JP5211290B2 - シヌクレイノパシー（ｓｙｎｕｃｌｅｉｎｏｐａｔｈｉｃ）およびアミロイド生成性疾患の予防および処置 - Google Patents

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Description

（関連出願の参照）
本発明は、２００２年１１月１日付で出願された特許出願第６０／４２３，０１２号の米国特許法第１１９条第（ｅ）項による利益を主張する２００３年１０月３１日付で出願された特許出願第１０／６９９，５１７号、および２００３年１０月３１日付で出願された特許出願第１０／６９８，０９９号の一部継続出願である、２００４年８月９日付で出願された特許出願第１０／９１５，２１４号の一部継続出願である、２００５年７月１９日付で出願された特許出願第１１／１８５，９０７号の一部継続出願である。上記出願は、すべての目的で参照されて本明細書に組み込まれる。
（発明の背景）
α−シヌクレイン（ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ）（α−ＳＮ）による脳の病変は、パーキンソン病（ＰＤ）、レビー小体型痴呆（ＤＬＢ）、アルツハイマー病のレビー小体変異型（ＬＢＶＡＤ）、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、および脳の鉄沈着を伴う神経変性１型（ＮＢＩＡ−１）など、いくつかの神経変性疾患の顕著な特徴である。これらの疾患のすべてに共通するシヌクレイン病と名付けられているものは、主としてα−ＳＮからなる、神経細胞およびグリア細胞におけるタンパク質の不溶性封入体である。
レビー小体およびレビー神経突起は、主としてα−ＳＮからなる神経細胞内封入体である。レビー小体およびレビー神経突起は、パーキンソン病（ＰＤ）の顕著な神経病理学的特徴である。ＰＤおよび他のシヌクレイン病は、まとめてレビー小体病（ＬＢＤ）と呼ばれてきた。ＬＢＤは、ドーパミン作動系の変性、運動変化、認知障害、およびレビー小体（ＬＢ）の形成を特徴とする。（非特許文献１）。他のＬＢＤには、びまん性レビー小体病（ＤＬＢＤ）、アルツハイマー病のレビー小体変異型（ＬＢＶＡＤ）、ＰＤとアルツハイマー病（ＡＤ）の混合型、および多系統萎縮症などがある。レビー小体型痴呆（ＤＬＢ）は、ＬＢＤの専門用語の差異を調整するために新たに作られた用語である。
ＬＢによる疾患は、依然として老齢者における運動障害および認知力低下の共通の原因である（非特許文献２）。その発生率は上昇し続け、深刻な公衆衛生問題を引き起こしているが、今日まで、これらの疾患は治療も予防もできるものではなく、ＰＤの原因および発症機序を理解することは新たな治療法の開発に重大な意味を持つ（非特許文献３）。ＰＤの原因は議論の余地があり、さまざまな神経毒および遺伝的感受性因子など、多数の要因が役割を果たしていると提唱されてきた。
近年、ＰＤの発症機序を理解する上で新たな期待が生じてきた。特に、いくつかの研究によって、以下のことから、シナプス・タンパク質であるα−ＳＮがＰＤ発症において中心的な役割を果たしていることが示されている：（１）このタンパク質がＬＢに沈着すること（非特許文献４）、（２）α−ＳＮ遺伝子の突然変異がまれな家族性パーキンソン病と同時分離すること（非特許文献５）、（３）トランスジェニックマウス（非特許文献６）およびショウジョウバエ（非特許文献７）におけるその過剰発現がＰＤの病理学的側面を模倣すること。したがって、脳におけるα−ＳＮの沈着がヒト、マウス、およびハエなどの多様な種において類似した形態学的および神経学的変化を伴うという事実が、この分子がＰＤの発症の一因となっていることを示唆している。
ＡＤアミロイド斑の構成成分であると以前決定されたα−ＳＮ断片は、ＡＤアミロイドの非アミロイド−β（非Ａβ）成分（ＮＡＣ）と命名された（非特許文献８〜１０）。ＮＡＣの正確な機能は未知であるが、例えば、発達過程における神経可塑性、ならびにＬＢＤ、ＡＤおよびその他の疾患における病態下での学習および神経終末の変性など、シナプス事象において重要な役割を果たしている可能性がある（非特許文献１１）；Ｍａｓｌｉａｈ，ｅｔ ａｌ．，（２０００））。
ＡＤ、ＰＤ、およびレビー小体認知症（ＤＬＢ）は、高齢者に最も普通に見られる神経変性疾患である。その発生率は上昇し続け、深刻な公衆衛生問題を引き起こしているが、今日まで、これらの疾患は治療も予防も不可能である。最近の疫学的研究により、アルツハイマー患者の約３０％がＰＤにも罹患しているように、ＡＤとＰＤの間には臨床上密接な関係があることが実証された。このように、ＡＤ患者は、老齢人口の残りの部分に比べて、ＰＤを併発する可能性が高い。さらに、痴呆になるＰＤ患者は、通常古典的なＡＤを発症している。各神経変性疾患は、特定の脳部位および細胞集団に好発して、その結果異なる病理学的特徴を示すように見えるが、ＰＤ、ＡＤ、ＤＬＢおよびＬＢＤは、共通の顕著な病理学的特徴を有する。家族性ＡＤ、ダウン症候群、または散発性ＡＤ患者では扁桃体上にＬＢが発生するが、これはＰＤの古典的な神経病理学的特徴である。さらに、それぞれの疾患は、神経細胞の変性、神経細胞間のシナプス結合、そして最終的には、細胞死、神経伝達物質の減少、および、その前駆体が正常な中枢神経系機能に関与するミスフォールドされたタンパク質の異常沈着に関連している。生化学実験により、ＡＤ、ＰＤおよびＤＬＢの間の関連が確認された。
ＡＤの古典的な病理学的特徴である老人斑は、β−アミロイド（Ａβ）ペプチドおよび非β−アミロイド成分（ＮＡＣ）ペプチドを含む。Ａβは、アミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ）と名付けられている、より大型の前駆タンパク質に由来する。ＮＡＣは、ＡＰＰの非β−アミロイド成分と名付けられ、現在ではより普通にα−ＳＮと呼ばれる、より大型の前駆タンパク質に由来する。ＮＡＣはα−ＳＮの６０〜８７位または６１〜９５位のアミノ酸残基を含む。ＡβおよびＮＡＣはともに、アミロイド斑の中に、それぞれの完全長タンパク質のタンパク質分解断片として初めて同定され、それらに対する完全長ｃＤＮＡが同定されてクローニングされた。
α−ＳＮは、β−シヌクレインおよびγ−シヌクレイン、ならびにシノレチン（ｓｙｎｏｒｅｔｉｎ）を含む、タンパク質の大きなファミリーの部分である。α−ＳＮは、シナプスに関連して標準状態で発現され、神経可塑性、学習および記憶において役割を果たすと考えられている。ヒト（ｈ）α−ＳＮにおける突然変異であって、α−ＳＮの凝集を促進する突然変異が同定されており（Ａｌａ３０ＰｒｏおよびＡｌａ５３Ｔｈｒ）、まれな型の常染色体優勢型ＰＤと関係がある。これらの突然変異が、凝集しようとするα−ＳＮの性質を強める機構は解明されていない。
いくつかの突然変異が集団中のＡＰＰおよびα−ＳＮに見出すことができるという事実にも関わらず、ＡＤおよびＰＤのほとんどの症例は散発性のものである。これらの疾患の最も頻度が高い散発型は、Ａβおよびα−ＳＮそれぞれの異常沈着に関連している。しかし、これらのタンパク質の過剰沈着の理由は解明されていない。Ａβは神経細胞から分泌されて細胞外のアミロイド斑に沈着する。さらに、Ａβは神経細胞内部で検出することもできる。α−ＳＮはＬＢと呼ばれる神経細胞内封入体に沈着する。これら２つのタンパク質は、典型的には細胞外の神経突起ＡＤ斑内に一緒に存在するが、共に細胞内封入体に存在することもある。
α−ＳＮ沈着により神経変性およびＰＤの特徴的症状が生じる機構は不明である。しかし、α−ＳＮ凝集を促進および／または阻害する因子の役割を同定することは、ＬＢＤの病因の理解、およびその関連疾患に対する新たな治療法の開発にとって重大な意味を持つ。治療法を同定する研究は、α−ＳＮ凝集を低減させる化合物を探し出すこと（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，ｅｔ ａｌ．）、または、主に病気の冒される細胞であるドーパミン作動性神経細胞の再生および／または残存を促進する成長因子を検討することに向けられてきた（非特許文献１２〜１３））。ＡＤのトランスジェニックマウスモデルでの最近の研究により、Ａβの１〜４２位に対する抗体が、脳からのアミロイドの除去を容易にしたり刺激したりし、ＡＤ様の病態を改善し、その結果として、認識能力を向上させることが示された（非特許文献１４〜１６）。アルツハイマー患者の脳の中に見出される細胞外アミロイド斑とは対照的に、レビー小体は細胞内にあるものであり、抗体は通常、細胞に侵入しない。
ＭｃＫｅｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｄｅｍａｎｔｉａ ｗｉｔｈ Ｌｅｗｙ ｂｏｄｉｅｓ （ＤＬＢ）：Ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ｔｈｅ ＣＤＬＢ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｗｏｒｋｓｈｏｐ，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ（１９９６），４７：１１１３−２４ Ｇａｌａｓｋｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ−ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ｄｅｍｅｎｔｉａｓ．Ａｒｃｈ．Ｎｅｕｒｏｌ．（１９９４）５１：８８８−９５ Ｔａｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ ａｋｉｎｅｔｉｃ ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．（２０００）１３：４２７−３０ Ｓｐｉｌｌａｎｔｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９９７）３８８：８３９−４０；Ｔａｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．，ＡＭ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．（１９９８）１５２：３６７−７２；Ｗａｋａｂａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．（１９９７）２３９：４５−８ Ｋｒｕｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎ．（１９９８）１８：１０６−８；Ｐｏｌｙｍｅｒｏｐｏｕｌｏｓ ＭＨ， ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９７）２７６：２０４５−７ Ｍａｓｌｉａｈ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０００）２８７：１２６５−９） Ｆｅａｎｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（２０００）４０４：３９４−８ Ｉｗａｉ Ａ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ（２０００）１５０２：９５−１０９ Ｍａｓｌｉａｈ ｅｔ ａｌ．，ＡＭ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ（１９９６）１４８：２０１−１０ Ｕｅｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９３）９０：１１２８２−６ Ｈａｓｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ａｌｐｈａ−Ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ ｉｎ Ｌｅｗｙ ｂｏｄｙ ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ，Ｂｒａｉｎ Ｐａｔｈｏｌ（１９９９）９；７０７−２０ Ｄｊａｌｄｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｗ ｔｈｅｒａｐｉｅｓ ｆｏｒ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ（２００１）２４８：３５７−６２ Ｋｉｒｉｋ ｅｔ ａｌ．，Ｌｏｎｇ ｔｅｒｍ ｒＡＶＶ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ＧＤＮＦ ｉｎ ｔｈｅ ｒａｔ Ｐａｒｋｉｎｓｏ’ｓ ｍｏｄｅｌ：ｉｎｔｒａｓｔｒｉａｔａｌ ｂｕｔ ｎｏｔ ｉｎｔｒａｎｉｇｒａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｅｎｅｒｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｌｅｓｉｏｎｅｄ ｎｉｇｒｏｓｔｒｉａｔａｌ ｓｙｓｔｅｍ，Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ（２０００）２０：４６８６−４７００ Ｓｃｈｅｎｋ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａｍｙｌｏｉｄ−β ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ−ｄｉｓｅａｓｅ−ｌｉｋｅ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ｉｎ ＰＤＡＰＰ ｍｏｕｓｅ，Ｎａｔｕｒｅ（１９９９）４０８：１７３−１７７ Ｍｏｒｇａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａ−ｂｅｔａ ｐｅｐｔｉｄｅ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ｐｒｅｖｅｎｔｓ ｍｅｍｏｒｙ ｌｏｓｓ ｉｎ ａｎ ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ，Ｎａｔｕｒｅ（２０００）４０８：９８２−９８５ Ｊａｎｕｓ ｅｔ ａｌ．，Ａ−ｂｅｔａ ｐｅｐｔｉｄｅ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｒｅｄｕｃｅｓ ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ ａｎｄ ｐｌａｑｕｅｓ ｉｎ Ａ ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ，Ｎａｔｕｒｅ（２０００）４０８：９７９−８２
驚くべきことに、脳組織においてＬＢが細胞内にあるという性質を考慮して、本発明者らは、シヌクレインで免疫化したトランスジェニックマウス内の封入体の数を減らすことに成功した。本発明はとりわけ、患者に有益な免疫反応を起こす条件下で、シヌクレイン、シヌクレイン断片、シヌクレインもしくはその断片を模倣する抗原、または、シヌクレインの一定のエピトープに対する抗体を患者に投与することにより、ＰＤ、およびＬＢに関連した他の疾患を治療することを目的とするものである。本発明者らは、驚くべきことに、Ａβで免疫化したトランスジェニックマウス内の封入体の数を減らすことにも成功した。本発明はとりわけ、患者に有益な免疫反応を起こす条件下で、Ａβ、Ａβの断片、Ａβもしくはその断片を模倣する抗原、または、Ａβの一定のエピトープに対する抗体を患者に投与することにより、ＰＤ、およびＬＢに関連した他の疾患を治療することを目的とするものである。本発明は、このように、神経病理を予防または改善するための投薬計画に対する年来の需要を満たすものであり、また、一部の患者においては、ＰＤ、およびＬＢに関連した他の疾患に関連した認知障害を予防または改善するための投薬計画に対する年来の需要を満たすものである。
関連出願第０９／５８５，８１７号（２０００年６月１日付出願）、第６０／１３７，０１０号（１９９９年６月１日付出願）、第０９／５８０，０１５号（２０００年５月２６日付出願）および第１０／６９８，０９９号（２００３年１０月３１日付出願）は、すべての目的でそれら全体が参照されて組み込まれる。
（発明の開示）
１つの態様において、本発明は、脳におけるレビー小体およびα−ＳＮ凝集を特徴とする疾患を予防または治療する方法を提供する。このような方法は、α−ＳＮに対する免疫原性反応を誘導することを必要とする。このような誘導は、積極的に免疫原を投与するか、または消極的にシヌクレインに対する抗体、または抗体の誘導体を投与することによって行うことができる。いくつかの方法において、患者は無症候である。いくつかの方法において、患者は罹患しているが、無症候である。いくつかの方法において、患者は危険因子を有しているが、無症候である。いくつかの方法において、疾患はパーキンソン病である。いくつかの方法において、疾患はパーキンソン病であり、本薬剤の投与により患者の運動特性が改善される。いくつかの方法において、疾患はパーキンソン病であり、本薬剤の投与によって患者の運動特性の悪化が防ぐことができる。いくつかの方法において、患者はアルツハイマー病に罹患していない。
脳の中のレビー小体またはα−ＳＮ凝集に悩まされる患者を治療するために、１つの投薬計画では、患者にある用量のα−ＳＮまたはその活性断片を投与して、免疫反応を誘導することが必要とされる。いくつかの方法において、少なくとも６ヶ月にわたる期間、α−ＳＮまたはその活性断片を反復投与で投与する。例えば、α−ＳＮまたはその活性断片は、末梢血、腹腔内、経口、皮下、頭蓋内、筋肉内、局所的、鼻腔内、または静脈内に投与することができる。いくつかの方法では、α−ＳＮまたはその活性断片に対する免疫反応を促進するアジュバントとともにα−ＳＮまたはその活性断片を投与する。いくつかの方法において、免疫原性反応はα−ＳＮまたはその活性断片に対する抗体を含む。
いくつかの方法において、本薬剤はα−ＳＮの３５〜６５位のアミノ酸である。いくつかの方法において、本薬剤はα−ＳＮの１３０〜１４０位のアミノ酸を含み、全部で４０よりも少ないアミノ酸を有する。いくつかの方法において、本薬剤はα−ＳＮの１３０〜１３６位のアミノ酸を含み、全部で４０より少ないアミノ酸を有する。いくつかの方法において、本薬剤のＣ末端アミノ酸はα−ＳＮのＣ末端アミノ酸である。上記の方法のいくつかにおいて、α−ＳＮまたは活性断片は、α−ＳＮまたは活性断片のＮ末端において担体に連結している。いくつかの方法において、本薬剤はα−ＳＮの１〜１０位のアミノ酸を含み、全部で４０より少ないアミノ酸を有する。いくつかの方法において、本薬剤のＮ末端アミノ酸はα−ＳＮのＮ末端アミノ酸である。上記の方法のいくつかにおいて、α−ＳＮまたは活性断片は、α−ＳＮまたは活性断片のＣ末端において担体に連結している。上記の方法のいくつかにおいて、α−ＳＮまたは活性断片は担体分子に連結して結合体を形成する。いくつかの方法において、α−ＳＮ断片を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを投与することにより、本薬剤は患者に投与される。
脳の中のレビー小体またはα−ＳＮ凝集に悩まされる患者を治療するために、１つの投薬計画では、患者にある用量のα−ＳＮまたはその活性断片に対する抗体を投与して、免疫反応を誘導することが必要とされる。使用される抗体は、ヒト型、ヒト化型、キメラ型、またはポリクローナル型でもよく、モノクローナル型またはポリクローナル型であってもよい。いくつかの方法において、この抗体のアイソタイプはヒトＩｇＧ１である。いくつかの方法において、抗体は、α−ＳＮペプチドで免疫化されたヒトから調製されるが、このヒトは抗体を用いて治療しようとしている患者であってもよい。いくつかの方法において、この抗体は、レビー小体を有する神経細胞の外表面に結合して、レビー小体を消散させる。いくつかの方法において、この抗体は、レビー小体を有する神経細胞の内部に移行して、レビー小体を消散させる。
いくつかの方法において、本抗体を医薬組成物として、医薬担体とともに投与する。いくつかの方法において、抗体は、体重１ｋｇあたり０．０００１〜１００ｍｇ、好ましくは少なくとも１ｍｇの抗体という投与量で投与される。いくつかの方法において、この抗体を長期間にわたって、例えば、少なくとも６ヶ月間反復投与で投与する。いくつかの方法において、この抗体を徐放性組成物として投与することができる。この抗体は、例えば、末梢血、腹腔内、経口、皮下、頭蓋内、筋肉内、局所的、鼻腔内、または静脈内に投与することができる。いくつかの方法において、患者の血液中における投与抗体量について、患者をモニターする。
いくつかの方法において、少なくとも１つの抗体鎖をコードするポリヌクレオチドを患者に投与することにより、抗体を患者に投与する。このポリヌクレオチドは発現されて、患者の体内で抗体鎖を産生する。任意には、このポリヌクレオチドは、抗体の重鎖および軽鎖をコードし、このポリヌクレオチドが発現されて、患者の体内で重鎖および軽鎖を産生する。
本発明は、本出願に記載されたα−ＳＮに対する抗体のいずれか、および薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物をさらに提供する。
別の態様において、本発明は、脳におけるレビー小体またはα−ＳＮ凝集を特徴とする疾患を予防または治療する方法であって、α−ＳＮに対する免疫原性反応を誘導する薬剤を投与すること含み、さらに、Ａβに対する免疫原性反応を患者に誘導する第２の薬剤を患者に投与することを含む方法を提供する。いくつかの方法において、この薬剤はＡβまたはその活性断片である。いくつかの方法において、この薬剤はＡβに対する抗体である。
別の態様において、本発明は、脳におけるレビー小体またはα−ＳＮ凝集を特徴とする疾患を予防または治療する方法であって、Ａβに対する免疫原性反応を誘導する薬剤を患者に投与することを含む方法を提供する。いくつかの方法において、この薬剤はＡβまたはその活性断片である。いくつかの方法において、この薬剤はＡβに対する抗体である。いくつかの方法において、疾患はパーキンソン病である。いくつかの方法において、患者はアルツハイマー病に罹患しておらず、その危険因子も有さない。いくつかの方法において、患者におけるパーキンソン病の兆候または症状をモニターすることをさらに含む。いくつかの方法において、疾患はパーキンソン病であり、薬剤を投与することによって、パーキンソン病の兆候または症状の改善がもたらされる。
さらに、本発明は、患者の体内でレビー小体の成分に対する免疫原性反応を誘導するのに有効な薬剤、例えば上記したものなど、および薬学的に許容可能なアジュバントを含む医薬組成物を提供する。いくつかの化合物において、この薬剤はα−ＳＮまたは活性断片、例えば、ＮＡＣ、または本出願に記載したＣ末端断片のいずれかである。また、本発明は、レビー小体の成分に対して特異的な抗体を含む医薬組成物も提供する。
また、本発明は、患者の体内でアミロイド斑のシヌクレイン−ＮＡＣ成分に対する免疫反応を誘発するのに有効な薬剤を含む医薬組成物も提供する。いくつかの化合物において、この薬剤はα−ＳＮまたは活性断片、例えば、ＮＡＣ、または本出願に記載したα−シヌクレインのＣ末端断片のいずれかであり、任意にはアジュバントである。他の化合物において、この薬剤は、α−ＳＮまたはその断片を特異的に結合する抗体またはその断片であり、任意には医薬用担体である。
別の態様において、本発明は、レビー小体に関連した疾患を予防または治療する際の活性に関して抗体をスクリーニングする方法を提供する。このような方法は、シヌクレインを発現する神経細胞を抗体と接触させることを必要とする。次いで、抗体と接触していない対照細胞と比較して、接触によって細胞におけるシヌクレイン沈着物が減少するかどうかを決定する。
別の態様において、本発明は、患者の脳のレビー小体病を治療または予防する際の活性に関して抗体をスクリーニングする方法を提供する。このような方法は、抗体を、α−ＳＮの少なくとも５つ連続したアミノ酸を含むポリペプチドと接触させることを必要とする。そして、この抗体がポリペプチドに特異的に結合するかどうかを決定するが、この特異的結合は、この抗体が疾患の治療に活性を有することを示す目安となる。本発明は、脳におけるレビー小体またはα−シヌクレイン凝集を特徴とする疾患を予防または治療する方法をさらに提供する。この方法は、この疾患に罹患しているか、その危険を有する患者に、配列番号１に従って番号を付けると、ヒトα−シヌクレインの７０〜１４０位の残基の中にあるエピトープに特異的に結合する抗体を含む免疫原性反応を誘導するのに有効なα−シヌクレインの免疫原性断片を含むポリペプチドを投与して、この疾患の予防または治療をもたらすことを含む。
任意には、α−シヌクレインの免疫原性残基は、配列番号１に従って番号を付けると、α−シヌクレインの１〜６９位の残基を含まない。任意には、この免疫原性反応は、配列番号１に従って番号を付けると、ＳＮ８３〜１０１、ＳＮ１０７〜１２５、ＳＮ１１０〜１２８およびＳＮ１２４〜１４０からなる群から選択されたエピトープ内でヒトα−シヌクレインに特異的に結合する抗体を含む。任意には、この免疫原性反応は、選択されたエピトープの外側でヒトα−シヌクレインの残基に特異的に結合する抗体を含まない。任意には、免疫原性断片は、配列番号１に従って番号を付けると、α−シヌクレインの７０〜１４０位の間にある５〜２０個の連続したアミノ酸を有する。任意には、免疫原性断片は、配列番号１に従って番号を付けると、α−シヌクレインの１２０〜１４０位の間にある５〜２０個の連続したアミノ酸を有する。任意には、免疫原性断片は、配列番号１に従って番号を付けると、ＳＮ８７〜９７、ＳＮ１１１〜１２１、ＳＮ１１４〜１２４およびＳＮ１２８〜１３６からなる群から選択されたヒトα−シヌクレインのセグメントを含み、かつ、α−シヌクレインの全部で４０個を超えない連続した残基を含む。任意には、免疫原性断片は、配列番号１に従って番号を付けると、ＳＮ１２５〜１４０を含み、かつ、α−シヌクレインの全部で４０個を超えない連続した残基を含む。任意には、免疫原性断片は、配列番号１に従って番号を付けると、ＳＮ１３０〜１４０を含み、かつ、α−シヌクレインの全部で４０個を超えない連続した残基を含む。任意には、免疫原性断片は、配列番号１に従って番号を付けると、ＳＮ８３〜１４０を含む。
任意には、免疫原性断片は、配列番号１に従って番号を付けると、
Figure 0005211290
 からなる群から選択される。
任意には、この免疫原性反応は、配列番号１に従って番号を付けると、ＳＮ１〜２０、ＳＮ２〜２１、ＳＮ２〜２３およびＳＮ１〜４０からなる群から選択されたエピトープ内でヒトα−シヌクレインに特異的に結合する抗体を含む。任意には、この免疫原性反応は、ＳＮ２５〜６９、ＳＮ２５〜１４０、ＳＮ４０〜６９、ＳＮ４０〜１４０、またはＳＮ７０〜１４０の領域内にあるヒトα−シヌクレインの残基に特異的に結合する抗体を含まない。任意には、免疫原性断片は、配列番号１に従って番号を付けると、α−シヌクレインの１〜４０位の間にある５〜２０個の連続したアミノ酸を有する。任意には、免疫原性断片は、配列番号１に従って番号を付けると、α−シヌクレインの１位から２０位の間にある５〜２０個の連続したアミノ酸、およびα−シヌクレインの１２０位から１４０位の間にある５〜２０個の連続したアミノ酸を有する。任意には、免疫原性断片は、配列番号１に従って番号を付けると、α−シヌクレインの全部で４０個を超えない連続した残基を含む。
任意には、免疫原性反応は、ヒトα−シヌクレインの１〜２０位の残基の中にあるエピトープ内、およびヒトα−シヌクレインの７０〜１４０位の残基の中にあるエピトープ内でヒトα−シヌクレインに特異的に結合する抗体を含む。任意には、免疫原性反応は、ヒトα−シヌクレインの１〜２０位の残基の中にあるエピトープ内、およびヒトα−シヌクレインの１２０〜１４０位の残基の中にあるエピトープ内でヒトα−シヌクレインに特異的に結合する抗体を含む。任意には、免疫原性反応は、ヒトα−シヌクレイン４１位および１１９位の残基の中にあるエピトープ内でヒトα−シヌクレインに特異的に結合する抗体を含まない。
任意には、免疫原性断片を担体に連結させて結合体を形成させる。任意には、ポリペプチドは、担体に融合した免疫原性断片を含む。任意には、免疫原性断片を、α−シヌクレイン断片のＣ末端で担体分子に連結させる。任意には、この断片の複数のコピーを、担体の複数のコピーと相互連結させる。任意には、免疫原性断片をアジュバントとともに投与する。任意には、投与段階で、レビー小体の少なくとも部分的なクリアランスがもたらされる。任意には、投与段階でレビー小体が分解される。任意には、投与段階で、シナプスにおけるα−シヌクレインオリゴマーの量が減少する。任意には、投与段階で、リソソーム経路の活性化によってシヌクレインが除去される。
任意には、単一のポリペプチドまたは融合タンパク質の投与により、免疫原性反応を誘導する。任意には、２つ以上のポリペプチド（例えば、２つのポリペプチド）の投与により、免疫原性反応を誘導する。任意には、ヒトα−シヌクレインの１〜２０位の残基内のエピトープに特異的に結合する抗体を含む免疫原性反応を誘導するのに有効なα−シヌクレインの第１の免疫原性断片を含む第１のポリペプチドの投与、および、ヒトα−シヌクレインの７０〜１４０位の残基、好ましくは１２０〜１４０位の残基内のエピトープに特異的に結合する抗体を含む免疫原性反応を誘導するのに有効なα−シヌクレインの第２の免疫原性断片を含むポリペプチドの投与により、免疫原性反応を誘導する。
任意には、２つ以上のポリペプチドを組み合わせて投与することによって、免疫原性反応を誘導する。任意には、これらの２つ以上のポリペプチドを共投与および／または同時に処方して投与する。
別の態様において、本発明は、第１の免疫原性断片がヒトα−シヌクレインの１〜２０位の残基内のエピトープに特異的に結合する抗体を含む免疫原性反応を誘導するのに有効なものであり、α−シヌクレインの第２の免疫原性断片がヒトα−シヌクレインの１２０〜１４０位の残基内のエピトープに特異的に結合する抗体を含む免疫原性反応を誘導するのに有効なものである場合に、α−シヌクレインの第１の免疫原性断片を含む第１のポリペプチド、および、α−シヌクレインの第２の免疫原性断片を含む第２のポリペプチド含む組成物を提供する。任意には、この組成物は、α−シヌクレインの２５〜６９位の残基を含むα−シヌクレインの免疫原性断片を含まない。第１および第２の免疫原性断片は（例えば、結合体または融合タンパク質として）物理的に結合することができる。第１および第２の免疫原性断片を同時に処方することができる。
本発明は、脳におけるレビー小体およびα−ＳＮ凝集を特徴とする病気を効果的に予防、または治療する方法をさらに提供する。１つの実施態様において、この方法は、この病気に罹病しているかそのリスクを有する患者に、残基を配列番号１の記載に従って番号付けると、ヒトα−シヌクレインの７０〜１４０位の残基中にあるエピトープに特異的に結合する抗体の有効な投与計画を行うことを含む。別の実施態様において、この方法は、この病気に罹病しているかそのリスクにある患者に、残基を配列番号１の記載に従って番号付けると、ヒトα−シヌクレインの１〜４０位の残基の中にあるエピトープに特異的に結合する抗体の有効な投与計画を行うことを含む。さらに別の実施態様において、この方法は、この病気に罹病しているかそのリスクにある患者に、残基を配列番号１の記載に従って番号付けると、ヒトα−シヌクレインの１〜４０位の残基の中にあるエピトープに特異的に結合する第１の抗体の有効な投与計画、およびヒトα−シヌクレインの７０〜１４０位の残基の中にあるエピトープに特異的に結合する第２の抗体の有効な投与計画を行うことを含む。
抗体が、残基を配列番号１の記載に従って番号付けると、ヒトα−シヌクレインの７０〜１４０位の残基の中にあるエピトープに特異的に結合すると、任意には、この抗体は、残基を配列番号１の記載に従って番号付けると、ヒトα−シヌクレインの８３〜１４０位の残基中にあるエピトープに特異的に結合する。任意には、この抗体は、ヒトα−シヌクレインの１２０〜１４０位の残基の中にあるエピトープに特異的に結合する。任意には、この抗体は、残基を配列番号１の記載に従って番号付けると、ＳＮ８３〜１０１、ＳＮ１０７〜１２５、ＳＮ１１０〜１２８およびＳＮ１２４〜１４０からなる群から選択されたヒトα−シヌクレインのセグメントの中にあるエピトープの中で特異的に結合する。
抗体が、残基を配列番号１の記載に従って番号付けると、ヒトα−シヌクレインの１〜４０位の残基の中にあるエピトープの中で特異的に結合すると、任意には、この抗体は、残基を配列番号１の記載に従って番号付けると、１〜２０位の残基の中、または１〜１０位の残基の中にあるエピトープに特異的に結合する。
第１の抗体が、残基を配列番号１の記載に従って番号付けると、ヒトα−シヌレインの１〜４０位の残基中にあるエピトープに特異的に結合し、第２の抗体がヒトα−シヌレインの７０〜１４０位の残基の中にあるエピトープに特異的に結合すると、任意には、第２の抗体はヒトα−シヌクレインの１２０〜１４０位の残基の中にあるエピトープに特異的に結合する。任意には、第１および第２の抗体を同時に投与する。任意には、第１および第２の抗体を同一の治療過程において投与する。
任意には、抗体はモノクローナル抗体である。任意には、抗体は、このエピトープの外側にあるα−シヌレインの残基には特異的に結合しないポリクローナル抗体集団である。任意には、抗体はヒト化抗体である。任意には、抗体はヒト型抗体である。任意には、抗体はヒトＩｇＧ１アイソタイプ抗体である。任意には、抗体は医薬組成物として医薬担体とともに投与される。任意には、抗体を、体重１ｋｇ当り０．０００１〜１００ｍｇ、好ましくは少なくとも１ｍｇの投与量で投与する。任意には、抗体を複数回用量にして、６ヶ月以上にわたって投与する。任意には、徐放性組成物として抗体を投与する。任意には、抗体を、腹腔内、経口、皮下、頭蓋内、筋肉内、局所的、鼻腔内、または静脈内に投与する。任意には、抗体は、レビー小体を有する神経細胞の中に取り込まれてレビー小体を消散させる。任意には、抗体は、レビー小体を有する神経細胞の外表面に結合して、レビー小体を消散させる。任意には、抗体は、神経細胞の外表面上にあるα−シヌクレインに結合してα−シヌクレインの架橋を促進するが、そこでは、投与段階によってレビー小体が脱凝集する。任意には、投与段階で、シナプスの中にあるα−シヌクレインオリゴマーの量が減少する。任意には、投与段階で、リソソーム経路の活性化により、ヒトα−シヌクレインが除去される。いくつかの方法において、病気はパーキンソン病である。任意には、抗体は、免疫ブロットにより測定すると、変性したヒトα−シヌクレインに特異的に結合する。任意には、抗体は、少なくとも１０９Ｍ−１のアフィニティーで変性ヒトα−シヌクレインに特異的に結合する。任意には、抗体は、免疫細胞化学法によって測定すると、シナプスに特異的に結合する。
また、本発明は，脳におけるレビー小体およびα−シヌクレインを特徴とする病気の予防・治療するための組成物であって、残基を配列番号１の記載に従って番号付けると、ヒトα−シヌクレインの１〜２０位の残基中にあるエピトープに特異的に結合する第１のモノクローナル抗体、およびヒトα−シヌクレインの７０〜１４０位（好ましくは１２０〜１４０位）の残基中にあるエピトープに特異的に結合する第２のモノクローナル抗体を含む組成物も提供する。
また、本発明は、脳におけるレビー小体またはα−シヌクレイン凝集を特徴とする病気の予防および治療するためのキットであって、残基を配列番号１の記載に従って番号付けると、ヒトα−シヌクレインの１〜２０位の残基中にあるエピトープに特異的に結合する抗体を含む第１のコンテナ、および、ヒトα−シヌクレインの７０〜１４０位（好ましくは、１２０〜１４０位）の残基中にあるエピトープに特異的に結合する抗体を含む第２のコンテナを含むキットも提供する。
さらに、本発明は、脳におけるレビー小体またはα−シヌクレイン凝集を特徴とする病気の効果的な予防・治療法をさらに提供する。この方法は、この病気に罹病しているかそのリスクがある患者に、残基を配列番号１の記載に従って番号付けると、ヒトα−シヌクレインの７０〜１４０位の残基中にあるエピトープに特異的に結合する抗体を含む免疫原性反応を誘導する薬剤の有効な投与計画を行い、それによって、病気の予防または治療を達成することを含む。任意には，この免疫原性反応は、残基を配列番号１の記載に従って番号付けると、ヒトα−シヌクレインの１〜６９位の残基の中にあるエピトープに特異的に結合する抗体を含まない。任意には，この免疫原性反応は、残基を配列番号１の記載に従って番号付けると、ＳＮ８３〜１０１、ＳＮ１０７〜１２５、ＳＮ１１０〜１２８およびＳＮ１２４〜１４０からなる群から選択されたヒトα−シヌクレインのセグメントの中で特異的に結合する抗体を含む。
さらに、本発明は、レビー小体を特徴とする病気の治療において有用な活性を有する薬剤をスクリーニングする方法を提供する。この方法は、この薬剤によってレビー小体病の特徴が生じるよう処理されたトランスジェニック非ヒト動物に、この薬剤を接触させること、および、この薬剤が、対照トランスジェニック非ヒト動物と較べて、特徴が生じる範囲または速度に影響を及ぼすかどうかを決定することを含む。この薬剤は、残基を配列番号１の記載に従って番号付けると、（ｉ）ヒトα−シヌクレインの７０〜１４０位の残基中にある少なくとも１つのエピトープに特異的に結合する抗体を誘導するα−シヌクレインの断片、または（ｉｉ）ヒトα−シヌクレインの７０〜１４０位の残基の中にあるエピトープに特異的に結合する抗体である。
任意には、このトランスジェニック非ヒト動物は、ヒトα−シヌクレインを発現するトランスジーンを含む。任意には、この方法は、変性ヒトα−シヌクレインへの結合について複数の被験抗体をスクリーニングすること、および薬剤として最も強い結合抗体を選択することをさらに含む。任意には、この方法は、免疫細胞化学法によって、組織切片中のシヌクレイン沈着物への結合について複数の被験抗体をスクリーニングすること、および薬剤として最も強い結合抗体を選択することをさらに含む。
さらに、本発明は、モノクローナル抗体８Ａ５または６Ｈ７をヒト化する方法であって、このモノクローナル抗体のＣＤＲ領域のアミノ酸配列を決定すること、受容体抗体を選択すること、ならびにモノクローナル抗体由来のＣＤＲ、および受容体抗体由来の可変領域フレームワークを含むヒト化抗体を産生させることを含む方法を提供する。
本発明は、キメラ型モノクローナル抗体８Ａ５または６Ｈ７を製造する方法であって、このモノクローナル抗体の軽鎖および重鎖の可変領域のアミノ酸配列を決定すること、軽鎖および重鎖不変領域を選択すること、ならびに、軽鎖不変領域に融合した軽鎖可変領域を含む軽鎖、および重鎖不変領域に融合した重鎖可変領域を含む重鎖を含むキメラ抗体を産生させることを含む方法を提供する。
定義
「実質的同一性」という用語は、２つのペプチド配列が、デフォルト値のギャップ重みづけを用いてＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴプログラムによるなどして最適に整列されたときに、少なくとも６５パーセントの配列一致率、好ましくは、少なくとも８０または９０パーセントの配列一致率、より好ましくは、少なくとも９５パーセント以上の配列一致率（例えば９９パーセント以上の配列一致率）を共有することを意味する。好ましくは、一致しない残基位置は、保存的なアミノ酸置換によって異なっている。
配列比較に関して、典型的には１つの配列が参照配列として働き、それに対して被験配列を比較する。配列比較アルゴリズムを用いる場合、被験配列および参照配列をコンピューターに入力し、必要ならば、サブシークエンスの組み合わせを指定して、配列アルゴリズムプログラムのパラメーターを指定する。すると、配列比較アルゴリズムが、指定したプログラムのパラメーターに基づいて、参照配列に対する被験配列の配列一致率を計算する。
比較のための配列の最適アラインメントは、例えば，Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所的相同性アルゴリズムにより、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズムにより、Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：２４４４（１９８８）の類似性検索法により、これらのアルゴリズム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩに収められたＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）をコンピューターによって実行することにより、または目視により行うことができる（一般的には、Ａｕｓｂｅｌ ｅｔ．ａｌ．，上記を参照）。配列同一性および配列類似性の割合を決定するのに適したアルゴリズムの１つの例は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムであり、Ａｕｓｂｅｌ ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）に記載されている。ＢＬＡＳＴ解析を行うソフトウエアは、全米バイオテクノロジー情報センター（ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ：ＮＣＢＩ）のウエブサイトから公開されている。パラメーターをカスタマイズすることもできるが、一般的には、プログラムの初期パラメーターを使って配列比較を行うことができる。アミノ酸配列に関して、ＢＬＡＳＴＰプログラムは初期値として、ワード長（Ｗ）：３、期待値（Ｅ）：１０、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリクスを用いる（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ＆ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９，１０９１５（１９８９）参照）。
アミノ酸置換を保存的置換または非保存的置換に分類するために，アミノ酸を次のようにグループ化する。グループＩ（疎水性側鎖）：ノルロイシン、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ；グループＩＩ（中性親水性側鎖）：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；グループＩＩＩ（酸性側鎖）：ａｓｐ、ｇｌｕ；グループＩＶ（塩基性側鎖）：ａｓｎ、ｇｌｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ；グループＶ（鎖配向に影響を及ぼす残基）：ｇｌｙ、ｐｒｏ；およびグループＶＩ（芳香族側鎖）：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ。保存的置換は、同一クラスのアミノ酸の間における置換を含む。非保存的置換は、これらのクラスの１つのメンバーを別のクラスのメンバーと交換することからなる。
本発明の治療薬は、典型的に、望ましくない混入物を実質的に含まない。このことは，薬剤が典型的に、少なくとも約５０％ｗ／ｗ（重量／重量）の純度であり、かつ、実質的に妨害タンパク質および混入物を含まないことを意味する。時に、この薬剤は、少なくとも約８０％ｗ／ｗ、より好ましくは少なくとも９０または約９５％ｗ／ｗの純度である。しかし、従来のタンパク質精製技術を用いて、少なくとも９９％ｗ／ｗの均質なペプチドを得ることができる。
ある分子が標的に「特異的に結合」するという語句は、他の生体分子の混成集団の存在下で、この分子が存在することを判定できる結合反応を意味する。したがって、指定されたイムノアッセイ条件において、特定の分子は特定の標的に優先的に結合するが、試料中に存在する他の生体分子には顕著な量では結合しない。このような条件下で抗体が標的に特異的に結合するには、その抗体が、その標的に対する特異性について選択される必要がある。多様なイムノアッセイフォーマットを用いて、特定のタンパク質に特異的に免疫反応する抗体を選択してもよい。例えば、固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイを常に用いて、タンパク質と特異的に免疫反応するモノクローナル抗体を選択する。例えば、特異的免疫活性を測定するために用いることができるイムノアッセイフォーマトおよび条件の説明については、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照。２つの実体間の特異的結合は、少なくとも１０６、１０７、１０８、１０９Ｍ−１のアフィニティーを意味する。１０８Ｍ−１より大きいアフィニティーが好ましい。
「抗体」または「イムノグロブリン」という用語は、完全抗体およびその結合断片を含むように使用される。典型的には、断片は、抗原に対する特異的結合に関して、自身が由来する完全抗体と競合する。断片は個々の重鎖、軽鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂｃ、およびＦｖを含む。断片は、組換えＤＮＡ技術により、または、完全なイムノグロブリンの酵素的または化学的な分離によって産生される。また、「抗体」という用語は、他のタンパク質との融合タンパク質として化学的に結合されているか、発現されている１つ以上のイムノグロブリン鎖も含む。また、「抗体」という用語は二重特異性抗体も含むものである。二重特異性または二重機能性抗体は、２つの異なる重鎖／軽鎖対および２つの異なる結合部位を有する人工ハイブリッド抗体である。二重特異性抗体は、ハイブリドーマの融合、またはＦａｂ’断片の連結など、さまざまな方法によって製造することができる。例えば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ ＆ Ｌａｃｈｍａｎｎ，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７９：３１５−３２１（１９９０）；Ｋｏｓｔｅｌｎｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８，１５４７−１５５３（１９９２）参照。また、「抗体」という用語は、重鎖および軽鎖の可変領域がスペーサーを介して連結している単鎖抗体も含む。
ＡＰＰ６９５、ＡＰＰ７５１、およびＡＰＰ７７０はそれぞれ、ヒトＡＰＰ遺伝子によってコードされた、６９５個、７５１個、および７７０個のアミノ酸残基長のポリペプチドである。Ｋａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３２５，７７３（１９８７）；Ｐｏｎｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３１，５２５（１９８８）；およびＫｉｔａｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３１，５３０（１９８８）参照。ヒトアミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ）の中にあるアミノ酸には、ＡＰＰ７７０アイソフォームの配列に従って、番号が割り当てられている。例えば、Ａβ３９、Ａβ４０、Ａβ４１、Ａβ４２およびＡβ４３などという用語は、１〜３９位、１〜４０位、１〜４１位、１〜４２位および１〜４３位のアミノ酸残基を含むＡβペプチドを意味する。
「抗原」は、抗体が特異的に結合する実体である。
「エピトープ」または「抗原決定基」という用語は、Ｂ細胞および／またはＴ細胞が反応する抗原上の部位を意味する。Ｂ細胞エピトープは、連続したアミノ酸、またはタンパク質の三次折りたたみによって近接した不連続なアミノ酸の両方から形成することができる。連続したアミノ酸から形成されたエピトープは、典型的には変性溶媒に曝露されても保持されるが、三次折りたたみによって形成されたエピトープは、典型的には、変性溶媒によって処理されると失われる。エピトープは、ユニークな空間的立体構造の中に、典型的には少なくとも３個、より普通には、少なくとも５個または８〜１０個のアミノ酸を含む。エピトープの空間的立体構造を決定する方法には、例えば、Ｘ線結晶構造解析および２次元核磁気共鳴などがある。例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏ１．６６，Ｇｌｅｎｎ Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ，Ｅｄ．（１９９６）参照。ある抗体が、別の抗体の標的抗原への結合を阻止できることを示す簡単なイムノアッセイで、同一エピトープを認識する抗体を同定することができる。Ｔ細胞は、ＣＤ８細胞については約９アミノ酸の、ＣＤ４細胞については約１３〜１５アミノ酸の連続したエピトープを認識する。エピトープを認識するＴ細胞は、抗原依存性増殖を測定するインビトロアッセイによって同定することができ、エピトープに反応して抗原刺激を受けたＴ細胞による３Ｈチミジン取り込みによって（Ｂｕｒｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｆ．Ｄｉｓ．１７０，１１１０−１９（１９９４））、抗原依存性細胞傷害（細胞傷害性Ｔリンパ球アッセイ法、Ｔｉｇｇｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５６，３９０１−３９１０）によって、または、サイトカイン分泌によって測定される。
「免疫学的」または「免疫」反応という用語は、レシピエントである患者のアミロイドペプチドに対する有益な体液性（抗体介在性）反応および／または細胞性（抗原特異的Ｔ細胞またはそれらの分泌産物が介在する）反応が発生することである。このような反応は、免疫原の投与によって誘導される能動的な反応、または、抗体または抗原刺激を受けたＴ細胞の投与によって誘導される受動的な反応であってもよい。細胞性免疫反応は、抗原特異的ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞および／またはＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞を活性化するためにクラスＩまたはクラスＩＩのＭＨＣ分子とともに、ポリペプチドエピトープを提示することによって誘発される。また、この反応は、単核球、マクロファージ、ＮＫ細胞、好塩基球、樹状細胞、星状細胞、小グリア細胞、好酸球、または自然免疫の他の成分の活性化も含みうる。細胞介在性免疫学的反応の存在は、増殖アッセイ（ＣＤ４＋Ｔ細胞）またはＣＴＬ（細胞傷害性Ｔリンパ球）アッセイによって測定することができる（前掲のＢｕｒｋｅおよびＴｉｇｇｅｒｓ参照）。免疫原の防御作用または治療作用に対する体液性反応および細胞性反応の相対的寄与は、免疫した同系動物から抗体およびＴ細胞を別々に単離し、別の対象における防御作用および治療作用を測定して、識別することができる。
「免疫原性薬剤」または「免疫原」は、任意にはアジュバントとともに哺乳動物に投与すると、それ自体に対する免疫学的反応を誘導する能力がある。
「全Ｄ」という用語は、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、および１００％のＤ型アミノ酸を有するペプチドを意味する。
「裸のポリヌクレオチド」という用語は、コロイド物質と複合体をなしていないポリヌクレオチドを意味する。裸のポリヌクレオチドは時にプラスミドベクターの中にクローニングされることがある。
「アジュバント」という用語は、抗原とともに投与すると、抗原に対する免疫反応を増大させるが、単独で投与すると、抗原に対する免疫反応を生じない化合物を意味する。アジュバントは、リンパ球動員、Ｂ細胞および／またはＴ細胞の刺激、およびマクロファージの刺激など、いくつかの機構によって免疫反応を増強させることができる。
「患者」という用語は、予防的または治療的な処置を受けるヒトまたは他の哺乳動物の被験対象を含む。
抗体間の競合は、被験イムノグロブリンが、参照抗体の共通抗原、例えば、α−ＳＮなどへの特異的な結合を阻害するアッセイ法によって測定される。数多くのタイプの競合的結合アッセイ法、例えば、固相直接的または間接的放射免疫アッセイ法（ＲＩＡ）、固相直接的または間接的酵素免疫アッセイ法（ＥＩＡ）、サンドイッチ競合アッセイ法（Ｓｔａｈｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ９：２４２−２５３（１９８３）参照）；固相直接的ビオチン−アビジンＥＩＡ法（Ｋｉｒｋｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：３６１−３６１９（１９８６）参照）；固相直接的標識アッセイ法、固相直接的標識サンドイッチアッセイ法（Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９８８）参照）；Ｉ−１２５標識を用いる固相直接標識ＲＩＡ法（Ｍｏｒｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５（１）：７−１５（１９８８）参照）；固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ法（Ｃｈｅｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７６：５４６−５５２（１９９０））；および直接標識ＲＩＡ法（Ｍｏｌｄｅｎｈａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２：７７−８２（１９９０））が知られている。典型的には、このようなアッセイ法は、固体表面に結合している精製抗体、または、非標識被験イムノグロブリンか標識参照イムノグロブリンのどちらかを有する細胞を使用することを含む。被験イムノグロブリンが存在する中で固体表面または細胞に結合した標識の量を測定して、競合的阻害を測定する。通常、被験イムノグロブリンは過剰に存在する。競合アッセイによって同定される抗体（競合抗体）には、参照抗体と同一のエピトープに結合する抗体、および、参照抗体が結合するエピトープに対して、立体障害が生じるのに十分な近さにある隣接エピトープに結合する抗体などがある。通常、競合抗体が過剰に存在すると、参照抗体の共通抗原に対する特異的結合が少なくとも５０％または７５％阻害されるであろう。
「症状」または「臨床症状」という用語は、病気の主観的な証拠、例えば、患者が感じる歩き方の変化などを意味するものである。「兆候」は、内科医によって観察される病気の客観的な証拠を意味するものである。
「組み合わせて」という語句は、２つ以上の抗ヒトα−シヌクレイン抗体（すなわち、それぞれが異なるエピトープを認識する）の投与、または、ヒトα−シヌクレインに対する免疫反応を誘導する２つ以上のポリペプチドまたは免疫原の投与について言う場合には、同時投与、および同一治療過程における投与を含む。薬剤の同時投与は、薬剤を融合タンパク質または（例えば、互いに物理的に連結している）結合体として投与すること、同時処方（例えば、薬剤が混合または配合されて一つの投薬形態、例えば、徐放性またはデポー製剤となっている場合）、別々の組成物として互いの投与の数分内または２時間以内に投与すること（共投与）、または同じ日に別々の組成物として投与することなどがある。同一治療過程における投与とは、同じ症状を治療または予防するために、患者に両方の薬剤を投与することである。各薬剤を１回または複数回投与することができる。例えば、一つの薬剤をまず投与して、その翌日または翌週第２の薬剤を投与してもよい。同様に、２つの薬剤をそれぞれ１回以上、例えば、連日、隔日、隔週、または他のスケジュールに従って（例えば、患者に対する利益が、各薬剤を単独で投与したときの利益を超過することが期待されるよう）投与してもよい。
ＳＮｘ−ｙの形で命名された断片は、Ｘ位のアミノ酸から始まりＹ位のアミノ酸で終わるα−シヌクレインの断片を意味する。このような断片は、異種ペプチドに連結させることができるが、ヒトα−シヌクレインの別のアミノ酸に連結させて、断片がＸの前で始まるか、Ｙの後で終るようにすることはできない。
α−シヌクレインまたはその断片の中にある残基は、初期値のパラメーターを用いて上記したようにα−シヌクレインまたはその断片と配列番号１とを最大限に整列させた場合の配列番号１の記載に従って番号が付けられている。
１つ以上の列挙された要素を「含む」組成物または方法は、具体的には列挙されていない他の要素を含むことができる。例えば、α−ＳＮペプチドを含む組成物は、単離されたα−ＳＮ、および、より大きいポリペプチド配列の成分としてのα−ＳＮペプチドの両方を含む。
Ｉ．総説
本発明は、レビー小体という形で、患者の脳の中で凝集して不溶性の塊となったα−ＳＮの沈着物の存在を特徴とする、いくつかの病気および症状を予防または治療する方法を提供する。このような病気はまとめてレビー小体病（ＬＢＤ）と呼ばれ、パーキンソン病（ＰＤ）などがある。このような病気は、βプリーツシート構造を有するα−ＳＮの凝集体、ならびにチオフラビン−Ｓおよびコンゴレッドによる染色を特徴とする（Ｈａｓｉｍｏｔｏ，前掲書参照）。本発明は、α−ＳＮに対する免疫原性反応を生じさせることができる薬剤を用いて、このような病気を予防または治療する方法を提供する。この免疫原性反応は、脳の細胞の中でシヌクレイン沈着物が形成されるのを妨ぐか、それを除去するように作用する。しくみを理解することは本発明の実施に必須ではないが、シヌクレインに対する抗体が、単独またはα−シヌクレインとともに細胞の内部に取り込まれる結果、免疫原性反応によって除去を誘導することができる。実施例の中に示した結果は、末梢血に投与した、α−シヌクレインに対する抗体が血液脳関門を通過して、単独またはα−シヌクレインとともに、α−シヌクレイン沈着物を含む細胞の内部に取り込まれることを示している。取り込まれた抗体は、リソソーム経路の活性化を介して、α−シヌクレインの分解を促進することができる。変性型になったα−シヌクレインに対するアフィニティーを有する内在化抗体は、非凝集型の分子を安定させることもできる。あるいは、またはさらに、抗体は、細胞外表面上におけるシヌクレイン凝集を妨げることができる。例えば、α−シヌクレインに対する抗体は、神経細胞の表面において異常形成されたタンパク質を認識して架橋することができる。いくつかの方法において、少なくとも部分的にＦｃ受容体介在性食作用によって除去反応を生じさせることができる。シヌクレインによる免疫は、脳の中のシナプスおよび神経細胞体におけるシヌクレイン沈着を減少させることができる。しくみを理解することは本発明の実施に必須ではないが、この結果は、シヌクレインに対する抗体が神経細胞（例えば、シナプス小胞）によって取り込まれることによって説明することができよう。
任意には、α−ＳＮに対する免疫原性反応を生じさせる薬剤を、Ａβに対する免疫原性反応を生じさせる薬剤と組み合わせて使用することができる。この免疫原性反応は、Ａβの沈着物を有する個体（例えば、アルツハイマー病およびパーキンソン病に罹病している個体）のＡβ沈着物を除去する際に有用であるが、この免疫原性反応はシヌクレイン沈着物の除去においても活性を有する。したがって、本発明はこのような薬剤を単独で、または、ＬＢＤに罹病しているがアルツハイマー病には罹病しておらず、その発症のリスクもない個人において、α−ＳＮに対する免疫原性反応を生じさせる薬剤と組み合わせて使用する。
本発明は、アミロイド生成性疾患を予防および治療する薬学的組成物および方法をさらに提供する。α−シヌクレインおよびβ−シヌクレインがある種のアミロイド病、具体的にはアルツハイマー病におけるアミロイド沈着物の核形成に関与することが示されている。（Ｃｌａｙｔｏｎ，Ｄ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，ＴＩＮＳ ２１（６）：２４９−２５５，１９９８）。より具体的には、α−シヌクレインおよびβ−シヌクレインのＮＡＣドメインの断片（６１〜９５位の残基）がアルツハイマー患者のアミロイド斑から単離されており、実際に、この断片は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）による可溶化後も不溶性のままのプラークの約１０％を含む。（Ｇｅｏｒｇｅ，Ｊ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｎｅｗｓ ｌ：１２−１７，１９９５）。さらに、完全長α−ＳＮおよびそのＮＡＣ断片は、インビトロで不溶性アミロイドの中にβ−アミロイドペプチドが凝集するのを促進することが報告されている。（Ｃｌａｙｔｏｎ，前掲）。アミロイド斑のＮＡＣ成分は、以下で詳述するように、本発明の免疫学による治療用の標的として用いられる。１つの態様によれば、本発明は、患者のアミロイド斑のシヌクレイン−ＮＡＣ成分に対する免疫反応を誘発するのに有効な薬剤を含む医薬組成物を含む。このような組成物は、アミロイド病におけるプラーク沈着を予防、遅延、または減少させるのに有効かもしれない。
ＩＩ．α−シヌクレインに対して免疫原性反応を生じさせる薬剤
免疫原性反応は、免疫原を投与して患者の体内でα−ＳＮと反応する抗体を誘導する場合のように、能動的であってもよく、または、それ自体が患者の体内でα−ＳＮに結合する抗体を投与する場合のように、受動的であってもよい。
１．能動免疫反応を誘導する薬剤
治療薬は、α−ＳＮペプチドの中のある一定のエピトープに対する特異的な免疫原性反応を誘導する。好ましい薬剤はα−ＳＮペプチド自体およびその断片である。２００３年５月１９日出願の米国特許出願第６０／４７１，９２９号およびＰＣＴ特許公報ＷＯ０５／０１３８８９号はどちらも、あらゆる目的で参照されて本明細書に組み込まれるが、これらは、治療薬として使用することができ、任意にはアジュバントと組み合わせて使用することができる新規のα−シヌクレイン断片を開示している。このような断片の変異体、α−ＳＮペプチドの好ましいエピトープに対する抗体を誘導し、かつ／またはそれと交差反応する天然α−ＳＮペプチドのアナログおよび模倣体の変異体も使用することができる。２００３年５月１９日付出願の米国特許出願第６０／４７１，９２９号およびＰＣＴ特許公報ＷＯ０５／０１３８８９号はどちらも、あらゆる目的で参照されて本明細書に組み込まれるが、これらは、シヌクレイン病およびアミロイド生成性疾患を予防および治療する方法において有用な新規のα−シヌクレイン断片を提供する。任意には、これらの断片はアジュバントと組み合わせて使用することができる。
α−シヌクレインは、本来、ヒトの脳において、ＡＤ斑の非β−アミロイド成分（ＮＡＣ）の前駆タンパク質として同定された。（Ｕｅｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ａｃａｄ．Ｎａｔｌ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０（２３）：１１２８２−１１２８６（１９９３））。α−ＳＮは、ＡＤアミロイドの非Ａβ成分（ＮＡＣＰ）の前駆体とも呼ばれ、１４０アミノ酸からなるペプチドである。α−ＳＮは次のアミノ酸配列を有する。：
Figure 0005211290
 （Ｕｅｄａ ｅｔ． ａｌ．，前掲；ＧｅｎＢａｎｋ アクセッション番号：Ｐ３７８４０）。
ＡＤアミロイドの非Ａβ成分（ＮＡＣ）はα−ＳＮから生じる。α−シヌクレイン内にある高度に疎水性のドメインであるＮＡＣは、少なくとも２８個のアミノ酸残基（６０〜８７位の残基）（配列番号３）、任意には３５個のアミノ酸残基（６１〜９５位の残基）（配列番号２）からなるペプチドである。図１参照。ＮＡＣは、βシート構造を形成する傾向を示す（Ｉｗａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３４：１０１３９−１０１４５）。Ｊａｎｓｅｎらは、ＮＡＣが次のアミノ酸配列を有すると報告している。
Figure 0005211290
 （Ｊｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３１０（Ｐｔ１）： ９１−９４（１９９５）；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｓ５６７４６）。
Ｕｅｄａらは、ＮＡＣが次のアミノ酸配列を有すると報告している。
Figure 0005211290
 （Ｕｅｄａ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ＵＳＡ９０：１１２８２−１１２８６（１９９３））。
ＮＡＣなど、脱凝集型α−ＳＮまたはその断片は、モノマーのペプチドユニットを意味する。脱凝集型α−ＳＮまたはその断片は一般に可溶性であり、自己凝集して可溶性オリゴマーを形成する能力がある。α−ＳＮおよびその断片のオリゴマーは通常は可溶性であり、主にαへリックスとして存在する。モノマー型α−ＳＮは、凍結乾燥したペプチドを純粋ＤＭＳＯの中で超音波処理によって溶解することにより、インビトロで調製することができる。得られた溶液を遠心分離して、すべての不溶性微粒子を除去する。ＮＡＣなど、凝集型α−ＳＮまたはその断片は、結合して不溶性βシート集合体になる、α−ＳＮまたはその断片のオリゴマーを意味する。ＮＡＣなど、凝集型α−ＳＮまたはその断片は、原繊維ポリマーも意味する。原繊維は通常は不溶性である。いくつかの抗体は、可溶型α−ＳＮまたはその断片、あるいは、凝集型α−ＳＮまたはその断片を結合する。いくつかの抗体は、モノマー型または原繊維型のものよりも、α−シヌクレインのオリゴマーにより強く結合する。いくつかの抗体は、可溶型および凝集型のα−ＳＮまたはその断片の両方に結合し、任意にはオリゴマー型も結合する。
α−ＳＮはＰＤの特徴であるレビー小体の主要成分であり、そのエピトープ断片、例えば、ＮＡＣ、またはＮＡＣ以外の断片などを使用して免疫原性反応を誘導することができる。好ましくは、このような断片は、α−ＳＮの４つ以上のアミノ酸またはそのアナログを含む。いくつかの活性断片は、α−ＳＮのＣ末端に、または、その近くに（例えば、アミノ酸７０〜１４０位、１００〜１４０位、１２０〜１４０位、１３０〜１４０位または１３５〜１４０位の中に）エピトープを含む。いくつかの活性断片において、このエピトープのＣ末端残基はα−ＳＮのＣ末端残基である。レビー小体の他の成分、例えば、シンフィリン−１、パーキン、ユビキチン、神経フィラメント、βクリスタリン、および、これらのエピトープ断片を使用して、免疫原性反応を誘導することもできる。
上記のように、α−シヌクレインの、一定の好ましい断片はＣ末端分子由来のものである。そのような断片はヒトα−シヌクレインの１〜６９位の残基を欠いている。このような断片で免疫化すると、ヒトα−シヌクレインの７０〜１４０位の残基の中にある１つ以上のエピトープに対する抗体を含む免疫原性反応を生じさせる。免疫原性を有するＣ末端断片は、図８に示すように、ＳＮ８５〜９９、ＳＮ１０９〜１２３、ＳＮ１１２〜１２６、およびＳＮ１２６〜１３８を含み、また、これらの１つと、いずれかの末端においてアミノ酸が最大で２個多いか少ないかで異なっている、その他の断片も含む。別の好ましい断片はＳＮ８３〜１４０であり、前記エピトープの全部を含む。α−シヌクレインのいくつかの断片は、ヒトα−シヌクレインのＳＮ８３〜１０１、ＳＮ１０７〜１２５、ＳＮ１１０〜１２８、およびＳＮ１２４〜１４０の１つ以上の中にあるエピトープに特異的に結合する抗体を生じさせる。いくつかの断片は、上記４つの断片の１つの内部で排他的で特異的に結合する抗体を生じさせる。例えば、断片ＳＮ８３〜１０１は、α−シヌクレインの８３位の残基から始まり１０１位の残基で終わり、ＳＮ８３〜１０１に特異的に結合する抗体だけを生じさせる。
いくつかの断片は、α−シヌクレイン由来の全部で４０個以下の連続した残基を有する。いくつかのこのような断片は、ＳＮ１２５〜１４０、ＳＮ１３０〜１４０、ＳＮ８７、９７、ＳＮ１１１〜１２１、ＳＮ１１４〜１２４またはＳＮ１２８〜１３６を含む。いくつかの断片は、α−シヌクレインのＣ末端側半分（すなわち、７０〜１４０位の残基）由来の全部で５〜２０個の連続したアミノ酸を有する。いくつかの断片は、α−シヌクレインの１２０〜１４０位の間に由来する５〜２０個の連続したアミノ酸を有する。特に好ましい断片は、
Figure 0005211290
 などがある。
脳の中のレビー小体またはα−シヌクレイン凝集を特徴とする病気（例えば、パーキンソン病）の予防または治療を達成するのに有用なα−シヌクレインのその他の断片は、この分子のＮ末端領域由来のものである。これらの断片で免疫すると、１〜２０位の残基内にある１つ以上のエピトープ、または場合によっては、１〜１０位の残基内にある１つ以上のエピトープに対する抗体を含む免疫原性反応が生じる。実施例ＩＸに示すように、α−シヌクレインのアミノ末端を認識する抗体である６Ｈ７の投与によって、ヒトα−シヌクレインを過剰発現しているトランスジェニックマウスの脳におけるα−シヌクレイン凝集が除去されるように見えた。α−シヌクレインのアミノ末端領域を含むα−シヌクレイン断片による免疫も、同様に、このような凝集体の除去をもたらし、および／または凝集体の形成を妨げると期待される。
したがって、１つの態様において、本発明は、脳におけるレビー小体またはα−シヌクレイン凝集を特徴とする疾患の予防または治療を達成する方法であって、該疾患に罹病しているか、そのリスクを有する患者に、残基を配列番号１の記載に従って番号付けると、ヒトα−シヌクレインの１〜４０位の残基内、１〜２０位の残基内、または１〜１０位の残基内にあるエピトープに特異的に結合する抗体を含む免疫原性反応を誘導するのに有効なα−シヌクレインの免疫原性断片を含むポリペプチドを投与することによって、該疾患の予防または治療を達成する方法を提供する。１つの実施態様において、α−シヌクレインの免疫原性断片はα−シヌクレインの７０〜１４０位の残基を含まない。１つの実施態様において、α−シヌクレインの免疫原性断片はα−シヌクレインの４１〜１４０位の残基を含まない。１つの実施態様において、α−シヌクレインの免疫原性断片はα−シヌクレインの２５〜１４０位の残基を含まない。
脳におけるレビー小体またはα−シヌクレイン凝集を特徴とする病気の予防または治療を達成するのに適した免疫原には、α−シヌクレインのアミノ末端から５〜２０個の連続したアミノ酸残基を含む断片が含まれるが、それらに限定されない。好ましい実施態様において、断片はα−シヌクレインの第１の（アミノ末端）残基を含む。したがって、典型的な断片は、配列番号１の１〜Ｎａ位の残基の配列を含む。ただし、Ｎａは５〜２０である（
Figure 0005211290
 ）。他の好ましい実施態様において、断片はα−シヌクレインのアミノ酸残基を含まないが、α−シヌクレインの第２位および／または第３位の残基を含む。したがって、典型的な断片は、配列番号１の２〜Ｎｂ位、および３〜Ｎｃ位の配列を有する。ただし、Ｎｂは６〜２１、およびＮｃは７〜２２である（
Figure 0005211290
 ）。以下で検討するように、上記断片を担体分子（例えば、複合タンパク質または融合タンパク質、ＩＩ（３）節参照）に連結することができる。あるいは、以下で検討するように、上記断片は、それをコードする核酸を対象にワクチン接種することにより投与することができる（ＩＩ（４）節参照）。
α−ＳＮという場合、上記した天然のヒト型アミノ酸配列、ならびに対立遺伝子変異体、種変異体および誘導型変異体などのアナログ、完全長型、および、それらの免疫原性断片などを含む。ヒトα−シヌクレインとは、配列番号１と同一のアミノ酸配列を有するタンパク質、またはその対立遺伝子変異体を意味するが、これがすべての実施態様において好適である。アナログは、典型的には、しばしば保存的置換により、１つ、２つまたは数個の位置で天然ペプチドとは異なっている。アナログは、典型的には、天然ペプチドと少なくとも８０％または９０％の配列同一性を示す。天然α−シヌクレインのアナログにおけるアミノ酸の位置は、そのアナログと天然のα−シヌクレインを最大限に整列化した場合に、天然α−シヌクレインの対応するアミノ酸の番号が割り当てられる。また、いくつかのアナログは、非天然型アミノ酸、または、１つ、２つまたは数個の位置でＮ末端またはＣ末端にあるアミノ酸を修飾したものも含む。例えば、α−ＳＮの１３９位の天然グルタミン酸残基をイソアスパラギン酸で置換することができる。非天然型アミノ酸の例は、Ｄ型、アルファ型、α−二置換アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、乳酸、４−ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリジン、ε−Ｎ−アセチルリジン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリジン、ω−Ｎ−メチルアルギニン、β−アラニン、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、チロキシン、γ−アミノ酪酸、ホモセリン、シトルリン、およびイソアスパラギン酸などである。また、治療薬は、α−ＳＮ断片のアナログも含む。本発明のいくつかの治療薬は、全Ｄ型ペプチド、例えば、全Ｄ型αーＳＮまたは全Ｄ型ＮＡＣであり、また全Ｄ型ペプチドアナログであってもよい。アナログは、天然のヒトα−シヌクレインに対する抗体のポリクローン集団に特異的に結合する。断片およびアナログは、トランスジェニック動物モデルにおける予防または治療上の効能について、下記するような無処理またはプラセボの対照と比較してスクリーニングすることができる。
α−ＳＮ、その断片、およびアナログは、固相ペプチド合成法または組換え発現法によって合成するか、または天然の由来源から得ることができる。自動型ペプチド合成装置は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａなどの多数の供給業者から市販されている。組換え発現は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの細菌、酵母、昆虫細胞、または哺乳動物細胞の中で行うことができる。組換え発現の処理手順は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃ．Ｓ．Ｈ．Ｐ．Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ ２ｄ ｅｄ．，１９８９）に記載されている。α−ＳＮペプチドのいくつかの型も、例えば、ＢＡＣＨＥＭおよびＡｍｅｒｉｃａｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．から市販されている。
また、治療薬は、他のアミノ酸と一緒に、例えば、α−ＳＮペプチドの活性断片を含む、より長いポリペプチドも含む。例えば、好ましい薬剤は、異種アミノ酸配列に融合したα−ＳＮセグメントを含む融合タンパク質であって、該異種アミノ酸配列に対するヘルパーＴ細胞応答を誘導し、それによって該α−ＳＮセグメントに対するＢ細胞応答を誘導する融合タンパク質などである。このようなポリペプチドは、動物モデルにおける予防または治療上の効能について、下記するような無処理またはプラセボの対照と比較してスクリーニングすることができる。α−ＳＮペプチド、アナログ、活性断片またはその他のポリペプチドを会合型または多量体型にして投与することができ、あるいは、分離型では、治療薬はモノマー型免疫原因子の多量体も含む。本発明の治療薬はポリリジン配列を含むこともができる。
さらなる変異では、例えば、α−ＳＮの断片などの免疫原性ペプチドが、ウイルスまたは細菌により、免疫原性組成物の一部として提示される。免疫原性ペプチドをコードする核酸が、ウイルスまたは細菌のゲノムまたはエピソームの中に取り込まれるのである。任意には、免疫原性ペプチドが提示されるよう、分泌タンパク質として、またはウイルスの外表面タンパク質をもつ融合タンパク質として、または細菌の膜貫通タンパク質として発現させるという方法で、核酸を取り込む。このような方法で使われるウイルスまたは細菌は、非病原性または弱毒性のものでなければならない。適当なウイルスは、アデノウイルス、ＨＳＶ、ベネズエラ馬脳炎ウイルスおよびその他のアルファウイルス、水疱性口内炎ウイルス、およびその他のラブドウイルス、ワクシニアおよび禽痘などである。適当な細菌はサルモネラ菌および赤痢菌などである。免疫原性ペプチドがＨＢＶのＨＢｓＡｇに融合したものが特に適している。
また、治療薬は、必ずしもα−ＳＮとの顕著なアミノ酸配列の類似性を有しないが、それにも関わらずα−ＳＮの模倣体として作用し、類似した免疫反応を誘導するペプチドおよびその他の化合物を含む。例えば、βプリーツシートを形成する任意のペプチドおよびタンパク質を適合性についてスクリーニングすることができる。α−ＳＮまたはその他のレビー小体の成分に対するモノクローナル抗体に対する抗イディオタイプ抗体を使うこともできる。このような抗Ｉｄ抗体は抗原を模倣して、これに対する免疫反応を生じさせる（Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｒｏｉｔ ｅｄ．，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ ６ｔｈ ｅｄ．，ｐ．１８１参照）。α−ＳＮ以外の薬剤は、上に列挙したα−ＳＮの好ましいセグメント（例えば、ＮＡＣ）の１つ以上のものに対して免疫原性反応を誘導するはずである。好ましくは、このような薬剤は、α−ＳＮの他のセグメントに対しては向けられることなく、これらのセグメントの１つに対して特異的に向けられた免疫原性反応を誘導する。
ペプチドまたはその他の化合物のランダムなライブラリーも、適合性についてスクリーニングすることができる。段階的に合成することができるさまざまなタイプの化合物について、コンビナトリアルライブラリーを作製することができる。このような化合物には、ポリペプチド、βターン模倣物、多糖類、リン脂質、ホルモン、プロスタグランジン、ステロイド、芳香族化合物、複素環式化合物、ベンゾジアゼピン、オリゴマーＮ−置換型グリシン、およびオリゴカルバミン酸などがある。Ａｆｆｉｍａｘ，ＷＯ９５／１２６０８、Ａｆｆｉｍａｘ，ＷＯ９３／０６１２１、Ｃｏｌｕｍｂｉａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＷＯ９４／０８０５１、Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ，ＷＯ／３５５０３、およびＳｃｒｉｐｐｓ，ＷＯ９５／３０６４２に記載された、コードされた合成ライブラリー（ＥＳＬ）法によって、これらの化合物の大きなコンビナトリアルライブラリーを構築することができる（前記文献はそれぞれ、あらゆる目的で参照されて本明細書に組み込まれる）。ペプチドライブラリーは、ファージ提示法によっても作製することができる。例えば、Ｄｅｖｌｉｎ，ＷＯ９１／１８９８０参照。
コンビナトリアルライブラリーおよび他の化合物を、α−ＳＮまたはその他のレビー小体成分に特異的であることが知られている抗体または（ＢまたはＴ）リンパ球に結合する能力を測定して、まず適合性についてスクリーニングする。例えば、初回スクリーニングは、α−ＳＮまたはその断片に対するポリクローン血清またはモノクローン抗体を用いて行うことができる。これらのライブラリーを、好ましくは、ヒトα−シヌクレインの１〜２０位または７０〜１４０位の残基の中にあるエピトープに特異的に結合する抗体に結合する能力についてスクリーニングする。そして、化合物は、α−ＳＮ（例えば、ＳＮ１〜２０、ＳＮ８３〜１０１、ＳＮ１０７〜１２５、ＳＮ１１０〜１２８およびＳＮ１２４〜１４０）の中にある特定のエピトープに対する特異的結合についてスクリーニングすることができる。抗体エピトープ特異性をマッピングするために記述された手順と同一の手順によって化合物を試験することができる。そして、このようなスクリーニングによって同定した化合物を、さらに、α−ＳＮまたはその断片に対する抗体または反応性リンパ球を誘導する能力について解析する。例えば、血清を何通りかに希釈したものを、α−ＳＮまたはその断片をあらかじめ塗布したマイクロタイタープレート上で試験して、標準的なＥＬＩＳＡを行ってα−ＳＮまたはその断片に対する反応性抗体を調べることができる。次に、化合物を、実施例に記載したように、レビー小体の存在に関連する病気に罹り易くしたトランスジェニック動物で予防または治療効果について試験することができる。このような動物は、例えば、ＷＯ９８／５９０５０、Ｍａｓｌｉａｈ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８７：１２６５−１２６９（２０００）、およびｖａｎ ｄｅｒ Ｐｕｔｔｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ２０：６０２５−６０２９（２０００）に記載されているような、α−ＳＮまたはその変異体（例えば、５３位におけるアラニンのトレオニンへの置換）を過剰発現するトランスジェニックマウス、または、ＡＰＰまたはその変異体も過剰発現するようなトランスジェニックマウスなどである。特に好ましいものは、Ｇａｍｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３７３，５２３（１９９５）に記載された、ＡＰＰの７１７型変異を有するシヌクレイントランスジェニックマウス、および、ＭｃＣｏｌｏｇｕｅ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，６１２，４８６号、およびＨｓｉａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４，９９（１９９６）；Ｓｔａｕｅｎｂｉｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４，１３２８７−１３２９２（１９９７）；Ｓｔｕｒｃｈｌｅｒ−Ｐｉｅｒｒａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４，１３２８７−１３２９２（１９９７）；Ｂｏｒｃｈｅｌｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ １９，９３９−９４５（１９９７）に記載された、ＡＰＰの６７０／６７１スエーデン型変異を有するマウスなどである。このようなシヌクレイン／ＡＰＰトランスジェニック動物の例はＷＯ０１／６０７９４に記載されている。さらなるＰＤの動物モデルは、６−ヒドロキシドーパミン動物モデル、ロテノン動物モデル、および１−メチル−４−フェニル−１，２，３，６−テトラヒドロピリジン（ＭＰＴＰ）動物モデルなどである（Ｍ．Ｆｌｉｎｔ Ｂｅａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ２：３２５−３３４（２００１））。同じスクリーニング法を、その他α−ＳＮのアナログである可能性があるもの、およびα−ＳＮの断片を含む、より長いペプチドで、上記したもの、ならびにその他のレビー小体成分およびそのアナログまたは断片に対して利用することができる。
ｉ．α−シヌクレインの両末端にあるエピトープに対する免疫反応を惹起する能動免疫
本明細書に記載したように、α−シヌクレインのアミノ末端領域およびカルボキシ末端領域にあるエピトープを認識する抗体（すなわち、８Ａ５および６Ｈ７）の投与により、ヒトα−シヌクレインを過剰発現するトランスジェニックマウスの脳の中のα−シヌクレイン凝集体が減少した（例えば、実施例ＩＸ参照）。一部この発見に基づいて、α−シヌクレインの両末端にあるエピトープに対する免疫反応を誘導すれば、予防および治療する上で有利であろうと考えられる。このため、１つの態様において、本発明は、ヒトα−シヌクレインの１〜２０位、あるいは１〜１０位の残基の中にあるエピトープ、およびヒトα−シヌクレインの７０〜１４０位の残基の中にあるエピトープに特異的に結合する抗体を含む免疫原性反応を誘導して、脳内にあるレビー小体またはα−シヌクレイン凝集を特徴とする病気を予防または治療する方法を提供する。好適な実施態様において、免疫原性反応は、ヒトα−シヌクレインの１〜２０位の中、およびヒトα−シヌクレインの１２０〜１４０位の中にあるエピトープに特異的に結合する抗体を含む。タンパク質の両末端領域にあるエピトープに対する抗体を含む免疫反応は「二重」免疫反応と呼ぶことができる。二重免疫反応は、多数の方法で誘導することができるので、本発明は、このような反応を開始させるいずれかの特定の方法に限定はされない。
二重免疫反応は、ヒトα−シヌクレインの１〜２０位の残基の中にあるエピトープに特異的に結合する抗体、およびヒトα−シヌクレインの７０〜１４０位の残基の中にあるエピトープに特異的に結合する抗体を含む免疫原性反応を誘導するのに効果のある単一のポリペプチドをワクチン接種することによって誘導することができる。好適な実施態様において、抗体は、ヒトα−シヌクレインの１〜１０位の残基の中および／または１２０〜１４０位の残基の中にあるエピトープに特異的に結合する。ヒトα−シヌクレインの少なくとも２５〜６９位の残基、ヒトα−シヌクレインの少なくとも３０〜１１０位の残基、またはヒトα−シヌクレインの少なくとも２１〜１１９位の残基を欠くポリペプチドを用いることができる。このようなポリペプチドを使用する場合、免疫原性反応は、ヒトα−シヌクレインの２５〜６９位の残基の中にあるエピトープに特異的に結合する抗体を含むことはない。
二重免疫反応は、１つのポリペプチドが、ヒトα−シヌクレインの１〜２０位の残基の中にあるエピトープに特異的に結合する抗体、およびヒトα−シヌクレインの７０〜１４０位の残基の中にあるエピトープに特異的に結合する抗体を含む免疫原性反応を誘導する、２つ（以上）のポリペプチドを組み合わせてワクチン接種することによって誘導することもできる。好適な実施態様において、抗体は、ヒトα−シヌクレインの１〜１０位の残基の中および／または１２０〜１４０位の残基の中にあるエピトープに特異的に結合する。したがって、ヒトα−シヌクレインの１〜２０位の残基の中にあるエピトープに特異的に結合する抗体を含む免疫原性反応を誘導するα−シヌクレインの第１の免疫原性断片、および、ヒトα−シヌクレインの７０〜１４０位の残基（または１２０〜１４０）の中にあるエピトープに特異的に結合する抗体を含む免疫原性反応を誘導するα−シヌクレインの第２の免疫原性断片を投与することによって、治療または予防を達成することができる。ヒトα−シヌクレインの断片は、上記したように、組み合わせて投与することができる（例えば、同時処方で、または同一治療過程において、融合タンパク質または複合体として投与する）。
ｉｉ．組成物およびキット
本発明は、α−シヌクレインの両末端にあるエピトープに対する免疫反応を開始させるのに有用な組成物を提供する。組成物は、２つ以上のポリペプチドを含む投薬形態および処方を含み、例えば、上記したように、１つのポリペプチドが、ヒトα−シヌクレインの１〜２０位の残基の中にあるエピトープに特異的に結合する抗体、およびヒトα−シヌクレインの７０〜１４０位の残基の中にあるエピトープに特異的に結合する抗体を含む免疫原性反応を誘導する。好適な実施形態において、ポリペプチドは、ヒトα−シヌクレインの１〜１０位の残基の中および／または１２０〜１４０位の残基の中のエピトープに特異的に結合する抗体を誘導する。典型的な処方（ポリペプチドを同時処方するのに適した処方）は当技術分野において周知であり、下記第ＶＩＩ節（「投薬計画」）に記載したものなどがある。
また、本発明は、α−シヌクレインの両末端にあるエピトープに対する免疫反応を開始させるキットも提供する。本キットは、ヒトα−シヌクレインの１〜２０位の残基の中にあるエピトープに特異的に結合する抗体、およびヒトα−シヌクレインの７０〜１４０位の残基の中にあるエピトープに特異的に結合する抗体を含む免疫原性反応を誘導する２つ以上の薬剤を含む。これらの薬剤は、同時に使用するために単一の製剤で併用することもできる。これらの薬剤は、同時、連続、または個別に使用するために、それぞれが異なるペプチドを含む個別の容器（例えば、バイアル、注射器、またはチューブなど）に詰めてあってもよい。本発明に係るこれらの薬剤は、任意には、レビー小体病を治療するのに少なくとも部分的には有効な他の薬剤と組み合わせて投与してもよい。また、キットは、本発明の薬剤が血液脳関門を通過する量を増加させる薬剤、患者に投与するための他のアジュバントおよび物質を含むことも可能である。
２．受動免疫反応用薬剤
本発明の治療薬は、α−ＳＮまたは他のレビー小体成分に特異的に結合する抗体も含む。また、本発明は、アミロイド斑のシヌクレイン−ＮＡＣ成分に特異的に結合する抗体も提供する。α−ＳＮに対して免疫活性を有する抗体は周知されている（例えば、Ａｒｉｍａ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｒｉａｎ Ｒｅｓ．８０８：９３−１００（１９９８）；Ｃｒｏｗｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｅｔｔ．２９２：１２８−１３０（２０００）；Ｓｐｉｌｌａｎｔｉｎｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３８８：６３９−８４０（１９９７）参照）。このような抗体はモノクローナルまたはポリクローナルのものであってもよい。このような抗体には、α−ＳＮの可溶性のモノマー型には特異的に結合せず、不溶性の凝集体に特異的に結合するものもある。不溶性の凝集型には特異的に結合せずに、可溶性のモノマー型に特異的に結合するものもある。凝集型および可溶性のモノマー型に特異的に結合するものもある。このような抗体には、天然型の完全長α−ＳＮには結合せずに、天然型の短形α−ＳＮ（例えば、ＮＡＣ）に特異的に結合するものもある。いくつかの抗体は、短形のものには結合せずに、長形のものに特異的に結合する。いくつかの抗体は、ＬＢの他の成分には結合せずに、α−ＳＮに特異的に結合する。いくつかの抗体は、アミロイド斑の他の成分には特異的に結合せずに、α−ＳＮに特異的に結合する。ＰＣＴ特許公報ＷＯ０５／０１３８８９号、および２００３年５月１９日付出願の米国特許出願第６０／４７１，９２９号参照。後者は、あらゆる目的で参照されて本明細書に組み込まれ、完全なα−シヌクレインそれ自体には特異的に結合せずに、α−シヌクレインの断片に特異的に結合する、末端特異的抗体を提供する。これらの抗体は、シヌクレイン病およびアミロイド病を予防および治療する方法において有用である。
本発明を裏付けるために行った実験において、エクスビボでの予測アッセイを用いて（実施例ＶＩＩ）、シヌクレイン−ＮＡＣに特異的に結合する抗体の除去を調べた。ＮＡＣに対する抗体を、アミロイド斑および小グリア細胞を含む脳の組織サンプルに接触させた。ウサギ血清を対照として用いた。その後の観察によって、抗体の除去活性を示す、斑の数およびサイズの顕著な減少が示された。
これらのデータから、アルツハイマー病および他のアミロイド病に関連するアミロイド斑負荷を、アミロイド斑負荷を減らすのに有効な、ＮＡＣのエピトープに対する免疫試薬の投与によって大いに減弱できることは明らかである。また、多様な抗体をこのような組成物に使うことができるのは当然のことである。上記で論じたように、２００３年５月１９付出願の米国特許出願第６０／４７１，９２９号は、完全なα−シヌクレインそれ自体には特異的に結合せずに、α−シヌクレインの断片に特異的に結合する、末端特異的な抗体を提供する。
治療法に用いられる抗体は通常、完全な定常領域、または少なくともＦｃ受容体と相互作用するのに十分な定常領域を有する。食細胞上のＦｃＲＩ受容体に対してヒトアイソタイプの中で最も高いアフィニティーを有するため、ヒトアイソタイプＩｇＧ１が好適である。二重特異的Ｆａｂ断片も使用することができるが、その抗体の一方のアームはα−ＳＮに対する特異性を有し、他方はＦｃ受容体に対する特異性を有する。いくつかの抗体は、例えば、ＳＤＳにより処理された場合のように、任意には変性型で、約１０６、１０７、１０８、１０９、または１０１０Ｍ−１以上の結合アフィニティーでα−ＳＮに結合する。本発明の抗体には、免疫細胞化学により測定すると、シナプスまたは神経細胞本体のα−シヌクレインに特異的に結合するものもある。
ポリクローナル血清は、α−ＳＮの全長に沿ったいくつかのエピトープに結合する抗体の混合集団を典型的には含むが、ポリクローナル血清は、例えば、ＮＡＣのような、α−ＳＮの特定のセグメントに特異的なこともある。特定のセグメントに特異的なポリクローナル血清は、そのセグメントに特異的に結合する抗体を含み、α−ＳＮの他のセグメントに特異的に結合する抗体を含まない。モノクローナル抗体は、立体構造エピトープまたは非立体構造エピトープであり得る、α−ＳＮの中にある特定のエピトープに結合する。非立体構造エピトープは、α−ＳＮをＳＤＳにより変性しても、そのまま残る。抗体の予防および治療上の有効性は、実施例に記載したトランスジェニック動物モデル実験を用いて調べることができる。いくつかのモノクローナル抗体はＮＡＣ内にあるエピトープに結合する。いくつかの方法において、さまざまなエピトープに対して結合特異性を有する多数のモノクローナル抗体を使うことができる。このような抗体は、連続してまたは同時に投与することができる。α−ＳＮ以外のレビー小体成分に対する抗体を使用することもできる。例えば、抗体は、神経フィラメント、ユビキチン、またはシンフィリンに対するものであってもよい。また、治療薬は、α−ＳＮのアナログおよびその断片に対して作製された抗体も含む。本発明の治療薬には、全Ｄ型ペプチド、例えば、全Ｄ型α−ＳＮまたは全Ｄ型ＮＡＣのものもある。
抗体が特定の残基内、例えば、α−ＳＮ１〜５などの中にあるエピトープに結合するという場合、その意味は、この抗体が特定の残基（すなわち、この例ではα−ＳＮ１〜５）を含むポリペプチドに特異的に結合するということである。このような抗体は、必ずしもα−ＳＮ１〜５の中にあるすべての残基に接触するということではない。また、α−ＳＮ１〜５の中のどの単一のアミノ酸置換または欠失も、必ずしも顕著に結合アフィニティーに影響を及ぼすという訳でもない。抗体のエピトープ特異性は、例えば、さまざまなメンバーがα−ＳＮのさまざまな部分配列を提示するファージ提示ライブラリーを作製して測定することができる。そして、ファージ提示ライブラリーは、被験抗体に特異的に結合するメンバーについて選択する。配列のファミリーを単離する。典型的には、このようなファミリーは、共通のコア配列、および、さまざまなメンバーでさまざまな長さの隣接配列を含む。抗体への特異的結合を示す最も短いコア配列が、その抗体による結合を受けるエピトープを規定する。また、抗体は、エピトープ特異性がすでに決定されている抗体との競合アッセイ法で、エピトープ特異性について試験することもできる。
本発明のいくつかの抗体は、ＮＡＣの中にあるエピトープに特異的に結合する。いくつかの抗体は、２２キロダルトンのグリコシル化型シヌクレイン、例えば、Ｐ２２−シヌクレインの中にあるエピトープに特異的に結合する（Ｈ．Ｓｈｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００１，Ｊｕｌ １３：２９３（５５２８）：２２４−５）。
本発明のいくつかの抗体は、α−ＳＮのＮ末端にあるエピトープ（例えば、配列番号１に記載された番号によれば、α−シヌクレインのアミノ酸１〜２０位またはアミノ酸１〜１０位の中にあるエピトープ）に結合する。いくつかの抗体は、エピトープのＮ末端残基が完全長α−ＳＮのＮ末端残基であるエピトープに結合する。このような抗体は、１位の残基を欠失したα−シヌクレインの欠失変異体には結合しない。このような抗体には、Ｎ末端アミノ酸が異種ポリペプチドに連結している完全長α−シヌクレインには結合しないものがある。本発明のいくつかの抗体は、ヒトα−シヌクレインの１〜６９位の残基または１〜２０位の残基の中にあるエピトープに特異的に結合する。いくつかの抗体は、ヒトα−シヌクレインの１〜２０位の残基の中にあるエピトープに特異的に結合する。いくつかの抗体は、配列番号１の１〜Ｎａ位までの残基、ただしＮａは５〜２０；配列番号１の２〜Ｎｂ位までの残基、ただしＮｂは６〜２１；または、配列番号１の３〜Ｎｃ位までの残基、ただしＮｃは７〜２２、から選択されたヒトα−シヌクレインのセグメントをもつエピトープに特異的に結合する。いくつかの抗体は、ＳＮ１〜５、ＳＮ１〜６、ＳＮ１〜７、ＳＮ１〜８、ＳＮ１〜９、ＳＮ１〜１０、ＳＮ１〜１１、ＳＮ１〜１２、ＳＮ１〜１３、ＳＮ１〜１４、ＳＮ１〜１５、ＳＮ１〜１６、ＳＮ１〜１７、ＳＮ１〜１８、ＳＮ１〜１９、およびＳＮ１〜２０からなる群から選択されるヒトα−シヌクレインのセグメントの中にあるエピトープに特異的に結合する。
いくつかの抗体は、α−ＳＮのＣ末端にあるか、その近傍（例えば、７０〜１４０位、１００〜１４０位、１２０〜１４０位、１３０〜１４０位または１３５〜１４０位のアミノ酸の中）にあるエピトープに結合する。いくつかの抗体は、エピトープのＣ末端残基が（完全長）α−ＳＮのＣ末端残基であるエピトープに結合する。このような抗体は、１４０位の残基が欠失したα−シヌクレインの欠失変異体には結合しない。このような抗体には、Ｃ末端アミノ酸が異種ポリペプチドに連結している完全長α−シヌクレインには結合しないものがある。いくつかの方法において、抗体は完全長α−ＳＮには結合せず、ＮＡＣに特異的に結合する。
本発明のいくつかの抗体は、ヒトα−シヌクレインの７０〜１４０位の残基または８３〜１４０位の残基の中にあるエピトープに特異的に結合する。いくつかの抗体は、ヒトα−シヌクレインの１２０〜１４０位の残基の中にあるエピトープに特異的に結合する。いくつかの抗体は、８３〜１０１、１０７〜１２５，１１０〜１２８および１２４〜１４０から選択されたヒトα−シヌクレインのセグメントを有するエピトープに特異的に結合する。いくつかの抗体は、
Figure 0005211290
 からなる群から選択されたヒトα−シヌクレインのセグメントの中にあるエピトープに結合する。
Ｃ末端エピトープに結合するモノクローナル抗体は、好ましくは高アフィニティー、例えば、少なくとも１０８、１０９または１０１０Ｍ−１でヒトα−シヌクレインに結合する。
α−ＳＮの他の領域には特異的に結合せずに、α−ＳＮの好適なセグメントに特異的に結合するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体は、他の領域に結合するモノクローナル抗体、または完全なα−ＳＮに対するポリクローナル血清と比較するといくつかの長所がある。まず、等量の投薬量であれば、好適なセグメントに特異的結合する抗体の用量は、アミロイド斑を除去するのに有効な抗体をより高モル濃度で含む。次に、好適なセグメントに特異的結合する抗体は、完全なα−ＳＮに対する除去反応を誘導することなく、ＬＢに対する除去反応を誘導することができ、それにより副作用の可能性を低減することができる。
任意には、抗体は、上記したようにＬＢ病のトランスジェニック動物における予防または治療上の活性についてスクリーニングすることができる。任意には、抗体のコレクションを、変性したヒトα−シヌクレインまたはその断片に対する相対的結合について予備スクリーニングすることができる。相対的結合アフィニティーは、免疫ブロットにおけるシグナルの相対的強度から推定することができる。平均以上の相対的結合アフィニティーを有する抗体、または、好ましくは、試験した限り最も高い結合アフィニティーを有する抗体を、さらにトランスジェニック動物においてスクリーニングするために選択する。同様の予備スクリーニングを行って、組織切片におけるα−シヌクレインの凝集体に対する結合について、免疫細胞化学により抗体を試験することができる。組織切片は、罹病患者またはトランスジェニック動物の脳から得ることができる。
１つの実施態様において、６Ｈ７と名付けられた抗体、またはα−シヌクレインに対する特異的結合について６Ｈ７と競合する抗体を受動免疫のために使用する。１つの実施態様において、８Ａ５と名付けられた抗体、またはα−シヌクレインに対する特異的結合について８Ａ５と競合する抗体を受動免疫のために使用する。いくつかの実施態様において、６Ｈ７または８Ａ５を互いに組み合わせるか、他の抗α−シヌクレイン抗体と組み合わせて使用する。
ｉ．α−シヌクレインの両末端にあるエピトープに対する免疫反応を開始させるための能動免疫
本明細書に記載したように、α−シヌクレインのアミノ末端領域またはカルボキシ末端領域にあるエピトープを認識する抗体（すなわち、８Ａ５または６Ｈ７）を投与したところ、ヒトα−シヌクレインを過剰発現するトランスジェニックマウスの脳内におけるα−シヌクレイン凝集体が減少した（例えば、実施例ＩＸ参照）。部分的にこの発見に基づけば、Ｎ末端エピトープを認識する抗体（例えば、上記のもの）、およびＣ末端エピトープを認識する抗体（例えば、上記のもの）を組み合わせて投与すれば、予防および治療において特に効果が高いとが考えられる。したがって、１つの態様において、本発明は、脳におけるレビー小体またはα−シヌクレイン凝集を特徴とする疾患の予防または治療を達成する方法であって、該疾患に罹病しているか、そのリスクを有する患者に、残基を配列番号１の記載に従って番号付けると、ヒトα−シヌクレインの１〜２０位の残基の中にあるエピトープに特異的に結合する第１の抗体の有効な投与計画を、ヒトα−シヌクレインの７０〜１４０位の残基の中にあるエピトープに特異的に結合する第２の抗体の投与と組み合わせて投与することによる方法を提供する。好ましくは、第１の抗体は、配列番号１の１〜Ｎａ位までの残基の配列、ただしＮａは５〜２０；配列番号１の２〜Ｎｂ位までの残基の配列、ただしＮｂは６〜２１；および／または、配列番号１の３〜Ｎｃ位までの残基の配列、ただしＮｃは７〜２２、の中にあるα−シヌクレインのエピトープに結合する。好ましくは、第２の抗体は、ヒトα−シヌクレインの１２０〜１４０位の残基の中にあるエピトープに特異的に結合する。第１および第２の抗体は、同じ日、同じ月、および／または、同じ治療コースの一部として、同時に（例えば、同時処方して）投与することができる。
ｉｉ．組成物およびキット
本発明は、脳の中のレビー小体またはα−シヌクレイン凝集を特徴とする病気の予防または治療のための組成物であって、α−シヌクレインの末端部位に特異的に結合する、例えば、上記の特異性を有する１つ以上の抗体を含む組成物を提供する。組成物は、２つ以上の抗体を含む投薬形態および処方を含む。典型的な処方（抗体を同時処方するのに適した処方）は当技術分野において周知のものであり、下記の第ＶＩＩ節（「投薬計画」）に記載したものを含む。
本発明は、脳の中のレビー小体またはα−シヌクレイン凝集を特徴とする病気を予防または治療するためのキットも提供する。本キットは、第１の抗体がヒトα−シヌクレインのＮ末端にあるエピトープに結合し、第２の抗体がヒトα−シヌクレインのＣ末端にあるエピトープに結合する２つ（または、それ以上）の抗体を含む。これらの抗体は、同時使用のために単一の調製物またはキットにして併用することができる。あるいは、これらの抗体は、同時、連続、または個別に使用するため、キットの中の個別の容器（例えば、バイアル、注射器、チューブなど）に詰めることができる。これらの抗体は、任意には、レビー小体病の治療に少なくとも部分的に有効な他の薬剤と組み合わせて投与することもできる。また、キットは、本発明の抗体が血液脳関門を通過する量を増加させる薬剤、他のアジュバント、および患者に投与するための物質を含むこともできる。
ｉｉｉ．イムノグロブリンの一般的特徴
基本的な抗体構造ユニットは、サブユニットのテトラマーを含むことが知られている。各テトラマーは、２組の同一のポリペプチド鎖からなり、各組は、１つの「軽」鎖（約２５ｋＤａ）と１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分は、主に抗原認識に関与する約１００〜１１０個またはそれ以上のアミノ酸からなる可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、主にエフェクター機能に関与する定常領域を画定する。
軽鎖はκ鎖またはλ鎖に分類される。重鎖はγ鎖、μ鎖、α鎖、δ鎖、またはε鎖に分類され、抗体のアイソタイプは、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥと規定される。軽鎖および重鎖の中で、可変領域および定常領域が、１２個以上のアミノ酸からなる「Ｊ］領域により連結され、重鎖は１０個以上のアミノ酸からなる「Ｄ」領域も含む（一般には、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｐａｕｌ，Ｗ．，ｅｄ．，２ｎｄ ｅｄ．Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．，１９８９，Ｃｈ．７参照（あらゆる目的でその全体が参照して組み込まれる））。
各軽／重鎖対の可変領域は抗体結合部位を形成する。したがって、完全な抗体は２つの結合部位を有する。二機能性抗体または二重特異性抗体以外では、２つの結合部位は同一である。鎖はすべて、相補性決定領域またはＣＤＲとも呼ばれる３つの超可変領域によって連結された、比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）からなる同じ一般構造を示す。各対の２つの鎖のＣＤＲは、フレームワーク領域の近くに配置されているため、特定のエピトープに結合することができる。Ｎ末端からＣ末端まで、軽鎖も重鎖も、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４というドメインを含む。各ドメインへのアミノ酸の配置は、Ｋａｂａｔ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９８７ ａｎｄ １９９１）；Ｃｈｏｔｈｉａ ＆ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）；またはＣｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７８−８８３（１９８９）の定義に従っている。
ｉｖ．非ヒト抗体の産生
キメラ抗体およびヒト化抗体は、キメラ抗体またはヒト化抗体を構築するための出発材料を提供するマウスまたはその他非ヒト動物の抗体と同一または類似した結合特異性およびアフィニティーを有する。キメラ抗体は、その軽鎖および重鎖遺伝子が、別種に属するイムノグロブリン遺伝子セグメントから、典型的には遺伝子操作により構築されている抗体である。例えば、マウスモノクローナル抗体由来の遺伝子に可変（Ｖ）セグメントを、ヒトの定常（Ｃ）セグメント、例えば、ＩｇＧ１およびＩｇＧ４などに連結することができる。ヒトアイソタイプＩｇＧ１が好適である。いくつかの方法において、抗体のアイソタイプはヒトＩｇＧ１である。ＩｇＭ抗体も、いくつかの方法で使用することができる。従って、典型的なキメラ抗体は、マウス抗体由来のＶまたは抗原結合ドメイン、およびヒト抗体由来のＣまたはエフェクタードメインからなるハイブリッドタンパク質である。
ヒト化抗体は、実質的にはヒト抗体（受容抗体といわれる）に由来する可変領域フレームワーク残基、および、実質的にはマウス抗体（ドナーイムノグロブリンと呼ばれる）に由来する相補性決定領域を有する。Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１００２９−１００３３（１９８９）、ＷＯ９０／０７８６１、米国特許第５，６９３，７６２号、米国特許第５，６９３，７６１号、米国特許第５，５８５，０８９号、米国特許第５，５３０，１０１号、およびＷｉｎｔｅｒ，米国特許第５，２２５，５３９号参照（これらの各々は、あらゆる目的でその全体が参照されて組み込まれる）。また、定常領域は、もしあるとすれば、実質的に、または完全にヒトイムノグロブリンに由来する。ヒト可変ドメインは通常、フレームワーク配列が、ＣＤＲが由来したマウス可変領域ドメインと高度の配列同一性を示すヒト抗体から選ばれる。重鎖および軽鎖の可変領域フレームワーク残基は、同一または異なったヒト抗体配列に由来することが可能である。ヒト抗体配列は、天然のヒト抗体の配列でもよく、または、いくつかのヒト抗体のコンセンサス配列であってもよい。Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＷＯ９２／２２６５３参照。ヒトの可変領域フレームワーク残基に由来する一定のアミノ酸が、ＣＤＲの立体構造および／または抗原への結合に対する影響の可能性に基づいて、置換を行うために選択される。このような影響の可能性の検討は、モデリング、特定の部位にあるアミノ酸の特徴の調査、または、特定のアミノ酸の置換または変異誘発の効果の経験的観察によって行われる。
例えば、アミノ酸が、マウス可変領域フレームワークの残基と選択したヒト可変領域フレームワークの残基の間で異なる場合、通常、ヒトのフレームワークのアミノ酸を、そのアミノ酸が以下のようなものであると合理的に期待されるならば、マウス抗体由来の同等のフレームワークアミノ酸で置換すべきである：
（１）抗原に非共有結合的に直接結合する。
（２）ＣＤＲ領域に隣接している。
（３）そうでなければ、ＣＤＲ領域（すなわち、ＣＤＲ領域の約６個のＡの内側にある）と相互作用する。または
（４）ＶＬ−ＶＨ界面に関与する。
その他の置換候補は、ヒトイムノグロブリンにとって、その位置では普通にはない、受容体であるヒトフレームワークのアミノ酸である。これらのアミノ酸は、マウスドナー抗体の同等の位置に由来するか、または、より典型的なヒトイムノグロブリンの同等の位置に由来するアミノ酸で置換することができる。その他の置換候補は、ヒトイムノグロブリンにとっては、その位置では普通にはない、受容体であるヒトフレームワークのアミノ酸である。ヒト化イムノグロブリンの可変領域のフレームワークは、通常、ヒト可変領域のフレームワーク配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を示すか、またはそのような配列間で共通している。
いくつかのヒト化抗体は、マウスモノクローナル抗体ｍＡｂ６Ｈ７またはマウスモノクローナル抗体ｍＡｂ８Ａ５に由来する相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列を含む。６Ｈ７抗体を産生するＪＨ１７．６Ｈ７．１．５４．２８と名付けられた細胞株は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６９１０を有し、ブダペスト条約の規定に基づいて、２００５年８月４日にＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１０８）に寄託された。８Ａ５抗体を産生するＪＨ４．８Ａ５．２５．７．３６と名付けられた細胞株は、受託番号ＰＴＡ−６９０９を有し、２００５年８月４日に寄託された。
上記したように、抗体を発現する細胞株（例えば、ハイブリドーマ）を用いて、キメラ抗体およびヒト化抗体を産生するいくつかの方法が知られている。例えば、マウスの８Ａ５抗体および６Ｈ７抗体のイムノグロブリン可変領域を、周知の用法を用いてクローニングおよびシーケンシングすることができる。１つの方法において、例えばであって、限定するものではないが、重鎖の可変ＶＨ領域を、ハイブリドーマ細胞から調製したｍＲＮＡを用いて、ＲＴ−ＰＣＲによってクローニングする。コンセンサスプライマーを、翻訳開始コドンを含むＶＨ領域リーダーペプチドに対する５’プライマー、およびｇ２ｂ定常領域特異的３’プライマーとして使用する。典型的なプライマーが、Ｓｃｈｅｎｋらによる米国特許公報第２００５／０００９１５０号（以後「Ｓｈｃｅｎｋ」とする）に記載されている。複数の独立に得たクローンの配列同士を比較して、増幅過程で変異が生じていないことを確認することができる。また、ＶＨ領域の配列も、５’ＲＡＣＥ ＲＴ−ＰＣＲ法および３’ｇ２ｂ特異的プライマーにより得られたＶＨ断片をシーケンシングして決定または確認することができる。
８Ａ５または６Ｈ７３Ｄ６の軽鎖可変ＶＬ領域を、ＶＨ領域と同様の方法でクローニングすることができる。１つのアプローチ法において、マウスＶＬ領域を増幅するよう設計されているコンセンサスプライマーセットは、翻訳開始コドンを含むＶＬ領域にハイブリダイズするよう設計されており、また、３’プライマーは、Ｖ−Ｊ連結領域の下流にあるマウスＣｋ領域に特異的である。別のアプローチ法において、５’ＲＡＣＥ ＲＴ−ＰＣＲ法を用いて、ＶＬをコードするｃＤＮＡをクローニングする。典型的なプライマーがＳｃｈｅｎｋに記載されている。クローニングされた配列は、次に、ヒト定常領域をコードする配列と組み合わせる。
１つのアプローチ法において、重鎖および軽鎖の可変領域を、ＶＤＪまたはＶＪ接合部のそれぞれの下流にあるスプライスドナー配列をコードするよう再操作して、哺乳動物発現ベクター、例えば、重鎖にはｐＣＭＶ−ｈγｌ、または軽鎖にはｐＣＭＶ−ｈκｌなどにクローニングする。これらのベクターは、ヒトのγｌおよびＣｋという定常領域を、挿入した可変領域カセットの下流でエキソン断片としてコードする。配列を確認した後、重鎖および軽鎖の発現ベクターをＣＯＳ細胞に同時形質転換して、キメラ抗体を産生させることができる。培養培地を形質転換してから４８時間に回収し、抗体産生について、ウエスタンブロット解析によりアッセイするか、または抗原結合についてはＥＬＩＳＡでアッセイする。キメラ抗体が、上記したようにヒト化される。
ｖ．ヒト抗体
α−ＳＮに対するヒト抗体は、後述する多様な方法によって提供される。いくつかのヒト抗体を、競合的結合実験によるか、または別の方法で、特定のマウス抗体、例えば、実施例ＩＸに記載したマウスモノクローナル抗体の１つと同じエピトープ特異性を有するように選択する。また、ヒト抗体は、免疫原としてα−ＳＮの断片だけを用いて、および／または、α−ＳＮの欠失変異体のコレクションに対する抗体をスクリーニングして、特定のエピトープ特異性についてスクリーニングすることもできる。ヒト抗体は、好ましくは、ヒトＩｇＧ１のアイソタイプ特異性を有する。
（１）トリオーマ法
基本的なアプローチ法、および、このアプローチ法で使用するための例示的な細胞融合パートナーであるＳＰＡＺ−４は、Ｏｅｓｔｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ２：３６１−３６７（１９８３）；Ｏｅｓｔｂｅｒｇ，米国特許第４，６３４，６６４号；およびＥｎｇｌｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．，米国特許第４，６３４，６６６号に記載されている（これらはそれぞれあらゆる目的でその全体が参照されて組み込まれる）。この方法によって得られる抗体産生細胞株は、３つの細胞、すなわち２つのヒト細胞および１つのマウス細胞に由来するため、トリオーマと呼ばれる。最初に、マウスミエローマ株をヒトＢリンパ球に融合させて、非抗体産生異種間ハイブリッド細胞、例えば、Ｏｅｓｔｂｅｒｇ、前掲に記載されたＳＰＡＺ−４細胞株を得る。次に、この異種間細胞を免疫ヒトＢリンパ球と融合させて、抗体産生トリオーマ細胞株を得る。トリオーマは、ヒト細胞からつくられる通常のハイブリドーマより安定的に抗体を産生することがわかっている。
免疫Ｂリンパ球は、ヒトドナーの血液、脾臓、リンパ節または骨髄から得られる。特定の抗原またはエピトープに対する抗体が所望であれば、その抗原またはエピトープを免疫に使用することが好ましい。免疫はインビボでも、インビトロでも行うことができる。インビボで免疫するには、Ｂ細胞を、典型的には、α−ＳＮ、その断片、α−ＳＮもしくは断片を含むより大きなポリペプチド、またはα−ＳＮに対する抗体に対する抗イディオタイプ抗体で免疫したヒトから単離する。いくつかの方法において、Ｂ細胞を、最終的に抗体治療を施すことになっている同一の患者から単離する。インビトロで免疫するには、Ｂリンパ球を、典型的には、１０％ヒト血漿を添加したＲＰＭＩ−１６４０（Ｅｎｇｌｅｍａｎ、前掲参照）などの培地の中で７〜１４日間抗原に曝露する。
免疫したＢリンパ球を、周知の方法によって、ＳＰＡＺ−４などの異種間ハイブリッド細胞に融合させる。例えば、これらの細胞を、４０〜５０％のＭＷ１０００〜４０００のポリエチレングリコールで約５〜１０分間、約３７℃にて処理する。細胞を、融合細胞混合液から分離して、所望のハイブリッドを選択できる培地（例えば、ＨＡＴまたはＡＨ）の中で増殖させる。必要とする結合特異性を有する抗体を分泌するクローンを、α−ＳＮまたはその断片に結合する能力についてトリオーマ培養培地をアッセイして同定する。所望の特異性を有するヒト抗体を産生するトリオーマを、限界希釈法によってサブクローニングし、培養培地においてインビトロで増殖させる。そして、得られたトリオーマ細胞株を、α−ＳＮまたはその断片に結合する能力について試験する。
トリオーマは遺伝的に安定しているが、抗体を大量には産生しない。発現量は、抗体遺伝子をトリオーマから１つ以上の発現ベクターにクローニングし、そのベクターを標準的な哺乳動物、細菌または酵母菌の細胞株に形質転換することによって増加させることができる。
（２）トランスジェニック非ヒト哺乳動物
α−ＳＮに対するヒト抗体も、ヒトイムノグロブリン遺伝子座の少なくとも１つのセグメントをコードするトランスジーンを有する非ヒトトランスジェニック哺乳動物から発現させることができる。通常は、このようなトランスジェニック哺乳動物の内因性イムノグロブリン遺伝子座は機能的に不活性化されている。好ましくは、ヒトイムノグロブリン遺伝子座のセグメントは、重鎖および軽鎖成分の再編成されていない配列を含む。内因性イムノグロブリン遺伝子の不活性化も、外来性イムノグロブリン遺伝子の導入も、標的された相同的組換えによるか、または、ＹＡＣ染色体の導入によって達成することができる。この処理によって生じるトランスジェニック哺乳動物は、イムノグロブリン成分の配列を機能的に再編成して、内因性イムノグロブリン遺伝子を発現することなく、ヒトイムノグロブリン遺伝子によってコードされるさまざまなアイソタイプの抗体のレパートリーを発現することができる。これらの性質をもつ哺乳動物の作製および性質は、例えば、Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，ＷＯ９３／１２２２、米国特許第５，８７７，３９７号，米国特許第５，８７４，２９９号，米国特許第５，８１４，３１８号，米国特許第５，７８９，６５０号，米国特許第５，７７０，４２９号，米国特許第５，６６１，０１６号，米国特許第５，６３３，４２５号，米国特許第５，６２５，１２６号，米国特許第５，５６９，８２５号，米国特許第５，５４５，８０６号，Ｎａｔｕｒｅ １４８，１５４７−１５５３（１９９４），Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４，８２６（１９９６），Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ，ＷＯ９１／１０７４１により詳細に記述されている（これらはそれぞれ、あらゆる目的でその全体が参照されて組み込まれる）。トランスジェニックマウスが特に適している。抗α−ＳＮ抗体は、例えば、前掲のＬｏｎｂｅｒｇまたはＫｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉに記載されている非ヒトトランスジェニック哺乳動物を、α−ＳＮまたはその断片で免疫して得られる。モノクローナル抗体は、従来からのＫｏｈｌｅｒ−Ｍｉｌｓｔｅｉｎの技術を用いて、例えば、このような哺乳動物に由来するＢ細胞を適当なミエローマ細胞株に融合して調製する。ヒトポリクローナル抗体も、免疫原性剤によって免疫したヒト由来の血清という形で提供することができる。任意には、このようなポリクローナル抗体は、α−ＳＮまたは他のアミロイドペプチドをアフィニティー試薬として用いるアフィニティー精製により濃縮することができる。
（３）ファージ提示法
ヒト抗α−ＳＮ抗体を得るための更なる方法は、Ｈｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５−１２８１（１９８９）によって概説されている一般的プロトコールに従って、ヒトＢ細胞のＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることである。トリオーマ法について説明したように、このようなＢ細胞は、α−ＳＮ、その断片、α−ＳＮもしくは断片を含むより長いポリペプチド、または抗イディオタイプ抗体で免疫されたヒトから得ることができる。任意には、このようなＢ細胞を、最終的に抗体治療を受けることになっている同一患者から得る。α−ＳＮまたはその断片に結合する抗体を選択する。次に、このような抗体（または、結合断片）をコードする配列をクローニングして増幅する。Ｈｕｓｅに記載されたプロトコールは、ファージ提示技術と組み合わせることで、より効率的なものになる。例えば、Ｄｏｗｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＷＯ９１／１７２７１およびＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，、ＷＯ９２／０１０４７、米国特許第５，８７７，２１８号、米国特許第５，８１７，９０７号、米国特許第５，８５８，６５７号、米国特許第５，８３７，２４２号、米国特許第５，７３３７４３号および米国特許第５，５６５，３３２号参照（これらはそれぞれ、あらゆる目的でその全体が参照されて組み込まれる）。これらの方法において、メンバーが、それらの外表面上にさまざまな抗体を提示するファージライブラリーが作製される。抗体は、通常、Ｆｖ断片またはＦａｂ断片として提示される。所望の特異性を有する抗体を提示するファージは、α−ＳＮペプチドまたはその断片に対するアフィニティー濃縮によって選択される。
ファージ提示法の変法において、選択したマウス抗体の結合特異性を有するヒト抗体を作製することができる。Ｗｉｎｔｅｒ，ＷＯ９２／２０７９１参照。この方法において、選択したマウス抗体の重鎖または軽鎖の可変領域を出発物質として使用する。例えば、軽鎖可変領域を出発物質として選択した場合には、メンバーが同じ軽鎖可変領域（すなわち、マウス由来出発物質）、および異なった重鎖可変領域を提示するファージライブラリーが構築される。重鎖可変領域を、再編成されたヒト重鎖可変領域のライブラリーから得る。α−ＳＮに対して強い特異的結合（例えば、少なくとも１０８、好ましくは少なくとも１０９Ｍ−１）を示すファージを選択する。すると、このファージ由来のヒト重鎖可変領域が、更なるファージライブラリーを構築するための出発物質として働く。このライブラリーにおいて、各ファージは、同じ重鎖可変領域（すなわち、最初の提示ライブラリーから同定された領域）および異なる軽鎖可変領域を提示する。軽鎖可変領域は、再編成されたヒト可変軽鎖領域のライブラリーから得られる。再び、α−ＳＮに対して強い特異的結合を示すファージを選択する。これらのファージは完全なヒト抗α−ＳＮ抗体の可変領域を提示する。これらの抗体は通常、マウスの出発物質と同じであるか、それに類似のエピトープ特異性を有する。
ｖｉ．定常領域の選択
キメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体の重鎖および軽鎖の可変領域を、ヒト定常領域の少なくとも一部に連結させることができる。定常領域の選択は、部分的に、抗体依存性補体および／または細胞介在性毒性が所望であるか否かによる。例えば、ＩｇＧ１およびＩｇＧ３のアイソタイプは補体活性を有するが、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４のアイソタイプはそれを有しない。アイソタイプの選択も、抗体の脳内への通過に影響を及ぼす可能性がある。ヒトＩｇＧ１アイソタイプが好ましい。軽鎖定常領域はλ型またはκ型でありうる。抗体は、２つの軽鎖および２つの重鎖を含むテトラマーとして、別々の重鎖および軽鎖として、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖとして、または重鎖および軽鎖可変領域がスペーサーを介して連結している単鎖抗体として発現させることができる。
ｖｉｉ．組換え抗体の発現
キメラ抗体、ヒト化抗体およびヒト抗体は、典型的には、組換え発現によって産生される。組換えポリヌクレオチド構築物は、典型的には、本来付随しているプロモーター領域または異種プロモーター領域など、抗体鎖のコード配列に操作可能に結合した発現調節配列を含む。好ましくは、発現調節配列は、真核宿主細胞をトランスフォームまたはトランスフェクトすることができるベクターの中にある真核生物プロモーター系である。一旦、このベクターが適当な宿主に取り込まれたら、宿主を、ヌクレオチド配列を大量に発現させ、また、交差反応する抗体を回収および精製するのに適した条件下で保持する。
これらの発現ベクターは、典型的には、宿主生物の中で、エピソームとして、または宿主の染色体ＤＮＡの不可分の一部として複製することができる。一般的に、発現ベクターは、所望のＤＮＡにより形質転換された細胞の検出を可能にする、例えば、アンピシリン耐性またはハイグロマイシン耐性などの選択マーカーを含む。
大腸菌は、本発明のＤＮＡ配列をクローニングするのに特に有用な、１つの原核生物宿主である。酵母菌などの微生物も、発現にとって有用である。サッカロマイセス属は、発現調節配列、複製始点、終止配列などを所望に応じて有する適当なベクターを有する好適な酵母菌宿主である。典型的なプロモーターは、３−ホスホグリセリン酸キナーゼおよびその他の解糖酵素などである。酵母菌の誘導型プロモーターには、とりわけアルコール脱水素酵素、イソシトクロームＣ、およびマルトースおよびガラクトース利用に関与する酵素に由来するプロモーターなどがある。
哺乳動物細胞は、イムノグロブリンまたはその断片をコードするヌクレオチドセグメントを発現させるのに好適な宿主である。Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ，Ｆｒｏｍ Ｇｅｎｅｓ ｔｏ Ｃｌｏｎｅｓ，（ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，ＮＹ，１９８７）参照。完全な異種タンパク質を分泌する能力のある、いくつかの適当な宿主細胞株が当技術分野において開発されており、ＣＨＯ細胞株、さまざまなＣＯＳ細胞株、ＨｅＬａ細胞、Ｌ細胞、ヒト胎児由来腎臓細胞株、およびミエローマ細胞株などがある。好ましくは、細胞は非ヒト由来である。これらの細胞の発現ベクターは、発現調節配列、例えば、複製起点、プロモーター、エンハンサー（Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ．８９：４９（１９８６））、および、必要なプロセシング情報部位、例えば、リボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位など、ならびに転写終結の配列を含むことができる。好適な発現調節配列は、内在性遺伝子、サイトメガロウイルス、ＳＶ４０、アデノウイルス、ウシパピローマウイルスなどに由来するプロモーターである。Ｃｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１１４９（１９９２）参照。
あるいは、抗体コード配列を、トランスジェニック動物のゲノムに導入し、その後そのトランスジェニック動物のミルクの中で発現させるために、導入遺伝子の中に組み込むことができる（例えば、米国特許第５，７４１、９５７号、米国特許第５，３０４，４８９号、米国特許第５，８４９，９９２号参照）。適当な導入遺伝子は、例えば、カゼインまたはβ−ラクトグロブリンなどの乳腺特異的遺伝子に由来するプロモーターおよびエンハンサーと操作可能に結合した軽鎖および／または重鎖のコード配列を含む。
対象となるＤＮＡセグメントを含むベクターを、細胞宿主のタイプに応じて、周知の方法で宿主細胞に移行させることができる。例えば、塩化カルシウムトランスフェクション法が、原核細胞に広く利用されているが、他の細胞宿主には、リン酸カルシウム処理、エレクトロポレーション、リポフェクション、バイオリスティックスまたはウイルス媒介トランスフェクションを利用することができる。哺乳動物細胞を形質転換するために使用されるその他の方法には、ポリブレンの使用、プロトプラスト融合、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクションなどがある（一般的には、前掲Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．参照）。トランスジェニック動物を作製するために、導入遺伝子を受精卵母細胞にマイクロインジェクションするか、胚性幹細胞のゲノムの中に取り込ませることができ、このような細胞の核が脱核卵母細胞の中に移入される。
抗体は、いったん発現されれば、ＨＰＬＣ精製、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動など、当技術分野の標準的な手順に従って精製することができる（一般的には、Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｓｉｎｇｌｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，ＮＹ，１９８２）参照）。
３．結合体
免疫反応を誘導するためのいくつかの薬剤は、ＬＢに対する免疫反応を誘導するための適当なエピトープを含むが、あまりに小さくて免疫原とならない。このような状況では、ペプチド免疫原を適当な担体分子に連結させて、免疫反応を誘発するのに役立つ結合体を形成させることができる。適当な担体は、血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン、イムノグロブリン分子、チログロブリン、オボアルブミン、破傷風トキソイド、または、他の病原性細菌、例えば、ジフテリア、大腸菌、コレラ菌、またはピロリ菌などに由来するトキソイド、または弱毒化されたトキシン誘導体などである。Ｔ細胞エピトープも適当な担体分子である。いくつかの結合体は、本発明の薬剤を、免疫賦活性高分子（例えば、トリパルミトイル−Ｓ−グリセリンシステイン（Ｐａｍ３Ｃｙｓ）、マンナン（マンノースポリマー）、またはグルカン（β１→２ポリマー））、サイトカイン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−１αペプチドおよびＩＬ−βペプチド、ＩＬ−２、γ−ＩＮＦ、ＩＬ−１０、ＧＭ−ＣＳＦ）、およびケモカイン（例えば、ＭＩＰ１−αおよびＭＩＰ１−β、ならびにＲＡＮＴＥＳ）に連結することによって形成することができる。また、免疫原性剤は、Ｏ’Ｍａｈｏｎｙ，ＷＯ９７／１７６１３およびＷＯ９７／１７６１４に記載されているように、組織を通過する輸送を促進するペプチドに連結させることもできる。免疫原は、スペーサーアミノ酸（例えば、ｇｌｙ−ｇｌｙ）を有する担体、または、それを有しない担体に連結させることができる。
いくつかの結合体は、本発明の薬剤をすくなくとも１つのＴ細胞エピトープに連結させて形成することできる。Ｔ細胞エピトープには、乱交雑型（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ）のものもあれば、普遍型のものもある。乱交雑型Ｔ細胞エピトープは、さまざまなＨＬＡ型を提示する多様な対象の中で、Ｔ細胞免疫の誘導を促進することができる。乱交雑型Ｔ細胞エピトープとは対照的に、普遍型Ｔ細胞エピトープは、さまざまなＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子にコードされた多様なＨＬＡ分子を提示する対象のＴ細胞免疫の誘導を大きな割合で、例えば、少なくとも７５％促進することができる。
例えば、破傷風トキソイド（例えば、Ｐ２およびＰ３０エピトープ）、Ｂ型肝炎表面抗原、百日咳、トキソイド、麻疹ウイルスＦタンパク質、トラコーマクラミジア（Ｃｈｌａｍｉｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍｉｔｉｓ）主要外膜タンパク質、ジフテリアトキソイド、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）のスポロザイト周囲のＴ、熱帯熱マラリア原虫ＣＳ抗原、マンソン住血吸虫（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｍａｎｓｏｎｉ）トリオースリン酸イソメラーゼ、大腸菌ＴｒａＴ、インフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）など、多数の天然のＴ細胞エピトープが存在する。本発明の免疫原性ペプチドは、Ｓｉｎｉｇａｇｌｉａ Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３６：７７８−７８０（１９８８）；Ｃｈｉｃｚ Ｒ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７８：２７−４７（１９９３）；Ｈａｍｍｅｒ Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ７４：１９７−２０３（１９９３）；Ｆａｌｋ Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，３９：２３０−２４２（１９９４）；ＷＯ９８／２３６３５；およびＳｏｕｔｈｗｏｏｄ Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， １６０：３３６３−３３７３（１９９８）に記載されているＴ細胞エピトープに結合させることができる（これらはそれぞれ、あらゆる目的で参照されて、本明細書に組み込まれる）。さらなる例は以下のものなどである：
インフルエンザヘマグルチニン：ＨＡ３０７−３１９ ＰＫＹＶＫＱＮＴＬＫＬＡＴ（配列番号４）
マラリアＣＳ：Ｔ３エピトープ ＥＫＫＩＡＫＭＥＫＡＳＳＶＦＮＶ（配列番号５）
Ｂ型肝炎表面抗原：ＨＢｓＡｇ１９−２８ ＦＦＬＬＴＲＩＬＴＩ（配列番号６）
熱ショックタンパク質６５：ｈｓｐ６５１５３−１７１ ＤＱＳＩＧＤＬＩＡＥＡＭＤＫＶＧＮＥＧ（配列番号７）
カルメットゲラン桿菌 ＱＶＨＦＱＰＬＰＰＡＶＶＫＬ（配列番号８）
破傷風トキソイド：ＴＴ８３０−８４４ ＱＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩＴＥＬ（配列番号９）
破傷風トキソイド：ＴＴ９４７−９６７ ＦＮＮＦＴＶＳＦＷＬＲＶＰＫＶＳＡＳＨＬＥ（配列番号１０）
ＨＩＶ ｇｐ１２０ Ｔ１：ＫＱＩＩＮＭＷＱＥＶＧＫＡＭＹＡ（配列番号１１）
あるいは、結合体は、本発明の薬剤を、ＭＣＨクラスＩＩ分子の大部分を結合する能力のある少なくとも１つの人為的Ｔ細胞エピトープ、例えばｐａｎＤＲエピトープ（「ＰＡＤＲＥ」）に連結させて形成することができる。ＰＡＤＲＥは、米国特許第５，７３６，１４２号、ＷＯ９５／０７７０７、およびＡｌｅｘａｎｄｅｒ Ｊ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１：７５１−７６１（１９９４）に記載されている（これらはそれぞれ、あらゆる目的で参照されて本明細書に組み込まれる）。好適なＰＡＤＲＥペプチドはＡＫＸＶＡＡＷＴＬＫＡＡＡ（配列番号１２）であるが、（共通の残基は太字になっている）ここで、Ｘは好ましくはシクロへキシルアラニン、チロシンまたはフェニルアラニンであり、シクロへキシルアラニンが最も好適である。
免疫原性薬剤は、化学的架橋により担体に結合させることができる。免疫原を担体に結合させる技術には、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジル−チオ）プロピオン酸（ＳＰＤＰ）およびスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸（ＳＭＣＣ）を用いるジスルフィド結合の形成などがある（ペプチドにスルフヒドリル基がない場合には、システイン残基を付加することによってこれをもたらすことができる）。これらの試薬は、それら自身と一方のタンパク質のペプチドのシステイン残基との間にジスルフィド結合を、そして、リジンのε−アミノ、または他のアミノ酸の遊離アミノ基を介してアミド結合を形成する。このようなジスルフィド／アミド形成剤の多様なものが、Ｉｍｍｕｎ．Ｒｅｖ．６２，１８５（１９８２）に記載されている。他の二官能性カップリング剤は、ジスルフィド結合よりむしろチオエーテル結合を形成する。これらのチオエーテル形成剤の多くは市販されており、６−マレイミドカプロン酸、２−ブロモ酢酸および２−ヨード酢酸、４−（Ｎ−マレイミド−メチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸の反応性エステルなどである。カルボキシル基は、それらをスクシンイミドまたは１−ヒドロキシル−２−ニトロ−４−スルホン酸、ナトリウム塩と組み合わせて活性化することができる。
免疫原性は、Ｔｈエピトープと本発明のペプチド免疫原との間にスペーサー残基（例えば、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ）を加えることで改善することができる。グリシン残基は、ＴｈエピトープをＢ細胞エピトープ（すなわち、ペプチド免疫原）から物理的に分離するだけでなく、Ｔｈエピトープをペプチド免疫原に連結させることによって形成される任意の人為的二次構造を破壊し、それによってＴ細胞応答および／またはＢ細胞応答の間の干渉を除去することができる。このように、ヘルパーエピトープと抗体誘発ドメインの間の立体構造による分離により、提示された免疫原と適当なＴｈおよびＢ細胞との間の効率的な相互作用が可能になる。
本発明の薬剤に対してさまざまなＨＬＡ型を提示する被験対象の大部分においてＴ細胞免疫の誘導を促進するために、さまざまなＴｈ細胞エピトープとの結合体の混合物を調製することができる。この混合物は、異なったＴｈ細胞エピトープとの少なくとも２種類の結合体の混合物、異なったＴｈ細胞エピトープとの少なくとも３種類の結合体の混合物、または異なったＴｈ細胞エピトープとの少なくとも４種類の結合体の混合物を含むことができる。この混合物は、アジュバントとともに投与することができる。
また、免疫原性ペプチドは、担体（すなわち、異種ペプチド）との融合タンパク質として発現させることもできる。免疫原性ペプチドは、そのアミノ末端、カルボキシル末端、またはその両方の位置で担体に連結させることができる。任意には、免疫原性ペプチドが複数反復して融合タンパク質に存在することもできる。任意には、免疫原性ペプチドを、異種ペプチドの複数のコピーに、例えば、ペプチドのＣ末端とＮ末端の両方で結合させることもできる。いくつかの担体ペプチドは、担体ペプチドに対するヘルパーＴ細胞応答を誘導する役目を果たす。次に、誘導されたヘルパーＴ細胞は、担体ペプチドに結合した免疫原性ペプチドに対するＢ細胞応答を誘導する。
本発明のいくつかの薬剤は、α−ＳＮのＮ末端断片が、そのＣ末端において担体ペプチドに連結している融合タンパク質を含む。このような薬剤において、α−ＳＮの断片のＮ末端残基は融合タンパク質のＮ末端残基を構成する。したがって、このような融合タンパク質は、α−ＳＮのＮ末端残基が遊離型であることを必要とするエピトープに結合する抗体を誘導するのに有効である。本発明のいくつかの薬剤は、担体ペプチドの１つ以上のコピーにＣ末端で連結したＮＡＣの複数の反復を含む。いくつかの融合タンパク質は、タンデムに並んだα−ＳＮのさまざまなセグメントを含む。
本発明のいくつかの薬剤は、α−ＳＮのＣ末端断片が、そのＮ末端において担体ペプチドに連結している融合タンパク質を含む。このような薬剤において、α−ＳＮの断片のＣ末端残基は、融合タンパク質のＣ末端残基を構成する。したがって、このような融合タンパク質は、α−ＳＮのＣ末端残基が遊離型であることを必要とするエピトープに結合する抗体を誘導するのに有効である。本発明のいくつかの薬剤は、担体ペプチドの１つ以上のコピーにＮ末端で連結したＳＮ１２５−１４０などのＣ末端ペプチドの複数の反復を含む。いくつかの融合タンパク質は、タンデムに並んだα−ＳＮのさまざまなセグメントを含む。
いくつかの融合タンパク質において、ＮＡＣは、そのＮ末端側終端で異種由来の担体ペプチドに融合している。ＮＡＣはＣ末端融合体とともに利用することができる。いくつかの融合タンパク質は、ＮＡＣのＮ末端またはＣ末端に連結した異種ペプチドを含み、このペプチドは、次に、α−ＳＮの１つ以上のさらに別のＮＡＣセグメントにタンデムに結合している。いくつかの融合タンパク質は、上記したように、Ｃ末端α−シヌクレインペプチドの複数のコピー、および互いに連結した異種ペプチドの複数のコピーを含む。
本発明において使用するのに適した融合タンパク質のいくつかの例を以下に示す。これらの融合タンパク質のいくつかは、例えば、米国特許第５，１９６，５１２号、欧州特許第３７８，８８１号、および欧州特許第４２７，３４７号に記載されているような破傷風トキソイドのエピトープに連結したα−ＳＮのセグメント（上記した断片の任意のものなど）を含む。いくつかの融合タンパク質は、少なくとも１つのＰＡＤＲＥに連結したα−ＳＮのセグメントを含む。異種ペプチドには乱交雑型Ｔ細胞エピトープであるものもあれば、普遍型Ｔ細胞エピトープであるものもある。いくつかの方法において、投与用薬剤は、単に、直線的配置で異種セグメントに連結したα−ＳＮセグメントをもつ単一の融合タンパク質である。本発明の治療剤は、化学式を用いて表わすことができる。例えば、いくつかの方法において、本薬剤は、式中ｘが１〜５の整数である、化学式２ｘで表される融合タンパク質の多量体である。好ましくは、ｘは１、２、または３であり、２が最も好ましい。ｘが２の場合、このような多量体は、ＭＡＰ４と呼ばれる好適な構造で連結している４つの融合タンパク質を有する（米国特許第５，２２９，４９０号参照）。
ＭＡＰ４構造を以下に示す。ここで、分枝構造は、リジンのＮ末端および側鎖アミンの両方においてペプチド合成を開始させることによって作り出される。リジンが配列に取り込まれて分枝できる回数に応じて、得られる構造は複数のＮ末端を提示する。この例においては、４つの同一のＮ末端が分枝型リジン含有コア上に生じている。このような多重性は、同族Ｂ細胞の応答性を大いに促進する。
Figure 0005211290
 Ｚは、ＮＡＣペプチド、ＮＡＣペプチドの断片、または上記の第Ｉ．２節に記載したようなα−ＳＮの他の活性断片を意味する。Ｚは、例えば、１つよりも多い活性断片を表す可能性がある。
Ｚ＝α−ＳＮ６０〜７２（ＮＡＣ領域）ペプチド＝ＮＨ２−ＫＥＱＶＴＮＶＣＧＧＡＶＶＴ−ＣＯＯＨ（配列番号１３）
Ｚ＝α−ＳＮ７３〜８４（ＮＡＣ領域）ペプチド＝ＮＨ２−ＧＶＴＡＶＡＱＫＴＶＥＣＧ−ＣＯＯＨ（配列番号１４）
Ｚ＝α−ＳＮ１０２〜１１２ペプチド＝ＮＨ２−Ｃ−アミノヘプタン酸−ＫＮＥＥＧＡＰＣＱＥＧ−ＣＯＯＨ（配列番号１５）
α−ＳＮ１２８〜１４０ペプチド
融合タンパク質の他の例には以下のものなどがある。
ＭＡＰ４構造のＺ−破傷風トキソイド８３０〜８４４
Figure 0005211290
 ＭＡＰ４構造のＺ−破傷風トキソイド９４７〜９６７
Figure 0005211290
 ＭＡＰ４構造のＺ−破傷風トキソイド８３０〜８４４
Figure 0005211290
 直線構造のＺ−破傷風トキソイド８３０〜８４４＋破傷風トキソイド９４７〜９６７
Figure 0005211290
 Ｘが好ましくシクロヘキシルアラニン、チロシンまたはフェニルアラニンであり、シクロヘキシルアラニンが最も好ましいＰＡＤＲＥペプチド−Ｚ（すべて直線構造）。
Figure 0005211290
 ３Ｚ−ＰＡＤＲＥペプチド：
Figure 0005211290
 融合ペプチドの更なる例は以下のものなどである。
Figure 0005211290
 ２つに分枝した樹脂
Figure 0005211290
 上の
Figure 0005211290
Figure 0005211290
 （ＭＡＰ−４構造のシヌクレイン断片融合タンパク質）
同一または類似した担体タンパク質および連結法を、受動免疫で使用するためのα−ＳＮに対する抗体の作製に使用される免疫原を作製するために利用することができる。例えば、α−ＳＮに対するモノクローナル抗体を製造する際に、担体に連結したα−ＳＮまたは断片を実験動物に投与することができる。
４．治療剤をコードする核酸
レビー小体に対する免疫反応は、α−ＳＮペプチドのセグメントをコードする核酸、その断片、その他のペプチド免疫原、または受動免疫に使用される抗体およびそれらの成分鎖を投与することによって誘導することもできる。このような核酸はＤＮＡでもＲＮＡでもよい。免疫原をコードする核酸セグメントは、典型的には、患者の目的とする標的細胞の中でＤＮＡセグメントの発現を可能にするプロモーターおよびエンハンサーなどの制御因子に連結している。免疫反応を誘導するのには望ましいため、血液細胞内での発現には、軽鎖または重鎖のイムノグロブリン遺伝子に由来するプロモーターおよびエンハンサー因子、またはＣＭＶ主要中初期プロモーターおよびエンハンサーが直接発現させるのに適している。連結した制御因子およびコード配列は、しばしばベクターの中にクローニングされる。二重鎖抗体を投与するために、２つの鎖を同一または別々のベクターにクローニングすることができる。本発明の治療薬剤をコードする核酸は、少なくとも１つのＴ細胞エピトープをコードすることもできる。アジュバントの使用に関する本明細書の開示内容は、それらを本発明の治療薬剤をコードする核酸と一緒に使用する場合にも準用される。
レトロウイルス系（例えば、Ｌａｗｒｉｅ ａｎｄ Ｔｕｍｉｎ， Ｃｕｒ、Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．３，１０２−１０９（１９９３）参照）；アデノウイルスベクター（例えば、Ｂｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７，５９１１（１９９３））；アデノ随伴ウイルスベクター（例えば、Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７９，１８６７（１９９４）、ワクシニアウイルスおよび禽痘などのポックスファミリーに由来するウイルスベクター、シンドビスウイルス、およびセムリキ森林ウイルスに由来するものなど、アルファウイルス属のウイルスベクター（例えば、Ｄｕｂｅｎｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０，５０８−５１９（１９９６））、ベネズエラ馬脳炎ウイルス（米国特許第５，６４３，５７６号参照）、および水疱性口内炎ウイルスなどのラブドウイルス（ＷＯ９６／３４６２５参照）、およびパピローマウイルス（Ｏｈｅ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６，３２５−３３３（１９９５）；Ｗｏｏ ｅｔ ａｌ，ＷＯ９４／１２６２９、およびＸｉａｏ＆Ｂｒａｎｄｓｍａ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４，２６３０−２６２２（１９９６））など、いくつかのウイルスベクター系を利用することができる。
免疫原をコードするＤＮＡ、またはそれを含むベクターをリポソームにパッケージすることができる。適当な脂質、および関連するアナログが、米国特許第５，２０８，０３６号、第５，２６４，６１８号、第５，２７９，８８３号、および第５，２８３，１８５号に記載されている。免疫原をコードするベクターおよびＤＮＡは、ポリメチルメタクリル酸ポリマー、ポリラクチドおよびポリ（ラクチド−コ−グリコリド）などを例とする微粒子の担体に吸着させるか、結合させることもできる（例えば、ＭｃＧｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｉｃｒｏ Ｅｎｃａｐ．１９９６）。
各患者への投与、典型的には、全身投与（例えば、静脈内、腹腔内、経鼻、胃内、皮内、筋内、皮下、または頭蓋内への注入）、または局所適用（例えば、米国特許第５，３９９，３４６号参照）によって、遺伝子治療用ベクターまたは裸のＤＮＡをインビボで送達することができる。このようなベクターは、さらに、ブピバカインなどの促進剤を含む（例えば、米国特許第５，５９３，９７０号参照）。また、ＤＮＡは、遺伝子銃を用いて投与することもできる。Ｘｉａｏ＆Ｂｒａｎｄｓｍａ、前掲参照。免疫原をコードするＤＮＡを、微細な金属ビーズの表面上に沈着させる。微小発射体が、衝撃波または膨張するヘリウムガスによって加速されると、組織を貫いて何層もの細胞の深さにまで到達する。例えば、Ａｇａｃｅｔｕｓ，Ｉｎｃ．Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ，ＷＩによって製造されている商標Ａｃｃｅｌ遺伝子送達装置が適している。あるいは、裸のＤＮＡは、ＤＮＡを、化学的または物理的な刺激とともに皮膚の上にスポットするだけで皮膚を通過して血流に入りこむことができる（ＷＯ９５／０５８５３参照）。
更なる変法において、免疫原をコードするベクターを、例えば、各患者から外植された細胞（例えば、リンパ球、骨髄吸引液、および組織生検）、または万能供血の造血幹細胞などの細胞にエクスビボで送達した後、通常は、ベクターを取り込んでいる細胞を選抜してから、その細胞を患者に再移植することができる。
ＩＩＩ．Ａβに対する免疫反応を誘導するための薬剤
β−アミロイドペプチドとしても知られるＡβ、またはＡ４ペプチド（例えば、米国特許第４，６６６，８２９号；Ｇｌｅｎｎｅｒ＆Ｗｏｎｇ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１２０，１１３１（１９８４）参照）は、３９〜４３位のアミノ酸のペプチドであり、アルツハイマー病に特徴的なプラークの主要成分である。Ａβは、より大型のタンパク質ＡＰＰを、βセクレターゼおよびγセクレターゼと名付けられている２種類の酵素（Ｈａｒｄｙ，ＴＩＮＳ ２０，１５４（１９９７））で処理することによって生成する。アルツハイマー病に関連したＡＰＰの既知の変異は、βまたはγセクレターゼ部位の近傍、またはＡβ内で生じる。例えば、第７１７位は、ＡＰＰをＡβにプロセッシングするときにγ−セクレターゼで切断される部位の近傍にあり、６７０／６７１位は、β−セクレターゼ切断部位の近傍にある。これらの変異は、Ａβが形成される切断反応と相互作用して、生成されたＡβの４２／４３アミノ酸型の量を増加させることによってＡＤを引き起こすと考えられている。
Ａβは、古典的な補体カスケードおよび代替的な補体カスケードの両方を固定および活性化することができるという普通ではない性質を持っている。特に、Ｃｌｑ、および最終的にはＣ３ｂｉに結合する。この結合により、マクロファージへの結合が促進され、Ｂ細胞の活性化がもたらされる。また、Ｃ３ｂｉはさらに分解して、その後、Ｔ細胞依存的にＢ細胞上のＣＲ２に結合し、その結果、これらの細胞の活性化を１０，０００倍上昇させる。このメカニズムによって、Ａβは、他の抗原の免疫反応よりも過度に免疫反応を生じさせる。
Ａβには、いくつかの天然型がある。Ａβのヒト型は、Ａβ３９、Ａβ４０、Ａβ４１、Ａβ４２、およびＡβ４３と呼ばれている。これらのペプチドの配列、およびそれらのＡＰＰ前駆体に対する関係が、Ｈａｒｄｙ ｅｔ ａｌ．，ＴＩＮＳ２０，１５５−１５８（１９９７）の図１に示されている。例えば、Ａβ４２は以下の配列を有する。
Figure 0005211290
 Ａβ４１、Ａβ４０、およびＡβ３９は、それぞれ、Ｃ末端終端からＡｌａ、Ａｌａ−Ｉｌｅ、およびＡｌａ−Ｉｌｅ−Ｖａｌが脱落している点でＡβ４２と異なる。Ａβ４３は、Ｃ末端にＴｈｒ残基がある点でＡβ４２と異なる。
α−ＳＮについて上記した薬剤に類似した薬剤が、Ａβについて既に記載されている（ＷＯ９８／２５３８６およびＷＯ００／７２８８０を参照。これらは両方とも、あらゆる目的で本明細書句込まれる）。これらの薬剤は、Ａβおよびその活性断片、Ａβの結合体、およびＡβ活性断片の結合体、Ａβおよびその活性断片に対する抗体（例えば、マウス抗体、ヒト化抗体、ヒト型抗体、およびキメラ抗体）、ならびに、抗体鎖をコードする核酸を含む。ＡβのＮ末端側の半分からの活性断片が好適である。好適な免疫原性断片は、Ａβ１〜５、１〜６、１〜７、１〜１０、３〜７、１〜３および１〜４などである。例えば、Ａβ１〜５という名前は、Ａβの１〜５位の残基を含み、その他のＡβの残基を含まない断片を表している。Ａβの１〜３位の残基で始まり、Ａβの７〜１１位の残基で終る断片が特に好適である。
活性型免疫反応を誘導する薬剤、受動免疫反応を誘導する薬剤、結合体、および治療剤をコードする核酸に関する本明細書の開示内容（上記、第ＩＩ．１節、２節、３節、および４節参照）を、Ａβおよびその断片の使用に準用する。活性型免疫反応を誘導する薬剤、受動免疫反応を誘導する薬剤、結合体、および治療剤をコードする核酸に関する本明細書の開示内容（上記、第ＩＩ．１節、２節、３節、および４節参照）を、Ａβおよびその断片の使用に準用する。治療、および投薬計画に修正可能な患者に関する本明細書の開示内容（下記、第ＩＶ節および第Ｖ節参照）を、Ａβおよびその断片の使用に準用する。
脱凝集したＡβまたはその断片とは、モノマーのペプチド単位を意味する。脱凝集したＡβまたはその断片は、一般的に可溶性であって、自己凝集して可溶性のオリゴマーを形成することができる。Ａβおよびその断片のオリゴマーは、通常は可溶性であって、主にαへリックス型またはランダムコイル型として存在する。凝集型のＡβまたはその断片は、不溶性のβ−シート集合体に会合しているα−ＳＮまたはその断片のオリゴマーを意味する。また、凝集型のＡβまたはその断片は、原繊維ポリマーも意味する。原繊維は通常は不溶性である。いくつかの抗体は、可溶型Ａβもしくはその断片、または、凝集型Ａβまたはその断片のいずれかに結合する。可溶型Ａβまたはその断片、および凝集型Ａβまたはその断片の両方に結合する抗体もある。
結合体のいくつかの例は以下のものを含む：
ＡＮ９０５４９（ＭＡＰ４構造になっているＡβ１〜７−破傷風トキソイド８３０〜８４４）：（配列番号３４）
Figure 0005211290
 ＡＮ９０５５０（ＭＡＰ４構造になっているＡβ１〜７−破傷風トキソイド９４７〜９６７）：
Figure 0005211290
 ＡＮ９０５４２（直線構造になっているＡβ１〜７−破傷風トキソイド８３０〜８４４および９４７〜９６７）：
Figure 0005211290
 ＡＮ９０５７６（ＭＡＰ４構造になっているＡβ３〜９−破傷風トキソイド８３０〜８４４）：
Figure 0005211290
 Ｘが、好ましくはシクロへキシルアラニン、チロシンまたはフェニルアラニンであり、シクロへキシルアラニンが最も好適である、ＰＡＤＲＥペプチド（すべて直線構造になっている）：
ＡＮ９０５６２（ＰＡＤＲＥ−Ａβ１〜７）：
Figure 0005211290
 ＡＮ９０５４３（３ＰＡＤＲＥ−Ａβ１〜７）：
Figure 0005211290
 融合タンパク質の別の例には以下のものがある（Ａβの免疫原エピトープは太字）：
Figure 0005211290
 ２つに分枝した樹脂
Figure 0005211290
 上の
Figure 0005211290
 好適なモノクローナル抗体は、Ａβの１〜１０位の残基（天然型Ａβの最初のＮ末端残基を１とする）の中にあるエピトープに結合する。好適なモノクローナル抗体には、１〜５位のアミノ酸の中にあるエピトープに結合するものもあり、５から１０位の中にあるエピトープに結合するものもある。いくつかの好適なモノクローナル抗体は、１〜３位、１〜４位、１〜５位、１〜６位、１〜７位、または３〜７位のアミノ酸の中にあるエピトープに結合する。いくつかの好適なモノクローナル抗体は、Ａβの１〜３位の残基から開始して、７〜１１位の残基で終るエピトープに結合する。この他の抗体には、１３〜２８０位の残基を有するエピトープに結合する抗体などがある（例えば、モノクローナル抗体２６６）。好適な抗体はヒトＩｇＧ１アイソタイプをもつ。
ＩＶ．除去活性に関する抗体スクリーニング
本発明は、レビー小体もしくはその他の抗原、または関連する生物学的実体であって、それに対する除去活性が望まれるものを除去する活性について抗体をスクリーニングする方法を提供する。レビー小体に対する活性をスクリーニングするために、ＰＤ患者、または特徴的なパーキンソン病の病態をもつ動物モデルの脳から採取した組織サンプルを、小グリア細胞など、Ｆｃレセプターを有する食細胞、および被験抗体と、培地においてインビトロで接触させる。食細胞は、初代培養または細胞株、例えばＢＶ−２、Ｃ８−Ｂ４、またはＴＨＰ−１であってもよい。いくつかの方法では、成分を顕微鏡スライド上で混合して、顕微鏡観察を容易にする。いくつかの方法では、マイクロタイター皿のウエルの中で並行して複数の反応を行う。このような方法では、別々の小型顕微鏡スライドを別々のウエルにマウントするか、または、α−ＳＮのＥＬＩＳＡ検出のように、顕微鏡を使用しない検出方式を用いることもできる。好ましくは、一連の測定値は、反応が進行する前のベースライン値から出発する、インビトロ反応混合液中のレビー小体の量、および反応の過程における１つ以上の試験値からなる。抗原は、例えば、α−ＳＮ、またはその他のＬＢ成分に対する蛍光標識抗体による染色で検出することができる。染色に使用される抗体は、除去活性について調べようとしている抗体と同一のものであってもなくてもよい。ＬＢの反応の過程でベースラインよりも減少することが、被験抗体が除去活性を有することを示している。そのような抗体は、ＰＤおよびその他のＬＢＤを予防または治療する上で役に立つ可能性が高い。
類似の方法を用いて、別のタイプの生物学的実体を除去する活性について抗体をスクリーニングすることができる。このアッセイ法を用いて、実質的にあらゆる種類の生物学的実体に対する除去活性を検出することができる。典型的には、生物学的実体は、ヒトまたは動物の疾患に何らかの役割を有する。この生物学的実体を、組織サンプルまたは単離された形で提供することができる。組織サンプルとして提供される場合、好ましくは、その組織サンプルは固定されていないため、組織サンプルの成分と容易に接触させることができ、かつ、固定に伴って起こる成分の不安定な立体構造を避けることができる。このアッセイ法で調べることができる組織サンプルの例は、癌組織、前癌組織、いぼやほくろなど良性の増殖物を含む組織、病原性微生物に感染した組織、炎症細胞が浸潤した組織、細胞間に病的基質を有する組織（例えば、線維性心膜炎）、異常な抗原を有する組織、および瘢痕組織などである。使用可能な単離された生物学的実体の例は、α−ＳＮ、ウイルス抗原もしくはウイルス、プロテオグリカン、別の病原性微生物の抗原、腫瘍抗原、および接着分子などである。このような抗原は、なかでも、天然の由来源、組換え発現、または化学的合成から得ることができる。組織サンプルまたは単離した生物学的実体を、Ｆｃレセプターを有する食細胞、例えば単球または小グリア細胞、および調べようとしている抗体と培地の中で接触させる。抗体は、試験中の生物学的実体に対するものでも、その実体と結合する抗原に対するものでもよい。後者の場合には、目的は、その生物学的実体が、抗原の身代わりとなって貪食されるか否かを調べることである。通常、但し、必ずというわけではないが、抗体および生物学的実体は（時には、関連する抗原とともに）、食細胞を加える前に互いに接触させる。生物学的実体および／または関連抗原が、もし培地に残っていれば、その後その濃度を測定する。抗原またはそれに関連した生物学的実体の培地内の量または濃度が低下すると、抗体が、抗原および／または関連した生物学的実体に対する除去反応を、食細胞とともに有することが示される。
また、抗体またはその他の薬剤は、実施例ＩＩに記載したインビトロアッセイ法を用いて、レビー小体を除去する活性についてスクリーニングすることもできる。シヌクレインを発現する発現ベクターによって形質転換された神経細胞は、顕微鏡で見ることができるシヌクレイン封入体を形成する。このような封入体を除去する抗体またはその他の薬剤の活性は、薬剤で処理された形質転換細胞の中にあるシヌクレインの外観または量を、その薬剤で処理されていない対照細胞におけるシヌクレインの外観または量と比較して測定することができる。シヌクレイン封入体の大きさまたは強度の減少、またはシヌクレイン量の減少は、シヌクレイン除去の活性を示す。この活性は、シヌクレイン封入体を顕微鏡で見るか、または細胞抽出物をゲル泳動してシヌクレインのバンドを可視化することによって観察することができる。実施例１の第２節に記載したように、シヌクレインの量の変化は、抽出物を、サイトゾル画分と膜画分に分画すれば最も著明になるので、膜画分を解析する。
また、抗体またはその他の薬剤は、実施例ＩＸに記載したインビボアッセイ法を用いて、レビー小体を除去する活性についてスクリーニングすることもできる。要すれば、ヒトα−シヌクレインを過剰発現して神経細胞内にα−シヌクレイン凝集体を有するトランスジェニックマウスの新皮質に、被験抗体を注入する。１つのアプローチ法において、使用される動物は、ＰＤＧＦプロモーターの転写調節下で脳内においてヒトの野生型α−シヌクレインを過剰発現する、４〜８月齢のヘテロ接合トランスジェニックマウスである（Ｍａｌｉａｈ，２０００，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８７：１２６５−６９参照）。被験抗体および対照（例えば、無関係のアイソタイプが一致する対照抗体）を、マウスに注入するために適当な緩衝液（例えば、滅菌リン酸緩衝食塩水）に溶解させる。各マウスに対し、２ｍｇ／ｍｌの抗体溶液２μｌを、麻酔下で右半脳（同側部位）の頭頂部の新皮質の深層の中に定位固定して接種する。左半脳（対側部位）は、各マウスに対するベースライン対照となる。接種部位を縫合して、麻酔から回復するまでマウスを観察する。接種してから２週間後、マウスを安楽死させ、その脳を取り出して、４％パラホルムアルデヒドで４８時間固定してから、冠状に４０μｍの厚さに切る。接種部位近辺の切片を、α−シヌクレイン抗体（例えば、α−シヌクレインの１１５〜１２２位のアミノ酸を認識するＥＬＡＤＷ−４７）で染色する。各切片について、同側半脳の接種部位近辺にある４つの顕微鏡視野（２０×対物）、および対照半脳の対側部位における対応する４つの視野で神経細胞内α−シヌクレイン凝集体の数を計測した。各動物について、２つの切片のα−シヌクレイン凝集体の数を合計し、２つの半脳間でのα−シヌクレイン凝集体の合計数の違いは、各マウスについての凝集体除去に対する被験抗体の効果を判定するためのものである。処理された半脳におけるα−シヌクレイン凝集体の合計数の減少は、抗体またはその他の薬剤が、レビー小体を除去する活性をもつことを示す指標である。好ましくは、少なくとも１０％の減少が観察される。より好ましくは、少なくとも２０％、少なくとも４０％、少なくとも６０％、または少なくとも８０％の減少が観察される。
Ｖ．抗レビー小体成分投薬計画に適した患者
治療に適した患者は、シヌクレイン病のリスクはあるが、症状を示していない者、および、現在症状を示している患者を含む。また、治療に適した患者は、ＬＢＤの疾患のリスクはあるが、症状を示していない者、および、現在症状を示している患者を含む。このような疾患は、パーキンソン病（特発性パーキンソン病を含む）、ＤＬＢ、ＤＬＢＤ、ＬＢＶＡＤ、純粋自律神経障害、レビー小体嚥下障害、偶発性ＬＢＤ、遺伝性ＬＢＤ（例えば、α−ＳＮ遺伝子、ＰＡＲＫ３、およびＰＡＲＫ４の変異）、および多系統萎縮症（例えば、オリーブ橋小脳萎縮症、線条体黒質変性症、およびシャイ・ドレーガー症候群）などである。したがって、本方法は、ＬＢＤの既知の遺伝的リスクをもつ者に予防的に行うことも可能である。このような者には、この疾患を経験したことのある親類をもつ者、および遺伝子マーカーまたは生化学マーカーの解析によってリスクを判定された者などが含まれる。ＰＤに対するリスクの遺伝子マーカーは、シヌクレインまたはパーキン遺伝子、ＵＣＨＬＩ遺伝子、およびＣＹＰ２Ｄ６遺伝子における変異、特に、シヌクレイン遺伝子の５３位における変異などである。パーキンソン病に現在罹患している者は、静止時振戦、筋固縮、動作緩慢、および姿勢の不安定などの臨床症状から見分けることができる。
いくつかの方法において、患者は、いかなるアミロイド形成性疾患の臨床的な症状、徴候、および／または危険因子も示さずに、少なくとも１つのアミロイド形成性疾患を患っている。いくつかの方法において、患者は、細胞外へのアミロイド沈着を特徴とする疾患の臨床的な症状、徴候、および／または危険因子を示さない。いくつかの方法において、患者は、Ａβペプチドのアミロイド沈着を特徴とする疾患をもたない。いくつかの方法において、患者は、アルツハイマー病の臨床的な症状、徴候、および／または危険因子を示さない。いくつかの方法において、患者は、アルツハイマー病、認知障害、軽度認知障害、およびダウン症候群の臨床的な症状、徴候、および／または危険因子を示さない。いくつかの方法において、患者は、アルツハイマー病、およびレビー小体を特徴とする疾患を併発している。いくつかの方法において、患者は、アルツハイマー病、およびシヌクレイン蓄積を特徴とする疾患を併発している。いくつかの方法において、患者は、アルツハイマー病およびパーキンソン病を併発している。
無症状の患者では、何歳で治療を開始してもよい（例えば、１０、２０、または３０歳）。しかし、通常は、患者が４０、５０、６０、または７０に達するまでは治療を開始する必要はない。治療は、典型的には、一定の期間にわたって複数回投与する必要がある。治療は、長期間にわたって、治療薬剤（例えば、α−ＳＮペプチドもしくはＡβ、またはその両者）に対する抗体、または活性化Ｔ細胞もしくはＢ細胞の反応をアッセイしてモニターすることができる。反応が低下した場合には、追加抗原投与が指示される。
任意には、治療を始める前に病気の症状、徴候、または危険因子の有無を判定する。
ＶＩ．抗アミロイド成分投薬計画に適した患者
治療に適した患者は、病気のリスクはあるが、症状を示していない者、および、現在アミロイドーシスの症状を示している患者を含む。アルツハイマー病の場合には、長生きをしている人であれば、実質的に誰でもアルツハイマー病に罹るリスクがある。したがって、本方法は、対象となる患者のリスクを評価する必要なしに、一般的な集団に対して予防的に行うことができる。本方法は、アルツハイマー病、またはその他の遺伝的アミロイド病の既知の遺伝的リスクを持つ者に対して特に有用である。このような者には、この疾患を経験したことのある親類をもつ者、および遺伝子マーカーまたは生化学マーカーの解析によってリスクありと判定された者などが含まれる。アルツハイマー病に対するリスクの遺伝子マーカーは、ＡＰＰ遺伝子の変異、特に、それぞれＨａｒｄｙとＳｗｅｄｉｓｈの変異と呼ばれている７１７位、および６７０と６７１位における変異（Ｈａｒｄｙ，ＴＩＮＳ、前掲、参照）などである。別のリスクマーカーは、プレセニリン遺伝子、ＰＳ１およびＰＳ２、ならびにＡｐｏＥ４における変異、ＡＤの家族歴、高コレステロール血症、またはアテローム性動脈硬化である。アルツハイマー病に現在罹患している者は、特徴的な認知症、および上記の危険因子の存在から見分けることができる。また、ＡＤに罹った者を同定するために、いくつかの診断検査法を利用することができる。これらには、ＣＳＦタウおよびＡβ４２の量を測定することが含まれる。タウ量の増加およびＡβ４２量の低下は、ＡＤの存在を示している。また、アルツハイマー病に罹患した者は、実施例の節で検討するようにＭＭＳＥまたはＡＤＲＤＡの基準によって診断することも可能である。無症状の患者では、何歳で治療を開始してもよい（例えば、１０、２０、または３０歳）。しかし、通常は、患者が４０、５０、６０、または７０に達するまでは治療を開始する必要はない。治療は、典型的には、一定の期間にわたって複数回投与する必要がある。治療は、下記のＶＩＩＩ節の「モニター法および診断法」における記載に従って長期間にわたって、治療薬剤（例えば、ＮＡＣ）に対する抗体、または活性化Ｔ細胞もしくはＢ細胞の反応をアッセイしてモニターすることができる。反応が低下した場合には、追加抗原投与が指示される。
ＶＩＩ．投薬計画
一般的には、投薬計画は、α−ＳＮに対する免疫反応を誘導するのに効果的な薬剤および／またはＡβに対する免疫反応を誘導するのに効果的な薬剤を患者に投与することを含む。予防的な適用では、ＬＢＤまたは別のシヌクレイン病に対して感受性であるか、またはそのリスクがある患者に、その病気の生理学的、生化学的、組織学的、および／または行動学的な症状、その合併症、およびその病気が発症する際に表れる中間的な病理学的表現型を含む病気のリスクを除去または低下させ、重度を低下させ、または開始を遅らせるのに十分な医薬組成物または薬物の量および頻度で投与することを含む投与計画にして医薬組成物または薬物を投与する。治療的な適用では、このような病気が疑われるか、すでに罹患している患者に、その合併症、およびその病気が発症する際の中間的な病理学的表現型を含む、その病気の（生理学的、生化学的、組織学的、および／または行動学的な）症状を治癒、または少なくとも部分的に阻止するのに十分な量および頻度で組成物を投与することを含む投与計画にして医薬組成物または薬物を投与する。例えば、いくつかの方法において、治療は、少なくとも部分的なレビー小体の除去、少なくとも部分的なレビー小体の脱凝集をもたらし、および／またはシナプス内のα−シヌクレインオリゴマーの量を減少させる。治療的または予防的な処理を行うのに十分な量は、治療上、または予防上有効な用量と定義される。治療的または予防的な処理を行うのに十分な量および投薬頻度の組み合わせは、治療上、または予防上有効な投薬計画と定義される。予防的および治療的な計画において、通常、薬剤は、十分な免疫反応が達成されるまで何回かの投薬量にして投与される。典型的には、免疫反応をモニターして、免疫反応が弱くなり始めたら繰り返し投薬を行う。
いくつかの方法において、薬剤の投与は、凝集型シヌクレインの細胞内量の低下をもたらす。いくつかの方法において、薬剤の投与は、ＬＢＤの臨床症状、例えばパーキンソン病の場合には運動機能などの改善をもたらす。いくつかの方法において、凝集型シヌクレインの細胞内量の低下、または臨床症状の改善を、薬剤投与の後周期的にモニターする。
上記症状を治療するための本発明の組成物の有効用量は、投与手段、標的部位、患者の生理学的な状態、患者がヒトか動物か、投与される別の薬物、および処理が予防的か治療的かなど、さまざまな要素に応じて変動する。通常は、患者はヒトであるが、トランスジェニック哺乳動物などの非ヒト哺乳動物を治療することもできる。治療調剤は希釈して、安全性および有効性を最適なものにする必要がある。免疫原の量は、アジュバントも投与されるか否かによって決まり、アジュバントがない場合には、より高い用量が必要となる。投与するための免疫原の量は、時に、患者当り１〜５００μｇまで変動し、より普通には、ヒトに投与するための注射あたり５〜５００μｇまで変動する。場合によっては、注射あたり１〜２ｍｇというより高い用量が用いられる。典型的には、約１０、２０、５０、または１００μｇを各注射に使用する。投与するための免疫原の質量も、全体としての免疫原の質量に対する免疫原中にある免疫原性エピトープの質量比によって決まる。典型的には、１０−３から１０−５マイクロモルの免疫原性エピトープを１マイクログラムの免疫原に使用する。注射の時期は、１日１回から、１年１回、１０年に１回まで顕著に変えることができる。任意の所定日に１用量の免疫原を投与するとき、アジュバントも投与する場合には、投与量は１μｇ／患者よりも多く、通常は１０μｇ／患者よりも多い。アジュバントを投与しない場合には、１０μｇ／患者よりも多く、通常は１００μｇ／患者よりも多い。典型的な計画は、免疫した後、例えば６週間の間隔をおいて追加免疫接種する構成になる。別の計画では、免疫した後、１、２、および１２ヶ月後に追加免疫接種する構成となる。別の計画では、一生の間２ヶ月毎に接種をする必要がある。あるいは、追加免疫接種は、免疫反応をモニターすることによって不定期に行うことも可能である。
抗体による受動免疫では、投与量は、ホストの体重当りで約０．０００１から１００ｍｇ／ｍｌ、より普通には０．０１から５ｍｇ／ｍｌの範囲である。例えば、投与量は１ｍｇ／体重（ｋｇ）または１０ｍｇ／体重（ｋｇ）、または１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲内でもよい。すなわち、７０ｋｇの患者では、それぞれ７０ｍｇ、７００ｍｇ、または７０〜７００ｍｇの範囲内であればよい。典型的な投薬計画は、２週間毎に１回または月に１回または３〜６ヶ月毎に１回の投与を必要とする。いくつかの方法では、さまざまな結合特異性をもつ２種類以上のモノクローナル抗体を同時に投与するが、その場合、投与される各抗体の用量は指示された範囲内に含まれる。抗体は、通常、複数回投与される。１回毎の投薬間隔は週間、月間、または年間であってもよい。また、間隔は、患者のα−ＳＮに対する抗体の血中量を測定して示されるように不定期であってもよい。いくつかの方法では、血漿抗体濃度が１〜１０００μｇ／ｍｌになるよう、またいくつかの方法では２５〜３００μｇ／ｍｌになるよう用量を調整する。あるいは、抗体を徐放製剤として投与することができるが、その場合には、投与の頻度をより少なくする必要がある。用量および頻度は、患者の体内における抗体の半減期によって変わる。一般的には、ヒト抗体が最も長い半減期を示し、次にヒト化抗体、キメラ抗体、そして非ヒト抗体の順である。投与する用量および頻度は、治療が予防的か治療的かによっても変わる。予防的な適用では、比較的低用量を長期間にわたって比較的低頻度の間隔で投与する。患者には、生きている限り治療を受け続ける者もいる。治療的な適用では、病気の進行が抑制または終焉するまで、好ましくは、患者が一部または完全に症状の改善を示すまで、比較的短い期間比較的高量の投薬が必要とされることもある。その後、患者に予防的計画を施すことができる。
免疫原をコードする核酸の用量は、患者あたり約１０ｎｇから１ｇ、１００ｎｇから１００ｍｇ、１μｇから１０ｍｇ、または３０から３００μｇのＤＮＡである。感染性ウイルスベクターの用量は、１回投与あたり１０〜１００個、またはそれよりも多いビリオン数まで変動する。
免疫反応を誘導する薬剤は、予防的および／または治療的な処置のために非経口、局所的、静脈内、経口、皮下、動脈内、頭蓋内、くも膜下、腹腔内、鼻腔内、または筋肉内を利用して投与される。免疫原性薬剤のもっとも一般的な投与経路は皮下であるが、他の経路も同じように効果的であり得る。２番目にもっとも一般的な経路は筋肉内注射である。この種の注射は、もっとも一般的には腕または足の筋肉の中に行われる。いくつかの方法では、例えば、頭蓋内接種のように、沈着物が蓄積している特定の組織の中に薬剤を直接注入する。筋肉内注射または静脈内輸液が、抗体を投与するのに好適である。いくつかの方法では、特定の治療用の抗体は直接頭蓋に注入される。いくつかの方法では、商標Ｍｅｄｉｐａｄ装置のように、徐放性組成物または装置として抗体を投与する。
上記したように、それぞれα−ＳＮおよびＡβに対する免疫反応を誘導する薬剤を組み合わせて投与することができる。これらの薬剤は、同時に、連続して、または別個に使用するために単一の製剤またはキットに組み合わせることができる。薬剤を、製剤またはキットの別々のバイアルに詰めるか、または１つのバイアルで混合することも可能である。これら本発明の薬剤は、任意には、少なくとも部分的にＬＢＤの治療に有効な他の薬剤と組み合わせて投与することも可能である。パーキンソン病とダウン症候群の場合には、ＬＢが脳内に生じるため、本発明の薬剤を、本発明の薬剤が血液脳関門を通過する量を増加させる他の薬剤とともに投与することも可能である。
ペプチドなどの本発明の免疫原性薬剤はアジュバントとともに投与されることがある。さまざまなアジュバントを、α−ＳＮなどのペプチドと一緒に使用して、免疫反応を誘発することができる。好適なアジュバントは、反応の定性的な形に影響を与える免疫原の立体構造上の変化を引き起こすことなく、免疫原に対する本来の反応を強化する。好適なアジュバントは、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウム、３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリル脂質Ａ（商標ＭＰＬ）（英国特許第２２２０２１１号（ＲＩＢＩ ＩｍｍｕｎｏＣｈｅｍ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．， Ｈａｍｉｌｔｏｎ， Ｍｏｎｔ．、現在Ｃｏｒｉｘａの一部）参照）などである。商標Ｓｔｉｍｕｌｏｎ ＱＳ−２１は、南米で発見されたキラヤ・サポニア・モリナ（Ｑｕｉｌｌａｊａ Ｓａｐｏｎａｒｉａ Ｍｏｌｉｎａ）の木の樹皮から単離されたトリテルペン配糖体すなわちサポニンである（Ｋｅｎｓｉｌ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ：Ｔｈｅ Ｓｕｂｕｎｉｔ ａｎｄ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ａｐｐｒｏａｃｈ（ｅｄｓ．Ｐｏｗｅｌｌ＆Ｎｅｗｍａｎ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９９５）；米国特許第５，０５７，５４０号参照）、（Ａｑｕｉｌａ ＢｉｏＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ）。その他のアジュバントは、水中油型乳剤（スクアレンまたはピーナッツ油など）、任意には、モノホスホリル脂質Ａ（Ｓｔｏｕｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３６，８６−９１（１９９７）参照）、プルロニックポリマー、および死菌マイコバクテリアなどの免疫刺激剤と組み合わせる。別のアジュバントはＣｐＧ（ＷＯ９８／４０１００）である。あるいは、α−ＳＮまたはＡβを結合させてアジュバントとすることも可能である。しかし、このような結合によって、α−ＳＮの立体構造が実質的に変わって、それに対する免疫反応の性質に影響が出るようであってはならない。アジュバントは、治療用組成物の一成分として有効成分ともに投与することができ、または、治療薬投与とは別個に、その前に、それと同時に、またはその後に投与することもできる。
好適なアジュバントの種類は、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムなどのアルミニウム塩（ミョウバン）である。このようなアジュバントは、ＭＰＬ、または３−ＤＭＰ、ＱＳ−２１、ポリグルタミン酸またはポリリジンのようなポリマーまたはモノマーのアミノ酸など、他の特定の免疫刺激剤とともに、またはそれら無しで使用することができる。別の種類のアジュバントは水中油型乳剤の処方剤である。このようなアジュバントは、ムラミルペプチド（例えば、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）、Ｎ−アセチルグルサミル−Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−Ａｌ−Ｄ−イソｇｌｕ−Ｌ−Ａｌａ−ジパルミトキシプロルアミド（ＤＴＰ−ＤＰＰ）商標ｔｈｅｒａｍｉｄｅ）、またはその他の細菌細胞壁成分など、特定の免疫刺激剤とともに、またはそれら無しで使用することができる。水中油型乳剤には、以下のものなどがある：（ａ）ＭＦ５９（ＷＯ９０／１４８３７）：５％スクアレン、０．５％ Ｔｗｅｅｎ ８０、および０．５％ Ｓｐａｎ ８５を含み（任意には、さまざまな量のＭＴＰ−ＰＥを含み）、モデル１１０Ｙマイクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，Ｎｅｗｔｏｎ ＭＡ）などのマイクロフルイダイザーを用いて１ミクロン未満の粒子に製剤されている（ｂ）ＳＡＦ：１０％スクアレン、０．４％ Ｔｗｅｅｎ ８０、５％プルロニックブロック共重合体Ｌ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰを含み、マイクロフルイダイズされて１ミクロン未満の乳剤になっているか、ボルテックス撹拌されて大きな粒子サイズの乳剤になっている、および（ｃ）商標Ｒｉｂｉアジュバント系（ＲＡＳ）、（Ｒｉｂｉ ＩｍｍｕｎｏＣｈｅｍ， Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＭＴ）：２％スクアレン、０．２％ Ｔｗｅｅｎ ８０、および、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）、トレハロースジマイコレート（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）からなるグループからの１つ以上の細菌細胞壁成分、好ましくはＭＰＬ＋ＣＷＳ（商標Ｄｅｔｏｘ）を含む。
別の種類の好適なアジュバントは、商標Ｓｔｉｍｕｌｏｎ（ＱＳ−２１、Ａｑｕｉｌａ，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ）、またはそれから作製された粒子、例えばＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体）およびＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸなどのサポニンアジュバントである。その他のアジュバントは、ＲＣ−５２９、ＧＭ−ＣＳＦ、およびフロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）、およびフロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）などである。その他のアジュバントは、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＬ１３、およびＩＬ−１５）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）などのサイトカインなどである。別の種類のアジュバントは、それぞれの糖残基がアミノ酸によって置換されている、Ｎ−グリコシルアミド、Ｎ−グリコシルウレア、およびＮ−グルコシルカルバメートなど、免疫調節剤またはアジュバントとしての糖脂質アナログである（米国特許第４，８５５，２８３号参照）。熱ショックタンパク質、例えばＨＳＰ７０およびＨＳＰ９０もアジュバントとして使用できる。
アジュバントは、単一の組成物として免疫原とともに投与することができ、または、免疫原の投与の前、それと同時、またはその後に投与することもできる。免疫原およびアジュバントは、同一のバイアルに詰めて供給することも、別のバイアルに詰めて、使用前に混合することもできる。免疫原およびアジュバントは、典型的には、対象とする用途を表示したラベルとともに包装されている。免疫原およびアジュバントを別々に包装する場合、典型的には、パッケージに、使用前の混合に関する指示書を入れる。アジュバントおよび／または担体の選択は、アジュバントを含む免疫原性処方剤の安定性、投与経路、投薬スケジュール、ワクチン接種される生物種に対するアジュバントの有効性などによって決められ、また、ヒトでは、医薬上許容されるアジュバントは、該当する規制機関によって、ヒトへの投与を認められているか、認められうるものである。例えば、フロイント完全アジュバントはヒトへの投与には適さない。ミョウバン、ＭＰＬ、およびＱＳ−２１が好適である。任意には、２種類以上の異なったアジュバントを同時に使用することができる。好適な組み合わせは、ミョウバンとＭＰＬ、ミョウバンとＱＳ−２１、ＭＰＬとＱＳ−２１、ＭＰＬまたはＲＣ−５２９とＧＭ−ＣＳＦ、およびミョウバン、ＱＳ−２１、およびＭＰＬを併用するものである。また、フロイント不完全アジュバントを使用することができ（Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ３２，１７３−１８６（１９９８））、任意には、ミョウバン、ＱＳ−２１、およびＭＰＬ、ならびにこれら全部を併用したものと組み合わせて使用することができる。
本発明の薬剤は、有効治療剤、すなわち、さまざまな別の医薬上許容される成分を含む医薬組成物としてしばしば投与される。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ（１５ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ、１９８０）参照。このように、任意の薬剤（例えば、α−シヌクレインの断片、またはα−シヌクレインに特異的に結合する抗体）を、シヌクレイン病を治療するための薬物の製造で使用することができる。好適な形状は、意図した投与方法および治療用途によって変わる。また、組成物には、所望の処方に応じて、医薬上許容される非毒性の担体または希釈剤、すなわち、動物またはヒトに投与するための医薬組成物を処方するために一般的に使用される賦形剤と定義されているものが含まれる。希釈剤は、組み合わせるものの生物活性に影響を与えないように選択する。このような希釈剤の例は、蒸留水、生理学的リン酸緩衝食塩水、リンガー液、デキストロース溶液、およびハンクス液などである。また、医薬組成物または処方剤も、その他の担体、アジュバント、または非毒性、非治療用、非免疫原性の安定剤などを含むことができる。
また、医薬組成物は、タンパク質、キトサン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、およびコポリマー（例えば、ラテックス機能化セファロース（商標）、アガロース、セルロースなど）などの多糖類、ポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマー、および脂質凝集体（例えば、油摘またはリポソーム）のように大きくゆっくりと代謝される高分子を含むことも可能である。さらに、これらの担体は、免疫刺激薬剤（すなわちアジュバント）として機能することが可能である。
非経口投与では、本発明の薬剤を、生理学的に許容される希釈剤に入れた物質の溶液または懸濁液の注入可能な調剤として、水油、食塩水、グリセロール、またはエタノールなどの滅菌液でもよい、医薬上許容されうる担体とともに投与することができる。さらに、湿潤剤、乳化剤、界面活性剤、ｐＨ緩衝物質などの補助物質を組成物に入れることができる。医薬組成物のその他の成分は、石油由来、動物由来、植物由来、または合成由来の、例えばピーナッツ油、大豆油、およびミネラルオイルなどである。一般的に、プロピレングリコール、またはポリエチレングリコールなどのグリコール類が、特に注射用溶液にとって好適な液体担体である。抗体は、有効成分の徐放を可能にするよう処方することができるデポー注入またはインプラント製剤の形態で投与することができる。典型的な組成物は、５０ｍＭのＬ−ヒスチジン、１５０ｍＭのＮａＣｌを含む水性緩衝液をＨＣｌでｐＨ６．０に調整したものの中に処方された５ｍｇ／ｍＬのモノクローナル抗体を含む。非経口投与用組成物は、典型的には、実質的に滅菌されており、実質的には等張であり、ＦＤＡまたは同様の組織のＧＭＰ条件下で製造される。例えば、生物剤を含む組成物は、典型的には、濾過滅菌によって滅菌する。組成物は、１回用量に処方することができる。
典型的には、組成物は、液体溶液または懸濁液である注入液として調製されるが、注入前に液体媒体で溶液または懸濁液にするのに適した固形として調製することもできる。また、この調製物は、上記したように、ポリラクチド、ポリグリコリド、またはアジュバントの効果を高めるためのコポリマーなどのリポソームまたは微小粒子に乳化またはカプセル封入することもできる（Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９，１５２７（１９９０）、およびＨａｎｅｓ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２８，９７−１１９（１９９７）参照）。本発明の薬剤は、有効成分の徐放またはパルス放出を可能にする方法で処方することができるデポー注射またはインプラント製剤の形態にして投与することもできる。組成物は、単位投薬形態に処方することができる（すなわち、処方剤が、１人の患者に１回用量として十分な有効成分を含む）。
別の投与方法に適したさらに別の処方剤は、経口用、経鼻用、および肺用の処方剤、坐薬、および経皮適用剤などである。
坐薬では、結合剤および担体は、例えば、ポリアルキレングリコールまたはトリグリセリドなどであり、このような坐薬は、有効成分を０．５％から１０％、好ましくは１％から２％の範囲で含む混合液から形成することができる。経口用処方剤は、医薬品等級のマンニトール、ラクトース、スターチ、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、および炭酸マグネシウムなどの賦形剤を含む。これらの組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸薬、カプセル、徐放製剤、または粉末の形態を取り、１０％〜９５％、好ましくは２５％〜７０％の有効成分を含む。
経皮または皮内の送達によって局所適用をもたらすことができる。薬剤を、コレラ毒素、またはその解毒した誘導体またはサブユニット、またはその他の同様の細菌毒素と共投与することによって、局所投与を促進することができる。（Ｇｌｅｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３９１，８５１（１９９８）参照）。共投与は、この成分を、化学的架橋、または融合タンパク質として発現させることによって得られる混合液として、または架橋された分子として使用することによって行うことができる。
あるいは、皮膚経路を利用して、またはトランスフェロソーム（ｔｒａｎｓｆｅｒｏｓｏｍｅ）を利用して経皮送達を行うことができる（Ｐａｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２５，３５２１−２４（１９９５）；Ｃｅｖｃ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １３６８，２０１−１５（１９９８））。
ＶＩＩＩ．モニター法および診断法
本発明は、ＬＢＤに罹患しているか、それに感受性の患者の体内でα−ＳＮペプチドおよび／またはＡβペプチドに対する免疫反応を検出する方法を提供する。この方法は、患者に施されている治療過程をモニターするのに特に役立つ。この方法を用いて、症状のある患者に対する治療処置と、無症状の患者に対する予防処置をモニターすることができる。この方法は、能動免疫（例えば、免疫原の投与に対する抗体産生）および受動免疫（例えば、投与された抗体量の測定）をモニターするのに役立つ。
１．能動免疫
いくつかの方法では、１用量の薬剤を投与する前に患者の免疫反応のベースライン値を決定し、これを、治療後の免疫反応の値と比較する必要がある。免疫反応の値の有意な増加（すなわち、測定値の平均値からの標準偏差として表される、同一サンプルの反復測定値における実験誤差の一般的な限界よりも大きくなること）は、陽性の治療成果（すなわち、薬剤投与が免疫反応をもたらしたか、それを強化したこと）を表す。免疫反応に対する値が有意に変化しない場合、または減少した場合は、陰性の治療成果を示す。一般的に、免疫原性薬剤によって最初の治療コースを受けている患者は、連続投薬によって免疫反応の上昇を示し、最終的に定常状態になると期待される。免疫反応が上昇している間は、一般的に薬剤投与を継続する。定常状態に達したことが、施された治療を終らせるか、用量または頻度を減少させうることを示す指標となる。
別の方法では、対照集団について免疫反応の対照値（すなわち、平均および標準偏差）を決定する。典型的には、対照集団の中の個体は予め治療を受けていない。そして、治療薬を投与した後の患者における免疫反応の測定値を対照値と比較する。対照値に対して有意に増加していれば（例えば、平均値からの１標準偏差よりも大きくなれば）、陽性の治療成果が示される。有意な増加がないか、減少すれば、陰性の治療成果が示される。免疫反応が対照値と比較して増加している間は、一般的に、薬剤の投与を継続する。従来通り、対照値と比較して定常に達したことが、施された治療を終らせるか、用量または頻度を減少させうることを示す指標となる。
別の方法では、治療薬による治療を受けて、治療に対する免疫反応が定常状態に達した個体からなる対照集団から、免疫反応の対照値（すなわち、平均および標準偏差）を決定する。患者の免疫反応の測定値を対照値と比較する。患者で測定された量が、対照値と有意な差がない（例えば、１標準偏差を超えない）場合は、治療を中止することができる。患者における量が対照値よりも有意に低い場合には、当然、薬剤投与を継続する。患者における量が対照値よりも低い状態が続く場合には、投薬計画の変更、例えば、異なるアジュバントを使用するよう指示することができる。
別の方法では、現在は治療を受けていないが、以前治療コースを受けたことがある患者を、治療の再開が必要か否かを判定するため、免疫反応についてモニターする。患者における免疫反応の測定値を、以前の治療コースを終った後に患者の体内で以前達成された免疫反応の値と比較することができる。以前の測定値よりも有意に減少すること（すなわち、同一サンプルの反復測定値における誤差の一般的な限界よりも大きくなること）が、治療を再開できる指標となる。あるいは、患者で測定された値を、治療コースを受けた後の患者の集団で測定した対照値（平均＋標準偏差）と比較することができる。あるいは、患者で測定された値を、症状を示さない状態にある、予防的に治療された患者の集団、または、疾病特性の改善を示す、治療処置を受けた患者の集団で測定された対照値（平均＋標準偏差）と比較することができる。これら全ての場合に、対照量に対する有意に減少すること（すなわち、１標準偏差よりも大きいこと）が、患者の治療を再開すべきことの指標となる。
解析のための組織サンプルは、典型的には、患者の血液、血漿、血清、粘膜、または脳脊髄液である。サンプルは、任意の形態のα−ＳＮ、典型的にはＮＡＣまたはＡβに対する免疫反応の指標について解析される。免疫反応は、例えば、α−ＳＮまたはＡβに特異的に結合する抗体またはＴ細胞の存在から測定することができる。α−ＳＮに特異的な抗体を検出するＥＬＩＳＡ法が、実施例の節に記載されている。反応性Ｔ細胞を検出する方法は上記した（「定義」の項参照）。いくつかの方法では、上記第ＩＩＩ節に記載したような除去アッセイ法を用いて免疫反応を測定する。このような方法では、被験患者の組織または血液のサンプルを（例えば、シヌクレイン／ｈＡＰＰトランスジェニックマウスからの）ＬＢ、およびＦｃレセプターをもつ食細胞と接触させる。その後ＬＢの除去をモニターする。除去反応の存在および程度が、被験患者の組織サンプルにおいてα−ＳＮを除去するのに効果的な抗体の存在と量を示すことになる。
２．受動免疫
一般的に、受動免疫をモニターする方法は、上記した能動免疫をモニターする方法と同じである。しかし、受動免疫後の抗体プロフィールは、典型的には、抗体濃度が早期にピークに達した後、指数関数的減衰を示す。さらに投薬をしなければ、この減衰は、投与された抗体の半減期に応じて、何日間から何ヶ月間という期間内に治療前のレベルにまで近づく。例えば、いくつかのヒト抗体の半減期は約２０日間である。
いくつかの方法では、患者のα−ＳＮに対する抗体のベースラインの測定を、投与前に行ない、２回目の測定を投与のすぐ後に行って抗体量のピークを決定し、さらにもう１回以上間隔をおいて測定を行って抗体量の減衰をモニターする。抗体の量が減少してベースラインまで下がるか、またはベースラインを差し引いてピークが所定の割合（例えば、５０％、２５％、または１０％）になったとき、追加的な抗体投与が行われる。いくつかの方法では、バックグラウンドを差し引いたピークまたはその後の測定値を、以前別の患者で有益な予防または治療用の投薬計画を構成すると判定された基準量と比較する。測定された抗体量が、基準値よりも有意に低い（例えば、治療の利益を受ける患者の集団における基準値の平均から１標準偏差を引いたものよりも少ない）場合には、追加的な抗体投与を行うことが指示される。
３．診断キット
さらに、本発明は、上記した診断法を行うための診断用キットを提供する。典型的には、そのようなキットは、α−ＳＮに対する抗体に特異的に結合する薬剤を含む。また、このキットは標識も含む。α−ＳＮに対する抗体を検出するため、この標識は、典型的には標識された抗イディオタイプ抗体の形になっている。抗体を検出するために、薬剤を予め、マイクロタイター皿のウエルのような固相に結合させて供給することもできる。また、キットは、典型的には、そのキットを使用するための指示を記載したラベルも含む。また、このラベルは、測定された標識の量を、α−ＳＮに対する抗体の量と対応させるチャートまたはその他の通信用レジュメも含むことができる。ラベルという用語は、キットの製造、輸送、販売、または使用の過程における任意の時に、キットに付属または添付された任意の書類または記録を意味する。例えば、ラベルという用語は、宣伝用のチラシおよびパンフレット、包装材料、説明書、オーディオカセットまたはビデオカセット、コンピュータディスク、およびキット上に直接印刷された印刷を含む。
また、本発明は、インビボでの画像化を行う診断用キットも提供する。このようなキットは、典型的には、α−ＳＮのエピトープ、好ましくはＮＡＣ内にあるエピトープに結合する抗体を含む。好ましくは、抗体は標識されているか、二次標識用試薬がキットに含まれている。好ましくは、キットは、インビボ画像化アッセイを行うための説明書をラベル付されている。
ＩＸ．インビボにおける画像化
本発明は、患者のＬＢをインビボで画像化する方法を提供する。このような方法は、ＰＤ、または、脳内にＬＢが存在することに関連するその他の疾患、またはそれらへの感受性を診断または確認するのに役立つ。例えば、この方法は、認知症の症状を呈する患者に使用することができる。患者がＬＢを持っていれば、その患者は、例えばＰＤに罹患している可能性が高い。また、この方法を無症状の患者に使用することもできる。異常なアミロイド沈着が存在することは、将来、症候性疾患に罹りやすいことを示唆する。また、この方法は、以前パーキンソン病と診断された患者における病気の進行および／または治療への反応をモニターするのにも役立つ。
この方法は、患者の体内でα−ＳＮに結合する抗体などの試薬を投与した後、それが結合してから薬剤を検出することで機能する。好適な抗体は、患者の体内で、完全長のＮＡＣＰポリペプチドに結合することなく、α−ＳＮ沈着物に結合する。ＮＡＣの中でα−ＳＮのエピトープに結合する抗体が特に好適である。所望であれば、Ｆａｂのような完全長の定常領域を持たない抗体断片を使用することによって除去反応を回避することができる。いくつかの方法では、同一の抗体が、治療用の試薬にも診断用の試薬にもなる。一般的には、α−ＳＮのＮ末端のエピトープに結合する抗体は、Ｃ末端のエピトープに結合する抗体ほど強いシグナルを示さない。これは、おそらく、ＬＢではＮ末端エピトープには接触しにくいからである（Ｓｐｉｌｌａｎｔｉｎｉ ｅｔ ａｌ ＰＮＡＳ，１９９８）。したがって、このような抗体はあまり好適ではない。
診断用試薬は、患者の体内に静脈注射するか、あるいは、頭蓋内接種によって、または頭蓋骨を通る穴をドリルで開けて直接脳内に投与することができる。試薬の用量は、治療法と同じ範囲内でなければならない。典型的には、試薬は標識されているが、方法によっては、α−ＳＮに対してアフィニティーをもつ一次試薬は標識されておらず、二次標識剤を用いて一次試薬に結合させる。標識の選択は検出方法に応じる。例えば、光学的検出法には蛍光標識が適している。外科的介入なしにトモグラフィー検出する場合には常磁性標識の使用が適している。また、放射性標識も、ＰＥＴまたはＳＰＥＣＴを用いて検出することができる。
標識された遺伝子座の個数、サイズ、および／または強度を、対応するベースライン値と比較して診断を行う。ベースライン値は、病気に罹っていない個体の集団における平均量に相当するものであってもよい。また、ベースライン値は、同じ患者の以前に測定された量に相当するものであってもよい。例えば、ベースライン値は、治療を開始する前の患者について決定することができ、その後に測定した値をベースライン値と比較することもできる。ベースラインよりも値が少ないと、治療に対して陽性の反応を示すことになる。
（実施例Ｉ．ヒトα−でヒトα−シヌクレインのトランスジェニックマウスを免疫すると、血液脳関門を通過する高力価の抗α−シヌクレイン抗体が産生される結果となる）
全長の組換えヒトα−ＳＮを１×リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に１ｍｇ／ｍｌの濃度で再懸濁した。各回注射に、５０μｌのα−ＳＮを用い、１５０μｌの１×ＰＢＳを加えて１回の注射につき５０μｇの最終濃度とした。次に、フロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）をα−ＳＮまたはＰＢＳのみ（対照）のいずれかに１：１の割合で加え、撹拌および超音波処理してエマルジョンを完全に懸濁した。初回の注射には、８匹のＤ系列（Ｄ ｌｉｎｅ）ヒトα−ＳＮトランスジェニック（ｔｇ）で単一トランスジェニックの４〜７月齢マウス（Ｍａｓｌｉａｈ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８７：１２６５−１２６９（２０００））に、ＣＦＡに入れたヒトα−ＳＮの注射を受けさせ、また、対照として、４匹のＤ系列ヒトα−ＳＮ ｔｇマウスにＣＦＡに入れたＰＢＳの注射を受けさせた。マウスは、全部で６回の注射を受けた。３回の注射を２週間の間隔で行ってから、３回の注射を１ヶ月の間隔で行った。実験を開始してから５ヶ月後に、動物の人道的取り扱いのためのＮＩＨガイドラインを用いて、動物を殺した。抗体力価を測定するために血液サンプルを集めた後、脳を、ＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒドで４日間浸漬固定した。ＥＬＩＳＡによるヒトα−ＳＮに対する抗体の量を表１に示す。処理したマウスを力価によって２つのグループに分ける。第１のグループは、２〜８，０００という中程度の力価を生じさせた。第２のグループは、１２０００〜３００００という高力価を生じさせた。対照マウスでは力価は全く生じなかった。神経病理学的解析によって、高力価を生じたマウスでは、シヌクレイン封入体のサイズが顕著に減少したことが示された。中力価が生じたマウスは、減少の程度が小さいことを示した。図２（パネルａ〜ｄ）は、（ａ）非トランスジェニックマウス、（ｂ）ＣＦＡ単独で処理されたトランスジェニックマウス、（ｃ）α−シヌクレインおよびＣＦＡで免疫されたトランスジェニックマウスで中力価を生じたマウス、および（ｄ）α−シヌクレインおよびＣＦＡで免疫されたトランスジェニックマウスで高力価を生じたマウスにおけるシヌクレイン封入体を示している。サンプルを抗ヒトα−ＳＮ抗体で免疫染色して可視化した。図２は、パネル（ｂ）ではシヌクレイン封入体を示すが、パネル（ａ）では示さない。パネル（ｃ）の処理マウス、中力価では、封入体は幾分強度が低下している。パネル（ｄ）では、封入体の強度が顕著に低下している。パネル（ｅ）〜（ｈ）は、それぞれパネル（ａ）〜（ｄ）と同じ４匹のマウスの脳における抗ＩｇＧの量を示す。ＩｇＧはパネル（ｇ）に存在し、パネル（ｈ）ではより広く存在しているのが見られる。これらのデータは、末梢血から投与されたα−ＳＮに対する抗体が血液脳関門を通過して、脳に到達することを示している。パネル（ｉ）から（ｌ）は、星状グリア細胞のマーカーであるＧＡＰに対する染色を示すが、これらも、図の最初の２つの横列と同じように同じ４匹のマウスに関するものである。パネル（ｋ）および（ｌ）が、（ｉ）および（ｊ）と比較すると僅かに多い染色を示している。これらのデータは、シヌクレイン沈着物の除去が、軽度の星状グリア細胞反応および小グリア細胞反応を伴うことを示している。
Figure 0005211290
 （実施例ＩＩ．シヌクレイン封入体を除去する抗体のインビトロでのスクリーニング）
ＧＴ１−７神経細胞（Ｈｓｕｅ ｅｔ ａｌ．Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５７：４０１−４１０（２０００））を、マウスα−ＳＮを発現するｐＣＲ３．１−Ｔ発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）で形質転換し、発現ベクターだけで形質転換された細胞と比較した（図３、それぞれパネルＢおよびＡ）。ベクターだけで形質転換された細胞（パネルＡ）は線維芽細胞の外観を呈するが、α−ＳＮで形質転換された細胞は丸く、細胞表面に光学顕微鏡によっても共焦点走査型顕微鏡によっても可視化できる封入体を有する。次に、形質転換細胞をウサギ免疫前血清（パネルＣ）、または、マウスα−ＳＮのＣ末端側１３１〜１４０に対するアフィニティー精製ウサギポリクローナル抗体である６７−１０（Ｉｗａｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ １４：４６７（１９９５））（パネルＤ）で処理した。封入体の染色がパネルＣよりもパネルＤが弱くなっていることが分かり、α−シヌクレインに対する抗体が、封入体を除去またはその成長を阻害するのに有効であることを示している。図４は、ウサギ免疫前血清および６７−１０ポリクローナル抗体で処理したＧＴ１−７形質転換細胞の顆粒画分とサイトゾル画分のゲル解析の結果を示す。サイトゾル画分におけるシヌクレイン量は、免疫前血清またはα−ＳＮに対する抗体によって処理してもほとんど変化しないことが分かる。しかし、α−ＳＮに対する抗体で処理したＧＴ１−７細胞の膜画分ではα−ＳＮのバンドが消失している。これらのデータは、α−シヌクレイン抗体の活性が、細胞膜に結合したシヌクレインの除去をもたらすことを示している。
形質転換されたＧＴ１−７細胞を用いて、図３におけるような免疫組織化学法的解析、光学顕微鏡によるか、または、図４におけるようなゲル解析による検出により、シヌクレイン封入体を除去する活性について抗体をスクリーニングすることができる。
（実施例ＩＩＩ．α−シヌクレインによる免疫の予防的および治療的な効果）
ｉ．ヒトα−シヌクレインｔｇマウスの免疫
この研究のために、ヘテロ接合型ヒトα−ＳＮトランスジェニック（ｔｇ）マウス（系列Ｄ）（Ｍａｓｌｉａｈ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８６：１２６５−６９）、および非トランスジェニック（ｎｏｎｔｇ）対照を用いた。実験動物を３つのグループに分ける。グループＩでは、２ヶ月の月齢で開始して８ヶ月間マウスを免疫することによる早期免疫の予防効果を調べる。グループＩＩでは、若い成獣マウスに６ヶ月の月齢で開始して８ヶ月間ワクチンを接種し、免疫によって、一旦軽度の病変が成立したところで病気の進行を抑制することができるか否かを判定する。グループＩＩＩでは、高齢マウスに１２ヶ月の月齢で開始して４ヶ月間免疫し、免疫によって、一旦強固な病変が確立したところで症状の重度を低下させることができるか否かを判定する。すべてのグループについて、マウスを、組換えヒトα−ＳＮおよびＣＦＡ、またはＣＦＡ単独で免疫し、各実験につき、２０匹のｔｇマウスおよび１０匹のｎｏｎｔｇマウスを使用する。これらのうち、１０匹のｔｇマウスをヒトα−ＳＮ＋ＣＦＡで免疫し、残りの１０匹のｔｇマウスをＣＦＡ単独で免疫する。同様に、５匹のｎｏｎｔｇマウスをヒトα−ＳＮ＋ＣＦＡで免疫し、残りの５匹のｔｇマウスをＣＦＡ単独で免疫する。要すれば、免疫用のプロトコールは、ＣＦＡ中の精製された組換えヒトα−ＳＮ（２ｍｇ／ｍｌ）による初回注射、その１ヶ月後に、ＩＦＡと混合したヒトα−ＳＮによる注射とからなる。次に、１ヶ月に１回マウスにこの混合液を再注射する。ヒトα−ＳＮｔｇの小集団（各ｎ＝３；６月齢）マウスおよびｎｏｎｔｇの小集団（各ｎ＝３；６月齢）マウスにおいて、マウス（ｍ）α−ＳＮ、ヒトβシヌクレイン、または変異型（Ａ５３Ｔ）ヒトα−ＳＮによる免疫からなる更なる実験を行う。
α−ＳＮ抗体の量は、各ウエル当り０．４μｇの精製全長α−ＳＮでコートされた９６ウエルのマイクロタイタープレートを用いて、炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ９．６の中、４℃で一晩インキュベートして測定する。０．１％ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）を含むＰＢＳ２００μｇずつで４回ウエルを洗浄してから、ＰＢＳ−１％ＢＳＡ中３７℃で１時間ブロックする。血清サンプルを「インウエル（ｉｎ−ｗｅｌｌ）」で１：３の割合で連続希釈するが、横列Ａより開始し、１：１５０から１：３２８，０５０までの範囲に及ぶ。対照実験としては、マウスモノクローナル抗体のサンプルを、α−ＳＮ、タンパク質なし、および緩衝液だけのブランクに対して実験を行う。サンプルは、４℃で一晩インキュベートし、その後、ヤギ抗マウスＩｇＧアルカリホスファターゼ結合抗体（１：７５００、Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）とともに２時間インキュベートする。そして、登録商標Ａｔｔｏ−ｐｈｏｓアルカリホスファターゼ蛍光基質を加えて室温に３０分間置く。励起波長４５０ｎｍおよび発光波長５５０ｎｍでプレートを読み取る。相対的蛍光単位を縦軸上にとり、血清の希釈度を横軸にとって、結果を片対数グラフにプロットする。最大の抗体結合から５０％低下した希釈度を抗体力価と定義する。
各グループ毎に、処理が終ったところで、マウスに、既述したように（Ｍａｓｌｉａｈ，ｅｔ ａｌ．（２０００））ロータロッドでの運動評価を受けさせる。解析後、マウスを安楽死させて、下で述べるような詳細な神経化学的および神経病理学的な解析を行うために脳を取り出す。要すれば、凝集または非凝集のヒトα−ＳＮの免疫活性をウエスタンブロットで測定するために右半脳を凍結してホモジナイズする（Ｍａｓｌｉａｈ，ｅｔ ａｌ．（２０００））。左半脳は４％パラホルムアルデヒドで固定し、免疫細胞化学的および超微細構造的な解析を行うためにビブラトームで連続切片を作製する。
ｉｉ．免疫細胞化学および神経病理学的な解析
免疫が低下するか否かを判定するために、ヒトα−ＳＮ凝集切片を、ヒトα−ＳＮに対するウサギポリクローナル抗体（１：５００）で免疫染色する。４℃で一晩インキュベートした後、切片をビオチン化抗ウサギ二次抗体とともに、その後アビジンＤ−ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）複合体（１：２００、ＡＢＣ Ｅｌｉｔｅ，Ｖｅｃｔｏｒ）とともにインキュベートする。切片を、ビオチン化抗ウサギ、マウス、またはヒトの二次抗体単独でも免疫染色する。抗マウス二次抗体での実験で、ヒトα−ＳＮに対する抗体が脳に通過して行くか否かを判定する。この反応を、０．００１％Ｈ２Ｏ２を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）中０．１％の３，３，−ジアミノベンジジンテトラハイドロクロライド（ＤＡＢ）によって可視化し、その後、切片をエンテラン（Ｅｎｔｅｌｌａｎ）下でスライド上に装着する。免疫反応の大きさを、Ｑｕａｎｔｉｍｅｔ５７０Ｃを用いて光密度測定にて半定量的に評価する。これらの切片も画像解析によって調べて、α−ＳＮ免疫活性封入体の数を測定すると、この信頼性のあるα−ＳＮ凝集測定値は、ワクチン接種による抗凝集効果を示す有益な指標となる（Ｍａｓｌｉａｈ，ｅｔ ａｌ．（２０００））。
シナプトフィジンおよび微小管結合タンパク質２（ＭＡＰ２）に対し二重免疫標識し、ＬＳＣＭで可視化したビブラトーム切片を利用して、海馬、前頭皮質、側頭皮質、および大脳基底核におけるシナプス密度および樹状細胞密度を解析することによって神経変性のパターンの解析を行う。既述したように（Ｍａｓｌｉａｈ，ｅｔ ａｌ．（２０００））、尾状核被殻および黒質（ＳＮ）におけるチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）免疫活性を測定することによって神経変性の付加的な解析を行う。切片をＬＳＣＭで画像化し、直線範囲内で画素強度を表示するＴＨ−免疫活性ターミナルが含まれるよう、各個別の画像を相互作用的に閾値化する。スケールは、画素対μｍの比率を決めるよう設定する。そして、この情報を用いて、ＴＨ−免疫活性ターミナルによってカバーされる神経網の面積割合（％）を計算する。また、これら同一の切片を利用して、ＳＮにおけるＴＨニューロンの数を見積もる。
免疫に対する免疫反応のパターンを測定するために、ｎｏｎｔｇマウス、および組換えヒトα−ＳＮおよび対照用免疫原で免疫されたα−ＳＮｔｇマウスの脳切片の中で、ヒトのＧＦＡＰ、ＭＣＨクラスＩＩ、Ｍａｃ１、ＴＮＦ−α、ＩＬ１β、およびＩＬ６に対する抗体による免疫細胞化学的および超微細構造的な解析を行う。
ｉｉｉ．行動解析
自発運動を見るため、既述したように（Ｍａｓｌｉａｈ，ｅｔ ａｌ．（２０００））、ロータロッド（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）の中で２日間マウスを解析する。第１日目、マウスに５回試験を行う：最初の１回は１０ｒｐｍで、２回目は２０ｒｐｍで、３〜５回目は４０ｒｐｍにする。２日目には、それぞれ４０ｒｐｍでマウスを７回試験する。マウスを一匹ずつ円筒の上に置き、回転速度を０から４０ｒｐｍまで２４０秒かけて増加させる。ロッド上にマウスが居続ける時間（落下反応時間）を記録して運動機能の測定に用いる。
（実施例ＩＶ．α−シヌクレイン断片による免疫）
１０〜１３月齢のヒトα−ＳＮトランスジェニックマウスをα−ＳＮの９つの異なった領域で免疫して、どのエピトープが有効な反応をもたらすかを判定する。９つの異なった免疫原と１つの対照に、上記した通りに腹腔内注射する。免疫原は、そのすべてがシスチン結合を介してヒツジ抗マウスＩｇＧに結合している４つのヒトα−ＳＮペプチド結合体を含む。α−ＳＮおよびＰＢＳをそれぞれ陽性対照および陰性対照に用いた。上記したように力価をモニターし、注射を行う３〜１２ヶ月が終ったところでマウスを安楽死させる。死後、組織化学的解析、α−ＳＮ量、および毒物学的解析の測定を行う。
ｉ．免疫原の調製
結合α−ＳＮペプチドの調製：架橋試薬のスルホ−ＥＭＣＳを用い、α−ＳＮペプチドに人為的に付加されたシステインを介して結合させることによりＨα−ＳＮペプチド結合体を調製する。α−ＳＮペプチド誘導体は、以下の最終アミノ酸配列を用いて合成する。各場合について、挿入されたシステイン残基の位置が下線で示してある。
α−シヌクレイン６０〜７２（ＮＡＣ領域）ペプチド：
Figure 0005211290
 α−シヌクレイン７３〜８４（ＮＡＣ領域）ペプチド：
Figure 0005211290
 α−シヌクレイン１０２〜１１２ペプチド：
ＮＨ２−Ｃ−アミノ−ヘプタン酸−ＫＮＥＥＧＡＰＣＱＥＧ−ＣＯＯＨ（配列番号５６）
α−シヌクレイン１２８〜１４０ペプチド：
Figure 0005211290
 カップリング反応に備えて、１０ｍｇのヒツジ抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を１０ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ８．５で一晩透析する。そして、透析された抗体を、Ａｍｉｃｏｎ Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐチューブを用いて２ｍｌの容積に濃縮する。１０ｍｇのスルホ−ＥＭＣＳ［Ｎ（６−マレイミドカプロイルオキシ）スクシンイミド］（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏ．）を１ｍＬの脱イオン水に溶解させる。４０倍モル過剰のスルホ−ＥＭＣＳを一滴ずつ撹拌しながらヒツジ抗マウスＩｇＧに加えてから、溶液をさらに１０分間撹拌する。活性化されたヒツジ抗マウスＩｇＧを精製し、０．１Ｍ ＮａＰＯ４、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ６．５で平衡した１０ｍＬゲル濾過カラム（Ｐｉｅｒｃｅ Ｐｒｅｓｔｏ Ｃｏｌｕｍｎ、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社から入手する）を通過させて緩衝液を交換する。２８０ｎｍの吸光度で確認された抗体を含む画分をまとめ、吸光係数としてＯＤ当り１．４ｍｇを用いてほぼ１ｍｇ／ｍｌの濃度になるまで希釈する。１０ｍｇをまず０．５ｍＬのＤＭＳＯに溶解させてから、１０ｍＭ ＮａＰＯ４で２０ｍＬに希釈したα−ＳＮペプチド以外は、４０倍モル過剰のα−ＳＮペプチドを、２０ｍＬの１０ｍＭ ＮａＰＯ４、ｐＨ８．０に溶解する。このペプチド溶液をそれぞれ、１０ｍＬの活性化ヒツジ抗マウスＩｇＧに加え、室温で４時間振とうする。得られた結合体を、Ａｍｉｃｏｎ Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐチューブを用いて１０ｍＬよりも少ない最終容量に濃縮し、その後、ＰＢＳで透析して、緩衝液を交換し、遊離のペプチドを除去する。滅菌するために結合体を０．２２μｍ孔径のフィルターに通してから、１ｍｇの画分に等分し、−２０℃で凍結貯蔵する。ＢＣＡタンパク質アッセイ法（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を用い、標準曲線用にウマＩｇＧを用いて結合体の濃度を決定する。活性化ヒツジ抗マウスＩｇＧの分子量に対する結合したペプチドの分子量の増加によって結合体を記録する。
（実施例Ｖ．α−シヌクレインに対する抗体による受動免疫）
ヒトα−ＳＮマウスのそれぞれに、ＰＢＳに入った０．５ｍｇの下記に示すような抗α−ＳＮモノクローナル抗体を注射する。すべての抗体調製物は、内毒素量が低下するよう精製する。断片に対するモノクローナル抗体は、α−ＳＮの該断片かそれよりも長い形のものをマウスに注射し、ハイブリドーマを調製して、α−ＳＮの他の非重複断片には結合せず、所望のα−ＳＮ断片に特異的に結合する抗体についてそのハイブリドーマをスクリーニングすることによって調製することができる。
マウスには、必要に応じて４ヶ月の間ｉｐで注射して、ＥＬＩＳＡ力価で測定した循環血中の抗体濃度が、ＥＬＩＳＡによってα−ＳＮまたは他の免疫原に対して決められた１：１０００よりも高い状態を維持する。力価を上記したようにしてモニターし、注射する６ヶ月が終ったところでマウスを安楽死させる。死後、組織化学的解析、α−ＳＮ量、および毒物学的解析の測定を行う。
（実施例ＶＩ．Ｓｙｎ／ＡＰＰトランスジェニックマウスのＡβによる免疫）
この実験では、３種類のトランスジェニックマウス、すなわち、α−シヌクレイン導入遺伝子（ＳＹＮ）をもつトランスジェニックマウス、ＡＰＰ導入遺伝子を有するＡＰＰマウス（Ｇａｍｅｓ ｅｔ ａｌ．）、および単一トランスジェニックを交配して作製する二重トランスジェニックＳＹＮ／ＡＰＰマウスに対するＡβによる免疫の効果を比較する。二重トランスジェニックマウスについては、Ｍｉｓｌｉａｈ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９８：１２２４５−１２２５０（２００１）に記載されている。これらのマウスは、アルツハイマー病とパーキンソン病の両方を有する個体のモデルに相当する。表２は、さまざまなグループ、研究に使用されたマウスの月齢、処理手順、およびＡβに対する抗体の力価を示している。３種類すべてのマウスにおいて顕著な力価が生じたことが分かる。図５は、処理された対象動物の脳切片を顕微鏡検査して測定された、脳におけるＡβのアミロイド斑に覆われた面積の割合（％）を示している。実質的な沈着物がＡＰＰマウスとＳＹＮ／ＡＰＰマウスで蓄積しているが、ＳＹＮマウスまたは非トランスジェニック対照では蓄積していない。沈着物は、ＳＹＮ／ＡＰＰ二重トランスジェニックマウスにおける方が大きい。Ａβ１−４２で免疫すると、ＡＰＰマウスおよびＳＹＮ／ＡＰＰマウスで沈着物が小さくなる。図６は、共焦点レーザー走査顕微鏡および光学顕微鏡によって検出したときのさまざまなマウスグループにおけるシヌクレイン沈着物を示している。シヌクレイン沈着物は、ＣＦＡ単独で処理されたＳＹＮマウスおよびＳＹＮ／ＡＰＰマウスで蓄積する。しかし、Ａβ１−４２およびＣＦＡで処理された同じ種類のマウスでは、シヌクレイン沈着物量の顕著な減少が見られる。これらのデータは、Ａβによる処理が、Ａβ沈着物の除去だけでなく、シヌクレインの沈着物の除去にも有効であることを示している。したがって、Ａβまたはそれに対する抗体による処理は、アルツハイマー病だけでなく、アルツハイマー病とパーキンソン病の複合疾患、およびアルツハイマー病に罹っていない患者のパーキンソン病にも有益である。ＳＹＮ／ＡＰＰマウスにおける抗Ａβ抗体の力価は、シヌクレイン封入体の形成低下と相関があった（ｒ＝０．７１、ｐ＜０．０１）。
Figure 0005211290
 （実施例ＶＩＩ．アミロイド沈着物に対する抗体の活性に関するエクスビボでのスクリーニングアッセイ法）
プラーク除去に対する抗体の効果を調べるために、発明者らは、初代小グリア細胞を、ＰＤＡＰＰマウスまたはヒトＡＤ脳のいずれかの未固定凍結切片とともに培養するエクスビボアッセイ法を確立した。新生仔のＤＢＡ／２Ｎマウス（１〜３日）の大脳皮質から小グリア細胞を得た。皮質を、５０μｇ／ｍｌのＤＮＡｓｅＩ（Ｓｉｇｍａ）を含むＨＢＳＳ−（ハンクス平衡塩類溶液、Ｓｉｇｍａ）の中で機械的に分離した。分離した細胞を１００μｍの細胞ろ過器（Ｆａｌｃｏｎ）で濾過し、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。ペレットを増殖培地（高グルコースＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、２５ｎｇ／ｍｌ ｒｍＧＭ−ＣＳＦ）に再懸濁し、細胞をＴ−７５プラスチック製培養フラスコ当り２個の脳という密度で平板培養した。７〜９日後、フラスコを３７℃で２時間、オービタルシェイカー上にて２００ｒｐｍで回転させた。細胞懸濁液を１０００ｒｐｍで遠心分離して、アッセイ用培地に再懸濁した。
ＰＤＡＰＰマウスまたはヒトＡＤ脳（死亡後３時間経過前のもの）の１０μｍの凍結切片を融解し、ポリリジンコートした円形のカバーガラス上に載せ、２４ウエルの組織培養皿のウエルの中に置いた。カバーガラスを、１％ＦＢＳ、グルタミン、ペニシリン／ストレプトマイシン、および５ｎｇ／ｍｌのｒｍＧＭ−ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ）を含むＨ−ＳＦＭ（ハイブリドーマ用無血清培地、Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）からなるアッセイ用培地で２回洗浄した。対照または抗Ａβ抗体を２倍濃度（最終５μｇ／ｍｌ）で１時間加えた。そして、小グリア細胞を、アッセイ用培地１ｍｌ当り０．８×１０６細胞の密度で播種した。培養を加湿インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内で２４時間以上継続した。インキュベーションを終ったところで、培養物を４％パラホルムアルデヒドで固定し、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００で透過処理した。切片をビオチン化３Ｄ６で染色した後、ストレプトアビジン／Ｃｙ３結合体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）で染色した。外来性小グリア細胞を核染色（ＤＡＰＩ）で可視化した。培養物を倒立蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ、ＴＥ３００）で観察して、ＳＰＯＴデジタルカメラでＳＰＯＴソフトウエア（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて顕微鏡写真を撮った。ウエスタンブロット解析には、培養物を８Ｍ尿素で抽出し、還元トリシンサンプルバッファーで１：１に希釈して、１６％トリシンゲル（Ｎｏｖｅｘ）上にロードした。イモビロン上に転移させた後、ブロットを５μｇ／ｍｌのｐａｂＡβ２に暴露し、続いてＨＲＰ−結合抗マウス抗体に暴露して、ＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で発色させた。
ＮＡＣに対する抗体の存在下でＰＤＡＰＰ脳切片を用いたアッセイを行ったところ、抗体の除去活性の指標となるプラークの数と大きさの顕著な減少が見られた。ＮＡＣに対する抗体を、上記したように、アミロイド斑と小グリア細胞を含む脳組織サンプルに接触させた。ウサギ血清を対照として用いた。
同じアッセイを、Ａβに対するいくつかの抗体存在下でＰＤＡＰＰ脳切片を用いて行った。エクスビボアッセイにおいて、抗体が食作用を誘導できること、および受動転移（ｐａｓｓｉｖｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ）実験においてインビボでのプラーク負荷を低下させることができることを比較した。これらの結果によって、インビボにおける効果は、直接的な抗体介在による、ＣＮＳ内におけるプラーク除去によるものであること、および、エクスビボアッセイは、インビボでの有効性を予測できることが明らかになっている。（国際公開公報ＷＯ ００／７２８８０の実施例ＸＩＶの表１６および１７；および国際公開公報ＷＯ ００／７２８７６の実施例ＸＩＶの表１６参照。これらは本明細書において参照として組み込まれる）。
（実施例ＶＩＩＩ：α−シヌクレインによる能動的免疫）
Ａ．材料と方法
ｈα−シヌクレインｔｇマウスのワクチン接種。この研究では、血小板由来増殖因子−β（ＰＤＧＦβ）プロモーター（Ｍａｌｉａｈ，２０００，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８７：１２６５−６９）の制御調節下でｈα−シヌクレインを発現するヘテロ接合ｔｇマウス（Ｄ系列）を使用した。これらの動物は、脳の中でｈα−シヌクレイン免疫活性封入体を発生させ、また、ＬＢＤの一部を模倣する神経変性および運動障害も発生させるため、選択されたものである。実験動物を２つのグループに分けた。第１のグループでは、全部で２０匹の若い（３ヶ月齢）ｔｇマウスを８ヶ月間、組換えｈα−シヌクレイン（ｎ＝１０）またはアジュバント単独（ｎ＝１０）で免疫した。第２のグループでは、全部で２０匹の成熟した（６ヶ月齢）ｔｇマウスを８ヶ月間、組換えｈα−シヌクレイン（ｎ＝１０）またはアジュバント単独（ｎ＝１０）で免疫した。免疫用プロトコールは、まず、組換えｈα−シヌクレイン（８０μｇ／ｍｌ；１００μｌ）をフロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）とともに注射することからなっていた。２週間後、マウスにもう一度ｈα−シヌクレイン（８０μｇ／ｍｌ；１００μｌ）を不完全ＦＡとともに投与し、その後（引き続き７ヶ月間）、リン酸緩衝食塩水に入れたｈα−シヌクレイン（８０μｇ／ｍｌ；１００μｌ）を月に１回再注射した。組換えｈα−シヌクレインを調製して、Ｍａｓｌｉａｈ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｎｅｕｒｏｎ ４６：８５７−６８に記載されているように精製し、内毒素を検査した。
ｈα−シヌクレインに対する抗体力価および相対的アフィニティーの決定。血漿におけるｈα−シヌクレイン抗体の量を、１ウエル当り０．４μｇの精製全長α−シヌクレインでコートした９６ウエルマイクロタイタープレートを用いて測定した。サンプルを４℃で一晩インキュベートした後、洗浄して、ヤギ抗マウスＩｇＧアルカリホスファターゼ結合抗体（１：７５００、Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）とインキュベートした。励起波長４５０ｎｍおよび発光波長５５０ｎｍでプレートを読み取った。相対的蛍光単位を縦軸上に、また血清希釈度を横軸にとって、結果を片対数グラフにプロットした。最大の抗体結合から５０％低下した希釈度を抗体力価と定義した。
ワクチン接種されたマウスで産生された抗体によるｈα−シヌクレインに対する相対的アフィニティーを測定するために、２組の実験を行った。最初の組の実験では、非免疫ｈα−シヌクレインｔｇマウスの脳のホモジネートをミニゲル多チャンネル装置（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）で泳動した。各チャンネルを、各マウスの希釈血清とともにインキュベートし、ニトロセルロース上にブロットして、二次抗体のウサギ抗マウス抗体とともにインキュベートした後、Ｉ１２５標識されたプロテインＡ（Ａｌｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ，Ｃｙｔｏｃｈｅｍ ４２：２８３−２８７（１９９４））とインキュベートした。ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）でブロットを画像化し解析した。免疫活性バンドはＩｍａｇｅＱｉａｎｔソフトウエア（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＹ）を用いて定量した。２組目の実験では、非免疫ｈα−シヌクレインｔｇマウスのビブラトーム連続切片を、各処理済みマウスの希釈血清とインキュベートした後、ビオチン化ウマ抗マウスＩｇＧ（１：１００、Ｖｅｃｔｏｒ）、アビジンＤ−ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ、１：２００、ＡＢＣ Ｅｌｉｔｅ，Ｖｅｃｔｏｒ）とインキュベートして、０．００１％Ｈ２Ｏ２を含むジアミノベンジジンテトラハイドロクロライド（ＤＡＢ）と反応させた。顕微鏡検査の後、ラベル付された細胞区分（神経細胞本体、シナプス、および封入体）と免疫活性の程度（０＝なし；１＝非常に軽度；２＝軽度；３＝中度；４＝強度）によって切片を採点した。
ｈα−シヌクレイン抗体のエピトープマッピング。ｈα−シヌクレインの全長配列をカバーした重複直鎖ペプチドに対する抗体の結合を測定するＥＬＩＳＡによって、ｈα−シヌクレイン抗体によって認識されるエピトープを決定した。ｈα−シヌクレインの配列を持ち、Ｃ末端をビオチン化されたペプチド（Ｍｉｍｏｔｏｐｅｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を、１ペプチド当り１２残基が重複し３残基が階段となる１５アミノ酸（ａａ）長のペプチドとして調製した。最後が１３ａａの重複で２ａａの階段となるペプチドとなる、全部で４３個のペプチドを用いて、ｈα−シヌクレインの全長１４０ａａの配列をウォーキングした。また、最後の３個のペプチドは反復していたが、ビオチン化は、ペプチドのＮ末端で生じた。これは、抗体をペプチドのＣ末端に接触しやすくして、遊離したＣ末端に特異的な抗体の同定を可能にするために行われた。さらに、抗体と、ｈα−シヌクレインの非アミロイドβ（Ａβ）成分（ＮＡＣ）領域（６１〜９５）との相互作用をより綿密に調べることができるよう、このアッセイ法に別の特徴を追加した。このアッセイにおける２１番目のペプチドは、すでにＮＡＣ領域の遊離Ｎ末端を含んでいるため、ＮＡＣ領域の遊離Ｃ末端を含むＮ末端ビオチン化ペプチドをさらに一つ加えて、全部で４７個のペプチドによるアッセイ法を完成させた。
アッセイを行うために、これらのビオチン化ペプチドを、ストレプトアビジンで予めコートしておいたＥＬＩＳＡプレート（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）上に５ｎＭで一晩被覆させた。そして、このプレートを洗浄し、力価が６に等しくなるまで希釈した血清サンプルを１時間インキュベートして付加した。このインキュベーションのために５，０００よりも低い力価の血清サンプルを１：１０００に希釈した。もう一度洗浄工程を行った後、ＨＲＰに結合した種特異的二次抗体を用いて、比色ＥＬＩＳＡフォーマット中で結合抗体を検出した。
組織の処理。後述するように詳細な神経化学的および神経病理学的な解析を行うためにマウスを安楽死させて脳を取り出した。要すれば、ウエスタンブロットによって凝集型および非凝集型のｈα−シヌクレインの免疫活性を測定するために右半脳を凍結してホモジナイズした（Ｍａｓｌｉａｈ ｅｔ ａｌ．，２０００、前掲）。左半脳は、免疫細胞化学的および超微細構造的な解析を行うために４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で固定し、ビブラトームで連続切片を作製する（Ｌｅｉｃａ，Ｗｅｔｚｌａｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。
シナプトソーム調製および免疫ブロット解析。ｔｇマウスの脳内へのα−シヌクレイン蓄積に対するワクチン接種の効果を確認するために、ショ糖勾配を用いてシナプトソーム画分を調製し、１０％トリス−酢酸ポリアクリルアミドゲルでＳＤＳ−ＰＡＧＥ（商標ＮｕＰＡＧＥ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により解析した。免疫ブロットを、ｈα−シヌクレインに対する一次抗体（ＬＢ５０９、１：１０００、Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、およびＨＲＰ（１：５０００、ＳａｎｔａＣｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）で標識された二次抗体のヤギ抗マウスＩｇＧをプローブとし、高感度化学発光法で可視化して、ＶｅｒｓａｄｏｃＸＬ画像化装置（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）により解析を行った。
神経病理学および免疫細胞化学による解析。要すれば、既述したように（Ｍａｓｌｉａｈ ｅｔ ａｌ．，２０００、前掲）、α−シヌクレイン蓄積に対するワクチン接種の効果を調べるために、連続切片化し、浮遊させた盲検法による（ｂｌｉｎｄ−ｃｏｄｅｄ）ビブラトーム切片を、既述したように（Ｍａｓｌｉａｈ ｅｔ ａｌ．，２０００、前掲）ウサギをａａ１０１〜１２４からなる合成ｈα−シヌクレインペプチドで免疫して調製してアフィニティー精製した抗ｈα−シヌクレイン特異的抗体（７２−１０、ウサギポリクローナル、１：５００）とともに４℃で一晩インキュベートした。一次抗体とインキュベートした後、ビオチン化ヤギ抗ウサギＩｇＧ（１：１００、Ｖｅｃｔｏｒ）、アビジンＤ−ＨＲＰ（１：２００、ＡＢＣ Ｅｌｉｔｅ、Ｖｅｃｔｏｒ）とインキュベートし、０．００１％Ｈ２Ｏ２を含むＤＡＢテトラハイドロクロライドと反応させた。新皮質内にある免疫活性の封入体の数を測定するために、切片をＱｕａｎｔｉｍｅｔ５７０Ｃ（Ｌｅｉｃａ）で解析した。各場合について、３つの切片を解析し、結果の平均を出して、１ｍｍ平方当りの数で表した。切片を、ＣＤ４５（１：１０００、ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ）およびグリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ、１：５００、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）などのグリア細胞マーカーに対する抗体と免疫反応させて、更なる免疫細胞化学解析を行った。
二重免疫細胞化学解析を、既述した（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ ３２：２１３−２２３（２００１））通りに行って、神経終末密度、およびシナプスにおけるα−シヌクレイン蓄積に対するワクチン接種の効果を測定した。このために、ｈα−シヌクレインに対するポリクローナル抗体（１：１０００）、およびシナプトフィジンに対するモノクローナル抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）でビブラトーム切片を二重標識した。チラミドレッド（Ｔｙｒａｍｉｄｅ Ｒｅｄ、１：２００、Ｒｏｃｈｅ）でｈα−シヌクレインを検出し、シナプトフィジンをフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）で標識したウマ抗マウスＩｇＧで検出した。各場合について、切片を反復して免疫標識し、レーザー走査共焦点顕微鏡（ＬＳＣＭ）およびＮＩＨ Ｉｍａｇｅ １．４３ソフトウエアで解析して、新皮質においてシナプトフィジン免疫活性終末で覆われた神経網の面積パーセント（Ｍｕｃｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２０：４０５０−４０５８（２０００））、およびｈα−シヌクレイン陽性であったシナプトフィジン免疫活性終末の割合を計算した。一次抗体の特異性を確認するために、切片を、１次抗体なしで（失欠）、２０倍過剰量の対応するペプチドで４８時間事前吸着させておいた一次抗体とともに、または免疫前血清とともに一晩インキュベートして対照実験を行った。
すべての切片を同一条件下で同時処理し、結果の再現性を評価するために実験を２回行った。切片は、ＭＲＣ１０２４ＬＳＣＭ装置（ＢｉｏＲａｄ，Ｗａｔｔｆｏｒｄ，ＵＫ）を付属させたＡｘｉｏｖｅｒｔ３５顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）上のＺｅｉｓｓ６３Ｘ（Ｎ．Ａ．１．４）対物により画像化した（Ｍａｓｌｉａｈ ｅｔ ａｌ．，２０００、前掲）。
統計解析。両側独立スチューデントｔ−検定を利用してグループ間の統計学的比較を行った。線形回帰解析を行って変数間の関係を確認した。ボンフェローニ補正を適用して多重比較を行った。
Ｂ．結果
抗体力価、アフィニティー、およびエピトープマッピングの特徴
両実験グループの３つの時点（ワクチン接種後２週間、６ヶ月、および９ヶ月）における抗体力価を分析した。抗体力価は、グループＩに属する動物では、マウス間でかなり変動があった。ｈα−シヌクレインで免疫されたマウス間の抗体力価は、２００から２０，０００の範囲内であった（表３）。
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 このグループでは、平均力価が時間とともに僅かに上昇した。同様に、グループＩＩでは、ｈα−シヌクレインで免疫された動物が、２００から１３，０００の範囲の力価を示した（表３）。しかし、平均力価のレベルは、初回測定における方が高く、時間がたつにつれて低下した。免疫ブロット解析も、ｈα−シヌクレインを認識する能力が、マウス間で有意に変動することを示した。全体的に、抗体の相対的アフィニティーのレベルは、グループＩの免疫されたマウスに較べると、グループＩＩのマウスの方が高かった（表４）。
Figure 0005211290
 ＩＣＣによって、ｈα−シヌクレインをワクチン接種されたマウスの血清は、神経細胞、神経細胞内封入体、および前シナプス終末の標識を示した。それに対し、アジュバントのみで処理されたマウスは、細胞本体の広範で非特異的な軽度の染色を示した。グループＩＩに属するマウスの血清は、グループＩの免疫されたマウスと比較すると、ｔｇマウスのシナプスおよび神経細胞内のｈα−シヌクレインの認識でより高いアフィニティーを示した（表４）。
エピトープマッピングの研究によって、ｈα−シヌクレインでワクチン接種されたマウスにおいて、抗体は、ｈα−シヌクレインのＣ末端領域内にあるペプチドエピトープをもっとも高い頻度で認識したことが示された（図８）。また、さらに別のエピトープに対する抗体も場合によっては認識された。これに対して、ＣＦＡ単独で処理されたマウスの血清では、活性も抗体エピトープも検出されなかった。
免疫によってｔｇマウスの脳内におけるｈα−シヌクレイン蓄積が抑制され、シナプス密度が維持される
ｈα−シヌクレイン蓄積に対する免疫療法の効果を判定するために、ｈα−シヌクレインに対する抗体で切片を標識し、明視野顕微鏡またはＬＳＣＭで解析した。ｔｇマウスでは、神経網および神経細胞内封入体において十分なｈα−シヌクレイン免疫活性が観察された。ＣＦＡ単独で処理されたｔｇマウスと比較して、両方の免疫グループのマウスでは、側頭皮質内における封入体の数が同じように（約２５％）減少した（図９Ａ）。さらに、免疫した結果、神経網内でｈα−シヌクレイン免疫活性が低下した。ＣＦＡ単独で処理されたｔｇマウスと比較して、この効果は、グループＩのマウスよりもグループＩＩのマウスで大きかった（図９Ａ）。免疫の効果が、本当に、抗体が神経細胞のｈα−シヌクレイン蓄積を減少させることができることまたはマスキング作用と関係しているか否かを判定するために、ＣＦＡ単独でワクチン接種されたｔｇマウスと、ｈα−シヌクレインをワクチン接種されたｔｇマウスとでβ−シヌクレイン免疫活性の量を比較して対照実験を行った。α−シヌクレインに近似したホモログであるβ−シヌクレインの既知の分布（Ｉｗａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ １４：４６７−４７５（１９９４））と整合して、大量のβ−シヌクレイン免疫活性が、前シナプス終末と結合している神経網の中で観察され、神経細胞本体では軽度の免疫標識が検出されたが、封入体では検出されなかった。ＣＦＡ単独で処理されたｔｇマウスと比較して、ｈα−シヌクレインで免疫されたマウスにおいて、β−シヌクレインのパターンと量に違いはなかった。ｈα−シヌクレイン抗体の効果の特異性をさらに調べるために、マウス（ｍ）α−シヌクレイン免疫活性のレベルを、ＣＦＡ単独でワクチン接種されたｔｇマウスと、ｈα−シヌクレインをワクチン接種されたｔｇマウスとで比較した。ｈα−シヌクレインと同様に、ｍα−シヌクレイン免疫活性は、神経終末と結合している神経網の中で高かったが、神経細胞本体および封入体の中には存在しなかった。ＣＦＡで免疫されたマウスも、ｈα−シヌクレインで免疫されたマウスも、ｍα−シヌクレインのパターンとレベルは同等であった。まとめると、これらの研究は、ワクチン接種が特異的にｈα−シヌクレインに影響を与えるが、他の同族のシナプス分子には影響しないことを示唆している。
神経網の完全性に対する免疫療法の効果をさらに確認するために、切片を、シナプトフィジンに対する抗体で免疫染色するか、電子顕微鏡で調べた。非トランスジェニック（ｎｏｎｔｇ）マウスと比較して、ＣＦＡ単独で処理されたｔｇマウスは、シナプトフィジン免疫標識された終末の数が平均して２０％減少することを示したが、シナプトフィジン免疫活性のシナプス当りのレベルは変わらないままであった（図９Ｂ）。これに対して、免疫されたマウスは、両グループとも、ｎｏｎｔｇ対照と同程度のシナプトフィジン免疫活性レベルを示した（９Ｂ）。ＧＦＡＰおよびＣＤ４５などのグリア細胞マーカーに対する抗体を用いたさらなる免疫細胞化学的解析によって、ｈα−シヌクレインをワクチン接種したｔｇマウスの脳内で免疫活性が上昇する傾向が示された（図９Ｃ）。これらの知見と整合して、超微細構造解析では、ｈα−シヌクレインで免疫されたｔｇマウスの脳内において、本来のシナプス前終末および樹状突起があって神経網がよく保存されていること、および神経終末が多量の明小胞を含み、シナプス後膜肥厚を形成していることが示された。時に電子密度が高い凝集体が神経突起内で確認されただけで、全体的には、ミトコンドリアとミエリンがよく保存されていた。
シナプスにおけるｈα−シヌクレイン凝集に対するワクチン接種の効果の特徴をより詳しく調べるために、シナプトソーム調製物を用いて免疫細胞化学・ウエスタンブロット二重解析を行った。生理的条件下では、ｈα−シヌクレインは主にシナプス前ボタンに局在しており（Ｉｗａｉ ｅｔ ａｌ．，１９９４，前掲）、ＬＢＤおよびｔｇマウスでは、シナプスにおけるｈα−シヌクレインの蓄積増加が、機能障害およびシナプス消失を伴っている（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，２００１，前掲）。神経終末におけるｈα−シヌクレイン蓄積に対するワクチン接種の効果を確認するために、シナプス前終末マーカーであるシナプトフィジン、およびｈα−シヌクレインに対する抗体による二重免疫標識実験と、シナプトソーム調製物によるＷＢ解析を行った。二重標識した切片の共焦点画像により、ＣＦＡ単独でワクチン接種されたｈα−シヌクレインｔｇマウスと比較して（図９Ｄ）、ｈα−シヌクレインを注射されたｈα−シヌクレインｔｇマウスは、新皮質内のシナプトフィジン免疫活性神経終末におけるｈα−シヌクレインの蓄積低下を示したことが分かった（図９Ｄ）。
免疫細胞化学研究と一貫して、免疫ブロット解析では、ＣＦＡ単独で処理されたｔｇマウスで多量の高分子量バンドが存在し、それは、恐らく、シナプスでｈα−シヌクレイン免疫活性封入体が蓄積していることを反映していることが示された（図１０）。免疫されたマウスでは、ｈα−シヌクレインの高分子量バンドの蓄積および本来のバンドがかなり減少したが、ｍα−シヌクレインの量に対する効果は見られなかった。さらに、ＣＦＡ単独で処理されたｔｇマウスと比較して、免疫されたマウスのシナプトソーム調製物では、シナプトフィジン免疫活性レベルが高かった（図１０）。まとめてみると、これらの結果は、免疫療法が、毒性をもつ可能性があるｈα−シヌクレインオリゴマーのシナプスにおける蓄積を低下させることによって、ｔｇマウスの脳内での神経細胞損傷を改善できることを示唆している。
免疫の効果は、シナプス終末を認識する抗体の相対的アフィニティーに依存する
どの因子が免疫療法の有効性を予測できるかをよりよく理解するために、ｈα−シヌクレイン蓄積の神経病理学マーカーと、抗体の力価およびアフィニティーとの間で直線回帰解析を行った。この解析によって、免疫ブロットによる相対的抗体アフィニティーと、シナプスにおけるｈα−シヌクレイン免疫活性レベルとは有意に相関するが、神経細胞内封入体の数とは相関しないことが示された。同様に、ＩＣＣによるシナプスを認識する相対的抗体アフィニティーは、シナプスにおけるｈα−シヌクレインのレベルとは逆相関し、シナプトフィジン標識された神経終末によって占められら面積率と直接的に相関したが、神経細胞内の封入体の数とは相関しなかった。免疫ブロットおよびＩＣＣによる抗体反応性のレベルは、ＥＬＩＳＡによって測定される抗体力価と強度に相関していた。また、抗体力価は、抗ｈα−シヌクレイン抗体で標識された神経網の面積率とも相関していたが、神経細胞内の封入体の数とは相関していなかった（表４）。まとめてみると、これらの結果は、抗ヒトα−シヌクレイン抗体の相対的免疫ブロット反応性、およびある程度までは抗体のＥＬＩＳＡ力価が、神経細胞におけるヒトα−シヌクレインの蓄積低下と相関することを示唆している。
ｔｇマウスにおいて抗ヒトα−シヌクレイン抗体は内在化して、シナプスおよび封入体を含む神経細胞に結合する
輸送抗体（ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）が、ｔｇマウスの脳内でヒトα−シヌクレインが蓄積する特徴的な神経細胞部位を認識するか否かを判定するために、ウマ抗マウスＩｇＧ抗体を用いて一重および二重の免疫細胞化学的解析を行った。これらの抗体は、免疫された動物の体内で生成された抗ヒトα−シヌクレインを認識するが、ＣＦＡ対照で生成されたものは認識しないことになっている。免疫標識された切片の明視野デジタル顕微鏡によって、ｈα−シヌクレインで免疫されたマウスでは、ビオチン化抗マウスＩｇＧが、神経細胞本体および神経網内の神経突起を拡散的に標識することが示された。ＣＦＡ単独で処理されたｔｇ動物では、血管、および時には小グリア細胞に似た細胞に軽度の標識が見られた。二重免疫染色実験によって、ワクチン接種されたマウスでは、ＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧで標識された神経細胞本体が、ｈα−シヌクレイン免疫活性を示すことが確認された。ＣＦＡ単独で処理されたｔｇマウスと比較して、ｈα−シヌクレインをワクチン接種されたマウスでは、神経細胞の一部で、抗マウスＩｇＧとｈα−シヌクレイン免疫活性とが細胞本体の周辺部に共に局在し、別の領域では、神経突起およびシナプスの中でこの２つの標識が検出された。さらに、いくつかのヒトα−シヌクレイン含有神経細胞では、この２つのマーカーが、平均サイズ直径０．４〜０．８μｍの細胞内顆粒状構造体の中で検出された。さらに別の二重標識実験では、これらの顆粒状構造体がカテプシンＤ免疫活性を示すことが明らかになり、内在化した抗ヒトα−シヌクレイン抗体が、リソソーム内にあるシヌクレインと反応することが示唆された。この知見と一貫して、超微細構造解析は、ヒトα−シヌクレインをワクチン接種されたマウスの神経細胞のいくつかで、リソソームを示唆する電子密度の高い積層構造体およびファゴリソソームが同定されることを示した。まとめてみると、これらの結果は、ヒトα−シヌクレインによるワクチン接種が、リソソーム経路の活性化を介してこの分子の分解を促進できることを示唆している。
（実施例ＩＸ．α−シヌクレイン抗体の投与によるインビボにおけるα−シヌクレイン凝集体の除去）
本実施例では、α−シヌクレインの末端を認識するモノクローナル抗α−シヌクレイン抗体を用いた神経細胞内のα−シヌクレイン凝集体の除去を実証する。モノクローナル抗体を、ヒトα−シヌクレインを過剰発現して、神経細胞内にα−シヌクレイン凝集体を有するトランスジェニックマウスの新皮質の中に注射した。これら２つの抗体は、一つがα−シヌクレインのＮ末端に、もう一方がＣ末端に対するものであるが、無関係な対照抗体と比較すると、神経細胞内のα−シヌクレイン凝集体の数を最大８０％まで減少させた（図１１）。
方法。α−シヌクレイン分子、および無関係でアイソタイプが一致する対照抗体のさまざまなエピトープを認識するモノクローナル抗体を、マウスに注射するために滅菌したリン酸緩衝食塩水に溶解した（表５）。使用した動物は、脳内においてＰＤＧＦプロモーターの転写調節下でヒトの野生型α−シヌクレインを過剰発現する４〜８月齢のヘテロ接合マウスであった。それぞれの抗体について、４から６匹の異なったトランスジェニックマウスを使用した。
Figure 0005211290
 各マウスについて、麻酔下で右半脳の頭頂部新皮質（同側）の深層部に２μｌの２ｍｇ／ｍｌ抗体溶液を定位固定して接種した。左半脳（対側部位）は、各マウスに対するベースライン対照として使用した。接種部位を縫合して、麻酔から回復するまでマウスを観察した。各時点でどの抗体を接種したかは、接種を行う研究者には分からないようにした。接種してから２週間後、研究所のガイドラインに従ってマウスを安楽死させた。その脳を取り出して、４％パラホルムアルデヒドで４８時間固定してから、Ｌｅｉｃａビブラトームを使用して、冠状に４０μｍの厚さに切った。各動物につき２つの切片（接種部位近辺）を、ポリクローナルα−シヌクレイン抗体（ＥＬＡＤＷ−４７、α−シヌクレインの１１５〜１２２位のアミノ酸を認識する）を用いた免疫ペルオキシダーゼ染色によって染色した。各切片について、同側半脳の接種部位近辺にある４つの顕微鏡視野（２０×対物）、および対照半脳の対側部位における対応する４つの視野で神経細胞内α−シヌクレイン凝集体の数を測定した。各半脳について、２つの切片のα−シヌクレイン凝集体の数を合計した。最後に、各動物について、２つの半脳間での全α−シヌクレイン凝集体数の違いを計算し、対側部位と同側部位の半脳間における差を％差異で表して、各マウス個体について、α−シヌクレイン抗体の凝集体除去に対する効果の測定値を示した。切片は盲検用に番号を付けたが、この番号は解析を完了したところで破棄した。
マウスは、接種した抗体によって次の３つのグループに分類することができる：
グループ１：１１Ａ５、８Ａ５、またはＩｇＧ１対照を接種されたマウス
グループ２：９Ｇ５、２４Ｅ８、６Ｈ７、またはＩｇＧ１対照を接種されたマウス
グループ３：４Ｂ１、５Ｃ１２、ＩｇＧ２ａまたはＩｇＧ２ｂ対照を接種されたマウス
結果。実験結果を図１１および１２に示す。神経細胞内α−シヌクレイン凝集体は、２つのモノクローナル抗体８Ａ５（ＪＨ４．８Ａ５とも呼ばれる）および６Ｈ７（ＪＨ１７．６Ｈ７とも呼ばれる）によって除去された。これらの抗体は、ＰＣＴ特許公報ＷＯ０５０４７８６０Ａ２（２００５年５月２６日出願の「α−シヌクレインに対する抗体」）、および同時係属特許出願第１０／９８４１９２号に記載されている。これら両文献とも、参照されて組み込まれる。ＭＡｂ６Ｈ７は、大腸菌で発現された組換えヒトα−シヌクレインに対して作製され、ヒトおよびマウスのα−シヌクレインのアミノ末端を認識する。これは、α−シヌクレインの最初の３つのアミノ酸を含むエピトープを認識する。ｍＡｂ６Ｈ７は、タグタンパク質がシヌクレインのＮ末端に融合している、シヌクレインの融合タンパク質を認識することもできるため、遊離のアミノ末端を必要としないことを示唆している（が、それはあった方が好ましいかもしれない）。ｍＡｂ８Ａ５は、精製されたウシシヌクレイン（αおよびβの混合物）に対して作製され、ヒトおよびマウスのα−シヌクレインのカルボキシル末端におけるエピトープを認識する。ｍＡｂ８Ａ５は、１３９位のアミノ酸で終結する切断型シヌクレインに結合することができる。予備実験で、８Ａ５は、ビオチンに結合したＣ末端を有するシヌクレインと較べて、遊離したＣ末端に対して４〜５倍の選好性をもつことが示唆された。ｍＡｂ６Ｈ７もｍＡｂ８Ａ５も、β−シヌクレインを認識する。ｍＡｂ４Ｂ１は、シヌクレインのＣ末端領域を認識して、ウエスタンブロット上でシヌクレインに結合するが、溶液中ではシヌクレインを認識しない（すなわち、ｍＡｂ４Ｂ１は、シヌクレインを免疫沈殿しない）。図１２は、８Ａ５を接種したマウスの対側部位（左パネル；切片内の円い茶色の点はα−シヌクレインの凝集体である）および同側部位（右パネル）の切片を示している。８Ａ５接種マウスとＩｇＧ１接種対照との差異は統計学的に有意であった（ノンパラメトリッククラスカル・ワリス検定の後ダンの事後検定によってｐ＜０．０５）。これらの結果は、α−シヌクレインのＣ末端および／またはＮ末端を標的とすることが、ＰＤおよびＤＬＢなどのシヌクレイン病においては治療上有益であることを示している。他の被験抗α−シヌクレイン抗体の投与（表５、図１１）では、凝集体の除去はもたらされなかった。
当業者には、添付した請求項の精神と範囲から逸脱することなく、多くの変更および修正を加えることができることが明らかであろう。文脈から明らかでない限り、いずれの工程、特徴、実施態様、または態様も、他のそれらと組み合わせて利用できる。本明細書に記載した刊行物および出願はすべて、その個々の刊行物および出願が具体的かつ個別に参照して組み込まれると記載されているのと同程度に参照して本明細書に組み込まれる。
α−ＳＮのアミノ酸配列（配列番号１）を、２つのＮＡＣのアミノ酸配列、それぞれ配列番号２および配列番号３と並べて示す。 非トランスジェニックマウス（パネルＡ、Ｅ、およびＩ）、アジュバントのみで免疫されたα−ＳＮトランスジェニックマウス（パネルＢ、Ｆ、およびＪ）、ならびに、α−ＳＮで免疫されたα−ＳＮトランスジェニックマウスであって、低力価（パネルＣ、Ｇ、およびＫ）および高力価（パネルＤ、Ｈ、およびＩ）のα−ＳＮに対する抗体を発現したマウスに由来する免疫組織染色した脳切片を示す。切片は、シヌクレイン量を検出するため抗α−シヌクレイン抗体を用いた染色を（パネルＡ〜Ｄ）、切片中の総ＩｇＧ量を測定するため抗ＩｇＧ抗体を用いた染色を（パネルＥ〜Ｈ）、そして星状グリア細胞のマーカーであるグリア細胞線維性酸性プロテイン（ＧＦＡＰ）を用いた染色を受けた。 光学顕微鏡で見たときの、形質転換ＧＴ１−７細胞におけるシヌクレイン凝集体に対する抗ｍＳＹＮポリクローナル抗体の効果を示す。 解析前に（１：５０）の濃度で、免疫前血清、および６７−１０抗体によって４８時間処理されたＧＴ１−７α−ｓｙｎ細胞の細胞質（Ｃ）および膜（Ｐ）におけるシヌクレイン量のウエスタンブロットである。 非トランスジェニックマウス、ＳＹＮトランスジェニックマウス、ＡＰＰトランスジェニックマウス、およびＳＹＮ／ＡＰＰトランスジェニックマウスの脳におけるＡβ１−４２免疫アミロイド沈着効果の実験結果を示す。ＡＰＰマウスおよびＳＹＮ／ＡＰＰマウスで見られた検出可能なアミロイド量が、Ａβ１−４２による免疫によって減少している。 非トランスジェニックマウス、ＳＹＮトランスジェニックマウス、ＡＰＰトランスジェニックマウス、およびＳＹＮ／ＡＰＰトランスジェニックマウスの脳におけるシヌクレイン封入体形成に対するＡβ１−４２による免疫効果の実験結果を示す。ＳＹＮマウスおよびＳＹＮ／ＡＰＰマウスで検出されたシヌクレイン封入体が、Ａβ１−４２による免疫によって減少している。 抗体がα−ＳＮの凝集を阻害する直接的または間接的な機序を示す。 抗体エピトープマッピングを示す。高力価かつ高アフィニティーの抗ヒトα−シヌクレイン抗体を発現するマウスの抗体を、ＥＬＩＳＡ技術を用いてマッピングした。ワクチン接種したマウスの抗血清試料のほとんどで、認識されたエピトープは、ヒトα−シヌクレインのＣ末端領域内にあった。ＣＦＡ処理対照の血清では、エピトープは検出されなかった。 ヒトα−シヌクレイン免疫活性量、および他の神経変性マーカー量の画像解析を示す。（Ａ）側頭皮質におけるｈα−シヌクレイン陽性封入体の平均数。ヒトα−シヌクレインによるワクチン接種は、対照と比較すると有意な封入体数の減少をもたらした。この効果は、第ＩＩ群のマウスにおいて、第Ｉ群とは対照的に顕著であった。（Ｂ）前頭皮質においてシナプトフィジン免疫活性終末によって占められた神経網の面積率。ＣＦＡ単独で処理されたトランスジェニック（ｔｇ）マウスでは、シナプトフィジンで免疫標識された終末の数が２０％減少したが、シナプスあたりのシナプトフィジン免疫活性量は変化しなかった。（Ｃ）側頭皮質におけるＣＤ４５の免疫活性量（小グリアマーカー）が、ヒトα−シヌクレインワクチン接種マウスの脳では僅かに高かった。（Ｄ）側頭皮質においてヒトα−シヌクレイン免疫活性終末によって占められた神経網の面積率。ヒトα−シヌクレインをワクチン接種されたｔｇマウスでは、シナプトフィジン免疫活性終末におけるα−シヌクレインの沈着が減少した。＊＝ＣＦＡ単独で処理されたヒトα−シヌクレインｔｇマウスと比較したときの有意差（ｐ＜０．０５，スチューデントＴ検定）。 ワクチン接種された動物におけるヒトα−シヌクレインおよびシナプトフィジンの免疫活性量のウエスタンブロット解析を示す。ＣＦＡ単独で処理されたｔｇマウスの脳（レーン１〜３）と比較すると、ｈα−シヌクレインをワクチン接種されたｔｇマウス（レーン４〜６）では、ヒトα−シヌクレインのオリゴマー量もモノマー量もともに減少した（上パネル）が、シナプトフィジン免疫活性の量は増加した（下パネル）。 抗α−シヌクレイン抗体を脳内注射した後にα−シヌクレイン凝集体を解析した結果を示す。Ｃ末端抗体８Ａ５およびＮ末端抗体６Ｈ７には除去効果があった。ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、およびＩｇＧ２ｂはアイソタイプ対照であった。水平線は中央値を示す。 モノクローナル抗体８Ａ５を注射したマウスの対側部位（左パネル；切片内の円い茶色のドットはα−シヌクレイン凝集体である）および同側部位（右パネル）の切片を示す。免疫染色は、α−シヌクレインに対するポリクローナル抗体を用いて行った。対側部位における神経細胞内α−シヌクレイン凝集体は円形をしている。

Claims (8)

  1. 脳におけるレビー小体またはα−シヌクレイン凝集を特徴とする疾患の予防または治療のための組成物であって、該組成物は、ハイブリドーマＪＨ１７．６Ｈ７．１．５４．２８（ＡＴＣＣ受託番号：ＰＴＡ−６９１０）によって産生される抗体６Ｈ７のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列、および／またはハイブリドーマＪＨ１７．６Ｈ７．１．５４．２８（ＡＴＣＣ受託番号：ＰＴＡ−６９１０）によって産生される抗体６Ｈ７のアミノ酸配列に１または数個の保存的アミノ酸置換を含むアミノ酸配列を有する抗体を含み、該抗体は、ヒトα−シヌクレインへの結合について、ハイブリドーマＪＨ１７．６Ｈ７．１．５４．２８（ＡＴＣＣ受託番号：ＰＴＡ−６９１０）によって産生されるマウスモノクローナル抗体６Ｈ７と競合するものである、組成物。
  2. 脳におけるレビー小体またはα−シヌクレイン凝集を特徴とする疾患の予防または治療のための組成物であって、ハイブリドーマＪＨ１７．６Ｈ７．１．５４．２８（ＡＴＣＣ受託番号：ＰＴＡ−６９１０）によって産生されるモノクローナル抗体６Ｈ７またはそのヒト化バージョンもしくはキメラ化バージョンを含む、組成物。
  3. 脳におけるレビー小体またはα−シヌクレイン凝集を特徴とする疾患の予防または治療のための組成物であって、該組成物は、ハイブリドーマＪＨ１７．６Ｈ７．１．５４．２８（ＡＴＣＣ受託番号：ＰＴＡ−６９１０）によって産生されるモノクローナル抗体６Ｈ７、ハイブリドーマＪＨ１７．６Ｈ７．１．５４．２８（ＡＴＣＣ受託番号：ＰＴＡ−６９１０）によって産生される抗体６Ｈ７のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列、および／またはハイブリドーマＪＨ１７．６Ｈ７．１．５４．２８（ＡＴＣＣ受託番号：ＰＴＡ−６９１０）によって産生される抗体６Ｈ７のアミノ酸配列に１または数個の保存的アミノ酸置換を含むアミノ酸配列を有する抗体、ならびにそのヒト化バージョンまたはキメラ化バージョンからなる群より選択される、ヒトα−シヌクレインへの結合のための第1の抗体を含み、該第１の抗体は、ヒトα−シヌクレインへの結合について、ハイブリドーマＪＨ１７．６Ｈ７．１．５４．２８（ＡＴＣＣ受託番号：ＰＴＡ−６９１０）によって産生されるマウスモノクローナル抗体６Ｈ７と競合するものであり、該第1の抗体は、ヒトα−シヌクレインの７０〜１４０位の残基の中にあるエピトープに特異的に結合する第２の抗体と組み合わせて投与されるものであることを特徴とする、組成物。
  4. ヒトα−シヌクレインへの結合のための、ハイブリドーマＪＨ１７．６Ｈ７．１．５４．２８（ＡＴＣＣ受託番号：ＰＴＡ−６９１０）によって産生されるモノクローナル抗体６Ｈ７のキメラ抗体またはヒト化抗体と、医薬用担体とを含む医薬組成物。
  5. ハイブリドーマＪＨ１７．６Ｈ７．１．５４．２８（ＡＴＣＣ受託番号：ＰＴＡ−６９１０）またはＪＨ４．８Ａ５．２５．７．３６（ＡＴＣＣ受託番号：ＰＴＡ−６９０９）によって産生されるモノクローナル抗体、あるいは、該モノクローナル抗体のＣＤＲを有するモノクローナル抗体のキメラ化バージョンもしくはヒト化バージョンであって、該モノクローナル抗体またはそのキメラ化バージョンもしくはヒト化バージョンは、配列番号１のアミノ酸配列を有するα−シヌクレインに結合する、モノクローナル抗体。
  6. ハイブリドーマＪＨ１７．６Ｈ７．１．５４．２８（ＡＴＣＣ受託番号：ＰＴＡ−６９１０）またはＪＨ４．８Ａ５．２５．７．３６（ＡＴＣＣ受託番号：ＰＴＡ−６９０９）の細胞であって、該細胞は、配列番号１のアミノ酸配列を有するα−シヌクレインに結合する抗体を発現する、細胞。
  7. ハイブリドーマＪＨ４．８Ａ５．２５．７．３６（ＡＴＣＣ受託番号：ＰＴＡ−６９０９）によって産生されるモノクローナル抗体８Ａ５またはハイブリドーマＪＨ１７．６Ｈ７．１．５４．２８（ＡＴＣＣ受託番号：ＰＴＡ−６９１０）によって産生されるマウスモノクローナル抗体６Ｈ７をヒト化する方法であって、
    該モノクローナル抗体由来のＣＤＲ領域のアミノ酸配列を決定すること；
    受容体抗体を選択すること；および
    該モノクローナル抗体由来のＣＤＲ、および受容体抗体由来の可変領域のフレームワークを含むヒト化抗体を作製することを含む方法。
  8. ハイブリドーマＪＨ４．８Ａ５．２５．７．３６（ＡＴＣＣ受託番号：ＰＴＡ−６９０９）によって産生されるモノクローナル抗体８Ａ５またはハイブリドーマＪＨ１７．６Ｈ７．１．５４．２８（ＡＴＣＣ受託番号：ＰＴＡ−６９１０）によって産生されるマウスモノクローナル抗体６Ｈ７のキメラ型を作製する方法であって、
    該モノクローナル抗体の軽鎖および重鎖の可変領域のアミノ酸配列を決定すること；
    軽鎖および重鎖の定常領域を選択すること；
    該軽鎖定常領域に融合した軽鎖可変領域を含む軽鎖と、該重鎖定常領域に融合した重鎖可変領域を含む重鎖とを含むキメラ抗体を作製することを含む方法。
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Families Citing this family (56)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040146521A1 (en) * 1999-06-01 2004-07-29 Schenk Dale B. Prevention and treatment of synucleinopathic disease
US20080014194A1 (en) 2003-10-31 2008-01-17 Elan Pharmaceuticals, Inc. Prevention and Treatment of Synucleinopathic and Amyloidogenic Disease
US8697082B2 (en) * 2002-11-01 2014-04-15 Neotope Biosciences Limited Prevention and treatment of synucleinopathic and amyloidogenic disease
US9034337B2 (en) * 2003-10-31 2015-05-19 Prothena Biosciences Limited Treatment and delay of outset of synucleinopathic and amyloidogenic disease
TW200509968A (en) * 2002-11-01 2005-03-16 Elan Pharm Inc Prevention and treatment of synucleinopathic disease
US8506959B2 (en) 2002-11-01 2013-08-13 Neotope Biosciences Limited Prevention and treatment of synucleinopathic and amyloidogenic disease
US7358331B2 (en) * 2003-05-19 2008-04-15 Elan Pharmaceuticals, Inc. Truncated fragments of alpha-synuclein in Lewy body disease
US7674599B2 (en) 2003-11-08 2010-03-09 Elan Pharmaceuticals, Inc. Methods of using antibodies to detect alpha-synuclein in fluid samples
EA013752B1 (ru) 2004-08-09 2010-06-30 Элан Фармасьютикалз, Инк. Предупреждение и лечение синуклеинопатических и амилоидогенных заболеваний
AU2008203703C1 (en) 2007-01-05 2014-04-03 University Of Zurich Method of providing disease-specific binding molecules and targets
IL199534A (en) 2007-01-05 2013-01-31 Univ Zuerich An isolated human antibody capable of detecting a neoepitope in a disease-related protein, a polynucleotide encoding an antibody, a vector containing the polynucleotide, a host cell containing the polynucleotide or vector, a preparation containing the antibody and related methods and uses.
ES2546863T3 (es) 2007-02-23 2015-09-29 Prothena Biosciences Limited Prevención y tratamiento de enfermedad sinucleinopática y amiloidogénica
US8147833B2 (en) * 2007-02-23 2012-04-03 Neotope Biosciences Limited Prevention and treatment of synucleinopathic and amyloidogenic disease
EP2118300B1 (en) 2007-02-23 2015-05-27 Prothena Biosciences Limited Prevention and treatment of synucleinopathic and amyloidogenic disease
CN101265297B (zh) * 2007-03-15 2012-08-15 中国科学院上海生命科学研究院 α-突触核蛋白与Sph1的相互作用位点及其在筛选帕金森症药物中的应用
AU2015249034B2 (en) * 2007-12-28 2017-07-27 Prothena Biosciences Limited Treatment and prophylaxis of amyloidosis
EA036059B1 (ru) 2007-12-28 2020-09-21 Протена Байосайенсиз Лимитед Способ получения антитела или его фрагмента, которое специфически связывается с агрегированным амилоидным белком
AT506535B1 (de) * 2008-02-22 2010-04-15 Affiris Forschungs & Entwicklungs Gmbh Vaccine enthaltend alpha-synuclein-mimotope auf basis von peptiden
US8546532B2 (en) * 2008-04-17 2013-10-01 Declion Pharmaceuticals, Inc. Synthesis of directed sequence polymer compositions and antibodies thereof for the treatment of protein conformational disorders
JP5747414B2 (ja) * 2008-04-29 2015-07-15 バイオアークティック ニューロサイエンス アーベー α−シヌクレイン関連疾患についての治療および診断方法における使用のための抗体およびワクチン
CA2746778C (en) 2008-12-19 2019-04-23 University Of Zurich Human anti-alpha-synuclein autoantibodies
AT508638B1 (de) * 2009-08-21 2011-08-15 Affiris Ag Verwendung von peptiden und polypeptiden zur behandlung und/oder prävention von synukleinopathien
EP2539366B1 (en) 2010-02-26 2017-11-08 BioArtic Neuroscience AB Protofibril-binding antibodies and their use in therapeutic and diagnostic methods for parkinson's disease, dementia with lewy bodies and other alpha-synucleinopathies
GB201008682D0 (en) * 2010-05-25 2010-07-07 Vib Vzw Epitope tag for affinity based applications
WO2012068405A2 (en) 2010-11-17 2012-05-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of alpha synuclein expression
KR101308898B1 (ko) * 2011-02-08 2013-09-23 건국대학교 산학협력단 신규 항-α-시누클레인 단일클론항체 및 이를 이용한 ＥＬＩＳＡ 시스템
JP6061922B2 (ja) * 2011-06-22 2017-01-18 ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション プロテイノパチーの処置方法
CA2839563C (en) 2011-06-23 2019-10-29 Biogen Idec International Neuroscience Gmbh Anti-alpha synuclein binding molecules
KR101600733B1 (ko) 2011-10-28 2016-03-09 프로테나 바이오사이언시즈 리미티드 알파-시누클레인을 인식하는 인간화된 항체
DK2807188T3 (da) 2012-01-27 2019-10-07 Prothena Biosciences Ltd Humaniserede antistoffer, der genkender alpha-synuclein
UA118441C2 (uk) 2012-10-08 2019-01-25 Протена Біосаєнсиз Лімітед Антитіло, що розпізнає альфа-синуклеїн
KR20140077567A (ko) * 2012-12-14 2014-06-24 건국대학교 산학협력단 세포외 α-시누클레인 제거와 관련된 질환 치료용 조성물 및 그 치료제 스크리닝 방법
US10513555B2 (en) 2013-07-04 2019-12-24 Prothena Biosciences Limited Antibody formulations and methods
US10035847B2 (en) 2013-10-02 2018-07-31 The Rockefeller University Amyloid protofibril antibodies and methods of use thereof
EP3071974A2 (en) 2013-11-19 2016-09-28 Prothena Biosciences Limited Monitoring immunotherapy of lewy body disease from constipation symptoms
CA2944402A1 (en) * 2014-04-08 2015-10-15 Prothena Biosciences Limited Blood-brain barrier shuttles containing antibodies recognizing alpha-synuclein
JP2017536102A (ja) 2014-10-16 2017-12-07 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗アルファ−シヌクレイン抗体及び使用方法
MA41115A (fr) 2014-12-02 2017-10-10 Biogen Int Neuroscience Gmbh Procédé de traitement de la maladie d'alzheimer
GB201512203D0 (en) 2015-07-13 2015-08-19 Lundbeck & Co As H Agents,uses and methods
WO2017033152A1 (en) 2015-08-25 2017-03-02 Prothena Biosciences Limited Methods for detecting phosphorylated alpha-synuclein
IL259383B (en) * 2015-11-30 2022-07-01 Univ Wien A compound for use in the prevention and treatment of neurodegenerative diseases
EP3207925A1 (en) * 2016-02-22 2017-08-23 Universität Wien Compound for use in the prevention and treatment of neurodegenerative diseases
UA124733C2 (uk) 2016-06-02 2021-11-10 Медімм'Юн Лімітед Антитіло до альфа-синуклеїну
WO2018091444A1 (en) 2016-11-15 2018-05-24 H. Lundbeck A/S Agents, uses and methods for the treatment of synucleinopathy
BR112018016717A2 (pt) 2016-12-16 2018-12-26 H Lundbeck As agentes, usos e métodos
US10364286B2 (en) 2016-12-22 2019-07-30 H. Lundbeck A/S Monoclonal anti-alpha-synuclein antibodies for preventing tau aggregation
CA3051839A1 (en) 2017-02-17 2018-08-23 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies to alpha-synuclein and uses thereof
JOP20200041A1 (ar) 2017-08-22 2020-02-20 Biogen Ma Inc تركيبات صيدلية تحتوي على أجسام مضادة لبيتا نشوي
CA3076313A1 (en) 2017-09-28 2019-04-04 Prothena Biosciences Limited Dosing regimes for treatment of synucleinopathies
GB201720975D0 (en) * 2017-12-15 2018-01-31 Ucb Biopharma Sprl Anti-alpha synuclein antibodies
GB201720970D0 (en) * 2017-12-15 2018-01-31 Ucb Biopharma Sprl Antibodies
CN111836624A (zh) 2018-01-12 2020-10-27 百时美施贵宝公司 靶向α-突触核蛋白的反义寡核苷酸及其用途
EP4139349A1 (en) 2020-04-24 2023-03-01 F. Hoffmann-La Roche AG Enzyme and pathway modulation with sulfhydryl compounds and their derivatives
AU2021298222A1 (en) 2020-06-26 2022-12-15 Bioarctic Ab α-synuclein protofibril-binding antibodies
IL301039A (en) 2020-09-10 2023-05-01 Prothena Biosciences Ltd Treatment of Parkinson's disease
KR102513116B1 (ko) 2021-06-03 2023-03-22 고려대학교 산학협력단 알파시뉴클레인-금나노입자 복합체, 이의 제조방법 및 이를 이용한 약물 스크리닝 방법

Family Cites Families (130)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CH652145A5 (de) 1982-01-22 1985-10-31 Sandoz Ag Verfahren zur in vitro-herstellung von hybridomen welche humane monoklonale antikoerper erzeugen.
US4634666A (en) 1984-01-06 1987-01-06 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Human-murine hybridoma fusion partner
US5208036A (en) 1985-01-07 1993-05-04 Syntex (U.S.A.) Inc. N-(ω, (ω-1)-dialkyloxy)- and N-(ω, (ω-1)-dialkenyloxy)-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US4666829A (en) 1985-05-15 1987-05-19 University Of California Polypeptide marker for Alzheimer's disease and its use for diagnosis
DE3521994A1 (de) 1985-06-20 1987-01-02 Bayer Ag N-(2-aminoacylamido-2-desoxy-hexosyl)-amide-, -carbamate und -harnstoffe, verfahren zu ihrer herstellung sowie ihre verwendung in arzneimitteln
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
EP0832981A1 (en) 1987-02-17 1998-04-01 Pharming B.V. DNA sequences to target proteins to the mammary gland for efficient secretion
US4883666A (en) * 1987-04-29 1989-11-28 Massachusetts Institute Of Technology Controlled drug delivery system for treatment of neural disorders
US5229490A (en) 1987-05-06 1993-07-20 The Rockefeller University Multiple antigen peptide system
US5057540A (en) 1987-05-29 1991-10-15 Cambridge Biotech Corporation Saponin adjuvant
US5583112A (en) * 1987-05-29 1996-12-10 Cambridge Biotech Corporation Saponin-antigen conjugates and the use thereof
US6093406A (en) * 1988-06-02 2000-07-25 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Vaccine for induction of immunity to malaria
US4912094B1 (en) 1988-06-29 1994-02-15 Ribi Immunochem Research Inc. Modified lipopolysaccharides and process of preparation
US5576184A (en) * 1988-09-06 1996-11-19 Xoma Corporation Production of chimeric mouse-human antibodies with specificity to human tumor antigens
IL162181A (en) 1988-12-28 2006-04-10 Pdl Biopharma Inc A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
CA2006700A1 (en) 1989-01-17 1990-07-17 Antonello Pessi Synthetic peptides and their use as universal carriers for the preparation of immunogenic conjugates suitable for the development of synthetic vaccines
HU212924B (en) 1989-05-25 1996-12-30 Chiron Corp Adjuvant formulation comprising a submicron oil droplet emulsion
US5399346A (en) 1989-06-14 1995-03-21 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Gene therapy
IT1237764B (it) 1989-11-10 1993-06-17 Eniricerche Spa Peptidi sintetici utili come carriers universali per la preparazione di coniugati immunogenici e loro impiego per lo sviluppo di vaccini sintetici.
US5633076A (en) 1989-12-01 1997-05-27 Pharming Bv Method of producing a transgenic bovine or transgenic bovine embryo
DE69120146T2 (de) 1990-01-12 1996-12-12 Cell Genesys Inc Erzeugung xenogener antikörper
US5279833A (en) 1990-04-04 1994-01-18 Yale University Liposomal transfection of nucleic acids into animal cells
US5264618A (en) 1990-04-19 1993-11-23 Vical, Inc. Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules
CA2081482C (en) 1990-04-27 2000-11-21 Ellis L. Kline Method and composition for treatment of central nervous system disease states associated with abnormal amyloid beta protein molecular organization
US5753624A (en) * 1990-04-27 1998-05-19 Milkhaus Laboratory, Inc. Materials and methods for treatment of plaquing disease
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
CA2084307A1 (en) 1990-06-01 1991-12-02 Cetus Oncology Corporation Compositions and methods for identifying biologically active molecules
US5593970A (en) 1990-06-11 1997-01-14 Biochem Pharma Inc. Heterocyclic anthracycline analogs
JPH06508511A (ja) 1990-07-10 1994-09-29 ケンブリッジ　アンティボディー　テクノロジー　リミティド 特異的な結合ペアーの構成員の製造方法
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US5780587A (en) * 1990-08-24 1998-07-14 President And Fellows Of Harvard College Compounds and methods for inhibiting β-protein filament formation and neurotoxicity
DK0814159T3 (da) 1990-08-29 2005-10-24 Genpharm Int Transgene, ikke-humane dyr, der er i stand til at danne heterologe antistoffer
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5874299A (en) 1990-08-29 1999-02-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5877397A (en) 1990-08-29 1999-03-02 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5858657A (en) 1992-05-15 1999-01-12 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
US5871907A (en) 1991-05-15 1999-02-16 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
LU91067I2 (fr) 1991-06-14 2004-04-02 Genentech Inc Trastuzumab et ses variantes et dérivés immuno chimiques y compris les immotoxines
DE69228606T2 (de) 1991-07-03 1999-06-24 Kanebo, Ltd., Tokio/Tokyo Verfahren und vorrichtung zur herstellung eines thermoplastischen polyurethan-elastomers
US5283185A (en) 1991-08-28 1994-02-01 University Of Tennessee Research Corporation Method for delivering nucleic acids into cells
AU669489B2 (en) 1991-09-18 1996-06-13 Affymax Technologies N.V. Method of synthesizing diverse collections of oligomers
ES2136092T3 (es) 1991-09-23 1999-11-16 Medical Res Council Procedimientos para la produccion de anticuerpos humanizados.
US5733743A (en) 1992-03-24 1998-03-31 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
US5604102A (en) 1992-04-15 1997-02-18 Athena Neurosciences, Inc. Methods of screening for β-amyloid peptide production inhibitors
US5958883A (en) * 1992-09-23 1999-09-28 Board Of Regents Of The University Of Washington Office Of Technology Animal models of human amyloidoses
PT665897E (pt) 1992-10-01 2003-11-28 Trustees Of Columbia U In The Bibliotecas quimicas combinatorias complexas codificadas com etiquetas
WO1994012629A1 (en) 1992-12-02 1994-06-09 Baylor College Of Medicine Episomal vectors for gene therapy
CA2150262C (en) 1992-12-04 2008-07-08 Kaspar-Philipp Holliger Multivalent and multispecific binding proteins, their manufacture and use
CA2115900A1 (en) 1993-02-22 1994-08-23 Gerald W. Becker Pharmaceutical screens and antibodies
EP0714308A4 (en) 1993-08-26 1998-07-29 Univ California METHOD, COMPOSITIONS AND DEVICES FOR THE DELIVERY OF NAKED POLYNUCLEOTIDES THAT ENCODE BIOLOGICALLY ACTIVE PEPTIDES
WO1995006407A1 (en) 1993-08-30 1995-03-09 The Regents Of The University Of California Novel component of amyloid in alzheimer's disease and methods for use of same
JP3926839B2 (ja) 1993-09-14 2007-06-06 エピミューン，インコーポレイティド 万能ｄｒ−結合性ペプチドを用いる免疫応答の改変
JPH09508353A (ja) 1993-11-02 1997-08-26 アフィマックス テクノロジーズ ナムローゼ フェンノートシャップ 分子多様性の合成及びスクリーニング
US5827690A (en) 1993-12-20 1998-10-27 Genzyme Transgenics Corporatiion Transgenic production of antibodies in milk
US5877218A (en) 1994-01-10 1999-03-02 Teva Pharmaceutical Industries, Ltd. Compositions containing and methods of using 1-aminoindan and derivatives thereof and process for preparing optically active 1-aminoindan derivatives
US7473423B2 (en) * 1994-04-29 2009-01-06 Mayo Foundation For Medical Education And Research Human IgM antibodies, and diagnostic and therapeutic uses thereof particularly in the central nervous system
AU691296B2 (en) 1994-05-06 1998-05-14 Pharmacopeia Drug Discovery, Inc. Combinatorial dihydrobenzopyran library
US5505947A (en) 1994-05-27 1996-04-09 The University Of North Carolina At Chapel Hill Attenuating mutations in Venezuelan Equine Encephalitis virus
US5663046A (en) 1994-06-22 1997-09-02 Pharmacopeia, Inc. Synthesis of combinatorial libraries
EP1181937A3 (en) * 1994-08-09 2004-02-04 Cytrx Corporation Novel vaccine adjuvant and vaccine
US5589154A (en) * 1994-11-22 1996-12-31 Rutgers, The State University Of New Jersey Methods for the prevention or treatment of vascular hemorrhaging and Alzheimer's disease
US7153510B1 (en) 1995-05-04 2006-12-26 Yale University Recombinant vesiculoviruses and their uses
US5807741A (en) * 1995-07-20 1998-09-15 Brown; Douglas Richard Neutralizing monoclonal antibody against botulinum neurotoxin serotype F
EP0876615A1 (en) 1995-11-10 1998-11-11 Elan Corporation Plc Peptides which enhance transport across tissues and methods of identifying and using the same
AUPO390396A0 (en) 1996-11-29 1996-12-19 Csl Limited Novel promiscuous T helper cell epitopes
WO1998025386A2 (en) 1996-12-03 1998-06-11 Northern Telecom Limited System connecting remote agents over standard telephone lines
EP1005368B1 (en) 1997-03-10 2009-09-02 Ottawa Hospital Research Institute Use of nucleic acids containing unmethylated CpG dinucleotide in combination with alum as adjuvants
AU8163798A (en) 1997-06-25 1999-01-04 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The Cloning of a gene mutation for parkinson's disease
WO1999006545A2 (en) 1997-08-01 1999-02-11 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Composition and method for the detection of diseases associated with amyloid-like fibril or protein aggregate formation
US6923964B1 (en) * 1997-12-02 2005-08-02 Neuralab Limited Active immunization of AScr for prion disorders
US6761888B1 (en) * 2000-05-26 2004-07-13 Neuralab Limited Passive immunization treatment of Alzheimer's disease
US7964192B1 (en) 1997-12-02 2011-06-21 Janssen Alzheimer Immunotherapy Prevention and treatment of amyloidgenic disease
US6787523B1 (en) * 1997-12-02 2004-09-07 Neuralab Limited Prevention and treatment of amyloidogenic disease
TWI239847B (en) 1997-12-02 2005-09-21 Elan Pharm Inc N-terminal fragment of Abeta peptide and an adjuvant for preventing and treating amyloidogenic disease
US6743427B1 (en) * 1997-12-02 2004-06-01 Neuralab Limited Prevention and treatment of amyloidogenic disease
US6913745B1 (en) * 1997-12-02 2005-07-05 Neuralab Limited Passive immunization of Alzheimer's disease
US6710226B1 (en) * 1997-12-02 2004-03-23 Neuralab Limited Transgenic mouse assay to determine the effect of Aβ antibodies and Aβ Fragments on alzheimer's disease characteristics
EP1063294B1 (en) 1998-02-09 2006-01-11 Boehringer Ingelheim International GmbH Dnas or genes participating in parkinson's disease
AU3117799A (en) 1998-03-30 1999-10-18 Trustees Of The University Of Pennsylvania, The Method of identifying, diagnosing and treating synuclein positive neurodegenerative disorders
KR100701580B1 (ko) 1998-05-21 2007-03-30 유니버시티 오브 테네시 리서치 파운데이션 항-아밀로이드 항체를 이용한 아밀로이드 제거 방법들
US6184351B1 (en) 1998-09-25 2001-02-06 Amgen Inc. α-synuclein super-mutants accelerate α-synuclein aggregation
ATE415977T1 (de) 1998-10-06 2008-12-15 Univ California Methode zum screening von anti-amyloidogenen eigenschaften und methode zur behandlung neurodegenerativer krankheiten
US6172122B1 (en) * 1998-12-17 2001-01-09 The Lubrizol Corporation Stable emulsions from gelled overbased substrates with surfactants and aqueous liquids
US20040146521A1 (en) * 1999-06-01 2004-07-29 Schenk Dale B. Prevention and treatment of synucleinopathic disease
UA81216C2 (en) 1999-06-01 2007-12-25 Prevention and treatment of amyloid disease
JP2003531570A (ja) * 1999-07-27 2003-10-28 アブジェニックス インク． 神経障害に関連したポリペプチド蓄積を阻害する方法および組成物
GB9924513D0 (en) * 1999-10-15 1999-12-15 Novartis Ag Organic compounds
US6557129B1 (en) 1999-11-23 2003-04-29 Janusz Rajski Method and apparatus for selectively compacting test responses
US20020094335A1 (en) * 1999-11-29 2002-07-18 Robert Chalifour Vaccine for the prevention and treatment of alzheimer's and amyloid related diseases
WO2001053457A2 (en) 2000-01-21 2001-07-26 University Of Connecticut Health Center Vaccines against neurodegenerative disorders
US7276643B2 (en) 2000-02-18 2007-10-02 The Regents Of The University Of California Transgenic animals, cell lines derived therefrom, and methods for screening for anti-amyloidogenic agents
BR0108566A (pt) * 2000-02-21 2002-11-19 Pharmexa As Método para a regulação negativa in vivo de proteìna amilóide em um animal, incluindo um ser humano e para o tratamento e/ou prevenção e/ou melhora da doença de alzheimer ou outras doenças e condições cartacterizadas por depósitos de amilóide, análogo de um polipeptìdeo amiloidogênico,composição imunogênica, fragmento de ácido nucleico, vetor, célula transformada, composição para induzir a produção de anticorpos contra um polipeptìdeo amiloidogênico, linhagem celular estável, métodos para a preparação de uma célula, para a identificação de um polipeptìdeo amiloidogênico modificado, e para preparação de uma composição imunogênica, uso de um polipeptìdeo amiloidogênico ou de uma subsequência do mesmo, e, uso de um análogo de um polipeptìdeo amiloidogênico
MXPA02007796A (es) * 2000-02-21 2003-12-08 Pharmexa As Metodo novedoso para la disminucion de cuerpos amiloides.
US6784291B2 (en) * 2000-05-04 2004-08-31 Avi Biopharma, Inc. Splice-region antisense composition and method
CA2414772C (en) 2000-07-07 2011-06-28 Jan Naslund Prevention and treatment of alzheimer's disease
AU7186501A (en) * 2000-07-07 2002-01-21 Panacea Pharmaceuticals Inc Methods for preventing neural tissue damage and for the treatment of alpha-synuclein diseases
PE20020574A1 (es) 2000-12-06 2002-07-02 Wyeth Corp Anticuerpos humanizados que reconocen el peptido amiloideo beta
WO2002059621A2 (en) * 2001-01-24 2002-08-01 Bayer Corporation Regulation of transthyretin to treat obesity
US6815175B2 (en) * 2001-03-16 2004-11-09 Cornell Research Foundation, Inc. Anti-amyloid peptide antibody based diagnosis and treatment of a neurological disease or disorder
US20020197258A1 (en) * 2001-06-22 2002-12-26 Ghanbari Hossein A. Compositions and methods for preventing protein aggregation in neurodegenerative diseases
MY144532A (en) * 2001-08-20 2011-09-30 Lundbeck & Co As H Novel method for down-regulation of amyloid
WO2003037712A1 (fr) * 2001-11-01 2003-05-08 Ishigaki Company Limited Dispositif de propulsion par jet d'eau utilise dans un bateau
EP1451217A4 (en) * 2001-11-20 2005-10-12 Atgen Co Ltd NEW PEPTIDES PROVIDING ENVIRONMENTAL RESISTANCE, AND FUSION PROTEINS CONTAINING THOSE PEPTIDES
CA2466841A1 (en) * 2001-11-21 2003-06-05 New York University Synthetic immunogenic but non-deposit-forming polypeptides and peptides homologous to amyloid .beta., prion protein, amylin, .alpha.-synuclein, or polyglutamine repeats for induction of an immune response thereto
GB0203446D0 (en) * 2002-02-14 2002-04-03 Univ Lancaster Detection and/or monitoring of synuclein-related diseases
GB0216972D0 (en) 2002-07-22 2002-08-28 Univ Lancaster Peptides and peptide derivaties for the treatment of &-synuclein-related diseases
EP2068147A1 (en) * 2002-09-30 2009-06-10 Auburn University Method of isolation and self-assembly of small protein particles from blood and other biological materials
TW200509968A (en) * 2002-11-01 2005-03-16 Elan Pharm Inc Prevention and treatment of synucleinopathic disease
US9034337B2 (en) * 2003-10-31 2015-05-19 Prothena Biosciences Limited Treatment and delay of outset of synucleinopathic and amyloidogenic disease
US20080014194A1 (en) * 2003-10-31 2008-01-17 Elan Pharmaceuticals, Inc. Prevention and Treatment of Synucleinopathic and Amyloidogenic Disease
US8506959B2 (en) 2002-11-01 2013-08-13 Neotope Biosciences Limited Prevention and treatment of synucleinopathic and amyloidogenic disease
US8697082B2 (en) * 2002-11-01 2014-04-15 Neotope Biosciences Limited Prevention and treatment of synucleinopathic and amyloidogenic disease
US7358331B2 (en) * 2003-05-19 2008-04-15 Elan Pharmaceuticals, Inc. Truncated fragments of alpha-synuclein in Lewy body disease
SI2361928T1 (sl) 2003-05-19 2017-07-31 Prothena Biosciences Limited Skrajšani fragmenti alfa-sinukleina pri bolezni Lewyjevih telesc
US7674599B2 (en) * 2003-11-08 2010-03-09 Elan Pharmaceuticals, Inc. Methods of using antibodies to detect alpha-synuclein in fluid samples
US20050203010A1 (en) * 2003-11-14 2005-09-15 Atgen Co., Ltd. Novel peptides conferring environmental stress resistance and fusion proteins including said peptides
EA013752B1 (ru) 2004-08-09 2010-06-30 Элан Фармасьютикалз, Инк. Предупреждение и лечение синуклеинопатических и амилоидогенных заболеваний
US20080300204A1 (en) 2005-07-19 2008-12-04 University Of Rochester Alpha-Synuclein Antibodies and Methods Related Thereto
WO2007021255A1 (en) 2005-08-09 2007-02-22 Elan Pharmaceuticals, Inc. Antibodies to alpha-synuclein
US8147833B2 (en) * 2007-02-23 2012-04-03 Neotope Biosciences Limited Prevention and treatment of synucleinopathic and amyloidogenic disease
EP2118300B1 (en) 2007-02-23 2015-05-27 Prothena Biosciences Limited Prevention and treatment of synucleinopathic and amyloidogenic disease
US9387159B2 (en) 2013-03-13 2016-07-12 Transdermal Biotechnology, Inc. Treatment of skin, including aging skin, to improve appearance
US20150095800A1 (en) 2013-09-30 2015-04-02 Microsoft Corporation Prioritizing communications based on communication patterns

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