KR101896182B1 - 알파-시누클레인 응집체 매개 세포독성을 억제하는 방법 - Google Patents

알파-시누클레인 응집체 매개 세포독성을 억제하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명에 따르면, 구형의 SDS 저항성 α-Syn 응집체가 직접 결합에 의해 특정 시냅스 단백질, 예컨대 VAMP2 (vesicle-associated membrane protein 2)를 우선적으로 격리한다. α-Syn 응집체의 격리효과를 무세포시스템 (cell-free system), 배양된 1차 뉴런 및 PD 마우스 모델에서 확인하였다. 또한, 본 발명자들은 VAMP2에서 유래한 특이적 블로킹 펩타이드를 동정하였으며, 상기 펩타이드는 α-Syn 응집체에 의한 VAMP2 격리를 일부 저해하여 신경독성을 감소시켰다. 이들 결과는, 신경독성에서 α-Syn 응집체의 직접적인 기작을 제시하고, α-Syn 응집체의 병리학적 역할을 방해하는 블로킹 펩타이드는 PD 치료를 위한 잠재적 치료 약물을 개발에 이용될 수 있을 것이다.

Description

알파-시누클레인 응집체 매개 세포독성을 억제하는 방법 {A method for suppressing alpha-Synuclein aggregates-mediated cellular toxicity}
본 발명은 α-시누클레인 응집체에 의한 세포독성 및 세포사멸을 억제하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 α-시누클레인 응집체에 의한 세포독성 및 세포사멸을 억제하여 신경퇴행성질환을 예방 또는 치료하기 위한 방법에 관한 것이다. 본 발명은 미래창조과학부로부터 한국뇌연구원 기초연구프로그램 및 한국연구재단 뇌과학연구프로그램을 통한 지원으로 완성되었다.
단백질 응집체는 연령과 관련된 신경퇴행성질환 (neurodegenerative diseases, ND), 예를 들어, 파킨슨병 (Parkinsons disease, PD), 알츠하이머병 (Alzheimers disease, AD), 헌팅턴병 (Huntingtons disease, HD) 및 근위축성측생경화증 (amyotrophic lateral sclerosis, ALS)에서 특징적으로 발견된다. 일반적으로, 다수의 심각한 병리학적 조건, 유전적 요인 및 환경적 요인이, 비정상적인 단백질 응집체 형성에 관련된다. 응집 단백질 (즉, α-syn, Aβ 및 tau)은 정상적인 경우 모노머 형태로 뇌에 존재하나, ND 환자 뇌에서는 연령과 연관되어 전형적으로 아밀로이드 섬유를 형성한다. 통상, 섬유상 아밀로이드 응집 (fibrillar amyloid aggregation) 과정에서, 수용성 올리고머 형태의 중간체가 신경독 형태인 것으로 간주되어 왔다. 연령 외에도, 이들 단백질 내 변이 및 환경적 스트레스 예컨대, 극한 온도 및 pH 또는 산화 스트레스가 단백질 응집을 유도할 수 있다. 또한, 미스폴딩 (misfolding) 된 단백질을 재폴딩하거나 분해하는 세포 단백질 퀄리티-조절 시스템의 결함이 단백질 응집의 다른 중요한 요인이다.
α-시누클레인 (α-Synuclein)은 파킨슨병 (Parkinsons disease, PD)과 루이소체성 치매 (Dementia with Lewy Bodies)를 포함하는 시누클레인성 질환에서 발견되는 루이소체의 주요성분이다. 병리학적 조건하에서, α-Syn은 신경세포에 독성을 나타내고 세포를 가로질러 전달될 수 있는 다양한 형태의 응집체를 생성한다. 그러나 α-syn 응집체가 뉴런 세포 독성에 미치는 영향과 관련된 기작은 아직 완전히 밝혀지지 않았다. α-Syn 응집체는 PD, 루이소체성 치매, 및 다통계위축 (multiple system atrophy)의 주요 분자이다. α-syn (SNCA)을 엔코딩 하는 유전자 및 상기 유전자의 여러 점 돌연변이 (A30P, E46K 및 A53T)의 증가는, 응집 성향을 증대시켜 우세형 유전적 파킨슨증에 기여한다. 환경적 요인 (즉, 산화 스트레스), 전사후변형, 및 단백질분해가 α-syn 응집을 유도하는 것으로 알려졌다. 뉴런 시냅스전 단백질인 α-Syn는 이것의 형태에 따라 서로 상이한 기능을 보이면서 시냅스전달을 조절한다. 모노머로서 α-syn은 신경전달물질 방출, 시냅스 기능, 및 가소성에서 생리학적인 기능을 갖는다. 또한, α-syn은 시냅스 소포의 트래피킹 (trafficking) 및 소포 세포외유출의 조절에 관여하며, 이에 따라 소포 항상성을 조절한다. 그러나, 독소형태로 알려진 α-syn 응집체는 미토콘드리아 및 프로테아좀을 손상시키고, 소포체-골지체 트래피킹을 블로킹하며, 라이소좀 누출을 일으키거나 미세소관을 손상시킴에 의해 세포독성을 유발한다. 또한, α-syn 응집체는 시냅스 단백질, 예컨대, 시냅신1 (synapsin1)의 축삭운반을 방해하거나 시냅스 소포 리클러스터링 (reclustering)을 저해하여 시냅스 기능손상을 매개하고, 그 결과 신경전달물질 방출을 감소시킨다. α-syn 응집체의 비정상적인 축적은 흑질의 도파민성 뉴런에서 초기에 발견되나, 엔도시토시스, 직접적인 통과, 시냅스간 전달 또는 막수용체를 통한 세포간 (cell-to-cell) 전달에 의해 신피질 (neocortex)로 확장된다.
다양한 이종의 α-syn 올리고머종이 서로 다른 조건하에서 생성되며, 서로 다른 기작을 통해 α-syn 독성 발생에 관여하는 것이 in vitro 연구에서 확인되었다. 구형, 체인형, 막대형, 및 환형을 포함하는 상이한 형태가 나타났으며, α-syn 응집체의 다기능적 특성은 이것의 구조적 유연성에 기초한다. 구형 올리고머는 배양된 일차 대뇌피질 뉴런에서 막투과성에 영향을 주어 비정상적인 칼슘 전류를 유도하고, 결과로서 뉴런 변성을 유발하는 것이 보고된 바 있다. 짧은 막대형 올리고머는 감소된 세포외유출과 함께 SNARE-매개 소포 도킹 (docking)을 저해한다. 이들 올리고머들은 응집과정에서 일시적으로 형성되며 서로 다른 물리적 특성을 갖는다. 유사하게, 구조적 및 기능적으로 상이한 α-syn 응집체의 다형체가 독성의 수준 및 전달특성에 대해 다양한 영향을 준다. 이들 올리고머의 다양하고 일시적인 본질적 특성으로 인하여, 자연형과 비교하여 이들의 특성을 확인하고 분석하는 것이 보다 더 어렵다. 따라서, 이러한 복잡한 구조 및 생리학적 결과는, α-syn과 같은 단일 단백질이 어떻게 다양한 임상적 시누클레인증 징후를 유발하는지를 설명할 수 있을 것이다.
최근 연구는 비정상적인 단백질 응집에 의해 유도된 신경퇴행성 질환을 치료하기 위한 다양한 치료적 접근을 제공하였다. Aβ 응집체 형성을 저해하거나 이미 존재하는 Aβ 응집체를 제거하기 위한 저분자 화합물들이 보고되었다. 사람 타우병증 (tauopathy)의 마우스 모델에서 타우 단백질 발현을 감소시키기 위해, 안티센스 올리고누클레오티드가 AD 치료를 위한 유용한 수단으로서 개발되었다. 마이크로 RNA-기재 유전자치료가 도파민성 뉴런에서 α-syn 축적을 감소시키기 위해 사용된 바 있다. 또한, 면역치료는 α-syn 항체가 세포간 전달을 블로킹하며 그에 따라 α-syn 병리학을 예방할 수 있음을 입증하였다. 흥미롭게도, 항암 및 항바이러스 활성을 지닌 천연물이 α-syn 응집의 개시를 저해하고, α-syn를 지질 막으로부터 이동시켜 이것의 독성을 억제하는 것이 보고된 바 있다.
본 발명자들은 구형 α-syn 응집체가 다양한 뉴런 시스템에서 기능적 시냅스 단백질 예컨대, VAMP2를 격리하는 것을 확인하였다. 또한, 본 발명자들은 α-syn 응집체에 의한 VAMP2 격리를 저해하는 특이적 펩타이드를 동정하였다. 상기 펩타이드는 VAMP2의 정상적 분포 및 α-syn 응집체-매개 세포독성의 회복에 기여하였다.
한국특허출원공개 제 10-2011-0110200호
Jacqueline Burre et al., (2010) α-Synuclein Promotes SNARE-Complex Assembly in Vivo and in Vitro, Science, Vol. 329, Issue 5999, 1663-1667. Volpicelli-Daley, L. A., Luk, K. C., Patel, T. P., Tanik, S. A., Riddle, D. M., Stieber, A., Meaney, D. F., Trojanowski, J. Q., and Lee, V. M. (2011) Exogenous alpha-synuclein fibrils induce Lewy body pathology leading to synaptic dysfunction and neuron death. Neuron72, 57-71. Danzer, K. M., Ruf, W. P., Putcha, P., Joyner, D., Hashimoto, T., Glabe, C., Hyman, B. T., and McLean, P. J. (2011) Heat-shock protein 70 modulates toxic extracellular alpha-synuclein oligomers and rescues trans-synaptic toxicity. FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology25, 326-336. Tsigelny, I. F., Sharikov, Y., Wrasidlo, W., Gonzalez, T., Desplats,P. A., Crews, L., Spencer, B., and Masliah, E. (2012) Role of alpha-synuclein penetration into the membrane in the mechanisms of oligomer pore formation. The FEBS journal279, 1000-1013. Bousset, L., Pieri, L., Ruiz-Arlandis, G., Gath, J., Jensen, P. H., Habenstein, B., Madiona, K., Olieric, V., Bockmann, A., Meier, B. H., and Melki, R. (2013) Structural and functional characterization of two alpha-synuclein strains. Nature communications4, 2575.
이와 같이, 본 발명은 α-시누클레인 응집체에 의한 세포기능손상, 세포독성 또는 세포사멸을 저해 또는 억제하기 위한 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 α-시누클레인 응집체에 의한 세포기능손상, 세포독성 또는 세포사멸을 저해 또는 억제하는 물질을 스크리닝하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 α-시누클레인 응집체와 기능적 세포 단백질의 결합을 블로킹하는 물질을 스크리닝 하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 스크리닝된 물질을 포함하는 신경퇴행성질환 및/또는 신경퇴행성질환에 의한 치매의 예방, 치료, 또는 예방 및 치료를 위한 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 α-시누클레인 응집체에 의한 세포기능손상, 세포독성 또는 세포사멸을 저해하거나 억제하기 위한 펩타이드를 제공한다. 본 발명의 일 예에서 상기 펩타이드는 서열번호 1을 갖는, 기능적 시냅스 단백질의 일종인 VAMP2 단백질 유래 펩타이드이다.
또한, 본 발명은 상기 펩타이드를 포함하는 신경퇴행성질환 및/또는 신경퇴행성질환에 의한 치매의 예방, 치료, 또는 예방 및 치료를 위한 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 예에서, 상기 신경퇴행성질환은 파킨슨병 (Parkinsons disease, PD), 알츠하이머병 (Alzheimers disease, AD), 헌팅턴병 (Huntingtons disease, HD), 근위축성측생경화증 (amyotrophic lateral sclerosis) 또는 루이소체병 (Lewy body disease) 일 수 있다.
본 발명은 또한 α-시누클레인 응집체와 VAMP2 (vesicle-associated membrane protein 2)의 결합을 블로킹하여 세포기능손상, 세포독성 또는 세포사멸을 억제하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 α-시누클레인 응집체에 의한 세포기능손상, 세포독성 또는 세포사멸을 저해 또는 억제하는 물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 예에서, 상기 스크리닝 방법은, i) 분석대상 시료와 α-시누클레인 응집체를 인큐베이션 하고, ii) 상기 i)의 인큐베이션된 α-시누클레인 응집체와 VAMP2의 결합을 분석하며; 및 iii) 상기 결합이 감소 된 것으로 확인된 경우, 상기 시료가 α-시누클레인 응집체에 의한 세포기능손상, 세포독성 또는 세포사멸을 저해하거나 억제하는 물질로 판단하는 것을 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 상기 스크리닝한 물질을 포함하는 신경퇴행성질환 및/또는 신경퇴행성질환에 의한 치매의 예방, 치료, 또는 예방 및 치료를 위한 약학 조성물을 제공한다.
본 발명은 구형 α-syn 응집체와 기능적 시냅스 단백질의 일종인 VAMP2의 결합을 방해하는 작은 합성 펩타이드를 제공한다. 따라서, 본 발명의 펩타이드는 α-syn 응집체의 뉴런 세포 독성을 저해 또는 억제할 수 있으므로, 신경퇴행성질환 또는 신경퇴행성질환에 의한 치매 치료제 개발에 이용될 수 있다.
도 1은 α-Syn 응집체가 선택적으로 시냅스 단백질 수준을 감소시킨 것을 나타낸다.
도 2는 시험관 내에서 α-Syn 응집체가 직접 결합을 통해 VAMP2를 격리하는 것을 나타낸다.
도 3은 VAMP2가 α-syn 모노머 및 Aβ 응집체와 결합하지 않는 것을 제시한다.
도 4는 배양된 일차 뉴런에서 α-syn 응집체에 의한 VAMP2 격리가 시냅스 기능손상 및 세포독성을 유도함을 나타낸다.
도 5는 PD 마우스로 모델로부터의 α-syn 응집체가 in vivo에서 VANP2와 직접 결합하는 것을 나타낸다.
도 6은 VAMP2 펩타이드가 무세포조건에서 α-syn 응집체에 의한 VAMP2 격리를 부분적으로 없애는 것을 나타낸 것이다.
도 7은 배양된 일차 뉴런에서 VAMP2 펩타이드가 α-syn 응집체에 의한 VAMP2 격리를 방해하는 것을 타나낸다.
도 8은 배양된 일차 뉴런에서 VAMP2 펩타이드가 α-syn 응집체에 의해 유도된 세포독성을 감소시킨 것을 나타낸다.
도 9는 EF1α가 래트 대뇌피질 뉴런에서 α-syn 응집체에 의해 영향을 받는 주요 표적 단백질임을 나타낸 것이다.
본 발명에 따르면, 구형의 SDS 저항성 α-Syn 응집체가 직접 결합에 의해 특정 시냅스 단백질, 예컨대 VAMP2 (vesicle-associated membrane protein 2)를 우선적으로 격리한다. α-Syn 응집체의 격리효과를 무세포시스템 (cell-free system), 배양된 1차 뉴런 및 PD 마우스 모델에서 각각 확인하였다. 또한, 본 발명자들은 VAMP2에서 유래한 특이적 블로킹 펩타이드를 동정하였으며, 상기 펩타이드는 α-Syn 응집체에 의한 VAMP2 격리를 일부 저해하여 신경독성을 감소시켰다. 이들 결과는, 신경독성에서 α-Syn 응집체의 직접적인 기작을 제시하고, α-Syn 응집체의 병리학적 역할을 방해하는 블로킹 펩타이드가 PD 치료를 위한 잠재적 치료 약물을 개발 하는데 유용할 수 있음을 시사한다.
본 발명에서, 본 발명자들은 구형의 α-syn 응집체가 기능적 세포 단백질 예컨대, VAMP2 및 EF1의 격리를 통해, 신경독성에 영향을 주는 것에 대한 직접적인 기작을 조사하였다. 또한, 본 발명자들은 VAMP2에서 유래한 작은 합성 펩타이드가 상기 기능적 세포 단백질의 격리를 방해하여 신경손상을 회복시킬 수 있음을 확인하였다. 본 발명에 따르면, 구형 α-syn 응집체가 SNARE 모티브의 C-말단 도메인을 통해 VAMP2를 격리할 수 있다 (도 6). 이는 서로 다른 응집체 형태에 따라 VAMP2의 기능을 방해하는 α-syn 응집체의 추가의 생물화학적 특징을 제공하고, 응집체의 올리고머 형태가 섬유상 형태와 비교하여 보다 더 다양함을 재확인 시킨다.
모노머 α-syn가 VAMP2와 결합하는 것이 알려졌으나, 본 발명의 분석조건에서는 어떠한 직접적인 결합이 없었다 (도 3). 이러한 결과는 α-syn 모노머의 VAMP2에 대한 결합력은 응집체 형태의 경우와 비교하여 무시할 정도의 수준이며, 그에 따라 본 발명의 시험관 내 테스트는 이를 검출할 정도로 민감도가 높지 않기 때문인 것으로 추정된다. 또한, 광범위한 온도 및 pH 조건하에서의 α-syn 응집체와 VAMP2의 강력한 결합 (도 2)은, 상기 응집체의 타입이 in vivo 조건에서 격리능력의 손실 없이 지속될 수 있음을 제시한다.
선행연구에서, Volpicelli-Daley L 등은 외인성 α-syn 미리 형성된 미소섬유 (pre-formed fibrils, pff)가 배양된 뉴런 세포에 의해 내재화되고, 시냅스 기능손상과 뉴런 사멸을 유도함을 밝힌 바 있다. 이들은 뉴런 감수성 및 커넥티비디의 감소를 설명하면서, SNAP25 및 VAMP2를 포함하는 특정 시냅스 단백질의 수준이 세포독성 프로세싱 중에 α-syn pff 처리된 세포에서 선택적으로 감소 된 것을 제시하였다. 상기 연구와 마찬가지로, 본 발명자들은 또한 신경전달물질 방출의 감소 및 심각한 세포사멸을 α-syn 응집체 처리 뉴런에서 확인하였다 (도 4). 이러한 현상은 특이적 단백질 예컨대, SNAP25 및 VAMP2가 in vitro 및 in vivo 실험에서 제시된 것과 같이, α-syn 응집체의 격리에 대한 표적으로서 선택되는 것과 관련된 직접적인 기작을 설명할 수 있다 (도 1 및 5). 특히, 시험관 내 형성된 이들 응집체가 in vivo PD 마우스 조직에서 형성된 것과 유사한 특성 및 크기를 가진 것으로 확인되었다.
α-syn 응집체에 대한 광범위한 연구가 수행되었음에도 불구하고, 상기 응집체가 어떻게 그러한 특이적인 표적 선택성을 획득하였는지에 대해서는 거의 알려진 바 없다. α-syn 응집체에 의한 격리를 위한 표적으로서, VAMP2는 취약한 시냅스 단백질이며, 이 단백질은 시냅스 소포 방출 저해제로 알려진 보툴리늄 신경독 및 테타누스 신경독과 같은 신경독에 의해 쉽게 분해된다. 특히, VAMP2는 세포질 부위 내에 이들 신경독에 대한 특이적 절단부위들을 포함하며, 상기 절단부위들은 주로 VAMP2내의 코일드-코일 (coiled-coil) SNARE 모티프 말단에 위치한다. 흥미롭게도, 본 발명에서 사용된 펩타이드 P5 (83KLKRY87) 서열은 티티우스 세룰라투스 독 (Tityus serrulatus venom)으로부터의 안타레아제 메탈로프로테아제 (ntarease metalloprotease)에 대한 절단부위와 정확하게 일치하며, 이는 병리학에서 이러한 엔자임과 구형 α-syn 응집체가 VAMP2와 상호작용할 수 있는 유사한 토폴로지를 공유할 수 있음을 제시한다. 이와 같이, α-syn 응집체가 선택적인 반면에 SNARE 복합체 성분에 대해 다중결합 파트너인 것을 고려하면 (도 1), 세포 내의 많은 다른 알려지지 않은 표적 단백질이 존재할 수 있을 것으로 보인다. 다른 세포 기능 단백질로서, 대뇌피질 뉴런 용해물의 스크리닝으로부터, 단백질합성 및 이에 따른 일반적인 세포기능에 중요한 EF1α가 α-syn 응집체에 의한 격리의 주요 표적으로 확인되었다 (도 9).
본 발명에서는 비록 Aβ 응집체가 VAMP2와 결합하지 않았으나 (도 3), Aβ 응집체에 대한 다수의 결합 표적이 성공적으로 스크리닝 되고 동정되었다. 따라서, 뇌의 뉴런 세포 및 다른 세포 타입에서 α-syn 응집체에 대한 표적 단백질의 전체 풀 (pool)을 조사하기 위한 추가의 연구가 필요하다. α-syn 응집체가 세포간 전달을 통해 병리학적 역할을 하는 것이 알려졌고, 상기 응집체는 다른 비-뉴런 세포에도 영향을 주는 것으로 여겨지며, 이는 이들 세포로부터 신규한 결합 후보를 특성 확인할 수 있음을 제시한다.
본 발명자들은 VAMP2 유래의 특이적 블로킹 펩타이드가 α-syn 응집체의 격리 효과를 부분적으로 저해하고 세포독성을 경감시키는 것을 확인하였다. (도 6, 7, 및 8). PD 환자에서 도파민성 뉴런의 궁극적인 손실을 고려하면, α-syn 응집체 독성을 낮추는 것에 의해 세포사멸의 개시를 예방하거나 적어도 늦추는 것은 치료에 있어 유용한 전략이 될 수 있다. 비록 본 발명자들이 본 발명에서 신규한 α-syn 응집체 표적으로서 단지 EF1α을 추가로 확인하였을 뿐이나, 중요한 세포 생존을 조절하는 알려지지 않은 많이 표적이 존재할 것이다. 따라서, α-syn 응집체에 의해 영향을 받는 세포 표적의 광범위한 간섭으로 인하여, 펩타이드 P5는 α-syn 응집체에 의해 매개되는 세포 독성에 현저히 긍정적인 효과를 제시하였다.
본 발명에서, α-syn 응집체는 배양된 뉴런에서 VAMP2 클러스터링을 증가시키고 글루타메이트 방출을 현저히 감소시켰다 (도 4). 또한, VAMP2는 in vivo PD 마우스 모델에서 α-syn 응집체와 강하게 연관되었으며, 여기서 사람 질병에서의 α-syn의 병리학적 특성을 재현할 수 있다 (도 5). 그러나, VAMP2 클러스터링의 높은 간섭에도 불구하고 (도 7), 펩타이드 P5는 α-syn 응집체에 의해 손상된 뉴런에서 글루타메이트 방출을 회복시킬 수 없었으며 (도 8a), 이는 글루타메이트 방출에 관여하는 핵심 분자가 펩타이드 P5의 유익한 기능과는 무관함을 시사한다. 실제로, α-syn는 신경전달물질 방출을, 여러 요인 예컨대, 시냅스 소포 클러스터링 및 리사이클링 풀 사이즈 및 세포기관 막 지질에 영향을 주는 것 등에 의해 조절한다. 다른 잠재적인 가능성은 α-syn 응집체의 확인되지 않은 독성 모티프가 펩타이드 P5에 의해 블로킹되지 않는 것이다. 이러한 문제를 해결하기 위해서는, 전체 표적 풀로부터 α-syn 응집체의 결합 모티프에 대한 확실한 정보가 필요할 것이다. 끝으로, α-syn 응집체의 생물화학적 특성이 광범위하게 다변적이고 다양하므로, 적절한 치료법을 발견하는 것은 매우 어렵다. 본 발명의 기술 내용에 따라 α-syn 응집체의 독특한 특성을 이해하는 것을 통해, 본 발명자들은 α-syn 응집체의 표적 단백질을 모사하고 이와 경쟁적으로 상호작용하는 수단으로서 작은 펩타이드가 유용하며, 새로운 PD 치료법의 개발을 위한 강력한 전략이 될 수 있을 것이다.
이하, 실시예에 따라 본 발명을 기술한다. 하기 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 권리범위가 실시예에 한정되는 것은 아니다.
제조예 및 실험예
단백질 발현 및 정제
재조합 사람 VAMP2를 수용성 VAMP2 서열을 함유하는 pET28a 플라스미드로 형질전환된 Escherichia coli RogettaTM(DE3)pLysS (Novagen) 세포주에서 발현시켰다. 상기 세포를 50 ㎍/㎖ 카나마이신을 포함하는 37℃의 LB 배지에서, 흡광도가 0.6 ~ 0.8 (600 ㎚)에 이를 때까지 배양하였다. IPTG (isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside) (최종 농도 0.5 mM)을 가하고, 상기 세포를 16℃에서 하룻밤 배양하였다. 상기 세포를 용해 완충액 (25 mM HEPES, pH7, 300 mM KCl, 20 mM imidazole, 및 1X 프로테아제 저해제 칵테일) 내에서 초음파 분쇄하고, 4℃에서 15,000 g로 30분간 원심분리 하였다. 다음, 상기 세포 용해물을 Ni-NTA 아가로스 (Qiagen)와 4℃에서 1시간 동안 혼합하여 결합시킨 후, 상기 비드를 세척 완충액 (25 mM HEPES, pH7, 300 mM KCl, 및 20 mM 이미다졸 (imidazole))으로 강하게 세척하였다. 용출 완충액 (25 mM HEPES, pH7, 300 mM KCl, 및 400 mM 이미다졸) 내로 상기 단백질을 용출시키고 투석처리 하였다. 재조합 사람 신택신1A (Syntaxin1A) 및 SNAP25를 ProSpec Biotechnology로부터 구입하였다. 재조합 사람 α-syn을 대구경북첨단의료복합단지에서 정제하였다.
α-Syn 응집체 제조 및 형질도입
정제된 10 μM α-Syn 응집체와 200 μM 도파민을 20 mM 소듐포스페이트 완충액 (pH7) 내에서 일정하게 교반하면서 37℃에서 3일간 인큐베이션 하였다. 샘플을 4℃, 14,000 g에서 10분간 원심분리 하여 불용성 응집체를 제거하였다. 상등액을 농축하고 Superdex 200 10/30 GL 컬럼 (GE Healthcare)에 로딩한 다음, NGCTM Chromatography Systems (Bio-Rad, USA)을 사용하여 모노머로부터 응집체를 분리하였다. 응집체를 함유하는 분획을 다시 농축하고 사용 전까지 4℃에 보관하였다.
투과전자현미경 (Transmission electron microscopy) 분석
α-Syn 응집체를 300-메쉬 구리그리드 (Electron Microscopy Sciences)에 로딩하고 2% (w/v) 우라닐 아세테이트 (uranyl acetate)로 바탕 염색 (negatively stained) 한 다음, JEM-1011 투과전자현미경 (JEOL, Japan)으로 이미지를 수득하였다.
결합분석 (binding assay)
1 μM 재조합 단백질을 총부피 10 ㎕에서 100 nM α-Syn 응집체와 함께 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션 하였다. 5X 단백질 샘플 완충액을 가하여 반응을 종료한 후, SDS-PAGE를 수행하였다. 단백질 수준을 웨스턴블로팅 또는 Sypro　 Orange (Molecular Probes) 단백질 겔 염색으로 분석하였다.
웨스턴블로팅 분석
세포를 ice-cold Nonidet P-40 용해 완충액 (50 mM Tri, pH7.5, 150 mM NaCl, 30 mM MgCl2, 1 % Nonidet P-40, 1 mM DTT) 및 프로테아제와 포스파타나제의 혼합물로 추출하였다. 다음, 용해물을 4℃, 14,000 g로 10분간 원심분리하였다. 각 상등액으로부터 수득한 단백질 30 ㎍을 사용하여 12% SDS-PAGE를 수행하고, 실온에서 1시간 동안 3% BSA로 블로킹한 니트로셀룰로오스 막 (nitrocellulose membrane)으로 옮겼다. 면역블로팅을 α-Syn (BioLegend, 1:1000), VAMP2 (Abcam, 1:5000 or Abfrotier, 1:500), SNAP25 (Santa Cruz Biotechnoloy, 1:500), His-tag (Thermo Fisher Scientific, 1:1000), Syntaxin1A (Cell Signaling Technology, 1:1000), 또는 EF1α (Cell Signaling Technology, 1:1000)에 대한 일차 특이 항체로 수행하였다. 페록시다아제-컨쥬게이션된 이차 항체로 실온에서 1시간 인큐베이션하고, Fusion FX7 (Vilber, Germany)를 사용하여 증가 된 화학 루미네선스로 현상하였다.
일차 뉴런 배양
일차 대뇌피질 뉴런을 배아 18일령 래트 뇌로부터 배양하고 B27 (Invitrogen)을 함유하는 신경세포배양용 배지 (neurobasal media) 내에서 인큐베이션 하였다. 대부분의 실험은 7 ~ 14 DIV (days in vitro)에서 수행하였다. 5 ㎍/㎖의 α-syn 응집체를 12-웰 플레이트에 가하고, 1 ㎍/㎖를 96-웰에 가하였다. 펩타이드 실험을 위해, 1 mM 펩타이드를 실온에서 1시간 동안 α-syn 응집체와 함께 미리 인큐베이션하고 세포에 처리하였다.
면역형광
면역세포화학을 위해, 뉴런을 PBS 내 4% 파라포름알데히드로 고정하고, 이어서 PBS 내 0.1% Triton X-100로 투과처리 (permeabilization) 하였다. 뉴런을 마우스 안티-α-syn (BioLegend, 1:500), 마우스 안티-α-syn (BD, 1:500), 래빗 안티-VAMP2 (Abcam, 1:500), 또는 래빗 안티-절단된 카스파아제-3 (Cell Signaling, 1:500)과 함께 인큐베이션 한 후, Alex fluor (상표명) 컨쥬게이션된 2차 항체 (Invitrogen, 1:1000)로 처리하였다. 면역조직화학을 위해, 4% 파라포름알데히드로 후고정 (postfixed)되고 이어서 수크로스로 동결방지 된 뇌를 동결 마이크로톰 (freezing microtome) 상에서 60 ㎛로 절단하였다. 뇌를 5% 염소 혈청 PBST (0.3% Triton) 내의 마우스 안티-α-syn (BioLegend, 1:500) 및 래빗 안티-VAMP2 (Abcam, 1:500) 항체와 함께 4℃에서 하룻밤 인큐베이션 한 후, 형광-컨쥬게이션 된 2차 항체와 실온에서 2시간 인큐베이션 하였다. 모든 조각을 슬라이드 위에 올리고 Prolong Gold mounting solution (Invitrogen)을 사용하여 커버슬리핑 하였다. 한국뇌연구원의 공초점레이저스캐닝현미경 (Confocal laser scanning microscopy TCS SP8, Leica, Germany)을 사용하여 공초점현미경 데이터를 수득하였다.
글루타메이트 분석
방출된 글루타메이트 수준을 글루타메이트 어세이 키트 (Cell Biolabs)로 측정하였다. 불용성 입자를 10,000 rpm에서 5분 원심분리하여 제거하고, 상등액을 FlexStation 3 (Molecular Devices, USA)로 직접 분석하였다. 글루타메이트 수준을 글루타메이트 스탠다드 커브에 기초하여 정량화하였다. 모든 다른 과정은 제조자의 지시를 따랐다.
세포 생존력 분석
뉴런을 96-웰에 두었다. α-syn 응집체 처리 14일 후, CellVia 세포 생존력 어세이 키트 (Abfrontier)를 사용하여 세포 생존력을 측정하였다. CellVia 용액 (10 ㎕/웰)을 웰에 가하고 37℃에서 4시간 인큐베이션 하였다. VersaMax microplate reader (Molecular Devices, USA)로 450 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.
마우스
Prnp-SNCA*A53T 형질전환 마우스를 Jackson laboratory (Stock No. 004479)에서 구입하고, C57BL/6 및 C3H 혼합 배경에서 유지하였다. 모든 동물은 한국뇌연구원의 국제동물실험가이드라인 (M1-IACUC-16- 00004)에 따라 취급하였다.
In vivo 풀다운어세이 (pull down assay)
어린 (3개월령) 및 늙은 (22개월령) 마우스 이형접합 SNCA 마우스를 희생시키고 뇌 조직을 1X 프로테아제 저해제 칵테일을 함유하는 아이스-콜드 (ice-cold) 용해 완충액 (T-PER　 tissue protein extraction reagent, Thermo Fisher Scientific Inc.)으로 균질화 하였다. 균질화 된 조직을 얼음에서 10분 동안 인큐베이션 한 후, 4℃에서 10,000 g로 5분간 원심분리 하였다. 뇌 용해물의 단백질 농도를 바이신코니닉산 (Bicinchoninic acid, BCA) 단백질 어세이 (Pierce)로 측정하였다. 뇌 용해물 3 ㎎을, 안티-VAMP2 항체 (Abcam)와 4℃에서 하룻밤 미리 인큐베이션 한 Sepharose beads 4B (GE Healthcare)와 면역침강시킨 다음, anti-α-syn 항체 (BioLegend, 1:1000)를 사용하여 면역블로팅하였다.
펩타이드 합성
VAMP2 펩타이드를 95% 이상의 순도로 PEPTRON (Daejeon, Korea)에서 합성하였다. 상기 펩타이드를 최종 농도 10 ㎎/㎖가 되도록 물에 녹이고, 적절하게 분주하여 분석할 때까지 -20℃에서 보관하였다.
LDH 세포독성 분석
LDH 방출을 VersaMax microplate reader (Molecular Devices, USA)를 사용하고 Pierce LDH Cytotoxicity Assay Kit (Thermo Scientific)로 측정하였다. 모든 과정은 제조자의 지시에 따랐다.
질량분석에 의한 단백질 동정
펩타이드 매스 핑거프린팅에 의한 단백질 동정을 위해, 단백질 밴드를 잘라내고 제노마임 (Genomine, Pohang, Korea)에서 분석하였다. 잘라낸 단백질 밴드를 트립신 (Promega)으로 처리하고, MALDI-TOF (Microflex LRF 20, Bruker Daltonics) 분석을 수행하였다. Flex Analysis 3.0로 피크 리스트를 생성하였다. 서치 프로그램 MASCOT를, 펩타이드 매스 핑거프린팅에 의한 단백질 동정을 위해 사용하였다.
통계 분석
GraphPad Prism으로 그래프를 작성하였고, 통계분석은 2개의 다른 그룹 비교 및 반복-측정 분산분석을 위한 Students t-test 또는 2개 초과 다른 그룹에 대한 일원분산분석 (ANOVA)을 수행하였다. 에러 막대는 SEM (standard error of the mean)을 나타낸다.
실시예
실시예 1: α-syn 응집체에 의한 특정 시냅스 단백질 격리 확인
α-syn 응집체 올리고머에 의해 매개 된 시냅스 기능손상의 생물화학적 기작을 조사하기 위해, 본 발명자들은 먼저 α-syn의 올리고머 형태를 촉진하고 안정화 하는 것으로 알려진 도파민-유도 방법으로 α-syn 응집체를 제조하고, 섬유 형성과정은 저해하였다 (도 1의 A). 도 1의 A는 도파민과 37℃에서 3일간 인큐베이션 한 후 크기 배제 크로마토그래피를 수행하여 생성된 α-Syn 응집체를 나타낸다. 투과전자현미경 (ransmission electron microscopy, TEM) 분석은 본 방법에 따른 정제된 α-syn 응집체가 직경 10 ~ 20 ㎚의 구형임을 제시하였다 (도 1의 B). 다음, 본 발명자들은 정제된 α-syn 응집체를 몇몇 재조합 시냅스 단백질과 함께 인큐베이션 하고, 이들의 직접적인 상호작용을 테스트하였다. 흥미롭게도, 특정 SNARE 성분 예컨대, SNAP25 및 VAMP2가 α-syn 응집체 존재 하에서 크게 감소한 반면에, 신택신1A (syntaxin1A) 및 시냅토택민1 (synaptotagmin1)은 변하지 않았다 (도 1의 C). 도 1의 C는 재조합 시냅스 단백질 (1 μM)을 α-Syn 응집체 (100 nM)와 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션 한 후 웨스턴블로팅 분석 또는 SyproOrange 염색으로 단백질 수준을 검출한 것이다. 이러한 결과는 올리고머 α-syn 응집체가 특정 SNARE 성분과 우선적으로 상호작용 할 수 있음을 제시한다. α-syn 응집체의 특이성을 추가로 특성 확인하기 위해, 본 발명자들은 SNARE 복합체 내에서 α-syn과 결합하는 것으로 알려진 VAMP2에 대해 후속 연구를 수행하였다.
먼저, α-syn 응집체가 VAMP2에 직접 결합하는지 여부를 확인하기 위해, 본 발명자들은 α-syn 응집체와 인큐베이션 한 후 결합된 VAMP2 수준을 분석하였다. 도 2의 A에 도시된 것과 같이, 웨스턴블로팅에서 VAMP2는 α-syn 응집체에 대해 강한 SDS-저항성 결합을 보였다. 도 2의 A는 재조합 VAMP2를 α-Syn 응집체와 37℃에서 2시간 인큐베이션 한 것을 나타낸다. 안티-VAMP2 (왼쪽) 또는 안티-α-시누클레인 항체 (오른쪽)를 사용한 웨스턴블로팅 분석은, 각각 α-syn에 대한 VAMP2의 강력한 결합을 보여준다. 다음, VAMP2의 α-syn 응집체에 대한 결합의 생물화학적 특성을 확인하기 위해, 본 발명자들은 상이한 무세포조건에서 일련의 결합 분석을 수행하였다. VAMP2의 α-syn 응집체에 대한 결합은 시간 및 용량 의존적으로 발생하였다. 또한, 결합력은 생리학적 조건을 포괄하는 넓은 범위의 온도 및 pH에서 증가하였다 (도 2의 B). 결합 분석을 서로 다른 시간 (상부 왼쪽), α-syn 응집체 농도 (상부 오른쪽), 온도 (하부 왼쪽), 및 pH (하부 오른쪽) 조건에서 수행하였다. 각 블로팅은 독립적으로 반복 실험한 면역블로팅에서 대표적인 것을 나타낸다. 값은 평균 ± SEM이다. 또한, 특이적 결합이 단지 α-syn 응집체에서만 발생하는지를 조사하기 위해, α-syn의 모노머 형태를 VAMP2와 인큐베이션 하였다 (도 3의 A). 유사하게, VAMP2 자체가 임의의 병리학적 단백질 응집체에 결합할 가능성을 배제하기 위해, 아밀로이드β 응집체를 동일한 결합조건하에서 테스트하였다 (도 3의 B). 재조합 VAMP2를 α-syn 응집체 모노머 (A) 또는 Aβ 응집체 (B)와 37℃에서 2시간 인큐베이션 하였다. 웨스턴블로팅 분석은 VAMP2가 α-syn 모노머 및 Aβ 응집체와 결합하지 않은 것을 나타냈다. 이는 특이적 결합이 α-syn 응집체의 독특한 특성임을 제시한다. VAMP2 결합 분석에서 증가하는 농도 (0.1, 1, 10 μM)의 α-syn 모노머를 사용하여 테스트 하였으며, VAMP2는 매우 높은 농도에서도 α-syn 모노머와 결합하지 않았다. 이러한 결과는, α-syn 응집체가 직접적이고 특이적인 기작을 통해 시냅스 단백질 예컨대, VAMP2를 격리하는 것을 명백하게 입증한다. α-syn 응집체에 결합된 VAMP2의 약한 밴드 강도는 VAMP2로부터의 포화된 시그널 때문으로 추정되었다.
실시예 2: 배양된 뉴런 및 PD 마우스 모델에서 α-syn 응집체에 의한 VAMP2 단백질 격리 확인
다음, 본 발명자들은 VAMP2에 대한 α-syn 응집체의 영향을 일차 배양된 뉴런 세포에서 조사하였다. 배양된 래트 대뇌피질 뉴런 내에서 정제된 α-syn 응집체를 12일간 처리한 결과, VAMP2과 α-syn 응집체가 공동위치하는 것이 증가하였다 (도 4의 A, 화살표 머리). 도 4의 A에서, 래트 대뇌피질 일차 뉴런에서의 면역세포화학은, α-syn 응집체가 VAMP2 (화살표 머리)와 공동위치 함을 나타낸다. 특히, VAMP2는 비처리 세포와 비교하여 α-syn 응집체 처리된 세포에서 반점 (puncta) 패턴을 보였으며, 이는 α-syn 응집체 존재하에서 VAMP2 클러스터링을 제시한다 (도 4의 B). 도 4의 B에서 스캐일 바 (bar)는 50 ㎛이다. α-syn 응집체의 격리효과가 궁극적으로 신경독성을 유도하는 중요한 시냅스 단백질의 수준을 감소시킬 수 있는지 여부를 조사하기 위해, α-syn 응집체를 신경세포에서 3일간 처리하고 웨스턴블로팅을 수행하였다. 도 4의 C에 도시한 것과 같이, 비처리 세포와 비교하여 α-syn 응집체 처리한 세포에서 SNAP25 및 VAMP2 단백질 수준이 감소하였다 (도 4의 C). 도 4의 C는 α-syn 응집체로 3일간 연속 처리한 배양된 뉴런의 웨스턴블로팅으로서, α-syn 응집체에 대한 VAMP2의 직접 결합을 보여준다. 결합된 VAMP2를 분석하기 위해, α-syn 응집체 검출을 위한 블로팅을 재블로팅하고 빨간선 박스로 표시하였다. 또한, 본 발명자들은 α-syn 응집체에 결합한 VAMP2를 모니터링 할 수 있었다 (빨간선 박스). 이러한 결과는 상기 본 발명자들이 무세포시스템에서 확인한 결과를 강력하게 뒷받침한다. 도 4의 Dd는 뉴런 세포를 α-syn 응집체로 3일 연속 처리하고 글루타메이트 방출을 측정한 것이다. ****, p < 0.0001, by two-tailed, unpaired t test. 값은, 평균 ± SEM 이다.
시냅스기능에 대한 α-syn 응집체의 격리효과를 평가하기 위해, α-syn 응집체 처리 후 뉴런 세포에서 글루타메이트 수준을 측정하여 신경전달물질 방출을 확인하였다. 먼저, 본 발명자들은 α-syn 응집체 인큐베이션에 의해 글루타메이트 방출이 현저히 감소된 것을 확인하였다 (~ 45%) (도 4의 D). 또한, 14일 동안 α-syn 응집체에 노출된 뉴런은 감소된 세포 생존력을 보였고, 이는 세포 수준에서 직접적인 격리를 통한 뉴런 기능손상이 심각한 세포 생존력 손상을 초래하였음을 제시한다 (도 4의 E).
α-syn 응집체에 의한 VAMP2 격리를 in vivo 시스템에서 추가로 확인하기 위해, 본 발명자들은 마우스 프라이온 단백질 프로모터 아래 A53T 변이와 사람 α-syn를 갖는, 어린 (3개월령) 및 늙은 (22개월령) 이형접합체 A53T α-syn 형질전환 마우스 (이하, SNCA)를 사용하였다. 예상한 것과 같이, SNCA 마우스는 α-syn 병변의 연령 의존적인 발생 (도 5의 A, 흰색 화살표 머리) 예컨대, 늙은 마우스에서의 뚜렷한 α-syn 응집과 α-syn 응집체에 인접한 VAMP2 클러스터링을 나타냈다 (도 5의 A, 삽입 이미지). 도 5의 A는 어린 (3개월령) 및 늙은 (22개월령) SNCA 마우스 뇌의 면역조직화학이다. 늙은 마우스 뇌에서 흰색의 화살표 머리는 VAMP2 및 α-syn 응집체의 클러스터링 된 영역을 나타낸다. 고해상도 공초점 이미지 (낮은 패널)은 늙은 마우스 (파란색 화살표 머리)에서 VAMP2 클러스터링 및 α-syn 응집체에 인접한 격리를 제시한다. 스캐일 바 (상부 패널: 200 ㎛, 하부 패널: 50 ㎛). 그 밖에, 어린 마우스와 비교하여, 늙은 SNCA 마우스에서 과다한 양의 α-syn 올리고머 형태가 VAMP2와 함께 공동침전되었다 (도 5의 B). 도 5의 B는 뇌 조직 샘플을 균질화 하고 용해물을 VAMP2 항체로 면역침강한 후, α-syn 항체를 사용하여 면역블로팅 한 것이다. 올리고머종이 늙은 SNCA 마우스 뇌 (괄호표시)에서 증가하였고, 고분자량 올리고머 (* 표시)가 늙은 마우스에서만 관찰되었다. VAMP2 면역블로팅을 로딩 대조로 사용하였다. 면역블로팅은 2회 독립적인 실험에서 대표적인 결과이다 (n=2). 상기 결과는 α-syn 올리고머의 연령 의존적 증가 및 이들과 VAMP2의 상호작용이 시냅스 손상을 유발할 수 있으며, 궁극적으로 PD 징후를 일으킬 수 있음을 강력하게 뒷받침한다.
실시예 3: VAMP2-α-syn 응집체 상호작용을 방해하는 합성 펩타이드 동정
α-syn 응집체와 VAMP2 사이의 특이적 결합은 VAMP2 내에 상호작용하는 도메인이 존재함을 제시한다. 따라서, 본 발명자들은 VAMP2-α-syn 응집체 상호작용을 방해하는 작은 펩타이드-저해제를 확인하고자 하였다. 종래 연구에 따르면, 작은 펩타이드 (단지 4개의 잔기)가 SNAP25의 보툴리눔 신경독에 대한 결합에서 기질 저해제로 작용하는 것이 밝혀진 바 있다. 따라서, 본 발명자들은 VAMP2의 서열에 따라, α-syn 응집체에 대한 VAMP2의 결합을 블로킹하는 수개의 작은 합성 펩타이드를 디자인하였다 (도 6의 A, 빨간선 박스). 도 6의 A는 VAMP2내 수용성 부분의 서열에 기초하여 빨간선 박스에서 P1 내지 P5로 지정된 5개의 서로 다른 VAMP2 펩타이드를 디자인 한 것이다. VAMP2의 N-말단 영역이 α-syn 모노머의 C-말단과 상호작용 하는 것으로 알려졌으므로, 본 발명자들은 N-말단 펩타이드 (즉, P1 또는 P2)가 결합을 블로킹 할 것으로 예측하였다. 그러나, 예상과 달리, VAMP2 내의 SNARE 모티프의 C-말단부에서 유래된 펩타이드 P5 (서열번호 1: KLKRY)가 VAMP2 수준을 2배 증가시킴에 의해 테스트한 펩타이드 중에서 가장 효율적으로 결합을 저해하였다 (도 6의 B). 도 6의 B는 α-Syn 응집체 및 상기 펩타이드를 실온에서 1시간 미리 인큐베이션 한 다음, VAMP2 결합 분석을 수행한 것이다. 막대그래프는 α-syn 응집체와 펩타이드의 존재 시 VAMP2 수준이 배로 증가한 것을 제시한다. 에러 바는 4회 독립적인 실험으로부터 얻은 것이다. *, p < 0.05, by ANOVA. 값은 평균 ± SEM이다. 동일한 무세포조건에서, α-syn 응집체에 결합된 VAMP2 수준은 용량의존적으로 펩타이드 P5에 의해 감소하였다 (도 6의 C). 도 6의 C는 VAMP2 결합 분석을 지정된 농도의 펩타이드 P5와 미리 인큐베이션 한 α-syn 응집체 존재 하에서 수행한 것이다. 다음 본 발명자들은 펩타이드 P5가 일차 뉴런 세포에서 α-syn 응집체에 대한 VAMP2의 결합을 저해할 수 있는지 여부를 평가하였다. 펩타이드 P5로 미리 인큐베이션 한 α-syn 응집체를 처리한 후, 본 발명자들은 α-syn 응집체 단독에 노출된 뉴런과 비교하여, VAMP2 및 α-syn 응집체가 보다 더 적게 공동위치 하는 것을 관찰하였다 (도 7의 A). 도 7의 A는 배양된 일차 뉴런 (DIV 7)에서 2일 동안 펩타이드 P5와 함께 또는 없이 미리 인큐베이션 한 α-syn 응집체를 사용한 결과이다. VAMP2 및 α-syn 응집체의 공동위치화 (화살표 머리)가 펩타이드 P5에 의해 감소하였다. 스캐일 바는 50 ㎛이다. 또한, 고해상도 공초점 이미지는 α-syn 응집체 처리된 세포 내의 반점 패턴이 감소한 반면에, 펩타이드 P5 처리 세포에서는 발산된 패턴이 관찰되었다 (도 7의 B). 스캐일 바는 10 ㎛이다. 이러한 결과는 펩타이드 P5가 배양된 일차 세포에서 VAMP2 및 α-syn 응집체 사이의 직접적인 상호작용을 방해할 수 있음을 제시한다. 상기 결과는 펩타이드 P5가 배양된 뉴런에서 VAMP2-α-syn 응집체 상호작용의 블로킹 및 VAMP2 재분포에 효과적임을 뒷받침한다.
실시예 4: VAMP2 작은 펩타이드의 α-syn 응집체매개 독성으로부터 세포보호
다음, 본 발명자들은 글루타메이트 방출을 측정하여, 펩타이드 P5가 손상된 시냅스 기능을 회복시킬 수 있는지 여부를 평가하였다. 그러나, 본 발명자들은 α-syn 응집체 및 펩타이드 P5로 함께 처리한 뉴런에서 통계적으로 유의성 있는 글루타메이트 수준의 회복을 확인할 수 없었으며 (도 8의 A), 이는 펩타이드 P5가 α-syn 응집체에 의해 손상된 모든 기능적 시냅스 성분을 완전히 보호할 수 없을 수 있음을 시사한다. 그럼에도 불구하고, 본 발명자들은 펩타이드 P5 자체가 글루타메이트 방출에 영향을 주지 않는다는 것을 확인하였으며 (도 8의 A, bar), 이는 펩타이드 P5가 VAMP2 기원임에도 불구하고 그 자체로서 SNARE 기능에 영향을 미치지 않을 수 있음을 제시한다. 비록 펩타이드 P5에 의한 기능적 시냅스 회복을 관찰할 수는 없었으나, 본 발명자들은 펩타이드 P5와 공동처리된 뉴런이 α-syn 응집체에 대해 감소 된 세포독성을 보인 것을 확인하였다. 이러한 결과에 의해, 본 발명자들은 P5가 세포 생존과 같은 일반적인 세포 기능에 긍정적인 영향을 줄 것으로 보았다. 도 8의 A는 펩타이드 P5와 함께 또는 없이 미리 인큐베이션 한 α-syn 응집체로 뉴런 세포 (DIV7)를 3일 연속 처리하고 글루타메이트 수준을 측정한 것이다. 상기와 같이, 펩타이드 P5는 α-syn 응집체에 의해 매개된 손상된 글루타메이트 수준을 현저하게 회복시키지는 못하였다. ****, p < 0.0001, ***, p < 0.001, by ANOVA.
이에, 본 발명자들은 펩타이드 P5가 α-syn 응집체에 의해 유발된 세포독성에 효과적인지 여부를 조사하였다 (도 8의 B). 용액 상태에서 펩타이드의 짧은 반감기를 고려하여, 본 발명자들은 펩타이드 P5의 기능적 효과를 뉴런에서 짧은 시간 동안 단백질 트랜스펙션 방법으로 측정하였다. 단백질 트랜스펙션 시약을 사용하여 α-syn 응집체를 세포로 이동시킨 경우, 본 발명자들은 3시간 이내에 세포사멸을 관찰할 수 있었으나, 펩타이드 P5와 미리 인큐베이션 시킨 α-syn 응집체는 뉴런 세포 사멸을 현저히 감소시켰다 (도 8의 B). 도 8의 C는 펩타이드 P5와 함께 또는 없이 미리 인큐베이션 한 α-syn 응집체를 단백질 트랜스펙션 시약을 사용하여 뉴런에 전달하고 세포형태를 위상차 현미경으로 관찰한 것이다. 펩타이드 P5만으로 트랜스펙션 된 뉴런 세포 (왼쪽)는 정상적인 형태를 보인 반면에, α-syn 응집체의 트랜스펙션 (가운데)은 급속한 세포사멸을 초래하였다. 그러나, α-syn 응집체와 P5를 함께 트랜스펙션 한 세포 (오른쪽)는 세포사멸로부터 보호되었다. 스캐일 바는 100 ㎛이다. 또한, 펩타이드 P5 단독으로는 세포 사멸에 영향을 미치지 못했다 (도 8의 B, 왼쪽). 트랜스펙션 시약에 의한 세포독성 가능성을 배제하기 위해, 본 발명자들은 또한 α-syn 응집체를 트랜스펙션 시약 없이 자연적으로 도입한 후 기능 분석을 수행하였다. α-syn 응집체가 카스파아제-3 활성을 증가시켜 아포프토틱 (apoptotic) 세포사멸을 유발하는 것이 보고되었기 때문에, 본 발명자들은 아포프토틱 마커로서 절단된 카스파아제-3 (caspase-3)의 면역염색을 수행하였다. 도 8의 C에 도시된 것과 같이, 절단된 카스파아제-3-양성 뉴런이 α-syn 응집체-처리 세포에서 증가 한 반면, 펩타이드 P5 코팅된 α-syn 응집체는 절단된 카스파아제-3 염색을 감소시켰다. 도 8의 C에서 펩타이드 P5와 함께 또는 없이 미리 인큐베이션 된 α-syn 응집체로 단백질 트랜스펙션 시약 없이 뉴런 세포 (DIV 7)를 3일간 연속 처리하였다. 절단된 카스파아제-3 (녹색) 의 면역반응성을 이미지화 하고 분석하였다. 막대그래프는 DAPI-양성 세포에 대한 절단되 카스파아제3-양성 세포의 퍼센트를 나타낸다. *, p < 0.05, by ANOVA. 유사한 결과가 또한 젖산탈수소효소 (lactate dehydrogenase, LDH) 세포독성 분석에서 관찰되었다 (도 8의 D). 도 8의 D는 2일간 연속 처리한 후 LDH 세포독성 분석을 뉴런 세포 (DIV 7) 에서 수행한 결과이다. ****, p < 0.0001, *, p < 0.05, by ANOVA. 값은 평균 ± SEM 이다. 펩타이드 P5는 α-syn 응집체에 의해 유도된 LDH 방출을 감소시켰다. 이러한 결과는 펩타이드 P5가 α-syn 응집체에 의해 매개된 세포독성을 효율적으로 억제할 수 있음을 제시한다.
펩타이드 P5가 α-syn 응집체에 의한 비정상적인 시냅스 기능을 회복시키는 대신에 일반적인 세포 손상으로부터 뉴런 세포를 회복시킬 수 있음을 제시하는 상기 모든 관찰결과는, 시냅스 단백질 외에 알려지지 않은 세포 표적이 있음을 시사한다. α-syn 응집체에 의한 격리에 대한 표적 단백질을 발견하기 위해, 래트 대뇌피질 뉴런으로부터의 용해물을 α-syn 응집체와 함께 인큐베이션 하고 하향 조절된 단백질을 질량분석을 통해 분석하였다. 흥미롭게도, 본 발명자들은 단백질 합성에 대한 핵심 분자인 신장인자1 (elongation factor 1α, EF1α)를 α-syn 응집체에 의해 영향을 받는 주요 표적으로서 동정하였다 (도 9의 A). 도 9의 A는, 래트 대뇌피질 뉴런으로부터의 용해물 (100 ng)을 실온에서 2시간 α-syn 응집체 (100 nM)와 인큐베이션 한 후, 도은염색 (silverstaining) 한 것이다. 질량분석으로 감소된 단백질 (빨간색 박스)이 EF1α임을 확인 하였다. 본 발명자들은 α-syn 응집체에 대한 EF1α의 결합을 동일한 무세포시스템에서 재조합 단백질을 사용하여 평가하였다 (도 9의 B). 도 9의 B에서, 재조합 EF1α를 α-syn 응집체와 함께 37℃에서 2시간 인큐베이션 한 후, 웨스턴블로팅 또는 SyproOrange 염색을 하여 단백질 수준을 검출하였다. 결합 분석에서 BSA를 음성 대조로 사용하였다. 이러한 결과는 α-syn 응집체가 격리를 통해 단백질 합성과 같은 중요한 세포기능을 악화시키고, 펩타이드 P5가 이러한 독성을 경감시킬 수 있음을 시사한다.
본 발명에 따르면, α-syn 응집체는 세포기능손상, 세포독성 및 세포사멸과 관련되며, 배양된 뉴런에서 VAMP2 클러스터링을 증가시키고 글루타메이트 방출을 현저히 감소시킨다. 본 발명에 따라, α-syn 응집체의 세포손상기능 등을 저해 또는 억제하기 위해, α-syn 응집체의 표적 단백질을 모사하고 이와 경쟁적으로 상호작용하는 물질을 스크리닝 할 수 있으며, 이는 새로운 신경퇴행성질환 치료제 개발에 유용하게 이용될 수 있을 것이다.
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Claims (14)

  1. α-시누클레인 응집체에 의한 세포기능손상, 세포독성 또는 세포사멸을 저해하거나 억제하기 위한, 서열번호 1을 포함하는 펩타이드.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 세포가 신경세포인 것인, 서열번호 1을 포함하는 펩타이드.
  3. 제 1항 또는 제 2항의 펩타이드를 포함하는 신경퇴행성질환의 예방, 치료, 또는 예방 및 치료를 위한, 약학 조성물.
  4. 제 1항 또는 제 2항의 펩타이드를 포함하는 신경퇴행성질환에 의한 치매의 예방, 치료, 또는 예방 및 치료를 위한, 약학 조성물.
  5. 제 3항에 있어서, 상기 신경퇴행성질환이 파킨슨병 (Parkinsons disease, PD), 알츠하이머병 (Alzheimers disease, AD), 헌팅턴병 (Huntingtons disease, HD), 근위축성측생경화증 (amyotrophic lateral sclerosis) 또는 루이소체병 (Lewy body disease)인 것인, 약학 조성물.
  6. 제 4항에 있어서, 상기 신경퇴행성질환이 파킨슨병 (Parkinsons disease, PD), 알츠하이머병 (Alzheimers disease, AD), 헌팅턴병 (Huntingtons disease, HD), 근위축성측생경화증 (amyotrophic lateral sclerosis) 또는 루이소체병 (Lewy body disease)인 것인, 약학 조성물.
  7. α-시누클레인 응집체와 VAMP2 (vesicle-associated membrane protein 2)의 결합을 블로킹하여 생체 외에서 세포 기능손상, 세포 독성 또는 세포 사멸을 억제하는 방법.
  8. i) 분석대상 시료와 α-시누클레인 응집체를 인큐베이션 하고,
    ii) 상기 i)의 인큐베이션된 α-시누클레인 응집체와 VAMP2의 결합을 분석하며; 및
    iii) 상기 결합이 감소 된 것으로 확인된 경우, 상기 시료가 α-시누클레인 응집체에 의한 세포기능손상, 세포독성 또는 세포사멸을 저해하거나 억제하는 물질로 판단하는 것인,
    α-시누클레인 응집체에 의한 세포기능손상, 세포독성 또는 세포사멸을 저해 또는 억제하는 물질을 스크리닝하는 방법.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 α-시누클레인 응집체가 구형인 것인, α-시누클레인 응집체에 의한 세포기능손상, 세포독성 또는 세포사멸을 저해 또는 억제하는 물질을 스크리닝하는 방법.
  10. 제 8항 또는 제 9항에 있어서, 상기 세포가 신경세포인 것인, α-시누클레인 응집체에 의한 세포기능손상, 세포독성 또는 세포사멸을 저해 또는 억제하는 물질을 스크리닝하는 방법.
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