CN112955179A - 拮抗性抗肿瘤坏死因子受体超家族多肽 - Google Patents

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Abstract

描述了拮抗性TNFR2多肽如抗体及其抗原结合片段，以及这些多肽用于抑制调节性T细胞(T‑reg)和/或骨髓源性抑制细胞(MDSC)的增殖、扩增T效应细胞群或功能以及减少肿瘤细胞如表达TNFR2抗原的肿瘤细胞的增殖或者直接杀伤所述肿瘤细胞的用途。所述多肽如抗体及其抗原结合片段是TNFR2拮抗剂，如显性TNFR2拮抗剂。所述多肽可用于遏制肿瘤反应性T淋巴细胞的T‑reg介导的或MDSC介导的失活，扩增肿瘤反应性细胞毒性T细胞群，和/或直接杀伤TNFR2+肿瘤细胞。本文所述的拮抗性TNFR2多肽可用于治疗多种癌症和感染性疾病。

Description

拮抗性抗肿瘤坏死因子受体超家族多肽
序列表
本申请包含以ASCII格式以电子方式提交，并据此以引用的方式将其整体并入本文的的序列表。所述ASCII副本创建于2019年8月20日，命名为00786-0083WO2_Sequence_Listing_08.20.19_ST25，大小为193,232字节。
发明背景
使用天然存在的和遗传工程化的T淋巴细胞是用于改善各种人病理的突出范式。例如，虽然用于治疗癌症的传统治疗平台包括手术切除肿瘤块、放射疗法和施用化学治疗剂(Shewach,Chem.Rev.,109:2859-2861,2009)，但是过去十年见证了过继性免疫疗法应用于癌症治疗方案中的再现。随着嵌合抗原受体(CAR-T)疗法的出现，已经出现了向患者输注自体和同种异体肿瘤反应性T细胞的新方法(June,J.Clin.Invest.,117:1466-1476,2007)。CAR-T疗法利用适应性免疫响应的资源以促进癌细胞细胞毒性并根除肿瘤物质。过继性免疫疗法中的常见基序是使用T细胞，所述T细胞表现出在展示不同肿瘤抗原的细胞中选择性地加强细胞毒性的能力。这种技术的实例包括施用肿瘤浸润性淋巴细胞(Dudley等人,J.Immunother.,26:332-342,2003)，以及已经遗传重新工程化以便表现出与肿瘤特异性抗原的反应性的自体或同种异体T细胞(Yee等人,PNAS.,99:16168-16173,2002)。
尽管基于T淋巴细胞的癌症免疫疗法具有前景，但这种治疗平台的开发一直受免疫系统遏制自身细胞上固定的免疫攻击的自然倾向阻碍。癌细胞表达I类主要组织相容性复合物(MHC)蛋白，所述蛋白将这些细胞与外来细胞区相隔来。为了防止细胞自相残杀，已经进化出调节性T细胞(T-reg细胞)，所述调控T细胞遏制表现出针对“自身”MHC抗原的反应性的T细胞的活性。T-reg细胞代表异质类T细胞，所述T细胞可基于其独特的表面蛋白呈递来区分。最容易理解的T-reg细胞群体包括CD4+、CD25+、FoxP3+T-reg细胞和CD17+T-reg细胞。这些细胞遏制自身反应性T细胞的确切机制是正在进行的研究的主题，但是已经显示某些类别的T-reg细胞抑制靶T细胞中诱导增殖的细胞因子IL-2的产生，并且可另外地凭借CD25(IL-2受体的亚结构域)对IL-2的亲和力螯合来自自身反应细胞的IL-2(Josefowicz等人,Ann.Rev.Immun.,30:531-564,2012)。
虽然T-reg细胞在维持外周耐受中起重要作用，但构成这些细胞调节自身反应性T细胞活性的能力的基础的相同生物化学特征也用于通过遏制肿瘤反应性T淋巴细胞的活性来破坏过继性免疫疗法和天然免疫响应。T-reg细胞活性的化学调节剂的开发已经成为许多药理学研究的主题，因为获得能够抑制T-reg介导的T细胞遏制的剂可极大地提高过继性癌症免疫疗法的范围和功效，以及提高免疫系统根除引起感染性疾病的病原生物体的能力。
需要用于治疗细胞增殖症状(如癌症)和多种感染性疾病的改进疗法。
发明内容
本文描述了拮抗性肿瘤坏死因子受体超家族多肽，如单链多肽、抗体、其抗原结合片段和构建体。例如，特征是拮抗性肿瘤坏死因子受体2(TNFR2)结合多肽，如单链多肽、抗体、其抗原结合片段和构建体。人TNFR2包含四个富含半胱氨酸的结构域(CRD)：CRD1(SEQID NO:7的氨基酸残基48-76)、CRD2(SEQ ID NO:7的氨基酸残基78-120)、CRD3(SEQ ID NO:7的氨基酸残基121-162)和CRD4(SEQ ID NO:7的氨基酸残基162-202)。本文所述的拮抗性TNFR2多肽包括结合TNFR2的CRD3内的一个或多个表位和/或TNFR2的CRD4内的一个或多个表位的多肽，如仅在CRD3的一个或多个表位和/或CRD4的一个或多个表位内结合TNFR2而不在CRD1和/或CRD2内结合TNFR2的多肽。
本文所述的拮抗性TNFR2多肽包括在上述表位中的一个或多个表位处特异性结合TNFR2的IgG2同种型抗体及其抗原结合片段。本公开部分基于以下令人惊讶的发现，即当抗体及其抗原结合片段相对于其它抗体同种型呈IgG2同种型的形式时，这些分子表现出明显更优的TNFR2拮抗剂性质。本文所述的拮抗性TNFR2多肽还包括具有至少两个TNFR2结合位点(例如，抗原结合位点，其中TNFR2为“抗原”)的多肽，其中所述结合位点在空间上彼此相隔约
Figure BDA0003027090150000031
或更多，因为目前已经发现，相对于在上述一个或多个表位处特异性结合TNFR2但含有彼此相隔小于约
Figure BDA0003027090150000032
的TNFR2结合位点(例如，抗原结合位点)的多肽(如含有彼此相隔约
Figure BDA0003027090150000033
的抗原结合位点的IgG1抗体及其抗原结合片段，以及含有彼此相隔约
Figure BDA0003027090150000034
的抗原结合位点的IgG3及其抗原结合片段)，此类多肽表现出出乎意料的更好的TNFR2拮抗剂作用。
特征还有采用单个二硫键结合的同种型的抗TNFR2多肽和含有其的药物组合物。例如，本公开的药物组合物包括含有拮抗剂TNFR2结合多肽的那些，其中，例如，药物组合物中的10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％、99.99％或更多的多肽以单个二硫键结合的同种型存在。与采用其它人IgG2同种型如IgG2-B、IgG2-A/B1和IgG2-A/B2的TNFR2结合多肽相比，采用人IgG2-A同种型的拮抗性TNFR2结合多肽表现出显著更好的TNFR2拮抗作用。因此，可将采用单个二硫键结合的同种型的TNFR2多肽制备为药物组合物，并以本文所述的治疗方法施用，以促进强有力的TNFR2拮抗作用。
本公开公开的拮抗性TNFR2多肽表现出一种或多种有益的生物学特性，如抑制调节性T细胞(T-reg细胞)和/或骨髓源性抑制细胞(MDSC)增殖和/或促进所述细胞死亡的能力。拮抗性TNFR2多肽可用于抑制表达TNFR2和癌基因的癌细胞的增殖和/或促进所述细胞死亡。另外，或者可选地，可施用拮抗性TNFR2多肽来促进T效应细胞(如，细胞毒性CD8+T细胞)的相互扩增。例如，这可以例如由于T-reg细胞增殖和活性的减弱或T效应细胞(如细胞毒性CD8+T细胞)的直接扩增而发生。因此，将TNFR2多肽指定为拮抗剂是指它们减弱T-reg细胞、MDSC和/或表达TNFR2的癌细胞的增殖和活性的能力，为了清楚起见，并不表示T效应细胞反应的拮抗作用。本文所述的多肽(例如，单链多肽、抗体、其抗原结合片段及其构建体)可用于治疗多种病状，包括癌症和感染性疾病。
一方面，本公开的特征在于在富含半胱氨酸结构域(CRD)3(CRD3)和/或CRD4内的表位处特异性结合人肿瘤坏死因子受体2(TNFR2)而不在由CRD1内的一个或多个氨基酸确定的表位处特异性结合TNFR2的多肽，如单链多肽、抗体、其抗原结合片段及其构建体，其中所述多肽：
(a)含有人IgG2铰链区，其在IgG2铰链区氨基酸序列的位置232和/或233处缺少半胱氨酸残基；和/或
(b)包含彼此相隔至少约
Figure BDA0003027090150000041
的距离的抗原结合位点。
下表1中描述了表现出前述特征的本公开的示例性拮性抗TNFR2多肽(例如，抗体及其抗原结合片段)。表1提供了由其重链和轻链氨基酸序列限定的各种拮抗性TNFR2抗体及其抗原结合片段的描述。本公开的拮抗性TNFR2抗体及其抗原结合片段包括具有如表1所示的重链和/或轻链的抗体及其抗原结合片段，以及含有与表1中所示的重链和/或轻链具有至少85％序列同一性(例如，至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％序列同一性)的重链和/或轻链的抗体及其抗原结合片段。互补决定区域以粗体显示。
表1.本公开的示例性拮抗性TNFR2抗体
Figure BDA0003027090150000051
Figure BDA0003027090150000061
Figure BDA0003027090150000071
Figure BDA0003027090150000081
Figure BDA0003027090150000091
Figure BDA0003027090150000101
Figure BDA0003027090150000111
Figure BDA0003027090150000121
Figure BDA0003027090150000131
Figure BDA0003027090150000141
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Figure BDA0003027090150000161
Figure BDA0003027090150000171
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Figure BDA0003027090150000191
Figure BDA0003027090150000201
Figure BDA0003027090150000211
例如，在一些实施方案中，本公开的特征是包含重链的拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段，所述重链具有与SEQ ID NO:302的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段包含重链，所述重链具有与SEQ ID NO:302的氨基酸序列具有至少90％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段包含重链，所述重链具有与SEQ ID NO:302的氨基酸序列具有至少95％同一性(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段包含重链，所述重链具有SEQ ID NO:302的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本公开的特征是包含重链的拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段，所述重链具有与SEQ ID NO:303的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段包含重链，所述重链具有与SEQ ID NO:303的氨基酸序列具有至少90％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段包含重链，所述重链具有与SEQ ID NO:303的氨基酸序列具有至少95％同一性(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段包含重链，所述重链具有SEQ ID NO:303的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本公开的特征是包含重链的拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段，所述重链具有与SEQ ID NO:304的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段包含重链，所述重链具有与SEQ ID NO:304的氨基酸序列具有至少90％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段包含重链，所述重链具有与SEQ ID NO:304的氨基酸序列具有至少95％同一性(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段包含重链，所述重链具有SEQ ID NO:304的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本公开的特征是包含重链的拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段，所述重链具有与SEQ ID NO:305的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段包含重链，所述重链具有与SEQ ID NO:305的氨基酸序列具有至少90％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段包含重链，所述重链具有与SEQ ID NO:305的氨基酸序列具有至少95％同一性(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段包含重链，所述重链具有SEQ ID NO:305的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本公开的特征是包含重链的拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段，所述重链具有与SEQ ID NO:306的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段包含重链，所述重链具有与SEQ ID NO:306的氨基酸序列具有至少90％同一性(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段包含重链，所述重链具有与SEQ ID NO:306的氨基酸序列具有至少95％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段包含重链，所述重链具有SEQ ID NO:306的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本公开的特征是包含轻链的拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段，所述轻链具有与SEQ ID NO:297的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段包含轻链，所述轻链具有与SEQ ID NO:297的氨基酸序列具有至少90％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段包含轻链，所述轻链具有与SEQ ID NO:297的氨基酸序列具有至少95％同一性(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段包含轻链，所述轻链具有SEQ ID NO:297的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本公开的特征是包含轻链的拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段，所述轻链具有与SEQ ID NO:298的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段包含轻链，所述轻链具有与SEQ ID NO:298的氨基酸序列具有至少90％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段包含轻链，所述轻链具有与SEQ ID NO:298的氨基酸序列具有至少95％同一性(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段包含轻链，所述轻链具有SEQ ID NO:298的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本公开的特征是包含轻链的拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段，所述轻链具有与SEQ ID NO:299的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段包含轻链，所述轻链具有与SEQ ID NO:299的氨基酸序列具有至少90％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段包含轻链，所述轻链具有与SEQ ID NO:299的氨基酸序列具有至少95％同一性(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段包含轻链，所述轻链具有SEQ ID NO:299的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本公开的特征是包含轻链的拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段，所述轻链具有与SEQ ID NO:300的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段包含轻链，所述轻链具有与SEQ ID NO:300的氨基酸序列具有至少90％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段包含轻链，所述轻链具有与SEQ ID NO:300的氨基酸序列具有至少95％同一性(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段包含轻链，所述轻链具有SEQ ID NO:300的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本公开的特征是包含轻链的拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段，所述轻链具有与SEQ ID NO:301的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段包含轻链，所述轻链具有与SEQ ID NO:301的氨基酸序列具有至少90％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段包含轻链，所述轻链具有与SEQ ID NO:301的氨基酸序列具有至少95％同一性(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段包含轻链，所述轻链具有SEQ ID NO:301的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本公开的特征是包含重链和轻链的拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段，所述重链具有与SEQ ID NO:302的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列，所述轻链具有与SEQ ID NO:297的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链具有与SEQ ID NO:302的氨基酸序列具有至少90％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列，所述轻链具有与SEQ ID NO:297的氨基酸序列具有至少90％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链具有与SEQ ID NO:302的氨基酸序列具有至少95％同一性(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列，所述轻链具有与SEQ ID NO:297的氨基酸序列具有至少95％同一性(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链具有SEQ ID NO:302的氨基酸序列，所述轻链具有SEQ ID NO:297的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本公开的特征是包含重链和轻链的拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段，所述重链具有与SEQ ID NO:302的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列，所述轻链具有与SEQ ID NO:298的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链具有与SEQ ID NO:302的氨基酸序列具有至少90％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列，所述轻链具有与SEQ ID NO:298的氨基酸序列具有至少90％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链具有与SEQ ID NO:302的氨基酸序列具有至少95％同一性(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列，所述轻链具有与SEQ ID NO:298的氨基酸序列具有至少95％同一性(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链具有与SEQ ID NO:302的氨基酸序列，所述轻链具有SEQ ID NO:298的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本公开的特征是包含重链和轻链的拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段，所述重链具有与SEQ ID NO:302的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列，所述轻链具有与SEQ ID NO:299的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链具有与SEQ ID NO:302的氨基酸序列具有至少90％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列，所述轻链具有与SEQ ID NO:299的氨基酸序列具有至少90％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链具有与SEQ ID NO:302的氨基酸序列具有至少95％同一性(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列，所述轻链具有与SEQ ID NO:299的氨基酸序列具有至少95％同一性(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，其抗原结合片段的拮抗性TNFR2抗体包含具有SEQ ID NO:302的氨基酸序列的重链和具有SEQ IDNO:299的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，本公开的特征是包含重链和轻链的拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段，所述重链具有与SEQ ID NO:302的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列，所述轻链具有与SEQ ID NO:300的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链具有与SEQ ID NO:302的氨基酸序列具有至少90％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列，所述轻链具有与SEQ ID NO:300的氨基酸序列具有至少90％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链具有与SEQ ID NO:302的氨基酸序列具有至少95％同一性(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列，所述轻链具有与SEQ ID NO:300的氨基酸序列具有至少95％同一性(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链具有SEQ ID NO:302的氨基酸序列，所述轻链具有SEQ ID NO:300的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本公开的特征是包含重链和轻链的拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段，所述重链具有与SEQ ID NO:302的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列，所述轻链具有与SEQ ID NO:301的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链具有与SEQ ID NO:302的氨基酸序列具有至少90％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列，所述轻链具有与SEQ ID NO:301的氨基酸序列具有至少90％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链具有与SEQ ID NO:302的氨基酸序列具有至少95％同一性(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列，所述轻链具有与SEQ ID NO:301的氨基酸序列具有至少95％同一性(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链具有SEQ ID NO:302的氨基酸序列，所述轻链具有SEQ ID NO:301的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本公开的特征是包含重链和轻链的拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段，所述重链具有与SEQ ID NO:303的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列，所述轻链具有与SEQ ID NO:297的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链具有与SEQ ID NO:303的氨基酸序列具有至少90％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列，所述轻链具有与SEQ ID NO:297的氨基酸序列具有至少90％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链具有与SEQ ID NO:303的氨基酸序列具有至少95％同一性(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列，所述轻链具有与SEQ ID NO:297的氨基酸序列具有至少95％同一性(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链具有SEQ ID NO:303的氨基酸序列，所述轻链具有SEQ ID NO:297的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本公开的特征是包含重链和轻链的拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段，所述重链具有与SEQ ID NO:303的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列，所述轻链具有与SEQ ID NO:298的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链具有与SEQ ID NO:303的氨基酸序列具有至少90％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列，所述轻链具有与SEQ ID NO:298的氨基酸序列具有至少90％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链具有与SEQ ID NO:303的氨基酸序列具有至少95％同一性(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列，所述轻链具有与SEQ ID NO:298的氨基酸序列具有至少95％同一性(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链具有SEQ ID NO:303的氨基酸序列，所述轻链具有SEQ ID NO:298的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本公开的特征是包含重链和轻链的拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段，所述重链具有与SEQ ID NO:303的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列，所述轻链具有与SEQ ID NO:299的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链具有与SEQ ID NO:303的氨基酸序列具有至少90％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列，所述轻链具有与SEQ ID NO:299的氨基酸序列具有至少90％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链具有与SEQ ID NO:303的氨基酸序列具有至少95％同一性(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列，所述轻链具有与SEQ ID NO:299的氨基酸序列具有至少95％同一性(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链具有SEQ ID NO:303的氨基酸序列，所述轻链具有SEQ ID NO:299的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本公开的特征是包含重链和轻链的拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段，所述重链具有与SEQ ID NO:303的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列，所述轻链具有与SEQ ID NO:300的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链具有与SEQ ID NO:303的氨基酸序列具有至少90％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列，所述轻链具有与SEQ ID NO:300的氨基酸序列具有至少90％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链具有与SEQ ID NO:303的氨基酸序列具有至少95％同一性(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列，所述轻链具有与SEQ ID NO:300的氨基酸序列具有至少95％同一性(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链具有SEQ ID NO:303的氨基酸序列，所述轻链具有SEQ ID NO:300的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本公开的特征是包含重链和轻链的拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段，所述重链具有与SEQ ID NO:303的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列，所述轻链具有与SEQ ID NO:301的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链具有与SEQ ID NO:303的氨基酸序列具有至少90％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列，所述轻链具有与SEQ ID NO:301的氨基酸序列具有至少90％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链具有与SEQ ID NO:303的氨基酸序列具有至少95％同一性(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列，所述轻链具有与SEQ ID NO:301的氨基酸序列具有至少95％同一性(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链具有SEQ ID NO:303的氨基酸序列，所述轻链具有SEQ ID NO:301的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本公开的特征是包含重链和轻链的拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段，所述重链具有与SEQ ID NO:304的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列，所述轻链具有与SEQ ID NO:297的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链具有与SEQ ID NO:304的氨基酸序列具有至少90％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列，所述轻链具有与SEQ ID NO:297的氨基酸序列具有至少90％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链具有与SEQ ID NO:304的氨基酸序列具有至少95％同一性(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列，所述轻链具有与SEQ ID NO:297的氨基酸序列具有至少95％同一性(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链具有SEQ ID NO:304的氨基酸序列，所述轻链具有SEQ ID NO:297的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本公开的特征是包含重链和轻链的拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段，所述重链具有与SEQ ID NO:304的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列，所述轻链具有与SEQ ID NO:298的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链具有与SEQ ID NO:304的氨基酸序列具有至少90％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列，所述轻链具有与SEQ ID NO:298的氨基酸序列具有至少90％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链具有与SEQ ID NO:304的氨基酸序列具有至少95％同一性(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列，所述轻链具有与SEQ ID NO:298的氨基酸序列具有至少95％同一性(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链具有SEQ ID NO:304的氨基酸序列，所述轻链具有SEQ ID NO:298的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本公开的特征是包含重链和轻链的拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段，所述重链具有与SEQ ID NO:304的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列，所述轻链具有与SEQ ID NO:299的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链具有与SEQ ID NO:304的氨基酸序列具有至少90％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列，所述轻链具有与SEQ ID NO:299的氨基酸序列具有至少90％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链具有与SEQ ID NO:304的氨基酸序列具有至少95％同一性(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列，所述轻链具有与SEQ ID NO:299的氨基酸序列具有至少95％同一性(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链具有SEQ ID NO:304的氨基酸序列，所述轻链具有SEQ ID NO:299的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本公开的特征是包含重链和轻链的拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段，所述重链具有与SEQ ID NO:304的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列，所述轻链具有与SEQ ID NO:300的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链具有与SEQ ID NO:304的氨基酸序列具有至少90％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列，所述轻链具有与SEQ ID NO:300的氨基酸序列具有至少90％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链具有与SEQ ID NO:304的氨基酸序列具有至少95％同一性(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列，所述轻链具有与SEQ ID NO:300的氨基酸序列具有至少95％同一性(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链具有SEQ ID NO:304的氨基酸序列，所述轻链具有SEQ ID NO:300的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本公开的特征是包含重链和轻链的拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段，所述重链具有与SEQ ID NO:304的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列，所述轻链具有与SEQ ID NO:301的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链具有与SEQ ID NO:304的氨基酸序列具有至少90％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列，所述轻链具有与SEQ ID NO:301的氨基酸序列具有至少90％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链具有与SEQ ID NO:304的氨基酸序列具有至少95％同一性(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列，所述轻链具有与SEQ ID NO:301的氨基酸序列具有至少95％同一性(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链具有SEQ ID NO:304的氨基酸序列，所述轻链具有SEQ ID NO:301的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本公开的特征是包含重链和轻链的拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段，所述重链具有与SEQ ID NO:305的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列，所述轻链具有与SEQ ID NO:297的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链具有与SEQ ID NO:305的氨基酸序列具有至少90％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列，所述轻链具有与SEQ ID NO:297的氨基酸序列具有至少90％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链具有与SEQ ID NO:305的氨基酸序列具有至少95％同一性(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列，所述轻链具有与SEQ ID NO:297的氨基酸序列具有至少95％同一性(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链具有SEQ ID NO:305的氨基酸序列，所述轻链具有SEQ ID NO:297的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本公开的特征是包含重链和轻链的拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段，所述重链具有与SEQ ID NO:305的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列，所述轻链具有与SEQ ID NO:298的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链具有与SEQ ID NO:305的氨基酸序列具有至少90％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列，所述轻链具有与SEQ ID NO:298的氨基酸序列具有至少90％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链具有与SEQ ID NO:305的氨基酸序列具有至少95％同一性(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列，所述轻链具有与SEQ ID NO:298的氨基酸序列具有至少95％同一性(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链具有SEQ ID NO:305的氨基酸序列，所述轻链具有SEQ ID NO:298的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本公开的特征是包含重链和轻链的拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段，所述重链具有与SEQ ID NO:305的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列，所述轻链具有与SEQ ID NO:299的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链具有与SEQ ID NO:305的氨基酸序列具有至少90％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列，所述轻链具有与SEQ ID NO:299的氨基酸序列具有至少90％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链具有与SEQ ID NO:305的氨基酸序列具有至少95％同一性(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列，所述轻链具有与SEQ ID NO:299的氨基酸序列具有至少95％同一性(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链具有SEQ ID NO:305的氨基酸序列，所述轻链具有SEQ ID NO:299的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本公开的特征是包含重链和轻链的拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段，所述重链具有与SEQ ID NO:305的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列，所述轻链具有与SEQ ID NO:300的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链具有与SEQ ID NO:305的氨基酸序列具有至少90％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列，所述轻链具有与SEQ ID NO:300的氨基酸序列具有至少90％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链具有与SEQ ID NO:305的氨基酸序列具有至少95％同一性(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列，所述轻链具有与SEQ ID NO:300的氨基酸序列具有至少95％同一性(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链具有SEQ ID NO:305的氨基酸序列，所述轻链具有SEQ ID NO:300的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本公开的特征是包含重链和轻链的拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段，所述重链具有与SEQ ID NO:305的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列，所述轻链具有与SEQ ID NO:301的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链具有与SEQ ID NO:305的氨基酸序列具有至少90％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列，所述轻链具有与SEQ ID NO:301的氨基酸序列具有至少90％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链具有与SEQ ID NO:305的氨基酸序列具有至少95％同一性(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列，所述轻链具有与SEQ ID NO:301的氨基酸序列具有至少95％同一性(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链具有SEQ ID NO:305的氨基酸序列，所述轻链具有SEQ ID NO:301的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本公开的特征是包含重链和轻链的拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段，所述重链具有与SEQ ID NO:306的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列，所述轻链具有与SEQ ID NO:297的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链具有与SEQ ID NO:306的氨基酸序列具有至少90％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列，所述轻链具有与SEQ ID NO:297的氨基酸序列具有至少90％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链具有与SEQ ID NO:306的氨基酸序列具有至少95％同一性(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列，所述轻链具有与SEQ ID NO:297的氨基酸序列具有至少95％同一性(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链具有SEQ ID NO:306的氨基酸序列，所述轻链具有SEQ ID NO:297的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本公开的特征是包含重链和轻链的拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段，所述重链具有与SEQ ID NO:306的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列，所述轻链具有与SEQ ID NO:298的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链具有与SEQ ID NO:306的氨基酸序列具有至少90％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列，所述轻链具有与SEQ ID NO:298的氨基酸序列具有至少90％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链具有与SEQ ID NO:306的氨基酸序列具有至少95％同一性(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列，所述轻链具有与SEQ ID NO:298的氨基酸序列具有至少95％同一性(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链具有SEQ ID NO:306的氨基酸序列，所述轻链具有SEQ ID NO:298的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本公开的特征是包含重链和轻链的拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段，所述重链具有与SEQ ID NO:306的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列，所述轻链具有与SEQ ID NO:299的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链具有与SEQ ID NO:306的氨基酸序列具有至少90％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列，所述轻链具有与SEQ ID NO:299的氨基酸序列具有至少90％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链具有与SEQ ID NO:306的氨基酸序列具有至少95％同一性(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列，所述轻链具有与SEQ ID NO:299的氨基酸序列具有至少95％同一性(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链具有SEQ ID NO:306的氨基酸序列，所述轻链具有SEQ ID NO:299的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本公开的特征是包含重链和轻链的拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段，所述重链具有与SEQ ID NO:306的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列，所述轻链具有与SEQ ID NO:300的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链具有与SEQ ID NO:306的氨基酸序列具有至少90％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列，所述轻链具有与SEQ ID NO:300的氨基酸序列具有至少90％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链具有与SEQ ID NO:306的氨基酸序列具有至少95％同一性(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列，所述轻链具有与SEQ ID NO:300的氨基酸序列具有至少95％同一性(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链具有SEQ ID NO:306的氨基酸序列，所述轻链具有SEQ ID NO:300的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本公开的特征是包含重链和轻链的拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段，所述重链具有与SEQ ID NO:306的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列，所述轻链具有与SEQ ID NO:301的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链具有与SEQ ID NO:306的氨基酸序列具有至少90％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列，所述轻链具有与SEQ ID NO:301的氨基酸序列具有至少90％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链具有与SEQ ID NO:306的氨基酸序列具有至少95％同一性(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列，所述轻链具有与SEQ ID NO:301的氨基酸序列具有至少95％同一性(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链具有SEQ ID NO:306的氨基酸序列，所述轻链具有SEQ ID NO:301的氨基酸序列。
在本公开的一些实施方案中，多肽如单链多肽、抗体、其抗原结合片段及其构建体包含在IgG2铰链区氨基酸序列的位置232和/或位置233处缺少半胱氨酸残基的人IgG2铰链区。例如，所述多肽(例如，单链多肽、抗体、其抗原结合片段或其构建体)可包含人IgG2铰链区，所述人IgG2铰链区在IgG2铰链区氨基酸序列的位置232和/或233处具有除半胱氨酸外的氨基酸，如丝氨酸残基。
所述多肽(例如，单链多肽、抗体、其抗原结合片段或其构建体)可包含例如在半胱氨酸残基232和233之一或两者处具有氨基酸取代或缺失的人IgG2铰链区。氨基酸取代可以是保守氨基酸取代，如C232S和/或C233S氨基酸取代。
在一些实施方案中，IgG2铰链区具有与SEQ ID NO:291的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列，例如，条件是IgG2铰链区在IgG2铰链氨基酸序列的位置232和233之一或两者处包含丝氨基酸残基。IgG2铰链区可具有例如与SEQ ID NO:291的氨基酸序列具有至少90％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列，例如，条件是IgG2铰链区在IgG2铰链氨基酸序列的位置232和233处包含丝氨酸残基。在一些实施方案中，IgG2铰链区具有与SEQ ID NO:291的氨基酸序列具有至少95％同一性(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列，例如，条件是IgG2铰链区在IgG2铰链氨基酸序列的位置232和233处包含丝氨酸残基。
所述多肽(例如，单链多肽、抗体、其抗原结合片段或其构建体)可包含抗原结合位点，所述抗原结合位点彼此相隔至少约
Figure BDA0003027090150000461
(例如，约
Figure BDA0003027090150000462
至约
Figure BDA0003027090150000463
的距离，如约
Figure BDA0003027090150000464
Figure BDA0003027090150000465
Figure BDA0003027090150000466
Figure BDA0003027090150000467
或
Figure BDA0003027090150000468
)。在一些实施方案中，抗原结合位点彼此相隔至少约
Figure BDA0003027090150000469
的距离(例如，约
Figure BDA00030270901500004610
至约
Figure BDA00030270901500004611
Figure BDA00030270901500004612
的距离，如约
Figure BDA00030270901500004613
Figure BDA00030270901500004614
Figure BDA00030270901500004615
Figure BDA00030270901500004616
或
Figure BDA00030270901500004617
的距离)。在一些实施方案中，抗原结合位点彼此相隔至少约
Figure BDA00030270901500004618
的距离(例如，约
Figure BDA00030270901500004619
至约
Figure BDA00030270901500004620
的距离，如约
Figure BDA00030270901500004621
Figure BDA00030270901500004622
Figure BDA0003027090150000471
Figure BDA0003027090150000472
或
Figure BDA0003027090150000473
的距离)。在一些实施方案中，抗原结合位点彼此相隔至少约
Figure BDA0003027090150000474
的距离(例如，约
Figure BDA0003027090150000475
至约
Figure BDA0003027090150000476
的距离，如约
Figure BDA0003027090150000477
Figure BDA0003027090150000478
或
Figure BDA0003027090150000479
的距离)。
例如，所述多肽(例如，单链多肽、抗体、其抗原结合片段或其构建体)可包含抗原结合位点，所述抗原结合位点彼此相隔约
Figure BDA00030270901500004710
至约
Figure BDA00030270901500004711
的距离，如约
Figure BDA00030270901500004712
Figure BDA00030270901500004713
Figure BDA00030270901500004714
或
Figure BDA00030270901500004715
的距离。在一些实施方案中，抗原结合彼此相隔约
Figure BDA00030270901500004716
至约
Figure BDA00030270901500004717
的距离，如约
Figure BDA00030270901500004718
Figure BDA00030270901500004719
或
Figure BDA00030270901500004720
的距离。在一些实施方案中，抗原结合彼此相隔约
Figure BDA00030270901500004728
至约
Figure BDA00030270901500004721
的距离，如约
Figure BDA00030270901500004722
或
Figure BDA00030270901500004723
的距离。在一些实施方案中，抗原结合彼此相隔约
Figure BDA00030270901500004724
至约
Figure BDA00030270901500004725
的距离，如约
Figure BDA00030270901500004726
或
Figure BDA00030270901500004727
的距离。
所述多肽(例如，单链多肽、抗体、其抗原结合片段或其构建体)可包含互补决定区(CDR)重链1(CDR1)，所述互补决定区重链1具有氨基酸序列GJTF(J)2Y(SEQ ID NO:276)或GJTF(J)2YJ(SEQ ID NO:277)，其中每个J独立地为天然存在的氨基酸。在一些实施方案中，所述多肽(例如，单链多肽、抗体、其抗原结合片段或其构建体)还包含：
(a)CDR-H2，其具有氨基酸序列(J)3GSJ或(J)5GSJ；
(b)CDR-H3，其具有氨基酸序列JRJDGJSJY(J)2FDJ(SEQ ID NO:278)或JRJDGSY(J)2FD(J)3(SEQ ID NO:279)；
(c)CDR-L1，其具有氨基酸序列(J)9Y或(J)5Y；
(d)CDR-L2，其具有氨基酸序列(J)6S或(J)2S；和/或
(e)CDR-L3，其具有氨基酸序列(J)5Y(J)2T或(J)3Y(J)4T，
其中每个J独立地为天然存在的氨基酸。
所述多肽(例如，单链多肽、抗体、其抗原结合片段或其构建体)可包含具有氨基酸序列Z4FZ3Z5SSZ5或Z4YZ3Z5TDZ5X的CDR-H1；
其中每个Z3独立地为在生理pH下包括极性、不带电荷的侧链的氨基酸；
每个Z4独立地为甘氨酸或丙氨酸；
每个Z5独立地为包含疏水侧链的氨基酸；以及
每个X独立地为亮氨酸或异亮氨酸。
在一些实施方案中，所述多肽(例如，单链多肽、抗体、其抗原结合片段或其构建体)还包含：
(a)CDR-H2，其具有氨基酸序列SSGZ4Z3Y(SEQ ID NO:263)或VDPEYZ4Z3T(SEQ IDNO:264)；
(b)CDR-H3，其具有氨基酸序列QZ1VZ2Z4YZ3SZ5WYZ5Z2Z5(SEQ ID NO:265)或AZ1DZ2Z4Z3Z5SPZ5Z2Z5WG(SEQ ID NO:266)；
(c)CDR-L1，其具有氨基酸序列SASSSVYYMZ5(SEQ ID NO:267)或QNINKZ5(SEQ IDNO:268)；
(d)CDR-L2，其具有氨基酸序列STSNLAZ3(SEQ ID NO:269)、TYZ3或YTZ3；和/或
(e)CDR-L3，其具有氨基酸序列为QQRRNZ5PYZ3(SEQ ID NO:270)或CLQZ5VNLXZ3(SEQ ID NO:271)；
其中每个Z1独立地为在生理pH下包括阳离子侧链的氨基酸；
每个Z2独立地为在生理pH下包括阴离子侧链的氨基酸；
每个Z3独立地为在生理pH下包括极性、不带电荷的侧链的氨基酸；
每个Z4独立地为甘氨酸或丙氨酸；
每个Z5独立地为包含疏水侧链的氨基酸；以及
每个X独立地为亮氨酸或异亮氨酸。
所述多肽(例如，单链多肽、抗体、其抗原结合片段或其构建体)可包含CDR-H1，所述CDR-H1具有氨基酸序列GFTFSSY(SEQ ID NO:23)、GYTFTDYX(SEQ ID NO:257)或相对于这些序列具有最多两个氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代)的氨基酸序列，其中每个X独立地为亮氨酸或异亮氨酸，任选地其中所述氨基酸取代是保守氨基酸取代。在一些实施方案中，所述多肽(例如，单链多肽、抗体、其抗原结合片段或其构建体)还包含：
(a)CDR-H2，其具有氨基酸序列SSGGSY(SEQ ID NO:24)、VDPEYGST(SEQ ID NO:258)或相对于这些序列具有最多两个氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代)的氨基酸序列；
(b)CDR-H3，其具有氨基酸序列QRVDGYSSYWYFDV(SEQ ID NO:25)、ARDDGSYSPFDYWG(SEQ ID NO:259)、ARDDGSYSPFDY(SEQ ID NO:296)或相对于这些序列具有最多两个氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代)的氨基酸序列；
(c)CDR-L1，其具有氨基酸序列SASSSVYYMY(SEQ ID NO:26)、QNINKY(SEQ ID NO:260)或相对于这些序列具有最多两个氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代)的氨基酸序列；
(d)CDR-L2，其具有氨基酸序列STSNLAS(SEQ ID NO:27)、TYS、YTS或相对于SEQ IDNO:27具有最多两个氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代)的氨基酸序列；和/或
(e)CDR-L3，其具有氨基酸序列QQRRNYPYT(SEQ ID NO:28)、CLQYVNLXT(SEQ IDNO:261)或相对于这些序列具有最多两个氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述多肽(例如，单链多肽、抗体、其抗原结合片段或其构建体)包含重链，所述重链包括以下CDR中的一个或多个：
(a)CDR-H1，其具有氨基酸序列GFTFSSY(SEQ ID NO:23)；
(b)CDR-H2，其具有氨基酸序列SSGGSY(SEQ ID NO:24)；和
(c)CDR-H3，其具有氨基酸序列QRVDGYSSYWYFDV(SEQ ID NO:25)。
所述多肽(例如，单链多肽、抗体、其抗原结合片段或其构建体)可包含例如重链，所述重链具有以下CDR中的一个或多个：
(a)CDR-H1，其具有氨基酸序列GYTFTDYX(SEQ ID NO:257)；
(b)CDR-H2，其具有氨基酸序列VDPEYGST(SEQ ID NO:258)；和
(c)CDR-H3，其具有氨基酸序列ARDDGSYSPFDYWG(SEQ ID NO:259)；
其中每个X独立地为亮氨酸或异亮氨酸。
在一些实施方案中，CDR-H1具有氨基酸序列GYTFTDYL(SEQ ID NO:274)。在一些实施方案中，CDR-H1具有氨基酸序列GYTFTDYI(SEQ ID NO:275)。在一些实施方案中，CDR-H1具有氨基酸序列GYTFTDVI(SEQ ID NO:293)。在一些实施方案中，CDR-H1具有氨基酸序列GYTFTDYS(SEQ ID NO:294)。
另外地或可选地，所述多肽(例如，单链多肽、抗体、其抗原结合片段或其构建体)可包含例如具有以下CDR中的一种或多种的轻链：
(a)CDR-L1，其具有氨基酸序列SASSSVYYMY(SEQ ID NO:26)；
(b)CDR-L2，其具有氨基酸序列STSNLAS(SEQ ID NO:27)；和
(c)CDR-L3，其具有氨基酸序列QQRRNYPYT(SEQ ID NO:28)。
在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含具有以下CDR中的一个或多个的轻链：
(a)CDR-L1，其具有氨基酸序列QNINKY(SEQ ID NO:260)；
(b)CDR-L2，其具有氨基酸序列TYS或YTS；和
(c)CDR-L3，其具有氨基酸序列CLQYVNLXT(SEQ ID NO:261)；
其中每个X独立地为亮氨酸或异亮氨酸。
在一些实施方案中，CDR-L2具有氨基酸序列TYS。在一些实施方案中，CDR-L2具有氨基酸序列YTS。CDR-L3可具有氨基酸序列CLQYVNLLT(SEQ ID NO:272)。在一些实施方案中，CDR-L3具有氨基酸序列CLQYVNLIT(SEQ ID NO:273)。
所述多肽(例如，单链多肽、抗体、其抗原结合片段或其构建体)可包含三个重链CDR，所述三个重链CDR包括：
(a)CDR-H1，其具有氨基酸序列GFTFSSY(SEQ ID NO:23)；
(b)CDR-H2，其具有氨基酸序列SSGGSY(SEQ ID NO:24)；和
(c)CDR-H3，其具有氨基酸序列QRVDGYSSYWYFDV(SEQ ID NO:25)；
并且还可包含三个轻链CDR，所述三个轻链CDR包括：
(d)CDR-L1，其具有氨基酸序列SASSSVYYMY(SEQ ID NO:26)；
(e)CDR-L2，其具有氨基酸序列STSNLAS(SEQ ID NO:27)；和
(f)CDR-L3，其具有氨基酸序列QQRRNYPYT(SEQ ID NO:28)。
在一些实施方案中，所述多肽(例如，单链多肽、抗体、其抗原结合片段或其构建体)包含三个重链CDR，所述三个重链CDR包括：
(a)CDR-H1，其具有氨基酸序列GYTFTDYX(SEQ ID NO:257)，如GYTFTDYL(SEQ IDNO:274)或GYTFTDYI(SEQ ID NO:275)；
(b)CDR-H2，其具有氨基酸序列VDPEYGST(SEQ ID NO:258)；和
(c)CDR-H3，其具有氨基酸序列ARDDGSYSPFDYWG(SEQ ID NO:259)；
并且还包含三个轻链CDR，所述三个轻链CDR包括：
(d)CDR-L1，其具有氨基酸序列QNINKY(SEQ ID NO:260)；
(e)CDR-L2，其具有氨基酸序列TYS或YTS；和
(f)CDR-L3，其具有氨基酸序列CLQYVNLXT(SEQ ID NO:261)，如CLQYVNLLT(SEQ IDNO:272)或CLQYVNLIT(SEQ ID NO:273)；
其中每个X独立地为亮氨酸或异亮氨酸。
在一些实施方案中，所述多肽(例如，单链多肽、抗体、其抗原结合片段或其构建体)包括具有结合到CDR-L2的N末端的氨基酸序列LLIR(SEQ ID NO:262)的框架区和/或具有结合到CDR-L2的C末端的氨基酸序列TLE的框架区。
所述多肽(例如，单链多肽、抗体、其抗原结合片段或其构建体)可具有重链可变结构域，所述重链可变结构域具有与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述重链可变结构域具有与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少90％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，重链可变结构域具有与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少95％同一性(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列。
另外地或可选地，所述多肽(例如，单链多肽、抗体、其抗原结合片段或其构建体)可具有轻链可变结构域，所述轻链可变结构域具有与SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，轻链可变结构域具有与SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少90％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，轻链可变结构域具有与SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少95％同一性(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述多肽(例如，单链多肽、抗体、其抗原结合片段或其构建体)以小于约100nM的KD(例如，其中约10pM至约99nM的KD，如约20pM至约80nM、约30pM至约70nM、约40pM至约60nM、约50pM至约50nM、约60pM至约40nM、约70pM至约30nM、约80pM至约20nM，约90pM至约10nM或约100pM至约1nM的KD)与具有SEQ ID NO:11、19、20和34-117中的任一个的氨基酸序列的肽特异性结合，并且不与含有SEQ ID NO:7的氨基酸56-60(KCSPG)的肽特异性结合。所述多肽(例如，单链多肽、抗体、其抗原结合片段或其构建体)可以以例如约1pM、5pM、10pM、15pM、20pM、25pM、30pM、35pM、40pM、45pM、50pM、55pM、60pM、65pM、70pM、75pM、80pM、85pM、90pM、95pM、100pM、105pM、110pM、115pM、120pM、125pM、130pM、135pM、140pM、145pM、150pM、155pM、160pM、165pM、170pM、175pM、180pM、185pM、190pM、195pM、200pM、205pM、210pM、215pM、220pM、225pM、230pM、235pM、240pM、245pM、250pM、255pM、260pM、265pM、270pM、275pM、280pM、285pM、290pM、295pM、300pM、305pM、310pM、315pM、320pM、325pM、330pM、335pM、340pM、345pM、350pM、355pM、360pM、365pM、370pM、375pM、380pM、385pM、390pM、395pM、400pM、405pM、410pM、415pM、420pM、425pM、430pM、435pM、440pM、445pM、450pM、455pM、460pM、465pM、470pM、475pM、480pM、485pM、490pM、495pM、500pM、505pM、510pM、515pM、520pM、525pM、530pM、535pM、540pM、545pM、550pM、555pM、560pM、565pM、570pM、575pM、580pM、585pM、590pM、595pM、600pM、605pM、610pM、615pM、620pM、625pM、630pM、635pM、640pM、645pM、650pM、655pM、660pM、665pM、670pM、675pM、680pM、685pM、690pM、695pM、700pM、705pM、710pM、715pM、720pM、725pM、730pM、735pM、740pM、745pM、750pM、755pM、760pM、765pM、770pM、775pM、780pM、785pM、790pM、795pM、800pM、805pM、810pM、815pM、820pM、825pM、830pM、835pM、840pM、845pM、850pM、855pM、860pM、865pM、870pM、875pM、880pM、885pM、890pM、895pM、900pM、905pM、910pM、915pM、920pM、925pM、930pM、935pM、940pM、945pM、950pM、955pM、960pM、965pM、970pM、975pM、980pM、985pM、990pM、995pM、1nM、5nM、10nM、15nM、20nM、25nM、30nM、35nM、40nM、45nM、50nM、55nM、60nM、65nM、70nM、75nM、80nM、85nM、90nM、95nM、96nM、97nM、98nM或99nM等值的KD结合具有SEQ ID NO:11、19、20和34-117中任一个的氨基酸序列的肽。
所述多肽(例如，单链多肽、抗体、其抗原结合片段或其构建体)可在以下内的表位处特异性结合TNFR2：
(a)SEQ ID NO:7的氨基酸142-146(KCRPG)；
(b)SEQ ID NO:7的氨基酸142-149(KCRPGFGV)；
(c)SEQ ID NO:7的氨基酸137-144(CAPLRKCR)；
(d)SEQ ID NO:7的氨基酸150-190(RPGTETSDVVCKPCAPGTFSNTTSSTDICRPHQICNVVAI)；
(e)SEQ ID NO:7的氨基酸161-169(CKPCAPGTF)；
(f)SEQ ID NO:7的氨基酸75-128(CDSCEDSTYTQLWNWVPECLSCGSRCSSDQVETQACTREQNRICTCRPGWYCAL)，任选地其中表位在SEQ ID NO:7的氨基酸80-86(DSTYTQL)、91-98(PECLSCGS)或116-123(RICTCRPG)内；
(g)SEQ ID NO:7的氨基酸174-184(SSTDICRPHQI)；
(h)SEQ ID NO:7的氨基酸126-140(CALSKQEGCRLCAPL)；和/或
(i)SEQ ID NO:7的156-165(TSDVVCKPCA)。
在一些实施方案中，所述多肽(例如，单链多肽、抗体、其抗原结合片段或其构建体)在前述表位中的两个或更多个(例如，在上述氨基酸范围内的两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个表位处)表位处特异性结合TNFR2。
在一些实施方案中，所述多肽(例如，单链多肽、抗体、其抗原结合片段或其构建体)以不大于约10nM的KD如不大于约1nM的KD特异性结合TNFR2。例如，多肽(例如，单链多肽、抗体、其抗原结合片段或其构建体)可以以约1pM至约10nM的KD如约1pM、5pM、10pM、15pM、20pM、25pM、30pM、35pM、40pM、45pM、50pM、55pM、60pM、65pM、70pM、75pM、80pM、85pM、90pM、95pM、100pM、105pM、110pM、115pM、120pM、125pM、130pM、135pM、140pM、145pM、150pM、155pM、160pM、165pM、170pM、175pM、180pM、185pM、190pM、195pM、200pM、205pM、210pM、215pM、220pM、225pM、230pM、235pM、240pM、245pM、250pM、255pM、260pM、265pM、270pM、275pM、280pM、285pM、290pM、295pM、300pM、305pM、310pM、315pM、320pM、325pM、330pM、335pM、340pM、345pM、350pM、355pM、360pM、365pM、370pM、375pM、380pM、385pM、390pM、395pM、400pM、405pM、410pM、415pM、420pM、425pM、430pM、435pM、440pM、445pM、450pM、455pM、460pM、465pM、470pM、475pM、480pM、485pM、490pM、495pM、500pM、505pM、510pM、515pM、520pM、525pM、530pM、535pM、540pM、545pM、550pM、555pM、560pM、565pM、570pM、575pM、580pM、585pM、590pM、595pM、600pM、605pM、610pM、615pM、620pM、625pM、630pM、635pM、640pM、645pM、650pM、655pM、660pM、665pM、670pM、675pM、680pM、685pM、690pM、695pM、700pM、705pM、710pM、715pM、720pM、725pM、730pM、735pM、740pM、745pM、750pM、755pM、760pM、765pM、770pM、775pM、780pM、785pM、790pM、795pM、800pM、805pM、810pM、815pM、820pM、825pM、830pM、835pM、840pM、845pM、850pM、855pM、860pM、865pM、870pM、875pM、880pM、885pM、890pM、895pM、900pM、905pM、910pM、915pM、920pM、925pM、930pM、935pM、940pM、945pM、950pM、955pM、960pM、965pM、970pM、975pM、980pM、985pM、990pM、995pM、1nM、5nM或10nM等值的KD特异性结合TNFR2。在一些实施方案中，多肽(例如，单链多肽、抗体、其抗原结合片段或其构建体)可以以约621pM的KD特异性结合TNFR2。在一些实施方案中，多肽(例如，单链多肽、抗体、其抗原结合片段或其构建体)以约44pM的KD特异性结合TNFR2。
多肽(例如，单链多肽、抗体、其抗原结合片段或其构建体)可以以至少约104M-1s-1的Kon如约1x104M-1s-1至约1x108M-1s-1的kon特异性结合TNFR2以形成抗体-抗原复合物。例如，所述多肽(例如，单链多肽、抗体、其抗原结合片段或其构建体)可以以约1x104M-1s-1、2x104M-1s-1、3x104M-1s-1、4x104M-1s-1、5x104M-1s-1、6x104M-1s-1、7x104M-1s-1、8x104M-1s-1、9x104M-1s-1、1x105M-1s-1、2x105M-1s-1、3x105M-1s-1、4x105M-1s-1、5x105M-1s-1、6x105M-1s-1、7x105M-1s-1、8x105M-1s-1、9x105M-1s-1、1x106M-1s-1、2x106M-1s-1、3x106M-1s-1、4x106M-1s-1、5x106M-1s-1、6x106M-1s-1、7x106M-1s-1、8x106M-1s-1、9x106M-1s-1、1x107M-1s-1、2x107M-1s-1、3x107M-1s-1、4x107M-1s-1、5x107M-1s-1、6x107M-1s-1、7x107M-1s-1、8x107M-1s-1、9x107M-1s-1或1x108M-1s-1的Kon特异性结合TNFR2以形成抗体-抗原复合物。在一些实施方案中，所述多肽(例如，单链多肽、抗体、其抗原结合片段或其构建体)以约4.9x106M-1s-1的kon特异性结合TNFR2以形成抗体-抗原复合物。在一些实施方案中，所述多肽(例如，单链多肽、抗体、其抗原结合片段或其构建体)以约3.6x105M-1s-1的kon特异性结合TNFR2以形成抗体-抗原复合物。
所述多肽(例如，单链多肽、抗体、其抗原结合片段或其构建体)可以以例如不大于约10-3s-1的koff如约10-6s-1至约10-3s-1的koff(例如，约1x10-6s-1、2x10-6s-1、3x10-6s-1、4x10- 6s-1、5x10-6s-1、6x10-6s-1、7x10-6s-1、8x10-6s-1、9x10-6s-1、1x10-5s-1、2x10-5s-1、3x10-5s-1、4x10-5s-1、5x10-5s-1、6x10-5s-1、7x10-5s-1、8x10-5s-1、9x10-5s-1、1x10-4s-1、2x10-4s-1、3x10-4s-1、4x10-4s-1、5x10-4s-1、6x10-4s-1、7x10-4s-1、8x10-4s-1、9x10-4s-1或1x10-3s-1的koff)特异性结合TNFR2以形成抗体-抗原复合物。在一些实施方案中，抗体-抗原复合物以约2.2x10-4s-1的koff解离。
本文所述的多肽(如单链多肽、抗体、其抗原结合片段及其构建体)可以例如在表达TNFR2的细胞如T-reg细胞(例如，表达CD25高的T-reg细胞)、骨髓源性抑制细胞(MDSC)和/或TNFR2+癌细胞中抑制TNFR2信号传导。在一些实施方案中，所述单链多肽、抗体或其抗原结合片段降低或抑制选自由CHUK、NFKBIE、NFKBIA、MAP3K11、TRAF2、TRAF3、relB以及cIAP2/BIRC3组成的组的一种或多种基因的表达，如例如通过观察上述基因中的一个或多个的表达减少或通过本领域已知的用于评估基因活化的其它方法所评估的。例如，本文所述的拮抗性TNFR2单链多肽、抗体、其抗原结合片段和其构建体可使CHUK、NFKBIE、NFKBIA、MAP3K11、TRAF2、TRAF3、relB或cIAP2/BIRC3中的一种或多种的表达或翻译后修饰(例如，磷酸化)相对于从未用本文所述的拮抗性TNFR2单链多肽、抗体、其抗原结合片段及其构建体处理的样品中分离的这些蛋白质中的一种或多种的表达或翻译后修饰(例如，磷酸化)抑制例如约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。可用于测定表达水平和磷酸化状态的示例性测定是本领域中已知的，并且包括用于测定蛋白质含量的蛋白质印迹测定和用于测定mRNA含量的定量逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)实验。在优选的实施方案中，抗TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体、其抗原结合片段及其构建体)是显性TNFR2拮抗剂并且因此即使在TNFR2激动剂(如，例如，TNFα或卡介苗芽孢杆菌(BacillusCalmette-Guérin)(BCG))或生长促进剂(如IL-2)存在下也能够抑制TNFR2活化。
拮抗性TNFR2多肽(例如，本文所述的单链多肽、抗体、其抗原结合片段及其构建体)可表现出以下性质中的一个或多个或全部：
(a)例如，通过结合T-reg细胞表面上的TNFR2并使其失活，遏制T-reg细胞的增殖和/或直接杀伤T-reg细胞(例如，从而使细胞群中的T-reg细胞的数量相对于未暴露于所述多肽的细胞群中的T-reg细胞数的量减少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％)；
(b)例如，通过结合MDSC表面上的TNFR2并使其失活，遏制MDSC的增殖和/或直接杀伤MDSC(例如，从而使细胞群中的MDSC的数量相对于未暴露于所述多肽的细胞群中的MDSC的数量减少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％)；
(c)促进T效应细胞如CD8+T细胞的扩增(例如，从而使细胞群中CD8+效应T细胞的数量相对于未暴露于所述多肽的细胞群中的CD8+效应T细胞的数量增加约1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2倍、2.1倍、2.2倍、2.3倍、2.4倍、2.5倍、2.6倍、2.7倍、2.8倍、2.9倍、3倍、3.1倍、3.2倍、3.3倍、3.4倍、3.5倍、3.6倍、3.7倍、3.8倍、3.9倍、4倍、4.1倍、4.2倍、4.3倍、4.4倍、4.5倍、4.6倍、4.7倍、4.8倍、4.9倍、5倍、5.1倍、5.2倍、5.3倍、5.4倍、5.5倍、5.6倍、5.7倍、5.8倍、5.9倍、6倍、6.1倍、6.2倍、6.3倍、6.4倍、6.5倍、6.6倍、6.7倍、6.8倍、6.9倍、7倍、7.1倍、7.2倍、7.3倍、7.4倍、7.5倍、7.6倍、7.7倍、7.8倍、7.9倍、8倍、8.1倍、8.2倍、8.3倍、8.4倍、8.5倍、8.6倍、8.7倍、8.8倍、8.9倍、9倍、9.1倍、9.2倍、9.3倍、9.4倍、9.5倍、9.6倍、9.7倍、9.8倍、9.9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍或更多倍)；和/或
(d)遏制表达TNFR2的癌细胞的增殖和/或或者杀伤所述癌细胞(例如，从而使细胞群中表达TNFR2的癌细胞的数量相对于未暴露于所述多肽的细胞群中的表达TNFR2的癌细胞的数量减少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％)，所述癌细胞为如霍奇金淋巴瘤细胞、皮肤非霍奇金淋巴瘤细胞、T细胞淋巴瘤细胞、卵巢癌细胞、结肠癌细胞、多发性骨髓瘤细胞、肾细胞癌细胞、皮肤癌细胞、肺癌细胞、肝癌细胞、子宫内膜癌细胞、造血或淋巴细胞癌细胞、中枢神经系统癌细胞、乳腺癌细胞、胰腺癌细胞、胃癌细胞、食道癌细胞和上消化道癌细胞。
例如，本文所述的拮抗性TNFR2多肽如单链多肽、抗体、其抗原结合片段及其构建体可用于使患者(如人受试者)中或样品(例如，从患者，如接受本文所述的癌症或感染性疾病的治疗的人患者分离的样品)内的T-rge细胞或癌细胞的总量分别相对于未用所述多肽治疗的患者或样品减少。
在一些实施方案中，拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体或其抗原结合片段)减少例如T-reg细胞或癌细胞(如TNFR2+癌细胞，例如霍奇金淋巴瘤细胞、皮肤非霍奇金淋巴瘤细胞、T细胞淋巴瘤细胞、卵巢癌细胞、结肠癌细胞、多发性骨髓瘤细胞、肾细胞癌细胞、皮肤癌细胞、肺癌细胞、肝癌细胞子宫内膜癌细胞、造血或淋巴癌细胞、中枢神经系统癌细胞、乳腺癌细胞、胰腺癌细胞、胃癌细胞、食道癌细胞或上消化道癌细胞)的TNFR2的表达，和/或前述细胞中的一种或多种的可溶性TNFR2的分泌。
本文所述的拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体、其抗原结合片段及其构建体)可用于抑制或减少患者(例如，人患者)或样品(例如，从接受本文所述的癌症或感染性疾病的治疗的人患者分离的样品)中T-reg细胞的增殖或减少其总量。
本文所述的拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体、其抗原结合片段及其构建体)可用于抑制或减少T-reg细胞(例如，表达CD25高的活化的T-reg细胞)和/或表达TNFR2的癌细胞的增殖和/或直接杀伤它们。例如，癌细胞可选自由以下组成的组：霍奇金淋巴瘤细胞、皮肤非霍奇金淋巴瘤细胞、T细胞淋巴瘤细胞、卵巢癌细胞、结肠癌细胞、多发性骨髓瘤细胞、肾细胞癌细胞、皮肤癌细胞、肺癌细胞、肝癌细胞、子宫内膜癌细胞、造血或淋巴癌细胞、中枢神经系统癌细胞、乳腺癌细胞、胰腺癌细胞、胃癌细胞、食道癌细胞或上消化道癌细胞。不受机制的限制，癌细胞上的TNFR2的结合可以抑制或减少癌细胞的增殖和/或可直接杀伤癌细胞，如通过促进癌细胞的凋亡。
本文所述的拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体、其抗原结合片段及其构建体)可结合MDSC(例如，表达选自由以下组成的组的蛋白质和小分子的全部或子集的细胞：B7-1(CD80)、B7-H1(PD-L1)、CCR2、CD1d、CD1d1、CD2、CD31(PECAM-1)、CD43、CD44、补体组分C5a R1、F4/80(EMR1)、FcγRIII(CD16)、FcγRII(CD32)、FcγRIIA(CD32a)、FcγRIIB(CD32b)、FcγRIIB/C(CD32b/c)、FcγRIIC(CD32c)、FcγRIIIA(CD16A)、FcγRIIIB(CD16b)、半乳糖凝集素-3、GP130、Gr-1(Ly-6G)、ICAM-1(CD54)、IL-1RI、IL-4Rα、IL-6Rα、整联蛋白α4(CD49d)、整联蛋白αL(CD11a)、整联蛋白αM(CD11b)、M-CSFR、MGL1(CD301a)、MGL1/2(CD301a/b)、MGL2(CD301b)、一氧化氮、PSGL-1(CD162)、L-选择蛋白(CD62L)、siglec-3(CD33)、转铁蛋白受体(TfR)、VEGFR1(Flt-1)以及VEGFR2(KDR或Flk-1)表面上的TNFR2。特别地，MDSC不表达选自由B7-2(CD86)、B7-H4、CD11c、CD14、CD21、CD23(FcεRII)、CD34、CD35、CD40(TNFRSF5)、CD117(c-kit)、HLA-DR以及Sca-1(Ly6)组成的组的蛋白质。结合MDSC上的TNFR2可抑制或减少MDSC的增殖和/或可以如通过促进MDSC的凋亡直接杀伤MDSC。本文所述的多肽(如单链多肽、抗体、其抗原结合片段及其构建体)不需要TNFα来抑制T-reg细胞、癌细胞(例如，表达TNFR2的癌细胞)和/或MDSC的增殖。
在一些实施方案中，本文所述的多肽(如单链多肽、抗体、其抗原结合片段及其构建体)相对于未患癌症的受试者在患有癌症的患者中以更大的效力抑制T-reg细胞的增殖和/或直接杀伤T-reg细胞。在一些实施方案中，本文所述的多肽(如单链多肽、抗体、其抗原结合片段及其构建体)相对于不含癌细胞的部位(如患有癌症的患者中远离肿瘤的部位)在肿瘤的微环境中以更大的效力抑制T-reg细胞的增殖和/或直接杀伤T-reg细胞。
例如，在一些实施方案中，本文所述的多肽(如单链多肽、抗体、其抗原结合片段及其构建体)抑制T-reg细胞的增殖和/或直接杀伤T-reg细胞，其效力在肿瘤微环境中比在不含癌细胞的部位(如患有癌症的患者中远离肿瘤的部位)中或者相对于未患癌症的受试者更大。例如，本文所述的多肽(如单链多肽、抗体、其抗原结合片段及其构建体)可表现出用于抑制肿瘤微环境中T-reg细胞的增殖的IC50比所述多肽用于抑制不含癌细胞的部位中T-reg细胞的增殖的IC50小例如1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、100倍、1,000倍、10,000倍或更多。本文所述的多肽(如单链多肽、抗体、其抗原结合片段及其构建体)可抑制T-reg细胞的增殖，其效力在含有T细胞淋巴瘤细胞(例如，霍奇金氏或皮肤非霍奇金氏淋巴瘤细胞)、卵巢癌细胞、结肠癌细胞、多发性骨髓瘤细胞或肾细胞癌细胞的肿瘤的微环境中比在不含此类癌细胞的部位(如患有前述癌症中的一种或多种的患者中远离肿瘤的部位)中或者相对于未患癌症的受试者更大。
在一些实施方案中，本文所述的多肽(如单链多肽、抗体、其抗原结合片段及其构建体)相对于未患癌症的受试者在患有癌症的患者中以更大的效力抑制或减少MDSC的增殖和/或直接杀伤MDSC。在一些实施方案中，本文所述的多肽(如单链多肽、抗体、其抗原结合片段及其构建体)相对于不含癌细胞的部位(如患有癌症的患者中远离肿瘤的部位)或者相对于未患癌症的受试者在肿瘤的微环境中以更大的效力抑制或减少MDSC的增殖和/或直接杀伤MDSC。
例如，本文所述的拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体、其抗原结合片段及其构建体)可结合肿瘤的微环境内存在的MDSC表面上的TNFR2，并且可抑制或减少所述MDSC的增殖或者可促进MDSC的细胞凋亡，其效力在肿瘤微环境中比在不含癌细胞的部位(如患有癌症的患者中远离肿瘤的部位)或者相对于或未患癌症的受试者更大。例如，本文所述的多肽(如单链多肽、抗体、其抗原结合片段及其构建体)可表现出用于抑制肿瘤微环境中MDSC的增殖的IC50比所述多肽用于抑制不含癌细胞的部位中MDSC的增殖的IC50小例如1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、100倍、1,000倍、10,000倍或更多。本文所述的多肽(如单链多肽、抗体、其抗原结合片段及其构建体)可抑制MDSC的增殖或者可促进MDSC的细胞凋亡，其效力在含有T细胞淋巴瘤细胞(例如，霍奇金氏或皮肤非霍奇金氏淋巴瘤细胞)、卵巢癌细胞、结肠癌细胞、多发性骨髓瘤细胞或肾细胞癌细胞的肿瘤的微环境中比在不含此类癌细胞的部位(如患有前述癌症中的一种或多种的患者中远离肿瘤的部位)中或者相对于或未患癌症的受试者更大。
在一些实施方案中，本文所述的多肽(如单链多肽、抗体、其抗原结合片段及其构建体)相对于未患癌症的受试者在患有癌症的患者中以更大的效力扩增T效应细胞，如CD8+细胞毒性T细胞。在一些实施方案中，本文所述的多肽(如单链多肽、抗体、其抗原结合片段及其构建体)相对于不含癌细胞的部位(如患有癌症的患者中远离肿瘤的部位)在肿瘤的微环境中或者相对于未患癌症的受试者以更大的效力扩增T效应细胞，如CD8+细胞毒性T细胞。
例如，在一些实施方案中，本文所述的多肽(如单链多肽、抗体、其抗原结合片段及其构建体)直接扩增T效应细胞，如CD8+细胞毒性T细胞，其效力在肿瘤微环境中比在不含癌细胞的部位(如患有癌症的患者中远离肿瘤的部位)中或者相对于或未患癌症的受试者更大。例如，本文所述的多肽可具有的用于扩增癌症患者中的T效应细胞的EC50比所述多肽用于扩增未患癌症的受试者中的T效应细胞的EC50小例如1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、100倍、1,000倍、10,000倍或更多。本文所述的多肽(如单链多肽、抗体、其抗原结合片段及其构建体)可直接扩增T效应细胞，如CD8+细胞毒性T细胞，其效力在含有T细胞淋巴瘤细胞(例如，霍奇金氏或皮肤非霍奇金氏淋巴瘤细胞)、卵巢癌细胞、结肠癌细胞、多发性骨髓瘤细胞或肾细胞癌细胞的肿瘤的微环境中比在不含此类癌细胞的部位(如患有前述癌症中的一种或多种的患者中远离肿瘤的部位或未患癌症的受试者中的部位)中更大。在一些实施方案中，所述T效应细胞(例如，CD8+细胞毒性T细胞)与存在于一种或多种癌细胞(如霍奇金氏淋巴瘤细胞、皮肤非霍奇金氏淋巴瘤细胞、T细胞淋巴瘤细胞、卵巢癌细胞、结肠癌细胞、多发性骨髓瘤细胞或肾细胞癌细胞)上的抗原特异性地反应。
在一些实施方案中，所述多肽是人IgG2同种型抗体或其抗原结合片段。另外地或可选地，所述多肽可以是选自由以下组成的组的抗体或其抗原结合片段：单克隆抗体或其抗原结合片段、多克隆抗体或其抗原结合片段、人抗体或其抗原结合片段、人源化抗体或其抗原结合片段、灵长类化抗体或其抗原结合片段、双特异性抗体或其抗原结合片段、多特异性抗体或其抗原结合片段、双重可变免疫球蛋白结构域、单价抗体或其抗原结合片段、嵌合抗体或其抗原结合片段、单链Fv分子(scFv)、双抗体、三抗体、纳米抗体、抗体样蛋白支架、结构域抗体、Fv片段、Fab片段、F(ab’)2分子以及串联scFv(taFv)。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段含有例如通过酰胺键、硫醚键、碳-碳键或二硫桥键或通过接头(如本文所述的接头)彼此共价结合的两个或更多个CDR。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段为人抗体、人源化抗体或嵌合抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，所述多肽(例如，单链多肽、抗体、其抗原结合片段或其构建体)与治疗剂如细胞毒性剂(例如，本文所述的细胞毒性剂)缀合。
上述方面中的任一方面的拮抗性TNFR2抗体可以是双特异性抗体，如双特异性单克隆抗体，其中抗体的一个臂特异性结合TNFR2，另一个臂特异性结合免疫检查点蛋白，如本文所述的PD-1、PD-L1或CTLA-4，等等。特异性结合TNFR2的双特异性抗体的臂可以特异性结合例如由CRD3内的一个或多个氨基酸限定的人TNFR2的表位和/或由CRD4内的一个或多个氨基酸限定的表位。在一些实施方案中，特异性结合TNFR2的双特异性抗体的臂特异性结合人TNFR2的表位，所述表位选自：
(a)SEQ ID NO:7的氨基酸142-146(KCRPG)；
(b)SEQ ID NO:7的氨基酸142-149(KCRPGFGV)；
(c)SEQ ID NO:7的氨基酸137-144(CAPLRKCR)；
(d)SEQ ID NO:7的氨基酸150-190(RPGTETSDVVCKPCAPGTFSNTTSSTDICRPHQICNVVAI)；
(e)SEQ ID NO:7的氨基酸161-169(CKPCAPGTF)；
(f)SEQ ID NO:7的氨基酸75-128(CDSCEDSTYTQLWNWVPECLSCGSRCSSDQVETQACTREQNRICTCRPGWYCAL)，任选地其中表位在SEQ ID NO:7的氨基酸80-86(DSTYTQL)、91-98(PECLSCGS)或116-123(RICTCRPG)内；
(g)SEQ ID NO:7的氨基酸174-184(SSTDICRPHQI)；
(h)SEQ ID NO:7的氨基酸126-140(CALSKQEGCRLCAPL)；以及
(i)SEQ ID NO:7的氨基酸156-165(TSDVVCKPCA)。
在一些实施方案中，双特异性抗体包含特异性结合TNFR2的一个臂，如上述人TNFR2的表位，和特异性结合免疫检查点蛋白的一个臂，所述免疫检查点蛋白特异性结合PD-1。在一些实施方案中，特异性结合PD-1的双特异性抗体的臂可以与纳武单抗、帕博利珠单抗、阿维鲁单抗、德瓦鲁单抗或阿妥珠单抗特异性结合PD-1上相同的一个或多个表位。例如，特异性结合PD-1的双特异性抗体的臂可以竞争性地抑制PD-1与纳武单抗、帕博利珠单抗、阿维鲁单抗、德瓦鲁单抗和/或阿妥珠单抗的结合，如例如使用本文所述的或本领域已知的竞争性结合测定如竞争性ELISA所评估的。
在一些实施方案中，双特异性抗体包含特异性结合TNFR2的一个臂，如上述人TNFR2的表位，和特异性结合PD-L1的一个臂。在一些实施方案中，特异性结合PD-L1的双特异性抗体的臂可以与阿妥珠单抗或阿维鲁单抗特异性结合PD-L1上的相同的一种或多种表位。例如，通过例如使用本文所述或本领域已知的竞争性结合测定，如竞争性ELISA，特异性结合PD-L1的双特异性抗体的臂可以竞争性地抑制PD-L1与阿妥珠单抗或阿维鲁单抗的结合。
在一些实施方案中，双特异性抗体包含特异性结合TNFR2(如上述人TNFR2的表位)的一个臂和特异性结合CTLA-4的一个臂。在一些实施方案中，特异性结合CTLA-4的双特异性抗体的臂可以与伊匹木单抗或曲美木单抗特异性结合CTLA-4上的相同的一种或多种表位。例如，特异性结合CTLA-4的双特异性抗体的臂可以竞争性地抑制CTLA-4与伊匹木单抗和/或曲美木单抗的结合，如例如使用本文所述或本领域已知的竞争性结合测定如竞争性ELISA所评估的。
第二方面的特征是包含第一多肽结构域和第二多肽结构域的构建体。第一多肽结构域和第二多肽结构域各自独立地为第一方面或其任何实施方案的抗原结合片段。第一多肽结构域和第二多肽结构域可以例如通过共价接头，如含有(例如，为)酰胺键或二硫键的接头彼此结合。
第三方面的特征是编码第一方面的多肽(例如，单链多肽、抗体、其抗原结合片段或其构建体)和/或第二方面或其任何实施方案的的构建体的多核苷酸。
第四方面的特征是编码第三方面的多核苷酸的载体。载体可以是表达载体，如真核表达载体。在一些实施方案中，载体是病毒载体，如腺病毒(例如，血清型1-57腺病毒，如血清型2、5、11、12、24、26、34、35、40、48、49、50、52或Pan9腺病毒)、逆转录病毒(例如，γ-逆转录病毒或慢病毒)、痘病毒、腺相关病毒、杆状病毒、单纯疱疹病毒或痘苗病毒(例如，经修饰的安卡拉痘苗病毒)。
第五方面的特征是含有第三方面的多核苷酸和/或第四方面的载体的分离的宿主细胞。宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞，如哺乳动物细胞(例如，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞)。宿主细胞可以是例如Dinnis和James，Biotechnology and Bioengineering 91:180-189，2005(其公开内容以引用的方式并入本文)中描述的细胞。
第六方面的特征是包含多肽(例如，单链多肽、抗体、其抗原结合片段或其构建体)的药物组合物，所述多肽特异性结合人TNFR2并在结合时对TNFR2活性表现出拮抗作用。所述多肽可以是例如第一方面或其任何实施方案的抗体或抗原结合片段。另外地或可选地，抗体或其抗原结合片段可以是在CRD3和/或CRD4内的表位处特异性结合人TNFR2，而不在CRD1内的一个或多个氨基酸限定的表位处结合TNFR2的抗体或其抗原结合片段，其中药物组合物中至少10％的抗体或其抗原结合片段以单个二硫键结合的同种型，如IgG2-A或IgG2-B二硫键结合的同种型存在。在一些实施方案中，药物组合物中约10％至约99.999％的抗体或其抗原结合片段以单个二硫键结合的同种型存在，如约11％至约99.9％、约12％至约99.9％、约13％至约99.9％、约14％至约99.9％、约15％至约99％、约16％至约99.9％、约17％至约99.9％、约18％至约99.9％、约19％至约99.9％、约20％至约99.9％、约21％至约99.9％、约22％至约99.9％、约23％至约99.9％、约24％至约99.9％、约25％至约99.9％、约26％至约99.9％、约27％至约99.9％、约28％至约99.9％、约29％至约99.9％、约30％至约99.9％、约31％至约99.9％、约32％至约99.9％、约33％至约99.9％、约34％至约99.9％、约35％至约99.9％、约36％至约99.9％、约37％至约99.9％、约38％至约99.9％、约39％至约99.9％、约40％至约99.9％、约41％至约99.9％、约42％至约99.9％、约43％至约99.9％、约44％至约99.9％、约45％至约99.9％、约46％至约99.9％、约47％至约99.9％、约48％至约99.9％、约49％至约99.9％、约50％至约99.9％、约51％至约99.9％、约52％至约99.9％、约53％至约99.9％、约54％至约99.9％、约55％至约99.9％、约56％至约99.9％、约57％至约99.9％、约58％至约99.9％、约59％至约99.9％、约60％至约99.9％、约61％至约99.9％、约62％至约99.9％、约63％至约99.9％、约64％至约99.9％、约65％至约99.9％、约66％至约99.9％、约67％至约99.9％、约68％至约99.9％、约69％至约99.9％、约70％至约99.9％、约71％至约99.9％、约72％至约99.9％、约73％至约99.9％、约74％至约99.9％、约75％至约99.9％、约76％至约99.9％、约77％至约99.9％、约78％至约99.9％、约79％至约99.9％、约80％至约99.9％、约81％至约99.9％、约82％至约99.9％、约83％至约99.9％、约84％至约99.9％、约85％至约99.9％、约86％至约99.9％、约87％至约99.9％、约88％至约99.9％、约89％至约99.9％、约90％至约99.9％、约91％至约99.9％、约92％至约99.9％、约93％至约99.9％、约94％至约99.9％、约95％至约99.9％、约96％至约99.9％、约97％至约99.9％、约98％至约99.9％或约99％至约99.99％的抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，药物组合物中至少约10％的抗体或其抗原结合片段以单个二硫键结合的同种型存在。在一些实施方案中，药物组合物中至少约15％的抗体或其抗原结合片段以单个二硫键结合的同种型存在。在一些实施方案中，药物组合物中至少约20％的抗体或其抗原结合片段以单个二硫键结合的同种型存在。在一些实施方案中，药物组合物中至少约25％的抗体或其抗原结合片段以单个二硫键结合的同种型存在。在一些实施方案中，药物组合物中至少约30％的抗体或其抗原结合片段以单个二硫键结合的同种型存在。在一些实施方案中，药物组合物中至少约35％的抗体或其抗原结合片段以单个二硫键结合的同种型存在。在一些实施方案中，药物组合物中至少约40％的抗体或其抗原结合片段以单个二硫键结合的同种型存在。在一些实施方案中，药物组合物中至少约45％的抗体或其抗原结合片段以单个二硫键结合的同种型存在。在一些实施方案中，药物组合物中至少约50％的抗体或其抗原结合片段以单个二硫键结合的同种型存在。在一些实施方案中，药物组合物中至少约60％的抗体或其抗原结合片段以单个二硫键结合的同种型存在。在一些实施方案中，药物组合物中至少约65％的抗体或其抗原结合片段以单个二硫键结合的同种型存在。在一些实施方案中，药物组合物中至少约70％的抗体或其抗原结合片段以单个二硫键结合的同种型存在。在一些实施方案中，药物组合物中至少约75％的抗体或其抗原结合片段以单个二硫键结合的同种型存在。在一些实施方案中，药物组合物中至少约80％的抗体或其抗原结合片段以单个二硫键结合的同种型存在。在一些实施方案中，药物组合物中至少约85％的抗体或其抗原结合片段以单个二硫键结合的同种型存在。在一些实施方案中，药物组合物中至少约90％的抗体或其抗原结合片段以单个二硫键结合的同种型存在。在一些实施方案中，药物组合物中至少约95％的抗体或其抗原结合片段以单个二硫键结合的同种型存在。在一些实施方案中，药物组合物中至少约96％的抗体或其抗原结合片段以单个二硫键结合的同种型存在。在一些实施方案中，药物组合物中至少约97％的抗体或其抗原结合片段以单个二硫键结合的同种型存在。在一些实施方案中，药物组合物中至少约98％的抗体或其抗原结合片段以单个二硫键结合的同种型存在。在一些实施方案中，药物组合物中至少约99％的抗体或其抗原结合片段以单个二硫键结合的同种型存在。在一些实施方案中，药物组合物中至少约99.9％的抗体或其抗原结合片段以单个二硫键结合的同种型存在。
在一些实施方案中，在于非还原条件下进行凝胶电泳分析时，抗体或其抗原结合片段仅产生单一的可检测条带。
在一些实施方案中，如本文所述，抗体或抗原结合片段的单个二硫键结合的同种型为IgG2-A。在一些实施方案中，如本文所述，抗体或抗原结合片段的单个二硫键结合的同种型为IgG2-B。
另外地或可选地，药物组合物可包含第二方面或其任何实施方案的构建体、第三方面或其任何实施方案的多核苷酸、第四方面或其任何实施方案的载体和/或第五方面或其任何实施方案的宿主细胞。所述药物组合物还可包含药学上可接受的载体或赋形剂。
在一些实施方案中，所述多肽(例如，单链多肽、抗体、其抗原结合片段或其构建体)以约0.001mg/ml至约100mg/ml的量如约0.01mg/ml至约10mg/ml的量存在于药物组合物中。
所述药物组合物还可含有另外的治疗剂，如免疫治疗剂。在一些实施方案中，所述免疫治疗剂选自由以下组成的组：抗CTLA-4剂、抗PD-1剂、抗PD-L1剂、抗PD-L2剂、TNF-α交联剂、TRAIL交联剂、抗CD27剂、抗CD30剂、抗CD40剂、抗4-1BB剂、抗GITR剂、抗OX40剂、抗TRAILR1剂、抗TRAILR2剂、抗TWEAK剂、抗TWEAKR剂、抗细胞表面淋巴细胞蛋白剂、抗BRAF剂、抗MEK剂、抗CD33剂、抗CD20剂、抗HLA-DR剂、抗HLAI类剂、抗CD52剂、抗A33剂、抗GD3剂、抗PSMA剂、抗Ceacan 1剂、抗Galedin 9剂、抗HVEM剂、抗VISTA剂、抗B7H4剂、抗HHLA2剂、抗CD155剂、抗CD80剂、抗BTLA剂、抗CD160剂、抗CD28剂、抗CD226剂、抗CEACAM1剂、抗TIM3剂、抗TIGIT剂、抗CD96剂、抗CD70剂、抗CD27剂、抗LIGHT剂、抗CD137剂、抗DR4剂、抗CR5剂、抗TNFRS剂、抗TNFR1剂、抗FAS剂、抗CD95剂、抗TRAIL剂、抗DR6剂、抗EDAR剂、抗NGFR剂、抗OPG剂、抗RANKL剂、抗LTβ受体剂、抗BCMA剂、抗TACI剂、抗BAFFR剂、抗EDAR2剂、抗TROY剂和抗RELT剂。例如，免疫治疗剂可以是抗CTLA-4剂、抗PD-1剂或抗PD-L1剂。
在一些实施方案中，免疫治疗剂选自由以下组成的组：抗CTLA-4抗体或其抗原结合片段、抗PD-1抗体或其抗原结合片段、抗PD-L1抗体或其抗原结合片段、抗PD-L2抗体或其抗原结合片段、TNF-α交联抗体或其抗原结合片段、TRAIL交联抗体或其抗原结合片段、抗CD27抗体或其抗原结合片段、抗CD30抗体或其抗原结合片段、抗CD40抗体或其抗原结合片段、抗4-1BB抗体或其抗原结合片段、抗GITR抗体或其抗原结合片段、抗OX40抗体或其抗原结合片段、抗TRAILR1抗体或其抗原结合片段、抗TRAILR2抗体或其抗原结合片段、抗TWEAK抗体或其抗原结合片段、抗TWEAKR抗体或其抗原结合片段、抗细胞表面淋巴细胞蛋白抗体或其抗原结合片段、抗BRAF抗体或其抗原结合片段、抗MEK抗体或其抗原结合片段、抗CD33抗体或其抗原结合片段、抗CD20抗体或其抗原结合片段、抗HLA-DR抗体或其抗原结合片段、抗HLAI类抗体或其抗原结合片段、抗CD52抗体或其抗原结合片段、抗A33抗体或其抗原结合片段、抗GD3抗体或其抗原结合片段、抗PSMA抗体或其抗原结合片段、抗Ceacan 1抗体或其抗原结合片段、抗Galedin 9抗体或其抗原结合片段、抗HVEM抗体或其抗原结合片段、抗VISTA抗体或其抗原结合片段、抗B7H4抗体或其抗原结合片段、抗HHLA2抗体或其抗原结合片段、抗CD155抗体或其抗原结合片段、抗CD80抗体或其抗原结合片段、抗BTLA抗体或其抗原结合片段、抗CD160抗体或其抗原结合片段、抗CD28抗体或其抗原结合片段、抗CD226抗体或其抗原结合片段、抗CEACAM1抗体或其抗原结合片段、抗TIM3抗体或其抗原结合片段、抗TIGIT抗体或其抗原结合片段、抗CD96抗体或其抗原结合片段、抗CD70抗体或其抗原结合片段、抗CD27抗体或其抗原结合片段、抗LIGHT抗体或其抗原结合片段、抗CD137抗体或其抗原结合片段、抗DR4抗体或其抗原结合片段、抗CR5抗体或其抗原结合片段、抗TNFRS抗体或其抗原结合片段、抗TNFR1抗体或其抗原结合片段、抗FAS抗体或其抗原结合片段、抗CD95抗体或其抗原结合片段、抗TRAIL抗体或其抗原结合片段、抗DR6抗体或其抗原结合片段、抗EDAR抗体或其抗原结合片段、抗NGFR抗体或其抗原结合片段、抗OPG抗体或其抗原结合片段、抗RANKL抗体或其抗原结合片段、抗LTβ受体抗体或其抗原结合片段、抗BCMA抗体或其抗原结合片段、抗TACI抗体或其抗原结合片段、抗BAFFR抗体或其抗原结合片段、抗EDAR2抗体或其抗原结合片段、抗TROY抗体或其抗原结合片段和抗RELT抗体或其抗原结合片段。例如，免疫治疗剂可以是抗CTLA-4抗体或其抗原结合片段、抗PD-1抗体或其抗原结合片段、或抗PD-L1抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，药物组合物包含抗CTLA-4抗体或其抗原结合片段，如伊匹木单抗或曲美木单抗。另外地或可选地，药物组合物可包含抗PD-1抗体或其抗原结合片段，如纳武单抗、帕博利珠单抗、阿维鲁单抗、德瓦鲁单抗或阿妥珠单抗
在一些实施方案中，免疫治疗剂是抗细胞表面淋巴细胞蛋白抗体或其抗原结合片段，如结合以下的一种或多种的抗体或其抗原结合片段：CD1、CD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD9、CD10、CD11、CD12、CD13、CD14、CD15、CD16、CD17、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD26、CD27、CD28、CD29、CD30、CD31、CD32、CD33、CD34、CD35、CD36、CD37、CD38、CD39、CD40、CD41、CD42、CD43、CD44、CD45、CD46、CD47、CD48、CD49、CD50、CD51、CD52、CD53、CD54、CD55、CD56、CD57、CD58、CD59、CD60、CD61、CD62、CD63、CD64、CD65、CD66、CD67、CD68、CD69、CD70、CD71、CD72、CD73、CD74、CD75、CD76、CD77、CD78、CD79、CD80、CD81、CD82、CD83、CD84、CD85、CD86、CD87、CD88、CD89、CD90、CD91、CD92、CD93、CD94、CD95、CD96、CD97、CD98、CD99、CD100、CD101、CD102、CD103、CD104、CD105、CD106、CD107、CD108、CD109、CD110、CD111、CD112、CD113、CD114、CD115、CD116、CD117、CD118、CD119、CD120、CD121、CD122、CD123、CD124、CD125、CD126、CD127、CD128、CD129、CD130、CD131、CD132、CD133、CD134、CD135、CD136、CD137、CD138、CD139、CD140、CD141、CD142、CD143、CD144、CD145、CD146、CD147、CD148、CD149、CD150、CD151、CD152、CD153、CD154、CD155、CD156、CD157、CD158、CD159、CD160、CD161、CD162、CD163、CD164、CD165、CD166、CD167、CD168、CD169、CD170、CD171、CD172、CD173、CD174、CD175、CD176、CD177、CD178、CD179、CD180、CD181、CD182、CD183、CD184、CD185、CD186、CD187、CD188、CD189、CD190、CD191、CD192、CD193、CD194、CD195、CD196、CD197、CD198、CD199、CD200、CD201、CD202、CD203、CD204、CD205、CD206、CD207、CD208、CD209、CD210、CD211、CD212、CD213、CD214、CD215、CD216、CD217、CD218、CD219、CD220、CD221、CD222、CD223、CD224、CD225、CD226、CD227、CD228、CD229、CD230、CD231、CD232、CD233、CD234、CD235、CD236、CD237、CD238、CD239、CD240、CD241、CD242、CD243、CD244、CD245、CD246、CD247、CD248、CD249、CD250、CD251、CD252、CD253、CD254、CD255、CD256、CD257、CD258、CD259、CD260、CD261、CD262、CD263、CD264、CD265、CD266、CD267、CD268、CD269、CD270、CD271、CD272、CD273、CD274、CD275、CD276、CD277、CD278、CD279、CD280、CD281、CD282、CD283、CD284、CD285、CD286、CD287、CD288、CD289、CD290、CD291、CD292、CD293、CD294、CD295、CD296、CD297、CD298、CD299、CD300、CD301、CD302、CD303、CD304、CD305、CD306、CD307、CD308、CD309、CD310、CD311、CD312、CD313、CD314、CD315、CD316、CD317、CD318、CD319和/或CD320。
在一些实施方案中，免疫治疗剂是结合趋化因子或淋巴因子(如牵涉肿瘤生长的趋化因子或淋巴因子)的剂(例如，多肽、抗体、其抗原结合片段、单链多肽或其构建体)。例如，免疫治疗剂可以是结合CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL8、CCL2和CCL5中的一个或多个或全部并抑制其活性的剂(例如，多肽、抗体、其抗原结合片段、单链多肽或其构建体)。在一些实施方案中，免疫治疗剂是结合CCL3、CCL4、CCL8和CCL22中的一个或多个或全部并抑制其活性的剂(例如，多肽、抗体、其抗原结合片段、单链多肽或其构建体)。
所述免疫治疗剂可能能够特异性地结合Mahoney等人,Cancer Immunotherapy,14:561-584(2015)的表1中描述的一种或多种免疫靶标，所述文献的公开内容以引用的方式整体并入本文。例如，所述免疫治疗剂可以是特异性地结合以下中的一种或多种的剂，如抗体或其抗原结合片段：OX40L、TL1A、CD40L、LIGHT、BTLA、LAG3、TIM3、Singlecs、ICOS、B7-H3、B7-H4、VISTA、TMIGD2、BTNL2、CD48、KIR、LIR、LIR抗体、ILT、NKG2D、NKG2A、MICA、MICB、CD244、CSF1R、IDO、TGFβ、CD39、CD73、CXCR4、CXCL12、SIRPA、CD47、VEGF或神经纤毛蛋白。
在一些实施方案中，所述免疫治疗剂是塔革雷汀(Targretin)、干扰素-α、氯倍他索(clobestasol)、Peg干扰素(例如，
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)、泼尼松、罗米地辛(Romidepsin)、贝沙罗汀、甲氨蝶呤、曲安西龙乳膏、抗趋化因子、伏立诺他、加巴喷丁、针对淋巴细胞表面受体和/或淋巴因子的抗体、针对表面癌蛋白的抗体和/或小分子疗法如伏立诺他。
在一些实施方案中，药物组合物包含双特异性抗体，如双特异性单克隆抗体，其中抗体的一个臂特异性结合TNFR2，而另一个臂特异性结合免疫检查点蛋白，如本文所述的PD-1、PD-L1或CTLA-4，等等。特异性结合TNFR2的双特异性抗体的臂可以特异性结合例如由CRD3内的一个或多个氨基酸限定的人TNFR2的表位和/或由CRD4内的一个或多个氨基酸限定的表位，如在上文和本文中描述为产生拮抗性(例如，显性拮抗性的)表型的人TNFR2上的表位。
在一些实施方案中，双特异性抗体包含特异性结合TNFR2的一个臂，如上述人TNFR2的表位，和特异性结合免疫检查点蛋白的一个臂，所述免疫检查点蛋白特异性结合PD-1。在一些实施方案中，特异性结合PD-1的双特异性抗体的臂可以与纳武单抗、帕博利珠单抗、阿维鲁单抗、德瓦鲁单抗或阿妥珠单抗特异性结合PD-1上相同的一种或多种表位。例如，特异性结合PD-1的双特异性抗体的臂可以竞争性地抑制PD-1与纳武单抗、帕博利珠单抗、阿维鲁单抗、德瓦鲁单抗和/或阿妥珠单抗的结合，如例如使用本文所述的或本领域已知的竞争性结合测定如竞争性ELISA所评估的。
在一些实施方案中，双特异性抗体包含特异性结合TNFR2的一个臂，如上述人TNFR2的表位，和特异性结合PD-L1的一个臂。在一些实施方案中，特异性结合PD-L1的双特异性抗体的臂可以与阿妥珠单抗或阿维鲁单抗特异性结合PD-L1上的相同的一种或多种表位。例如，通过例如使用本文所述或本领域已知的竞争性结合测定，如竞争性ELISA，特异性结合PD-L1的双特异性抗体的臂可以竞争性地抑制PD-L1与阿妥珠单抗或阿维鲁单抗的结合。
在一些实施方案中，双特异性抗体包含特异性结合TNFR2(如上述人TNFR2的表位)的一个臂和特异性结合CTLA-4的一个臂。在一些实施方案中，特异性结合CTLA-4的双特异性抗体的臂可以与伊匹木单抗或曲美木单抗特异性结合CTLA-4上的相同的一种或多种表位。例如，特异性结合CTLA-4的双特异性抗体的臂可以竞争性地抑制CTLA-4与伊匹木单抗和/或曲美木单抗的结合，如例如使用本文所述或本领域已知的竞争性结合测定如竞争性ELISA所评估的。
在一些实施方案中，药物组合物中的另外的治疗剂是嵌合抗原受体(CAR-T)剂、化学治疗剂、小分子抗癌剂或癌症疫苗。
在一些实施方案中，药物组合物中的另外的治疗剂是嵌合抗原受体(CAR-T)剂，如经工程化以表达特异性结合在癌细胞表面上表达的一种或多种抗原的T细胞受体的T细胞。本文所述的抗体或其抗原结合片段、单链多肽、构建体、多核苷酸、载体或宿主细胞(例如，TNFR2拮抗剂抗体或其抗原结合片段)可被配制成与CAR-T剂共施用，例如通过将所述抗体或其抗原结合片段、单链多肽、构建体、多核苷酸、载体或宿主细胞与CAR-T剂混合来共施用。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段、单链多肽、构建体、多核苷酸、载体或宿主细胞被配制成与化学治疗剂分开施用，如通过连续施用的方式。
在一些实施方案中，药物组合物中的另外的治疗剂是化学治疗剂，如本文所述的化学治疗剂。本文所述的抗体或其抗原结合片段、单链多肽、构建体、多核苷酸、载体或宿主细胞(例如，TNFR2拮抗剂抗体或其抗原结合片段)可被配制成与化学治疗剂共同施用，例如通过将所述抗体或其抗原结合片段、单链多肽、构建体、多核苷酸、载体或宿主细胞与化学治疗剂混合来共同施用。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段、单链多肽、构建体、多核苷酸、载体或宿主细胞被配制成与化学治疗剂分开施用。在一些实施方案中，例如，使用本文所述或本领域已知的成键技术将化学治疗剂直接与抗体或其抗原结合片段、单链多肽、构建体、多核苷酸、载体或宿主细胞缀合。
在一些实施方案中，另外的治疗剂是小分子抗癌剂，如在Imai等人，NatureReviews Cancer 6:714-727(2006)(其公开内容以引用的方式并入本文)中描述的小分子。
在一些实施方案中，另外的治疗剂是癌症疫苗，如在Palucka等人，Journal ofImmunology 186:1325-1331(2011)(其公开内容以引用的方式并入本文)中描述的疫苗。
第七方面的特征是生产第一方面的多肽(例如，单链多肽、抗体、其抗原结合片段或其构建体)和/或第二方面或其任何实施方案的构建体的方法。所述方法可包括在宿主细胞(例如，本文所述的宿主细胞)中表达编码多肽或构建体的多核苷酸，并从宿主细胞培养基中回收所述多肽。
第八方面的特征是减少或抑制哺乳动物(例如，人)中由T-reg细胞介导的免疫响应的方法，该方法通过向哺乳动物施用第一方面或其任何实施方案的多肽(例如，单链多肽、抗体、其抗原结合片段或其构建体)、第二方面或其任何实施方案的构建体、第三方面或其任何实施方案的多核苷酸、第四方面或其任何实施方案的载体、第五方面或其任何实施方案的宿主细胞，和/或第六方面或其任何实施方案的药物组合物。
第九方面的特征是通过向哺乳动物施用第一方面或其任何实施方案的多肽(例如，单链多肽、抗体、其抗原结合片段或其构建体)、第二方面或其任何实施方案的构建体、第三方面或其任何实施方案的多核苷酸、第四方面或其任何实施方案的载体、第五方面或其任何实施方案的宿主细胞和/或第六方面或其任何实施方案的药物组合物来治疗哺乳动物(例如，人)中的细胞增殖病症的方法。
细胞增殖病症可以是例如癌症，如选自由以下组成的组的癌症：白血病、淋巴瘤、肝癌、骨癌、肺癌、脑癌、膀胱癌、胃肠癌、乳腺癌、贲门癌、宫颈癌、子宫癌、头颈癌、胆囊癌、喉癌、唇癌和口腔癌、眼癌、黑色素瘤、胰腺癌、前列腺癌、结直肠癌、睾丸癌和喉癌。在一些实施方案中，癌症选自由以下组成的组：霍奇金淋巴瘤、皮肤非霍奇金淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、卵巢癌、结肠癌、多发性骨髓瘤、肾细胞癌、皮肤癌、肺癌、肝癌、子宫内膜癌、造血或淋巴系统癌症、中枢神经系统癌症、乳腺癌、胰腺癌、胃癌、食道癌和上消化道癌症。在一些实施方案中，癌症选自由以下组成的组：T细胞淋巴瘤、卵巢癌和结肠癌。
在一些实施方案中，癌症选自由以下组成的组：急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性骨髓性白血病(CML)、肾上腺皮质癌、AIDS相关淋巴瘤、原发性CNS淋巴瘤、肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤、非典型畸胎瘤样/横纹肌样瘤、基底细胞癌、胆管癌、肝外癌、尤文肉瘤家族、骨肉瘤和恶性纤维组织细胞瘤、中枢神经系统胚胎肿瘤、中枢神经系统生殖细胞肿瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、支气管肿瘤、伯基特淋巴瘤、类癌肿瘤、原发性淋巴瘤、脊索瘤、慢性骨髓增生性肿瘤、结肠癌、肝外胆管癌、原位导管癌(DCIS)、子宫内膜癌、室管膜瘤、食道癌、成感觉神经细胞瘤、颅外生殖细胞肿瘤、性腺外生殖细胞肿瘤、输卵管癌、骨纤维组织细胞瘤、胃肠类癌肿瘤、胃肠间质肿瘤(GIST)、睾丸生殖细胞肿瘤、妊娠滋养细胞疾病、神经胶质瘤、儿童脑干神经胶质瘤、毛细胞白血病、肝细胞癌、朗格汉斯细胞组织细胞增生症、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、胰岛细胞肿瘤、胰腺神经内分泌肿瘤、威尔姆斯肿瘤和其他儿童肾脏肿瘤、朗格汉斯细胞组织细胞增生症、小细胞肺癌、皮肤T细胞淋巴瘤、眼内黑色素瘤、梅克尔细胞癌、间皮瘤、转移性鳞状颈癌、中线道癌、多发性内分泌瘤形成综合征、多发性骨髓瘤/浆细胞肿瘤、骨髓增生异常综合征、鼻腔和副鼻窦癌、鼻咽癌、成神经细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、非小细胞肺癌(NSCLC)、上皮性卵巢癌、生殖细胞卵巢癌、低恶性潜能卵巢癌、胰腺神经内分泌肿瘤、乳头瘤病、副神经节瘤、副鼻窦和鼻腔癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、垂体肿瘤、胸膜肺母细胞瘤、原发性腹膜癌、直肠癌、肾癌、成视网膜细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、卡波济肉瘤、横纹肌肉瘤、塞扎里综合征(sézary syndrome)、小肠癌、软组织肉瘤、喉癌、胸腺瘤和胸腺癌、甲状腺癌、肾盂和输尿管移行细胞癌、尿道癌、子宫内膜子宫癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌以及瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症。
第十方面的特征是通过向哺乳动物施用第一方面或其任何实施方案的多肽(例如单链多肽、抗体、其抗原结合片段或其构建体)、第二方面或其任何实施方案的构建体、第三方面或其任何实施方案的多核苷酸、第四方面或其任何实施方案的载体、第五方面或其任何实施方案的宿主细胞和/或第六方面或其任何实施方案的药物组合物来治疗哺乳动物(例如，人)中的感染性疾病的方法。传染病可以是例如由病毒、细菌、真菌和/或寄生虫引起的。
在一些实施方案中，所述感染性疾病由选自由以下组成的组的病毒引起：丙型肝炎病毒、黄热病病毒、凯丹姆病毒、科萨努尔森林病病毒、兰加特病毒、鄂木斯克出血热病毒、波瓦森病毒、皇家农场病毒、喀什病毒、蜱传脑炎病毒、纽多佛病毒、索夫吉病毒、跳跃病病毒、根岸病毒、米班病毒、索马里兹礁病毒、秋列尼病毒、阿罗阿病毒、登革病毒、凯杜古病毒、卡西帕科利病毒、库坦戈病毒、日本脑炎病毒、墨累谷脑炎病毒、圣路易斯脑炎病毒、乌苏图病毒、西尼罗河病毒、雅温德病毒、科科贝拉病毒、巴加扎病毒、伊利乌斯病毒、以色列火鸡脑脊膜脑脊髓炎病毒、恩塔亚病毒、坦布苏病毒、寨卡病毒、班齐病毒、博博衣病毒、边山病毒、朱格拉病毒、萨沃亚病毒，赛皮克病毒、乌干达S病毒、韦塞尔斯布朗病毒、黄热病毒、恩德培蝙蝠病毒、横须贺病毒、阿波依病毒、牛骨山脊病毒、胡蒂亚帕病毒、摩多克病毒、萨尔别霍病毒、圣帕利塔病毒，布卡拉沙蝙蝠病毒、凯里岛病毒、达卡尔蝙蝠病毒、蒙大拿鼠耳蝙蝠脑白质炎病毒、金边蝙蝠病毒、里约布拉沃病毒、塔马纳蝙蝠病毒、细胞融合因子病毒、伊皮病毒、拉沙病毒、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)、莫巴拉病毒、莫佩亚病毒、阿马帕里病毒、弗莱克索病毒、瓜纳里托病毒、胡宁病毒、拉蒂诺病毒、马邱波病毒、奥利华斯病毒、巴拉那病毒、皮钦德病毒、皮里陶病毒、萨比亚病毒、塔卡里伯病毒、太米阿米病毒、怀特沃特阿罗约病毒、查帕雷病毒、卢约病毒、汉坦病毒、辛诺柏病毒、道格比病毒、布尼奥罗病毒、裂谷热病毒、拉克罗斯病毒、加利福尼亚脑炎病毒、克里米亚-刚果出血热(CCHF)病毒、埃博拉病毒、马尔堡病毒、委内瑞拉马脑炎病毒(VEE)、东方马脑炎病毒(EEE)、西方马脑炎病毒(WEE)、辛德毕斯病毒、风疹病毒、塞姆利基森林病毒、罗斯河病毒、巴马森林病毒、阿尼昂-尼昂病毒(O’nyong’nyong virus)和基孔肯雅病毒、天花病毒、猴痘病毒、牛痘病毒、单纯疱疹病毒、人疱疹病毒、巨细胞病毒(CMV)、爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)、水痘-带状疱疹病毒、卡波西氏肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)、流感病毒、严重急性呼吸综合征(SARS)病毒、狂犬病毒、水疱性口炎病毒(VSV)、人呼吸道合胞病毒(RSV)、新城疫病毒、亨德拉病毒、尼帕病毒、麻疹病毒、牛瘟病毒、犬瘟热病毒、仙台病毒、人副流感病毒(例如，1、2、3和4)、鼻病毒、腮腺炎病毒、脊髓灰质炎病毒、人肠道病毒(A、B、C和D)、甲型肝炎病毒、柯萨奇病毒、乙型肝炎病毒、人乳头状瘤病毒、腺相关病毒、星状病毒、JC病毒、BK病毒、SV40病毒、诺沃克病毒、轮状病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)、人T-嗜淋巴细胞病毒I型和II型。
在一些实施方案中，所述感染性疾病由属于选自由以下组成的组的属的细菌引起：沙门氏菌属、链球菌属、芽孢杆菌属、李斯特菌属、棒状杆菌属、诺卡氏菌属、奈瑟氏菌属、放线杆菌属、莫拉氏菌属、肠杆菌属、假单胞菌属、埃希氏菌属、克雷伯氏菌属、沙雷氏菌属、肠杆菌属、变形杆菌属、沙门氏菌属、志贺氏菌属、耶尔森氏菌属、嗜血杆菌属、博德特氏菌属、军团菌属、巴斯德氏菌属、弗朗西斯氏菌属、布鲁氏菌属、巴尔通氏体属、梭菌属、弧菌属、弯曲杆菌属和葡萄球菌属。
在一些实施方案中，所述感染性疾病由选自由以下组成的组的真菌引起：曲霉属、假丝酵母属、马拉色菌属、毛孢子菌属、镰刀菌属、枝顶孢属、根霉菌属、毛霉菌属、肺囊虫属和犁头霉属。
在一些实施方案中，所述感染性疾病由选自由以下组成的组的寄生虫引起：溶组织内阿米巴、兰伯氏贾第虫、鼠型隐孢子虫、冈比亚锥虫、罗德西亚锥虫、克氏锥虫、墨西哥利什曼原虫、巴西利什曼原虫、热带利什曼原虫、杜氏利什曼原虫、刚地弓形虫、间日疟原虫、卵形疟原虫、三日疟原虫、镰状疟原虫、阴道毛滴虫和火鸡组织滴虫。示例性蠕虫寄生虫包括毛首鞭形线虫、人蛔虫、蛲虫、十二指肠钩虫、美洲钩虫、粪类圆线虫、班氏丝虫和麦地那龙线虫、曼氏血吸虫、埃及血吸虫、日本血吸虫、肝片吸虫、大片吸虫、异形吸虫、卫氏并殖吸虫、猪带绦虫、牛带绦虫、短膜壳绦虫和细粒棘球绦虫。
在第八、第九和/或第十方面的一些实施方案中，所述方法还包括向人施用免疫治疗剂。免疫治疗剂可以例如选自由以下组成的组：抗CTLA-4剂、抗PD-1剂、抗PD-L1剂、抗PD-L2剂、TNF-α交联剂、TRAIL交联剂、抗CD27剂、抗CD30剂、抗CD40剂、抗4-1BB剂、抗GITR剂、抗OX40剂、抗TRAILR1剂、抗TRAILR2剂、抗TWEAK剂、抗TWEAKR剂、抗细胞表面淋巴细胞蛋白剂、抗BRAF剂、抗MEK剂、抗CD33剂、抗CD20剂、抗HLA-DR剂、抗HLA I类剂、抗CD52剂、抗A33剂、抗GD3剂、抗PSMA剂、抗Ceacan1剂、抗Galedin 9剂、抗HVEM剂、抗VISTA剂、抗B7H4剂、抗HHLA2剂、抗CD155剂、抗CD80剂、抗BTLA剂、抗CD160剂、抗CD28剂、抗CD226剂、抗CEACAM1剂、抗TIM3剂、抗TIGIT剂、抗CD96剂、抗CD70剂、抗CD27剂、抗LIGHT剂、抗CD137剂、抗DR4剂、抗CR5剂、抗TNFRS剂、抗TNFR1剂、抗FAS剂、抗CD95剂、抗TRAIL剂、抗DR6剂、抗EDAR剂、抗NGFR剂、抗OPG剂、抗RANKL剂、抗LTβ受体剂、抗BCMA剂、抗TACI剂、抗BAFFR剂、抗EDAR2剂、抗TROY剂和抗RELT剂，如抗CTLA-4剂、抗PD-1剂和/或抗PD-L1剂。
向人施用的免疫治疗剂可以是例如选自由以下组成的组：抗CTLA-4抗体或其抗原结合片段、抗PD-1抗体或其抗原结合片段、抗PD-L1抗体或其抗原结合片段、抗PD-L2抗体或其抗原结合片段、TNF-α交联抗体或其抗原结合片段、TRAIL交联抗体或其抗原结合片段、抗CD27抗体或其抗原结合片段、抗CD30抗体或其抗原结合片段、抗CD40抗体或其抗原结合片段、抗4-1BB抗体或其抗原结合片段、抗GITR抗体或其抗原结合片段、抗OX40抗体或其抗原结合片段、抗TRAILR1抗体或其抗原结合片段、抗TRAILR2抗体或其抗原结合片段、抗TWEAK抗体或其抗原结合片段、抗TWEAKR抗体或其抗原结合片段、抗细胞表面淋巴细胞蛋白抗体或其抗原结合片段、抗BRAF抗体或其抗原结合片段、抗MEK抗体或其抗原结合片段、抗CD33抗体或其抗原结合片段、抗CD20抗体或其抗原结合片段、抗HLA-DR抗体或其抗原结合片段、抗HLAI类抗体或其抗原结合片段、抗CD52抗体或其抗原结合片段、抗A33抗体或其抗原结合片段、抗GD3抗体或其抗原结合片段、抗PSMA抗体或其抗原结合片段、抗Ceacan 1抗体或其抗原结合片段、抗Galedin 9抗体或其抗原结合片段、抗HVEM抗体或其抗原结合片段、抗VISTA抗体或其抗原结合片段、抗B7H4抗体或其抗原结合片段、抗HHLA2抗体或其抗原结合片段、抗CD155抗体或其抗原结合片段、抗CD80抗体或其抗原结合片段、抗BTLA抗体或其抗原结合片段、抗CD160抗体或其抗原结合片段、抗CD28抗体或其抗原结合片段、抗CD226抗体或其抗原结合片段、抗CEACAM1抗体或其抗原结合片段、抗TIM3抗体或其抗原结合片段、抗TIGIT抗体或其抗原结合片段、抗CD96抗体或其抗原结合片段、抗CD70抗体或其抗原结合片段、抗CD27抗体或其抗原结合片段、抗LIGHT抗体或其抗原结合片段、抗CD137抗体或其抗原结合片段、抗DR4抗体或其抗原结合片段、抗CR5抗体或其抗原结合片段、抗TNFRS抗体或其抗原结合片段、抗TNFR1抗体或其抗原结合片段、抗FAS抗体或其抗原结合片段、抗CD95抗体或其抗原结合片段、抗TRAIL抗体或其抗原结合片段、抗DR6抗体或其抗原结合片段、抗EDAR抗体或其抗原结合片段、抗NGFR抗体或其抗原结合片段、抗OPG抗体或其抗原结合片段、抗RANKL抗体或其抗原结合片段、抗LTβ受体抗体或其抗原结合片段、抗BCMA抗体或其抗原结合片段、抗TACI抗体或其抗原结合片段、抗BAFFR抗体或其抗原结合片段、抗EDAR2抗体或其抗原结合片段、抗TROY抗体或其抗原结合片段以及抗RELT抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，向人施用的免疫治疗剂是抗CTLA-4抗体或其抗原结合片段、抗PD-1抗体或其抗原结合片段、或抗PD-L1抗体或其抗原结合片段。
在第八、第九和/或第十方面的一些实施方案中，所述方法包括向哺乳动物(例如，人)施用抗CTLA-4抗体或其抗原结合片段，如伊匹木单抗或曲美木单抗。另外地或可选地，所述方法可包括向人施用抗PD-1抗体或其抗原结合片段，如纳武单抗、帕博利珠单抗、阿维鲁单抗、德瓦鲁单抗或阿妥珠单抗。
在第八、第九和/或第十方面的一些实施方案中，所述方法包括向哺乳动物(例如，人)施用抗细胞表面淋巴细胞蛋白抗体或其抗原结合片段，如结合以下的一种或多种的抗体或其抗原结合片段：CD1、CD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD9、CD10、CD11、CD12、CD13、CD14、CD15、CD16、CD17、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD26、CD27、CD28、CD29、CD30、CD31、CD32、CD33、CD34、CD35、CD36、CD37、CD38、CD39、CD40、CD41、CD42、CD43、CD44、CD45、CD46、CD47、CD48、CD49、CD50、CD51、CD52、CD53、CD54、CD55、CD56、CD57、CD58、CD59、CD60、CD61、CD62、CD63、CD64、CD65、CD66、CD67、CD68、CD69、CD70、CD71、CD72、CD73、CD74、CD75、CD76、CD77、CD78、CD79、CD80、CD81、CD82、CD83、CD84、CD85、CD86、CD87、CD88、CD89、CD90、CD91、CD92、CD93、CD94、CD95、CD96、CD97、CD98、CD99、CD100、CD101、CD102、CD103、CD104、CD105、CD106、CD107、CD108、CD109、CD110、CD111、CD112、CD113、CD114、CD115、CD116、CD117、CD118、CD119、CD120、CD121、CD122、CD123、CD124、CD125、CD126、CD127、CD128、CD129、CD130、CD131、CD132、CD133、CD134、CD135、CD136、CD137、CD138、CD139、CD140、CD141、CD142、CD143、CD144、CD145、CD146、CD147、CD148、CD149、CD150、CD151、CD152、CD153、CD154、CD155、CD156、CD157、CD158、CD159、CD160、CD161、CD162、CD163、CD164、CD165、CD166、CD167、CD168、CD169、CD170、CD171、CD172、CD173、CD174、CD175、CD176、CD177、CD178、CD179、CD180、CD181、CD182、CD183、CD184、CD185、CD186、CD187、CD188、CD189、CD190、CD191、CD192、CD193、CD194、CD195、CD196、CD197、CD198、CD199、CD200、CD201、CD202、CD203、CD204、CD205、CD206、CD207、CD208、CD209、CD210、CD211、CD212、CD213、CD214、CD215、CD216、CD217、CD218、CD219、CD220、CD221、CD222、CD223、CD224、CD225、CD226、CD227、CD228、CD229、CD230、CD231、CD232、CD233、CD234、CD235、CD236、CD237、CD238、CD239、CD240、CD241、CD242、CD243、CD244、CD245、CD246、CD247、CD248、CD249、CD250、CD251、CD252、CD253、CD254、CD255、CD256、CD257、CD258、CD259、CD260、CD261、CD262、CD263、CD264、CD265、CD266、CD267、CD268、CD269、CD270、CD271、CD272、CD273、CD274、CD275、CD276、CD277、CD278、CD279、CD280、CD281、CD282、CD283、CD284、CD285、CD286、CD287、CD288、CD289、CD290、CD291、CD292、CD293、CD294、CD295、CD296、CD297、CD298、CD299、CD300、CD301、CD302、CD303、CD304、CD305、CD306、CD307、CD308、CD309、CD310、CD311、CD312、CD313、CD314、CD315、CD316、CD317、CD318、CD319和/或CD320。
在第八、第九和/或第十方面的一些实施方案中，所述法包括向哺乳动物(例如，人)施用结合趋化因子或淋巴因子(如参与肿瘤生长的趋化因子或淋巴因子)的剂(例如，多肽、抗体、其抗原结合片段、单链多肽或其构建体)。例如，免疫治疗剂可以是结合CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL8、CCL2和CCL5中的一个或多个或全部并抑制其活性的剂(例如，多肽、抗体、其抗原结合片段、单链多肽或其构建体)。在一些实施方案中，免疫治疗剂是结合CCL3、CCL4、CCL8和CCL22中的一个或多个或全部并抑制其活性的剂(例如，多肽、抗体、其抗原结合片段、单链多肽或其构建体)。
在第八、第九和/或第十方面的一些实施方案中，所述方法包括向哺乳动物(例如，人)施用免疫治疗剂，所述免疫治疗剂能够特异性结合Mahoney等人，CancerImmunotherapy,14:561-584(2015)(其公开内容以引用的方式整体并入本文)的表1中描述的一种或多种免疫靶标。例如，免疫治疗剂可以是特异性结合以下的一种或多种的剂，如抗体或其抗原结合片段：OX40L、TL1A、CD40L、LIGHT、BTLA、LAG3、TIM3、Singlecs、ICOS、B7-H3、B7-H4、VISTA、TMIGD2、BTNL2、CD48、KIR、LIR、LIR抗体、ILT、NKG2D、NKG2A、MICA、MICB、CD244、CSF1R、IDO、TGFβ、CD39、CD73、CXCR4、CXCL12、SIRPA、CD47、VEGF或神经毡蛋白(neuropilin)。
在第八、第九和/或第十方面的一些实施方案中，所述方法包括向哺乳动物(例如，人)施用免疫治疗剂，所述免疫治疗剂选自由以下组成的组：塔革雷汀、干扰素-α、氯贝他索、Peg干扰素(例如，
Figure BDA0003027090150000851
)、泼尼松、罗米地新、贝沙罗汀(Bexarotene)、甲氨蝶呤、曲安西龙乳膏、抗趋化因子、伏力诺他、加巴喷丁、针对淋巴细胞表面受体和/或淋巴因子的抗体、针对表面癌症蛋白的抗体和小分子疗法如伏力诺他。
在一些实施方案中，所述方法包括向哺乳动物(例如，人)施用CAR-T剂、化学治疗剂、小分子抗癌剂或癌症疫苗，如上文和本文所述的CAR-T剂、化学治疗剂、小分子抗癌剂或癌症疫苗。
在一些实施方案中，向哺乳动物(例如，人)以约0.001mg/kg至约100mg/kg的量如以约0.01mg/kg至约10mg/kg的量施用特异性结合TNFR2的多肽，如单链多肽、抗体、其抗原结合片段或构建体。
第十一方面的特征是药盒，其包含第一方面或其任何实施方案的多肽(例如，单链多肽、抗体、其抗原结合片段或其构建体)、第二方面或其任何实施方案的构建体、第三方面或其任何实施方案的多核苷酸、第四方面或其任何实施方案的载体、第五方面或其任何实施方案的宿主细胞和/或第六方面或其任何实施方案的药物组合物。
在一些实施方案中，药盒包含将载体转染入宿主细胞的说明。另外地或可选地，药盒可包括在宿主细胞中表达多肽(例如，单链多肽、抗体、其抗原结合片段或其构建体)的说明。药盒可包括可用于在宿主细胞中表达多肽(例如，单链多肽、抗体、其抗原结合片段或其构建体)的试剂。在一些实施方案中，药盒包括用于向哺乳动物(例如，人)如患有本文所述的细胞增殖病症和/或感染性疾病的人患者施用剂的说明。在一些实施方案中，药盒包括制造或使用剂的说明。
定义
如本文所用，术语“约”是指高于或低于所描述值的不超过10％的值。例如，术语“约5nM”指示4.5nM至5.5nM的范围。
如本文所用，术语“抗体”(Ab)是指特异性地结合至特定抗原或与特定抗原免疫反应的免疫球蛋白分子，并且包括多克隆、单克隆、遗传工程化和以其他方式修饰形式的抗体，包括但不限于嵌合抗体、人源化抗体、灵长类化抗体、异缀合物抗体(例如，双-、三-和四-特异性抗体、双抗体、三抗体和四抗体)以及抗体的抗原结合片段，包括例如Fab'、F(ab')2、Fab、Fv、rlgG和scFv片段。此外，除非另外说明，否则术语“单克隆抗体”(mAb)是指包括完整分子以及能够特异性地结合至靶蛋白的抗体片段(例如像，Fab和F(ab')2片段)两者。Fab和F(ab')2片段缺乏完整抗体的Fc片段，从动物的循环中更快地清除，并且可具有比完整抗体更少的非特异性组织结合(参见Wahl等人，J.Nucl.Med.24:316,1983；以引用的方式并入本文)。
如本文所用的术语“抗原结合片段”是指抗体的保留特异性地结合至靶抗原的能力的一个或多个片段。抗体的抗原结合功能可由全长抗体的片段执行。抗体片段可以是Fab、F(ab’)2、scFv、SMIP、双抗体、三抗体、亲和体、纳米抗体、适体或结构域抗体。涵盖于术语抗体的“抗原结合片段”中的结合片段的实例包括但不限于：(i)Fab片段，一种由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，一种包含在铰链区处通过二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(v)包含VH和VL结构域的dAb；(vi)dAb片段(Ward等人,Nature 341:544-546,1989)，其由VH结构域组成；(vii)由VH或VL结构域组成的dAb；(viii)分离的互补决定区(CDR)；以及(ix)两个或更多个分离的CDR的组合，所述CDR可任选地通过合成接头连接。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由单独基因编码，但它们可使用重组方法通过接头连接，所述接头使它们能够制成其中VL和VH区配对以形成单价分子的单一蛋白质链(称为单链Fv(scFv)；参见例如，Bird等人,Science 242:423-426,1988和Huston等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883,1988)。可使用本领域技术人员已知的常规技术来获得这些抗体片段，并且可以与完整抗体相同的方式筛选所述片段的效用。抗原结合片段可通过重组DNA技术、完整免疫球蛋白的酶促或化学裂解或者在一些实施方案中通过本领域中已知的化学肽合成程序而产生。
如本文所用，术语“抗肿瘤坏死因子受体2抗体”、“TNFR2抗体”、“抗TNFR2抗体部分”和/或“抗TNFR2抗体片段”等包括能够特异性地结合至TNFR2的任何含蛋白质或肽的分子，所述分子包含免疫球蛋白分子的至少一部分，如但不限于重链或轻链的至少一个互补决定区(CDR)或其配体结合部分、重链或轻链可变区、重链或轻链恒定区或其任何部分。例如，免疫球蛋白分子的两个或更多个部分可例如通过酰胺键、硫醚键、碳-碳键、二硫桥键或通过接头(如本文描述或本领域中已知的接头)彼此共价结合。TNFR2抗体还包括抗体样蛋白支架，如第十纤连蛋白III型结构域(10Fn3)，其含有在结构以及对抗体CDR的溶剂可及性方面相似的BC、DE和FG结构环。10Fn3结构域的三级结构类似于IgG重链的可变区的三级结构，并且本领域技术人员可通过用来自TNFR2单克隆抗体的CDR-H1、CDR-H2或CDR-H3区的残基替代10Fn3的BC、DE和FG环的残基来将例如TNFR2单克隆抗体的CDR移植到纤连蛋白支架上。
如本文所用，术语“拮抗剂TNFR2抗体”和“拮抗性TNFR2抗体”是指能够抑制或降低TNFR2的活化，减弱由TNFR2介导的一种或多种信号转导途径，和/或降低或抑制由TNFR2的活化介导的至少一种活性的TNFR2抗体。例如，拮抗性TNFR2抗体可抑制或减少调节性T细胞的生长和增殖。拮抗性TNFR2抗体可通过阻断TNFR2结合TNFα来抑制或降低TNFR2活化。以这种方式，拮抗性TNFR2抗体可阻断TNFR2的三聚化，否则所述TNFR2的三聚化将通过与TNFα相互作用诱导、从而导致TNFR2活性的遏制。
如本文所用，术语“双特异性抗体”是指对至少两种不同的抗原具有结合特异性的抗体(例如，单克隆抗体，通常是人或人源化抗体)。例如，结合特异性中的一种可针对TNFR2，并且另一种可针对任何其他抗原，例如针对细胞表面蛋白、受体、受体亚基、组织特异性抗原、病毒源性蛋白、病毒编码包膜蛋白、细菌源性蛋白或细菌表面蛋白等。
如本文所用，短语“化学治疗剂”是指在治疗癌症(如本文所述的癌症)中具有治疗有用性的任何化学试剂。化学治疗剂涵盖化学剂和生物剂两者。这些剂可起到抑制细胞活性的作用，癌细胞依赖于细胞活性以继续存活。化学治疗剂的类别包括烷化/生物碱剂、抗代谢物、激素、激素类似物和抗肿瘤药物。适合与本文所述的组合物和方法结合使用的示例性化学治疗剂包括但不限于Slapak和Kufe,Principles of Cancer Therapy,Chapter86in Harrison's Principles of Internal medicine,第14版；Perry等人,Chemotherapeutic,Chapter 17in Abeloff,Clinical Oncology第2版,2000；Baltzer L.和Berkery R.(编):Oncology Pocket Guide to Chemotherapeutic,第2版St.Luois,mosby-Year Book,1995；Fischer D.S.,Knobf M.F.,Durivage H.J.(编):The CancerChemotherapeutic Handbook,第4版St.Luois,Mosby-Year Handbook中列出的那些，其各自的公开内容均以引用的方式并入本文，因为它们属于化学治疗剂。
如本文所用，术语“嵌合”抗体是指具有源自一种来源生物(如大鼠或小鼠)的免疫球蛋白的可变结构域序列(例如，CDR序列)和源自不同生物体(例如，人、另一种灵长类动物、猪、山羊、兔、仓鼠、猫、狗、豚鼠、牛科的成员(如牛、野牛、水牛、麋鹿和牦牛等)、奶牛、绵羊、马或野牛等)的免疫球蛋白的恒定区的抗体。用于产生嵌合抗体的方法是本领域中已知的。参见例如，Morrison,1985,Science229(4719):1202-7；Oi等人,1986,BioTechniques4:214-221；Gillies等人,1985,J.Immunol.Methods 125:191-202；美国专利号5,807,715；4,816,567；和4,816,397；其以引用的并入本文。
如本文所用，术语“互补决定区”(CDR)是指在轻链和重链可变结构域中发现的高变区。可变结构域的更高度保守的部分被称为框架区(FR)。如本领域所理解的，描绘抗体的高变区的氨基酸位置可根据上下文和本领域中已知的各种定义而变化。可变结构域内的一些位置可被视为杂合高变位置，因为这些位置可被认为是在一组标准下的高变区内，同时被认为是在不同组标准下的高变区之外。这些位置中的一个或多个也可在扩增的高变区中找到。本文所述的抗体可在这些杂合高变位置中包含修饰。天然重链和轻链的可变结构域各自包含通过三个CDR连接的四个框架区，所述框架区主要采用β-折叠构型，所述CDR形成连接β-折叠结构并且在一些情况下形成β-折叠结构的一部分的环。每条链中的CDR通过FR区按顺序FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4紧密靠近地保持在一起，并且与来自其他抗体链的CDR一起有助于抗体的靶结合位点的形成(参见Kabat等人,Sequences of Proteinsof Immunological Interest(National Institute of Health,Bethesda,Md.1987；其以引用的并入本文)。如本文所用，除非另有说明，否则根据Kabat等人的免疫球蛋白氨基酸残基编号系统进行免疫球蛋白氨基酸残基的编号。
如本文所用，术语“保守突变”、“保守取代”或“保守氨基酸取代”是指一个或多个氨基酸取代表现出类似物理化学性质(如极性、静电荷和空间体积)的一个或多个不同的氨基酸。对于以下表2中的20种天然存在的氨基酸中的每一种，总结了这些性质。
表2.天然存在的氨基酸的代表性物理化学性质
Figure BDA0003027090150000901
从此表可以看出，保守氨基酸家族包括例如(i)G、A、V、L、I、P和M；(ii)D和E；(iii)C、S和T；(iv)H；K和R；(v)N和Q；以及(vi)F、Y；并且W.A保守突变或取代因此是一种氨基酸取代相同氨基酸家族的成员的突变或取代(例如，Ser取代Thr或Lys取代Arg)。
氨基酸取代在本文中可以使用以下约定来表示：(AA1)(N)(AA2)，其中“AA1”表示通常存在于氨基酸序列中特定位点的氨基酸，“N”表示发生取代的氨基酸序列中的残基号，“AA2”表示完成取代后存在于所述氨基酸序列中的氨基酸。例如，在抗体铰链区(如IgG2抗体铰链区)的上下文中，符号“C232S”是指天然存在的半胱氨酸残基对所示铰链氨基酸序列的氨基酸残基232处的丝氨酸残基的取代。同样，在抗体铰链区(如IgG2抗体铰链区)的上下文中，符号“C233S”是指天然存在的半胱氨酸残基对所示铰链氨基酸序列的氨基酸残基233处的丝氨酸残基的取代。
如本文所用，术语“缀合物”是指通过一个分子的反应性官能团与另一个分子的适当反应性官能团的化学键合形成的化合物。
如本文在TNFR2拮抗剂的背景下所用，术语“构建体”是指含有与第二多肽结构域结合的第一多肽结构域的融合蛋白。多肽结构域可各自独立地为拮抗性TNFR2单链多肽，例如，如本文所述。第一多肽结构域可例如通过接头如肽接头或二硫桥等与第二多肽结构域共价结合。可用于连接拮抗性TNFR2构建体的多肽结构域的示例性接头包括但不限于在Leriche等人,Bioorg.Med.Chem.,20:571-582(2012)中描述的那些，其公开内容以引用的方式整体并入本文。
如本文所用，术语“衍生化抗体”是指通过化学反应进行修饰以便裂解残基的抗体或添加对分离的抗体不是天然的化学部分。衍生化抗体可通过糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、通过添加已知的化学保护/封闭基团衍生化、蛋白水解裂解、与细胞配体或其他蛋白质的键联来获得。可通过已知技术进行多种化学修饰中的任一种，所述技术包括但不限于使用已建立的程序的特异性化学裂解、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成等。另外，衍生物可含有一种或多种非天然氨基酸，例如使用琥珀抑制技术(参见例如，美国专利号6,964,859；以引用的方式并入本文)。
如本文所用，术语“双抗体”是指包含两条多肽链的二价抗体，其中每条多肽链包含通过太短的接头(例如，由五个氨基酸组成的接头)连接的VH和VL结构域以允许同一肽链上的VH和VL结构域的分子内缔合。这种构型迫使每个结构域与另一条多肽链上的互补结构域配对，以便形成同二聚体结构。因此，术语“三抗体”是指包含三条肽链的三价抗体，所述肽链各自含有通过极短的接头(例如，由1-2个氨基酸组成的接头)连接的一个VH结构域和一个VL结构域以允许同一肽链内的VH和VL结构域的分子内缔合。为了折叠成它们的天然结构，以这种方式配置的肽通常是三聚化以便将相邻肽链的VH和VL结构域定位成在空间上彼此接近以允许适当的折叠(参见Holliger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-48,1993；以引用的方式并入本文)。
如本文中所用，抗体或其抗原结合片段的“二硫键结合的同种型”是具有特定内部二硫键结合模式的抗体或其抗原结合片段的形式。二硫键结合的同种型是给定抗体或其抗原结合片段的结构异构体，它们在氨基酸序列上彼此没有区别，但表现出不同的二硫键连接性。例如，在人IgG2抗体或其变体的上下文下，抗体可以以四种可能的二硫键结合的同种型(在本文中表示为同种型IgG2-A、IgG2-B、IgG2-A/B1和IgG2-A/B2)之一存在。图13A-图13D中图示了这些同种型中的每一种内的二硫键结合连接性。
如本文所用，TNFR2的“显性拮抗剂”是即使在TNFR2激动剂如TNFα或IL-2存在下也能够抑制TNFR2活化的拮抗剂(例如，拮抗性多肽，如单链多肽、抗体或其抗原结合片段)。例如，如果在TNFR2激动剂(例如，TNFα)或IL-2存在下拮抗剂的IC50相对于如在TNFR2激动剂(如TNFα或IL-2)不存在下在相同测定中测量的拮抗剂的IC50增加小于200％(例如，小于200％、100％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、1％或更少)，则TNFR2拮抗剂是显性拮抗剂。可例如通过测量TNFR2+细胞(如T-reg细胞，表达TNFR2的癌细胞，或骨髓源性抑制细胞)的增殖的抑制以及通过测量NFκB信号传导的抑制(例如，通过在常规基因表达测定中监测选自由CHUK、NFKBIE、NFKBIA、MAP3K11、TRAF2、TRAF3、relB以及cIAP2/BIRC3组成的组的一种或多种基因的表达降低来评估TNFR2活化的抑制)。
如本文所用，“双重可变结构域免疫球蛋白”(“DVD-Ig”)是指通过接头组合两种单克隆抗体的靶结合可变结构域以产生四价双重靶向单一剂的抗体。(Gu等人,Meth.Enzymol.,502:25-41,2012；以引用的方式并入本文)。用于本文所述的DVD的轻链的合适接头包括Gu等人的第30页上表2.1中鉴定的那些：短K链接头ADAAP(SEQ ID NO:118)(鼠)和TVAAP(SEQ ID NO:119)(人)；长k链接头ADAAPTVSIFP(SEQ ID NO:120)(鼠)和TVAAPSVFIFPP(SEQ ID NO:121)(人)；短λ链接头QPKAAP(SEQ ID NO:122)(人)；长λ链接头QPKAAPSVTLFPP(SEQ ID NO:123)(人)；GS-短接头GGSGG(SEQ ID NO:124)，GS-培养基接头GGSGGGGSG(SEQ ID NO:125)和GS-长接头GGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:126)(所有GS接头都是鼠和人)。用于DVD的重链的合适接头包括在Gu&Ghayur,2012,Methods in Enzymology502:25-41的第30页上的表2.1中鉴定的那些，所述文献以引用的方式并入本文：短接头AKTTAP(SEQ ID NO:127)(鼠)和ASTKGP(SEQ ID NO:128)(人)；长接头AKTTAPSVYPLAP(SEQID NO:129)(鼠)和ASTKGPSVFPLAP(SEQ ID NO:130)(人)；GS-短接头GGGGSG(SEQ ID NO:131)，GS-培养基接头GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:26)和GS-长接头GGGGSGGGGSGGGG(SEQ IDNO:133)(所有GS接头都是鼠和人)。
如本文所用，术语“内源性”描述天然存在于特定生物体(例如人)中或生物体内的特定位置(例如，器官、组织或细胞，如人细胞)中的分子(例如，多肽、核酸或辅因子)。
如本文中所用，术语“表位”是指被本文所述的多肽如抗体、其抗原结合片段、单链多肽或构建体识别并结合的抗原的部分。在蛋白质抗原(如TNFR2，例如由SEQ ID NO:7指定的人TNFR2或非人哺乳动物(诸本文所述的非人哺乳动物)的TNFR2)的上下文中，表位可以是连续的表位，其为通过肽键彼此共价连接的一个或多个氨基酸的单个不间断片段，其中所有组成氨基酸都结合所述多肽(例如抗体、其抗原结合片段、单链多肽或其构建体)。下面的实施例1中描述了用于确定拮抗性TNFR2多肽与抗原内的特定氨基酸结合的示例性测定。连续的表位可以由例如抗原，如本文所述的TNFR2蛋白(例如，由SEQ ID NO:7指定的人TNFR2)中的1个、5个、10个、15个、20个或更多个氨基酸组成。例如，连续表位可由抗原内的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个或更多个氨基酸组成。本文所述的由拮抗性多肽(例如，单链多肽、抗体、其抗原结合片段及其构建体)结合的TNFR2上的连续表位的实例包括SSTDICRPHQI基序(SEQ ID NO:288)的一个或多个连续残基或全部残基、CALSKQEGCRLCAPL基序(SEQ ID NO:289)的一个或多个连续残基或全部残基和TSDVVCKPCA基序(SEQ ID NO:290)的一个或多个连续残基或全部残基，以及非人哺乳动物(例如，野牛、牛和本文所述的其它动物)的TNFR2蛋白上的相应区域。在一些实施方案中，表位可以是不连续的表位，其包含两个或更多个氨基酸区段，每个区段在抗原的氨基酸序列中通过一个或多个居间氨基酸残基彼此分离。不连续的表位可以由例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个此类氨基酸残基区段，如一个或多个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个)包含来自人TNFR2内的SSTDICRPHQI基序(SEQ ID NO:288)、CALSKQEGCRLCAPL基序(SEQ ID NO:289)和TSDVVCKPCA基序(SEQ ID NO:290)中的一个或多个以及非人哺乳动物(例如，野牛、牛和本文所述的其它动物)的TNFR2蛋白上的相应区域的氨基酸的区段组成。尽管通过居间氨基酸进行了这种分离，但组成不连续表位的区段可以例如在抗原的三维构象中在空间上彼此接近。被本文描述的拮抗性多肽(例如，单链多肽、抗体、其抗原结合片段及其构建体)结合的TNFR2上的示例性不连续表位包括含有以下元件的表位：(i)SSTDICRPHQI基序(SEQ ID NO:288)的一个或多个残基，或所有残基；(ii)CALSKQEGCRLCAPL基序(SEQ ID NO:289)的一个或多个残基，或所有残基，和(iii)TSDVVCKPCA基序(SEQ ID 290)的一个或多个残基，所有残基。被本文所述的拮抗性多肽(例如，单链多肽、抗体、其抗原结合片段及其构建体)结合的TNFR2上的不连续表位的其它实例包括含有上述元件(i)和(ii)的表位、含有上述元件(i)和(iii)的表位以及含有上述元件(ii)和(iii)的表位。
如本文所用，术语“外源性”描述不天然存在于特定生物体(例如人)中或生物体内的特定位置(例如，器官、组织或细胞，如人细胞)中的分子(例如，多肽、核酸或辅因子)。外源性物质包括从外部来源提供给生物体或从其提取的培养物质的那些。
如本文所用，术语“框架区”或“FW区”包括与CDR相邻的氨基酸残基。FW区残基可存在于例如人抗体、啮齿动物来源的抗体(例如鼠抗体)、人源化抗体、灵长类化抗体、嵌合抗体、抗体片段(例如Fab片段)、单链抗体片段(例如，scFv片段)、抗体结构域和双特异性抗体等。
如本文所用，术语“融合蛋白”是指通过共价键与另一分子连接的蛋白质。融合蛋白可通过例如一种蛋白质的N末端与另一种蛋白质的C末端之间的形成酰胺键的反应来化学合成。或者，可通过例如从载体或细胞的基因组表达编码融合蛋白的多核苷酸来在细胞(例如，真核细胞或原核细胞)中重组表达含有与另一种蛋白质共价结合的一种蛋白质的融合蛋白。融合蛋白可含有与接头共价结合的一种蛋白质，所述接头进而与另一分子共价结合。可用于形成融合蛋白的接头的实例包括含肽的接头，如含有天然存在的或非天然存在的氨基酸的接头。在一些实施方案中，可能需要在接头中包含D-氨基酸，因为这些残基不存在于天然存在的蛋白质中并且因此对内源性蛋白酶的降解更具抗性。接头可使用本领域中熟知的各种策略来制备，并且取决于接头的反应性组分可通过酶水解、光解、在酸性条件下的水解、在碱性条件下的水解、氧化、二硫化物还原、亲核裂解或有机金属裂解而裂解(Leriche等人,Bioorg.Med.Chem.,20:571-582,2012)。
如本文所用，术语“异种特异性抗体”是指对至少两种不同的抗原具有结合特异性的单克隆抗体，优选人或人源化抗体。传统上，异种特异性抗体的重组产生是基于两个免疫球蛋白重链-轻链对的共表达，其中两条重链具有不同特异性(Milstein等人,Nature 305:537,1983)。类似的程序公开于例如WO 93/08829；美国专利号6,210,668；6,193,967；6,132,992；6,106,833；6,060,285；6,037,453；6,010,902；5,989,530；5,959,084；5,959,083；5,932,448；5,833,985；5,821,333；5,807,706；5,643,759；5,601,819；5,582,996；5,496,549；4,676,980；WO 91/00360；WO 92/00373；EP 03089；Traunecker等人,EMBO J.10:3655(1991)；Suresh等人,Methods in Enzymology 121:210(1986)中；其以引用的方式并入本文。异种特异性抗体可包含在多特异性抗体中强制正确链结合的Fc突变，如Klein等人,mAbs 4(6):653-663,2012所描述；其以引用的方式并入本文。
如本文中所用，术语“铰链区”是指位于抗体或其抗原结合片段的一个或多个抗原结合部分(如抗体或其抗原结合片段的Fab区)与决定抗体或其抗原结合片段的同种型的抗体或其抗原结合片段的部分(如抗体或其抗原结合片段的Fc区)之间的抗体或其抗原结合片段(例如，IgG2抗体或其抗原结合片段)的结构域。例如，在单克隆抗体的情况下，铰链区是大致位于每个重链中心，将CH1结构域连接到CH2和CH3结构域的多肽。抗体或其抗原结合片段的铰链区可在抗体或其抗原结合片段的链之间提供化学键联。例如，在单克隆抗体中，铰链区内的半胱氨酸残基形成链间二硫键，从而在重链之间提供显性共价键。野生型人IgG2的氨基酸序列为ERKCCVECPPCP(SEQ ID NO:292)。如本文中所用，抗体铰链区根据Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Instituteof Health,Bethesda,Md.1987)(其公开内容以引用的方式并入本文)的编号系统进行编号。例如，使用Kabat等人的编号方案，从残基226至243对示于SEQ ID NO:292的野生型人IgG2铰链区进行编号，使得SEQ ID NO:292的N末端谷氨酸残基为残基226，SEQ ID NO:292的C末端脯氨酸残基为残基243。在整个本公开中，除非有相反的明确说明，否则变体IgG2铰链区，如示于SEQ ID NO:291(ERCCVECPCP)的变体，根据Kabat等人的惯例编号。
如本文所用，术语“人抗体”是指其中蛋白质的基本上每个部分(例如，CDR、框架、CL、CH结构域(例如，CH1、CH2、CH3)、铰链、(VL，VH))在人中是基本上非免疫原性、只有微小序列变化或变异的抗体。人抗体可在人细胞中(例如，通过重组表达)产生或者由能够表达功能重排的人免疫球蛋白(例如，重链和/或轻链)基因的非人动物或原核或真核细胞产生。此外，当人抗体是单链抗体时，它可包括不存于天然人抗体中的接头肽。例如，Fv可包含接头肽，如2至约8个甘氨酸或其他氨基酸残基，所述接头肽连接重链的可变区和轻链的可变区。此类接头肽被认为具有人源。人抗体可通过本领域已知的多种方法来制备，所述方法包括使用源自人免疫球蛋白序列的抗体文库的噬菌体展示方法。参见美国专利号4,444,887和4,716,111；以及PCT公布WO 1998/46645；WO 1998/50433；WO 1998/24893；WO 1998/16654；WO 1996/34096；WO 1996/33735；和WO 1991/10741；其以引用的方式并入本文。人抗体还可使用不能表达功能性内源免疫球蛋白、但可表达人免疫球蛋白基因的转基因小鼠来产生。参见例如，PCT公布WO 98/24893；WO 92/01047；WO 96/34096；WO 96/33735；美国专利号5,413,923；5,625,126；5,633,425；5,569,825；5,661,016；5,545,806；5,814,318；5,885,793；5,916,771；以及5,939,598；其以引用的方式并入本文。
如本文所用，术语“人源化”抗体是指非人(例如，鼠)抗体的形式，所述形式是嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或抗体的其他靶结合亚结构域)，其含有源自非人免疫球蛋白的最小序列。通常，所述人源化抗体将包含至少一个且通常两个可变结构域的基本全部，其中全部或基本全部的CDR区对应于非人免疫球蛋白的那些。全部或基本全部的FR区也可以是人免疫球蛋白序列的那些。人源化抗体还可包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白共有序列的至少一部分。抗体人源化的方法是本领域中已知的。参见例如，Riechmann等人,Nature 332:323-7,1988；Queen等人的美国专利号5,530,101；5,585,089；5,693,761；5,693,762；以及6,180,370；EP239400；PCT公布WO 91/09967；美国专利号5,225,539；EP592106；以及EP519596；其以引用的方式并入本文。
如本文所用，术语“疏水性侧链”是指由于例如侧链内存在的化学部分的空间或电子性质而在水中表现出低溶解度的氨基酸侧链。含有疏水性侧链的氨基酸的实例包括含有不饱和脂族烃的那些，如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸和甲硫氨酸；以及含有在生理pH下静电中性的芳环系统的氨基酸，如色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。
如本文所用，术语“免疫治疗剂”是指如本文所述的化合物，如抗体、其抗原结合片段、单链多肽或构建体，所述化合物特异性地结合免疫检查点蛋白(例如，免疫检查点受体或配体)并且对受体或配体发挥拮抗性作用，从而减少或抑制受体或配体的信号转导，所述受体或配体的信号转导否则会导致免疫响应的下调。免疫治疗剂包括化合物，如抗体、抗原结合片段、单链多肽和的构建体，所述化合物能够特异性地结合在造血细胞如淋巴细胞(例如T细胞)表面上表达的受体，并且遏制由受体或配体诱导的信号传导，所述信号传导否则将导致针对内源性(“自身”)抗原(如肿瘤相关抗原)的耐受性。免疫治疗剂可使由受体或配体诱导的信号传导相对于在所述免疫治疗剂不存在下表现出的由所述受体或配体诱导的信号传导降低例如1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％。可用于测量受体或配体信号传导的程度的示例性测定包括例如，用于测量与特定信号转导途径相关的蛋白质表达改变的酶联免疫吸附测定(ELISA)技术，以及基于聚合酶链式反应(PCR)的技术，如可用于确定与特定信号转导途径相关的基因表达的变化的定量PCR、逆转录PCR和实时PCR实验等。可用于确定剂是否是“免疫治疗剂”的示例性方法包括Mahoney等人,Cancer Immunotherapy,14:561-584(2015)中描述的测定，其公开内容以引用的方式整体并入本文。免疫治疗剂的实例包括例如，特异性地结合以下中的一种或多种的抗体或其抗原结合片段：OX40L、TL1A、CD40L、LIGHT、BTLA、LAG3、TIM3、Singlecs、ICOS、B7-H3、B7-H4、VISTA、TMIGD2、BTNL2、CD48、KIR、LIR、LIR抗体、ILT、NKG2D、NKG2A、MICA、MICB、CD244、CSF1R、IDO、TGFβ、CD39、CD73、CXCR4、CXCL12、SIRPA、CD47、VEGF和神经纤毛蛋白。免疫治疗剂的另外实例包括塔革雷汀、干扰素-α、氯倍他索、Peg干扰素(例如，
Figure BDA0003027090150000991
)、泼尼松、罗米地辛、贝沙罗汀、甲氨蝶呤、曲安西龙乳膏、抗趋化因子、伏立诺他、加巴喷丁、针对淋巴细胞表面受体和/或淋巴因子的抗体、针对表面癌蛋白的抗体和/或小分子疗法如伏立诺他。可与本文所述的组合物和方法结合使用的免疫治疗剂的具体实例包括抗PD-1抗体及其抗原结合片段，如纳武单抗、帕博利珠单抗、阿维鲁单抗、德瓦鲁单抗或阿妥珠单抗，以及抗PD-L1抗体及其抗原结合片段，如阿妥珠单抗和阿维鲁单抗，以及抗CTLA-4抗体及其抗原结合片段，如伊匹木单抗或曲美木单抗。
如本文所用，术语“单克隆抗体”是指来源于单一克隆(包括任何真核、原核或噬菌体克隆)的抗体，而不是指产生所述抗体的方法。
如本文所用，术语“多特异性抗体”是指对多于一种靶抗原表现出亲和力的抗体。多特异性抗体可具有与完整免疫球蛋白分子相似的结构，并且包括Fc区，例如IgG Fc区。此类结构可包括但不限于IgG-Fv、IgG-(scFv)2、DVD-Ig、(scFv)2-(scFv)2-Fc和(scFv)2-Fc-(scFv)2。在IgG-(scFv)2的情况下，scFv可连接至重链或轻链的N末端或C末端。包含Fc区并且抗TNFR2抗体或其抗原结合片段可掺入其中的示例性多特异性分子已由Kontermann,2012,mAbs 4(2):182-197；Yazaki等人,2013,Protein Engineering,Design&Selection26(3):187-193和Grote等人,2012,在Proetzel&Ebersbach(eds.),Antibody Methods andProtocols,Methods in Molecular Biology第901卷,第16章:247-263中进行了综述；其以引用的方式并入本文。在一些实施方案中，基于IgG或DVD或scFv的片段，抗体片段可以是无Fc区的多特异性分子的组分。缺乏Fc区并且抗体或抗体片段可掺入其中的示例性多特异性分子包括scFv二聚体(双抗体)、三聚体(三抗体)和四聚体(四抗体)，Fab二聚体(通过粘附多肽或蛋白质结构域缀合)和Fab三聚体(化学缀合的)由Hudson和Souriau,2003,NatureMedicine 9:129-134描述；所述文献以引用的方式并入本文。
如本文所用，术语“骨髓源性抑制细胞”或“MDSC”是指免疫系统的调节多种效应细胞和抗原呈递细胞的活性的细胞，如T细胞、NK细胞、树突细胞和巨噬细胞等。骨髓源性抑制细胞通过它们的基因表达谱区分，并且表达选自由以下组成的组的蛋白质和小分子的全部或子集：B7-1(CD80)、B7-H1(PD-L1)、CCR2、CD1d、CD1d1、CD2、CD31(PECAM-1)、CD43、CD44、补体组分C5a R1、F4/80(EMR1)、FcγRIII(CD16)、FcγRII(CD32)、FcγRIIA(CD32a)、FcγRIIB(CD32b)、FcγRIIB/C(CD32b/c)、FcγRIIC(CD32c)、FcγRIIIA(CD16A)、FcγRIIIB(CD16b)、半乳糖凝集素-3、GP130、Gr-1(Ly-6G)、ICAM-1(CD54)、IL-1RI、IL-4Rα、IL-6Rα、整联蛋白α4(CD49d)、整联蛋白αL(CD11a)、整联蛋白αM(CD11b)、M-CSFR、MGL1(CD301a)、MGL1/2(CD301a/b)、MGL2(CD301b)、一氧化氮、PSGL-1(CD162)、L-选择蛋白(CD62L)、siglec-3(CD33)、转铁蛋白受体(TfR)、VEGFR1(Flt-1)以及VEGFR2(KDR或Flk-1)。特别地，MDSC不表达选自由B7-2(CD86)、B7-H4、CD11c、CD14、CD21、CD23(FcεRII)、CD34、CD35、CD40(TNFRSF5)、CD117(c-kit)、HLA-DR以及Sca-1(Ly6)组成的组的蛋白质。
如本文所用，术语“中性TNFR2多肽”和“表型-中性TNFR2多肽”是指结合TNFR2并且不发挥对TNFR2活化的拮抗或激动作用的多肽(如单链多肽、抗体或抗体片段)。例如，如果TNFR2多肽结合TNFR2并且既不加强也不遏制TNFR2活化，例如，如通过测量表达TNFR2的细胞(例如，T-reg细胞、TNFR2+癌细胞和/或MDSC)和/或通过测量一种或多种NFκB靶基因(如CHUK、NFKBIE、NFKBIA、MAP3K11、TRAF2、TRAF3、relB和/或cIAP2/BIRC3)的表达，则所述多肽是中性TNFR2多肽。
如本文所用，术语“非天然恒定区”是指抗体恒定区，源自不同于抗体可变区的来源或者是具有不同于天然抗体恒定区序列的氨基酸序列的人源合成多肽的抗体恒定区。例如，含有非天然恒定区的抗体可具有源自非人来源(例如，小鼠、大鼠或兔)的可变区和源自人来源的恒定区(例如，人抗体恒定区)，或者源自另一种灵长类动物、猪、山羊、兔、仓鼠、猫、狗、豚鼠、牛科动物的成员(如牛、野牛、水牛、麋鹿和牦牛等)、奶牛、绵羊、马或野牛等的恒定区。
如本文所用，术语“序列同一性百分比(％)”是指在比对序列并且(必要时)引入空位以获得最大序列同一性百分比(例如，为了进行最佳比对，可将空位引入候选序列和参考序列中的一个或两个，并且为了比较目的，可忽略非同源序列)之后，候选序列中与参考序列的氨基酸(或核酸)残基相同的氨基酸(或核酸)残基的百分比。用于确定序列同一性百分比的目的的比对可以本领域技术范围内的各种方式实现，所述方式例如使用可公开获得的计算机软件，如BLAST、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可确定用于测量比对的适当参数，包括为在所比较序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。例如，出于比较与候选序列进行比对的参考序列可显示，候选序列在候选序列的全长或在候选序列的连续氨基酸(或核酸)残基的选定部分上表现出50％至100％的序列同一性。出于比较目的而比对的候选序列的长度可以是例如，参考序列的长度的至少30％(例如，30％、40、50％、60％、70％、80％、90％或100％)。当候选序列中的位置由与参考序列中的相应位置相同的氨基酸残基占据时，则在所述位置处的分子是相同的。
如本文所用，术语“灵长类化抗体”是指包含来自灵长类动物来源的抗体的框架区和来自非灵长类动物来源的抗体的其他区(如CDR和/或恒定区)的抗体。用于产生灵长类化抗体的方法是本领域中已知的。参见例如，美国专利号5,658,570；5,681,722；和5,693,780；所述专利以引用的方式并入本文。例如，本文所述的灵长类化抗体或其抗原结合片段可通过将非灵长类动物抗体或其抗原结合片段的CDR插入含有灵长类动物的一个或多个框架区的抗体或其抗原结合片段中来产生。
如本文中所用，术语“增殖”在细胞群，如TNFR2+细胞(例如，T-reg细胞、MDSC或TNFR2+癌细胞)群的上下文中是指细胞的有丝分裂和细胞动力学分裂，以便产生多个细胞。细胞增殖可以例如通过发现细胞样品中细胞(例如，TNFR2+细胞)的数量在给定的时间段内(如在一小时或数小时、一天或数天或一周或数周的过程中)已增加来证明。本领域技术人员可使用多种已知技术，如通过可视显微镜、血细胞计数、流式细胞计数、荧光激活细胞分选和本领域已知的其它测定法来监测细胞增殖。在本公开中，当细胞群(如与本文所述的拮抗性TNFR2多肽接触的TNFR2+细胞群)的增殖速率相对于对照细胞群(如不与所述拮抗性TNFR2多肽接触的TNFR2+细胞群)的增殖速率降低时，认为细胞增殖被“抑制”。增殖速率的降低可表现为，例如，在给定时间段内样品中目标细胞数量的减少，如1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％或更多的给定时间段内样品中目标细胞数量的减少。另外地或可选地，细胞增殖的抑制可通过发现目标细胞(例如，与本文所述的拮抗性TNFR2多肽接触的TNFR2+细胞)分裂的速率相对于对照细胞(例如，未与所述拮抗性TNFR2多肽接触的TNFR2+细胞)分裂的速率下降例如％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％或更多来证明。
如本文所用，在多核苷酸片段的背景下术语“可操作地连接”意图指将两个多核苷酸片段连接以使得由所述两个多核苷酸片段编码的氨基酸序列保持在框内。
如本文所用，术语“药物代谢动力学概况”是指在将药物施用至患者后药物随时间推移的吸收、分布、代谢和清除。
如本文所用，TNFR2的“隐性拮抗剂”是在如TNFα或IL-2的TNFR2激动剂存在下将TNFR2活化抑制至相对于如在如TNFα或IL-2的TNFR2激动剂不存在下测量的相同拮抗剂的抑制程度显著更低程度的拮抗剂(例如，拮抗性多肽，如单链多肽、抗体或其抗原结合片段)。例如，如果在TNFR2激动剂(例如，TNFα或卡介苗芽孢杆菌(BCG))或IL-2存在下拮抗剂的IC50相对于如在TNFR2激动剂(如TNFα或IL-2)不存在下在相同测定中测量的拮抗剂的IC50增加例如10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍或更多倍，则TNFR2拮抗剂是隐性拮抗剂。可例如通过测量TNFR2+细胞(如T-reg细胞，表达TNFR2的癌细胞，或骨髓源性抑制细胞)的增殖的抑制以及通过测量NFκB信号传导的抑制(例如，通过在常规基因表达测定中监测选自由CHUK、NFKBIE、NFKBIA、MAP3K11、TRAF2、TRAF3、relB以及cIAP2/BIRC3组成的组的一种或多种基因的表达降低)来评估TNFR2活化的抑制。
如本文所用，术语“调控序列”包括控制抗体链基因的转录或翻译的启动子、增强子和其他表达控制元件(例如，聚腺苷酸化信号)。此类调控序列描述于例如Goeddel,GeneExpression Technology:Methods in Enzymology 185(Academic Press,San Diego,CA,1990)中；所述文献以引用的方式并入本文。
如本文所用，术语“scFv”是指单链Fv抗体，其中来自抗体的重链和轻链的可变结构域已经连接以形成一条链。scFv片段含有单条多肽链，所述多肽链包含通过接头隔开的抗体轻链(VL)的可变区(例如，CDR-L1、CDR-L2和/或CDR-L3)和抗体重链(VH)的可变区(例如，CDR-H1、CDR-H2和/或CDR-H3)。连接scFv片段的VL和VH区的接头可以是由蛋白原氨基酸组成的肽接头。可使用替代接头以便增加scFv片段对蛋白水解降解的抗性(例如，含有D-氨基酸的接头)，以便增强scFv片段的溶解度(例如，亲水性接头如含有重复甘氨酸和丝氨酸残基的含聚乙二醇的接头或多肽)，以改善分子的生物物理稳定性(例如，含有形成分子内或分子间二硫键的半胱氨酸残基的接头)，或者以减弱scFv片段的免疫原性(例如，含有糖基化位点接头)。scFv分子是本领域中已知的并且描述于例如美国专利5,892,019；Flo等人，(Gene 77:51,1989)；Bird等人，(Science 242:423,1988)；Pantoliano等人，(Biochemistry 30:10117,1991)；Milenic等人，(Cancer Research51:6363,1991)；以及Takkinen等人，(Protein Engineering 4:837,1991)中。scFv分子的VL和VH结构域可源自一种或多种抗体分子。本领域普通技术人员还将理解，可修饰本文所述的scFv分子的可变区，以使得它们的氨基酸序列与它们所源自的抗体分子不同。例如，在一个实施方案中，可(例如，在CDR和/或框架残基中)进行导致氨基酸残基的保守取代或改变的核苷酸或氨基酸取代。或者或另外，使用本领域公认的技术对CDR氨基酸残基进行突变以优化抗原结合。scFv片段描述于例如WO 2011/084714中；其以引用的方式并入本文。
如本文所用，短语“特异性地结合”是指以特殊性决定蛋白质和其他生物分子的异源群体中抗原的存在的结合反应，所述蛋白质和其他生物分子例如通过抗体或其抗原结合片段识别。特异性地结合至抗原的抗体或其抗原结合片段将以小于100nM的KD结合至抗原。例如，特异性地结合至抗原的抗体或其抗原结合片段将以达100nM(例如，1pM与100nM之间)的KD结合至抗原。未表现出与特定抗原或其表位的特异性结合的抗体或其抗原结合片段将对所述特定抗原或其表位表现出大于100nM(例如，大于500nm、1μM、100μM、500μM或1mM)的KD。可使用多种免疫测定形式来选择与特定蛋白质或碳水化合物特异性免疫反应的抗体。例如，固相ELISA免疫测定常规地用于选择与蛋白质或碳水化合物特异性免疫反应的抗体。关于可用于确定特异性免疫反应性的免疫测定形式和条件的描述，参见Harlow和Lane,Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,New York(1988)以及Harlow和Lane,Using Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,New York(1999)。
如本文所用，术语“受试者”和“患者”是指接受针对如本文所述的特定疾病或病状(如癌症或感染性疾病)的治疗的生物体。受试者和患者的实例包括接受针对疾病或病状(例如，如癌症或感染性疾病的细胞增殖病症)的治疗的哺乳动物，如人、灵长类动物、猪、山羊、兔、仓鼠、猫、狗、豚鼠、牛科的成员(如牛、野牛、水牛、麋鹿和牦牛等)、奶牛、绵羊、马和野牛等。
如本文所用，术语“转染”是指通常用于将外源DNA引入原核或真核宿主细胞中的多种技术中的任一种，例如电穿孔、脂质转染、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染等。
如本文所用，术语“治疗(treat)”或“治疗(treatment)”是指目的是预防或减缓(减轻)不希望的生理变化或病症，如细胞增殖病症(如癌症或感染性疾病)的进展的治疗性治疗。有益或所需的临床结果包括但不限于症状减轻、疾病程度减轻、疾病状态稳定化(即未恶化)、疾病进展延迟或减缓、疾病状态改善或缓和以及缓解(无论是部分缓解还是全部缓解)，无论是可检测的还是不可检测的。需要治疗的那些包括已患有病状或病症的那些以及易于患上病状或病症的那些或有待预防病状或病症的那些。
如本文所用，术语“肿瘤微环境”是指形成肿瘤的癌细胞以及肿瘤内或肿瘤边界或围绕癌细胞的非癌细胞、分子和/或血管的群体。
如本文所用，术语“肿瘤坏死因子受体超家族”、“TNFR超家族”或“TNFRS”是指特征在于常见富含半胱氨酸的结构域(CRD)的具有羧基末端细胞内结构域和氨基末端细胞外结构域的一组I型跨膜蛋白。TNFR超家族包括由于与TNF超家族中的一种或多种配体结合而介导细胞信号传导的受体。TNFR超家族可分成两个亚组：含有细胞内死亡结构域的受体和缺乏这种结构域的那些受体。死亡结构域是80个氨基酸的基序，所述基序在受体活化后传播细胞凋亡信号转导级联。含有细胞内死亡结构域的示例性TNFR超家族成员包括TNFR1，而TNFR2表示不含这种结构域的TNFR超家族蛋白。TNFR超家族的成员包括TNFR1、TNFR2、RANK、CD30、CD40、淋巴毒素β受体(LT-βR)、OX40、Fas受体、诱饵受体3(DCR3)、CD27、4-1BB、死亡受体4(DR4)、死亡受体5(DR5)、诱饵受体1(DCR1)、诱饵受体2(DCR2)、骨保护素、TWEAK受体、TACI、BAFF受体、疱疹病毒进入介质、神经生长因子受体、B细胞成熟抗原、糖皮质激素诱导的TNFR-相关的TROY、死亡受体6(DR6)、死亡受体3(DR3)和外异蛋白A2受体。
如本文中所用，术语“肿瘤坏死因子受体2信号传导”、“TNFR2信号传导”、“TNFR2信号传导”等可互换使用，是指通常在TNFR2+细胞(如T-reg细胞、MDSC或TNFR2+癌细胞)表面上的TNFR2被内源TNFR2配体(如TNFα)激活时发生的细胞事件。TNFR2信号传导可通过发现选自由以下组成的组的一个或多个基因的表达增加来证明：CHUK、NFKBIE、NFKBIA、MAP3K11、TRAF2、TRAF3、relB和cIAP2/BIRC3。当在使TNFR2+细胞与剂(如本文所述的TNFR2拮抗剂多肽)接触时，在所述TNFR2+细胞中相对于不与该剂(例如，TNFR2拮抗剂多肽)接触的TNFR2+细胞，前述基因中的一个或多个或全部的表达(和/或在编码的蛋白的活性需要这种修饰的情况下的翻译后修饰)降低时，认为TNFR2信号传导被“抑制”(如本文所用的)。例如，当与拮抗性TNFR2多肽接触的TNFR2+细胞中CHUK、NFKBIE、NFKBIA、MAP3K11、TRAF2、TRAF3、relB或cIAP2/BIRC3中的一种或多种的表达或翻译后修饰(例如，磷酸化)，相对于未与所述拮抗性TNFR2多肽接触的TNFR2+细胞中这些基因中的一种或多种的表达或翻译后修饰(例如，磷酸化)，减少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％时，认为TNFR2信号传导被“抑制”。可用于确定表达水平和磷酸化状态的示例性测定在本领域中是已知的，包括例如测定蛋白质含量的蛋白质印迹分析和测定mRNA含量的定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)实验。
如本文所用，术语“可变区CDR”包括如使用基于序列或结构的方法鉴定的CDR或互补决定区中的氨基酸。如本文所用，术语“CDR”或“互补决定区”是指在重链和轻链多肽两者的可变区内发现的非连续抗原结合位点。这些特定区已由以下文献描述：Kabat等人,J.Biol.Chem.252:6609-6616,1977和Kabat,等人,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第五版,美国卫生和公共服务部,NIH出版号91-3242,1991；Chothia等人,(J.Mol.Biol.196:901-917,1987)以及MacCallum等人,(J.Mol.Biol.262:732-745,1996)，其中定义包括当彼此比较时氨基酸残基的重叠或子集。术语“CDR”可以是例如由Kabat基于序列比较定义的CDR。
如本文所用，术语“载体”包括核酸载体，例如DNA载体，如质粒、RNA载体、病毒或其他合适的复制子(例如，病毒载体)。已经开发了多种载体用于将编码外源蛋白质的多核苷酸递送到原核或真核细胞中。此类表达载体的实例公开于例如WO 1994/11026中；其以引用的方式并入本文。本文所述的表达载体含有多核苷酸序列以及例如用于表达蛋白质和/或将这些多核苷酸序列整合到哺乳动物细胞的基因组中的另外序列元件。可用于表达本文所述的抗体和抗体片段的某些载体包括含有调控序列的质粒，如指导基因转录的启动子和增强子区。用于表达抗体和抗体片段的其他有用载体含有多核苷酸序列，所述多核苷酸序列增强这些基因的翻译速率或改善由基因转录产生的mRNA的稳定性或核输出。这些序列元件包括例如5'和3'非翻译区、内部核糖体进入位点(IRES)和聚腺苷酸化信号位点，以便指导表达载体上携带的基因的有效转录。本文所述的表达载体还可含有编码用于选择含有这种载体的细胞的标记的多核苷酸。合适的标记的实例包括编码对抗生素(如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素或诺尔丝菌素)的抗性的基因。
如本文所用，术语“VH”是指抗体的免疫球蛋白重链的可变区，包括Fv、scFv或Fab的重链。提及“VL”是指免疫球蛋白轻链的可变区，包括Fv、scFv、dsFv或Fab的轻链。抗体(Ab)和免疫球蛋白(Ig)是具有相同结构特征的糖蛋白。虽然抗体表现出对特定靶标的结合特异性，但免疫球蛋白包括抗体和缺乏靶标特异性的其他抗体样分子两者。天然抗体和免疫球蛋白通常是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，其由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链组成。天然抗体的每条重链在氨基末端具有可变结构域(VH)，随后是许多恒定结构域。天然抗体的每条轻链在氨基末端(VL)具有可变结构域，并且在羧基末端具有恒定结构域。
附图说明
图1示出人TNFR2的氨基酸序列(SEQ ID NO:7)。人TNFR2在本文编号，以位置1的N末端甲硫氨酸开始并且以位置461的C末端丝氨酸结束(SEQ ID NO:7)。对TNFR2内的氨基酸位置的所有提及都是在图1中所示的TNFR2编号方案的背景下进行的。以粗体和下划线标的字体显示的残基(KCRPG，SEQ ID NO:19)连同存在于人TNFR2的富含半胱氨酸的结构域3(CRD3)和CRD4中的其它表位(SEQ ID NO:7的残基121-162和162-202)和非人如非人哺乳动物的TNFR2内的等同区域的结合，促进TNFR2信号传导的拮抗作用。斜体标示的残基(KCSPG，SEQ ID NO:12)连同人TNFR2的CRD1中存在的其它表位(SEQ ID NO:7的残基48-76)和非人如非人哺乳动物的TNFR2内的等同区域的结合，不利于TNFR2拮抗作用。
图2是对比小鼠单克隆TNFR2拮抗剂抗体TNFRAB2在体外对调节性T(T-reg)细胞的活力的影响(左)与人嵌合型TNFRAB2在相同测定条件下对T-reg细胞的活力的影响(右)的图。TNFRAB2是鼠IgG2抗体，在本实施例中测试的人嵌合TNFR2拮抗剂抗体具有人IgG1同种型。x轴上的值代表以μg/ml为单位的抗体浓度。y轴上的值代表在将样品与指定浓度的TNFR2抗体孵育后，体外细胞样品中存在的T-reg细胞的百分比。
图3是对比小鼠单克隆TNFR2拮抗剂抗体TNFRAB2对体外样品中效应T细胞数量的影响(左)与人人嵌合型TNFRAB2在相同测定条件下对体外样品中效应T细胞的数量的影响(右)的图。人嵌合TNFR2拮抗剂抗体与图2中描述的抗体相同。x轴上的值代表以μg/ml为单位的抗体浓度。y轴上的值代表在将样品与指定浓度的TNFR2抗体一起孵育后，体外细胞样品中存在的T效应细胞的百分比。
图4是对比小鼠单克隆TNFR2拮抗剂抗体TNFRAB2对体外样品中TNFR2+SW480结肠癌细胞数量的影响(左)与人嵌合型TNFRAB2在相同测定条件下对体外样品中TNFR2+SW480结肠癌细胞数量的影响(右)的图。人嵌合TNFR2拮抗剂抗体与图2中描述的抗体相同。x轴上的值代表以μg/ml为单位的抗体浓度。y轴上的值代表在将样品与指定浓度的TNFR2抗体一起孵育后，体外细胞样品中存在的TNFR2+SW480结肠癌细胞的数量。
图5是对比小鼠单克隆TNFR2拮抗剂抗体TNFRAB2对体外样品中效应T细胞数量的影响(左)与人人嵌合型TNFRAB2在相同测定条件下对体外样品中效应T细胞的数量的影响(右)的图。人嵌合TNFR2拮抗剂抗体与图2中描述的抗体相同。x轴上的值代表以μg/ml为单位的抗体浓度。y轴上的值代表在将样品与指定浓度的TNFR2抗体一起孵育后，体外细胞样品中存在的T效应细胞的百分比。
图6是对比小鼠单克隆TNFR2拮抗剂抗体TNFRAB2在体外对T-reg细胞的活力的影响(左)与人嵌合型TNFRAB2在相同测定条件下对T-reg细胞的活力的影响(右)的图。人嵌合TNFR2拮抗剂抗体与图2中描述的抗体相同。x轴上的值代表以μg/ml为单位的抗体浓度。y轴上的值代表在将样品与指定浓度的TNFR2抗体孵育后，体外细胞样品中存在的T-reg细胞的百分比。
图7是对比小鼠单克隆TNFR2拮抗剂抗体TNFRAB2对体外样品中TNFR2+SW480结肠癌细胞数量的影响(左)与人嵌合型TNFRAB2在相同测定条件下对体外样品中TNFR2+SW480结肠癌细胞数量的影响(右)的图。人嵌合TNFR2拮抗剂抗体与图2中描述的抗体相同。x轴上的值代表以μg/ml为单位的抗体浓度。y轴上的值代表在将样品与指定浓度的TNFR2抗体一起孵育后，体外细胞样品中存在的TNFR2+SW480结肠癌细胞的数量。
图8是对比小鼠单克隆TNFR2拮抗剂抗体TNFRAB2对体外样品中效应T细胞数量的影响(左)与人人嵌合型TNFRAB2在相同测定条件下对体外样品中效应T细胞的数量的影响(右)的图。在该实施例中测试的人嵌合TNFR2拮抗剂抗体具有人IgG2同种型，并且具有特征在于C232S和C233S氨基酸取代的人IgG2铰链区。x轴上的值代表以μg/ml为单位的抗体浓度。y轴上的值代表在将样品与指定浓度的TNFR2抗体一起孵育后，体外细胞样品中存在的T效应细胞的百分比。
图9是对比小鼠单克隆TNFR2拮抗剂抗体TNFRAB2在体外对T-reg细胞的活力的影响(左)与人嵌合型TNFRAB2在相同测定条件下对T-reg细胞的活力的影响(右)的图。在该实施例中测试的人嵌合TNFR2拮抗剂抗体具有人IgG2同种型，并且具有特征在于C232S和C233S氨基酸取代的人IgG2铰链区。x轴上的值代表以μg/ml为单位的抗体浓度。y轴上的值代表在将样品与指定浓度的TNFR2抗体孵育后，体外细胞样品中存在的T-reg细胞的百分比。
图10是对比小鼠单克隆TNFR2拮抗剂抗体TNFRAB2对体外样品中TNFR2+SW480结肠癌细胞数量的影响(左)与人嵌合型TNFRAB2在相同测定条件下对体外样品中TNFR2+SW480结肠癌细胞数量的影响(右)的图。在该实施例中测试的人嵌合TNFR2拮抗剂抗体具有人IgG2同种型，并且具有特征在于C232S和C233S氨基酸取代的人IgG2铰链区。x轴上的值代表以μg/ml为单位的抗体浓度。y轴上的值代表在将样品与指定浓度的TNFR2抗体一起孵育后，体外细胞样品中存在的TNFR2+SW480结肠癌细胞的数量。
图11是显示单克隆抗体TNFRAB2的嵌合变体的TNFR2+癌细胞杀伤特性的图。在该实施例中测试的人嵌合TNFR2拮抗剂抗体具有人IgG2同种型，并且具有特征在于C232S和C233S氨基酸取代的人IgG2铰链区。x轴上的值代表用嵌合TNFRAB2变体抗体处理TNFR2+SW480肿瘤细胞后的天数。y轴上的值代表用TNFRAB2变体抗体治疗后以立方毫米为单位的SW480肿瘤体积。用TNFRAB2变体抗体(正方形)治疗后观察到的肿瘤体积值与用媒介物对照(圆形)治疗后观察到的值进行比较。
图12是显示包含人IgG2恒定结构域连同野生型人IgG2铰链区和本文所述的鼠TNFRAB2单克隆抗体的可变结构域的嵌合TNFRAB2变体抗体的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离结果的图像。该图所示的凝胶电泳分离是在非还原条件下进行的。在进行该分离时观察到四条独特的条带，对应于人IgG2同种型的IgG2-A、IgG2-B、IgG2-A/B1和IgG2-A/B2二硫键结合的同种型。为清晰起见，这些条带用白色方框突出显示。
图13A-图13D是一系列比较人IgG2同种型抗体的IgG2-A(图13A)、IgG2-B(图13B)、IgG2-A/B1(图13C)和IgG2-A/B2(图13D)同种型的每一个中存在的二硫键合排列的示意图。细线表示连接每个抗体重链或轻链各个部分的二硫键，其用阴影矩形表示。重链由每种抗体的较长的最外面的矩形来表示。在每条重链内，黑色阴影表示恒定区，浅色阴影表示可变区。轻链由每种抗体的较短的、最里面的矩形来表示。在每条轻链中，深色阴影表示恒定区域，浅色阴影表示可变区。
具体实施方式
本文所述的拮抗性TNFR2多肽(如单链多肽、抗体、其抗原结合片段及其构建体)抑制表达TNFR2的细胞上的TNFR2的活化。这可以例如通过结合TNFR2(例如，在T-reg细胞、表达TNFR2的癌细胞或骨髓源性抑制细胞(MDSC)的外表面上)并阻止受体采用适合于结合其同源配体TNFα的三维构象来实现。TNFα通过使TNFR2蛋白的三聚体成核来加强TNFR2信号传导。正是这种三聚化事件使个体TNFR2蛋白紧密接近并且通过MAPK/NFκB/TRAF2/3途径引发TNFR2信号传导，其最终导致细胞生长并逃避细胞凋亡。本文所述的拮抗性TNFR2多肽可通过结合受体并阻止受体三聚化来拮抗这种相互作用。例如，可能发生这种情况的一种机制是通过形成反平行TNFR2二聚体，所述二聚体是受体的无活性结构形式。
本文所述的TNFR2多肽特异性结合TNFR2内的表位，促进受体拮抗作用和各种有利的下游生物活性。人TNFR2包含四个富含半胱氨酸的结构域(CRD)：CRD1(SEQ ID NO:7的氨基酸残基48-76)、CRD2(SEQ ID NO:7的氨基酸残基78-120)、CRD 3(SEQ ID NO:7的氨基酸残基121-162)和CRD4(SEQ ID NO:7的氨基酸残基162-202)。本文所述的拮抗性TNFR2多肽在CRD3和/或CRD4内的一个或多个表位处特异性结合TNFR2。在一些实施方案中，拮抗性TNFR2多肽不结合CRD1和/或CRD2内的表位。例如，本公开的多肽(例如，单链多肽、抗体、其抗原结合片段或其构建体)可在以下残基中的一个或多个内的表位处结合人TNFR2：
(a)SEQ ID NO:7的氨基酸142-146(KCRPG)；
(b)SEQ ID NO:7的氨基酸142-149(KCRPGFGV)；
(c)SEQ ID NO:7的氨基酸137-144(CAPLRKCR)；
(d)SEQ ID NO:7的氨基酸150-190(RPGTETSDVVCKPCAPGTFSNTTSSTDICRPHQICNVVAI)；
(e)SEQ ID NO:7的氨基酸161-169(CKPCAPGTF)；
(f)SEQ ID NO:7的氨基酸75-128(CDSCEDSTYTQLWNWVPECLSCGSRCSSDQVETQACTREQNRICTCRPGWYCAL)，任选地其中表位在SEQ ID NO:7的氨基酸80-86(DSTYTQL)、91-98(PECLSCGS)或116-123(RICTCRPG)内；
(g)SEQ ID NO:7的氨基酸174-184(SSTDICRPHQI)；
(h)SEQ ID NO:7的氨基酸126-140(CALSKQEGCRLCAPL)；和/或
(i)SEQ ID NO:7的氨基酸156-165(TSDVVCKPCA)；
或非人哺乳动物(如本文所述的非人哺乳动物)的TNFR2内的等同表位。
本公开部分基于以下发现，即当抗TNFR2多肽以IgG2同种型的形式存在时，这些分子表现出显著改善的TNFR2拮抗作用。如以下实施例所述，目前已经发现，相对于其它同种型的TNFR2结合多肽，这类TNFR2多肽表现出令人惊讶的破坏TNFR2信号传导，减弱T-reg细胞和癌细胞生长以及增强效应T细胞的增殖的优异能力。
本公开潜在的另一个发现是发现：相对于在上述一个或多个表位处特异性结合TNFR2但包含彼此相隔小于约
Figure BDA0003027090150001132
的抗原结合位点的多肽，包含在空间上彼此相隔约
Figure BDA0003027090150001133
或更多的抗原结合位点的拮抗性TNFR2多肽表现出出乎意料的更优的TNFR2拮抗作用。此类多肽的实例包括含有彼此相隔约
Figure BDA0003027090150001131
的抗原结合位点的IgG1抗体及其抗原结合片段，以及含有彼此相隔
Figure BDA0003027090150001141
的抗原结合位点的IgG3抗体及其抗原结合片段。
本公开的拮抗性TNFR2多肽可被配制成药物组合物。优选地，药物组合物中存在的多肽采用单个二硫键结合的同种型。例如，本公开的药物组合物包括含有拮抗剂TNFR2多肽的那些，其中，例如，药物组合物中的10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％、99.99％或更多的多肽以单个二硫键结合的同种型存在。本公开的拮抗性TNFR2多肽可以有利地采用IgG2-A二硫键结合的同种型，令人惊讶地发现，所述同种型相对于其它IgG2二硫键结合的同种型，例如IgG2-B、IgG2-A/B1和IgG2-A/B2同种型，促进了显著更强水平的TNFR2拮抗作用。在图13A-图13D中图示了这些同种型。例如，可通过在IgG2铰链区中引入禁止其它二硫键结合的同种型形成的突变来将本公开的多肽工程化成主要采用IgG2-A亚型。人IgG2铰链区氨基酸序列中促进排除上述其余同种型外的IgG2-A同种型形成的示例性突变包括野生型人IgG2铰链氨基酸序列的位置232和233处的半胱氨酸残基的缺失和/或取代，其示于SEQ ID NO:291。例如，为了工程化IgG2抗体或其抗原结合片段以便主要采用IgG2-A同种型，可在SEQ ID NO:291的半胱氨酸残基232和/或233处引入保守氨基酸取代。主要以IgG2-A同种型存在的示例性IgG2铰链区具有SEQ IDNO:292的氨基酸序列，其相对于SEQ ID NO:291包含C232S和C233S取代。
以下生物活性是由本公开的多肽相对于(i)具有除IgG2外的同种型，(ii)包含彼此相隔小于
Figure BDA0003027090150001142
的抗原结合位点，和/或(iii)主要不以单个二硫键结合的同种型(例如，IgG2-A同种型)存在的TNFR2结合多肽，在更高程度上展示了拮抗性TNFR2表型的实例：
(a)抑制T-reg细胞的增殖和/或直接杀伤T-reg细胞，例如通过结合T-reg细胞表面上的TNFR2并使其失活；
(b)抑制MDSC的增殖和/或直接杀伤MDSC，例如通过结合MDSC表面上的TNFR2并使其灭活；
(c)促进T效应细胞的扩增，如CD8+T细胞；和/或
(d)抑制表达TNFR2的癌细胞(如霍奇金淋巴瘤细胞、皮肤非霍奇金淋巴瘤细胞、T细胞淋巴瘤细胞、卵巢癌细胞、结肠癌细胞、多发性骨髓瘤细胞、肾细胞癌细胞、皮肤癌细胞、肺癌细胞、肝癌细胞、子宫内膜癌细胞、造血或淋巴癌细胞、中枢神经系统癌细胞、乳腺癌细胞、胰腺癌细胞、胃癌细胞、食道癌细胞和上消化道癌细胞)的增殖和/或直接杀伤所述癌细胞。
以下部分提供了本文所述的拮抗性TNFR2多肽(如单链多肽、抗体、其抗原结合片段及其构建体)的示例性特征的描述，以及它们在治疗方法中的用途。
拮抗性TNFR2多肽
IgG2同种型抗体促进最佳TNFR2拮抗作用
如上所述和本文所述，当抗体或抗体片段具有人IgG2同种型时，特别是当抗体或抗体片段具有IgG2-A二硫键结合的同种型时，实现了人TNFR2拮抗剂抗体、人源化TNFR2拮抗剂抗体和嵌合TNFR2拮抗剂抗体及其抗原结合片段中的最佳TNFR2拮抗作用。人IgG2抗体不同同种型的二硫键结合模式如图13A-图13D所示。如图13A所示，IgG2-A同种型在重链的半胱氨酸残基C133与轻链的C214之间显示二硫键合，以及在每个重链上存在的相应半胱氨酸残基C221、C222、C225和C228之间显示二硫键。
为了稳定IgG2-A二硫键结合的同种型，可将突变引入IgG2铰链区，以防止或减少IgG2-A同种型中以非结合硫醇形式存在的半胱氨酸残基之间二硫键结合出现。此类突变的实例是人IgG2铰链区的残基C232和C233处的氨基酸取代或缺失。通过去除这些残基之一或两者，并任选地用不能形成二硫键的氨基酸替换这些残基，可以使IgG2同种型群中的二硫键结合模式偏向IgG2-A同种型。可用于获得IgG2-A同种型抗体群的氨基酸取代的实例包括保守氨基酸取代，如C232S和C233S氨基酸取代。由于半胱氨酸和丝氨酸的分子体积和极性相似，因此C232S和C233S取代的特点是保留天然存在的半胱氨酸残基的空间和电负性的有益作用，同时阻止在IgG2铰链区的位置232和/或233处形成二硫键。通过将C232S和/或C233S取代引入TNFR2抗体或其片段，可以获得具有IgG2-A同种型的TNFR2拮抗剂抗体或片段的群体。实现抗体或其抗原结合片段中氨基酸取代和缺失的方法包括本文所述和本领域已知的诱变技术。
抗原结合位点之间的间距
本文所述的拮抗剂TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体、其抗原结合片段或其构建体)可包含抗原结合位点(即，抗原结合臂)，所述抗原结合位点彼此相隔至少约
Figure BDA0003027090150001161
的距离，这是在人IgG2同种型抗体中观察到的抗原结合臂之间的间隔。如以下实施例中所述，已经发现这种间隔产生了具有最佳TNFR2拮抗特性的抗体。本公开的TNFR2拮抗剂多肽包括含有抗原结合臂的多肽，所述抗原结合臂相隔例如约
Figure BDA0003027090150001162
至约
Figure BDA0003027090150001163
的距离，如约
Figure BDA0003027090150001164
Figure BDA0003027090150001165
Figure BDA0003027090150001166
Figure BDA0003027090150001167
或
Figure BDA0003027090150001168
的距离例如，所述多肽(例如，单链多肽、抗体、其抗原结合片段或其构建体)可包含抗原结合位点，所述抗原结合位点彼此相隔约
Figure BDA0003027090150001169
至约
Figure BDA00030270901500011610
的距离，如约
Figure BDA00030270901500011611
Figure BDA00030270901500011612
Figure BDA00030270901500011613
或
Figure BDA00030270901500011614
的距离。在一些实施方案中，抗原结合彼此相隔约
Figure BDA00030270901500011615
Figure BDA00030270901500011616
至约
Figure BDA00030270901500011617
的距离，如约
Figure BDA00030270901500011618
Figure BDA00030270901500011619
或
Figure BDA00030270901500011620
的距离。在一些实施方案中，抗原结合彼此相隔约
Figure BDA00030270901500011621
至约
Figure BDA00030270901500011622
的距离，如约
Figure BDA0003027090150001171
或
Figure BDA0003027090150001172
的距离。在一些实施方案中，抗原结合彼此相隔约
Figure BDA0003027090150001173
至约
Figure BDA0003027090150001174
的距离，如约
Figure BDA0003027090150001175
或
Figure BDA0003027090150001176
的距离。
本文所述的TNFR2拮抗剂多肽可具有例如两个、三个、四个、五个或更多个相隔上文指定的距离的抗原结合臂。具有两个或更多个抗原结合臂的抗体片段的实例包括但不限于双抗体、三抗体、F(ab’)2分子和串联scFv(taFv)分子，等等。产生这些抗体片段的方法包括本文所述和本领域已知的肽合成和重组蛋白表达技术。
存在多种用来测量抗体或抗体片段的抗原结合臂之间的距离的方法。例如，抗体的抗原结合臂之间的距离可通过使用计算机软件，如通过使用
Figure BDA0003027090150001177
和其它分子成像软件分析抗体或抗体片段的三维结构来测定。多肽，如抗体和抗体片段的三维结构，可使用从X光晶体学实验和本领域已知的核磁共振(NMR)技术获得的数据来计算。可用于获得三维多肽结构的X射线晶体学和核磁共振方法的实例描述于，例如，Eigenbrot等人，Journal ofMolecular Biology,229:969-995,1993；和Huang等人，Science,317:1930-1934,2007中，所述文献中的每一篇的公开内容以引用的方式整体并入本文。
TNFR2拮抗剂多肽群的一致性
可产生药物组合物，其中本文所述的TNFR2拮抗剂多肽(例如，抗体、其抗原结合片段、单链多肽或其构建体)以单个二硫键结合的同种型存在。例如，药物组合物中至少10％或更多的多肽可以以单个二硫键结合的同种型(例如，IgG2-A同种型)存在。这可以例如通过野生型人IgG2铰链区的半胱氨酸残基232和233之一或两者的氨基酸取代或缺失来实现，从而防止或减少可能产生除IgG2-A外的IgG2同种型的二硫键结合的出现(例如，参见图13A-图13D)。本公开的药物组合物包括其中例如药物组合物中约10％至约99.999％的拮抗剂TNFR2多肽以单个二硫键结合的同种型如IgG2-A同种型存在的那些组合物。例如，本公开的药物组合物包括含有拮抗剂TNFR2多肽的那些，其中，例如，药物组合物中的10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％、99.99％或更多的多肽以单个二硫键结合的同种型存在。
用于测量拮抗剂TNFR2多肽的样品中存在的各种二硫键结合的同种型的相对量的技术包括本领域已知的和本文所述的液相色谱技术，如Wypych等人The Journal ofBiological Chemistry,283:16194-16205,2008(其公开内容以引用的方式整体并入本文)中举例说明的那些技术。
对TNFR2/MAPK/TRAF2/3信号转导级联的影响
本文所述的抗TFNR2多肽(例如，单链多肽、抗体及其抗原结合片段)能够与TNFR2相互作用并抑制其活性。因此，本文所述的抗TNFR2多肽可选择性地拮抗TNFα-TNFR2相互作用而不是促进TNFR2信号传导。这对于治疗性应用(如癌症免疫疗法)尤其重要，因为在与TNFα缔合后的TNFR2活化导致MAPK和TRAF2/3信号级联的传播和NFκB介导的参与T-reg细胞生长和逃避细胞凋亡的基因的转录活化(Faustman,等人,Nat.Rev.Drug Disc.,9:482-493,2010)。本文所述的TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体及其抗原结合片段)在一个或多个特定表位处结合TNFR2，这阻止受体与相邻TNFR2蛋白形成三聚体。这种三聚化通过TNFR2激活细胞内信号传导，这例如促进TNFR2+细胞如T-reg细胞、MDSC和/或TNFR2+癌细胞的增殖。有利地，本文所述的TNFR2拮抗剂多肽在特定的表位处结合TNFR2，从而以反向平行二聚体构象稳定TNFR2，其中TNFα结合位点在空间上不可接近。这阻止了TNFα成核TNFR2三聚体的形成，否则所述成核将触发TNFR2信号转导。因此，本文所述的多肽可用于遏制TNFR2+细胞如T-reg细胞、MDSC和TNFR2+癌细胞的生长和增殖。例如，对T-reg和MDSC增殖的遏制使得能够发动针对例如癌细胞或外来病原体的免疫响应的T效应细胞的能够增殖。因此，本文所述的拮抗性TNFR2多肽可施用于哺乳动物受试者，如患有细胞增殖病症或感染性疾病的人，以便增强受试者的免疫响应(例如，针对癌细胞或病原生物体的免疫响应)的有效性。
对T-reg细胞增殖的影响
本文所述的拮抗性TNFR2多肽(如单链多肽、抗体或其抗原结合片段)可用于减弱T-reg细胞的活性，所述T-reg细胞通常伴随T细胞介导的针对自身细胞的细胞毒性，如T淋巴细胞对肿瘤细胞的攻击。这可例如通过本文所述的拮抗性TNFR2多肽抑制T-reg细胞的增殖和/或直接杀伤T-reg细胞的能力来实现。因此，可将拮抗性TNFR2多肽施用(例如，通过本文所述的各种施用途径中的任一种)于哺乳动物受试者，如人，以便延长适应性免疫响应(如针对癌细胞或病原生物体的响应)的持续时间。例如，以这种方式，本文所述的拮抗性TNFR2多肽(如单链多肽、抗体或其抗原结合片段)可与现有技术协同增强用于癌症和感染性疾病的基于T淋巴细胞的治疗。例如，可施用本文所述的TNFR2拮抗剂以遏制T-reg细胞活性，由此增强肿瘤反应性T细胞的细胞毒性作用。TNFR2拮抗剂还可与现有策略协同促进肿瘤反应性T细胞存活(如淋巴细胞耗竭和生长因子疗法)，并且进而延长体内抗肿瘤反应性的持续时间。
拮抗性TNFR2多肽(如单链多肽、抗体及其抗原结合片段)也可用于治疗哺乳动物受试者(例如人)中的多种传染性疾病，因为抑制T-reg增殖促进能够发动对病原生物体的攻击的CD8+T-淋巴细胞的活性。另外，本文所述的拮抗性TNFR2抗体及其抗原结合片段可用于治疗人或农业农场动物(例如，牛科哺乳动物、猪、奶牛、马、绵羊、山羊、猫、狗、兔、仓鼠、豚鼠或其他非人哺乳动物)的各种感染性疾病，如结核分枝杆菌。
对TNFR2+癌细胞的直接作用
本文所述的拮抗性TNFR2多肽(如单链多肽、抗体或其抗原结合片段)可结合癌细胞(如TNFR2+肿瘤细胞)表面上的TNFR2并使其失活。例如，本文所述的拮抗性TNFR2抗体及其抗原结合片段可结合T细胞淋巴瘤细胞(例如，霍奇金氏或皮肤非霍奇金氏淋巴瘤细胞)、卵巢癌细胞、结肠癌细胞、多发性骨髓瘤细胞或肾细胞癌细胞等表面上的TNFR2。本文所述的拮抗性TNFR2抗体及其抗原结合片段直接结合癌细胞上的TNFR2的能力提供了另一种途径，这些分子可通过所述途径减弱癌细胞存活和增殖。例如，本文所述的拮抗性TNFR2多肽(如含有拮抗性TNFR2单链多肽、抗体、其抗原结合片段或构建体)可直接结合癌细胞(例如，皮肤T细胞淋巴瘤细胞、卵巢癌细胞、结肠癌细胞或多发性骨髓瘤细胞，如卵巢癌细胞)表面上的TNFR2以便遏制所述细胞增殖和/或促进细胞的细胞凋亡的能力。
TNFR2拮抗剂多肽不依赖于额外的TNFR2结合剂获得活性
值得注意的是，本文所述的拮抗性TNFR2多肽(如单链多肽、抗体或其抗原结合片段)能够结合TNFR2并遏制TNFR2介导的信号传导而不需要内源性TNFR2结合剂，如TNFα。本文所述的拮抗性TNFR2多肽(如单链多肽、抗体、其抗原结合片段)不需要TNFα来减弱T-reg和/或癌细胞增殖。不受机制的限制，本文所述的拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段可表现出这种性质，因为这些抗体或其抗原结合片段能够在特定的表位处结合TNFR2，当结合时，这稳定这种受体的反平行二聚体构象。这种结构构型不能加强NFκB信号传导。通过将TNFR2维持在无活性结构状态，本文所述的拮抗性TNFR2抗体可阻止TNFR2激动剂恢复细胞生长，和/或可导致TNFR2+细胞，如T-reg细胞、MDSC细胞或TNFR2+癌细胞的直接杀伤(例如，通过凋亡)。
例如，本文所述的拮抗性TNFR2多肽(如单链多肽、抗体、其抗原结合片段及其构建体)可结合TNFR2+细胞，如T-reg细胞、癌细胞或骨髓源性抑制细胞(MDSC)表面上的TNFR2，并且在存在或不存在TNFα的情况下抑制此类细胞的增殖。例如，本文所述的拮抗性TNFR2多肽(如单链多肽、抗体及其抗原结合片段)可使此类细胞的增殖相对于未用所述TNFR2拮抗剂多肽处理的此类细胞抑制例如1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％或更多。拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体或其抗原结合片段)可在这种细胞增殖测定中表现出在TNFα的存在或不存在下基本不变的IC50值(例如，在TNFα存在下的IC50值相对于在TNFα不存在下在相同细胞增殖测定中所述拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体或其抗原结合片段)的IC50值变化小于50％、45％、40％、35％、25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或小于1％)。可用于测量TNFR2抗体的拮抗作用的细胞死亡测定的实例在本文中，例如在下文的实施例2中进行了描述。类似地，本文所述的拮抗性TNFR2多肽(如单链多肽、抗体、其抗原结合片段及其构建体)可使如通过测量选自由CHUK、NFKBIE、NFKBIA、MAP3K11、TRAF2、TRAF3、relB和cIAP2/BIRC3组成的组的一种或多种基因的表达评估的TNFR2信号传导相对于未用所述TNFR2拮抗剂多肽处理的此类细胞抑制例如1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％或更多。拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体或其抗原结合片段)可在这种基因表达测定中表现出在TNFα的存在或不存在下基本不变的IC50值(例如，在TNFα存在下的IC50值相对于在TNFα不存在下在相同基因表达测定中所述拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体或其抗原结合片段)的IC50值变化小于50％、45％、40％、35％、25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或小于1％)。
直接杀死T-reg细胞、MDSC和TNFR2+癌细胞
本文公开的拮抗性TNFR2多肽(如单链多肽、抗体、其抗原结合片段及其构建体)不仅可以例如减少T-reg细胞、TNFR2+癌细胞和/或MDSC的增殖，而且还可以诱导样品内(例如，患者如人患者体内)的T-reg细胞、TNFR2+癌细胞和/或MDSC的死亡。本文所述的拮抗性TNFR2抗体可以例如能够使用拮抗剂TNFR2抗体或其抗原结合片段处理的样品(如从正经历针对如本文所述的癌症或感染性疾病的治疗的人患者分离的样品)中的T-reg细胞、癌细胞(如皮肤T细胞淋巴瘤细胞、卵巢癌细胞、结肠癌细胞、肾细胞癌细胞或多发性骨髓瘤细胞)和/或MDSC的总数量相对于未用拮抗剂TNFR2抗体或其抗原结合片段处理的样品减少例如1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％或更多。
本文所述的拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体及抗原结合片段)减弱T-reg、MDSC和/或癌细胞生长的能力可能部分由于这些多肽减少样品(例如，从正经历针对如本文所述的癌症或感染性疾病的治疗的人患者分离的样品)中的可溶性TNFR2的数量的能力。在这种有益活性不存在的情况下，可溶性TNFR2可由例如T-reg细胞分泌，并且否则可能通过结合并隔离细胞外环境中的此类拮抗剂来干扰TNFR2拮抗剂定位至T-reg细胞、TNFR2+癌细胞或MDSC表面处的TNFR2的能力。通过减少TNFR2分泌，本文所述的拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段可使T-reg细胞、TNFR2+癌细胞和/或MDSC对治疗性分子，如拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段和/或可与本文所述的组合物和方法结合使用的额外抗癌剂，如本文所述或本领域中已知的那些越来越敏感。
活性(CD25高和CD45RA低)T-reg细胞的选择性调节
本文所述的拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体、其抗原结合片段及其构建体)可能能够抑制样品(例如，从正经历针对如本文所述的癌症或感染性疾病的治疗的人患者分离的样品)中的T-reg细胞的增殖或减少所述T-reg细胞的总数量，并且可在活跃分裂状态下选择性地作用于T-reg细胞。本文所述的拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段可选择性地靶向表达CD25高和CD45RA低的活性T-reg细胞，例如超过表达CD25中和CD45RA高的静息T-reg细胞。例如，本文所述的拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段可能能够使表达CD25高和CD45RA低的T-reg细胞的增殖相对于不表达CD25高和CD45RA低蛋白的T-reg细胞(如表达CD25中和CD45RA高蛋白的T-reg细胞)减少例如1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％或更多。
肿瘤微环境中的T-reg细胞、MDSC和T效应细胞的调节
本文所述的拮抗剂TNFR2多肽(如单链多肽、抗体及其抗原结合片段)可相对于未患癌症的受试者在患有癌症的患者中以更大的效力抑制T-reg细胞的增殖。本文所述的拮抗剂TNFR2多肽(如单链多肽、抗体及其抗原结合片段)可相对于不含癌细胞的部位(如患有癌症的患者中远离肿瘤的部位或未患癌症的受试者中的部位)在肿瘤的微环境中以更大的效力抑制T-reg细胞的增殖。可使用例如本文所述的细胞死亡测定来确定这种作用。例如，本文所述的多肽(如单链多肽、抗体、其抗原结合片段及其构建体)可表现出用于减少或抑制肿瘤微环境中T-reg细胞的增殖的IC50比所述多肽用于减少或抑制不含癌细胞的部位中T-reg细胞的增殖的IC50小例如1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、100倍、1,000倍、10,000倍或更多。可用于测量抗TNFR2多肽的拮抗作用的细胞死亡测定的实例在本文中，例如在下文的实施例2中进行了描述。本文所述的多肽(如单链多肽、抗体、其抗原结合片段及其构建体)可抑制T-reg细胞的增殖或者可促进T-reg细胞的凋亡，其效力在含有TNFR2+癌细胞(如霍奇金氏淋巴瘤细胞、皮肤非霍奇金氏淋巴瘤细胞、T细胞淋巴瘤细胞)、卵巢癌细胞、结肠癌细胞、多发性骨髓瘤细胞、肾细胞癌细胞、皮肤癌细胞、肺癌细胞、肝癌细胞、子宫内膜癌细胞、造血或淋巴癌细胞、中枢神经系统癌细胞、乳腺癌细胞、胰腺癌细胞、胃癌细胞、食道癌细胞和上消化道癌细胞的肿瘤的微环境中比在不含此类癌细胞的部位(如患有前述癌症中的一种或多种的患者中远离肿瘤的部位或未患癌症的受试者中的部位)中更大。
另外或可替代地，本文所述的多肽(如单链多肽、抗体、其抗原结合片段及其构建体)可相对于未患癌症的受试者在患有癌症的患者中以更大的效力抑制MDSC的增殖。本文所述的多肽(如单链多肽、抗体、其抗原结合片段及其构建体)可相对于不含癌细胞的部位(如患有癌症的患者中远离肿瘤的部位或未患癌症的受试者中的部位)在肿瘤的微环境中以更大的效力抑制MDSC的增殖。可使用例如本文所述的细胞死亡测定来确定这种作用。例如，本文所述的多肽(如单链多肽、抗体、其抗原结合片段及其构建体)可具有的用于减少或抑制肿瘤微环境中MDSC的增殖的IC50比所述多肽用于减少或抑制不含癌细胞的部位中MDSC的增殖的IC50小例如1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、100倍、1,000倍、10,000倍或更多。可用于测量抗TNFR2多肽的拮抗作用的细胞死亡测定的实例在本文中，例如在下文的实施例2中进行了描述。本文所述的多肽(如单链多肽、抗体、其抗原结合片段及其构建体)可抑制MDSC的增殖或者可促进MDSC的细胞凋亡，其效力在含有TNFR2+癌细胞(如霍奇金氏淋巴瘤细胞、皮肤非霍奇金氏淋巴瘤细胞、T细胞淋巴瘤细胞、卵巢癌细胞、结肠癌细胞、多发性骨髓瘤细胞、肾细胞癌细胞、皮肤癌细胞、肺癌细胞、肝癌细胞、子宫内膜癌细胞、造血或淋巴癌细胞、中枢神经系统癌细胞、乳腺癌细胞、胰腺癌细胞、胃癌细胞、食道癌细胞和上消化道癌细胞)的肿瘤的微环境中比在不含此类癌细胞的部位(如患有前述癌症中的一种或多种的患者中远离肿瘤的部位或未患癌症的受试者中的部位)中更大。
另外地或可替代地，本文所述的多肽(如单链多肽、抗体、其抗原结合片段及其构建体)可相对于未患癌症的受试者在患有癌症的患者中以更大的效力扩增T效应细胞，如CD8+细胞毒性T细胞。在一些实施方案中，本文所述的多肽(如单链多肽、抗体、其抗原结合片段及其构建体)相对于不含癌细胞的部位(如患有癌症的患者中远离肿瘤的部位或未患癌症的受试者中的部位)在肿瘤的微环境中以更大的效力扩增T效应细胞，如CD8+细胞毒性T细胞。可使用例如本文所述的细胞增殖测定来确定这种作用。例如，本文所述的多肽(如单链多肽、抗体、其抗原结合片段及其构建体)可具有的用于扩增肿瘤微环境中的T效应细胞的EC50比所述多肽用于扩增不含癌细胞的部位中的T效应细胞的EC50小例如1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、100倍、1,000倍、10,000倍或更多。可用于测量抗TNFR2多肽对T效应细胞的作用的细胞增殖测定的实例在本文中，例如在下文的实施例2中进行了描述。本文所述的多肽(如单链多肽、抗体、其抗原结合片段及其构建体)可直接扩增T效应细胞，如CD8+细胞毒性T细胞，其效力在含有TNFR2+癌细胞(如霍奇金氏淋巴瘤细胞或皮肤非霍奇金氏淋巴瘤细胞、T细胞淋巴瘤细胞)、卵巢癌细胞、结肠癌细胞、多发性骨髓瘤细胞、肾细胞癌细胞、皮肤癌细胞、肺癌细胞、肝癌细胞、子宫内膜癌细胞、造血或淋巴癌细胞、中枢神经系统癌细胞、乳腺癌细胞、胰腺癌细胞、胃癌细胞、食道癌细胞和上消化道癌细胞的肿瘤的微环境中比在不含此类癌细胞的部位(如患有前述癌症中的一种或多种的患者中远离肿瘤的部位或未患癌症的受试者中的部位)中更大。所述T效应细胞(例如，CD8+细胞毒性T细胞)可例如与存在于一种或多种癌细胞如霍奇金氏淋巴瘤细胞、皮肤非霍奇金氏淋巴瘤细胞、T细胞淋巴瘤细胞、卵巢癌细胞、结肠癌细胞、多发性骨髓瘤细胞、肾细胞癌细胞、皮肤癌细胞、肺癌细胞、肝癌细胞、子宫内膜癌细胞、造血或淋巴癌细胞、中枢神经系统癌细胞、乳腺癌细胞、胰腺癌细胞、胃癌细胞、食道癌细胞和上消化道癌细胞上的抗原特异性地反应。
全长TNFR2拮抗剂抗体的抗原结合片段的活性
本文所述的拮抗性TNFR2抗体可抑制例如T-reg、癌细胞和/或MDSC生长或者促进T效应细胞生长，其效力与此类抗体的抗原结合片段所表现出的效力相似。例如，除去本文所述的拮抗性TNFR2抗体的Fc区可能不会改变所述分子减弱样品(例如，从正经历针对如本文所述的癌症或感染性疾病的治疗的人患者分离的样品)中的T-reg细胞、MDSC和/或癌细胞的增殖或减少所述T-reg细胞、MDSC和/或癌细胞的总数量的能力。本文所述的拮抗性TNFR2抗体以及其抗原结合片段可以例如通过不同于抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的途径起作用，在抗体依赖性细胞毒性途径中需要Fc区来募集效应蛋白以诱导细胞死亡。另外，拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段可以以多种形式表现出治疗活性，所述形式如单链多肽(例如，含有一个或多个CDR例如通过酰胺键、硫醚键、碳-碳键或二硫桥彼此共价结合的单链多肽)、单克隆抗体或其抗原结合片段、多克隆抗体或其抗原结合片段、人源化抗体或其抗原结合片段、灵长类化抗体或其抗原结合片段、双特异性抗体或其抗原结合片段、多特异性抗体或其抗原结合片段、双重可变免疫球蛋白结构域、单价抗体或其抗原结合片段、嵌合抗体或其抗原结合片段、单链Fv分子(scFv)、双抗体、三抗体、纳米抗体、抗体样蛋白支架、结构域抗体、Fv片段、Fab片段、F(ab’)2分子以及串联scFv(taFv)。
拮抗性TNFR2多肽的特异性结合性质
本文所述的多肽(如单链多肽、抗体或抗体片段)与人TNFR2的特异性结合可通过多种已建立的方法中的任一种来确定。亲和力可通过各种测量来定量地表示，包括实现体外TNFα-TNFR2相互作用的半数最大抑制所需的抗体的浓度(IC50)和抗体-TNFR2复合物解离的平衡常数(KD)。描述TNFR2与本文所述的抗体的相互作用的平衡常数KD是TNFR2-抗体复合物解离反应成彼此不相互作用的溶剂分离的TNFR2和抗体分子的化学平衡常数。
本文所述的多肽(例如，单链多肽、抗体和抗原结合片段)包括以小于100nM(例如，95nM、90nM、85nM、80nM、75nM、70nM、65nM、60nM、55nM、50nM、45nM、40nM、35nM、30nM、25nM、20nM、15nM、10nM、5nM、4nM、3nM、2nM或1nM)的KD值特异性地结合至TNFR2的那些。在一些实施方案中，本文所述的多肽(例如，单链多肽、抗体、其抗原结合片段及其构建体)以小于1nM(例如，(例如，990pM、980pM、970pM、960pM、950pM、940pM、930pM、920pM、910pM、900pM、890pM、880pM、870pM、860pM、850pM、840pM、830pM、820pM、810pM、800pM、790pM、780pM、770pM、760pM、750pM、740pM、730pM、720pM、710pM、700pM、690pM、680pM、670pM、660pM、650pM、640pM、630pM、620pM、610pM、600pM、590pM、580pM、570pM、560pM、550pM、540pM、530pM、520pM、510pM、500pM、490pM、480pM、470pM、460pM、450pM、440pM、430pM、420pM、410pM、400pM、390pM、380pM、370pM、360pM、350pM、340pM、330pM、320pM、310pM、300pM、290pM、280pM、270pM、260pM、250pM、240pM、230pM、220pM、210pM、200pM、190pM、180pM、170pM、160pM、150pM、140pM、130pM、120pM、110pM、100pM、90pM、80pM、70pM、60pM、50pM、40pM、30pM、20pM、10pM、5pM或1pM)的KD值特异性结合至TNFR2。
本文所述的多肽还可通过多种体外结合测定来表征。可用于确定抗TNFR2多肽的KD或IC50的实验的实例包括例如表面等离子体共振、等温滴定量热法、荧光各向异性和基于ELISA的测定等。ELISA代表了用于分析抗体活性的特别有用的方法，因为此类测定通常需要最小浓度的抗体。在典型的ELISA测定中进行分析的常见信号是发光，发光通常是与特异性地结合一级抗体(例如，本文所述的TNFR2抗体)的二级抗体缀合的过氧化物酶的活性的结果。本文所述的多肽(例如，单链多肽、抗体及抗原结合片段)能够结合TNFR2和源自其中的表位，如含有人TNFR2的CD3和/或CD4内的一个或多个连续或不连续残基的表位。本文所述的拮抗性多肽可额外地结合源自TNFR2的以模拟上述表位在天然蛋白质中的构象的方式在结构上预组构各种残基的分离的肽。例如，本文所述的多肽(例如，单链多肽、抗体、其抗原结合片段及其构建体)可结合含有SEQ ID NO:11、19、20和34-117中任一个的氨基酸序列的肽，或相对于SEQ D NO:11、19、20和34-117中任一个的氨基酸序列具有最多五个氨基酸取代的肽(如相对于SEQ D NO:11、19、20和34-117中任一个的氨基酸序列具有最多五个保守氨基酸取代的肽)，和/或具有与SEQ D NO:11、19、20和34-117中任一个的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列的肽。在直接ELISA实验中，可例如通过分析在HRP底物(例如，2,2'-连氮基-二-3-乙基苯并噻唑啉磺酸盐)与结合至HRP缀合的二级抗体的抗原-抗体复合物一起孵育时发生的发光来定量这种结合。
拮抗性TNFR2多肽的动力学性质
除了TNFR2-多肽相互作用的热力学参数外，还有可能定量地表征本文所述的多肽与TNFR2的动力学缔合和解离。这可例如通过根据已建立的程序监测多肽-抗原(例如，抗体-抗原)复合物形成的速率来进行。例如，可使用表面等离子体共振(SPR)来确定抗体-TNFR2复合物的形成(kon)和解离(koff)的速率常数。这些数据还使得能够计算抗体-TNFR2复合物解离的平衡常数(KD)，因为这种单分子解离的平衡常数可表示为koff与kon值的比率。SPR是特别有利于确定受体-抗体相互作用的动力学和热力学参数的技术，因为所述实验不需要通过连接化学标记来修饰一种组分。相反，所述受体通常固定在固体金属表面上，所述表面用增加浓度的抗体溶液脉冲处理。抗体-受体结合诱导金属表面处入射光的反射角失真，并且在将抗体引入系统时，可将折射率随时间推移的这种变化拟合至建立的回归模型以计算抗体-受体相互作用的缔合和解离速率常数。
本文所述的多肽(例如，单链多肽、抗体、抗原结合片段及其构建体)在与TNFR2相互作用时可表现出高kon和低koff值，与高亲和力受体结合一致。例如，本文所述的多肽可在TNFR2存在下表现出大于104M-1s-1(例如，1.0x104M-1s-1、1.5x104M-1s-1、2.0x104M-1s-1、2.5x104M-1s-1、3.0x104M-1s-1、3.5x104M-1s-1、4.0x104M-1s-1、4.5x104M-1s-1、5.0x104M-1s-1、5.5x104M-1s-1、6.0x104M-1s-1、6.5x104M-1s-1、7.0x104M-1s-1、7.5x104M-1s-1、8.0x104M-1s-1、8.5x104M-1s-1、9.0x104M-1s-1、9.5x104M-1s-1、1.0x105M-1s-1、1.5x105M-1s-1、2.0x105M-1s-1、2.5x105M-1s-1、3.0x105M-1s-1、3.5x105M-1s-1、4.0x105M-1s-1、4.5x105M-1s-1、5.0x105M-1s-1、5.5x105M-1s-1、6.0x105M-1s-1、6.5x105M-1s-1、7.0x105M-1s-1、7.5x105M-1s-1、8.0x105M-1s-1、8.5x105M-1s-1、9.0x105M-1s-1、9.5x105M-1s-1或1.0x106M-1s-1)的kon值。当与TNFR2结合时，本文所述的多肽(例如，单链多肽、抗体、抗原结合片段及其构建体)可表现出低koff值，因为这些多肽能够以高亲和力与不同的TNFR2表位相互作用。这些表位内的残基可与TFNR2形成强烈的分子间接触，其可减缓抗体-TNFR2复合物的解离。这种高受体亲和力可表现在低koff值。例如，本文所述的多肽当与TNFR2复合时可表现出小于10-3s-1(例如，1.0x10-3s-1、9.5x10-4s-1、9.0x10-4s-1、8.5x10-4s-1、8.0x10-4s-1、7.5x10-4s-1、7.0x10-4s-1、6.5x10-4s-1、6.0x10-4s-1、5.5x10-4s-1、5.0x10-4s-1、4.5x10-4s-1、4.0x10-4s-1、3.5x10-4s-1、3.0x10-4s-1、2.5x10-4s-1、2.0x10-4s-1、1.5x10-4s-1、1.0x10-4s-1、9.5x10-5s-1、9.0x10-5s-1、8.5x10-5s-1、8.0x10-5s-1、7.5x10-5s-1、7.0x10-5s-1、6.5x10-5s-1、6.0x10-5s-1、5.5x10-5s-1、5.0x10-5s-1、4.5x10-5s-1、4.0x10-5s-1、3.5x10-5s-1、3.0x10-5s-1、2.5x10-5s-1、2.0x10-5s-1、1.5x10-5s-1或1.0x10-5s-1)的koff值。
TNFR2内由拮抗性TNFR2多肽结合的表位
开发能够拮抗TNFR2的抗TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体及抗原结合片段)的困难之一一直是阐明TNFR2内参与拮抗性复合物形成的表位而不是促进信号转导的表位。本公开部分基于TNFR2内表位的发现，当结合时，所述表位促进受体拮抗作用和促进以下有利的生物活性中的一个或多个或全部活性的能力：
(a)遏制T-reg细胞的增殖和/或直接杀伤T-reg细胞，例如通过结合T-reg细胞表面上的TNFR2并使其失活；
(b)遏制MDSC的增殖和/或直接杀伤MDSC，例如通过结合MDSC表面上的TNFR2并使其灭活；
(c)促进T效应细胞的扩增，如CD8+T细胞；和/或
(d)遏制表达TNFR2的癌细胞(如霍奇金淋巴瘤细胞、皮肤非霍奇金淋巴瘤细胞、T细胞淋巴瘤细胞、卵巢癌细胞、结肠癌细胞、多发性骨髓瘤细胞、肾细胞癌细胞、皮肤癌细胞、肺癌细胞、肝癌细胞、子宫内膜癌细胞、造血或淋巴癌细胞、中枢神经系统癌细胞、乳腺癌细胞、胰腺癌细胞、胃癌细胞、食道癌细胞和上消化道癌细胞)的增殖和/或直接杀伤所述癌细胞。
拮抗性TNFR2多肽，本文所述的此类显性拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体、抗原结合片段及其构建体)可特异性结合人TNFR2上的以下表位中的一个或多个表位：
(a)SEQ ID NO:7的氨基酸142-146(KCRPG)；
(b)SEQ ID NO:7的氨基酸142-149(KCRPGFGV)；
(c)SEQ ID NO:7的氨基酸137-144(CAPLRKCR)；
(d)SEQ ID NO:7的氨基酸150-190(RPGTETSDVVCKPCAPGTFSNTTSSTDICRPHQICNVVAI)；
(e)SEQ ID NO:7的氨基酸161-169(CKPCAPGTF)；
(f)SEQ ID NO:7的氨基酸75-128(CDSCEDSTYTQLWNWVPECLSCGSRCSSDQVETQACTREQNRICTCRPGWYCAL)，任选地其中表位在SEQ ID NO:7的氨基酸80-86(DSTYTQL)、91-98(PECLSCGS)或116-123(RICTCRPG)内；
(g)SEQ ID NO:7的氨基酸174-184(SSTDICRPHQI)；
(h)SEQ ID NO:7的氨基酸126-140(CALSKQEGCRLCAPL)；
(i)SEQ ID NO:7的氨基酸156-165(TSDVVCKPCA)；
(j)非人哺乳动物(如本文所述的非人哺乳动物)的TNFR2内的等同表位，显示出与任何前述表位具有至少85％序列同一性(例如，85％、90％、95％、97％、99％或100％序列同一性)的表位，和/或相对于这些表位包含一个或多个保守氨基酸取代的表位。
在一些实施方案中，本文所述的拮抗性TNFR2多肽，如显性拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体、抗原结合片段及其构建体)，不结合人TNFR2内的SEQ ID NO:7的142-146(KCRPG,SEQ ID NO:19)的或多个或所有残基。另外，本文描述的拮抗性TNFR2多肽明显未表现出与含有人TNFR2内的SEQ ID NO:7的残基56-60(KCSPG,SEQ ID NO:12)的表位特异性结合。表现出结合人TNFR2内的一个或多个上述表位和包含人TNFR2内的SEQ ID NO:7的残基56-60的表位的能力的多肽缺乏抑制性(拮抗性)活性。因此，TNFR2多肽区分这些表位并与上述表位中的一种或多种特异性相互作用以及不参与与由人TNFR2内的SEQ ID NO:7的残基56-60组成的表位的特异性结合的能力表征了本文所述的拮抗TNFR2信号传导的多肽。
可用于预测本文所述的TNFR2多肽的抑制活性的一个示例性程序是确定抗体或抗体片段对含有KCRPG基序(SEQ ID NO:19)的肽，如含有该基序的线性或环状肽的亲和力。例如，以模拟KCRPG基序(SEQ ID NO:19)的三维取向的方式通过一种或多种构象约束(例如，主链或侧链对侧链环化(side-chain-to-side-chain cyclization))对所述肽进行结构预组织。例如，本文所述的拮抗性TNFR2多肽可以特异性结合这种肽，其中亲和力大于拮抗性TNFR2多肽对由人TNFR2内的SEQ ID NO:7的残基48-67(QTAQMCCSKCSPGQHAKVFC,SEQ IDNO:18)定义的肽片段的亲和力。例如，本文所述的拮抗性TNFR2多肽可以结合含有KCRPG基序(SEQ ID NO:19)的肽，其中亲和力例如为所述拮抗性多肽对具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的肽的亲和力的10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍或1000多倍。
结合非人动物的TNFR2的拮抗性TNFR2多肽
除了结合人TNFR2内的上述表位外，本文所述的拮抗性TNFR2多肽，如显性拮性TNFR2多肽，还包括特异性结合非人动物的TNFR2内的含有一个或多个等同基序的表位的多肽。在例如WO2016/187068和WO 2017/197331(它们的公开内容以引用的方式整体并入本文)中描述了与人TNFR2中在结合时产生拮抗表型的那些表位等同的表位的位置。可被本公开的拮抗性多肽结合的非人动物的示例性TNFR2蛋白包括但不限于来自牛、野牛和本文所述的其它农业动物的TNFR2蛋白。
拮抗性TNFR2抗体TNFRAB1
本文所述的示例性拮抗性TNFR2多肽(如单链多肽、抗体、其抗原结合片段及其构建体)可包括TNFRAB1(一种拮抗TNFRα-TNFR2相互作用的鼠抗体)的CDR中的一个或多个或全部。例如，TNFRAB1的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和/或CDR-L3及这些CDR的变体(例如，相对于这些CDR序列表现出保守氨基酸取代的变体)可用于例如，使用本文所述或本领域中已知的抗体人源化方法来产生拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段。
本公开的拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体及抗原结合片段)可表现出与TNFRAB1的结合性质相同或相似的结合性质。这些性质是如下：在TNFR2存在下，TNFRAB1表现出在与TNFR2的复合中4.98x106M-1s-1的高kon值，以及2.21x10-4s-1的低koff值和约44.4pM的KD。KCRPGFGV基序(SEQ ID NO:20)，并且特别是KCRPG序列(SEQ ID NO:19)已被鉴别为与TNFRAB1建立分子间接触的功能性表位的特别重要的组分，如通过表位作图分析所确定。这些残基与本公开的抗TNFR2抗体的相互作用选择性地促进拮抗活性。值得注意的是，包含人TNFR2内的SEQ ID NO:7的氨基酸残基56-60(KCSPG，SEQ ID NO:12)的TNFR2表位明显不是由本公开的TNFRAB1或拮抗性TNFR2抗体或抗体片段特异性结合的构象表位的一部分，因为已经显示与这两种表位的特异性结合导致拮抗活性的丧失或显著降低。
除了结合序列KCRPGFGV(SEQ ID NO:20)内包含的表位外，TNFRAB1还结合由人TNFR2内的SEQ ID NO:7的位置161-169(CKPCAPGTF，SEQ ID NO:21)限定的序列内包含的下游表位。本公开的TNFR2抗体和抗体片段还可结合此表位或TNFR2内含有此表位的较大区域(例如，包含人TNFR2内的SEQ ID NO:7的位置150-190(ARPGTETSDVVCKPCAPGTFSNTTSSTDICRPHQICNVVAI，SEQ ID NO:22)的至少五个连续或不连续残基的序列)。TNFRAB1含有两条重链，以及两条轻链。TNFRAB1的重链含有以下氨基酸序列(CDR以粗体表示)：
Figure BDA0003027090150001331
TNFRAB1轻链的序列是如下(CDR以粗体表示)：
Figure BDA0003027090150001332
TNFRAB2的重链和轻链CDR如下所示：
TNFRAB1 CDR-H1：GFTFSSY(SEQ ID NO：23)
TNFRAB1 CDR-H2：SSGGSY(SEQ ID NO：24)
TNFRAB1 CDR-H3：QRVDGYSSYWYFDV(SEQ ID NO：25)
TNFRAB1 CDR-L1：SASSSVYYMY(SEQ ID NO:26)
TNFRAB1 CDR-L2：STSNLAS(SEQ ID NO：26)
TNFRAB1 CDR-L3：QQRRNYPYT(SEQ ID NO：28)
拮抗性TNFR2抗体TNFRAB2
本文所述的拮抗性TNFR2多肽，如单链多肽、抗体、其抗原结合片段及其构建体，可包括TNFRAB2的一个或多个或全部CDR，所述TNFRB2是拮抗TNFRAα-TNFR2相互作用的另一种抗体。例如，TNFRAB2的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和/或CDR-L3以及这些CDR的变体(例如，相对于这些CDR序列表现出保守氨基酸取代的变体)可用于产生拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段，例如使用本文所述或本领域已知的抗体人源化方法。
例如，本公开的拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体及抗原结合片段)可表现出与TNFRAB2的结合性质相同或相似的结合性质。这些性质是如下：在TNFR2存在下，TNFRAB2表现出在与TNFR2的复合中3.6099x105M-1s-1的高kon值，以及2.24x10-4s-1的低koff值和约621pM的KD。含有人TNFR2内的SEQ ID NO:7的残基137-144(CAPLRKCR，SEQ ID NO:11)的表位已被鉴别为与TNFRAB2建立分子间接触的功能性表位的特别重要的组分，如通过表位作图分析所确定。本公开包括TNFR2抗体和特异性地结合此表位的抗体片段。
除了结合含有残基CAPLRKCR(SEQ ID NO:11)的表位外，TNFRAB2还结合至包含人TNFR2内的SEQ ID NO:7的位置80-86(DSTYTQL，SEQ ID NO:8)、人TNFR2内的SEQ ID NO:7的位置91-98(PECLSCGS，SEQ ID NO:9)以及人TNFR2内的SEQ ID NO:7的位置116-123(RICTCRPG，SEQ ID NO:10)内的一个或多个残基的表位。本公开的TNFR2抗体和抗体片段也可结合这些表位中的一个或多个。可使用由TNFRAB2特异性结合的表位的知识来设计并鉴别本公开的抗体和抗体片段。例如，可使用如本文所述或本领域中已知的多种体外肽展示技术或组合抗体文库筛选中的任一种，以筛选能够以高亲和力和选择性结合这些表位的抗体。
TNFRAB2的重链和轻链CDR在以下示出：
TNFRAB2 CDR-H1：GYTFTDYL(SEQ ID NO：274)
TNFRAB2 CDR-H2：VDPEYGST(SEQ ID NO：258)
TNFRAB2 CDR-H3：ARDDGSYSPFDYWG(SEQ ID NO：259)
TNFRAB2 CDR-L1：QNINKY(SEQ ID NO：260)
TNFRAB2 CDR-L2：TYS
TNFRAB2 CDR-L3：CLQYVNLLT(SEQ ID NO：272)
另外，TNFRAB2的CDR-L2侧接N末端框架残基LLIR(SEQ ID NO:262)和C末端框架残基TLE。因此，本公开的拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体及抗原结合片段)包括含有TNFRAB2的上述CDR中的一个或多个以及N末端LLIR(SEQ ID NO:262)和侧接拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段的CDR-L2序列的C末端TLE残基的那些。
拮抗性TNFR2抗体TNFRAB3
本文所述的拮抗性TNFR2多肽，如单链多肽、抗体、其抗原结合片段及其构建体，可表现出与TNFRAB3的结合性质相同或相似的结合特性。TNFRAB3是单克隆抗体，并且也是显性TNFR2拮抗剂。单克隆抗体TNFRAB3具有GYTFTDVI(SEQ ID NO:293)的CDR-H1氨基酸序列。TNFRAB3结合人TNFR2的CDR3和/或CRD4内的表位但不结合人TNFR2的CRD1内的表位。
如下文详细描述的，本文所述的拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体、其抗原结合片段及其构建体)可通过产生和鉴定表现出与TNFRAB3的表位结合特性相似的表位结合特性的抗体来产生。用于产生具有与TNFRAB3相似的表位结合特性的多肽(例如，单链多肽、抗体、其抗原结合片段及其构建体)的示例性技术，包括但不限于产生包含TNFRAB3的一个或多个或全部互补决定区(CDR)的完全人抗体、人源化抗体、灵长类化抗体和嵌合抗体，以及筛选特异性结合TNFRAB3所特异性结合的TNFR2上的一个或多个或全部表位的多肽。
拮抗性TNFR2抗体TNFRAB4
本文所述的拮抗性TNFR2多肽，如单链多肽、抗体、其抗原结合片段及其构建体，可以表现出与TNFRAB4的结合特性相同或相似的结合特性。TNFRAB4是本文所述的鼠单克隆抗体。这种抗体是显性TNFR2拮抗剂。单克隆抗体TNFRAB4结合人TNFR2内含有下列氨基酸残基的表位:
(a)人TNFR2内的SEQ ID NO:7的残基174-184(SSTDICRPHQI,SEQ ID NO:288)；
(b)人TNFR2(CALSKQEGCRLCAPL)内的SEQ ID NO:7的残基126-140(CALSKQEGCRLCAPL)，SEQ ID NO:289)；和
(c)人TNFR2(TSDVVCKPCA)内的SEQ ID NO:7的残基156-165(TSDVVCKPCA)，SEQ IDNO:290)。
如下文所详细描述的，本文所述的拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体、其抗原结合片段及其构建体)可通过产生和鉴定表现出与TNFRAB4的表位结合特性相似的表位结合特性的抗体来产生。用于产生具有与TNFRAB4的表位结合特性相似的表位结合特性的多肽(例如，单链多肽、抗体、其抗原结合片段及其构建体)的示例性技术，包括但不限于产生包含TNFRAB4的一个或多个或全部互补决定区(CDR)的完全人抗体、人源化抗体、灵长类化抗体和嵌合抗体，以及筛选特异性结合TNFRAB4所特异性结合的TNFR2上的一个或多个或全部表位的多肽。
拮抗性TNFR2抗体TNFRAB5
本文所述的拮抗性TNFR2多肽，如单链多肽、抗体、其抗原结合片段及其构建体，可表现出与TNFRAB5的结合特性相同或相似的结合特性。TNFRAB5是单克隆抗体和显性TNFR2拮抗剂。单克隆抗体TNFRAB5具有GYTFTDYS(SEQ ID NO:294)的CDR-H1氨基酸序列。TNFRAB5结合人TNFR2的CDR3和/或CDR4内的表位但不结合人TNFR2的CDR1内的表位。
如下文所详细描述的，本文描述的拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体、其抗原结合片段及其构建体)可通过产生和鉴定表现出与TNFRAB5的表位结合特性相似的表位结合特性的抗体来产生。用于产生具有与TNFRAB5的表位结合特性相似的表位结合特性的多肽(例如，单链多肽、抗体、其抗原结合片段及其构建体)的示例性技术，包括但不限于产生包含TNFRAB5的一个或多个或全部互补决定区(CDR)的完全人抗体、人源化抗体、灵长类化抗体和嵌合抗体，以及筛选特异性结合TNFRAB5所特异性结合的TNFR2上的一个或多个或全部表位的多肽。
完全人抗体、人源化抗体和嵌合抗体
本文所述的抗体包括完全人抗体、人源化抗体、灵长类化抗体和嵌合抗体，其含有TNFRAB1、TNFRAB2、TNFRAB3、TNFRAB4或TNFRAB5的一个或多个或全部CDR序列(例如，TNFRAB1、TNFRAB2、TNFRAB3、TNFRAB4或TNFRAB5的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和/或CDR-L3序列)。另外，本文所述的抗体包括全人抗体、人源化抗体、灵长类化抗体和嵌合抗体，所述抗体含有CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列中的一个或多个或全部，其中所述CDR序列中的一个或多个或全部表现出与TNFRAB1、TNFRAB2、TNFRAB3、TNFRAB4或TNFRAB5的相应CDR序列具有至少85％序列同一性(例如，90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性)。本文所述的拮抗性TNFR2抗体还包括完全人抗体、人源化抗体、灵长类化抗体和嵌合抗体，所述抗体含有CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列中的一个或多个或全部，其中所述CDR序列中的一个或多个或全部相对于TNFRAB1、TNFRAB2、TNFRAB3、TNFRAB4或TNFRAB5的相应CDR序列含有一个或多个(例如，多达3个)氨基酸取代(例如，一个或多个保守氨基酸取代)。例如，本文所述的拮抗性TNFR2抗体可通过将TNFRAB1、TNFRAB2、TNFRAB3、TNFRAB4或TNFRAB5的CDR序列中的任一个或多个并入人抗体的框架区(例如，FW1、FW2、FW3和FW4)来产生。可用于开发包含TNFRAB1、TNFRAB2、TNFRAB3、TNFRAB4或TNFRAB5的CDR中的一个或多个的人源化抗TNFR2抗体的示例性框架区，包括但不限于美国专利号7,732,578、美国专利号8,093,068和WO 2003/105782中描述的那些；所述专利中的每个专利的公开内容以引用的方式并入本文。
例如，可用于设计本文所述人源化抗体的一种策略是将TNFRAB1、TNFRAB2、TNFRAB3、TNFRAB4或TNFRAB5的重链可变区和轻链可变区的序列与共有人抗体的重链可变区和轻链可变区进行比对。共有人抗体重链和轻链序列是本领域已知的(参见例如，“VBASE”人种系序列数据库；也参见Kabat等人，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第5版，U.S.Department of Health and Human Services,NIHPublication No.91-3242,1991；Tomlinson等人，J.Mol.Biol.227:776-98,1992；和Cox等人，Eur.J.Immunol.24:827-836,1994；其公开内容以引用的方式并入本文)。这样，可变结构域框架残基和CDR可通过序列比对(参见Kabat，同上)来鉴定。例如，可用TNFRAB1、TNFRAB2、TNFRAB3、TNFRAB4或TNFRAB5的一个或多个相应CDR取代共有人抗体的一个或多个CDR，以产生人源化TNFR2拮抗剂抗体。共有人抗体的示例性可变结构域包括在美国专利号6,054,297中鉴别的重链可变结构域：
Figure BDA0003027090150001391
和轻链可变结构域：
Figure BDA0003027090150001392
所述专利以引用的方式并入本文(以粗体示出的CDR是根据Chothia,等人,J.Mol.Biol,196:901-917,1987的方法所确定)。这些氨基酸取代可例如通过使用本领域已知的或本文描述的方法在宿主细胞中重组表达编码人源化抗体的重链和轻链的多核苷酸来进行。
类似地，该策略也可用于产生灵长类化的拮抗性TNFR2抗体，因为可以用例如TNFRAB1、TNFRAB2、TNFRAB3、TNFRAB4或TNFRAB5的一个或多个或全部CDR取代例如灵长类抗体共有序列的一个或多个或全部CDR。本领域已知的共有灵长类抗体序列(参见例如，美国专利号5,658,570、5,681,722和5,693,780；每个专利的公开内容以引用的方式并入本文)。
在一些实施方案中，除了来自拮抗性TNFR2抗体如TNFRAB1、TNFRB2、TNFRAB3、TNFRAB4或TNFRAB5的CDR序列以外，还可能需要将特定的框架残基引入人抗体的重链和/或轻链可变结构域。例如，美国专利号6,054,297确定了在所得人源化抗体中保留来自特定抗体重链或轻链可变区的某些框架残基可能有利的几种情况。在一些实施方案中，框架残基可以参与与抗原的非共价相互作用，因此促成抗体对靶抗原的亲和力。在一些实施方案中，单个框架残基可以调节CDR的构象，从而间接影响抗体与抗原的相互作用。某些框架残基可形成VH与VL结构域之间的界面，因此可促成整体抗体结构。在一些情况下，框架残基可构成功能性糖基化位点(例如，Asn-X-Ser/Thr)，所述位点可决定抗体结构和与碳水化合物部分附着时的抗原亲和力。在如上所述那些的情况下，在例如人源化或灵长类化拮抗性抗体或其抗原结合片段中保留TNFR2拮抗剂抗体(例如，TNFRAB1、TNFRB 2、TNFRAB3、TNFRAB4或TNFRAB5)的某些框架残基可以是有益的，因为各种框架残基可以促进抗体或其抗原结合片段的高表位亲和力和改善的生化活性。
本文所述的抗体还包括抗体片段、Fab结构域、F(ab’)分子、F(ab’)2分子、单链可变片段(scFv)、串联scFv片段、双抗体、三抗体、双重可变结构域免疫球蛋白、多特异性抗体、双特异性抗体和异源特异性抗体，所述抗体包含TNFRAB1、TNFRAB2、TNFRAB3、TNFRAB4或TNFRAB5的CDR中的一个或多个或全部，或CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3中的一个或多个或全部，其中所述CDR序列中的一个或多个或全部表现出与TNFRAB1、TNFRAB2、TNFRAB3、TNFRAB4或TNFRAB5的相应CDR序列具有至少85％序列同一性(例如，90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性)。本文所述的拮抗性TNFR2抗体还包括全人抗体、人源化抗体、灵长类化抗体和嵌合抗体，所述抗体包含CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列中的一个或多个或全部，其中所述CDR序列中的一个或多个或全部相对于TNFRAB1、TNFRAB2、TNFRAB3、TNFRAB4或TNFRAB5的相应CDR包含有一个或多个(例如，最多3个)氨基酸取代(例如，一个或多个保守氨基酸取代)。这些分子可例如通过使用本文所述或本领域中已知的技术将编码这些蛋白质的多核苷酸掺入表达载体中以用于在真核或原核细胞中转染而重组表达或者例如通过本文所述或本领域中已知的固相肽合成方法化学地合成。
本文所述的多肽另外包括抗体样支架，其包含例如TNFRAB1、TNFRAB2、TNFRAB3、TNFRAB4或TNFRAB5的CDR中的一个或多个或全部，或CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列中的一个或多个或全部，其中所述CDR序列中的一个或多个或全部表现出与TNFRAB1、TNFRAB2、TNFRAB3、TNFRAB4或TNFRAB5的相应CDR序列具有至少85％序列同一性(例如，90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性)，或者相对于TNFRAB1、TNFRAB2、TNFRAB3、TNFRAB4或TNFRAB5的相应CDR序列包含一个或多个(例如，多达3个)氨基酸取代(例如，一个或多个保守氨基酸取代)。抗体样支架的实例包括包含第十纤连蛋白III型结构域(10Fn3)的蛋白质，所述结构域包含类似于典型抗体的BC、DE和FG结构环。10Fn3结构域的三级结构类似于IgG重链的可变区的三级结构，本领域技术人员可以通过用TNFRAB1、TNFRAB2、TNFRAB3、TNFRAB4或TNFRAB5的相应CDR序列的残基替换10Fn3的BC、DE和FG环的残基，将例如TNFRAB1、TNFRAB2、TNFRAB3、TNFRAB4或TNFRAB5的CDR序列中的一个或多个或全部，或与这些CDR序列中的任一个或多个具有至少85％序列同一性(例如，90％、95％、97％、99％或100％序列同一性)的序列，或相对于这些CDR序列中的一个或多个包含氨基酸取代(如保守或非保守氨基酸取代)(例如，多达3个氨基酸取代)的序列，移植到纤连蛋白支架上。这可通过在原核或真核细胞中重组表达修饰的10Fn3结构域来实现(例如，使用本文所述的载体和技术)。使用10Fn3结构域作为抗体样支架以用于将来自抗体的CDR移植到BC、DE和FG结构环上的实例在WO 2000/034784、WO 2009/142773、WO 2012/088006和美国专利号8,278,419中进行报道；所述专利的每一个的公开内容以引用的方式并入本文。
TNFR2亲和力和拮抗作用的分子决定簇
本公开的多肽可以表现出一系列产生TNFR2拮抗剂表型(例如，显性TNFR2拮抗剂表型)的共有结构特征。例如，TNRAB1、TNFRAB2、TNFRAB3和TNFRAB5中每一个的CDR-H1氨基酸序列的比对表明，这些抗体的特征是如下显示的保守共有序列：
Figure BDA0003027090150001421
序列的比对揭示了共有GXTFXXYX基序，其中“X”独立地表示任意氨基酸，如位置2处的芳族残基(例如，酪氨酸或苯丙氨酸残基)，位置5处的极性不带电荷的残基(例如，丝氨酸或苏氨酸残基)，位置6处的极性，任选带负电荷的残基(例如，丝氨酸、天冬氨酸或谷氨酸残基)，以及在位置7处的亮氨酸、异亮氨酸或丝氨酸残基。已经发现，尽管通过免疫来源于多种不同的动物类型，但令人惊讶的是，表现出本文所述表型的拮抗性TNFR2多肽表现出共享的CDR-H1核心序列。
另外，对TNFRAB1和TNFRAB2的CDR-H2区的序列分析类似地揭示了在整个这些区域中的不同位置处的一组保守氨基酸：
SSG--GSY(TNFRAB1 CDR-H2，SEQ ID NO：24)
VDPEYGST(TNFRAB2 CDR-H2，SEQ ID NO：258)
-----GS-(共有序列)
对此序列比对的分析证明CDR-H2序列在CDR-H2区的C末端表现出保守的GS基序，在剩余位置容许具有可变分子大小、极性和静电荷的侧链。
拮抗性TNFR2抗体的CDR-H3区显示出对共有氨基酸序列的类似趋同。下面显示的是NFRAB1、TNFRAB2和TNFRAB3(另一种单克隆拮抗性TNFRA2抗体)的CDR-H3序列。TNFR2A3描述于WO 2017/197331(其公开内容以引用的方式整体并入本文)中。对这些抗体的CDR-H3序列所共有的残基的分析提供了对结合TNFR2并表现出拮抗作用(如显性拮抗作用)的抗体的分子特征的了解。表位作图分析已经显示，TNFRAB1、TNFRAB2和TNFR2A3都结合TNFR2内含有SEQ ID NO:7的残基142-146的表位并且不结合含有SEQ ID NO:7的残基56-60的表位。相应的CDR-H3区之间的结构相似性为预测可保持或增强TNFR2亲和力和拮抗作用(例如显性拮抗作用)的残基取代提供了基础。TNFRAB1、TNFRAB2和TNFR2A3的CDR-H3序列在以下示出：
QRVDGYSSYWYFDV(TNFRAB1 CDR-H3，SEQ ID NO：25)
ARDDG-S-YSPFDYWG(TNFRAB2 CDR-H3，SEQ ID NO：259)
ARDDG-S-YSPFDYFG(TNFR2A3 CDR-H3，SEQ ID NO：284)
-R-DG-S-Y--FD---(共有序列)
对TNFRAB1、TNFRAB2和TNFR2A3的CDR-H3序列的检查揭示了在整个此CDR中保守的精氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、丝氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸残基。值得注意的是，在剩余位置中容许具有不同空间和静电性质的残基。例如，CDR-H3序列的第一位置容许具有差别大小和氢键形成倾向的氨基酸残基，因为TNFRAB1中的CDR-H3的第一位置的特征是含有具有氢键供体和受体部分的羧酰胺侧链的极性谷氨酰胺残基，而带有未官能化的甲基侧链的丙氨酸残基在TNFRAB2和TNFR2A3的相应位置处发现。另外，上述CDR-H3序列中的第三位置的特征是TNFRAB1中的疏水性缬氨酸和TNFRAB2的相应位置中的阴离子天冬氨酸部分。类似地，TNFRAB1的CDR-H3的位置十和十一含有芳族系统，而TNFRAB2和TNFR2A3中的相应残基含有极性和环状脂族取代基。
类似的分析揭示了TNFRAB1和TNFRAB2的CDR-L序列所共有的分子特征。例如，TNFRAB1和TNFRAB2的CDR-L1序列在以下示出：
SASSSVYYMY(TNFRAB1 CDR-L1，SEQ ID NO：26)
Q-N--INK-Y(TNFRAB2 CDR-L1，SEQ ID NO：260)
Y(共有残基)
对这些序列的检查揭示了含羟基的酪氨酸残基是CDR-L1的最终位置处的特征，而在剩余位置容许具有不同物理化学性质的残基。类似地，对TNFRAB1和TNFRAB2的CDR-L2区的分析揭示了两个区中最终位置处的保守氨基酸：
STSNLAS(TNFRAB1 CDR-L2，SEQ ID NO：27)
YT----S(TNFRAB2 CDR-L2)
T----S(共有序列)
对上述序列比对的分析证明，丝氨酸残基是这些CDR-L2序列的第三位置处的特征，而在剩余残基处广泛容许取代。类似地，TNRAB1和TNFRAB2的CDR-L3序列是如下：
Q-QRRNYPY------T(TNFRAB1 CDR-L3，SEQ ID NO：28)
CLQ---YVNL(L/I)T(TNFRAB2 CDR-L3，SEQ ID NO：261）
--Q---Y--------T(共有序列)
对TNFRAB1和TNFRAB2的CDR-L3序列的分析揭示了在这些区内的不同位置处对酪氨酸和苏氨酸残基的偏好，而在其他位置容许具有广泛物理化学特征的氨基酸，包括具有阳离子侧链(Arg)、构象限制的侧链(Pro)和不同极性的侧链(例如，Gln、Asn、Leu和Val)的残基。总之，上述CDR-H和CDR-L序列的共有结构特征提供了对以反平行二聚体构型选择性地结合TNFR2的KCRPG表位(SEQ ID NO:7的位置142-146位，如SEQ ID NO:19中所示)的一个或多个残基来说重要的那些残基的了解，并且证明某些氨基酸可在保持亲和力和显性拮抗活性的同时变化。
因此，本公开的拮抗性TNFR2多肽，如显性拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体或其抗原结合片段)可具有含有上述共有序列的重链和轻链CDR。例如，本公开的TNFR2拮抗剂可具有CDR-H1，所述CDR-H1具有氨基酸序列Z4JZ3Z5(J)2Z5J；CDR-H2，所述CDR-H2具有氨基酸序列(J)5Z4Z3J；CDR-L1，所述CDR-L1具有氨基酸序列(J)5Z5；CDR-L2，所述CDR-L2具有氨基酸序列(J)2Z3；和/或CDR-L3，所述CDR-L3具有氨基酸序列(J)3Z5(J)4Z3；其中每个J独立地为天然存在的氨基酸，每个Z1独立地为在生理pH下含有阳离子侧链的天然存在的氨基酸；每个Z2独立地为在生理pH下含有阴离子侧链的天然存在的氨基酸；每个Z3独立地为在生理pH下含有极性不带电荷的侧链的天然存在的氨基酸；每个Z4独立地为甘氨酸或丙氨酸；并且每个Z5独立地为含有疏水性侧链的天然存在的氨基酸。
在一些实施方案中，本公开的拮抗性TNFR2多肽，如显性拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体或其抗原结合片段)可具有具有CDR-H1，所述CDR-H1具有氨基酸序列GJTF(J)2YJ(SEQ ID NO:277)；CDR-H2，所述CDR-H2具有氨基酸序列(J)5GSJ；CDR-L1，所述CDR-L1具有氨基酸序列(J)5Y；CDR-L2，所述CDR-L2具有氨基酸序列(J)2S；和/或CDR-L3，所述CDR-L3具有氨基酸序列(J)3Y(J)4T；其中每个J独立地为天然存在的氨基酸。
本公开的拮抗性TNFR2多肽，如显性拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体或其抗原结合片段)可具有CDR-H1，所述CDR-H1具有氨基酸序列Z4YZ3Z5TDZ5X；CDR-H2，所述CDR-H2具有氨基酸序列VDPEYZ4Z3T(SEQ ID NO:264)；CDR-L1，所述CDR-L1具有氨基酸序列QNINKZ5(SEQ ID NO:268)；CDR-L2，所述CDR-L2具有氨基酸序列TYZ3或YTZ3；和/或CDR-L3，所述CDR-L3具有氨基酸序列CLQZ5VNLXZ3(SEQ ID NO:271)；其中每个Z1独立地为在生理pH下含有阳离子侧链的氨基酸；每个Z2独立地为在生理pH下含有阴离子侧链的氨基酸；每个Z3独立地为在生理pH下含有极性不带电荷的侧链的氨基酸；每个Z4独立地为甘氨酸或丙氨酸；每个Z5独立地为含有疏水性侧链的氨基酸；并且每个X独立地为亮氨酸或异亮氨酸。
在一些实施方案中，本公开的拮抗性TNFR2多肽，如显性拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体或其抗原结合片段)可具有CDR-H1，所述CDR-H1具有氨基酸序列GYTFTDYX(SEQ ID NO:257)，或相对于此序列具有至多两个氨基酸取代的氨基酸序列；CDR-H2，所述CDR-H2具有氨基酸序列VDPEYGST(SEQ ID NO:258)，或相对于此序列具有至多两个氨基酸取代的氨基酸序列；CDR-L1，所述CDR-L1具有氨基酸序列QNINKY(SEQ ID NO:260)，或相对于此序列具有至多两个氨基酸取代的氨基酸序列；CDR-L2，所述CDR-L2具有氨基酸序列TYS或YTS；和/或CDR-L3，所述CDR-L3具有氨基酸序列CLQYVNLXT(SEQ ID NO:261)，或相对于此序列具有至多两个氨基酸取代的氨基酸序列。
例如，在一些实施方案中，本公开的拮抗性TNFR2多肽，如显性拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体或其抗原结合片段)可具有CDR-H1，所述CDR-H1具有氨基酸序列GYTFTDYL(SEQ ID NO:274)，或相对于此序列具有至多两个氨基酸取代的氨基酸序列；和CDR-L3，所述CDR-L3具有氨基酸序列CLQYVNLIT(SEQ ID NO:273)，或相对于此序列具有至多两个氨基酸取代的氨基酸序列。本公开部分基于以下发现：CDR-H1和CDR-L3区的这种特定组合促进活化的T-reg细胞的选择性杀死并且加强增强的T效应细胞增殖。如本文所述，这些表型对于治疗癌症和感染性疾病是有益的，因为在患有此类病理的患者中耗竭活化的T-reg细胞群体的能力可减轻细胞毒性CD8+T细胞的衰减，从而使效应细胞能够发动针对癌细胞和感染性细胞的免疫响应。
示例性人源化TNFR2抗体及其抗原结合片段
本公开的人源化拮抗性TNFR2抗体及其抗原结合片段的实例包括具有表1所示的重链和/或轻链的抗体，其在下面复制。如实施例中进一步详细描述的，上表1中描述的拮抗性TNFR2抗体是通过使用本文所述的人源化技术对鼠单克隆抗体进行人源化而开发的。除了人源化之外，表1中所示的抗体在免疫球蛋白铰链区内包含了C232S和C233S取代。如上所述，这些取代赋予拮抗性TNFR2抗体多种有益的特性，包括对TNFR2信号传导的增强的抑制作用(因此，提高了Treg耗竭和效应T细胞增殖)。本公开的示例性拮抗性TNFR2抗体和抗原结合片段包括上表1所示的那些，以及包含与表1所示的重链和/或轻链具有至少85％序列同一性(例如，至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性)的重链和/或轻链的那些。
人源化拮抗性TNFR2抗体及其抗原结合片段的实例还包括含有表1、上文中显示的CDR中的一个或多个或全部或本文所述的另一个CDR的抗体和抗原结合片段。例如，本公开的人源化TNFR2抗体或抗原结合片段可包含具有氨基酸序列GJTF(J)2Y(SEQ ID NO:276)或GJTF(J)2YJ(SEQ ID NO:277)的CDR-H1，其中每个J独立地为天然存在的氨基酸。在一些实施方案中，所述多肽(例如，单链多肽、抗体、其抗原结合片段或其构建体)还包含：
(a)CDR-H2，其具有氨基酸序列(J)3GSJ或(J)5GSJ；
(b)CDR-H3，其具有氨基酸序列JRJDGJSJY(J)2FDJ(SEQ ID NO:278)或JRJDGSY(J)2FD(J)3(SEQ ID NO:279)；
(c)CDR-L1，其具有氨基酸序列(J)9Y或(J)5Y；
(d)CDR-L2，其具有氨基酸序列(J)6S或(J)2S；和/或
(e)CDR-L3，其具有氨基酸序列(J)5Y(J)2T或(J)3Y(J)4T，
其中每个J独立地为天然存在的氨基酸。
人源化抗体或其抗原结合片段可包含具有氨基酸序列Z4FZ3Z5SSZ5或Z4YZ3Z5TDZ5X的CDR-H1；
其中每个Z3独立地为在生理pH下包括极性、不带电荷的侧链的氨基酸；
每个Z4独立地为甘氨酸或丙氨酸；
每个Z5独立地为包含疏水侧链的氨基酸；以及
每个X独立地为亮氨酸或异亮氨酸。
在一些实施方案中，人源化抗体或其抗原结合片段还包含：
(a)CDR-H2，其具有氨基酸序列SSGZ4Z3Y(SEQ ID NO:263)或VDPEYZ4Z3T(SEQ IDNO:264)；
(b)CDR-H3，其具有氨基酸序列QZ1VZ2Z4YZ3SZ5WYZ5Z2Z5(SEQ ID NO:265)或AZ1DZ2Z4Z3Z5SPZ5Z2Z5WG(SEQ ID NO:266)；
(c)CDR-L1，其具有氨基酸序列SASSSVYYMZ5(SEQ ID NO:267)或QNINKZ5(SEQ IDNO:268)；
(d)CDR-L2，其具有氨基酸序列STSNLAZ3(SEQ ID NO:269)、TYZ3或YTZ3；和/或
(e)CDR-L3，其具有氨基酸序列QQRRNZ5PYZ3(SEQ ID NO:270)或CLQZ5VNLXZ3(SEQID NO:271)；
其中每个Z1独立地为在生理pH下包含阳离子侧链的氨基酸；
每个Z2独立地为在生理pH下包含阴离子侧链的氨基酸；
每个Z3独立地为在生理pH下包含极性、不带电荷的侧链的氨基酸；
每个Z4独立地为甘氨酸或丙氨酸；
每个Z5独立地为包含疏水侧链的氨基酸；以及
每个X独立地为亮氨酸或异亮氨酸。
人源化抗体或其抗原结合片段可包含CDR-H1，所述CDR-H1具有氨基酸序列GFTFSSY(SEQ ID NO:23)、GYTFTDYX(SEQ ID NO:257)或相对于这些序列具有最多两个氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代)的氨基酸序列，其中每个X独立地为亮氨酸或异亮氨酸，任选地其中所述氨基酸取代是保守氨基酸取代。在一些实施方案中，人源化抗体或其抗原结合片段还包含：
(a)CDR-H2，其具有氨基酸序列SSGGSY(SEQ ID NO:24)、VDPEYGST(SEQ ID NO:258)或相对于这些序列具有最多两个氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代)的氨基酸序列；
(b)CDR-H3，其具有氨基酸序列QRVDGYSSYWYFDV(SEQ ID NO:25)、ARDDGSYSPFDYWG(SEQ ID NO:259)、ARDDGSYSPFDY(SEQ ID NO:296)或相对于这些序列具有最多两个氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代)的氨基酸序列；
(c)CDR-L1，其具有氨基酸序列SASSSVYYMY(SEQ ID NO:26)、QNINKY(SEQ ID NO:260)或相对于这些序列具有最多两个氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代)的氨基酸序列；
(d)CDR-L2，其具有氨基酸序列STSNLAS(SEQ ID NO:27)、TYS、YTS或相对于SEQ IDNO:27具有最多两个氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代)的氨基酸序列；和/或
(e)CDR-L3，其具有氨基酸序列QQRRNYPYT(SEQ ID NO:28)、CLQYVNLXT(SEQ IDNO:261)或相对于这些序列具有最多两个氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，人源化抗体或其抗原结合片段包含重链，所述重链包含以下CDR中的一个或多个：
(a)CDR-H1，其具有氨基酸序列GFTFSSY(SEQ ID NO:23)；
(b)CDR-H2，其具有氨基酸序列SSGGSY(SEQ ID NO:24)；和
(c)CDR-H3，其具有氨基酸序列QRVDGYSSYWYFDV(SEQ ID NO:25)。
人源化抗体或其抗原结合片段可包含例如具有以下CDR中的一个或多个的重链：
(a)CDR-H1，其具有氨基酸序列GYTFTDYX(SEQ ID NO:257)；
(b)CDR-H2，其具有氨基酸序列VDPEYGST(SEQ ID NO:258)；和
(c)CDR-H3，其具有氨基酸序列ARDDGSYSPFDYWG(SEQ ID NO:259)；
其中每个X独立地为亮氨酸或异亮氨酸。
在一些实施方案中，CDR-H1具有氨基酸序列GYTFTDYL(SEQ ID NO:274)。在一些实施方案中，CDR-H1具有氨基酸序列GYTFTDYI(SEQ ID NO:275)。在一些实施方案中，CDR-H1具有氨基酸序列GYTFTDVI(SEQ ID NO:293)。在一些实施方案中，CDR-H1具有氨基酸序列(SEQ ID NO:294)。
另外地或可选地，人源化抗体或其抗原结合片段可包含例如轻链，所述轻链具有以下CDR中的一个或多个：
(a)CDR-L1，其具有氨基酸序列SASSSVYYMY(SEQ ID NO:26)；
(b)CDR-L2，其具有氨基酸序列STSNLAS(SEQ ID NO:27)；和
(c)CDR-L3，其具有氨基酸序列QQRRNYPYT(SEQ ID NO:28)。
在一些实施方案中，人源化抗体或其抗原结合片段包含轻链，所述轻链具有以下CDR中的一个或多个：
(a)CDR-L1，其具有氨基酸序列QNINKY(SEQ ID NO:260)；
(b)CDR-L2，其具有氨基酸序列TYS或YTS；和
(c)CDR-L3，其具有氨基酸序列CLQYVNLXT(SEQ ID NO:261)；
其中每个X独立地为亮氨酸或异亮氨酸。
在一些实施方案中，CDR-L2具有氨基酸序列TYS。在一些实施方案中，CDR-L2具有氨基酸序列YTS。CDR-L3可具有氨基酸序列CLQYVNLLT(SEQ ID NO:272)。在一些实施方案中，CDR-L3具有氨基酸序列CLQYVNLIT(SEQ ID NO:273)。
人源化抗体或其抗原结合片段可包含三个重链CDR，所述三个重链CDR包括：
(a)CDR-H1，其具有氨基酸序列GFTFSSY(SEQ ID NO:23)；
(b)CDR-H2，其具有氨基酸序列SSGGSY(SEQ ID NO:24)；和
(c)CDR-H3，其具有氨基酸序列QRVDGYSSYWYFDV(SEQ ID NO:25)；
并且还可包含三个轻链CDR，所述三个轻链CDR包括：
(a)CDR-L1，其具有氨基酸序列SASSSVYYMY(SEQ ID NO:26)；
(b)CDR-L2，其具有氨基酸序列STSNLAS(SEQ ID NO:27)；和
(c)CDR-L3，其具有氨基酸序列QQRRNYPYT(SEQ ID NO:28)。
在一些实施方案中，人源化抗体或其抗原结合片段包含三个重链CDR，所述三个重链CDR包括：
(a)CDR-H1，其具有氨基酸序列GYTFTDYX(SEQ ID NO:257)，如GYTFTDYL(SEQ IDNO:274)或GYTFTDYI(SEQ ID NO:275)，优选为SEQ ID NO:274)；
(b)CDR-H2，其具有氨基酸序列VDPEYGST(SEQ ID NO:258)；和
(c)CDR-H3，其具有氨基酸序列ARDDGSYSPFDYWG(SEQ ID NO:259)；
并且还包含三个轻链CDR，所述三个轻链CDR包括：
(d)CDR-L1，其具有氨基酸序列QNINKY(SEQ ID NO:260)；
(e)CDR-L2，其具有氨基酸序列TYS或YTS；和
(f)CDR-L3，其具有氨基酸序列CLQYVNLXT(SEQ ID NO:261)，如CLQYVNLLT(SEQ IDNO:272)或CLQYVNLIT(SEQ ID NO:273)，优选为SEQ ID NO:273),
其中每个X独立地为亮氨酸或异亮氨酸。
在一些实施方案中，人源化抗体或其抗原结合片段包括具有结合到CDR-L2的N末端的氨基酸序列LLIR(SEQ ID NO:262)的框架区和/或具有结合到CDR-L2的C末端的氨基酸序列TLE的框架区。
核酸和表达系统
本文所述的拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体、其抗原结合片段及其构建体)(例如，表1中所述的抗体1-25中的任一种或多种及其变体，如包含表1中列出的CDR中的一个或多个或全部的抗体或抗原结合片段)可通过多种已建立的技术中的任一种来制备。例如，本文所述的拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段可通过在宿主细胞中重组表达免疫球蛋白轻链和重链基因来制备。为了重组表达抗体，可用一种或多种重组表达载体转染宿主细胞，所述重组表达载体携带编码所述抗体的免疫球蛋白轻链和重链的DNA片段，以使得所述轻链和重链在宿主细胞中表达并且任选地分泌到培养宿主细胞的培养基中，可从所述培养基中回收抗体。标准重组DNA方法用于获得抗体重链和轻链基因，将这些基因掺入重组表达载体中并且将所述载体引入宿主细胞中，如在Molecular Cloning；A LaboratoryManual,第二版(Sambrook,Fritsch和Maniatis(编),Cold Spring Harbor,N.Y.,1989)；Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel等人,编,Greene PublishingAssociates,1989)以及在美国专利号4,816,397中描述的那些；所述文献的每一篇的公开内容以引用的方式并入本文。
用于表达拮抗性TNFR2多肽的载体
病毒基因组提供了可用于将外源基因有效递送到细胞(例如，真核或原核细胞并且可用于表达本文所述的TNFR2拮抗剂多肽(例如，表1中所述的抗体1-25中的任一种或多种及其变体，如包含表1中列出的CDR中的一种或多种或全部的抗体或抗原结合片段)的基因组中的丰富载体来源。病毒基因组是用于基因递送的特别有用的载体，因为包含在此类基因组内的多核苷酸通常通过普遍性或特异性转导掺入靶细胞的基因组中。这些过程作为天然病毒复制周期的一部分发生，并且不需要添加蛋白质或试剂以诱导基因整合。病毒载体的实例包括逆转录病毒、腺病毒(例如，Ad5、Ad26、Ad34、Ad35和Ad48)、细小病毒(例如，腺相关病毒)、冠状病毒、负链RNA病毒如正粘病毒(例如，流感病毒)、弹状病毒(例如狂犬病和水疱性口炎病毒)、副粘病毒(例如麻疹和仙台病毒)、正链RNA病毒(如小核糖核酸病毒和甲病毒)和双链DNA病毒(包括腺病毒、疱疹病毒(例如，1型和2型单纯疱疹病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒、巨细胞病毒)以及痘病毒(例如，牛痘、修饰的牛痘安卡拉(MVA)、禽痘和金丝雀痘)。适用于递送编码本文所述的抗体轻链和重链或抗体片段的多核苷酸的其他病毒包括例如诺沃克病毒、披膜病毒、黄病毒、呼肠孤病毒、乳多空病毒、嗜肝DNA病毒和肝炎病毒。逆转录病毒的实例包括：禽白血病-肉瘤病毒、哺乳动物C型病毒、B型病毒、D型病毒、HTLV-BLV组、慢病毒、泡沫病毒(Coffin,J.M.,Retroviridae:The viruses and their replication,InFundamental Virology,第三版,B.N.Fields,等人,编,Lippincott-Raven Publishers,Philadelphia,1996)。其他实例包括鼠白血病病毒、鼠肉瘤病毒、小鼠乳腺肿瘤病毒、牛白血病病毒、猫白血病病毒、猫肉瘤病毒、禽白血病病毒、人T细胞白血病病毒、狒狒内源性病毒、长臂猿白血病病毒、Mason Pfizer猴病毒、猿猴免疫缺陷病毒、猿猴肉瘤病毒、劳斯肉瘤病毒和慢病毒。载体的其他实例例如在McVey等人(美国专利号5,801,030)中进行了描述；所述专利的每一篇的公开内容以引用的方式并入本文。
基因组编辑技术
除病毒载体外，已经开发了多种另外的方法用于将基因(例如，编码抗体轻链和重链、单链多肽、单链可变片段(scFv)、串联scFv、Fab结构域、F(ab’)2结构域、双抗体和三抗体等的那些基因)掺入用于多肽表达的靶细胞的基因组中。可用于将编码抗TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体、其抗原结合片段或其构建体)(例如，表1中所述的抗体1-25中的任一种或多种及其变体，如包含表1中列出的CDR中的一个或多个或全部的抗体或抗原结合片段)的多核苷酸掺入原核或真核细胞的一种这样的方法包括转座子。转座子是编码转座酶并且含有侧接5'和3'位置的切除位点的目标多核苷酸序列或基因的多核苷酸。一旦转座子已被递送到细胞中，转座酶基因的表达就开始并且产生从转座子裂解目标基因的活性酶。这种活性由转座酶对转座子切除位点的位点特异性识别介导。在一些实施方案中，这些切除位点可以是末端重复序列或反向末端重复序列。一旦从转座子切除，目标基因就可通过转座酶催化裂解存在于细胞的核基因组内的类似切除位点而整合到原核或真核细胞的基因组中。这允许编码抗TNFR2抗体或其片段或结构域的基因在所述切除位点处插入到裂解的核DNA中，并且随后连接使目标基因连接至原核或真核细胞基因组的DNA的磷酸二酯键完成了掺入过程。在一些实施方案中，转座子可以是逆转录转座子，以使得编码抗体的基因首先转录成RNA产物且然后逆转录成DNA，之后掺入原核或真核细胞基因组中。示例性转座子系统包括piggybac转座子(在WO 2010/085699中详细描述)和睡美人转座子(在US20050112764中详细描述)；所述专利的每一篇的公开内容以引用的方式并入本文。
将编码本文所述的抗TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体或其抗原结合片段)(例如，表1中所述的抗体1-25中的任一种或多种及其变体，如包含表1中列出的CDR中的一个或多个或全部的抗体或抗原结合片段)的核酸分子整合到原核或真核细胞的基因组中的另一种有用方法是成簇规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)/Cas系统，所述系统是最初在细菌和古细菌中进化为针对病毒感染的适应性防御机制的系统。CRISPR/Cas系统由质粒DNA内的回文重复序列和相关的Cas9核酸酶组成。这种DNA和蛋白质的集合通过首先将外来DNA掺入CRISPR基因座中来指导靶序列的位点特异性DNA裂解。含有这些外来序列和CRISPR基因座的重复序列-间隔区元件的多核苷酸进而在宿主细胞中转录以产生指导RNA，所述指导RNA随后可与靶序列退火并将Cas9核酸酶定位于此位点。以这种方式，高度位点特异性cas9介导的DNA裂解可在外来多核苷酸中产生，因为使cas9在靶DNA分子附近内的相互作用受RNA:DNA杂交控制。结果，理论上可设计CRISPR/Cas系统来裂解任何目标靶DNA分子。已经利用这种技术以编辑真核基因组(Hwang等人,Nat.Biotech.,31:227-229,2013)并且可用作位点特异性编辑真核或原核基因组的有效手段，以便在掺入编码本文所述的抗TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体或其抗原结合片段)的多核苷酸之前裂解DNA。CRISPR/Cas调节基因表达的用途已在美国专利号8,697,359中进行了描述，所述专利的公开内容以引用的方式并入本文。
用于在掺入编码本文所述的TNFR2抗体或抗体片段(例如，表1中所述的抗体1-25中的任一种或多种及其变体，如包含表1中列出的CDR中的一个或多个或全部的抗体或抗原结合片段)的多核苷酸之前位点特异性裂解基因组DNA的替代方法包括使用锌指核酸酶和转录活化因子样效应物核酸酶(TALEN)。与CRISPR/Cas系统不同，这些酶不含用于定位至特异性靶序列的引导多核苷酸。相反，靶特异性由这些酶内的DNA结合结构域控制。用于基因组编辑应用的锌指核酸酶和TALEN在Urnov等人(Nat.Rev.Genet.,11:636-646,2010)；和Joung等人,(Nat.Rev.Mol.Cell.Bio.14:49-55,2013)中进行了描述；所述文献以引用的方式并入本文。可用于将编码本文所述的抗体的多核苷酸掺入原核或真核细胞的基因组中的另外基因组编辑技术包括使用可合理设计以便位点特异性地裂解基因组DNA的ARCUSTM大范围核酸酶。鉴于已经针对此类酶建立的结构活性关系，使用这些酶来将编码本文所述的拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体、其抗原结合片段及其构建体)的多核苷酸掺入原核或真核细胞的基因组中是特别有利的。因此，可在某些氨基酸位置修饰单链大范围核酸酶，以产生在所需位置处选择性地裂解DNA的核酸酶。这些单链核酸酶已例如在美国专利号8,021,867和8,445,251中进行了广泛描述；所述专利的每一篇的公开内容以引用的方式并入本文。
多核苷酸序列元件
为了表达本文所述的拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体、其抗原结合片段或其构建体)(例如，表1中所述的抗体1-25中的任一种或多种及其变体，如包含表1中列出的CDR中的一个或多个或全部的抗体或抗原结合片段)，可将编码部分或全长轻链和重链的多核苷酸(例如编码如本文所述的抗体或其抗原结合片段的CDR中的一个或多个或全部的多核苷酸)插入表达载体中，以使得基因可操作地连接至转录和翻译控制序列。选择表达载体和表达控制序列以与所使用的表达宿主细胞相容。编码TNFR2抗体的轻链基因和重链的多核苷酸可插入单独的载体中，或者任选地可使用本文所述或本领域中已知的已建立的技术来将两种多核苷酸掺入同一表达载体中。
除了编码抗体的重链和轻链的多核苷酸(或编码单链多肽或抗体片段如scFv分子或本文所述的构建体的多核苷酸)外，本文所述的重组表达载体可携带控制抗体链基因在宿主细胞中的表达的调控序列。表达载体的设计(包括调控序列的选择)可取决于这类因素，如待转化的宿主细胞的选择、所需的蛋白质的表达水平。例如，用于哺乳动物宿主细胞表达的合适调控序列包括指导哺乳动物细胞中的高水平蛋白质表达的病毒元件，如来源于巨细胞病毒(CMV)(如CMV启动子/增强子)、猿猴病毒40(SV40)(如SV40启动子/增强子)、腺病毒(例如，腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))和多瘤病毒的启动子和/或增强子。病毒调控元件以及其序列详细地描述于例如美国专利号5,168,062、美国专利号4,510,245和美国专利号4,968,615中，所述专利的每一篇的公开内容以引用的方式并入本文。
除抗体链基因和调控序列外，本文所述的重组表达载体还可携带额外的序列，如调控载体在宿主细胞中的复制的序列(例如复制起点)和选择性标记基因。选择性标记基因有助于载体已经引入其中的宿主细胞的选择(参见例如，美国专利号4,399,216、4,634,665和5,179,017)。例如，通常选择型标记基因赋予已向其中引入载体的宿主细胞对细胞毒性药物如G418、嘌呤霉素、杀稻瘟菌素、潮霉素或甲氨蝶呤的抗性。合适的选择性标记基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于在用甲氨蝶呤选择/扩增的DHFR”宿主细胞中使用)和neo基因(用于G418选择)。为了表达TNFR2抗体或TNFR2抗体片段的轻链和重链，可通过标准技术将含有编码所述重链和轻链的多核苷酸的一种或多种表达载体转染到宿主细胞中。
编码修饰的拮抗性TNFR2多肽的多核苷酸
本公开的拮抗TNFR2多肽包括表1中所述的抗体1-25中的任一种或多种及其变体，如包含表1中列出的CDR中的一种或多种或全部的抗体或抗原结合片段。另外地或可选地，本文所述的拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体、其抗原结合片段或其构建体)可包含TNFRAB1、TNFRAB2、TNFRAB3、TNFRAB4或TNFRAB5的CDR中的一个或多个或全部，或CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列中的一个或多个或全部，其中所述CDR序列中的一个或多个或全部显示与TNFRAB1、TNFRAB2、TNFRAB3、TNFRAB4或TNFRAB5的相应CDR序列具有至少85％序列同一性(例如，90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性)，或者相对于TNFRAB1、TNFRAB2、TNFRAB3、TNFRAB4或TNFRAB5的相应CDR序列包含一个或多个(例如，最多3个)氨基酸取代(例如，一个或多个保守氨基酸取代)，但可在TNFRAB1、TNFRAB2、TNFRAB3、TNFRAB4或TNFRAB5的一个或多个框架区中具有差异。例如，TNFRAB1、TNFRAB2、TNFRA3、TNFRA4或TNFRA5的一个或多个框架区可被人抗体的框架区取代。示例性框架区包括例如，US 7,829,086中描述的人框架区和如在EP 1945668中描述的灵长类动物框架区；所述专利的每一篇的公开内容以引用的方式并入本文。为了产生编码此类TNFR2抗体的核酸，可通过化学合成(例如，通过固相多核苷酸合成技术)、体外基因扩增(例如，通过聚合酶链式反应技术)或通过在宿主生物体中复制多核苷酸来产生编码例如轻链可变区和重链可变区中的至少一者或两者的DNA片段。例如，编码本文所述的拮抗性TNFR2抗体的核酸可通过扩增和修饰编码轻链和重链可变序列的种系DNA或cDNA以便将TNFRAB1、TNFRAB2、TNFRAB3、TNFRAB4或TNFRAB5的CDR的一个或多个或全部掺入共有抗体的框架残基中而获得。
在一些实施方案中，人源化拮抗性TNFR2抗体(例如表1中所述的人源化抗体)可包含CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列中的一个或多个或全部，其中所述CDR序列中的一个或多个或全部显示与TNFRAB1、TNFRAB2、TNFRAB3、TNFRAB4或TNFRAB5的相应CDR序列具有至少85％序列同一性(例如，90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性)，或者相对于TNFRAB1、TNFRAB2、TNFRAB3、TNFRAB4或TNFRAB5的相应CDR序列包含一个或多个(例如，最多3个)氨基酸取代(例如，一个或多个保守氨基酸取代)。例如，这可通过进行种系DNA或cDNA的定点诱变并且根据已建立的程序使用聚合酶链式反应(PCR)扩增所得多核苷酸来实现。人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列是本领域中已知的(参见例如，“VBASE”人种系序列数据库；还参见Kabat等人,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第五版,美国卫生和公共服务部,NIH出版号91-3242,1991；Tomlinson等人,J.Mol.Biol.227:776-798,1992；以及Cox等人,Eur.J.Immunol.24:827-836,1994；所述文献以引用的方式并入本文)。编码含有TNFRAB1、TNFRAB2、TNFRAB3、TNFRAB4或TNFRAB5的CDR中的一个或多个或全部或者上述相似的序列的人重链和轻链可变区的嵌合核酸构建体可例如使用本领域中已知的已建立的克隆技术来产生。另外，可合成编码含有TNFRAB1、TNFRAB2、TNFRAB3、TNFRAB4或TNFRAB5的CDR中的一个或多个或者上述相类的序列的重链可变区的多核苷酸并将其用作诱变的模板，以使用常规诱变技术产生如本文所述的变体。或者，可直接合成编码变体的DNA片段(例如，通过建立的固相核酸化学合成程序)。
一旦获得编码含有TNFRAB1、TNFRAB2、TNFRAB3、TNFRAB4或TNFRAB5的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列中的一个或多个或全部的VH区段的DNA片段，就可通过标准重组DNA技术来进一步操作这些DNA片段，例如以将可变区基因转化为全长抗体链基因、Fab片段基因或scFv基因。在这些操作中，将编码VL或VH的DNA片段可操作地连接至编码另一种蛋白质的另一个DNA片段，如抗体恒定区或柔性接头。
可例如通过将编码VH的DNA可操作地连接至编码重链恒定区结构域(CH1、CH2、CH3和任选的CH4)的另一个DNA分子上来将编码本文所述的拮抗性TNFR2抗体的VH区的分离的DNA转化为全长重链基因(以及Fab重链基因)。人重链恒定区基因的序列是本领域中已知的(参见例如，Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版,美国卫生和公共服务部,NIH出版号91-3242,1991)，并且可通过标准PCR扩增来获得涵盖这些区的DNA片段。重链恒定区可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区，并且在某些实施方案中是IgG1恒定区。对于Fab片段重链基因，编码VH的DNA可与仅编码重链CH1结构域的另一个DNA分子可操作地连接。
可通过将编码VL的DNA可操作地连接至编码轻链恒定区CL的另一个DNA分子来将编码拮抗性TNFR2抗体的VL区的分离的DNA转化为全长轻链基因(以及Fab轻链基因)。人轻链恒定区基因的序列是本领域中已知的(参见例如，Kabat等人,Sequences of Proteinsof Immunological Interest,第五版(美国卫生和公共服务部，NIH出版号91-3242,1991))，并且可例如通过在原核或真核细胞中扩增编码这些区的多核苷酸、通过PCR扩增或通过化学多核苷酸合成来获得涵盖这些区的DNA片段。轻链恒定区可以是κ(κ)或λ(λ)恒定区，但在某些实施方案中是κ恒定区。为了产生scFv基因，将编码VH和VL的DNA片段可操作地连接至编码柔性接头(例如编码柔性亲水性氨基酸序列，如氨基酸序列(Gly4Ser)3的多核苷酸)的另一片段，以使得VH和VL序列可表达为连续的单链蛋白，其中VL和VH区通过所述接头连接(参见例如，Bird等人,Science 242:423-426,1988；Huston等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883,1988；McCafferty等人,Nature348:552-554,1990)。
重组DNA技术也可用于除去一些或全部编码并非结合至TNFR2所必需的轻链和重链中的任一者或两者的DNA。由此类截短的DNA分子表达的分子也涵盖于本文所述的抗体中。此外，可产生双功能抗体，其中一条重链含有源自TNFRAB1、TNFRAB2、TNFRAB3、TNFRAB4或TNFRAB5的CDR中的一个或多个或全部或上述相似的CDR序列，并且另一条重链和/或轻链对除TNFR2以外的抗原具有特异性。可例如使用标准化学交联方法(例如，通过二硫键形成)通过使含有TNFRAB1、TNFRAB2、TNFRAB3、TNFRAB4或TNFRAB5的CDR中的一个或多个或全部或上述相似的CDR序列的重链和抗TNFR2抗体的轻链交联至特异于不同抗原的二级抗体的重链和轻链来产生此类抗体。也可通过在原核或真核细胞中表达经工程化以编码双功能抗体的核酸分子来制备双功能抗体。
可通过突变轻链和/或重链CDR中的氨基酸残基来产生双特异性抗体，即使用同一结合位点结合TNFR2和不同抗原的抗体。在一些实施方案中，可通过突变抗原结合位点外围的氨基酸残基来产生结合两种抗原(例TNFR2和第二细胞表面受体)的双特异性抗体(Bostrom等人,Science 323:1610-1614,2009)。可通过表达经工程化以编码双特异性抗体的多核苷酸来制备双功能抗体。
也可通过化学合成(例如，通过在Solid Phase Peptide Synthesis,第2版,1984The Pierce Chemical Co.,Rockford,111中描述的方法；所述文献以引用的方式并入本文)来产生本文所述的修饰的拮抗性TNFR2抗体和抗体片段。还可使用不含细胞的合成平台来产生变体抗体(参见，例如，Chu等人,Biochemia No.2,2001(Roche MolecularBiologicals)；所述文献以引用的方式并入本文)。
用于表达拮抗性TNFR2多肽的宿主细胞
有可能在原核或真核宿主细胞中表达本文所述的多肽(例如，单链多肽、抗体、其抗原结合片段及其构建体)(例如，表1中所述的抗体1-25中的任一种或多种及其变体，如包含表1中列出的CDR中的一个或多个或全部的抗体或抗原结合片段)。在某些实施方案中，多肽(例如，单链多肽、抗体或其抗原结合片段)的表达在真核细胞(例如哺乳动物宿主细胞)中进行，以最佳分泌正确折叠且免疫活性的抗体。用于表达本文所述的重组抗体或其抗原结合片段的示例性哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)(包括Urlaub和Chasin(1980,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216-4220)中所描述的DHFR CHO细胞，其与DHFR选择性标记一起使用，例如如Kaufman和Sharp(1982,Mol.Biol.159:601-621)中所描述)、NSO骨髓瘤细胞、COS细胞、293细胞和SP2/0细胞。可用于表达抗体及其片段的其他细胞类型包括细菌细胞，如BL-21(DE3)大肠杆菌细胞，其可根据已建立的方案用含有外来DNA的载体转化。可用于表达抗体的另外真核细胞包括酵母细胞，如酿酒酵母的营养缺陷型菌株，其可根据本领域中已知的已建立的程序在不完全培养基中转化并选择性地生长。当将编码抗体基因的重组表达载体引入到哺乳动物宿主细胞中时，通过将宿主细胞培养足以允许抗体在宿主细胞中表达或者允许抗体分泌到宿主细胞所生长的培养基中的一段时间来产生抗体。
可使用标准蛋白质纯化方法从培养基中回收多肽(例如，单链多肽、抗体、其抗原结合片段及其构建体)。宿主细胞也可用于产生完整抗体的部分，如Fab片段或scFv分子。本文还包括根据本领域中已知的已建立的方案改变上述程序的方法。例如，可能希望用编码本文所述的拮抗性TNFR2抗体的轻链或重链(但不是两者)的DNA转染宿主细胞，以产生所述抗体的抗原结合片段。
一旦已经通过重组表达产生了本文所述的拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体、其抗原结合片段或其构建体)(例如，表1中所述的抗体1-25中的任一种或多种及其变体，如包含表1中列出的CDR中的一个或多个或全部的抗体或抗原结合片段)，就可通过本领域中已知的任何方法(如适用于纯化免疫球蛋白分子的方法)将其纯化，例如通过色谱法(例如，离子交换色谱法、亲和色谱法，特别是通过蛋白A或蛋白G选择后对TNFR2的亲和力，以及尺寸分级柱色谱法)、离心、差异溶解度或通过用于纯化蛋白质的任何其他标准技术。此外，本文所述的拮抗性TNFR2多肽或其片段可与本文所述或本领域中另外已知的异源多肽序列融合，以促进纯化或产生治疗性缀合物(参见下文的“拮抗性TNFR2多肽缀合物”)。
一旦分离，如果需要，可进一步纯化抗TNFR2单链多肽、抗体或其抗原结合片段，例如通过高效液相色谱法(参见例如，Fisher,Laboratory Techniques in Biochemistryand Molecular Biology(Work和Burdon,编,Elsevier,1980)；所述文献以引用的方式并入本文)或通过如SuperdexTM 75柱(Pharmacia Biotech AB,Uppsala,Sweden)上的凝胶过滤色谱法。
用于产生拮抗性抗TNFR2多肽并使所述多肽亲和力成熟的平台对TNFR2的促进受体拮抗作用的表位作图
本文所述的拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体、其抗原结合片段及其构建体)(例如，表1中所述的抗体1-25中的任一种或多种及其变体，如包含表1中列出的CDR中的一个或多个或全部的抗体或抗原结合片段)可通过针对能够结合TNFR2内选择性地促进受体拮抗作用而不是受体活化的表位的功能性分子筛选多肽文库(例如，单链多肽、抗体、其抗原结合片段及其构建体)来产生。此类表位可通过针对一系列线性或环状肽筛选抗体或其抗原结合片段来建模，所述线性或环状肽含有对应于TNFR2内的所需表位的残基。
作为实例，含有从TNFR2分离的促进受体拮抗作用的单个片段的肽可通过本文所述或本领域中已知的肽合成技术合成。可将这些肽固定在固体表面上，并且例如使用基于ELISA的筛选平台使用已建立的程序筛选结合拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体、其抗原结合片段及其构建体)的分子。使用这种测定，以高亲和力特异性地结合TNFRAB1、TNFRAB2、TNFRAB3、TNFRAB4或TNFRAB5的肽，或者表1中所述的抗体1-25中的任一种或多种及其变体，如包含表1中列出的CDR中的一个或多个或全部的抗体或抗原结合片段因此含有TNFR2的优先结合这些抗体的表位内的残基。以这种方式鉴别的肽(例如，具有SEQ ID NO:11、19、20和34-117中任一个的序列的肽)可用于筛选多肽(例如，单链多肽、抗体、其抗原结合片段及其构建体)的文库，以鉴别拮抗性TNFR2多肽。此外，由于这些肽充当TNFR2内促进受体拮抗作用的表位的替代物，因此使用这种筛选技术产生的多肽可结合TNFR2中的相应表位并且预期对受体活性具有拮抗作用。
筛选拮抗性TNFR2多肽的文库
用于针对能够结合TNFR2内的表位(例如，具有SEQ ID NO:11、19、20和34-117中任一个的序列的肽)的分子高通量筛选多肽(例如，单链多肽、抗体、抗体片段或其构建体)文库的方法包括但不限于展示技术，包括噬菌体展示、细菌展示、酵母展示、哺乳动物展示、核糖体展示、mRNA展示和cDNA展示。使用噬菌体展示来分离结合生物学相关分子的配体已经例如在Felici等人(Biotechnol.Annual Rev.1:149-183,1995)；Katz(AnnualRev.Biophys.Biomol.Struct.26:27-45,1997)和Hoogenboom等人(Immunotechnology 4:1-20,1998)中进行了综述。已经构建了若干随机化组合肽文库以选择结合不同靶标(例如细胞表面受体或DNA)的多肽(由Kay(Perspect.Drug Discovery Des.2,251-268,1995)；Kay等人(Mol.Divers.1:139-140,1996)综述)。蛋白质和多聚体蛋白质已被成功地噬菌体展示为功能性分子(参见EP0349578A、EP 4527839A、EP 0589877A；Chiswell和McCafferty(Trends Biotechnol.10,80-84 1992))。此外，已经表达了功能性抗体片段(例如Fab、单链Fv[scFv])(McCafferty等人(Nature 348:552-554,1990)；Barbas等人(Proc.Natl.AcadSci.USA 88:7978-7982,1991)；Clackson等人(Nature 352:624-628,1991))。这些参考文献特此以引用的方式整体并入。
(i)噬菌体展示技术
作为实例，可使用噬菌体展示技术以便针对能够结合含有TNFR2内的促进受体拮抗作用的表位(例如，具有SEQ ID NO:11、19、20和34-117中任一个的序列的肽)的环状或多环肽的功能性分子筛选多肽(例如，单链多肽、抗体、其抗原结合片段及其构建体)的文库。例如，可使用已建立的程序(例如，固相多核苷酸合成或易错PCR技术，参见McCullum等人(Meth.Mol.Biol.,634:103-109,2010)；所述文献以引用的方式并入本文)获得编码包含随机化高变区的单链抗体片段(如scFv片段)的多核苷酸文库。随后可将这些随机化的多核苷酸掺入病毒基因组中，以使得由这些基因编码的随机化抗体链在丝状噬菌体的表面上表达，例如通过抗体链与外壳蛋白(例如，M13噬菌体的表面上的pIII外壳蛋白)之间的共价键。这提供了抗体链的基因型与表型之间的物理连接。以这种方式，可针对外部抗体链结合TNFR2表位(例如，具有SEQ ID NO:11、19、20和34-117中任一个的序列的肽)的能力筛选展示在高变区中含有随机突变的不同抗体链的噬菌体文库，所述表位使用已建立的程序固定至表面。例如，可通过在肽与表位标签(例如，生物素)之间形成共价键并将所述肽在微量滴定板的孔中孵育来使此类肽可物理地结合至微量滴定板的表面，所述孔已经先前涂覆有以高亲和力结合与肽连接的标签的互补标签(例如，抗生物素蛋白)。合适的表位标签包括但不限于，麦芽糖结合蛋白、谷胱甘肽-S-转移酶、聚组氨酸标签、FLAG-标签、myc-标签、人流感血凝素(HA)标签、生物素、链霉亲和素。含有由这些分子呈递的表位的肽能够分别固定在含有此类互补分子(如麦芽糖、谷胱甘肽、含镍复合物、抗FLAG抗体、抗myc抗体、抗HA抗体、链霉亲和素或生物素)的表面上。以这种方式，可使噬菌体与含有固定的TNFR2源性肽的表面一起孵育适合于允许所述抗体与约束肽结合的一段时间并且在合适的缓冲系统(例如，含有生理盐浓度、离子强度并通过缓冲剂维持在生理pH下的系统)存在下。然后可(例如，用含有0.1％Tween-20的磷酸盐缓冲液)洗涤表面，以除去不呈递以大于特定阈值的亲和力与TNFR2源性肽相互作用的抗体链的噬菌体。
可通过调整洗涤步骤的条件(例如，通过包含弱酸性或碱性组分，或通过包含低浓度的其他TNFR2源性肽以与固定化肽竞争抗原结合位点)来调节在这一初始淘选(即筛选)步骤后保留的多肽的亲和力。以这种方式，在洗涤步骤之后保持与微量滴定板的表面结合的噬菌体群体富含结合TNFR2源性肽表位的噬菌体，所述表位促进受体拮抗作用。然后可通过从含有这些肽的表面洗脱噬菌体(例如，通过改变环境pH、离子强度或温度)以降低蛋白质-蛋白质相互作用强度来扩增剩余的噬菌体。然后可例如通过感染细菌细胞来扩增分离的噬菌体，并且可任选地通过额外的筛选重复使所得噬菌体进行淘选，以进一步富集噬菌体群体以获得具有更高亲和力抗TNFR2多肽的那些噬菌体。在这些淘选阶段之后，随后可分离展示高亲和力抗体或其抗原结合片段的噬菌体，并且可对这些噬菌体的基因组进行测序，以鉴别编码的抗体的多核苷酸和多肽序列。如此类的噬菌体展示技术可用于产生例如抗体链，如scFv片段、串联scFv片段以及可用作TNFR2的拮抗剂的本文所述的其他抗原结合片段。用于鉴别以高亲和力结合特定抗原的抗体链及其抗原结合片段的示例性噬菌体展示方案是公认的，并且描述于例如美国专利号7,846,892、WO 1997/002342、美国专利号8,846,867和WO 2007/132917中；所述专利以引用的方式并入本文。类似的噬菌体展示技术可用于产生本文所述的抗体样支架(例如，10Fn3结构域)，所述支架结合TNFR2内促进受体拮抗作用的表位(例如，由具有SEQ ID NO:11、19、20和34-117中任一个的序列的肽呈递的表位)。用于鉴别抗体样支架蛋白的示例性噬菌体展示方案描述于例如WO 2009/086116中；所述专利的每一篇的公开内容以引用的方式并入本文)。
(ii)基于细胞的展示技术
利用溶剂暴露的多肽的基因型与表型之间的联系的其他体外展示技术包括酵母和细菌展示。酵母展示技术在本领域中已建立并且通常是有利的，因为可在单个酵母细胞的表面上呈递大量抗体(通常达30,000)(参见，例如，Boder等人(Nat Biotechno.15:553,1997)；所述文献以引用的方式并入本文)。与丝状噬菌体相比更大尺寸的酵母细胞能够实现额外的筛选策略，因为可使用流式细胞术来分析并分选酵母文库。例如，已建立的程序可用于产生表达含有随机化高变区的多肽(例如，单链多肽、抗体及其抗原结合片段)的细菌细胞或酵母细胞文库(参见例如，参见美国专利号7,749,501和US 2013/0085072；所述专利各自的教义以引用的方式并入本文)。例如，表达编码天然scFv片段的多核苷酸的大型酵母细胞文库可使用已建立的程序来制备(de Bruin等人,Nat Biotechnol 17:397,1999；所述文献以引用的方式并入本文)。然后可在淘选步骤期间将表达这些多核苷酸的酵母细胞与两种不同的荧光分子一起孵育：一种结合抗体内的保守残基且因此反映所展示的抗体的量的染料，以及另一种在不同波长下发荧光并结合抗原且因此指示所结合的抗原的量的染料。例如，本领域技术人员可使用含有SEQ ID NO:11、19、20和34-117中任一项的序列的TNFR2源性肽，所述肽已经任选地在所述肽的N-或C末端或在预期不会干扰抗体-抗原结合的残基处与表位标签(例如，生物素)缀合的。这使得用互补标签(例如，抗生物素蛋白)标记的荧光染料能够定位至抗体-抗原复合物。这样产生较大灵活性并且可立即反馈选择的进展。与噬菌体展示相反，通过归一化为抗体展示水平，可容易地选择具有更高亲和力而非更高表达水平的抗体。事实上，有可能区分并分选亲和力仅相差两倍的抗体(VanAntwerp和Wittrup(Biotechnol Prog 16:31,2000))。
(iii)核苷酸展示技术
利用随机化多核苷酸文库的体外翻译的展示技术也提供了产生本文所述的拮抗性TNFR2多肽的有效方法。例如，编码在指定高变区内含有突变的多肽(例如，单链多肽、抗体及其抗原结合片段)的随机化DNA文库可例如使用如本文所述的已建立的基于PCR的诱变技术获得。这些文库的多核苷酸可含有转录调控序列，如启动子和转录终止序列，并且可另外编码提高所得mRNA构建体的翻译速率的序列(例如，IRES序列、5'和3'UTR、聚腺苷酸化道等)。这些多核苷酸文库可在含有RNA聚合酶和RNA核苷三磷酸(NTP)的适当缓冲溶液中孵育，以便能够将DNA序列转录成感受态mRNA分子，所述mRNA分子随后可通过大和小核糖体亚基、氨基酰基tRNA分子以及溶液中存在的翻译起始和延伸因子进行翻译(例如，使用
Figure BDA0003027090150001681
体外蛋白质合成试剂盒，New England
Figure BDA0003027090150001682
)。设计的mRNA修饰可使抗体产物通过与嘌呤霉素的化学键保持共价结合至mRNA模板(参见例如，Keefe(Curr.Protoc.Mol.Biol.,第24章,Unit 24.5,2001)；所述以引用的方式并入本文)。因此，这种基因型-表型联系可用于通过将mRNA:抗体融合构建体与固定至表面的肽一起孵育并且以类似于噬菌体展示技术的方式进行淘选来选择结合TNFR2源性肽(例如，具有序列SEQID NO:11、19、20和34-117中任一个的肽)的抗体(参见例如，WO 2006/072773；所述专利以引用的方式并入本文)。
任选地，本文所述的多肽(例如，单链多肽、抗体及其抗原结合片段)可使用类似的技术产生，除了抗体产物可与核糖体-mRNA复合物非共价结合而不是通过嘌呤霉素接头共价结合。这种平台(称为核糖体展示)已在例如美国专利号7,074,557中进行了描述；所述专利以引用的方式并入本文。或者，可使用cDNA展示(一种类似于mRNA展示的技术，除了cDNA而不是mRNA通过嘌呤霉素接头共价结合至抗体产物)来产生抗体。cDNA展示技术提供了能够在越来越严格的条件下进行淘选步骤的优点，例如，在调整环境的盐浓度、离子强度、pH和/或温度以便筛选对TNFR2源性肽具有特别高亲和力的抗体的条件下。这是由于双链cDNA相对于单链mRNA的更高天然稳定性。cDNA展示筛选技术描述于例如Ueno等人(MethodsMol.Biol.,805:113-135,2012)中；所述文献以引用的方式并入本文。
除了产生本文所述的拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体、其抗原结合片段及其构建体)外，体外展示技术(例如，本文所述的那些和本领域中已知的那些)也提供了用于提高本文所述的拮抗性TNFR2多肽的亲和力的方法。例如，不是筛选含有完全随机化的高变区的抗体及其片段的文库，而是可筛选特征在于高变区内的特定位点处的靶向突变的抗体及其抗原结合片段的较窄文库。这可例如通过组装编码抗体或其抗原结合片段的多核苷酸的文库来实现，所述抗体或其抗原结合片段仅在高变区内的特定位点编码随机突变。然后可使用例如核糖体展示、mRNA展示或cDNA展示技术在例如丝状噬菌体、细菌细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞中或在体外表达这些多核苷酸，以筛选以提高的结合亲和力特异性地结合TNFR2表位(例如，含有SEQ ID NO:11、19、20和34-117中任一个的序列的肽)的抗体或其抗原结合片段。酵母展示例如非常适合于亲和力成熟，并且先前已用于将单链抗体的亲和力提高至48fM的KD(Boder等人(Proc Natl Acad Sci USA 97:10701,2000))。
可用于本文所述的拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体及其抗原结合片段)的产生和亲和力成熟的其他体外技术包括针对能够特异性结合TNFR2源性肽(例如，具有SEQID NO:11、19、20和34-117中任一个的氨基酸序列的肽)的功能性分子筛选抗体或其抗原结合片段的组合文库。组合抗体文库可例如通过在真核或原核细胞中表达编码抗体或其抗原结合片段的随机化高变区的多核苷酸来获得。这可例如使用本文所述的或本领域中已知的基因表达技术来实现。可例如通过蛋白A或蛋白G选择、尺寸分级柱色谱法、离心、差异溶解度和/或通过用于纯化蛋白质的任何其他标准技术来纯化抗体的异质混合物。可例如通过将这些抗体的异质混合物与已经固定至表面的TNFR2源性肽(例如，固定至固相树脂的表面或微量滴定板的孔的具有SEQ ID NO:11、19、20和34-117中任一个的氨基酸序列的肽)一起孵育足以允许抗体-抗原结合的一段时间来筛选如此获得的组合文库的文库。可通过用合适的缓冲液(例如，在生理pH(大约7.4)下缓冲并含有生理盐浓度和离子强度且任选地含有洗涤剂如TWEEN-20的溶液)洗涤表面来除去非结合抗体或其片段。随后可例如使用基于ELISA的检测方案来检测保持结合的抗体(参见例如，美国专利号4,661,445；所述专利的每一篇的公开内容以引用的方式并入本文)。
用于针对特异性地结合TNFR2源性肽(例如，含有SEQ ID NO:11、19、20和34-117中任一个的氨基酸序列的肽)的那些多肽筛选多肽(例如，单链多肽、抗体、其抗原结合片段及其构建体)的组合文库的另外技术包括筛选抗体片段的一珠一化合物文库。抗体片段可在由亲水性水溶胀性材料组成的固体珠上化学合成(例如，使用已建立的分裂与汇集(split-and-pool)固相肽合成方案)，以使得每个珠展示单个抗体片段。然后可将异质珠混合物与TNFR2源性肽一起孵育，所述肽任选地用可检测部分(例如，荧光染料)标记或者与表位标签(例如，生物素、抗生物素蛋白、FLAG标签、HA标签)缀合，所述表位标签随后可通过用互补标签(例如，分别为抗生物素蛋白、生物素、抗FLAG抗体、抗HA抗体)处理来检测。含有特异性地结合TNFR2源性肽(例如，含有SEQ ID NO:11、19、20和34-117中任一个的氨基酸序列的肽)的抗体片段的珠可通过在与荧光标记的抗原或互补标签一起孵育后分析珠的荧光性质来鉴别(例如，通过共焦荧光显微镜或通过荧光活化珠分选；参见例如，Muller等人(J.Biol.Chem.,16500-16505,1996)；所述文献以引用的方式并入本文)。因此，可使含有特异性地结合TNFR2源性肽的抗体片段的珠与不含高亲和力抗体片段的那些珠分离。特异性地结合TNFR2源性肽的抗体片段的序列可通过本领域中已知的技术来确定，所述技术包括例如埃德曼降解(Edman degradation)、串联质谱、基质辅助激光解吸飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)、核磁共振(NMR)和2D凝胶电泳等(参见例如，WO 2004/062553；所述专利的每一篇的公开内容以引用的方式并入本文)。
多肽的阴性筛选
除了上述用于筛选特异性地结合至源自人TNFR2的促进受体拮抗作用的表位的单链多肽、抗体或抗体片段的方法外，还可另外地进行阴性筛选以消除也可结合含有KCSPG序列的表位的抗体或抗体片段。例如，可针对也特异性地结合至源自人TNFR2的含有KCSPG基序的肽，如含有SEQ ID NO:7的残基48-67(QTAQMCCSKCSPGQHAKVFC，SEQ ID NO:18)的肽的抗体或抗体片段筛选由于任何上述筛选技术而分离的抗体或抗体片段的混合物。这可使用任何上述方法或其变型来实现，例如，以使得所筛选的抗体或抗体片段是先前鉴别为能够特异性地结合含SEQ ID NO:11、19、20和34-117的一个或多个残基的肽的那些。适用于阴性筛选的示例性技术包括上文或本领域已知的那些技术，如噬菌体展示、酵母展示、细菌展示、核糖体展示、mRNA展示、cDNA展示或基于表面的组合文库筛选(例如，呈ELISA格式)。这种筛选技术代表了用于鉴别拮抗性TNFR2抗体或抗体片段的有用策略，因为能够结合含有KCSPG序列的TNFR2表位的抗体或抗体片段缺乏或具有显著降低的拮抗活性。
非人哺乳动物的免疫
可用于产生本文所述的拮抗性TNFR2抗体及其抗原结合片段的另一种策略包括免疫非人哺乳动物。可免疫以产生本文所述的拮抗性TNFR2抗体及其片段的非人哺乳动物的实例包括兔、小鼠、大鼠、山羊、豚鼠、仓鼠、马和绵羊以及非人灵长类动物。例如，用于免疫灵长类动物的已建立的程序是本领域中已知的(参见例如，WO1986/6004782；所述专利以引用的方式并入本文)。免疫代表了通过利用B淋巴细胞的抗原特异性来产生单克隆抗体的稳健方法。例如，单克隆抗体可通过Kohler-Millstein程序(描述于例如EP 0110716中；所述专利以引用的方式并入本文)制备，其中来自非人动物(例如，灵长类动物)的脾细胞用呈递促进受体拮抗作用的TNFR2源性抗原的肽(例如，含有SEQ ID NO:11、19、20和34-117中任一个的氨基酸序列的肽)免疫。通过免疫产生的克隆扩增的B淋巴细胞可从动物的血清中分离且随后与骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤。杂交瘤是用于抗体产生的特别有用的剂，因为这些永生化细胞可提供持久的抗原特异性抗体供应。随后可使用本领域中已知的技术(例如通过亲和色谱法使用如蛋白A或蛋白G的试剂从细胞培养基中纯化抗体)来分离来自此类杂交瘤的抗体。
拮抗性TNFR2多肽缀合物
在将本文所述的拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体及其抗原结合片段)(例如，表1中所述的抗体1-25中的任一种或多种及其变体，如包含表1中列出的CDR中的一个或多个或全部的抗体或抗原结合片段)施用于哺乳动物受试者(例如人)之前，可能希望使抗体或其片段缀合至第二分子，例如以调节体内抗体活性。拮抗性TNFR2抗体及其片段可使用本领域中熟知的各种已建立的缀合策略中的任一种在抗体的轻链或重链的N末端或C末端处缀合至其他分子。可用于将拮抗性TNFR2抗体或其片段共价系连至另一分子的反应性官能团对的实例包括但不限于硫醇对、羧酸和氨基、酮和氨基、醛和氨基、硫醇和α,β-不饱和部分(如马来酰亚胺或脱氢丙氨酸)、硫醇和α-卤代酰胺、羧酸和酰肼、醛和酰肼以及酮和酰肼。
拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体、其抗原结合片段及其构建体)可通过如所描述的化学缀合直接共价附接至另一分子。或者，可从细胞(例如真核细胞或原核细胞)重组表达含有拮抗性TNFR2抗体及其片段的融合蛋白。这可例如通过将编码融合蛋白的多核苷酸掺入细胞的核基因组中(例如，使用本文所述的或本领域中已知的技术)来实现。任选地，可通过在抗体与接头之间形成共价键来将本文所述的抗体及其片段连接至第二分子。然后此接头可随后与另一分子缀合，或者可在连接至抗TNFR2抗体或其片段之前将接头与另一分子缀合。可用于形成缀合物的接头的实例包括多肽接头，如含有天然存在的或非天然存在的氨基酸的接头。在一些实施方案中，可能需要在接头中包含D-氨基酸，因为这些残基不存在于天然存在的蛋白质中并且因此对内源性蛋白酶的降解更具抗性。可使用化学合成技术(如本文所述的那些)或通过在细胞(例如原核或真核细胞)中重组表达编码融合蛋白的多核苷酸来制备含有多肽接头的融合蛋白。接头可使用本领域中熟知的各种策略来制备，并且取决于接头的反应性组分可通过酶水解、光解、在酸性条件下的水解、在碱性条件下的水解、氧化、二硫化物还原、亲核裂解或有机金属裂解而裂解(Leriche等人,Bioorg.Med.Chem.,20:571-582,2012)。
药物-多肽缀合物
本文所述的拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体及其抗原结合片段)(例如，表1中所述的抗体1-25中的任一种或多种及其变体，如包含表1中列出的CDR中的一个或多个或全部的抗体或抗原结合片段)可另外与治疗剂(如细胞毒性分子)缀合、混合或分开施用。本文所述的缀合物可适用于治疗或预防与异常细胞增殖相关的疾病，如本文所述的癌症。可与拮抗性TNFR2多肽缀合、混合或分开施用的示例性细胞毒性剂包括但不限于，抗肿瘤剂如：阿西维辛；阿克拉霉素；盐酸阿考达唑；阿克罗宁；阿多来新；阿地白介素；六甲蜜胺；安波霉素；醋酸阿美蒽醌；氨鲁米特；安吖啶；阿那曲唑；氨茴霉素；天冬酰胺酶；曲林菌素；阿扎胞苷；阿扎替派；阿佐霉素；巴马司他；苯佐替派；比卡鲁胺；盐酸比生群；二甲磺酸双奈法德；比折来新；硫酸博来霉素；布喹那钠；溴匹立明；白消安；放线菌素C(cactinomycin)；卡鲁睾酮；卡醋胺；卡贝替姆；卡铂；卡莫司汀；盐酸卡柔比星；卡折来新；西地芬戈；苯丁酸氮芥；西罗霉素；顺铂；克拉屈滨；考布他汀a-4；甲磺酸克立那托；环磷酰胺；阿糖胞苷；达卡巴嗪；daca(n-[2-(二甲基-氨基)乙基]吖啶-4-甲酰胺)；更生霉素；盐酸柔红霉素；道诺霉素；地西他滨；右奥马铂；地扎胍宁；甲磺酸地扎胍宁；地吖醌；多西他赛；多拉司他汀；阿霉素；盐酸阿霉素；屈洛昔芬；柠檬酸屈洛昔芬；丙酸屈他雄酮；偶氮霉素；依达曲沙；盐酸依洛尼塞；椭圆玫瑰树碱(ellipticine)；依沙芦星；恩洛铂；恩普氨酯；依匹哌啶；盐酸表柔比星；厄布洛唑；盐酸依索比星；雌莫司汀；雌莫司汀磷酸钠；依他硝唑；乙碘油i 131；依托泊苷；磷酸依托泊苷；艾托卜宁；盐酸法屈唑；法扎拉滨；维甲酰酚胺；氟尿苷；磷酸氟达拉滨；氟尿嘧啶；5-fdump；氟西他滨；磷喹酮；福司曲星钠；吉西他滨；盐酸吉西他滨；金au 198；高喜树碱；羟基脲；盐酸伊达比星；异环磷酰胺；伊莫福新；干扰素α-2a；干扰素α-2b；干扰素α-nl；干扰素α-n3；干扰素β-i a；干扰素γ-i b；异丙铂；盐酸伊立替康；醋酸兰瑞肽；来曲唑；醋酸亮丙瑞林；盐酸利阿唑；洛美曲索钠；洛莫司汀；盐酸洛索蒽醌；马索丙考；美登素；盐酸氮芥；醋酸甲地孕酮；醋酸美仑孕酮；美法仑；美诺立尔；巯基嘌呤；甲氨蝶呤；甲氨蝶呤钠；氯苯氨啶；美妥替哌；米丁度胺；米托卡星；丝裂红素；丝林霉素；丝裂马菌素；丝裂霉素；米托司培；米托坦；盐酸米托蒽醌；霉酚酸；诺考达唑；诺加霉素；奥马他辛；奥马铂；奥昔舒仑；紫杉醇；培门冬酶；培利霉素；戊氮芥；硫酸培洛霉素；过磷酰胺；哌泊溴烷；哌泊舒凡；盐酸吡罗昔康；普卡霉素；普洛美坦；卟吩姆钠；紫菜霉素；泼尼莫司汀；盐酸丙卡巴肼；嘌呤霉素；盐酸嘌呤霉素；吡唑呋喃菌素；根霉素；根霉属d；利波腺苷；罗谷亚胺；沙芬戈；盐酸沙芬戈；司莫司汀；辛曲秦；磷乙酰天冬氨酸钠；司帕霉素；盐酸螺旋锗；螺莫司汀；螺铂；链黑菌素；链脲佐菌素；氯化锶sr 89；磺氯苯脲；他利霉索；紫杉烷；紫杉烷类(taxoid)；替可加兰钠；替加氟；盐酸替托蒽酮；替莫卟吩；替尼泊苷；替罗昔隆；睾内酯；硫唑嘌呤胺；硫鸟嘌呤；噻替派；thymitaq；噻唑羧胺核苷；替拉扎明；拓优得(tomudex)；top53；盐酸托泊替康；柠檬酸托瑞米芬；醋酸曲托龙；磷酸曲西立滨；三甲曲沙；葡醛酸三甲曲沙；曲普瑞林；盐酸妥布氯唑；尿嘧啶氮芥；尿烷亚胺；伐普肽；维替泊芬；长春碱；硫酸长春碱；长春新碱；硫酸长春新碱；长春地辛；硫酸长春地辛；硫酸长春匹定；硫酸长春甘酯；硫酸长春罗辛；酒石酸长春瑞滨；硫酸长春罗定；硫酸长春利定；伏氯唑；折尼铂；净司他丁；盐酸佐柔比星；2-氯脱氧腺苷；2'脱氧霉素；9-氨基喜树碱；雷替曲塞；N-炔丙基-5,8-二脱氮叶酸；2氯-2'-阿拉伯糖-氟-2'-脱氧腺苷；2-氯-2'-脱氧腺苷；茴香霉素；曲古抑菌素A；hPRL-G129R；CEP-751；利诺胺；硫芥；氮芥(nitrogen mustard/mechlor ethamine)；环磷酰胺；美法仑；苯丁酸氮芥；异环磷酰胺；白消安；N-甲基-亚硝基脲(MNU)；N,N'-双(2-氯乙基)-N-亚硝基脲(BCNU)；N-(2-氯乙基)-N'环己基-N-亚硝基脲(CCNU)；N-(2-氯乙基)-N'-(反式-4-甲基环己基-N-亚硝基脲(MeCCNU)；N-(2-氯乙基)-N'-(二乙基)乙基膦酸酯-N-亚硝基脲(福莫司汀)；链脲霉素；达卡巴嗪(DTIC)；米托唑胺；替莫唑胺；噻替派；丝裂霉素C；AZQ；阿多来新；顺铂；卡铂；奥马铂；奥沙利铂；C1-973；DWA 2114R；JM216；JM335；双(铂)；拓优得；阿扎胞苷；阿糖胞苷；吉西他滨；6-巯基嘌呤；6-硫鸟嘌呤；次黄嘌呤；替尼泊苷9-氨基喜树碱；托泊替康；CPT-11；阿霉素；道诺霉素；表柔比星；依达比星；米托蒽醌；洛索蒽醌；更生霉素(放线菌素D)；安吖啶；吡唑吖啶；全反式视黄醇；14-羟基-反-视黄醇；全反式视黄酸；N-(4-羟基苯基)视黄酰胺；13-顺式视黄酸；3-甲基TTNEB；9-顺式视黄酸；氟达拉滨(2-F-ara-AMP)；或2-氯脱氧腺苷(2-Cda)。
可与本文所述的拮抗性TNFR2单链多肽、抗体或其抗原结合片段缀合、混合或分开施用以治疗与异常细胞增殖相关的疾病、预防或研究所述疾病的进展的其他治疗性化合物包括但不限于，细胞毒性剂如20-pi-1,25二羟基维生素D3；5-乙炔基尿嘧啶；阿比特龙；酰基富烯；腺环戊醇；阿多来新；阿地白介素；ALL-TK拮抗剂；六甲蜜胺；氨莫司汀；艾美多；阿米福汀；氨基乙酰丙酸；氨柔比星；安吖啶；阿那格雷；阿那曲唑；雄茸交酯；血管生成抑制剂；拮抗剂D；拮抗剂G；安雷利克斯；抗背部化形态发生蛋白-1；抗雄激素，前列腺癌；抗雌激素；抗瘤酮；反义寡核苷酸；甘氨酸蚜肠霉素；细胞凋亡基因调节剂；细胞凋亡调节剂；嘌呤酸；ara-CDP-DL-PTBA；精氨酸脱氨酶；奥沙那宁；阿他美坦；阿莫司汀；阿新司坦汀1；阿新司坦汀2；阿新司坦汀3；阿扎司琼；阿扎毒素；重氮酪氨酸；巴卡亭III衍生物；班兰诺；巴马司他；BCR/ABL拮抗剂；苯并二氢卟酚；苯甲酰星形孢菌素；β内酰胺衍生物；β-阿立辛；贝他霉素B；桦木酸；bFGF抑制剂；比卡鲁胺；比生群；双吖丙啶基精胺；双萘法德；双崔特(bistratene)A；比折来新；比锐来特(breflate)；博来霉素A2；博来霉素B2；溴匹立明；布多替钛；丁硫氨酸亚砜胺；卡泊三醇；钙感光蛋白C；喜树碱衍生物(例如，10-羟基-喜树碱)；金丝雀痘IL-2；卡培他滨；甲酰胺-氨基-三唑；羧基酰氨基三唑；CaRest M3；CARN 700；软骨来源抑制剂；卡折来新；酪蛋白激酶抑制剂(ICOS)；栗精胺；杀菌肽B；西曲瑞克；二氢卟酚；氯喹喔啉磺酰胺；西卡前列素；顺卟啉；克拉屈滨；氯米芬类似物；克霉唑；克里斯霉素A；克里斯霉素B；考布他丁A4；考布他汀类似物；考那格宁(conagenin)；卡那贝西汀(crambescidin)816；克雷斯托；念珠藻素8；念珠藻素A衍生物；卡拉新(curacin)A；环戊蒽醌；环铂(cycloplatam)；次帕霉素(cypemycin)；阿糖胞苷烷磷酯；溶细胞因子；磷酸己烷雌酚(cytostatin)；达昔单抗；地西他滨；去氢膜海鞘素B；2'脱氧助间型霉素(DCF)；地洛瑞林；右异环磷酰胺；右雷佐生；右维拉帕米；亚丝醌；膜海鞘素B；地多西(didox)；二乙基去甲精胺；二氢-5-氮杂胞嘧啶核苷；9-二氢紫杉醇；二噁霉素；二苯基螺莫司汀；圆皮海绵内酯(discodermolide)；二十二醇；多拉司琼；脱氧氟尿苷；屈洛昔芬；屈大麻酚；倍癌霉素SA；依布硒啉；依考莫司汀；依地福新；依决洛单抗；依氟鸟氨酸；榄香烯；乙嘧替氟；表柔比星；埃博霉素(A，R＝H；B，R＝Me)；埃坡霉素(epithilone)；爱普列特；雌莫司汀类似物；雌激素激动剂；雌激素拮抗剂；依他硝唑；依托泊苷；4'-磷酸依托泊苷(etopofos)；依西美坦；法屈唑；法扎拉滨；维甲酰酚胺；非格司亭；非那雄安；夫拉平度；氟卓斯汀；氟海星酮；氟达拉滨；盐酸氟道诺霉素；福酚美克；福美司坦；福司曲星；福莫司汀；钆德克萨卟啉；硝酸镓；加洛他滨；加尼瑞克；明胶酶抑制剂；吉西他滨；谷胱甘肽抑制剂；和普苏姆；和瑞古林；六亚甲基双乙酰胺；高三尖杉酯碱(HHT)；金丝桃素；伊班膦酸；伊达比星；艾多昔芬；伊决孟酮；伊莫福新；伊洛马司他；咪唑吖啶酮；咪喹莫特；免疫刺激剂肽；胰岛素样生长因子-1受体抑制剂；干扰素激动剂；干扰素；白细胞介素；碘苄胍；碘多柔比星；甘薯苦醇；伊立替康；伊罗普拉；伊索拉定；异苯胍唑；异高软海绵素B；伊他司琼；杰斯普拉克立德(jasplakinolide)；卡哈拉得(kahalalide)F；三乙酸片螺素-N；兰乐肽；雷纳霉素(leinamycin)；来格司亭；硫酸香菇多糖；利特斯塔汀(leptolstatin)；来曲唑；白血病抑制因子；白细胞α干扰素；亮丙立德+雌激素+孕酮；亮丙瑞林；左旋咪唑；利阿唑；直链聚胺类似物；亲脂性二糖肽；亲脂性铂化合物；立索克林酰胺(lissoclinamide)7；洛铂；蚯蚓磷脂；洛美曲索；氯尼达明；洛索蒽醌；洛伐他汀；洛索立宾；勒托替康；德克萨斯卟啉镥；立索茶碱(lysofylline)；裂解肽；美登素；抑甘露糖苷酶素(mannostatin)A；马马司他(marimastat)；马索罗酚；马司非(maspin)；基质溶素抑制剂；基质金属蛋白酶抑制剂；美诺立尔；麦尔巴隆；美替瑞林；甲硫氨酸酶；甲氧氯普胺；MIF抑制剂；美服培酮；米替福新；米立司亭；错配双链RNA；光神霉素(mithracin)；米托胍腙；二溴卫矛醇；丝裂霉素类似物；米托萘胺；迈托毒素成纤维细胞生长因子-皂草素；米托蒽醌；莫法罗汀；莫拉司亭；单克隆抗体、人绒毛膜促性腺激素；单磷酰基脂质A+分枝杆菌细胞壁sk；莫哌达醇；多重抗药性基因抑制剂；基于多肿瘤抑制因子1的治疗剂；芥末抗癌剂；美卡普罗B；分枝杆菌细胞壁提取物；美瑞泡仁(myriaporone)；N-乙酰基地那林；N-取代苯甲酰胺；那法瑞林；纳格瑞替；纳洛酮+戊唑星；纳普维；萘特非；那托司亭；奈达铂；奈莫柔比星；奈立膦酸；中性内肽酶；尼鲁米特；丽沙霉素；一氧化氮调节剂；氮氧化物抗氧化剂；里挫林；06-苄基鸟嘌呤；奥曲肽；奥克恩；寡核苷酸；奥那司酮；昂丹司琼；昂丹司琼；奥拉新；口服细胞因子诱导剂、奥马铂；奥沙特隆；奥赛力铂；厄诺霉素；紫杉醇类似物；紫杉醇衍生物；帕诺明；十六酰基根霉素；帕米膦酸；人参三醇；帕诺米芬；帕拉贝新；帕折普汀；培门冬酶；皮地新(peldesine)；戊聚糖聚硫酸钠；喷司他汀；戊四唑(pentrozole)；全氟溴烷；培磷酰胺；紫苏子醇；苯连氮霉素；乙酸苯酯；磷酸酶抑制剂；皮西板尼；盐酸毛果芸香碱；吡柔比星；吡曲克辛；普来司汀A；普来司汀B；血纤维蛋白溶酶原活化剂抑制剂；铂络合物；铂化合物；铂-三胺络合物；鬼臼毒素；卟吩姆钠；泊非霉素；丙基双吖啶酮；前列腺素J2；蛋白酶抑制剂；基于蛋白A的免疫调节剂；蛋白激酶C抑制剂；蛋白激酶C抑制剂、微藻；蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂；嘌呤核苷磷酸化酶抑制剂；紫红素；吡唑并吖啶；吡哆醛化血红蛋白聚氧乙烯缀合物；raf拮抗剂；雷替曲赛；雷莫司琼；ras法呢基蛋白转移酶抑制剂；ras抑制剂；ras-GAP抑制剂；去甲基化瑞替立汀；依替膦酸铼Re 186；根霉素；核酶；RII视黄酰胺；罗谷亚胺；罗希吐碱；罗莫肽；罗喹美克；鲁滨吉隆(rubiginone)B1；鲁泊塞(ruboxyl)；沙芬戈；圣特平(saintopin)；SarCNU；沙卡弗托A；沙格司亭；Sdi 1模拟物；司莫司汀；衰老源性抑制剂1；有义寡核苷酸；信号转导抑制剂；信号转导调节剂；单链抗原结合蛋白；西佐糖；索布佐生；硼卡钠；苯基乙酸钠；索佛罗；生长调节素结合蛋白；索纳明；斯帕磷酸；斯皮卡霉素(spicamycin)D；螺莫司汀；斯兰罗皮汀；海绵抑制素1；角鲨胺；干细胞抑制剂、干细胞分裂抑制剂；斯替匹酰胺(stipiamide)；基质溶素抑制剂；索非罗新；超活性血管活性肠肽拮抗剂；苏拉迪司塔(suradista)；苏拉明；苦马豆素；合成葡糖氨基葡聚糖；他莫司汀；甲碘化他莫昔芬；牛磺莫司汀；他扎罗汀；替可加兰钠；喃氟啶；碲哌喃鎓；端粒酶抑制剂；替莫卟吩；替莫唑胺；替尼泊苷；四氯十氧化物；替唑明；噻立拉斯汀(thaliblastine)；萨力多胺；噻考瑞林；血小板生成素；血小板生成素模拟物；胸腺法新；促胸腺生成素受体激动剂；胸腺曲南；促甲状腺激素；乙基初卟啉锡；替拉扎明；二氯化二茂钛；托泊替康；托普升替；托瑞米芬；全能干细胞因子；翻译抑制剂、维甲酸；三乙酰基尿苷；曲西立滨；三甲曲沙；曲普瑞林；托烷司琼；妥罗雄脲；酪氨酸激酶抑制剂；酪氨酸磷酸化抑制剂；UBC抑制剂；乌苯美司；泌尿生殖窦源性生长抑制因子；尿激酶受体拮抗剂；伐普肽；凡瑞林B；载体系统、红细胞基因治疗剂；维拉雷琐；凡拉明；凡啶；维替泊芬；维萨汀；维他欣；伏罗唑；扎诺特隆；折尼铂；亚苄维C(zilascorb)；以及净司他丁斯酯。
标记的抗TNFR2多肽
在一些实施方案中，本文所述的拮抗性TNFR2单链多肽、抗体、其抗原结合片段或构建体(例如，表1中所述的抗体1-25中的任一种或多种及其变体，如包含表1中列出的CDR中的一个或多个或全部的抗体或抗原结合片段)出于纯化或检测的目的与另一分子(例如表位标签)缀合。可用于蛋白质纯化的此类分子的实例包括呈现能够被第二分子识别的结构表位的那些分子。这是通过亲和色谱法在蛋白质纯化中采用的常用策略，其中将分子固定在固体支撑物上并暴露于含有与能够结合固定的化合物的分子缀合的靶蛋白的异质混合物。可出于分子识别的目的与拮抗性TNFR2多肽缀合的表位标签分子的实例包括但不限于麦芽糖结合蛋白、谷胱甘肽-S-转移酶、多组氨酸标签、FLAG-标签、myc-标签、人流感血凝素(HA)标签、生物素、链霉亲和素。含有由这些分子呈递的表位的缀合物能够分别被此类互补分子(如麦芽糖、谷胱甘肽、含镍复合物、抗FLAG抗体、抗myc抗体、抗HA抗体、链霉亲和素或生物素)识别。例如，可通过用含有互补分子的固相树脂处理其他蛋白质和生物分子(例如，DNA、RNA、碳水化合物、磷脂等)的复杂混合物来纯化已经与来自所述混合物的表位标签缀合的本文所述的拮抗性TNFR2抗体或其片段，所述互补分子可选择性地识别并结合所述拮抗性抗TNFR2抗体或其片段的表位标签。固相树脂的实例包括琼脂糖珠，其与水溶液中的纯化相容。
本文所述的拮抗性TNFR2多肽也可共价附接至荧光分子，例如以通过荧光测定法和/或通过使用荧光显微镜直接可视化来检测所述抗体或其抗原结合片段。可与本文所述的抗体缀合的示例性荧光分子包括绿色荧光蛋白、青色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白、藻红蛋白、别藻蓝蛋白、赫斯特、4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)、碘化丙啶、荧光素、香豆素、罗丹明、四甲基罗丹明和花菁。适用于与本文所述的抗体缀合的荧光分子的其他实例是本领域中熟知的，并且已在例如美国专利号7,417,131和7,413,874中进行了详细描述，所述专利各自以引用的方式并入本文。
含有荧光分子的拮抗性TNFR2多肽特别适用于监测本文所述的抗体及其片段的细胞表面定位性质。例如，可使培养的哺乳动物细胞(例如，T-reg细胞)暴露于已与荧光分子共价缀合的本文所述的拮抗性TNFR2多肽，并且随后使用本领域中已知的常规荧光显微镜技术分析这些细胞。共聚焦荧光显微镜是用于确定拮抗性TNFR2多肽的细胞表面定位的特别有效的方法，因为可分析细胞的各个平面以区分已经内化到细胞内部(例如通过受体介导的内吞作用)的抗体或其片段与结合至细胞膜外表面的那些抗体或其片段。另外，可用缀合至发射特定波长的可见光的荧光分子(例如，荧光素，其在约535nm下发荧光)和另一荧光分子的拮抗性TNFR2抗体处理细胞，所述另一荧光分子已知定位于T-reg细胞表面上的特定位点并且在不同波长下发荧光(例如，定位于CD25并且在约599nm下发荧光的分子)。可通过共聚焦荧光显微镜可视化所得发射图案，并且可合并来自这两个波长的图像，以揭示关于拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段在T-reg细胞表面上相对于其他受体的位置的信息。
为了检测和可视化拮抗性TNFR2多肽(如单链多肽、抗体或其片段)，也可将生物发光蛋白掺入融合蛋白中。生物发光蛋白(如荧光素酶和水母发光蛋白)作为与底物(例如荧光素和腔肠素)的化学反应的一部分发光。适合用作诊断序列的示例性生物发光蛋白及其使用方法描述于例如美国专利号5,292,658、5,670,356、6,171,809和7,183,092中，所述专利各自以引用的方式并入本文。用生物发光蛋白标记的拮抗性TNFR2抗体或其片段是在体外测定后检测本文所述的抗体的有用工具。例如，可通过使用本领域中已知的凝胶电泳方法(例如，天然凝胶分析)分离另外蛋白质的复杂混合物的组分且随后将分离的蛋白质转移到膜上以进行蛋白质印迹来在所述混合物中检测已与生物发光蛋白缀合的拮抗性TNFR2抗体的存在。可通过用适当的荧光素酶底物处理膜并随后使用已建立的方案使膜上的蛋白质混合物可视化来实现在其他蛋白质的混合物中检测拮抗性TNFR2多肽。
本文所述的多肽(例如，单链多肽、抗体、其抗原结合片段及其构建体)也可与包含放射性核的分子缀合，以使得可通过分析核的放射性发射图案来检测本文所述的抗体或其片段。或者，可通过在蛋白质制备过程中在抗体内掺入放射性核来直接修饰拮抗性TNFR2抗体或其片段。甲硫氨酸(35S)、氮(15N)或碳(13C)的放射性同位素可通过例如在补充有含有这些同位素的营养素的培养基中培养细菌而掺入本文所述的抗体或其片段中。任选地，含有放射性卤素的酪氨酸衍生物可通过例如在补充有放射性标记的酪氨酸的培养基中培养细菌细胞而掺入拮抗性TNFR2多肽中。已经表明，使用体内内源性翻译酶，在酚系统的C2位置用放射性卤素官能化的酪氨酸迅速掺入延伸多肽链中(美国专利号4,925,651；所述专利以引用的方式并入本文)。卤素包括氟、氯、溴、碘和砹。另外，拮抗性TNFR2多肽可在通过用放射性同位素官能化本文所述的多肽从细胞培养物中分离和纯化后进行修饰。卤素代表一类同位素，所述同位素可通过酪氨酸或色氨酸处的芳族取代而容易地掺入纯化的蛋白质中，例如通过这些残基中的一个或多个与亲电子卤素物质的反应。放射性卤素同位素的实例包括18F、75Br、77Br、122I、123I、124I、125I、129I、131I或211At。
用于掺入放射性同位素的另一种替代策略是螯合基团与拮抗性TNFR2多肽(如单链多肽、抗体、其片段或构建体)的共价连接。可通过连接至反应性官能团(如硫醇、氨基、醇或羧酸)来使螯合基团共价附接至拮抗性TNFR2抗体或其片段。然后可将螯合基团修饰为含有各种金属放射性同位素中的任一种，所述金属放射性同位素包括但不限于如125I、67Ga、111In、99Tc、169Yb、186Re、123I、124I、125I、131I、99mTc、111In、64Cu、67Cu、186Re、188Re、177Lu、90Y、77As、72As、86Y、89Zr、211At、212Bi、213Bi或225Ac的此类放射性核素。
在一些实施方案中，可能希望将本文所述的多肽(例如，单链多肽、抗体、其片段或其构建体)与能够结合来自重元素或稀土离子的金属离子(如Gd3+、Fe3+、Mn3+或Cr2+)的螯合基团共价缀合。含有与此类顺磁性金属配位的螯合基团的缀合物可用于MRI成像应用。顺磁性金属包括但不限于铬(III)、锰(II)、铁(II)、铁(III)、钴(II)、镍(II)、铜(II)、镨(III)、钕(III)、钐(III)、钆(III)、铽(III)、镝(III)、钬(III)、铒(III)以及镱(III)。以这种方式，可通过MRI光谱检测拮抗性TNFR2多肽。例如，可将缀合至与顺磁性离子结合的螯合基团的拮抗性TNFR2抗体或其片段施用至哺乳动物受试者(例如，人患者)，以监测施用后抗体的分布。这可通过本文所述的任何施用途径(如静脉内)向患者施用所述抗体并且随后通过根据建立的方案记录患者的MRI来分析所施用的抗体的位置而实现。
拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体、其抗原结合片段及其构建体)可另外与其他分子缀合，以提高蛋白质在水溶液中的溶解度和稳定性。此类分子的实例包括PEG、PSA、牛血清白蛋白(BSA)和人血清白蛋白(HSA)等。例如，可使拮抗性TNFR2多肽与碳水化合物部分缀合，以避免接受治疗的患者的免疫系统检测所述抗体或其片段。这种高糖基化过程通过空间抑制蛋白质与循环中的B细胞受体的相互作用而降低治疗性蛋白质的免疫原性。或者，拮抗性TNFR2抗体或其片段可与防止从人血清中清除并改进本文所述的抗体的药代动力学概况的分子缀合。可缀合或插入本文所述的抗TNFR2抗体或其片段内以减弱清除并改进这些抗体和片段的药代动力学概况的示例性分子包括补救受体结合表位。这些表位在IgG免疫球蛋白的Fc区内发现，并且已显示结合Fc受体并延长人血清中的抗体半衰期。将补救受体结合表位插入抗TNFR2抗体或其片段中可例如，如美国专利号5,739,277中所描述来实现；所述专利以引用的方式并入本文。
修饰的拮抗性TFNR2多肽
除了与其他治疗剂和标记缀合以进行鉴别或可视化外，还可修饰本文所述的拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体、其抗原结合片段及其构建体)(例如，表1中所述的抗体1-25中的任一种或多种及其变体，如包含表1中列出的CDR中的一个或多个或全部的抗体或抗原结合片段)以改进其药代动力学概况、生物物理稳定性或抑制能力。例如，任何不参与维持拮抗性TNFR2多肽的正确构象的半胱氨酸残基可被异构或等电子氨基酸(例如丝氨酸)取代，以改进分子的氧化稳定性并防止异常交联。相反，可将一个或多个胱氨酸键添加至抗体或其片段以改善其稳定性(特别是当抗体是抗体片段，如Fv片段时)。这可例如通过改变编码抗体重链和轻链的多核苷酸或编码抗体片段的多核苷酸以编码一个或多个另外的半胱氨酸残基对来实现，所述半胱氨酸残基可在氧化条件下形成二硫键以增强抗体三级结构(参见例如，美国专利号7,422,899；所述专利以引用的方式并入本文)。
可对本文所述的拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体、其抗原结合片段及其构建体)进行的另一种有用的修饰包括改变这些抗体及其片段的糖基化概况。这可例如通过在拮抗性TNFR2抗体中取代、插入或缺失氨基酸以插入或除去糖基化位点来实现。抗体的糖基化通常以N-连接或O-连接的方式发生。N-连接糖基化是其中碳水化合物部分与抗体的连接发生在天冬酰胺残基的侧链处的过程。用于N-连接糖基化的共有氨基酸序列包括三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸(NXS)和天冬酰胺-X-苏氨酸(NXT)，其中X是除脯氨酸以外的任何氨基酸。将这些三肽序列中的任一个插入多肽(例如，拮抗性TNFR2抗体)中产生潜在糖基化位点。O-连接的糖基化是指糖N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖中的一种与羟基氨基酸的连接，最常见的是丝氨酸或苏氨酸，但是5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸也是糖苷形成的有效底物。因此，可通过改变TNFR2抗体的氨基酸序列(例如，使用如本文所述的重组表达技术)来实现将糖基化位点添加至所述抗体，以使得所述抗体含有上述三肽序列中的一个或多个以促进N-连接的糖基化，或者原始抗体的序列的一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基产生O-连接的糖基化(参见例如，美国专利号7,422,899；所述专利以引用的方式并入本文)。
在替代情况下，就效应子功能而言，可能需要修饰本文所述的抗体或其片段，例如以便增强所述抗体的抗原依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)。这可通过在抗体的Fc区中引入一个或多个氨基酸取代来实现。例如，可将半胱氨酸残基引入抗TNFR2抗体或其片段的Fc区中(例如，通过如本文所述的重组表达技术)，以促进此区域中的额外链间二硫键形成。由此产生的同二聚体抗体可具有增加的构象约束，这可促进提高的内化能力和/或增加的补体介导的细胞杀伤和抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。具有增强的抗肿瘤活性的同二聚体抗体也可以使用如，例如在Wolff等人(Canc.Res.,53:2560-2565,1993)中描述的异双功能交联剂来制备；所述文献以引用的方式并入本文。或者，可工程化具有双Fc区的抗体，并且所述抗体可由此具有增强的补体溶解和ADCC能力(参见Stevenson等人(Anti-Canc.Drug Des.,3:219-230,1989)；所述文献以引用的方式并入本文)。
在一些实施方案中，可通过掺入再一种氨基酸修饰(如通过改变Fab结构域的CH1或CL区以引入补救受体基序(例如在IgG的Fc区的CH2结构域的两个环中发现的补救受体基序)来改进本文所述的拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体及其抗原结合片段)的血清半衰期。此类改变例如在美国专利号5,869,046和美国专利号6,121,022中进行了描述；所述专利以引用的方式并入本文。还可进行另外的框架修饰以降低抗体或其片段的免疫原性或减少或除去其中存在的T细胞表位，如例如在US2003/0153043中所描述；所述专利以引用的方式并入本文。
治疗方法
本文所述的拮抗性TNFR2多肽，这样的显性拮抗性TNFR2多肽(例如，表1中所述的抗体1-25中的任一种或多种及其变体，如包含表1中列出的CDR中的一个或多个或全部的抗体或抗原结合片段)可用于治疗患有细胞增殖病症(如本文所述的癌症)、感染性疾病(如本文所述的病毒、细菌、真菌或寄生虫感染)或由TNFR2信号传导介导的另一种疾病的患者。这些适应症将在接下来的章节中详细解释。
治疗细胞增殖病症的方法
本文所述的拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体、其抗原结合片段及其构建体)，如显性拮抗性TNFR2多肽是用于治疗多种癌症和细胞增殖病症的有用治疗剂。拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体、其抗原结合片段及其构建体)，如显性拮抗性TNFR2多肽可施用于患有细胞增殖病症(如癌症)的哺乳动物受试者(如人)，例如以增强针对靶癌细胞的适应性免疫响应的有效性。
可用于这些目的的本公开的示例性组合物包括拮抗性TNFR2多肽(例如，表1中所述的抗体1-25中的任一种或多种及其变体，如包含表1中列出的CDR中的一个或多个或全部的抗体或抗原结合片段)，如具有至少两个TNFR2结合位点的那些，其中所述结合位点在空间上彼此相隔约
Figure BDA0003027090150001841
或更多，以及具有人IgG2同种型例如人IgG2-A同种型(例如，拥有具有C232S和/或C233S氨基酸取代的人IgG2铰链区的拮抗性TNFR2抗体、其抗原结合片段及其构建体)的那些。可用于这些目的的本公开的组合物还包括含有拮抗性TNFR2多肽的药物组合物，所述拮抗性TNFR2多肽采用单个二硫键结合的同种型，如其中例如，药物组合物中10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％、99.99％或更多的多肽以单个二硫键结合的同种型存在的那些。
特别地，本文所述的拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体、其抗原结合片段及其构建体)(例如，表1中所述的抗体1-25中的任一种或多种及其变体，如包含表1中列出的CDR中的一个或多个或全部的抗体或抗原结合片段)可施用于哺乳动物受试者(如人)，以抑制T-reg细胞生长和活化，其允许肿瘤浸润性T淋巴细胞定位于呈递肿瘤相关抗原的细胞并促进细胞毒性。此外，本文所述的多肽可与现有的过继性T细胞治疗平台协同作用，因为关于这种策略的有效性的限制之一一直是难以在输注到哺乳动物受试者(例如，人)后延长肿瘤反应性T细胞的细胞毒性。本文所述的多肽还可促进同种异体T淋巴细胞的活性，所述T淋巴细胞可表达外来MHC蛋白并且可越来越易于通过宿主免疫系统失活。例如，本文所述的拮抗性TNFR2多肽可通过遏制通常伴随T细胞输注的T-reg细胞的生长和增殖来减轻T-reg介导的肿瘤反应性T细胞的耗竭。例如，本文所述的多肽(例如，单链多肽、抗体、其抗原结合片段及其构建体)可能能够使T-reg细胞的生长相对于未处理的细胞减少约50％至约200％(例如，50％、75％、100％、125％、150％、175％或200％)。细胞生长的减少不需要TNFα的存在。在一些实施方案中，本文所述的多肽(例如，单链多肽、抗体、其抗原结合片段及其构建体)可能能够在TNFα存在下使T-reg细胞的生长相对于未处理的细胞限制至90％与150％之间(例如，90％、100％、110％、120％、130％、140％或150％)。本文所述的拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体、其抗原结合片段及其构建体)还能够使T-reg细胞的增殖限制至未处理的T-reg细胞群体的增殖的小于70％(例如，60％、50％、40％、30％、20％、10％、5％或1％)。本文所述的拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体、其抗原结合片段及其构建体)还能够使T-reg细胞的存活相对于未处理的T-reg细胞群体降低约10％(例如，约20％、30％、40％或50％或更多)。
本文所述的拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体、其抗原结合片段及其构建体)(例如，表1中所述的抗体1-25中的任一种或多种及其变体，如包含表1中列出的CDR中的一个或多个或全部的抗体或抗原结合片段)可施用于患有癌症的哺乳动物受试者(例如，人)，以便通过促进针对癌细胞和致瘤性物质的免疫响应来改善患者的病状。本文所述的多肽可例如通过本文所述的任何施用途径施用于受试者。本文所述的多肽还可与赋形剂、生物学上可接受的载体一起配制，并且可任选地与另外的治疗剂(如抗癌剂)缀合、混合或相隔地(例如，顺序地)共同施用。可通过施用本文所述的抗体或其抗原结合片段来治疗的癌症包括此类癌症，如白血病、淋巴瘤、肝癌、骨癌、肺癌、脑癌、膀胱癌、胃肠癌、乳腺癌、贲门癌、宫颈癌、子宫癌、头颈癌、胆囊癌、喉癌(laryngeal cancer)、唇癌和口腔癌、眼癌、黑色素瘤、胰腺癌、前列腺癌、结肠直肠癌、睾丸癌以及喉癌(throat cancer)。可通过施用本文所述的抗体或其抗原结合片段来治疗的特定癌症包括但不限于，急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性骨髓性白血病(CML)、肾上腺皮质癌、AIDS相关淋巴瘤、原发性CNS淋巴瘤、肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤、非典型畸胎瘤样/横纹肌样瘤、基底细胞癌、胆管癌、肝外癌、尤文肉瘤家族、骨肉瘤和恶性纤维组织细胞瘤、中枢神经系统胚胎肿瘤、中枢神经系统生殖细胞肿瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、支气管肿瘤、伯基特淋巴瘤、类癌肿瘤、原发性淋巴瘤、脊索瘤、慢性骨髓增生性肿瘤、结肠癌、肝外胆管癌、原位导管癌(DCIS)、子宫内膜癌、室管膜瘤、食道癌、成感觉神经细胞瘤、颅外生殖细胞肿瘤、性腺外生殖细胞肿瘤、输卵管癌、骨纤维组织细胞瘤、胃肠类癌肿瘤、胃肠间质肿瘤(GIST)、睾丸生殖细胞肿瘤、妊娠滋养细胞疾病、神经胶质瘤、儿童脑干神经胶质瘤、毛细胞白血病、肝细胞癌、朗格汉斯细胞组织细胞增生症、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、胰岛细胞肿瘤、胰腺神经内分泌肿瘤、威尔姆斯肿瘤和其他儿童肾脏肿瘤、朗格汉斯细胞组织细胞增生症、小细胞肺癌、皮肤T细胞淋巴瘤、眼内黑色素瘤、梅克尔细胞癌、间皮瘤、转移性鳞状颈癌、中线道癌、多发性内分泌瘤形成综合征、多发性骨髓瘤/浆细胞肿瘤、骨髓增生异常综合征、鼻腔和副鼻窦癌、鼻咽癌、成神经细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、非小细胞肺癌(NSCLC)、上皮性卵巢癌、生殖细胞卵巢癌、低恶性潜能卵巢癌、胰腺神经内分泌肿瘤、乳头瘤病、副神经节瘤、副鼻窦和鼻腔癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、垂体肿瘤、胸膜肺母细胞瘤、原发性腹膜癌、直肠癌、成视网膜细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、卡波济肉瘤、横纹肌肉瘤、塞扎里综合征、小肠癌、软组织肉瘤、喉癌、胸腺瘤和胸腺癌、甲状腺癌、肾盂和输尿管移行细胞癌、尿道癌、子宫内膜子宫癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌以及瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症。
例如，本文所述的拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体、其抗原结合片段及其构建体)(例如，表1中所述的抗体1-25中的任一种或多种及其变体，如包含表1中列出的CDR中的一个或多个或全部的抗体或抗原结合片段)可施用于患者(例如，哺乳动物患者，如人患者)以治疗特征在于TNFR2+癌细胞的癌症，如霍奇金氏淋巴瘤或皮肤非霍奇金氏淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、卵巢癌、结肠癌、多发性骨髓瘤、肾细胞癌、皮肤癌、肺癌、肝癌、子宫内膜癌、造血或淋巴癌、中枢神经系统癌(例如，神经胶质瘤、母细胞瘤或本文所述或本领域已知的另一种中枢神经系统癌)、乳腺癌、胰腺癌、胃癌、食道癌和上消化道癌。
本文所述的拮抗性TNFR2多肽(例如，表1中所述的抗体1-25中的任一种或多种及其变体，如包含表1中列出的CDR中的一个或多个或全部的抗体或抗原结合片段)也可与对癌细胞表现出反应性的治疗性抗体共同施用。以这种方式，本文所述的拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体、其抗原结合片段及其构建体)不仅可与适应性免疫响应协同作用(例如通过延长T淋巴细胞肿瘤反应性)，而且可与肿瘤细胞生长的其他抑制剂协同作用。可用于治疗癌症和其他细胞增殖病症的另外治疗性抗体的实例包括表现出与在癌细胞表面上过表达的肿瘤抗原或细胞表面蛋白的反应性的那些。可与本文所述的拮抗性TNFR2多肽混合、共同施用或顺序施用的示例性抗体包括但不限于曲妥珠单抗
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贝伐单抗
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西妥昔单抗
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帕尼单抗
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伊匹单抗
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利妥昔单抗(
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和
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)、阿仑单抗
Figure BDA0003027090150001888
奥法木单抗
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吉妥珠单抗奥佐米星
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贝伦妥单抗维多汀
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90Y-替伊莫单抗
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以及131I-托西莫单抗
Figure BDA00030270901500018813
其在Scott等人(Cancer Immun.,12:14-21,2012)中进行了详细描述；所述文献以引用的方式并入本文。
本领域普通技术人员可容易地确定用于施用至有需要的哺乳动物受试者(例如，人)的本文所述的拮抗性TNFR2多肽(如单链多肽、抗体、抗体片段或构建体)(例如，表1中所述的抗体1-25中的任一种或多种及其变体，如包含表1中列出的CDR中的一个或多个或全部的抗体或抗原结合片段)的有效量。例如，医生可以低于所需剂量的水平开始开出本文所述的多肽的剂量以实现所需的治疗作用，并且逐渐增加剂量直到实现所需作用。或者，医生可通过以高剂量施用拮抗性TFNR2多肽(如单链多肽、抗体或抗体片段)开始治疗方案，并且随后逐渐施用较低剂量直到实现治疗作用(例如，一个或多个肿瘤的体积减小、T-reg细胞群体的减少或细胞增殖病症的缓解)。一般来说，本文所述的单链多肽、抗体、抗原结合片段或构建体的合适每日剂量将为化合物有效产生治疗作用的最低剂量的量。本文所述的拮抗性TNFR2多肽可以例如通过注射，如通过静脉内、肌内、腹膜内或皮下注射，任选地接近靶组织部位(例如肿瘤)施用。本文所述的拮抗性TNFR2多肽的治疗组合物的每日剂量可作为单一剂量或作为在一天、一周、一个月或一年中任选地以单位剂型以适当的间隔分开施用的两个、三个、四个、五个、六个或更多个剂量施用。尽管本文所述的拮抗性TNFR2多肽有可能单独施用，但它也可作为与赋形剂、载体和任选的另外治疗剂组合的药物制剂施用。
可通过本领域中已知的多种方法中的任一种来监测本文所述的多肽(例如，单链多肽、抗体、其抗原结合片段及其构建体)(例如，表1中所述的抗体1-25中的任一种或多种及其变体，如包含表1中列出的CDR中的一个或多个或全部的抗体或抗原结合片段)减弱细胞增殖疾病(如癌症)的进展的能力。例如，医生可通过分析患者体内的一个或多个肿瘤的体积来监测哺乳动物受试者(例如，人)对用本文所述的多肽(如单链多肽、抗体、抗体片段或构建体)治疗的反应。例如，本文所述的多肽(例如，单链多肽、抗体、其抗原结合片段及其构建体)可能能够是肿瘤体积减小1％与100％之间(例如，1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％)。或者，医生可通过分析特定受试者的淋巴中的T-reg细胞群体来监测受试者(例如，人)对用本文所述的拮抗性TNFR2多肽(如单链多肽、抗体、其抗原结合片段或构建体)治疗的反应性。例如，医生可从哺乳动物受试者(例如，人)取出血液样本并使用已建立的程序(如荧光活化细胞分选)来确定T-reg细胞(例如，CD4+CD25+FOXP3+T-reg细胞或CD17+T-reg细胞)的数量或密度。
治疗感染性疾病的方法
本文所述的拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体、其抗原结合片段及其构建体)(例如，表1中所述的抗体1-25中的任一种或多种及其变体，如包含表1中列出的CDR中的一个或多个或全部的抗体或抗原结合片段)也可用于治疗感染性疾病，如由病毒、细菌、真菌或寄生虫(例如，真核寄生虫)中的任何一种或多种引起的感染性疾病。例如，拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体、其抗原结合片段及其构建体)可施用于患有感染性疾病的哺乳动物受试者(例如，人)以治疗所述疾病，以及减轻所述疾病的一种或多种症状。
可用于这些目的的本公开的示例性组合物包括拮抗性TNFR2多肽(例如，表1中所述的抗体1-25中的任一种或多种及其变体，如包含表1中列出的CDR中的一个或多个或全部的抗体或抗原结合片段)，如具有至少两个TNFR2结合位点的那些，其中所述结合位点在空间上彼此相隔约
Figure BDA0003027090150001901
或更多，以及具有人IgG2同种型例如人IgG2-A同种型(例如，拥有具有C232S和/或C233S氨基酸取代的人IgG2铰链区的拮抗性TNFR2抗体、其抗原结合片段及其构建体)的那些。可用于这些目的的本公开的组合物还包括含有拮抗性TNFR2多肽的药物组合物，所述拮抗性TNFR2多肽采用单个二硫键结合的同种型，如其中例如，药物组合物中10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％、99.99％或更多的多肽以单个二硫键结合的同种型存在的那些。
例如，本文所述的拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体、其抗原结合片段及其构建体)(例如，表1中所述的抗体1-25中的任一种或多种及其变体，如包含表1中列出的CDR中的一个或多个或全部的抗体或抗原结合片段)可用于治疗或减轻哺乳动物受试者(如人)中由以下引起的病毒感染的一种或多种症状：例如黄病毒科的成员(例如，黄病毒属、瘟病毒属和肝炎病毒属的成员)，其包括丙型肝炎病毒、黄热病病毒；蜱传病毒，如加德格兹谷病毒(Gadgets Gully virus)、凯丹姆病毒、科萨努尔森林病病毒、兰加特病毒、鄂木斯克出血热病毒、波瓦森病毒、皇家农场病毒、喀什病毒、蜱传脑炎病毒、纽多佛病毒、索夫吉病毒、跳跃病病毒和根岸病毒；海鸟蜱传病毒，如米班病毒、索马里兹礁病毒和秋列尼病毒；蚊子传播的病毒，如阿罗阿病毒、登革病毒、凯杜古病毒、卡西帕科利病毒、库坦戈病毒、日本脑炎病毒、墨累谷脑炎病毒、圣路易斯脑炎病毒、乌苏图病毒、西尼罗河病毒、雅温德病毒、科科贝拉病毒、巴加扎病毒、伊利乌斯病毒、以色列火鸡脑脊膜脑脊髓炎病毒、恩塔亚病毒、坦布苏病毒、寨卡病毒、班齐病毒、博博衣病毒、边山病毒、朱格拉病毒、萨沃亚病毒，赛皮克病毒、乌干达S病毒、韦塞尔斯布朗病毒、黄热病毒；和无已知节肢动物载体的病毒，如恩德培蝙蝠病毒、横须贺病毒、阿波依病毒、牛骨山脊病毒、胡蒂亚帕病毒、摩多克病毒、萨尔别霍病毒、圣帕利塔病毒，布卡拉沙蝙蝠病毒、凯里岛病毒、达卡尔蝙蝠病毒、蒙大拿鼠耳蝙蝠脑白质炎病毒、金边蝙蝠病毒、里约布拉沃病毒、塔马纳蝙蝠病毒和细胞融合因子病毒；沙粒病毒科的成员，其包括伊皮病毒、拉沙病毒(例如，Josiah、LP或GA391菌株)、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)、莫巴拉病毒、莫佩亚病毒、阿马帕里病毒、弗莱克索病毒、瓜纳里托病毒、胡宁病毒、拉蒂诺病毒、马邱波病毒、奥利华斯病毒、巴拉那病毒、皮钦德病毒、皮里陶病毒、萨比亚病毒、塔卡里伯病毒、太米阿米病毒、怀特沃特阿罗约病毒、查帕雷病毒和卢约病毒；布尼亚病毒科家族的成员(例如，汉坦病毒属、内罗病毒属、正本雅病毒属和白蛉病毒属的成员)，其包括汉坦病毒、辛诺柏病毒、道格比病毒、布尼奥罗病毒、裂谷热病毒、拉克罗斯病毒、加利福尼亚脑炎病毒、克里米亚-刚果出血热(CCHF)病毒；丝状病毒科的成员，其包括埃博拉病毒(例如，扎伊尔、苏丹、象牙海岸、莱斯顿和乌干达菌株)和马尔堡病毒(例如，安哥拉、Ci67、穆索克、波普、雷文(Ravn)和维多利亚湖菌株)；披膜病毒科的成员(例如，甲病毒属的成员)，其包括委内瑞拉马脑炎病毒(VEE)、东方马脑炎病毒(EEE)、西方马脑炎病毒(WEE)、辛德毕斯病毒、风疹病毒、塞姆利基森林病毒、罗斯河病毒、巴马森林病毒、阿尼昂-尼昂病毒(O’nyong’nyong virus)和基孔肯雅病毒；痘病毒科的成员(例如，正痘病毒属的成员)，其包括天花病毒、猴痘病毒和牛痘病毒；疱疹病毒科的成员，其包括单纯疱疹病毒(HSV；1型、2型和6型)、人疱疹病毒(例如，7型和8型)、巨细胞病毒(CMV)、爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)、水痘-带状疱疹病毒和卡波西氏肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)；正粘病毒科的成员，其包括流感病毒(A、B和C)，如H5N1禽流感病毒或H1N1猪流感；冠状病毒科的成员，其包括严重急性呼吸综合征(SARS)病毒；弹状病毒科的成员，其包括狂犬病毒和水疱性口炎病毒(VSV)；副粘病毒科的成员，其包括人呼吸道合胞病毒(RSV)、新城疫病毒、亨德拉病毒、尼帕病毒、麻疹病毒、牛瘟病毒、犬瘟热病毒、仙台病毒、人副流感病毒(例如，1、2、3和4)、鼻病毒、腮腺炎病毒；小核糖核酸病毒科的成员，其包括脊髓灰质炎病毒、人肠道病毒(A、B、C和D)、甲型肝炎病毒和柯萨奇病毒；嗜肝DNA病毒科的成员，其包括乙型肝炎病毒；乳头瘤病毒科的成员，其包括人乳头状瘤病毒；细小病毒科的成员，其包括腺相关病毒；星状病毒科的成员，其包括星状病毒；多瘤病毒科的成员，其包括JC病毒、BK病毒和SV40病毒；杯状病毒科的成员，其包括诺沃克病毒；呼肠孤病毒科的成员，其包括轮状病毒；逆转录病毒科的成员，其包括人免疫缺陷病毒(HIV；例如1型和2型)和人T-嗜淋巴细胞病毒I型和II型(分别HTLV-1和HTLV-2)；以及传染性海绵状脑病，如慢性耗竭疾病。特别地，本文所述的方法包括向人施用本文所述的拮抗性TNFR2多肽以治疗HIV感染(如患有AIDS的人)。
本文所述的拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体、其抗原结合片段及其构建体)(例如，表1中所述的抗体1-25中的任一种或多种及其变体，如包含表1中列出的CDR中的一个或多个或全部的抗体或抗原结合片段)还可用于治疗或减轻哺乳动物受试者(例如，人)的细菌感染的一种或多种症状。可通过施用本文所述的拮抗性TNFR2多肽(如单链多肽、抗体或抗体片段)治疗的细菌感染的实例包括但不限于由以下属内的细菌引起的那些细菌感染：链球菌属、芽孢杆菌属、李斯特菌属、棒状杆菌属、诺卡氏菌属、奈瑟氏菌属、放线杆菌属、莫拉氏菌属、肠杆菌属(例如，大肠杆菌，如O157:H7)、假单胞菌属(如铜绿假单胞菌)、埃希氏菌属、克雷伯氏菌属、沙雷氏菌属、肠杆菌属、变形杆菌属、沙门氏菌属、志贺氏菌属、耶尔森氏菌属、嗜血杆菌属、博德特氏菌属(如百日咳博德特氏菌)、军团菌属、巴斯德氏菌属、弗朗西斯氏菌属、布鲁氏菌属、巴尔通氏体属、梭菌属、弧菌属、弯曲杆菌属、葡萄球菌属、分枝杆菌属(如结核分枝杆菌和副结核鸟分枝杆菌)以及幽门螺杆菌属(如幽门螺杆菌和肝螺杆菌)。特别地，本文所述的方法包括向人或非人哺乳动物施用拮抗性TNFR2多肽，如含有TNFRAB1、TNFRAB2、TNFRAB3、TNFRAB4或TNFRAB5，如TNFRAB1、TNFRAB2、TNFRAB3、TNFRAB4或TNFRAB5的人变体、人源化变体或嵌合变体的CDR序列中的一个或多个或全部的单链多肽、抗体、其抗原结合片段或构建体以治疗结核分枝杆菌感染。本文所述的特定方法包括向牛科哺乳动物或野牛施用本文所述的拮抗性TNFR2多肽以治疗结核分枝杆菌感染。另外，本文所述的方法包括向人或非人哺乳动物施用本文所述的拮抗性TNFR2多肽以治疗副结核鸟分枝杆菌感染。本文所述的特定方法包括向牛科哺乳动物或野牛施用本文所述的拮抗性TNFR2多肽以治疗副结核鸟分枝杆菌感染。
本文所述的拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体、其抗原结合片段及其构建体)(例如，表1中所述的抗体1-25中的任一种或多种及其变体，如包含表1中列出的CDR中的一个或多个或全部的抗体或抗原结合片段)也可施用于哺乳动物受试者(例如，人)以用于治疗或减轻由以下引起的寄生虫感染的一种或多种症状：原生动物寄生虫(例如，肠道原生动物、组织原生动物或血液原生动物)或蠕虫寄生虫(例如，线虫、蠕虫、有腺纲、侧尾腺口纲(secementea)、吸虫(trematode)、吸虫(fluke)(血吸虫、肝吸虫、肠吸虫和肺吸虫)或绦虫)。可根据本文所述的方法治疗的示例性原生动物寄生虫包括但不限于，溶组织内阿米巴、兰伯氏贾第虫、鼠型隐孢子虫、冈比亚锥虫、罗德西亚锥虫、克氏锥虫、墨西哥利什曼原虫、巴西利什曼原虫、硕大利什曼原虫、热带利什曼原虫、杜氏利什曼原虫、刚地弓形虫、间日疟原虫、卵形疟原虫、三日疟原虫、镰状疟原虫、约氏疟原虫、阴道毛滴虫和火鸡组织滴虫。示例性蠕虫寄生虫包括毛首鞭形线虫、人蛔虫、蛲虫、十二指肠钩虫、美洲钩虫、粪类圆线虫、班氏丝虫和麦地那龙线虫、曼氏血吸虫、埃及血吸虫、日本血吸虫、肝片吸虫、大片吸虫、异形吸虫、卫氏并殖吸虫、猪带绦虫、牛带绦虫、短膜壳绦虫和细粒棘球绦虫。可根据本文所述的方法治疗的其他寄生虫感染包括旋盘尾丝虫。
拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体及其抗原结合片段，如表1中所述的抗体1-25中的任一种或多种及其变体，如包含表1中列出的CDR中的一个或多个或全部的抗体或抗原结合片段)也可施用于哺乳动物受试者(例如，人)以治疗或减轻真菌感染的一种或多种症状。可根据本文所述的方法治疗的真菌感染的实例包括但不限于由以下引起的真菌感染：例如，曲霉属、假丝酵母属、马拉色氏霉菌属、毛孢子菌属、镰刀菌属、枝顶孢霉属、根霉属、毛霉属、肺囊虫属和犁头霉属。可根据本文所述的方法治疗的示例性真菌感染还包括卡氏肺囊虫、巴西副球孢子菌和荚膜组织胞浆菌。
药物组合物
可以使用本领域已知的方法制备药物组合物，所述药物组合物含有本文所述的拮抗性TNFR2多肽，如单链多肽、抗体、其抗原结合片段或构建体(例如，表1中所述的抗体1-25中的任一种或多种及其变体，如包含表1中列出的CDR中的一个或多个或全部的抗体或抗原结合片段)。可掺入到本发明的药物组合物中的示例性拮抗性TNFR2多肽包括具有至少两个TNFR2结合位点(其中所述结合位点在空间上彼此相隔约
Figure BDA0003027090150001941
或更多)的那些，以及具有人IgG2同种型(例如,人IgG2-A同种型)的那些(例如，拥有具有C232S和/或C233S氨基酸取代的人IgG2铰链区的拮抗性TNFR2抗体、其抗原结合片段及其构建体)。
本文所述的药物组合物可包含本文所述的拮抗性TNFR2多肽(例如，表1中所述的抗体1-25中的任一种或多种及其变体，如包含表1中列出的CDR中的一个或多个或全部的抗体或抗原结合片段)与一种或多种药学上可接受的赋形剂的组合。例如，本文所述的药物组合物可使用例如生理学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂(Remington's PharmaceuticalSciences第16版,Osol,A.Ed.(1980)；其以引用的方式并入本文)并且以所需的形式，例如以冻干制剂或水溶液的形式来制备。还可制备组合物以便含有所需浓度的活性剂(例如，拮抗性抗TNFR2抗体或其片段)。例如，本文所述的药物组合物可含有按重量计(w/w)至少10％(例如，10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％或100％)的活性剂。
另外，可掺入药物制剂中的活性剂(例如，本文所述的拮抗性TNFR2多肽，如本文所述的显性拮抗性TNFR2多肽)本身可具有所需的纯度水平。例如，本文所述的多肽(如单链多肽、抗体或其抗原结合片段)可在从细胞培养基中分离抗体后或在通过已建立的固相肽合成方法或如本文所述的天然化学连接化学合成(例如)单链抗体片段(例如，scFv)后通过一定程度的纯度进行表征。在将抗体掺入药物组合物之前，本文所述的拮抗性TNFR2可以是至少10％纯(例如，10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％、99.99％或100％纯)。
另外，可将本公开的拮抗性TNFR2多肽(例如，表1中所述的抗体1-25中的任一种或多种及其变体，如包含表1中列出的CDR中的一个或多个或全部的抗体或抗原结合片段)掺入到药物组合物中，使得所述药物组合物中存在的许多多肽采用单个二硫键结合的同种型。例如，本公开的药物组合物包括含有拮抗剂TNFR2多肽的那些，其中，例如，药物组合物中的10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％、99.99％或更多的多肽以单个二硫键结合的同种型(如本文所述的IgG2-A同种型)存在。
可通过将具有所需纯度的抗体与本领域中通常使用的任选的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂(例如缓冲剂、稳定剂、防腐剂、等渗剂、非离子型洗涤剂、抗氧化剂和其他混杂添加剂)混合来制备本文所述的拮抗性TNFR2多肽(例如，表1中所述的抗体1-25中的任一种或多种及其变体，如包含表1中列出的CDR中的一个或多个或全部的抗体或抗原结合片段)的药物组合物用于作为冻干制剂或水溶液储存。参见例如，Remington'sPharmaceutical Sciences,第16版(Osol,编1980；其以引用的方式并入本文)。此类添加剂在所使用的剂量和浓度下必须对接受者无毒性。
缓冲剂
缓冲剂有助于将pH维持在接近生理条件的范围内。它们可以约2mM至约50mM范围内的浓度存在。适用于与本文所述的拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体及其抗原结合片段)一起使用的缓冲剂包括有机酸和无机酸及其盐，如柠檬酸盐缓冲剂{例如，柠檬酸单钠-柠檬酸二钠混合物、柠檬酸-柠檬酸三钠混合物、柠檬酸-柠檬酸单钠混合物等)、琥珀酸盐缓冲剂{例如，琥珀酸-琥珀酸单钠混合物、琥珀酸-氢氧化钠混合物、琥珀酸-琥珀酸二钠混合物等)、酒石酸盐缓冲剂(例如，酒石酸-酒石酸钠混合物、酒石酸-酒石酸钾混合物、酒石酸-氢氧化钠混合物等)、富马酸盐缓冲剂{例如，富马酸-富马酸单钠混合物、富马酸-富马酸二钠混合物、富马酸单钠-富马酸二钠混合物等)、葡糖酸盐缓冲剂(例如，葡糖酸-葡糖酸钠混合物、葡糖酸-氢氧化钠混合物、葡糖酸-葡糖酸钾混合物等)、草酸盐缓冲剂{例如，草酸-草酸钠混合物、草酸-氢氧化钠混合物、草酸-草酸钾混合物等)、乳酸盐缓冲剂{例如，乳酸-乳酸钠混合物、乳酸-氢氧化钠混合物、乳酸-乳酸钾混合物等)以及乙酸盐缓冲剂(例如，乙酸-乙酸钠混合物、乙酸-氢氧化钠混合物等)。另外，可使用磷酸盐缓冲剂、组氨酸缓冲剂和三甲胺盐如Tris。
防腐剂
可将防腐剂添加至本文所述的组合物中以延缓微生物生长，并且可以0.2％-1％(w/v)范围内的量添加。适用于与本文所述的拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体、其抗原结合片段及其构建体)一起使用的防腐剂包括苯酚、苄醇、间甲酚、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、十八烷基二甲基苄基氯化铵、苯扎卤铵{例如，苯扎氯铵、苯扎溴铵和苯扎碘铵)、氯化六烃季铵和对羟基苯甲酸烷基酯如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯、儿茶酚、间苯二酚、环己醇和3-戊醇。可添加有时称为“稳定剂”的等渗剂(Isotonifier)以确保本文所述的液体组合物的等渗性，并且包括多元醇糖醇，例如三元或更高级的糖醇，如甘油、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇和甘露糖醇。稳定剂是指功能范围可从填充剂至添加剂的广泛类别的赋形剂，所述稳定剂可溶解治疗剂或有助于防止变性或粘附至容器壁。典型的稳定剂可以是多元糖醇(上文列举的)；氨基酸，如精氨酸、赖氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、丙氨酸、鸟氨酸、L-亮氨酸、2-苯丙氨酸、谷氨酸、苏氨酸等；有机糖或糖醇，如乳糖、海藻糖、水苏糖、甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇、核糖醇、肌醇、半乳糖醇、甘油等，包括如肌醇的环醇；聚乙二醇；氨基酸聚合物；含硫还原剂，如尿素、谷胱甘肽、硫辛酸、硫代乙醇酸钠、硫代甘油、a-单硫代甘油和硫代硫酸钠；低分子量多肽(例如，10个残基或更少的肽)；蛋白质，如人血清白蛋白、牛血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；单糖，如木糖、甘露糖、果糖、葡萄糖；二糖，如乳糖、麦芽糖、蔗糖；和三糖，如棉子糖；以及多糖，如葡聚糖。稳定剂可以每重量份的活性蛋白质0.1至10,000重量的范围存在。
洗涤剂
可添加非离子表面活性剂或洗涤剂(也称为“润湿剂”)以帮助溶解治疗剂以及保护治疗性蛋白质免受搅动诱导的聚集，其还允许制剂暴露于受到应力的剪切表面而不会导致蛋白质变性。合适的非离子表面活性剂包括聚山梨醇酯(20、80等)、泊洛沙姆(184、188等)、普朗尼克多元醇、聚氧乙烯脱水山梨糖醇单醚(
Figure BDA0003027090150001971
等)。非离子表面活性剂可以约0.05mg/mL至约1.0mg/mL、例如约0.07mg/mL至约0.2mg/mL的范围存在。
另外的混杂赋形剂包括填充剂(例如，淀粉)、螯合剂(例如，EDTA)、抗氧化剂(例如，抗坏血酸、甲硫氨酸、维生素E)和助溶剂。
其他药物载体
可掺入本文所述的药物组合物中的替代药学上可接受的载体可包括右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、淀粉、橡胶可食用物、磷酸钾、精氨酸盐、明胶、硅酸钾、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、甲基羟基苯甲酸酯、丙基羟基苯甲酸酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油，但不限于此。含有本文所述的拮抗性TNFR2抗体的组合物还可包含润滑剂、保湿剂、甜味剂、调味剂、乳化剂、悬浮剂和防腐剂。合适的药学上可接受的载体和制剂的细节可在Remington's Pharmaceutical Sciences(第19版,1995)中找到，所述文献以引用的方式并入本文。
用于组合疗法的组合物和方法
本文所述的药物组合物可任选地包含多于一种活性剂。例如，本文所述的组合物可含有与另一种药物活性分子(例如，细胞毒性剂、抗生素或T淋巴细胞(例如，用于CAR-T疗法中的基因编辑的T淋巴细胞)缀合、混合或分开施用的拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体、其抗原结合片段或构建体，如表1中所述的抗体1-25中的任一种或多种及其变体，如包含表1中列出的CDR中的一个或多个或全部的抗体或抗原结合片段)。例如，拮抗性TNFR2多肽或其治疗性缀合物(例如，本文所述的药物-抗体缀合物)可与一种或多种可用于治疗癌症或另一种细胞增殖病症(例如，肿瘤)的另外活性剂混合。或者，本文所述的药物组合物可被配制成与一种或多种可用于治疗癌症或其他细胞增殖病症的另外活性剂共同施用或顺序施用。可用于治疗癌症和其他细胞增殖病症并且可与本文所述的拮抗性TNFR2多肽缀合、混合或分开施用的另外活性剂的实例包括细胞毒性剂(例如，本文所述的那些)以及表现出与在癌细胞表面上过表达的肿瘤抗原或细胞表面蛋白的反应性的抗体。可与本文所述的拮抗性TNFR2抗体缀合、混合或分开施用的示例性抗体包括但不限于曲妥珠单抗
Figure BDA0003027090150001981
贝伐单抗
Figure BDA0003027090150001982
西妥昔单抗
Figure BDA0003027090150001983
帕尼单抗
Figure BDA0003027090150001991
伊匹单抗
Figure BDA0003027090150001992
利妥昔单抗(
Figure BDA0003027090150001993
和
Figure BDA0003027090150001994
)、阿仑单抗
Figure BDA0003027090150001995
奥法木单抗
Figure BDA0003027090150001996
吉妥珠单抗奥佐米星
Figure BDA0003027090150001997
贝伦妥单抗维多汀
Figure BDA0003027090150001998
90Y-替伊莫单抗
Figure BDA0003027090150001999
以及131I-托西莫单抗
Figure BDA00030270901500019910
其在Scott等人(Cancer Immun.,12:14-21,2012)中进行了详细描述；所述文献以引用的方式并入本文。
可与本文所述的拮抗性TNFR2多肽(例如，表1中所述的抗体1-25中的任一种或多种及其变体，如包含表1中列出的CDR中的一个或多个或全部的抗体或抗原结合片段)缀合、混合或分开施用的另外剂包括表现出与特定病理学相关的特异性抗原的反应性的T淋巴细胞。例如，本文所述的拮抗性TNFR2多肽可被配制用于与表达嵌合抗原受体的T细胞(CAR-T)一起施用，以治疗细胞增殖病症，如本文所述的癌症。拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体及其抗原结合片段)可通过阻止T-reg细胞使已进行遗传修饰以表达肿瘤反应性抗原受体的T淋巴细胞失活而与CAR-T疗法协同作用。以这种方式，可在施用拮抗性TNFR2多肽之前、同时或之后向患者施用CAR-T细胞，以治疗患有细胞增殖病症(如癌症)的哺乳动物受试者(例如，人)。
鉴于遗传工程化T淋巴细胞以表达对肿瘤相关抗原具有特异性的抗原受体的能力，CAR-T疗法是用于靶向癌细胞的特别稳健的平台。例如，鉴别在肿瘤和其他癌细胞表面上过表达的抗原可为嵌合T细胞受体的设计和发现提供信息，嵌合T细胞受体通常由源自天然存在的T细胞受体的细胞质和跨膜结构域组成，所述结构域可操作地连接至特异性地结合特定抗原肽的细胞外scFv片段。可通过本文所述或本领域中已知的多种基因组编辑技术中的任一种对T细胞进行遗传修饰，以表达特异性地结合至特定肿瘤抗原的抗原受体。用于修饰T细胞基因组以掺入编码嵌合抗原受体的基因的示例性技术包括本文所述的CRISPER/Cas、锌指核酸酶、TALEN、ARCUSTM平台。用于CAR-T淋巴细胞的遗传工程化的方法已在例如WO2014/127261、WO 2014/039523、WO 2014/099671和WO 20120790000中进行了描述；所述专利各自的公开内容均以引用的方式并入本文。
可用于本文所述的组合物和方法中的CAR-T细胞包括已进行遗传修饰以使得细胞不表达内源性T细胞受体的那些细胞。例如，可通过基因组编辑技术(如本文所述的那些)修饰CAR-T细胞，以遏制内源性T细胞受体的表达，从而预防接受CAR-T输注的患者中的移植物抗宿主反应。另外或可替代地，可对CAR-T细胞进行遗传修饰以降低一种或多种内源性MHC蛋白的表达。这是用于输注同种异体T淋巴细胞的特别有用的技术，因为外来MHC蛋白的识别代表了促进同种异体移植物排斥的一种机制。本领域技术人员还可修饰T淋巴细胞以遏制免疫抑制蛋白的表达，如程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)和细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)。这些蛋白质是当活化时减弱T细胞活化的细胞表面受体。输注已进行遗传修饰以减少一种或多种免疫抑制蛋白的表达的CAR-T细胞代表了可用于延长体内T淋巴细胞介导的细胞毒性的一种策略。
除了缺失特定基因外，还可修饰CAR-T细胞以表达具有所需抗原特异性的T细胞受体。例如，可遗传修饰T淋巴细胞以表达特异性地结合至肿瘤相关抗原、以使输注的T细胞靶向癌细胞的T细胞受体。可由CAR-T细胞表达的示例性T细胞受体是结合PD-L1的T细胞受体，PD-L1是经常在各种肿瘤细胞上过表达的细胞表面蛋白。当PD-L1活化T淋巴细胞表面上的PD-1时，用CAR-T疗法靶向这种肿瘤抗原可与本文所述的拮抗性TNFR2抗体或抗体片段协同作用，以增加由体内T淋巴细胞介导的免疫响应的持续时间。还可修饰CAR-T细胞以表达特异性地结合与一种或多种感染性疾病相关的抗原(如来自病毒蛋白、细菌细胞、真菌或其他寄生生物体的抗原)的T细胞受体。
本文所述的其他药物组合物包括含有拮抗性TNFR2抗体或抗体片段(例如，表1中所述的抗体1-25中的任一种或多种及其变体，如包含表1中列出的CDR中的一个或多个或全部的抗体或抗原结合片段)、干扰素α和/或一种或多种抗生素的药物组合物，所述药物组合物可施用于患有感染性疾病的患者(例如，人患者)。例如，拮抗性TNFR2抗体或抗体片段可与适用于治疗一种或多种感染性疾病的抗生素缀合、混合或分开施用，所述抗生素如阿米卡星、庆大霉素、卡那霉素、新霉素、奈替米星、妥布霉素、巴龙霉素、链霉素、壮观霉素、格尔德霉素、除莠霉素、利福昔明、氯碳头孢、厄他培南、多利培南、亚胺培南、美罗培南、头孢羟氨苄、头孢唑啉、头孢氨苄(cefazlexin)、头孢克洛、头孢西丁、头孢丙烯、头孢呋辛、头孢地尼、头孢妥仑、头孢哌酮、克林霉素、林可霉素、达托霉素、红霉素、利奈唑胺、特地佐利、阿莫西林、氨苄青霉素、杆菌肽、环丙沙星、强力霉素和四环素等。
免疫治疗剂
本文所述的拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体、其抗原结合片段或其构建体)(例如，表1中所述的抗体1-25中的任一种或多种及其变体，如包含表1中列出的CDR中的一个或多个或全部的抗体或抗原结合片段)可与免疫治疗剂混合、缀合、一起施用或分开施用，例如以用于治疗癌症或感染性疾病，如本文所述的癌症或感染性疾病。可与本文所述的组合物和方法结合使用的示例性免疫治疗剂包括但不限于抗CTLA-4剂、抗PD-1剂、抗PD-L1剂、抗PD-L2剂、抗TNF-α交联剂、抗TRAIL交联剂、抗CD27剂、抗CD30剂、抗CD40剂、抗4-1BB剂、抗GITR剂、抗OX40剂、抗TRAILR1剂、抗TRAILR2剂和抗TWEAKR剂，以及例如针对在Mahoney等人,Cancer Immunotherapy,14:561-584(2015)的表1中描述的免疫靶标的剂，所述文献的公开内容以引用的方式整体并入本文。例如，免疫治疗剂可以是抗CTLA-4抗体或其抗原结合片段，如伊匹木单抗和曲美木单抗。免疫治疗剂可以是抗PD-1抗体或其抗原结合片段，如纳武单抗、帕博利珠单抗、阿维鲁单抗、德瓦鲁单抗或阿妥珠单抗。免疫治疗剂可以是抗PD-L1抗体或其抗原结合片段，如阿妥珠单抗或阿维鲁单抗。作为另一个实例，可用抗4-1BB配体抗体靶向免疫靶标4-1BB配体；可用抗OX40L抗体靶向免疫靶标OX40L；可用抗GITR抗体靶向免疫靶标GITR；可用抗CD27抗体靶向免疫靶标CD27；可用抗TL1A抗体靶向免疫靶标TL1A；可用抗CD40L抗体靶向免疫靶标CD40L或CD40；可用抗LIGHT抗体靶向免疫靶标LIGHT；可用抗BTLA抗体靶向免疫靶标BTLA；可用抗LAG3抗体靶向免疫靶标LAG3；可用抗TIM3抗体靶向免疫靶标TIM3；可用抗Singlecs抗体靶向免疫靶标Singlecs；可用抗ICOS配体抗体靶向免疫靶标ICOS配体；可用抗B7-H3抗体靶向免疫靶标B7-H3；可用抗B7-H4抗体靶向免疫靶标B7-H4；可用抗VISTA抗体靶向免疫靶标VISTA；可用抗TMIGD2抗体靶向免疫靶标TMIGD2；可用抗BTNL2抗体靶向免疫靶标BTNL2；可用抗CD48抗体靶向免疫靶标CD48；可用抗KIR抗体靶向免疫靶标KIR；可用抗LIR抗体靶向免疫靶标LIR；可用抗ILT抗体靶向免疫靶标ILT；可用抗NKG2D抗体靶向免疫靶标NKG2D；可用抗NKG2A抗体靶向免疫靶标NKG2A；可用抗MICA抗体靶向免疫靶标MICA；可用抗MICB抗体靶向免疫靶标MICB；可用抗CD244抗体靶向免疫靶标CD244；可用抗CSF1R抗体靶向免疫靶标CSF1R；可用抗IDO抗体靶向免疫靶标IDO；可用抗TGFβ抗体靶向免疫靶标TGFβ；可用抗CD39抗体靶向免疫靶标CD39；可用抗CD73抗体靶向免疫靶标CD73；可用抗CXCR4抗体靶向免疫靶标CXCR4；可用抗CXCL12抗体靶向免疫靶标CXCL12；可用抗SIRPA抗体靶向免疫靶标SIRPA；可用抗CD47抗体靶向免疫靶标CD47；可用抗VEGF抗体靶向免疫靶标VEGF；可用抗神经纤毛蛋白抗体靶向免疫靶标神经纤毛蛋白(参见例如，Mahoney等人的表1)。
可与本文所述的组合物和方法组合使用的免疫治疗剂包括，例如，抗TWEAK剂、抗细胞表面淋巴细胞蛋白剂、抗BRAF剂、抗MEK剂、抗CD33剂、抗CD20剂、抗HLA-DR剂、抗HLA I类剂、抗CD52剂、抗A33剂、抗GD3剂、抗PSMA剂、抗Ceacan 1剂、抗Galedin 9剂、抗HVEM剂、抗VISTA剂、抗B7H4剂、抗HHLA2剂、抗CD155剂、抗CD80剂、抗BTLA剂、抗CD160剂、抗CD28剂、抗CD226剂、抗CEACAM1剂、抗TIM3剂、抗TIGIT剂、抗CD96剂、抗CD70剂、抗CD27剂、抗LIGHT剂、抗CD137剂、抗DR4剂、抗CR5剂、抗TNFRS剂、抗TNFR1剂、抗FAS剂、抗CD95剂、抗TRAIL剂、抗DR6剂、抗EDAR剂、抗NGFR剂、抗OPG剂、抗RANKL剂、抗LTβ受体剂、抗BCMA剂、抗TACI剂、抗BAFFR剂、抗EDAR2剂、抗TROY剂和抗RELT剂。例如，免疫治疗剂可以是抗TWEAK抗体或其抗原结合片段、抗细胞表面淋巴细胞蛋白抗体或其抗原结合片段、抗BRAF抗体或其抗原结合片段、抗MEK抗体或其抗原结合片段、抗CD33抗体或其抗原结合片段、抗CD20抗体或其抗原结合片段、抗HLA-DR抗体或其抗原结合片段、抗HLAI类抗体或其抗原结合片段、抗CD52抗体或其抗原结合片段、抗A33抗体或其抗原结合片段、抗GD3抗体或其抗原结合片段、抗PSMA抗体或其抗原结合片段、抗Ceacan 1抗体或其抗原结合片段、抗Galedin 9抗体或其抗原结合片段、抗HVEM抗体或其抗原结合片段、抗VISTA抗体或其抗原结合片段、抗B7H4抗体或其抗原结合片段、抗HHLA2抗体或其抗原结合片段、抗CD155抗体或其抗原结合片段、抗CD80抗体或其抗原结合片段、抗BTLA抗体或其抗原结合片段、抗CD160抗体或其抗原结合片段、抗CD28抗体或其抗原结合片段、抗CD226抗体或其抗原结合片段、抗CEACAM1抗体或其抗原结合片段、抗TIM3抗体或其抗原结合片段、抗TIGIT抗体或其抗原结合片段、抗CD96抗体或其抗原结合片段、抗CD70抗体或其抗原结合片段、抗CD27抗体或其抗原结合片段、抗LIGHT抗体或其抗原结合片段、抗CD137抗体或其抗原结合片段、抗DR4抗体或其抗原结合片段、抗CR5抗体或其抗原结合片段、抗TNFRS抗体或其抗原结合片段、抗TNFR1抗体或其抗原结合片段、抗FAS抗体或其抗原结合片段、抗CD95抗体或其抗原结合片段、抗TRAIL抗体或其抗原结合片段、抗DR6抗体或其抗原结合片段、抗EDAR抗体或其抗原结合片段、抗NGFR抗体或其抗原结合片段、抗OPG抗体或其抗原结合片段、抗RANKL抗体或其抗原结合片段、抗LTβ受体抗体或其抗原结合片段、抗BCMA抗体或其抗原结合片段、抗TACI抗体或其抗原结合片段、抗BAFFR抗体或其抗原结合片段、抗EDAR2抗体或其抗原结合片段、抗TROY抗体或其抗原结合片段、或抗RELT抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，免疫治疗剂是抗细胞表面淋巴细胞蛋白抗体或其抗原结合片段，如结合以下的一种或多种的抗体或其抗原结合片段：CD1、CD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD9、CD10、CD11、CD12、CD13、CD14、CD15、CD16、CD17、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD26、CD27、CD28、CD29、CD30、CD31、CD32、CD33、CD34、CD35、CD36、CD37、CD38、CD39、CD40、CD41、CD42、CD43、CD44、CD45、CD46、CD47、CD48、CD49、CD50、CD51、CD52、CD53、CD54、CD55、CD56、CD57、CD58、CD59、CD60、CD61、CD62、CD63、CD64、CD65、CD66、CD67、CD68、CD69、CD70、CD71、CD72、CD73、CD74、CD75、CD76、CD77、CD78、CD79、CD80、CD81、CD82、CD83、CD84、CD85、CD86、CD87、CD88、CD89、CD90、CD91、CD92、CD93、CD94、CD95、CD96、CD97、CD98、CD99、CD100、CD101、CD102、CD103、CD104、CD105、CD106、CD107、CD108、CD109、CD110、CD111、CD112、CD113、CD114、CD115、CD116、CD117、CD118、CD119、CD120、CD121、CD122、CD123、CD124、CD125、CD126、CD127、CD128、CD129、CD130、CD131、CD132、CD133、CD134、CD135、CD136、CD137、CD138、CD139、CD140、CD141、CD142、CD143、CD144、CD145、CD146、CD147、CD148、CD149、CD150、CD151、CD152、CD153、CD154、CD155、CD156、CD157、CD158、CD159、CD160、CD161、CD162、CD163、CD164、CD165、CD166、CD167、CD168、CD169、CD170、CD171、CD172、CD173、CD174、CD175、CD176、CD177、CD178、CD179、CD180、CD181、CD182、CD183、CD184、CD185、CD186、CD187、CD188、CD189、CD190、CD191、CD192、CD193、CD194、CD195、CD196、CD197、CD198、CD199、CD200、CD201、CD202、CD203、CD204、CD205、CD206、CD207、CD208、CD209、CD210、CD211、CD212、CD213、CD214、CD215、CD216、CD217、CD218、CD219、CD220、CD221、CD222、CD223、CD224、CD225、CD226、CD227、CD228、CD229、CD230、CD231、CD232、CD233、CD234、CD235、CD236、CD237、CD238、CD239、CD240、CD241、CD242、CD243、CD244、CD245、CD246、CD247、CD248、CD249、CD250、CD251、CD252、CD253、CD254、CD255、CD256、CD257、CD258、CD259、CD260、CD261、CD262、CD263、CD264、CD265、CD266、CD267、CD268、CD269、CD270、CD271、CD272、CD273、CD274、CD275、CD276、CD277、CD278、CD279、CD280、CD281、CD282、CD283、CD284、CD285、CD286、CD287、CD288、CD289、CD290、CD291、CD292、CD293、CD294、CD295、CD296、CD297、CD298、CD299、CD300、CD301、CD302、CD303、CD304、CD305、CD306、CD307、CD308、CD309、CD310、CD311、CD312、CD313、CD314、CD315、CD316、CD317、CD318、CD319和/或CD320。
在一些实施方案中，免疫治疗剂是结合趋化因子或淋巴因子(如牵涉肿瘤生长的趋化因子或淋巴因子)的剂(例如，多肽、抗体、其抗原结合片段、单链多肽或其构建体)。例如，可与本文所述的组合物和方法结合使用的示例性免疫治疗剂包括结合并抑制CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL8、CCL2和CCL5中的一个或多个或全部的活性的剂(例如，多肽、抗体、其抗原结合片段、单链多肽及其构建体)。参与肿瘤生长并可使用本文所述的免疫治疗剂靶向的示例性趋化因子包括例如在Chow等人，Cancer Immunol.Res.,2:1125-1131,2014(其公开内容以引用的方式并入本文)中描述的那些。可与本文所述的组合物和方法结合使用的示例性免疫治疗剂还包括结合并抑制CCL3、CCL4、CCL8和CCL22中的一个或多个或全部的活性的剂(例如，多肽、抗体、其抗原结合片段、单链多肽及其构建体)，所述剂描述于例如Balkwill,Nat.Rev.Cancer,4:540-550,2004(其公开内容以引用的方式并入本文)中。
可与本文所述的组合物和方法结合使用的免疫治疗剂的其他实例包括塔革雷汀、干扰素-α、氯倍他索、Peg干扰素(例如，
Figure BDA0003027090150002061
)、泼尼松、罗米地辛、贝沙罗汀、甲氨蝶呤、曲安西龙乳膏、抗趋化因子、伏立诺他、加巴喷丁、针对淋巴细胞表面受体和/或淋巴因子的抗体、针对表面癌蛋白的抗体和/或小分子疗法如伏立诺他。
使用本文所述的方法，本文所述的拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体、其抗原结合片段或其构建体)(例如，表1中所述的抗体1-25中的任一种或多种及其变体，如包含表1中列出的CDR中的一个或多个或全部的抗体或抗原结合片段)可与免疫治疗剂共同施用(例如，混合)或与免疫治疗剂分开施用。例如，本文所述的拮抗性TNFR2多肽(如本文所述单链多肽、抗体、其抗原结合片段或构建体)可同时或在不同时间施用于患者，如患有癌症或感染性疾病的人患者。在一些实施方案中，在向患者施用免疫治疗剂之前，将拮抗性TNFR2多肽(例如，本文所述单链多肽、抗体、其抗原结合片段或构建体)施用于患者。或者，可在免疫治疗剂之后向患者施用拮抗性TNFR2多肽(例如，本文所述的单链多肽、抗体、其抗原结合片段或构建体)。例如，可在免疫疗法治疗失败之后向患者施用拮抗性TNFR2多肽(例如，本文所述的单链多肽、抗体、其抗原结合片段或构建体)。本领域的熟练医生可使用本文所述和本领域中已知的方法来监测免疫疗法治疗的功效以确定所述疗法是否已成功改善了所治疗的病理(如癌症或感染性疾病，例如本文所述的癌症或感染性疾病)。
例如，本领域的熟练医生可例如使用流式细胞术或FACS分析来监测从患者(如人患者)分离的样品(例如，血液样品或活组织检查样品)中的癌细胞的数量。另外地或可替代地，本领域的熟练医生可例如的通过监测患者体内的一个或多个肿瘤的大小(例如，通过CT扫描、MRI或X射线分析)来监测患者的癌症疾病的进展。本领域的熟练医生可通过评价患者体内的肿瘤生物标志物的数量和/或浓度，如患者血液中存在的细胞表面结合的肿瘤相关抗原或分泌的肿瘤抗原的数量和/或浓度作为肿瘤存在的指标来监测癌症(如本文所述的癌症)的进展。癌细胞的数量、肿瘤的大小和/或患者体内或从患者分离的样品中存在的一种或多种肿瘤抗原的数量或浓度在特定时间段内(例如，1天至6个月，如1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、2周、3周、4周、2个月、3个月、4个月、5个月或6个月)施用免疫治疗剂后没有降低例如统计学上显著的量的发现可表明免疫疗法治疗未能改善癌症。基于此适应症，本领域的熟练医生可施用本文所述的拮抗性TNFR2多肽，如本文所述的单链多肽、抗体、其抗原结合片段或构建体。类似地，本领域的医生或熟练的医生可监测从患有感染性疾病(如本文所述的感染性疾病)的患者分离的样品中的细菌、真菌或寄生细胞的数量或病毒颗粒的数量。另外地或可替代地，本领域的熟练医生可通过评价患有这种病理的患者的症状来监测感染性疾病的进展。例如，医生可通过确定感染性疾病的一种或多种症状的频率和/或严重程度在用免疫治疗剂治疗后是否已经稳定(例如，保持相同)或降低来监测患者。从患者分离的样品中的细菌、真菌或寄生细胞或病毒颗粒的数量和/或感染性疾病的一种或多种症状的频率或严重程度在特定时间段内(例如，1天至6个月，如1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、2周、3周、4周、2个月、3个月、4个月、5个月或6个月)施用免疫治疗剂后没有降低例如统计学上显著的量的发现可表明免疫疗法治疗未能改善感染性疾病。基于此适应症，本领域的熟练医生可施用本文所述的拮抗性TNFR2多肽，如本文所述的单链多肽、抗体、其抗原结合片段或构建体。
化学治疗剂和放射疗法
另外地或可替代地，本文所述的拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体、其抗原结合片段或其构建体)(例如，表1中所述的抗体1-25中的任一种或多种及其变体，如包含表1中列出的CDR中的一个或多个或全部的抗体或抗原结合片段)可与化学治疗剂混合、缀合、一起施用或分开施用，例如以用于治疗癌症，如本文所述的癌症。适用于与本文所述的组合物和方法结合使用的示例性化学治疗剂包括但不限于，醋酸阿比特龙，
Figure BDA0003027090150002081
(甲氨蝶呤)，
Figure BDA0003027090150002082
(紫杉醇白蛋白)，
Figure BDA0003027090150002083
博来霉素、长春碱和达卡巴嗪(ABVD)，
Figure BDA0003027090150002084
博来霉素、硫酸长春新碱和磷酸依托泊苷(ABVE)，
Figure BDA0003027090150002085
博来霉素、硫酸长春新碱、磷酸依托泊苷、泼尼松和环磷酰胺(ABVE-PC)，阿霉素和环磷酰胺(AC)，阿霉素、环磷酰胺和紫杉醇或多西他赛(AC-T)，
Figure BDA0003027090150002086
(贝伦妥单抗维多汀)、阿糖胞苷、柔红霉素和依托泊苷(ADE)，阿多-曲妥珠单抗恩他新，
Figure BDA0003027090150002087
(盐酸阿霉素)，二马来酸阿法替尼，
Figure BDA0003027090150002088
(依维莫司)，
Figure BDA0003027090150002089
(奈妥吡坦(netupitant)和盐酸帕洛诺司琼)，
Figure BDA00030270901500020810
(咪喹莫特)，阿地白介素，
Figure BDA00030270901500020811
(艾乐替尼)，艾乐替尼，阿仑单抗，注射用
Figure BDA00030270901500020812
(盐酸美法仑)，
Figure BDA00030270901500020813
片剂(美法仑)，
Figure BDA00030270901500020814
(培美曲塞二钠)，
Figure BDA00030270901500020815
(盐酸帕洛诺司琼)，
Figure BDA00030270901500020816
(苯丁酸氮芥)，
Figure BDA00030270901500020817
(苯丁酸氮芥)，氨基乙酰丙酸，阿那曲唑，阿瑞匹坦，
Figure BDA00030270901500020818
(帕米膦酸二钠)，
Figure BDA00030270901500020819
(阿那曲唑)，
Figure BDA00030270901500020820
(依西美坦)，
Figure BDA00030270901500020821
(奈拉滨)，三氧化二砷，
Figure BDA00030270901500020822
(奥法木单抗)，天冬酰胺酶菊欧文氏菌，
Figure BDA00030270901500020823
(贝伐单抗)，阿西替尼，阿扎胞苷，BEACOPP Becenum(卡莫司汀)，
Figure BDA00030270901500020824
(贝利司他)，贝利司他，盐酸苯达莫司汀，博来霉素、依托泊苷和顺铂(BEP)，贝伐单抗，蓓萨罗丁，
Figure BDA00030270901500020825
(托西莫单抗和碘131I托西莫单抗)，比卡鲁胺，BiCNU(卡莫司汀)，博来霉素，博纳吐单抗，
Figure BDA00030270901500020826
(博纳吐单抗)，硼替佐米、
Figure BDA00030270901500020827
(博舒替尼)，博舒替尼，贝伦妥单抗-维多汀，白消安，
Figure BDA00030270901500020828
(白消安)，卡巴他塞，S-苹果酸卡博替尼，CAF，
Figure BDA00030270901500020829
(阿仑单抗)，
Figure BDA00030270901500020830
(盐酸伊立替康)，卡培他滨，CAPOX，
Figure BDA00030270901500020831
(氟尿嘧啶)，卡铂，卡铂--
Figure BDA00030270901500020832
卡非佐米，
Figure BDA00030270901500020833
(卡莫司汀)，卡莫司汀，卡莫司汀植入物，
Figure BDA00030270901500020834
(比卡鲁胺)，CEENU(洛莫司汀)，顺铂、依托泊苷和甲氨蝶呤(CEM)，色瑞替尼，
Figure BDA00030270901500020835
(盐酸柔红霉素)，
Figure BDA0003027090150002091
(重组HPV二价疫苗)，西妥昔单抗，苯丁酸氮芥，苯丁酸氮芥-泼尼松，CHOP，顺铂，
Figure BDA0003027090150002092
(环磷酰胺)，氯法拉滨，
Figure BDA0003027090150002093
(氯法拉滨)，
Figure BDA0003027090150002094
(氯法拉滨)，CMF，考比替尼，cometriq(S-苹果酸卡博替尼)，COPDAC，COPP，COPP-ABV，
Figure BDA0003027090150002095
(更生霉素)，
Figure BDA0003027090150002096
(考比替尼)，克唑替尼，CVP，环磷酰胺，
Figure BDA0003027090150002097
(异环磷酰胺)，
Figure BDA0003027090150002098
(雷莫芦单抗)，阿糖胞苷，阿糖胞苷脂质体，
Figure BDA0003027090150002099
(阿糖胞苷)，
Figure BDA00030270901500020910
(环磷酰胺)，达拉菲尼，达卡巴嗪，
Figure BDA00030270901500020911
(地西他滨)，更生霉素，达雷木单抗，
Figure BDA00030270901500020912
(达雷木单抗)，达沙替尼，盐酸柔红霉素，地西他滨，地加瑞克，地尼白介素-毒素连接物，地诺单抗，
Figure BDA00030270901500020913
(阿糖胞苷脂质体)，地塞米松，盐酸地塞米松，达妥昔单抗，多西他赛，
Figure BDA00030270901500020914
(盐酸阿霉素)，盐酸阿霉素，
Figure BDA00030270901500020915
(盐酸阿霉素)，
Figure BDA00030270901500020916
(达卡巴嗪)，EFUDEX(氟尿嘧啶)，
Figure BDA00030270901500020917
(拉布立酶)，
Figure BDA00030270901500020918
(盐酸表柔比星)，乐沙定(奥沙利铂)，依洛珠单抗，
Figure BDA00030270901500020919
(奥沙利铂)，艾曲波帕乙醇胺，
Figure BDA00030270901500020920
(阿瑞吡坦)，
Figure BDA00030270901500020921
(依洛珠单抗)，恩扎鲁胺，盐酸表柔比星，EPOCH，
Figure BDA00030270901500020922
(西妥昔单抗)，甲磺酸艾日布林，
Figure BDA00030270901500020923
(维莫德吉)，盐酸埃罗替尼，
Figure BDA00030270901500020924
(天门冬酰胺酶菊欧文氏菌)，
Figure BDA00030270901500020925
(磷酸依托泊苷)，依托泊苷，磷酸依托泊苷，
Figure BDA00030270901500020926
(盐酸阿霉素脂质体)，依维莫司，
Figure BDA00030270901500020927
(盐酸雷洛昔芬)，
Figure BDA00030270901500020928
(盐酸美法仑)，依西美坦，5-FU(5-氟尿嘧啶)，
Figure BDA00030270901500020929
(托瑞米芬)，
Figure BDA00030270901500020930
(帕比司他)，
Figure BDA00030270901500020931
(氟维司群)，FEC，
Figure BDA00030270901500020932
(来曲唑)，非格司亭，
Figure BDA00030270901500020933
(磷酸氟达拉滨)，磷酸氟达拉滨，
Figure BDA00030270901500020934
(氟尿嘧啶)，氟尿嘧啶，
Figure BDA00030270901500020935
(甲氨蝶呤)，
Figure BDA00030270901500020936
PFS(甲氨蝶呤)，FOLFIRI，FOLFIRI-贝伐单抗，FOLFIRI-西妥昔单抗，FOLFIRINOX，FOLFOX，
Figure BDA00030270901500020937
(普拉曲沙)，FU-LV，氟维司群，
Figure BDA00030270901500020938
(重组HPV四价疫苗)，GARDASIL
Figure BDA00030270901500020939
(重组HPV九价疫苗)，
Figure BDA00030270901500020940
(奥比妥珠单抗)，吉非替尼，盐酸吉西他滨，吉西他滨-顺铂，吉西他滨-奥沙利铂，吉妥珠单抗奥佐米星，
Figure BDA00030270901500020941
(盐酸吉西他滨)、
Figure BDA0003027090150002101
(二马来酸阿法替尼)，
Figure BDA0003027090150002102
(甲磺酸伊马替尼)，
Figure BDA0003027090150002103
(卡莫司汀植入物)，
Figure BDA0003027090150002104
晶片(卡莫司汀植入物)，羧肽酶，醋酸戈舍瑞林，
Figure BDA0003027090150002105
(甲磺酸艾日布林)，
Figure BDA0003027090150002106
(曲妥珠单抗)，HPV二价疫苗，
Figure BDA0003027090150002107
(盐酸托泊替康)，Hyper-CVAD，IBRANCE(帕博西尼)，
Figure BDA0003027090150002108
替伊莫单抗，依布替尼，ICE，
Figure BDA0003027090150002109
(盐酸普那替尼)，
Figure BDA00030270901500021010
(盐酸伊达比星)，盐酸伊达比星，艾代拉里斯，
Figure BDA00030270901500021011
(异环磷酰胺)，异环磷酰胺(ifosfamide)，异环磷酰胺(ifosfamidum)，IL-2(阿地白介素)，甲磺酸伊马替尼，
Figure BDA00030270901500021012
(伊布替尼)，咪喹莫特，
Figure BDA00030270901500021013
(拉他莫金冻干混悬剂)，INLYTA(阿昔替尼)，重组干扰素α-2b，内含子A，托西莫单抗，如131I托西莫单抗，伊匹单抗，
Figure BDA00030270901500021015
(吉非替尼)，盐酸伊立替康，
Figure BDA00030270901500021014
(罗米地辛)，伊沙匹隆，柠檬酸伊沙佐米，
Figure BDA00030270901500021016
(伊沙匹隆)，
Figure BDA00030270901500021017
(磷酸鲁索替尼)，
Figure BDA00030270901500021018
(卡巴他赛)，
Figure BDA00030270901500021019
(阿多-曲妥珠单抗恩他新)，
Figure BDA00030270901500021020
(盐酸雷洛昔芬)，
Figure BDA00030270901500021021
(帕利夫明)，
Figure BDA00030270901500021022
(派姆单抗)，
Figure BDA00030270901500021023
(卡非佐米)，醋酸兰瑞肽，二甲苯磺酸拉帕替尼，来那度胺，甲磺酸乐伐替尼，
Figure BDA00030270901500021024
(甲磺酸乐伐替尼)，来曲唑，甲酰四氢叶酸钙，瘤可宁(苯丁酸氮芥)，醋酸亮丙瑞林，levulan(氨基乙酰丙酸)，
Figure BDA00030270901500021025
(苯丁酸氮芥)，
Figure BDA00030270901500021026
(盐酸阿霉素脂质体)，洛莫司汀，
Figure BDA00030270901500021027
(三氟尿苷和盐酸地匹福林)，
Figure BDA00030270901500021028
(醋酸亮丙瑞林)，
Figure BDA00030270901500021029
(奥拉帕尼)，
Figure BDA00030270901500021030
(硫酸长春新碱脂质体)，
Figure BDA00030270901500021031
(盐酸丙卡巴肼)，盐酸氮芥，醋酸甲地孕酮，
Figure BDA00030270901500021032
(曲美替尼)，美法仑，盐酸美法仑，巯嘌呤，
Figure BDA00030270901500021033
(美司钠)，
Figure BDA00030270901500021034
(替莫唑胺)，甲氨蝶呤，甲氨蝶呤LPF，
Figure BDA00030270901500021035
(甲氨蝶呤)，
Figure BDA00030270901500021036
(甲氨蝶呤)，丝裂霉素C，盐酸米托蒽醌，
Figure BDA00030270901500021037
(丝裂霉素C)，MOPP，
Figure BDA00030270901500021038
(普乐沙福)，
Figure BDA00030270901500021039
(盐酸氮芥)，
Figure BDA00030270901500021040
(丝裂霉素C)，
Figure BDA00030270901500021041
(白消安)，
Figure BDA00030270901500021042
(阿扎胞苷)，
Figure BDA00030270901500021043
(吉妥单抗奥佐米星)，纳米颗粒紫杉醇，
Figure BDA00030270901500021044
(酒石酸长春瑞滨)，NECITUMUMAB，奈拉滨，
Figure BDA0003027090150002111
(环磷酰胺)，奈妥吡坦和盐酸帕洛诺司琼，
Figure BDA0003027090150002112
(非格司亭)，
Figure BDA0003027090150002113
(甲苯磺酸索拉非尼)，尼洛替尼，
Figure BDA0003027090150002114
(柠檬酸伊沙佐米)，纳武单抗，
Figure BDA0003027090150002115
(柠檬酸他莫昔芬)，
Figure BDA0003027090150002116
(罗米司亭)，奥比妥珠单抗，
Figure BDA0003027090150002117
(索尼德吉)，OEPA，奥法木单抗，OFF，奥拉帕尼，高三尖杉酯碱，
Figure BDA0003027090150002118
(培门冬酶)，盐酸昂丹司琼，
Figure BDA0003027090150002119
(盐酸伊立替康脂质体)，
Figure BDA00030270901500021110
(地尼白介素-毒素连接物)，
Figure BDA00030270901500021111
(纳武单抗)，OPPA，奥希替尼，奥沙利铂，紫杉醇，紫杉醇白蛋白稳定的纳米颗粒制剂，PAD，帕博西尼，帕利夫明，盐酸帕洛诺司琼，盐酸帕洛诺司琼和奈妥吡坦，帕米膦酸二钠，帕尼单抗，帕比司他，
Figure BDA00030270901500021112
(卡铂)，
Figure BDA00030270901500021113
(卡铂)，盐酸帕唑帕尼，PCV，培门冬酶，聚乙二醇干扰素α-2b，
Figure BDA00030270901500021114
(聚乙二醇干扰素α-2b)，派姆单抗，培美曲塞二钠，
Figure BDA00030270901500021115
(帕妥珠单抗)，帕妥珠单抗，
Figure BDA00030270901500021116
(顺铂)，
Figure BDA00030270901500021117
(顺铂)，普乐沙福，泊马度胺，
Figure BDA00030270901500021118
(泊马度胺)，盐酸帕纳替尼，
Figure BDA00030270901500021119
(耐昔妥珠单抗)，普拉曲沙，泼尼松，盐酸丙卡巴肼，
Figure BDA00030270901500021120
(阿地白介素)，
Figure BDA00030270901500021121
(地诺单抗)，PROMACTA(艾曲波帕乙醇胺)，
Figure BDA00030270901500021122
(西普鲁塞-T)，
Figure BDA00030270901500021123
(巯基嘌呤)，
Figure BDA00030270901500021124
(巯基嘌呤)，二氯化223Ra，盐酸雷洛昔芬，雷莫芦单抗，拉布立酶，R-CHOP，R-CVP，重组人乳头瘤病毒(HPV)，重组干扰素α-2b，瑞戈非尼，R-EPOCH，
Figure BDA00030270901500021125
(来那度胺)，
Figure BDA00030270901500021126
(甲氨蝶呤)，
Figure BDA00030270901500021127
(利妥昔单抗)，盐酸罗拉吡坦，罗米地辛，罗米司亭，红比霉素(盐酸柔红霉素)，磷酸鲁索替尼，
Figure BDA00030270901500021128
胸膜内气雾剂(滑石)，司妥昔单抗，西普鲁塞-T，索马杜林储库(醋酸兰瑞肽)，索尼德吉，甲苯磺酸索拉非尼，
Figure BDA00030270901500021129
(达沙替尼)，斯坦福V，无菌滑石粉(滑石)，
Figure BDA00030270901500021130
(滑石)，
Figure BDA00030270901500021131
(瑞戈非尼)，苹果酸舒尼替尼，
Figure BDA00030270901500021132
(苹果酸舒尼替尼)，
Figure BDA00030270901500021133
(聚乙二醇干扰素α-2b)，
Figure BDA00030270901500021134
(司妥昔单抗)，
Figure BDA00030270901500021135
(沙利度胺)，
Figure BDA00030270901500021136
(高三尖杉酯碱)，硫鸟嘌呤，TAC，
Figure BDA00030270901500021137
(达拉菲尼)，
Figure BDA0003027090150002121
(奥希替尼)，拉他莫金冻干混悬剂，柠檬酸他莫昔芬，tarabine PFS(阿糖胞苷)，TARCEVA(盐酸埃罗替尼)，
Figure BDA0003027090150002122
(蓓萨罗丁)，
Figure BDA0003027090150002123
(尼罗替尼)，
Figure BDA0003027090150002124
(紫杉醇)，
Figure BDA0003027090150002125
(多西他赛)，
Figure BDA0003027090150002126
(替莫唑胺)，坦罗莫司，沙利度胺，
Figure BDA0003027090150002127
(沙利度胺)，硫鸟嘌呤，噻替派，
Figure BDA0003027090150002128
(局部氟尿嘧啶)，盐酸托泊替康，托瑞米芬，
Figure BDA0003027090150002129
(坦罗莫司)，
Figure BDA00030270901500021210
(盐酸右雷佐生)，TPF，曲贝替定，曲美替尼，
Figure BDA00030270901500021211
(盐酸苯达莫司汀)，三氟尿苷和盐酸替吡嘧啶，
Figure BDA00030270901500021212
(三氧化二砷)，
Figure BDA00030270901500021213
(二甲苯磺酸拉帕替尼)，
Figure BDA00030270901500021214
(达妥昔单抗)，三乙酸尿苷，VAC，凡德他尼，VAMP，
Figure BDA00030270901500021215
(盐酸罗拉吡坦)，维克替比(帕尼单抗)，VelP，
Figure BDA00030270901500021216
(硫酸长春碱)，
Figure BDA00030270901500021217
(硼替佐米)，VELSAR(硫酸长春碱)，威罗非尼，VIADUR(醋酸亮丙瑞林)，VIDAZA(阿扎胞苷)，硫酸长春碱，
Figure BDA00030270901500021218
PFS(硫酸长春新碱)，硫酸长春新碱，酒石酸长春瑞滨，VIP，维莫德吉，
Figure BDA00030270901500021219
(三乙酸尿苷)，
Figure BDA00030270901500021220
(羧肽酶)，伏立诺他，
Figure BDA00030270901500021221
(盐酸帕唑帕尼)，
Figure BDA00030270901500021222
(甲酰四氢叶酸钙)，
Figure BDA00030270901500021223
(克唑替尼)，
Figure BDA00030270901500021224
(卡培他滨)，XELIRI，XELOX，
Figure BDA00030270901500021225
(地诺单抗)，
Figure BDA00030270901500021226
(二氯化223Ra)，
Figure BDA00030270901500021227
(恩杂鲁胺)，
Figure BDA00030270901500021228
(伊匹单抗)，
Figure BDA00030270901500021229
(曲贝替定)，
Figure BDA00030270901500021230
(阿柏西普)，
Figure BDA00030270901500021231
(非格司亭)，
Figure BDA00030270901500021232
(威罗菲尼)，
Figure BDA00030270901500021233
(替伊莫单抗)，
Figure BDA00030270901500021234
(盐酸右雷佐生)，阿柏西普，
Figure BDA00030270901500021235
(盐酸昂丹司琼)，
Figure BDA00030270901500021236
(g醋酸戈舍瑞林)，唑来膦酸，
Figure BDA00030270901500021237
(伏立诺他)，
Figure BDA00030270901500021238
(唑来膦酸)，
Figure BDA00030270901500021239
(艾代拉里斯)，
Figure BDA00030270901500021240
(色瑞替尼)以及ZYTIGA(醋酸阿比特龙)。
使用本文所述的方法，本文所述的拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体、其抗原结合片段或其构建体)可与用于治疗癌症的化学治疗剂共同施用(例如，混合)或与化学治疗剂分开施用。例如，本文所述的拮抗性TNFR2多肽(如本文所述单链多肽、抗体、其抗原结合片段或构建体)可同时或在不同时间施用于患者，如患有癌症的人患者。在一些实施方案中，在向患者施用化学治疗剂之前，将拮抗性TNFR2多肽(例如，本文所述单链多肽、抗体、其抗原结合片段或构建体)施用于患者。或者，可在化学治疗剂之后向患者施用拮抗性TNFR2多肽(例如，本文所述的单链多肽、抗体、其抗原结合片段或构建体)。例如，可在化学疗法治疗失败之后向患者施用拮抗性TNFR2多肽(例如，本文所述的单链多肽、抗体、其抗原结合片段或构建体)。本领域的熟练医生可使用本文所述和本领域中已知的方法来监测化学疗法治疗的功效以确定所述疗法是否已成功改善了所治疗的病理(如本文所述的癌症)。
例如，本领域的熟练医生可例如使用流式细胞术或FACS分析来监测从患者(如人患者)分离的样品(例如，血液样品或活组织检查样品)中的癌细胞的数量。另外地或可替代地，本领域的熟练医生可例如的通过监测患者体内的一个或多个肿瘤的大小(例如，通过CT扫描、MRI或X射线分析)来监测患者的癌症疾病的进展。本领域的熟练医生可通过评价患者体内的肿瘤生物标志物的数量和/或浓度，如患者血液中存在的细胞表面结合的肿瘤相关抗原或分泌的肿瘤抗原的数量和/或浓度作为肿瘤存在的指标来监测癌症(如本文所述的癌症)的进展。癌细胞的数量、肿瘤的大小和/或患者体内或从患者分离的样品中存在的一种或多种肿瘤抗原的数量或浓度在特定时间段内(例如，1天至6个月，如1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、2周、3周、4周、2个月、3个月、4个月、5个月或6个月)施用化学治疗剂后没有降低例如统计学上显著的量的发现可表明化学疗法治疗未能改善癌症。基于此适应症，本领域的熟练医生可施用本文所述的拮抗性TNFR2多肽，如本文所述的单链多肽、抗体、其抗原结合片段或构建体。
另外地或可替代地，本文所述的拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体、其抗原结合片段或其构建体)可与放射疗法同时施用或与放射疗法分开施用。例如，本领域的熟练医生可通过用外部和/或内部电磁辐射治疗患者来向患者(如患有本文所述癌症的人患者)施用放射疗法。这种辐射所传递的能量(通常呈X射线、γ射线的形式以及类似形式的低波长能量)可对癌细胞的DNA造成氧化损伤，从而导致细胞死亡(例如通过细胞凋亡)。例如，可使用如辐射束的机器来施用外部放射疗法，以使患者暴露于受控的电磁辐射脉冲。另外地或可替代地，可例如通过向患者施用含有放射性取代基的治疗剂(如含有223Ra或131I的剂，其分别发射高能α和β颗粒)来向患者施用内部辐射。可与放射性标记缀合的示例性治疗剂包括例如，小分子化学治疗剂、抗体以及其抗原结合片段等。例如，本文所述的拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体、其抗原结合片段或其构建体)可例如使用本领域中已知或本文所述的键形成技术与放射性取代基或连接这种取代基的部分缀合。可将此类缀合物施用于受试者，以便在同时施用中递送治疗剂量的放射疗法和本文所述的TNFR2拮抗剂(参见例如，上文“拮抗性TNFR2多肽缀合物”)。
在一些实施方案中，在放射治疗失败后向患者施用拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体、其抗原结合片段或构建体)。本领域的熟练医生可使用例如本文所述的方法监测放射治疗的功效以确定所述疗法是否已成功改善了所治疗的病理(如本文所述的癌症)。例如，本领域的熟练医生可例如使用流式细胞术或FACS分析来监测从患者(如人患者)分离的样品(例如，血液样品或活组织检查样品)中的癌细胞的数量。另外地或可替代地，本领域的熟练医生可例如的通过监测患者体内的一个或多个肿瘤的大小(例如，通过CT扫描、MRI或X射线分析)来监测患者的癌症疾病的进展。本领域的熟练医生可通过评价患者体内的肿瘤生物标志物的数量和/或浓度，如患者血液中存在的细胞表面结合的肿瘤相关抗原或分泌的肿瘤抗原的数量和/或浓度作为肿瘤存在的指标来监测癌症(如本文所述的癌症)的进展。癌细胞的数量、肿瘤的大小和/或患者体内或从患者分离的样品中存在的一种或多种肿瘤抗原的数量或浓度在特定时间段内(例如，1天至6个月，如1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、2周、3周、4周、2个月、3个月、4个月、5个月或6个月)施用辐射疗法后没有降低例如统计学上显著的量的发现可表明辐射治疗未能改善癌症。基于此适应症，本领域的熟练医生可施用本文所述的拮抗性TNFR2多肽，如本文所述的单链多肽、抗体、其抗原结合片段或构建体。
在一些实施方案中，本领域的熟练医生可向患有癌症的患者施用化学治疗剂、放射疗法和本文所述的TNFR2拮抗剂(如本文所述的单链多肽、抗体、其抗原结合片段或构建体)。本文所述的TNFR2拮抗剂、化学治疗剂和放射疗法可同时(例如，在单一药物组合物中或作为同时施用于患者的多种组合物)或在不同时间施用于患者。在一些实施方案中，首先将TNFR2拮抗剂(如本文所述的抗体、其抗原结合片段、单链多肽或构建体)施用于患者，并且然后施用化学治疗剂和放射疗法。或者，可在化学疗法和放射治疗后向患者施用TNFR2拮抗剂(如本文所述的单链多肽、抗体、其抗原结合片段或构建体)。例如，可在化学疗法和/或放射治疗失败后向患者施用拮抗性TNFR2多肽(例如，本文所述的单链多肽、抗体、其抗原结合片段或构建体)。
本领域的熟练医生可使用本文所述(如上文所述的方法)来监测化学疗法和放射治疗的功效以确定所述疗法是否已成功改善了所治疗的病理(如本文所述的癌症)。例如，本领域的熟练医生可例如使用流式细胞术或FACS分析来监测从患者(如人患者)分离的样品(例如，血液样品或活组织检查样品)中的癌细胞的数量。另外地或可替代地，本领域的熟练医生可例如的通过监测患者体内的一个或多个肿瘤的大小(例如，通过CT扫描、MRI或X射线分析)来监测患者的癌症疾病的进展。本领域的熟练医生可通过评价患者体内的肿瘤生物标志物的数量和/或浓度，如患者血液中存在的细胞表面结合的肿瘤相关抗原或分泌的肿瘤抗原的数量和/或浓度作为肿瘤存在的指标并且甚至测量血清可溶性TNFR2来监测癌症(如本文所述的癌症)的进展。本领域技术人员将预期活化的T-reg的数量减少，以及T效应子的数量增加和癌细胞的总数减少。由于这些TNFR2抗体对癌症的特异性，临床监测将预期在肿瘤微环境中是最显著的。癌细胞的数量、肿瘤的大小和/或患者体内或从患者分离的样品中存在的一种或多种肿瘤抗原的数量或浓度在特定时间段内(例如，1天至6个月，如1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、2周、3周、4周、2个月、3个月、4个月、5个月或6个月)施用化学治疗剂和辐射后没有降低例如统计学上显著的量的发现可表明化学疗法和辐射治疗未能改善癌症。基于此适应症，本领域的熟练医生可施用本文所述的拮抗性TNFR2多肽，如本文所述的单链多肽、抗体、其抗原结合片段或构建体。
血脑屏障渗透
在某些实施方案中，可配制本文所述的拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体、其抗原结合片段及其构建体)以确保体内的适当分布。例如，血脑屏障(BBB)排斥许多高度亲水性化合物。为确保本文所述的治疗组合物穿过BBB(如果需要)，所述治疗组合物可配制到例如脂质体中。已经描述了制造脂质体的方法，例如美国专利号4,522,811；5,374,548；以及5,399,331。脂质体可包含被选择性地输送到特定细胞或器官中、从而增强靶向药物递送的一个或多个部分(参见例如V.V.Ranade(J.Clin.Pharmacol.29:685,1989))。示例性靶向部分包括例如，叶酸或生物素(参见例如，美国专利号5,416,016)；甘露糖苷(Umezawa等人(Biochem.Biophys.Res.Commun.153:1038,1988))；抗体(P.G.Bloeman等人(FEBSLett.357:140,1995)；M.Owais等人(Antimicrob.Agents Chemother.39:180,1995))；表面活性蛋白A受体(Briscoe等人(Am.J.Physiol.1233:134,1995))；所述文献各自的公开内容均以引用的方式并入本文。
施用途径和剂量
本文所述的拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体、其抗原结合片段及其构建体)(例如，表1中所述的抗体1-25中的任一种或多种及其变体，如包含表1中列出的CDR中的一个或多个或全部的抗体或抗原结合片段)可通过多种途径施用于哺乳动物受试者(例如，人)，所述途径如口服、透皮、皮下、鼻内、静脉内、肌肉内、眼内、肿瘤内、胃肠外、局部、鞘内和脑室内。在任何给定情况下最合适的施用途径将取决于所施用的特定多、患者、药物配制方法、施用方法(例如，施用时间和施用途径)、患者的年龄、体重、性别、所治疗疾病的严重程度、患者的饮食以及患者的排泄率。
本文所述的拮抗性TNFR2多肽的有效剂量可在例如每单次(例如，大丸剂)施用、多次施用或连续施用(例如，连续输注)约0.0001至约100mg/kg体重的范围内，或者每单次(例如，大丸剂)施用、多次施用或连续施用(例如，连续输注)实现0.0001-5000μg/mL的血清浓度，或者其中的任何有效范围或值，其取决于所治疗的病状、施用途径以及受试者的年龄、体重和状况。在某些实施方案中，例如，对于癌症的治疗，每个剂量可在约0.0001mg至约500mg/kg体重的范围内。例如，本文所述的药物组合物可以0.001-100mg/kg(体重)范围内的每日剂量施用。剂量可每天、每周、每月或每年施用于有需要的哺乳动物受试者(例如，人)一次或多次(例如，2-10次)。
可通过连续静脉内输注或单次大丸剂施用的方式向患者施用本文所述的拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体、其抗原结合片段及其构建体)。可以以例如0.01μg至约5g(于例如10μL至10mL的体积中)的量向患者施用本文所述的拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体、其抗原结合片段及其构建体)。可在数分钟至数小时的过程中向患者施用拮抗性TNFR2多肽。例如，可在5分钟至5小时的过程中，如5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、35分钟、40分钟、45分钟、50分钟、55分钟、60分钟、65分钟、70分钟、80分钟、90分钟、95分钟、100分钟、105分钟、110分钟、115分钟、120分钟、125分钟、130分钟、135分钟、140分钟、145分钟、150分钟、155分钟、160分钟、165分钟、170分钟、175分钟、180分钟、185分钟、190分钟、195分钟、200分钟、205分钟、210分钟、215分钟、220分钟、225分钟、230分钟、235分钟、240分钟、245分钟、250分钟、255分钟、260分钟、265分钟、270分钟、275分钟、280分钟、285分钟、290分钟、295分钟或300分钟或更长时间的过程中向患者施用本文所述的拮抗性TNFR2多肽。
本文所述的拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体、其抗原结合片段及其构建体)可以与免疫治疗剂(如抗PD-1抗体或其抗原结合片段、抗PD-L1抗体或其抗原结合片段和/或抗CTLA-4抗体或其抗原结合片段)组合施用。示例性抗PD-1抗体包括纳武单抗、帕博利珠单抗、阿维鲁单抗、德瓦鲁单抗或阿妥珠单抗。示例性抗CTLA4抗体包括伊匹木单抗和曲美木单抗。示例性抗PD-L1抗体包括阿妥珠单抗和阿维鲁单抗。
当将抗PD-1抗体或其抗原结合片段与拮抗剂TNFR2多肽组合施用于患者(例如，患有本文所述的癌症或感染性疾病的患者)时，可通过单次大丸剂施用或连续静脉内输注的方式向患者施用抗PD-1抗体。例如，可根据需要，通过在30分钟的过程中连续静脉内输注200mg(例如,每三周一次)的方式向人患者施用帕博利珠单抗(
Figure BDA0003027090150002181
(帕博利珠单抗)[包装插页]。Merck Sharp&Dohme Corp.,Whitehouse Station,NJ，其公开内容以引用的方式整体并入)。在另一个实例中，可以根据需要，通过例如每两周一次，在30分钟的过程中连续静脉内输注240mg的方式向患者施用纳武单抗。或者，可以根据需要，通过例如，每4周一次，在30分钟的过程中连续静脉内输注480mg的方式向患者施用纳武单抗(
Figure BDA0003027090150002182
(纳武单抗)[包装插页]。Bristol-Myers Squibb Company,Princeton,NJ，其公开内容以引用的方式整体并入)。
当将抗CTLA-4抗体或其抗原结合片段与拮抗剂TNFR2多肽组合施用于患者(例如，患有本文所述的癌症或感染性病的患者)时，可通过单次大丸剂施用或连续静脉内输注的方式向患者施用抗CTLA-4抗体。例如，可以根据需要，通过在90分钟的过程中连续静脉内输注3mg/kg(例如,每三周一次)的方式，或者通过在90分钟的过程中连续静脉内输注10mg/kg(每三周一次)进行4个剂量，然后在90分钟的过程中静脉内输注10mg/kg(每12周一次)，持续长达3年的方式向人患者施用伊匹木单抗(
Figure BDA0003027090150002191
(伊匹木单抗)[包装插页]。Bristol-Myers Squibb Company,Princeton,NJ，其公开内容以引用的方式整体并入)。
当将TNFR2拮抗多肽(例如，单链多肽、抗体、其抗原结合片段及其构建体)与免疫治疗剂(如抗PD-1抗体或抗CTLA-4抗体)组合施用于患者时，可将拮抗性TNFR2多肽和免疫治疗剂共同施用于患者，例如，通过第一剂的连续静脉内输注或大丸剂施用，随后第二剂的连续静脉内输注或大丸剂施用。两种药物的施用可以同时进行。或者，拮抗剂TNFR2抗体或其抗原结合片段的施用可在施用免疫治疗剂的施用之前或之后进行。在一些实施方案中，第二剂(例如，拮抗剂TNFR2多肽)的施用在第一剂(例如，免疫治疗药剂)施用结束后约5分钟至约4周或更长时间内开始。例如，第二剂的施用可在第一剂施用结束后约5分钟、10分钟、20分钟、30分钟、40分钟、50分钟、60分钟、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、2周、3周、4周或更长时间内开始。
治疗组合物可使用本领域中已知的医疗装置来施用。例如，在一个实施方案中，本文所述的治疗组合物可使用无针皮下注射装置，如在美国专利号5,399,163；5,383,851；5,312,335；5,064,413；4,941,880；4,790,824；或4,596,556中公开的装置来施用。可用于与本文所述的组合物和方法结合使用的熟知植入物和模块的实例包括：美国专利号4,487,603，其公开以受控速率分配药物的可植入微型输注泵；美国专利号4,486,194，其公开通过皮肤施用药物的治疗装置；美国专利号4,447,233，其公开以精确输注速率递送药物的药物输注泵；美国专利号4,447,224，其公开用于连续药物递送的变流量可植入输注设备；美国专利号4,439,196，其公开具有多腔室隔室的渗透药物递送系统；以及美国专利号4,475,196，其公开渗透药物递送系统。这些专利以引用的方式并入本文。许多其他此类植入物、递送系统和模块是本领域技术人员已知的。
含有拮抗性抗TNFR2多肽的药盒
本文中还包括含有拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体、其抗原结合片段及其构建体，如表1中所述的抗体1-25中的任一种或多种及其变体，如包含表1中列出的CDR中的一个或多个或全部的抗体或抗原结合片段)的药盒。本文提供的药盒可含有上述拮抗性TNFR2多肽中的任一种以及编码这些多肽的任何多核苷酸、含有这些多核苷酸的载体或经工程化以表达和分泌本文所述的抗体的细胞(例如，原核或真核细胞)。
可包含在本文所述的药盒中的本公开的示例性组合物包括拮抗性TNFR2多肽，如具有至少两个TNFR2结合位点的那些，其中所述结合位点在空间上彼此相隔约
Figure BDA0003027090150002201
或更多，以及具有人IgG2同种型(例如人IgG2-A同种型)的那些(例如，拥有具有C232S和/或C233S氨基酸取代的人IgG2铰链区的拮抗性TNFR2抗体、其抗原结合片段及其构建体)。可包含到本文所述的药盒中的本公开的组合物还包括含有拮抗性TNFR2多肽的药物组合物，所述拮抗性TNFR2多肽采用单个二硫键结合的同种型，如其中例如，药物组合物中10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％、99.99％或更多的多肽以单个二硫键结合的同种型存在。
本文所述的药盒可包括可用于产生本文所述的组合物的试剂(例如，拮抗性TNFR2多肽，如单链多肽、抗体，含有拮抗性TNFR2多肽的缀合物，编码拮抗性TNFR2多肽的多核苷酸，含有这些多核苷酸的载体)。任选地，本文所述的药盒可包括可诱导细胞(例如，哺乳动物细胞)内的拮抗性TNFR2多肽表达的试剂，如多西环素或四环素。在其他情况下，本文所述的药盒可含有能够结合并检测含有拮抗性TNFR2抗体和表位标签的融合蛋白的化合物。例如，在此类情况下，本文所述的药盒可含有麦芽糖、谷胱甘肽、含镍复合物、抗FLAG抗体、抗myc抗体、抗HA抗体、生物素或链霉亲和素。
本文所述的药盒还可包括能够直接检测拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体、其片段或其构建体)的试剂。此类试剂的实例包括二级抗体，所述二级抗体选择性地识别并结合本文所述的抗TNFR2抗体的Fc区内的特定结构特征。本文所述的药盒可含有识别拮抗性TNFR2抗体的Fc区并与荧光分子缀合的二级抗体。这些抗体-荧光团缀合物提供了用于使用已建立的免疫荧光技术分析拮抗性抗TNFR2抗体例如在特定组织或培养的哺乳动物细胞中的定位的工具。在一些实施方案中，本文所述的药盒可包括表现出已知的亚细胞定位模式的额外荧光化合物。这些试剂可与另一种抗体-荧光团缀合物，例如特异性地识别细胞表面上的不同受体的抗体-荧光团缀合物组合使用，以分析抗TNFR2抗体相对于其他细胞表面蛋白的定位。
本文所述的药盒还可含有可用于通过施用本文所述的拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体、其抗原结合片段及其构建体)来分析患者对治疗的反应的试剂。例如，本文所述的药盒可包括拮抗性TNFR2抗体和一种或多种试剂，所述试剂可用于确定从正在用本文所述的抗体治疗的受试者(例如，人)中抽取的血液样品中T-reg细胞的数量。这种药盒可含有例如选择性地结合由T-reg细胞呈递的细胞表面抗原(如CD4和CD25)的抗体。任选地，这些抗体可用荧光染料(如荧光素或四甲基罗丹明)标记，以便有助于通过本领域中已知的荧光活化细胞分选(FACS)方法分析T-reg细胞。本文所述的药盒可任选地含有一种或多种试剂，所述试剂可用于定量肿瘤反应性T淋巴细胞，以确定本文所述的拮抗性TNFR2多肽在恢复肿瘤浸润性淋巴细胞增殖方面的有效性。例如，本文所述的药盒可含有选择性地结合细胞毒性T细胞表面上的细胞表面标志物(如CD8或CD3)的抗体。任选地，可用荧光分子标记这些抗体，以便能够通过FACS分析进行定量。
本文所述的药盒还可含有一种或多种可用于测定本文所述的拮抗性TNFR2多肽对一种或多种源自TNFR2的肽(例如，含有SEQ ID NO:11、19、20和34-117中任一个的序列的肽)的亲和力和选择性的试剂。例如，药盒可含有拮抗性TNFR2多肽和一种或多种试剂，所述试剂可用于ELISA测定中以测定本文所述的抗体对一种或多种肽的KD，所述肽呈现与天然蛋白质中的表位的构象类似的构象的TNFR2表位。药盒可含有例如先前已与抗生物素蛋白缀合的孔的微量滴定板，并且可含有TNFR2源性肽的文库，所述肽各自与生物素部分缀合。这种药盒可任选地含有特异性地结合至本文所述的拮抗性TNFR2抗体的Fc区的二级抗体，并且所述二级抗体可与催化化学反应的酶(例如，辣根过氧化物酶)缀合，所述化学反应产生发光的发射。
本文所述的药盒还可含有本文所述的拮抗性TNFR2多肽以及可与这种抗体缀合的试剂，所述试剂包括先前描述的那些(例如，细胞毒性剂、荧光分子、生物发光分子、含有放射性同位素的分子、含有与顺磁离子结合的螯合基团的分子等)。这些药盒可另外含有关于可实现本文所述的拮抗性TNFR2抗体与第二分子(如上文所述的那些)的缀合的方式的说明书。
本文所述的药盒还可含有载体，所述载体含有编码拮抗性TNFR2多肽的多核苷酸，如本文所述的任何载体。或者，药盒可包括哺乳动物细胞(例如，CHO细胞)，所述细胞已被遗传改变以自细胞的核基因组表达和分泌拮抗性TNFR2抗体或其片段。这种药盒还可含有描述可诱导自多核苷酸表达拮抗性TNFR2抗体或其片段的方式的说明书，并且可另外包括可用于促进这些多核苷酸的转录的试剂(例如像强力霉素或四环素)。此类药盒可用于制备本文所述的拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段。
本文所述的其他药盒可包括用于工程化原核或真核细胞(例如，CHO细胞或BL21(DE3)大肠杆菌细胞)以便自所述细胞的核基因组表达和分泌本文所述的拮抗性TNFR2多肽的工具。例如，药盒可含有储存在适当培养基中并且任选地根据本领域中已知的方法冷冻的CHO细胞。所述药盒还可提供含有编码核酸酶(例如，如本文所述的CRISPER/Cas、锌指核酸酶、TALEN、ARCUSTM核酸酶)的多核苷酸的载体以及用于在细胞中表达核酸酶的试剂。所述药盒可另外提供用于修饰编码核酸酶以能够改变所述核酸酶的DNA序列来指导特定目标靶DNA序列的裂解的多核苷酸的工具。此类工具的实例包括用于编码目标核酸酶的多核苷酸的扩增和定点诱变的引物。所述药盒还可包括限制酶，所述限制酶可用于从载体中选择性地切除编码核酸酶的多核苷酸，并且一旦使用者已经修饰基因，随后就将修饰的多核苷酸重新引入载体中。这种药盒还可包括DNA连接酶，所述DNA连接酶可用于催化修饰的编码核酸酶的多核苷酸和靶载体之间的共价磷酸二酯键联的形成。本文所述的药盒还可提供编码拮抗性TNFR2多肽的多核苷酸，以及描述可用于选择性地裂解细胞基因组中的特定DNA序列以便将编码拮抗性TNFR2抗体的多核苷酸在此位点掺入基因组中的方法的包装说明书。任选地，所述药盒可提供编码融合蛋白的多核苷酸，所述融合蛋白含有拮抗性TNFR2抗体或其片段和另外的多肽，例如像本文所述的那些。
实施例
提出以下实施例以便为本领域普通技术人员提供本文所要求的组合物和方法如何进行、制备和评价的描述，并且意图纯粹是对本文所述的举例说明且不意图限制本发明人所认定的发明范围。
实施例1.对被拮抗性TNFR2多肽结合的TNFR2内的离散表位作图
将源自人TNFR2的线性肽、环状肽和双环肽的文库针对蛋白质内对TNFR2抗体TNFRAB4表现出高亲和力的不同序列进行筛选。为了筛选TFNR2内的构象表位，使来自初级蛋白质序列的不同区域的肽彼此缀合以形成嵌合肽。这些肽在其一级序列内的策略位置含有半胱氨酸残基。这促进了分子内交联策略，所述策略用于将单独肽约束为多种三维构象中的一种。使未受保护的半胱氨酸残基的硫醇通过亲核取代反应与二价和三价亲电子试剂如2,6-双(溴甲基)吡啶和1,3,5-三(溴甲基)苯交联，以便分别形成构象限制的环状肽和双环肽。以这种方式，约束含有来自TNFR2一级序列的不同区域的氨基酸的独特组合的肽，以便在结构上预组构可类似于天然TNFR2三级结构中呈现的那些表位的表位。通过将肽固定至固体表面的不同区域并且在过氧化氢存在下依次用拮抗性TNFR2抗体如TNFRAB1、TNFRAB2、TNFRAB3、TNFRAB4或TNFRAB5，然后用与辣根过氧化物酶(HRP)缀合的二级抗体和HRP底物(2,2'-偶氮-二-3-乙基苯并噻唑啉磺酸盐)处理所述表面来筛选含有这些肽的文库。在用连续试剂处理之间洗涤所述固体表面，以除去过量或非特异性结合的物质。随后使用电荷耦合器件(CCD)-相机和图像处理系统分析每个表面的每个区域的发光。
“表面上肽的受约束文库”(CLIPS)平台开始于使用组合矩阵设计将靶蛋白(例如TNFR2)转化为多达10,000个重叠肽构建体的文库(Timmerman等人,J.Mol.Recognit.,20:283-29,2007)。在固体载体上，合成线性肽的矩阵，随后将所述线性肽成形为空间限定的CLIPS构建体。表示呈正确构象的不连续表位的多个部分的构建体以高亲和力结合抗体，对其进行检测和定量。呈递不完整表位的构建体以较低亲和力结合抗体，而不含表位的构建体根本不结合。在迭代筛选中使用亲和力信息来详细限定表位的序列和构象。从这些ELISA实验获得的原始发光数据告知了TNFR2表面上存在的结合拮抗性TNFR2抗体的表位的分析。
肽合成
为了重新构建靶分子的表位，合成了肽文库。通过使用二环己基碳二亚胺(DCC)和N-羟基苯并三唑(HOBt)经由与叔丁氧基羰基-六亚甲基二胺(BocHMDA)反应移植专有亲水性聚合物制剂并且随后使用三氟乙酸(TFA)裂解Boc基团来获得氨基官能化的聚丙烯支撑物。使用标准Fmoc肽合成来通过定制改良的
Figure BDA0003027090150002251
液体处理站(Perkin Elmer)在氨基官能化的固体支撑物上合成肽。CLIPS技术允许将肽构建成单环、双环、三环、片状折叠、螺旋状折叠以及其组合。将CLIPS模板与半胱氨酸残基偶联。将肽中的多个半胱氨酸的侧链与一个或两个CLIPS模板偶联。例如，在碳酸氢铵(20mM，pH 7.8)/乙腈(1:3(v/v))中溶解0.5mM的CLIPS模板(2,6-双(溴甲基)吡啶)溶液。将此溶液添加至表面结合的肽阵列中。CLIPS模板将与存在于肽阵列(具有3μl孔的455孔板)的固相结合肽中的两个半胱氨酸的侧链反应。将肽阵列在溶液中轻轻摇动30至60分钟，同时完全覆盖在溶液中。最后，用过量的H2O充分洗涤肽阵列，并且在70℃下在PBS(pH 7.2)中的含有1％SDS/0.1％β-巯基乙醇的破坏缓冲液中超声处理30分钟，接着在H2O中再进行超声处理45分钟。
通过表面等离子体共振分析拮抗性TNFR2抗体的结合亲和力
使用BIACORETM Analysis Services(Precision Antibody)测量拮抗性TNFR2抗体对重组人TNFR2的亲和力。简言之，使用PBS中的生物素-LC-LC-NOSE(Thermo-Fisher)以5:1的化学计量比使抗体生物素化。通过离心色谱法除去过量的生物素化试剂，并将生物素化的抗体在3000RU的链霉亲和素表面上捕获至100RU的水平。具有该抗体捕获水平的TNFR2的信号的理论最大值是26RU，并且在运行缓冲液中使用500nM TNFR2的初步实验情况下达到该信号。以60μL/分钟的流速注入2分钟进行抗原结合的动力学分析。将抗体以1mg/ml的浓度注入至100RU的最终捕获。所使用的仪器是具有BioCap芯片的BIACORETM 3000(GEHealthcare)。双重参考方法用于分析。参考通道含有相同水平的链霉亲和素。
ELISA筛选
以ELISA形式测试抗体与合成的肽中的每一种的结合。将表面固定的肽阵列与一级抗体溶液一起孵育(在4℃下过夜)。在洗涤后，将肽阵列与1/1000稀释的合适的抗体过氧化物酶缀合物(SBA)一起在25℃下孵育1小时。在洗涤后，添加过氧化物酶底物2,2'-连氮基-二-3-乙基苯并噻唑啉磺酸盐(ABTS)和2μl/ml的3％H2O2。在一小时后，测量显色。使用电荷耦合器件(CCD)-照相机和图像处理系统对显色进行定量。从CCD相机获得的值在0至3000mAU的范围内，类似于标准96孔板ELISA读取器。将结果量化并存储到Peplab数据库中。有时，孔含有气泡，从而导致假阳性值，手动检查卡片，并且将由气泡引起的任何值计分为0。
为了验证合成肽的质量，平行合成了一组单独的阳性和阴性对照肽。用阴性对照抗体57.9筛选这些，所述阴性对照抗体57.9不特异性结合TNFR2(Posthumus等人(J.Virology.64:3304-3309,1990))。
表位作图
ELISA也用于确定TNFR2细胞外表面上存在的线性表位。对应于TNFR2一级序列内的不同区域的线性肽购自GenScript(Piscataway,NJ)，在包被缓冲液中稀释并以1μg/孔的浓度置于Immulon 4HBX平底微量滴定板(Thermo Scientific)上。将一级TNFR2拮抗性抗体(0.1μg/孔)与底物一起孵育。针对啮齿动物IgG的二级抗体用于检测一级抗体。使用
Figure BDA0003027090150002261
190吸光度读板仪测量吸光度，并用SoftMax Pro 6.3(MolecularDevices)进行分析。
表位作图分析的结果如图1所示，该图显示了人TNFR2的一级结构，突出显示了被示例性拮抗性TNFR2抗体TNFRAB1、TNFRAB2、TNFRAB3、TNFRAB4和TNFRAB5结合的区域。
实施例2.人IgG2-A同种型的拮抗性TNFR2多肽最佳地杀伤T-reg细胞、扩增T效应细胞以及耗竭TNFR2+癌细胞
制造了包含TNFRAB2的可变结构域和各种人IgG抗体同种型的恒定结构域的单克隆抗体TNFRAB2的嵌合变体。TNFRAB2是具有IgG2同种型的鼠抗体，并且是显性TNFR2拮抗剂。TNFRAB2的TNFR2结合特性如上所述。TNFRAB2包含以下CDR：
TNFRAB2 CDR-H1：GYTFTDYL(SEQ ID NO：274)
TNFRAB2 CDR-H2：VDPEYGST(SEQ ID NO：258)
TNFRAB2 CDR-H3：ARDDGSYSPFDYWG(SEQ ID NO：259)
TNFRAB2 CDR-L1：QNINKY(SEQ ID NO：260)
TNFRAB2 CDR-L2：TYS
TNFRAB2 CDR-L3：CLQYVNLLT(SEQ ID NO：272)
嵌合抗体是使用三种不同的人IgG恒定结构域亚型：IgG1、IgG2和IgG3之一产生的。为了研究嵌合抗体的作用，使用分子生物学技术(如本文所述的那些)产生编码这些抗体的核酸，随后从宿主细胞表达所述编码的抗体，然后进行体外评估。
进行了一系列实验来评估这些嵌合抗体的TNFR2拮抗特性，特别是杀伤T-reg细胞、诱导T效应细胞扩增和杀伤TNFR2+SW480结肠癌细胞的能力。图2-图4显示了具有人IgG1亚型的嵌合抗体的这些特性，图5-图7显示了具有人IgG2亚型的嵌合抗体的这些特性。具有人IgG3亚型的嵌合抗体的作用报告于下面的表3中，该表还提供了对IgG1和IgG2亚型观察到的特征的概括。
表3.嵌合TNFR2拮抗剂抗体对T-reg细胞和效应T细胞的影响
Figure BDA0003027090150002271
在表3中，定性地报告了T-reg杀伤和T-效应子扩增特性。括号中的值表示在n＝5个单独实验中观察到特定作用(例如，T-reg细胞杀伤或T效应子扩增)的实例数。
如图2-图7和表3所示，相对于具有人IgG1同种型恒定结构域或IgG3同种型恒定结构域的嵌合抗体，发现具有人IgG2同种型的嵌合抗体表现出杀伤T-reg细胞和TNFR2+癌细胞以及扩增T效应细胞的优异能力。上表3将抗体同种型与相应抗体的抗原结合臂之间的间距相关联。总的来说，这些数据表明，抗原结合臂之间的最小间距是最佳TNFR2拮抗剂表型所必需的。例如，基于这些实验的结果，通过将抗原结合臂之间的距离与人IgG2抗体中存在的抗原结合臂之间的距离相匹配，可以开发出具有最佳TNFR2拮抗剂特性的抗体。
尽管具有人IgG2同种型恒定结构域的嵌合抗体的结果优于具有人IgG1或IgG3同种型恒定结构域的嵌合抗体，但观察到具有人IgG2亚型的嵌合抗体对T-reg细胞、T效应细胞和TNFR2+癌细胞表现出双峰效应。也就是说，随着在这些测定中IgG2抗体浓度的增加，被测量的值似乎在一个方向上变化，然后改变过程。例如，在图5中，T效应细胞的数量在抗体浓度较低时似乎减少，然后随着抗体浓度的增加而增加。类似地，在图6和图7中，T-reg细胞和TNFR2+癌细胞的数量分别随着抗体浓度的降低而增加，然后随着抗体浓度的升高而减少。这一行为激发了对嵌合IgG2抗体结构的研究。
在于非还原条件下进行嵌合IgG2抗体的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，观察到四条独特的条带。这些结果如图12所示。这四条条带对应于图13A-图13D中举例说明的人IgG2同种型的四种不同的二硫键结合的同种型。为了评估这些二硫键结合的同种型的TNFR2拮抗剂特性，纯化单个条带，并进行上述T-reg杀伤、T效应子扩增和TNFR2+癌细胞杀伤测定。这些实验的结果如表4所示。
表4.人IgG2二硫键结合的同种型对TNFR2拮抗剂抗体杀伤T-reg细胞和扩增效应T细胞的能力的影响
Figure BDA0003027090150002291
令人惊讶的是，如表4所示，相对于条带3和4中存在的二硫键结合的同种型，图12所示的凝胶条带1中存在的二硫键结合的同种型表现出更优的TNFR2拮抗剂作用。相对于条带3和4，条带2中存在的二硫键结合的同种型也表现出更强的拮抗活性。确定条带1对应于IgG2-A二硫键结合的同种型，条带2对应于IgG2-B二硫键结合的同种型。这些同种型的结构分别如图13A和图13B所示。
为了稳定IgG2-A亚型，在基于TNFRAB2的嵌合IgG2抗体的人IgG2铰链区中引入了一系列突变。这些突变包括C232S和C233S氨基酸取代，其保留了位置232和233处的半胱氨酸的立体化学和电负性，同时禁止IgG2-A同种型中不存在的二硫键的形成。这些突变对嵌合IgG2抗体的TNFR2拮抗剂特性的影响如下表5所示。
表5.IgG2铰链区氨基酸取代对TNFR2拮抗剂抗体杀伤T-reg细胞和扩增效应T细胞的能力的影响
Figure BDA0003027090150002292
如表5所示，人IgG2铰链区的C232S和C233S突变导致拮抗剂TNFR2抗体表现出杀伤T-reg细胞和诱导T效应细胞扩增的优异能力。如图8-图10所示，将C232S和C233S突变引入基于TNFRAB2的嵌合抗体的人IgG2铰链区，在T-reg细胞杀伤、T效应细胞扩增和TNFR2+癌细胞杀伤试验中不再显示双峰效应。图11所示的数据进一步证明了这些突变赋予IgG2抗体以最佳癌细胞杀伤特性的能力，这表明包含以C232S和C233S氨基酸取代为特征的人IgG2同种型的嵌合抗体表现出减小肿瘤体积的时间依赖性能力。
综上所述，这些数据表明具有人IgG2同种型的TNFR2拮抗剂抗体，特别是IgG2-A二硫键结合的同种型，以及在较低程度上IgG2-B二硫键结合的同种型，表现出优异的TNFR2拮抗剂特性。使用本文所述的组合物和方法，可以采用多种技术来产生特别地采用IgG2-A二硫键结合模式的抗体。
用于T-reg杀伤测定的材料和方法
·人T-reg FlowTM试剂盒(BioLegend，目录号320401)
ο混合物抗人CD4PE-Cy5/CD25PE(BioLegend，料号78930)
οAlexa
Figure BDA0003027090150002301
488抗人FOXP3，克隆259D(BioLegend，料号79467)
οAlexa
Figure BDA0003027090150002302
488小鼠IgG1，k同种型对照(ICFC)，克隆MOPC-21(BioLegend，料号79486)
οFOXP3固定/透化缓冲液(4X)(BioLegend，目录号421401)
οFOXP3透化缓冲液(10X)(BioLegend，目录号421402)
·PE抗人CD25，克隆：BC96(BioLegend，目录号302606)
·Alexa
Figure BDA0003027090150002303
488抗人FOXP3，克隆259D(BioLegend，目录号320212)
·PBS pH 7.4(1X)(Gibco目录号10010-023)
·HBSS(1X)(Gibco目录号14175-095)
·FBS(热灭活)
·15ml管
·具有悬桶式转子的台式离心机用于15ml管(设定速度1100rpm或200g)
将培养的T-reg细胞用不同浓度的TNFR2拮抗剂抗体处理设定的时间段。在上述条件下孵育T-reg细胞后，使用流式细胞术分析测定细胞计数。将密度为0.2-1x106个细胞/100μl的T-reg细胞分配到15-ml锥形管中并离心5分钟以沉淀细胞。丢弃上清液，并将细胞重新悬浮于100μl洗涤缓冲液(含2％FBS的1x HBSS)中。向此混合物中添加5μl的PE抗人CD25荧光团-抗体缀合物，且随后将细胞涡旋并在黑暗中孵育25分钟。然后通过加入1ml的洗涤缓冲液洗涤细胞且随后离心5分钟。然后丢弃上清液，并向细胞中添加1ml的FoxP3固定/透化缓冲液(4x FOXP3固定/透化缓冲液在PBS中的1:4稀释液)。然后将细胞涡旋并在黑暗中孵育20分钟。随后将细胞离心5分钟并丢弃上清液。然后将细胞重新悬浮于1ml新鲜洗涤缓冲液中，涡旋并离心5分钟。随后将细胞重新悬浮于1ml的1x FOXP3透化缓冲液(10xFOXP3透化缓冲液在PBS中的1:10稀释液)中，涡旋并在黑暗中孵育15分钟。在孵育后，将细胞离心5分钟且随后丢弃上清液。然后将细胞团块重新悬浮于100μl的1x FOXP3透化缓冲液中。此时，向细胞中添加5μl的Alexa
Figure BDA0003027090150002311
488抗人FOXP3或Alexa
Figure BDA0003027090150002312
488小鼠IgG1,k同种型对照。然后将细胞涡旋并在黑暗中孵育35分钟。在孵育后，通过向细胞中添加1ml新鲜洗涤缓冲液洗涤细胞，涡旋细胞并离心5分钟。然后丢弃上清液，并将细胞团块重新悬浮于0.2-0.5ml的不含FBS的1x HBSS中。然后通过流式细胞术分析确定细胞计数。
用于T效应子诱导测定的材料和方法
如Torrey等人(Science Signaling 10:462,2017，其公开内容以引用的方式以其整体并入本文)中所概述，进行本实施例中描述的T效应子诱导测定。
用于癌细胞杀伤测定的材料和方法
将SW480结肠癌细胞以每孔0.1×106个细胞的浓度在200ml培养基中于96孔平板中培养。将细胞直接用TNFR2拮抗性抗体处理，最多孵育21天，每2-3天更新一半培养基。
孵育后，将细胞用0.25％胰蛋白酶-EDTA(Gibco)从平板上分离，收集，并染色以进行FACS分析，或用锥虫蓝(Sigma-Aldrich)计数活细胞或进行细胞活力测定。
实施例3.通过噬菌体展示产生拮抗性TNFR2抗体
用于本文所述的拮抗性TNFR2抗体的体外蛋白质进化的示例性方法是噬菌体展示，其是本领域中熟知的技术。可通过在抗体的CDR或抗体样支架的类似区域(例如，10Fn3结构域的BC、CD和DE环)的编码序列内进行一系列设计的突变或变异来产生噬菌体展示文库。这些突变可被引入其中的模板抗体编码序列可以是例如，如本文所述的天然人种系序列。可使用本文描述或本领域中已知的标准诱变技术来进行这些突变。因此，每个突变体序列编码在总体结构上与模板对应的抗体，除了在模板的序列中具有一个或多个氨基酸变异。可使用如本文所述或本领域中已知的标准载体构建技术来工程化逆转录病毒和噬菌体展示载体。如本领域所熟知的，P3噬菌体展示载体连同相容性蛋白质表达载体可用来产生用于如本文所述的抗体多样化的噬菌体展示载体。
突变的DNA提供序列多样性，并且每个转化体噬菌体展示由所述DNA编码的初始模板氨基酸序列的一个变体，从而产生展示大量不同但结构相关的氨基酸序列的噬菌体群体(文库)。由于抗体高变区的结构明确，所以预期在噬菌体展示筛选中引入的氨基酸变异会改变结合肽或结构域的结合性质而不会显著改变其结构。
在典型的筛选中，使噬菌体文库与TNFR2源性肽(例如，具有序列SEQ ID NO:11、19、20和34-117中任一个的肽)或其特定亚组分接触并允许结合。为了促进结合者和非结合者的分离，方便的是将靶标固定在固体支撑物上。带有TNFR2结合部分的噬菌体可在固体支撑物上与靶标形成复合物，而非结合噬菌体保留在溶液中并且可用过量缓冲液洗掉。然后可通过将缓冲液改变至极端pH(pH 2或pH 10)、改变缓冲液的离子强度、添加变性剂或其他已知方式来从靶标释放结合的噬菌体。为了分离表现出本文所述的多肽的结合噬菌体，可进行蛋白质洗脱。
然后可通过感染细菌细胞来扩增回收的噬菌体，并且可使用现在耗尽非结合抗体并富含结合至靶肽的抗体的新的汇集物来重复筛选过程。即使少数结合噬菌体的回收也足以扩增噬菌体以用于随后的筛选迭代。在几轮选择后，通过常规方法测定编码源自结合汇集物中的选定噬菌体克隆的抗体或其抗原结合片段的基因序列，从而揭示赋予噬菌体与靶标结合亲和力的肽序列。在淘选过程中，群体的序列多样性随着每轮选择而降低，直到剩余所希望的肽结合抗体。所述序列可在少量相关抗体或其抗原结合片段上会聚，通常来自每个文库的约109至1010个原始候选物中的10-50个。在每轮选择中回收的噬菌体数量的增加是在筛选中发生文库会聚的良好指示。在鉴别一组结合多肽后，序列信息可用于设计其他二级噬菌体文库，偏向具有另外所需性质的成员(参见，例如，WO 2014/152660；其公开内容以引用的方式并入本文)。
实施例4.产生人源化拮抗性TNFR2抗体
一种用于产生本文所述人源化TNFR2抗体的方法是将非人拮抗性TNFR2抗体(如TNFRAB1、TNFRAB2、TNFRAB3、TNFRAB4或TNFRAB5)的CDR中的一个或多个或全部引入人抗体共有序列中。共有人抗体重链和轻链序列是本领域已知的(参见例如，“VBASE”人种系序列数据库；Kabat等人(Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版,美国卫生和人类服务部,NIH出版号91-3242,1991)；Tomlinson等人(J.Mol.Biol.227:776-798,1992)；以及Cox等人(Eur.J.Immunol.24:827-836,1994)；所述文献以引用的方式并入本文)。通过使用已建立的程序，可以鉴定共有抗体序列的可变结构域框架残基和CDR(例如，通过序列比对(参见Kabat，同上))。可以用本文所述的非人拮抗性TNFR2抗体的相应的一个或多个CDR序列取代替例如共有抗体的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列中的一个或多个或全部，以产生本文所述的人源化拮抗性TNFR2抗体。可以例如使用本文所述或本领域已知的技术，合成地或重组地产生编码上述CDR序列的多核苷酸。
共有人抗体的可变结构域的一个实例包含在美国专利号6,054,297中鉴定的重链可变结构域
Figure BDA0003027090150002341
Figure BDA0003027090150002342
Figure BDA0003027090150002343
和轻链可变结构域
Figure BDA0003027090150002344
Figure BDA0003027090150002345
Figure BDA0003027090150002346
所述专利的公开内容以引用的方式并入本文(CDR以粗体显示)。为了产生本公开的人源化拮抗性TNFR2抗体，可以重组表达编码上述共有序列的可变结构域的多核苷酸，其中所述CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列中的一个或多个或全部被本文所述的非人拮抗性TNFR2抗体(如TNFRAB1、TNFRAB2、TNFRAB3、TNFRAB4或TNFRAB5)的相应CDR序列(如具有SEQ ID NO:23、257、274、275、293、294或295中任一个的氨基酸序列的CDR-H1)替代。
可将可操作地彼此连接的编码上述重链和轻链可变结构域的多核苷酸整合到表达载体(例如，本文所述或本领域已知的针对原核或真核细胞中的蛋白质表达而优化的表达载体)中。例如，所述多核苷酸可包含编码TNFRAB1、TNFRAB2、TNFRAB3、TNFRAB4或TNFRAB5的CDR-H1(如具有SEQ ID NO:23、257、274、275、293、294或295中任一个的氨基酸序列的CDR-H1)的区域。可将人源化抗体在宿主细胞中表达，随后使用已建立的技术(如本文所述的尺寸排阻色谱和/或亲和色谱)从宿主细胞培养基或宿主细胞中纯化出来。
实施例5.含有C232S和C233S氨基酸取代的人源化TNFR2抗体
使用本文所述的人源化技术，通过鼠单克隆抗体TNFRAB2的人源化开发了一系列25种人源化TNFRAB2抗体。这些人源化TNFR2抗体具有IgG2同种型，并在IgG2铰链区内含有C232S和C233S氨基酸取代。如本文所述，这些取代赋予TNFR2抗体有益的特性，包括提高杀伤Treg细胞和增殖CD8+效应T细胞的能力。为了研究C232S和C233S氨基酸取代对具有IgG2亚型的人源化拮抗性TNFR2抗体的影响，在至少三个功能性测定中测试了所有25种人源化抗体的拮抗活性。首先，测试所有人源化抗体以剂量依赖方式杀伤从人献血者获得的Treg细胞的能力。然后测试所有人源化抗体的使来自人献血者的T效应细胞增殖的能力。另外还测试了人源化抗体的杀伤至少一种表达TNFR2的肿瘤细胞系如SW480或MOTN-1细胞系的能力。
在IgG2铰链区内含有C232S和C233S取代的所有25种人源化TNFR2抗体都表现出杀伤Treg细胞、扩增CD8+效应T细胞和杀伤表达TNFR2的癌细胞的能力。这些结果概述于下表6中。
表6.在IgG2铰链区含有C232S和C233S取代的人源化TNFR2抗体耗竭Treg细胞、扩增CD8+T效应细胞和杀伤表达肿TNFR2的癌细胞的能力
Figure BDA0003027090150002361
Figure BDA0003027090150002371
Figure BDA0003027090150002381
Figure BDA0003027090150002391
Figure BDA0003027090150002401
Figure BDA0003027090150002411
Figure BDA0003027090150002421
Figure BDA0003027090150002431
Figure BDA0003027090150002441
Figure BDA0003027090150002451
Figure BDA0003027090150002461
Figure BDA0003027090150002471
Figure BDA0003027090150002481
Figure BDA0003027090150002491
Figure BDA0003027090150002501
Figure BDA0003027090150002511
Figure BDA0003027090150002521
Figure BDA0003027090150002531
Figure BDA0003027090150002541
Figure BDA0003027090150002551
Figure BDA0003027090150002561
Figure BDA0003027090150002571
Figure BDA0003027090150002581
Figure BDA0003027090150002591
Figure BDA0003027090150002601
Figure BDA0003027090150002611
Figure BDA0003027090150002621
Figure BDA0003027090150002631
Figure BDA0003027090150002641
Figure BDA0003027090150002651
Figure BDA0003027090150002661
Figure BDA0003027090150002671
Figure BDA0003027090150002681
Figure BDA0003027090150002691
Figure BDA0003027090150002701
Figure BDA0003027090150002711
实施例6.通过施用拮抗性TNFR2多肽来治疗人患者的癌症
可向人患者施用本文所述的拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体、其抗原结合片段或其构建体)以治疗细胞增殖病症，如癌症。所述拮抗性多肽可包含例如具有SEQ IDNO:23、257、274、275、293、294或295中任一个的氨基酸序列的CDR-H1。这些多肽的施用可遏制T-reg细胞的生长和增殖。因此，可将本文所述的抗体施用于人患者以遏制T-reg介导的免疫响应。例如，可在数天、数周、数月或数年时程内以特定剂量(例如，0.001与100mg/kg/天之间)通过适当途径(例如，静脉内)施用本文所述的拮抗性TNFR2多肽来治疗患有癌症(例如，本文所述的癌症)的人患者。如果需要，可例如通过高糖基化或通过与PEG缀合来对拮抗性TNFR2多肽进行修饰以逃避免疫识别和/或改进所述多肽的药代动力学概况。
癌症可以是例如以表达TNFR2的细胞为特征的癌症，例如霍奇金淋巴瘤、皮肤非霍奇金淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、卵巢癌、结肠癌、多发性骨髓瘤、肾细胞癌、皮肤癌、肺癌、肝癌、子宫内膜癌、造血或淋巴细胞癌、中枢神经系统癌(例如，神经胶质瘤、神经母细胞瘤和本文所述的中枢神经系统细胞的其它癌症)、乳腺癌、胰腺癌、胃癌、食道癌和上消化道癌。在此类情况下，拮抗性TNFR2多肽可以通过一种或多种机制治疗癌症。例如，拮抗性TNFR2多肽可结合T-reg细胞如表达CD25高和CD45RA低的活化的T-reg细胞或MDSC的表面上的TNFR2，从而抑制T-reg细胞或MDSC的增殖和/或直接杀伤它们。被杀伤或增殖被遏制的T-reg细胞和/或MDSC可以是位于肿瘤微环境中的那些。通过拮抗性TNFR2多肽实现的T-reg细胞和/或MDSC细胞群减少反过来可以使肿瘤反应性CD8+细胞毒性T细胞群扩增，这可针对癌细胞产生免疫响应。拮抗性TNFR2多肽可以另外地或替代地诱导CD8+效应T细胞的直接扩增。另外，或者可选地，拮抗性TNFR2多肽可以结合TNFR2+癌细胞表面上的TNFR2，从而抑制癌细胞的增殖和/或直接杀伤所述癌细胞。
用本文所述的拮抗性TNFR2多肽治疗的癌症的进展可通过若干已建立的方法中的任何一种或多种来监测。医生可通过直接观察来监测患者，以评价患者所表现出的症状如何响应于治疗而改变。还可对患者进行MRI、CT扫描或PET分析，以确定肿瘤是否已经转移或肿瘤的大小是否已经改变，例如响应于用本文所述的抗TNFR2抗体治疗而降低。任选地，可从患者中提取细胞，并且可进行定量生物化学分析以确定各种生长因子受体(如表皮生长因子受体)的相对细胞表面浓度。基于这些分析的结果，医生可在随后的治疗轮次中开出更高/更低剂量或更高/更低频率的拮抗性TNFR2多肽给药。
实施例7.通过施用拮抗性抗TNFR2多肽治疗人患者的HIV
本文所述的拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体、其抗原结合片段及其构建体)可施用于人患者，以治疗病毒感染，如HIV。施用这些多肽可以例如遏制T-reg细胞和MDSC的生长和增殖，这通过允许能够对受感染的细胞发动攻击的细胞毒性T淋巴细胞扩增而增强患者的免疫响应。例如，可通过在数天、数周、数月或数年时程内以特定剂量(例如，0.001与100mg/kg/天之间)通过适当途径(例如，静脉内)施用本文所述的拮抗性TNFR2多肽来治疗患有HIV的人患者。所述拮抗性多肽可包含例如具有SEQ ID NO:23、257、274、275、293、294或295中任一个的氨基酸序列的CDR-H1。如果需要，可例如通过高糖基化或通过与PEG缀合来对所述多肽进行修饰以逃避免疫识别和/或改进所述多肽的药代动力学概况。
用本文所述的拮抗性TNFR2多肽治疗的HIV的进展可通过若干已建立的方法中的任何一种或多种来监测。医生可通过直接观察来监测患者，以评价患者所表现出的症状如何响应于治疗而改变。还可从患者中抽取血液样品以分析一个或多个白细胞的细胞计数，以便确定受感染的细胞的数量是否响应于用本文所述的拮抗性TNFR2多肽治疗而改变(例如，减少)。基于这些分析的结果，医生可在随后的治疗轮次中开出更高/更低剂量的拮抗性TNFR2多肽或更高/更低频率的拮抗性TNFR2抗体给药。
实施例8.通过施用拮抗性抗TNFR2多肽治疗非人哺乳动物中的结核分枝杆菌
本文所述的拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体、其抗原结合片段及其构建体)可施用于非人哺乳动物(例如，牛科哺乳动物、猪、野牛、马、绵羊、山羊、奶牛、猫、狗、兔、仓鼠、豚鼠或其他非人哺乳动物)以治疗细菌感染，如结核分枝杆菌。施用这些多肽可以例如遏制T-reg细胞和/或MDSC的增殖，和/或直接杀伤T-reg细胞和/或MDSC，这可通过允许能够对病原生物体发动攻击的细胞毒性T淋巴细胞扩增而增强患者的免疫响应。例如，可通过在数天、数周、数月或数年时程内以特定剂量(例如，0.001与100mg/kg/天之间)通过适当途径(例如，静脉内)施用本文所述的拮抗性TNFR2多肽来治疗患有结核分枝杆菌的非人哺乳动物。所述拮抗性多肽可包含例如具有SEQ ID NO:23、257、274、275、293、294或295中任一个的氨基酸序列的CDR-H1。如果需要，可例如通过高糖基化或通过与PEG缀合来对拮抗性TNFR2多肽进行修饰以逃避免疫识别和/或改进所述多肽的药代动力学概况。
用本文所述的拮抗性TNFR2多肽治疗的结核分枝杆菌感染的进展可通过若干已建立的方法中的任一种或多种来监测。医生可通过直接观察来监测患者，以评价患者所表现出的症状如何响应于治疗而改变。还可从患者中抽取血液样品以分析一个或多个白细胞的细胞计数，以便确定免疫响应是否响应于用本文所述的拮抗性TNFR2多肽治疗而改变(例如，增加)。基于这些分析的结果，医生可在随后的治疗轮次中开出更高/更低剂量的拮抗性TNFR2多肽或更高/更低频率的拮抗性TNFR2抗多肽给药。
实施例9.通过施用拮抗性TNFR2多肽与免疫治疗剂的组合来治疗人患者的癌症或感染性疾病
本文所述的拮抗性TNFR2抗体、抗原结合片段、单链多肽和构建体可与免疫治疗剂组合(例如，与免疫治疗剂混合、共同施用或分开施用)施用于人患者以治疗细胞增殖病症如癌症，或感染性疾病如病毒、细菌、真菌或寄生虫感染。施用所述抗体、抗原结合片段、单链多肽或构建体可遏制表达TNFR2的T-reg细胞和/或癌细胞的生长和增殖。如抗CTLA-4剂(例如，抗CTLA-4抗体或其抗原结合片段，如伊匹木单抗和曲美木单抗)、抗PD-1剂(例如，抗PD-1抗体或其抗原结合片段，如纳武单抗、帕博利珠单抗、阿维鲁单抗、德瓦鲁单抗或阿妥珠单抗)、抗PD-L1剂(阿妥珠单抗和阿维鲁单抗)、抗PD-L2剂、TNF-α交联剂、TRAIL交联剂、抗CD27剂、抗CD30剂、抗CD40剂、抗4-1BB剂、抗GITR剂、抗OX40剂、抗TRAILR1剂、抗TRAILR2剂以及抗TWEAKR剂的免疫治疗剂可与拮抗剂TNFR2抗体、其抗原结合片段、单链多肽或构建体协同起作用，因为免疫治疗剂能够下调免疫检查点蛋白(例如，免疫检查点受体和/或配体)的信号转导，否则所述信号转导将导致对肿瘤相关抗原的耐受性以及细胞毒性T细胞响应的下调。可与拮抗性TNFR2抗体、其抗原结合片段、单链多肽或构建体结合使用的免疫治疗剂的另外实例包括塔革雷汀、干扰素-α、氯倍他索、Peg干扰素(例如，
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)、泼尼松、罗米地辛、贝沙罗汀、甲氨蝶呤、曲安西龙乳膏、抗趋化因子、伏立诺他、加巴喷丁、针对淋巴细胞表面受体和/或淋巴因子的抗体、针对表面癌蛋白的抗体和/或小分子疗法如伏立诺他。
本领域的熟练医生可向患有癌症或感染性疾病的人患者施用与免疫治疗剂组合的作为拮抗剂的本文所述的特异性结合TNFR2的多肽(例如，抗体、其抗原结合片段、单链多肽或其构建体)。所述拮抗性多肽可包含例如具有SEQ ID NO:23、257、274、275、293、294或295中任一个的氨基酸序列的CDR-H1。所述肽和免疫治疗剂可在数天、数周、数月或数年时程内以特定剂量(例如，0.001与100mg/kg/天之间，以及其他范围)通过适当施用途径(例如，静脉内、肌内或皮下等)施用于患者。如果需要，可例如通过高糖基化或通过与PEG缀合来对抗TNFR2抗体、抗原结合片段、单链多肽或构建体进行修饰以逃避免疫识别和/或改进所述抗体、抗原结合片段、单链多肽或构建体的药代动力学概况。
以这种方式治疗的癌症或感染性疾病的进展可通过若干已建立的方法中的任何一种或多种来监测。医生可通过直接观察来监测患者，以评价患者所表现出的症状如何响应于治疗而改变。还可对患者进行MRI、CT扫描或PET分析以确定肿瘤是否已经转移或肿瘤的大小是否已经改变，例如，响应于用抗TNFR2抗体、抗原结合片段、单链多肽或构建体和免疫治疗剂治疗而降低。任选地，可从患者中提取细胞，并且可进行定量生物化学分析以确定各种生长因子受体(如表皮生长因子受体)的相对细胞表面浓度。基于这些分析的结果，医生可在随后的治疗轮次中开出更高/更低剂量的拮抗性TNFR2抗体、抗原结合片段、单链多肽或构建体和免疫治疗剂给药或更高/更低频率的拮抗性TNFR2抗体、抗原结合片段、单链多肽或构建体和免疫治疗剂给药。
其他实施方案
本说明书中所提及的所有公布、专利和专利申请以引用的方式并入本文，其引用的程度犹如每个独立的公布或专利申请被具体地和单独地指出以引用的方式并入。
尽管本发明已经结合其具体的实施方案进行了描述，但应了解能够对其进行进一步的修改并且本申请意图涵盖任何基本根据本文所述的原理的本文所述的改变、用途或改编，并且包括虽然不属于本发明但属于本发明所属领域的已知或常规实践的和属于上文所述的实质特征的以及符合权利要求书范围之内的变更。
其他实施方案在权利要求书内。
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Claims (256)

1.一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段在富含半胱氨酸的结构域(CRD)3(CRD3)和/或CRD4内的表位处特异性结合人肿瘤坏死因子受体2(TNFR2)，而不在由CRD1内的一个或多个氨基酸限定的表位处特异性结合TNFR2，其中所述抗体或其抗原结合片段：
(a)包含人IgG2铰链区，其在所述IgG2铰链区氨基酸序列的位置232和/或233处缺少半胱氨酸残基；和/或
(b)包含彼此相隔至少约
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的距离的抗原结合位点。
2.一种特异性结合人TNFR2的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含：
(a)具有与SEQ ID NO:302的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列的重链；
(b)具有与SEQ ID NO:303的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列的重链；
(c)具有与SEQ ID NO:304的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列的重链；
(d)具有与SEQ ID NO:305的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列的重链；或者
(e)具有与SEQ ID NO:306的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列的重链；和/或
(f)具有与SEQ ID NO:297的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列的轻链；
(g)具有与SEQ ID NO:298的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列的轻链；
(h)具有与SEQ ID NO:299的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列的轻链；
(i)具有与SEQ ID NO:300的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列的轻链；或者
(j)具有与SEQ ID NO:301的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列的轻链。
3.如权利要求2所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含：
(a)具有与SEQ ID NO:302的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列的重链，和具有与SEQ ID NO:297的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列的轻链；
(b)具有与SEQ ID NO:302的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列的重链，和具有与SEQ ID NO:298的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列的轻链；
(c)具有与SEQ ID NO:302的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列的重链，和具有与SEQ ID NO:299的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列的轻链；
(d)具有与SEQ ID NO:302的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列的重链，和具有与SEQ ID NO:300的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列的轻链；
(e)具有与SEQ ID NO:302的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列的重链，和具有与SEQ ID NO:301的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列的轻链；
(f)具有与SEQ ID NO:303的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列的重链，和具有与SEQ ID NO:297的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列的轻链；
(g)具有与SEQ ID NO:303的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列的重链，和具有与SEQ ID NO:298的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列的轻链；
(h)具有与SEQ ID NO:303的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列的重链，和具有与SEQ ID NO:299的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列的轻链；
(i)具有与SEQ ID NO:303的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列的重链，和具有与SEQ ID NO:300的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列的轻链；
(j)具有与SEQ ID NO:303的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列的重链，和具有与SEQ ID NO:301的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列的轻链；
(k)具有与SEQ ID NO:304的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列的重链，和具有与SEQ ID NO:297的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列的轻链；
(l)具有与SEQ ID NO:304的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列的重链，和具有与SEQ ID NO:298的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列的轻链；
(m)具有与SEQ ID NO:304的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列的重链，和具有与SEQ ID NO:299的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列的轻链；
(n)具有与SEQ ID NO:304的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列的重链，和具有与SEQ ID NO:300的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列的轻链；
(o)具有与SEQ ID NO:304的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列的重链，和具有与SEQ ID NO:301的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列的轻链；
(p)具有与SEQ ID NO:305的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列的重链，和具有与SEQ ID NO:297的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列的轻链；
(q)具有与SEQ ID NO:305的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列的重链，和具有与SEQ ID NO:298的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列的轻链；
(r)具有与SEQ ID NO:305的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列的重链，和具有与SEQ ID NO:299的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列的轻链；
(s)具有与SEQ ID NO:305的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列的重链，和具有与SEQ ID NO:300的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列的轻链；
(t)具有与SEQ ID NO:305的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列的重链，和具有与SEQ ID NO:301的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列的轻链；
(u)具有与SEQ ID NO:306的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列的重链，和具有与SEQ ID NO:297的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列的轻链；
(v)具有与SEQ ID NO:306的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列的重链，和具有与SEQ ID NO:298的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列的轻链；
(w)具有与SEQ ID NO:306的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列的重链，和具有与SEQ ID NO:299的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列的轻链；
(x)具有与SEQ ID NO:306的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列的重链，和具有与SEQ ID NO:300的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列的轻链；或者
(y)具有与SEQ ID NO:306的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列的重链，和具有与SEQ ID NO:301的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列的轻链。
4.如权利要求2或3所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段在CRD3和/或CRD4内的表位处特异性结合人TNFR2，而不在由CRD1内的一个或多个氨基酸限定的表位处特异性结合TNFR2，并且任选地，其中所述抗体或其抗原结合片段：
(a)包含人IgG2铰链区，其在所述IgG2铰链区的氨基酸序列的位置232和/或位置233处缺少半胱氨酸残基；和/或
(b)包含彼此相隔至少约
Figure FDA0003027090140000081
的距离的抗原结合位点。
5.如权利要求1-4中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含人IgG2铰链区，其在所述IgG2铰链区氨基酸序列的位置232和/或233处缺少半胱氨酸残基。
6.如权利要求1-5中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含人IgG2铰链区，其在所述IgG2铰链区氨基酸序列的位置232处缺少半胱氨酸残基。
7.如权利要求1-6中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含人IgG2铰链区，其在所述IgG2铰链区氨基酸序列的位置233处缺少半胱氨酸残基。
8.如权利要求1-7中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含人IgG2铰链区，其在所述IgG2铰链区氨基酸序列的位置232和/或233处具有除半胱氨酸外的氨基酸。
9.如权利要求8所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含人IgG2铰链区，其在所述IgG2铰链区氨基酸序列的位置232处具有除半胱氨酸外的氨基酸。
10.如权利要求8或9所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含人IgG2铰链区，其在所述IgG2铰链区氨基酸序列的位置233处具有除半胱氨酸外的氨基酸。
11.如权利要求1-10中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含人IgG2铰链区，其在所述IgG2铰链区氨基酸序列的位置232和/或233处具有丝氨酸残基。
12.如权利要求11所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含人IgG2铰链区，其在所述IgG2铰链区氨基酸序列的位置232处具有丝氨酸残基。
13.如权利要求11或12所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含人IgG2铰链区，其在所述IgG2铰链区氨基酸序列的位置233处具有丝氨酸残基。
14.如权利要求1-13中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含人IgG2铰链区，其在半胱氨酸残基232和233之一或两者处包含氨基酸取代或缺失。
15.如权利要求14所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述IgG2铰链区在半胱氨酸残基232和233之一或两者处包含氨基酸取代。
16.如权利要求15所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述IgG2铰链区在半胱氨酸残基232处包含氨基酸取代。
17.如权利要求15或16所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述IgG2铰链区在半胱氨酸残基233处包含氨基酸取代。
18.如权利要求14-17中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述氨基酸取代是保守氨基酸取代。
19.如权利要求18所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述IgG2铰链区包含C232S取代。
20.如权利要求18或19所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述IgG2铰链区包含C233S取代。
21.如权利要求1-20中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述IgG2铰链区具有与SEQ ID NO:291的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列。
22.如权利要求21所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述IgG2铰链区具有与SEQ IDNO:291的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。
23.如权利要求22所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述IgG2铰链区与SEQ ID NO:291的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列。
24.如权利要求23所述的抗体或其抗原结合片段，其中除了氨基酸取代C232S和C233S外，所述IgG2铰链区具有SEQ ID NO:291的氨基酸序列。
25.如权利要求1-24中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含彼此相隔至少约
Figure FDA0003027090140000101
的距离的抗原结合位点。
26.如权利要求25所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗原结合位点彼此相隔至少约
Figure FDA0003027090140000111
的距离。
27.如权利要求26所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗原结合位点彼此相隔至少约
Figure FDA0003027090140000112
的距离。
28.如权利要求27所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗原结合位点彼此相隔至少约
Figure FDA0003027090140000113
的距离。
29.如权利要求1-24中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗原结合位点彼此相隔约
Figure FDA0003027090140000114
至约
Figure FDA0003027090140000115
的距离。
30.如权利要求29所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗原结合位点彼此相隔约
Figure FDA0003027090140000116
至约
Figure FDA0003027090140000117
的距离。
31.如权利要求29所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗原结合位点彼此相隔约
Figure FDA0003027090140000118
至约
Figure FDA0003027090140000119
的距离。
32.如权利要求29所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗原结合位点彼此相隔约
Figure FDA00030270901400001110
至约
Figure FDA00030270901400001111
的距离。
33.如权利要求1-32中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含互补决定区(CDR)重链1(CDR1)，所述互补决定区重链1具有氨基酸序列GJTF(J)2Y(SEQ ID NO:276)或GJTF(J)2YJ(SEQ ID NO:277)，其中每个J独立地为天然存在的氨基酸。
34.如权利要求33所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段还包含：
(a)CDR-H2，其具有氨基酸序列(J)3GSJ或(J)5GSJ；
(b)CDR-H3，其具有氨基酸序列JRJDGJSJY(J)2FDJ(SEQ ID NO:278)或JRJDGSY(J)2FD(J)3(SEQ ID NO:279)；
(c)CDR-L1，其具有氨基酸序列(J)9Y或(J)5Y；
(d)CDR-L2，其具有氨基酸序列(J)6S或(J)2S；和/或
(e)CDR-L3，其具有氨基酸序列(J)5Y(J)2T或(J)3Y(J)4T。
35.如权利要求1-32中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含具有氨基酸序列Z4FZ3Z5SSZ5或Z4YZ3Z5TDZ5X的CDR-H1；
其中每个Z3独立地为在生理pH下包含极性、不带电荷的侧链的氨基酸；
每个Z4独立地为甘氨酸或丙氨酸；
每个Z5独立地为包含疏水侧链的氨基酸；以及
每个X独立地为亮氨酸或异亮氨酸。
36.如权利要求35所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段还包含：
(a)CDR-H2，其具有氨基酸序列SSGZ4Z3Y(SEQ ID NO:263)或VDPEYZ4Z3T(SEQ ID NO:264)；
(b)CDR-H3，其具有氨基酸序列QZ1VZ2Z4YZ3SZ5WYZ5Z2Z5(SEQ ID NO:265)或AZ1DZ2Z4Z3Z5SPZ5Z2Z5WG(SEQ ID NO:266)；
(c)CDR-L1，其具有氨基酸序列SASSSVYYMZ5(SEQ ID NO:267)或QNINKZ5(SEQ ID NO:268)；
(d)CDR-L2，其具有氨基酸序列STSNLAZ3(SEQ ID NO:269)、TYZ3或YTZ3；和/或
(e)CDR-L3，其具有氨基酸序列为QQRRNZ5PYZ3(SEQ ID NO:270)或CLQZ5VNLXZ3(SEQ IDNO:271)；
其中每个Z1独立地为在生理酸pH下包含阳离子侧链的氨基酸；以及
每个Z2独立地为在生理pH下包含阴离子侧链的氨基酸。
37.如权利要求1-32中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含CDR-H1，所述CDR-H1具有氨基酸序列GFTFSSY(SEQ ID NO:23)、GYTFTDYX(SEQID NO:257)或相对于所述序列具有最多两个氨基酸取代的氨基酸序列，其中每个X独立地为亮氨酸或异亮氨酸，任选地其中所述氨基酸取代是保守氨基酸取代。
38.如权利要求37所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段还包含：
(a)CDR-H2，其具有氨基酸序列SSGGSY(SEQ ID NO:24)、VDPEYGST(SEQ ID NO:258)或相对于所述序列具有最多两个氨基酸取代的氨基酸序列；
(b)CDR-H3，其具有氨基酸序列QRVDGYSSYWYFDV(SEQ ID NO:25)、ARDDGSYSPFDYWG(SEQID NO:259)或相对于所述序列具有最多两个氨基酸取代的氨基酸序列；
(c)CDR-L1，其具有氨基酸序列SASSSVYYMY(SEQ ID NO:26)、QNINKY(SEQ ID NO:260)或相对于所述序列具有最多两个氨基酸取代的氨基酸序列；
(d)CDR-L2，其具有氨基酸序列STSNLAS(SEQ ID NO:27)、TYS、YTS或相对于SEQ ID NO:27具有最多两个氨基酸取代的氨基酸序列；和/或
(e)CDR-L3，其具有氨基酸序列QQRRNYPYT(SEQ ID NO:28)、CLQYVNLXT(SEQ ID NO:261)或相对于所述序列具有最多两个氨基酸取代的氨基酸序列；
任选地其中所述氨基酸取代是保守氨基酸取代。
39.如权利要求1-38中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含重链，所述重链包含以下CDR中的一个或多个：
(a)CDR-H1，其具有氨基酸序列GFTFSSY(SEQ ID NO:23)；
(b)CDR-H2，其具有氨基酸序列SSGGSY(SEQ ID NO:24)；和
(c)CDR-H3，其具有氨基酸序列QRVDGYSSYWYFDV(SEQ ID NO:25)。
40.如权利要求1-38中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含重链，所述重链包含以下CDR中的一个或多个：
(a)CDR-H1，其具有氨基酸序列GYTFTDYX(SEQ ID NO:257)；
(b)CDR-H2，其具有氨基酸序列VDPEYGST(SEQ ID NO:258)；和
(c)CDR-H3，其具有氨基酸序列ARDDGSYSPFDYWG(SEQ ID NO:259)；
其中每个X独立地为亮氨酸或异亮氨酸。
41.如权利要求40所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述CDR-H1具有氨基酸序列GYTFTDYL(SEQ ID NO:274)。
42.如权利要求40所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述CDR-H1具有氨基酸序列GYTFTDYI(SEQ ID NO:275)。
43.如权利要求1-42中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含轻链，所述轻链包含以下CDR中的一个或多个：
(a)CDR-L1，其具有氨基酸序列SASSSVYYMY(SEQ ID NO:26)；
(b)CDR-L2，其具有氨基酸序列STSNLAS(SEQ ID NO:27)；和
(c)CDR-L3，其具有氨基酸序列QQRRNYPYT(SEQ ID NO:28)。
44.如权利要求1-42中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含轻链，所述轻链包含以下CDR中的一个或多个：
(a)CDR-L1，其具有氨基酸序列QNINKY(SEQ ID NO:260)；
(b)CDR-L2，其具有氨基酸序列TYS或YTS；和
(c)CDR-L3，其具有氨基酸序列CLQYVNLXT(SEQ ID NO:261)；
其中每个X独立地为亮氨酸或异亮氨酸。
45.如权利要求44所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述CDR-L2具有氨基酸序列TYS。
46.如权利要求44所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述CDR-L2具有氨基酸序列YTS。
47.如权利要求44-46中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述CDR-L3具有氨基酸序列CLQYVNLLT(SEQ ID NO:272)。
48.如权利要求45-46中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述CDR-L3具有氨基酸序列CLQYVNLIT(SEQ ID NO:273)。
49.如权利要求1-48中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含三个重链CDR，所述三个重链CDR包含：
(a)CDR-H1，其具有氨基酸序列GFTFSSY(SEQ ID NO:23)；
(b)CDR-H2，其具有氨基酸序列SSGGSY(SEQ ID NO:24)；和
(c)CDR-H3，其具有氨基酸序列QRVDGYSSYWYFDV(SEQ ID NO:25)；
并且其中所述抗体或其抗原结合片段还包含三个轻链CDR，所述三个轻链CDR包含：
(d)CDR-L1，其具有氨基酸序列SASSSVYYMY(SEQ ID NO:26)；
(e)CDR-L2，其具有氨基酸序列STSNLAS(SEQ ID NO:27)；和
(f)CDR-L3，其具有氨基酸序列QQRRNYPYT(SEQ ID NO:28)。
50.如权利要求1-48中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含三个重链CDR，所述三个重链CDR包含：
(a)CDR-H1，其具有氨基酸序列GYTFTDYX(SEQ ID NO:257)；
(b)CDR-H2，其具有氨基酸序列VDPEYGST(SEQ ID NO:258)；和
(c)CDR-H3，其具有氨基酸序列ARDDGSYSPFDYWG(SEQ ID NO:259)；
并且其中所述抗体或其抗原结合片段还包含三个轻链CDR，所述三个轻链CDR包含：
(d)CDR-L1，其具有氨基酸序列QNINKY(SEQ ID NO:260)；
(e)CDR-L2，其具有氨基酸序列TYS或YTS；和
(f)CDR-L3，其具有氨基酸序列CLQYVNLXT(SEQ ID NO:261)；
其中每个X独立地为亮氨酸或异亮氨酸。
51.如权利要求50所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述CDR-H1具有氨基酸序列GYTFTDYL(SEQ ID NO:274)。
52.如权利要求50所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述CDR-H1具有氨基酸序列GYTFTDYI(SEQ ID NO:275)。
53.如权利要求50-53中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述CDR-L2具有氨基酸序列TYS。
54.如权利要求50-53中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述CDR-L2具有氨基酸序列YTS。
55.如权利要求50-55中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述CDR-L3具有氨基酸序列CLQYVNLLT(SEQ ID NO:272)。
56.如权利要求50-55中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述CDR-L3具有氨基酸序列CLQYVNLIT(SEQ ID NO:273)。
57.如权利要求34、36、38和43-56中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含具有结合到所述CDR-L2的N末端的氨基酸序列LLIR(SEQ ID NO:262)的框架区。
58.如权利要求34、36、38和43-57中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含具有结合到所述CDR-L2的C末端的氨基酸序列TLE的框架区。
59.如权利要求1-58中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变结构域，所述重链可变结构域具有与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列。
60.如权利要求59所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变结构域具有与SEQID NO:2的氨基酸序列具有至少90％同一性例如至少95％、97％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
61.如权利要求1-60中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含轻链可变结构域，所述轻链可变结构域具有与SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列。
62.如权利要求61所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链可变结构域具有与SEQID NO:4的氨基酸序列具有至少90％同一性例如至少95％、97％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
63.如权利要求59-62中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的重链可变结构域和具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的轻链可变结构域。
64.如权利要求1-63中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段以小于约100nM的KD与具有SEQ ID NO:11、19、20和34-117中的任一个的氨基酸序列的肽特异性结合，并且不结合包含SEQ ID NO:7的氨基酸56-60(KCSPG)的肽。
65.如权利要求1-64中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段在以下内的表位处特异性结合所述TNFR2：
(a)SEQ ID NO:7的氨基酸142-146(KCRPG)；
(b)SEQ ID NO:7的氨基酸142-149(KCRPGFGV)；
(c)SEQ ID NO:7的氨基酸137-144(CAPLRKCR)；
(d)SEQ ID NO:7的氨基酸150-190(RPGTETSDVVCKPCAPGTFSNTTSSTDICRPHQICNVVAI)；
(e)SEQ ID NO:7的氨基酸161-169(CKPCAPGTF)；
(f)SEQ ID NO:7的氨基酸75-128(CDSCEDSTYTQLWNWVPECLSCGSRCSSDQVETQACTREQNRICTCRPGWYCAL)，任选地其中所述表位在SEQ ID NO:7的氨基酸80-86(DSTYTQL)、91-98(PECLSCGS)或116-123(RICTCRPG)内；
(g)SEQ ID NO:7的氨基酸174-184(SSTDICRPHQI)；
(h)SEQ ID NO:7的氨基酸126-140(CALSKQEGCRLCAPL)；和/或
(i)SEQ ID NO:7的氨基酸序列156-165(TSDVVCKPCA)。
66.如权利要求1-65中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段抑制TNFR2信号传导。
67.如权利要求1-66中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段减少表达TNFR2的细胞中的选自由以下组成的组的一种或多种基因的表达：CHUK、NFKBIE、NFKBIA、MAP3K11、TRAF2、TRAF3、relB和cIAP2/BIRC3。
68.如权利要求1-67中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段减少表达TNFR2的细胞中的NFκB活化。
69.如权利要求67或68所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述细胞是调节性T细胞(T-reg细胞)或癌细胞。
70.如权利要求1-69中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段以不大于约10nM的KD特异性结合所述TNFR2。
71.如权利要求70所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段以不大于1nM的KD特异性结合所述TNFR2。
72.如权利要求71所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段以约621pM的KD特异性结合所述TNFR2。
73.如权利要求71所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段以约44pM的KD特异性结合所述TNFR2。
74.如权利要求1-73中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段以至少约104M-1s-1的kon特异性结合所述TNFR2以形成抗体-抗原复合物。
75.如权利要求74所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段以约4.9x106M-1s-1的kon特异性结合所述TNFR2以形成抗体-抗原复合物。
76.如权利要求74所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段以约3.6x105M-1s-1的kon特异性结合所述TNFR2以形成抗体-抗原复合物。
77.如权利要求1-75中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段特异性结合所述TNFR2以形成抗体-抗原复合物，并且其中所述复合物以不大于约10-3s-1的koff解离。
78.如权利要求77所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段以不大于约3.0x10-5s-1的koff与所述TNFR2解离。
79.如权利要求78所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段以约2.2x10-4s-1的koff与所述TNFR2解离。
80.如权利要求1-79中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段减少或抑制T-reg细胞群的增殖和/或诱导CD8+效应T细胞群的增殖。
81.如权利要求80所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述T-reg细胞表达CD25高。
82.如权利要求80或81所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段在TNFα存在的情况下减少或抑制所述T-reg细胞群的增殖。
83.如权利要求1-82中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段减少或抑制表达TNFR2的癌细胞群的增殖。
84.如权利要求83所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述癌细胞选自由以下组成的组：霍奇金淋巴瘤细胞、皮肤非霍奇金淋巴瘤细胞、T细胞淋巴瘤细胞、卵巢癌细胞、结肠癌细胞、多发性骨髓瘤细胞和肾细胞癌细胞。
85.如权利要求1-84中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段减少或抑制骨髓源性抑制细胞群的增殖。
86.如权利要求1-85中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段选自由以下组成的组：单克隆抗体或其抗原结合片段、多克隆抗体或其抗原结合片段、人抗体或其抗原结合片段、人源化抗体或其抗原结合片段、灵长类化抗体或其抗原结合片段、双特异性抗体或其抗原结合片段、多特异性抗体或其抗原结合片段、双重可变免疫球蛋白结构域、单价抗体或其抗原结合片段、嵌合抗体或其抗原结合片段、单链Fv分子(scFv)、双抗体、三抗体、纳米抗体、抗体样蛋白支架、结构域抗体、Fv片段、Fab片段、F(ab’)2分子以及串联scFv(taFv)。
87.如权利要求86所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段是人抗体、人源化抗体或嵌合抗体或其抗原结合片段。
88.如权利要求1-87中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段是人IgG2同种型抗体或其抗原结合片段。
89.如权利要求1-87中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体与治疗剂缀合。
90.如权利要求89所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述治疗剂是细胞毒性剂。
91.一种构建体，其包含第一多肽结构域和第二多肽结构域，其中所述第一多肽结构域和所述第二多肽结构域各自独立地为权利要求1-90中任一项所述的抗原结合片段。
92.如权利要求91所述的构建体，其中所述第一多肽结构域和所述第二多肽结构域通过共价接头结合。
93.如权利要求92所述的构建体，其中所述共价接头包含酰胺键。
94.如权利要求93所述的构建体，其中所述共价接头包含二硫键。
95.一种多核苷酸，其编码权利要求1-90中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
96.一种多核苷酸，其编码权利要求91-94中任一项所述的构建体。
97.一种载体，其包含权利要求95或96所述的多核苷酸。
98.如权利要求97所述的载体，其中所述载体是表达载体。
99.如权利要求98所述的载体，其中所述表达载体是真核表达载体。
100.如权利要求97所述的载体，其中所述载体是病毒载体。
101.如权利要求100所述的载体，其中所述病毒载体选自由以下组成的组：腺病毒(Ad)、逆转录病毒、痘病毒、腺相关病毒、杆状病毒、单纯疱疹病毒和牛痘病毒。
102.如权利要求101所述的载体，其中所述腺病毒是血清型1-57腺病毒。
103.如权利要求102所述的载体，其中所述腺病毒是血清型5、26、35或48腺病毒。
104.如权利要求101所述的载体，其中所述逆转录病毒是γ-逆转录病毒或慢病毒。
105.如权利要求101所述的载体，其中所述牛痘病毒是修饰的牛痘安卡拉(MVA)。
106.一种分离的宿主细胞，其包含权利要求97-105中任一项所述的载体。
107.如权利要求106所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是原核细胞。
108.如权利要求106所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是真核细胞。
109.如权利要求108所述的宿主细胞，其中所述真核细胞是哺乳动物细胞。
110.如权利要求109所述的宿主细胞，其中所述哺乳动物细胞是CHO细胞。
111.一种包含抗体或其抗原结合片段的药物组合物，所述抗体或其抗原结合片段在CRD3和/或CRD4内的表位处特异性结合人TNFR2，而不在由CRD1内的一个或多个氨基酸限定的表位处结合TNFR2，其中所述药物组合物中至少50％的所述抗体或其抗原结合片段存在于单个二硫键结合的同种型中。
112.如权利要求111所述的药物组合物，其中所述抗体或其抗原结合片段包含人IgG2铰链区，其在所述IgG2铰链区氨基酸序列的位置232和/或233处缺少半胱氨酸残基。
113.如权利要求111或112所述的药物组合物，其中所述抗体或其抗原结合片段包含人IgG2铰链区，其在所述IgG2铰链区氨基酸序列的位置232处缺少半胱氨酸残基。
114.如权利要求111-113中任一项所述的药物组合物，其中所述抗体或其抗原结合片段包含人IgG2铰链区，其在所述IgG2铰链区氨基酸序列的位置233处缺少半胱氨酸残基。
115.如权利要求111-114中任一项所述的药物组合物，其中所述抗体或其抗原结合片段包含人IgG2铰链区，其在所述IgG2铰链区氨基酸序列的位置232和/或233处具有除半胱氨酸外的氨基酸。
116.如权利要求115所述的药物组合物，其中所述抗体或其抗原结合片段包含人IgG2铰链区，其在所述IgG2铰链区氨基酸序列的位置232处具有除半胱氨酸外的氨基酸。
117.如权利要求115或116所述的药物组合物，其中所述抗体或其抗原结合片段包含人IgG2铰链区，其在所述IgG2铰链区氨基酸序列的位置233处具有除半胱氨酸外的氨基酸。
118.如权利要求111-117中任一项所述的药物组合物，其中所述抗体或其抗原结合片段包含人IgG2铰链区，其在所述IgG2铰链区氨基酸序列的位置232和/或233处具有丝氨酸残基。
119.如权利要求118所述的药物组合物，其中所述抗体或其抗原结合片段包含人IgG2铰链区，其在所述IgG2铰链区氨基酸序列的位置232处具有丝氨酸残基。
120.如权利要求118或119所述的药物组合物，其中所述抗体或其抗原结合片段包含人IgG2铰链区，其在所述IgG2铰链区氨基酸序列的位置233处具有丝氨酸残基。
121.如权利要求111-120中任一项所述的药物组合物，其中所述抗体或其抗原结合片段包含人IgG2铰链区，其在半胱氨酸残基232和233之一或两者处包含氨基酸取代或缺失。
122.如权利要求121所述的药物组合物，其中所述IgG2铰链区在半胱氨酸残基232和233之一或两者处包含氨基酸取代。
123.如权利要求122所述的药物组合物，其中所述IgG2铰链区在半胱氨酸残基232处包含氨基酸取代。
124.如权利要求122或123所述的药物组合物，其中所述IgG2铰链区在半胱氨酸残基233处包含氨基酸取代。
125.如权利要求122-124中任一项所述的药物组合物，其中所述氨基酸取代是保守氨基酸取代。
126.如权利要求125所述的药物组合物，其中所述IgG2铰链区包含C232S取代。
127.如权利要求125或126所述的药物组合物，其中所述IgG2铰链区包含C233S取代。
128.如权利要求111-127中任一项所述的药物组合物，其中所述IgG2铰链区具有与SEQID NO:291的氨基酸具有至少85％同一性的氨基酸序列。
129.如权利要求128所述的药物组合物，其中所述IgG2铰链区具有与SEQ ID NO:291的氨基酸具有至少90％同一性的氨基酸序列。
130.如权利要求129所述的药物组合物，其中所述IgG2铰链区具有与SEQ ID NO:291的氨基酸具有至少95％同一性的氨基酸序列。
131.如权利要求130所述的药物组合物，其中除了氨基酸取代C232S和C233S外，所述IgG2铰链区具有SEQ ID NO:291的氨基酸序列。
132.如权利要求111-131中任一项所述的药物组合物，其中所述抗体或其抗原结合片段包含彼此相隔至少约
Figure FDA0003027090140000261
的距离的抗原结合位点。
133.如权利要求132所述的药物组合物，其中所述抗原结合位点彼此相隔至少约
Figure FDA0003027090140000262
的距离。
134.如权利要求133所述的药物组合物，其中所述抗原结合位点彼此相隔至少约
Figure FDA0003027090140000263
的距离。
135.如权利要求134所述的药物组合物，其中所述抗原结合位点彼此相隔至少约
Figure FDA0003027090140000271
的距离。
136.如权利要求111-131中任一项所述的药物组合物，其中所述抗原结合位点彼此相隔约
Figure FDA0003027090140000272
至约
Figure FDA0003027090140000273
的距离。
137.如权利要求136所述的药物组合物，其中所述抗原结合位点彼此间相隔约
Figure FDA0003027090140000274
至约
Figure FDA0003027090140000275
的距离。
138.如权利要求136所述的药物组合物，其中所述抗原结合位点彼此间相隔约
Figure FDA0003027090140000276
至约
Figure FDA0003027090140000277
的距离。
139.如权利要求136所述的药物组合物，其中所述抗原结合位点彼此间相隔约
Figure FDA0003027090140000278
至约
Figure FDA0003027090140000279
的距离。
140.如权利要求111-139中任一项所述的药物组合物，其中所述抗体或其抗原结合片段包含：
(a)具有与SEQ ID NO:302的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列的重链；
(b)具有与SEQ ID NO:303的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列的重链；
(c)具有与SEQ ID NO:304的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列的重链；
(d)具有与SEQ ID NO:305的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列的重链；或者
(e)具有与SEQ ID NO:306的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列的重链；和/或
(f)具有与SEQ ID NO:297的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列的轻链；
(g)具有与SEQ ID NO:298的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列的轻链；
(h)具有与SEQ ID NO:299的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列的轻链；
(i)具有与SEQ ID NO:300的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列的轻链；或者
(j)具有与SEQ ID NO:301的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列的轻链。
141.如权利要求140所述的药物组合物，其中所述抗体或其抗原结合片段包含：
(a)具有与SEQ ID NO:302的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列的重链，和具有与SEQ ID NO:297的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列的轻链；
(b)具有与SEQ ID NO:302的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列的重链，和具有与SEQ ID NO:298的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列的轻链；
(c)具有与SEQ ID NO:302的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列的重链，和具有与SEQ ID NO:299的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列的轻链；
(d)具有与SEQ ID NO:302的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列的重链，和具有与SEQ ID NO:300的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列的轻链；
(e)具有与SEQ ID NO:302的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列的重链，和具有与SEQ ID NO:301的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列的轻链；
(f)具有与SEQ ID NO:303的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列的重链，和具有与SEQ ID NO:297的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列的轻链；
(g)具有与SEQ ID NO:303的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列的重链，和具有与SEQ ID NO:298的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列的轻链；
(h)具有与SEQ ID NO:303的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列的重链，和具有与SEQ ID NO:299的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列的轻链；
(i)具有与SEQ ID NO:303的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列的重链，和具有与SEQ ID NO:300的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列的轻链；
(j)具有与SEQ ID NO:303的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列的重链，和具有与SEQ ID NO:301的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列的轻链；
(k)具有与SEQ ID NO:304的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列的重链，和具有与SEQ ID NO:297的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列的轻链；
(l)具有与SEQ ID NO:304的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列的重链，和具有与SEQ ID NO:298的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列的轻链；
(m)具有与SEQ ID NO:304的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列的重链，和具有与SEQ ID NO:299的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列的轻链；
(n)具有与SEQ ID NO:304的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列的重链，和具有与SEQ ID NO:300的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列的轻链；
(o)具有与SEQ ID NO:304的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列的重链，和具有与SEQ ID NO:301的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列的轻链；
(p)具有与SEQ ID NO:305的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列的重链，和具有与SEQ ID NO:297的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列的轻链；
(q)具有与SEQ ID NO:305的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列的重链，和具有与SEQ ID NO:298的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列的轻链；
(r)具有与SEQ ID NO:305的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列的重链，和具有与SEQ ID NO:299的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列的轻链；
(s)具有与SEQ ID NO:305的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列的重链，和具有与SEQ ID NO:300的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列的轻链；
(t)具有与SEQ ID NO:305的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列的重链，和具有与SEQ ID NO:301的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列的轻链；
(u)具有与SEQ ID NO:306的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列的重链，和具有与SEQ ID NO:297的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列的轻链；
(v)具有与SEQ ID NO:306的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列的重链，和具有与SEQ ID NO:298的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列的轻链；
(w)具有与SEQ ID NO:306的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列的重链，和具有与SEQ ID NO:299的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列的轻链；
(x)具有与SEQ ID NO:306的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列的重链，和具有与SEQ ID NO:300的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列的轻链；或者
(y)具有与SEQ ID NO:306的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列的重链，和具有与SEQ ID NO:301的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列的轻链。
142.如权利要求111-141中任一项所述的药物组合物，其中所述抗体或其抗原结合片段包含互补决定区(CDR)重链1(CDR1)，所述互补决定区重链1具有氨基酸序列GJTF(J)2Y(SEQ ID NO:276)或GJTF(J)2YJ(SEQ ID NO:277)，其中每个J独立地为天然存在的氨基酸。
143.如权利要求142所述的药物组合物，其中所述抗体或其抗原结合片段还包含：
(a)CDR-H2，其具有氨基酸序列(J)3GSJ或(J)5GSJ；
(b)CDR-H3，其具有氨基酸序列JRJDGJSJY(J)2FDJ(SEQ ID NO:278)或JRJDGSY(J)2FD(J)3(SEQ ID NO:279)；
(c)CDR-L1，其具有氨基酸序列(J)9Y或(J)5Y；
(d)CDR-L2，其具有氨基酸序列(J)6S或(J)2S；和/或
(e)CDR-L3，其具有氨基酸序列(J)5Y(J)2T或(J)3Y(J)4T。
144.如权利要求111-141中任一项所述的药物组合物，其中所述抗体或其抗原结合片段包含具有氨基酸序列Z4FZ3Z5SSZ5或Z4YZ3Z5TDZ5X的CDR-H1；
其中每个Z3独立地为在生理pH下包含极性、不带电荷的侧链的氨基酸；
每个Z4独立地为甘氨酸或丙氨酸；
每个Z5独立地为包含疏水侧链的氨基酸；以及
每个X独立地为亮氨酸或异亮氨酸。
145.如权利要求142所述的药物组合物，其中所述抗体或其抗原结合片段还包含：
(a)CDR-H2，其具有氨基酸序列SSGZ4Z3Y(SEQ ID NO:263)或VDPEYZ4Z3T(SEQ ID NO:264)；
(b)CDR-H3，其具有氨基酸序列QZ1VZ2Z4YZ3SZ5WYZ5Z2Z5(SEQ ID NO:265)或AZ1DZ2Z4Z3Z5SPZ5Z2Z5WG(SEQ ID NO:266)；
(c)CDR-L1，其具有氨基酸序列SASSSVYYMZ5(SEQ ID NO:267)或QNINKZ5(SEQ ID NO:268)；
(d)CDR-L2，其具有氨基酸序列STSNLAZ3(SEQ ID NO:269)、TYZ3或YTZ3；和/或
(e)CDR-L3，其具有氨基酸序列QQRRNZ5PYZ3(SEQ ID NO:270)或CLQZ5VNLXZ3(SEQ IDNO:271)；
其中每个Z1独立地为在生理酸pH下包含阳离子侧链的氨基酸；以及
每个Z2独立地为在生理pH下包含阴离子侧链的氨基酸。
146.如权利要求111-141中任一项所述的药物组合物，其中所述抗体或其抗原结合片段包含CDR-H1，其具有氨基酸序列GFTFSSY(SEQ ID NO:23)、GYTFTDYX(SEQ ID NO:257)或相对于所述序列具有最多两个氨基酸取代的氨基酸序列，其中每个X独立地为亮氨酸或异亮氨酸，任选地其中所述氨基酸取代是保守氨基酸取代。
147.如权利要求146所述的药物组合物，其中所述抗体或其抗原结合片段还包含：
(a)CDR-H2，其具有氨基酸序列SSGGSY(SEQ ID NO:24)、VDPEYGST(SEQ ID NO:258)或相对于所述序列具有最多两个氨基酸取代的氨基酸序列；
(b)CDR-H3，其具有氨基酸序列QRVDGYSSYWYFDV(SEQ ID NO:25)、ARDDGSYSPFDYWG(SEQID NO:259)或相对于所述序列具有最多两个氨基酸取代的氨基酸序列；
(c)CDR-L1，其具有氨基酸序列SASSSVYYMY(SEQ ID NO:26)、QNINKY(SEQ ID NO:260)或相对于所述序列具有最多两个氨基酸取代的氨基酸序列；
(d)CDR-L2，其具有氨基酸序列STSNLAS(SEQ ID NO:27)、TYS、YTS或相对于SEQ ID NO:27的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代的氨基酸序列；和/或
(e)CDR-L3，其具有氨基酸序列QQRRNYPYT(SEQ ID NO:28)、CLQYVNLXT(SEQ ID NO:261)或相对于所述序列具有最多两个氨基酸取代的氨基酸序列；
任选地其中所述氨基酸取代是保守氨基酸取代。
148.如权利要求111-147中任一项所述的药物组合物，其中所述抗体或其抗原结合片段包含重链，所述重链包含以下CDR中的一个或多个：
(a)CDR-H1，其具有氨基酸序列GFTFSSY(SEQ ID NO:23)；
(b)CDR-H2，其具有氨基酸序列SSGGSY(SEQ ID NO:24)；和
(c)CDR-H3，其具有氨基酸序列QRVDGYSSYWYFDV(SEQ ID NO:25)。
149.如权利要求111-147中任一项所述的药物组合物，其中所述抗体或其抗原结合片段包含重链，所述重链包含以下CDR中的一个或多个：
(a)CDR-H1，其具有氨基酸序列GYTFTDYX(SEQ ID NO:257)；
(b)CDR-H2，其具有氨基酸序列VDPEYGST(SEQ ID NO:258)；和
(c)CDR-H3，其具有氨基酸序列ARDDGSYSPFDYWG(SEQ ID NO:259)；
其中每个X独立地为亮氨酸或异亮氨酸。
150.如权利要求149所述的药物组合物，其中所述CDR-H1具有氨基酸序列GYTFTDYL(SEQ ID NO:274)。
151.如权利要求149所述的药物组合物，其中所述CDR-H1具有氨基酸序列GYTFTDYI(SEQ ID NO:275)。
152.如权利要求111-151中任一项所述的药物组合物，其中所述抗体或其抗原结合片段包含轻链，所述轻链包含以下CDR中的一个或多个：
(a)CDR-L1，其具有氨基酸序列SASSSVYYMY(SEQ ID NO:26)；
(b)CDR-L2，其具有氨基酸序列STSNLAS(SEQ ID NO:27)；和
(c)CDR-L3，其具有氨基酸序列QQRRNYPYT(SEQ ID NO:28)。
153.如权利要求111-151中任一项所述的药物组合物，其中所述抗体或其抗原结合片段包含轻链，所述轻链包含以下CDR中的一个或多个：
(a)CDR-L1，其具有氨基酸序列QNINKY(SEQ ID NO:260)；
(b)CDR-L2，其具有氨基酸序列TYS或YTS；和
(c)CDR-L3，其具有氨基酸序列CLQYVNLXT(SEQ ID NO:261)；
其中每个X独立地为亮氨酸或异亮氨酸。
154.如权利要求153所述的药物组合物，其中所述CDR-L2具有氨基酸序列TYS。
155.如权利要求153所述的药物组合物，其中所述CDR-L2具有氨基酸序列YTS。
156.如权利要求153-155中任一项所述的药物组合物，其中所述CDR-L3具有氨基酸序列CLQYNVNLLT(SEQ ID NO:272)。
157.如权利要求148-150中任一项所述的药物组合物，其中所述CDR-L3具有氨基酸序列CLQYVNLIT(SEQ ID NO:273)。
158.如权利要求111-157中任一项所述的药物组合物，其中所述抗体或其抗原结合片段包含三个重链CDR，所述三个重链CDR包含：
(a)CDR-H1，其具有氨基酸序列GFTFSSY(SEQ ID NO:23)；
(b)CDR-H2，其具有氨基酸序列SSGGSY(SEQ ID NO:24)；和
(c)CDR-H3，其具有氨基酸序列QRVDGYSSYWYFDV(SEQ ID NO:25)；
并且其中所述抗体或其抗原结合片段还包含三个轻链CDR，所述三个轻链CDR包含：
(d)CDR-L1，其具有氨基酸序列SASSSVYYMY(SEQ ID NO:26)；
(e)CDR-L2，其具有氨基酸序列STSNLAS(SEQ ID NO:27)；和
(f)CDR-L3，其具有氨基酸序列QQRRNYPYT(SEQ ID NO:28)。
159.如权利要求111-157中任一项所述的药物组合物，其中所述抗体或其抗原结合片段包含三个重链CDR，所述三个重链CDR包含：
(a)CDR-H1，其具有氨基酸序列GYTFTDYX(SEQ ID NO:257)；
(b)CDR-H2，其具有氨基酸序列VDPEYGST(SEQ ID NO:258)；和
(c)CDR-H3，其具有氨基酸序列ARDDGSYSPFDYWG(SEQ ID NO:259)；
并且其中所述抗体或其抗原结合片段还包含三个轻链CDR，所述三个轻链CDR包含：
(d)CDR-L1，其具有氨基酸序列QNINKY(SEQ ID NO:260)；
(e)CDR-L2，其具有氨基酸序列TYS或YTS；和
(f)CDR-L3，其具有氨基酸序列CLQYVNLXT(SEQ ID NO:261)；
其中每个X独立地为亮氨酸或异亮氨酸。
160.如权利要求159所述的药物组合物，其中所述CDR-H1具有氨基酸序列GYTFTDYL(SEQ ID NO:274)。
161.如权利要求159所述的药物组合物，其中所述CDR-H1具有氨基酸序列GYTFTDYI(SEQ ID NO:275)。
162.如权利要求159-161中任一项所述的药物组合物，其中所述CDR-L2具有氨基酸序列TYS。
163.如权利要求159-161中任一项所述的药物组合物，其中所述CDR-L2具有氨基酸序列YTS。
164.如权利要求159-163中任一项所述的药物组合物，其中所述CDR-L3具有氨基酸序列CLQYNVNLLT(SEQ ID NO:272)。
165.如权利要求159-163中任一项所述的药物组合物，其中所述CDR-L3具有氨基酸序列CLQYVNLIT(SEQ ID NO:273)。
166.如权利要求143、145、147和152-165中任一项所述的药物组合物，其中所述抗体或其抗原结合片段包含具有结合到所述CDR-L2的N末端的氨基酸序列LLIR(SEQ ID NO:262)的框架区。
167.如权利要求143、145、146和152-166中任一项所述的药物组合物，其中所述抗体或其抗原结合片段包含具有结合到所述CDR-L2的C末端的氨基酸序列TLE的框架区。
168.如权利要求111-167中任一项所述的药物组合物，其中所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变结构域，所述重链可变结构域具有与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列。
169.如权利要求168所述的药物组合物，其中所述重链可变结构域具有与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少90％同一性例如至少95％、97％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
170.如权利要求111-169中任一项所述的药物组合物，其中所述抗体或其抗原结合片段包含轻链可变结构域，所述轻链可变结构域具有与SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列。
171.如权利要求170所述的药物组合物，其中所述轻链可变结构域具有与SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少90％同一性例如至少95％、97％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
172.如权利要求168-171中任一项所述的药物组合物，其中所述抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的重链可变结构域和具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的轻链可变结构域。
173.如权利要求111-172中任一项所述的药物组合物，其中所述抗体或抗原结合片段以小于约100nM的KD与具有SEQ ID NO:11、19、20和34-117中的任一个的氨基酸序列的肽特异性结合，并且不结合包含SEQ ID NO:7的氨基酸56-60(KCSPG)的肽。
174.如权利要求111-173中任一项所述的药物组合物，其中所述抗体或其抗原结合片段在以下内的表位处特异性结合所述TNFR2：
(a)SEQ ID NO:7的氨基酸142-146(KCRPG)；
(b)SEQ ID NO:7的氨基酸142-149(KCRPGFGV)；
(c)SEQ ID NO:7的氨基酸137-144(CAPLRKCR)；
(d)SEQ ID NO:7的氨基酸150-190(RPGTETSDVVCKPCAPGTFSNTTSSTDICRPHQICNVVAI)；
(e)SEQ ID NO:7的氨基酸161-169(CKPCAPGTF)；
(f)SEQ ID NO:7的氨基酸75-128(CDSCEDSTYTQLWNWVPECLSCGSRCSSDQVETQACTREQNRICTCRPGWYCAL)，任选地其中所述表位在SEQ ID NO:7的氨基酸80-86(DSTYTQL)、91-98(PECLSCGS)或116-123(RICTCRPG)内；
(g)SEQ ID NO:7的氨基酸174-184(SSTDICRPHQI)；
(h)SEQ ID NO:7的氨基酸126-140(CALSKQEGCRLCAPL)；和/或
(i)SEQ ID NO:7的氨基酸156-165(TSDVVCKPCA)。
175.如权利要求111-174中任一项所述的药物组合物，其中所述抗体或其抗原结合片段抑制TNFR2信号传导。
176.如权利要求111-175中任一项所述的药物组合物，其中所述抗体或其抗原结合片段减少表达TNFR2的细胞中的选自由以下组成的组的一种或多种基因的表达：CHUK、NFKBIE、NFKBIA、MAP3K11、TRAF2、TRAF3、relB和cIAP2/BIRC3。
177.如权利要求111-176中任一项所述的药物组合物，其中所述抗体或其抗原结合片段减少表达TNFR2的细胞中的NFκB活化。
178.如权利要求176或177所述的药物组合物，其中所述细胞是调节性T(T-reg)细胞或癌细胞。
179.如权利要求111-178中任一项所述的药物组合物，其中所述抗体或其抗原结合片段以不大于约10nM的KD特异性结合所述TNFR2。
180.如权利要求179所述的药物组合物，其中所述抗体或其抗原结合片段以不大于约1nM的KD特异性结合所述TNFR2。
181.如权利要求180所述的药物组合物，其中所述抗体或其抗原结合片段以约621pM的KD特异性结合所述TNFR2。
182.如权利要求180所述的药物组合物，其中所述抗体或其抗原结合片段以约44pM的KD特异性结合所述TNFR2。
183.如权利要求111-182中任一项所述的药物组合物，其中所述抗体或其抗原结合片段以至少约104M-1s-1的kon特异性结合所述TNFR2以形成抗体-抗原复合物。
184.如权利要求183所述的药物组合物，其中所述抗体或其抗原结合片段以约4.9x106M-1s-1的kon特异性结合所述TNFR2以形成抗体-抗原复合物。
185.如权利要求184所述的药物组合物，其中所述抗体或其抗原结合片段以约3.6x105M-1s-1的kon特异性结合所述TNFR2以形成抗体-抗原复合物。
186.如权利要求111-185中任一项所述的药物组合物，其中所述抗体或其抗原结合片段特异性结合所述TNFR2以形成抗体-抗原复合物，并且其中所述复合物以不大于约10-3s-1的koff解离。
187.如权利要求186所述的药物组合物，其中所述抗体或其抗原结合片段以不大于约3.0x10-5s-1的koff与所述TNFR2解离。
188.如权利要求186所述的药物组合物，其中所述抗体或其抗原结合片段以约2.2x10- 4s-1的koff与所述TNFR2解离。
189.如权利要求111-188中任一项所述的药物组合物，其中所述抗体或其抗原结合片段减少或抑制T-reg细胞群的增殖和/或诱导CD8+效应T细胞群的增殖。
190.如权利要求189所述的药物组合物，其中所述T-reg细胞表达CD25高。
191.如权利要求188-190中任一项所述的药物组合物，其中所述抗体或其抗原结合片段在TNFα存在的情况下减少或抑制所述T-reg细胞群的增殖。
192.如权利要求111-191中任一项所述的药物组合物，其中所述抗体或其抗原结合片段减少或抑制表达TNFR2的癌细胞群的增殖。
193.如权利要求192所述的药物组合物，其中所述癌细胞选自由以下组成的组：霍奇金淋巴瘤细胞、皮肤非霍奇金淋巴瘤细胞、T细胞淋巴瘤细胞、卵巢癌细胞、结肠癌细胞、多发性骨髓瘤细胞和肾细胞癌细胞。
194.如权利要求111-193中任一项所述的药物组合物，其中所述抗体或其抗原结合片段减少或抑制骨髓源性抑制细胞群的增殖。
195.如权利要求111-194中任一项所述的药物组合物，其中所述抗体或其抗原结合片段选自由以下组成的组：单克隆抗体或其抗原结合片段、多克隆抗体或其抗原结合片段、人抗体或其抗原结合片段、人源化抗体或其抗原结合片段、灵长类动物化抗体或其抗原结合片段、双特异性抗体或其抗原结合片段、多特异性抗体或其抗原结合片段、双重可变免疫球蛋白结构域、单价抗体或其抗原结合片段、嵌合抗体或其抗原结合片段、单链Fv分子(scFv)、双抗体、三抗体、纳米抗体、抗体样蛋白支架、结构域抗体、Fv片段、Fab片段、F(ab’)2分子和串联scFv(taFv)。
196.如权利要求195所述的药物组合物，其中所述抗体或其抗原结合片段是人抗体、人源化抗体或嵌合抗体或其抗原结合片段。
197.如权利要求111-196中任一项所述的药物组合物，其中所述抗体或其抗原结合片段为人IgG2同种型抗体或其抗原结合片段。
198.如权利要求111-197中任一项所述的药物组合物，其中所述抗体与治疗剂缀合。
199.如权利要求198所述的药物组合物，其中所述治疗剂为细胞毒性剂。
200.如权利要求111-199中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物中至少75％的所述抗体或其抗原结合片段以单个二硫键结合的同种型存在。
201.如权利要求200所述的药物组合物，其中所述药物组合物中至少80％的所述抗体或其抗原结合片段以单个二硫键结合的同种型存在。
202.如权利要求201所述的药物组合物，其中所述药物组合物中至少85％的所述抗体或其抗原结合片段以单个二硫键结合的同种型存在。
203.如权利要求202所述的药物组合物，其中所述药物组合物中至少90％的所述抗体或其抗原结合片段以单个二硫键结合的同种型存在。
204.如权利要求203所述的药物组合物，其中所述药物组合物中至少95％的所述抗体或其抗原结合片段以单个二硫键结合的同种型存在。
205.如权利要求111-199中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物中约75％至约99.9％的所述抗体或其抗原结合片段以单个二硫键结合的同种型存在。
206.如权利要求205所述的药物组合物，其中所述药物组合物中约80％至约99.9％的所述抗体或其抗原结合片段以单个二硫键结合的同种型存在。
207.如权利要求206所述的药物组合物，其中所述药物组合物中约85％至约99.9％的所述抗体或其抗原结合片段以单个二硫键结合的同种型存在。
208.如权利要求207所述的药物组合物，其中所述药物组合物中约90％至约99.9％的所述抗体或其抗原结合片段以单个二硫键结合的同种型存在。
209.如权利要求208所述的药物组合物，其中所述药物组合物中约95％至约99.9％的所述抗体或其抗原结合片段以单个二硫键结合的同种型存在。
210.如权利要求111-209中任一项所述的药物组合物，其中所述抗体或其抗原结合片段在于非还原条件下进行凝胶电泳分析时产生单一可检测的条带。
211.如权利要求111-210中任一项所述的药物组合物，其中所述单个二硫键结合的同种型为IgG2-A。
212.一种药物组合物，其包含权利要求1-90中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求91-94中任一项所述的构建体、权利要求95或96所述的多核苷酸、权利要求97-105中任一项所述的载体或权利要求106和108-110中任一项所述的宿主细胞，以及药学上可接受的载体或赋形剂。
213.如权利要求111-212中任一项所述的药物组合物，其中所述抗体或其抗原结合片段以约0.001mg/ml至约100mg/ml的量存在于所述药物组合物中。
214.如权利要求111-213中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物还包含另外的治疗剂。
215.如权利要求214所述的药物组合物，其中所述另外的治疗剂是免疫治疗剂。
216.如权利要求215所述的药物组合物，其中所述免疫治疗剂选自由以下组成的组：抗CTLA-4剂、抗PD-1剂、抗PD-L1剂、抗PD-L2剂、TNF-α交联剂、TRAIL交联剂、抗CD27剂、抗CD30剂、抗CD40剂、抗4-1BB剂、抗GITR剂、抗OX40剂、抗TRAILR1剂、抗TRAILR2剂、抗TWEAK剂、抗TWEAKR剂、抗细胞表面淋巴细胞蛋白剂、抗BRAF剂、抗MEK剂、抗CD33剂、抗CD20剂、抗HLA-DR剂、抗HLAI类剂、抗CD52剂、抗A33剂、抗GD3剂、抗PSMA剂、抗Ceacan 1剂、抗Galedin 9剂、抗HVEM剂、抗VISTA剂、抗B7 H4剂、抗HHLA2剂、抗CD155剂、抗CD80剂、抗BTLA剂、抗CD160剂、抗CD28剂、抗CD226剂、抗CEACAM1剂、抗TIM3剂、抗TIGIT剂、抗CD96剂、抗CD70剂、抗CD27剂、抗LIGHT剂、抗CD137剂、抗DR4剂、抗CR5剂、抗TNFRS剂、抗TNFR1剂、抗FAS剂、抗CD95剂、抗TRAIL剂、抗DR6剂、抗EDAR剂、抗NGFR剂、抗OPG剂、抗RANKL剂、抗LTβ受体剂、抗BCMA剂、抗TACI剂、抗BAFFR剂、抗EDAR2剂、抗TROY剂和抗RELT剂，任选地其中所述免疫治疗剂为抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体。
217.如权利要求216所述的药物组合物，其中所述免疫治疗剂选自由以下组成的组：抗CTLA-4抗体或其抗原结合片段、抗PD-1抗体或其抗原结合片段、抗PD-L1抗体或其抗原结合片段、抗PD-L2抗体或其抗原结合片段、TNF-α交联抗体或其抗原结合片段、TRAIL交联抗体或其抗原结合片段、抗CD27抗体或其抗原结合片段、抗CD30抗体或其抗原结合片段、抗CD40抗体或其抗原结合片段、抗4-1BB抗体或其抗原结合片段、抗GITR抗体或其抗原结合片段、抗OX40抗体或其抗原结合片段、抗TRAILR1抗体或其抗原结合片段、抗TRAILR2抗体或其抗原结合片段、抗TWEAK抗体或其抗原结合片段、抗TWEAKR抗体或其抗原结合片段、抗细胞表面淋巴细胞蛋白抗体或其抗原结合片段、抗BRAF抗体或其抗原结合片段、抗MEK抗体或其抗原结合片段、抗CD33抗体或其抗原结合片段、抗CD20抗体或其抗原结合片段、抗HLA-DR抗体或其抗原结合片段、抗HLA I类抗体或其抗原结合片段、抗CD52抗体或其抗原结合片段、抗A33抗体或其抗原结合片段、抗GD3抗体或其抗原结合片段、抗PSMA抗体或其抗原结合片段、抗Ceacan 1抗体或其抗原结合片段、抗Galedin 9抗体或其抗原结合片段、抗HVEM抗体或其抗原结合片段、抗VISTA抗体或其抗原结合片段、抗B7 H4抗体或其抗原结合片段、抗HHLA2抗体或其抗原结合片段、抗CD155抗体或其抗原结合片段、抗CD80抗体或其抗原结合片段、抗BTLA抗体或其抗原结合片段、抗CD160抗体或其抗原结合片段、抗CD28抗体或其抗原结合片段、抗CD226抗体或其抗原结合片段、抗CEACAM1抗体或其抗原结合片段、抗TIM3抗体或其抗原结合片段、抗TIGIT抗体或其抗原结合片段、抗CD96抗体或其抗原结合片段、抗CD70抗体或其抗原结合片段、抗CD27抗体或其抗原结合片段、抗LIGHT抗体或其抗原结合片段、抗CD137抗体或其抗原结合片段、抗DR4抗体或其抗原结合片段、抗CR5抗体或其抗原结合片段、抗TNFRS抗体或其抗原结合片段、抗TNFR1抗体或其抗原结合片段、抗FAS抗体或其抗原结合片段、抗CD95抗体或其抗原结合片段、抗TRAIL抗体或其抗原结合片段、抗DR6抗体或其抗原结合片段、抗EDAR抗体或其抗原结合片段、抗NGFR抗体或其抗原结合片段、抗OPG抗体或其抗原结合片段、抗RANKL抗体或其抗原结合片段、抗LTβ受体抗体或其抗原结合片段、抗BCMA抗体或其抗原结合片段、抗TACI抗体或其抗原结合片段、抗BAFFR抗体或其抗原结合片段、抗EDAR2抗体或其抗原结合片段、抗TROY抗体或其抗原结合片段和抗RELT抗体或其抗原结合片段。
218.如权利要求216所述的药物组合物，其中所述免疫治疗剂为抗CTLA-4剂或抗PD-1剂。
219.如权利要求217所述的药物组合物，其中所述免疫治疗剂是抗CTLA-4抗体或其抗原结合片段或抗PD-1抗体或其抗原结合片段。
220.如权利要求218所述的药物组合物，其中所述抗CTLA-4抗体为伊匹木单抗或曲美木单抗。
221.如权利要求219或220所述的药物组合物，其中所述抗PD-1抗体为纳武单抗、帕博利珠单抗、阿维鲁单抗、德瓦鲁单抗或阿妥珠单抗。
222.如权利要求214所述的药物组合物，其中所述另外的治疗剂为嵌合抗原受体(CAR-T)剂、化学治疗剂、小分子抗癌剂或癌症疫苗。
223.一种产生权利要求1-90中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括在宿主细胞中表达编码所述抗体或其抗原结合片段的多核苷酸，以及从宿主细胞培养基中回收所述抗体或其抗原结合片段。
224.一种产生权利要求91-94中任一项所述的构建体的方法，所述方法包括在宿主细胞中表达编码所述构建体的多核苷酸，以及从宿主细胞培养基中回收所述构建体。
225.一种减少或抑制人中由T-reg细胞介导的免疫响应的方法，所述方法包括向所述人施用权利要求1-90中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求91-94中任一项所述的构建体、权利要求95或96所述的多核苷酸、权利要求97-105中任一项所述的载体、权利要求106和108-110中任一项所述的宿主细胞或权利要求111-222中任一项所述的药物组合物。
226.一种治疗人的细胞增殖病症的方法，所述方法包括向所述人施用权利要求1-90中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求91-94中任一项所述的构建体、权利要求95或96所述的多核苷酸、权利要求97-105中任一项所述的载体、权利要求106和108-110中任一项所述的宿主细胞或权利要求111-222中任一项所述的药物组合物。
227.如权利要求226所述的方法，其中所述细胞增殖病症是选自由以下组成的组的癌症：白血病、淋巴瘤、肝癌、骨癌、肺癌、脑癌、膀胱癌、胃肠癌、乳腺癌、贲门癌、宫颈癌、子宫癌、头颈癌、胆囊癌、喉癌、唇癌和口腔癌、眼癌、黑色素瘤、胰腺癌、前列腺癌、结肠直肠癌、睾丸癌以及喉癌。
228.如权利要求226所述的方法，其中所述细胞增殖病症是选自由以下组成的组的癌症：霍奇金淋巴瘤、皮肤非霍奇金淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、卵巢癌、结肠癌、多发性骨髓瘤、肾细胞癌、皮肤癌、肺癌、肝癌、子宫内膜癌、造血或淋巴系统癌、中枢神经系统癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌、食道癌和上消化道癌。
229.如权利要求228所述的方法，其中所述细胞增殖病症是选自由以下组成的组的癌症：T细胞淋巴瘤、卵巢癌和结肠癌。
230.如权利要求226所述的方法，其中所述细胞增殖病症是选自由以下组成的组的癌症：急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性骨髓性白血病(CML)、肾上腺皮质癌、AIDS相关淋巴瘤、原发性CNS淋巴瘤、肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤、非典型畸胎瘤样/横纹肌样瘤、基底细胞癌、胆管癌、肝外癌、尤文肉瘤家族、骨肉瘤和恶性纤维组织细胞瘤、中枢神经系统胚胎肿瘤、中枢神经系统生殖细胞肿瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、支气管肿瘤、伯基特淋巴瘤、类癌肿瘤、原发性淋巴瘤、脊索瘤、慢性骨髓增生性肿瘤、结肠癌、肝外胆管癌、原位导管癌(DCIS)、子宫内膜癌、室管膜瘤、食道癌、成感觉神经细胞瘤、颅外生殖细胞肿瘤、性腺外生殖细胞肿瘤、输卵管癌、骨纤维组织细胞瘤、胃肠类癌肿瘤、胃肠间质肿瘤(GIST)、睾丸生殖细胞肿瘤、妊娠滋养细胞疾病、神经胶质瘤、儿童脑干神经胶质瘤、毛细胞白血病、肝细胞癌、朗格汉斯细胞组织细胞增生症、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、胰岛细胞肿瘤、胰腺神经内分泌肿瘤、威尔姆斯肿瘤和其他儿童肾脏肿瘤、朗格汉斯细胞组织细胞增生症、小细胞肺癌、皮肤T细胞淋巴瘤、眼内黑色素瘤、梅克尔细胞癌、间皮瘤、转移性鳞状颈癌、中线道癌、多发性内分泌瘤形成综合征、多发性骨髓瘤/浆细胞肿瘤、骨髓增生异常综合征、鼻腔和副鼻窦癌、鼻咽癌、成神经细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、非小细胞肺癌(NSCLC)、上皮性卵巢癌、生殖细胞卵巢癌、低恶性潜能卵巢癌、胰腺神经内分泌肿瘤、乳头瘤病、副神经节瘤、副鼻窦和鼻腔癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、垂体肿瘤、胸膜肺母细胞瘤、原发性腹膜癌、直肠癌、肾癌、成视网膜细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、卡波济肉瘤、横纹肌肉瘤、塞扎里综合征、小肠癌、软组织肉瘤、喉癌、胸腺瘤和胸腺癌、甲状腺癌、肾盂和输尿管移行细胞癌、尿道癌、子宫内膜子宫癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌以及瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症。
231.一种治疗人的感染性疾病的方法，所述方法包括向所述人施用权利要求1-90中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求91-94中任一项所述的构建体、权利要求95或96所述的多核苷酸、权利要求97-105中任一项所述的载体、权利要求106和108-110中任一项所述的宿主细胞或权利要求111-222中任一项所述的药物组合物。
232.如权利要求231所述的方法，其中所述感染性疾病由选自由以下组成的组的一种或多种因子引起：病毒、细菌、真菌或寄生虫。
233.如权利要求232所述的方法，其中所述感染性疾病由选自由以下组成的组的病毒引起：丙型肝炎病毒、黄热病病毒、凯丹姆病毒、科萨努尔森林病病毒、兰加特病毒、鄂木斯克出血热病毒、波瓦森病毒、皇家农场病毒、喀什病毒、蜱传脑炎病毒、纽多佛病毒、索夫吉病毒、跳跃病病毒、根岸病毒、米班病毒、索马里兹礁病毒、秋列尼病毒、阿罗阿病毒、登革病毒、凯杜古病毒、卡西帕科利病毒、库坦戈病毒、日本脑炎病毒、墨累谷脑炎病毒、圣路易斯脑炎病毒、乌苏图病毒、西尼罗河病毒、雅温德病毒、科科贝拉病毒、巴加扎病毒、伊利乌斯病毒、以色列火鸡脑脊膜脑脊髓炎病毒、恩塔亚病毒、坦布苏病毒、寨卡病毒、班齐病毒、博博衣病毒、边山病毒、朱格拉病毒、萨沃亚病毒、赛皮克病毒、乌干达S病毒、韦塞尔斯布朗病毒、黄热病毒、恩德培蝙蝠病毒、横须贺病毒、阿波依病毒、牛骨山脊病毒、胡蒂亚帕病毒、摩多克病毒、萨尔别霍病毒、圣帕利塔病毒、布卡拉沙蝙蝠病毒、凯里岛病毒、达卡尔蝙蝠病毒、蒙大拿鼠耳蝙蝠脑白质炎病毒、金边蝙蝠病毒、里约布拉沃病毒、塔马纳蝙蝠病毒、细胞融合因子病毒、伊皮病毒、拉沙病毒、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)、莫巴拉病毒、莫佩亚病毒、阿马帕里病毒、弗莱克索病毒、瓜纳里托病毒、胡宁病毒、拉蒂诺病毒、马邱波病毒、奥利华斯病毒、巴拉那病毒、皮钦德病毒、皮里陶病毒、萨比亚病毒、塔卡里伯病毒、太米阿米病毒、怀特沃特阿罗约病毒、查帕雷病毒、卢约病毒、汉坦病毒、辛诺柏病毒、道格比病毒、布尼奥罗病毒、裂谷热病毒、拉克罗斯病毒、加利福尼亚脑炎病毒、克里米亚-刚果出血热(CCHF)病毒、埃博拉病毒、马尔堡病毒、委内瑞拉马脑炎病毒(VEE)、东方马脑炎病毒(EEE)、西方马脑炎病毒(WEE)、辛德毕斯病毒、风疹病毒、塞姆利基森林病毒、罗斯河病毒、巴马森林病毒、阿尼昂-尼昂病毒和基孔肯雅病毒、天花病毒、猴痘病毒、牛痘病毒、单纯疱疹病毒、人疱疹病毒、巨细胞病毒(CMV)、爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)、水痘-带状疱疹病毒、卡波西氏肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)、流感病毒、严重急性呼吸综合征(SARS)病毒、狂犬病毒、水疱性口炎病毒(VSV)、人呼吸道合胞病毒(RSV)、新城疫病毒、亨德拉病毒、尼帕病毒、麻疹病毒、牛瘟病毒、犬瘟热病毒、仙台病毒、人副流感病毒(例如，1、2、3和4)、鼻病毒、腮腺炎病毒、脊髓灰质炎病毒、人肠道病毒(A、B、C和D)、甲型肝炎病毒、柯萨奇病毒、乙型肝炎病毒、人乳头状瘤病毒、腺相关病毒、星状病毒、JC病毒、BK病毒、SV40病毒、诺沃克病毒、轮状病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)以及人T-嗜淋巴细胞病毒I型和II型。
234.如权利要求232所述的方法，其中所述感染性疾病由属于选自由以下组成的组的属的细菌引起：沙门氏菌属、链球菌属、芽孢杆菌属、李斯特菌属、棒状杆菌属、诺卡氏菌属、奈瑟氏菌属、放线杆菌属、莫拉氏菌属、肠杆菌属、假单胞菌属、埃希氏菌属、克雷伯氏菌属、沙雷氏菌属、肠杆菌属、变形杆菌属、沙门氏菌属、志贺氏菌属、耶尔森氏菌属、嗜血杆菌属、博德特氏菌属、军团菌属、巴斯德氏菌属、弗朗西斯氏菌属、布鲁氏菌属、巴尔通氏体属、梭菌属、弧菌属、弯曲杆菌属以及葡萄球菌属。
235.如权利要求232所述的方法，其中所述感染性疾病由选自由以下组成的组的真菌引起：曲霉属、假丝酵母属、马拉色氏霉菌属、毛孢子菌属、镰刀菌属、枝顶孢霉属、根霉属、毛霉属、肺囊虫属以及犁头霉属。
236.如权利要求232所述的方法，其中所述感染性疾病由选自由以下组成的组的寄生虫引起：溶组织内阿米巴、兰伯氏贾第虫、鼠型隐孢子虫、冈比亚锥虫、罗德西亚锥虫、克氏锥虫、墨西哥利什曼原虫、巴西利什曼原虫、热带利什曼原虫、杜氏利什曼原虫、刚地弓形虫、间日疟原虫、卵形疟原虫、三日疟原虫、镰状疟原虫、阴道毛滴虫以及火鸡组织滴虫；示例性蠕虫寄生虫包括毛首鞭形线虫、人蛔虫、蛲虫、十二指肠钩虫、美洲钩虫、粪类圆线虫、班氏丝虫和麦地那龙线虫、曼氏血吸虫、埃及血吸虫、日本血吸虫、肝片吸虫、大片吸虫、异形吸虫、卫氏并殖吸虫、猪带绦虫、牛带绦虫、短膜壳绦虫和细粒棘球绦虫。
237.如权利要求225-236中任一项所述的方法，其中所述方法还包括向所述人施用免疫治疗剂。
238.如权利要求237所述的方法，其中所述免疫治疗剂选自由以下组成的组：抗CTLA-4剂、抗PD-1剂、抗PD-L1剂、抗PD-L2剂、TNF-α交联剂、TRAIL交联剂、抗CD27剂、抗CD30剂、抗CD40剂、抗4-1BB剂、抗GITR剂、抗OX40剂、抗TRAILR1剂、抗TRAILR2剂、抗TWEAK剂、抗TWEAKR剂、抗细胞表面淋巴细胞蛋白剂、抗BRAF剂、抗MEK剂、抗CD33剂、抗CD20剂、抗HLA-DR剂、抗HLAI类剂、抗CD52剂、抗A33剂、抗GD3剂、抗PSMA剂、抗Ceacan 1剂、抗Galedin 9剂、抗HVEM剂、抗VISTA剂、抗B7 H4剂、抗HHLA2剂、抗CD155剂、抗CD80剂、抗BTLA剂、抗CD160剂、抗CD28剂、抗CD226剂、抗CEACAM1剂、抗TIM3剂、抗TIGIT剂、抗CD96剂、抗CD70剂、抗CD27剂、抗LIGHT剂、抗CD137剂、抗DR4剂、抗CR5剂、抗TNFRS剂、抗TNFR1剂、抗FAS剂、抗CD95剂、抗TRAIL剂、抗DR6剂、抗EDAR剂、抗NGFR剂、抗OPG剂、抗RANKL剂、抗LTβ受体剂、抗BCMA剂、抗TACI剂、抗BAFFR剂、抗EDAR2剂、抗TROY剂和抗RELT剂，任选地其中所述免疫治疗剂为抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体。
239.如权利要求238所述的方法，其中所述免疫治疗剂选自由以下组成的组：抗CTLA-4抗体或其抗原结合片段、抗PD-1抗体或其抗原结合片段、抗PD-L1抗体或其抗原结合片段、抗PD-L2抗体或其抗原结合片段、TNF-α交联抗体或其抗原结合片段、TRAIL交联抗体或其抗原结合片段、抗CD27抗体或其抗原结合片段、抗CD30抗体或其抗原结合片段、抗CD40抗体或其抗原结合片段、抗4-1BB抗体或其抗原结合片段、抗GITR抗体或其抗原结合片段、抗OX40抗体或其抗原结合片段、抗TRAILR1抗体或其抗原结合片段、抗TRAILR2抗体或其抗原结合片段、抗TWEAK抗体或其抗原结合片段、抗TWEAKR抗体或其抗原结合片段、抗细胞表面淋巴细胞蛋白抗体或其抗原结合片段、抗BRAF抗体或其抗原结合片段、抗MEK抗体或其抗原结合片段、抗CD33抗体或其抗原结合片段、抗CD20抗体或其抗原结合片段、抗HLA-DR抗体或其抗原结合片段、抗HLA I类抗体或其抗原结合片段、抗CD52抗体或其抗原结合片段、抗A33抗体或其抗原结合片段、抗GD3抗体或其抗原结合片段、抗PSMA抗体或其抗原结合片段、抗Ceacan 1抗体或其抗原结合片段、抗Galedin 9抗体或其抗原结合片段、抗HVEM抗体或其抗原结合片段、抗VISTA抗体或其抗原结合片段、抗B7 H4抗体或其抗原结合片段、抗HHLA2抗体或其抗原结合片段、抗CD155抗体或其抗原结合片段、抗CD80抗体或其抗原结合片段、抗BTLA抗体或其抗原结合片段、抗CD160抗体或其抗原结合片段、抗CD28抗体或其抗原结合片段、抗CD226抗体或其抗原结合片段、抗CEACAM1抗体或其抗原结合片段、抗TIM3抗体或其抗原结合片段、抗TIGIT抗体或其抗原结合片段、抗CD96抗体或其抗原结合片段、抗CD70抗体或其抗原结合片段、抗CD27抗体或其抗原结合片段、抗LIGHT抗体或其抗原结合片段、抗CD137抗体或其抗原结合片段、抗DR4抗体或其抗原结合片段、抗CR5抗体或其抗原结合片段、抗TNFRS抗体或其抗原结合片段、抗TNFR1抗体或其抗原结合片段、抗FAS抗体或其抗原结合片段、抗CD95抗体或其抗原结合片段、抗TRAIL抗体或其抗原结合片段、抗DR6抗体或其抗原结合片段、抗EDAR抗体或其抗原结合片段、抗NGFR抗体或其抗原结合片段、抗OPG抗体或其抗原结合片段、抗RANKL抗体或其抗原结合片段、抗LTβ受体抗体或其抗原结合片段、抗BCMA抗体或其抗原结合片段、抗TACI抗体或其抗原结合片段、抗BAFFR抗体或其抗原结合片段、抗EDAR2抗体或其抗原结合片段、抗TROY抗体或其抗原结合片段和抗RELT抗体或其抗原结合片段。
240.如权利要求238所述的方法，其中所述免疫治疗剂是抗CTLA-4剂或抗PD-1剂。
241.如权利要求240所述的方法，其中所述免疫治疗剂是抗CTLA-4抗体或其抗原结合片段或抗PD-1抗体或其抗原结合片段。
242.如权利要求241所述的方法，其中所述抗CTLA-4抗体是伊匹木单抗或曲美木单抗。
243.如权利要求241或242所述的方法，其中所述抗PD-1抗体是纳武单抗、帕博利珠单抗、阿维鲁单抗、德瓦鲁单抗或阿妥珠单抗。
244.如权利要求225-243中任一项所述的方法，其中向所述人以约0.001mg/kg至约100mg/kg的量施用特异性结合TNFR2的所述抗体或其抗原结合片段。
245.一种药盒，其包括选自由以下组成的组的剂：权利要求1-90中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求91-94中任一项所述的构建体、权利要求95或96所述的多核苷酸、权利要求97-105中任一项所述的载体、权利要求106-110中任一项所述的宿主细胞以及权利要求111-222中任一项所述的药物组合物。
246.如权利要求245所述的药盒，其中所述药盒包括权利要求1-90中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
247.如权利要求245所述的药盒，其中所述药盒包括权利要求91-94中任一项所述的构建体。
248.如权利要求245所述的药盒，其中所述药盒包括权利要求95或96所述的多核苷酸。
249.如权利要求245所述的药盒，其中所述药盒包括权利要求97-105中任一项所述的载体。
250.如权利要求249所述的药盒，其中所述药盒还包括用于将所述载体转染到宿主细胞中的说明书。
251.如权利要求250所述的药盒，其中所述药盒还包括用于在所述宿主细胞中表达所述抗体、其抗原结合片段或构建体的说明书。
252.如权利要求245所述的药盒，其中所述药盒包括权利要求106-110中任一项所述的宿主细胞。
253.如权利要求252所述的药盒，其中所述药盒还包括可用于在所述宿主细胞中表达所述抗体、其抗原结合片段或构建体的试剂。
254.如权利要求245所述的药盒，其中所述药盒还包括权利要求111-222中任一项所述的药物组合物。
255.如权利要求245所述的药盒，其还包括用于向人患者施用所述剂的说明书。
256.如权利要求245所述的药盒，其还包括用于制备或使用所述剂的说明书。
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