CN116650660B - 制备抗体偶联小分子药物的方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种制备抗原结合片段偶联小分子药物的方法及其应用。本发明是一种改造人IgG Fc的方法，包括针对人IgG Fc的N端序列进行改造。所述方法获得的IgG Fc变体与抗原结合片段融合表达时，功能性分子负载量显著增加且表达后产生聚体的情况大大减少。本发明也揭示了包含该IgG Fc变体的融合蛋白、偶联药物等。

Description

制备抗体偶联小分子药物的方法及其应用
技术领域
本发明属于生物技术和药物学领域，更具体地，本发明涉及一种制备抗体偶联小分子药物的方法及其应用。
背景技术
抗体偶联药物(antibody-drug conjugate，ADC)是通过化学方法将抗体与小分子药物偶联到一起，利用抗体的靶向性，将小分子药物带到目标细胞，从而发挥药效。抗体偶联药物由于兼具抗体的靶向性以及小分子药物在肿瘤组织中高活性的双重优点，可高效杀伤肿瘤细胞，比传统的化疗药物副作用更低，也比传统的抗体类肿瘤药物具有更好的疗效，因此被称为肿瘤治疗领域的“生物导弹”，展示出了巨大的临床治疗价值，成为当前肿瘤治疗的研究热点。
目前大多数抗体偶联药物的偶联过程依赖于小分子药物与抗体中氨基酸残基采用随机或者定点的方式进行偶联，其中又以随机偶联方式为主。随机偶联的方式包括例如赖氨酸残基偶联和半胱氨酸残基偶联。赖氨酸残基偶联是利用抗体中的赖氨酸残基进行偶联，IgG分子中具有超过80个赖氨酸残基，其中溶剂可及性高的位点超过20个，这些赖氨酸残基均可通过酰化偶联小分子药物，但由于可以偶联的位点太多，容易导致每一批次的抗体偶联药物的产品异质性较大，药物抗体比(Drug to antibody ratio，DAR)分布不均，进而使研究抗体偶联药物的药物动力、药物代谢受到影响。半胱氨酸残基偶联是利用抗体中的半胱氨酸残基进行偶联，抗体表面一般不存在可以用于偶联反应的游离的半胱氨酸残基，其均以二硫键的形式存在。
人的IgG可以分为四种亚型，即 IgG1、IgG2、IgG3、IgG4，存在于其序列上链间二硫键的位置和分子量的不同，不同IgG亚型的Fc片段在结构和功能上也有所不同。目前上市和在研的绝大多数ADC均是常规的IgG，在IgG亚型选择方面，大多数采用人的IgG1亚型。
重链抗体最初发现于骆驼和鲨鱼类动物体内，是轻链天然缺失，只有重链组成的新型抗体分子。重链抗体和普通的抗体相比，虽然缺失了轻链，但是依然保留结合抗原的能力，同时还具有分子量小，易表达，易工程化改造，稳定性好等优点，正越来越多地被应用到抗体药物的开发中。但是，目前还没有利用重链抗体制备抗体偶联药物成功上市的报道。
利用重链抗体制备抗体偶联药物，将小分子药物通过半胱氨酸残基偶联到抗体上，如果采用人IgG1的Fc的话，可以利用链间二硫键是非常局限的，本领域中，一个ADC分子最多只能偶联4个小分子药物。而若是希望提高药效，就必须偶联更多的小分子药物，例如偶联6-8个小分子药物。
因此，本领域亟待对于此类抗体偶联药物进行进一步的优化改造，以期提高携带小分子药物的量，提高药效。
发明内容
本发明的目的在于提供一种制备抗体偶联小分子药物的方法及其应用。
在本发明的第一方面，提供一种增加抗原结合片段-人IgG Fc融合蛋白的功能性分子负载量且减少表达后聚体产生的方法，包括：(1)提供抗原结合片段-人IgG Fc融合蛋白，所述人IgG Fc的N端序列为经改造的序列，所述改造为：将N端6-15个(较佳地7-13个或8-12个)氨基酸残基替换为SEQ ID NO: 6 (ERKCCVECPPCP)所示的氨基酸残基，且基于该序列进行选自下组的改造：(a)在SEQ ID NO: 6序列的第4和第5位的CC两残基之间、之前(N端)或之后(C端)插入1-9个氨基酸残基；(b)对SEQ ID NO: 6序列的第4或第5位任一C进行突变。
在一种或多种实施方式中，(a)中，在CC两残基之间插入2-8个非半胱氨酸残基(较佳地插入2-7个残基；更佳地为2-4个残基)。
在一种或多种实施方式中，用于进行插入或突变改造的氨基酸残基包括：天冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、赖氨酸、精氨酸或组氨酸。
在一种或多种实施方式中，用于进行插入的氨基酸残基为酸性氨基酸，包括：天冬氨酸，谷氨酸，或其组合。
在一种或多种实施方式中，所述方法还包括：(2)在所述的抗原结合片段-人IgGFc融合蛋白上连接功能性分子；所述功能性分子的负载量为6-8个。
在一种或多种实施方式中，所述功能性分子包括：小分子抗肿瘤药物，细胞毒素，放射性同位素，生物活性蛋白质，靶向肿瘤表面标志物的分子，抑制肿瘤的分子，靶向免疫细胞的表面标志物的分子或可检测标记物，基于嵌合抗原受体技术的胞外铰链区、跨膜区及胞内信号区，或其组合。
在一种或多种实施方式中，所述靶向肿瘤表面标志物的分子是结合肿瘤表面标志物的抗体或配体。
在一种或多种实施方式中，所述的抑制肿瘤的分子是抗肿瘤的细胞因子或抗肿瘤的毒素。
在一种或多种实施方式中，所述的可检测标记物包括：荧光标记物、显色标记物。
在一种或多种实施方式中，所述的抗肿瘤的毒素包括：作用于微管蛋白的毒素；作用于DNA的毒素；作用于细胞内代谢、转录、翻译或信号转导的化合物。
在一种或多种实施方式中，所述的抗肿瘤的细胞因子包括：IL-2、IL-12、IL-15、IFN-beta、TNF-alpha或其变体。
在一种或多种实施方式中，所述的结合肿瘤表面标志物的抗体是识别肿瘤抗原的抗体。
在一种或多种实施方式中，所述作用于微管蛋白的毒素为单甲基澳瑞他汀、其相关化合物或其衍生物。
在一种或多种实施方式中，所述作用于微管蛋白的毒素为美登木素生物碱、其相关化合物或其衍生物。
在一种或多种实施方式中，所述作用于DNA的毒素为duocarmycin，calicheamicin，pyrrolobenzodiazepines，SN-38，DXd、其相关化合物或其衍生物。
在一种或多种实施方式中，所述抗肿瘤的毒素与融合蛋白通过连接子连接，所述连接子包括：不可剪切的连接子；可剪切的连接子，包括基于二硫键的连接子，基于组织蛋白酶敏感的连接子，基于腙键的连接子，基于溶酶体蛋白酶的连接子。
在一种或多种实施方式中，所述不可剪切的连接子为SMCC。
在一种或多种实施方式中，所述基于二硫键的连接子为sulfo-SPDB。
在一种或多种实施方式中，所述基于组织蛋白酶敏感的连接子为mc-vc-PAB。
在一种或多种实施方式中，所述基于溶酶体蛋白酶的连接子为maleimide-GGFGpeptide linker。
在一种或多种实施方式中，所述的胞内信号区包括：CD3ζ链，FcεRIγ酪氨酸激活基序，共刺激信号分子CD27、CD28、CD137、CD134、MyD88、CD40的胞内信号区。
在一种或多种实施方式中，所述跨膜区包括：CD8或CD28的跨膜区。
在一种或多种实施方式中，所述人IgG选自：人IgG1，人IgG2或人IgG4。
在一种或多种实施方式中，所述的抗原结合片段包括(但不限于)：重链抗体，单链抗体，单域抗体，BiTE抗体，DART抗体，Fv抗体，Fd抗体中能与抗原结合的多肽。
在一种或多种实施方式中，所述的抗原结合片段为抗体的重链或轻链的可变区，或两者的组合。
在本发明的另一方面，提供一种经改造的人IgG Fc变体，所述人IgG Fc的N端序列为经改造的序列，其N端6-15个(较佳地7-13个或8-12个)氨基酸残基被替换为SEQ ID NO:6 (ERKCCVECPPCP)所示的氨基酸残基，且基于该序列进行选自下组的改造：(a)在SEQ IDNO: 6序列的第4和第5位的CC两残基之间、之前(N端)或之后(C端)插入1-9个氨基酸残基；(b)对SEQ ID NO: 6序列的第4或第5位任一C进行突变。
在一种或多种实施方式中，所述的经改造的人IgG Fc变体中，在CC两残基之间插入2-8个氨基酸残基(较佳地插入2-7个氨基酸残基；更佳地为2-4个)。
在一种或多种实施方式中，所述的经改造的人IgG Fc变体中，用于进行插入或突变改造的氨基酸残基包括：天冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、赖氨酸、精氨酸或组氨酸。
在一种或多种实施方式中，所述的经改造的人IgG Fc变体中，用于进行插入的氨基酸残基为酸性氨基酸，包括：天冬氨酸，谷氨酸，或其组合。
在一种或多种实施方式中，所述的经改造的人IgG Fc变体中，所述人IgG Fc的N端序列为经改造的序列，所述改造包括：将SEQ ID NO: 6所示氨基酸序列突变为SEQ ID NO:28、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQID NO: 34、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQID NO: 10、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 7。
在本发明的另一方面，提供前面任一所述的经改造的人IgG Fc变体的用途，用于制备抗原结合片段-人IgG Fc融合蛋白；所述的抗原结合片段-人IgG Fc融合蛋白上连接功能性分子时，功能性分子负载量为6-8个。
在本发明的另一方面，提供一种融合蛋白，其为抗原结合片段-人IgG Fc融合蛋白；其中所述人IgG Fc为前面任一所述的人IgG Fc变体。
在本发明的另一方面，提供一种多核苷酸，其编码前面任一所述的人IgG Fc变体，或编码前面任一所述的融合蛋白。
在本发明的另一方面，提供一种表达构建体(如表达载体)，其包含所述的多核苷酸。
在本发明的另一方面，提供一种表达系统，其包含所述的表达构建体或基因组中整合有所述的多核苷酸。
在本发明的另一方面，提供一种制备前面任一所述的人IgG Fc变体，或所述的融合蛋白的方法，包括：在适合表达的条件下，利用所述的表达系统进行表达，从而获得所述的人IgG Fc变体或融合蛋白。
在本发明的另一方面，提供一种缀合物，其包括：所述的融合蛋白；以及与所述融合蛋白连接的功能性分子；所述功能性分子的负载量为6-8个。
在一种或多种实施方式中，所述功能性分子包括：小分子抗肿瘤药物，细胞毒素，放射性同位素，生物活性蛋白质，靶向肿瘤表面标志物的分子，抑制肿瘤的分子，靶向免疫细胞的表面标志物的分子或可检测标记物，基于嵌合抗原受体技术的胞外铰链区、跨膜区及胞内信号区，或其组合。
在本发明的另一方面，提供一种药物组合物或药盒，其包括：所述的融合蛋白，或所述的缀合物。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1为利用人IgG1 Fc构建的重链抗体SDS-PAGE图。
图2为将IgG1 Fc突变后的重链抗体SDS-PAGE图。
图3为将IgG1 Fc半胱氨酸突变后的重链抗体SDS-PAGE图。
图4为将IgG1 Fc第四位和第五位的半胱氨酸间插入不同数量氨基酸的重链抗体SDS-PAGE图。
图5为将IgG1 Fc半胱氨酸前、中、后插入氨基酸的重链抗体SDS-PAGE图。
图6为将IgG1 Fc间插入不同属性氨基酸的重链抗体SDS-PAGE图。
图7为将IgG1 Fc插入不同属性氨基酸的重链抗体偶联小分子DXd的SEC结果。
图8为将人IgG2和IgG4的Fc相应位置突变后的重链抗体SDS-PAGE图。
图9为将人IgG2和IgG4的Fc相应位置突变后的重链抗体偶联小分子DXd的SEC结果。
图10为IgG1 Fc突变后的重链抗体以及重链抗体偶联药物与OVCAR-3细胞的结合能力。
图11为IgG1 Fc突变后的重链抗体制备成抗体偶联药物对OVCAR-3细胞的杀伤效果。
具体实施方式
本发明人经过深入的研究和试验，揭示一种改造人IgG Fc的方法，包括针对人IgGFc的N端序列进行改造。本发明获得的IgG Fc变体与抗原结合片段融合表达时，功能性分子负载量显著增加且表达后产生聚体的情况大大减少。本发明也揭示了包含该IgG Fc变体的融合蛋白、偶联药物(如抗体偶联药物)等。
如本文所用，抗体的“抗原结合片段”或“抗原结合部位”或“抗原结合部分”是指抗体中的关键性区域，其决定了抗体与抗原的结合，其可以是决定抗体与抗原相结合的最短的序列区段。
如本文所用，所述“重链抗体”、“单域抗体”、“结构域抗体”或“纳米抗体”可互换使用。
如本文所用，“操作性连接(相连)”或“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列/氨基酸序列的某些部分与同一线性DNA序列/氨基酸序列其它部分的有机连接、相互配合。例如，如果启动子控制以编码序列的转录，那么它就是可操作地连于编码序列。
如本文所用，所述的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上由……构成”、和“由……构成”；“主要由……构成”、“基本上由……构成”和“由……构成”属于“含有”，“具有”或“包括”的下位概念。
如本文所用，“药学上可接受的载体”、“生理学上可接受的载体”或“生物学可接受的载体”是用于将本发明的融合蛋白传送给需要处理的对象(包括食品、饲料)的，在毒性、副作用方面可控的、环境友好或对人畜无害的溶剂、悬浮剂或赋形剂等。所述载体可以是液体或固体，较佳的是能够较高程度保持本发明的融合蛋白的生物活性的载体。
IgG Fc改造
本发明人在前期的研究发现，利用人IgG的Fc片段与抗原结合片段构建融合蛋白时，所能在表达过程中容易形成大量聚体，影响融合蛋白的质量，同时所述融合蛋白所能负载的功能性分子较少。经由深入研究分析，改造了IgG Fc，增加了抗原结合片段-人IgG Fc融合蛋白的功能性分子负载量且避免了聚体的形成，从而使带有IgG的Fc融合蛋白具有更好的工艺开发前景。
因此，本发明提供了新的改造IgG Fc的方法，包括针对人IgG Fc的N端序列进行改造，将N端一部分氨基酸残基替换为SEQ ID NO: 6 所示的氨基酸残基，且基于该序列进行选自下组的改造：(a)在SEQ ID NO: 6序列的第4和第5位的CC两残基之间、之前(N端)或之后(C端)插入1-9个氨基酸残基；(b)对SEQ ID NO: 6序列的第4或第5位任一C进行突变。所述改造获得一些能够与多个功能性分子良好连接的IgG Fc变体；获得的抗原结合片段-人IgG Fc融合蛋白在表达时聚体的形成大大减少或消失。
本发明的IgG Fc变体(突变蛋白)是合成蛋白或重组蛋白，即可以是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、植物)中产生。根据重组生产方案所用的宿主。本发明的IgG Fc变体还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。
本发明还包括IgG Fc变体的片段(生物活性片段)、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明实施例中所列举的突变蛋白相同的生物学功能或活性的蛋白。
本发明的IgG Fc变体的片段、衍生物或类似物可以是在本发明所具体列举的IgGFc变体的基础上：(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的突变蛋白，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的突变蛋白，或(iii)成熟突变蛋白与另一个化合物(比如延长突变蛋白半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的突变蛋白，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此突变蛋白序列而形成的突变蛋白(如前导序列或分泌序列或用来纯化此突变蛋白的序列或蛋白原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。然而，所述的片段、衍生物和类似物的氨基酸序列中，对应于野生型IgG Fc，本发明所主张的关键突变位点/区域(如位于N端的SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 36、SEQID NO: 12、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 8、SEQ IDNO: 7所示的序列区域)是保守存在的；也即，所述的片段、衍生物和类似物所涵盖的序列变化，存在于IgG Fc上非关键性的部位，所述的片段、衍生物和类似物仍能够与本发明实施例所列举的IgG Fc变体具有的功能/活性是相同或基本相同的。
此外，还可以对本发明IgG Fc变体进行修饰。修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在突变蛋白的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的衍生蛋白。这种修饰可以通过将蛋白暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能、提高了半衰期或优化了溶解性能的衍生蛋白。同样地，修饰后的IgG Fc变体的氨基酸序列中，对应于野生型IgG Fc，本发明所主张的关键突变位点/区域是保守存在的；也即，所述的片段、衍生物和类似物所涵盖的序列变化，存在于IgGFc上非关键性的部位，所述的片段、衍生物和类似物仍能够与本发明实施例所列举的IgGFc变体具有的功能/活性是相同或基本相同的。
术语“编码突变蛋白的多核苷酸”可以是包括编码本发明IgG Fc变体的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
融合蛋白
本发明的IgG Fc变体可与抗体的抗原结合片段融合，形成抗原结合片段-人IgGFc融合蛋白。
本发明的新型融合蛋白中，所包括的抗原结合片段与人IgG Fc是可操作性连接的，两者兼容性理想，生物活性高。
作为本发明的一种优选的方式，所述的IgG Fc与抗原结合片段通过多肽连接子连接，从而形成融合蛋白。例如，所述的连接子包括3-40个氨基酸。作为常用的连接子，所述的连接子的氨基酸序列为(GSG)n或(GGGGS)n或(GGGS)n(例如n＝1～8)。
如本文所提及的术语“抗体”包括完整抗体和任何抗原结合片段(即“抗原结合部分”)或其单链。
“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”是指单分子组成的抗体分子的制备物。单克隆抗体组合物表现出对特定表位的单一结合特异性和亲和力。
“抗原结合片段”是指保留特异性结合抗原(例如PD-1)的能力的抗体的一个或更多个片段。可以理解的是，抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段进行。囊括在抗体的术语“抗原结合片段”内的结合片段的实例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab’)2片段，包含在铰链区由二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段，(v)dAb片段，其由VH结构域组成；和(vi)分离的互补决定区(CDR)。
本发明的抗体包括人源化抗体，“人源化抗体”旨在指其中来源于另一种哺乳动物物种例如小鼠的种系的CDR序列已被移植到人框架序列上的抗体。可以在人框架序列内进行额外的框架区修饰。
本发明的抗体包括嵌合抗体，术语“嵌合抗体”旨在指其中可变区序列来源于一种物种并且恒定区序列来源于另一种物种的抗体，例如其中可变区序列来源于小鼠抗体并且恒定区序列来源于人抗体的抗体。
作为本发明的更优选的方式，所述的融合蛋白中，所述IgG Fc与重链抗体的可变区(VHH)连接，从而形成重链抗体的可变区-人IgG Fc。“重链抗体”为包含有重链的抗体，其抗原结合部分只含有重链可变区，而不含有轻链及其可变区部分。
核酸分子及含有其的构建体或细胞
本发明也提供了编码所述的人IgG Fc变体或所述融合蛋白的分离的核酸，也可以是其互补链。
并且，本发明还提供了包含编码所述人IgG Fc变体或融合蛋白的核酸分子的载体。所述的载体还可包含与所述核酸分子的序列操作性相连的表达调控序列，以便于所述人IgG Fc变体或融合蛋白的表达。
多种编码人IgG Fc变体的合适的核酸分子都适用于本发明。多种编码所述人IgGFc变体或融合蛋白的合适的核酸分子也适用于本发明。下文实例中提及的序列都适用于本发明的方法。应理解，当提供了蛋白的氨基酸序列后，本领域及时人员能够方便地确定编码其的核酸分子。
多种合适的载体都可以使用，比如一些用于哺乳动物、细菌、真菌、酵母的克隆和表达的载体，如Pouwels等，克隆载体：实验室手册(Elsevier最新版)中所描述的。在本发明的优选方式中，所述的载体为哺乳动物细胞适用的载体。
在一些实施方案中，所述载体可以是一些病毒类载体，例如但不限于逆转录病毒载体、噬菌体载体、腺病毒载体、单纯疱疹病毒(HSV)载体、AAV载体、或慢病毒载体。
表达载体包括连接有合适的转录和翻译调节序列的人IgG Fc变体或融合蛋白的DNA序列，如哺乳动物、微生物、病毒或昆虫基因。调节序列包括转录启动子、操纵子、增强子、核糖体结合位点或控制转录和翻译起始和终止的合适序列。在IgG Fc变体或融合蛋白序列需要调节序列功能的时候，则连接合适的调节序列。这样，启动子序列被连接在编码人IgG Fc变体或融合蛋白的DNA序列前端。在宿主细胞内的复制的能力通常由复制起始点控制。用于转化株识别的筛选基因也可加入表达载体。
另外，引导物序列可以和与人IgG Fc变体或融合蛋白编码序列融合，从而使翻译的人IgG Fc变体或融合蛋白可分泌到细胞外。信号肽可增强宿主细胞向胞外分泌嵌合多肽。信号肽在多肽从细胞内分泌出来的过程中可被切去。
本发明还提供一种表达人IgG Fc变体或融合蛋白的表达系统(例如宿主细胞)，所述表达系统含有本发明所述的表达载体或基因组中整合有外源的本发明所述的多核苷酸。任何适用于表达载体进行表达的细胞都可以作为宿主细胞，例如，所述宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞，具体可以是包括但不限于大肠杆菌；链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母、丝状真菌、植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS、HEK293细胞、或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等中的一种或多种的组合。构建所述表达系统的方法对于本领域技术人员来说应该是已知的，例如，可以是包括但不限于显微注射法、基因枪法、电穿孔法、病毒介导的转化法、电子轰击法、磷酸钙沉淀法等中的一种或多种的组合。作为本发明的优选方式，所述的表达系统为动物细胞表达系统，例如CHO，NS0，BHK，HEK-293或PER-C6等。在更具体的实施方式中，所述的细胞为CHO (如CHO-K1、CHO-S、CHO-DG44、ExpiCHO、CHOZN等)。
生产人IgG Fc变体或融合蛋白的方法也已包括在本发明中。所述方法包括培养含有人IgG Fc变体或融合蛋白编码核酸的重组细胞。所述方法可包括让细胞表达编码的人IgG Fc变体或融合蛋白，以及使表达的人IgG Fc变体或融合蛋白的复性。在一个实例中，所述方法还可包括复性的人IgG Fc变体或融合蛋白的分离和/或纯化。所述方法的产物也被保护。
可将上述制备获得的人IgG Fc变体或融合蛋白纯化为基本均一的性质，例如在SDS-PAGE电泳上呈单一条带。
偶联药物
本发明的技术方案是一种生物大分子的分子设计和改进，可被应用于生物大分子药物的开发。
本发明的融合蛋白可以与其它的异源功能性分子进一步连接或耦合，从而构成缀合物/偶联物(如抗体偶联药物(ADC))；所述的异源功能性分子可以包括但不限于：细胞因子，可检测标记物，毒素(如抑制肿瘤的毒素)、转录激活域、转录抑制域、核酸酶、脱氨基酶、甲基酶、脱甲基酶、转录释放因子等。所述的可检测标记物可以包括但不限于：荧光标记物、显色标记物、报告基因、定位信号等。所述异源功能结构域可连接、偶联或辍合于本发明的融合蛋白的N端、C端或内部。
所述的可检测标记物例如可包括但不限于：荧光标记物、显色标记物；如：酶、辅基、荧光材料、发光材料，生物发光材料、放射性材料、正电子发射金属以及非放射性顺磁性金属离子。也可包含一个以上的标记物。为了检测和/或分析和/或诊断目的用于标记抗体的标记依赖于使用的特定检测/分析/诊断技术和/或方法例如免疫组织化学染色(组织)样品、流式细胞计量术等。对于本领域已知的检测/分析/诊断技术和/或方法合适的标记为本领域技术人员所熟知。
本发明的技术方案可被应用于抗体偶联药物(ADC)的制备。可将携带VHH可变区的本发明的融合蛋白通过连接子与小分子药物结合，获得抗体偶联药物，其兼具小分子药物强大的杀伤力和单抗的靶向性，借助抗体极高的特异性，将药物精确地投放到肿瘤细胞内，避免对体内正常细胞的杀伤，从而减少治疗过程中的不良反应。ADC目前已成为一类有前景的抗癌治疗药物，是癌症治疗发展最快的领域之一。
重链抗体(HcAb)与传统抗体相比，仅由两条重链组成，没有轻链，具有分子量小、表达量高、稳定性好等特点。重链抗体也可以看作是一种Fc融合蛋白，其重链由与抗原结合的VHH可变区和常规的Fc结构区组合而成。本领域中如何改造人IgG Fc、提高其组装靶向药的量、降低聚体的形成，以及如何将带有人IgG Fc的重链抗体成功应用到药物开发上，是一项亟待解决的关键技术。而本发明提供了新的解决方案。经过改造的人IgG Fc可被用于构建重链抗体。
本发明中，所述的人IgG可以包括人IgG1，人IgG2或人IgG4。带有人IgG2的Fc的重链抗体相比IgG1的Fc，ADCC和CDC的功能要弱很多，而选择人IgG2的Fc，对于不需要ADCC和CDC功能的重链抗体可以多一种选择。而人IgG2的Fc的重链抗体也因为和融合蛋白同样的原因，容易产生聚体，所以本发明的改造对其尤为重要，使得带有人IgG2的Fc的重链抗体药物在工艺开发上更容易。
根据本发明的实施例论证，采用本发明优化改造的人IgG Fc，一个ADC分子可以偶联6个或8个小分子药物，这可大大提高ADC分子携带小分子药物的能力，从而增加对靶细胞(例如肿瘤细胞)的杀伤功能。但是采用人IgG Fc的重链抗体制备ADC的过程中，也要面对聚体形成的问题，所以通过本发明优选的突变，来减少聚体的形成，从而使带有人IgG Fc重链抗体在工艺开发上更容易，在制备成ADC后，其功能比IgG1的重链抗体更有优势。
药物组合物或药盒
本发明还提供一种药物组合物，所述的药物组合物包括：本发明所述的融合蛋白/缀合物/偶联物(如抗体偶联药物)或编码它们的多核苷酸，或含有该多核苷酸的表达载体或表达该融合蛋白/缀合物/偶联物的表达系统(如重组细胞)；以及药学上或生理学上可接受的载体。除非另外说明，其中“/”标示“或”。
合适的药学上可接受的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington’sPharmaceutical Sciences中可找到关于药学上可接受的载体的充分说明。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、磷酸盐缓冲液、ringer溶液、生理盐水、平衡盐溶液、冻干保护剂如甘油或山梨醇等。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质和稳定剂，如白蛋白等。
在使用时，是将安全有效量的本发明所述的融合蛋白/缀合物/偶联物(如抗体偶联药物)或编码它们的多核苷酸，或含有该多核苷酸的表达载体或表达该融合蛋白/缀合物/偶联物的表达系统施用于哺乳动物(如人)，其中该安全有效量通常至少约0.001微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约10毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
对于某一对象的精确有效量取决于该对象的体型和健康状况、病症的性质和程度、以及选择给予的治疗剂和/或治疗剂的组合。对于某给定的状况而言，可以用常规实验来确定该有效量，临床医师是能够判断出来的。
本发明还提供了一种药盒或试剂盒，其中包括：本发明所述的融合蛋白/缀合物/偶联物(如抗体偶联药物)或编码它们的多核苷酸，或含有该多核苷酸的表达载体或表达该融合蛋白/缀合物/偶联物的表达系统；或所述的药物组合物。
为了便于临床应用，本发明的药物组合物可以包含在注射用给药器(如注射用针)中，所述的注射用给药器中，可以包含一次给药量的所述的药物组合物。所述的注射用给药器可以被包含在药盒中，以方便储存、使用。
本发明所述的药盒或试剂盒中，还可包括使用说明书，以利于本领域技术人员按照正确的方式使用。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第3版，科学出版社中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1、重链抗体偶联药物的制备
为了得到重链抗体偶联药物，选取2种不同重链抗体的可变区编码基因(VHH1和VHH2的编码基因)与人IgG1的Fc的编码基因连在一起，将连接后的基因构建到pCGS3(Merck)表达载体的多克隆位点中，再将构建好的质粒转染到ExpiCHO细胞中表达，通过Protein A纯化获得重链抗体，分别命名为抗体1和抗体2。其中人IgG1的Fc的氨基酸序列如下(SEQ ID NO: 1)：
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
2种不同的重链抗体可变区氨基酸序列如下：
VHH1(SEQ ID NO: 2)：
mgwslillflvavatrvhsQVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGITFPVNAYGWYRQAPGKQRDLVAIISAGGTTNYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCYLQRRIGMLRDYWGQGTQVTVSS
VHH2(SEQ ID NO: 3)：
mgwslillflvavatrvhsevqlvesggglvkpggslrlscaasgstssinamawyrqapgkqrefvagvtssgsivrenyafyvkgrftisrdnaknslylqmnslraedtavyycnaippystwgqgtqvtvss
通过SDS-PAGE检测蛋白的纯度。在非还原的状态下，分子量大约为80 kDa，如图1所示，在非还原状态下，抗体1和抗体2出现了一条分子量大约为80 kDa的条带，说明重链抗体可变区与人IgG1的Fc连接后，不产生聚体且抗体纯度高。
将抗体1和抗体2分别与TCEP(Sigma)孵育，打开两条重链之间的二硫键，然后加入maleimide-GGFG-DXd(MedChemExpress)进行偶联，最后用脱盐柱进行纯化，去除多余的小分子药物。通过疏水相互作用色谱以及LC-MS分析，偶联药物抗体1和抗体2与小分子比例均为1:4。
实施例2、突变对聚体形成的影响
由于实施例1中的重链抗体偶联小分子药物时最多偶联4个小分子，如能进行改造以负载更多小分子，将更为有利。本发明人进行了深入的序列分析以及实验研究，结果显示，对IgG1部分序列(第1-10位)进行突变，可以达到增加二硫键的目的。相应的突变位点及突变方案如表1。
表 1
突变后的序列为ERKCCVECPPCP(SEQ ID NO: 6)。也即，分别将VHH1和VHH2两个不同重链抗体的可变区基因与突变后的IgG1 Fc的编码基因连在一起。
具体做法是，先将人IgG1的Fc序列相应位置编码基因替换为突变后的编码基因，然后将2个不同重链抗体可变区VHH1或VHH2编码基因连接到该IgG1的Fc的基因5’端，将连接后的基因构建到pCGS3(Merck)表达载体的多克隆位点中，再将构建好的质粒转染到ExpiCHO细胞中表达，通过Protein A纯化获得重链抗体，VHH1或VHH2分别连接突变后Fc的抗体分别命名为抗体3和抗体4。通过SDS-PAGE检测蛋白的纯度。
如图2所示，2个抗体在非还原的状态下，除了在目标分子量对应处有一条条带之外，均还有分子量更大的条带，尤其是两倍于目标分子量对应处有一条很宽的条带。说明将人IgG1的Fc进行相应突变后，表达的重链抗体出现了大量的聚体，尤其是二聚体比较多，而且在两个不同的重链抗体中都出现了聚体，说明这是一个普遍存在的现象。结果提示，这可能是由于突变靶区域存在链间二硫键，在重链抗体表达过程中容易发生错配，从而造成聚体的产生。因此，本发明人决定进行进一步改造。
主要是对表1中突变后的序列的第4位、第5位、第8位和第11位其中一个半胱氨酸残基(C)突变成其它氨基酸残基，减少一对二硫键的形成。本发明人将所述第4位、第5位、第8位和第11位的半胱氨酸残基(C)进行突变，跟半胱氨酸残基的侧链大小相似的氨基酸残基，这里以突变为丝氨酸残基(S)为例，如表2。
将抗体3的IgG1相应位置(对应表1所示位置)序列突变为如表2所示，再将构建好的质粒转染到ExpiCHO细胞中表达，通过Protein A纯化获得突变体1、突变体2、突变体3和突变体4。
在非还原的状态下，经过突变的重链抗体分子量大约为80 kDa，如图3所示，在非还原状态下，突变体1、突变体2、突变体3和突变体4，聚体均显著减少，特别是第4位和第5位突变后几乎没有聚体。
通过分子排阻色谱分析，结果如表2，进一步说明第4位、第5位、第8位和第10位的半胱氨酸残基所在位置的改变可以显著减少聚体的形成，尤其是第4位和第5位的半胱氨酸残基改变显著降低聚体的形成。
表 2
分析表达产量，结果显示抗体1、抗体2和突变体1-4的表达量均在120～150 μg/mL的范围之间，说明所述突变不会影响重链抗体的表达量。
实施例3、重链抗体突变区域插入不同数量氨基酸对聚体形成的影响
由实施例2中的突变体1、突变体2、突变体3和突变体4可知，序列突变后的重链抗体不仅显著降低聚体的产生，也可以将重链抗体链间二硫键的数目从2对提高的3对，因此偶联小分子的数量可以由4个提高至6个。
为了进一步增加链间二硫键，本发明人深入研究试验后发现，采取了另外一种改造方法是有效的，即在前面所述的突变位置中第4位和第5位的半胱氨酸残基中间插入不同数量的氨基酸残基。为了验证插入不同数量氨基酸残基的效果，本发明人分别插入1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12和13个氨基酸残基，这里以插入丙氨酸残基(A)为例，如表3。
将以上13种不同的突变体，分别连接到VHH1编码基因的C端，表达纯化获得突变体5～17。
SDS-PAGE结果如图4和表3所示，在第4位和第5位的半胱氨酸残基中间插入不同个数的丙氨酸残基(A)后，均可以减少聚体的形成，其中插入2、4、5、6或7个丙氨基酸残基(A)完全去除聚体的产生。说明只要在第4位和第5位的半胱氨酸残基中间插入2、4、5、6或7个氨基酸残基，就可以极大地减少重链抗体聚体的形成。
表 3
为了研究在第4位和第5位的半胱氨酸残基前面和后面插入氨基酸残基是否也可以减少聚体的形成，分别在第4位和第5位的半胱氨酸残基前面或后面插入2个氨基酸残基，这里以插入2个丙氨酸残基(A)为例，如表4。
将带有表4中不同的突变形式的IgG Fc编码基因，分别连接到VHH1编码基因的3’端，将连接后的基因构建到pCGS3(Merck)表达载体上，再将构建好的质粒转染到ExpiCHO细胞中表达，通过Protein A纯化获得突变体18和突变体19。
结果如图5所示，相比抗体3，在第4位和第5位的半胱氨酸残基前、中、后插入丙氨基酸残基(A)，突变体6、突变体18和突变体19均可以减少聚体的形成，通过分子排阻色谱分析，结果如表4，在第4位和第5位的半胱氨酸残基中间插入2个氨基酸对降低聚体的形成最为明显。
表 4
上述结果说明，说明只要在第4位和第5位的半胱氨酸残基前、中、后插入氨基酸均可以显著地减少重链抗体聚体的形成，但在第4位和第5位的半胱氨酸残基中间插入氨基酸残基的效果最好。
实施例4、突变靶区域插入不同属性氨基酸对抗体偶联药物的影响
基于抗体3和抗体4，在第4位和第5位的半胱氨酸残基中间插入不同属性的氨基酸残基，分别是非极性氨基酸，这里以插入2个丙氨酸残基(A)为例；极性不带电荷氨基酸，这里以插入2个丝氨酸残基(S)为例；碱性氨基酸，这里以插入2个赖氨酸残基(K)为例；酸性氨基酸，这里以插入2个谷氨酸残基(E)和2个天冬氨酸残基(D)为例，如表5。将不同突变体表达纯化，如图6所示，在第4位和第5位的半胱氨酸残基中间插入不同属性的氨基酸残基，相比抗体3和抗体4，突变体均可以显著减少聚体的形成；通过分子排阻色谱分析，如表5所示，突变体6、突变体20～28几乎没有聚体产生。
表 5
将上述不同突变的重链抗体与TCEP(Sigma)孵育，打开链间的二硫键，然后加入maleimide-GGFG-DXd(MedChemExpress)进行偶联，最后用脱盐柱进行纯化，去除多余的小分子药物，将得到的抗体偶联药物命名为抗体3-DXd、突变体6-DXd、突变体20-DXd、突变体21-DXd、突变体22-DXd、突变体23-DXd、抗体4-DXd、突变体24-DXd、突变体25-DXd、突变体26-DXd、突变体27-DXd和突变体28-DXd。
结果显示，抗体3-DXd和抗体4-DXd在制备过程中，出现了大量沉淀，发明人分析显示这是由于制备过程中二硫键错配以及蛋白结构不稳定导致的。突变体-DXd在制备过程中，几乎没有出现沉淀，说明制备过程中二硫键错配的概率很小，蛋白的结构相比抗体3-DXd和抗体4-DXd也更稳定。
通过疏水相互作用色谱和LC-MS分析，得到的抗体偶联药物的DAR值为8。
通过分子排阻色谱分析，结果如图7所示，突变体6-DXd、突变体20-DXd、突变体21-DXd、突变体24-DXd、突变体25-DXd和突变体26-DXd偶联后峰形展宽、对称性差，说明突变体6、突变体20、突变体21、突变体24、突变体25和突变体26与小分子药物偶联之后，结构变得松散；突变体22-DXd、突变体23-DXd、突变体27-DXd和突变体28-DXd偶联后峰形与偶联前几乎一致，说明突变体22，突变体23，突变体27和突变体28与小分子药物偶联后得到的抗体偶联药物结构没有发生明显变化。
通过以上实验说明，在第4位和第5位的半胱氨酸残基中间插入酸性氨基酸天冬氨酸(D)或谷氨酸(E)，不仅可以显著减少重链抗体聚体的形成，而且制备得到重链抗体偶联药物，能够保持其结构的稳定。
实施例5、突变靶区域插入不同个数氨基酸对抗体稳定性的影响
通过实施例4可知，在第4位和第5位的半胱氨酸残基中间插入酸性氨基酸残基天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)，不仅可以减少重链抗体的聚体，而且利于制备抗体偶联药物。进一步考察在第4位和第5位的半胱氨酸残基中间插入更多数量的天冬氨酸(D)或者谷氨酸(E)，是否对抗体的稳定性有影响。参考实施例3，这里以在抗体3的相应区域分别插入2、4、5、6和7个氨基酸残基天冬氨酸(D)或谷氨酸(E)为例，如表6。
表 6
将表6中不同突变体表达纯化，分子排阻色谱分析结果如表6所示，带有突变体的重链抗体均没有聚体形成。再利用动态光散射(Dynamic Light Scattering，DLS)的方法来检测这10个重链抗体的热稳定性。DLS(wyatt)仪器是检测抗体从25oC加热到85oC时的光散射，从而得到抗体的聚合温度Tagg的值。
如表6所示，随着插入天冬氨酸(D)或谷氨酸(E)插入个数的增加，重链抗体的聚合温度Tagg的值逐渐降低，所以在第4位和第5位的半胱氨酸残基中间，随着插入酸性氨基酸天冬氨酸(D)或谷氨酸(E)数目的增加，重链抗体的稳定性会变差，插入2个酸性氨基酸天冬氨酸(D)或谷氨酸(E)时，稳定性最好。
实施例6、将人IgG2或IgG4 Fc突变后用于构建重链抗体
为了考察所述突变改造是否能同样应用于人IgG2 Fc或IgG4 Fc，不仅不影响抗体的产生而且能提高抗体偶联小分子的数量。将改造好的突变区域(以插入2个谷氨酸残基(E)或2个天冬氨酸残基(D)为例)替换至IgG2和IgG4 的Fc的相应区域，将得到的重链抗体分别命名为突变体37、突变体38、突变体39和突变体40，如表7。
其中，人IgG2的Fc氨基酸序列如下(SEQ ID NO: 4)：
ERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
其中，人IgG4的Fc氨基酸序列如下(SEQ ID NO: 5)：
ERKCCVECPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
表 7
将VHH1分别与带有表7中改造的人IgG2或IgG4 Fc构建为重链抗体，经过表达纯化获得突变体37、突变体38、突变体39和突变体40，如图8的SDS-PAGE、表7的分子排阻色谱分析所示，改造后的人IgG2或IgG4 Fc与抗体连接后，得到的突变体几乎不产生聚体。
将突变体37、突变体38、突变体39和突变体40制备成抗体偶联药物，参考实施例4，分别得到突变体37-DXd、突变体38-DXd、突变体39-DXd和突变体40-DXd。
通过疏水相互作用色谱和LC-MS分析，其中突变体37-DXd、突变体38-DXd、突变体39-DXd和突变体40-DXd的DAR值为8。
进行分子排阻色谱分析，结果如图9所示，突变体37-DXd、突变体38-DXd、突变体39-DXd和突变体40-DXd的色谱峰形正常，说明将人IgG2或IgG4改造后，制备得到的重链抗体不仅不产生聚体，而且同样可以提高抗体偶联小分子的数量。
实施例7、突变后的重链抗体对细胞结合能力的影响
接下来本发明人验证突变后的重链抗体在细胞结合能力上，是否与野生型的Fc有差异。
因为VHH1能与人卵巢癌细胞OVCAR-3相结合，采用流式细胞术，将抗体1、突变体22、突变体23、突变体37、突变体38、突变体39、突变体40、抗体1-DXd、突变体22-DXd、突变体23-DXd、突变体37-DXd、突变体38-DXd、突变体39-DXd、突变体40-DXd与人卵巢癌细胞OVCAR-3先孵育，然后洗掉不结合的抗体，再加入带有PE标签的抗人Fc抗体的二抗，孵育结束后，洗掉不结合的二抗，用流式细胞仪检测。如图10所示，VHH1与人IgG1、IgG2和IgG4的Fc的突变体构成的重链抗体与OVCAR-3细胞的结合能力与野生型的Fc构建的重链抗体相同，而且相对于偶联4个小分子药物的VHH1-IgG1-DXd，在偶联8个小分子药物后也不影响对OVCAR-3细胞的结合能力，说明突变后不会影响重链抗体与抗原的亲和力。
实施例8、突变改造后制备的重链抗体制备抗体偶联药物及其药效
将OVCAR-3细胞株按5000个每孔接种到96孔细胞板中，37oC培养过夜。将抗体1-DXd、突变体22-DXd、突变体23-DXd、突变体37-DXd、突变体38-DXd、突变体39-DXd和突变体40-DXd进行梯度稀释，加入到含有OVCAR-3细胞的96孔细胞板中，37oC培养5天。用CellTiter-Glo(Promega)检测细胞活率，从而得到抗体偶联药物对细胞的杀伤效果。
结果如图11所示，相比偶联4个小分子药物的抗体1-DXd，突变体22-DXd、突变体23-DXd、突变体37-DXd、突变体38-DXd、突变体39-DXd和突变体40-DXd对OVCAR-3细胞造成显著的杀伤，按照DXd的浓度换算，其IC50能提高7～20倍，说明改造后构成的重链抗体的抗体偶联药物相比利用野生型人IgG1的Fc构建的重链抗体的抗体偶联药物，对肿瘤细胞的杀伤显著更有效。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。同时，在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。

Claims (22)

1. 一种增加抗原结合片段-人IgG Fc融合蛋白的功能性分子负载量且减少表达后聚体产生的方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)提供抗原结合片段-人IgG Fc融合蛋白，所述人IgG Fc为基于人IgG1 Fc、人IgG2Fc或人IgG4 Fc改造的蛋白，所述改造针对N端序列，所述人IgG Fc选自：
(a) SEQ ID NO: 1所示氨基酸的蛋白，将其N端10个氨基酸残基替换为SEQ ID NO: 6所示的氨基酸残基，且将SEQ ID NO: 6突变为SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 35、SEQID NO: 36、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 8或SEQID NO: 7；
(b) SEQ ID NO: 4所示氨基酸的蛋白，将其N端12个氨基酸残基替换为SEQ ID NO: 6所示的氨基酸残基，且将SEQ ID NO: 6突变为SEQ ID NO: 28或SEQ ID NO: 29；
(c) SEQ ID NO: 5所示氨基酸的蛋白，将其N端12个氨基酸残基替换为SEQ ID NO: 6所示的氨基酸残基，且将SEQ ID NO: 6突变为SEQ ID NO: 28或SEQ ID NO: 29；
(d) SEQ ID NO: 1所示氨基酸的蛋白，将其N端10个氨基酸残基替换为SEQ ID NO: 6所示的氨基酸残基，且对SEQ ID NO: 6序列的第4或第5位任一C进行突变，突变为残基S。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：(2)在所述的抗原结合片段-人IgG Fc融合蛋白上连接功能性分子；所述功能性分子的负载量为6-8个。
3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述功能性分子包括：细胞毒素，放射性同位素，生物活性蛋白质，靶向肿瘤表面标志物的分子，抑制肿瘤的分子，靶向免疫细胞的表面标志物的分子或可检测标记物，基于嵌合抗原受体技术的胞外铰链区、跨膜区及胞内信号区，或其组合。
4. 如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述靶向肿瘤表面标志物的分子是结合肿瘤表面标志物的抗体或配体；或
所述的抑制肿瘤的分子是抗肿瘤的细胞因子或抗肿瘤的毒素；或
所述的可检测标记物包括：荧光标记物、显色标记物。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的抗肿瘤的毒素包括：作用于微管蛋白的毒素；作用于DNA的毒素；作用于细胞内代谢、转录、翻译或信号转导的化合物。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的抗肿瘤的细胞因子包括：IL-2、IL-12、IL-15、IFN-beta或TNF-alpha。
7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的结合肿瘤表面标志物的抗体是识别肿瘤抗原的抗体。
8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述作用于微管蛋白的毒素为单甲基澳瑞他汀。
9.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述作用于微管蛋白的毒素为美登木素生物碱。
10.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述作用于DNA的毒素为duocarmycin，calicheamicin，pyrrolobenzodiazepines，SN-38或DXd。
11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，
所述的抗原结合片段包括：重链抗体，单链抗体，单域抗体，BiTE抗体，DART抗体，Fv抗体，Fd抗体中能与抗原结合的多肽；或所述的抗原结合片段为抗体的重链或轻链的可变区，或两者的组合。
12. 一种经改造的人IgG Fc变体，其为基于人IgG1 Fc、人IgG2 Fc或人IgG4 Fc改造的蛋白，所述改造针对N端序列，选自：
(a) SEQ ID NO: 1所示氨基酸的蛋白，将其N端10个氨基酸残基替换为SEQ ID NO: 6所示的氨基酸残基，且将SEQ ID NO: 6突变为SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 35、SEQID NO: 36、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 8或SEQID NO: 7；
(b) SEQ ID NO: 4所示氨基酸的蛋白，将其N端12个氨基酸残基替换为SEQ ID NO: 6所示的氨基酸残基，且将SEQ ID NO: 6突变为SEQ ID NO: 28或SEQ ID NO: 29；
(c) SEQ ID NO: 5所示氨基酸的蛋白，将其N端12个氨基酸残基替换为SEQ ID NO: 6所示的氨基酸残基，且将SEQ ID NO: 6突变为SEQ ID NO: 28或SEQ ID NO: 29；
(d) SEQ ID NO: 1所示氨基酸的蛋白，将其N端10个氨基酸残基替换为SEQ ID NO: 6所示的氨基酸残基，且对SEQ ID NO: 6序列的第4或第5位任一C进行突变，突变为残基S。
13. 权利要求12所述的经改造的人IgG Fc变体的用途，用于制备抗原结合片段-人IgGFc融合蛋白；所述的抗原结合片段-人IgG Fc融合蛋白上连接功能性分子时，功能性分子负载量为6-8个。
14. 一种融合蛋白，其为抗原结合片段-人IgG Fc融合蛋白；其中所述人IgG Fc为权利要求12所述的人IgG Fc变体。
15. 一种多核苷酸，其编码权利要求12所述的人IgG Fc变体，或编码权利要求14所述的融合蛋白。
16.一种表达构建体，其包含权利要求15所述的多核苷酸。
17.一种表达系统，其包含权利要求16所述的表达构建体或基因组中整合有权利要求15所述的多核苷酸。
18. 一种制备权利要求12所述的人IgG Fc变体，或权利要求14所述的融合蛋白的方法，包括：在适合表达的条件下，利用权利要求17所述的表达系统进行表达，从而获得所述的人IgG Fc变体或融合蛋白。
19.一种缀合物，其包括：权利要求14所述的融合蛋白；以及与所述融合蛋白连接的功能性分子；所述功能性分子的负载量为6-8个。
20.如权利要求19所述的缀合物，其特征在于，所述功能性分子包括：细胞毒素，放射性同位素，生物活性蛋白质，靶向肿瘤表面标志物的分子，抑制肿瘤的分子，靶向免疫细胞的表面标志物的分子或可检测标记物，基于嵌合抗原受体技术的胞外铰链区、跨膜区及胞内信号区，或其组合；所述的抑制肿瘤的分子是抗肿瘤的细胞因子或抗肿瘤的毒素。
21.一种药物组合物，其特征在于，其包括：权利要求14所述的融合蛋白，或权利要求19-20任一所述的缀合物。
22.一种药盒，其特征在于，其包括：权利要求14所述的融合蛋白，或权利要求19-20任一所述的缀合物。
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