KR20110110200A - 인간 항-알파-시누클레인 자가항체 - Google Patents

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Abstract

본원에는 인간 α-시누클레인-특이 자가항체, 이의 단편, 유도체 및 변이체, 및 이와 관련된 제조 방법이 기술된다. 또한, α-시누클레인에 대해 특이적인 항체와 관련된 검정법, 키트 및 고체 지지체도 기술된다. 상기 항체, 면역글로불린쇄(들), 및 이의 결합 단편, 유도체 및 변이체는 α-시누클레인 표적화된 면역요법을 위한 약제학적 조성물 및 α-시누클레인 표적화된 진단을 위한 진단 조성물에 사용될 수 있다.

Description

인간 항-알파-시누클레인 자가항체 {HUMAN ANTI-ALPHA-SYNUCLEIN AUTOANTIBODIES}
본 발명은 신규한 α-시누클레인-특이 결합 분자, 특히 인간 항체, 및 α-시누클레인 및 응집 형태의 α-시누클레인 각각을 인식하는 이의 단편, 유도체 및 변이체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 혈장 및 CSF에서 α-시누클레인의 독성 종을 확인하기 위한 진단 도구로서 및 α-시누클레인 응집체와 관련된 장애, 예를 들어 파킨슨 질환 (PD), 루이 소체 치매 (DLB) 및 알츠하이머 질환 (AD)의 루이 소체 변형 및 기타 시누클레인병증 (synucleinopathic) 질환을 치료하기 위한 수동 예방접종 전략에서 유용한 상기한 결합 분자, 항체 및 이의 유사체를 포함하는 약제학적 및 진단 조성물에 관한 것이다.
단백질의 미스폴딩 및 응집은 다수의 신경퇴행성 질환에 대한 병적 양상이다. α-시누클레인의 응집체는 파킨슨 질환 (PD)과 관련된 루이 소체 및 루이 신경돌기의 주요 성분이다. 천연적으로는 폴딩되지 않은 단백질인 α-시누클레인은 올리고머, 프로토피브릴 및 피브릴을 포함한 상이한 응집 형태를 취할 수 있다. 작은 올리고머 응집체가 특히 독성인 것으로 밝혀졌다.
α-시누클레인에 대한 천연 발생 자가항체가 건강한 인간에서 검출되었으며, 환자에서의 변형된 수준은 특정 신경퇴행성 장애와 연관되었다 [참조: Neff et al., Autoimmun. Rev. 7 (2008), 501-507]. 따라서, 파킨슨 질환을 앓는 환자에서, 자발적으로 또는 예방접종 시, 특히 건강한 환자에서, 천연적으로 발생하는 항체는 α-시누클레인 응집에 관한 보호적 역할을 할 수 있다 [참조: Woulfe et al., Neurology 58 (2002), 1435-1436; 그리고 Papachroni et al ., J. Neurochem. 101 (2007), 749-756]. 지금껏, 자가항체의 치료적 중요성은 평가가 어려웠다. 이는 주로 이들의 분리 및 시험관내에서의 후속적 특징분석에 대한 간단한 실험적 접근법이 없기 때문이다.
최근 들어, α-시누클레인의 올리고머 종은 혈장 및 CSF에서 세포외적으로 보고되었으며 [참조: El-Agnaf et al ., FASEB J. 20 (2006), 419-425], PD 생쥐 모델에서의 면역화 조사로 α-시누클레인에 대한 세포외 생쥐 모노클로날 항체가 세포내 α-시누클레인 응집체의 축적을 감소시킬 수 있다는 것이 밝혀졌으며 [참조: Masliah et al ., Neuron, 46 (2005), 857-868], 이는 신경독소 응집체를 중화시키는 항체가 단량체성 α-시누클레인의 유리한 기능을 방해하지 않으면서 유용한 치료제일 수 있다는 생각을 지지한다. 그러나, 인간에서 뮤린에 기초한 항체의 치료적 이용은 이들이 비-인간 기원이기 때문에 인간 항-생쥐 항체 (HAMA) 반응에 의해 제한된다.
문헌 [참조: Emadi et al . in J. Mol. Biol. 368 (2007), 1132-1144]은, α-시누클레인의 올리고머 형태에만 결합하고 시험관내에서 α-시누클레인의 응집과 독성을 모두 억제하는, α-시누클레인에 대한 인간 서열에 기초하는 파아지 디스플레이 항체 라이브러리로부터 단쇄 항체 단편 (scFv)을 분리하는 것을 기술한다. 그러나, 비록 파아지 디스플레이로부터 scFv의 생성이 비교적 간단하기는 하지만, 이러한 기술은, 이렇게 생성된 항체가 자기-항원에 대한 바람직하지 못한 교차반응성의 위험을 가지며 인간 면역계에 의해 생성되는 진화적으로 최적화된 천연 인간 항체의 특성이 결여되기 때문에, 심각한 결점을 갖는다. 또한, 이러한 항체는 정상적인 생리학적 환경 및 기능과 관련하여 다른 단백질 및/또는 표적 단백질과의 교차반응성 때문에 충분히 특이적이지 않을 수 있다. 파킨슨 질환의 경우, 예를 들어 α-시누클레인의 생리학적 유도체도 교차반응하는 항체는 생리학적 표적 구조물의 정상적 기능과 관련된 부작용을 일으킬 잠재성을 갖는다. 이러한 측면에서, 바람직하지 못한 자가면역 질환이 노골적으로 유도될 것이다 - 변이 형태의 단백질 구조물을 사용하는 능동 면역화 실험에 대한 개념적 디자인에서도 거의 계산할 수 없는 위험이 병리학적으로도 발생한다.
더욱 최근에, 문헌 [참조: Seitz et al ., 81. Kongress der Deutschen Gesellschaft fur Neurologie mit Fortbildungsakademie Hamburg 10.-13.09.2008]은 친화성 크로마토그래피를 통한 단일 혈액 공여자의 샘플 및 상이한 면역글로불린 용액으로부터 항-α-시누클레인 폴리클로날 자가항체의 분리를 보고하였다. 그러나, 이러한 접근이 단지 제한량의 목적하는 항체를 제공한다는 사실에 더하여, 폴리클로날 항체는, 예를 들어 이의 이질성 및 바람직하지 않은 부작용을 갖는 다른 α-시누클레인 관련 분자로 오염되는 위험 때문에, 치료적 적용에 있어 단지 제한적으로 사용된다. 마찬가지로, 항체 조성물의 가변성이 전체적인 특이성 및 반응성에 영향을 끼칠 것이기 때문에, 폴리클로날 항체의 진단적 가치가 감소된다. 이는 미스폴딩에 의해 응집 및 침착되는 단백질에 대한 항체에 대해서는 더 잘 맞는다.
따라서, 상술한 한계를 극복하고 α-시누클레인에 대한 치료적 및 진단적 인간 항체를 제공할 필요가 있다.
발명의 요지
본 발명은 천연 α-시누클레인 특이적 인간 모노클로날 항체의 분리를 위해 나이든 건강한 대조 피험자 및 신경학적 질환을 갖는 환자의 α-시누클레인-특이적 면역 반응을 이용한다. 특히, 본 발명에 따라 수행되는 실험은 파킨슨증의 징후가 없는 노령의 피험자 풀로부터 α-시누클레인에 특이적인 모노클로날 항체를 분리하는데 성공적이었다.
따라서, 본 발명은 α-시누클레인을 특이적으로 인식할 수 있는 인간 항체, 항원-결합 단편 및 유사한 항원-결합 분자에 관한 것이다. "α-시누클레인을 특이적으로 인식하는", "α-시누클레인에 대해 특이적인 항체" 및 "항-α-시누클레인 항체"는, 특히, 일반적으로, 집합적으로, 천연 형태의 α-시누클레인, 또는 미스폴딩된 또는 올리고머 또는 응집된 또는 해독후 변형된 α-시누클레인에 대한 항체를 의미한다. 본원에는 천연 단량체, 전체 길이, 절두형 및 응집형에 대해 선택적인 인간 항체가 제공된다.
본원 발명의 특히 바람직한 양태에서, 인간 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 도 1에 제시된 바와 같은 가변 영역 VH 및/또는 VL에 의해 특징지어지는 항체의 면역학적 결합 특성을 나타낸다.
항체의 항원-결합 단편은 단쇄 Fv 단편, F(ab') 단편, F(ab) 단편, 및 F(ab')2 단편, 또는 임의의 다른 항원-결합 단편일 수 있다. 특정 양태에서, 하기 항체 또는 이의 단편은 인간 IgG 이소타입 항체이다. 대안적으로, 항체는 키메라 인간-뮤린 또는 뮤린화된 항체이며, 후자는 진단 방법 및 동물에서의 조사에 특히 유용하다.
또한, 본 발명은 본 발명의 항체 또는 이의 활성 단편, 또는 작용제 (agonist) 및 인지체 (cognate) 분자, 또는, 대안적으로, 이의 길항제를 포함하는 조성물, 및 유효량의 조성물을 이를 필요로 하는 환자에게 투여함으로써 시누클레인병증 질환의 예방, 진단 또는 치료에 이러한 조성물을 사용하는 면역요법 및 면역진단법에 관한 것이다.
당연히, 본 발명은 후술되는 바와 같이 구별되는 독특한 특성을 갖는 항체를 생성하는 불멸화된 인간 B 기억 림프구 및 B 세포 각각에까지 확장된다.
또한, 본 발명은 본 발명의 항체의 면역글로불린 쇄의 적어도 가변 영역을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 바람직하게는, 상기한 가변 영역은 도 1에 제시되는 바와 같은 가변 영역의 VH 및/또는 VL의 적어도 하나의 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함한다.
따라서, 본 발명은 또한 상기한 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터 및 이로 형질전환된 숙주 세포, 및 α-시누클레인에 대해 특이적인 항체 및 동등한 결합 분자의 생성을 위한 이들의 용도를 포함한다. 항체 및 이의 유사체의 재조합 생성을 위한 수단 및 방법, 및 항체이거나 항체가 아닐 수 있는 경쟁적 결합 분자를 위한 스크리닝 방법이 당해 기술 분야에 공지되어 있다. 그러나, 본원에서 기술되는 바와 같이, 특히 인간에서의 치료적 적용과 관련하여, 본 발명의 항체는 상기 항체의 적용이 키메라 및 심지어 인간화된 항체에 대해 관측되는 HAMA 반응이 실질적으로 없다는 의미에서 인간 항체이다.
또한, 본원에는 샘플 중의 α-시누클레인을 동정하는데 사용될 수 있는 조성물 및 방법이 기술된다. 기술된 항-α-시누클레인 항체는, 예를 들어 ELISA-기본 또는 표면 개질된 검정법을 이용하여, 샘플 중의 α-시누클레인의 존재에 대해 인간 혈액, CSF 및 소변을 스크리닝하는데 사용될 수 있다. 본원에서 기술되는 방법 및 조성물은 파킨슨 질환 진단과 같은 시누클레인병증 질환에 도움이 될 수 있으며 질환 진행 및 치료 효능을 모니터링하는데 사용될 수 있다.
실시예 4에서 입증되는 바와 같이, 본 발명의 항-α-시누클레인 항체는 파킨슨 질환의 유전자도입 생쥐 모델에서 운동 수행능 및 고가 플러스 미로 행동 (elevated plus maze behavior)을 개선할 수 있다. 이러한 결과는 본 발명의 인간-유도된 항-α-시누클레인 항체의 예측된 치료적 가치를 확증한다.
따라서, 본 발명의 특정 목적은 파킨슨 질환 (PD), 파킨슨 질환 치매 (PDD), 루이 소체 치매 (DLB), 알츠하이머 질환의 루이 소체 변형 (LBVAD), 다발기 계통 위축증 (MSA), 순수 자율신경 부전 (PAF), 뇌에 철 축적을 동반하는 신경변성 제1형 (NBIA-I), 알츠하이머 질환, 픽 질환, 소아-발병 전신 신경축삭 디스트로피 (할러보르덴-슈파츠 질환), 근위축성측삭경화증, 외상성 뇌손상 및 다운 증후군과 같은 시누클레인병증 질환을 치료 또는 예방하기 위한 방법을 제공하는 것이다. 이 방법은 피험자에게 α-시누클레인을 표적으로 하는 인간 항체 또는 항체 유도체의 유효 농도를 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 추가의 양태는 하기 설명 및 실시예로부터 분명해질 것이다.
도 1: 인간 항체 NI-202.3G12 (A), NI-202.12F4 (B) 및 NI-202.3D8 (C)의 가변 영역, 즉 중쇄 및 카파/람다 경쇄의 아미노산 및 뉴클레오타이드 서열. 인간 항체 NI-202.3D8에 대해 2개의 가변 경쇄 서열 VKa1 (C) 및 VKc1 (D)이 클로닝되었으며, 각각 가변 중쇄 서열 VHE1 (C)과 짝을 지을 수 있다. 프레임웍 ((FR) 및 상보성 결정 영역 (CDR)이 표시되며, CDR은 밑줄로 강조된다. 중쇄 연결 영역 (JH) 및 경쇄 연결 영역 (JK)도 표시된다. 클로닝 전략 때문에, 중쇄 및 경쇄의 N-말단에 있는 아미노산 서열은 잠정적으로 FR1에서 프라이머-유도된 변형을 포함할 수 있으나, 항체의 생물학적 활성에는 실질적인 영향을 끼치지 않는다. 컨센서스 인간 항체를 제공하기 위해서, 최초 클론의 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열을 데이터베이스에 있는 적절한 인간 생식계열 가변 영역 서열과 함께 정렬하고 이에 따라 조정하였다; 예를 들어, 기관 (MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, UK)에 의해 주관되는 Vbase (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)를 참조한다. 잠재적으로 컨센서스 생식계열 서열로부터 벗어나는 것으로 여겨지며 따라서 PCR 프라이머 때문일 수 있었던 아미노산은 굵게 표시된다.
도 2: 재조합 인간 α-시누클레인 항체는 독특한 에피토프에 대해 지시된다. 재조합의 전체 길이 및 절두형 α-시누클레인을 동일한 코팅 농도 (20μg/ml)로 ELISA 플레이트에 코팅하였다. (A) 재조합 인간 α-시누클레인 항체 NI-202.3G12는 직접적 ELISA에서 전체 길이의 α-시누클레인에는 결합하나 α-시누클레인 절두형에는 결합하지 않으며, 이는 NI-202.3G12가 구조적 인식 에피토프라는 것을 나타낸다. (B) 재조합 NI-202.12F4는 직접적 ELISA에서 전체 길이 α-시누클레인 및 아미노산 (aa) 1-60을 포함하는 α-시누클레인 절두형에 결합하며, 이는 NI-202.12F4의 에피토프가 알파 시누클레인의 N-말단 양친매성 반복 영역 내에 있다는 것을 나타낸다. (C) LB509 항체는 C-말단 α-시누클레인 단편에 결합하며, 이는 앞서 결정된 에피토프 (aa 115-122)를 확증한다. 값은 평균 ± SEM이다 (n=2-3).
도 3: 재조합 인간 α-시누클레인 항체는 직접적 ELISA에서 α-시누클레인은 결합하나 β- 및 γ-시누클레인은 결합하지 않는다. 동일 코팅 농도 (2μg/ml)로 ELISA 플레이트에 코팅된 재조합 α-, β- 및 γ-시누클레인을 재조합 인간 α-시누클레인 항체 또는 팬 (pan) 시노클레인 항체와 함께 인큐베이션하였다. (A) 후자는 모든 3가지 시누클레인 단백질을 검출하고, 재조합 인간 α-시누클레인 항체 (B) NI-202.3G12 및 (C) NI-202.12F4는 α-시누클레인에 선택적으로 결합한다. 값은 평균 ± SEM이다 (n=2-3).
도 4: 재조합 인간 α-시누클레인 항체 NI-202.12F4는 웨스터 블롯 분석에서 α-시누클레인은 결합하나 β- 및 γ-시누클레인은 결합하지 않는다. 재조합 α-, β- 및 γ-시누클레인 (각각 750 ng)을 SDS-PAGE한 후, 웨스터 블롯 분석하였다. (A) 코마시 염색은 SDS-PAGE 상에서 각각의 단백질 농도를 나타낸다. (B) NI-202.12F4는 α-시누클레인과 강력하게 상호작용하나 베타 또는 감마 시누클레인과는 그러하지 아니하다. (C) 일차 항체 없이는 어떠한 신호도 검출되지 않았다.
도 5: (A) 비-유전자도입 및 인간 알파-시누클레인 유전자도입 생쥐로부터의 뇌 추출물에 대한 NI-202.12F4 면역블롯 분석은 인간 α-시누클레인에 대한 우선적인 결합을 보인다. 야생형 및 인간 α-시누클레인 유전자도입 생쥐로부터의 뇌 추출물을 인간 특이적 α-시누클레인 항체 LB509, 인간 및 생쥐 α-시누클레인 반응성 항체 클론 42 및 NI-202.12F4로 면역블로팅하여 분석하였다. 클론 42는 생쥐 및 인간 α-시누클레인에 상응하는 두드러진 밴드를 검출하고, LB509 및 NI-202.12F4는 인간 α-시누클레인에 대해 강력한 선호도를 나타낸다. (B) 뇌 추출물의 NI-202.12F4 면역블롯 분석은 인간 α-시누클레인 응집체에 대한 우선적 결합을 나타낸다. 건강한 대조 피험자 및 루이 소체 치매 (DLB) 환자로부터의 피질 뇌 추출물 및 야생형 생쥐 및 인간 A30P α-시누클레인 유전자도입 생쥐로부터의 뇌 추출물을 웨스턴 블롯팅으로 분석하였다. NI-202.12F4는 DLB 및 A30P α-시누클레인 유전자도입 뇌 추출물 중의 α-시누클레인 응집체의 올리고머 및 피브릴 형태를 고감도로 검출한다. 최소 결합은 인간 또는 야생형 생쥐 조직에서의 α-시누클레인의 단량체 형태에 대해 관측되고, 중등도 결합은 α-시누클레인을 매우 과다발현하는 A30P α-시누클레인 유전자도입 뇌 추출물에서 관측된다. 이와는 대조적으로, 클론 42 항체는 단량체 형태 및 α-시누클레인 단편을 고감도로 검출하고, 응집된 α-시누클레인 종에 저조하게 결합한다.
도 6: 재조합 NI-202.12F4는 인간 α-시누클레인의 야생형 및 질병 발생 돌연변이체에 대해 고친화도 결합을 나타낸다. 재조합 야생형 (●), A53T (■), A30P (*) 및 E64K (◇) 인간 α-시누클레인을 ELISA 플레이트 (2 mg/ml)에 코팅하고, 다양한 농도의 NI202.12F4로 탐침하였다. 1/2 최대 유효 농도 (EC50)는 야생형 α-시누클레인에 대해서는 321pM, A53T에 대해서는 293pM, A30P에 대해서는 228pM, E64K 돌연변이체 인간 α-시누클레인에 대해서는 483pM이었다.
도 7: NI-202.12F4의 면역조직화학 결합 분석. NI-202.12F4는 인간 A53T (A) 또는 A30P α-시누클레인 (B)을 발현하는 유전자도입 생쥐로부터의 자유-부유 (free-floating) 섹션에서 및 파킨슨 질환 (C) 및 루이 소체 치매 (D)의 인간 뇌 조직에서 루이 소체 및 루이 신경돌기 유사 봉입체, 및 작은 세포체수상돌기 및 시냅스 α-시누클레인 축적을 포함한 α-시누클레인 병리에 대해 현저한 염색을 나타낸다. 항체 Syn211은 인간 A30P α-시누클레인 유전자도입 생쥐에서 생리학적 시냅스 α-시누클레인을 고감도로 검출하고 (E), NI-202.12F4는 병적 α-시누클레인 응집체에 우선적으로 결합한다 (B). NI-202.12F4의 결합은 이차 항체 단독 대조 염색과 유사하게 (G) 야생형 생쥐의 뇌 섹션으로부터 실질적으로 부재하고 (F), 클론 42 항체는 생쥐 α-시누클레인 단백질의 두드러진 시냅스 염색을 나타낸다 (H).
도 8: 재조합 NI-202.12F4는 고밀도 코팅된 α-시누클레인에 대해 우선적인 결합을 나타낸다. 재조합의 전체 길이 또는 절두형 α-시누클레인을 지시된 농도로 ELISA 플레이트에 코팅하고, 다양한 농도의 NI-202.12F4 또는 Syn211 항체로 직접적 ELISA에 의해 탐침하였다 (○ 20 μg/ml; ▲ 2 μg/ml; ▼ 1 μg/ml; ◆ 250 ng/ml; □ 100 ng/ml 코팅 농도의 재조합 전체 길이 또는 1-60 α-시누클레인). 항체의 효능을 나타내는 1/2 최대 유효 농도 (EC50)를 측정하였다. (A) α-시누클레인에 대한 재조합 NI-202.12F4의 고친화도 결합은 높은 코팅 밀도의 α-시누클레인 단백질을 필요로 한다. 111 pM EC50이 20 μg/ml 농도로 코팅된 α-시누클레인에 대해 관측되고, EC50 값은 코팅 농도의 감소와 함께 가파르게 증가하며, 이는 낮은 코팅 농도의 α-시누클레인에서 친화도의 극적 상실을 입증한다. 이러한 특징은 높은 코팅 농도의 α-시누클레인에서 우선적으로 형성되는 NI-202.12F4 의 구조적 에피토프를 가리킨다. (B) Syn211 결합은 코팅 농도에 의해 영향을 받지 않는다. 낮은 코팅 밀도의 시판되는 Syn211 항체에 대해 어떠한 친화도 감소도 관측되지 않으며, EC50은 α-시누클레인의 20 μg/ml 코팅 밀도에 대해 335 pm 내지 100 ng/ml의 코팅 밀도에 대해 99 pM이며, 이는 선형의 비구조적 에피토프에 대한 결합을 제시한다. (C) 재조합 NI-202.12F4의 아미노산 1-60을 포함하는 N-말단 α-시누클레인 단편에 대한 고친화도 결합은 높은 코팅 밀도를 필요로 한다. NI-202.12F4는 전체 길이의 α-시누클레인 및 절두형 α-시누클레인에 대해 동등한 코팅 농도 의존적인 결합을 보이며, α-시누클레인 단백질의 아미노산 1-60에 포함된 NI-202.12F4의 구조적 에피토프를 지시한다. (D) α-시누클레인의 N-말단 60개 아미노산을 커버하는 중복 20개 아미노산 단편을 포함하는 바이오티닐화된 펩타이드를 아비딘 플레이트에 코팅하고 aa 21-40 내의 에피토프를 검출하는 NI-202.12F4 또는 팬-시누클레인 대조 항체로 탐침하였다. 따라서, 대조 항체는 강력하게 펩타이드 21-40에 결합하고 덜한 정도로 펩타이드 11-30 및 31-50에 결합한다. 이와는 대조적으로, NI-202.12F4에 대해서는 시험된 임의의 펩타이드에 대해 어떠한 결합도 관측되지 않으며, 이는 N-말단 단편의 어떠한 것도 NI-202.12F4 에피토프로서 충분하지 않으며 보다 큰 단편이 최적 결합 및 구조적인 NI-202.12F4 에피토프의 형성에 필요할 수 있다는 것을 제시한다.
도 9: NI-202.12F4로의 장기간 처리가 α-시누클레인 A53T 유전자도입 생쥐에서 운동 수행능을 개선한다. 10.5 월령의 α-시누클레인 A53T 유전자도입 생쥐를 NI-202.12F4 또는 PBS (5mg/kg; 복강내 투여)로 매주 처리하였다. 운동 수행능은 장대-시험에서 2개월 처치 후 평가하였다. (A) NI-202.12F4 처리된 동물은 아래로 전환하는데 상당히 적은 시간을 필요로 했다 (t-턴: 1.7 ±0.3 대 4.6 ±0.6 sec, p=0.0002, 2단 (two-tailed) 스튜던츠 t-검증). (B) NI-202.12F4 처리된 동물은 또한 본 우리로 내려오는데 상당히 적은 시간 (t-합계)을 사용하였다 (7.3 ±0.9 대 10.4 ±0.7 sec, p=0.012, 2단 스튜던츠 t-검증).
도 10: α-시누클레인 A53T 유전자도입 생쥐의 NI-202.12F4로의 장기간 처리는 고가 플러스 미로 행동을 회복시킨다. 10.5월령의 α-시누클레인 A53T 유전자도입 생쥐를 5 mg/kg NI-202.12F4 또는 PBS로 매주 복강내 처리하였다. 2개월 처리 후, 동물을 고가 플러스 미로 행동에 대해 시험하였다. NI-202.12F4 처리된 동물은 운반제 처리 대조 동물에 비해 개방 암에서 상당히 적은 시간을 소비하고 상당히 낮은 거리를 커버하였으며, 이는 정상적인 행동의 회복을 나타낸다.
도 11: α-시누클레인 A53T 유전자도입 생쥐의 NI-202.12F4로의 장기간 처리는 인간 A53T α-시누클레인의 혈장 수준을 증가시킨다. 혈장 샘플을 5mg/kg NI-202.12F4 또는 PBS로 2개월 동안 매주 복강내 처리된 12.5월령의 α-시누클레인 A53T 유전자도입 생쥐로부터 준비하였다. 마지막으로 적용한 지 24시간 후 채혈하였다. (A) 혈장 중 NI-202.12F4 수준을 직접적인 α-시누클레인 ELISA를 이용하여 측정하였다. (B) 혈장 중 인간 A53T α-시누클레인 수준을 인간-특이적 α-시누클레인 샌드위치 ELISA를 이용하여 측정하였다. NI-202.12F4로 처리된 동물은 대조 동물과 비교하여 혈장 중에 상당히 증가된 수준의 인간 α-시누클레인을 가졌다 (24.9 ±4.1 대 1.9 ±1.2 ng/ml, p=0.0002).
I. 정의
시누클레인병증 질환 또는 시누클레인병증은 뉴런 및 신경교에 대해 선택적으로 취약한 집단에서 불용성 α-시누클레인 단백질의 응집체로 구성된 일반적인 병적 병변을 공유하는 다양한 그룹의 신경변성 장애이다. 이러한 장애는 파킨슨 질환 (PD), 파킨슨 질환 치매 (PDD), 루이 소체 치매 (DLB), 소아-발병 전신 신경축삭 디스트로피 (할러보르덴-슈파츠 질환), 순수 자율신경 부전 (PAF), 다발기 계통 위축증 (MSA) 및 뇌에 철 축적을 동반하는 신경변성 제1형 (NBIA-I)을 포함한다. 임상적으로, 이들은, 병변의 분포에 따라, 운동, 인지, 행동 및 자율신경 기능의 만성적 및 진행적 저하로 특징지어진다.
파킨슨 질환은 미지의 병인을 갖는 나이-의존적 신경퇴행성 질환이다. 돌발성 파킨슨 질환은 유전적 취약함 및 환경적 상해의 조합으로부터 발생하는 것으로 믿어진다. 또한, 파킨슨 질환 (PD)은 본질적으로 상이한 기전에 의해 유발되는 한편 공유되는 병리생리학적 경로를 따르는 것으로 믿어진다. 이러한 단백질과 파킨슨 질환 발병과의 연계는 가족력의 경우에 점 돌연변이와 유전자 삼중화 (triplication) 모두의 동정, α-시누클레인의 루이 소체에의 국소화, 파킨슨 질환의 특징적인 병리적 특성 중 하나, 및 파킨슨 질환의 신경독성 모델에서 α-시누클레인 발현과 질환 병리의 상관 관계에 의해 확인되었다. 추가의 입증은 α-시누클레인의 특정 형태 (예: 미스폴딩되고 α-시누클레인 결합된 도파민)가 산발적 질환에 연루된다는 것을 나타낸다.
시누클레인은 주로 신경 조직 및 특정 종양에서 발현되는 작은 가용성 단백질이다. 시누클레인 패밀리는 3개의 공지된 단백질을 포함한다: α-시누클레인, β-시누클레인, 및 γ-시누클레인. 모든 시누클레인은 교환가능한 아포지질단백질의 부류-A2 지질-결합 도메인에 대한 유사성과 함께 고도로 보존된 α-나선형의 지질-결합 모티프를 공통적으로 갖는다. 시누클레인 패밀리 구성원들은 식물 '만기-태아-풍부 (late-embryo-abundant)' 단백질과 다소 보존된 구조적 유사성을 갖지만, 척추동물을 제외하고는 발견되지 않는다. α- 및 β-시누클레인 단백질은 대부분 뇌 조직에서 발견되며, 여기서 이들은 주로 시냅스이전 터미널에서 나타난다. γ-시누클레인 단백질은 대부분 말초 신경계 및 망막에서 발견되나, 유방암에서의 이의 발현은 종양 진행에 대한 마커이다. 일부 자료가 막 안정성 및/또는 회전 조절에서의 역할을 제시하기는 하지만, 정상적인 세포 기능이 어떠한 시누클레인 단백질에 대해서도 측정되지 못했다. α-시누클레인에서의 돌연변이는 조기-발병 파킨슨의 드문 가족력과 연관되며, 이 단백질은 파킨슨 질환, 알츠하이머 질환 및 수개의 다른 신경퇴행성 질환에서 비정상적으로 축적된다. 검토를 위해, 문헌 [참조: George, Genome Biol. 3 (2002), reviews3002.1-reviews3002.6, 2001년 12월 20일에 온라인 상에서 공개됨, 표 1은 GenBank에 최근 열거된 시누클레인 패밀리의 독특한 구성원들을목록에 수록함, 이의 기술 내용이 본원에 참조로 삽입됨]을 참조한다.
α-시누클레인은 알츠하이머 질환 (AD) 플라크의 비-β-아밀로이드 성분 (NAC)의 전구체 단백질로서 인간 뇌에서 최초로 동정되었다 [참조: Ueda et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90 (1993), 1282-1286]. AD 아밀로이드의 비-Aβ 성분 (NACP)의 전구체로도 불리는 α-시누클레인은 140개 아미노산의 단백질이다. α-시누클레인은 이의 천연 형태에서 무작위 코일로 존재하나, pH, 분자 과밀, 중금속 함량 및 도파민 수준의 변화는 단백질 구조에 영향을 끼친다. 올리고머, 프로토-피브릴, 피브릴 및 응집 잔기에 대한 구조 변화가 단백질 독성을 조절하는 것으로 생각된다. 더욱 많은 증거가 도파민-부가된 α-시누클레인이 비-부가된 단백질에 비해 피브릴 형성에 보다 신속한 시간 경과를 갖는다는 것을 나타낸다. 또한, α-시누클레인 과발현의 배경에 있는 도파민은 독성이다.
본원에서 용어 "α-시누클레인", "알파-시누클레인", "a-시누클레인" 및 "aSyn"은 특히 α-시누클레인의 천연 단량체 형태를 언급하기 위해 상호교환적으로 사용된다. 용어 "α-시누클레인"은 또한 일반적으로 다른 이형태체, 예를 들어 도파민-퀴논 (DAQ)에 결합된 α-시누클레인 및 α-시누클레인의 올리고머 또는 응집체를 확인하는데 사용된다. 용어 "α-시누클레인"은 또한 총체적으로 모든 유형 및 형태의 α-시누클레인을 언급하는데 사용된다. 인간 α-시누클레인의 단백질 서열은 MDVFMKGLSKAKEGVVAAAEKTKQGVAEAAGKTKEGVLYVGSKTKEGVVHGVATVAEKTKEQVTNVGGAVVTGVTAVAQKTVEGAGSIAAATGFVKKDQLGKNEEGAPQEGILEDMPVDPDNEAYEMPSEEGYQDYEPEA (서열 1)이다. α-시누클레인의 아미노산 서열은 문헌 및 관련 데이터베이스로부터 검색될 수 있다 [참조: Ueda et al ., ibid .; GenBank swissprot: locus SYUA_HUMAN, accession number P37840]. AD 아밀로이드의 비-Aβ 성분 (NAC)는 α-시누클레인로부터 유도된다. α-시누클레인 내의 고도의 소수성 도메인인 NAC는 적어도 28개의 아미노산 잔기 (잔기 60-87) 및 임의로 35개의 아미노산 잔기 (잔기 61-95)로 구성된 펩타이드이다. NAC는 베타-시트 구조를 형성하는 경향을 나타낸다 [참조: Iwai, et al ., Biochemistry, 34 (1995) 10139-10145]. NAC의 아미노산 서열은 문헌 [참조: Jensen et al ., Biochem. J. 310 (1995), 91-94; GenBank accession number S56746; 그리고 Ueda et al ., PNAS USA 90 (1993), 1282-11286]에 기술되어 있다.
NAC를 포함한 탈응집된 α-시누클레인 또는 이의 단편은 단량체성 펩타이드 단위를 의미한다. 탈응집된 α-시누클레인 또는 이의 단편은 일반적으로 가용성이며, 가용성 올리고머를 형성하도록 자가-응집할 수 있다. α-시누클레인 및 이의 단편의 올리고머는 통상 가용성이며 주로 α-나선으로 존재한다. 단량체성 α-시누클레인은 동결건조된 펩타이드를 음파처리와 함께 순수 DMSO에 용해시킴으로써 시험관내에서 제조될 수 있다. 생성 용액은 임의의 불용성 미립자를 제거하기 위해 원심분리된다. NAC를 포함하여 응집된 α-시누클레인 또는 이의 단편은 불용성 β-시트 조립물로의 결합을 갖는 α-시누클레인 또는 이의 단편의 올리고머를 의미한다. NAC를 포함하여 응집된 α-시누클레인 또는 이의 단편은 또한 피브릴 중합체를 의미한다. 피브릴은 통상 불용성이다. 일부 항체는 가용성 α-시누클레인 또는 이의 단편 또는 응집된 α-시누클레인 또는 이의 단편에 결합한다. 일부 항체는 단량체 형태 또는 피브릴 형태에 대해서 보다 α-시누클레인의 올리고머에 더욱 강력하게 결합한다. 일부 항체는 가용성 및 응집된 α-시누클레인 또는 이의 단편, 및 임의로 올리고머 형태에 결합한다.
본원에서 기술되는 인간 항-α-시누클레인 항체는 α-시누클레인 및 이의 에피토프, 및 α-시누클레인 및 이의 에피토프의 다양한 구조물에 특이적으로 결합한다. 예를 들어, 본원에는 α-시누클레인에 특이적으로 결합하는 항체, 이의 천연 단량체 형태의 α-시누클레인, 전체 길이 및 절두된 α-시누클레인 및 α-시누클레인 응집체가 기술된다. 본원에서 사용되는 바와 같은 α-시누클레인에 "특이적으로 결합하는" "선택적으로 결합하는" 또는 "우선적으로 결합하는" 항체에 대한 언급은 다른 비관련된 단백질에 결합하지 않는 항체를 말한다. 하나의 예에서, 본원에서 기술되는 α-시누클레인 항체는 α-시누클레인 또는 이의 에피토프를 결합할 수 있고 다른 단백질에 대해 약 1.5 x 배경을 초과하는 어떠한 결합도 나타내지 않는다. α-시누클레인 이형태체에 "특이적으로 결합하는" 또는 "선택적으로 결합하는" 항체는 α-시누클레인의 모든 구조물에 결합하지는 않는, 즉 적어도 하나의 다른 α-시누클레인 이형태체에 결합하지 않는 항체를 언급한다. 예를 들어, 단량체 및 응집체 형태의 α-시누클레인, 인간 및 생쥐 α-시누클레인; 전체 길이 α-시누클레인 및 절두 형태를 구분할 수 있는 항체, 및 β- 및 γ-시누클레인과 대비해서 인간 α-시누클레인을 구분할 수 있는 항체가 본원에 기술된다. 본 발명의 인간 항-α-시누클레인 항체는 파킨슨 징후가 없고 α-시누클레인-특이적 면역 반응을 나타내는 노인 피험자의 풀로부터 분리되었으므로, 본 발명의 항-α-시누클레인 항체는 또한 이들 항체가 피험자에 의해 실제로 발현되었고, 예를 들어 인간 면역글로불린 발현 파지 라이브러리 (지금껏 인간-유사 항체를 제공하기 위해 시도되는 하나의 일반적인 방법을 나타냄)로부터 분리되지 않았다는 것을 강조하기 위해 "인간 자가-항체"라 칭해질 수 있다.
용어 "하나"는 하나 이상의 실체를 언급한다는 것에 주목해야 하며; 예를 들어 "일 항체"는 하나 이상의 항체를 나타내는 것으로 이해된다. 그러한 것으로서, 용어 "하나", "하나 이상" 및 "적어도 하나"는 본원에서 상호교환적으로 사용될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "폴리펩타이드"는 단일 "폴리펩타이드" 및 다수의 "폴리펩타이드"를 포함하고자 하며, 아미드 결합 (또한 펩타이드 결합으로도 공지됨)에 의해 선형으로 연결된 단량체 (아미노산)로 구성된 분자를 언급한다. 용어 "폴리펩타이드"는 2개 이상의 아미노산의 임의의 쇄 또는 쇄들을 언급하며, 특정 길이의 생성물을 언급하지는 않는다. 따라서, 펩타이드, 디펩타이드, 트리펩타이드, 올리고펩타이드, "단백질", "아미노산 쇄", 또는 2개 이상의 아미노산의 쇄 또는 쇄들을 언급하기 위해 사용되는 임의의 다른 용어가 "폴리펩타이드"의 정의에 포함되며, 용어 "폴리펩타이드"는 임의의 이들 용어 대신 또는 이들과 상호교환적으로 사용될 수 있다.
용어 "폴리펩타이드"는 또한, 제한 없이, 글리코실화, 아세틸화, 포스포릴화, 아미드화, 공지된 보호/차단 그룹으로의 유도체화, 단백질분해 절단, 또는 비천연 발생 아미노산으로의 변형을 포함하여, 폴리펩타이드의 발현후 변형 생성물을 언급하고자 한다. 폴리펩타이드는 천연 생물학적 공급원으로부터 유도되거나 재조합 기술로 생성될 수 있으나, 반드시 지정된 핵산 서열로부터 해독되지는 않는다. 이는 화학적 합성을 포함하여 임의의 방식으로 생성될 수 있다.
본 발명의 폴리펩타이드는 약 3개 이상, 5개 이상, 10개 이상, 20개 이상, 25개 이상, 50개 이상, 75개 이상, 100개 이상, 200개 이상, 500개 이상, 1,000개 이상, 또는 2,000개 이상의 아미노산 크기일 수 있다. 폴리펩타이드는 반드시 그러한 것은 아니지만 규정된 3차원 구조를 가질 수 있다. 규정된 3차원 구조를 갖는 폴리펩타이드는 폴딩된 것으로 언급되며, 규정된 3차원 구조를 갖지 않고 오히려 다수의 상이한 구조를 채택할 수 있는 폴리펩타이드는 폴딩되지 않은 것으로 언급된다. 본원에서 사용되는 용어 당단백질은 아미노산 잔기, 예를 들어 세린 잔기 또는 아르기닌 잔기의 산소-포함 또는 질소-포함 측쇄를 통해 단백질에 결합되는 적어도 하나의 탄수화물 잔기에 커플링된 단백질을 언급한다.
"분리된" 폴리펩타이드 또는 이의 단편, 변이체 또는 유도체는 이의 천연 환경에 있지 않은 폴리펩타이드를 의도한다. 특정 수준의 정제가 요구되지는 않는다. 예를 들어, 분리된 폴리펩타이드는 이의 고유 또는 천연 환경으로부터 분리될 수 있다. 숙주 세포에서 발현되는 재조합적으로 생성되는 폴리펩타이드 및 단백질은, 임의의 적합한 기술로 분리되거나 분획화되거나 부분적으로 또는 실질적으로 정제된 고유 또는 재조합 폴리펩타이드이기 때문에, 본 발명의 목적상 분리되는 것으로 간주된다.
또한, 본 발명의 폴리펩타이드로서 상기 폴리펩타이드들의 단편, 유도체, 동족체 또는 변이체, 및 이들의 배합물이 포함된다. 본 발명의 항체 또는 항체 폴리펩타이드를 언급할 때 용어 "단편", "변이체", "유도체" 및 "동족체"는 상응하는 고유 결합 분자, 항체 또는 폴리펩타이드의 항원-결합 특성 중 적어도 일부를 보유하는 임의의 폴리펩타이드를 포함한다. 본 발명의 폴리펩타이드의 단편은, 본원의 다른 곳에서 논의되는 특정 항체 단편에 추가하여, 단백질분해 단편 및 결실 단편을 포함한다. 본 발명의 항체 및 항체 폴리펩타이드의 변이체는 상술된 단편, 및 아미노산 치환, 결실 또는 삽입에 의해 변형된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 변이체는 천연적으로나 비-천연적으로 발생할 수 있다. 비-천연 발생 변이체는 당해 기술 분야의 공지된 돌연변이유발 기술을 이용하여 생성될 수 있다. 변이체 폴리펩타이드는 보존적 또는 비-보존적 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 포함할 수 있다. α-시누클레인 특이적 결합 분자의 유도체, 예를 들어 본 발명의 항체 및 항체 폴리펩타이드의 유도체는 고유 폴리펩타이드에서는 발견되지 않는 추가의 특성을 나타내도록 변형된 폴리펩타이드이다. 그 예는 융합 단백질을 포함한다. 변이체 폴리펩타이드는 또한 본원에서 "폴리펩타이드 동족체"로 언급될 수 있다. 본원에서 사용되는 결합 분자 또는 이의 단편, 항체, 또는 항체 폴리펩타이드의 "유도체"는 기능적 측쇄의 반응에 의해 화학적으로 유도체화된 하나 이상의 잔기를 갖는 해당 폴리펩타이드를 언급한다. 또한, "유도체"에는 20개의 표준 아미노산에 대한 하나 이상의 천연 발생 아미노산 유도체를 포함하는 펩타이드도 포함된다. 예를 들어, 4-하이드록시프롤린은 프로필 대신 치환될 수 있고, 5-하이드록실리신은 리신 대신 치환될 수 있고; 3-메틸히스티딘은 히스티딘에 대해 치환될 수 있고; 호모세린은 세린 대신 치환될 수 있고; 오르니틴은 리신 대신 치환될 수 있다.
용어 "폴리뉴클레오타이드"는 단일 핵산 및 다수의 핵산을 포함하고자 하며, 분리된 핵산 분자 또는 작제물, 예를 들어 메신저 RNA (mRNA) 또는 플라스미드 DNA (pDNA)를 언급한다. 폴리뉴클레오타이드는 통상적인 포스포디에스테르 결합 또는 비통상적인 결합 (예를 들어, 펩타이드 핵산 (PNA)에서 발견된 것과 같은 아미드 결합)을 포함할 수 있다. 용어 "핵산"은 폴리뉴클레오타이드에 존재하는 하나 이상의 핵산 절편, 예를 들어 DNA 또는 RNA 단편을 언급한다. "분리된" 핵산 또는 폴리뉴클레오타이드는 이의 고유 환경으로부터 떼어낸 핵산 분자, DNA 또는 RNA를 나타내는 것이다. 예를 들어, 벡터에 포함된 항체를 암호화하는 재조합 폴리뉴클레오타이드는 본 발명의 목적을 위해 분리된 것으로 여겨진다. 분리된 폴리뉴클레오타이드의 추가적 예로는 이종 숙주 세포 중에 유지된 재조합 폴리뉴클레오타이드 또는 용액중의 정제된 (부분적으로 또는 실질적으로) 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 분리된 RNA 분자는 본 발명의 폴리뉴클레오타이드의 생체내 또는 시험관내 RNA 전사체를 포함한다. 본 발명에 따른 분리된 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산은 추가로 합성적으로 생성된 이러한 분자를 포함한다. 또한, 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산은 조절 인자, 예를 들어 프로모터, 리보좀 결합 부위 또는 전사 터미네이터일 수 있거나 이를 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "암호화 영역"은 아미노산으로 해독된 코돈으로 구성된 핵산 부분이다. "정지 코돈" (TAG, TGA 또는 TAA)은 아미노산으로 해독되지 않지만, 이는 암호화 영역의 일부로서 간주될 수 있으며, 플랭킹 서열, 예를 들어 프로모터, 리보좀 결합 부위, 전사 터미네이터, 인트론 등은 암호화 영역의 일부가 아니다. 본 발명의 2개 이상의 암호화 영역은 단일 폴리뉴클레오타이드 작제물에, 예를 들어 단일 벡터 또는 별도의 폴리뉴클레오타이드 작제물, 예를 들어 별도의 (상이한) 벡터에 존재할 수 있다. 또한, 임의의 벡터는 단일 암호화 영역을 포함할 수 있거나, 2개 이상의 암호화 영역을 포함할 수 있으며, 예를 들어 단일 벡터는 각각 면역글로불린 중쇄 가변 영역 및 면역글로불린 경쇄 가변 영역을 별도로 암호화할 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터, 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산은 결합 분자, 항체, 또는 이의 단편, 변이체 또는 유도체를 암호화하는 핵산에 융합되거나 비융합된 이종 암호화 영역을 암호화할 수 있다. 이종 암호화 영역은, 무제한적으로, 특정 인자 또는 모티프, 예를 들어 분비 신호 펩타이드 또는 이종 작용 도메인을 포함한다.
특정 양태에서, 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산은 DNA이다. DNA의 경우에, 일반적으로 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 암호화 영역과 작동적으로 결합된 프로모터 및/또는 기타 전사 또는 해독 조절 인자를 포함할 수 있다. 작동가능한 결합은 유전자 생성물, 예를 들어 폴리펩타이드에 대한 암호화 영역이 조절 서열(들)의 영향 또는 조종 하에 유전자 생성물이 발현되게 하는 방식으로 하나 이상의 조절 서열과 결합되는 경우이다. 2개의 DNA 단편 (예를 들어, 폴리펩타이드 암호화 영역 및 이와 결합된 프로모터)은, 프로모터 기능의 유도가 목적하는 유전자 생성물을 암호화하는 mRNA의 전사를 초래하고, 2개의 DNA 단편 사이의 연결 특징이 유전자 생성물의 발현을 지시하는 발현 조절 서열의 능력을 방해하지 않거나 전사될 DNA 주쇄의 능력을 방해하지 않는 경우, "작동적으로 결합"되거나 "작동적으로 연결"된다. 따라서, 프로모터가 핵산의 전사를 수행할 수 있는 경우, 프로모터 영역은 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산과 작동적으로 결합된 것이다. 프로모터는 예정된 세포에서만 DNA의 실질적인 전사를 지시하는 세포-특이적 프로모터일 수 있다. 프로모터 이외의 다른 전사 조종 인자, 예를 들어 인핸서, 오퍼레이터, 리프레서 및 전사 종결 신호이 폴리뉴클레오타이드에 작동적으로 결합되어 세포-특이적 전사를 지시할 수 있다. 적합한 프로모터 및 기타 전사 조종 영역이 본원에 기술되어 있다.
다양한 전사 조종 영역은 당업자에게 공지되어 있다. 무제한적으로, 척추동물 세포에서 작동하는 전사 조종 영역, 예를 들어, 무제한적으로, 사이토메갈로바이러스 (인트로-A와 함께 극초기 프로모터), 시미안 바이러스 40 (초기 프로모터) 및 레트로바이러스 (예를 들어, 로우스 사르코마 바이러스)로부터의 프로모터 및 인핸서 절편이 포함된다. 기타 전사 조종 영역은 척추동물 유전자로부터 유래되는 것, 예를 들어 악틴, 열 쇼크 단백질, 소 성장 호르몬 및 토끼 β-글로빈, 및 진핵 세포에서 유전자 발현을 조종할 수 있는 그 밖의 서열을 포함한다. 추가적인 적합한 전사 조절 영역은 림포카인-유도성 프로모터 (인터페론 또는 인터류킨에 의해 유도가능한 프로모터)뿐만 아니라 조직-특이적 프로모터 및 인핸서를 포함한다.
유사하게는, 다양한 해독 조절 인자가 당업자에게 공지되어 있다. 무제한적으로, 리보좀 결합 부위, 해독 개시 및 종결 코돈, 및 피코르나바이러스로부터 유래된 인자 (특히, 내부 리보좀 도입 부위, 또는 IRES (CITE 서열로도 불림))를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 RNA, 예를 들어 메신저 RNA (mRNA)의 형태이다.
본 발명의 폴리뉴클레오타이드 및 핵산 암호화 영역은 본 발명의 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 폴리펩타이드의 분비를 지시하는 분비성 또는 신호 펩타이드를 암호화하는 추가적인 암호화 영역과 결합될 수 있다. 신호 가설에 따르면, 포유동물 세포에 의해 분비되는 단백질은, 일단 조면 소포체를 가로지르는 성장하는 단백질 쇄의 외수송이 개시되면, 성숙한 단백질로부터 절단되는 신호 펩타이드 또는 분비 리더 서열을 갖는다. 당업자는 척추동물 세포에 의해 분비되는 폴리펩타이드는 일반적으로 폴리펩타이드의 N-말단에 융합된 신호 펩타이드를 가지며, 이는 완전 또는 "전체 길이" 폴리펩타이드로부터 절단되어 분비 또는 "성숙한" 형태의 폴리펩타이드를 생성한다는 것을 알고 있다. 특정 양태에서, 고유 신호 펩타이드, 예를 들어 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄 신호 펩타이드가 사용되거나, 작동적으로 결합된 폴리펩타이드의 분비를 지시하는 능력을 보유하는 이러한 서열의 작용성 유도체가 사용된다. 대안적으로, 이종 포유동물 신호 펩타이드, 또는 이의 작용성 유도체가 사용될 수 있다. 예를 들어, 야생형 리더 서열은 인간 조직 플라스미노겐 활성화제 (TPA) 또는 생쥐 β-글루쿠로니다아제의 리더 서열로 치환될 수 있다.
달리 언급되지 않는 한, 용어 "장애" 및 "질환"은 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
본 발명에 사용되는 바와 같은 "결합 분자"는 주로 항체 및 이의 단편을 나타내나, 또한, 무제한적으로, 호르몬, 수용체, 리간드, 주요 조직적합 복합체 (MHC) 분자, 샤페론, 예를 들어 열 쇼크 단백질 (HSP) 및 세포-세포 부착 분자, 예를 들어 캐더린 (cadherin), 인테그린, C-타입 렉틴 및 면역글로불린 (Ig) 슈퍼패밀리의 구성원을 포함하는 α-시누클레인에 결합하는 기타 비-항체 분자를 언급할 수 있다. 따라서, 본 발명의 범위를 제한하지 않으면서 단지 명확히 하기 위해, 하기 양태 대부분이 치료제 및 진단제의 개발을 위한 바람직한 결합 분자를 나타내는 항체 및 항체 유사 분자와 관련하여 논의된다.
용어 "항체" 및 "면역글로불린"은 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 항체 또는 면역글로불린은 적어도 중쇄의 가변 도메인을 포함하는 α-시누클레인-결합 분자이며, 일반적으로, 중쇄 및 경쇄의 적어도 가변 도메인을 포함한다. 척추동물계에서의 기본적 면역글로불린 구조는 비교적 널리 알려졌다. 예를 들어, 문헌 [Harlow et al ., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988]을 참조한다.
하기 더욱 상세히 논의되는 바와 같이, 용어 "면역글로불린"은 생화학적으로 구별될 수 있는 다양한 광범위한 부류의 폴리펩타이드를 포함한다. 당업자는 중쇄가 감마, 뮤, 알파, 델타 또는 엡실론 (γ, μ, α, δ, ε)으로 분류되며, 이들 중 일부는 아부류 (예를 들어, γ1-γ4)를 갖는다. 이것이 항체의 "부류"를 각각 IgG, IgM, IgA, IgG 또는 IgE로서 결정하는 이러한 쇄의 특징이다. 면역글로불린 아부류 (이소타입), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 등이 널리 특징분석되어 있으며, 작용 특이성을 부여하는 것으로 공지되어 있다. 이러한 부류 및 이소타입 각각의 변형된 이형은 본 기술에 비추어 볼 때 당업자기 용이하게 인식할 수 있으므로, 본 발명의 범위 내에 있다. 모든 면역글로불린 부류가 본 발명의 범위 내에 있으며, 하기 논의는 일반적으로 면역글로불린 분자의 IgG 부류에 관한 것이다. IgG에 있어서, 표준 면역글로불린 분자는 분자량 약 23,000 달톤의 2개의 동일한 경쇄 폴리펩타이드, 및 분자량 53,000-70,000 달톤의 2개의 동일한 중쇄 폴리펩타이드를 포함한다. 4개의 쇄는 전형적으로, "Y" 배치로 디설파이드 결합에 의해 연결되며, 여기서 경쇄는 "Y"의 입에서 시작하여 가변 영역을 지나서 이어지는 중쇄를 브래킷 (bracket)한다.
경쇄는 카파 또는 람다 (κ, λ)로 분류된다. 각각의 중쇄 부류는 카파 또는 람다 경쇄와 결합할 수 있다. 일반적으로, 경쇄 및 중쇄는 서로 공유적으로 결합되며, 면역글로불린이 하이브리도마, B 세포 또는 유전자 조작된 숙주 세포에 의해 생성되는 경우, 두 중쇄의 "테일" 부분은 공유 디설파이드 결합 또는 비공유 결합에 의해 서로 결합된다. 중쇄에서, 아미노산 서열은 Y 배열의 포크 끝의 N 말단으로부터 각 쇄 하부의 C-말단으로 이어진다.
경쇄 및 중쇄는 구조적 및 기능적 상동 영역으로 나누어진다. 용어 "불변" 및 "가변"은 기능적으로 사용된다. 이와 관련하여, 경쇄 (VL) 및 중쇄 (VH) 부분 둘 모두의 가변 도메인은 항원 인지성 및 특이성을 결정한다. 역으로, 경쇄 (CL) 및 중쇄 (CH1, CH2 또는 CH3)의 불변 도메인은 중요한 생물학적 특성, 예를 들어 분비, 경태반 (tansplacental) 이동성, Fc 수용체 결합, 보체 결합 등을 부여한다. 관행적으로, 불변 영역 도메인이 항체의 항원 결합 부위 또는 아미노-말단으로부터 더욱 멀리 떨어질수록 불변 영역 도메인의 넘버링은 증가한다. N-말단 부분은 가변 영역이며, C-말단 부분은 불변 영역이며, CH3 및 CL 도메인은 실질적으로 각각 중쇄 및 경쇄의 카르복시-말단을 포함한다.
상기 나타낸 바와 같이, 가변 영역은 항체가 항원상의 에피토프를 선택적으로 인식하고 특이적으로 결합하게 한다. 즉, 항체의 VL 도메인과 VH 도메인, 또는 상보성 결정 영역 (CDR)의 서브셋은 연합되어 3차원 항원-결합 부위를 규정하는 가변 영역을 형성한다. 이러한 4차 항체 구조는 Y의 각 암의 말단에 존재하는 항원-결합 부위를 형성한다. 더욱 특정하게, 항원 결합 부위는 각각의 VH 및 VL 쇄 상의 3개의 CDR에 의해 규정된다. α-시누클레인에 특정하게 결합하기에 충분한 구조를 포함하는 항체 또는 면역글로불린 단편은 본원에서 "결합 단편" 또는 "면역특이적 단편"으로서 상호교환가능하게 나타내어진다.
천연 발생 항체에서, 항체는 각각의 항원-결합 도메인에 존재하는, 때때로 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"이라 불리는, 6개의 과가변 영역을 포함하며, 이는 항체를 수성 환경에서 이의 3차원 배열로 추정하는 경우 항원-결합 도메인을 형성하도록 특이적으로 위치하는 아미노산의 짧은 비연속성 서열이다. "CDR"은 보다 적은 분자간 가변성을 나타내는 4개의 비교적 보존된 "프레임웍" 영역에 의해 플랭킹된다. 프레임웍 영역은 주로 β-시트 형태를 취하며, CDR은 연결되는 루프를 형성하며, 일부 경우에는, β-시트 구조의 일부를 형성한다. 따라서, 프레임웍 영역은 쇄간 비공유 상호작용에 의해 정확한 배향으로 CDR를 위치시키기 위해 제공되는 스캐폴드 (scaffold)를 형성하도록 작용한다. 정위된 CDR에 의해 형성된 항원 결합 도메인은 면역반응성 항원상의 에피토프에 상보적인 표면을 규정한다. 이러한 상보적 표면은 항체의 이의 인지체 에피토프에 대한 비공유 결합을 증진시킨다. CDR 및 프레임웍 영역을 각각 포함하는 아미노산은 당업자에 의해 임의의 주어진 중쇄 또는 경쇄 가변 영역에 대해 용이하게 확인될 수 있는데, 이는 이들이 명확히 정의되었기 때문이다. 문헌 [참조: "Sequences of Proteins of Immunological Interest, "Kabat, E., et al ., U.S. Department of Health and Human Services, (1983); Chothia and Lesk, J.Mol.Biol., 196 (1987), 901-917, 모두 본원에 참조로 삽입됨]을 참조한다.
당해 기술 분야에서 사용되고 및/또는 허용되는 용어에 대한 2개 이상의 정의가 존재하는 경우, 본원에서 사용되는 바와 같은 용어의 정의는 달리 명확하게 언급되어 않는 한 모든 이러한 의미를 포함하는 것으로 의도된다. 특정 예로는 중쇄 및 경쇄 폴리펩타이드 둘 모두의 가변 영역내에 발견된 비연속성 항원 화합 부위를 기술하기 위한 용어 "상보성 결정 영역" ("CDR")의 사용이다. 이러한 특정 영역은 문헌 [참조: Kabat et al ., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983); 그리고 Chothia and Lesk, J.Mol.Biol. 196 (1987), 901-917, 본원에 참조로 삽입됨]에 기술되어 있으며, 여기서 정의는 서로 비교되는 경우 아미노산 잔기의 오버랩핑 또는 서브셋을 포함한다. 그럼에도 불구하고, 항체 또는 이의 변이체의 CDR에 대한 정의의 적용은 본원에 규정되고 사용되는 바와 같은 용어의 범위 내에 포함되는 것으로 의도된다. 상기 참조문헌 각각에 의해 규정된 바와 같은 CDR을 포함하는 적합한 아미노산 잔기는 비교를 위해 하기 표 1에 제시된다. 특정 CDR을 포함하는 정확한 잔기 번호는 CDR의 서열 및 크기에 따라 변화될 것이다. 항체의 가변 영역 아미노산 서열이 주어지는 한, 당업자는 통상적으로 어떤 잔기가 항체의 인간 IgG 서브타입의 초가변 영역 또는 CDR을 포함하는지 결정할 수 있다.
[표 1]
CDR 규정1
Figure pct00001
1표 1의 모든 CDR 규정의 넘버링은 카뱃 (Kabat) 등 (하기 참조)의 넘버링 관행에 따른 것이다.
카뱃 등은 또한 임의의 항체에 적용가능한 가변 도메인 서열에 대한 넘버링 시스템을 규정하였다. 당업자는 서열 자체 이외의 임의의 실험 데이터에 의존하지 않고도 이러한 "카뱃 넘버링 (Kabat numbering)" 시스템을 임의의 가변 도메인 서열에 명확하게 지정할 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같은 "카뱃 넘버링"은 문헌 [참조: Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest" (1983)]에 의해 규정된 넘버링 시스템을 언급한다. 달리 명시하지 않는 한, 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체에서 특이적 아미노산 잔기 위치의 넘버링에 대한 기준은 카뱃 넘버링 시스템에 따른다.
본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 면역특이적 단편, 변이체, 또는 유도체는 무제한적으로, 폴리클로날, 모노클로날, 다중특이적, 인간, 인간화된, 영장류화된 또는 키메라 항체, 단쇄 항체, 에피토프-결합 단편, 예를 들어 Fab, Fab' 및 F(ab')2, Fd, Fv, 단쇄 Fv (scFv), 단쇄 항체, 디설파이드-연결된 Fv (sdFv), VL 또는 VH 도메인을 포함하는 단편, Fab 발현 라이브러리에 의해 생성된 단편, 및 항-이디오타입 (항-Id) 항체 (예를 들어, 본원에서 기술되는 항체에 대한 항-Id 항체 포함)를 포함한다. scFv 분자는 당해 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 US 특허 5,892,019에 기술되어 있다. 본 발명의 면역글로불린 또는 항체 분자는 면역글로불린 분자의 임의의 유형 (예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, 및 IgY), 부류 (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 아부류일 수 있다.
일 양태에서, 본 발명의 항체는 5가 구조를 갖는 IgM 또는 이의 유도체가 아니다. 특히, 본 발명의 특정 적용에서, 특히 치료 용도에서, IgM은 IgG 및 다른 이가 항체 또는 상응하는 결합 분자에 비해 덜 유용한데, 그 이유는 IgM은 이의 5가 구조 및 친화도 성숙 결핍으로 인해 종종 비특이적 교차-반응성을 보이며, 매우 낮은 친화도를 나타내기 때문이다.
특히 바람직한 양태에서, 본 발명의 항체는 폴리클로날 항체가 아니다. 즉, 본 발명의 항체는 혈장 면역글로불린 샘플로부터 수득된 혼합물이기보다는 실질적으로 하나의 특정 항체 종으로 구성된다.
단쇄 항체를 포함하는 항체 단편은 가변 영역(들)을 단독으로 또는 하기 중 전체 또는 일부와 함께 포함할 수 있다: 힌지 영역, CH1, CH2 및 CH3 도메인. 또한, 본 발명에는 가변 영역(들)과 힌지 영역, CH1, CH2 및 CH3 도메인의 임의 조합을 포함하는 α-시누클레인-결합 단편이 포함된다. 본 발명의 항체 또는 면역특이적 단편은 조류 및 포유동물을 포함하는 임의의 동물 기원으로부터 유래될 수 있다. 바람직하게는, 항체는 인간, 쥐, 당나귀, 토끼, 염소, 기니아 피그, 낙타, 야마, 말 또는 닭 항체이다. 또 다른 양태에서, 가변 영역은 (예를 들어, 상어로부터의) 콘드리초이드 (condricthoid) 기원일 수 있다.
일 양태에서, 본 발명의 항체는 인간으로부터 분리된 인간 모노클로날 항체이다. 임의로, 인간 항체의 프레임웍 기원은 데이터베이스에 있는 적절한 인간 생식계열 가변 영역 서열에 따라 정렬되고 채택된다; 기관 (MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, UK)이 주관하는 Vbase (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)를 참조한다. 예를 들어, 진성 생식계열 서열로부터 잠재적으로 이탈할 것으로 생각되는 아미노산은 클로닝 과정 동안 삽입되는 PCR 프라이머 서열 때문일 수 있었다. 본 발명의 인간 모노클로날 항체는, 파지 디스플레이된 항체 라이브러리 또는 이종 개체 생쥐로부터 인위적으로 생성되는 인간-유사 항체, 예를 들어 단쇄 항체 단편 (scFv)와 비교하여, (i) 동물 대용물의 면역 반응보다는 인간 면역 반응을 이용하여 수득되며, 즉 항체는 이의 관련 형태의 천연 α-시누클레인에 반응하여 인간 신체에서 생성되며, (ii) 개체를 보호하거나 α-시누클레인의 존재에 대해 적어도 암시적이며, (iii) 항체가 인간 기원이므로 자가-항원에 대한 교차-반응성의 위험이 최소화된다. 따라서, 본 발명에 따라 용어 "인간 모노클로날 항체", "인간 모노클로날 자가항체", "인간 항체" 등은 인간 기원인 (즉, 인간 세포, 예를 들어 B 세포 또는 이의 하이브리도마로부터 분리되거나 이의 cDNA가 인간 세포, 예를 들어 인간 기억 B 세포의 mRNA로부터 직접적으로 클로닝되는) α-시누클레인 결합 분자를 나타내는데 사용된다. 인간 항체는, 예를 들어 결합 특성을 개선하기 위해, 항체에서 아미노산 치환이 일어나더라도 여전히 "인간" 항체이다.
본 발명의 진성 인간 항체로부터 인간-유사 항체를 구별하기 위해, 후술되는 바와 같이, 예를 들어 US 특허 5,939,598 (Kucherlapati 등)에 기술되어 있는 바와 같이, 인간 면역글로불린 라이브러리로부터 또는 하나 이상의 인간 면역글로불린에 대해 유전자도입인 동물로부터 유도되고 내인적 면역글로불린을 발현하지 않는 항체가 인간-유사 항체로 표시된다.
본원에서 사용되는 용어 "뮤린화된 항체" 또는 "뮤린화된 면역글로불린"은 본 발명의 인간 항체로부터 하나 이상의 CDR; 및 생쥐 항체 서열에 기초된 아미노산 치환 및/또는 결실 및/또는 삽입을 포함하는 인간 프레임웍 영역을 포함하는 항체를 언급한다. CDR을 제공하는 인간 면역글로불린은 "모" 또는 "수용자"로 불리고, 프레임웍 변화를 제공하는 생쥐 항체는 "공여자"로 불린다. 불변 영역은 존재할 필요는 없으나, 존재하는 경우, 이는 통상적으로 생쥐 항체 불변 영역과 실질적으로 동일, 즉 적어도 약 85-90%, 바람직하게는 약 95% 또는 그 이상으로 동일하다. 따라서, 일부 양태에서, 전체 길이의 뮤린화된 인간 중쇄 또는 경쇄 면역글로불린은 생쥐 불변 영역, 인간 CDR 및 다수의 "뮤린화" 아미노산 치환을 갖는 실질적인 인간 프레임웍을 포함한다. 전형적으로, "뮤린화된 항체"는 뮤린화된 가변 경쇄 및/또는 뮤린화된 가변 중쇄를 포함하는 항체이다. 예를 들어, 뮤린화된 항체는, 예를 들어 키메라 항체의 전체 가변 영역이 비-생쥐이기 때문에, 전형의 키메라 항체를 포함하지는 않을 것이다. "뮤린화"의 과정에 의해 "뮤린화된" 변형된 항체는 CDR을 제공하는 모 항체와 동일한 항원에 결합하고, 모 항체와 비교하여, 통상적으로 생쥐에서 덜 면역원성이다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "중쇄부"는 면역글로불린 중쇄로부터 유래되는 아미노산 서열을 포함한다. 중쇄부를 포함하는 폴리펩타이드는 하기 중 하나 이상을 포함한다: CH1 도메인, 힌지 (예를 들어, 상위, 중위 및/또는 하위 힌지 영역) 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인, 또는 이의 변이체 또는 단편. 예를 들어, 본 발명에 사용하기 위한 결합 폴리펩타이드는 CH1 도메인을 포함하는 폴리펩타이드 쇄; CH1 도메인, 힌지 도메인의 적어도 일부, 및 CH2 도메인을 포함하는 폴리펩타이드 쇄; CH1 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩타이드 쇄; CH1 도메인, 힌지 도메인의 적어도 일부, 및 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩타이드 쇄, 또는 CH1 도메인, 힌지 도메인의 적어도 일부, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩타이드 쇄를 포함할 수 있다. 또 다른 양태에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩타이드 쇄를 포함한다. 또한, 본 발명에 사용하기 위한 결합 폴리펩타이드는 CH2 도메인의 적어도 일부 (예를 들어, CH2 도메인의 전부 또는 일부)가 결여될 수 있다. 상기 기술된 바와 같이, 이들 도메인 (예를 들어, 중쇄부)이 천연 발생 면역글로불린 분자와 아미노산 서열이 상이하도록 변형될 수 있음이 당업자에게는 자명할 것이다.
본원에서 기술되는 특정 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체에서, 멀티머 중 하나의 폴리펩타이드 쇄의 중쇄부는 멀티머의 제2 폴리펩타이드 쇄의 중쇄부와 동일하다. 대안적으로, 본 발명의 중쇄부-포함 단량체들은 동일하지 않다. 예를 들어, 각 단량체는, 예를 들어 이중특이적 (bispecific) 항체 또는 디아바디 (diabody)를 형성하는 상이한 표적 결합 부위를 포함할 수 있다.
또 다른 양태에서, 본원에서 기술되는 항체, 또는 항원-결합 단편, 변이체 또는 이의 유도체는 폴리펩타이드 단쇄, 예를 들어 scFv로 구성되며, 잠재적인 생체내 치료 및 진단 적용을 위해 세포내적으로 (인트라바디: intrabody) 발현될 수 있다.
본원에서 기술되는 진단 및 치료 방법에 사용하기 위한 결합 폴리펩타이드의 중쇄부는 상이한 면역글로불린 분자로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩타이드의 중쇄부는 IgG1 분자로부터 유래되는 CH1 도메인 및 IgG3 분자로부터 유래되는 힌지 영역을 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 중쇄부는 부분적으로는 IgG1 분자 및 부분적으로는 IgG3 분자로부터 유래되는 힌지 영역을 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 중쇄부는 부분적으로는 IgG1 분자 및 부분적으로는 IgG4 분자로부터 유래되는 키메라 힌지를 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "경쇄부"는 면역글로불린 경쇄로부터 유래되는 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, 경쇄부는 VL 또는 CL 도메인중 하나 이상을 포함한다.
항체에 대한 펩타이드 또는 폴리펩타이드 에피토프의 최소 크기는 약 4 내지 5개 아미노산인 것으로 여겨진다. 펩타이드 또는 폴리펩타이드 에피토프는 바람직하게는, 적어도 7개, 더욱 바람직하게는, 적어도 9개, 가장 바람직하게는, 적어도 약 15 내지 약 30개 아미노산을 포함한다. CDR이 3차 형태의 항원 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 인식할 수 있기 때문에, 에피토프를 포함하는 아미노산은 연속성일 필요가 없으며, 일부 경우에, 동일한 펩타이드 쇄에 존재하지 않을 수도 있다. 본 발명에서, 본 발명의 항체에 의해 인식되는 펩타이드 또는 폴리펩타이드 에피토프는 α-시누클레인의 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 더욱 바람직하게는, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 15개, 적어도 20개, 적어도 25개 또는 약 15개 내지 약 30개의 연속 또는 비연속 아미노산 서열을 포함한다.
본원에서 상호교환적으로 사용되는 "특이적으로 결합하는", 또는 "특이적으로 인식하는"은 일반적으로 결합 분자, 예를 들어 항체가 이의 항원-결합 도메인을 통해 에피토프에 결합하며, 결합이 항원-결합 도메인과 에피토프 간에 다소의 상보성을 수반한다는 것을 의미한다. 이러한 정의에 따르면, 항체가 이의 항원-결합 도메인을 통해 무작위의 비관련된 에피토프로 결합하는 것보다 더욱 용이하게 에피토프에 결합하는 경우, 항체는 에피토프에 "특이적으로 결합한다"고 한다. 용어 "특이성"은 본원에서 특정 항체가 특정 에피토프에 결합하는 상대적 친화도를 정성화하는데 사용된다. 예를 들어, 항체 "A"는 항체 "B" 보다 주어진 에피토프에 대한 더 높은 특이성을 갖는 것으로 간주될 수 있거나, 항체 "A"는 관련된 에피토프 "D"에서 보다 더 높은 특이성으로 에피토프 "C"에 결합하는 것으로 표현될 수 있다.
존재하는 경우, 용어 "면역학적 결합 특성" 또는 항체의 항원과의 다른 결합 특성은, 이의 문법상의 형태 모두에서, 특이성, 친화성, 교차-반응성 및 항체의 기타 결합 특성을 언급한다.
"우선적으로 결합하는"은 결합 분자, 예를 들어 항체가 관련된 유사한 상동성 또는 동족체성 에피토프에 결합하는 것보다 더욱 용이하게 에피토프에 결합함을 의미한다. 따라서, 소정의 에피토프에 "우선적으로 결합하는" 항체는 이러한 항체가 관련된 에피토프와 교차반응할 수 있음에도 불구하고 관련된 에피토프 보다 소정의 에피토프에 더 잘 결합할 것이다.
무제한적 예로서, 결합 분자, 예를 들어 항체가 제2 에피토프에 대한 항체의 해리 상수 (KD) 보다 낮은 KD로 제1 에피토프에 결합하는 경우, 항체가 제1 에피토프에 우선적으로 결합하는 것으로 간주될 수 있다. 또 다른 무제한적 예에서, 항체가 제2 에피토프에 대한 항체의 KD 보다 한 자릿수 이상 낮은 정도의 친화도로 제1 에피토프에 결합하는 경우, 항체는 제1 항원에 우선적으로 결합하는 것으로 간주될 수 있다. 또 다른 무제한적 예에서, 항체가 제2 에피토프에 대한 항체의 KD 보다 두 자릿수 이상 낮은 정도의 친화도로 제1 에피토프에 결합하는 경우, 항체는 제1 항원에 우선적으로 결합하는 것으로 간주될 수 있다.
또 다른 무제한적 예에서, 결합 분자, 예를 들어 항체가 제2 에피토프에 대한 항체의 오프율 (k(off)) 보다 낮은 오프율로 제 1 에피토프에 결합하는 경우, 항체는 제1 에피토프에 우선적으로 결합하는 것으로 간주될 수 있다. 또 다른 무제한적 예에서, 항체가 제2 에피토프에 대해 항체의 k(off) 보다 한 자릿수 이상 낮은 정도의 친화도로 제1 에피토프에 결합하는 경우 제1 에피토프에 우선적으로 결합하는 것으로 간주될 수 있다. 또 다른 무제한적 예에서, 항체가 제2 에피토프에 대해 항체의 k(off) 보다 두 자릿수 이상 낮은 정도의 친화도로 제1 에피토프에 결합하는 경우 제1 에피토프에 우선적으로 결합하는 것으로 간주될 수 있다.
결합 분자, 예를 들어 본원에서 기술되는 항체 또는 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 5 X 10-2 sec-1, 10-2 sec-1, 5 X 10-3 sec-1 또는 10-3 sec-1 이하의 오프율 (k(off))로 α-시누클레인 또는 이의 단편 또는 변이체에 결합할 수 있다. 더욱 바람직하게는, 본 발명의 항체는 5 X 10-4 sec-1, 10-4 sec-1, 5 X 10-5 sec-1, 또는 10-5 sec-1 5 X 10-6 sec-1, 10-6 sec-1, 5 X 10-7 sec-1 또는 10-7 sec-1 이하의 오프율 (off rate: k(off))로 α-시누클레인 또는 이의 단편 또는 변이체에 결합할 수 있다.
결합 분자, 예를 들어 본원에서 기술되는 항체 또는 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체는 103 M-1 sec-1, 5 X 103 M-1 sec-1, 104 M-1 sec-1 또는 5 X 104 M-1 sec-1 이상의 온율 (k(on))로 α-시누클레인 또는 이의 단편 또는 변이체에 결합할 수 있다. 더욱 바람직하게는, 본 발명의 항체는 105 M-1 sec-1, 5 X 105 M-1 sec-1, 106 M-1 sec-1, 또는 5 X 106 M-1 sec-1 또는 107 M-1 sec-1 이상의 온율 (on rate: k(on))로 α-시누클레인 또는 이의 단편 또는 변이체에 결합한다고 할 수 있다.
결합 분자, 예를 들어 항체가 기준 항체의 에피토프에 대한 결합을 다소간 차단하는 정도로 에피토프에 우선적으로 결합하는 경우, 주어진 에피토프에 대한 기준 항체의 결합을 경쟁적으로 억제한다고 한다. 경쟁적 억제는, 예를 들어 경쟁 ELISA 검정과 같은 당해 기술 분야의 공지된 방법에 의해 결정될 수 있다. 항체는 소정의 에피토프에 대한 기준 항체의 결합을 90% 이상, 80% 이상, 70% 이상, 60% 이상, 또는 50% 이상으로 경쟁적으로 차단한다고 할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "친화도"는 결합 분자, 예를 들어 면역글로불린 분자의 CDR과 개별 에피토프의 결합 강도의 측정치를 나타낸다. 예를 들어, 문헌 [참조: Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988), pages 27-28]을 참조한다. 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "결합활성 (avidity)"은 면역글로불린 집단과 항원 사이의 복합체의 전체적 안정도를 나타내는 것으로서, 면역글로불린 혼합물과 항원의 작용성 화합 강도를 나타낸다. 예를 들어, 문헌 [참조: Harlow, pages 29-34]을 참조한다. 결합활성은 군집형태의 개별 면역글로불린 분자와 특이적 에피토프와의 친화도 및 또한, 면역글로불린과 항원의 결합가에 관한 것이다. 예를 들어, 이가 모노클로날 항체와 고도의 반복 에피토프 구조를 갖는 항원, 예를 들어 중합체 사이의 상호작용은 높은 결합활성 중 하나일 것이다. 항체의 항원에 대한 친화도 또는 결합활성은 임의의 적합한 방법, 예를 들어 문헌 [참조: Berzofsky et al ., "Antibody-Antigen Interactions" In Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press New York, N Y (1984), Kuby, Janis Immunology, W. H. Freeman and Company New York, N Y (1992)] 의 방법 및 이에 기술된 방법을 이용하여 실험적으로 결정될 수 있다. 항체의 항원에 대한 친화도를 측정하는 일반적인 기술은 ELISA RIA 및 표면 플라스몬 공명을 포함한다. 특정 항체-항원 상호작용에 대한 측정된 친화도는, 상이한 조건, 예를 들어 염 농도, pH 하에서 측정되는 경우, 다양할 수 있다. 따라서, 친화도 및 기타 항원-결합 변수, 예를 들어 KD, IC50의 측정은 바람직하게는 항체 및 항원의 표준화 용액 및 표준화 완충액으로 수행된다.
결합 분자, 예를 들어 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체는 또한 이들의 교차-반응성에 대해 기술되거나 구체화될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "교차-반응성"은 하나의 항원에 특이적인 항체의 제2 항원과의 반응 능력을 나타내며; 2개의 상이한 항원 물질 사이의 관련성의 측정치이다. 따라서, 항체는 이의 형성을 유도하는 것 이외의 에피토프에 결합하는 경우 교차 반응성이 있다. 교차 반응성 에피토프는 일반적으로 유도성 에피토프와 많은 동일한 상보적인 구조적 특징을 포함하며, 일부 경우에는 원래의 에피토프 보다 실질적으로 더욱 잘 맞을 수 있다.
예를 들어, 특정 항체는 관련되나 동일하지 않은 에피토프, 예를 들어 기준 에피토프와 95% 이상, 90% 이상, 85% 이상, 80% 이상, 75% 이상, 70% 이상, 65% 이상, 60% 이상, 55% 이상 및 50% 이상의 동일성 (당해 기술 분야에 공지되고 본원에 기술된 방법을 이용하여 계산)을 갖는 에피토프에 결합한다는 점에 있어서 어느 정도의 교차 반응성을 갖는다고 할 수 있다. 항체는 이들이 기준 에피토프와 95% 미만, 90% 미만, 85% 미만, 80% 미만, 75% 미만, 70% 미만, 65% 미만, 60% 미만, 55% 미만, 및 50% 미만의 동일성 (당해 기술 분야에 공지되고 본원에 기술된 방법을 이용하여 계산)을 갖는 에피토프에 결합하지 않을 경우 교차-반응성이 없거나 거의 없다고 할 수 있다. 항체는 특정 에피토프의 또 다른 유사체, 오르토로그 (ortholog) 또는 상동체에 결합하지 않는 경우 이러한 에피토프에 대해 "고도로 특이적"인 것으로 간주될 수 있다.
결합 분자, 예를 들어 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체는 α-시누클레인에 대한 이들의 결합 친화도에 대해 기술되고 특정화될 수 있다. 바람직한 결합 친화도는 5 x 10-2 M, 10-2 M, 5 x 10-3 M, 10-3 M, 5 x 10-4 M, 10-4 M, 5 x 10-5 M, 10-5 M, 5 x 10-6 M, 10-6 M, 5 x 10-7 M, 10-7 M, 5 x 10-8 M, 10-8 M, 5 x 10-9 M, 10-9 M, 5 x 10-10 M, 10-10 M, 5 x 10-11 M, 10-11 M, 5 x 10-12 M, 10-12 M, 5 x 10-13 M, 10-13　M, 5 x 10-14 M, 10-14 M, 5 x 10-15 M, 또는 10-15 M 미만의 해리 상수 또는 Kd를 갖는 것을 포함한다.
앞서 나타낸 바와 같이, 다양한 면역글로불린 부류의 불변 영역의 서브유닛 구조 및 3차원 배열은 널리 공지되어 있다. 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "VH 도메인"은 면역글로불린 중쇄의 아미노 말단 가변 도메인을 포함하며, 용어 "CH1 도메인"은 면역글로불린 중쇄의 제1 (대부분 아미노 말단) 불변 영역을 포함한다. CH1 도메인은 VH 도메인에 인접하고, 면역글로불린 중쇄 분자의 힌지 영역에 대한 아미노 말단이다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "CH2 도메인"은, 통상적인 넘버링 설계를 이용할 때, 예를 들어 항체의 잔기 약 244부터 360까지의 중쇄 분자의 부분을 포함한다 (잔기 244 내지 360, 카뱃 넘버링 시스템; 및 잔기 231-340, EU 넘버링 시스템; 문헌 [Kabat EA et al. 상기 참조]을 참조). CH2 도메인은 다른 도메인과 밀접하게 쌍을 이루지 않는다는 점에서 독특하다. 오히려, 2개의 N-연결된 분지된 탄수화물 쇄가 온전한 고유 IgG 분자의 2개의 CH2 도메인 사이에 개입된다. 또한, CH3 도메인은 CH2 도메인에서 IgG 분자의 C-말단으로 연장되어 있으며, 약 108개 잔기를 포함한다는 것이 잘 입증되어 있다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "힌지 영역"은 CH1 도메인을 CH2 도메인에 결합시키는 중쇄 분자의 부분을 포함한다. 이러한 힌지 영역은 약 25개 잔기를 포함하며, 유연성이 있어 2개의 N-말단 항원-결합 영역이 독립적으로 움직일 수 있게 한다. 힌지 영역은 3개의 구분된 도메인으로 다시 나누어질 수 있다: 상위, 중위 및 하위 힌지 도메인 [참조: Roux et al ., J. Immunol. 161 (1998), 4083].
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "디설파이드 결합"은 2개의 황 원자 사이에 형성되는 공유 결합을 포함한다. 아미노산 시스테인은 디설파이드 결합을 형성할 수 있거나 2개의 티올 기를 가교할 수 있는 티올 기를 포함한다. 대부분의 천연 발생 IgG 분자에서, CH1 및 CL 영역은 디설파이드 결합에 의해 연결되고, 2개의 중쇄는 카뱃 넘버링 시스템을 이용하여 239 및 242 (EU 넘버링 시스템을 이용시 226 또는 229)에 상응하는 위치에서 2개의 디설파이드 결합에 의해 연결된다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "연결된", "융합된" 또는 "융합"은 상호교환적으로 사용된다. 이들 용어는 화학적 컨쥬게이션 또는 재조합 수단을 포함하는 임의의 수단에 의해서 2개 이상의 인자 또는 성분이 함께 연합됨을 의미한다. "인-프레임 융합"은 최초의 ORF의 정확한 해독 판독 프레임을 유지하는 방식으로 연속성의 더욱 긴 ORF을 형성하도록 2개 이상의 폴리뉴클레오타이드 개방 판독 프레임 (ORF)을 연결하는 것을 나타낸다. 따라서, 재조합 융합 단백질은 최초의 ORF에 의해 암호화되는 폴리펩타이드에 상응하는 2개 이상의 절편을 포함하는 단일 단백질이다 (이들 절편들은 자연적으로는 이렇게 정상적으로 연결되지 않는다). 판독 프레임은 융합된 절편을 통해 연속적이게 되지만, 절편들은, 예를 들어 인-프레임 링커 서열에 의해 물리적으로 또는 공간적으로 분리될 수 있다. 예를 들어, 면역글로불린 가변 영역의 CDR을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 인-프레임 융합될 수 있으나, "융합된" CDR이 연속 폴리펩타이드의 부분으로 공동-해독되는 한, 하나 이상의 면역글로불린 프레임웍 영역 또는 추가적인 CDR 영역을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 의해 분리된다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "발현"은 유전자가 생화학물, 예를 들어 RNA 또는 폴리펩타이드를 생성하는 과정을 의미한다. 이러한 과정은 무제한적으로 유전자 넉다운 및 일시적 발현과 안정적 발현 모두를 포함하여 세포 내에서 유전자의 작용성 존재에 대한 임의의 표현을 포함한다. 이는 무제한적으로 유전자의 메신저 RNA (mRNA), 트랜스퍼 RNA (tRNA), 작은 헤어핀 RNA (shRNA), 작은 간섭 RNA (siRNA) 또는 기타 RNA 생성물, 및 이러한 mRNA의 폴리펩타이드(들)로의 해독을 포함한다. 최종 목적하는 생성물이 생화학물인 경우, 발현은 이러한 생화학물 및 임의의 전구체의 생성을 포함한다. 유전자의 발현은 "유전자 생성물"을 생성시킨다. 본원에서 사용되는 바와 같은 유전자 생성물은 핵산, 예를 들어 유전자 전사에 의해 생성되는 메신저 RNA, 또는 전사체로부터 해독되는 폴리펩타이드일 수 있다. 본원에서 기술되는 유전자 생성물은 추가로, 예를 들어 폴리아데닐화와 같은 전사후 변형된 핵산, 또는, 예를 들어 메틸화, 글리코실화, 지질 첨가, 다른 단백질 서브유닛과의 화합, 단백질분해 절단 등과 같은 해독후 변형된 폴리펩타이드를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "샘플"은 피험자 또는 환자로부터 수득되는 임의의 생물학적 물질을 언급한다. 하나의 양상으로, 샘플은 혈액, 뇌척수액 ("CSF") 또는 소변을 포함할 수 있다. 다른 양상으로, 샘플은 전혈, 혈장, 혈액 샘플로부터 농축된 B 세포 및 배양된 세포 (예를 들어, 피험자로부터의 B 세포)를 포함할 수 있다. 샘플은 또한 생검 또는 신경 조직을 포함하는 조직 샘플을 포함할 수 있다. 또 다른 양상으로, 샘플은 전체 세포 및/또는 세포의 용해물을 포함할 수 있다. 혈액 샘플은 당해 기술 분야에 공지된 방법으로 수집될 수 있다. 하나의 양상으로, 펠렛은 200 μl 완충액 (20 mM Tris, pH. 7.5, 0.5% Nonidet, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 0.1M NaCl, IX 시그나 프로테아제 억제제, 및 IX 시그마 포스파타제 억제제 1 및 2) 중에서 4℃에서 와동시킴으로써 재현탁될 수 있다. 현탁물은 간헐적 와동과 함께 20분 동안 얼음에 둘 수 있다. 약 4℃에서 5분 동안 15,000 xg로 회전시킨 후, 상등액의 분취물을 약 -70℃에서 저장할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "치료하는" 또는 "치료"는 치료학적 처치 및 예방학적 또는 예방적 조치 모두를 언급하며, 이때 목적은 원하지 않는 생리학적 변화 또는 장애, 예를 들어 파킨슨증을 예방하거나 저하 (감소)시키는 것이다. 유리하거나 목적하는 임상 결과는 무제한적으로 검출가능한지의 여부에 상관없이 증상의 경감, 질환 정도의 저하, 질환의 안정화된 (즉, 악화되지 않은) 상태, 질환 진행의 지연 또는 저속화, 질환 상태의 개선 또는 완화, 및 진정 (부분적이든 전체적이든)을 포함한다. "치료"는 치료를 받지 않을 경우 예상되는 생존과 비교하여 연장된 생존을 갖는 것을 의미할 수 있다. 치료를 필요로 하는 대상은 질병 또는 장애를 갖고 있는 대상 및 질병 또는 장애에 걸리기 쉬운 대상 또는 질병 또는 장애의 소견이 억제된 대상을 포함한다.
"피검자" 또는 "개체" 또는 "동물" 또는 "환자" 또는 "포유동물"은 진단, 예후, 예방 또는 치료가 요망되는 임의의 피검자, 특히 포유동물 피검자, 예를 들어 인간 환자를 의미한다.
II . 항체
일반적으로, 본 발명은 바람직하게는 실시예에서 예시되는 항체에 대해 개요되는 바와 같은 면역학적 결합 특성 및/또는 생물학적 특성을 나타내는 인간 항-α-시누클레인 항체 및 이의 항원-결합 단편에 관한 것이다. 본 발명에 따라, α-시누클레인에 특이적인 인간 모노클로날 항체는 나이든 피험자의 풀로부터 클로닝되었다.
본 발명에 따라 수행된 실험 과정에서, 초기 시도는 α-시누클레인 특이적 항체를 클로닝하는데 실패하였으며 거의 항상 가성-양성 클론을 생성하였다. 이들 클론에 대한 추가의 연구 결과, 클론들이 대장균의 단백질을 인식하는 항체를 생성하는 것으로 나타났다. 이러한 문제를 회피하기 위해 인간 기억 B 세포 배양물의 조건 조절된 배지 중의 항체를 코팅된 전체-길이 알파 시누클레인 단량체에 대한 결합 및 대장균 단백질 및 소 혈청 알부민 (BSA)에 대한 결합의 부재에 대해 동시에 스크리닝하였다. 특히, B 세포 조건 조절된 배지를 α-시누클레인 결합 인간 항체를 스크리닝하기 위한 ELISA 검정을 수행 전에 대장균 단백질로 사전흡수시켰다.
특이 항체를 분리하기 위한 초기 시도는, 순환하는 α-시누클레인 항체 혈장의 증가된 수준을 제시하는 것으로서, α-시누클레인에 대해 높은 혈장 결합 활성을 갖는 인간 피험자의 풀에 초점을 맞추었다. 예기치 않게도, 이러한 시도는 α-시누클레인 특이적 인간 기억 B 세포를 생성하는데 실패하였으며, 본 발명에 기술된 항체는 α-시누클레인에 대해 낮은 혈장 반응성을 갖는 피험자의 풀로부터 분리되었다.
이러한 척도에 기인하여, 수개의 항체가 분리될 수 있었다. 선별된 항체는 부류 및 경쇄 하위부류 결정을 위해 추가로 분석하였다. 이어서, 기억 B 세포 배양물로부터의 선별된 관련 항체를 RT-PCR로 전사시키고, 클로닝하고, 재조합 생성을 위한 발현 벡터에 조합하였다; 첨부된 실시예를 참조한다. HEK293 또는 CHO 세포에서 인간 항체의 재조합 발현 및 웨스턴 블롯 (도 4)에서의 전체 길이 α-시누클레인 및 이의 절두 형태 (도 2) 및 β- 및 γ-시누클레인 (도 3)에 대한 결합 특이성의 특징분석에 의해, 처음으로 α-시누클레인에 대해 고도로 특이적이고 α-시누클레인 단백질 내의 상이한 에피토프를 인식하는 인간 항체가 클로닝되었다는 것이 확인되었다.
따라서, 본 발명은 일반적으로 분리된 천연 발생 인간 모노클로날 항-α-시누클레인 항체 및 이의 결합 단편, 유도체 및 변이체에 관한 것이다. 실시예 및 도 3에서 입증되는 바와 같이, 본 발명의 인간 모노클로날 항-α-시누클레인 항체는 바람직하게는 β-시누클레인 및 γ-시누클레인과 비교하여 α-시누클레인을 특이적으로 결합하는 것으로 특징지어진다. 유리하게는, 이 항체는 고유한 단량체 형태 및/또는 올리고머 또는 응집 형태의 α-시누클레인을 특이적으로 결합할 수 있다. 또한, 본 발명의 인간 항-α-시누클레인 항체는 웨스턴 블롯팅에서 α-시누클레인을 인식하는 능력에 의해 더욱 특징지어진다; 도 4를 참조한다.
일 양태에서, 본 발명은 NI-202.3G12, NI-202.12F4 또는 NI-202.3D8로 이루어진 그룹에서 선택되는 기준 (reference) 항체와 동일한 α-시누클레인의 에피토프를 특이적으로 결합하는 항-α-시누클레인 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체에 관한 것이다. 실시예에서 설명되는 바와 같이, 항체 NI-202.3G12는 직접적 ELISA 검정에서 야생형 (wt) α-시누클레인은 결합하나 α-시누클레인 절두물에 대해서는 결합하지 않으며, 이는 NI-202.3G12에 대한 구조적 에피토프를 가리키는 것이다; 도 2A를 참조한다. 이와는 대조적으로, 항체 NI-202.12F4는 직접적 ELISA 검정에서 N-말단 양친매성 반복 영역 (아미노산 1-60)을 포함하는 α-시누클레인 절두물을 결합하며, 이는 NI-202.12F4에 대한 N-말단 에피토프를 가리키는 것이다; 도 2B를 참조한다. 또한, 항체 NI-202.3D8로 수행된 직접적 ELISA 검정의 예비 결과는 NI-202.3D8이 α-시누클레인의 C-말단, 바람직하게는 아미노산 96-140을 특이적으로 인식한다는 것을 나타내었다. 또한, 초기의 실험 관측에 구속됨이 없이, 추가의 예비 실험은 항체 NI-202.3D8은 직접적 ELISA 항체 검정에서 피브릴보다는 α-시누클레인 단량체를 우선적으로 결합하고, 항체 NI-202.12F4 및 NI-202.3G12는 단량체 형태의 α-시누클레인에 비해 α-시누클레인 응집체 또는 피브릴을 우선적으로 결합한다는 것을 추정하게 한다. 따라서, 본 발명은 상이한 특이성을 갖는 일 세트의 인간 항-α-시누클레인 항체를 제공하며, 이는 특히 진단 및 치료 목적에 유용하다.
일 양태에서, 본 발명의 항체는 실시예 1 내지 5 중 어느 하나에서 기술되는 바와 같이 예시적인 NI-202.12F4 항체의 결합 특성을 나타낸다. 예를 들어, 일 양태에서, 본 발명의 항-α-시누클레인 항체는, 특히 실시예 3에 따라 분석하는 경우, 생쥐 α-시누클레인보다는 인간 α-시누클레인을 우선적으로 인식한다. 추가로 또는 대안적으로, 본 발명의 항-α-시누클레인 항체는, 특히 실시예 3에 따라 분석하는 경우, 생리학적 단량체 형태보다는 응집되거나 미스폴딩된 형태의 α-시누클레인을 우선적으로 인식한다. 추가로 또는 대안적으로, 본 발명의 항-α-시누클레인 항체는 인간 α-시누클레인에 대한 질환 유발 돌연변이체, 특히 실시예 3에 기술된 것들에 결합한다. 이와 관련하여, 결합 특이성은 도 5의 예시적 NI-202.12F4 항체에 대해 제시되는 바와 같은 범위, 즉 약 100 내지 1000 pM의 1/2 최대 유효 농도 (EC50), 바람직하게는 야생형 α-시누클레인 또는 이의 질환 유발 돌연변이체에 대해 약 100 내지 500 pM의 EC50을 가질 수 있다.
따라서, 본 발명의 항-α-시누클레인 항체는 바람직하게는 뇌에서의 병적 형태의 α-시누클레인, 예를 들어 웨스턴 블롯 및 면역조직화학 염색 (실시예 3)으로 예시되는 바와 같은 α-시누클레인의 병적 응집체에 우선적으로 결합한다. 따라서, 또 다른 추가 또는 다른 양태에서, 본 발명의 항-α-시누클레인 항체는 인간 α-시누클레인의 구조적 에피토프에는 결합하나 아미노산 1-20; 21-40; 41-60; 11-30; 또는 31-50으로 구성된 α-시누클레인의 N-말단 유도된 단편에는 유의하게 결합하지 않는다.
또한, 본 발명은 NI-202.3G12, NI-202.12F4 또는 NI-202.3D8로 이루어진 그룹에서 선택되는 항체의 항원-결합 도메인과 동일한 항원-결합 도메인을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 가변 영역, 예를 들어 결합 도메인에 도 1에 도시되는 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하는 VH 및/또는 VL 가변 영역의 적어도 하나의 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함하는 것으로 특징지어질 수 있는 수개의 이러한 결합 분자, 예를 들어 항체 및 이의 결합 단편을 예시한다. 상기 확인된 가변 영역을 암호화하는 상응하는 뉴클레오타이드 서열이 첨부된 서열 목록에 제시된다. 또한, 도 1에 도시되는 바와 같은 VH 및/또는 VL 영역의 아미노산 서열에 대한 예시적 세트의 CDR이 첨부된 서열 목록에 제시된다. 그러나, 하기에서 논의되는 바와 같이, 당업자는 아미노산 서열에서 도 1에 제시된 CDR과 1개, 2개, 3개 또는 CDR2 및 CDR3의 경우 심지어 그 이상의 아미노산이 상이한 CDR에 추가로 또는 대안적으로 사용될 수 있다는 것을 잘 알고 있다.
일 양태에서, 본 발명의 항체는 도 1에 도시되는 바와 같은 VH 및/또는 VL 영역의 아미노산 서열을 포함하는 항체 중 어느 하나이다. 대안적으로, 본 발명의 항체는 도 1에 도시되는 바와 같은 VH 및/또는 VL 영역을 갖는 항체 중 적어도 하나와 α-시누클레인에 대한 결합에 대해 경쟁하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 유도체 또는 변이체이다. 이들 항체는 또한 특히 치료 적용을 위한 인간 항체일 수 있다. 대안적으로, 이 항체는 동물에서의 진단 방법 및 조사에 특히 유용한 뮤린, 뮤린화된 및 키메라 뮤린-인간 항체이다.
상술된 바와 같이, 인간 면역 반응에 대한 이의 생성에 기인하여, 본 발명의 인간 모노클로날 항체는 특정한 생리학적 관련 에피토프를 인식하고, 각각 예를 들어 생쥐 모노클로날 항체의 생성을 위한 면역화 과정의 경우 및 파아지 디스플레이 라이브러리의 시험관내 스크리닝에서는 영향을 받기 쉽지 않거나 낮은 면역원성일 수 있는 에피토프를 인식할 것이다. 따라서, 본 발명의 인간 항-α-시누클레인 항체의 에피토프가 독특하며 본 발명의 인간 모노클로날 항체에 의해 인식되는 에피토프에 결합할 수 있는 다른 항체가 존재하지 않는다는 것을 신중히 규정한다. 따라서, 본 발명은 또한 일반적으로 α-시누클레인에 대한 특이적 결합에 대해 본 발명의 인간 모노클로날 항체와 경쟁하는 항-α-시누클레인 항체 및 α-시누클레인 결합 분자로 확장된다. 본 발명은 보다 특히 NI-202.3G12, NI-202.12F4 또는 NI-202.3D8로 이루어진 그룹에서 선택되는 기준 항체와 동일한 α-시누클레인 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체에 관한 것이다.
항체 간의 경쟁은 시험 하에 있는 면역글로불린이 공통 항원, 예를 들어 α-시누클레인에 대해 기준 항체의 특이적 결합을 억제하는 검정으로 측정된다. 다수 유형의 경쟁적 결합 검정, 예를 들어 고체상 직접 또는 간접 방사성면역검정 (RIA), 고체상 직접적 또는 간접적 효소 면역검정 (EIA), 샌드위치 경쟁 검정 [참조: Stahli et al., Methods in Enzymology 9 (1983), 242-253]; 고체상 직접적 바이오틴-아비딘 EIA [참조: Kirkland et al ., J. Immunol. 137 (1986), 3614-3619; 그리고 Cheung et al., Virology 176 (1990), 546-552]; 고체상 직접 표지 검정, 고체상 직접 표지 샌드위치 검정 [참조: Harlow and Lane, 항체, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988)]; I125 표지물을 사용하는 고체상 직접 표지 RIA [참조: Morel et al ., Molec. Immunol. 25 (1988), 7-15; 그리고 Moldenhauer et al ., Scand. J. Immunol. 32 (1990), 77-82]가 공지되어 있다. 전형적으로, 이러한 검정은 고체 표면 또는 세포에 결합된 정제된 α-시누클레인 또는 이의 응집체 또는 이들 중 어느 하나를 갖는 세포, 비표지된 시험 면역글로불린 및 표지된 기준 면역글로불린, 즉 본 발명의 인간 모노클로날 항체의 사용을 포함한다. 경쟁적 억제는 시험 면역글로불린의 존재 하에서 고체 표면 또는 세포에 결합된 표지물의 양을 결정함으로써 측정된다. 통상적으로, 시험 면역글로불린은 과량으로 존재한다. 바람직하게는, 경쟁적 결합 검정은 첨부된 실시예에서 ELISA 검정에 대해 기술되는 바와 같은 조건 하에 수행된다. 경쟁적 검정에 의해 확인되는 항체 (경쟁 항체)는 기준 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체 및 입체 방해가 일어나는 기준 항체에 의해 결합되는 에피토프에 충분히 근접한 인접 에피토프에 결합하는 항체를 포함한다. 통상적으로, 경쟁 항체가 과량으로 존재하는 경우, 이는 공통 항원에 대한 기준 항체의 특이적 결합을 적어도 50% 또는 75% 억제할 것이다. 따라서, 본 발명은 또한 NI-202.3G12, NI-202.12F4 또는 NI-202.3D8로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 기준 항체의 α-시누클레인에 대한 결합을 경쟁적으로 억제하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체에 관한 것이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 면역글로불린 중쇄 가변 영역 (VH)을 포함하거나 이로 본질적으로 구성되거나 이로 구성되는 분리된 폴리펩타이드를 제공하며, 여기서 중쇄 가변 영역의 VH-CDR 중 하나 이상 또는 중쇄 가변 영역의 VH-CDR 중 2개 이상은 본원에 기술된 항체로부터의 기준 중쇄 VH-CDR1, VH-CDR2 또는 VH-CDR3 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일하다. 대안적으로, VH의 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3 영역은 본원에 기술된 항체로부터의 기준 중쇄 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일하다. 따라서, 이러한 양태에 따르면, 본 발명의 중쇄 가변 영역은 도 1에 기술된 그룹과 관련된 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3 폴리펩타이드 서열을 갖는다. 도 1은 카뱃 시스템에 의해 규정된 VH-CDR을 나타내지만, 다른 CDR 규정법, 예를 들어 초티아 시스템 (Chothia system)에 의해 규정된 VH -CDR이 또한 본 발명에 포함되며, 도 1에 제시된 데이터를 사용하여 당업자에 의해 용이하게 확인될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3 영역이 도 1에 제시된 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3 그룹과 동일한 폴리펩타이드 서열을 갖는 면역글로불린 중쇄 가변 영역 (VH)을 포함하거나 이로 본질적으로 구성되거나 이로 구성되는 분리된 폴리펩타이드를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3 영역이 어느 하나의 VH-CDR에서의 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개 아미노산 치환을 제외하고는 도 1에 기재된 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3 그룹과 동일한 폴리펩타이드 서열을 갖는 면역글로불린 중쇄 가변 영역 (VH)을 포함하거나 이로 본질적으로 구성되거나 이로 구성되는 분리된 폴리펩타이드를 제공한다. 특정 양태에서, 아미노산 치환체는 보존적이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 경쇄 가변 영역의 VL-CDR 중 하나 이상 또는 경쇄 가변 영역의 VL-CDR 중 2개 이상이 본원에 기술된 항체로부터의 기준 경쇄 VL-CDR1, VL-CDR2 또는 VL-CDR3 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 면역글로불린 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하거나 이로 본질적으로 구성되거나 이로 구성되는 분리된 폴리펩타이드를 제공한다. 대안적으로, VL의 VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3는 본원에 기재된 항체로부터의 기준 경쇄 VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일하다. 따라서, 본 양태에 있어서, 본 발명의 경쇄 가변 영역은 도 1에 기재된 폴리펩타이드와 관련된 VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3 폴리펩타이드 서열을 갖는다. 도 1은 카뱃 시스템에 의해 규정된 VL-CDR을 나타내지만, 다른 CDR 규정법, 예를 들어 초티아 시스템에 의해 규정된 VL-CDR도 본 발명에 포함된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3 영역이 도 1에 제시된 VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3 그룹과 동일한 폴리펩타이드 서열을 갖는 면역글로불린 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하거나 이로 본질적으로 구성되거나 이로 구성되는 분리된 폴리펩타이드를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3 영역이 어느 하나의 VL-CDR에서의 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개 아미노산 치환을 제외하고는 도 1에 기재된 VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3 그룹과 동일한 폴리펩타이드 서열을 갖는 면역글로불린 중쇄 가변 영역 (VL)을 포함하거나 이로 본질적으로 구성되거나 이로 구성되는 분리된 폴리펩타이드를 제공한다. 특정 양태에서, 아미노산 치환은 보존적이다.
면역글로불린 또는 이의 암호화 cDNA는 추가로 변형될 수 있다. 따라서, 추가의 양태에서, 본 발명의 방법은 키메라 항체, 뮤린화된 항체, 단쇄 항체, Fab-단편, 이중-특이적 항체, 융합 항체, 표지된 항체 또는 이들 중 어느 하나의 동족체를 생성하는 단계(들)중 어느 하나를 포함한다. 상응하는 방법은 당업자에게 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌 [참조: Harlow and Lane "Antibodies, A Laboratory Manual", CSH Press, Cold Spring Harbor, 1988]에 기술되어 있다. 상기 항체의 유도체가 파아지 디스플레이 기법에 의해 수득되는 경우, BIAcore 시스템에 사용되는 바와 같은 표면 플라즈몬 공명이 사용되어 본원에 기술된 항체 중 어느 하나의 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 파아지 항체의 효율을 증가시키는데 사용될 수 있다 [참조: Schier, Human Antibodies Hybridomas 7 (1996), 97-105; Malmborg, J.Immunol. Methods 183 (1995), 7-13]. 키메라 항체의 생성은, 예를 들어 국제 출원 WO 89/09622에 기술되어 있다. 인간화된 항체의 생성 방법은, 예를 들어 유럽 출원 EP-A1 0 239 400 및 국제 출원 WO90/07861에 기술되어 있다. 본 발명에 따라 사용되는 항체의 추가의 공급원은 소위 이종 개체 항체이다. 생쥐에서 이종 개체 항체, 예를 들어 인간-유사 항체를 생성하는 일반적 원리는, 예를 들어 국제 출원 WO91/10741, WO94/02602, WO96/34096 및 WO96/33735에 기술되어 있다. 상기 기술된 바와 같이, 본 발명의 항체는 완전한 항체 이외에 다양한 형태로 존재할 수 있으며, 예를 들어 Fv, Fab 및 F(ab)2, 및 단쇄를 포함한다; 예를 들어, 국제 출원 WO88/09344를 참조한다.
본 발명의 항체 또는 이의 상응하는 면역글로불린 쇄(들)는, 예를 들어 당해 분야에서 공지된 아미노산 결실(들), 삽입(들), 치환(들), 첨가(들) 및/또는 재조합(들) 및/또는 임의의 다른 변형을 단독으로 또는 조합하여 사용함으로써 당해 분야에서 공지된 통상적인 기술을 이용하여 추가로 변형될 수 있다. 면역글로불린 쇄의 아미노산 서열의 기초가 되는 DNA 서열에서 이러한 변형을 도입하는 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있다; 예를 들어, 문헌 [참조: Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y.; 그리고 Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1994)]을 참조한다. 본 발명의 항체의 변형은 측쇄 변형, 골격 변형, 및 아세틸화, 하이드록실화, 메틸화, 아미드화, 및 탄수화물 또는 지질 잔기, 보조인자 등의 부착을 포함한 N- 및 C-말단 변형을 포함하는, 하나 이상의 구성 아미노산에서의 화학적 및/또는 효소적 유도체화를 포함한다. 마찬가지로, 본 발명은 카르복실 말단에 있는 면역자극 리간드와 같은 이종 분자에 융합된 아미노 말단에 있는 기술된 항체 또는 이의 일부 단편을 포함하는 키메라 단백질의 생성을 포함한다; 예를 들어, 상응하는 기술적 상세한 내용에 대해 국제 출원 WO 00/30680을 참조한다.
또한, 본 발명은 상술된 결합 분자를 포함하는, 예를 들어 언급된 항체 중 어느 하나의 가변 영역의 CDR3 영역, 특히 중쇄의 CDR3를 포함하는 펩타이드를 포함하는 펩타이드를 포함하는데, 그 이유는 중쇄 CDR3 (HCDR3)이 더욱 높은 정도의 가변도 및 항원-항체 상호작용에서의 두드러진 관여를 갖는 영역인 것으로 빈번하게 관찰되었기 때문이다. 이러한 펩타이드는 본 발명에 따라 유용한 결합제를 생성하기 위한 재조합 수단에 의해 용이하게 합성되거나 생성될 수 있다. 이러한 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 펩타이드는, 예를 들어 시중에서 입수가능한 자동화된 펩타이드 합성기를 사용하여 합성될 수 있다. 또한, 펩타이드는 펩타이드를 발현하는 DNA를 발현 벡터에 삽입하고, 발현 벡터로 세포를 형질전환시켜 펩타이드를 생성하는 재조합 기술에 의해 생성될 수 있다.
따라서, 본 발명은 임의의 결합 분자, 예를 들어 본 발명의 인간 항-α-시누클레인 항체에 적응되고 언급된 특성, 예를 들어 α-시누클레인을 특이적으로 인식하는 특성을 나타내는 항체 또는 이의 결합 단편을 언급한다. 이러한 항체 및 결합 분자는 본원에서 기술되는 바와 같은 ELISA 및 웨스턴 블롯 및 면역조직화학에 의해 결합 특이성 및 친화도를 시험할 수 있으며, 예를 들어 실시예를 참조한다. 또한, 본 발명에 따라 수행되는 후속 실험의 예비 결과에 의해 본 발명의 인간 항-α-시누클레인 항체, 특히 항체 NI-202.12F4가 루이 소체 치매 (DLB) 또는 파킨슨 질환 (PD)을 앓는 환자의 인간 뇌 절편에 존재하는 α-시누클레인 봉입체를 인식한다는 것이 밝혀졌다. 따라서, 본 발명의 특히 바람직한 양태에서, 인간 항체 또는 이의 결합 단편, 유도체 또는 변이체는 인간 DLB 또는 PD 뇌 절편에 있는 α-시누클레인을 인식한다.
불멸화된 B 세포 또는 B 기억 세포의 배양물로부터 직접적으로 면역글로불린을 수득하기 위한 대안으로서, 불멸화된 세포는 후속 발현 및/또는 유전자 조작에 대한 재배열된 중쇄 및 경쇄 유전자 자리의 공급원으로서 사용될 수 있다. 재배열된 항체 유전자는 cDNA를 생성하기 위한 적합한 mRNA로부터 역전사될 수 있다. 필요에 따라, 중쇄 불변 영역은 상이한 이소타입의 영역으로 교환되거나 전체적으로 제거될 수 있다. 가변 영역은 단쇄 Fv 영역을 암호화하도록 연결될 수 있다. 다중 Fv 영역은 하나 초과의 표적물에 대한 결합 능력을 부여하도록 연결될 수 있거나, 키메라 중쇄 및 경쇄 조합물이 사용될 수 있다. 일단 유전자 물질이 사용가능하면, 목적하는 표적물에 결합하는 이들의 능력을 보유하는 상술된 동족체의 설계가 간단해진다. 항체 가변 영역의 클로닝 및 재조합 항체의 생성 방법은 당업자에게 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌 [참조: Gilliland et al., Tissue Antigens 47 (1996), 1-20; Doenecke et al ., Leukemia 11 (1997), 1787-1792]에 기술되어 있다.
일단 적합한 유전자 물질이 수득되고, 필요에 따라 동족체를 암호화하도록 변형되면, 최소한 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 암호화하는 서열을 포함하는 암호화 서열이 표준 재조합 숙주 세포로 트랜스펙션될 수 있는 벡터에 포함되는 발현 시스템으로 삽입될 수 있다. 다양한 이러한 숙주 세포가 사용될 수 있으나, 효과적인 프로세싱을 위해 포유동물 세포가 바람직하다. 전형적으로, 이러한 목적에 유용한 포유동물 세포주는 무제한적으로 CHO 세포, HEK 293 세포, 또는 NSO 세포를 포함한다.
항체 또는 동족체의 생성은 숙주 세포의 성장 및 암호화 서열의 발현의 적합한 배양 조건하에서 변형된 재조합 숙주를 배양함으로써 수행된다. 그 후, 항체는 배양물로부터 이를 분리함으로써 회수된다. 발현 시스템은 바람직하게는 생성된 항체가 배지로 분비되도록 신호 펩타이드를 포함하게 디자인되나; 세포내 생성도 가능하다.
상기에 따라, 본 발명은 또한 본 발명의 항원 또는 동등한 결합 분자, 항체의 경우, 바람직하게는, 상기 기술된 항체의 면역글로불린 쇄의 적어도 가변 영역을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 전형적으로, 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되는 상기 가변 영역은 상기 항체의 가변 영역의 VH 및/또는 VL의 하나 이상의 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함한다.
당업자는 상술된 가변 도메인을 갖는 항체의 가변 도메인이 목적하는 특이성 및 생물학적 기능을 가진 다른 폴리펩타이드 또는 항체의 작제에 사용될 수 있음을 용이하게 인지할 수 있을 것이다. 따라서, 본 발명은 또한 상술된 가변 도메인의 하나 이상의 CDR을 포함하며 유리하게는 첨부된 실시예에 기술되는 항체와 실질적으로 동일하거나 유사한 결합 특성을 갖는 항체 및 폴리펩타이드를 포함한다. 당업자는 결합 친화도가 CDR 내에서 또는 카뱃에 의해 규정되는 바와 같은 CDR과 부분적으로 중복되는 과변이 루프 [참조: Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196 (1987), 901-917] 내에서 아미노산을 치환함으로써 향상될 수 있음을 알고 있다; 예를 들어, 문헌 [참조: Riechmann, et al, Nature 332 (1988), 323-327]을 참조한다. 따라서, 본 발명은 또한, 언급된 CDR 중 하나 이상이 하나 이상, 바람직하게는, 2개 이하의 아미노산 치환을 포함하는 항체에 관한 것이다. 바람직하게는, 본 발명의 항체는 이의 면역글로불린 쇄 중 하나 또는 둘 모두에서 도 1에 제시된 바와 같은 가변 영역의 2개 또는 모든 3개의 CDR을 포함한다.
당업자에게 공지된 바와 같이, 결합 분자, 예를 들어 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체는 하나 이상의 효과기 (effector) 작용을 매개하는 불변 영역을 포함할 수 있다. 예를 들어, 보체의 C1 성분의 항체 불변 영역으로의 결합은 보체 시스템을 활성화시킬 수 있다. 보체의 활성화는 세포 병원체의 옵소닌화 및 용균에 중요하다. 보체의 활성화는 또한 염증 반응을 자극하고, 자가면역 과민반응에 관련될 수 있다. 또한, 항체는 Fc 영역을 통해 다양한 세포 상의 수용체와 결합하며, 항체 Fc 영역 상의 Fc 수용체 결합 부위는 세포 상의 Fc 수용체 (FcR)에 결합한다. IgG (감마 수용체), IgE (엡실론 수용체), IgA (알파 수용체) 및 IgM (뮤 수용체)를 포함한 상이한 부류의 항체에 특이적인 많은 Fc 수용체가 있다. 세포 표면상의 Fc 수용체로의 항체의 결합은 항체-피복된 입자의 포식 및 파괴, 면역 복합체의 제거, 킬러 세포 (소위, 항체-의존적 세포 매개된 세포독성, 또는 ADCC)에 의한 항체-코팅된 표적 세포의 분해, 염증 매개체의 방출, 태반 전달 및 면역글로불린 생성의 조절을 포함하는 많은 중요하고 다양한 생물학적 반응을 촉발시킨다.
따라서, 본 발명의 특정 양태는 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체를 포함하며, 여기서 하나 이상의 불변 도메인의 적어도 일부는 저하된 효과기 작용, 비공유적으로 다이머화되는 능력, α-시누클레인 응집 및 침착 부위에 국소화되는 능력의 증가, 저하된 혈청 반감기, 또는 대략 동일한 면역원성을 갖는 전체의 비변형된 항체와 비교시 증가된 혈청 반감기와 같은 목적하는 생화학적 특징을 제공하도록 결실되거나 다르게는 변형된다. 예를 들어, 본원에 기술된 진단 및 치료 방법에 사용하기 위한 특정 항체는 면역글로불린 중쇄와 유사한 폴리펩타이드 쇄를 포함하나, 하나 이상의 중쇄 도메인의 적어도 일부가 결여된 도메인 결실된 항체이다. 예를 들어, 특정 항체에서, 변형된 항체의 불변 영역의 하나의 전체 도메인이 결실될 것이며, 예를 들어 CH2 도메인의 전부 또는 일부가 결실될 것이다. 다른 양태에서, 본원에 기술된 진단 및 치료 방법에 사용하기 위한 특정 항체는 글리코실화가 제거되도록 변화된 불변 영역, 예를 들어 IGg 중쇄 불변 영역을 가지며, 이는 본원에서 아글리코실화된 또는 "agly" 항체로 언급된다. 이러한 "agly" 항체는 불변 영역에서 효소적으로 및 컨센서스 글리코실화 부위(들)를 조작함으로써 제조될 수 있다. 이론에 제한되지 않으면서, "agly" 항체는 생체내에서 증가된 안전성 및 안정성을 가질 수 있는 것으로 여겨진다. 목적하는 효과기 작용을 갖는 아글리코실화된 항체를 생성하는 방법은, 예를 들어 WO 2005/018572 (본원에 전부 첨조로 삽입됨)에서 찾아볼 수 있다.
본원에 기술된 특정 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체에서, Fc 부분은 당해 분야에서 공지된 기술을 이용하여 효과기 작용을 저하시키도록 돌연변이될 수 있다. 예를 들어, (점 돌연변이 또는 다른 수단을 통한) 불변 영역 도메인의 결실 또는 불활성화는 순환하는 변형된 항체의 Fc 수용체 결합을 저하시켜 α-시누클레인 국소화를 증가시킬 수 있다. 다른 경우에, 본 발명에 따르는 불변 영역 변형은 보체 결합을 완화시킴으로써 혈청 반감기 및 컨쥬게이션된 세포독소의 비특이적 결합을 저하시킨다. 불변 영역의 또 다른 변형은 증가된 항원 특이성 또는 항체 유연성으로 인한 증가된 국소화를 가능하게 하는 디설파이드물 결합 또는 올리고사카라이드 잔기를 변화시키는데 이용될 수 있다. 변형으로 인한 생긴 생리학적 프로필, 생체이용성 및 기타 생화학적 효과, 예를 들어 α-시누클레인 국소화, 생물분포 및 혈청 반감기는 과도한 실험 없이 널리 공지된 면역학적 기술을 이용하여 용이하게 측정되고 정량화될 수 있다.
특정 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체에서, Fc 부분은, 예를 들어 Fcγ 수용체, LRP, 또는 Thy1 수용체를 통한 항체의 수용체-매개된 세포내이입을 증진시키거나 항체에 해를 끼치지 않으면서 살아있는 세포로의 항체 셔틀링을 가능하게 한다는 "슈퍼항체 기술"에 의해 항체의 세포 흡수를 증가시키기 위한 대안적 단백질 서열로 돌연변이되거나 교체될 수 있다 [참조: Expert Opin. Biol. Ther. (2005), 237-241]. 예를 들어, 항체 결합 영역과 세포 표면 수용체의 인지체 단백질 리간드의 융합 단백질 생성 또는 세포 표면 수용체뿐만 아니라 α-시누클레인에도 결합하는 특정 서열을 갖는 이중- 또는 다중-특이적 항체의 생성은 당해 분야에서 공지된 기술을 이용하여 조작될 수 있다. 본원에 기술된 특정 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체에서, Fc 부분은 대안적 단백질 서열로 돌연변이 또는 교체될 수 있으며, 또한 항체는 이의 혈관 뇌 장벽 통과 증진을 위해 화학적으로 변형될 수 있다.
본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체의 변형 형태는 당해 분야에서 공지된 기술을 이용하여 전체 전구체 또는 모 항체로부터 제조될 수 있다. 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체는 당해 분야에서 공지된 기술을 이용하여 제조되거나 제작될 수 있다. 특정 양태에서, 항체 분자 또는 이의 단편은 "재조합적으로 생성"되며, 즉, 재조합 DNA 기술을 이용하여 생성된다. 항체 분자 또는 이의 단편을 제조하는 예시적인 기술은 본원의 다른 곳에 더욱 상세히 논의된다.
또한, 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체는, 예를 들어 임의 유형의 분자의 항체로의 공유 부착에 의해 변형된 유도체를 포함하며, 이러한 공유 부착은 항체가 이의 인지체 에피토프에 대해 특이적으로 결합하는 것을 방해하지 않아야 한다. 예를 들어, 무제한적으로, 항체 유도체는, 예를 들어 글리코실화, 아세틸화, 페길화, 포스포릴화, 아미드화, 공지된 보호/차단 그룹에 의한 유도체화, 단백질 분해 절단, 세포 리간드 또는 다른 단백질에의 연결 등에 의해 변형된 항체를 포함한다. 다수의 화학적 변형은, 무제한적으로, 특정 화학 절단, 아세틸화, 포르밀화, 투니카마이신 (tunicamycin)의 대사 합성 등을 포함하는 공지된 기술에 의해 수행될 수 있다. 또한, 유도체는 하나 이상의 비-전형적 아미노산을 포함할 수 있다.
특히 바람직한 양태에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체는 치료할 동물, 예를 들어 인간에서 유해한 면역 반응을 유도하지 않을 것이다. 특정 양태에서, 결합 분자, 예를 들어 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 환자, 예를 들어 인간 환자로부터 유래되며, 후속적으로 이들이 유래되는 동일한 종, 예를 들어 인간에 사용되어, 유해한 면역 반응의 발생을 완화 또는 최소화시킨다.
또한, 탈면역화가 항체의 면역원성을 저하시키는데 이용될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "탈-면역화"는 T-세포 에피토프를 변형시키기 위해 항체를 변화시키는 것을 포함한다; 예를 들어, 국제 출원 WO9852976, WO0034317을 참조한다. 예를 들어, 출발 항체로부터의 VH 및 VL 서열이 분석되며, 각 V 영역으로부터의 인간 T 세포 에피토프 "맵 (map)"은 서열내의 상보성-결정 영역 (CDR) 및 다른 주요 잔기와 관련하여 에피토프의 위치를 나타낸다. T 세포 에피토프 맵으로부터의 개별적인 T 세포 에피토프는 최종 항체의 활성을 변형시킬 위험이 낮은 대안적인 아미노산 치환을 확인하기 위해 분석된다. 아미노산 치환의 조합을 포함하는 대안적인 VH 및 VL 서열의 범위가 디자인되며, 이들 서열은 후속적으로 여러 가지 결합 폴리펩타이드, 예를 들어 본원에 기술된 진단 및 치료 방법에 사용하기 위한 α-시누클레인-특이적 항체 또는 이의 면역특이적 단편에 삽입되고, 기능이 시험된다. 전형적으로, 12개 내지 24개 변이 항체가 생성되고 시험된다. 이어서, 변형된 V 및 인간 C 영역을 포함하는 완전한 중쇄 및 경쇄 유전자가 발현 벡터로 클로닝되고, 후속 플라스미드는 전체 항체의 생성을 위한 세포주로 도입된다. 이어서, 항체는 적합한 생화학 및 생물학적 검정법으로 비교되며, 최적의 변이체가 동정된다.
모노클로날 항체는 하이브리도마, 재조합 및 파아지 디스플레이 기술, 또는 이의 조합을 포함하는 당해 분야에서 공지된 다양한 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 모노클로날 항체는, 예를 들어 문헌 [참조: Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. (1988); Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas Elsevier, N.Y., 563-681 (1981), 전체가 본원에 참조로서 삽입됨]에 교시되고 당해 분야에서 공지된 것을 포함하는 하이브리도마 기술을 이용하여 생성될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "모노클로날 항체"는 하이브리도마 기술로 생성되는 항체로 제한되지 않는다. 용어 "모노클로날 항체"는 임의의 진핵, 원핵 또는 파아지 클론을 포함하는 단일 클론으로부터 유래된 항체를 나타내며, 이것이 생성되는 방법을 나타내는 것은 아니다. 따라서, 용어 "모노클로날 항체"는 하이브리도마 기술을 통해 생성되는 항체에 제한되지 않는다. 특정 양태에서, 본 발명의 항체는 본원에서 기술되는 바와 같은 엡스테인-바르 바이러스로의 형질전환을 통해 불멸화된 인간 B 세포로부터 유래된다.
널리 공지된 하이브리도마 공정 [참조: Kohler et al., Nature 256 (1975), 495]에서, 포유동물로부터의 비교적 짧은 수명의 또는 죽음을 면할 수 없는 림프구, 예를 들어 본원에서 기술되는 바와 같은 인간 피검자로부터 유래된 B 세포는 불멸의 종양 세포주 (예를 들어, 골수종 세포주)와 융합되어, B 세포의 유전적으로 암호화된 항체를 생성할 수 있으며 죽지 않는 하이브리드 세포 또는 "하이브리도마"를 생성한다. 생성된 하이브리드는 선별, 희석, 및 재성장에 의해 단일 유전자 스트레인으로 분리되며 각각의 개별 스트레인은 단일 항체의 형성을 위한 특정 유전자를 포함한다. 이들은 목적하는 항원에 대해 상동성인 항체를 생성하며, 이들의 순수한 유전자 비율 (%)과 관련하여 "모노클로날"로 불린다.
이와 같이 제조된 하이브리도마 세포는 바람직하게는 비융합된 모 골수종 세포의 성장 또는 생존을 억제하는 하나 이상의 물질을 포함하는 적합한 배양 배지에 접종되고 성장된다. 당업자는 하이브리도마의 형성, 선별 및 성장을 위한 시약, 세포주 및 배지가 많은 공급원으로부터 시중에서 입수가능하며, 표준 프로토콜이 널리 성립되어 있음을 인지하고 있을 것이다. 일반적으로, 하이브리도마 세포가 성장하는 배양 배지는 목적하는 항원에 대한 모노클로날 항체의 생성을 위해 분석된다. 하이브리도마 세포에 의해 생성되는 모노클로날 항체의 결합 특이성은 시험관내 검정, 예를 들어 본원에서 기술되는 바와 같은 면역침전, 방사성면역측정 (RIA) 또는 효소-연결된 면역흡착 검정 (ELISA)에 의해 결정된다. 목적하는 특이성, 친화도 및/또는 결합활성의 항체를 생성하는 하이브리도마 세포가 확인된 후, 클론은 희석 공정을 제한함으로써 서브클로닝되고, 표준 방법에 의해 성장시킬 수 있다 [참조: Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, pp 59-103 (1986)]. 또한, 서브클론에 의해 분비되는 모노클로날 항체는 통상적인 정제 방법, 예를 들어 단백질-A, 하이드록시아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화도 크로마토그래피에 의해 배양 배지, 복수액 또는 혈청으로부터 분리될 수 있음을 알 수 있을 것이다.
또 다른 양태에서, 림프구는 극미조작 및 분리된 가변 유전자에 의해 선택될 수 있다. 예를 들어, 말초 혈액 단핵 세포는 면역화된 또는 천연 면역 포유동물, 예를 들어 인간으로부터 분리되고, 시험관내에서 약 7일 동안 배양될 수 있다. 배양물을 스크리닝 기준을 충족시키는 특이적 IgG에 대해 스크리닝될 수 있다. 양성 웰로부터의 세포가 분리될 수 있다. 개별적인 Ig-생성 B 세포는 FACS에 의해 또는 보체-매개된 용혈성 플라크 검정에서 이들을 확인함으로써 분리될 수 있다. Ig-생성 B 세포는 튜브에서 극미조작될 수 있으며, VH 및 VL 유전자는, 예를 들어 RT-PCR을 이용하여 증폭될 수 있다. VH 및 VL 유전자는 항체 발현 벡터로 클로닝되고, 발현을 위한 세포 (예를 들어, 진핵 또는 원핵 세포)로 트랜스펙션될 수 있다.
대안적으로, 항체-생성 세포주가 당업자에게 널리 공지된 기술을 이용하여 선별되고 배양될 수 있다. 이러한 기술은 다양한 실험실 매뉴얼 및 주요 공개문헌에 기술되어 있다. 이러한 점에서, 본 발명에 사용하기에 적합한 기술은 보충물을 포함한 그 전체가 본원에 참조로 삽입되는 문헌 [참조: Current Protocols in Immunology, Coligan et al., Eds., Green Publishing Associates and Wiley-Interscience, John Wiley and Sons, New York (1991)]에 기술되어 있다.
특이적 에피토프를 인식하는 항체 단편은 공지된 기술에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, Fab 및 F(ab')2 단편은 효소, 예를 들어 파파인 (Fab 단편을 생성) 또는 펩신 (F(ab')2 단편을 생성)과 같은 효소를 이용하여 면역글로불린 분자의 단백질분해 절단 또는 재조합에 의해 생성될 수 있다. F(ab')2 단편은 가변 영역, 경쇄 불변 영역 및 중쇄의 CH1 도메인을 포함한다. 이러한 단편은, 예를 들어 방사성동위원소와 같은 시약을 검출하기 위해 면역글로불린의 면역특이적 부분에 커플링하는 것을 포함하는 면역진단 공정에 사용하기에 충분하다.
본원에서 기술되는 바와 같은 완전한 인간 항체는 인간 환자의 치료적 처치에 특히 바람직하다. 본 발명의 인간 항체는, 예를 들어 나이 때문에 장애, 예를 들어 파킨슨 질환을 발병할 위험에 처할 것으로 의심될 수 있는 노령의 피험자 또는 장애는 있지만 비정상적으로 안정한 질환 추이를 갖는 환자로부터 분리된다. 그러나, 비록 신중하게는 노령의 건강한 피험자 및 증상이 없는 피험자가 젊은 피험자보다 보호적 항-α-시누클레인 항체를 생성할 것으로 예상은 되지만, 후자도 또한 본 발명의 인간 항체를 수득하기 위한 공급원으로 사용될 수 있다. 이는 가족성 시누클레인병증을 발병시킬 소인은 있으나 면역계 및 반응이 나이 든 성인에 비해 보다 효과적으로 작용하기 때문에 증상이 없는 젊은 환자에 대해서는 특히 해당된다.
일 양태에서, 본 발명의 항체는 항체 분자의 적어도 하나의 중쇄 또는 경쇄 CDR을 포함한다. 다른 양태에서, 본 발명의 항체는 하나 이상의 항체 분자로부터의 적어도 2개의 CDR을 포함한다. 또 다른 양태에서, 본 발명의 항체는 하나 이상의 항체 분자로부터의 적어도 3개의 CDR을 포함한다. 또 다른 양태에서, 본 발명의 항체는 하나 이상의 항체 분자로부터의 적어도 4개의 CDR을 포함한다. 또 다른 양태에서, 본 발명의 항체는 하나 이상의 항체 분자로부터의 적어도 5개의 CDR을 포함한다. 또 다른 양태에서, 본 발명의 항체는 하나 이상의 항체 분자로부터의 적어도 6개의 CDR을 포함한다. 본 발명의 항체에 포함될 수 있는 하나 이상의 CDR을 포함하는 예시적 항체 분자가 본원에 기술된다.
본 발명의 항체는 항체의 합성을 위한 당해 분야에서 공지된 임의의 방법 특히, 화학 합성법 또는 바람직하게는 본원에서 기술되는 바와 같은 재조합 발현 기술에 의해 생성될 수 있다.
일 양태에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체는 하나 이상의 도메인이 부분적으로 또는 전체적으로 결실된 합성 불변 영역을 포함한다 ("도메인-결실된 항체"). 특정 양태에서, 적합한 변형된 항체는 전체 CH2 도메인이 제거된 도메인 결실된 작제물 또는 변이체를 포함할 것이다 (△CH2 작제물). 다른 양태에 있어서, 짧은 연결 펩타이드가 결실 도메인에 대신 치환되어 가변 영역에 대해 유연성 및 이동의 자유로움을 제공할 수 있다. 당업자는 이러한 작제물이 항체의 이화율에 대한 CH2 도메인의 조절 특성으로 인해 특히 바람직하다는 것을 알고 있을 것이다. 도메인 결실된 작제물은 IgG1 인간 불변 도메인을 암호화하는 벡터를 사용하여 유래될 수 있다; 예를 들어, 국제 출원 WO 02/060955 및 WO02/0906948A2를 참조한다. 이러한 벡터는 CH2 도메인이 결실되고, 도메인 결실된 IgG1 불변 영역을 발현하는 합성 벡터를 제공하도록 조작된다.
특정 양태에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체는 미니바디 (minibody)이다. 미니바디는 당해 분야에 기술된 방법을 이용하여 제조될 수 있다; 예를 들어, US 특허 5,837,821 또는 국제 출원 WO 94/09817을 참조한다.
일 양태에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체는 단량체 서브유닛 사이의 화합을 허용하는 한, 소수 또는 심지어 단일 아미노산이 결실되거나 치환된 면역글로불린 중쇄를 포함한다. 예를 들어, CH2 도메인의 선택된 영역에서 단일 아미노산의 변이는 실질적으로 Fc 결합을 저하시키기에 충분할 수 있으며, 따라서 α-시누클레인 국소화를 증가시킬 수 있다. 유사하게는, 조절될 효과기 작용 (예를 들어, 보체 결합)을 조절하는 하나 이상의 불변 영역 도메인의 일부를 단순히 결실시키는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 불변 영역의 부분적 결실은 해당 불변 영역 도메인과 관련된 다른 바람직한 작용은 그대로 유지한 채, 항체의 선택된 특징 (혈청 반감기)을 개선시킬 수 있다. 또한, 상기에서 언급되는 바와 같이, 본 항체의 불변 영역은 생성된 작제물의 프로필을 향상시키는 하나 이상의 아미노산의 변이 또는 치환을 통해 합성될 수 있다. 이와 관련하여, 변형된 항체의 형태 및 면역원성 프로필은 실질적으로 유지하면서 보존된 결합 부위에 의해 제공되는 활성 (예를 들어, Fc 결합)을 파괴할 수 있다. 또 다른 양태는 효과기 작용과 같은 바람직한 특징을 향상시키거나 더 많은 세포독소 또는 탄수화물 부착을 제공하기 위해 불변 영역에 하나 이상의 아미노산을 부가하는 것을 포함한다. 이러한 양태에서, 선택된 불변 영역 도메인으로부터 유래되는 특정 서열을 삽입하거나 복제하는 것이 바람직할 수 있다.
또한, 본 발명은 본원에서 기술되는 항체 분자 (예를 들어, VH 영역 및/또는 VL 영역)의 변이체 (유도체 포함)를 포함하거나 이로 본질적으로 구성되거나 이로 구성되는 항체를 제공하며, 이러한 항체 또는 이의 단편은 α-시누클레인에 면역특이적으로 결합한다. 당업자에게 공지된 표준 기술을 이용하여 항체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 돌연변이를 도입할 수 있으며, 이러한 기술은 무제한적으로 부위-지시된 돌연변이유발 및 PCR-매개된 돌연변이 유발을 포함하며, 이는 아미노산 치환을 유도한다. 바람직하게는, 변이체 (유도체 포함)는 기준 VH 영역, VH-CDR1, VH-CDR2, VH-CDR3, VL 영역, VL-CDR1, VL-CDR2 또는 VL-CDR3과 비교하여 50개 미만의 아미노산 치환, 40개 미만의 아미노산 치환, 30개 미만의 아미노산 치환, 25개 미만의 아미노산 치환, 20개 미만의 아미노산 치환, 15개 미만의 아미노산 치환, 10개 미만의 아미노산 치환, 5개 미만의 아미노산 치환, 4개 미만의 아미노산 치환, 3개 미만의 아미노산 치환, 또는 2개 미만의 아미노산 치환을 암호화한다. "보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 하전의 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체되는 것이다. 이러한 패밀리는 염기성 측쇄 (예를 들어, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄 (예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전된 극성 측쇄 (예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄 (예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지쇄 (예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄 (예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 갖는 아미노산을 포함한다. 대안적으로, 돌연변이는, 예를 들어 포화 돌연변이유발에 의해 암호화 서열의 전체 또는 일부에 따라 무작위로 도입될 수 있으며, 생성된 돌연변이체는 활성 (예를 들어, α-시누클레인에 결합하는 능력)을 보유하는 돌연변이체를 확인하기 위해 생물학적 활성에 대해 스크리닝될 수 있다.
예를 들어, 항체 분자의 CDR 영역에만 또는 프레임웍 영역에만 돌연변이를 도입하는 것이 가능하다. 도입된 돌연변이는 침묵 또는 중성의 미스센스 돌연변이일 수 있으며, 예를 들어 항원에 결합할 수 있는 항체의 능력에 영향을 끼치지 않거나 거의 영향을 끼치지 않으며, 실제로 일부 이러한 돌연변이는 아미노산 서열을 변화시키지 않는다. 이러한 유형의 돌연변이는 코돈 사용을 최적화하거나 하이브리도마 항체 생성을 개선하는데 유용할 수 있다. 본 발명의 항체를 암호화하는 코돈-최적화된 암호화 영역은 본원의 다른 곳에 기술되어 있다. 대안적으로, 비-중성 미스센스 변이는 항원을 결합하는 항체의 능력을 변화시킬 수 있다. 비록 절대 요건은 아니나, 대부분의 비-중성 미스센스 돌연변이의 위치는 CDR에 존재할 것으로 예상되고, 대부분의 침묵 및 중성 미스센스 돌연변이의 위치는 프레임웍 영역에 존재할 것으로 예상된다. 당업자는 항원-결합 활성 또는 결합 활성의 변화 (예를 들어, 항원-결합 활성의 향상 또는 항체 특이성 변화) 없이 목적하는 특성을 갖는 변이체 분자를 디자인하고 시험할 수 있을 것이다. 돌연변이유발 후, 암호화된 단백질은 통상적으로 발현되고, 암호화된 단백질의 기능 및/또는 생물학적 활성 (예를 들어, α-시누클레인의 하나 이상의 에피토프에 면역특이적으로 결합하는 능력)은 당해 분야에서 공지된 통상적인 변형 기술 또는 본원에 기술된 기술을 이용하여 측정될 수 있다.
III . 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드
항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 비변형된 RNA 또는 DNA 또는 변형된 RNA 또는 DNA일 수 있는 임의의 폴리리보뉴클레오타이드 또는 폴리데옥시리보뉴클레오타이드로 구성될 수 있다. 예를 들어, 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 단일 가닥 및 이중 가닥 DNA, 단일 가닥 영역과 이중 가닥 영역의 혼합물인 DNA, 단일 및 이중 가닥 RNA, 및 단일 가닥 영역과 이중 가닥 영역의 혼합물인 RNA, 및 단일 가닥이거나, 더욱 전형적으로, 이중 가닥 또는 단일 가닥과 이중 가역 영역의 혼합물일 수 있는 DNA와 RNA를 포함하는 하이브리드 분자로 구성될 수 있다. 또한, 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 RNA 또는 DNA 또는 RNA와 DNA 둘 모두를 포함하는 삼중 가닥 영역으로 구성될 수 있다. 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 또한 하나 이상의 변형된 염기 또는 안정성 또는 다른 이유로 변형된 DNA 또는 RNA 골격을 포함할 수 있다. "변형된" 염기는, 예를 들어 트리틸화된 염기 및 일반적이지 않은 염기, 예를 들어 이노신을 포함한다. DNA 및 RNA에 다양한 변형이 이루어질 수 있으며; 따라서, "폴리뉴클레오타이드"는 화학적으로, 효소적으로 또는 대사적으로 변형된 형태를 포함한다.
면역글로불린 (예를 들어, 면역글로불린 중쇄부 또는 경쇄부)으로부터 유래되는 폴리펩타이드의 비천연 변이체를 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오타이드는 암호화된 단백질로 하나 이상의 아미노산 치환, 부가 또는 결실이 도입되도록 면역글로불린의 뉴클레오타이드 서열로 하나 이상의 뉴클레오타이드 치환, 첨가 또는 결실을 도입함으로써 생성될 수 있다. 돌연변이는 표준 기술, 예를 들어 부위-지시된 돌연변이유발 및 PCR-매개된 돌연변이유발에 의해 도입될 수 있다. 바람직하게는, 보존적 아미노산 치환은 하나 이상의 비필수 아미노산 잔기에서 수행된다.
널리 공지된 바와 같이, RNA는 표준 기술, 예를 들어 구아니디늄 이소티오시아네이트 추출 및 침전 후 원심분리 또는 크로마토그래피에 의해 최초의 B 세포, 하이브리도마 세포 또는 기타 형질전환된 세포로부터 분리될 수 있다. 필요에 따라, mRNA가 표준 기술, 예를 들어 올리고 dT 셀룰로오즈상의 크로마토그래피에 의해 전체 RNA로부터 분리될 수 있다. 적합한 기술은 당해 분야에 잘 알려져 있다. 일 양태에서, 항체의 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 cDNA는 동시에 또는 별도로 널리 공지된 방법에 따라 역전사효소 및 DNA 중합효소를 사용하여 제조될 수 있다. PCR은 공개된 중쇄 및 경쇄 DNA 및 아미노산 서열에 기초하여 컨센서스 불변 영역 프라이머 또는 더욱 특이적인 프라이머에 의해 개시될 수 있다. 상기 논의되는 바와 같이, PCR은 또한 항체 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 DNA 클론을 분리하는데 사용될 수 있다. 이러한 경우, 라이브러리는 컨센서스 프라이머 또는 보다 큰 상동성 프로브, 예를 들어 생쥐 불변 영역 프로브에 의해 스크리닝될 수 있다.
예를 들어, 재조합 DNA 기술과 관련하여 상기 참조문헌에서 상세히 기술된 널리 공지된 표준 기술에 따라 제한 맵핑되고 서열분석된 DNA, 전형적으로 플라스미드 DNA는 당해 분야에서 공지된 기술을 사용하여 세포로부터 분리될 수 있다. 물론, DNA는 분리 과정 또는 후속 분석 동안 임의의 시점에서 본 발명에 따라 합성될 수 있다.
일 양태에서, 본 발명은 면역글로불린 중쇄 가변 영역 (VH)을 암호화하는 핵산을 포함하거나 이로 본질적으로 구성되거나 이로 구성되는 분리된 폴리뉴클레오타이드로서, 중쇄 가변 영역의 CDR중 하나 이상 또는 중쇄 가변 영역의 VH-CDR중 2개 이상은 본원에 기술된 항체로부터의 기준의 중쇄 VH-CDR1, VH-CDR2 또는 VH-CDR3 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 대안적으로, VH의 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3 영역은 본원에 기술된 항체로부터의 기준의 중쇄 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3과 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일하다. 따라서, 본 양태에 따르면, 본 발명의 중쇄 가변 영역은 도 1에 기재되는 폴리펩타이드 서열과 관련된 VH-CDR1, VH-CDR2 또는 VH-CDR3 폴리펩타이드 서열을 갖는다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 면역글로불린 경쇄 가변 영역 (VL)을 암호화하는 핵산을 포함하거나 이로 본질적으로 구성되거나 이로 구성되는 분리된 폴리뉴클레오타이드로서, 경쇄 가변 영역의 VL-CDR중 하나 이상 또는 경쇄 가변 영역의 VL-CDR중 2개 이상은 본원에 기술된 항체로부터의 기준의 경쇄 VL-CDR1, VL-CDR2 또는 VL-CDR3 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 대안적으로, VL의 VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3 영역은 본원에 기술된 항체로부터의 기준의 경쇄 VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3과 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일하다. 따라서, 본 양태에 따르면, 본 발명의 경쇄 가변 영역은 도 1에 기재되는 폴리펩타이드 서열과 관련된 VL-CDR1, VL-CDR2 또는 VL-CDR3 폴리펩타이드 서열을 갖는다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 면역글로불린 중쇄 가변 영역 (VH)을 암호화하는 핵산을 포함하거나 이러한 핵산으로 본질적으로 구성되거나 이러한 핵산으로 구성된 분리된 폴리뉴클레오타이드로서, VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3 영역이 도 1 및 첨부된 서열 목록에 기재되는 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3과 동일한 폴리펩타이드 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
당해 분야에 공지되어 있는 바와 같이, 2개의 폴리펩타이드 또는 2개의 폴리뉴클레오타이드 사이의 "서열 동일성"은 하나의 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드의 아미노산 또는 핵산 서열을 제2 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드의 서열과 비교함으로써 결정된다. 본원에서 논의되는 바와 같이, 임의의 특정 폴리펩타이드가 다른 폴리펩타이드와 적어도 약 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한지의 여부는 무제한적으로, BESTFIT 프로그램 (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711)과 같은 당해 분야에서 공지된 방법 및 컴퓨터 프로그램/소프트웨어를 이용하여 결정될 수 있다. BESTFIT는 문헌 [참조: Smithe and Waterman, Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981)]의 로컬 상동성 알고리즘을 사용하여 두 서열 사이의 가장 우수한 상동성 절편을 발견한다. 특정 서열이 본 발명에 따른 기준 서열과 예를 들어 95% 동일한지의 여부를 결정하기 위해 BESTFIT 또는 임의의 다른 서열 정렬 프로그램을 사용하는 경우, 파라미터는 물론 동일성 비율 (%)이 기준 폴리펩타이드 서열 전체 길이에 걸쳐 계산되고, 기준 서열의 아미노산 전체 수 중 상동성 갭이 5% 이하 이도록 세팅된다.
본 발명의 바람직한 양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 서열 2, 5, 8, 11, 14, 17 또는 20에 제시되는 바와 같은 항-α-시누클레인 항체의 VH 또는 VL 영역의 폴리뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산을 포함하거나 이로 본질적으로 구성되거나 이로 구성된다. 이에 관련하여, 당업자는 경쇄 및/또는 중쇄의 적어도 가변 도메인을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 2개의 면역글로불린 쇄 모두 또는 단지 하나의 가변 도메인을 암호화할 수 있다는 것을 용이하게 알 수 있을 것이다.
또한, 본 발명은 다른 곳에서 기술되는 바와 같은 본 발명의 폴리뉴클레오타이드의 단편을 포함한다. 추가로, 본원에서 기술되는 바와 같은 융합 폴리뉴클레오타이드, Fab 단편 및 기타 유도체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 또한 본 발명으로 고찰된다.
폴리뉴클레오타이드는 당해 분야에서 공지된 방법에 의해 생성되거나 조작될 수 있다. 예를 들어, 항체의 뉴클레오타이드 서열이 공지된 경우, 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는, 예를 들어 문헌 [참조: Kutmeier et al., BioTechniques 17 (1994), 242]에 기술되어 있는 바와 같이, 화학적으로 합성된 올리고뉴클레오타이드로부터 조립될 수 있으며, 이는, 간략하게는, 항체를 암호화하는 서열 부분들을 포함하는 중복 올리고뉴클레오타이드를 합성하고, 이들 올리고뉴클레오타이드를 어닐링시키고 결합시킨 후, PCR에 의해 결합된 올리고뉴클레오타이드를 증폭시키는 합성법에 관한 것이다.
대안적으로, 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 적합한 공급원으로부터의 핵산으로부터 생성될 수 있다. 특정 항체를 암호화하는 핵산을 포함하는 클론이 입수될 수는 없으나, 항체 분자의 서열이 공지된 경우, 항체를 암호화하는 핵산은, 서열의 3' 및 5' 말단으로 하이브리드화가능한 합성 프라이머를 사용하여 PCR 증폭시키거나, 예를 들어 항체를 암호화하는 cDNA 라이브러리로부터 cDNA 클론을 확인하기 위한 특정 유전자 서열에 대해 특이적인 올리고뉴클레오타이드 프로브를 사용하여 클로닝함으로써 화학적 합성하거나 적합한 공급원 (예를 들어, 항체 cDNA 라이브러리, 또는 α-시누클레인-특이적 항체를 발현하는 임의의 조직 또는 세포, 예를 들어 항체를 발현시키기 위해 선택된 하이브리도마 세포로부터 생성되는 cDNA 라이브러리, 또는 이로부터 분리된 핵산, 바람직하게는 폴리 A+RNA)으로부터 수득될 수 있다. 그 후, PCR에 의해 생성되는 증폭된 핵산은 당해 분야에 널리 공지된 방법을 이용하여 복제가능한 클로닝 벡터로 클로닝될 수 있다.
일단 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체의 뉴클레오타이드 서열 및 상응하는 아미노산 서열이 결정되면, 이의 뉴클레오타이드 서열은, 예를 들어 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 유도하도록, 뉴클레오타이드 서열의 조작에 대해 당해 분야에서 널리 공지된 방법, 예를 들어 재조합 DNA 기술, 부위-지시된 돌연변이유발, PCR 등 (예를 들어, [참조: Sambrook et al ., Molecular Cloning , A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990); 그리고 Ausubel et al ., eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1998), 모두 본원에 그 전체가 참조로 삽입됨]에 설명된 기술)을 이용하여 조작됨으로써 상이한 아미노산 서열을 갖는 항체를 생성할 수 있다.
IV . 항체 폴리펩타이드의 발현
본 발명의 항체 또는 이의 단편, 유도체 또는 유사체를 제공하기 위한 분리된 유전자 물질의 조작 후, 상기 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 전형적으로 목적하는 양의 항체를 생성하는데 사용될 수 있는 숙주 세포로의 도입을 위한 발현 벡터에 삽입된다. 항체 또는 이의 단편, 유도체 또는 동족체, 예를 들어 표적 분자에 결합하는 항체의 중쇄 또는 경쇄의 재조합 발현이 본원에 기술된다. 본 발명의 항체 분자, 또는 항체의 중쇄 또는 경쇄, 또는 이의 일부 (바람직하게는, 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인을 포함)를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 수득되면, 항체 분자의 생성을 위한 벡터는 당해 분야에 널리 공지된 기술을 이용하여 재조합 DNA 기술에 의해 생성될 수 있다. 따라서, 뉴클레오타이드 서열을 암호화하는 항체를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 발현시킴으로써 단백질을 제조하는 방법이 본원에 기술되어 있다. 당업자에게 널리 공지된 방법이 항체 암호화 서열 및 적합한 전사 및 해독 조절 신호을 포함하는 발현 벡터를 작제하는데 이용될 수 있다. 이러한 방법은, 예를 들어 시험관내 재조합 DNA 기술, 합성 기술, 및 생체내 유전자 재조합을 포함한다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 항체 분자 또는 이의 중쇄 또는 경쇄, 또는 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인을 암호화하고 프로모터에 작동적으로 연결된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 복제가능한 벡터를 제공한다. 이러한 벡터는 항체 분자의 불변 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 (예를 들어, 국제 출원 WO 86/05807; 국제 출원 WO 89/01036; 및 U.S. 특허 5,122,464 참조)을 포함할 수 있으며, 항체의 가변 도메인은 전체 중쇄 또는 경쇄의 발현을 위해 이러한 벡터로 클로닝될 수 있다.
용어 "벡터" 또는 "발현 벡터"는 숙주 세포로 목적하는 유전자를 도입시키고 발현시키기 위한 운반제로서 본 발명에 따라 사용되는 벡터를 의미하도록 본원에서 사용된다. 당업자에게 공지되어 있는 바와 같이, 이러한 벡터는 플라스미드, 파아지, 바이러스 및 레트로바이러스로 구성된 군으로부터 용이하게 선택될 수 있다. 일반적으로, 본 발명에 적합한 벡터는 선별 마커, 목적하는 유전자의 클로닝을 촉진하는 적합한 제한 부위, 및 진핵 세포 또는 원핵 세포에서 유입 및/또는 복제하는 능력을 포함할 것이다. 본 발명의 목적을 위해서, 많은 발현 벡터 시스템이 사용될 수 있다. 예를 들어, 벡터의 한 부류는 동물 바이러스, 예를 들어 소 파필로마 바이러스, 폴리오마 바이러스, 아데노바이러스, 우두 바이러스, 바쿨로바이러스, 레트로바이러스 (RSV, MMTV 또는 MOMLV) 또는 SV40 바이러스로부터 유래된 DNA 인자를 사용한다. 다른 것은 내부 리보좀 결합 부위를 갖는 폴리시스트론 시스템의 사용을 포함한다. 추가적으로, DNA를 이들의 염색체로 삽입시킨 세포는 트랜스펙션된 숙주 세포의 선별을 가능하게 하는 하나 이상의 마커를 도입함으로써 선택될 수 있다. 마커는 영양요구 숙주에 대한 원영양 (prototrophy), 살생제 내성 (예를 들어, 항생제) 또는 중금속, 예를 들어 구리에 대한 내성을 위해 제공될 수 있다. 선별가능한 마커 유전자는 발현될 DNA 서열에 직접적으로 연결되거나, 공동형질전환에 의해 동일한 세포로 도입될 수 있다. mRNA의 최적의 합성을 위해 추가적인 인자가 또한 필요할 수 있다. 이들 인자는 신호 서열, 스플라이스 신호 및 전사 프로모터, 인핸서 및 종결 신호을 포함할 수 있다.
특히 바람직한 양태에서, 클로닝된 가변 영역 유전자는 상기 기술된 바와 같은 중쇄 및 경쇄 불변 영역 유전자 (바람직하게는, 인간)와 함께 발현 벡터로 삽입된다. 일 양태에서, 이는 NEOSPLA로서 언급되는 Biogen IDEC, Inc. 소유의 발현 벡터를 사용하여 수행된다 (U.S. 특허 6,159,730에 기술됨). 이 벡터는 사이토메갈로바이러스 프로모터/인핸서, 생쥐 베타 글로빈 주요 프로모터, SV40 복제 기원, 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열, 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제 엑손 1 및 엑손 2, 디하이드로폴레이트 환원효소 유전자 및 리더 서열을 포함한다. 이러한 벡터는 가변 및 불변 영역 유전자의 삽입, CHO 세포에서의 트랜스펙션 및 이어서, G418 포함 배지에서의 선별 및 메토트렉세이트 증식시 항체의 매우 높은 수준의 발현을 유도하는 것으로 밝혀졌다. 물론, 진핵 세포에서 발현을 유도할 수 있는 임의의 발현 벡터가 본 발명에 사용될 수 있다. 적합한 벡터의 예로는 무제한적으로 플라스미드 pcDNA3, pHCMV/Zeo, pCR3.1, pEF1/His, pIND/GS, pRc/HCMV2, pSV40/Zeo2, pTRACER-HCMV, pUB6/V5-His, pVAX1, 및 pZeoSV2 (시판사: Invitrogen, San Diego, CA), 및 플라스미드 pCI (시판사: Promega, Madison, WI)를 포함한다. 일반적으로, 면역글로불린 중쇄 및 경쇄를 적합하게 높은 수준으로 발현하는 다수의 형질전환된 세포를 스크리닝하는 것은, 예를 들어 로보트 시스템에 의해 수행될 수 있는 통상적인 실험이다. 벡터 시스템은 U.S. 특허 5,736,137 및 5,658,570 (각각 전체가 참조로 본원에 삽입됨)에 교시되어 있다. 이러한 시스템은 높은 발현 수준, 예를 들어 > 30pg/세포/일을 제공한다. 다른 예시적 벡터 시스템은, 예를 들어 U.S. 특허 6,413,777에 기술되어 있다.
또 다른 바람직한 양태에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체는 미국특허 출원 공개 번호 2003-0157641 A1 (본원에 전부 삽입됨)에 기술된 것과 같은 폴리시스트론 작제물을 사용하여 발현될 수 있다. 이러한 신규한 발현 시스템에서, 항체의 중쇄 및 경쇄와 같은 목적하는 다수의 유전자 생성물이 단일 폴리시스트론 작제물로부터 생성될 수 있다. 이들 시스템은 유리하게는 비교적 높은 수준의 항체를 제공하기 위해 내부 리보좀 도입 부위 (IRES)를 사용한다. 적합한 IRES 서열은 U.S. 특허 6,193,980 (본원에 삽입됨)에 기술되어 있다. 당업자는 이러한 발현 시스템이 본 출원에 기재된 전 범위의 항체를 효과적으로 생성하는데 사용될 수 있음을 인지할 것이다.
더욱 일반적으로, 일단 항체의 단량체성 서브유닛을 암호화하는 DNA 서열 또는 벡터가 준비되면, 발현 벡터는 적합한 숙주 세포로 도입될 수 있다. 플라스미드의 숙주 세포로의 도입은 당업자에게 널리 공지된 다양한 기술로 달성될 수 있다. 이러한 기술로는 무제한적으로, 예를 들어 푸진 (Fugene) 또는 리포펙타민을 사용하는 리포트랜스펙션을 포함한 트랜스펙션, 원형질체 융합, 인산칼슘 침전, 외피보유 DNA와의 세포 융합, 미세주입, 및 온전한 바이러스로의 감염을 포함한다. 전형적으로, 숙주로의 플라스미드 도입은 표준 인산칼슘 공동-침전법을 통해 수행된다. 발현 작제물을 갖는 숙주 세포는 경쇄 및 중쇄의 생성에 적합한 조건하에서 성장되며, 중쇄 및/또는 경쇄 단백질 합성에 대해 분석된다. 예시적인 분석 기술은 효소-결합된 면역흡착 검정 (ELISA), 방사성면역검정 (RIA) 또는 형광-활성화된 세포 분류 분석 (FACS), 면역조직화학법 등을 포함한다.
발현 벡터는 통상적인 기술에 의해 숙주 세포로 이동되며, 트랜스펙션된 세포는 통상적인 기술에 의해 배양되어 본원에 기술된 방법에 사용하기 위한 항체를 생성한다. 따라서, 본 발명은 이종 프로모터에 작동적으로 연결된 본 발명의 항체 또는 이의 중쇄 또는 경쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 숙주 세포를 포함한다. 이중쇄 항체의 발현을 위한 바람직한 양태에서, 중쇄 및 경쇄 둘 모두를 암호화하는 벡터는 하기 기술된 바와 같이 전체 면역글로불린 분자의 발현을 위한 숙주 세포에 공동-발현될 수 있다.
숙주 세포는 본 발명의 2개의 발현 벡터, 즉 중쇄 유래된 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 벡터, 및 경쇄 유래된 폴리펩타이드를 암호화하는 제2 벡터로 공동-트랜스펙션될 수 있다. 2개의 벡터는 중쇄 폴리펩타이드 및 경쇄 폴리펩타이드의 동등한 발현을 가능하게 하는 동일한 선택가능한 마커를 포함할 수 있다. 대안적으로, 중쇄 폴리펩타이드 및 경쇄 폴리펩타이드 둘 모두를 암호화하는 단일 벡터가 사용될 수 있다. 이러한 경우, 경쇄는 유리하게는 과잉의 독성 비포함 (toxic free) 중쇄를 피하기 위해 중쇄 앞에 위치된다; 문헌 [참조: Proudfoot, Nature 322 (1986), 52; Kohler, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980), 2197]을 참조한다. 중쇄 및 경쇄의 암호화 서열은 cDNA 또는 게놈 DNA를 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 "숙주 세포"는 재조합 DNA 기술을 이용하여 제작되고 하나 이상의 이종 유전자를 암호화하는 벡터를 갖는 세포를 언급한다. 재조합 숙주로부터 항체를 분리하기 위한 공정을 기술함에 있어서, 용어 "세포" 및 "세포 배양물"은 달리 명시되지 않는 한, 항체 공급원을 나타내기 위해 상호교환적으로 사용된다. 달리, "세포"로부터의 폴리펩타이드의 회수는 스핀 다운(spin down) 전체 세포로부터 또는 배지 및 현탁된 세포 둘 모두를 포함하는 세포 배양물로부터의 폴리펩타이드 회수를 의미할 수 있다.
다양한 숙주-발현 벡터 시스템이 본원에 기술되는 방법에 사용하기 위한 항체 분자를 발현하는데 사용될 수 있다. 이러한 숙주-발현 시스템은 목적하는 암호화 서열이 생성되고 이후 정제될 수 있는 운반제를 나타낼 뿐만 아니라, 적합한 뉴클레오타이드 암호화 서열로 형질전환되거나 트랜스펙션되는 경우에, 본 발명의 항체 분자를 제자리 (in situ) 발현할 수 있는 세포를 나타낼 수 있다. 이러한 시스템은, 항체 암호화 서열을 포함하는 재조합 박테리오파지 DNA, 플라스미드 DNA, 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질전환된 세균 (예를 들어, 대장균 (E. coli), 바실루스 서브틸리스 (B. subtilis)); 항체 암호화 서열을 포함하는 재조합 효모 발현 벡터로 형질전환된 효모 (예를 들어, 사카로마이세스 (Saccharomyces), 피치아 (Pichia)); 항체 암호화 서열을 포함하는 재조합 바이러스 발현 벡터 (예를 들어, 바쿨로바이러스)로 감염된 곤충 세포 시스템; 재조합 바이러스 발현 벡터 (예를 들어, 꽃양배추 모자이크 바이러스 (CaMV); 담배 모자이크 바이러스 (TMV))로 감염되거나, 항체 암호화 서열을 포함하는 재조합 플라스미드 발현 벡터 (예를 들어, Ti 플라스미드)로 형질전환된 식물 세포 시스템; 또는 포유동물 세포의 게놈 (예를 들어, 메탈로티오네인 프로모터) 또는 포유동물 바이러스 (예를 들어, 아데노바이러스 후기 프로모터; 우두 바이러스 7.5K 프로모터)로부터 유래되는 프로모터를 포함하는 재조합 발현 작제물을 갖는 포유동물 세포 시스템 (예를 들어, COS, CHO, BLK, 293, 3T3 세포)과 같은 미생물을 포함하나, 이로 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는, 에스케리키아 콜라이 (Escherichia coli)와 같은 세균 세포, 더욱 바람직하게는, 특히 전체 재조합 항체 분자의 발현을 위해, 진핵 세포가 재조합 항체 분자의 발현에 사용된다. 예를 들어, 차이니즈 햄스터 난소 세포 (CHO)와 같은 포유동물 세포가 인간 사이토메갈로바이러스로부터의 주요 즉시 초기 유전자 프로모터 인자와 같은 벡터와 함께 항체에 대한 효과적인 발현 시스템이다; 예를 들어, 문헌 [참조: Foecking et al ., Gene 45 (1986), 101; Cockett et al ., Bio/Technology 8 (1990), 2]을 참조한다.
단백질 발현을 위해 사용되는 숙주 세포주는 종종 포유동물 기원이며, 당업자는 발현될 목적하는 유전자 생성물에 가장 적합한 특정 숙주 세포주를 선택적으로 결정할 수 있을 것이다. 예시적인 숙주 세포주는 CHO (차이니즈 햄스터 난소), DG44 및 DUXB11 (차이니즈 햄스터 난소 세포주, DHFR-), HELA (인간 자궁경부 암종), CVI (원숭이 신장 세포주), COS (SV40 T 항원을 갖는 CVI의 유도체), VERY, BHK (베이비 햄스터 신장), MDCK, 293, WI38, R1610 (차이니즈 햄스터 섬유아세포), BALBC/3T3 (생쥐 섬유아세포), HAK (햄스터 신장 세포주), SP2/O (생쥐 골수종), P3x63-Ag3.653 (생쥐 골수종), BFA-1c1BPT (소 내피 세포), RAJI (인간 림프구) 및 293 (인간 신장)을 포함하나, 이로 제한되는 것은 아니다. CHO 및 293 세포가 특히 바람직하다. 숙주 세포주는 전형적으로 시판사인 ATCC (The American Tissue Culture Collection) 또는 공개된 문헌으로부터 입수가능하다.
또한, 삽입된 서열의 발현을 조절하거나, 요망되는 특정 형태로 유전자 생성물을 변형하고 처리하는 숙주 세포 균주가 선택될 수 있다. 단백질 생성물의 이러한 변형 (예를 들어, 글리코실화) 및 처리 (예를 들어, 분해)는 단백질의 기능에 중요할 수 있다. 상이한 숙주 세포는 단백질 및 유전자 생성물의 해독후 프로세싱 및 변형에 대한 특징적이고 특이적인 메카니즘을 갖는다. 적합한 세포주 또는 숙주 시스템은 발현되는 외래 단백질의 올바른 변형 및 프로세싱을 보장하도록 선택될 수 있다. 이러한 목적으로, 유전자 생성물의 일차 전사, 글리코실화 및 포스포릴화의 적합한 프로세싱을 위한 세포 수단을 지닌 진핵 숙주 세포가 사용될 수 있다.
재조합 단백질의 장기간 고수율 생성을 위해, 안정한 발현이 바람직하다. 예를 들어, 항체 분자를 안정하게 발현하는 세포주가 조작될 수 있다. 숙주 세포는, 바이러스 복제 기원을 포함하는 발현 벡터를 사용하기보다는, 적합한 발현 조절 인자 (예를 들어, 프로모터, 인핸서, 서열, 전사 터미네이터, 폴리아데닐화 부위 등) 및 선별가능한 마커에 의해 조절되는 DNA로 형질전환될 수 있다. 조작된 세포는, 외래 DNA의 도입후, 농축 배지 중에서 1-2일 동안 성장시킨 후 선별 배지로 스위칭된다. 재조합 플라스미드 중의 선별가능한 마커는 선별물에 대한 내성을 부여하고, 세포로 하여금 플라스미드를 염색체로 안정하게 통합되게 하고 성장하게 하여 차례로 클로닝되고 세포주로 확대될 수 있는 포커스를 형성한다. 이러한 방법은 항체 분자를 안정하게 발현하는 세포주를 조작하는데 유리하게 이용될 수 있다.
단순 포진 바이러스 티미딘 키나아제 [참조: Wigler et al ., Cell 11 (1977), 223], 히포크산틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제 [참조: Szybalska & Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48 (1992), 202], 및 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제 [참조: Lowy et al., Cell 22 (1980), 817]를 포함하나 이로 제한되지 않는 다수의 선별 시스템이 사용될 수 있으며, 유전자는 각각 tk-, hgprt- 또는 aprt-세포에서 사용될 수 있다. 또한, 항-대사물 내성이 하기 유전자에 대한 선별의 토대로 이용될 수 있다: 메토트렉세이트에 내성을 부여하는 dhfr [참조: Wigler et al ., Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980), 357; O'Hare et al ., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 (1981), 1527]; 미코페놀산에 내성을 부여하는 gpt [참조: Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 (1981), 2072]; 아미노글리코시드 G-418에 내성을 부여하는 neo [참조: Goldspiel et al ., Clinical Pharmacy 12 (1993), 488-505; Wu and Wu, Biotherapy 3 (1991), 87-95; Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32 (1993), 573-596; Mulligan, Science 260 (1993), 926-932; 그리고 Morgan and Anderson, Ann. Rev. Biochem. 62 (1993), 191-217; TIB TECH 11 (1993), 155-215]; 및 히그로마이신에 내성을 부여하는 hygro [참조: Santerre et al ., Gene 30 (1984), 147]. 이용될 수 있는 재조합 DNA 기술에 대한 당해 분야에 일반적으로 공지된 방법이 문헌 [참조: Ausubel et al . (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990); 그리고 Chapters 12 and 13, Dracopoli et al . (eds), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994); Colberre-Garapin et al ., J. Mol. Biol. 150:1 (1981), 전부 본원에 참조로 삽입됨]에 기술되어 있다
항체 분자의 발현 수준은 벡터 증폭에 의해 증대될 수 있으며, 검토를 위해 문헌 [참조: Bebbington and Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Academic Press, New York, Vol. 3. (1987)]을 참조한다. 항체를 발현하는 벡터 시스템 내의 마커가 증폭가능한 경우, 숙주 세포의 배양물에 존재하는 억제제의 수준 증가는 마커 유전자의 복사체의 수를 증가시킬 것이다. 증폭된 영역은 항체 유전자와 관련이 있기 때문에, 항체의 생성 또한 증가할 것이다; 문헌 [참조: Crouse et al ., Mol. Cell. Biol. 3 (1983), 257]을 참조한다.
시험관내 생성은 다량의 목적하는 폴리펩타이드를 제공하도록 규모를 증대시킨다. 조직 배양 조건 하에서 포유동물 세포의 배양 기술은 당해 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 에어리프트 (airlift) 반응기 또는 연속 교반 반응기에서의 균질 현탁 배양, 또는 예를 들어 유공 섬유, 마이크로캡슐, 아가로스 마이크로비드 또는 세라믹 카트리지에서의 부동화되거나 트랩된 세포 배양을 포함한다. 필요에 따라 및/또는 요망에 따라, 폴리펩타이드 용액은, 예를 들어 합성 힌지 영역 폴리펩타이드의 우선적 생합성 이후에 또는 본원에 기술된 HIC 크로마토그래피 단계 전후에, 예를 들어 겔 투과, 이온 교환 크로마토그래피, DEAE-셀룰로스 상에서의 크로마토그래피 또는 (면역-)친화성 크로마토그래피와 같은 통상적인 크로마토그래피 방법에 의해 정제될 수 있다.
또한, 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체를 암호화하는 유전자는 세균 또는 곤충 또는 효모 또는 식물 세포와 같은 비-포유동물 세포에서 발현될 수 있다. 핵산을 용이하게 취할 수 있는 세균은 에스케리키아 콜라이 (Escherichia coli) 또는 살모넬라 (Salmonella)의 균주와 같은 엔테로박테리아(과) (enterobacteriaceae); 바실루스 서브틸리스 (Bacillus subtilis)와 같은 바실루스(과) (Bacillaceae); 뉴모코쿠스 (Pneumococcus); 스트렙토코쿠스 (Streptococcus), 및 해모필루스 인플루엔자 (Haemophilus influenzae)의 구성원을 포함한다. 또한, 세균에서 발현되는 경우, 이종 폴리펩타이드가 일반적으로 봉입체의 일부가 된다는 것을 알 수 있을 것이다. 이종 폴리펩타이드는 분리되고, 정제된 후, 기능성 분자로 어셈블링되어야 한다. 4가 형태의 항체가 요망되는 경우, 서브유닛은 4가 항체로 자가-어셈블링될 것이다; 예를 들어, 국제 출원 WO 02/096948을 참조한다.
세균 시스템에서, 다수의 발현 벡터는, 발현되는 항체 분자에 대해 의도되는 용도에 따라 유리하게 선택될 수 있다. 예를 들어, 이러한 단백질이 다량 생성되어야 하는 경우, 항체 분자의 약제 조성물을 생성하기 위해, 용이하게 정제되는, 높은 수준의 융합 단백질 생성물 발현을 유도하는 벡터가 바람직할 수 있다. 이러한 벡터는 항체 암호화 서열이 융합 단백질이 생성되도록 lacZ 암호화 영역과 함께 인 프레임으로 벡터에 개별적으로 결합될 수 있는 대장균 발현 벡터 pUR278 [참조: Ruther et al ., EMBO J. 2 (1983), 1791]; pIN 벡터 [참조: Inouye & Inouye, Nucleic Acids Res. 13 (1985), 3101-3109; Van Heeke & Schuster, J. Biol. Chem. 24 (1989), 5503-5509] 등을 포함하나, 이로 제한되는 것은 아니다. 또한, pGEX 벡터는 글루타티온 S-트랜스퍼라제 (GST)와 함께 융합 단백질로서 외래 폴리펩타이드를 발현시키는데 사용될 수 있다. 일반적으로, 이러한 융합 단백질은 가용성이며, 글루타티온-아가로스 비드 매트릭스에 흡착 및 결합시킨 후 유리 글루타디온의 존재 하에서 용출시켜 용해된 세포로부터 용이하게 정제할 수 있다. pGEX 벡터는 트롬빈 또는 인자 Xa 프로테아제 절단 부위를 포함하도록 디자인됨으로써 클로닝된 표적 유전자 생성물은 GST 잔기로부터 방출될 수 있다.
원핵세포 이외에, 진핵세포 미생물이 사용될 수도 있다. 예를 들어 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris)와 같은 다수의 다른 균주도 일반적으로 이용가능하나, 사카로마이세스 세레비시애 (Saccharomyces cerevisiae) 또는 통상의 제빵용 효모가 진핵세포 미생물 중에서 가장 보편적으로 사용된다. 사카로마이세스에서의 발현을 위해, 예를 들어 플라스미드 YRp7 [참조: Stinchcomb et al., Nature 282 (1979), 39; Kingsman et al., Gene 7 (1979), 141; Tschemper et al ., Gene 10 (1980), 157]가 보편적으로 사용된다. 상기 플라스미드는 이미 TRPl 유전자를 포함하고 있으며, 이 유전자는 트립토판에서 성장하는 능력이 결여되어 있는 효모의 돌연변이체 균주, 예를 들어 ATCC No. 44076 또는 PEP4-1 [참조: Jones, Genetics 85 (1977), 12]에 대한 선별적인 마커를 제공한다. 이후, 효모 숙주 세포 게놈의 특징으로서 trpl 장애의 존재가 트립토판의 부재 하에서의 성장에 의한 형질전환을 검출하기 위한 효과적인 환경을 제공한다.
곤충 시스템에서는, 오토그라파 캘리포니카 핵 다면체 바이러스 (Autographa californica nuclear polyhedrosis virus: AcNPV)가 외래 유전자를 발현시키는 벡터로서 일반적으로 사용된다. 상기 바이러스는 스포돕테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda) 세포에서 성장한다. 항체 암호화 서열은 바이러스의 비-필수적 영역(예를 들어, 폴리헤드린 유전자)로 개별적으로 클로닝되어, AcNPV 프로모토 (예를 들어, 폴리헤드린 프로모터)의 조절 하에 놓일 수 있다.
일단 본 발명의 항체 분자가 재조합적으로 발현되면, 예를 들어 크로마토그래피 (예를 들어, 이온 교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 특히 단백질 A 크로마토그래피 후 특정 항원에 대한 친화성 크로마토그래피, 및 사이징 컬럼 크로마토그래피), 원심분리, 차등 용해도, 예를 들어 황산암모늄 침전 또는 단백질 정제를 위한 임의의 다른 표준 기술을 포함한 당해 분야의 표준 기술에 따라 본 발명의 전체 항체, 이들의 다이머, 개별적 경쇄 및 중쇄 또는 기타 면역글로불린 형태가 정제될 수 있다; 예를 들어 문헌 [참조: Scopes, "Protein Purification", Springer Verlag, N.Y. (1982)]을 참조한다. 대안적으로, 본 발명의 항체의 친화성을 증대시키기 위한 바람직한 방법이 US 특허원 공개 2002 0123057 Al에 기술되어 있다.
V. 융합 단백질 및 컨쥬게이트
특정 양태에서, 항체 폴리펩타이드는 통상적으로는 항체와 관련되지 않는 하나 이상의 잔기 또는 아미노산 서열을 포함한다. 예시적 변형은 하기에서 더욱 자세히 기술된다. 예를 들어, 본 발명의 단쇄 fv 항체 단편은 유연한 링커 서열을 포함하거나 작용성 잔기 (예를 들어, PEG, 약물, 독소, 또는 형광물, 방사성물, 효소, 핵 자기물, 중금속 등과 같은 표지물)을 부가하도록 변형될 수 있다.
본 발명의 항체 폴리펩타이드는 융합 단백질을 포함하거나 이로 본질적으로 구성되거나 이로 구성된다. 융합 단백질은, 예를 들어 하나 이상의 표적물 결합 부위를 갖는 면역글로불린 α-시누클레인-결합 도메인 및 하나 이상의 이종 부분, 즉, 사실상 천연적으로는 연결되지 않는 부분을 포함하는 키메라 분자이다. 아미노산 서열은 일반적으로 융합 폴리펩타이드로 합쳐지는 별개 단백질로 존재하거나, 일반적으로 동일한 단백질에는 존재할 수 있지만 융합 폴리펩타이드 내에서 새로운 정렬로 배치될 수도 있다. 융합 단백질은, 예를 들어 화학 합성에 의해, 또는 펩타이드 영역이 목적하는 관계로 암호화되는 폴리뉴클레오타이드를 생성하고 해독함으로써 생성될 수 있다.
폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드에 대해 사용되는 용어 "이종"은 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드가 비교되는 나머지 실체와 구별되는 실체로 유래되는 것을 의미한다. 예를 들어, 본원에서 사용되는 바와 같은 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유사체에 융합되는 "이종 폴리펩타이드"는 동일한 종의 비-면역글로불린 폴리펩타이드 또는 상이한 종의 면역글로불린 또는 비-면역글로불린 폴리펩타이드로부터 유래된다. 본원의 다른 부분에서 보다 자세히 논의되어 있는 바와 같이, 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체는 추가로 N- 또는 C-말단에서 이종 폴리펩타이드에 재조합에 의해 융합되거나, 폴리펩타이드 또는 다른 조성물에 화학적으로 컨쥬게이션 (공유 및 비공유 컨쥬게이션 포함)될 수 있다. 예를 들어, 항체는 검출 검정에서 표지물로서 유용한 분자 및 이종 폴리펩타이드, 약물, 방사성핵종, 또는 독소와 같은 효과기 분자에 재조합에 의해 융합되거나 컨쥬게이션될 수 있다 [참조: 국제 출원 WO 92/08495; WO 91/14438; WO 89/12624; U.S. 특허 5,314,995; 및 유럽 특허원 EP 0 396 387].
본 발명의 항체, 이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체는 펩타이드 결합 또는 변형된 펩타이드 결합, 즉 펩타이드 이소스테레 (peptide isostere)에 의해 서로 결합된 아미노산으로 구성될 수 있으며, 20개의 유전자 암호화된 아미노산 이외의 아미노산을 포함할 수 있다. 항체는 천연 과정, 예를 들어 해독후 과정에 의해, 또는 당해 분야에 널리 공지되어 있는 화학적 변형 기술에 의해 변형될 수 있다. 이러한 변형은 기본 교재에 잘 기술되어 있으며, 전공논문에 보다 자세히 기술되어 있고, 방대한 연구 문헌에 잘 기술되어 있다. 변형은 펩타이드 골격, 아미노산 측쇄 및 아미노 또는 카르복실 말단을 포함하여 항체에서 또는 탄수화물과 같은 잔기에서 일어날 수 있다. 동일한 유형의 변형이 소정의 항체의 여러 부위에서 동일하게 또는 상이한 정도로 존재할 수 있다는 것을 알 수 있을 것 것이다. 또한, 소정의 항체는 많은 유형의 변형을 포함할 수 있다. 항체는, 예를 들어 유비퀴틴화 (ubiquitination)의 결과로서 분지될 수 있으며, 분지화가 있거나 없는 사이클일 수 있다. 사이클, 분지형 및 분지형 사이클 항체는 해독후 천연 과정으로부터 초래되거나, 합성 방법에 의해 제조될 수 있다. 변형은 아세틸화, 아실화, ADP-리보실화, 아미드화, 플라빈의 공유 결합, 헴 (heme) 잔기의 공유 결합, 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유도체의 공유 결합, 지질 또는 지질 유도체의 공유 결합, 포스포티딜이노시톨의 공유 결합, 가교, 고리화, 디설파이드 결합 형성, 탈메틸화, 공유 가교결합의 형성, 시스테인의 형성, 피로글루타메이트의 형성, 포르밀화, 감마-카르복실화, 글리코실화, GPI 앵커 형성, 하이드록실화, 요오드화, 메틸화, 미리스토일화, 산화, 페길화, 단백질분해 프로세싱, 포스포릴화, 프레닐화, 라세미화, 셀레노일화, 설페이트화, 아미노산의 단백질로의 트랜스퍼-RNA 매개된 부가 (예를 들어, 아르기닐화), 및 유비퀴틴화를 포함한다; 예를 들어, 문헌 [참조: Proteins - Structure And Molecular Properties, T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, New York 2nd Ed., (1993); Posttranslational Covalent Modification Of Proteins, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, pgs. 1-12 (1983); Seifter et al ., Meth. Enzymol. 182 (1990), 626-646; Rattan et al ., Ann. NY Acad. Sci. 663 (1992), 48-62)]을 참조한다.
또한, 본 발명은 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체, 및 이종 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 일 양태에서, 본 발명의 융합 단백질은 본 발명의 항체의 하나 이상의 VH 영역의 아미노산 서열 또는 본 발명의 항체 또는 이의 단편 또는 변이체의 하나 이상의 VL 영역의 아미노산 서열을 지닌 폴리펩타이드, 및 이종 폴리펩타이드 서열을 포함하거나 이로 본질적으로 구성되거나 이로 구성된다. 또 다른 양태에서, 본원에서 기술되는 진단 및 치료 방법에 사용하기 위한 융합 단백질은 항체 또는 이의 단편, 변이체 또는 유도체의 임의의 1, 2 또는 3개의 VH-CDR의 아미노산 서열, 또는 항체 또는 이의 단편, 변이체 또는 유도체의 임의의 1, 2 또는 3개의 VL-CDR의 아미노산 서열을 지닌 폴리펩타이드, 및 이종 폴리펩타이드 서열을 포함하거나 이로 본질적으로 구성되거나 이로 구성된다. 일 양태에서, 융합 단백질은 본 발명의 항체 또는 이의 단편, 변이체 또는 유도체의 VH-CDR3의 아미노산 서열을 지닌 폴리펩타이드, 및 이종 폴리펩타이드 서열을 포함하며, 융합 단백질은 α-시누클레인에 특이적으로 결합한다. 또 다른 양태에서, 융합 단백질은 본 발명의 항체의 하나 이상의 VH 영역의 아미노산 서열 및 본 발명의 항체 또는 이의 단편, 유도체 또는 변이체의 하나 이상의 VL 영역의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드, 및 이종 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 바람직하게는, 융합 단백질의 VH 및 VL 영역은 α-시누클레인과 특이적으로 결합하는 단일 공급원 항체 (또는 scFv 또는 Fab 단편)에 상응한다. 또 다른 양태에서, 본원에서 기술되는 진단 및 치료 방법에 사용하기 위한 융합 단백질은 항체의 임의의 1, 2, 3개 또는 그 초과의 VH CDR의 아미노산 서열 및 항체 또는 이의 단편 또는 변이체의 임의의 1, 2, 3개 또는 그 초과의 VL CDR의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드, 및 이종 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 바람직하게는, 2, 3, 4, 5, 6개 또는 그 초과의 VH-CDR 또는 VL-CDR은 본 발명의 단일 공급 항체 (또는 scFv 또는 Fab 단편)에 상응한다. 또한, 이러한 융합 단백질을 암호화하는 핵산 분자가 본 발명에 포함된다.
문헌에 보고되어 있는 예시적인 융합 단백질은 T 세포 수용체 [참조: Gascoigne et al ., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987), 2936-2940]; CD4 [참조: Capon et al ., Nature 337 (1989), 525-531; Traunecker et al ., Nature 339 (1989), 68-70; Zettmeissl et al ., DNA Cell Biol. USA 9 (1990), 347-353; 그리고 Byrn et al., Nature 344 (1990), 667-670]; L-셀렉틴 (호밍 수용체: homing receptor) [참조: Watson et al ., J. Cell. Biol. 110 (1990), 2221-2229; 그리고 Watson et al ., Nature 349 (1991), 164-167]; CD44 [참조: Aruffo et al ., Cell 61 (1990), 1303-1313]; CD28 및 B7 [참조: Linsley et al ., J. Exp. Med. 173 (1991),721-730); CTLA-4 (Lisley et al ., J. Exp. Med. 174 (1991), 561-569]; CD22 [참조: Stamenkovic et al ., Cell 66 (1991), 1133-1144 ]; TNF 수용체 [참조: Ashkenazi et al ., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991), 10535-10539; Lesslauer et al ., Eur. J. Immunol. 27 (1991), 2883-2886; 그리고 Peppel et al ., J. Exp. Med. 174 (1991), 1483-1489 (1991)]; 및 IgE 수용체 [참조: Ridgway and Gorman, J. Cell. Biol. 115 (1991), Abstract No. 1448]의 융합물을 포함한다.
본원의 다른 부분에서 논의되는 바와 같이, 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체는 폴리펩타이드의 생체내 반감기를 증가시키기 위해, 또는 당해 분야에서 공지되어 있는 방법을 이용한 면역검정에 사용하기 위해 이종 폴리펩타이드에 융합될 수 있다. 예를 들어, 일 양태에서, PEG는 생체내 반감기를 증가시키기 위해 본 발명의 항체에 컨쥬게이션될 수 있다; 예를 들어, 문헌 [참조: Leong et al ., Cytokine 16 (2001), 106-119; Adv. in Drug Deliv. Rev. 54 (2002), 531; Weir et al ., Biochem. Soc. Transactions 30 (2002), 512]을 참조한다.
또한, 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체는 이의 정제 또는 검출을 용이하게 하기 위한 펩타이드와 같은 마커 서열에 융합될 수 있다. 바람직한 양태에서, 마커 아미노산 서열은 특히 헥사-히스티딘 펩타이드 (HIS), 예를 들어 pQE 벡터에 제공되는 태그 (QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, Calif, 91311)이며, 다수가 구입가능하다. 예를 들어, 문헌 [참조: Gentz et al ., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989), 821-824]에 기술되어 있는 바와 같이, 헥사-히스티딘은 편리한 융합 단백질 정제를 제공한다. 정제에 유용한 다른 펩타이드 태그는 인플루엔자 헤마글루티닌 단백질로부터 유래된 에피토프에 상응하는 "HA" 태그 [참조: Wilson et al ., Cell 37 (1984), 767] 및 "flag" 태그를 포함하나, 이로 제한되는 것은 아니다.
융합 단백질은 당해 널리 공지되어 있는 방법을 이용하여 제조될 수 있다; 예를 들어, US 특허 5,116,964 및 5,225,538을 참조한다. 융합이 일어나는 정확한 부위는 융합 단백질의 분비 또는 결합 특성을 최적화하도록 실험적으로 선별될 수 있다. 이후, 융합 단백질을 암호화하는 DNA는 발현을 위한 숙주 세포로 트랜스펙션된다.
본 발명의 항체는 비-컨쥬게이션된 형태로 사용되거나, 예를 들어 분자의 치료적 특성을 개선시키기 위해, 표적 검출을 용이하게 하기 위해, 또는 영상화 또는 환자의 치료를 위해 다수 분자 중 하나 이상에 컨쥬게이션될 수 있다. 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 정제가 수행되는 경우, 정제 전후에 표지되거나 컨쥬게이션될 수 있다. 특히, 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체는 치료제, 전구약물, 펩타이드, 단백질, 효소, 바이러스, 지질, 생물학적 반응 개질제, 약제학적 제제 또는 PEG에 컨쥬게이션될 수 있다.
통상적인 항체를 포함하는 면역독소인 컨쥬게이트는 당해 분야에 널리 개시되어 있다. 이러한 독소는 통상적인 결합 기술에 의해 항체에 결합될 수 있거나, 단백질 독소 부분을 포함하는 면역독소는 융합 단백질로서 생성될 수 있다. 본 발명의 항체는 이러한 면역독소를 수득하기 위한 상응하는 방법에 사용될 수 있다. 이러한 면역독소의 예는 문헌 [참조: Byers, Seminars Cell. Biol. 2 (1991), 59-70 및 Fanger, Immunol. Today 12 (1991), 51-54]에 기술된 것들이다.
당업자들은, 컨쥬게이트가 또한 컨쥬게이션되는 선택된 제제에 따라 다양한 기술을 이용하여 조립될 수 있음을 인지할 것이다. 예를 들어, 바이오틴과의 컨쥬게이트는 α-시누클레인 폴리펩타이드를, 예를 들어 바이오틴 N-하이드록시석신이미드 에스테르와 같은 바이오틴의 활성화된 에스테르와 반응시킴으로써 제조된다. 유사하게, 형광 마커와의 컨쥬게이트는, 예를 들어 본원에 기재되어 있는 것들과 같은 결합제의 존재 하에, 또는 이소티오시아네이트, 바람직하게는 플루오레세인-이소티오시아네트와의 반응에 의해 제조될 수 있다. 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체의 컨쥬게이트도 유사한 방식으로 제조된다.
본 발명은 진단제 또는 치료제에 컨쥬게이션된 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체를 추가로 포함한다. 항체는, 예를 들어 신경성 질환의 존재를 입증하기 위해, 신경성 질환을 소지할 위험을 암시하기 위해, 예를 들어 소정의 치료 및/또는 예방 요법의 효능을 측정하기 위한 임상 시험 절차의 일부로서 신경성 질환의 발병 또는 진행을 모니터링하기 위해 진단적으로 사용될 수 있다. 검출은 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체를 검출가능한 물질에 결합시킴으로써 용이하게 될 수 있다. 검출가능한 물질의 예는, 다양한 효소, 보결분자단 (prosthetic group), 형광 물질, 발광 물질, 바이오발광 물질, 방사성 물질, 다양한 양전자 방출 단층술을 이용하는 양전자 방출 금속, 및 비방사성 상자성 금속 이온을 포함한다; 예를 들어, 본 발명에 따른 진단제로서의 사용하기 위해 항체에 컨쥬게이션될 수 있는 금속 이온에 대해서 미국 특허 4,741,900을 참조할 수 있다. 적합한 효소의 예는 양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리 포스파타제, β-갈락토시다제, 또는 아세틸콜린에스테라제를 포함하고; 적합한 보결분자단 복합체의 예는 스트렙타비딘/바이오틴 및 아비딘/바이오틴을 포함하고; 적합한 형광 물질의 예는 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 단실 클로라이드 또는 피코에리트린을 포함하고; 발광 물질의 예는 루미놀을 포함하고; 바이오발광 물질의 예는 루시퍼라제, 루시페린, 및 애쿠오린을 포함하고, 적합한 방사성 물질의 예는 125I, 131I, 111In 또는 99Tc를 포함한다.
또한, 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 이를 화학발광 화합물에 결합함으로써 검출가능하게 표지될 수 있다. 이후, 화학발광물-태그 항체의 존재는 화학 반응 과정 동안에 발생하는 발광의 존재를 검출함으로써 측정된다. 특히 유용한 화학발광 화합물의 예는 루미놀, 이소루미놀, 테로마틱 (theromatic) 아크리디늄 에스테르, 이미다졸, 아크리디늄 염 및 옥살레이트 에스테르이다.
항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체가 검출가능하게 표지될 수 있는 방법 중 하나는 이를 효소에 동일하게 결합시키고, 결합된 생성물을 효소 면역검정 (EIA)에 사용하는 것이다 [참조: Voller, A., "The Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA)" Microbiological Associates Quarterly Publication, Walkersville, Md., Diagnostic Horizons 2 (1978), 1-7); Voller et al., J. Clin. Pathol. 31 (1978), 507-520; Butler, Meth. Enzymol. 73 (1981), 482-523; Maggio, E. (ed.), Enzyme Immunoassay, CRC Press, Boca Raton, Fla., (1980); Ishikawa, E. et al ., (eds.), Enzyme Immunoassay, Kgaku Shoin, Tokyo (1981)]. 항체에 결합되어 있는 효소는, 예를 들어 분광분석, 형광분석에 의해, 또는 시각적 수단에 의해 검출될 수 있는 화학 잔기를 생성하는 방식으로, 적합한 기질, 바람직하게는 색원체 기질과 반응할 것이다. 항체를 검출가능하게 표지하는데 사용될 수 있는 효소에는 말레에이트 데하이드로게나제, 스타필로코칼 누클레아제, 델타-5-스테로이드 아이소머라제, 효모 알코올 데하이드게나제, 알파-글리세로포스페이트, 데하이드게나제, 트리오스 포스페이트 아이소머라제, 양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리 포스파타제, 아스파라기나제, 글루코스 옥시다제, 베타-갈락토시다제, 리보누클레아제, 우레아제, 카탈라제, 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제, 글루코아밀라제 및 아세틸콜린에스테라제가 포함되나, 이로 제한되는 것은 아니다. 또한, 검출은 효소에 대한 색원체 기질을 사용하는 비색법에 의해 달성될 수 있다. 또한, 검출은 유사하게 제조되는 표준물질과 비교하여 기질의 효소적 반응 정도를 시각적으로 비교하여 달성될 수 있다.
또한, 검출은 여러 다른 면역검정 중 어느 하나를 이용하여 달성될 수 있다. 예를 들어, 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체를 방사성 표지시킴으로써, 방사성면역검정 (RIA)을 통해 항체를 검출할 수 있다 [참조: Weintraub, B., Principles of Radioimmunoassays , Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques , The Endocrine Society, (March, 1986), 본원에 참조로 삽입됨]. 방사성 동위원소는 무제한적으로 감마 계수기, 섬광 계수기, 또는 자가방사선술을 포함하는 수단에 의해 검출될 수 있다.
또한, 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 152Eu와 같은 형광 발광 금속, 또는 다른 란타니드 계열을 사용하여 검출가능하게 표지될 수 있다. 이러한 금속은 디에틸렌트리아민펜트아세트산 (DTPA) 또는 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA)과 같은 금속 킬레이트화 그룹을 사용하여 항체에 부착될 수 있다.
다양한 잔기를 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체에 컨쥬게이션시키기 위한 기술은 널리 공지되어 있다 [참조: Arnon et al ., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al . (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. (1985); Hellstrom et al ., "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al . (eds.), Marcel Dekker, Inc., pp. 623-53 (1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al . (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al . (eds.), Academic Press pp. 303-16 (1985), 그리고 Thorpe et al ., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev. 62 (1982), 119-158].
언급된 바와 같이, 특정 양태에서, 결합 분자, 예를 들어 결합 폴리펩타이드, 예를 들어 항체 또는 이의 면역특이적 단편의 안정성 또는 효능을 증진시키는 잔기가 컨쥬게이션될 수 있다. 예를 들어, 일 양태에서, PEG는 생체내 반감기를 증가시키기 위해 본 발명의 결합 분자에 컨쥬게이션될 수 있다 [참조: Leong et al., Cytokine 16 (2001), 106; Adv. in Drug Deliv. Rev. 54 (2002), 531; Weir et al ., Biochem. Soc. Transactions 30 (2002), 512].
VI . 조성물 및 사용 방법
본 발명은 상술된 α-시누클레인 결합분자, 예를 들어 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 이의 유도체 또는 변이체, 또는 본 발명의 폴리뉴클레오타이드, 벡터 또는 세포를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적 조성물의 의도된 사용에 따라 추가의 제제, 예를 들어 인터류킨 또는 인터페론을 포함할 수 있다. 예를 들어, 파킨슨 질환의 치료에서의 사용을 위해, 추가의 제제는 작은 유기 분자, 항-α-시누클레인 항체 및 이의 배합물로 이루어진 그룹 중에서 선택될 수 있다. 따라서, 특히 바람직한 양태에서, 본 발명은 시누클레인병증 질환의 예방적 및 치료적 처치를 위한 약제학적 또는 진단학적 조성물의 제조, 시누클레인병증 질환의 진행 또는 환자에서 시누클레인병증 질환 처리에 대한 반응의 모니터링 또는 시누클레인병증 질환의 발병 위험을 측정하기 위한 본 발명의 α-시누클레인 결합 분자, 예를 들어 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 이와 실질적으로 동일한 결합 특이성을 갖는 결합 분자, 폴리뉴클레오타이드, 벡터 또는 세포의 용도에 관한 것이다.
따라서, 일 양태에서, 본 발명은 신경학적 장애의 치료가 필요한 피험자에게 본 발명의 상술된 α-시누클레인 결합 분자, 항체, 폴리뉴클레오타이드, 벡터 또는 세포의 치료학적 유효량을 투여하는 것을 포함하여 뇌 및 중추신경계 각각에서 α-시누클레인의 비정상적 축적 및/또는 침착으로 특징지어지는 신경학적 장애를 치료하는 방법에 관한 것이다. 용어 "신경학적 장애"는 일반적으로 시누클레인병증 질환, 예를 들어 파킨슨 질환 (PD), 파킨슨 질환 치매 (PDD), 루이 소체 치매 (DLB), 알츠하이머 질환의 루이 소체 변형 (LBVAD), 다발기 계통 위축증 (MSA), 순수 자율신경 부전 (PAF), 뇌에 철 축적을 동반하는 신경변성 제1형 (NBIA-I), 알츠하이머 질환, 픽 질환, 소아-발병 전신 신경축삭 디스트로피 (할러보르덴-슈파츠 질환), 근위축성측삭경화증, 외상성 뇌손상, 다운 증후군, 및 중추신경계 (CNS)의 기타 운동 장애 및 질환을 포함하며, 이로 제한되지 않는다. 달리 언급하지 않는 한, 용어 신경퇴행성, 신경학적 또는 신경정신병 질환은 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
본 발명의 치료적 접근의 특별한 이점은 본 발명의 항체가 파킨슨병의 징후가 없는 나이든 피험자로부터의 B 세포 또는 B 기억 세포로부터 유도되며, 따라서 확실한 개연성으로 임상적으로 명백한 시누클레인병증 질환을 예방할 수 있거나, 임상적으로 명백한 질환의 발병 위험을 감소시킬 수 있거나, 임상적으로 명백한 질환의 발병 또는 진행을 지연시킬 수 있다는 사실에 있다. 일반적으로, 본 발명의 항체는 또한 이미 체세포 성숙 (somatic maturation), 즉 항체의 가변 영역의 신체 변형에 의해 표적 α-시누클레인 분자로의 높은 친화성 결합의 선택성 및 효율성에 대한 최적화를 성공적으로 달성하였다.
생체내에서, 예를 들어 인간에서의 이러한 세포가 자가면역 또는 알레르기 반응에 있어서 관련되어 있거나 그 밖의 생리적 단백질 또는 세포 구조에 의해 활성화되지 않았다는 사실은, 이것이 임상 시험 단계를 통해 성공적으로 생존할 기회를 상당히 증가시키는 것을 나타내기 때문에, 의학적으로 크게 중요하다. 말하자면, 효능, 허용성 및 내성이 1명 이상의 인간 피검자에서 예방적 또는 치료적 항체의 전임상 및 임상 개발 전에 이미 입증된 것이다. 따라서, 본 발명의 인간 항-α-시누클레인 항체에 의해, 치료제로서 항체의 표적 구조-특이적 효능 및 이의 부작용 가능성 감소 둘 모두가 이의 임상 성공 가능성을 상당히 증가시키는 것으로 예상될 수 있다.
또한, 본 발명은 하나 이상의 본 발명의 상술된 성분, 예를 들어 항-α-시누클레인 항체, 이의 결합 단편, 유도체 또는 변이체, 폴리뉴클레오타이드, 벡터 또는 세포로 충전된 하나 이상의 용기를 포함하는 약제학적 및 진단학적 팩 또는 키트를 제공한다. 약 또는 생물학적 생성물의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 기관에 의해 지시되는 형태의 통지가 이러한 용기(들)과 연관될 수 있으며, 상기한 통지는 인간 투여를 위한 제조, 사용 또는 판매 대행사에 의한 승인을 반영한다. 또한 또는 대안적으로, 키트는 적합한 진단 검정에 사용하기 위한 시약 및/또는 사용 설명서를 포함한다. 본 발명의 조성물, 예를 들어 키트는 α-시누클레인의 존재를 동반하는 장애의 위험 평가, 진단, 예방 및 치료에 특히 적합하고, 파킨슨 질환 (PD), 파킨슨 질환 치매 (PDD), 루이 소체 치매 (DLB) 및 알츠하이머 질환의 루이 소체 변형 (LBVAD)의 치료에 특히 적용가능하다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 분야에 널리 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다; 예를 들어, 문헌 [참조: Remington: The Science and Practice of Pharmacy (2000) by the University of Sciences in Philadelphia, ISBN 0-683-306472]을 참조한다. 적합한 약제학적 담체의 예들이 당해 분야에 널리 공지되어 있으며, 인산염 완충된 식염수 용액, 물, 에멀젼, 예를 들어 오일/물 에멀젼, 다양한 유형의 습윤제, 멸균 용액 등을 포함한다. 이러한 담체를 포함하는 조성물은 널리 공지된 통상의 방법으로 제조될 수 있다. 이러한 약제학적 조성물은 피험자에게 적합한 용량으로 투여될 수 있다. 적합한 조성물의 투여는 상이한 방식으로, 예를 들어 정맥내, 복강내, 피하, 근육내, 비강내, 국소 또는 피내 투여 또는 척수 또는 뇌 전달로 수행될 수 있다. 에어로졸 제형, 예를 들어 비 분무 제형은 보존제 및 등장화제와 함께 활성 성분의 정제된 수성 또는 기타 용액을 포함한다. 이러한 제형은 바람직하게는 비 점막에 적합한 pH 및 등장성 상태로 조절된다. 직장 또는 질 투여를 위한 제형은 적합한 담체를 갖는 좌제로 제공될 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 약물을 투여하기 위해 두개골에 작은 구멍을 뚫는 현재의 표준 (그렇지만 다행히도 드문) 절차를 포함하기는 하지만, 바람직한 양태에서, 본 발명의 결합 분자, 특히 항체 또는 항체 기본 약물은 혈관-뇌 장벽을 가로지를 수 있으며, 이는 정맥내 또는 경구 투여를 가능하게 한다.
투여 요법은 주치의 및 임상적 요소에 의해 결정될 것이다. 의학 분야에서 널리 알려져 있는 바와 같이, 임의의 환자에 대한 용량은 환자의 크기, 신체 표면적, 나이, 투여된 특정 화합물, 성별, 투여 시간 및 경로, 전반적인 건강, 및 동시 투여되는 다른 약물을 비롯한 많은 인자에 의존적이다. 전형적인 용량은, 예를 들어 0.001 내지 1000 μg의 범위 (또는 이 범위에서 발현을 위한 또는 발현의 억제를 위한 핵산에 대한 범위)이나, 이러한 예시적 범위 이하 또는 이상의 용량도 특별히 상술된 인자를 고려하여 고려된다. 일반적으로, 용량은, 예를 들어 수용자의 체중에 대해 약 0.0001 내지 100 mg/kg, 보다 일반적으로 0.01 내지 5 mg/kg (예를 들어, 0.02 mg/kg, 0.25 mg/kg, 0.5 mg/kg, 0.75 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg 등)의 범위일 수 있다. 예를 들어, 용량은 체중 kg당 1 mg 또는 10 mg 또는 1 내지 10 mg의 범위, 바람직하게는 1 mg 이상일 수 있다. 또한, 상기 범위 내의 중간 용량도 본 발명의 범위에 포함시키고자 한다. 피험자에게 이러한 용량은 매일, 격일로, 매주 또는 경험적 분석에 의해 결정되는 임의의 다른 스케줄에 따라 투여될 수 있다. 예시적 처리는 연장된 기간에 걸쳐, 예를 들어 적어도 6개월의 연장된 기간에 걸쳐 다수 용량으로의 투여를 포함한다. 추가의 예시적 치료 요법은 격주당 1회 또는 매월 1회 또는 3 내지 6개월당 1회의 투여를 포함한다. 예시적 용량 스케줄은 연속일에 대해서는 1-10 mg/kg 또는 15 mg/kg, 격일에 대해서는 30 mg/kg 또는 매주에 대해서는 60 mg/kg을 포함한다. 일부 방법에서는, 상이한 결합 특이성을 갖는 2개 이상의 모노클로날 항체가 동시에 투여되며, 이 경우 투여되는 각 항체의 용량은 지시된 범위 내이다. 경과는 주기적 평가로 모니터링될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제는 멸균 수성 또는 비수성 용액, 현탁액 및 에멀젼을 포함한다. 비수성 용매의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성유, 예를 들어 올리브유 및 주사가능한 유기산 에스테르, 예를 들어 에틸 올레에이트이다. 수성 담체는 물, 알콜/수성 용액, 에멀젼 또는 현탁액 (식염수 및 완충 매질 포함)을 포함한다. 비경구 운반제는 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로즈, 덱스트로즈 및 염화나트륨, 락테이트화된 링거, 또는 비휘발성 오일을 포함한다. 정맥내 운반제는 유체 및 영양 보충물, 전해질 보충물 (예를 들어, 링거 덱스트로즈에 기초된 것) 등을 포함한다. 보존제 및 기타 첨가제, 예를 들어 항미생물제, 항산화제, 킬레이트화제 및 불활성 가스 등도 존재할 수 있다. 또한, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적 조성물의 의도된 사용에 따라 추가의 제제, 예를 들어 도파민 또는 정신약리학적 약물을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 바람직한 양태에서, 약제학적 조성물은, 예를 들어 본 발명의 약제학적 조성물이 수동 면역화를 위해 항-α-시누클레인 항체 또는 이의 결합 단편, 유도체 또는 변이체를 포함하는 경우, 백신으로 제형화될 수 있다. 배경부에서 설명된 바와 같이, α-시누클레인의 올리고머 종은 혈장 및 CSF에서 세포외적인 것으로 보고되었으며 [참조: El-Agnaf et al ., FASEB J. 20 (2006), 419-425], 파킨슨 질환의 생쥐 모델에서 수동 면역화 조사는 α-시누클레인에 대한 세포외적 생쥐 모노클로날 항체가 세포내적 α-시누클레인 응집체의 축적을 감소시킬 수 있음을 밝혔다 [참조: Masliah et al ., Neuron, 46 (2005), 857-868]. 따라서, 신중하게는 본 발명의 인간 항-α-시누클레인 항체 및 동등한 α-시누클레인 결합 분자가 시누클레인병증 질환, 예를 들어 PD, DLB 및 LBVAD의 예방 또는 개선을 위한 백신으로 특히 유용하다는 것이 예측된다.
일 양태에서, 재조합 세포막을 용이하게 투과할 수도 있는 본 발명의 항체의 Fab (rFab) 및 단쇄 단편 (scFv)을 사용하는 것이 유리할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [참조: Robert et al ., Protein Eng. Des. Sel. (2008) Oct 16; S1741-0134, 온라인 상에서 먼저 공개됨]은 Aβ의 N-말단 영역에 있는 에피토프를 인식하는 모노클로날 항체 WO-2의 키메라 재조합 Fab (rFab) 및 단쇄 단편 (scFv)의 사용을 기술한다. 조작된 단편은 (i) 아밀로이드의 피브릴화를 방지하고, (ii) 미리형성된 Aβ1-42 피브릴을 분해하며, (iii) 전체 IgG 분자와 같이 효과적으로 시험관내에서 Aβ1-42 올리고머-매개된 신경독성을 억제할 수 있었다. 효과기 기능이 없는 작은 Fab 및 scFv 조작된 항체 포맷을 사용하는 것에 대해 인지되는 이점은 혈관-뇌 장벽을 가로지르는 보다 효과적인 통과 및 염증 부작용을 유발하는 위험의 감소를 포함한다. 또한, scFv 및 단일-도메인 항체는 전체 길이 항체의 결합 특이성을 보유한다는 것 이외에, 이들은 폴딩, 상호작용, 변형 또는 이들의 표적물의 세포하 국소화에 대한 변화 가능성과 함께 단일 유전자로서 발현되고 인트라바디 (intrabody)로서 포유동물에서 세포내적으로 발현될 수 있다; 검토를 위해, 예를 들어 문헌 [참조: Miller and Messer, Molecular Therapy 12 (2005), 394-401]을 참조한다.
상이한 접근으로, 문헌 [참조: Muller et al ., Expert Opin. Biol. Ther. (2005), 237-241]은 항체에 해를 끼치지 않으면서 살아있는 세포로의 항체 셔틀링을 가능하게 한다는 기술 플랫폼인 소위 "슈퍼항체 기술"을 기술한다. 이러한 세포-투과 항체는 새로운 진단 및 치료 윈도우를 개시한다. 용어 "TransMab"가 이러한 항체에 대해 만들어졌다.
추가의 양태에서, 시누클레인병증 질환을 치료하는데 유용한 다른 신경보호제의 공동-투여 또는 연속 투여가 바람직할 수 있다. 일 양태에서, 추가의 제제가 본 발명의 약제학적 조성물에 포함된다. 피험자를 치료하는데 사용될 수 있는 신경보호제의 예는 무제한적으로 아세틸콜린에스테라제 억제제, 글루타마터직 (glutamatergic) 수용체 길항제, 키나아제 억제제, HDAC 억제제, 소염제, 디발프로엑스 나트륨 (divalproex sodium) 또는 이들의 배합물을 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물과 함께 사용될 수 있는 신경보호제의 예가 당해 분야에 기술되어 있다; 예를 들어, 국제 출원 WO2007/011907을 참조한다. 일 양태에서, 추가의 제제는 도파민 또는 도파민 수용체 작용제이다.
본 발명의 추가의 양태에서, 본 발명의 α-시누클레인 결합 분자, 특히 항체는 또한 시누클레인병증 질환을 치료하는데 유용한 신경 이식물 또는 줄기 세포 요법과 함께 이식 요법 전후에 공동-투여되거나 투여될 수 있다. 배아 중간뇌 뉴런 이식물을 사용한 이러한 접근이 파킨슨 질환에서 상실되는 뉴런을 대체하고 선조체에서 도파민작동성 신경전달을 회복하고자 파킨슨 질환을 갖는 환자에서 수행되었다. 이식 후 11-16년 후, 이식된 뉴런은 루이 소체 및 루이 신경돌기를 포함하는 것으로 밝혀졌다. 호스트로부터 이식된 조직으로의 α-시누클레인 병리에 대한 확대가 α-시누클레인 결합 분자, 특히 본 발명의 항체의 공동-투여에 의해 방지될 수 있다.
치료학적 유효 용량 또는 유효량은 증상 또는 상태를 개선하기에 충분한 활성 성분의 양을 언급한다. 이러한 화합물의 치료 효능 및 독성은 세포 배양물 또는 실험 동물에서 표준 약제학적 공정, 예를 들어 ED50 (집단의 50%에서 치료학적으로 유효한 용량) 및 LD50 (집단의 50%에 대한 치사 용량)으로 측정될 수 있다. 치료학적 효과와 독성 효과 사이의 용량 비율이 치료 지수이며, 이는 비율 LD50/ED50으로 표현될 수 있다. 바람직하게는, 조성물 중의 치료제는 PD, DLB 또는 다른 시누클레인병증 질환의 경우에 정상적 행동 및/또는 인지 특성을 회복 또는 유지하기에 충분한 양으로 존재한다.
상기한 바로부터, 명백히 본 발명은 특히 상술된 바와 같은 시누클레인 질환, 특히 파킨슨 질환의 진단 및/또는 치료를 위한 상술된 항체의 적어도 하나의 CDR을 포함하는 α-시누클레인 결합 분자의 임의의 용도를 포함한다. 바람직하게는, 상기 결합 분자는 본 발명의 항체 또는 이의 면역글로불린 쇄이다. 또한, 본 발명은 전술된 항체 중 어느 하나의 항-이디오타입 항체에 관한 것이다. 이들은 항원-결합 부위 근처의 항체 가변 영역에 위치되는 독특한 항원 펩타이드 서열에 결합하는 항체 또는 다른 결합 분자이며, 예를 들어 피험자 샘플 중의 항-α-시누클레인 항체의 검출에 유용하다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 전술된 α-시누클레인 결합 분자, 항체, 항원-결합 단편, 폴리뉴클레오타이드, 벡터 또는 세포 중 어느 하나 및 임의로 검출에 적합한 수단, 예를 들어 면역 또는 핵산 기초한 진단법에 통상적으로 사용되는 시약을 포함하는 진단 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 항체는, 예를 들어 액체상으로 사용되거나 고체상 담체에 결합될 수 있는 면역검정에서의 사용을 위해 조절된다. 본 발명의 항체를 사용할 수 있는 면역검정의 예는 직접적 또는 간접적 포맷의 경쟁적 및 비-경쟁적 면역검정이다. 이러한 면역검정의 예는 방사성면역검정 (RIA), 샌드위치 (면역측정 검정), 유도 세포측정 및 웨스턴 블롯 검정이다. 항원 및 본 발명의 항체는 많은 상이한 담체에 결합될 수 있으며, 이에 특이적으로 결합된 세포를 분리하는데 사용될 수 있다. 널리 공지된 담체의 예는 유리, 폴리스티렌, 폴리비닐 클로라이드, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리카보네이트, 덱스트란, 나일론, 아밀로즈, 천연 및 개질 셀룰로즈, 폴리아크릴아미드, 아가로즈 및 마그네타이트를 포함한다. 담체의 특성은 본 발명의 목적상 가용성 또는 불용성일 수 있다. 당업자에게 공지된 많은 상이한 표지물 및 표지 방법이 있다. 본 발명에 사용될 수 있는 표지물 유형의 예는 효소, 방사성 동위원소, 콜로이드성 금속, 형광 화합물, 화학발광 화합물 및 바이오발광 화합물을 포함한다; 또한 상기 논의된 양태도 참조한다.
추가의 양태로서, 본 발명의 α-시누클레인 결합 분자, 특히 항체는 또한 혈액 샘플, 림프 샘플 또는 다른 체액 샘플일 수 있는 시험 개체로부터의 체액 샘플을 수득하고, 이러한 체액 샘플을 본 발명의 항체와 항체-항원 복합체의 형성을 가능하게 하는 조건 하에서 접촉시킴으로써, 개체에서 장애를 진단하는 방법에 사용될 수 있다. 이어서, 이러한 복합체의 수준은 당해 분야에 공지된 방법으로 측정되며, 대조군 샘플에서 형성되는 수준 보다 상당히 높은 수준은 시험 개체에서 질환을 나타낸다. 동일한 방식으로, 본 발명의 항체에 의해 결합되는 항원도 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 결합 분자, 예를 들어 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 시험관내 면역검정에 관한 것이다.
이와 관련하여, 본 발명은 또한 이러한 목적으로 특별히 디자인된 수단에 관한 것이다. 예를 들어, α-시누클레인을 특이적으로 인식하는 본 발명의 항체 또는 동등한 항원-결합 분자로 로딩된 항체-기초된 어레이가 사용될 수 있다. 마이크로어레이 면역검정의 디자인은 문헌 [참조: Kusnezow et al ., Mol. Cell Proteomics 5 (2006), 1681-1696]에 요약되어 있다. 따라서, 본 발명은 또한 본 발명에 따라 확인되는 α-시누클레인 결합 분자로 로딩된 마이크로어레이에 관한 것이다.
일 양태에서, 본 발명은
(a) 본 발명의 항체, 이의 α-시누클레인 결합 단편 또는 이와 실질적으로 동일한 결합 활성을 갖는 α-시누클레인 결합 분자를 사용하여 진단될 피험자로부터의 샘플 중에 존재하는 α-시누클레인의 수준을 평가하는 단계; 및
(b) α-시누클레인의 수준을 하나 이상의 대조 피험자에서의 α-시누클레인의 수준을 나타내는 기준 표준물 (reference standard)과 비교하는 단계를 포함하며, 이때 α-시누클레인의 수준과 기준 표준물의 수준 사이의 차이 또는 유사성이 피험자가 파킨슨 질환을 갖는다는 것을 나타내는, 피험자에서 시누클레인병증 질환을 진단하는 방법에 관한 것이다.
진단될 피험자는 질환에 대해 무증상 또는 잠복기일 수 있다. 바람직하게는, 대조 피험자는 시누클레인병증 질환, 예를 들어 PD, DLB 또는 LBVAD을 가지며, 이때 α-시누클레인 수준과 기준 표준물 수준 사이의 유사성은 진달될 피험자가 시누클레인병증 질환을 갖는다는 것을 나타낸다. 대안적으로, 또는 추가로, 제2 대조로서 대조 피험자는 시누클레인병증 질환을 갖지 않으며, 이때 α-시누클레인 수준과 기준 표준물 수준 사이의 차이는 진달될 피험자가 시누클레인병증 질환을 갖는다는 것을 나타낸다. 바람직하게는, 진단될 피험자 및 대조 피험자(들)는 나이를 비슷하게 한다. 분석될 샘플은 α-시누클레인을 포함하는 것으로 의심되는 임의의 체액, 예를 들어 혈액, CSF 또는 소변 샘플일 수 있다.
α-시누클레인의 수준은, 예를 들어 웨스턴 블롯, 면역침전, 효소-결합된 면역흡착 검정 (ELISA), 방사성면역검정 (RIA), 형광 활성화된 세포 분류 (FACS), 이차원 겔 전기영동, 질량 분광분석 (MS), 매트릭스 - 보조 레이저 탈착 / 이온화 시간 - 비행 질량 분석계 (MALDI-TOF), 표면-강화 레이저 탈착 이온화 시간 - 비행 분석계 (SELDI-TOF), 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC), 다차원 액체 크로마토그래피 (LC)에 이은 직렬식 질량 분광분석 (MA/MS) 및 레이저 농도계측으로부터 선택되는 하나 이상의 기술에 의한 α-시누클레인 분석을 포함하는 당해 분야에서 공지된 임의의 적합한 방법으로 평가될 수 있다. 바람직하게는, α-시누클레인의 생체내 영상화는 양전자 방사 단층촬영법 (PET), 단일 광자 방사 단층촬영법 (SPECT), 근적외선 (NIR) 광학 영상화 또는 자기 공명 영상화 (MRI)을 포함한다.
본 발명에 따라 변형될 수 있는 항체 및 관련 수단을 사용하여 시누클레인병증 질환, 예를 들어 파킨슨 질환 또는 루이 소체 질환을 진단하고, 시누클레인 질환 진행을 모니터링하며, 시누클레인병증 질환 치료를 모니터링하는 방법이 또한 국제 출원 WO2007/011907에 기술되어 있다. 마찬가지로, α-시누클레인에 대한 항체-기초 검출 방법이 국제 출원 WO99/50300, WO2005/047860, WO2007/021255 및 WO2008/103472 (모든 기술 내용이 본원에 참조로 삽입됨)에 기술되어 있다. 이러한 방법이 본 발명의 α-시누클레인 특이 항체, 결합 단편, 유도체 또는 변이체를 사용하는 것을 제외하고, 기술되어 있는 바와 같이 적용될 수 있다.
상기 및 그 밖의 양태가 본 발명의 상세한 설명 및 실시예에 기술되고 이에 포함된다. 본 발명에 따라 사용되는 물질, 방법, 용도, 및 화합물 중 어느 하나와 관련된 추가의 문헌은, 예를 들어 전자 장치를 사용하여 공공 도서관 및 데이터베이스로부터 찾을 수 있다. 예를 들어, 기관 (the National Center for Biotechnology Information 및/또는 the National Library of Medicine at the National Institutes of Health)에서 주관하는, 공용 데이터베이스 "Medline"이 이용될 수 있다. EMBL (European Molecular Biology Laboratory)의 파트인 EBI (European Bioinformatics Institute)의 데이터베이스 및 웹 주소와 같은 추가의 데이터베이스 및 웹 주소가 당업자들에게 공지되어 있으며, 인터넷 검색 엔진을 사용하여 얻어질 수 있다. 회고적 검색 및 현행 주지에 유용한 특허 정보에 대한 관련 자료의 조사 및 생명공학의 특허 정보 개요는 문헌 [참조: Berks, TIBTECH 12 (1994), 352-364]에 제시되어 있다.
상기 기재는 본 발명을 일반적으로 기술한 것이다. 다르게 명시되지 않는 한, 본원에 사용되는 용어는 사전 (Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology, Oxford University Press, 1997, 2000 개정, 2003 재발행, ISBN 0 19 850673 2)에 있는 정의에 따른다. 수개의 문헌이 본 명세서의 본문에 인용된다. 완전한 서지 인용은 청구 범위 바로 앞의 명세서 끝에서 찾아볼 수 있다. 모든 인용된 문헌(본 출원 전반에 인용된 참조 문헌, 등록 특허, 공개된 특허 출원, 제조업자의 설명서, 지시서 등을 포함)의 내용은 명백히 본원에서 참고로 삽입되지만, 인용된 임의의 문헌이 실제로 본 발명에 대한 선행 기술이라는 것은 아니다.
본 발명은 본원에서 단지 예시적 목적으로 제시되는 하기 특정 실시예를 참조하여 더욱 완전하게 이해될 수 있으며, 본 발명의 범위를 이로 제한하려는 것은 아니다.
실시예
하기 실시예는 본 발명을 더욱 설명하며, 어떠한 경우에도 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 간주되지 않아야 한다. 실시예 1 및 2에서의 하기 실험은 클로닝된, 즉 프레임웍 1 Ig-가변 영역의 바로 N-말단에 프라이머 유도된 돌연변이를 포함하고 인간 가변 중쇄 및 경쇄의 생식계열 (GL) 서열에 적응되지 않은, 항체 NI-202.3G12, NI-202.12F4, 및 NI-202.3D8에 대해 예시되고 기술된다; 도 1을 참조한다. 그러나, NI-202 시리즈의 다른 항체, 특히 적응된 GL 서열을 갖는 항체가 구조적으로 유사하므로, 필적하는 결과를 제공할 것으로 예상될 수 있다. 이들 항체는 인간 IgG1 분자로 발현되었다. 실시예 3 및 4의 실험은 인간 가변 중쇄 및 경쇄의 생식계열 (GL) 서열에 적응된 Ig-가변 영역의 N-말단에 프라이머 유도된 돌연변이를 갖는 항체 NI-202.12F4에 대해 예시되고 기술된다. 이 항체는 적응된 인간 가변 도메인을 생쥐 IgG2a 불변 영역에 융합시킨 키메라 분자로 발현되어 유전자도입 생쥐 모델에서 생쥐 항-인간 면역 반응의 유도 없이 장기 투여 조사가 가능하게 하였다.
재료 및 방법
통상적인 방법, 예를 들어 본원에서 이용되는 방법들에 대한 상세한 설명은 인용된 문헌에서 찾을 수 있다. 하기에서 달리 지시하지 않는 한, α-시누클레인-특이적 B 세포의 동정 및 목적하는 특이성을 나타내는 α-시누클레인 항체의 분자 클로닝 및 이들의 재조합 발현 및 기능 평가는 WO2008/081008로 공개된 국제 출원 PCT/EP2008/000053 (전부 본원에 참조로 삽입됨)의 실시예 및 보충적 방법 부분에서 기술된 바와 같이 수행되거나 수행될 수 있다.
항원의 정제
재조합 His-α-시누클레인은 에스케리키아 콜라이 (Escherichia coli)에서 재조합적으로 발현한 후, 열 유도된 침전, 니켈 친화-, 음이온 교환- 및 크기 배재-크로마토그래피를 이용하여 정제되었다.
예를 들어, T7 프로모터의 조절 하에 α-시누클레인을 암호화하는 cDNA를 포함하는 DNA 작제물을 사용하여 적합한 에스케리키아 콜라이 균주, 예를 들어 BL21(DE3)를 형질전환시키고, 200 ml 세포 배양물의 발현을 1 mM 이소프로필 β-D-티오갈락토피라노사이드 (IPTG)를 첨가하여 유도하였다. 37℃에서 4시간 유도후 세포를 수거하고, 20 ml 50mM Tris, 150 mM NaCl pH 8에 재현탁시킨 후, 음파처리하였다. 15분 동안 끓인 후, 내열성의 17000g 상등액을 수집하였다. 모의 (mock) 에스케리키아 콜라이로부터의 유사한 내열성 17000g 상등액을 수집하였다. His-태그 α-시누클레인을 발현하는 에스케리키아 콜라이로부터의 내열성 17000g 상등액을 50 mM Tris, 300 mM NaCl, 20 mM 이미다졸, pH 8에 대해 적응시킨 후, HisTrap HP 1ml (GE Life Science) 컬럼에 로딩하고, HIS-α-시누클레인을 30-500mM 이미다졸 구배로 용출하였다. HIS-α-시누클레인을 포함하는 분획을 푸울링한 후, 50 mM Tris pH 8로 1:10 희석하였다. 희석된 푸울링 분획을 HiTrap Q HP 1ml (GE Life Science) 컬럼에 적용시키고, 결합된 단백질을 30-1000 mM NaCl 구배에서 용출하였다. 마지막으로, HIS-α-시누클레인을 포함하는 용출물을 고성능 겔 여과 (Superdex 200 10/300 GL)를 이용하여 더욱 정제하였다. 이러한 정제 절차로 SDS-PAGE 및 코마시 염색으로 평가시 약 99% 순도 등급의 HIS-α-시누클레인을 수득하였다. 정제된 단백질의 농도를 BCA 검정 (Pierce)으로 측정하였다.
α- 시누클레인 항체 스크리닝
96 웰 1/2 면적 마이크로플레이트 (Corning)를 코팅 완충액 (PBS pH 9.6) 중의 2μg/ml의 표준 농도로 정제된 HIS-α-시누클레인 또는 α-시누클레인 (rPeptide)로 하룻밤동안 4℃에서 코팅하였다. 플레이트를 PBS-T pH 7.6 중에서 세척하고, 비-특이적 결합 부위를 2% BSA (Sigma, Buchs, Switzerland)를 포함하는 PBS-T로 RT에서 1시간 동안 차단하였다. B 세포 조건 조절된 배지를 1% BSA 중의 10% 내열성 대장균 단백질로 RT에서 1시간 동안 예비흡수시켰다. 이러한 예비흡수 단계는, 인간 α-시누클레인 특이 항체를 동정하는데 있어서 ELISA 스크리닝에 대한 수회의 이전 시도들이 실패한 후, 개발되었다. 따라서, 다행히도, ELISA 플레이트의 내열성 대장균 단백질로의 예비흡수가 가성 양성 히트, 예를 들어 점착성 항체 및 아마도 정제된 재조합 α-시누클레인 샘플에 존재하는 대장균 단백질 오염물에 대해 지시되는 항체에 대한 스크리닝을 배제시키는 것으로 판명되었다. 이어서, 예비흡수된 배지를 기억 B 세포 배양 플레이트로부터 ELISA 플레이트로 옮기고, RT에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. ELISA 플레이트를 PBS-T로 세척한 후, 서양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP)-컨쥬게이션된 당나귀 항-인간 IgG (Fcγ 단편 특이적) 폴리클로날 항체와 함께 인큐베이션하였다. PBS-T로 세척한 후, 인간 항체의 결합을 표준 비색 검정으로 HRP 활성을 측정함으로써 결정하였다.
α- 시누클레인 항체의 분자 클로닝
기억 B 세포를 포함하는 샘플을 60세 초과의 지원자로부터 수득하였다. 모든 지원자는 공통적으로 파킨스 징후가 없었다. 선택된 기억 B 세포 배양물의 살아있는 B 세포를 수거하고, mRNA를 제조하였다. 이어서, 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 서열을 3' 프라이머로서 모든 인간 J 절편 (중쇄 및 카파 경쇄) 및 C 절편 (람다 경쇄)에 대해 특이적인 프라이머와 함께. 5' 프라이머로서 모든 인간 가변 중쇄 및 경쇄 패밀리에 대한 Ig-프레임웍 1 특이적 프라이머를 사용하여 수득하였다 [참조: Marks et al., Mol. Biol. 222 (1991), 581-597; de Haard et al ., J. Biol. Chem. 26 (1999), 18218-18230].
목적하는 특이성을 갖는 항체 클론의 동정은 완전한 항체의 재조합 발현 시 ELISA에서 재-스크리닝하여 수행하였다. 완전한 인간 IgG1 항체 또는 키메라 IgG2a 항체의 재조합 발현은, 적합한 불변 도메인(들)을 암호화하는 서열과 함께 5'-말단 및 3'-말단에서 리더 펩타이드를 암호화하는 서열로 가변 영역 서열을 보완하는 발현 벡터에 "정확한 판독 프레임으로" 가변 중쇄 및 경쇄 서열을 삽입함으로써 달성되었다. 이러한 목적상, 프라이머는 가변 중쇄 및 경쇄 서열의 항체 발현 벡터로의 클로닝을 용이하게 하도록 고안된 제한 부위들을 포함하였다. 중쇄 면역글로불린은 면역글로불린 중쇄 RT-PCR 생성물을 신호 펩타이드 및 인간 면역글로불린 감마 1 또는 생쥐 면역글로불린 감마 2a의 불변 도메인을 갖는 중쇄 발현 벡터에 프레임으로 삽입함으로써 발현되었다. 카파 경쇄 면역글로불린은 NI-202.3D8의 카파 경쇄 RT-PCR-생성물을 신호 펩타이드 및 인간 카파 경쇄 면역글로불린의 불변 도메인을 제공하는 경쇄 발현 벡터에 프레임으로 삽입함으로써 발현되었다. NI-202.12F4 및 NI-202.3G12 람다 경쇄 면역글로불린은 람다 경쇄 RT-PCR 생성물을 신호 펩타이드 및 인간 또는 생쥐 람다 경쇄 면역글로불린의 불변 영역을 제공하는 람다 경쇄 발현 벡터에 프레임으로 삽입함으로써 발현되었다.
작용성 재조합 모노클로날 항체는 Ig-중쇄 발현 벡터 및 카파 또는 람다 Ig-경쇄 발현 벡터를 HEK293 또는 CHO 세포 (또는 인간 또는 생쥐 기원의 다른 적합한 수용 세포주)로 트랜스펙션시킴으로써 수득되었다. 이어서, 재조합 인간 모노클로날 항체를 표준 단백질 A 컬럼 정제를 이용하여 조건 조절된 배지로부터 정제하였다. 재조합 인간 모노클로날 항체는 일시적으로 또는 안정하게 트랜스펙션된 세포를 사용하여 비제한량으로 생성될 수 있다. 재조합 인간 모노클로날 항체를 생성하는 세포주는 Ig-발현 벡터를 사용하거나 Ig-가변 영역을 상이한 발현 벡터로 재-클로닝하여 확립될 수 있다. 또한, 유도체, 예를 들어 F(ab), F(ab)2 및 scFv는 이들 Ig-가변 영역들로부터 생성될 수 있다.
항체
토끼 폴리클로날 팬 시누클레인 항체 (Abcam), 생쥐 모노클로날 LB509 α-시누클레인 특이적 항체 (Invitrogen), 항체 Syn211 (Sigma) 및 클론 42 (BD Biosciences)를 제작자의 프로토콜에 따라 사용하였다. 재조합 인간 α-시누클레인 항체 NI202.3G12, NI202.12F4 및 NI-202.3D8이 본 발명의 항체이다. 이들을 HEK293 또는 CHO 세포에서 발현시킨 후, 달리 지시되지 않는 한, 조건 조절된 배지를 후속 적용에 직접적으로 사용하였다. 실시예 3 내지 5에서, 본 발명의 정제된 재조합 항체를 사용하였다.
직접적 ELISA
항원을 PBS pH 9.6 중의 지시된 농도로 96 웰 1/2 면적 마이크로플레이트 (Corning)에 하룻밤동안 4℃에서 코팅하였다. 플레이트를 PBS-T pH 7.6에서 세척하고, 비-특이적 결합 부위를 1시간 동안 RT에서 2% BSA (Sigma)를 포함하는 PBS-T로 차단하였다. 이어서, 프로브 (일차 항체)를 웰에 옮긴 후, 2시간 동안 RT에서 인큐베이션하였다. PBS-T pH 7.6에서 세척한 후, 웰을 서양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP)-컨쥬게이션된 폴리클로날 항-인간 (재조합 인간 항체에 대해), 항-토끼 (팬 시누클레인 항체에 대해) 또는 항-생쥐 (LB509 또는 Syn211에 대해) 이차 항체와 함께 1시간 동안 RT에서 인큐베이션하였다. PBS-T에서 격렬히 세척한 후, 프로브의 결합을 색원체 기질로서 3,3',5,5'-테트라메틸비페닐-4,4'-디아민 (Sigma)을 사용하는 표준 비색 검정으로 HRP 활성을 측정함으로써 결정하였다.
웨스턴 블롯팅 및 코마시 단백질 염색
인간 및 생쥐 α-시누클레인에 대한 결합을 평가하기 위해서, 야생형 또는 α-시누클레인 유전자도입 생쥐의 냉동 뇌를 Dounce 호모게나이저를 사용하여 PBS (10 ml/g 습윤 중량) 중에서 분쇄하였다. 추출물을 100,000 g로 회전시키고, 상등액을 가용성 분획으로 표시하였다. 가용성 분획 또는 재조합 단백질 (750 ng)을 로딩 염료와 혼합하고, 10분 동안 65℃에서 가열한 후, 레인 당 0.75 μg을 로딩하고, 4-20% Tris-글리신 SDS-PAGE에서 분리하였다. 겔을 0.025% 코마시 브릴런트 블루 R 250 (Fluka) 용액에서 염색하거나 니트로셀룰로즈 전달 막으로 전기블롯팅하였다. 이어서, 블롯을 일차 항체와 2시간 동안 인큐베이션하였다. 일차 항체의 결합을 HRP와 컨쥬게이션된 이차 항 인간 항체를 사용하여 가시화하였다. 블롯을 ECL 및 웨스턴 블롯팅 검출 시약 (GE Healthcare)을 사용하여 전개시켰다.
α-시누클레인 단량체 및 응집체에 대한 결합을 평가하기 위해서, 뇌 추출물을 0.5% Triton X100을 포함하는 PBS에 준비한 후, 1000 g에서 5분 동안 원심분리하였다. 상등액을 4-12% Bis-Tris NuPAGE 겔 전기영동으로 분리시킨 후, WB로 분석하였다.
장대 ( pole ) 시험
생쥐를 이들이 가장 활동적인 어둠 시기가 시작할 때 시험하였다. 장대는 오르는 것이 용이하도록 천으로 덮은 길이 50 cm 및 폭 1 cm의 나무로 된 막대로 만들었다. 장대의 기초부는 생쥐의 본 우리에 놓았다. 생쥐를 장대의 상단에 놓고, 30분의 시행 간 간격으로 5회의 시도에 걸쳐 아래로 향하는 시간 및 본 우리로 기어 내려오는 시간을 기록하였다. 최상의 이행 시도를 분석하였다.
고가 플러스 미로 시험
생쥐를 이들이 가장 활동적인 어둠 시기가 시작할 때 시험하였다. 시험은 희미한 조명 (40 lux)에서 수행하였다. 고가 플러스 미로는 2개의 개방 암 및 2개의 폐쇄 암 (암 길이: 30 cm; 폭: 5 cm)으로 구성된다. 개방 암은 작은 1 cm 모서리를 갖고, 폐쇄 암은 15 cm 벽에 접해진다. 임무를 시작할 때, 생쥐를 개방 암과 마주하는 고가 플러스 미로의 중심에 놓았다. 5분 동안 미로를 답사하면서 생쥐를 비디오-추적하였다. 개방 및 밀폐 암에서 소비된 시간 및 커버된 거리를 측정하고 분석하였다.
유전자도입 생쥐
B6;C3-Tg(Prnp-SNCA*A53T)83Vle/J (Giasson et al ., Neuron. 34 (2002), 521-533) 유전자도입 α-시누클레인 생쥐 및 상응하는 야생형 생쥐를 사료 및 물에 자유로이 접근하게 하고 12h:12h의 낮/밤 주기를 교대하면서 표준 하우징 조건 하에 두었다. 처리 그룹의 나이 및 성별에 균형을 맞추었다.
생쥐 혈장 중 NI -202.12F4 및 α- 시누클레인 수준의 결정
NI-202.12F4 혈장 수준을 표준물로서 공지된 농도의 재조합 NI-202.12F4를 사용하여 직접적인 α-시누클레인 ELISA로 측정하였다. 혈장 중의 인간 α-시누클레인 수준을 측정하기 위해서, 샌드위치 ELISA를 적용하였다 (Invitrogen, USA).
실시예 1: 상이한 에피토프 특이성을 갖는 인간 α- 시누클레인 -특이 항체의 동정
α-시누클레인은 3개의 도메인으로 구성된 140개 아미노산 (aa) 길이의 천연적으로 폴딩되지 않은 단백질이다. 이들은 N-말단 양친매성 반복 영역 (1-60 aa), 중심 영역 (61-95 aa) 및 산성 C-말단 영역 (96-140)이다. 재조합 인간 α-시누클레인 항체의 특이성을 더욱 이해하기 위해서, 인지 서열을 포함하는 α-시누클레인의 도메인을 결정하였다. α-시누클레인 절단물 1-60 aa, 1-95 aa, 61-140 aa 및 96-140 aa를 동일 농도로 ELISA 플레이트에 코팅한 후, 재조합 인간 α-시누클레인 자가항체 NI-202.3G12 및 NI-202.12F4를 이들 절단물에 대한 결합에 대해 탐침하였다.
흥미롭게도, NI-202.3G12는 단지 전체 길이의 α-시누클레인에만 결합하고 시험된 절단물 중 어느 것에도 결합하지 않는다 (도 2A). 이는 NI-202.3G12의 인지 에피토프가 선형의 일차 인지 서열보다는 구조적 모티프라는 것을 제시한다.
다른 한편으로, NI-202.12F4는 aa 1-60를 포함하는 α-시누클레인 단편에 결합하나 (도 2B), 아미노산 61-140 또는 96-140를 포함하는 N-말단 절단 단편에는 결합하지 않는다. 이는 이의 에피토프가 N-말단에 위치된다는 것을 나타낸다. 특히, 병적 봉입체에 있는 α-시누클레인에 선택적으로 결합하는 생쥐 모노클로날 항체의 평가는, 이들의 에피토프가 바로 N-말단 절편 내에 있음을 보였다 [참조: Waxman et al ., Acta Neuropathol. 116 (2008), 37-46].
또한, 항체 NI-202.3D8로 수행된 직접적 ELISA 검정의 예비적 결과는, NI-202.3D8이 α-시누클레인의 C-말단, 특히 아미노산 96-140을 특이적으로 인식한다는 것을 보였다. C-말단 도메인 내의 주요 아미노산 125-140의 결실은 α-시누클레인 응집체를 크게 변화시키며, 루이 소체 질환 (LBD)을 갖는 치매 환자의 뇌 및 유전자도입 동물 모델에서는 C-말단 α-시누클레인 단편의 과다 축적이 있다. 이러한 조사는 C-말단 영역을 인식할 수 있는 항체가 잠재적인 치료 효과를 가질 수 있다는 것을 제시한다 [참조: Masliah et al ., Neuron, 46 (2005), 857-868].
절단물을 포함하는 C-말단 α-시누클레인이 ELISA 플레이트에 효과적으로 코팅되지 않는다는 것을 배제시키기 위해서, 생쥐 모노클로날 알파 시누클레인 항체 LB509의 에피토프 맵핑 [참조: Baba et al ., Am. J. Pathol. 152 (1998), 879-884]을 수행하였다. LB509는 C-말단 에피토프에 결합한다 [참조: Jakes et al ., Neuroscience Letters 269 (1999), 13-16]. 도 2C에 나타난 바와 같이, 이 조사는 LB509의 C-말단 에피토프를 확증하며, 따라서 C-말단 α-시누클레인 단편의 효과적인 코팅을 확증한다. 결론적으로, 본 발명에 따라 수행된 실험에서 재조합 인간 α-시누클레인의 에피토프 맵핑은 이들 항체가 구조적 에피토프를 포함하는 상이한 에피토프 및 N-말단 및 C-말단에 있는 잠재적인 병적 구조에 대해 지시된다는 것을 나타낸다.
실시예 2: 인간 항체는 α- 시누클레인에 특이적이다
α-, β- 및 γ-시누클레인은 신경계, 골격근 및 심장에서 주로 발현되는 매우 상동성인 단백질이다. 그러나, 단지 비정상적인 α-시누클레인은 광범위한 스펙트럼의 CNS 질환과 연결되며, β-시누클레인은 α-시누클레인 응집의 억제제인 것으로 제안되며 α-시누클레인의 신경독성 효과로부터 중추신경계를 보호할 수 있다. 따라서, 병적 α-시누클레인 변이체에 대한 (치료) 항체는 β- 및 γ-시누클레인과 우선적으로 교차 반응하지 않는다. 재조합 인간 항-α-시누클레인 항체의 특이성 및 잠재적인 치료적 이용을 지지하기 위해서, 후보 항체를 직접적인 ELISA 검정에서 및 웨스턴 블롯팅 (WB)에 의해 α-, β- 및 γ-시누클레인 결합에 대해 탐침하였다. 먼저, 재조합 α-, β- 및 γ-시누클레인을 동일 코팅 농도 (2μg/ml) 로 ELISA 플레이트에 코팅한 후, 팬 시누클레인 대조 항체 또는 재조합 인간 α-시누클레인 항체와 인큐베이션하였다. 팬 시누클레인 항체는 ELISA 플레이트에 코팅된 모든 3가지 시누클레인 단백질과 반응한다 (도 3A). 이어서, 재조합 인간 α-시누클레인 항체를 특이적인 α-시누클레인 결합에 대해 탐침하였다. NI-202.3G12 및 NI-202.12F4 모두 코팅된 α-시누클레인과 반응하나, β- 및 γ-시누클레인과는 반응하지 않는다 (도 3A 및 3B).
유사하게, 또한 재조합 항체의 특이성을 WB 분석을 이용하여 조사하였다. 코마시 단백질 염색은 동일 농도의 모든 3가지 시누클레인 단백질이 SDS PAGE 분석에 적용되었다는 것을 확증한다 (도 4A). 이어서, WB 분석은 NI-202.12F4는 α-시누클레인에 선택적으로 결합하는 반면 (도 4B), 일차 항체 없이는 어떠한 신호도 검출되지 않았다는 것을 보인다 (도 4C). WB에서 α-시누클레인에 대한 NI-202.3G12 결합은 검출가능하지 않았다. 이는 NI-202.3G12의 선형 인지 서열보다는 구조적 에피토프와 일치한다. 이러한 발견은 본원에 기술된 재조합 인간 알파 시누클레인 항체가 고도록 특이적일 수 있다는 것을 입증한다.
모든 후속 실험들은 NI-202.12F4 생쥐 키메라 항체로 수행되었다.
실시예 3: 항체 NI -202.12F4의 결합 특이성
응집된 α- 시누클레인 종에 대한 선호도와 함께 인간 α- 시누클레인에 대한 특이적 결합
NI-202.12F4의 인간 및 생쥐 α-시누클레인에 대한 결합을 평가하기 위해서, 야생형 및 α-시누클레인 A53T 유전자도입 생쥐로부터 뇌 추출물을 준비하고, 항체 결합을 웨스턴 블롯팅으로 분석하였다. NI-202.12F4는 인간 A53T α-시누클레인 유전자도입 생쥐로부터의 뇌 추출물에 있는 α-시누클레인에 상응하는 두드러진 밴드를 검출하며, 이러한 밴드가 야생형 생쥐로부터의 뇌 추출물에서는 실질적으로 부재하며 (도 5A 참조), 이는 생쥐 α-시누클레인에 대해서가 아닌 인간에 대한 특이적 결합을 제시한다. 유사한 결과가 인간 α-시누클레인에 대해 특이적인 에피토프에 대해 지시되는 시판되는 LB509 항체 [참조: Jakes et al ., Neuroscience Letters 269 (1999), 13-16]로 수득되었다. 대조적으로, 두 종 모두의 α-시누클레인에 결합하는 것으로 보고된 시판 항체 클론 42 [참조: van der Putten et al ., J. Neurosci. 20 (2000), 6021-6029]는 인간 및 생쥐 α-시누클레인 단백질을 검출하였다. 이러한 자료는 NI-202.12F4가 인간 α-시누클레인에 우선적으로 결합한다는 것을 제시한다.
NI-202.12F4의 인간 α-시누클레인의 생리학적 형태 및 병적 응집체에 대한 결합을 평가하기 위해서, 건강한 대조 피험자 및 루이 소체 치매 (DLB) 환자로부터의 피질 뇌 추출물, 및 야생형 생쥐 및 인간 A30P α-시누클레인 유전자도입 생쥐 뇌로부터의 추출물 [참조: Kahle et al . J. Neurosci. 20 (2000), 6365-73]을 제조하고, SDS 겔 전기영동으로 분리시킨 후, 웨스턴 블롯팅으로 분석하였다. NI-202.12F4는 DLB 및 A30P α-시누클레인 유전자도입 뇌 추출물에서 α-시누클레인 응집체의 올리고머 및 피브릴 형태를 반영하는 두드러진 도말 (smear)을 고감도로 검출하나 건강한 대조 추출물 및 야생형 대조 추출물에서는 검출하지 못한다 (도 5B 참조). 대조적으로, 최초 결합은 인간 또는 야생형 생쥐 조직에서의 α-시누클레인의 단량체 형태에 대해 관측되었으며, α-시누클레인 단백질을 고도로 과발현하는 A30P α-시누클레인 유전자도입 뇌 추출물에서는 중등도 결합이 관측되었다. 대조적으로, 클론 42 항체는 웨스턴 블롯 분석에서 반대의 결합 패턴을 보였으며, 단량체 형태 및 α-시누클레인 단편을 고감도로 검출하고 응집된 α-시누클레인 종에 대해 저조한 결합을 보였다. 이들 결과는 NI-202.12F4가 생리학적 α-시누클레인 단량체에 비해 α-시누클레인의 병적 응집체, 예를 들어 올리고머 및 피브릴에 우선적으로 결합한다는 것을 제시한다.
NI -202.12F4은 인간 알파 시누클레인의 야생형 및 질병 유발 돌연변이체에 고친화도로 결합한다.
1/2 최대 유효 농도 (EC50)를 직접적인 α-시누클레인 ELISA를 이용하여 야생형 및 질병 유발 인간 α-시누클레인에 대해 측정하였다. 고친화 결합이 인간 α-시누클레인의 야생형 및 A30P, E46K 및 A53T 돌연변이체에 대해 관측되었다 (도 6).
재조합 NI -202.12F4는 뇌에서 α- 시누클레인의 병적 형태에 우선적으로 결합한다.
NI-202.12F4의 α-시누클레인에 대한 결합을 α-시누클레인 유전자도입 생쥐 및 신경병리학적으로 확인된 파킨슨 질환 또는 루이 소체 치매를 갖는 환자로부터의 뇌 절편에 대한 면역조직화학 염색으로 더욱 특징분석하였다. NI-202.12F4는 루이 소체 및 루이 신경돌기 유사 봉입체를 포함하는 α-시누클레인 병리 및 인간 A53T (도 7A) 또는 A30P α-시누클레인 (도 7B)을 발현하는 유전자도입 생쥐로부터의 자유-부유 섹션 및 파킨슨 질환 및 루이 소체 치매 (도 7C, 7D)에서 α-시누클레인의 작은 세포체수상돌기 및 시냅스 축적물에 대해 두드러진 염색을 보인다. 생리학적 시냅스 α-시누클레인도 고감도로 검출하는 시판되는 Syn211 항체 [참조: Giasson et al ., J. Neurosci. Res. 59 (2000), 528-33]와는 대조적으로 (도 7E), NI-202.12F4는 인간 A30P α-시누클레인 유전자도입 생쥐의 면역조직화학 염색에 의해 예시되는 바와 같이 (도 7B) α-시누클레인의 병적 응집체에 대해 우선적으로 결합한다. NI-202.12F4의 결합이 야생형 생쥐의 뇌 절편에서는 실질적으로 부재하고 (도 7F) 이차 항체 단독 대조 염색 (도 7G)에 필적하며, 이는 웨스턴 블롯 분석에서 관측된 바와 같이 생쥐 α-시누클레인에 대비해 인간 α-시누클레인에 대한 우선적 결합을 확증한다 (도 5). 대조적으로, 인간 및 생쥐 기원의 α-시누클레인을 결합하는 것으로 보고된 시판되는 클론 42 항체 [참조: van der Putten et al ., J. Neurosci. 20 (2000), 6021-6029]는 야생형 생쥐의 뇌 절편에서 생쥐 α-시누클레인 단백질의 두드러진 시냅스 염색을 보였다 (도 7H).
NI -202.12F4는 높은 코팅 농도의 인간 α- 시누클레인에 대해 우선적 결합을 보이며 구조적 에피토프에 대해 지시된다.
항체의 효능을 나타내는 1/2 최대 유효 농도 (EC50)를 직접적 α-시누클레인 ELISA를 이용하여 재조합 α-시누클레인의 낮은 코팅 농도 및 높은 코팅 농도에 대해 측정하였다. 약 100 pM의 EC50을 갖는 재조합 NI-202.12F4의 고친화 결합은 α-시누클레인 단백질 (20 μg/ml)의 높은 코팅에 대해 관측되었다. α-시누클레인의 낮은 코팅 농도에서는 100배에 가까운 EC50의 상응하는 증가와 함께 가파른 친화도 감소가 관측되었다 (도 8A). 대조적으로, α-시누클레인 C-말단 내에서 선형 에피토프에 대해 지시되는 시판되는 Syn211 항체 [참조: Giasson et al ., J. Neurosci. Res. 59 (2000), 528-33]는 알파 시누클레인의 낮은 코팅 밀도에서 결합 친화도 감소를 보이지 않았다 (도 8B). 이러한 발견은 NI-202.12F4가 고농도의 α-시누클레인에서 형성되는 α-시누클레인의 구조적 에피토프를 우선적으로 표적으로 한다는 것을 제시한다. 이 결과는 α-시누클레인 피브릴 또는 올리고머와 같은 α-시누클레인 응집체의 병적 구조에 대한 선호를 제시하는 NI-202.12F4의 면역화학염색 결합 특성과 일치한다. 전체 길이의 α-시누클레인에 대해 관측된 바와 같이, 절단된 α-시누클레인 1-60에 대한 NI-202.12F4 결합은 α-시누클레인 단백질의 아미노산 1-60 내에 포함되는 구조적 에피토프를 지시하는 코팅 농도에 대한 동등한 의존도를 나타낸다 (도 8C). 그러나, α-시누클레인의 아미노산 60-140이 N-말단 에피토프의 형성에 영향을 끼칠 수 있다는 것을 배제할 수 없다. 특히, A53T 돌연변이를 포함하는 인간 α-시누클레인의 N-말단 아미노산 1-60은 생쥐 α-시누클레인의 N-말단과 100% 동일하다. 따라서, 생쥐 오르토로그 (ortholog)에 대비하여 인간 α-시누클레인에 대한 관측된 선호는 N-말단에서 선호되는 NI-202.12F4 에피토프의 접근가능성 또는 형성에 대한 시누클레인의 C-말단부의 영향 때문일 수 있다. α-시누클레인의 작은 N-말단 유도된 단편을 사용하는 에피토프 맵핑 조사 (아미노산 1-20; 21-40; 41-60; 11-30; 31-50)는 어떠한 펩타이드에도 NI-202.12F4 항체가 결합하지 않는 것으로 나타났으며, 이는 이들 영역이 NI-202.12F4의 결합에 충분하지 않다는 것을 제시한다 (도 8D).
실시예 4: 알파- 시누클레인에 대한 재조합 인간-유도된 항체는 파킨슨 질환의 유전 자도입 생쥐 모델에서 운동 수행능 및 고가 플러스 미로 행동을 개선한다.
NI-202.12F4 처리의 약리학적 효과를 평가하기 위해서, 인간 A53T α-시누클레인 트랜스유전자를 과다발현하는 10.5월령의 유전자도입 생쥐 [참조: Giasson et al ., Neuron 34 (2002), 521-533]를 총 4개월 동안 5 mg/kg의 재조합 키메라 NI-202.12F4 항체 또는 운반제 대조군으로 매주 복강내 처리하였다. 처리한 지 2개월 후, 운동 수행능을 장대 시험으로 평가하였다. NI-202.12F4 처리된 생쥐는 운반제 처리군과 비교하여 운도 성능이 상당히 개선되었으며, 도 9에 도시되는 바와 같이, 장대에서의 전환에 걸리는 시간 (T-턴: p<0.001; 그룹당 n=17-19마리 동물) 및 본 우리로 내려오는 총 시간 (T-합계; p<0.05; 그룹당 n=17-19마리 동물)이 상당히 감소하였다. 제2 행동 시험으로 고가 플러스 미로 수행에 대한 처리 효과를 분석하였다. α-시누클레인 A53T 유전자도입 생쥐는 고가 플러스 미로 행동에 장애를 나타내어 야생형 대조군과 비교하여 개방 암에서 보다 많은 시간을 소비하는 것으로 이전에 보고되었다 [참조: George et al ., Exp. Neurol., 210 (2008), 788-92]. 도 10에 나타난 바와 같이, NI-202.12F4의 장기간 처리는 α-시누클레인 A53T 유전자도입 동물에서 고가 플러스 미로 행동을 상당히 개선한다. 항체 처리된 생쥐는 운반제 처리된 동물과 비교하여 개방 암에서 상당히 적은 시간을 소비하고 상당히 줄어든 거리를 커버하며 (p<0.05; 그룹당 n=17-19마리 동물), 활성 수준은 두 그룹 모두 동일하였다. 이러한 결과는 NI-202.12F4 항체로의 장기 처리가 파킨슨 질환의 α-시누클레인 유전자도입 생쥐 모델에서 운동 수행능을 상당히 개선하고 비정상적인 고가 플러스 미로 행동을 구제한다는 것을 입증한다.
실시예 5: NI -202.12F4 항체는 파킨슨 질환의 시누클레인 유전자도입 생쥐 모델에서 혈장 시누클레인 수준을 증가시킨다.
10.5월령의 유전자도입 A53T α-시누클레인 유전자도입 생쥐를 2개월 동안 5 mg/kg 키메라 NI-202.12F4 또는 PBS로 매주 복강내 처리하였다. 마지막 주사한 지 24시간 후, 혈장 샘플을 준비하고, 처리 항체 및 인간 α-시누클레인의 혈장 농도를 ELISA로 측정하였다 (도 11). 인간 α-시누클레인의 혈장 수준은 운반제 처리된 동물과 비교하여 10배 초과로 상당히 증가하였으며 (NI-202.12F4 처리 그룹 25 ±4.1 ng/ml 대 PBS 그룹 1.9 ± 1.2 ng/ml, p = 0.0002), 이는 NI-202.12F4로의 처리시 α-시누클레인의 약력학적 조절을 입증한다. 유사한 효과가 A30P α-시누클레인 유전자도입 생쥐에서 급성 항체 처리시 관측되었다. A53T 및 A30P α-시누클레인 유전자도입 모델에서와 같이, 인간 α-시누클레인은 뇌에서 주로 발현되며, 순환하는 인간 α-시누클레인의 증가는 뇌로부터 주변부로의 α-시누클레인의 NI-202.12F4 매개된 순수 유출 (net efflux)에 기인할 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> Neurimmune Therapeutics AG <120> Human anti-alpha-synuclein antibodies <130> NE30A27/P-WO <150> US 61/139,253 <151> 2008-12-19 <150> EP 08 022 188.0 <151> 2008-12-19 <160> 22 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 140 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(140) <223> Amino acid sequence of alpha-synuclein; see, e.g., Ueda et al, Proc. Natl. Acad. Sci. 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aac tgg ctg aca ctt gac gac acg gcc gtg tat tac tgt 288 Met Asp Leu Asn Trp Leu Thr Leu Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 acg aga ccc cat gat ggc gca gga aac tac cga ttt gac acc tgg ggc 336 Thr Arg Pro His Asp Gly Ala Gly Asn Tyr Arg Phe Asp Thr Trp Gly 100 105 110 cag gga acc ctg gtc acc gtc tcc tcg 363 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 3 <211> 121 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Arg Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gly Tyr Asn Phe Ile Asp Phe 20 25 30 His Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ser Asn Pro Gln Ser Gly Asn Ser Ser Ser Ala Gln Arg Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Met Ser Ala Ala Tyr 65 70 75 80 Met Asp Leu Asn Trp Leu Thr Leu Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Pro His Asp Gly Ala Gly Asn Tyr Arg Phe Asp Thr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 4 <211> 121 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(121) <223> NI-202.3G12-VHB1-GL variable heavy chain (VH) sequence aligned to the Germ Line (GL) Sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (31)..(35) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (50)..(66) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (99)..(110) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR3 <400> 4 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Arg Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gly Tyr Asn Phe Ile Asp Phe 20 25 30 His Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ser Asn Pro Gln Ser Gly Asn Ser Ser Ser Ala Gln Arg Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Met Ser Ala Ala Tyr 65 70 75 80 Met Asp Leu Asn Trp Leu Thr Leu Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Pro His Asp Gly Ala Gly Asn Tyr Arg Phe Asp Thr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 5 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(324) <223> NI-202.3G12-VLc1 variable light chain (VL) sequence <220> <221> V_region <222> (67)..(99) <223> complementarity determining region (CDR) VL-CDR1 <220> <221> V_region <222> (145)..(165) <223> complementarity determining region (CDR) VL-CDR2 <220> <221> V_region <222> (262)..(294) <223> complementarity determining region (CDR) VL-CDR3 <400> 5 cag tct gtg ttg acg cag ccg ccc tcg gtg tca gtg gcc cca gga cag 48 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 acg gcc agg atc acc tgc tct ggt gat gcc ttg cca aaa cac tat gct 96 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Ala Leu Pro Lys His Tyr Ala 20 25 30 cat tgg tac cag cag aag cca ggc cag gtc cct ata gtg gtc atc tat 144 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Val Pro Ile Val Val Ile Tyr 35 40 45 aaa gac act gag agg ccc tca ggg atc cct gag cga ttc tct ggt tcc 192 Lys Asp Thr Glu Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 acc tca ggg aca aca gtc acc ctg acc atc agt ggc gtc cag gca gag 240 Thr Ser Gly Thr Thr Val Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Ala Glu 65 70 75 80 gac gag gct cat tat tat tgt caa tca gca gac gtc agt tca act tat 288 Asp Glu Ala His Tyr Tyr Cys Gln Ser Ala Asp Val Ser Ser Thr Tyr 85 90 95 gtt gtg ttt ggc gga ggg acc aag ctg acc gtc cta 324 Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 6 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Ala Leu Pro Lys His Tyr Ala 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Val Pro Ile Val Val Ile Tyr 35 40 45 Lys Asp Thr Glu Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Thr Ser Gly Thr Thr Val Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Ala Glu 65 70 75 80 Asp Glu Ala His Tyr Tyr Cys Gln Ser Ala Asp Val Ser Ser Thr Tyr 85 90 95 Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 7 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(108) <223> NI-202.3G12-VLc1-GL variable light chain (VL) sequence aligned to the Germ Line (GL) Sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(33) <223> complementarity determining region (CDR) VL-CDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (49)..(55) <223> complementarity determining region (CDR) VL-CDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (88)..(98) <223> complementarity determining region (CDR) VL-CDR3 <400> 7 Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Ala Leu Pro Lys His Tyr Ala 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Val Pro Ile Val Val Ile Tyr 35 40 45 Lys Asp Thr Glu Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Thr Ser Gly Thr Thr Val Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Ala Glu 65 70 75 80 Asp Glu Ala His Tyr Tyr Cys Gln Ser Ala Asp Val Ser Ser Thr Tyr 85 90 95 Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 8 <211> 339 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(339) <223> NI-202.12F4-VHA1b variable heavy chain (VH) sequence <220> <221> V_region <222> (91)..(105) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR1 <220> <221> V_region <222> (147)..(204) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR2 <220> <221> V_region <222> (301)..(306) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR3 <220> <221> misc_feature <222> (319)..(339) <223> The nucleotide sequence at positions 319 to 339 may alternatively read "tcc cgg gtc acc gtc gcc tca" and encode the amino acids "Ser Arg Val Thr Val Ala Ser" <400> 8 gag gtg cag ctg gtg cag tct ggg gga ggt ctg gtc gag ccg ggg ggg 48 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Glu Pro Gly Gly 1 5 10 15 tcc cta aga ctc tcc tgt gca gtc tcc gga ttc gat ttc gaa aaa gcc 96 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Asp Phe Glu Lys Ala 20 25 30 tgg atg agt tgg gtc cgc cag gct cca ggg cag ggg cta cag tgg gtt 144 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Gln Trp Val 35 40 45 gcc cgt atc aag agc aca gct gat ggt ggg aca aca agc tac gcc gcc 192 Ala Arg Ile Lys Ser Thr Ala Asp Gly Gly Thr Thr Ser Tyr Ala Ala 50 55 60 ccc gtg gaa ggc agg ttc atc atc tca aga gat gat tcg aga aac atg 240 Pro Val Glu Gly Arg Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asp Ser Arg Asn Met 65 70 75 80 ctt tat ctg caa atg aac agt ctg aaa act gaa gac aca gcc gtc tat 288 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 tat tgt aca tca gcc cac tgg ggc cag gga acc ctg gtc acc gtc tcc 336 Tyr Cys Thr Ser Ala His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 100 105 110 tcg 339 Ser <210> 9 <211> 113 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Glu Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Asp Phe Glu Lys Ala 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Gln Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Lys Ser Thr Ala Asp Gly Gly Thr Thr Ser Tyr Ala Ala 50 55 60 Pro Val Glu Gly Arg Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asp Ser Arg Asn Met 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Thr Ser Ala His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 100 105 110 Ser <210> 10 <211> 113 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(113) <223> NI-202.12F4-VHA1b-GL variable heavy chain (VH) sequence aligned to the Germ Line (GL) Sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (31)..(35) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (50)..(68) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (101)..(102) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR3 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (107)..(113) <223> The amino acid sequence at positions 107 to 113 may alternatively read "Ser Arg Val Thr Val Ala Ser" <400> 10 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Glu Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Asp Phe Glu Lys Ala 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Gln Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Lys Ser Thr Ala Asp Gly Gly Thr Thr Ser Tyr Ala Ala 50 55 60 Pro Val Glu Gly Arg Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asp Ser Arg Asn Met 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Thr Ser Ala His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 100 105 110 Ser <210> 11 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(324) <223> NI-202.12F4-VLa1 variable light chain (VL) sequence <220> <221> V_region <222> (67)..(99) <223> complementarity determining region (CDR) VL-CDR1 <220> <221> V_region <222> (145)..(165) <223> complementarity determining region (CDR) VL-CDR2 <220> <221> V_region <222> (262)..(294) <223> complementarity determining region (CDR) VL-CDR3 <400> 11 cag tct gtg ctg act cag cca ccc tcg gtg tca gtg tcc cca gga cag 48 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 acg gcc agg atc acc tgc tct gga gaa gca ttg cca atg caa ttt gct 96 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Glu Ala Leu Pro Met Gln Phe Ala 20 25 30 cat tgg tac caa cag agg cca ggc aag gcc cca gtg ata gtg gtg tac 144 His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Val Ile Val Val Tyr 35 40 45 aaa gac agt gag aga ccg tca ggt gtc cct gag cga ttc tct ggc tcc 192 Lys Asp Ser Glu Arg Pro Ser Gly Val Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 agc tca ggg aca aca gcc acg ttg acc atc act gga gtc cag gca gaa 240 Ser Ser Gly Thr Thr Ala Thr Leu Thr Ile Thr Gly Val Gln Ala Glu 65 70 75 80 gat gag gct gac tat tac tgc cag tcg cca gac agc act aac act tat 288 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Pro Asp Ser Thr Asn Thr Tyr 85 90 95 gaa gtc ttc ggc gga ggg acc aag ctg acc gtc cta 324 Glu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 12 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Glu Ala Leu Pro Met Gln Phe Ala 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Val Ile Val Val Tyr 35 40 45 Lys Asp Ser Glu Arg Pro Ser Gly Val Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Ser Ser Gly Thr Thr Ala Thr Leu Thr Ile Thr Gly Val Gln Ala Glu 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Pro Asp Ser Thr Asn Thr Tyr 85 90 95 Glu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 13 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(108) <223> NI-202.12F4-VLa1-GL variable light chain (VL) sequence aligned to the Germ Line (GL) Sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(33) <223> complementarity determining region (CDR) VL-CDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (49)..(55) <223> complementarity determining region (CDR) VL-CDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (88)..(98) <223> complementarity determining region (CDR) VL-CDR3 <400> 13 Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Glu Ala Leu Pro Met Gln Phe Ala 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Val Ile Val Val Tyr 35 40 45 Lys Asp Ser Glu Arg Pro Ser Gly Val Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Ser Ser Gly Thr Thr Ala Thr Leu Thr Ile Thr Gly Val Gln Ala Glu 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Pro Asp Ser Thr Asn Thr Tyr 85 90 95 Glu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 14 <211> 369 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(369) <223> NI-202.3D8-VHE1 variable heavy chain (VH) sequence <220> <221> V_region <222> (91)..(105) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR1 <220> <221> V_region <222> (148)..(198) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR2 <220> <221> V_region <222> (295)..(336) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR3 <400> 14 gag gtg cag ctg gtg gag tct ggg gga ggc gtg gtc cag cct ggg agg 48 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gcc tct gga ttc act ttc agt acc tat 96 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr 20 25 30 gcc att tcc tgg gtc cgc cag gct cca ggc aag ggg ctg gag tgg gtg 144 Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 gca att att tca aat gat gga agt cgt aaa tat tat gca gac tcc gtg 192 Ala Ile Ile Ser Asn Asp Gly Ser Arg Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 aag ggc cga ttc acc atc tcc aga gac aat tcc agg gac acg ctg gat 240 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Arg Asp Thr Leu Asp 65 70 75 80 ctg gaa atg aac agc ctg aga gat gag gac acg gct gtg tat tac tgt 288 Leu Glu Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gcg aaa aaa cga ggg acg tat gcc agc agg tgc aaa gcc ttt gac ttc 336 Ala Lys Lys Arg Gly Thr Tyr Ala Ser Arg Cys Lys Ala Phe Asp Phe 100 105 110 tgg ggc cag gga acc ctg gtc acc gtc tcc tcg 369 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 15 <211> 123 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr 20 25 30 Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ile Ile Ser Asn Asp Gly Ser Arg Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Arg Asp Thr Leu Asp 65 70 75 80 Leu Glu Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Lys Arg Gly Thr Tyr Ala Ser Arg Cys Lys Ala Phe Asp Phe 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 16 <211> 123 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(123) <223> NI-202.3D8-VHE1-GL variable heavy chain (VH) sequence aligned to the Germ Line (GL) Sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (31)..(35) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (50)..(66) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (99)..(112) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR3 <400> 16 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr 20 25 30 Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ile Ile Ser Asn Asp Gly Ser Arg Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Arg Asp Thr Leu Asp 65 70 75 80 Leu Glu Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Lys Arg Gly Thr Tyr Ala Ser Arg Cys Lys Ala Phe Asp Phe 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 17 <211> 318 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(318) <223> NI-202.3D8-VKa1 variable light chain (VL) sequence <220> <221> V_region <222> (70)..(102) <223> complementarity determining region (CDR) VL-CDR1 <220> <221> V_region <222> (148)..(168) <223> complementarity determining region (CDR) VL-CDR2 <220> <221> V_region <222> (265)..(288) <223> complementarity determining region (CDR) VL-CDR3 <400> 17 gac atc cag ttg acc cag tct cct tcc acc ctg tct gca tct gta gga 48 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 gac aga gtc acc atc act tgc cgg gcc agt cag agt att agt ggc tgg 96 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Trp 20 25 30 ttg gcc tgg tat cag cag aaa cca ggg aaa gcc cct aag ctc ctg atc 144 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 tat gat gcc tcc aat ttg gaa agt ggg gtc cca tca agg ttc agc ggc 192 Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 agt gga tct ggg aca gaa ttc act ctc acc atc agc agc ctg cag cct 240 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 gat gat ttt gca act tat tat tgc caa cag tat gat aat tat tgg acg 288 Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Asn Tyr Trp Thr 85 90 95 ttc ggc caa ggg acc aag gtg gaa atc aaa 318 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 18 <211> 106 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Asn Tyr Trp Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 19 <211> 106 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(106) <223> NI-202.3D8-VKa1-GL variable light chain (VL) sequence aligned to the Germ Line (GL) Sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(34) <223> complementarity determining region (CDR) VL-CDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (50)..(56) <223> complementarity determining region (CDR) VL-CDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (89)..(96) <223> complementarity determining region (CDR) VL-CDR3 <400> 19 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Asn Tyr Trp Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 20 <211> 321 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(321) <223> NI-202.3D8-VKc1 variable light chain (VL) sequence <220> <221> V_region <222> (70)..(102) <223> complementarity determining region (CDR) VL-CDR1 <220> <221> V_region <222> (148)..(168) <223> complementarity determining region (CDR) VL-CDR2 <220> <221> V_region <222> (265)..(291) <223> complementarity determining region (CDR) VL-CDR3 <400> 20 gaa att gtg atg acg cag tct cca tcc tca ctg tct gca tct att gga 48 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Ile Gly 1 5 10 15 gac aga gtc acc ttc act tgt cgg gcg agt cac gac att agc aat tat 96 Asp Arg Val Thr Phe Thr Cys Arg Ala Ser His Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 tta gcc tgg ttt cgg cag caa cca ggg aaa gcc cct aag tcc ctg atc 144 Leu Ala Trp Phe Arg Gln Gln Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile 35 40 45 tat gct gca tct agt ctg caa agt ggg gtc cca tca aga ttc agc gcc 192 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Ala 50 55 60 agt gga tct ggg aca gac ttc act ctc acc atc agc agc ctg cag ccc 240 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 gaa gat ttt gca act tat tat tgt gtt caa tat agg act tac ccc ctc 288 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Val Gln Tyr Arg Thr Tyr Pro Leu 85 90 95 acc ttc ggc caa ggg aca cga ctg gag att aaa 321 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 21 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Ile Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Phe Thr Cys Arg Ala Ser His Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Phe Arg Gln Gln Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Ala 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Val Gln Tyr Arg Thr Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 22 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(107) <223> NI-202.3D8-VKc1-GL variable light chain (VL) sequence aligned to the Germ Line (GL) Sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(34) <223> complementarity determining region (CDR) VL-CDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (50)..(56) <223> complementarity determining region (CDR) VL-CDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (89)..(97) <223> complementarity determining region (CDR) VL-CDR3 <400> 22 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Ile Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Phe Thr Cys Arg Ala Ser His Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Phe Arg Gln Gln Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Ala 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Val Gln Tyr Arg Thr Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 100 105

Claims (30)

  1. 인간 모노클로날 항-α-시누클레인 항체.
  2. 제1항에 있어서, 천연 단량체 형태의 α-시누클레인에 특이적으로 결합할 수 있는 항체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 올리고머 또는 응집 형태의 α-시누클레인에 결합할 수 있는 항체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 β-시누클레인 또는 γ-시누클레인에 비해 α-시누클레인에 특이적으로 결합하는 항체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, α-시누클레인의 N-말단1 -60 단편 또는 C-말단96 -140 단편을 인식하는 항체.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, α-시누클레인의 절두형을 인식하지 않는 항체.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 항체, 또는 이의 가변 영역에 도 1에 도시된 하나 이상의 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함하는 이의 α-시누클레인 결합 단편.
  8. 제7항에 있어서, 도 1에 도시된 VH 및/또는 VL 영역의 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 결합 단편.
  9. α-시누클레인에 대한 특이적 결합에 대해 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 항체와 경쟁하는 항체 또는 항원-결합 분자.
  10. 제9항에 있어서, 키메라 뮤린-인간 또는 뮤린화된 항체인 항체.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 단쇄 Fv 단편 (scFv), F(ab') 단편, F(ab) 단편, 및 F(ab')2 단편으로 이루어진 그룹에서 선택되는 항체.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 항체의 면역글로불린 쇄의 적어도 결합 도메인 또는 가변 영역을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드.
  13. 제12항의 폴리뉴클레오타이드를 임의로 항체의 다른 면역글로불린 쇄의 가변 영역을 암호화하는 제12항의 폴리뉴클레오타이드와 함께 포함하는 벡터.
  14. 제10항의 폴리뉴클레오타이드 또는 제13항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  15. (a) 제14항의 세포를 배양하는 단계;
    (b) 배양물로부터 항-α-시누클레인 항체 또는 이의 면역글로불린 쇄(들)을 분리하는 단계를 포함하는, 항-α-시누클레인 항체 또는 이의 면역글로불린 쇄(들)을 제조하는 방법.
  16. 제12항의 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되거나 제15항의 방법에 의해 수득가능한 항체 또는 이의 면역글로불린 쇄(들).
  17. 제1항 내지 제11항 또는 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 검출가능하게 표지된 항체.
  18. 제17항에 있어서, 검출가능한 표지물이 효소, 방사성동위원소, 형광단 및 중금속으로 이루어진 그룹에서 선택되는 항체.
  19. 제1항 내지 제11항 또는 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 약물에 부착된 항체.
  20. 제1항 내지 제11항 또는 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항의 항체, 제12항의 폴리뉴클레오타이드, 제13항의 벡터 또는 제14항의 세포를 포함하는 조성물.
  21. 제20항에 있어서, 약제학적 조성물로서, 추가로 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물.
  22. 제21항에 있어서, 백신인 조성물.
  23. 제21항 또는 제22항에 있어서, 시누클레인병증 질환을 치료하는데 유용한 부가제를 추가로 포함하는 약제학적 조성물.
  24. 제20항에 있어서, 진단 조성물로서, 임의로 면역 또는 핵산 기초된 진단 방법에 통상적으로 사용되는 시약을 포함하는 조성물.
  25. 시누클레인병증 질환의 예방적 및 치료적 처치를 위한 약제학적 또는 진단 조성물의 제조, 피험자에서 시누클레인병증 질환의 진행 또는 시누클레인병증 질환 처치에 대한 반응을 모니터링하기 위한, 제1항 내지 제11항 또는 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항의 항체 또는 이와 실질적으로 동일한 결합 특이성을 갖는 α-시누클레인 결합 분자, 제12항의 폴리뉴클레오타이드, 제13항의 벡터 또는 제14항의 세포의 용도.
  26. (a) 진단될 피험자로부터의 샘플 중에 있는 α-시누클레인의 수준을 제1항 내지 제11항 또는 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항의 항체, 이의 α-시누클레인 결합 단편 또는 이와 실질적으로 동일한 결합 특이성을 갖는 α-시누클레인 결합 분자로 평가하는 단계;
    (b) 상기 α-시누클레인의 수준을 하나 이상의 대조 피험자에서의 α-시누클레인 수준을 나타내는 기준 표준물과 비교하는 단계를 포함하며,
    이때 상기 α-시누클레인 수준과 기준 표준물 사이의 차이 또는 유사성으로 피험자가 파킨슨 질환을 갖는다는 것을 나타내는, 피험자에서 시누클레인병증 질환을 진단하는 방법.
  27. 제25항 또는 제26항에 있어서, 시누클레인병증 질환이 파킨슨 질환 (PD), 파킨슨 질환 치매 (PDD), 루이 소체 치매 (DLB), 알츠하이머 질환의 루이 소체 변형 (LBVAD), 다발기 계통 위축증 (MSA), 순수 자율신경 부전 (PAF), 뇌에 철 축적을 동반하는 신경변성 제1형 (NBIA-I), 알츠하이머 질환, 픽 질환, 소아-발병 전신 신경축삭 디스트로피 (할러보르덴-슈파츠 질환), 근위축성측삭경화증, 외상성 뇌손상 및 다운 증후군으로 이루어진 그룹에서 선택되는 용도 또는 방법.
  28. 제1항 내지 제11항 또는 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항의 항체 또는 이와 실질적으로 동일한 결합 활성을 갖는 α-시누클레인 결합 분자, 제12항의 폴리뉴클레오타이드, 제13항의 벡터 또는 제14항의 세포를 임의로 시약 및/또는 사용 설명서와 함께 포함하는 시누클레인병증 질환의 진단용 키트.
  29. 인간 또는 동물 신체 중의 α-시누클레인의 생체내 검출 또는 이에 대한 치료제 및/또는 진단제의 표적화용 조성물을 제조하기 위한 제1항 내지 제11항 또는 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항의 항체의 적어도 하나의 CDR을 포함하는 α-시누클레인 결합 분자의 용도.
  30. 제29항에 있어서, 생체내 영상화가 양전자 방사 단층촬영법 (PET), 단일 광자 방사 단층촬영법 (SPECT), 근적외선 (NIR) 광학 영상화 또는 자기 공명 영상화 (MRI)를 포함하는 용도.

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