ES2544569T3 - Autoanticuerpos humanos anti alfa-sinucleina - Google Patents

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Abstract

Un anticuerpo monoclonal humano anti-α-sinucleína o su fragmento de unión a α-sinucleína; en el que el anticuerpo o su fragmento de unión a α-sinucleína comprende en su región variable una región VH CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de los restos 31-35 de la SEC ID Nº 9, una región VH CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de los restos 50-68 de la SEC ID Nº 9, una región VH CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de los restos 101-102 de la SEC ID Nº 9, una región VL CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de los restos 23-33 de la SEC ID Nº 12, una región VL CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de los restos 49-55 de la SEC ID Nº 12, una región VL CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de los restos 88-89 de la SEC ID Nº 12.

Description

Autoanticuerpos humanos anti alfa-sinucleina
5 Campo de la invención
[0001] la presente invención se refiere en general a nuevas moléculas de unión específica a a-sinucleina, especialmente anticuerpos humanos así como sus fragmentos, derivados y variantes que reconocen la a-sinucleína y formas agregadas de a-sinucleína, respectivamente. Además, la presente invención se refiere a composiciones
10 farmacéuticas y diagnósticas que comprenden dichas moléculas de unión, anticuerpos y sus miméticos válidos ambos como herramientas diagnósticas para identificar especies tóxicas de a-sinucleina en plasma y lCE y también en estrategias de vacunación pasiva para tratar trastornos relacionados con agregados de a-sinucleína, como la enfermedad de Parkinson (EP), demencia con cuerpos de lewy (DCl) y variante con cuerpos de lewy de la enfermedad de Alzheimer (EA) y otras enfermedades sinucleinopáticas.
ANTECEDENTES DE LA INVENCiÓN
[0002] El plegamiento erróneo y la agregación de las proteínas son aspectos patológicos de numerosas enfermedades neurodegenerativas. los agregados de a-sinucleína son los componentes principales de los cuerpos
20 de lewy y de las neuritas de lewy asociadas con la enfermedad de Parkinson (EP). la a-sinucleina, una proteina desplegada en su forma nativa, puede adoptar diferentes morfologías agregadas, incluidos oligómeros, protofibrillas y fibrillas. Se ha demostrado que los agregados oligoméricos pequeños son especialmente tóxicos.
[00031 Se han detectado autoanticuerpos naturales frente a a-sinuc!eina en personas sanas y sus niveles
25 alterados en los pacientes se asociaron con trastornos neurodegenerativos en particular; para revisión véase Neff y col., Autoimmun. Rev. 7 (2008), 501-507. Por tanto, la apa rición de anticuerpos naturales en pacientes que sufren enfermedad de Parkinson, de forma espontánea o tras la vacunación, especialmente en pacientes sanos puede ofrecer un papel protector con respecto a la agregación de la a-sinudeina, véase. por ejemplo, Woulfe y col., Neurology 58 (2002), 1435-1436 Y Papachroni y col., J. Neurochem. 101 (2007), 749-756. Hasta ahora, el significado
30 terapéutico de los autoanticuerpos ha sido dificil de evaluar. Esto se debe principalmente a la falta de técnicas experimentales directas para su aislamiento y posterior caracterización in vi/ro. Recientemente, se han publicados especies oligoméricas de a-sinucleína que están extracelularmente en plasma y lCE (EI-Agnaf y col., FASEB J. 20 (2006),419-425) Y estudios de inmunización en modelos murinos de EP muestran que los anticuerpos monoclonales de ratón extracelulares frente a a-sinucleina pueden reducir la acumulación de agregados intracelulares de 0
35 sinucleina (Masliah y col., Neuron, 46 (2005), 857-868) lo que apoya la idea de que los anticuerpos que neutralizan los agregados neurotóxicos sin interferir con las funciones beneficiosas de la a-sinucleina monomérica pueden ser agentes terapéuticos útiles. Sin embargo, la utilidad terapéutica de los anticuerpos de base murina en humanos se ve limitada por la respuesta de anticuerpos humanos anti-ratón (HAMA) debido a su origen no humano.
40 [0004] Emadi y col. en J. Mol. Biol. 368 (2007), 1132-1144, describen el aislamiento de fragmentos de anticuerpo de cadena sencilla (scFv) a partir de una libreria de anticuerpos de despliegue de fagos a base de secuencias humanas frente a a-sinucleina, que se unen solo a una forma oligomérica de a-sinucleina e inhiben tanto la agregación como la toxicidad de dicha proteína in vitro. No obstante, aunque la generación de scFv a partir de despliegue de fagos es más bien sencilla, esta técnica tiene inconvenientes graves ya que los anticuerpos
45 producidos de este modo conllevan el riesgo de reactividad cruzada no deseada frente a autoantígenos y carecen de las caracteristicas de los anticuerpos humanos naturales optimizados de forma evolutiva producidos por el sistema inmunitario humano. Adicionalmente, estos anticuerpos pueden no ser suficientemente específicos debido a la reactividad cruzada con otras proteinas ylo con la proteína diana en el contexto de un entorno fisiológico y una función normales. En el caso de la enfermedad de Par1<inson, por ejemplo, los anticuerpos que también pueden
50 presentar reacción cruzada con derivados fisiológicos de a-sinucleina conllevan la posibilidad de producir efectos adversos relacionados con las funciones normales de las estructuras fisiológicas diana. A este respecto, una enfermedad autoinmune no deseada podria inducir realmente un riesgo difícil de calcular en el diseño conceptual de experimentos de inmunización activa empleando estructuras proteicas que, en su forma variante, también se producen fisiológicamente.
55 [00051 Más recientemente, Seitz y col. (81. Kongress der Deutschen Gesellschaft fur Neurologie mit Fortbildungsakademie Hamburg 10.-13.09.2008) comunicaron el aislamiento de autoanticuerpos policlonales anti-asinucleína a partir de diferentes soluciones de inmunoglobulinas y muestras de sangre de donantes individuales mediante cromatografia de afinidad. No obstante, a pesar del hecho de que esta técnica proporciona cantidades bastante limitadas del anticuerpo deseado, los anticuerpos policlonales tienen solo una aplicación terapéutica limitada debido, por ejemplo, a su heterogeneidad y al ries90 de estar contaminados con otras moléculas asociadas a a-sinucleina que tienen efectos adversos no deseados. De este modo, el valor diagnóstico de los anticuerpos policlonales se reduce ya que la variabilidad de la composición de los anticuerpos influirá sobre la especificidad y
5 reactividad globales. Esto es tanto más cierto para anticuerpos frente a proteinas objeto de agregación y depósito debido a un mal plegamiento.
[0006] Por tanto, existe la necesidad de superar las limitaciones descritas anterionnente y proporcionar un anticuerpo humano terapéutico y diagnóstico frente a la a-sinucleina.
RESUMEN DE LA INVENCiÓN
[0007] El problema técnico que subyace a la presente invención se ha resuelto mediante las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones.
[0008] La presente invención utiliza la respuesta inmune especifica frente a a-sinucleina en sujetos control de edad avanzada sanos y en pacientes con enfermedad neurológica para el aislamiento de anticuerpos monoclonales humanos naturales espeCíficos de a-sinucleina. En particular, los experimentos realizados según la presente invención fueron útiles para aislar anticuerpos monoclonales específicos de la a-sinucleína a partir de un colectivo de
20 sujetos de edad avanzada sin signos de Parkinsonismo.
[0009] Por tanto, la presente invención está dirigida a anticuerpos humanos, fragmentos de unión al antígeno y moléculas de unión al antígeno similares que son capaces de reconocer específicamente a-sinucleína, donde el anticuerpo o su fragmento de unión a a-sinucleína comprende en su región variable una región VH CDR1 que 25 comprende la secuencia de aminoácidos de los restos 31-35 de la SEC ID. N.O 9, una región VH CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de los restos 50-68 de la SEC ID N.O 9, una región VH CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de los restos 101-102 de la SEC ID N.O 9, una región VL CDR1 que comprende la secuencía de aminoácidos de los restos 23-33 de la SEC ID N.O 12, una región VL COR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de los restos 49-55 de la $EC ID N.O 12, una región VL CDR3 que 30 comprende la secuencia de aminoácidos de los restos 88-89 de la $EC ID N.O 12. Por «reconociendo específicamente a-sinucleína», «anticuerpo especifico para/de a-sinuc!eína)) y ((anticuerpo anti-a-sinucleína» especialmente se entiende, en general, y colectivamente, anticuerpos frente a la fonna nativa de a-sinucleína, o frente a a-sinucleína mal plegada, oligomérica, agregada o postransduccionalmente modificada. En este documento se proporcionan anticuerpos humanos selectivos para las fonnas monoméricas nativas, de longitud completa,
35 truncadas y agregadas.
[0010] En una realización especialmente preferida de la presente invención, el anticuerpo humano o su fragmento de unión al antígeno muestra las características inmunológicas de unión de un anticuerpo caracterizado por las regiones variables VH y VL como se establecen en la figura 1 B.
40 [0011] El fragmento de unión al antígeno del anticuerpo puede ser un fragmento Fv de cadena sencilla, un fragmento F(ab'), un fragmento F(ab) y un fragmento F(ab')2 o cualquier otro fragmento de unión al antígeno. En una realización especifica, más abajo, el anticuerpo o su fragmento es un anticuerpo humano de isotipo IgG. Alternativamente, el anticuerpo es un anticuerpo quimérico humano-murino o murinizado, siendo este último
45 especialmente útil para los procedimientos diagnósticos y los estudios en animales.
[0012] Adicionalmente, la presente invención se refiere a composiciones que comprenden el anticuerpo de la presente invención o sus fragmentos actívos, o agonistas y moléculas relacionadas, o alternativamente, antagonistas del mismo y a procedimientos inmunoterapéuticos e inmunodiagnósticos usando dichas composiciones en la
50 prevención, diagnóstico o tratamiento de una enfermedad sinucleinopática, en la que se administra una cantidad eficaz de la composición a un paciente que la necesita.
[0013] La presente invención también se refiere a polinucleótidos que codifican al menos una regíón variable de una cadena de inmunoglobulina del anticuerpo de la invención. Dicha región variable comprende al menos las 55 regiones determinantes de complementariedad (CDR) de las VH y VL de la región variable como se establece en la figura 1 B.
[0014J Por consiguiente, la presente invención también abarca vectores que comprenden dichos pOlinucleótidos y células huésped transfonnadas con estos, así como su uso en la producción de un anticuerpo y moléculas de unión equivalentes que son especificas para la a-sinucleina. En la técnica son conocidos medidas y procedimientos para la producción recombinante de anticuerpos y sus miméticos asi como procedimientos de selección para moléculas de unión competitivas, que pueden o no ser anticuerpos. No obstante, como se describe en este documento, en particular con respecto a aplicaciones terapéuticas en humanos, el anticuerpo de la presente invención es un
5 anticuerpo humano en el sentido de que la aplicación de dicho anticuerpo está sustancialmente libre de respuesta HAMA observada, por otro lado, para anticuerpos quiméricos e incluso humanizados.
[0015] Adicionalmente, en este documento se describen composiciones y procedimientos que pueden usarse para identificar la a-sinucleina en las muestras. los anticuerpos anti-a-sinucleina descritos pueden usarse para analizar la
10 presencia de a-sinucleina en muestras de sangre humana, lCE y orina, por ejemplo, usando ensayos tipo ELiSA o adaptados a superfiCie. los procedimientos y composiciones descritos en este documento pueden ser de ayudar en enfermedades sinucleinopáticas, como en el diagnóstico de la enfermedad de Parkinson, y pueden usarse para controlar la progresión de la enfermedad y la eficacia terapéutica.
15 [0016] Como se demuestra en el ejemplo 4, el anticuerpo anti-a-sinucleina de la presente invención es capaz de mejorar el rendimiento motor y el comportamiento en el laberinto en cruz elevado en un modelo de ratón transgénico de la enfermedad de Parkinson. Estos resultados confirman el valor terapéutico esperado de los anticuerpos derivados de humanos anti-a-sinucleina de la presente invención.
20 [0017] Por tanto, es un objeto particular de la presente invención proporcionar el anticuerpo de la presente invención para su uso en el tratamiento o prevención de una enfermedad sinucleinopática como la enfermedad de Parkinson (EP), demencia por enfermedad de Parkinson (DEP), demencia con cuerpos de lewy (DCl), la variante con cuerpos de lewy de la enfermedad de Alzheimer (VClEA), atrofia sistemática múltiple (ASM), insuficiencia autonómica pura (IAP), neurodegeneración con acumulación cerebral de hierro de tipo 1 (NACH-1 ), enfermedad de
25 Alzheimer, enfermedad de Pick, distrofia neuroaxonal generalizada de inicio juvenil (enfermedad de HallervordenSpatz), esclerosis lateral amiotrófica, lesión cerebral traumática y sindrome de Down. El tratamiento comprende la administración de una concentración eficaz de un anticuerpo humano o un derivado del anticuerpo al sujeto donde el anticuerpo va dirigido hada la a-sinucleina.
30 [0018] Realizaciones adicionales de la presente invención serán aparentes a partir de la descripción y de los ejemplos que se recogen a continuación.
BREVE DESCRIPCiÓN DE lOS DIBUJOS
35 [001 9]
Figura 1: Secuencias de aminoácidos y nucleótidos de la región variable, es decir, cadena pesada y cadena ligera kappallambda de los anticuerpos humanos NI-202.3G12 (A), NI-202.12F4 (B) Y NI-202.3D8 (C). Para el anticuerpo humano NI-202.3D8 se han clonado dos secuencias variables de la cadena ligera VKa1 (e) y VKc1 (D), cada una de 40 las cuales puede formar pareja con la secuencia variable de la cadena pesada VHE1 (C). Las regiones estructurales (FR) y determinantes de complementariedad (CDR) se indican con las CDR subrayadas. También se indican las regiones de unión (JH) de la cadena pesada y la región de unión de la cadena ligera (JK). Debido a la estrategia de clonación, la secuencia de aminoácidos en el extremo N-terminal de la cadena pesada y la cadena ligera puede contener alteraciones inducidas por el cebador en FR1 , que sin embargo no afectan sustancialmente a la actividad 45 biológica del anticuerpo. Para proporcionar un anticuerpo humano consenso, las secuencias de nucleótidos y aminoácidos del clon original se alinearon y adaptaron según las secuencias de la correspondiente región variable de la linea germinal humana de las bases de datos: véase, por ejemplo Vbase lhttp://vbase.mrc-cpe.cam.ac.ukJ) alojada por el MRC Centre for Protein Engineering (Cambridge, RU). Se indican en negrita aquellos aminoácidos que se consideran posiblemente desviados de la secuencia de la linea germinal consenso y, por tanto, puedan ser
50 debido al cebador de la PCR.
Figura 2: Los anticuerpos recombinantes humanos frente a a-sinucleína se dirigen a diferentes epítopes. Se recubrieron placas de ELiSA con a-sinucleina recombinante de longitud completa y truncada a una concentración de recubrimiento equivalente (20 IJg/ml). (A) El anticuerpo recombinante humano frente a a-sinucleina NI-201.3G12 se 55 une a la a-sinucleina de longitud completa pero no a las formas truncadas de a-sinucleina en un ELiSA directo, lo que apunta a un epitope de reconocimiento estructural de NI-202.3G12. (B) NI-2Q2.12F4 recombinanle se une a la a-sinucleina de longitud completa y a las formas truncadas de a-sinucleina que contienen los aminoácidos (aa) 1-60 en un ELiSA directo, lo que apunta a un epitope de NI-202.12F4 dentro de la región N-terminal anfipática repetida de la alfa sinucleina. (C) El anticuerpo LB509 se une a los fragmentos C-terminales de la a-sinucleina lo que confirma el
epítope previamente determinado (aa 115-122). Los valores son las medias t EMT (n = 2-3).
Figura 3: Los anticuerpos humanos recombinantes frente a a-sinucleina se unen a la a-sinudeina pero no a 13 y ysinudeina en un EUSA directo. Placas de EUSA recubiertas con a, 13 y y-sinudeína recombinantes a
5 concentraciones de recubrimiento equivalentes (2 IJglml) se incubaron con anticuerpos humanos recombinantes frente a a-sinudeína o con un anticuerpo pan sinucleina. (A) Este último anticuerpo detecta las tres proteinas sinucleina mientras que los anticuerpos humanos recombinantes frente a a-sinucleina (B) NI-202.3G12 Y (e) NI202.12F4 se unen selectivamente a la a-sinudeina. Los valores son las medias t EMT (n = 2-3).
10 Figura 4: El anticuerpo humano recombinante frente a a-sinudeína NI-202.12F4 se une a la a-sinucleína pero no a 13 ni a y-sinucleína en un análisis de inmunotransferencia. Las a, 13 y y-sinucleina recombinantes (750 ng de cada una) se sometieron a PAGE-SDS y, posteriormente, a análisis por inmunotransferencia. (A) La tinción con Coomassie muestra una concentración de proteina equivalente en PAGE-SDS. (B) NI-202.12F interacciona fuertemente con a-sinucleína pero no con beta ni gamma sinucleína. (C) No se detecta señal sin anticuerpo primario.
Figura 5: (A) El análisis por inmunotransferencia con NI-202.12F4 de extractos de cerebro de ratones no transgénicos y transgénicos para la alfa-sinudeína humana muestra una unión preferente a la a-sinudeina humana. Los extractos de cerebro de ratones de tipo salvaje y transgénicos para a-sinucleina humana se analizaron mediante inmunotransferencia con el anticuerpo LB508 especifico de a-sinucleína humana, el anticuerpo del don 42 reactivo 20 con a-sinucleína humana y de ratón y NI-202.12F4. Mientras que el don 42 detecta bandas prominentes que se corresponden con las a-sinucleína de ratón y humana, LB509 y NI-202.12F4 mostraban una fuerte preferencia por la a-sinucleína humana. (B) El análisis mediante inmunotransferencia con NI-202.12F4 de los extractos de cerebro muestra una unión preferente a los agregados de a-sinucleína humana. Se analizaron mediante inmunotransferencia extractos del cerebro cortical de un sujeto control sano y un paciente con demencia con cuerpos de Lewy (DeL) así 25 como extractos de cerebro de ratones de tipo salvaje y ratones transgénicos para a-sinucleina A30P humana. NI202.12F4 detecta las formas oligoméricas y fibrilares de los agregados de a-sinudeina en extractos de cerebro con DeL y de animales transgénicos para a-sinUcleína A30P con alta sensibilidad. La unión minima se observó a formas monoméricas de a-sinucleina en tejidos humanos o de ratón de tipo salvaje y una unión moderada en los extractos de cerebro de ratones transgénicos para a-sinucleina A30P Que sobreexpresaban en gran medida a-sinucleina. Por
30 el contrario, el anticuerpo del clan 42 detecta formas monoméricas y fragmentos de a-sinucleína con una alta sensibilidad y se une muy mal a las especies agregadas de a-sinucleína.
Figura 6: NI-202.12F4 recombinante muestra alta afinidad de unión a la a-sinucleina humana de tipo natural y a mutantes causantes de enfermedad. Placas de ELlSA se recubrieron con a-sinucleína humana de tipo natural (_),
35 A53T (. ), A30P (*) and E64K (O) (2 IJgfml) y se incubaron con varias concentraciones de NI202.12F4. Las concentraciones eficaces máximas medias (ED50) fueron de 321 pM para la a-sinudeína de tipo natural, 293 pM para A53T, 228 pM para A30P y 483 pM para el mutante E64K de la a-sinucleína humana.
Figura 7: Análisis inmunohistoquímico de unión de NI-202.12F4. NI-202.12F4 muestra una linción prominente de la
40 patología de a-sinucleína induyendo inclusiones como cuerpos de Lewy y neuritas de Lewy así como pequeñas acumulaciones somatodendriticas y sinápticas de a-sinucleina en cortes flotantes de ratones transgénicos Que expresan a-sinucleína humana A53T (A) o A30P (B) así como en tejidos de cerebro humano de enfermedad de Parkinson (C) y demencia con cuerpos de Lewy (D). El anticuerpo Syn211 detecta a-sinudeína sináptica fisiológica con una alta sensibilidad en ratones transgénicos para a-sinucleína A30P humana (E) mientras Que NI-202.12F4 se
45 une preferentemente a agregados patológicos de a-sinucleína (B). La unión de NI-202.12F4 está prácticamente ausente en los cortes de cerebro de los ratones de tipo salvaje (F) en comparación con la tinción control solo con anticuerpo secundario (G) mientras que el anticuerpo del clon 42 muestra una tinción sináptica prominente de la proteína a-sinudeína de ratón (H).
50 Figura 8: El anticuerpo recombinante NI-202.12F4 muestra una unión preferente a placas recubiertas con asinudeina a alta densidad. Las placas de ELlSA se recubrieron con a-sinudeina recombinante de longitud completa o truncada a las concentraciones indicadas y se incubaron con varias concentraciones de anticuerpos NI-202.12F4 o Syn21 1 mediante ELlSA directo (concentraciones de recubrimiento de a-sinucleina recombinante de longitud completa o 1-60: 20 IJg/ml; .. 2 IJg/ml; ... 1 IJgfml; • 250 nglml; o 100 ng/ml). Se determinó la concentración eficaz
55 máxima media (EC50) que ind icaba la potencia de los anticuerpos. (A) La alta afin idad de unión de NI-202.12F4 recombinante a a-sinucleina requiere altas densidades de recubrimiento de la proteina o-sinucleina. Mientras que se observa una EC50 de 111 pM para la concentración de recubrimiento con a-sinudeina a 20 IJgfml, los valores de EC50 aumentan rápidamente con la disminución de las concentraciones de recubrimiento lo que muestra una pérdida drástica de afinidad a concentraciones más bajas de recubrimiento con o-sinucleina. Estas caracteristicas apuntan a
un epitope conformacional de NI-202.12F4 que se forma preferentemente a concentraciones altas de recubrimiento con a-sinuclelna. (B) La unión de Sun211 no se ve afectada por la concentración de recubrimiento. No se observa disminución de la afinidad del anticuerpo comercial Sny211 a las densidades de recubrimiento más bajas con ECso que oscilan de 335 pM para una densidad de recubrimiento con a-sinucleína de 20 IJg/ml a 99 pM para100 ng/ml, lo 5 que sugiera la unión a un epítope no conformacional lineal. (C) La unión de alta afinidad de NI-202.12F4 recombinante al fragmento N-terminal de a-sinucleina que comprende los aminoácidos 1-60 requiere de densidades altas de recubrimiento. NI-202.F4 muestra una unión equivalente y dependiente de la concentración de recubrimiento a la a-sinucleína de longitud completa, así como a la molécula truncada lo que apunta a un epítope conformacional de NI-202.12F4 que está contenido en los aminoácidos 1-60 de la proteina a-sinucleina. (D) Se 10 recubrieron placas de avidina con péptidos biotinilados que comprendían fragmentos de 20 aminoácidos solapantes que cubrian los 60 aminoácidos N-terminales de la a-sinucleina y se incubaron con NI-202.12F4 o un anticuerpo control pan sinucleína que detectaba un epítope en los aa 21-40. Por consiguiente, el anticuerpo control se une con fuerza al péptido 21-40 y en menor grado a los péptidos 11-30 y 31-50. Por el contrario, no se observa unión de NI202-12F4 a ninguno de los péptidos probados, lo que sugiere que ninguno de los fragmentos N-terminales es
15 suficiente como epítope de NI-202.12.F4 y puede ser necesario un fragmento más largo para una unión óptima y para la formación del epitope estructural de NI-202.12F4.
Figura 9: El tratamiento crónico con NI-202.12F4 mejora el rendimiento motor en ratones transgénicos para asinucleína A53T. Se trató a ratones transgénicos para a-sinuc!eína A53T de 10,5 meses de edad semanalmente con
20 NI-202.12F4 o PBS (5 mglkg; aplicación intraperitoneal). El rendimiento motor se evaluó después de dos meses de tratamiento en la prueba de la barra. (A) Los animales tratados con NI-202.12F4 necesitaron significativamente menos tiempo para girarse hacia abajo (t-giro: 1,7 ± 0,3 frente a 4,6 ± 0,6 s, p = 0,0002, prueba de la t de Student bilateral). (B) Los animales tratados con NI-202.12F4 también utilizaron significativamente menos tiempo para descender a la jaula (7,3 ± 0,9 frente a 10,4 ± 0,7 s, P = 0,012, prueba de la t de Student bilateral).
25 Figura 10: El tratam iento crónico de ratones transgénicos para a-sinucleina A53T con NI-20212F4 induce la recuperación del comportamiento en el laberinto en cruz elevado. Se trató a ratones transgénicos para A53T Qsinuc!eina de 10,5 meses de edad semanalmente i.p. con Nl-202.12F4 o pas a 5 mglkg. Después de dos meses de tratamiento, se comprobó en los animales el comportamiento en el laberinto en cruz elevado. Los animales tratados
30 con NI-202.12F4 tardaban significativamente menos tiempo y recorrian distancias significativamente más cortas en los brazos abiertos en comparación con los animales control tratados con el vehículo lo que indica una recuperación del comportamiento normal.
Figura 11 : El tratamiento crónico de los ratones transgénicos para a-sinucleina A53T con NI-202.12F4 tiene como
35 resultado la elevación de los niveles plasmáticos de la a-sinucleina A53T humana. Las muestras de plasma se prepararon a partir de ratones transgénicos para a-sinuc!eína A53T de 12,5 meses de edad que habían sido tratados semanalmente i.p durante 2 meses con NI-202.12F4 a 5 mg/kg o con PBS. Se extrajo sangre 24 horas después de la última aplicación. (A) Los niveles de NI-202.12F4 en plasma se determinaron usando un ELlSA directo para asinucleína. (B) Los niveles de a-sinucleína A53T humano en plasma se determinaron usando un ELlSA tipo
40 sandwich para la a-sinuc!eína específica humana. Los animales tratados con NI-202.12F4 presentaban niveles significativamente elevados de a-sinucleina humana en plasma en comparación con los animales control (24,9 ± 4,1 frente a 1,9 ± 1,2 ngfml, p = 0,0002).
DESCRIPCiÓN DETALLADA DE LA INVENCiÓN
1. Definiciones
[0020] Las enfermedades sinucleinopáticas o sinucleinopatias son un grupo diverso de enfermedades neurodegenerativas que comparten una lesión patológica común compuesta de agregados de proteína a-sinuc!eina 50 insoluble en poblaciones selectivamente vulnerables de neuronas y glla. Entre estas enfermedades se incluyen la enfermedad de Parkinson (EP), demencia por enfermedad de Parkinson (DEP), demencia con cuerpos de Lewy (DeL), distrofia neuroanoxal generalizada de inicio juvenil (enfermedad de Hallervorden-Spatz), insuficiencia autonómica pura (IAP), atrofia sistémica múltiple (ASM) y neurodegeneración con acumulación cerebral de hierro de tipo a (NACH-1). Clínicamente, se caracterizan por una disminución crónica y progresiva de las funciones motora,
55 cognitiva, del comportamiento y autonómica, dependiendo de la distribución de las lesiones.
[0021] La enfermedad de Parkinson es una enfermedad neurodegenerativa dependiente de la edad de etiologia desconocida. Se considera que la enfermedad de Parkinson esporádica es el resultado de una combinación de vulnerabilidad genética y ataques ambientales. Adicionalmente se considera que la enfermedad de Par1<inson (EP) aunque puede desencadenarse mediante mecanismos dispares, estos van seguidos de una ruta fisiopatológica compartida. Un nodo compartido es la implicación de la a-sinudeina. La relación de esta proteina con la patogénesis de la enfermedad de Parkinson ha sido establecido mediante la identificación tanto de mutaciones puntuales como de triplicación del gen en casos familiares, la localización de la a-sinucleina en los cuerpos de Lewy, una de las
5 caracteristicas patológicas principales de la enfermedad de Parkinson y la correlación de la expresión de asinucleina con la patologia de la enfermedad en modelos neurotóxicos de la enfermedad de Parkinson. Evidencias adicionales indican que formas particulares de a-sinucleína (p .ej., mal plegada y a-sinucleína unida a dopamina) están implicadas en la enfermedad esporádica.
10 [0022J Las sinudeínas son proteínas pequeñas y solubles expresadas principalmente en el tejido nervioso y en determinados tumores. La familia incluye tres proteinas conocidas: a-sinudeina, ~-sinucleina y y-sinucleina. Todas las sinucleínas tienen en común un motivo de unión a lípidos a-helicoidal altamente conservado con similitud con los dominios de unión a lípidos de d ase A2 de las apolipoproteínas intercambiables. Los miembros de la familia de las sinucleinas no se encuentran fuera de los vertebrados, aunque tienen cierta similitud estructural conservada con
15 proteínas vegetales «abundantes en embrión tardío». Las proteínas a y ~-sinucleína se encuentran principalmente en tejido cerebral, donde se observan principalmente en las terminales presinápticas. La proteina y-sinucleina se encuentra principalmente en el sistema nervioso periférico y en la retina, pero su expresión en tumores de mama es un marcador de la progresión tumoral. No se han determinado las funciones celulares normales de ninguna de las proteínas sinudeínas, aunque algunos datos sugieren su función en la regulación de la estabilidad y{o recambio de
20 la membrana. Las mutaciones en la a-sinucleína se asocian con casos familiares raros de enfermedad de Parkinson de aparición temprana, y la proteina se acumula de forma anómala en la enfermedad de Parkinson, en la enfermedad de Alzheimer y en otras diversas enfermedades neurodegenerativas. Para revisión véase, por ejemplo, George, Genome Biol. 3 (2002), revisiones 3002.1-revisiones 3002.6 publicado online el 20 de diciembre de 2001, en cuya tabla 1 se catalogan los miembros exclusivos de la familia de las sinucleinas que actualmente se enumeran
25 en GenBank.
[0023J La a-sinudeína se identificó originalmente en cerebros humanos como la proteína precursora del componente no P-amiloide (NAC, por sus siglas en inglés) de las placas de la enfermedad de Alzheimer (EA); véase, por ejemplo, Ueda y col, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90 (1993), 1281-1286. La a-sinucleina, también denominada 30 precursor del componente no A~ del amiloide de la EA (NACP , por sus siglas en inglés), es una proteina de 140 aminoácidos. La a-sinucleína aparece en su forma nativa como un ovino aleatorio; sin embargo, los cambios en el pH, la aglomeración molecular, el contenido en metales pesados y los niveles de dopamina afectan todos a la conformación de la proteina. Se piensa que los cambios en su conformación a oligomérica, protofibrilar, fibrilar y restos agregados regulan la toxicidad de la proteína. Evidencias crecientes indican que la a-sinucleína adicionada
35 con dopamina tiene una evolución temporal más rápida hacia la formación de fibrillas en comparación con la proteína no adicionada. Adicionalmente, la dopa mina en el trasfondo de la sobreexpresión de a-sinudeína es tóxica.
[0024J En esta especificación, los términos «a-sinudeina», «alfa-sinucleina», «a-sinucleina» y «aSin» se usan indistintamente para referirse específicamente a la forma monomérica nativa de la a-sinucleína. El término ~~a
40 sinucleína)) también se usa generalmente para identificar otros contómeros de a-sinudeína, por ejemplo, asinucleina unida a dopamina-quinona (DAQ) y oligómeros o agregados de a-sinucleina. El término «a-sinucleina» también se usa para referirse colectivamente a todos los tipos y formas de a-sinudeína. La secuencia proteica de la a-sinucleína humana es MOVFMKGLSKAKEGWAAAEKTKQGVAEAAGKTKEGVL YVGSKTKEGWHGVAT VAEKTKEQVTNVGGAVVTGVTAVAQKTVEGAGSIAAATGFVKKDQLGKNEEGAPQ
45 EGILEDMPVOPONEAYEMPSEEGYQDYEPEA (SEC ID N.O 1). La secuencia de aminoácidos de la a-sinucleina puede obtenerse de la bibliografia y de las bases de datos pertinentes; véase, por ejemplo, Ueda y col., ibid. ; GenBank de swissprot: locus SYUA_HUMAN, número de acceso P37840. El componente no A~ del amiloide de EA (NAC) deriva de la a-sinucleina. NAC, un dominio altamente hidrófobo dentro de la a-sinucleina, es un péptido compuesto de al menos 28 restos de aminoácidos (restos 60-87) y, opcionalmente, 35 restos de aminoácidos (restos
50 61-95). NAC muestra tendencia a formar una estructura beta laminar (Iwai y col., Biochemistry, 34 (1995) 1013810145). Las secuencias de aminoácidos de NAC se describen en Jensen y col., Biochem. J. 310 (1995), 91-94; número de acceso a GenBank S56746 y Ueda y col., PNAS USA 90 (1993),1282-11286.
[0025J a-Sinucleína desagregada o sus fragmentos, incluido NAC, significa unidades peptídicas monoméricas. La
55 a-sinucleína desagregada o sus fragmentos son generalmente solubles y son capaces de autoagregarse para formar oligómeros solubles. Los oligómeros de a-sinucleina y sus fragmentos normalmente son solubles y están predominantemente como hélices a. La a-sinucleina monomérica puede prepararse in vitro disolviendo el péptido liofilizado en OMSO puro con sonicación. La solución resultante se centrifuga para eliminar cualquier partícula insoluble. a-Sinucleína agregada o sus fragmentos, incluido NAC, significa oligómeros de a-sinucleina o sus fragmentos que están asociados en láminas ~ ensambladas insolubles. a-Sinucleina desagregada o sus fragmentos, incluido NAC, significa también polimeros fibrilares. Las fibrinas normalmente son insolubles. Algunos anticuerpos se unen a la a-sinucleina soluble o a sus fragmentos o a la a-sinucleina agregada o a sus fragmentos. Algunos anticuerpos se unen a los oligómeros de a-sinucleina más fuertemente que a las formas monomericas o a formas
5 fibrilares. Otros anticuerpos se unen tanto a la a-sinucleina soluble como agregada o a sus fragmentos y, opcionalmente a las formas oligoméricas también.
[0026] Los anticuerpos anti-a-sinucleina humanos descritos en este documento se unen especifica mente a la asinucleina y a sus epitopes y a diversas conformaciones de a-sinucleina y sus epitopes. Por ejemplo, en este 10 documento se describen anticuerpos que se unen especifica mente a a-sinucleina, a a-sinucleina en su forma monomérica nativa, a a-sinucleina de longitud completa y truncada ya agregados de a-sinucleina. Según se usa en este documento, la referencia a un anticuerpo que «se une específicamente», «se une selectivamente» o «se une preferentemente)) a a-sinucleina se refiere a un anticuerpo que no se une a otras proteinas no relacionadas. En un ejemplo, un anticuerpo frente a a-sinucleina descrito en este documento puede unirse a la a-sinucleina o a un 15 epitope de la misma y no muestra unión por encima de aproximadamente 1,5 veces el fondo para otras proteinas. Un anticuerpo que «se une especifica mente» o «se une selectivamente» a confórmeros de a-sinucleina se refiere a un anticuerpo que no se une a todas las conformaciones de a-sinucleina, es decir, no se une al menos a uno de los otros confórmeros de a-sinucleina. Por ejemplo, en este documento se describen anticuerpos que pueden distinguir entre formas monoméricas y agregadas de a-sinucleína, entre a-sinucleína humana y de ratón entre a-sinucleina de 20 longitud completa y formas truncadas así como entre a-sinucleína humana y ~ y y-sinucleínas. Puesto que los anticuerpos anti-a-sinucleina humanos de la presente invención se han aislado a partir de un grupo de sujetos de edad avanzada sin signos de Parkinsonismo y que muestran una respuesta inmunitaria específica de a-sinucleína, los anticuerpos frente a a-sinucleína de la presente invención también pueden denominarse ((autoanticuerpos humanos» para hacer hincapié en que dichos anticuerpos fueron expresados de hecho por sujetos y no se han
25 aislado de, por ejemplo, una biblioteca de fagos que expresan inmunoglobulinas humanas, lo que hasta ahora representaba un procedimiento común para intentar obtener anticuerpos similares a humanos.
[0027] El termino ((polinucleótidQ)) pretende abarcar un ácido nucleico singular así como ácidos nucleicos plurales y se refiere a una molécula o construcción de ácido nucleico aislada, por ejemplo, ARN mensajero (ARNm) o ADN 30 plasmidico (ADNp). Un polinucleótido puede comprender un enlace fosfodiester convencional o un enlace no convencional (p. ej., un enlace amida como el que se encuentra en los ácidos nucleicos peptidicos (PNA)). El término ((ácido nucleico» se refiere a uno o más segmentos de cualquier ácido nucleico, por ejemplO, fragmentos de ADN o ARN, presentes en un polinucleótido. Por ácido nUcleico o polinucleótido «aislado» se entiende una molécula de ácido nucleico, AON o ARN, que se ha extraído de su entorno nativo. Por ejemplo, un polinucleótido 35 recombinante que codifica un anticuerpo contenido en un vector se considera aislado a los fines de la presente invención. Entre otros ejemplos de polinucleótido aislado se incluyen polinucleótidos recombinantes mantenidos en células huésped heterólogas o polinucleótidos purificados (parcial o sustancialmente) en solución. Las moléculas de ARN aisladas incluyen transcritos de polinucleótidos de ARN in vivo o in vitro de la presente invención. Los polinucleótidos o ácidos nucleicos aislados según la presente invención además incluyen aquellas moléculas
40 producidas sintéticamente. Además, el polinucleótido o ácido nucleico puede ser o puede incluir un elemento regulador como un promotor, un sitio de unión a los ribosomas o un terminador de transcripción.
[0028J Según se usa en este documento, una «región codificadora)) es una porción de ácido nucleico que consta de codones traducidos en aminoácidos. Aunque un «codón de parada» (TAG, TGA o TAA) no se traduce en 45 aminoácido. puede considerarse parte de la región codificadora, aunque todas las secuencias flanqueantes, por ejemplo promotores, sitios de unión a ribosomas, terminadores de transcripción, intrones y similares, no son parte de la región codificadora. Dos o más regiones codificadoras de la presente invención pueden estar presentes en una única construcción polinucleotidica, por ejemplo, en un único vector, o en construcciones polinucleotidicas independientes, por ejemplo, en vectores separados (diferentes). Adicionalmente, cualquier vector puede contener 50 una única región codificadora, o puede comprender dos o más regiones codificadoras, por ejemplo, un único vector puede codificar independientemente una región variable de la cadena pesada de la inmunoglobulina y una región variable de la cadena ligera de la inmunoglobulina. Además, un vector, polinucleótido o ácido nucleico de la invención puede codificar regiones codificadoras heterólogas, fusionadas o no con un ácido nucleico que codifica una molécula de unión, un anticuerpo, o su fragmento, variante o derivado. Entre las regiones codificadoras
55 heterólogas se incluyen sin limitaciones, elementos o motivos especializados, como un péptido señal secretor o un domino funcional heter6logo.
[0029J En determinadas realizaciones, el polinucleótido o ácido nucleico es ADN. En el caso de AON, un polinucleótido que comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido normalmente puede incluir un promotor
y/u otros elementos de transcripción o traducción asociado de forma operativa con una o más regiones codificadoras. Una asociación operativa es cuando una región codificadora de un producto génico, por ejemplo, un polipéptido, se asocia con una o más secuencias reguladoras de modo que se coloca la expresión del producto génico bajo la influencia o control de las secuencias reguladoras. Dos fragmentos de ADN (como una región 5 codificadora de un polipéptido y un promotor asociado a esta) están ((asociados de forma operativa» o ({Unidos de fonna operativa» si la inducción de la función promotora liene como resultado la transcripción del ARNm que codifica el producto génico deseado y si la naturaleza de la unión entre los dos fragmentos de ADN no interfiere con la capacidad de las secuencias reguladoras de la expresión para dirigir la expresión del producto génico ni interfiere con la capacidad del molde de ADN que se va a transcribir. Por tanto, una región promotora podria estar asociada 10 de forma operativa con un ácido nucleico que codifica un polipéptido si el promotor era capaz de llevar a cabo la transcripción de dicho ácido nucleico. El promotor puede ser un promotor especifico de célula que dirija la transcripción sustancial del ADN sólo en células predeterminadas. Otros elementos de control de la transcripción además del promotor, por ejemplo, potenciadores, operadores, represores y seFiales de terminación de la transcripción, pueden estar unidos de fonna operativa con el polinucleótido para dirigir la transcripción especifica de
15 célula. En este documento se describen promotores y otras regiones de control de la transcripción adecuadas.
[0030] Los ténninos «anticuerpo» e ((inmunoglobulina» se usan indistintamente en este documento. Un anticuerpo
o inmunoglobulina es una molécula que se une a a-sinucleina que comprende al menos el dominio variable de una cadena pesada y normalmente comprende al menos los dominios variables de una cadena pesada y una cadena
20 ligera. Las estructuras de la inmunoglobulina básicas en sistemas de vertebrados se conocen relativamente bien; véase, por ejemplo, Harlow y col., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold $pring Harbor Laboratory Press, 2a edición, 1988).
[0031] Como se describirá con más detalle a continuación, el término «inmunoglobulina» comprende diversas
25 clases amplias de polipéptidos que pueden distinguirse desde un punto de vista bioquimico: Los expertos en la materia apreciarán que las cadenas pesadas se clasifican como gamma, mu, alfa, delta o épsilon (y, IJ, a, 6, r) con algunas subclases entre ellas (p. ej., y1-y4). Es la naturaleza de esta cadena la que determina la «clase» del anticuerpo como IgG, IgM, IgA, IgG o IgE, respectivamente. Las subclases de inmunoglobulinas (isolipos), por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, etc., están bien caracterizadas y se sabe que confieren especialización
30 funcional. Las versiones modificadas de cada una de estas clases e isotipos son fácilmente discemibles por los expertos en la materia a la vista de la descripción actual y, por consiguiente, están dentro del alcance de la presente invención. Todas las clases de inmunoglobulinas están claramente dentro del alcance de la presente invención, la siguiente descripción estará generalmente dirigida a la clase de IgG de moléculas de inmunoglobulina. Con respecto a la IgG, una molécula de inmunoglobulina estándar comprende dos polipéptidos de cadena ligera idénticos de un
35 peso molecular de aproximadamente 23.000 Da1tons y dos polipéptidos de cadena pesada idénticos de peso molecular 53.000-70.000. Típicamente, las cuatros cadenas se unen mediante puentes disulfuro en una configuración en fonna de ((y» donde las cadenas ligeras abrazan a las cadenas pesadas desde la boca de la «y» y continúan a través de la región variable.
40 [0032] Las cadenas ligeras se clasifican en kappa o lambda (K, A). Cada clase de cadena pesada puede unirse con una cadena ligera kappa o lambda. En general, las cadenas ligeras y pesadas están unidas covalentemente entre si y las porciones de la «cola» de las dos cadenas pesadas se unen entre si mediante puentes disulfuro covalentes o enlaces no covalentes cuando las inmunoglobulinas se generan en los hibridomas, las células B o células huésped genéticamente modificadas. En la cadena pesada, las secuencias de aminoácidos van desde un extremo N tenninal
45 en los extremos forzados de la configuración en Y hacia el extremo C-terminal de la parte inferior de cada cadena.
[0033] Tanto las cadenas ligeras como las pesadas se dividen en regiones de homologia estructural y funcional. Los ténninos «constante» y «variable» se usan a nivel funcional. A este respecto, se apreciará que los dominios variables de ambas porciones de las cadenas ligera (Vl) y pesada (VH) determinan el reconocimiento y especificidad 50 del antígeno. Por el contrario, los dominios constantes de la cadena ligera (Cl ) y la cadena pesada (CH1, CH2 o CH3) confieren propiedades biológicas importantes como secreción, movilidad transplacental, unión al receptor Fe, unión a complemento y similares. Por convención, la numeración de los dominios de la región constante aumentan conforme se alejan del sitio de unión al antigeno o al extremo amino tenninal del anticuerpo. La porción N-terminal es una región variable y la porción C-terminal es una región constante; los dominios CH3 y Cl comprenden
55 realmente el extremo carboxilo terminal de las cadenas pesada y ligera, respectivamente.
[0034] Como se indica a continuación, la región variable permite al anticuerpo reconocer de fonna selectiva y especifica epitopes de unión en los antígenos. Es decir, el dominio Vl y el dominio VH, o el subconjunto de las regiones determinantes de complementariedad (CDR), de un anticuerpo se mezclan para formar la región variable que define un sitio de unión al antigeno tridimensional. Esta estructura cuatemaria del anticuerpo forma el sitio de unión al anUgeno que aparece al final de cada brazo de la Y. Más espedficamente, el sitio de unión al antígeno queda definido mediante las tres CDR de las cadenas VH y VL. Cualquier anticuerpo o fragmento de inmunoglobulina que contiene estructura suficiente para unirse espedficamente a la a-sinucleína se indica en este documento
5 indistintamente como ((fragmento de unión» o un «fragmento inmunoespecífico».
[0035] En los anticuerpos naturales, un anticuerpo comprende seis regiones hipervariables, en ocasiones denominadas ((regiones determinantes de complementariedad)) o ((CDR» presentes en cada dominio de unión al antigeno, que son secuencias cortas de aminoácidos no contiguas que se colocan específicamente para formar el 10 dominio de unión al antígeno cuando el anticuerpo adquiere su configuración tridimensional en un entorno acuoso. Las «CDR» están flanqueadas por cuatro regiones «estructurales» o «FR» relativamente conservadas que muestran menor variabilidad intermolecular. Las regiones estructurales adoptan en gran medida una conformación ¡3-laminar y las CDR forman bucles que conectan y, en algunos casos, forman pa ra de la estructura ¡3-lam ina r. Por tanto, las regiones estructurales actúan formando un andamiaje que permite que las CDR se coloquen en la orientación 15 correcta mediante interacciones intercatenarias no covalentes. El dominio de unión al antígeno formado mediante la colocación de las CDR define una superficie complementaria con el epítope del antigeno inmunoreactivo. Esta superficie complementaria promueve la unión no covalente del anticuerpo a su epítope relacionado. Un experto en la materia puede identificar fácilmente los aminoácidos que comprenden las CDR y las regiones estructurales, respectivamente, para cada región variable de cualquier cadena pesada o ligera en concreto ya que estas han sido
20 definidas con precisión; véase ((Sequences of Proteins of Immunological Interest," Kabat, E., y col., U.S. Department of Heallh and Human Services, (1983) y Chothia y Lesk, J. Mol. Biol., 196 (1987), 901-917.
[0036] En el caso en que haya dos o más definiciones de un término utilizado yfo aceptado en la técn ica, se pretende que la definición del término utilizada en este documento incluya todos los significados, siempre que no se 25 establezca explicita mente lo contrario. Un ejemplo específico es el uso del término «región determinante de complementariedad)) «((CDR))) para describir los sitios de combinación con el antigeno no contiguos que se encuentran en la región variable de ambos polipéptidos de las cadenas pesada y ligera. Esta región en particular ha sido descrita por Kabat y col., U.S. Dept. of Health and Human Services, «Sequences of Proteins of Immunological Interes!» (1983) y por Chothia y Lesk, J. Mol Biol., 196 (1987), 901-917, donde las definiciones incluyen 30 solapamientos o subconjuntos de restos de aminoácidos cuando se comparan entre si. No obstante, la aplicación de cualquier definición para denominar a una CDR de un anticuerpo o sus variantes se pretende que esté dentro del alcance del término según se define y usa en este documento. Los restos de aminoácidos apropiados que abarcan las CDR según se definen en cada una de las referencias citadas anteriormente se establecen a continuación en la tabla 1 de forma comparativa. El número exacto de restos que abarca una CDR en particular variará dependiendo de
35 la secuencia y el tamaño de la CDR. Los expertos en la materia pueden determinar de forma rutinaria qué restos contiene una región hipervariable o CDR en concreto del subtipo IgG humano de un anticuerpo dada la secuencia de aminoácidos de la región variable del an1icuerpo.
Tabla 1: Definiciones de CDR1
Kaba'
IVH ~
VH
~~2
50-5'
IVL ~
VL <3
~
91-96 'La . i i con las i de
de lod;a~o~a~aba:yicol. (v.::e ~~: eO,'a labia 1
I
[0037] Kabat y col. también definen un sistema de numeración para las secuencias de los dominios variables que es aplicable a cualquier anticuerpo. Un experto en la materia puede asignar sin ambigüedad este sistema de «numeración de Kabab> a cualquier secuencia de dominio variable, sin depender de ningún dato experimental más 45 allá de la propia secuencia. Según se usa en este documento, la «numeración de Kabat» hace referencia al sistema de numeración establecido por Kabat y col., U.S. Dept. of Health and Human Services, ({Sequence of Proteins of Immunological Inleres!» (1983). Siempre que no se especifique otra cosa, las referencias a la numeración de las posiciones específicas de los restos de aminoácidos en un anticuerpo o su fragmento de unión al antígeno, variante
o derivado de la presente invención se hacen según el sistema de numeración de Kabat.
[0038] Entre los anticuerpos o sus fragmentos de unión al antigeno, fragmentos inmunoespecíficos, variantes o derivados de la invención se incluyen, pero sin limitaciones, anticuerpos policlonales, monoclonales, multiespecíficos, humanos, humanizados, primatizados, murinizados o quiméricos, anticuerpos de cadena sencilla, fragmentos de unión al epítope, por ejemplo, Fab, Fab' ° F(ab')2, Fd, Fv, Fs de cadena sencilla (scFv), anticuerpos 5 de cadena sencilla, Fv unidos mediante puentes disulfuro (sdFv), fragmentos que comprenden dominios VL o VH, fragmentos producidos por una biblioteca de expresión de Fab y anticuerpos antiidiotipo (anti-Id) (incluidos, p. ej., anticuerpos anti-Id frente a los anticuerpos descritos en este documento). Las moléculas de ScFv son conocidas en la técnica y se describen, por ejemplo en la patente de EE. UU. 5.892.019. Las moléculas de inmunoglobulina o anticuerpos de la invención pueden ser de cualquier tipo (p. ej., IgG, IgE, IgM, IgO, IgA e IgY), clase (por ejemplo,
10 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) o subclase de molécula de inmunoglobulina.
[0039] En una realización, el anticuerpo de la presente invención no es IgM ni un derivado de misma con estructura pentavalente. En especial, en aplicaciones especificas de la presente invención, especialmente durante el uso terapéutico, las IgM son menos útiles que las IgG y otros anticuerpos bivalentes o las correspondientes
15 moléculas de unión ya que las IgM, debido a su estructura pentavalente ya la falta de maduración de la afinidad, a menudo muestran reactividades cruzadas inespecificas y de muy baja afinidad.
[0040] En una realización especialmente preferida, el anticuerpo de la presente invención no es un anticuerpo policlonal, es decir, consiste sustancialmente en una especie de anticuerpo en particular en vez de ser una mezcla 20 obtenida a partir de una muestra de inmunoglobulinas plasmáticas.
[0041] Los fragmentos de anticuerpo, incluidos los anticuerpos de cadena sencilla, pueden comprender las regiones variables solas o en combinación con la totalidad o una porción de las siguientes regiones: región bisagra, dominios CH1, CH2 y CH3. También se incluyen en la invención los fragmentos de unión a a-sinucleina que también
25 comprenden cualquier combinación de regiones variables con una región bisagra y dominios CH1, CH2 y CH3. Los anticuerpos o sus fragmentos inmunoespecificos de la presente invención pueden ser de cualquier origen animal incluyendo pájaros y mamiferos. Preferiblemente, los anticuerpos son anticuerpos humanos, murinos, de burro, conejo, cabra, cobaya, camello, llama, caballo o pollo. En otra realización, la región variable puede ser de origen condrictoide (p. ej., de tiburones).
[0042] En otro aspecto, el anticuerpo de la presente invención es un anticuerpo monoclonal humano aislado a partir de un humano. Opcionalmente, la región variable del anticuerpo humano se alinea y adopten según las secuencias de la correspondiente región variable de la linea genninal humana en la base de datos; véase, por ejemplo Vbase (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.ukJ) alojada por el MRC Centre for Protein Engineering (Cambridge, 35 RU). Por ejemplo, los aminoácidos considerados como posiblemente desviados con respecto a la secuencia de la linea germinal verdadera podrian deberse a las secuencias del cebador de PCR incorporadas durante el proceso de clonación. En comparación con los anticuerpos similares a humanos obtenidos artificialmente como fragmentos de anticuerpo de cadena sencilla (scFV) a partir de una biblioteca de anticuerpos de despliegue de fagos o de ratones xenogénicos, el anticuerpo monoclonal humano de la presente invención se caracteriza porque (i) se obtiene usando 40 la respuesta inmunitaria humana en lugar de a partir de sustitutos animales, es decir, el anticuerpo se ha generado en respuesta a una a-sinucleina natural en su conformación relevante en el organismo humano; (ií) protege al individuo o, al menos, es significativo para la presencia de a-sinucleina y (iii) puesto que el anticuerpo es de origen humano, se minimizan los riesgos de reactividad cruzada frente a autoantigenos. Por tanto, de acuerdo con la presente invención, los ténninos «anticuerpo monoclonal humano», «autoanticuerpo monoclonal humano»,
45 «anticuerpo humano» y similares se usan para indicar una molécula que se une a a-sinucleina que es de origen humano, es decir, que se ha aislado de una célula humana, tal como una célula B o un hibridoma de la misma, o cuyo AONc se ha clonado directamente a partir del ARNm de una célula humana, por ejemplo una célula B de memoria humana. Un anticuerpo humano sigue siendo «humano» incluso si se han hecho sustituciones en dicho anticuerpo, por ejemplo, para mejorar sus caracteristicas de unión.
50 [0043] Los anticuerpos derivados de bibliotecas de inmunoglobulinas humanas o de animales transgénicos para una o más inmunoglobulinas humanas, y que no expresan inmunoglobulinas endógenas, como se describe más abajo, y, por ejemplo, en la patente de EE. UU N. o 5.939.589 de Kucherlapati y col., se denominan anticuerpos similares a humanos para distinguirlos de los anticuerpos realmente humanos de la presente invención.
55 [0044] Según se usa en este documento, el ténnino «anticuerpo murinizado» o «inmunoglobulina murinizada» se refiere a un anticuerpo que comprende una o más COR de un anticuerpo humano de la presente invención, y una región estructural humana que contiene sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácidos basados en una secuencia de un anticuerpo murino. La inmunoglobulina humana que proporciona las COR se denomina la ((original»
o «aceptora» y el anticuerpo monoclonal de ratón que proporciona los cambios estructurates se denomina el «donante». No es necesario que presente regiones constantes, aunque si las tiene, nonnalmente son sustancialmente idénticas a las regiones constantes del anticuerpo de ratón, es decir, al menos aproximadamente el 85-90%, preferiblemente aproximadamente el 95% o más idénticas. Por tanto, en algunas realizaciones, una cadena 5 pesada o ligera de inmunoglobulina humana murinizada de longitud completa contiene una región constante de ratón, CDR humanas y una región estructural sustancialmente humana que tiene varias sustituciones de aminoácidos «murinizados». Típicamente, un «anticuerpo murinizado» es un anticuerpo que comprende una cadena ligera variable murinizada yfo una cadena pesada variable murinizada. Por ejemplo, un anticuerpo murinizado podría no abarca un anticuerpo quimérico típico, por ejemplo, debido a que la región variable completa de un anticuerpo
10 quimérico no es de ratón. Un anticuerpo modificado que ha sido «murinizadQ) mediante el proceso de «murinización» se une al mismo antígeno que el anticuerpo original que proporciona las CDR y normalmente es menos inmunogénico en ratones, en comparación con el anticuerpo original.
[0045] Según se usa en este documento, el ténnino «porción de cadena pesada» inctuye secuencias de
15 aminoácidos derivados de una cadena pesada de inmunoglobulina. Un polipéptido que comprende una porción de cadena pesada comprende al menos uno de los siguientes dominios: un dominio CH1, un dominio bisagra (p. ej., región bisagra superior, media yfo inferior), un dominio CH2, un dominio CH3 o una variante o fragmento del mismo. Por ejemplo, un polipéptido de unión utilizado en la invención puede comprender una cadena polipeptídica que comprende un dominio CH1, una cadena polipeptídica que comprende un dominio CH1, al menos una porción de un
20 dominio bisagra y un dominio CH2; una cadena polipeptídica que comprende un dominio CH1 y un dominio CH3; una cadena polipeptídica que comprende un dominio CH1, al menos una porción de un dominio bisagra y un dominio CH3, o una cadena polipeptídica que comprende un dominio CH1, al menos una porción de un dominio bisagra, un dominio CH2 y un dominio CH3. En otra realización, un polipéptido de la invención comprende una cadena polipeptídica que comprende un dominio CH3. Adicionalmente, un polipéptido de unión para su uso en la
25 invención puede carecer al menos una porción de un dominio CH2 (p. ej., todo o parte de un dominio CH2). Como se estableció anteriormente, un experto en la materia entenderá que estos dominios (p. ej., las porciones de la cadena pesada) pueden modificarse de modo que varíen en secuencia de aminoácidos con respecto a la molécula de inmunoglobulina natural.
30 [0046] En determinados anticuerpos, o fragmentos de unión al antigeno, variantes o derivados de los mismos descritos en este documento, las porciones de la cadena pesada de una cadena polipeptídica de un multímero son idénticas a las de una segunda cadena polipeptídica del multrmero. Altemativamente, los monómeros que contienen porciones de la cadena pesada de la invención no son idénticos. Por ejemplo, cada monómero puede comprender un sitio de unión diana diferente, formando, por ejemplo, un anticuerpo o dianticuerpo biespecifico.
35 [0047] En otra realización, los anticuerpos, o fragmentos de unión al antígeno, variantes o derivados de los mismos descritos en este documento están compuestos por una cadena polipeptidica sencilla, como un scFv, y tienen que expresarse intracelularmente (intraanticuerpos) para obtener sus posibles aplicaciones terapéuticas y diagnósticas in vivo.
40 [0048] Las porciones de la cadena pesada de un polipéptido de unión para su uso en los procedimientos de diagnóstico y tratamiento descritos en este documento pueden derivar de diferentes moléculas de inmunoglobulina. Por ejemplo, una porción de cadena pesada de un polipéptido puede comprender un dominio CH1 derivado de una molécula de IgG1 y una región bisagra derivada de una molécula de IgG3. En otro ejemplo, una porción de la
45 cadena pesada puede comprender una región bisagra derivada, en parte, de una molécula de IgG1 y, en parte, de una molécula de IgG3. En otro ejemplo, una porción de la cadena pesada puede comprender una bisagra quimérica derivada, en parte, de una molécula de IgG1 y, en parte, de una molécula de IgG4.
[0049] Según se usa en este documento, el término ((porción de cadena ligera» incluye secuencias de
50 aminoácidos derivadas de una cadena ligera de inmunoglobulina. Preferiblemente, la porción de cadena ligera comprende al menos un dominio VL o el. Se piensa que el tamaño minimo de un péptido o epitope polipeptidico para un anticuerpo es de aproximadamente de cuatro a cinco aminoácidos. Los péptidos o epitopes polipeptidicos preferiblemente contienen al menos siete, más preferiblemente al menos nueve y, lo más preferible, entre de al menos aproximadamente 15 a aproximadamente 30 aminoácidos. Puesto que una CDR puede reconocer un péptido
55 o polipéptido antigénico en su fonna terciaria, no es necesario que los aminoácidos que comprende un epítope estén contiguos y, en algunos casos, puede incluso Que no estén en la misma cadena peptidica. En la presente invención, un péptido o epitope polipeptidico reconocido por los anticuerpos de la presente invención contiene una secuencia de al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, más preferiblemente al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 15, al menos 20, al menos 25, o entre de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 aminoácidos
contiguos o no contiguos de a-sinucleina.
[0050] Por «unido específicamente» o «reconocido especifica mente», usados indistintamente en este documento, generalmente se entiende que una molécula de unión, p. ej., un anticuerpo se une a un epítope a través de su 5 dominio de unión al anUgeno y que la unión implica cierta complementariedad entre el dominio de unión al anUgeno y el epitope. Según esta definición, se dice que un anticuerpo se «une específicamente» a un epitope cuando se une a dicho epítope a través de su dominio de unión al antígeno más fácilmente que si se uniera a un epítope aleatorio no relacionado. El término ((especificidad» se usa en este documento para calificar la afinidad relativa a la que un determinado anticuerpo se une a un determinado epitope. Por ejemplo, puede considerarse que el anticuerpo «A» 10 tiene una especificidad mayor por un epítope determinado que el anticuerpo ((B» o puede decirse que un anticuerpo
«A» se une a un epítope «e» con una especificidad más alta que la que tiene para el epitope relacionado «D».
[0051] Cuando se presenta, el término «características inmunológicas de unión» u otras características de unión de un anticuerpo con un antigeno, en todas sus formas gramaticales, se refiere a la especificidad, afinidad, 15 reactividad cruzada y otras características de unión de un anticuerpo.
[0052] Por «unido preferentemente» , se entiende que la molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo se une especificamente a un epitope más fácilmente de lo que podria unirse a un epitope relacionado, similar, homólogo o análogo. Por tanto, un anticuerpo que se «une preferentemente» a un determinado epítope podría unirse más
20 probablemente a dicho epítope que a otro epítope relacionado, incluso si este anticuerpo puede presentar reacción cruzada con el epitope relacionado.
[0053] A modo de ejemplo no limitante, una molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo, puede considerarse que se une a un primer epitope preferentemente si se une a dicho epitope con una constante de disociación (Ko) 25 que es menor que la Ko del anticuerpo para el segundo epítope. En otro ejemplo no limitante, puede considerarse que un anticuerpo se une a un primer antígeno preferentemente si se une al primer epítope con una afinidad que es al menos un orden de magnitud menor que la Ko del anticuerpo para el segundo epítope. En otro ejemplo no limitante, puede considerarse que un anticuerpo se une a un primer epitope preferentemente si se une al primer epitope con una afinidad Que es al menos dos órdenes de magnitud menor Que la Ko del anticuerpo para el segundo
30 epitope.
[0054] En otro ejemplo no limitante, una molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo, puede considerarse que se une a un primer epitope preferentemente si se une al primer epitope con una velocidad de disociación (K[otI) Que es menor que la k(off) del anticuerpo para el segundo epítope. En otro ejemplo no limitante, puede considerarse que un
35 anticuerpo se une a un primer epitope preferentemente si se une al primer epitope con una afinidad que es al menos un orden de magnitud menor que la k{off) del anticuerpo para el segundo epitope. En otro ejemplo no limitante, puede considerarse que un anticuerpo se une a un primer epitope preferentemente si se une al primer epitope con una afinidad Que es al menos dos órdenes de magnitud menor Que la k(oH) del anticuerpo para el segundo epitope.
40 [0055] Puede decirse que una molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno, variante o derivado descrito en este documento se une a a-sinucleina o a un fragmento o variante de la misma, con una velocidad de disociación (k[off]) igualo menor a 5 x 10.2 s·l, 10.2 s·l, 5 X 10.3 S·l o 10-3 S·l. Más preferiblemente, puede decirse que un anticuerpo de la invención se une a a-sinucleína o a un fragmento o variante de la misma con una velocidad de disociación (k[off]) menor o igual a 5 X 10"" s·l, 10-4 s·1, 5 X 10.5 s·l, o 10-5 S·l 5 X 10.fi s·1, 10.fi s·l, 5
45 X 10.7 S·l o 10.7 S·l .
[0056] Se dice que una molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión al anUgeno, variante o derivado descrito en este documento se une a a-sinucleina o a un fragmento o variante de la misma, con una velocidad de disociación (k[off]) mayor o igual a 103 M1 s·1, 5 X 103 M·1 s·1, 104 M·1 S·l o 5 X 104 M-1 S·l . Más
50 preferiblemente, puede decirse que un anticuerpo de la invención se une a a-sinucleína o a un fragmento o variante de la misma, con una velocidad de disociación (k[off]) mayor o igual a 105 M·l S·l, 5 X 105 M·l S·l, 106 M-l S-l O 5 X 106 M·' s·, o 10' M·' s·'.
[0057] Se dice que una molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo inhibe competitiva mente la unión de un
55 anticuerpo de referencia a un epitope determinado si se une preferentemente a dicho epítope hasta el punto de bloquear, en algún grado, la unión del anticuerpo de referencia al epitope. La inhibición competitiva puede determinarse mediante cualquier método conocido en la materia, por ejemplo, ensayos de tipo ELlSA competitivos. Puede decirse que un anticuerpo inhibe de forma competitiva la unión del anticuerpo de referencia a un epitope determinado en al menos eI 90%, al menos el 80%, al menos el 70%, al menos el 60% o al menos el 50%.
[0058J Según se usa en este documento, el término «afinidad» se refiere a una medida de la fuerza de unión de un epitope individual con la CDR de una molécula de unión, por ejemplo, una molécula de inmunoglobulina; véase, por ejemplo., Harlow y col. , Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a edición, (1988) 5 páginas 27-28. Según se usa en este documento, el término ((avidez» se refiere a la estabilidad en conjunto del complejo entre una población de inmunoglobulinas y un antigeno, es decir, la fuerza funcional de combinación de una mezcla de inmunoglobulina con el anUgeno; véanse, por ejemplo, las páginas 29-34 de Harlow. La avidez se relaciona tanto con la afinidad de moléculas de inmunoglobulina individuales en la población con epitopes especificos como con las valencias de las inmunoglobulinas y el antigeno. Por ejemplo, la interacción entre un 10 anticuerpo monoclonal bivalente y un antigeno con una estructura de epitope altamente repetitiva, como un polimero, seria de alta avidez. La afinidad o avidez de un anticuerpo por un antigeno puede determinarse experimentalmente usando cualquier metodo adecuado; véase, por ejemplo, Berzofsky y col., «Antibody-Antigen Interactions» en Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press New York, N Y (1984), Kuby, Janis Immunology, W. H. Freeman and Company New York, N Y (1992) Y los procedimientos descritos en este
15 documento. Entre las técnicas generales para determinar la afinidad de un anticuerpo por un antigeno se induyen ELlSA, RIA y resonancia de plasmones superficiales. La afinidad determinada de una interacción entre anticuerpo y antigeno en particular puede variar si se mide en condiciones diferentes de, por ejemplo, concentración salina, pH, etc. Por tanto, las determinaciones de la afinidad y de otros parámetros de unión al antigeno, por ejemplo, Ko o ICso, se hacen preferiblemente con soluciones estandarizadas de anticuerpo y antigeno y con un tampón estandarizado.
20 [0059J Las moléculas de unión, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de unión al antlgeno, variantes o derivados de los mismos de la invención también pueden describirse o especificarse en términos de su reactividad cruzada. Según se describe en este documento, el término ((reactividad cruzada» hace referencia a la capacidad de un anticuerpo, especifico de un antigeno, para reacciona con un segundo antigeno; una medida de la relación entre dos
25 sustancias antigénicas diferentes. Por tanto, un anticuerpo presenta reacción cruzada si se une a un epitope que no es el que indujo su formación. El epitope de reacción cruzada contiene, generalmente, muchas de las caracteristicas estructurales complementarias semejantes a las del epitope inductor y, en algunos casos, puede encajar realmente mejor que el original.
30 [0060J Por ejemplo, determinados anticuerpos tienen cierto grado de reactividad cruzada, de modo que se unen a epitopes relacionados, aunque no idénticos, por ejemplo, epitopes con una identidad de al menos el 95%, al menos el 90%, al menos el 85%, al menos el 80%, al menos el 75%, al menos el 70%, al menos el 65%, al menos el 60%, al menos el 55% y al menos el 50% (según se calcula usando procedimientos conocidos en la materia y descritos en este documento) con un epitope de referencia. Puede decirse que un anticuerpo tiene poca o ninguna reactividad
35 cruzada si no se une a epitopes con una identidad de menos del 95%, menos del 90%, menos del 85%, menos del 80%, menos del 75%, menos del 70%, menos del 65%, menos del 60%, menos del 55% y menos del 50% (según se calcula usando procedimientos conocidos en la materia y descritos en este documento) con respecto a un epitope de referencia. Un anticuerpo puede considerarse «altamente especifico» por un determinado epitope si no se una a ningún otro análogo, ortólogo u homólogo de dicho epitope.
40 [0061J Las moléculas de unión, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de unión al antigeno, variantes o derivados de los mismos de la invención también pueden describirse o especificarse en términos de su afinidad de unión a 0sinucleina. Entre las afinidades de unión preferidas se incluyen aquellas con una constante de disociación o Kd de menos de 5 x 10-2M, 10-2M, 5 X 10-3 M, 10-3 M, 5 X 10-4 M, 10-4 M, 5 X 10-5 M, 10-5 M, 5 X 10-6 M, 10-6 M, 5 X 10-7 M,
45 10-7 M, 5 X 10-il M, 10-8 M, 5 X 10-9 M, 10-9 M, 5 X 10-10 M, 10-10 M, 5 x 10-~ M, 10-11 M, 5 X 10-12 M, 10-12 M, 5 x 1013 M, 10-13 M, 5 X 10-14 M, 10-14 M, 5 X 10-15 M o 10-15 M.
[0062J Como se indicó previamente, las estructuras de subunidades y la configuración tridimensional de las regiones constantes de las diversas clases de inmunoglobulinas son bien conocidas. Según se usa en este
50 documento, el término «dominio VH» incluye el dominio variable amino terminal de una cadena pesada de la inmunoglobulina y el término «domino CH1» incluye la primera región constante (la más amino terminal) de una cadena pesada de la inmunoglobutina. El dominio CH1 se encuentra adyacente al dominio VH y es aminoterminal con respecto a la región bisagra de una molécula de cadena ligera de la inmunoglobulina.
55 [0063J Según se usa en este documento, el término ((dominio CH2» incluye la porción de una molécula de cadena pesada que abarca, por ejemplo, desde aproximadamente el resto 244 al resto 360 de un anticuerpo usando esquemas de numeración convencionales (restos 244 a 260, según el sistema de numeración de Kabat, y residuos 231 a 340 según el sistema de numeración de la UE; véase Kabat EA y col. op. cit). El dominio CH2 es exclusivo porque no se empareja estrechamente con ningún otro dominio. Más bien, se interponen dos cadenas de hidratos de carbono ramificados con sitios N de glucosilación entre los dos dominios CH2 de una molécula de IgG nativa intacta. También está bien documentado que el dominio CH3 se extiende desde el dominio CH2 hasta el extremo e terminal de la molécula de IgG y comprende aproximadamente 108 restos.
5 [0064J Según se usa en este documento, el término «región bisagra» incluye la porción de una molécula de cadena pesada que une el dominio CH1 al dominio CH2. Esta región bisagra comprende aproximadamente 25 restos y es flexible lo que permite que las dos regiones N terminales de unión al antigeno se muevan independientemente. Las regiones bisagra pueden subdividirse en tres dominios diferentes: dominios bisagra superior, medio e inferior; véase Roux y col., J. Immunol161 (1998), 4083.
10 [0065J Según se usa en este documento, el término «enlace disulfuro» incluye en enlace covalente formado entre dos átomos de azufre. El aminoácido cisteína contiene un grupo tiol que puede formar un enlace o puente disulfuro con un segundo grupo tiol. En la mayoría de las moléculas de IgG naturales, las regiones CH1 y CL están unidas mediante enlaces disulfuro y las dos cadenas pesadas están unidas por dos enlaces disulfuro en las posiciones
15 correspondientes con 239 y 242 según el sistema de numeración de Kabat (posición 226 o 229 según el sistema de numeración de la UE).
[0066J Según se usa en este documento, los términos «unido», «fusionado» o «fusión» se usan indistintamente. Estos términos se refieren a la unión de dos o más elementos o componentes, por cualquier método incluyendo 20 conjugación quimica o métodos recombinantes. Una «fusión en marco» se refiere a la unión de dos o más marcos de lectura abierta (ORF) de polinucleótidos para formar un ORF continuo más largo, de manera que se mantiene el marco de lectura Iraduccional correcto del OFR original. Por tanto, una proteína de fusión recombinante es una proteína única que contiene dos o más segmentos que se corresponden con los polipéptidos codificados por los ORF originales (cuyos segmentos no están unidos de este modo en la naturaleza). Aunque el marco de lectura se
25 hace continuo de este modo a lo largo de los segmentos fusionados, los segmentos pueden separarse fisica o espacialmente mediante, por ejemplo, una secuencia enlazadora en marco. Por ejemplo, pueden fusionarse en marco polinucle6tidos que codifican las CDR de una región variable de inmunoglobulina, pero estar separados por un polinucleótido que codifica al menos una región estructura de la inmunoglobulina o regiones CDR adicionales siempre Que las CDR «fusionadas» se traduzcan conjuntamente como parte de un polipéptido continuo.
30 [0067J Según se usa en este documento, el término «muestra» se refiere a cualquier material biológico obtenido a partir de un sujeto o paciente. En un aspecto, una muestra puede comprender sangre, liquido cerebroespinal (<<LCE») u orina. En otros aspectos, una muestra puede comprender sangre completa, plasma, estar enriquecida en células B de muestras de sangre y células cultivas (p. ej., células B de un sujeto). Una muestra también puede incluir
35 una biopsia o muestra de tejido, como tejido nervioso. Aún en otros aspectos, una muestra puede comprender células completas y/o un lisado de las células. Las muestras de sangre pueden extraerse mediante procedimientos bien conocidos en la materia. En un aspecto, el sedimento puede resuspenderse mediante agitación a 4°C en 200 !JI de tampón (Tris 20 mM, pH 7,5, Nonidet al 0,5%, EDTA 1 mM, PMSF 1 mM, NaCI 0,1 M, inhibidor de proteasas IX de Sigma e inhibidores de fosfatadas IX de Sigma 1 y 2). La suspensión puede mantenerse en hielo durante 20
40 minutos con agitación intermitente. Tras centrifugar a 15000 g durante 5 minutos a aproximadamente 4OC, pueden conservarse alicuotas del sobrenadante a aproximadamente -70°C.
[0068J Según se usa en este documento, los términos dratar» o (dratamientm) se refieren tanto a tratamiento terapéutico como a medidas profilácticas o preventivas, donde el objeto es prevenir o ralentizar (disminuir) un
45 cambio fisiológico o trastorno no deseado, como el desarrollo de Parkinsonismo. Entre los resultados clinicos beneficiosos o deseados se incluyen, pero sin limitaciones, alivio de los síntomas, disminución de la extensión de la enfermedad, estabilización (es decir, sin empeoramiento) del estado de la enfermedad, retraso o reducción de la progresión de la enfermedad, mejoria o paliación del estado de la enfermedad y remisión (total o parcial) tanto detectable como indetectable. «Tratamiento» también puede incluir prolongar la supervivencia en comparación con
50 la supervivencia esperada si no se recibe tratamiento. Entre aquellos que necesitan tratamiento se incluye tanto a los que ya presentan la afección o trastorno como a los que son propensos a dicha afección o trastorno o aquellos en los que la manifestación de la afección o trastorno se va a prevenir.
[0069J Por «sujeto», (dndividuo»), «animah¡ «paciente» o «mamífero») se entiende todo sujeto, especialmente un 55 sujeto mamífero, por ejemplo, un paciente humano para el cual se desea un diagnóstico, pronóstico, prevención o terapia.
11. Anticuerpos
[0070] La presente invención generalmente se refiere a anticuerpos humanos anti-a-sinucleína y a sus fragmentos de unión al antígeno según se caracteriza en las reivindicaciones, que preferiblemente muestran las características inmunológicas de unión y/o las propiedades biológicas que se destacan para el anticuerpo NI-202-12F4 ilustradas en los ejemplos. Según la presente invención los anticuerpos monodonales humanos específicos de a-sinucleina se
5 clonaron a partir de un grupo de sujetos de edad avanzada.
[0071] En el lranscurso de los experimentos realizados según la presente invención los intentos iniciales de clonar anticuerpos específicos de a-sinucleína fallaron ya que prácticamente en todas las ocasiones se obtuvieron dones falsos positivos. El estudio adicional de estos clones mostró que se producian anticuerpos que reconocian proteinas
10 de E. coli. Para superar este problema, se cribaron los anticuerpos en paralelo en medios condicionados de cultivos de células B de memoria humanas por su capacidad de unión a placas recubiertas de monómeros de alfa sinucleina de longitud completa y ausencia de unión a proteinas de E. coli y a albumina sérica bovina (BSA). En particular, el medio condicionado de células B se preabsorbió con proteinas de E. coli antes de someterlo a un ensayo de tipo ELlSA para el cribado de anticuerpos humanos que se unen a a-sinucleina.
[0072] Los intentos iniciales de aislar anticuerpos específicos se centraron en un grupo de sujetos humanos con alta actividad plasmática de unión a o-sinucleína, que sugeria niveles elevados en plasma de anticuerpos anti 0sinucleína en circulación. De forma inesperada, en estos intentos no se consiguió obtener células 8 de memoria humanas específicas de a-sinucleína y los anticuerpos descritos en la invención actual se aislaron a partir de
20 conjuntos de sujetos con baja reactividad plasmática a la a-sinucleina.
[0073] Gracias a esta medida pudieron aislarse varios anticuerpos. Los anticuerpos seleccionados se analizaron adicionalmente para la determinación de la clase y la subclase de la cadena ligera. A continuación, se transcribieron los mensajeros de anticuerpos relevantes seleccionados a partir de cultivos de células B mediante RT-PCR, se 25 clonaron y combinaron en vectores de expresión para su producción recombinante; véanse los ejemplos adjuntos. La expresión recombinante de los anticuerpos humanos en células HEK293 o CHO y la posterior caracterización de sus especificidades de unión a a-sinudeína de longitud completa y a sus formas truncadas (figura 2) mediante inmunotransferencia (figura 4) así como a 13 y y-sinucleina (figura 3), confirmaron que por primera vez se habían clonado anticuerpos humanos que eran altamente especificos para a-sinucleina y reconocian epitopes diferentes
30 dentro de la proteina o-sinucleina.
[0074] Por tanto, la presente invención se refiere en general a un anticuerpo monoclonal humano natural anti-asinucleína aislado y a sus fragmentos de unión, derivados y variantes según se caracteriza en las reivindicaciones. Como se demuestra en los ejemplos y se muestra en la figura 3, el anticuerpo monoclonal humano anti-a-sinudeína
35 de la presente invención se caracteriza preferiblemente porque se une especifica mente a la o-sinucleina en comparación con ¡3-sinucleína y y-sinucleina. De forma ventajosa, el anticuerpo es capaz de unirse especifica mente a a-sinucleina en la forma monomérica nativa y/o en la forma oIigomérica o agregada. Además, el anticuerpo humano anti-a-sinucleina de la presente invención puede caracterizarse adicionalmente por su capacidad para reconocer la a-sinucleína en inmunotransferencia; véase la figura 4.
40 [0075] En una realización, la presente invención está dirigida a un anticuerpo anti-a-sinucleina, o su fragmento de unión al antígeno, variante o derivados, donde el anticuerpo se une específicamente al mismo epítope de la asinucleina que el anticuerpo de referencia NI-202.12F4. Como se muestra en los ejemplos, el anticuerpo NI202.3G12 se une a la a-sinucleína de tipo natural (wilde type, wt) pero no a las formas truncadas de a-sinucleína en
45 un ELI$A directo, lo que apunta a un epitope estructural de NI-202.3GI2, véase la figura 28. Por el contrario, el anticuerpo NI-202.12F4 se une a formas truncadas de a-sinucleína que contienen la región repetida antipática Nterminal (aminoácidos 1-60) en un ELlSA directo, lo que apunta a un epítope N-terminal de NI-202.12F4; véase la figura 28. Además, los resultados preliminares de los ensayos ELI$A directos realizados con el anticuerpo NI
202.308 mostraron que NI-202.308 reconoce específicamente el extremo C-terminal de a-sinudeína, 50 preferiblemente los aminoácidos 96-140.
[0076] Adicionalmente, sin pretender estar condicionados por las observaciones experimentales iniciales experimentos preliminares adicionales han permitido asumir que el anticuerpo NI-202.308 preferentemente se une a monómeros de a-sinucleína en lugar de a las fibrillas en un ensayo ELlSA directo con el anticuerpo mientras que los
55 anticuerpos Nl-202.12F4 y NI-202.3GI2 preferentemente se unen a agregados o fibrillas de a-sinucleina sobre la forma monomérica de a-sinucleina. Por tanto, la presente invención proporciona un conjunto de anticuerpos humanos anti-a-sinucleina con especificidades diferentes, que son especialmente útiles para fines diagnósticos y terapéuticos.
[0077] En una realización, el anticuerpo de la presente invención muestra las propiedades de unión del anticuerpo ejemplo NI-202.12F4 como se describe en cualquiera de los ejemplos 1 a 5. Por ejemplo, en una realización el anticuerpo anti-a-sinucleina de la presente invención reconoce preferentemente a la a-sinucleina humana en lugar de a la de ratón, en particular cuando se analiza según el ejemplo 3. Además, o altemativamente, el anticuerpo anti5 a-sinucleina de la presente invención reconoce preferentemente forma agregadas o mal plegadas de a-sinudeina en lugar de formas monoméricas fisiológicas, en particular cuando se analiza según el ejemplo 3. Además, o altemativamente, el anticuerpo anti-a-sinucleina de la presente invención se une a mutantes de la a-sinucleina humana causantes de enfermedad, en particular los descritos en el ejemplo 3. En este contexto, las especificidades de unión pueden estar en el intervalo mostrado para el anticuerpo ejemplo NI-202.12F4 en la figura 5, es decir, 10 teniendo concentraciones eficaz máxima medias (ECso) de aproximadamente 100 a 1000 pM, preferiblemente una EC50 de aproximadamente 100 a 500 pM para la a-sinudeina wt o un mutante de la misma causante la enfermedad.
[0078] Por tanto, el anticuerpo anti-a-sinucleina de la presente invención preferiblemente se une de forma preferente a formas patológicas de a-sinucleina en el cerebro, por ejemplo, agregados patológicos de a-sinucleina
15 como se ejemplifica mediante la inmunotransferencia y la tinción inmunohistoquimica descritas en el ejemplo 3. Por consiguiente, en otra realización adicional o alternativa el anticuerpo anti-a-sinudeina de la presente invención preferiblemente se une a un epitope conformacional de la a-sinucleina humana y no se une significativamente a fragmentos derivados del extremo N-terminal de a-sinucleina que conste de los aminoácidos 1-20, 21-40, 41-60, 1130 o 31-50.
20 [0079] La presente invención también se refiere a un anticuerpo o su fragmento de unión al antigeno, variante o derivados, donde el anticuerpo comprende un dominio de unión al antigeno idéntico al del anticuerpo NI-202.12F4.
[0080] En la presente invención además se ponen varios ejemplos de moléculas de unión, por ejemplo,
25 anticuerpos y sus fragmentos de unión, que se caracterizan por comprender en su región variable, por ejemplo, en el dominio de unión, al menos las regiones determinantes de complementa riedad (CDR) de la región variable VH y VL que comprenden cualquier de las secuencias de aminoácidos mostradas en la figura 1 B. Las secuencias de nucleótidos correspondientes que codifican las regiones variables identificadas anteriormente se establecen en la lista de secuencias adjunta. También se indican en el listado de secuencias adjuntas un conjunto de ejemplos de
30 CDR de las secuencias de aminoácidos anteriores de la región VH y VL como se muestran en la figura 1 B. Sin embargo, como se describe a continuación, el experto en la materia es conocedor de hecho de que además, o alternativamente, pueden usarse CDR que difieren en sus secuencias de aminoácidos de las establecidas en la figura 1 B en uno, dos o tres o incluso mas aminoácidos en el caso de CDR2 y CDR3.
35 [0081] En una realización, el anticuerpo de la presente invención es cualquiera de los anticuerpos que comprenden una secuencia de aminoácidos de las regiones VH y VL como se muestra en la figura 1B. Alternativamente, el anticuerpo de la presente invención es un anticuerpo o su fragmento de unión al antigeno, derivado o variante, que compite por la unión a a-sinucleina con al menos uno de los anticuerpos que tienen las regiones VH y Vl como se muestra en la figura 1B. Estos anticuerpos pueden también ser humanos, en partiCUlar para aplicaciones
40 terapéuticas. Alternativamente, el anticuerpo es un anticuerpo murino, mu rinizado y anticuerpo quimérico murinohumano, que son especialmente útiles para los procedimientos diagnósticos y los estudios en animales.
[0082] Como se mencionó anteriormente, debido a su generación tras una respuesta inmunitaria humana, el anticuerpo monoclonal humano de la presente invención reconocerá epitopes que son de especial importancia 45 fisiológica y que podrian no estar accesibles o ser menos inmunogénicos en caso de procesos de inmunización para la generación de, por ejemplo, anticuerpos monoclonales de ratón y en el cribado in vitro de bibliotecas de despliegue de fagos, respectivamente. Por consiguiente, es prudente estipUlar que el epitope del anticuerpo humano anti-a-sinucleina de la presente invención es exclusivo y no existe ningún otro anticuerpo que sea capaz de unirse al epitope reconocido por el anticuerpo monoclonal humano de la presente invención. Por tanto, la presente invención
50 está dirigida a un anticuerpo o su fragmento de unión al antigeno, variante o derivados, donde el anticuerpo se une específicamente al mismo epitope de la a-sinucleina que el anticuerpo de referencia NI-202.12F4.
[0083] La competición entre anticuerpos se determina mediante un ensayo en el que la inmunoglobulina a prueba inhibe la unión especifica de un anticuerpo de referencia a un antígeno común, como la a-sinucleina. Se conocen 55 numerosos tipos de ensayos de unión competitivos: radioinmunoensayo (RIA) directo o indirecto en fase sólida, inmunoensayo enzimático (EIA) directo o indirecto en fase sólida, ensayo de competición tipo sandwich; véase Stahli y col., Methods in Enzymology 9 (1983), 242-253; EIA con biotina-avidina directo en fase sólida; véase Kirkland y col., J. Immunol137 (1986), 3614-3619 Y Cheung y col., Virology 176 (1990), 546-552; ensayo directo marcado en fase sólida, ensayo tipo sandwich marcado directo en fase sólida; véase Harlow y Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold $pring Harbor Press (1988); RIA marcado directo en fase sólida usando marcaje con ¡125; véase Morel y col, Molec. Immunol. 25 (1988), 7-15 Y Moldenhauer y col., Scand. J. Immunol. 32 (1990), 77-82. Tipicamente, este ensayo supone el uso de a-sinucleina purificada o sus agregados unidos a una superficie sólida o a células portadoras de cualquiera de estos, una inmunoglobulina de ensayo sin marcar y una inmunoglobulina de referencia 5 marcada, es decir, el anticuerpo monoclonal humano de la presente invención. La inhibición competitiva se mide detenninando la cantidad de marcaje unido a la superficie sólida o a las células en presencia de la inmunoglobulina de ensayo. Nonnalmenle la inmunoglobulina de ensayo se expresa en exceso. Preferiblemente, el ensayo de unión competitivo se realiza en las condiciones descritas para el ensayo de tipo ELlSA en los ejemplos adjuntos. Los anticuerpos identificados mediante el ensayo de competición (anticuerpos en competición) incluyen anticuerpos que 10 se unen al mismo epítope que el anticuerpo de referencia y anticuerpos que se unen a un epitope adyacente suficientemente próximo al epitope al que se une el anticuerpo de referencia para que se produzca un impedimento estérico. Nonnalmente, cuando un anticuerpo en competición está presente en exceso, inhibirá la unión de un anticuerpo de referencia a un antigeno común en al menos el 50% o el 75%. Por tanto, la presente invención está además dirigida a un anticuerpo, o su fragmento de unión al antigeno, variante o derivados, donde el anticuerpo
15 inhibe competitivamente la unión del anticuerpo de referencia NI-202.12F4 a la a-sinudeina.
[0084] En otra realización, la presente invención proporciona un polipéptido aislado que comprende, consta esencialmente o consta de una región variable de la cadena pesada de la inmunoglobulina (VH) en la que las regiones VH-CDR1, VH-CDR2 Y VH-CDR3 tienen secuencias polipeptidicas que son idénticas a los grupos VH-CDR1,
20 VH-CDR2 Y VH-CDR3 mostrados en la figura 18.
[0085] En otra realización, la presente invención proporciona un polipéptido aislado que comprende, consta esencialmente o consta de una reg ión variable de la cadena ligera de la inmunoglobulina (VL) en la que las reg iones VL-CDR1 , VL-CDR2 Y VL-CDR3 tienen secuencias polipeptidicas que son idénticas a los grupos VL-CDR1, VL-CDR2
25 Y Vv CDR3 mostrados en la figura 1 B.
[0086] Una inmunoglobulina o sus AONc codificadores pueden modificarse adicionalmente. Por tanto, en una realización adicional, el procedimiento de la presente descripción comprende cualquiera de las otras etapas de producción de un anticuerpo quimérico, anticuerpo murinizado, anticuerpo de cadena sencilla, fragmento Fab, 30 anticuerpo biespecifico, anticuerpo de fusión, anticuerpo marcado o un análogo de cualquiera de ellos. Los procedimientos correspondientes son conocidos para el experto en la materia y se describen, por ejemplo, en Harlow y Lane ((Antibodies, A Laboratory Manual» , CSH Press, Cold Spring Harbor (1998). Cuando se obtienen derivados de dichos anticuerpos mediante técnicas de despliegue de fagos, puede usarse resonancia de plasmones superficiales como la empleada en el sistema BIAcore para aumentar la eficiencia de los anticuerpos de fagos que 35 se unen al mismo epitope que el de cualquiera de los anticuerpos descritos en este documento (Schier, Human Antibodies Hybridomas 7 (1996), 97-105; Malmborg, J. Immunol. Methods 183 (1995), 7-13). La producción de anticuerpos quiméricos se describe por ejemplO, en la solicitud internacional W089/09622. Los procedimientos para la producción de anticuerpos humanizados se describen, por ejemplo, en la solicitud europea EP-A 1 0239400 Y en la solicitud internacional W090/07861. Una fuente adicional de anticuerpos que se utilizarán según la presente 40 invención son los denominados anticuerpos xenogénicos. El principio general para la producción de anticuerpos xenogénicos como anticuerpos similares a humanos en ratones se describe en, por ejemplo, las solicitudes internacionales W091 /10741 , W094/02602, W096/34096 Y W096/33735. Como se describe anteriormente, el anticuerpo de la invención puede existir en diversas fonnas además de anticuerpos completos; que incluyen, por ejemplo, Fv, Fab y F{ab)2, asi como en cadenas sencillas; véase, por ejemplo, la solicitud internacional
45 W088/09344.
[0087] Los anticuerpos de la presente invención o sus correspondientes cadenas de inmunoglobulina pueden modificarse adicionalmente usando técnicas convencionales conocidas en la materia, por ejemplo, usando deleciones, inserciones, sustituciones, adiciones y/o recombinaciones de aminoácidos y/o cualesquiera otra 50 modificación conocida en la materia sola o en combinación. Los procedimientos para introducir dichas modificaciones en la secuencia de ADN que subyace a la secuencia de aminoácidos de una cadena de inmunoglobulina son bien conocidos para el experto en la materia; véase, por ejemplo, Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbar Laboratory (1989) N.Y. Y Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates y Wiley Interscience, N.Y. (1994). Las modificaciones del anticuerpo de la invención 55 incluyen derivatizaciones quimicas y/o enzimáticas en uno o más de los aminoácidos constituyentes, incluyendo modificaciones de la cadena lateral, modificaciones de la estructura molecular y modificaciones de los extremos N y C-tenninales incluyendo acetilación, hidroxilación, metilación, amidación y la unión de restos de hidratos de carbono
o lípidos, cofactores y similares. Asimismo, la presente invención abarca la producción de proteinas quiméricas que comprenden el anticuerpo descrito o algún fragmento del mismo en el extremo amino terminal fusionado a una molécula heteróloga como un ligando inmunoestimulador en el término carboxilo; véase, por ejemplo, la solicitud internacional WOOOf30680 para obtener la infonnación técnica correspondiente.
[0088] Según lo anterior, la presente invención también se refiere a un polinucleótido que codifica el anticuerpo o la
5 molécula de unión equivalente de la presente invención, en caso del anticuerpo preferiblemente al menos una región variable de una cadena de inmunoglobulina del anticuerpo descrito anteriormente. Tipicamente, dicha región variable codificada por el polinucleótido comprende al menos una región delerminanle de complementariedad (CDR) del VH y/o VL de la región variable de dicho anticuerpo.
10 [0089] El experto en la materia apreciará con facilidad que el dominio variable del anticuerpo que tiene el dominio variable descrito anlerionnenle puede usarse para la construcción de otros polipéptidos o anticuerpos de especificidad y función biológica deseadas. Por lanlo, la presente invención también abarca polipéplidos y anticuerpos que comprenden al menos una región CDR del dominio variable descrito anteriormente y que de forma ventajosa tienen sustancialmente las mismas, o similares, propiedades de unión que el anticuerpo descrito en los
15 ejemplos adjuntos. El experto en la materia sabe que la afinidad de unión puede potenciarse haciendo sustituciones de aminoácidos dentro de las CDR y dentro de los bucles hiperva riables (Chothia y Lesk, J. Mol. Biol. 196 (1987), 901-917) que parcialmente solapan con los CDR como se define en Kabat; véase, por ejemplo, Riechmann, y col, Nature 332 (1988), 323-327. Por tanto, la presente descripción también se refiere a anticuerpos en los que una o más de las CDR mencionadas comprenden uno o más, preferiblemente no más de dos sustituciones de
20 aminoácidos. Preferiblemente, el anticuerpo de la invención comprende una o ambas de estas cadenas de inmunoglobul ina o las tres CDR de las regiones variables como se establece en la figura 1.
[0090] Las moléculas de unión, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de unión al antigeno, variantes o derivados de los mismos de la invención, según es sabido para los expertos en la materia, pueden comprender una región 25 constante que media en una o más funciones efectoras. Por ejemplo, la unión del componente C1 del complemento a una región constante del anticuerpo puede activar el sistema de complemento. La activación del complemento es importante en la opsonización y lisis de patógenos celulares. La activación del complemento también estimula la respuesta inflamatoria y también puede estar implicada en la hipersensibilidad autoinmune. Además, los anticuerpos se unen a los receptores en diversas células a través de la región Fe, con un sitio de unión al receptor Fc en la 30 región Fe del anticuerpo que se une a un receptor Fc (FcR) de una célula. Existen varios receptores Fc que son especificos para diferentes clases de anticuerpos, incluyendo IgG (receptores gamma), IgE (receptores épsilon), IgA (receptores alfa) e IgM (receptores mulo La unión del anticuerpo a los receptores Fc de las superficies celulares desencadena varias respuestas biológ icas diversas e importantes que incluyen la agregación y destrucción de partículas recubiertas de anticuerpo, aclaramiento de complejos inmunes, lisis de células diana recubiertas de 35 anticuerpos mediante células citotóxicas (denominado citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos,
o ADCC), liberación de mediadores inflamatorios, transferencia placental y control de la producción de inmunoglobulinas.
[0091] Por consiguiente, determinadas realizaciones de la presente invención incluyen un anticuerpo, o su
40 fragmento de unión al antígeno, variante o derivado, en el que se ha delecionado o alterado de alguna otra forma al menos una fracción de uno o más de los dominios de la región constante de modo que se proporcionen las características bioquímicas deseadas como reducción de las funciones efectoras, la capacidad dimerización no covalente, aumento de la capacidad para localizar el sitio de agregación y depósito de a-sinucleína, reducción de la semivida en suero o aumento de la semivida en suero cuando se compara con un anticuerpo completo no alterado
45 de aproximadamente la misma inmunogenicidad. Por ejemplo, determinados anticuerpos para su uso en los procedimientos diagnóstico y de tratamiento descritos en este documento son anticuerpos con dominios delecionados que comprenden una cadena polipeptidica similar a un cadena pesada de inmunoglobulina, pero que carecen de al menos una porCión de uno o más dominios de la cadena pesada. Por ejemplo, en detenninados anticuerpos, se delecionará un domino completo de la región constante del anticuerpo modificado, por ejemplo, se
50 delecionará todo o parte del domino CH2. En otras realizaciones, determinados anticuerpos para su uso en los procedimientos diagnósticos y de tratamiento descritos en este documento tienen una región constante, por ejemplo, una región constante de la cadena pesada de la IgG, que esta alterada para eliminar la glucosilación, referidos en otro punto de este documento como anticuerpos aglucosilados o «aglu». Dichos anticuerpos «aglu» pueden prepararse enzimáticamente así como mediante ingeniería genética aplicada a los sitios de glucosilación consenso
55 en la región constante. Sin cenirse a la teoría, se considera que los anticuerpos ((agluH pueden tener perfiles de seguridad y estabilidad mejorados in vivo. Los procedimientos para la producción de anticuerpos aglucosilados, con la función efectora deseada se encuentran por ejemplo en la solicitud intemacional WQ2005/018572.
[0092] En determinados anticuerpos, o fragmentos de unión al antigeno, variantes o derivados de 105 mismos
descritos en este documento, la porción Fc puede haber sido mutada para disminuir la función efectora usando técnicas conocidas en la materia. Por ejemplo, la deleción o inactivación (a través de mutaciones puntuales u otros medios) de un dominio de la región constante puede reducir la unión al receptor Fc del anticuerpo modificado en circulación aumentando de este modo la localización de la a-sinucleína. En otros casos puede ser que las 5 modificaciones de la región constante consistentes con la invención actual moderen la unión al complemento y reduzcan, de este modo, la semivida en suero y la asociación no espeCifica de una citotoxina conjugada. Aún pueden usarse otras modificaciones de la región constante para modificar los puentes disulfuro o los restos de oligosacáridos que permitan potenciar la localización debido a un aumento de la especificidad por el antigeno o de la flexibilidad del anticuerpo. El perfil fisiológico resultante, la biodisponibilidad y otros efectos bioquimicos de las
10 modificaciones, como la locación de a-sinucleína, su biodistribución y semivida en suero, pueden medirse y cuantificarse fácilmente usando técnicas inmunológicas bien conocidas sin necesidad de experimentación.
[0093J En determinados anticuerpos, o fragmentos de unión al antigeno, variantes o derivados de los mismos descritos en este documento, la porción Fc puede estar mutada o haberse cambiado por secuencias proteicas 15 altemativas para aumentar la captación celular de anticuerpos, a modo de ejemplo, mediante la potenciación, por ejemplo, de la endocitosis de anticuerpos mediada por receptor a través de receptores Fcy, LRP o receptores Thy1 o mediante decnologia de superanticuerpos» que según se afirma potencia la transferencia de los anticuerpos dentro de células vivas sin efectos nocivos para ellas (Expert Opino Biol. Ther. (2005), 237-241). Por ejemplo, la generación de proteínas de fusión de la región de unión al anticuerpo y los ligandos proteicos relacionados de receptores de la
20 superficie celular o anticuerpos bi o multiespecificos con secuencias especificas de unión a a-sinucleina asi como a la superfiCie celular puede realizarse mediante ingenieria genética usando técnicas conocidas en la materia.
[0094J En determinados anticuerpos, o fragmentos de unión al antigeno, variantes o derivados de los mismos descritos en este documento, la porción Fc puede estar mutada o haberse intercambiado por secuencias proteicas 25 alternativas o el anticuerpo puede haberse modificado quimicamente para aumentar su capacidad de penetración en la barrera hematoencefálica.
[0095] Las formas modificadas de anticuerpos, o fragmentos de unión al antígeno, variantes o derivados de los mismos de la invención pueden obtenerse a partir de anticuerpos precursores u originales completos usando 30 técnicas conocidas en la materia. A continuación, en este documento se describen ejemplos de técnicas con más detalle. Los anticuerpos, o fragmentos de unión al antígeno, variantes o derivados de los mismos de la invención pueden obtenerse o producirse usando técnicas conocidas en la materia. En determinadas realizaciones, las moléculas de anticuerpo o sus fragmentos se «producen recombinantemente», es decir, se producen usando tecnologia de ARN recombinante. En otro punto de este documento se describan con más detalles ejemplos de
35 técn icas para la obtención de moléculas de anticuerpos o fragmentos de los mismos.
[0096J Los anticuerpos, o fragmentos de unión al antigeno, variantes o derivados de los mismos de la invención también incluyen derivados que se modifican, por ejemplo, mediante la unión covalente al anticuerpo de cualquier tipo de molécula de modo que la unión o:;ovalente no impide que el anticuerpo se una específicamente a su epitope 40 correspondiente. Por ejemplo, pero no a modo de limitación, los derivados del anticuerpo incluyen anticuerpos que se han modificado, por ejemplo, mediante glucosilación, acetilación pegilación, fosforilación, amidación, derivación mediante grupos de protección/bloqueo conocidos, escisión proteolitica, unión a un ligando celular o a otra proteína, etc. Cualquiera de las numerosas modificaciones quimicas puede realizarse med iante técnicas conocidas, incluyendo, pero sin limitaciones, escisión quimica espeCifica, acetilación, formilación, sintesis metabólica de
45 tunicamicina, etc. Adicionalmente, el derivado puede contener uno o más aminoácidos no clásicos.
[0097J En realizaciones concretas preferidas, los anticuerpos o fragmentos de unión al antigeno, variantes o derivados de los mismos de la invención no mostrarán una respuesta inmune nociva en el animal que se va a tratar, por ejemplo, en un humano. En determinadas realizaciones, las moléculas de unión, por ejemplo, anticuerpos, o sus
50 fragmentos de unión al antigeno de la invención derivan de un paciente, por ejemplo, un paciente humano y, posteriormente, se usan en la misma especie de la que derivan, es decir, en humanos, para aliviar o minimizar la aparición de respuestas inmunes nocivas.
[0098] También puede usarse la desinmunización para disminuir la inmunogenicidad de un anticuerpo. Según se
55 usa en este documento, el término ((desinmunización» incluye alteración de un anticuerpo para modificar los epitopes de las células T; véase, por ejemplo, las solicitudes internacionales W098f52976 y WOOOf34317. Por ejemplo, se analizan las secuencias VH y VL del anticuerpo inicial y se realiza un «mapa» de epitopes de las células T humanas a partir de cada región V en el que se muestra la localización de epítopes en relación con las regiones determinantes de complementariedad (CDR) y otros residuos clave dentro de la secuencia. Se analizan los epitopes
de células T individuales del mapa de epitopes de células T para identificar sustituciones de aminoácidos alternativas con bajo ries90 de alteración de la actividad del anticuerpo final. Se diseñan una variedad de secuencias de VH y Vl altemativas que comprenden combinaciones de sustituciones de aminoácidos y estas secuencias se incorporar posteriormente a una variedad de polipéptidos de unión, por ejemplo, anticuerpos especificos de 05 sinucleina o sus fragmentos inmunoespecíficos para su uso en los procedimientos diagnósticos y de tratamiento descritos en este documento, cuya función se comprueba a continuación. Tipicamente, se generan entre 12 y 24 variantes de anticuerpo que se prueban. A continuación se clonan los genes completos de las cadenas pesada y ligera, que comprenden regiones V modificadas y e humanas en vectores de expresión y los plásmidos subsecuentes se introducen en lineas celulares para la producción de un anticuerpo completo. Después, los
10 anticuerpos se comparan en ensayos bioquímicos y biológicos adecuados y se identifica la variante óptima.
[0099] Los anticuerpos monoclonales pueden prepararse usando una amplia variedad de técnicas conocidas en la materia que incluyen el uso de tecnologias de hibridoma, recombinante y de despliegue de fagos o una combinación de estas. Por ejemplo, pueden producirse anticuerpos monoclonales usando las técnicas de hibridoma incluyendo 15 las conocidas en la materia y mostradas, por ejemplo, en Har10w y col. Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2' ed. (1988); Hammer1ing, y col., en: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas Elsevier, N.Y., 563-681 (1981). La expresión ((anticuerpo monoclonal» como se usa en este documento no se limita a anticuerpos producidos mediante tecnologla de hibridoma. La expresión «anticuerpo monoclonal» se procedimiento a un anticuerpo que deriva de un único clon, incluyendo cualquier clan eucariota, procariota o fago y
20 no el método por el cual se produce. Por tanto, el término «anticuerpo monoclonal» no se limita a anticuerpos producidos mediante tecnologia de hibridoma. En determinadas realizaciones, los anticuerpos de la presente invención derivan de células B humanas que se han inmortalizado mediante transformación con el virus de EpsteinBa r, como se describe en este documento.
25 [0100] En el proceso bien conocido de obtención de hibridomas (Kohler y col., Nature 256 (1975) 495) los linfocitos de vida relativamente corta, o mortales, de un mamifero, por ejemplo, células B derivadas de un humano según se describe en este documento, se fusionan con una línea de células tumorales inmortal (p. ej., una linea celular de mieloma), produciéndose de este modo células híbridas o ((hibridomas» que son a la vez inmortales y capaces de producir el anticuerpo genéticamente codificado de la célula B. Los hlbridos resultantes se segregan en cepas
30 genéticas únicas mediante selección, dilución y recultivo con cada cepa individual que contiene el gen espeCifico para la formación de un único anticuerpo. Estos producen anticuerpos, que son homogéneos frente a un antígeno deseado y, en referencia a su origen genético puro, se denominan «monoclonales».
[0101] Las células de hibridoma preparadas de este modo se siembran y cultivan en un medio de cultivo adecuado
35 que, preferiblemente, contenga una o más sustancias que inhiban el crecimiento o la supervivencia de las células parentales del mieloma no fusionadas. Los expertos en la materia apreciarán que los reactivos, líneas celulares y medios para la formación, selección y crecimiento de hibridomas están disponibles en el mercado a partir de varias fuentes y los protocolos estandarizados están bien establecidos. En general, se comprueba la producción de anticuerpos monoclonales frente al antígeno deseado en el medio de cultivo en el que se crecen las células de
40 hibridoma. La especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales producidos por las células de hibridoma se determina mediante ensayos in vitro como inmunoprecipitación, radioinmunoensayo (RIA) o ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas (ELlSA), como se describe en este documento. Tras identificar las células de hibridoma que producen los anticuerpos de especificidad, afinidad y{o actividad deseadas, los clones pueden subclonarse mediante procedimientos de dilución limitante y crecerse mediante procedimientos estándar, véase, por
45 ejemplo, Goding, Monoclonal Antibodies PrincipIes and Practice, Academic Press, pág. 59-103 (1986). Adicionalmente se apreciará que los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones pueden separarse del medio de cultivo, el líquido ascítico o el suero mediante procedimientos de purificación convencionales como, por ejemplo, protelna A, cromatografia en hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis o cromatografía de afinidad.
50 [0102] En otra realización, pueden seleccionarse linfocitos mediante micromanipulación y aislarse los genes variables. Por ejemplo, pueden aislarse células mononucleares de sangre periférica a partir de un mamífero inmunizado o naturalmente inmune, por ejemplo, un humano, y cultivarlas durante aproximadamente 7 dlas in vitro. Pueden cribarse los cultivos en busca de IgG específicas que cumplan los criterios de selección. Pueden aislarse células de los pocillOS positivos. Las células B productoras de Ig individuales pueden aislarse mediante FACS o
55 identificarse en un ensayo hemolítico en placa mediado por complemento. Las células B productoras de Ig pueden micromanipularse dentro de un tubo y pueden amplificarse los genes de VH y VL usando, por ejemplo, RT-PCR. Los genes de VH y Vl pueden clonarse en un vector de expresión de anticuerpos y transfectarse a células (p. ej., células eucariotas o procariotas) para su expresión.
[0103] Altemativamente, las lineas celulares productoras de anticuerpos pueden seleccionarse y cultivarse usando técnicas bien conocidas por los expertos en la materia. Estas técnicas se describen en diversos manuales de laboratorio y en publicaciones principales. A este respecto, las técnicas adecuadas por su uso en la invención segun se describe a continuación, se describen en Current Protocols in Immunology, Coligan y col., Eds., Green Publishing
5 Associates and Wiley-Interscience, John Wiley e hijos, Nueva York (1991).
[0104] Pueden generarse fragmentos de anticuerpo que reconocen epítopes específicos por técnicas conocidas. Por ejemplo, los fragmentos Fab y F(ab')2 pueden producirse recombinantemente o mediante escisión proteolítica de las moléculas de inmunoglobulina, usando enzimas como la papaína (para producir los fragmentos Fab) o la pepsina
10 (para producir los fragmentos F(ab')2). Los fragmentos F(ab')2 contiene la región variable, la región constante de la cadena ligera yel dominio CH1 de la cadena pesada. Estos fragmentos son suficientes para su uso, por ejemplo, en procedimientos de inmunodiagnóstico que suponen conjugar las porciones inmunoespecíficas de las inmunoglobulinas con reactivos de detección como rad ioisótopos.
15 [0105] Los anticuerpos completamente humanos, como se describe en este documento, son especialmente deseables para el tratamiento terapéutico de pacientes humanos. Los anticuerpos humanos de la presente invención se aíslan, por ejemplo, a partir de sujetos ancianos que debido a su edad se sospecha que pueden están en riesgo de desarrollar una enfermedad, por ejemplo, la enfennedad de Parkinson, o de un paciente con el trastorno pero con una evolución de la enfermedad inusualmente estable. No obstante, aunque es prudente esperar que los sujetos
20 ancianos sanos y libres de síntomas, respectivamente, desarrollan de fonna más regular anticuerpos protectores anti-a-sinucleina que los sujetos más jóvenes, estos últimos también pueden usarse como fuente para obtener un anticuerpo humano de la presente invención. Esto es especialmente cierto en los pacientes más jóvenes con predisposición a desarrollar una forma familiar de una enfennedad sinudeinopática pero que siguen sin síntomas debido a que su sistema inmunitario y las respuestas del mismo funcionan de fonna más eficaz que en los adultos
25 de mayor edad .
[0106] Los anticuerpos de la presente invención pueden producirse por cualquier procedimiento de síntesis de anticuerpos conocido en la materia, en particular, mediante síntesis química o, preferiblemente, mediante técnicas de expresión recombinante como se describe en este documento.
[0107] En una realización, un anticuerpo, o fragmento de unión al antígeno, variante o derivado de mismo de la invención comprende una reg ión constante sintética en la que se han delecionado parcial o completamente uno o más dominios (<<anticuerpos de dominios delecionados»). En detenninadas realizaciones los anticuerpos modificados compatibles comprenderán construcciones o variantes de deleción de dominio donde se haya eliminado 35 el dominio CH2 completo (construcciones .l'..CH2). En otras realizaciones, puede sustituirse un péptido de conexión corto por el domino delecionado para proporcionar flexibilidad y libertad de movimiento a la región variable. Los expertos en la materia apreciarán que estas construcciones son especialmente preferidas debido a las propiedades reguladoras del dominio CH2 sobre la velocidad catabólica del anticuerpo. Las construcciones con deleción de dominio pueden derivarse usando un vector que codifica un dominio constante humano de IgG1, véanse, por
40 ejemplo, las solicitudes internacionales W002l060955 y W002l096948a2. Este vector se modifica mediante ingeniería genética para delecionar el dominio CH2 y proporcionar un vector sintético que exprese una región constante de IgG1 con deleción de dominio.
[0108] En detenninadas realizaciones, los anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno, variantes o derivados de
45 los mismos de la presente invención son minianticuerpos. Los minianticuerpos pueden obtenerse usando procedimientos descritos en la técnica; véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. 5.837.821 o la solicitud internacional WO 94f09817.
[0109] En una realización, un anticuerpo, o su fragmento de unión al antígeno, variante o derivado de la invención
50 comprende una cadena pesada de inmunoglobulina que tiene una deleción o sustitución de unos pocos o incluso un único aminoácido siempre que esto permita la asociación entre las subunidades monoméricas. Por ejemplo, la mutación de un único aminoácido en áreas seleccionadas del dominio CH2 puede ser suficiente para reducir sustancialmente la unión a Fe y aumentar, de este modo, la localización de a-sinucleina. De fonna similar, puede ser deseable simplemente delecionar la parte de uno o más dominios constantes que controla la función efectora (p. ej.,
55 de unión al complemento) que se va a modular. Estas deleciones parciales de las regiones constantes pueden mejorar caracteristicas seleccionadas del anticuerpo (semivida en suero) mientras que se conservan otras funciones deseadas asociadas con el dominio intacto de la región constante del sujeto. Además, como se ha señalado antes, las regiones constantes de los anticuerpos descritos pueden ser sintéticas mediante la mutación o sustitución de uno
o más aminoácidos que potencian el periil de la construcción resultante. A este respecto puede ser posible alterar la actividad proporcionada por un sitio de unión conservado (p. ej., unión a Fc) mientras que se mantienen sustancialmente la configuración y el perfil inmunogénico del anticuerpo modificado. Aún otras realizaciones comprenden la adición de uno o más aminoácidos a la región constante para potenciar caracteristicas deseadas como la función efectora o proporcionar más citotoxina o unión de hidratos de carbono. En dichas realizaciones
5 puede ser deseable insertar o replicar secuencias específicas derivadas de dominios de la región constante seleccionados.
[0110] La presente invención también proporciona anticuerpos que comprenden, consisten esencialmente o consisten en variantes (incluidos derivados) de moléculas de anticuerpo (p. ej. , las regiones VH ylo las regiones VL) 10 descritas en este documento, cuyos anticuerpos o sus fragmentos se unen inmunoespecificamente a la a-sinucleina. Pueden usarse técnicas estándar conocidas por los expertos en la materia para introducir mutaciones en la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína, incluyendo, pero sin limitaciones, la mutagénesis dirigida a sitio y la mutagénesis mediada por PCR, que tienen como resultado sustituciones de aminoácidos. Preferiblemente, las variantes (incluidos derivados) codifican menos de 50 sustituciones de aminoácidos, menos de 40 sustituciones de 15 aminoácidos, menos de 30 sustituciones de aminoácidos, menos de 25 sustituciones de aminoácidos, menos de 20 sustituciones de aminoácidos, menos de 15 sustituciones de aminoácidos, menos de 10 sustituciones de aminoácidos, menos de 5 sustituciones de aminoácidos, menos de 4 sustituciones de aminoácidos, menos de 3 sustituciones de aminoacidos, menos de 2 sustituciones de aminoácidos en relación con la región VH, VH-CDR1, VHCOR2, VH-COR3, región VL, VL-COR1, VL-CDR2 o VL-COR3 de referencia. Una «sustitución de aminoácidos 20 conservadora)) es aquella en la que el resto de aminoácido se sustituye por un aminoácido con una cadena lateral con carga similar. En la materia se han descrito familias de restos de aminoácidos que tienen cadenas laterales con cargas similares. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (p. ej., lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (p. ej., ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares sin carga (p. ej., glicina, asparragina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteina), cadenas laterales no polares (p. ej ., alanina, 25 valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales ramificadas beta (p. ej., treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (p. ej., tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Alternativamente, pueden introducirse mutaciones de forma aleatoria a lo largo de toda o parte de la secuencia codificadora, como mediante mutagénesis por saturación, y los mutantes resultantes pueden cribarse según su actividad biológica para identificar mutantes que mantengan la actividad (p. ej., la capacidad para unirse a a
30 sinucleina).
[0111] Por ejemplo, es posible introducir mutaciones solo en las regiones estructurales o solo en las regiones CDR de una molécula de anticuerpo. Las mutaciones introducidas puede ser silente o mutaciones de sentido erróneo neutras, por ejemplo, que tienen un efecto mínimo o nulo sobre la capacidad del anticuerpo para unirse al antígeno, 35 de hecho, algunas de estas mutaciones no alteran en absoluto la secuencia de aminoácidos. Estos tipos de mutaciones pueden ser útiles para optimizar el uso de los codones o mejora la producción de un anticuerpo por un hibridoma. En otra parte de este documento se describen regiones codificadas con codones optimizados que codifican anticuerpos de la presente invención. Altemativamente, las mutaciones de sentido erróneo no neutras pueden alterar la capacidad del anticuerpo para unirse al antígeno. La localización de la mayoría de las mutaciones 40 silentes o de sentido erróneo neutras es probablemente en las regiones estructurales, mientras que la localización de la mayoría de las mutaciones erróneas no neutras es probable que se produzca en las CDR, aunque esto no es un requisito absoluto. Un experto en la materia sería capaz de diseñar y probar moléculas mutantes con las propiedades deseadas, como sin alteración de la actividad de unión al antígeno o alteración en la actividad de unión
(p. ej., mejora en la actividad de unión al antigeno o cambios en la especificidad del anticuerpo). Tras la
45 mutagénesis, la proteina codificada puede expresarse de forma rutinaria y la actividad funcional ylo biológica de la proteína codificada (p. ej., capacidad para unirse inmunoespecíficamente a al menos un epítope de la a-sinucleína) puede determinarse usando técnicas descritas en este documento o modificando de forma rutinaria técnicas conocidas en la materia .
50 111. Polinucleótidos que codifican los anticuerpos
[0112] Un polinucle6lido que codifica un anticuerpo, o su fragmento de unión al antigeno, variante o derivado puede estar compuesto por cualquier polirribonucleótido o polidesoxirribonucleótido, que puede ser un ARN o ADN sin modificar o un ARN o AON modificado. Por ejemplo, un polinucleótido que codifica un anticuerpo, o su fragmento 55 de unión al antígeno, variante o derivado puede estar compuesto por AON de cadena sencilla y doble, AON que sea una mezcla de regiones de cadena sencilla y doble, ARN de cadena sencilla y doble y ARN que sea una mezcla de regiones de cadena sencilla y doble, moléculas hibridas compuestas de ADN y ARN que pueden ser de cadena sencilla o, más típicamente, de doble cadena o una mezcla de reg iones de cadena sencilla y doble. Además, un polinucleótido que codifica un anticuerpo, o su fragmento de unión al antígeno, variante o derivado puede estar
compuesto por regiones de cadena triple que comprenden ARN o ADN °tanto ARN como ADN. Un polinucleótido que codifica un anticuerpo, °su fragmento de unión al antígeno, variante o derivado también puede contener una o más bases modificadas °esqueletos de ADN o ARN modificados por razones de estabilidad entre otras. Entre las bases «modificadas» se incluyen, por ejemplo, bases Iriliadas y bases poco corrientes tales como inosina. Pueden
5 hacerse diversas modificaciones del ADN y el ARN: de este modo, «polinucleótido» abarca formas modificadas quimica, enzimática o metabólicamente.
[01 13] Un polinucleótido aislado que codifica una variante no natural de un polipéptido derivado de una inmunoglobulina (p. ej., una porción de cadena pesada °una porción de cadena ligera de inmunoglobulina) puede
10 obtenerse introduciendo una o más sustituciones, adiciones o deleciones de nucle6tidos en la secuencia de nucleótidos de la inmunoglobulina de modo que se introduzcan una o más sustituciones, adiciones o deleciones de aminoácidos dentro de la proteina codificada. Las mutaciones pueden introducirse mediante técnicas estándar, como mutagénesis dirigida a sitio y mutagénesis mediada por PCR. Preferiblemente, las sustituciones de aminoácidos conservadoras se hacen en uno o más restos de aminoácidos no esenciales.
[0114] Como es conocido, el ARN puede aislarse a partir de las células B originales, células de hibridoma o de otras células transformadas mediante técnicas estándar, como extracción con isotiocianato de guanidinio y precipitación seguida de centrifugación o cromatografía. Cuando se desee, puede aislarse el ARNm a partir del ARN total med iante técn icas estándar como cromatografía en oligo dT celulosa. Estas técnicas adecuadas son conocidas 20 en la materia. En una realización, los ADNc que codifican las cadenas ligera y pesada del anticuerpo pueden obtenerse, de forma simultánea o por separado, usando transcriptasa inversa y ADN polimerasa según procedimientos bien conocidos. La PCR puede iniciarse mediante cebadores consenso de la región constante o mediante cebadores más especificos en base a las secuencias de ADN y aminoácidos de las cadenas pesada y ligera publicadas. Como se describe anteriormente, también puede usarse la PCR para aislar clones de ADN que
25 codifican las cadenas ligera y pesada del anticuerpo. En este caso, pueden cribarse las bibliotecas mediante cebadores consenso o sondas homólogas más largas, como sondas de la región constante humana.
[01 15] El ADN, típicamente ADN plasmídico, puede aislarse a partir de las células usando técnicas conocidas en la materia, mapearse y secuenciarse con enzimas de restricción según técnicas estándar bien conocidas establecidas
30 en detalle, por ejemplo, en las referencias precedentes relacionadas con las técnicas de ADN recombinante. Por supuesto, el ADN puede sintetizarse según la presente invención en cualquier momento durante el proceso de aislamiento o de análisis posterior.
[0116] La presente invención proporciona un polinucieótido aislado que comprende, consta esencialmente o 35 consta de un ácido nucleico que codifica una reg ión variable (Vd de la cadena ligera de la inmunoglobulina que tiene las secuencias polipeptídicas VL-CDR1, VL-CDR2, o VL-CDR3 mostradas en la figura 1B.
[0117] En otra realización, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado que comprende, consta esencialmente o consta de un ácido nucleico que codifica una reg ión variable de la cadena pesada de la
40 inmunoglobulina (VH) en el que las regiones VH-CDR1, VH-CDR2 Y VH-CDR3 tienen secuencias polipeptídicas que son idénticas a los grupos VH-CDR1, VH-CDR2 y VH-CDR3 mostrados en la figura 1B y en el listado de secuencias adjunto.
[0118] En una realización preferida de la presente invención, el polinucleótido comprende, consta esencialmente o
45 consta de un ácido nucleico que tiene una secuencia de polinucleótidos de la región VH o VL de un anticuerpo anti-asinucleína como se establece en la SEC ID N.O 8 o 11. A este respecto, el experto en la materia apreciará fácilmente que los polinucleótidos que codifican al menos el dominio variable de la cadena ligera yfo pesada pueden codificar el dominio variable de ambas cadenas de inmunoglobulina °solo de una.
50 [0119] La presente invención también incluye fragmentos de los polinucieótidos de la invención, como se describe en otra parte de este documento. Adicionalmente, los polinucieótidos que codifican polinucleótidos de fusión, los fragmentos Fab y otros derivados, como se describe en este documento también son contemplados con la invención.
55 [0120] Los polinucle6tidos pueden producirse o fabricarse mediante cualquier método conocido en la materia. Por ejemplo, si la secuencia de nucleótidos del anticuerpo es conocida, un polinucle6tido Que codifica el anticuerpo puede ensamblarse a partir de oligonucleótidos químicamente sintetizados, por ejemplo, como se describe en Kutmeier y col., BioTechniques 17 (1994), 242 que, brevemente, implica la síntesis de oligonucleótidos solapantes que contienen porciones de la secuencia Que codifica el anticuerpo, hibridación y ligamiento de estos oligonucleótidos y, a continuación, amplificación de los oligonucleótidos ligados mediante PCR.
[0121] Altemativamente, un polinucleótido que codifica un anticuerpo o su fragmento de unión al antigeno, variante
o derivado puede generarse a partir del ácido nudeico de una fuente adecuada. Si no se dispone de un don que
5 contenga un ácido nucleico que codifica un anticuerpo en particular, pero se conoce la secuencia de la molécula de anticuerpo, puede sintetizarse quimicamente u obtenerse a partir de una fuente adecuada un ácido nucleico que codifique el anticuerpo (por ejemplo, una biblioteca de ADNc de anticuerpo o una biblioteca de ADNc generada a partir de, o ácido nudeico, preferiblemente ARN poli N , aislado de cualquier tejido o célula que exprese el anticuerpo específico de a-sinucleína, tal como células de hibridoma seleccionadas para expresar un anticuerpo)
10 mediante amplificación por PCR usando cebadores sintéticos capaces de hibridar con los extremos 3' y 5' de la secuencia o clonando usando una sonda oligonucleotidica específica de la secuencia génica en particular para identificar, por ejemplo, un don de ADNc a partir de una biblioteca de ADNc que codifica el anticuerpo. Los ácidos nudeicos amplificados generados mediante PCR pueden donarse a continuación en vectores de donación replicables usando cualquier procedimiento bien conocido en la materia.
[0122] Una vez que se determine la secuencia de nucleótidos y la correspondiente secuencia de aminoácidos del anticuerpo, o de su fragmento de unión al antígeno, variante o derivado, su secuencia nudeotídica puede manipularse usando procedimientos bien conocidos en la materia para la manipulación de las secuencias de nudeótidos, por ejemplo, técnicas de ADN recombinante, mutagénesis dirigida a sitio, PCR, etc. (véase, por ejemplo,
20 las técnicas descritas en Sambrook y col., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 28 Ed., Cold Spring Harbar Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y (1990) Y Ausubel y col., eds ., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1998)) para generar anticuerpos que tengan una secuencia de aminoácidos diferente, por ejemplo para generar sustituciones, deleciones yfo inserciones de aminoácidos.
25 IV. Expresión de polipéptidos de anticuerpos
[0123] Tras la manipulación del material genético aislado para proporcionar anticuerpos, o fragmentos de unión al antígeno, variantes o derivados de los mismos de la invención, los polinucle6tidos que codifican los anticuerpos tipicamente están insertados en un vector de expresión para la introducción en las células huésped que pueden 30 usarse para producir la cantidad de anticuerpo deseada. En este documento se describe la expresión recombinante de un anticuerpo, o su fragmento, derivado o análogo, por ejemplo, una cadena pesada o ligera de un anticuerpo que se une a una molécula diana. Una vez que se ha obtenido un polinucleótido que codifica una molécula de anticuerpo o una cadena pesada o ligera de un anticuerpo o porción del mismo (conteniendo preferiblemente el dominio variable de la región pesada o ligera) de la invención, puede producirse el vector para la producción de la 35 molécula de anticuerpo por tecnologia de ADN recombinante usando técnicas bien conocidas en la materia. De este modo, se describen en este documento procedimientos para preparar una proteína mediante la expresión de un polinucleótido que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo. Pueden usarse procedimientos bien conocidos por los expertos en la materia para construir vectores de expresión que contengan secuencias que codifican el anticuerpo y seiíales de control de la transcripción y de la traducción apropiadas. Estos procedimientos 40 incluyen, por ejemplo, las técnicas de recombinación de ADN in vitro, técnicas sintéticas y recombinación genética in vivo. La invención proporciona, de este modo, vectores replicables que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica una molécula de anticuerpo de la invención o una cadena pesada o ligera del mismo, o un domino variable de la cadena pesada o ligera, unida de forma operativa a un promotor. Estos vectores pueden induir la secuencia de nucleótidos que codifica la región constante de la molécula de anticuerpo (véanse, por ejemplo, las
45 solicitudes intemacionales WO 86f05807 y WO 89fOl036 y la patente de EE.UU. N° 5.122.464) Y el dominio variable del anticuerpo puede donarse en este vector para la expresión de la cadena pesada o ligera completa.
[0124] El ténnino «vector» o «vector de expresión» se usa en este documento para referirse a los vectores usados de acuerdo con la presente invención como vehículo para introducir y expresar un gen deseado en una célula 50 huésped. Como es sabido por los expertos en la materia, estos vectores pueden seleccionarse fácilmente a partir del grupo compuesto por plásmidos, fagos, virus y retrovirus. En general, los vectores compatibles con la presente invención comprenderán un marcador de selección, sitios de restricción apropiados para facilitar la clonación del gen deseado y la capacidad de entrar yfo replicarse en células euca riotas o proca riotas. Para los fines de esta invención, pueden emplearse muchos sistemas de vector de expresión. Por ejemplo, una clase de vectores utiliza elementos 55 de ADN que derivan de virus animales como el virus del papiloma bovino, virus del poliorna, adenovirus, virus de la vacuna, baculovirus, retrovirus (RSV, MMTV o MOMLV) o virus SV40. Otros implican el uso de sistemas policistrónicos con sitios internos de unión a ribosomas. Adicionalmente, las células que tienen integrado el ADN en sus cromosomas pueden seleccionarse introduciendo uno o más marcadores que permitan la selección de las células huésped transfectadas. El marcador puede proporcionarse para inducir fototrofia a un huésped auxótrofo,
resistencia biocida (p. ej., antibióticos) o resistencia a metales pesados como el cobre. El gen del marcador seleccionable también puede estar directamente unido a las secuencias de ADN para que se exprese, o introduzca dentro de la misma célula mediante transformación conjunta. También pueden ser necesarios elementos adicionales para la síntesis de los ARNm. Estos elementos pueden incluir secuencias seFial, señales de ayuste así como
5 promotores transcripcionales, potenciadores y seFiales de terminación.
[0125] En realizaciones especialmente preferidas los genes de la región variable clonados se insertan en un vector de expresión junto con los genes de la región constante de las cadenas pesada y ligera (preferiblemente humana) como se describe anteriormente. En una realización, esto se realiza usando un vector de expresión patentado de 10 Biegen IDEC, Inc., denominado NEOSPLA, descrito en la patente de EE. UU. N.O 6.159.730. Este vector contiene el promotor/potenciador del citomegalovirus, el promotor principal de la globina beta de ratón, el origen de replicación de SV40, la secuencia de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina, el exón 1 y el exón 2 de la neomicina fosfotransferasa, el gen y la secuencia líder de la dihidrofolato reductada. Se ha encontrado que este vector tiene como resultado un nivel muy alto de expresión de anticuerpos tras la incorporación de los genes de las regiones 15 variable y constante, transfección en células CHO, seguida de la selección en medio que contiene G418 y amplificación con metotrexato. Por supuesto, en la presente invención puede usarse cualquier vector de expresión que sea capaz de inducir la expresión en células eucariotas. Entre los ejemplos de vectores adecuados se incluyen, pero sin limitaciones, los plásmidos pcDNA3, pHCMV/Zeo, pCR3.1, pEF11His, pIND/GS, pRclHCMV2, pSV40/Ze02, pTRACER-HCMV, pUB6N5-His, pVAX1 y pZeoSV2 (disponible en Invitrogen, San Diego, CA) y el plásmido pCI
20 (disponible en Promega, Madison, WI). En general, es un experimento rutinario el cribado del gran número de células transformadas para obtener aquellas que expresan adecuadamente niveles altos de cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina que puede llevarse a cabo, por ejemplo, mediante sistemas robotizados. Los sistemas de vector también se muestran en las patentes de EE. UU. N.O 5.736.137 Y 5.658.570. Este sistema proporciona altos niveles de expresión, por ejemplo, >30 pg/célulaldia. Otros ejemplos de sistemas de vector se describen, por
25 ejemplo, en la patente de EE. UU. N.O 6.413.777.
[0126] En otras realizaciones preferidas los anticuerpos, o fragmentos de unión al antígeno, variantes o derivados de los mismos de la invención pueden expresarse usando construcciones policistrónicas como las que se describen en la publicación de solicitud de patente N.O 2003-0157641 A1 incorporada a este documento en su totalidad. En 30 estos sistemas de expresión, los productos de genes múltiples de interés, como las cadenas pesada y ligera de anticuerpos pueden producirse a partir de una única construcción policistrónica. Estos sistemas usan de forma ventajosa un sitio intemo de entrada al ribosoma (lRES) para proporcionar niveles relativamente altos de anticuerpos. Las secuencias IRES compatibles se describen en la patente de EE. UU. N.O 6.193.980 que también se incorpora a este documento. Los expertos en la materia apreciarán que estos sistemas de expresión pueden usarse
35 para producir de forma eficaz la variedad completa de anticuerpos descritos en la presente solicitud.
[0127] Más generalmente, una vez que se ha preparado el vector o la secuencia de ADN que codifica una subunidad monomérica del anticuerpo, el vector de expresión puede introducirse en una célula huésped apropiada. La introducción del plásmido en la célula huésped puede conseguirse mediante diversas técnicas bien conocidas por 40 los expertos en la materia. Entre estas se incluyen, pero sin limitaciones, la transfección incluyendo lipotransfección usando, por ejemplo, Fugene o lipofectamina, fusión de protoplastos, precipitación con fosfato de calcio, fusión celular con ADN envuelto, microinyección e infección con el virus intacto. Típicamente, la introducción de plásmidos en el huésped se hace a través del método estándar de coprecipitación con fosfato cálcico. Las células huésped portadoras de la construcción de expresión se cultivan en condiciones apropiadas para la producción de las cadenas
45 ligeras y las cadenas pesadas y se comprueba la sintesis de proteinas de cadenas pasada ylo ligera. Entre los ejemplos de técnicas de ensayo se incluyen el ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas (ELlSA), radioinmunoensayo (RIA) o el análisis de clasificación celular activado por fluorescencia (FACS), inmunohistoquimica y similares.
50 [0128] El vector de expresión se transfiere a una célula huésped mediante técnicas convencionales y, a continuación, las células transfectadas se cultivan por técnicas convencionales para producir un anticuerpo para su uso en los procedimientos descritos en este documento. De esta manera, la invención incluye células huésped que contienen un polinucle6tido que codifica un anticuerpo de la invención, o una cadena pesada o ligera del mismo, unido de forma operativa a un promotor heterólogo. En realizaciones preferidas para la expresión de anticuerpos de
55 cadenas dobles, pueden expresarse conjuntamente en una célula huésped vectores que codifican tanto las cadenas pesadas como las ligeras para la expresión de la molécula de inmunoglobulina completa, como se detalla a conti nuación.
[0129] La célula huésped puede transfectarse conjuntamente con dos vectores de expresión de la invención, codificando el primer vector un polipéptido derivado de la cadena pesada y codificando el se9undo vector un polipéptido derivado de una cadena ligera. Los dos vectores pueden contener marcadores seleccionables idénticos que permitan la expresión equivalente de los polipéptidos de las cadenas pesada y ligera. Alternativamente, puede usarse un vector único que codifique ambos polipéptidos de las cadenas pesada y ligera. En estas situaciones, la
5 cadena ligera se coloca de forma ventajosa antes de la cadena pesada para evitar un exceso de cadena pesada libre tóxica; véase PrOUdfoot, Nature 322 (1986), 52, Khler, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980), 2197. Las secuencias que codifican las cadenas pesada y ligera pueden comprender AONc o AON genómico.
[01 30] Según se usa en este documento, «células huésped» se refiere a células que portan vectores construidos
10 usando técnicas de AON recombinante y codifican al menos un gen heterólogo. En las descripciones de los procesos de aislamiento de anticuerpos a partir de huéspedes recombinantes, los términos «célula» y «cultivo celular» se usan indistintamente para indicar la fuente del anticuerpo, siempre que no se especifique claramente otra cosa. En otras palabras, la recuperación del polipéptido de las ((células» puede significar obtenerlo a partir de células completas centrifugadas o de cultivos celulares que contienen tanto el medio como las células en
15 suspensión.
[01 31] Puede utilizarse una diversidad de sistemas vector de expresión en huésped para expresar las moléculas de anticuerpo para su uso en los procedimientos descritos en este documento. Estos sistemas de expresión en huésped representan vehículos por los cuales las secuencias codificadoras de interés pueden producirse y, 20 posteriormente purificarse, pero también representan células que pueden expresar, cuando se transforman o transfectan con las secuencias codificadoras de nucleótidos apropiadas, una molécula de anticuerpo de la invención in situ. Estos incluyen, pero sin limitaciones, microorganismos como bacterias (p. ej., E. eoli, B. sublilis) transformadas con vectores de expresión de AON de bacteriófago recombinante, AON plasmídico o AON de cósmido que contienen secuencias codificadoras del anticuerpo, levaduras (p. ej., Saceharomyces, Piehia) transformadas con 25 vectores de expresión de levaduras recombinantes que contienen secuencias codificadoras del anticuerpo, sistemas de células de insecto infectadas con vectores de expresión de virus recombinantes (p. ej., baculovirus) que contienen las secuencias codificadoras del anticuerpo, sistemas de células vegetales infectadas con vectores de expresión de virus recombinantes (p. ej., virus del mosaico de la coliflor, CaMV; virus del mosaico del tabaco, TMV) o transformadas con vectores de expresión de plásmidos recombinantes (p. ej., plásmido Ti) Que contienen secuencias 30 codificadoras del anticuerpo o sistemas de células de mamiferos (p. ej., células COS, CHO, NSO, BLK, 293, 3T3) que portan construcciones de expresión recombinantes que contienen promotores derivados del genoma de células de mamifero (p. ej., promotor de metalotioneina) o de virus de mamiferos (p. ej., el promotor tardio de adenovirus, el promotor 7,5 k del virus vaccinia). Preferiblemente, se usan células bacterianas, como Eseherichia eoli, para la expresión de una molécula de anticuerpo recombinante y más preferiblemente, células eucariotas, especialmente
35 para la expresión de la molécula de anticuerpo recombinante completa. Por ejemplo, las células de mamífero, como las células de ovario de hámster chino (CHO), junto con un vector como el elemento promotor génico principal temprano intermedio del citomegalovirus humano, es un sistema de expresión eficaz para anticuerpos; véase, por ejemplo, Foecking y col., Gene 45 (1986), 101; Cockett y col., BiolTechnology 8 (1990), 2.
40 [0132] La línea celular huésped usada para la expresión de la proteínas a menudo es de origen mamífero; los expertos en la materia están acreditados para determinar preferiblemente células huésped concretas que se adapta mejor a la expresión en ellas del producto génico deseado. Entre los ejemplos de líneas celulares huésped se incluyen, pero sin limitaciones, CHO (ovario de hámster chino), DG44 y DUXB11 (líneas de ovario de hámster chino, OHFR negativa), HELA (carcinoma de cuello de útero humano), CVI (linea de riñón de mono), COS (derivada de CVI
45 con antígeno T de SV40), VERY , BHK (riñón de cría de hámster), MDCK, W138 , R1610 (fibroblasto de hámster chino) BALBC/3T3 (fibroblasto de ratón), HAK (línea de riñón de hámster), SP2IO (mieloma de ratón), P3x63Ag3.653 (mieloma humano), BFA-1c1BPT (células endoteliales bovinas), RAJI (linfocito humano) y 293 (riñón humano). Son especialmente preferidas las células CHO y 293. Típicamente, las lineas de células huésped están disponibles en los servicios comerciales, en la American Tissue Culture Collection o de la bibliografía publicada.
50 [01 33] Además, puede elegirse una cepa de células huésped que module la expresión de las secuencias insertadas o modifique y procese el producto génico en la manera especifica deseada. Estas modificaciones (p. ej., glucosilación) y procesamiento (p. ej., escisión) de productos proteicos pueden ser importantes para la función de la proteína. Se han caracterizado células huésped diferentes y mecanismos específicos para el procesamiento
55 postraducional y modificación de proteínas y productos génicos. Pueden elegirse líneas celulares o sistemas huésped apropiados para asegurar la modificación correcta y el procesamiento de la proteina extraña expresada. Para este fin, pueden usarse células huésped eucariotas que poseen la maquinaria celular para el procesamiento apropiado del transcripto principal, glucosilación y fosforilación del producto génico.
[01 34] Para una producción de alto rendimiento a largo plazo de proteinas recombinanles, se prefiere la expresión estable. Por ejemplo, pueden modificarse por ingenieria genética líneas celulares que expresan de forma estable la molécula de anticuerpo. Antes que usar vectores de expresión que contienen origenes de replicación virico, pueden transformarse células huésped con AON controlado por elementos de control de la expresión apropiados (p. ej., 5 promotor, potenciador, secuencias, terminadores de transcripción, sitios de poliadenilación, etc.) y un marcador seleccionable. Tras la introducción del ADN extraño, puede dejarse que las células modificadas genéticamente crezcan durante 1-2 días en medios enriquecidos y, a continuación, se cambian a un medio selectivo. El marcador seleccionable en el plásmido recombinante confiere resistencia a la selección y permite que las células integren de forma estable el plásmido en sus cromosomas y crezcan para forman focos que sucesivamente puede ctonarse y
10 expandirse en líneas celulares. Puede ser ventajoso usar este procedimiento para modificar genéticamente líneas celulares que expresan de forma estable la molécula de anticuerpo.
[0135] Pueden usarse varios sistemas de selección que induyen, pero sin !imitación, !os genes de la timidina quinasa del virus del herpes simple (Wigler y col., Cell11 (1977), 223), hipoxantina-guanina fosforibosiltransferasa 15 (Szybalska y Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48 (1992), 202) Y la adenina fosforibosiltransferasa (Lowy y col., Cell 22 (1980), 817) que pueden emplearse en células tk, hgprt o aprt, respectivamente. También, puede usarse la resistencia antimetabolito como base de la selección para los siguientes genes: dhfr, que confiere resistencia a metotrexato (Wigler y col., Natl. Acad. Sei. USA 77 (1980), 357; Q'Hare y col., Proc. Nat!. Acad. Sci. USA 78 (1981) 1527); gpt, que confiere resistencia al ácido micofenólico (Mulligan y Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 (1981), 20 2072); neo, que confiere resistencia al aminoglucósido G-418, Goldspiel y col., Clinical Pharmacy 12 (1993), 488505; Wu yWu, Biotherapy 3 (1991), 87-95; Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32 (1993), 573-596; Mulligan, Science 260 (1993), 926-932; Y Morgan y Anderson, Ann. Rev. Biochem. 62 (1993),191-217; TIB TECH 11 (1993), 155-215; e hygro, que confiere resistencia a la higromicina (Santerre y col., Gene 30 (1984), 147. Pueden usarse procedimientos normalmente conocidos en la materia de tecnologia de AON recombinante como se describe en
25 Ausubel y col. (editores), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley e Hijos, NY (1993); Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990) Y en los capítulos 12 y 13, Oracopoli y col. (editores), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley e hijos, NY (1994); Colberre-Garapin y col., J. Mol. 9io1.150: Biol. 1501:1 (1981).
30 [0136] Los niveles de expresión de una molécula de anticuerpo pueden aumentarse mediante amplificación del vector; para una revisión, véase Bebbington y Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of doned genes in mammalian cells in DNA cloning, Academic Press, Nueva York, Vo1.3. (1987). Cuando un marcador en el sistema vector que expresa el anticuerpo es amplificable, un aumento en nivel de inhibición presente en el cultivo de células huésped aumentará el número de copias del gen marcador. Puesto que la región
35 amplificada se asocia con el gen del anticuerpo, también se aumentará la producción del anticuerpo (Crouse y col., Mol. Cell. Biol. 3 (1983), 257. La producción in vitro permite su escalada para obtener cantidades grandes de los polipéptidos deseados. Las técnicas para el cultivo de células de mamífero en condiciones de cultivo tisular son conocidas en la materia e incluyen cultivo en suspenSión homogéneo, por ejemplo, en un reactor de transporte aéreo o en un reactor con agitador continuo o cultivo celular inmovilizado o atrapado, por ejemplo, en fibras huecas,
40 microcápsulas, en microesferas de agarosa o cartuchos cerámicos. Si es necesario yfo se desea, las soluciones de polipéptidos pueden purificarse mediante por métodos cromatográficos habituales, por ejemplo, filtración en gel, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía sobre DEAE-celulosa o cromatografía de (inmuno)afinidad, por ejemplo, tras biosíntesis preferencial de un polipéptido sintético de la reg ión bisagra o antes o después del paso de cromatografia HIC descrito en este documento.
45 [0137] Los genes que codifican los anticuerpos, o los fragmentos de unión al antígeno, variantes o derivados de los mismos de la invención también puede expresarse en células no mamíferas como bacterias, insectos, levaduras
o células vegetales. Entre las bacterias que aceptan fácilmente ácidos nucleicos se incluyen miembros de la familia Enterobacteriaceae, como cepas de Escherichia coli o Salmonella; Bacillaceae, como Bacillus subtilis;
50 Pneumococcus; Streptococcus y Haemophilus influenzae. Adicionalmente se apreciará que, cuando se expresan en bacterias, los polipéptidos heterólogos típicamente forman parte de los cuerpos de inclusión. Los polipéptidos heterólogos pueden aislarse, purificarse y, a continuación, ensamblarse en moléculas funcionales. Cuando se desean forma tetravalentes, a continuación, las subunidades se autoensamblarán en anticuerpos tetravalente; véase, por ejemplo, la solicitud internacional WQ02f096948.
55 [0138] En sistemas bacterianos, pueden seleccionarse de forma ventajosa varios vectores de expresión dependiendo del uso pretendido para la molécula de anticuerpo que se está expresando. Por ejemplo, cuando se va a producir una gran cantidad de esta proteína, para la generación de composiciones farmacéuticas de una molécula de anticuerpo, pueden ser deseables vectores que dirijan la expresión de altos niveles de productos proteicos de fusión que se purifican fácilmente. Entre estos vectores se incluyen, pero sin limitaciones, el vector de expresión de
E. col; pUR278 (Ruther y col.. EMBO J. 2 (1983). 1791). en el que la secuencia codificadora del anticuerpo puede estar ligada individualmente dentro del vector en marco con la región cod ificadora de lacZ de modo que se produce una proteína de fusión; vectores plN (Inouye e Inouye, Nucleic Acids Res. 13 (1985), 3101-3109; Van Heeke y 5 Schuster, J. Biol. Chem. 24 (1989), 5503-5509) Y similares; también pueden usarse vectores pGEX para expresar polipéptidos extraños como proteinas de fusión con glutatión S-transferasa (GST). En general, estas proteínas de fusión son solubles y pueden purificarse fácilmente a partir de las células lisadas por adsorción y unión a una matriz de perlas de glutatión-agarosa seguido de la elución en presencia de glutatión libre. Los vectores pGEX se diseñan para incluir sítios de escisión de las proteasas trombina o factor Xa de modo que el producto génico diana clonado
10 pueda liberarse del resto GST.
[0139J Además de procariotas, también pueden usarse microbios eucariotas. Saccharomyces cerevis;ae, o la levadura de panadería común, es la usada con mayor frecuencia entre los microorganismos eucariotas, aunque normalmente se dispone de varias cepas diferentes, por ejemplo, Pichia pastoris. Para la expresión en 15 Saccharomyces, el plásmido YRp7, por ejemplo, (Stinchcomb y col., Nature 282 (1979), 39; Kingsman y col., Gene 7 (1979), 141; Tschemper y col., Gene 10 (1980), 157) se usa frecuentemente. Este plásmido ya contiene el gen TRPl que proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levadura carente de la capacidad para crecer en presencia de triptófano, por ejemplo, ATCC N° 44076 o PEP4-1 (Jones, Genetics, 85 (1977), 12). La presencia de la lesión trpl como una característica del genoma de la célula huésped de levadura proporciona a continuación un
20 ambiente eficaz para detectar la transformación mediante crecimiento en ausencia de triptófano.
[0140J En un sistema de insecto, se usa típicamente el vil1Js de la poliedrosis nuclear de Autographa califom;ca (AcNPV) como vector para expresar genes extraños. El vil1Js crece en células de Spodoptera frug;perda. La secuencia codificadora del anticuerpo puede clonarse individualmente en regiones no esenciales (por ejemplo, el
25 gen poliedrina) del virus y colocarse bajo el control de un promotor AcNPV (por ejemplo, el promotor de poliedrina).
[0141J Una vez que una molécula de anticuerpo de la invención se ha expresado recombinantemente, los anticuerpos completos, sus dímeros, cadenas ligera y pesada individuales u otras formas de inmunoglobulina de la presente invención, pueden pUrificarse según procedimientos estándar de la técnica, incluido por ejemplo, mediante
30 cromatografía (p. ej., cromatografía de intercambio iónico, afinidad, especialmente mediante afinidad por el antigeno específico tras Proteína A y exclusión molecular), cent rifugación, solubilidad diferencial, p. ej., precipitación con sulfato amónico, o mediante cualquier otra técnica estándar de purificación de proteinas: véase p. ej., Scopes, «Protein Purification», Springer Verlag, N.Y. (1982). Altemativamente, un procedimiento preferido para aumentar la afinidad de los anticuerpos de la invención se describe en la publicación de patente de EE. UU. 2002-0123057 A1.
V. Proteínas de fusión y conjugados
[0142J En determinadas realizaciones, el polipéptido del anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos o uno o más restos normalmente no asociados con un anticuerpo. A continuación se describen ejemplos de
40 modificaciones con más detalle. Por ejemplo, un fragmento de anticuerpo fv de cadena senci11a de la invención puede comprender una secuencia enlazadora flexible, o puede modificarse añadiendo un resto funcional (p. ej., PEG, un fármaco, una toxina o una etiqueta fluorescente, radioactiva, enzimática, magnético nuclear, metal pesado y similares).
45 [0143J Un polipéptido de anticuerpo de la invención puede comprender, constar esencialmente o constar de una proteína de fusión. Las proteínas de fusión son moléculas quiméricas que comprende, por ejemplo, un dominio de inmunoglobulina de unión a a-sinucleina con al menos un sitio de unión diana y al menos una porción heteróloga, es decir, una porción a la que no está unido de forma natural en la naturaleza. Las secuencias de aminoácidos pueden encontrarse normalmente en proteínas independientes que se colocan juntas en el polipéptido de fusión o pueden
50 existir normalmente en la misma proteína pero se colocan en una nueva disposición en el polipéptido de fusión. Las proteínas de fusión pueden crearse, por ejemplo, mediante síntesis química, o creando y traduciendo un polinucleótido en el que las regiones peptidicas se codifican en la relación deseada.
[0144J El término «heterólogo» si se aplica a un polinucleótido o un polipéptido, significa que el polinucleótido o
55 polipéptido deriva de una entidad diferente de la del resto de la entidad con la que se está comparando. Por ejemplo, según se usa en este documento, un «polipéptido heterólogo» que va a fusionarse con un anticuerpo, o su fragmento de unión al antigeno, variante o análogo derivado de un polipéptido no inmunoglobulina de la misma especie, o un polipéptido inmunoglobulina o no inmunoglobulina de una especie diferente. Como se describe con mayor detalle en otra parte de este documento, los anticuerpos o sus fragmentos de unión al antigeno, variantes o derivados de la invención pueden además fusionarse de forma recombinante en el extremo N o C-terminal con un polipéptido heterólogo o conju9arse quimicamente (incluyendo conjugaciones covalentes o no covalentes) con polipéptidos u otras composiciones. Por ejemplo, los anticuerpos pueden estar fusionados o conjugados de forma recombinante a moléculas útiles como etiquetas en ensayos de detección y a moléculas efectoras como polipéptidos
5 heterólogos, fármacos, radionucleidos o toxinas: véase, por ejemplo, las solicitudes internacionales W092/08495: W091/14438: W089/12624; la patente de EE. UU. N.o 5.314.995 y la solicitud de patente europea EP O396 387.
[0145] Los anticuerpos, o sus fragmentos de unión al antígeno, variantes o derivados de la presente invención pueden estar compuestos por aminoácidos unidos entre si por enlaces peptrdicos o por enlaces pepUdicos 10 modificados, es decir, isoésteres peptídicos, y pueden contener aminoácidos distintos de los 20 aminoácidos codificados por genes. Los anticuerpos pueden modificarse mediante procesos naturales, como procesado postraduccional, o mediante técnicas de modificación química que son bien conocidos en la materia. Estas modificaciones están bien descritas en textos básicos y en monografías más detalladas, así como en una voluminosa literatura de investigación. Las modificaciones pueden tener lugar en cualquier parte del anticuerpo, 15 incluido el esqueleto peptídico, las cadenas laterales de los aminoácidos y los extremos amino o carboxilo terminales, o en restos como hidratos de carbono. Se apreciará que el mismo tipo de modificación puede estar presente en el mismo grado o en grado variable en varios sitios de un determinado anticuerpo. También un determinado anticuerpo puede contener muchos tipos de modificaciones. Los anticuerpos pueden estar ramificados, por ejemplo, como resultados de una ubiquitinación y pueden ser cíclicos con o sin ramificaciones. Los anticuerpos 20 cíclicos, ramificados y cídicos ramificados pueden ser el resultado de procedimientos naturales postraduccionales o pueden obtenerse mediante procedimientos sintéticos. Entre las modificaciones se incluyen acetilación, acilación, ADP-ribosilación, amidación, unión covalente de flavina, unión covalente de un resto hemo, unión covalente de un nucleótido o derivado de nucleótido, unión covalente de un lipido o derivado lipídico, unión covalente de fosfotidilinositol, entrecruzamiento, ciclización, formación de puentes disulfuro, demetilación, formación de 25 entrecruzamientos covalentes, formación de cisterna, formación de piroglutamato, formilación, gamma-carboxilación, glucosilación, formación de anclajes GPI, hidroxilación, yodinación, metilación, miristoilación, oxidación, pegilación, procesamiento proteolítico, fosforilación, prenilación, racemización, selenoilación, sulfatación, adición mediada por ARN de transferencia de aminoácidos a proteínas tales como arginilaci6n y ubiquitinación; véanse, por ejemplo, Proteins -Structure And Molecular Properties, T. E. Creighton, W. H. Freeman y compañia, Nueva York 28 Ed.,
30 (1993); Posttranslational Covalent Modification Of Proteins, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, Nueva York, pág. 1-12 (1983); Seifter y col., Meth. Enzymol. 182 (1990), 626-646; Rallan y col., Ann. NY Acad. Sci. 663 (1992), 4862).
[0146] La presente invención también proporciona proternas de fusión que comprenden un anticuerpo o su
35 fragmento de unión al antigeno, variante o derivado, y un polipéptido heterÓlogo. En una realización, una proteina de fusión de la invención comprende, consta esencialmente o consta de un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de una cualquiera o más de la regiones VH de un anticuerpo de la invención o la secuencia de aminoácidos de una cualquiera o más de las regiones VL de un anticuerpo de la invención o sus fragmentos o variantes, y una secuencia polipeptídica heteróloga. En otra realización, una proteína de fusión para su uso en
40 procedimientos diagnósticos y de tratamiento descrita en este documento comprende, consta esencialmente o consta de un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de una cualquiera o más de la regiones VH-CDR de un anticuerpo o sus fragmentos, variantes o derivados, o la secuencia de aminoácidos de una cualquiera, dos o tres de las VL-CDR de un anticuerpo de la invención o sus fragmentos, variantes o derivados y una secuencia polipepUdica heterÓloga. En una realización, la proteina de fusión comprende un polipéptido que tiene la secuencia
45 de aminoácidos de una VwCDR3 de un anticuerpo de la presente invención o su fragmento, derivado o variante y una secuencia polipeptrdica heteróloga, proteína de fusión que se une especrficamente a a-sinuclerna. En otra realización, una proteina de fusión comprende un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de al menos una región VH de un anticuerpo de la invención y la secuencia de aminoácidos de al menos una región VL de un anticuerpo de la invención o sus fragmentos, derivados o variantes, y una secuencia polipeptrdica heteróloga.
50 Preferiblemente, las regiones VH y VL de la proterna de fusión corresponden a un anticuerpo original sencillo (o fragmento scFV o Fab) que se une especificamente a a-sinucleina. Aún en otra realización, una proterna de fusión para su uso en los procedimientos diagnósticos y de tratamiento descritos en este documento comprende un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de una cualquiera, dos, tres o más de las regiones VH-CDR de un anticuerpo y la secuencia de aminoácidos de una cualquiera, dos, tres o más de las VvCDR de un anticuerpo, o
55 sus fragmentos o variantes, y una secuencia polipepUdica heteróloga. Preferiblemente, dos, tres, cualro, cinco, seis O más de las regiones VwCDR o VvCDR se corresponden con un anticuerpo original sencillo (fragmento scFv o Fab) de la invención. La invención también abarca a las moléculas de ácido nudeico que codifican estas proteinas de fusión.
[0147] Entre los ejemplos de proteinas de fusión publicadas en la literatura se incluyen proteinas de fusión del receptor de células T (Gacoi9ne y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987), 2936-2940; CD4 (Capon y col., Nature 337 (1989), 525-531; Traunecker y col., Nature 339 (1989), 68-70; Zettmeissl y col., DNA Cell Biol. USA 9 (1990), 347-353 Y Bym y col., Nature 344 (1990), 667-670); L-selectina (receptor de alojamiento) (Watson y col., J. Cell. Biol. 5 110 (1990), 2221-2229 Y Watson y col., Nature 349 (1991),164-167); CD44 (Aruffo y col., Cell 61 (1990), 13031313); CD28 Y B7 (Linsley y col., J. Exp. Med. 173 (1991), 721-730); CTLA-4 (lisley y col., J. Exp. Med. 174 (1991), 561-569); CD22 (Stamenkovic y col., Cell 66 (1991), 1133-1144); receptor de TNF (Ashkenazi y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991),10535-10539; Lesslauer y col., Eur. J. Immunol. 27 (1991), 2883-2886; Y Peppel y col., J. Exp. Med. 174 (1991),1483-1489 (1991); Y receptor de IgE receptor a (Ridgway y Gorman, J. Cell. Biol. 115 (1991),
10 Resumen N.O 1448).
[0148] Como se describe en otra parte de este documento, los anticuerpos o sus fragmentos de unión al antigeno, variantes o derivados de la invención pueden fusionarse a polipéptidos heterólogos para aumentar la semivida in vivo de los polipéptidos o para su uso en inmunoensayos usando procedimientos conocidos en la materia. Por
15 ejemplo, en una realización, el PEG puede conjugarse con los anticuerpos de la invención para aumentar su semivida in vivo; véase, por ejemplo, Leong y col., Cytokine 16 (2001), 106-119, Adv. in Drug Deliv. Rev. 54 (2002); Adv. in Drug Deliv. Rev. 54 (2002), 531; oWeir y col., Biochem. Soco Transactions 30 (2002), 512.
[0149] Además, los anticuerpos o sus fragmentos de unión al antigeno, variantes o derivados de la invención
20 pueden fusionarse con secuencias marcadoras, como un péptido, para facilitar su purificación o detección. En realizaciones preferidas, la secuencia de aminoácidos marcadora es un péptido hexahistidina (HIS), como la etiqueta proporcionada en un vector pQE (QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91311), entre otros, muchos de los cuales están disponibles en el mercado. Como se describe en Gentz y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989), 821 -824, por ejemplo, la hexahistidina proporciona una purificación conveniente de la proteina de fusión. Entre otras
25 etiquetas peptidicas útiles para la purificación se incluyen, pero sin limitaciones, la etiqueta «HA» que se corresponde con un epítope derivado de la proteína hemaglutinina del virus influenza (Wilson y col., Cell 37 (1984), 767) Y la etiqueta «flag».
[0150] Las proteinas de fusión pueden prepararse usando procedimientos que son bien conocidos en la materia,
30 véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. N.O 5.116.964 Y 5.225.538. El sitio preciso en el que se realiza la fusión puede seleccionarse empíricamente para optimizar las características de secreción o un ión de la proteína de fusión. A continuación, el ADN que codifica la proteína de fusión se transfecta en una célula huésped para su expresión.
35 [0151] Los anticuerpos de la presente invención pueden usarse en forma no conjugada o pueden conjugarse al menos con una variedad de moléculas, por ejemplo, para mejorar las propiedades terapéuticas de la molécula, para facilitar la detección de la diana o para estudio por imagen o terapia del paciente. Los anticuerpos, o sus fragmentos de unión al antigeno, va riantes o derivados de la invención pueden marcarse o conjugarse antes o después de la purificación, cuando se realiza la purificación. En especial, los anticuerpos o sus fragmentos de unión al antígeno,
40 variantes o derivados de la invención pueden conjugarse con agentes terapéuticos. profármacos, péptidos. proteinas, enzimas, virus, lipidos, modificadores de la respuesta biológica, fármacos o PEG.
[0152] Se han descrito ampliamente en la materia conjugados que son inmunotoxinas que incluyen anticuerpos convencionales. Las toxinas pueden conjugarse con los anticuerpos mediante técnicas de conjugación
45 convencionales o pueden producirse como proteinas de fusión inmunotoxinas que contienen porciones de toxinas proteicas. Los anticuerpos de la presente invención pueden usarse de la forma correspondiente para obtener dichas inmunotoxinas. Son ejemplos ilustrativos de dichas inmunotoxinas aquellas descritas por Byers. Seminars Cen o Biol. 2 (1991),59-70 Y por Fanger, Immunol. Today 12 (1991),51-54.
50 [0153] Los expertos en la materia apreciarán que los conjugados también pueden ensamblarse usando diversas técnicas dependiendo del agente seleccionado que se va a conjugar. Por ejemplo. los conjugados con biotina se preparan, haciendo reaccionar un polipéptido de unión a a-sinucleina con un éster de biotina activado, como el éster de N-hidroxisuccinimida biotina. De forma similar, pueden prepararse conjugados con un marcador fluorescente en presencia de un agente de conjugación, por ejemplo, los enumerados en este documento, o mediante la reacción
55 con un isotiocianato, preferiblemente isotiocianato de fluoresceína. Los conjugados de los anticuerpos o sus fragmentos de unión al antigeno, variantes o derivados de la invendón se preparan de una forma análoga.
[0154] La presente invención además abarca anticuerpos o sus fragmentos de unión al antígeno, variantes o derivados de la invendón conjugados a un agente diagnóstico o terapéutico. Los anticuerpos pueden usarse a nivel
dia9nóstico para, por ejemplo, demostrar la presencia de una enfermedad neurológica, para indicar el riesgo de desarrollar una enfennedad neurológica, para controlar el desarrollo o progresión de una enfermedad neurológica, es decir, una enfennedad sinucleinopática como parte de un procedimiento de ensayo clinico para, por ejemplo, detenninar la eficacia de un determinado régimen de tratamiento y/o prevención. La detección puede facilitarse 5 mediante la conjugación del anticuerpo, o su fragmento de unión al antígeno, variante o derivado a una sustancia detectable. Entre los ejemplos de sustancias detectables se incluyen diversas enz.imas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes, materiales radioactivos, metales emisores de positrones usando diversas tomografias de emisión de positrones e iones metálicos paramagnéticos no radiactivos; véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. N.O 4.741 .900 para iones metálicos que pueden estar 10 conjugados a anticuerpos para su uso como agentes diagnósticos según la presente invención. Entre los ejemplos de enzimas adecuadas se incluyen peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, ~-galactosidasa o acetilcolinesterasa, entre los ejemplos de complejos de grupos prostéticos adecuados se incluyen estreptavidinafbiotina y avidina/biotina; entre los ejemplos de materiales fluorescentes adecuados se incluyen umbeliferona, f1uoresce¡na, isotiocianato de f1uoresceina, roda mina, diclorotriazinilamina f1uoresce¡na, cloruro de
15 dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de material luminiscente es el luminol; entre los ejemplos de materiales bioluminiscentes se incluyen luciferasa, luciferina y aecuorina, y entre los ejemplos de material radiactivo adecuado se incluyen 1151, 1311, 1111n o 99Tc.
[0155] Un anticuerpo o su fragmento de unión al ant¡geno, variante o derivado también puede marcarse de forma
20 detectable mediante la conjugación con un compuesto quimioluminiscente. La presencia del anticuerpo con etiqueta quimioluminiscente se determina a continuación mediante la detección de la presión de luminiscencia surgida durante el transcurso de una reacción quimica. Son ejemplos de compuestos de marcaje quimioluminiscente especialmente útiles luminol, isoluminol, éster de acridinio teromático, imidazol, sal de acridinio y éster de oxalato.
25 [0156] Una de las maneras en las que un anticuerpo, o su fragmento de unión al antigeno, variante o derivado puede marcarse de forma detectable es uniendo el mismo a una enzima y usando el producto unido en un inmunoensayo enzimático (EIA) (Voller, A., «The Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELlSA)>> Microbiological Associates Quarteriy Publication, Walkersville, Md., Diagnostic Horizons 2 (1978), 1-7); Voller y col., J. Clin. Pathol. 31 (1978), 507-520; Butler, Meth. Enzymol. 73 (1981), 482-523; Maggio, E. (ed.), Enzyme Immunoassay, CRC
30 Press, Boca Raton, Fla., (1980); Ishikawa, E. y col., (eds.), Enz.yme Immunoassay, Kgaku Shoin, Tokio (1981 ). La enzima, que está unida al anticuerpo reaccionará con un sustrato apropiado, preferiblemente un sustrato cromogénico, de manera que se produzca un resto quimico que pueda detectarse, por ejemplO, mediante métodos espectrofotométricos, ffuorimétricos o visuales. Entre las enzimas que pueden usarse para marcar de forma detectable se incluyen, pero sin limitaciones, malato deshidrogenasa, nucleasa de estafilococos, della-5-esteroide
35 isomerasa, alcohol deshidrogenasa de levadura, alfa-glicerofosfato deshidrogenasa, triosa fosfato isomerasa, peroxidasa de rábano picante, alcalina fosfatasa, aspa rraginasa, glucosa oxidasa, beta-gatactosidasa, ribonucleasa, ureasa, catalasa, glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, glucoamilasa y acetilcolinesterasa. Adicionalmente, la detección puede conseguirse mediante procedimientos colorimétricos que emplean un sustrato cromogénico para la enzima. La detección también puede conseguirse mediante comparación visual del grado de la reacción enzimática de un
40 sustrato en comparación con patrones preparados de forma similar.
[0157] La detección también puede conseguirse usando cualquiera de una variedad de otros inmunoensayos. Por ejemplo, mediante marcaje radioactivo del anticuerpo o su fragmento de unión al antigeno, variante o derivado, es posible detectar el anticuerpo mediante el uso de un radioinmunoensayo (RIA), (véase, por ejemplo, Weintraub, B.,
45 Principies of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, [marzo, 1986]). El isótopo radiactivo puede detectarse por métodos que incluyen, pero sin limitaciones, un contador gamma, un contador de centelleo o una autorradiografía.
[0158] Un anticuerpo, o su fragmento de unión al antigeno, variante o derivado también puede marcarse de forma
50 detectable usando metales emisores de fluorescencia, como 15:lEu u otros de la serie de los lantánidos. Estos metales pueden unirse al anticuerpo usando dichos grupos quelantes de metales, como el ácido dietilentriaminofentacético (DTPA) o ácido etilendiaminotetraacético. Las técnicas para conjugar varios restos a un anticuerpo, o su fragmento de unión al antigeno, variante o derivado son bien conocidas, véase, por ejemplo, Arnon y col., «Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy», en Monoclonal Antibodies And
55 Cancer Therapy, Reisfeld y col. (eds.), pág. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom y col., ((Antibodies For Drug Delivery», en Controlled Drug Delivery (2° Edición .), Robinson y col. (eds.), Marcel Dekker, Inc., pág 623-53 (1987); Thorpe, «Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", en Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera y col. (eds.), pág. 475-506 (1985); «Analysis, Resulls, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy», en Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin y col. (eds.), Academic Press pá9. 303-16 (1985), Y Thorpe y col., «The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates», Immunol. Re". 62 (1982), 119-158.
[0159] Como se mencionó, en determinadas realizaciones, puede conjugarse un resto que potencia la estabilidad y
5 eficacia de una molécula de unión, por ejemplo, un polipéptido de unión, por ejemplo, un anticuerpo o su fragmento inmunoespecífico. Por ejemplo, en una realización, puede conjugarse PEG a las moléculas de unión de la invención para aumentar su semivida in vivo. leong y col., Cytokine 16 (2001), 106; Ad". in Drug Deliv. Rev. 54 (2002), 531 o Weir y col., Biochem. Soco Transactions 30 (2002) , 512.
10 VI. Composiciones y procedimientos de uso
[0160] la presente invención se refiere a composiciones que comprenden la molécula de unión a la o-sinucleina mencionada anteriormente, por ejemplo, el anticuerpo o su fragmento de unión al antígeno de la presente invención
o su derivado o variante, o el polinucleótido, vector o célula de la invención. la composición de la presente invención
15 puede comprender adicionalmente un vehículo farmacéuticamente aceptable. Además, la composición farmacéutica de la presente invención puede comprender otros agentes como interleuquinas o interferones dependiendo del uso pretendido de la composición farmacéutica. Por ejemplo, para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Parkinson, el agente adicional puede seleccionarse a partir del grupo compuesto por moléculas orgánicas pequeñas, anticuerpos anti-a-sinucleína y combinaciones de los mismos. Por tanto, en una realización preferida en particular la
20 presente invención se refiere al uso de la molécula de unión a a-sinucleína, por ejemplo, anticuerpo o su fragmento de unión al antígeno de la presente invención o una molécula de unión que tiene sustancialmente las mismas especificidades de unión de cualquiera de las mismas, el polinucleótido, el vector y la célula de la presente invención para la preparación de una composición farmacéutica o diagnóstica para el tratamiento profiláctico y terapéutico de una enfermedad sinucleinopática, el control de una progresión de una enfermedad sinucleinopática o una respuesta
25 al tratamiento de la enfermedad sinucleinopática en un sujeto o para determinar el riesgo del sujeto para desarrollar dicha enfermedad sinucleinopática.
[0161] Por tanto, en una realización la presente invención se refiere al anticuerpo anti-a-sinucleína y su fragmento de unión a la a-sinucleína de la presente invención para su uso en el tratamiento de un trastorno neurológico 30 caracterizado por una acumulación anómala y/o depÓSito de a-sinucleína en el cerebro y el sistema nervioso central, respectivamente, cuyo tratamiento comprende la administración a un sujeto que necesita de una cantidad terapéuticamente eficaz de cualquiera de las moléculas de unión a o-sinucleína, anticuerpos, polinucleótidos, vectores o células descritas anteriormente de la presente invención. El término «trastomo neurológico» incluye, pero sin limitaciones, enfermedades sinucleinopáticas como enfermedad de Parkinson (EP), demencia por enfermedad 35 de Parkinson (DEP), demencia con cuerpos de lewy (DCl), la variante con cuerpos de Lewy de la enfermedad de Alzheimer (VClEA), atrofia sistémica múltiple (ASM), insuficiencia autónoma pura (IAP), neurodegeneración con acumulación cerebral de hierro de tipo 1 (NACH-1), enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Piel<, distrofia neuroaxonal generalizada de inicio juvenil (enfermedad de Hallervorden-Spatz), esclerosis lateral amiotrófica, lesión cerebral traumática y síndrome de Down así como otros trastomos y enfermedades del movimiento del sistema
40 nervioso central (SNC) en general. A no ser que se especifique otra cosa, los términos neurodegenerativo, neurológico y neuropsiquiátrico se usan indistintamente en este documento.
[0162J Una ventaja en particular de la estrategia terapéutica de la presente invención recae en el hecho de que los anticuerpos de la presente invención derivan de células B o células B de memoria de sujetos de edad avanzada sin 45 signos de Parkinsonismo y, por tanto son, con una determinada probabilidad, capaces de prevenir una enfermedad sinucleinopática clínicamente manifiesta, o de disminuir el riesgo de aparición de la enfermedad clínicamente manifiesta, o de retrasar el inicio o progresión de la enfermedad clinicamente manifiesta. Tipicamente, los anticuerpos de la presente invención también han pasado ya con éxito a través de maduración somática, es decir, la optimización con respecto a la selectividad y eficacia en la alta afinidad de unión a la molécula de a-sinucleína diana
50 mediante variación somática de las regiones variables del anticuerpo.
[0163] El conocimiento de que estas células in vivo, por ejemplo en un humano, no se han activado a través de proteinas fisiológicas o estructuras celulares relacionadas, o de otro tipo, en el sentido de una reacción autoinmunológica o alérgica también es de gran importancia médica ya que esto significa un aumento considerable 55 en la posibilidad de sobrevivir a través de las fases de las pruebas clínicas. Por así decirlo, la eficiencia, aceptabilidad y tolerabilidad ya se han demostrado antes del desarrollo preclinico y clínico del anticuerpo profiláctico
o terapéutico en al menos un sujeto humano. Por lo tanto, se puede esperar que los anticuerpos anti-a-sinucleina humanos de la presente invención, tanto su eficacia específica de la estructura diana como agente terapéutico y la disminución de la probabilidad de efectos adversos aumentan significativamente su probabilidad clinica de éxito.
[0164] La presente invención también proporciona un producto farmacéutico y de diagnóstico, respectivamente, paquete o kit que comprende uno o más recipientes llenos con uno o más de los componentes descritos anteriormente, por ejemplo, anticuerpo anti-a-sinucleína, fragmento de unión, derivado o variante de la misma, 5 polinucleótido, vector o célula de la presente invención. Asociado con estos recipientes puede haber una nota en la forma establecida por una agencia gubemamental para la regulación de la fabricación, uso o venta de productos farmacéuticos o biológicos, que refleje la aprobación por la agencia de fabricación, uso o venta para la administración en humanos. Además o alternativamente, el kit comprende reactivos y/o instrucciones para su uso en ensayos diagnósticos apropiados. La composición, por ejemplo, el kit de la presente invención es, por supuesto,
10 especialmente adecuada pa ra la evaluación del riesgo, diagnóstico, prevención y tratamiento de un trastorno que va acompañado con la presencia de a-sinucleina, y en particular, aplicable para el tratamiento de la enfermedad de Parkinson (EP), demencia por enfermedad de Parkinson (DEP), demencia con cuerpos de Lewi (DCL) y variante con cuerpo de Lewy de la enfermedad de Alzheimer (VCLEA).
15 [0165] Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden formularse de acuerdo con procedimientos bien conocidos en la técnica; véase por ejemplo Remington: The Science and Practice of Pharmacy (2000) de la Universily of Sciences in Philadelphia, ISBN 0-683-306472. Ejemplos de vehículos farmacéuticos adecuados son bien conocidos en la materia e incluyen soluciones salinas tamponadas con fosfato, agua, emulsiones, como emulsiones aceitefagua, diversos tipos de agentes humectantes, soluciones estériles, etc. Las
20 composiciones que comprenden estos vehiculos pueden formularse mediante procedimientos convencionales bien conocidos. Estas composiciones farmacéuticas pueden administrarse al sujeto a una dosis adecuada. La administración de las composiciones adecuadas puede efectuarse a través de diversas medios, por ejemplo, mediante administración intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, intramuscular, intranasal, tópica o intradérmica o administración intramedular o cerebral. Las formulaciones en aerosol, como formulación de spray nasal incluyen
25 soluciones acuosas o de otro tipo pUrificadas del principio activo con agentes conservantes y agentes isotónicos. Estas formulaciones se ajustan preferiblemente a un pH y estado isotónico compatibles con las membranas de la mucosa nasal. Las formulaciones para la administración rectal o vaginal pueden presentarse como supositorios con un vehículo adecuado.
30 [0166] Además, mientras que la presente invención incluye el procedimiento ahora habitual (aunque afortunadamente infrecuente) de realizar un pequeño agujero en el cráneo para administrar un fármaco de la presente invención, en un aspecto preferido, la molécula de unión, especialmente el anticuerpo o fármaco basado en un anticuerpo de la presente invención puede atravesar la barrera hematoencefálica, lo que permite su administración intravenosa u oral.
[0167] El médico responsable determinará la pauta posológica y demás factores dínicos. Como es bien conocido en las técnicas médicas, las dosis para cualquier paciente dependen de muchos factores, como la estatura del paciente, el área de supemcie corporal, la edad, el compuesto en particular que se va a administrar, el sexo, el tiempo y la via de administración, el estado de salud general y otros fármacos que se estén administrando 40 simultáneamente. Una dosis típica puede estar, por ejemplo, en el intervalo de 0,001 a 1000 I-Ig (o de ácido nucleico para su expresión o para inhibición de la expresión en este intervalo); sin embargo, también están previstas las dosis por debajo o por encima de este ejemplo de intervalo, especialmente considerando los faclores mencionados anteriormente. En general, la dosis puede oscilar, por ejemplo, de aproximadamente 0,0001 a 100 mgfkg, y más normalmente de 0,01 a 5 mgfkg (p. ej., 0,02 mgfkg, 0.25 mgfkg, 0,5 mgfkg, 0,75 mgfkg, 1 mgfkg, 2 mgfkg, etc.), del 45 peso corporal del huésped. Por ejemplo, las dosis pueden ser de 1 mg/kg de peso corporal o de 10 mg.lkg de peso corporal o esta r dentro del intervalo de 1 a 10 mg/kg, preferiblemente al menos 1 mgfkg. También se pretende que las dosis intermedias en los intervalos anteriores estén dentro del alcance de la invención. Puede administrársele a los sujetos estas dosis diariamente, en dias altemos, semanalmente o según cualquier otro programa determinado mediante análisis empírico. Un ejemplo de tratamiento implica la administración en múltiples dosis durante un 50 periodo prolongado, por ejemplo, de al menos seis meses. Ejemplos de pautas posológicas adicionales implican la administración una vez cada dos semanas o una vez al mes o una vez cada 3 a 6 meses. Entre los calendarios posológicos se incluyen 1-10 mgfkg o 15 mg/kg en dias consecutivos, 30 mg/kg en dias allernos o 60 mgfkg semanalmente. En algunos procedimientos, se administran simultáneamente dos o más anticuerpos monoclonales con diferentes especificidades de unión, en cuyo caso la dosis de cada anticuerpo administrado está dentro de los 55 intervalos indicados. El progreso puede controlarse mediante evaluación periódica. Las preparaciones para administración parenteral incluyen soluciones, suspensiones y emulsiones acuosas o no acuosas estériles. Son ejemplos de solventes no acuosos propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales como el aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables como el oleato de etilo. Entre los vehículos acuosos se incluyen agua, soluciones, emulsiones
o suspensiones alcohólico/acuosas, incluyendo medios salinos y tamponados. Entre 105 vehiculos parenterales se
incluyen solución de cloruro sódico, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro sódico, solución de Ringer con lactato o aceites fijados. Entre los vehiculos intravenosos se incluyen agentes de sustitución de liquidos y nutrientes, agentes de sustitución de electrolitos (como aquellos a base de dextrosa de Ringer) y similares. También pueden estar presentes conservantes y otros aditivos como, por ejemplo, antrimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes y
5 gases inertes y similares. Además, la composición farmacéutica de la invención puede comprender otros agentes como dopa mina o fármacos psicofarmacológicos, dependiendo del uso pretendido de la composición farmacéutica.
[0168] Además, en una realización preferida de la presente invención, la composición farmacéutica puede formularse como una vacuna, por ejemplo, si la composición farmacéutica de la invención comprende un anticuerpo 10 anti-o-sinucleina o su fragmento de unión, derivado o variante para inmunización pasiva. Como se mencionó en la sección de antecedentes, se han encontrado especies oligoméricas de a-sinucleina extracelularmente en plasma y en lCE (E1-Agnaf el al., FASEB J. 20 (2006), 419-425) Y estudios de inmunización pasiva en modelos humanos de la enfermedad de Parkinson muestran que los anticuerpos monoclonales de ratón extracelulares frente a 0sinucleina pueden reducir el acúmulo de agregados de o-sinucleina intracelulares (Masliah y col., Neuron, 46 (2005),
15 857-868). Por consiguiente, es prudente esperar que los anticuerpos anli-a-sinucleina humanos y sus moléculas de unión frente a o-sinucleina equivalente de la presente invención sean especialmente útiles como vacuna para la prevención o mejora de las enfermedades sinucleinopáticas como EP, Del y VClEA.
[0169] En una realización, puede ser beneficioso usar Fab recombinante (rFab) y fragmentos de cadena sencilla
20 (scFv) del anticuerpo de la presente invención, que podrian penetrar más fácilmente la membrana celular. Por ejemplo, Robert y col., Protein Eng. Des. Sel. (2008) Oct 16; S1741-0134, publicado preViamente online, describen el uso de fragmentos Fab quiméricos recombinantes (rFab) y de cadena sencilla (scFv) del anticuerpo monoclonal W0-2 que reconoce un epitope en la región N-terminal de A¡3. los fragmentos obtenidos por ingenieria genética modificados eran capaces de (i) prevenir la fibrilación del amiloide, (ii) disgregar las fibrillas A¡31-42 previamente
25 formadas y (iii) inhibir la neurotoxicidad mediada por los oligómeros A¡31-42 in vitro de forma tan eficaz como la molécula de IgG completa. Entre las ventajas percibidas del uso de los formatos pequenos de anticuerpos genéticamente modificados Fab y scFv que carecen de la función efectora se incluyen su paso más eficaz a través de la barrera hematoencefálica y que minimizan el riesgo de desencadenar reacciones inflamatorias secundarias. Adicionalmente, además de conservar los anticuerpos scFv y de dominio sencillo la especificidad de unión de los
30 anticuerpos de longitud completa, pueden expresarse como genes únicos e intracelularmente, en células de mamíferos como intracuerpos, con el potencial para la alteración de los plegamientos, interacciones, modificaciones
o localización subcelular de sus dianas, véase para revisión, por ejempo, Miller y Messer, Molecular Therapy 12 (2005), 394-401.
35 [0170] En una estrategia diferente, Muller y col., Expert Opino Biol. Ther. (2005) 237-241, describen una plataforma tecnológica denominada decnología de superanticuerpos», que según se afirma potencia la transferencia de los anticuerpos dentro de células vivas sin efectos nocivos para las mismas. Estos anticuerpos que entran en las células abren nuevas ventanas de diagnóstico y tratamiento. Se ha acunado el término de «TransAcm» para estos anticuerpos.
40 [0171] En una realización adicional, puede ser deseable la administración conjunta o secuencial de otros agentes neuroprotectores útiles para tratar una enfermedad sinucleinopática. En una realización, el agente adicional está comprendido en la composición farmacéutica de la presente invención. Entre los ejemplos de agentes neuroprotectores que pueden usarse para tratar a un sujeto se incluyen, pero sin limitaciones, un inhibidor de la
45 acetilcolinesterasa, un antagonista del receptor glutamatérgico, inhibidores de quinasas, inhibidores de HDAC, agentes antiinflamatorios, divalproex sódico o cualquier combinación de los mismos. En la materia se describen ejemplos de otros agentes neuroprotectores que pueden usarse de forma concomitante con la composición farmacéutica de la presente invención; véase, por ejemplo, la solicitud internacional W02007/011907. En una realización, el agente adicional es dopamina o un agonista del receptor de la dopamina.
50 [0172] En una realización adicional de la presente invención las moléculas de unión a a-sinucleína, en especial los anticuerpos de la presente invención también pueden administrarse conjuntamente o antes o después de la terapia de trasplante con trasplantes neurales o terapia de células madre útiles para el tratamiento de una enfermedad sinucleinopática. Estas estrategias con trasplantes de neuronas mesencefálicas embriónicas se han realizado en
55 pacientes con enfermedad de Parkinson con el objetivo de sustituir las neuronas perdidas en la enfermedad y restituir la neurotransmisión dopaminérgica en el núcleo estriado. A los 11-16 anos postrasplante, se encontró que las neuronas trasplantadas contenian cuerpos de Le'hj' y neuritas de Lewy. Esta propagaCión de la patologia de 0sinucleina desde el huésped a los tejidos trasplantados puede prevenirse mediante la administración conjunta de moléculas de unión a a-sinucleína, en especial los anticuerpos de la presente invención.
[0173J Una dosis o cantidad terapéuticamente eficaz se refiere a aquella cantidad del principio activo suficiente para mejora los sintomas o la afección. la eficacia terapéutica y la toxicidad de estos compuestos pueden determinarse mediante procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares o animales de experimentación,
5 por ejemplo, la DE50 (dosis terapéuticamente eficaz en el 50% de la población) y la Dl50 (dosis letal para el 50% de la población). la relación de dosis entre los efectos terapéuticos y tóxicos es el indice terapéutico y puede expresarse como la relación DL5OIDE50. Preferiblemente, el agente terapéutico en la composición se presenta en una cantidad suficiente para reestablecer o conservar el comportamiento normal y/o las propiedades cognitivas en el caso de EP, DCl u otras enfermedades sinucleinopáticas.
[0174J A partir de lo anterior, es evidente que la presente invención abarca cualquier uso de una molécula de unión a a-sinucleína que comprende las CDR del anticuerpo descrito anteriormente, en especial para el diagnóstico y/o para su uso en el tratamiento de una enfermedad sinucleinopática como se mencionó anteriormente, especialmente la enfermedad de Parkinson. Preferiblemente, dicha molécula de unión al ligando es un anticuerpo de la presente
15 invención o una cadena de inmunoglobulina del mismo.
[0175] En otra realización, la presente invención se refiere a una composición diagnóstica que comprende cualquiera de las moléculas de unión a o-sinucleina descritas anteriormente, anticuerpos, fragmentos de unión al antigeno, polinucleótidos, vectores o células de la invención y, opcionalmente, medios adecuados para la detección, 20 como reactivos usados convencionalmente en métodos diagnósticos inmunológicos o basados en ácidos nucleicos. los anticuerpos de la invención son, por ejemplo, adecuados para su uso en inmunoensayos en los que pueden utilizarse en fase liquida o unidos a un vehiculo en fase sólida. los ejemplos de inmunoensayos en los que se puede utilizar el anticuerpo de la invención son inmunoensayos competitivos y no competitivos en un formato directo o indirecto. Son ejemplos de estos inmunoensayos el radioinmunoensayo (RIA), el sandwich (ensayo inmunométrico), 25 citometria de flujo y el ensayo de inmunotransferencia. los antigenos y anticuerpos de la invención pueden unirse a muchos vehiculos diferentes y usarse para aislar las células unidas específicamente a estos. Entre los ejemplos de vehiculos bien conocidos se incluyen vidrio, poliestireno, cloruro de polivinilo, polipropileno, polietileno, policarbonato, dextrano, nailon, amilosas, celulosas naturales y modificadas, poliacrilamidas, agarosas y magnetita. la naturaleza del vehiculo puede ser soluble o insoluble para los fines de la invención. Hay muchos marcadores
30 diferentes y procedimientos de marcaje que son conocidos para los expertos en la materia. Entre los ejemplos de los tipos de marcadores que pueden usarse en la presente invención se incluyen enzimas, radioisótopos, metales coloidales, compuestos fluorescentes, compuestos quimioluminiscentes y compuestos bioluminiscentes; véanse también las realizaciones descritas anteriormente en este documento.
35 [0176J Mediante una realización adicional, las moléculas de unión a o-sinucleina, en especial los anticuerpos de la presente invención también pueden usarse en un procedimiento para el diagnóstico de una enfermedad en un individuo obteniendo una muestra de liquido corporal del individuo del ensayo que puede ser una muestra de sangre, una muestra de linfa o cualquier otra muestra de liquido corporal y poniendo en contacto la muestra de liquido corporal con un anticuerpo de la presente invención en condiciones que permitan la formación de complejos
40 antigeno-anticuerpo. El nivel de estos complejos se determina a continuación mediante procedimientos conocidos en la técnica, indicando un nivel significativamente mayor que el formado en una muestra control la presencia de enfermedad en el individuo estudiado. De la misma forma, también puede usarse el antígeno específico al que se unen los anticuerpos de la invención. Por tanto, la presente invención se refiere a un inmunoensayo in vitro que comprende la molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo o su fragmento de unión al antigeno de la invención.
45 [0177J En este contexto, la presente invención también se refiere a medios disenados específicamente para este fin. Por ejemplo, puede usarse una matriz a base de anticuerpos, que esté cargada, por ejemplo, con anticuerpos o moléculas de unión al antigeno equivalentes de la presente invención que reconocen especificamente a la 0sinucleina. El diseno de inmunoensayos con micromatrices se resumen en Kusnezow y col., Mol. Cen Proteomics 5
50 (2006), 1681-1696. Por consiguiente, la presente invención también se refiere a micfOmatrices cargados con moléculas de unión a a-sinucleína identificadas según la presente invención.
[0178J En una realización, la presente invención se refiere a un procedimiento para el diagnóstico de una enfermedad sinucleinopática en un sujeto, comprendiendo el procedimiento:
(a)
evaluar el nivel de o-sinucleina en una muestra del sujeto que se va a diagnosticar con un anticuerpo de la presente invención o su fragmento de unión a o-sinucleina; y
(b)
comparar el nivel de o-sinucleina con un patrón de referencia que indica el nivel de la a-sinucleina en uno o más
sujetos controt,
donde una diferencia o similitud entre el nivel de la a-sinucleína y el patrón de referencia ind ica que el sujeto tiene enfermedad de Parkinson.
[0179] El sujeto que se va a diagnosticar puede estar asintomático o presintomático para la enfermedad. Preferiblemente, el sujeto control tiene una enfermedad sinucleinopática, por ejemplo EP, DCL o VCLEA, donde una similitud entre el nivel de a-sinucleína y el patrón de referencia indica que el sujeto que va a ser diagnosticado tiene una enfermedad sinucleinopática. Alternativamente, o además como segundo control, el sujeto control no tiene
10 enfermedad sinucleinopática, donde una diferencia entre el nivel de a-sinucleína y el patrón de referencia indica que el sujeto que va a ser diagnosticado tiene una enfermedad sinucleinopática. Preferiblemente, el sujeto que va a ser diagnosticado y el sujeto control tienen una edad similar. La muestra que se va analizar puede ser cualquier líquido corporal que se sospecha contiene a-sinucleína, por ejemplo una muestra de sangre, LCE u orina.
15 [0180] El nivel de a-sinucleína puede evaluarse mediante cualquier procedimiento conocido en la materia adecuado que comprende, por ejemplo, analizar la a-sinucleína mediante una o más técnicas elegidas entre inmunotransferencia, inmunoprecipitación, ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas (ELlSA), radioinmunoensayo (RIA), selección de células activada por fluorescencia (FACS), electroforesis bidimensional en gel, espectroscopía de masas (EM), desorciónfionización mediante láser asistida por matriz acoplada a tiempo de
20 vuelo-EM (MALDI-TOF), desorciónfionización por láser de superficie acoplada a tiempo de vuelo (SELDI-TOF), cromatografia liquida de alta resolución (HPLC), cromatografia liquida rápida de proteinas (FPLC), cromatografia líquida mullidimensional (LC) seguido de especlrometría de masa en tándem (EMfEM) y densitómetro láser. Preferiblemente, dicho estudio por imagen in vivo de a-sinucleína comprende tomografía de emisión de positrones (PET), tomografias de emisión de fotón único (SPECT), estudio por imagen óptica en el infrarrojo cercano (NIR) o
25 estudio por imagen mediante resonancia magnética (MRI).
[0181] Los procedimientos de diagnóstico de una enfermedad sinucleinopática como la enfermedad de Parkinson
o enfermedad de cuerpos de Lewy, el seguimiento de la progresión de la enfermedad sinucleinopática y el seguimiento del tratamiento de una enfermedad sinucleinopática usando anticuerpos y medios relacionados que
30 pueden adaptarse segun la presente invención también se describen en la solicitud internacional W02007f011907. De forma similar, los procedimientos de detección basados en anticuerpos para a-sinucleína se describen en las solicitudes intemacionales W099f50300, W02005/047860, W02007f021255 Y W02008f103472. Esos procedimientos pueden aplicarse como se describe, pero con un anticuerpo especifico de a-sinucleína, fragmento de unión, derivado o variante de la presente invención.
35 [0182] Estas y otras realizaciones están descritas y las abarcan la descripción y los ejemplos de la presente invención. La bibliografia adicional correspondiente a cualquiera de los materiales, procedimientos, usos y compuestos que han de utilizarse segun la presente invención pueden obtenerse de bibliotecas y bases de datos publicas, usando por ejemplo, dispositivos electrónicos. Por ejemplo, puede utilizarse la base de datos publica
40 ((Medline» que está hospedada por el National Center for Biotechnology Information y/o la National Library of Medicine de los National Institutes of Health. Otras bases de datos y direcciones web, como la del European Bioinformatics Institute (EBI ), que es parte del European Molecular Biology Laboratory (EMBL) son conocidas por los expertos en la materia y también pueden obtenerse usando motores de búsqueda en Internet. En Berks, TIBTECH 12 (1994), 352-364, se proporciona una visión general de la información de patentes en biotecnología y un estudio
45 de las fuentes relevantes de información de patentes útil para la búsqueda retrospectiva y el conocimiento actual.
[0183] La presente invención se describe, en general, en la memoria descriptiva. Siempre que no se especifique otra cosa, los términos usados en este documento cuentan con las definiciones proporcionadas en el Diccionario Oxford de Bioquímica y Biologia Molecular, Oxford Universily Press, 1997, revisado en 2000 e reimpreso en 2003,
50 ISBN 0198506732.
[0184] Puede obtenerse un entendimiento más completo en referencia a los siguientes ejemplos especificos que se proporcionan en este documento solo con fines ilustrativos.
55 EJEMPLOS
[0185] Los ejemplos que aparecen a continuación ilustran adicionalmente la invención, pero no deben interpretarse como una limitación del alcance de la invención de ninguna forma. Los siguientes experimentos de los ejemplos 1 y 2 se ilustran y describen en referencia a los anticuerpos NI-202.3G12, NI-202.12F4 Y NI-202.3D8 como clonados, es
decir, que contienen mutaciones inducidas por el cebador justo en los extremos N-terminal de las regiones variables de Ig estructurales 1 y sin ajustarse a las secuencias de la linea germinal (LG) de las cadenas pesada y ligera variables humanas; véase la figura 1. Sin embargo, los otros anticuerpos de la serie NI-202, en especial aquellos con las secuencias LG ajustadas son estructuralmente similares y, por tanto puede esperarse que proporcionen 5 resultados comparables. Estos anticuerpos se expresaron como moléculas de IgG1 humanas. Los experimentos de los ejemplos 3 y 4 se ilustran y describen en referencia al anticuerpo NI-202.12F4 con mutaciones inducidas por cebador en los extremos N-terminales de las regiones variables de la Ig ajustado a las secuencias de la linea germinal (LG) de las cadenas pesada y ligera de la región variable humana; véase la figura 1. Este anticuerpo se expresaba como una molécula quimérica donde los dominios variables humanos ajustados estaban fusionados con
10 las regiones constantes de la IgG2a de ratón para permitir estudios de administración crónica en modelos de ratones transgénicos sin inducir una respuesta inmune antihumano en ratones.
Material y procedimientos
15 [0186] Las descripciones detalladas de los métodos convencionales, como los empleados en este documento, pueden encontrarse en la literatura citada. Siempre que no se especifique otra cosa a continuación, la identificación de células B específicas de a-sinucleína y la clonación molecular de los anticuerpos anti-a-sinucleína que muestran especificidad de interés as¡ como su expresión recombinante y caracterización funcional se han realizado o pueden realizarse como se describe en los ejemplos y en la sección de procedimientos suplementarios de la solicitud
20 intemacional PCTfEP2008fOOO053 publicada como W02008f081 008.
Purificación del antigeno
[0187] His-a-sinucle¡na recombinante se obtuvo mediante expresión recombinante en Escherichia coli y posterior 25 pUrificación usando precipitación inducida por calor, cromatografia de afinidad a n¡quel, intercambio aniónico y exclusión molecular.
[0188] Por ejemplo, se usó una construcción de ADN que comprendía el ADNc que codifica la a-sinucleína bajo el control del promotor T7 para transformar una cepa de Escherichia coli apropiada, como la BL21(DE3) y se indujo la 30 expresión de un cultivo de células de 200 mi mediante la adición de ~-D-tiogalactopiranosido de isopropilo (IPTG) 1 mM. Las células se recogieron tras 4 h de inducción a 370C y, a continuación, se resuspendieron en 20 mi de Tris 50 mM, NaCI 150 mM pH 8, seguido de sonicación. Tras hervir durante 15 min, se recogió el sobrenadante de 17000 g resistente al calor. De forma similar, se recogió el sobrenadante de 17000 g resistente al calor del control de Escherichia coli. Desde, el sobrenadante de 17000 g resistente al calor (20 mi) de Escherichia coli que expresaba 035 sinucleina etiquetada con His se ajustó con Tris 50 mM, NaCI 300 mM, imidazol 20 mM, pH 8, se cargó en una columna HisTrap HP de 1 mi (GE Life Science) y la HIS-o-sinucleína se eluyó con un gradiente de imidazol 30500 mM. Las fracciones que contienen HIS-a-sinucleina se agruparon y, a continuación se diluyeron 1:10 con Tris 50 mM pH 8. La fracciones agrupadas y diluidas se aplicaron en una columna HiTrap Q HP de 1 mi (GE Life Science) y las proteínas unidas se eluyeron en un gradiente de NaCI de 30-1000 mM. Finalmente, los eluídos que
40 contenían HIS-a-sinucle¡na se purificaron usando filtración en gel de alta resolución (Superdex 200 10/300 GL). Este procedimiento de purificación produce HIS-o-sinucle¡na con un grado de pureza de aproximadamente el 99% según se estima mediante PAGE-SDS y tinción con Coomassie. La concentración de proteína purificada se determinó usando un ensayo de BCA (Pierce).
45 Selección de anticuerpos frente a o-sinudeina
[0189] Se recubrieron microplacas de 96 pocillOS de media área (Coming) con HIS-a-sinucle¡na purificada o asinucleina (rPéptido) a una concentración estándar de 2 ~gfml en tampón de recubrimiento (PBS pH 9,6) durante toda la noche a 4OC. Las placas se lavaron con PBS-T pH 7,6 Y los sitios de unión inespedfica se bloquearon 50 durante 1 hora a TA con PBS-T que conten¡a BSA al 2% (Sigma, Buchs, Suiza). El medio condicionado con células B se preabsorbió durante 1 ha TA con proteinas resistentes al calor de E. coli al 10% en BSA aI1 %. Este paso de preabsorción se ha desarrollado después de que varios intentos previos de selección mediante ELlSA no permitieran identificar anticuerpos humanos especificos de a-sinucleina. Por tanto, afortunadamente se descubrió que la preabsorción de la placa de ELlSA con prote¡nas resistentes al calor de E. coli excluye de la selección falsos 55 negativos como anticuerpos adhesivos y anticuerpos dirigidos frente a contaminaciones proteicas de E. eoli, probablemente presentes en las muestras purificadas de a-sinucleina recombinante. A continuación, el medio preabsorbido se transfirió de las placas de cultivo de linfocito B de memoria a placas de ELlSA y se incubó durante 2 h a TA. Las placas de ELlSA se lavaron con PBS-T y, después, se incubaron con anticuerpos policlonales de burro anti IgG humana (especifica del fragmento Fcy) conjugados con peroxidasa de rábano picante (HRP). Tras lavar con
PBS-T, se determinó la unión de anticuerpos humanos midiendo la actividad de la HRP en un ensayo colorimétrico estándar.
Clonación molecular de los anticuerpos frente a a-sinucleina
[01 90] Se obtuvieron muestras que contenian células B de memoria de voluntarios >60 años de edad. Todos los voluntarios tenia n en común la ausencia de cualquier signo de Parkinsonismo. Se recogieron las células B vivas de los cultivos de células B de memoria seleccionadas y se preparó el ARNm. A continuación, se obtuvieron las secuencias de las cadenas pesada y ligera de las inmunoglobulinas usando cebadores especificos de la región
10 estructural 1 de la Ig para todas las familias de cadenas variables pesadas y ligeras humanas como cebadores 5' en combinación con cebadores especificos de todos los segmentos J (cadenas pesada y ligera kappa) y segmentos C (cadena ligera lambda) como cebadores 3' (Marks y col., Mol. Biol. 222 (1991), 581-597; de Haard y col., J. Biol. Chem. 26 (1999), 18218-18230).
15 [01 91] La identificación del clon de anticuerpo con la especificidad deseada se realizó mediante la repetición del cribado en ELlSA tras la expresión recombinante de anticuerpos completos. La expresión recombinantes de anticuerpos IgG1 humanos completos o de anticuerpos IgG2a quiméricos se consigue tras la inserción de la secuencias de las cadenas pesada y ligera variables «en marco de lectura correcto» en vectores de expresión que complementan la secuencia de la región variable con una secuencia que codifica un péptido lider en el extremo 5' y
20 en el extremo 3' con una secuencia que codifica los dominios constantes apropiados. Para este fin, los cebadores conten ian sitios de restricción diseñados para facilitar la clonación de las secuencias variables de las cadenas pesada y ligera en vectores de expresión de anticuerpos. Las cadenas pesadas de las inmunoglobulinas se expresan insertando en marco el producto de RT-PCR de la cadena pesada de la inmunoglobulina en un vector de expresión de cadena pesada que neva un péptido seña l y los dominios constantes de las cadenas gamma 1 de la
25 inmunoglobulina humana o gamma 2' de la inmunoglobulina de ratón. La cadena ligera kappa de la inmunoglobulina se expresa mediante la inserción en marco del producto de la RT-PCR de la cadena ligera kappa de NI-202.3D8 en un vector de expresión de cadena ligera que proporciona un péptido señal y el dominio constante de la cadena ligera kappa de la inmunoglobulina humana. La cadena ligera lambda de las inmunoglobulinas NI-202.12F4 y NI-202.3G12 se expresa mediante la inserción del producto de la RT-PCR de la cadena ligera kappa en marco dentro de un
30 vector de expresión de cadena ligera lambda que proporciona un péptido señal y el dominio constante de la cadena ligera kappa de la inmunoglobulina humana o de ratón.
[01 92] Los anticuerpos monoclonales recombinantes funcionales se obtienen tras la transfección conjunta en células HEK293 o CHO (o en cualquier otra línea celular receptora apropiada de origen humano o murino) de un 35 vector de expresión de la cadena pesada de Ig y un vector de expresión de la cadena ligera kappa o lambda de Ig. Posteriormente, el anticuerpo monoclonal humano recombinante se purifica a partir del medio condicionado usando una purificación en columna de proteina A estandar. El anticuerpo monoclonal humano recombinante puede producirse en cantidades ilimitadas usando células transfectadas de forma transitoria o estable. La linea celular productora del anticuerpo monoclonal humano recombinante puede estabilizarse usando los vectores de expresión
40 de Ig directamente o clonando de nuevo las regiones variables de Ig en diferentes vectores de expresión . También pueden generarse derivados como F{ab), F{ab)z y scFV a partir de estas regiones variables de Ig.
Anticuerpos
45 [01 93] El anticuerpo policlonal de conejo pan sinucleina (Abcam), el anticuerpo monoclonal de ratón espeCifico de a-sinucleína LB509 (Invitrogen), el anticuerpo Sny211 (Sigma) y el Clan 42 (SD Siosciences) se usaron según el protocolo del fabricante. Los anticuerpos humanos recombinantes frente a a-sinucleina N1202.3G12, N1202.12F4 Y NI-202.3D8 son anticuerpos de esta invención. Estos se expresaron en células HEK293 o CHO y, a continuación, se usaron directamente medios condicionados en aplicaciones posteriores siempre que no se indicara otra cosa. En los
50 ejemplos 3 a 5 se usaron anticuerpos recombinantes purificados de la presente invención.
ELlSA directo
[01 94] Se recubrieron microplacas de 96 pocillOS de media área (Corning) con antígenos a las concentraciones
55 indicadas en PBS pH 9.6 durante toda la noche a 4°C. Las placas se lavaron en PSS-T pH 7,6 Y los sitios de unión inespecífica se bloquearon durante 1 h a TA con PB$-T que contenía BSA al 2% (Sigma). A continuación, las sondas (anticuerpos primarios) se transfirieron a los pocillos y se incubaron durante 2 h a TA. Tras lavar con PBS-T pH 7,6, los pocillos se incubaron con anticuerpos secundarios policlonales anti-humano (para los anticuerpos humanos recombinantes), anti-conejo (para el anticuerpo pan sinuclelna) o anti-ratón (para LB509 o Syn211) conjugados con peroxidasa de rábano picante (HRP) durante 1 ha TA. Tras un lavado riguroso con PBS-T, la unión de las sondas se determinó midiendo la actividad HRP en un ensayo colorimétrico estándar usando 3,3',5,5'tetrametilbifenil-4,4·-diamina (Sigma) como sustrato cromogénico.
5 Inmunotransferencia y linción de proteinas con Coomassie
[0195] Para evaluar la unión a a-sinucleina humana y de ratón se homogeneizaron cerebros congelados de ratones de tipo salvaje o transgénicos para a-sinucleina en PBS (10 mllg de peso húmedo) usando un homogeneizador Dounce. El extracto se centrifugó a 100000 g y el sobrenadante se denominó fracción soluble. La 10 fracción soluble o de proteínas recombinantes (750 ng) se mezcló con colorante de carga, se calentó a 650C durante 10 min y se cargaron 0,75!Jg por carril y se separaron en un PAGE-SDS con Tris-Glicina 4-20%. Los geles se tiñeron con una solución de Coomassie Brilliant blue R 250 al 0,025% (Fluka) o se electrotransfirieron a una membrana de transferencia de nitrocelulosa. A continuación las transferencias se incubaron con el anticuerpo primario durante 2 horas. La unión de los anticuerpos primarios se reveló usando anticuerpos secunda rios anti
15 humano conjugados con HRP. Las transferencias se desarrollaron usando ECL más reactivos de detección para inmunotransferencias (GE Healthcare). Para evaluar la unión a los monómeros y agregados de a-sinucleina, se prepararon extractos de cerebro en PBS con Tritón X100 al 0,5% seguido de la centrifugación a 1000 g durante 5 mino Los sobrenadantes se separaron mediante electroforesis en gel NuPAGE con Bis-Tris 4-12% y se analizaron mediante inmunotransferencia.
Prueba de la barra
[0196] La prueba se realizó en los ratones al inicio de la fase de oscu ridad cuando estaban más activos. La barra se prepara a partir de un palo de madera de 50 cm de longitud y un 1 cm de espesor cubierto con un trapo para
25 facilitar el ascenso. La base de la barra se coloca en la jaula del ratón. El ratón se colocan en la parte superior de la barra y se registra el tiempo que tarda en orientarse hacia abajo y el tiempo que tarda en descender hasta la jaula durante 5 pruebas con intervalos de 30 min entre cada prueba. Se analiza la prueba mejor realizada.
Prueba del laberinto en CnJZ elevado
30 [0197] La prueba se realizó en los ratones al inicio de la fase de oscuridad cuando estaban más activos y con poca luz (40 lux). El laberinto en cruz elevado consta de dos brazos abiertos y dos brazos cerrados (longitud del brazo: 30 cm; anchura: 5 cm). Los brazos abiertos tienen un pequeño borde de 1 cm y los brazos cerrados están bordeados por una pared de 15 cm. Al inicio de la tarea, los ratones se colocan en el centro del laberinto en cruz
35 elevado mirando hacia un brazo abierto. Se graba en video a los ratones mientras exploran el laberinto durante 5 mino Se mide y analiza el tiempo empleado en los brazos abiertos y cerrados y la distancia recorrida.
Ratones transgénicos
40 [0198] Los ratones transgénicos para a-sinucleína 86;C3-Tg(Pmp-SNCA*A53T)83Vle/J (Giasson y col., Neuron. 34 (2002), 521-533) Y los correspondientes ratones de tipo salvaje se mantuvieron en condiciones de alojamiento estándar con un ciclo invertido de 12h:12h luz/oscuridad con acceso libre al pienso y al agua. Los grupos de tratamiento se equilibraron por edad y sexo.
45 Determinación de los niveles de NI-202.12F4 y a-sinucleina en el plasma del ratón
[0199] Los niveles en plasma de NI-202.12F4 se determinaron usando un ELlSA directo para o-sinucleina usando NI-202.12F4 recombinante de concentración conocida como patrón. Para la determinación de los niveles de 0sinucleina humana en plasma se aplicó un ELlSA tipo sandwich (Invitrogen, EE. UU.).
50 Ejemplo 1: Identificación de anticuerpos humanos específicos de a-sinucleína con diferentes especificidades de epítope
[0200] La a-sinucleina es una proteina de 140 aminoácidos (aa) de longitud desplegada en su forma nativa t
55 compuesta por tres dominios. Estos son la región N-terminal repetida anfipática (1-60 aa), la región central (61-95 aa) y la región e-terminal ácida (96-140). Para entender mejor la especificidad de los anticuerpos humanos recombinantes frente a-sinucleina, se determinó la secuencia del dominio de a-sinucleina que contiene la secuencia de reconocimiento. Se recubrieron placas de ELlSA con las formas truncadas de a-sinucleina 1-60 aa, 1-95 aa, 61140 aa y 96-140 aa a igual concentración y se comprobó a continuación la capacidad de unión de los
autoanticuerpos NI-202.3G12 Y NI-202.12F4 a estas formas truncadas.
[0201] Curiosamente, NI-202.3G12 sólo se une a las placas recubiertas con a-sinucleina de longitud completa pero no lo hace a ninguna de las cuatro formas truncadas ensayadas (fig. 2a). Esto sugiere que el epítope de 5 reconocimiento de NI-202.3G12 es un motivo estructural en lugar de una secuencia de reconocimiento primaria lineal.
[0202] Por otro lado, NI-202.12F4 se une a los fragmentos de a-sinucleína que comprenden los aa 1-60 (figura 2B) pero no a los fragmentos truncados en el extremo N-terminal que comprenden los aminoácidos 61 -140 o 96-140.
10 Esto muestra que este epítope se localiza dentro del extremo N-terminal. Es de destacar que la caracterización de los anticuerpos monoclonales de ratón que selectivamente se unen a la a-sinucleina en las inclusiones patológicas, reveló que sus epítopes están dentro del segmento más próximo al extremo N-terminal (Waxman y col., Acta Neuropathol.116 (2008), 37-46.
15 [0203] Además, los resultados preliminares de los ensayos ELlSA directos realizados con el anticuerpo NI202.3D8 mostraron que NI-202.3D8 reconoce especificamente el extremo C-terminal de a-sinucleina, en particular los aminoácidos 96-140. La deleción de los aminoácidos clave 125-140 dentro del dominio C-terminal altera en gran medida la agregación de la a-sinucleina y en los cerebros de pacientes con demencia debido a enfermedad de cuerpos de Lewy (ECL) así como en modelos de animales transgénicos, se produce una abundante acumulación de
20 fragmentos C-terminales de a-sinucleína. Estos estudios sugieren que los anticuerpos capaces de reconocer la región C-terminal podrian tener posibles efectos terapéuticos; véase Masliah y col., Neuron, 46 (2005), 857-568.
[0204] Para excluir que las formas truncadas que comprenden el extremo C-terminal de la a-sinucleína no recubren de forma eficaz las placas de ELlSA, se realizó un mapeo de epitopes del anticuerpo monoclonal de ratón 25 frente a alfa sinucleina LB509 (Baba y col., Am. J. Pathol. 152 (1998), 879-884). LB509 se une a un epitope Cterminal (Jakes y col., Neuroscience Letlers 269 (1999), 13-16). Como se muestra en la figura 2C, este estudio confirma el epítope C-terminal de LB509 y, por tanto, confirma el recubrimiento eficaz de los fragmentos Cterminales de la a-sinucleína. En conclusión, el mapeo de epítopes de los anticuerpos humanos recombinantes frente a a-sinucleina en los experimentos realizados según la presente invención muestra que estos anticuerpos
30 están dirigidos frente a diferentes epitopes, incluyendo epitopes conformacionales y posibles estructuras patológicas en los extremos N-terminal y C-terminal.
Ejemplo 2: Los anticuerpos humanos son específicos dea-sinucleína
35 [0205] Las a, ~ y y-sinucleinas son proteinas con una elevada homologia que se expresan predominantemente en el sistema nervioso, en músculo esquelético y en el corazón. Sin embargo, solo la a-sinucleína anómala se asocia con un amplio espectro de enfermedades del SNC mientras que se sugiere que la ~-sinucleina puede ser un inhibidor de la agregaCión de a-sinucleina y puede proteger al sistema nervioso central de los efectos neurotóxicos de esta última. Por tanto, los anticuerpos (terapéuticos) frente a variantes patológicas de a-sinucleína
40 preferiblemente no correaccionan con ~ y y-sinucleína. Para apoyar el uso específico y el potencial terapéutico de los anticuerpos humanos recombinantes anti-a-sinucleina, se comprobó la unión de los anticuerpos candidatos a a, ~ y y-sinucieína en un ensayo ELlSA directo y mediante inmunotransferencia (WB). En primer luga r, las placas de ELlSA se recubrieron con a, ~ y y-sinucleína recombinantes a concentraciones de recubrimiento equivalentes (2 ¡Jgfml) y, a continuación, se incubaron con un anticuerpo control pan sinucleina o anticuerpos humanos
45 recombinantes frente a a-sinucleina. El anticuerpo pan sinucleina reacciona con las placas de ELlSA recubiertas con las tres proteínas sinucleína (figura 3a). Después, se comprobó la especificidad de unión a a-sinucleína de los anticuerpos humanos recombinantes frente a o-sinucleína. Tanto NI-202.3G12 como NI-202.12F4 reaccionan con los pocillos recubiertos de a-sinucleina pero no con ~ ni y-sinucleina (figuras 3a y 3B).
50 [0206] De forma similar, la especificidad de los anticuerpos recombinantes también se estudió usando análisis mediante WB. La tinción de proteínas con Coomassie confirma que se han aplicado concentraciones equivalentes de las tres proteinas sinucleina al análisis por PAGE-SDS (figura 4a). A continuación el análisis mediante WB mostraba que NI-202.12F4 se une selectivamente a a-sinucleina (figura 4B) mientras que sin anticuerpo primario no se detectaba señal (figura 4C). La unión de NI-202.3G12 a a-sinucleína en WB era indetectable. Esto coincide con
55 un epítope estructural en lugar de la secuencia de reconocimiento lineal de NI-202.3G12. Estos resultados demuestran que los anticuerpos recombinantes humanos frente a alfa sinucleína descritos en la presente invención puede ser altamente especificos .
[0207] Todos los experimentos posteriores se realizaron con el anticuerpo quimérico de ratón NI-202.12F4.
Ejemplo 3: Especificidades de unión del anticuerpo NI-202.12F4
Unión especifica a a-sinucleína humana con preferencia por especies de a-sinucleina agregada
[0208] Para evaluar la unión de NI-202.12F4 a a-sinucleina humana y de ratón, se prepararon extractos de cerebro de ratones de tipo salvaje y transgénicos para a-sinucleína A53T y se analizó la unión del anticuerpo mediante inmunotransferencia. NI-202.12F4 detecta una banda prominente que se corresponde con a-sinucleina en extractos de cerebros de ratones transgénicos para a-sinucleina A53T humana mientras que dicha banda está prácticamente 10 ausente en los extractos de los cerebros de ratones de tipo salvaje (figura 5a), que sugiere la unión a la a-sinucleina humana pero no de ratón. Se obtuvieron resultados similares con el anticuerpo comercial lB509 (Jakes y col., Neuroscience letters 269 (1999), 13-16) dirigido frente a un epitope especifico de la a-sinucleina humana. Por el contrario, el anticuerpo comercial del clan 42 (van der Pullen y col., J. Neurosci. 20 (2000), 6021-6029) que como se pUblicó se une a ambas especies de a-sinucleina, detecta tanto la proteina a-sinucleina humana como la de ratón.
15 Estos datos sugieren que NI-202.12F4 se une preferentemente a la a-sinucleina humana.
[0209] Para evaluar la unión de NI-202.12F4 tanto a formas fisiológicas como a agregados patológicos de la asinucleina humana, se prepararon extractos de cerebros corticales de un sujeto control sano y de un paciente con demencia con cuerpos de Lewy (DCl) así como extractos de cerebro de ratones de tipo salvaje y de ratones 20 transgénicos para la a-sinucleína A30P humana (Kahle y col. J. Neurosci. 20 (2000), 6365-73) que se separaron mediante electroforesis en gel en presencia de SOS y se analizaron mediante inmunotransferencia. NI-202.12F4 detecta con alta sensibilidad una mancha prominente que refleja formas oligoméricas y fibrilares de agregados de asinucleína en DCl y en extracto de cerebro de transgénicos para a-sinucleína A30P pero no en los extractos del control sano ni en control de tipo salvaje (figura 5B). Por el contrario, se observó una unión minima a formas 25 monoméricas de a-sinucleina en tejidos humanos o de ratón de tipo salvaje y una unión moderada en los extractos de cerebro de ratones transgénicos para a-sinucleína A30P que sobreexpresaban en gran medida a-sinucleína. Por el contrario, el anticuerpo del clan 42 mostraba el patrón de unión opuesto en el análisis mediante inmunotransferencia, detectando formas monoméricas y fragmentos de a-sinucleína con una alta sensibilidad y uniéndose muy mal a las especies agregadas de a-sinucleina. Estos resultados sugieren Que NI-202.12F4 se une
30 preferentemente a agregados patológicos de a-sinucleina como oligómeros y fibrillas por encima de los monómeros fisiológicos de a-sinucleína.
NI-202.12F4 se une a la alfa sinucleina humana de tipo natural y a los mutantes causantes de enfermedad con alta afinidad
35 [0210] Se determinó la concentración eficaz máxima medida (EC50) para la a-sinucleína humana de tipo natural así como para los mutantes causantes de la enfermedad usando un ELlSA directo para a-sinucleina. Se observó una unión de alta afinidad para el tipo natural asi como para las formas mutantes A30P, E46K y A53T de la a-sinucleina humana (figura 6).
NI-202.12F4 recombinante se une preferentemente a formas patológicas de a-sinucleina en cerebro.
[0211] la unión de NI-202.12F4 a a-sinucleína se caracterizó adicionalmente mediante ¡inción inmunohistoquímica de cortes de cerebro de ratones transgénicos para a-sinucleina y de pacientes con enfermedad de Parkinson o 45 demencia con cuerpos de lewy neuropalológicamente confirmada. NI-202.12F4 muestra una tinción prominente de la patología de a-sinucleína incluyendo inclusiones como cuerpos de Lewy y neuritas de Lewy así como pequeñas acumulaciones somatodendriticas y sinápticas de a-sinucleina en cortes flotantes de ratones transgénicos que expresan a-sinucleina A53T (figura 7a) o A30P (figura 7B) humana asi como en tejidos de cerebro humano de enfermedad de Parkinson y demencia con cuerpos de lewy (figuras 7C y O). Al contrario que el anticuerpo comercial 50 Syn211 (Gianson y col., J. Neurosci. Res. 59 (2000), 528.33) que también detecta a-sinucleína sináptica fisiológica con una alta sensibilidad (figura 7E), NI-202.12F4 se une preferentemente a agregados patológicos de a-sinucleína como ocurre por ejemplo en la tinción inmunohistoquimica de ratones transgénicos para la a-sinucleina A30P humana (figura 7B). la unión de NI-202.12F4 está prácticamente ausente en los cortes de cerebro de ratones de tipo salvaje (figura 7F) comparable con la tinción control solo con anticuerpo secunda rio (figura 7G) lo que confirma
55 la unión preferente a a-sinucleína humana frente a la de ratón como se observó en el análisis mediante inmunotransferencia (figura 5). Por el contrario, el anticuerpo comercial del clan 42 (van der Putten y col., J. Neurosci. 20 (2000), 6021-6029) que se publicó se une a la a-sinucleina de origen humano asi como de ratón, mostraba una tinción sináptica prominente de la proteína a-sinuc!eína de ratón en cortes de cerebro de ratones de tipo salvaje (figura 7 H).
NI-202 12F4 muestra unión preferencial por la a-sinlJdeina humana a altas concentraciones de recubrimiento lo que apunta a un epitope conformacional
5 [0212J La concentración eficaz máxima media (ECso) que indica la potencia de un anticuerpo se determinó para concentraciones de recubrimiento bajas y altas de a-sinucleina recombinantes usando un ELlSA directo para asinucleina. Se observó unión de alla afinidad de NI-202.12F4 recombinante con una EC50 de 0100 pM para altas densidades de recubrimiento de proteina a-sinucleina (20 j.Igfml). A concentraciones de recubrimiento más bajas de a-sinucleina, se observó una rápida caida de la afinidad, con un aumento correspondiente de la ECso de
10 aproximadamente 100 veces (figura 8 A). Por el contrario, el anticuerpo comercial Syn211 (Gianson y col., J. Neurosci. Res. 59 (2000), 528-33) dirigido frente a un epitope lineal dentro del extremo C-terminal de la a-sinucleina no mostraba disminución de la afinidad de unión a las densidades de recubrimiento más bajas de alfa sinucleína (figura 8 B). Estos hallazgos sugieren que NI-202.12F4 se dirige preferentemente a un epitope estructural de la asinucleina que se forma a altas concentraciones de a-sinucleina. Los resultados concuerdan con las caracteristicas
15 inmunohistoquimicas de unión de NI-202.12F14 que sugieren una preferencia por conformaciones patológicas de agregados de a-sinucleina como fibrillas u oligómeros de a-sinucleina. Como se observó para la a-sinucleina de longitud completa, al unirse a la a-sinucleína truncada 1-60, NI-202.12F4, muestra una dependencia equivalente de la concentración de recubrimiento lo que apunta a un epitope conformacional contenido dentro de los aminoácidos 1-60 de la proteina a-sinucleina (figura 8 C). No obstante, no puede excluirse que los aminoácidos 60-140 de la a
20 sinucleina puedan influir sobre la formación del epitope N-terminal. Es de destacar que los aminoácidos N-terminales 1-60 de la a-sinucleina humana que contienen la mutación A53T son idénticos al 100% al extremo N-terminal de la a-sinucleína de ralÓn . Por tanto, la preferencia observada por la a-sinucleína humana frenle a su homóloga de ralón podría ser debida a la influencia de la parte C-terminal de la a-sinucleina sobre la accesibilidad o formación del epitope de NI-202.12F4 preferido en el extremo N-terminal. Los estudios de mapeo de epitopes usando fragmentos
25 más pequeños derivados del extremo N-terminal de la a-sinucleina (aminoácidos 1-20, 21-40, 41-60, 11-30, 31-50) no revelaron unión del anticuerpo NI-202.12F4 a ninguno de los péptidos, lo que sugiere que estas regiones no son suficientes para la unión de NI-202.12F4 (figura 8 O).
Ejemplo 4: El anticuerpo derivado de humano recombinante frente a alfa sinuc!eina mejora el rendimiento 30 motor y el comportamiento en el laberinto en cruz elevado en un modelo de ratón transgénico de enfermedad de Parkinson
[0213J Para evaluar los efectos farmacológicos del tratamiento con NI-202.12F4, se trató semanalmente i.p. a ratones transgénicos de 10,5 meses de edad que sobreexpresaban el transgén de la a-sinucleina A53T humana 35 (Giasson y col., Neuron 34 (2002), 521-533) con 5 mgf1<g de anticuerpo NI-202.12F4 quimérico recombinante o vehiculo control durante un total de 4 meses. Tras 2 meses de tratamiento, el rend imiento motor se evaluó en la prueba de la barra. Los ratones tratados con NI-202.12F4 mostraban una mejora significativa en el rendimiento motor en comparación con el grupo tratado con el vehiculo con una reducción significativa en el tiempo de giro en la barra (Tgiro; p<Q,Q01; n=17-19 animales por grupo) asi como en el tiempo tolal para descender a la jaula (Ttotal; 40 p<O,05; n=17-19 animales por grupo) como se muestra en la figura 9. En una segunda prueba de comportamiento, se analizaron los efectos del tratamiento sobre la realización del laberinto en cruz elevado. Previamente se comunicó que los ratones transgénicos para a-sinucleina A53T mostraban alteraciones de comportamiento en el laberinto en cruz elevado, utilizando más tiempo en los brazos abiertos en comparación con los controles de tipo silvestre (George y col., Exp. Neurol., 210 (2008), 788-92). Como se muestra en la figura 10, el tratamiento crónico con NI45 202.12F4 induce una mejora significativa en el comportamiento en el laberinto en cruz elevado de los animales transgénicos para a-sinucleina A53T. Los ratones tratados con anticuerpos tardan significativamente menos tiempo y cubren una distancia significativamente menor en los brazos abiertos en comparación con los animales tratados con el vehiculo (p<0,05; n=17-19 animales por grupo) mientras que los niveles de actividad eran equivalentes en ambos grupos. Estos resultados demuestran que el tratamiento crónico con el anticuerpo NI-202.12F4 induce una
50 mejora significativa en el rendimiento motor y una recuperación del comportamiento anómala en el laberinto en cruz elevado en modelos de ratón transgénico para a-sinucleina de enfermedad de Parkinson.
Ejemplo 5: El anticuerpo NI-202.12F4 aumenta los niveles plasmáticos de a-sinucleina en modelos de ratones transgénicos para a-sinucleína de enfermedad de Parkinson
55 [0214J Se trató a ratones transgénicos para a-sinucleina A53T de 10,5 meses de edad semanalmente i.p. con NI202.12F4 quimérico a 5 mgf1<g o PBS durante 2 meses. Veinticuatro horas después de la última inyección, se prepararon muestras de plasma y se determinaron las concentraciones plasmáticas del anticuerpo de tratamiento y de a-sinucleina humana mediante ELISA (figura 11). Los niveles plasmáticos de a-sinucleina humana aumentaban significativamente en más de 10 veces en comparación con los animales tratados con el vehiculo (25 ± 4,1 ngfml para el grupo de tratamiento con NI-202.12F4 frente a 1,9 ± 1,2 ngfml para el grupo de PBS, p = 0,0002) lo que demuestra la modulación farmacodinámica de la a-sinucleina tras el tratamiento con NI-202.12F4. Se observaron efectos similares tras el tratamiento agudo con anticuerpo en los ratones transgénicos para a-sinucleína A30P.
5 Como en los modelos transgénicos para a-sinucleina A53T y A30P, la a-sinucleína humana se expresan predominantemente en el cerebro, el aumento de a-sinucleina humana en circulación podria ser debido a un flujo de salida neto mediado por N1-202.12F4 de esta proteína del cerebro a la periferia.
LISTADO DE SECUENCIAS
[021 5]
<110> Neurimmune Therapeutics AG 15 <120> Anticuerpos humanos anti-alfa sinucleína
<130> NE30A27fP-WO
<150> US 611139.253 20 <151> 19/12/2008
<150>EP 08 022 188.0
<151> 19/12/2008 25 <160> 22
<170> Patentln versión 3.5
<210> 1 30 <211> 140
<212> PROT
<213> Homo sapiens
<220> 35 <221> PÉPTIDO
<222> (1) .. (140)
<223> Secuencia de aminoácidos de alfa-sinucleína: véase, p. ej., Ueda y col., Proc. Natl. Acad. ScL U.S.A. 90 (1993), 1282-1286; GenBank de swissprot: locus SYUA_HUMAN, numero de acceso P37B40
40 <400> 1
Met Asp Val Phe Met Lys Gly Le~ Ser Ly~ Ala Lys Glu Gly Val Val 1 S la 15
Ala Ala Ala Glu Lys Thr Lys Gln Gly Val Al a Glu Ala Ala Gly Lys
20 25 30
Thr Lys Glu Gly Val Leu Tyr Val Gly Ser Lys Thr Lys Glu Gly Va l 35 40 45
Val His Gly Val Ala Thr Val Ala Glu Lys Thr Lys Glu Gln Val Thr 50 55 60
Asn Val Gly Gly Ala Val Val Thr Gly Val Thr Ala Val Ala Gln Lys 65 70 75 80
Thr Val Glu Gly Ala Gly Ser rle Ala Ala Ala Thr Gly Phe Val Lys 85 90 95
Lys Asp Gln Leu Gly Lys Asn Glu Glu Gly Ala Pro Gln Glu Gly Ile
100 105 110
Leu Glu Asp Met Pro Val Asp Pro Asp Asn Glu Ala Tyr Glu Met Pro
115 120 125
Ser Glu Glu Gly Tyr Gln Asp Tyr Glu Pro Glu Ala 130 135 140
<210:. 2 <211:.363 5 <212:. AON <213:. Homo sapiens
<220:. <221:. se
10 <222:. (1) .. (363)
<223>NI-202.3G12-VHB1 secuencia de la reg ión variable (VH) de la cadena pesada
<220>
<221>
Reg ión V 15 <222> (91) .. (105)
<223> Reg ión determinante de complementariedad (CDR) VH-CDR1
<220>
<221>
Reg ión V 20 <222> (198)..(198)
<223> Reg ión determinante de complementariedad (COR) VH-COR2
<220>
<221> Re9ión V
<222> (295)..(330)
<223> Región determinante de complementariedad (CDR) VH-CDR3
<220>
<221> Región V
<222> (295)..(330)
<223> Región determinante de complementariedad (CDR) VH-CDR3
10 <400> 2
gag gtg cag ctg gtg cag tet ggg get gag gtg aag Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys 1 5 10
tca gtg aga ctc tcc tgt agg gct tet gga tac aae Ser Val Arg Leu Ser Cys Arg Al. Ser Gly Tyr Asn 20 25
cat ata cae tgg gtg cg. cag gcc cct gga gag ggg His 11e Hls Trp Val IIrg Gln lila Pro Gly Glu Gly 35 40
ggc tgg agt aat cct caa agt ggc ooc tca agt tct Gly Trp Ser IIsn Pro Gln Ser Gly IIsn Ser Ser Ser 50 55 60
cao Ooc coo otc acc ato acc aco oac aco tCC atg Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr IIsp Thr Ser Het 65 10 15
atg gac ctg aae t09 ctO aca ctt oae gac aco occ Het Asp Leu IIsn Trp Leu Thr Leu IIsp IIsp Thr Ala 85 90
acg aga ccc ca, gat ggc gea gga aac tae cga ttt
Thr IIrg Pro Hls IIsp Gly lila Gly IIsn Tyr IIrg Phe 100 lOS
cag gga acc ctg gtc acc gtc tcc tcg Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 3 15 <211> 121
<212> PRQT
<213> Homo sapiens
<400> 3
aag ecg Lys Pro
tte ate Phe Ue 30
ctt gag Leu Glu <5
gca cag lila Gln
tcc OCO Ser lila
gtg tat Val Tyr
gae acc
IIsp Thr no
ggg gcc Gly Ala
gac ttc Asp Phe
tgg atg Trp Het
agg ttt IIrg Phe
gcc tac lila Tyr
tae tgt Tyr Cys 95
t90 ggc
Trp Gly
,..
Glu Yal Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15
Ser Yal Arg Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gly Tyr Asn Phe Ile Asp Phe 20 25 30
His Ile His Trp Yal Ar g Gln Ala Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Trp Ser Asn Pro Gln Ser Gly Asn Ser Ser Ser Ala Gln Arg Phe 50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Met Ser Ala Ala Tyr
65 70 75 80
Met ASp Leu Asn Trp Leu Thr Leu Asp ASp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Thr Arg Pro His Asp Gly Ala Gly Asn Tyr Arg Phe ASp Thr Trp Gly 100 105 110
Gln Gly Thr Leu Yal Thr Yal Ser Ser 115 120
<210> 4
<211 > 121 5 <212> PROT
<213> Horno sapiens
<220>
<221> PÉPTIDO 10 <222> (1) .. (121)
<223> NI-202.3G12-VHB1-LG Secuencia de la región variable de la cadena pesada (VH) alineada con la secuencia de la linea germinal (LG)
<220>
15 <221> MISC_CARACTERlsTICA
<222> (31 ) .. (35)
<223> Reg ión determinante de complementariedad (CDR) VH-CDR1
<220>
20 <221> MISC_CARACTERISTICA
<222> (50) .. (66)
<223> Reg ión determinante de complementariedad (CDR) VH-CDR2
<220>
25 <221> MISC CARACTERíSTICA
<222> (99) .. {::¡ 1O)
<223> Región determinante de complementariedad (CDR ) VH-CDR3 <400> 4
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15
Ser Val Arg Leu Ser Cys Arq Ala Ser Gly Tyr Asn Phe Ile Asp Phe 20 25 30
His Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp Met
35 4 O 45
Gly Trp Ser Asn Pro Gln Ser Gly Asn Ser Ser Ser Ala Gln Arg Phe 50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr ASp Thr Ser Met Ser Ala Ala Tyr
65 70 15 80
Met Asp Leu Asn Trp Leu Thr Leu Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Thr Arg Pro His Asp Gly Ala Gly Asn Tyr Arg Phe Asp Thr Trp Gly
10 0
Gln Gly Thr Leu Val
<210> 5
<211 > 324
<212> ADN
<213> Horno sapiens
<220>
<221> SC
<222> (1 ) .. (324)
105 110
Thr Val Ser Ser
<223>NI-202.3G12-VLc1 secuencia de la región variable de la cadena ligera (VL)
<220>
<221 > Reg ión V
<222> (67) .. (99)
<223> Región determinante de complementariedad (CDR) VL-CDR1
<220>
<221 > Reg ión V
<222> (145) ..(165)
<223> Reg ión determinante de complementariedad (CDR ) VL-CDR2
<220>
<221 > Reg ión V
<222> (262) .. (294) <223> Re9ión determinante de complementariedad (CDR) VL-CDR3
5
<400> 5 cag tct gtg Gln Ser Val 1 t tg acg cag Leu Thr Gln 5 ccg ccc tcg gtg Pro Pro Ser Val 10 tca Ser gtg Val gcc Al a cca Pr o gga cag Gl y Gln 15 48
acg Thr
gcc agg Ala Arg ate ace tge Ile Thr Cys 20 tet ggt gat gec Ser Gly Asp Ala 25 ttg Leu cea Pro ••• c.c Lyo His 30 t.t gct Tyr Ala 96
cat 'His
tgg tac cag cag Trp Tyr Gln Gln 35 aag Lyo cea Pro ggc eag gte eet Gly Gln Va l Pro 40 ata g tg gtc !le Val Val 45 atc tat Ile Tyr 14 4
aaa gac act gag Lyo Asp Thr G1u 50
agg Arg ccc Pro tea Ser 55 ggg Gly atc cct gag Ue Pro Glu cga Arg 60 ttc tet Phe Ser ggt tee Gly Ser 192
aee Thr 6S
tea ggg aea aea gte Ser Gly Thr Thr Val 70 ace etg Thr Leu aee Thr ate agt Ue Ser 75 gge gte eag Gly Val Gln gea gag Ala G1u 80 240
gac gag gc~ cat Asp Glu Ala His
tat tat tgt Tyr Tyr Cys 85 caa Gln tca gca Ser Ala 90 gac Asp gtc agt tea Val Ser Ser act tat Thr Tyr 95 288
gtt gtg Val Val
ttt gge gg. ggg acc Phe Gly Gly Gly Thr 100 a.g Lys ct. Leu 105 acc Thr gtc V.1 e t a Leu 324
10
<210> 6 <211> 108 <212> PROT <213> Horno sapiens
<400> 6
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala ~ro Gly Gln 1 S 10 lS
Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Ala Leu Pro Lys His Tyr Ala 20 25 30
Hi s Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Val Pro Ile Val Val Ile Tyr 35 40 4S
Lys Asp Th~ Glu Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser SO 55 60
Thr Ser Gly Thr Thr Val Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Ala Glu 6S 70 75 eo
Asp Glu Ala His Tyr Tyr Cys Gl n Ser Ala Asp Val Ser Ser Thr Tyr
85 90 95
Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 7
<211> 108 5 <212> PRQT
<213> Horno sapiens
<220>
<221> PÉPTIDO 10 <222> (1) ..(108)
<223> NI-202.3G12-VLc1-LG Secuencia de la región variable de la cadena ligera (VL) alineada con la secuencia de la linea germinal (LG)
<220>
15 <221> MISC_CARACTERíSTICA
<222> (23)..(33)
<223> Región determinante de complementariedad (CDR) VL-CDR1
<220>
20 <221> MISC_CARACTERíSTICA
<222> (49)..(55)
<223> Región determinante de complementariedad (CDR) VL-CDR2
<220>
25 <221> MISC CARACTERlsTICA
<222> (88)..(98)
<223> Región determinante de complementariedad (CDR) VL-CDR3
<400> 7
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Arg 1le Thr Cys Ser Gly Asp Ala Leu Pro Lys His Tyr Ala
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gl n Val Pro 1le Val Val 11e Tyr 35 40 45
Lys Asp Thr Glu Arg Pro Ser Gly 11e Pro Glu Arg Phe Ser Gl y Ser ~ SS ~
Thr Ser Gly Thr Thr Val Thr Leu Thr 1le Ser Gly Val Gln Ala Glu 65 70 75 80
ASp Glu Al a His Tyr Tyr Cys Gln Ser Ala Asp Val Ser Ser Thr Tyr 85 90 95
Val Val Phe Gly Gly Gl y Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105
5 <210> 8
<211> 339
<212> ADN
<213> Horno sapiens
10 <220>
<221> CDS
<222> (1)..(339)
<223>NI-2Q2.12F4-VHA1 b secuencia de la región variable de la cadena pesada (VH)
15 <220>
<221> Región V
<222> (91)..(105)
<223> Región determinante de complementariedad (CDR) VH-CDR1
20 <220>
<221> Región V
<222> (147)..(204)
<223> Región determinante de complementariedad (CDR) VH-CDR2
25 <220>
<221> Región V
<222> (301)..(306)
<223> Región determinante de complementariedad (CDR) VH-CDR3
30 <220>
<221> misc_caracteristica
<222> (319)..(339)
<223> La secuencia de nudeótidos de las posiciones 319 a 339 puede leerse alternativamente «tcc cgg gtc acc gtc gcc tca» y codifica los aminoácidos «Ser Arg Val Thr Val Ala Ser»
<400> 8
gag gtg cag ctg gtg cag tct ggg Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly 1 5
tcc cta aga ctc tcc tgt gca gtc Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val 20
tgg atg agt tgg gtc cgc cag gct Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala 35 40
gee cgt atc aag age aca gct gat Ala Arg Ile Lys Ser Thr Ala ASp 50 55
cce 9t9 gaa 9ge a9g ttc ate atc Pro Val Glu Gly Ar9 Phe Ile Ile 65 70
ctt cat ctg caa atg aac agt ct9 Leu Tyr" Leu Gln Met Asn Ser Leu 85
tat tgt aca tca gcc cac t99 99C
Tyr Cys Thr Ser Ala Mis Trp Gly 100
tcg Ser
5 <210> 9
<211> 113
<212> PROT
<213> Horno sapiens
10 <400> 9
gga ggt ctg gtc gag Gly Gly Leu Val Glu 10
ccg Pro ggg ggg Gly Gly 15 48
tce gga ttc gat Ser Gly Phe Asp 25
ttc Phe gaa Glu 30 aaa gee Lys Alo 96
cca ggg cag ggg eta Pro Gly Gln Gly Leu 45
cag Gln tgg gtt Trp Val 144
ggt ggg aca aea agc Gly Gly Thr Thr Ser 60
tac Tyr gee gee Ala Ala 192
tca aga gat gat tcg Ser Ar9 Asp Asp Ser 75
aga Arg aac atg Asn Met SO 240
a•• aet ga. gac aca Lys Thr Glu Asp Thr 90
gee Ala 9tc tat Val Tyr 95 2••
cag 99"
acc ctg gtc acc gtc tcc 336
Gln Gly Thr 105
Leu Val Thr 110 Val Ser
339
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Glu Pro Gly Gly 1 S 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Asp Phe Glu Lys Ala 20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Al a Pro Gly Gln Gly Leu Gln Trp Val 35 40 45
Ala Arg Ile Lys Ser Thr Ala Asp Gly Gly Thr Thr Ser Tyr Ala Ala 50 55 60
Pro Val Glu Gly Arg Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asp Ser Arg Asn Met 65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leo Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95
Tyr Cys Thr Ser Ala His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 100 105 110
Ser
<210> 10
<211> 113 5 <212> PROT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> PÉPTIDO 10 <222> (1 ) .. (113)
<223> NI-202.12F4-VHA 1b-LG Secuencia de la región variable de la cadena pesada (VH) alineada con la secuencia de la linea germinal (LG)
<220>
15 <221> MISC CARACTERlsTICA
<222> (31 ) .. (3 5)
<223> Región determinante de complementariedad (CDR) VH-CDR1
<220>
20 <221> MISC CARACTERlsTICA
<222> (50) .. (68)
<223> Región determinante de complementariedad (CDR) VH-CDR2
<220>
25 <221> MISC_CARACTERíSTICA
<222> (1 01 ) ..(1 02)
<223> Reg ión determinante de complementariedad (CDR ) VH-CDR3 <220>
<221> MISC_CARACTERlsTICA
<222> (107)..(113)
<223> La secuencia de aminoácidos de las posiciones 107 a 1132 puede leerse alternativamente «Ser Arg Val Thr 5 Val Ala Ser»
<400> 10
Glu Val Gln Leu val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Glu Pro Gly Gly 1 S 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Asp Phe Glu Lys Ala
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Gln Trp Val 3S 40 4S
Ala Arg Ile Lys Ser Thr Ala Asp Gly Gly Thr Thr Ser Tyr Ala Ala ~ 55 ~
Pro Val Glu Gly Arg Phe 11e l1e Ser Arg Asp Asp Ser Arg Asn Met
65 70 75 60
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu ASp Thr Ala Val Tyr 65 ~ 95
Tyr Cys Thr Ser Ala His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 100 105 110
Ser 10
<210> 11
<211> 324
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<220>
<221 > SC
<222> (1 ) .. (324)
<223>NI-202.12F4-VLa1 secuencia de la región variable de la cadena ligera (VL)
<220>
<221 > Reg ión V
<222> (67) .. (99)
<223> Región determinante de complementariedad (CDR) VL-CDR1
<220>
<221> Reg ión V
<222> (145)..(165)
<223> Región determinante de complementariedad (CDR) VL-CDR2
<220>
<221> Reg ión V 5 <222> (262) ..(294)
<223> Reg ión determinante de complementariedad (CDR) VL-CDR3
<400> 11
cag tct qtq ctg act cag cea cee teg gtg tea gtg tcc cca 9ga cag 48 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln 1 5 10 1;
aeg gee agg ate aec tgc tct 9ga gaa gea ttg cea atg caa ttt gct 96 Thr Ala Ar 9 Ile Thr Cys Ser Gly Glu Ala Leu Pro Met Gln Phe Ala 20 25 30
cat t99 tae caa eag a99 cea gge aag gcc cea gtg ata gtg gtg tae 144 His Trp Tyr Gln Gln Arg Pr o Gly Lys Ala Pro Val Ile Val Val Tyr
35 40 45
aa. g4C agt gag aga ccg tea ggt gtc eet gag cga ttc tct gge tce 192 Lys Asp Ser Glu Arg Pro Ser Gly Val Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60
4gC tea 999 aca aca gcc aeg ttg aee ate act gga gtc eag gea gaa 240 Ser Ser Gly Thr Thr Ala Thr Leu Thr Ile Thr Gly Val Gln Al a Glu 65 70 75
'O
gat gag gct gac tat tac tge cag tcg cea gae age aet aae aet tat 266 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Pro Asp Ser Thr Asn Thr Tyr 85 90 95
gaa gte ttc ggc 9ga ggg ace aag ctg aee gtc cta 324 Glu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105
<210> 12
<211> 108
<212> PROT 15 <213> Homo sapiens
<400> 12
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Yal Ser Yal Ser Pro Gly Gln 1 5 la 15
Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Glu Ala Leu Pro Met Gln Phe Ala
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gl y Lys Ala Pro Val Ile val Val Tyr 35 40 4S 20
Lys Asp Ser Glu Arg Pro Ser Gly Val Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 ~
Ser Ser Gly Thr Thr Ala Thr Leu Thr Ile Thr Gly Val Gln Ala Glu
6S 70 75 80
ASp Glu Ala ASp Tyr Tyr Cys Gln Ser Pro Asp Ser Thr Asn Thr Tyr 85 90 95
Gl u Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105
<210> 13
<211> 108 5 <212> PRQT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> PÉPTIDQ 10 <222> (1) ..(108)
<223> NI-202.12F4-VLa1-LG Secuencia de la región variable de la cadena ligera (VL) alineada con la secuencia de la linea germinal (LG)
<220>
15 <221> MISC_CARACTERISTICA
<222> (23) ..(33)
<223> Región determinante de complementariedad (CDR) VL-CDR1
<220>
20 <221> MISC_CARACTERISTICA
<222> (49) ..(55)
<223> Región determinante de complementariedad (CDR) VL-CDR2
<220>
25 <221> MISC CARACTERíSTICA
<222> (88) ..(98)
<223> Región determinante de complementariedad (CDR) VL-CDR3
<400> 13
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Arq Ile Thr Cys Ser Gly Glu Ala Leu Pro Met Gln Phe Ala
20 25 JO
His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Val Ile Val Val Tyr 35 40 45
Lys Asp Ser Glu Arg Pro Ser Gly Val Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60
Ser Ser Gly Thr Thr Ala Thr Leu Thr Ile Thr Gly Val Gln Ala Glu 65 10 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Pro Asp Ser Thr Asn Thr Tyr 85 90 95
Glu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105
<210> 14
<211 > 369 S <212>AON
<213> Horno sapiens
<220>
<221> SC 10 <222> (1 ) .. (369)
<223>NI-202.3D8-VHE1 secuencia de la región variable de la cadena pesada (VH)
<220>
<221> Región V 15 <222> (91) .. (105)
<223> Región determinante de complementariedad (CDR) VH-CDR1
<220>
<221> Reg ión V 20 <222> (148) ..(198)
<223> Región determinante de complementariedad (CDR) VH-CDR2
<220>
<221> Reg ión V 25 <222> (295) ..(336)
<223> Región determinante de complemenlariedad (CDR) VH-CDR3
<400> 14
gag gtg cag ctg gtg gag tet ggg Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly 1 5
tcc ctg aga cte tcc tgt gea gce Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala 20
gcc att tcc tgg gtc cgc cag gct Ala Ue Ser Trp Val Arg Gl"n Ala 35 40
gca .tt att tca aat gato gga agt Ala Ue Ue Ser Asn Asp Gly Ser 50 55
aag 90c COa ttc acc atc tee aga Lys Gly Arg Phe Thr U. Ser Arg 65 70
ctg gaa atg .ae agc ctg aga g.t Leu Glu Met Asn Ser Leu ArO Asp as
Ocg .aa aaa COa 090 acO tat gcc Ala Lys Lys Arg Gly Thr Tyr Ala
tOg ooc cag oga acc ctg otc ace Trp Gly Gln Gly Thr Leu val Thr 115 120
<210> 15
<211> 123 5 <212> PROT
<213> Horno sapiens
<400> 15
gga
ggc gtg gte cag cct ggg agg 4a
Gly Gly Val Val
Gln Pro Gly Arg
10
15
tet
gga ttc .ct ttc agt .cc tat 96
Ser Gly
Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
25
30
ce.
ggc ••g ggg ctg gag tgg gtg 144
Pro Gly Lyo Gly
Leu Glu Trp Val
45
cgt
aaa tat tat gca gac tcc gtg 192
Arg Lys Tyr Tyr Ala
Asp Ser Val
60
gac
aat tcc aog gac .eg ctg gat 240
Asp Asn
Ser Arg Asp Thr Leu ASp
75
ao
gag gac acg gct
gtg tat tac tgt 2aa
Glu Asp
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
90
.5
aOe
aOg tgc aaa OCC ttt Oac tte 336
Ser Aro Cys Lys
Ala Phe Asp Phe
105
110
otc
tcc tcg 36.
Val
Ser Ser
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr 20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ile Ile Ser Asn Asp Gly Ser Arg Lys Tyr Tyr Ala ASp Ser Val ~ 55 W
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg ASp Aso Ser Arg Asp Thr Leu Asp
65 70 15 80
Leu Glu Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Lys Lys Arg Gly Thr Tyr Ala Ser Arg Cys Lys Ala Phe ASp Phe
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 115
<210> 16
<211> 123 5 <212> PROT
<213> Hamo sapiens
<220>
<221> PÉPTIDO 10 <222> (1) ..(123)
105 110 Thr Val Ser Ser
<223> NI-202.3D8-VHE1-LG Secuencia de la región variable de la cadena pesada (VH) alineada con la secuencia de la linea germinal (LG)
<220>
15 <221> MISC_CARACTER lsTICA
<222> (31 )..(35)
<223> Región determinante de complementariedad (CDR) VH-CDR1
<220>
20 <221> MISC_CARACTERISTICA
<222> (50) ..(66)
<223> Región determinante de complementariedad (CDR) VH-CDR2
<220>
25 <221> MISC CARACTERíSTICA
<222> (99) ..{112)
<223> Región determinante de complementariedad (CDR) VH-CDR3
<400> 16
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ile rle Ser Asn Asp Gly Ser Arg Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser val 50 55 ~
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Arg Asp Thr Leu Asp 65 70 75 80
Leu Glu Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Lys Lys Arg Gly Thr Tyr Ala Ser Arg Cys Lys Ala Phe ASp Phe 100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 5
<210> 17
<211> 318
<212> ADN
<213> Horno sapiens 10
<220>
<221> SC
<222> (1)..(318)
<223>NI-202.3D8-VKa1 secuencia de la región variable de la cadena ligera (VL)
<220>
<221> Región V
<222> (70)..(102)
<223> Región determinante de complementariedad (CDR) VL-CDR1
<220>
<221> Región V
<222> (148)..(168)
<223> Región determinante de complementariedad (CDR) VL-CDR2
<220>
<221> Región V
<222> (265) ..(288) <223> Reg ión determinante de complementariedad (CDR) VL-CDR3
5
<400> 17 gac ate eag Asp Ile Gln 1 ttg acc eag tct cct Leu The Gln See Peo 5 tcc acc See The 10 ctg Le" tct See gca Ala tct gta gga See Va l Gly 15 48
gac aga A.p Aeg
gtc acc Val Thr 20 atc act tge cgg gcc agt cag Ue Thr Cys Arg Ala Ser Gln 25 agt Ser att agt ggc tgg Ue Ser Gly Trp 30 96
ttg gec tgg tat cag cag Le" Ala Tep Tyr Gln Gln 35
aaa Lys cca ggg aaa gcc Peo Gly Lys Ala 40 cct Peo aag Lys .5 ctc ctg atc Leu Leu Ile 14'
tat gat gcc tcc aat ttg gaa agt ggg gtc Tye Asp Ala Ser Asn Leu Glu See Gly Val 50 55
cca Peo tca agg See Aeg 60 ttc agc ggc Phe See Gly 192
agt See 65
gga tct ggg aca Gly Ser Gly Thr gaa Glu 70 ttc act etc Phe The Leu acc Thr ate agc Ue See 75 agc Ser ctg cag Leu Gln cct Pro 80 240
gat gat Asp Asp
ttt gca act Phe Ala Thr 85 tat tat tge Tyr Tyr Cys caa Gln eag tat gat aat Gln Tyr Asp Asn 90 tat tqg aeg Tyr Trp Thr 95 288
tte Phe
gge caa ggg aee Gly Gln Gly Thr 100 a.g gtg '1" Ly. Val Glu ate •••Ile Lys 105 318
10
<210> 18 <211 > 106 <212> PROT <213> Homo sapiens
<400> 18
Asp I le Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Trp 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 3S 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 W
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Asn Tyr Trp Thr 85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys val Glu Ile Lys 100 105
5 <210> 19
<211> 106
<212> PRQT
<213> Horno sapiens
10 <220>
<221> PÉPTIDO
<222> (1)..(106)
<223> NI-202.3D8-VKa1-LG Secuencia de la región variable de la cadena ligera (VL) alineada con la secuencia de la linea germinal (LG)
<220>
<221> MISC CARACTER lsTICA
<222> (24) ..(34)
<223> Región determinante de complementariedad (CDR) VL-CDR1
<220>
<221> MISC_CARACTERíSTICA
<222> (50) .. (56)
<223> Reg ión determinante de complementariedad (CDR) VL-CDR2
<220>
<221> MISC_CARACTERlsTICA
<222> (89) .. (96)
<223> Reg ión determinante de complementariedad (CDR) VL-CDR3
<400> 19
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15
ASp Arg Yal Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Trp 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 \1 O \1 5
Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Yal Pro Ser Arg Phe Ser Gly ~ 55 ~
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 15 80
ASp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Asn Tyr Trp Thr 85 90 95
Phe Gl y Gln Gly Thr Lys Val Gl u Ile Lys
100 105
5 <210> 20 <211>321
<212> AON
<213> Horno sapiens
10 <220>
<221> SC
<222> (1) .. (321)
<223>NI-202.308-VKc1 secuencia de la región variable de la cadena ligera (VL)
15 <220>
<221> Reg ión V
<222> (70) .. (102)
<223> Reg ión determinante de complementariedad (COR) VL-COR1
20 <220>
<221 > Reg ión V
<222> (148)..(168)
<223> Reg ión determinante de complementariedad (COR) VL-COR2
25 <220>
<221> Reg ión V
<222> (265)..(291)
<223> Reg ión determinante de complementariedad (COR) VL-COR3
30 <400> 20
gaa Glu 1
att gtg atg acg cag !le Val Met Thr Gln 5 tct cca tcc Ser Pro Ser tca ctg Ser Leu 10 tct gca Ser Al. tct Ser att gga Ile Gly 15 48
gac aga gtc Asp Arg Val
acc Thr 20 ttc act tot cgg gcg Phe Thr Cys Arg Ala 25 agt cac gac Ser Hls Asp ate agc aot tat Ile Ser Asn Tyr 30 96
tta Leu
gcc Ala tgg Trp 35 ttt cgg cag caa Phe Arg Gln Gln cca ggg aaa gcc Pro Gly Lys Ala 40 cct aag Pro Lys 45 tcc ctg atc Ser Leu !le 144
tat Tyr
gct gca Ala Ala 50 tct agt ctg caa agt ggg gtc Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val 55 cca tca ag,a Pro Ser Arg 60 ttc agc gcc Phe Ser Ala 192
agt gga tct ggg aca gac Ser Gly Ser Gly Thr Asp 65 70
ttc act Phe Thr ctc Leu acc Thr atc agc !le Ser 75 agc Ser ctg cag Leu Gln ccc Pro 80 240
gaa Glu
gat Asp ttt gca Phe Ala act Thr 85 tat tat tgt gtt Tyr Tyr cys Val caa tat agg act tac Gln Tyr Arg Thr Tyr 90 ccc ctc Pro Leu 95 288
acc Thr
ttc ggc caa ggg Phe Gly Gln Gly 100 aca cga ctg gag Thr Arg Leu Glu 105 att aaa !le Ly, 321
<210> 21 <211> 107 5 <212> PRQT <213> Horno sapiens
<400> 21
Glu 1le Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Ile Gly 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Phe Thr Cys Arg Ala Ser His Asp Ile Ser Asn Tyr W 25 ~
Leu Ala Trp Phe Arq Gln Gln Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu 11e 35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Ala 50 55 W
Ser Gly Ser Gly Thr ASp Phe Thr Leu Thr 1le Ser Ser Leu Gln Pro 65 10 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Val Gln Tyr Arg Thr Tyr Pro Leu 85 ~ 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu 11e Lys 100 105
<210> 22
<211> 107 5 <212> PRQT
<213> Horno sapiens
<220>
<221> PÉPTIDO 10 <222> (1) ..(107)
<223> NI-202.3D8-VKc1-LG Secuencia de la región variable de la cadena ligera (VL) alineada con la secuencia de la linea germinal (LG)
<220>
15 <22 1> MISC_CARACTERíSTICA
<222> (24 l ..(34)
<223> Región determinante de complementariedad (CDR) VL-CDR1
<220>
20 <22 1> MISC_CARACTERíSTICA
<222> (50l..(56)
<223> Región detenninante de complementariedad (CDR) VL-CDR2
<220>
25 <221> MISC CARACTER lsTICA
<222> (89l..(97)
<223> Región detenninante de complementariedad (CDR) VL-CDR3
<400> 22
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Ile Gly
1 5 lO 15
Asp Arg val Thr Phe Thr Cys Ar~J Ala Ser Hi~ Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Phe Arg Gln Gln Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile 35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Sel: Gly val Pro Ser Arg Phe Ser Ala 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thl:' Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Val Gln Tyr Arg Thr Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys l OO 105

Claims (16)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Un anticuerpo monoclonal humano anti-a-sinucleina o su fragmento de unión a a-sinucleina; en el que el anticuerpo o su fragmento de unión a a-sinucleina comprende en su región variable una región VH CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de los restos 31-35 de la SEC ID N° 9, una región VH CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de los restos SO-68 de la $EC ID N° 9, una región VH CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de los restos 101-102 de la SEC ID N° 9, una región VL CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de los restos 23-33 de la SEC ID N° 12, una región VL COR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de los restos 49-55 de la $EC ID N° 12, una región VL COR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de los restos 88-89 de la SEC ID N° 12.
  2. 2.
    El anticuerpo o su fragmento de unión a a-sinUcleina de la reivindicación 1, en el que la región VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.O 9 Y la región VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.O 12.
  3. 3.
    El anticuerpo o su fragmento de unión a a-sinucleina de la reivindicación 1, en el que la región VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.O 10 Y la región VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.O 13.
  4. 4.
    Un polinudeótido que codifica el anticuerpo o su fragmento de unión a a-sinucleina de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
  5. 5.
    Un vector que comprende el polinucleótido de la reivindicación 4.
  6. 6.
    Una célula huésped que comprende el vector de la reivindicación 5.
  7. 7.
    Un procedimiento para preparar un anticuerpo anti-a-sinucleina o su fragmento, comprendiendo dicho proced imiento
    (a)
    cultivar la célula de la reivindicación 6 y
    (b)
    aislar dicho anticuerpo o su fragmento a partir del cultivo.
  8. 8.
    Un anticuerpo anti-a-sinucleína o su fragmento codificado por el polinucleótido de la reivindicación 4 u obtenible mediante el procedimiento de la reivindicación 7.
  9. 9.
    El anticuerpo o su fragmento de unión a o-sinucleina de cualquier de las reivindicaciones 1 a 3 u 8, que está
    (i)
    marcado detectablemente, donde el marcador detectable se selecciona a partir del grupo compuesto por una enzima, un radioisótopo, un fluoróforo y un metal pesado o
    (ii)
    unido a un fármaco.
  10. 10. Una composición que comprende el anticuerpo o su fragmento de unión a a-sinucleina de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, 8 o 9, el polinucleótido de la reivindicación 4, el vector de la reivindicación 5 o la célula de la reivindicación 6 en el que la composición es
    (i)
    una composición farmacéutica que además comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable o
    (ii)
    una composición diagnóstica que además comprende uno o más reactivos de diagnóstico inmunológicos o a base de ácido nucleico.
  11. 11 . El anticuerpo o su fragmento de unión a a-sinucleina de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, 8 o 9 para su uso en el tratamiento o prevención de una enfermedad sinucleinopática en un sujeto, en el que la enfermedad sinucleinopática se selecciona a partir del grupo compuesto por enfermedad de Parkinson (EP), demencia por enfermedad de Parkinson (DEP), demencia con cuerpos de Lewy (OCl), la variante con cuerpos de Lewy de la enfermedad de Alzheimer (VCLEA), atrofia sistémica múltiple (ASM), insuficiencia autonómica pura (IAP), neurodegeneración con acumulación cerebral de hierro de tipo 1 (NACH-1), enfermedad de Alzheimer, enfermedad
    de Pick, distrofia neuroaxonal generalizada de inicio juvenil (enfermedad de Hanervorden-$palZ), esclerosis lateral amiotr6fica, lesión cerebral traumática y sindrome de Down.
  12. 12.
    El anticuerpo o su fragmento de unión a o-sinuc!eína de la reivindicación 3 para su uso según la reivindicación 11, en el que la enfermedad sinucleinopatica es la enfermedad de Parkinson.
  13. 13.
    Un procedimiento de diagnóstico o control de la progresión de una enfermedad sinucleinopática en un sujeto, comprendiendo el procedimiento:
    (a)
    evaluar el nivel de a-sinuc!eína en una muestra del sujeto que se va a diagnosticar con el anticuerpo o su fragmento de unión a o-sinucleina de cualquiera de la reivindicaciones 1 a 3, 8 o 9; y
    (b)
    comparar el nivel de o-sinucleína con un patrón de referencia que indica el nivel de a-sinucleína en uno o más sujetos control,
    en el que una diferencia o similitud entre el nivel de o-sinucleina y el patrón de referencia indica que el sujeto tiene una enfermedad sinuc!einopática, donde la enfermedad sinucleinopática se selecciona a partir del grupo compuesto por enfermedad de Parkinson (EP), demencia por enfermedad de Parkinson (DEP), demencia con cuerpos de lewy (DCl), la variante con cuerpos de lewy de la enfermedad de Alzheimer (VClEA), atrofia sistémica múltiples (ASM), insuficiencia autónoma pura (IAP), neurodegeneración con acumulación cerebral de hierro de tipo 1 (NACH-1), enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Pick, distrofia neuroaxonal generalizada de inicio juvenil (enfermedad de Haliervorden-Spatz), esclerosis lateral amiotrófica, lesión cerebral traumática y síndrome de Down.
  14. 14.
    Un kit para el diagnóstico de una enfermedad sinucleinopática, comprendiendo dicho kit el anticuerpo o su fragmento de unión a o-sinucleina de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, 8 o 9, el polinucleótido de la reivindicación 3, el vector de la reivindicación 5 y la célula de la reivindicación 6 con reactivos y/o instrucciones para su uso.
  15. 15.
    Una composición que comprende el anticuerpo o su fragmento de unión a o-sinucleina de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, 8 o 9 unido a un agente terapéutico o de diagnóstico para su uso en la detección in vivo de 0sinucleína, o dirige un agente terapéutico y/o de diagnóstico hacia la a-sinucleína en el cuerpo humano o animal, donde la a-sinuclerna se detecta mediante tomografia de emisión de positrones (PETl, tomografía de emisión de fotón único (SPECT), estudio por imagen óptica en el infrarrojo cercano (N IR), estudio por imagen mediante resonancia magnética (MRI) o una combinación de los mismos.
  16. 16.
    Un procedimiento de seguimiento de la progresión de una enfermedad sinucleinopática o de la respuesta al tratamiento de la enfermedad sinucleinopatica en un sujeto que comprende:
    (a)
    poner en contacto una muestra biológica con el anticuerpo o su fragmento de unión a a-sinuclerna de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, 8 o 9; y
    (b)
    detectar el anticuerpo o su fragmento de unión a a-sinucleína,
    en el que la enfermedad sinucleinopática se selecciona a partir del grupo compuesto por enfermedad de Parkinson (EP), demencia por enfermedad de Parkinson (DEP), demencia con cuerpos de lewy (Del), la variante con cuerpos de lewy de la enfermedad de Alzheimer (VClEA), atrofia sistémica múltiple (ASM), insuficiencia autonómica pura (IAP), neurodegeneración con acumulación cerebral de hierro de tipo 1 (NACH-1), enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Pick, distrofia neuroaxonal generalizada de inicio juvenil (enfermedad de Hanervorden-$patz), esclerosis lateral amiotrófica, lesión cerebral traumática y síndrome de Down.
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