PT2118300E - Prevenção e tratamento da doença sinucleinopática e amiloidogénica - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

"PREVENÇÃO E TRATAMENTO DA DOENÇA SINUCLEINOPÁTICA E AMILOIDOGÉNICA" A patologia cerebral alfa-sinucleína (alfa-SN) é uma característica evidente de várias doenças neurodegenerativas, incluindo a doença de Parkinson (DP) , demência de corpos de Lewy (DeCL) , a variante da doença de Alzheimer com corpos de Lewy (VDACL), atrofia multi-sistémica (AMS), e neurodegeneração cerebral com acumulação de ferro tipo-1 (NCAF-1). Comum a todas estas doenças, denominadas por sinucleinopatias, são as inclusões proteicas insolúveis nos neurónios e glia, sendo compostas principalmente por alfa-SN.

Os corpos de Lewy e neurites de Lewy são inclusões intraneuronais, que são compostas principalmente por alfa-SN. Os corpos de Lewy e neurites de Lewy são as principais características neuropatológicas da doença de Parkinson (DP) . A DP e as outras doenças sinucleinopáticas têm sido referidas coletivamente como doenças de corpos de Lewy (DCL) . A DCL é caracterizada pela degeneração do sistema dopaminérgico, alterações motoras, disfunção cognitiva, e formação de corpos de Lewy (CLs). (McKeith et ai., Clinicai and pathological diagnosis of dementia with Lewy bodies (DLB): Report of the CDLB International Workshop, Neurology (1996) 47:1113-24) Outras DCLs incluem doença difusa de corpos de Lewy (DDCL), variante da doença de Alzheimer com corpos de Lewy (VDACL) , DP e doença de Alzheimer (DA) combinadas e atrofia multi-sistémica. A demência de corpos de Lewy (DeCL) é um termo cunhado para conciliar as diferenças na terminologia das DCLs.

Os distúrbios com CLs continuam a ser uma causa comum para distúrbios do movimento e deterioração cognitiva na população envelhecida (Galasko et al., Clinical-neuropathological correlations in Alzheimer's disease and related dementias. Arch. Neurol. (1994) 51:888-95). Embora a sua incidência continue a aumentar, criando um problema de saúde pública grave, até à data, estes distúrbios não são curáveis ou evitáveis, e a compreensão das causas e patogénese da DP é fundamental para o desenvolvimento de novos tratamentos (Tanner et al., Epidemiology of Parkinson's disease and akinetic syndromes, Curr. Opin. Neurol. (2000) 13:427-30). A causa para a DP é controversa e vários factores têm sido propostos com participativos, incluindo vários factores como neurotoxinas e suscetibilidade genética.

Nos últimos anos, surgiu uma nova esperança para a compreensão da patogénese da DP. Especificamente, vários estudos têm demonstrado que a proteína sináptica alfa-SN desempenha um papel central na patogénese da DP, dado que: (1) esta proteína acumula-se nos CLs (Spillantini et al., Nature (1997) 388:839-40; Takeda et al., AM J. Pathol. (1998) 152:367-72; Wakabayashi et al., Neurosci. Lett. (1997) 239:45-8), (2) as mutações no gene da alfa-SN estão co-segregadas com formas familiares raras de parkinsonismo (Kruger et al., Nature Gen. (1998) 18:106-8; Polymeropoulos MH, et al., Science (1997) 276:2045-7) e, (3) a sua sobre-expressão em ratos transgénicos (Masliah et al., Science (2000) 287:1265-9) e Drosophila (Feany et al. , Nature (2000) 404:394-8) mimetiza vários aspetos patológicos da DP. Assim, o facto de que a acumulação da alfa-SN no cérebro estar associada com alterações morfológicas e neurológicas semelhantes em espécies tão diversas como os seres humanos, ratos e moscas, sugere que esta molécula contribui para o desenvolvimento da DP.

Um fragmento de alfa-SN, previamente determinado como sendo um componente das plaquetas amiloides na DA, foi denominado como sendo um componente não-beta-amiloide (não-Αβ) da DA amiloide (CNA) (Iwai A., Biochim. Biophys. Acta (2000) 1502:95-109); Masliah et al., AM. J. Pathol (1996) 148:201-10; Uéda et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1993) 90:11282-6) . Embora a função exata de um CNA não seja conhecida, este pode desempenhar um papel crítico em eventos sinápticos, tais como a plasticidade neural, durante o desenvolvimento e aprendizagem, e a degeneração de terminais nervosos sob condições patológicas em DCLs, DA e outros distúrbios (Hasimoto et al., Alpha-Synuclein in Lewy body disease and Alzheimer's disease, Brain Pathol (1999) 9:707-20; Masliah, et al. , (2000)). A DA, a DP e a demência de corpos de Lewy (DeCL) , são os distúrbios neurodegenerativos mais comuns encontrados em idosos. Embora a sua incidência continue a aumentar, criando um problema de saúde pública grave, até à data, estes distúrbios não são curáveis ou evitáveis. Estudos epidemiológicos recentes têm demonstrado uma estreita relação clínica entre a DA e a DP, com cerca de 30 % dos pacientes com Alzheimer a terem também a DP. Em comparação com o resto da população envelhecida, os pacientes com DA são, portanto, mais propensos a desenvolver concomitante a DP. Além disso, os pacientes com DP que se tornaram dementes geralmente desenvolveram a DA clássica. Embora que cada doença neurodegenerativa pareça ter uma predileção por regiões do cérebro e populações celulares específicas, resultando em características patológicas distintas, a DP, a DA, DeCL e DCL também compartilham características patológicas comuns. Os pacientes com DA familiar, síndrome de Down ou DA esporádica, desenvolvem CLs na amígdala, que são as principais características neuropatológicas clássicas da DP. Além disso, cada doença está associada à degeneração de neurónios e de conexões sinápticas interneuronais e, eventualmente, à morte celular, à depleção de neurotransmissores e à acumulação anormal de proteínas mal-dobradas, os precursores que participam no funcionamento normal do sistema nervoso central. Os estudos bioquímicos têm confirmado a relação entre a DA, DP e DeCL.

As plaquetas neuríticas que são a marca patológica clássica da DA contêm o péptido beta-amiloide (Αβ) e o componente peptídico não-beta-amiloide (CNA). 0 Αβ é derivado de uma proteína precursora de grandes dimensões denominada por proteína precursora amiloide (APP). 0 CNA é derivado de uma proteína precursora de grandes dimensões denominada por componente não-beta-amiloide da APP, agora mais vulgarmente conhecida como alfa-SN. 0 CNA compreende os resíduos de aminoácidos 60-87 ou 61-95 da alfa-SN. Ambos Αβ e CNA foram inicialmente identificados em plaquetas amiloides como fragmentos proteolíticos das suas proteínas de comprimento total, para os quais foram identificados e clonados os ADNc de comprimento total. A alfa-SN é parte de uma grande família de proteínas que inclui a beta- e gama- sinucleína e sinoretina. No estado normal, a alfa-SN é expressa associada com sinapses e acredita-se que esta desempenha um papel na plasticidade neuronal, aprendizagem e memória. Foram identificadas mutações (Ala30Pro e Ala53Thr) da alfa-SN humana (h) que aumentam a agregação da alfa-SN, e que estão associadas a formas autossómicas dominantes raras da DP. O mecanismo pelo qual estas mutações aumentam a propensão de agregação da alfa-SN é desconhecido.

Apesar do facto de que várias mutações podem ser encontradas na APP e alfa-SN, na população, a maioria dos casos de DA e DP são esporádicos. As formas esporádicas mais frequentes destas doenças estão associadas com uma acumulação anormal de Αβ e alfa-SN respetivamente. No entanto, as razões para a sobre-acumulação destas proteínas são desconhecidas. A Αβ é segregada a partir dos neurónios e é acumulada em plaquetas amiloides extracelulares. Adicionalmente a Αβ pode ser detetada no interior dos neurónios. A alfa-SN acumula-se nas inclusões intraneuronais chamadas de CLs. Apesar das duas proteínas serem tipicamente encontradas em conjunto nas plaquetas neuríticas extracelulares da DA, estas também são ocasionalmente encontradas em conjunto nas inclusões intracelulares. Não são claros, quer os mecanismos pelos quais a acumulação de alfa-SN leva à neurodegeneração, quer os sintomas característicos da DP. No entanto, a identificação do papel dos factores de promoção e/ou bloqueio da agregação da alfa-SN, é fundamental para a compreensão da patogénese das DCLs e para o desenvolvimento de novos tratamentos para os distúrbios associados. A investigação para a identificação de tratamentos tem sido direcionada para a procura de compostos que reduzam a agregação da alfa-SN (Hashimoto, et al.), ou para o teste de factores de crescimento que promoverão a regeneração e/ou sobrevivência de neurónios dopaminérgicos, que são as células principalmente afetadas (Djaldetti et al., New therapies for Parkinson's disease, J. Neurol (2001) 248:357-62; Kirik et al., Long-term rAAV-mediated gene transfer of GDNF in the rat Parkinson's model: intrastriatal but not intranigral transduction promoles functional regeneration in the lesioned nigrostriatal system, J. Neurosci (2000) 20:4686-4700).

Estudos recentes num modelo da DA em ratos transgénicos demonstraram que os anticorpos contra ο Αβ 1-42 facilitaram, e simularam, a remoção de amiloide do cérebro, melhorando a patologia semelhante à DA e resultando num desempenho cognitivo melhorado (Schenk et al., Immunization with amyloid-β attenuates Alzheimer-disease-like pathology in PDAPP mouse, Nature (1999) 408:173-177; Morgan et al. , A-beta peptide vaccination prevents memory loss in an animal models of Alzheimer's disease, Nature (2000) 408:982-985; Janus et al., A-beta peptide immunization reduces behavioral impairment and plaques in a model of Alzheimer's disease, Nature (2000) 408:979-82) . Em contraste com as plaquetas amiloides extracelulares encontradas em cérebros de pacientes com Alzheimer, os corpos de Lewy são intracelulares, e os anticorpos normalmente não entram dentro da célula.

Surpreendentemente, atendendo à natureza intracelular dos CLs no tecido cerebral, os inventores foram bem-sucedidos na redução do número de inclusões em ratos transgénicos imunizados com sinucleína. A presente divulgação é dirigida, inter alia, para o tratamento da DP e outras doenças associadas com CLs, através da administração de sinucleína ou fragmentos de sinucleína, antigénios ou fragmentos resultantes que mimetizam a sinucleína, ou anticorpos para determinados epítopos da sinucleína, num paciente em condições de gerar uma resposta imunitária de efeito benéfico. Os inventores também conseguiram surpreendentemente reduzir o número de inclusões em ratos transgénicos imunizados com Αβ. A presente divulgação é dirigida, inter alia, para o tratamento da DP e outras doenças associadas com CLs, através da administração de Αβ, fragmentos de Αβ, antigénios ou fragmentos resultantes que mimetizam ο Αβ, ou anticorpos para determinados epítopos do Αβ, num paciente em condições de gerar uma resposta imunitária de efeito benéfico. A invenção satisfaz uma necessidade de longa data para os regimes terapêuticos de prevenção ou melhoramento da disfunção neuropatológica, e em alguns pacientes cognitiva, associados à DP e a outras doenças relacionadas com CLs.

Esta aplicação está relacionada com a Aplicação E.U.A. N° 11/710,248 depositada em 23 de fevereiro de 2006, Aplicação E.U.A. N° 11/660,015 depositada em 9 de fevereiro de 2006, Publicação PCT N° WO/2006/02058 depositada em 9 de agosto de 2005, Aplicação da Patente E.U.A. N°s 11/185,907 depositada em 19 de julho de 2005, 10/915,214 depositada em 9 de agosto de 2004, Patente E.U.A. N°s 6,787,523 e 6,923,964, Aplicação da Patente E.U.A. N°s 60/423012; 10/699517; e 10/698099, e Aplicação PCT N° PCT/US03/34527.

Breve sumário da invenção A presente invenção proporciona um anticorpo monoclonal anti-sinucleína 9E4, ou 9E4 humanizado ou quimérico, em que o anticorpo 9E4 é produzido pelo hibridoma JH17.9E4.3.37.1.14.2 depositado com o número de acesso ATCC PTA-8221. A invenção também proporciona usos terapêuticos, tal como definidos na reivindicação 5. A invenção também proporciona um método para a humanização do anticorpo monoclonal 9E4 produzido pelo hibridoma depositado com o número de acesso ATCC PTA-8221, compreendendo o processo: a determinação da sequência de aminoácidos das regiões CDR do anticorpo monoclonal; a seleção de um anticorpo recetor; e a produção de um anticorpo humanizado que compreende as RDCs provenientes do anticorpo monoclonal e estruturas da região variável do anticorpo recetor. A invenção também proporciona um método de produção de uma forma quimérica do anticorpo monoclonal 9E4 produzido pelo hibridoma depositado com o número de acesso ATCC PTA-8221, compreendendo o processo: a determinação da sequência de aminoácidos das cadeias leves e pesadas das regiões variáveis do anticorpo monoclonal; a seleção da região contante de cadeia leve e pesada; a produção de um anticorpo quimérico que compreende uma cadeia leve que possui a região variável de cadeia leve fundida com a região constante de cadeia leve, e uma cadeia pesada que possui a região variável de cadeia pesada fundida com a região constante de cadeia pesada. A invenção também proporciona uma célula do hibridoma JH17.9E4.3.37.1.14.2 depositado com o número de acesso ATCC PTA-8221.

Num aspeto, a divulgação proporciona métodos para a prevenção ou tratamento de uma doença caracterizada por corpos de Lewy ou agregação de alfa-SN no cérebro. Tais métodos envolvem a indução de uma resposta imunitária contra o alfa-SN. Tal indução pode ser conseguida pela administração ativa de um imunogénico, ou pela administração passiva através de um anticorpo, ou derivado de um anticorpo, para a sinucleina. Em alguns métodos, o paciente encontra-se assintomático. Em alguns métodos, o paciente tem a doença e encontra-se assintomático. Em alguns métodos, o paciente tem um fator de risco para a doença e encontra-se assintomático. Em alguns métodos, a doença é a doença de Parkinson. Em alguns métodos, a doença é a doença de Parkinson, e a administração do agente melhora as caracteristicas motoras do paciente. Em alguns métodos, a doença é a doença de Parkinson, e a administração do agente previne a detioração das características motoras do paciente. Em alguns métodos, o paciente não tem a doença de Alzheimer.

Para o tratamento de pacientes que sofrem de agregação de corpos de Lewy ou de alfa-SN no cérebro, um regime de tratamento envolve a administração ao paciente de uma dose de alfa-SN ou de um fragmento ativo seu, para a indução de uma resposta imunitária. Em alguns métodos, o alfa-SN ou um fragmento ativo seu, é administrado em múltiplas doses durante um período de pelo menos seis meses. 0 alfa-SN ou um fragmento ativo seu, pode ser administrado por via, a título de exemplo, periférica, intraperitoneal, oral, subcutânea, intracraniana, intramuscular, tópica, intranasal ou intravenosa. Em alguns métodos, o alfa-SN ou um fragmento ativo seu, é administrado com um adjuvante que aumenta a resposta imunitária para o alfa-SN ou um fragmento ativo seu. Em alguns métodos, a resposta imunitária compreende anticorpos para o alfa-SN ou um fragmento ativo seu.

Em alguns métodos, o agente é o conjunto dos aminoácidos 35-65 do alfa-SN. Em alguns métodos, o agente compreende os aminoácidos 130-140 do alfa-SN e tem menos do que 40 aminoácidos no total, ou menos do que 30 aminoácidos no total. Em alguns métodos, o agente compreende os aminoácidos 130-136 do alfa-SN e tem menos do que 40 aminoácidos no total, ou menos do que 30 aminoácidos no total. Em alguns métodos, os aminoácidos do C-terminal do agente são os aminoácidos do C-terminal do alfa-SN. Em alguns dos métodos referidos acima, o alfa-SN ou fragmento ativo está ligado a um veículo de transporte no N-terminal do alfa-SN ou de um fragmento ativo seu.

Em alguns métodos, o agente compreende os aminoácidos 91-99 do alfa-SN e tem menos do que 40 aminoácidos no total, ou menos do que 30 aminoácidos no total. Em alguns métodos, o agente compreende os aminoácidos 118-126 do alfa-SN e tem menos do que 40 aminoácidos no total, ou menos do que 30 aminoácidos no total. Em alguns métodos, o agente compreende os aminoácidos 1-10 do alfa-SN e tem menos do que 40 aminoácidos no total, ou menos do que 30 aminoácidos no total. Em alguns métodos, os aminoácidos do N-terminal do agente são os aminoácidos do N-terminal do alfa-SN. Em alguns dos métodos referidos acima, o alfa-SN ou fragmento ativo está ligado a um veículo de transporte no C-terminal do alfa-SN ou de um fragmento ativo. Em alguns dos métodos referidos acima, o alfa-SN ou fragmento ativo está ligado a uma molécula de transporte para formar um conjugado.

Em alguns métodos, o agente é administrado a um paciente por administração de um polinucleótido que codifica um polipéptido que compreende um fragmento do alfa-SN.

Para o tratamento de pacientes que sofrem de agregação de corpos de Lewy ou de alfa-SN no cérebro, um regime de tratamento envolve a administração ao paciente de uma dose de um anticorpo para o alfa-SN ou fragmento ativo, para a indução de uma resposta imunitária. O anticorpo utilizado pode ser humano, humanizado, quimérico ou policlonal, e pode ser monoclonal ou policlonal. Em alguns métodos, o isotipo do anticorpo é uma IgG 1 humana. Em alguns métodos, o anticorpo é preparado a partir de um humano imunizado com o péptido alfa-SN e o humano pode ser o paciente a ser tratado com o anticorpo. Em alguns métodos, o anticorpo liga-se à superfície exterior das células neuronais com corpos de Lewy, dissipando assim os corpos de Lewy. Em alguns métodos, o anticorpo é internalizado pelas células neuronais com corpos de Lewy, dissipando assim os corpos de Lewy.

Em alguns métodos, o anticorpo é administrado com um veículo de transporte farmacêutico, como sendo uma composição farmacêutica. Em alguns métodos, o anticorpo é administrado numa dose entre 0,0001 a 100 mg/kg, preferencialmente, pelo menos, 1 mg/kg de relação anticorpo e peso corporal. Em alguns métodos, o anticorpo é administrado em múltiplas doses durante um período prolongado, por exemplo, pelo menos seis meses. Em alguns métodos, os anticorpos podem ser administrados como uma composição de libertação sustentada. O anticorpo pode ser administrado por via, a título de exemplo, periférica, intraperitoneal, oral, subcutânea, intracraniana, intramuscular, tópica, intranasal ou intravenosa. Em alguns métodos, o paciente é monitorizado para o nível de anticorpo administrado, no sangue do paciente.

Em alguns métodos, o anticorpo é administrado a um paciente por administração de um polinucleótido que codifica pelo menos uma cadeia do anticorpo. O polinucleótido é expresso para produzir a cadeia do anticorpo no paciente. Opcionalmente, o polinucleótido codifica as cadeias pesadas e leves do anticorpo e o polinucleótido é expresso para produzir as cadeias pesadas e leves no paciente.

Esta invenção proporciona ainda, composições farmacêuticas que compreendem qualquer um dos anticorpos para o alfa-SN que são descritos na presente aplicação, e um veículo de transporte farmaceuticamente aceitável.

Num outro aspeto, a divulgação proporciona métodos para a prevenção ou tratamento de uma doença caracterizada por corpos de Lewy ou agregação de alfa-SN no cérebro, que compreende a administração de um agente que induz uma resposta imunitária contra o alfa-SN, e que compreende ainda a administração de um segundo agente que induz uma resposta imunitária contra ο Αβ no paciente. Em alguns métodos, o agente é Αβ ou um fragmento ativo seu. Em alguns métodos, o agente é um anticorpo para Αβ.

Num outro aspeto, a divulgação proporciona métodos para a prevenção ou tratamento de uma doença caracterizada por corpos de Lewy ou agregação de alfa-SN no cérebro, que compreende a administração de um agente que induz uma resposta imunitária contra ο Αβ no paciente. Em alguns métodos, o agente é Αβ ou um fragmento ativo seu. Em alguns métodos, o agente é um anticorpo para Αβ. Em alguns métodos, a doença é a doença de Parkinson. Em alguns métodos, o paciente não tem a doença de Alzheimer e não tem fatores de risco relacionados com a mesma. Em alguns métodos, compreende-se ainda a monitorização de um sinal ou sintoma da doença de Parkinson do paciente. Em alguns métodos, a doença é a doença de Parkinson e a administração do agente resulta na melhoria de um sinal ou sintoma da doença de Parkinson. São ainda proporcionadas composições farmacêuticas, que compreendem um agente eficaz para induzir uma resposta imunitária contra um componente de um corpo de Lewy num paciente, tal como descrito anteriormente, e um adjuvante farmaceuticamente aceitável. Em alguns compostos, o agente é alfa-SN ou um fragmento ativo seu, por exemplo, CNA, ou qualquer um dos fragmentos descritos na aplicação. São também são proporcionadas composições farmacêuticas que compreendem um anticorpo especifico para um componente de um corpo de Lewy. São também proporcionadas composições farmacêuticas, que compreendem um agente eficaz para induzir uma resposta imunitária num paciente, contra um componente CNA-sinucleíno de uma plaqueta amilóide. Em alguns compostos, o agente é alfa-SN ou um fragmento ativo seu, por exemplo, CNA, ou qualquer um dos fragmentos de alfa-sinucleina descritos na aplicação, e, opcionalmente, um adjuvante. Noutros compostos, o agente é um anticorpo ou fragmento seu que se liga especificamente ao alfa-SN ou a um fragmento seu, e, opcionalmente, a um veiculo de transporte farmacêutico.

Num outro aspeto, a divulgação proporciona métodos de rastreio da atividade de um anticorpo para a prevenção ou tratamento de uma doença associada com corpos de Lewy. Tais métodos envolvem o contacto de células neuronais que expressem sinucleina com o anticorpo. Posteriormente, determina-se se o contacto reduz os depósitos de sinucleina nas células, em comparação com células de controlo que não contactaram com o anticorpo.

Num outro aspeto, a divulgação proporciona métodos de rastreio da atividade de um anticorpo para a prevenção ou tratamento de uma doença com corpos de Lewy, presentes no cérebro de um paciente. Tais métodos envolvem o contacto do anticorpo com um polipéptido que compreende pelo menos cinco aminoácidos contíguos do alfa-SN. Posteriormente, determina-se se o anticorpo se liga especificamente ao polipéptido, a ligação específica fornece uma indicação de que o anticorpo possui atividade no tratamento da doença. São ainda proporcionados métodos para a afetação da profilaxia ou tratamento de uma doença, caracterizada por corpos de Lewy ou por agregação de alf a-sinucleína no cérebro. 0 método compreende a administração, a um paciente que tem ou em risco de ter a doença, de um polipéptido que compreende um fragmento imunogénico da alfa-sinucleína eficaz na indução de uma resposta imunitária, possuindo anticorpos que se ligam especificamente a um epítopo entre os resíduos 70-140 da alfa-sinucleína humana, sendo os resíduos numerados de acordo com a SEQ ID NO: 1, afetando assim a profilaxia ou tratamento da doença.

Opcionalmente, o fragmento imunogénico da alfa-sinucleína não contém os resíduos 1-69 da alfa-sinucleína, sendo os resíduos numerados de acordo com a SEQ ID NO: 1. Opcionalmente, a resposta imunitária compreende anticorpos que se ligam especificamente à alfa-sinucleína humana num epítopo selecionado a partir do grupo que consiste em SN83-101, SN107-125, SN110-128 e SN124-140, sendo os resíduos numerados de acordo com a SEQ ID NO: 1. Opcionalmente, a resposta imunitária não contém anticorpos que se ligam especificamente aos resíduos da alfa-sinucleína humana fora do epítopo selecionado. Opcionalmente, o fragmento imunogénico tem desde 5-20, 5-25 ou 5-30 aminoácidos contíguos a partir das posições entre 70-140 de alfa-sinucleína, sendo os resíduos numerados de acordo com a SEQ ID NO: 1. Opcionalmente, o fragmento imunogénico tem desde 5-20 aminoácidos contíguos a partir das posições entre 120-140 de alfa-sinucleína, sendo os resíduos numerados de acordo com a SEQ ID NO: 1. Opcionalmente, o fragmento imunogénico compreende um segmento de alfa-sinucleína humana selecionado a partir do grupo que consiste em SN87-97, SNlll-121, SN114-124 e SN128-136, e no total, não contém mais do que 40, ou não mais do que 30 resíduos contíguos de alfa-sinucleína, sendo os resíduos numerados de acordo com a SEQ ID NO: 1. Opcionalmente, o fragmento imunogénico compreende um segmento de alfa-sinucleína humana selecionado a partir do grupo que consiste em SN124-134, SN91-99 e SN118-126, e no total, não contém mais do que 40, ou não mais do que 30 resíduos contíguos de alfa-sinucleína, sendo os resíduos numerados de acordo com a SEQ ID NO: 1. Opcionalmente, o fragmento imunogénico compreende SN125-140, e no total, não contém mais do que 40, ou não mais do que 30 resíduos contíguos de alfa-sinucleína, sendo os resíduos numerados de acordo com a SEQ ID NO: 1. Opcionalmente, o fragmento imunogénico compreende SN130-140, e no total, não contém mais do que 40, ou não mais do que 30 resíduos contíguos de alfa-sinucleína, sendo os resíduos numerados de acordo com a SEQ ID NO: 1. Opcionalmente, o fragmento imunogénico compreende SN83-140, sendo os resíduos numerados de acordo com a SEQ ID NO: 1.

Opcionalmente, o fragmento imunogénico é selecionado de entre um grupo constituído por SN124-140, SN125-140, SN126-140, SN127-140, SN128-140, SN129-140, SN130-140, SN131-140, SN132-140, SN133-140, SN134-140, SN135-140, SN136-140, SN137-140, SN124-139, SN125-139, SN126-139, SN127-139, SN128-139, SN124-139, SN125-139, SN126-139, SN127-139, SN128-139, SN129-139, SN130-139, SN131-139, SN132-139, SN133-139, SN134-139, SN135-139, SN136-139, SN137-139, SN124-138, SN124-138, SN125-138, SN126-138, SN127-138, SN128-138, SN129-138, SN130-138, SN131-138, SN132-138, SN133-138, SN134-138, SN135-138, SN136-138, SN124-137, SN125-137, SN126-137, SN127-137, SN128-137, SN129-137, SN130-137, SN131-137, SN132-137, SN133-137, SN134-137, SN135-137, SN124-136, SN125-136, SN126-136, SN127-136, SN128-136, SN129-136, SN130-136, SN131-136, SN132-136, SN133-136 e SN134-136.

Opcionalmente, a resposta imunitária compreende anticorpos que se ligam especificamente à alfa-sinucleína humana num epítopo selecionado a partir do grupo que consiste em SNl-20, SN2-21, SN2-23 e SNl-40, sendo os resíduos numerados de acordo com a SEQ ID NO: 1. Opcionalmente, a resposta imunogénica não contém anticorpos que se ligam especificamente aos resíduos de alfa-sinucleína humana dentro da região SN25-69, SN25-140, SN40-69, SN40-140 ou SN70-140. Opcionalmente, o fragmento imunogénico tem desde 5-20, 5-25 ou 5-30 aminoácidos contíguos a partir das posições entre 70-140 de alfa-sinucleína, sendo os resíduos numerados de acordo com a SEQ ID NO: 1.

Opcionalmente, o fragmento imunogénico tem desde 5-20 aminoácidos contíguos a partir das posições entre 1 e 20, e 5-20 aminoácidos contíguos das posições entre 120 e 140 da alfa-sinucleína, sendo os resíduos numerados de acordo com a SEQ ID NO: 1. Opcionalmente, o fragmento imunogénico no total, não contém mais do que 40, ou não mais do que 30 resíduos contíguos de alfa-sinucleína, sendo os resíduos numerados de acordo com a SEQ ID NO: 1.

Opcionalmente, a resposta imunitária compreende anticorpos que se ligam especificamente à alfa-sinucleína humana num epítopo entre 1-20 resíduos da alfa-sinucleína humana, e num epítopo entre 70-140 resíduos da alfa-sinucleína humana. Opcionalmente, a resposta imunitária compreende anticorpos que se ligam especificamente à alfa-sinucleína humana num epítopo entre 1-20 resíduos da alfa-sinucleína humana, e num epítopo entre 120-140 resíduos da alfa-sinucleína humana. Opcionalmente, a resposta imunogénica não compreende anticorpos que se ligam especificamente à alfa-sinucleína humana num epítopo nos resíduos 41 e 119 da alfa-sinucleína humana.

Opcionalmente, o fragmento imunogénico está ligado a um veículo de transporte para a formação de um conjugado. Opcionalmente, o polipéptido compreende o fragmento imunogénico fundido com o veículo de transporte. Opcionalmente, o fragmento imunogénico está ligado ao veículo de transporte no C-terminal do fragmento de alfa-sinucleína. Opcionalmente, múltiplas cópias do fragmento estão interligadas com múltiplas cópias do veículo de transporte. Opcionalmente, o fragmento imunogénico é administrado com um adjuvante. Opcionalmente, a etapa de administração afeta, pelo menos, parcialmente a remoção de corpos de Lewy. Opcionalmente, a etapa de administração desagrega os corpos de Lewy. Opcionalmente, a etapa de administração reduz os níveis de oligómeros da alfa-sinucleína nas sinapses. Opcionalmente, a etapa de administração remove a sinucleína por ativação de uma via lisossomal.

Opcionalmente, a resposta imunitária é induzida pela administração de um único polipéptido ou proteína de fusão. Opcionalmente, a resposta imunitária é induzida pela administração de mais do que um polipéptido (por exemplo, dois polipéptidos). Opcionalmente, a resposta imunitária é induzida pela administração de um primeiro polipéptido que compreende um primeiro fragmento imunogénico da alfa-sinucleína, eficaz na indução de uma resposta imunitária, e que compreende anticorpos que se ligam especificamente num epítopo entre os resíduos 1-20 da alfa-sinucleína humana, e a administração de um polipéptido que compreende um segundo fragmento imunogénico da alfa-sinucleína, eficaz na indução de uma resposta imunitária, e que compreende anticorpos que se ligam especificamente num epítopo entre os resíduos 70-140, preferencialmente os resíduos 120-140, da alfa-sinucleína humana.

Opcionalmente, a resposta imunitária é induzida através da administração de dois ou mais polipéptidos em combinação. Opcionalmente, os dois ou mais polipéptidos são co-administrados e/ou co-formulados.

Num outro aspeto, a invenção proporciona uma composição que compreende um primeiro polipéptido compreendendo um primeiro fragmento imunogénico da alfa-sinucleína, e um segundo polipéptido que compreende um segundo fragmento imunogénico da alfa-sinucleína, em que o primeiro fragmento imunogénico é eficaz na indução de uma resposta imunitária que compreende anticorpos que se ligam especificamente a um epitopo entre os resíduos 1-20 da alfa-sinucleína humana, e o segundo fragmento imunogénico da alfa-sinucleína é eficaz na indução de uma resposta imunitária que compreende anticorpos que se ligam especificamente a um epitopo entre os resíduos 120-140 da alfa-sinucleína humana. Opcionalmente, a composição não contém um fragmento imunogénico da alfa-sinucleína que compreende os resíduos 25-69 da alfa-sinucleína. O primeiro e segundo fragmento imunogénico podem estar fisicamente ligados (por exemplo, como um conjugado ou uma proteína de fusão) . O primeiro e segundo fragmento imunogénico podem ser co-formulados. A divulgação proporciona ainda métodos para a afetação da profilaxia ou tratamento de uma doença, caracterizada por corpos de Lewy ou pela agregação de alfa-sinucleína no cérebro. Numa forma de realização, os métodos compreendem a administração, a um paciente que tem ou em risco de ter a doença, de um regime eficaz de um anticorpo que se liga especificamente a um epitopo entre os resíduos 70-140 da alfa-sinucleína humana, sendo os resíduos numerados de acordo com a SEQ ID NO: 1. Quando o anticorpo se liga especificamente a um epitopo entre os resíduos 70-140 da alfa-sinucleína humana, sendo os resíduos numerados de acordo com a SEQ ID NO: 1, opcionalmente, o anticorpo liga-se especificamente a um epitopo entre os resíduos 83-140 da alfa-sinucleína humana, sendo os resíduos numerados de acordo com a SEQ ID NO: 1. Opcionalmente, o anticorpo liga-se especificamente a um epitopo entre os resíduos 120-140 da alfa-sinucleína humana. Opcionalmente, o anticorpo liga-se especificamente a um epitopo dentro de um segmento de alfa-sinucleína humana, selecionado a partir do grupo que consiste em SN83-101, SN107-125, SN110-128, SN118-126, SN91-99, SN124-134 e SN124-140, sendo os resíduos numerados de acordo com a SEQ ID NO: 1.

Numa outra forma de realização, os métodos compreendem a administração, a um paciente que tem ou em risco de ter a doença, de um regime eficaz de um anticorpo que se liga especificamente a um epítopo entre os resíduos 1-40 da alfa-sinucleína humana, sendo os resíduos numerados de acordo com a SEQ ID NO: 1. Quando o anticorpo se liga especificamente a um epítopo entre os resíduos 1-40 da alfa-sinucleína humana, sendo os resíduos numerados de acordo com a SEQ ID NO: 1, opcionalmente, o anticorpo liga-se especificamente a um epítopo entre os resíduos 1-20, ou resíduos 1-10, sendo os resíduos numerados de acordo com a SEQ ID NO: 1.

Ainda noutra forma de realização, os métodos compreendem a administração, a um paciente que tem ou em risco de ter a doença, de um regime eficaz que compreende um primeiro anticorpo que se liga especif icamente a um epítopo dos resíduos 1-40 da alfa-sinucleína humana, e um segundo anticorpo que se liga especif icamente a um epítopo dos resíduos 70-140 da alfa-sinucleína humana, sendo os resíduos numerados de acordo com a SEQ ID NO: 1.

Quando um primeiro anticorpo que se liga especificamente a um epítopo entre os resíduos 1-40 da alfa-sinucleína humana e um segundo anticorpo se liga especificamente a um epítopo entre os resíduos 70-140 da alfa-sinucleína humana, sendo os resíduos numerados de acordo com a SEQ ID NO: 1, opcionalmente, o segundo anticorpo liga-se especificamente a um epítopo entre os resíduos 120-140 da alfa-sinucleína humana. Opcionalmente, o primeiro anticorpo e o segundo anticorpo são administrados simultaneamente. Opcionalmente, o primeiro anticorpo e o segundo anticorpo são administrados no mesmo ciclo de tratamento.

Opcionalmente, o anticorpo é um anticorpo monoclonal. Opcionalmente, o anticorpo é uma população policlonal de anticorpos em que falta a ligação especifica para os resíduos da alfa-sinucleína que estão fora do epítopo. Opcionalmente, o anticorpo é um anticorpo humanizado. Opcionalmente, o anticorpo é um anticorpo humano. Opcionalmente, o anticorpo é um anticorpo do isotipo da IgGl humana. Opcionalmente, o anticorpo é administrado com um veículo de transporte farmacêutico, como uma composição farmacêutica. Opcionalmente, o anticorpo é administrado numa dose entre 0,0001 a 100 mg/kg, preferencialmente, pelo menos, 1 mg/kg de relação anticorpo e peso corporal. Opcionalmente, o anticorpo é administrado em múltiplas doses durante um período prolongado, por exemplo, pelo menos seis meses. Opcionalmente, o anticorpo é administrado como uma composição de libertação sustentada. Opcionalmente, o anticorpo é administrado por via periférica, intraperitoneal, oral, subcutânea, intracraniana, intramuscular, tópica, intranasal ou intravenosa. Opcionalmente, o anticorpo é internalizado nas células neuronais com corpos de Lewy, dissipando assim os corpos de Lewy. Opcionalmente, o anticorpo liga-se à superfície externa das células neuronais que possuem corpos de Lewy, dissipando assim os corpos de Lewy. Opcionalmente, o anticorpo liga-se à alfa-sinucleína na superfície externa das células neuronais, promovendo a reticulação da alfa-sinucleína, em que a etapa de administração desagrega os corpos de Lewy. Opcionalmente, a etapa de administração reduz os níveis de oligómeros da alfa-sinucleína nas sinapses. Opcionalmente, a etapa de administração remove a sinucleína por ativação de uma via lisossomal. Em alguns métodos, a doença é a doença de Parkinson. Opcionalmente, o anticorpo liga-se especificamente a uma forma desnaturada da alfa-sinucleina humana, tal como determinado pelo ensaio immunoblot. Opcionalmente, o anticorpo liga-se especificamente a uma forma desnaturada da alfa-sinucleina humana, com uma afinidade de pelo menos 109 M_1. Opcionalmente, o anticorpo liga-se especificamente às sinapses tal como determinado por imunocitoquimica. A invenção também proporciona uma composição para a profilaxia ou tratamento de uma doença caracterizada por corpos de Lewy ou agregação da alfa-sinucleina no cérebro, que compreende um primeiro anticorpo monoclonal que se liga especificamente a um epítopo entre os resíduos 1-20 da alfa-sinucleina humana, e um segundo anticorpo monoclonal que se liga especificamente a um epítopo entre os resíduos 70-140 (e preferencialmente entre os resíduos 120-140) da alfa-sinucleina humana, sendo os resíduos numerados de acordo com a SEQ ID NO: 1. A invenção também proporciona um kit para a profilaxia ou tratamento de uma doença caracterizada por corpos de Lewy ou agregação da alfa-sinucleína no cérebro, que compreende um primeiro recipiente que contém um anticorpo que se liga especificamente a um epítopo entre os resíduos 1-20 da alfa-sinucleína humana, e um segundo recipiente que contém um anticorpo que se liga especif icamente a um epítopo nos resíduos 70-140 (e preferencialmente nos resíduos 120-140) da alfa-sinucleína humana, sendo os resíduos numerados de acordo com a SEQ ID NO: 1. A divulgação proporciona ainda métodos para a afetação da profilaxia ou tratamento de uma doença, caracterizada por corpos de Lewy ou pela agregação de alfa-sinucleína no cérebro. Os métodos compreendem a administração, a um paciente que tem ou em risco de ter a doença, de um regime eficaz de um agente que induz uma resposta imunitária, compreendendo anticorpos que se ligam especificamente a um epitopo nos resíduos 70-140 da alfa-sinucleína humana, sendo os resíduos numerados de acordo com a SEQ ID NO: 1, afetando assim a profilaxia ou tratamento da doença. Opcionalmente, a resposta imunitária não contém anticorpos que se ligam especificamente a um epitopo nos resíduos 1-69 da alfa-sinucleína humana, sendo os resíduos numerados de acordo com a SEQ ID NO: 1. Opcionalmente, a resposta imunitária compreende anticorpos que se ligam especificamente dentro de um segmento da alfa-sinucleína humana, selecionado a partir do grupo que consiste em SN83-101, SN107-125, SN110-128, SN118-126, SNl-99, SN124-134 e SN124-140, sendo os resíduos numerados de acordo com a SEQ ID NO: 1. A divulgação proporciona ainda métodos de rastreio da atividade de um agente, para o tratamento de uma doença caracterizada por corpos de Lewy. Os métodos compreendem o contacto do agente com um animal transgénico não-humano predisposto a desenvolver uma característica de uma doença com corpos de Lewy; e a determinação se o agente afeta a extensão ou a velocidade de desenvolvimento da característica, relativamente a um animal transgénico não-humano de controlo. O agente é: (i) um fragmento de alfa-sinucleína que induz anticorpos que se ligam especificamente a pelo menos um epitopo nos resíduos 70-140 da alfa-sinucleína humana; ou (ii) um anticorpo que se liga especificamente a um epitopo com os resíduos 70-140 da alfa-sinucleína humana, sendo os resíduos numerados de acordo com a SEQ ID NO: 1.

Opcionalmente, o animal transgénico não-humano compreende um transgene que expressa a alfa-sinucleína humana. Opcionalmente, o método compreende ainda o rastreio de uma pluralidade de anticorpos de teste para se ligarem a uma forma desnaturada da alfa-sinucleína humana, e a seleção do anticorpo com maior afinidade de ligação como o agente. Opcionalmente, o método compreende ainda, por imunocitoquímica, o rastreio de uma pluralidade de anticorpos de teste para a ligação a depósitos de sinucleína presentes numa secção de tecido, e a seleção do anticorpo com maior afinidade de ligação como o agente. A divulgação proporciona ainda um método para a humanização de um anticorpo monoclonal, selecionado a partir de 8A5, 6H7, 9E4, 1H7 e 11A5, que compreende: a determinação da sequência de aminoácidos das regiões CDR do anticorpo monoclonal; a seleção de um anticorpo recetor; e a produção de um anticorpo humanizado que compreende as RDCs derivadas do anticorpo monoclonal e estruturas da região variável do anticorpo recetor. A divulgação proporciona ainda um método de produção de uma forma quimérica de um anticorpo monoclonal selecionado a partir de 8A5, 6H7, 9E4, 1H7 e 11A5, que compreende: a determinação da sequência de aminoácidos das regiões variáveis referentes às cadeias leve e pesada do anticorpo monoclonal; a seleção da região constante referente às cadeias leve e pesada; a produção de um anticorpo quimérico que compreende uma cadeia leve compreendendo a região variável da cadeia leve fundida com a região constante da cadeia leve e uma cadeia pesada compreendendo a região variável da cadeia pesada fundida com a região constante da cadeia pesada. A divulgação proporciona métodos para a afetação da profilaxia ou tratamento de uma doença, caracterizada por corpos de Lewy ou pela agregação de alf a-sinucleína no cérebro, compreendendo o método a administração, a um paciente que tem ou em risco de ter a doença, de um regime eficaz de um anticorpo que se liga especif icamente a um epitopo nos resíduos 110-130 da alfa-sinucleína humana, sendo os resíduos numerados de acordo com a SEQ ID NO: 1. Opcionalmente, o anticorpo liga-se a um epitopo nos resíduos 118-126 da alfa-sinucleína humana. Opcionalmente, a doença é a doença de Parkinson. Opcionalmente, o anticorpo é um anticorpo monoclonal. Opcionalmente, o anticorpo é um anticorpo quimérico, um anticorpo humano ou um anticorpo humanizado. Opcionalmente, o anticorpo compete com o anticorpo monoclonal 9E4 derivado de ratos (número de acesso ATCC PTA-8221) para a ligação à alfa-sinucleína humana. Opcionalmente, o anticorpo é o anticorpo monoclonal 9E4 (número de acesso ATCC PTA-8221) ou o anticorpo 9E4 humanizado ou quimérico. Opcionalmente, o anticorpo é um anticorpo do isotipo da IgGl humana. Opcionalmente, o anticorpo é administrado com um veículo de transporte farmacêutico, como uma composição farmacêutica. Opcionalmente, o anticorpo é administrado numa dose entre 0,0001 a 100 mg de anticorpo/kg peso corporal. Opcionalmente, o anticorpo é administrado em múltiplas doses pelo menos durante seis meses. Opcionalmente, O anticorpo pode ser administrado por via intraperitoneal, oral, subcutânea, intracraniana, intramuscular, tópica, intranasal ou intravenosa. Opcionalmente, o anticorpo é administrado por via periférica. Opcionalmente, o anticorpo é administrado a uma dose de 1-10 mg/kg. A invenção proporciona um anticorpo monoclonal 9E4 (número de acesso ATCC PTA-8221) ou um anticorpo 9E4 humanizado ou quimérico A invenção também proporciona um método para a humanização de um anticorpo monoclonal 9E4 (número de acesso ATCC PTA-8221), que compreende: a determinação da sequência de aminoácidos das regiões CDR do anticorpo monoclonal; a seleção de um anticorpo recetor; e a produção de um anticorpo humanizado que compreende as RDCs provenientes do anticorpo monoclonal e estruturas da região variável do anticorpo recetor. A invenção também proporciona um método de produção de uma forma quimérica do anticorpo monoclonal 9E4 (número de acesso ATCC PTA-8221), que compreende: a determinação da sequência de aminoácidos das regiões variáveis referentes às cadeias leve e pesada do anticorpo monoclonal; a seleção da região constante referente às cadeias leve e pesada; a produção de um anticorpo quimérico que compreende uma cadeia leve compreendendo a região variável da cadeia leve fundida com a região constante da cadeia leve e uma cadeia pesada compreendendo a região variável da cadeia pesada fundida com a região constante da cadeia pesada. A invenção proporciona ainda um anticorpo monoclonal anti-sinucleína produzido pelo hibridoma JH17.9E4.3.37.1.14.2 (número de acesso ATCC PTA-8221), pelo hibridoma JH17.1H7.4.24.34 (número de acesso ATCC PTA-8220), ou pelo hibridoma JH22.11 A5.6.29.70.54.16.14 (número de acesso ATCC PTA-8222) . A invenção proporciona ainda um anticorpo quimérico ou humanizado de um anticorpo monoclonal produzido pelo hibridoma JH17.1H7.4.24.34 (número de acesso ATCC PTA-8220), ou pelo hibridoma JH22.11 A5.6.29.70.54.16.14 (número de acesso ATCC PTA- 8222).

A invenção proporciona ainda um método para a humanização de um anticorpo monoclonal produzido pelo hibridoma JH17.1H7.4.24.34 (número de acesso ATCC PTA-8220), ou pelo hibridoma 1H22.11A5.6.29.70.54.16.14 (número de acesso ATCC PTA-8222), que compreende: a determinação da sequência de aminoácidos das regiões CDR do anticorpo monoclonal; a seleção de um anticorpo recetor; e a produção de um anticorpo humanizado que compreende as RDCs provenientes do anticorpo monoclonal e estruturas da região variável do anticorpo recetor. A invenção proporciona ainda um método de produção de uma forma quimérica de um anticorpo monoclonal produzido pelo hibridoma JH17.1H7.4.24.34 (número de acesso ATCC PTA-8220), ou pelo hibridoma JH22.11A5.6.29.70.54.16.14 (Número de Acesso ATCC PTA-8222), que compreende: a determinação da sequência de aminoácidos das regiões variáveis referentes às cadeias leve e pesada do anticorpo monoclonal; a seleção da região constante referente às cadeias leve e pesada; a produção de um anticorpo quimérico que compreende uma cadeia leve compreendendo a região variável da cadeia leve fundida com a região constante da cadeia leve e uma cadeia pesada compreendendo a região variável da cadeia pesada fundida com a região constante da cadeia pesada. A invenção proporciona ainda uma célula do hibridoma JH17.9E4.3.37.1.14.2 (número de acesso ATCC PTA-8221). A divulgação também proporciona uma célula do hibridoma JH17.1H7.4.24.34 (número de acesso ATCC PTA-8220), ou do hibridoma JH22.111A5.6.29.70.54.16.14 (número de acesso ATCC PTA-8222). A invenção proporciona ainda uma utilização de um anticorpo, que se liga especificamente a um epítopo nos resíduos 110-130 da alfa-sinucleína humana, sendo os resíduos numerados de acordo com a SEQ ID NO: 1, no fabrico de um medicamento para o tratamento de uma doença caracterizada por corpos de Lewy ou agregação de alfa-sinucleína, no qual o anticorpo é administrado por uma via periférica, reduzindo os corpos de Lewy intracelulares ou a agregação da alfa-sinucleina por uma via lisossomal. Opcionalmente, o anticorpo entra numa célula por endocitose que contém um corpo de Lewy ou alfa-sinucleína agregada. Opcionalmente, o anticorpo liga-se à alfa-sinucleina ligada à membrana na parte exterior da célula, e um complexo de anticorpo e alfa-sinucleina sofre endocitose para o interior da célula, combinando-se com um lisossoma no interior da célula. Opcionalmente, o anticorpo e alfa-sinucleína são separadamente endocitados e combinados com um lisossoma no interior da célula. A divulgação proporciona ainda um método para a afetação da profilaxia ou tratamento de uma doença, caracterizada por corpos de Lewy ou pela agregação de alf a-sinucleina no cérebro, compreendendo o método a administração, a um paciente que tem ou em risco de ter a doença, de um regime eficaz de um agente que induz um anticorpo que se liga especificamente a um epítopo nos resíduos 110-130 da alfa-sinucleína humana, sendo os resíduos numerados de acordo com a SEQ ID NO: 1. Opcionalmente, o agente é um fragmento de alfa-sinucleína. Opcionalmente, o fragmento não tem mais, no total, do que 30 resíduos contíguos de alfa-sinucleína. Opcionalmente, o fragmento induz um anticorpo a um epítopo nos resíduos 118-126 da alfa-sinucleína. Opcionalmente, o fragmento compreende os resíduos 118-126 da alfa-sinucleína. Opcionalmente, o fragmento está ligado a um veículo de transporte.

Breve descrição das figuras A FIG. 1 apresenta a sequência de aminoácidos da alfa-SN (SEQ ID: 1), em alinhamento com duas sequências de aminoácidos CNA SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 3, respetivamente. A FIG. 2 apresenta as secções do cérebro fixadas imuno-histoquimicamente de ratos transgénicos (painéis A, E, e I), de ratos alfa-SN transgénicos imunizados com apenas adjuvante (painéis B, F, J), e de ratos alfa-SN transgénicos imunizados com alfa-SN que desenvolveram títulos baixos (painéis C, G e K) e títulos elevados (painéis D, Hei) de anticorpos contra a alfa-SN. As secções foram submetidas à fixação com um anticorpo anti-alfa-sinucleína para detetar os níveis de sinucleína (painéis A-D), um anticorpo anti-IgG para determinar os níveis totais de IgG presentes na secção (painéis E-H), e para a proteína ácida fibrilar glial (PAFG), um marcador de células astrogliais.

As FIGS. 3A-D apresentam os efeitos do anticorpo policlonal anti-mSYN na agregação de sinucleína em células transfetada GTl-7 como pode ser visto por microscopia de luz. A FIG. 4 é um Western blot dos níveis de sinucleína no citoplasma (C) e em membranas (P) de células GTl-7 a-syn, tratadas com soro pré-imune e com anticorpo 67-10 a uma concentração de (1:50), durante 48 horas anteriormente à análise. A FIG. 5 apresenta os resultados de estudos sobre o efeito da deposição amilóide da imunização com Αβ1-42 em cérebros de ratos não-transgénicos, SYN, APP e SYN/APP transgénicos. Os níveis amilóides detetáveis observados em ratos APP e SYN/APP são reduzidos pela imunização com a Αβ1-42. A FIG. 6 apresenta os resultados de estudos sobre o efeito da imunização com Αβ1-42 na formação de inclusões de sinucleína em cérebros de ratos não-transgénicos, SYN, APP e SYN/APP transgénicos. As inclusões de sinucleína detetadas em ratos SYN e SYN/APP são reduzidas pela imunização com Αβ1-42. A FIG. 7 apresenta os mecanismos diretos e indiretos através dos quais os anticorpos bloqueiam a agregação de alfa-SN. A FIG. 8 apresenta o mapeamento do epítopo do anticorpo. Os anticorpos de ratos que exibiram títulos elevados e elevada afinidade para a α-sinucleína anti-humana, foram mapeados utilizando a técnica ELISA. Na maioria das amostras de antissoro de ratos vacinados, os epítopos reconhecidos estavam dentro da região C-terminal da α-sinucleína. Nos soros de controlo tratados com a CFA, não foram detetados quaisquer epítopos. A FIG. 9 apresenta uma análise imagiológica dos níveis de imunorreatividade para α-sinucleína humana e outros marcadores de neurodegeneração. (A) Número médio de inclusões de ha-sinucleína positivas no córtex temporal. A vacinação com α-sinucleína humana resultou na diminuição significativa do número de inclusões em comparação com os controlos. Este efeito foi mais pronunciado em ratos do grupo II em oposição ao grupo I. (B) Área em forma de percentagem, referente ao neurópilo ocupado por terminais de sinaptofisina imunorreativos no córtex frontal. Em ratos transgénicos (tg) tratados apenas com CFA, o número de terminais de sinaptofisina com marcadores imunológicos diminuiu em 20%, ao passo que os níveis de imunorreatividade para a sinaptofisina por sinapse foram inalterados. (C) Os níveis de imunorreatividade para CD45 (marcador da microglia) no córtex temporal foram ligeiramente mais elevados nos cérebros de ratos vacinados com α-sinucleína humana. (D) Área em forma de percentagem, referente ao neurópilo ocupado por terminais imunorreativos para a α-sinucleína humana no córtex temporal. Em ratos tg vacinados com α-sinucleína humana, houve uma diminuição na acumulação de α-sinucleína nos terminais de sinaptofisina imunorreativos. *= diferença significativa em comparação com ratos tg para a α-sinucleína humana tratados com apenas com CFA (p<0,05, teste t de Student). A FIG. 10 apresenta a análise por Western blot dos níveis de α-sinucleína humana e imunorreatividade da sinaptofisina em animais vacinados. Em comparação com os cérebros de ratos tg tratados com apenas CFA (faixas 1-3), nos ratos tg vacinados com α-sinucleína (faixas 4-6), os níveis quer de oligómeros, quer de monómeros, da α-sinucleína diminuíram (faixa superior), enquanto os níveis da imunoreativadade da sinaptofisina aumentaram no último grupo (painel inferior). A FIG. 11 apresenta a análise de agregados intraneuronais de α-sinucleína, após a injeção intracerebral de anticorpos anti-a-sinucleína. O C-terminal do anticorpo 8A5 e o N-terminal do anticorpo 6H7 tiveram um efeito de remoção. IgGl, IgG2a e IgG2b foram isotipos de controlo. As barras horizontais representam a mediana. A FIG. 12 apresenta as seções do lado contralateral (painel esquerdo; os pontos castanhos redondos dentro da seção são agregados de α-sinucleína) e do lado ipsilateral (painel direito) de um rato injetado com o anticorpo monoclonal 8A5. A imunocoloração foi realizada com um anticorpo policlonal para α-sinucleína. Os agregados interneuronais de α-sinucleína do lado contralateral estão identificados por círculos. A FIG. 13 apresenta a remoção de agregados intraneuronais de α-sinucleína no neocórtex de ratos transgénicos que sobre-expressam a α-sinucleína humana, por anticorpos monoclonais anti-a-sinucleína 8A5, 9E4 e 6H7. A FIG. 14 apresenta a agregação de α-sinucleína na membrana e localização de α-sinucleína em lisossomas de ratos a-sinucleína humana, após uma única injeção intravenosa com 9E4-FITC. A FIG. 15 apresenta níveis reduzidos de oligómeros α-syn, e foram encontradas formas insolúveis de α-syn nos cérebros de ratos tg, injetados intraperitonealmente com uma dose de 9E4 de 1 mg/kg durante seis meses. A FIG. 16 apresenta níveis de beclina-1, de clivagem LC3 e Atg5, que foram aumentados e co-localizados com os agregados de α-syn em neurónios de ratos tg imunizados. A FIG. 17 apresenta como um anticorpo para um epítopo no, ou próximo do, C-terminal da α-syn, se transpõem para o SNC, reconhece agregados em neurónios afetados e desencadeia a remoção através de uma via lisossomal, como a autofagia.

Definição 0 termo "identidade substancial" significa que duas sequências peptídicas, quando alinhadas otimamente, como por exemplo através dos programas GAP ou BESTFIT que usam pesos de hiatos por defeito, partilham pelo menos 65 por cento da identidade de sequência, de preferência pelo menos 80 ou 90 por cento da identidade de sequência, mais preferencialmente pelo menos 95 por cento da identidade de sequência ou mais (por exemplo, 99 por cento da identidade de sequência ou superior). Preferencialmente, as posições dos resíduos que não são idênticas diferem por substituições conservativas de aminoácidos.

Para a comparação de sequências, tipicamente uma sequência atua como a sequência de referência, face à qual as sequências de teste são comparadas. Quando utilizado um algoritmo de comparação de sequências, as sequências de teste e de referência são introduzidas num computador, as coordenadas de subsequências são designadas, se necessário, e os parâmetros do programa do algoritmo de sequenciação são designados. 0 algoritmo de comparação de sequências calcula então a percentagem de identidade de sequência para a(s) sequência (s) de teste em relação à sequência de referência, com base nos parâmetros do programa designados. 0 alinhamento ótimo das sequências a comparar pode ser realizado, por exemplo, pelo algoritmo de homologia local de Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), pelo algoritmo de alinhamento de homologia de Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), pelo método de pesquisa de similaridade de Pearson & Lipman, Proc. Nat'1. Acad. Sei. USA 85:2444 (1988), por implementações

computadorizadas destes algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA no pacote de software Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), ou por inspeção visual (ver em geral Ausubel et ai., supra). Um exemplo de um algoritmo que é adequado para determinar a percentagem da identidade de sequência e a semelhança de sequências é o algoritmo BLAST, que está descrito em Altschul et ai., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990). O software para a realização de análises de BLAST está disponível publicamente através do website do National Center for Biotechnology Information (NCBI). Tipicamente, os parâmetros do programa presentes por defeito podem ser utilizados para a realização da comparação de sequências, embora parâmetros personalizados possam também ser utilizados. Para sequências de aminoácidos, o programa BLASTP usa como caracteristicas de defeito um comprimento de palavra (W) de 3, uma expectativa (E) de 10 e a matriz de pontuação BLOSUM62 (ver Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89, 10915 (1989)).

Para efeitos de classificação das substituições de aminoácidos como conservativas ou não conservativas, os aminoácidos são agrupados da seguinte forma: Grupo I (cadeias laterais hidrofóbicas): norleucina, met, ala, vai, leu, ile; Grupo II (cadeias laterais hidrófilas neutras): cys, ser, thr; Grupo III (cadeias laterais acidicas): asp, glu; Grupo IV (cadeias laterais básicas) : asn, gin, his, lys, arg; Grupo V (resíduos que influenciam a orientação da cadeia) : gly, pro; e Grupo VI (cadeias laterais aromáticas): trp, tyr, phe. As substituições conservativas envolvem substituições entre aminoácidos da mesma classe. As substituições não conservativas constituem a troca de um membro de uma destas classes por um membro de outra classe.

Os agentes terapêuticos da invenção são, em geral, substancialmente puros face a contaminantes indesejados. Isto significa que um agente está tipicamente, pelo menos, cerca de 50 % w/w (peso/peso) puro, assim como está substancialmente livre de proteínas e contaminantes de interferência. Por vezes, os agentes estão, pelo menos, cerca de 80 % w/w e, mais preferencialmente, pelo menos 90 ou cerca de 95 % w/w, puros. No entanto, utilizando técnicas convencionais de purificação de proteínas, podem ser obtidos péptidos homogéneos de pelo menos 99 % w/w. A frase que uma molécula "liga-se especificamente" a um alvo, refere-se a uma reação de ligação que é determinativa da presença da molécula na presença de uma população heterogénea de outros produtos biológicos. Assim, sob condições de imunoensaio designadas, uma molécula especificada liga-se preferencialmente a um alvo em particular e não se liga, numa quantidade significativa, a outros produtos biológicos presentes na amostra. A ligação especifica de um anticorpo a um alvo, sob tais condições, requer que o anticorpo seja selecionado pela sua especificidade face ao alvo. Uma variedade de formatos de imunoensaios pode ser utilizada para selecionar anticorpos especificamente imunorreativos para uma proteína em particular. Por exemplo, imunoensaios ELISA em fase sólida são rotineiramente usados para selecionar anticorpos monoclonais especificamente imunorreativos para uma proteína. Ver, por exemplo, Harlow e Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York, para uma descrição de formatos de imunoensaios e condições que podem ser utilizados para determinar imunorreatividade específica. A ligação específica entre duas entidades significa uma afinidade de pelo menos ΙΟ6, ΙΟ7, ΙΟ8, 109 M_1 ou IO10 M_1. Afinidades superiores a 108 M_1 são preferenciais. 0 termo "anticorpo" ou "imunoglobulina" é usado para incluir anticorpos intactos e fragmentos de ligação resultantes destes. Tipicamente, os fragmentos competem com o anticorpo intacto, a partir do qual eles foram derivados, pela ligação a um antigénio específico. Os fragmentos incluem cadeias pesadas separadas, cadeias leves, Fab, Fab', F(ab')2, Fabc e Fv. Os fragmentos são produzidos por técnicas de ADN recombinante, ou por separação enzimática ou química de imunoglobulinas intactas. 0 termo "anticorpo" também inclui uma ou mais cadeias de imunoglobulina que são quimicamente conjugadas, ou expressas, como proteínas de fusão com outras proteínas. 0 termo "anticorpo" também inclui um anticorpo biespecífico. Um anticorpo biespecífico ou anticorpo bifuncional, é um híbrido artificial que tem dois pares diferentes de cadeias pesadas/leves e dois locais diferentes de ligação. Os anticorpos biespecificos podem ser produzidos por uma variedade de métodos, incluindo a fusão de hibridomas ou de fragmentos Fab' de ligação. Ver, por exemplo, Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990); Kostelny et ai., J. Immunol. 148, 1547-1553 (1992). O termo "anticorpo" também inclui anticorpos de cadeia simples, em que os domínios variáveis da cadeia leve e pesada estão ligados através de um espaçador. APP695, APP751 e app770 , referem-se respetivamente aos polipéptidos com 695, 751 e 770 resíduos de aminoácidos de comprimento, codificados pelo gene APP humano. Ver, Rang et ai., Nature 325, 773 (1987); Ponte et ai., Nature 331, 525 (1988); e Kitaguchi et al., Nature 331, 530 (1988). Aos aminoácidos dentro da proteína precursora amiloide (APP) são atribuídos números de acordo com a sequência da isoforma APP770. Termos como Αβ39, Αβ40, Αβ41, Αβ42 e Αβ43 referem-se a um péptido Αβ que contém os resíduos de aminoácidos 1-39, 1-40, 1-41, 1-42 e 1-43.

Um "antigénio" é uma entidade à qual se liga um anticorpo especificamente. O termo "epítopo" ou "determinante antigénico" refere-se a um local num antigénio ao qual células-B e/ou T respondem. Epítopos de células-B podem ser formados tanto a partir de aminoácidos contíguos ou aminoácidos não contíguos justapostos, através da dobragem terciária de uma proteína. Os epítopos formados a partir de aminoácidos contíguos, são tipicamente mantidos face à exposição a solventes desnaturantes, enquanto os epítopos formados por dobragem terciária são tipicamente perdidos no tratamento com solventes desnaturantes. Um epítopo tipicamente inclui pelo menos 3, e mais usualmente, pelo menos 5 ou 8-10, aminoácidos numa conformação espacial única. Métodos de determinação da conformação espacial de epítopos incluem, por exemplo, cristalografia de raios-X e de ressonância magnética nuclear bidimensional. Ver, por exemplo, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Glenn E. Morris, Ed. (1996). Anticorpos que reconhecem ο mesmo epítopo podem ser identificados num simples imunoensaio, demonstrando a capacidade de um anticorpo para bloquear a ligação de outro anticorpo a um antigénio alvo. As células-T reconhecem epítopos contínuos de cerca de nove aminoácidos para as células CD8, ou de cerca de 13-15 aminoácidos para as células CD4. As células-T que reconhecem o epítopo podem ser identificadas por ensaios in vitro que medem a proliferação dependente de antigénio, tal como determinado pela incorporação de 3H-timidina através de células-T ativadas em resposta a um epítopo (Burke et al., J. Inf. Dis. 170, 1110-19 (1994)), pelo efeito de morte dependente de antigénio (ensaio citotóxico linfócito T, Tigges et al. , J. Immunol. 156, 3901-3910) ou pela secreção de citocinas. O termo resposta "imunológica" ou "imunitária" é o desenvolvimento de uma resposta humoral benéfica (mediada por anticorpos) e/ou uma resposta celular (mediada por células-T específicas para o antigénio ou seus produtos de secreção) dirigida contra um péptido amiloide num paciente recetor. Tal resposta, pode ser uma resposta ativa induzida pela administração de um imunogénio, ou uma resposta passiva induzida pela administração de anticorpos ou de células-T ativadas. Uma resposta imunitária celular é suscitada pela apresentação de epítopos de polipéptidos em associação com moléculas MHC de classe I ou classe II, para a ativação de células-T CD4+ auxiliares e/ou células-T CD8+ citotóxicas, especificas para o antigénio. A resposta pode envolver também a ativação de monócitos, macrófagos, basófilos, células NK, células dendriticas, astrócitos, células da microglia, eosinófilos ou outros componentes de imunidade inata. A presença de uma resposta imunológica mediada por células pode ser determinada por ensaios de proliferação de células CD4+ (células-T) ou ensaios LTC (linfócitos T citotóxicos) (ver Burke, supra; Tigges, supra). As contribuições relativas das respostas humoral e celular para o efeito protetor ou terapêutico de um imunogénico, podem ser distinguidas pelo isolamento separado de anticorpos e células-T a partir de um animal singeneico imunizado, e medindo o efeito protetor ou terapêutico num segundo sujeito.

Um "agente imunogénico" ou "imunogénio" é capaz de induzir uma resposta imunológica contra si mesmo na administração a um mamífero, opcionalmente em conjunto com um adjuvante. 0 termo "tudo-D" refere-se a péptidos que possuem >15%, > 80 %, > 85 %, > 90 %, > 95 % e 100% de aminoácidos com configuração-D. O termo "polinucleótido nu" refere-se a um polinucleótido não complexado com materiais coloidais. Polinucleótidos nus são por vezes clonados num vetor plasmídico. O termo "adjuvante" refere-se a um composto que quando administrado em conjunto com um antigénio aumenta a resposta imunitária contra o antigénio, mas quando administrado sozinho não gera uma resposta imunitária face ao antigénio. Os adjuvantes podem aumentar uma resposta imunitária através de vários mecanismos, incluindo o recrutamento de linfócitos, a estimulação de células-B e/ou T e estimulação de macrófagos. 0 termo "paciente" inclui sujeitos humanos e outros mamíferos que recebem quer um tratamento profilático ou um tratamento terapêutico. A competição entre anticorpos é determinada através de um ensaio em que a imunoglobulina em teste, inibe a ligação específica de um anticorpo de referência a um antigénio comum, tal como a alfa-SN. Vários tipos de ensaios de ligação competitiva são conhecidos, por exemplo: Radioimunoensaio direto ou indireto em fase sólida (RIA), imunoensaio enzimático direto ou indireto em fase sólida (EIA), ensaio de competição em sanduíche (ver Stahli et ai., Methods in Enzymology 9:242-253 (1983)); EIA biotina-avidina direto em fase sólida (ver Kirkland et ai., J. Immunol. 137:3614-3619 (1986)); ensaio direto com marcador em fase sólida, ensaio em sanduíche direto com marcador em em fase sólida (ver Harlow e Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988)); RIA direto com marcador em fase sólida usando o marcador 1-125 (ver Morei et ai., Molec. Immunol. 25(1):7-15 (1988));); EIA biotina-avidina direto em fase sólida (Cheung et ai., Virology 176:546-552 (1990)); e RIA direto com marcador (Moldenhauer et ai., Scand. J. Immunol. 32:77-82 (1990)). Tipicamente, tal ensaio envolve a utilização de antigénios purificados e ligados a uma superfície sólida ou células portadoras de qualquer um destes, uma imunoglobulina de teste sem marcador e uma imunoglobulina de referência com marcador. A inibição competitiva é medida pela determinação da quantidade de marcador ligado à superfície sólida ou às células, na presença da imunoglobulina de teste. Geralmente a imunoglobulina de teste está presente em excesso. Os anticorpos identificados pelo ensaio de competição (anticorpos competidores) incluem anticorpos que se ligam ao mesmo epítopo que o anticorpo de referência, e anticorpos que se ligam a um epitopo adjacente suficientemente próximo do epitopo ligado ao anticorpo de referência, ocorrendo assim impedimento estereoquimico. Geralmente, quando um anticorpo competidor está presente em excesso, este irá inibir a ligação especifica de um anticorpo de referência a um antigénio comum pelo menos em 50 % ou 75 %. O termo "sintoma" ou "sintoma clinico" refere-se a uma evidência subjetiva de uma doença, tal como a alteração da marcha, como entendida pelo paciente. Um "sinal" refere-se a uma evidência objetiva de uma doença como observado por um médico. A frase "em combinação", quando se refere à administração de dois ou mais anticorpos para a alf a-sinucleina anti-humana (isto é, cada um reconhecendo um epitopo diferente), ou à administração de dois ou mais polipéptidos ou imunogénios que induzem uma resposta de anticorpos contra a alfa-sinucleina humana, inclui a administração simultânea e a administração no mesmo ciclo de tratamento. A administração simultânea de agentes engloba, a administração dos agentes como uma proteína de fusão ou conjugado (por exemplo, fisicamente ligados um ao outro), uma co-f ormulação (por exemplo, em que os agentes são combinados ou compostos numa forma de dose, por exemplo, de libertação sustentada ou formulação de depósito), a administração como composições separadas num período, uma face à outra, desde alguns minutos ou até duas horas (co-administração), ou a administração como composições separadas no mesmo dia. Administração no mesmo ciclo de tratamento significa que ambos os agentes são administrados a um paciente para o tratamento ou profilaxia da mesma condição. Cada agente pode ser administrado uma vez ou várias vezes. Por exemplo, um agente pode ser administrado em primeiro lugar, e o segundo agente pode ser administrado no dia seguinte ou na semana seguinte. Da mesma forma, os dois agentes podem ser administrados mais do que uma vez, por exemplo, em dias sequenciais, dias alternados, semanas alternadas ou de acordo com outras programações (por exemplo, de tal modo que os benefícios para o paciente deverão ser superiores àqueles da administração do agente apenas).

Um fragmento designado na forma SNx-y significa um fragmento de alfa-sinucleína, que começa no aminoácido X e termina no aminoácido Y. Tal fragmento pode ser ligado a um polipéptido heterólogo, mas não a outros aminoácidos da alfa-sinucleína humana cujo fragmento comece antes de X ou termine após de Y.

Os resíduos na alfa-sinucleína ou num fragmento seu, são numerados de acordo com a SEQ ID NO: 1, quando alfa-sinucleína ou o fragmento está maximamente alinhada(o) com a SEQ ID NO: 1, tal como descrito anteriormente e utilizando os parâmetros de defeito.

As composições ou métodos "compreendendo" um ou mais elementos recitados, podem incluir outros elementos não especificamente recitados. Por exemplo, uma composição que compreende o péptido alfa-SN abrange quer um péptido de alfa-SN isolado, quer um péptido de alfa-SN como componente de uma sequência de um polipéptido maior.

Descrição detalhada da invenção I. Geral A invenção proporciona métodos de prevenção ou tratamento de várias doenças e condições, caracterizadas pela presença de depósitos do péptido alfa-SN, agregados como massas insolúveis no cérebro de um paciente na forma de corpos de Lewy. Tais doenças são coletivamente referidas como doenças com corpos de Lewy (DCL) e incluem a doença de Parkinson (DP) . Tais doenças são caracterizadas por agregados de alfa-SN que têm uma estrutura em folha-β pregueada e são fixadas com tioflavina-S e vermelho-Congo (ver Hasimoto, Ibid) . A invenção proporciona métodos para a prevenção ou tratamento de tais doenças, utilizando um agente que pode gerar uma resposta imunitária para a alfa-SN. A resposta imunitária atua de modo a evitar a formação, ou remoção, de depósitos de sinucleína no interior de células cerebrais. Apesar do entendimento do mecanismo não ser essencial para a prática da invenção, a resposta imunitária pode induzir a remoção, sendo a remoção o resultado da internalização dos anticorpos para a sinucleína em células apenas ou em células com alfa-sinucleína. Os resultados apresentados nos Exemplos demonstram que os anticorpos administrados perifericamente para a alfa-sinucleína, atravessam a barreira hematoencefálica, e são internalizados, quer sozinhos quer com a alfa-sinucleína, no interior de células que contêm depósitos de alfa-sinucleína. Os anticorpos internalizados podem promover a degradação da alfa-sinucleína através da ativação de vias lisossomais. Os anticorpos internalizados com afinidade para a forma desnaturada da alfa-sinucleína, podem também estabilizar a molécula numa forma não agregada. Alternativamente ou adicionalmente, os anticorpos podem interferir com a agregação de sinucleína na superfície exterior das células.

Por exemplo, os anticorpos para a alfa-sinucleína podem reconhecer e reticular proteínas com conformações anormais na superfície de células neuronais. Em alguns métodos, a resposta de remoção pode ser efetuada, pelo menos em parte, pelo recetor Fc mediador da fagocitose. A imunização com sinucleína pode reduzir a acumulação de sinucleina em sinapses e em corpos celulares neuronais do cérebro. Apesar do entendimento do mecanismo não ser essencial para a prática da invenção, este resultado pode ser explicado pela absorção de anticorpos para a sinucleína pelas células neuronais (por exemplo, por vesículas sinápticas).

Opcionalmente, agentes que geram uma resposta imunitária contra a alfa-SN, podem ser utilizados em combinação com agentes que geram uma resposta imunitária para a Αβ. A resposta imunitária é útil na remoção de depósitos de Αβ em indivíduos com tais depósitos (por exemplo, os indivíduos que têm ambas as doenças de Parkinson e de Alzheimer) ; no entanto, a resposta imunitária também tem atividade na remoção de depósitos de sinucleína. Assim, estes agentes podem ser utilizados isoladamente, ou em combinação com agentes que geram uma resposta imunitária para a alfa-SN, em indivíduos com DCL, mas que não sofram, ou estão em risco de desenvolvimento, da doença de Alzheimer. A invenção proporciona ainda composições farmacêuticas e métodos para a prevenção e tratamento da doença amiloidogénica. Tem sido demonstrado que a alfa e beta-sinucleína estão envolvidas na nucleação de depósitos amiloides em certas doenças amiloides, em particular na doença de Alzheimer. (Clayton, D.F., et al., TINS 21(6): 249-255, 1998). Mais especificamente, um fragmento do domínio CNA da alfa e beta-sinucleína (resíduos 61-95) foi isolado a partir de plaquetas amiloides em pacientes com a doença de Alzheimer; na verdade, este fragmento compreende cerca de 10 % das plaquetas que permanecem insolúveis após solubilização com dodecil sulfato de sódio (DSS). (George, J.M., et al. Neurosci. News 1: 12-17, 1995). Além disso, tanto a alfa-SN de comprimento total e o fragmento CNA resultante da mesma, têm sido relatados com aceleradores da agregação do péptido β-amiloide para uma forma amiloide insolúvel in vitro. (Clayton, supra). O componente CNA das plaquetas amiloides serve como um alvo para os tratamentos de base imunológica da presente divulgação, como detalhado abaixo. De acordo com um aspeto, a divulgação inclui composições farmacêuticas que compreendem agentes eficazes para suscitar uma resposta imunitária face a um componente CNA-sinucleína presente numa plaqueta amiloide num paciente. Tais composições podem ser eficazes para prevenir, retardar ou reduzir a deposição de plaquetas amiloides na doença. II. Agentes que geram uma resposta imunitária contra a alfa-sinucleina

Uma resposta imunitária pode ser ativa, quando um imunogénio é administrado para induzir anticorpos reativos face à alfa-SN de um paciente, ou passiva, quando é administrado um anticorpo que se liga à alfa-SN de um paciente. 1. Agentes Indutores de Resposta Imunitária Ativa

Os agentes terapêuticos induzem uma resposta imunitária especificamente dirigida a determinados epítopos dentro do péptido alfa-SN. Os agentes preferenciais são o próprio péptido alfa-SN e os seus fragmentos. A aplicação da patente E.U.A. N° US20060259986A1 e a publicação da patente PCT WO 05/013889, divulgam novos fragmentos de alfa- sinucleína úteis nos métodos de prevenção e tratamento da doença sinucleinopática e amiloidogénica. Opcionalmente, estes fragmentos podem ser utilizados em combinação com um adj uvante. A alfa-sinucleina foi originalmente identificada em cérebros humanos como a proteína precursora do componente não-beta-amiloide (CNA) das plaquetas na DA. (Uéda et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 90 (23):11282-11286 (1993)). A alfa-SN, também denominada por precursor do componente não-beta da DA amiloide (PCNA), é um péptido de 140 aminoácidos. A alfa-SN tem a sequência de aminoácidos: MDVFMKGLSKAKEGWAAAEKTKQGVAEAAGKTKEGVLYVGSKTKEGW HGVATVAEKTKEQVTNVGGAWTGVTAVAQKTVEGAGSIAAATGFVKKDQLGKNE EGAPQEGILEDMPVDPDNEAYEMPSEEGYQDYEPEA (SEQ ID NO:l) (Uéda et al., Ibid.; GenBank accession number: P37840). O componente não-beta da DA amiloide (CNA) é derivado a partir da alfa-SN. CNA, um domínio altamente hidrofóbico dentro da alfa-sinucleína, é um péptido que consiste em pelo menos 28 resíduos de aminoácidos (resíduos 60-87) (SEQ ID NO: 3) e, opcionalmente, 35 resíduos de aminoácidos (resíduos 61-95 ) (SEQ ID NO: 2) . Ver Fig. 1. O CNA exibe uma tendência para formar uma estrutura de folha-beta (Iwai, et al., Biochemistry, 34:10139-10145). Jensen et al. relataram que o CNA tem a sequência de aminoácidos: EQVTNVGGAWTGVTAVAQKTVEGAGSIAAATGFV (SEQ ID NO: 2) (Jensen et ai., Biochem. J. 310 (Pt 1): 91-94 (1995); Número de acesso GenBank S56746) . Uéda et al. reportaram que o CNA tem a sequência de aminoácidos: KEQVTNVGGAWTGVTAVAQKTVEGAGS (SEQ ID NO: 3) (Uéda et al., PNAS USA 90:11282-11286 (1993)).

Alfa-SN desagregada ou os seus fragmentos, incluindo CNA, significam unidades monoméricas peptídicas. A alfa-SN desagregada ou os seus fragmentos são geralmente solúveis, e são capazes de auto-agregação para formação de oligómeros solúveis. Os oligómeros de alfa-SN e os seus fragmentos são geralmente solúveis e existem predominantemente como alfa-hélices. A alfa-SN monomérica pode ser preparada in vitro por dissolução, com sonicação, do péptido liofilizado em DMSO puro. A solução resultante é centrifugada para remover quaisquer partículas insolúveis. Agregados de alfa-SN ou os seus fragmentos, incluindo o CNA, significam oligómeros de alfa-SN ou os seus fragmentos, que se associaram em construções de folha-beta insolúveis. Agregados de alfa-SN ou os seus fragmentos, incluindo o CNA, significam também polímeros fibrilares. As fibrilas são geralmente insolúveis. Alguns anticorpos ligam-se quer à alfa-SN solúvel ou aos seus fragmentos solúveis, quer aos agregados de alfa-SN ou aos seus fragmentos agregados. Alguns anticorpos ligam-se mais fortemente a oligómeros de alfa-sinucleína, do que a formas monoméricas ou formas fibrilares. Alguns anticorpos ligam-se à alfa-SN quer solúvel quer em forma agregada, ou aos seus fragmentos, e, opcionalmente, de igual modo às formas oligoméricas. A alfa-SN, o principal componente dos corpos de Lewy característicos da DP, e fragmentos epitópicos desta, tais como, por exemplo, o CNA, ou outros fragmentos de CNA, tais como fragmentos no, ou perto do, N-terminal, ou no, ou perto do, C-terminal, podem ser usados para induzir uma resposta imunitária. Preferencialmente, tais fragmentos compreendem quatro ou mais aminoácidos da alfa-SN ou de um análogo seu resultante.

Outros componentes de corpos de Lewy, por exemplo, sinfilina-1, Parkina, ubiquitina, neurofilamento, beta-cristalina e fragmentos epitópicos destes, podem também ser utilizados para induzir uma resposta imunitária.

Como se observa, certos fragmentos preferenciais da alfa-sinucleína são da região C-terminal da molécula. Estes fragmentos não têm os resíduos 1-69 da alfa-sinucleína humana. A imunização com tais fragmentos gera uma resposta imunitária que compreende anticorpos para um ou mais dos epítopos nos resíduos 70-140 da alfa-sinucleína humana. Alguns fragmentos ativos incluem um epítopo no, ou próximo do, C-terminal da alfa-SN (por exemplo, nos aminoácidos 70-140, 100-140, 120-140, 130-140 ou 135-140). Alguns fragmentos ativos incluem um epítopo na, ou perto da, região reconhecida pelo anticorpo monoclonal 8A5. Alguns fragmentos ativos incluem um epítopo na, ou perto da, região reconhecida pelo anticorpo monoclonal 9E4 (por exemplo, nos aminoácidos 90-140, 98-140, 108-136, 110-130 ou 118-126). Alguns fragmentos ativos incluem um epítopo na, ou perto da, região reconhecida pelo anticorpo monoclonal 1H7 (por exemplo, nos aminoácidos 70-119, 80-109, 88-101, ou 91-99). Em alguns fragmentos ativos, o resíduo do C-terminal do epítopo é o resíduo do C-terminal da alfa-SN.

Alguns fragmentos da alfa-sinucleína geram anticorpos que se ligam especif icamente a um epítopo num ou mais dos seguintes fragmentos: SN83-101, SN107-125, SN110-128, SN124-140, SN110-130, SN85-105, SN118-126 e SN91-99, da alfa-sinucleína humana. Alguns fragmentos geram anticorpos que se ligam especificamente e de forma exclusiva num dos fragmentos acima. Por exemplo, o fragmento SN83-101 começa no resíduo 83 e termina no resíduo 101 da alfa-sinucleína, gerando apenas anticorpos que se ligam especificamente ao SN83-101. Fragmentos imunogénicos da região C-terminal incluem SN85-99, SN109-123, SN112-126 e SN126-138 (como demonstrado na Fig. 8), SN110-130, SN85-105 e outros fragmentos que diferem de um dos anteriores, até dois ou menos aminoácidos adicionais em ambas as extremidades. Outro fragmento preferencial, o SN83-140, inclui todos estes epítopos.

Alguns fragmentos não contém mais do que 40, ou não mais do que 30, resíduos contíguos de alfa-sinucleína. Alguns destes fragmentos compreendem SN125-140, SN130-140, SN87-97, SNlll-121, SN114-124 ou SN128-136. Alguns fragmentos têm um total de 5-20, 5-25 ou 5-30 aminoácidos contíguos a partir de metade do C-terminal da alfa-sinucleína (isto é, os resíduos 70-140) .

Alguns fragmentos têm 5-20 aminoácidos contíguos a partir das posições entre 120-140 da alfa-sinucleína. Fragmentos particularmente preferenciais incluem SN124-140, SN125-140, SN126-140, SN127-140, SN128-140, SN129-140, SN130-140, SN131-140, SN132-140, SN133-140, SN134-140, SN135-140, SN136-140, SN137-140, SN124-139, SN125-139, SN126-139, SN127-139, SN128-139, SN124-139, SN125-139, SN126-139, SN127-139, SN128-139, SN129-139, SN130-139, SN131-139, SN132-139, SN133-139, SN134-139, SN135-139, SN136-139, SN137-139, SN124-138, SN124-138, SN125-138, SN126-138, SN127-138, SN128-138, SN129-138, SN130-138, SN131-138, SN132-138, SN133-138, SN134-138, SN135-138, SN136-138, SN124-137, SN125-137, SN126-137, SN127-137, SN128-137, SN129-137, SN130-137, SN131-137, SN132-137, SN133-137, SN134-137, SN135-137, SN124-136, SN125-136, SN126-136, SN127-136, SN128-136, SN129-136, SN130-136, SN131-136, SN132-136, SN133-136, e SN134-136.

Alguns fragmentos têm 5-20 aminoácidos contíguos a partir das posições entre 118-126, 108-136 e 98-140, da alfa-sinucleína. Alguns fragmentos têm 5-20 aminoácidos contíguos a partir das posições entre 70-99, 91-131, 136, ou 91-99, da alfa sinucleína.

Como demonstrado nos Exemplos IX e X, a administração de 6H7, um anticorpo que reconhece a terminação amina da alfa-sinucleína, ou de 8A5, um anticorpo que reconhece a terminação carboxílica da alfa-sinucleína, ou de 9E4, um anticorpo que reconhece um epítopo na região C-terminal da sinucleína, reduziu a agregação de alfa-sinucleína no cérebro de ratos transgénicos que sobre-expressam a alfa-sinucleína humana. É esperado que a imunização com fragmentos de alfa-sinucleína, que compreendem sequências nas, ou perto das, regiões terminais da alfa-sinucleína, resulte semelhantemente na remoção de agregados e/ou previna a formação de agregados.

Outros fragmentos de alfa-sinucleína úteis para a afetação da profilaxia, ou tratamento de uma doença caracterizada por corpos de Lewy ou por agregação de alfa-sinucleína no cérebro (por exemplo, a doença de Parkinson), são da região N-terminal da molécula. A imunização com os fragmentos gera uma resposta imunitária que compreende anticorpos para um ou mais epítopos nos resíduos 1-20 ou, em alguns casos, um ou mais epítopos nos resíduos 1-10. Como demonstrado no Exemplo IX, a administração de 6H7, um anticorpo que reconhece a terminação amina da alfa-sinucleína, reduziu a agregação de alfa-sinucleína no cérebro de ratos transgénicos que sobre-expressam a alfa-sinucleína humana. É esperado que a imunização com fragmentos de alfa- sinucleína, que compreendem a região terminal amina da alfa-sinucleina, resulte semelhantemente na remoção de agregados e/ou previna a formação de agregados.

Assim, num aspeto, a divulgação proporciona um método para a afetação da profilaxia, ou tratamento de uma doença caracterizada por corpos de Lewy ou por agregação de alfa-sinucleína no cérebro, através da administração, a um paciente que tem ou em risco de ter a doença, de um polipéptido que compreende um fragmento imunogénico da alfa-sinucleina eficaz na indução de uma resposta imunitária, compreendendo anticorpos que se ligam especificamente a um epítopo entre os resíduos 1-40, resíduos 1-20 ou resíduos 1-10 da alfa-sinucleina humana, sendo os resíduos numerados de acordo com a SEQ ID NO: 1. Numa forma de realização, o fragmento imunogénico da alfa-sinucleína não tem os resíduos 70-140 da alfa-sinucleina. Numa forma de realização, o fragmento imunogénico da alfa-sinucleína não tem os resíduos 41-140 da alfa-sinucleina. Numa forma de realização, o fragmento imunogénico não tem os resíduos 25-140 da alfa-sinucleina.

Imunogénios adequados para a afetação da profilaxia, ou tratamento de uma doença caracterizada por corpos de Lewy ou por agregação de alfa-sinucleína no cérebro, incluem, mas não estão limitados a, fragmentos que compreendem desde 5 a 20 resíduos de aminoácidos contíguos do terminal amina da alfa-sinucleína. Numa forma de realização preferencial, o fragmento compreende o primeiro resíduo (do terminal amina) da alfa-sinucleína. Assim, os fragmentos exemplificativos incluem a sequência de resíduos de 1 a Na da SEQ ID NO. : 1, em que Na é desde 5 a 20 (por exemplo, MDVFMKGLSKAKE GVVAAAE; MDVFMKG LSKAKEGWAAA; MDVFMKGLSKAKEGVVAA; MDVFMKGLSKAKE GVVA; MDVFMKGLSKAKEGVV; MDVFMKGLSKAKEGV; MDVFMKGLSKAKEG; MDVFMKGLSKAK; MDVFMKGLSKA; MDVFMKGLSK; MDVFMKGLS; MDVFMKGL; MDVFMKG; MDVFMK; e MDVFM). Noutras formas de realização preferenciais, o fragmento não compreende o resíduo terminal amina da alfa-sinucleína, mas compreende o segundo e/ou terceiro resíduo da alfa-sinucleína. Assim, os fragmentos exemplificativos têm a sequência de resíduos de 2 a Nb, e de 3 a Nc de SEQ ID NO.: 1, em que Nb é desde 6 a 21 e Nc é desde 7 a 22 (por exemplo, DVFM KGL S ΚΑΚΕ GWAAAE K; DVFMKGL S ΚΑΚΕ GWAAAE; DVFMKGLSKAKEGWAAA; DVFMKGLSKAKEGVVAA; DVFMKGLSKAKEGVVA; DVFMKGLSKAKEGW; DVFMKGLSKAKEGV; DVFMKGLSKAKEG; DVFMKGLSKAK; DVFMKGLSKA; DVFMKGLSK; DVFMKGLS; DVFMKGL; DVFMKG; DVFMK, VFMKGLSKAKEGVVAAAEKT; VFMKGLSKAKEGVVAAAEK; VFMKGLS ΚΑΚΕ GWAAAE; V FMK G L S ΚΑΚΕ G V V A A A; VFMKGLSKAKEGVVAA; VFMKGLSKAKEGWA; VFMKGLSKAKEGW; VFMKGLSKAKEGV; VFMKGLSΚΑΚΕG; VFMKGLSKAK; VFMKGLSKA; VFMKGLSK; VFMKGLS; VFMKGL; e VFMKG). Como discutido abaixo, os fragmentos acima mencionados podem estar ligados a uma molécula de transporte (por exemplo, um conjugado ou uma proteína de fusão, ver See. II (3)) . Alternativamente, como discutido abaixo, um fragmento acima mencionado pode ser administrado pela vacinação dos sujeitos com um ácido nucleico que codifica o fragmento (ver Sec. 11(4)).

Outros fragmentos de alfa-sinucleína úteis para a afetação da profilaxia, ou tratamento de uma doença caracterizada por corpos de Lewy ou por agregação de alfa-sinucleína no cérebro (por exemplo, a doença de Parkinson), são da região próxima da serina 129 da alfa-SN. A imunização com fragmentos incluindo este resíduo, na sua forma fosforilada (por exemplo, SN124-134 com Serl29 fosforilada), gera uma resposta imunitária que compreende anticorpos para um ou mais epítopos, incluindo o phosphoSerl29. Alguns fragmentos ativos induzem anticorpos que reconhecem um epítopo na, ou próximo da, região reconhecida pelo anticorpo monoclonal 11A5 .

Para facilidade de referenciação, os fragmentos de alfa-SN e epitopos podem ser referidos com base na sua posição na molécula, por exemplo, e sem limitação, fragmentos que contêm o aminoácido do N-terminal da alfa-SN, fragmentos que contêm o aminoácido do C-terminal, os fragmentos do CNA tal como descrito anteriormente, os fragmentos que não contêm nem o aminoácido do N-terminal ou o aminoácido do C-terminal, fragmentos da metade C-terminal da alfa-SN, fragmentos da metade N-terminal da alfa-SN, fragmentos de entre os 40 resíduos do N-terminal da alfa-SN. Em certas formas de realização, os fragmentos podem conter de 5 a 100 resíduos contíguos de alfa-SN, por exemplo na gama delimitada por um limite inferior de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 15, 20, 25, 30 ou 40 resíduos contíguos, e um limite superior de 10, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50 ou 100 resíduos contíguos, onde o limite superior é maior do que o limite inferior. Preferencialmente, o fragmento contém pelo menos 5, pelo menos 8, pelo menos 10, pelo menos 15 ou pelo menos 20 resíduos contíguos da alfa-SN. A referência à alfa-SN inclui as sequências de aminoácidos humanos naturais acima indicadas, bem como análogos incluindo variantes alélicas, de espécie e de indução, as formas com comprimento total e fragmentos imunogénicos resultantes destes. A alfa-sinucleína humana, ou seja, uma proteína que possui a mesma sequência de aminoácidos como a SEQ ID NO: 1, ou as suas variantes alélicas, são preferenciais em todas as formas de realização. Os análogos diferem tipicamente dos péptidos que ocorrem naturalmente numa, duas ou em algumas posições, frequentemente em virtude das substituições conservativas. Os análogos tipicamente apresentam pelo menos 80 % ou 90 % da identidade de sequência com péptidos naturais. Às posições dos aminoácidos em análogos de alfa-sinucleína de ocorrência natural, são atribuídos os números dos aminoácidos correspondentes na alfa-sinucleína de ocorrência natural, quando o análogo e a alfa-sinucleína de ocorrência natural estão maximamente alinhados. Alguns análogos incluem também aminoácidos não naturais ou modificações dos aminoácidos no N-terminal ou C-terminal, numa, duas ou em algumas posições. Por exemplo, o resíduo natural de ácido glutâmico na posição 139 da alfa-SN, pode ser substituído pelo ácido iso-aspártico. Exemplos de aminoácidos não naturais são aminoácidos D, alfa e alfa-dissubstituídos, aminoácidos N-alquil, ácido láctico, 4-hidroxiprolina, gama-carboxiglutamato, épsilon-N,N,N-trimetil, épsilon-N-acetilisina, 0-fosfoserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3-metilhistidina, 5-hidroxilisina, omega-N-metilarginina, beta-alanina, ornitina, norleucina, norvalina, hidroxiprolina, tiroxina, ácido gama-aminobutírico, homoserina, citrulina e ácido iso-aspártico. Os agentes terapêuticos também incluem análogos de fragmentos da alfa-SN. Alguns agentes terapêuticos da divulgação são péptidos tudo-D, por exemplo, tudo-D alfa-SN ou tudo-D CNA, e os péptidos tudo-D análogos. Os análogos ligam-se especificamente a uma população policlonal de anticorpos para a alfa-sinucleína humana de ocorrência natural. Os fragmentos e análogos podem ser rastreados para a eficácia profilática ou terapêutica em modelos animais transgénicos, em comparação com controlos não tratados ou placebo, como descrito abaixo. A alfa-SN, os seus fragmentos e análogos, podem ser sintetizados por síntese peptídica em fase sólida ou por expressão recombinante, ou podem ser obtidos a partir de fontes naturais. Sintetizadores automáticos de péptidos estão disponíveis comercialmente a partir de vários fornecedores, tais como a Applied Biosystems, Foster City,

Califórnia. A expressão recombinante pode ser efetuada em bactérias, tais como E. coli, leveduras, células de insetos ou células de mamíferos. Os procedimentos para a expressão recombinante são descritos por Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (C.S.H.P. Press, NY 2d ed., 1989) . Algumas formas do péptido alfa-SN estão também disponíveis comercialmente, por exemplo, na BACHEM e na American Peptide Company, Inc.

Os agentes terapêuticos também incluem polipéptidos mais longos que compreendem, por exemplo, um fragmento ativo do péptido alfa-SN em conjunto com outros aminoácidos. Por exemplo, agentes preferenciais incluem proteínas de fusão que compreendem um segmento da alfa-SN fundido com uma sequência de aminoácidos heteróloga, que induz uma resposta das células-T auxiliares contra a sequência de aminoácidos heteróloga e, consequentemente, uma resposta das células-B contra o segmento de alfa-SN. Tais polipéptidos podem ser rastreados para a eficácia profilática ou terapêutica em modelos animais transgénicos, em comparação com controlos não tratados ou placebo, como descrito abaixo. 0 péptido alfa-SN, análogo, fragmento ativo ou outro polipéptido, pode ser administrado na forma associada ou multimérica ou na forma dissociada, onde os agentes terapêuticos incluem multímeros de agentes imunogénicos monoméricos. Os agentes terapêuticos da divulgação podem incluir sequências de polilisina.

Numa outra variação, um péptido imunogénico, tal como um fragmento de alfa-SN, pode ser apresentado por um vírus ou bactéria como parte de uma composição imunogénica. Um ácido nucleico que codifica o péptido imunogénico é incorporado no genoma ou epissoma do vírus ou bactéria. Opcionalmente, o ácido nucleico é incorporado de tal modo que o péptido imunogénico é expresso como uma proteína excretada, ou como uma proteína de fusão com uma proteína da superfície do exterior de um vírus ou uma proteína transmembranar da bactéria, de modo que o péptido seja exibido. Os vírus ou bactérias utilizados em tais métodos devem ser não-patogénicos ou atenuados. Vírus adequados incluem adenovirus, HSV, o vírus da encefalomielite equina venezuelana e outros vírus alfa, o vírus da estomatite vesicular, e outros vírus rabdo, vaccinia e varíola aviária. Bactérias adequadas incluem a Salmonella e Shigella. A fusão de um péptido imunogénico ao HBsAg do HBV é particularmente adequada.

Os agentes terapêuticos também incluem péptidos e outros compostos cuja sequência de aminoácidos não tem necessariamente uma semelhança significativa com a alfa-SN, mas, no entanto, servem como miméticos da alfa-SN e induzem uma resposta imunitária semelhante. Por exemplo, quaisquer péptidos e proteínas que formam folhas-beta pregueadas, podem ser rastreados quanto à sua adequabilidade. Anticorpos anti-idiotípicos contra os anticorpos monoclonais para a alfa-SN ou para outros componentes dos corpos de Lewy, podem também ser usados. Tais anticorpos anti-Id imitam o antigénio e geram uma resposta imunitária para este (ver Essential Immunology, Roit ed., Blackwell Scientific Publications, Palo Alto, CA 6a ed., p. 181). Outros agentes para além da alfa-SN, devem induzir uma resposta imunitária contra um ou mais dos segmentos preferenciais da alfa-SN listados anteriormente (por exemplo, CNA) . Preferencialmente, tais agentes induzem uma resposta imunitária que é especificamente dirigida a um destes segmentos, sem ser dirigida a outros segmentos da alfa-SN.

Bibliotecas aleatórias de péptidos ou de outros compostos podem também ser rastreadas quanto à adequabilidade. As bibliotecas combinatoriais podem ser produzidas para muitos tipos de compostos, que podem ser sintetizados num formato passo-a-passo. Tais compostos incluem polipéptidos, miméticos beta-turn, polissacáridos, fosfolipidos, hormonas, prostaglandinas, esteroides, compostos aromáticos, compostos heterociclicos, benzodiazepinas, glicinas N-substituídas oligoméricas e oligocarbamatos. Grandes bibliotecas combinatoriais para os compostos podem ser construídas pelo método das bibliotecas sintéticas codificadas (BSC) descrito em Affymax, documento WO 95/12608, Affymax, documento WO 93/06121, Columbia University, documento WO 94/08051, Pharmacopeia, documento WO 95/35503 e Scripps, documento WO 95/30642. As bibliotecas de péptidos também podem ser geradas através de métodos de phage display. Ver, por exemplo, Devlin, documento WO 91/18980.

As bibliotecas combinatoriais e outros compostos são inicialmente rastreados quanto à sua adequabilidade, pela determinação da sua capacidade em ligarem-se a anticorpos ou linfócitos (B ou T) que se sabe serem específicos para a alfa-SN ou para outros componentes dos corpos de Lewy. Por exemplo, os rastreios iniciais podem ser realizados com qualquer soro policlonal ou anticorpo monoclonal para a alfa-SN ou para um fragmento seu. As bibliotecas são rastreadas preferencialmente quanto à capacidade para ligarem-se a anticorpos que se ligam especificamente a um epítopo entre os resíduos 1-20 ou 70-140 da alfa-sinucleína humana. Os compostos podem então ser rastreados quanto à ligação específica para um epítopo específico na alfa-SN (por exemplo, SNl-20, SN83-101, SN107-125, SN110-128, SN124-140, SN91-99 e SN118-126 da alfa-sinucleína). Os compostos podem ser testados pelos mesmos procedimentos descritos, aquando o mapeamento das especificidades dos epítopos para os anticorpos. Os compostos identificados por tais rastreios, são consequentemente analisados quanto à capacidade para induzir anticorpos ou linfócitos reativos para a alfa-SN ou para os seus fragmentos. Por exemplo, várias diluições de soros podem ser testadas em placas de microtitulação que foram pré-revestidas com alfa-SN ou um fragmento seu, e um ensaio ELISA convencional pode ser realizado para testar os anticorpos reativos para a alfa-SN ou fragmento. Os compostos podem então ser testados quanto à eficácia profilática e terapêutica em animais transgénicos com predisposição para uma doença associada à presença de corpos de Lewy, tal como descrito nos Exemplos. Tais animais incluem, por exemplo, ratos transgénicos que sobre-expressam a alfa-SN ou um mutante seu (por exemplo, com substituição da alanina para treonina na posição 53) , tal como descrito, por exemplo, no documento WO 98/59050, Masliah, et ai., Science 287: 1265-1269 (2000), e van der Putter, et ai., J. Neuroscience 20: 6025-6029 (2000), ou ratos transgénicos que sobre-expressam também a PPA ou um mutante seu. São particularmente preferenciais ratos sinucleina transgénicos portadores de uma mutação 717 da PPA, descrita por Games et ai., Nature 373, 523 (1995), e ratos portadores de uma mutação Swedish 670/671 da PPA, como descrita por McConlogue et ai., documento US 5,612,486 e Hsiao et ai., Science 274, 99 (1996); Staufenbiel et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 94, 13287-13292 (1997); Sturchler-Pierrat et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 94, 13287-13292 (1997); Borchelt et ai., Neuron 19, 939-945 (1997)). Exemplos de tais animais sinucleina/PPA transgénicos são providenciados no documento WO 01/60794. Modelos animais adicionais da DP incluem os modelos animais 6-hidroxidopamina, rotenona, e l-metil-4-fenil-l,2,3,6-tetrahidropiridina (MPTP) (M. Flint Beal, Nature Reviews Neuroscience 2:325-334 (2001)). A mesma abordagem de rastreio pode ser usada noutros análogos potenciais da alfa-SN e péptidos mais compridos, incluindo fragmentos da alfa-SN descritos anteriormente, e outros componentes dos corpos de Lewy e análogos e fragmentos seus.

Tal como descrito aqui, a administração de anticorpos que reconhecem epítopos nas regiões com terminação amina e carboxilica da alfa-sinucleina (isto é, 8A5 e 6H7), reduz os agregados de alfa-sinucleina em cérebros de ratos transgénicos que sobre-expressam a alfa-sinucleina humana (ver, por exemplo, Exemplo IX) . Com base em parte desta descoberta, é contemplado que a indução de uma resposta imunitária contra os epitopos em ambos os terminais da alfa-sinucleina, terá vantagens na profilaxia e terapia. Assim, num aspeto, a divulgação providencia um método para a profilaxia ou tratamento de uma doença, caracterizada por corpos de Lewy ou pela agregação de alf a-sinucleina no cérebro, através da indução de uma resposta imunitária que compreende anticorpos que se ligam especificamente a um epitopo entre os resíduos 1-20, ou alternativamente, entre os resíduos 1-10, da alfa-sinucleina humana, e um epitopo entre os resíduos 70-140 da alfa-sinucleina humana.

Numa forma de realização preferencial, a resposta imunitária compreende anticorpos que se ligam especificamente a um epitopo entre os resíduos 1-20 da alfa-sinucleina humana e resíduos 120-140 da alfa-sinucleína humana. Uma resposta imunitária que compreenda anticorpos contra epítopos em ambas as regiões terminais da proteína, pode ser referida como uma resposta imunitária "dupla". Uma resposta imunitária dupla pode ser induzida de várias maneiras, e a presente divulgação não está limitada a qualquer método em particular para a iniciação de tal resposta.

Uma resposta imunitária dupla pode ser induzida por vacinação com um único polipéptido que é eficaz na indução de uma resposta imunitária, incluindo anticorpos que se ligam especificamente a um epítopo entre os resíduos 1-20 da alfa-sinucleína humana e anticorpos que se ligam especificamente a um epítopo entre os resíduos 70-140 da alfa-sinucleína humana. Em formas de realização preferenciais, os anticorpos ligam-se especificamente a um epítopo entre os resíduos 1-10 e/ou entre os resíduos 120-140 da alfa-sinucleína humana. Um polipéptido a que falta pelo menos os resíduos 25-69 da alfa-sinucleína humana, pelo menos os resíduos 30-110 da alfa-sinucleína humana, ou pelo menos os resíduos 21-119 da alfa-sinucleína humana, pode ser utilizado. Quando tais polipéptidos são utilizados, a resposta imunitária não inclui anticorpos que se ligam especificamente a um epítopo entre os resíduos 25-69 da alfa-sinucleína humana.

Uma resposta imunitária dupla pode também ser induzida por vacinação de uma combinação de dois (ou mais) polipéptidos, onde um polipéptido induz uma resposta imunitária, incluindo anticorpos que se ligam especificamente a um epítopo entre os resíduos 1-20 da alfa-sinucleína humana e anticorpos que se ligam especificamente a um epítopo entre os resíduos 70-140 da alfa-sinucleína humana. Em formas de realização preferenciais, os anticorpos ligam-se especificamente a um epítopo entre os resíduos 1-10 e/ou entre os resíduos 120-140 da alfa-sinucleína humana. Assim, o tratamento ou profilaxia podem ser afetados através da administração de um primeiro fragmento imunogénico de alfa-sinucleína, que induz uma resposta imunitária que compreende anticorpos que se ligam especificamente a um epítopo entre os resíduos 1-20 da alfa-sinucleína humana, e um segundo fragmento imunogénico que induz uma resposta imunitária que compreende anticorpos que se ligam especificamente a um epítopo entre os resíduos 70-140 (ou 120-140) da alfa-sinucleína humana. Fragmentos da alfa-sinucleína humana podem ser administrados em combinação, como discutido anteriormente (por exemplo, a administração de uma proteína de fusão ou conjugado, numa co-formulação, ou no mesmo ciclo da terapia). A divulgação proporciona composições úteis para a iniciação de uma resposta imunitária contra epítopos em qualquer dos, ou em ambos, terminais da alfa-sinucleína. As composições incluem formas de dose e formulações que contêm dois ou mais polipéptidos, como descrito acima, em que um polipéptido induz uma resposta imunitária, incluindo anticorpos que se ligam especificamente a um epítopo entre os resíduos 1-20 da alfa-sinucleína humana e anticorpos que se ligam especificamente a um epítopo entre os resíduos 70-140 da alfa-sinucleína humana. Em formas de realização preferenciais, os polipéptidos induzem anticorpos que se ligam especificamente a um epítopo entre os resíduos 1-10 e/ou entre os resíduos 120-140 da alfa-sinucleína humana. Exemplos de formulações (adequadas para a co-formulação de polipéptidos) são conhecidos na especialidade e incluem aqueles descritos abaixo na Secção VII ("Regimes de Tratamento"). A divulgação também proporciona kits para a iniciação de uma resposta imunitária contra epítopos em ambos os terminais da alfa-sinucleína. Os kits incluem dois ou mais agentes que induzem uma resposta imunitária, incluindo anticorpos que se ligam especificamente a um epítopo entre os resíduos 1-20 da alfa-sinucleína humana e anticorpos que se ligam especificamente a um epítopo entre os resíduos 70-140 da alfa-sinucleína humana. Os agentes podem ser combinados numa única preparação para uso em simultâneo. Os agentes podem ocupar recipientes separados (por exemplo, frascos, seringas, tubos, ou semelhantes), cada um contendo um polipéptido diferente, para a sua utilização em simultâneo, sequencial ou em separado. Estes agentes podem, opcionalmente, ser administrados em combinação com outros agentes que sejam, pelo menos, parcialmente eficazes no tratamento da doença com corpos de Lewy. Os kits podem também incluir, agentes que aumentam a passagem dos agentes da divulgação através da barreira hematoencefálica, outros adjuvantes e materiais para a administração no paciente. 2. Agentes para resposta imunitária ativa

Os agentes terapêuticos da divulgação incluem também anticorpos que se ligam especificamente à alfa-SN ou a outros componentes dos corpos de Lewy. Esta divulgação também proporciona anticorpos que se ligam especificamente a um componente CNA-sinucleína de uma plaqueta amiloide. Anticorpos imunorreativos para a alfa-SN são conhecidos (ver, por exemplo, Arima, et al., Brian Res. 808: 93-100 (1998); Crowther et al. , Neuroscience Lett. 292: 128-130 (2000); Spillantini et al., Nature 388: 839-840 (1997)). Tais anticorpos podem ser monoclonais ou policlonais. Alguns destes anticorpos ligam-se especificamente a agregados insolúveis de alfa-SN, sem se ligarem especificamente à forma monomérica solúvel. Alguns ligam-se especificamente à forma monomérica solúvel, sem se ligarem à forma agregada insolúvel. Alguns ligam-se especificamente a ambas as formas monoméricas agregada e solúvel. Alguns destes anticorpos ligam-se especificamente a uma forma curta da alfa-SN de ocorrência natural (por exemplo, CNA) , sem se ligarem a uma alfa-SN de comprimento total de ocorrência natural. Alguns anticorpos ligam-se especificamente a uma forma de comprimento total, sem se ligarem a uma forma curta. Alguns anticorpos ligam-se especificamente à alfa-SN, sem se ligarem a outros componentes de CLs. Alguns anticorpos ligam-se especificamente à alfa-SN, sem se ligarem especificamente a outros componentes das plaquetas amiloides. Ver a publicação da patente E.U.A. US20060259986A1 e a publicação da patente PCT WO 05/013889, proporciona anticorpos para o fim específico de ligação específica a fragmentos da alfa-sinucleína, sem se ligarem especificamente à alfa-sinucleína intacta per se. Estes anticorpos são úteis em métodos de prevenção e tratamento da doença sinucleinopática e amiloidogénica.

Em experiências realizadas em suporte à invenção, um ensaio preditivo ex vivo (Exemplo VII), foi usado para testar a eliminação de um anticorpo que se liga especificamente a um CNA-sinucleína. Um anticorpo para o CNA foi colocado em contacto com uma amostra de tecido cerebral, que continha plaquetas amiloides e células da microglia. Foi usado soro de coelho como controlo. A monitorização subsequente demonstrou uma redução acentuada no número e tamanho das plaquetas, indicativo da atividade de eliminação do anticorpo. A partir destes dados é evidente que a carga de plaquetas amiloides associada à doença de Alzheimer e a outras doenças amiloides, pode ser bastante reduzida através da administração de reagentes imunitários dirigidos contra epítopos do CNA, sendo eficazes na redução da carga de plaquetas amiloides. É entendido ainda que uma grande variedade de anticorpos pode ser utilizada em tais composições. Como discutido acima, a publicação da patente E.U.A. US20060259986A1 e a publicação da patente PCT WO 05/013889, proporcionam anticorpos para o fim específico de ligação especifica a fragmentos da alfa-sinucleína, sem se ligarem especificamente à alfa-sinucleína intacta per se.

Os anticorpos utilizados nos métodos terapêuticos geralmente têm uma região constante intacta ou, pelo menos, uma parte suficiente da região constante, para interagir com um recetor Fc. 0 isotipo IgGl humano é preferencial dado ter a maior afinidade, face aos isotipos humanos, para o recetor FcRI em células fagociticas. Fragmentos biespecificos Fab podem também ser utilizados em cada braço do anticorpo, num braço para especificidade à alfa-SN e noutro para especificidade a um recetor Fc. Alguns anticorpos ligam-se à alfa-SN, opcionalmente numa forma desnaturada, do mesmo modo que quando tratados com DSS, com uma afinidade de ligação maior ou igual a cerca de 106, ΙΟ7, ΙΟ8, 109 ou IO10 M-1. Alguns anticorpos da divulgação ligam-se especificamente à alfa-sinucleina humana em sinapses ou em corpos celulares neuronais, como determinado por imunocitoquimica.

Os soros policlonais normalmente contêm populações mistas de anticorpos que se ligam a vários epitopos ao longo do comprimento da alfa-SN. No entanto, os soros policlonais podem ser específicos para um determinado segmento da alfa-SN, tal como o CNA. Os soros policlonais que são específicos para um determinado segmento, contêm anticorpos que se ligam especificamente a esse segmento e carecem de anticorpos que se ligam especificamente a outros segmentos da alfa-SN. Os anticorpos monoclonais ligam-se a um epítopo específico na alfa-SN que pode ser um epítopo conformacional ou não conformacional. Os epitopos não conformacionais permanecem presentes quando a alfa-SN é desnaturada com DSS. A eficácia profilática e terapêutica dos anticorpos pode ser testada usando os procedimentos referentes aos modelos animais transgénicos descritos nos Exemplos, alguns anticorpos monoclonais ligam-se a um epítopo no CNA. Em alguns métodos, vários anticorpos monoclonais que possuem especificidades de ligação a diferentes epítopos são usados. Tais anticorpos podem ser administrados sequencialmente ou simultaneamente. Os anticorpos para componentes de corpos de Lewy, que não a alfa-SN, podem também ser usados. Por exemplo, os anticorpos podem ser direcionados para neurofilamento, ubiquitina ou sinfilina. Os agentes terapêuticos incluem também anticorpos produzidos contra análogos da alfa-SN e fragmentos seus resultantes. Alguns agentes terapêuticos da divulgação são péptidos tudo-D, por exemplo, alfa-SN tudo-D ou CNA tudo-D.

Quando é referido que um anticorpo se liga a um epitopo entre os resíduos especificados, tais como alfa-SN 1-5, por exemplo, o que se quer dizer é que o anticorpo se liga especificamente a um polipéptido que contém os resíduos especificados (isto é, alfa-SN 1-5 neste exemplo). Tal anticorpo não contacta necessariamente cada resíduo no alfa-SN 1-5. Nem todas as substituições ou eliminações de aminoácidos no alfa-SN 1-5 afetam necessariamente de forma significativa a afinidade da ligação. A especificidade para o epitopo de um anticorpo, pode ser determinada, por exemplo, através da formação de uma biblioteca de phage display, na qual diferentes membros apresentam diferentes subsequências da alfa-SN. A biblioteca de phage display é então selecionada para os membros que se ligam especificamente a um anticorpo em teste. A família de sequências é isolada. Tipicamente, tal família contém uma sequência nuclear comum, e sequências laterais com comprimentos variáveis para diferentes membros. A sequência nuclear mais curta que demonstra ligação específica para com o anticorpo, define o epitopo ligado ao anticorpo. Os anticorpos podem também ser testados quanto à especificidade para o epitopo, num ensaio de competição com um anticorpo cuja especificidade para o epítopo já tenha sido determinada.

Alguns anticorpos da divulgação ligam-se especificamente a um epitopo no CNA. Alguns anticorpos ligam-se especificamente a um epitopo numa forma glicosilada de 22 kilodalton da sinucleina, por exemplo, P22-sinucleína (H. Shimura et al., Science 2001 Jul 13:293(5528):224-5).

Alguns anticorpos da divulgação ligam-se a um epitopo na extremidade N-terminal da alfa-SN (por exemplo, um epitopo nos aminoácidos 1-20 ou nos aminoácidos 1-10 da alfa-sinucleína, numerados de acordo com a SEQ ID NO: 1). Alguns anticorpos ligam-se a um epitopo, em que o resíduo N-terminal do epítopo é o resíduo N-terminal da alfa-SN de comprimento total. Tais anticorpos não se ligam a mutantes da alfa-sinucleína derivados de processos de eliminação, em que o resíduo 1 está em falta. Alguns destes anticorpos não se ligam à alfa-sinucleína de comprimento total, na qual o aminoácido do N-terminal está ligado a um polipéptido heterólogo. Alguns anticorpos da divulgação ligam-se especificamente a um epítopo entre os resíduos 1-69 ou resíduos 1-20 da alfa-sinucleína humana. Alguns anticorpos ligam-se especificamente a um epítopo entre os resíduos 1-20 da alfa-sinucleína humana. Alguns anticorpos ligam-se especificamente a um epítopo num segmento da alfa-sinucleína, selecionado a partir dos resíduos de 1 a Na da SEQ ID NO. : 1, em que Na é de 5 a 20; dos resíduos de 2 a Nb da SEQ ID NO.: 1, em que Nb é 6 a 21; ou dos resíduos de 3 a Nc da SEQ ID NO.: 1, em que Nc é de 7 a 22. Alguns anticorpos ligam-se especificamente a um epítopo num segmento da alfa-sinucleína humana, selecionado a partir do grupo que consiste em SNl-5, SNl-6, SNl-7, SNl-8, SNl-9, SN1-10, SN1-11, SNl-12, SNl-13, SNl-14, SNl-15, SNl-16, SN1-17, SN1-18, SNl-19 e SNl-20.

Alguns anticorpos ligam-se a um epítopo no, ou próximo do, C-terminal da alfa-SN (por exemplo, nos aminoácidos 70-140, 100-140, 120-140, 130-140 ou 135-140). Alguns anticorpos ligam-se a um epítopo no qual o resíduo C-terminal do epítopo é o resíduo C-terminal da alfa-SN (de comprimento total) . Tais anticorpos não se ligam a mutantes da alfa-sinucleína derivados de processos de eliminação, em que o resíduo 140 está em falta. Alguns destes anticorpos não se ligam à alfa-sinucleína de comprimento total, na qual o aminoácido do C-terminal está ligado a um polipéptido heterólogo. Em alguns métodos, o anticorpo liga-se especif icamente ao CNA sem se ligar à alfa-SN de comprimento completo.

Alguns anticorpos da divulgação ligam-se especificamente a um epítopo nos resíduos 70-140 ou 83-140 da alfa-sinucleína humana. Alguns anticorpos ligam-se especificamente a um epítopo nos resíduos 120-140 da alfa-sinucleína humana. Alguns anticorpos ligam-se especificamente a um epítopo num segmento da alfa-sinucleína humana selecionado a partir de 83-101, 107-125, 110-128 e 124-140. Alguns anticorpos ligam-se a um epítopo num segmento da alfa-sinucleína humana, selecionado a partir do grupo que consiste em SN124-140, SN125-140, SN126-140, SN127-140, SN128-140, SN129-140, SN130-140, SN131-140, SN132-140, SN133-140, SN134-140, SN135-140, SN136-140, SN137-140, SN124-139, SN125-139, SN126-139, SN127-139, SN128-139, SN124-139, SN125-139, SN126-139, SN127-139, SN128-139, SN129-139, SN130-139, SN131-139, SN132-139, SN133-139, SN134-139, SN135-139, SN136-139, SN137-139, SN124-138, SN124-138, SN125-138, SN126-138, SN127-138, SN128-138, SN129-138, SN130-138, SN131-138, SN132-138, SN133-138, SN134-138, SN135-138, SN136-138, SN124-137, SN125-137, SN126-137, SN127-137, SN128-137, SN129-137, SN130-137, SN131-137, SN132-137, SN133-137, SN134-137, SN135-137, SN124-136, SN125-136, SN126-136, SN127-136, SN128-136, SN129-136, SN130-136, SN131-136, SN132-136, SN133-136 e SN134-136.

Alguns anticorpos ligam-se a um epítopo num segmento da alfa-sinucleína humana, selecionado a partir dos aminoácidos 90-140, 98-140, 108-136, 110-130 ou 118-126 da alfa-sinucleína.

Alguns anticorpos ligam-se a um epítopo num segmento da alfa-sinucleína humana, selecionado a partir de SN70-119, 80-109, 88-101, ou 91-99 ou 70-99.

Os anticorpos monoclonais que se ligam a epítopos nas regiões C-terminal, preferencialmente ligam-se com elevada afinidade, por exemplo, pelo menos, ΙΟ8, 109 ou 1010 M_1 para a alfa-sinucleína humana.

Alguns anticorpos da divulgação reconhecem especificamente a alfa-SN fosforilada na posição 129 (serina), e não se ligam especificamente a uma alfa-SN não fosforilada. Alguns anticorpos ligam-se a um epítopo no segmento SN120-130 da alfa-sinucleína humana, selecionado a partir de, como por exemplo o SN124-134.

Os anticorpos monoclonais ou policlonais que se ligam especificamente a um segmento preferencial da alfa-SN, sem se ligarem especificamente a outras regiões da alfa-SN, têm várias vantagens em relação a anticorpos monoclonais que se ligam a outras regiões, ou a soros policlonais, para a alfa-SN intacta. Em primeiro lugar, para dosagens mássicas iguais, as dosagens de anticorpos que se ligam especificamente aos segmentos preferenciais, contêm uma dose molar de anticorpos eficazes na remoção de plaquetas amiloides mais elevada. Em segundo lugar, os anticorpos que se ligam especificamente aos segmentos preferenciais, podem induzir uma resposta de remoção de CLs sem induzir uma resposta de remoção para a alfa-SN intacta, reduzindo assim a probabilidade para efeitos secundários.

Opcionalmente, os anticorpos podem ser rastreados quanto à atividade profilática ou terapêutica em animais transgénicos da doença com CLs, tal como descrito anteriormente. Opcionalmente, um conjunto de anticorpos é pré-rastreado quanto à ligação relativa para a alfa-sinucleína humana desnaturada ou para um fragmento seu. As afinidades de ligação relativa podem ser estimadas a partir das intensidades relativas do sinal de um ensaio de immunblot. Um anticorpo que tenha afinidade de ligação relativa acima da média, ou preferencialmente, um anticorpo que tenha a maior afinidade de ligação testada, é selecionado para o rastreio suplementar em animais transgénicos. Pode ser realizado um pré-rastreio semelhante, a fim de testar anticorpos quanto à sua ligação a agregados de alfa-sinucleína em secções de tecidos, através de imunocitoquímica. As secções de tecido podem ser obtidas a partir do cérebro de um paciente ou de um modelo animal transgénico.

Numa forma de realização, o anticorpo designado por 6H7, ou um anticorpo que compete com ο 6H7 para se ligar especificamente à alfa-sinucleína, é utilizado para imunização passiva. Numa forma de realização, o anticorpo designado por 8A5, ou um anticorpo que compete com ο 8A5 para se ligar especificamente à alfa-sinucleína, é utilizado para imunização passiva. Numa forma de realização, o anticorpo designado por 9E4, ou um anticorpo que compete com ο 9E4 para se ligar especificamente à alfa-sinucleína, é utilizado para imunização passiva. Numa forma de realização, o anticorpo designado por 1H7, ou um anticorpo que compete com ο 1H7 para se ligar especificamente à alfa-sinucleina, é utilizado para imunização passiva. Numa forma de realização, o anticorpo designado por 11A5, ou um anticorpo que compete com ο 11A5 para se ligar especificamente à alfa-sinucleina, é utilizado para imunização passiva. Em algumas formas de realização, um anticorpo acima descrito é usado em combinação com cada um dos outros anticorpos ou com outros anticorpos anti-alfa-sinucleina.

Tal como descrito aqui, a administração de anticorpos que reconhecem epitopos nas regiões com terminação amina e carboxilica da alfa-sinucleina (isto é, 8A5 e 6H7), reduz os agregados de alfa-sinucleina em cérebros de ratos transgénicos que sobre-expressam a alfa-sinucleina humana (ver, por exemplo, Exemplo IX) . Com base em parte desta descoberta, contempla-se que a administração com a combinação de anticorpos que reconhecem um epitopo N-terminal (por exemplo, tal como descrito acima) e anticorpos que reconhecem um epitopo C-terminal (por exemplo, tal como descrito acima), seja particularmente eficaz na profilaxia e terapia. Assim, num aspeto, a divulgação providencia um método para a profilaxia ou tratamento de uma doença, caracterizada por corpos de Lewy ou pela agregação de alfa-sinucleina no cérebro, através da administração em combinação a um paciente que tem ou em risco de ter a doença, de um regime eficaz que compreende um primeiro anticorpo que se liga especificamente a um epitopo nos resíduos 1-20 da alfa-sinucleina humana, sendo os resíduos numerados de acordo com a SEQ ID NO: 1, e uma administração de um segundo anticorpo que se liga especificamente a um epitopo nos resíduos 70-140 da alfa-sinucleina humana. Preferencialmente, o primeiro anticorpo liga-se a um epitopo da alfa-sinucleina na sequência de resíduos de 1 a Na da SEQ ID NO.: 1, em que Na é de 5 a 20; na sequência de resíduos de 2 a Nb da SEQ ID NO.: 1, em que Nb é 6 a 21; e/ou na sequência de resíduos de 3 a Nc da SEQ ID NO.: 1, em que Nc é de 7 a 22. Preferencialmente, o segundo anticorpo liga-se especificamente a um epítopo nos resíduos 120-140 da alfa-sinucleína humana. Os primeiro e segundo anticorpos podem ser administrados simultaneamente (por exemplo, co-formulados), no mesmo dia, no mesmo mês e/ou como parte do mesmo ciclo terapêutico. A divulgação providencia composições para a profilaxia ou tratamento de uma doença, caracterizada por corpos de Lewy ou pela agregação de alfa-sinucleína no cérebro, compreendendo um ou mais anticorpos que se ligam a uma região terminal da alfa-sinucleína, por exemplo, possuindo uma especificidade acima descrita. As composições incluem formas de dose e formulações que contêm dois ou mais anticorpos. Exemplos de formulações (adequadas para a co-formulação de anticorpos) são conhecidos na especialidade e incluem aqueles descritos abaixo na Secção VII ("Regimes de Tratamento"). A divulgação providencia também kits para a profilaxia ou tratamento de uma doença, caracterizada por corpos de Lewy ou pela agregação de alfa-sinucleína no cérebro. Os kits incluem dois (ou mais) anticorpos, em que o primeiro anticorpo se liga a um epítopo no N-terminal da alfa-sinucleína humana e o segundo anticorpo liga-se a um epítopo no C-terminal da alfa-sinucleína humana. Os anticorpos podem ser combinados numa única preparação ou num kit para utilização em simultâneo. Alternativamente, os anticorpos podem ocupar recipientes separados (por exemplo, frascos, seringas, tubos, ou semelhantes) num kit, para a sua utilização em simultâneo, sequencial ou em separado. Estes anticorpos podem, opcionalmente, ser administrados em combinação com outros agentes que sejam pelo menos parcialmente eficazes no tratamento da doença com corpos de Lewy. Os kits podem também incluir agentes que aumentam a passagem dos anticorpos da divulgação através da barreira hematoencefálica, outros adjuvantes e materiais para a administração no paciente. i. Caracteristicas Gerais das Imunoglobulinas A unidade estrutural básica do anticorpo é conhecida por incluir um tetrâmero de subunidades. Cada tetrâmero é composto por dois pares idênticos de cadeias polipeptidicas, tendo cada par uma cadeia "leve" (cerca de 25 kDa) e uma cadeia "pesada" (cerca de 50-70 kDa) . A porção terminal amina de cada cadeia inclui uma região variável de cerca de 100 a 110, ou mais, aminoácidos, principalmente responsáveis pelo reconhecimento do antigénio. A porção terminal carboxilica de cada cadeia define uma região constante principalmente responsável pela função efetora.

As cadeias leves são classificadas como kapa ou lambda. As cadeias pesadas são classificadas como gama, mu, alfa, delta ou epsilon, e definem o isotipo do anticorpo como IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respetivamente. Nas cadeias leves e pesadas, as regiões variáveis e constantes estão unidas por uma região "J" com cerca de 12 ou mais aminoácidos, com a cadeia pesada incluindo também uma região "D" com cerca de 10 aminoácidos. (Ver em geral, Fundamental Immunology, Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y., 1989, Ch. 7.)

As regiões variáveis de cada par de cadeias leve/pesada formam o local de ligação do anticorpo. Assim, um anticorpo intacto tem dois locais de ligação. Exceto em anticorpos bifuncionais ou biespecificos, onde os dois locais de ligação são o mesmo. Todas as cadeias exibem a mesma estrutura geral referente às regiões de estrutura (RE) relativamente conservadas, que são unidas por três regiões hipervariáveis, também denominadas por regiões determinantes de complementaridade ou RDCs. As RDCs das duas cadeias de cada par estão alinhadas pelas regiões de estrutura, permitindo a ligação a um epítopo específico. A partir do N-terminal para o C-terminal, ambas as cadeias leve e pesada compreendem os domínios REI, RDC1, RE2, RDC2, RE3, RDC3 e RE4. A atribuição dos aminoácidos para cada domínio está em conformidade com as definições de Rabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1987 e 1991); Chothia & Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); ou Chothia et al. ,

Nature 342:878-883 (1989). ii. Produção de Anticorpos Não Humanos

Os anticorpos quiméricos e humanizados têm a mesma, ou similar, especificidade de ligação e afinidade do que os anticorpos provenientes de um rato ou outro não humano, caso estes anticorpos proporcionem o material de partida para a construção de um anticorpo quimérico ou humanizado. Os anticorpos não humanos podem ser humanizados por fixação de RDCs não-humanas nas regiões de estrutura e regiões constantes humanas, ou pela incorporação de domínios variáveis inteiros não humanos (opcionalmente "camuflando" os anticorpos com uma superfície de tipo humana através da substituição dos resíduos expostos, cujo resultado é um anticorpo "compensado"). Ver, Gonzales et al., Minimizing the immunogenicity of antibodies for clinical application, Tumour Biol. 26(1):31-43 (2005). Os anticorpos quiméricos são anticorpos cujos genes da cadeia leve e pesada foram construídos, tipicamente através de engenharia genética, a partir de segmentos de genes de imunoglobulina que pertencem a diferentes espécies. Por exemplo, os segmentos da região variável (V) dos genes de um anticorpo monoclonal de ratos podem ser unidos aos segmentos da região constante humana (C), tal como na IgGl e IgG4. 0 isotipo IgGl humano é preferencial. Em alguns métodos, o isotipo do anticorpo é a IgGl. A IgM humana pode também ser utilizada em alguns métodos. Um anticorpo quimérico típico é então uma proteína híbrida que consiste, no domínio V ou no domínio de ligação ao antigénio de um anticorpo de um rato, e no domínio C ou no domínio efetor de um anticorpo humano.

Os anticorpos humanizados possuem resíduos estruturais da região variável provenientes substancialmente de um anticorpo humano (designado por anticorpo aceitador), e regiões determinantes de complementaridade provenientes substancialmente de um anticorpo de um rato, (referido como a imunoglobulina dadora), Ver, Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86:10029-10033 (1989), documento WO 90/07861, documento US 5,693,762, documento US 5,693,761, documento US 5,585,089, documento US 5,530,101, e Winter, documento US 5,225,539. A(s) região(ões) constante(s), se presente(s), também é(são) substancialmente ou inteiramente proveniente(s) de uma imunoglobulina humana. Os domínios variáveis humanos são geralmente escolhidos a partir de anticorpos humanos, cujas sequências de estrutura apresentam um elevado grau de identidade de sequência para com os domínios da região variável de murganhos, a partir dos quais as RDCs foram derivadas. Os resíduos estruturais das cadeias pesada e leve da região variável, podem ser derivados a partir das mesmas, ou de diferentes, sequências de anticorpo humano. As sequências de anticorpo humano podem ser as sequências de anticorpos humanos de ocorrência natural, ou podem ser sequências consensuais de vários anticorpos humanos. Ver Carter et al., documento WO 92/22653. Alguns aminoácidos dos resíduos estruturais da região variável humana, são selecionados para substituição com base na sua possível influência na conformação da RDC e/ou ligação ao antigénio. A investigação de tais possíveis influências é realizada através da modelação e análise das caracteristicas dos aminoácidos em determinadas localizações, ou pela observação empírica dos efeitos da substituição ou mutagénese de determinados aminoácidos.

Por exemplo, quando um aminoácido difere entre o resíduo estrutural de uma região variável de um murganho, e um resíduo estrutural selecionado de uma região variável humana, o aminoácido estrutural humano deve ser geralmente substituído pelo aminoácido estrutural equivalente de um anticorpo de um rato, quando for razoavelmente expectável que o aminoácido: (1) liga-se de forma não covalente e direta ao antigénio, (2) é adjacente a uma região RDC, (3) de outra forma, interage com uma região RDC (por exemplo, está entre cerca de 6 A de uma região RDC), ou (4) participa na interface VL-VH.

Outros candidatos para a substituição, são aminoácidos estruturais humanos aceitadores que não são usuais numa imunoglobulina humana para esta posição. Estes aminoácidos podem ser substituídos por aminoácidos provenientes da posição equivalente em anticorpos dadores de rato, ou provenientes da posição equivalente em imunoglobulinas humanas mais típicas. Outros candidatos para a substituição são aminoácidos estruturais humanos aceitadores que não são usuais numa imunoglobulina humana para esta posição. As regiões de estrutura variável de imunoglobulinas humanizadas, apresentam normalmente pelo menos 85 % de identidade de sequência para com uma sequência da região de estrutura variável humana ou um consenso de tais sequências.

Alguns anticorpos humanizados compreendem sequências de regiões determinantes de complementaridade (RDCs) derivadas a partir do anticorpo monoclonal de rato mAb 6H7. A linha celular designada por JH17.6H7.1.54.28, que produz o anticorpo 6H7, tem o número de acesso ATCC PTA-6910, tendo sido depositada ao abrigo das disposições do Tratado de Budapeste com a American Type Culture Collection (ATCC, P.0. Box 1549, Manassas, VA 20108) a 4 de agosto de 2005.

Alguns anticorpos humanizados compreendem sequências de regiões determinantes de complementaridade (RDCs) derivadas a partir do anticorpo monoclonal de rato mAb 8A5. A linha celular designada por JH4.8A5.25.7.36, que produz o anticorpo 8A5, tem o número de acesso ATCC PTA-6909 e foi depositada a 4 de Agosto de 2005.

Alguns anticorpos humanizados compreendem sequências de regiões determinantes de complementaridade (RDCs) derivadas a partir do anticorpo monoclonal de rato mAb 9E4. A linha celular designada por JH17.9E4.3.37.1.14.2, que produz o anticorpo 9E4, tem o número de acesso ATCC PTA-8221, tendo sido depositada ao abrigo das disposições do Tratado de Budapeste com a American Type Culture Collection (ATCC, P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108) a 26 de Fevereiro de 2007 .

Alguns anticorpos humanizados compreendem sequências de regiões determinantes de complementaridade (RDCs) derivadas a partir do anticorpo monoclonal de rato mAb 11A5. A linha celular designada por JH22.11A5.6.29.70.54.16.14, que produz o anticorpo 11A5, tem o número de acesso ATCC PTA-8222, tendo sido depositada ao abrigo das disposições do Tratado de Budapeste com a American Type Culture Collection (ATCC, P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108) a 26 de Fevereiro de 2007.

Alguns anticorpos humanizados compreendem sequências de regiões determinantes de complementaridade (RDCs) derivadas a partir do anticorpo monoclonal de rato mAb 1H7. A linha celular designada por JH17.1H7.4.24.34, que produz o anticorpo 1H7, tem o número de acesso ATCC PTA-8220, tendo sido depositada ao abrigo das disposições do Tratado de Budapeste com a American Type Culture Collection (ATCC, P.0. Box 1549, Manassas, VA 20108) a 26 de Fevereiro de 2007 .

Como observado anteriormente, são conhecidos vários métodos para a produção de anticorpos quiméricos e humanizados através do uso de uma linha celular que expressa o anticorpo (por exemplo, hibridomas). Por exemplo, as regiões variáveis da imunoglobulina dos anticorpos 8A5 e/ou 6H7 e/ou 9E4 de ratos, podem ser clonadas e sequenciadas utilizando métodos conhecidos. Igualmente, as regiões variáveis da imunoglobulina dos anticorpos 1H7 ou 11A5 de ratos, podem ser clonadas e sequenciadas utilizando métodos conhecidos. Num método, como ilustração e não limitação, a região variável da cadeia pesada VH é clonada por RT-PCR utilizando ARNm preparado a partir de células do hibridoma. São empregues promotores consensuais no péptido líder da região VH, de forma a abranger o codão de iniciação da tradução como o promotor 5' e um promotor 3' específico para regiões constantes g2b. Exemplos de promotores são descritos na publicação da patente US 2005/0009150 por Schenk et ai. (doravante, "Schenk"). As sequências para múltiplos clones derivados independentemente, podem ser comparadas para garantir que não são introduzidas alterações durante a amplificação. A sequência da região VH pode também ser determinada ou confirmada pela sequenciação de um fragmento VH, obtido através da metodologia 5'RACERT-PCR e o promotor 3' específico g2b. A região variável da cadeia leve VL de 8A5, 6H7, 9E4, 1H7 ou 11A5, pode ser clonada de forma análoga à região VH. Numa abordagem, um conjunto de promotores consensuais concebido para a amplificação de regiões VL de murganhos é desenhado para hibridar com a região VL, englobando o codão de iniciação da tradução e um promotor 3' especifico para a região Ck, a jusante da região de união V-J, de murganhos. Numa segunda abordagem, a metodologia 5'RACE RT-PCR é utilizada para clonar um ADNc que codifica a VL. Exemplos de promotores estão descritos em Schenk. As sequências clonadas são então combinadas com sequências que codificam regiões constantes humanas.

Numa abordagem, as regiões variáveis de cadeia pesada e leve são re-manipuladas para codificar as sequências dadoras de splicing a jusante das respetivas junções VDJ ou VJ, e clonadas num vetor de expressão mamífero, tal como o pCMV-hyl para a cadeia pesada e pCMV-sxkl para a cadeia leve. Estes vetores codificam as regiões constantes γΐ humana e Ck, como fragmentos exónicos a jusante da cassete genética da região variável inserida. Após a verificação da sequência, os vetores de expressão da cadeia pesada e da cadeia leve podem ser co-transfectados em células COS para produção de anticorpos quiméricos. 48 horas após a transfeção, o meio condicionado é recolhido e analisado pela técnica de Western blot face à produção de anticorpos, ou pela técnica ELISA face à ligação ao antigénio. Os anticorpos quiméricos são humanizados, tal como descrito acima. iii. Anticorpos Humanos

Os anticorpos humanos para a alfa-SN são fornecidos por uma variedade de técnicas descritas a seguir. Alguns anticorpos humanos são selecionados através de experiências de ligação competitiva, ou de outra forma, por terem a mesma especificidade de epítopo que um anticorpo de rato em particular, tal como por exemplo, um dos anticorpos monoclonais de rato descritos nos Exemplos IX e X. Os anticorpos humanos podem também ser rastreados quanto à especificidade para um epítopo em particular, utilizando apenas um fragmento da alfa-SN como imunogénio, e/ou através do rastreio de anticorpos para um conjunto de mutantes de eliminação da alfa-SN. Os anticorpos humanos têm preferencialmente especificidade para o isotipo IgGl humano. (1) Metodologia do trioma A abordagem básica e um parceiro de fusão celular exemplar, SPAZ-4, para utilização nesta abordagem, foram descritos por Oestberg et ai., Hybridoma 2:361-367 (1983); Oestberg, Patente E.U.A. No. 4,634,664; e Engleman et ai., Patente E.U.A. No. 4,634,666. As linhas celulares produtoras de anticorpos obtidas por este método são denominadas por triomas, dado que descendem de três células, duas humanas e uma de rato. Inicialmente, uma linha de mieloma de rato é fundida com um linfócito-B humano para obtenção de uma célula híbrida xenogeneica não produtora de anticorpos, tal como a linha celular SPAZ-4 descrita por Oestberg, supra. A célula xenogénica é então fundida com um linfócito-B humano imunizado, para obtenção de uma linha celular trioma produtora de anticorpos. Concluiu-se que os triomas produzem anticorpos mais estavelmente do que os hibridomas feitos a partir de células humanas normais.

Os linfócitos-B imunizados são obtidos a partir do sangue, baço, nódulos linfáticos ou da medula óssea de um dador humano. Se os anticorpos contra um antigénio ou epítopo em específico são desejados, é preferível utilizar esse antigénio ou seu epítopo para a imunização. A imunização pode ser in vivo ou in vitro. Para a imunização in vivo, as células-B são normalmente isoladas a partir de um humano imunizado com alfa-SN, um fragmento seu, um polipéptido maior que contém alfa-SN ou um fragmento seu, ou um anticorpo anti-idiotípico para um anticorpo da alfa-SN. Em alguns métodos, as células-B são isoladas a partir do mesmo paciente ao qual, em último lugar, será administrada a terapia com anticorpos. Para a imunização in vitro, os linfócitos-B são tipicamente expostos ao antigénio durante um período de 7-14 dias num meio, como por exemplo, um meio RPMI-1640 (ver Engleman, supra) suplementado com 10 % de plasma humano.

Os linfócitos-B imunizados são fundidos com uma célula híbrida xenogénica, tal como SPAZ-4, através de métodos conhecidos. Por exemplo, as células são tratadas com polietilenoglicol a 40-50 % e com PM 1000-4000, a cerca de 37 graus Celsius, aproximadamente durante 5-10 min. As células são separadas da mistura de fusão e propagadas em meios seletivos para os híbridos desejados (por exemplo, HAT ou AH). Os clones que segregam anticorpos que possuem a especificidade de ligação requerida, são identificados testando o meio de cultura do trioma quanto à capacidade para se ligarem à alfa-SN ou a um fragmento seu. Os triomas que produzem anticorpos humanos possuindo a especificidade desejada, são subclonados através da técnica de diluição limitante, e cultivados in vitro em meio de cultura. As linhas celulares do trioma obtidas, são então testadas quanto à capacidade para se ligarem à alfa-SN ou a um fragmento seu.

Embora os triomas sejam geneticamente estáveis, estes não produzem anticorpos a níveis muito elevados. Os níveis de expressão podem ser aumentados através da clonagem dos genes do anticorpo provenientes do trioma, para um ou mais vetores de expressão, e transformando o vetor em linhas celulares padrão mamíferas, bacterianas ou de levedura. (2) Mamíferos Não Humanos Transgénicos

Os anticorpos humanos para a alfa-SN podem também ser produzidos a partir de mamíferos transgénicos não humanos, que possuem transgenes que codificam pelo menos um segmento do locus da imunoglobulina humana. Geralmente, o locus endógeno da imunoglobulina para tais mamíferos transgénicos está funcionalmente inativado. Preferencialmente, o segmento do locus da imunoglobulina humana inclui sequências não rearranjadas de componentes das cadeias pesadas e leves. Tanto a inativação dos genes endógenos da imunoglobulina e a introdução de genes exógenos de imunoglobulina, podem ser alcançadas através de recombinação homóloga dirigida, ou através da introdução de cromossomas YAC. Os mamíferos transgénicos que resultam deste processo são capazes de rearranjamento funcional das sequências dos componentes da imunoglobulina, e de expressar um repertório de anticorpos de vários isotipos codificados pelos genes da imunoglobulina humana, sem expressar os genes endógenos da imunoglobulina. A produção e as propriedades dos mamíferos que possuem estas propriedades são descritas em detalhe em, por exemplo,

Lonberg et al., documento W093/1222, documento US

5,877,397, documento US 5,874,299, documento US 5,814,318, documento US 5,789,650, documento US 5,770,429, documento US 5,661,016, documento US 5,633,425, documento US 5,625,126, documento US 5,569,825, documento US 5,545,806, Nature 148, 1547-1553 (1994), Nature Biotechnology 14, 826 (1996), Kucherlapati, documento WO 91/10741. Ratos transgénicos são particularmente adequados. Os anticorpos anti-alfa-SN são obtidos pela imunização de um mamífero transgénico não humano, tal como descrito por Lonberg ou Kucherlapati, supra, com alfa-SN ou um fragmento seu. Os anticorpos monoclonais são preparados, por exemplo, através da fusão de células-B de tais mamíferos para linhas celulares de mieloma adequadas, segundo a utilização de tecnologia convencional Kohler-Milstein. Os anticorpos policlonais humanos podem também ser fornecidos sob a forma de soro proveniente de humanos imunizados com um agente imunogénico. Opcionalmente, estes anticorpos policlonais podem ser concentrados por purificação de afinidade utilizando a alfa-SN ou outro péptido amiloide como um reagente de afinidade. (3) Métodos de Phage Display

Uma outra abordagem para a obtenção de anticorpos anti-alfa-SN humanos, é o rastreio de uma biblioteca de ADN a partir de células-B humanas, de acordo com o protocolo geral delineado por Huse et al., Science 246:1275-1281 (1989) . Tal como descrito para a metodologia do trioma, tais células-B pode ser obtidas a partir de um humano imunizado com alfa-SN, fragmentos, polipéptidos maiores ou fragmentos que contêm alfa-SN, ou anticorpos anti-idiotípicos. Opcionalmente, tais células-B são obtidas a partir do mesmo paciente ao qual, em último lugar, será administrada a terapia com anticorpos. São selecionados os anticorpos que se ligam à alfa-SN ou a um fragmento seu. As sequências que codificam tais anticorpos (ou fragmentos de ligação) são então clonadas e amplificadas. 0 protocolo descrito por Huse tem maior eficácia em combinação com a tecnologia de phage-display. Ver, por exemplo, Dower et al., documento WO 91/17271 e McCafferty et al., documento WO 92/01047, documento US 5,877,218, documento US 5,871,907, documento US 5,858,657, documento US 5,837,242, documento US 5,733,743 e documento US 5,565,332. Nestes métodos, são produzidas bibliotecas de fagos cujos membros exibem diferentes anticorpos nas suas superfícies exteriores. Os anticorpos são normalmente apresentados como fragmentos Fv ou Fab. Os fagos que exibem anticorpos com uma especificidade desejada, são selecionados pelo enriquecimento da afinidade para um péptido alfa-SN ou um fragmento seu.

Numa variante do método de phage display, podem ser produzidos anticorpos humanos que possuem especificidade de ligação para um anticorpo de murganho selecionado. Ver Winter, documento WO 92/20791. Neste método, quer a região variável da cadeia pesada ou a região variável da cadeia leve do anticorpo de murganho selecionado, são utilizadas como material de partida. Se, por exemplo, uma região variável de cadeia leve é selecionada como o material de partida, é construída uma biblioteca de fagos cujos membros exibem a mesma região variável da cadeia leve (isto é, o material de partida do murganho) e uma região variável da cadeia pesada que é diferente. As regiões variáveis da cadeia pesada são obtidas a partir de uma biblioteca de regiões variáveis da cadeia pesada, que são rearranjadas e de origem humana. Um fago que demonstre uma forte ligação específica para a alfa-SN (por exemplo, pelo menos 108, e preferencialmente, pelo menos 109 M_1) é selecionado. A região variável da cadeia pesada de origem humana deste fago, serve então como um material de partida para a construção de uma nova biblioteca de fagos. Nesta biblioteca, cada fago exibe a mesma região variável da cadeia pesada (isto é, a região identificada a partir da primeira biblioteca de exibição) e uma região variável da cadeia leve que é diferente. As regiões variáveis da cadeia leve são obtidas a partir de uma biblioteca de regiões variáveis da cadeia leve, que são rearranjadas e de origem humana.

Novamente, fagos que demonstrem uma forte ligação específica para a alfa-SN são selecionados. Estes fagos exibem as regiões variáveis dos anticorpos anti-alfa-SN completamente humanos. Estes anticorpos têm geralmente a mesma, ou similar, especificidade para o epítopo, do que o material de partida proveniente de murganhos. iv. Seleção da Região Constante

As regiões variáveis das cadeias pesada e leve de anticorpos quiméricos, humanizados ou humanos, podem ser ligadas, pelo menos, a uma porção de uma região constante humana. A escolha de uma região constante depende, em parte, se é desejado um complemento dependente do anticorpo e/ou toxicidade mediada por células. Por exemplo, os isotipos IgGl e IgG3 têm atividade do complemento, e os isotipos IgG2 e IgG4 não têm esta atividade. A escolha do isotipo pode também afetar a passagem do anticorpo para o cérebro. É preferencial o isotipo IgGl humano. As regiões constantes das cadeias leves podem ser lambda ou kapa. Os anticorpos podem ser expressos como tetrâmeros que contêm duas cadeias leves e duas cadeias pesadas, como cadeias pesadas e leves separadas, como Fab, Fab' F(ab')2, e Fv, ou como anticorpos de cadeia simples, nos quais os domínios variáveis das cadeias pesada e leve estão ligados através de um espaçador. v. Expressão de Anticorpos Recombinantes

Os anticorpos quiméricos, humanizados e humanos, são tipicamente produzidos através de expressão recombinante. As estruturas polinucleotídicas recombinantes tipicamente incluem uma sequência de controlo de expressão, que está operativamente ligada às sequências de codificação das cadeias do anticorpo, incluindo as regiões promotoras naturalmente associadas ou heterólogas. Preferencialmente, as sequências de controlo de expressão são sistemas promotores eucarióticos em vetores capazes de transformar ou transfectar células hospedeiras eucarióticas. Uma vez que o vetor tenha sido incorporado no hospedeiro apropriado, o hospedeiro é mantido sob condições adequadas para um elevado nivel de expressão das sequências nucleotidicas, e para a recolha e purificação dos anticorpos que verificam reações cruzadas.

Estes vetores de expressão são tipicamente replicáveis nos organismos hospedeiros, quer como epissomas ou como uma parte integrante do ADN cromossómico do hospedeiro. Usualmente, os vetores de expressão contêm marcadores de seleção, por exemplo, de resistência à ampicilina ou à higromicina, para permitir a deteção das células transformadas com as sequências de ADN desejadas. A E. coli é um hospedeiro procariótico particularmente útil para a clonagem das sequências de ADN da presente divulgação. Os microrganismos, tais como leveduras, são também úteis para a expressão. A Saccharomyces é um hospedeiro de levedura preferencial, com vetores adequados que possuem sequências de controlo da expressão, uma origem de replicação, sequências de terminação e semelhantes, como é desejado. Tipicamente os promotores incluem a cinase 3-fosfoglicerato e outras enzimas glicoliticas. Os promotores de levedura passíveis de indução incluem, entre outros, promotores do álcool desidrogenase, isocitocromo C e enzimas responsáveis pela utilização da maltose e galactose.

As células de mamíferos são um hospedeiro preferencial para a expressão de segmentos nucleotídicos que codificam imunoglobulinas ou fragmentos destas. Ver Winnacker, From Genes to Clones, (VCH Publishers, NY, 1987) . Várias linhas celulares hospedeiras, adequadas e capazes de segregar proteínas heterólogas intactas, foram desenvolvidas na especialidade e incluem as linhas celulares CHO, várias linhas celulares COS, células HeLa, células L, células de rim embrionário humano e linhas celulares do mieloma. Preferencialmente, as células não são humanas. Os vetores de expressão para estas células podem incluir sequências de controlo de expressão, tal como uma origem de replicação, um promotor, um intensificador (Queen et al., Immunol. Rev. 89:49 (1986)), e locais necessários de processamento de informação, tais como locais de ligação a ribossomas, locais de splicing de ARN, locais de poliadenilação e sequências de terminação da transcrição. Sequências de controlo da expressão preferenciais, são promotores derivados de genes endógenos, citomegalovírus, SV40, adenovirus, virus do papiloma bovino e semelhantes. Ver Co et ai., J. Immunol. 148:1149(1992).

Alternativamente, as sequências codificadoras de anticorpos podem ser incorporadas em transgenes para introdução no genoma de um animal transgénico, e subsequente expressão no leite do animal transgénico (ver, por exemplo, documento US 5,741,957, documento US 5,304,489, documento US 5,849,992). Os transgenes adequados incluem sequências que codificam as cadeias leves e/ou pesadas, numa ligação operacional com um promotor e intensificador de um gene especifico da glândula mamária, tal como a caseína ou beta lactoglobulina.

Os vetores que possuem os segmentos de ADN de interesse podem ser transferidos para a célula hospedeira através de métodos conhecidos, dependendo do tipo de hospedeiro celular. Por exemplo, a transfecção com cloreto de cálcio é vulgarmente utilizada para células procarióticas, enquanto o tratamento com fosfato de cálcio, electroporação, lipofecção, biolística ou transfecção de base virai, podem ser utilizados para outros hospedeiros celulares. Outros métodos utilizados para transformar células de mamíferos incluem a utilização de polibreno, fusão de protoplastos, lipossomas, electroporação e microinjeção (ver geralmente, Sambrook et al., supra). Para a produção de animais transgénicos, os transgenes podem ser micro-injectados em oócitos fertilizados, ou podem ser incorporados no genoma de células estaminais embrionárias, e os núcleos de tais células são transferidos para oócitos enucleados.

Uma vez expressos, os anticorpos podem ser purificados de acordo com procedimentos padrão da técnica, incluindo a purificação por HPLC, cromatografia em coluna, eletroforese em gel e semelhantes (ver geralmente, Scopes, Protein Purification (Springer-iVerlag, NY, 1982)). 3. Conjugados

Alguns agentes para induzirem uma resposta imunitária contêm o epítopo apropriado para a indução de uma resposta imunitária contra os CLs, mas são demasiado pequenos para serem imunogénicos. Nesta situação, um péptido imunogénico pode ser ligado a uma molécula de transporte adequada, de modo a formar um conjugado que ajuda a suscitar uma resposta imunitária. Os veículos de transporte adequados incluem albuminas de soro, hemocianina de lapa, moléculas de imunoglobulina, tiroglobulina, ovalbumina, toxóide tetânico ou um toxóide obtido a partir de outras bactérias patogénicas, tais como difteria, E. coli, cólera ou H. pylori, ou um derivado tóxico atenuado. Os epítopos de células-T também são moléculas de transporte adequadas. Alguns conjugados podem ser formados pela ligação a uma molécula de polímero imunoestimulante (por exemplo, tripalmitoil-S-glicerina cisteína (Pam3Cys) , manana (um polímero de manose) , orgtucan (um polímero beta l->2), citocinas (por exemplo, IL-1, alfa e beta péptidos de IL-1, IL-2, gama-INF, IL-10, GM-CSF) e quimiocinas (por exemplo, alfa e beta MIPl, e RANTES). Os agentes imunogénicos também podem ser ligados a péptidos que aumentam o transporte através de tecidos, tal como descrito por 0'Mahony, documento WO 97/17613 e documento WO 97/17614. Os imunogénios podem ser ligados aos veículos de transporte com, ou sem, espaçadores constituídos por aminoácidos (por exemplo, gly-gly).

Alguns conjugados podem ser formados pela ligação dos agentes a pelo menos um epítopo das células-T. Alguns epítopos das células-T são promíscuos, enquanto outros epítopos das células-T são universais. Os epítopos promíscuos das células-T são capazes de melhorar a indução da imunidade de células-T, numa ampla variedade de sujeitos que exibem diversos tipos de HLA. Em contraste com os epítopos promíscuos das células-T, os epítopos universais das células-T são capazes de melhorar a indução da imunidade de células-T numa grande percentagem, por exemplo, pelo menos 75 %, dos sujeitos que exibem várias moléculas de HLA codificadas pelos diferentes alelos HLA-DR.

Existe um grande número de epítopos de células-T de ocorrência natural, tais como, o toxóide do tétano (por exemplo, os epítopos P2 e P30), o antigénio de superfície da Hepatite B, pertussis, toxóide, a proteína F do vírus do sarampo, a principal proteína membranar externa da Chlamydia trachomatis, o toxóide da difteria, circumsporozite T de Plasmodium falciparum, o antigénio CS Plasmodium falciparum, a isomerase fosfato de triose da

Schistosoma mansoni, TraT da Escherichia coli e a hemaglutinina (HA) do virus Influenza. Os péptidos imunogénicos da divulgação podem também ser conjugados com os epitopos de células-T descritos em Sinigaglia F. et al., Nature, 336:778-780 (1988); Chicz R.M. et al., J. Exp.

Med., 178:27-47 (1993); Hammer J. et al., Cell 74:197-203 (1993); Falk K. et al., Immunogenetics, 39:230-242 (1994); WO 98/23635; e, Southwood S. et al., J. Immunology, 160:3363-3373 (1998). Outros exemplos incluem:

Hemaglutinina da influenza: HA307-319 PKYVKQNTLKLAT (SEQ ID NO: 4)

Malária CS: epítopo T3 EKKIAKMEKASSVFNV (SEQ ID NO: 5) Antigénio de Superfície da Hepatite B: HBsAgi9_28 FFLLTRILTl (SEQ ID NO: 6)

Proteína de choque térmico 65: hsp65i53-i7i DQSIGDLIAEAMDKVGNEG (SEQ ID NO: 7)

Bacilo de Calmette-Guerin: QVHFQPLPPAVVKL (SEQ ID NO: 8) Toxóide do tétano: TT830-844 QYIKANSKFIGITEL (SEQ ID NO: 9) Toxóide do tétano: TT947-967 FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE (SEQ ID NO: 10) HIV gpi2o Tl: KQIINMWQEVGKAMYA (SEQ ID NO:)

Alternativamente, os conjugados podem ser formados pela ligação dos agentes da invenção a pelo menos um epítopo artificial de células-T, que é capaz de ligar-se a uma grande proporção de moléculas MHC de classe II, tal como o epítopo pan DR ("PADRE"). O PADRE é descrito no documento US 5,736, 142, documento WO 95/07707 e Alexander J et al. , Immunity, 1:751-761 (1994). Um péptido PADRE preferencial é AKXVAAWTLKAAA (SEQ ID NO: 12), (resíduos comuns em negrito) em que X é preferencialmente ciclohexilalanina, tirosina ou fenilalanina, sendo a ciclohexilalanina a mais preferencial.

Os agentes imunogénicos podem ser ligados aos veículos de transporte por reticulação química. As técnicas para a ligação de um imunogénio a um veículo de transporte incluem a formação de ligações dissulfureto, utilizando N- succinimidil-3-(2-piridil-tio)propionato (SPDP) e succinimidil-4-(N-maleimidometil)ciclohexano-l-carboxilato (SMCC) (se o péptido não tem um grupo sulfidrilo, este pode ser proporcionado pela adição de um resíduo de cisteína). Estes reagentes criam uma ligação dissulfureto entre si e o péptido cisteína que reside numa proteína, e uma ligação amida através da epsilon-amina numa lisina ou através de outro grupo amino que esteja livre noutros aminoácidos.

Uma variedade de tais agentes formadores de ligações dissulfureto/amida são descritos por Immun. Rev. 62, 185 (1982). Outros agentes de acoplamento bifuncionais formam um tioéter em vez de uma ligação dissulfureto. Muitos destes agentes formadores de tioéter estão comercialmente disponíveis e incluem ésteres reativos de ácido 6-maleimidocapróico, ácido 2-bromoacético e ácido 2- iodoacético, ácido 4-(N-maleimido-metil)ciclohexano-1-carboxílico. Os grupos carboxilo podem ser ativados pela combinação destes com succinimida ou ácido l-hidroxil-2-nitro-4-sulfónico, sal de sódio.

A imunogenicidade pode ser melhorada através da adição de resíduos que atuem como um espaçador (por exemplo, Gly-Gly) , entre o epítopo Th e o péptido imunogénico da divulgação. Além de se separar fisicamente o epítopo Th do epítopo da célula-B (ou seja, o péptido imunogénico), os resíduos de glicina podem perturbar quaisquer estruturas secundárias artificiais criadas pela união do epítopo Th com o péptido imunogénico e, assim, eliminar a interferência entre as respostas referentes às células-T e/ou B. A separação conformacional entre o epítopo auxiliar e o domínio suscitado do anticorpo, permite então interações mais eficientes entre o imunogénio apresentado e o Th adequado e células B.

De forma a aumentar a indução de imunidade de células-T numa grande percentagem de pacientes, que exibam diversos tipos de HLA para um agente da presente divulgação, pode ser preparada uma mistura de conjugados com diferentes epitopos celulares Th. A mistura pode conter uma mistura de pelo menos dois conjugados com diferentes epitopos celulares Th, uma mistura de pelo menos três conjugados com diferentes epitopos celulares Th, ou uma mistura de pelo menos quatro conjugados com diferentes epitopos celulares Th. A mistura pode ser administrada com um adjuvante.

Os péptidos imunogénicos podem também ser expressos como proteínas de fusão com veículos de transporte (isto é, péptidos heterólogos). 0 péptido imunogénico pode ser ligado no seu terminal amina, no seu terminal carboxílico ou em ambos, a um veículo. Opcionalmente, várias repetições do péptido imunogénico podem estar presentes na proteína de fusão. Opcionalmente, um péptido imunogénico pode ser ligado a várias cópias de um péptido heterólogo, por exemplo, em ambos os terminais N e C do péptido. Alguns péptidos de transporte servem para induzir uma resposta de células-T auxiliares contra o péptido de transporte. As células-T auxiliares induzidas, por sua vez induzem uma resposta de células-B contra o péptido imunogénico ligado ao péptido de transporte.

Alguns agentes da divulgação compreendem um a proteína de fusão na qual um fragmento N-terminal da alfa-SN está ligado à extremidade C-terminal de um péptido de transporte. Em tais agentes, o resíduo N-terminal do fragmento de alfa-SN constitui o resíduo N-terminal da proteína de fusão. Deste modo, tais proteínas de fusão são eficazes na indução de anticorpos que se ligam a um epítopo que requer que o resíduo N-terminal da alfa-SN esteja numa forma livre. Alguns agentes compreendem um a pluralidade de repetições de CNA, ligadas ao C-terminal de uma ou mais cópias de um péptido de transporte. Algumas proteínas de fusão compreendem diferentes segmentos da alfa-SN em tandem.

Alguns agentes compreendem um a proteína de fusão na qual um fragmento C-terminal da alfa-SN está ligado à extremidade N-terminal de um péptido de transporte. Em tais agentes, o resíduo C-terminal do fragmento de alfa-SN constitui o resíduo C-terminal da proteína de fusão. Deste modo, tais proteínas de fusão são eficazes na indução de anticorpos que se ligam a um epítopo que requer que o resíduo C-terminal da alfa-SN esteja numa forma livre. Alguns agentes compreendem um a pluralidade de repetições de um péptido C-terminal, tal como o SN125-140, ligadas ao N-terminal de uma ou mais cópias de um péptido de transporte. Algumas proteínas de fusão compreendem diferentes segmentos da alfa-SN em tandem.

Em algumas proteínas de fusão, o CNA está fundido na sua extremidade N-terminal a um péptido de transporte heterólogo. Em algumas proteínas de fusão, o CNA está fundido na sua extremidade C-terminal a um péptido de transporte heterólogo. Algumas proteínas de fusão compreendem um péptido heterólogo ligado ao N-terminal ou C-terminal do CNA, o qual por sua vez está ligado a um ou mais segmentos CNA da alfa-SN em tandem. Algumas proteínas de fusão compreendem múltiplas cópias de um péptido C-terminal da alfa-sinucleína, como descrito acima, e múltiplas cópias de um péptido heterólogo interligadas umas às outras.

Alguns exemplos de proteínas de fusão são apresentados abaixo. Algumas destas proteínas de fusão compreendem segmentos da alfa-Sn (incluindo qualquer um dos fragmentos acima descritos) ligados aos epítopos do toxóide do tétano, como descrito no documento US 5,196,512, documento EP 378,881 e documento EP 427,347. Algumas proteínas de fusão compreendem segmentos da alfa-SN ligados a pelo menos um PADRE. Alguns péptidos heterólogos são epítopos promíscuos de células-T, enquanto outros péptidos heterólogos são epítopos universais de células-T. Em alguns métodos, o agente para administração é simplesmente uma única proteína de fusão com um segmento de alfa-SN ligado a um segmento heterólogo numa configuração linear. Os agentes terapêuticos da divulgação podem ser representados por uma fórmula. Por exemplo, em alguns métodos, o agente é um multímero de proteínas de fusão representado pela fórmula 2X, em que x é um número inteiro de 1-5. Preferencialmente, x é 1, 2 ou 3, sendo 2 o mais preferencial. Quando x é dois, tal multímero possui quatro proteínas de fusão ligadas numa configuração preferencial que é referida como MAP4 (ver documento US 5,229,490). A configuração MAP4 é apresentada abaixo, onde as estruturas ramificadas são produzidas pela iniciação da síntese peptídica quer no N-terminal, quer nas aminas das cadeias laterais referentes à lisina. Dependendo do número de vezes que a lisina está incorporada na sequência e permitida a ramificar, a estrutura resultante apresentará múltiplos terminais N. Neste exemplo, quatro terminais N idênticos foram produzidos no núcleo ramificado que contém lisina. Tal multiplicidade aumenta em muito a resposta de cognatos células-B.

Z refere-se a um péptido do CNA, a um fragmento do péptido do CNA, ou a outro fragmento ativo da alfa-SN, tal como descrito na secção I. 2 acima. Z pode representar mais do que um fragmento ativo, por exemplo: Z = péptido alfa-SN 60-72 (região CNA) = NH2-KEQVTNVCGGAVVT-COOH (SEQ ID NO: 13) Z = péptido alfa-SN 73-84 (região CNA) = NH2-GVTAVAQKTVECG-COOH (SEQ ID NO: 14) Z = péptido alfa-SN 102-112 = ácido NH2-C-amino-heptanóico KNEEGAPCQEG-COOH (SEQ ID NO: 15) péptido alfa-SN 128-140

Outros exemplos de proteínas de fusão incluem: Z-toxóide do tétano 830-844 numa configuração MAP4: Z-QYIKANSKFIGITEL (SEQ ID NO: 16) Z- toxóide do tétano 947-967 numa configuração MAP4: Z-FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE (SEQ ID NO: 17) Z- toxóide do tétanos3o-844 numa configuração MAP4: Z-QYlKANSKFIGITEL (SEQ ID NO : 18) Z- toxóide do tétanos3o-844 + toxóide do tétano947-967 numa configuração linear: Z - QYIKANSKFIGITELFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE (SEQ ID NO : 19) Péptido PADRE (todos em configurações lineares), em que X é preferencialmente ciclohexilalanina, tirosina ou fenilalanina, sendo a ciclohexilalanina a mais preferencial: AKXVAAWTLKAAA-Z (SEQ ID NO: 20) Péptido 3Z-PADRE : Z-Z-Z-AKXVAAWTLKAAA (SEQ ID NO: 21)

Outros exemplos de proteínas de fusão incluem: AKXVAAWTLKAAA-Z-Z-Z-Z (SEQ ID NO: 22) Z-AKXVAAWTLKAAA (SEQ ID NO: 23) Z-1SQAVHAAHAEINEAGR (SEQ ID NO: 24) PKYVKQNTLKLAT-Z-Z-Z (SEQ ID NO: 25) Z-Z-PKYVKQNTLKLAT (SEQ ID NO: 26) Z-Z-Z-PKYVKQNTLKLAT (SEQ ID NO: 27) Z-Z-PKYVKQNTLKLAT (SEQ ID NO: 28) Z-PKYVKQNTLKLAT-EKKiAKMEKASSVFNV-QYIKANSKFIGITEL-FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE-ZZZZ-QYIKANSKFIGITEL-FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE (SEQ ID NO: 29) Z-QYIKANSKFIGITELCFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE-Z-QYIKANSKFIGITELCFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE-Z (SEQ ID NO: 30) Z-QYIKANSKFIGITEL (SEQ ID NO: 31) numa resina birramifiçada:

EQVTNVGGAISQAVHAAHAEINEAGR (SEQ ID NO: 32) (Fragmento da proteína de fusão de sinucleina em configuração MAP-4)

As mesmas proteínas de transporte, ou semelhantes, e os métodos de ligação, podem ser utilizados para a geração de imunogénios a serem usados na produção de anticorpos contra a alfa-SN, a fim de serem utilizados em imunização passiva. Por exemplo, a alfa-SN ou um fragmento ligado a um veiculo de transporte, podem ser administrados a um animal de laboratório na produção de anticorpos monoclonais de alfa-SN. 4. Agentes Terapêuticos de Codificação dos Ácidos Nucleicos

As respostas imunitárias contra corpos de Lewy, podem também ser induzidas por administração de segmentos de ácidos nucleicos que codificam segmentos do péptido alfa-SN e fragmentos peptídicos resultantes deste, outros péptidos imunogénicos, ou anticorpos e respetivas cadeias de componentes, utilizados para imunização passiva. Tais ácidos nucleicos podem ser ADN ou ARN. Um segmento de ácido nucleico que codifica um imunogénio está tipicamente ligado a elementos reguladores, tais como um promotor e um potenciador, que permitem a expressão do segmento de ADN nas células alvo pretendidas de um paciente. Para a expressão em células do sangue, como é desejável para induzir uma resposta imunitária, os elementos promotor e intensificador dos genes das cadeias leves e pesadas da imunoglobulina, ou os elementos promotor e intensificador do intermediário inicial mais importante CMV, são adequados para dirigir a expressão. Os elementos reguladores ligados e as sequências de codificação são frequentemente clonados num vetor. Para a administração de anticorpos de cadeia dupla, as duas cadeias podem ser clonadas no mesmo vetor ou em vetores separados. Os agentes terapêuticos de codificação dos ácidos nucleicos da divulgação, podem também codificar pelo menos um epitopo de células-T. As divulgações desta invenção relacionam-se com a utilização de adjuvantes e a utilização de aplicações mutatis mutandis para o seu uso, e com os agentes terapêuticos de codificação dos ácidos nucleicos da presente divulgação.

Está disponível um certo número de sistemas de vetores virais, incluindo sistemas retrovirais (ver, por exemplo, Lawrie e Tumin, Cur. Opin. Genet. Develop. 3, 102-109 (1993)); vetores adenovirais (ver, por exemplo, Bett et ai., J. Virol. 67, 5911 (1993)); vetores virais adeno- associados (ver, por exemplo, Zhou et ai., J. Bxp. Med. 179, 1867 (1994)), vetores virais da família varíola, incluindo os vírus vaccinia e poxvirus aviário, vetores virais do vírus alfa género, tais como aqueles derivados a partir de Sindbis e da Floresta Semliki Vírus (ver, por exemplo, Dubensky et ai., J. Virol. 70, 508-519 (1996)), vírus da encefalomielite equina venezuelana (ver documento US 5,643,576) e vírus rabdo, tal como o vírus da estomatite vesicular (ver documento WO 96/34625) e vírus do papiloma (Ohe et ai., Human Gene Therapy 6, 325-333 (1995); Woo et ai., documento WO 94/12629 e Xiao & Brandsma, Nucleic

Acids. Res. 24, 2630-2622 (1996)).

Um ADN que codifica um imunogénio, ou um vetor que contém o mesmo, pode ser empacotado em lipossomas. Lípidos adequados e análogos relacionados, estão descritos no documento US 5,208,036, documento US 5,264,618, documento US 5,279,833 e documento US 5,283,185. Os vetores e ADN que codificam um imunogénio podem também ser adsorvidos em, ou associados a, partículas de transporte, exemplos dos quais se incluem os polímeros de polimetilo metacrilato e polilacticos e poli (lactido-co-glicolados), (ver, por exemplo, McGee et ai., J. Micro Encap. 1996).

Os vetores de terapia genética ou ADN sem histidina, podem ser entregues in vivo por administração a um paciente individual, tipicamente por administração sistémica (por exemplo, intravenosa, intraperitoneal, nasal, gástrica, intradérmica, intramuscular, subdérmica ou infusão intracraniana) ou por aplicação tópica (ver por exemplo, documento US 5,399,346). Tais vetores podem ainda incluir agentes de ajuda tais como bupivacine (ver por exemplo, documento US 5,593,970). O ADN pode também ser administrado utilizando uma pistola de genes. Ver Xiao & Brandsma, supra. O ADN que codifica um imunogénio é precipitado sobre a superfície de partículas metálicas microscópicas. Os microprojécteis são então acelerados por uma onda de choque ou por expansão de gás de Hélio, e penetram nos tecidos a uma profundidade de várias camadas celulares. Por exemplo, o dispositivo de entrega genética Accel™ fabricado pela Agacetus, Inc. Middleton, WI, é adequado. Como alternativa, o ADN sem histidina pode atravessar a pele até à corrente sanguínea, derramando simplesmente o ADN sobre a pele com irritação química ou mecânica associada (ver documento WO 95/05853).

Numa outra variação, os vetores que codificam os imunogénios podem ser entregues a células ex vivo, tais como células explantadas de um paciente individual (por exemplo, linfócitos, aspirados de medula óssea, e tecidos de biopsias) ou células estaminais hematopoiéticas de dador universal, seguindo-se o reimplante das células num paciente geralmente após a seleção das células que incorporaram o vetor. III. AGENTES PARA INDUZIR UMA RESPOSTA IMUNITÁRIA CONTRA Αβ Αβ, também conhecido como péptido β-amiloide, ou péptido A4 (ver documento US 4,666,829; Glenner & Wong, Biochem. Biophys. Res. Commun. 120, 1131 (1984)), é um péptido com 39-43 aminoácidos, que é o principal componente das plaquetas caracteristicas da doença de Alzheimer. 0 Αβ é gerado pelo processamento de uma grande proteína PPA por duas enzimas, designadas secretases β e γ (ver Hardy, TINS 20, 154 (1997)). As mutações conhecidas na PPA, associadas à doença de Alzheimer, ocorrem na proximidade do local das secretases β e γ, ou dentro do Αβ. Por exemplo, a posição 717 está na proximidade do local de clivagem da PPA pela secretase γ durante o seu processamento para formação do Αβ, e as posições 670/671 estão na proximidade do local de clivagem pela secretase β. Acredita-se que as mutações causam a DA através da interação com as reações de clivagem pelas quais ο Αβ é formado, aumentando-se a quantidade de aminoácidos gerados de forma 42/43 de Αβ. Ο Αβ tem a propriedade incomum de poder corrigir e ativar ambas as cascatas clássicas ou alternativas dos complementos. Em particular, liga-se a Clq e finalmente a C3bi. Esta associação facilita a ligação aos macrófagos, conduzindo à ativação de células-B. Além disso, o C3bi decompõe-se ainda mais e liga-se de seguida ao CR2 nas células-B segundo um modo dependente das células-T, levando a um aumento de 10000 vezes na ativação destas células. Este mecanismo faz com que ο Αβ gere uma resposta imunitária em excesso em comparação com outros antigénios. Ο Αβ apresenta várias formas de ocorrência natural. As formas humanas do Αβ são referidas como Αβ39, Αβ40, Αβ41, Αβ42 e Αβ43. As sequências destes péptidos e a sua relação com o precursor PPA são ilustradas pela Fig. 1 em Hardy et ai., TINS 20, 155-158 (1997) . Por exemplo, Αβ42 tem a sequência: DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIAT (SEQ ID NO: 33) Αβ41, Αβ39 e Αβ40 diferem de Αβ42 pela omissão de Ala, Ala-Ile e Ala-Ile-Val, respetivamente, a partir da extremidade C-terminal. Αβ43 difere de Αβ42 pela presença de um resíduo Thr na posição C-terminal.

Agentes análogos aos descritos anteriormente para a alfa-SN, foram previamente descritos para Αβ (ver documento WO 98/25386 e documento WO 00/72880) . Estes agentes incluem Αβ e fragmentos ativos resultantes do mesmo, conjugados de Αβ e conjugados de fragmentos ativos de Αβ, anticorpos para Αβ e fragmentos ativos resultantes dos mesmos (por exemplo, anticorpos de rato, humanizados, humanos e quiméricos), e ácidos nucleicos que codificam as cadeias dos anticorpos. São preferenciais os fragmentos ativos da metade N-terminal do Αβ. Fragmentos imunogénicos preferenciais incluem Αβ1-5, 1-6, 1-7, 1-10, 3-7, 1-3 e 1-4. Por exemplo, a designação Αβ1-5 indica um fragmento que inclui os resíduos 1-5 do Αβ e a que falta os outros resíduos de Αβ. Fragmentos que comecem nos resíduos 1-3 do Αβ e que acabem nos resíduos 7-11 do Αβ são particularmente preferenciais. Às divulgações que aqui se referem a agentes indutores de uma resposta imunitária ativa, agentes para a indução de uma resposta imunitária passiva, conjugados e ácidos nucleicos que codificam agentes terapêuticos (ver Secções II. 1, 2, 3 e 4, acima), aplica-se mutatis mutandis ao uso de Αβ e fragmentos resultante do mesmo. Às divulgações que aqui se referem a agentes indutores de uma resposta imunitária ativa, agentes para a indução de uma resposta imunitária passiva, conjugados e ácidos nucleicos que codificam agentes terapêuticos (ver Secções II. 1, 2, 3 e 4, acima), aplica-se mutatis mutandis ao uso de Αβ e fragmentos resultante do mesmo. Às divulgações que aqui referem-se a pacientes passíveis ao tratamento e a regimes de tratamento (ver Secções IV e V, abaixo), aplica-se mutatis mutandis ao uso de Αβ e fragmentos resultante do mesmo . Αβ desagregado ou os seus fragmentos significam unidades monoméricas peptídicas. 0 Αβ desagregado ou os seus fragmentos são geralmente solúveis, e são capazes de auto-agregação para formação de oligómeros solúveis. Os oligómeros de Αβ e os seus fragmentos são geralmente solúveis e existem predominantemente como alfa-hélices ou random coils. Agregados de Αβ ou os seus fragmentos, significam oligómeros de Αβ ou os seus fragmentos, que se associaram em construções de folha-beta insolúveis. Agregados de Αβ ou os seus fragmentos, significam também polímeros fibrilares. As fibrilas são geralmente insolúveis. Alguns anticorpos ligam-se quer ao Αβ solúvel ou aos seus fragmentos solúveis, quer aos agregados de Αβ ou aos seus fragmentos agregados. Alguns anticorpos ligam-se a ambas as formas solúvel e agregada de Αβ e os seus fragmentos.

Alguns exemplos de conjugados incluem: AN90549 (ΑβΙ-7-toxóide do tétano 830-844 numa configuração MAP4): DAEFRHD-QYIKANSKFIGITEL (SEQ ID NO: 34) AN90550 (ΑβΙ-7-toxóide do tétano 947-967 numa configuração MAP4): DAEFRHD-FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE (SEQ ID NO: 35) AN90542 (Αβ1-7 Toxóide do tétano 830-844 + 947-967 numa configuração linear): DAEFRHD-QYIKANSKFIGITELFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE (SEQ ID NO: 36) AN90576: (Αβ3-9-Tetanus toxóide 830-844 numa configuração MAP4): EFRHDSG-QYIKANSKFIGITEL (SEQ ID NO: 37) Péptido PADRE (todos em configurações lineares) , em que X é preferencialmente ciclohexilalanina, tirosina ou fenilalanina, sendo a ciclohexilalanina a mais preferencial: AN 9 0 5 62 (PADRE-Apl-7) : AKXVAAWTLAAA-DAEFRHD (SEQ ID NO: 38) AN9 0 54 3 (3 PADRE-Api-7) : DAEFRHD-DAEFRHD-DAEFRHD-AKXVAAWTLKAAA (SEQ ID NO: 39)

Outros exemplos de proteínas de fusão (epítopo imunogénico de Αβ em negrito) incluem: AKXVAAWTLKAAA-DAEFRHD-DAEFRHD-DAEFRHD (SEQ ID NO : 40) DAEFRHD-AKXVAAWTLKAAA (SEQ ID NO: 41) DAEFRHD-ISQAVHAAHAEINEAGR (SEQ ID NO: 42) FRHDSGY-ISQAVHAAHAEINEAGR (SEQ ID NO: 43) EFRHDSG-ISQAVHAAHAEINEAGR (SEQ ID NO: 44) PKYVKQNTLKLAT-DAEFRHD-DAEFRHD-DAEFRHD (SEQ ID NO: 45) DAEFRHD-PKYVKQNTLKLAT-DAEFRHD (SEQ ID NO: 4 6) DAEFRHD-DAEFRHD-DAEFRHD-PKYVKQNTLKLAT (SEQ ID NO: 47) DAEFRHD-DAEFRHD-PKYVKQNTLKLAT (SEQ ID NO: 48) DAEFRHD-PKYVKQNTLKLAT-EKKIAKMEKASSVFNVQYIKANSKFIGITEL-FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE-DAEFRHD (SEQ ID NO: 49) DAEFRHD-DAEFRHD-DAEFRHD-QYIKANSKFIGITELNNFTVS FWLR VPKVSASHLE (SEQ ID NO: 50) DAEFRHD-QYIKANSKFIGITELCFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE (SEQ ID NO: 51) DAEFRHD-QYIKANSKFIGITELCFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE-DAEFRHD (SEQ ID NO: 52) DAEFRHD-QYIKANSKFIGITEL (SEQ ID NO: 53) numa resina birramifiçada:

Os anticorpos monoclonais preferenciais ligam-se a um epitopo nos resíduos 1-10 de Αβ (com o primeiro resíduo do N-terminal de Αβ de ocorrência natural a ser designado por 1). Alguns anticorpos monoclonais preferenciais ligam-se a um epitopo nos aminoácidos 1-5, e alguns ao epitopo nos 5-10. Alguns anticorpos preferenciais ligam-se a epítopos nos aminoácidos 1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7 ou 3-7. Alguns anticorpos preferenciais ligam-se a um epitopo gue começa nos resíduos 1-3 e gue termina nos resíduos 7-11 de Αβ. Outros anticorpos incluem aqueles que se ligam a epítopos nos resíduos 13-280 (por exemplo, o anticorpo monoclonal 266) . Os anticorpos preferenciais têm o isotipo IgGl humano.

IV. RASTREIO DE ANTICORPOS PARA A ATIVIDADE DE REMOÇÃO A divulgação proporciona métodos de rastreio de um anticorpo quanto à atividade de remoção de um corpo de Lewy ou qualquer outro antigénio, ou entidade biológica associada, quando a sua remoção é desejada. Para o rastreio da atividade face a um corpo de Lewy, uma amostra de tecido cerebral de um paciente com DP, ou de um modelo animal com características da patologia de Parkinson, é colocada em contacto com células fagocíticas que possuem um recetor Fc, tais como as células da microglia, e com um anticorpo a ser testado in vitro. As células fagocíticas podem ser uma cultura primária ou uma linha celular, tal como BV-2, C8-B4 ou THP-1. Em alguns métodos, os componentes são combinados numa lâmina de microscópio para facilitar a monitorização microscópica. Em alguns métodos, várias reações são efetuadas em paralelo nos poços de uma placa de microtitulação. Em tal formato, uma lâmina de microscópio em miniatura pode ser montada em poços independentes, ou num formato de deteção não microscópica, como por exemplo a técnica ELISA, que pode ser utilizada para a detestação da alfa-SN. Preferencialmente, são realizadas várias medições in vitro da quantidade de corpos de Lewy na mistura reacional, partindo de um valor de base anterior à ocorrência da reação, e um ou mais valores de teste durante a reação.

Podem ser usados métodos análogos para rastrear anticorpos quanto à atividade de remoção para com outros tipos de entidades biológicas. 0 ensaio pode ser utilizado para detetar a atividade de remoção contra virtualmente qualquer tipo de entidade biológica. Tipicamente, a entidade biológica tem algum papel numa doença humana ou animal. A entidade biológica pode ser fornecida como uma amostra de tecido ou na forma isolada. Se fornecida como uma amostra de tecido, a amostra de tecido não é preferencialmente fixada, permitindo o fácil acesso aos componentes da amostra de tecido e evitando a perturbação acidental da conformação dos componentes aquando a fixação. Exemplos de amostras de tecidos que podem ser testadas neste ensaio incluem tecido cancerígeno, tecido pré-cancerígeno, tecido que contém tumores benignos, tais como verrugas ou sinais, tecido infetado com microrganismos patogénicos, tecido infiltrado com células inflamatórias, tecido que contém matrizes patológicas entre as células (por exemplo, fibrinosa pericardite), tecido que contém antigénios aberrantes e tecido de cicatriz. Exemplos de entidades biológicas isoladas que podem ser utilizadas incluem alfa-SN, antigénios virais ou vírus, proteoglicanos, antigénios de outros microrganismos patogénicos, antigénios tumorais e moléculas de adesão. Tais antigénios podem ser obtidos a partir de fontes naturais, por expressão recombinante ou por síntese química, entre outros meios. A amostra de tecido ou entidade biológica isolada é colocada em contacto com células fagocíticas portadoras de recetores Fc, tais como monócitos ou células da microglia, e em contacto com um anticorpo a ser testado no meio. 0 anticorpo pode ser dirigido para a entidade biológica em teste ou para um antigénio associado à entidade. Nesta última situação, o objetivo é testar se a entidade biológica é fagocitada vicariously com o antigénio. Normalmente, embora não necessariamente, o anticorpo e entidade biológica (por vezes com um antigénio associado) são colocados em contacto um com o outro antes de serem adicionados às células fagocíticas. A concentração da entidade biológica e/ou do antigénio associado, se presente, que se mantém no meio, é então monitorizada. A redução na quantidade ou na concentração de antigénio ou da entidade biológica associada no meio, indica que o anticorpo tem uma resposta de remoção para com o antigénio e/ou entidade biológica associada, em conjunto com as células fagocíticas.

Os anticorpos ou outros agentes podem também ser rastreados para a atividade de remoção de corpos de Lewy, utilizando o ensaio in vitro descrito no Exemplo II. Células neuronais transfectadas com um vetor de expressão que expressa sinucleína a partir de inclusões de sinucleína podem ser visualizadas microscopicamente. A atividade de um anticorpo ou de outro agente na remoção destas inclusões, pode ser determinada através da comparação entre a aparência ou o nível de sinucleína em células transfectadas tratadas com o agente, e a aparência ou o nível de sinucleína em células de controlo não tratadas com o agente. Uma redução no tamanho ou na intensidade de inclusões de sinucleína ou uma redução no nível da atividade de sinais de sinucleína na remoção de sinucleína. A atividade pode ser monitorizada quer pela visualização microscópica das inclusões de sinucleína, quer pela análise de extratos celulares num gel e visualização da banda da sinucleína. Como observado no Exemplo 1, secção 2, a mudança no nível de sinucleína é mais acentuada se os extratos são fracionados em frações citosólicas e da membrana, e a fração da membrana é analisada.

Os anticorpos ou outros agentes podem também ser rastreados para a atividade de remoção de corpos de Lewy, utilizando o ensaio in vitro descrito no Exemplo IX. Resumidamente, um anticorpo de teste é injetado no neocórtex de ratos transgénicos que sobre-expressam uma α-sinucleína humana e possuem agregados intraneuronais de α-sinucleína. Numa abordagem, os animais utilizados são ratos transgénicos heterozigóticos com 4 a 8 meses de idade, e que sobre-expressam α-sinucleína humana não mutante no cérebro sob o controlo transcricional do promotor PDGF (ver Masliah, 2000, Science 287:1265-1269). O anticorpo de teste e controlos (por exemplo, anticorpos de controlo irrelevantes e com isotipos em combinação) são dissolvidos numa solução adequada (por exemplo, uma solução tampão estéril e salina de fosfato) para injeção em ratos. Para cada rato, 2 yL de uma solução de 2 mg/mL de anticorpo é injetada estereotaxicamente, sob anestesia, nas camadas profundas do neocórtex parietal do hemisfério direito do cérebro (lado ipsilateral). O hemisfério esquerdo (lado contralateral) serve como uma linha de controlo para cada rato. Os locais de injeção são suturados e os ratos são monitorizados até que recuperem da anestesia. Duas semanas após a injeção, os ratos são sacrificados, os seus cérebros são removidos e fixados em paraformaldeído a 4 % durante 48 h, e cortados coronalmente com uma espessura de 40 ym. As secções em torno do local da injeção são coradas com um anticorpo para a α-sinucleína (por exemplo, ELADW-47, que reconhece os aminoácidos 115-122 da α-sinucleína) . Para cada secção, os agregados intraneuronais de α-sinucleína são contados em 4 campos microscópicos (com uma objetiva 20χ) em redor do local da injeção referente ao hemisfério ipsilateral, e em 4 campos correspondentes no hemisfério contralateral de controlo. Para cada animal, os agregados de a-sinucleína contabilizados para duas secções são somados, e a diferença entre a contagem total de agregados de α-sinucleína entre os dois hemisférios é determinativa do efeito do anticorpo de teste na remoção de agregados em cada rato individualmente. A redução na contatem total de agregados de α-sinucleína no hemisfério tratado, é indicativa que os anticorpos ou outros agentes têm atividade para a remoção de corpos de Lewy. Preferencialmente, observa-se uma redução de pelo menos 10 %. Mais preferencialmente, observa-se uma redução de pelo menos 20 %, de pelo menos 40 %, de pelo menos 60 % ou de pelo menos 80 %.

V. PACIENTES PASSÍVEIS A REGIMES DE TRATAMENTO COM COMPONENTES ΑΝΤΙ-CORPO DE LEWY

Os pacientes passíveis ao tratamento incluem os indivíduos em risco de uma doença sinucleinopática mas que não apresentam sintomas, bem como os pacientes que atualmente apresentam sintomas. Os pacientes passíveis ao tratamento incluem os indivíduos em risco de uma DCL mas que não apresentam sintomas, bem como os pacientes que atualmente apresentam sintomas. Tais doenças incluem a doença de Parkinson (incluindo doença de Parkinson idiopática), DCL, DDCL, VDACL, insuficiência autonômica pura, disfagia de corpos de Lewy, DCL incidental, DCL hereditária (por exemplo, mutações do gene da alfa-SN, PARK3 e PARK4) e atrofia multi-sistémica (por exemplo, atrofia olivopontocerebelar, degeneração estriatonigral e síndrome de Shy-Drager). Portanto, os presentes métodos podem ser administrados profilaticamente a indivíduos que possuem um risco genético conhecido para uma DCL. Tais indivíduos incluem aqueles que têm familiares que experienciaram esta doença, e aqueles cujo risco é determinado pela análise a marcadores genéticos ou bioquímicos. Marcadores genéticos de risco em relação à DP incluem mutações na sinucleína ou Parkin, genes UCHLI e CYP2D6; em particular, as mutações na posição 53 do gene da sinucleína. Indivíduos que atualmente sofrem da doença de Parkinson podem ser identificados a partir das suas manifestações clínicas, que incluem tremor em repouso, rigidez muscular, bradicinesia e instabilidade postural.

Em alguns métodos, o paciente não tem sintomas clínicos, sinais e/ou fatores de risco de qualquer doença amiloidogénica, e sofre de pelo menos uma doença sinucleinopática. Em certos métodos, o paciente não tem sintomas clínicos, sinais e/ou fatores de risco de qualquer doença caracterizada por depósitos amiloides extracelulares. Em certos métodos, o paciente não tem doenças caracterizadas por depósitos amiloides do péptido Αβ. Em certos métodos, o paciente não tem sintomas clínicos, sinais e/ou fatores de risco da doença de Alzheimer. Em certos métodos, o paciente não tem sintomas clínicos, sinais e/ou fatores de risco da doença de Alzheimer, comprometimento cognitivo, comprometimento cognitivo moderado e síndrome de Down. Em alguns métodos, o paciente tem a doença de Alzheimer em simultâneo com uma doença caracterizada por corpos de Lewy. Em alguns métodos, o paciente tem a doença de Alzheimer em simultâneo com uma doença caracterizada por acumulação de sinucleína. Em alguns métodos, o paciente tem, em simultâneo, as doenças de Alzheimer e de Parkinson.

Em pacientes assintomáticos, o tratamento pode começar em qualquer idade (por exemplo, 10, 20 ou 30 anos) . Normalmente, no entanto, não é necessário começar o tratamento até que um paciente atinja a idade de 40, 50, 60 ou 70 anos. O tratamento tipicamente implica múltiplas doses ao longo de um período de tempo. O tratamento pode ser monitorizado pelo ensaio das respostas do anticorpo, das células-T ou das células-B para o agente terapêutico (por exemplo, o péptido alfa-SN ou Αβ, ou ambos) ao longo do tempo. Caso a resposta diminua, é sugerida uma dose de reforço.

Opcionalmente, a presença ou ausência de sintomas, de sinais ou de factores de risco de uma doença, é determinada antes do início do tratamento.

VI. PACIENTES PASSÍVEIS A REGIMES DE TRATAMENTO COM COMPONENTES ANTI-AMILOIDES

Os pacientes passíveis ao tratamento incluem os indivíduos em risco de doença mas que não apresentam sintomas, assim como os pacientes que apresentam presentemente sintomas de amiloidose. No caso da doença de Alzheimer, praticamente qualquer pessoa está em risco de sofrer da doença de Alzheimer, se este ou esta viver durante bastante tempo. Portanto, os presentes métodos podem ser administrados profilaticamente para a população em geral, sem existir a necessidade de qualquer avaliação do risco do paciente. Os presentes métodos são especialmente úteis para os indivíduos que têm um risco genético conhecido para a doença de Alzheimer, ou para qualquer uma das outras doenças amiloides hereditárias. Tais indivíduos incluem os que têm familiares que experienciaram esta doença, e aqueles cujo risco é determinado pela análise a marcadores genéticos ou bioquímicos. Os marcadores genéticos de risco em relação à doença de Alzheimer incluem as mutações no gene PPA, em particular as mutações na posição 717 e posições 670 e 671, referidas como as mutações de Hardy e Swedish respetivamente (ver Hardy, TINS, supra).

Outros marcadores de risco são mutações nos genes da presenilina, PS1 e PS2, e ApoE4, história familiar da DA, hipercolesterolemia ou arteriosclerose. Os indivíduos que sofrem atualmente da doença de Alzheimer podem ser identificados através da demência característica, bem como a presença dos factores de risco descritos acima. Além disso, uma série de testes de diagnóstico estão disponíveis para a identificação de indivíduos que têm a DA. Estes incluem a medição de tau CSF e dos níveis Αβ42. Níveis elevados de tau e níveis reduzidos de Αβ42, significam a da DA. Os indivíduos que sofrem da doença de Alzheimer, também podem ser diagnosticados pelos critérios MMSE ou ADRDA, como discutido na secção de Exemplos. Em pacientes assintomáticos, o tratamento pode começar em qualquer idade (por exemplo, 10, 20 ou 30 anos) . Normalmente, no entanto, não é necessário começar o tratamento até que um paciente atinja a idade de 40, 50, 60 ou 70 anos. O tratamento tipicamente implica múltiplas doses ao longo de um período de tempo. O tratamento pode ser monitorizado pelo ensaio das respostas do anticorpo, das células-T ou das células-B para o agente terapêutico (por exemplo, o CNA) ao longo do tempo, segundo as linhas descritas em VII Métodos de Monitorização e de Diagnóstico, abaixo. Caso a resposta diminua, é sugerida uma dose de reforço.

VII. REGIMES DE TRATAMENTO

Em geral, os regimes de tratamento envolvem a administração de um agente eficaz na indução de uma resposta imunitária para a alfa-SN, e/ou um agente eficaz na indução de uma resposta imunitária para ο Αβ num paciente. Em aplicações profiláticas, as composições farmacêuticas ou os medicamentos são administrados a um paciente suscetível, ou de outro modo em risco de uma DCL ou outra doença sinucleinopática, num regime que compreende uma quantidade e frequência de administração da composição ou medicamento, suficiente para eliminar ou reduzir o risco, diminuir a gravidade ou atrasar o início da doença, incluindo os sintomas fisiológicos, bioquímicos, histológicos e/ou comportamentais da doença, as suas complicações e fenótipos patológicos intermediários apresentados durante o desenvolvimento da doença. Em aplicações terapêuticas, as composições ou medicamentos são administrados a um paciente suspeito de, ou que já sofre de tal doença, num regime que compreende uma quantidade e frequência de administração da composição ou medicamento, suficiente para curar, ou pelo menos parar parcialmente, os sintomas da doença (fisiológicos, bioquímicos, histológicos e/ou comportamentais), as suas complicações e fenótipos patológicos intermediários apresentados durante o desenvolvimento da doença. Por exemplo, em alguns métodos o tratamento afeta pelo menos a remoção parcial de corpos de Lewy, pelo menos a desagregação parcial dos corpos de Lewy e/ou reduz os níveis de oligómeros de alfa-sinucleína em sinapses. Uma quantidade adequada para conseguir o tratamento terapêutico ou profilático é definida como a dose terapeuticamente ou profilaticamente eficaz. Uma combinação da quantidade e frequência de dose adequadas para conseguir o tratamento terapêutico ou profilático, é definido como um regime terapeuticamente ou profilaticamente eficaz. Em ambos os regimes profilático e terapêutico, os agentes são geralmente administrados em várias doses até ser alcançada uma resposta imunitária suficiente. Tipicamente, a resposta imunitária é monitorizada, e são repetidas dosagens caso a resposta imunitária comece a diminuir.

Em alguns métodos, a administração de um agente resulta na redução dos níveis da sinucleína agregada intracelularmente. Em alguns métodos, a administração de um agente resulta na melhoria de um sintoma clínico de uma DCL, tal como a função motora no caso da doença de Parkinson. Em alguns métodos, a redução nos níveis da sinucleína agregada intracelularmente ou a melhoria de um sintoma clínico da doença, são monitorizados em intervalos após a administração de um agente.

As doses eficazes das composições da presente invenção, para o tratamento das condições acima descritas, variam dependendo de muitos factores diferentes que incluem os meios da administração, o local alvo, o estado fisiológico do paciente, se o paciente é um ser humano ou um animal, outros medicamentos administrados e se o tratamento é profilático ou terapêutico. Normalmente o paciente é um humano, mas mamíferos não humanos, incluindo mamíferos transgénicos, também podem ser tratados. As dosagens de tratamento necessitam de ser tituladas para a otimização da segurança e eficácia. A quantidade de imunogénio depende se um adjuvante é também administrado, com dosagens mais elevadas a serem necessárias na ausência de adjuvante. A quantidade de um imunogénio para administração varia por vezes entre 1-500 yg por paciente, e mais usualmente entre 5-500 yg por injeção na administração em seres humanos. Ocasionalmente, uma dose mais elevada de 1-2 yg por injeção é utilizada. Tipicamente cerca de 10, 20, 50 ou 100 yg são usados para cada injeção em humanos. A massa de imunogénio depende também do rácio em massa entre o epítopo imunogénico no imunogénio e a massa de imunogénio como um todo. Tipicamente, 10~3 a 10~5 micromoles do epítopo imunogénico são utilizadas para um micrograma de imunogénio. 0 período das injeções pode variar significativamente entre uma vez por dia, a uma vez por ano, a uma vez por década. Em qualquer dia, no qual uma dose de imunogénio é administrada, a dose é maior do que 1 yg/paciente e geralmente superior a 10 yg/paciente caso o adjuvante também seja administrado, e superior a 10 yg/paciente e geralmente superior a 100 yg/paciente na ausência de adjuvante. Um regime típico consiste numa imunização seguida de injeções de reforço em intervalos de tempo sequenciais, tais como intervalos de 6 semanas. Um outro regime típico consiste numa imunização seguida de injeções de reforço ao fim de 1, 2 e 12 meses. Outro regime envolve uma injeção a cada dois meses para o restante período de vivência. Alternativamente, as injeções de reforço podem ser administradas de forma irregular como indicado pela monitorização da resposta imunitária.

Para a imunização passiva com um anticorpo, as gamas de dose situam-se entre cerca de 0,0001 a 100 mg/kg, e mais usualmente de 0,01 a 5 mg/kg, face ao peso corporal do hospedeiro. Por exemplo, as dosagens podem ser de 1 mg/kg de peso corporal ou 10 mg/kg de peso corporal, ou no intervalo de 1-10 mg/kg, ou por outras palavras, 70 mg ou 700 mg ou no intervalo de 70-700 mg, respetivamente, para um paciente com 70 kg. Um regime de tratamento exemplar implica a administração uma vez em cada duas semanas, ou uma vez por mês ou uma vez a cada 3 a 6 meses. Em alguns métodos, dois ou mais anticorpos monoclonais com diferentes especificidades de ligação são administrados simultaneamente, nos quais a dose de cada anticorpo administrado situa-se dentro das gamas indicadas. O anticorpo é administrado geralmente em várias ocasiões. Os intervalos entre as doses individuais podem ser semanais, mensais ou anuais. Os intervalos também podem ser irregulares como indicado pela medição dos níveis no sangue do anticorpo para a alfa-SN num paciente. Em alguns métodos, a dose é ajustada para se obter uma concentração de anticorpo no plasma de 1-1000 yg/mL e, em alguns métodos de 25-300 yg/mL. Alternativamente, o anticorpo pode ser administrado como uma formulação de libertação sustentada, na qual é necessária uma administração menos frequente. A dose e a frequência variam dependendo do tempo de semivida do anticorpo no paciente. Em geral, os anticorpos humanos apresentam os tempos de semivida mais longos, seguidos dos anticorpos humanizados, dos anticorpos quiméricos e dos anticorpos não-humanos. A dose e frequência da administração pode variar dependendo se o tratamento é profilático ou terapêutico. Em aplicações profiláticas, uma dose relativamente baixa é administrada em intervalos relativamente pouco frequentes durante um longo período de tempo. Alguns pacientes continuam a receber tratamento para o resto das suas vidas. Em aplicações terapêuticas, uma dose relativamente elevada, em intervalos de tempo relativamente curtos, é por vezes necessária, até que a progressão da doença seja reduzida ou terminada, e preferencialmente até que o paciente apresente uma melhoria parcial ou completa dos sintomas da doença. Posteriormente, o paciente pode ser administrado num regime profilático.

As doses de ácidos nucleicos que codificam os imunogénios variam desde cerca de 10 ng a 1 g, 100 ng a 100 mg, 1 yg a 10 mg ou 30-300 yg de ADN por paciente. As doses para vetores virais infeciosos variam entre 10-100, ou mais, viriões por dose.

Os agentes para induzir uma resposta imunitária podem ser administrado por via parentérica, tópica, intravenosa, oral, subcutânea, intra-arterial, intracraniana, intratecal, intraperitoneal, intranasal ou intramuscular, para o tratamento profilático e/ou terapêutico. A via mais comum de administração de um agente imunogénico é a via subcutânea, embora outras vias possam ser igualmente eficazes. A próxima via mais comum é a injeção intramuscular. Este tipo de injeção é tipicamente efetuado nos músculos do braço ou da perna. Em alguns métodos, os agentes são injetados diretamente num tecido em particular no qual os depósitos já se tinham acumulado, por exemplo, através de uma injeção intracraniana. A injeção intramuscular ou infusão intravenosa são preferenciais para a administração do anticorpo. Em alguns métodos, anticorpos terapêuticos específicos são injetados diretamente no crânio. Em alguns métodos, os anticorpos são administrados como uma composição de libertação sustentada ou como um dispositivo, tal como o dispositivo Medipad™.

Como observado acima, os agentes que induzem uma resposta imunitária contra a alfa-SN e Αβ, respetivamente, podem ser administrados em combinação. Os agentes podem ser combinados numa única preparação ou kit para utilização em simultâneo, sequencial ou em separado. Os agentes podem ocupar frascos separados da preparação ou kit, ou podem ser combinados num único frasco. Estes agentes podem, opcionalmente, ser administrados em combinação com outros agentes que sejam, pelo menos, parcialmente eficazes no tratamento da DCL. No caso da doença Parkinson e síndroma de Down, nos quais CLs podem ocorrer no cérebro, os agentes da divulgação podem também ser administrados em conjunto com outros agentes que aumentam a passagem dos agentes através da barreira hematoencefálica.

Os agentes imunogénicos da divulgação, tais como péptidos, são por vezes administrados em combinação com um adjuvante. Uma variedade de adjuvantes pode ser utilizada em combinação com um péptido, tal como a alfa-SN, para induzir uma resposta imunitária.

Os adjuvantes preferenciais aumentam a resposta intrínseca para um imunogénio, sem causar alterações conformacionais no imunogénio que afetem a forma qualitativa da resposta. Os adjuvantes preferenciais incluem hidróxido de alumínio e fosfato de alumínio, lípido A 3-De-O-acilado monofosforil (MPL™) (ver documento GB 2220211 (RIBI ImmunoChem Research Inc., Hamilton, Montana, now part of Corixa)). Stimulon™ QS-21 é um triterpeno glicósido ou saponina isolado a partir da casca da árvore Quillaja Saponaria Molina encontrada na América do Sul (ver Kensil et ai., in Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (eds. Powell & Newman, Plenum Press, NY, 1995); Patente E.U.A. N° 5, 057,540), (Aquila BioPharmaceuticals, Framingham, MA) . Outros adjuvantes são emulsões de óleo em água (tais como esqualeno ou o óleo de amendoim), opcionalmente em combinação com estimulantes imunitários, tais como lípido A monofosforil (ver Stoute et ai., N. Engl. J. Med. 336, 86-91 (1997)), polímeros plurónicos e micobactérias mortas. Outro adjuvante é CpG (documento WO 98/40100). Alternativamente, a alfa-SN ou ο Αβ podem ser acoplados a um adjuvante. No entanto, tal acoplamento não deve alterar substancialmente a conformação da alfa-SN, nem afetar a natureza da resposta imunitária aos mesmos. Os adjuvantes podem ser administrados como um componente de uma composição terapêutica que possui um agente ativo, ou podem ser administrados separadamente, antes, em simultâneo ou após à administração do agente terapêutico.

Uma classe preferencial de adjuvantes são os sais de alumínio (alum), tais como hidróxido de alumínio, fosfato de alumínio, sulfato de alumínio. Tais adjuvantes podem ser usados com, ou sem, outros agentes imunoestimulantes específicos, tais como MPL ou 3-DMP, QS-21, aminoácidos poliméricos ou monoméricos, tais como o ácido poliglutâmico ou a polilisina. Uma outra classe de adjuvantes são as formulações em emulsão de óleo-em-água. Tais adjuvantes podem ser usados com, ou sem, outros agentes imunoestimulantes específicos, tais como péptidos de muramil (por exemplo, N-acetilmuramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetil-normuramil-L-alanil-D-iso-glutamina (nor-MDP), N-acetilmuramil-L-alanil-D- isoglutaminil-L-alanina-2-(1'-fosforiloxi-2'dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxi)-etilamina (MTP-PE), N- acetilglucosaminil-N-acetilmuramil-L-Al-D-isoglu-L-Ala-dipalmitoxi propilamida (DTP-DPP) theramideTM) ou outros componentes da parede celular bacteriana.

As emulsões de óleo-em-água incluem (a) MF59 (documento WO 90/14837), contendo 5 % de esqualeno, 0,5 % de Tween 80, e 0,5 % de Span 85 (contendo opcionalmente diversas quantidades de MTP-PE) , formulado em partículas submicron através da utilização de um microfluidificador tal como o microfluidificador Modelo 110Y (Microfluidics, Newton MA), (b) SAF, contendo 10 % de esqualeno, 0,4 % de Tween 80, 5 % de polímero de bloqueio plurónico L121, e thr-MDP, quer microfluidizado numa emulsão submicron ou vortexado para gerar uma emulsão com tamanho de partícula maior, e (c) sistema adjuvante Ribi™ (RAS), (Ribi ImmunoChem, Hamilton, MT) contendo 2 % de esqualeno, 0,2 % de Tween 80, e um ou mais componentes da parede celular bacteriana a partir do grupo que consiste em lípido A monofosforil (MPL), dimicolato de trealose (TDM), e esqueleto da parede celular (CWS), preferencialmente MPL + CWS (Detox™) .

Outra classe de adjuvantes preferenciais são os adjuvantes de saponina, tais como Stimulon™ (QS-21, Aquila,

Framingham, MA) ou partículas geradas deste, como ISCOMs (complexos imunoestimulantes) e ISCOMATRIX. Outros adjuvantes incluem RC-529, GM-CSF e Adjuvante Completo de Freund (CFA) e Adjuvante Incompleto de Freund (IFA). Outros adjuvantes incluem citocinas, tais como interleucinas (por exemplo, IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-12, IL-13 e IL-15), o fator de estimulação de colónias de macrófagos (M-CSF), o fator de estimulação de colónias de granulócitos-macrófagos (GM-CSF) e o fator de necrose tumoral (TNF). Uma outra classe de adjuvantes são os análogos de glicolípidos incluindo N-glicosilamidas, N-glicosilureias e N-glicosilcarbamatos, cada um dos quais é substituído no resíduo do açúcar por um aminoácido, como imunomoduladores ou adjuvantes (ver patente E.U.A. N° 4,855,283). As proteínas de choque térmico, por exemplo, a HSP70 e HSP90, também podem ser utilizadas como adjuvantes.

Um adjuvante pode ser administrado com um imunogénio como uma única composição, ou pode ser administrado antes, em simultâneo ou após a administração do imunogénio. 0 imunogénio e o adjuvante podem ser embalados e fornecidos no mesmo frasco, ou podem ser embalados em frascos separados e misturados antes da utilização. 0 imunogénio e o adjuvante são tipicamente embalados com uma etiqueta que indica a aplicação terapêutica pretendida. Se o imunogénio e o adjuvante são embalados separadamente, a embalagem tipicamente inclui instruções para a mistura antes da utilização. A escolha de um adjuvante e/ou veículo de transporte depende da estabilidade da formulação imunogénica que contém o adjuvante, a via de administração, o esquema de administração, a eficácia do adjuvante para as espécies a serem vacinadas, e em seres humanos, um adjuvante farmaceuticamente aceitável é aquele que foi aprovado, ou pode ser aprovado, para administração humana segundo corpos reguladores pertinentes. Por exemplo, o adjuvante completo de Freund não é adequado para a administração em seres humanos. Alum, MPL e QS-21 são os preferenciais. Opcionalmente, dois ou mais adjuvantes diferentes podem ser usados simultaneamente. As combinações preferenciais incluem alum com MPL, alum com QS-21, MPL com QS-21, MPL ou RC-529 com GM-CSF, e alum, QS-21 e MPL em conjunto. Além disso, o adjuvante incompleto de Freund pode ser usado (Chang et al., Advanced Drug Delivery Reviews 32, 173-186 (1998)) opcionalmente em combinação com qualquer um dos alum, QS-21 e MPL, e todas as combinações resultantes destes.

Os agentes da divulgação são muitas vezes administrados na forma de composições farmacêuticas que compreendem um agente terapêutico ativo, e uma variedade de outros componentes farmaceuticamente aceitáveis. Ver Remington's Pharmaceutical Science (15a Ed., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 1980). Assim, qualquer agente (por exemplo, um fragmento de alfa-sinucleína ou um anticorpo que se liga especif icamente à alfa-sinucleína) pode ser utilizado no fabrico de um medicamento para o tratamento da doença sinucleinopática. A forma preferencial depende do modo de administração e aplicação terapêutica pretendidas. As composições podem também incluir, dependendo da formulação pretendida, diluentes ou veículos de transporte farmaceuticamente aceitáveis e não tóxicos, que estão definidos como os veículos de transporte habitualmente utilizados na formulação de composições farmacêuticas para a administração em seres humanos ou em animais. O diluente é selecionado de modo a não afetar a atividade biológica da combinação. Exemplos de tais diluentes são água destilada, solução fisiológica tampão de fosfato salina, soluções de Ringer, solução de dextrose e solução de Hank. Além disso, a composição farmacêutica ou formulação pode também incluir outros veículos de transporte, adjuvantes ou estabilizadores não tóxicos, não terapêuticos e não imunogénicos, e semelhantes.

As composições farmacêuticas podem também incluir macromoléculas de grandes dimensões e metabolizadas lentamente, como por exemplo proteínas, polissacáridos, tais como quitosano, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos e copolímeros (tais como sefarose(TM) funcionalizada com látex, agarose, celulose e semelhantes), aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos e agregados lipídicos (tais como gotículas de óleo ou lipossomas). Adicionalmente, estes veículos de transporte podem funcionar como agentes imunoestimulantes (isto é, adjuvantes).

Para administração parentérica, os agentes da divulgação podem ser administrados com doses injetáveis de uma solução ou suspensão da substância, que contém um diluente fisiologicamente aceitável e um veículo de transporte farmacêutico que pode ser um líquido estéril tal como água, óleos, solução salina, glicerol ou etanol.

Adicionalmente, substâncias auxiliares, tais como agentes molhantes ou emulsionantes, tensioativos, substâncias tampão para o pH e similares, podem estar presentes nas composições. Outros componentes das composições farmacêuticas são aqueles com origem petrolífera, animal, vegetal ou sintética, por exemplo, óleo de amendoim, óleo de soja e óleo mineral. Em geral, glicóis tais como propileno glicol ou polietileno glicol, são os veículos de transporte líquidos preferenciais, particularmente para soluções injetáveis. Os anticorpos podem ser administrados na forma de uma injeção de depósito, ou através da preparação de um implante que pode ser formulado de tal modo a permitir uma libertação controlada do princípio ativo. Uma composição exemplificativa compreende um anticorpo monoclonal a 5 mg/mL, que se encontra formulado numa solução aquosa tampão consistindo em 50 mM de L-histidina, 150 mM de NaCl, ajustada para pH 6,0 com HC1. Tipicamente, as composições para a administração parentérica são substancialmente estéreis, substancialmente isotónicas e fabricadas em condições GMP da FDA ou corpo semelhante. Por exemplo, composições que contêm produtos biológicos são normalmente esterilizadas através de esterilização por filtração. As composições podem ser formuladas para administração de uma dose única.

Tipicamente, as composições são preparadas como injetáveis, quer como soluções liquidas ou suspensões; também podem ser preparadas, anteriormente à injeção, formas sólidas adequadas para a solução, ou a suspensão, em veículos de transporte líquidos. A preparação também pode ser emulsionada ou encapsulada em lipossomas ou micropartícuias, tais como micropartículas de polilactidos, de poliglicolidos ou de copolímeros, para um efeito adjuvante melhorado como discutido acima (ver Langer, Science 249, 1527 (1990) e Hanes, Advanced Drug Delivery Reviews 28, 97-119 (1997)). Os agentes desta divulgação podem ser administrados na forma de uma injeção de depósito, ou através da preparação de um implante que pode ser formulado de tal modo a permitir uma libertação controlada ou pulsátil do princípio ativo. As composições podem ser formuladas na forma de dose unitária (isto é, a formulação contém uma quantidade de ingrediente ativo suficiente numa dose para um paciente).

Formulações adicionais adequadas para outros modos de administração incluem a via oral, intranasal, e formulações pulmonares, supositórios e aplicações transdérmicas.

Para supositórios, aglutinantes e veículos de transporte incluem, por exemplo, polialquilenoglicóis ou triglicéridos; tais supositórios podem ser formados a partir de misturas que contêm o princípio ativo no intervalo de 0,5 % a 10 %, preferencialmente 1-2 %. As formulações orais incluem excipientes, tais como manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina sódica, celulose e carbonato de magnésio, de qualidade farmacêutica. Estas composições tomam a forma de soluções, suspensões, comprimidos, pílulas, cápsulas, formulações de libertação sustentada ou pós, e contêm 10-95 % do princípio ativo, preferencial 25-70 %. A aplicação tópica pode resultar na administração intradérmica ou transdérmica. A administração tópica pode ser facilitada pela coadministração do agente com toxina de cholera ou derivados destoxifiçados ou subunidades desta, bem como outras toxinas bacterianas similares (Ver Glenn et ai., Nature 391, 851 (1998)). A coadministração pode ser conseguida usando os componentes como uma mistura, ou como moléculas ligadas obtidas por reticulação química ou por expressão como uma proteína de fusão.

Alternativamente, a administração transdérmica pode ser conseguida utilizando uma via já presente na pele ou usando transferossomas (Paul et ai., Eur. J. Immunol. 25, 3521-24 (1995); Ceve et ai., Biochem. Biophys. Acta 1368,201-15 (1998)).

VIII. MÉTODOS DE MONITORIZAÇÃO E MÉTODOS DE DIAGONÓSTICO A divulgação proporciona métodos para detetar uma resposta imunitária contra o péptido alfa-SN e/ou o péptido Αβ num paciente que sofre de, ou é suscetível a, uma DCL. Os métodos são particularmente úteis para monitorizar o curso do tratamento a ser administrado a um paciente. Os métodos podem ser utilizados para monitorizar quer o tratamento terapêutico em pacientes sintomáticos, quer o tratamento profilático em pacientes assintomáticos. Os métodos são úteis para a monitorização, tanto da imunização ativa (por exemplo, o anticorpo produzido em resposta à administração de imunogénio) como da imunização passiva (por exemplo, a medição do nivel de anticorpo administrado). 1. Imunização Ativa

Alguns métodos implicam a determinação de um valor de linha de base, referente a uma resposta imunitária num paciente anteriormente à administração de uma dose do agente, e a comparação deste valor de base com um valor da resposta imunitária após o tratamento. Um aumento significativo (isto é, maior do que a típica margem de erro experimental das medições repetidas referentes à mesma amostra, expresso como um desvio padrão da média de tais medições) no valor da resposta imunitária, sinaliza um resultado positivo do tratamento (isto é, a administração do agente atingiu ou aumentou a resposta imunitária). Se o valor para a resposta imunitária não se altera significativamente, ou diminui, um resultado negativo do tratamento é indicado. Em geral, é esperado que os pacientes submetidos a um curso inicial de tratamento com um agente imunogénico, apresentam um aumento na resposta imunitária de acordo com doses sucessivas, atingindo eventualmente um patamar. A administração do agente é geralmente continuada enquanto a resposta imunitária está a aumentar. A observação de convergência para um patamar é indicativo de que o tratamento administrado pode ser interrompido ou reduzido na sua dose ou frequência.

Em outros métodos, um valor de controlo (isto é, uma média e desvio padrão) da resposta imunitária é determinado para uma população de controlo. Normalmente, os indivíduos da população de controlo não receberam tratamento prévio. Os valores medidos da resposta imunitária num paciente após a administração de um agente terapêutico, são então comparados com o valor de controlo. Um aumento significativo relativamente ao valor de controlo (por exemplo, maior do que um desvio padrão da média) sinaliza um resultado positivo do tratamento. A falta de aumento ou uma diminuição significativa, sinalizam um resultado negativo de tratamento. A administração do agente é geralmente continuada enquanto a resposta imunitária está a aumentar face ao valor de controlo. Como antes, a observação de convergência para um patamar face aos valores de controlo, é indicativo de que o tratamento administrado pode ser interrompido ou reduzido na sua dose ou frequência.

Em outros métodos, um valor de controlo da resposta imunitária (por exemplo, uma média e um desvio padrão) é determinado a partir de uma população de indivíduos que foram submetidos a tratamento com um agente terapêutico, e cujas respostas imunitárias atingiram um patamar de resposta ao tratamento. Os valores medidos da resposta imunitária num paciente são comparados com o valor de controlo. Se o valor medido num paciente não é significativamente diferente (por exemplo, em mais do que um desvio padrão) face ao valor de controlo, o tratamento pode ser descontinuado. Se o nível num paciente está significativamente abaixo do valor de controlo, é desejada a administração contínua do agente. Se o nível no paciente persistir abaixo do valor de controlo, então uma alteração do regime de tratamento, por exemplo, a utilização de um adjuvante diferente, pode ser indicada.

Em outros métodos, um paciente que não está presentemente a receber tratamento, mas que foi submetido a um curso prévio de tratamento, é monitorizado quanto à resposta imunitária para determinar se o retorno ao tratamento é necessário. 0 valor medido da resposta imunitária no paciente, pode ser comparado com o valor da resposta imunitária anteriormente conseguida no paciente após o curso prévio de tratamento. Uma diminuição significativa face à medição anterior (ou seja, maior do que a típica margem de erro das medições repetidas referentes à mesma amostra) é uma indicação de que o tratamento pode ser retomado. Alternativamente, o valor medido num paciente pode ser comparado com o valor de controlo (média mais desvio padrão) determinado numa população de pacientes após realizarem o curso de tratamento. Alternativamente, o valor medido num paciente pode ser comparado com o valor de controlo em populações de pacientes tratados profilaticamente e que permanecem sem sintomas da doença, ou em populações de pacientes tratados terapeuticamente e que apresentam melhorias das características da doença. Em todos estes casos, uma redução significativa face ao nível de controlo (ou seja, mais do que um desvio padrão) é indicativo de que o tratamento deve ser retomado num paciente.

A amostra de tecido para análise é tipicamente sangue, plasma, soro, fluido da mucosa ou fluido cerebrospinal do paciente. A amostra é analisada quanto à indicação de uma resposta imunitária para qualquer forma da alfa-SN, tipicamente o CNA, ou do Αβ. A resposta imunitária pode ser determinada a partir da presença de, por exemplo, anticorpos ou células-T que se ligam especificamente à alfa-SN ou ao Αβ. Métodos de ELISA para a deteção de anticorpos específicos para a alfa-SN estão descritos na secção de Exemplos. Os métodos para a deteção de células-T reativas foram descritos anteriormente (ver Definições). Em alguns métodos, a resposta imunitária é determinada utilizando um ensaio de remoção, tal como descrito na Secção III, acima. Em tais métodos, uma amostra de tecido ou de sangue, de um paciente a ser testado, é colocada em contacto com CLs (por exemplo, a partir de um rato sinucleína/hPPA transgénico) e células fagociticas portadoras do recetor Fc. A remoção posterior dos CLs é então monitorizada. A existência e grau da resposta de remoção fornecem uma indicação da existência e do nivel de eficácia dos anticorpos, na remoção da alfa-SN que está presente na amostra de tecido do paciente a ser testado. 2. Imunização Passiva

Em geral, os procedimentos para a monitorização da imunização passiva, são similares àqueles para a monitorização da imunização ativa descritos acima. No entanto, o perfil de anticorpos após a imunização passiva, apresenta tipicamente um pico imediato na concentração dos anticorpos, seguido de um decaimento exponencial. Sem uma dose posterior, o decaimento aproxima-se dos níveis de pré-tratamento num período de dias a meses, dependendo do tempo de semivida do anticorpo administrado. Por exemplo, o tempo de semivida de alguns anticorpos humanos é da ordem de 20 dias.

Em alguns métodos, uma medição da linha de base do anticorpo para a alfa-SN é feita antes da administração no paciente, uma segunda medição é feita logo a seguir para determinar o pico do nível referente ao anticorpo, e uma ou mais medições são realizadas em determinados intervalos de tempo para monitorizar o decaimento dos níveis do anticorpo. Quando o nível do anticorpo diminuiu para o nível da linha de base, ou diminui para uma percentagem predeterminada de pico inferior à linha de base (por exemplo, 50 %, 25 % ou 10 %) , a administração de uma dose adicional de anticorpo é administrada. Em alguns métodos, o pico ou os níveis subsequentes medidos que são inferiores aos valores de fundo, são comparados com os níveis de referência previamente determinados e que constituem um regime de tratamento profilático ou terapêutico benéfico em outros pacientes. Se o nível medido do anticorpo for significativamente inferior a um nível de referência (por exemplo, menos do que a média subtraída de um desvio padrão do valor de referência da população de pacientes que beneficiam do tratamento) a administração de uma dose adicional de anticorpo é indicada. 3. Kits de Diagnóstico A divulgação proporciona ainda kits de diagnóstico para a realização dos métodos de diagnóstico acima descritos. Tipicamente, tais kits contêm um agente que se liga especificamente a anticorpos para a alfa-SN. O kit pode também incluir um marcador. Para a deteção de anticorpos contra a alfa-SN, o marcador está tipicamente na forma de anticorpos anti-idiotípicos com marcadores. Para a deteção de anticorpos, o agente pode ser fornecido previamente ligado a uma fase sólida, tal como os poços de uma placa de microtitulação. Tipicamente, os kits contêm também rótulos de orientação de como utilizar o kit. A rotulagem pode também incluir um gráfico ou outras formas de correspondência, que correlacionam os níveis medidos com marcadores e os níveis de anticorpos para a alfa-SN. O termo rotulagem refere-se a qualquer material escrito ou gravado que foi anexado a, ou que de outra forma acompanha, um kit, em qualquer momento durante o seu fabrico, transporte, venda ou utilização. Por exemplo, o termo rotulagem engloba folhetos publicitários e brochuras, materiais de embalamento, instruções, cassetes de áudio ou de vídeo, discos de computador, bem como a escrita impressa diretamente nos kits. A divulgação também fornece kits de diagnóstico para a realização in vivo de imagiologia. Tais kits contêm tipicamente um anticorpo de ligação a um epítopo da alfa-SN, por exemplo, no CNA. Preferencialmente, o anticorpo possui um marcador ou um segundo reagente de marcação está incluído no kit. Preferencialmente, o kit está rotulado com instruções para a realização de um ensaio de imagiologia in vi vo.

Numa forma de realização, o anticorpo é selecionado de entre mAb 6H7, mAb 8A5, mAb 9E4, mAb 1H7, mAb 11A5 ou um fragmento de ligação resultante destes. Os anticorpos anti-alfa-sinucleína acima mencionados, podem também ser utilizados nos ensaios, como descrito na publicação da patente E.U.A N° 2005196818.

IX. IMAGIOLOGIA IN VIVO A divulgação proporciona métodos de imagiologia in vivo de CLs num paciente. Tais métodos são úteis para diagnosticar ou confirmar o diagnóstico da DP, ou outra doença associada com a presença de CL no cérebro ou a suscetibilidade da mesma. Por exemplo, os métodos podem ser utilizados num paciente que apresente sintomas de demência. Se o paciente tem CLs, então é provável que o paciente sofra de, por exemplo, DP. Os métodos também podem ser utilizados em pacientes assintomáticos. A presença de depósitos anormais amiloides indica a suscetibilidade para a futura doença sintomática. Os métodos são também úteis para monitorizar o progresso e/ou resposta ao tratamento da doença, em pacientes que tenham sido previamente diagnosticados com a doença de Parkinson.

Os métodos funcionam através da administração de um reagente, tal como um anticorpo que se liga à alfa-SN no paciente, e detetando-se o agente após este se ter ligado. Os anticorpos preferenciais ligam-se a depósitos de alfa-SN num paciente, sem se ligarem ao polipéptido PCNA de comprimento total. Os anticorpos que se ligam a um epitopo da alfa-SN no CNA são particularmente preferenciais. Se desejado, a resposta de remoção pode ser evitada pelo uso de fragmentos de anticorpos a que falta a região constante de comprimento completo, tais como Fabs. Em alguns métodos, o mesmo anticorpo pode servir tanto como um reagente de tratamento e de diagnóstico. Em geral, os anticorpos com ligação em epítopos no N-terminal da alfa-SN não apresentam um sinal tão forte quanto os anticorpos com ligação em epitopos no C-terminal, presumivelmente porque os epitopos do N-terminal são inacessíveis nos CLs (Spillantini et ai., PNAS, 1998) . Deste modo, tais anticorpos são menos preferenciais.

Os reagentes de diagnóstico podem ser administrados por injeção intravenosa no corpo do paciente, ou diretamente no cérebro por injeção intracraniana ou perfurando um buraco através do crânio. A dose do reagente deverá estar dentro dos mesmos intervalos do que aqueles usados nos métodos de tratamento. Tipicamente, o reagente tem um marcador, embora que em alguns métodos, o reagente primário com afinidade para a alfa-SN não tenha um marcador, e é usado um segundo agente de marcação para se ligar ao reagente primário. A escolha do marcador depende dos meios de deteção. Por exemplo, um marcador fluorescente é adequado para a deteção ótica. 0 uso de marcadores paramagnéticos é adequado para a deteção por tomográfica sem intervenção cirúrgica. Os marcadores radioativos também podem ser detetados usando PET ou SPECT. 0 diagnóstico é feito através da comparação do número, tamanho e/ou intensidade dos loci com marcadores, face aos valores da linha de base correspondentes. Os valores da linha de base podem representar os níveis médios de uma população de indivíduos que não tem a doença. Os valores da linha de base, podem também representar os níveis anteriormente determinados no mesmo paciente. Por exemplo, os valores de linha de base podem ser determinados num paciente anteriormente ao início do tratamento, e os valores medidos posteriormente são comparados com os valores da linha de base. Uma diminuição dos valores relativos face à linha de base, indica uma resposta positiva ao tratamento.

EXEMPLOS

Exemplo I. A Imunização Com Alfa-Sinucleína Humana em Ratos Transgénicos Alfa-Sinucleína Humana Resulta na Produção de Títulos Elevados de Anticorpos Anti-Alfa-Sinucleína que Atravessam a Barreira Hematoencefálica

Alfa-SN humana recombinante de comprimento completo foi ressuspensa a uma concentração de 1 mg/mL em IX de tampão fosfato salino (PBS). Para cada injeção, utilizou-se 50 pL de alfa-SN; dando uma concentração final de 50 pg por injeção, à qual foi adicionada 150 pL de IX PBS. Adjuvante completo de Freund (CFA) foi, de seguida, adicionado num rácio 1:1 face à alfa-SN ou apenas em PBS (controlo), sendo posteriormente agitado em vórtice e sonicado para ressuspender completamente a emulsão. Para as injeções iniciais, oito ratos transgénicos (tg) alfa-sinucleína humana de linha D, como 4-7 meses de idade (Masliah, et al. Science 287:1265-1269 (2000)), receberam injeções da alfa- SN humana em CFA e, como controlo, quatro ratos transgénicos (tg) alfa-sinucleína humana de linha D receberam injeções de PBS em ACF. Os ratos receberam um total de seis injeções. Três injeções foram realizadas com intervalos de duas semanas, e 3 injeções posteriores com intervalos de um mês. Os animais foram sacrificados utilizando as orientações do NIH para o tratamento humanizado de animais, após 5 meses do início da experiência. Depois de as amostras de sangue terem sido recolhidas para a determinação dos títulos de anticorpos, os cérebros foram fixados por imersão em 4% de paraformaldeído em PBS, durante 4 dias. Os níveis de anticorpos para a alfa-SN humana determinados por ELISA são apresentados na Tabela 1.

Os ratos tratados são divididos em dois grupos de acordo com os seus títulos. O primeiro grupo desenvolveu um título moderado de 2-8000. O segundo grupo desenvolveu um título elevado de 12000-30000. Nenhum título foi encontrado nos ratos de controlo. A análise neuropatológica demonstrou que os ratos que produziram títulos elevados, tiveram um decréscimo acentuado no tamanho das inclusões de sinucleína. Os ratos que produziram títulos moderados apresentam uma diminuição menor. A Fig. 2 (painéis a-d) apresenta as inclusões sinucleína (a) num rato não transgénico, (b) um rato transgénico tratado com apenas CFA, (c) um rato transgénico imunizado com alfa-sinucleína e CFA, e que desenvolveu um título moderado e (d) um rato transgénico imunizado com alfa-sinucleína e CFA, e que desenvolveu um título mais elevado. As amostras foram visualizadas por imunocoloração com um anticorpo para a alfa-SN anti-humana. A Fig. 2 apresenta inclusões de sinucleína no painel (b) , mas não apresenta inclusões no painel (a) . No painel (c) , no rato tratado e com títulos moderados, as inclusões estão ligeiramente reduzidas na sua intensidade. No painel (d) as inclusões estão acentuadamente reduzidas em intensidade. Os painéis (e)-(h) apresentam os níveis de anti-IgG no cérebro, iguais para os quatro ratos nos painéis de (a) a (d), respetivamente. Pode-se observar que a IgG está presente nos painéis (g) e numa maior extensão no painel (h). Os dados demonstram que os anticorpos para a alfa-SN administrados perifericamente, atravessam a barreira hematoencefálica e chegam ao cérebro. Os painéis (i) a (1) apresentam a coloração do GAP, um marcador de células astrogliais, igualmente para os mesmos quatro ratos como nas duas primeiras linhas da figura. Pode ser observados que os painéis (k) e (1) apresentam uma coloração moderadamente aumentada em comparação com os painéis (i) e (j). Estes dados demonstram que a remoção de depósitos sinucleína é acompanhada por uma moderada reação astroglial e microglial.

Exemplo II. Rastreio in vitro de Anticorpos de Remoção de Inclusões de Sinucleína Células neuronais GTl-7 (Hsue et al. Am. J. Pathol. 157:401-410 (2000)) foram transfectadas com um vetor de expressão pCR3.1-T T (Invitrogen, Carlsbad, CA) que expressa alfa-SN de murganhos, e comparadas com as células transfectadas apenas com vetor de expressão (Figs. 3, B e A, respetivamente). As células transfectadas com o vetor apenas (A) têm uma aparência fibroblástica, enquanto as células transfectadas com alfa-SN são arredondadas, com corpos de inclusão visíveis na superfície da célula, observáveis tanto por microscopia ótica, tanto por microscopia de varrimento confocal. As células transfectadas foram então tratadas com soro pré-imune de coelho (Fig. 3 C) ou com 67-10, um anticorpo policlonal de coelho purificado contra os resíduos 131-140 no C-terminal da alfa-SN de murganhos (Iwai, et al., Neuron 14:467 (1995)) (Fig. 3D) . Pode ser observado que os corpos de inclusão estão menos fortemente corados no Painel D do que no painel C, indicando que o anticorpo contra a alfa-sinucleína foi eficaz na eliminação ou prevenção do desenvolvimento de inclusões. A Fig. 4 apresenta a análise de um gel referente a partículas e frações citosólicas das células transfectadas GTl-7 e tratadas com o soro pré-imune de coelho e com o anticorpo policlonal 67-10. Pode ser observado que os níveis de sinucleína na fração citosólica são praticamente inalteráveis por tratamento com soro pré-imune ou com anticorpos para a alfa-SN. No entanto, a banda referente à alfa-SN desaparece na fração da membrana de células GTl-7 tratadas com anticorpo para a alfa-SN. Estes dados indicam que a atividade do anticorpo para a alfa-sinucleína, resulta na remoção de sinucleína associada à membrana celular.

As células transfectadas GTl-7 podem ser utilizadas para rastrear anticorpos quanto à atividade de remoção de inclusões de sinucleína, com deteção quer por análise imunohistoquímica, microscopia ótica, como na Fig. 3, ou pela análise em gel, como na Fig. 4.

Exemplo III. Eficácia Profilática e Terapêutica da Imunização com Alfa-Sinucleína i. Imunização de ratos tg alfa-sinucleína humana Para este estudo, ratos transgénicos (tg) heterozigóticos alfa-SN humana (Linha D) (Masliah et al., 2000, Science 286:1265-69) e controlos não transgénicos (não-tg) são utilizados. Os animais experimentais são divididos em 3 grupos. Para o grupo I, são testados os efeitos preventivos da imunização precoce através da imunização em ratos durante 8 meses, começando a partir dos 2 meses de idade. Para o grupo II, ratos adultos jovens são vacinados durante 8 meses, com início aos 6 meses de idade, para determinar se a vacinação pode reduzir a progressão da doença, após uma patologia moderada ter sido estabelecida. Para o grupo III, os ratos mais velhos são imunizados durante 4 meses, com início aos 12 meses de idade, para determinar se a vacinação pode reduzir a progressão da doença, após uma patologia robusta ter sido estabelecida. Para todos os grupos, os ratos são imunizados com alfa-SN humana recombinante mais CFA, ou apenas com CFA, e para cada experiência 20 ratos tg e 10 ratos não-tg são utilizados. Destes, 10 ratos tg são imunizados com alfa-SN humana + CFA e outros 10 ratos tg são imunizados apenas com CFA. Da mesma forma, 5 ratos não-tg são imunizados com alfa-SN humana + CFA e outros 5 ratos não-tg são imunizados apenas com CFA. Resumidamente, o protocolo de imunização consiste numa injeção inicial com alfa-SN humana recombinante purificada (2 mg/mL) em CFA, seguida por uma reinjeção um mês mais tarde com alfa-SN humana em combinação com IFA. Os ratos são então reinjetados com esta mistura, uma vez por mês. Num pequeno subconjunto de ratos alfa-SN humana tg (n = 3/cada; 6 meses de idade) e ratos não-tg (n = 3/cada; 6 meses de idade), são realizadas experiências adicionais consistindo na imunização com alfa-SN de murganhos (m) , com beta-sinucleína humana ou com alfa-SN humana mutante (A53T).

Os níveis do anticorpo para a alfa-SN são determinados utilizando placas de microtitulação de 96 poços, revestidas com 0,4 yg por poço de alfa-SN de comprimento completo purificada, incubando-se durante a noite a 4 °C em tampão de carbonato de sódio, pH 9,6. Os poços são lavados individualmente com 4X 200 mL de PBS contendo 0,1 % de Tween, e são bloqueados durante 1 hora em PBS-BSA a 1 % a 37 °C. As amostras de soro são diluídas em série "nos poços", 1:3, com início na linha A, numa diluição entre 1:150 a 1:328050. Para as experiências de controlo, uma amostra de anticorpo monoclonal de rato é analisada contra a alfa-SN, e tem-se brancos sem proteína e apenas com tampão. As amostras são incubadas durante a noite a 4 °C, seguindo-se uma incubação de 2 horas com anticorpo de cabra conjugado-fosfatase IgG alcalino anti-rato (1:7500, Promega, Madison, WI). O substrato fluorescente alcalino fosfatase Atto-phos® é então adicionado durante 30 minutos à temperatura ambiente. A placa é lida a um comprimento de onda de excitação de 450 nm, e a um comprimento de onda de emissão de 550 nm. Os resultados são representados num gráfico semi-log com unidades de fluorescência relativa no eixo das ordenadas, e diluição de soro no eixo das abcissas. O título de anticorpo é definido como a diluição à qual houve uma redução de 50 % do máximo da ligação do anticorpo.

Para cada grupo, no final do tratamento, os ratos são submetidos a uma avaliação locomotora num rotarod, como descrito (Masliah et al. (2000)). Após a análise, os ratos são sacrificados e os cérebros são removidos para análise neuropatológica e neuroquímica detalhada, como descrito abaixo. Resumidamente, o hemisfério direito do cérebro é congelado e homogeneizado para a determinação da imunoreatividade de agregados e não agregados da alfa-SN humana por Western blot (Masliah, et al. (2000)). O hemisfério esquerdo do cérebro é fixado em paraformaldeido a 4 %, seccionado sequencialmente no vibratome para análise imunocitoquimica e ultraestrutural. ii. Análise imunocitoquimica e neuropatológica A fim de determinar se a imunização diminui, secções de agregação da alfa-SN humana são imunocoradas com um anticorpo policlonal de coelho contra a alfa-SN humana (1:500) . Após uma incubação durante a noite a 4 °C, as secções são incubadas com um anticorpo secundário anti-coelho biotinilado, seguindo-se pela incubação com o complexo peroxidase Avidina D-Horseradish (HRP) (1:200, Elite ABC, Vector). As secções são também imunocoradas com um anticorpo anti-coelho biotinilado, de rato ou humano secundário. As experiências com o anticorpo anti-rato secundário determinam se os anticorpos contra a alfa-SN humana atravessam o cérebro. A reação é visualizada com 0,1 % de tetracloridrato 3,3-diaminobenzidina (DAB) em 50 mM Tris-HCl (pH 7,4) com 0,001 % de H2O2 e, de seguida, as secções são montadas numa lamela sob Entellan. Os niveis de imunorreactividade são semiquantitativamente avaliados por densitometria ótica utilizando o Quantimet 570C. Estas secções são também estudadas por análise de imagem, para determinar o número de inclusões imunorreativas de alfa-SN, e esta medição fiável da agregação de alfa-SN atua como um índice valioso dos efeitos anti-agregação de vacinação (Masliah, et al. (2000)). A análise dos padrões de neurodegeneração é conseguido por meio da análise sináptica e de densidades dendríticas no hipocampo, córtex frontal, córtex temporal e ganglia basal, utilizando secções do vibratoma duplamente imunomarcadas para sinaptofisina e a proteína 2 associada ao microtúbulo (MAP2), sendo visualizadas com LSCM. A análise adicional da neurodegeneração é alcançada através da determinação imunorreactividade da tirosina hidroxilase (TH) no caudoputamen e substantia nigra (SN), conforme descrito anteriormente (Masliah, et al. (2000)). As secções vão ser analisadas por LSCM e cada imagem é interactivamente nivelada, de tal modo que são incluídos os terminais TH-imunorreativos que exibem intensidade de pixel numa gama linear. A escala é definida para determinar o rácio pixel vs. ym. De seguida, esta informação é usada para calcular a % da área do neurópilo coberto pelos terminais TH-imunorreativos. Estas mesmas secções são também utilizadas para avaliar o número de neurónios TH no SN.

Para avaliar os padrões de resposta imunitária à imunização, são realizadas análises imunocitoquímicas e ultra-estruturais com anticorpos contra o GFAP humano, MCH de classe II, Mac 1, TNF-alfa, IL-1 beta e IL-6, em secções do cérebro de ratos não-tg e alfa-SN tg imunizados com alfa-SN humana recombinante e imunogénios de controlo. iii. Análise Comportamental

Através da atividade locomotora, os ratos são analisados durante 2 dias no rotarod (San Diego Instruments, San

Diego, CA), como descrito anteriormente (Masliah, et al. (2000)) . No primeiro dia, os ratos são treinados para cinco ensaios: o primeiro a 10 rpm, a 20 rpm no segundo e do terceiro ao quinto a 40 rpm. No segundo dia, os ratos são testados para 7 ensaios cada um a 40 rpm. Os ratos são colocados individualmente no cilindro, e a velocidade de rotação é aumentada de 0 a 40 rpm durante um período de 240 seg. O período de tempo em que os ratos permanecem na haste (queda de latência) é registado e utilizado como uma medida da função motora.

Exemplo IV. Imunização com Fragmentos de Alfa-Sinucleína

Ratos transgénicos alfa-SN humana, com 10-13 meses de idade, foram imunizados com 9 regiões diferentes de alfa-SN para determinar que epítopos transmitem a resposta eficaz. Os 9 imunogénios diferentes e um controlo são injetados como descrito acima. Os imunogénios incluem quatro conjugados de péptidos da alfa-SN humana, todos acoplados a IgG anti-rato de ovelha, através de uma ligação cistina. A alfa-SN e PBS são utilizados como controlos positivos e negativos, respetivamente. Os títulos são monitorados tal como acima, e os ratos são sacrificados no final de 3-12 meses de injeções. Análise histoquímica, níveis de alfa-SN e toxicologia, são determinados post mortem. i. Preparação de imunogénios

Preparação de péptidos alfa-SN acoplados: conjugados peptídicos H alfa-SN são preparados por acoplamento através de uma cisteína artificial, adicionada ao péptido alfa-SN utilizando o reagente de reticulação sulfo-EMCS. Os derivados de péptidos alfa-SN são sintetizados com as seguintes sequências finais de aminoácidos. Em cada caso, a localização do resíduo de cisteína inserido é indicado sublinhando. Péptido 60-72 alfa-sinucleína (região CNA): NH2-KEQVTNVCGGAVVT-C00H (SEQ ID NO: 54) Péptido 73-84 alfa-sinucleína (região CNA): NH2-GVTAVAQKTVECG-COOH (SEQ ID NO: 55) Péptido 102-112 alfa-sinucleína (região CNA): ácido NH2-C-amino-heptanóico - KNEEGAPCQEG-COOH (SEQ ID NO: 56) Péptido 128-140 alfa-sinucleína:

Ac-NH-PSEEGYQDYEPECA-COOH (SEQ ID NO: 57)

Para preparar a reação de acoplamento, dez mg de IgG anti-rato de ovelha (Jackson ImmunoResearch Laboratories) são dialisados durante a noite contra um tampão de borato de sódio 10 mM, pH 8,5. O anticorpo dialisado é então concentrado para um volume de 2 mL usando um tubo Amicon Centriprep. Dez mg de sulfo-EMCS [N(ε-maleimidocuproiloxi) succinimida] (Molecular Sciences Co.) são dissolvidos num mL de água desionizada. Um excesso molar de 40 vezes de sulfo-EMCS é adicionado gota a gota com agitação a IgG anti-rato de ovelha e, em seguida, a solução é agitada durante dez minutos adicionais. A IgG anti-rato de ovelha ativada é purificada e o tampão foi substituído, por passagem num coluna de 10 mL de filtração em gel (coluna Pierce Presto, obtido de Pierce Chemicals) equilibrada com NaP04 0, 1 M, EDTA 5 mM, pH 6,5. As frações contendo anticorpo, identificadas por absorvância a 280 nm, são reunidas e diluídas para uma concentração de aproximadamente 1 mg/mL, usando 1,4 mg por OD como coeficiente de extinção. Um excesso molar de 40 vezes do péptido alfa-SN é dissolvido em 20 mL de NaP04 10 mM, pH 8,0, com a exceção do péptido alfa-SN no qual 10 mg são inicialmente dissolvidos em 0,5 mL de DMSO e em seguida diluídos em 20 mL com o tampão de NaP04 10 mM. Cada solução de péptidos é adicionada a 10 mL de IgG anti-rato de ovelha ativada, e agitada à temperatura ambiente durante 4 h. Os conjugados resultantes são concentrados até um volume final inferior a 10 mL, usando um tubo Amicon Centriprep, e depois dialisados contra PBS para trocar de tampão e remover o péptido livre. Os conjugados são passados através de filtros com tamanho de poro de 0,22 ym, para a esterilização e, em seguida, divididos em alíquotas de frações de 1 mg e armazenados em congelação a -20 °C. As concentrações de conjugados são determinadas utilizando o ensaio de proteína BCA (Pierce Chemicals), com a IgG de cavalo para a curva padrão. A conjugação é documentada pelo aumento do peso molecular dos péptidos conjugados, relativamente à IgG anti-rato de ovelha ativada.

Exemplo V. Imunização Passiva Com Anticorpos Para a Alfa-Sinucleína

Cada rato alfa-SN humana é injetado com 0,5 mg em PBS de anticorpos monoclonais anti-alfa-SN, conforme apresentado abaixo. Todas as preparações de anticorpos são purificadas de forma a terem níveis baixos de endotoxina. Os anticorpos monoclonais podem ser preparados contra um fragmento através da injeção do fragmento, ou de uma forma mais longa da alfa-SN, num rato, da preparação de hibridomas e rastreio dos hibridomas para um anticorpo que se liga especificamente a um fragmento desejado de alfa-SN, sem se ligar a outros fragmentos que não se sobrepõem à alfa-SN.

Os ratos são injetados ip conforme necessário, ao longo de um período de 4 meses, para manter uma concentração de anticorpo circulante mensurável por ELISA, cujo título é superior a 1:1000, definido por ELISA, para a alfa-SN ou outro imunogénio. Os títulos são monitorizados tal como anteriormente, e os ratos são sacrificados ao final de 6 meses de injeções. Análise histoquímica, níveis de alfa-SN e toxicologia, são determinados post mortem.

Exemplo VI. Imunização com Αβ em ratos transgénicos Syn/PPA

Esta experiência compara os efeitos de imunização com Αβ em três tipos de ratos transgénicos: ratos transgénicos com um transgene alfa-sinucleína (SYN), ratos PPA com um transgene de PPA (Games et al.) e ratos duplamente transgénicos SYN/APP produzidos pelo cruzamento dos singularmente transgénicos. Os ratos duplamente transgénicos são descritos em Masliah et al., PNAS USA 98:12245-12250 (2001) . Estes ratos representam um modelo de indivíduos que possuem as doenças de Alzheimer e de Parkinson. A Tabela 2 apresente os diferentes grupos, a idade dos ratos utilizados neste estudo, o procedimento de tratamento e o título de anticorpos para ο Αβ. Pode ser observado que um título significativo foi gerado em todos os três tipos de ratos. A Fig. 5 apresenta a % de área coberta por plaquetas amiloides de Αβ no cérebro, determinada pela examinação microscópica de seções do cérebro a indivíduos tratados. Depósitos substanciais acumulam-se nos ratos PPA e ratos SYN/PPA, mas não nos ratos SYN ou nos controlos não transgénicos. Os depósitos são maiores nos ratos duplamente transgénicos SYN/PPA. A imunização com Αβ1-42 reduz os depósitos quer em ratos PPA, quer em ratos SYN/PPA. A Fig. 6 apresenta depósitos de sinucleína nos vários grupos de ratos, tal como detetado por varrimento confocal e microscopia ótica. Depósitos sinucleína acumulam-se nos ratos SYN e SYN/PPA tratados apenas com CFA. No entanto, nos mesmos tipos de ratos tratados com Αβ1-42 e CFA, e existe uma redução acentuada no nível de depósitos de sinucleína. Estes dados indicam que o tratamento com Αβ não só é eficaz na remoção de depósitos de Αβ, mas também na remoção de depósitos de sinucleína. Portanto, o tratamento com Αβ ou anticorpos deste, é útil no tratamento não só da doença de Alzheimer, mas também as doenças combinadas de Alzheimer e de Parkinson, e a doença de Parkinson em pacientes sem a doença de Alzheimer. 0 titulo de anticorpos anti-Αβ em ratos SYN/PPA, correlaciona-se com a diminuição da formação de inclusões sinucleina (r = -0,71, p <0,01).

Tabela 2 I 7~! i I I I 7^ I Títulos de

Grupo n= Idade Tratamento/Duraçao ^ — - 12=20 Αβ inj. 50ug/inj durante 6 10000_58000 meses meses 12-20 PPA 2 Sal inj. durante 6 meses 0 meses

ppA 2 12-20 Αβ inj. 50ug/inj durante 6 25 0QQ meses meses ' 12-20 PPA 2 Sal inj. durante 6 meses 0 meses . 12-20 Αβ inj. 50uq/inj durante 6 „„„ „„„„ SYN/PPA 4 u j y/ j 1000-50000 meses meses 12-20 SYN/PPA 2 Sal inj. durante 6 meses 0 meses

Exemplo VII. Ensaio de Rastreio Ex Vivo Triagem Para a Atividade de um Anticorpo Contra Depósitos Amiloides

Para examinar o efeito de anticorpos sobre a remoção das plaquetas, estabelecemos um ensaio ex vivo em que as células microgliais primárias foram cultivadas com secções criostáticas não fixadas, de ambos os cérebros referentes a ratos DPPPA ou humanos com DA. As células da microglia foram obtidas a partir dos córtexes cerebrais de ratos recém-nascidos DBA/2N (1-3 dias). Os córtexes foram dissociados mecanicamente em HBSS (Solução Salina Equilibrada de Hanks, Sigma) com 50 yg/mL de DNase I (Sigma). As células dissociadas foram filtradas com um filtro celular de 100 ym (Falcon) e centrifugadas a 1000 rpm durante 5 minutos. O sedimento foi ressuspenso em meio de crescimento (DMEM de alto teor de glucose, 10 % de FBS, 25 ng/mL de rmGM-CSF) e as células foram plaqueadas a uma densidade de 2 cérebros por frasco de cultura T-75 de plástico. Após 7-9 dias, os frascos foram agitados levemente num agitador orbital a 200 rpm durante 2 h a 37 °C. A suspensão celular foi centrifugada a 1000 rpm e ressuspenderam-se as células no meio celular do ensaio.

Secções criostáticas de 10 ym de cérebro de rato DPPPA ou de cérebro humano com DA (intervalo post mortem < 3 h) , foram descongeladas e montadas sobre lamelas redondas de vidro revestidas com poli-lisina, e colocadas em poços de placas de cultura de tecidos de 24 poços. As lamelas foram lavadas duas vezes com meio de ensaio consistindo em H-SFM (meio isento de soro de hibridoma, Gibco BRL) com 1 % de FBS, glutamina, penicilina/estreptomicina e 5 ng/mL de rmGM-CSF (R&D). Anticorpos de controlo ou anti-Αβ foram adicionados a uma concentração de 2X (5 yg/mL final) durante 1 hora. As células microgliais foram então semeadas a uma densidade de 0,8x 106 células/mL de meio de ensaio. As culturas foram mantidas numa incubadora humidificada (37 °C, 5 % CO2) durante 24 horas ou mais. No final da incubação, as culturas foram fixadas com 4 % de paraformaldeído e permeabilizadas com 0,1 % de Triton-Xl00. Os cortes foram corados com 3D6 biotinilado, seguido por um conjugado estreptavidina/Cy3 (Jackson ImmunoResearch). As células microgliais exógenas foram visualizadas por coloração nuclear (DAPI). As culturas foram observadas com um microscópio de fluorescência invertida (Nikon, TE300), e fotomicrografias foram tiradas com uma câmara digital SPOT usando o software SPOT (Diagnostic Instruments). Para análise a Western blot, as culturas foram extraídas em 8 M de ureia, diluídos 1:1 em tampão redutor de tricina, e adicionados a um gel de tricina a 16 % (Novex) . Após transferência para as membranas Immobilon, os blots foram expostos a 5 yg/mL do pabAp42, seguidos por um anticorpo conjugado-HRP anti-rato e desenvolvidos com ECL (Amersham).

Quando o ensaio foi realizado com secções do cérebro de ratos DPPPA na presença de um anticorpo contra um CNA, observou-se uma redução acentuada no número e tamanho das plaquetas, indicando a atividade do anticorpo de remoção. Um anticorpo para CNA foi colocado em contacto com uma amostra de tecido contendo plaquetas amiloides cerebrais e células da microglia, como discutido acima. Soro de coelho foi usado como controlo. 0 mesmo ensaio foi realizado com seções de cérebro de ratos DPPPA, na presença de vários anticorpos contra Αβ. Foi comparada a capacidade dos anticorpos para induzir fagocitose no ensaio ex vivo, e para reduzir a carga in vivo de plaquetas nos estudos de transferência passiva. Estes resultados demonstram que a eficácia in vivo deve-se à remoção mediada pelos anticorpos das plaquetas no SNC, e que o ensaio ex vivo é preditivo da eficácia in vivo (Ver Tabelas 16 e 17 do Exemplo XIV do documento WO 00/72880; e, Exemplo XIV, a Tabela 16, do documento WO 0072876).

Exemplo VIII: Imunização Ativa com Alfa-Sinucleina A. Materiais e Métodos

Vacinação de ratos h α-sinucleína tg. Para este estudo, os ratos heterozigóticos tg (Linha D) que expressam ha-sinucleína sob o controlo regulado pelo promotor factor β de crescimento derivado de plaquetas (ΡϋΘΕβ) (Masliah, 2000, Science 287: 1265-1269) foram usados. Estes animais foram selecionados porque desenvolvem inclusões de ha-sinucleína imunorreativas no cérebro, bem como défices neurodegenerativos e motores que imitam certos aspetos da DCL. Os animais experimentais foram divididos em dois grupos. Para o primeiro grupo, um total de 20 ratos tg jovens (3 meses de idade) foram imunizados durante 8 meses, com ha-sinucleína recombinante (n = 10) ou apenas com adjuvante (n = 10) . Para o segundo grupo, um total de 20 ratos tg jovens adultos (6 meses de idade) foram imunizados durante 8 meses, com ha-sinucleína recombinante (n = 10) ou apenas com adjuvante (n = 10) . O protocolo de imunização consistia numa primeira injeção com ha-sinucleína recombinante (80 yg/mL; 100 mL) com adjuvante de Freund completo (CFA). Duas semanas mais tarde os ratos receberam outra injeção de ha-sinucleína (80 yg/mL; 100 mL) com FA incompleto, seguido da re-injeção, uma vez por mês (durantes os 7 meses subsequentes) com ha-sinucleína (80 yg/mL; 100 mL) em solução salina de tampão fosfato, ha-sinucleína recombinante foi preparada e purificada como descrito em Masliah et ai., 2005, Neuron. 46: 857-68, e testada para endotoxinas.

Determinação de títulos do anticorpo e afinidade relativa para ha-sinucleína. Os níveis no plasma de anticorpo para a ha-sinucleína foram determinados utilizando placas de microtitulação de 96 poços revestidas com 0,4 mg por poço de α-sinucleína purificada de comprimento completo. As amostras foram incubadas durante a noite a 4 °C, seguindo-se a lavagem e incubação com anticorpo de cabra conjugado fosfatase IgG alcalino anti-rato (1:7500, Promega, Madison, WI) . A placa é lida a um comprimento de onda de excitação de 450 nm, e a um comprimento de onda de emissão de 550 nm. Os resultados são representados num gráfico semi-log com unidades de fluorescência relativa no eixo das ordenadas, e diluição de soro no eixo das abcissas. O título de anticorpo é definido como a diluição à qual houve uma redução de 50 % do máximo de ligação do anticorpo.

Para determinar a afinidade relativa para a ha-sinucleína pelos anticorpos gerados em ratos vacinados, foram realizados dois conjuntos de experiências. No primeiro conjunto, homogeneizados de cérebro de ratos tg não imunizados com ha-sinucleína foram analisados em mini-gel num aparelho de multicanal (Invitrogen, Carlsbad, CA). Cada canal foi incubado com o soro diluído de cada um dos ratos, e transferido para nitrocelulose e incubado com anticorpo de coelho anti-rato secundário seguido da proteína A com o marcador I125 (Alford et ai., J. Histochem Cytochem 42:283-287 (1994)). Os blotts foram fotografados e analisados com o Phosphorlmager (Molecular Dynamics, Piscataway, NJ) . A banda imunorreativa foi quantificada utilizando o software ImageQuant (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) . Para o segundo conjunto de experiências, os cortes do vibratoma em série, derivados de um rato tg não imunizado com ha-sinucleína, foram incubados em soro diluído a partir de cada um dos ratos tratados, seguindo-se a reação com a IgG anti-rato biotinilada de cavalo (1:100, Vector), peroxidase Avidina D-horseradish (HRP, 1:200, ABC Elite, Vector), e reagindo-se igualmente com tetrahidrocloreto diaminobenzidina (DAB) contendo 0,001 % H2O2. Após examinação no microscópico, os cortes foram pontuados de acordo com o compartimento celular marcado (corpos celulares neuronais, sinapses e inclusões) e o grau de imunoreativadade (0 = nenhum; 1 = muito ligeira, 2 = ligeira, 3 = moderada, 4 = intensa).

Mapeamento de epitopos de anticorpos para a ha-sinucleína. Os epitopos reconhecidos pelos anticorpos para a ha-sinucleína foram determinados pela técnica ELISA, que mede a ligação de um anticorpo a péptidos linearmente sobrepostos que cobrem toda a sequência da ha-sinucleína. Foram preparados péptidos biotinilados no C-terminal com sequências da ha-sinucleína (Mimotopes, San Diego, CA) com 15 aminoácidos (aa) de comprimento, com uma sobreposição de 12 resíduos e um passo de 3 resíduos por péptido. Um total de 43 péptidos foi usado para percorrer toda a sequência de 140 aa da ha-sinucleína, com o último péptido a ter uma sobreposição de 13 aa e um passo de 2 aa. Além disso, os últimos 3 péptidos foram repetidos, mas com a biotinilação a ocorre no N-terminal do péptido. Isto foi realizado para melhorar o acesso ao C-terminal dos péptidos por anticorpos, e para permitir a identificação de anticorpos específicos para o C-terminal livre. Além disso, outros recursos foram adicionados a este ensaio para permitir uma análise mais aprofundada das interações entre os anticorpos e a região de componente não-amiloide β (Αβ) (CNA) (61-95) da ha-sinucleína. Uma vez que o 21° péptido neste ensaio já contém o N-terminal livre da região do CNA, um péptido adicional N-terminalmente biotinilado que contém o C-terminal livre da região do CNA, foi adicionado para completar o ensaio com um total de 47 péptidos.

Para executar o ensaio, estes péptidos biotinilados foram revestidos durante a noite a 5 nM, em placas para a técnica ELISA pré-revestidas com estreptavidina (Pierce, Rockford, IL) . As placas foram então lavadas e amostras de soro, diluídas a um equivalente de título 6, foram adicionados para uma incubação de 1 hora. As amostras de soro com títulos inferiores a 5000 foram diluídas 1:1000 para esta incubação. Após outro passo de lavagem, os anticorpos ligados foram detetados usando anticorpos secundários específicos das espécies, que estavam conjugados com HRP num formato colorimétrico da técnica de ELISA.

Processamento de tecidos. Os ratos foram sacrificados e os cérebros removidos para análise neuropatológica e neuroguímica detalhada, como descrito abaixo.

Resumidamente, o hemisfério direto do cérebro foi congelado e homogeneizou-se para se determinar a imunoreativadade da ha-sinucleína agregada, ou não, por Western blot (Masliah et ai., 2000, supra). O hemisfério esquerdo do cérebro foi fixado em 4 % de paraformaldeido (PFA) e seccionado com um vibratoma (Leica, Wetzlar, Alemanha), para a análise imunocitoquimica (ICC) e ultra-estrutural.

Preparações sinaptosomais e análise de immunoblot. Para verificar os efeitos da vacinação na acumulação cerebral de ha-sinucleína em ratos tg, frações sinaptossomais foram preparadas utilizando gradientes de sacarose e foram analisadas por SDS-PAGE num gel de poliacrilamida com 10 % de Tris-acetato (NuPAGE™, Invitrogen) . Os immunoblots foram sondados com anticorpos primários contra a ha-sinucleína (LB509, 1:1000, Transduction Laboratories, San Diego, CA) e sinaptofisina (1:20, Chemicon, Temecula, CA), e uma IgG anti-rato secundária de cabra com marcador HRP (1:5000, SantaCruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA), sendo e visualizados por quimiluminescência aumentada e analisados com um equipamento de imagem Versadoc XL (BioRad, Hercules, CA) .

Análise neuropatológica e imunocitoquimica. Resumidamente, tal como descrito anteriormente (Masliah et al., 2000, supra), para investigar os efeitos da vacinação na acumulação de ha-sinucleína, secções de vibrotoma serialmente seccionadas, em flutuação não restritiva e codificadas secretamente, foram incubadas durante a noite a 4 °C com um anticorpo específico de afinidade para a anti-ha-sinucleína em estado puro (72-10, policlonal de coelho, 1:500), preparado tal como descrito anteriormente (Masliah et al., 2000, supra) através da imunização de coelhos com péptidos sintéticos de ha-sinucleína consistindo aa 101- 124. A incubação com o anticorpo primário foi seguida pela incubação com a IgG anti-coelho biotinilada de cabra (1:100, Vector), D Avidina-HRP (1:200, Elite ABC, Vector), e feito reagir com DAB tetrahidrocloreto contendo 0,001 % de H2O2 · As secções foram analisadas com o equipamento Quantimet 570C (Leica), a fim de determinar o número de inclusões imunorreativas de ha-sinucleína no neocórtex. Para cada caso, três secções foram analisadas e calculou-se a média dos resultados, expressa como números por mm quadrado. Outras análises imunocitoquimicas foram realizadas ao imunorreagir secções com anticorpos contra marcadores gliais, incluindo o CD45 (1:1000, DakoCytomation, Carpinteria, CA) e a proteína ácida fibrilar glial (GFAP; 1:500, Chemicon). A análise de carácter imunocitoquímico duplo foi realizada como descrito anteriormente (Hashimoto et ai., Neuron 32:213-223 (2001)) para determinar os efeitos da vacinação na densidade terminal nervosa, e na acumulação de ha-sinucleína em sinapses. Para este efeito, secções do vibratoma foram duplamente marcadas com um anticorpo policlonal contra a ha-sinucleína (1:1000) e com um anticorpo monoclonal contra a sinaptofisina (Chemicon). A ha-sinucleína foi detetada com vermelho Tyramide (1:2000, Roche), e a sinaptofisina foi detetada com IgG anti-rato de cavalo com marcador de fluoresceína isotiocianato (FITC). Para cada caso, as secções foram imunomarcadas em duplicado e analisadas por microscopia de varrimento confocal (LSCM), e segundo o software NIH Image 1,43, para cálculo da percentagem de área do neurópilo coberto por terminais de sinaptofisina imunorreativa no neocórtex (Mucke et ai., J. Neurosci. 20:4050-4058 (2000)), e a proporção de terminais não reativos imunitariamente de sinaptofisina que eram ha-sinucleína positivos. A fim de confirmar a especificidade dos anticorpos primários, foram realizadas experiências de controlo onde as secções foram incubadas durante a noite na ausência do anticorpo primário (excluído), com o anticorpo primário pré-adsorvido durante 48 horas com um excesso de 20 vezes do péptido correspondente ou com soro pré-imune.

Todas as secções foram processadas simultaneamente sob as mesmas condições, e as experiências foram realizadas duas vezes, de modo a avaliar a reprodutibilidade dos resultados. As secções foram fotografadas com uma objetiva Zeiss 63X (1,4 NA) num microscópio Axiovert 35 (Zeiss,

Alemanha), que possui um sistema de MRC1024 LSCM conectado (BioRad, Wattford, Reino Unido) (Masliah et ai., 2000, s upra)

Análise estatística. As comparações estatísticas entre grupos foram realizadas utilizando o teste t de Student não emparelhada de duas caudas. A análise de regressão linear foi realizada para determinar a relação entre as variáveis. O teste de Bonferroni foi aplicado para contabilizar comparações múltiplas. B. Resultados

Caracterização dos títulos de anticorpos, afinidade e mapeamento de epítopos

Os títulos de anticorpos foram analisados em 3 pontos no tempo (2 semanas, 6 meses e 9 meses após a vacinação) , em ambos os grupos experimentais. Os títulos de anticorpos variaram consideravelmente entre os ratos, em animais que pertencem ao grupo I, os títulos de anticorpo variaram de 200 a 20000 entre os ratos imunizados com ha-sinucleína (Tabela 3).

Tabela 3. Sumário dos títulos de α-sinucleína e afinidade immunoblot (corrigida para os títulos)

Neste grupo os títulos médios aumentaram ligeiramente ao longo do tempo. Da mesma forma, para o grupo II, os animais imunizados com ha-sinucleína apresentaram títulos que variaram de 200 a 13000 (Tabela 3) . No entanto, os níveis médios de titulação foram maiores na primeira determinação e, e diminuíram posteriormente ao longo do tempo. A análise de immunobloting também apresentou uma variação significativa de rato para rato, na sua capacidade em reconhecer a ha-sinucleína. Em geral, os níveis de afinidade relativa dos anticorpos foram maiores em ratos do grupo II, em comparação com os ratos imunizados do grupo I (Tabela 4).

Tabela 4. Sumário das correlações entre a afinidade por immunoblot, neuropatologia e títulos.

Por ICC, soros de ratos vacinados com ha-sinucleína demonstraram a marcação de neurónios, inclusões intraneuronais e terminais pré-sinápticos. Em contraste, os ratos tratados apenas com adjuvante mostraram uma ligeira coloração difusa e não específica dos corpos celulares. Os soros de ratos que pertencem ao grupo II, apresentaram uma maior afinidade no reconhecimento da ha-sinucleína nas sinapses e neurónios dos ratos tg, em comparação com ratos imunizados do grupo I (Tabela 4).

Os estudos de mapeamento de epítopos demonstraram que, em ratos vacinados com ha-sinucleína, os anticorpos reconhecem com mais frequência os epítopos peptídicos na região C-terminal da ha-sinucleína (Figura 8). Além disso, os anticorpos para epítopos adicionais também foram ocasionalmente reconhecidos. Em contraste, não foram detetados nem reatividade ou anticorpos de epítopos no soro de ratos tratados com apenas CFA. A imunização reduz a acumulação de sozinho e preserva a densidade sináptica no cérebro de ratos tg

Para determinar os efeitos da imunoterapia na acumulação de ha-sinucleína, secções foram marcadas com anticorpos contra a ha-sinucleína e analisadas por microscopia ótica ou por LSCM. Em ratos tg, foi observada grande imunoreativadade para a ha-sinucleína no neurópilo, bem como em inclusões intraneuronais. Comparado com os ratos tg tratados com apenas CFA, ratos de ambos os grupos imunizados demonstraram uma redução comparável (aproximadamente 25 %) no número de inclusões no córtex temporal (Figura 9A). Além disso, a imunização resultou numa redução da imunorreatividade da ha-sinucleína no neurópilo. Quando comparado com os ratos tg tratados apenas com CFA, este efeito foi maior em ratos do grupo II face aos ratos do grupo I (Figura 9A) . Para determinar se os efeitos de imunização estão realmente relacionados com a capacidade dos anticorpos para reduzir a acumulação neuronal de ha-sinucleína ou efeitos de encobrimento, experiências de controlo foram realizadas, comparando os níveis de imunorreatividade da β-sinucleína entre ratos tg apenas tratados com CFA e ratos tg vacinados com ha-sinucleína. D forma consiste com a distribuição conhecida da β-sinucleína, um homólogo próximo da α-sinucleína (Iwai et al., Neuron. 14:467-475 (1994)), a grande imunorreatividade da β-sinucleína foi observada no neurópilo em associação com os terminais pré-sinápticos, e imunomarcação moderada foi detetada nos corpos celulares neuronais, mas não nas inclusões. Comparado com os ratos tg tratados com apenas CFA, não foram encontradas diferenças nos padrões e níveis de a-sinucleína em ratos imunizados com ha-sinucleína. Para investigar ainda mais a especificidade dos efeitos dos anticorpos para a ha-sinucleína, foram comparados os níveis de imunorreatividade da α-sinucleína de murganhos (m) entre ratos tg tratados apenas com CFA e ratos tg vacinados com ha-sinucleína. Semelhante à ha-sinucleína, a imunorreatividade da ma-sinucleína foi abundante na neurópilo em associação com os terminais nervosos, mas esteve ausente nos corpos celulares neuronais e nas inclusões. Tanto nos ratos tratados apenas com CFA e ratos imunizados com ha-sinucleína, os padrões e níveis de ma-sinucleína foram comparáveis. Tomados em conjunto, estes estudos sugerem que a vacinação afeta especificamente a ha-sinucleína, mas não afeta outras moléculas sinápticas relacionadas.

Para avaliar ainda mais os efeitos da imunoterapia na integridade do neurópilo, as secções foram imunocoradas com um anticorpo contra a sinaptofisina ou analisadas por microscopia eletrónica. Em comparação com ratos não transgénicos, os ratos tg tratados com apenas CFA mostraram uma média de 2 0 % de redução no número de terminais sinaptofisina imunomarcados, e os níveis de imunorreatividade da sinaptofisina por sinapse permaneceram inalterados (Figura 9B). Em contraste, os ratos imunizados de ambos os grupos mostraram níveis de imunorreatividade da sinaptofisina comparáveis aos controlos não-tg (9B). Uma análise imunocitoquímica posterior com anticorpos contra marcadores gliais, tais como GFAP e CD45, demonstrou uma tendência de aumento da imunorreatividade nos cérebros de ratos tg vacinados com ha-sinucleína (Figura 9C). De forma consistente com estes resultados, a análise ultra-estrutural demonstrou que nos cérebros de ratos tg imunizados com ha-sinucleína, o neurópilo estava bem preservado, com terminais pré-sinápticos e dendrites intactos, com os terminais nervosos a conter abundantemente vesículas de remoção e com densidades pós-sinápticas formadas. Apenas agregados ocasionais eletrodensos foram identificados nos processos neuríticos, e em geral a mitocôndria e mielina estavam bem preservadas.

Para melhor caracterizar os efeitos da vacinação na agregação de ha-sinucleína em sinapses, foram realizadas duplas análises através de imunocitoquímica e através da técnica de Western blot, com preparações sinaptosomais. Em condições fisiológicas a ha-sinucleína está localizada principalmente nos boutons pré-sinápticos (Iwai et ai., 1994, supra), e na DCL e nos ratos tg, o aumento da acumulação de ha-sinucleína nas sinapses está associada a défices funcionais e a perda da sinapse (Hashimoto et ai., 2001, supra) . Para verificar os efeitos da vacinação na acumulação da ha-sinucleína nos terminais nervosos, foram realizados estudos duplos de imunomarcação com anticorpos contra o marcador pré-sináptico terminal sinaptofisina e contra a ha-sinucleína, e análise por WB com os preparativos sinaptosomais. Imageologia confocal das secções duplamente marcadas, revelou que, em comparação com os ratos tg ha-sinucleína vacinados com apenas CFA (Figura 9D), aqueles que foram injetados com ha-sinucleína exibiram uma redução da acumulação de ha-sinucleína em terminais nervosos sinaptofisina-imunorreativos no neocórtex (Figura 9D) .

De forma consistente com os estudos imunocitoquímicos, a análise por immunoblot mostrou que, nos ratos tg tratados com apenas CFA, existiam, de forma abundante, bandas referentes a pesos moleculares mais altos, possivelmente devido à acumulação de inclusões imunorreativas de ha-sinucleína nas sinapses (Figura 10). Nos ratos imunizados houve uma diminuição considerável na acumulação de bandas com peso molecular mais elevado da ha-sinucleína e da banda nativa, mas não foram observados efeitos nos níveis de ma-sinucleína. Além disso, em comparação com ratos tg tratados com apenas CFA, os níveis de imunoreativadade da sinaptofisina foram maiores em preparações sinaptosomais de ratos imunizados (Figura 10) . Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que a imunoterapia pode melhorar o dano neuronal nos cérebros de ratos tg, através da redução da acumulação de oligómeros de ha-sinucleína potencialmente tóxicos sinapses.

Os efeitos de imunização são dependentes da afinidade relativa dos anticorpos para reconhecer os terminais sinápticos

Para compreender melhor quais os factores que predizem a eficácia da imunoterapia, foi realizada a análise de regressão linear entre os marcadores neuropatológicos da acumulação de ha-sinucleína e os títulos de anticorpos e respetivas afinidades. Esta análise demonstrou uma correlação significativa entre afinidade relativa de anticorpos por immunoblot e os níveis de imunoreativadade de ha-sinucleína nas sinapses, mas não demonstrou uma correlação significativa com o número de inclusões neuronais. Da mesma forma, a afinidade do anticorpo em para reconhecer sinapses por ICC, foi inversamente correlacionada com os níveis de ha-sinucleína nas sinapses e diretamente correlacionada com a percentagem de área ocupada por terminais nervosos marcados com sinaptofisina, mas não foi relacionada com o número de inclusões neuronais. Os níveis de reatividade do anticorpo determinados por immunoblot e por ICC, foram fortemente correlacionados com os títulos de anticorpo tal como determinado pela técnica ELISA. Os títulos de anticorpos também foram correlacionados com a percentagem de área do neurópilo marcada com o anticorpo anti-hasinucleína, mas não foi correlacionada com o número de inclusões neuronais (Tabela 4) . Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que a reatividade relativa ao immunoblot dos anticorpos para α-sinucleína anti-humana e, em certa medida os títulos determinados por ELISA dos anticorpos, correlacionam-se com a redução da acumulação neuronal de α-sinucleína humana.

Os anticorpos contra a α-sinucleína anti-humana são internalizados e ligam-se a sinapses e inclusões contidas em neurónios em ratos tg

Para determinar se os anticorpos que são traficados reconhecem os locais neuronais característicos onde a a-sinucleína humana se acumula nos cérebros de ratos tg, foi realizada análise imunocitoquímica simples e dupla anticorpos IgG anti-rato de cavalo. Estes anticorpos reconhecem putativamente a α-sinucleína anti-humana gerada nos animais imunizados, mas não nos controlos CFA. Microscopia ótica digital das secções imunomarcadas demonstrou que em ratos imunizados com a ha-sinucleína, a IgG anti-rato biotinilada difusamente marcou os corpos celulares neuronais e processos neurítico no neurópilo. Nos animais tg tratados apenas com CFA, houve uma marcação moderada dos vasos sanguíneos e células ocasionais que se assemelham à microglia. As experiências com a dupla imunocoloração, confirmou que nos ratos vacinados, os corpos celulares neuronais marcados com uma IgG anti-rato com o marcador FITC, apresentaram imunorreatividade para a ha-sinucleína. Comparado com os ratos tg tratados com apenas CFA, em ratos vacinados com ha-sinucleína, em alguns neurónios, a anti-IgG de rato e a imunorreatividade da ha-sinucleína foram co-localizadas na periferia dos corpos celulares, em outras áreas os dois marcadores foram detetados em processos neuríticos e em sinapses. Além disso, em vários neurónios que contêm α-sinucleína humana foram detetados os dois marcadores em estruturas subcelulares granulares com uma média de tamanho 0,4-0,8 ym de diâmetro. Experiências de marcação dupla adicionais mostraram que estas estruturas granulares exibem imunoreativadade para a catepsina D, o que sugere que os anticorpos para a α-sinucleína anti-humana internalizados reagem com a sinucleína dentro dos lisossomas. De forma consistente com esta observação, a análise ultra-estrutural mostrou que em alguns dos neurónios dos ratos vacinados com α-sinucleína humana, são identificáveis laminadas eletrodensas sugestivas de lisossomas e fagolisossomas. Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que a vacinação com uma α-sinucleína humana, pode promover a degradação desta molécula através da ativação de uma via lisossomal. EXEMPLO IX. Remoção In Vivo de Agregados de a-Sinucleína Pela Administração de Anticorpos para a a-Sinucleína

Este exemplo demonstra a remoção de agregados intraneuronais de α-sinucleína, utilizando anticorpos monoclonais anti-a-sinucleína que reconhecem os terminais da α-sinucleína. Os anticorpos monoclonais foram injetados no neocórtex de ratos transgénicos que sobre-expressam uma α-sinucleína humana, e possuem agregados intraneuronais de α-sinucleína. Os dois anticorpos, um dirigido contra o N-terminal e o outro dirigido contra o C-terminal da a- sinucleína, reduziram o número de agregados intraneuronais de α-sinucleina até 80 % em comparação com os anticorpos de controlo irrelevantes (Fig. 11). Métodos. Os anticorpos monoclonais que reconhecem diferentes epítopos da molécula de α-sinucleina, e anticorpos irrelevantes de controlo do mesmo isotipo, foram dissolvidos numa solução salina esterilizada de tampão fosfato (Tabela 5) para injeção em ratos. Os animais utilizados foram 4 ratos transgénicos heterozigóticos com 8 meses de idade, que sobre-expressam α-sinucleína humana não mutante no cérebro, sob o controlo transcricional do promotor PDGF. Foram utilizados 4 a 6 ratos transgénicos diferentes para cada um dos anticorpos.

Tabela 5. Anticorpos Para a α-Sinucleína e Controlos Utilizados na Injeção Intracerebral no Modelo Transgénico Sinucleinopático Neuronal.

Para cada rato, 2 yL de uma solução de 2 mg/mL de anticorpo é injetada estereotaxicamente, sob anestesia, nas camadas profundas do neocórtex parietal do hemisfério direito do cérebro (lado ipsilateral) . 0 hemisfério esquerdo (lado contralateral) serve como uma linha de controlo para cada rato. Os locais de injeção são suturados e os ratos são monitorizados até que recuperem da anestesia. 0 investigador que executou as injeções desconhecia o anticorpo que foi injetado em cada vez. Duas semanas após a injeção, os ratos foram sacrificados de acordo com as diretrizes institucionais. Os seus cérebros foram removidos, fixados em paraformaldeído a 4 % durante 48 h, e cortados coronalmente com uma espessura de 40 ym de utilizando um vibratomo Leica. Duas secções por animal (em torno do sítio de injeção) foram coradas por coloração de imunoperoxidase com um anticorpo policlonal para a a-sinucleína (ELADW-47, que reconhece os aminoácidos 115-122 da α-sinucleína). Para cada secção, os agregados intraneuronais de α-sinucleína são contados em 4 campos microscópicos (com uma objetiva 20x) em redor do local da injeção referente ao hemisfério ipsilateral, e em 4 campos correspondentes no hemisfério contralateral de controlo. Os agregados de A α-sinucleína contabilizados para duas seções foram somados em cada hemisfério. Finalmente, para cada animal, a diferença entre a contagem total de agregados de α-sinucleína entre os dois hemisférios foi calculada, e expressa como a % de diferença entre os resultados do hemisfério contralateral e ipsilateral, fornecendo assim uma medida do efeito dos anticorpos para a α-sinucleína na remoção de agregados em cada rato individual. As secções possuem um código desconhecido, e o código foi revelado quando a análise foi concluída.

Os ratos podem ser categorizados em três grupos, com base nos anticorpos que foram injetados:

Grupo 1: Ratos injetados com 11A5, 8A5 ou com uma IgGl como controlo.

Grupo 2: Ratos injetados com 9G5, 23E8, 6H7 ou com uma IgGl como controlo.

Grupo 3: Ratos injetados com 4B1, 5C12, com uma IgG2b ou

IgG2b como controlo.

Resultados. Os resultados do estudo são apresentados nas Figuras 11 e 12. Agregados intraneuronais de a-sinucleína foram removidos por dois anticorpos monoclonais: 8A5 (também denominado por JH4.8A5) e 6H7 (também denominado por JH17.6H7), ambos descritos na publicação de patente PCT WO 05047860A2 ("Anticorpos para a Alfa-Sinucleina" depositada em 26 de maio de 2005) e no pedido de patente copendente No. 10/984192. O anticorpo mAb 6H7 foi criado contra α-sinucleína humana recombinante expressa em E. coli, e reconhece o terminal amina da α-sinucleína humana e de ratos. Este reconhece um epítopo que contém os três primeiros aminoácidos da α-sinucleína. O mAb 6H7 é capaz de reconhecer as proteínas de fusão da sinucleína, em que a proteína de cauda está fundida com o N-terminal da sinucleína, sugerindo que um terminal amina livre não é necessário (embora possa ser preferencial) . O mAb 8A5 foi criado contra sinucleínas purificadas de bovino (mistura de α eD) e reconhece um epítopo no terminal carboxílico da α -sinucleínas humanas e de rato. O MAb 8A5 pode ligar-se a uma sinucleína truncada com terminação no aminoácido 139. As experiências preliminares sugerem que ο 8A5 tem uma preferência 4-5 vezes superior pela sinucleína com um C-terminal livre, em comparação com um C-terminal conjugado com biotina. Ambos mAb 6H7 e mAb 8A5 reconhecem também a beta-sinucleína. O mAb 4B1 reconhece a região do C-terminal da sinucleína e liga-se à sinucleína em western blots, mas não reconhece a sinucleína em solução (isto é, o mAb 4B1 não imunoprecipita a sinucleína). A Figura 12 apresenta as seções do lado contralateral (painel esquerdo; pontos castanhos redondos dentro da seção são agregados de a-sinucleína) e do lado ipsilateral (painel direito) referentes a um rato injetado com 8A5. A diferença entre os ratos injetados com 8A5 e os ratos de controlo injetados com IgGl, foi estatisticamente significativa (p < 0,05 pelo teste não-paramétrico de Kruskal-Wallis seguido do teste post-hoc de Dunn). Estes resultados indicam que o ataque ao C-terminal e/ou N-terminal da α-sinucleína é terapeuticamente benéfico no sinucliopatias tais como a DP e DCL. A administração de outros anticorpos anti-a-sinucleína testados (Tabela 5, Fig. 11) não resultou na remoção de agregados. EXEMPLO X: Remoção In Vivo de Agregados de a-Sinucleína Pela Administração de Anticorpos Para a a-Sinucleína

Este exemplo demonstra a remoção de agregados intraneuronais de α-sinucleína, utilizando anticorpos monoclonais anti-a-sinucleína, que reconhecem os terminais α-sinucleína (6H7 e 8A5) como descrito no Exemplo IX. Este exemplo também demonstra a remoção de agregados intraneuronais de α-sinucleína, utilizando um anticorpo monoclonal anti-a-sinucleína que reconhece um epítopo próximo do C-terminal (9E4). O mAb 9E4 reconhece um epítopo da alfa-sinucleína na região dos aminoácidos 118-126.

Os anticorpos monoclonais foram injetados 3X no neocórtex do hemisfério direito de ratos transgénicos que sobre-expressam α-sinucleína humana, e que formam agregados intraneuronais de α-sinucleína. Como descrito acima, o mAb 6H7 reconhece o N-terminal da α-sinucleína, e o mAb 8A5 que reconhece o C-terminal da α-sinucleína, reduzindo o número de agregados intraneuronais de α-sinucleina até 80 %, em comparação com um anticorpo irrelevante de controlo (Fig. 13) . Além disso, o mAb 9E4 reconhece um epitopo da a-sinucleína em aalll8-126, tendo efeito de redução semelhante de agregados de α-sinucleína (Fig. 13). Métodos. Os anticorpos monoclonais que reconhecem diferentes epítopos da molécula de α-sinucleina, e anticorpos irrelevantes de controlo do mesmo isotipo, foram dissolvidos numa solução salina esterilizada de tampão fosfato (Tabela 6) para injeção em ratos. Os animais utilizados foram 4 ratos transgénicos heterozigóticos com 8 meses de idade, que sobre-expressam α-sinucleína humana não mutante no cérebro, sob o controlo transcricional do promotor PDGF. Foram utilizados 4 a 6 ratos transgénicos diferentes para cada um dos anticorpos.

Tabela 6. Anticorpos Para a α-Sinucleína e Controlos Utilizados em 3 Injeções Intracerebrais no Modelo Transgénico Sinucleinopático Neuronal.

Para cada rato, 2 yL de uma solução de 2 mg/mL de anticorpo é injetada estereotaxicamente, sob anestesia, nas camadas profundas do neocórtex parietal do hemisfério direito do cérebro (lado ipsilateral). O hemisfério esquerdo (lado contralateral) serve como uma linha de controlo para cada rato. As três coordenadas da injeção estereotáxica foram: injeção 1: 2,0 mm bregma, 1,5 mm lateral, 2,0 mm profundidade; injeção 2: 0,4 mm bregma, 1,5 mm lateral, 1,4 mm profundidade; injeção 3: -2,3 mm bregma, 1,5 mm lateral, 1,2 mm profundidade. Os locais de injeção foram suturados e os ratos foram monitorizados até recuperarem da anestesia. O investigador que executou as injeções desconhecia o anticorpo que foi injetado em cada vez. Duas semanas após a injeção, os ratos foram sacrificados de acordo com as diretrizes institucionais. Os seus cérebros foram removidos, fixados em paraformaldeído a 4 % durante 48 h, e cortados coronalmente com uma espessura de 40 ym de utilizando um vibratomo Leica. Toda a terceira seção ao longo do cérebro de cada animal, foi corada por coloração de imunoperoxidase com um anticorpo policlonal para a a-sinucleína (ELADW-47, que reconhece os aminoácidos 115-122 da α-sinucleína). Com base na localização de cada local de injeção, duas a quatro secções em torno de cada um dos três locais de injeção, foram escolhidos para cada animal. Agregados intraneuronais de α-sinucleína foram contabilizados em 4 campos microscópicos (objetivas 20x) em torno do local da injeção no hemisfério ipsilateral, e em 4 campos correspondentes no hemisfério contralateral de controlo. As contagens dos agregados de α-sinucleína para todas as seções (3-12 seções total/animal) foram somadas para cada hemisfério. Finalmente, para cada animal, a diferença entre a contagem total de agregados de a-sinucleína entre os dois hemisférios foi calculada, e expressa como a % de diferença entre os resultados do hemisfério contralateral e ipsilateral, fornecendo assim uma medida do efeito dos anticorpos para a α-sinucleína na remoção de agregados em cada rato individual. As secções possuem um código desconhecido, e o código foi revelado quando a análise foi concluída. EXEMPLO XI: Um anticorpo monoclonal contra o C-terminal da a-sinucleína entra no cérebro e reconhece a alfa-sinucleína

Ratos tg α-syn foram injetados intravenosamente com 9E4-FITC a uma dosagem de 5 mg/kg; 100 yL. Os ratos foram sacrificados uma semana mais tarde para determinar a presença do anticorpo no cérebro e CSF. Visualizámos diretamente o anticorpo fluorescente, e descobrimos que o anticorpo, de fato, passou para o cérebro e reconheceu especificamente a α-syn presente nos corpos celulares neuronais e em sinapses. A IgG de controlo libertada perifericamente demonstrou apenas atividade de imurreatividade de fundo em ambos os ratos tg e não-tg. Além disso, descobrimos que a CSF dos ratos tratados era imunorreativa contra α-syn nos cérebros de ratos tg não tratados, demonstrando um padrão de coloração semelhante àquele da imunomarcação direta com o anticorpo 9E4-FITC. (Ver Fig. 14) EXEMPLO XII: A imunização passiva com um anticorpo contra o C-terminal da α-syn reduz a défices de α-syn em ratos tg O objetivo do presente estudo foi demonstrar que a imunização passiva com um anticorpo contra o C-terminal da α-syn resulta na sua passagem para o SNC, e é capaz de reconhecer e de remover agregados de α-syn no cérebro de ratos tg. Para este efeito, ratos tg α-syn humana foram injetados intraperitonealmente com 9E4 numa dosagem de 1 mg/kg, durante seis meses. Os animais tratados com 9E4 foram eutanizados após 6 meses de injeções semanais. Foram observados níveis reduzidos de oligómeros de α-syn e formas insolúveis de α-syn nos cérebros dos ratos th injetados tg. (Veja a Figura 15.) EXEMPLO XIII: A imunização com um anticorpo contra o exterminai da α-syn promove a remoção através da ativação da via de autofagia num transgénico da doença de Parkinson

Um anticorpo monoclonal (clone 9E4) marcado com FITC, foi injetado por via intravenosa em ratos tg alfa-syn e não-tg. 3 dias após a injeção, baixos níveis do anticorpo foram detetados no cérebro, enquanto níveis elevados foram detetados no plasma. Ao 14° e 30° dia após a injeção, os níveis mais elevados foram detetados no cérebro com a diminuição dos níveis no plasma como evidenciado tanto por imunocitoquímica e como pela técnica ELISA. Nos cérebros de ratos tg, o anticorpo 9E4-FITC foi detetado em associação com agregados granulares de α-syn em neurónios. Estes agregados foram co-marcados com anticorpos contra marcadores lisossomais (catepsina D) . Experiências de controlo com uma IgG-FITC não imunitária, apresentaram apenas marcadores de fundo em ratos tg alfa-syn e não-tg. Além disso, a imunomarcação de secções de ratos tg alfa-syn, com a CSF de ratos tratados com 9E4-FITC, conduziu à marcação imunológica das sinapses e neurónios em secções de ratos tg alfa-syn não tratados, em contraste nenhuma marcação foi observada com a CSF de ratos tratados com uma IgG-FITC não imunitária. A remoção da alfa-syn em ratos tg imunizados com 9E4 foi, provavelmente, relacionada com a ativação da via autofagia, dado gue os níveis de beclina-1, clivagem LC3 e Atg5 aumentaram, e foram co-localizados com os agregados a-syn nos neurónios de ratos tg imunizados (Ver FIG 16) . Estes resultados sugerem que um anticorpo monoclonal contra um epítopo no, ou perto do, C-terminal da α-syn, trafica-se para o SNC, reconhecendo agregados em neurónios afetados e desencadeia a remoção através de uma via lisossomal, tal como na autofagia. A Fig. 17 ilustra tais vias. No lado esquerdo da figura, o anticorpo liga-se à alfa-sinucleina ligada à membrana do exterior das células, e o complexo resultante é sujeito à endocitose, combinando-se com um lisossoma no interior da célula e formando uma autofagossoma que provoca a degradação por enzimas lisossomais. No lado direito da figura, a alfa-sinucleina e o anticorpo para a alfa-sinucleina são separadamente endocitados, o anticorpo provável consegue a sua entrada através dos recetores Fc, e combina-se com um lisossoma na célula seguindo-se a degradação lisossomal.

DEPÓSITO

As seguintes linhas de células produtoras de anticorpos monoclonais foram depositadas sob as disposições do Tratado de Budapeste com a American Type Culture Collection (ATCC, PO Box 1549, Manassas, VA 20108), nas datas indicadas:

Será evidente para um perito comum na especialidade, que muitas alterações e modificações podem ser realizadas sem afastarmos-nos do conteúdo das reivindicações anexas. A menos de outro modo evidente a partir do contexto, qualquer passo, recurso, forma de realização ou aspeto, pode ser usado em combinação com qualquer outro.

LISTA DE SEQUÊNCIAS

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Lisboa, 11 de Agosto de 2015

Claims (10)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Um anticorpo monoclonal anti-sinucleína 9E4, ou um 9E4 humanizado ou quimérico, onde o anticorpo 9E4 é produzido pelo hibridoma JH17.9E4.3.37:1.14.2 depositado com o número de acesso ATCC PT-8221.
2. 2. 0 anticorpo monoclonal anti-sinucleina de acordo com a reivindicação 1, o qual o seu 9E4 humanizado é produzido por enxerto das RDCs do 9E4 na estrutura humana e regiões constantes, cujos residuos selecionados da estrutura da região variável de origem humana são opcionalmente substituídos como se segue: um resíduo selecionado da estrutura de região variável humana é substituído por um aminoácido equivalente estrutural do anticorpo de rato 9E4, quando o aminoácido (1) liga-se de forma não covalente diretamente ao antigénio, (2) é adjacente a uma região RDC, (3) de outra forma interage com uma região RDC, ou (4) participa na interface VL-VH; ou um aminoácido estrutural humano que é invulgar para uma imunoglobulina humana nessa posição, é substituído por um aminoácido da posição equivalente do anticorpo dador de rato ou a partir da posição equivalente de uma imunoglobulina humana mais típica.
3. 3. Um método de produção de uma forma quimérica do anticorpo monoclonal 9E4, produzido pelo hibridoma depositado com o número de acesso ATCC PTA-8221, compreendendo o método: a determinação da sequência de aminoácidos das regiões RDC do anticorpo monoclonal; a seleção de um anticorpo aceitador; e a produção de um anticorpo humanizado que compreende as RDCs provenientes do anticorpo monoclonal, e as estruturas da região variável do anticorpo aceitador.
4. 4. Um método de produção de uma forma quimérica do anticorpo monoclonal 9E4, produzido pelo hibridoma depositado com o número de acesso ATCC PTA-8221, compreendendo o método: a determinação da sequência de aminoácidos das regiões variáveis de cadeia leve e pesada do anticorpo monoclonal; a seleção da região constante de cadeia leve e pesada; a produção de um anticorpo quimérico que compreende uma cadeia leve compreendendo a região variável da cadeia leve fundida com a região constante da cadeia leve, e uma cadeia pesada compreendendo a região variável da cadeia pesada fundida com a região constante da cadeia pesada.
5. 5.0 anticorpo de acordo com a reivindicação 1 ou a reivindicação 2, para utilização na profilaxia ou tratamento de uma doença caracterizada por corpos de Lewy ou pela agregação alfa-sinucleína no cérebro.
6. 6.0 anticorpo de acordo com a reivindicação 5, para a utilização da referida reivindicação, onde a doença é a doença de Parkinson.
7. 7.0 anticorpo de acordo com a reivindicação 5 ou a reivindicação 6, para a utilização da referida reivindicação, onde o anticorpo é o isotipo IgGl humano.
8. 8.0 anticorpo de qualquer uma das reivindicações de 5 a 7, para a utilização da referida reivindicação, onde o anticorpo é administrado em doses múltiplas durante, pelo menos, seis meses.
9. 9. 0 anticorpo de qualquer uma das reivindicações de 5 a 7, para a utilização da referida reivindicação, em que o anticorpo é administrado por cia periférica.
10. 10. Uma célula do hibridoma JH17.9E4.3.37.1.14.2 depositado com o número de acesso ATCC PTA-8221. Lisboa, 11 de Agosto de 2015