KR20210111242A - 혈액 뇌 장벽 수송을 향상시키기 위한 인간화 및 안정화된 fc5 변이체 - Google Patents

혈액 뇌 장벽 수송을 향상시키기 위한 인간화 및 안정화된 fc5 변이체 Download PDF

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안드레아스 레만
토마스 오 카메론
알 블레이크 페핀스키
딩이 웬
그라햄 케이 파링턴
고팔란 라그후나탄
넬스 이 페더슨
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트라이안 술레아
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Abstract

항체 가변 도메인(예컨대, FC5)의 인간화 및 조작된 변이체를 포함하는 조성물, 이를 포함하는 키메라 분자, 이를 포함하는 조성물, 및 이들의 용도를 특징으로 한다.

Description

혈액 뇌 장벽 수송을 향상시키기 위한 인간화 및 안정화된 FC5 변이체
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2018년 10월 29일자로 출원된 미국 임시 출원 번호 62/751,962의 우선권 이익을 주장하고, 이의 내용은 그 전체가 본 명세서에 참고로 포함된다.
기술 분야
본 개시내용은 일반적으로 혈액 뇌 장벽을 가로질러 원하는 제제(예컨대, 치료제, 진단제)를 전달하기 위한 조성물 및 이를 신경계 장애의 치료 및/또는 예방에 사용하는 방법에 관한 것이다.
중추 신경계(CNS)로 약물의 전달은 알츠하이머병 및 파킨슨병과 같은 신경계 질환의 치료에 있어 과제였다. 약물이 신경계에 도달하기 위해서는 먼저 혈액 뇌 장벽(blood brain barrier: BBB)을 통과해야 하는데, 이는 BBB의 선택성으로 인해 주요 과제이다. BBB는 반투과성 막으로서 작용하여 대부분의 분자가 혈액으로부터 신경계로 진입하지 못하게 하고 저분자량(<400 Da) 및 친지성 화합물만이 통과하도록 한다. 단클론 항체 및 안티센스 올리고뉴클레오타이드와 같은 대부분의 작은 분자 및 큰 분자는 이 장벽을 통과할 수 없다. 이러한 BBB를 가로질러 약물 침투라는 어려운 과정으로 인해, 신경계 질환용 치료제의 소분획이 임상 실험에 이르게 된다.
본 기술분야에는 CNS로 치료제를 전달하기 위한 개선된 조성물 및 방법이 요구된다.
본 출원은 혈액 뇌 장벽을 가로질러 치료제를 수송하는 데 사용될 수 있는 항체 가변 도메인(예컨대, FC5 변이체)을 포함하는 분자에 관한 것이다.
일 양상에서, 본 개시내용은 혈액 뇌 장벽을 가로질러 이동하는 항체 가변 도메인을 특징으로 한다. 항체 가변 도메인은 서열번호 1에 제시된 서열과 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 아미노산 서열은 (i) 서열번호 1과 비교하여 서열번호 1의 위치 5, 6, 14, 75, 87, 88, 93, 114 및 117에 상응하는 위치 중 하나 이상에 아미노산 치환; 및 (ii) 서열번호 47 또는 57에 제시된 서열을 포함하는 상보성 결정 영역(CDR)1, 서열 50에 제시된 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열번호 51에 제시된 서열을 포함하는 CDR3을 포함한다.
일부 예에서, 아미노산 서열은 서열번호 1과 비교하여 서열번호 1의 위치 5, 6, 14, 75, 87, 88, 93, 114 및 117에 상응하는 위치 중 적어도 4개에 아미노산 치환을 포함한다. 다른 예에서, 아미노산 서열은 서열번호 1과 비교하여 서열번호 1의 위치 5, 6, 14, 75, 87, 88, 93, 114 및 117에 상응하는 위치 중 적어도 5개에 아미노산 치환을 포함한다. 또 다른 예에서, 아미노산 서열은 서열번호 1과 비교하여 서열번호 1의 위치 5, 6, 14, 75, 87, 88, 93, 114, 및 117에 상응하는 위치 중 적어도 6개에 아미노산 치환을 포함한다. 일 예에서, 아미노산 서열은 서열번호 1과 비교하여 서열번호 1의 위치 5, 6, 14, 75, 87, 88, 93, 114 및 117에 상응하는 각 위치에 아미노산 치환을 포함한다.
특정 예에서, CDR1은 서열번호 47에 제시된 서열을 포함한다. 다른 경우에, CDR1은 서열번호 57에 제시된 서열을 포함한다.
일부 경우에, 아미노산 서열은 서열번호 1의 위치 5에 상응하는 위치에 발린; 서열번호 1의 위치 6에 상응하는 위치에 글루탐산; 서열번호 1의 위치 14에 상응하는 위치에 프롤린; 서열번호 1의 위치 75에 상응하는 위치에 세린; 서열번호 1의 위치 87에 상응하는 위치에 아르기닌; 서열번호 1의 위치 88에 상응하는 위치에 알라닌; 서열번호 1의 위치 93에 상응하는 위치에 발린; 서열번호 1의 위치 114에 상응하는 위치에 글루타민; 또는 서열번호 1의 위치 117에 상응하는 위치에 류신 중 하나 이상(즉, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9개)을 포함한다.
특정 경우에, 아미노산 서열은 서열번호 1의 위치 5에 상응하는 위치에 발린; 서열번호 1의 위치 6에 상응하는 위치에 글루탐산; 서열번호 1의 위치 14에 상응하는 위치에 프롤린; 서열번호 1의 위치 75에 상응하는 위치에 세린; 서열번호 1의 위치 87에 상응하는 위치에 아르기닌; 서열번호 1의 위치 88에 상응하는 위치에 알라닌; 서열번호 1의 위치 93에 상응하는 위치에 발린; 서열번호 1의 위치 114에 상응하는 위치에 글루타민; 및 서열번호 1의 위치 117에 상응하는 위치에 류신을 포함한다.
일부 예에서, 아미노산 서열은 서열번호 1과 비교하여 서열번호 1의 위치 1, 37, 44, 45, 47 또는 79에 상응하는 위치 중 하나 이상(즉, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개)에 치환을 포함한다. 일부 실시형태에서, 아미노산 서열은 서열번호 1의 위치 1에 상응하는 위치에 글루탐산; 서열번호 1의 위치 37에 상응하는 위치에 발린; 서열번호 1의 위치 44에 상응하는 위치에 글리신; 서열번호 1의 위치 45에 상응하는 위치에 류신; 서열번호 1의 위치 47에 상응하는 위치에 트립토판; 또는 서열번호 1의 위치 79에 상응하는 위치에 류신 중 하나 이상(즉, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개)을 포함한다. 일부 경우에, 아미노산 서열은 서열번호 1과 비교하여 서열번호 1의 위치 44 및 45에 상응하는 위치에 치환을 포함한다. 특정 실시형태에서, 아미노산 서열은 서열번호 1의 위치 44에 상응하는 위치에 글리신; 및 서열번호 1의 위치 45에 상응하는 위치에 류신을 포함한다. 다른 경우에, 아미노산 서열은 서열번호 1과 비교하여 서열번호 1의 위치 1, 44 및 45에 상응하는 위치에 치환을 포함한다. 특정 실시형태에서, 아미노산 서열은 서열번호 1의 위치 1에 상응하는 위치에 글루탐산; 서열번호 1의 위치 44에 상응하는 위치에 글리신; 및 서열번호 1의 위치 45에 상응하는 위치에 류신을 포함한다. 또 다른 경우에, 아미노산 서열은 서열번호 1과 비교하여 서열번호 1의 위치 44, 45 및 47에 상응하는 위치에 치환을 포함한다. 일부 실시형태에서, 아미노산 서열은 서열번호 1의 위치 44에 상응하는 위치에 글리신; 서열번호 1의 위치 45에 상응하는 위치에 류신; 및 서열번호 1의 위치 47에 상응하는 위치에 트립토판을 포함한다. 일부 경우에, 아미노산 서열은 서열번호 1과 비교하여 서열번호 1의 위치 1, 44, 45 및 47에 상응하는 위치에 치환을 포함한다. 특정 실시형태에서, 아미노산 서열은 서열번호 1의 위치 1에 상응하는 위치에 글루탐산; 서열번호 1의 위치 44에 상응하는 위치에 글리신; 서열번호 1의 위치 45에 상응하는 위치에 류신; 및 서열번호 1의 위치 47에 상응하는 위치에 트립토판을 포함한다. 특정 경우에, 아미노산 서열은 서열번호 1과 비교하여 서열번호 1의 위치 37, 44, 45 및 47에 상응하는 위치에 치환을 포함한다. 일부 실시형태에서, 아미노산 서열은 서열번호 1의 위치 37에 상응하는 위치에 발린; 서열번호 1의 위치 44에 상응하는 위치에 글리신; 서열번호 1의 위치 45에 상응하는 위치에 류신; 및 서열번호 1의 위치 47에 상응하는 위치에 트립토판을 포함한다. 다른 예에서, 아미노산 서열은 서열번호 1과 비교하여 서열번호 1의 위치 1, 37, 44, 45 및 47에 상응하는 위치에 치환을 포함한다. 특정 실시형태에서, 아미노산 서열은 서열번호 1의 위치 1에 상응하는 위치에 글루탐산; 서열번호 1의 위치 37에 상응하는 위치에 발린; 서열번호 1의 위치 44에 상응하는 위치에 글리신; 서열번호 1의 위치 45에 상응하는 위치에 류신; 및 서열번호 1의 위치 47에 상응하는 위치에 트립토판을 포함한다. 일부 예에서, 아미노산 서열은 서열번호 1과 비교하여 서열번호 1의 위치 37, 44, 45, 47 및 79에 상응하는 위치에 치환을 포함한다. 특정 실시형태에서, 아미노산 서열은 서열번호 1의 위치 37에 상응하는 위치에 발린; 서열번호 1의 위치 44에 상응하는 위치에 글리신; 서열번호 1의 위치 45에 상응하는 위치에 류신; 서열번호 1의 위치 47에 상응하는 위치에 트립토판; 및 서열번호 1의 위치 79에 상응하는 위치에 류신을 포함한다.
특정 예에서, 아미노산 서열은 서열번호 10 내지 17 중 어느 하나에 제시된 서열이다.
또 다른 양상에서, 본 개시내용은 혈액 뇌 장벽을 가로질러 이동하는 항체 가변 도메인에 관한 것이고, 여기서 항체 가변 도메인은 서열번호 1과 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 아미노산 서열은 상보성 결정 영역(CDR)1, CDR2 및 CDR3을 포함하고, 여기서 CDR2는 서열번호 50에 제시된 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, CDR1은 서열번호 47에 제시된 서열을 포함하고, CDR3은 서열번호 51에 제시된 서열을 포함하고, 아미노산 서열은 서열번호 1의 위치 49 및 70에 상응하는 위치에 시스테인을 포함한다. 다른 실시형태에서, CDR1은 서열번호 48에 제시된 서열을 포함하고, CDR3은 서열번호 51에 제시된 서열을 포함하고, 아미노산 서열은 서열번호 1의 위치 79에 상응하는 위치에 시스테인을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, CDR1은 서열번호 49에 제시된 서열을 포함하고, CDR3은 서열번호 52에 제시된 서열을 포함한다. 다른 실시형태에서, CDR1은 서열번호 58에 제시된 서열을 포함하고, CDR3은 서열번호 52에 제시된 서열을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, CDR1은 서열번호 49에 제시된 서열을 포함하고, CDR3은 서열번호 53에 제시된 서열을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, CDR1은 서열번호 58에 제시된 서열을 포함하고, CDR3은 서열번호 53에 제시된 서열을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, CDR1은 서열번호 49에 제시된 서열을 포함하고, CDR3은 서열번호 54에 제시된 서열을 포함한다. 다른 실시형태에서, CDR1은 서열번호 58에 제시된 서열을 포함하고, CDR3은 서열번호 54에 제시된 서열을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, CDR1은 서열번호 49에 제시된 서열을 포함하고, CDR3은 서열번호 55에 제시된 서열을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, CDR1은 서열번호 58에 제시된 서열을 포함하고, CDR3은 서열번호 55에 제시된 서열을 포함한다.
일부 예에서, 아미노산 서열은 서열번호 1과 비교하여 서열번호 1의 위치 1, 5, 6, 14, 37, 44, 45, 47, 75, 87, 88, 93, 114 또는 117에 상응하는 위치 중 하나 이상(예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 또는 14개)에 치환을 포함한다. 일부 실시형태에서, 아미노산 서열은 서열번호 1의 위치 1에 상응하는 위치에 글루탐산; 서열번호 1의 위치 5에 상응하는 위치에 발린; 서열번호 1의 위치 6에 상응하는 위치에 글루탐산; 서열번호 1의 위치 14에 상응하는 위치에 프롤린; 서열번호 1의 위치 37에 상응하는 위치에 발린; 서열번호 1의 위치 44에 상응하는 위치에 글리신; 서열번호 1의 위치 45에 상응하는 위치에 류신; 서열번호 1의 위치 47에 상응하는 위치에 트립토판; 서열번호 1의 위치 75에 상응하는 위치에 세린; 서열번호 1의 위치 87에 상응하는 위치에 아르기닌; 서열번호 1의 위치 88에 상응하는 위치에 알라닌; 서열번호 1의 위치 93에 상응하는 위치에 발린; 서열번호 1의 위치 114에 상응하는 위치에 글루타민; 또는 서열번호 1의 위치 117에 상응하는 위치에 류신 중 하나 이상(예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14개)을 포함한다.
특정 예에서, 아미노산 서열은 서열번호 1과 비교하여 서열번호 1의 위치 5, 6, 14, 75, 87, 88, 93, 114 또는 117에 상응하는 위치 중 하나 이상(예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9개)에 치환을 포함한다. 일 실시형태에서, 아미노산 서열은 서열번호 1의 위치 5에 상응하는 위치에 발린; 서열번호 1의 위치 6에 상응하는 위치에 글루탐산; 서열번호 1의 위치 14에 상응하는 위치에 프롤린; 서열번호 1의 위치 75에 상응하는 위치에 세린; 서열번호 1의 위치 87에 상응하는 위치에 아르기닌; 서열번호 1의 위치 88에 상응하는 위치에 알라닌; 서열번호 1의 위치 93에 상응하는 위치에 발린; 서열번호 1의 위치 114에 상응하는 위치에 글루타민; 또는 서열번호 1의 위치 117에 상응하는 위치에서 류신 중 하나 이상(예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9개)을 포함한다.
다른 예에서, 아미노산 서열은 서열번호 1과 비교하여 서열번호 1의 위치 44 및 45에 상응하는 위치에 치환을 포함한다. 일부 실시형태에서, 아미노산 서열은 서열번호 1의 위치 44에 상응하는 위치에 글리신; 및 서열번호 1의 위치 45에 상응하는 위치에 류신을 포함한다.
또 다른 예에서, 아미노산 서열은 서열번호 1과 비교하여 서열번호 1의 위치 1, 44 및 45에 상응하는 위치에 치환을 포함한다. 일 실시형태에서, 아미노산 서열은 서열번호 1의 위치 1에 상응하는 위치에 글루탐산; 서열번호 1의 위치 44에 상응하는 위치에 글리신; 및 서열번호 1의 위치 45에 상응하는 위치에 류신을 포함한다.
일부 예에서, 아미노산 서열은 서열번호 1과 비교하여 서열번호 1의 위치 44, 45 및 47에 상응하는 위치에 치환을 포함한다. 일 실시형태에서, 아미노산 서열은 서열번호 1의 위치 44에 상응하는 위치에 글리신; 서열번호 1의 위치 45에 상응하는 위치에 류신; 및 서열번호 1의 위치 47에 상응하는 위치에 트립토판을 포함한다.
또 다른 예에서, 아미노산 서열은 서열번호 1과 비교하여 서열번호 1의 위치 1, 44, 45 및 47에 상응하는 위치에 치환을 포함한다. 일 실시형태에서, 아미노산 서열은 서열번호 1의 위치 1에 상응하는 위치에 글루탐산; 서열번호 1의 위치 44에 상응하는 위치에 글리신; 서열번호 1의 위치 45에 상응하는 위치에 류신; 및 서열번호 1의 위치 47에 상응하는 위치에 트립토판을 포함한다.
특정 예에서, 아미노산 서열은 서열번호 1과 비교하여 서열번호 1의 위치 37, 44, 45 및 47에 상응하는 위치에 치환을 포함한다. 일 실시형태에서, 아미노산 서열은 서열번호 1의 위치 37에 상응하는 위치에 발린; 서열번호 1의 위치 44에 상응하는 위치에 글리신; 서열번호 1의 위치 45에 상응하는 위치에 류신; 및 서열번호 1의 위치 47에 상응하는 위치에 트립토판을 포함한다.
일부 예에서, 아미노산 서열은 서열번호 1과 비교하여 서열번호 1의 위치 1, 37, 44, 45 및 47에 상응하는 위치에 치환을 포함한다. 일 실시형태에서, 아미노산 서열은 서열번호 1의 위치 1에 상응하는 위치에 글루탐산; 서열번호 1의 위치 37에 상응하는 위치에 발린; 서열번호 1의 위치 44에 상응하는 위치에 글리신; 서열번호 1의 위치 45에 상응하는 위치에 류신; 및 서열번호 1의 위치 47에 상응하는 위치에 트립토판을 포함한다.
다른 예에서, 아미노산 서열은 서열번호 1과 비교하여 서열번호 1의 위치 37, 44, 45, 47 및 79에 상응하는 위치에 치환을 포함한다. 일 실시형태에서, 아미노산 서열은 서열번호 1의 위치 37에 상응하는 위치에 발린; 서열번호 1의 위치 44에 상응하는 위치에 글리신; 서열번호 1의 위치 45에 상응하는 위치에 류신; 서열번호 1의 위치 47에 상응하는 위치에 트립토판; 및 서열번호 1의 위치 79에 상응하는 위치에 류신을 포함한다.
특정 예에서, 아미노산 서열은 서열번호 1의 위치 1, 37, 44, 45, 47 및 79에 상응하는 위치에 서열번호 1과 비교하여 치환을 포함한다. 일 실시형태에서, 아미노산 서열은 서열번호 1의 위치 1에 상응하는 위치에 글루탐산; 서열번호 1의 위치 37에 상응하는 위치에 발린; 서열번호 1의 위치 44에 상응하는 위치에 글리신; 서열번호 1의 위치 45에 상응하는 위치에 류신; 서열번호 1의 위치 47에 상응하는 위치에 트립토판; 및 서열번호 1의 위치 79에 상응하는 위치에 류신을 포함한다.
일 실시형태에서, 아미노산 서열은 서열번호 20에 제시된 서열이다. 또 다른 실시형태에서, 아미노산 서열은 서열번호 21에 제시된 서열이다. 또 다른 실시형태에서, 아미노산 서열은 서열번호 22에 제시된 서열이다. 또 다른 실시형태에서, 아미노산 서열은 서열번호 23에 제시된 서열이다. 또 다른 실시형태에서, 아미노산 서열은 서열번호 24에 제시된 서열이다. 다른 실시형태에서, 아미노산 서열은 서열번호 25에 제시된 서열이다. 또 다른 실시형태에서, 아미노산 서열은 서열번호 26에 제시된 서열이다. 다른 실시형태에서, 아미노산 서열은 서열번호 27에 제시된 서열이다. 또 다른 실시형태에서, 아미노산 서열은 서열번호 28에 제시된 서열이다.
또 다른 양상에서, 본 개시내용은 상기 기재된 임의의 항체 가변 도메인을 포함하는 키메라 분자를 특징으로 한다.
특정 예에서, 키메라 분자는 항체 Fc 영역을 포함한다. 일부 예에서, 키메라 분자는 항체, 항체의 항원 결합 단편(예컨대, Fab), 단일 사슬 항체, 디아바디(diabody), 나노바디(nanobody), 효소, 핵산(예컨대, 안티센스 올리고뉴클레오타이드), 소분자 약물, 또는 핵산(예컨대, 안티센스 올리고뉴클레오타이드), 소분자 약물 또는 펩타이드를 캡슐화하는 리포솜 또는 지질 나노입자를 포함한다. 일부 예에서, 키메라 분자는 안키린-반복체(Darpins), 피브로넥틴(Adnectins), 단백질 A(Affibodies) 또는 Stefin A(Affimers)와 같은 디스플레이 스캐폴드를 포함한다.
일부 예에서, 키메라 분자의 항체 가변 도메인은 직접 또는 개재(intervening) 아미노산 서열을 통해 항체의 힌지 영역의 N-말단에 연결된다. 힌지 영역의 C-말단은 Fc 모이어티(moiety)에 융합된다. 특정 실시형태에서, 키메라 분자는 항체 가변 도메인과 관련하여 2가이다(즉, 각각 직접 또는 개재 아미노산 서열을 통해 항체의 힌지 영역의 N-말단에 연결된 2개의 항체 가변 도메인을 포함하고, 여기서 힌지 영역의 C-말단은 Fc 모이어티에 융합됨).
특정 경우에, 힌지 영역은 서열 AEPKSCD(서열번호 56), AEPKSSD(서열번호 59) 또는 KTHTCPPCP(서열번호 19)를 포함한다.
일부 경우에, 개재 아미노산 서열은 항체의 중쇄 가변 영역; 항체의 경쇄 가변 영역; 효소; 펩타이드, 또는 아미노산 서열 3X(G4S)(서열번호 60), G4S(서열번호 5), GG 또는 G를 포함하는 링커를 포함한다.
일부 경우에, Fc 모이어티는 hIgG1 Fc, hIgG2 Fc, hIgG3 Fc, hIgG4 Fc, hIgG1agly Fc, hIgG2 SAA Fc, hIgG4(S228P) Fc, hIgG4(S228P)/G1 agly Fc이다(이 형식에서 - 이펙터 기능을 최소화함 - CH1 및 CH2 도메인은 '고정된' 힌지(S228P)를 가진 IgG4이고, 비글리코실화됨)이다. CH3 도메인은 hIgG1, 또는 hIgG4(S228P)agly Fc이다.
특정 경우에, Fc 모이어티는 직접 또는 제2의 개재 아미노산 서열을 통해 제2 항체 가변 도메인[예를 들어, 치료 항체의 가변 도메인(들)]; Fab; scFv; 단일 도메인 항체; 나노바디, 디아바디, 펩타이드; 효소; 또는 핵산(예컨대, 안티센스 올리고뉴클레오타이드)을 포함하는 폴리펩타이드에 연결된다.
일부 경우에, 키메라 분자에서 힌지 영역은 핵산에 연결된다. 일부 경우에, 키메라 분자에서 힌지 영역은 핵산에 화학적으로 접합된다. 특정 실시형태에서, 핵산은 안티센스 올리고뉴클레오타이드이다.
또 다른 양상에서, 본 개시내용은 리포솜, 중합체성 나노캐리어 또는 지질 나노입자에 직접 또는 개재 아미노산 서열을 통해 연결된 본 명세서에 기재된 항체 가변 도메인을 포함하는 키메라 분자를 제공한다.
일부 예에서, 리포솜, 중합체성 나노캐리어 또는 지질 나노입자는 소분자 또는 핵산을 캡슐화한다. 일부 예에서, 리포솜, 중합체성 나노캐리어 또는 지질 나노입자는 펩타이드를 캡슐화한다. 일부 예에서, 리포솜, 중합체성 나노캐리어 또는 지질 나노입자는 효소를 캡슐화한다. 일부 예에서, 리포솜, 중합체성 나노캐리어 또는 지질 나노입자는 항체 또는 항체 단편(Fab, Fab'2, scFv 포함)을 캡슐화한다. 일부 예에서, 리포솜, 중합체성 나노캐리어 또는 지질 나노입자는 나노바디를 캡슐화한다. 일부 예에서, 리포솜, 중합체성 나노캐리어 또는 지질 나노입자는 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 캡슐화한다. 일부 실시형태에서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 갭머(gapmer)이다. 다른 실시형태에서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 스플라이스 교환 안티센스 올리고뉴클레오타이드(splice switching antisense oligonucleotide)이다.
또 다른 양상에서, 본 개시내용은 본 명세서에 기재된 항체 가변 도메인을 포함하는 키메라 분자를 제공하고, 여기서 항체 가변 도메인은 전체 항체에 직접 또는 개재 아미노산 서열을 통해 연결된다. 일부 실시형태에서, 전체 항체는 인간 LINGO-1, 인간 LINGO-2, 인간 LINGO-3, 인간 LINGO-4, 인간 NOGO 수용체 인간 TREM2, 인간 염색체 9 오픈 리딩 프레임 72(C9orf72) 유전자로부터 해독된 것으로서 적어도 6개의 반복체 (GA)6을 갖는 폴리-글리신-알라닌(GA)의 다이펩타이드 반복체(DPR)(인간 C9orf72 DPR), 인간 TWEAK, 인간 TWEAK 수용체, 인간 베타 아밀로이드, 인간 타우(tau), 인간 알파-시누클레인(synuclein), 인간 TDP-43, 인간 DR6, 인간 SOD1, DR6, JC 바이러스(또는 다른 감염성 질환 표적), 또는 인간 ErbB2, VEGF, CD20, Her2(또는 다른 인간 뇌암 표적)에 결합하는 항체이다. 일부 경우에, 전체 항체는 베바시주맙(bevacizumab), 리툭시맙(rituximab), 트라스투주맙(trastuzumab), 항-PD1 항체 또는 항-PDL-L1 항체이다.
또 다른 양상에서, 본 개시내용은 본 명세서에 기재된 항체 가변 도메인 및 인간 혈청 알부민, 또는 인간 혈청 알부민 결합 모이어티를 포함하는 키메라 분자를 제공한다. 일부 예에서, 이 키메라 분자는 치료제를 더 포함한다. 일 실시형태에서, 치료제는 항체 가변 도메인[예를 들어, 치료 항체의 가변 도메인(들)]; Fab; scFv; 단일 도메인 항체; 나노바디, 디아바디, 펩타이드; 효소; 핵산(예컨대, 안티센스 올리고뉴클레오타이드)이다.
또 다른 양상에서, 본 개시내용은 도 49에 제시된 임의의 분자를 포괄하는 키메라 분자를 제공한다. 일부 경우에, 예시된 분자의 Fc 영역은 인간 혈청 알부민으로 대체되고 이러한 키메라 분자도 본 개시내용의 일부이다. 일부 예에서, 화물(cargo)은 설프하이드릴(말레이미드, 요오도, 비닐설폰)과 같은 화학적 접합을 사용하여 연결된다.
또 다른 양상에서, 본 개시내용은 치료 벡터를 함유하는 바이러스 캡시드(예컨대, AAV)에 직접 또는 개재 아미노산 서열을 통해 연결된 본 명세서에 기재된 항체 가변 도메인을 포함하는 키메라 분자를 제공한다. 예를 들어, 문헌[Naso et al., BioDrugs. 2017; 31(4): 317-334] 참조.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 (1) (i) 본 명세서에 기재된 항체 가변 도메인, 및 (ii) 항체의 제1 힌지 영역 및 제1 Fc 모이어티를 포함하되, 제1 힌지 영역의 C-말단은 제1 Fc 모이어티의 N-말단에 연결되는 제1 단백질을 포함하고, 항체 가변 도메인의 C-말단은 직접 또는 개재 아미노산 서열을 통해 제1 힌지 영역의 N-말단에 융합되는 키메라 단백질; (2) 항체의 제2 힌지 영역 및 제2 Fc 모이어티를 포함하되, 제2 힌지 영역의 C-말단은 제2 Fc 모이어티의 N-말단에 연결되는 제2 단백질; 및 (3) 치료제를 포함하되, 제2 단백질은 제1 단백질과 쌍을 이루는, 조성물을 특징으로 한다. 일부 예에서, 링커는 제1 항체 가변을 제1 단백질에; 및/또는 키메라 단백질을 치료제에 연결한다. 일부 경우에, 링커는 3X(G4S)(서열번호 60), G4S(서열번호 5), GG 또는 G이다.
또 다른 양상에서, 본 개시내용은 (1) (i) 본 명세서에 개시된 항체 가변 도메인 중 어느 하나의 제1 항체 가변 도메인; 및 (ii) 항체의 제1 힌지 영역 및 제1 Fc 모이어티를 포함하되, 제1 힌지 영역의 C-말단은 제1 Fc 모이어티의 N-말단에 연결되는 제1 단백질을 포함하고, 여기서 제1 항체 가변 도메인의 C-말단은 직접 또는 개재 아미노산 서열을 통해 제1 힌지 영역의 N-말단에 융합되는 제1 키메라 단백질; (2) (i) 본 명세서에 개시된 항체 가변 도메인 중 어느 하나의 제2 항체 가변 도메인; 및 (ii) 항체의 제2 힌지 영역 및 제2 Fc 모이어티를 포함하되, 제2 힌지 영역의 C-말단은 제2 Fc 모이어티의 N-말단에 연결되는 제2 단백질을 포함하고, 제2 항체 가변 도메인의 C-말단은 직접 또는 개재 아미노산 서열을 통해 제2 힌지 영역의 N-말단에 융합되는 제2 키메라 단백질; 및 (3) 치료제를 포함하되, 제2 단백질이 제1 단백질과 쌍을 이루는 조성물을 제공한다. 일부 예에서, 링커는 제1 항체 가변을 제1 단백질에; 및/또는 제2 항체 가변을 제2 단백질에; 및/또는 키메라 단백질을 치료제에 연결한다. 일부 경우에, 링커는 3X(G4S)(서열번호 60), G4S(서열번호 5), GG 또는 G이다.
다른 양상에서, 본 개시내용은 (1) (i) 본 명세서에 개시된 항체 가변 도메인 중 어느 하나의 제1 항체 가변 도메인; 및 (ii) 항체의 제1 힌지 영역 및 제1 Fc 모이어티를 포함하되, 제1 힌지 영역의 C-말단은 제1 Fc 모이어티의 N-말단에 연결되는 제1 단백질을 포함하고, 여기서 제1 항체 가변 도메인의 C-말단은 제1 개재 아미노산 서열을 통해 제1 힌지 영역의 N-말단에 융합되는 제1 키메라 단백질; 및 (2) (i) 본 명세서에 개시된 항체 가변 도메인 중 어느 하나의 제2 항체 가변 도메인; 및 (ii) 항체의 제2 힌지 영역 및 제2 Fc 모이어티를 포함하되, 제2 힌지 영역의 C-말단은 제2 Fc 모이어티의 N-말단에 연결되는 제2 단백질을 포함하고, 여기서 제2 항체 가변 도메인의 C-말단은 제2 개재 아미노산 서열을 통해 제2 힌지 영역의 N-말단에 융합되는 제2 키메라 단백질을 포함하는 조성물로서, 여기서 제2 단백질은 제1 단백질과 쌍을 이루고; 제1 및 제2 개재 아미노산 서열은 치료제인 Fab를 포함하는 조성물을 특징으로 한다. 일부 예에서, 링커는 제1 항체 가변을 제1 단백질에; 및/또는 제2 항체 가변을 제2 단백질에; 및/또는 키메라 단백질을 치료제에 연결한다. 일부 경우에, 링커는 3X(G4S)(서열번호 60), G4S(서열번호 5), GG 또는 G이다.
일부 예에서, 힌지 영역은 서열 AEPKSCD(서열번호 56) 또는 AEPKSSD(서열번호 59)를 포함한다. 다른 예에서, 힌지 영역은 서열 KTHTCPPCP(서열번호 19)를 포함한다.
특정 예에서, 제1 및 제2 Fc 모이어티는 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 다른 예에서, 제1 및 제2 Fc 모이어티는 상이한 아미노산 서열을 갖는다.
일부 경우에, 제1 및/또는 제2 Fc 모이어티는 비글리코실화된다.
특정 예에서, 제1 및 제2 Fc 모이어티는 hIgG1 Fc, hIgG2 Fc, hIgG3 Fc, hIgG4 Fc, hIgG1agly Fc, hIgG2 SAA Fc, hIgG4(S228P) Fc, hIgG4(S228P)/G1 agly Fc, 및 hIgG4(S228P) agly Fc로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 예에서, 상기 기재된 조성물은 반감기를 연장시키는 모이어티를 더 포함한다. 일부 경우에, 제1 및/또는 제2 Fc 모이어티는 반감기를 연장시키는 역할을 하는, 야생형 Fc의 돌연변이된 변이체이다. YTE 및 LS와 같은 Fc 변이체는 인간에서 향상된 항체 반감기를 초래하였다. 일부 예에서, 변이체 Fc 영역은 위치 428 및 434에 아미노산 치환을 포함한다는 점에서 부모 Fc 영역과 상이하고, 여기서 상기 아미노산 치환은 M428L 및 N434S이다. 예를 들어, 미국 특허 번호 8546543 및 8624007; US20140056879A1; 문헌[Brian J. Booth, et al.(2018) Extending human IgG half-life using structure-guided design, mAbs, DOI: 10.1080/19420862.2018.1490119; 및 Shen Y, et al.(2017) Increased half-life and enhanced potency of Fc-modified human PCSK9 monoclonal antibodies in primates. PLoS ONE 12(8): e0183326.doi.org/10.1371/journal.pone.0183326] 참조. 다른 경우에, 조성물은 반감기를 연장하는 HSA 돌연변이체를 더 포함한다. 예를 들어, US8748380; 및 WO2014179657A1 참조. 일부 예에서, HSA 변이체는 Y411, V415, V418, T422, L423, V426, L430, L453, L457, L460, V473, R485, F488, L491, F502, F507, F509, K525, A528, L529, L532, V547, M548, F551, K573, L575, V576, S579 및 L583으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 잔기에서 돌연변이된다. 또 다른 경우에, 조성물은 XTEN을 더 포함한다. 예를 들어, WO2013130683A2 및 문헌[Podust et al., Journal of Controlled Release, Volume 240, 28 Octorber 2016, Pages 52-66] 참조.
일부 경우에, 제1 및 제2 힌지 영역은 동일한 아미노산 서열을 갖는다.
특정 예에서, 치료제는 항체 가변 도메인을 포함하는 결합 분자이다. 일 실시형태에서, 결합 분자는 인간 LINGO-1, 인간 LINGO-2, 인간 LINGO-3, 인간 LINGO-4, 인간 TREM2, 인간 C9orf72 DPR), 인간 TWEAK, 인간 TWEAK 수용체, 인간 베타 아밀로이드, 인간 타우, 인간 알파-시누클레인 또는 인간 TDP-43에 결합한다. 일부 경우에, 결합 분자는 Fab이고, Fab의 VH 또는 VL 도메인의 N-말단은 제1 Fc 모이어티의 C-말단에 연결된다.
일부 예에서, 치료제는 안티센스 올리고뉴클레오타이드이다. 일 실시형태에서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 갭머이다. 다른 실시형태에서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 스플라이스 교환 안티센스 올리고뉴클레오타이드이다. 일부 경우에, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 제1 및/또는 제2 힌지 영역에 연결된다.
특정 예에서, 치료제는 소분자 약물, 펩타이드, 효소, 나노바디, 또는 리포솜, 중합체성 나노캐리어, 또는 지질 나노입자에 캡슐화된 핵산(예컨대, 안티센스 올리고뉴클레오타이드)이다.
또 다른 양상에서, 본 개시내용은 (1) (i) 본 명세서에 기재된 항체 가변 도메인 중 어느 하나의 항체 가변 도메인, 및 (ii) 항체 경쇄를 포함하되, 항체 가변 도메인의 C-말단은 직접 또는 개재 아미노산 서열을 통해 항체 경쇄의 N-말단에 융합되는 키메라 단백질; 및 (2) 항체의 경쇄와 쌍을 이루는 항체의 중쇄를 포함하는 조성물을 제공한다.
또 다른 양상에서, 본 개시내용은 (1) (i) 본 명세서에 기재된 항체 가변 도메인 중 어느 하나의 항체 가변 도메인; 및 (ii) 항체 중쇄를 포함하되, 항체 가변 도메인의 C-말단은 직접 또는 개재 아미노산 서열을 통해 항체 중쇄의 N-말단에 융합되는 키메라 단백질; 및 (2) 항체 중쇄와 쌍을 이루는 항체 경쇄를 포함하는 조성물을 특징으로 한다.
또 다른 양상에서, 본 개시내용은 (1) (i) 본 명세서에 기재된 항체 가변 도메인 중 어느 하나의 제1 항체 가변 도메인, 및 (ii) 항체 경쇄를 포함하되, 제1 항체 가변 도메인의 C-말단은 직접 또는 개재 아미노산 서열을 통해 항체 경쇄의 N-말단에 융합된 제1 키메라 단백질; 및 (2) (i) 본 명세서에 기재된 항체 가변 도메인 중 어느 하나의 제2 항체 가변 도메인, 및 (ii) 항체 중쇄를 포함하되, 제2 항체 가변 도메인의 C-말단은 직접 또는 개재 아미노산 서열을 통해 항체 중쇄의 N-말단에 융합된 제2 키메라 단백질을 포함하는 조성물을 제공한다.
일부 예에서, 개재 아미노산 서열은 3X(G4S)(서열번호 60), G4S(서열번호 5), GG 또는 G이다.
특정 예에서, 항체는 인간 LINGO-1, 인간 LINGO-2, 인간 LINGO-3, 인간 LINGO-4, 인간 TREM2, 인간 C9orf72 DPR, 인간 TWEAK, 인간 TWEAK 수용체, 인간 베타 아밀로이드, 인간 타우, 인간 알파-시누클레인, 또는 인간 TDP-43에 결합한다. 일부 실시형태에서, 항체는 Li81, Li113, huP2D10, 12F6A, 12F4, 21D11, 6C5, 40E8, BMS-986168, 15O7, 5J10, 41D1, 14W3 및 51C1로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체의 6개 CDR을 포함한다. 다른 실시형태에서, 항체는 Li81, Li113, huP2D10, 12F6A, 12F4, 21D11, 6C5, 40E8, BMS-986168, 15O7, 5J10, 41D1, 14W3 및 51C1로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체의 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 항체는 Li81, Li113, huP2D10, 12F6A, 12F4, 21D11, 6C5, 40E8, BMS-986168, 15O7, 5J10, 41D1, 14W3, 및 51C1로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체의 중쇄 및 경쇄를 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 개시내용은 (i) 본 명세서에 기재된 항체 가변 도메인 중 어느 하나의 항체 가변 도메인, (ii) 항체의 힌지 영역 및 Fc 모이어티를 포함하는 단백질, 및 (iii) 치료제를 포함하되, 항체 가변 도메인의 C-말단은 직접 또는 개재 아미노산 서열을 통해 단백질의 힌지 영역의 N-말단에 융합된 키메라 단백질을 포함하는 조성물을 특징으로 한다. 일부 경우에, 조성물은 키메라 단백질의 이량체를 포함한다. 일부 경우에, 힌지 영역은 서열 AEPKSCD(서열번호 56) 또는 AEPKSSD(서열번호 59)를 포함한다. 다른 경우에, 힌지 영역은 서열 KTHTCPPCP(서열번호 19)를 포함한다. 특정 경우에, Fc 모이어티는 비글리코실화된다. 일부 경우에, Fc 모이어티는 hIgG1 Fc, hIgG2 Fc, hIgG3 Fc, hIgG4 Fc, hIgG1agly Fc, hIgG2 SAA Fc, hIgG4(S228P)/G1 agly Fc, hIgG4(S228P) Fc, hIgG4(S228P) agly Fc로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 경우에, 항체 가변 도메인의 C-말단은 단백질의 힌지 영역의 N-말단에 직접 융합된다. 특정 경우에, 치료제는 제2 항체 가변 도메인을 포함하는 결합 분자이다. 일부 실시형태에서, 결합 분자는 인간 LINGO-1, 인간 LINGO-2, 인간 LINGO-3, 인간 LINGO-4, 인간 TREM2, 인간 C9orf72 DPR, 인간 TWEAK, 인간 TWEAK 수용체, 인간 베타 아밀로이드, 인간 타우, 인간 알파-시누클레인, 또는 인간 TDP-43에 결합한다. 일부 예에서, 결합 분자는 Fab이고 Fab의 VH 또는 VL 도메인의 N-말단은 Fc 모이어티의 C-말단에 연결된다. 특정 예에서, 치료제는 안티센스 올리고뉴클레오타이드이다. 일 실시형태에서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 스플라이스 교환 올리고뉴클레오타이드이다. 또 다른 실시형태에서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 갭머이다. 특정 경우에, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 힌지 영역에 연결된다. 일부 경우에, 치료제는 리포좀, 중합체성 나노캐리어 또는 지질 나노입자 내에 캡슐화된 소분자, 펩타이드, 효소, 단일 사슬 항체, 나노바디 또는 핵산(예컨대, ASO)이다.
또 다른 양상에서, 본 개시내용은 본 명세서에 기재된 항체 가변 도메인, 본 명세서에 기재된 키메라 분자, 또는 본 명세서에 기재된 임의의 조성물, 및 약제학적 허용성 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
또 다른 양상에서, 본 개시내용은 본 명세서에 기재된 항체 가변 도메인, 키메라 분자 또는 조성물을 암호화하는 핵산 또는 핵산들을 제공한다.
또 다른 양상에서, 본 개시내용은 이러한 핵산을 포함하는 벡터 또는 벡터들을 제공한다.
또 다른 양상에서, 본 개시내용은 상기 벡터 또는 벡터들을 포함하는 숙주 세포를 특징으로 한다.
또 다른 양상에서, 본 개시내용은 항체 가변 도메인, 키메라 분자 또는 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 방법은 항체 가변 도메인, 키메라 분자 또는 조성물의 발현을 초래하는 조건하에 세포 배양 배지에서 상기 기재된 숙주 세포를 배양하고, 세포 배양 배지로부터 항체 가변 도메인, 키메라 분자 또는 조성물을 단리하는 것을 포함한다. 일부 예에서, 숙주 세포는 CHO 세포, COS 세포 또는 HEK293 세포이다. 다른 예에서, 숙주 세포는 박테리아 세포이다. 또 다른 예에서, 숙주 세포는 효모 세포[예를 들어, 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe)]이다. 특정 예에서, 숙주 세포는 진균 세포[예를 들어, 아스퍼질러스(Aspergillus)]이다.
또 다른 양상에서, 본 개시내용은 본 명세서에 기재된 항체 가변 도메인을 포함하는 융합 폴리펩타이드를 생산하는 방법을 제공한다. 이 방법은 융합 폴리펩타이드의 발현을 초래하는 조건하에 세포 배양 배지에서 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 벡터(들)를 함유하는 숙주 세포를 배양하고, 세포 배양 배지로부터 융합 폴리펩타이드를 단리하는 것을 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 개시내용은 필요로 하는 인간 대상체에서 알츠하이머 병을 치료하는 방법을 제공한다. 이 방법은 인간 베타-아밀로이드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 직접 또는 개재 아미노산 서열을 통해 연결된 본 명세서에 기재된 항체 가변 도메인을 포함하는 키메라 분자를 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 특정 예에서, 개재 아미노산 서열은 3X(G4S)(서열번호 60), G4S(서열번호 5), GG 또는 G 링커이다. 다른 예에서, 개재 아미노산 서열은 Fc 모이어티에 융합된 항체의 힌지 영역을 포함한다. 일부 경우에, 항원 결합 단편은 Fab이다. 일부 경우에, 항체 또는 항원 결합 단편은 12F6A의 6개 CDR을 포함한다(미국 특허 번호 8,906,367 참조). 일부 경우에, 항체 또는 항원 결합 단편은 12F6A의 VH 및 VL을 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 개시내용은 필요로 하는 인간 대상체에서 진행성 핵상 마비(PSP) 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 인간 베타-아밀로이드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 직접 또는 개재 아미노산 서열을 통해 연결된 본 명세서에 기재된 항체 가변 도메인을 포함하는 키메라 분자를 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 특정 예에서, 개재 아미노산 서열은 3X (G4S)(서열번호 60), G4S(서열번호 5), GG 또는 G 링커이다. 다른 예에서, 개재 아미노산 서열은 Fc 모이어티에 융합된 항체의 힌지 영역을 포함한다. 일부 예에서, 항원 결합 단편은 Fab이다. 일부 경우에, 항체 또는 항원 결합 단편은 12F6A의 6개 CDR을 포함한다(미국 특허 번호 8,906,367 참조). 일부 경우에, 항체 또는 항원 결합 단편은 12F6A의 VH 및 VL을 포함한다.
또 다른 예에서, 본 개시내용은 필요로 하는 인간 대상체에서 시누클레인병증(synucleinopathy)(예컨대, 파킨슨병)을 치료하는 방법을 특징으로 한다. 이 방법은 인간 알파 시누클레인에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 직접 또는 개재 아미노산 서열을 통해 연결된 본 명세서에 기재된 항체 가변 도메인을 포함하는 키메라 분자를 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 특정 예에서, 개재 아미노산 서열은 3X(G4S)(서열번호 60), G4S(서열번호 5), GG 또는 G 링커이다. 다른 예에서, 개재 아미노산 서열은 Fc 모이어티에 융합된 항체의 힌지 영역을 포함한다. 일부 예에서, 항원 결합 단편은 Fab이다. 일부 경우에, 항체 또는 항원 결합 단편은 12F4(미국 특허 번호 8,940,276 참조) 또는 21D11(미국 특허 번호 9,580,493 참조)의 6개 CDR을 포함한다. 일부 경우에, 항체 또는 항원 결합 단편은 12F4 또는 21D11의 VH 및 VL을 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 개시내용은 필요로 하는 인간 대상체에서 타우병증(예컨대, 알츠하이머 병)을 치료하는 방법을 특징으로 한다. 이 방법은 인간 타우에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 직접 또는 개재 아미노산 서열을 통해 연결된 본 명세서에 기재된 항체 가변 도메인을 포함하는 키메라 분자를 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 특정 예에서, 개재 아미노산 서열은 3X(G4S)(서열번호 60), G4S(서열번호 5), GG 또는 G 링커이다. 다른 경우에, 개재 아미노산 서열은 Fc 모이어티에 융합된 항체의 힌지 영역을 포함한다. 일부 경우에, 항원 결합 단편은 Fab이다. 일부 경우에, 항체 또는 항원 결합 단편은 6C5, 40E8(미국 특허 번호 9,598,484 참조), 4E4(미국 특허 번호 9,605,059 참조) 또는 BMS-986168/hIPN002(미국 특허 번호 9,447,180 및 미국 출원 공개번호 US2017/0174755A1 참조)의 6개 CDR을 포함한다. 일부 경우에, 항체 또는 항원 결합 단편은 6C5, 40E8, 4E4 또는 BMS-986168/hIPN002의 VH 및 VL을 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 개시내용은 필요로 하는 인간 대상체에서 진행성 핵상 마비를 치료하는 방법을 특징으로 한다. 방법은 인간 타우에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 직접 또는 개재 아미노산 서열을 통해 연결된 본 명세서에 기재된 항체 가변 도메인을 포함하는 키메라 분자를 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 특정 예에서, 개재 아미노산 서열은 3X(G4S)(서열번호 60), G4S(서열번호 5), GG 또는 G 링커이다. 다른 예에서, 개재 아미노산 서열은 Fc 모이어티에 융합된 항체의 힌지 영역을 포함한다. 일부 예에서, 항원 결합 단편은 Fab이다. 일부 경우에, 항체 또는 항원 결합 단편은 6C5, 40E8(미국 특허 번호 9,598,484 참조), 4E4(미국 특허 번호 9,605,059 참조) 또는 BMS-986168/hIPN002(미국 특허 번호 9,447,180 및 미국 출원 공개번호 US2017/0174755A1 참조)의 6개 CDR을 포함한다. 일부 경우에, 항체 또는 항원 결합 단편은 6C5, 40E8, 4E4 또는 BMS-986168/hIPN002의 VH 및 VL을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 필요로 하는 인간 대상체에서 전두측두엽 치매를 치료하는 방법을 특징으로 한다. 이 방법은 인간 TDP-43에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 직접 또는 개재 아미노산 서열을 통해 연결된 본 명세서에 기재된 항체 가변 도메인을 포함하는 키메라 분자를 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 특정 예에서, 개재 아미노산 서열은 3X(G4S)(서열번호 60), G4S(서열번호 5), GG 또는 G 링커이다. 다른 예에서, 개재 아미노산 서열은 Fc 모이어티에 융합된 항체의 힌지 영역을 포함한다. 일부 예에서, 항원 결합 단편은 Fab이다. 일부 경우에, 항체 또는 항원 결합 단편은 41D1, 14W3, 51C1(미국 특허 번호 9,587,014 참조) 또는 C9orf72 DPR의 6개 CDR을 포함한다. 일부 경우에, 항체 또는 항원 결합 단편은 41D1, 14W3, 51C1, 또는 항-C9orf72 DPR 항체의 VH 및 VL(예컨대, 본 명세서에 개시된 것들)을 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 개시내용은 필요로 하는 인간 대상체에서 근위축성 측삭 경화증(ALS)을 치료하는 방법을 특징으로 한다. 이 방법은 인간 SOD1, DR6 또는 C9orf72 DPR에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 직접 또는 개재 아미노산 서열을 통해 연결된 본 명세서에 기재된 항체 가변 도메인을 포함하는 키메라 분자를 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 특정 예에서, 개재 아미노산 서열은 3X(G4S)(서열번호 60), G4S(서열번호 5), GG 또는 G 링커이다. 다른 예에서, 개재 아미노산 서열은 Fc 모이어티에 융합된 항체의 힌지 영역을 포함한다. 일부 예에서, 항원 결합 단편은 Fab이다. 일부 경우에, 항체 또는 항원 결합 단편은 미국 특허 번호 9,283,271; 8,759,029; 또는 문헌[Broering et al., doi.org/10.1371/journal.pone.0061210] 중 어느 하나에 기재된 항체의 6개 CDR을 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 개시내용은 필요로 하는 인간 대상체에서 다발성 경화증을 치료하는 방법을 제공한다. 이 방법은 인간 LINGO-1에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 직접 또는 개재 아미노산 서열을 통해 연결된 본 명세서에 기재된 항체 가변 도메인을 포함하는 키메라 분자를 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 특정 예에서, 개재 아미노산 서열은 3X(G4S)(서열번호 60), G4S(서열번호 5), GG 또는 G 링커이다. 다른 예에서, 개재 아미노산 서열은 Fc 모이어티에 융합된 항체의 힌지 영역을 포함한다. 일부 예에서, 항원 결합 단편은 Fab이다. 일부 경우에, 항체 또는 항원 결합 단편은 Li81(미국 특허 번호 8,128,926 참조) 또는 Li113(미국 특허 번호 8,058,406 참조)의 6개 CDR을 포함한다. 일부 경우에, 항체 또는 항원 결합 단편은 Li81 또는 Li113의 VH 및 VL을 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 개시내용은 필요로 하는 인간 대상체에서 시신경염 (예컨대, AON)을 치료하는 방법을 제공한다. 이 방법은 인간 LINGO-1에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 직접 또는 개재 아미노산 서열을 통해 연결된 본 명세서에 기재된 항체 가변 도메인을 포함하는 키메라 분자를 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 특정 경우에, 개재 아미노산 서열은 3X(G4S)(서열번호 60), G4S(서열번호 5), GG 또는 G 링커이다. 다른 예에서, 개재 아미노산 서열은 Fc 모이어티에 융합된 항체의 힌지 영역을 포함한다. 일부 예에서, 항원 결합 단편은 Fab이다. 일부 경우에, 항체 또는 항원 결합 단편은 Li81(미국 특허 번호 8,128,926 참조) 또는 Li113(미국 특허 번호 8,058,406 참조)의 6개 CDR을 포함한다. 일부 경우에, 항체 또는 항원 결합 단편은 Li81 또는 Li113의 VH 및 VL을 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 개시내용은 필요로 하는 인간 대상체에서 척추 근육 위축을 치료하는 방법을 특징으로 한다. 이 방법은 뉴시너센(nusinersen)(CAS 등록 번호 1258984-36-9; UNII: 5Z9SP3X666)에 직접 또는 개재 아미노산 서열을 통해 연결된 본 명세서에 기재된 항체 가변 도메인을 포함하는 키메라 분자를 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 경우에, 뉴시너센은 리포솜, 중합체 나노캐리어, 또는 지질 나노입자에 캡슐화된다. 다른 경우에, 개재 아미노산 서열은 Fc 모이어티에 융합된 힌지 영역을 포함하고 뉴시너센은 힌지 영역, 키메라 분자(예컨대, 힌지 영역) 내의 조작된 시스테인(예컨대, S442C) 또는 비-표적 부위(예컨대, 아민 화학 사용)에 연결된다.
또 다른 양상에서, 본 개시내용은 항체 가변 도메인의 불안정성을 평가하는 방법을 특징으로 한다. 이 방법은 항체 가변 도메인을 제공하는 것을 수반한다. 이 항체 가변 도메인을 혈청 샘플에 첨가하여 혼합물을 만든다. 혼합물을 인큐베이션한다. 항체 가변 도메인을 정제하고 펩타이드 맵핑(mapping)을 수행한다.
또 다른 양상에서, 본 개시내용은 FC5의 안정화된 형태를 선별하는 방법을 특징으로 한다. 이 방법은 하나 이상(예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65개)의 아미노산이 서열번호 1과 상이하거나, 또는 서열번호 1과 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 FC5 변이체를 포함하는 항체 가변 도메인을 제공하는 것을 수반한다. 항체 가변 도메인을 혈청 샘플에 첨가하여 혼합물을 만든다. 이 혼합물을 인큐베이션한다. 항체 가변 도메인을 정제하고 펩타이드 맵핑을 수행한다. 증가된 펩타이드 회수를 나타내는 항체 가변 도메인은 FC5의 안정화된 형태로서 선택된다.
상기 두 양상의 일부 예에서, 혈청 샘플은 래트 혈청이다. 다른 경우에, 혈청 샘플은 인간 혈청이다. 특정 예에서, 항체 가변 도메인은 약 0.01 내지 1 ㎎/㎖의 농도로 혈청에 존재한다. 특정 예에서, 항체 가변 도메인은 약 0.05 내지 0.5 ㎎/㎖의 농도로 혈청에 존재한다. 특정 예에서, 항체 가변 도메인은 약 0.05 ㎎/㎖의 농도로 혈청에 존재한다. 특정 예에서, 항체 가변 도메인은 약 0.1 ㎎/㎖의 농도로 혈청에 존재한다. 특정 예에서, 항체 가변 도메인은 약 0.5 ㎎/㎖의 농도로 혈청에 존재한다. 일부 경우에, 혼합물은 약 25 내지 37℃에서 약 10 내지 100시간 동안 인큐베이션된다. 하나의 경우에, 혼합물은 약 37℃에서 약 70시간 동안 인큐베이션된다. 일 실시형태에서, 항체 가변 도메인은 FC5 변이체를 포함한다. 일부 경우에, FC5 변이체는 인간화된 FC5이다. 다른 경우에, FC5 변이체는 이황화 안정화된 FC5를 포함한다. 또 다른 경우에, FC5 변이체는 인간화 및 이황화 안정화된 FC5를 포함한다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 기술자가 일상적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 기재된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 예시적인 방법 및 물질이 이하에 기재된다. 본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 기타 참고 문헌은 그 전체가 참고로 포함된다. 상충되는 경우, 정의를 포함한 본 출원이 우선한다. 재료, 방법 및 실시예는 예시일 뿐이고 제한하려는 의도가 아니다.
본 발명의 다른 특징 및 이점은 이하의 상세한 설명 및 청구 범위로부터 명백해질 것이다.
도 1은 야생형 FC5 단일 도메인 항체의 아미노산 서열(서열번호 1)을 제공한다. FC5 아미노산 서열에서 각 아미노산의 위치도 제공된다(1차 서열에 따라 번호매김). CDR은 위치 23-35(CDR1), 50-66(CDR2) 및 97-111(CDR3)에 있다. CDR 1 및 3은 구조 가변성을 설명하기 위해 North 등[North, B., Lehmann, A. & Dunbrack, RL, Jr, "A New Clustering of Antibody CDR Loop Conformations", J. Mol. Biol., 406:228-256(2011)]에 따라 정의되고, CDR2는 구조 및 서열 가변성을 모두 설명하기 위해 Kabat 등[Kabat, E. A., Wu, T.T., Perry, H.M., Gottesman, K. S. & Foeller, C.(1991). Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th edit. National Institutes of Health, Bethesda, MD] 및 North 등의 정의의 통합으로서 정의된다.
도 2는 Li81의 경쇄(서열번호 2), FC5-3X(G4S)-HC Li81의 중쇄(서열번호 3) 및 FC5-3X(G4S)-LC Li81의 경쇄(서열번호 4)의 아미노산 서열을 제공한다. 이들은 작제물 3014, 3015 및 3016을 생성하는 데 사용된 작제물의 서열이다. 신호 펩타이드 서열은 더 밝은 글꼴로 표시된다.
도 3은 SDS-PAGE에 의한 FC5-(G4S)3-Li81 샘플의 특성화를 나타낸다. 샘플은 Invitrogen의 4 내지 20% 트리스-글리신(Tris-glycine) 구배 겔에서 SDS-PAGE로 처리하였다. 비환원 샘플은 분석 전에 2분 동안 95℃에서 가열하였다(왼쪽 패널). 환원된 샘플은 2% 2-머캅토에탄올을 함유하는 샘플 완충액으로 처리하고 가열하였다(오른쪽 패널). 레인 1, FC5 Li81 HC, wtLC(4D# 3014); 레인 2, Li81 wtHC, FC5 Li81 LC(4D# 3015); 레인 3, FC5 Li81 HC, FC5 Li81 LC(4D# 3016); 레인 S, 고분자량 마커.
도 4는 작제물 3014의 환원된 샘플에 대한 경쇄(상단) 및 중쇄(하단)의 디컨볼루션된(deconvoluted) 질량 스펙트럼을 도시한 것이다.
도 5는 작제물 3015의 환원된 샘플에 대한 중쇄 및 경쇄의 디컨볼루션된 질량 스펙트럼을 나타낸다.
도 6은 작제물 3016의 환원된 샘플에 대한 중쇄 및 경쇄의 디컨볼루션된 질량 스펙트럼을 도시한 것이다.
도 7은 SDS-PAGE에 의한 FC5-(G4S)1-Li81 샘플의 특성화를 예시한다. 샘플은 인비트로겐의 4 내지 20% 트리스-글리신 구배 겔에서 SDS-PAGE로 처리하였다. 비환원 샘플은 분석 전에 95℃에서 2분 동안 가열하였다. 왼쪽 패널: 레인 1, FC5(G4S)1-Li81(ID# 3438); 레인 2, FC5-Fc(G4S)1-Li81 긴 힌지(ID# 3440); 레인 3, FC5-Fc(G4S)1-Li81 짧은 힌지(ID# 3441); 레인 4 이종이량체 ID# 3442; 레인 5 이종이량체 ID# 3443; 레인 6 이종이량체 ID# 3444; 레인 7 이종이량체 ID# 3443(배치 2); 레인 S, 고 분자량 마커. 오른쪽 패널, SEC에 의한 이종이량체 ID# 3443의 정제: 레인 1, 칼럼 로드; 레인 2 내지 11, 순차 용출 분획; 레인 S, 고 분자량 마커.
도 8은 FC5-(G4S)1-Li81 작제물을 생산하는 데 사용된 작제물의 아미노산 서열을 제공한다. Li81의 경쇄(서열번호 2), FC5-(G4S)1-Li81 huIgG1 agly의 중쇄(서열번호 7), FC5-Fc-(G4S)1-Li81 huIgG1 agly 긴 힌지의 경쇄(서열번호 8) 및 FC5-Fc-(G4S)1-Li81 huIgG1 agly 짧은 힌지(서열번호 9). 신호 펩타이드 서열은 더 밝은 글꼴로 표시된다.
도 9는 FC5-(G4S)1-Li81 작제물에 대한 중쇄의 디컨볼루션된 질량 스펙트럼을 도시한 것이다. Li81/FC5 변이체 1-FC5-(G4S)1-Li81; Li81/FC5 변이체 3-FC5-Fc-(G4S)1-Li81 긴 힌지; Li81/FC5 변이체 4 FC5-Fc-(G4S)1-Li81 짧은 힌지; Li81/FC5 변이체 5 이중 1가 FC5-Fc-(G4S)1-Li81 긴 힌지; Li81/FC5 변이체 6 이중 1가 FC5-Fc-(G4S)1-Li81 짧은 힌지; 및 Li81/FC5 변이체 7 모노Fab FC5-Fc-(G4S)1-Li81 짧은 힌지 샘플.
도 10은 FC5-(G4S)1-Li81 작제물의 역가 평가를 나타낸다. LINGO-1에 대한 FC5-(G4S)1-Li81 샘플의 겉보기 친화도는 직접 결합 ELISA로 측정하였다. 데이터는 405㎚에서의 흡광도 대 농도로서 플로팅된다.
도 11은 시험관내 BBB 세포 배양 검정에서 FC5-Li81 샘플의 특성화를 도시한 것이다. 하단 챔버에서 항체 수준(15, 30, 60 및 90분)은 MRM-ILIS에 의해 결정하였다. 값은 Papp의 평균±SD이다.
도 12는 염증성 통증의 하그리브스(Hargreaves) 모델에서 열 통각과민에 대한 dalargin(Dal)과 가교된 FC5-Li81 융합체의 효과를 예시한 것이다. 상단 패널: 열자극에 대한 대조군 온전한 발 또는 염증이 있는 발의 철회 지연시간(latency)을 시험 분자 13㎎/㎏의 단일 정맥내(i.v.) 용량, 또는 PBS 후 4시간에 걸쳐 15분 간격으로 측정하였다. 데이터는 평균으로 표시된다(2 마리 동물/그룹, 오차 막대는 개별 측정을 나타냄). 하단 패널: 대조군 발의 최대 가능한 효과(MPE) 백분율로서 표현된 상단 패널의 통합 곡선 아래 면적(AUC) 데이터.
도 13a는 염증성 통증의 하그리브스 모델에서 열 통각과민에 대한 Dal과 가교된 FC5-Li81 융합체의 효과를 나타낸다. 상승 용량의 Li81 및 FC5-Li81의 단일 정맥내 주사에 의해 달성된 진통 효과. 데이터는 대조군 발의 MPE 백분율로서 표현된 반응 기간(4시간) 동안의 통합 AUC이다(표시된 바와 같이 2마리 또는 5마리 동물/그룹의 평균±표준편차).
도 13b는 dalargin과 가교된, FC5-Li81(3438) 및 Li81의 진통 효과로서 플로팅된 도 13a의 데이터를 정맥내 용량에 대비하여 나타낸 것이다.
도 14는 FC5-Li81의 혈청 및 CSF PK 평가를 제공한다. 샘플은 꼬리 정맥을 통해 각각 20, 65 및 200 n㏖/㎏으로 IV 투여하였고, 주사 후 표시된 시점에서 항체 수준은 소뇌연수조(cisterna magna)로부터의 혈청(상단 패널) 및 CSF(중간 패널) 샘플에서 측정하였다. 각 시점에서 쌍을 이룬 CSF/혈청 비율(%)은 하단 패널에 플로팅된다. 결과는 2마리 개별 동물의 평균이다.
도 15는 래트에서 FC5-(G4S)1-Li81의 PK 분석을 예시한 것이다. 혈청 및 CSF 수준은 질량 분광분석법으로 정량하였다. 데이터는 CSF와 혈청 수준의 비율로서 표시된다.
도 16은 SDS-PAGE에 의한 FC5-(G4S)1-Li81 샘플의 특성화를 도시한 것이다. 샘플은 인비트로겐의 4 내지 20% 트리스-글리신 구배 겔에서 SDS-PAGE로 처리하였다. 비환원 샘플을 5mM N-에틸 말레이미드로 실온에서 5분 동안 처리하고, 램리(Laemmli) 비환원 샘플 완충액으로 희석하고 분석 전에 95℃에서 2분 동안 가열하였다. 환원된 샘플은 2% 2-머캅토에탄올을 함유하는 샘플 완충액으로 처리하고 가열하였다. 레인 1. 고 분자량 마커. 레인 2. FC5-(G4S)1-Li81(투약 제조물). 레인 3. 72 시간 후 래트 혈청에서 정제된 FC5-(G4S)1-Li81. 레인 4. 100㎍/㎖에서 래트 혈청 스파이크 샘플로부터 정제된 FC5-(G4S)1-Li81-HC.
도 17은 크기 배제 크로마토그래피에 의한 FC5-(G4S)1-Li81 샘플의 특성화를 나타낸다. 샘플(300㎕ 칼럼 완충액 중 25㎍)은 Superdex 200 HR10/30 FPLC 칼럼(GE Healthcare)에서 이동상으로서 20mM 인산나트륨, 150mM NaCl, pH 7.2를 사용하여 실온에서 SEC로 처리하였다. 칼럼은 0.3 ㎖/분으로 진행시켰다. 칼럼 유출물은 280㎚에서 UV 검출로 모니터링하였다. 화살표는 주입 시간을 나타낸다. SEC/광산란은 BioSep-SEC-S3000 칼럼, 300×7.8㎜(Phenomenex)에서 0.6 ㎖/분의 유속의 20mM 인산나트륨, 150mM NaCl, pH 7.2로 Waters Alliance 기기(Waters 2790, 매사추세츠주)에서 수행하였다. 정적 광산란은 SEC와 동시에 가동시키고 Precision PD2100 검출기(Precision Detectors, 매사추세츠주)를 사용하여 직렬로 측정하였다. 분자량은 Discovery 32 Light Scattering Analysis Software를 사용하여 계산하였다.
도 18은 시험관내 BBB 세포 배양물 검정에서 FC5-(G4S)1-Li81 샘플의 특성화를 보여준다. 바닥 챔버의 항체 수준(15, 30, 60 및 90분)은 MRM-ILIS에 의해 결정하였다. 값은 Papp의 평균±SD이다.
도 19는 천연 FC5-(G4S)1-Li81 샘플의 질량 스펙트럼을 나타낸다. 천연 FC5 (G4S)1Li81 투약 용액, FC5-(G4S)1-Li81 스파이크 및 FC5-(G4S)1-Li81 72시간 샘플의 디컨볼루션된 질량 스펙트럼.
도 20은 FC5-Li81 HC 샘플의 질량 스펙트럼을 나타낸다. 천연 FC5(G4S)1Li81 투약 용액, FC5-(G4S)1-Li81 스파이크 및 FC5-(G4S)1-Li81 72시간 샘플의 디컨볼루션된 질량 스펙트럼.
도 21은 FC5-Li81 LC 샘플의 질량 스펙트럼을 나타낸다. 천연 FC5(G4S)1Li81 투약 용액, FC5-(G4S)1-Li81 스파이크 및 FC5-(G4S)1-Li81 72시간 샘플의 디컨볼루션된 질량 스펙트럼.
도 22는 FC5-Li81 샘플의 EndoLysC/트립신 펩타이드 맵을 도시한 것이다. FC5(G4S)1Li81(대조군), FC5-(G4S)1-Li81-HC 스파이크 및 FC5-(G4S)1-Li81-HC 72h의 비환원 및 환원된 Lys-C/트립신분해된 이황화물 맵의 214㎚에서 모니터링된 UV 추적.
도 23은 비환원 및 환원된 펩타이드 맵에서 중쇄 펩타이드의 회수율을 나타낸다. 회수율%(y축)은 대조군 샘플의 상응하는 펩타이드에 대해 정규화되었다. 특성화된 HC 펩타이드가 x축에 표시된다. 불량한 회수율의 펩타이드, HC 215-249; 소수성 펩타이드, HC 171-192 및 HC 276-338.
도 24는 비환원 및 환원된 펩타이드 맵에서 경쇄 펩타이드의 회수율을 도시한 것이다. 회수율%(y축)은 대조군 샘플의 상응하는 펩타이드에 대해 정규화되었다. 특성화된 LC 펩타이드는 x축에 표시된다.
도 25는 인간화 FC5의 설계를 예시한다. FC5(서열번호 1) 및 인간화 변이체 H12(서열번호 11) 및 H62(서열번호 15)를 비교하는 서열 정렬 및 컴퓨터 구조 모델. 모델에서 측쇄의 밝은 음영 및 정렬에서 아미노산 1문자 코드는 낙타과 기원을 나타내고 어두운 음영은 인간 기원을 나타낸다. H12는 종래 항체의 VH/VL 계면에 상응하는 완전히 인간화된 패치(대시선 윤곽)를 갖는다. 이 계면은 종래 항체에서는 경쇄에 의해 덮여 있지만, 단일 도메인 항체에서는 노출된다. 메티오닌 산화를 피하기 위해 M34T 돌연변이가 도입된다.
도 26은 변성 미세유체 모세관 전기영동에 의한 FC5-hFc 인간화 변이체의 특성화를 도시한 것이다. 1) H11. 2) H12. 3) H31. 4) H32. 5) H61. 6) H62. 7) H71. 8) H72. 왼쪽: 비환원 샘플. 오른쪽: 환원 샘플. 분자량 마커는 양측에 kDa로 표시된다. 기기 소프트웨어를 사용하여, 정렬을 위해 하부 마커(LM)를 사용한 가상 젤처럼 2D로 전기영동도가 표시된다. SP = 시스템 피크
도 27은 환원된 FC5-hFc 인간화 변이체 샘플의 디컨볼루션된 온전한 질량 스펙트럼을 나타낸다. H11: 예측된 질량 38553.7 Da, 관찰된 질량 38551. H12: 예측된 질량 38523.6 Da, 관찰된 질량 38521 Da. H31: 예측된 질량 38548.6 Da, 관찰된 질량 38544 Da. H32: 예측된 질량 38518.6 Da, 관찰된 질량 38516 Da. H61: 예측된 질량 38649.7 Da, 관찰된 질량 38645 Da. H62: 예측된 질량 38619.6 Da, 관찰된 질량 38617 Da. H71: 예측된 질량 38677.8 Da, 관찰된 질량 38674 Da. H72: 예측된 질량 38647.7 Da, 관찰된 질량 38645 Da.
도 28은 FC5-hFc의 인간화 변이체의 분석용 크기 배제 크로마토그래피의 결과를 나타낸다. 변이체 H61, H62 및 H71은 약 17.3분에 동종 피크로서 용출된 반면, 다른 변이체는 나열된 순서대로 지연된 용출 시간을 보여준다. 데이터는 일정한 피크 높이에 대해 정규화된 것이다.
도 29는 시험관내 래트 BBB 세포 배양 트랜스웰 검정에서 FC5-hFc의 인간화 변이체의 특성화이다. 하단 챔버에서 항체 수준(15, 30 및 60분)은 MRM에 의해 결정하였고 투과도 값을 계산하는데 사용하였다. 값은 PAPP의 평균±SD이다.
도 30은 염증성 통증의 하그리브스 모델에서 열 통각과민에 대한 Dalargin과 가교된 FC5-hFc 인간화 변이체의 효과를 나타낸다. 왼쪽 패널: 열 자극에 대한 대조군 온전한 발 또는 염증이 있는 발의 철회 지연시간을 약 5 ㎎/㎏의 시험 분자, 또는 PBS의 단일 정맥내 투약 후 4시간 동안 15분 간격으로 측정하였다. 데이터는 평균(그룹 당 2마리 동물에 대한 sd)으로 표시된다. 오른쪽 패널: 대조군 발의 MPE 백분율로서 표현된 왼쪽 패널의 통합 반응(AUC) 데이터.
도 31은 구조를 안정화하기 위한 FC5 내 이황화 결합의 조작을 나타낸다. 시스테인 돌연변이에 대한 위치 사이의 적절한 거리와 단백질 내부의 최소 파괴는 컴퓨터 모델링을 통해 확인하였다. 상단 패널은 표시된 시스테인의 위치를 보여주고 하단 패널은 이황화물이 형성된 모델을 보여준다.
도 32는 SDS-PAGE에 의한 FC5-(G4S)1-Li81 샘플의 특성화를 도시한 것이다. 샘플은 인비트로겐의 4 내지 20% 트리스-글리신 구배 겔에서 SDS-PAGE로 처리하였다. 비환원 샘플은 분석 전에 95℃에서 2분 동안 가열하였다. 환원된 샘플은 2% 2-머캅토에탄올을 함유하는 샘플 완충액으로 처리하고 가열하였다. 레인 1, 4D 4662; 레인 2, 4D 4663; 레인 3, 4D 4664; 레인 4, 4D 4665; 레인 5, 4D 4666; 레인 6, 4D 4667; 레인 7, 4D 4668; 레인 8, 4D 4669; 레인 9, 4D 4670; 레인 10, 고분자량 마커.
도 33은 시험관내 BBB 세포 배양 트랜스웰 검정에서 이황화 안정화된 FC5-(G4S)1-Li81 샘플의 특성화를 도시한 것이다. 하단 챔버에서 항체 수준(15, 30, 60 및 90분)은 MRM-ILIS에 의해 결정하였다. 값은 PAPP의 평균±SD이다.
도 34는 단백질분해에 대한 FC5-(G4S)1-Li81 샘플의 감수성을 SDS-PAGE로 평가한 것이다. 샘플은 인비트로겐의 4 내지 20% 트리스-글리신 구배 겔에서 SDS-PAGE로 처리하였다. 비환원 샘플은 분석 전에 95℃에서 2분 동안 가열하였다. 환원된 샘플은 2% 2-머캅토에탄올을 함유하는 샘플 완충액으로 처리하고 가열하였다. 레인 1, H32(T34C/V79C)-G4S-Li81; 레인 2, H32(T34C/V79C)-G4S-Li81 + 펩신; 레인 3, H32(T33C/T103C)-G4S-Li81; 레인 4, H32(T33C/T103C)-G4S-Li81 + 펩신; 레인 5, Li81; 레인 6, Li81 + 펩신; 레인 7, FC5-H32-G4S-Li81; 레인 8, FC5-H32-G4S-Li81 + 펩신; 레인 9, 고 분자량 마커.
도 35는 단백질분해에 대한 FC5-(G4S)1-Li81 샘플의 감수성을 SDS-PAGE로 평가한 것이다. 샘플은 인비트로겐의 4 내지 20% 트리스-글리신 구배 겔에서 SDS-PAGE로 처리하였다. 비환원 샘플은 분석 전에 95℃에서 2분 동안 가열하였다. 환원된 샘플은 2% 2-머캅토에탄올을 함유하는 샘플 완충액으로 처리하고 가열하였다. 레인 1, FC5-H62(S49C/I70C)-G4S-Li81; 레인 2, FC5-H62(S49C/I70C)-G4S-Li81 + 펩신; 레인 3, FC5-H62(T34C/V79C)-G4S-Li81 + 펩신; 레인 4, FC5-H62(T33C/S102C) -G4S-Li81 + 펩신; 레인 5, FC5-H62(T33C/T103C)-G4S-Li81 + 펩신; 레인 6, FC5-H62(T33C/A104C)-G4S-Li81 + 펩신; 레인 7, FC5-H62(T33C/T105C)-G4S-Li81 + 펩신; 레인 8, FC5-H32-Li81-G4S-Li81 + 펩신; 레인 9, Li81 + 펩신; 레인 10, H62-FC5-Fc; 레인 11, H62-FC5-Fc + 펩신; 레인 12, H32-FC5-Fc; 레인 13, H32-FC5-Fc + 펩신; 레인 14, 고 분자량 마커. 샘플의 분석을 용이하게 하기 위해 하단 패널에는 비환원 SDS-PAGE의 100-150 kDa 영역의 레인 1 내지 9를 확대한 도면을 도시한다.
도 36은 환원된 샘플 4662, 4665, 4667 및 4668에 대한 중쇄의 디컨볼루션된 질량 스펙트럼을 보여준다.
도 37은 환원된 샘플 4662, 4665, 4667 및 4668에 대한 경쇄의 디컨볼루션된 질량 스펙트럼을 보여준다.
도 38은 비환원 및 환원된 펩타이드 맵에서 중쇄 펩타이드의 회수율을 도시한 것이다. 회수율%(y축)은 대조군 샘플의 상응하는 펩타이드에 대해 정규화하였다. 특성화된 HC 펩타이드는 x축에 표시된다. 불량한 회수율의 펩타이드, HC 215-249; 소수성 펩타이드, HC 171-192 및 HC 276-338.
도 39는 비환원 및 환원된 펩타이드 맵에서 경쇄 펩타이드의 회수율을 도시한 것이다. 회수율%(y축)은 대조군 샘플의 상응하는 펩타이드에 대해 정규화하였다. 특성화된 LC 펩타이드는 x축에 표시된다.
도 40은 FC5-Li81의 혈청 및 CSF PK 평가를 도시한 것이다. 샘플은 각각 65 n㏖/㎏씩 꼬리 정맥을 통해 IV 투여하였고, 주사 후 표시된 시점에서의 항체 수준은 소뇌연수조로부터의 혈청(상단 패널) 및 CSF(중간 패널) 샘플에서 결정하였다. 각 시점에서 쌍을 이룬 CSF/혈청 비율(%)을 하단 패널에 플로팅하였다. 결과는 2마리 개별 동물의 평균이다.
도 41은 시험관내 안정성에서 가장 큰 개선을 나타내는 3개의 이황화 안정화된 FC5-Li81 변이체의 혈청 PK 평가를 나타낸 것이다. 샘플은 각각 65 n㏖/㎏으로 꼬리 정맥을 통해 정맥내 투여하였고, 주사 후 표시된 시점에서의 항체 수준은 혈청에서 결정하였다. 결과는 2마리 개별 동물의 평균이다.
도 42A는 시험관내 안정성에서 가장 큰 개선을 보여주는 3개의 이황화 안정화된 FC5-Li81 변이체의 뇌 수치 평가를 도시한 것이다. 샘플은 각각 65 n㏖/㎏으로 꼬리 정맥을 통해 정맥내 투여하였고, 주사 후 표시된 시점에서의 항체 수준은 혈청 샘플에서 결정하였다.
도 42B는 시험관내 안정성에서 가장 큰 개선을 보여주는 3개의 이황화 안정화 FC5-Li81 변이체의 CSF 수준의 평가를 도시한 것이다. 샘플은 각각 65 n㏖/㎏으로 꼬리 정맥을 통해 정맥내 투여하였고, 주사 후 표시된 시점에서의 항체 수준은 소뇌연수조로부터 CSF 샘플에서 결정하였다.
도 42C는 3개의 이황화 안정화 FC5-Li81 변이체의 쌍을 이룬 CSF/혈청 비율(%)을 각 시점에서 플로팅한 플롯을 나타낸다. 결과는 2마리 개별 동물의 평균이다.
도 42D는 24시간 시점에서 측정된 3개 이황화 안정화 FC5-Li81 변이체의 뇌 수준을 도시한 것이다.
도 43A는 래트에서 FC5-Li81의 혈청 및 CSF PK 평가를 나타낸다. 샘플은 각각 65 n㏖/㎏으로 꼬리 정맥을 통해 정맥내 투여하였고, 주사 후 표시된 시점에서의 항체 수준은 MRM에 의해 혈청 샘플에서 결정하였다. 결과는 2 내지 3마리의 개별 동물의 평균이다. 분자 설계의 개략도는 왼쪽에 도시된다.
도 43B는 래트에서 FC5-Li81의 혈청 및 CSF PK 평가를 나타낸다. 샘플은 각각 65 n㏖/㎏으로 꼬리 정맥을 통해 정맥내 투여하였고, 주사 후 표시된 시점에서의 항체 수준은 소뇌연수조의 CSF 샘플에서 결정하였다. 결과는 2 내지 3마리의 개별 동물의 평균이다. 분자 설계의 개략도는 왼쪽에 도시된다.
도 43C는 도 43A 및 43B에 플로팅된 데이터로부터 쌍을 이룬 CSF/혈청 비율(%)을 나타낸다. 결과는 2 내지 3마리의 개별 동물의 평균이다. 분자 설계의 개략도는 왼쪽에 도시된다.
도 44는 사이노몰구스 원숭이(n=12)에서 FC5-H62(T33C/A104C)-Li81(실선) 대 Li81(대시선)의 혈청 및 CSF PK 평가를 나타낸다. 시험 물품은 65 n㏖/㎏으로 단일 정맥 볼러스 주사를 통해 투여했고, 주사 후 표시된 시점에서의 항체 수준은 혈청(상단 패널) 및 CSF(중간 패널) 샘플에서 nanoLC-MRM에 의해 결정하였다. 쌍을 이룬 CSF/혈청 비율도 플로팅하였다(하단 패널).
도 45A는 FC5-H62(T33C/A104C)-12F6A 아밀로이드 베타 직접 결합 ELISA의 그래프를 도시한 것이다. 합성 아밀로이드 베타(aa 1-40) 펩타이드를 ELISA 평판에 코팅하고 시험 시약의 여러 희석물에 노출시켰으며, 표시된 농도에서 항체 결합은 450㎚에서 흡광도로 측정한 HRP 접합된 항-hIgG 2차로 검출하였다. 데이터를 S자형 곡선에 피팅하여 계산된 EC50 값이 표시된다.
도 45B는 MRM에 의해 바닥-웰 항체 농도를 측정하여 기록한 SV40-불멸화된 뇌 내피 세포(svARBEC) 트랜스웰 검정 결과를 나타낸다(n = 3 반복물에 대한 겉보기 투과성 PAPP의 평균±SD). 각 웰의 대조군 항체는 항-HEL 뮤린 IgG1이었다. hFC5.2는 FC5-H62(T33C/A104C)이다.
도 45C는 MRM에 의해 바닥-웰 항체 농도를 측정하여 기록한 인간 iPSC-유래 뇌 내피 세포 트랜스웰 검정 결과를 나타낸다(n = 3회 반복물에 대한 겉보기 투과성 PAPP의 평균±SD). 각 웰의 대조군 항체는 항-HEL 뮤린 IgG1이었다. hFC5.2는 FC5-H62(T33C/A104C)이다.
도 46A는 알파-시누클레인 직접 결합 ELISA를 보여주는 그래프이다. 인간 알파-시누클레인을 ELISA 평판에 코팅하고, 시험 시약의 여러 희석물로 처리하고, 표시된 농도에서 항체 결합을 450㎚에서 흡광도에 의해 측정된, HRP 접합된 항-hIgG 2차로 검출하였다. 데이터를 S자 곡선에 피팅하여 계산한 EC50 값이 표시된다. hFC5.2는 FC5-H62(T33C/A104C)이다.
도 46B는 MRM에 의해 바닥-웰 항체 농도를 측정하여 기록한 SVARBEC 트랜스웰 검정 결과의 막대 그래프이다. 데이터는 웰내의 항-HEL mIgG1 대조군에 대한 시험 항체의 PAPP의 비율로서 플로팅된다(n = 3회 반복물에 대한 평균±SD); 항-HEL에 대한 PAPP는 모든 웰에서 <1.5x10-5 cm/분이었다. hFC5.2는 FC5-H62(T33C/A104C)이다.
도 47A는 타우 직접 결합 ELISA의 결과를 나타낸다. 인간 타우를 ELISA 평판에 코팅하고, 여러 희석율의 시험 시약으로 처리하고, 결합된 항체를 450 ㎚에서 흡광도로 측정되는 HRP 접합된 항-hIgG 2차로 검출하였다. 데이터를 S자 곡선에 피팅하여 계산한 EC50 값이 표시된다. hFC5.2는 FC5-H62(T33C/A104C)이다.
도 47B는 MRM에 의해 바닥-웰 항체 농도를 측정하여 기록한 SVARBEC 트랜스웰 검정 결과의 막대 그래프이다. 데이터는 웰내 항-HEL mIgG1 대조군에 대한 시험 항체의 PAPP의 비율로서 플로팅된다(n = 3회 반복물에 대한 평균 ± SD); 항-HEL에 대한 PAPP는 모든 웰에 대해 <1.5x10-5 cm/분였다. hFC5.2는 FC5-H62(T33C/A104C)이다.
도 48은 이황화 조작된 FC5-항체 융합체의 펩신 분해에 대한 감소된 감수성의 검증이다. 왼쪽: 37℃에서 1시간 동안 펩신 분해를 사용하거나 사용함이 없이 수행된, Li81 hIgG1 agly, 12F4 hIgG1 및 12F4 hIgG1 agly에 융합된 FC5-H62(T33C/A104C)의 SDS-PAGE 분석. FC5-H32-Li81 hIgG1 agly는 보다 저 분자량 단편(화살표)에 의해 표시된 바와 같은 증가된 분해를 보여준다. 오른쪽: Li81 hIgG1 agly 및 12F6A hIgG1에 융합된 FC5-H62(T33C/A104C) 또는 FC5-H32의 펩신 분해물(37℃에서 2.5시간)의 SDS-PAGE 분석.
도 49는 비제한적인 예시적 2가 FC5 융합체 형식의 개략도이다.
중추 신경계(CNS)로의 약물 전달은 혈액 뇌 장벽(BBB)이 대부분의 치료 분자가 뇌로 들어가는 것을 막는 바리케이드이기 때문에 신경계 질환 치료의 핵심 문제였다. 뇌에 접근없이 이러한 분자의 치료 가능성은 손상되거나 없어질 수 있다.
본 개시내용은 부분적으로 인간화된 FC5 및 이황화-조작된 FC5를 포함하는 분자를 기반으로 한다. 이들 분자는 항체, 항원 결합 단편, 펩타이드, 효소 및 핵산(예컨대, 안티센스 올리고뉴클레오타이드)과 같은 관심 "화물(cargo)"을 CNS로 수송하는 데 유용하다. 일부 실시형태에서, 이들 분자는 BBB를 가로질러 트랜스 시토시스를 일으킨다(transcytose). 일부 실시형태에서, 이들 분자는 인간 TMEM30A(UniProtKB-Q9NV96)에 직접 또는 간접적으로 결합할 수 있다. 특정 실시형태에서, 이들 분자는 TMEM30A를 발현하지 않는(또는 발현하지 않도록 변형된) 세포보다 TMEM30A를 발현하는 세포에 더 잘 결합한다. 일부 실시형태에서, 이들 분자는 인간 혈청에서 야생형 FC5(서열번호 1)에 비해 감소된 불안정성을 갖는다. 도 48에 개략적으로 예시된 1가 FC5 형식을 포함하는 각각의 FC5-치료제(예컨대, 항체) 형식은 본 개시내용에 포괄된다.
인간화 FC5
FC5는 BBB를 가로질러 트랜스시토시스를 일으킬 수 있고 CNS에 생체활성 분자를 전달할 수 있는 낙타과 단일 도메인 항체이다[예를 들어, Muruganandam et al., FASEB J., 16: 240-242(2002); Abulrob et al., J Neurochem., 95: 1201-1214(2005); Haqqani et al., Mol. Pharmaceutics, 10: 1542-1556(2013); Farrington et al., FASEB J., 28: 4764-4778(2014); 미국 특허 9,676,849]. 야생형 FC5의 아미노산 서열은 서열번호 1에 제공된다.
FC5는 종 교차 반응성이고 래트, 마우스 및 인간의 뇌 내피 세포에 결합할 수 있다. 본 개시내용은 특히 인간화된 FC5 항체 가변 도메인을 특징으로 한다. 이러한 인간화된 FC5 항체 가변 도메인은 용해도 및 안정성을 유지하면서 FC5의 인간 면역원성의 잠재적 위험을 감소시킨다. FC5 서열 항체 가변 도메인은 인간 VH3 컨센서스 프레임워크에 대해 다양한 정도의 상동성을 갖는다.
낙타과 VHH 도메인 프레임워크는 중쇄 가변 도메인 프레임워크의 인간 VH3과에 매우 상동성이다. 인간 VH3 컨센서스 프레임워크를 작제하기 위해, 복수의 서열 정렬(MSA)은 2014년 8월 25일자로 IMGT에 기탁된 모든 인간 기능적 및 ORF VH3 유전자가 정리된 Clustal Omega(www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)에서 입수하였다. 컨센서스 프레임워크는 MSA의 각 위치에 최고 빈도의 아미노산의 서열로서 정의되었고, 인간 JH4 유전자의 첫번째 대립유전자(IGHJ4*01, IMGT 명명법)와 조합되어 완전한 VH 도메인의 프레임워크가 되었다. 프레임워크 영역 1, 2 및 3에서, 컨센서스 프레임워크는 인간 VH3 유전자 IGHV3-23*04의 4번째 대립유전자의 컨센서스 프레임워크와 동일하다. FC5는 인간 VH3 컨센서스 프레임워크와 상이한 15개의 프레임워크 잔기를 갖는다. 낙타과 잔기 37, 44, 45 및 47은 인간 IgG의 VH/VL 계면에 상응하는 표면에 존재한다. 이 잔기들은 단일 도메인 항체의 용해도, 발현 수준, 또는 결합 친화성에 강하게 영향을 미칠 수 있지만, 이 효과들은 또한 개별 단일 도메인 항체 각각의 CDR에도 의존적이다.
야생형 FC5의 상보성 결정 영역(CDR)은 서열번호 1의 위치 23-35(CDR1), 50-66(CDR2), 및 97-111(CDR3)에 위치하고, 이하에 제공된다.
야생형 FC5 CDR1: AASGFKITHYTMG(서열번호 47)
야생형 FC5 CDR2: RITWGGDNTFYSNSVKG(서열번호 50)
야생형 FC5 CDR3: AAGSTSTATPLRVDY(서열번호 51).
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 FC5 폴리펩타이드는 이하에 나열된 아미노산 서열 중 하나로부터 선택되는 CDR1을 갖는다.
AASGFKITHYTTG(서열번호 57)
AASGFKITHYTCG(서열번호 48)
AASGFKITHYCMG(서열번호 58)
AASGFKITHYCTG(서열번호 49)
특정 실시형태에서, 본 개시내용의 FC5 폴리펩타이드는 이하에 나열된 아미노산 서열 중 하나로부터 선택되는 CDR3을 갖는다.
AAGSTCTATPLRVDY(서열번호 52)
AAGSTSCATPLRVDY(서열번호 53)
AAGSTSTCTPLRVDY(서열번호 54)
AAGSTSTACPLRVDY(서열번호 55)
특정 실시형태에서, 본 개시내용의 항체 가변 도메인은 2개 이하(예컨대, 2, 1, 0개)의 아미노산 치환을 갖는 서열번호 47에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 구성된 CDR1, 2개 이하의 아미노산 치환을 갖는 서열번호 50에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 구성된 CDR2, 및 2개 이하의 아미노산 치환을 갖는 서열번호 51에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 구성된 CDR3을 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항체 가변 도메인은 2개 이하(예컨대, 2, 1, 0개)의 아미노산 치환을 갖는 서열번호 47에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 구성된 CDR1, 서열번호 50에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 구성된 CDR2, 및 2개 이하의 아미노산 치환을 갖는 서열번호 51에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 구성된 CDR3을 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 개시내용의 항체 가변 도메인은 하나의 아미노산 치환을 갖거나 갖지 않는 서열번호 47에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 구성된 CDR1, 하나의 아미노산 치환을 갖거나 갖지 않는 서열번호 50에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 구성된 CDR2, 및 하나의 아미노산 치환을 갖거나 갖지 않는 서열번호 51에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 구성된 CDR3을 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항체 가변 도메인은 하나의 아미노산 치환을 갖거나 갖지 않는 서열번호 47에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 구성된 CDR1, 서열번호 50에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 구성된 CDR2, 및 하나의 아미노산 치환을 갖거나 갖지 않는 서열번호 51에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 구성된 CDR3을 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다. 전술한 항체 가변 도메인은 인간화될 수 있다. 일부 예에서, 상기 실시형태 전부에서, 아미노산 치환은 서열번호 1의 위치 33, 34, 102, 103, 104 또는 105 중 하나 이상(예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6개)에서 일어난다. 일부 실시형태에서, 이들 분자는 BBB를 가로질러 트랜스시토시스를 일으킨다. 일부 실시형태에서, 이들 분자는 인간 TMEM30A(UniProtKB-Q9NV96)에 직접 또는 간접적으로 결합할 수 있다. 특정 실시형태에서, 이들 분자는 TMEM30A를 발현하지 않거나 발현하지 않도록 변형된 세포보다 TMEM30A를 발현하는 세포에 더 잘 결합한다. 일부 실시형태에서, 이들 분자는 야생형 FC5(서열번호 1)보다 인간 혈청에서 감소된 불안정성을 갖는다.
특정 실시형태에서, 본 개시내용의 항체 가변 도메인은 서열번호 57에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 구성된 CDR1, 서열번호 50에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 구성된 CDR2, 및 서열번호 52에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 구성된 CDR3을 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다. 다른 실시형태에서, 본 개시내용의 항체 가변 도메인은 서열번호 57에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 구성된 CDR1, 서열번호 50에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 구성된 CDR2, 및 서열번호 53에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 구성된 CDR3을 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다. 다른 실시형태에서, 본 개시내용의 항체 가변 도메인은 서열번호 57에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 구성된 CDR1, 서열번호 50에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 구성된 CDR2, 및 서열번호 54에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 구성된 CDR3을 포함한다. 다른 실시형태에서, 본 개시내용의 항체 가변 도메인은 서열번호 57에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 구성된 CDR1, 서열번호 50에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 구성된 CDR2, 및 서열번호 55에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 구성된 CDR3을 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 이들 분자는 BBB를 가로질러 트랜스시토시스를 일으킨다. 일부 실시형태에서, 이들 분자는 인간 TMEM30A(UniProtKB-Q9NV96)에 직접 또는 간접적으로 결합할 수 있다. 특정 실시형태에서, 이들 분자는 TMEM30A를 발현하지 않거나 발현하지 않도록 변형된 세포보다 TMEM30A를 발현하는 세포에 더 잘 결합한다. 일부 실시형태에서, 이들 분자는 야생형 FC5(서열번호 1)보다 인간 혈청에서 감소된 불안정성을 갖는다.
특정 실시형태에서, 본 개시내용의 항체 가변 도메인은 서열번호 48에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 구성된 CDR1, 서열번호 50에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 구성된 CDR2, 및 서열번호 52에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 구성된 CDR3을 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다. 다른 실시형태에서, 본 개시내용의 항체 가변 도메인은 서열번호 48에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 구성된 CDR1, 서열번호 50에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 구성된 CDR2, 및 서열번호 53에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 구성된 CDR3을 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다. 다른 실시형태에서, 본 개시내용의 항체 가변 도메인은 서열번호 48에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 구성된 CDR1, 서열번호 50에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 구성된 CDR2, 및 서열번호 54에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 구성된 CDR3을 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다. 다른 실시형태에서, 본 개시내용의 항체 가변 도메인은 서열번호 48에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 구성된 CDR1, 서열번호 50에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 구성된 CDR2, 및 서열번호 55에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 구성된 CDR3을 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 이들 분자는 BBB를 가로질러 트랜스시토시스를 일으킨다. 일부 실시형태에서, 이들 분자는 인간 TMEM30A(UniProtKB-Q9NV96)에 직접 또는 간접적으로 결합할 수 있다. 특정 실시형태에서, 이들 분자는 TMEM30A를 발현하지 않거나 발현하지 않도록 변형된 세포보다 TMEM30A를 발현하는 세포에 더 잘 결합한다. 일부 실시형태에서, 이들 분자는 야생형 FC5(서열번호 1)보다 인간 혈청에서 감소된 불안정성을 갖는다.
특정 실시형태에서, 본 개시내용의 항체 가변 도메인은 서열번호 58에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 구성된 CDR1, 서열번호 50에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 구성된 CDR2, 및 서열번호 52에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 구성된 CDR3을 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다. 다른 실시형태에서, 본 개시내용의 항체 가변 도메인은 서열번호 58에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 구성된 CDR1, 서열번호 50에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 구성된 CDR2, 및 서열번호 53에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 구성된 CDR3을 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다. 다른 실시형태에서, 본 개시내용의 항체 가변 도메인은 서열번호 58에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 구성된 CDR1, 서열번호 50에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 구성된 CDR2, 및 서열번호 54에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 구성된 CDR3을 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다. 다른 실시형태에서, 본 개시내용의 항체 가변 도메인은 서열번호 58에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 구성된 CDR1, 서열번호 50에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 구성된 CDR2, 및 서열번호 55에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 구성된 CDR3을 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 이들 분자는 BBB를 가로질러 트랜스시토시스를 일으킨다. 일부 실시형태에서, 이들 분자는 인간 TMEM30A(UniProtKB-Q9NV96)에 직접 또는 간접적으로 결합할 수 있다. 특정 실시형태에서, 이들 분자는 TMEM30A를 발현하지 않거나 발현하지 않도록 변형된 세포보다 TMEM30A를 발현하는 세포에 더 잘 결합한다. 일부 실시형태에서, 이들 분자는 야생형 FC5(서열번호 1)보다 인간 혈청에서 감소된 불안정성을 갖는다.
특정 실시형태에서, 본 개시내용의 항체 가변 도메인은 서열번호 49에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 구성된 CDR1, 서열번호 50에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 구성된 CDR2, 및 서열번호 52에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 구성된 CDR3을 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다. 다른 실시형태에서, 본 개시내용의 항체 가변 도메인은 서열번호 49에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 구성된 CDR1, 서열번호 50에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 구성된 CDR2, 및 서열번호 53에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 구성된 CDR3을 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다. 다른 실시형태에서, 본 개시내용의 항체 가변 도메인은 서열번호 49에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 구성된 CDR1을 포함하는 폴리펩타이드, 서열번호 50에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 구성된 CDR2, 및 서열번호 54에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 구성된 CDR3을 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다. 다른 실시형태에서, 본 개시내용의 항체 가변 도메인은 서열번호 49에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 구성된 CDR1, 서열번호 50에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 구성된 CDR2, 및 서열번호 55에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 구성된 CDR3을 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 이들 분자는 BBB를 가로질러 트랜스시토시스를 일으킨다. 일부 실시형태에서, 이들 분자는 인간 TMEM30A(UniProtKB-Q9NV96)에 직접 또는 간접적으로 결합할 수 있다. 특정 실시형태에서, 이들 분자는 TMEM30A를 발현하지 않는(또는 발현하지 않도록 변형된) 세포보다 TMEM30A를 발현하는 세포에 더 잘 결합한다. 일부 실시형태에서, 이들 분자는 야생형 FC5(서열번호 1)보다 인간 혈청에서 감소 된 불안정성을 갖는다.
일부 예에서, 본 개시내용의 인간화된 FC5 폴리펩타이드는 서열번호 1에 제시된 서열과 적어도 80%(예컨대, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%) 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일 예에서, 인간화된 FC5 폴리펩타이드는 서열번호 1에 제시된 서열과 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 이러한 인간화 된 FC5 폴리펩타이드는 혈액 뇌 장벽을 가로질러 이동할 수 있어 "화물"(예컨대, 생체활성 모이어티, 예컨대, 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 소분자 약물, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 효소, 펩타이드)을 CNS로 수송할 수 있다. 일부 실시형태에서, 이들 분자는 인간 TMEM30A(UniProtKB-Q9NV96)에 직접 또는 간접적으로 결합할 수 있다. 특정 실시형태에서, 이들 분자는 TMEM30A를 발현하지 않는(또는 발현하지 않도록 변형된) 세포보다 TMEM30A를 발현하는 세포에 더 잘 결합한다. 일부 실시형태에서, 이들 분자는 야생형 FC5(서열번호 1)보다 인간 혈청에서 감소된 불안정성을 갖는다. 일부 실시형태에서, 이러한 FC5 폴리펩타이드는 서열번호 1과 비교하여 서열번호 1의 30개 이하(예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30개)의 아미노산에서 아미노산 치환을 갖는다. 특정 실시형태에서, 이러한 FC5 폴리펩타이드는 서열번호 1과 비교하여, 서열번호 1의 위치 5, 6, 14, 75, 87, 88, 93, 114 및 117에 상응하는 위치 중 하나 이상(예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9개)에서 아미노산 치환을 갖는다. 본 개시내용은 서열번호 1의 상기 9개 위치 중 가능한 모든 순열로 치환을 갖는 FC5 항체 가변 도메인을 포괄한다. 치환될 수 있는 서열번호 1의 위치의 비제한적인 예는 다음을 포함한다: 5 및 6; 5, 6 및 14; 5, 6, 14 및 75; 5, 6, 14, 75 및 87; 5, 6, 14, 75, 87 및 88; 5, 6, 14, 75, 87, 88 및 93; 5, 6, 14, 75, 87, 88, 93 및 114; 5, 6, 14, 75, 87, 88, 93, 114 및 117; 5 및 14; 5, 14 및 75; 5, 14, 75 및 87; 5, 14, 75, 87 및 88; 5, 14, 75, 87, 88 및 93; 5, 14, 75, 87, 88, 93 및 114; 5, 14, 75, 87, 88, 93, 114 및 117; 5 및 75; 5, 75 및 87; 5, 75, 87 및 88; 5, 75, 87, 88 및 93; 5, 75, 87, 88, 93 및 114; 5, 75, 87, 88, 93, 114 및 117; 5 및 87; 5, 87 및 88; 5, 87, 88 및 93; 5, 87, 88, 93 및 114; 5, 87, 88, 93, 114 및 117; 5 및 88; 5, 88 및 93; 5, 88, 93 및 114; 5, 88, 93, 114 및 117; 5 및 93; 5, 93 및 114; 5, 93, 114 및 117; 5 및 114; 5, 114 및 117; 및 5 및 117. 일부 실시형태에서, 상기 기재된 항체 가변 도메인은 서열번호 47에 제시된 서열을 포함하는 CDR1, 서열 50에 제시된 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열번호 51에 제시된 서열을 포함하는 CDR3을 더 포함한다. 다른 실시형태에서, 이러한 항체 가변 도메인은 서열번호 57에 제시된 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 50에 제시된 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열번호 51에 제시된 서열을 포함하는 CDR3을 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체 가변 도메인은 다음 중 하나 이상(예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9개)을 포함한다: 서열번호 1의 위치 5에 상응하는 위치에 발린; 서열번호 1의 위치 6에 t상응하는 위치의 글루탐산; 서열번호 1의 위치 14에 상응하는 위치에 프롤린; 서열번호 1의 위치 75에 상응하는 위치에 세린; 서열번호 1의 위치 87에 상응하는 위치에 아르기닌; 서열번호 1의 위치 88에 상응하는 위치에 알라닌; 서열번호 1의 위치 93에 상응하는 위치에 발린; 서열번호 1의 위치 114에 상응하는 위치에 글루타민; 또는 서열 1의 위치 117에 상응하는 위치에 류신. 상기 기재된 항체 가변 도메인은 이하에 기재된 것과 같은 추가 아미노산 치환을 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, 항체 가변 도메인은 서열번호 1과 비교하여 서열번호 1의 위치 1, 37, 44, 45, 47 및 79에 상응하는 위치 중 하나 이상(예컨대, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개)에 아미노산 치환을 갖는다. 본 개시내용은 서열번호 1의 상기 6개 위치의 가능한 모든 순열로 치환을 갖는 항체 가변 도메인을 포괄한다.
일부 예에서, 상기 기재된 항체 가변 도메인은 서열번호 1과 비교하여, 서열번호 1의 44 및 45 위치에 상응하는 위치 중 하나 이상에 아미노산 치환을 더 포함한다. 일부 경우에, 아미노산 서열은 서열번호 1의 위치 44에 상응하는 위치에 글리신 및/또는 서열번호 1의 위치 45에 상응하는 위치에 류신을 포함한다. 이러한 항체 가변 도메인은 혈액 뇌 장벽을 가로질러 이동할 수 있다. 일부 실시형태에서, 이들 분자는 인간 TMEM30A(UniProtKB-Q9NV96)에 직접 또는 간접적으로 결합할 수 있다. 특정 실시형태에서, 이들 분자는 TMEM30A를 발현하지 않거나 발현하지 않도록 변형된 세포보다 TMEM30A를 발현하는 세포에 더 잘 결합한다. 일부 실시형태에서, 이들 분자는 야생형 FC5(서열번호 1)보다 인간 혈청에서 감소된 불안정성을 갖는다.
특정 예에서, 본 개시내용의 항체 가변 도메인은 서열번호 1과 비교하여 서열번호 1의 위치 1, 44 및 45에 상응하는 위치 중 하나 이상에 아미노산 치환을 더 포함한다. 일부 경우에, 아미노산 서열은 다음 중 하나 이상(예컨대, 1, 2 또는 3개)을 포함한다: 서열번호 1의 위치 1에 상응하는 위치에 글루탐산; 서열번호 1의 위치 44에 상응하는 위치에 글리신; 또는 서열번호 1의 위치 45에 상응하는 위치에 류신. 이러한 항체 가변 도메인은 혈액 뇌 장벽을 가로질러 이동할 수 있다. 일부 실시형태에서, 이들 분자는 인간 TMEM30A(UniProtKB-Q9NV96)에 직접 또는 간접적으로 결합할 수 있다. 특정 실시형태에서, 이들 분자는 TMEM30A를 발현하지 않거나 발현하지 않도록 변형된 세포보다 TMEM30A를 발현하는 세포에 더 잘 결합한다. 일부 실시형태에서, 이들 분자는 야생형 FC5(서열번호 1)보다 인간 혈청에서 감소된 불안정성을 갖는다.
다른 예에서, 본 개시내용의 항체 가변 도메인은 서열번호 1과 비교하여 서열번호 1의 위치 44, 45 및 47에 상응하는 위치 중 하나 이상에 아미노산 치환을 더 포함한다. 일부 경우에, 아미노산 서열은 다음 중 하나 이상(예컨대, 1, 2 또는 3개)을 포함한다: 서열번호 1의 위치 44에 상응하는 위치에 글리신; 서열번호 1의 위치 45에 상응하는 위치에 류신; 또는 서열번호 1의 위치 47에 상응하는 위치에 트립토판. 이러한 항체 가변 도메인은 혈액 뇌 장벽을 가로질러 이동할 수 있다. 일부 실시형태에서, 이들 분자는 인간 TMEM30A(UniProtKB-Q9NV96)에 직접 또는 간접적으로 결합할 수 있다. 특정 실시형태에서, 이들 분자는 TMEM30A를 발현하지 않거나 발현하지 않도록 변형된 세포보다 TMEM30A를 발현하는 세포에 더 잘 결합한다. 일부 실시형태에서, 이들 분자는 야생형 FC5(서열번호 1)보다 인간 혈청에서 감소된 불안정성을 갖는다.
일부 예에서, 본 개시내용의 항체 가변 도메인은 서열번호 1과 비교하여 서열번호 1의 위치 1, 44, 45 및 47에 상응하는 위치 중 하나 이상에 아미노산 치환을 더 포함한다. 일부 경우에, 아미노산 서열은 다음 중 하나 이상(예컨대, 1, 2, 3 또는 4개)을 포함한다: 서열번호 1의 위치 1에 상응하는 위치에 글루탐산; 서열번호 1의 위치 44에 상응하는 위치에 글리신; 서열번호 1의 위치 45에 상응하는 위치에 류신; 또는 서열번호 1의 위치 47에 상응하는 위치에 트립토판. 이러한 항체 가변 도메인은 혈액 뇌 장벽을 가로질러 이동할 수 있다. 일부 실시형태에서, 이들 분자는 인간 TMEM30A(UniProtKB-Q9NV96)에 직접 또는 간접적으로 결합할 수 있다. 특정 실시형태에서, 이들 분자는 TMEM30A를 발현하지 않거나 발현하지 않도록 변형된 세포보다 TMEM30A를 발현하는 세포에 더 잘 결합한다. 일부 실시형태에서, 이들 분자는 야생형 FC5(서열번호 1)보다 인간 혈청에서 감소된 불안정성을 갖는다.
특정 예에서, 본 개시내용의 항체 가변 도메인은 서열번호 1과 비교하여 서열번호 1의 위치 37, 44, 45 및 47에 상응하는 위치 중 하나 이상에 아미노산 치환을 더 포함한다. 일부 경우에, 아미노산 서열은 다음 중 하나 이상(예컨대, 1, 2, 3 또는 4개)을 포함한다: 서열번호 1의 위치 37에 상응하는 위치에 발린; 서열번호 1의 위치 44에 상응하는 위치에 글리신; 서열번호 1의 위치 45에 상응하는 위치에 류신; 또는 서열번호 1의 위치 47에 상응하는 위치에 트립토판. 이러한 항체 가변 도메인은 혈액 뇌 장벽을 가로질러 이동할 수 있다. 일부 실시형태에서, 이들 분자는 인간 TMEM30A(UniProtKB-Q9NV96)에 직접 또는 간접적으로 결합할 수 있다. 특정 실시형태에서, 이들 분자는 TMEM30A를 발현하지 않거나 발현하지 않도록 변형된 세포보다 TMEM30A를 발현하는 세포에 더 잘 결합한다. 일부 실시형태에서, 이들 분자는 야생형 FC5(서열번호 1)보다 인간 혈청에서 감소된 불안정성을 갖는다.
일부 예에서, 본 개시내용의 항체 가변 도메인은 서열번호 1과 비교하여 서열번호 1의 위치 1, 37, 44, 45 및 47에 상응하는 위치 중 하나 이상에 아미노산 치환을 더 포함한다. 일부 경우에, 아미노산 서열은 다음 중 하나 이상(예컨대, 1, 2, 3, 4 또는 5개)을 포함한다: 서열번호 1의 위치 1에 상응하는 위치에 글루탐산; 서열번호 1의 위치 37에 상응하는 위치에 발린; 서열번호 1의 위치 44에 상응하는 위치에 글리신; 서열번호 1의 위치 45에 상응하는 위치에 류신; 또는 서열번호 1의 위치 47에 상응하는 위치에 트립토판. 이러한 항체 가변 도메인은 혈액 뇌 장벽을 가로질러 이동할 수 있다. 일부 실시형태에서, 이들 분자는 인간 TMEM30A (UniProtKB-Q9NV96)에 직접 또는 간접적으로 결합할 수 있다. 특정 실시형태에서, 이들 분자는 TMEM30A를 발현하지 않거나 발현하지 않도록 변형된 세포보다 TMEM30A를 발현하는 세포에 더 잘 결합한다. 일부 실시형태에서, 이들 분자는 야생형 FC5 (서열번호 1)보다 인간 혈청에서 감소된 불안정성을 갖는다.
다른 예에서, 본 개시내용의 항체 가변 도메인은 서열번호 1과 비교하여 서열번호 1의 위치 37, 44, 45, 47 및 79에 상응하는 위치 중 하나 이상에 아미노산 치환을 더 포함한다. 일부 경우에, 아미노산 서열은 다음 중 하나 이상(예컨대, 1, 2, 3, 4 또는 5개)을 포함한다: 서열번호 1의 위치 37에 상응하는 위치에 발린; 서열번호 1의 위치 44에 상응하는 위치에 글리신; 서열번호 1의 위치 45에 상응하는 위치에 류신; 서열번호 1의 위치 47에 상응하는 위치에 트립토판; 또는 서열번호 1의 위치 79에 상응하는 위치에 류신. 이러한 항체 가변 도메인은 혈액 뇌 장벽을 가로질러 이동할 수 있다. 일부 실시형태에서, 이들 분자는 인간 TMEM30A (UniProtKB-Q9NV96)에 직접 또는 간접적으로 결합할 수 있다. 특정 실시형태에서, 이들 분자는 TMEM30A를 발현하지 않거나 발현하지 않도록 변형된 세포보다 TMEM30A를 발현하는 세포에 더 잘 결합한다. 일부 실시형태에서, 이들 분자는 야생형 FC5(서열번호 1)보다 인간 혈청에서 감소된 불안정성을 갖는다.
일부 예에서, 상기 기재된 항체 가변 도메인은 서열번호 1과 비교하여 서열번호 1의 위치 1, 37, 44, 45, 47 또는 79에 상응하는 위치 중 하나 이상에 아미노산 치환을 더 포함한다. 일부 경우에, 아미노산 서열은 다음 중 하나 이상(예컨대, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개)을 포함한다: 서열번호 1의 위치 1에 상응하는 위치에 글루탐산; 서열번호 1의 위치 37에 상응하는 위치에 발린; 서열번호 1의 위치 44에 상응하는 위치에 글리신; 서열번호 1의 위치 45에 상응하는 위치에 류신; 서열번호 1의 위치 47에 상응하는 위치에서 트립토판; 또는 서열번호 1의 위치 79에 상응하는 위치에 류신. 이러한 항체 가변 도메인은 혈액 뇌 장벽을 가로질러 이동할 수 있다. 일부 실시형태에서, 이들 분자는 인간 TMEM30A(UniProtKB-Q9NV96)에 직접 또는 간접적으로 결합할 수 있다. 특정 실시형태에서, 이들 분자는 TMEM30A를 발현하지 않거나 발현하지 않도록 변형된 세포보다 TMEM30A를 발현하는 세포에 더 잘 결합한다. 일부 실시형태에서, 이들 분자는 야생형 FC5(서열번호 1)보다 인간 혈청에서 감소된 불안정성을 갖는다.
인간화된 FC5 분자의 예시적이고 비제한적인 예는 본 개시내용의 실시예 4에 기재되어 있다. 특정 예에서, 인간화된 FC5 폴리펩타이드는 서열번호 10 내지 17 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 인간화된 FC5 분자는 BBB를 트랜스시토시스할 수 있다. 일 실시형태에서, 인간화된 FC5 폴리펩타이드는 서열번호 10에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실시형태에서, 인간화된 FC5 폴리펩타이드는 서열번호 11에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실시형태에서, 인간화된 FC5 폴리펩타이드는 서열번호 12에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 인간화된 FC5 폴리펩타이드는 서열번호 13에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실시형태에서, 인간화된 FC5 폴리펩타이드는 서열번호 14에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실시형태에서, 인간화된 FC5 폴리펩타이드는 서열번호 15에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 인간화된 FC5 폴리펩타이드는 서열번호 16에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 인간화된 FC5 폴리펩타이드는 서열 17에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 인간화된 FC5 변이체의 생물학적 활성은 예를 들어 본 개시내용의 실시예 2에 기재된 바와 같은 SV-ARBEC 세포를 사용하는 시험관내 BBB 트랜스웰 세포 배양 검정을 사용하여 평가할 수 있다.
FC5의 안정화
본 개시내용의 실시예 3에 나타낸 바와 같이, FC5는 혈청에서 불안정할 수 있다. 단백분해는 혈청에 노출되었을 때 FC5 내의 하나 이상의 부위에서 일어날 수 있다. FC5의 안정화는 FC5가 임상용으로 개발될 수 있도록 단백분해적 분해에 대한 감수성을 감소시킬 수 있다. 일 실시형태에서, 본 개시내용의 FC5 분자는 FC5 분자 내에 제2 이황화 결합을 도입시킴으로써 안정화된다.
미경험(naive) 라마 단일 도메인 항체 라이브러리에서 단리된 FC5는 단일 이황화 결합을 함유한다. 모든 낙타과 종의 VHH 생식세포계열의 약 절반은 제3의 시스테인을 함유하여, 체세포 과돌연변이 동안 제4의 시스테인을 얻을 수 있으며, 많은 낙타과 VHH는 2개의 이황화물을 갖고 있다.
모든 면역글로불린 가변 도메인에 공통적인 Cys22 및 Cys96에 의해 형성된 시스테인 외에도, FC5에 제2의 이황화 결합을 첨가하기 위해 몇 가지 전략이 추구되었다. 첫 번째 전략에서 FC5는 위치 34와 79에 있는 시스테인에 의해 형성된 제2 이황화물을 포함하도록 조작되어(위치 번호는 도 1을 기반으로 함), 각각 프레임워크 영역 2와 3 내에서 β-가닥 C와 E를 연결한다. C34는 β-가닥 C의 시작 부분인 CDR-H1의 끝에 있다. 이 이황화물은 단백질 구(globule)의 내부에 위치하고 4 내지18℃ 사이로 열 용융 온도(Tm)를 개선시킬 수 있다. 두 번째 전략은 이황화-형성 시스테인을 수용할 수 있는 공간적으로 가까운 내부 위치를 조합하는 것을 수반하였다. 이 전략은 다시 프레임워크 영역 2 및 3에서 가닥 C'와 E를 연결하는 위치 49 및 70(위치 번호는 도 1을 기반으로 함)에 의존한다. 이 전략의 경우 Tm은 6 내지 19℃ 사이로 개선될 수 있다. 세 번째 이황화물 안정화 전략은 CDR-H1의 외향성 위치 33을 CDR-H3의 다양한 위치(위치 102, 103, 104 및 105)와 연결하는 것이었으며, 여기서 VHH는 종래 항체의 VH/VL 계면에 상응하는 측면 상에 종종 폴딩된다. 따라서, 이 루프간 이황화 결합은 부분적으로 용매-노출된다.
본 개시내용은 혈액 뇌 장벽을 가로질러 이동하고 서열번호 1과 적어도 80% 동일한(예컨대, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97% 또는 100% 동일한) 항체 가변 도메인을 특징으로 한다. 일부 예에서, 항체 가변 도메인은 서열번호 47에 제시된 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 50에 제시된 서열을 포함하는 CDR2, 서열번호 51에 제시된 서열을 포함하는 CDR3을 포함하고, 아미노산 서열은 서열번호 1의 위치 49 및 70에 상응하는 위치에 시스테인을 포함한다. 다른 예에서, 항체 가변 도메인은 서열번호 48에 제시된 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 50에 제시된 서열을 포함하는 CDR2, 서열번호 51에 제시된 서열을 포함하는 CDR3을 포함하고, 아미노산 서열은 서열번호 1의 위치 79에 상응하는 위치에 시스테인을 포함한다. 특정 예에서, 항체 가변 도메인은 서열번호 49에 제시된 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 50에 제시된 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열번호 52에 제시된 서열을 포함하는 CDR3을 포함한다. 일부 예에서, 항체 가변 도메인은 서열번호 58에 제시된 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 50에 제시된 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열번호 52에 제시된 서열을 포함하는 CDR3을 포함한다. 특정 예에서, 항체 가변 도메인은 서열번호 49에 제시된 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 50에 제시된 서열을 포함하는 CDR2, 서열번호 53에 제시된 서열을 포함하는 CDR3을 포함한다. 특정 예에서, 항체 가변 도메인은 서열번호 58에 제시된 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 50에 제시된 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열번호 53에 제시된 서열을 포함하는 CDR3을 포함한다. 일부 예에서, 항체 가변 도메인은 서열번호 49에 제시된 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 50에 제시된 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열번호 54에 제시된 서열을 포함하는 CDR3을 포함한다. 특정 예에서, 항체 가변 도메인은 서열번호 58에 제시된 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 50에 제시된 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열번호 54에 제시된 서열을 포함하는 CDR3을 포함한다. 특정 예에서, 항체 가변 도메인은 서열번호 49에 제시된 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 50에 제시된 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열번호 55에 제시된 서열을 포함하는 CDR3을 포함한다. 또 다른 경우에, 항체 가변 도메인은 서열번호 58에 제시된 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 50에 제시된 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열번호 55에 제시된 서열을 포함하는 CDR3을 포함한다. 일부 실시형태에서, 이들 분자는 인간 TMEM30A(UniProtKB-Q9NV96)에 직접 또는 간접적으로 결합할 수 있다. 특정 실시형태에서, 이들 분자는 TMEM30A를 발현하지 않거나 발현하지 않도록 변형된 세포보다 TMEM30A를 발현하는 세포에 더 잘 결합한다. 일부 실시형태에서, 이들 분자는 야생형 FC5(서열번호 1)보다 인간 혈청에서 감소된 불안정성을 갖는다.
전술한 항체 가변 도메인은 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열에 비해 30개 이하(예컨대, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개)의 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 특정 경우에 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환이다. 일부 예에서, 항체 가변 도메인은 서열번호 1과 비교하여, 서열번호 1의 위치 1, 5, 6, 14, 37, 44, 45, 47, 75, 87, 88, 93, 114 또는 117에 상응하는 위치 중 하나 이상(예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14개)에 치환을 포함한다. 특정 예에서, 아미노산 서열은 다음 중 하나 이상(예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14개)을 포함한다: 서열번호 1의 위치 1에 상응하는 위치에 글루탐산; 서열번호 1의 위치 5에 상응하는 위치에 발린; 서열번호 1의 위치 6에 상응하는 위치에 글루탐산; 서열번호 1의 위치 14에 상응하는 위치에 프롤린; 서열번호 1의 위치 37에 상응하는 위치에 발린; 서열번호 1의 위치 44에 상응하는 위치에 글리신; 서열번호 1의 위치 45에 상응하는 위치에 류신; 서열번호 1의 위치 47에 상응하는 위치에 트립토판; 서열번호 1의 위치 75에 상응하는 위치에 세린; 서열번호 1의 위치 87에 상응하는 위치에 아르기닌; 서열번호 1의 위치 88에 상응하는 위치에 알라닌; 서열번호 1의 위치 93에 상응하는 위치에 발린; 서열번호 1의 위치 114에 상응하는 위치에 글루타민; 또는 서열 1의 위치 117에 상응하는 위치에서 류신. 일부 실시형태에서, 이들 분자는 인간 TMEM30A(UniProtKB-Q9NV96)에 직접 또는 간접적으로 결합할 수 있다. 특정 실시형태에서, 이들 분자는 TMEM30A를 발현하지 않거나 발현하지 않도록 변형된 세포보다 TMEM30A를 발현하는 세포에 더 잘 결합한다. 일부 실시형태에서, 이들 분자는 야생형 FC5(서열번호 1)보다 인간 혈청에서 감소된 불안정성을 갖는다.
이황화 안정화 전략은 야생형 FC5 또는 인간화된 FC5 분자와 함께 사용될 수 있다. 본 개시내용의 실시예 5는 이황화 안정화된 항체 가변 도메인의 비제한적인 예를 제공한다. 본 개시내용은 서열번호 20 내지 28 중 어느 하나와 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 항체 가변 도메인을 포괄하고, 여기서 항체 가변 도메인은 BBB를 트랜스시토시스할 수 있다. 일 실시형태에서, 이황화 안정화된 항체 가변 도메인은 서열번호 20에 제시된 아미노산 서열을 갖는다. 또 다른 실시형태에서, 이황화 안정화된 항체 가변 도메인은 서열번호 21에 제시된 아미노산 서열을 갖는다. 또 다른 실시형태에서, 이황화 안정화된 항체 가변 도메인은 서열번호 22에 제시된 아미노산 서열을 갖는다. 또 다른 실시형태에서, 이황화 안정화된 항체 가변 도메인은 서열번호 23에 제시된 아미노산 서열을 갖는다. 또 다른 실시형태에서, 이황화 안정화된 항체 가변 도메인은 서열번호 24에 제시된 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, 이황화 안정화된 항체 가변 도메인은 서열번호 25에 제시된 아미노산 서열을 갖는다. 또 다른 실시형태에서, 이황화 안정화된 항체 가변 도메인은 서열번호 26에 제시된 아미노산 서열을 갖는다. 또 다른 실시형태에서, 이황화 안정화된 항체 가변 도메인은 서열번호 27에 제시된 아미노산 서열을 갖는다. 특정 실시형태에서, 이황화 안정화된 항체 가변 도메인은 서열번호 28에 제시된 아미노산 서열을 갖는다.
키메라 분자
본 개시내용은 또한 본 명세서에 개시된 임의의 항체 가변 도메인(예컨대, 인간화된 항체 가변 도메인, 이황화 안정화된 항체 가변 도메인 또는 인간화 및 이황화 안정화된 항체 가변 도메인)을 포함하는 키메라 분자를 특징으로 한다. 특정 실시형태에서, 키메라 분자는 이량체 모이어티(예컨대, Fc) 또는 다른 융합 단백질[예를 들어, 인간 혈청 알부민(HSA) - 알부민은 이량체가 아니지만, 이의 N- 및/또는 C-말단에서 융합될 수 있음을 유의함]을 포함한다. 일부 예에서, 본 명세서에 개시된 항체 가변 도메인의 C-말단은 이량체 모이어티의 각 구성원의 N-말단에 직접 또는 간접적으로 연결된다. 특정 경우에, 키메라 분자는 항체, 항체의 항원 결합 단편, 단일 사슬 항체, 펩타이드, 효소, 핵산(예컨대, 안티센스 올리고뉴클레오타이드), 소분자 약물, 또는 핵산, 소분자 약물 또는 펩타이드와 같은 생체활성 모이어티를 캡슐화하는 리포솜 또는 지질 나노입자를 포함한다. 본 개시내용의 키메라 융합체의 비제한적인 예는 도 48에 개략적 형태로 제공된다.
Fc 영역
일부 경우에, 키메라 분자는 항체 Fc 영역을 포함한다. 본 명세서에 사용된 용어 "Fc 영역"은 이의 2개의 중쇄 각각의 Fc 도메인(또는 Fc 모이어티)의 이량체 연합에 의해 형성된 면역글로불린의 부분으로서 정의된다. 천연 Fc 영역은 동종이량체이고 두 개의 폴리펩타이드 사슬을 포함한다. 본 개시내용의 Fc 영역은 동종이 량체(동일한 Fc 도메인) 또는 이종이량체(동일하지 않은 Fc 도메인)일 수 있다. 본 명세서에 사용된 용어 "Fc 도메인" 또는 "Fc 모이어티"는 CH2 도메인 및 CH3 도메인, 또는 그의 변이체를 포함하는 면역글로불린의 단일 폴리펩타이드 사슬을 지칭한다. 일부 실시형태에서, Fc 영역은 인간 IgG1, 인간 IgG2, 인간 IgG3 또는 인간 IgG4로부터 유래된다. 특정 실시형태에서, Fc 영역은 비글리코실화된다(예컨대, N297Q 또는 T299A). 특정 실시형태에서, Fc 영역은 인간 IgG1 agly Fc 영역이다. 특정 실시형태에서, Fc 영역은 인간 IgG4P agly CH2 도메인 및 인간 IgG1 CH3 도메인을 함유한다. 특정 예에서, Fc 영역 또는 Fc 도메인은 이의 야생형 대응물에 비해 감소된 이펙터 기능을 갖는다. IgG 항체는 다양한 동종이인자형(allotype) 및 아이소동종이인자형(isoallotype)으로 존재하고, 이들 각각은 본 개시내용에 포괄된다. 특정 실시형태에서, 본 개시내용의 Fc 영역은 G1m1; nG1m2; G1m3; G1m17,1; G1m17,1,2; G1m3,1; 또는 G1m17의 동종이인자형을 갖는 IgG1 중쇄 Fc를 포함한다. 이러한 동종이인자형 또는 아이소동종이인자형은 IgG1 중쇄 불변 영역(Fc) 내의 표시된 위치(EU 번호매김)에 다음과 같은 아미노산 잔기를 특징으로 한다: G1m1: D356, L358; nG1m1: E356, M358; G1m3: R214, E356, M358, A431; G1m17,1: K214, D356, L358, A431; G1m17,1,2: K214, D356, L358, G431; G1m3,1: R214, D356, L358, A431; 및 G1m17: K214, E356, M358, A431. 예시적인 Fc 도메인 서열은 이하에 제공된다:
IgG1의 Fc(IgG1m3):
Figure pct00001
IgG1 agly의 Fc(T299A와 같은 다른 agly 버전이 이용될 수 있는 것으로 이해되어야 함):
Figure pct00002
IgG2의 Fc:
Figure pct00003
IgG2 SAA의 Fc:
Figure pct00004
"SAA" 버전은 또한 힌지에 C222S 돌연변이를 포함한다는 것을 유의한다:
Figure pct00005
IgG3의 Fc:
Figure pct00006
IgG4의 Fc:
Figure pct00007
IgG4 agly/G1의 Fc:
Figure pct00008
특정 예에서, Fc 도메인은 야생형 Fc 도메인에 비해 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 돌연변이는 이펙터 기능을 저하시키고, 안정성을 증가시키고, 약동학을 개선시키고, 및/또는 반감기를 증가시키도록 이루어질 수 있다. 특정 경우에, 각 IgG1 Fc 도메인의 맨 마지막 C-말단 잔기는 결실되는데(즉, 마지막 라이신은 제거됨), 그 이유는 이 C-말단 라이신에서 스플라이싱 및/또는 효소적 절단이 이루어질 수 있어 생성물 불균일성을 초래할 수 있기 때문이다. 특정 예에서, IgG1 Fc 도메인의 맨 마지막 C-말단 잔기는 라이신 잔기이다. 특정 예에서, IgG1 Fc 도메인의 바로 C-말단 잔기는 라이신에서 시스테인 잔기로 변화된다. 이것은 C-말단 부위 접합을 허용한다. 일부 예에서, Fc 도메인은 S442C 돌연변이(EU 인덱스에 따라 번호매김)를 포함한다. 일부 경우에, 돌연변이(들)는 이종이량체화[예를 들어, 노브 인투 홀(knob-into-hole) 돌연변이, 전기조정(electrosteering) 돌연변이, 듀오바디(DuoBody) 돌연변이 등을 포함함]를 촉진하기 위해 도입될 수 있다. 이러한 돌연변이는 본 기술분야에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 문헌[Ridgway et al., Protein Engineering 9(7):617-21(1996); US 5,807,706; US 9,862,778; WO2017/106462; Labrijn et al, PNAS, 110(13):5145-5150(2013); Gramer et al. mAbs, 5(6): 962-973(2013); Labrijn et al. Nature Protocols, 9 (10): 2450-63(2014)] 참조.
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
특정 경우에, Fc 영역은 서열번호 61 내지 101 중 어느 하나와 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일한 Fc 도메인을 갖는다. 특정 실시형태에서, Fc 영역은 상응하는 야생형 Fc 영역보다 더 낮은 이펙터 기능을 갖는다.
힌지 영역
특정 예에서, 키메라 분자는 항체 힌지 영역을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 키메라 분자는 항체 힌지 영역 및 항체 Fc 영역을 포함한다. 힌지 영역은 직접 또는 링커를 통해 Fc 모이어티에 융합될 수 있다. 예를 들어, 힌지는 전술한 항체 가변 도메인의 C-말단과 Fc 도메인의 CH2 도메인의 N-말단을 연결한다. 힌지 영역은 1개 내지 30개의 아미노산(즉, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개) 길이의 임의의 가요성 펩타이드 서열일 수 있다. 일부 경우에, 힌지 영역은 길이가 1개 내지 20개의 아미노산이다. 다른 경우에, 힌지 영역은 1개에서 18개의 아미노산 길이이다. 일부 경우에, 힌지 영역은 인간 IgG1, 인간 IgG2, 인간 IgG3 또는 인간 IgG4의 힌지이다. 특정 경우에, 이러한 힌지 영역은 하나 이상의 아미노산 치환(예컨대, IgG4 중 S228P)을 포함하도록 조작될 수 있다. 특정 예에서, 힌지 영역은 아미노산 서열 AEPKSCD(서열번호 56)를 포함한다. 다른 경우에, 힌지 영역은 아미노산 서열 AEPKSSD(서열번호 59)를 포함한다. 또 다른 예에서, 힌지 영역은 아미노산 서열 KTHTCPPCP(서열번호 19)를 포함한다. 특정 예에서, 힌지 영역은 아미노산 서열 AEPKSCDKTHTCPPCP(서열번호 74)를 포함한다. 다른 예에서, 힌지 영역은 아미노산 서열 AEPKSSDKTHTCPPCP(서열번호 75)를 포함한다. 다른 예에서, 힌지 영역은 아미노산 서열 GGGGSDKTHTCPPCP(서열번호 76)를 포함한다. 일부 예에서, 힌지 영역은 아미노산 서열 VERKCCVECPPCP(서열번호 102)를 포함한다. 다른 경우에, 힌지 영역은 아미노산 서열 VESKYGPPCPSCP(서열번호 103)를 포함한다. 다른 예에서, 힌지 영역은 아미노산 서열 ELKTPLGDTTHTCPRCP(서열번호 104)를 포함한다. 또 다른 예에서, 힌지 영역은 아미노산 서열 EPKSCDTPPPCPRCP(서열번호 105)를 포함한다.
특정 실시형태에서, 키메라 분자는 다른 키메라 분자와 동종이량체화 또는 이종이량체화한다. 예를 들어, 키메라 분자의 Fc 도메인이 동일하다면, 이들은 동종이량체화하여 동종이량체성 Fc 영역을 형성한다. 그러나 키메라 분자의 Fc 도메인이 동일하지 않다면(예컨대, 이들이 노브-인투-홀, 전기조정 또는 듀오바디 돌연변이를 함유한다면), 이들은 이종이량체화하여 이종이량체성 Fc 영역을 형성한다. 본 개시내용의 항체 가변 도메인의 C-말단은 직접 또는 개재 아미노산 서열을 통해 힌지 영역의 N-말단에 연결될 수 있으며, 결과적으로 이의 C-말단을 통해 Fc 도메인의 CH2 도메인의 N-말단에 연결된다.
링커
일부 예에서, 키메라 분자는 하나 이상의 링커를 포함한다. 키메라 분자의 다른 영역을 연결하는 링커에는 특별한 제한이 없다(예컨대, 항체 가변 도메인을 치료 항체의 VH 또는 VL 도메인의 N-말단에 연결; 항체 가변 도메인을 치료 모이어티에 연결; Fc 영역의 Fc 도메인의 C-말단을 치료 항체 또는 이의 단편의 N-말단에 연결; Fc 영역의 Fc 도메인의 C-말단을 치료 모이어티에 연결; 항체 가변 도메인을 힌지 영역에 연결). 일부 실시형태에서, 링커는 펩타이드 링커이다. 약 1개 내지 30개의 아미노산 잔기(예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개의 aa 잔기)를 포함하는 임의의 자의적인 단일 사슬 펩타이드가 링커로서 사용될 수 있다. 이러한 펩타이드 링커의 예는 다음을 포함한다: Gly; Ser; Gly Ser; Gly Gly Ser; Ser Gly Gly; Gly Gly Gly Ser(서열번호 77); Ser Gly Gly Gly(서열번호 78); Gly Gly Gly Gly Ser(서열번호 5); Ser Gly Gly Gly Gly(서열번호 79); Gly Gly Gly Gly Gly Ser(서열번호 80); Ser Gly Gly Gly Gly Gly(서열번호 81); Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser(서열번호 82); Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly(서열번호 83); (Gly Gly Gly Gly Ser)n(서열번호 5)n, 여기서 n은 하나 이상의 정수이고; 및 (Ser Gly Gly Gly Gly)n(서열번호 79)n, 여기서 n은 1 이상의 정수이다.
다른 실시형태에서, 링커 펩타이드는 아미노산 서열 GSG(전통적인 Gly/Ser 링커 펩타이드 반복체의 접합부에서 나타남)가 존재하지 않도록 변형된다. 예를 들어, 펩타이드 링커는 (GGGXX)nGGGGS(서열번호 84) 및 GGGGS(XGGGS)n(서열번호 85)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 X는 서열에 삽입될 수 있고 서열 GSG를 포함하는 폴리펩타이드를 생성하지 않을 수 있는 임의의 아미노산이고, n은 0 내지 4이다. 일 실시형태에서, 링커 펩타이드의 서열은 (GGGX1X2)nGGGGS이고 X1은 P이고 X2는 S이고 n은 0 내지 4이다(서열번호 86). 또 다른 실시형태에서, 링커 펩타이드의 서열은 (GGGX1X2)nGGGGS이고 X1은 G이고 X2는 Q이고 n은 0 내지 4이다(서열번호 87). 또 다른 실시형태에서, 링커 펩타이드의 서열은 (GGGX1X2)nGGGGS이고 X1은 G이고 X2는 A이고 n은 0 내지 4이다(서열번호 88). 또 다른 실시형태에서, 링커 펩타이드의 서열은 GGGGS(XGGGS)n이고, X는 P이고 n은 0 내지 4(서열번호 89)이다. 일 실시형태에서, 본 발명의 링커 펩타이드는 아미노산 서열 (GGGGA)2GGGGS(서열번호 90)를 포함하거나 이것으로 구성된다. 또 다른 실시형태에서, 링커 펩타이드는 아미노산 서열 (GGGGQ)2GGGGS(서열번호 91)를 포함하거나 이것으로 구성된다. 또 다른 실시형태에서, 링커 펩타이드는 아미노산 서열 (GGGPS)2GGGGS(서열번호 92)를 포함하거나, 이것으로 구성된다. 추가 실시형태에서, 링커 펩타이드는 아미노산 서열 GGGGS(PGGGS)2(서열번호 93)를 포함하거나, 이것으로 구성된다.
특정 실시형태에서, 링커는 합성 화합물 링커(화학적 가교제)이다. 가교제의 예는 N-하이드록시숙신이미드(NHS), 다이숙신이미딜수베레이트(DSS), 비스(설포숙신이미딜)수베레이트(BS3), 다이티오비스(숙신이미딜프로피오네이트)(DSP), 다이티 오비스(설포숙신이미딜프로피오네이트)(DTSSP), 에틸렌글리콜 비스(숙신이미딜숙시네이트)(EGS), 에틸렌글리콜 비스(설포숙신이미딜숙시네이트)(설포-EGS), 다이숙신이미딜 타르트레이트(DST), 다이설포숙신이미딜 타르트레이트(설포-DST), 비스[2-(숙신이미도옥시 카보닐옥시)에틸]설폰(BSOCOES), 비스[2-(설포숙신이미도옥시카보닐옥시)에틸]설폰(설포-BSOCOES), 설포-SMCC 시리즈 및 비스말레이미도헥산(BMH) 시리즈 가교제를 포함한다.
XTEN
일부 예에서, 키메라 분자는 XTEN 서열을 포함한다. "XTEN 서열"은 주로 작은 친수성 아미노산으로 구성되고 생리적 조건 하에서 2차 또는 3차 구조가 적거나 없는, 비-천연 발생의 실질적으로 비-반복적 서열을 갖는 연장된 길이의 폴리펩타이드를 지칭한다. 키메라 분자 파트너로서, XTEN은 운반체 역할을 하여 응고 인자, 응고 인자의 중쇄, 경쇄 또는 응고 인자, 표적 모이어티, 또는 키메라 분자 상의 임의의 다른 서열 또는 분자에 연결된 경우, 특정의 바람직한 약동학적, 이화학적 및 약제학적 특성을 부여할 수 있다. 이러한 바람직한 특성은 강화된 약동학적 파라미터 및 용해도 특성을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 XTEN 서열은 약 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1200, 1400, 1600, 1800 또는 2000개 초과의 아미노산 잔기를 갖는 펩타이드 또는 폴리펩타이드이다. 특정 실시형태에서, XTEN은 약 20개 초과 내지 약 3000개의 아미노산 잔기, 30개 초과 내지 약 2500개의 잔기, 40개 초과 내지 약 2000개의 잔기, 50개 초과 내지 약 1500개의 잔기, 60개 초과 내지 약 1000개의 잔기, 70개 초과 내지 약 900개의 잔기, 80개 초과 내지 약 800개의 잔기, 90개 초과 내지 약 700개의 잔기, 100개 초과 내지 약 600개의 잔기, 110개 초과 내지 약 500개의 잔기, 또는 120개 초과 내지 약 400개의 잔기를 갖는 펩타이드 또는 폴리펩타이드이다.
이하의 표는 비제한적인 XTEN의 아미노산 서열을 제공한다.
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
일부 예에서, XTEN은 AE42, AG42, AE42_2, AE42_3, AE48, AM48, AE72, AE72_2, AE72_3, AG72, AE108, AG108, AE144, AF144, AE144_2, AE144_3, AG144, AE180, AG180, AE216, AG216, AE252, AG252, AE288, AG288, AE295, AE324, AG324, AE360, AG360, AE396, AG396, AE432, AG432, AE468, AG468, AE504, AG504, AF504, AE540, AG540, AF540, AD576, AE576, AF576, AG576, AE612, AG612, AE624, AE648, AG648, AG684, AE720, AG720, AE756, AG756, AE792, AG792, AE828, AG828, AD836, AE864, AF864, AG864, AE872, AE884, AM875, AE912, AM923, AM1318, BC864, BD864, AE948, AE1044, AE1140, AE1236, AE1332, AE1428, AE1524, AE1620, AE1716, AE1812, AE1908, AE2004A, AG948, AG1044, AG1140, AG1236, AG1332, AG1428, AG1524, AG1620, AG1716, AG1812, AG1908 및 AG2004로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 예에서, XTEN은 AE42, AE864, AE576, AE288, AE144, AE288, AG864, AG576, AG288 및 AG144로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 예에서, XTEN은 선택된 AE144이다. 일부 예에서, XTEN은 AE288이다.
본 개시내용에 따라 사용될 수 있는 XTEN 폴리펩타이드의 추가 예는 미국 특허 번호 7,855,279 및 7,846,445, 미국 특허 공개 번호 2009/0092582, 2010/0239554, 2010/0323956, 2011/0046060, 2011/0046061, 2011/0077199 A1, 2011/0172146, 2012/0178691; 2012/0263701; 또는 2013/0017997, 국제 특허 공개 번호 WO 2010091122, WO 2010144502, WO 2010144508, WO 2011028228, WO 2011028229, WO 2011028344; 및 WO2013130683에 개시된다.
인간 혈청 알부민
일부 예에서, 키메라 분자는 Fc 영역 대신에 융합 모이어티로서 인간 혈청 알부민(HSA)을 포함한다. HSA는 이량체성 모이어티가 아니지만, N- 및/또는 C-말단 융합체가 가능하다는 점에 유의한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항체 가변 도메인의 C-말단은 HSA 폴리펩타이드의 N-말단에 직접 또는 간접[예를 들어, 링커 또는 치료제(예컨대, 항체, 항체 단편, 펩타이드, 효소, 안티센스 올리고뉴클레오타이드)를 통해]적으로 연결된다.
HSA는 많은 바람직한 약제학적 성질을 갖고 있다. 여기에는 19 내지 20일의 혈청 반감기; 약 300 ㎎/㎖의 용해도; 양호한 안정성; 발현 용이성; 이펙터 기능 없음; 낮은 면역원성; 및 약 45 ㎎/㎖의 순환 혈청 수준. 지방산 및 약물과 같은 생물학적으로 중요한 분자를 포함한 리간드가 있거나 없이, 또는 다른 단백질과 복합체화되는 HSA의 결정 구조는 본 기술분야에 잘 알려져 있다. 예를 들어, Universal Protein Resource Knowledgebase P02768; He et al., Nature, 358: 209-215(1992); Sugio et al., Protein Eng., 12:439-446(1999). HSA의 X선 결정학 연구에 따르면, 이 폴리펩타이드는 80x80x80Å의 대략적인 치수 및 30Å의 두께를 갖는 심장 모양의 단백질을 형성한다. 약 67%의 α-나선을 갖지만 β-시트는 없으며 3개의 상동성 도메인(I 내지 III)으로 나뉠 수 있다. 이 세 개의 도메인은 각각 두 개의 하위도메인(A 및 B)으로 구성된다. A 및 B 하위도메인은 가요성 루프에 의해 연결된 각각 6개 및 4개의 α-나선을 갖는다. 인간 혈청 알부민에 대한 리간드 결합의 주요 영역은 대부분 소수성 및 양전하를 띤 잔기로 형성되고 유사한 화학을 나타내는 하위도메인 IIA 및 IIIA의 공동에 위치한다. 분자 중 35개 시스테인 잔기 중 하나를 제외한 전부는 17개 안정화 이황화 결합의 형성에 관여한다. 소, 말(horse), 토끼, 말(equine) 및 레포라인(leporine) 알부민의 구조뿐만 아니라 아미노산 서열은 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Majorek et al., Mol. Immunol., 52: 174-182(2012); Bujacz, Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr., 68: 1278-1289 (2012)] 참조. 인간 혈청 알부민의 수많은 유전자 변이체는 본 기술분야에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 덴마크 오르후스 대학과 이탈리아 파비아 대학이 관리하는 알부민 웹사이트, albumin.org/genetic-variants-of-human-serum-albumin 및 albumin.org/genetic-variants-of-human-serum-albumin-reference-list 참조.
일 실시형태에서, 키메라 분자에 사용되는 인간 혈청 알부민은 하기 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 구성된다:
Figure pct00016
다른 실시형태에서, 키메라 분자에 사용되는 인간 혈청 알부민은 서열번호 94에 제시된 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 HSA 변이체이다. 아미노산 서열 간의 동일성 퍼센트는 BLAST 2.0 프로그램을 사용하여 결정할 수 있다. 서열 비교는 갭이 없는 정렬과 디폴트 파라미터(Blossom 62 매트릭스, 갭 존재 비용 11, 잔기 갭 당 비용 1, 및 람다 비율 0.85)를 사용하여 수행할 수 있다. BLAST 프로그램에 사용된 수학적 알고리즘은 Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Research 25: 3389-3402에 기재되어 있다.
특정 실시형태에서, 키메라 분자에 사용되는 인간 혈청 알부민은 서열번호 94의 서열에 N 및/또는 C-말단 결실을 가질 수 있는(예컨대, N- 및/또는 C-말단에서 1-10, 1-9, 1-8, 1-7, 1-6, 1-5, 1-4, 1-3, 1-2, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 연속 아미노산이 결실될 수 있음) HSA 변이체이다. 일부 예에서, HSA 변이체는 서열번호 94의 아미노산 서열을 갖는 HSA와 동일하거나 실질적으로 동일한 바람직한 약제학적 성질을 갖는다(예컨대, 19 내지 20일의 혈청 반감기; 약 300 ㎎/㎖의 용해도; 양호한 안정성; 발현 용이성; 이펙터 기능 없음; 낮은 면역 원성; 및/또는 약 45 ㎎/㎖의 순환 혈청 수준). 일부 예에서, 키메라 분자에 사용되는 HSA는 HSA의 유전자 변이체이다. 일부 예에서, HSA 변이체는 Otagiri et al, 2009, Biol. Pharm. Bull. 32(4), 527-534(2009)에 개시된 77개 변이체 중 어느 하나이다. 특정 실시형태에서, 키메라 분자에 사용된 HSA는 서열번호 94의 HSA에 비해 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 대한 친화성이 개선된 HSA의 돌연변이된 버전이다(예컨대, US 9,120,875; US 9,045,564; US 8,822,417; US 8,748,380; Sand et al., Front. Immunol., 5:682(2014); Andersen et al., J. Biol. Chem., 289(19): 13492-502(2014); Oganesyan et al., J. Biol. Chem., 289(11): 7812-24(2014); Schmidt et al., Structure, 21(11): 1966-78(2013); WO 2014/125082A1; WO 2011/051489, WO2011/124718, WO 2012/059486, WO 2012/150319; WO 2011/103076; 및 WO 2012/112188 참조, 이들 모두는 본 명세서에 참조로 포함됨). 특정 예에서, HSA 돌연변이체는 E505G/V547A 돌연변이체이다. 특정 예에서, HSA 돌연변이체는 K573P 돌연변이체이다. FcRn에 대한 친화성이 개선된 HSA와 같은 HSA 돌연변이체는 키메라 분자의 반감기를 증가시키는 데 사용될 수 있다.
치료제
키메라 분자는 치료제(들)를 포함할 수 있다. 치료제의 예는 단독으로 사용되거나 표준 치유 치료와 병용 요법으로 사용되는, 항체, 항체의 항원 결합 단편, 단일 사슬 항체[예를 들어, scFv, sc(Fv)2], 디아바디, 나노바디, 항체 단편, 핵산(예컨대, 안티센스 올리고뉴클레오타이드), 펩타이드 또는 효소를 포함한다. 본 개시내용의 키메라 분자는 치료제를 BBB를 가로질러 CNS로 수송할 수 있다. 따라서, 키메라 분자는 신경계 장애를 치료 및/또는 예방하는데 사용될 수 있다. 예시적인 신경계 장애는 알츠하이머 병, 파킨슨 병, 전두측두엽성 치매, ALS, 헌팅턴병, 다발성 경화증, 척추 근육 위축, 근이영양증, 척수 손상, 뇌졸중, 안과 질환, 급성 또는 만성 시신경염, 정신 장애, 투렛병 뇌 손상, 뇌종양 및 간질을 포함한다.
알츠하이머 병을 치료하기 위한 예시적인 치료제는 카프릴산 트리글리세리드, 항-타우 항체, 항-베타 아밀로이드 항체, 항-DKK1 항체, APOE 길항제 항체, 도네페질, 퀴니딘, 세로토닌 6 수용체 길항제, 베타-세크래타제 억제제, RAGE 길항제, BACE 억제제, 아밀로이드 베타-단백질 억제제, 포스포다이에스터라제 9A 억제제, 비스노르심세린, 브리오스타틴-1, 알파-7 강화제, 퓨리노셉터 P2Y6 작용제, 타우 단백질 응집/TDP-43 응집 억제제, N3pG-Aβ mAb, mGlu2 작용제, 퀴나졸리논, 미토콘드리아 단백질 자극제, 아밀로이드 전구체 단백질 세크래타제 억제제, 5HT6 길항제, R-펜세린, 아밀로이드 베타/타우 단백질 억제제, MAO-B 억제제, Lp-PLA2 억제제, 5-HT6 수용체 길항제, BET 단백질 억제제, 항-원섬유 AB mAb, 노메티아졸, 히스타민 H3 수용체 길항제, PPAR-델타/감마 작용제, 아베오탁산, 및 p38 미토겐-활성화 단백질 키나제 억제제를 포함한다.
ALS를 치료하기 위한 예시적인 치료제는 항-SOD1 항체, 항-DR6 항체, 항-DPR 항체, 덱스프라미펙솔, 아리모클로말, GM6, 이부딜라스트, 대식세포 조절제, NOGO-A 억제제 및 트로포닌 복합 자극제를 포함한다.
뇌 손상을 치료하기 위한 예시적인 치료제는 아포몰핀, 사이토카인 억제제/뉴로펩타이드 수용체 조절제 및 프로게스테론 수용체 작용제를 포함한다.
뇌종양을 치료하기 위한 예시적인 치료제는 IDH1 억제제, 독소루비신, 파클리탁셀, 항-EGFRvIII 항체-약물 접합체, 베바시주맙, FGF-R 키나제 억제제, PI3K 억제제, 카보잔티닙, 요오드 I 131 데를로툭시맙 비오틴, PDGFR 억제제, 카복시아미도트리아졸 오로테이트, 펜클로미딘의 비-신경독성 유도체, 골바티닙, 덱사나비놀, TGF-베타 1 키나제 억제제, 아파티닙, IDO 억제제, 카바지탁셀, Src 키나제/예비튜불린 억제제, SMO 단백질 억제제, 엔도텔린 A/B 수용체 길항제, 프로테아좀 억제제, T형 칼슘 채널 길항제, 탑시가르긴 유사체, 이리노테칸, 니볼루맙, CSF-1R 억제제, 펠라레오렙, EGFR 길항제, 엑스포틴-1 단백질 억제제/핵 단백질 억제제, BIRC5 단백질 억제제, 에보포스파미드(evofosfamide), 아베오탁산(abeotaxane), ENG 단백질 억제제, 트랜스-소듐 크로세티네이트(trans-sodium crocetinate), N7-알킬화제, 표적화된 항-혈관형성제 및 벨리파립(veliparib)을 포함한다.
간질을 치료하기 위한 예시적인 치료제는 에베롤리무스, 에슬리카바제핀 아세테이트, 알프라졸람, 브리바라세탐, 카바마제핀, 칸나비디올, 4-아미노부티레이트 트랜스아미나제 억제제, 페람파넬, GABA-A 수용체 작용제, 합성 후퍼진, 프레가발린, 클로바잠, 디아제팜, GABAA 시냅스 및 시냅스외 수용체 조절제, 토피라메이트 IV, 라코사미드, 및 세로토닌 수용체 작용제를 포함한다.
유전자 장애(예컨대, 프리드리히 운동실조증, 유아기 후기 신경세포 자궁, 척추 및 구근 위축, 운동실조 모세혈관확장증, 판토텐산 키나제 관련 신경변성, 척추 근육 위축, 가족성 아밀로이드 다발신경병증, 레트 증후군, 레이 증후군, 윌슨 병)를 치료하기 위한 예시적인 치료제는 NF/E2 관련 인자 2 자극제, 인터페론 감마-1b, rhTPP1 효소 대체 요법, 바티퀴논, 데페리프론, Spinraza®, ISIS-TTRRX, 세로토닌 1A 수용체 작용제, 사이토카인 억제제/뉴로펩타이드 수용체 조절제, siRNA 억제제 표적화 TTR, 포스포판토테네이트 대체물, DcpS 억제제, 시스테아민 비타르트레이트, 인돌프로피온산, 트랜스티레틴 해리 억제제 및 비스-콜린 테트라티오몰리브데이트를 포함한다.
두통을 치료하기 위한 예시적인 치료제는 항-CGRP mAb, CGRP 수용체 길항제 mAb, 수마트립탄, 덱스트로메토르판/퀴니딘, 오나보툴리눔톡신 A, 세로토닌-1F 수용체 작용제, nNOS 억제제/5HT, 다이하이드로에르고타민, 사이클로벤자프린 및 아스피린/수마트립탄 조합을 포함한다.
헌팅턴병을 치료하기 위한 예시적인 치료제는 라퀴니모드, PDE10 억제제, 프리도피딘, 시스테아민 바이타르트레이트 및 aVMAT2 억제제를 포함한다.
다발성 경화증을 치료하기 위한 예시적인 치료제는 나탈리주맙, 모노메틸 푸마레이트 전구약물, 항-LINGO-1 항체, Nck 단백질 조절제, S1PR-1/5 수용체 작용제, 핀골리모드, 항-CD52 mAb, 이데베논, PPAR-감마 작용제/조절제, 라퀴니모드, 티로신 키나제 억제제, 항-CD19 mAb, 이부딜라스트, 구아나벤즈, 항-CD20 mAb, 인터페론 베타-1b, IL-7 수용체 억제제, S1P1 수용체 작용제, 미엘린 단백질 자극제, 에스트리올 숙시네이트, 이밀렉류셀(imilecleucel)-T, 항-VLA 2 mAb, BAFF-R 조절제, CD100 항원 억제제, 항-DR6 항체 및 NF-카파 B 억제제를 포함한다.
근이영양증을 치료하기 위한 예시적인 치료제는 미오스타틴 억제제, 드리사퍼센, 에테플리르센, 할로푸기논, 이데베논, ISIS-DMPKRX, (스테로이드 수용체 작용제, GAPDH 억제제, 유전자 전사 억제제, 타달라필, 아탈루렌 및 글루코코르티코이드 수용체 작용제를 포함한다.
통증을 치료하기 위한 예시적인 치료제는 뉴블라스틴, P2X3 퓨린수용체 길항제, SNARE 단백질 길항제, 옥시코돈-날트렉손 코어(남용 내성), 아미트립틸린/케타민, 린타톨리모드, 칸나비노이드 수용체 CB2 작용제, 비-적혈구조혈성 펩타이드, PPAR-감마 작용제, 글리코겐 포스포릴라제 억제제, NMDA 수용체 길항제, 졸레드론산, 조기 성장 반응 단백질 1 억제제, (히스타민-3 수용체 길항제, 부프레노르핀, 사이토카인 억제제, 세브라노파돌, 셀레콕시브, 아라키돈산 유사체, 합성 캡사이신, Nav1.7 나트륨 채널 억제제, 아편양 카파 수용체 작용제, 둘록세틴, 신경 성장 인자 자극제, 덱스메데토미딘, 전압 게이트 나트륨 채널 억제제, 부피바카인, 안지오텐신 2형 수용체 길항제, 신경 성장 인자 억제제, p38 억제제, 라파스티넬, 레보파놀, CGRP mAb, 프레가발린, mGlu2/3 수용체 작용제, CACNA2D1 단백질 조절제, 골 흡수 인자 억제제, 뉴블라스틴(neublastin), 뮤-아편양 진통제, nNOS 억제제, O-데스메틸트라마돌, 팔미토일에탄올아미드, GABA A 작용제, TRPV-1 수용체 작용제, 나빅시몰, 사이클로-옥시게나제 2 억제제, 신경 성장 인자 조절제, 사이클로벤자프린, 플루르비프로펜, 지방산 아미드 가수분해효소 억제제, 및 이부프로펜/포스파티딜콜린을 포함한다.
파킨슨 병을 치료하기 위한 예시적인 치료제는 아만타딘, 아포몰핀, 알파7 니코틴 아세틸콜린 수용체 부분 작용제, 항-알파-시누클레인 항체, 알파-시누클레인 억제제, 레보도파, D1 강화제, 디프라글루란트, 세로토닌 1A/1B 부분 작용제, 피파메졸, GM6, 레티노이드 X 수용체 작용제, 이스트라데필린, 로티고틴, 프라미펙솔/라사길린, R-펜세린, 세로토닌 2A/6 수용체 길항제, 아데노신 A2A 수용체 길항제, 사피나미드 및 도파민 수용체 작용제를 포함한다.
경직을 치료하기 위한 예시적인 치료제는 바클로펜, 오나보툴리눔톡신 A, 아보보툴리눔톡신 A, 아르바클로펜, 나빅시몰 및 인코보툴리눔톡신 A를 포함한다.
척수 손상을 치료하기 위한 예시적인 치료제는 항-Lingo-1 항체, 항-NgR1 항체, 뉴블라스틴, 신경계 조절제, Rho GTP-결합 단백질-억제제 및 섬유아세포 성장 인자 수용체를 포함한다.
뇌졸중을 치료하기 위한 예시적인 치료제는 나탈리주맙, 인간 야생형 활성화 단백질 C의 재조합 돌연변이형태, 티카그렐러, 달팜프리딘, 아스피린, 니모디핀 마이크로입자, GM6, PARP 억제제, PDZ 도메인 억제제, 베타 아밀로이드 억제제, 다비가트란, 및 아질산 나트륨을 포함한다.
투렛 증후군을 치료하기 위한 예시적인 치료제는 히스타민-3 수용체 길항제, 4-아미노부티레이트 트랜스아미나제 억제제, 아보보툴리눔톡신 A, 에코피팜, VMAT2 억제제, 아캄프로세이트 및 비가바트린을 포함한다.
다른 신경계 장애를 치료하기 위한 다른 예시적인 치료제는 미오스타틴 억제제, NF/E2 관련 인자 2 자극제, 항-타우 항체, 마이엘로퍼옥시다제 억제제, 미토콘드리아 투과성 전이 기공 억제제, 벨리무맙, 타입 II-B 액티빈 수용체 조절제 mAb, C1 에스터라제 억제제, 제2 철 카복시말토스, 아미팜프리딘, 핀골리모드, 모노아민 산화효소 B 억제제, 신경전달물질 조절제, 도파민 수용체 작용제, 항-CD19 mAb, VMAT2 억제제, CD20 mAb, 티모신 베타-4, 항-IL-6 수용체 mAb, 에쿨리주맙(eculizumab), AMPA 수용체 조절제, 스테로이드 수산화효소 억제제, 피리독살 포스페이트, 아베오탁산, 아세뉴라민산 및 소듐 옥시베이트를 포함한다.
일 예에서, 치료제는 항체이다. 예시적인 치료 항체의 CDR의 비제한적인 예는 이하에 제공된다.
Figure pct00017
Figure pct00018
예시적인 치료 항체의 VH 및 VL의 비제한적인 예는 이하에 제공된다.
항-LINGO-1:
Figure pct00019
항-TWEAK:
Figure pct00020
항-베타-아밀로이드:
Figure pct00021
항-타우:
Figure pct00022
항-타우:
Figure pct00023
항-타우:
Figure pct00024
항-알파-시누클레인:
Figure pct00025
Figure pct00026
항-C9orf72 DPR:
Figure pct00027
일부 실시형태에서, 키메라 분자는 전술한 항체 가변 도메인 및 전 항체(치료제)를 포함하는 융합 폴리펩타이드이다(도 48 참조). 본 명세서에 기재된 항체 가변 도메인의 C-말단은 직접 또는 링커(예컨대, G, GG, G4S(서열번호 5), 3X G4S(서열번호 60)를 통해 항체의 두 VH 또는 두 VL 도메인의 N-말단에 연결된다. 특정 실시형태에서, 전 항체는 항-베타 아밀로이드 항체, 항-타우 항체, 항-알파 시누클레인 항체, 항-TDP-43 항체, 항-LINGO-1 항체, 항-LINGO-2 항체, 항-LINGO-3 항체, 항-LINGO-4 항체, 항-TREM2 항체, 항-C9orf72 다이펩타이드 반복 폴리-GA 항체(즉, 염색체 9 오픈 리딩 프레임 72(C9orf72) 유전자로부터 해독된 것으로서 적어도 6개의 반복체(GA)6을 갖는 폴리-글리신-알라닌(GA)의 다이펩타이드 반복체(DPR)에 결합할 수 있는 항체), 항-TWEAK 항체, 또는 항-TWEAK-R 항체이다.
일부 실시형태에서, 키메라 분자는 전술한 항체 가변 도메인, 힌지 영역, Fc 영역 및 Fab(치료제)를 포함한다(도 48 참조). 항체 가변 도메인의 C-말단은 이후 직접 또는 간접적으로 Fc 영역에 연결되는 각 힌지 영역의 N-말단에 직접 또는 간접적으로 연결된다. Fc 영역의 각 Fc 도메인의 C-말단은 링커[예를 들어, G, GG, G4S(서열번호 5), 3XG4S(서열번호 60)]를 통해 Fab(치료제)의 VH 또는 VL 도메인의 N-말단에 연결된다. 특정 실시형태에서, Fab는 항-베타 아밀로이드 Fab, 항-타우 Fab, 항-알파 시누클레인 Fab, 항-TDP-43 Fab, 항-LINGO-1 Fab, 항-LINGO-2 Fab, 항-LINGO-3 Fab, 항-LINGO-4 Fab, 항-TREM2 Fab, 항-C9orf72 다이펩타이드 반복체 폴리-GA Fab, 항-TWEAK Fab, 또는 항-TWEAK-R Fab이다.
특정 실시형태에서, 키메라 분자는 본 명세서에 기재된 항체 가변 도메인, 치료제, 힌지 영역 및 Fc 영역을 포함한다. 항체 가변 도메인의 C-말단은 직접 또는 링커[예를 들어, G, GG, G4S(서열번호 5), 3XG4S(서열번호 60)]를 통해 치료제[예를 들어, 항체 단편(예컨대, Fab)), 효소, 펩타이드]의 N-말단에 연결된다. 치료제의 C-말단은 직접 또는 링커를 통해 힌지 영역의 N-말단에 연결된다. 힌지 영역의 C-말단은 Fc 영역의 각 Fc 도메인의 N-말단에 연결된다. 일부 경우에,
일부 실시형태에서, 키메라 분자는 본 명세서에 기재된 항체 가변 도메인, 치료제, 힌지 영역 및 Fc 영역을 포함한다. 항체 가변 도메인의 C-말단은 직접 또는 링커를 통해 힌지 영역의 N-말단에 연결된다. 힌지 영역의 C-말단은 Fc 영역의 각 Fc 도메인의 N-말단에 연결된다. 치료제[예를 들어, 항체 단편(예컨대, Fab)), 효소, 펩타이드]의 N-말단은 직접 또는 링커(예컨대, G, GG, G4S(서열번호 5), 3X G4S(서열번호 60)를 통해 Fc 영역의 하나의 Fc 도메인 또는 둘 모두의 Fc 도메인의 C-말단에 연결된다.
특정 실시형태에서, 키메라 분자는 본 명세서에 기재된 항체 가변 도메인, ASO(치료제), 힌지 영역 및 Fc 영역을 포함한다. 항체 가변 도메인의 C-말단은 힌지 영역의 N-말단에 직접 또는 링커를 통해 연결된다. 힌지 영역의 C-말단은 Fc 영역의 각 Fc 도메인의 N-말단에 연결된다. ASO는 힌지 영역에 연결된다. 특정 경우에, ASO는 스플라이스 교환 올리고뉴클레오타이드이다. 다른 경우에, ASO는 갭머이다.
일부 경우에, 키메라 분자는 본 명세서에 기재된 항체 가변 도메인, 힌지 영역, Fc 영역, 및 치료제[예를 들어, ASO(예컨대, 스플라이스 교환 올리고뉴클레오타이드 또는 갭머), 소분자 약물, 핵산, 펩타이드]를 캡슐화하는 지질 나노입자, 리포좀 또는 중합체성 나노캐리어를 포함한다. 항체 가변 도메인의 C-말단은 직접 또는 링커를 통해 힌지 영역의 N-말단에 연결된다. 힌지 영역의 C-말단은 Fc 영역의 각 Fc 도메인의 N-말단에 연결된다. 리포솜은 Fc 영역의 하나 또는 둘 모두의 Fc 도메인의 C-말단에 연결될 수 있다. 나노스케일 전달 방법은 본 기술분야에 잘 알려져 있다. 예를 들어, Juliano et al., Nucl. Acids Res., 44(14)(2016) 및 여기에 인용된 참고 문헌을 참조하고, 이 문헌들은 모두 본 명세서에 참고로 포함된다.
전술한 키메라 분자는 Fc 영역 대신 HSA 모이어티를 포함할 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
또한, 본 개시내용은 도 49에 도시된 바와 같이 1가, 이중특이적 및 4가 설계를 포괄한다.
핵산, 벡터, 숙주 세포 및 폴리펩타이드 제조 방법
본 개시내용은 또한 상기 개시된 항체 가변 도메인을 암호화하는 핵산을 포괄한다. 또한, 본 명세서에 기재된 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 또는 핵산들이 포괄된다. 핵산 또는 핵산들은 벡터 또는 벡터들(예컨대, 발현 벡터)에 삽입될 수 있다.
상기 기재된 항체 가변 도메인 및 이를 포함하는 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산은 임의의 바람직한 숙주 세포(예컨대, 박테리아 세포, 효모 세포, 포유류 세포)에서 발현될 수 있다. 특정 실시형태에서, 폴리펩타이드는 숙주 세포로부터 분비된다. 일 실시형태에서, 숙주 세포는 포유류 세포이다. 특정 실시형태에서, 숙주 세포는 CHO 세포 또는 세포주이다. 일부 예에서, 항체 가변 도메인 폴리펩타이드 암호 서열(예컨대, 인간화된 FC5 또는 이황화 안정화 및 인간화된 FC5)은 개재 아미노산 서열을 통해 Fc(예컨대, IgG1, agly IgG1, IgG2, IgG3, IgG4) 암호 서열에 융합된다. 일부 경우에, 개재 아미노산 서열은 힌지 서열(예컨대, IgG1, IgG4 등의 힌지)을 포함한다. 일부 경우에, 개재 아미노산 서열은 Fab 및 힌지 서열을 포함한다.
폴리펩타이드가 박테리아 세포(예컨대, E. 콜라이)에서 발현되어야 하는 경우, 발현 벡터는 박테리아 세포에서 벡터의 증폭을 허용하는 특성을 가져야 한다. 또한, JM109, DH5α, HB101 또는 XL1-Blue와 같은 E. 콜라이가 숙주로서 사용되는 경우, 벡터는 프로모터, 예를 들어, lacZ 프로모터[Ward et al., Nature, 341: 544-546(1989)], araB 프로모터[Better et al., Science, 240: 1041-1043(1988)] 또는 E. 콜라이에서 효율적인 발현을 가능하게 하는 T7 프로모터를 보유해야 한다. 이러한 벡터의 예는, 예를 들어 M13-시리즈 벡터, pUC-시리즈 벡터, pBR322, pBluescript, pCR-Script, pGEX-5X-1(Pharmacia), "QIAexpress 시스템"(QIAGEN), pEGFP 및 pET(이 발현 벡터가 사용되는 경우, 숙주는 바람직하게는 T7 RNA 폴리머라제를 발현하는 BL21임)를 포함한다. 발현 벡터는 분비를 위한 신호 서열을 함유할 수 있다. E. 콜라이의 주변세포질로 생산하도록 하기 위해, pelB 신호 서열[Lei et al., J. Bacteriol., 169:4379(1987)]이 분비를 위한 신호 서열로서 사용될 수 있다. 박테리아 발현을 위해, 염화칼슘 방법 또는 전기천공법을 사용하여 발현 벡터를 박테리아 세포에 도입시킬 수 있다.
폴리펩타이드가 효모 세포[예를 들어, 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae), 사카로마이세스 이탈리커스(Saccharomyces italicus), 사카로마이세스 룩시(Saccharomyces rouxii), 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 피치아 안구스타(Pichia angusta), 피치아 아노말라(Pichia anomala), 피치아 캡슐레이트(Pichia capsulate), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis) 또는 아스퍼질러스(Aspergillus) 속의 효모, 캔디다(Candida), 토룰롭시스(Torulopsis), 토룰라스포라(Torulaspora), 시조사카로마이세스(Schizosaccharomyces), 시테로마이세스(Citeromyces), 파치솔렌(Pachysolen), 자이고사카로마이세스(Zygosaccharomyces), 데바로마이세스(Debaromyces), 트리코데르마(Trichoderma), 세팔로스포리움(Cephalosporium), 휴미콜라(Humicola), 뮤코(Mucor), 뉴로스포라(Neurospora), 야로위아(Yarrowia), 메츄니코위아(Metschunikowia), 로도스포리디움(Rhodosporidium), 류코스포리디움(Leucosporidium), 보리오아스커스(Borryoascus), 스포리디오볼러스(Sporidiobolus), 또는 엔도마이콥시스(Endomycopsis)]에서 발현되어야 한다면, 발현 벡터는 효모 세포에서 폴리펩타이드의 발현을 유도하는 프로모터, 및/또는 효모에서 분비를 유도하는 데 효과적인 신호 서열을 포함한다. 사카로마이세스에 적합한 프로모터는 PGK1 유전자, GAL1 또는 GAL10 유전자, CYC1, PHOS, TRP1, ADH1, ADH2, 글리세르알데하이드-3-포스페이트 탈수소효소, 헥소키나제, 피루베이트 탈탄산효소, 포스포프럭토키나제, 트리오스 포스페이트 이성질체화효소, 포스포글루코스 포스페이트 이성질체화효소, 글루코키나제, 알파-교배 인자 페로몬, [교배 인자 페로몬]에 대한 유전자와 관련된 것, PRB1 프로모터, GUT2 프로모터, GPD1 프로모터, 및 5' 조절 영역의 일부와 다른 프로모터의 5' 조절 영역의 일부 또는 업스트림 활성화 부위와의 혼성체를 수반하는 혼성 프로모터(예컨대, EP-A-258 067에 기재된 프로모터)를 포함한다. 피치아에 적합한 프로모터는 AOX1, AOX2, MOX1 및 FMD1을 포함한다. 일부 예에서, 신호 서열은 효모 유래 신호 서열(예컨대, 효모 숙주에 상동성인 것)이다.
폴리펩타이드가 CHO, COS 및 NIH3T3 세포와 같은 세포에서 발현되어야 한다면, 발현 벡터는 이러한 세포에서의 발현에 필수적인 프로모터, 예를 들어, SV40 프로모터[Mulligan et al., Nature, 277:108 (1979)], MMLV-LTR 프로모터, EF1α 프로모터[Mizushima et al., Nucleic Acids Res., 18:5322(1990)] 또는 CMV 프로모터를 포함한다. 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열 외에도, 재조합 발현 벡터는 숙주 세포에서 벡터의 복제를 조절하는 서열(예컨대, 복제 기원) 및 선택가능한 마커 유전자와 같은 추가 서열을 운반할 수 있다. 선택가능한 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포의 선택을 용이하게 한다(예컨대, 미국 특허 번호 4,399,216, 4,634,665 및 5,179,017 참조). 예를 들어, 일반적으로 선택가능한 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포에서 G418, 하이그로마이신 또는 메토트렉세이트와 같은 약물에 대한 내성을 부여한다. 선택가능한 마커가 있는 벡터의 예로는 pMAM, pDR2, pBK-RSV, pBK-CMV, pOPRSV 및 pOP13을 포함한다.
폴리펩타이드는 또한 HEK-293 세포와 같은 인간 세포에서 발현될 수 있다.
변이체 FC5 폴리펩타이드(및 이의 융합체)는 본 기술분야에 공지된 여러 방법 중 임의의 방법을 사용하여 작제할 수 있다. 이러한 방법 중 하나는 암호화된 변이체 FC5 폴리펩타이드에서 단일 아미노산(또는 바람직한 경우, 소수의 소정의 아미노산 잔기)을 변화시키기 위해 특정 뉴클레오타이드(또는 바람직한 경우 소수의 특정 뉴클레오타이드)를 변화시키는 부위 지시성 돌연변이유발(site-directed mutagenesis)이다. 많은 부위 지시성 돌연변이유발 키트는 시중에서 입수용이하다. 이러한 하나의 키트는 Clontech Laboratories(캘리포니아주 팔로 알토)에서 판매하는 "Transformer Site Directed Mutagenesis Kit"이다.
FC5 폴리펩타이드 및 이의 융합체는 본 기술분야에 잘 알려진 방법을 사용하여 생산 및 단리될 수 있다. 일부 실시형태에서, 이러한 폴리펩타이드는 재조합 DNA 기술에 의해 생산된다. 예를 들어, FC5 폴리펩타이드 또는 이의 융합체를 암호화하는 핵산 분자(들)는 벡터(들), 예를 들어, 발현 벡터에 삽입될 수 있고, 이 핵산이 세포 내로 도입될 수 있다. 적합한 세포는, 예를 들어, 포유류 세포(예컨대, 인간 세포 또는 CHO 세포), 진균 세포, 효모 세포, 곤충 세포 및 박테리아 세포를 포함한다. 재조합 세포에서 발현될 때, 세포는 바람직하게는 폴리펩타이드의 발현을 허용하는 조건 하에서 배양된다. 폴리펩타이드는 원하는 경우 세포 현탁액으로부터 회수될 수 있다. 본 명세서에 사용된 "회수된"은 회수 공정 전에 존재하던 세포 또는 배양 배지의 성분들로부터 제거된 것을 의미한다. 회수 공정은 하나 이상의 리폴딩(refolding) 또는 정제 단계를 포함할 수 있다. 단백질 정제에 일반적으로 사용되는 단리 및 정제 방법은 본 명세서에 기재된 폴리펩타이드의 단리 및 정제에 사용될 수 있으며, 임의의 특정 방법에 제한되지 않는다. 예를 들어, 칼럼 크로마토그래피, 여과, 한외여과, 염석, 용매 침전, 용매 추출, 증류, 면역침전, SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동, 등전 집속, 투석 및 재결정을 적절하게 선택하고 조합하여 폴리펩타이드를 단리 및 정제할 수 있다. 크로마토그래피에는 예를 들어 친화성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 겔 여과, 금속 킬레이트화 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피 및 흡착 크로마토그래피가 포함된다(Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996). 크로마토그래피는 HPLC 및 FPLC와 같은 액상 크로마토그래피를 사용하여 수행할 수 있다. 친화성 크로마토그래피에 사용되는 칼럼은 단백질 A 칼럼 및 단백질 G 칼럼, Capture Select HSA 및 Heparin Sepharose를 포함한다. 단백질 A 칼럼을 사용하는 칼럼의 예로는 Hyper D, POROS 및 Sepharose FF(GE Healthcare Biosciences)를 포함한다. 본 개시내용은 또한 이러한 정제 방법을 사용하여 고도로 정제된 폴리펩타이드를 포함한다.
치료 방법
본 명세서에 기재된 항체 가변 도메인은 질병 또는 장애를 치료 및/또는 예방하는 데 유용한 화물(예컨대, 치료제)을 수송하는 데 사용될 수 있다. 치료제는 예를 들어 항체, 항체 단편(예컨대, Fab), 나노바디, 디아바디, 단일 사슬 항체, 소분자 약물, 펩타이드, 효소 또는 핵산(예컨대, ASO)일 수 있다. 특정 예에서, 치료제는 항체 가변 도메인에 직접 또는 간접적으로 연결된다. 다른 예에서, 치료제는 항체 가변 도메인에 직접 또는 간접적으로 연결되는 리포솜, 지질 나노입자 또는 중합체성 나노캐리어에 캡슐화된다. 중추 신경계에 표적화될 치료제를 본 명세서에 기재된 항체 가변 도메인에 연결함으로써, 이러한 융합체는 BBB를 가로질러 치료제를 수송할 수 있다.
특정 실시형태에서, 질병 또는 장애는 신경계 장애이다. 일부 예에서, 질병 또는 장애는 타우병증이다. 일부 예에서, 질병 또는 장애는 시누클레인병증(synucleinopathy)이다.
일부 예에서, 질환 또는 장애는 알츠하이머 병, 파킨슨 병, 다발성 경화증, 전두측두엽 치매(FTD), 근위축성 측삭 경화증(ALS), 진행성 핵상 마비(PSP), 척수 손상(SCI), 척추 근육 위축(SMA), 신경계 암, 급성 또는 만성 시신경염, 근위축성 측삭 경화증/파킨슨증-치매 복합증, 은친화과립 치매, 영국형 아밀로이드 혈관병증, 뇌 아밀로이드 혈관병증, 피질기저 변성, 크로이츠펠트-야콥병, 권투선수 치매, 석회화를 동반한 미만성 신경원섬유 매듭, 다운 증후군, 17번 염색체와 관련된 파킨슨증을 동반한 전두측두엽 치매, 전두측두엽 변성, 게르스트만-슈트라우슬러-샤인커(Gerstmann-Straussler-Scheinker) 질환, 할러보르덴-슈파츠(Hallervorden-Spatz) 질환, 봉입체 근염, 다발계 위축증, 근긴장성 이영양증, 니만-피크(Niemann-Pick) 질환 타입 C, 신경원섬유 매듭을 동반하는 비-과메이니언 운동뉴론질환(Non-Guamanian motor neuron disease with neurofibrillary tangles), 피크 병(Pick's disease), 뇌염후 파킨슨증상(postencephalitic parkinsonism), 프리온 단백질 대뇌 아밀로이드 혈관병증(Prion protein cerebral amyloid angiopathy), 진행성 피질하 신경교종(progressive subcortical gliosis), 아급성 경화성 범뇌염(subacute sclerosing panencephalitis), 신경원섬유 매듭-우세 치매(Tangle only dementia), 또는 다발성 경색성 치매로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 예에서, 질병 또는 장애는 뇌졸중, 만성 외상성 뇌병증, 외상성 뇌 손상(TBI), 뇌진탕, 발작, 간질 또는 급성 납 뇌병증으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
사용될 수 있는 예시적인 치료 항체는 미국 특허 번호 8,906,367, 9,605,059; 9,598,484; 9,587,014; 9,777,058; 9,567,395; 8,128,926; 8,058,406; 8,048,422; 및 미국 출원 번호 2017/0247471-A1에 개시되어 있고, 이들 모두는 그 전체가 본 명세서에 참고로 포함된다.
사용될 수 있는 예시적인 치료용 ASO는 미국 특허 번호 8,361,977 및 8,980,853에 개시되어 있으며, 이들 모두는 그 전체가 본 명세서에 참고로 포함된다.
조성물의 치료학적 유효량은 본 기술분야의 기술자에 의해 확인될 수 있는 투여 요법으로 이를 필요로 하는 인간 대상체에게 투여될 수 있다. 조성물에 대한 투약 빈도는 의사의 기술 및 임상적 판단 범위 내에 있다. 전형적으로, 투여 요법은 최적의 투여 파라미터를 확립할 수 있는 임상 실험에 의해 확립된다. 그러나, 실무자는 대상체의 연령, 건강, 체중, 성별 및 의학적 상태에 따라 이러한 투여 요법을 변경할 수 있다. 투약 빈도는 질병 또는 장애에 대한 급성 및 만성 치료 간에도 달라질 수 있다. 또한, 투약 빈도는 치료가 예방적인지 치료적인지에 따라 달라질 수 있다.
검정
본 개시내용은 또한 항체 가변 도메인의 불안정성을 평가하기 위한 검정을 특징으로 한다. 특정 예에서, 항체 가변 도메인은 단일 도메인 항체이다. 일 예에서, 단일 도메인 항체는 FC5 또는 이의 변이체(예컨대, 인간화된, 이황화 안정화된, 또는 인간화 및 이황화 안정화된 것)이다.
이 방법은 항체 가변 도메인을 혈청 샘플에 첨가하여 혼합물을 만드는 것을 제공하는 단계; 혼합물을 인큐베이션하는 단계; 항체 가변 도메인을 정제하는 단계; 및 펩타이드 맵핑을 수행하는 단계를 수반한다. 일부 예에서, 혈청 샘플은 래트 혈청이다. 다른 예에서, 혈청 샘플은 인간 혈청이다.
특정 실시형태에서, 항체 가변 도메인은 0.01 내지 0.5 ㎎/㎖의 농도로 혈청에 존재한다. 일부 실시형태에서, 항체 가변 도메인은 약 0.1 ㎎/㎖의 농도로 혈청에 존재한다. 일부 실시형태에서, 항체 가변 도메인은 0.05 ㎎/㎖의 농도로 혈청에 존재한다. 일부 실시형태에서, 항체 가변 도메인은 0.1 ㎎/㎖의 농도로 혈청에 존재한다. 일부 실시형태에서, 항체 가변 도메인은 0.2 ㎎/㎖의 농도로 혈청에 존재한다. 일부 실시형태에서, 항체 가변 도메인은 0.3 ㎎/㎖의 농도로 혈청에 존재한다. 일부 실시형태에서, 항체 가변 도메인은 0.4 ㎎/㎖의 농도로 혈청에 존재한다. 일부 실시형태에서, 항체 가변 도메인은 0.5 ㎎/㎖의 농도로 혈청에 존재한다.
특정 경우에, 혼합물은 25 내지 50℃에서 10 내지 100시간 동안 인큐베이션된다. 특정 경우에, 혼합물은 약 37℃에서 약 70시간 동안 인큐베이션된다. 일 실시형태에서, 혼합물은 37℃에서 70시간 동안 인큐베이션된다.
본 개시내용의 실시예 3은 이 검정을 수행하는 비제한적인 방식을 제공한다.
이하 실시예는 청구된 발명을 더 잘 예시하기 위해 제공되며 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 특정 물질이 언급되는 한, 이는 단지 예시를 위한 것이고 본 발명을 제한하려는 의도가 아니다. 본 기술분야의 기술자는 독창적인 능력을 발휘함이 없이, 그리고 본 발명의 범위를 벗어남이 없이 동등한 수단 또는 반응물을 개발할 수 있다.
실시예
실시예 1: FC5-항-LINGO-1 항체(Li81) 융합 단백질의 생산
FC5 수송 활성 및 Li81 기능을 함유하는 FC5 Li81 이중특이성 항체가 생성될 수 있는지 평가하기 위해 표 1에 나열된 9개의 상이한 버전을 설계, 발현, 정제 및 특성화하였다. 설계의 개략은 구조가 표지된 칼럼에 제시되며, 각 작제물에서 FC5 Vhh 및 Li81 원자가의 비율은 FC5:Li81로 표지된 칼럼에 나열된다. 작제물은 1개, 2개, 또는 4개의 FC5 Vhh 모이어티, 및 1개 또는 2개의 Li81 Fab를 함유하였다. 나열된 처음 4개의 작제물에서 FC5는 언급한 바와 같이 도메인들을 연결하기 위해 1개 또는 3개의 G4S(서열번호 5) 링커를 사용하여 Li81 중쇄, 경쇄, 또는 둘 모두의 N-말단에 부착시켰다. 5번째 및 6번째 작제물에서 FC5는 Li81 mAb의 힌지-Fc에 직접 부착시켰고, Li81 Fab는 Fc의 C-말단에 이의 중쇄를 통해 융합시켰다. 힌지는 2개의 다른 버전을 긴 것과 짧은 것으로 표시하여 FC5Vhh와 Fc 도메인을 연결하는데 사용하였다. 4개의 다른 버전은 각 암이 상이한 작용기를 운반하고 있다고 언급한 바와 같이 이종이량체였다.
Figure pct00028
FC5 Li81 작제물은 CHO 세포에서 발현시켰다. 조정 배지의 제조를 위해, 형질감염된 CHO 세포를 무-혈청 배지에서 확장시키고, 고밀도로 성장시키고, 보충제를 공급하고, 저하된 온도로 이동시켰다. 이 저하된 온도에서 배양물을 11일 내지 14일 동안 유지시킨 다음 원심분리하여 수확하고 0.45 미크론 여과에 의해 청징화시켰다.
정제를 위해, 청징화 및 여과된 배양 배지를 단백질 A 칼럼에 로드하고 20mM NaH2PO4 pH 7.4, 100mM NaCl로 세척한 다음, 25mM NaH2PO4 pH 5.5, 100mM NaCl로 세척하였다. FC5-Li81은 25mM NaH2PO4 pH 2.8, 100mM NaCl pH 2.8로 칼럼으로부터 용출시키고 0.5M 스톡 용액에서 희석한 25mM NaH2PO4 pH 8.6으로 중화하였다. 용출된 샘플의 단백질 함량은 1 ㎎/㎖ 용액에 대해 1.4의 흡광 계수를 사용하여 280㎚에서의 흡광도로부터 추산하였다. 도 3은 FC5를 HC(ID# 3014), LC(ID# 3015) 또는 둘 모두(ID# 3016)의 N-말단에 연결하는 3xG4S(서열번호 6) 링커를 사용하여 FC5를 Li81 mAb의 N-말단에 융합시킨 처음 3개의 작제물을 SDS-PAGE 분석한 것을 나타낸다. 이 분석은 비환원 조건에서 HC 및 LC의 발현 및 특징적인 HC2LC2 사량체 복합체로의 어셈블리를 확인시켜 준다. 레인 3에서 단백질의 약간 더 큰 크기는 다른 샘플에서 2 카피에 대비하여 FC5의 4 카피의 존재와 일치한다. 도 2는 3개의 작제물에 사용된 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열을 나타낸다. 환원된 중쇄 3014(예측된 질량 62784.5Da, 관찰된 질량 62783 Da), 환원된 경쇄 3014(예측된 질량 23628.4 Da, 관찰된 질량 23628 Da), 환원된 중쇄 3015(예측된 질량 48608.9 Da, 관찰된 질량 48608 Da), 환원된 경쇄 3015(예측된 질량 37804.0 Da 관찰된 질량 37804 Da), 환원된 중쇄 3016(예측된 질량 62784.5 Da, 관찰된 질량 62782 Da), 및 환원된 경쇄 3016(예측된 질량 37804.0 Da, 관찰된 질량 37804 Da)의 온전한 질량 분석은 모든 샘플의 주요 성분이 예측된 경쇄 및 중쇄였음을 보여주었다. 상응하는 디컨볼류션된 스펙트럼은 도 4, 5 및 6에 제시된다. 주요 성분에서 예상치 못한 변형은 관찰되지 않았다.
도 7(왼쪽 패널)은 표 1에 기재된 6개의 상이한 생성물을 비환원 조건 하에서 SDS-PAGE 분석한 것을 나타낸다. 버전 3438, 3440, 3441은 항체의 특징적인 HC2LC2 이량체 구조 특성을 함유하고 단백질 A 정제 후 >95% 순도였다. 이에 반해, 버전 3442, 3443 및 3444는 단백질 A 정제 후에 매우 불균일했다. 이들은 어느 한 쪽 암의 바람직한 헤테로머(heteromer) 및 호모머(homomer)를 생성할 3가지 다른 가능성을 반영하는 헤테로머 설계에 대해 예상할 수 있는 성분들의 예측된 혼합물을 함유하였다. 이 혼합물로부터 헤테로머를 농축시키기 위해 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 사용하였다. SEC 분별을 위해, 단백질 A 용출물을 농축한 뒤, 24㎖ Superdex 200 칼럼에서 20mM Na2HPO4 pH 7.4, 150mM NaCl로 0.5 ㎖/분의 유속 하에 SEC로 처리하였다. 칼럼 분획을 수집하고, SDS-PAGE로 분석하고, 헤테로머를 함유하는 분획을 모아서, 여과하고, 분취하여 -70℃에 보관하였다. 도 7(오른쪽 패널)은 샘플 3443의 SEC 분획을 나타낸다. 레인 7 및 8(화살표로 표시됨)에 표시된 분획을 모아서, 왼쪽 패널의 레인 7에 나타낸 샘플을 생성하였다.
도 8은 다양한 FC5-(G4S)1-Li81 작제물에 대한 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열을 나타낸다. 환원된 중쇄 3438(예측된 질량 62,153.9 Da, 관찰된 질량 62155 Da), 환원된 중쇄 3440(예측된 질량 62,897.8 Da, 관찰된 질량 62899 Da), 환원된 중쇄 3441(예측된 질량 62,167.0 Da, 관찰된 질량 62168 Da), 환원된 중쇄 3442(예측된 질량 62,897.8 Da 관찰된 질량 62899 Da), 환원된 중쇄 3443(예측된 질량 62,167.0 Da, 관찰된 질량 62169 Da), 환원된 중쇄 3444(예측된 질량 62,167.0 Da, 관찰된 질량 62169 Da)의 온전한 질량 분석. 모든 작제물은 Li81 경쇄를 함유했다(환원된 경쇄 예측 질량 23,628.4, 관찰된 질량 23629 Da). 이러한 분석은 모든 샘플 중의 주요 성분들이 예측된 경쇄와 중쇄를 함유하고 있음을 보여주었다. 중쇄에 대한 상응하는 디컨볼류션된 스펙트럼은 도 9에 제시된다. 주요 성분에 대한 예상치 못한 변형은 관찰되지 않았다.
FC5 융합체가 Li81 기능에 영향을 미치는지를 시험하기 위해, 96웰 평판을 LINGO-1로 코팅한 뒤, FC5-Li81 이중특이체의 연속 희석물로 처리한 ELISA 형식에서 샘플을 LINGO-1에 대한 결합에 대해 분석하였다. 도 10은 6개의 FC5-(G4S)1-Li81 작제물에 대한 ELISA 데이터를 나타낸다. 3개의 2가 작제물(3438, 3440, 3441)은 FC5가 부착되지 않은 Li81과 모두 동등효력이었고, 이는 FC5의 첨가가 LINGO-1에 대한 작제물의 결합에 영향을 미치지 않았음을 나타낸다. 이에 반해, Li81 Fab의 단일 카피를 함유하는 3개의 헤테로머 버전(3442, 3443 및 3444)은 2가 작제물에 존재하는 1개 대 2개의 결합 부위의 존재와 일치하는 감소된 신호를 나타내었다. 3개의 FC5-(G4S)3-Li81 작제물도 ELISA에서 시험하였고 FC5가 부착되지 않은 Li81과 동등효력이었다. 9개의 샘플을 또한 희소돌기세포 분화 검정에서의 기능에 대해 시험하였고 모두 활성이었다. 역가 검정에서 분화 촉진에 대한 EC50은 FC5가 부착되지 않은 Li81보다 모두 약 3배 더 낮았다. Li81 항체의 특성화를 위해 종래 설명된 방법을 사용하는 분화 검정 및 ELISA에 의해 샘플의 활성을 특성화하였다[Pepinsky et al., Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 339:519-529(2011)].
FC5-Li81 샘플의 FC5 모이어티의 생물학적 활성은 시미안(Simian) 바이러스 40 불멸화된 성인 래트 뇌 내피 세포(SV-ARBEC)에 대한 시험관내 BBB 트랜스웰 세포 배양 검정에서 평가하였다. 분자를 쌍을 이룬 조합(대조군 및 시험 분자)으로서 시험관내 BBB 모델의 상부 챔버에 공동적용하였고, 하단 구획에서 질량 분광분석 정량(MRM)에 의해 정량하였고; 각각의 PAPP 값은 90분에 걸쳐 계산하였다. FC5-Li81의 (상단 챔버) 투입 농도는 1.5 내지 3μM(직선 상) 사이였으며, 다양한 공동투여된 대조군 항체도 등몰 투입되었다. 이 분석의 결과는 도 11에 제시된다. 모든 샘플은 대조군에 비해 증가된 FC5 매개 수송을 나타내었고, PAPP 값의 개선이 2 내지 15배 범위였다. 3개의 2가 FC5-(G4S)3-Li81 작제물(3014, 3015, 3016)은 모두 동등효력이었으며, 이는 FC5가 HC, LC 또는 둘 모두에 첨가되었는지의 여부가 작제물의 활성에 영향을 미치지 않았음을 나타낸다. 모두 PAPP 값의 약 3배 개선을 나타내었다. FC5-(G4S)1-Li81(3438)에서 볼 수 있는 개선 배수가 가장 유의적이었며, 이 버전은 상응하는 FC5-(G4S)3-Li81(3015)보다 약 5배 더 큰, PAPP 값의 약 15배 증가를 나타내었다. FC5-(G4S)3-Li81(3015) 및 FC5-(G4S)1-Li81(3438) 작제물은 둘 다 Li81 HC에 융합된 FC5를 함유하는 것으로서, FC5를 Li81과 연결하는 G4S 서열(서열번호 5)의 길이만 상이하다. FC5가 Fc에 융합되고 Li81 Fab가 (G4S)1 링커를 통해 Fc의 C-말단에 부착된 FC5-(G4S)1-Li81(3440) 작제물도 이의 PAPP 값에 있어서 약 12배의 큰 개선을 보여주었다. 이에 반해, 더 짧지만 더욱 가요성인 힌지를 갖는 동일한 작제물 설계(3441)를 시험한 경우에는 이의 PAPP 값이 약 6배만 개선되는 것으로 나타났다. 즉, 작제물 3015 및 3438을 연결하는 링커 길이에 의해 나타나는 것과 유사하게, 작제물 3440 및 3441에서 힌지의 설계는 작제물의 시험관내 수송 활성에 영향을 미쳤다. 3개의 헤테로머 버전(3442, 3443 및 3444)은 대조군에 비해 2 내지 5배 범위의 개선을 나타내었다. 수송 증가는 유의적이었지만, 이러한 작제물은 생체내 연구를 통해 시험되지 않았다.
시험관내 트랜스웰 검정은 다음과 같이 수행하였다. SV-ARBEC는 페놀 레드가없는 1㎖ SV-ARBEC 피딩(feeding) 배지에서 1㎛ 기공 크기인, 래트-테일 콜라겐 코팅된 0.83cm2 Falcon 셀 인서트(cell insert) 상에 80,000 세포/막으로 접종하였다. 12웰 조직 배양판(즉, 수송을 위한 하단 챔버)의 웰은 페놀 레드가 없는 SV-ARBEC 배지와 래트 성상세포-조정 배지의 50:50(v/v) 혼합물 2㎖를 함유하였다. 이 모델 특성화는 Garberg et al., Toxicol In Vitro, 19(3):299-334(2005)에 자세히 설명되어 있다. 이 모델은 Pe[수크로스]가 0.4 내지 0.6[x10-3] cm/분 사이일 때 사용되었다. 수송 실험은 상단 챔버에 등몰 농도의 시험 샘플과 대조군의 혼합물을 첨가하고 하단 챔버에서 15분, 30분, 60분, 및 90분에 100㎕ 분취량을 수집하여(이어서 100㎕의 수송 완충액을 대체함) 다중화된 SRM-ILIS 방법을 사용하여 모든 항체를 동시에 정량하기 위해 Haqqani et al., Mol. Pharm., 10:1542-1556(2012)에 기재된 바와 같이 수행하였다. 겉보기 투과 계수 Papp은 이전에 설명된 바와 같이 계산하였다[Haqqani et al., 2012(상기 문헌 참조)].
FC5-Li81 작제물이 생체내에서 BBB 수송 활성을 나타내는지 시험하기 위해, 작제물 3015, 3438 및 3440을 염증성 통각과민의 하그리브스 모델에서 시험하였다. 이 모델에서 작제물은 dalargin에 화학적으로 접합시켜 정맥(IV) 주사로 투여했으며, 통증 반응을 경시적으로 측정하였다. 이 모델의 진행에 대한 방법론은 이전에 설명된 바와 같다[Farrington et al, A novel platform for engineering blood-brain barrier-crossing bispecific biologics, FASEB J., 28(11):4764-78(2014)]. 아편양 펩타이드 dalargin은 BBB를 가로지르지 않으며 전신 투약 후 진통성이 없다. 도 12에서 나타낸 바와 같이, FC5-Li81 Dalargin 접합체의 전신 투약은 상당한 진통 반응을 유도하였다. 데이터는 FC5-Li81에 화학적으로 연결된 dalargin이 전신 투여 후 중심 아편양 수용체에 체결될 수 있음을 보여준다. 세 가지 치료에 대한 AUC 값은 최대 가능 효과(maximum possible effect, MPE)의 25% 내지 35% 범위로 유사했다. 도 13a는 세 작제물 및 이 모델의 대조군에서와 같은 Li81의 반응의 용량 의존성을 나타낸다. 도 13b는 작제물 3438 및 Li81의 플롯이다. FC5-Li81의 치료는 Li81 단독의 경우보다 10배 낮은 용량에서 나타난 곡선 아래 면적(AUC)의 %로서 20% MPE를 초래하여, Li81에 FC5의 첨가가 혈액 뇌 장벽을 가로질러 아편양 수용체에 체결하는 능력을 개선시켰음을 시사한다.
FC5-Li81 융합체 및 Li81 단독을 Mattson et al., Mol. Biol. Rep., 17: 167-183(1993)에 기재된 바와 같은 일반적 방법을 사용하여 dalargin 유사체 Tyr-dAla-Gly-Phe-Leu-Arg-시스테아미드(Dal-Cys)에 접합시켰다. 간략하게 설명하면, N,N-다이메틸포름아미드 중 10 ㎎/㎖의 설포-숙신이미딜-4-[N-말레이미도메틸]사이클로헥산-1-카복실레이트(SMCC; 미국 일리노이주 피어스 록랜드 소재)를 PBS 중 1 내지 2 ㎎/㎖의 시험 항체보다 7.5배 몰 과량으로 첨가하였다. 반응액은 실온에서 2.5시간 동안 인큐베이션하였고, 50mM MES(pH 6.0) 중 Dal-Cys을 SMCC에 4배 몰 과량으로 첨가하였다. Dal-표지된 단백질을 원심분리 장치에서 농축시키고 탈염시켜 미접합된 Dal-Cys과 SMCC를 제거하였다. Dalargin/분자의 화학량론은 표지된 단백질의 온전한 질량 분광분석으로부터 결정하였다. 도 11은 3015 및 3016의 Dalargin 접합체의 수송 활성을 나타낸다. 이러한 조건 하에, 접합은 dalargin이 첨가되지 않은 상응하는 단백질에 비해 PAPP 값의 20 내지 40% 감소를 초래하였다.
Li81 및 FC5-Li81 작제물의 dalargin 접합체들의 평가는 FC5에 대한 항체의 융합체가 중추신경계(CNS)로의 그의 전달을 개선시킬 수 있다는 분명한 생체내 증거를 제공하였지만, 아편양 판독값의 기간은 4시간만 지속되었다. 수송체의 더욱 정량적인 판독값을 수득하고 그 효과의 기간을 탐색하기 위해, 우리는 정맥내 투여 후 24시간, 48시간 및 72시간째 질량 분광분석에 의해 혈청 및 CNS 수준을 평가하는 약동학 분석을 수행하였다. 도 14는 20, 65 및 200 n㏖/㎏의 용량에서 Li81 및 3가지 FC5-Li81 작제물(3015, 3438, 및 3441)의 분석 결과를 나타낸다. 모든 농도에서 FC5 융합체 전부는 Li81 mAb에 의해 관찰되는 수준에 비해 24시간째 상승된 CSF 수준을 초래하였고, 투여된 용량과 CSF 수준의 분명한 의존성이 있었다. 이에 반해, 72시간 시점에서 대조군과의 차이는 감소하였다. 이와 일관되는 것으로, FC5 융합체에 대한 CSF/혈청 비율은 경시적으로 감소한 반면, Li81 CSF/혈청 비율은 모든 시점 및 모든 용량에서 비교적 일정하였다. 이러한 데이터는 FC5가 CNS로 Li81의 전달을 개선시키지만, 그 효과는 경시적으로 감소한다는 것을 입증한다.
실시예 2: FC5-(G 4 S)1-Li81의 생산
FC5-(G 4 S)1-Li81
Figure pct00029
FC5-(G4S)1-Li81은 CHO 세포에서 발현되었다. 조정 배지의 준비를 위해, 분류되지 않은 풀(pool)로부터 형질감염된 CHO 세포를 무혈청 배지에서 확장시키고, 고밀도로 성장시키고, 보충제를 공급하고, 저하된 온도로 이동시켰다. 배양물을 이 저하된 온도에서 14일 동안 유지시킨 다음, 원심분리로 수확하고 0.45 마이크론 여과에 의해 청징화했다. 1.8ℓ의 청징화되고 여과된 배양 배지(150 ㎎/ℓ의 FC5-Li81의 추정 역가)를 20㎖ 단백질 A 칼럼에 로드하였다. 칼럼을 10mM Na2HPO4 pH 7.0, 150mM NaCl로 세척하고 25mM Na2HPO4 pH 2.8, 100mM NaCl pH 2.8을 이용하여 칼럼으로부터 FC5-(G4S)1-Li81을 용출시키고 0.5M 스톡 용액으로부터 희석된 25mM NaH2PO4 pH 8.6으로 중화시켰다. 용출된 샘플의 단백질 함량은 1 ㎎/㎖ 용액에 대해 1.4의 흡광 계수를 사용하여 280㎚에서의 흡광도로부터 추정하였다. 290㎎의 정제된 FC5-(G4S)1-Li81이 회수되었다. 제조물을 여과하고 분취하여 -70℃에 보관하였다.
실시예 3: 래트 혈청에서 FC5(G 4 S)1-Li81의 안정성 평가
30 ㎎/Kg의 정맥 투약 후 24, 48 및 72 시간에 혈청 및 CSF 수준을 측정한 래트에서의 FC5-(G4S)1-Li81의 약동학 분석은 FC5의 수송체 활성이 경시적으로 감소하여, 24시간에 시험된 최초 시점의 CSF에서 0.45%의 CSF/혈청 비율로 가장 높았고, 48시간에 0.28%의 CSF/혈청 비율로 감소하였고, 72시간 후 0.13%의 CSF/혈청 비율로 더욱 감소한 것으로 드러났다. 이 분석의 결과는 도 15에 제시된다. 72시간 시점에서 FC5-(G4S)1-Li81의 혈청 수준은 약 150 ㎍/㎖여서, CSF에서 검출된 단백질의 감소는 고려하지 않았다.
수송 활성의 상실이 FC5-(G4S)1-Li81의 생화학적 또는 기능적 특성의 변화로부터 초래되었는지를 결정하기 위해, 3마리의 래트에게 30 ㎎/Kg FC5-(G4S)1-Li81을 정맥 투여했고 72시간 후 혈청으로부터 단백질을 정제하였고, 다음과 같이 특성화하였다. 72시간 후, 투여된 동물을 방혈시키고 혈청을 준비하였다. 이 혈청을 0.45μ 주사기 구동식 필터 장치를 통해 여과하였다. 래트 3마리로부터 모은 혈청 12㎖를 350㎕ Ig-Select(GE Healthcare) 상에 1.5시간 동안 회분식으로 로드하였다. 수지를 칼럼에 쌓고, 12 칼럼 부피의 20mM Na2HPO4 pH 7.0, 150mM NaCl(PBS), 12 칼럼 부피의 25mM NaH2PO4 pH 5.5, 100mM NaCl로 세척한 다음, 25mM NaH2PO4 pH 2.8, 100mM NaCl pH 2.8로 용출시켰다. 200㎕ 분획을 수집하였다. 용출된 샘플의 단백질 함량은 1 ㎎/㎖ 용액에 대한 흡광 계수 1.4를 사용하여 280㎚에서의 흡광도로부터 추산하였다(분획물 4 내지 7을 모아서 0.5M 스톡 용액으로부터 희석된 25mM NaH2PO4 pH 8.6으로 중화함). 용출 풀 800㎕의 농도는 1.9 ㎎/㎖였다. 회수율은 MRM에 의해 결정된 혈청 내 FC5-(G4S)1-Li81의 측정된 농도를 기준으로 90% 초과였다. 샘플을 분취하고 드라이 아이스에서 급속 냉동하고 -70℃에 보관하였다. 샘플 처리를 위한 대조군으로서 1.2㎎의 FC5-(G4S)1-Li81을 Wistar 래트 혈청(Innovative Research, Inc.) 10㎖에 스파이크하고 생체내 연구로부터 회수한 샘플로서 샘플 정제 공정으로 처리하였다. 도 16은 환원 및 비환원 조건하에 SDS-PAGE를 이용한 정제된 샘플의 분석을 나타낸다. FC5-Li81 중쇄(HC) 60kDa 및 경쇄(LC) 25kDa 밴드는 환원 조건하에 관찰되었고, 특징적인 175kDa 사량체성 2FC5Li81HC-2LC 복합체가 비환원 조건하에 관찰되었다. Li81 샘플은 165 kDa의 분자량을 갖는 두드러진 단일 피크로서 용출되는 예측된 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 용출 프로파일(도 17)을 나타냈다.
FC5-(G4S)1-Li81 샘플의 생물학적 활성은 SV-ARBEC 세포에 대한 시험관내 BBB 트랜스웰 세포 배양 검정에서 평가하였다. 분자는 다양한 쌍을 이룬 조합(대조군 및 시험 분자)으로 시험관내 BBB 모델의 상단 챔버에 공동적용하였고 하단 구획에서 MRM에 의해 정량하였다; 각각에 대한 Papp 값은 90분에 걸쳐 계산하였다. FC5-Li81 샘플의 (상단 챔버) 투입 농도는 1.5 내지 3μM(직선 상) 사이였으며, 다양한 공동투여되는 대조군 항체가 등몰 투입되었다. 이 분석의 결과는 도 18에 나타낸다. FC5-(G4S)1-Li81의 수송 활성은 래트에서 72 시간 후에 유의적으로 변경되지 않았다.
FC5-(G4S)1-Li81 샘플은 질량 분광분석에 의해 광범위한 특성화로 처리했다. 첫째, 환원 및 비환원 조건하에 온전한 질량 분석은 모든 샘플의 주요 성분이 예측 단백질 FC5-(G4S)1-Li81(비환원체 예측 질량 171,528.3Da, 관찰된 질량 투약 용액 171530Da, 스파이크된 샘플 171530Da, 72시간 혈청 샘플 171534 Da: 환원체 예측 질량 FC5Li81 HC 62,153.9Da; 관찰된 질량 투약 용액 62155 Da, 스파이크된 샘플 62154 Da, 72시간 혈청 샘플 62154Da: 환원된 LC 예측 질량 23,628.4Da; 관찰된 질량 투약 용액 23629Da, 스파이크된 샘플 23629Da, 72시간 혈청 샘플 23629Da)이었음을 보여주었다. 이러한 분석의 결과는 도 19, 도 20 및 도 21에 제시된다. 주요 성분에 대한 예측하지 못한 변형은 관찰되지 않았다. 이러한 분석을 위해, 약 20 p㏖의 각 샘플을 비환원 및 환원(37℃에서 1시간 동안 10mM EDTA 및 4M 우레아 중 40mM DTT) 조건하에 분리용 MassPREP Micro Desalting 20㎛ 칼럼(2.1 id×5㎜ 페닐(Phenyl), Waters)을 사용하는 Xevo G2 질량 분광분석기에서 분석하였다. 분자 질량은 MaxEnt1 프로그램을 사용하여 디컨볼루션에 의해 생성하였다. 둘째, 모든 시스테인에 대한 이황화 구조는 LC/MS 검출을 이용한 펩타이드 맵핑에 의해 결정하였다. 도 22는 3가지 시험 샘플에 대한 환원 및 비환원 펩타이드 맵을 나타낸다. 이황화 함유 펩타이드의 분석은 각 샘플에서 예측된 바와 같이 전부 주요 이황화 연결임을 보여주었다(표 2).
Figure pct00030
특히, 중쇄 C1-C2 이황화물의 존재는 FC5 도메인이 융합 단백질에서 적절하게 접혀있음을 시사한다. 분석은, 추출된 이온 크로마토그램(EIC)의 피크 면적을 기반으로 한 삼황화물 수준은 대조군 및 스파이크 샘플에서 중쇄(Cys348)와 경쇄(Cys215) 사이의 연결의 약 4.5%였고 중쇄의 힌지에서 약 1%였음을 나타냈다. 삼황화물은 72시간 샘플에서 관찰되지 않았고, 이는 이전에 공개된 Li81에 대한 삼황화물 데이터[Gu et al. 2010. Anal Biochem. 400(1): 89-98에서의 mAb1-B]와 일치한다. FC5-(G4S)1-Li81 샘플의 이황화 펩타이드 맵핑에 사용된 방법은 다음과 같다. 약 1.4㎕의 1:10 희석된 4-비닐피리딘[8M 구아니딘 염산염 중에]을 약 24㎍(240p㏖, 비환원)의 단백질을 포함하는 용액에 첨가한 다음, 즉시 60㎕의 8M 구아니딘 HCl(최종 부피 약 70㎕)을 첨가하였다. 이 용액을 암실에서 45분 동안 실온에서 유지시켰다. 각 바이알의 단백질은 40 부피의 냉각된 에탄올로 침전시켜 회수하였다. 혼합물을 -20℃에서 1 시간 동안 보관한 다음 14000g에서 12분 동안 4℃에서 원심분리하였다. 상청액을 버리고 침전물을 냉각된 에탄올로 1회 세척하였다. 단백질 펠릿은 50% 아세토나이트릴 중 0.1% 트라이플루오로아세트산 100㎕로 재용해시키고 1.5 시간 동안 Speed-Vac에서 건조했다. 샘플을 분석하기 위해 두 가지 다른 펩타이드 맵핑 방법을 사용하였다; 하나는 엔도프로테이나제 Lys-C 및 트립신을 사용하는 방법이고 다른 하나는 엔도프로테이나제 AspN을 사용하는 방법이다. LysC/트립신 맵의 경우, 각 샘플에서 약 8㎍의 4-비닐피리딘 처리된 단백질을 2M 우레아, 0.15M Tris-HCl, pH 6.7, 2mM CaCl2, 5mM 메틸아민 중 5%(w/w) 엔도프로테이나제 Lys-C(Wako)로 실온에서 5시간 동안 분해한 뒤, 5%(w/w) 트립신(Promega)을 첨가했다. 분해물을 실온에서 추가 4시간 동안 유지한 다음, 5%(w/w) 트립신을 첨가한 뒤, 분해물을 실온에서 밤새 유지시켰다. 총 부피는 50㎕였다. AspN을 이용한 분해를 위해, 약 4㎍의 4-비닐피리딘 처리된 단백질을 2M 우레아, 0.15M Tris-HCl, pH 6.7, 5mM MgCl2, 5mM 메틸아민 중 5%(w/w) Asp-N(Roche)으로 실온에서 8시간 동안 분해한 후, 5%(w/w) Asp-N을 첨가하고 분해물을 밤새 유지시켰다. 총 부피는 50㎕였다. LC-MS로 분해물을 분석하기 전에, 각 분해물은 1㎕의 25% 트라이플루오로아세트산과 4M 우레아를 첨가하여 ??치시켰다. Lys-C/트립신분해성 분해물의 절반과 모든 Asp-N 분해물을 1mM EDTA 중 100mM TCEP로 실온에서 1시간 동안 환원시켰다. 비환원 및 환원된 Lys-C/트립신분해성 분해물 및 환원된 Asp-N 분해물의 분취량(약 4㎍)을 UPLC-Xevo G2-S 시스템으로 구성된 LC-MS 시스템에서 분석하였다. 칼럼 및 분리 구배는 펩타이드 맵핑 섹션에서 설명한 것과 동일했다. 이황화물 맵핑 데이터는 BioPharmaLynx 1.3.3을 사용하여 처리하였다.
4-비닐피리딘 처리된, 비환원 샘플의 환원된 Lys-C/트립신분해성 및 Asp-N 맵을 조사하여 유리 티올 수준을 평가하고 대조군, 스파이크 샘플 및 72시간 샘플에 존재하는 유리 티올의 수준에 임의의 유의적인 차이가 있는지를 평가하기 위해 검사하였다. 유리 티올의 양은 추출된 이온 크로마토그램(EIC)으로부터 추산하였다. 분석 결과, 모든 샘플에서 소량의 유리 티올이 드러났지만 FC5 영역에는 없었다. 유리 티올 수치는 대조군 및 스파이크 샘플에서보다 72시간 샘플에서 2 내지 3배 더 높았다.
72시간 및 스파이크 샘플의 펩타이드 맵에서의 펩타이드 회수율을 래트 혈청에 노출되지 않은 대조군 샘플의 맵에서의 펩타이드 회수율과 체계적으로 비교한 결과, HC 가변 영역(펩타이드 HC 215-249)의 말단부터 시작하여 N-말단(펩타이드 HC 1-19)까지 펩타이드 회수율이 점차 감소하였기 때문에 혈청에서 FC5-Li81 중쇄의 N-말단 클리핑(clipping)이 일어났음을 시사했다(도 22). N-말단 펩타이드(HC 잔기 1 내지 19)의 회수율은 60%였으며, 이것은 단백질의 40%에 이 펩타이드가 결여되었음을 시사한다. 다음 펩타이드(HC29-38)의 회수율은 70%였고, 펩타이드 51-65의 회수율은 80%였다. 이에 반해, Li81 HC 내로부터의 펩타이드의 회수율은 약 100%였고, 이것은 클리핑이 융합 단백질의 FC5 부분 내에 주로 제한되었음을 시사한다. N-말단 클리핑은 혈청 스파이크 샘플에서 검출되었다; 하지만, 클리핑의 정도는 스파이크 샘플보다 72시간 샘플에서 훨씬 더 광범위했다(도 23). 이에 반해, 경쇄 펩타이드의 회수율은 모든 샘플에서 서열 전체에 걸쳐 거의 100%였다(도 24). 이러한 발견은 융합 단백질의 FC5 부분이 혈청에서 불안정하고 FC5 도메인 내의 다수의 부위에서의 단백질분해가 N-말단 펩타이드의 불량한 회수를 초래한다는 것을 시사한다.
실시예 4: FC5의 인간화
용해성 및 안정성을 유지하면서 인간에서 FC5의 면역원성의 위험을 감소시키기 위해, 인간 VH3 컨센서스 프레임워크에 다양한 상동성 정도를 갖는 일련의 FC5 서열 변이체를 설계하였다. 모든 변이체에 대해, 다음과 같은 9가지 인간화 돌연변이를 포함시켰다: Q5V, A6E, A14P, A75S, K87R, P88A, D93V, K114Q 및 Q117L. 다른 인간화 설계를 차별짓는 나머지 6개 프레임워크 위치에서의 돌연변이는 표 3에 나열한다. 이들은 상응하는 인간 IgG VH/VL 계면(아미노산 위치 37, 44, 45 및 47), 뿐만 아니라 아미노산 위치 1 및 79에 돌연변이를 포함한다. 상응하는 계면 위치의 부분적인 인간화는 돌연변이체 H31 및 H32에서 탐침된다. 마지막으로, 낙타과 FC5 야생형 및 인간 VH3 컨센서스 프레임워크는 둘 모두 FC5의 컴퓨터 모델을 기반으로 한 경우, 부분적으로 용매 노출될 수 있는 CDR-H1에 메티오닌(M34)을 함유한다. 노출된 메티오닌은 이의 산화에 의해 변형될 가능성으로 인하여 개발가능성에 책임이 있을 수 있다. 따라서, 각 인간화 설계는 표 3에 나타낸 바와 같이 M34T 치환의 존재 및 부재 하에 생산되었다. 홀수 작제물에서 위치 34의 메티오닌은 유지되고 짝수 작제물에서 메티오닌은 트레오닌으로 교체된다.
Figure pct00031
표 4는 표 3에 나열된 8가지 인간화된 FC5 변이체 설계로부터의 전체 VHH 서열(잔기 치환은 볼드체임), 뿐만 아니라 짧은 힌지 및 긴 힌지의 hIgG1-Fc agly 설계의 서열을 제공한다.
Figure pct00032
FC5의 컴퓨터 모델은 FC5의 NMR 연구에서 얻은 백본 원자의 지정을 조합하여 생성하였고, 이는 PyIgClassify 웹서버(http://dunbrack2.fccc.edu/PyIgClassify/)를 사용한, CDR H1 및 H2에 대한 가능성있는 입체구조의 분석에 의해 FC5 프레임워크 및 CDR-H3의 구조적 특징을 드러냈다. 이 정보는 주형으로서 Protein Data Bank(PDB)로부터 X선 결정 구조의 선택을 안내하는데 사용하였다. 이 모델은 결정 구조로부터 프레임워크 및 CDR H1과 H2에 대한 좌표와 NMR 연구로부터 CDR-H3에 대한 좌표를 조합시켰다. 인간화된 변이체 설계 H62 및 H12의 모델은 도 25에 제시된다. 상응하는 인간 VH/VL 계면의 표면에 측쇄 잔기가 표시되어 있다.
FC5 인간화 변이체는 DC44 CHO 세포에서 짧은 힌지 링커[KTHTCPPCP(서열번호 19)]를 갖는 hIgG1 Fc 융합체(비글리코실화됨)로서 발현되었고 단백질 A 세파로스 친 화성 크로마토그래피에 의해 정제되었다. 조정 배지를 제조하기 위해, 분류되지 않은 풀에서 형질감염된 CHO 세포를 무혈청 배지에서 확장시키고, 고밀도로 성장시키고, 보충제를 공급하고, 저하된 온도로 이동시켰다. 이 저하된 온도에서 배양물을 14일 동안 유지시킨 다음, 원심분리하여 수확하고, 0.45 마이크론 여과로 청징화했다. 1.8L의 청징화되고 여과된 배양 배지를 25㎖ 단백질 A 칼럼(MabSelect SuRe; GE) 상에 로드했다. 이 칼럼을 20mM Na2HPO4 pH 7.4, 150mM NaCl로 세척하였고, FC5-hFc 분자를 25mM NaH2PO4 pH 2.8, 100mM NaCl로 용출시키고, 0.5M 스톡 용액으로부터 희석된 12.5mM Na2HPO4 pH 8.6으로 중화시켰다. 정제된 단백질은 변성 미세유동적 모세관 전기영동(LabChip GXII Protein Express Assay; Perkin Elmer)을 이용하여 크기 및 동종성에 대해 분석하였다. 모든 분자는 비환원 조건 하에서 VHH-hFc 이량체의 예상 크기 및 환원 조건 하에서 상응하는 단량체의 예상 크기를 보여주었으며(도 26), 명백한 응집체 또는 단백질분해 생성물은 없었다. 환원된 샘플의 온전한 질량 분광측정 분석은 모든 FC5-hFc 인간화 변이체에 대해 예측된 질량과 측정된 질량 간의 상응성을 확인시켜주었다(5 Da 이내; 도 27).
크기 배제 크로마토그래피 분석은 모든 FC5-hFc 변이체에 대해 100mM Na2HPO4, 200mM NaCl, pH 6.8로 0.6 ㎖/분씩 Biosep s3000 7.8×300㎜ 실리카 칼럼(Phenomenex)에서 수행하였다. 모든 인간화 변이체는 단일 피크로서 용출되었지만(도 28), H11, H12, H31, H32 및 H72는 용출 시간이 상당히 지연되어, 실리카 수지와의 상호작용을 나타내었다. 특히, H31과 H32는 얕은 상승 및 하강 어깨를 가진 광범위한 피크 확장을 보여주었다.
FC5-hFc 인간화 변이체에 대해 분자 안정성의 추가 시험을 수행하였다. 모든 변이체에 대한 시차 주사 열량법(VP-DSC, MicroCal)에 의해 생성된 열 안정성 프로파일은 유사했으며 VHH 및 CH2 도메인에 대한 용융 온도는 55 내지 62℃ 범위였고, CH3 도메인의 용융 온도는 90℃ 초과였다(표 5). 2가지 주요 용융 전이는 hFc CH2 도메인과 FC5 VHH의 언폴딩(unfolding)을 특징으로 하는 온도 Tm1, 및 hFc CH3 도메인의 언폴딩을 특징으로 하는 Tm2에서 DCS에 의해 관찰되었다.
Figure pct00033
4℃에서 4개월 동안 보관 후 H11, H12 및 H32 변이체 샘플에서는 소량의 미세 침전물이 보였다.
FC5-hFc 인간화 변이체의 생물학적 활성은 실시예 2에 기재된 바와 같이 SV-ARBEC 세포를 사용하는 시험관내 BBB 트랜스웰 세포 배양 검정에서 평가하였다. 분자는 쌍을 이룬 조합(A20.1 대조군 항체 및 시험 분자)으로 1.25μM씩 시험관내 BBB 모델의 상단 챔버에 공동적용하였고, 하단 구획에서 MRM에 의해 정량하였다. 각 샘플의 겉보기 투과율(PAPP) 값은 60분에 걸쳐 계산하였다. 각 시험 분자는 3반복 트랜스웰 배양물에서 시험하였다. FC5-hFc 및 인간화 변이체에 대한 상기 분석의 결과는 도 29에 제시한다. H72 변이체를 제외한 모든 시험 샘플은 130 내지 220×10-6 cm/분의 평균 PAPP 값을 갖는 FC5 매개의 수송을 나타내었고, 대부분은 야생형 FC5-hFc의 종래 범위(145 내지 190×10-6 cm/분)에 속했다. H72는 다른 인간화 변이체보다 유의적으로 낮은 수송 활성을 나타내었다.
FC5-hFc 인간화 변이체가 생체내에서 BBB 수송 활성을 나타내는지를 시험하기 위해, 야생형 FC5-hFc뿐만 아니라 H32 및 H62 변이체를 염증성 통각과민의 하그리브스 모델에서 시험하였다. 이 모델에서 작제물은 dalargin-시스테인에 화학적으로 접합되었고, 정맥 주사로 투여했고, 통증 반응을 경시적으로 측정하였다(실시예 1에 기재된 바와 같음). 도 30에 나타낸 바와 같이, FC5-hFc dalargin 접합체의 전신 투약은 야생형과 H32 또는 H62 인간화 변이체 사이에 유의적인 차이가 없는 유의적인 진통 반응을 유도했다. 세 분자에 대한 통합 진통 반응(AUC 값)은 최대 가능 효과의 20 내지 30% 범위로 유사하였다.
실시예 5: 래트 혈청에서 분해에 대해 보호하기 위한 FC5 중 제2 이황화물의 조작
FC5 인간화 설계 H62에서 S102C, T103C, A104C 또는 T105C, 뿐만 아니라 FC5 인간화 설계 H32에서 S49C-I70C, T34C-V79C 및 T33C-T103C와 쌍을 이루는 다음 부위, 즉 S49C-I70C, T34C-V79C 및 T33C에 제2 이황화물을 삽입하여 분해로부터 FC5를 안정시키는 일련의 9개 작제물(표 6)을 설계하였다. FC5 VHH 내에 조작된 이황화물의 분자 모델은 도 31에 제시된다. 이 모델에서, 조작된 시스테인은 이황화물이 형성될 수 있게 하는 위치에 배향된다. T34C-V79C는 프레임워크 영역 2(CDR1과 CDR2 사이)를 프레임워크 영역 3(CDR2와 CDR3 사이)에 연결하는 이황화물을 만들고, S49C-I70C는 프레임워크 영역 2와 3을 연결하는 다른 이황화물을 만들며, S33C 시리즈는 CDR1과 3을 연결하는 이황화물을 만든다.
Figure pct00034
작제물은 CHO 세포에서 발현시켰고, 단백질 A 세파로스 크로마토그래피로 정제하였다. 표 7은 9개 작제물의 목록 및 250㎖의 조정 배지로부터의 정제 수율을 나타낸다.
Figure pct00035
작제물의 발현 수준은 Octet에 의해 7 내지 20 ㎎/ℓ로 추정되었다. 정제를 위해, 청징화 및 여과된 배양 배지를 0.5 내지 0.8㎖ 단백질 A 칼럼에 로드하고, 5 칼럼 부피의 20mM Na2HPO4 pH 7.4, 100mM NaCl로 세척한 다음, 25mM NaH2PO4 pH 5.5, 100mM NaCl로 세척했다. FC5-Li81은 25mM NaH2PO4 pH 2.8, 100mM NaCl pH 2.8에 의해 칼럼으로부터 용출되었고, 0.5M 스톡 용액에서 희석된 25mM NaH2PO4 pH 8.6에 의해 중화되었다. 용출된 샘플의 단백질 함량은 1 ㎎/㎖ 용액에 대한 흡광 계수 1.4를 사용하여 280㎚에서의 흡광도로부터 추산하였다. 도 32에 나타낸 SDS-PAGE 분석은 비환원 조건 하에서 HC 및 LC의 발현 및 특징적인 HC2LC2 사량체 복합체로의 조합을 확인시켜 주었다. 샘플 4669는 비환원 조건 하에서 관찰된 밴드(화살표로 표시됨)에서 불균질성에 반영된 이황화물의 일부 스크램블링(scrambling)을 나타냈다. FC5-Li81 샘플은 각각 약 165kDa의 분자 질량을 갖는 현저한 단일 피크로서 용출되는 예측된 크기 배제 크로마토그래피 프로파일을 나타내었다.
이황화 안정화된 FC5-(G4S)1-Li81 샘플의 생물학적 활성은 실시예 2에 기재된 SV-ARBEC 세포에 대한 시험관내 BBB 트랜스웰 세포 배양 검정으로 평가하였다. 분자는 쌍을 이룬 조합(항-HEL 대조군 항체 및 시험 분자)으로 시험관내 BBB 모델의 상단 챔버에 공동적용하였고, 하단 구획에서 MRM에 의해 정량되었다; 각 샘플의 PAPP 값은 90분에 걸쳐 계산하였다. 투입 농도(상단 챔버)는 1.5 내지 3μM(직선 상) 사이였고, 공동투여된 대조군 항체도 등몰 투입하였다. 7가지 이황화 안정화된 작제물에 대한 이 분석의 결과는 도 33에 제시된다. 모든 시험 샘플은 평균 PAPP 값이 100 내지 130×10-6 cm/분인 FC5 매개의 수송을 나타냈다. FC5-(G4S)1-Li81의 수송 활성은 제2 이황화물의 삽입에 의해 크게 변경되지 않았다.
삽입된 시스테인/이황화물이 단백질분해에 대해 작제물을 안정시키는지를 평가하기 위해, 샘플을 펩신과 1:30(펩신:샘플)의 비율로 37℃에서 2.5시간 동안 인큐베이션하였고, SDS-PAGE로 분석하였다. 도 34 및 도 35는 이 분석의 결과를 나타낸다. Li81의 펩신 분해(도 34 레인 6)는 펩신으로 항체를 처리할 때 통상적으로 관찰되고 Li81 mAb에 대해 구체적으로 설명되어 있는 저분자량 Fc 단편 및 특징적인 Fab'2 단편(100kDa)을 형성시켰다[Pepinsky et al. al., J Pharmacol Exp Ther., 339:519-529(2011)]. FC5-H32-G4S-Li81의 펩신 분해(도 34 레인 8)는 FC5 VHH의 존재 및 FC5 도메인 내의 단편화와 일치하는 일련의 약간 더 큰 단편을 초래하였다. Li81 mAb에서 볼 수 있듯이, 이 작제물의 펩신 처리는 또한 Fc를 저 분자량 단편으로 절단시켰다. 이에 반해, FC5-H32(T34C/V79C)-G4S-Li81 및 FC5-H32(T33C/T103C)-G4S-Li81은 FC5 도메인에 특이적인 밴드의 적은 절단을 나타내었고, 이것은 FC5의 안정화를 시사한다. FC5-H62-G4S-Li81 작제물의 펩신 분해(도 35)는 또한 분자량이 유사한 밴드의 단편화 패턴을 변화시켰다. 특히 FC5-H62(S49C/I70C)-G4S-Li81, FC5-H62(T34C/V79C) -G4S-Li81, FC5-H62(T33C/T103C)-G4S-Li81 및 FC5-H62(T33C/A104C)-G4S-Li81은 FC5-H62(T33C/S102C)-G4S-Li81 및 FC5-H62(T33C/T105C)-G4S-Li81보다 더 안정적이었다. 이러한 발견은 제2 이황화물의 첨가가 펩신 처리로부터 FC5 VHH를 보호할 수 있고 첨가된 이황화물의 위치가 FC5의 안정화 정도에 영향을 미칠 수 있음을 시사한다. 안정화의 독립적인 측정 방법으로서 시차 주사 열량측정법에 의해 열 안정성의 변화에 대해 샘플을 분석하였다. 모든 이황화 조작된 작제물은 안정화없이 60℃의 값을 갖는 FC5 및 조작된 이황화물을 갖는 모든 작제물에 대해 72.7 내지 73.2℃에 상응하는 전이 Tm의 12 내지 13°증가를 나타내었다.
샘플 4662, 4665, 4667 및 4668은 질량 분광분석 및 래트 혈청에서 안정성 평가에 의해 광범위한 특성화로 처리되었다. 첫째, 환원된 중쇄 4662(예측된 질량 62,172.0Da, 관찰된 질량 62172Da), 4665(예측된 질량 62,172.0Da, 관찰된 질량 62175Da), 4667(예측된 질량 62,170.0Da, 관찰된 질량 62173Da), 및 4668(예측된 질량 62,200.0Da 관찰된 질량 62202Da) 샘플 및 경쇄(예측된 질량 23,628.4Da, 관찰된 질량 23630Da)의 온전한 질량 분석은 모든 샘플의 주요 성분이 예측된 경쇄 및 중쇄였음을 나타냈다. 상응하는 디컨볼루션된 스펙트럼은 도 36 및 도 37에 제시된다. 주요 성분에 대한 예상치 못한 변형은 관찰되지 않았다.
혈청 안정성 평가는 4662, 4665, 4667 및 4668 샘플을 래트 혈청에서 37℃에서 70시간 동안 인큐베이션한 다음, Ig select에서 정제하고, 실시예 3에 기재된 바와 같이 환원 및 비-환원 조건하에서 펩타이드 맵핑으로 처리하여 수행하였다. 샘플을 Wistar 래트 혈청에 100㎍/㎖로 스파이크하고, Ig-Select에서 50㎕ 수지/㎖ 혈청으로 정제했다. 각 샘플은 혈청 처리없이 대조군과 비교하였다. 대조군 및 FC5-H62-G4S-Li81 4662, 4665, 4667 및 4668 작제물의 70시간 샘플의 이황화 펩타이드 맵 분석은 주요 이황화 결합이 각 작제물에서 예상한 전부인 것으로 나타났다(표 8 내지 표 11).
Figure pct00036
Figure pct00037
Figure pct00038
Figure pct00039
또한, 중쇄 FC5 영역 및 가변 영역의 Cys 잔기에서는 어떠한 결합오류(mislinkage)도 검출되지 않았다. 분석에 따르면, 작제물 4667 및 4668은 FC5 영역에 삼황화물 결합, 즉 C1, C2, C3 및 C4[HC 20-28(C1), HC 88-108(C3, C4), HC 29-38(C2)]를 함유하는 이황화 연결된 펩타이드 클러스터에 삼황화물 결합을 함유하는 것으로 나타났다. 삼황화물의 수준은 4667 작제물에서 약 11%였고 4668 작제물에서 약 6%였다. 중쇄(Cys348) 및 경쇄(Cys215) 사이에 삼황화 결합은 4807 및 4809 작제물(4807 = FC5-H32(E1Q)-G4S-Li81; 4809 = FC5-H62(D1Q)-G4S-Li81)에서 가장 높았지만(13 내지 16%), 하지만 나머지 작제물 4662, 4665, 4667 및 4668에서는 낮았다(1 내지 4%). Wistar 래트 혈청에서 인큐베이션된 70시간 샘플에서 삼황화물 수준은 대조군의 수준에 비해 작은 감소만이 관찰되었다. 모든 샘플에서 유의적인 수준으로 관찰되는 다른 Cys 변형은 없었다. 또한, 4-비닐피리딘 처리된, 비환원 대조군 및 70시간 6쌍 작제물의 환원된 Lys-C/트립신분해 맵을 조사하여, 천연 샘플 중의 유리 티올 수준에 임의의 유의적인 차이가 있는지 평가하였다. 분석 결과, 모든 샘플에서 소량의 자유 티올이 드러났고, 대조군과 70시간 샘플 간에 유의적인 차이는 없었다. 샘플 중 삼황화물 수준은 배양 조건의 차이에 따라 달라지며, 이에 따라 보고된 수준을 생성물-특이적 특성을 반영하는 것은 아니다.
70시간 샘플의 환원된 펩타이드 맵에서의 펩타이드 회수율과 상응하는 대조군 샘플 맵에서의 회수율의 체계적인 비교는 이전에 관찰된 중쇄의 N-말단 클리핑(실시예 3 참조)이 중쇄의 FC5 영역에 이황화 가교의 첨가에 의해 유의적으로 감소/제거되었음을 나타내었다. 이 분석의 결과는 도 38 및 도 39에 제시된다. C1(제1 Cys) 및 C3(제3 Cys) 사이 및 C2(제2 Cys)와 C4(제4 Cys) 사이에 이황화 결합을 가진 FC5-H62 돌연변이 작제물 4667(T33C=T103C) 및 4668(T33C=A104C)의 70시간 샘플의 펩타이드 회수율은 대조용 샘플과 유사했지만, 반면 C1과 C4 사이 및 C2와 C3 사이에 이황화 결합을 가진 FC5-H62 돌연변이 작제물 4662(S49C=I70C) 및 4665(T34C=V79C)의 70시간 샘플의 펩타이드 회수율은 각각 대조군의 약 85% 및 70%였다. 이러한 발견은 FC5에 제2 이황화 결합의 첨가가 야생형 FC5 단백질에 의해 도 23에서 관찰된 혈청 중 단백분해적 분해로부터 융합 단백질의 FC5 부분을 보호한다는 것을 시사한다.
H62 FC5에서 제1 아미노산은 아스파르트산 잔기이다. 항체는 종종 피로글루타메이트로 시작하고 이러한 변형이 아미노 펩티다제 활성으로부터 보호할 수 있기 때문에, 우리는 야생형 H62FC5 서열을 함유하지만 N-말단 피로글루타메이트의 형성을 초래할 수 있는 글루타민(D1Q)으로 시작하는 작제물(4809)을 설계하였다. 흥미로운 것은, 이 샘플을 혈청 안정성에 대해 시험했을 때(도 38), 크게 불안정하여, 대조군에 비해 N-말단 펩타이드의 겨우 30% 회수율을 보였다. 70시간 샘플의 경쇄 펩타이드 회수율은 상응하는 대조군 샘플의 회수율과 매우 유사했다. 경쇄 펩타이드의 회수율에 대한 플롯은 도 39에 제시된다.
도 38에서 관찰되는 H62-T33C/A104C(4D#4668)의 혈청 안정성의 개선을 기반으로, 10 ㎎/㎏(약 65 n㏖/㎏)의 정맥내 투여 후 혈청 및 CSF 수준을 측정한 래트에서 PK 분석을 수행하였다. 이 분석의 결과는 도 40에 제시된다. 이황화 안정화된 생성물에 대한 혈청 및 CSF 수준은 안정화되지 않은 버전보다 모든 시점에서 더 높았다. 도 40의 하단 패널에서 관찰되는 CSF/혈청은 이황화 조작이 야생형 작제물에서 관찰되는 시간 경과에 따른 수송 활성의 상실을 방지했음을 보여주었다. 뇌 수준은 또한 MRM에 의해 24시간째에 측정되었고, 여기서 FC5, Li81 및 hFc의 값은 각 도메인의 시그니처 펩타이드 농도를 반영한다(표 12).
Figure pct00040
이황화 안정화는 뇌 수준을 약 30% 증가시켰다. 다른 이황화 안정화된 변이체가 전신 투여 후 CNS 노출을 개선시키는지를 시험하기 위해, H62-S49C/I70C(4D#4662), H62-T34C/V79C(4D#4665), H62-T33C/A104C(4D#4668)를 나란히 분석 시험하였다. 이 분석의 결과는 도 41(혈청 분석) 및 42(CSF 및 뇌 조직 분석)에 제시한다. 세 형태 모두 Li81보다 높은 혈청 수준을 보였고 CNS에서 증가된 수준을 초래하였다. 이러한 개선은 더 높은 CSF 및 뇌 수준으로 이어졌다.
실시예 1에서 상이한 프레임워크 설계의 분석에서, 우리는 FC5가 Li81의 N-말단에 부착된 작제물 3438과 FC5가 긴 힌지를 갖는 Fc에 부착되고 Li81 Fab가 Fc의 C-말단에 부착된 작제물 3440(표 1, 도 11) 둘 모두가 양호한 수송 활성을 나타 냈음을 관찰하였다. 이러한 발견의 결과로서 우리는 위에서 설명한 3438 작제물의 안정화된 버전 외에도 FC5 H62 T33C/A104C 설계를 함유하는 3440 작제물의 이황화 안정화된 버전을 조작하였다(도 40). 도 43에 제시된 두 샘플의 래트에서의 PK 분석은 FC5-H62(T33C/A104C)-Fc-G4S-Li81(VH,CH1)(형식 3440)이 IV 투여 후 처음 72시간 동안 더 높은 수준을 보이고, FC5-H62(T33C/A104C)-G4S-Li81 huIgG1(형식 3438)이 보다 완만하지만, IV 투여 후 168시간에 걸쳐 보다 지속적인 CSF 수준을 나타내고, 둘 모두 개선된 CSF 수준을 초래하는 것으로 드러났다. 패널 왼쪽의 개략도는 2가지 조작 설계를 보여준다.
추가 연구로서 사이노몰구스 원숭이에서 FC5-H62(T33C/A104C)-G4S-Li81(작제물 3438의 형식에서)은 단일특이적 Li81에 비해 상기 이중특이적 항체의 개선된 CSF 노출이 비인간 영장류로도 이어진다는 것을 보여주었다. 반복적인 CSF 수집을 위해 요추 척수강내 카테터를 원숭이에게 이식하고, 그룹당 미경험 동물을 12 마리로 하여 단일 IV 볼루스 주사를 통해 65 n㏖/㎏의 항체 시험 물품을 투여하였다. 혈청 및 CSF 샘플에서 항체 수준은 열 변성 및 트립신 분해 후 nanoLC-MRM에 의해 정량하였고, 부합하는 매트릭스에서 단백질 표준물질에 비해 Li81에 대해 2개의 펩타이드 및 FC5-H62(T33C/A104C)-G4S-Li81에 대해 3개의 펩타이드를 모니터링하였다. IV 투여 후 3주 동안의 혈청 및 CSF 항체 수준에 대한 결과는 도 44에 제시된다. 투약 후 10일이 지나서 일부 동물에서 Li81에 비해 FC5-H62(T33C/A104C)-G4S-Li81의 혈청 약물 수준의 저하가 관찰되었지만, 혈청 PK는 두 분자가 유사했다. 이는 항-약물 항체의 검출 및 평균 반감기의 감소와 상응하는 것이었다(표 13). CSF 수준은 IV 투여 후 첫 주 동안 Li81에 비해 FC5-H62(T33C/A104C)-G4S-Li81이 상승했다. CSF/혈청 비율은 Li81에 비해 FC5-H62(T33C/A104C)-G4S-Li81이 약 3배 상승했으며, IV 투여 후 4일부터 14일까지 지속되었다. Pheonix 8.1 소프트웨어를 사용하여 비구획적 약동학 분석을 수행했으며 약동학 파라미터는 표 13에 기록된다.
Figure pct00041
FC5의 인간화 및 이황화 안정화된 형태[FC5-H62(T33C/A104C); hFC5.2라고도 지칭됨]가 뇌 표적에 대한 다른 항체의 뇌 내피 세포 투과성을 증가시킬 수 있는지를 조사하기 위해, 다른 형식의 항-아밀로이드 베타(12F6A), 항-알파 시누클레인(12F4), 및 항-타우(6C5) 항체에 대한 hFC5.2의 융합체를 생성하였다. 모든 작제물을 CHO에서 발현시켰고 FC5-Li81 융합체에 대해 기술한 바와 같이 단백질 A 친 화성 크로마토그래피로 정제하였다. 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 FC5가 경쇄에 융합된 분자 샘플에서 응집물 및 유리의 중쇄 또는 경쇄만의 불순물을 제거하였다.
항체 12F6A의 경우, FC5-H62(T33C/A104C)는 G4S 링커(서열번호 5)를 통해 중쇄의 N-말단에 융합시켜 FC5-H62(T33C/A104C)-12F6A 작제물을 형성하였다.
Figure pct00042
이 융합체는 ELISA 결합 검정에서 아밀로이드 베타에 대해 12F6A 항체와 매우 유사한 결합을 나타내었다(도 45A). hIgG1 Fc의 C-말단에 12F6A Fab가 융합된 작제물은 아밀로이드 베타에 대한 결합에 있어 상당한 상실을 나타내어, FC5-H62(T33C/A104C) 융합체는 이러한 형식으로 추구되지 않았다. FC5-H62(T33C/A104C)-12F6A는 또한 SVARBEC 트랜스웰 검정(도 45B)에서 래트 뇌 내피 세포를 가로질러 증가된 침투를 나타냈으며, PAPP 값이 대조군 항체[항-HEL 뮤린 IgG1; Goldbaum et al., J Immunol., 162: 6040-6045(1999); Genbank AF110316 VH 및 AY277254.1 VL]보다 4 내지 8배 더 높았다. 그러나, 12F6A 단독도 대조군보다 약 2배 더 높은 PAPP를 나타내었으며, FC5-H62(T33C/A104C)-12F6A에 대한 PAPP는 12F6A 단독보다 약 3배 더 높았다. 인간 뇌 내피 세포에서의 트랜스시토시스도 역시 인간 다능성 줄기 세포(hu-iPSC) 유래 트랜스웰 BBB 모델[Ribecco-Lutkiewicz et al. Sci Rep., 8(1):1873 (2018); 도 45C]에서 입증되었는데, 여기서 FC5-H62(T33C/A104C)-12F6A에 대해 훨씬 더 큰 PAPP 값이 관찰되었다(대조군 항체에 비해 10배 초과; 12F6A 단독에 비해 약 5배).
항체 12F4의 경우, 중쇄의 N-말단의 변형이 알파-시누클레인에 대한 결합을 약간 감소시키는 것으로 이전에 결정되었기 때문에, 단일 G4S 링커(서열번호 5)를 사용하여 경쇄의 N-말단에 FC5-H62(T33C/A104C)의 융합을 수행하여 FC5-H62(T33C/A104C)-12F4(LC)를 만들었다.
Figure pct00043
FC5 기반의 트랜스시토시스가 Fc 수용체에 대한 결합을 조절하는 Fc 영역의 차이에 의해 영향을 받는지 여부를 조사하기 위해, FC5-H62(T33C/A104C)-12F4(LC)를 야생형 hIgG1 서브클래스뿐만 아니라 저하된 이펙터 기능을 가진 3개의 스캐폴드, 즉 hIgG1 agly(N297Q), hIgG2 SAA[Vafa et al. Methods. 65(1): 114-26(2014)] 및 hIgG4P/G1 agly(US 2012/0100140 A1 참조)를 갖는 12F4 중쇄와 공동발현시켰다.
Figure pct00044
또한, Fc의 C-말단부터 12F4 경쇄까지 G4S 연결을 통해 긴 힌지 hIgG1 Fc 및 12F4 Fab에 FC5-H62(T33C/A104C)를 융합시킨 작제물(FC5-H62(T33C/A104C)-Fc-12F4 Fab(LC)도 생성했다.
Figure pct00045
Figure pct00046
알파-시누클레인 직접 결합 ELISA에 의한 이들 분자의 분석은 12F4 경쇄에 직접 융합된 FC5-H62(T33C/A104C) 도메인이 12F4 hIgG1의 결합에 비해 알파-시누클레인에 대한 결합을 손상시키지 않는다는 것을 보여주었다(도 46A). 이에 반해, FC5-H62(T33C/A104C)-Fc-12F4 Fab(LC) 분자는 알파-시누클레인에 대해 심각하게 손상된 결합을 나타내었다. FC5-H62(T33C/A104C)-12F4(LC) hIgG 분자의 일련의 이펙터 기능 변이체를 래트 뇌 내피 세포(SVARBEC) 트랜스웰 검정에서 기능적 트랜스시토시스에 대해 추가 시험하였다(도 46B). Fc 프레임워크에 관계없이 모든 분자는 각 트랜스웰에 포함된 항-HEL mIgG1 대조군 항체보다 4 내지 9배 더 높은 PAPP 값을 갖는 개선된 수송을 나타냈으며, 이에 반해 FC5가 부착되지 않은 12F4는 대조군과 트랜스-세포 투과성의 유의적인 차이를 나타내지 않았다.
BBB 침투가 향상된 이중기능성 항-타우 결합 항체를 확인하기 위해, FC5-H62(T33C/A104C)-6C5 hIgG1을 중쇄 및 경쇄 융합 분자 둘 모두로서 만들어냈다.
Figure pct00047
Figure pct00048
또한, 대안적 형식 FC5-H62(T33C/A104C)-Fc-6C5 Fab도 중쇄 및 경쇄 융합 분자로서 만들어냈다.
Figure pct00049
Figure pct00050
FC5-H62(T33C/A104C)-6C5 hIgG1은 6C5 hIgG1(도 47A)과 유사한 타우에 대한 결합을 보인 반면, FC5-H62(T33C/A104C)-Fc-6C5 Fab 분자는 상당히 감소된 타우 결합을 보였다. FC5-H62(T33C/A104C)-6C5(HC) hIgG1 및 FC5-H62(T33C/A104C)-6C5(LC) hIgG1 분자는 SVARBEC 트랜스웰 검정에서 트랜스시토시스에 대해 추가 시험하였고(도 47B), 대조군 항체보다 4배 내지 8배 높은 PAPP를 나타내었다. 6C5 hIgG1은 대조군보다 약간 더 높은 PAPP를 나타내었다(항-HEL mIgG1에 비해 1.7배).
이황화 조작된 FC5-H62(T33C/A104C)-Li81(도 35)에서 나타난 바와 같이, 12F4 및 12F6A 항체에 융합된 이황화 조작된 FC5가 비-이황화 조작된 변이체보다 개선된 분자 안정성을 갖고 있는지를 검증하기 위해 펩신 분해를 수행하였다. FC5-H62(T33C/A104C)-Li81 hIgG1 agly는 펩신 분해에 대해 안정성이 좋은 분자의 예로서 사용하였고, FC5-H32-Li81 hIgG1 agly는 안정성이 낮은 분자의 예로서 사용하였으며, 이들의 펩신 분해물을 이황화 조작된 FC5-H62(T33C/A104C)-12F4(야생형 및 비글리코실화된 hIgG1 스캐폴드 둘 모두에 대해), FC5-H62(T33C/A104C)-12F6A hIgG1 및 비-안정화된 FC5-H32-12F6A hIgG1의 분해물과 비교하였다(도 48). 모든 단백질 분해는 20mM 아세트산 나트륨, pH 3.6에서 1 ㎎/㎖ 및 0.033 ㎎/㎖ 펩신으로 수행하였고, 37℃에서 1시간 또는 2.5시간 동안 인큐베이션하였다. 추가 이황화물을 가진 모든 분자[FC5-H62(T33C/A104C) 융합체]는 분해 후 SDS-PAGE 분석에서, 이황화 조작되지 않은 분자(FC5-H32 융합체)에 비해 더 높은 분자량 밴드의 더 높은 강도를 나타내었다. 도 48에서 화살표로 강조 표시된 저 분자량 밴드의 감소는 이황화 안정화없이 프로테아제 민감성에 대한 양성 대조군인 FC5-H32 융합체에서 관찰되었다.
다른 실시형태
본 발명은 이의 상세한 설명과 함께 설명되었지만, 전술한 설명은 첨부된 청구항의 범위에 의해 한정되는 본 발명의 범위를 제한하는 것이 아니라 예시하기 위한 것이다. 다른 양상, 장점 및 변형은 이하 청구 범위 내에 속한다.
SEQUENCE LISTING <110> BIOGEN MA INC. NATIONAL RESEARCH COUNCIL OF CANADA <120> HUMANIZED AND STABILIZED FC5 VARIANTS FOR ENHANCEMENT OF BLOOD BRAIN BARRIER TRANSPORT <130> 13751-0300WO1 <140> PCT/US2019/058286 <141> 2019-10-28 <150> US 62/751,962 <151> 2018-10-29 <160> 204 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 122 <212> PRT <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: wild type FC5 single domain antibody sequence" <400> 1 Asp Val Gln Leu Gln Ala Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Lys Ile Thr His Tyr 20 25 30 Thr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ser Arg Ile Thr Trp Gly Gly Asp Asn Thr Phe Tyr Ser Asn Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Asp Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Gly Ser Thr Ser Thr Ala Thr Pro Leu Arg Val Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Lys Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 2 <211> 237 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Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 129 Glu Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Pro Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Thr 1 5 10 15 Gly <210> 130 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 130 Val Leu Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gly Asp Arg Ile Glu Val Met Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 131 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 131 Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Ser Ser Lys Gly Asn Thr Tyr Leu His 1 5 10 15 <210> 132 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 132 Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 1 5 <210> 133 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 133 Ser Gln Ser Thr His Phe Pro Arg Thr 1 5 <210> 134 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial 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Claims (157)

  1. 혈액 뇌 장벽을 가로질러 이동하는 항체 가변 도메인으로서, 상기 항체 가변 도메인은 서열번호 1과 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하되, 상기 아미노산 서열은 상보성 결정 영역 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하고, 상기 CDR2는 서열번호 50에 제시된 서열을 포함하고,
    (i) 상기 CDR1은 서열번호 47에 제시된 서열을 포함하고, 상기 CDR3은 서열번호 51에 제시된 서열을 포함하고, 상기 아미노산 서열은 서열번호 1의 위치 49 및 70에 상응하는 위치에 시스테인을 포함하거나;
    (ii) 상기 CDR1은 서열번호 48에 제시된 서열을 포함하고, 상기 CDR3은 서열번호 51에 제시된 서열을 포함하고, 상기 아미노산 서열은 서열번호 1의 위치 79에 상응하는 위치에 시스테인을 포함하거나;
    (iii) 상기 CDR1은 서열번호 49에 제시된 서열을 포함하고, 상기 CDR3은 서열번호 52에 제시된 서열을 포함하거나;
    (iv) 상기 CDR1은 서열번호 58에 제시된 서열을 포함하고, 상기 CDR3은 서열번호 52에 제시된 서열을 포함하거나;
    (v) 상기 CDR1은 서열번호 49에 제시된 서열을 포함하고, 상기 CDR3은 서열번호 53에 제시된 서열을 포함하거나;
    (vi) 상기 CDR1은 서열번호 58에 제시된 서열을 포함하고, 상기 CDR3은 서열번호 53에 제시된 서열을 포함하거나;
    (vii) 상기 CDR1은 서열번호 49에 제시된 서열을 포함하고, 상기 CDR3은 서열번호 54에 제시된 서열을 포함하거나;
    (viii) 상기 CDR1은 서열번호 58에 제시된 서열을 포함하고, 상기 CDR3은 서열번호 54에 제시된 서열을 포함하거나;
    (ix) 상기 CDR1은 서열번호 49에 제시된 서열을 포함하고, 상기 CDR3은 서열번호 55에 제시된 서열을 포함하거나; 또는
    (x) 상기 CDR1은 서열번호 58에 제시된 서열을 포함하고, 상기 CDR3은 서열번호 55에 제시된 서열을 포함하는, 항체 가변 도메인.
  2. 제1항에 있어서, 상기 아미노산 서열은 서열번호 1과 비교하여 서열번호 1의 위치 1, 5, 6, 14, 37, 44, 45, 47, 75, 87, 88, 93, 114, 또는 117에 상응하는 위치 중 하나 이상에 치환을 포함하는, 항체 가변 도메인.
  3. 제2항에 있어서, 상기 아미노산 서열은,
    서열번호 1의 위치 1에 상응하는 위치에 글루탐산;
    서열번호 1의 위치 5에 상응하는 위치에 발린;
    서열번호 1의 위치 6에 상응하는 위치에 글루탐산;
    서열번호 1의 위치 14에 상응하는 위치에 프롤린;
    서열번호 1의 위치 37에 상응하는 위치에 발린;
    서열번호 1의 위치 44에 상응하는 위치에 글리신;
    서열번호 1의 위치 45에 상응하는 위치에 류신;
    서열번호 1의 위치 47에 상응하는 위치에 트립토판;
    서열번호 1의 위치 75에 상응하는 위치에 세린;
    서열번호 1의 위치 87에 상응하는 위치에 아르기닌;
    서열번호 1의 위치 88에 상응하는 위치에 알라닌;
    서열번호 1의 위치 93에 상응하는 위치에 발린;
    서열번호 1의 위치 114에 상응하는 위치에 글루타민; 또는
    서열번호 1의 위치 117에 상응하는 위치에 류신
    중 하나 이상을 포함하는, 항체 가변 도메인.
  4. 제1항에 있어서, 상기 아미노산 서열은 서열번호 1과 비교하여 서열번호 1의 위치 5, 6, 14, 75, 87, 88, 93, 114, 또는 117에 상응하는 위치 중 하나 이상에 치환을 포함하는, 항체 가변 도메인.
  5. 제4항에 있어서, 상기 아미노산 서열은,
    서열번호 1의 위치 5에 상응하는 위치에 발린;
    서열번호 1의 위치 6에 상응하는 위치에 글루탐산;
    서열번호 1의 위치 14에 상응하는 위치에 프롤린;
    서열번호 1의 위치 75에 상응하는 위치에 세린;
    서열번호 1의 위치 87에 상응하는 위치에 아르기닌;
    서열번호 1의 위치 88에 상응하는 위치에 알라닌;
    서열번호 1의 위치 93에 상응하는 위치에 발린;
    서열번호 1의 위치 114에 상응하는 위치에 글루타민; 또는
    서열번호 1의 위치 117에 상응하는 위치에 류신
    중 하나 이상을 포함하는, 항체 가변 도메인.
  6. 제1항에 있어서, 상기 아미노산 서열은 서열번호 1과 비교하여 서열번호 1의 위치 44 및 45에 상응하는 위치에 치환을 포함하는, 항체 가변 도메인.
  7. 제6항에 있어서, 상기 아미노산 서열은,
    서열번호 1의 위치 44에 상응하는 위치에 글리신; 및
    서열번호 1의 위치 45에 상응하는 위치에 류신
    을 포함하는, 항체 가변 도메인.
  8. 제1항에 있어서, 상기 아미노산 서열은 서열번호 1과 비교하여 서열번호 1의 위치 1, 44 및 45에 상응하는 위치에 치환을 포함하는, 항체 가변 도메인.
  9. 제8항에 있어서, 상기 아미노산 서열은,
    서열번호 1의 위치 1에 상응하는 위치에 글루탐산;
    서열번호 1의 위치 44에 상응하는 위치에 글리신; 및
    서열번호 1의 위치 45에 상응하는 위치에 류신
    을 포함하는, 항체 가변 도메인.
  10. 제1항에 있어서, 상기 아미노산 서열은 서열번호 1과 비교하여 서열번호 1의 위치 44, 45 및 47에 상응하는 위치에 치환을 포함하는, 항체 가변 도메인.
  11. 제10항에 있어서, 상기 아미노산 서열은,
    서열번호 1의 위치 44에 상응하는 위치에 글리신;
    서열번호 1의 위치 45에 상응하는 위치에 류신; 및
    서열번호 1의 위치 47에 상응하는 위치에 트립토판
    을 포함하는, 항체 가변 도메인.
  12. 제1항에 있어서, 상기 아미노산 서열은 서열번호 1과 비교하여 서열번호 1의 위치 1, 44, 45 및 47에 상응하는 위치에 치환을 포함하는, 항체 가변 도메인.
  13. 제12항에 있어서, 상기 아미노산 서열은,
    서열번호 1의 위치 1에 상응하는 위치에 글루탐산;
    서열번호 1의 위치 44에 상응하는 위치에 글리신;
    서열번호 1의 위치 45에 상응하는 위치에 류신; 및
    서열번호 1의 위치 47에 상응하는 위치에 트립토판
    을 포함하는, 항체 가변 도메인.
  14. 제1항에 있어서, 상기 아미노산 서열은 서열번호 1과 비교하여 서열번호 1의 위치 37, 44, 45 및 47에 상응하는 위치에 치환을 포함하는, 항체 가변 도메인.
  15. 제14항에 있어서, 상기 아미노산 서열은,
    서열번호 1의 위치 37에 상응하는 위치에 발린;
    서열번호 1의 위치 44에 상응하는 위치에 글리신;
    서열번호 1의 위치 45에 상응하는 위치에 류신; 및
    서열번호 1의 위치 47에 상응하는 위치에 트립토판
    을 포함하는, 항체 가변 도메인.
  16. 제1항에 있어서, 상기 아미노산 서열은 서열번호 1과 비교하여 서열번호 1의 위치 1, 37, 44, 45 및 47에 상응하는 위치에 치환을 포함하는, 항체 가변 도메인.
  17. 제16항에 있어서, 상기 아미노산 서열은,
    서열번호 1의 위치 1에 상응하는 위치에 글루탐산;
    서열번호 1의 위치 37에 상응하는 위치에 발린;
    서열번호 1의 위치 44에 상응하는 위치에 글리신;
    서열번호 1의 위치 45에 상응하는 위치에 류신; 및
    서열번호 1의 위치 47에 상응하는 위치에 트립토판
    을 포함하는, 항체 가변 도메인.
  18. 제1항에 있어서, 상기 아미노산 서열은 서열번호 1과 비교하여 서열번호 1의 위치 37, 44, 45, 47 및 79에 상응하는 위치에 치환을 포함하는, 항체 가변 도메인.
  19. 제18항에 있어서, 상기 아미노산 서열은,
    서열번호 1의 위치 37에 상응하는 위치에 발린;
    서열번호 1의 위치 44에 상응하는 위치에 글리신;
    서열번호 1의 위치 45에 상응하는 위치에 류신;
    서열번호 1의 위치 47에 상응하는 위치에 트립토판; 및
    서열번호 1의 위치 79에 상응하는 위치에 류신
    을 포함하는, 항체 가변 도메인.
  20. 제1항에 있어서, 상기 아미노산 서열은 서열번호 1과 비교하여 서열번호 1의 위치 1, 37, 44, 45, 47 및 79에 상응하는 위치에 치환을 포함하는, 항체 가변 도메인.
  21. 제20항에 있어서, 상기 아미노산 서열은,
    서열번호 1의 위치 1에 상응하는 위치에 글루탐산;
    서열번호 1의 위치 37에 상응하는 위치에 발린;
    서열번호 1의 위치 44에 상응하는 위치에 글리신;
    서열번호 1의 위치 45에 상응하는 위치에 류신;
    서열번호 1의 위치 47에 상응하는 위치에 트립토판; 및
    서열번호 1의 위치 79에 상응하는 위치에 류신
    을 포함하는, 항체 가변 도메인.
  22. 제1항에 있어서, 상기 아미노산 서열은 서열번호 20 내지 28 중 어느 하나에 제시된 서열인, 항체 가변 도메인.
  23. 혈액 뇌 장벽을 가로질러 이동하는 항체 가변 도메인으로서, 상기 항체 가변 도메인은 서열번호 1에 제시된 서열과 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 상기 아미노산 서열은,
    (i) 서열번호 1과 비교하여 서열번호 1의 위치 5, 6, 14, 75, 87, 88, 93, 114 및 117에 상응하는 위치 중 하나 이상에 아미노산 치환; 및
    (ii) 서열번호 47 또는 57에 제시된 서열을 포함하는 상보성 결정 영역(CDR)1, 서열번호 50에 제시된 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열번호 51에 제시된 서열을 포함하는 CDR3
    을 포함하는, 항체 가변 도메인.
  24. 제23항에 있어서, 상기 아미노산 서열은 서열번호 1과 비교하여 서열번호 1의 위치 5, 6, 14, 75, 87, 88, 93, 114 및 117에 상응하는 위치 중 적어도 4개에 아미노산 치환을 포함하는, 항체 가변 도메인.
  25. 제23항에 있어서, 상기 아미노산 서열은 서열번호 1과 비교하여 서열번호 1의 위치 5, 6, 14, 75, 87, 88, 93, 114 및 117에 상응하는 위치 중 적어도 5개에 아미노산 치환을 포함하는, 항체 가변 도메인.
  26. 제23항에 있어서, 상기 아미노산 서열은 서열번호 1과 비교하여 서열번호 1의 위치 5, 6, 14, 75, 87, 88, 93, 114 및 117에 상응하는 위치 중 적어도 6개에 아미노산 치환을 포함하는, 항체 가변 도메인.
  27. 제23항에 있어서, 상기 아미노산 서열은 서열번호 1과 비교하여 서열번호 1의 위치 5, 6, 14, 75, 87, 88, 93, 114, 및 117에 상응하는 위치 각각에 아미노산 치환을 포함하는, 항체 가변 도메인.
  28. 제23항에 있어서, 상기 CDR1은 서열번호 47에 제시된 서열을 포함하는, 항체 가변 도메인.
  29. 제23항에 있어서, 상기 CDR1은 서열번호 57에 제시된 서열을 포함하는, 항체 가변 도메인.
  30. 제23항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아미노산 서열은,
    서열번호 1의 위치 5에 상응하는 위치에 발린;
    서열번호 1의 위치 6에 상응하는 위치에 글루탐산;
    서열번호 1의 위치 14에 상응하는 위치에 프롤린;
    서열번호 1의 위치 75에 상응하는 위치에 세린;
    서열번호 1의 위치 87에 상응하는 위치에 아르기닌;
    서열번호 1의 위치 88에 상응하는 위치에 알라닌;
    서열번호 1의 위치 93에 상응하는 위치에 발린;
    서열번호 1의 위치 114에 상응하는 위치에 글루타민; 또는
    서열번호 1의 위치 117에 상응하는 위치에 류신
    중 하나 이상을 포함하는, 항체 가변 도메인.
  31. 제23항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아미노산 서열은,
    서열번호 1의 위치 5에 상응하는 위치에 발린;
    서열번호 1의 위치 6에 상응하는 위치에 글루탐산;
    서열번호 1의 위치 14에 상응하는 위치에 프롤린;
    서열번호 1의 위치 75에 상응하는 위치에 세린;
    서열번호 1의 위치 87에 상응하는 위치에 아르기닌;
    서열번호 1의 위치 88에 상응하는 위치에 알라닌;
    서열번호 1의 위치 93에 상응하는 위치에 발린;
    서열번호 1의 위치 114에 상응하는 위치에 글루타민; 및
    서열번호 1의 위치 117에 상응하는 위치에 류신
    중 하나 이상을 포함하는, 항체 가변 도메인.
  32. 제23항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아미노산 서열은 서열번호 1과 비교하여 서열번호 1의 위치 1, 37, 44, 45, 47, 또는 79에 상응하는 위치 중 하나 이상에 치환을 포함하는, 항체 가변 도메인.
  33. 제32항에 있어서, 상기 아미노산 서열은,
    서열번호 1의 위치 1에 상응하는 위치에 글루탐산;
    서열번호 1의 위치 37에 상응하는 위치에 발린;
    서열번호 1의 위치 44에 상응하는 위치에 글리신;
    서열번호 1의 위치 45에 상응하는 위치에 류신;
    서열번호 1의 위치 47에 상응하는 위치에 트립토판; 또는
    서열번호 1의 위치 79에 상응하는 위치에 류신
    중 하나 이상을 포함하는, 항체 가변 도메인.
  34. 제23항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아미노산 서열은 서열번호 1과 비교하여 서열번호 1의 위치 44 및 45에 상응하는 위치에 치환을 포함하는, 항체 가변 도메인.
  35. 제34항에 있어서, 상기 아미노산 서열은,
    서열번호 1의 위치 44에 상응하는 위치에 글리신; 및
    서열번호 1의 위치 45에 상응하는 위치에 류신
    을 포함하는, 항체 가변 도메인.
  36. 제23항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아미노산 서열은 서열번호 1과 비교하여 서열번호 1의 위치 1, 44 및 45에 상응하는 위치에 치환을 포함하는, 항체 가변 도메인.
  37. 제36항에 있어서, 상기 아미노산 서열은,
    서열번호 1의 위치 1에 상응하는 위치에 글루탐산;
    서열번호 1의 위치 44에 상응하는 위치에 글리신; 및
    서열번호 1의 위치 45에 상응하는 위치에 류신
    을 포함하는, 항체 가변 도메인.
  38. 제23항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아미노산 서열은 서열번호 1과 비교하여 서열번호 1의 위치 44, 45, 및 47에 상응하는 위치에 치환을 포함하는, 항체 가변 도메인.
  39. 제38항에 있어서, 상기 아미노산 서열은,
    서열번호 1의 위치 44에 상응하는 위치에 글리신;
    서열번호 1의 위치 45에 상응하는 위치에 류신; 및
    서열번호 1의 위치 47에 상응하는 위치에 트립토판
    을 포함하는, 항체 가변 도메인.
  40. 제23항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아미노산 서열은 서열번호 1과 비교하여 서열번호 1의 위치 1, 44, 45 및 47에 상응하는 위치에 치환을 포함하는, 항체 가변 도메인.
  41. 제40항에 있어서, 상기 아미노산 서열은,
    서열번호 1의 위치 1에 상응하는 위치에 글루탐산;
    서열번호 1의 위치 44에 상응하는 위치에 글리신;
    서열번호 1의 위치 45에 상응하는 위치에 류신; 및
    서열번호 1의 위치 47에 상응하는 위치에 트립토판
    을 포함하는, 항체 가변 도메인.
  42. 제23항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아미노산 서열은 서열번호 1과 비교하여 서열번호 1의 위치 37, 44, 45 및 47에 상응하는 위치에 치환을 포함하는, 항체 가변 도메인.
  43. 제42항에 있어서, 상기 아미노산 서열은,
    서열번호 1의 위치 37에 상응하는 위치에 발린;
    서열번호 1의 위치 44에 상응하는 위치에 글리신;
    서열번호 1의 위치 45에 상응하는 위치에 류신; 및
    서열번호 1의 위치 47에 상응하는 위치에 트립토판
    을 포함하는, 항체 가변 도메인.
  44. 제23항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아미노산 서열은 서열번호 1과 비교하여 서열번호 1의 위치 1, 37, 44, 45 및 47에 상응하는 위치에 치환을 포함하는, 항체 가변 도메인.
  45. 제44항에 있어서, 상기 아미노산 서열은,
    서열번호 1의 위치 1에 상응하는 위치에 글루탐산;
    서열번호 1의 위치 37에 상응하는 위치에 발린;
    서열번호 1의 위치 44에 상응하는 위치에 글리신;
    서열번호 1의 위치 45에 상응하는 위치에 류신; 및
    서열번호 1의 위치 47에 상응하는 위치에 트립토판
    을 포함하는, 항체 가변 도메인.
  46. 제23항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아미노산 서열은 서열번호 1과 비교하여 서열번호 1의 위치 37, 44, 45, 47 및 79에 상응하는 위치에 치환을 포함하는, 항체 가변 도메인.
  47. 제46항에 있어서, 상기 아미노산 서열은,
    서열번호 1의 위치 37에 상응하는 위치에 발린;
    서열번호 1의 위치 44에 상응하는 위치에 글리신;
    서열번호 1의 위치 45에 상응하는 위치에 류신;
    서열번호 1의 위치 47에 상응하는 위치에 트립토판; 및
    서열번호 1의 위치 79에 상응하는 위치에 류신
    을 포함하는, 항체 가변 도메인.
  48. 제23항에 있어서, 상기 아미노산 서열은 서열번호 10 내지 17 중 어느 하나에 제시된 서열인, 항체 가변 도메인.
  49. 제40항에 있어서, 상기 아미노산 서열은 서열번호 20에 제시된 서열인, 항체 가변 도메인.
  50. 제40항에 있어서, 상기 아미노산 서열은 서열번호 26에 제시된 서열인, 항체 가변 도메인.
  51. 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항의 항체 가변 도메인을 포함하는, 키메라 분자.
  52. 제51항에 있어서, 항체 Fc 영역을 포함하는, 키메라 분자.
  53. 제51항 또는 제52항에 있어서, 항체, 항체의 항원 결합 단편, 펩타이드, 효소, 올리고뉴클레오타이드, 소분자 약물, 또는 핵산, 소분자 약물 또는 펩타이드를 캡슐화하는 리포좀 또는 지질 나노입자를 포함하는, 키메라 분자.
  54. 제51항에 있어서, 상기 항체 가변 도메인은,
    (i) 직접, 또는
    (ii) 개재 아미노산 서열을 통해,
    항체의 힌지 영역의 N-말단에 연결되고, 상기 힌지 영역은 Fc 모이어티에 융합되는, 키메라 분자.
  55. 제54항에 있어서, 상기 힌지 영역은 서열 AEPKSCD(서열번호 56), AEPKSSD(서열번호 59), 또는 KTHTCPPCP(서열번호 19)를 포함하는, 키메라 분자.
  56. 제54항에 있어서, 상기 개재 아미노산 서열은 항체의 중쇄 가변 영역; 항체의 경쇄 가변 영역; 효소; 펩타이드, 또는 아미노산 서열 3X(G4S)(서열번호 60), G4S(서열번호 5), GG 또는 G를 포함하는 링커 중 하나를 포함하는, 키메라 분자.
  57. 제54항에 있어서, 상기 Fc 모이어티는 hIgG1 Fc, hIgG2 Fc, hIgG3 Fc, hIgG4 Fc, hIgG1agly Fc, hIgG2 SAA Fc, hIgG4(S228P)/G1 agly Fc, hIgG4(S228P) Fc 및 hIgG4(S228P) agly Fc로 이루어진 군으로부터 선택되는, 키메라 분자.
  58. 제54항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Fc 모이어티는 직접 또는 제2 개재 아미노산 서열을 통해 제2 항체 가변 도메인을 포함하는 폴리펩타이드; Fab; scFv; 단일 도메인 항체; 펩타이드; 효소; 핵산; 또는 올리고뉴클레오타이드에 연결되는, 키메라 분자.
  59. 제54항에 있어서, 상기 힌지 영역은 핵산에 연결되는, 키메라 분자.
  60. 제59항에 있어서, 상기 핵산이 안티센스 올리고뉴클레오타이드인, 키메라 분자.
  61. 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항의 항체 가변 도메인을 포함하는 키메라 분자로서, 상기 항체 가변 도메인은,
    (i) 직접, 또는
    (ii) 개재 아미노산 서열을 통해,
    리포솜 또는 지질 나노입자에 연결되어 있는, 키메라 분자.
  62. 제61항에 있어서, 상기 리포솜 또는 지질 나노입자가 소분자 또는 핵산을 캡슐화하는, 키메라 분자.
  63. 제61항에 있어서, 상기 리포솜 또는 지질 나노입자가 안티센스 올리고뉴클레오타이드인 핵산을 캡슐화하는, 키메라 분자.
  64. 제63항에 있어서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 갭머 또는 스플라이스 교환 안티센스 올리고뉴클레오타이드인, 키메라 분자.
  65. 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항의 항체 가변 도메인을 포함하는 키메라 분자로서, 상기 항체 가변 도메인은,
    (i) 직접, 또는
    (ii) 개재 아미노산 서열을 통해,
    전체 항체에 연결되는, 키메라 분자.
  66. 제51항 또는 제52항에 있어서, 인간 혈청 알부민(HSA)을 더 포함하는, 키메라 분자.
  67. 조성물로서,
    (1) (i) 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항의 항체 가변 도메인, 및 (ii) 항체의 제1 힌지 영역 및 제1 Fc 모이어티를 포함하되, 상기 제1 힌지 영역의 C-말단은 상기 제1 Fc 모이어티의 N-말단에 연결되는 제1 단백질을 포함하고, 상기 항체 가변 도메인의 C-말단은 직접 또는 개재 아미노산 서열을 통해 상기 제1 힌지 영역의 N-말단에 융합되는 키메라 단백질;
    (2) 항체의 제2 힌지 영역 및 제2 Fc 모이어티를 포함하되, 상기 제2 힌지 영역의 C-말단은 상기 제2 Fc 모이어티의 N-말단에 연결되는 제2 단백질; 및
    (3) 치료제
    를 포함하되, 상기 제2 단백질이 상기 제1 단백질과 쌍을 이루는, 조성물.
  68. (1) (i) 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항의 제1 항체 가변 도메인; 및 (ii) 항체의 제1 힌지 영역 및 제1 Fc 모이어티를 포함하되, 상기 제1 힌지 영역의 C-말단은 상기 제1 Fc 모이어티의 N-말단에 연결되는 제1 단백질을 포함하고, 상기 제1 항체 가변 도메인의 C-말단은 직접 또는 개재 아미노산 서열을 통해 상기 제1 힌지 영역의 N-말단에 융합되는 제1 키메라 단백질;
    (2) (i) 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항의 제2 항체 가변 도메인; 및 (ii) 항체의 제2 힌지 영역 및 제2 Fc 모이어티를 포함하되, 상기 제2 힌지 영역의 C-말단은 상기 제2 Fc 모이어티의 N-말단에 연결되는 제2 단백질을 포함하고, 상기 제2 항체 가변 도메인의 C-말단은 직접 또는 개재 아미노산 서열을 통해 상기 제2 힌지 영역의 N-말단에 융합되는 제2 키메라 단백질; 및
    (3) 치료제
    를 포함하되, 상기 제2 단백질이 상기 제1 단백질과 쌍을 이루는, 조성물.
  69. 조성물로서,
    (1) (i) 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항의 제1 항체 가변 도메인; 및 (ii) 항체의 제1 힌지 영역 및 제1 Fc 모이어티를 포함하되, 상기 제1 힌지 영역의 C-말단은 상기 제1 Fc 모이어티의 N-말단에 연결되는 제1 단백질을 포함하고, 상기 제1 항체 가변 도메인의 C-말단은 제1 개재 아미노산 서열을 통해 상기 제1 힌지 영역의 N-말단에 융합되는, 제1 키메라 단백질; 및
    (2) (i) 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항의 제2 항체 가변 도메인; 및 (ii) 항체의 제2 힌지 영역 및 제2 Fc 모이어티를 포함하되, 상기 제2 힌지 영역의 C-말단은 상기 제2 Fc 모이어티의 N-말단에 연결되는 제2 단백질을 포함하고, 상기 제2 항체 가변 도메인의 C-말단은 제2 개재 아미노산 서열을 통해 상기 제2 힌지 영역의 N-말단에 융합되는, 제2 키메라 단백질;
    을 포함하되, 상기 제2 단백질이 상기 제1 단백질과 쌍을 이루며;
    상기 제1 및 제2 개재 아미노산 서열은 치료제로서 작용하는 Fab인, 조성물.
  70. 제67항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 힌지 영역은 서열 AEPKSCD(서열번호 56) 또는 AEPKSSD(서열번호 59)를 포함하는, 조성물.
  71. 제67항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 힌지 영역은 서열 KTHTCPPCP(서열번호 19)를 포함하는, 조성물.
  72. 제67항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 및 제2 Fc 모이어티가 동일한 아미노산 서열을 갖는, 조성물.
  73. 제67항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 및 제2 Fc 모이어티가 상이한 아미노산 서열을 갖는, 조성물.
  74. 제67항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 및 제2 Fc 모이어티가 비글리코실화된, 조성물.
  75. 제67항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 및 제2 Fc 모이어티가 hIgG1 Fc, hIgG2 Fc, hIgG3 Fc, hIgG4 Fc, hIgG1agly Fc, h IgG2 SAA Fc, hIgG4(S228P) Fc, hIgG4(S228P)/G1 agly Fc 및 hIgG4(S228P) agly Fc로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조성물.
  76. 제67항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 및 제2 힌지 영역이 동일한 아미노산 서열을 갖는, 조성물.
  77. 제67항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료제는 항체 가변 도메인을 포함하는 결합 분자인, 조성물.
  78. 제77항에 있어서, 상기 결합 분자는 Fab이고 상기 Fab의 VH 또는 VL 도메인의 N-말단이 상기 제1 Fc 모이어티의 C-말단에 연결되는, 조성물.
  79. 제67항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료제는 안티센스 올리고뉴클레오타이드인, 조성물.
  80. 제79항에 있어서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 제1 및/또는 제2 힌지 영역에 연결되는, 조성물.
  81. 제67항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료제는 리포솜 또는 지질 나노입자에 캡슐화된 소분자 약물 또는 핵산인, 조성물.
  82. 조성물로서,
    (1) (i) 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항의 항체 가변 도메인, 및 (ii) 항체의 경쇄를 포함하되, 상기 항체 가변 도메인의 C-말단은 직접 또는 개재 아미노산 서열을 통해 상기 항체 경쇄의 N-말단에 융합되는 키메라 단백질; 및
    (2) 상기 항체의 경쇄와 쌍을 이루는 항체의 중쇄
    를 포함하는, 조성물.
  83. 조성물로서,
    (1) (i) 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항의 항체 가변 도메인; 및 (ii) 항체의 중쇄를 포함하되, 상기 항체 가변 도메인의 C-말단은 직접 또는 개재 아미노산 서열을 통해 상기 항체 중쇄의 N-말단에 융합되는 키메라 단백질; 및
    (2) 상기 항체의 중쇄와 쌍을 이루는 항체의 경쇄
    를 포함하는, 조성물.
  84. (1) (i) 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항의 제1 항체 가변 도메인, 및 (ii) 항체의 경쇄를 포함하되, 상기 제1 항체 가변 도메인의 C-말단은 직접 또는 개재 아미노산 서열을 통해 상기 항체 경쇄의 N-말단에 융합되는 제1 키메라 단백질; 및
    (2) (i) 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항의 제2 항체 가변 도메인, 및 (ii) 항체의 중쇄를 포함하되, 상기 제2 항체 가변 도메인의 C-말단은 직접 또는 개재 아미노산 서열을 통해 상기 항체 중쇄의 N-말단에 융합되는 제2 키메라 단백질
    을 포함하는, 조성물.
  85. 제82항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개재 아미노산 서열은 3X(G4S)(서열번호 60), G4S(서열번호 5), GG 또는 G인, 조성물.
  86. (i) 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항의 항체 가변 도메인, (ii) 항체의 힌지 영역 및 Fc 모이어티를 포함하는 단백질을 포함하되, 상기 항체 가변 도메인의 C-말단은 직접 또는 개재 아미노산 서열을 통해 상기 단백질의 힌지 영역의 N-말단에 융합되는 키메라 단백질, 및 (iii) 치료제를 포함하는, 조성물.
  87. 제86항에 있어서, 상기 조성물은 상기 키메라 단백질의 이량체를 포함하는, 조성물.
  88. 제86항 또는 제87항에 있어서, 상기 힌지 영역은 서열 AEPKSCD(서열번호 56) 또는 AEPKSSD(서열번호 59)를 포함하는, 조성물.
  89. 제86항 또는 제87항에 있어서, 상기 힌지 영역은 서열 KTHTCPPCP(서열번호 19)를 포함하는, 조성물.
  90. 제86항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Fc 모이어티는 비글리코실화된 조성물.
  91. 제86항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Fc 모이어티는 hIgG1 Fc, hIgG2 Fc, hIgG3 Fc, hIgG4 Fc, hIgG1agly Fc, hIgG2 SAA Fc, hIgG4(S228P)/G1 agly Fc, hIgG4(S228P)Fc 및 hIgG4(S228P) agly Fc로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조성물.
  92. 제86항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 가변 도메인의 C-말단은 상기 단백질의 힌지 영역의 N-말단에 직접 융합되는, 조성물.
  93. 제86항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료제는 제2 항체 가변 도메인을 포함하는 결합 분자인, 조성물.
  94. 제86항 또는 제87항에 있어서, 상기 결합 분자는 Fab이고 상기 Fab의 VH 또는 VL 도메인의 N-말단은 상기 Fc 모이어티의 C-말단에 연결되는, 조성물.
  95. 제86항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료제는 안티센스 올리고뉴클레오타이드인, 조성물.
  96. 제95항에 있어서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 스플라이스 교환(splice switching) 올리고뉴클레오타이드 또는 갭머(gapmer)인, 조성물.
  97. 제95항 또는 제96항에 있어서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 상기 힌지 영역에 연결되는, 조성물.
  98. 제86항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료제는 리포솜 또는 지질 나노입자 내에 캡슐화된 소분자 또는 핵산인, 조성물.
  99. 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항의 항체 가변 도메인, 제51항 내지 제66항 중 어느 한 항의 키메라 분자, 또는 제67항 내지 제98항 중 어느 한 항의 조성물, 및 약제학적 허용성 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  100. 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항의 항체 가변 도메인을 암호화하는 핵산.
  101. 제100항의 핵산을 포함하는 벡터.
  102. 제101항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  103. 항체 가변 도메인을 생산하는 방법으로서,
    상기 항체 가변 도메인의 발현을 초래하는 조건하에 세포 배양 배지에서 제102항의 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
    상기 세포 배양 배지로부터 상기 항체 가변 도메인을 단리하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  104. 필요로 하는 인간 대상체의 알츠하이머 병을 치료하는 방법으로서, 인간 베타-아밀로이드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 직접 또는 개재 아미노산 서열을 통해 연결된 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항의 항체 가변 도메인을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  105. 제104항에 있어서, 상기 개재 아미노산 서열은 3X(G4S)(서열번호 60), G4S(서열번호 5), GG 또는 G 링커인, 방법.
  106. 제104항에 있어서, 상기 개재 아미노산 서열은 Fc 모이어티에 융합된 항체의 힌지 영역을 포함하는, 방법.
  107. 제104항 또는 제105항에 있어서, 상기 항원 결합 단편은 Fab인, 방법.
  108. 제104항 내지 제107항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 12F6A의 6개 CDR을 포함하는, 방법.
  109. 제104항 내지 제107항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 12F6A의 VH 및 VL을 포함하는, 방법.
  110. 필요로 하는 인간 대상체의 시누클레인병증(synucleinopathy)을 치료하는 방법으로서, 인간 알파 시누클레인에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 직접 또는 개재 아미노산 서열을 통해 연결된 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항의 항체 가변 도메인을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  111. 제110항에 있어서, 상기 개재 아미노산 서열은 3X(G4S)(서열번호 60), G4S(서열번호 5), GG 또는 G 링커인, 방법.
  112. 제110항에 있어서, 상기 개재 아미노산 서열은 Fc 모이어티에 융합된 항체의 힌지 영역을 포함하는, 방법.
  113. 제110항 또는 제111항에 있어서, 상기 항원 결합 단편은 Fab인, 방법.
  114. 제110항 내지 제113항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 12F4 또는 21D11의 6개 CDR을 포함하는, 방법.
  115. 제110항 내지 제113항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 12F4 또는 21D11의 VH 및 VL을 포함하는, 방법.
  116. 필요로 하는 인간 대상체의 타우병증을 치료하는 방법으로서, 인간 타우(tau)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 직접 또는 개재 아미노산 서열을 통해 연결된 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항의 항체 가변 도메인을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  117. 제116항에 있어서, 상기 개재 아미노산 서열은 3X(G4S)(서열번호 60), G4S(서열번호 5), GG 또는 G 링커인, 방법.
  118. 제116항에 있어서, 상기 개재 아미노산 서열은 Fc 모이어티에 융합된 항체의 힌지 영역을 포함하는, 방법.
  119. 제116항 또는 제117항에 있어서, 상기 항원 결합 단편은 Fab인, 방법.
  120. 제116항 내지 제119항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 6C5, 40E8, 또는 BMS-986168의 6개 CDR을 포함하는, 방법.
  121. 제116항 내지 제119항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 6C5, 40E8, 또는 BMS-986168의 VH 및 VL을 포함하는, 방법.
  122. 필요로 하는 인간 대상체의 전두측두엽성 치매를 치료하는 방법으로서, 인간 TDP-43에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 직접 또는 개재 아미노산 서열을 통해 연결된 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항의 항체 가변 도메인을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  123. 제122항에 있어서, 상기 개재 아미노산 서열은 3X(G4S)(서열번호 60), G4S(서열번호 5), GG 또는 G 링커인, 방법.
  124. 제122항에 있어서, 상기 개재 아미노산 서열은 Fc 모이어티에 융합된 항체의 힌지 영역을 포함하는, 방법.
  125. 제122항 또는 제123항에 있어서, 상기 항원 결합 단편은 Fab인, 방법.
  126. 제122항 내지 제125항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 41D1, 14W3 또는 51C1의 6개 CDR을 포함하는, 방법.
  127. 제122항 내지 제125항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 41D1, 14W3, 또는 51C1의 VH 및 VL을 포함하는, 방법.
  128. 필요로 하는 인간 대상체의 다발성 경화증을 치료하는 방법으로서, 인간 LINGO-1에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 직접 또는 개재 아미노산 서열을 통해 연결된 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항의 항체 가변 도메인을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  129. 제128항에 있어서, 상기 개재 아미노산 서열은 3X(G4S)(서열번호 60), G4S(서열번호 5), GG 또는 G 링커인, 방법.
  130. 제128항에 있어서, 상기 개재 아미노산 서열은 Fc 모이어티에 융합된 항체의 힌지 영역인, 방법.
  131. 제128항 또는 제129항에 있어서, 상기 항원 결합 단편은 Fab인, 방법.
  132. 제128항 내지 제131항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 Li81 또는 Li113의 6개 CDR을 포함하는, 방법.
  133. 제128항 내지 제131항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 Li81 또는 Li113의 VH 및 VL을 포함하는, 방법.
  134. 필요로 하는 인간 대상체의 척추 근육 위축을 치료하는 방법으로서, 뉴시너센(nusinersen)에 직접 또는 개재 아미노산 서열을 통해 연결된 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항의 항체 가변 도메인을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  135. 제134항에 있어서, 상기 뉴시너센은 리포솜 또는 지질 나노입자에 캡슐화되어 있는, 방법.
  136. 제134항에 있어서, 상기 개재 아미노산 서열은 Fc 모이어티에 융합된 힌지 영역을 포함하고 상기 힌지 영역 또는 힌지외 연결 부위에 상기 뉴시너센은 연결되는, 방법.
  137. 항체 가변 도메인의 불안정성을 평가하는 방법으로서,
    항체 가변 도메인을 제공하는 단계;
    상기 항체 가변 도메인을 혈청 샘플에 첨가하여 혼합물을 만드는 단계;
    상기 혼합물을 인큐베이션하는 단계;
    상기 항체 가변 도메인을 정제하는 단계; 및
    펩타이드 맵핑을 수행하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  138. 제137항에 있어서, 상기 혈청 샘플은 래트 혈청인, 방법.
  139. 제137항 또는 제138항에 있어서, 상기 항체 가변 도메인은 약 0.1 ㎎/㎖의 농도로 혈청에 존재하는, 방법.
  140. 제137항 내지 제139항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 혼합물은 약 37℃에서 약 70시간 동안 인큐베이션되는, 방법.
  141. 제140항에 있어서, 상기 항체 가변 도메인은 FC5 변이체를 포함하는, 방법.
  142. 제140항에 있어서, 상기 항체 가변 도메인은 FC5의 안정화된 형태를 포함하는, 방법.
  143. FC5의 안정화된 형태를 선별하는 방법으로서,
    하나 이상의 아미노산이 서열번호 1과 상이한 FC5 변이체를 포함하는 항체 가변 도메인을 제공하는 단계;
    상기 항체 가변 도메인을 혈청 샘플에 첨가하여 혼합물을 만드는 단계;
    상기 혼합물을 인큐베이션하는 단계;
    상기 항체 가변 도메인을 정제하는 단계;
    펩타이드 맵핑을 수행하는 단계; 및
    증가된 펩타이드 회수율을 나타내는 항체 가변 도메인을 선택하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  144. 제143항에 있어서, 상기 FC5 변이체는 1 내지 10개의 아미노산에서 서열번호 1과 상이한, 방법.
  145. 제143항 또는 제144항에 있어서, 상기 혈청 샘플은 래트 혈청인, 방법.
  146. 제143항 내지 제145항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 가변 도메인은 약 0.1 ㎎/㎖의 농도로 상기 혈청에 존재하는, 방법.
  147. 제143항 내지 제146항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 혼합물은 약 37℃에서 약 70시간동안 인큐베이션되는, 방법.
  148. 제51항 내지 제66항 중 어느 한 항의 키메라 분자를 암호화하는 핵산.
  149. 제148항의 핵산을 포함하는 벡터.
  150. 제149항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  151. 키메라 분자를 생산하는 방법으로서,
    상기 키메라 분자의 발현을 초래하는 조건하에 세포 배양 배지에서 제150항의 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
    상기 세포 배양 배지로부터 상기 키메라 분자를 단리하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  152. 제67항 내지 제98항 중 어느 한 항의 조성물을 암호화하는 핵산.
  153. 제152항의 핵산을 포함하는 벡터.
  154. 제153항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  155. 조성물을 생산하는 방법으로서,
    상기 조성물의 발현을 초래하는 조건하에 세포 배양 배지에서 제154항의 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
    상기 세포 배양 배지로부터 상기 조성물을 단리하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  156. 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항의 항체 가변 도메인을 포함하는 키메라 분자로서, 상기 항체 가변 도메인은,
    (i) 직접, 또는
    (ii) 개재 아미노산 서열을 통해,
    치료 벡터를 함유하는 바이러스 캡시드에 연결되는, 키메라 분자.
  157. 제156항에 있어서, 상기 바이러스 캡시드는 AAV인, 키메라 분자.
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