JP5952331B2 - シヌクレイノパチーおよびアミロイド形成疾患（ａｍｙｌｏｉｄｏｇｅｎｉｃｄｉｓｅａｓｅ）の予防および処置 - Google Patents

シヌクレイノパチーおよびアミロイド形成疾患（ａｍｙｌｏｉｄｏｇｅｎｉｃｄｉｓｅａｓｅ）の予防および処置 Download PDF

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Description

［関連出願へのクロスリファレンス］
本願は、２００７年２月２３日に出願された１１／７１０，２４８の一部継続出願である、２００７年４月６日に出願された１１／６９７６４６の一部継続出願、および２００７年１１月１日に出願された６０／９８４，７２１の非仮出願である。前述の出願の各々は、全ての目的のためにその全部が引用することにより本明細書に組み込まれる。
アルファ−シヌクレイン（アルファ−ＳＮ）脳病変は、パーキンソン病（ＰＤ）、レビー小体型認知症（ＤＬＢ）、アルツハイマー病レビー小体亜型（Ｌｅｗｙ ｂｏｄｙ ｖａｒｉａｎｔ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）（ＬＢＶＡＤ）、多系統萎縮症（ＭＳＡ）および脳鉄蓄積を伴う神経変性１型（ＮＢＩＡ−１）を包含するいくつかの神経変性疾患の顕著な特徴である。シヌクレイノパチーと呼ばれるこれらの疾患の全てに共通しているのは、主としてアルファＳＮからなるニューロンおよびグリアにおけるタンパク様不溶性封入体である。
レビー小体およびレビー神経突起は、主としてアルファ−ＳＮからなるニューロン内封入体である。レビー小体およびレビー神経突起は、パーキンソン病（ＰＤ）の神経病理学的特徴である。ＰＤおよび他のシヌクレイノパチー疾患は、まとめてレビー小体病（ＬＢＤ）と呼ばれている。ＬＢＤは、ドーパミン作動系の変性、運動変調、認識障害およびレビー小体（ＬＢ）の形成を特徴とする。（非特許文献１）。他のＬＢＤには、びまん性レビー小体病（ＤＬＢＤ）、アルツハイマー病レビー小体亜型（ＬＢＶＡＤ）、複合ＰＤ・アルツハイマー病（ＡＤ）（ｃｏｍｂｉｎｅｄ ＰＤ ａｎｄ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ
ｄｉｓｅａｓｅ（ＡＤ））および多系統萎縮症が包含される。レビー小体型認知症（ＤＬＢ）は、ＬＢＤの専門用語における違いを調整するために作られた用語である。
ＬＢを有する疾患は、老齢人口における運動障害および認識力低下の共通原因であり続ける（非特許文献２）。それらの罹患率は増加し続け、深刻な公衆衛生問題を引き起こしているが、これまでこれらの疾患は治療可能でも予防可能でもなく、そしてＰＤの原因および発症機序を理解することは新規処置を開発することに向けて重要である（非特許文献３）。ＰＤの原因は意見が分かれ、そして様々な神経毒および遺伝的感受性因子を包含する多数の因子が役割を果たすことが提示されている。
最近、ＰＤの発症機序を理解することに対する新たな希望が浮上している。特に、シナプスタンパク質アルファ−ＳＮは、（１）このタンパク質はＬＢに蓄積し（非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６）、（２）アルファ−ＳＮ遺伝子における突然変異はパーキンソニズムの稀な家族型と一緒に分離し（非特許文献７；非特許文献８）、そして（３）トランスジェニックマウス（非特許文献９）およびショウジョウバエ（非特許文献１０）におけるその過剰発現はＰＤのいくつかの病理学的特徴を再現するので、ＰＤ発症機序において中心的役割を果たすことがいくつかの研究により示されている。従って、脳におけるアルファ−ＳＮの蓄積がヒト、マウスおよびハエのような多様な種における同様の形態学的および神経学的変化と関連することは、この分子がＰＤの発症に寄与することを示唆する。
ＡＤアミロイド斑の構成要素であると以前に決定されたアルファ−ＳＮフラグメントは、ＡＤアミロイドの非アミロイド−ベータ（非Ａβ）成分（ＮＡＣ）と命名された（非特
許文献１１；非特許文献１２；非特許文献１３）。ＮＡＣの正確な機能は不明であるが、それはシナプス事象、例えば発生中の神経可塑性、および学習ならびにＬＢＤ、ＡＤおよび他の疾患における病的状態下での神経終末の変性において重要な役割を果たし得る（非特許文献１４；非特許文献９）。
ＡＤ、ＰＤおよびレビー小体型認知症（ＤＬＢ）は、高齢者における最も一般的に見出される神経変性疾患である。それらの罹患率は増加し続け、深刻な公衆衛生問題を引き起こすが、これまでこれらの疾患は治療可能でも予防可能でもない。最近の疫学研究は、アルツハイマー患者の約３０％はＰＤにもかかっているように、ＡＤとＰＤとの間の密接な臨床関係を示している。従って、老齢人口の残りと比較して、ＡＤにかかっている患者はＰＤを併発する可能性が高い。さらに、認知症になるＰＤ患者は通常は典型的なＡＤを発症している。各神経変性疾患は特定の脳領域および細胞集団への傾向を有するように思われ、顕著な病理学的特徴をもたらすが、ＰＤ、ＡＤ、ＤＬＢおよびＬＢＤもまた共通の病理学的特徴を共有する。家族性ＡＤ、ダウン症候群もしくは孤発性ＡＤにかかっている患者は扁桃体上にＬＢを発生し、それはＰＤの典型的な神経病理学的特徴である。さらに、各疾患はニューロン、ニューロン間シナプス結合の変性そして最終的には細胞死、神経伝達物質の枯渇、およびその前駆体が正常な中枢神経系機能に関与する、ミスフォールディングしたタンパク質の異常な蓄積と関連する。ＡＤ、ＰＤおよびＤＬＢ間の関連は生化学的研究により裏付けられている。
ＡＤの典型的な病理学的特徴である老人斑は、ベータ−アミロイド（Ａβ）ペプチドおよび非ベータアミロイド成分（ＮＡＣ）ペプチドを含有する。Ａβは、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）と呼ばれるより大きい前駆体タンパク質に由来する。ＮＡＣは、現在ではアルファ−ＳＮとより一般的に呼ばれる、ＡＰＰの非ベータアミロイド成分と呼ばれるより大きい前駆体タンパク質に由来する。ＮＡＣは、アルファ−ＳＮのアミノ酸残基６０〜８７もしくは６１〜９５を含んでなる。ＡβおよびＮＡＣは両方とも、その全長ｃＤＮＡが同定されそしてクローン化された、それらのそれぞれの全長タンパク質のタンパク質分解フラグメントとしてアミロイド斑において最初に同定された。
アルファ−ＳＮは、ベータ−およびガンマ−シヌクレインならびにシノレチンを包含するタンパク質の大きなファミリーの一部である。アルファ−ＳＮはシナプスと関連して正常な状態において発現され、神経可塑性、学習および記憶において役割を果たすと考えられる。アルファ−ＳＮの凝集を高めるヒト（ｈ）アルファ−ＳＮにおける突然変異が同定されており（Ａｌａ３０ＰｒｏおよびＡｌａ５３Ｔｈｒ）、そしてＰＤの常染色体優性型の稀な型と関連する。これらの突然変異がアルファ−ＳＮの凝集する傾向を増す機序は不明である。
多数の突然変異が該人口においてＡＰＰおよびアルファ−ＳＮで見られることにもかかわらず、ＡＤおよびＰＤの大部分の症例は孤発性である。これらの疾患の最も頻度の高い孤発型は、それぞれ、Ａβおよびアルファ−ＳＮの異常な蓄積と関連する。しかしながら、これらのタンパク質の過剰蓄積の理由は不明である。Ａβはニューロンから分泌され、そして細胞外アミロイド斑に蓄積する。さらに、Ａβはニューロン内部で検出することができる。アルファ−ＳＮは、ＬＢと呼ばれるニューロン内封入体に蓄積する。これら２つのタンパク質は典型的に細胞外ＡＤ老人斑において一緒に見出されるが、それらはまた細胞内封入体において一緒に見出されることもある。
アルファ−ＳＮ蓄積が神経変性およびＰＤの特徴的症状をもたらす機序は不明である。しかしながら、アルファ−ＳＮ凝集を促進するそして／もしくは阻止する因子の役割を同定することはＬＢＤ発症機序の理解およびその関連疾患の新規処置の開発にとって重要である。処置を同定するための研究は、アルファ−ＳＮ凝集を減少させる化合物を探すこと
（非特許文献１４）または主に罹患する細胞であるドーパミン作動性ニューロンの再生および／もしくは生存を促進する成長因子を試験することに向けられている（非特許文献１５；非特許文献１６）。Ａβ１〜４２に対する抗体は脳からのアミロイドの除去を促進しそして刺激し、ＡＤ様病変を改善し、そして認識能力の改善をもたらすことがＡＤのトランスジェニックマウスモデルにおける最近の研究により示されている（非特許文献１７；非特許文献１８；非特許文献１９）。アルツハイマー患者の脳において見出される細胞外アミロイド斑と対照的に、レビー小体は細胞内であり、そして抗体は典型的に細胞に入らない。
脳組織におけるＬＢの細胞内の性質を考えると、驚くべきことに、本発明者等はシヌクレインで免疫したトランスジェニックマウスにおいて封入体の数を減少させることに成功した。本発明は、とりわけ、患者において有益な免疫反応を起こす条件下での患者へのシヌクレイン、シヌクレインのフラグメント、シヌクレインもしくはそのフラグメントを模倣する抗原、またはシヌクレインのあるエピトープに対する抗体の投与によるＰＤおよびＬＢと関連する他の疾患の処置に関する。本発明者等はまた、驚くべきことに、Ａβで免疫したトランスジェニックマウスにおいて封入体の数を減少させることにも成功した。本発明は、とりわけ、患者において有益な免疫反応を起こす条件下での患者へのＡβ、Ａβのフラグメント、Ａβもしくはそのフラグメントを模倣する抗原、またはＡβのあるエピトープに対する抗体の投与によるＰＤおよびＬＢと関連する他の疾患の処置に関する。従って、本発明は神経病変そしてある患者においてはＰＤおよびＬＢと関連する他の疾患と関係する認識障害を予防するかもしくは改善する治療処方計画（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ
ｒｅｇｉｍｅｓ）に対する長年にわたる必要性を満たす。
本願は、２００６年２月２３日に出願された特許文献１、２００６年２月９日に出願された特許文献２、２００５年８月９日に出願された特許文献３、２００５年７月１９日に出願された特許文献４、２００４年８月９日に出願された特許文献５、特許文献６および特許文献７、特許文献８；特許文献９；および特許文献１０、ならびに特許文献１１に関連しており、これらの各々は全ての目的のためにその全部が引用することにより組み込まれる。
米国出願第１１／７１０，２４８号明細書 米国出願第１１／６６０，０１５号明細書 ＰＣＴ公開第ＷＯ／２００６／０２０５８号明細書 米国特許出願第１１／１８５，９０７号明細書 米国特許出願第１０／９１５，２１４号明細書 米国特許第６，７８７，５２３号明細書 米国特許第６，９２３，９６４号明細書 米国特許出願第６０／４２３０１２号明細書 米国特許出願第１０／６９９５１７号明細書 米国特許出願第１０／６９８０９９号明細書 ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ０３／３４５２７号明細書
ＭｅＫｅｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｄｅｍｅｎｔｉａ ｗｉｔｈ Ｌｅｗｙ ｂｏｄｉｅｓ（ＤＬＢ）：Ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ｔｈｅ ＣＤＬＢ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｗｏｒｋｓｈｏｐ，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ（１９９６）４７：１１１３−２４） Ｇａｌａｓｋｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ−ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ｄｅｍｅｎｔｉａｓ．Ａｒｃｈ．Ｎｅｕｒｏｌ．（１９９４）５１：８８８−９５） Ｔａｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ ａｋｉｎｅｔｉｃ ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．（２０００）１３：４２７−３０ Ｓｐｉｌｌａｎｔｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９９７）３８８：８３９−４０ Ｔａｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．，ＡＭ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．（１９９８）１５２：３６７−７２ Ｗａｋａｂａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．（１９９７）２３９：４５−８ Ｋｒｕｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎ．（１９９８）１８：１０６−８ Ｐｏｌｙｍｅｒｏｐｏｕｌｏｓ ＭＨ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９７）２７６：２０４５−７ Ｍａｓｌｉａｈ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０００）２８７：１２６５−９ Ｆｅａｎｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（２０００）４０４：３９４−８ Ｉｗａｉ Ａ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ（２０００）１５０２：９５−１０９ Ｍａｓｌｉａｈ ｅｔ ａｌ．，ＡＭ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ（１９９６）１４８：２０１−１０ Ｕeｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９３）９０：１１２８２−６ Ｈａｓｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ａｌｐｈａ−Ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ ｉｎ Ｌｅｗｙ ｂｏｄｙ ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ，Ｂｒａｉｎ Ｐａｔｈｏｌ（１９９９）９：７０７−２０ Ｄｊａｌｄｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｗ ｔｈｅｒａｐｉｅｓ ｆｏｒ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ（２００１）２４８：３５７−６２ Ｋｉｒｉｋ ｅｔ ａｌ．，Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ ｒＡＡＶ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ＧＤＮＦ ｉｎ ｔｈｅ ｒａｔ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｍｏｄｅｌ：ｉｎｔｒａｓｔｒｉａｔａｌ ｂｕｔ ｎｏｔ ｉｎｔｒａｎｉｇｒａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｌｅｓｉｏｎｅｄ ｎｉｇｒｏｓｔｒｉａｔａｌ ｓｙｓｔｅｍ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ（２０００）２０：４６８６−４７００ Ｓｃｈｅｎｋ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａｍｙｌｏｉｄ−β ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ−ｄｉｓｅａｓｅ−ｌｉｋｅ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ｉｎ ＰＤＡＰＰ ｍｏｕｓｅ，Ｎａｔｕｒｅ（１９９９）４０８：１７３−１７７ Ｍｏｒｇａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａ−ｂｅｔａ ｐｅｐｔｉｄｅ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ｐｒｅｖｅｎｔｓ ｍｅｍｏｒｙ ｌｏｓｓ ｉｎ ａｎ ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ，Ｎａｔｕｒｅ（２０００）４０８：９８２−９８５ Ｊａｎｕｓ ｅｔ ａｌ．，Ａ−ｂｅｔａ ｐｅｐｔｉｄｅ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｒｅｄｕｃｅｓ ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ ａｎｄ ｐｌａｑｕｅｓ ｉｎ ａ ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ，Ｎａｔｕｒｅ（２０００）４０８：９７９−８２
［発明の簡単な要約］
１つの態様において、本発明は脳におけるレビー小体もしくはアルファ−ＳＮ凝集を特徴とする疾患を予防するかもしくは処置する方法を提供する。そのような方法は、アルファ−ＳＮに対する免疫反応を誘導することを伴う。そのような誘導は、免疫原の能動的投与によりまたはシヌクレインに対する抗体もしくは抗体の誘導体の受動的投与により成し遂げることができる。ある方法において、患者は無症状である。ある方法において、患者は疾患にかかっておりそして無症状である。ある方法において、患者は疾患の危険因子を有しそして無症状である。ある方法において、疾患はパーキンソン病である。ある方法において、疾患はパーキンソン病であり、そして薬剤を投与することは患者の運動特性を改善する。ある方法において、疾患はパーキンソン病であり、薬剤を投与することは患者の運動特性の悪化を防ぐ。ある方法において、患者はアルツハイマー病にかかっていない。
脳におけるレビー小体もしくはアルファ−ＳＮ凝集を患っている患者の処置のために、１つの処置処方計画は免疫反応を誘導するために患者にアルファ−ＳＮもしくはその活性フラグメントの用量を投与することを伴う。ある方法において、アルファ−ＳＮもしくはその活性フラグメントは少なくとも６か月の期間にわたって複数回投与において投与される。アルファ−ＳＮもしくはその活性フラグメントは、例えば、末梢に、腹腔内に、経口で、皮下に、頭蓋内に、筋肉内に、局所に、鼻腔内にもしくは静脈内に投与することができる。ある方法において、アルファ−ＳＮもしくはその活性フラグメントは、アルファ−ＳＮもしくはその活性フラグメントに対する免疫反応を高めるアジュバントと共に投与される。ある方法において、免疫原性反応はアルファ−ＳＮもしくはその活性フラグメントに対する抗体を含んでなる。
ある方法において、薬剤はアルファ−ＳＮのアミノ酸３５〜６５である。ある方法において、薬剤はアルファ−ＳＮのアミノ酸１３０〜１４０を含んでなり、そして合計４０個未満のアミノ酸もしくは合計３０個未満のアミノ酸を有する。ある方法において、薬剤はアルファ−ＳＮのアミノ酸１３０〜１３６を含んでなり、そして合計４０個未満のアミノ酸もしくは合計３０個未満のアミノ酸を有する。ある方法において、薬剤のＣ末端アミノ酸はアルファ−ＳＮのＣ末端アミノ酸である。上記の方法のあるものにおいて、アルファ−ＳＮもしくは活性フラグメントはアルファ−ＳＮもしくは活性フラグメントのＮ末端で担体に連結される。
ある方法において、薬剤はアルファ−ＳＮのアミノ酸９１〜９９を含んでなり、そして合計４０個未満のアミノ酸もしくは合計３０個未満のアミノ酸を有する。ある方法において、薬剤はアルファ−ＳＮのアミノ酸１１８〜１２６を含んでなり、そして合計４０個未満のアミノ酸もしくは合計３０個未満のアミノ酸を有する。ある方法において、薬剤はアルファ−ＳＮのアミノ酸１〜１０を含んでなり、そして合計４０個未満のアミノ酸もしくは合計３０個未満のアミノ酸を有する。ある方法において、薬剤のＮ末端アミノ酸はアルファ−ＳＮのＮ末端アミノ酸である。上記の方法のあるものにおいて、アルファ−ＳＮもしくは活性フラグメントはアルファ−ＳＮもしくは活性フラグメントのＣ末端で担体に連結される。上記の方法のあるものにおいて、アルファ−ＳＮもしくは活性フラグメントは担体分子に連結されてコンジュゲートを形成する。
ある方法において、薬剤はアルファ−ＳＮフラグメントを含んでなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを投与することにより患者に投与される。
脳におけるレビー小体もしくはアルファ−ＳＮ凝集を患っている患者の処置のために、１つの処置処方計画は、免疫反応を誘導するために患者にアルファ−ＳＮもしくはその活性フラグメントに対する抗体の用量を投与することを伴う。使用する抗体はヒト、ヒト化、キメラもしくはポリクローナルであることができ、そしてモノクローナルもしくはポリクローナルであることができる。ある方法において、抗体のアイソタイプはヒトＩｇＧ１である。ある方法において、抗体はアルファ−ＳＮペプチドで免疫したヒトから調製され、そしてヒトは抗体で処置される患者であることができる。ある方法において、抗体はレビー小体を有するニューロン細胞の外側表面に結合し、それによりレビー小体を消散させる。ある方法において、抗体はレビー小体を有するニューロン細胞内に取り込まれ、それによりレビー小体を消散させる。
ある方法において、抗体は製薬学的組成物として製薬学的担体と共に投与される。ある方法において、抗体は０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは少なくとも１ｍｇ／ｋｇ体重の抗体の投薬量で投与される。ある方法において、抗体は長期、例えば少なくとも６カ月にわたって複数回投与において投与される。ある方法において、抗体は持続放出組成物として投与することができる。抗体は、例えば、末梢に、腹腔内に、経口で、皮下に、頭蓋内に、筋肉内に、局所に、鼻腔内にもしくは静脈内に投与することができる。ある方法において、患者は患者の血液における投与抗体のレベルに関してモニターされる。
ある方法において、抗体は患者に少なくとも１つの抗体鎖をコードするポリヌクレオチドを投与することにより投与される。ポリヌクレオチドは、患者において抗体鎖を生成するように発現される。場合により、ポリヌクレオチドは抗体の重鎖および軽鎖をコードし、そしてポリヌクレオチドは患者において重鎖および軽鎖を生成するように発現される。
本発明はさらに、本願に記載のアルファ−ＳＮに対する抗体のいずれかおよび製薬学的に許容しうる担体を含んでなる製薬学的組成物を提供する。
別の態様において、本発明は、患者にアルファ−ＳＮに対する免疫原性反応を誘導する薬剤を投与することを含んでなりそしてＡβに対する免疫原性反応を誘導する第二の薬剤を投与することをさらに含んでなる脳におけるレビー小体もしくはアルファ−ＳＮ凝集を特徴とする疾患を予防するかもしくは処置する方法を提供する。ある方法において、薬剤はＡβもしくはその活性フラグメントである。ある方法において、薬剤はＡβに対する抗体である。
別の態様において、本発明は患者にＡβに対する免疫原性反応を誘導する薬剤を投与することを含んでなる脳におけるレビー小体もしくはアルファ−ＳＮ凝集を特徴とする疾患を予防するかもしくは処置する方法を提供する。ある方法において、薬剤はＡβもしくはその活性フラグメントである。ある方法において、薬剤はＡβに対する抗体である。ある方法において、疾患はパーキンソン病である。ある方法において、患者はアルツハイマー病にかかっておらず、そしてその危険因子を有さない。ある方法において、患者におけるパーキンソン病の兆候もしくは症状をモニターすることをさらに含んでなる。ある方法において、疾患はパーキンソン病であり、そして薬剤を投与することはパーキンソン病の兆候もしくは症状の改善をもたらす。
本発明はさらに、上記のような、患者においてレビー小体の成分に対する免疫原性反応を誘導するために有効な薬剤および製薬学的に許容しうるアジュバントを含んでなる製薬学的組成物を提供する。ある化合物において、薬剤はアルファ−ＳＮもしくは活性フラグメント、例えばＮＡＣ、もしくは本願に記載のフラグメントのいずれかである。本発明はまた、レビー小体の成分に特異的な抗体を含んでなる製薬学的組成物も提供する。
本発明はまた、患者においてアミロイド斑のシヌクレイン−ＮＡＣ成分に対する免疫反応を引き起こすために有効な薬剤を含んでなる製薬学的組成物も提供する。ある化合物において、薬剤はアルファ−ＳＮもしくは活性フラグメント、例えばＮＡＣ、もしくは本願に記載のアルファシヌクレインのフラグメントのいずれか、および場合によりアジュバントである。ある化合物において、薬剤はアルファ−ＳＮもしくはそのフラグメントに特異的に結合する抗体もしくはそのフラグメント、および場合により製薬学的担体である。
別の態様において、本発明はレビー小体と関連する疾患を予防するかもしくは処置することにおける活性について抗体をスクリーニングする方法を提供する。そのような方法は、シヌクレインを発現するニューロン細胞を抗体と接触させることを伴う。次に、接触させることが、抗体と接触していないコントロール細胞と比較して細胞におけるシヌクレイン沈着物を減少させるかどうかを決定する。
別の態様において、本発明は患者の脳におけるレビー小体病を処置するかもしくは予防することにおける活性について抗体をスクリーニングする方法を提供する。そのような方法は、アルファ−ＳＮの少なくとも５個の連続するアミノ酸を含んでなるポリペプチドと抗体を接触させることを伴う。次に、抗体がポリペプチドに特異的に結合するかどうかを決定し、特異的結合は、抗体が疾患を処置することにおいて活性を有する指標を提供する。
本発明はさらに、脳におけるレビー小体もしくはアルファ−シヌクレイン凝集を特徴とする疾患の予防をもたらすかもしくはそれを処置する方法を提供する。該方法は、ヒトアルファ−シヌクレインの残基７０〜１４０内のエピトープに特異的に結合する抗体を含んでなる免疫原性反応を誘導するために有効なアルファ−シヌクレインの免疫原性フラグメントを含んでなるポリペプチドを疾患にかかっているかもしくはその危険性がある患者に投与すること（残基は配列番号：１に従って番号が付けられている）、それにより疾患の予防もしくは処置をもたらすことを含んでなる。
場合により、アルファ−シヌクレインの免疫原性フラグメントはアルファシヌクレインの残基１〜６９を含まない（残基は配列番号：１に従って番号が付けられている）。場合により、免疫原性反応はＳＮ８３〜１０１、ＳＮ１０７〜１２５、ＳＮ１１０〜１２８およびＳＮ１２４〜１４０よりなる群から選択されるエピトープ内のヒトアルファシヌクレインに特異的に結合する抗体を含んでなる（残基は配列番号：１に従って番号が付けられている）。場合により、免疫原性反応は選択したエピトープ以外のヒトアルファシヌクレインの残基に特異的に結合する抗体を含まない。場合により、免疫原性フラグメントはアルファシヌクレインの位置７０〜１４０の間からの５〜２０、５〜２５もしくは５〜３０個の連続するアミノ酸を有する（残基は配列番号：１に従って番号が付けられている）。場合により、免疫原性フラグメントはアルファシヌクレインの位置１２０〜１４０の間からの５〜２０個の連続するアミノ酸を有する（残基は配列番号：１に従って番号が付けられている）。場合により、免疫原性フラグメントはＳＮ８７〜９７、ＳＮ１１１〜１２１、ＳＮ１１４〜１２４およびＳＮ１２８〜１３６よりなる群から選択されるヒトアルファシヌクレインのセグメントを含んでなり、そしてアルファシヌクレインの合計で４０個以下もしくは３０個以下の連続する残基を含有する（残基は配列番号：１に従って番号が付けられている）。場合により、免疫原性フラグメントはＳＮ１２４〜１３４、ＳＮ９１〜９９およびＳＮ１１８〜１２６よりなる群から選択されるヒトアルファシヌクレインのセグメントを含んでなり、そしてアルファシヌクレインの合計で４０個以下もしくは３０個以下の連続する残基を含有する（残基は配列番号：１に従って番号が付けられている）。場合により、免疫原性フラグメントはＳＮ１２５〜１４０を含んでなり、そしてアルファシヌクレインの合計で４０個以下もしくは３０個以下の連続する残基を含有する（残基は配列番号：１に従って番号が付けられている）。場合により、免疫原性フラグメントはＳ
Ｎ１３０〜１４０を含んでなり、そしてアルファシヌクレインの合計で４０個以下もしくは３０個以下の連続する残基を含有する（残基は配列番号：１に従って番号が付けられている）。場合により、免疫原性フラグメントはＳＮ８３〜１４０を含んでなる（残基は配列番号：１に従って番号が付けられている）。
場合により、免疫原性フラグメントはＳＮ１２４〜１４０、ＳＮ１２５〜１４０、ＳＮ１２６〜１４０、ＳＮ１２７〜１４０、ＳＮ１２８〜１４０、ＳＮ１２９〜１４０、ＳＮ１３０〜１４０、ＳＮ１３１〜１４０、ＳＮ１３２〜１４０、ＳＮ１３３〜１４０、ＳＮ１３４〜１４０、ＳＮ１３５〜１４０、ＳＮ１３６〜１４０、ＳＮ１３７〜１４０、ＳＮ１２４〜１３９、ＳＮ１２５〜１３９、ＳＮ１２６〜１３９、ＳＮ１２７〜１３９、ＳＮ１２８〜１３９、ＳＮ１２４〜１３９、ＳＮ１２５〜１３９、ＳＮ１２６〜１３９、ＳＮ１２７〜１３９、ＳＮ１２８〜１３９、ＳＮ１２９〜１３９、ＳＮ１３０〜１３９、ＳＮ１３１〜１３９、ＳＮ１３２〜１３９、ＳＮ１３３〜１３９、ＳＮ１３４〜１３９、ＳＮ１３５〜１３９、ＳＮ１３６〜１３９、ＳＮ１３７〜１３９、ＳＮ１２４〜１３８、ＳＮ１２４〜１３８、ＳＮ１２５〜１３８、ＳＮ１２６〜１３８、ＳＮ１２７〜１３８、ＳＮ１２８〜１３８、ＳＮ１２９〜１３８、ＳＮ１３０〜１３８、ＳＮ１３１〜１３８、ＳＮ１３２〜１３８、ＳＮ１３３〜１３８、ＳＮ１３４〜１３８、ＳＮ１３５〜１３８、ＳＮ１３６〜１３８、ＳＮ１２４〜１３７、ＳＮ１２５〜１３７、ＳＮ１２６〜１３７、ＳＮ１２７〜１３７、ＳＮ１２８〜１３７、ＳＮ１２９〜１３７、ＳＮ１３０〜１３７、ＳＮ１３１〜１３７、ＳＮ１３２〜１３７、ＳＮ１３３〜１３７、ＳＮ１３４〜１３７、ＳＮ１３５〜１３７、ＳＮ１２４〜１３６、ＳＮ１２５〜１３６、ＳＮ１２６〜１３６、ＳＮ１２７〜１３６、ＳＮ１２８〜１３６、ＳＮ１２９〜１３６、ＳＮ１３０〜１３６、ＳＮ１３１〜１３６、ＳＮ１３２〜１３６、ＳＮ１３３〜１３６およびＳＮ１３４〜１３６よりなる群から選択される（残基は配列番号：１に従って番号が付けられている）。
場合により、免疫原性反応はＳＮ１〜２０、ＳＮ２〜２１、ＳＮ２〜２３およびＳＮ１〜４０よりなる群から選択されるエピトープ内でヒトアルファシヌクレインに特異的に結合する抗体を含んでなる（残基は配列番号：１に従って番号が付けられている）。場合により、免疫原性反応は領域ＳＮ２５〜６９、ＳＮ２５〜１４０、ＳＮ４０〜６９、ＳＮ４０〜１４０もしくはＳＮ７０〜１４０内のヒトアルファシヌクレインの残基に特異的に結合する抗体を含まない。場合により、免疫原性フラグメントはアルファシヌクレインの位置１〜４０の間からの５〜２０、５〜２５もしくは５〜３０個の連続するアミノ酸を有する（残基は配列番号：１に従って番号が付けられている）。
場合により、免疫原性フラグメントはアルファシヌクレインの位置１〜２０の間からの５〜２０個の連続するアミノ酸および位置１２０〜１４０の間からの５〜２０個の連続するアミノ酸を有する（残基は配列番号：１に従って番号が付けられている）。場合により、免疫原性フラグメントはアルファシヌクレインの合計で４０個以下もしくは３０個以下の連続する残基を含有する（残基は配列番号：１に従って番号が付けられている）。
場合により、免疫原性反応はヒトアルファ−シヌクレインの残基１〜２０内のエピトープ内でそしてヒトアルファ−シヌクレインの残基７０〜１４０内のエピトープ内でヒトアルファシヌクレインに特異的に結合する抗体を含んでなる。場合により、免疫原性反応はヒトアルファ−シヌクレインの残基１〜２０内のエピトープ内でそしてヒトアルファ−シヌクレインの残基１２０〜１４０内のエピトープ内でヒトアルファシヌクレインに特異的に結合する抗体を含んでなる。場合により、免疫原性反応はヒトアルファ−シヌクレインの残基４１〜１１９内のエピトープ内でヒトアルファシヌクレインに特異的に結合する抗体を含んでならない。
場合により、免疫原性フラグメントは担体に連結されてコンジュゲートを形成する。場
合により、ポリペプチドは担体に融合している免疫原性フラグメントを含んでなる。場合により、免疫原性フラグメントはアルファ−シヌクレインフラグメントのＣ末端で担体分子に連結される。場合により、フラグメントの多数のコピーが担体の多数のコピーと相互連結される。場合により、免疫原性フラグメントはアジュバントと共に投与される。場合により、投与する段階はレビー小体の少なくとも部分的なクリアランスをもたらす。場合により、投与する段階はレビー小体を解離させる。場合により、投与する段階はシナプスにおけるアルファシヌクレインオリゴマーのレベルを減少させる。場合により、投与する段階はリソソーム経路の活性化によりシヌクレインを除去する。
場合により、免疫原性反応は単一ポリペプチドもしくは融合タンパク質の投与により誘導される。場合により、免疫原性反応は１個より多くのポリペプチド（例えば２個のポリペプチド）の投与により誘導される。場合により、免疫原性反応はヒトアルファ−シヌクレインの残基１〜２０内のエピトープに特異的に結合する抗体を含んでなる免疫原性反応を誘導するために有効なアルファ−シヌクレインの第一の免疫原性フラグメントを含んでなる第一のポリペプチドの投与、およびヒトアルファ−シヌクレインの残基７０〜１４０そして好ましくは残基１２０〜１４０内のエピトープに特異的に結合する抗体を含んでなる免疫原性反応を誘導するために有効なアルファ−シヌクレインの第二の免疫原性フラグメントを含んでなるポリペプチドを投与することにより誘導される。
場合により、免疫原性反応は組み合わせた２個もしくはそれ以上のポリペプチドの投与により誘導される。場合により、２個もしくはそれ以上のポリペプチドは共投与されそして／もしくは共処方される（ｃｏ−ｆｏｒｍｕｌａｔｅｄ）。
別の態様において、本発明はアルファ−シヌクレインの第一の免疫原性フラグメントを含んでなる第一のポリペプチドおよびアルファ−シヌクレインの第二の免疫原性フラグメントを含んでなる第二のポリペプチドを含んでなる組成物を提供し、ここで、第一の免疫原性フラグメントはヒトアルファ−シヌクレインの残基１〜２０内のエピトープに特異的に結合する抗体を含んでなる免疫原性反応を誘導するために有効であり、そしてアルファ−シヌクレインの第二の免疫原性フラグメントはヒトアルファ−シヌクレインの残基１２０〜１４０内のエピトープに特異的に結合する抗体を含んでなる免疫原性反応を誘導するために有効である。場合により、組成物はアルファ−シヌクレインの残基２５〜６９を含んでなるアルファ−シヌクレインの免疫原性フラグメントを含まない。第一および第二の免疫原性フラグメントは、（例えば、コンジュゲートもしくは融合タンパク質として）物理的に連結することができる。第一および第二の免疫原性フラグメントは共処方することができる。
本発明はさらに、脳におけるレビー小体もしくはアルファ−シヌクレイン凝集を特徴とする疾患の予防をもたらすかもしくはそれを処置する方法を提供する。１つの態様において、該方法はヒトアルファ−シヌクレインの残基７０〜１４０内のエピトープに特異的に結合する抗体の有効な処方計画を疾患にかかっているかもしくはその危険性がある患者に施すことを含んでなる（残基は配列番号：１に従って番号が付けられている）。抗体がヒトアルファ−シヌクレインの残基７０〜１４０内のエピトープに特異的に結合する場合（残基は配列番号：１に従って番号が付けられている）、場合により、抗体はヒトアルファ−シヌクレインの残基８３〜１４０内のエピトープに特異的に結合する（残基は配列番号：１に従って番号が付けられている）。場合により、抗体はヒトアルファ−シヌクレインの残基１２０〜１４０内のエピトープに特異的に結合する。場合により、抗体はＳＮ８３〜１０１、ＳＮ１０７〜１２５、ＳＮ１１０〜１２８、ＳＮ１１８〜１２６、ＳＮ９１〜９９、ＳＮ１２４〜１３４およびＳＮ１２４〜１４０よりなる群から選択されるヒトアルファシヌクレインのセグメント内のエピトープ内で特異的に結合する（残基は配列番号：１に従って番号が付けられている）。
別の態様において、該方法はヒトアルファ−シヌクレインの残基１〜４０内のエピトープに特異的に結合する抗体の有効な処方計画を疾患にかかっているかもしくはその危険性がある患者に施すことを含んでなる（残基は配列番号：１に従って番号が付けられている）。抗体がヒトアルファ−シヌクレインの残基１〜４０内のエピトープに特異的に結合する場合（残基は配列番号：１に従って番号が付けられている）、場合により、抗体は残基１〜２０内のもしくは残基１〜１０内のエピトープに特異的に結合する（残基は配列番号：１に従って番号が付けられている）。
さらに別の態様において、該方法はヒトアルファ−シヌクレインの残基１〜４０内のエピトープに特異的に結合する第一の抗体およびヒトアルファ−シヌクレインの残基７０〜１４０内のエピトープに特異的に結合する第二の抗体の有効な処方計画を疾患にかかっているかもしくはその危険性がある患者に施すことを含んでなる（残基は配列番号：１に従って番号が付けられている）。
ヒトアルファ−シヌクレインの残基１〜４０内のエピトープに特異的に結合する第一の抗体およびヒトアルファ−シヌクレインの残基７０〜１４０内のエピトープに特異的に結合する第二の抗体の場合（残基は配列番号：１に従って番号が付けられている）、場合により、第二の抗体はヒトアルファ−シヌクレインの残基１２０〜１４０内のエピトープに特異的に結合する。場合により、第一の抗体および第二の抗体は同時に投与される。場合により、第一の抗体および第二の抗体は同じ処置過程で投与される。
場合により、抗体はモノクローナル抗体である。場合により、抗体はエピトープ以外のアルファシヌクレインの残基への特異的結合を欠く抗体のポリクローナル集団である。場合により、抗体はヒト化抗体である。場合により、抗体はヒト抗体である。場合により、抗体はヒトＩｇＧ１アイソタイプの抗体である。場合により、抗体は製薬学的組成物として製薬学的担体と共に投与される。場合により、抗体は０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは少なくとも１ｍｇ／ｋｇ体重の抗体の投薬量で投与される。場合により、抗体は少なくとも６カ月にわたって複数回投与において投与される。場合により、抗体は持続放出組成物として投与される。場合により、抗体は腹腔内に、経口で、皮下に、頭蓋内に、筋肉内に、局所に、鼻腔内にもしくは静脈内に投与される。場合により、抗体はレビー小体を有するニューロン細胞内に取り込まれ、それによりレビー小体を消散させる。場合により、抗体はレビー小体を有するニューロン細胞の外側表面に結合し、それによりレビー小体を消散させる。場合により、抗体はニューロン細胞の外側表面上のアルファシヌクレインに結合し、アルファシヌクレインの架橋を促進し、ここで、投与する段階はレビー小体を解離させる。場合により、投与する段階はシナプスにおけるヒトアルファシヌクレインオリゴマーのレベルを減少させる。場合により投与する段階はリソソーム経路の活性化によりヒトアルファシヌクレインを取り除く。ある方法において、疾患はパーキンソン病である。場合により、抗体は免疫ブロットにより決定した場合に変性したヒトアルファ−シヌクレインに特異的に結合する。場合により、抗体は少なくとも１０9Ｍ-1の親和性で変性したヒトアルファ−シヌクレインに特異的に結合する。場合により、抗体は免疫細胞化学により決定した場合にシナプスに特異的に結合する。
本発明はまた、ヒトアルファ−シヌクレインの残基１〜２０内のエピトープに特異的に結合する第一のモノクローナル抗体およびヒトアルファ−シヌクレインの残基７０〜１４０（そして好ましくは残基１２０〜１４０）内のエピトープに特異的に結合する第二のモノクローナル抗体を含んでなる（残基は配列番号：１に従って番号が付けられている）、脳におけるレビー小体もしくはアルファ−シヌクレイン凝集を特徴とする疾患の予防もしくは処置用の組成物も提供する。
本発明はまた、ヒトアルファ−シヌクレインの残基１〜２０内のエピトープに特異的に結合する抗体を含んでなる第一の容器およびヒトアルファ−シヌクレインの残基７０〜１４０（そして好ましくは残基１２０〜１４０）内のエピトープに特異的に結合する抗体を含んでなる第二の容器を含んでなる（残基は配列番号：１に従って番号が付けられている）、脳におけるレビー小体もしくはアルファ−シヌクレイン凝集を特徴とする疾患の予防もしくは処置用のキットも提供する。
本発明はさらに、脳におけるレビー小体もしくはアルファ−シヌクレイン凝集を特徴とする疾患の予防をもたらすかもしくはそれを処置する方法を提供する。該方法は、ヒトアルファ−シヌクレインの残基７０〜１４０内のエピトープに特異的に結合する抗体を含んでなる免疫原性反応を誘導する薬剤の有効な処方計画を疾患を患っているかもしくはその危険性がある患者に施し（残基は配列番号：１に従って番号が付けられている）、それにより疾患の予防をもたらすかもしくはそれを処置することを含んでなる。場合により、免疫原性反応はヒトアルファ−シヌクレインの残基１〜６９内のエピトープに特異的に結合する抗体を含まない（残基は配列番号：１に従って番号が付けられている）。場合により、免疫原性反応はＳＮ８３〜１０１、ＳＮ１０７〜１２５、ＳＮ１１０〜１２８、ＳＮ１１８〜１２６、ＳＮ９１〜９９、ＳＮ１２４〜１３４およびＳＮ１２４〜１４０よりなる群から選択されるヒトアルファシヌクレインのセグメント内で特異的に結合する抗体を含んでなる（残基は配列番号：１に従って番号が付けられている）。
本発明はさらに、レビー小体を特徴とする疾患を処置することにおいて有用な活性を有する薬剤に関してスクリーニングする方法を提供する。該方法は、レビー小体病の特徴を発症する性質があるトランスジェニック非ヒト動物と薬剤を接触させること；および薬剤がコントロールトランスジェニック非ヒト動物に対して該特徴の発症の程度もしくは割合に影響を及ぼすかどうかを決定することを含んでなる。薬剤は、（ｉ）ヒトアルファ−シヌクレインの残基７０〜１４０内の少なくとも１つのエピトープに特異的に結合する抗体を誘導するアルファシヌクレインのフラグメントもしくは（ｉｉ）ヒトアルファ−シヌクレインの残基７０〜１４０内のエピトープに特異的に結合する抗体である（残基は配列番号：１に従って番号が付けられている）。
場合により、トランスジェニック非ヒト動物はヒトアルファ−シヌクレインを発現する導入遺伝子を含んでなる。場合により、該方法は変性したヒトアルファシヌクレインへの結合について複数の試験抗体をスクリーニングすること、および薬剤として最も高い結合抗体を選択することをさらに含んでなる。場合により、該方法は免疫細胞化学により組織切片におけるシヌクレインの沈着物への結合について複数の試験抗体をスクリーニングすること、および薬剤として最も高い結合抗体を選択することをさらに含んでなる。
本発明はさらに、モノクローナル抗体のＣＤＲ領域のアミノ酸配列を決定すること；アクセプター抗体を選択すること；ならびにモノクーナル抗体からのＣＤＲおよびアクセプター抗体からの可変領域フレームワークを含んでなるヒト化抗体を製造することを含んでなる８Ａ５、６Ｈ７、９Ｅ４、１Ｈ７および１１Ａ５から選択されるモノクローナル抗体をヒト化する方法を提供する。
本発明はさらに、モノクローナル抗体の軽鎖および重鎖可変領域のアミノ酸配列を決定すること；重鎖および軽鎖定常領域を選択すること；軽鎖定常領域に融合した軽鎖可変領域を含んでなる軽鎖、および重鎖定常領域に融合した重鎖可変領域を含んでなる重鎖を含んでなるキメラ抗体を製造することを含んでなる８Ａ５、６Ｈ７、９Ｅ４、１Ｈ７および１１Ａ５から選択されるモノクローナル抗体のキメラ形態を製造する方法を提供する。
本発明は、脳におけるレビー小体もしくはアルファ−シヌクレイン凝集を特徴とする疾
患の予防をもたらすかもしくはそれを処置する方法を提供し、該方法はヒトアルファ−シヌクレインの残基１１０〜１３０内のエピトープに特異的に結合する抗体の有効な処方計画を疾患にかかっているかもしくはその危険性がある患者に施すことを含んでなる（残基は配列番号：１に従って番号が付けられている）。場合により、抗体はヒトアルファ−シヌクレインの残基１１８〜１２６内のエピトープに結合する。場合により、疾患はパーキンソン病である。場合により、抗体はモノクローナル抗体である。場合により、抗体はキメラ抗体、ヒト抗体もしくはヒト化抗体である。場合により、抗体はヒトアルファ−シヌクレインへの結合に関してマウスモノクローナル抗体９Ｅ４（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８２２１）と競合する。場合により、抗体はモノクローナル抗体９Ｅ４（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８２２１）またはヒト化もしくはキメラ９Ｅ４である。場合により、抗体はヒトＩｇＧ１アイソタイプの抗体である。場合により、抗体は製薬学的組成物として製薬学的担体と共に投与される。場合により、抗体は０．０００１〜１００ｍｇ抗体／ｋｇ体重の投薬量で投与される。場合により、抗体は少なくとも６カ月にわたって複数回投与において投与される。場合により、抗体は腹腔内に、経口で、皮下に、頭蓋内に、筋肉内に、局所に、鼻腔内にもしくは静脈内に投与される。場合により、抗体は抹消経路により投与される。場合により、抗体は１〜１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。
本発明はさらに、モノクローナル抗体９Ｅ４（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８２２１）またはヒト化もしくはキメラ９Ｅ４を提供する。
本発明はさらに、モノクローナル抗体のＣＤＲ領域のアミノ酸配列を決定すること；アクセプター抗体を選択すること；ならびにモノクーナル抗体からのＣＤＲおよびアクセプター抗体からの可変領域フレームワークを含んでなるヒト化抗体を製造することを含んでなるモノクローナル抗体９Ｅ４（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８２２１）をヒト化する方法を提供する。
本発明はさらに、モノクローナル抗体の軽鎖および重鎖可変領域のアミノ酸配列を決定すること；重鎖および軽鎖定常領域を選択すること；ならびに軽鎖定常領域に融合した軽鎖可変領域を含んでなる軽鎖、および重鎖定常領域に融合した重鎖可変領域を含んでなる重鎖を含んでなるキメラ抗体を製造することを含んでなるモノクローナル抗体９Ｅ４（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８２２１）のキメラ形態を製造する方法を提供する。
本発明はさらに、ハイブリドーマＪＨ１７．９Ｅ４．３．３７．１．１４．２（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８２２１）、ハイブリドーマＪＨ１７．１Ｈ７．４．２４．３４（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８２２０）もしくはハイブリドーマＪＨ２２．１１Ａ５．６．２９．７０．５４．１６．１４（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８２２２）により生産される抗シヌクレインモノクローナル抗体を提供する。
本発明はさらに、ハイブリドーマＪＨ１７．１Ｈ７．４．２４．３４（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８２２０）もしくはハイブリドーマＪＨ２２．１１Ａ５．６．２９．７０．５４．１６．１４（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８２２２）により生産されるモノクローナル抗体のキメラもしくはヒト化抗体を提供する。
本発明はさらに、モノクローナル抗体のＣＤＲ領域のアミノ酸配列を決定すること；アクセプター抗体を選択すること；ならびにモノクローナル抗体からのＣＤＲおよびアクセプター抗体からの可変領域フレームワークを含んでなるヒト化抗体を製造することを含んでなるハイブリドーマＪＨ１７．１Ｈ７．４．２４．３４（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８２２０）もしくはハイブリドーマＪＨ２２．１１Ａ５．６．２９．７０．５４．１６．１４（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８２２２）により生産されるモノクローナル抗体をヒト化する方法を提供する。
本発明はさらに、モノクローナル抗体の軽鎖および重鎖可変領域のアミノ酸配列を決定すること；重鎖および軽鎖定常領域を選択すること；軽鎖定常領域に融合した軽鎖可変領域を含んでなる軽鎖、および重鎖定常領域に融合した重鎖可変領域を含んでなる重鎖を含んでなるキメラ抗体を製造することを含んでなるハイブリドーマＪＨ１７．１Ｈ７．４．２４．３４（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８２２０）もしくはハイブリドーマＪＨ２２．１１Ａ５．６．２９．７０．５４．１６．１４（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８２２２）により生産されるモノクローナル抗体のキメラ形態を製造する方法を提供する。
本発明はさらに、ハイブリドーマＪＨ１７．９Ｅ４．３．３７．１．１４．２（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８２２１）、ハイブリドーマＪＨ１７．１Ｈ７．４．２４．３４（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８２２０）もしくはハイブリドーマＪＨ２２．１１Ａ５．６．２９．７０．５４．１６．１４（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８２２２）の細胞を提供する。
本発明はさらに、抗体が末梢経路により投与されそしてリソソーム経路により細胞内レビー抗体もしくはアルファシヌクレイン凝集を減少させる、レビー小体もしくはアルファシヌクレイン凝集を特徴とする疾患を処置するための薬剤の製造におけるヒトアルファ−シヌクレインの残基１１０〜１３０内のエピトープに特異的に結合する抗体の使用を提供する（残基は配列番号：１に従って番号が付けられている）。場合により、抗体はエンドサイトーシスによりレビー小体もしくはアルファシヌクレイン凝集を含有する細胞に入る。場合により、抗体は細胞の外側から膜結合型アルファシヌクレインに結合し、そして抗体とアルファシヌクレインの複合体は細胞内にエンドサイトーシスされ、そして細胞内でリソソームと結合する。場合により、抗体およびアルファシヌクレインは別個にエンドサイトーシスされ、そして細胞内でリソソームと結合される。
本発明はさらに、脳におけるレビー小体もしくはアルファ−シヌクレイン凝集を特徴とする疾患の予防をもたらすかもしくはそれを処置する方法を提供し、該方法はヒトアルファ−シヌクレインの残基１１０〜１３０内のエピトープに特異的に結合する抗体を誘導する薬剤の有効な処方計画を疾患にかかっているかもしくはその危険性がある患者に施すことを含んでなる（残基は配列番号：１に従って番号が付けられている）。場合により、薬剤はアルファ−シヌクレインのフラグメントである。場合により、フラグメントはアルファ−シヌクレインの合計３０個以下の連続する残基を有する。場合により、フラグメントはアルファ−シヌクレインの残基１１８〜１２６内のエピトープに対する抗体を誘導する。場合により、フラグメントはアルファシヌクレインの残基１１８〜１２６を含んでなる。場合により、フラグメントは担体に連結される。
それぞれ、２つのＮＡＣアミノ酸配列、配列番号：２および配列番号：３と並んでアルファ−ＳＮのアミノ酸配列（配列番号：１）を示す。 非トランスジェニックマウス（パネルＡ、ＥおよびＩ）、アジュバントのみで免疫したアルファ−ＳＮトランスジェニックマウス（パネルＢ、Ｆ、Ｊ）、ならびにアルファ−ＳＮに対する低力価（パネルＣ、ＧおよびＫ）および高力価（パネルＤ、ＨおよびＩ）の抗体を生成したアルファ−ＳＮで免疫したアルファ−ＳＮトランスジェニックマウスからの免疫組織染色した脳切片を示す。切片は、シヌクレインレベルを検出するために抗アルファ−シヌクレイン抗体（パネルＡ〜Ｄ）、切片に存在する総ＩｇＧレベルを決定するために抗ＩｇＧ抗体（パネルＥ〜Ｈ）での、そして星状膠細胞のマーカー、グリア細胞線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）についての染色に供した。 光学顕微鏡検査により見た場合のトランスフェクションしたＧＴ１−７細胞におけるシヌクレイン凝集への抗ｍＳＹＮポリクローナル抗体の効果を示す。 分析の前に免疫前血清でそして６７−１０抗体で（１：５０）の濃度で４８時間処置したＧＴ１−７ α−ｓｙｎ細胞の細胞質（Ｃ）および膜（Ｐ）におけるシヌクレインレベルのウェスタンブロットである。 非トランスジェニック、ＳＹＮ、ＡＰＰおよびＳＹＮ／ＡＰＰトランスジェニックマウスの脳におけるアミロイド沈着物へのＡβ１〜４２免疫の効果の研究の結果を示す。ＡＰＰおよびＳＹＮ／ＡＰＰマウスにおいて見られる検出可能なアミロイドレベルは、Ａβ１〜４２免疫により減少する。 非トランスジェニック、ＳＹＮ、ＡＰＰおよびＳＹＮ／ＡＰＰトランスジェニックマウスの脳におけるシヌクレイン封入体形成へのＡβ１〜４２免疫の効果の研究の結果を示す。ＳＹＮおよびＳＹＮ／ＡＰＰマウスにおいて検出されるシヌクレイン封入体は、Ａβ１〜４２免疫により減少する。 抗体がアルファ−ＳＮ凝集を阻止する直接的および間接的機序を示す。 抗体エピトープマッピングを示す。高力価および高親和性抗ヒトα−シヌクレイン抗体を示すマウスからの抗体をＥＬＩＳＡ技術を用いてマッピングした。ワクチン接種したマウスからの大部分の抗血清サンプルにおいて、認識されるエピトープはヒトα−シヌクレインのＣ末端領域内であった。ＣＦＡで処置したコントロールからの血清において、エピトープは検出されなかった。 ヒトα−シヌクレイン免疫反応性および神経変性の他のマーカーのレベルの画像解析を示す。（Ａ）側頭皮質におけるｈα−シヌクレイン陽性封入体の平均数。ヒトα−シヌクレインでのワクチン接種は、コントロールと比較して封入体の数の有意な減少をもたらした。この効果は、群Ｉとは対照的に群ＩＩからのマウスにおいていっそう顕著であった。（Ｂ）前頭皮質におけるシナプトフィジン免疫反応性終末により占められる神経網の面積パーセント。ＣＦＡのみで処置したトランスジェニック（ｔｇ）マウスにおいて、シナプトフィジン免疫標識終末の数は２０％減少し、一方、シナプス当たりのシナプトフィジン免疫反応性のレベルは変化しなかった。（Ｃ）側頭皮質におけるＣＤ４５免疫反応性（小グリアマーカー）のレベルは、ヒトα−シヌクレインワクチン接種マウスの脳においてわずかに高かった。（Ｄ）側頭皮質におけるヒトα−シヌクレイン免疫反応性終末により占められる神経網の面積パーセント。ヒトα−シヌクレインでワクチン接種したｔｇマウスにおいて、シナプトフィジン免疫反応性終末におけるα−シヌクレインの蓄積の減少があった。*＝ＣＦＡのみで処置したヒトα−シヌクレインｔｇマウスと比較して有意な差（ｐ＜０．０５、スチューデントＴ検定）。 ワクチン接種した動物におけるヒトα−シヌクレインおよびシナプトフィジン免疫反応性のレベルのウェスタンブロット分析を示す。ＣＦＡのみで処置したｔｇマウスの脳（レーン１〜３）と比較して、ｈα−シヌクレインワクチン接種ｔｇマウス（レーン４〜６）において、ヒトα−シヌクレインオリゴマーおよびモノマーの両方のレベルは減少し（上のパネル）、一方、シナプトフィジン免疫反応性のレベルは後者の群において増加した（下のパネル）。 抗α−シヌクレイン抗体の脳内注射後のニューロン内α−シヌクレイン凝集体の分析を示す。Ｃ末端の抗体８Ａ５およびＮ末端の抗体６Ｈ７は、除去効果を有した。ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂは、アイソタイプコントロールであった。水平バーはメジアンを表す。 モノクローナル抗体８Ａ５を注射したマウスの反対側（左のパネル；切片内の丸い褐色の点はα−シヌクレイン凝集体である）および同側（右のパネル）の切片を示す。免疫染色は、α−シヌクレインに対するポリクローナル抗体で行った。反対側におけるニューロン内α−シヌクレイン凝集体を丸で囲む。 抗α−シヌクレインモノクローナル抗体８Ａ５、９Ｅ４および６Ｈ７によるヒトα−シヌクレインを過剰発現するトランスジェニックマウスの新皮質におけるニューロン内α−シヌクレイン凝集体のクリアランスを示す。 ９Ｅ４−ＦＩＴＣでの単回静脈内注射後のヒトα−シヌクレインマウスにおける膜でのα−シヌクレインの凝集およびリソソームへのα−シヌクレインの局在化を示す。 α−ｓｙｎオリゴマーおよびα−ｓｙｎの不溶性型の減少したレベルが、６カ月間１ｍｇ／ｋｇの投薬量で９Ｅ４を腹腔内に注射したｔｇマウスの脳において見出されたことを示す。 免疫したｔｇマウスのニューロンにおいてベクリン−１、ＬＣ３切断およびＡｔｇ５のレベルは増加し、そしてα−ｓｙｎ凝集体と共局在化したことを示す。 α−ｓｙｎのｃ末端のもしくはその近くのエピトープに対する抗体がどのようにしてＣＮＳに移動し、罹患ニューロンにおける凝集体を認識し、そして自食作用のようなリソソーム経路によってクリアランスを引き起こすかを示す。
［定義］
「実質的な同一性」という用語は、２つのペプチド配列が、デフォルトギャップ加重を用いてプログラムＧＡＰもしくはＢＥＳＴＦＩＴによるような、最適に並べられる場合に、少なくとも６５パーセントの配列同一性、好ましくは少なくとも８０もしくは９０パーセントの配列同一性、より好ましくは少なくとも９５パーセントの配列同一性もしくはそれ以上（例えば、９９パーセントの配列同一性もしくはそれ以上）を共有することを意味する。好ましくは、同一でない残基位置は保存的アミノ酸置換によって異なる。
配列比較のために、典型的に一方の配列は、試験配列をそれと比較する参照配列として働く。配列比較アルゴリズムを用いる場合、試験および参照配列はコンピューターに入力され、必要に応じて、部分列座標が指定され、そして配列アルゴリズムプログラムパラメーターが指定される。次に、配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメーターに基づいて、参照配列に対して試験配列（１つもしくは複数）の配列同一性パーセントを計算する。
比較のための配列の最適なアライメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所的相同性アルゴリズムにより、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アライメントアルゴリズムにより、Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４（１９８８）の類似性検索方法により、これらのアルゴリズムのコンピューター化実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）により、もしくは視覚的検査（一般的には、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，上記を参照）により行うことができる。配列同一性および配列類似性パーセントを決定するために適当なアルゴリズムの一例はＢＬＡＳＴアルゴリズムであり、それはＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）に記述される。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）ウェブサイトを通して公的に利用可能である。専用パラメーターもまた使用することができるが、典型的には、デフォルトプログラムパラメーターを用いて配列比較を行うことができる。アミノ酸配列について、ＢＬＡＳＴＰプログラムはデフォルトとして３のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを使用する（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ＆ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ ８９，１０９１５（１９８９）を参照）。
アミノ酸置換を保存的もしくは非保存的として分類する目的のために、アミノ酸を下記のとおり分類する：群Ｉ（疎水性側鎖）：ノルロイシン、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ；群ＩＩ（中性親水性側鎖）：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；群ＩＩＩ（酸性側鎖）：ａｓｐ、ｇｌｕ；群ＩＶ（塩基性側鎖）：ａｓｎ、ｇｌｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ
；群Ｖ（鎖配向に影響を与える残基）：ｇｌｙ、ｐｒｏ；および群ＶＩ（芳香族側鎖）：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ。保存的置換は、同じクラスにおけるアミノ酸間の置換に関する。非保存的置換は、これらのクラスの１つのメンバーを別のもののメンバーと交換することに相当する。
本発明の治療薬は、典型的には望ましくない汚染物質から実質的に純粋である。これは、薬剤が典型的に少なくとも約５０％ｗ／ｗ（重量／重量）の純度であり、ならびに干渉タンパク質および汚染物質を実質的に含まないことを意味する。薬剤は少なくとも約８０％ｗ／ｗ、そしてより好ましくは少なくとも９０もしくは約９５％ｗ／ｗの純度であることもある。しかしながら、通常のタンパク質精製技術を用いて、少なくとも９９％ｗ／ｗの均質なペプチドを得ることができる。
分子が標的に「特異的に結合する」という語句は、他の生物製剤の不均一集団の存在下で分子の存在を決定する結合反応をさす。従って、指定された免疫アッセイ条件下で、特定の分子は特定の標的に優先的に結合し、そしてサンプルに存在する他の生物製剤に有意な量で結合しない。そのような条件下での標的への抗体の特異的結合は、抗体が標的に対するその特異性に関して選択されることを必要とする。特定のタンパク質と特異的に免疫反応性である抗体を選択するために様々な免疫アッセイ形式を用いることができる。例えば、タンパク質と特異的に免疫反応性であるモノクローナル抗体を選択するために固相ＥＬＩＳＡ免疫アッセイが日常的に用いられる。特異的免疫反応性を決定するために用いることができる免疫アッセイ形式および条件の記述については、例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照。２つの存在間の特異的結合は、少なくとも１０6、１０7、１０8、１０9Ｍ-1もしくは１０10Ｍ-1の親和性を意味する。１０8Ｍ-1より大きい親和性が好ましい。
「抗体」もしくは「免疫グロブリン」という用語には、完全な抗体およびその結合フラグメントが包含されるように用いられる。典型的に、フラグメントは、抗原への特異的結合に関してそれらが由来する完全な抗体と競合する。フラグメントには、別個の重鎖、軽鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ’Ｆ（ａｂ’）２、ＦａｂｃおよびＦｖが包含される。フラグメントは組換えＤＮＡ技術により、または完全な免疫グロブリンの酵素もしくは化学分離により製造される。「抗体」という用語にはまた、他のタンパク質に化学的に連結されるかもしくはそれとの融合タンパク質として発現される１つもしくはそれ以上の免疫グロブリン鎖も包含される。「抗体」という用語にはまた、二重特異性抗体も包含される。二重特異性もしくは二機能性抗体は、２つの異なる重鎖／軽鎖対および２つの異なる結合部位を有する人工ハイブリッド抗体である。二重特異性抗体は、ハイブリドーマの融合もしくはＦａｂ’フラグメントの連結を包含する様々な方法により製造することができる。例えば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ ＆ Ｌａｃｈｍａｎｎ，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７９：３１５−３２１（１９９０）；Ｋｏｓｔｅｌｎｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８，１５４７−１５５３（１９９２）を参照。「抗体」という用語にはまた、重鎖および軽鎖可変ドメインがスペーサーを介して連結される一本鎖抗体も包含される。
ＡＰＰ695、ＡＰＰ751およびＡＰＰ770は、それぞれ、ヒトＡＰＰ遺伝子によりコードされる６９５、７５１および７７０アミノ酸残基長ポリペプチドをさす。Ｋａｎｇ ｅｔ
ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３２５，７７３（１９８７）；Ｐｏｎｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３１，５２５（１９８８）；およびＫｉｔａｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３１，５３０（１９８８）を参照。ヒトアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）内のアミノ酸は、ＡＰＰ７７０アイソフォームの配列に従って番号が付けられる。Ａβ３９、Ａβ４０、Ａβ４１、Ａβ４２およびＡβ４３のような用語は、アミノ酸残基１〜３９、１〜４０、１〜４１、１〜４２および１〜４３を含有するＡβペプチドをさ
す。
「抗原」は、抗体が特異的に結合する存在である。
「エピトープ」もしくは「抗原決定基」という用語は、Ｂおよび／もしくはＴ細胞がそれに対して反応する抗原上の部位をさす。Ｂ細胞エピトープは、連続アミノ酸もしくはタンパク質の三次フォールディングにより近接して並べられる非連続アミノ酸の両方から形成されることができる。連続アミノ酸から形成されるエピトープは変性溶媒にさらした状態で典型的に保持され、一方、三次フォールディングにより形成されるエピトープは変性溶媒での処理で典型的に失われる。エピトープは、特有の空間配置において典型的には少なくとも３個、そしてより通常には少なくとも５もしくは８〜１０個のアミノ酸を含む。エピトープの空間配置を決定する方法には、例えば、ｘ線結晶学および２次元核磁気共鳴が包含される。例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６６，Ｇｌｅｎｎ Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ，Ｅｄ（１９９６）を参照。同じエピトープを認識する抗体は、標的抗原への別の抗体の結合を阻止するある抗体の能力を示す簡単な免疫アッセイにおいて同定することができる。Ｔ細胞はＣＤ８細胞では約９個のアミノ酸もしくはＣＤ４細胞では約１３〜１５個のアミノ酸の連続するエピトープを認識する。エピトープを認識するＴ細胞は、エピトープに反応した感作されたＴ細胞による3Ｈ−チミジンの取り込みにより決定されるような、抗原依存性増殖を測定するインビトロアッセイにより（Ｂｕｒｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｆ．Ｄｉｓ．１７０，１１１０−１９（１９９４））、抗原依存性致死により（細胞傷害性Ｔリンパ球アッセイ、Ｔｉｇｇｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５６，３９０１−３９１０）もしくはサイトカイン分泌により同定することができる。
「免疫学的」もしくは「免疫」反応という用語は、レシピエント患者におけるアミロイドペプチドに対する有益な体液性（抗体に媒介される）および／もしくは細胞性（抗原特異的Ｔ細胞もしくはそれらの分泌産物により媒介される）反応の発生である。そのような反応は、免疫原の投与により誘導される能動的反応または抗体もしくは感作されたＴ細胞の投与により誘導される受動的反応であることができる。細胞性免疫反応は、クラスＩもしくはクラスＩＩ ＭＨＣ分子と結合したポリペプチドエピトープの提示により引き起こされて抗原特異的ＣＤ４+Ｔヘルパー細胞および／もしくはＣＤ８+細胞傷害性Ｔ細胞を活性化する。反応はまた単球、マクロファージ、ＮＫ細胞、好塩基球、樹状細胞、星状細胞、小グリア細胞、好酸球もしくは先天性免疫の他の成分の活性化も伴い得る。細胞性免疫反応の存在は、増殖アッセイ（ＣＤ４+Ｔ細胞）もしくはＣＴＬ（細胞傷害性Ｔリンパ球）アッセイにより決定することができる（Ｂｕｒｋｅ，上記；Ｔｉｇｇｅｓ，上記を参照）。免疫原の予防もしくは治療効果への体液性および細胞性反応の相対的寄与は、免疫した同系動物から抗体およびＴ細胞を別個に単離しそして第二の被検体における予防もしくは治療効果を測定することにより区別することができる。
「免疫原性薬剤」もしくは「免疫原」は、場合によりアジュバントと併せて、哺乳類に投与するとそれ自体に対して免疫反応を誘導することができる。
「全てＤ」という用語は、＞７５％、＞８０％、＞８５％、＞９０％、＞９５％および１００％Ｄ配置のアミノ酸を有するペプチドをさす。
「裸のポリヌクレオチド」という用語は、コロイド材料と複合体形成していないポリヌクレオチドをさす。裸のポリヌクレオチドは、プラスミドベクターにクローン化されることもある。
「アジュバント」という用語は、抗原と併せて投与した場合に抗原に対する免疫反応を高めるが、単独で投与した場合に抗原に対する免疫反応を起こさない化合物をさす。アジュバントは、リンパ球動員、Ｂおよび／もしくはＴ細胞の刺激、ならびにマクロファージの刺激を包含するいくつかの機序により免疫反応を高めることができる。
「患者」という用語には、予防的もしくは治療的処置のいずれかを受けるヒトおよび他の哺乳類患者が包含される。
抗体間の競合は、試験下の免疫グロブリンがアルファ−ＳＮのような共通の抗原への参照抗体の特異的結合を妨げるアッセイにより決定される。多数のタイプの競合的結合アッセイが既知である、例えば：固相直接もしくは間接ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、固相直接もしくは間接酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）、サンドイッチ競合アッセイ（Ｓｔａｈｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ９：２４２−２５３（１９８３）を参照）；固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ（Ｋｉｒｋｌａｎｄ ｅｔ
ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：３６１４−３６１９（１９８６）を参照）；固相直接標識アッセイ、固相直接標識サンドイッチアッセイ（Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９８８）を参照）；Ｉ−１２５標識を用いる固相直接標識ＲＩＡ（Ｍｏｒｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５（１）：７−１５（１９８８）を参照）；固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ（Ｃｈｅｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７６：５４６−５５２（１９９０））；および直接標識ＲＩＡ（Ｍｏｌｄｅｎｈａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２：７７−８２（１９９０））。典型的に、そのようなアッセイは固体表面に結合している精製された抗原もしくはこれらのいずれかを保有する細胞、非標識試験免疫グロブリンおよび標識参照免疫グロブリンの使用を伴う。競合阻害は、試験免疫グロブリンの存在下で固体表面もしくは細胞に結合している標識の量を決定することにより測定される。通常、試験免疫グロブリンは過剰に存在する。競合アッセイ（競合抗体）により同定される抗体には、参照抗体と同じエピトープに結合する抗体および立体障害が起こるように参照抗体が結合するエピトープの十分に近位にある隣接エピトープに結合する抗体が包含される。通常、競合抗体が過剰に存在する場合、それは共通抗原への参照抗体の特異的結合を少なくとも５０％もしくは７５％阻害する。
「症状」もしくは「臨床症状」という用語は、患者によって知覚されるような、変化した歩行（ａｌｔｅｒｅｄ ｇａｉｔ）のような疾患の主観的証拠をさす。「兆候」は、医師により観察されるような疾患の客観的証拠をさす。
「組み合わせた」という語句には、２つもしくはそれ以上の抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体（すなわち、各々異なるエピトープを認識する）の投与またはヒトアルファ−シヌクレインに対する抗体反応を誘導する２つもしくはそれ以上のポリペプチドもしくは免疫原の投与をさす場合、同時投与および同じ処置過程における投与が包含される。薬剤の同時投与には、融合タンパク質もしくはコンジュゲート（例えば、相互に物理的に連結される）、共処方（例えば、ここで、薬剤は投与形態物、例えば持続放出もしくはデポー製剤に組み合わされるかもしくは混ぜ合わされる）としての薬剤の投与、お互いの数分もしくは２時間以内の別個の組成物としての投与（共投与）、または同じ日に別個の組成物としての投与が包含される。同じ処置過程における投与は、両方の薬剤が同じ条件の処置もしくは予防のために患者に投与されることを意味する。各薬剤は、１回もしくは複数回投与することができる。例えば、一方の薬剤が最初に投与され、そして第二の薬剤が翌日もしくは翌週に投与され得る。同様に、２つの薬剤は１回より多く、例えば、連続した日、隔日、隔週もしくは他のスケジュールに従って（例えば、患者への利益がいずれかの薬剤単独の投与のものを上回ることが予想されるように）各々投与され得る。
ＳＮｘ〜ｙの形態で指定されるフラグメントは、アミノ酸Ｘで始まりそしてアミノ酸Ｙで終わるアルファシヌクレインのフラグメントを意味する。そのようなフラグメントは異種ポリペプチドに連結することはできるが、フラグメントがＸより前で始まるかもしくはＹより後で終わるようにヒトアルファシヌクレインの他のアミノ酸に連結することはできない。
アルファ−シヌクレインもしくはそのフラグメントがデフォルトパラメーターを用いて上記のとおり配列番号：１と最大限に整列される場合、アルファ−シヌクレインもしくはそのフラグメントにおける残基は配列番号：１に従って番号が付けられている。
１つもしくはそれ以上の列挙した要素を「含んでなる」組成物もしくは方法には、特に列挙されない他の要素を包含することができる。例えば、アルファ−ＳＮペプチドを含んでなる組成物は、単離されたアルファ−ＳＮペプチドおよびより大きいポリペプチド配列の成分としてのアルファ−ＳＮペプチドの両方を包含する。
［発明の詳細な記述］
Ｉ．概要
本発明は、レビー小体の形態の、患者の脳における不溶性の塊に凝集したアルファ−ＳＮペプチドの沈着物の存在を特徴とするいくつかの疾患および症状を予防するかもしくは処置する方法を提供する。そのような疾患はレビー小体病（ＬＢＤ）とまとめて呼ばれ、そしてパーキンソン病（ＰＤ）が包含される。そのような疾患は、β−プリーツシート構造を有しそしてチオフラビン−Ｓおよびコンゴレッドで染まるアルファ−ＳＮの凝集体を特徴とする（Ｈａｓｉｍｏｔｏ，同書を参照）。本発明は、アルファ−ＳＮに対する免疫原性反応を起こすことができる薬剤を用いてそのような疾患を予防するかもしくは処置する方法を提供する。免疫原性反応は、脳における細胞内のシヌクレイン沈着物の形成を防ぐかもしくはそれを除去するように働く。機序の理解は本発明の実施にとって必須ではないが、免疫原性反応は単独でもしくはアルファシヌクレインと共に細胞内に取り込まれるシヌクレインに対する抗体の結果として除去を誘導することができる。実施例において提示される結果は、末梢に投与したアルファシヌクレインに対する抗体が血液脳関門を越え、そしてアルファシヌクレイン沈着物を含有する細胞内に単独でもしくはアルファシヌクレインと共に取り込まれることを示す。取り込まれた抗体は、リソソーム経路の活性化によってアルファシヌクレインの分解を促進することができる。変性形態のアルファシヌクレインに対する親和性を有する取り込まれた抗体はまた、非凝集形態の分子を安定させることもできる。あるいはまたもしくはさらに、抗体は細胞外側表面上のシヌクレインの凝集を妨げることができる。例えば、アルファ−シヌクレインに対する抗体はニューロン細胞表面における異常構造（ａｂｎｏｒｍａｌｌｙ ｃｏｎｆｏｒｍｅｄ）タンパク質を認識しそして架橋し得る。ある方法において、除去反応はＦｃ受容体に媒介される食作用により少なくとも部分的にもたらされることができる。シヌクレインでの免疫は、脳におけるシナプスおよびニューロン細胞体でのシヌクレイン蓄積を減少させることができる。機序の理解は本発明の実施にとって必須ではないが、この結果はニューロン細胞により（例えばシナプス小胞により）取り込まれているシヌクレインに対する抗体により説明することができる。
場合により、アルファ−ＳＮに対する免疫原性反応を起こす薬剤は、Ａβに対する免疫原性反応を起こす薬剤と組み合わせて使用することができる。該免疫原性反応は、Ａβの沈着物をそのような沈着物を有する個体（例えば、アルツハイマー病およびパーキンソン病の両方にかかっている個体）において除去することに有用であり；しかしながら、該免疫原性反応はまたシヌクレイン沈着物を除去することにおける活性も有する。従って、本
発明はＬＢＤにかかっているがアルツハイマー病を患っていないかもしくは発症する危険性がない個体においてそのような薬剤を単独でもしくはアルファ−ＳＮに対する免疫原性反応を起こす薬剤と組み合わせて使用する。
本発明はさらに、アミロイド形成疾患を予防しそして処置するための製薬学的組成物および方法を提供する。アルファ−およびベータシヌクレインはある種のアミロイド疾患、特にアルツハイマー病におけるアミロイド沈着物の核形成に関与することが示されている（Ｃｌａｙｔｏｎ，Ｄ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，ＴＩＮＳ ２１（６）：２４９−２５５，１９９８）。さらに特に、アルファ−およびベータ−シヌクレインのＮＡＣドメインのフラグメント（残基６１〜９５）はアルツハイマーの患者におけるアミロイド斑から単離されており；実際にこのフラグメントはドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）での可溶化後に不溶性のままである斑の約１０％を含んでなる。（Ｇｅｏｒｇｅ，Ｊ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｎｅｗｓ １：１２−１７，１９９５）。さらに、全長アルファ−ＳＮおよびそのＮＡＣフラグメントは両方とも、インビトロで不溶性アミロイドへのβ−アミロイドペプチドの凝集を加速することが報告されている。（Ｃｌａｙｔｏｎ，上記）。アミロイド斑のＮＡＣ成分は、下記に詳述されるように、本発明の免疫学的に基づく処置の標的として働く。１つの態様によれば、本発明には患者におけるアミロイド斑のシヌクレイン−ＮＡＣ成分に対する免疫反応を引き起こすために有効な薬剤を含んでなる製薬学的組成物が包含される。そのような組成物は、アミロイド疾患における斑沈着を防ぐこと、遅らせることもしくは減少させることにおいて有効であることができる。
ＩＩ．アルファシヌクレインに対する免疫原性反応を起こす薬剤
免疫原性反応は、患者におけるアルファ−ＳＮと反応する抗体を誘導するために免疫原が投与される場合のように能動的であるか、もしくは患者におけるアルファ−ＳＮにそれ自体が結合する抗体が投与される場合のように受動的であることができる。
１．能動免疫反応を誘導する薬剤
治療薬は、アルファ−ＳＮペプチド内のあるエピトープに特異的に向けられる免疫原性反応を誘導する。好ましい薬剤は、アルファ−ＳＮペプチド自体およびそのフラグメントである。米国特許公開ＵＳ２００６０２５９９８６Ａ１およびＰＣＴ特許公開ＷＯ０５／０１３８８９（これらの両方とも、全ての目的のために引用することにより本明細書に組み込まれる）は、シヌクレイノパチーおよびアミロイド形成疾患の予防および処置の方法において有用な新規アルファ−シヌクレインフラグメントを開示する。場合により、これらのフラグメントはアジュバントと組み合わせて用いることができる。
アルファシヌクレインは、最初はＡＤ斑の非β−アミロイド成分（ＮＡＣ）の前駆体タンパク質としてヒト脳において同定された。（Ｕeｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０（２３）：１１２８２−１１２８６（１９９３））。ＡＤアミロイドの非Ａβ成分の前駆体（ＮＡＣＰ）とも呼ばれるアルファ−ＳＮは、１４０アミノ酸のペプチドである。アルファ−ＳＮはアミノ酸配列：
ＭＤＶＦＭＫＧＬＳＫＡＫＥＧＶＶＡＡＡＥＫＴＫＱＧＶＡＥＡＡＧＫＴＫＥＧＶＬＹＶＧＳＫＴＫＥＧＶＶＨＧＶＡＴＶＡＥＫＴＫＥＱＶＴＮＶＧＧＡＶＶＴＧＶＴＡＶＡＱＫＴＶＥＧＡＧＳＩＡＡＡＴＧＦＶＫＫＤＱＬＧＫＮＥＥＧＡＰＱＥＧＩＬＥＤＭＰＶＤＰＤＮＥＡＹＥＭＰＳＥＥＧＹＱＤＹＥＰＥＡ（配列番号：１）（Ｕeｄａ ｅｔ ａｌ
，同書；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：Ｐ３７８４０）
を有する。
ＡＤアミロイドの非Ａβ成分（ＮＡＣ）は、アルファ−ＳＮに由来する。アルファシヌクレイン内の高度に疎水性のドメイン、ＮＡＣは、少なくとも２８個のアミノ酸残基（残基６０〜８７）（配列番号：３）および場合により３５個のアミノ酸残基（残基６１〜９
５）（配列番号：２）からなるペプチドである。図１を参照。ＮＡＣは、ベータシート構造を形成する傾向を示す（Ｉｗａｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３４：１０１３９−１０１４５）。Ｊｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．は、ＮＡＣがアミノ酸配列：
ＥＱＶＴＮＶＧＧＡＶＶＴＧＶＴＡＶＡＱＫＴＶＥＧＡＧＳＩＡＡＡＴＧＦＶ（配列番号：２）（Ｊｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３１０（Ｐｔ１）：９１−９４（１９９５）；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｓ５６７４６）
を有することを報告している。
Ｕｅｄａ ｅｔ ａｌ．は、ＮＡＣがアミノ酸配列：
ＫＥＱＶＴＮＶＧＧＡＶＶＴＧＶＴＡＶＡＱＫＴＶＥＧＡＧＳ（配列番号：３）（Ｕｅｄａ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９０：１１２８２−１１２８６（１９９３）
を有することを報告している。
解離したアルファ−ＳＮもしくはＮＡＣを包含するそのフラグメントは、モノマーペプチド単位を意味する。解離したアルファ−ＳＮもしくはそのフラグメントは一般に可溶性であり、そして自己凝集して可溶性オリゴマーを形成することができる。アルファ−ＳＮもしくはそのフラグメントのオリゴマーは通常は可溶性であり、そして主にアルファへリックスとして存在する。モノマーアルファ−ＳＮは、凍結乾燥ペプチドを超音波処理で未希釈の（ｎｅａｔ）ＤＭＳＯに溶解することによりインビトロで調製することができる。得られる溶液を遠心分離してあらゆる不溶性微粒子を取り除く。凝集したアルファ−ＳＮもしくはＮＡＣを包含するそのフラグメントは、不溶性のベータシート集合体に会合しているアルファ−ＳＮもしくはそのフラグメントのオリゴマーを意味する。ＮＡＣを包含する、凝集したアルファ−ＳＮもしくはそのフラグメントはまた線維ポリマーも意味する。原線維は通常は不溶性である。ある抗体は、可溶性のアルファ−ＳＮもしくはそのフラグメントまたは凝集したアルファ−ＳＮもしくはそのフラグメントのいずれかに結合する。ある抗体は、モノマー形態もしくは線維形態によりもアルファ−シヌクレインのオリゴマーに強く結合する。ある抗体は、可溶性および凝集したアルファ−ＳＮもしくはそのフラグメントの両方、ならびに場合により同様にオリゴマー形態に結合する。
ＰＤに典型的なレビー小体の主要成分、アルファ−ＳＮおよび例えばＮＡＣ、あるいはＮ末端のもしくはその近くのまたはＣ末端のもしくはその近くのフラグメントのようなＮＡＣ以外のフラグメントのようなそのエピトープフラグメントは、免疫原性反応を誘導するために用いることができる。好ましくは、そのようなフラグメントはアルファ−ＳＮもしくはそのアナログの４個もしくはそれ以上のアミノ酸を含んでなる。
レビー小体の他の成分、例えば、シンフィリン−１、パーキン、ユビキチン、ニューロフィラメント、ベータ−クリスタリン、およびそのエピトープフラグメントもまた、免疫原性反応を誘導するために用いることができる。
記載の通り、アルファ−シヌクレインのある種の好ましいフラグメントは分子のＣ末端領域からである。そのようなフラグメントは、ヒトアルファ−シヌクレインの残基１〜６９を欠く。そのようなフラグメントでの免疫は、ヒトアルファ−シヌクレインの残基７０〜１４０内の１つもしくはそれ以上のエピトープに対する抗体を含んでなる免疫原性反応を起こす。ある活性フラグメントは、アルファ−ＳＮのＣ末端のもしくはその近く（例えば、アミノ酸７０〜１４０、１００〜１４０、１２０〜１４０、１３０〜１４０もしくは１３５〜１４０内）のエピトープを含む。ある活性フラグメントは、モノクローナル抗体８Ａ５により認識される領域のもしくはその近くのエピトープを含む。ある活性フラグメントは、モノクローナル抗体９Ｅ４により認識される領域のもしくはその近く（例えば、アミノ酸９０〜１４０、９８〜１４０、１０８〜１３６、１１０〜１３０もしくは１１８〜１２６内）のエピトープを含む。ある活性フラグメントは、モノクローナル抗体１Ｈ７
により認識される領域のもしくはその近く（例えば、アミノ酸７０〜１１９、８０〜１０９、８８〜１０１もしくは９１〜９９内）のエピトープを含む。ある活性フラグメントにおいて、エピトープのＣ末端残基はアルファ−ＳＮのＣ末端残基である。
アルファシヌクレインのあるフラグメントは：ヒトアルファシヌクレインのＳＮ８３〜１０１、ＳＮ１０７〜１２５、ＳＮ１１０〜１２８、ＳＮ１２４〜１４０、ＳＮ１１０〜１３０、ＳＮ８５〜１０５、ＳＮ１１８〜１２６およびＳＮ９１〜９９の１つもしくはそれ以上内のエピトープに特異的に結合する抗体を生成する。あるフラグメントは、上記のフラグメントの１つ内で特異的に結合する抗体のみを生成する。例えば、フラグメントＳＮ８３〜１０１はアルファ−シヌクレインの残基８３で始まりそして残基１０１で終わり、ＳＮ８３〜１０１に特異的に結合する抗体のみを生成する。免疫原性Ｃ末端領域フラグメントには、ＳＮ８５〜９９、ＳＮ１０９〜１２３、ＳＮ１１２〜１２６およびＳＮ１２６〜１３８（図８に示されるとおり）、ＳＮ１１０〜１３０、ＳＮ８５〜１０５およびいずれかの末端での２個までの追加のもしくは少ないアミノ酸によりこれらの１つと異なる他のフラグメントが包含される。別の好ましいフラグメントは、これらのエピトープの全てを含む、ＳＮ８３〜１４０である。
あるフラグメントは、アルファシヌクレインからの合計で４０個以下もしくは３０個以下の連続する残基を有する。あるそのようなフラグメントは、ＳＮ１２５〜１４０、ＳＮ１３０〜１４０、ＳＮ８７〜９７、ＳＮ１１１〜１２１、ＳＮ１１４〜１２４もしくはＳＮ１２８〜１３６を含んでなる。あるフラグメントは、アルファシヌクレインのＣ末端半分（すなわち、残基７０〜１４０）からの合計５〜２０、５〜２５もしくは５〜３０個の連続するアミノ酸を有する。あるフラグメントは、アルファシヌクレインの位置１２０〜１４０の間からの５〜２０個の連続するアミノ酸を有する。特に好ましいフラグメントには、ＳＮ１２４〜１４０、ＳＮ１２５〜１４０、ＳＮ１２６〜１４０、ＳＮ１２７〜１４０、ＳＮ１２８〜１４０、ＳＮ１２９〜１４０、ＳＮ１３０〜１４０、ＳＮ１３１〜１４０、ＳＮ１３２〜１４０、ＳＮ１３３〜１４０、ＳＮ１３４〜１４０、ＳＮ１３５〜１４０、ＳＮ１３６〜１４０、ＳＮ１３７〜１４０、ＳＮ１２４〜１３９、ＳＮ１２５〜１３９、ＳＮ１２６〜１３９、ＳＮ１２７〜１３９、ＳＮ１２８〜１３９、ＳＮ１２４〜１３９、ＳＮ１２５〜１３９、ＳＮ１２６〜１３９、ＳＮ１２７〜１３９、ＳＮ１２８〜１３９、ＳＮ１２９〜１３９、ＳＮ１３０〜１３９、ＳＮ１３１〜１３９、ＳＮ１３２〜１３９、ＳＮ１３３〜１３９、ＳＮ１３４〜１３９、ＳＮ１３５〜１３９、ＳＮ１３６〜１３９、ＳＮ１３７〜１３９、ＳＮ１２４〜１３８、ＳＮ１２４〜１３８、ＳＮ１２５〜１３８、ＳＮ１２６〜１３８、ＳＮ１２７〜１３８、ＳＮ１２８〜１３８、ＳＮ１２９〜１３８、ＳＮ１３０〜１３８、ＳＮ１３１〜１３８、ＳＮ１３２〜１３８、ＳＮ１３３〜１３８、ＳＮ１３４〜１３８、ＳＮ１３５〜１３８、ＳＮ１３６〜１３８、ＳＮ１２４〜１３７、ＳＮ１２５〜１３７、ＳＮ１２６〜１３７、ＳＮ１２７〜１３７、ＳＮ１２８〜１３７、ＳＮ１２９〜１３７、ＳＮ１３０〜１３７、ＳＮ１３１〜１３７、ＳＮ１３２〜１３７、ＳＮ１３３〜１３７、ＳＮ１３４〜１３７、ＳＮ１３５〜１３７、ＳＮ１２４〜１３６、ＳＮ１２５〜１３６、ＳＮ１２６〜１３６、ＳＮ１２７〜１３６、ＳＮ１２８〜１３６、ＳＮ１２９〜１３６、ＳＮ１３０〜１３６、ＳＮ１３１〜１３６、ＳＮ１３２〜１３６、ＳＮ１３３〜１３６およびＳＮ１３４〜１３６が包含される。
あるフラグメントは、アルファシヌクレインの位置１１８〜１２６、１０８〜１３６および９８〜１４０の間からの５〜２０個の連続するアミノ酸を有する。あるフラグメントは、アルファシヌクレインの位置７０〜９９、９１〜１３１、１３６もしくは９１〜９９の間からの５〜２０個の連続するアミノ酸を有する。
実施例ＩＸおよびＸに示されるように、アルファ−シヌクレインのアミノ末端を認識する抗体６Ｈ７の、もしくはアルファ−シヌクレインのカルボキシ末端を認識する抗体８Ａ
５の、もしくはシヌクレインのＣ末端領域におけるエピトープを認識する抗体９Ｅ４の投与は、ヒトアルファ−シヌクレインを過剰発現するトランスジェニックマウスの脳におけるアルファ−シヌクレイン凝集を減少させた。アルファ−シヌクレイン末端領域のもしくはその近くの配列を含んでなるアルファ−シヌクレインフラグメントでの免疫は、凝集体のそのような除去を同様にもたらしそして／もしくは凝集体の形成を防ぐことが予想される。
脳におけるレビー小体もしくはアルファ−シヌクレイン凝集を特徴とする疾患（例えばパーキンソン病）の予防をもたらすかもしくはそれを処置するために有用なアルファ−シヌクレインの他のフラグメントは、該分子のＮ末端領域からである。これらのフラグメントでの免疫は、残基１〜２０内の１つもしくはそれ以上のエピトープまたはある場合には残基１〜１０内の１つもしくはそれ以上のエピトープに対する抗体を含んでなる免疫原性反応を起こす。実施例ＩＸに示されるように、アルファ−シヌクレインのアミノ末端を認識する抗体６Ｈ７の投与は、ヒトアルファ−シヌクレインを過剰発現するトランスジェニックマウスの脳におけるアルファ−シヌクレイン凝集を減少させた。アルファ−シヌクレインアミノ末端領域を含んでなるアルファ−シヌクレインフラグメントでの免疫は、凝集体のそのような除去を同様にもたらしそして／もしくは凝集体の形成を防ぐことが予想される。
従って、１つの態様において、本発明は、ヒトアルファ−シヌクレインの残基１〜４０、残基１〜２０もしくは残基１〜１０内のエピトープに特異的に結合する抗体を含んでなる免疫原性反応を誘導するために有効なアルファ−シヌクレインの免疫原性フラグメントを含んでなるポリペプチドを疾患にかかっているかもしくはその危険性がある患者に投与することにより脳におけるレビー小体もしくはアルファ−シヌクレイン凝集を特徴とする疾患の予防をもたらすかもしくはそれを処置する方法を提供する（残基は配列番号：１に従って番号が付けられている）。１つの態様において、アルファ−シヌクレインの免疫原性フラグメントはアルファ−シヌクレインの残基７０〜１４０を含まない。１つの態様において、免疫原性フラグメントはアルファ−シヌクレインの残基４１〜１４０を含まない。１つの態様において、免疫原性フラグメントはアルファ−シヌクレインの残基２５〜１４０を含まない。
脳におけるレビー小体もしくはアルファ−シヌクレイン凝集を特徴とする疾患の予防をもたらすかもしくはそれを処置するために適当な免疫原には、アルファ−シヌクレインのアミノ末端からの５〜２０個の連続するアミノ酸残基を含んでなるフラグメントが包含されるがこれらに限定されるものではない。好ましい態様において、フラグメントはアルファ−シヌクレインの１番目の（アミノ末端の）残基を含んでなる。従って、典型的なフラグメントは、配列番号：１の残基１〜Ｎaの配列を含み、ここで、Ｎaは５〜２０である（例えば、ＭＤＶＦＭＫＧＬＳＫＡＫＥＧＶＶＡＡＡＥ；ＭＤＶＦＭＫＧＬＳＫＡＫＥＧＶＶＡＡＡ；ＭＤＶＦＭＫＧＬＳＫＡＫＥＧＶＶＡＡ；ＭＤＶＦＭＫＧＬＳＫＡＫＥＧＶＶＡ；ＭＤＶＦＭＫＧＬＳＫＡＫＥＧＶＶ；ＭＤＶＦＭＫＧＬＳＫＡＫＥＧＶ；ＭＤＶＦＭＫＧＬＳＫＡＫＥＧ；ＭＤＶＦＭＫＧＬＳＫＡＫ；ＭＤＶＦＭＫＧＬＳＫＡ；ＭＤＶＦＭＫＧＬＳＫ；ＭＤＶＦＭＫＧＬＳ；ＭＤＶＦＭＫＧＬ；ＭＤＶＦＭＫＧ；ＭＤＶＦＭＫ；およびＭＤＶＦＭ）。別の好ましい態様において、フラグメントはアルファシヌクレインのアミノ末端残基を含んでならないが、アルファ−シヌクレインの２番目および／もしくは３番目の残基を含んでなる。従って、典型的なフラグメントは、配列番号：１の残基２〜Ｎbおよび３〜Ｎcの配列を有し、ここで、Ｎbは６〜２１であり、そしてＮcは７〜２２である（例えば、ＤＶＦＭＫＧＬＳＫＡＫＥＧＶＶＡＡＡＥＫ；ＤＶＦＭＫＧＬＳＫＡＫＥＧＶＶＡＡＡＥ；ＤＶＦＭＫＧＬＳＫＡＫＥＧＶＶＡＡＡ；ＤＶＦＭＫＧＬＳＫＡＫＥＧＶＶＡＡ；ＤＶＦＭＫＧＬＳＫＡＫＥＧＶＶＡ；ＤＶＦＭＫＧＬＳＫＡＫＥＧＶＶ；ＤＶＦＭＫＧＬＳＫＡＫＥＧＶ；ＤＶＦＭＫＧＬＳＫＡＫＥＧ；ＤＶＦＭＫＧＬＳＫＡＫ；
ＤＶＦＭＫＧＬＳＫＡ；ＤＶＦＭＫＧＬＳＫ；ＤＶＦＭＫＧＬＳ；ＤＶＦＭＫＧＬ；ＤＶＦＭＫＧ；ＤＶＦＭＫ、ＶＦＭＫＧＬＳＫＡＫＥＧＶＶＡＡＡＥＫＴ；ＶＦＭＫＧＬＳＫＡＫＥＧＶＶＡＡＡＥＫ；ＶＦＭＫＧＬＳＫＡＫＥＧＶＶＡＡＡＥ；ＶＦＭＫＧＬＳＫＡＫＥＧＶＶＡＡＡ；ＶＦＭＫＧＬＳＫＡＫＥＧＶＶＡＡ；ＶＦＭＫＧＬＳＫＡＫＥＧＶＶＡ；ＶＦＭＫＧＬＳＫＡＫＥＧＶＶ；ＶＦＭＫＧＬＳＫＡＫＥＧＶ；ＶＦＭＫＧＬＳＫＡＫＥＧ；ＶＦＭＫＧＬＳＫＡＫ；ＶＦＭＫＧＬＳＫＡ；ＶＦＭＫＧＬＳＫ；ＶＦＭＫＧＬＳ；ＶＦＭＫＧＬ；およびＶＦＭＫＧ）。以下に説明されるように、上記のフラグメントは担体分子に連結することができる（例えば、コンジュゲートもしくは融合タンパク質、節ＩＩ（３）を参照）。あるいはまた、以下に説明されるように、上記のフラグメントはフラグメントをコードする核酸を患者にワクチン接種することにより投与することができる（節ＩＩ（４）を参照）。
脳におけるレビー小体もしくはアルファ−シヌクレイン凝集を特徴とする疾患（例えばパーキンソン病）の予防をもたらすかもしくはそれを処置するために有用なアルファ−シヌクレインの他のフラグメントは、アルファ−ＳＮのセリン１２９の近くの領域からである。そのリン酸化された形態のこの残基を含むフラグメント（例えば、リン酸化されたＳｅｒ１２９を有するＳＮ１２４−１３４）での免疫は、ホスホＳｅｒ１２９を含む１つもしくはそれ以上のエピトープに対する抗体を含んでなる免疫原性反応を起こす。ある活性フラグメントは、モノクローナル抗体１１Ａ５により認識される領域のもしくはその近くのエピトープを認識する抗体を誘導する。
容易に参照できるように、アルファ−ＳＮフラグメントおよびエピトープは分子におけるそれらの位置に基づいて、例えばそして限定せずに、アルファ−ＳＮ Ｎ末端アミノ酸を含有するフラグメント、Ｃ末端アミノ酸を含有するフラグメント、上記のようなＮＡＣフラグメント、Ｎ末端アミノ酸もＣ末端アミノ酸も含有しないフラグメント、アルファ−ＳＮのＣ末端半分からのフラグメント、アルファ−ＳＮのＮ末端半分からのフラグメント、アルファ−ＳＮのＮ末端の４０残基内のフラグメントと言及することができる。ある態様において、フラグメントは例えば５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１５、２０、２５、３０もしくは４０個の連続する残基の下限値および１０、１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０もしくは１００個の連続する残基の上限値によって境される範囲（ここで、上限値は下限値より高い）において、アルファ−ＳＮの５〜１００個の連続する残基を含有することができる。好ましくは、フラグメントはアルファ−ＳＮの少なくとも５個、少なくとも８個、少なくとも１０個もしくは少なくとも１５個もしくは少なくとも２０個の連続する残基を含有する。
アルファ−ＳＮへの言及には、上記に示される天然のヒトアミノ酸配列ならびに対立遺伝子、種および誘導バリアントを包含するアナログ、全長形態およびその免疫原性フラグメントが包含される。配列番号：１と同じアミノ酸配列もしくはその対立遺伝子バリアントを有するタンパク質を意味する、ヒトアルファシヌクレインは全ての態様において好ましい。アナログは、典型的に、しばしば保存的置換のために、１、２もしくは数個の位置で天然に存在するペプチドと異なる。アナログは、典型的に、天然のペプチドと少なくとも８０もしくは９０％の配列同一性を示す。天然アルファシヌクレインのアナログにおけるアミノ酸の位置は、アナログおよび天然アルファシヌクレインを最大限に整列させた場合の天然アルファシヌクレインにおける対応するアミノ酸の番号が付けられる。あるアナログはまた、１、２もしくは数個の位置での非天然アミノ酸またはＮもしくはＣ末端アミノ酸の改変も含む。例えば、アルファ−ＳＮの位置１３９の天然のグルタミン酸残基はイソアスパラギン酸で置換することができる。非天然アミノ酸の例は、Ｄ、アルファ、アルファ−ジ置換されたアミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、乳酸、４−ヒドロキシプロリン、ガンマ−カルボキシグルタメート、イプシロン−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリシン、イプシロン−Ｎ−アセチルリシン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチ
オニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリシン、オメガ−Ｎ−メチルアルギニン、ベータ−アラニン、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、チロキシン、ガンマ−アミノ酪酸、ホモセリン、シトルリンおよびイソアスパラギン酸である。治療薬にはまた、アルファ−ＳＮフラグメントのアナログも包含される。本発明のある治療薬は全てＤのペプチド、例えば、全てＤのアルファ−ＳＮもしくは全てＤのＮＡＣ、および全てＤのペプチドアナログのものである。アナログは天然ヒトアルファシヌクレインに対する抗体のポリクローナル集団に特異的に結合する。フラグメントおよびアナログは、下記のように未処置のもしくはプラセボコントロールと比較してトランスジェニック動物モデルにおいて予防もしくは治療効能についてスクリーニングすることができる。
アルファ−ＳＮ、そのフラグメントおよびアナログは、固相ペプチド合成もしくは組換え発現により合成することができ、または天然源から得ることができる。自動ペプチド合成機は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａのような多数の供給業者から市販されている。組換え発現は、エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）のような細菌、酵母、昆虫細胞もしくは哺乳類細胞においてであることができる。組換え発現の方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃ．Ｓ．Ｈ．Ｐ．Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ 第２版，１９８９）により記述される。アルファ−ＳＮペプチドのある形態はまた、例えば、ＢＡＣＨＥＭおよびＡｍｅｒｉｃａｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．でも市販されている。
治療薬にはまた、他のアミノ酸と一緒に、例えば、アルファ−ＳＮペプチドの活性フラグメントを含むより長いポリペプチドも包含される。例えば、好ましい薬剤には、異種アミノ酸配列に対してヘルパーＴ細胞反応そしてそれによりアルファ−ＳＮセグメントに対してＢ細胞反応を誘導する異種アミノ酸配列に融合したアルファ−ＳＮのセグメントを含んでなる融合タンパク質が包含される。そのようなポリペプチドは、下記のように未処置のもしくはプラセボコントロールと比較して動物モデルにおいて予防もしくは治療効能についてスクリーニングすることができる。アルファ−ＳＮペプチド、アナログ、活性フラグメントもしくは他のポリペプチドは、会合したもしくはマルチマーの形態においてまたは解離した形態において投与することができ、治療薬にはまたモノマー免疫原性薬剤のマルチマーも包含される。本発明の治療薬は、ポリリシン配列を含むことができる。
さらなるバリエーションにおいて、アルファ−ＳＮのフラグメントのような免疫原性ペプチドは、免疫原性組成物の一部としてウイルスもしくは細菌により提示されることができる。免疫原性ペプチドをコードする核酸は、ウイルスもしくは細菌のゲノムもしくはエピソームに導入される。場合により、核酸は、免疫原性ペプチドが分泌タンパク質としてまたはペプチドが提示されるようにウイルスの外側表面タンパク質もしくは細菌の膜貫通タンパク質との融合タンパク質として発現されるように導入される。そのような方法において使用するウイルスもしくは細菌は、非病原性であるかもしくは弱毒化されなければならない。適当なウイルスにはアデノウイルス、ＨＳＶ、ベネズエラウマ脳炎ウイルスおよび他のアルファウイルス、水泡性口内炎ウイルス、ならびに他のラブドウイルス、ワクシニアおよび鳥類ポックスが包含される。適当な細菌には、サルモネラおよびシゲラが包含される。ＨＢＶのＨＢｓＡｇへの免疫原性ペプチドの融合は特に適当である。
治療薬にはまた、アルファ−ＳＮと有意なアミノ酸配列類似性を必ずしも有さないがそれにもかかわらずアルファ−ＳＮの模倣物として働きそして同様の免疫反応を誘導するペプチドおよび他の化合物も包含される。例えば、ベータプリーツシートを形成する任意のペプチドおよびタンパク質を適合性についてスクリーニングすることができる。アルファ−ＳＮもしくは他のレビー小体成分に対するモノクローナル抗体に対する抗イディオタイプ抗体もまた用いることができる。そのような抗Ｉｄ抗体は抗原を模倣し、そしてそれに
対して免疫反応を起こす（Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｒｏｉｔ ｅｄ．，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｐａｌｏ
Ａｌｔｏ，ＣＡ 第６版，ｐ．１８１を参照）。アルファ−ＳＮ以外の薬剤は、上記のアルファ−ＳＮの好ましいセグメントの１つもしくはそれ以上に対して免疫原性反応を誘導するはずである（例えばＮＡＣ）。好ましくは、そのような薬剤はアルファ−ＳＮの他のセグメントに向けられずにこれらのセグメントの１つに特異的に向けられる免疫原性反応を誘導する。
ペプチドもしくは他の化合物のランダムライブラリーもまた、適合性についてスクリーニングすることができる。組み合わせライブラリーは、段階的に合成することができる化合物の多数のタイプに対して製造することができる。そのような化合物にはポリペプチド、ベータターン模倣物、多糖、リン脂質、ホルモン、プロスタグランジン、ステロイド、芳香族化合物、複素環式化合物、ベンゾジアゼピン、オリゴマーのＮ−置換されたグリシンおよびオリゴカルバメートが包含される。化合物の大きな組み合わせライブラリーは、Ａｆｆｙｍａｘ，ＷＯ９５／１２６０８，Ａｆｆｙｍａｘ，ＷＯ９３／０６１２１，Ｃｏｌｕｍｂｉａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＷＯ９４／０８０５１，Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ，ＷＯ９５／３５５０３およびＳｃｒｉｐｐｓ，ＷＯ９５／３０６４２（これらの各々は、全ての目的のために引用することにより本明細書に組み込まれる）に記述されるコード化合成ライブラリー（ＥＳＬ）法により構築することができる。ペプチドライブラリーはまた、ファージディスプレイ法により作製することもできる。例えば、Ｄｅｖｌｉｎ，ＷＯ９１／１８９８０を参照。
組み合わせライブラリーおよび他の化合物は、アルファ−ＳＮもしくは他のレビー小体成分に特異的であることが既知である抗体もしくはリンパ球（ＢもしくはＴ）に結合するそれらの能力を決定することにより適合性について最初にスクリーニングされる。例えば、初期スクリーニングは、アルファ−ＳＮもしくはそのフラグメントに対する任意のポリクローナル血清もしくはモノクローナル抗体で行うことができる。ライブラリーは、好ましくは、ヒトアルファシヌクレインの残基１〜２０もしくは７０〜１４０内のエピトープに特異的に結合する抗体に結合する能力についてスクリーニングされる。次に、化合物をアルファ−ＳＮ内の特定のエピトープ（例えば、アルファシヌクレインのＳＮ１〜２０、ＳＮ８３〜１０１、ＳＮ１０７〜１２５、ＳＮ１１０〜１２８、ＳＮ１２４〜１４０、ＳＮ１１８〜１２６およびＳＮ９１〜９９）への特異的結合についてスクリーニングすることができる。化合物は、抗体エピトープ特異性をマッピングするために記載した同じ方法により試験することができる。次に、そのようなスクリーニングにより同定される化合物をアルファ−ＳＮもしくはそのフラグメントに対する抗体もしくは反応性リンパ球を誘導する能力についてさらに分析する。例えば、アルファ−ＳＮもしくはそのフラグメントでプレコーティングされているマイクロタイタープレート上で血清の多数の希釈物を試験することができ、そしてアルファ−ＳＮもしくはフラグメントに対する反応性抗体について試験するために標準的なＥＬＩＳＡを行うことができる。次に、実施例に記載のとおり、レビー小体の存在と関連する疾患にかかりやすいトランスジェニック動物において化合物を予防および治療効能について試験することができる。例えば、そのような動物には、例えばＷＯ９８／５９０５０，Ｍａｓｌｉａｈ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８７：１２６５−１２６９（２０００）およびｖａｎ ｄｅｒ Ｐｕｔｔｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ２０：６０２５−６０２９（２０００）に記述されるようなアルファ−ＳＮもしくはその突然変異体（例えば、位置５３でのアラニン→トレオニン置換）を過剰発現するトランスジェニックマウス、またはＡＰＰもしくはその突然変異体もまた過剰発現するそのようなトランスジェニックマウスが包含される。特に好ましいのは、Ｇａｍｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３７３，５２３（１９９５）により記述されるＡＰＰの７１７突然変異を保有するそのようなシヌクレイントランスジェニックマウスならびにＭｃＣｏｎｌｏｇｕｅ ｅｔ ａｌ．，ＵＳ５，６１２，４８６およびＨ
ｓｉａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４，９９（１９９６）；Ｓｔａｕｆｅｎｂｉｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４，１３２８７−１３２９２（１９９７）；Ｓｔｕｒｃｈｌｅｒ−Ｐｉｅｒｒａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４．１３２８７−１３２９２（１９９７）；Ｂｏｒｃｈｅｌｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ １９，９３９−９４５（１９９７）により記述されるようなＡＰＰの６７０／６７１ Ｓｗｅｄｉｓｈ突然変異を保有するマウスである。そのようなシヌクレイン／ＡＰＰトランスジェニック動物の例は、ＷＯ０１／６０７９４に提供される。ＰＤのさらなる動物モデルには、６−ヒドロキシドーパミン、ロテノンおよび１−メチル−４−フェニル−１，２，３，６−テトラヒドロピリジン（ＭＰＴＰ）動物モデル（Ｍ．Ｆｌｉｎｔ Ｂｅａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ２：３２５−３３４（２００１））が包含される。同じスクリーニング方法は、上記のアルファ−ＳＮの他の潜在的アナログおよびアルファ−ＳＮのフラグメントを含むより長いペプチドならびに他のレビー小体成分およびそのアナログもしくはフラグメントに対して用いることができる。
本明細書に記載のとおり、アルファ−シヌクレインのアミノ末端およびカルボキシ末端領域におけるエピトープを認識する抗体（すなわち、８Ａ５および６Ｈ７）の投与は、ヒトアルファ−シヌクレインを過剰発現するトランスジェニックマウスの脳におけるアルファ−シヌクレイン凝集体を減少させた（例えば、実施例ＩＸを参照）。この発見に一部基づいて、アルファ−シヌクレインの両方の末端のエピトープに対する免疫反応を誘導することは、予防および治療において利点を有すると考えられる。従って、１つの態様において、本発明はヒトアルファ−シヌクレインの残基１〜２０、あるいはまた残基１〜１０内のエピトープおよびヒトアルファ−シヌクレインの残基７０〜１４０内のエピトープに特異的に結合する抗体を含んでなる免疫原性反応を誘導することによる脳におけるレビー小体もしくはアルファ−シヌクレイン凝集を特徴とする疾患の予防もしくは処置の方法を提供する。好ましい態様において、免疫原性反応はヒトアルファ−シヌクレインの残基１〜２０およびヒトアルファ−シヌクレインの残基１２０〜１４０内のエピトープに特異的に結合する抗体を含んでなる。タンパク質の両方の末端領域のエピトープに対する抗体を含んでなる免疫反応は、「二重」免疫反応と呼ぶことができる。二重免疫反応は多数の方法において誘導することができ、そして本発明はそのような反応を開始する任意の特定の方法に限定されない。
二重免疫反応は、ヒトアルファ−シヌクレインの残基１〜２０内のエピトープに特異的に結合する抗体およびヒトアルファ−シヌクレインの残基７０〜１４０内のエピトープに特異的に結合する抗体を含む免疫原性反応を誘導するために有効な単一ポリペプチドでのワクチン接種により誘導することができる。好ましい態様において、抗体はヒトアルファ−シヌクレインの残基１〜１０内のそして／もしくは残基１２０〜１４０内のエピトープに特異的に結合する。ヒトアルファ−シヌクレインの少なくとも残基２５〜６９、ヒトアルファ−シヌクレインの少なくとも残基３０〜１１０もしくはヒトアルファ−シヌクレインの少なくとも残基２１〜１１９を欠くポリペプチドを用いることができる。そのようなポリペプチドを使用する場合、免疫原性反応はヒトアルファ−シヌクレインの残基２５〜６９内のエピトープに特異的に結合する抗体を含まない。
二重免疫反応はまた、２つ（もしくはそれ以上）のポリペプチドを組み合わせたワクチン接種により誘導することもでき、ここで、１つのポリペプチドは、ヒトアルファ−シヌクレインの残基１〜２０内のエピトープに特異的に結合する抗体およびヒトアルファ−シヌクレインの残基７０〜１４０内のエピトープに特異的に結合する抗体を含む免疫原性反応を誘導する。好ましい態様において、抗体はヒトアルファ−シヌクレインの残基１〜１０内のそして／もしくは残基１２０〜１４０内のエピトープに特異的に結合する。従って、処置もしくは予防は、ヒトアルファ−シヌクレインの残基１０〜２０内のエピトープに
特異的に結合する抗体を含んでなる免疫原性反応を誘導するアルファ−シヌクレインの第一の免疫原性フラグメントおよびヒトアルファ−シヌクレインの残基７０〜１４０（もしくは１２０〜１４０）内のエピトープに特異的に結合する抗体を含んでなる免疫原性反応を誘導する第二の免疫原性フラグメントを投与することよりもたらすことができる。ヒトアルファ−シヌクレインのフラグメントは、上記に説明したとおり、組み合わせて投与することができる（例えば、融合タンパク質もしくはコンジュゲートとして、共処方において、または同じ治療過程において投与すること）。
本発明は、アルファ−シヌクレインのいずれかのもしくは両方の末端のエピトープに対する免疫反応を開始するために有用な組成物を提供する。組成物には上記のような２つもしくはそれ以上のポリペプチドを含有する投与形態物および製剤が包含され、ここで、１つのポリペプチドはヒトアルファ−シヌクレインの残基１〜２０内のエピトープに特異的に結合する抗体およびヒトアルファ−シヌクレインの残基７０〜１４０内のエピトープに特異的に結合する抗体を含む免疫原性反応を誘導する。好ましい態様において、ポリペプチドはヒトアルファ−シヌクレインの残基１〜１０内のそして／もしくは残基１２０〜１４０内のエピトープに特異的に結合する抗体を誘導する。典型的な製剤（共処方するポリペプチドに適当な）は当該技術分野において既知であり、そして節ＶＩＩ（「処置処方計画」）において以下に記述するものが包含される。
本発明はまた、アルファ−シヌクレインの両方の末端のエピトープに対する免疫反応を開始するためのキットも提供する。キットは、ヒトアルファ−シヌクレインの残基１〜２０内のエピトープに特異的に結合する抗体およびヒトアルファ−シヌクレインの残基７０〜１４０内のエピトープに特異的に結合する抗体を含む免疫原性反応を誘導する２つもしくはそれ以上の薬剤を含む。薬剤は、同時使用のために単一の製剤において組み合わせることができる。薬剤は、各々同時、逐次もしくは別個使用のために異なるポリペプチドを含有する別個の容器（例えば、バイアル、シリンジ、チューブなど）を占めることができる。本発明のこれらの薬剤は、場合により、レビー小体病の処置において少なくとも部分的に有効な他の薬剤と組み合わせて投与してもよい。キットはまた、血液脳関門を越える本発明の薬剤の通過を増加する薬剤、他のアジュバントおよび患者への投与のための材料を含むこともできる。
２．受動免疫反応のための薬剤
本発明の治療薬にはまた、アルファ−ＳＮもしくはレビー小体の他の成分に特異的に結合する抗体も包含される。本発明はまた、アミロイド斑のシヌクレイン−ＮＡＣ成分に特異的に結合する抗体も提供する。アルファ−ＳＮに免疫反応性の抗体は既知である（例えば、Ａｒｉｍａ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｒｉａｎ Ｒｅｓ．８０９：９３−１００（１９９８）；Ｃｒｏｗｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｅｔｔ．２９２：１２８−１３０（２０００）；Ｓｐｉｌｌａｎｔｉｎｉ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ３８８：８３９−８４０（１９９７）を参照）。そのような抗体は、モノクローナルもしくはポリクローナルであることができる。あるそのような抗体は、可溶性モノマー形態に特異的に結合せずにアルファ−ＳＮの不溶性凝集体に特異的に結合する。あるものは、不溶性凝集形態に結合せずに可溶性モノマー形態に特異的に結合する。あるものは、凝集および可溶性モノマー形態の両方に特異的に結合する。あるそのような抗体は、天然に存在する全長アルファ−ＳＮに結合せずにアルファ−ＳＮの天然に存在する短い形態（例えばＮＡＣ）に特異的に結合する。ある抗体は、短い形態に結合せずに長い形態に特異的に結合する。ある抗体は、ＬＢの他の成分に結合せずにアルファ−ＳＮに特異的に結合する。ある抗体は、アミロイド斑の他の成分に特異的に結合せずにアルファ−ＳＮに特異的に結合する。例えば、米国特許公開ＵＳ２００６０２５９９８６Ａ１およびＰＣＴ特許公開ＷＯ０５／０１３８８９を参照、これらは全ての目的のために引用することにより本明細書に組み込まれ、完全なアルファ−シヌクレイン自体に特異的に結合せずにアルファ−シヌク
レインのフラグメントに特異的に結合する末端特異的抗体を提供する。これらの抗体は、シヌクレイノパチーおよびアミロイド形成疾患の予防および処置の方法において有用である。
本発明の裏付けとして実施される実験において、シヌクレイン−ＮＡＣに特異的に結合する抗体の除去を試験するために予測エクスビボアッセイ（実施例ＶＩＩ）を用いた。アミロイド斑および小グリア細胞を含有する脳組織サンプルとＮＡＣに対する抗体を接触させた。ウサギ血清をコントロールとして用いた。抗体の除去活性を示す斑の数およびサイズの顕著な減少がその後のモニタリングにより示された。
これらのデータから、アルツハイマー病および他のアミロイド疾患と関連するアミロイド斑負荷は、ＮＡＣのエピトープに対する免疫試薬の投与により大幅に減少させることができ、これらはアミロイド斑負荷を減少させるために有効であることが明らかである。そのような組成物において多種多様な抗体を使用できることがさらに理解される。上記に説明したとおり、米国特許公開ＵＳ２００６０２５９９８６Ａ１およびＰＣＴ特許公開ＷＯ０５／０１３８８９は、完全なアルファ−シヌクレイン自体に特異的に結合せずにアルファ−シヌクレインのフラグメントに特異的に結合する末端特異的抗体を提供する。
治療法において使用する抗体は、通常、完全な定常領域もしくはＦｃ受容体と相互作用するために定常領域の少なくとも十分な量を有する。ヒトアイソタイプＩｇＧ１は、食細胞上のＦｃＲＩ受容体に対するヒトアイソタイプの最も高い親和性を有するので好ましい。二重特異性Ｆａｂフラグメントもまた用いることができ、ここで、抗体の一方の腕はアルファ−ＳＮに対する、そしてもう一方はＦｃ受容体に対する特異性を有する。ある抗体は、約１０6、１０7、１０8、１０9もしくは１０10Ｍ-1以上の結合親和性で、ＳＤＳで処理した場合のような場合により変性した形態の、アルファ−ＳＮに結合する。本発明のある抗体は、免疫細胞化学により決定した場合にシナプスもしくはニューロン細胞体におけるヒトアルファシヌクレインに特異的に結合する。
ポリクローナル血清は、典型的に、アルファ−ＳＮの長さに沿ったいくつかのエピトープに結合する抗体の混合集団を含有する。しかしながら、ポリクローナル血清は、ＮＡＣのようなアルファ−ＳＮの特定のセグメントに特異的であることができる。特定のセグメントに特異的なポリクローナル血清は、そのセグメントに特異的に結合する抗体を含有し、そしてアルファ−ＳＮの他のセグメントに特異的に結合する抗体を欠く。モノクローナル抗体は、立体構造もしくは非立体構造エピトープであることができるアルファ−ＳＮ内の特定のエピトープに結合する。非立体構造エピトープは、アルファ−ＳＮがＳＤＳで変性される場合に依然として存在する。抗体の予防および治療効能は、実施例に記載のトランスジェニック動物モデル方法を用いて試験することができる。あるモノクローナル抗体は、ＮＡＣ内のエピトープに結合する。ある方法において、異なるエピトープに対する結合特異性を有する多数のモノクローナル抗体が用いられる。そのような抗体は、逐次もしくは同時に投与することができる。アルファ−ＳＮ以外のレビー小体成分に対する抗体もまた用いることができる。例えば、抗体はニューロフィラメント、ユビキチンもしくはシンフィリンに対してであることができる。治療薬にはまた、アルファ−ＳＮのアナログおよびそのフラグメントに対してもたらされる抗体も包含される。本発明のある治療薬は、全てＤのペプチド、例えば全てＤのアルファ−ＳＮもしくは全てＤのＮＡＣである。
抗体が例えばアルファ−ＳＮ１〜５のような特定の残基内のエピトープに結合するといわれる場合、意味されるのは、抗体が特定の残基（すなわち、この例ではアルファ−ＳＮ１〜５）を含有するポリペプチドに特異的に結合することである。そのような抗体は、アルファ−ＳＮ１〜５内のあらゆる残基と必ずしも接触するとは限らない。アルファ−ＳＮ１〜５内のあらゆる単一アミノ酸置換もしくは欠失もまた、結合親和性に必ずしも有意に
影響を及ぼすとは限らない。抗体のエピトープ特異性は、例えば、異なるメンバーがアルファ−ＳＮの異なる部分配列を提示するファージディスプレイライブラリーを形成することにより、決定することができる。ファージディスプレイライブラリーは、次に、試験下の抗体に特異的に結合するメンバーについて選択される。配列群が単離される。典型的に、そのような群は共通コア配列、および異なるメンバーにおける様々な長さの隣接配列を含有する。抗体への特異的結合を示す最も短いコア配列は、抗体により結合されるエピトープを定義する。抗体はまた、そのエピトープ特異性がすでに決定されている抗体との競合アッセイにおいてエピトープ特異性について試験することもできる。
本発明のある抗体は、ＮＡＣ内のエピトープに特異的に結合する。ある抗体は、シヌクレインの２２キロダルトンのグリコシル化形態、例えばＰ２２−シヌクレイン内のエピトープに特異的に結合する（Ｈ．Ｓｈｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００１ Ｊｕｌ １３：２９３（５５２８）：２２４−５）。
本発明のある抗体は、アルファ−ＳＮのＮ末端のエピトープ（例えば、配列番号：１に従って番号を付けた場合にアルファ−シヌクレインのアミノ酸１〜２０もしくはアミノ酸１〜１０内のエピトープ）に結合する。ある抗体は、エピトープのＮ末端残基が全長アルファ−ＳＮのＮ末端残基であるエピトープに結合する。そのような抗体は、残基１が欠けているアルファシヌクレインの欠失突然変異体に結合しない。あるそのような抗体は、Ｎ末端アミノ酸が異種ポリペプチドに連結される全長アルファシヌクレインに結合しない。本発明のある抗体は、ヒトアルファシヌクレインの残基１〜６９もしくは残基１〜２０内のエピトープに特異的に結合する。ある抗体は、ヒトアルファ−シヌクレインの残基１〜２０内のエピトープに特異的に結合する。ある抗体は、配列番号：１の残基１〜Ｎa（ここで、Ｎaは５〜２０である）；配列番号：１の残基２〜Ｎb（ここで、Ｎbは６〜２１である）；もしくは配列番号：１の残基３〜Ｎc（ここで、Ｎcは７〜２２である）から選択されるヒトアルファ−シヌクレインのセグメントを有するエピトープに特異的に結合する。ある抗体はＳＮ１〜５、ＳＮ１〜６、ＳＮ１〜７、ＳＮ１〜８、ＳＮ１〜９、ＳＮ１〜１０、ＳＮ１〜１１、ＳＮ１〜１２、ＳＮ１〜１３、ＳＮ１〜１４、ＳＮ１〜１５、ＳＮ１〜１６、ＳＮ１〜１７、ＳＮ１〜１８、ＳＮ１〜１９およびＳＮ１〜２０よりなる群から選択されるヒトアルファシヌクレインのセグメント内のエピトープに結合する。
ある抗体は、アルファ−ＳＮのＣ末端のもしくはその近くの（例えば、アミノ酸７０〜１４０、１００〜１４０、１２０〜１４０、１３０〜１４０もしくは１３５〜１４０内の）エピトープに結合する。ある抗体は、エピトープのＣ末端残基が（全長）アルファ−ＳＮのＣ末端残基であるエピトープに結合する。そのような抗体は、残基１４０が欠けているアルファシヌクレインの欠失突然変異体に結合しない。あるそのような抗体は、Ｃ末端アミノ酸が異種ポリペプチドに連結される全長アルファシヌクレインに結合しない。ある方法において、抗体は全長アルファ−ＳＮに結合せずにＮＡＣに特異的に結合する。
本発明のある抗体は、ヒトアルファシヌクレインの残基７０〜１４０もしくは８３〜１４０内のエピトープに特異的に結合する。ある抗体は、ヒトアルファシヌクレインの残基１２０〜１４０内のエピトープに特異的に結合する。ある抗体は８３〜１０１、１０７〜１２５、１１０〜１２８および１２４〜１４０から選択されるヒトアルファ−シヌクレインのセグメントを有するエピトープに特異的に結合する。ある抗体はＳＮ１２４〜１４０、ＳＮ１２５〜１４０、ＳＮ１２６〜１４０、ＳＮ１２７〜１４０、ＳＮ１２８〜１４０、ＳＮ１２９〜１４０、ＳＮ１３０〜１４０、ＳＮ１３１〜１４０、ＳＮ１３２〜１４０、ＳＮ１３３〜１４０、ＳＮ１３４〜１４０、ＳＮ１３５〜１４０、ＳＮ１３６〜１４０、ＳＮ１３７〜１４０、ＳＮ１２４〜１３９、ＳＮ１２５〜１３９、ＳＮ１２６〜１３９、ＳＮ１２７〜１３９、ＳＮ１２８〜１３９、ＳＮ１２４〜１３９、ＳＮ１２５〜１３９、ＳＮ１２６〜１３９、ＳＮ１２７〜１３９、ＳＮ１２８〜１３９、ＳＮ１２９〜１３９
、ＳＮ１３０〜１３９、ＳＮ１３１〜１３９、ＳＮ１３２〜１３９、ＳＮ１３３〜１３９、ＳＮ１３４〜１３９、ＳＮ１３５〜１３９、ＳＮ１３６〜１３９、ＳＮ１３７〜１３９、ＳＮ１２４〜１３８、ＳＮ１２４〜１３８、ＳＮ１２５〜１３８、ＳＮ１２６〜１３８、ＳＮ１２７〜１３８、ＳＮ１２８〜１３８、ＳＮ１２９〜１３８、ＳＮ１３０〜１３８、ＳＮ１３１〜１３８、ＳＮ１３２〜１３８、ＳＮ１３３〜１３８、ＳＮ１３４〜１３８、ＳＮ１３５〜１３８、ＳＮ１３６〜１３８、ＳＮ１２４〜１３７、ＳＮ１２５〜１３７、ＳＮ１２６〜１３７、ＳＮ１２７〜１３７、ＳＮ１２８〜１３７、ＳＮ１２９〜１３７、ＳＮ１３０〜１３７、ＳＮ１３１〜１３７、ＳＮ１３２〜１３７、ＳＮ１３３〜１３７、ＳＮ１３４〜１３７、ＳＮ１３５〜１３７、ＳＮ１２４〜１３６、ＳＮ１２５〜１３６、ＳＮ１２６〜１３６、ＳＮ１２７〜１３６、ＳＮ１２８〜１３６、ＳＮ１２９〜１３６、ＳＮ１３０〜１３６、ＳＮ１３１〜１３６、ＳＮ１３２〜１３６、ＳＮ１３３〜１３６およびＳＮ１３４〜１３６よりなる群から選択されるヒトアルファシヌクレインのセグメント内のエピトープに結合する。
ある抗体は、アルファシヌクレインのアミノ酸９０〜１４０、９８〜１４０、１０８〜１３６、１１０〜１３０もしくは１１８〜１２６から選択されるヒトアルファ−シヌクレインのセグメント内のエピトープに結合する。
ある抗体は、ＳＮ７０〜１１９、８０〜１０９、８８〜１０１もしくは９１〜９９もしくは７０〜９９から選択されるヒトアルファ−シヌクレインのセグメントを有するエピトープに結合する。
Ｃ末端領域エピトープに結合するモノクローナル抗体は、好ましくは、高い親和性、例えば少なくとも１０8、１０9もしくは１０10Ｍ-1でヒトアルファシヌクレインに結合する。
本発明のある抗体は位置１２９（セリン）でリン酸化されたアルファ−ＳＮを特異的に認識し、そして非リン酸化アルファ−ＳＮに特異的に結合しない。ある抗体は、例えばＳＮ１２４〜１３４から選択されるヒトアルファ−シヌクレインのセグメントＳＮ１２０〜１３０内のエピトープに結合する。
アルファ−ＳＮの他の領域に特異的に結合せずにアルファ−ＳＮの好ましいセグメントに特異的に結合するモノクローナルもしくはポリクローナル抗体は、他の領域に結合するモノクローナル抗体もしくは完全なアルファ−ＳＮに対するポリクローナル血清に対して多数の利点を有する。第一に、等しい質量投薬量に関して、好ましいセグメントに特異的に結合する抗体の投薬量はアミロイド斑を除去することにおいて有効な抗体のより高いモル投薬量を含有する。第二に、好ましいセグメントに特異的に結合する抗体は、完全なアルファ−ＳＮに対する除去反応を誘導せずにＬＢに対する除去反応を誘導することができ、それにより副作用の可能性を減らす。
場合により、抗体は上記のようなＬＢ病のトランスジェニック動物において予防もしくは治療活性についてスクリーニングすることができる。場合により、一群の抗体は、変性したヒトアルファシヌクレインもしくはそのフラグメントへの相対的結合に関してプレスクリーニングされる。相対的結合親和性は、免疫ブロットにおけるシグナルの相対強度から概算することができる。平均を上回る相対的結合親和性を有する抗体、もしくは好ましくは試験した最も高い結合親和性を有する抗体は、トランスジェニック動物におけるさらなるスクリーニング用に選択される。免疫細胞化学により組織切片におけるアルファ−シヌクレインの凝集体への結合について抗体を試験するために同様なプレスクリーニングを行うことができる。組織切片は、罹患患者もしくはトランスジェニック動物モデルの脳から得ることができる。
１つの態様において、６Ｈ７と称する抗体、もしくはアルファシヌクレインへの特異的結合に関して６Ｈ７と競合する抗体を受動免疫に使用する。１つの態様において、８Ａ５と称する抗体、もしくはアルファシヌクレインへの特異的結合に関して８Ａ５と競合する抗体を受動免疫に使用する。１つの態様において、９Ｅ４と称する抗体、もしくはアルファシヌクレインへの特異的結合に関して９Ｅ４と競合する抗体を受動免疫に使用する。１つの態様において、１Ｈ７と称する抗体、もしくはアルファシヌクレインへの特異的結合に関して１Ｈ７と競合する抗体を受動免疫に使用する。１つの態様において、１１Ａ５と称する抗体、もしくはアルファシヌクレインへの特異的結合に関して１１Ａ５と競合する抗体を受動免疫に使用する。ある態様において、上記の抗体は相互にもしくは他の抗アルファシヌクレイン抗体と組み合わせて用いられる。
本明細書に記載のとおり、アルファ−シヌクレインのアミノ末端およびカルボキシ末端領域におけるエピトープを認識する抗体（すなわち、８Ａ５および６Ｈ７）の投与は、ヒトアルファ−シヌクレインを過剰発現するトランスジェニックマウスの脳におけるアルファ−シヌクレイン凝集体を減少させた（例えば、実施例ＩＸを参照）。この発見に一部基づいて、Ｎ末端エピトープを認識する抗体（例えば、上記のとおり）およびＣ末端エピトープを認識する抗体（例えば、上記のとおり）の組み合わせた投与は、予防および治療において特に有効であると考えられる。従って、１つの態様において、本発明は、ヒトアルファ−シヌクレインの残基１〜２０内のエピトープに特異的に結合する第一の抗体（残基は配列番号：１に従って番号が付けられている）およびヒトアルファ−シヌクレインの残基７０〜１４０内のエピトープに特異的に結合する第二の抗体の有効な処方計画を疾患にかかっているかもしくはその危険性がある患者に組み合わせて施すことによる脳におけるレビー小体もしくはアルファ−シヌクレイン凝集を特徴とする疾患の予防もしくは処置の方法を提供する。好ましくは、第一の抗体は配列番号：１の残基１〜Ｎa（ここで、Ｎaは５〜２０である）の配列内の；配列番号：１の残基２〜Ｎb（ここで、Ｎbは６〜２１である）の配列内の；そして／もしくは配列番号：１の残基３〜Ｎc（ここで、Ｎcは７〜２２である）の配列内のアルファ−シヌクレインのエピトープに結合する。好ましくは、第二の抗体はヒトアルファ−シヌクレインの残基１２０〜１４０内のエピトープに特異的に結合する。第一および第二の抗体は、同時に（例えば、共処方される）、同じ日に、同じ月にそして／もしくは同じ治療過程の一部として投与することができる。
本発明は、アルファ−シヌクレインの末端領域で結合する、例えば上記の特異性を有する１つもしくはそれ以上の抗体を含んでなる脳におけるレビー小体もしくはアルファ−シヌクレイン凝集を特徴とする疾患の予防もしくは処置のための組成物を提供する。組成物には、２つもしくはそれ以上の抗体を含有する投与形態物および製剤が包含される。典型的な製剤（共処方する抗体に適当な）は当該技術分野において既知であり、そして節ＶＩＩ（「処置処方計画」）において以下に記述されるものが包含される。
本発明はまた、脳におけるレビー小体もしくはアルファ−シヌクレイン凝集を特徴とする疾患の予防もしくは処置のためのキットも提供する。キットは２つ（もしくはそれ以上の）抗体を含み、ここで、第一の抗体はヒトアルファ−シヌクレインのＮ末端のエピトープに結合し、そして第二の抗体はヒトアルファ−シヌクレインのＣ末端のエピトープに結合する。抗体は、同時使用のために単一の製剤もしくはキットにおいて組み合わせることができる。あるいはまた、抗体は同時、逐次もしくは別個使用のためにキットにおいて別個の容器（例えば、バイアル、シリンジ、チューブなど）を占めることができる。これらの抗体は、場合により、レビー小体病の処置において少なくとも部分的に有効な他の薬剤と組み合わせて投与してもよい。キットはまた、血液脳関門を越える本発明の抗体の通過を増加する薬剤、他のアジュバントおよび患者への投与のための材料を含むこともできる。
ｉ．免疫グロブリンの一般的特徴
基本抗体構造単位は、サブユニットのテトラマーを含んでなることが既知である。各テトラマーはポリペプチド鎖の２つの同一対からなり、各対は１本の「軽」鎖（約２５ｋＤａ）および１本の「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分は、主に抗原認識に関与する約１００〜１１０個もしくはそれ以上のアミノ酸の可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、主にエフェクター機能に関与する定常領域を定義する。
軽鎖はカッパもしくはラムダのいずれかとして分類される。重鎖はガンマ、ミュー、アルファ、デルタもしくはイプシロンとして分類され、そして抗体のアイソタイプをそれぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥとして定義する。軽鎖および重鎖内で、可変および定常領域は約１２個もしくはそれ以上のアミノ酸の「Ｊ」領域により連結され、重鎖はまた約１０個もしくはそれ以上のアミノ酸の「Ｄ」領域も含む（一般には、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｐａｕｌ，Ｗ．，ｅｄ．，第２版，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．，１９８９，Ｃｈ．７（全ての目的のためにその全部が引用することにより組み込まれる）を参照）。
各軽／重鎖対の可変領域は、抗体結合部位を形成する。従って、完全な抗体は２つの結合部位を有する。二機能性もしくは二重特異性抗体を除いて、２つの結合部位は同じである。鎖は全て、相補性決定領域もしくはＣＤＲとも呼ばれる、３つの超可変領域により連結される比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）の同じ一般構造を示す。各対の２本の鎖からのＣＤＲはフレームワーク領域によって整列され、特定のエピトープへの結合を可能にする。Ｎ末端からＣ末端へ、軽鎖および重鎖は両方ともドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４を含んでなる。各ドメインへのアミノ酸の指定は、Ｋａｂａｔ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９８７および１９９１）；Ｃｈｏｔｈｉａ ＆ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）；もしくはＣｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７８−８８３（１９８９）の定義に従う。
ｉｉ．非ヒト抗体の製造
キメラおよびヒト化抗体は、キメラもしくはヒト化抗体の構築のための出発材料を提供するマウスもしくは他の非ヒト抗体と同じもしくは同様の結合特異性および親和性を有する。非ヒト抗体は、ヒトフレームワークおよび定常領域上に非ヒトＣＤＲを移植することにより、もしくは全非ヒト可変ドメインを取り込むこと（場合により、露出残基の置換によりそれらをヒト様表面で「覆い隠すこと」、ここで、結果は「ベニヤ」抗体である）によりヒト化することができる。Ｇｏｎｚａｌｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｎｉｍｉｚｉｎｇ
ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｔｕｍｏｕｒ Ｂｉｏｌ．２６（１）：３１−４３（２００５）を参照。キメラ抗体は、異なる種に属する免疫グロブリン遺伝子セグメントから、典型的には遺伝子工学により、その軽鎖および重鎖遺伝子が構築されている抗体である。例えば、マウスモノクローナル抗体からの遺伝子の可変（Ｖ）セグメントをＩｇＧ１およびＩｇＧ４のようなヒト定常（Ｃ）セグメントに連結することができる。ヒトアイソタイプＩｇＧ１が好ましい。ある方法において、抗体のアイソタイプはヒトＩｇＧ１である。ＩｇＭ抗体もまた、ある方法において用いることができる。従って、典型的なキメラ抗体はマウス抗体からのＶもしくは抗原結合ドメインおよびヒト抗体からのＣもしくはエフェクタードメインからなるハイブリッドタンパク質である。
ヒト化抗体は、実質的にヒト抗体（アクセプター抗体と呼ばれる）からの可変領域フレームワーク残基および実質的にマウス抗体（ドナー免疫グロブリンと呼ばれる）からの相補性決定領域を有する。Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１００２９−１００３３（１９８９）、ＷＯ９０／０７８６１、ＵＳ５，６９３，７６２、ＵＳ５，６９３，７６１、ＵＳ５，５８５，０８９、ＵＳ５，５３０，１０１およびＷｉｎｔｅｒ，ＵＳ５，２２５，５３９（これらの各々は、全ての目的のためにその全部が引用することにより組み込まれる）を参照。定常領域（１つもしくは複数）もまた、存在する場合、実質的にもしくは完全にヒト免疫グロブリンからである。ヒト可変ドメインは、通常、ＣＤＲが由来するマウス可変領域ドメインと高度の配列同一性をそのフレームワーク領域が示すヒト抗体から選択される。重鎖および軽鎖可変領域フレームワーク残基は、同じもしくは異なるヒト抗体配列由来であることができる。ヒト抗体配列は天然に存在するヒト抗体の配列であることができ、もしくはいくつかのヒト抗体の共通配列であることができる。Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＷＯ９２／２２６５３を参照。ヒト可変領域フレームワーク残基からのあるアミノ酸は、ＣＤＲ構造および／もしくは抗原への結合へのそれらの可能な影響に基づいて置換に選択される。そのような可能な影響の研究は、モデリング、特定の位置でのアミノ酸の特性の試験、または特定のアミノ酸の置換もしくは突然変異誘発の効果の実験的観察によってである。
例えば、アミノ酸がマウス可変領域フレームワーク残基と選択したヒト可変領域フレームワーク残基間で異なる場合、アミノ酸が：
（１）直接抗原に非共有結合する、
（２）ＣＤＲ領域に隣接する、
（３）そうでなければＣＤＲ領域と相互作用する（例えば、ＣＤＲ領域の約６Ａ以内である）、もしくは
（４）ＶＬ−ＶＨ界面に関与する
ことが合理的に予想されるならばヒトフレームワークアミノ酸はマウス抗体からの同等なフレームワークアミノ酸により通常は置換されるべきである。
置換の他の候補は、その位置でヒト免疫グロブリンには稀なアクセプターヒトフレームワークアミノ酸である。これらのアミノ酸は、マウスドナー抗体の同等な位置からのもしくはより典型的なヒト免疫グロブリンの同等な位置からのアミノ酸で置換することができる。置換の他の候補は、その位置でヒト免疫グロブリンには稀なアクセプターヒトフレームワークアミノ酸である。ヒト化した免疫グロブリンの可変領域フレームワークは、通常、ヒト可変領域フレームワーク配列もしくはそのような配列のコンセンサスに少なくとも８５％の配列同一性を示す。
あるヒト化抗体は、マウスモノクローナル抗体ｍＡｂ ６Ｈ７由来の相補性決定領域（ＣＤＲ）配列を含んでなる。抗体６Ｈ７を産生するＪＨ１７．６Ｈ７．１．５４．２８と指定される細胞系は、２００５年８月４日にＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ，Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ １５４９，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１０８）でブダペスト条約の規定に基づいて寄託されているＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６９１０を有する。
あるヒト化抗体は、マウスモノクローナル抗体ｍＡｂ ８Ａ５由来の相補性決定領域（ＣＤＲ）配列を含んでなる。抗体８Ａ５を産生するＪＨ４．８Ａ５．２５．７．３６と指定される細胞系は、２００５年８月４日に寄託されているＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６９０９を有する。
あるヒト化抗体は、マウスモノクローナル抗体ｍＡｂ ９Ｅ４由来の相補性決定領域（ＣＤＲ）配列を含んでなる。抗体９Ｅ４を産生するＪＨ１７．９Ｅ４．３．３７．１．１
４．２と指定される細胞系は、２００７年２月２６日にＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ，Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ １５４９，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１０８）でブダペスト条約の規定に基づいて寄託されているＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８２２１を有する。
あるヒト化抗体は、マウスモノクローナル抗体ｍＡｂ １１Ａ５由来の相補性決定領域（ＣＤＲ）配列を含んでなる。抗体１１Ａ５を産生するＪＨ２２．１１Ａ５．６．２９．７０．５４．１６．１４と指定される細胞系は、２００７年２月２６日にＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ，Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ １５４９，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１０８）でブダペスト条約の規定に基づいて寄託されているＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８２２２を有する。
あるヒト化抗体は、マウスモノクローナル抗体ｍＡｂ １Ｈ７由来の相補性決定領域（ＣＤＲ）配列を含んでなる。抗体１Ｈ７を産生するＪＨ１７．１Ｈ７．４．２４．３４と指定される細胞系は、２００７年２月２６日にＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ，Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ １５４９，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１０８）でブダペスト条約の規定に基づいて寄託されているＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８２２０を有する。
上記のとおり、抗体を発現する細胞系（例えば、ハイブリドーマ）を用いてキメラおよびヒト化抗体を製造するために多数の方法が既知である。例えば、周知の方法を用いてマウス８Ａ５および／もしくは６Ｈ７および／もしくは９Ｅ４抗体の免疫グロブリン可変領域をクローン化しそして配列決定することができる。同様に、周知の方法を用いてマウス１Ｈ７もしくは１１Ａ５抗体の免疫グロブリン可変領域をクローン化しそして配列決定することができる。例示のためにそして限定ではなく、１つの方法において、ハイブリドーマ細胞から調製したｍＲＮＡを用いてＲＴ−ＰＣＲにより重鎖可変ＶＨ領域をクローン化する。５’プライマーとして翻訳開始コドンを含むＶＨ領域リーダーペプチドおよびｇ２ｂ定常領域特異的３’プライマーに共通プライマーを用いる。典型的なプライマーは、Ｓｃｈｅｎｋ ｅｔ ａｌ．（以下、「Ｓｃｈｅｎｋ」）により米国特許公開ＵＳ２００５／０００９１５０に記述される。増幅中に変異が導入されないことを保証するために多数の、独立して得られるクローンからの配列を比較することができる。５’ＲＡＣＥ ＲＴ−ＰＣＲ方法論および３’ｇ２ｂ特異的プライマーにより得られるＶＨフラグメントを配列決定することによりＶＨ領域の配列もまた決定するかもしくは確認することができる。
８Ａ５、６Ｈ７、９Ｅ４、１Ｈ７もしくは１１Ａ５の軽鎖可変ＶＬ領域をＶＨ領域と同様にしてクローン化することができる。１つの方法において、マウスＶＬ領域の増幅のために設計される共通プライマー組は、翻訳開始コドンを含むＶＬ領域にハイブリダイズするように、そしてＶ−Ｊ連結領域の下流のマウスＣｋ領域に特異的な３’プライマーが設計される。第二の方法において、ＶＬをコードするｃＤＮＡをクローン化するために５’ＲＡＣＥ ＲＴ−ＰＣＲ方法論が用いられる。典型的なプライマーは、Ｓｃｈｅｎｋに記述される。次に、クローン化した配列をヒト定常領域をコードする配列と組み合わせる。
１つの方法において、重鎖および軽鎖可変領域をそれぞれのＶＤＪもしくはＶＪ連結部の下流のスプライスドナー配列をコードするように設計し直し、そして重鎖はｐＣＭＶ−ｈγ１そして軽鎖はｐＣＭＶ−ｈκ１のような哺乳類発現ベクターにクローン化する。これらのベクターは、挿入した可変領域カセットの下流のエキソンフラグメントとしてヒトγ１およびＣｋ定常領域をコードする。配列確認の後、重鎖および軽鎖発現ベクターは、キメラ抗体を製造するためにＣＯＳ細胞に共トランスフェクションすることができる。トランスフェクション後４８時間でならし培地を集め、そして抗体生産についてはウェスタンブロット分析もしくは抗原結合についてはＥＬＩＳＡによりアッセイする。キメラ抗体
は、上記のとおりヒト化される。
ｉｉｉ．ヒト抗体
アルファ−ＳＮに対するヒト抗体は、以下に記述する様々な技術により提供される。あるヒト抗体は競合的結合実験により、もしくはそうでなければ、実施例ＩＸおよびＸに記述されるマウスモノクローナル抗体の１つのような特定のマウス抗体と同じエピトープ特異性を有するように選択される。ヒト抗体はまた、免疫原としてアルファ−ＳＮのフラグメントのみを用いることにより、そして／もしくはアルファ−ＳＮの欠失突然変異体の一群に対して抗体をスクリーニングすることにより特定のエピトープ特異性に関してスクリーニングすることもできる。ヒト抗体は、好ましくはアイソタイプ特異性ヒトＩｇＧ１を有する。
（１）トリオーマ方法論
基本的方法およびこの方法において使用する典型的な細胞融合相手、ＳＰＡＺ−４は、Ｏｅｓｔｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ２：３６１−３６７（１９８３）；Ｏｅｓｔｂｅｒｇ，米国特許第４，６３４，６６４号；およびＥｎｇｌｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．，米国特許４，６３４，６６６（これらの各々は、全ての目的のためにその全部が引用することにより組み込まれる）により記述されている。この方法により得られる抗体産生細胞系は、２つはヒトそして１つはマウスの３つの細胞に由来するのでトリオーマと呼ばれる。最初に、マウス骨髄腫系をヒトＢリンパ球と融合させてＯｅｓｔｂｅｒｇ，上記により記述されるＳＰＡＺ−４細胞系のような非抗体産生異種ハイブリッド細胞を得る。次に、免疫したヒトＢリンパ球と異種細胞を融合させて抗体産生トリオーマ細胞系を得る。トリオーマは、ヒト細胞から作られる通常のハイブリドーマより安定に抗体を産生することが見出されている。
免疫したＢリンパ球は、ヒトドナーの血液、脾臓、リンパ節もしくは骨髄から得られる。特定の抗原もしくはエピトープに対する抗体が所望される場合、免疫にその抗原もしくはそのエピトープを使用することが好ましい。免疫は、インビボもしくはインビトロのいずれかであることができる。インビボ免疫では、Ｂ細胞は典型的にアルファ−ＳＮ、そのフラグメント、アルファ−ＳＮもしくはフラグメントを含有するより大きいポリペプチド、またはアルファ−ＳＮに対する抗体に対する抗イディオタイプ抗体で免疫したヒトから単離される。ある方法において、Ｂ細胞は最終的に抗体治療が施される同じ患者から単離される。インビトロ免疫では、Ｂリンパ球は典型的に１０％ヒト血漿を補足したＲＰＭＩ−１６４０（Ｅｎｇｌｅｍａｎ，上記を参照）のような培地において７〜１４日の期間にわたって抗原にさらされる。
免疫したＢリンパ球を周知の方法によりＳＰＡＺ−４のような異種ハイブリッド細胞に融合させる。例えば、細胞をＭＷ１０００〜４０００の４０〜５０％ポリエチレングリコールで約３７℃で約５〜１０分間処理する。細胞を融合混合物から分離し、そして所望のハイブリッドに選択的な培地（例えば、ＨＡＴもしくはＡＨ）において増殖させる。必要とされる結合特異性を有する抗体を分泌するクローンは、アルファ−ＳＮもしくはそのフラグメントに結合する能力に関してトリオーマ培養培地をアッセイすることにより同定される。所望の特異性を有するヒト抗体を産生するトリオーマは限界希釈技術によりサブクローン化され、そして培養培地においてインビトロで培養される。次に、得られるトリオーマ細胞系は、アルファ−ＳＮもしくはそのフラグメントに結合する能力について試験される。
トリオーマは遺伝的に安定であるが、それらはあまり高いレベルで抗体を産生しない。発現レベルは、トリオーマからの抗体遺伝子を１つもしくはそれ以上の発現ベクターにクローン化し、そして標準的な哺乳類、細菌もしくは酵母細胞系にベクターを形質転換する
ことにより増加することができる。
（２）トランスジェニック非ヒト哺乳類
アルファ−ＳＮに対するヒト抗体はまた、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の少なくともセグメントをコードする導入遺伝子を有する非ヒトトランスジェニック哺乳類から製造することもできる。通常、そのようなトランスジェニック哺乳類の内因性免疫グロブリン遺伝子座は機能的に不活性化される。好ましくは、ヒト免疫グロブリン遺伝子座のセグメントは、重鎖および軽鎖成分の再構成していない配列を含む。内因性免疫グロブリン遺伝子の不活性化および外来免疫グロブリン遺伝子の導入の両方は、標的化相同的組換えにより、もしくはＹＡＣ染色体の導入により成し遂げることができる。この方法に由来するトランスジェニック哺乳類は、免疫グロブリン成分配列を機能的に再構成すること、および内因性免疫グロブリン遺伝子を発現せずに、ヒト免疫グロブリン遺伝子によりコードされる様々なアイソタイプの抗体のレパートリーを発現することができる。これらの特性を有する哺乳類の製造および特性は、例えば、Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，ＷＯ９３／１２２２、ＵＳ５，８７７，３９７、ＵＳ５，８７４，２９９、ＵＳ５，８１４，３１８、ＵＳ５，７８９，６５０、ＵＳ５，７７０，４２９、ＵＳ５，６６１，０１６、ＵＳ５，６３３，４２５、ＵＳ５，６２５，１２６、ＵＳ５，５６９，８２５、ＵＳ５，５４５，８０６、Ｎａｔｕｒｅ １４８，１５４７−１５５３（１９９４），Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４，８２６（１９９６），Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ，ＷＯ９１／１０７４１（これらの各々は、全ての目的のためにその全部が引用することにより組み込まれる）により詳細に記述される。トランスジェニックマウスは、特に適当である。抗アルファ−ＳＮ抗体は、アルファ−ＳＮもしくはそのフラグメントで、ＬｏｎｂｅｒｇもしくはＫｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ，上記により記述されるようなトランスジェニック非ヒト哺乳類を免疫することにより得られる。モノクローナル抗体は、例えば、通常のＫｏｈｌｅｒ−Ｍｉｌｓｔｅｉｎ技術を用いて適当な骨髄腫細胞系にそのような哺乳類からのＢ細胞を融合させることにより製造される。ヒトポリクローナル抗体もまた、免疫原性薬剤で免疫したヒトからの血清の形態で提供されることができる。場合により、そのようなポリクローナル抗体は、親和性試薬としてアルファ−ＳＮもしくは他のアミロイドペプチドを用いて親和性精製により濃縮することができる。
（３）ファージディスプレイ法
ヒト抗アルファ−ＳＮ抗体を得るためのさらなる方法は、Ｈｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５−１２８１（１９８９）により概説される一般的なプロトコルに従ってヒトＢ細胞からのＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることである。トリオーマ方法論に記述したように、そのようなＢ細胞はアルファ−ＳＮ、フラグメント、アルファ−ＳＮもしくはフラグメントを含有するより長いポリペプチドまたは抗イディオタイプ抗体で免疫したヒトから得ることができる。場合により、そのようなＢ細胞は最終的に抗体処置を受ける患者から得られる。アルファ−ＳＮもしくはそのフラグメントに結合する抗体が選択される。次に、そのような抗体（もしくは結合フラグメント）をコードする配列をクローン化し、そして増幅する。Ｈｕｓｅにより記述されるプロトコルは、ファージディスプレイ技術と組み合わせてさらに効率よくされる。例えば、Ｄｏｗｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＷＯ９１／１７２７１およびＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，ＷＯ９２／０１０４７、ＵＳ５，８７７，２１８、ＵＳ５，８７１，９０７、ＵＳ５，８５８，６５７、ＵＳ５，８３７，２４２、ＵＳ５，７３３，７４３およびＵＳ５，５６５，３３２（これらの各々は、全ての目的のためにその全部が引用することにより組み込まれる）を参照。これらの方法において、メンバーがそれらの外側表面上に異なる抗体を提示するファージのライブラリーが製造される。抗体は、通常、ＦｖもしくはＦａｂフラグメントとして提示される。所望の特異性を有する抗体を提示するファージは、アルファ−ＳＮペプチドもしくはそのフラグメントに対する親和性濃縮により選択される。
ファージディスプレイ法のバリエーションにおいて、選択したマウス抗体の結合特異性を有するヒト抗体を製造することができる。Ｗｉｎｔｅｒ，ＷＯ９２／２０７９１を参照。この方法において、選択したマウス抗体の重鎖もしくは軽鎖可変領域のいずれかを出発材料として用いる。例えば、軽鎖可変領域が出発材料として選択される場合、メンバーが同じ軽鎖可変領域（すなわち、マウス出発材料）および異なる重鎖可変領域を提示するファージライブラリーが構築される。重鎖可変領域は、再構成したヒト重鎖可変領域のライブラリーから得られる。アルファ−ＳＮに対する強い特異的結合（例えば、少なくとも１０8そして好ましくは少なくとも１０9Ｍ-1）を示すファージが選択される。次に、このファージからのヒト重鎖可変領域はさらなるファージライブラリーを構築するための出発材料として働く。このライブラリーにおいて、各ファージは同じ重鎖可変領域（すなわち、最初のディスプレイライブラリーから同定される領域）および異なる軽鎖可変領域を提示する。軽鎖可変領域は、再構成したヒト可変軽鎖領域のライブラリーから得られる。再び、アルファ−ＳＮに対する強い特異的結合を示すファージが選択される。これらのファージは、完全にヒトの抗アルファ−ＳＮ抗体の可変領域を提示する。これらの抗体は、通常、マウス出発材料と同じもしくは同様のエピトープ特異性を有する。
ｉｖ．定常領域の選択
キメラ、ヒト化もしくはヒト抗体の重鎖および軽鎖可変領域は、ヒト定常領域の少なくとも一部に連結することができる。定常領域の選択は、１つには、抗体依存性補体および／もしくは細胞媒介性毒性が所望されるかどうかにより決まる。例えば、アイソタイプＩｇＧ１およびＩｇＧ３は補体活性を有し、そしてアイソタイプＩｇＧ２およびＩｇＧ４はそうでない。アイソタイプの選択はまた、脳への抗体の通過に影響を及ぼすこともできる。ヒトアイソタイプＩｇＧ１が好ましい。軽鎖定常領域は、ラムダもしくはカッパであることができる。抗体は、２本の軽鎖および２本の重鎖を含有するテトラマーとして、別個の重鎖、軽鎖として、Ｆａｂ、Ｆａｂ’Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖとして、もしくは重鎖および軽鎖可変ドメインがスペーサーを介して連結される一本鎖抗体として発現することができる。
ｖ．組換え抗体の発現
キメラ、ヒト化およびヒト抗体は、典型的に、組換え発現により製造される。組換えポリヌクレオチド構築物は、典型的に、生来結合しているかもしくは異種のプロモーター領域を包含する、抗体鎖のコーディング配列に操作可能に連結された発現制御配列を含む。好ましくは、発現制御配列は真核生物宿主細胞を形質転換するかもしくはトランスフェクションすることができるベクターにおける真核生物プロモーター系である。いったんベクターが適切な宿主に導入されると、宿主はヌクレオチド配列の高レベル発現ならびに交差反応抗体の収集および精製に適当な条件下で維持される。
これらの発現ベクターは、典型的に、エピソームとしてもしくは宿主染色体ＤＮＡの不可分の部分として宿主生物において複製可能である。一般に、発現ベクターは所望のＤＮＡ配列で形質転換された細胞の検出を可能にするために選択マーカー、例えばアンピシリン耐性もしくはハイグロマイシン耐性を含有する。
エシェリキア・コリは、本発明のＤＮＡ配列をクローン化するために特に有用な１つの原核生物宿主である。酵母のような微生物もまた、発現に有用である。サッカロミセスは、所望に応じて発現制御配列、複製起点、終結配列などを有する適当なベクターと共に、好ましい酵母宿主である。典型的なプロモーターには、３−ホスホグリセリン酸キナーゼおよび他の糖分解酵素が包含される。誘導性酵母プロモーターには、とりわけ、アルコールデヒドロゲナーゼ、イソシトクロムＣ、ならびにマルトースおよびガラクトース利用に関与する酵素からのプロモーターが包含される。
哺乳類細胞は、免疫グロブリンもしくはそのフラグメントをコードするヌクレオチドセグメントを発現するための好ましい宿主である。Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ，Ｆｒｏｍ Ｇｅｎｅｓ ｔｏ Ｃｌｏｎｅｓ，（ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，ＮＹ，１９８７）を参照。完全な異種タンパク質を分泌することができる多数の適当な宿主細胞系が当該技術分野において開発されており、そしてＣＨＯ細胞系、様々なＣＯＳ細胞系、ＨｅＬａ細胞、Ｌ細胞、ヒト胎児腎臓細胞および骨髄腫細胞系が包含される。好ましくは、細胞は非ヒトである。これらの細胞の発現ベクターは、複製起点、プロモーター、エンハンサー（Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．８９：４９（１９８６））および必要なプロセシング情報部位、例えばリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位および転写ターミネーター配列のような発現制御配列を含むことができる。好ましい発現制御配列は、内因性遺伝子、サイトメガロウイルス、ＳＶ４０、アデノウイルス、ウシパピローマウイルスなど由来のプロモーターである。Ｃｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１１４９（１９９２）を参照。
あるいはまた、抗体をコードする配列は、トランスジェニック動物のゲノムへの導入およびトランスジェニック動物の乳におけるその後の発現のために導入遺伝子に導入することができる（例えば、ＵＳ５，７４１，９５７、ＵＳ５，３０４，４８９、ＵＳ５，８４９，９９２を参照）。適当な導入遺伝子には、カゼインもしくはベータラクトグロブリンのような乳腺特異的遺伝子からのプロモーターおよびエンハンサーと操作可能に連結された軽鎖および／もしくは重鎖のコーディング配列が包含される。
興味のあるＤＮＡセグメントを含有するベクターは、細胞宿主のタイプにより、周知の方法により宿主細胞に導入することができる。例えば、塩化カルシウムトランスフェクションは原核細胞に一般に利用され、一方、リン酸カルシウム処理、電気穿孔、リポフェクション、バイオリスティクスもしくはウイルスに基づくトランスフェクションは他の細胞宿主に用いることができる。哺乳類細胞を形質転換するために用いられる他の方法には、ポリブレンの使用、プロトプラスト融合、リポソーム、電気穿孔および微量注入が包含される（一般には、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，上記を参照）。トランスジェニック動物の製造のために、導入遺伝子を受精卵母細胞に微量注入することができ、もしくは胚幹細胞のゲノムに導入し、そしてそのような細胞の核を除核卵母細胞に導入することができる。
いったん発現されると、ＨＰＬＣ精製、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動などを包含する当該技術分野の標準的な方法に従って抗体を精製することができる（一般には、Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，ＮＹ，１９８２）を参照）。
３．コンジュゲート
免疫反応を誘導するためのある薬剤は、ＬＢに対して免疫反応を誘導するための適切なエピトープを含有するが、免疫原性であるには小さすぎる。この場合、ペプチド免疫原を適当な担体分子に連結して免疫反応を引き起こすのを助けるコンジュゲートを形成することができる。適当な担体には血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン、免疫グロブリン分子、サイログロブリン、オボアルブミン、破傷風トキソイド、またはジフテリア、エシェリキア・コリ、コレラもしくはヘリコバクター・ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）のような他の病原性細菌からのトキソイド、または弱毒化した毒素誘導体が包含される。Ｔ細胞エピトープもまた、適当な担体分子である。あるコンジュゲートは、本発明の薬剤を免疫刺激ポリマー分子（例えば、トリパルミトイル−Ｓ−グリセリンシステイン（Ｐａｍ3Ｃｙｓ））、マンナン（マンノースポリマー）もしくはグルカン（ベータ１→２ポリマー）、サイトカイン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−１アルファおよびベータペプチド、ＩＬ−２、ガンマ−ＩＮＦ、ＩＬ−１０、ＧＭ−ＣＳＦ）およびケモカイン（例えば、Ｍ
ＩＰ１アルファおよびベータ、ならびにＲＡＮＴＥＳ）に連結することにより形成することができる。免疫原性薬剤はまた、Ｏ’Ｍａｈｏｎｙ、ＷＯ９７／１７６１３およびＷＯ９７／１７６１４に記述されるように、組織を越えた輸送を高めるペプチドに連結することもできる。免疫原は、スペーサーアミノ酸（例えば、ｇｌｙ−ｇｌｙ）と共にもしくはそれなしに担体に連結することができる。
あるコンジュゲートは、少なくとも１つのＴ細胞エピトープに本発明の薬剤を連結することにより形成することができる。あるＴ細胞エピトープは無差別（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ）であり、一方、あるＴ細胞エピトープは普遍的である。無差別Ｔ細胞エピトープは、様々なＨＬＡタイプを提示する多種多様な患者においてＴ細胞免疫の誘導を高めることができる。無差別Ｔ細胞エピトープと対照的に、普遍的Ｔ細胞エピトープは、異なるＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子によりコードされる様々なＨＬＡ分子を提示する患者の大部分、例えば少なくとも７５％においてＴ細胞免疫の誘導を高めることができる。
破傷風トキソイド（例えば、ｐ２およびＰ３０エピトープ）、Ｂ型肝炎表面抗原、百日咳トキソイド、麻疹ウイルスＦタンパク質、クラミジア・トラコミティス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍｉｔｉｓ）主要外膜タンパク質、ジフテリアトキソイド、プラスモジウム・ファルシパルム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）サーカムスポロゾイト（ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｉｔｅ）Ｔ、プラスモジウム・ファルシパルムＣＳ抗原、シストソーマ・マンソニ（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｍａｎｓｏｎｉ）トリオースリン酸イソメラーゼ、エシェリキア・コリＴｒａＴおよびインフルエンザウイルス血球凝集素（ＨＡ）のような、多数の天然に存在するＴ細胞エピトープがある。本発明の免疫原性ペプチドはまた、Ｓｉｎｉｇａｇｌｉａ Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３６：７７８−７８０（１９８８）；Ｃｈｉｃｚ Ｒ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７８：２７−４１（１９９３）；Ｈａｍｍｅｒ Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ７４：１９７−２０３（１９９３）；Ｆａｌｋ Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，３９：２３０−２４２（１９９４）；ＷＯ９８／２３６３５；およびＳｏｕｔｈｗｏｏｄ Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１６０：３３６３−３３７３（１９９８）（これらの各々は、全ての目的のために引用することにより本明細書に組み込まれる）に記述されるＴ細胞エピトープに連結することもできる。さらなる例には：
インフルエンザ血球凝集素：ＨＡ307-319ＰＫＹＶＫＱＮＴＬＫＬＡＴ（配列番号：４）
マラリアＣＳ：Ｔ３エピトープＥＫＫＩＡＫＭＥＫＡＳＳＶＦＮＶ（配列番号：５）
Ｂ型肝炎表面抗原：ＨＢｓＡｇ19-28ＦＦＬＬＴＲＩＬＴＩ（配列番号：６）
熱ショックタンパク質６５：ｈｓｐ６５153-171ＤＱＳＩＧＤＬＩＡＥＡＭＤＫＶＧＮＥＧ（配列番号：７）
カルメット・ゲラン桿菌 ＱＶＨＦＱＰＬＰＰＡＶＶＫＬ（配列番号：８）
破傷風トキソイド：ＴＴ830-844ＱＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩＴＥＬ（配列番号：９）
破傷風トキソイド：ＴＴ947-967ＦＮＮＦＴＶＳＦＷＬＲＶＰＫＶＳＡＳＨＬＥ（配列番号：１０）
ＨＩＶ ｇｐ１２０Ｔ１：ＫＱＩＩＮＭＷＱＥＶＧＫＡＭＹＡ（配列番号：１１）
が包含される。
あるいはまた、コンジュゲートは、汎ＤＲエピトープ（「ＰＡＤＲＥ」）のような、ＭＨＣクラスＩＩ分子の大部分に結合することができる少なくとも１つの人工Ｔ細胞エピトープに本発明の薬剤を連結することにより形成することができる。ＰＡＤＲＥは、ＵＳ５，７３６，１４２、ＷＯ９５／０７７０７およびＡｌｅｘａｎｄｅｒ Ｊ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１：７５１−７６１（１９９４（これらの各々は、全ての目的のために引用することにより本明細書に組み込まれる）に記述される。好ましいＰＡＤＲＥペプチドはＡＫＸＶＡＡＷＴＬＫＡＡＡ（配列番号：１２）（共通残基をボールド体にする
）であり、ここで、Ｘは好ましくはシクロヘキシルアラニン、チロシンもしくはフェニルアラニンであり、シクロヘキシルアラニンが最も好ましい。
免疫原性薬剤は、化学的架橋により担体に連結することができる。担体に免疫原を架橋する技術には、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジル−チオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）およびスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）を用いるジスルフィド結合の形成が包含される（ペプチドがスルフヒドリル基を欠く場合、システイン残基の付加によりこれを提供することができる）。これらの試薬は、それら自体とあるタンパク質上のペプチドシステイン残基との間でジスルフィド結合およびリシン上のイプシロン−アミノもしくは他のアミノ酸における他の遊離アミノ基を介してアミド結合をもたらす。様々なそのようなジスルフィド／アミド形成薬剤は、Ｉｍｍｕｎ．Ｒｅｖ．６２，１８５（１９８２）により記述される。他の二機能性カップリング剤は、ジスルフィド結合よりむしろチオエーテルを形成する。これらのチオエーテル形成剤の多くは市販されており、そして６−マレイミドカプロン酸、２−ブロモ酢酸および２−ヨード酢酸、４−（Ｎ−マレイミド−メチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸の反応性エステルを包含する。カルボキシル基は、スクシンイミドもしくは１−ヒドロキシル−２−ニトロ−４−スルホン酸、ナトリウム塩とそれらを合わせることにより活性化することができる。
免疫原性は、Ｔhエピトープと本発明のペプチド免疫原との間のスペーサー残基（例えば、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ）の付加によって改善することができる。ＴhエピトープをＢ細胞エピトープ（すなわち、ペプチド免疫原）から物理的に分離することに加えて、グリシン残基はペプチド免疫原とＴhエピトープとの連結によりもたらされる任意の人工二次構造を壊し、そしてそれによりＴおよび／もしくはＢ細胞反応間の干渉を除くことができる。従って、ヘルパーエピトープと抗体誘発ドメインとの間の構造分離は、提示される免疫原と適切なＴhおよびＢ細胞との間のより効率のよい相互作用を可能にする。
本発明の薬剤に対する様々なＨＬＡタイプを提示する患者の大部分におけるＴ細胞免疫の誘導を高めるために、異なるＴh細胞エピトープを有するコンジュゲートの混合物を製造することができる。混合物には、異なるＴh細胞エピトープを有する少なくとも２つのコンジュゲートの混合物、異なるＴh細胞エピトープを有する少なくとも３つのコンジュゲートの混合物もしくは異なるＴh細胞エピトープを有する少なくとも４つのコンジュゲートの混合物を包含することができる。混合物は、アジュバントと共に投与することができる。
免疫原性ペプチドはまた、担体（すなわち、異種ペプチド）との融合タンパク質として発現することもできる。免疫原性ペプチドはそのアミノ末端、そのカルボキシル末端もしくは両方で担体に連結することができる。場合により、免疫原性ペプチドの多数の反復が融合タンパク質に存在することができる。場合により、免疫原性ペプチドは、例えば、ペプチドのＮおよびＣ末端の両方で、多数コピーの異種ペプチドに連結することができる。ある担体ペプチドは、担体ペプチドに対するヘルパーＴ細胞反応を誘導するように働く。誘導されたヘルパーＴ細胞は、今度は、担体ペプチドに連結された免疫原性ペプチドに対するＢ細胞反応を誘導する。
本発明のある薬剤は、アルファ−ＳＮのＮ末端フラグメントが担体ペプチドにそのＣ末端で連結される融合タンパク質を含んでなる。そのような薬剤において、アルファ−ＳＮのフラグメントのＮ末端残基は融合タンパク質のＮ末端残基を構成する。従って、そのような融合タンパク質は、アルファ−ＳＮのＮ末端残基が遊離形態であることを必要とするエピトープに結合する抗体を誘導することにおいて有効である。本発明のある薬剤は、１コピーもしくはそれ以上の担体ペプチドにＣ末端で連結されたＮＡＣの複数の反復を含ん
でなる。ある融合タンパク質は、タンデムにアルファ−ＳＮの異なるセグメントを含んでなる。
本発明のある薬剤は、アルファ−ＳＮのＣ末端フラグメントが担体タンパク質にそのＮ末端で連結される融合タンパク質を含んでなる。そのような薬剤において、アルファ−ＳＮのフラグメントのＣ末端残基は融合タンパク質のＣ末端残基を構成する。従って、そのような融合タンパク質は、アルファ−ＳＮのＣ末端残基が遊離形態であることを必要とするエピトープに結合する抗体を誘導することにおいて有効である。本発明のある薬剤は、１コピーもしくはそれ以上の担体ペプチドにＮ末端で連結されたＳＮ１２５−１４０のようなＣ末端ペプチドの複数の反復を含んでなる。ある融合タンパク質は、タンデムにアルファ−ＳＮの異なるセグメントを含んでなる。
ある融合タンパク質において、ＮＡＣは異種担体ペプチドにそのＮ末端側終端で融合される。ある融合タンパク質において、ＮＡＣは異種担体ペプチドにそのＣ末端側終端で融合される。ある融合タンパク質はＮＡＣのＮ末端もしくはＣ末端に連結された異種ペプチドを含んでなり、それは今度はタンデムにアルファ−ＳＮの１つもしくはそれ以上の追加のＮＡＣセグメントに連結される。ある融合タンパク質は、上記のように、Ｃ末端アルファシヌクレインペプチドの多数コピー、および相互に連結された異種ペプチドの多数コピーを含んでなる。
ある融合タンパク質において、Ｃ末端もしくはＮ末端のいずれも含まないアルファ−ＳＮのフラグメント（例えば、ＳＮ１１０〜１３０、ＳＮ８５〜１０５）は異種担体ペプチドにそのＮ末端側終端で融合される。ある融合タンパク質において、フラグメントは異種担体ペプチドにそのＣ末端側終端で融合される。ある融合タンパク質はフラグメントのＮ末端もしくはＣ末端に連結された異種ペプチドを含んでなり、それは今度はタンデムにアルファ−ＳＮの１つもしくはそれ以上の追加のフラグメントに連結される。ある融合タンパク質は、上記のように、アルファシヌクレインペプチドの多数コピー、および相互に連結された異種ペプチドの多数コピーを含んでなる。
本発明における使用に適当な融合タンパク質のある例を以下に示す。これらの融合タンパク質のあるものは、ＵＳ５，１９６，５１２、ＥＰ３７８，８８１およびＥＰ４２７，３４７に記述されるような破傷風トキソイドエピトープに連結されたアルファ−ＳＮのセグメント（上記のフラグメントのいずれかを包含する）を含んでなる。ある融合タンパク質は、少なくとも１つのＰＡＤＲＥに連結されたアルファ−ＳＮのセグメントを含んでなる。ある異種ペプチドは無差別Ｔ細胞エピトープであり、一方、ある異種ペプチドは普遍的Ｔ細胞エピトープである。ある方法において、投与用の薬剤は、単に、直線状配置で異種セグメントに連結されたアルファ−ＳＮセグメントを有する単一の融合タンパク質である。本発明の治療薬は、式を用いて表すことができる。例えば、ある方法において、薬剤は式２xにより表される融合タンパク質のマルチマーであり、ここで、ｘは１〜５の整数である。好ましくは、ｘは１、２もしくは３であり、２が最も好ましい。ｘが２である場合、そのようなマルチマーはＭＡＰ４と呼ばれる好ましい配置で連結された４つの融合タンパク質を有する（ＵＳ５，２２９，４９０を参照）。
ＭＡＰ４配置は以下に示され、ここで、分枝構造はペプチド合成をＮ末端およびリシンの側鎖アミンの両方で開始することにより製造される。リシンが配列に取り入れられそして分枝することができる回数により、得られる構造は多数のＮ末端を与える。この例では、４個の同一のＮ末端が分枝したリシンを含有するコア上に生成されている。そのような多様性は、コグネイトＢ細胞の反応性を非常に高める。
Figure 0005952331
ＺはＮＡＣペプチド、ＮＡＣペプチドのフラグメント、もしくは上記の節Ｉ．２に記述されるようなアルファ−ＳＮの他の活性フラグメントをさす。Ｚは１つより多くの活性フラグメントを表すことができ、例えば：
Ｚ＝アルファ−ＳＮ ６０〜７２（ＮＡＣ領域）ペプチド＝ＮＨ２−ＫＥＱＶＴＮＶＣＧＧＡＶＶＴ−ＣＯＯＨ（配列番号：１３）
Ｚ＝アルファ−ＳＮ ７３〜８４（ＮＡＣ領域）ペプチド＝ＮＨ２−ＧＶＴＡＶＡＱＫＴＶＥＣＧ−ＣＯＯＨ（配列番号：１４）
Ｚ＝アルファ−ＳＮ １０２〜１１２ペプチド＝ＮＨ２−Ｃ−アミノ−ヘプタン酸−ＫＮＥＥＧＡＰＣＱＥＧ−ＣＯＯＨ（配列番号：１５）
アルファ−ＳＮ １２８〜１４０ペプチド
融合タンパク質の他の例には：
ＭＡＰ４配置のＺ−破傷風トキソイド８３０〜８４４：
Ｚ−ＱＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩＴＥＬ（配列番号：１６）
ＭＡＰ４配置のＺ−破傷風トキソイド９４７〜９６７：
Ｚ−ＦＮＮＦＴＶＳＦＷＬＲＶＰＫＶＳＡＳＨＬＥ（配列番号：１７）
ＭＡＰ４配置のＺ−破傷風トキソイド830〜844：
Ｚ−ＱＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩＴＥＬ（配列番号：１８）
直線状配置のＺ−破傷風トキソイド830〜844＋破傷風トキソイド947〜967：
Ｚ−ＱＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩＴＥＬＦＮＮＦＴＶＳＦＷＬＲＶＰＫＶＳＡＳＨＬＥ（配列番号：１９）
ＰＡＤＲＥペプチド（全て直線状配置の）、ここで、Ｘは好ましくはシクロヘキシルアラニン、チロシンもしくはフェニルアラニンであり、シクロヘキシルアラニンが最も好ましい−Ｚ：
ＡＫＸＶＡＡＷＴＬＫＡＡＡ−Ｚ（配列番号：２０）
３Ｚ−ＰＡＤＲＥペプチド：
Ｚ−Ｚ−Ｚ−ＡＫＸＶＡＡＷＴＬＫＡＡＡ（配列番号：２１）
が包含される。
融合タンパク質のさらなる例には：
ＡＫＸＶＡＡＷＴＬＫＡＡＡ−Ｚ−Ｚ−Ｚ−Ｚ（配列番号：２２）
Ｚ−ＡＫＸＶＡＡＷＴＬＫＡＡＡ（配列番号：２３）
Ｚ−ＩＳＱＡＶＨＡＡＨＡＥＩＮＥＡＧＲ（配列番号：２４）
ＰＫＹＶＫＱＮＴＬＫＬＡＴ−Ｚ−Ｚ−Ｚ（配列番号：２５）
Ｚ−ＰＫＹＶＫＱＮＴＬＫＬＡＴ−Ｚ（配列番号：２６）
Ｚ−Ｚ−Ｚ−ＰＫＹＶＫＱＮＴＬＫＬＡＴ（配列番号：２７）
Ｚ−Ｚ−ＰＫＹＶＫＱＮＴＬＫＬＡＴ（配列番号：２８）
Ｚ−ＰＫＹＶＫＱＮＴＬＫＬＡＴ−ＥＫＫＩＡＫＭＥＫＡＳＳＶＦＮＶ−ＱＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩＴＥＬ−ＦＮＮＦＴＶＳＦＷＬＲＶＰＫＶＳＡＳＨＬＥ−Ｚ−Ｚ−Ｚ−Ｚ−ＱＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩＴＥＬ−ＦＮＮＦＴＶＳＦＷＬＲＶＰＫＶＳＡＳＨＬＥ（配列
番号：２９）
Ｚ−ＱＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩＴＥＬＣＦＮＮＦＴＶＳＦＷＬＲＶＰＫＶＳＡＳＨＬＥ−Ｚ−ＱＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩＴＥＬＣＦＮＮＦＴＶＳＦＷＬＲＶＰＫＶＳＡＳＨＬＥ−Ｚ（配列番号：３０）
２分枝樹脂上のＺ−ＱＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩＴＥＬ（配列番号：３１）：
Figure 0005952331
ＥＱＶＴＮＶＧＧＡＩＳＱＡＶＨＡＡＨＡＥＩＮＥＡＧＲ（配列番号：３２）
（ＭＡＰ−４配置のシヌクレインフラグメント融合タンパク質）
が包含される。
受動免疫における使用のためのアルファ−ＳＮに対する抗体の生成において使用する免疫原を生成するために同じもしくは同様の担体タンパク質および連結の方法を用いることができる。例えば、担体に連結されたアルファ−ＳＮもしくはフラグメントをアルファ−ＳＮに対するモノクローナル抗体の製造において実験動物に投与することができる。
４．治療薬をコードする核酸
レビー小体に対する免疫反応はまた、アルファ−ＳＮペプチドのセグメント、およびそのフラグメント、他のペプチド免疫原、もしくは受動免疫に使用する抗体およびそれらの成分鎖をコードする核酸の投与により誘導することもできる。そのような核酸は、ＤＮＡもしくはＲＮＡであることができる。免疫原をコードする核酸セグメントは、典型的に、患者の意図される標的細胞におけるＤＮＡセグメントの発現を可能にするプロモーターおよびエンハンサーのような調節要素に連結される。免疫反応の誘導に望ましいように、血液細胞における発現には、軽鎖もしくは重鎖免疫グロブリン遺伝子からのプロモーターおよびエンハンサー要素またはＣＭＶ主要中早期プロモーターおよびエンハンサーが発現を導くために適当である。連結される調節要素およびコーディング配列は、ベクターにクローン化されることが多い。二本鎖抗体の投与のために、２本の鎖を同じもしくは別個のベクターにおいてクローン化することができる。本発明の治療薬をコードする核酸はまた、少なくとも１つのＴ細胞エピトープをコードすることもできる。アジュバントの使用および の使用に関する本明細書における開示は、本発明の治療薬をコードする核酸でのそれらの使用に変更すべきところは変更して適用される。
レトロウイルス系（例えば、Ｌａｗｒｉｅ ａｎｄ Ｔｕｍｉｎ，Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．３，１０２−１０９（１９９３）を参照）；アデノウイルスベクター（例えば、Ｂｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７，５９１１（１９９３）を参照）；アデノ随伴ウイルスベクター（例えば、Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７９，１８６７（１９９４）を参照）、ワクシニアウイルスおよび鳥類ポックスウイルスを包含するポックス科からのウイルスベクター、アルファウイルス属、例えばシンドビスおよびセムリキ森林ウイルス（例えば、Ｄｕｂｅｎｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０，５０８−５１９（１９９６）を参照）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＵＳ５，６４３，５７６を参照）由来のものおよびラブドウイルス、例えば水疱性口内炎ウイルス（ＷＯ９６／３４６２５を参照）およびパピローマウイルス（Ｏｈ
ｅ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６，３２５−３３３（１９９５）；Ｗｏｏ ｅｔ ａｌ．，ＷＯ９４／１２６２９およびＸｉａｏ ＆ Ｂｒａｎｄｓｍａ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２４，２６３０−２６２２（１９９６））からのウイルスベクターを包含する多数のウイルスベクター系が利用可能である。
免疫原をコードするＤＮＡもしくはそれを含有するベクターは、リポソームに入れることができる。適当な脂質および関連アナログは、ＵＳ５，２０８，０３６、ＵＳ５，２６４，６１８、ＵＳ５，２７９，８３３およびＵＳ５，２８３，１８５により記述される。ベクターおよび免疫原をコードするＤＮＡはまた微粒子担体に吸着させるかもしくはそれと結合させることもでき、その例にはポリメチルメタクリレートポリマーおよびポリラクチドおよびポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（例えば、ＭｃＧｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｉｃｒｏ Ｅｎｃａｐ．１９９６を参照）が包含される。
遺伝子治療ベクターもしくは裸のＤＮＡは個々の患者への投与により、典型的には全身投与（例えば、静脈内、腹腔内、鼻腔内、胃内、皮内、筋肉内、皮下もしくは頭蓋内注入）もしくは局所適用（例えば、ＵＳ５，３９９，３４６を参照）によりインビボで送達することができる。そのようなベクターはさらに、ブピバシン（ｂｕｐｉｖａｃｉｎｅ）（例えば、ＵＳ５，５９３，９７０を参照）のような促進剤を含むことができる。ＤＮＡはまた、遺伝子銃を用いて投与することもできる。Ｘｉａｏ ＆ Ｂｒａｎｄｓｍａ、上記を参照。免疫原をコードするＤＮＡを微細金属ビーズの表面上に沈殿させる。マイクロプロジェクタイルは衝撃波もしくは膨張するヘリウムガスで加速され、そして数細胞層の深さまで組織に入り込む。例えば、Ａｇａｃｅｔｕｓ，Ｉｎｃ．Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ，ＷＩにより製造されるＡｃｃｅｌTM Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｄｅｖｉｃｅが適当である。あるいはまた、裸のＤＮＡは単に化学もしくは機械的刺激と共に皮膚上にＤＮＡをスポットすることにより皮膚を通って血流に入ることができる（ＷＯ９５／０５８５３を参照）。
さらなるバリエーションにおいて、免疫原をコードするベクターは個々の患者から外植した細胞（例えば、リンパ球、骨髄穿刺液および組織生検）もしくは万能供血者造血幹細胞のような細胞にエクスビボで送達し、続いて通常はベクターを取り込んでいる細胞の選択後に、患者に細胞を再移植することができる。
ＩＩＩ．Ａβに対する免疫原性反応を誘導するための薬剤
β−アミロイドペプチドもしくはＡ４ペプチド（ＵＳ４，６６６，８２９；Ｇｌｅｎｎｅｒ ＆ Ｗｏｎｇ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１２０，１１３１（１９８４））としても知られているＡβは３９〜４３個のアミノ酸のペプチドであり、それはアルツハイマー病の特徴的な斑の主要成分である。Ａβは、βおよびγセクレターゼと呼ばれる２つの酵素によるより大きいタンパク質ＡＰＰのプロセシングによって生成される（Ｈａｒｄｙ，ＴＩＮＳ ２０，１５４（１９９７）を参照）。アルツハイマー病と関連するＡＰＰにおける既知の突然変異は、βもしくはγセクレターゼの部位に近接して、もしくはＡβ内で起こる。例えば、位置７１７はＡβへのそのプロセシングにおけるＡＰＰのγ−セクレターゼ切断の部位に近接し、そして位置６７０／６７１はβ−セクレターゼ切断の部位に近接する。これらの突然変異は、生成されるＡβの４２／４３アミノ酸形態の量を増加するようにＡβが形成される切断反応と相互作用することによりＡＤを引き起こすと考えられる。
Ａβは、それが古典的および第二補体カスケードの両方を固定しそして活性化するという異常な性質を有する。特に、それはＣ１ｑにそして最終的にＣ３ｂｉに結合する。この結合はマクロファージへの結合を促進し、Ｂ細胞の活性化をもたらす。さらに、Ｃ３ｂｉはさらに分解し、そして次にＴ細胞依存的にＢ細胞上のＣＲ２に結合し、これらの細胞の
活性化の１０，０００増加をもたらす。この機序は、Ａβに他の抗原のものを上回る免疫反応を起こさせる。
Ａβはいくつかの天然に存在する型を有する。Ａβのヒト型は、Ａβ３９、Ａβ４０、Ａβ４１、Ａβ４２およびＡβ４３と呼ばれる。これらのペプチドの配列およびＡＰＰ前駆体とのそれらの関係は、Ｈａｒｄｙ ｅｔ ａｌ．，ＴＩＮＳ ２０，１５５−１５８（１９９７）の図１により例示される。例えば、Ａβ４２は配列：
ＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹＥＶＨＨＱＫＬＶＦＦＡＥＤＶＧＳＮＫＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶＩＡＴ（配列番号：３３）
を有する。
Ａβ４１、Ａβ４０およびＡβ３９は、Ｃ末端側終端からのそれぞれＡｌａ、Ａｌａ−ＩｌｅおよびＡｌａ−Ｉｌｅ−Ｖａｌの削除によりＡβ４２と異なる。Ａβ４３は、Ｃ末端でのＴｈｒ残基の存在によりＡβ４２と異なる。
アルファ−ＳＮについての上記のものと同様の薬剤は、Ａβについて以前に記述されている（ＷＯ９８／２５３８６およびＷＯ００／７２８８０を参照、これらは両方とも全ての目的のために本明細書に組み込まれる）。これらの薬剤にはＡβおよびその活性フラグメント、ＡβのコンジュゲートおよびＡβ活性フラグメントのコンジュゲート、Ａβおよびその活性フラグメントに対する抗体（例えば、マウス、ヒト化、ヒトおよびキメラ抗体）、ならびに抗体鎖をコードする核酸が包含される。ＡβのＮ末端半分からの活性フラグメントが好ましい。好ましい免疫原性フラグメントには、Ａβ１〜５、１〜６、１〜７、１〜１０、３〜７、１〜３および１〜４が包含される。例えば、表示Ａβ１〜５は、Ａβの残基１〜５を含みそしてＡβの他の残基を欠くフラグメントを示す。Ａβの残基１〜３で始まりそしてＡβの残基７〜１１で終わるフラグメントが特に好ましい。
能動免疫反応を誘導する薬剤、受動免疫反応を誘導するための薬剤、コンジュゲート、および治療薬をコードする核酸に関する本明細書における開示（上記の節ＩＩ．１、２、３および４を参照）は、Ａβおよびそのフラグメントの使用に変更すべきところは変更して適用される。能動免疫反応を誘導する薬剤、受動免疫反応を誘導するための薬剤、コンジュゲート、および治療薬をコードする核酸に関する本明細書における開示（上記の節ＩＩ．１、２、３および４を参照）は、Ａβおよびそのフラグメントの使用に変更すべきところは変更して適用される。処置および処置処方計画に適している患者に関する本明細書における開示（以下の節ＩＶおよびＶを参照）は、Ａβおよびそのフラグメントの使用に変更すべきところは変更して適用される。
解離したＡβもしくはそのフラグメントは、モノマーペプチド単位を意味する。解離したＡβもしくはそのフラグメントは一般に可溶性であり、そして自己凝集して可溶性オリゴマーを形成することができる。Ａβおよびそのフラグメントのオリゴマーは通常は可溶性であり、そして主にアルファヘリックスもしくはランダムコイルとして存在する。凝集したＡβもしくはそのフラグメントは、不溶性のベータシート集合に会合しているアルファ−ＳＮもしくはそのフラグメントのオリゴマーを意味する。凝集したＡβもしくはそのフラグメントはまた、線維ポリマーも意味する。原線維は通常は不溶性である。ある抗体は、可溶性のＡβもしくはそのフラグメントまたは凝集したＡβもしくはそのフラグメントのいずれかに結合する。ある抗体は、可溶性のＡβもしくはそのフラグメントおよび凝集したＡβもしくはそのフラグメントの両方に結合する。
コンジュゲートのある例には：
ＡＮ９０５４９（ＭＡＰ４配置のＡβ１〜７−破傷風トキソイド８３０〜８４４）：（配列番号：３４）
ＤＡＥＦＲＨＤ−ＱＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩＴＥＬ
ＡＮ９０５５０（ＭＡＰ４配置のＡβ１〜７−破傷風トキソイド９４７〜９６７）：
ＤＡＥＦＲＨＤ−ＦＮＮＦＴＶＳＦＷＬＲＶＰＫＶＳＡＳＨＬＥ（配列番号：３５）
ＡＮ９０５４２（直線状配置のＡβ１〜７−破傷風トキソイド８３０〜８４４＋９４７〜９６７）：
ＤＡＥＦＲＨＤ−ＱＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩＴＥＬＦＮＮＦＴＶＳＦＷＬＲＶＰＫＶＳＡＳＨＬＥ（配列番号：３６）
ＡＮ９０５７６：（ＭＡＰ４配置のＡβ３〜９−破傷風トキソイド８３０〜８４４）：
ＥＦＲＨＤＳＧ−ＱＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩＴＥＬ（配列番号：３７）
ＰＡＤＲＥペプチド（全て直線状配置の）、ここで、Ｘは好ましくはシクロヘキシルアラニン、チロシンもしくはフェニルアラニンであり、シクロヘキシルアラニンが最も好ましい：
ＡＮ９０５６２（ＰＡＤＲＥ−Ａβ１〜７）：
ＡＫＸＶＡＡＷＴＬＡＡＡ−ＤＡＥＦＲＨＤ（配列番号：３８）
ＡＮ９０５４３（３ＰＡＤＲＥ−Ａβ１〜７）：
ＤＡＥＦＲＨＤ−ＤＡＥＦＲＨＤ−ＤＡＥＦＲＨＤ−ＡＫＸＶＡＡＷＴＬＫＡＡＡ（配列番号：３９）
が包含される。
融合タンパク質の他の例（Ａβの免疫原性エピトープをボールド体にする）には：
ＡＫＸＶＡＡＷＴＬＫＡＡＡ−ＤＡＥＦＲＨＤ−ＤＡＥＦＲＨＤ−ＤＡＥＦＲＨＤ（配列番号：４０）
ＤＡＥＦＲＨＤ−ＡＫＸＶＡＡＷＴＬＫＡＡＡ（配列番号：４１）
ＤＡＥＦＲＨＤ−ＩＳＱＡＶＨＡＡＨＡＥＩＮＥＡＧＲ（配列番号：４２）
ＦＲＨＤＳＧＹ−ＩＳＱＡＶＨＡＡＨＡＥＩＮＥＡＧＲ（配列番号：４３）
ＥＦＲＨＤＳＧ−ＩＳＱＡＶＨＡＡＨＡＥＩＮＥＡＧＲ（配列番号：４４）
ＰＫＹＶＫＱＮＴＬＫＬＡＴ−ＤＡＥＦＲＨＤ−ＤＡＥＦＲＨＤ−ＤＡＥＦＲＨＤ（配列番号：４５）
ＤＡＥＦＲＨＤ−ＰＫＹＶＫＱＮＴＬＫＬＡＴ−ＤＡＥＦＲＨＤ（配列番号：４６）
ＤＡＥＦＲＨＤ−ＤＡＥＦＲＨＤ−ＤＡＥＦＲＨＤ−ＰＫＹＶＫＱＮＴＬＫＬＡＴ（配列番号：４７）
ＤＡＥＦＲＨＤ−ＤＡＥＦＲＨＤ−ＰＫＹＶＫＱＮＴＬＫＬＡＴ（配列番号：４８）
ＤＡＥＦＲＨＤ−ＰＫＹＶＫＱＮＴＬＫＬＡＴ−ＥＫＫＩＡＫＭＥＫＡＳＳＶＦＮＶＱＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩＴＥＬ−ＦＮＮＦＴＶＳＦＷＬＲＶＰＫＶＳＡＳＨＬＥ−ＤＡＥＦＲＨＤ（配列番号：４９）
ＤＡＥＦＲＨＤ−ＤＡＥＦＲＨＤ−ＤＡＥＦＲＨＤ−ＱＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩＴＥＬＮＮＦＴＶＳＦＷＬＲＶＰＫＶＳＡＳＨＬＥ（配列番号：５０）
ＤＡＥＦＲＨＤ−ＱＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩＴＥＬＣＦＮＮＦＴＶＳＦＷＬＲＶＰＫＶＳＡＳＨＬＥ（配列番号：５１）
ＤＡＥＦＲＨＤ−ＱＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩＴＥＬＣＦＮＮＦＴＶＳＦＷＬＲＶＰＫＶＳＡＳＨＬＥ−ＤＡＥＦＲＨＤ（配列番号：５２）
２分枝樹脂上のＤＡＥＦＲＨＤ−ＱＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩＴＥＬ（配列番号：５３）
Figure 0005952331
が包含される。
好ましいモノクローナル抗体は、Ａβの残基１〜１０内のエピトープに結合する（天然のＡβの最初のＮ末端残基を１と指定する）。ある好ましいモノクローナル抗体はアミノ酸１〜５内のエピトープに、そしてあるものは５〜１０内のエピトープに結合する。ある好ましい抗体は、アミノ酸１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７もしくは３〜７内のエピトープに結合する。ある好ましい抗体は、Ａβの残基１〜３で始まりそして残基７〜１１で終わるエピトープに結合する。他の抗体には、残基１３〜２８０を有するエピトープに結合するもの（例えば、モノクローナル抗体２６６）が包含される。好ましい抗体は、ヒトＩｇＧ１アイソタイプを有する。
ＩＶ．除去活性について抗体をスクリーニングすること
本発明は、それに対する除去活性が望ましい、レビー小体もしくは任意の他の抗原、または関連する生物学的存在を除去することにおける活性について抗体をスクリーニングする方法を提供する。レビー小体に対する活性についてスクリーニングするために、ＰＤにかかっている患者もしくは特徴的なパーキンソン病変を有する動物モデルの脳からの組織サンプルを小グリア細胞のようなＦｃ受容体を保有する食細胞および試験下の抗体とインビトロで培地において接触させる。食細胞は、ＢＶ−２、Ｃ８−Ｂ４もしくはＴＨＰ−１のような、初代培養もしくは細胞系であることができる。ある方法において、これらの成分は顕微鏡モニタリングを容易にするために顕微鏡スライド上で合わせられる。ある方法において、多数の反応はマイクロタイター皿のウェルにおいて並行して行われる。そのような形式において、別個の小型顕微鏡スライドを別個のウェルに載せることができ、もしくはアルファ−ＳＮのＥＬＩＳＡ検出のような非顕微鏡検出形式を用いることができる。好ましくは、一連の測定は、反応が進行する前のベースライン値から出発する、インビトロ反応混合物におけるレビー小体の量、および反応中の１つもしくはそれ以上の試験値からなる。抗原は、例えば、アルファ−ＳＮもしくはＬＢの他の成分に対する蛍光標識抗体で染色することにより検出することができる。染色に使用する抗体は、除去活性について試験される抗体と同じであってもなくてもよい。ＬＢの反応中のベースラインに対する減少は、試験下の抗体が除去活性を有することを示す。そのような抗体は、ＰＤおよび他のＬＢＤを予防することもしくは処置することにおいて有用であると思われる。
生物学的存在の他のタイプを除去することにおける活性について抗体をスクリーニングするために同様の方法を用いることができる。アッセイは、実質的に任意の種類の生物学的存在に対する除去活性を検出するために用いることができる。典型的に、生物学的存在はヒトもしくは動物疾患において何らかの役割を有する。生物学的存在は、組織サンプルとしてもしくは単離された形態において提供されることができる。組織サンプルとして提供される場合、組織サンプルの成分への容易なアクセスを可能にするためにそして固定に付随する成分の構造を乱すことを防ぐために組織サンプルは好ましくは固定されない。このアッセイにおいて試験することができる組織サンプルの例には、癌組織、前癌組織、いぼもしくはほくろのような良性腫瘍を含有する組織、病原性微生物が感染した組織、炎症細胞が浸潤した組織、細胞間に病的マトリックスを保有する組織（例えば、線維性心膜炎）、異常な抗原を保有する組織、および瘢痕組織が包含される。使用することができる単
離された生物学的存在の例には、アルファ−ＳＮ、ウイルス抗原もしくはウイルス、プロテオグリカン、他の病原性微生物の抗原、腫瘍抗原、および接着分子が包含される。そのような抗原は、他の手段の中でも、天然源、組換え発現もしくは化学合成から得ることができる。組織サンプルもしくは単離された生物学的存在を単球もしくは小グリア細胞のようなＦｃ受容体を保有する食細胞、および試験する抗体と培地において接触させる。抗体は、試験下の生物学的存在に対してもしくは該存在と関連する抗原に対してであることができる。後者の場合、目的は生物学的存在が抗原と共に代理で貪食されるかどうかを試験することである。通常、必ずではないが、抗体および生物学的存在（関連抗原でのこともある）は、食細胞を加える前にお互いに接触させる。次に、培地に残っている生物学的存在および／もしくは関連抗原（存在する場合）の濃度をモニターする。培地における抗原もしくは関連する生物学的存在の量もしくは濃度の減少は、抗体が食細胞と共に抗原および／もしくは関連する生物学的存在に対する除去反応を有することを示す。
抗体もしくは他の薬剤はまた、実施例ＩＩに記述されるインビトロアッセイを用いてレビー小体を除去することにおける活性についてスクリーニングすることもできる。シヌクレインを発現する発現ベクターでトランスフェクションしたニューロン細胞は、顕微鏡によって視覚化することができるシヌクレイン封入体を形成する。そのような封入体を除去することにおける抗体もしくは他の薬剤の活性は、薬剤で処置しないコントロール細胞におけるシヌクレインの外観もしくはレベルと薬剤で処置したトランスフェクション細胞におけるシヌクレインの外観もしくはレベルを比較することにより決定することができる。シヌクレイン封入体のサイズもしくは強度の減少またはシヌクレインのレベルの減少は、シヌクレインを除去することにおける活性を示唆する。活性は、シヌクレイン封入体を顕微鏡によって視覚化することによりもしくはゲル上で細胞抽出物を泳動しそしてシヌクレインバンドを視覚化することによりモニターすることができる。実施例１、節２に記載のとおり、シヌクレインのレベルの変化は、抽出物が細胞質および膜画分に分画されそして膜画分が分析される場合に最も顕著である。
抗体もしくは他の薬剤はまた、実施例ＩＸに記載のインビボアッセイを用いてレビー小体を除去することにおける活性についてスクリーニングすることもできる。簡潔に言えば、ヒトα−シヌクレインを過剰発現しそしてニューロン内α−シヌクレイン凝集体を有するトランスジェニックマウスの新皮質に試験抗体を注射する。１つの方法において、使用する動物はＰＤＧＦプロモーターの転写制御下で脳においてヒト野生型α−シヌクレインを過剰発現する４〜８か月齢のヘテロ接合体トランスジェニックマウスである（Ｍａｓｌｉａｈ，２０００，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８７：１２６５−６９を参照）。試験抗体およびコントロール（例えば、関係のない、アイソタイプの一致したコントロール抗体）をマウスへの注射のために適当な溶液（例えば、滅菌リン酸緩衝食塩水溶液）に溶解する。各マウスについて、２μｌの２ｍｇ／ｍｌの抗体溶液を右脳半球（同側）の頭頂葉新皮質の深層に麻酔下で定位固定で注射する。左半球（反対側）は、各マウスのベースラインコントロールとして働く。注射部位を縫合し、そしてマウスを麻酔から回復するまでモニターする。注射後２週で、マウスを安楽死させ、それらの脳を取り出し、そして４％のパラホルムアルデヒドにおいて４８ｈ固定し、そして４０μｍの厚さで冠状に切断する。注射部位の周りの切片をα−シヌクレイン抗体（例えば、α−シヌクレインアミノ酸１１５〜１２２を認識するＥＬＡＤＷ−４７）で染色する。各切片について、ニューロン内α−シヌクレイン凝集体を同側半球における注射部位の周りの４つの顕微鏡視野（２０ｘ対物）において、そして反対側コントロール半球における視野に対応する４つの視野において計数する。各動物について２つの切片のα−シヌクレイン凝集体計数を加え、そして２つの半球間の全α−シヌクレイン凝集体計数間の差は、各個々のマウスの凝集体クリアランスへの試験抗体の効果を決定するためである。処置した半球における全α−シヌクレイン凝集体計数の減少は、抗体もしくは他の薬剤がレビー小体を除去することにおいて活性を有することを示す。好ましくは、少なくとも１０％の減少が認められる。より好ましくは、少な
くとも２０％、少なくとも４０％、少なくとも６０％もしくは少なくとも８０％の減少が認められる。
Ｖ．抗レビー抗体成分処置処方計画に適している患者
処置に適している患者には、シヌクレイノパチー疾患の危険性があるが症状を示していない個体、ならびに症状を現在示している患者が包含される。処置に適している患者にはまた、ＬＢＤの疾患の危険性があるが症状を示していない個体、ならびに症状を現在示している患者も包含される。そのような疾患には、パーキンソン病（特発性パーキンソン病を包含する）、ＤＬＢ、ＤＬＢＤ、ＬＢＶＡＤ、純粋自律神経障害、レビー小体嚥下障害、偶発的ＬＢＤ、遺伝的ＬＢＤ（例えば、アルファ−ＳＮ遺伝子、ＰＡＲＫ３およびＰＡＲＫ４の突然変異）および多系統委縮症（例えば、オリーブ橋小脳委縮症、線条体黒質変性症およびシャイ−ドレーガー症候群）が包含される。従って、本発明の方法は、ＬＢＤの既知の遺伝的危険性を有する個体に予防的に投与することができる。そのような固体には、この疾患を経験している血縁者を有するもの、および遺伝子もしくは生化学マーカーの分析により危険性が決定されるものが包含される。ＰＤに対する危険性の遺伝子マーカーには、シヌクレインもしくはＰａｒｋｉｎ、ＵＣＨＬＩおよびＣＹＰ２Ｄ６遺伝子における突然変異；特にシヌクレイン遺伝子の位置５３での突然変異が包含される。パーキンソン病を現在患っている個体は、安静時振せん、筋硬直、運動緩徐および姿勢の不安定を包含するその臨床兆候から認識することができる。
ある方法において、患者は任意のアミロイド形成疾患の臨床症状、兆候および／もしくは危険因子がなく、そして少なくとも１つのシヌクレイノパチー疾患を患っている。ある方法において、患者は細胞外アミロイド沈着物を特徴とする任意の疾患の臨床症状、兆候および／もしくは危険因子がない。ある方法において、患者はＡβペプチドのアミロイド沈着物を特徴とする疾患がない。ある方法において、患者はアルツハイマー病の臨床症状、兆候および／もしくは危険因子がない。ある方法において、患者はアルツハイマー病、認識障害、軽度認識障害およびダウン症候群の臨床症状、兆候および／もしくは危険因子がない。ある方法において、患者は同時に起こるアルツハイマー病およびレビー小体を特徴とする疾患を有する。ある方法において、患者は同時に起こるアルツハイマー病およびシヌクレイン蓄積を特徴とする疾患を有する。ある方法において、患者は同時に起こるアルツハイマー病およびパーキンソン病を有する。
無症状患者において、処置は任意の年齢（例えば、１０、２０もしくは３０）で開始することができる。しかしながら、通常、患者が４０、５０，６０もしくは７０に達するまで処置を開始する必要はない。処置は、典型的に、ある期間にわたる複数回投薬量を伴う。処置は、経時的に治療薬（例えば、アルファ−ＳＮペプチドもしくはＡβ、または両方）に対する抗体または活性化Ｔ細胞もしくはＢ細胞反応をアッセイすることによりモニターすることができる。反応が落ちる場合、ブースター投薬量が指示される。
場合により、疾患の症状、兆候もしくは危険因子の有無が処置を開始する前に決定される。
ＶＩ．抗アミロイド成分処置処方計画に適している患者
処置に適している患者には、疾患の危険性があるが症状を示していない個体、ならびにアミロイドーシスの症状を現在示している患者が包含される。アルツハイマー病の場合、十分に長く生きる場合には実質的に誰もがアルツハイマー病を患う危険性がある。従って、本発明の方法は、対象患者の危険性の任意の評価の必要性なしに一般集団に予防的に投与することができる。本発明の方法は、アルツハイマー病もしくは他の遺伝性アミロイド疾患のいずれかの既知の遺伝的危険性を有する個体に特に有用である。そのような個体には、この疾患を経験している血縁者を有するもの、および遺伝子もしくは生化学マーカー
の分析によりその危険性が決定されるものが包含される。アルツハイマー病に対する危険性の遺伝子マーカーには、ＡＰＰ遺伝子における突然変異、特にそれぞれＨａｒｄｙおよびＳｗｅｄｉｓｈ突然変異と呼ばれる位置７１７ならびに位置６７０および６７１での突然変異が包含される（Ｈａｒｄｙ，ＴＩＮＳ，上記を参照）。危険性の他のマーカーは、プレセニリン遺伝子、ＰＳ１およびＰＳ２、ならびにＡｐｏＥ４における突然変異、ＡＤの家族歴、高コレステロール血症もしくはアテローム性動脈硬化症である。アルツハイマー病を現在患っている個体は特徴的な認知症、ならびに上記の危険因子の存在から認識することができる。さらに、ＡＤにかかっている個体を同定するために多数の診断試験が利用可能である。これらには、ＣＳＦタウおよびＡβ４２レベルの測定が包含される。上昇したタウおよび減少したＡβ４２レベルは、ＡＤの存在を示す。アルツハイマー病を患っている個体はまた、実施例の節に説明されるようにＭＭＳＥもしくはＡＤＲＤＡ基準により診断することもできる。無症状の患者において、処置は任意の年齢（例えば、１０、２０もしくは３０）で開始することができる。しかしながら、通常、患者が４０、５０，６０もしくは７０に達するまで処置を開始する必要はない。処置は、典型的に、ある期間にわたる複数回投薬量を伴う。処置は、以下のＶＩＩモニタリングおよび診断の方法の記載に従って、経時的に治療薬（例えばＮＡＣ）に対する抗体または活性化Ｔ細胞もしくはＢ細胞反応をアッセイすることによりモニターすることができる。反応が落ちる場合、ブースター投薬量が指示される。
ＶＩＩ．処置処方計画
一般に、処置処方計画は、患者にアルファ−ＳＮに対する免疫原性反応を誘導するために有効な薬剤および／もしくはＡβに対する免疫原性反応を誘導するために有効な薬剤を投与することを伴う。予防的適用において、製薬学的組成物もしくは薬剤は、危険性を除くかもしくは軽減する、重症度を軽くする、または疾患の生理学的、生化学的、組織学的および／もしくは行動的症状、その合併症ならびに疾患の発症中に見つかる中間病理学的表現型を包含する疾患の発生を遅らせるために十分な組成物もしくは薬剤の投与の量および頻度を含んでなる処方計画においてＬＢＤもしくは別のシヌクレオパチー疾患にかかりやすいかもしくはそうでなければその危険性がある患者に投与される。治療的適用において、組成物もしくは薬剤は、その合併症および疾患の発症中における中間病理学的表現型を包含する疾患の症状（生理学的、生化学的、組織学的および／もしくは行動的）を治すかもしくは少なくとも部分的に阻むために十分な組成物の投与の量および頻度を含んでなる処方計画においてそのような疾患の疑いがあるかもしくはすでに患っている患者に投与される。例えば、ある方法において処置はレビー小体の少なくとも部分的なクリアランス、レビー小体の少なくとも部分的な解離をもたらし、そして／もしくはシナプスにおけるアルファ−シヌクレインオリゴマーのレベルを減少させる。治療的もしくは予防的処置を成し遂げるために適当な量は、治療的にもしくは予防的に有効な用量として定義される。治療的もしくは予防的処置を成し遂げるために適当な量および投薬頻度の組み合わせは、治療的にもしくは予防的に有効な処方計画として定義される。予防的および治療的処方計画の両方において、薬剤は通常は十分な免疫反応が得られるまでいくつかの投薬量において投与される。典型的に、免疫反応はモニターされ、そして免疫反応が減弱し始める場合には反復投薬量が与えられる。
ある方法において、薬剤の投与は凝集したシヌクレインの細胞内レベルの減少をもたらす。ある方法において、薬剤の投与は、パーキンソン病の場合には運動機能のような、ＬＢＤの臨床症状の改善をもたらす。ある方法において、凝集したシヌクレインの細胞内レベルの減少もしくは疾患の臨床症状の改善は、薬剤の投与後に間隔をおいてモニターされる。
上記の症状の処置のための本発明の組成物の有効用量は、投与の手段、標的部位、患者の生理学的状態、患者がヒトかもしくは動物か、投与される他の薬剤、および処置が予防
的かもしくは治療的かを包含する多数の異なる因子により変わる。通常、患者はヒトであるが、トランスジェニック哺乳類を包含する非ヒト哺乳類もまた処置することができる。処置投薬量は、安全性および効能を最適化するために滴定する必要がある。免疫原の量は、アジュバントもまた投与されるかどうかにより決まり、アジュバントの不在下ではより高い投薬量が必要とされる。投与ための免疫原の量は、ヒト投与には患者当たり１〜５００μｇ、そしてより通常には注射当たり５〜５００μｇと異なることもある。時折、注射当たり１〜２ｍｇのより高い用量が使用される。典型的には約１０、２０、５０もしくは１００μｇが各ヒト注射に用いられる。免疫原の質量もまた、全体としての免疫原の質量に対する免疫原内の免疫原性エピトープの質量比により決まる。典型的に、免疫原のマイクログラムに１０-3〜１０-5マイクロモルの免疫原性エピトープを使用する。注射のタイミングは１日に１回から、１年に１回まで、１０年に１回まで有意に異なることができる。免疫原の投薬量が与えられる任意の既定の日に、投薬量はアジュバントもまた投与される場合には１μｇ／患者より大きくそして通常は１０μｇ／患者より大きく、そしてアジュバントの不在下では１０μｇ／患者より大きくそして通常は１００μｇ／患者より大きい。典型的な処方計画は免疫、続いて６週間隔のような時間間隔でのブースター注射からなる。別の処方計画は免疫、続いて１、２および１２か月後のブースター注射からなる。別の処方計画は、生涯にわたって２か月ごとの注射を伴う。あるいはまた、ブースター注射は免疫反応のモニタリングにより指示されるように不定期であることができる。
抗体での受動免疫では、投薬量は約０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇそしてより通常には０．０１〜５ｍｇ／ｋｇ宿主体重である。例えば、投薬量は１ｍｇ／ｋｇ体重もしくは１０ｍｇ／ｋｇ体重または１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲内、すなわち言い換えれば、７０ｋｇの患者には、それぞれ、７０ｍｇもしくは７００ｍｇまたは７０〜７００ｍｇの範囲内であることができる。典型的な処置処方計画は、２週ごとに１回もしくは１か月に１回もしくは３〜６か月ごとに１回の投与を伴う。ある方法において、異なる結合特異性を有する２つもしくはそれ以上のモノクローナル抗体は同時に投与され、この場合、投与される各抗体の投薬量は示される範囲内に入る。抗体は通常は複数回投与される。単回投薬量間の間隔は、毎週、毎月もしくは毎年であることができる。間隔はまた、患者におけるアルファ−ＳＮに対する抗体の血液レベルを測定することにより指示されるように不定期であることもできる。ある方法において、投薬量は１〜１０００μｇ／ｍｌそしてある方法において２５〜３００μｇ／ｍｌの血漿抗体濃度に達するように調整される。あるいはまた、抗体は持続放出製剤として投与することができ、この場合、より少ない頻度の投与が必要とされる。投薬量および頻度は、患者における抗体の半減期により異なる。一般に、ヒト抗体は最も長い半減期を示し、その後にヒト化抗体、キメラ抗体および非ヒト抗体が続く。投薬量および投与の頻度は、処置が予防的かもしくは治療的かにより異なることができる。予防的適用において、比較的低い投薬量が長い期間にわたって比較的低い頻度の間隔で投与される。ある患者は、その生涯の残りにわたって処置を受け続ける。治療的適用において、疾患の進行を軽減するかもしくは終わらせるまで、そして好ましくは患者が疾患の症状の部分的なもしくは完全な改善を示すまで比較的短い間隔で比較的高い投薬量が必要とされることもある。その後、患者に予防的処方計画を施すことができる。
免疫原をコードする核酸の用量は、患者当たり約１０ｎｇ〜１ｇ、１００ｎｇ〜１００ｍｇ、１μｇ〜１０ｍｇもしくは３０〜３００μｇのＤＮＡである。感染性ウイルスベクターの用量は、用量当たり１０〜１００もしくはそれ以上のビリオンと異なる。
免疫反応を誘導する薬剤は、予防的および／もしくは治療的処置のために非経口、局所、静脈内、経口、皮下、動脈内、頭蓋内、髄腔内、腹腔内、鼻腔内もしくは筋肉内手段により投与することができる。他の経路は同等に有効であることができるが免疫原性薬剤の投与の最も典型的な経路は皮下である。次に最も一般的な経路は筋肉内注射である。このタイプの注射は最も典型的には腕もしくは脚筋肉において行われる。ある方法において、
薬剤は沈着物が蓄積している特定の組織に直接注射される、例えば頭蓋内注射。筋肉内注射もしくは静脈内注射は、抗体の投与のために好ましい。ある方法において、特定の治療抗体は頭蓋に直接注射される。ある方法において、抗体は持続放出組成物もしくは装置、例えばＭｅｄｉｐａｄTM装置として投与される。
上記のように、それぞれアルファ−ＳＮおよびＡβに対する免疫原性反応を誘導する薬剤を組み合わせて投与することができる。薬剤は、同時、逐次もしくは別個使用のために単一の製剤もしくはキットにおいて組み合わせることができる。薬剤は製剤もしくはキットにおいて別個のバイアルを占めることができ、または単一のバイアルにおいて組み合わせることができる。本発明のこれらの薬剤は、場合により、ＬＢＤの処置において少なくとも部分的に有効である他の薬剤と組み合わせて投与してもよい。ＬＢが脳に生じる、パーキンソン病およびダウン症候群の場合、本発明の薬剤はまた血液脳関門を越える本発明の薬剤の通過を増加する他の薬剤と併せて投与することもできる。
ペプチドのような本発明の免疫原性薬剤は、アジュバントと組み合わせて投与されることもある。免疫反応を引き起こすために、様々なアジュバントをアルファ−ＳＮのようなペプチドと組み合わせて用いることができる。好ましいアジュバントは、反応の質的形態に影響を及ぼす免疫原における構造変化を引き起こさずに免疫原に対する固有の反応を増大させる。好ましいアジュバントには、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウム、３Ｄｅ−Ｏ−アシル化モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬTM）（ＧＢ２２２０２１１（ＲＩＢＩ ＩｍｍｕｎｏＣｈｅｍ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｍｏｎｔａｎａ、現在はＣｏｒｉｘａの一部）を参照）が包含される。ＳｔｉｍｕｌｏｎTM ＱＳ−２１は、南アメリカにおいて見られるキラヤ・サポナリア・モリナ（Ｑｕｉｌｌａｊａ
Ｓａｐｏｎａｒｉａ Ｍｏｌｉｎａ）の木の樹皮から単離されたトリテルペングリコシドもしくはサポニンである（Ｋｅｎｓｉｌ ｅｔ ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ：Ｔｈｅ Ｓｕｂｕｎｉｔ ａｎｄ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ａｐｐｒｏａｃｈ（ｅｄｓ．Ｐｏｗｅｌｌ ＆ Ｎｅｗｍａｎ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９９５）；米国特許第５，０５７，５４０号を参照）、（Ａｑｕｉｌａ ＢｉｏＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ）。他のアジュバントは、場合によりモノホスホリル脂質Ａ（Ｓｔｏｕｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３６，８６−９１（１９９７）を参照）、プルロニックポリマーおよび死菌のような免疫刺激剤と組み合わせた、水中油滴型エマルジョン（スクアレンもしくはピーナッツ油のような）である。別のアジュバントはＣｐＧ（ＷＯ９８／４０１００）である。あるいはまた、アルファ−ＳＮもしくはＡβをアジュバントに連結することができる。しかしながら、そのような連結は、それに対する免疫反応の性質に影響を及ぼすようにアルファ−ＳＮの構造を実質的に変えるべきではない。アジュバントは活性薬剤と共に治療組成物の成分として投与することができ、または治療薬の投与の前に、それと同時にもしくはその後に別個に投与することができる。
アジュバントの好ましいクラスは、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムのようなアルミニウム塩（ａｌｕｍ）である。そのようなアジュバントは、ＭＰＬもしくは３−ＤＭＰ、ＱＳ−２１、ポリマーもしくはモノマーアミノ酸、例えばポリグルタミン酸もしくはポリリシンのような他の特定の免疫刺激剤と共にもしくはそれなしに使用することができる。アジュバントの別のクラスは、水中油滴型エマルジョン製剤である。そのようなアジュバントは、ムラミルペプチド（例えば、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）、Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−Ａｌ−Ｄ−イソグル−Ｌ−Ａｌ
ａ−ジパルミトキシプロピルアミド（ＤＴＰ−ＤＰＰ）テラミド（ｔｈｅｒａｍｉｄｅ）ＴＭ）、もしくは他の細菌細胞壁成分のような他の特定の免疫刺激剤と共にもしくはそれなしに用いることができる。水中油滴型エマルジョンには、（ａ）Ｍｏｄｅｌ １１０Ｙマイクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，Ｎｅｗｔｏｎ ＭＡ）のようなマイクロフルイダイザーを用いてサブミクロン粒子に調合される５％のスクアレン、０．５％のＴｗｅｅｎ ８０および０．５％のＳｐａｎ ８５を含有する（場合により様々な量のＭＴＰ−ＰＥを含有してもよい）ＭＦ５９（ＷＯ９０／１４８３７）、（ｂ）サブミクロンエマルジョンに顕微溶液化されるかもしくはより大きい粒径のエマルジョンを生成するようにボルテックスされる、１０％のスクアレン、０．４％のＴｗｅｅｎ ８０、５％のプルロニック−ブロックポリマーＬ１２１およびｔｈｒ−ＭＤＰを含有するＳＡＦ、ならびに（ｃ）２％のスクアレン、０．２％のＴｗｅｅｎ ８０ならびにモノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）および細胞壁骨格（ＣＷＳ）よりなる群からの１つもしくはそれ以上の細菌細胞壁成分、好ましくはＭＰＬ＋ＣＷＳ（ＤｅｔｏｘTM）を含有するＲｉｂｉTMアジュバントシステム（ＲＡＳ）、（Ｒｉｂｉ ＩｍｍｕｎｏＣｈｅｍ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＭＴ）が包含される。
好ましいアジュバントの別のクラスは、ＳｔｉｍｕｌｏｎTM（ＱＳ−２１，Ａｑｕｉｌａ，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ）もしくはそれから生成される粒子、例えばＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体）およびＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸのようなサポニンアジュバントである。他のアジュバントには、ＲＣ−５２９、ＧＭ−ＣＳＦならびに完全フロインドアジュバント（ＣＦＡ）および不完全フロインドアジュバント（ＩＦＡ）が包含される。他のアジュバントには、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３およびＩＬ−１５）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）のようなサイトカインが包含される。アジュバントの別のクラスは、免疫調節剤もしくはアジュバントとしての、Ｎ−グリコシルアミド、Ｎ−グリコシル尿素およびＮ−グリコシルカルバメートを包含する糖脂質アナログであり、これらの各々はアミノ酸により糖残基において置換される（米国特許第４，８５５，２８３号を参照）。熱ショックタンパク質、例えばＨＳＰ７０およびＨＳＰ９０もまたアジュバントとして用いることができる。
アジュバントは単一の組成物として免疫原と共に投与することができ、または免疫原の投与の前に、それと同時にもしくは後に投与することができる。免疫原およびアジュバントは同じバイアルにおいて包装しそして供給することができ、もしくは別個のバイアルにおいて包装しそして使用前に混合することができる。免疫原およびアジュバントは、典型的に、意図される治療用途を示すラベルと共に包装される。免疫原およびアジュバントが別個に包装される場合、包装は使用前に混合するための説明書を典型的に含む。アジュバントおよび／もしくは担体の選択は、アジュバントを含有する免疫原性製剤の安定性、投与の経路、投与スケジュール、ワクチン接種する種に対するアジュバントの効能により決まり、そしてヒトにおいて、製薬学的に許容しうるアジュバントは、認可されているかもしくは関連する規制機関によりヒト投与に承認可能なものである。例えば、完全フロインドアジュバントはヒト投与に適当でない。Ａｌｕｍ、ＭＰＬおよびＱＳ−２１は好ましい。場合により、２つもしくはそれ以上の異なるアジュバントを同時に使用することができる。好ましい組み合わせには、ＭＰＬとａｌｕｍ、ＱＳ−２１とａｌｕｍ、ＱＳ−２１とＭＰＬ、ＧＭ−ＣＳＦとＭＰＬもしくはＲＣ−５２９、ならびに一緒にａｌｕｍ、ＱＳ−２１およびＭＰＬが包含される。また、場合によりａｌｕｍ、ＱＳ−２１およびＭＰＬのいずれかならびにその全ての組み合わせと組み合わせて、不完全フロインドアジュバントを用いることができる（Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ３２，１７３−１８６（１９９８））。
本発明の薬剤は、活性治療薬および様々な他の製薬学的に許容しうる成分を含んでなる製薬学的組成物として投与されることが多い。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ（第１５版，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，１９８０）を参照。従って、任意の薬剤（例えば、アルファシヌクレインのフラグメントもしくはスファシヌクレインに特異的に結合する抗体）をシヌクレイノパチー疾患の処置のための薬剤の製造において用いることができる。好ましい形態は、意図される投与形態および治療用途により決まる。組成物はまた、所望の製剤により、製薬学的に許容しうる無毒の担体もしくは希釈剤を含むこともでき、それらは動物もしくはヒト投与のための製薬学的組成物を調合するために一般に使用される賦形剤として定義される。希釈剤は、組み合わせの生物学的活性に影響を及ぼさないように選択される。そのような希釈剤の例は、蒸留水、生理リン酸緩衝食塩水、リンガー溶液、デキストロース溶液およびハンクス溶液である。さらに、製薬学的組成物もしくは製剤はまた他の担体、アジュバントもしくは無毒の非治療的非免疫原性安定剤などを含むこともできる。
製薬学的組成物はまた、タンパク質、多糖、例えばキトサン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸およびコポリマー（ラテックス機能化セファロース（ＴＭ）、アガロース、セルロースなどのような）、ポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマー、ならびに脂質凝集体（油滴もしくはリポソームのような）のような大きいゆっくり代謝される巨大分子を含むこともできる。さらに、これらの担体は免疫刺激剤（すなわち、アジュバント）として機能することができる。
非経口投与には、本発明の薬剤は水、油、食塩水、グリセロールもしくはエタノールのような滅菌液であることができる製薬学的担体を有する生理学的に許容しうる希釈剤における該物質の溶液もしくは懸濁液の注射可能な投薬量として投与することができる。さらに、湿潤剤もしくは乳化剤、界面活性剤、ｐＨ緩衝物質などのような補助物質が組成物に存在することができる。製薬学的組成物の他の成分は、石油、動物、植物もしくは合成由来のもの、例えば、ピーナッツ油、ダイズ油および鉱油である。一般に、特に注射可能な溶液には、プロピレングリコールもしくはポリエチレングリコールのようなグリコールが好ましい液状担体である。抗体は、有効成分の持続放出を可能にするように調合することができるデポー注射もしくは埋め込み製剤の形態で投与することができる。典型的な組成物は、ＨＣｌでｐＨ６．０に調整した、５０ｍＭのＬ−ヒスチジン、１５０ｍＭのＮａＣｌからなる水性バッファーにおいて調合した、５ｍｇ／ｍＬのモノクローナル抗体を含んでなる。非経口投与用の組成物は、典型的に、実質的に無菌であり、実質的に等張であり、そしてＦＤＡもしくは同様の機関のＧＭＰ条件下で製造される。例えば、生物製剤を含有する組成物は典型的に濾過滅菌により滅菌される。組成物は、単回投与用に調合することができる。
典型的に、組成物は注射物質として、液状溶液もしくは懸濁液のいずれかとして製造され；注射前の液状賦形剤における溶解もしくは懸濁に適当な固形形態もまた製造することができる。製剤はまた、上記に説明したように、強化されたアジュバント効果のためにリポソームもしくはミクロ粒子、例えばポリラクチド、ポリグリコリドもしくはコポリマーに乳化するかもしくはカプセル封入することもできる（Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９，１５２７（１９９０）およびＨａｎｅｓ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２８，９７−１１９（１９９７）を参照）。本発明の薬剤は、有効成分の持続もしくはパルス放出を可能にするように調合することができるデポー注射もしくは埋め込み製剤の形態で投与することができる。組成物は、単位投与形態物（すなわち、製剤は１人の患者への１回の投薬量のための有効成分の十分な量を含有する）において調合することができる。
他の投与形態に適当な追加の製剤には、経口、鼻腔内および肺内製剤、座薬ならびに経皮適用が包含される。
座薬では、結合剤および担体には例えばポリアルキレングリコールもしくはトリグリセリドが包含され；そのような座薬は０．５％〜１０％、好ましくは１％〜２％の範囲の有効成分を含有する混合物から形成することができる。経口製剤は、製薬学的等級のマンニトール、ラクトース、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロースおよび炭酸マグネシウムのような賦形剤を含む。これらの組成物は液剤、懸濁剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、持続放出製剤もしくは散剤の形態をとり、そして１０％〜９５％、好ましくは２５％〜７０％の有効成分を含有する。
局所適用は、経皮もしくは皮内送達をもたらすことができる。局所投与は、コレラ毒素またはその無毒化誘導体もしくはサブユニットまたは他の同様な細菌毒素と薬剤との共投与により促進することができる（Ｇｌｅｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３９１，８５１（１９９８）を参照）。共投与は、混合物としてまたは化学架橋もしくは融合タンパク質としての発現により得られる連結分子として成分を用いることにより成し遂げることができる。
あるいはまた、経皮送達は皮膚パッチを用いてもしくはトランスフェロソームを用いて成し遂げることができる（Ｐａｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５，３５２１−２４（１９９５）；Ｃｅｖｃ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １３６８，２０１−１５（１９９８））。
ＶＩＩＩ．モニタリングの方法および診断の方法
本発明は、ＬＢＤを患っているかもしくはそれにかかりやすい患者におけるアルファ−ＳＮペプチドおよび／もしくはＡβペプチドに対する免疫反応を検出する方法を提供する。該方法は、患者に投与されている処置の経過をモニターするために特に有用である。該方法はまた、症状を示す患者への治療的処置および無症状患者への予防的処置の両方をモニターするために用いることができる。該方法は、能動免疫（例えば、免疫原の投与に反応して生産される抗体）および受動免疫（例えば、投与した抗体のレベルを測定すること）の両方をモニターするために有用である。
１．能動免疫
ある方法は、薬剤の投薬量を投与する前に患者における免疫反応のベースライン値を決定すること、そしてこれを処置後の免疫反応の値と比較することを伴う。免疫反応シグナルの値における有意な増加（すなわち、そのような測定の平均からの１標準偏差として表される、同じサンプルの反復測定における実験誤差の典型的な限界より大きい）は、陽性処置結果（すなわち、薬剤の投与が免疫反応を成し遂げるかもしくは増大していること）を示す。免疫反応の値が有意に変化しないか、もしくは減少する場合、陰性処置結果が示される。一般に、免疫原性薬剤での最初の処置過程を受けている患者は、連続投薬量で免疫反応の増加を示すことが予想され、それは最終的にプラトーに達する。薬剤の投与は、免疫反応が増加している間は一般に続けられる。プラトーの達成は、処置の投与を中止するかまたは投薬量もしくは頻度を減らすことができる指標である。
他の方法において、免疫反応のコントロール値（すなわち、平均および標準偏差）がコントロール集団について決定される。典型的に、コントロール集団における個体は事前の処置を受けていない。次に、治療薬を投与した後の患者における免疫反応の測定値をコントロール値と比較する。コントロール値に対する有意な増加（例えば、平均からの１標準偏差より大きい）は、陽性処置結果を示す。有意な増加の欠如もしくは減少は、陰性処置結果を示す。薬剤の投与は、免疫反応がコントロール値に対して増加している間は一般に
続けられる。前述のように、コントロール値に対するプラトーの達成は、処置の投与を中止するかまたは投薬量もしくは頻度を減らすことができる指標である。
他の方法において、免疫反応のコントロール値（例えば、平均および標準偏差）は、治療薬での処置を受けておりそしてその免疫反応が処置に反応してプラトーに達している個体のコントロール集団から決定される。患者における免疫反応の測定値をコントロール値と比較する。患者における測定レベルがコントロール値と（例えば、１標準偏差より大きく）有意に異ならない場合、処置を中止することができる。患者におけるレベルがコントロール値より有意に下回る場合、薬剤の継続投与が必要とされる。患者におけるレベルがコントロール値より下回り続ける場合、処置処方計画の変更、例えば異なるアジュバントの使用が示唆され得る。
他の方法において、現在処置を受けていないが以前の処置過程を受けた患者は、処置の再開が必要とされるかどうかを決定するために免疫反応についてモニターされる。患者における免疫反応の測定値は、以前の処置過程後に患者において以前に得られた免疫反応の値と比較することができる。以前の測定に対する有意な減少（すなわち、同じサンプルの反復測定における誤差の典型的な限界より大きい）は、処置を再開できる指標である。あるいはまた、患者において測定される値は、処置過程を受けた後の患者の集団において決定されるコントロール値（平均＋標準偏差）と比較することができる。あるいはまた、患者における測定値は、疾患の症状がないままである予防的に処置した患者の集団、もしくは疾患の特徴の改善を示す治療的に処置した患者の集団におけるコントロール値と比較することができる。これらの場合の全てにおいて、コントロールレベルに対する有意な減少（すなわち、標準偏差より多い）は、患者において処置を再開すべきであることの指標である。
分析のための組織サンプルは、典型的に、患者からの血液、血漿、血清、粘液もしくは脳脊髄液である。サンプルは任意の形態のアルファ−ＳＮ、典型的にはＮＡＣ、もしくはＡβに対する免疫反応の表示について分析される。免疫反応は、例えば、アルファ−ＳＮもしくはＡβに特異的に結合する抗体もしくはＴ細胞の存在から決定することができる。アルファ−ＳＮに特異的な抗体を検出するＥＬＩＳＡ方法は、実施例の節に記述される。反応性Ｔ細胞を検出する方法は、上に記述されている（定義を参照）。ある方法において、免疫反応は上記の節ＩＩＩに記述されるような除去アッセイを用いて決定される。そのような方法において、試験されている患者からの組織もしくは血液サンプルをＬＢ（例えば、シヌクレイン／ｈＡＰＰトランスジェニックマウスから）およびＦｃ受容体を保有する食細胞と接触させる。次に、ＬＢのその後の除去をモニターする。除去反応の存在および程度は、試験下の患者の組織サンプルにおけるアルファ−ＳＮを除去するために有効な抗体の存在およびレベルの指標を提供する。
２．受動免疫
一般に、受動免疫をモニターする方法は上記の能動免疫をモニターするものと同様である。しかしながら、受動免疫後の抗体プロフィールは典型的に抗体濃度の即時のピーク、続いて指数関数的減衰を示す。さらなる投薬量なしに、減衰は投与した抗体の半減期により数日〜数か月の期間内に処置前レベルに近づく。例えば、あるヒト抗体の半減期は２０日の次数のものである。
ある方法において、患者におけるアルファ−ＳＮに対する抗体のベースライン測定は投与前に行われ、第二の測定はピーク抗体レベルを決定するためにその後すぐに行われ、そして１つもしくはそれ以上のさらなる測定は抗体レベルの減衰をモニターするために間隔をおいて行われる。抗体のレベルがベースラインもしくはベースラインを差し引いたピークの既定パーセンテージ（例えば、５０％、２５％もしくは１０％）まで減少している場
合、抗体のさらなる投薬量の投与が施される。ある方法において、ピークもしくはその後のバックグラウンドを差し引いた測定レベルは、他の患者における有益な予防的もしくは治療的処置処方計画を構成することが以前に決定された基準レベルと比較される。測定される抗体レベルが基準レベルより有意に少ない（すなわち、処置から恩恵を受ける患者の集団における基準値の平均−１標準偏差より少ない）場合、抗体の追加投薬量の投与が示唆される。
３．診断キット
本発明はさらに、上記の診断方法を行うための診断キットを提供する。典型的に、そのようなキットはアルファ−ＳＮに対する抗体に特異的に結合する薬剤を含有する。キットはまた、標識を含むこともできる。アルファ−ＳＮに対する抗体の検出用には、標識は典型的に標識された抗イディオタイプ抗体の形態である。抗体の検出用に、薬剤はマイクロタイター皿のウェルのような固相に事前に結合して供給することができる。キットはまた、キットの用法を提供する表示も典型的に含有する。表示はまた、アルファ−ＳＮに対する抗体のレベルと測定される標識のレベルを相関させる図表もしくは他の対応処方計画（ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ ｒｅｇｉｍｅ）を含むこともできる。表示という用語は、その製造、輸送、販売もしくは使用中の任意の時点でキットに添付されるかもしくはそうでなければ付随する任意の書かれたもしくは記録された資料をさす。例えば、表示という用語には広告リーフレットおよびパンフレット、包装材料、説明書、オーディオもしくはビデオカセット、コンピューターディスクならびにキット上に直接記された文書が包含される。
本発明はまた、インビボ画像化を行うための診断キットも提供する。そのようなキットは例えばＮＡＣ内の、アルファ−ＳＮのエピトープに結合する抗体を典型的に含有する。好ましくは、抗体は標識されるかもしくは二次標識試薬がキットに含まれる。好ましくは、キットにはインビボ画像化アッセイを行うための説明書が付けられる。
１つの態様において、抗体はｍＡｂ ６Ｈ７、ｍＡｂ ８Ａ５、ｍＡｂ ９Ｅ４、ｍＡｂ １Ｈ７もしくはｍＡｂ １１Ａ５またはその結合フラグメントから選択される。上記の抗アルファシヌクレイン抗体はまた、その全内容が引用することにより本明細書に組み込まれる、米国特許公開第２００５１９６８１８に記述されるようなアッセイにおいて用いることもできる。
ＩＸ．インビボ画像化
本発明は、患者におけるＬＢをインビボ画像化する方法を提供する。そのような方法は、ＰＤもしくは脳におけるＬＢの存在と関連する他の疾患、またはそれに対する感受性を診断するかもしくはその診断を裏付けるために有用である。例えば、該方法は認知症の症状を提示する患者に対して用いることができる。患者がＬＢを有する場合、患者は例えばＰＤを患っている可能性がある。該方法はまた、無症状の患者に対して用いることもできる。アミロイドの異常な沈着物の存在は、将来の症候性疾患に対する感受性を示唆する。該方法はまた、パーキンソン病と以前に診断されている患者における疾患の進行および／もしくは処置に対する反応をモニターするためにも有用である。
該方法は、患者におけるアルファ−ＳＮに結合する抗体のような試薬を投与しそして次にそれが結合した後に薬剤を検出することにより機能する。好ましい抗体は、全長ＮＡＣＰポリペプチドに結合せずに患者におけるアルファ−ＳＮ沈着物に結合する。ＮＡＣ内のアルファ−ＳＮのエピトープに結合する抗体は特に好ましい。所望に応じて、Ｆａｂのような、全長定常領域を欠く抗体フラグメントを用いることにより除去反応を防ぐことができる。ある方法において、同じ抗体が処置および診断試薬の両方として働くことができる。一般に、おそらくＮ末端のエピトープはＬＢにおいて近づき難いので（Ｓｐｉｌｌａｎ
ｔｉｎｉ ｅｔ ａｌ ＰＮＡＳ，１９９８）、アルファ−ＳＮのＮ末端のエピトープに結合する抗体は、Ｃ末端のエピトープに結合する抗体ほど強いシグナルを示さない。従って、そのような抗体はあまり好ましくない。
診断試薬は、患者の体内に静脈内注射により、または頭蓋内注射によりもしくは頭蓋骨に穴を開けることにより脳内に直接投与することができる。試薬の投薬量は、処置方法についてと同じ範囲内であるべきである。ある方法において、アルファ−ＳＮに対する親和性を有する一次試薬は標識されずそして二次標識薬剤が一次試薬に結合するために用いられるが、典型的に、試薬は標識される。標識の選択は、検出の手段により決まる。例えば、蛍光標識は光学検出に適している。常磁性標識の使用は、外科的介入のない断層撮影検出に適している。放射性標識もまた、ＰＥＴもしくはＳＰＥＣＴを用いて検出することができる。
診断は、対応するベースライン値に標識された場所の数、サイズおよび／もしくは強度を比較することにより行われる。ベースライン値は、非罹患個体の集団における平均レベルを表すことができる。ベースライン値はまた、同じ患者において決定された以前のレベルを表すこともできる。例えば、処置を開始する前にベースライン値を患者において決定し、そしてその後で測定値をベースライン値と比較することができる。ベースラインシグナルに対する値の減少は、処置に対する陽性反応を示す。
実施例Ｉ． ヒトアルファ−シヌクレインでのヒトアルファ−シヌクレイントランスジェニックマウスの免疫は、血管脳関門を越える高力価の抗アルファ−シヌクレイン抗体の生産をもたらす
全長組換えヒトアルファ−ＳＮを１Ｘリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に１ｍｇ／ｍｌの濃度で再懸濁した。各注射用に、５０μｌのアルファ−ＳＮを使用し；注射当たり５０μｇの最終濃度を与え、それに１５０μｌの１Ｘ ＰＢＳを加えた。次に、完全フロインドアジュバント（ＣＦＡ）をアルファ−ＳＮもしくはＰＢＳのみ（コントロール）のいずれかに１：１で加え、ボルテックスし、そして超音波処理してエマルジョンを完全に再懸濁した。最初の注射には、８匹のＤ系ヒトアルファ−ＳＮトランスジェニック（ｔｇ）単一トランスジェニック４〜７か月齢マウス（Ｍａｓｌｉａｈ，ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８７：１２６５−１２６９（２０００））にＣＦＡ中のヒトアルファ−ＳＮの注射を与え、そしてコントロールとして４匹のＤ系ヒトアルファ−ＳＮ ｔｇマウスにＣＦＡ中のＰＢＳの注射を与えた。マウスに合計６回の注射を与えた。３回の注射は２週間隔で、そして次に３回の注射は１か月間隔で行った。実験の開始後５カ月で動物の人道的扱いに関するＮＩＨガイドラインを用いて動物を屠殺した。抗体力価の測定用に血液サンプルを集めた後、脳をＰＢＳ中４％のパラホルムアルデヒドにおいて４日間浸漬固定した。ＥＬＩＳＡによるヒトアルファ−ＳＮに対する抗体のレベルを表１に示す。処置したマウスを力価により２群に分ける。第一群は、２〜８，０００の中等度の力価を生じた。第二群は、１２０００〜３００００の高い力価を生じた。コントロールマウスにおいて力価は見出されなかった。高い力価をもたらすマウスはシヌクレイン封入体のサイズの顕著な減少を有することが神経病理学的解析により示された。中等度の力価をもたらすマウスは、より小さい減少を示した。図２（パネルａ〜ｄ）は、（ａ）非トランスジェニックマウス、（ｂ）ＣＦＡのみで処置したトランスジェニックマウス、（ｃ）中等度の力価を生じたアルファシヌクレインおよびＣＦＡで免疫したトランスジェニックマウスならびに（ｄ）より高い力価を生じたアルファシヌクレインおよびＣＦＡで免疫したトランスジェニックマウスにおけるシヌクレイン封入体を示す。抗ヒトアルファ−ＳＮ抗体で免疫染色することによりサンプルを視覚化した。図２は、パネル（ｂ）においてシヌクレイン封入体を示すが、パネル（ａ）ではそうでない。中等度の力価の処置マウスのパネル（ｃ）において、封入体は強度がいくらか減少している。パネル（ｄ）において、封入体は強度が顕著に減少し
ている。パネル（ｅ）〜（ｈ）は、それぞれパネル（ａ）〜（ｄ）と同じ４匹のマウスの脳における抗ＩｇＧのレベルを示す。ＩｇＧはパネル（ｇ）にそしてより大きい程度にパネル（ｈ）に存在することが分かる。データは、末梢投与したアルファ−ＳＮに対する抗体が血液脳関門を越えそして脳に到達することを示す。パネル（ｉ）〜（ｌ）は、図の最初の２列と同じ４匹のマウスについて再び、星状膠細胞のマーカー、ＧＡＰについての染色を示す。パネル（ｋ）および（ｌ）は、（ｉ）および（ｊ）と比較して適度に増加した染色を示すことが分かる。これらのデータは、シヌクレイン沈着物の除去には軽度の星状膠および小グリア反応が不随して起こることを示す。
Figure 0005952331
実施例ＩＩ． シヌクレイン封入体を除去する抗体についてのインビトロスクリーニング
ＧＴ１−７ニューロン細胞（Ｈｓｕｅ ｅｔ ａｌ．Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５７：４０１−４１０（２０００））をマウスアルファ−ＳＮを発現するｐＣＲ３．１−Ｔ発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）でトランスフェクションし、そして発現ベクターのみでトランスフェクションした細胞と比較した（それぞれ、図３、ＢおよびＡ）。ベクターのみでトランスフェクションした細胞（Ａ）は線維芽細胞様外観を有し、一方、アルファ−ＳＮでトランスフェクションした細胞は丸く、細胞表面での封入体が光学および共焦点走査型顕微鏡検査の両方によって見える。次に、トランスフェクションした細胞をウサギ免疫前血清（図３Ｃ）もしくはマウスアルファ−ＳＮ Ｃ末端残基１３１〜１４０に対する親和性精製したウサギポリクローナル抗体、６７−１０（Ｉｗａｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ １４：４６７（１９９５））（図３Ｄ）で処置した。封入体はパネルＣにおけるよりもパネルＤにおいて弱く（ｌｅｓｓ ｓｔｒｏｎｇｌｙ）染まることが分かり、アルファシヌクレインに対する抗体は封入体を除去することもしくはその発生を防ぐことにおいて有効であったことを示す。図４は、ウサギ免疫前血清および６７−１０ポリクローナル抗体で処置したＧＴ１−７トランスフェクション細胞の粒子および細胞質画分のゲル分析を示す。細胞質画分におけるシヌクレインレベルは、免疫前血清もしくはアルファ−ＳＮに対する抗体での処置によりほとんど変化していないことが分かる。しかしながら、アルファ−ＳＮバンドは、アルファ−ＳＮに対する抗体で処置したＧＴ１−７細胞の膜画分において消失する。これらのデータは、アルファシヌクレイン抗体活性が細胞膜と結合するシヌクレインのクリアランスをもたらすことを示す。
トランスフェクションしたＧＴ１−７細胞は、図３におけるような免疫組織化学分析、
光学顕微鏡検査によるかもしくは図４におけるようなゲル分析によるいずれかでの検出でシヌクレイン封入体を除去することにおける活性について抗体をスクリーニングするために用いることができる。
実施例ＩＩＩ． アルファ−シヌクレインでの免疫の予防的および治療的効能
ｉ．ヒトアルファ−シヌクレインｔｇマウスの免疫
本研究のために、ヘテロ接合体ヒトアルファ−ＳＮトランスジェニック（ｔｇ）マウス（Ｄ系）（Ｍａｓｌｉａｈ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８６：１２６５−６９）および非トランスジェニック（ｎｏｎｔｇ）コントロールを用いる。実験動物を３群に分ける。群Ｉでは、２か月の年齢で開始して８か月間マウスを免疫することによる早期免疫の予防的効果を試験する。群ＩＩでは、若年成体マウスに６か月の年齢で開始して８か月間ワクチン接種していったん中等度の病変が確立されると免疫が疾患の進行を軽減することができるかどうかを決定する。群ＩＩＩでは、より高齢のマウスに１２か月の年齢で開始して４か月間免疫していったん強固な病変が確立されると免疫が症状の重症度を軽減することができるかどうかを決定する。全ての群について、マウスを組換えヒトアルファ−ＳＮ＋ＣＦＡもしくはＣＦＡのみで免疫し、そして各実験について２０匹のｔｇおよび１０匹のｎｏｎｔｇマウスを使用する。それらのうち、１０匹のｔｇマウスにはヒトアルファ−ＳＮ＋ＣＦＡで、そして他の１０匹のｔｇにはＣＦＡのみで免疫する。同様に、５匹のｎｏｎｔｇマウスにはヒトアルファ−ＳＮ＋ＣＦＡで、そして他の５匹はＣＦＡのみで免疫する。簡潔に言えば、免疫プロトコルはＣＦＡ中の精製された組換えヒトアルファ−ＳＮ（２ｍｇ／ｍｌ）での最初の注射、続いてＩＦＡと組み合わせたヒトアルファ−ＳＮでの１か月後の再注射からなる。次に、マウスに１か月に１回この混合物を再注射する。ヒトアルファ−ＳＮ ｔｇ（ｎ＝３／各々；６か月齢）およびｎｏｎｔｇ（ｎ＝３／各々；６か月齢）マウスの小サブセットにおいて、マウス（ｍ）アルファ−ＳＮ、ヒトベータシヌクレインもしくは突然変異体（Ａ５３Ｔ）ヒトアルファ−ＳＮでの免疫からなる追加の実験を行う。
アルファ−ＳＮ抗体のレベルは、炭酸ナトリウムバッファー、ｐＨ９．６において４℃で一晩のインキュベーションによりウェル当たり０．４μｇの精製された全長アルファ−ＳＮを被覆した９６ウェルマイクロタイタープレートを用いて決定する。０．１％のＴｗｅｅｎを含有する各２００μＬのＰＢＳでウェルを４Ｘ洗浄し、そして３７℃でＰＢＳ−１％ＢＳＡにおいて１時間ブロックする。血清サンプルをＡ列から開始し、１：１５０から１：３２８，０５０希釈まで、１：３で「ウェルにおいて」連続希釈する。コントロール実験では、マウスモノクローナル抗体のサンプルをアルファ−ＳＮ、タンパク質なしおよびバッファーのみのブランクに対して行う。サンプルを４℃で一晩インキュベーションし、続いてヤギ抗マウスＩｇＧアルカリホスファターゼ結合抗体（１：７５００、Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）と２時間インキュベーションする。次に、Ａｔｔｏ−ｐｈｏｓRアルカリホスファターゼ蛍光基質を室温で３０分間加える。プレートを４５０ｎｍの励起波長および５５０ｎｍの発光波長で読み取る。相対蛍光単位を縦座標上そして血清希釈を横座標上で片対数グラフ上に結果をプロットする。抗体力価は、最大の抗体結合から５０％の減少があった希釈として定義される。
各群について、処置の最後に、記載のとおり（Ｍａｓｌｉａｈ，ｅｔ ａｌ．（２０００））、マウスはロータロッドにおける運動評価を受ける。分析後に、マウスを安楽死させ、そして下記のような詳細な神経化学および神経病理学的解析用に脳を取り出す。簡潔に言えば、ウェスタンブロットによる凝集および非凝集ヒトアルファ−ＳＮ免疫反応性の測定のために右半脳を凍結させそして均質化する（Ｍａｓｌｉａｈ，ｅｔ ａｌ．（２０００））。免疫細胞化学および超微細構造解析のために左半脳を４％パラホルムアルデヒドにおいて固定し、ビブラトームにおいて連続切片にする。
ｉｉ．免疫細胞化学および神経病理学的解析
免疫が減少するかどうかを決定するために、ヒトアルファ−ＳＮ凝集切片をヒトアルファ−ＳＮに対するウサギポリクローナル抗体（１：５００）で免疫染色する。４℃で一晩のインキュベーション後に、切片をビオチニル化した抗ウサギ二次抗体、続いてアビジンＤ−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）複合体（１：２００、ＡＢＣ Ｅｌｉｔｅ，Ｖｅｃｔｏｒ）とインキュベーションする。切片をまた、ビオチニル化した抗ウサギ、マウスもしくはヒト二次抗体のみでも免疫染色する。抗マウス二次抗体での実験は、ヒトアルファ−ＳＮに対する抗体が脳に入るかどうかを決定する。反応は０．００１％のＨ2Ｏ2を有する５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）中０．１％の３，３−ジアミノベンジジン４塩酸塩（ＤＡＢ）で視覚化し、そして次に切片をエンテラン下でスライド上に載せる。Ｑｕａｎｔｉｍｅｔ ５７０Ｃを用いて光学デンシトメトリーにより免疫反応性のレベルを半定量的に評価する。これらの切片はまた、アルファ−ＳＮ免疫反応性封入体の数を決定するために画像解析によっても調べられ、そしてアルファ−ＳＮ凝集のこの信頼できる測定はワクチン接種の抗凝集効果の重要な指標として働く（Ｍａｓｌｉａｈ，ｅｔ
ａｌ．（２０００））。
神経変性のパターンの分析は、シナプトフィジンおよび微小管結合タンパク質２（ＭＡＰ２）について二重免疫標識しそしてＬＳＣＭで視覚化したビブラトーム切片を利用して海馬、前頭皮質、側頭皮質および脳幹神経節におけるシナプスおよび樹状突起密度を分析することにより行われる。神経変性のさらなる分析は、以前に記述されたように（Ｍａｓｌｉａｈ，ｅｔ ａｌ．（２０００））尾状核被殻および黒質（ＳＮ）におけるチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）免疫反応性を決定することにより行われる。切片をＬＳＣＭで画像化し、そして直線範囲内の画素強度を示すＴＨ免疫反応性終末が含まれるように各個々の画像を相互に閾値化する。μｍ比率まで画素を決定するようにスケールを設定する。次に、この情報を用いてＴＨ免疫反応性終末により覆われる神経網の面積％を計算する。これらの同じ切片はまた、ＳＮにおけるＴＨニューロンの数を評価するためにも利用される。
免疫に対する免疫反応のパターンを評価するために、ヒトＧＦＡＰ、ＭＣＨクラスＩＩ、Ｍａｃ１、ＴＮＦ−アルファ、ＩＬ１ベータおよびＩＬ６に対する抗体での免疫細胞化学および超微細構造解析を組換えヒトアルファ−ＳＮおよびコントロール免疫原で免疫したｎｏｎｔｇおよびアルファ−ＳＮ ｔｇマウスの脳切片において行う。
ｉｉｉ．行動分析
以前に記述されたように（Ｍａｓｌｉａｈ，ｅｔ ａｌ．（２０００））、自発運動活性についてマウスをロータロッド（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）において２日間分析する。１日目にマウスを５回の試験にわたって：第１のものは１０ｒｐｍで、第２のものは２０ｒｐｍで、そして第３〜第５のものは４０ｒｐｍで訓練する。２日目に、マウスを各々４０ｒｐｍで７回の試験にわたって試験する。マウスを個々にシリンダー上に置き、そして回転の速度を２４０秒の期間にわたって０から４０ｒｐｍまで上げる。マウスがロッド上にとどまる時間の長さ（落下待ち時間）を記録し、そして運動機能の尺度として使用する。
実施例ＩＶ． アルファ−シヌクレインフラグメントでの免疫
どのエピトープが有効な反応を伝えるかを決定するために１０〜１３か月の年齢のヒトアルファ−ＳＮトランスジェニックマウスをアルファ−ＳＮの９つの異なる領域で免疫する。９つの異なる免疫原および１つのコントロールを上記のようにｉ．ｐ．注射する。免疫原には、全てシスチン結合を介してヒツジ抗マウスＩｇＧに連結される、４つのヒトアルファ−ＳＮペプチドコンジュゲートが包含される。アルファ−ＳＮおよびＰＢＳをそれぞれ陽性および陰性コントロールとして用いる。力価を上記のとおりモニターし、そして
３〜１２か月の注射の最後にマウスを安楽死させる。組織化学、アルファ−ＳＮレベルおよび毒物学的分析を死後に測定する。
ｉ．免疫原の製造
連結されたアルファ−ＳＮペプチドの製造：Ｈ アルファ−ＳＮペプチドコンジュゲートは、架橋試薬スルホ−ＥＭＣＳを用いてアルファ−ＳＮペプチドに付加された人工システインを介して連結することにより製造される。アルファ−ＳＮペプチド誘導体は、以下の最終アミノ酸配列で合成される。各場合において、挿入されるシステイン残基の位置を下線で示す。
アルファ−シヌクレイン６０〜７２（ＮＡＣ領域）ペプチド：
ＮＨ２−ＫＥＱＶＴＮＶＣＧＧＡＶＶＴ−ＣＯＯＨ（配列番号：５４）
アルファ−シヌクレイン７３〜８４（ＮＡＣ領域）ペプチド：
ＮＨ２−ＧＶＴＡＶＡＱＫＴＶＥＣＧ−ＣＯＯＨ（配列番号：５５）
アルファ−シヌクレイン１０２〜１１２ペプチド：
ＮＨ２−Ｃ−アミノ−ヘプタン酸−ＫＮＥＥＧＡＰＣＱＥＧ−ＣＯＯＨ（配列番号：５６）
アルファ−シヌクレイン１２８〜１４０ペプチド：
Ａｃ−ＮＨ−ＰＳＥＥＧＹＱＤＹＥＰＥＣＡ−ＣＯＯＨ（配列番号：５７）
カップリング反応の準備をするために、１０ｍｇのヒツジ抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を１０ｍＭのホウ酸ナトリウムバッファー、ｐＨ８．５に対して一晩透析する。次に、透析した抗体をＡｍｉｃｏｎ Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐチューブを用いて２ｍＬの容量まで濃縮する。１０ｍｇのスルホ−ＥＭＣＳ［Ｎ（ε−マレイミドカプロイルオキシ）スクシンイミド］（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏ．）を１ｍＬの脱イオン水に溶解する。４０倍モル過剰のスルホ−ＥＭＣＳをヒツジ抗マウスＩｇＧに攪拌しながら滴下して加え、そして次に溶液をさらに１０分間攪拌する。活性化されたヒツジ抗マウスＩｇＧを０．１ＭのＮａＰＯ4、５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ６．５で平衡化した１０ｍＬのゲル濾過カラム（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから入手した、Ｐｉｅｒｃｅ Ｐｒｅｓｔｏ Ｃｏｌｕｍｎ）上に通すことにより精製しそしてバッファー交換する。２８０ｎｍでの吸光度により同定される抗体含有画分をプールし、そして吸光係数として１．４ｍｇ／ＯＤを用いて約１ｍｇ／ｍＬの濃度に希釈する。１０ｍｇを最初に０．５ｍＬのＤＭＳＯに溶解しそして次に１０ｍＭのＮａＰＯ4バッファーで２０ｍＬに希釈するアルファ−ＳＮペプチドを除いて、４０倍モル過剰のアルファ−ＳＮペプチドを２０ｍＬの１０ｍＭ ＮａＰＯ4、ｐＨ８．０に溶解する。ペプチド溶液を各々１０ｍＬの活性化ヒツジ抗マウスＩｇＧに加え、そして室温で４時間振盪する。得られるコンジュゲートをＡｍｉｃｏｎ Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐチューブを用いて１０ｍＬ未満の最終容量まで濃縮し、そして次にＰＢＳに対して透析してバッファーをバッファー交換しそして遊離のペプチドを除く。コンジュゲートを滅菌のために０．２２μｍの細孔径のフィルターに通し、そして次に１ｍｇの画分に等分し、そして−２０℃で凍結保存する。コンジュゲートの濃度は、標準曲線にウマＩｇＧを用いてＢＣＡタンパク質アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を使用して決定する。連結は、活性化ヒツジ抗マウスＩｇＧのものに対して連結されたペプチドの分子量増加によって実証される。
実施例Ｖ． アルファ−シヌクレインに対する抗体での受動免疫
ヒトアルファ−ＳＮマウスに各々、以下に示されるようなＰＢＳ中０．５ｍｇの抗アルファ−ＳＮモノクローナル抗体を注射する。全ての抗体製剤は、低い内毒素レベルを有するように精製される。モノクローナル抗体は、アルファ−ＳＮのフラグメントもしくはより長い形態をマウスに注射し、ハイブリドーマを調製し、そしてアルファ−ＳＮの他の非重複フラグメントに結合せずにアルファ−ＳＮの所望のフラグメントに特異的に結合する
抗体についてハイブリドーマをスクリーニングすることによりフラグメントに対して製造することができる。
ＥＬＩＳＡ力価により測定される循環抗体濃度をアルファ−ＳＮもしくは他の免疫原に対するＥＬＩＳＡにより定義される１：１０００より大きく保つために４ヶ月の期間にわたって必要に応じてマウスにｉｐ注射する。力価を上記のとおりモニターし、そして６ヶ月の注射の最後にマウスを安楽死させる。組織化学、アルファ−ＳＮレベルおよび毒物学を死後に行う。
実施例ＶＩ． Ｓｙｎ／ＡＰＰトランスジェニックマウスのＡβ免疫
本実験は、３つのタイプのトランンスジェニックマウス：アルファシヌクレイン導入遺伝子（ＳＹＮ）を有するトランスジェニックマウス、ＡＰＰ導入遺伝子を有するＡＰＰマウス（Ｇａｍｅｓ ｅｔ ａｌ．）および単一のトランスジェニックを交配することにより作られる二重トランスジェニックＳＹＮ／ＡＰＰマウスへのＡβ免疫の効果を比較する。二重トランスジェニックマウスは、Ｍａｓｌｉａｈ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ＵＳＡ
９８：１２２４５−１２２５０（２００１）に記述される。これらのマウスは、アルツハイマー病およびパーキンソン病の両方にかかっている個体のモデルに相当する。表２は異なる群、研究に使用したマウスの年齢、処置方法およびＡβに対する抗体の力価を示す。３タイプ全てのマウスにおいて有意な力価を生じたことが分かる。図５は、顕微鏡検査による処置被験体からの脳切片の試験により決定される脳におけるＡβのアミロイド斑により被覆される面積％を示す。かなりの沈着物がＡＰＰおよびＳＹＮ／ＡＰＰマウスにおいて蓄積するが、ＳＹＮマウスもしくは非トランスジェニックコントロールにおいてはそうでない。沈着物は、ＳＹＮ／ＡＰＰ二重トランスジェニックマウスにおいていっそう大きい。Ａβ１〜４２での免疫は、ＡＰＰおよびＳＹＮ／ＡＰＰマウスの両方において沈着物を減少させる。図６は、共焦点レーザー走査型および光学顕微鏡検査により検出した場合のマウスの様々な群におけるシヌクレイン沈着物を示す。シヌクレイン沈着物は、ＣＦＡのみで処置したＳＹＮおよびＳＹＮ／ＡＰＰマウスにおいて蓄積する。しかしながら、Ａβ１〜４２およびＣＦＡで処置したマウスの同じタイプにおいて、シヌクレイン沈着物のレベルの顕著な減少がある。これらのデータは、Ａβでの処置がＡβ沈着物を除去することにおいてだけでなく、シヌクレインの沈着物を除去することにおいても有効であることを示す。従って、Ａβもしくはそれに対する抗体での処置は、アルツハイマー病だけでなく複合アルツハイマー・パーキンソン病、およびアルツハイマー病のない患者におけるパーキンソン病を処置することにおいても有用である。ＳＹＮ／ＡＰＰマウスにおける抗Ａβ抗体の力価は、シヌクレイン封入体の減少した形成と相関した（ｒ＝−０．７１、ｐ＜０．０１）。
Figure 0005952331
実施例ＶＩＩ．アミロイド沈着物に対する抗体の活性についてのエクスビボスクリーニングアッセイ
斑クリアランスへの抗体の効果を調べるために、初代小グリア細胞をＰＤＡＰＰマウスもしくはヒトＡＤ脳のいずれかの非固定クリオスタット切片と培養するエクスビボアッセイを確立した。小グリア細胞は、新生ＤＢＡ／２Ｎマウス（１〜３日）の大脳皮質から得られた。皮質を５０μｇ／ｍｌのＤＮアーゼＩ（Ｓｉｇｍａ）を有するＨＢＳＳ--（ハンクス平衡塩溶液、Ｓｉｇｍａ）において機械的に解離させた。解離した細胞を１００μｍの細胞濾過器（Ｆａｌｃｏｎ）で濾過し、そして１０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。ペレットを増殖培地（高グルコースＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、２５ｎｇ／ｍｌ ｒｍＧＭ−ＣＳＦ）に再懸濁し、そして細胞をＴ−７５プラスチック培養フラスコ当たり２個の脳の密度で平板培養した。７〜９日後に、フラスコをオービタルシェーカー上で３７℃で２００ｒｐｍで２ｈ回転させた。細胞懸濁液を１０００ｒｐｍで遠心分離し、そしてアッセイ培地に再懸濁した。
ＰＤＡＰＰマウスもしくはヒトＡＤ脳（死後間隔＜３ｈｒ）の１０μｍクリオスタット切片をポリリシンで被覆した丸いカバーガラス上に融解して載せ、そして２４ウェル組織培養プレートのウェルに置いた。カバーガラスを１％ＦＢＳ、グルタミン、ペニシリン／ストレプトマイシンおよび５ｎｇ／ｍｌのｒｍＧＭ−ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ）を有するＨ−ＳＦＭ（ハイブリドーマ−無血清培地、Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）からなるアッセイ培地で２回洗浄した。コントロールもしくは抗Ａβ抗体を２ｘ濃度（最終５μｇ／ｍｌ）で１時間加えた。次に、小グリア細胞を０．８ｘ１０6細胞／ｍｌアッセイ培地の密度で接種した。培養物を加湿インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ2）において２４ｈｒもしくはそれ以上維持した。インキュベーションの最後に、培養物を４％のパラホルムアルデヒドで固定し、そして０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００で透過化した。切片をビオチニル化３Ｄ６、続いてストレプトアビジン／Ｃｙ３コンジュゲート（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅａｅａｒｃｈ）で染色した。外来の小グリア細胞は、核染色（ＤＡＰＩ）により視覚化した。培養物を倒立蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ，ＴＥ３００）で観察し、そしてＳＰＯＴソフトウェア（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いてＳＰＯＴデジタルカメラで顕微鏡写真を撮った。ウェスタンブロット分析のために、培養物を８Ｍ尿素におい
て抽出し、還元トリシンサンプルバッファーにおいて１：１希釈し、そして１６％のトリシンゲル（Ｎｏｖｅｘ）上に載せた。イモビロン上への移動後に、ブロットを５μｇ／ｍｌのｐａｂＡβ４２、続いてＨＲＰ結合抗マウス抗体にさらし、そしてＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で現像した。
アッセイがＮＡＣに対する抗体の存在下でＰＤＡＰＰ脳切片で行われた場合、抗体の除去活性を示す斑の数およびサイズの顕著な減少が認められた。上記に説明したとおり、ＮＡＣに対する抗体をアミロイド斑を含有する脳組織サンプルおよび小グリア細胞と接触させた。ウサギ血清をコントロールとして用いた。
同じアッセイをＡβに対するいくつかの抗体の存在下でＰＤＡＰＰ脳切片で行った。エクスビボアッセイにおいて食作用を誘導するそして受動伝達研究においてインビボ斑負荷を減少させる抗体の能力を比較した。これらの結果は、インビボでの効能がＣＮＳ内の斑の直接抗体に媒介されるクリアランスによること、そしてエクスビボアッセイがインビボ効能を予測することを示す（ＷＯ００／７２８８０の実施例ＸＩＶの表１６および１７；ならびにＷＯ００７２８７６の実施例ＸＩＶ、表１６を参照、これらは両方とも全ての目的にために本明細書に引用することにより組み込まれる）。
実施例ＶＩＩＩ： アルファ−シヌクレインでの能動免疫
Ａ．材料および方法
ｈα−シヌクレインｔｇマウスのワクチン接種．本研究のために、血小板由来増殖因子−β（ＰＤＧＦβ）プロモーターの調節制御下でｈα−シヌクレインを発現するヘテロ接合体ｔｇマウス（Ｄ系）（Ｍａｓｌｉａｈ，２０００，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８７：１２６５−６９）を用いた。これらの動物は、脳におけるｈα−シヌクレイン免疫反応性封入体ならびにＬＢＤのある種の特徴を再現する神経変性および運動障害を発症するので、それらを選択した。実験動物を２群に分けた。第一群では、合計２０匹の幼若（３か月齢）ｔｇマウスを組換えｈα−シヌクレイン（ｎ＝１０）もしくはアジュバントのみ（ｎ＝１０）で８か月間免疫した。第二群では、合計２０匹の若年成体（６か月齢）ｔｇマウスを組換えｈα−シヌクレイン（ｎ＝１０）もしくはアジュバントのみ（ｎ＝１０）で８か月間免疫した。免疫プロトコルは、最初に、完全フロインドアジュバント（ＣＦＡ）と組換えｈα−シヌクレイン（８０μｇ／ｍｌ；１００μｌ）での注射からなった。２週後にマウスに不完全ＦＡとｈα−シヌクレイン（８０μｇ／ｍｌ；１００μｌ）とのもう１回の注射を与え、続いてリン酸緩衝食塩水中のｈα−シヌクレイン（８０μｇ／ｍｌ；１００μｌ）で１か月に１回（次の７か月にわたって）再注射した。組換えｈα−シヌクレインは、Ｍａｓｌｉａｈ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｎｅｕｒｏｎ ４６：８５７−６８に記載のとおり製造しそして精製し、内毒素に関して試験した。
抗体力価およびｈα−シヌクレインに対する相対的親和性の決定．ウェル当たり０．４μｇの精製された全長α−シヌクレインで被覆された９６ウェルマイクロタイタープレートを用いて血漿におけるｈα−シヌクレイン抗体レベルを決定した。サンプルを４℃で一晩インキュベーションし、続いて洗浄し、そしてヤギ抗マウスＩｇＧアルカリホスファターゼ結合抗体（１：７５００，Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）とインキュベーションした。プレートを４５０ｎｍの励起波長および５５０ｎｍの発光波長で読み取った。相対的蛍光単位を縦座標上そして血清希釈を横座標上で片対数グラフ上に結果をプロットした。抗体力価は、最大の抗体結合から５０％の減少があった希釈として定義した。
ワクチン接種したマウスにおいて生成された抗体によるｈα−シヌクレインに対する相対的親和性を決定するために、２組の実験を行った。第一のものにおいて、非免疫ｈα−シヌクレインｔｇマウスからの脳ホモジネートをミニゲル、マルチチャンネル装置（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）において泳動した。各チャンネルをマウス
の各々からの希釈した血清とインキュベーションし、ニトロセルロース上にブロッティングし、そして二次ウサギ抗マウス抗体、続いてＩ125標識プロテインＡとインキュベーションした（Ａｌｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ
４２：２８３−２８７（１９９４））。ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）でブロットを画像化しそして分析した。ＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウェア（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いて免疫反応性バンドを定量した。第二組の実験では、非免疫ｈα−シヌクレインｔｇマウスからの連続ビブラトーム切片を処置マウスの各々からの希釈した血清、続いてビオチニル化ウマ抗マウスＩｇＧ（１：１００，Ｖｅｃｔｏｒ）、アビジンＤ−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ、１：２００、ＡＢＣ Ｅｌｉｔｅ、Ｖｅｃｔｏｒ）においてインキュベーションし、そして０．００１％のＨ2Ｏ2を含有するジアミノベンジジン４塩酸塩（ＤＡＢ）と反応させた。顕微鏡検査後に、標識される細胞内コンパートメント（ニューロン細胞体、シナプスおよび封入体）および免疫反応性の程度（０＝なし；１＝非常に軽度、２＝軽度、３＝中等度、４＝強い）に従って切片を評点した。
ｈα−シヌクレイン抗体のエピトープマッピング．全ｈα−シヌクレイン配列におよぶ重複する線状ペプチドへの抗体の結合を測定するＥＬＩＳＡによりｈα−シヌクレイン抗体により認識されるエピトープを決定した。ｈα−シヌクレインの配列を有するＣ末端でビオチニル化されたペプチド（Ｍｉｍｏｔｏｐｅｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を１２残基の重複およびペプチド当たり３残基の歩みで１５アミノ酸（ａａ）長ペプチドとして製造した。ｈα−シヌクレインの全１４０ａａ配列を歩行するために合計４３個のペプチドを用い、最後のペプチドは１３ａａの重複および２ａａの歩みを有する。さらに、最後の３個のペプチドは反復されるが、ビオチニル化がペプチドのＮ末端上に存在する。これは、抗体によるペプチドのＣ末端へのアクセスを改善するために、そして遊離のＣ末端特異的抗体の同定を可能にするために行われた。さらに、抗体とｈα−シヌクレインの非アミロイドβ（Ａβ）成分（ＮＡＣ）領域（６１〜９５）との間の相互作用のより完全な試験を可能にするために他の特徴をこのアッセイに加えた。本アッセイにおける２１番目のペプチドはＮＡＣ領域の遊離のＮ末端をすでに含有するので、ＮＡＣ領域の遊離のＣ末端を含有する１つの追加のＮ末端でビオチニル化されたペプチドを加えて合計４７個のペプチドでアッセイを完了した。
アッセイを行うために、これらのビオチニル化ペプチドをストレプトアビジンでプレコーティングしたＥＬＩＳＡプレート（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）上に５ｎＭで一晩被覆した。次に、プレートを洗浄し、そして６に相当する力価に希釈した血清サンプルを１時間のインキュベーションの間加えた。５，０００より低い力価を有する血清サンプルは、このインキュベーション用に１：１０００希釈した。もう１回の洗浄工程の後に、結合した抗体を比色分析ＥＬＩＳＡ形式においてＨＲＰに結合した種特異的二次抗体を用いて検出した。
組織処理．マウスを安楽死させ、そして下記のような詳細な神経化学および神経病理学的解析のために脳を取り出した。簡潔に言えば、ウェスタンブロットによる凝集および非凝集ｈα−シヌクレイン免疫反応性の測定のために右半脳を凍結させそして均質化した（Ｍａｓｌｉａｈ ｅｔ ａｌ．，２０００，上記）。免疫細胞化学（ＩＣＣ）および超微細構造解析のために左半脳を４％のパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）において固定し、そしてビブラトーム（Ｌｅｉｃａ，Ｗｅｔｚｌａｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で連続切片にした。
シナプトソーム調製および免疫ブロット分析．ｔｇマウスの脳におけるα−シヌクレイン蓄積へのワクチン接種の効果を確かめるために、ショ糖勾配を用いてシナプトソーム画分を調製し、そして１０％ｔｒｉｓ−酢酸塩ポリアクリルアミドゲル（ＮｕＰＡＧＥTM，
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。免疫ブロットをｈα−シヌクレイン（ＬＢ５０９，１：１０００，Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）およびシナプトフィジン（１：２０，Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）に対する一次抗体ならびにＨＲＰで標識した二次ヤギ抗マウスＩｇＧ（１：５０００，ＳａｎｔａＣｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）で調べ、増強した化学発光により視覚化し、そしてＶｅｒｓａｄｏｃ ＸＬ画像化装置（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）で分析した。
神経病理学的および免疫細胞化学分析．簡潔に言えば、以前に記載のとおり（Ｍａｓｌｉａｈ ｅｔ ａｌ．，２０００，上記）、ｈα−シヌクレイン蓄積へのワクチン接種の効果を調べるために、ａａ１０１〜１２４からなる合成ｈα−シヌクレインペプチドでウサギを免疫することにより以前に記載のとおり（Ｍａｓｌｉａｈ ｅｔ ａｌ．，２０００，上記）調製される親和性精製した抗ｈαシヌクレイン特異的抗体（７２−１０、ウサギポリクローナル、１：５００）と連続切片にした浮遊性のブラインドコード化したビブラトーム切片を４℃で一晩インキュベーションした。一次抗体とのインキュベーションの後にビオチニル化ヤギ抗ウサギＩｇＧ（１：１００，Ｖｅｃｔｏｒ）、アビジンＤ−ＨＲＰ（１：２００，ＡＢＣ Ｅｌｉｔｅ，Ｖｅｃｔｏｒ）を続け、そして０．００１％のＨ2Ｏ2を含有するＤＡＢ４塩酸塩と反応させた。新皮質におけるｈα−シヌクレイン免疫反応性封入体の数を決定するために切片をＱｕａｎｔｉｍｅｔ ５７０Ｃ（Ｌｅｉｃａ）で分析した。各場合について、これらの切片を分析し、そして結果を平均し、そして平方ｍｍ当たりの数として表した。ＣＤ４５（１：１０００，ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ）およびグリア細胞線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ，１：５００，Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）を包含するグリアマーカーに対する抗体と切片を免疫反応させることによりさらなる免疫細胞化学分析を行った。
神経終末密度およびシナプスにおけるｈα−シヌクレイン蓄積へのワクチン接種の効果を決定するために以前に記載のとおり（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ ３２：２１３−２２３（２００１））二重免疫細胞化学分析を行った。この目的のために、ビブラトーム切片をｈα−シヌクレインに対するポリクローナル抗体（１：１０００）でそしてシナプトフィジンに対するモノクローナル抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）で二重標識した。ｈα−シヌクレインはチラミドレッド（Ｔｙｒａｍｉｄｅ Ｒｅｄ）（１：２０００，Ｒｏｃｈｅ）で、そしてシナプトフィジンはフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）で標識したウマ抗マウスＩｇＧで検出した。各場合について、切片を二重反復で免疫標識し、そしてレーザー走査共焦点顕微鏡（ＬＳＣＭ）およびＮＩＨ Ｉｍａｇｅ １．４３ソフトウェアで分析して新皮質におけるシナプトフィジン免疫反応性終末により覆われる神経網の面積パーセント（Ｍｕｃｋｅ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ
２０：４０５０−４０５８（２０００））およびｈα−シヌクレイン陽性であるシナプトフィジン免疫反応性終末の割合を計算した。一次抗体の特異性を確かめるために、一次抗体を２０倍過剰の対応するペプチドでもしくは免疫前血清で４８ｈｒ事前に吸着させて、一次抗体（削除された）の不在下で切片を一晩インキュベーションするコントロール実験を行った。
全ての切片を同じ条件下で同時に処理し、そして結果の再現性を評価するために実験を２回行った。装着したＭＲＣ１０２４ ＬＳＣＭシステム（ＢｉｏＲａｄ，Ｗａｔｔｆｏｒｄ，ＵＫ）を有するＡｘｉｏｖｅｒｔ ３５顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）上でＺｅｉｓｓ ６３Ｘ（Ｎ．Ａ．１．４）対物で切片を画像化した（Ｍａｓｌｉａｈ ｅｔ ａｌ．，２０００，上記）。
統計分析．両側不対スチューデントｔ検定を利用して群間の統計比較を行った。変数間
の関係を確かめるために線形回帰分析を行った。多重比較を説明するためにボンフェローニ補正を適用した。
Ｂ．結果
抗体力価、親和性およびエピトープマッピングの特性化
抗体力価は、両方の実験群において３つの時間点（ワクチン接種後２週、６か月および９か月）で分析した。抗体力価はマウス間でかなり異なり、群Ｉに属する動物において、ｈα−シヌクレインで免疫したマウス間の抗体力価は２００〜２０，０００の間であった（表３）。
Figure 0005952331
この群において、平均力価は経時的にわずかに上昇した。同様に、群ＩＩについて、ｈα−シヌクレインで免疫した動物は２００〜１３，０００の間である力価を示した（表３）。しかしながら、平均力価レベルは最初の測定でより高く、そして次に経時的に減少した。免疫ブロッティング分析もまた、ｈα−シヌクレインを認識するそれらの能力においてマウスごとの有意な変動性を示した。全体として、抗体相対的親和性のレベルは群Ｉからの免疫マウスと比較して群ＩＩからのマウスにおいて高かった（表４）。
Figure 0005952331
ＩＣＣにより、ｈα−シヌクレインをワクチン接種したマウスからの血清は、ニューロン、ニューロン内封入体およびシナプス前終末の標識化を示した。対照的に、アジュバントのみで処置したマウスは、細胞体の広がったそして非特異的な軽度の染色を示した。群ＩＩに属するマウスからの血清は、群Ｉからの免疫マウスと比較してｔｇマウスのシナプスおよびニューロンにおけるｈα−シヌクレインを認識することにおいていっそう高い親和性を示した（表４）。
エピトープマッピング研究は、ｈα−シヌクレインをワクチン接種したマウスにおいて、抗体がｈα−シヌクレインのＣ末端領域内のペプチドエピトープを最も高い頻度で認識することを示した（図８）。さらに、追加のエピトープに対する抗体もまた時折認識された。対照的に、ＣＦＡのみで処置したマウスの血清では反応性もしくは抗体エピトープは検出されなかった。
免疫はｔｇマウスの脳におけるｈα−シヌクレイン蓄積を減少させそしてシナプス密度を維持する
ｈα−シヌクレイン蓄積への免疫療法の効果を決定するために、ｈα−シヌクレインに対する抗体で切片を標識し、そして明視野顕微鏡検査によりもしくはＬＳＣＭにより分析した。ｔｇマウスにおいて、豊富なｈα−シヌクレイン免疫反応性が神経網においてならびにニューロン内封入体において認められた。ＣＦＡのみで処置したｔｇマウスと比較して、免疫した群の両方からのマウスは側頭皮質における封入体の数の同程度の減少（約２５％）を示した（図９Ａ）。さらに、免疫は神経網におけるｈα−シヌクレイン免疫反応性の減少をもたらした。ＣＦＡのみで処置したｔｇマウスと比較した場合、この効果は群Ｉからのマウスにおけるよりも群ＩＩからのマウスにおいて大きかった（図９Ａ）。免疫効果が実際にニューロンのｈα−シヌクレイン蓄積を減少させる抗体の能力にもしくはマスキング効果に関連するかどうかを決定するために、ＣＦＡのみおよびｈα−シヌクレインワクチン接種ｔｇマウス間でβシヌクレイン免疫反応性のレベルを比較することにより
コントロール実験を行った。α−シヌクレインに近いホモログ、βシヌクレインの既知の分布と一致して（Ｉｗａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ １４：４６７−４７５（１９９４））、豊富なβ−シヌクレイン免疫反応性がシナプス前終末と関連する神経網において認められ、そして軽度の免疫標識化がニューロン細胞体において検出されたが、封入体においてはそうでなかった。ＣＦＡのみで処置したｔｇマウスと比較して、ｈα−シヌクレインで免疫したマウスにおいてβ−シヌクレインのパターンおよびレベルの違いは見出されなかった。ｈα−シヌクレイン抗体の効果の特異性をさらに調べるために、マウス（ｍ）αシヌクレイン免疫反応性のレベルをＣＦＡのみおよびｈα−シヌクレインワクチン接種ｔｇマウス間で比較した。ｈαシヌクレインと同様に、ｍαシヌクレイン免疫反応性は神経終末と関連する神経網において豊富であったが、ニューロン細胞体にはそして封入体にはなかった。ＣＦＡおよびｈα−シヌクレイン免疫マウスの両方において、ｍαシヌクレインのパターンおよびレベルは同等であった。総合すると、これらの研究は、ワクチン接種がｈα−シヌクレインに特異的に影響を及ぼすが、他の関連するシナプス分子にはそうでないことを示唆する。
神経網完全性への免疫療法の効果をさらに確かめるために、シナプトフィジンに対する抗体でもしくは電子顕微鏡検査により切片を免疫染色した。非トランスジェニック（ｎｏｎｔｇ）マウスと比較して、ＣＦＡのみで処置したｔｇマウスはシナプトフィジン免疫標識終末の数の平均２０％の減少を示し、そしてシナプス当たりのシナプトフィジン免疫反応性のレベルは不変であった（図９Ｂ）。対照的に、両方の群からの免疫したマウスは、ｎｏｎｔｇコントロールに匹敵するシナプトフィジン免疫反応性のレベルを示した（９Ｂ）。ＧＦＡＰおよびＣＤ４５のようなグリアマーカーに対する抗体でのさらなる免疫細胞化学分析は、ｈα−シヌクレインをワクチン接種したｔｇマウスの脳における増加した免疫反応性への傾向を示した（図９Ｃ）。これらの結果と一致して、ｈα−シヌクレインで免疫したｔｇマウスの脳において、神経網は完全なシナプス前終末および樹状突起を有してよく保存され、そして神経終末は豊富な明小胞を含有し、シナプス後密度を形成することが超微細構造解析により示された。ほんの時折電子密度の高い凝集体が神経突起において同定され、そして全体としてミトコンドリアおよびミエリンはよく保存された。
シナプスにおけるｈα−シヌクレイン凝集へのワクチン接種の効果をよりよく特性化するために、シナプトソーム調製物での二重免疫細胞化学およびウェスタンブロット分析を行った。生理的条件下でｈα−シヌクレインは主にシナプス前ボタンに局在化し（Ｉｗａｉ ｅｔ ａｌ．，１９９４，上記）、ＬＢＤにおいてそしてｔｇマウスにおいて、シナプスにおけるｈα−シヌクレインの増加した蓄積は機能障害およびシナプス喪失と関連する（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，２００１，上記）。神経終末におけるｈα−シヌクレイン蓄積へのワクチン接種の効果を確かめるために、シナプス前終末マーカーシナプトフィジンおよびｈα−シヌクレインに対する抗体での二重免疫標識研究ならびにシナプトソーム調製物でのＷＢ分析を行った。ＣＦＡのみをワクチン接種したｈα−シヌクレインｔｇマウス（図９Ｄ）と比較して、ｈα−シヌクレインを注射したものは新皮質のシナプトフィジン免疫反応性神経終末におけるｈα−シヌクレインの減少した蓄積を示すことが二重標識切片の共焦点画像化により示された（図９Ｄ）。
免疫細胞化学研究と一致して、免疫ブロット分析は、ＣＦＡのみで処置したｔｇマウスにおいて、シナプスにおけるｈα−シヌクレイン免疫反応性封入体の蓄積をおそらく反映する、豊富なより高分子量のバンドがあることを示した（図１０）。免疫したマウスにおいて、ｈα−シヌクレインのより高分子量バンドの蓄積および生来のバンドのかなりの減少があったが、ｍα−シヌクレインのレベルに対して効果は認められなかった。さらに、ＣＦＡのみで処置したｔｇマウスと比較して、シナプトフィジン免疫反応性のレベルは免疫したマウスからのシナプトソーム調製物において高かった（図１０）。総合すると、これらの結果は、免疫療法がシナプスにおける潜在的に有毒なｈα−シヌクレインオリゴマ
ーの蓄積を減少させることによりｔｇマウスの脳におけるニューロン損傷を改善できることを示唆する。
免疫の効果はシナプス終末を認識する抗体の相対的親和性によって決まる
どの因子が免疫療法の効果を予測するかをよりよく理解するために、ｈα−シヌクレイン蓄積の神経病理学マーカーと抗体力価および親和性との間で線形回帰分析を行った。この分析は、免疫ブロットによる相対的抗体親和性とシナプスにおけるｈα−シヌクレイン免疫反応性のレベルとの間の有意な相関関係を示したが、ニューロン封入体の数とはそうでなかった。同様に、ＩＣＣによるシナプスを認識する相対的抗体親和性は、シナプスにおけるｈα−シヌクレインのレベルと逆相関し、そしてシナプトフィジン標識神経終末により占められる面積パーセントと直接相関するが、ニューロン封入体の数とはそうでなかった。免疫ブロットおよびＩＣＣによる抗体反応性のレベルは、ＥＬＩＳＡにより決定した場合の抗体力価と強く相関した。抗体力価はまた、抗ｈαシヌクレイン抗体で標識される神経網の面積パーセントとも相関したが、ニューロンにおける封入体の数とはそうでなかった（表４）。総合すると、これらの結果は、抗ヒトα−シヌクレイン抗体の相対的免疫ブロット反応性およびある程度は抗体のＥＬＩＳＡ力価がニューロンのヒトα−シヌクレイン蓄積の減少と相関することを示唆する。
抗ヒトα−シヌクレイン抗体はｔｇマウスにおいて取り込まれ、そしてシナプスおよび封入体含有ニューロンに結合する
ｔｇマウスの脳においてヒトα−シヌクレインが蓄積する特有のニューロン部位を輸送抗体が認識するかどうかを決定するために、単一および二重免疫細胞化学分析をウマ抗マウスＩｇＧ抗体で行った。これらの抗体は、免疫した動物において生成される抗ヒトα−シヌクレインを推定上認識するが、ＣＦＡコントロールにおいてはそうでない。免疫標識切片の明視野デジタル顕微鏡検査は、ｈα−シヌクレインで免疫したマウスにおいて、ビオチニル化した抗マウスＩｇＧが神経網におけるニューロン細胞体および神経突起を広範に標識することを示した。ＣＦＡのみで処置したｔｇ動物において、血管および小グリアに似ている時折の細胞の軽度の標識化があった。ワクチン接種したマウスにおいて、ＦＩＴＣ標識した抗マウスＩｇＧにより標識されるニューロン細胞体はｈα−シヌクレイン免疫反応性を示すことが二重免疫染色実験により確かめられた。ＣＦＡのみで処置したｔｇマウスと比較して、ｈα−シヌクレインワクチン接種マウスにおいて、あるニューロンでは、抗マウスＩｇＧおよびｈα−シヌクレイン免疫反応性は細胞体の周辺で共局在化しており、ある領域ではこれら２つの標識は神経突起およびシナプスにおいて検出された。さらに、いくつかのヒトα−シヌクレイン含有ニューロンにおいて２つのマーカーは平均して直径が０．４〜０．８μｍのサイズの粒状細胞内構造において検出された。これらの粒状構造はカテプシンＤ免疫反応性を示すことがさらなる二重標識実験により示され、取り込まれた抗ヒトα−シヌクレイン抗体がリソソーム内でシヌクレインと反応したことを示唆する。この結果と一致して、ヒトα−シヌクレインワクチン接種マウスのニューロンのあるものにおいて、リソソームおよびファゴリソソームを示唆する電子密度の高い積層構造が同定されることが超微細構造解析により示された。総合すると、これらの結果は、ヒトα−シヌクレインでのワクチン接種がリソソーム経路の活性化によってこの分子の分解を促進できることを示唆する。
実施例ＩＸ． α−シヌクレイン抗体の投与によるインビボでのα−シヌクレイン凝集体のクリアランス
本実施例は、α−シヌクレイン末端を認識するモノクローナル抗α−シヌクレイン抗体を用いたニューロン内α−シヌクレイン凝集体のクリアランスを示す。ヒトα−シヌクレインを過剰発現しそしてニューロン内α−シヌクレイン凝集体を有するトランスジェニックマウスの新皮質にモノクローナル抗体を注射した。一方はα−シヌクレインのＮ−末端に対しそしてもう一方はＣ末端に対する２つの抗体は、関係のないコントロール抗体と比
較してニューロン内α−シヌクレイン凝集体の数を８０％まで減少させた（図１１）。
方法．α−シヌクレイン分子の異なるエピトープを認識するモノクローナル抗体および関係のないアイソタイプの一致するコントロール抗体をマウスへの注射のために滅菌リン酸緩衝食塩水溶液に溶解した（表５）。使用した動物は、ＰＤＧＦプロモーターの転写制御下で脳においてヒト野生型α−シヌクレインを過剰発現する４〜８か月齢のヘテロ接合体トランスジェニックマウスであった。４〜６匹の異なるトランスジェニックマウスを抗体の各々に使用した。
Figure 0005952331
各マウスについて、２μｌの２ｍｇ／ｍｌの抗体溶液を右脳半球（同側）の頭頂葉新皮質の深層に麻酔下で定位固定で注射した。左半球（反対側）は、各マウスのベースラインコントロールとして働いた。注射部位を縫合し、そしてマウスを麻酔から回復するまでモニターした。注射を行う研究者は、毎回どの抗体が注射されるかに関して盲検であった。注射後２週で、組織ガイドラインに従ってマウスを安楽死させた。それらの脳を取り出し、４％のパラホルムアルデヒドにおいて４８ｈ固定し、そしてＬｅｉｃａビブラトームを用いて４０μｍの厚さで冠状に切断した。動物当たり２つの切片（注射部位の周り）をポリクローナルα−シヌクレイン抗体（α−シヌクレインアミノ酸１１５〜１２２を認識するＥＬＡＤＷ−４７）での免疫ペルオキシダーゼ染色により染色した。各切片について、ニューロン内α−シヌクレイン凝集体を同側半球における注射部位の周りの４つの顕微鏡視野（２０ｘ対物）において、そして反対側コントロール半球における視野に対応する４つの視野において計数した。２つの切片のα−シヌクレイン凝集体計数を各半球について合計した。最後に、各動物について２つの半球間の合計α−シヌクレイン凝集体計数間の差を計算し、そして反対側および同側半球間の％差として表し、このようにして各個々のマウスの凝集体クリアランスへのα−シヌクレイン抗体の効果の尺度を提供した。切片はブラインドコード化され、そしてコードは分析が完了すると解かれた。
どの抗体を注射したかに基づいてマウスを３群に分類することができる：
群１：１１Ａ５、８Ａ５もしくはＩｇＧ1コントロールを注射したマウス。
群２：９Ｇ５、２３Ｅ８、６Ｈ７もしくはＩｇＧ1コントロールを注射したマウス。
群３：４Ｂ１、５Ｃ１２、ＩｇＧ2aもしくはＩｇＧ2bコントロールを注射したマウス。
結果．研究の結果を図１１および１２に示す。ニューロン内α−シヌクレイン凝集体は、両方ともＰＣＴ特許公開ＷＯ０５０４７８６０Ａ２（２００５年５月２６日に出願された「アルファ−シヌクレインに対する抗体」）にそして同時係属特許出願第１０／９８４１９２に記述される（これらは両方とも引用することにより組み込まれる）、２つのモノクローナル抗体：８Ａ５（ＪＨ４．８Ａ５とも呼ばれる）および６Ｈ７（ＪＨ１７．６Ｈ７とも呼ばれる）により除去された。ＭＡｂ ６Ｈ７は、エシェリキア・コリにおいて発現された組換えヒトα−シヌクレインに対してもたらされ、そしてヒトおよびマウスα−シヌクレインのアミノ末端を認識する。それは、α−シヌクレインの最初の３個のアミノ酸を含むエピトープを認識する。ＭＡｂ ６Ｈ７は、標識タンパク質がシヌクレインのＮ末端に融合しているシヌクレインの融合タンパク質を認識することができ、遊離のアミノ末端が（それは好ましい可能性があるが）必要とされないことを示唆する。
ＭＡｂ ８Ａ５は精製されたウシシヌクレイン（αおよびβの混合物）に対してもたらされ、そしてヒトおよびマウスα−シヌクレインのカルボキシ末端のエピトープを認識する。ＭＡｂ ８Ａ５は、アミノ酸１３９で終わるトランケーションされたシヌクレインに結合することができる。８Ａ５は、ビオチンに結合したＣ末端と比較して遊離のＣ末端を有するシヌクレインに４〜５倍の優先傾向を有することが予備実験により示唆される。また、ｍＡｂ ６Ｈ７およびｍＡｂ ８Ａ５は両方ともベータ−シヌクレインも認識する。ＭＡｂ ４Ｂ１はシヌクレインのＣ末端領域を認識し、そしてウェスタンブロット上でシヌクレインに結合するが、溶液においてシヌクレインを認識しない（すなわち、ｍＡｂ ４Ｂ１はシヌクレインを免疫沈降させない）。図１２は、８Ａ５を注射したマウスの反対側（左のパネル；切片内部の丸い褐色の点はα−シヌクレイン凝集体である）および同側（右のパネル）の切片を示す。８Ａ５を注射したマウスとＩｇＧ1を注射したコントロールとの間の差は、統計的に有意であった（ノンパラメトリッククラスカル−ウォリス（Ｋｒｕｓｋａｌｌ−Ｗａｌｌｉｓ）続いてダン多重比較検定によりｐ＜０．０５）。これらの結果は、α−シヌクレインＣ末端および／もしくはＮ末端を標的とすることがＰＤおよびＤＬＢのようなシヌクレオパチーにおいて治療的に有益であることを示す。試験した他の抗α−シヌクレイン抗体の投与（表５、図１１）は、凝集体の除去をもたらさなかった。
実施例Ｘ： α−シヌクレイン抗体の投与によるインビボでのα−シヌクレイン凝集体のクリアランス
本実施例は、実施例ＩＸに記述されるようなα−シヌクレイン末端を認識するモノクローナル抗α−シヌクレイン抗体（６Ｈ７および８Ａ５）を用いたニューロン内α−シヌクレイン凝集体のクリアランスを示す。本実施例はまた、Ｃ末端の近くのエピトープを認識するモノクローナル抗α−シヌクレイン抗体（９Ｅ４）を用いたニューロン内α−シヌクレイン凝集体のクリアランスも示す。ｍＡｂ ９Ｅ４は、アミノ酸１１８〜１２６の領域におけるアルファ−シヌクレインのエピトープを認識する。
ヒトα−シヌクレインを過剰発現しそしてニューロン内α−シヌクレイン凝集体を形成するトランスジェニックマウスの右半球の新皮質にモノクローナル抗体を３ｘ注射した。上記のように、α−シヌクレインのＮ末端を認識するｍＡｂ ６Ｈ７およびα−シヌクレインのＣ末端を認識するｍＡｂ ８Ａ５は、関係のないコントロール抗体と比較してニューロン内α−シヌクレイン凝集体の数を８０％まで減少させた（図１３）。さらに、ａａ１１８〜１２６でのα−シヌクレインエピトープを認識するｍＡｂ ９Ｅ４は、同様のα−シヌクレイン凝集体減少効果を有した（図１３）。
方法．α−シヌクレイン分子の異なるエピトープを認識するモノクローナル抗体および関係のないアイソタイプの一致するコントロール抗体をマウスへの注射のために滅菌リン酸緩衝食塩水溶液に溶解した（表６）。使用した動物は、ＰＤＧＦプロモーターの転写制御下で脳においてヒト野生型α−シヌクレインを過剰発現する４〜８か月齢のヘテロ接合体トランスジェニックマウスであった。４〜６匹の異なるトランスジェニックマウスを抗
体の各々に使用した。
Figure 0005952331
各マウスについて、２μｌの２ｍｇ／ｍｌ抗体溶液を右脳半球（同側）の頭頂葉新皮質の深層に麻酔下で定位固定で各注射部位に注射した。左半球（反対側）は、各マウスのベースラインコントロールとして働いた。３回の定位固定注射座標は：注射１：２．０ｍｍブレグマ、１．５ｍｍ横方向、２．０ｍｍ深さ；注射２：０．４ｍｍブレグマ、１．５ｍｍ横方向、１．４ｍｍ深さ；注射３：−２．３ｍｍブレグマ、１．５ｍｍ横方向、１．２ｍｍ深さであった。注射部位を縫合し、そしてマウスを麻酔から回復するまでモニターした。注射を行う研究者は、毎回どの抗体が注射されるかについて盲検であった。注射後２週で、組織ガイドラインに従ってマウスを安楽死させた。それらの脳を取り出し、４％のパラホルムアルデヒドにおいて４８ｈ固定し、そしてＬｅｉｃａビブラトームを用いて４０μｍの厚さで冠状に切断した。各動物の脳全体にわたる３切片ごとをポリクローナルα−シヌクレイン抗体（α−シヌクレインアミノ酸１１５〜１２２を認識するＥＬＡＤＷ−４７）での免疫ペルオキシダーゼ染色により染色した。各注射部位の位置に基づいて、３回の注射部位の各々の周りの２〜４切片を各動物について選択した。ニューロン内α−シヌクレイン凝集体を同側半球における注射部位の周りの４つの顕微鏡視野（２０ｘ対物）において、そして反対側コントロール半球における視野に対応する４つの視野において計数した。数えた全ての切片のα−シヌクレイン凝集体計数（合計３〜１２切片／動物）を各半球について合計した。最後に、各動物について２つの半球間の合計α−シヌクレイン凝集体計数間の差を計算し、そして反対側および同側半球間の％差として表し、このようにして各個々のマウスの凝集体クリアランスへのα−シヌクレイン抗体の効果の尺度を提供した。切片はブラインドコード化され、そしてコードは分析が完了すると解かれた。
実施例ＸＩ： アルファ−シヌクレインのＣ末端に対するモノクローナル抗体は脳に入り、そしてアルファ−シヌクレインを認識する
ヒトα−ｓｙｎ ｔｇマウスに９Ｅ４−ＦＩＴＣを５ｍｇ／ｋｇ；１００μｌの投薬量で静脈内注射した。マウスを１週後に安楽死させて脳およびＣＳＦにおける抗体の存在を決定した。蛍光抗体を直接視覚化し、そして抗体が実際に脳に移動し、そしてニューロン細胞体およびシナプスにおけるαｓｙｎを特異的に認識することを見出した。末梢に送達されたコントロールＩｇＧは、ｔｇおよびｎｏｎｔｇマウスの両方においてバックグラウンド免疫反応性のみを示した。さらに、処置したマウスからのＣＳＦは未処置のｔｇマウスの脳におけるαｓｙｎに対して免疫反応性であり、そして９Ｅ４−ＦＩＴＣ抗体での直接免疫標識と同様の染色のパターンを示すことが見出された（図１４を参照）。
実施例ＸＩＩ： Ｃ末端のα−ｓｙｎに対する抗体での受動免疫はｔｇマウスにおけるα−ｓｙｎ障害を軽減する
本研究の目的は、α−ｓｙｎ Ｃ末端に対する抗体での受動免疫がＣＮＳに移動し、そしてｔｇマウスの脳におけるα−ｓｙｎ凝集体を認識しそして除去できることを示すためであった。この目的のためにヒトα−ｓｙｎ ｔｇマウスに９Ｅ４を１ｍｇ／ｋｇの投薬
量で６か月間腹腔内注射した。６ヵ月の毎週の注射後に９Ｅ４で処置した動物を安楽死させた。α−ｓｙｎオリゴマーおよびα−ｓｙｎの不溶性形態の減少したレベルが、注射したｔｇマウスの脳において見出された（図１５を参照）。
実施例ＸＩＩＩ： α−シヌクレインのｃ末端に対する抗体での免疫はパーキンソン病のトランスジェニックにおいて自食作用経路の活性化によってクリアランスを促進する
ＦＩＴＣで標識したモノクローナル抗体（クローン９Ｅ４）をｎｏｎｔｇおよびアルファ−ｓｙｎ ｔｇマウスにおいてＩＶ注射した。注射後３日で低レベルの抗体が脳において検出され、一方、高いレベルが血漿において検出された。注射後１４および３０日で免疫細胞化学およびＥＬＩＳＡの両方により明らかなように血漿におけるレベルの減少を伴っていっそう高いレベルが脳において検出された。ｔｇマウスの脳において、９Ｅ４−ＦＩＴＣ抗体はニューロンにおける粒状α−ｓｙｎ凝集体と関連して検出された。これらの凝集体は、リソソームマーカー（カテプシンＤ）に対する抗体で共標識された。非免疫ＩｇＧ−ＦＩＴＣでのコントロール実験は、ｎｏｎｔｇおよびアルファ−ｓｙｎ ｔｇマウスにおけるバックグラウンド標識のみを示す。さらに、９Ｅ４−ＦＩＴＣで処置したマウスのＣＳＦでのアルファ−ｓｙｎ ｔｇマウスからの切片の免疫標識は、未処置のアルファ−ｓｙｎ ｔｇマウスからの切片におけるシナプスおよびニューロンを免疫標識し、対照的に非免疫ＩｇＧ−ＦＩＴＣで処置したマウスのＣＳＦでは標が認められなかった。
免疫したｔｇマウスのニューロンにおいてベクリン−１、ＬＣ３切断およびＡｔｇ５のレベルは増加しそしてα−ｓｙｎ凝集体と共局在化したので、９Ｅ４で免疫したｔｇマウスにおけるアルファ−ｓｙｎのクリアランスはおそらく自食作用経路の活性化と関係した（図１６を参照）。これらの結果は、α−ｓｙｎのｃ末端のもしくはその近くのエピトープに対するモノクローナル抗体がＣＮＳに移動し、罹患したニューロンにおける凝集体を認識し、そして自食作用のようなリソソーム経路によってクリアランスを引き起こすことを示唆する。図１７は、そのような経路を例示する。図の左側において、抗体は細胞の外側から膜結合型アルファシヌクレインに結合し、そして得られる複合体はエンドサイトーシスされ、そして細胞内でリソソームと結合し、オートファゴソームを形成し、そしてリソソーム酵素による分解を引き起こす。図の右側において、アルファ−シヌクレインおよびアルファ−シヌクレインに対する抗体は別個にエンドサイトーシスされ、抗体はおそらくＦｃ受容体を介して入り込み、そして細胞中でリソソームと結合し、続いてリソソーム分解される。
寄託
以下のモノクローナル抗体産生細胞系は、示された日付にＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ
Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ，Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ １５４９，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１０８）でブダペスト条約の規定に基づいて寄託されている：
Figure 0005952331
添付の請求項の精神もしくは範囲からそれずにそれに多数の変更および改変を行えることは当業者に明らかである。他に文脈から明らかでない限り、任意の段階、特徴、実施態様もしくは態様は任意の他のものと組み合わせて用いることができる。本明細書に記載される全ての公開および特許出願は、各個々の公開もしくは特許出願が引用することにより組み込まれることが特にそして個々に示されるのと同じように引用することにより本明細書に組み込まれる。
以下に本発明の主な特徴と態様を列挙する。
１． 疾患にかかっているかもしくはその危険性がある患者にヒトアルファ−シヌクレインの残基１１０〜１３０内のエピトープに特異的に結合する抗体の有効な処方計画を施すことを含んでなる（残基は配列番号：１に従って番号が付けられている）、脳におけるレビー小体もしくはアルファ−シヌクレイン凝集を特徴とする疾患の予防をもたらすかもしくはそれを処置する方法。
２． 抗体がヒトアルファ−シヌクレインの残基１１８〜１２６内のエピトープに結合する１．の方法。
３． 疾患がパーキンソン病である１．の方法。
４． 抗体がモノクローナル抗体である１．の方法。
５． 抗体がキメラ抗体、ヒト抗体もしくはヒト化抗体である４．の方法。
６． 抗体がヒトアルファ−シヌクレインへの結合についてマウスモノクローナル抗体９Ｅ４（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８２２１）と競合する１．の方法。
７． 抗体がモノクローナル抗体９Ｅ４（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８２２１）またはヒト化もしくはキメラ９Ｅ４である５．の方法。
８． 抗体がヒトＩｇＧ１アイソタイプの抗体である４．の方法。
９． 抗体が製薬学的組成物として製薬学的担体と共に投与される２．の方法。
１０． 抗体が０．０００１〜１００ｍｇ抗体／ｋｇ体重の投薬量で投与される９．の方法。
１１． 抗体が少なくとも６カ月にわたって複数回投薬量において投与される９．の方法。
１２． 抗体が腹腔内に、経口で、皮下に、頭蓋内に、筋肉内に、局所に、鼻腔内にもしくは静脈内に投与される９．の方法。
１３． 抗体が末梢経路により投与される任意の前記の方法。
１４． 抗体が１〜１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される任意の前記の方法。
１５． モノクローナル抗体９Ｅ４（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８２２１）またはヒト化もしくはキメラ９Ｅ４。
１６． モノクローナル抗体のＣＤＲ領域のアミノ酸配列を決定すること；
アクセプター抗体を選択すること；および
モノクローナル抗体からのＣＤＲおよびアクセプター抗体からの可変領域フレームワークを含んでなるヒト化抗体を製造すること
を含んでなるモノクローナル抗体９Ｅ４（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８２２１）をヒト化する方法。
１７． モノクローナル抗体の軽鎖および重鎖可変領域のアミノ酸配列を決定すること；
重鎖および軽鎖定常領域を選択すること；
軽鎖定常領域に融合した軽鎖可変領域を含んでなる軽鎖、および重鎖定常領域に融合した重鎖可変領域を含んでなる重鎖を含んでなるキメラ抗体を製造すること
を含んでなるモノクローナル抗体９Ｅ４（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８２２１）のキメラ形態を製造する方法。
１８． ハイブリドーマＪＨ１７．９Ｅ４．３．３７．１．１４．２（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８２２１）、ハイブリドーマＪＨ１７．１Ｈ７．４．２４．３４（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８２２０）もしくはハイブリドーマＪＨ２２．１１Ａ５．６．２９．７０．５４．１６．１４（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８２２２）により生産される抗シヌクレインモノクローナル抗体。
１９． ハイブリドーマＪＨ１７．１Ｈ７．４．２４．３４（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８２２０）もしくはハイブリドーマＪＨ２２．１１Ａ５．６．２９．７０．５４．１６．１４（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８２２２）により生産されるモノクローナル抗体のキメラもしくはヒト化抗体。
２０． モノクローナル抗体のＣＤＲ領域のアミノ酸配列を決定すること；
アクセプター抗体を選択すること；および
モノクローナル抗体からのＣＤＲおよびアクセプター抗体からの可変領域フレームワークを含んでなるヒト化抗体を製造すること
を含んでなるハイブリドーマＪＨ１７．１Ｈ７．４．２４．３４（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８２２０）もしくはハイブリドーマＪＨ２２．１１Ａ５．６．２９．７０．５４．１６．１４（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８２２２）により生産されるモノクローナル抗体をヒト化する方法。
２１． モノクローナル抗体の軽鎖および重鎖可変領域のアミノ酸配列を決定すること；
重鎖および軽鎖定常領域を選択すること；
軽鎖定常領域に融合した軽鎖可変領域を含んでなる軽鎖、および重鎖定常領域に融合した重鎖可変領域を含んでなる重鎖を含んでなるキメラ抗体を製造すること
を含んでなるハイブリドーマＪＨ１７．１Ｈ７．４．２４．３４（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８２２０）もしくはハイブリドーマＪＨ２２．１１Ａ５．６．２９．７０．５４．１６．１４（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８２２２）により生産されるモノクローナル抗体のキメラ形態を製造する方法。
２２． ハイブリドーマＪＨ１７．９Ｅ４．３．３７．１．１４．２（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８２２１）、ハイブリドーマＪＨ１７．１Ｈ７．４．２４．３４（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８２２０）もしくはハイブリドーマＪＨ２２．１１Ａ５．６．２９．７０．５４．１６．１４（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８２２２）の細胞。
２３． 抗体が末梢経路により投与され、そしてリソソーム経路により細胞内レビー小体もしくはアルファシヌクレイン凝集を減少させる、レビー小体もしくはアルファシヌクレイン凝集を特徴とする疾患を処置するための薬剤の製造におけるヒトアルファ−シヌクレインの残基１１０〜１３０内のエピトープに特異的に結合する抗体の使用（残基は配列番号：１に従って番号が付けられている）。
２４． 抗体がエンドサイトーシスによりレビー小体もしくはアルファシヌクレイン凝集を含有する細胞に入る２３．の使用。
２５． 抗体が細胞の外側から膜結合型アルファシヌクレインに結合し、そして抗体とアルファシヌクレインの複合体が細胞内にエンドサイトーシスされ、そして細胞内でリソソームと結合する２３．もしくは２４．の使用。
２６． 抗体およびアルファシヌクレインが別々にエンドサイトーシスされ、そして細胞内でリソソームと結合される２３．もしくは２４．の使用。
２７． 疾患にかかっているかもしくはその危険性がある患者にヒトアルファ−シヌクレインの残基１１０〜１３０内のエピトープに特異的に結合する抗体を誘導する薬剤の有効な処方計画を施すことを含んでなる（残基は配列番号：１に従って番号が付けられている）、脳におけるレビー小体もしくはアルファ−シヌクレイン凝集を特徴とする疾患の予防をもたらすかもしくはそれを処置する方法。
２８． 薬剤がアルファ−シヌクレインのフラグメントである２７．の方法。
２９． フラグメントがアルファ−シヌクレインの合計３０個以下の連続する残基を有する２８．の方法。
３０． フラグメントが抗体をアルファ−シヌクレインの残基１１８〜１２６内のエピトープに対する抗体を誘導する２８．の方法。
３１． フラグメントがアルファシヌクレインの残基１１８〜１２６を含んでなる３０．の方法。
３２． フラグメントが担体に連結される２７．〜３１．のいずれかの方法。

Claims (9)

  1. 脳におけるレビー小体もしくはアルファ−シヌクレイン凝集を特徴とする疾患の予防または処置に使用するための、ヒトアルファ−シヌクレインの残基９１〜９９（残基は配列番号：１に従って番号が付けられている）内のエピトープに特異的に結合する抗体であって、モノクローナル抗体１Ｈ７（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８２２０）のＣＤＲを含んで成る、上記抗体、を含んでなる医薬組成物。
  2. 疾患がパーキンソン病である、請求項１の医薬組成物。
  3. 抗体がキメラ抗体またはヒト化抗体である、請求項１の医薬組成物。
  4. 抗体がモノクローナル抗体１Ｈ７（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８２２０）である、請求項３の医薬組成物。
  5. 抗体が少なくとも６か月の期間にわたって複数回投与において投与される、請求項１の医薬組成物。
  6. 抗体が末梢経路により投与される、請求項１〜５のいずれかに記載の医薬組成物。
  7. 抗シヌクレインモノクローナル抗体が、ハイブリドーマＪＨ１７．１Ｈ７．４．２４．３４によって製造される１Ｈ７抗体のＣＤＲを含んで成る、請求項１の医薬組成物。
  8. ヒト化またはキメラ１Ｈ７である、請求項７の医薬組成物。
  9. 抗体が、末梢経路により投与され、リソソーム経路により細胞内レビー小体もしくはアルファシヌクレイン凝集を減少させる、請求項１に記載の医薬組成物。
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