KR20140077567A - 세포외 α-시누클레인 제거와 관련된 질환 치료용 조성물 및 그 치료제 스크리닝 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 세포외 α-시누클레인 제거와 관련된 질환 치료용 조성물 및 그 치료제 스크리닝 방법에 관한 것이다.

Description

세포외 α-시누클레인 제거와 관련된 질환 치료용 조성물 및 그 치료제 스크리닝 방법{Composition for treating diseases related with clearance of extracellular alpah-Synuclein and method for screening the candidate thereof}

본 발명은 세포외 α-시누클레인 제거와 관련된 질환 치료용 조성물 및 그 치료제 스크리닝 방법에 관한 것이다.

파킨슨병(PD)은 만성 진행성 운동 신경계 이상이다. 약 5만 정도의 미국인들이 매년 PD로 진단된다. 이러한 퇴행성신경 질환의 주증세들은 떨림, 경직, 운동 완서 및 균형 장애이다. 또한, 많은 PD 환자들은 감정변화, 기억상실, 언어 장애 또는 수면 곤란을 포함하는 다양한 다른 증세들을 겪는다.

PD는 중뇌 도파민(DA) 신경세포들의 특이성 및 진행성 신경세포 손실에 의하여 유발된다. 주로, 이러한 신경세포들은 흑색질 및 선조체 사이의 신호 전달을 담당하는 화학 전달물질인 도파민을 생성하여 매끄럽고 의도적인 근육 활성을 발생시킨다. 그러나, 도파민의 손실은 선조체의 신경세포들이 제어할 수 없을 만큼 흥분하게 하여 환자들이 자신의 운동을 지시하고 제어하는 능력에 손상을 입게 한다.

PD에 대하여 현재 이용되는 요법은 도파민 전구체인 L-DOPA(L-디히드록시페닐-알라닌(L-dihydroxyphenylalanine))을 환자에게 경구 투여하여 도파민을 보충하는데 크게 의존한다. 이러한 요법은 치료가 계속됨에 따라 투여량의 증가를 필요로 하고, 결국 심각한 부작용들을 도출하게 된다. PD에 대한 다른 요법들에 대한 요구가 있다.

관련 선행특허로 대한민국 특허공개번호 제1020080106928호는 아모다이아퀸(amodiaquine) 또는 글라페닌(glafenine)과 같은 7-클로로-4-아미노퀴놀린 화합물들(7-chloro-4-aminoquinoline compounds)을 투여하여 파킨슨병을 치료하거나 파킨슨병 발달을 억제시키는 방법들 및 키트들을 특징으로 한다.

한편 파킨슨병(PD) 및 루이소체 치매(DLB)와 같은 α-시누클레인(synuclein)의 축적을 가지는 질환은 운동 장애 및 노인 인구에서 치매의 일반적인 원인이다. 생리적인조건에서 α-시누클레인은 시냅스전(presynaptic) 부위에 위치한 원형질에 존재하는 단백질이다(Iwai A, Masliah E, Yoshimoto M, Ge N, Flanagan L, de Silva HA, Kittel A,Saitoh T (1995) Neuron 14:467-475).

본 발명은 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 새로운 파킨슨병(PD) 및 루이소체 치매(DLB) 치료제 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 파킨슨병(PD) 및 루이소체 치매(DLB) 치료제 후보물질을 스크리닝하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 서열번호 1에 기재된 α-시누클레인 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다.

또 본 발명은 상기 본 발명의 항체를 유효성분으로 포함하는 파킨슨 질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

또 본 발명은 상기 본 발명의 항체를 유효성분으로 포함하는 루이소체 치매(DLB) 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

또 본 발명은 후보 물질과 세포외 α-시누클레인 단백질을 이 두 성분이 상호작용하기에 적합한 환경 하에서 미세아교세포주에 접촉시키고, 상기 α-시누클레인 단백질의 업테이크 및 분해 속도가 증가한 경우에 해당 후보물질을 파킨슨 질환 또는 루이소체 치매(DLB) 치료제 후보물질로 판정하는 것을 특징으로 하는 파킨슨 질환 또는 루이소체 치매(DLB) 치료제 후보물질 동정 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 후보물질은 항체 안티센스 올리고뉴클레오티드인 또는 화합물인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명에서 "에피토프"라는 용어는 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 결정부위 (determinant)를 의미한다. 에피토프는 통상화학적으로 활성인 표면 분자군, 예를 들어 아미노산 또는 당 측쇄로 구성되며, 일반적으로 특정한 3차원의 구조적 특징뿐만 아니라 특정한 전하 특성을 갖는다. 입체적 에피토프 및 비입체적 에피토프는 변성 용매의 존재하에서 전자에 대한 결합은 소실되지만 후자에 대해서는 소실되지 않는다는 점에서 구별된다.

바람직한 실시형태에서, 본 발명은 약학적으로 용인가능한 희석제, 담체, 가용화제, 유화제, 방부제 및/또는 아쥬반트와 함께 본 발명의 하나 또는 그 이상의 항체의 치료학적 유효량을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 바람직하게, 용인가능한 제형화 물질은 수용자에게 사용된 투여량 및 농도에서 비독성이다. 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 항체의 치료학적 유효량을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.

특정 실시형태에서, 바람직하게 용인가능한 제형 물질은 사용된 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이다.

특정 실시형태에서, 약학적 조성물은 예를 들어, 조성물의 pH, 삼투 몰농도, 점도, 정화도, 색, 등장, 향, 살균, 안정성, 용해나 방출 속도, 흡착 또는 투과를 변형, 유지 또는 보존하기 위한 제형화 물질을 포함한다. 이러한 실시형태에서, 적합한 제형화 물질로는 다음을 포함하나 이에 한정되지는 않는다 : 아미노산(예를 들어, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌또는 리신) ; 항미생물제 ; 항산화제(예를 들어, 아스코르브산, 황산나트륨 또는 황화수소나트륨) ; 완충용액(예를 들어, 붕산염, 중탄산염, 트리스-HCl, 시트르산염, 인산염 또는 다른 유기산) ; 부피 조절제(예를 들어, 만니톨 또는 글리신) ; 킬레이트제(예를 들어, 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA) ; 착화제(예를 들어, 카페인, 폴리비닐피롤리돈, β-시클로덱스틴 또는 히드록시프로필-β-시클로덱스트린) ; 충전제 ; 단당류 ; 이당류 ; 및 그외 탄수화물(예를 들어, 글루코스, 만노스 또는 덱스트린) ; 단백질(예를 들어, 혈청 알부민, 겔라틴 또는 면역글로불린) ; 색소, 항미제 및 희석제 ; 유화제 ; 친수성 중합체(예를 들어, 폴리비닐피롤리돈) ; 저 분자량 폴리펩티드 ; 염-형성 대이온(예를 들어, 나트륨) ; 방부제(예를 들어, 염화벤잘코늄, 벤조산, 살리실산, 치메로살, 페네틸알콜, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 클로르헥시딘, 소르브산 또는 과산화수소) ; 용매(예를 들어, 글리세린, 프로필렌글리콜 또는 폴리에틸렌글리콜) ; 당알콜(예를 들어, 만니톨 또는 소르비톨) ; 현탁화제 ;계면활성제 또는 습윤제(예를 들어, 플루로닉, PEG, 소르비탄에스텔류, 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80 과 같은 폴리소르베이트, 트리톤, 트로메타민, 레시틴, 콜레스테롤 및 틸옥사팔) ; 안정성 증강제(예를 들어, 수크로스 또는 소르비톨) ; 장도 증강제(예를 들어, 알칼리 금속 할로겐 화합물, 바람직하게, 염화나트륨, 염화칼륨, 만니톨 소르비톨) ; 수송 부형제 ; 희석제 ; 보형약 ; 및/또는 약학적 아쥬반트. Mack Publishing Company 로부터 입수한 REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18th Edition, (A.R. Gennaro, ed.), 1990 을 참조.

특정 실시형태에서, 최적의 약학적 조성물은 예를 들어, 의도된 투여 경로, 수송 형식 및 요구되는 투여량에 따라 본 분야의 숙련자들에 의해 결정될 것이다. 예를 들어, 상기의 REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES 을 참조하라. 특정 실시형태에서, 상기 조성물은 본 발명의 항체의 생체내 제거 속도, 생체내 방출 속도, 안정성 및 물리적 상태에 영향을 미친다.

특정 실시형태에서, 약학적 조성물 내의 원발성 부형제 또는 담체는 자연 상태에서 수성이거나 비-수성이다. 예를 들어,적합한 부형제 또는 담체는 비경구적으로 투여하기 위한 조성물에 일반적으로 다른 물질을 보충하는 것이 가능한 주사용물, 생리식염수 또는 인공 뇌척수액일 수 있다. 중성인 완충생리식염수 또는 혈청 알부민과 혼합된 생리식염수는 추가로 전형적인 부형제이다. 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 약학적 조성물은 약 pH 7.0-8.5 의 트리스 완충용액 또는 약 pH 4.0-5.5 의 아세트산염 완충용액을 포함하며, 이는 추가로 소르비톨, 수크로스, Tween-20 및/또는 적합한 이의 치환체를 포함한다. 본 발명의 특정 실시형태에서, 본 발명의 항체 조성물을 바람직한 순도를 갖는 선택 조성물과 최적의 제형화 제제

를 혼합하여(상기 참고문헌으로 인용한 REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES 을 참조) 동결건조된 케이크 또는 수용액 형태로 저장하기 위해 제조하였다.

본 발명의 약학적 조성물을 비경구적 투여를 위해 선택할 수 있다. 선택적으로, 조성물을 경구와 같은 소화관을 통한 수송 이나 또는 흡입을 위해 선택할 수 있다. 이러한 약학적으로 용인가능한 조성물의 제조는 본 분야의 기술에 속한다.

제형화 성분은 바람직하게 투여 부위에 용인가능한 농도로 존재한다. 특정 실시형태에서, 생리학적 pH 또는 약간 낮은 pH, 일반적으로 약 pH 5 내지 약 pH 8 의 범위로 조성물을 유지하기 위해서 완충용액을 사용하였다.

또한 제형을 또한 경구적으로 투여할 수 있다. 이러한 방식으로 투여되는 본 발명의 항체를 정제 및 캡슐과 같은 고체 약제학적 제형의 조제시에 일반적으로 사용되는 담체와 함께 또는 담체 없이 제형화할 수 있다. 특정 실시형태에서, 캡슐은 생체내이용효율이 최대화되고 예비-전신성의(pre-systemic) 분해가 최소화되는 위장관 위치에서 제형의 유효 부분이 방출되도록 설계될 수 있다. 부가적인 제제를 본 발명의 항체의 흡수를 용이하게 하기 위해 포함할 수 있다. 희석제, 향미료, 저융점 왁스, 식물성 오일, 윤활유, 현탁화제, 정제 붕해제 및 결합제를 또한 사용할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 정제의 제조에 적절한 비-독성 부형제와 함께 혼합물에서 하나 또는 다수의 본 발명의 항체의 유효량을 포함하여 제공되는 것이 바람직하다. 정제를 멸균수 또는 다른 적절한 부형제에 용해시킴으로써, 용액을 단위 약제학적 제형으로 제조할 수 있다. 적절한 부형제는 다음을 포함하지만 이로 제한하지 않는다 : 탄산칼슘, 탄산나트륨 또는 중탄산나트륨, 락토스 또는 인산칼슘과 같은 비활성 희석제 ; 또는 녹말, 겔라틴 또는 아카시아와 같은 결합제 ; 또는 스테아르산 마그네슘, 스테아르산 또는 활석과 같은 윤활제.

일반적으로 생체내로 투여하기 위해 사용되는 약학적 조성물은 일반적으로 멸균 제제로서 제공된다. 멸균 여과막을 통하여 여과시킴으로써 멸균할 수 있다. 조성물을 동결건조시킬 경우, 동결건조 및 재구성 전에 또는 후에 상기 방법을 이용하여 멸균 처리할 수 있다. 비경구 투여용 조성물을 동결건조된 형태나 용제로 저장할 수 있다. 일반적으로 비경구용 조성물을 멸균 접근 구멍(sterile access port)을 구비한 용기, 예를 들어 피하 주사바늘로 찔러넣을 수 있는 스토퍼(stopper)를 구비한 바이알 또는 정맥내 용액백 내에 보관하였다.

일단 약학적 조성물이 제형화되면, 용제, 현탁액, 겔, 에멀젼, 고형제 또는 탈수소화되었거나 동결건조된 분말의 형태로 멸균 바이알에 저장하였다. 이러한 제형을 사용하기 쉬운 형태로 저장하거나 또는 투여하기에 전에 재구성이 요구되는 형태(예를 들어, 동결건조된 형태)로 저장하였다.

치료학적으로 이용되는 본 발명의 항체를 함유한 약학적 조성물의 유효량은 예를 들어, 치료 상황 및 대상에 좌우된다. 본 분야에 숙련자들은 치료에 적합한 투여량 수준이 부분적으로 수송 분자, 본 발명의 항체가 사용되는 징후, 투여 경로와 크기(체중, 체표면적 또는 기관 크기) 및/또는 환자의 증상(연령 및 총체적인 건강 상태)에 따라 다양하다는 것을 인지할 것이다. 특정 실시형태에서, 임상의는 최적의 치료 효과를 얻기 위해 투여량을 적정하고 투여 경로를 변경할 수 있다. 일반적인 투여량의 범위는 상기 언급한 인자에 따라 약 0.1 ㎍/㎏ 내지 최대 약 30 ㎎/㎏ 또는 그 이상이다. 바람직한 실시형태에 있어서, 투여량 범위는 0.1 ㎍/㎏ 내지 약 30 ㎎/㎏ 까지 ; 보다 바람직하게 1 ㎍/㎏ 내지 약 30 ㎎/㎏ 까지 ; 보다 더 바람직하게 5 ㎍/㎏ 내지 약 30 ㎎/㎏ 까지이다.

투여 횟수는 사용된 제형의 특정 본 발명의 항체의 약물동력학 파라미터에 좌우될 것이다. 일반적으로, 임상의는 투여량이 바람직한 효과를 달성할 때까지 조성물을 투여하였다. 그러므로, 조성물을 단일 투여 또는 시간에 따라 두 번 또는 그 이상의 투여(원하는 분자의 동일양을 포함하거나 포함하지 않는) 또는 삽입 장치 또는 카테터를 통해 지속적으로 주입함으로써 투여하였다. 더욱이, 적합한 투여량의 정련은 본 분야의 숙련자에 의해 통상적으로 만들어지며 숙련자에 의해 행해지는 통상적인 일의 영역이다. 적합한 투여량을 적절한 투여-반응 데이터를 이용하여 확인하였다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 항체를 연장된 시간 기간 동안 환자에게 투여할 수 있다. 본 발명의 항체의 상습적인 투여는 비-인체 동물에서 인체 항원에 대한 항체, 예를 들어 비-인체 종에서 생산된 비-완전 인간 항체와 일반적으로 관련된 면역 역반응 또는 알레르기성 반응을 최소화하였다.

약학적 조성물의 투여 경로는 예를 들어 다음을 포함하는 공지된 방법에 따른 것이다 : 경구 ; 정맥내, 복강내, 뇌내(뇌실질), 뇌실내, 근육내, 안내, 동맥내, 문맥내, 병변내 경로으로 주사 ; 서방성 시스템 ; 또는 삽입 장치를 이용한 주사. 특정 실시형태에서, 조성물을 농축괴 주사하거나 연속적으로 주입 또는 삽입 장치로 투여할 수 있다.

조성물을 요구되는 분자가 흡수되거나 또는 캡슐화된 멤브레인, 스폰지 또는 다른 적절한 물질의 삽입을 통하여 국소적으로 투여할 수 있다. 특정 실시형태에서, 삽입 장치를 사용할 경우, 장치를 적절한 조직 또는 기관 내로 삽입하였으며, 요구되는 분자를 확산, 지효성 농축괴 또는 연속 투여함으로써 수송하였다.

이하 본 발명을 설명한다.

본 발명자들은 α-시누클레인에 대한 항체가 세포외 α-시누클레인 단백질을 특이적으로 타겟하고 미세아교세포(microglia)에 의한 제거에 도움을 주어 인접한 세포에 대한 그들의 작용을 억제한다는 것을 보여준다. 항체 지원된 제거는 신경세포나 성상교세포에서가 아니라 Fcγ 수용체를 통하여 미세아교세포에서 주로 일어난다. α-시누클레인 tg 마우스의 뇌에 항체의 정위방법적(Stereotaxic) 투여는 α-시누클레인의 뉴런에서 성상교세포로의 전달을 억제하여 미세아교세포에서 α-시누클레인 및 그 항체의 증가를 야기한다. 또한α-시누클레인 항체를 이용한 수동면역은 α-시누클레인의 신경 및 신경교 축적을 감소시키고 α-시누클레인 과발현과 관련된 행동 장애 및 신경퇴행을 완화시킨다. 이 결과들은 PD/DLB에 대한 면역치료를 위한 기전을 제공하고 치료타겟으로 α-시누클레인의 세포외 형태를 제안한다.

이하 본 발명을 상세하게 설명한다.

미세아교세포에 의한 세포외 α- 시누클레인 응집체의 항체 매개된 제거

α-시누클레인에 대한 항체의 치료효과를 조사하기 위하여, 본 발명자들은 단클론 인간 α-시누클레인에 대한 항체를 제조하고 미세아교세포에서 세포외 α-시누클레인 응집체의 제거에 대한 그들의 효과를 테스트하였다.

본 발명자들은 재조합 인간 α-시누클레인으로부터 올리고머 및 피브릴을 생성하고; 전자현미경(EM), 크기 배제 크로마토그래피(SEC), 및 젤 전기영동으로 그들의 물리적인 특성을 확인하였다.α-시누클레인 올리고머는 EM 상에서 구형, 커비(curvy) 및 짧은 신장형(elongated) 구조의 이종 혼합체로 나타난다(도 1C-F). SEC 데이터에 기반하여, 올리고머에서 약 절반의 단백질은 높은 분자량 올리고머이고 다른 절반은 모노머이었다(도1G,H). 실버 염색 및 웨스턴 블럿팅에 의하여 본 발명자들은 피브릴과 올리고머는 SDS-저항성 응집체(다중 고 분자량) 및 SDS 가용성 응집체, 모노머로 16 kDa 분자량을 나타냄, 모두를 포함하는 것을 발견하였다(도 1H, I ).

먼저 본 발명자들은 BV-2 미세아교세포주에서 α-시누클레인 피브릴의 업테이크에 대한 네 클론의 단클론 항체의 효과를 평가하였다. 이들 중, 169 및 274 두 클론은 업테이크를 촉진한 반면, 다른 두 클론(62 및 171)은 효과가 없었다(도 2A,B). 이 항체들의 효과는 용량 의존적이고 포화 지점에 도달한다(도 2C). 이 예비적인 특성화에 기초하여 274 항체를 본 발명에서 선택하여 사용하였다. 274 항체는 인간 형의 α-시누클레인에 특이적이고, 단백질의 C 말단에 에피토프가 존재한다. 본 발명자들은 274 항체 또는 대조군 IgG의 존재 하에서 BV-2 미세아교세포주에서 α-시누클레인 응집체의 업테이크 및 분해 속도를 비교하였다. 업테이크 실험을 위하여, 5μg/ml의 274 항체 또는 대조군 IgG로 미리 배양된 0.2 μM α-시누클레인 응집체를 세포에 첨가하였다. 세포들을 37℃에서 배양 후 기재된 시간에 수집하였다. 분해 실험을 위하여, 그 응집체를 피브릴 및 올리고머 각각에 대해서 10분 및 5 분 동안 미리배양하였고 그 세포들을 세척하고 기재된 시간 동안 신선한 배양 배지에서 37℃에서 배양하였다. 274 항체의 존재에서, 흡수된(internalized) 피브릴 α-시누클레인의 최대 수준에 도달하는데 필요한 시간은 30에서 10 분으로 감소하였고(도 3A), 들어온(imported) 피브릴 α-시누클레인의 반감기는 77에서 11 분으로 감소하였다(도 3B). 올리고머 α-시누클레인 응집체의 제거의 경우, 최대 수준에 도달하기 위한 흡수된 α-시누클레인 올리고머에 필요한 시간은 274 항체의 존재에서 11에서 4분으로 되었고 흡수된 올리고머의 반감기는 18에서 6 분으로 감소하였다(도3C,D). 한편 62 항체(도 2)의 첨가는 BV-2 세포에서 α-시누클레인 피브릴 또는 올리고머의 업테이크 및 분해 속도에 영향이 없었고(데이터 도시 안함), 이것은 이러한 효과가 항체 특이적이라는 것을 시사한다. 피브릴 및 올리고머와 대조적으로, 모노머에 대한 업테이크 속도는 미세아교세포에서 274 항체의 첨가에 의하여 변화가 없었다(도시 안함). 이들 결과는 274 항체의 존재에서, 모노머가 아닌 세포외α-시누클레인 응집체의 업테이크 및 분해는 미세아교세포에서 촉진된다는 것을 나타낸다.

뇌 세포 환경을 더욱 재생하기 위하여, 본 발명자들은 쥐 1차 미세아교세포 배양을 하여 이들 미세아교세포가 뉴런 세포로부터 분비된 α-시누클레인 단백질의 업테이크하는 속도를 측정하였다. 이 실험을 위하여, 본 발명자들은 인간 α-시누클레인을 과발현하는 분화된 SH-SY5Y 신경모세포종(neuroblastoma) 세포로부터 얻은 조건화된 배지를 사용하였다. 그 조건화된 배지는 모노머 및 SDS 안정적인 응집체 모두를 포함한다(도 1I). 대조군 IgG로 처리된 세포와 비교하여, 뉴런 세포로부터 분비된 a-시누클레인의 업테이크는 274 항체 처리된 1차 미세아교세포에서 더 빠르고 높은 수준에 도달하였고(도 3E,F),그것은 그 항체가 뉴런 분비된 세포외 a-시누클레인의 제거에서 미세아교세포를 돕는다는 것을 시사한다.

본 발명자들은 다음으로 분화된 SH-SY5Y 인간 신경모세포종(neuroblastoma) 세포뿐만 아니라 쥐 1차 성상세포 및 피질(cortical) 뉴런에서 외래(exogenous) α-시누클레인 피브릴의 업테이크 및 분해 속도에 대한 274 항체의 효과를 조사하였다. 미세아교세포와 대조적으로, 세포외 α-시누클레인 피브릴의 업테이크 또는 분해 속도의 변화가 이들 세포에서는 관찰되지 않았다(도 4A-F). 유사하게, 모노머의 업테이크는 성상세포 또는 뉴런에서 그 항체에 의하여 영향이 없었다(도시 안함). 따라서 세포외 α-시누클레인의 항체 매개된 제거는 미세아교세포에 선택적인 과정이고 모노머가 아니라 응집체에만 적용된다는 것을 나타낸다.

α- 시누클레인 응집체의 항체 지원된 제거는 라이소좀으로 신속한 배달을 야기하는 Fcγ 수용체에 의하여 매개됨

항체 매개된 α-시누클레인 제거에서 Fcγ 수용체의 역할을 평가하기 위하여, Fcγ 수용체를 Fcγ 수용체 II 및 III을 블럭하는 CD16/CD32에 대한 단클론 항체(Wijngaarden S, van Roon JA, van de Winkel JG, Bijlsma JW, Lafeber FP(2005) Rheumatology 44:729-734)로 배양하여 억제하였다. Fcγ 수용체의 봉쇄(Blockage)는 α-시누클레인 올리고머의 업테이크에 대한 274항체의 효과를 제거하였다 (도5A). Fcγ 수용체는 대조군 IgG 또는 274항체의 Fab 절편의 존재시가 아니라 274 항체의 존재시에만 BV-2 세포의 표면 상에서 올리고머 α-시누클레인와 함께 존재하였고(도 5B), 그것은 업테이크 과정에서 Fcγ 수용체의 관여를 증명한다. Fcγ 수용체는 BV-2 미세아교세포 및 쥐 1차 미세아교세포에서 현저하게 발현을 나타내었으나 성상세포 또는 분화된 신경모세포종 세포에서는 검출되지 않았다(도 5C).타입 II 및 타입 III (CD32/CD16) Fcγ 수용체는 IgG에 대한 낮은 친화도 수용체이고 높은 결합력을 위해서는 다가(multivalent) 항원-항체 복합체를 필요로 한다(Ravetch JV, Bolland S (2001) Annu Rev Immunol19:275-290).따라서 항체 단독으로는 높은 친화도를 가지고 이들 Fcγ 수용체에 결합할 수 없다. α-시누클레인-항체 면역 복합체의 업테이크를 확인하기 위하여, 대조군 IgG 또는 단클론 항체 274를 여러 양의 α-시누클레인 피브릴과 미리 배양하고 BV-2 세포에 첨가하였다. 흡수된 항체의 수준은 외래 α-시누클레인 응집체의 양에 직접적으로 비례하였다(도5D). α-시누클레인과 미리배양된 대조군 IgG는 세포에 의하여 흡수되지 아니하였고,외래 β-시누클레인과 미리배양된 274항체도 그러하였다(도 5D). 또, 면역형광 분석은 외래 α-시누클레인 응집체의 존재에서 항체 업테이크에서 큰 증가를 나타내었고, α-시누클레인와 항체의 공동존재는 흡수 후 원형질에서 증명되었다(도 5E,F). 전체적으로, 이들 결과는 미세아교세포에서 α-시누클레인-항체 복합체의 특이적인 흡수를 시사한다.

다음으로 본 발명자들은 α-시누클레인 단독에 의해서 수행되는 경로와 비교하여 α-시누클레인-항체 면역 복합체의 세포내 수송(trafficking) 경로를 조사하였다. 이를 위하여, 본 발명자들은 clathrin-매개된 엔도사이토시스의 마커로 형광 표지된 저밀도 리포프로틴(LDL), 및 지질 raft 매개된 엔도사이토시스에 대한 마커로 콜레라 톡신 B 서브유닛(CTB)(Sharma DK, Brown JC, Choudhury A, Peterson TE, Holicky E, Marks DL,Simari R, Parton RG, Pagano RE (2004) Mol Biol Cell15:3114-3122)을 사용하였다. 대조군 항체의 존재에서, 흡수된 α-시누클레인 응집체 단독으로는 어느 한 마커와 광범위하게 공동으로 존재하지 않았고(도 6A), 그것은 새로운 수송 기작을 시사한다. 그러나 α-시누클레인 응집체를 274 항체와 함께 적용한 경우, 많은 부분의 흡수된 α-시누클레인 응집체가 CTB와 공동으로 존재하였다(도 6A).

이 결과들을 확인하기 위하여, 본 발명자들은 면역위치화 실험을 수행하였다. 흡수된 α-시누클레인 응집체는 골지체 마커인 GM130과 공동으로 존재하지 않았고, 이것은 생합성 경로와 중복되는 결핍을 시사한다(도시 안함). 한편, 274 항체로 배양한 경우,약 38.6%의 흡수된 α-시누클레인 응집체가 caveolin-1에 대한 포지티브 구역에서 발견된 반면에, 대조군 IgG의 존재에서, 그들은 거의 caveolin-1와 함께 존재하지 않았다(도 6B,C).

이것은 274 항체가 CTB에 의하여 수행된 흡수된 α-시누클레인의 수송 경로를 변화시킨다는 결과와 일치한다(도 6A). 수송 경로에서 변화는 라이소좀에서 증가된 공동존재를 야기한다; 274 항체의 존재에서, 라이소좀 마커인 카텝신 D와 α-시누클레인의 공동존재는 28에서 93%로 증가되었다(도 6D,E). 종합적으로, 이들 결과는 항체와 복합체를 형성한 경우에 α-시누클레인 응집체는 Fcγ 수용체를 통하여 흡수되고 다른 세포내 수소 경로를 수행하고 자유 α-시누클레인 응집체에 비하여 더 효과적으로 라이소좀에 배달되고 거기서 더 빠르게 분해될 수 있다는 것을 시사한다.

274 항체는 tg 마우스 모델에서 신경퇴행 질환, 행동 장애 및 α- 시누클레인의 세포에서 세포 전달을 감소

세포외 α-시누클레인 응집체의 항체 지원된 제거가 세포내 응집체 전달을 억제하는지를 결정하기 위하여 본 발명자들은 274 항체를 인간α-시누클레인을 발현하는 tg 마우스의 해마에 주사하고 α-시누클레인 단백질의 뉴런에서 성상세포로 전달의 양을 분석하였다.

대조군 IgG의 주사는 뉴런에서 성상세포로 α-시누클레인 전달에 대한 효과를 나타내지 않았다; 해마의 동측(ipsilateral) 및 대측(contralateral) 면 모두는 동일한 정도의 성상아교세포(astroglial) α-시누클레인 축적을 나타내었다(도 7A,E,K). 반면에, 274 항체의 주사는 동측면에서 α-시누클레인의 성상아교세포 축적의 현저한 감소를 야기하였다(도 7B,F,L). 항체의 주사는 뉴런에서 α-시누클레인 발현에 영향은 없었고(도 7C,D), 성상세포의 수도 변화시키지 않았으며 (도 7G,H), 따라서 항체 처리가 α-시누클레인의 세포에서 세포 전달을 억제한다는 것을 시사한다. 대조군 IgG의 주사는 미세아교세포에 대한 효과를 나타내지 않았다(도 7I ); 그러나 274항체로 주사된 해마의 동측 및 대측 면 모두는 미세아교 활성화에서 약한 증가를 나타내었다(도 7J ).

세포에서 세포 전달의 봉쇄에서 미세아교세포의 관여를 확인하기 위하여 본 발명자들은 이중 면역형광 염색을 사용하여 미세아교에서 인간 α-시누클레인 및 274 항체의 위치를 조사하였다.

인간 α-시누클레인을 포함하는 미세아교세포의 수는 274 항체로 주사된 마우스에서 동측면에서 현저한 증가를 나타내었다(도 8A,B). 주사된 항체는 274 항체로 주사된 tg 마우스에서 동측면에서 미세아교세포에서도 검출되었지만(도 8C,D), 대조군 IgG로 주사된 마우스에서는 그러하지 않았다(도 8D). α-시누클레인 및 주사된 항체의 같은위치 존재는 274 항체로 주사된 tg 마우스에서 일치되게 관찰되었지만(도 8E), 대조군 IgG로 주사된 마우스에서는 그러하지 않았다. 이 결과들은 α-시누클레인 항체가 미세아교세포에 의한 뉴런 유래된 α-시누클레인의 제거를 촉진하여 α-시누클레인 응집체의 세포에서 세포 전달을 억제한다는 것을 시사한다.

274 항체 주사에 수반하는 α-시누클레인의 미세아교세포 지원된 제거에 대한 카이네틱스를 평가하기 위하여, α-시누클레인 및 Iba-1에 대한 항체로 이중 표지를 여러 시간 지점에서 수행하였다(도 8F). 주사 1일 후에,약 20%의 미세아교세포가 α-시누클레인 축적을 나타낸 반면, 7일 및 14일에서 약 10%의 미세아교세포가 α-시누클레인을 가졌고, 28일에는 약 5%로 감소하였다(도 8G).

274 항체가 뉴런 및 성상아교세포로부터 α-시누클레인의 전달을 저해하는지를 확인하기 위하여, 이중 표지 연구를 NeuN 및 GFAP 항체로 수행하였다.

공초점 지원된 이미지는 피라미드형 NeuN-포지티브 뉴런과 같은위치에 존재하는 α-시누클레인이 약 20%의 세포를 나타낸다는 것을 나타내었고(도 8H), IgG 및 274 항체 군 사이의 현저한 차이가 관찰되지 않았다(도 8I). 대조적으로 방추형을 가지는 α-시누클레인-포지티브 세포는 NeuN과 동시에 존재하지 아니하고, 차라리 GFAP와 존재한다(도 8J). 약 15%의 GFAP 세포는 대조군에서 α-시누클레인을 포함하였다. 그러나 274 항체로 처리는 주사 부위에서 GFAP/α-시누클레인-포지티브 세포의 감소를 야기하였다(도 8K).

GFAP 및 Iba-1-포지티브 세포의 이미지 분석은 자국을 따르는 흔적(scar)의 비특이적인 효과를 회피하기 위하여 바늘 자국의 부위 밑에 해마에서 수행하였다. 주사자국을 따라 성상교세포증(astrogliosis)은 주사 후 4 주간 지속된 반면에 자국을 따라 미세아교세포 반응은 일시적이고 2주 후에 감소하기 시작하였다. 유사하게 해마(주사 자국 밑)에서 α-시누클레인을 함유한 활성화된 미세아교세포의 수는 시간에 따라 감소하였다(도 8F,G).

기능적 및 신경병리학적 파라미터에 대한 세포외 α-시누클레인 응집체의 항체 지원된 제거의 효과를 더 평가하기 위하여 수동 면역 실험을 non-tg 및 tg 마우스로 대조군 IgG 또는 274 항체의 복강내 주사에 의하여 수행하였다. 폴(pole) 테스트에서 기능적 모터 연합(coordination)의 분석은 IgG 및 274-처리된 non-tg와 비교하여, IgG-처리된 tg 마우스는 그 패러다임을 완성하는데 더 오랜 시간이 소요되었다(도 9A). 대조적으로, 274 항체로 처리된 tg 마우스는 non-tg 군과 유사하게 수행되었다(도 9A). 오픈 필드에서, IgG-처리된 tg 마우스는 non-tg와 비교하여 일부 과민활성을 나타내었다(도 9B). α-시누클레인 tg 마우스에서 이 효과는 274 항체의 처리에 의하여 역전되었다(도 9B). 전체 거리 및 사육(rearing)을 포함한 오픈 필드에서 다른 활성들은 네 군 중에서 차이가 없었다(도 9C,D).

종간(cross-species) 다클론 항체로, α-시누클레인 면역염색은 대조군 IgG 및 274 항체 군 사이에서 관찰된 차이가 없는 것을 가지는 non-tg 마우스에서 신경망(neuropil)에 제한되었다(도 9E-G). IgG-처리된 α-시누클레인 tg 마우스에서,신피질(neocortex) (도 9H) 및 해마(도 9I)에서 성상아교세포 (도 9F) 및 뉴런 세포(도 9G) α-시누클레인 (도 9E)의 광범위한 축적이 있었다. 반면, 274 항체로 처리된 α-시누클레인 tg 마우스(도 9E)는 신피질(neocortex) (도 9H) 및 해마(도 9I)에서 성상아교세포 (도 9F) 및 뉴런 α-시누클레인(도 9G)의 축적에서 상당한 감소를 나타내었다.

본 발명자들은 또한 수동적으로 면역화된 마우스의 선조체(striatum)를 분석하였고 α-시누클레인의 레벨이 피질 및 해마와 비교할 때 더 낮은 정도로 감소하였다는 것을 발견하였다.

피질 및 해마에서 274는 α-시누클레인의 레벨을 약 70-80%로 감소시키고(도 9H, I); 선조체에서는 그 레벨은 30-35%로 감소되었고(도 9J), 이것은 항체의 차별적인 부위별 수송을 시사한다.

본 발명자들은 대조군 및 항체 처리된 α-시누클레인 마우스의 CSF 및 뇌에서α-시누클레인에 대한 ELISA를 수행하였다. 비히클 처리된 α-시누클레인 tg 마우스의 뇌 균질체(homogenates)에서 α-시누클레인의 레벨은 13.57±1.610 ng/ml (n=8)인 반면, 274 항체로 처리된 α-시누클레인 tg는 5.031±1.011 ng/ml (n= 8)이었다. 그러나, CSF에서 α-시누클레인의 레벨은 본 발명의 ELISA 시스템의 검출 한계 하에서 매우 낮다.

α-시누클레인-함유 미세아교세포는 신경망에서 주로 관찰되었고 혈관 주위에서는 거의 관찰되지 않았다.

수동 면역에서 α-시누클레인의 제거에 대한 274항체의 효과를 더 평가하기 위하여, NeuN, GFAP, 및 Iba-1에 대한 항체로 이중 표지 연구를 수행하였다. 공초점 이미지 분석은 α-시누클레인 면역반응성을 나타낸 피라미드형 NeuN-포지티브 세포의 비율은 274 항체로 주사한 군에서 감소하였다(도 9K,L)는 것을 나타낸다. 게다가, IgG로 처리한 α-시누클레인 tg 마우스와 비교하여, 274 항체로 처리는 α-시누클레인을 포함한 방추형 GFAP 포지티브 성상아교세포의 감소를 야기하였다(도 9M,N).

반면, IgG 단독으로 면역화된 α-시누클레인 tg 마우스와 비교하여, 274 항체로 처리는 α-시누클레인을 포함한 Iba-1-포지티브 미세아교세포의 증가를 야기하였다 (도 9 O,P). 본 발명자들은 또한 α-시누클레인 및 cathepsin D에 대한 이중 표지 분석을 수행하고 274로 면역화된 동물의 미세아교세포에서 두 마커 사이에 같은 위치에 존재하는 것을 발견하였다 (도 9Q,R).

신경퇴행 및 신경염증 병리학에 대한 수동 면역의 효과를 연구하기 위하여 면역조직화학 및 이미지 분석을 수행하였다. NeuN에 대한 항체로, non-tg 대조군과 비교하여,IgG-처리된 α-시누클레인 tg 마우스는 해마에서 입체학적 신경세포 평가에서 감소를 나타내었다(도 10A,B). 뉴런의 손실은 해마의 CA3 부위에서 명확하였다(도 10A, 화살표). 반면, 274항체로 처리된 α-시누클레인 tg 마우스는 non-tg 대조군 상당하는 해마 NeuN 세포 카운트를 나타내었다(도 10A,B).

시냅스 변화도 분석하였다. 본 발명자들은 IgG-처리된 tg에서 시냅토파이신(synaptophysin)에서 28%감소를 발견하였고, 이 시냅스 손상은 274 항체로 처리에 의하여 현저하게 완화되었다(도 10C,D). GFAP에 대한 항체로 면역조직화학은 non-tg 대조군과 비교하여, α-시누클레인 tg 마우스는 신피질(neocortex)의 깊은 층(도 10E, 삽도) 및 해마(도 10E,F)에서 증가된 성상교세포증(astrogliosis)을 나타내었다는 것을 보였다. 274 항체로 수동면역은 α-시누클레인 tg 마우스에서 신피질(도 10E,삽도) 및 해마(도 10E,F)에서 GFAP 면역반응성의 레벨을 감소시켰다. 최종적으로, 미세아교세포 마커, Iba-1에 대한 항체로 미세아교세포 카운트를 수행한 결과, 유사한 레벨의 미세아교세포가 IgG 대조군으로 처리된 a-시누클레인 tg 마우스 뿐만 아니라 IgG 및 274 항체로 처리된 non-tg 마우스 사이에서 검출되었다(도 10G). 그러나, 274항체로 처리된 α-시누클레인 tg 마우스는 Iba-1 면역염색의 레벨에서 적당한 증가를 나타내었다(도 10G,H). 이것과 일치하게 IgG 단독으로 처리된 α-시누클레인 tg 마우스는 전 면역성 사이토카인, TNFα (도 10 I, J ), 및 IL-6 (도 10K,L)의 증가된 레벨을 나타낸 반면, 274 항체로 면역화는 그 레벨을 기준선까지로 감소시켰다. 이 결과는 274 항체가 세포외 α-시누클레인의 제거를 촉진한다는 결과와 일치한다.

종합하면, 이들 결과들은 274 항체로 면역화는 α-시누클레인 tg 마우스에서 기능적인 손상을 감소시키고, 이것은 신경교 및 뉴런 세포에서 α-시누클레인의 축적에서 감소 및 신경퇴행의 완화에 동반된다.

본 발명을 통하여 알 수 있는 바와 같이, α-시누클레인에 대한 항체는 미세아교세포에 의하여 특이적으로 세포외 α-시누클레인 응집체의 제거를 촉진하고, 특정항체와 복합체를 형성하는 경우, α-시누클레인 응집체는 미세아교세포의 표면 상 Fcγ 수용체를 통하여 흡수되고 흡수 후 그 면역 복합체는 수송경로를 따라서 운송되고 라이소좀으로 더 효과적인 전달을 야기한다. 또한 항체에 의해 매개된 α-시누클레인의 제거는 tg 마우스 모델에서 세포에서 세포로 α-시누클레인의 전달을 억제하였다. 이 결과들은 α-시누클레인 면역치료가 세포외 α-시누클레인의 미세아교세포 매개된 제거의 촉진을 통하여 치료 및 예방효과를 수행할 수 있다는 것을 시사한다.

도 1은 α-시누클레인 피브릴 및 올리고머의 특성. A-F, 피브릴의 EM 이미지 (A), 소니케이트된 피브릴 (B), 및 올리고머(C-F). 스케일 바: A-C, 0.5μm; D-F, 30 nm. G, 올리고머의 크기 배제 크로마토그래피. 별표(7 ml 분획)는 올리고머 분획을 나타낸다. 모노머는 13-15 ml 분획에서 존재한다. H, SEC 분획의 실버 염색 이미지. I, 여러 형태의 α-시누클레인의 웨스턴 블럿 분석. M, 모노머; F, 피브릴; O, 올리고머; CM, α-시누클레인을 발현하는 분화된 SH-SY5Y 세포의 조건화된 배지.
도 2는 세포외 α-시누클레인 응집체의 업테이크에 대한 단클론 항체의 효과를 나타낸 그림.A, BV-2 미세아교세포에서 α-시누클레인 또는 대조군 IgG (-)에 대한 기재된 단클론 항체의 존재에서 α-시누클레인 피브릴의 흡수.α-시누클레인 피브릴(0.2μM)을 5μg/ml의 대조군 IgG 또는α-시누클레인에 대한 항체들로 상온에서 5분간 미리배양하고 BV-2 세포로 5 분 동안 37℃에서 처리하였다. 흡수된 α-시누클레인의 양을 웨스턴 블럿으로 분석하였다. B, 흡수된 α-시누클레인의 양을 정량화하고 베타-actin의 레벨로 표준화하였다. y-축의 수는 대조군에 대한 α-시누클레인의 양을 나타냄. n= 4, *p〈0.05. C, α-시누클레인 피브릴의 항체 용량 의존적인 업테이크(n=3, p〈0.05) *, 274; #, 169.
도 3은 미세아교에서 세포외α-시누클레인의 업테이크 및 분해에 대한 274항체의 효과를 나타냄.A-D, BV-2 세포에서 α-시누클레인 피브릴(A,B) 및 올리고머(C,D)의 업테이크 (A,C) 및 분해(B,D)의 속도. 흡수된 α-시누클레인 응집체를 기재된 시간에서 웨스턴 블럿팅에 의하여 분석하였다. A 및 C에서 그래프는 대조군 IgG로 최대 흡수된 레벨과 비교한 α-시누클레인 양의 나타냄. B 및 D에서 그래프는 시간 O에서의 것과 비교한 남아 있는 α-시누클레인의 양을 나타냄. 모든 값들은 베타-actin으로 표준화하였다. 각 그래프의 곡선은 현저하게 차이가 있다(n=4, p〈 0.05). E, F, 1차 미세아교에서 뉴런 분비된 α-시누클레인의 업테이크에 대한 274 항체의 효과를 나타냄. E, 1차 랫트 미세아교를 대조군 IgG 또는 274 항체의 존재 하에서 분화된 SH-SY5Y 세포로부터 분비된 α-시누클레인를 함유하는 조건화된 배지로 처리하였다. F, E에서 데이터의 정량분석. 곡선은 현저하게 다르다( p〈0.05, n=3). 대조군 블럿:베타-tubulin.
도 4는 1차 성상세포 및 신경 세포에서 α-시누클레인 피브릴의 업테이크 및 분해에 대한 274 항체의 효과의 부족을 나타냄. A, B, 1차 성상세포 (n=4). C, D, 1차 피질 뉴런 (n=3). E, F, 분화된 SH-SY5Y 세포 (n=4). A, C, E, 업테이크 률. 그래프는 대조군 IgG로 최대 흡수된 레벨에 대한 α-시누클레인의 양을 나타냄. B, D, F, 분해 속도. 그래프는 시간 O에서의 것과 비교한 남아 있는 α-시누클레인의 양을 나타냄. α-시누클레인 피브릴로 미리배양 시간은 12시간 (B, D, F ). 모든 α-시누클레인 데이터는 베타-actin 데이터로 표준화함. 그래프의 곡선은 현저하게 다르지 않음.
도 5는 α-시누클레인-항체 면역 복합체의 업테이크에서 Fcγ 수용체의 역할을 나타냄. A, BV-2 세포에서 α-시누클레인 올리고머의 흡수에 대한 Fcγ 수용체 블럭킹 항체의 효과.흡수된 α-시누클레인 올리고머를 웨스턴 블럿으로 분석하였고 베타-actin으로 표준화하였다. 그래프의 y-축은 대조군 IgG로 최대 흡수된 레벨에 대한 α-시누클레인의 양을 나타냄. 적색 곡선은 다른 것과 현저하게 다르다 (n=7, p〈0.05).B, Fcγ 수용체 및 α-시누클레인의 면역형광 이미지. 화살표는 세포의 표면 상에 α-시누클레인 및 Fcγ 수용체의 동시존재를 나타냄. 스케일 바: 20μm. C, 여러 세포 타입에서 Fcγ 수용체의 발현. BV-2, 랫트 미세아교, 및 랫트 성상세포를 위해서,설치류에 특이적인 항-CD16/CD32 항체를 사용한 반면에 SH-SY5Y를 위해서, 인간 단백질에 특이적인 항-CD32 항체를 사용하였다. CD16의 발현은 기존 연구에서 뇌 뉴런에서 보고되지 않음. 적색, Fcγ 수용체; 청색, 핵. 스케일 바: 20μm. D, 여러 다른 양의 α-시누클레인 피브릴 또는 α-시누클레인 (0 -330 nM)의 존재에서 BV-2 세포로 항체의 흡수. 흡수된 항체를 항-마우스 IgG 항체로 분석함. 하단 패널은 베타-actin. E, BV-2 세포에서 흡수된 α-시누클레인 피브릴 및 항체의 면역형과 현미경 결과. 스케일 바: 20μm. F, E에서 흡수된 항체로부터 나온 형광을 정량화. 150개 세포를 세 번의 독립적인 실험으로 분석(각 실험 당 50 개의 세포). *p〈0.0001.
도 6은 흡수된 α-시누클레인 응집체의 변경된 세포내 수송 및 라이소좀으로 증가된 운반을 나타냄. A,BV-2 세포에서 흡수된 α-시누클레인 피브릴의 변경된 세포내 수송. 형광 표지된 추적자를 대조군 IgG-α-시누클레인 혼합물 또는 α-시누클레인-274 면역 복합체로 BV-2 미세아교 세포에 5 분간 37℃에서 처리하였다. 화살표는 274 항체의 존재 하에서 α-시누클레인 및 CTB 사이에 동시존재를 나타냄. 스케일 바: 5μm. B-E, 식균 구획(endocytic compartment)에서 흡수된 α-시누클레인 응집체의 위치화. 면역 복합체를 BV-2 세포에 5분간 처리. C, E, α-시누클레인 점(puncta)의 수는 caveolin-1 (C)과 동위치에 존재하고 cathepsin D (E)를 정량화하였다. 3000 점을 세 독립적인 실험으로부터 분석하였다 (각 실험 당 1000 점). 스케일 바: 5 μm. *p〈0.005.
도 7은 274 항체의 단독 주사 후 인 비보에서 α-시누클레인의 감소된 뉴런에서 성상세포 전달을 나타냄. A, B, α-시누클레인 면역반응성의 패턴을 비교하는 PDGF-α-시누클레인 tg mice (line M)의 피질 및 해마의 낮은 파위 (20X)뷰. 스케일 바: 200 μm. C-J, 뉴런에서 α-시누클레인 축적을 보여주는 해마 CA1 부위(C, D) 및 신경교세포에서α-시누클레인 축적을 보여주는 치상회(dentate gyrus) 부위(E-J ) (E, F ), GFAP 성상교세포의 존재 (G, H), 및 Iba1 미세아교세포의 존재 (I, J )의 하이 파워 뷰(200X). 스케일 바: 25μm. K, L, α-시누클레인-포지티브 뉴런 및 신경교세포의 수의 이미지 분석. 그룹 당 n=8, 9 월령. * 양방 Student's t 테스트 p〈0.01,unpaired.
도 8은 항체의 일방 주사 후 인 비보에서 미세아교 세포에서 α-시누클레인 및 IgG의 증가된 위치화를 나타냄. PDGF-α-시누클레인 tg 마우스(line M)는 도 7과 같이 해마 내 주사 수여됨. A-E에서 이미지들은 주사와 동측 부위와 치상회로부터 얻음. 스케일 바, 10μm. A, α-시누클레인 (적색) 및 미세아교세포 마커(Iba1, 녹색)에 대한 항체로 이중 표지. B, α-시누클레인과 동시 위치하는 Iba-1-포지티브 세포의 비율의 측정용 이중 표지에 대한 이미지 분석. 그룹 당 n=8 , 9 월령. * 양방 Student's t 테스트 p〈0.01,unpaired. C, 마우스 IgG (적색) 및 Iba-1 (녹색)에 대한 항체로 이중 표지. D,마우스 IgG와 동시 위치하는 Iba-1-포지티브 세포의 비율의 측정용 이중 표지에 대한 이미지 분석. 그룹 당 n=8 , 9 월령. * 양방 Student's t 테스트 p〈0.01,unpaired. E,마우스 IgG (적색) 및 α-시누클레인(녹색)에 대한 항체로 이중 표지. 화살표는 각 패널에서 두 마커들의 동시존재를 나타냄. F-K에서 모든 이미지들은 주사와 동측 부위에서 해마로부터 얻음. F, α-시누클레인 (적색) 및 Iba-1 (녹색)에 대한 항체로 이중 표지된 미세아교세포의 예. G, 주사 후 1, 7, 14, 및 28 일 후 α-시누클레인을 가지는 Iba-1-포지티브 세포의 퍼센트. H, α-시누클레인 (적색) 및 뉴런 마커(NeuN, 녹색)에 대한 항체로 이중 표지. 화살표는 상부에서는 동시 존재를 나타낸 반면, 하부에서 화살표는 NeuN과 동시존재하지 않는 방추형 α-시누클레인 포지티브 세포를 나타냄. I, α-시누클레인과 동시존재하는 포지티브 세포의 비율 측정용 이중 표지를 위한 이미지 분석.그룹 당 n=8 , 9 월령. J, α-시누클레인 (적색) 및 GFAP(녹색)에 대한 항체로 이중 표지. 화살표 머리는 GFAP와 동시존재하지 않는 α-시누클레인-포지티브 뉴런을 나타냄;화살표는 GFAP와 동시존재하는 α-시누클레인-포지티브 세포를 나타냄. K, α-시누클레인에 대한 항체와 동시존재하는 GFAP-포지티브 세포의 비율 측정용 이중표지를 위한 이미지 분석 (그룹 당 n=8 , 9 월령.; * 일방 ANOVA,post hoc Tukey-Kramer에 의한 p〈0.05). 스케일 바: H, J, 25μm.
도 9는 274 항체로 수동 면역화한 후 α-시누클레인 tg 마우스에서 행동 개선 및 감소된 α-시누클레인 축적을 나타냄. A, pole 테스트를 내려오는데 여행한 전체 시간. B,Open field 전체 자발적인 활성(광전지의 크로스 수). C, Open field 자발적인 활성 테스팅 5분 후 여행한 전체 거리.D, Open field 자발적인 활성 테스팅 5분 후 왕복(rearings)의 전체 수.A-D, *non-tg 및 α-시누클레인 tg와 비교시 post hoc Dunnet's를 가지는 일방 ANOVA에 의한 p〈0.05 ; # α-시누클레인 tg에서 IgG 및 274 항체와 비교시 post hoc를 가지는 일방 ANOVA에 의한 p〈0.05 . E, 피질 및 해마에서 α-시누클레인 면역반응성의 저배율 뷰(x20). 스퀘어는 F 및 G에서 확대된 부위를 나타냄.스케일 바, 250μm. F, G, 고 배율(x630) 뷰 (F, 성상세포; G, 뉴런). 스케일 바, 20μm. H-ㅓ, 각각 신피질, 해마, 선조체에서 α-시누클레인을 나타내는 아교세포 및 뉴런 세포의 추정 수(해부 방법)의 이미지 분석.* Student's t test에 의한 p〈0.001. K, 해마에서 α-시누클레인(적색) 및 뉴런 마커(NeuN, 녹색)에 대한 항체로 이중 표지. 화살표 머리는 동시존재를 나타냄.L, α-시누클레인과 동시존재하는 NeuN-포지티브 세포의 비율을 평가하기 위한 이중 표지를 위한 이미지 분석.M, 해마에서 α-시누클레인(적색) 및 GFAP (녹색)에 대한 항체로 이중 표지. 화살표 머리는 성상아교와 동시존재하는 α-시누클레인-포지티브 세포를 나타냄. N, α-시누클레인에 대한 항체와 동시존재하는 GFAP포지티브 세포의 비율의 평가를 위한 이중 표지를 위한 이미지 분석. O, 해마에서 α-시누클레인(적색) 및 Iba-1 (녹색)에 대한 항체로 이중 표지. 화살표 머리는 미세아교와 동시존재하는 α-시누클레인-포지티브 세포를 나타냄. P, α-시누클레인에 대한 항체와 동시존재하는 Iba-1-포지티브 세포의 비율의 평가를 위한 이중 표지를 위한 이미지 분석.Q, 해마에서 α-시누클레인(적색) 및 cathepsin D (녹색)에 대한 항체로 이중 표지. 화살표 머리는 동시존재를 나타냄. R, α-시누클레인에 대한 항체와 동시존재하는 cathepsin-D-포지티브 세포의 비율의 평가를 위한 이중 표지를 위한 이미지 분석. 스케일 바, 10 μm. * 양방 Student's t 테스트에 의한 p〈 0.01 unpaired, .n=8-에서 10-월령 마우스.
도 10은 274 항체로 수동 면역화 후 감소된 신경퇴행성 및 전 염증성 사이토카인을 나타냄. A, IgG 또는 274 항체로 처리된 α-시누클레인 tg 및 non-tg 마우스에서 NeuN에 대한 항체로 면역염색된 절편의 저배율 뷰(x20). IgG로 처리된 α-시누클레인 tg 마우스는 해마에서 뉴런 손실을 나타냄(화살표). 스케일 바, 250μm. B, 해마에서 NeuN의 입체학 분석(해부자 방법). C, 각각 IgG 또는 274 항체로 처리된 α-시누클레인 tg 및 non-tg 마우스에서 synaptophysin에 대한 항체로 면역염색된 절편의 고배율 뷰(x630), 스케일 바, 20μm. D, 해마에서 synaptophysin의 입체학 분석(해부자 방법).E, IgG 또는 274 항체로 처리된 α-시누클레인 tg 및 non-tg 마우스에서 GFAP에 대한 항체로 면역염색된 절편의 저배율 뷰(x20). IgG로 처리된 α-시누클레인 tg 마우스는 신피질(inset) 및 해마에서 증가된 성상교세포증을 나타냄. 스케일 바, 250μm. F, 흡광도에서 발현된 GFAP 면역반응서의 이미지 분석. 그 측정은 전체 해마에서 수행됨.G, 각각 IgG 또는 274 항체로 처리된 α-시누클레인 tg 및 non-tg 마우스에서 Iba-1에 대한 항체로 면역염색된 해마 절편의 고배율 뷰(x630), 스케일 바, 20μm. H, 해마에서 미세아교세포의 평가된 수의 이미지 분석. *non-tg 및 α-시누클레인 tg와 비교시 post hoc Dunnet?를 가지는 일방 ANOVA에 의한 p〈0.05 ; #α-시누클레인 tg에서 IgG 및 274 항체와 비교 시 post hoc Fisher를 가지는 일방 ANOVA에 의한 p〈0.05 . I-L, 절편을 TNFα 및 IL-6에 대한 항체로 면역표지하고 해마에서 미세농도(microdensitometric) 분석을 수행하였다. non-tg 대조군과 비교하여, IgG로 처리된 α-시누클레인 tg 마우스에서, TNFα(I, J) 및 IL-6 (K, L)의 레벨은 증가하였지만, 274 항체로 처리는 α-시누클레인 tg 마우스에서 이들 사이코카인의 레벨을 감소시킴. * 처리 그룹을 비교할 때 Fisher 그리고 non-tg 및 α-시누클레인 tg을 비교할 때 post hoc Dunnet's인 일방 ANOVA에 의한 p〈0.05.

이하 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 의도로 기재된 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.

본 발명에 사용된 항체는 : α-시누클레인 단클론 항체(BD Biosciences, #610787), α-시누클레인 다클론 항체 (Cell Signaling Technology, #2642), myc 다클론 항체 (Abcam, #ab9106), CD32 다클론 항체 (United States Biological, #c2384-0B), 및 CD16/CD32 단클론 항체(Abcam,#ab25235), GM130 단클론 항체(BD Biosciences, #G65120),cathepsin D 단클론 항체(Abcam, #ab6313), 및 caveolin-1 단클론 항체(BD Biosciences, #C13620). FITC-표지된 콜레라 톡신 B 소단위체(CTB)는 시그마로부터 구입. Bodipy-표지된 GM1,Bodipy-FL LDL, 및 Alexa Fluor 568-부착된 Dextran은 Invitrogen로부터 구입. UltraLink 고정화 단백질 A/G, Gentle Ag/Ab 결합 버퍼 pH 8.0, 및 IgG 정제용 용출 버퍼는 Piercef부터 구입.

실시예 1 항체 생산

α-시누클레인에 대한 단클론 항체의 생산 및 특성은 Lee et al., 2011b에 기재. α-시누클레인에 대한 모든 항체는 IgG2a isotype의 단클론 항체이다. 62 및 274 항체의 에피토프는 α-시누클레인의 C말단 끝에 존재하지만 (120-140), 169 및 171 항체의 에피토프는 C-말단 부위(120-140) 및 중간 부위(61-95) 모두를 필요로한다. 종 반응성 테스트는 169, 274, 및 171 항체는 인간 α-시누클레인에 대해서만 반응하지만, 62 항체는 인간 및 마우스 α-시누클레인 모두에 반응성이 있다는 것을 나타낸다. 본 발명에서 사용된 항체들은 다른 형태를 구분하지 못한다. 특히 274 항체는 α-시누클레인의 세포외 및 원형질내 형태 모두와 모노머 및 응집체 형태 모두에 면역반응성을 나타낸다. 대조군 IgG, 마우스 IgG isotypes의 혼합물은 프로틴 A/G 컬럼을 사용하여 모아진 정상 마우스 혈청으로부터 제조하였다.

실시예 2: α- 시누클레인의 정제 및 피브릴 및 올리고머의 생성

야생형 인간 α-시누클레인은 Lee HJ, Bae EJ, Jang A, Ho DH, Cho ED, Suk JE, Yun YM, Lee SJ (2011b)J Neurosci Methods 199:249-257의 기재와 같이 정제하였다. 피브릴화를 위하여, α-시누클레인 (3 mg/ml in PBS)를 250 rpm에서 계속 교반하면서 37℃에서 2주간 배양하였다. 짧은 초음파처리 후, α-시누클레인을 1주일 더 배양하였다. 배양 후 그 단백질을 100,000xg에서 1시간 원심분리하고 그 펠렛을 PBS에 재부유하였다. 일부 실험에서, 초음파처리에 의하여 제조된 작은 피브릴 절편을 사용하였다. α-시누클레인 올리고머는 Danzer KM, Haasen D, Karow AR, Moussaud S, Habeck M, Giese A, Kretzschmar H, Hengerer B, Kostka M (2007) J Neurosci 27:9220-9232에 기재된 방법으로 제조하였다. 동결건조된 α-시누클레인을 20% ethanol를 가지는 50mM sodium phosphate,pH7.0에 녹여 최종 농도 0.1 mg/ml로 하고 상온에서 4시간 동안 250 rpm으로 교반하였다. α-시누클레인을 다시 동결건조하고 1/2 시작 부피의 10% ethanol을 가지는 50mM sodium phosphate, pH 7.0에 재부유하였다. 그 단백질을 잔류 에탄올의 증발을 위하여 뚜껑을 열어 놓은채로 상온에서 24시간 동안 배양하였다.

실시예 3: 세포 배양

SH-SY5Y 세포를 Lee HJ, Khoshaghideh F, Patel S, Lee SJ (2004) J Neurosci 24:1888-1896에 기재된 것과 같이 유지하고 분화하였다. BV-2 미세아교 세포주를 5% fetal bovine serum (FBS) 및 penicillin 및 streptomycin를 가지는 DMEM에서 유지하였다. 하이브리도마 세포를 10% FBS 및 100 μM hypoxanthine 보충(Invitrogen)을 가지는 DMEM에서 배양하였다. 랫트 1차 아교세포 배양은 Lee HJ, Suk JE, Bae EJ, Lee SJ (2008) Biochem Biophys Res Commun 372:423-428에 기재된 것과 같이 준비하였다.

1차 피질 뉴런은 Lee HJ, Patel S, Lee SJ (2005) J Neurosci 25:6016-6024에 기재된 방법에 따라서 Sprague Dawley 랫트의 15-16(E15-16)일째 배아로부터 얻었다.

실시예 4: 조건화된 배지의 제조

분화된 SH-SY5Y 세포를 adeno/α-syn로 주사하였다. 주사 2일 후, 세포를 DMEM로 3회 세척하고 혈청 없는 DMEM에서 배양하였다. 37℃에서 18시간 배양 후, 조건화된 배지를 모아서 4℃, 250xg에서 10 분간 원심분리한 후, 세포 찌꺼기를 제거하기 위하여 그 상등액을 4℃, 10,000 xg에서 10 분간 원심분리하였다.그 상등액을 Amicon 10K MWCO 필터(Millipore)를 사용하여 농축하였다.

실시예 5: 세포에서 α- 시누클레인 응집체 및 모노머의 업테이크 및 분해

BV-2, 미세아교 및 성상세포를 실험 전날 배양 접시로 나누었다. 냉장 PBS로 세포를 2회 세척 후, 상온에서 5분간 5 μg/ml 정상 마우스 IgG 또는 α-시누클레인항체로 미리 배양된 0.2 μM α-시누클레인 피브릴 또는 올리고머를 배양 배지와 세포에 첨가하였다. 모노머를 1 μM로 첨가하였다. 조건화된 배지(5x 농축)를 5분 동안 항체로 미리배양하였다. 그 후 세포를 37℃에서 배양하고 기재된 시간에서 수집하였다. 분해 속도를 측정하기 위하여, 상기와 같이 응집체를 흡수하고 세포를 냉장 PBS로 2회 세척하였다. 신선한 배양 배지를 첨가하고, 기재된 시간 동안 37℃에서 세포의 배양을 수행하였다.

실시예 6:α- 시누클레인 항체의 흡수

5μg/ml의 274 항체 또는 대조군 IgG으로 처리된 BV-2 세포를 여러 양의 α-시누클레인 피브릴(0, 2.66, 13.3, 66.5, 133, 및 330 nM)으로 미리배양하였다. 274 항체의 비특이적인 흡착의 가능성을 배제하기 위하여, 여러 양의 α-시누클레인 모노머(0, 66.5, 및 330 nM)로 미리배양된 5 μg/ml의 274항체를 세포에 첨가하였다. 흡수된 항체의 레벨을 항-마우스 IgG 항체로 검출하였다.

실시예 7: 세포 추출물의 제조

세포를 PBS로 세척하고 추출 버퍼[PBS, 1% Triton X-100, 1% (v/v) 프로테이즈 저해제 혼합물(Sigma)]에서 파쇄하였다. 10분간 얼음에서 배양한 후, 세포 파쇄액을 10분간 16,000 xg에서 원심분리하였다. Triton X-100 불용성 펠렛을 Laemmli 샘플 버퍼에서 재부유하고 잠시 초음파처리하였다.

실시예 8: 웨스턴 블럿팅

웨스턴 블럿팅을 Lee HJ, Lee SJ (2002)J Biol Chem 277:48976-48983에 기재된 것과 같이 수행하였다. 이미지를 얻고 Fujifilm Luminescent Image Analyzer LAS-3000 및 Multi Gauge (v3.0) 소프트웨어(Fujifilm)를 사용하여 정량화하였다.

정량화를 위하여, 런닝 젤의 시작으로부터 α-시누클레인 모노머 밴드까지 모든 레인을 분석하였다.

실시예 9: 배양된 세포의 면역형광 염색

세포 염색에 대한 과정을 Lee HJ, Lee SJ (2002)J Biol Chem 277:48976-48983에 기재된 것과 같이 수행하였다.

요약하면, poly-L-lysine-코팅된 커버슬립 상에 배양된 세포를 PBS 내의 4% paraformaldehyde에서 고정화하고 0.1% Triton X-100 내에서 흡수하였다. 블럭킹 용액에서 희석된 1차 항체의 첨가 전에 세포를 블럭킹 용액(5% bovine serum albumin/3% goat serum in PBS)에서 배양하였다. 세척 후, 세포를 형광 염료 부착된 2차 항체로 배양하였다. 핵을 TOPRO-3 iodide (Invitrogen)으로 염색하고, 커버슬립을 antifade reagent (Invitrogen)를 사용하여 슬라이드 글래스 상에 마운트하였다. Olympus FV1000 공초점 레이져 스캐닝 현미경을 세포의 관찰에 사용하였다.

실시예 10: Tg 마우스 주 및 항체의 뇌내 ( intracerebral ) 주사

본 발명을 위하여 platelet-derived growth factor-베타 (PDGF-베타) 프로모터로부터 유래한 α-시누클레인을 과발현하는 마우스(line M)를 사용하였다 (Masliah E, Rockenstein E, Veinbergs I, Mallory M, Hashimoto M, Takeda A,Sagara Y, Sisk A, Mucke L (2000) Science 287:1265-1269). 이 모델은 이들 라인으로부터 유래한 마우스는 루이소체 질환에서 기재된 것과 유사한 신피질, 해마, 및 선조체를 통하여 분포된 신경 및 아교세포 모두에서 α-시누클레인 응집체를 발생하기 때문에 선택하였다. 이들 마우스에서,α-시누클레인은 신피질 및 해마의 깊은 층에서 신경망 및 뉴런 세포체에 축적한다.α-시누클레인은 3개월 령에서 뉴런에 축적되기 시작하여 12개월 령에서 최대 축적을 가진다. 따라서 이 tg 마우스 모델에서, α-시누클레인 병리는 매우 일정하고 시공적인(spatiotemporal) 순서로 진행한다. 모든 동물 실험 과정은 실험 동물윤리 위원회의 승인을 받았다. 모든 실험은 암컷 마우스에서 수행되었다. 각 실험을 위하여 그룹 당 8마리 마우스를 사용하였다. 전체 32 마리 마우스를 이 실험에 사용하였다;이중 16 마리 마우스는 α-시누클레인 tg 마우스이고 다른 16 마리는 non-tg 동물 대조군(9 월령). 각 그룹으로부터 마우스를 3μl의 비면역 IgG 대조군(n=8 non-tg 및 n=8 α-시누클레인 tg) 또는 α-시누클레인 (clone 274; 1 mg/ml)에 대한 항체(n = 8 non-tg 및 n=8 α-시누클레인 tg)로 해마(5 μl Hamilton 주사기를 사용, 0.25 μl/분)에 주사하였다. 요약하면, 마취하에서 Koft 정위 장치 및 코디네이트(해마:AP: 2.0 mm, 외측 1.5 mm, 깊이 1.3 mm) 상에 위치한 마우스를 Franklin 및 Paxinos (Franklin KBJ, Paxinos G, (2008) The mouse brain in stereotaxic coordinates,Ed 3. Burlington, MA: Elsevier) 도해서에 의해서 결정하였다. 용액의 주사를 위하여 수압 시스템에 연결된 Hamilton 주사기를 항체 전달에 사용하였다. 뇌 조직으로 용액의 확산을 위하여, 바늘을 주사 완료 후 5분간 유지하였다.

대측면에 대하여 비교를 위하여 마우스를 일방 주사(우측)를 하였다. 마우스를 항체 주사 후 4 주간 생존시켰다. 12 마리 α-시누클레인 tg 마우스 (3 월령) 추가 그룹은 α-시누클레인 (clone 274; 1 mg/ml)에 대한 항체로 해마에 일방주사를 받았고 주사 후 1, 7, 14, 및 28일에 분석을 위하여 희생시켰다. 동물의 인간적인 처리를 위한 국립보건원 가이드라인에 따라서 마우스를 chloral hydrate로 마취하고 0.9% 식염수로 심장으로 관류하였다. 뇌를 제거하고 신경병리 분석을 위하여 인산-버퍼 4% paraformaldehyde,pH7.4에서 4℃에서 48시간 고정하였다.

실시예 11: 수동 면역화 및 행동 연구

전체 32 마리 마우스를 본 실험에 사용하였고, 이중 16 마리는 α-시누클레인 tg 마우스 (line M, 10 월령)이고 나머지 16 마리는 non-tg 동물 대조군 (10 월령)이다. 각 그룹으로부터 마우스에 비면역 IgG 대조군(n=8 non-tg 및 n=8 α-시누클레인 tg) 또는α-시누클레인 (clone 274; 1 mg/ml)에 대한 마우스 단클론 항체(n=8 non-tg 및 n= 8 α-시누클레인 tg)를 복강내로 1 mg/ml의 농도(100 μl/주, 4 동안)로 주었다. 그 첫번째 주사 후 1달 동안 마우스를 생존시키고 Masliah E, Rockenstein E, Veinbergs I, Mallory M, Hashimoto M, Takeda A,Sagara Y, Sisk A, Mucke L (2000) Science 287:1265-1269에 기재된 것과 같은 폴 테스트에서 모터 기능에 대한 테스트 및 오픈 필드에서 자발적인 활성에 대한 테스트를 수행하였다. 행동 테스트를 수행하여 마우스를 신경 병리 분석을 수행하였다.

실시예 12: 신경병리 및 α- 시누클레인 축적의 면역조직화학 분석

α-시누클레인 축적의 분석은 IgG 또는 α-시누클레인 (clone 274)에 대한 항체로 처리된 non-tg 및 α-시누클레인 tg 마우스로부터 유래한 프리 플로팅, 일련의 절편에서 수행하였다. 절편들을 4℃에서 항-α-시누클레인 항체(1:500, affinity purified rabbit polyclonal;Millipore Bioscience Research Reagents)로 오버나잇 배양한 후, 바이오틴화된 염소 항-토기 IgG (1:100; Vector Laboratories), Avidin D-horseradish peroxidase (1:200, ABC Elite; Vector Laboratories)로 처리한 후, diaminobenzidine (DAB)로 검출하였다. 절편을 Olympus 명시야 디지털 현미경으로 이미지화하였다. 각 경우에 대해서, 세 절편을 Stereo-Investigator System (MBF Bioscience)을 사용하여 해부자 분석에 의하여 분석하였고 그 결과를 평균화하고 수/mm³로 표현하였다. 신경퇴행 및 신경 염증성 반응에 대한 항체의 효과를 분석하기 위하여, 절편들을 NeuN (Millipore), glial fibrillary acidic protein (GFAP) (Millipore), Iba1 (Wako), IL6 (Novus Biologicals),및 종양괴사인자(Abcam)에 대한 마우스 단클론 항체로 면역표지하고 DAB로 검출하였다. 항체 GFAP 및 Iba-1로 면역염색된 절편들을 Olympus 명시야 디지털 현미경으로 이미지화하고 Image Pro-Plus 시스템으로 흡광도 및 세포 카운트를 분석하였다. NeuN에 대한 항체로 면역염색된 절편을 Stereo-Investigator System (MBF Bioscience)을 사용한 해부자 분석에 의하여 분석하고 그 결과를 평균화하고 수/mm³로 표현하였다.

실시예 13: 이중 면역조직화학 및 공초점 분석

동시위치화를 결정하기 위하여, 40-μm-두께 바이브라톰 절편을 α-시누클레인 (Millipore Bioscience Research Reagents, affinity purified polyclonal, 1:500), 마우스 IgG(274 항체 분포를 검출하기 위함), 및 Iba-1 (미세아교세포 마커)에 대한 항체의 조합으로 이중 표지하였다. α-시누클레인 면역반응성 구조는 Tyramide Signal Amplification-Direct (Red) 시스템(1:100; NEN Life Sciences)으로 검출한 반면 마우스 IgG 또는 Iba-1은 fluorescein isothiocyanate (FITC)-부착된 horse 항-마우스 항체(1:75; Vector Laboratories)로 검출하였다.

모든 절편들을 동일한 조건에서 동시에 진행하였고, 결과의 재생성을 평가하기 위하여 실험을 2회 수행하였다. 절편들을 MRC1024 LSCM 시스템(Bio-Rad)이 부착된 Axiovert 35 현미경(Zeiss) 상에서 Zeiss 63 x (NA 1.4) 대물로 이미지화하였다. 각 절편에 대해서, 10μm의 플레인에서 일련의 광학 절편을 얻어서 α-시누클레인-면역반응성 물질을 나타내는 Iba-1-포지티브 세포의 퍼센트의 분석을 위하여 사용하였다. 각 케이스로부터, 평균 120 Iba-1-포지티브 세포를 분석하였다(절편 당 30 개). 면역화 후 뉴런 또는 성상아교세포에 α-시누클레인의 동시존재를 결정하기 위한 추가적인 연구가 NeuN (뉴런 마커; Millipore, 마우스 단클론, 1:1000) 또는 GFAP (성상아교세포 마커; Millipore, 마우스 단클론, 1:2000) 및 α-시누클레인 (토끼 다클론; Millipore, 1:5000)에 대한 항체로 이중 표지된 절편에 의하여 수행되었다. α-시누클레인을 Tyramide Signal Amplification-Direct (Red) 시스템(1:100; NEN Life Sciences)으로 검출한 반면, NeuN 또는 GFAP는 FITC로 검출하였다.

실시예 14: 통계 분석

도면에 나타낸 값들은 평균±SEM으로 나타낸다. 편차의 통계적 유의성의 결정을 위한 P 값을 GraphPad InStat 버젼 3.05 소프트웨어를 사용한 paired 또는 unpaired, 양방 Student's t test, 일방 ANOVA with a post hoc Dunnet 또는 일방 ANOVA with Tukey 포스트 테스트를 통하여 계산하였다. 흡수 카이네틱 데이터의 통계적 분석을 위하여, 독립적인 실험들을 통하여 얻은 α-시누클레인의 베스트-fit 상대적인 값들을 Graph-Pad InStat 버젼 3.05 소프트웨어를 사용한 엑스트라 추가 제곱합 F 테스트에 의하여 분석하였다.

<110> Konkuk University Industrial Cooperation Corp. <120> Composition for treating diseases related with clearance of extracellular alpah-Synuclein and method for screening the candidate thereof <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 274 Epitope <400> 1 Pro Asp Asn Glu Ala Tyr Glu Met Pro Ser Glu Glu Gly Tyr Gln Asp 1 5 10 15 Tyr Glu Pro Glu Ala 20 <210> 2 <211> 140 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Asp Val Phe Met Lys Gly Leu Ser Lys Ala Lys Glu Gly Val Val 1 5 10 15 Ala Ala Ala Glu Lys Thr Lys Gln Gly Val Ala Glu Ala Ala Gly Lys 20 25 30 Thr Lys Glu Gly Val Leu Tyr Val Gly Ser Lys Thr Lys Glu Gly Val 35 40 45 Val His Gly Val Ala Thr Val Ala Glu Lys Thr Lys Glu Gln Val Thr 50 55 60 Asn Val Gly Gly Ala Val Val Thr Gly Val Thr Ala Val Ala Gln Lys 65 70 75 80 Thr Val Glu Gly Ala Gly Ser Ile Ala Ala Ala Thr Gly Phe Val Lys 85 90 95 Lys Asp Gln Leu Gly Lys Asn Glu Glu Gly Ala Pro Gln Glu Gly Ile 100 105 110 Leu Glu Asp Met Pro Val Asp Pro Asp Asn Glu Ala Tyr Glu Met Pro 115 120 125 Ser Glu Glu Gly Tyr Gln Asp Tyr Glu Pro Glu Ala 130 135 140

Claims (6)

1. 서열번호 1에 기재된 α-시누클레인 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체.
2. 제 1항의 항체를 유효성분으로 포함하는 파킨슨 질환 예방 또는 치료용 조성물.
3. 제 1항의 항체를 유효성분으로 포함하는 루이소체 치매(DLB) 예방 또는 치료용 조성물.
4. 후보 물질과 세포외 α-시누클레인 단백질을 이 두 성분이 상호작용하기에 적합한 환경 하에서 미세아교세포에 접촉시키고, 상기 미세아교세포에서 상기 α-시누클레인 단백질의 업테이크 및 분해 속도가 증가한 경우에 해당 후보물질을 파킨슨 질환 또는 루이소체 치매(DLB) 치료제 후보물질로 판정하는 것을 특징으로 하는 파킨슨 질환 또는 루이소체 치매(DLB) 치료제 후보물질 동정 방법.
5. 제 4항에 있어서, 상기 후보물질은 항체인 것을 특징으로 하는 파킨슨 질환 또는 루이소체 치매(DLB) 치료제 후보물질 동정 방법.
6. 제 4항에 있어서, 상기 미세아교세포는 Fcγ 수용체를 발현하는 것을 특징으로 하는 파킨슨 질환 또는 루이소체 치매(DLB) 치료제 후보물질 동정 방법.
   

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