CN115819605A - 一种连接抗体的抗原结合功能域的方法及其应用 - Google Patents

一种连接抗体的抗原结合功能域的方法及其应用 Download PDF

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CN115819605A CN202111093725.6A CN202111093725A CN115819605A CN 115819605 A CN115819605 A CN 115819605A CN 202111093725 A CN202111093725 A CN 202111093725A CN 115819605 A CN115819605 A CN 115819605A
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徐伟
丁栋
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Abstract

本发明提供了一种连接抗体的抗原结合功能域的方法及其应用。具体地，本发明提供了一种具有抗原结合活性的多肽，所述的多肽包含靶向预定抗原的结合功能域、CTP元件和任选的额外功能域，其中，所述的结合功能域选自下组：抗体重链、抗体轻链、VH、VL和VHH；并且所述的CTP元件位于两个所述的结合功能域之间或者位于一个所述结合功能域与所述的额外功能域之间。特别地，含有CTP元件的本发明的蛋白的表达量大大提升，其半衰期和稳定性均有提高。

Description

一种连接抗体的抗原结合功能域的方法及其应用
技术领域
本发明涉及生物抗体领域，具体地，涉及一种连接抗体的抗原结合功能域的方法及其应用。
背景技术
人绒毛膜促性腺激素羧基末端肽CTP是hCGβ亚基112-118位任一位点至145位的羧基末端肽(C-terminal peptide,CTP)，带有四个O-糖基化位点。将带有O-糖基化位点的肽段与蛋白的N-端或C-端连接，能够显著延长与其融合的蛋白分子的半衰期，对蛋白分子的活性影响小甚至可以增强其活性。例如，通过将CTP与人干扰素(rhIFN-_2b)、人促卵泡激素(FSH)与CTP连接，都可以达到在保留蛋白活性的同时，增加蛋白半衰期的效果，并且临床实验也已经证实了这种方法的安全性。
人工抗体改造自天然抗体。例如将人IgG抗体的重链可变区VH和轻链可变区VL通过肽接头(linker)组成scFv(single chain Fv)。scFv通常仍然保留了母本抗体的抗原结合活性。但是由于其分子量较小，且非天然结构的蛋白，在动物或人体内较易被清除或降解。
此外，天然抗体与天然抗体(例如人天然抗体与羊驼单域抗体)、天然抗体与人工抗体(例如人天然抗体与scFv)或人工抗体之间(例如BiTE)可以组成双特异性或多特异性抗体。通过组合来自不同的单抗的抗原结合功能域，实现一个分子同时能结合两类不同抗原的效果，并进而达到协同不同疾病治疗机制，增强疾病治疗效果的目的。在实际工作中，双特异性抗体或多特异性抗体的成药性常常劣于经典单克隆抗体，表现在抗体的表达低、纯度低、稳定性差和体内半衰期短等问题。
另一种情况是天然抗体或人工抗体可以与其它功能性蛋白(例如细胞因子与受体蛋白的配体结合功能域)组成双特异性或多特异性抗体融合蛋白。这种抗体融合蛋白同样可以实现一个分子同时能结合两类不同抗原的效果，并进而达到协同不同疾病治疗机制，增强疾病治疗效果的目的。与双特异性抗体或多特异性抗体类似，抗体融合蛋白的成药性常常劣于经典单克隆抗体，表现在表达低、纯度低、稳定性差和体内半衰期短等问题。
因此，如果能发现一种普遍有效的、可以显著改善双/多特异性抗体成药性的方法，则对于双/多特异性抗体的开发将有极大的促进作用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种连接抗体的抗原结合功能域的方法及其应用。
在本发明的第一方面，提供了一种具有抗原结合活性的多肽，所述的多肽包含至少两个靶向预定抗原的结合功能域、CTP元件和任选的额外功能域，
其中，所述的结合功能域选自下组：抗体重链、抗体轻链、VH、VL和VHH；
并且所述的CTP元件位于两个所述的结合功能域之间或者位于一个所述结合功能域与所述的额外功能域之间。
在另一优选例中，所述的额外功能域选自下组：抗体的Fc区段、血清蛋白、细胞因子、细胞因子受体的功能域。
在另一优选例中，所述细胞因子选自下组：IL2、IL4、IL6、IL7、IL8、IL9、IL10、IL11、IL12、IL15、IL17、IL21、IL25、IL30、IL33、IL36、干扰素家族蛋白、G-CSF、GM-CSF、胰岛素、GLP-1、GIP、EPO、人血小板生成素、人生长激素或其组合。
在另一优选例中，所述细胞因子受体的功能域选自下组：VEGFR、TGF-βRII、BAFFR、或其组合。
在另一优选例中，所述的多肽包括抗体或其活性片段。
在另一优选例中，所述的多肽包括单特异性抗体、双特异性抗体或多特异性抗体。
在另一优选例中，所述的抗体包括单链抗体、二聚体抗体或多聚体抗体。
在另一优选例中，所述CTP元件包含一个或多个CTP序列，所述CTP序列如SEQ IDNO：20所示。
在另一优选例中，所述CTP元件还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留CTP元件功能的衍生序列。
在另一优选例中，所述CTP元件在CTP序列的一侧或两侧还包含柔性接头。
在另一优选例中，所述柔性接头包括(G)m，(GS)n或(G4S)n，其中m为选自1-10的正整数，n为选自1-5的正整数。
在另一优选例中，所述CTP元件的序列如SEQ ID NO：21所示。
在另一优选例中，在所述的抗体中，所述CTP元件位于(i)抗体重链或其VH，和(ii)抗体轻链或其VL之间。
在另一优选例中，所述的抗体在抗体重链和抗体轻链之间，或者在VH和VL之间通过所述CTP元件连接。
在另一优选例中，在所述的抗体中，所述CTP元件位于(i)抗体重链或其VH，和(iii)额外功能域之间。
在另一优选例中，在所述的抗体中，所述CTP元件位于(ii)抗体轻链或其VL，和(iii)额外功能域之间。
在另一优选例中，在所述的抗体中，所述CTP元件作为接头(linker)元件。
在另一优选例中，所述的多肽为重组蛋白。
在另一优选例中，所述的多肽是在真核的宿主细胞中重组表达的多肽。
在另一优选例中，所述的宿主细胞为哺乳动物的基因工程化细胞。
在另一优选例中，所述的宿主细胞包括人或非人哺乳动物的体细胞。
在另一优选例中，所述的宿主细胞选自CHO细胞或HEK293细胞。
在另一优选例中，所述的多肽包含VH和VL，其中VH和VL通过CTP元件连接。
在另一优选例中，所述的多肽包含IgG抗体和VHH，其中IgG抗体和VHH通过CTP元件连接。
在另一优选例中，所述的多肽包含IgG抗体和scFv，其中IgG抗体和scFv通过CTP元件连接。
在另一优选例中，所述的多肽具有如式I所示的结构：
Z1-L1-Z2-L2-Z3 (I)
Z1或Z2为靶向预定抗原的结合功能域；
Z3为任选的额外功能域；
L1或L2为无或CTP元件或接头，且至少有一个为CTP元件；
“-”各自独立地为键；
其中，所述的结合功能域选自下组：抗体重链、抗体轻链、VH、VL和VHH。
在另一优选例中，所述的CTP元件包含一个或多个CTP序列。
在另一优选例中，所述CTP序列包含hCGβ亚基112-118位任一位点至145位的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述CTP序列如SEQ ID NO：20所示。
在另一优选例中，所述的CTP元件在CTP序列的一侧或两侧还包含柔性接头，所述柔性接头选自(G)m，(GS)n或(G4S)n，其中m为选自1-10的正整数，n为选自1-5的正整数。
在另一优选例中，所述的CTP元件含有2-4个O-糖基化位点。
在另一优选例中，所述的Z1或Z2选自下组：抗体重链、抗体轻链、VH、VL、scFv、单域抗体(VHH)、Fab或F(ab’)2、或其组合。
在另一优选例中，所述的L1和L2选自下组：
(1)所述的L1为CTP元件；和L2为接头；
(2)所述的L1为CTP元件；和L2为CTP元件；或
(3)所述的L1为接头；和L2为CTP元件。
在另一优选例中，所述接头为柔性接头。
在另一优选例中，所述的靶向预定抗原的结合功能域为靶向选自下组预定抗原的结合功能域：CD47、BAFF、CEACAM5、CEACAM6、PD-1、PD-L1、CTLA-4、CD3、Claudin18.2、Tigit、LAG3、IL1、IL4、IL5、IL6、IL7、IL8、IL10、IL12、IL15、IL17、IL23、IL33、IL36、OX40L、IL5、TNFα、interferonα、interferonβ、interferonγ。
在另一优选例中，所述的靶向预定抗原的结合功能域选自下组抗体的结合功能域：抗人CD47抗体、belimumab抗体、抗CEACAM5抗体、抗CEACAM6抗体、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗CTLA-4抗体、抗CD3抗体、抗Claudin18.2抗体、抗Tigit抗体、抗LAG3抗体、抗IL1抗体、抗IL4抗体、抗IL5抗体、抗IL6抗体、抗IL7抗体、抗IL8抗体、抗IL10抗体、抗IL12抗体、抗IL15抗体、抗IL17抗体、抗IL23抗体、抗IL33抗体、抗IL36抗体、抗OX40L抗体、抗IL5抗体、抗TNFα抗体、抗interferonα抗体、抗interferonβ抗体、抗interferonγ抗体、或其组合。
在另一优选例中，所述抗体为IgG抗体，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体。
在另一优选例中，所述的多肽的氨基酸序列选自下组：SEQ ID NO：11、12、13、14、15、16、17、或18。
在另一优选例中，所述的多肽为二聚体。
在另一优选例中，所述的多肽为同源或异源二聚体。
在另一优选例中，所述的多肽从N端到C端具有选自式II、III、IV或V所示的结构：
Figure BDA0003268530440000041
Figure BDA0003268530440000042
Figure BDA0003268530440000043
Figure BDA0003268530440000044
其中，
Z1为无、或靶向预定抗原的VH、VL或VHH；
Z2为靶向预定抗原的VH、VL或VHH；
H-Chain--L-Chain为靶向其他抗原的结合功能域；其中，
H-Chain为抗体的重链或其活性片段；L-Chain为抗体的轻链或其活性片段；
Z1-L1-Z2-L2-H-Chain或H-Chain-L2-Z2-L1-Z1为多肽的重链融合片段，
Z1-L1-Z2-L2-L-Chain或L-Chain-L2-Z2-L1-Z1为多肽的轻链融合片段，
L1或L2为无或CTP元件或接头，且至少有一个为CTP元件；
Figure BDA0003268530440000051
表示重链和轻链之间的二硫键；
“-”各自独立地为键。
在另一优选例中，所述的Z1为VH；和Z2为VL。
在另一优选例中，所述的Z1为VL；和Z2为VH。
在另一优选例中，所述的Z1为无，L1为无，L2为CTP元件，和Z2为VHH。
在另一优选例中，所述的Z1和Z2之间还通过一个或多个二硫键配合。
在另一优选例中，所述的L1和L2选自下组：
(1)所述的L1为CTP元件；和L2为接头；
(2)所述的L1为CTP元件；和L2为CTP元件；或
(3)所述的L1为接头；和L2为CTP元件。
在另一优选例中，所述的多肽为重组蛋白。
在另一优选例中，所述的接头为柔性接头。
在另一优选例中，所述的柔性接头选自下组：(G)m、(GGGGS)n、(GGGSG)n、(GGSGG)n；其中，其中m为选自1-10的正整数，n为选自1-5的正整数；优选地，m或n为1-3之间的整数。
在另一优选例中，所述的H-Chain--L-Chain为靶向CEACAM5的结合功能域。
在另一优选例中，所述的H-Chain为抗人CEACAM5单抗的重链或其活性片段，和/或所述的L-Chain为抗人CEACAM5单抗的轻链或其活性片段。
在另一优选例中，所述活性片段为含有抗体的F(ab)、scFv、VH、CH、VL或VHH的活性片段。
在另一优选例中，所述的Z1为抗人CD47抗体的VH；和Z2为抗人CD47抗体的VL。
在另一优选例中，所述的Z1为抗人CD47抗体的VL；和Z2为抗人CD47抗体的VH。
在另一优选例中，所述多肽中的重链融合多肽的序列如SEQ ID NO：6、7、8、9或10所示。
在另一优选例中，所述多肽中的重链融合多肽的序列还包括将SEQ ID NO：6、7、8、9或10所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有CEACAM5结合功能的衍生的多肽。
在本发明的第二方面，提供了一种药物组合物，所述的药物组合物含有：
(a)如本发明的第一方面所述的多肽；以及
(b)药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述的药物组合物为液态或固体制剂。
在另一优选例中，所述的药物组合物为单元剂型。
在另一优选例中，所述的药物组合物用于治疗肿瘤或癌症。
在另一优选例中，所述的药物组合物的剂型包括胃肠给药剂型或胃肠外给药剂型。
在另一优选例中，所述的胃肠外给药剂型包括静脉注射、静脉滴注、皮下注射、局部注射、肌肉注射、瘤内注射、腹腔内注射、颅内注射、或腔内注射。
在本发明的第三方面，提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸编码如本发明的第一方面所述的多肽。
在本发明的第四方面，提供了一种载体，所述载体含有如本发明的第三方面所述的多核苷酸。
在另一优选例中，所述的载体包括：细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒、或其他载体。
在本发明的第五方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有如本发明的第四方面所述的载体或基因组中整合有本发明的第三方面所述的多核苷酸。
在另一优选例中，所述的宿主细胞为哺乳动物体细胞。
在另一优选例中，所述哺乳动物体细胞包括CHO细胞或HEK293细胞。
在本发明的第六方面，提供了一种免疫偶联物，所述该免疫偶联物含有：
(a)如本发明的第一方面所述的多肽；和
(b)选自下组的偶联部分：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、或酶。
在另一优选例中，所述偶联物部分选自：荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶、放射性核素、生物毒素、细胞因子(如IL-2等)。
在另一优选例中，所述的免疫偶联物包括抗体－药物偶联物(ADC)。
在另一优选例中，所述的免疫偶联物用于制备治疗肿瘤的药物组合物。
在另一优选例中，所述肿瘤选自下组：结肠癌、直肠癌、淋巴瘤、胰腺癌、肺癌、胃癌、肝细胞瘤、乳腺癌、甲状腺癌、或其组合。
在本发明的第七方面，提供了一种重组蛋白，所述重组蛋白含有：
(a)如本发明的第一方面所述的多肽；和
(b)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。
在本发明的第八方面，提供了一种CTP元件的用途，用于提高多肽的(a)表达量、(b)表达纯度，和/或(c)增加半衰期。
在另一优选例中，所述多肽具有抗原结合活性。
在另一优选例中，所述多肽包含至少两个靶向预定抗原的结合功能域、CTP元件和任选的额外功能域，其中，所述的结合功能域选自下组：抗体重链、抗体轻链、VH、VL和VHH；并且所述的CTP元件位于两个所述的结合功能域之间或者位于一个所述结合功能域与所述的额外功能域之间。
在另一优选例中，所述CTP元件的序列如SEQ ID NO.20或SEQ ID NO.21所示。
在另一优选例中，所述的CTP元件包含一个或多个CTP序列。
在另一优选例中，所述的CTP元件在CTP序列的一侧或两侧还包含柔性接头，所述柔性接头选自(G)m，(GS)n或(G4S)n，其中m为选自1-10的正整数，n为选自1-5的正整数。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1不同连接方式。其中，“SS”表示二硫键。其中L1-L4，L9-L12，L17是根据Belimumab设计的scFv-Fc多肽，L5-L8，L13-L16是根据抗CD47单抗(序列来自中国专利2020102402387)设计的scFv-Fc蛋白。
图2显示了L1-L8、L17的HPLC质控检测结果。
图3显示了L1～L4、L17蛋白与人BAFF蛋白结合的ELISA检测结果。
图4显示了CTP linker对蛋白的热稳定性检测结果；其中，4A为L1～L4蛋白的热稳定性检测结果；4B为L5～L8蛋白的热稳定性检测结果。
图5显示了L1和L17分子的蛋白质3D模型的构建和分子动力学模拟结果；其中，A是L1蛋白质二聚体Fc-VL-(G4S)3-VH的构象变化，其中(A)初始构象；(B)模拟30ns时的构象；(C)模拟60ns的构象。B是L17蛋白质二聚体Fc-VL-CTP-VH的构象变化，其中(A)初始构象；(B)模拟30ns时的构象；(C)模拟60ns的构象。
图6显示了本发明中的双特异性抗体(抗CEACAM5抗体和抗CD47)的结构示意图。其中UM11-L32中链接CD47 scFv和CEACAM5单抗的连接头为(GGGGS)3；UM11-L33的scFv序列中VH44位和VL100位(以Kabat编号)分别突变为Cysteine，UM11-L34则在UM11-L33的基础上进一步将连接scFv和重链氨基端的连接头改为CTP；UM11-L38则在UM11-L34的基础上进一步将scFv内部的(GGGGS)3接头改为CTP。
图7显示了抗CEACAM5和抗CD47双特异性抗体的SEC图谱。
图8显示了抗CEACAM5和抗CD47双特异性抗体与抗CD47活性的ELISA检测结果。
图9显示了抗CEACAM5和抗CD47双特异性抗体与抗CEACAM5活性的ELISA检测结果。
图10显示了CEACAM5-CD47双特异性抗体的小鼠模型PK分析
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入地研究，首次意外发现，通过CTP接头连接抗体的抗原结合功能域(如VH、VL、scFv、单域抗体、Fab、F(ab’)2等)获得的多特异性蛋白，可以在保留结合功能域活性的同时，提高蛋白的表达量和表达纯度，并增加半衰期。具体地，本发明提供了通过不同连接方式构建的CD47抗体、belimumab抗体衍生的scFv蛋白，以及抗CEACAM5-CD47双特异性蛋白，并测定其表达以及活性。在此基础上完成了本发明。
CTP元件
人绒毛膜促性腺激素羧基末端肽CTP是hCGβ亚基112-118位任一位点至145位的羧基末端肽(C-terminal peptide,CTP)，带有四个O-糖基化位点。将带有O-糖基化位点的肽段与蛋白的N-端或C-端连接，能够显著延长与其融合的蛋白分子的半衰期，对蛋白分子的活性影响小甚至可以增强其活性。
本发明的CTP接头含有2-4个O-糖基化位点。并且能够连接不同抗体抗原结合功能域，所述抗体的抗原结合功能域包括VH、VL、scFv、单域抗体、Fab、(Fab’)2等。此外，抗体的抗原结合功能域可以通过这种CTP接头连接到其它蛋白的氨基端，或者羧基端。
具体地，所述CTP接头序列可以被用于连接2个或2个以上相同或不同的抗原结合功能域，例如VH-VH，VL-VL，VH-VL，VL-VH或VHH-VHH。应理解，本发明的CTP接头序列，可以和其它蛋白序列修饰、或其他的接头序列(柔性接头，如G4S序列)联合使用，达到更佳的抗体成药性。
如本文所用，“本发明的CTP接头”、“本发明的CTP接头序列”、“本发明的CTP元件”可以互换使用，均指本发明中位于具有抗原结合活性的多肽中的两个靶向预定抗原的结合功能域之间，或位于靶向预定抗原的结合功能域和任选的额外功能域之间的CTP接头序列。本发明的CTP元件还可以包含一个或多个CTP序列，所述的CTP序列如下所示：
SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ(SEQ ID NO：20)。
此外，CTP元件在CTP序列的一侧或两侧还可以含有柔性接头。在本发明中，对于连接在CTP序列两侧的柔性接头没有特别限制，只要该CTP序列可以将相关的功能域连接在一起，并且对其各自的功能没有影响或基本上没有影响。
较佳地，所述柔性接头或连接头选自(G)m，(GS)n或(G4S)n，其中m为选自1-10的正整数，n为选自1-5的正整数，优选m为3，n为1。例如，一种优选的CTP元件为GGG-CTP序列-GGG或GS-CTP序列-GS。
在本发明的一个具体实施例中，一种两端连接有柔性接头的CTP元件(GGG-CTP序列-GGG)的序列如下所示：
GGGSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQGGG(SEQ ID NO：21)。
在具体实施例中，本发明的CTP接头序列可用于连接抗CEACAM5抗体的scFv中VH和VL，或用于连接双特异性抗体中靶向不同靶点的抗原结合功能域，例如连接抗CEACAM5抗体的scFv和抗CD47抗体的重链氨基端。
抗体或其活性片段
如本文所用，术语“抗体或其活性片段”是指能够结合靶抗原的分子，包括单克隆抗体、多克隆抗体、单特异性和多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段(例如Fv、scFv、Fab、scFab、F(ab’)2、Fab2、二抗体、三抗体、scFv-Fc、微抗体、单域抗体(例如VHH)等)，只要它们显示与相关靶分子的结合即可。
如本文所用，术语“抗体”或“免疫球蛋白”是有相同结构特征的约150000道尔顿的异四聚糖蛋白，其由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区(VH)，其后是多个恒定区。每条轻链的一端有可变区(VL)，另一端有恒定区；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对，轻链的可变区与重链的可变区相对。特殊的氨基酸残基在轻链和重链的可变区之间形成界面。
如本文所用，术语“单域抗体”、“VHH”“纳米抗体”(nanobody)具有相同的含义并可互换使用，指克隆抗体重链的可变区，构建仅由一个重链可变区组成的单域抗体(VHH)，其具有完整功能的最小的抗原结合片段。通常先获得天然缺失轻链和重链恒定区1(CH1)的抗体后，再克隆抗体重链的可变区，构建仅由一个重链可变区组成的单域抗体(VHH)。
如本文所用，术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区(CDR)或超变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区，它们大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连，在某些情况下可形成部分β折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位(参见Kabat等,NIH Publ.No.91-3242,卷I，647-669页(1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。
脊椎动物抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可根据其恒定区的氨基酸序列归为明显不同的两类(称为κ和λ)中的一类。根据其重链恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋白可以分为不同的种类。主要有5类免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中一些还可进一步分成亚类(同种型)，如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。对应于不同类免疫球蛋白的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ、和μ。不同类免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型是本领域人员所熟知的。
一般，抗体的抗原结合特性可由位于重链和轻链可变区的3个特定的区域来描述，称为可变区域(CDR)，将该段间隔成4个框架区域(FR)，4个FR的氨基酸序列相对比较保守，不直接参与结合反应。这些CDR形成环状结构，通过其间的FR形成的β折叠在空间结构上相互靠近，重链上的CDR和相应轻链上的CDR构成了抗体的抗原结合位点。可以通过比较同类型的抗体的氨基酸序列来确定是哪些氨基酸构成了FR或CDR区域。
多肽
如本文所用，“本发明的多肽”、“重组多肽”、“本发明的具有抗原结合活性的多肽”均指本发明第一方面所述的多肽。应理解，本发明的多肽可以为重组蛋白或融合蛋白。
如本文所用，术语“本发明的具有抗原结合活性的多肽”具有结合不同抗体的抗原结合功能域的活性。此外，所述多肽还具有上述活性的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：1-3个(通常为1-2个，更佳地1个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为3个以内，较佳地为2个以内，更佳地为1个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的结构和功能。此外，所述术语还包括单体和多聚体形式的本发明多肽。该术语还包括线性以及非线性的多肽(如环肽)。
本发明还包括上述多肽的活性片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明多肽的功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或几个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合于此多肽序列而形成的多肽(与前导序列、分泌序列或6His等标签序列融合而形成的多肽)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
一类优选的活性衍生物指与本发明的氨基酸序列相比，有至多3个，较佳地至多2个，更佳地至多1个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表A进行氨基酸替换而产生。
表A
最初的残基 代表性的取代 优选的取代
Ala(A) Val；Leu；Ile Val
Arg(R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn(N) Gln；His；Lys；Arg Gln
Asp(D) Glu Glu
Cys(C) Ser Ser
Gln(Q) Asn Asn
Glu(E) Asp Asp
Gly(G) Pro；Ala Ala
His(H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile(I) Leu；Val；Met；Ala；Phe Leu
Leu(L) Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys(K) Arg；Gln；Asn Arg
Met(M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe(F) Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Leu
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Ser Ser
Trp(W) Tyr；Phe Tyr
Tyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val(V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala Leu
本发明还提供本发明多肽的类似物。这些类似物与本发明的多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
此外，还可以对本发明多肽进行修饰。修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
术语“编码本发明多肽的多核苷酸”可以是包括编码本发明多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件(或严紧条件)下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。
本发明的多肽和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地，被纯化至均质。
本发明多核苷酸全长序列通常可以通过PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明多肽(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。
应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的多核苷酸。特别是很难从文库中得到全长的cDNA时，可优选使用RACE法(RACE-cDNA末端快速扩增法)，用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。
表达载体
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或本发明多肽编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。
通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的多肽。一般来说有以下步骤：
(1).用本发明的编码本发明多肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；
(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；
(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
本发明中，编码多肽的多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含本发明多肽编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体PL启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。
包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞优选地为高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：CHO细胞或HEK293细胞。
本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。可举的例子包括在复制起始点晚期一侧的100到270个碱基对的SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子等。
本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
药物组合物
本发明还提供了一种组合物。在优选例中，所述的组合物是药物组合物，它含有本发明的抗体、多肽或蛋白，以及药学上可接受的载体。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：瘤内、腹膜内、静脉内、或局部给药。
本发明的药物组合物可直接用于结合不同抗体的靶点分子，因而可用于预防和治疗肿瘤等疾病。此外，还可同时使用其他治疗剂。
本发明的药物组合物含有安全有效量(如0.001-99wt％,较佳地0.01-90wt％，更佳地0.1-80wt％)的本发明多肽、抗体或蛋白，以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的抗体或蛋白还可与其他治疗剂一起使用。
使用药物组合物时，是将安全有效量的多肽、抗体或蛋白施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约50毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约20毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
当用本发明的多肽、抗体或蛋白治疗时，可以通过本领域常规的方法进行递送。例如，它可以通过使用脂质体，水凝胶，环糊精，生物可降解的纳米胶囊，或生物粘附性微球被引入到细胞中。或者，所述核酸或载体可在本地通过直接注射或通过使用输注泵递送。
本发明的主要优点包括
(1)本发明的CTP接头有助于改善融合蛋白/双抗的表达性质(表达量和纯度)；
(2)本发明的CTP接头保留重组蛋白活性的同时，增加了重组蛋白的半衰期；
(3)本发明的CTP接头有助于改善融合蛋白/双抗的稳定性。
下面结合具体实施例，进一步陈述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
本发明的蛋白序列：
表1.scFv蛋白的序列
Figure BDA0003268530440000161
Figure BDA0003268530440000171
其中L1-L4，L9-L12，L17是根据Belimumab设计的scFv-Fc蛋白；L5-L8，L13-L16是根据抗CD47单抗(序列来源为中国专利2020102402387)设计的scFv-Fc蛋白。设计的不同的抗CD47、belimumab抗体的scFv蛋白的结构参见图1。
实施例1Belimumab衍生的scFv-Fc的蛋白表达以及CTP linker对其功能的影响
1.1蛋白表达
将编码蛋白质的cDNA序列连接在编码信号肽的序列之后，克隆到哺乳动物细胞表达载体pcDNA3.4上。将蛋白表达质粒用Lipofectamine 2000转染试剂(Invitrogen)转染入HEK293细胞，并在37℃、5％二氧化碳条件下培养7天。收集培养液上清，并用Protein A亲和层析法提纯上清中的抗体。纯化后抗体的质量可以用SDS-PAGE电泳和分子筛层析等经典的蛋白分析方法分析。纯化后的抗体经PBS溶液透析和冷冻干燥浓缩后，保存于-20℃。
如果表达的是抗体，则与上述方法类似的，将编码抗体重链或轻链的cDNA序列分别克隆到pcDNA3.4上。将重链表达质粒和轻链表达质粒按2：1的摩尔比用Lipofectamine2000转染入HEK293细胞。其余方法同上。
其中，根据Belimumab设计的scFv-Fc蛋白(L1-L4，L17)在HEK293细胞中的瞬转表达情况如下表2所示：
表2.scFv-Fc蛋白(L1-L4，L17)的表达情况
Figure BDA0003268530440000172
L1-L4，L17的HPLC质控检测结果见图2。
结果显示：
比较L1及L17，表明CTP较(GGGGS)3接头可以大幅提升产量和纯度；
比较L2及L3，表明在同有1个CTP的基础上，L3用CTP取代scFv中间的GS linker，虽然表达量相差不大，但是L3的纯度显著提升；
比较L4及L3，在L3的基础上，加了H44-L100二硫键，可以进一步提升表达量。
因此，对于L1～L4，L17系列分子来说，增加CTP linker(L2 vs L1)，或是将scFv内部的常规柔性linker(GGGGS)3改成CTP(L17 vs L1,L3 vs L2)，可以明显增加蛋白的表达量和减少聚体的比例，提高蛋白纯度。并且，使用了CTP linker的scFv蛋白，还可以进行H44-L100的突变改造而进一步提升蛋白的表达性质(L4 vs L3)。
1.2CTP linker对belimumab衍生的scFv功能的影响
将浓度为1μg/mL的人BAFF蛋白溶液以100μL/孔包被96孔高亲和力板，4℃，振荡过夜。其余步骤同2.1。
考察了使用CTP linker对belimumab衍生的scFv蛋白的功能的影响。在本实施例中，用ELISA试验检测L1～L4蛋白与人BAFF蛋白的结合。将浓度为1μg/mL的人BAFF蛋白溶液以100μL/孔包被96孔高亲和力板，4℃，振荡过夜。其余步骤同2.1。
结果显示(见图3)，在本实施例中，使用CTP linker连接scFv和Fc可以提升scFv对Blys蛋白的结合活性(L2 vs L1)，而将scFv内部连接VH和VL的(GGGGS)3接头替换成CTP对其活性没有影响(L17 vs L1，L3 vs L2)。进一步的，在L3基础上，叠加改善scFv稳定性的H44-L100突变对该scFv的活性亦无明显影响。
实施例2抗CD47衍生的scFv蛋白的蛋白表达以及CTP linker对其功能的影响
2.1蛋白表达
使用与实施例1.1类似的方法。对于L5-L8分子来说，类似地，使用CTP linker对蛋白的表达量和纯度略有提升(L7 vs L6)。蛋白表达的结果如表3所示。
表3.scFv-Fc蛋白(L5-L8)的表达情况
抗体编号 表达量(mg/L)
L5 99.9
L6 100.7
L7 126.2
L8 112.2
2.2抗CD47的scFv蛋白与人CD47蛋白的结合
将浓度为1μg/mL的人CD47蛋白溶液以100μL/孔包被96孔高亲和力板，4℃，振荡过夜。第二天先以300μL PBST(Tween20：0.5‰)洗涤3次，之后用100μL/孔的5％BSA/PBS封闭2小时，室温振荡。300μL PBST洗涤3次。用PBS配制蛋白样品的梯度稀释溶液。以100μL/孔加入96孔板，室温振荡1小时。300μL PBST洗涤3次。配制二抗羊抗人(goat anti-human)IgGHRP溶液，以100μL/孔加入96孔板，室温振荡1小时。300μLPBST洗涤4次。加入100μL/孔TMB，显色20min。加入100μL/孔0.6N H2SO4，终止显色，检测OD450 nm。
类似地，本发明涉及的抗CD47衍生的scFv蛋白与CD47蛋白结合基本上无明显影响。
实施例3使用不同连接头的scFv的热稳定性比较
Tycho通过检测蛋白的结构完整性来评估蛋白的品质。系统升温过程中，记录蛋白内部色氨酸和酪氨酸残基的內源荧光，检测波长为350nm和330nm。这些荧光信号的变化可以表明蛋白折叠状态的转变。在转变发生时的温度被称为拐点温度(Ti)。在升温过程中，荧光信号会被记录下来，350nm与330nm的比值被用来计算Ti值。而其比值的初始值以及在整个实验过程中的信号变化(Δratio)也被记录下来。取少量待检测样品，保证其蛋白浓度在1mg/ml左右，体积约100μl，并依据仪器要求进行操作。实验结束时，导出原始数据和分析结果，对结果进行总结分析。
如图4所示为350nm与330nm的比值的导数曲线，显示了L1～L4、L17和L5～L8蛋白的Δratio的变化速率，其中的曲线波峰对应的温度即为Ti值。
检测结果显示，使用CTP linker对蛋白的热稳定性没有影响。进一步地，在使用CTP linker的基础上，叠加改善scFv稳定性的H44-L100突变可以显著改善蛋白的热稳定性。
实施例4L1和L17蛋白质3D模型的构建和分子动力学模拟
为分析CTP可以提升蛋白成药性的可能的原因，发明人选择L1和L17这两个分子进行蛋白质结构的建模分析。L1和L17分子仅在scFv结构的VH和VL间的linker序列上有差别，因此对这两个蛋白的结构分析可以提示包含CTP的linker对蛋白结构的影响。
4.1融合蛋白的3D模型构建
将L1和L17的融合蛋白的原子模型采用同源模建(Homology Modeling)方法构建，其基本过程与文献(Comput.Struct.Biotechnol.J.19:467-476(2021))的蛋白质同源建模过程类似。首先，把蛋白单体的氨基酸序列递交到SWISS-MODEL在线服务器(https://swissmodel.expasy.org)，按标准程序搜索3D结构模板，根据网站所给出的最佳结构模板(PDB IDs:5Y9K,6FXN,6HYG)进行全长蛋白的3D建模；接着，根据网站输出的模型评估分数最高的原子模型作为蛋白单体的3D模型。最后，利用所得的单体模型，以IgG4/IgG1的Fc片段二聚体晶体结构(PDB ID:6HYG)为模板，建立Fc片段同源二聚化的蛋白二聚体模型，见图5A(A)和5B(A)。其中，图5A(A)为含(GGGGS)3的二聚体模型，图5B(A)为含CTP的二聚体模型。由图可见，基于同源抗体结构模板构建的两个蛋白质的二聚体模型与通常的天然抗体结构十分类似，特别是Fc二聚化部分。但是，在Fc片段C端连接的VL-Linker-VH与天然抗体的结构不一样。天然抗体的Fab区VH-CH1与轻链相互结合可以稳定其构象。与天然抗体不同，L1和L17分子的scFv结构缺少CH1-CL的相互作用，因此其构象不如天然抗体的Fab片段稳定。所以，VL、VH和Fc三者之间的动态构象，可能最终影响蛋白质的表达量和抗体生物活性。
4.2分子动力学模拟与构象分析
为了解两个蛋白二聚体在溶液环境下的构象状态，对这两个二聚体进行显式溶剂分子动力学模拟。模拟计算采用GROMACS(Ver.2021)程序(J.Comput.Chem.26:1701-1718(2005))进行，模拟系统的建立与具体的模拟参数设置、计算过程与4.1中所述类似。首先，以图5A或5B中的蛋白二聚体作为模拟的初始结构，把二聚体放置在一个长方型盒子中间，并使蛋白质的表面原子至少离盒子边界1.6纳米(nm)；接着，在盒子内部放入一定数目的水分子，使得水的密度等于1.0g/cm3；最后，在盒子中加入一定量的Na+和Cl-离子，使得系统内的离子强度为150mM，并通过调整Na+和Cl-的数目，确保模拟系统为电中性。模拟计算所需的蛋白质和离子的分子力场参数由Amber ff19SB力场表示，水分子由TIP3P模型表示。模拟开始时，首先使用能量最小化方法优化模拟系统2000步，以消除系统内可能存在的原子位置重叠或距离过近；然后，对系统进行1纳秒(ns)的NVT(恒定粒子、体积和温度)模拟，再接着进行1ns的NPT(恒定粒子、压力和温度)模拟，以平衡模拟系统。在模拟过程中，系统的平衡温度为300K，平衡压力为105Pa。最后，在系统平衡后共进行60ns的成品模拟，获得蛋白质构象随模拟时间变化的运动轨迹，供蛋白质构象分析用。
以图5A或图5B的初始结构(0ns)为参考构象，对所得的60ns成品模拟轨迹中的蛋白质构象进行了详细分析，结果与上述推断基本一致。我们发现，VL与VH之间的Linker对两者的构象由较大影响。由图5A和图5B可见，无论是含(GGGGS)3的二聚体还是含CTP元件的二聚体，VL和VH的结构柔性都很大，呈现出至少两个不同的平衡构象。由图5A(B)(30ns)和图5A(C)(60ns)中的单体构象可见，左边单体的构象与初始构象类似，而右边单体的构象则差别较大。由于这两种构象都是在模拟过程中长时间出现了的，说明在真实情况下，这些构象在蛋白质溶液中完全有可能共存。对比图5B(B)(30ns)和图5B(C)(60ns)中左右两个单体的构象，可以看出含CTP元件的L9的构象变化更明显。CTP元件的存在导致VH趋向于与Fc片段结合(见图5B(C)右边单体的构象)，从而导致该二聚体的整体结构更为紧凑(与图5A(C)相比)。显然，VH与Fc之间的稳定相互作用有助于增强蛋白二聚体的结构稳定性。
综合天然抗体结构和融合蛋白分子动力学模拟的结果，可以获得以下结论：由于scFv的构象不如天然抗体的Fab片段的构象稳定，这会对蛋白质的表达、折叠、Linker的易酶解性及抗体生物活性等都会产生一定的影响。但是，由于L17分子蛋白中CTP元件的使用，VL-CTP-VH片段趋向与Fc紧密结合，因此该蛋白比L1蛋白更有利于在表达后快速折叠成稳定结构，从而表现出较好的蛋白表达量。同时，稳定结构的形成也有利于提高VL和VH活性构象的比例，并最终提升蛋白的抗体活性。
实施例5CEACAM5-CD47双特异性抗体设计、表达及活性
5.1双特异性抗体的设计
抗人CEACAM5和抗人CD47抗体的可变区序列如下表所示：
表4.双特异性抗体的序列及编号
Figure BDA0003268530440000211
将抗人CD47的可变区序列组成scFv的形式通过接头连到抗人CEACAM5单抗的重链氨基端上(抗体亚型为IgG1/kappa)，得到四个双特异性抗体UM11-L32、UM11-L33、UM11-L34、UM11-L38和UM11-L41。其中UM11-L32中链接CD47 scFv和CEACAM5单抗的接头为(GGGGS)3；UM11-L33的scFv序列中VH44位和VL100位(以Kabat编号)分别突变为Cysteine，UM11-L34则在UM11-L33的基础上进一步将连接scFv和重链氨基端的连接头改为CTP；UM11-L38则在UM11-L34的基础上进一步将scFv内部的(GGGGS)3接头改为CTP(连接方式如图6所示)。UM11-L41则在UM11-L38的基础上进一步在scFv内部的CTP序列两侧各增加了3个甘氨酸。
UM11-L32、UM11-L33、UM11-L34、UM11-L38和UM11-L41四个双特异性抗体共用同一轻链序列：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCGASENIYGTLNWYQQKPGKSPKLLIYGATNLADAVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDVATYYCQNVLSIPYTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ IDNO：5)
UM11-L32的重链序列：
QVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYGMAWIRQAPGKGPEWIAFINNLASSIYYADTVTGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARAGDYRSFPYWGQGTLVTVSAGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASSSVNYVNWYQQKPGQAPRILIYGISNLASGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSTFPPYTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVVKPGASVKISCKGSGYTFTDYAMHWVKQAPGQGLEWIGVISTYSGHTNYNQKFKGKAIMTRDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCVRGSTTAHYYTMDFWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：6)
UM11-L33的重链序列：
QVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYGMAWIRQAPGKCPEWIAFINNLASSIYYADTVTGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARAGDYRSFPYWGQGTLVTVSAGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASSSVNYVNWYQQKPGQAPRILIYGISNLASGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSTFPPYTFGCGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVVKPGASVKISCKGSGYTFTDYAMHWVKQAPGQGLEWIGVISTYSGHTNYNQKFKGKAIMTRDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCVRGSTTAHYYTMDFWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：7)
UM11-L34的重链序列：
QVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYGMAWIRQAPGKCPEWIAFINNLASSIYYADTVTGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARAGDYRSFPYWGQGTLVTVSAGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASSSVNYVNWYQQKPGQAPRILIYGISNLASGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSTFPPYTFGCGTKLEIKSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQQVQLVQSGAEVVKPGASVKISCKGSGYTFTDYAMHWVKQAPGQGLEWIGVISTYSGHTNYNQKFKGKAIMTRDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCVRGSTTAHYYTMDFWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：8)
UM11-L38的重链序列：
QVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYGMAWIRQAPGKCPEWIAFINNLASSIYYADTVTGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARAGDYRSFPYWGQGTLVTVSASSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASSSVNYVNWYQQKPGQAPRILIYGISNLASGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSTFPPYTFGCGTKLEIKSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQQVQLVQSGAEVVKPGASVKISCKGSGYTFTDYAMHWVKQAPGQGLEWIGVISTYSGHTNYNQKFKGKAIMTRDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCVRGSTTAHYYTMDFWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：9)
UM11-L41的重链序列：
QVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYGMAWIRQAPGKCPEWIAFINNLASSIYYADTVTGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARAGDYRSFPYWGQGTLVTVSAGGGSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQGGGEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASSSVNYVNWYQQKPGQAPRILIYGISNLASGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSTFPPYTFGCGTKLEIKSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQQVQLVQSGAEVVKPGASVKISCKGSGYTFTDYAMHWVKQAPGQGLEWIGVISTYSGHTNYNQKFKGKAIMTRDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCVRGSTTAHYYTMDFWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：10)
5.2双特异性抗体的表达
抗体表达方法如实施例1中所述。
各双特异性抗体的表达情况如下表5所示。结果发现，把双抗中的(GGGGS)3接头改为CTP元件后，可以显著增加抗体的表达量。
表5.双特异性抗体的表达情况
Figure BDA0003268530440000241
其中，SEC图谱如图7所示，结果显示，Protein A一步法提纯后抗体纯度也略有提升。
5.3双特异性抗体的活性评价
a)抗CD47活性
抗CD47活性用ELISA法评价，方法如实施例2.1中所述。
结果如图8所示，发现把双抗中的(GGGGS)3接头改为CTP元件后，不影响双抗靶向CD47活性。
b)抗CEACAM5活性
抗CEACAM5活性用ELISA法评价，方法如实施例2.2中所述。
结果如图9所示，发现把双抗中的(GGGGS)3接头改为CTP元件序列后，基本不影响双抗靶向CEACAM5活性。
实施例6CEACAM5-CD47双特异性抗体的热稳定性分析
双抗样品的热稳定性分析方法如实施例3所述。
表6.双抗样品的热稳定性分析结果
抗体编号 Ti#1(℃) Ti#2(℃)
UM11-L32 69.3 83.6
UM11-L33 74.1 83.6
UM11-L34 73.6 83.3
UM11-L38 75.1 83.2
UM11-L41 76.0 82.7
结果显示，把双抗中的(GGGGS)3接头改为CTP序列后，有助于改善抗体的热稳定性(UM11-L38 vs UM11-L34，UM11-L38 vs UM11-L34)。
实施例7CEACAM5-CD47双特异性抗体的小鼠模型PK分析
12只6-8周龄雄性Balb/c小鼠，分为4组，每组3只，分别静脉注射给予UM11-L33、UM11-L34、UM11-L38、UM11-L41。给药剂量为5mg/kg。采集给药前，和给药后的4、7、24、72、120、168、240、288、336小时动物外周静脉血；离心收集血清。每个时间点采集3只动物血清。
浓度为1μg/mL的人CEACAM5蛋白溶液以100μL/孔包被96孔高亲和力板，4℃，振荡过夜。第二天先以300μL PBST(Tween20：0.5‰)洗涤3次，之后用100μL/孔的5％BSA/PBS封闭1小时，室温振荡。300μL PBST洗涤3次。用PBS配制待测血清样品、以及不同浓度对照品血清溶液的100倍稀释溶液。以100μL/孔加入96孔板，室温振荡1小时。300μL PBST洗涤4次。配制二抗羊抗人IgG HRP(abcam，货号ab6858)溶液，以100μL/孔加入96孔板，室温振荡半小时。300μLPBST洗涤3次。加入100μL/孔TMB，显色3min。加入100μL/孔0.6N H2SO4，终止显色，检测OD450nm。不同浓度的对照品溶液检测值与对照品浓度进行Logistic四参数拟合，得到标准曲线回归方程。将待测样品的检测值代入方程计算，得到不同时间点的血清药物浓度。
实验结果(图10)显示，与使用(GGGGS)3的L32和L33分子相比较，使用了CTP元件替代了(GGGGS)3接头的L34分子或L38分子在小鼠模型上的血药浓度可以保持更长时间，药物PK性质得到改善。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 优迈生物科技（连云港）有限公司
<120> 一种连接抗体的抗原结合功能域的方法及其应用
<130> P2021-1380
<160> 21
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Val Ile Ser Thr Tyr Ser Gly His Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Ile Met Thr Arg Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Arg Gly Ser Thr Thr Ala His Tyr Tyr Thr Met Asp Phe Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 2
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gly Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Gly Thr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Thr Asn Leu Ala Asp Ala Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Val Leu Ser Ile Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 3
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Gly Met Ala Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Ile
35 40 45
Ala Phe Ile Asn Asn Leu Ala Ser Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val
50 55 60
Thr Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Gly Asp Tyr Arg Ser Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ala
115
<210> 4
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Val
20 25 30
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Ile Leu Ile Tyr
35 40 45
Gly Ile Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Thr Phe Pro Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 5
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gly Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Gly Thr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Thr Asn Leu Ala Asp Ala Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Val Leu Ser Ile Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 6
<211> 706
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Gly Met Ala Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Ile
35 40 45
Ala Phe Ile Asn Asn Leu Ala Ser Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val
50 55 60
Thr Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Gly Asp Tyr Arg Ser Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu
130 135 140
Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser
145 150 155 160
Ser Val Asn Tyr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
165 170 175
Arg Ile Leu Ile Tyr Gly Ile Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala
180 185 190
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
195 200 205
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser
210 215 220
Thr Phe Pro Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
225 230 235 240
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln
245 250 255
Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala Ser
260 265 270
Val Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Ala
275 280 285
Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly
290 295 300
Val Ile Ser Thr Tyr Ser Gly His Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
305 310 315 320
Gly Lys Ala Ile Met Thr Arg Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Met
325 330 335
Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val
340 345 350
Arg Gly Ser Thr Thr Ala His Tyr Tyr Thr Met Asp Phe Trp Gly Gln
355 360 365
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
370 375 380
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
385 390 395 400
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
405 410 415
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
420 425 430
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
435 440 445
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
450 455 460
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
465 470 475 480
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
485 490 495
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
500 505 510
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
515 520 525
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
530 535 540
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
545 550 555 560
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
565 570 575
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
580 585 590
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
595 600 605
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
610 615 620
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
625 630 635 640
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
645 650 655
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
660 665 670
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
675 680 685
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
690 695 700
Gly Lys
705
<210> 7
<211> 706
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Gly Met Ala Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Pro Glu Trp Ile
35 40 45
Ala Phe Ile Asn Asn Leu Ala Ser Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val
50 55 60
Thr Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Gly Asp Tyr Arg Ser Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu
130 135 140
Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser
145 150 155 160
Ser Val Asn Tyr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
165 170 175
Arg Ile Leu Ile Tyr Gly Ile Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala
180 185 190
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
195 200 205
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser
210 215 220
Thr Phe Pro Pro Tyr Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
225 230 235 240
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln
245 250 255
Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala Ser
260 265 270
Val Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Ala
275 280 285
Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly
290 295 300
Val Ile Ser Thr Tyr Ser Gly His Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
305 310 315 320
Gly Lys Ala Ile Met Thr Arg Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Met
325 330 335
Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val
340 345 350
Arg Gly Ser Thr Thr Ala His Tyr Tyr Thr Met Asp Phe Trp Gly Gln
355 360 365
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
370 375 380
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
385 390 395 400
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
405 410 415
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
420 425 430
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
435 440 445
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
450 455 460
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
465 470 475 480
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
485 490 495
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
500 505 510
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
515 520 525
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
530 535 540
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
545 550 555 560
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
565 570 575
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
580 585 590
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
595 600 605
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
610 615 620
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
625 630 635 640
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
645 650 655
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
660 665 670
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
675 680 685
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
690 695 700
Gly Lys
705
<210> 8
<211> 719
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Gly Met Ala Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Pro Glu Trp Ile
35 40 45
Ala Phe Ile Asn Asn Leu Ala Ser Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val
50 55 60
Thr Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Gly Asp Tyr Arg Ser Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu
130 135 140
Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser
145 150 155 160
Ser Val Asn Tyr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
165 170 175
Arg Ile Leu Ile Tyr Gly Ile Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala
180 185 190
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
195 200 205
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser
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Thr Phe Pro Pro Tyr Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
225 230 235 240
Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg
245 250 255
Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln Gln Val Gln Leu
260 265 270
Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile
275 280 285
Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Ala Met His Trp
290 295 300
Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Val Ile Ser
305 310 315 320
Thr Tyr Ser Gly His Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala
325 330 335
Ile Met Thr Arg Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser
340 345 350
Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg Gly Ser
355 360 365
Thr Thr Ala His Tyr Tyr Thr Met Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Thr
370 375 380
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
385 390 395 400
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
405 410 415
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
420 425 430
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
435 440 445
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
450 455 460
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
465 470 475 480
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
485 490 495
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
500 505 510
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
515 520 525
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
530 535 540
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
545 550 555 560
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
565 570 575
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580 585 590
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
595 600 605
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
610 615 620
Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
625 630 635 640
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
645 650 655
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
660 665 670
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
675 680 685
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690 695 700
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705 710 715
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<211> 732
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
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1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Gly Met Ala Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Pro Glu Trp Ile
35 40 45
Ala Phe Ile Asn Asn Leu Ala Ser Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val
50 55 60
Thr Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Gly Asp Tyr Arg Ser Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ala Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser
115 120 125
Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu
130 135 140
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145 150 155 160
Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Asn
165 170 175
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180 185 190
Ile Tyr Gly Ile Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser
195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
Pro Tyr Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Ser Ser Ser
245 250 255
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260 265 270
Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln Gln Val Gln Leu Val Gln Ser
275 280 285
Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys
290 295 300
Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Ala Met His Trp Val Lys Gln
305 310 315 320
Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Val Ile Ser Thr Tyr Ser
325 330 335
Gly His Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Ile Met Thr
340 345 350
Arg Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg
355 360 365
Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg Gly Ser Thr Thr Ala
370 375 380
His Tyr Tyr Thr Met Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val
385 390 395 400
Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser
405 410 415
Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys
420 425 430
Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu
435 440 445
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450 455 460
Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr
465 470 475 480
Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val
485 490 495
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500 505 510
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515 520 525
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<400> 10
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Gln Arg Ser Thr Phe Pro Pro Tyr Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu
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Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
435 440 445
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515 520 525
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530 535 540
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545 550 555 560
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725 730 735
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
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Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
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Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln Thr Val Arg Val Thr Cys Gln Gly
245 250 255
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Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn His Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Glu
325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
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420 425 430
Thr Ala Ser Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val
435 440 445
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450 455 460
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465 470 475
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<211> 506
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
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35 40 45
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Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
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Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
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Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
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Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro
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Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro
245 250 255
Ile Leu Pro Gln Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val
260 265 270
Ala Leu Gly Gln Thr Val Arg Val Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg
275 280 285
Ser Tyr Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val
290 295 300
Leu Val Ile Tyr Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg
305 310 315 320
Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly
325 330 335
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340 345 350
Ser Gly Asn His Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Glu Leu Thr Val Leu
355 360 365
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln
370 375 380
Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser
385 390 395 400
Val Arg Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Asn Asn Asn Ala
405 410 415
Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly
420 425 430
Gly Ile Ile Pro Met Phe Gly Thr Ala Lys Tyr Ser Gln Asn Phe Gln
435 440 445
Gly Arg Val Ala Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Gly Thr Ala Ser Met
450 455 460
Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
465 470 475 480
Arg Ser Arg Asp Leu Leu Leu Phe Pro His His Ala Leu Ser Pro Trp
485 490 495
Gly Arg Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
500 505
<210> 13
<211> 519
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
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1 5 10 15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
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Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro
225 230 235 240
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245 250 255
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275 280 285
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325 330 335
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355 360 365
Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg
370 375 380
Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln Gln Val Gln Leu
385 390 395 400
Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Arg Val
405 410 415
Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Asn Asn Asn Ala Ile Asn Trp
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450 455 460
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485 490 495
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515
<210> 14
<211> 519
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Glu Pro Lys Ser Ala Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65 70 75 80
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165 170 175
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Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro
225 230 235 240
Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro
245 250 255
Ile Leu Pro Gln Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val
260 265 270
Ala Leu Gly Gln Thr Val Arg Val Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg
275 280 285
Ser Tyr Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val
290 295 300
Leu Val Ile Tyr Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg
305 310 315 320
Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly
325 330 335
Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Arg Asp Ser
340 345 350
Ser Gly Asn His Trp Val Phe Gly Cys Gly Thr Glu Leu Thr Val Leu
355 360 365
Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg
370 375 380
Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln Gln Val Gln Leu
385 390 395 400
Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Arg Val
405 410 415
Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Asn Asn Asn Ala Ile Asn Trp
420 425 430
Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Cys Leu Glu Trp Met Gly Gly Ile Ile
435 440 445
Pro Met Phe Gly Thr Ala Lys Tyr Ser Gln Asn Phe Gln Gly Arg Val
450 455 460
Ala Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Gly Thr Ala Ser Met Glu Leu Ser
465 470 475 480
Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Arg
485 490 495
Asp Leu Leu Leu Phe Pro His His Ala Leu Ser Pro Trp Gly Arg Gly
500 505 510
Thr Met Val Thr Val Ser Ser
515
<210> 15
<211> 487
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Gly Met Ala Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Ile
35 40 45
Ala Phe Ile Thr Asn Leu Ala Ser Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val
50 55 60
Thr Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Gly Asp Tyr Arg Ser Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu
130 135 140
Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser
145 150 155 160
Ser Val Asn Tyr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
165 170 175
Arg Ile Leu Ile Tyr Gly Ile Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala
180 185 190
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
195 200 205
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser
210 215 220
Thr Phe Pro Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
225 230 235 240
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu
245 250 255
Pro Lys Ser Ala Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
260 265 270
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
275 280 285
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
290 295 300
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
305 310 315 320
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
325 330 335
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
340 345 350
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
355 360 365
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
370 375 380
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys
385 390 395 400
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
405 410 415
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
420 425 430
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
435 440 445
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
450 455 460
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
465 470 475 480
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
485
<210> 16
<211> 500
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Gly Met Ala Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Ile
35 40 45
Ala Phe Ile Thr Asn Leu Ala Ser Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val
50 55 60
Thr Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Gly Asp Tyr Arg Ser Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu
130 135 140
Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser
145 150 155 160
Ser Val Asn Tyr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
165 170 175
Arg Ile Leu Ile Tyr Gly Ile Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala
180 185 190
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
195 200 205
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser
210 215 220
Thr Phe Pro Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
225 230 235 240
Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg
245 250 255
Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln Glu Pro Lys Ser
260 265 270
Ala Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
275 280 285
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
290 295 300
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
305 310 315 320
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
325 330 335
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
340 345 350
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
355 360 365
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
370 375 380
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
385 390 395 400
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
405 410 415
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
420 425 430
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
435 440 445
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
450 455 460
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
465 470 475 480
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
485 490 495
Ser Pro Gly Lys
500
<210> 17
<211> 513
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Gly Met Ala Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Ile
35 40 45
Ala Phe Ile Thr Asn Leu Ala Ser Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val
50 55 60
Thr Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Gly Asp Tyr Arg Ser Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ala Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser
115 120 125
Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu
130 135 140
Pro Gln Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser
145 150 155 160
Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Asn
165 170 175
Tyr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Ile Leu
180 185 190
Ile Tyr Gly Ile Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser
195 200 205
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu
210 215 220
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Thr Phe Pro
225 230 235 240
Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Ser Ser Ser
245 250 255
Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly
260 265 270
Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln Glu Pro Lys Ser Ala Asp Lys
275 280 285
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
290 295 300
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
305 310 315 320
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
325 330 335
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
340 345 350
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
355 360 365
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
370 375 380
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
385 390 395 400
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
405 410 415
Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
420 425 430
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
435 440 445
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
450 455 460
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
465 470 475 480
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
485 490 495
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
500 505 510
Lys
<210> 18
<211> 513
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Gly Met Ala Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Pro Glu Trp Ile
35 40 45
Ala Phe Ile Thr Asn Leu Ala Ser Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val
50 55 60
Thr Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Gly Asp Tyr Arg Ser Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ala Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser
115 120 125
Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu
130 135 140
Pro Gln Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser
145 150 155 160
Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Asn
165 170 175
Tyr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Ile Leu
180 185 190
Ile Tyr Gly Ile Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser
195 200 205
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu
210 215 220
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Thr Phe Pro
225 230 235 240
Pro Tyr Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Ser Ser Ser
245 250 255
Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly
260 265 270
Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln Glu Pro Lys Ser Ala Asp Lys
275 280 285
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
290 295 300
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
305 310 315 320
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
325 330 335
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
340 345 350
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
355 360 365
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
370 375 380
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
385 390 395 400
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
405 410 415
Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
420 425 430
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
435 440 445
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
450 455 460
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
465 470 475 480
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
485 490 495
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
500 505 510
Lys
<210> 19
<211> 491
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
Glu Pro Lys Ser Ala Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65 70 75 80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85 90 95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100 105 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
130 135 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145 150 155 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180 185 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro
225 230 235 240
Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln Thr Val Arg Val Thr Cys Gln Gly
245 250 255
Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
260 265 270
Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly
275 280 285
Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu
290 295 300
Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser
305 310 315 320
Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn His Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Glu
325 330 335
Leu Thr Val Leu Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro
340 345 350
Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln
355 360 365
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
370 375 380
Ser Val Arg Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Asn Asn Asn
385 390 395 400
Ala Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
405 410 415
Gly Gly Ile Ile Pro Met Phe Gly Thr Ala Lys Tyr Ser Gln Asn Phe
420 425 430
Gln Gly Arg Val Ala Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Gly Thr Ala Ser
435 440 445
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
450 455 460
Ala Arg Ser Arg Asp Leu Leu Leu Phe Pro His His Ala Leu Ser Pro
465 470 475 480
Trp Gly Arg Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
485 490
<210> 20
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg
1 5 10 15
Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln
20 25
<210> 21
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
Gly Gly Gly Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser
1 5 10 15
Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln Gly
20 25 30
Gly Gly

Claims (10)

1.一种具有抗原结合活性的多肽，其特征在于，所述的多肽包含至少两个靶向预定抗原的结合功能域、CTP元件和任选的额外功能域，
其中，所述的结合功能域选自下组：抗体重链、抗体轻链、VH、VL和VHH；
并且所述的CTP元件位于两个所述的结合功能域之间或者位于一个所述结合功能域与所述的额外功能域之间。
2.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述的多肽具有如式I所示的结构：
Z1-L1-Z2-L2-Z3 (I)
Z1或Z2为靶向预定抗原的结合功能域；
Z3为任选的额外功能域；
L1或L2为无或CTP元件或接头，且至少有一个为CTP元件；
“-”各自独立地为键；
其中，所述的结合功能域选自下组：抗体重链、抗体轻链、VH、VL和VHH。
3.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述的多肽从N端到C端具有选自式II、III、IV或V所示的结构：
Figure FDA0003268530430000011
其中，
Z1为无、或靶向预定抗原的VH、VL或VHH；
Z2为靶向预定抗原的VH、VL或VHH；
H-Chain--L-Chain为靶向其他抗原的结合功能域；其中，
H-Chain为抗体的重链或其活性片段；L-Chain为抗体的轻链或其活性片段；
Z1-L1-Z2-L2-H-Chain或H-Chain-L2-Z2-L1-Z1为多肽的重链融合片段，
Z1-L1-Z2-L2-L-Chain或L-Chain-L2-Z2-L1-Z1为多肽的轻链融合片段，
L1或L2为无或CTP元件或接头，且至少有一个为CTP元件；
Figure FDA0003268530430000021
表示重链和轻链之间的二硫键；
“-”各自独立地为键。
4.一种药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物含有：
(a)如权利要求1至3任一项所述的多肽；以及
(b)药学上可接受的载体。
5.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码如权利要求1至3任一项所述的多肽。
6.一种载体，其特征在于，所述载体含有如权利要求5所述的多核苷酸。
7.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有如权利要求6所述的载体或基因组中整合有权利要求5所述的多核苷酸。
8.一种免疫偶联物，其特征在于，所述该免疫偶联物含有：
(a)如权利要求1至3任一项所述的多肽；和
(b)选自下组的偶联部分：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、或酶。
9.一种重组蛋白，其特征在于，所述重组蛋白含有：
(a)如权利要求1至3任一项所述的多肽；和
(b)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。
10.一种CTP元件的用途，其特征在于，用于提高多肽的(a)表达量、(b)表达纯度，和/或(c)增加半衰期。
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