CN107880136A - 多聚体il‑15可溶性融合分子与其制造与使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供多聚体IL‑15可溶性融合分子与其制造与使用方法。本发明提供具有至少二个可溶性融合蛋白质的可溶性融合蛋白质复合物。第一融合蛋白质是共价性连结至介白素‑15(IL‑15)或其功能性片段的生物活性多肽。第二融合蛋白质是共价性连结至可溶性介白素‑15受体α(IL‑15Rα)多肽或其功能性片段的第二生物活性多肽。本发明的复合物中，第一及第二融合蛋白质中的一者或二者进一步包含免疫球蛋白Fc结构域或其功能性片段；及第一融合蛋白质结合至第二融合蛋白质的可溶性IL‑15Rα结构域以形成可溶性融合蛋白质复合物。本发明进一步提供制造与使用本发明的复合物的方法。

Description

多聚体IL-15可溶性融合分子与其制造与使用方法
本申请是申请号为201180055995.6，申请日为2011年9月21日，发明名称为“多聚体IL-15可溶性融合分子与其制造与使用方法”的中国专利申请的分案申请。
相关申请案
此申请案主张2010年9月21日申请的美国临时申请案第61/384,817号以及2011年8月26日申请的美国临时申请案第61/527,911号的优先权，其全部内容以引用方式并入本文。
政府支持
支持此申请案的研究是由部长代表的美国卫生与公众福利部所进行。
背景技术
先前的研究已经显示创造多聚体标靶蛋白质对于经由形成多价分子而增强有效亲和性或经由形成多重特异性分子而增广辨识幅度的用途。已将多种蛋白质交互作用结构域应用在产生具有二聚性与多聚性结合位点的重组蛋白质。起始地，标靶结构域对亮胺酸拉链结构域的融合常用在二聚化。在此方案中，亮氨酸拉链结构域的疏水性互动是通过平行α-螺旋中规律间隔的亮氨酸所调控，但是二聚化同伴则是由疏水性芯的立刻外侧的其它胺基酸决定，主要是带电残基，以形成盐桥(1-3)。此互动例举为Fos与Jun家族蛋白质，其较佳形成异源二聚物而不显着影响标靶结构域特异性。此方案提供多功能支架以创造多聚性复合物(4,5)。然而，有限制显着影响此方案用在治疗蛋白质开发的有效性。最重要地，Fos与Jun为胞内蛋白质其几乎特有的累积在核中。因此，可溶性与分泌的Fos与Jun融合物通常使用杆状病毒感染或安定的转形昆虫细胞系统生产，为相对低产率且不容易升级制造过程(6,7)。在创造双特异性分子的尝试中，连结至Fos-Jun的抗体结构域在细菌细胞或哺乳动物细胞中生产，但主要限制为亚单元的同源二聚化(8,9)，此会复杂化纯化过程及降低整体产率(8,9)。再者，当使用治疗应用时，通过昆虫细胞或细菌细胞所生产的不同形式的蛋白质糖基化，提升产物潜在免疫原性的顾虑。
除了亮氨酸拉链模体外，免疫球蛋白(IgG)恒定结构域、螺旋-转角-螺旋自二聚化肽、胶原蛋白及p53的三-及四-聚性亚结构域已用在在作为支架用以创造多价分子(8,10-13)。除了IgG片段，这些互动结构域主要作为分子支架且其本身缺乏其它功能活性。同时，含有这些结构域的融合蛋白质通常需要进一步的最佳化以促进安定多聚体的形成及特殊化生产细胞株及生产方法，这些对于治疗开发是令人厌烦的或强加的管控障碍(10,12)。许多这些支架是非人类蛋白质结构域或写将非原始成分的衍生物，可能显现不佳的药物动力学性质及拥有可能限制这些的治疗潜力的免疫原性回应风险。
发明内容
本发明提供具有至少二种可溶性融合蛋白质的可溶性融合蛋白质复合物。在某需实施例中，第一融合蛋白质包含共价性连结至介白素-15(IL-15)多肽或其功能性片段的第一生物活性多肽。第二融合蛋白质包含共价性连结至可溶性介白素-15受体α(IL-15Rα)多肽或其功能性片段的第二生物活性多肽。这些复合物中，第一及第二融合蛋白质中的一者或二者进一步包含免疫球蛋白Fc结构域或其功能性片段。这些复合物中，第一融合蛋白质的IL-15结构域结合至第二融合蛋白质的可溶性IL-15Rα结构域以形成可溶性融合蛋白质复合物。
某些实施例中，在可溶性融合蛋白质复合物中，第1及第二生物活性多肽的一者包含第一可溶性T细胞受体(TCR)或其功能性片段。某些实施例中，包含第一可溶性TCR的可溶性融合蛋白质包含第二可溶性TCR作为生物活性多肽，藉此创造具有增加的结合活性的多价TCR融合蛋白质复合物。某些实施例中，复合物中的TCR包含至少二个不同的TCR。某些实施例中，当存在至少二个不同的TCR时，TCR结合至分别的标靶分子。某些实施例中，当存在至少二个不同的TCR时，TCR结合至相同分子上的不同表位。某些实施例中，TCR是特异辨识特定抗原。
本发明的可溶性融合复合物中，某些实施例中，TCR是独立地选自包括α及β链TCR的异源二聚物与单链TCR多肽。某些实施例中，单链TCR包含通过肽连结子序列共价性连结至TCR V-β链的TCR V-α链。某些实施例中，单链TCR进一步包含共价性连结至TCR V-β链的可溶性TCR Cβ链片段。某些实施例中，单链TCR进一步包含共价性连结至TCR V-α链的可溶性TCR Cα链片段。可溶性融合蛋白质复合物的某些实施例中，第一生物活性多肽包含TCRα多肽或其功能性片段及第二生物活性多肽包含TCRβ多肽或其功能性片段。
某些实施例中，可溶性融合蛋白质复合物中，第一及第二生物活性多肽的一者或二者包含抗体或其功能性片段。某些实施例中，所有抗体都相同。某些实施例中，当存在至少二种不同抗体时，抗体结合至分别的标靶分子。某些实施例中，当存在至少二种不同抗体时，抗体结合至相同标靶分子上的不同表位。某些实施例中，抗体是特异辨识特定抗原。
可溶性融合蛋白质复合物的某些实施例中，抗体是单-链抗体或单-链Fv。某些实施例中，单-链抗体包括通过多肽连结子序列共价性连结至免疫球蛋白重链可变结构域的免疫球蛋白轻链可变结构域。某些实施例中，第一生物活性多肽包括抗体重链多肽或其功能性片段及第二生物活性多肽包括抗体轻链多肽或其功能性片段。
本发明的可溶性融合蛋白质复合物的某些实施例中，IL-15多肽是相较于原始IL-15多肽为具有不同胺基酸序列的IL-15变体。人类IL-15多肽在本文指称为huIL-15、hIL-15、huIL15、hIL15、IL-15野生型(wt)等且其变体是使用原始胺基酸指称其在成熟序列及变体胺基酸的位置。例如，huIL15N72D指称包括在位置72的N取代为D的人类IL-15。某些实施例中，IL-15变体作用为IL-15激动剂如通过相较于原始IL-15多肽显示增加的IL-15RβγC受体结合活性。某些实施例中，IL-15变体作用为IL-15拮抗剂如通过相较于原始IL-15多肽显示减少的IL-15RβγC受体结合活性。某些实施例中，IL-15变体相较于原始IL-15多肽对于IL-15RβγC受体具有增加的结合亲和性或减少的结合活性。某些实施例中，IL-15变体的序列，相较于原始IL-15序列，具有至少1个(也就是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个)胺基酸改变。胺基酸改变可包含与IL-15R及/或IL-15RβγC互动的IL-15结构中的一个或多个胺基酸取代或删除。某些实施例中，胺基酸改变是成熟人类IL-15序列(序列编号：1)的位置8、61、65、72、92、101、108或111的一或多个胺基酸取代或删除。例如，成熟人类IL-15序列的位置8的D取代为N或A，位置61的D取代为A，位置65的N取代为A，位置72的N取代为R或位置108的Q取代为A，或这些取代的任何组合。某些实施例中，胺基酸改变是成熟IL-15序列的位置72的N取代为D。
本发明的某些实施例中，在可溶性融合蛋白质复合物中，Fc结构域或其功能性片段包含选自由IgG Fc结构域、人类IgGl Fc结构域、人类IgG2 Fc结构域、人类IgG3 Fc结构域、人类IgG4 Fc结构域、IgA Fc结构域、IgD Fc结构域、IgE Fc结构域及IgM Fc结构域；或其任何组合所组成群的Fc结构域。某些实施例中，Fc结构域包含造成Fc结构域具有改变的补体或Fc受体结合性质的胺基酸改变。生产具有改变的补体或Fc受体结合性质的胺基酸改变为此项技术中已知的。例如，在IgGl CH2的位置234及235(根据抗体共有序列编号)的亮氨酸残基(也就是...P E L L G G...)经丙氨酸残基取代(也就是...P E A A G G...)造成Fcγ受体结合的损失，相反地，在IgGl CH2的位置322(根据抗体共有序列编号)的赖氨酸残基(也就是...K C KS L...)经丙氨酸残基取代(也就是...K C A S L...)造成补体活化的损失。某些实施例中，可组合这些突变。
可溶性融合蛋白质复合物的某些实施例中，第一生物活性多肽是通过多肽连结子序列共价性连结至IL-15多肽(或其功能性片段)。可溶性融合蛋白质复合物的某些实施例中，第二生物活性多肽是通过多肽连结子序列共价性连结至IL-15α多肽(或其功能性片段)。可溶性融合蛋白质复合物的某些实施例中，IL-15α多肽(或其功能性片段)是通过多肽连结子序列共价性连结至Fc结构域(或其功能性片段)。各多肽连结子序列可独立选择。某些实施例中，多肽连结子序列是相同的。某些实施例中，他们是不同的。
某些实施例中，TCR结构域的抗原包含存在于MHC或HLA分子的肽抗原。某些实施例中，肽抗原是衍生自(有介是包含至少一部分序列)肿瘤相关多肽或病毒编码多肽。某些实施例中，抗体结构域的抗原包括细胞表面受体或配体。
某些实施例中，抗体结构域的抗原是CD抗原、细胞激素或趋化激素受体或配体，生长因子受体或配体、细胞粘合分子、MHC/类-MHC分子、Fc受体,、类-Toll受体、NK受体、TCR、BCR、阳性/阴性共刺激受体或配体、死亡受体或配体、肿瘤相关抗原或病毒编码抗原的一者或多者。
可溶性融合蛋白质复合物的某些实施例中，IL-15Rα多肽包含能结合IL-15多肽的IL-15受体α的细胞外结构域。可溶性人类IL-15Rα多肽在本文中指称为hlL-15Rα、huIL-15Rα、hIL-15Rα、huIL-15Rα等。某些实施例中，IL-15Rα多肽包含IL-15Rαsushi(Su)结构域或IL-15RαΔE3结构域。
某些实施例中，本发明的可溶性融合蛋白质复合物是多聚化，例如，二聚化、三聚化或其它多聚化(例如4复合物、5复合物等)。某些实施例中，多聚体是同源多聚体。某些实施例中，多聚体是异源多聚体。某些实施例中，可溶性融合蛋白质复合物联合是通过共价键，例如双硫键、化学交联剂。某些实施例中，双硫键是共价连结第一可溶性融合蛋白质复合物的第二多肽的Fc结构域至第二可溶性融合蛋白质复合物的第二多肽的Fc结构域。
某些实施例中，本发明的可溶性融合蛋白质复合物包含IL-15多肽、IL-15变体或其功能性片段及可溶性IL-15Rα多肽或其功能性片段，其中IL-15及IL-15Rα多肽中的一者或二者进一步包含免疫球蛋白Fc结构域或其功能性片段。
某些实施例中，本发明的可溶性融合蛋白质复合物包含至少一个包括可侦测标记的可溶性融合蛋白质。可侦测标记包含，但不限于，生物素、链霉亲和素、酵素或其催化性活性片段、放射性核、纳米粒子、顺磁金属离子、或荧光、磷光或化学冷光分子；或其任何组合。
本发明提供编码任何本发明的融合蛋白质的核酸序列。某些实施例中，核酸序列进一步包含一个或多个转译及/或转录调控序列，例如，启动子、转译起始序列及前导序列；可操作地连结至编码所述融合蛋白质的序列。某些实施例中，核酸序列是在载体中用于复制、表现或二者。
本发明提供用于制造本发明的可溶性融合蛋白质复合物的方法。所述方法包含步骤：
a)将具有编码第一融合蛋白质的合适调控序列的DNA载体导入第一宿主细胞，
b)在足以在细胞中或媒质媒质中表现第一融合蛋白质的条件下在媒质中培养第一宿主细胞；
c)自第一宿主细胞或媒质纯化第一融合蛋白质，
d)将具有编码第二融合蛋白质的合适调控序列的DNA载体导入第二宿主细胞，
e)在足以在细胞中或媒质中表现第二融合蛋白质的条件下在媒质中培养第二宿主细胞；及
f)自第二宿主细胞或媒质纯化第二融合蛋白质，及
g)在足以使第一融合蛋白质的IL-15结构域与第二融合蛋白质的可溶性IL-15Rα结构域结合的条件下混合第一及2融合蛋白质，以形成可溶性融合蛋白质复合物。
某些实施例中，所述方法进一步包含在足以使自表现载体所表现的多肽间形成双硫键的条件下混合第一及第二融合蛋白质。
本发明提供用于制造本发明的可溶性融合蛋白质复合物的方法，所述方法包含步骤：
a)将具有编码第一融合蛋白质的合适调控序列的DNA载体及具有编码第二融合蛋白质的合适调控序列的DNA载体导入宿主细胞，
b)在足以在细胞中或媒质中表现融合蛋白质及使第一融合蛋白质的IL-15结构域与第二融合蛋白质的可溶性IL-15Rα结构域之间结合的条件下，在媒质中培养宿主细胞以形成可溶性融合蛋白质复合物；
c)自宿主细胞或媒质中纯化可溶性融合蛋白质复合物。
某些实施例中，所述方法进一步包含在足以使自表现载体所表现的多肽间形成双硫键的条件下混合第一及第二融合蛋白质。
本发明提供用于制造本发明的可溶性融合蛋白质复合物的方法，所述方法包含步骤：
a)将具有编码第一及第二融合蛋白质的合适调控序列的DNA载体导入宿主细胞，
b)在足以在细胞中或媒质中表现融合蛋白质以及使第一融合蛋白质的IL-15结构域与第二融合蛋白质的可溶性IL-15Rα结构域之间结合以形成可溶性融合蛋白质复合物，且使权利要求46的核酸所编码的多肽间形成双硫键的条件下，在媒质中培养宿主细胞；
c)自宿主细胞或媒质中纯化可溶性融合蛋白质复合物。
某些实施例中，所述方法进一步包含在足以使自表现载体所表现的多肽间形成双硫键的条件下混合第一及第二融合蛋白质。
本发明提供用于杀标靶细胞的方法，所述方法包含步骤：
a)使多种细胞与本发明的可溶性融合蛋白质接触，其中多种细胞进一步包含带有由IL-15结构域所辨识的IL-15R链的免疫细胞，或带有由Fc结构域所辨识的Fc受体链的免疫细胞，及带有由至少一个生物活性多肽所辨识抗原的标靶细胞，
b)在标靶细胞的抗原及免疫细胞的IL-15R链或Fc受体链之间形成特异结合复合物(桥)，足以结合及活化免疫细胞；及
c)通过所结合的免疫细胞杀标靶细胞。
杀方法的某些实施例中，标靶细胞为肿瘤细胞或病毒感染细胞。
杀方法的某些实施例中，生物活性多肽包含TCR。
杀方法的某些实施例中，标靶细胞的抗原包含呈现在MHC或HLA分子且为TCR所辨识的肿瘤或病毒编码肽抗原。免疫细胞为例如T细胞、LAK细胞、NK细胞、巨噬细胞、单核球或颗粒球。
本发明提供在患者用以预防或治疗疾病的方法，其中疾病细胞表现疾病相关抗原，所述方法包含步骤：
a)对患者投药具有辨识疾病相关抗原的生物活性多肽的本发明可溶性融合蛋白质复合物；
b)在抗原表现疾病细胞及IL-15R或Fc受体表现免疫细胞之间形成特异性结合复合物(桥)足以定位免疫细胞；及
c)足以预防或治疗患者疾病地损伤或杀疾病细胞。
本发明提供在患者用以预防或治疗疾病的方法，其中疾病细胞表现疾病相关抗原，所述方法包含步骤：
a)将带有IL-15R链或Fc受体链的免疫细胞与包括辨识疾病相关抗原的生物活性多肽的本发明可溶性融合蛋白质复合物混合，
b)对患者投药免疫细胞-融合蛋白质复合物混合物；
c)在抗原表现疾病细胞与IL-15R和Fc受体表现免疫细胞之间形成特异性结合复合物(桥)足以定位免疫细胞；及
d)足以预防或治疗患者疾病地损伤或杀疾病细胞。
在患者用以预防或治疗疾病的方法的某些实施例中，其中疾病细胞表现疾病相关抗原，所述疾病是癌症或病毒感染。某些实施例中，所述疾病相关抗原是肽/MHC复合物。
本发明提供在哺乳动物刺激免疫回应的方法，所述方法是通过对哺乳动物投药有效量的本发明的可溶性融合蛋白质复合物。
本发明提供在哺乳动物压抑免疫回应的方法，所述方法是通过对哺乳动物投药有效量的本发明的可溶性融合蛋白质复合物。
本发明提供侦测细胞或组织的方法，所述细胞或组织包括呈现在细胞或组织的抗原，所述方法包含步骤：
a)将细胞或组织与至少一种包含可侦测标记的本发明可溶性融合蛋白质复合物，在抗原及可溶性融合蛋白质复合物的生物活性多肽之间形成特异结合复合物的条件下接触，
b)在适合移除未结合至抗原的任何可溶性融合蛋白质复合物的条件下清洗细胞或组织；及
c)侦测特异结合复合物作为包括抗原的细胞或组织的指示。
侦测方法的某些实施例中，生物活性多肽包括TCR及抗原，所述抗原包括由TCR所辨识的呈现在MHC或HLA分子的肽抗原。本文所提供的侦测方法为高度敏感的。例如，在方法中，所呈现的抗原拷贝数为每个细胞1000或更少拷贝。本文所提供的侦测方法可实用在体内、体外或离体内。
本发明提供增加本发明的可溶性融合蛋白质复合物的每个分子结合活性的方法，所述方法是通过形成第一可溶性融蛋白质复合物与第二可溶性融合蛋白质复合物的二聚物，其中各融合蛋白质复合物的1生物活性多肽及第二生物活性多肽的结合位点为相同或不同。某些实施例中，结合是协同性增加。例如，每个分子结合活性增加10％或更多、20％或更多、30％或更多、40％或更多、50％或更多、60％或更多、70％或更多。
本发明也提供增加本发明的可溶性融合蛋白质复合物的每个分子IL-15活性的方法，所述方法是通过形成第一可溶性融蛋白质复合物与第二可溶性融合蛋白质复合物的二聚物。
一态样中，本发明提供用于制造介白素-15(IL-15)：介白素-15受体α(IL-15Rα)融合蛋白质复合物的方法，所述方法涉及将编码IL-15(或IL-15变体)的第一DNA载体及编码IL-15Rα融合蛋白质的第二DNA载体导入宿主细胞(如哺乳动物细胞)；在足以表现IL-15(或IL-15变体)及IL15Rα融合蛋白质的条件下在媒质中培养宿主细胞；及自宿主细胞或媒质中纯化IL-15：IL-15Rα融合蛋白质复合物。
另一态样中，本发明提供制造含有IL-15Rα/Fc融合蛋白质的IL-15：IL-15Rα复合物的方法，所述方法涉及将编码IL-15(或IL-15变体)的第一DNA及编码IL-15Rα/Fc融合蛋白质的第二DNA导入宿主细胞；在足以表现IL-15(或IL-15变体)及IL-15Rα/Fc融合蛋白质的条件下在媒质中培养宿主细胞；及自宿主细胞或媒质中纯化IL-15：IL-15Rα/Fc复合物。
另一态样中，本发明提供制造含有IL-15Rα/Fc融合蛋白质的IL-15：IL-15Rα融合蛋白质复合物的方法，所述方法涉及在宿主细胞中共表现IL-15(或IL-15变体)及IL-15Rα/Fc融合蛋白质；在足以表现IL-15(或IL-15变体)及IL-15Rα/Fc融合蛋白质的条件下在媒质中培养宿主细胞；自宿主细胞或媒质中纯化IL-15：IL-15Rα/Fc融合蛋白质复合物。
另一态样中，本发明提供制造IL-15N72D：IL-15RαSu/Fc融合蛋白质复合物的方法，所述方法涉及在宿主细胞中共表现IL-15N72D及IL-15RαSu/Fc融合蛋白质；在足以表现IL-15N72D及IL-15RαSu/Fc融合蛋白质的条件下在媒质中培养宿主细胞；及自宿主细胞或媒质中纯化IL-15N72D：IL-15RαSu/Fc融合蛋白质复合物，其中IL-15N72D：IL-15RαSu/Fc复合物的二IL-15结合位点是完全被占用的。
另一态样中，本发明提供细胞，所述细胞含有编码IL-15或IL-15变体的第一多肽及编码IL-15受体融合蛋白质的第二多肽。一实施例中，细胞包括编码IL-15N72D的第一表现载体及编码IL-15RαSu/Fc融合蛋白质的第二表现载体。
另一态样中，本发明提供含有二聚化IL-15RαSu/Fc及二个IL-15N72D分子的经单离完全被占用的IL-15N72D：IL-15RαSu/Fc复合物。一实施例中，复合物为至少90至95％或更高的经纯化完全被占用；具有等电点介于5.6至6.5之间；具有分子量约114kDa；及/或IL-15N72D多肽及IL-15RαSu/Fc多肽的一者或二者经糖基化。
另一态样中，本发明提供经单离完全被占有的IL-15N72D：IL-15RαSu/Fc复合物，所述复合物是根据本文揭露的表现及纯化的任何方法所生产。
另一态样中，本发明提供在个体中调节(如增加或减少)免疫回应的方法，所述方法涉及对个体投药完全占用的IL-15N72D：IL-15RαSu/Fc复合物。
另一态样中，本发明提供在具有瘤形成的个体中增强免疫回应的方法，所述方法涉及对个体投药完全被占用的IL-15N72D：IL-15RαSu/Fc复合物。
上述态样或本文所揭露的本发明任何其它态样的各种实施例中，IL-15Rα融合蛋白质包括共价性连结生物活性多肽(如IgG的重链恒定结构域，IgG的重链恒定结构域的Fc结构域)的可溶性IL-15Rα。上述态样的本发明的其它实施例中，IL-15包括共价性连结至第二生物活性多肽的IL-15。其它实施例中，自宿主细胞或媒质中纯化IL-15：IL-15Rα复合物涉及在特异性结合IL-15：IL-15Rα融合蛋白质复合物的亲和性试剂捕集IL-15：IL-15Rα复合物。其它实施例中，IL-15Rα融合蛋白质含有IL-15Rα/Fc融合蛋白质且所述亲和性试剂特异性结合Fc结构域。其它实施例中，亲和性试剂为蛋白质A或蛋白质G。其它实施例中，亲和性试剂为抗体。其它实施例中，自宿主细胞或媒质中纯化IL-15：IL-15Rα复合物包括离子交换层析。其它实施例中，自宿主细胞或媒质中纯化IL-15：IL-15Rα复合物包括尺寸排除层析。其它实施例中，IL-15Rα包括IL-15RαSushi(IL-15RαSu)。其它实施例中，IL-15为变体IL-15(如IL-15N72D))。其它实施例中，IL-15：IL-15Rα复合物的IL-15结合位点为完全被占用的。其它实施例中，IL-15：IL-15RαSu/Fc复合物的二个IL-15结合位点是完全被占用的。其它实施例中，IL-15：IL-15Rα复合物是根据复合物电荷或尺寸性质纯化。其它实施例中，完全被占用的IL-15N72D：IL-15RαSu/Fc融合蛋白质复合物是根据复合物电荷性质通过阴离子交换层析纯化。其它实施例中，完全被占用的IL-15N72D：IL-15RαSu/Fc融合蛋白质复合物是利用具有结合条件的四级胺系树脂而纯化，所述结合条件应用低离子强度中性pH缓冲液及应用增加离子强度缓冲液的洗提条件。
本发明也包含套组，所述套组包含一个或多个本发明的可溶性融合蛋白质复合物，用于制造本发明的可溶性融合蛋白质复合物的一个或多个特异性试剂(如编码一个或多个本发明的可溶性融合蛋白质的核苷酸)，及/或用以使用本发明的一个或多个可溶性融合蛋白质复合物的特异性材料。套组中的材料是以合适包装提供，典型是与说明书一并使用。
其它实施例将由后文揭露而清楚。
附图说明
图1显示由多链多肽组成的称为T2分子(T2M)的融合蛋白质。
图2显示含有正确人类IL15RαSushi基因插入的载体(pMC.c264scTCR-Su/IgGl.PUR)。
图3显示c264scTCR/huIL15RαSushi/huIgGl核酸序列的序列。
图4显示c264scTCR/huIL15RαSushi/huIgGl肽的蛋白质序列。
图5显示指名为c264scTCR/Sushi/hIgGl-pMSGVc或pMSGVc264SuIg的载体。
图6显示c264scTCR/huIL15RαSushi/huIgGl核酸序列的序列。
图7显示c264scTCR/huIL15RαSushi/huIgGl肽的蛋白质序列。
图8显示cl49scTCR/IL15N72D-pMSGVn或pMSGV-cl49IL15N72D的载体。
图9显示cl49scTCR/huIL15N72D核酸序列的序列。
图10显示cl49scTCR/huIL15N72D肽的蛋白质序列。
图11显示在还原条件及未还原条件下，T2、c264scTCR/huIgGl及c264scTCR/huIgGlΔCHl融合蛋白质的纯化组分的SDS-PAGE分析。在还原条件下，T2分子带移动于与c264scTCR/huIL15及c264scTCR/huIL15RαSushi/huIgGl多肽一致的分子量。在未还原条件下，c264scTCR/huIL15RαSushi/huIgGl带移动于与二聚化双硫键连结的c264scTCR/huIL15RαSushi/huIgGl复合物及c264scTCR/huIL15N72D多肽一致的分子量。
图12显示原始T2蛋白质显现于所期望的四-链(2xc264scTCR/IL15N72D,2xc264scTCR/huIL15RαSushi/huIgGl)分子的分子量溶离的尺寸排除凝胶过滤层析的结果。
图13显示体外结合试验的结果，其中等摩尔量的经纯化T2蛋白质，由c264scTCR/huIL15N72D及c264scTCR/huIL15RαSushi/huIgGl链组成，或经纯化的c264scTCR/huIgGl融合蛋白质是捕集在被覆有抗人类IgG抗体的孔中。结合后，在ELISA条件下使用抗人类IgGl抗体侦测蛋白质。
图14显示体外结合试验的结果，其中等摩尔量的T2或c264scTCR/huIgGl蛋白质是捕集在被覆有抗人类IgG抗体的孔中且以抗人类TCR Cβ抗体(W4F)侦测。
图15显示体外结合试验的结果，其中估算T2分子的TCR结构域的肽/MHC结合活性。等摩尔量的T2(由c264scTCR/huIL15N72D及c264scTCR/huIL15RαSushi/huIgGl链组成)或c264scTCR/huIgGl蛋白质是捕集在被覆有抗人类IgGl Ab的孔中且以p53(aa 264-272)肽/HLA-A2链霉亲和素-HRP四聚物侦测。
图16显示显现T2分子的IL-15结构域活性的体外试验结果。微量滴定孔经被覆抗人类IL-15抗体及等摩尔量的经纯化T2蛋白质，由c264scTCR/huIL15N72D及c264scTCR/huIL15RαSushi/huIgGl链组成，或经纯化c264scTCR/huIL15N72D融合蛋白质是添加至这些孔。结合及清洗步骤后，在标准ELISA条件下利用抗人类IL-15抗体侦测结合的蛋白质。
图17显示来自增殖试验的结果，所述增殖试验是使用细胞激素-依赖性32Dβ细胞株进一步特征化T2分子IL-5结构域的功能活性。为了测量细胞增殖，32Dβ细胞(2x104细胞/孔)与增加浓度的T2蛋白质(由c264scTCR/huIL15N72D及c264scTCR/huIL15RαSushi/huIgGl链组成)或c264scTCR/huIL15N72D融合蛋白质在37℃培养48小时。根据制造者的程序，在最后4小时的细胞生长期间添加细胞增殖试剂WST-1(Roche(R)Applied Science)。通过代谢活性细胞转换WST-1成着色的甲瓒(formazan)颜料是通过测量440nm的吸收而测定。
图18A至B显示体内灵长类模型测量T2蛋白质促进IL-15回应性免疫细胞增殖能力的结果。注射T2蛋白质5日后收集血液且以CD8记忆T细胞标记(CD8及CD95)(A)及NK细胞标记(CD56及CD16)染色(B)且与处理前采集的血液比较。
图19A至B显示特征化T2分子的IgGlFc结构域的结合活性的细胞结合试验。A.流式细胞仪分析显示其中带有Fc-γ受体的U937细胞与33nM的T2蛋白质(由c264scTCR/huIL15N72D及c264scTCR/huIL15RαSushi/huIgGl链)，c264scTCR/huIgGl或A2AL9scTCR/IgGl(阴性对照)培养20分钟。清洗细胞一次与PE-接合p53(aa264-272)肽/HLA-A2四聚物培养20分钟。对U937细胞表面的Fc-γ受体的结合是利用流式细胞仪分析。B.流式细胞仪分析显示结果，所述结果来自使用蛋白质浓度范围的类似U937结合研究如所述的进行且作途经染色细胞的平均荧光强度。
图20显示试验结果，所述试验是用于估算T2分子的Fc结构域对于调节抗体依赖性细胞的细胞毒性活性的生物活性。将T2蛋白质、c264scTCR/huIgGl或A2AL9scTCR/IgGl(阴性对照)以浓度0.137nM至100nM添加至96孔盘。HLA-A2-阳性T2标靶细胞以10μM的p53aa264-272肽脉冲且以50μg/ml的钙黄绿素-AM(Calcein-AM)标记。融合蛋白质与每孔lxl04的标靶细胞混合且添加lxl06/孔的新鲜人类PBMC。将盘在37℃的CO2培养箱中培养2小时且收集100μl的条件培养基及定量分析自裂解细胞释放的钙黄绿素。
图21A及B显示试验结果，其中HLA-A2-阳性T2细胞以各种量的p53aa264-272肽脉冲以估算T2蛋白质对细胞表面的肽/MHC标靶的结合活性。经附载肽的细胞与T2蛋白质(由c264scTCR/huIL15N72D及c264scTCR/huIL15RαSushi/huIgGl链组成)、c264scTCR/huIgGl或A2AL9scTCR/IgGl(阴性对照)培养，各为83nM。细胞与生物素化抗-TCRAb(BF1)及链霉亲和素-PE培养。然后细胞通过流式细胞仪分析抗体染色(A)及经附载不同浓度肽的细胞的平均荧光染色强度作图(B)。
图22显示ELISA结果，其中cl49scTCR/huIL15N72D及c264scTCR/huIL15RαSushi/huIgGl或c264scTCR/huIL15N72D及c264scTCR/huIL15RαSushi/huIgGl(在细胞培养上清液中)的T2分子捕集在经被覆抗人类TCR抗体BF1的微量滴定盘，且使用抗人类TCR抗体W4F-BN侦测结合的T2分子。
图23显示ELISA结果，其中cl49scTCR/huIL15N72D及c264scTCR/huIL15RαSushi/huIgGl或c264scTCR/huIL15N72D及c264scTCR/huIL15RαSushi/huIgGl(在细胞培养上清液中)的T2分子捕集在经被覆山羊抗人类IgG抗体的微量滴定盘，且使用抗人类IL-15抗体侦测结合的T2分子。
图24显示ELISA结果，其中cl49scTCR/huIL15N72D及c264scTCR/huIL15RαSushi/huIgGl(在细胞培养上清液中)的T2分子捕集在经被覆山羊抗人类IgG抗体或抗人类TCR抗体BF1的微量滴定盘。BF-1捕集T2分子使利用抗人类TCR抗体W4F-BN或抗人类IL-15抗体侦测。山羊抗人类IgG Ab-捕集T2分子是利用p53(aa 49-157)肽/HLA-A2链霉亲和素-HRP四聚物或p53(aa 264-272)肽/HLA-A2链霉亲和素-HRP四聚物侦测。
图25显示流式细胞仪试验结果，其中包括二个不同TCR结构域的T2分子，也就是c264scTCR/huIL15N72D及cl49scTCR/huIL15RαSushi/tiuIgGl链，经特征化。这些分子的Fc及TCR活性是在结合至带有Fc-γ受体的U937细胞且接着以流式细胞仪利用p53(aa 264-272)肽/HLA-A2四聚物侦测而估算。
图26A及B显示药物动力学试验结果，其中A.小鼠或B.猴子以由c264scTCR/huIL15N72D及c264scTCR/huIL15RαSushi/huIgGl链组成的经纯化的T2蛋白质注射。在指定时间收集样品。A.ELISA格式化试验其中山羊抗人类IgG Ab用在在被覆孔，以及抗人类TCRAb(W4F-BN)用在侦测；或山羊抗人类IgG Ab用在被覆盘，及抗人类IL-15Ab用在侦测，在指定时间定量血液中T2蛋白质的量。B.抗人类TCR Ab(F-l)用在被覆孔，及HRP接合山羊抗人类IgG Ab用在侦测；或抗人类IL-15Ab用在被覆盘，及HRP接合山羊抗人类IgG Ab用在侦测；或抗人类IL-15Ab用在被覆盘及抗人类TCR Ab(W4F-BN)用在侦测。
图27显示使用人类p53+HLA-A2+A375黑色素瘤细胞株在裸小鼠的原发性肿瘤生长模型的结果。带有肿瘤的小鼠以32μg/剂量(1.6mg/kg)的由c264scTCR/huIL15N72D及c264scTCR huIL15RαSushi/huIgGl链组成的T2蛋白质、32μg/剂量(1.6mg/kg)c264scTCR/huIL2或60μg/剂量(3mg/kg)264scTCR/huIgGl静脉注射。测量肿瘤生长且数据显示在图。
图28显示在IL-15结构域中具有各种点突变的T2分子的IL-15活性试验结果，通过32Dβ细胞的增值而测量。
图29显示抗体依赖性细胞的细胞毒性试验结果，所述试验用在IL-15结构域及IgGFc结构域中具有各种点突变的T2分子，通过附载肽的T2标靶细胞的PBMC-依赖性裂解而测量。
图30显示试验结果，所述试验是侦测IL-15及Fc突变对于T2分子刺激人类NK及T细胞回应回应的能力的效果。人类PBMCs以1.8至5x 105细胞/mL在含有1nM的包括指定的突变的T2分子或具有10ng/mL的作为对照的重组人类IL-2或IL-15的培养基在37℃培养4日。NK细胞的细胞毒性是使用NK-敏感性K-562细胞作为标靶细胞接着以50ug/ml的钙黄绿素-AM标记而估算。
图31显示NK细胞增殖试验的结果，其中人类PBMCs与在IL-15及IgG Fc结构域中包括各种点突变的T2分子或与作为对照的重组人类IL-2或IL-15一起培养。包括c264scTCR/huIL15RαSushi/huIgGl及c264scTCR/huIL15N72D链的T2分子或具有Fc结构域LALA及KA变体者，造成CD56+NK细胞的增值增加，反之包括IL-15N65D或D8N取代的T2分子并未提供一样多的NK细胞增殖活性。
图32A及B显示流式细胞仪试验的结果，所述试验是测试包含IL-15及Fc突变的T2分子对于具有(T2.265)及不具有附载的p53肽(T2)的T2细胞的抗原特异性结合。A显示流式细胞仪柱状图及B显示肽-特异性对于非特异性细胞染色的信号对噪声比。
图33A至C显示试验结果，所述试验是侦测各种T2分子及IL-15分子对于A.支持32Dβ细胞生长，对于B.刺激各种T细胞族群的扩张，以及对于C.刺激NK细胞活性的活性。
图34显示体内试验结果，所述结果是测量小鼠中各种T2分子使用流式细胞仪通过血液中及胰脏细胞中CD8+T细胞及NK细胞的百分比改变所显示的免疫刺激活性。
图35A及B显示ELISA结果，所述ELISA是使用多特异性T2分子包括1)融合至特异于卵白蛋白的胺基酸257-264的scTCR的huIL15N72D结构域及2)连结至huIL15RαSushi/huIgGl融合物的单链CD8α/β结构域。OT1-CD8-T2M的结合活性与OTlscTCR/huIL15N72D融合物的结合活性通过ELISA比较。等摩尔量的各蛋白质在经被覆抗-TCRC mAb(H57)的孔被捕集且以OVA aa257-264/H-2Kb四聚物或对IL15、CD8α、CD8β或TCR Vα2的mAb当作探针。试验也在经被覆抗人类Ig的孔且以抗-TCR Va2当作探针。
图36.A.显示c264scTCR/hIL-15：c264scTCR/hIL-15RαSu/birA复合物(c264scTCR二聚物)的示意图。二聚化L-15：hIL-15RαSu结构域的模型是根据人类IL-15：IL-15Rα复合物(33)(PDB 2Z3Q)的公开结晶结构。B.显示c264scTCR融合蛋白质的SEC分析。框图显示c264scTCR/hIL-15(顶部)、c264scTCR/hIL-5RαSu/birA(中间)及c264scTCR/hIL-15：c264scTCR/hIL-15RαSu/birA复合物(c264scTCR二聚物)(底部)的尺寸分析，以虚线表示相对的蛋白质峰。
图37显示包括c264scTCR/hIL-15：c264scTCR/hIL-15RαSu/birA复合物及包括cl49scTCR/hIL-15：c264scTCR/hIL-15RαSu/birA复合物的c264scTCR/cl49scTCR异源二聚物的c264scTCR二聚物的结合活性特征。A.T2细胞是经0-62.5nM的p53(aa264-272)肽脉冲。细胞以等量(80nM)的c264scTCR二聚物或c264scTCR/birA的PE-接合多聚物染色。B.以c264scTCR/birA试剂比较c264scTCR二聚物的细胞中染色的相对增加是以不同的肽浓度测定。增加倍数＝(T2细胞以c264scTCR二聚物染色的Geo平均)/(T2细胞以c264scTCR/birA染色的Geo平均)。C.c264scTCR/c 149scTCR异源二聚物的p53肽/HLA-A*0201结合活性事通过ELISA测量。使用抗-hIL-15单抗(R&D System)做为捕集抗体。A2/p53.264-272.HRP或A2/p53.149-157.HRP四聚物使用作为探针。数据显示为三重复测量的平均±SD。
图38显示包括OT1scTCR/hIL-15：OT1scTCR/hIL-15RαSu/birA复合物的OTlscTCR二聚物的结合活性的特征。EL4细胞以OVA(aa257-264)肽附载且以OTlscTCR/birA-SA-PE(顶部)及OTlscTCR二聚物-SA-PE(底部)在200nM染色。
图39显示包括OTlscTCR/hlL-15：scCD8/hIL-15RαSu/birA复合物的OTscTCR/scCD8异源二聚物显现增强的pMHCI结合活性。A.OTlscTCR/scCD8异源二聚物的鼠科CD8表现是通过ELISA测量。使用抗-mTCR H57-597mAb做为捕集抗体。使用生物素化抗-鼠科CD8aor CD8mAb作为探针接着使用SA-HRP。数据显示为三重复测量的平均±SD。B.EL4细胞以指定浓度的OVA(aa257-264)肽附载且以OTlscTCR二聚物-SA-PE(顶部)及OTlscTCR/scCD8异源二聚物-SA-PE(底部)在200nM染色。
图40含有包括TCRα/hIL-15：TCR/hIL-15RαSu/birA复合物的TCRα/β异源二聚物的融合蛋白质保有pMHCI结合活性。A.OTlscTCR/birA及OT1TCRα/β异源二聚物对OVA(aa257-264)/H-2Kb复合物的结合活性是通过ELISA测量。使用抗-mTCR H57-597mAb做为捕集抗体。使用Kb/OVA.257-264.HRP四聚物作为探针。B.264scTCR/birA及264TCRα/β异源二聚物对p53(aa264-272)/HLA-A*0201复合物的结合活性是通过ELISA测量。使用抗-TCR mAb做为捕集抗体。使用A2/p53.264-272.HRP四聚物作为探针。数据显示为三重复测量的平均±SD。
图41显示融合蛋白质的IL-15结合活性及功能活性。A.32Dβ细胞与包括IL-15野生型或IL-15N72D或IL-15D8N突变蛋白结构域的320nM的c264scTCR二聚物培养。融合蛋白质的结合是依序以抗人类TCR CβAb侦测。B.包括IL-15野生型或突变蛋白结构域的c264scTCR二聚物对于支持32Dβ细胞增殖的能力是根据实例揭露的方式测量。数据显示为二重复测量的平均±范围。
图42显示OTlscTCR/hlL-15D8N、OTlscTCR/hIL-15RαSu/birA及OTlscTCR二聚物的OVA(aa257-264)/H-2Kb结合活性是通过ELISA测量。使用抗-mTCR H57-597mAb做为捕集抗体。使用Kb/OVA.257-264.HRP四聚物作为探针。数据显示为三重复测量的平均±SD。
图43显示通过SPR所测量的OTlscTCR融合蛋白质对于OVA(aa257-264)/H-2Kb及对照VSV/H-2Kb复合物的结合曲线。
图44A及B显示使用鼠科B16肿瘤细胞株在免疫活性的小鼠中的原发肿瘤生长模型的结果。带有肿瘤的小鼠静脉注射rhIL-15、T2M、T2MΔCH1及T2MΔTCRΔCH1蛋白质或PBS(对照)。测量肿瘤生长且数据显示在A。治疗后动物体重的改变显示于B。
图45A及B显示显示显示使用鼠科EG7肿瘤细胞株在免疫活性的小鼠中的原发肿瘤生长模型的结果。带有肿瘤的小鼠静脉注射rhIL-15、T2M及T2MΔTCRΔCH1蛋白质或PBS(对照)。测量肿瘤生长且数据显示在A。治疗后动物体重的改变显示在B。
图46显示人类IgGl CH2-CH3结构域或Fc结构域共价性及/或遗传性其它蛋白质育融合所产生的融合蛋白质的蛋白质序列。
图47显示用于测量由T2M及scTCR-huIgGl蛋白质对抗表现肽MHC标靶的细胞所调节的抗体依赖性细胞的细胞毒性的试验结果。各种量的融合蛋白质(T2M、T2M2或c264scTCR-Ig)与新鲜人类PBMCs及p53肽-脉冲HLA-A2-阳性T2细胞(钙黄绿素标记)(E：T比例，40：1)混合。培养2小时后，收集培养媒质且定量分析自裂解细胞释放的钙黄绿素。
图48显示在小鼠中测量各种T2分子的免疫刺激活性的体内试验结果。C57BL/6小鼠以等摩尔IL-15剂量的hIL-15(1mg/kg)、IL15N72D：IL15Rα-Fc(3.6mg/kg)、T2M(11mg/kg)、T2M2(10mg/kg)或等体积的PBS在研究第一日以i.v.处理。在研究第4日，牺牲小鼠且测量血液WBC技术及脾脏重量而示于框图A。周边血液单核细胞(PBMC)CD8+及NKp46+细胞的变化百分比利用流式细胞估算而示于框图B。也使用PBMCs根据NK-敏感性Yac-1标靶细胞在钙黄绿素释放试验估算NK细胞活性而示于框图C。
图49显示体内试验中测量免疫小鼠中各种T2分子的剂量及暂时回应的结果。A.C57BL/6小鼠以等摩尔IL-15剂量的hIL-15(1mg/kg)、IL15N72D：IL15Rα-Fc(4mg/kg)、T2M2(各种剂量)或等体积的PBS在研究第一日以i.v.处理。在研究第4日，PBMCCD8+及NKp46+细胞的百分比利用流式细胞估算。B.裸小鼠以IL15N72D/IL15Rα-Fc(0.2mg/kg)或T2M2(2mg/kg)在研究第一日以i.v.处理。在处理后第4及7日，PBMC NKp46+细胞的百分比通过流式细胞仪估算。
图50显示在裸小鼠中使用人类p53+HLA-A2+A375黑色素瘤细胞株的原发肿瘤生长模型。A.A375人类黑色素肿瘤细胞(1x 106)s.c.注射至裸小鼠(5-6/群)。使肿瘤建立且小鼠以等摩尔剂量的IL-15(0.35mg/kg)、scTCR-IL15融合物(1.6mg/kg)、scTCR-IL15/scTCR-IL15Rα复合物(3.2mg/kg)或PBS进行i.v.处理。在研究第11日开始一周处理小鼠三次且持续三周。B.带有A375-肿瘤的小鼠也如A以4mg/kg T2M进行i.v.处理。C.带有A375肿瘤的裸小鼠以等摩尔剂量的IL-15(0.2mg/kg)、T2M2(2mg/kg)或PBS进行i.v.处理。每隔一日测量肿瘤且以肿瘤体积作图(平均±SEM)。
图51显示c264scTCR/huIL15RαSushi/huIgGl CH2-CH3(Fc)建构物(也称为T2MΔTCRΔCH1及T2M2)的核酸序列。
图52显示成熟c264scTCR/huIL15RαSushi/huIgGl CH2-CH3(Fc)融合蛋白质(也称为T2MΔTCRΔCH 1及T2M2)的蛋白质序列。
图53显示抗-CD20scAb/hIL-15N72D建构物的核酸序列。
图54显示成熟抗-CD20scAb/hIL-15N72D融合蛋白质的蛋白质序列。
图55显示抗-CD20scAb/huIL-15RαSu/huIgGl Fc建构物的核酸序列。
图56显示成熟抗-CD20scAb/huIL-15RαSu/huIgGl Fc融合蛋白质的蛋白质序列。
图57显示测试抗-CD20scAb T2M分子对Daudi细胞的CD20抗原特异性结合的流式细胞仪试验结果。
图58显示测量通过抗-CD20scAb T2Ms对抗CD20+人类肿瘤细胞所调节的抗体依赖性细胞的细胞毒性活性试验结果。各种量的融合蛋白质(抗-CD20scAb T2M,c264scTCR T2M(阴性对照)或嵌合性抗-CD20mAb(阳性对照))与新鲜人类PBMCs(来自不同的2捐赠者)及Daudi细胞(钙黄绿素标记)(E：T比例，100：1)混合。培养时期后，收集培养基及定量分析自裂解细胞释放的钙黄绿素。
图59显示抗-CD20scAb T2Ms对抗CD20+人类肿瘤细胞所调节的抗体依赖性细胞的细胞毒性活性试验结果。融合蛋白质(抗-CD20scAbT2M、c264scTCR T2M(阴性对照)或嵌合性抗-CD20mAb(阳性对照))与各种比例的新鲜人类PBMCs(来自不同的2捐赠者)及Daudi细胞(钙黄绿素标记)混合。培养时期后，收集培养基及定量分析自裂解细胞释放的钙黄绿素。
图60显示抗-CD20轻链V结构域/人类κ恒定结构域/hIL-15N72D建构物的核酸序列。
图61显示成熟抗-CD20轻链V结构域/人类κ恒定结构域/hIL-15N72D融合蛋白质的蛋白质序列。
图62显示抗-CD20重链V结构域/人类IgGl CH1结构域/huIL-15RαSu/huIgGl Fc建构物的核酸序列。
图63显示成熟抗-CD20重链V结构域/人类IgGl CH1结构域/huIL-15RαSu/huIgGlFc融合蛋白质的蛋白质序列。
图64是由IL-15N72D与二聚性IL-15RαSu/Fc融合蛋白质非共价性连接所组成的IL-15N72D：IL-15RαSu/Fc复合物的示意图。
图65(A至D)是IL-15N72D：IL-15RαSu/Fc制剂的凝胶电泳分析图。(A)IEF pH 3-10凝胶分析。条带1，IEF标号。条带2，经rProteinA管柱纯化的IL-15N72D：IL-15RαSu/Fc复合物。条带3，IL-15RαSu/Fc。条带4，IL-15wt。(B)IEF pH3-10凝胶分析。条带1,IEF标号。条带2，经Q步骤1洗提纯化的IL-15N72D：IL-15RαSu/Fc复合物。条带3，Qlc接着Q步骤2洗提。条带4，Q2c接着Q步骤2洗提。(C)SDS-PAGE(还原性)分析。条带1，MW标号。条带2，经rProteinA管柱纯化的IL-15N72D：IL-15RαSu/Fc复合物。条带3，经Q步骤洗提纯化的IL-15N72D：IL-15RαSu/Fc(Q2c)。条带4，IL-15RαSu/Fc(自Q通过)。(D)显示蛋白质去糖基化作用的SDS-PAGE(还原性)分析。条带1，MW标号。条带2及3分别显示N-糖苷酶F分解及未分解的IL-15N72D：IL-15RαSu/Fc蛋白质。条带4，IL-15wt。
图66为使用Superdex 200HR 10/30凝胶过滤管柱的SEC层析图。经纯化的IL-15N72D：IL-15Roc/Fc复合物洗提为单峰。
图67为显示静脉投药CD-I小鼠之后比较IL-15wt及IL-15N72D：IL-15RαSu/Fc复合物的药物动力学分布的图。抗-IL-15Ab ELISA测量IL-15wt的浓度(■)。抗-IL-15Ab ELISA测量完整IL-15N72D：IL-15RαSu/Fc分子的浓度(Δ)，而抗人类IgG Fc Ab ELISA测量IL-15RαSu/Fc融合蛋白质的浓度(▼)。所观察到的浓度由符号表示且拟合模型曲线由线表示。
图68为显示IL-15N72D：IL-15RαSu/Fc与体外组装IL-15N72D：IL-15RαSu/Fc(IL-15N72D：IL-15RαSu/Fc IVA)的生物活性的比较图。在添加WST-1达4小时前，32Dβ细胞与增加浓度的体外组装的IL-15N72D：IL-15RαSu/Fc(■)或IL-15N72D：IL-15RαSu/Fc(□)培养72小时。通过440nm的吸收读值定量细胞增殖以估算甲瓒(formazan)浓度。显示的数据点为三重复样品的平均(±标准差)及符合ED50测量的线表示反曲剂量-回应曲线。结果为至少三次实验的代表。
图69为一组显示IL-15wt及IL-15N72D：IL-15RαSu/Fc复合物对于脾脏重量及白血球浓度的效果图。C57BL/6小鼠(每群5只小鼠)以1mg/kg IL-15wt在0.28mg/kg(摩尔当量剂量)静脉注射单一剂量的IL-15N72D：IL-15RαSu/Fc融合复合物，或PBS作为阴性对照。脾脏重量(左框图)及血液中白血球计数(右框图)在注射4日后测量。条棒表示平均±标准差(n＝5)。*P>0.05相较于PBS及IL-15wt。结果为至少二个实验的代表。
图70为一组显示IL-15wt及IL-15N72D：IL-15RαSu/Fc复合物对于小鼠淋巴球的效果图。C57BL/6小鼠(每群5只小鼠)以1mg/kgIL-15wt在0.28mg/kg(摩尔当量剂量)静脉注射单一剂量的IL-15N72D：IL-15RαSu/Fc融合复合物，或PBS作为阴性对照。测量注射后4日的B细胞(CD19)、CD4T细胞(CD4)、NK细胞(NKp46)及CD8T细胞(CD8)在脾细胞(左框图：平均±标准差(n＝5))及PBMCs(右框图：合并血液中的浓度(n＝5))的百分比。*P>0.05相较于PBS，**P>0.05相较于IL-15。结果为至少二个实验的代表。
具体实施方式
定义
对于用在后述说明书揭露的特定用语提供下述定义。
如用在本文，用语"包括"意指组合物及方法包含所揭露的组件，但不排除其它组件。"主要由…组成"，当用在定义组合物及方法时，应意味排除任何对组合明显为重要的其它组件。因此，本文所定义的主要由这些组件所组成的组合物将不排除来自单离与纯化方法以及药学上可接受载剂的微量污染，所述的载剂如磷酸盐缓冲盐水、防腐剂等。"由…所组成"应意味排除用于投药本发明组合物的其它成分及实质方法的微量组件。由这些临时用语各者所定义的实施例都在本发明的范畴。
如用在本文，用语"IL-15：IL-15Rα融合蛋白质复合物"是具有IL-15的复合物，所述IL-15非共价性结合至可溶性IL-15Rα的IL-15Rα结构域，可溶性IL-15Rα共价性链接至生物活性多肽。IL-15可为IL-15或共价性连结至第二生物活性多肽的IL-15。
如用在本文，用语"共表现"意图指称二个不同的多肽同时表现在宿主细胞而使这二个多肽可互动或在宿主细胞中或在宿主细胞培养基中结合以形成复合物。
如用在本文，用语"亲和性试剂"意图指称特异性结合至另一分子的任何组合物。亲和性试剂的实例包含多株抗体、单株抗体、蛋白质A及蛋白质G。
"抗体"为任何免疫球蛋白，包含抗体及其片段，所述片段结合特异表位。此用语涵盖多株、单株、嵌合、Fabs、Fvs、单链抗体及单或多免疫球蛋白可变链或CDR结构域设计以及双特异性及多特异性抗体。
如用在本文的用语"抗原"意指引起免疫系统生产抗体或对抗它的特异细胞-媒介的免疫回应的任何物质。疾病相关联抗原是与任何疾病相关联而引起免疫系统生产抗体或对抗它的特异细胞-媒介的免疫回应的任何物质。
如用在本文的用语"生物活性多肽"意图指称可生产如本文所讨论的期望效果的胺基酸序列，如蛋白质、多肽或肽；糖或多醣；脂质或糖脂、糖蛋白或脂蛋白，包含TCR或具有抗原结合活性的抗体，包含CD8的CD分子或包含Fc结构域的抗体结构域。
如用在本文的用语"细胞"意图包含任何原核、真核、原始细胞或不死化细胞株，在如组织或器官中的任何群组。优选的细胞为哺乳动物细胞及特别的为人类来源的细胞，且可受到一种或多种病原感染。根据本发明的”宿主细胞”可为任何来源的经转染的、经转形、经转导的或经感染的细胞，包含原核、真核、哺乳动物、禽鸟、昆虫、植物或细菌细胞，或其可为可用在繁衍本文所揭露的核酸的任何来源的细胞。
如用在本文的用语"接合分子"意图指称TCR或抗体分子及起效子分子，通常为通过化学或其它合适方法共价性连结(也就是融合)的化学或合成分子。期望时，接合分子可通过肽连结子序列或载体分子在一个或多个位点融合。或者，肽连结子或载体可用在协助接合分子的建构。特别优选的接合分子是接合毒素或可侦测标记。
如用在本文的用语"起效子分子"意图指称可生产如本文所讨论的期望效果的胺基酸序列，如蛋白质、多肽或肽；糖或多醣；脂质或糖脂、糖蛋白、脂蛋白或化学试剂，包含IL-15结构域、IL-15变体或IL-15受体如IL-15R-α、IL-15RαSu、IL-15Rα外显子3删除、IL-2R-β或γ-C、或其功能性片段且该等多肽进一步包括免疫球蛋白Fc结构域或其功能性片段。
用语"融合分子"及"融合蛋白质"交换地使用且意图指称生物活性多肽，通常为TCR或抗体以及起效子分子，通常是通过重组、化学或其它合适方法共价性连结(也就是融合)的蛋白质或肽序列。期望时，融合分子可危通过肽连结子序列在一个或多个位点融合。或者，肽连结子可用在协助融合分子的建构。具体优选的融合分子为融合蛋白质。通常融合分子也可由接合分子组成。
用语"宿主细胞"意指含有克隆载体或表现载体的原核细胞或真核细胞。此用语也包含经遗传工程化以在宿主细胞的染色体或基因体中含有克隆基因的原核细胞或真核细胞。
如用在本文的用语"免疫回应"意图指称过程，藉此经由涉及不同黏着及/或活化步骤的多因子过程，免疫细胞受刺激及/或由血液回到淋巴腺以及非淋巴腺组织。活化条件引起细胞激素、生长因子、趋化激素及其它因子的释放，黏合及其活化分子对免疫细胞的上调表现，病理改变，及/或通过组织与趋化作用同时发生的外渗，增加细胞增殖及细胞毒性活性，刺激抗原呈现及提供其它表现型改变包含产生记忆细胞类型。免疫回应也意图指称免疫细胞对压抑或调节其它免疫细胞的炎性或细胞毒性活性的活性。免疫回应指称免疫细胞体内或体外的活性。
如用在本文，用语"多核苷酸"及"核酸分子"交换地用在指称任何长度的核苷酸的聚合形式。多核苷酸可涵有脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸及/或其类似物。核苷酸可具有任何三维结构，且可实施任何以之或未知的功能。用语"多核苷酸"包含，例如，单-股、双-股及三螺旋分子，基因或基因片段，外显子，内含子，mRNA，tRNA，rRNA，核糖酶，反义分子，cDNA，重组多核苷酸，支链多核苷酸，适体，质体，载体，任何序列的单离DNA，任何序列的单离RNA，核酸探针及引子。核酸分子也可包括修改的核酸分子(如包括修改的碱基、糖类及/或核苷酸间连结子)。
用语"多肽"意图指称优选主要由20个天然胺基酸的任何者所组成的任何聚合物，不论其长度。虽然用语"蛋白质"通常用于指称相对较大的蛋白质，以及"肽"通常用于指称小的多肽，但是该等用语在此技术领结构域中的使用通常重迭。用语"多肽"通常指称蛋白质、多肽及肽除非另行指明。根据本发明的肽通常为介于约0.1至100KD或更大至约1000KD，优选介于约0.1、0.2、0.5、1、2,5、10、20、30及50KD，其为通过例如离心或SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的标准分子尺寸技术判断。
用语"预防"(prevent、preventing、prevention)、"预防性处理"等意图指称在个体中降低发展疾病或症状的可能性，所述个体不具有疾病或症状，但具有疑似发展疾病或症状的风险。预防等不意指预防个体免于获得特定疾病或症状。与防可能需要多剂量的投药。预防可包含所有疾病症候群已经移除的个体的疾病重复发生的预防，或预防复发-缓解疾病的重复发生。
用语"单链抗体"意图指称单链格式为主的抗体。单链抗体可由抗体的最低的结合亚单元组成。单链抗体可只有结合这些抗体在单一安定折迭多肽链的抗原-结合区(如所有或某些补体决定区、呈现在重链可变区及/或轻链可变区的CDR)。因此，单链抗体相较于免疫球蛋白为相当小的尺寸但保持抗体的抗原-特异性结合性质。单链抗体可连结至广范围的配体，例如起效子分子或药物接合物。
如用在本文的用语"可溶性"意指融合分子且特别是融合蛋白质，其为在低G-力离心(如标准离心中低于每分钟30,000转)不容易从如细胞媒质的水性缓冲液沉降。又，融合分子为可溶性只要其保留在水溶液在温度大于约5至37℃且在或接近中性pH，在低浓度或无阴离子性或非离子性清洁剂的存在下。在这些条件下，可溶性蛋白质通常具有低沉降值，如低于约10至50斯维德伯格单元。
本文的水性溶液意指具有缓冲化合物以建立pH，传统上在约5至9的pH范围，以及介于约2mM及500mM之间的离子强度范围。有时添加蛋白酶抑制剂或温和非离子性清洁剂。此外，如果期望时可添加载体蛋白质如牛血清白蛋白(BSA)达数mg/ml。例示水性缓冲物包含标准磷酸盐缓冲盐水、崔斯-缓冲盐水或其它习知缓冲液及细胞媒质配方。
用语"刺激(stimulate或stimulating)"意图指称增加、放大、增强、提高生理活性，如免疫回应。刺激可为正向改变。例示增加可为如5％、10％、25％、50％、75％或甚至90至100％。其它例示增加包含2-倍、5-倍、10-倍、20-倍、40-倍或甚至100-倍。
用语"压抑或(suppress或suppressing)"意图指称降低、减弱、减少、止住或安定生理活性，如免疫回应。压抑可为负向改变。例示降低可为如5％、10％、25％、50％、75％或甚至90至100％。其它例示降低包含2-倍、5-倍、10-倍、20-倍、40-倍或甚至100-倍。
用语"T细胞受体"(TCR)意图指称为完整膜蛋白的复合物的多肽或衍生自完整膜蛋白的复合物的多肽，所述膜蛋白参予回应抗原存在的T细胞活化。某些情况中T细胞辨识经由αβ或γδ-异源二聚性T细胞受体(TCR)结合至MHC产物的肽。TCR指令具有由用在抗体重链及轻链基因的相同基因重排机制所创造的很大差异性[Tonegawa,S.(1988)Biosci.Rep.8：3-26]。多数的差异性产生在编码α及β链的互补决定区3(CDR3)的可变(V)与接合(J)(或差异性，D)区的连接处[Davisand Bjorkman(1988)Nature 334：395-402]。然而，TCR不进行体细胞点突变，而抗体会，且可能不一致。TCR也不进行如抗体相同程度的亲和性成熟。由于TCR自然发生而具有范围由105至107M-1的亲和性，而抗体传统上具有范围由105至109M-1的亲和性[Davis等人(1998)Annu.Rev.Immunol.16：523-544；Eisen等人(1996)Adv.ProteinChem.49：1-56]。虽然TCR缺乏体细胞突变可能与较低亲和性有关，亦有争执对于TCR具有较高亲和性不具有选择性益处。事实上，T细胞活化的连续触发[Valitutti等人(1995)Nature 375：148-151]及动态校正[Rabinowitz等人(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：1401-1405]模型二方面都显示较长的止率(与较高亲和性相关)对于信号传递过程为不利的。也有可能较高亲和性TCR可能无法维持T细胞回应所需的肽特异性。例如，结合于MHC沟内的肽显示有限的可触及表面[Bjorkman,P.J.(1997)Cell89：167-170]，此点可能转为限制互动中可产生的能量的量。另外，通过导引能量向MHC螺旋而提升TCR亲和性推测会导致在负向选择中的胸腺删除[Bevan,M.J.(1997)Immunity 7：175-178]。用语"TCR"涵盖多株、单株、嵌合性、人源化、异源二聚物性及单链T细胞受体或其功能性片段，包含包括TCR Vα及Vβ结构域的分子。用语"TCR"也涵盖揭露在T细胞，例如美国临时申请案发明名称为"T细胞受体融合物及接合物及其使用方法"，申请于2008年3月19日，以及美国专利公开案US 20030144474的T细胞受体。
用语"载体"为在宿主细胞中能自体复制且可接受DNA的核酸分子。载体带有其自身的复制起始，可用于插入外来DNA的用于限制内切核酸酶的一个或多个独特的辨识位点，以及通常的选择性标号如编码抗生素抗性抗性抗性的基因，以及一般辨识序列(如启动子)用于表现插入的DNA。一般载体包含质体载体及噬菌体载体。
用语"Fc结构域"或"Fc区"意图指称免疫球蛋白重链"片段可结晶"区。一般而言，Fc结构域能与第二Fc结构域互动以形成二聚性复合物。Fc结构域可为称为Fc受体的能结合细胞表面及/和互补系统的蛋白质和可经修改以降低和增加这些结合活性。Fc结构域可衍生自IgG、IgA、IgD、IgM或IgE抗体的同型抗原及有效免疫活性包含调理素作用、细胞裂解、浆细胞去颗粒化、嗜碱性球及嗜酸性球，以及其它Fc受体依赖性过程；互补路径的活化；以及体内蛋白质安定。
所使用的简写为：IgG，免疫球蛋白；h，人类；IL，介白素；R，受体；Su，sushi结构域；TCR，T细胞受体；sc，单-链；sTNFR，可溶性肿瘤坏死因子-α(TNF-α)受体；NK，天然杀手r；KD，平衡解离常数；CTLs，细胞毒性T淋巴球；aa，胺基酸；OVA，卵白蛋白；VSV，水疱性口炎病毒；IMDM，Iscove's改良的Dulbecco's媒质；CHO，中国仓鼠卵巢；mAb，单株抗体；β2m，β2微球蛋白；SA，链霉亲和素；HRP，辣根过氧化酶；PE，藻红蛋白；ABTS，2,2'-联氮双[3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸]-二铵盐；PLE，肽附载增强子；c264scTCR，特异于人类p53(aa264-272)肽/HLA-A*0201复合物的可溶性单链TCR；
cl49scTCR，特异于人类p53(aal49-157)肽/HLA-A*0201复合物的可溶性单链TCR；OTlscTCR，特异于OVA(aa257-264)肽/H-2Kb复合物的可溶性单链TCR；SEC，尺寸排除层析；pMHCI，肽/MHC型I；SPR，表面等离子体共振；MW，分子量；m，鼠科；A，吸收；RU，回应单位。
本文所提供的范围应了解为范围内所有数值的简略表达方式。例如，1至50的范围应了解为包含任何数值、数值的组合或由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50所成群组的次范围。
"多于一"应了解为如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、100等，或介于其中的任何数值。"至少"一特定值，应了解为该值及大于该值的数值。
除非特别叙述或由内文中明显可知，如用于本文，用语"或"应了解为包含的意义。
除非特别叙述或由内文中明显可知，如用于本文，用语"一"、"一者"及"所述"应了解为单数或复数。
除非特别叙述或由内文中明显可知，如用于本文，用语"约"应了解如此项技术领结构域中标准可容忍的范围内，例如于平均值的2个标准差内。约可了解为如于所述数值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％和0.01％以内。除非由内文中清楚可知，本文所提供的所有数值可使用用语约修正。
本文中任何变量定义中化学基团的列举清单包含作为任何单一基团或列举基团组合的变量定义。对于本文中可变化或态样列举的实施例包含实施例如单一实施例或与任何其它实施例或其部份的组合。
本文所提供的任何组合物或方法可与本文所提供的其它组合物及方法的任何一者或多者合并。
Fc结构域
IgG类型的免疫球蛋白在人类血液中为最富含的蛋白质。其循环半衰期可长达21天。已有报导组合IgG的Fc区与另一蛋白质(如各种细胞激素及可溶性受体)的结构域的融合蛋白质(参照，例如，Capon et al.,Nature,337：525-531,1989；Chamow et al.,TrendsBiotechnol.,14：52-60,1996)；美国专利第5,116,964号及第5,541,087号)。原型融合蛋白质为经由IgG的Fc铰链区中的半胱氨酸残基连结的同源二聚性蛋白质，造成分子类似于没有重链可变结构域及CH1结构域且没有轻链的IgG分子。包含Fc结构域的融合蛋白质的二聚物本质在提供与其它分子较高等级互动(也就是二价或双特异性结合)上可为有利的。由于结构的同源性，Fc融合蛋白质显示可相较于具有类似同型的人类IgG者的体内药物动力学分布。为了延长IL-15或IL-15融合蛋白质的循环半衰期及/或增加其生物活性，期望制造含有非共价性连结至IL-15α的IL-15结构域的融合蛋白质，所述的IL-15Rα共价性连结至人类重链IgG蛋白质的Fc部分，如本发明所揭露或叙述者。
用语"Fc"意指包括完整抗体的非-抗原结合片段序列的分子或序列，无论是单体或多聚体形式。天然Fc的原始免疫球蛋白来源优选的为人类起源及可为任何免疫球蛋白，然而优选为IgGl及IgG2。天然Fc是由可通过共价(也就是，二硫键)与非共价连接而连结至二聚体或多聚体形式的单体多肽所制成。介于天然Fc分子的单体亚单元间的分子间双硫键数目根据类型(如IgG、IgA、IgE)或亚型(如IgGl、IgG2、IgG3、IgAl、IgGA2)范围为1至4。天然Fc的一实例为来自IgG的木瓜酵素分解的双硫键结二聚体(参照Ellison等人(1982),Nucleic Acids Res.10：4071-9)。如用在本文的用语"天然Fc"是泛指单体性、二聚体性及多聚体形式。Fc结构域含有对于蛋白质A、蛋白质G、各种Fc受体及补体蛋白质的结合位点。
某些实施例中，用语"Fc变体"意指由天然Fc修改而仍包括对于补救受体(FcRn)的结合位点的分子或序列。国际申请案WO 97/34631(公开于1998年9月25日)及WO 96/32478揭示例示的Fc变体，以及与补救受体的互动，且所述申请案以参考方式并入本案。因此，用语"Fc变体"包括由非人类天然Fc经人源化的分子或序列。此外，由于所提供的结构特征或生物活性不是本发明融合分子所需，所以天然Fc包括可移除位点。因此，某些实施例中，用语"Fc变体"包括缺乏一个或多个天然Fc位点或残基的分子或序列，所述位点或残基影响或涉及(1)双硫键行程，(2)与选定宿主细胞的不兼容性，(3)在选定宿主细胞扁现实的N-终端异源性，(4)糖基化作用，(5)与补体的互动，(6)结合至补救受体的Fc受体或(7)抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)。Fc变体在后文中进一步详细揭示。
用语"Fc结构域"涵盖如上所述的天然Fc及Fc变体的分子与序列。关于Fc变体及天然Fc，用语"Fc结构域"包含单体性或多聚体形式的分子，不论是自完整抗体分解或通过重组基因表现或通过其它手段所产生。
T细胞受体(TCR)
T细胞是与其它免疫细胞类型(多型核细胞、嗜酸性细胞、嗜碱性细胞、肥大细胞、B细胞、NK细胞)一起，构成免疫系统的细胞成分。再生理条件下T细胞在免疫监视及外来抗原的移除中发挥作用。然而，在病理条件下有强而有利的证据显示T细胞在疾病的因果关系与传播中扮演重要角色。在这些失调症状中，T细胞免疫性耐受的崩解，不论是中枢或周边的，再自体免疫疾病的因果关系中为基础过程。
TCR复合物由至少七种穿膜蛋白质组成。双硫键连结的(αβ或γδ)异源二聚物形成单类型抗原辨识单位，而在CD3的变体链中，ε、γ、δ、ζ及η组成的链，负责将配体结合至造成T细胞或化与细胞免疫回应发展的信号途径。虽然TCR链的基因多样性，二个结构特征常见于所有已知亚单元。首先，有穿膜蛋白质具有推测为α-螺旋的单一穿膜生成结构域。再者，TCR链具有在预测的穿膜结构域中拥有带电胺基酸的不寻常特征。不变链具有单一负电荷，保留于小鼠与人类，且所述变体链拥有一种(TCR-β)或二种(TCR-α)正电荷。TCR-α的穿膜序列在许多物种高度保留且因而系统发育地可作为重要功能角色。含有疏水性胺基酸精氨酸与赖氨酸的八肽序列在物种间为相同。
T细胞回应是通过结合至TCR的抗原调节。TCR的一类型是由组装免疫球蛋白可变(V)及恒定(C)区的α及β链所组成的膜结合异源二聚物。TCR链包涵共价性连结的V-α与C-α链，而β链包含共价性连结至C-β链的V-β链。V-α及V-β链形成可结合主要组织兼容性复合物(在人类已知为HLA复合物)的内容物中的超抗原或抗原的口袋或裂缝。概括参照DavisAnn.Rev.of Immunology 3：537(1985)；Fundamental Immunology 3rd Ed.,W.PaulEd.Rsen Press LTD.NewYork(1993)。
TCR链(αβ或γδ)的细胞外结构域也可被工程化为融合至异源性穿膜结构域，用以在细胞表面表现。该些TCR可包含融合至CD3、CD28、CD8、4-1BB及/或嵌合性活化受体(CAR)穿膜或活化结构域。TCR也可为包括αβ或γδ链的一个或多个结合结构域的可溶性蛋白质。该些TCR可包含TCR可变结构域或其功能性片段具有或不具有TCR恒定结构域。可溶性TCR可为异源二聚物性或单链分子。
融合蛋白质复合物
本发明的可溶性融合蛋白质与接合分子复合物包括至少二种可溶性融合蛋白质。某些实施例中，第一融合蛋白质包括共价性连结至介白素-15(IL-15)或其功能性片段的第一生物活性多肽；及第二融合蛋白质包括共价性连结至可溶性介白素-15受体α(IL-15Rα)多肽或其功能性片段的第二生物活性多肽，及其中第一融合蛋白质的IL-15结构域结合至第二融合蛋白质的可溶性IL-15Rα结构域以形成可溶性融合蛋白质复合物。本发明的融合蛋白质复合物也包括联结至第一及第二融合蛋白质的一或二者的免疫球蛋白Fc结构域或其功能性片段。优选地，连结至第一及第二融合蛋白质的Fc结构域互动以形成融合蛋白质复合物。该复合物可为通过介于免疫球蛋白之间的双硫键而安定化。某些实施例中，本发明的可溶性融合蛋白质复合物包含IL-15多肽、IL-15变体或其功能性片段及可溶性IL-15Rα多肽或其功能性片段，其中IL-15及IL-15Rα多肽的一者或二者复包含免疫球蛋白Fc结构域或其功能性片段。
某些实例中，生物活性多肽的一者包括第一可溶性TCR或其片段。另一或第二生物活性多肽包括第一可溶性TCR或其功能性片段且因而创造相较于单价TCR对于同源配体具有增加的结合活性的多价TCR融合蛋白质复合物。再者，另一生物活性多肽包括第二可溶性TCR或其功能性片段，不同于第一可溶性TCR。某些实例中，制造具有较高亲和性的TCR，或相较于例如原始TCR，对于同源配体具有增加的结合亲和性。如本文所揭示的如果本发明的可溶性TCR对于其配体具有较高活性或亲和性，择期有用于使用作为细胞表面结合抗原的特异性探针。本发明的某些优选实例中，TCR是特异辨识特定抗原。
例示实施例中，TCR是包括α链(本文中称为α、阿伐或a链)及β链(本文中称为β、贝它或b链)的异源二聚物。其它例示实施例中，TCR包括单链TCR多肽。单链TCR可包括通过肽连结子序列共价性连结至TCR V-β链的TCR V-α链。单链TCR可再包括共价性连结至TCR V-β链的可溶性TCR Cβ链片段。单链TCR可再包括共价性连结至TCR V-α链的可溶性TCR Cα链片段。
再一实施例中，第一及第二生物活性多肽的一者或二者包括抗体或其功能性片段。
另一实施例中，对于TCR结构域的抗原包括呈现在MHC或HLA分子的肽抗原。再一实施例中，所述肽抗原衍生自肿瘤相关多肽或病毒编码多肽。
另一实施例中，对抗体结构域的抗原包括细胞表面受体或配体。
再一实施例中，抗原包括CD抗原、细胞激素或趋化激素受体或配体、组织因子、细胞粘附分子、MHC/类MHC分子、Fc受体、类Toll受体、NK受体、TCR、BCR、阳性/阴性共刺激受体或配体、死亡受体或配体、肿瘤相关抗原或病毒编码抗原。
如用于本文，用语"生物活性多肽"或"起效子分子"意指可产生如本文所揭露的期望效果的胺基酸序列如蛋白质、多肽或肽；糖或多醣；脂质或糖脂或糖蛋白。起效子分子也包含化学剂。也涵盖的起效子分子为编码生物活性或起效子蛋白质、多肽或肽的核酸。因此，合适的分子包含调节因子、酵素、抗体或药物以及DNA、RNA或寡核苷酸。生物活性多肽或起效子分子可为天然发生的或其可自已知成分，例如通过重组或化学合成而合成且包含异源性成分。生物活性多肽或起效子分子通常介于约0.1至100KD或更大至约1000KD，优选介于约0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、30及50KD，其由通过标准分子尺寸技术如离心或SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳所判定。本发明期望的效果包含，但不限于，例如，形成本发明的具有增加活性的融合蛋白质复合物，杀标靶细胞，如诱发细胞增殖或细胞死亡，起始免疫回应，预防或治疗疾病，或作用为用于诊断目的的侦测分子。对于该些侦测，可使佣的分析，例如，包含培养细胞以增殖相同者，且将细胞与本发明的TCR融合复合物接触以进一步抑制细胞的发展的一系列步骤的分析。
根据本发明的共价性连结起效子分子至本发明的融合蛋白质复合物提供数个显着有利点。本发明的融合蛋白质复合物可被产生为含有单一起效子分子，包含如已知结构的肽。此外，多种起效子分子可被产生于类似的DNA载体。也就是，不同起效子分子的库可连结至融合蛋白质复合物用以辨识受感染或疾病细胞。再者，对于治疗性应用，除了对个体投药本发明的融合蛋白质复合物，可投药编码融合蛋白质复合物的DNA表现载体用以体内表现融合蛋白质复合物。该些方案避免典型与重组蛋白质制备相关的耗成本的纯化步骤以及避免抗原摄入及与传统方案相关处理的复杂性。
必要时，揭露于本文的融合蛋白质的成分，如起效子分子如细胞激素、趋化激素、生长因子、蛋白质毒素、免疫球蛋白结构域或其它生物活性分子及任何肽连结子，可以任何形式被组织，限制条件为融合蛋白质具有所期望的功能。特别地，融合蛋白质的各成分期望时可通过至少一个合适的肽连结子序列与另一成分隔开。此外，融合蛋白质可包含如标签以助于修改、鉴定及/或纯化融合蛋白质。更具体的融合蛋白质揭示于后文实例中。
连结子
本发明的融合复合物优选也包含可挠性连结子序列介入于IL-15或IL-15Rα结构域与生物活性多肽之间。连结子序列应使得生物活性多肽相对于IL-15或IL-15Rα结构域有效定位以使二结构域具功能性活性。实施例中，生物活性多肽为TCR，连结子序列定位TCR结合沟而使得T细胞受体可辨识存在的MHC-肽复合物且可传递起效子分子至所期望的位点。起效子分子的成功呈现可调整细胞活性以诱发或抑制T细胞增殖，或起始或抑制对特定位点的免疫回应，如通过下述分析所测定的，包含体外分析，所述分析包含培养T细胞以增殖相同者、即将T细胞与本发明的TCR融合复合物接触，然后评估TCR融合复合物是否进一步抑制细胞发展的一系列步骤。
某些实施例中，可溶性融合蛋白质复合物具有连结子，其中第一生物活性多肽通过多肽连结子序列共价性连结至IL-15(或其功能性片段)。
其它某些实施例中，揭露于本文的可溶性融合蛋白质复合物具有连结子，其中第二生物活性多肽通过多肽连结子序列共价性连结至IL-15Rα多肽(或其功能性片段)。
连结子序列优选是通过核苷酸序列编码造成可有效定位TCR分子的结合沟用以辨识存在的抗原或抗体分子的结合结构域用以辨识抗原的肽。如用在本文，词组"生物活性多肽相对于IL-15或IL-15Rα结构域有效定位"，或其它类似词组，意图指称连结至IL-15或IL-15Rα结构域的生物活性多肽是经定位，以使得IL-15或IL-15Rα结构域能与彼此互动以形成蛋白质复合物。某些实施例中，IL-15或IL-15Rα结构域是有效地定位以与免疫细胞互动而起始或抑制免疫反应，或抑制或刺激细胞发展。
本发明的融合复合物优选也包含可挠性连结子序列介入IL-15或IL-15Rα结构域与免疫球蛋白Fc结构域之间。连结子序列应使得Fc结构域、生物活性多肽与IL-15或IL-15Rα结构域有效定位而使各结构域具功能性活性。某些实施例中，Fc结构域有效地被定位以使得合适的融合蛋白质复合物形成及/或与Fc受体或免疫细胞或补体系统的蛋白质互动以刺激Fc-媒介效果包含调理素作用、细胞裂解、肥大细胞的降解、嗜碱性球及嗜酸性球及其它Fc受体依赖性过程；捕体路径的活化；以及增强融合蛋白质复合物的体内半衰期。
连结子序列也可用在连结生物活性多肽的二个或更多个多肽已产生具有期望的功能性活性的单链分子。优选的连结子序列包括自7至20个胺基酸，更优选字8至16个胺基酸。连结子序列优选为可挠性而不将生物活性多肽或起效子分子保持于单一非期望的构型。连结子序列可用于自融合分子间隔出辨识位点。具体地，肽连结子序列可定位于生物活性多肽与其它起效子分子之间，以如化学交联相同者及提供分子可挠性。连结子优选主要包括具有侧链的胺基酸，如甘氨酸、丙氨酸与丝氨酸，以提供可挠性。优选地为约80或90百分比或更多百分比的连结子序列包括甘氨酸、丙氨酸与丝氨酸残基，优选为甘氨酸与丝氨酸残基。对于包括异源二聚物TCR的融合蛋白质复合物，连结子序列适合连结至TCR分子的β链，虽然连结子序列也可附接至TCR分子的α链。或者，连结子序列可连结至TCR分子的α链与β链二者。当该β肽链与α链表现时，连结的TCR多肽应折迭造成功能性TCR分子如一般叙述于图1。一种合适的连结子序列为ASGGGGSGGG(也就是，Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser GlyGly Gly)，优选连结至TCR的β结构域的第1氨基酸。可使用不同连结子序列包含任何已成功用在一起接合抗体可变区的多数可挠性连结子，参照Whitlow,M.等人(1991)Methods：ACompanion to Methods in Enzymology 2：97-105。某些实例中，对于共价性连结起效子分子至TCRβ链分子，连结子的氨基酸序列应能自TCRβ链的C终端残基至起效子分子的N-终端残基共有合适距离。合适的连结子序列可以经验为主而容易地鉴定。此外，连结的合适尺寸与序列也可通过传统计算器模式技术根据TCR分子的预测尺寸与形状而决定。
一般而言，本发明的融合蛋白质复合物的制备可通过揭露于本文的过程及通过可辨认的重组DNA技术而完成，所述DNA技术涉及如聚合酶链锁扩增反应(PCR)、质体DNA的制备、利用限制酵素的DNA剪切、寡核苷酸的制备、DNA的接合、mRNA的单离、DNA导入至合适细胞、宿主的转型或转染、培养宿主。此外，融合分子可使用变性剂(chaotropic agent)以及已知的电泳、离心及层析方法单离与纯化。通常参照Sambrook等人，Molecular Cloning：ALaboratory Manual(2nd ed.(1989)；及Ausubel等人的Current Protocols in MolecularBiology,John Wiley&Sons,New York(1989)用以揭露相关这些方法。
如用在本文，本发明的生物活性多肽或起效子分子可包含因子如细胞激素、趋化激素、生长因子、蛋白质毒素、免疫球蛋白结构域或其它生物活性蛋白质如酵素。生物活性多肽也可包含接合物至其它化合物如非蛋白质毒素、细胞毒性剂、化疗剂、可侦测标记、放射性材料等。
本发明的细胞激素定义为通过任何细胞所生产的任何因子，所述细胞激素使其它细胞有效且负责任何多数的细胞免疫性的多重效果。细胞激素的实例包含但不限于IL-2家族、干扰素(IFN)、IL-10、IL-1、IL-17、TGF及TNF细胞激素家族，以及IL-1至IL-35、IFN-α、IFN-β、IFNγ、TGF-β,TNF-α及TNFβ。
本发明的一态样中，第一融合蛋白质包括共价性连结至介白素-15(IL-15)结构域或其功能性片段的第一生物活性多肽。IL-15是影响T细胞活化与增殖的细胞激素。IL-15活性影响免疫细胞活化与增殖是类似于某些IL2，然而基本上的差异已被特征化(Waldmann,TA,2006,Nature Rev.Immunol.6：595-601)。
本发明的另一态样中，第一融合蛋白质包括介白素-15(IL-15)结构域其为IL-15变体(本文中也称为IL-15突变体)。IL-15变体优选包括与原始(或野生型)IL-15蛋白质不同的氨基酸序列。IL-15变体优选结合IL-15Rα多肽且作用为IL-15机动剂或拮抗剂。优选地具有激动剂活性的IL-15变体具有优越的激动剂活性。某些实施例中，IL-15变体可作用为IL-15激动剂或拮抗剂独立于其与IL-15Rα的关联。
IL-15激动剂例举相较于野生型IL-15为相当的或增加的生物活性。
IL-15拮抗剂例举相较于野生型type IL-15为降低的生物活性或例举为抑制IL-15媒介回应的能力。某些实例中，IL-15变体具有增加的或降低的活性结合至IL-15RβγC受体。某些实施例中，IL-15变体的序列具有至少一个胺基酸改变，如取代或删除，相较于原始IL-2序列，该些改变造成IL-15激动剂或拮抗剂活性。优选地，胺基酸取代/删除是在与IL-15Rβ及/或γC互动的IL-15结构域。更优选地，胺基酸取代/删除不影响结合至IL-15Rα多肽或产生IL-15变体的能力。合适的胺基酸取代/删除以产生IL-15变体可根据推定的或已知的IL-15结构，比较具有同源性分子如IL-2与已知结构，通过理论或随机突变与功能性分析，如本文所提供，或其它理论方法而鉴定。其它合适的胺基酸取代可为额外的胺基酸的保留性或非保留性改变与插入。优选地，本发明的IL-15变体在成熟人类IL-15序列的位置6、8、10、61、65、72、92、101、104、105、108、109、111或112含有一个或多个胺基酸取代/删除；特别地，D8N("D8"意指原始成熟人类IL-15序列的氨基酸与残基位置及"N"意指IL-15变体中在该位置的取代的胺基酸)、I6S、D8A、D61A、N65A、N72R、V104P或Q108A取代造成具有拮抗剂活性的IL-15变体以及N72D取代造成具有激动剂活性的IL-15变体。
趋化激素，类似于细胞激素，是定义为当暴露于其它细胞时负责细胞性的任何多数的多重效果任何化学因子或分子。合适的趋化激素可包含但不限于CXC、CC、C及CX3C趋化激素家族以及CCL-1至CCL-28、CXC-1至CXC-17、XCL-1、XCL-2、CX3CL1、MIP-lb、IL-8、MCP-1及Rantes。
生长因子包含当暴露于特定细胞诱发受影响细胞的增殖及/或分化的任何分子。生长因子包含蛋白质与化学分子，其等某些包含：GM-CSF、G-CSF、人类生长因子与干细胞生长因子。其它的生长因子也可合适用在本文。
毒素或细胞毒性剂包含当暴露至细胞时具有致死效果或对于生长具有抑制效果的任何物质。更具体地，起效子分子可为如源自植物或细菌的细胞毒素，如白猴毒素、志贺毒素、相思子毒素、霍乱毒素、篦麻毒素、肥皂草素、假单胞菌外毒素(PE)、美商陆根抗病毒蛋白或多花白树毒蛋白。该等毒素的生物活性片段已知于此项技艺中且包含如DT A链与篦麻毒素A链。此外，毒素可为于细胞表面活化剂如磷酸酯酶(如磷酸酯酶C)。
再者，起效子分子可为化疗药物如长春地辛、长春新碱、长春花碱、甲氨蝶呤、阿霉素、博来酶素或顺铂。
此外，起效子分子可为适合用于诊断或成像研究的可侦测标记分子。该些标记包含生物素或链霉亲和素/抗生物素蛋白、可侦测的纳米粒子或结晶、酵素或其催化性片段、荧光标记如绿色荧光蛋白质、FITC、藻红蛋白、细胞色素、德州红或量子点；放射核素如碘-131、钇-90、铼-188或钼-212；磷光或化学冷光分子或通过PET的可侦测标记、超音波或MRI如Gd-顺磁金属离子为主的造影剂。参照例如Moskaug,等人/J.Biol.Chem.264,15709(1989)；Pastan,I.等人Cell 47,641,1986；Pastan et al.,Recombinant Toxins asNovel Therapeutic Agents,Ann.Rev.Biochem.61,331,(1992)；"Chimeric Toxins"Olsnes and Phil,Pharmac.Ther.,25,355(1982)；PCT专利公开案号WO 94/29350；PCT专利公开案号WO 94/04689；PCT专利公开案号WO2005046449及美国专利第5,620,939号揭露关于制造及使用包括起效子或标签的蛋白质。
包含共价性连结的IL-15及IL-15Rα结构域的蛋白质融合或接合复合物具有数种重要用途。例如，包括TCR的蛋白质融合或接合复合物可应用于传递IL-15：IL-15Rα复合物至能特异性结核TCR的某些细胞。因此，蛋白质融合或接合复合物提供选择性损伤或杀包括配体的细胞。包括TCR的能通过蛋白质融合或接合复合物备损伤或被杀的细胞或组织的实例包含肿瘤及病毒或细菌感染的细胞所述细胞表现一或多种能通过TCR特异性结合的配体。易于损伤或杀死的细胞或组织可容易地通过本文揭露的方法分析。
本发明的IL-15及IL-15Rα多肽适当地对应天然产生IL-15及IL-15Rα分子的氨基酸序列，如人类、小鼠或其囓齿科或其它动物的IL-15及IL-15Rα分子。这些多肽及编码胺基酸的序列已知于文献，包含人类介白素15(IL15)mRNA-GenBank：U14407.1、野生小家鼠(Musmusculus)介白素15(IL15)mRNA-GenBank：U14332.1、人类介白素-15受体α链前驱物(IL15RΑ)mRNA-GenBank：U31628.1、野生小家鼠介白素15受体α链-GenBank：BC095982.1。
某些设定中，可有用于制造本发明的蛋白质融合或接合复合物的多价物，如用以增加sc-TCR或sc-抗体的价数。特别地，融合蛋白质复合物的IL-15及IL-15Rα结构域之间的互动提供产生多价复合物的手段。此外，多价融合蛋白质可藉由使用如标准生物素-链霉亲和素标记技术通过共价性或非共价性一起连结一与四个蛋白质(相同或相异)，或通过接合至合适的固体支持物如乳胶珠粒。化学交联蛋白质(例如交联至树枝状聚合物)也可适用多价物种。例如，蛋白质可通过包含编码卷标序列的序列修改，所述标嵌序列可经修改如生物素化BirA标签或氨基酸残基利用化学反应侧链如Cys或His。这些胺基酸标签或化学反应性氨基酸可位于融合蛋白质的各种位置，优选地是远离生物活性多肽或起效子分子的活性位点。例如，可溶性融合蛋白质的C-终端可共价性连结至标签或其它融合蛋白质其包含该等反应性氨基酸。合适的侧链可包含化学连结二个或多个融合蛋白质至合适的树枝状聚合物或其它纳米粒子以提供多价分子。树枝状聚合物是合成的化学聚合物，其可具有其表面多数不同官能基的任何一个(D.Tomalia,Aldrichimica Acta,26：91：101(1993))。根据本发明所使用的例示树枝状聚合物包含如E9星爆多胺树枝状聚合物及E9燃烧型多胺树枝状聚合物，其可连结半胱氨酸残基。例示纳米粒子包含微脂体、芯-壳颗粒或PLGA-为主的颗粒。
本发明的另一实施例中，融合蛋白质复合物的多肽的一者或二者包括免疫球蛋白结构域。或者，蛋白质结合结构域-IL-15融合蛋白质可进一步连结至免疫球蛋白结构域。优选的免疫球蛋白结构域包括与其它免疫球蛋白结构域互动以形成如上述所提供的多链蛋白质的区结构域。例如，免疫球蛋白重链区，如IgGl CH2-CH3，能安定地互动以增加Fc区。优选的免疫球蛋白结构域包含Fc结构域也包括具有起效子功能的区，包含Fc受体或补体蛋白质结合活性，及/或具有糖基化位点。某些实施例中，融合蛋白质复合物的免疫球蛋白结构域含有降低或增强Fc受体或补体结合活性或糖基化的突变，藉此影响所得蛋白质的生物活性。例如，含有降低结合至Fc受体的突变的免疫球蛋白结构域可用在产生对带有Fc受体的细胞的结合活性降低的本发明的融合蛋白质复合物，其对于设计用于辨识或侦测特异抗原的试剂可为有利的。
核酸与载体
本发明进一步提供核酸序列及特别地为编码本发明融合蛋白质的DNA序列。优选地，DNA序列是通过载体携带，所述载体适合用于染色体外复制如噬菌体、病毒、质体、噬粒体、黏体(cosmid)、YAC或附加体。特别地，编码所期望的融合蛋白质的DNA载体可使用于有助于本文所揭露的制备方法及获得显着量的融合蛋白质。DNA序列可插入至合适的表现载体，也就是含有用于编码所插入蛋白质得序列的转录及转译所必要的单元的载体。可使用各种宿主载体系统表现编码蛋白质的序列。该些包含以病毒(如牛痘病毒、腺病毒等)感染的哺乳动物细胞系统；以病毒(如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；微生物入含有酵母菌载体的酵母菌或以噬菌体DNA、质体DNA或黏体DNA转形的细菌。根据所使用的宿主载体系统，可使用合适的多数转录与转译单元的任一者。一般参照Sambrook等人，如前述及Ausubel等人如前述。
包含于本发明的为用于制造可溶性融合蛋白质复合物的方法，所述方法包括对宿主细胞导入如本文揭露的编码第一及第二融合蛋白质的DNA载体，在足以在细胞中或媒质中表现融合蛋白质且使第一融合蛋白质的IL-15结构域与第二融合蛋白质的可溶性IL-15Rα结构域之间结合的条件下，在媒质中培养宿主细胞，以形成可溶性融蛋白质复合物，自宿主细胞或媒质纯化可溶性融合蛋白质复合物。
通常，根据本发明的优选DNA载体包括通过磷二酯键连结的核苷酸序列，所述磷二酯键包括5'至3'方向的用于倒入编码生物活性多肽的第一核苷酸序列的第一克隆位点，操作性地联结至编码起效自分子的序列。
通过DNA载体所编码的融合蛋白质成分可以匣(cassette)形式提供。用语”匣”意指各成分可容易地通过标准重组方法以另一成分取代。特别地，当所编码的融合复合物是用于对抗具有或具有能力发展血清型的病原体特别期望为构筑在匣形式的DNA载体。
为了制造编码融合蛋白质复合物的载体，编码生物活性多肽的序列是通过合适接合酶的使用连结至编码起效子肽的序列。编码存在肽的DNA可通过自天然来源单离DNA而获得如自合适的细胞株或通过已知合成方法，如磷酸三酯方法。参照如OligonucleotideSynthesis,IRL Press(M.J.Gait,ed.,1984)。合成的寡核苷酸也可使用市售可得自动化寡核苷酸合成仪制备。一旦单离，编码生物活性多酞的基因可通过聚合酶链锁反应(PCR)或此项技艺中已知其它手段而扩增。用于扩增生物活性多肽基因的合适的PCR引子可对PCR产物增加限制酶位点。PCR产物优选地包含用于起效子肽地剪切位点以及生物活性肽-起效子融合蛋白质的合适表现及分泌所需的前导序列。PCR产物也优选地包含编码连结子序列的序列，或用于接合该些序列的限制酵素位点。
揭露在本文的融合蛋白质优选地通过标准重组DNA技术生产。例如，一旦编码生物活性多肽的DNA分子被单离，序列可被接合至编码起效子肽的另一DNA分子。编码生物活性多肽的核苷酸序列可直接接合至编码起效子肽的DNA序列，或更典型地，本文所讨论的编码连结子序列的DNA序列可插入至编码生物活性多肽的序列与编码起效子肽的序列之间且使用合适的接合酶接合。所得杂合DNA分子可表现于合适的宿主细胞以产生融合蛋白质复合物。DNA分子是彼此接合至5’或3’定向，而使得接合后所编码的多肽的转译框架不改变(也就是，DNA分子接合至彼此的框架内)。所得DNA分子编码框架内融合蛋白质。
其它核苷酸序列也可包含在基因构筑物中。例如，启动子序列，其调控编码生物活性多肽的序列融合置起效子肽或前导序列，所述前导序列导引融合蛋白质至细胞表面或培养媒质，可包含于构筑物中或存在于表现载体而至够筑物所插入处。特别优选为免疫球蛋白或CMV启动子。
在获得变体生物活性多肽中，IL-15、IL-15Rα或Fc结构域编码序列，此项技艺者将辨识所述多肽可通过某些胺基酸取代、添加、删除及后转译修改而修改，而不损失或降低生物活性。特别地，已知保留性氨基酸取代，也就是，一个胺基酸取代为另一氨基酸的相似的尺寸、电荷、极性及构型，不会显着改变蛋白质功能。构筑蛋白质质的20个标准胺基酸可大致分类为四群保留性氨基酸如下:非极性(疏水性)群包含丙氨酸、异白胺酸、白胺酸、甲硫胺酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸及缬氨酸；极性(未带电荷、中性)群包含天冬酰胺、半胱氨酸、榖胺酰胺、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸及酪氨酸；正电荷(碱性)群含有精氨酸、组氨酸及赖氨酸；以及负电荷(酸性)群含有天冬氨酸及榖氨酸。于蛋白质的一个胺基酸以另一个相同的胺基酸取代对于蛋白质的生物活性不会有不良效果。其它例中，可制造对胺基酸位置的修改以降低或增强蛋白质的生物胡姓。该些改变可随机导入或根据标靶残基的已知或推测的结构或功能性的性质经过位点特异性突变导入。变体蛋白质的表现后，因修改所引起的生物活性的改变可容易地使用结合或功能性分析而估计。
介于核苷酸序列之间的同源性，可通过DNA杂交分析予以测定，其中双股DNA杂合物的安定性是取决于碱基配对产生的程度。高温及/或低盐含量的条件降低杂合物的安定性，且可为多变的以预防具有小于所选择的同源性程度的序列退火。例如序列具有约55％G-C含量，杂交及清洗条件为40-50C，6xSSC(氯化钠/柠檬酸钠缓冲液)及0.1％SDS(十二烷基硫酸钠)显示约60-70％同源性，杂交及清洗条件为50-65C，1xSSC及0.1％SDS显示约82-97％同源性，以及杂交及清洗条件为52C，0.1xSSC及0.1％SDS显示约99-100％同源性。也可以使用计广泛为的计算器程序用于比较核苷酸与胺基酸序列(以及测量同源性程度)，及可提供市售可得软件与免付费软件的清单可见于Ausubel等人(1999)。容易地可取得序列比较与多种序列对准几何学，分别为Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)(Altschul等人，1997)及ClustalW progRαms。BLAST可于ncbi.nlm.nih.gov的因特网取得及ClustalW可于2.ebi.ac.uk取得。
融合蛋白质的成分可以任何顺序组织限制条件为任一者皆能实施所期望的功能。例如，一实施例中，生物活性多肽是位在起效子分子的C或N终端。
本发明的优选的起效子分子将具有有助于所期望结构域的功能的尺寸。本发明的起效子分子可通过各种方法包含已知的学交联方法制造及融合至生物活性多肽。参照如Means,G.E.及Feeney,R.E.(1974)in Chemical Modification of Proteins,Holden-Day。也参照如S.S.Wong(1991)in Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking,CRC Press。然而其一般优选为使用重组制备方式以制造框架内融合蛋白质。
应注意的，根据本发明的融合分子或接合分子可以数种方式组装。例示构型中，生物活性多肽的C终端是操作性地连结至起效子分子的N终端。期望时，该连结可通过重组方法达成。然而，另一构型中，生物活性多肽的N终端是连结至起效子的C终端。
或者，或额外地，必要时一或多个额外的起效子可插入至生物活性多肽或接合复合物中。
载体及表现
可应用数种方案表现本发明的蛋白质融合复合物。例如，上述融合蛋白质构筑物可通过已知手段并入合适载体如通过使用限制酵素以于载体制造切点用以在构筑物插入后接合。然后将含有基因构筑物的载体插入合适宿主用以表现融合蛋白质。一般参照Sambrook等人，如上述。合适载体的选择理论上可根据相关于克隆方式的因子进行。例侞，载体对于采用的宿主应为兼容的且具有合适的复制圈。再者，载体应能容置编码欲表现的融合蛋白质的DNA序列。合适的宿主细胞包含真核细胞及原核细胞，优选为该些细胞容易地转形及在媒质中显现快速生长。具体地优选宿主细胞包含原核细胞如大肠菌、枯草杆菌等级真核细胞如动物细胞与酵母菌株，如酿酒酵母。一般优选哺乳动物细胞，特别地为J558、NSO、SP2-O或CHJO。其它合适的宿主包含如昆虫细胞如S9。应用传统的培养条件。参照Sambrook，如上述。然后可选择安定的转形或转染细胞株。表现本发明融合蛋白质复合物的细胞可通过已知过程测定。例如，连结至免疫球蛋白的融合蛋白质复合物的表现可通过特异于所联结的免疫球蛋白的ELISA及/或免疫墨点法测定。用于侦测包括连结至IL-15或IL-15Rα结构域的融合蛋白质表现的其它方法揭露在实例。
如上述一般所述，宿主细胞可使用在制备目的以传递编码所期望融合蛋白质的核酸。因此宿主细胞可包含原核细胞或真核细胞其中融合蛋白质的产生为特别意图。因此宿主细胞特别包含能传递编码融合物的核酸的酵母菌、蝇、蚯蚓、植物、蛙、哺乳动物细胞及组织。可使用的哺乳动物细胞的非限制性示例包含CHO dhfr-细胞(Urlaub及Chasm,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:4216(1980))、293细胞(GRαham等人，/Gen.Virol.,36:59(1977))或类骨髓瘤细胞SP2或NSO(Galfre及Milstein,Meth.EnzymoL,73(B):3(1981))。
能传递编码所期望的融合蛋白质复合物的核酸的宿主细胞涵盖非哺乳动物真核细胞，以及包含昆虫(如，秋夜盗蛾细胞)、酵母菌(如，酿酒酵母、裂殖酵母、毕赤酵母、乳酸克鲁维酵母、汉森酵母；一般参照Fleer,R.,Current Opinion in Biotechnology,3(5):486496(1992))，真菌及植物细胞。也涵盖的为某些原核细胞如大肠菌及杆菌。
编码所期望融合蛋白质的核酸可通过用在转染细胞的标准技术导入至宿主细胞。用语”转染”或”转染”意图涵盖用于将核酸导入宿主细胞的所有传统技术，包含钙磷酸盐共沉淀、DEAE-环糊精-媒介转染、脂转染、电穿孔、微注射、病毒转导及/或整合。用于转染宿主细胞的合适方法可见于Sambrook等人，如上述，及其它实验教科书。
根据本发明可使用各种启动子(转录起始调节区)。合适启动子的选择是根据合适的表现宿主。可使用来自异源性来源的启动子只要期等可于所选择的宿主中发挥功能。
启动子选择也根据所期望的肽或蛋白质产生的效率及程度。通常应用可诱发的启动子如tac以急遽地增加大肠菌中蛋白质表现的程度。蛋白质的过度表现对于宿主细胞可能有害。结果，宿主细胞生长受到限制。可诱发启动子系统的使用将使宿主细胞在幼发基因表现之前被培养达可接受的密度，藉此有助于较高产率。
根据本发明可使用各种信号续序列。可使用同源于编码生物活多肽的序列的信号序列。或者，也可使用经选择或设计信号序列以于表现宿主中有效地分泌与加工。例如，合适的信号序列/宿主细胞配对包含枯草杆菌sacB信号序列用以于枯草杆菌中分泌，以及酿酒酵母α-黏合因子或毕赤酵母酸性磷酸酶phoI信号序列用于毕赤酵母分泌。信号序列可通过编码信号肽酶裂解位点的序列，或通过通常由小于10的密码子所组成的短核苷酸桥(其中所述的桥确保下游TCR序列的正确读框)，直接接合至蛋白质编码序列。
用于增强转录及转译的单元已被鉴定于真核蛋白质表现系统。例如，定位椰菜嵌纹病毒(CaMV)启动子1000bp于异源启动子的任一侧，可于植物细胞提升转录成度危10至400倍。表现构筑物也应包含合适的转录起始序列。用以包含kozak共有序列用于合适的转译起始的表现构筑物的修改可增加10倍转译程度。
通常应用选择性标号，其可为表现构筑物的一部分或与其分开(如，由表现载体所携带)，以使标号可整合于不同于有兴趣基因的位点。实例包含确认对抗生素抗性抗性抗性的标号(如bla确认于大肠菌对安比西林的抗性抗性抗性，nptII确认对广泛多种原核细胞与真核细胞的卡拉霉素抗性抗性抗性)或使宿主于基础媒质生长(如，HIS4可使毕赤酵母或His-酿酒酵母于组氨酸缺乏中生长)。可选择的标号具有其本身的直转录及转译起始与结束调节区以使标号的表现独立。如果应用抗生素抗性抗性抗性做为标号，用于选择的抗生素浓度会根据抗生素而变化，一般范围在每毫升媒质为10至60微克抗生素。
表现构筑物是通过使用已知重组DNA技术组装(Sambrook等人，1989；Ausubel等人，1999)。限制酵素分解及接合为结合二个DMNA片段的基本步骤。DNA片段的末端可于接合前修改，且此可通过填入悬突、以核酸酶(如ExoIII)删除片段的终端部分，位点导向突变或通过PCR增加新的碱基对而达成。可应用多连结子及适体以助于结合所选择片段。表现构筑物典型地应用限制酶、接合及大肠菌转形的循环而阶段性组装。合适于构筑表现构筑物的多种可龙载体已知于此项技艺(γZAP及pBLUESCRIPT SK-1，Stratagene，La Jolla，CA，pET,Novagen Inc.,Madison,WI，引用于Ausubel等人，1999)及特定的选择对本发明并不重要。克隆载体的选择将通过选择用于将表现构筑物导入至宿主细胞的基因转移系统受到影响。于各阶段末，所得构筑物可通过限制酶、DNA定序、杂交及PCR分析而进行分析。
表现构筑物可转形至宿主细胞作为克隆载体构筑物，不论为线形或环形，或可由克隆载体移除且使用作为传递载体或导入至传递载体。传递载体有助于表现构筑物于所选择宿主细胞类型中的传导及维持。表现构筑物是通过任何已知的基因转移系统(如，自然胜任、化学媒介转形、原生质体转形、电穿孔、生物射弹转形、转染或接合)而导入至宿主细胞(Ausubel等人，1999；Sambrook等人，1989)。基因转移系统的选择取决于所使用的宿主细胞及载体系统。
举例而言，表现构筑物可通过原生质体转形或电穿孔导入至酿酒酵母(S.cerevisiae)。酿酒酵母的电穿孔可容易地达成，及产生相当于原生质球转形的转形效率。
本发明进一步提供用于单离感兴趣的融合蛋白质的制造过程。此过程中，宿主细胞(如，酵母菌、真菌、昆虫、细菌或动物细胞)，其中经导入编码感兴趣的蛋白质的核酸，操作性地连结至调节序列，以制造规模生长于媒质以刺激编码感兴趣的融合蛋白质的核苷酸序列的转录。接着，感兴趣的融合蛋白质自所收集的宿主细胞或自媒质单离。可使用标准的蛋白质纯化技术自媒质或自所收集的宿主细胞单离感兴趣的蛋白质。特别地纯化技术可用于大规模的(也就是至少毫克量)自各种实施中包含转动瓶、锥型瓶、组织培养盘、生物反应器或酦酵槽，表现及纯化所期望的融合蛋白质。
可通过已知方法单离及纯化经表现的蛋白质融合复合物。典型地将媒质离心或过滤然后通过亲和性或免疫亲和性层析，如蛋白质A或蛋白质G亲和性层析或免疫亲和性方案纯化上清液，所述免疫亲和性方案包括使用结合至经表现的融合复合物如经连结的TCR或其免疫球蛋白区的单株抗体。本发明的融合蛋白质可通过合适的组合已知技术而制备及纯化。该些方法包含，例如，使用溶解度的方法如盐沉淀，使用分子量不同的方法如透析、超过滤、凝胶过滤及SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，使用电荷不同的方法如离子交换管柱层析，使用特异亲和性的方法如亲和性层析，使用疏水性不同的方法如逆相高效液体层析及使用等电点不同的方法如等电点聚焦电泳、金属亲和性管柱如Ni-NTA。一般参照Sambrook等人及Ausubel等人如上述用于揭露相关该些方法。
优选为本发明的融合蛋白质可为实质纯的。也就是，融合蛋白质已自天然伴随的细胞取代物单离以使融合蛋白质存在优选为至少80％或90％至95％同源性(w/w)。具有至少98至99％同源性(w/w)的融合蛋白质对于许多医药、临床及研究应用最为重要。一旦实质纯化，融合蛋白质应为实质不含对于医疗应用的污染物。一旦部份纯化或达实质纯的，可溶性融合蛋白质可为医疗使用，或进行本文揭露的体外或体内分析。实质纯度可通过种标准技术如层析及凝胶电泳测定。
本发明的可溶性TCR融合复合物含有TCR结构域足以截短而使TCR融合复合物在表现后可分泌进入培养媒质。因此，截短的TCR融合复合物将不包含富含疏水型残基的区，典型地为TCR分子的穿膜及细胞质结构域。因此，例如，对于本发明优选的截短TCR分子，优选为自TCR分子的β链的约最终半胱氨酸至C-终端残基及自α链的约最终半胱氨酸至C终端残基不包含在截短的TCR融合复合物。
本发明的融合蛋白质复合物适合以各种细胞用于体外或体内，所述细胞为癌性细胞或被感染细胞或可通过一或多种疾病变成被感染。
详细说明
人类介白素-15(hIL-15)是通过表现在抗原呈现细胞的人类IL-15受体a链(hIL-15Rα)横越-呈现在免疫起效子细胞。IL-15Rα主要经由细胞外sushi结构域(hlL-15RαSu)以高亲和性(38pM)结合hIL-15。本文显示hIL-15及L-15RαSu结构域可使用作为支架以构筑多结构域融合复合物。二价及双特异性T细胞受体(TCR)融合复合物二者使用此支架经由各种单链(sc)TCR结构域融合至hIL-15及hIL-15RαSu链的N终端而形成。这些融合物中，scTCR结构域保有抗原结合活性及hlL-15结构域显示受体结合活性与生物活性。二价scTCR融合物因增加的分子结合活性而显现改良的抗原结合能力，而包括二种不同scTCR结构域的融合物能结合二同族肽/MHC复合物。含有scTCR结构域及scCD8αβ结构域的双特异性分子较双价或单价scTCR分子也显示显着较佳的键合至同族肽/MHC复合物，说明IL-15:IL-15Rα支架显示对于与给定标钯互动的支持多结构域所需的可挠性。意外地，功能性scTCR也可通过共表现TCR TCRα及β链分别地因融合至hIL-15及hIL-15RαSu结构域而形成。最后，本文显示融合的hIL-15结构域可经由位点特异性突变而制备以提供优异的激动剂或拮抗剂细胞激素活性。同时，这些性质指出hIL-15及hlL-15RαSu结构域可使用作为用在产生新颖标靶免疫分子的多功能、功能性支架。
IgG结构域，特别是Fc片段，已经成功地使用在多种治疗分子做为二聚化支架包含已获准的生物药物。例如，伊那西普(etanercept)是is a dimer of连结至人类IgG1的Fc结构域的可溶性人类p75肿瘤坏死因子-α(TNF-α)受体(sTNFR)的二聚物。二聚化使得伊那西普相较于单体性sTNFR对于抑制TNF-α活性为高达1,000倍更强及提供教单体形式具有5-倍更长的血清半衰期。其结果，依那西普有效于TNF-α体内前炎性活性的中和及改良患者对于数种不同的自体免疫适应症的结果。
除了其二聚化活性外，Fc片段也经由补体活性及与显示于天然杀手(NK)细胞、中性球、巨噬细胞及树突状细胞的Fcγ受体互动而提供细胞毒性的起效子功能。在抗癌治疗抗体及其它抗体结构域-Fc融合蛋白质的内容中，这些活性在动物肿瘤模型及癌症患者所观察到的药效中扮演重要角色。然而，这些细胞毒性的起效子响应在多数治疗应用中可能不充分。因此，已有相当的兴趣在经由标钯志良芬子对疾病位点的改良及扩充Fc结构域的起效子活性及开发补充细胞溶解性免疫反应的其它手段，包含T细胞活性。IgG结构域已使用作为支架以形成双特异性抗体用于改良自传统融合瘤融合技术所产生的产物的质与量。虽然这些方法避开其它支架的缺点，但已难以足以支持临床开发与使用的程度于哺乳动物细胞中制造双特异性抗体。
在开发新的、衍生自人类的免疫刺激性多聚化支架的努力中，聚焦于人类IL-15(hIL-15)及IL-15受体结构域的使用。hIL-15是以高的结合亲和性(平衡解离常数(KD)约10-11M)相关于hIL-15受体α链(hIL-15Rα)的细胞激素的小的四个α-螺旋束家族。然后所得复合物横越-呈现至人类IL-2/15受体β/通用γ链(hIL-15RβγC)复合物显示于T细胞及N细胞的表面。此细胞激素/受体互动造成起效子T细胞及NK细胞的扩充与活化，此再清除病毒感染细胞及恶性肿瘤细胞中扮演要角。正常地，hIL-15及hIL-15Rα在树突状细胞中共产生以形成细胞间复合物，其接着呈异源二聚性分子分泌及显示于细胞表面。因此，hIL-15及hIL-15Rα互动的特征显示这些链内的结合结构域可作为新的、衍生自人类的免疫刺激性二聚性支架以制造能标钯特异性结合的可溶性二聚性分子。本文中，揭示包括T细胞受体(TCR)及CD8结合结构域的多数种融合蛋白质的制造与特征，以显示使用hIL-15:hIL-15Rα5支架用以制造对标靶抗原具有增加的功能性结合亲和性的二种可溶性异源性二聚物以及多位点特异性蛋白质复合物的异源二聚物的可行性。本文也显示这些融合蛋白质保留蛋白质hIL-15能刺激免疫起效子细胞回应的活性。
本文中，显示hIL-15:hIL-15RαSu-为主的支架创造新的、二聚性分子的潜在用途。二聚性融合蛋白质复合物保留其等hIL-15结构域及结合结构域的免疫刺激性与标靶特异性生物活性，显示添加hIL-15及hIL-15Rα不显着改变融合结构域的空间性安排且提供足够的构型可挠性程度而不损及细胞激素活性。因此，此支架可使用于形成多价融合复合物，如c264scTCR二聚物，以增加分子或双特异性分子的总结合亲和性，如c264scTCR/cl49scTCR异源二聚物。在所有情况中，可溶性融合蛋白质以相对高浓度在重组CHO细胞培养中(每升细胞培养上清液中的毫克数而无广泛的细胞株筛选或最适化)制造且可容易地自细胞培养上清液中纯化。本文也显示hIL-15:hIL-15RαSu-为主的支架的用途可扩充至创造可溶性、生物活性、双链分子如α/βTCVR，通过将二个多肽链的细胞外结构域融合至hIL-15及hIL-15RαSu的N终端。此格式造成中等程度降低的hIL-15活性，可能原因为内部折迭的TCRα/β链融合至位于复合物中间的hIL-15:hIL-15RαSu复合物及hIL-15RβγC结合位点的相隔的N终端之间的立体阻碍。可为其它格式且可使用常规方法产生。
hIL-15:hIL-15RαSu-为主的支架也使用于产生OTlscTCR/scCD8异源二聚物，其中CD8α/β及TCR结构域能结合相同的pMHCI复合物但于分开的同位点。使用可溶性but at aspatially distinct sites.Previous studies using可溶性pMHCI试剂的先前研究已测定经由对于结束速率与起始速率二者的效果在细胞表面的CD8安定及增强TCR:pMHCI互动。此效果在决定T细胞对于CD8共受体活性的依赖性上为重要的，而使CD8对于pMHCI-特异性T细胞活化的需要性为逆相关于TCR:pMHCI亲和性。然而，使用可溶性纯化的CD8α/β、TCR及pMHCI蛋白质的数种结合研究已显示TCR:pMHCI互动不为CD8的存在与否所影响，显示没有合作的结合效果。
本发明以细胞为主的研究以及利用OTlscTCR/scCD8异源二聚物的SPR结合与早期报导相反，其显示表现于相同可溶性分子上的TCR与CD8结构域显示相较于带有单价或二价TCR结构域的分子所观察到为更较佳的肽/MHC结合活性。此效果反映于pMHCI:OTlscTCR/scCD8异源二聚物复合物的较慢结束速率及较快起始速率，与结合至T细胞的CD8及TCR分子的pMHCI所观察到的一致。因此，于T细胞结合OT1TCR的OTlscTCR/scCD8异源二聚物模拟物，其对于pMHC互动的共受体活性显示较强的CD8依赖性。这些结果显示此分子的scTCR/scCD8异源二聚物及变体可作为非常有用的工具用以进一步解析无细胞系统中三级TCR:pMHCI:CD8复合物之间的分子互动。此外，具有增强的MHCI结合或性的scTCR/scCD8异源二聚物-为主的试剂可具有有用性于侦测疾病细胞的抗原呈现，而不需要突变TCR结构域以增加结合亲和性。
本文在OT1scTCR融合物的SPR试验结果与Alam等人所报导的不同，Alam等人报导单价OT1TCRα/β异源二聚物对经固定OVA肽/H-2Kb复合物的亲和性显示为约6μM。本文研究中，无法侦测OT1TCR/birA单体的OVA肽/H-2Kb复合物结合及OT1TCR/birA二聚物显现明显的KD为30μM。可能是当格式化为单链Vα-连结子-Vβ-Cβ分子时OT1TCR丧失结合活性。然而，当比较OT1TCR/birA与二链构筑物时观察到相等的活性。再者，先前研究已显示具有Kb突变而废除CD8结合的OVA肽/H-2Kb四聚物对于带有OT1TCR的细胞显示哨的或无特异的结合活性，即便使用高浓度的四聚物，此显示在OT1TCR及其共有pMHI之间为非常低亲和性的互动。相反地，不具有CD8结合突变的OVA肽/H-2Kb四聚物能对带有OT1TCR的细胞明显染色，与此研究中观察到的CD8对于增强OT1TCR结合活性的能力一致。
hIL-15:hIL-15RαSu为主的支架可能利用IgG支架的Fc结构域产生多价或多特异性标靶治疗物。以其对于刺激起效子NK及CD8+记忆T细胞的增殖与活化的潜在活性，hIL-15育扩充可能免疫治疗机制的范围超过相关于IgG为主的方案的抗体依赖性细胞的细胞毒性及补体活化。使用类似于该等用于制备IgG分子的Fc结构域的活性，本案显示IL-15结构域可变异以增加或降低其功能性活性。本案显示于IL-15结构域含有N72D突变的hIL-15:hIL-15RαSu融合物分子显现生物活性增加3至4倍，而IL-15D8N突变显现较少或无活性。虽然IL-15超激动剂为主的融合物蛋白质可作为癌证及感染疾病的标靶免疫治疗物，但能在疾病位点抑制IL-15反应细胞的IL-15拮抗剂可能对于处理外来移植物排斥及炎性液体免疫疾病具有治疗潜力，特别是记忆CD8T细胞在疾病病理上扮演要角。非标靶IL-15突变体/Fcγ2a拮抗剂但白质已显示在实验动物模式中对于抑制胰岛及心脏外来移植物排斥及预防关节炎的发展与进程为有效的。利用在hIL-15:hIL-15RαSu融合蛋白质内容中的IL-15拮抗剂结构域的类似方案为可能的。此外，在某些环境下，可期望具有功能性惰性支架用以产生多聚体分子。例如，本案已发现含有IL-15D8N突变的scTCR/hIL-15:scTCR/hIL-15RαSu融合物，其去除了与IL-15Rβγ的互动，提供显示IL-15受体复合物的细胞的较佳TCR抗原特异性染色。
虽然本案已着眼于TCR及CD8分子作为标把结构域，用以显示本文的目的，应了解hIL-15:hIL-15RαSu支架可使用于构筑具有衍生自抗体、黏附分子或其它受体的蛋白质结构域的新颖分子。亦可能创造蛋白质结构域融合物至IL-15及hIL-15RαSu的C终端，根据结晶结构，而易于修改。所得分子可含有辨识多达四个标靶的能力。利用合适的融合伙伴，这些类型的分子可促进免疫起效子细胞与标靶细胞的接合且达成有效杀死标靶细胞。此外，复合物的IL-15结构域可进ㄧ步通过提供免疫刺激活性增强这些过程以支持起效子细胞增殖与细胞毒性。基于此种概念的各种多功能性的分子使用作为抗癌及抗病毒的免疫治疗剂。
先前，标准哺乳动物细胞系统的不良表现程度限制了重组hIL-15作为治疗剂的发展。如本案所显示，可达成scTCR/hIL-15:scTCR/hIL-15RαSu复合物的表现为能支持临床开发极有潜力产品商业化的程度。此外，已显示IL-15Rα链增强hIL-15的体内活性，而不为机制所限制，可能通过改良细胞激素的药物动力学。这些hIL-15:hIL-15RαSu复合物的二链，与其价天然及/或多特异性标靶设计，提供补集全能hIL-15作为对抗癌症及病毒杆的免疫治疗剂的机会。
如提供于实例，已发现包括免疫球蛋白Fc结构域的hIL-15:hIL-15RαSu融合蛋白质复合物具有额外的有利点。与Fc结构域相关使得能多价及多特异性互动的多链分子的产生。事实上，包括相同scTCR的多重结构域的本发明的融合蛋白质复合物相较于二聚性scTCR融合物得活性为基准所期望者显现增强的抗原结合活性。某些情况中，本发明的融合复合物能结合与活化带有hIL-15RβγC的免疫细胞及带有Fc受体的免疫细胞，使得有强力的免疫刺激活性。已发现包括二个IL-15结构域的本发明的蛋白质融合复合物相较于当与其它IL-15融合蛋白质比较时所期望者显现较佳的IL-15活性。此外，本发明的蛋白质融合复合物在媒介抗体Fc依赖性细胞的细胞毒性对抗肽/MHC呈现标靶细胞，较TCR-IgG1融合蛋白质更为有效。所改良的活性为增加蛋白质融合复合物对肽/MHC复合物的结合及/或增加对显现Fc受体或IL-15受体的起效子细胞的反应性的结果。再者，经由变异分析已发现融合蛋白质复合物的TCR、IL-15及IgG Fc结构域的各种可容易地且独立地制备以改变其结合与功能性活性而提供具有所期望的生物效果的多特异性复合物。
本发明的融合蛋白质复合物在哺乳动物相较于无IL-15已显现具有显着较佳的药物动力学曲线。此外，根据以不同分析方法所观察到的类似PK曲线，融合蛋白质复合物完整保留于体内呈多链分子而无多肽链裂解或解离的证据。此外，本发明的融合蛋白质复合物在动物中显示能媒介抗肿瘤活性对抗带有标靶及带有非标靶的肿瘤且显现相较于以等莫耳剂量投药的rhIL-15更为强力的抗肿瘤药效。再者，以有效剂量的融合蛋白质治疗对于多种动物模型为耐受良好的。
实例1–构筑含有c264scTCR/huIL15RαSushi-hulgGI及cl49scTCR/huIL15N72D的基因融合物的表现载体。
指称为T2分子(T2M)的融合蛋白质由多链多肽组成(图1)。本发明一实施例中，该等多肽之一者包括介于蛋白质结合结构域及IL-15(或IL-15变体)之间的融合物，如揭示于WO2008143794(以参考方式并入本文)。T2的第二多肽包括介于蛋白质结合结构域、IL-15Rα及免疫球蛋白结构域之间的融合物。或者，蛋白质结合结构域-IL-15融合蛋白质可进一步连结至免疫球蛋白结构域。优选的免疫球蛋白结构域包括与其它免疫球蛋白结构域互动的区以形成多链蛋白质。例如，免疫球蛋白重链区，如IgGlCH2-CH3，能互动以创造Fc区。优选的免疫球蛋白结构域也包括具有起效子功能，包含Fc受体或补体蛋白质结合活性，及/或具有糖基化为碘。某些实施例中，T2分子的免疫球蛋白结构域含有降低或增强Fc受体或补体结合活性或醣基化作用的突变，藉此影响所得蛋白质的生物活性。例如，含有降低对Fc受体的结合的突变可使用于生产对于带有Fc-受体细胞具有较低结合活性的T2分子，其可对于试剂设计以辨识或侦测TCR特异性抗原具有有利点。
构筑含有融合至人类L-15Rαsushi结构域(huIL15RαSushi)及人类IgGl恒定区(huIgG1CH1-CH2-CH3)的p53(aa264-272)单链TCR(称为c264scTCR)的表现载体是根据下述方式进行。自前述pNEF38-c264scTCR/huIgGl载体通过Pad及Mlu1的限制分解移除c264scTCR/huIgGl基因片段。基因片段经凝胶纯化且接合至经相同限制酵素分解的pMSGV，所得构筑物称为pMSGV-c264scTCR/huIgGl。含有CMV启动子的DNA片段自pcDNA3.1纯化，接着以Nrul及Hindlll分解。此片段接合至经Pad分解的pMSGV-c264scTCR/huIgGl且以DNA聚合酶填充以创造钝端然后以HindIII分解。所得构筑物命名为pMC-c264scTCR/huIgGl。来自前述构筑物
pNEF38-c264scTCR/huIL15RαSushi(参照WO2008143794)的
huIL15RαSushi基因片段以前向引子:
5'-TGTTGGGAATTCATCACGTGCCCTC-3'
及后向引子：
5'-TGGTGTGAATTCTCTAATGCATTTGAGACTGG-3'
通过KOD Hot Start DNA聚合酶(EMD)在下述PCR条件下扩增：95C 2min，1循环；95C、20sec，65C、20sec；70C，20sec，35循环；72C，10min，1循环。人类IL15RαSushi基因的PCR产物经凝胶纯化且以EcoRI分解。将基因接合至经EcoRI分解的pMC-c264scTCR/huIgGl。编码人类IL15RαSushi结构域的DNA片段克隆至pMC-c264scTCR/huIgGl产生c264scTCR/huIL15RαSushi-huIgGl融合基因包括下述序列：3'-免疫球蛋白重链前导子-264TCRV-a–肽连结子-264TCR V-β-人类TCRC-β-人类IL15RαSushi-人类IgGl重链。所得载体(pMC.c264scTCR-Su/IgGl.PUR)，如图2所示，含有正确的人类IL15RαcSushi基因插入是根据诊断PCR鉴定及根据DNA定序再确认。c264scTCR/huIL15RαSushi/huIgGl基因及蛋白质的序列分别示于图3及图4。
构筑含有c264scTCR/huIL15RαSushi-huIgGl基因融合物的不同表现载体，惟缺乏内EcoRI位点(及对应编码序列)。对于此载体，c264scTCR基因片段的一部分是自c264scTCR/huIgGl载体利用前向引子：
5'GTACGACTTAATTAACTCGAGCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGTTATGG3'
及后向引子扩增：
5'CTTCCCGTTAACCCACCAGCTCAGCTCCACGTG3'
c264scTCR基因片段的TCRβ恒定区的残余部分由
c264scTCR/huIgGl载体利用前向引子：
5'CTGGTGGGTTAACGGGAAGGAGGTGCACAGTGGGGTC3'
及后向引子扩增：
5'GAGGGCACGTGATGTCTGCTCTACCCCAGGCCTC3'
huIL15RαSushi基因片段由c264scTCR/huIL15RαSushi载体利用前向引子：
5'GTAGAGCAGACATCACGTGCCCTCCCCCCATG3'
及后向引子扩增：
5'CCTTGGTGCTAGCTCTAATACATTTGAGACTGGGGGTTGTCC3'.
huIgGI重链恒定区基因片段由c264scTCR/huIgGl载体利用前向引子：
5'CCAGTCTCAAATGTATTAGAGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTC3'
及后向引子扩增：
5'GTAATATTCTAGACGCGTTCATTATTTACCAGGAGACAGGGAGAGGCTCTTC3'。
使用含有TCRβ恒定区序列及huIL15RαSushi基因的所得产物作为模板通过PCR利用前向引子：
5'CTGGTGGGTTAACGGGAAGGAGGTGCACAGTGGGGTC3'
及后向引子：
5'CCTTGGTGCTAGCTCTAATACATTTGAGACTGGGGGTTGTCC3'
产生基因片段。
所得PCR产物及huIgGI基因片段作为模板，通过PCR利用前向引子：
5'CTGGTGGGTTAACGGGAAGGAGGTGCACAGTGGGGTC3'
及后向引子：
5'GTAATATTCTAGACGCGTTCATTATTTACCAGGAGACAGGGAGAGGCTCTTC3'
产生TCRβc/huIL15RαSushi/huIgGl融合基因。
c264scTCR PCR产物以PacI及HpaI分解以及TCRβ
c/huIL15RαSushi/huIgGl融合基因以HpaI及NsiI分解。经分解的基因片段接合至含有CMV启动子的pMSGV反转录病毒载体。所得载体命名为c264scTCR/Sushi/hIgGl-pMSGVc或pMSGVc264SuIg(图5)。此
c264scTCR/huIL15RαSushi/huIgGl基因及蛋白质的序列分别示于图6及图7。
在单链TCR结合结构域(也就是c264scTCR)及IL-15(或IL-15变体)之间产生融合物的表现载体的产生已揭露在WO2008143794。特别有用的IL-15变体为降低或去除IL-15生物活性者或增加IL-15生物活性者。例如，具有取代于位置72(也就是N72D取代)的人类IL-15变体可增加IL-15生物活性5至10倍。IL-15变体提供下表中：
如上表中所示包括IL-15变体的融合蛋白质复合物特征化为其结合TCR特异性抗原的能力，所述抗原为p53(aa264-272)/HLA-A2.1。为了产生呈现p53(aa264-272)/HLA-A2.1的细胞，HLA-A2.1-阳性T2细胞(2x106/mL)在37℃、1x PLE(AltorBioscience)的存在下以20μMp53(aa264-272)肽负载2至3小时。未与肽培养的T2细胞及表现IL-2/15Rβγc的32Dβ细胞作为对照。然后p53肽-负载T2细胞、对照T2细胞或32Dβ(2x105/100uL)与320nM的下述二聚化融合蛋白质复合物在4℃培养30分钟：
1)c264scTCR/huIL15+c264scTCR/huIL15RαSushi,2)
c264scTCR/huIL15D8A+c264scTCR/huIL15RαSushi，及3)
c264scTCR/huIL15D8N+c264scTCR/huIL15RαSushi。这些复合物是通过160nM的经纯化c264scTCRhuIL15融合蛋白质与160nM的经纯化c264scTCRhuIL15RαSushi融合蛋白质于4℃培养3小时产生。接着染色，细胞以清洗缓冲液(含有0.5％BSA及0.05％迭氮化钠的PBAS)清洗一次且以0.5ug的生物素化小鼠单株抗人类TCRCβ抗体(BF1)于100uL的清洗缓冲液中于4℃染色30分钟。细胞清洗一次且以0.5ug的R-藻红素接合链霉亲和素妤100uL的清洗缓冲液中于4℃染色30分钟。细胞经清洗及再悬浮用于流式细胞仪分析。
c264scTCR/huIL15D8A+c264scTCR/huIL15RαSushi复合物及c264scTCR/huIL15D8N+c264scTCR/huIL15RαSushi复合物显现相等活性，因c264scTCR/huIL15+c264scTCR/huIL15RαSushi复合物对于p53肽-负载T2细胞的特异性染色。这些结果显示多价scTCR于这些融合复合物各者为完全功能性。包括IL-15变体(D8A及D8N)的融合蛋白质复合物不显示对于存在32Dβ细胞的IL-15Rβγc受体的结合活性。
IL-15Rβγc受体结合的类似研究使利用其它包括IL-15变体的其它融合蛋白质进行且总结于表1。结果显示本发明的包括IL-15变体的融合蛋白质及融合蛋白质复合物保留对于辨识肽/MHC复合物的活性且显示对于IL-15Rβγc受体降低或增加的结合活性。
对于某些T2分子，具有融合至IL-15及IL-15Rα组份的多种不同结合结构域为有用的。一实例中说明该等分子的活性，单链TCR结构域(称为cl49scTCR)，特异于存在HLA-A2内容中的p53(aa149-157)肽，连结至IL-15N72D结构域且所得融合蛋白质与c264scTCR/huIL15RαSushi/huIgGl融合蛋白质共表现已产生具有c264scTCR及cl49scTCR结合结构域的多链T2蛋白质。
为了产生cl49scTCR/IL15N72D基因融合物，cl49scTCR基因片段(TCR-α、连结子、TCR-β及TCR-β恒定片段)由cl49scTCR/huIgGl表现载体利用前向引子：
5'GACTTCAAGCTTAATTAAGCCACCATGGACAGACTTACTTCTTC3'
及后向引子扩增：
5'-CTTCCCGTTAACCCACCAGCTCAGCTCCACGTG-3'
cl49scTCR/huIgGl载体的TCRβ恒定区的其余部分利用前向引子：
5'CTGGTGGGTTAACGGGAAGGAGGTGCACAGTGGGGTC3'
及后向引子扩增：
5'CACCCAGTTGTCTGCTCTACCCCAGGCCTC3'
huIL15N72D基因由c264scTCR/huIL15N72D表现载体利用前向引子：
5'CTGGGGTAGAGCAGACAACTGGGTGAATGTAATAAGTGATTTG3'
及后向引子扩增：
5'CCTCATGCATTCGAATCCGGATCATTAAGAAGTGTTGATGAACATTTGG3
使用含有TCRβ恒定区序列及huIL15N72D基因的所得产物作为模板通过PCR利用前向引子：
5"CTGGTGGGTTAACGGGAAGGAGGTGCACAGTGGGGTC3'
及后向引子：
5'CCTCATGCATTCGAATCCGGATCATTAAGAAGTGTTGATGAACATTTGG3，
产生基因片段。
该cl49scTCR的PCR产物利用Pac I及Hpa I分解及该TCRβc/huIL15N72D PCR产物利用Hpa I及BstB I分解。经分解的基因片段接合至含有CMV启动子的pMSGV反转录病毒载体。所得载体命名为cl49scTCR/IL15N72D-pMSGVn或pMSGV-c149IL15N72D(图8)。此cl49scTCR/huIL15N72D基因及蛋白质的序列分别示于图9及图10。
实例2–产生制造融合蛋白质的经转染的宿主细胞株
表现载体可通过数种不同的转形、转染或转导方法导入至各种宿主细胞株。该些方法之一，将CHO-K1细胞(5x105)接种于6孔盘且于二氧化碳培养箱中培养隔夜。细胞使用10uL的Minis TransIT-LTl试剂(Mirus)根据制造商的方案以5μg含有c264scTCR/huIL15N72D融合基因的表现载体转染细胞。转染一天后使用4mg/mL的G418(Invitrogen)选择细胞。展开G418抗性抗性抗性细胞且TCR/IL15融合蛋白质表现细胞通过限制稀释次克隆三次及如先前技术所述(参照WO2008143794)利用补集抗体(抗人类TCR Cβ抗体(BF1))及侦测抗体(生物素化抗人类IL-15抗体(BAM247，R&DSystems)通过TCR及huIL-15特异性ELISA根据分泌至培养媒质的可溶性融合蛋白质的浓度筛选产生细胞株。然后c264scTCR/IL15N72D产生细胞株利用如下述含有c264scTCR/huIL15RαSushi-huIgGl融合基因的假型反转录病毒载体转染。
为了生产假型反转录病毒载体，2x106的293GP包装细胞于多-赖氨酸被覆的10cm培养皿(BD Bioscience)在二氧化碳培养箱中37℃培养二天。然后细胞使用Lipofectamine2000(Invitrogen)以9μg的质体pMC-c264scTCR/huIL15RαSushi/huIgGl及4μg的编码VSV-G封套蛋白质的质体pMD-G共转染。含有病毒的上清液在转染后48小时收集且通过0.45μM聚偏氟乙烯过滤器移除细胞碎片。在10μg/ml的聚凝氨(Sigma-Aldrich)的存在下将病毒施加至c264scTCR/IL15N72D产生细胞(1x105细胞/孔于6孔盘中)。细胞以10μg/ml的嘌呤霉素及2mg/ml的G418在转染后二天选择。展开嘌呤霉素及G418抗性抗性抗性细胞及T2融合蛋白质表现细胞通过限制稀释次克隆三次，及利用具补集抗体抗人、抗人类IgG抗体(Jackson ImmunoResearch)及侦测抗体，生物素化抗人类IL-15抗体(BAM 247，R&DSystems)的huIgG1/huIL-15特异性ELISA，根据分泌至培养媒质的可溶性融合蛋白质的浓度筛选产生细胞株。
实例3–T2融合蛋白质的产生与纯化
表现c264scTCR/huIL15N72D及c264scTCR/huIL15RαSushi/huIgGl的细胞株在生长条件下(也就是25至37℃培养5至28天，在小规模的培养烧瓶、搅拌式培养瓶或振荡式培养瓶中或在大规模的中空纤维、振荡包或搅拌槽生物反应器中或相当的培养容器或反应器中)以在培养媒质中产生T2分子作为可溶性蛋白质。为了纯化T2分子，培养媒质进行pH调整且装载于含有共价偶合至Sepharose的抗-TCR抗体(BF1)的免疫亲和性管柱。清洗管柱且以0.5M柠檬酸钠pH4.0溶洗T2分子。浓缩经洗提的蛋白质及缓冲液交换为磷酸缓冲盐水(PBS)，然后装载至rProtein A-Sepharose管柱。清洗步骤后，蛋白质以0.5M柠檬酸钠pH4.0洗提且缓冲交换制PBS。所得蛋白质由考马希染色的SDS-PAGE及尺寸排除层析特征化。
在还原SDS-PAGE条件下，经纯化的T2蛋白质移动如同回应于c264scTCR/huIL15N72D及c264scTCR/huIL15RαSushi/huIgGl成分所期望的分子量的二多肽带，相较于移动同源二聚物分子所期望的单一带的经纯化c264scTCR/huIgGl及c264scTCR/huIgGlΔCHl融合蛋白质(图11)。在未还原变性条件下，c264scTCR/huIL15RαSushi/huIgGl带移动于分子量与二聚物多肽一致的分子量而c264scTCR/huIL15N72D带是与其单体形式一致(图11)。通过尺寸排除凝胶过滤层析，原始T2蛋白质以所期望的四链(2x c264scTCR/IL15N72D,2xc264scTCR/huIL15RαSushi/huIgGl)分子的分子量洗提(图12)。这些结果确认T2分子显现多链构型与huIL15N72D及huIL15RαSushi结构域之间的互动ㄧ致以及与huIG1之间的共价互动示于图1。
使用类似的哺乳动物细胞表现及亲和性层析纯化方法以产生本文所揭露的T2蛋白质复合物。
实例4–T2分子的体外结合活性特征
进行体外分析以特征化T2分子的结构域的结合活性且与其它融合分子比较活性。为了特征化IgG1结构域，微滴定孔以抗人类IgG1抗体与等莫耳量的经纯化T2蛋白质被覆，由c264scTCR/huIL15N72D及c264scTCR/huIL15RαSushi/huIgGl链组成，或对孔施用经纯化c264scTCR/huIgGl融合蛋白质。在结合与清洗步骤后，结合的蛋白质利用抗人类IgGl抗体在标准ELISA条件下侦测。
分析结果示于图13显示T2分子的IgGl结构域相较于TCR/IgGl融合物的结构域时显示相等的抗体结合活性，表示T2IgGl结构域保留原始构型。T2分子的TCR结构域在类似分析中估算。等摩尔量的T2或c264scTCR/huIgGl蛋白质补集在抗人类IgGlAb被覆孔及以抗人类TCRCβ抗体(W4F)侦测。
如图14所示，T2蛋白质显示2-倍较高活性相较于c264scTCR/huIgGl蛋白质对抗-TCR抗体。对于给定的T2分子的四链TCR融合蛋白质组成物与c264scTCR/huIgGl融合物的同源二聚物性组成物是所预期的。估算T2分子的TCR结构域的肽/MHC结合活性等摩尔量的T2(由c264scTCR/huIL15N72D及c264scTCR/huIL15RαSushi/huIgGl链组成)或c264scTCR/huIgGl蛋白质补集于抗人类IgGl Ab被覆孔及利用p53(aa264-272)肽/HLA-A2链霉亲和素-HRP四聚物侦测。如示于图15，T2蛋白质相较于c264scTCR/huIgGl蛋白质对肽/MHC试剂显现3-倍较高活性。由于根据其结构及抗-TCR Ab反应性(参照图14)T2蛋白质预料相较于c264scTCRhuIgG1仅显示2-倍较高TCR结合活性，此是非预期的。因此T2分子结构相较于根据个别成份所预期的提供较佳抗原-特异性结合活性。此增加的结合活性可能为TCR结构域及肽/MHC抗原之间的较少的立体干扰、较佳的亲和力效果、合作互动及/或较佳的构型配适的结果。
实例5-T2IL-15结构域的生物活性的特征化
也估算T2分子的IL-15结构域的活性。微滴定孔以抗人类IL-15抗体及等摩尔量的经纯化T2蛋白质被覆，由c264scTCR/huIL15N72D及c264scTCR/huIL15RαSushi/huIgGl链组成，或对孔施加经纯化的c264scTCR/huIL15N72D融合蛋白质。在结合与清洗步骤后，结合的蛋白质利用抗人类IL-15抗在标准ELISA条件下侦测。
如图16所示，T2蛋白质显现增加的活性(1.6倍较高)相较于c264scTCR/huIL15N72D融合物对抗-IL15Ab，如根据各T2分子含有二个IL-15结构域的假设所预期的。T2分子的IL-15结构域的活性进一步使用细胞激素依赖性32Dβ细胞株于增值分析中特征化。为了测量细胞增殖，32Dβ细胞(2x104细胞/孔)以具有增加浓度的T2蛋白质(由c264scTCR/huIL15N72D及c264scTCR/huIL15RαSushi/huIgGl链组成)或c264scTCR/huIL15N72D融合蛋白质在37℃培养48小时。根据制造商的程序宰细胞生长的最后4小时添加细胞增殖试剂WST-1(Roche Applied Science)。通过代谢活性细胞WST-1成为经着色的甲瓒染料的转化是经由440nm的吸收测定。
如示于图17，T2蛋白质相较于c264scTCR/huIL15N72D融合蛋白质显现3-倍较佳生物活性。由于根据其结构及抗-IL-15Ab反应性，此并非预期的(参照图16)，期望T2蛋白质相较于c264scTCR/huIL15N72D仅显示2-倍较高的IL-15活性。相较于单以这些成分或于其它融合蛋白质格式的内容中未观察到的，综合这些结果说明提供增加的TCR结合活性及IL-15结合活性的T2分子格式的多种优点。
T2蛋白质促进IL-15反应免疫细胞的增殖能力于灵长类模型中检测。食蟹猴(n＝2，lm，1f)以经纯化的T2蛋白质(由c264scTCR/huIL15N72D及c264scTCR/huIL15RαSushi/huIgGl链组成)以0.5mg/kg静脉注射。5天后收集的血液对于CD8记忆T细胞标记(CD8及CD95)及NK细胞标记(CD56及CD16)染色及与处理前所采集的血液相比较。如示于图18，T2处理造成CD8+CD95+记忆T细胞(A)及CD56dimCD16+起效子NK细胞(B)的扩充。这些结果与体内显示强力IL-15活性的T2分子一致。
实例6-T2Fc结构域的结合活性与生物活性的特征化
T2分子的IgG1Fc结构域的结合活性于细胞结合分析中特征化。带有Fc-γ受体的U937细胞与33nM的T2蛋白质(由c264scTCR/huIL15N72D及c264scTCR/huIL15RαSushi/huIgGl链组成)、c264scTCR/huIgGl或A2AL9scTCR/IgGl(阴性对照)培养20分钟。清洗细胞一次且与PE-接合p53(aa264-272)肽/HLA-A2四聚物培养20分钟。U937细胞表面Fc-γ受体的结合是使利用流式细胞仪分析，如示于图19A。也进行使用一范围的蛋白质浓度的类似U937结合研究及染色细胞的平均荧光强度绘图于图19B。
这些研究结果显示U937细胞以T2分子染色相较于对应的c264scTCR/huIgGl融合蛋白质更为有效，确认T2分子的Fc受体的结合活性。为了估算Fc结构域的生物活性，T2分子媒介抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)活性的能力。此研究中，T2蛋白质、c264scTCR/huIgGl或A2AL9scTCR/IgGl(阴性对照)以0.137至100nM添加至96孔盘。
HLA-A2-阳性T2标靶细胞以10uM的p53aa264-272肽脉冲且以50μg/ml的钙黄绿素-AM标记。融合蛋白质与1x104的每孔标靶细胞混合且添加1x106/孔的新鲜人类PBMC。盘于37℃的CO2培养相中培养2小时后收集100ul的条件媒质且自裂解细胞分析释放的钙黄绿素。钙黄绿素以荧光测读仪于Ex-485nm、E-538nm及Cutoff-530nm定量。特异细胞裂解以下述公式计算：特异裂解＝[实验-(背景-自动释放)]/[完全释放-(背景-自动释放)]x100％.Exp＝融合蛋白质+T2细胞+PBMC；背景＝只有媒质；自动释放＝只有T2细胞；C完全释放＝T2细胞+0.5％Triton X-100。
各数据点的三重复测试的结果示于图20其中特征化T2蛋白质的2个不同批次。结果显示T2蛋白质教TCR-IgG1溶合蛋白质更有效于媒介类ADCC活性对抗肽/MHC呈现标靶细胞。改良的活性可能为T2分子对肽/MHC复合物的增强活性及/或显现Fc受体或IL-15受体的起效子细胞的增加反应性的结果。
实例7-T2分子结合至显现在细胞上的肽/MHC复合物的特征化
为了估算T2蛋白质对细胞上肽/MHC标靶的结合活性，，HLA-A2-阳性T2细胞以各种量的p53aa264-272肽脉冲。然后细胞与T2蛋白质(由c264scTCR/huIL15N72D及c264scTCR/huIL15RαSushi/huIgGl链组成)，c264scTCR/huIgGl或A2AL9scTCR/IgGl(阴性对照)，各为83nM。细胞与生物素化抗-TCRAb(BF1)及链霉亲和素-PE培养。然后细胞通过流是细胞仪分析如图21A所示。染色细胞的平均荧光强度作图于图21B。
结果显示T2分子显示相较于c264scTCR/huIgGl融合蛋白质对于侦测p53肽/HLA-A2复合物在细胞的增强能力。结果显示T2蛋白质比c264scTCR/huIgGl融合物能更有效的结合至标靶细胞上的肿瘤相关肽抗原。
类似的结果是期望使用包括特异于其它肽/MHC标靶的TCR结构域的T2分子。例如，衍生自人类肿瘤相关联蛋白质的各种肽；p53、gplOO、MARTI、MAGE-A3、PSMA、PSA、Her2/neu、hTERT、酪氨酸酶、生存素、WT1、PR1、NY-ESOl、EGFR、BRΑF及其它，以知结合至HLA分子且经由TCR互动标靶于人类T细胞回应。此外，已鉴定特异于显示来自HIV、HCV、HBC、CMV、HTLV、HPV、EBC及其它病毒的病毒肽抗原的HLA复合物的TCR。如上所述，这些TCR可溶合至IL-15或huIL15RαSushi蛋白质且特征化在合适的肽附载抗原呈现细胞上的肽/MHC反应性。
实例8-带有2个不同TCR结构域的T2分子的特征化
如上所述，具有多个不同TCR结构域溶合至T2分子的IL-15、IL-15Rα及IgG成分是有用的。这会使得多于一个抗原标靶活性呈现于单一多链蛋白质。为了显现此方案的可实用性，c264scTCR-Sushi-hIgGl-pMSGVc及cl49scTCR-hIL15N72D-pMSGVn表现载体共转染至培养在IMDM10媒质的CHO细胞。培养上清液在转染株室温培养6天后收集。cl49scTCR/huIL15N72D及c264scTCR/huIL15RαSushi/huIgGl的T2分子以ELISA特征化。
c264scTCR/huIL15RαSushi/huIgGl及c264scTCR/huIL15N72D的经纯化T2分子作为对照。于一分析中估算TCR结构域，孔利用抗人类TCRAb(BF1)被覆，添加融合蛋白质且结合的蛋白质以生物素化抗人类TCR Ab(W4F-BN)侦测。
示于图22的结果显示由cl49scTCR/huIL15N72D及c264scTCR/huIL15RαSushi/huIgGl组成的T2分子的TCR结构域通过抗-TCR抗体侦测。为了估算T2蛋白质的IgG1及IL-15结构域，如上述使用ELISA包括山羊抗人类IgG Ab补集及抗人类IL-15Ab侦测。
如示于图23，由cl49scTCR/huIL15N72D及c264scTCR/huIL15RαSushi/huIgGl组成的T2分子于此格式中可侦测含有IgG及IL-15N72D结构域的蛋白质链之间的互动。cl49scTCR结构域的活性也使用抗人类IgGAB补集于ELISA中检测且以p53(aa 149-157)肽/HLA-A2链霉亲和素四聚物侦测。
示于图24，由c149scTCR/huIL15N72D及c264scTCR/huIL15RαSushi/huIgGl组成的T2分子于此格式中可侦测显示具有IgG1结构域的分子也具有对p53(aa 149-157)肽/HLA-A2复合物经由介于cl49scTCR/huIL15N72D及c264scTCR/huIL15RαSushi/huIgGl链互动的结合活性。额外的分析组成由抗人类IgG Ab补集及p53(aa 149-157)肽/HLA-A2或p53(aa264-272)肽/HLA-A2四聚物或抗-TCR Ab(BF1)补集及抗-TCR Ab或抗IL15Ab侦测确认各结构域功能性连结在由c264scTCR/huIL15RαSushi/huIgGl及cl49scTCR/huIL15N72D链组成的蛋白质(图24)。
也产生其中二个TCR结构域表现于其它蛋白质链的T2分子，亦即c264scTCR/huIL15N72D及cl49scTCR/huIL15RαSushi/huIgGl链。这些分子的Fc及TCR活性接着估算结合至U937细胞及以p53(aa 264-272)肽/HLA-A2四聚物接着通故流示细胞仪侦测。
如示于图25，由c264scTCR/huIL15N72D及cl49scTCR/huIL15RαSushi/huIgGl链组成的T2分子能经由Fc结构域结合于U937细胞的Fcγ受体且经由c264scTCR结构域辨识p53(aa264-272)肽/HLA-A2复合物。这些研究确认T2分子具有多功能的TCR结构域且IL-15及IL15Rα及IgGl结构域能形成如示于图1的结构。
实例9-T2蛋白质在小鼠及食蟹猴的药物动力学的特征化
利用IL-15的可能治疗的主要限制为细胞激素体内非常短的生物半衰期。为了估算T2分子在动物模型的生物药物动力学，HLA/A2/Kb-基因转殖鼠(每时间点5只小鼠)以每只小鼠135μg静脉注射经纯化的T2蛋白质(由c264scTCR/huIL15N72D及c264scTCR/huIL15RαSushi/huIgGl链组成)。选择HLA-A2/Kb-基因转殖鼠模型是因为HLA-A2.1结构域的存在，其中此c264scTCR受限制，可影响此蛋白质的药物动力学且应给与相较于其它非人类模型的药物动力学的相关"人源化"观点。此研究中，收集注射后0、1、4、8、24、48及72、96小时的血液及T2蛋白质在血清中的浓度通过ELISA测量。使用二种不同ELISA格式：1)山羊抗人类IgG Ab补集及抗人类TCRAb(W4F-BN)侦测或2)山羊抗人类IgG Ab补集及抗人类IL-15Ab侦测。这些分析可以估算完整蛋白质及多链蛋白质复合物的安定性。
如示于图26A，T2分子在静脉注射后具有9至11小时的生物半衰期。此显着较长于所报导的在小鼠IP注射后所观察到的人类IL-15的约1小时的半衰期(Stoklasek TA etal.2006.J.Immunol.177：6072)。此外，T2分子达到的血清浓度与传递的剂量一致，而非常少的IL-15投药量在此类先前报导中被发现于血清中(Stoklasek TA etal.2006.J.Immunol.177：6072)。因此，T2分子相较于游离的人类IL-15具有较佳的药物动力学曲线。此外，根据二个ELISA所观察到的类似PK曲线，T2分子保留完整为不具有裂解证据的多链分子。
为了估算T2分子于灵长类模型的药物动力学性质，以0.5mg/kg的经纯化T2蛋白质(由c264scTCR/huIL15N72D及c264scTCR/huIL15RαSushi/huIgGl链组成)静脉注射食蟹猴(n＝2，1雄，1雌)。此研究中，收集注射后0、1、4、8、24、48、72、96及120小时的血液及T2蛋白质在血清中的浓度通过ELISA测量。使用三种不同ELISA格式：1)抗人类TCR Ab(F-l)补集及HRP接合山羊抗人类IgG Ab侦测或2)抗人类IL-15Ab补集及HRP接和山羊抗人类IgG Ab侦测或3)抗人类IL-15Ab补集及抗人类TCR Ab(W4F-BN)侦测。这些分析可以估算完整蛋白质及多链蛋白质复合物的安定性。
如示于图26B，T2分子在静脉注射后具有约4至6小时的半衰期。此显着较长于所报导的于猴子皮下注射后所观察到的人类IL-15的约1小时的半衰期(Villinger,F.etal.2004.Vaccine 22：3510)。因此，T2相较于游离的人类IL-15显示具有较佳的药物动力学曲线。此外，根据三个ELISA所观察到的类似PK曲线，这些数据支持鼠科的PK数据显示T2分子保留完整为不具有裂解证据的多链分子。
实例10-异种移植物肿瘤小鼠模型中T2分子对抗固体人类肿瘤的抗肿瘤活性
为了测定T2蛋白质的治疗效果，本发明利用裸鼠中人类p53+HLA-A2+A375黑色素瘤细胞株检测在原发性肿瘤生长模型的抗肿瘤活性。肿瘤细胞皮下注射至裸鼠及在治疗开始前使肿瘤生长至10mm3。带有肿瘤的小鼠以32μg/剂量(1.6mg/kg)静脉注射由c264scTCR/huIL15N72D及c264scTCR/huIL15RαSushi/huIgGl链组成的T2蛋白质、32μg/剂量(1.6mg/kg)的c264scTCR/huIL2或60μg/剂量(3mg/kg)的264scTCR/huIgGl。小鼠每隔一天接受治疗持续一周(注射3次)接着休息9天然后每隔一天接受治疗持续再一周(注射3次)。研究中，测量肿瘤生长及作图肿瘤体积(图27)。结果与仅以PBS治疗的小鼠中生长的A375肿瘤相比较。
如示于图27，A375肿瘤生长在以T2分子或TCR-IL2或TCR-IgG融合蛋白质治疗的裸鼠中受到抑制。先前研究显示p53特异TCR-IL2或TCR-IgG融合蛋白质在此模型中的抗肿瘤效果为标靶起效子结构域对肿瘤位点经由TCR结构域的结果(Belmont etal.2006Clin.Immunol.121：29,Mosquera et al.2005J.Immunol.174：4781)。为了估算此可能性，具有非标靶TCR结构域的T2蛋白质以A375肿瘤外来移植小鼠模型测试。非标靶T2分子相较于p53-特异T2蛋白质对抗A375肿瘤的药效降低提供证据为肿瘤抗原标靶在T2分子的抗肿瘤活性中扮演重要角色。
实例11-在IL-15及Fc域具有突变的T2分子的特征化
如揭露于WO2008143794，突变可导入IL-15结构域以增加或降低其与IL-15Rβγ链互动的能力及影响其生物活性。例如，如上所示，N72D取代可增加IL-15生物活性5至10倍。其它例中，有用于降低IL-15活性以提供拮抗剂功能。为了检测该些突变在T2分子格式内容中的效果，产生含有于IL-15结构域的位置8(亦即D8N)及65(亦即N65D)取代的c264scTCR/huIL15构筑物，且以c264scTCR/huIL15RαSushi/huIgGl蛋白质共表现。所得c264scTCR/huIL15变体及c264scTCR/huIL15RαSushi/huIgGl链的复合物，如实例5所述使用32Dβ细胞测试IL-15活性。如示于图28，包括IL-15D8N及N65D变体的T2分子，相较于包括IL-15N72D结构域或c264scTCR/huIL15融合物的T2分子，显现其支持32Dβ细胞增值的能力显着降低。与实例5的结果一致，包括IL-15N72D结构域的T2分子，c264scTCR/huIL15N72D或c264scTCR/huIL15融合物，相较于显现较高的IL-15活性。
亦可将突变导入IgG1Fc结构域，此于先前显示降低与Fcγ受体或补体的互动能力(Hessell,A.J.,et al.2007.Nature 449:101-1040，以参考方式并入本文)。例如，亮氨酸残基在IgGl CH2的位置234及235(根据抗体共有序列编号)(也就是...P E L L G G...)取代为丙氨酸残基(也就是...P E A A G G...)造成Fcγ受体结合的损失，相反地，赖氨酸残基于IgGl CH2(根据抗体共有序列编号)的位置322(根据抗体共有序列编号)(也就是...KC KS L...)取代为丙氨酸残基(也就是...K C AS L...)造成补体活化的损失(Hessell,A.J.,et al.2007.Nature 449:101-1040，以参考方式并入本文)。这些取代如上述导入c264scTCR/huIL15RαSushi/huIgGl构筑物及所得蛋白质与c264scTCR/huIL15N72D或其它TCR-IL-15变体共转染。这些复合物媒介人类PBMC对抗p53aa264-272肽-负载HLA-A2-阳性T2标靶细胞的ADCC活性如实例6揭示方式估算。提供其它以之改变Fc功能的突变，例如，于Lazar等人,PNAS,103:4005-4010,2006(以参考方式并入本文)。
如示于图29，包括c264scTCR/huIL15RαSushi/huIgGl-LALA及c264scTCR/huIL15N72D链的T2分子不能媒介高浓度的ADCC活性，与通过Fc-LALA变体所显现的Fcγ受体结合损失一致。相对地，如上述包括c264scTCR/huIL15RαSushi/huIgGl-KA及c264scTCR/huIL15N72D链或IL-15变体(N65D或D8N)的复合物显现与c264scTCR/huIL15RαSushi/huIgGl-c264scTCR/huIL15N72D复合物相同程度的ADCC活性。不受机制限制，这些数据也期望根据似乎IL-15结构域及Fc补体-结合结构域不涉入媒介ADCC活性。也检测IL-15及Fc突变对于T2分子刺激人类NK及T细胞响应的能力的效果。人类PBMC以1.8至5x 105细胞/mL于含有包括如上述突变的1nM的T2分子或以10ng/mL的重组人类IL-2或IL-15作为对照的培养基中于37℃培养4天。
NK细胞的细胞毒性使用NK-敏感性K-562细胞做为标靶细胞接着以50ug/ml的Calcein-AM标记而估算。混合各种比例的PBMCs及K-562细胞且于CO2培养箱于37℃培养2小时且收及100ul的条件将与分析自裂解细胞释放的Calcein。Calcein以荧光测读仪于Ex-485nm、E-538nm及Cutoff-530nm定量。特异细胞裂解以下述公式计算:特异裂解＝[实验-(背景-自动释放)]/[完全释放-(背景-自动释放)]x100％.Exp＝融合蛋白质+T2细胞+PBMC；背景＝只有培养基；自动释放＝只有T2细胞；C完全释放＝T2细胞+0.5％Triton X-100。
如示于图30，与包括c264scTCR/huIL15RαSushi/huIgGl及c264scTCR/huIL15N72D链的T2分子的培养，相较于单独与培养基培养后所观察到的结果，能刺激人类PBMC的NK细胞的细胞毒性活性。此外，包括Fc结构域LALA及KA变体的T2分子也能刺激NK细胞活性而包括于IL-15结构域的N65D或D8N取代者，对于刺激NK细胞的细胞毒性应为少的或无能力。与这些结果一致，人类PBMC与包括c264scTCR/huIL15RαSushi/huIgGl及c264scTCR/huIL15N72D链的T2分子或具有Fc结构域LALA及KA变体者培养，造成CD56+NK细胞的增值增加，相反地，包括IL-15N65D或D8N取代的T2分子未提供伊样多的NK细胞增殖活性(图31)。这些结果根据各IL-15结构域的功能性是所期望的。
对于某些应用，T2分子与IL-15或Fc受体之间的互动降低可为期望的以降低非特异性结合智带有这些受体的细胞。为了估算，含有IL-15及Fc突变的T2分子，使用以肽负载的T2分子进行TCR特异性标靶细胞辨识而评估。以T2分子或c264scTCR-链霉亲和素四聚物阳性对照的细胞染色，使用实例7揭示的方式，于含有(T2.265)或不含有负载p53肽(T2)的T2细胞进行。根据未负载细胞的染色，可了解包括c264scTCR/huIL15RαSushi/huIgGl及c264scTCR/huIL15N72D链的T2分子，相较于c264scTCR-链霉亲和素四聚物或BF1抗体对照，显示显着的细胞结合。导入Fc LALA或IL-15N65D或D8N突变降低细胞结合，显示与Fc及IL-15受体的互动在T2复合物结合中扮演要角。Fc LALA及IL-15N65D或D8N突变的组合进一步降低T2分子复合物结合，使得包括c264scTCR/huIL15RαSushi/huIgGl-LALA及c264scTCR/huIL15D8N的分子不显出结合至未负载T2细胞高于BF1抗体阴性对照。p53肽负载细胞的染色不受Fc和IL-15突变导入的影响。然而，当T2分子染色对于肽附载相对于未负载细胞作为比较的平均荧光强度(特异性对非特异性比例)，清楚可知包括c264scTCR/huIL15RαSushi/huIgGl-LALA及c264scTCR/huIL15D8N链的T2分子对于p53肽抗原提供最高染色特异性(图32B)。这些结果显示T2分子的TCR、IL-15及IgG Fc结构域各者的结合活性可容易地且独立地制备以提供具有所期望的生物活性的多特异性复合物。
其它情况中，修改IL-15结构域及IgG Fc结构域的活性以最佳化T2复合物的治疗指数及最小化T2复合物的毒性是有用的。例如，部分仰赖于ADCC活性对于旗等的治疗效果的标靶复合物可能需要高浓度剂量(也就是1至20mg/kg)，这会超过IL-15补体的可耐受剂量浓度。这些情况中，降低其活性的IL-15结构域含有突变的复合物是所期望的以提供较佳治疗效果及降低毒性。如上所述于IL-15结构域含有N65D或D8N取代或其它取代的T2分子，所述取代包含已发现降低IL-15活性的I6S、D8A、D61A、N65A、N72R、V104P或Q108A，特别有兴趣。
实例12-非标靶T2分子的特征化
某些应用中，需要以T2复合物标靶特异性抗原。该些分子中，抗原特异性结构域如TCR结合结构域，可通过突变或完全删除而去活性化。使用本案所揭露方法，指称为T2MΔTCR的包括huIL15RαSushi/huIgGl及huIL15D8N链的分子的活性，与包括c264scTCR/huIL15RαSushi/huIgGl及c264scTCR/huIL15N72D链的T2分子(指称为T2M)及损失hulgG1链的T2分子(c264scTCR/huIL15RαSushi及c264scTCR/huIL15N72D，指称为T2MAIg或c264scTCR二聚物)相比较。当如实例5所揭示方式测试支持32Dβ细胞生长的能力时，T2MΔTCR显现非常强力的IL-15活性(图33A)，所述活性大于利用重组人类IL-15所观察到活性的24倍。
也估算T2MΔTCR对于支持人类免疫细胞生长的能力。人类PBMC以1×106细胞/孔于T2M(0.5nM)、T2MΔTCR(0.5nM)或T2MAIg(1nM)的存在或不存在下的培养基培养7天。细胞利用抗-CD45RO及抗-CD8或抗-CD8,、抗-CD95及抗-CCR7或抗-CD56及抗-CD 16染色，及利用FACScan分析。示于图33B的由8个不同捐赠者所的的平均结果示于图33B，显示T2MΔTCR及其它T2分子可有效地刺激各种CD8+记忆T细胞及NK细胞亚群包含起效子记忆T细胞的扩增。这些细胞的NK细胞活性使用揭示于实例11的方法检测。示于图33C的来自2个捐赠者的PBMC的代表性结果显示T2MΔTCR及其它T2分子可有效地刺激NK细胞的溶细胞活性。总结这些结果显示T2MΔTCR蛋白质为强力的免疫刺激分子。
实例13-T2分子的体内活性
为了进一步特征化T2分子的免疫刺激活性，测T2M、T2MΔTCR、缺乏IgGl CH1结构域的T2MΔTCR(T2MΔTCRΔCH 1)、具有Fc-LALA突变的T2M(T2MLALA)及具有IL-15D8N突变的T2M(T2MD8N)的诱发NK及CD8T-细胞于C57BL/6小鼠的扩增能力。此外，评估c264scTCR/huIL15N72D、c264scTCR/huIL15RαSushi及c264scTCR/huIL15N72D+c264scTCR/huIL15RαSushi复合物。
小鼠于第1及4天注射融合蛋白质量为相等于2.5ug剂量的IL-15，收集血液细胞及脾脏细胞，对CD8T-细胞及NK细胞染色，及以流式细胞仪分析。示于图34的结果显示T2分子于体内有效于扩增血液及脾脏NK细胞及CD8T细胞。T2MLALA显示类似于T2M的活性，建议FcR结合及信号传地可能在NK及CD8T细胞扩增中没有扮演显着角色。T2MD8N治疗当相较于T2M时造成降低的活性，确认D8N突变去除了使用人类PBMC的分子体外的免疫刺激活性。TCR的删除(T2MΔTCR)及TCR及CH1的删除(T2MΔTCRΔCH1)显示降低的活性。这些效果可能起因于这些较小分子的较短半衰期。c264scTCR/huIL15N72D、c264scTCR/huIL15RαSushi及c264scTCR/huIL15N72D+c264scTCR/huIL15RαSushi复合物，相对于T2M也显示降低的体内活性，确认替外的结果显示T2分子是更为强力的免疫刺激化合物。
实例14-T2分子的多特异性
为了进一步特征化IL-15及IL-15Rα/IgG Fc融合结构域作为用于多重结合结构域的支架的能力，创造包括特异于连结至huIL 15N72D及连结至huIL15RαSushi/huIgGl融合物的单链CD8α/β结构域的H-2Kb-限制OVA aa257-264肽(SIINFEKL)的单链融合TCR结构域(OT1scTCR)的蛋白质复合物(OT1-CD8-T2M)。单链CD8α/β结构域包括经由(G4S)4肽连结至鼠科CD8β的细胞外结构域的鼠科CD8α的细胞外结构域。CD8于MHC分子源离TCR-特异性肽/MHC接口的MHC分子的结合位点被良好特征化。因此，OT1-CD8-T2M复合物的OTscTCR及scCD8α/β结构域期望于aa257-264/H-2Kb-分子的不同位点互动。
为了测试此点，OT1-CD8-T2M的结合活性与OTlscTCR/huIL15N72D融合α物的结合活性通过ELISA比较。等莫耳量的各蛋白质补集于经被覆抗-TCR C mAb(H57)的孔及利用OVA aa257-264/H-2Kb四聚物或对IL15、CD8a、CD8β或TCR Vα2的mAb作探针。也经抗-人类Ig的孔进行分析及利用抗-TCR Vα2作探针。
如示于图35A，OT1-CD8-T2M蛋白质显现对于抗-IL15、CD8a、CD8β或TCR Vα2及人类Ig抗体的反应性。对于抗-TCR Vα2mAb相较于OTlscTCR/huIL15N72D有约3-倍更高的反应性，如根据T2M融合复合物的多价格示所期望的。然而，OTlscTCR/huIL15N72D融合物对于OVAaa257-264/H-2Kb四聚物显示少或无结合，相反地，与OT1-CD8-T2M蛋白质的结合为明显清楚(图35B)。这些结果显示OT1-CD8-T2M复合物的OTscTCR及scCD8α/β结构域二者结合至OVA aa257-264/H-2Kb分子以提供高亲和性安定的互动。
实例15-IL-15:IL-15Rα结构域作为功能性支架
制备肽/MHC类型I(pMHCI)四聚物-如上所述，鼠科H-2Kb基因自萃取至C57BL/6小鼠淋巴球的总RNA进行克隆。细胞外区结构域接合至HLA-A*0201重链表现载体(31)以HLA-A*0201编码序列(31)置换。将β2m、HLA-A*0201及H-2Kb表现载体各别转形至大肠菌及如所述诱发重组蛋白质的表现(31)，及表现呈不溶性包涵体。具有肽的复合物中的活性与可溶性蛋白质通过揭露于
http://www.microbiology.emory.edu/altman/jdaWebSite_v3/ptetPrepOverview.shtml的再折迭方法获得。p53(aa264-272)及(aal49-157)肽/HLA-A*0201试剂分别指称为A2/p53.264-272及A2/p53.149-157，及the OVA(aa257-264)肽/H-2Kb指称为Kb/OVA.257-264。
ELISA–I免疫盘(Maxisorb,Nunc,Rochester,NY)被覆(BF1)8A3.31mAb用以补集c264scTCR融合蛋白质或利用H57-597mAb用以补集OTlscTCR融合蛋白质。清洗后，如叙述于结果段落，蛋白质利用各种探针侦测。然后添加ABTS(2,2'-联氮双[3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸]-二铵盐)基质及使用96-孔读盘仪(Versamax,Sunnyvale,CA)测量405nm的吸收。
流式细胞仪–为了特征化c264scTCR融合蛋白质复合物，T2细胞以p53(aa264-272)肽在肽附载增强剂(PLE,Altor Bioscience Corp.,MiRαmar,FL)的存在下于37℃脉冲2小时。对于OTlscTCR融合蛋白质复合物，鼠科淋巴瘤EL4细胞以OVA肽于100ug/ml及PLE于37℃脉冲6小时。添加各种birA融合蛋白质(与SA-PE复合)及于4℃培养1小时。清洗样品二次及于i FACScan细胞流式仪使用CellQuest软件分析(BD Biosciences,San Jose,CA)。
为了估算IL-15结构域结合活性，32SDβ细胞与320nM的c264scTCR融合蛋白质复合物于4℃培养30分钟。蛋白质的结合转换为以生物素化(BF1)8A3.31mAb侦测15分钟及SA-PE(各5ug/ml)侦测15分钟。如上所述，经染色的细胞通过流示细胞仪分析。
细胞增殖分析-细胞增殖如先前文献所揭露方式测量(25)。简言之，Briefly,32Dβ细胞(1x 105细胞/孔)与增加浓度的TCR/hIL-15或scTCR/hIL-15变异株在等莫耳浓度的scTCR/hIL-15RαSu的存在或不存下于37℃培养48小时。根据制造商程序，在细胞生长的最后4小时期间添加细胞增殖剂WST-1(Roche Applied Science,Indianapolis,IN)。WST-1通过代谢活性细胞成为着色甲瓒的转换使经由于440nm的吸收测量。EC50以自通过非线性回归可变斜率-适配Prizm4软件(GRαphPad Software,La Jolla,CA)。
表面薄层共振-OTlscTCR融合蛋白质对其同源pMHCI的亲和常数使用表面薄层共振(SPR)方法BIAcore 2000仪器测量(GE Healthcare,Piscataway,NJ)。生物素化pMHCI复合物固定至SA5感应器芯片的链霉亲和素-被覆表面(GE Healthcare,Piscataway,NJ)通过注射蛋白质为2ug/ml于HBS缓冲液中(10mM HEPES，150mM NaCl，3.4mM EDTA，0.005％P20界面活性剂，pH 7.4)以流速为10ul/min。此造成1000至1200RU的经固定pMHCI复合物。
经纯化的OTlscTCR融合蛋白质于HBS中稀释为1uM、0.5uM及0.25uM。各浓度注射一次(50ul)以流速10ul/min通过新鲜固定的pMHCI表面以及对照的晶以生物素封阻的链霉亲和素表面(基线)及登记结合曲线。解离常数(KD)及相连(kon)与分离(koff)自正确结合曲线(基线萃取)使用BIAevaluation 4.1.1软件(GE Healthcare Sciences,Piscataway,NJ)计算。
使用ML-15:hIL-15Rα支架创造scTCR二聚物-先前已显示生物活性、双功能性融合蛋白质，指称为c264scTCR/hIL-15，可创造通过融合hIL-15的N-终端至三-结构域、HLA-A*0201-限制嵌合TCR特异于p53(aa264-272)肽抗原(c264scTCR)(25)(图36A)。本发明构筑具有人类IL-15Rα(L-15RαSu)的c264scTCR及the sushi-结合结构域(aa1-66)的类似融合蛋白质，其已显示含有负责hIL-15结合的结构单元。此融合蛋白质遗传性地连结至birA肽标签而允许生物素化及在链霉亲和素存在下的后续多聚物化(32)。此融合蛋白质指名为c264scTCR/hIL-15RαSu/birA及其表现及自CHO细胞纯化式类似于c264scTCR/hIL-15(25).。这些融合蛋白质容易制造每升毫克等级的细胞培养上清液(数据未显示)。
根据hIL-15及hIL-15RαSu结构域之间的高特异性结合活性，解读为融合蛋白质可形成异源二据物性复合物。此外，人类IL-15:IL15Rα复合物的结晶结构的检测显示二个蛋白质的N-终端于复合物的相反末端相隔约50A(33)，因此，scTCR结构域对这些区的融合物不期望阻碍复合物形成。
c264scTCR/hIL-15及c264scTCR/hIL-15RαSu/birA融合蛋白质之间的结合的起始证据是使用盘-结合c264scTCR/hIL-15RαSu/birA以补集hIL-15及c264scTCR/hIL-15蛋白质于ELISA中观察(25)。为进一步特征化二聚物性T c264scTCR融合蛋白质复合物(指称为c264scTCR二聚物)，混合等莫耳量的经纯化c264scTCR/hIL-15及c264scTCR/hIL-15RαSu/BirA融合蛋白质且使其于室温相联超过10分钟。复合物及各别蛋白质融合物通过尺寸排除层析评估。
如示于图36B，经纯化的c264scTCR/hIL-15及c264scTCR/hIL-15RαSu/BirA融合蛋白质制剂中的主要物种显示的SEC曲线与单体性蛋白质一致(分子量分别(MW)＝115及113kDa)而二种蛋白质的混合物造成主要峰具有分子量队应于二聚物性复合物(MW>192kDa)。因此，c264scTCR二聚物制剂中较大分子量的出现是异源二聚物性复合物已产生的证据。
c264scTCR二聚物与单体性c264scTCR/BirA蛋白质相比较其结合TCR-s特异性抗原，p53(aa264-272)/HLA-A*0201的能力。各情况中，蛋白质以生物素接合酶生物素化接着与SA-PE(32)复合以产生多聚体性流式细胞仪式剂如先前所述(32)。当使用染色HLA-A*0201-阳性T2细胞以各种浓度的p53(aa264-272)肽脉冲，二种试剂显示抗原-特异性结合以肽-浓度依赖性模式增加(图37A)。然而，包括c264scTCR二聚物的染色试剂染上为3倍较佳于单体-衍生的c264scTCR/birA相对部分(图37B)。不受机制限制，这些数据建议经由IL-15:IL-15Rα于反应中的二聚物化，预防scTCR的功能性活性及经由增加亲合力增加cTCR融合复合物对其同源物HLA/肽的有效亲和性。当经由birA卷标的生物素化直接导向复合物的scTCR/hIL-15的N-终端时观察到类似结果(数据未显示)。此显示复合物的N-终端有助于接合至显着尺寸的分子探针(链霉亲和素的MW接近60kDa)而不干扰融合蛋白质复合物的二聚物化或抗源结合结构域。
这些研究扩充至检测产生双特异性分子的可能性。创造第二scTCR(cl49scTCR)其辨识人类p53蛋白质的HLA-A*0201限制表位淘选氨基酸残基149至157(24)。此scTCR融合至hIL-15及所得蛋白质，指名为cl49scTCR/hIL-15，是利用c264scTCR/hIL-15aSu/birA融合物共表现于CHO细胞。重组CHO细胞培养的上清液中所观察到的融合复合物使用抗-IL-15a抗体固定及利用HRP-标记p53(aa264-272)或p53(aal49-157)肽/HLA-A*0201四聚物为探针。如示于图37C，抗-IL-15抗体补集融合蛋白质复合物能结合至二个肽-负载HLA四聚物。结果显示各别的scTCR分子保留功能性活性当融合至hIL-15:hIL-15RαSu支架及远离安排的hlL-15:hIL-15RαSu复合物不显着甘扰scTCR结构域的组装其具有各别分子量接近40kDa。
为了显示hIL-15:hIL-15RαSu支架对于蛋白质二聚物化的广范围使用，本发明创造第二个二聚物性scTCR融合复合物，通过备对二个单链OT1TCRs，一个融合至hIL-15的N-终端及另一个融合至hlL-15RαSu/birA蛋白质的N-终端。OT1是良好特征化的OVA蛋白质的TCR辨识表位淘选小鼠H-2Kb内容物中的氨基酸残剂257至264(34)。产生OT1单链TCR(OTlscTCR)基因且融合至hIL-15及OTlscTCR/hIL-15RαSu/birA构筑物用于重组CHO细胞表现。发现经纯化OTlscTCR融合蛋白质的亲和性于ELISA中具有pMHCI结合活性，使用抗-小鼠TCR C H57抗体作为补集试剂及HRP-标记，OVA(aa257-264)肽-负载H-2Kb四聚物(图42)。为了区别OTlscTCR二聚物及OTlscTCR/birA单体之间的结合活性，本发明进行流示细胞仪分析类似于前文所述用于c264scTCR二聚物，但利用负载OVA(aa257-264)肽的H-2Kb-阳性EL4细胞。
如示于图38，包括OTlscTCR二聚物的SA-PE四聚物确实显着染色，相较于包括单体性OTlscTCR/birA融合物者。本发明也进行表面薄层共振分析以估算OTlscTCR单体及二聚物对抗固定于链霉亲和素感应器芯片的生物素化OVA(aa257-264)肽-负载H2-Kb/birA复合物的结合亲和性。The apparent结合affinity(KD)of the OTlscTCR二聚物对OVA肽/H-2Kb复合物的表关结合亲和性(KD)估计约30uM，而对于单体性OTlscTCR/birA融合蛋白质(表1)观察到无结合。这些数据确认经由hIL-15:hIL-15Rα互动的二聚物化预防scTCR的生物活性及经由增加亲和力scTCR分子对其同源物pMHCI复合物的有效亲和性。
创造OTlscTCR/scCD8异源二聚物-由于CD8分子先前在已显示在OT1TCR及其同原物OVA肽/H2-Kb复合物之间的互动扮演枢纽角色(35-37)，hIL-15:hIL-15RαSu支架提供估算是否CD8分子增强OT1TCR对表现于细胞表面的OVA肽/H-2Kb的结合亲和性及在无细胞及无黏附分子条件下的结合亲和性。为了完成此项，首先创造鼠科CD 8分子为单链格式(scCD8)，通过使用可挠性连结子融合鼠科CD8的α及β链的细胞外结构域。此融合基因融合至hIL-15RαSu/birA构筑物于反转录病毒表现载体中。然后使用重组反转录病毒感染表现OTlscTCR/hIL-15融合蛋白质的CHO细胞株。异源二聚物性融合蛋白质复合物如上所述自培养重组CHO细胞的上清液使用抗-TCR抗体-为主的亲和性层析纯化。然后经纯化的蛋白质进行ELISA使用抗-TCR抗体作为补集试剂及生物素化抗-mCD8a或抗-mCD8mAbs作为探针。
如示于图39A，抗-TCR Ab-固定融合复合物含有CD8α及CD8β，且因而显示OTlscTCR/scCD8异源二聚物的形成。本发明使用流式细胞仪分析以比较具有OTlscTCR二聚物的OTlscTCR/scCD8异源二聚物的结合活性以确认OVA肽/H-2Kb复合物显示于细胞表面的量。如示于图39B，包括OTlscTCR/scCD8异源二聚物的SA-PE染色试剂可容易地侦测OVA肽/H-2Kb复合物于负载少于10ng/ml OVA肽的EL4细胞，而当使用包括OTlscTCR二聚物的可比较试剂时，在此肽浓度观察到少或无染色。在未以肽脉冲的EL4细胞观察到较高背景的OTlscTCR/scCD8异源二聚物染色，建议肽-依赖性互动于细胞表面发生于CD8结构域及MHC分子之间。类似效果已报导于pMHCI四聚物结合至表现于T细胞的CD8分子(38)。
这些结果建议OTlscTCR/scCD8异源二聚物的肽-特异性互动进一步通过表面薄层共振分析确认。OTlscTCR/scCD8异源二聚物对OVA肽/H-2Kb复合物的结合亲和性(KD)估计为2.6uM，其显着较高于OTlscTCR二聚物所观察到的30uM(表1，图43)。没有融合蛋白质显示任何结合至对照VSV肽/H-2Kb复合物。
在特异性pMHCI结合活性的差异异外地给出OTlscTCR二聚物的二价本质，期望于此分析格式中提供增加的功能性亲和性。此外，类似的SPR结合研究进行可溶性TCR、CD8α/β及pMHCI蛋白质作为依赖性成分显示仅有弱的互动(KD 30至100uM)介于CD8蛋白质及肽/H-2Kb复合物之间且无明显CD8于TCR:肽/H-2Kb互动(39-41)的互动效果。总结而言，这些数据显示添加CD8α/β结构域至OTlscTCR融合物对于pMHCI结合具有较大于创造二价OTlscTCR分子的影响。本发明的结果进一步显示hIL-15:hIL-15RαSu支架可使用于创造功能性双特异性分子具有壳能性以安置复合物蛋白质-蛋白质互动。此外，本发明是第一次显示功能性CD8分子可构筑为可溶性单链分子及显示scCD8结构域当与OTlscTCR复合为异源二聚物性分子时于无细胞条件无其它黏附分子存在下增强TCR:pMHCI互动。
创造功能性TCRα/β异源二聚物-如上文所述，hIL-15及hIL-15Rα结构域的N-终端为复合物的远距末端产生是否此支架适合用于融合至多链蛋白质的多肽。为了测定是否可溶性、生物活性、异源二聚物性TCRα/β可使用hIL-15及hIL-15RαSu支架构筑，细胞外OTlTCR Vα-Cα及Vβ-Cβ结构域是分别连结至hIL-15及hIL-15RαSu/birA链的N-终端。根据已公开α/βTCR结晶结构，合适折迭的OTl TCRα/β分子的TCR Cα及Cβ的C-终端氨基酸期望为远(42)。OTl TCRα/hIL-15及OTl TCR/hIL-15RαSu/birA融合基因克隆至两个分开的表现载体及共转染至CHO细胞。分泌的融合蛋白质复合物如上所述使用抗-TCR CβmAb亲和性层析纯化。当于还原条件下进行考马西-染色SDS-PAGE分析时，经纯化蛋白质带移动至50kDa，与二融合分子的各者的计算的单体性MW(40kDa)一致(数据未显示)。
经纯化的蛋白质进一步于功能性ELISA(抗-TCR C mAb补集:OVA肽/H2-Kb四聚物探针)特征化。如示于图40A，发现经纯化的蛋白质具有相当于pMHCI结合活性而OTl TCR为单链格式。类似的结果观察到在hIL-15:hIL-15RαSu/birA融合至p53-特异性264TCR的Vα-Cα及Vβ-C链of(图40B)。以往企图于哺乳动物细胞制造可溶性α/βTCR异源二聚物已大为成功(43,44)。因此，本发明的结果建议TCRα及βc链于转染细胞内经由hIL-15及L-15RαSu/birA结构域的相联合适的折迭。有趣地，融合至hIL-15:hIL-15RαSu支架的N-终端能提供远距安排足以功能性独立地结合结构域如所观察的c264scTCR/cl49scTCR异源二聚物性复合物而保留可挠性允许接进的配对链如OT1TCR及264TCR的α及β链的折迭。
hIL-15结构域对于hIL-15:ML-15RαSu融合复合物的生物活性-IL-15受体(IL-15RβγC)的c264scTCR二聚物的hIL-15:hIL-15Rα结构域的结合能力是使用带有hIL-15R及鼠科γC(mγC)链的32Dβ细胞通过流式细胞仪评估。这些研究使用含有野生型hIL-15结构域的c264scTCR二聚物以及具有先前显示增加(N72D)或降低(D8N)结合至hIL-15R链的hIL-15变异结构域的二聚物(25)。此外本发明已显示这些突变不影响L-15:hIL-15RαSu复合物的形成(25)。与c264scTCR二聚物培养后，32Dβ细胞利用抗-TCR mAb染色以侦测细胞结合融合蛋白质二聚物。如示于图41A，32Dβ细胞通过含有hIL-15野生型或ML-15N72D结构域的c264scTCR二聚阳性染色而非含有L-15D8N结构域者，显示复合物的IL-15:hIL-15RαSu部分保留所期望的IL-15βγC结合活性。
融合蛋白质二聚物的hIL-15生物活性也使用32Dβ细胞于细胞增殖分析中检测。如示于图42B，单体性(scTCR/hIL-15融合物)或二聚物性(scTCR/hIL-15:scTCR/hIL-15RαSu)融合格式中的hIL-15野生型结构域也能以浓度性方式支持f 32Dβ细胞的生长，显示半-极大刺激(EC50)于-300pM。hIL-15N72D或D8N结构域分别增加或去除融合蛋白质的生物活性，不论其存在为单体性或二聚物性融合物。这些结果与对于代有N72D或D8N突变的非-融合IL-15细胞激素所观察到的功能性活性一致(25)。因此，含有二个独立的TCR结构域的融合蛋白质复合物不显着改变IL-15结构域的生物活性。相对地，对于OT1TCRα/β异源二聚物复合物至少有3倍的IL-15活性损失(数据未显示)，建议异源二聚物性TCR结构物的形成抑制，达某些程度，hIL-15结构域与hIL-15RβmγC的互动能力。此外，这些结果显示hIL-15结构域可容易地制备以允许增强或降低受体结合及功能性活性，因而提供对于使用hIL-15:hIL-15RαSu支架于不同应用的额外的弹性。
实例16-T2分子于免疫受容小鼠的毒性曲线及抗-肿瘤活性
为了进一步测定T2分子的体内效果，缺乏IgG1CH1结构域(T2MΔCH1)的T2M及非标靶T2MΔTCRΔCH1蛋白质复合物，本发明于带有肿瘤的免疫受容C57BL小鼠中检测毒性及抗肿瘤活性。B16(5x 105/小鼠)或EG7(1x 106/小鼠)鼠科肿瘤细胞于研究的第0天皮下注射至C57BL/6NHsd小鼠。带有肿瘤的小鼠于研究第1、4、8及11天静脉注射51或25.5ug/剂量T2蛋白质(由c264scTCR/huIL15N72D及c264scTCR/huIL15RαSushi/huIgGl链组成)、47.7ug/剂量的T2MΔCH1(由c264scTCR/huIL15N72D及c264scTCR/huIL15RαSushi/huIgGlCH2-CH3链组成)(莫耳相等于51ug/剂量的T2蛋白质)、16.6或8.3ug/剂量的T2MΔTCRΔCH1(由huIL15N72D及huIL15RαSushi/huIgGlCH2-CH3链组成)(分别莫耳相等于51及25.5ug/剂量的T2蛋白质)或1.2ug/剂量的rhIL-15(m莫耳相等25.5ug/剂量的T2蛋白质)。研究中，测量动物重量及作图所得结果(图44A-B及45A-B)。
利用T2M、T2MΔCH1及T2MΔTCRΔCH1蛋白质的处理显着抑制B 16(图s 44A)及EG7(图45A)肿瘤生长，相较于PBS处理后所观察到的结果且各融合蛋白质复合物相较于以相等莫耳浓度投药rhIL-15，更为有效。此外，T2M、T2MΔCH1及T2MΔTCRΔCH1处理的毒性效果非常少如所测量的带有肿瘤小鼠的体重变化(图44B及45B)。不受机制限制，这些数据与这些分子载免疫受容动物中的体内免疫刺激活性一致(实例13)。
实例17-T2M及其衍生物的免疫刺激性及抗-肿瘤活性的进一步特征化
为了进一步特征化类似标靶IL-15:IL-15Rα-Fc复合物，产生共表现c264scTCR/huIL-15及c264scTCR/huIL15Rα/IgGl Fc融合蛋白质的重组CHO细胞株。在一情况中使用人类IgGl结构域含有完整重链恒定(CH1-CH2-CH3)及ㄧ第二情况中使佣CH2-CH3结构域(也就是ACHl)或Fc结构域，如上文所述。人类IgGl CH2-CH3结构域或Fc结构域的蛋白质序列示于图46。为了简化，此实例中，所得c264scTCR/huIL15N72D超拮抗剂:c264scTCR/huIL15Rα/IgGlCH1-CH2-CH3复合物指称为T2分子(T2M)及c264scTCR/huIL15N72D超拮抗剂:c264scTCR/huIL15Rα/IgGl CH2-CH3复合物指称为T2M2(亦如上述T2MΔCH1)。这些复合物的优势为经由Fc结构域及IL-15及IL-15Rα结构域之间的互动的二聚物化产生能结合至IL-15Rβγ-阳性细胞及Fc受体(FcR)-阳性细胞的四聚物性标靶分子。这些结构域各者的额外活性可通过降低与同源受体的互动的突变而分析。通过将重组CHIO细胞的可溶性表现，这些复合物使用抗-TCR CβmAb-Sepharose及蛋白质A Sepharose通过亲和性层析经纯化为均一性。尺寸排除层析显示分子移动于完整复合物所期望的尺寸。
类似于上述分析，ELISA为主的方法已确认T2M及T2M2的scTCR及IL-15结构域保留其等所期望的结合活性。此外，T2M及T2M2的IgG1结构域保留结合带有Fc受体(FcR)细胞的能力，允许具有肽/HLA四聚物的特异性侦测具有对TCR-IgG1融合物为相当活性。T2M及T2M2能媒介人类淋巴球的ADCC活性对抗显示p53(aa264-272)/HLA-A2复合物的标靶细胞(图47)。这些结果证实T2M及T2M2保留类抗体起效子功能，先前对于scTCR-IgG融合物的叙述。利用含有降低FcR结合活性的Fc突变(LALA)的复合物研究显示功能性Fc结构域对于ADCC活性为必要的。T2M及T2M2也支持IL-15依赖性32Dβ细胞株的生长，经由T2M2显示约3倍低于T2M的体外IL-15活性损失。估算这些分子于小鼠对于刺激免疫响应的能力。以IL-15(1mg/kg)处理C57BL/6小鼠在白血球(WBC)计数具有少的或无效果，脾脏重量或血液中NK及CD8+T细胞族群以IL-15N72D:IL-15Rα-IgG CH2-CH3复合物(以相等莫耳IL-15剂量)处理造成脾肿大及上升的血液CD8+T细胞浓度(图48A及B)，与先前对于类似的
IL-15:IL-15Rα-Fc复合物所观察到的结果一致。T2M及T2M2二种复合物刺激增加逾WMC浓度、脾脏重量及血液NK及CD 8+T细胞族群，具有T2M2复合物显示渔乡等莫耳际量显示更强力的免疫刺激效果(虽然在32Dβ细胞显示较低的IL-15活性)。类似的处理依赖性效果在NK及CD8+T细胞族群于脾脏中观察到。自T2M2及IL-15N72D/IL-15Rα-IgG复合物处理的小鼠单离的脾脏细胞显示溶胞性活性对抗NK-敏感性YAC细胞(图48C)。剂量响应研究显示这些效果以单一剂量浓度低至0.4mg/kg所观察到(图49A)。裸小鼠以T2M2及IL-15N72D/IL-15Rα-IgG处理显示处理4天后血液中NK细胞百分比的增加及处理7天后脾脏降低至接近基线(图49B)。总结，这些结果显示T2M2复合物于小鼠相较于IL-15以及NK细胞相较于IL-15N72D/IL-15Rα-IgG复合物能以显着较高的活性刺激CD8+T细胞及NK细胞回应。
这些复合物的抗肿瘤活性进一步于裸小鼠的皮下A375外来移植模型中检测。起始研究中，投药重组人类IL-15、c264scTCR-IL15及c264scTCR-IL15N72D融合蛋白质或c264scTCR-IL15N72D/c264scTCR-IL15Rα复合物对于s.c.A375肿瘤外来移植物相较于PBS或c264scTCR-IL15Rα融合蛋白质处理显示无效果(图50A)。TCR IL-15融合物鱼此模型中缺乏效果四起因于这些蛋白质相对于所报导利用c264scTCR-IL2的结果为不能刺激NK细胞回应。如示于前文，当T2M复合物测试于此模型时，其显示中度但令人满意的显着的抗肿瘤活性，与其刺激NK细胞增殖的能力一致(图50B)。然而，相对于以等莫耳量的c264scTCR-IL15溶合物楚哩，T2M剂量排程(每隔一日用药4mg/kg持续3周)造成显着的体重损失及最后剂量后的6只小鼠死亡。临床观察包括小鼠不活动性、弓背姿势及皮肤发红。目前IL-15蛋白质复合物于其它动物模型的研究确认每隔一日重复用药并非耐受良好及周剂量提供免疫刺激而无过量毒性。用药方案由每隔一日改变为周排程，T2M2复合物，以显示于诱发NK细胞增殖为有效的用药浓度，相较于IL-15或PBC处理显示显着更强力的抗肿瘤活性(图50C)。更重要地，这个周用药方案也可为带有肿瘤的裸小鼠及免疫受容小鼠为耐受良好的。
如上所述，同时以体内活性研究估算scTCR-IL15融合物及T2M复合物的毒性曲线。如上所述。以scTCR-IL15融合物每隔一日处理持续3周为带有肿瘤的裸小鼠良好耐受但T2M(4mg/kg)处理造成死亡率>30只动物。此进一步于HLA-A*0201/Kb-基因转植小鼠投药9、18或36mg/kg T2M或等莫耳量的T2M2复合物每隔一日持续1周进行评估。于第1周起始处理后，用药及时间依赖性对于体重及床进行观察。小鼠接受36mg/kg T2M显示20％体重损失相较于以等量T2M2处理的小鼠观察到为12％降低。以～9mg/kg T2M或T2M2处理持续1周的小鼠没有体重改变。以T2M所观察到的感兴趣的较高毒性与增将的免疫细胞活化没有相关而已T2M2处理的小鼠相较于T2M处理的小鼠显示较高浓度的WBC计数及NK细胞浓度。对小鼠体重、脾脏重量级面一细胞的最低效果在单一剂量静脉注射投药0.4mg/kg T2M2后观察到。于食蟹猴中的额外预先研究显示以剂量0.5mg/kg静脉注射用药T2M后不会引起可核可观察到的毒性但能诱发CD8+记忆T细胞及起效子NK细胞扩增。这些研究结果显示可产生标靶IL-15融合复合物其具有强力的免疫刺激性及抗肿瘤活性及优选的毒性与药物动力学曲线。经由这些研究定义及特征化最适化的TCR-标靶T2M2(有指称为T2MΔCH1由c264scTCR/huIL15N72D及
c264scTCR/huIL15RαSushi/huIgGl CH2-CH3链组成)。
c264scTCR/huIL15RαSushi/huIgGl CH2-CH3构筑物的核酸序列及蛋白质序列分别示于图51及52。
实例18-C包括抗体标靶结构域的T2分子的特征化
为了显示huIL-15:huIL-15RαSu支架对于创造额外的疾病标靶分子的利用性，制造连结抗-人类CD20单链抗体的C-终媏至huIL-15N72D及huIL-15RαSu/huIgGl CH2-CH3(Fc)链的N-终端的构筑物。抗-人类CD20单链抗体(抗-CD20scAb)序列包括编码经由可挠性连结子序列连结的利妥昔单抗的重链及轻链及V结构域的区。抗-CD20scAb/hIL-15N72D构筑物的核酸序列及蛋白质序列分别示于图53及54。抗-CD20scAb/huIL-15RαSu/huIgGl Fc构筑物的核酸序列及蛋白质序列分别示于图s 55及56。这些序列如上所述克隆至表现载体及表现载体转型至CHO细胞。这二个构筑物个共表现允许可溶性抗-CD20scAb/huIL-15N72D:抗-CD20scAb/huIL-15RαSu/huIgGl Fc复合物(指称为抗-CD20scAb T2M)的形成与分泌，其使用蛋白质亲和性层析自CHO细胞培养上清液纯化。
类似于上述分析，ELISA为主的方法已确认抗-CD20
scAb/huIL-15N72D:抗-CD20scAb/huIL-15RαSu/huIgGl Fc复合物的形成。此外，使用32Dβ细胞如上所述的IL-15受体结合及细胞增殖分析显示复合物显示IL-15结合及生物活性。然后测试抗-CD20scAb T2M复合物的抗原特异性结合活性对抗人类CD20+Burkitt淋巴瘤Daudi细胞株。Daudi细胞以抗-CD20scAb T2M、c264scTCR T2M或PBS培养。清洗步骤后，细胞结合融合蛋白质复合物以PE-c接合山羊抗-人类Ig抗体(GAH-Ig-PE)通过刘是细胞仪侦测(图57)。抗-CD20 scAb T2M复合物显示显着的结合至Daudi细胞而利用c264scTCRT2M或GAH-Ig-PE未观察到，显示对这些细胞的特异性反应性。
有进行测定抗-CD20scAb T2M复合物是否能杀死CD20+肿瘤细胞经由ADCC为主的机制的研究。Calcein-AM标记Daudi标靶细胞与人类PMBCs(E:T-100:1)及各种浓度的抗-CD20scAb T2M、c264scTCR T2M(阴性对照)或嵌合性抗-CD20mAb(阳性对照)混合。培养时期后，标靶细胞溶解并如上所述评估。如示于图58，抗-CD20scAb T2M复合物高度有效于媒介ADCC活性对抗CD20+人类淋巴瘤细胞。此通过类似研究证实，检测不同起效子对标靶细胞比例，其中抗-CD20scAb T2M复合物(于2nM)显示相当于活性嵌合性抗-CD20mAb(图59)。
根据这些结果，抗-CD20scAb T2M分子期望显现抗肿瘤活性对抗人类淋巴瘤细胞于标准外来移植肿瘤模型中(参照例如，Rossi et al.Blood 2009；114:3864；Gillis etal.Blood.2005；105:3972；及Xuan et al.Blood 2010；115:2864-2871)。包括抗-CD20轻链及重链结构域各自分别融合至huIL-15N72D及huIL-15RαSu/huIgGl CH2-CH3(Fc)链的额外的T2M构筑物(或相反)，可如本文前段所述产生及表现。该二融合构筑物的核酸序列及蛋白质序列分别示于图60至63。包括这些融合蛋白质的经纯化复合物期望显现t Fc结构域及IL-15生物活性，及CD20-特异性结合活性，如上所述。这些复合物期望体内媒介ADCC活性对抗CD20+肿瘤细胞及抗肿瘤活性对抗CD20+肿瘤细胞。
包括scAb或抗体辨识结构域的类似T2M构筑物可容易地以特异于其它CD抗原、细胞激素或驱化激素受体或配体、生长因子受体会配体、细胞粘附分子、MHC/类MHC分子、Fc受体、类Toll受体、NK受体、TCR、BCR、阳性/阴性共刺激受体或配体死亡受体或配体、肿瘤相关抗原、病毒编码及细菌编码抗原及细菌-特异性抗体序列而容易地制造。特别有兴趣的为T2M具有抗体结构域特异性于表位:CD3、CD4、CD19、CD21、CD22、CD23、CD25、CD30、CD33、CD38、CD40、CD44、CD51、CD52、CD70、CD74、CD80、CD152、CD147、CD221、EGFR HER-2/neu、HER-1、HER-3、HER-4、CEA、OX40配体、cMet、组织因子、Nectin-4、PSA PSMA、EGFL7、FGFR、IL-6受体、IGF-1受体GD2、CA-125、EpCam、死亡受体5MUC1、VEGFR1、VEGFR2、PDGFR TRαil R2、叶酸受体、血管生成素-2、alphavbeta3整合素受体及HLA-DR抗原。对抗来自HIV、HCV、HBC、CMV、HTLV、HPV、EBV、RSV及其它病毒的病毒抗原的抗体结构域也感兴趣，特别是辨识HIV封套棘及/或gpl20及gp41表位。该抗体结构域可产自此项技艺已知序列或自各种来源再次单离的(也就是兽医宿主或细胞、组合库、随机合成库、计算器模型等)已知于此项技艺。
此外，如上所述，增加或降低IL-15结构域及IgG Fc结构域的活性以最适化治疗指数及最低化抗体-标靶T2复合性为有用的。Fc结构域的活性的修改方法如上所述且已特征化于此项技艺。于该情况中，含有降低其活性的于IL-15结构域的突变的复合物期望提聪较佳治疗活性及较低毒性。含有于IL-15结构域的N65D或D8N取代的抗体标靶T2分子如上所述或其它取代包括I6S、D8A、D61A、N65A、N72R、V104P或Q108A，其已被发现降低IL-15活性，特别有兴趣。
实例19：IL-15N72D及IL-15RαSu/Fc融合基因于CHO细胞的共表现
先前研究已显示重组IL-15通过哺乳动物细胞的不良表现(A.Ward et al.,蛋白质Expr Purif 68(2009)42-48)。然而，已有报导利用IL-15Rα的细胞内复合物形成可预防IL-15于ER降解(C.Bergamaschi et al.,J Biol Chem 283(2008)4189-4199)。因此，推测如果IL-15与IL-15Rα共表现，则IL-15可以较高浓度产生。已知IL-15Rα片段，含有所谓的"sushi"结构域(Su)于N终端，带有大部份的负责细胞激素结合的结构单元。可溶性IL-15RocSu(无其穿膜结构域)及IL-15余溶液中能形成非常安定的异源二聚物性复合物(Kdof复合物＝100pM(G.Bouchaud et al.,J Mol Biol 382(2008)1-12))及这些复合物能调节(也就是刺激或阻断)免疫回应经由IL-15Rβγc复合物(E.Mortier et al.,J Biol Chem281(2006)1612-1619；M.P.Rubinsteinet al.,Proc Natl Acad Sci U S A 103(2006)9166-9171；T.A.Stoklasek et al.,J Immunol 177(2006)6072-6080；G.Bouchaud etal.,J Mol Biol 382(2008)1-12)。因此，选择由IL-15N72D及an IL-15RαSu/Fc融合蛋白质所组成的复合物用于生产(参照图64)。IL-15RαSu结构域遗传性地融合至人类IgGl-Fc区有助于其纯化及经由链内双硫键的二聚物化。为了共表现IL-15N72D及the IL-15RocSu/Fc，构筑二种个别反转录病毒为主的表现载体，pMSGV-IL-15RocSu/Fc及pMSGV-IL-15N72D，及更转染至CHO细胞。根据二种表现载体所提供的新霉素及嘌呤霉素抗性单元选择重组CHO细胞及个别的产生细胞株使用限制性稀释克隆制造。鉴定于无血清、限制培养基中中能制造接近100mg/L of IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc复合物的克隆。所得结果显示如果IL-15与IL-15RαSu共表现则IL-15能于哺乳动物细胞中以高浓度表现。
实例20：IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc复合物的纯化与特征化
当IL-15RαSu/Fc及IL-15N72D于重组CHO细胞于细胞内共表现及组装时，期望四种不同形式的蛋白质于细胞培养上清液中:1)二聚物性IL-15RocSu/Fc分子完全被二个IL-15N72D亚单元占据，2)二聚物性IL-15RocSu/Fc分子部分被一个IL-15N72D亚单元占据，3)小量的不具有IL-15结合的无同源二聚物性IL-15RocSu/Fc分子及4)游离IL-15N72D。由于IL-15N72D缺乏Fc区，使用r蛋白质A为主的亲和纯化步骤于培养上清液中自所有形式的带有Fc的溶合蛋白质分离游离IL-15N72D。
然后开发离子交换层析方法以分离各种形式的IL-15RαSu/Fc复合物。IL-15RocSu/Fc二聚物性分子的计算等电点(pi)为8.5。如所期望的，随后发现此蛋白质于20mMTris-HCl，pH 8.0的溶液中结合至QSFF树脂。此外，IL-15N72D的计算等电点为4.5。因此，预期部份占据的IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc(也就是二聚物性IL-15RαSu/Fc+oneIL-15N72D分子)及完全占据的IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc(二聚物性IL-15RαSu/Fc+two IL-15N72D分子)的总电荷不同。此与蛋白质-纯化制剂的IREF凝胶分析的结果一致，其显示复合物的二个族群具有pi于5.6至6.5及6.8至7.5之间分别响应于完全占据及部分复合物占据所期望的(图65A)。各蛋白质族群的pi中的异源性可能起因于糖基化及C-终端赖氨酸变体于IgG1链的程度。因此，具有不同离子强度的缓冲液应用于自QSFF分别溶洗部分占据及完全占据的复合物。使用130mM NaCl、20mM Tris-HCl、pH 8.0，自QSSF溶洗单一蛋白质分液(Q步骤1)且根据ELISA决定发现IL-15RocSu/Fc分子的片段占据性发现含有主要为部份占据复合物。后续步骤中使用300mM NaCl、20mMTris-HCl、pH 8.0，进一步由QSFF溶洗二种蛋白质分液，命名为Qlc及Q2c。ELISA分析显示这些制剂指出Qlc分液含有部份占据(全部的10％)及完全占据(90％)复合物的混合物而Q2c分液仅含有完全占据复合物(数据未显示)。这些发现与经纯化的蛋白质制剂的IEF凝胶分析的结果一致(图65B)。自Q步骤1溶洗的蛋白质具有宽广pi范围由5.6至7.5；pi为6.8至7.5的蛋白质代表部份占据复合物。FRαctionQlc of Q步骤2的分液Q1c溶洗主要含有pi范围5.6至6.5的蛋白质(也就是，完全占据复合物)但有小量的具有pi为5.6至7.5的杂质蛋白质。Q2c分液仅含有蛋白质具有pi为5.6至6.5。
SEC分析中，发现经纯化IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc Q2c制剂溶洗呈具有高纯度的单一分子(图66)。同源二聚物的估计分子量接近114kDa，其较大于根据IL-15N72D及IL-15RαSu/Fc融合蛋白质的推导胺基酸序列所计算的92kDa分子量。此可能起因于通过哺乳动物细胞所产生的蛋白质的糖基化。
在还原SDS-PAGE(图65C)中，发现经纯化IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc制剂含有具分子量为40kDa、16kDa及13kDa的三种蛋白质。然而，以N-糖苷酶F分解后，仅侦测到具有分子量为37kDa及13kDa的二种蛋白质(图65D)。这些分子量接近符合所计算的IL-15RαSu/Fc及IL-15或IL-15N72D的分子量。此建议这二种蛋白质在哺乳动物细胞生产期间被糖基化及IL-15N72D产生两种主要糖基化形式具有分子量为13kDa及16kDa。这些The relativeabundance of these IL-15N72D物种于不同纯化分液中的相对丰度示于图65C，与通过ELISA及IEF凝胶分析所测定的复合务占有程度一致。
IL-15N72D及IL-15RαSu/Fc于还原SDS-PAGE中分离及这些蛋白质的N终端胺基酸序列使用Edman降解方法测定。对于IL-15RαSu/Fc及IL15N72D分别获得接近15个N-终端胺基酸序列。所测定的这些蛋白质的N-终端胺基酸序列复合由该二基因的编码区所推导的胺基酸序列。对于在还原SDS-PAGE于13及16kDa呈现的二个主要带的胺基酸序列确认为IL-15N72D。此序列确认再次提供IL-15N72D于哺乳动物细胞的糖基化的证据。
实例21：IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc复合物的药物动力学性质
已预先报导IL-15及体外组装的IL15:IL-15Roc/Fc复合物当腹腔内注射于小鼠分别具有1小时及20小时的血清半衰期(T.A.Stoklaseket al.,J Immunol 177(2006)6072-6080)。为了估算在静脉投药IL-15及共表现、经纯化IL-15:IL-15ocSu/Fc复合物是后否行为类似，其药物动力学参数于CD-1小鼠中测定。选择静脉投药是因为其类似于使用于人类的IL-15:IL-15ocSu-Fc复合物的药物传递途径。雌性小鼠以1.0mg/kg IL-15:IL-15ocSu/Fc或0.28mg/kg IL-15静脉注射(莫耳等量剂量)及血液于各种时间点收集，对于IL-15为注射后15分钟至8小时及对于IL-15N72D:IL-15ocSu/Fc为30分钟至72小时。
IL-15N72D:IL-15aSu/Fc的血清浓度使用二种ELISA格式评估，一(抗-IL-15Ab侦测)其侦测完整复合物及其它(抗-人类IgG Fc Ab侦测)其仅侦测IL-15ocSu/Fc融合蛋白质。IL-15的浓度以标准IL-15-特异性ELISA评估。
对于IL-15:IL-15ocSu/Fc及IL-15在单一静脉浓注注射后的预期配适及确实数据示于图67。使用抗-IL-15Ab-为主的或抗-人类IgG FcAb-为主的ELISA估算IL-15:IL-15ocSu/Fc的半衰期分别为约25小时及18小时。这些结果显示融合蛋白质无裂解及IL-15于体内不显着由IL-15RocSu/Fc分子解离。The cleaRαnce(CI)of IL-15:IL-15aSu/Fc的扩清(C)范围由约0.059至0.051mL/h及稳态分布的体积(Vss)范围由约2.1to 1.3mL，取决于分析格式。比较中，IL-15具有吸收半衰期为0.24小时及最终半衰期为0.64小时。IL-15的CI为49mL/h，及Vss是18.4mL。这些结果显示IL-15:IL-15αSu/Fc显示>24倍长的终末半衰期及明显>800倍缓慢于IL-15。
实例22：IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc复合物的体外及体内生物活性
使用IL-15依赖性32Dβ细胞增殖分析评估共表现及经纯化的IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc复合物的生物活性。在此分析中，亦通过混合1：1比例的IL-15N72D及IL-15RαSu/Fc在4℃下30分钟产生体外组装的(IVA)IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc复合物(IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc IVA)。如图68如所示,IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc复合物具有与IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc IVA相当的生物活性以支持32Dβ细胞的生长。IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc复合物展现15.61pM的EC50且IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc IVA显示15.83pM的EC50。此显示共表现的IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc复合物经适当的细胞内处理且在纯化后维持完整的IL-15活性。因此，本文所呈现的方法显示一种比现有应用体外组装体(个别产生且在某些情况下再折迭的蛋白质)的策略，产生cGMP等级临床材料更好的方法。
亦比较IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc复合物及IL-15wt在C57BL/6小鼠中诱导NK细胞及CD8+T细胞扩充的能力。如图69所示，在0.28mg/kg的单一静脉剂量后4天，IL-15wt对NK及CD8+细胞的扩充没有显着的影响。相比之下，IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc复合物在血液及脾脏显着促进NK及CD8+T细胞增殖，其导致血液中的淋巴球增多及脾肿大(图69及70)。这些发现与IL-15:IL-15Rα复合物显着增加IL-15体内生物活性的先前报导一致(M.P.Rubinsteinet al.,Proc Natl Acad Sci US A 103(2006)9166-9171；T.A.Stoklasek et al.,JImmunol 177(2006)6072-6080；S.Dubois et al.,J Immunol 180(2008)2099-2106；M.Epardaud et al.,Cancer Res 68(2008)2972-2983；A.Bessard et al.,Mol CancerTher 8(2009)2736-2745)。IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc复合物的此增强活性很可能是下述组合的结果：N72D突变蛋白与IL-15Rβγc复合物的增强结合活性(X.Zhu et al.,JImmunol183(2009)3598-3607)，通过体内IL-15Rα链最佳化细胞激素反式-呈现(trans-presentation)(通过树突状细胞与巨噬细胞上的FcR受体)，细胞激素结构域的二聚化本质(结合到IL-15Rβγc的增强亲和力)及相较IL-15，其增强的体内半衰期(25小时比<40分钟)。
总结，本文所述的结果显示IL-15N72D及IL-15RαSu/Fc基因可经共表现在重组CHO细胞且完全被占有的IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc复合物可使用简单可升级的纯化方法从细胞培养上清液经高度纯化。
上述实例是使用下述材料与方法进行。
蛋白质复合物表现载体的构筑
通过重迭PCR(overlap PCR)扩增编码人类IL-15Rα(人类IL-15Rα的aa l-66)sushi结构域及人类IgGl Fc片段的DNA模版构筑IL-15RαSu/Fc融合基因。使用下述引子扩增对单一肽-IL-15RαSu编码区(R.L.Wong et al.,Protein Eng Des Sel 24(2011)373-383)及人类IgGl-Fc基因片段(L.A.MosqueRαet al.,J Immunol 174(2005)4381-4388)，分别为：
BA494：5'-GACTTCAAGCTTAATTAAGCCACCATGGACAGACTTACTTCTTC-3'；
BA550R：
5'-GTGAGTTTTGTCACAAGATTTCGGCTCTCTAATGCATTTGAGACTGGGGGTTG-3'，及
BA550F：5'GAGCCGAAATCTTGTGACAAAACTCAC-3'；
BA393R:5'-GTAATATTCTAGACGCGTTCATTATTTACCAGGAGACAGGGAGAGGCTCTTC-3'。所得的IL-15RαSu/Fc融合基因接合到嘌呤霉素抗性表现载体pMSGV-1(M.S.Hughes et al.,Hum Gene Ther 16(2005)457-472)以构筑pMSGV-IL-15RαSu/Fc的表现载体。
将IL-15N72D的编码序列(X.Zhu et al.,J Immunol 183(2009)3598-3607)克隆到经修改的反转录病毒表现载体pMSGV-1(M.S.Hugheset al.,Hum Gene Ther 16(2005)457-472)，其在IRES区之后携带新霉素抗性基因以构筑表现载体pMSGV-IL-15N72D。
在CHO细胞中共表现IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc融合复合物
为了共表现IL-15N72D及IL-15RαSu/Fc融合蛋白质(见图64)，将pMSGV-IL-15RαSu/Fc及pMSGV-IL-15N72D共转染到CHO细胞，接着在含有2mg/mL G418(Hyclone,Logan,UT)及10ug/mL的嘌呤霉素(Hyclone,Logan,UT)的媒质中选择。IL-15RαSu/Fc融合蛋白质亦个别表现在CHO细胞，以供用来装载作为对照的重组人类野生型IL-15(IL-15wt)。为了产生融合蛋白质，重组CHO细胞生长在37℃无血清定义的媒质中(SFM4CHO,Hyclone,Logan,UT)。当培养物的可存活细胞密度达到最大值，培养温度调降至30℃以累积可溶性复合物。当培养物的可存活细胞密度达约10％可存活细胞之后，收集培养上清液。
纯化程序
以1M Tris-HCl(pH 8.0)将上清液调整到pH 8.0前，离心且过滤重组CHO细胞培养媒质以移除细胞及碎片。使用二步骤亲和性及离子交换层析为主的方法纯化可溶性IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc融合蛋白质复合物。
由于IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc复合物包含IgGl-Fc结构域，使用rProtein ASepharose Fast Flow(GE Healthcare)管柱作为纯化方法的第一步。在样品装载之前，以5管柱体积(CV)的20mM Tris-HCl(pH8.0)清洗管柱，以5CV的0.1N NaOH净化管柱1小时，之后以7CV的20mM Tris-HCl(pH 8.0)平衡管柱。将上清液以2mL/分钟装载到11mL管柱，之后以8CV的20mM Tris-HCl(pH8.0)、接着以7CV的清洗缓冲液(0.1M柠檬酸钠，pH 5.0)清洗管柱，以移除非特异性结合的蛋白质。之后以0.2M柠檬酸钠(pH 4.0)洗提蛋白质且立刻以0.2M柠檬酸将所收集到的峰值馏分(peak fraction)的pH调整到pH3.5；所洗提的蛋白质保持在此低pH达30分钟，作为标准病毒清除步骤。在低pH保持步骤之后，通过使用2M Tris-HCl(pH8.0)将所洗提制剂的pH调整到pH 7.7。在使用0.22μm滤器(Corning LifeSciences,Lowell,MA)无菌过滤之前，通过使用Amicon Ultra-15离心浓缩器(30kDa cut-off,Millipore,Billerica,MA)浓缩制剂且与20mM Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液交换(bufferexchange)。
将蛋白质制剂施用到Q Sepharose Fast Flow(QSFF；GE HealthcareBio-Sciences,Piscataway,NJ)离子交换管柱。以缓冲液A(20mMTris-HCl，pH 8.0)清洗5mL管柱，以5CV的0.1N NaOH净化管柱l小时，之后以缓冲液A平衡管柱。制剂中的蛋白质浓缩物先以20mMTris-HCl(pH 8.0)调整到<1mg/mL，之后再以1mL/分钟速率装载到QSFF管柱。之后使用如下所述三步骤梯度方法从管柱洗提蛋白质：20mMTris-HCl(pH 8.0)，130mM NaCl，使用4CV作为第一步骤，20mM Tris-HCl(pH 8.0)，300mM NaCl，使用4CV作为第二步骤及20mMTris-HCl(pH 8.0)，1M NaCl使用2CV作为最后步骤。收集蛋白质峰值馏分，与PBS(Hyclone,Logan,UT)缓冲液交换，及使用0.22μm滤器过滤。使用消光系数A280nm＝0.79mg/mL通过280nMUV分光光度计测定蛋白质浓缩物。依据IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc复合物的推论氨基酸序列计算此消光系数。
使用如上所述的rProtein A亲和性层析，纯化个别表现的IL-15RαSu/Fc，用来在溶液中与大肠杆菌所产生的IL-15N72D或IL-15wt组装复合物且再折迭(Zhu,2009#3315)。这些体外组装的复合物用来作为在共表现复合物中评估生物活性及IL-15结合位点占有度估计的标准品。
凝胶电泳及尺寸排除层析(SEC)分析
通过不同类型的凝胶电泳方法(其包含NuPAGE 12％Bis-Tris凝胶(于还原及非还原条件下)、4-20％Tris-甘氨酸凝胶(原始条件)及IEFpH3-10凝胶(用于pi测定))分析经纯化蛋白质。所有提供物来自Invitrogen(Carlsbad,CA)。通过制造商所述进行实验方法。以PBS(Hyclone,Logan,UT)作为移动缓冲液的Superdex 200HR 10/30(GEHealthcare Bio-Sciences)层析用来检验纯度及估计蛋白质分子量。
N-端氨基酸序列及糖基化分析
在SDS-PAGE凝胶分离有兴趣的蛋白质带，转移墨点到PVDF膜及通过Ponceau S溶液染色。使用Edman降解法(Molecular StructureFacility,UC Davis,Davis,CA)进行N-端氨基酸定序。
为了检验融合复合物是否经糖基化，将离子交换层析后的50μg的经高度纯化蛋白质以在PBS总量为50μl的2μl N-糖苷酶F(Calbiochem,La Jolla,CA)在室温水解48小时，之后在还原条件下在NuPAGE 12％Bis-Tris凝胶经历电泳。
经纯化IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc复合物的IL-15N72D占有率的测定
在4℃以各种比例将经纯化的IL-15RαSu/Fc与IL-15wt(在大肠杆菌产生且再折迭，由J.Yovandich,NCI,Fredrick,MD提供)装载达15小时。培养之后，使用如上所述的rProtein A亲和性层析纯化IL-15wt:IL-15RαSu/Fc复合物。使用二种ELISA形式评估此经纯化复合物，一种为检测完整复合物(抗-人类IgG Fc补集及抗-IL-15侦测)而另一种为只检测IL-15ocSu/Fc融合蛋白质(抗-人类IgG Fc补集及抗-人类IgG Fc侦测)。完整IL-15wt:IL-15αSu/Fc复合物及IL-15RαSu/Fc蛋白质量之间的比例反映出复合物的IL-15结合位点的占有率。[占有率(％)＝完整复合物(ng/mL)/IL-15RαSu/Fc(ng/mL)x 100％]。之后使用完全被占有复合物(1:3比例的IL-15RαSu/Fc及IL-15wt连结前)作为标准品以定量纯化后经纯化IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc融合蛋白质复合物的占有率。
IL-15生物活性的测量
使用IL-15-依赖性32Dβ细胞株的体外细胞增殖分析被用来评估经纯化复合物及如前所述的IL-15wt蛋白质的IL-15生物活性(X.Zhuet al.,J Immunol 183(2009)3598-3607)。
药物动力学评估
在母CD-1小鼠(4小鼠/时间点，Harlan,Indianapolis,IN)(如之前针对IL-2所描述(H.J.Belmont et al.,Clin Immunol 121(2006)29-39))评估IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc复合物及IL-15wt的药物动力学分布。以上面所描述的二种ELISA形式评估IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc复合物的血清量。通过使用抗-IL-15补集(MAB647；R&D Systems,Minneapolis,MN)及抗-IL-15侦测(BAM247；R&D Systems,Minneapolis,MN)的ELISA评估IL-15wt量。来自每个ELISA形式的IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc量，使用PK Solution 2.0(Summit ResearchServices,Montrose,CO)以一室模型(one-compartment model)拟合。来自小鼠(以IL-15wt处理)的数据被最佳模型化为二室模型。
淋巴球刺激
以单一剂量的IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc融合复合物(1mg/kg)或人类IL-15wt(0.28mg/kg)(摩尔当量剂量)分别静脉注射C57BL/6小鼠(公，6周大，Harlan,Indianapolis,IN)，或PBS作为阴性对照。处理后4天，收集合并血液(每组5小鼠)及脾细胞。使用histopaque(Sigma,St.Louis,MO)自血液中单离PBMC。
之后以PE-标记的抗CD19、PE-标记的抗CD335(NKp46)、FITC-标记的抗CD4及FITC-标记的抗CD8抗体(BioLegend,San Diego,CA)染色PBMC及脾细胞。在FACScan流式细胞仪(BD Bioscience,San Jose,CA)分析所染色的细胞。依照Altor's IACUC所认可的方法进行所有动物研究。
下述肽使用于前述实例中所呈现的研究。
蛋白质 胺基酸 序列(序列编号)
p53 149-157 STPPPGTRV
p53 264-272 LLGRNSFEV
OVA 257-264 SIINFEKL
VSV 52-59 RGYVYQGL
下述融合物蛋白质的蛋白质结构域连结子序列使用于呈现的实例中。
下列参考文献以及本申请案中所引用的文献、专利及GenBank编号(在申请案的优先权可取得的版本)以引用方式个别并入如其等为个别并入。
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<212> PRT
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<212> PRT
<213> 智人
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成肽
<400> 5
Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
1 5 10
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成引子
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<212> DNA
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<220>
<223> 人工序列的说明: 合成引子
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<213> 人工序列
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<223> 人工序列的说明: 合成引子
<400> 8
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成引子
<400> 9
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<212> DNA
<213> 人工序列
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ctggtgggtt aacgggaagg aggtgcacag tggggtc 37
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<212> DNA
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<223> 人工序列的说明: 合成引子
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<212> DNA
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<223> 人工序列的说明: 合成引子
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<223> 人工序列的说明: 合成引子
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<212> DNA
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<223> 人工序列的说明: 合成引子
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<213> 原鸡
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<212> PRT
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<220>
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1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
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<223> 人工序列的说明: 合成引子
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gtgagttttg tcacaagatt tcggctctct aatgcatttg agactggggg ttg 53
<210> 23
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成引子
<400> 23
gagccgaaat cttgtgacaa aactcac 27
<210> 24
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 24
Ser Thr Pro Pro Pro Gly Thr Arg Val
1 5
<210> 25
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 25
Leu Leu Gly Arg Asn Ser Phe Glu Val
1 5
<210> 26
<211> 8
<212> PRT
<213> 水泡性口炎病毒
<400> 26
Arg Gly Tyr Val Tyr Gln Gly Leu
1 5
<210> 27
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成肽
<400> 27
Asp Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Ser
20 25
<210> 28
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成肽
<400> 28
Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Gly Gly Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Ser
20 25
<210> 29
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成肽
<400> 29
Asp Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ala Ser Gly Gly Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Ser
20 25
<210> 30
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成肽
<400> 30
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly Ser
20
<210> 31
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成肽
<400> 31
Val Asn Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser
1 5 10 15
Pro Thr Arg
<210> 32
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成肽
<400> 32
Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Asp
1 5 10
<210> 33
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成肽
<400> 33
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly Ser
20
<210> 34
<211> 2397
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成多核苷酸
<400> 34
atggacagac ttacttcttc attcctgctc ctgattgtcc ctgcgtacgt cttgtcccag 60
tcagtgacgc agcccgatgc tcgcgtcact gtctctgaag gagcctctct gcagctgaga 120
tgcaagtatt cctactctgg gacaccttat ctgttctggt atgtccagta cccgcggcag 180
gggctgcagc tgctcctcaa gtactattca ggagacccag tggttcaagg agtgaatggc 240
ttcgaggctg agttcagcaa gagtaactct tccttccacc tgcggaaagc ctctgtgcac 300
tggagcgact ctgctgtgta cttctgtgtt ttgagcgagg atagcaacta tcagttgatc 360
tggggctctg ggaccaagct aattataaag ccagacacta gtggtggcgg tggcagcggc 420
ggtggtggtt ccggtggcgg cggttctggc ggtggcggtt cctcgagcaa ttcaaaagtc 480
attcagactc caagatatct ggtgaaaggg caaggacaaa aagcaaagat gaggtgtatc 540
cctgaaaagg gacatccagt tgtattctgg tatcaacaaa ataagaacaa tgagtttaaa 600
tttttgatta actttcagaa tcaagaagtt cttcagcaaa tagacatgac tgaaaaacga 660
ttctctgctg agtgtccttc aaactcacct tgcagcctag aaattcagtc ctctgaggca 720
ggagactcag cactgtacct ctgtgccagc agtctgtcag ggggcggcac agaagttttc 780
tttggtaaag gaaccaggct cacagttgta gaggacctga acaaggtgtt cccacccgag 840
gtcgctgtgt ttgagccatc agaagcagag atctcccaca cccaaaaggc cacactggtg 900
tgcctggcca caggcttctt ccctgaccac gtggagctga gctggtgggt gaatgggaag 960
gaggtgcaca gtggggtcag cacggacccg cagcccctca aggagcagcc cgccctcaat 1020
gactccagat actgcctgag cagccgcctg agggtctcgg ccaccttctg gcagaacccc 1080
cgcaaccact tccgctgtca agtccagttc tacgggctct cggagaatga cgagtggacc 1140
caggataggg ccaaacccgt cacccagatc gtcagcgccg aggcctgggg tagagcagac 1200
gaattcatca cgtgccctcc ccccatgtcc gtggaacacg cagacatctg ggtcaagagc 1260
tacagcttgt actccaggga gcggtacatt tgtaactctg gtttcaagcg taaagccggc 1320
acgtccagcc tgacggagtg cgtgttgaac aaggccacga atgtcgccca ctggacaacc 1380
cccagtctca aatgcattag agaattcgcc tccaccaagg gcccatcggt cttccccctg 1440
gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac 1500
tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac 1560
accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg 1620
ccctccagca gcttgggcac ccagacctac atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac 1680
accaaggtgg acaagaaagt tgagcccaaa tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg 1740
tgcccagcac ctgaactcct ggggggaccg tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag 1800
gacaccctca tgatctcccg gacccctgag gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac 1860
gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag 1920
acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc 1980
ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc 2040
ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa gccaaagggc agccccgaga accacaggtg 2100
tacaccctgc ccccatcccg ggatgagctg accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg 2160
gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag 2220
aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg gactccgacg gctccttctt cctctacagc 2280
aagctcaccg tggacaagag caggtggcag caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg 2340
catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag aagagcctct ccctgtctcc gggtaaa 2397
<210> 35
<211> 799
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成多肽
<400> 35
Met Asp Arg Leu Thr Ser Ser Phe Leu Leu Leu Ile Val Pro Ala Tyr
1 5 10 15
Val Leu Ser Gln Ser Val Thr Gln Pro Asp Ala Arg Val Thr Val Ser
20 25 30
Glu Gly Ala Ser Leu Gln Leu Arg Cys Lys Tyr Ser Tyr Ser Gly Thr
35 40 45
Pro Tyr Leu Phe Trp Tyr Val Gln Tyr Pro Arg Gln Gly Leu Gln Leu
50 55 60
Leu Leu Lys Tyr Tyr Ser Gly Asp Pro Val Val Gln Gly Val Asn Gly
65 70 75 80
Phe Glu Ala Glu Phe Ser Lys Ser Asn Ser Ser Phe His Leu Arg Lys
85 90 95
Ala Ser Val His Trp Ser Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Val Leu Ser
100 105 110
Glu Asp Ser Asn Tyr Gln Leu Ile Trp Gly Ser Gly Thr Lys Leu Ile
115 120 125
Ile Lys Pro Asp Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Ser Asn Ser Lys Val
145 150 155 160
Ile Gln Thr Pro Arg Tyr Leu Val Lys Gly Gln Gly Gln Lys Ala Lys
165 170 175
Met Arg Cys Ile Pro Glu Lys Gly His Pro Val Val Phe Trp Tyr Gln
180 185 190
Gln Asn Lys Asn Asn Glu Phe Lys Phe Leu Ile Asn Phe Gln Asn Gln
195 200 205
Glu Val Leu Gln Gln Ile Asp Met Thr Glu Lys Arg Phe Ser Ala Glu
210 215 220
Cys Pro Ser Asn Ser Pro Cys Ser Leu Glu Ile Gln Ser Ser Glu Ala
225 230 235 240
Gly Asp Ser Ala Leu Tyr Leu Cys Ala Ser Ser Leu Ser Gly Gly Gly
245 250 255
Thr Glu Val Phe Phe Gly Lys Gly Thr Arg Leu Thr Val Val Glu Asp
260 265 270
Leu Asn Lys Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro Ser Glu
275 280 285
Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala Thr
290 295 300
Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys Glu Gln
325 330 335
Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val
340 345 350
Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys Gln Val
355 360 365
Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp Arg Ala
370 375 380
Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp
385 390 395 400
Glu Phe Ile Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile
405 410 415
Trp Val Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn
420 425 430
Ser Gly Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val
435 440 445
Leu Asn Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys
450 455 460
Cys Ile Arg Glu Phe Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
465 470 475 480
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
485 490 495
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
500 505 510
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
515 520 525
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
530 535 540
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
545 550 555 560
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
565 570 575
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
580 585 590
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
595 600 605
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
610 615 620
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
625 630 635 640
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
645 650 655
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
660 665 670
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
675 680 685
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
690 695 700
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
705 710 715 720
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
725 730 735
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
740 745 750
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
755 760 765
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
770 775 780
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
785 790 795
<210> 36
<211> 2391
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成多核苷酸
<400> 36
atggagacag acacactcct gttatgggta ctgctgctct gggttccagg ttccaccggt 60
cagtcagtga cgcagcccga tgctcgcgtc actgtctctg aaggagcctc tctgcagctg 120
agatgcaagt attcctactc tgggacacct tatctgttct ggtatgtcca gtacccgcgg 180
caggggctgc agctgctcct caagtactat tcaggagacc cagtggttca aggagtgaat 240
ggcttcgagg ctgagttcag caagagtaac tcttccttcc acctgcggaa agcctctgtg 300
cactggagcg actctgctgt gtacttctgt gttttgagcg aggatagcaa ctatcagttg 360
atctggggct ctgggaccaa gctaattata aagccagaca ctagtggtgg cggtggcagc 420
ggcggtggtg gttccggtgg cggcggttct ggcggtggcg gttcctcgag caattcaaaa 480
gtcattcaga ctccaagata tctggtgaaa gggcaaggac aaaaagcaaa gatgaggtgt 540
atccctgaaa agggacatcc agttgtattc tggtatcaac aaaataagaa caatgagttt 600
aaatttttga ttaactttca gaatcaagaa gttcttcagc aaatagacat gactgaaaaa 660
cgattctctg ctgagtgtcc ttcaaactca ccttgcagcc tagaaattca gtcctctgag 720
gcaggagact cagcactgta cctctgtgcc agcagtctgt cagggggcgg cacagaagtt 780
ttctttggta aaggaaccag gctcacagtt gtagaggacc tgaacaaggt gttcccaccc 840
gaggtcgctg tgtttgagcc atcagaagca gagatctccc acacccaaaa ggccacactg 900
gtgtgcctgg ccacaggctt cttccctgac cacgtggagc tgagctggtg ggttaacggg 960
aaggaggtgc acagtggggt cagcacggac ccgcagcccc tcaaggagca gcccgccctc 1020
aatgactcca gatactgcct gagcagccgc ctgagggtct cggccacctt ctggcagaac 1080
ccccgcaacc acttccgctg tcaagtccag ttctacgggc tctcggagaa tgacgagtgg 1140
acccaggata gggccaaacc cgtcacccag atcgtcagcg ccgaggcctg gggtagagca 1200
gacatcacgt gccctccccc catgtccgtg gaacacgcag acatctgggt caagagctac 1260
agcttgtact ccagggagcg gtacatttgt aactctggtt tcaagcgtaa agccggcacg 1320
tccagcctga cggagtgcgt gttgaacaag gccacgaatg tcgcccactg gacaaccccc 1380
agtctcaaat gtattagagc tagcaccaag ggcccatcgg tcttccccct ggcaccctcc 1440
tccaagagca cctctggggg cacagcggcc ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc 1500
gaaccggtga cggtgtcgtg gaactcaggc gccctgacca gcggcgtgca caccttcccg 1560
gctgtcctac agtcctcagg actctactcc ctcagcagcg tggtgaccgt gccctccagc 1620
agcttgggca cccagaccta catctgcaac gtgaatcaca agcccagcaa caccaaggtg 1680
gacaagaaag ttgagcccaa atcttgtgac aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca 1740
cctgaactcc tggggggacc gtcagtcttc ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc 1800
atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct 1860
gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg 1920
cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag 1980
gactggctga atggcaagga gtacaagtgc aaggtctcca acaaagccct cccagccccc 2040
atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg 2100
cccccatccc gggatgagct gaccaagaac caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc 2160
ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac 2220
aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac ggctccttct tcctctacag caagctcacc 2280
gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct 2340
ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc tccctgtctc cgggtaaata a 2391
<210> 37
<211> 796
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成多肽
<400> 37
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Gln Ser Val Thr Gln Pro Asp Ala Arg Val Thr Val
20 25 30
Ser Glu Gly Ala Ser Leu Gln Leu Arg Cys Lys Tyr Ser Tyr Ser Gly
35 40 45
Thr Pro Tyr Leu Phe Trp Tyr Val Gln Tyr Pro Arg Gln Gly Leu Gln
50 55 60
Leu Leu Leu Lys Tyr Tyr Ser Gly Asp Pro Val Val Gln Gly Val Asn
65 70 75 80
Gly Phe Glu Ala Glu Phe Ser Lys Ser Asn Ser Ser Phe His Leu Arg
85 90 95
Lys Ala Ser Val His Trp Ser Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Val Leu
100 105 110
Ser Glu Asp Ser Asn Tyr Gln Leu Ile Trp Gly Ser Gly Thr Lys Leu
115 120 125
Ile Ile Lys Pro Asp Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Ser Asn Ser Lys
145 150 155 160
Val Ile Gln Thr Pro Arg Tyr Leu Val Lys Gly Gln Gly Gln Lys Ala
165 170 175
Lys Met Arg Cys Ile Pro Glu Lys Gly His Pro Val Val Phe Trp Tyr
180 185 190
Gln Gln Asn Lys Asn Asn Glu Phe Lys Phe Leu Ile Asn Phe Gln Asn
195 200 205
Gln Glu Val Leu Gln Gln Ile Asp Met Thr Glu Lys Arg Phe Ser Ala
210 215 220
Glu Cys Pro Ser Asn Ser Pro Cys Ser Leu Glu Ile Gln Ser Ser Glu
225 230 235 240
Ala Gly Asp Ser Ala Leu Tyr Leu Cys Ala Ser Ser Leu Ser Gly Gly
245 250 255
Gly Thr Glu Val Phe Phe Gly Lys Gly Thr Arg Leu Thr Val Val Glu
260 265 270
Asp Leu Asn Lys Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro Ser
275 280 285
Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala
290 295 300
Thr Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys Glu
325 330 335
Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu Arg
340 345 350
Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys Gln
355 360 365
Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp Arg
370 375 380
Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala
385 390 395 400
Asp Ile Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp
405 410 415
Val Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser
420 425 430
Gly Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu
435 440 445
Asn Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys
450 455 460
Ile Arg Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser
465 470 475 480
Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys
485 490 495
Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu
500 505 510
Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu
515 520 525
Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr
530 535 540
Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val
545 550 555 560
Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
565 570 575
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
580 585 590
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
595 600 605
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
610 615 620
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
625 630 635 640
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
645 650 655
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
660 665 670
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
675 680 685
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
690 695 700
Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
705 710 715 720
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
725 730 735
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
740 745 750
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
755 760 765
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
770 775 780
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
785 790 795
<210> 38
<211> 1539
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成多核苷酸
<400> 38
atggacagac ttacttcttc attcctgctc ctgattgtcc ctgcgtacgt cttggcccag 60
aaggtaacac agactcagac ttcaatttct gtgatggaga agacaacggt gacaatggac 120
tgtgtgtatg aaacccggga cagttcttac ttcttattct ggtacaagca aacagcaagt 180
ggggaaatag ttttccttat tcgtcaggac tcttacaaaa aggaaaatgc aacagaaggt 240
cattattctc tgaactttca gaagccaaaa agttccatcg gactcatcat cactgccaca 300
cagattgagg actcagcagt atatttctgt gctatgagag acacaaatgc ttacaaagtc 360
atctttggaa aagggacaca tcttcatgtt ctgcctacta gtggtggcgg tggcagcggc 420
ggtggtggtt cccctggtgg cggcggttct ggcggtggcg gttcctcgag cgaggctgca 480
gtcacccaaa gtccaagaag caaggtggca gtaacaggag gaaaggtgac attgagctgt 540
caccagacta ataaccatga ctatatgtac tggtatcggc aggacacggg gcatgggctg 600
aggctgatcc attactcata tgtcgctgac agcacggaga aaggagatat ccctgatggg 660
tacaaggcct ccagaccaag ccaagagaat ttctctctca ttctggagtt ggcttccctt 720
tctcagacag ctgtatattt ctgtgccagc agcccccact cctatgaaca gtacttcggt 780
cccggcacca ggctcacggt tttagaggac ctgaacaagg tgttcccacc cgaggtcgct 840
gtgtttgagc catcagaagc agagatctcc cacacccaaa aggccacact ggtgtgcctg 900
gccacaggct tcttccctga ccacgtggag ctgagctggt gggttaacgg gaaggaggtg 960
cacagtgggg tcagcacgga cccgcagccc ctcaaggagc agcccgccct caatgactcc 1020
agatactgcc tgagcagccg cctgagggtc tcggccacct tctggcagaa cccccgcaac 1080
cacttccgct gtcaagtcca gttctacggg ctctcggaga atgacgagtg gacccaggat 1140
agggccaaac ctgtcaccca gatcgtcagc gccgaggcct ggggtagagc agacaactgg 1200
gtgaatgtaa taagtgattt gaaaaaaatt gaagatctta ttcaatctat gcatattgat 1260
gctactttat atacggaaag tgatgttcac cccagttgca aagtaacagc aatgaagtgc 1320
tttctcttgg agttacaagt tatttcactt gagtccggag atgcaagtat tcatgataca 1380
gtagaaaatc tgatcatcct agcaaacgac agtttgtctt ctaatgggaa tgtaacagaa 1440
tctggatgca aagaatgtga ggaactggag gaaaaaaata ttaaagaatt tttgcagagt 1500
tttgtacata ttgtccaaat gttcatcaac acttcttaa 1539
<210> 39
<211> 512
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成多肽
<400> 39
Met Asp Arg Leu Thr Ser Ser Phe Leu Leu Leu Ile Val Pro Ala Tyr
1 5 10 15
Val Leu Ala Gln Lys Val Thr Gln Thr Gln Thr Ser Ile Ser Val Met
20 25 30
Glu Lys Thr Thr Val Thr Met Asp Cys Val Tyr Glu Thr Arg Asp Ser
35 40 45
Ser Tyr Phe Leu Phe Trp Tyr Lys Gln Thr Ala Ser Gly Glu Ile Val
50 55 60
Phe Leu Ile Arg Gln Asp Ser Tyr Lys Lys Glu Asn Ala Thr Glu Gly
65 70 75 80
His Tyr Ser Leu Asn Phe Gln Lys Pro Lys Ser Ser Ile Gly Leu Ile
85 90 95
Ile Thr Ala Thr Gln Ile Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Met
100 105 110
Arg Asp Thr Asn Ala Tyr Lys Val Ile Phe Gly Lys Gly Thr His Leu
115 120 125
His Val Leu Pro Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Ser Glu Ala Ala
145 150 155 160
Val Thr Gln Ser Pro Arg Ser Lys Val Ala Val Thr Gly Gly Lys Val
165 170 175
Thr Leu Ser Cys His Gln Thr Asn Asn His Asp Tyr Met Tyr Trp Tyr
180 185 190
Arg Gln Asp Thr Gly His Gly Leu Arg Leu Ile His Tyr Ser Tyr Val
195 200 205
Ala Asp Ser Thr Glu Lys Gly Asp Ile Pro Asp Gly Tyr Lys Ala Ser
210 215 220
Arg Pro Ser Gln Glu Asn Phe Ser Leu Ile Leu Glu Leu Ala Ser Leu
225 230 235 240
Ser Gln Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Pro His Ser Tyr Glu
245 250 255
Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu Glu Asp Leu Asn
260 265 270
Lys Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu
275 280 285
Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe
290 295 300
Phe Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val
305 310 315 320
His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala
325 330 335
Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala
340 345 350
Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe
355 360 365
Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro
370 375 380
Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp Asn Trp
385 390 395 400
Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile Gln Ser
405 410 415
Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His Pro Ser
420 425 430
Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile
435 440 445
Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu Asn Leu
450 455 460
Ile Ile Leu Ala Asn Asp Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val Thr Glu
465 470 475 480
Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile Lys Glu
485 490 495
Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser
500 505 510
<210> 40
<211> 232
<212> PRT
<213> 智人
<400> 40
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65 70 75 80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85 90 95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100 105 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
130 135 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145 150 155 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180 185 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230
<210> 41
<211> 2097
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成多核苷酸
<400> 41
atggagacag acacactcct gttatgggta ctgctgctct gggttccagg ttccaccggt 60
cagtcagtga cgcagcccga tgctcgcgtc actgtctctg aaggagcctc tctgcagctg 120
agatgcaagt attcctactc tgggacacct tatctgttct ggtatgtcca gtacccgcgg 180
caggggctgc agctgctcct caagtactat tcaggagacc cagtggttca aggagtgaat 240
ggcttcgagg ctgagttcag caagagtaac tcttccttcc acctgcggaa agcctctgtg 300
cactggagcg actctgctgt gtacttctgt gttttgagcg aggatagcaa ctatcagttg 360
atctggggct ctgggaccaa gctaattata aagccagaca ctagtggtgg cggtggcagc 420
ggcggtggtg gttccggtgg cggcggttct ggcggtggcg gttcctcgag caattcaaaa 480
gtcattcaga ctccaagata tctggtgaaa gggcaaggac aaaaagcaaa gatgaggtgt 540
atccctgaaa agggacatcc agttgtattc tggtatcaac aaaataagaa caatgagttt 600
aaatttttga ttaactttca gaatcaagaa gttcttcagc aaatagacat gactgaaaaa 660
cgattctctg ctgagtgtcc ttcaaactca ccttgcagcc tagaaattca gtcctctgag 720
gcaggagact cagcactgta cctctgtgcc agcagtctgt cagggggcgg cacagaagtc 780
ttctttggta aaggaaccag gctcacagtt gtagaggacc tgaacaaggt gttcccaccc 840
gaggtcgctg tgtttgagcc atcagaagca gagatctccc acacccaaaa ggccacactg 900
gtgtgcctgg ccacaggctt cttccctgac cacgtggagc tgagctggtg ggttaacggg 960
aaggaggtgc acagtggggt cagcacggac ccgcagcccc tcaaggagca gcccgccctc 1020
aatgactcca gatactgcct gagcagccgc ctgagggtct cggccacctt ctggcagaac 1080
ccccgcaacc acttccgctg tcaagtccag ttctacgggc tctcggagaa tgacgagtgg 1140
acccaggata gggccaaacc cgtcacccag atcgtcagcg ccgaggcctg gggtagagca 1200
gacatcacgt gccctccccc catgtccgtg gaacacgcag acatctgggt caagagctac 1260
agcttgtact ccagggagcg gtacatttgt aactctggtt tcaagcgtaa agccggcacg 1320
tccagcctga cggagtgcgt gttgaacaag gccacgaatg tcgcccactg gacaaccccc 1380
agtctcaaat gcattagaga gccgaaatct tgtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc 1440
ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac 1500
accctcatga tctcccggac ccctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa 1560
gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca 1620
aagccgcggg aggagcagta caacagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg 1680
caccaggact ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca 1740
gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac 1800
accctgcccc catcccggga tgagctgacc aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc 1860
aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac 1920
aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag 1980
ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat 2040
gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag agcctctccc tgtctcctgg taaataa 2097
<210> 42
<211> 678
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成多肽
<400> 42
Gln Ser Val Thr Gln Pro Asp Ala Arg Val Thr Val Ser Glu Gly Ala
1 5 10 15
Ser Leu Gln Leu Arg Cys Lys Tyr Ser Tyr Ser Gly Thr Pro Tyr Leu
20 25 30
Phe Trp Tyr Val Gln Tyr Pro Arg Gln Gly Leu Gln Leu Leu Leu Lys
35 40 45
Tyr Tyr Ser Gly Asp Pro Val Val Gln Gly Val Asn Gly Phe Glu Ala
50 55 60
Glu Phe Ser Lys Ser Asn Ser Ser Phe His Leu Arg Lys Ala Ser Val
65 70 75 80
His Trp Ser Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Val Leu Ser Glu Asp Ser
85 90 95
Asn Tyr Gln Leu Ile Trp Gly Ser Gly Thr Lys Leu Ile Ile Lys Pro
100 105 110
Asp Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Ser Asn Ser Lys Val Ile Gln Thr
130 135 140
Pro Arg Tyr Leu Val Lys Gly Gln Gly Gln Lys Ala Lys Met Arg Cys
145 150 155 160
Ile Pro Glu Lys Gly His Pro Val Val Phe Trp Tyr Gln Gln Asn Lys
165 170 175
Asn Asn Glu Phe Lys Phe Leu Ile Asn Phe Gln Asn Gln Glu Val Leu
180 185 190
Gln Gln Ile Asp Met Thr Glu Lys Arg Phe Ser Ala Glu Cys Pro Ser
195 200 205
Asn Ser Pro Cys Ser Leu Glu Ile Gln Ser Ser Glu Ala Gly Asp Ser
210 215 220
Ala Leu Tyr Leu Cys Ala Ser Ser Leu Ser Gly Gly Gly Thr Glu Val
225 230 235 240
Phe Phe Gly Lys Gly Thr Arg Leu Thr Val Val Glu Asp Leu Asn Lys
245 250 255
Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile
260 265 270
Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Phe
275 280 285
Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His
290 295 300
Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu
305 310 315 320
Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr
325 330 335
Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr
340 345 350
Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val
355 360 365
Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp Ile Thr Cys
370 375 380
Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val Lys Ser Tyr
385 390 395 400
Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly Phe Lys Arg
405 410 415
Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn Lys Ala Thr
420 425 430
Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile Arg Glu Pro
435 440 445
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
450 455 460
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
465 470 475 480
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
485 490 495
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
500 505 510
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
515 520 525
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
530 535 540
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
545 550 555 560
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
565 570 575
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
580 585 590
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
595 600 605
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
610 615 620
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
625 630 635 640
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
645 650 655
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
660 665 670
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
675
<210> 43
<211> 1140
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成多核苷酸
<400> 43
atggattttc aggtgcagat tatcagcttc ctgctaatca gtgcttcagt cataatgtcc 60
agaggacaaa ttgttctctc ccagtctcca gcaatcctgt ctgcatctcc aggggagaag 120
gtcacaatga cttgcagggc cagctcaagt gtaagttaca tccactggtt ccagcagaag 180
ccaggatcct cccccaaacc ctggatttat gccacatcca acctggcttc tggagtccct 240
gttcgcttca gtggcagtgg gtctgggact tcttactctc tcacaatcag cagagtggag 300
gctgaagatg ctgccactta ttactgccag cagtggacta gtaacccacc cacgttcgga 360
ggggggacca agctggaaat caaaagtgga ggtggcggat caggaggcgg aggttctggc 420
ggaggtggga gtcaggtaca actgcagcag cctggggctg agctggtgaa gcctggggcc 480
tcagtgaaga tgtcctgcaa ggcttctggc tacacattta ccagttacaa tatgcactgg 540
gtaaaacaga cacctggtcg gggcctggaa tggattggag ctatttatcc cggaaatggt 600
gatacttcct acaatcagaa gttcaaaggc aaggccacat tgactgcaga caaatcctcc 660
agcacagcct acatgcagct cagcagcctg acatctgagg actctgcggt ctattactgt 720
gcaagatcga cttactacgg cggtgactgg tacttcaatg tctggggcgc agggaccacg 780
gtcaccgtct ctgcaaactg ggtgaatgta ataagtgatt tgaaaaaaat tgaagatctt 840
attcaatcta tgcatattga tgctacttta tatacggaaa gtgatgttca ccccagttgc 900
aaagtaacag caatgaagtg ctttctcttg gagttacaag ttatttcact tgagtccgga 960
gatgcaagta ttcatgatac agtagaaaat ctgatcatcc tagcaaacga cagtttgtct 1020
tctaatggga atgtaacaga atctggatgc aaagaatgtg aggaactgga ggaaaaaaat 1080
attaaagaat ttttgcagag ttttgtacat attgtccaaa tgttcatcaa cacttcttaa 1140
<210> 44
<211> 357
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成多肽
<400> 44
Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile
20 25 30
His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Ser Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln
115 120 125
Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys
130 135 140
Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Lys
145 150 155 160
Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr Pro Gly
165 170 175
Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu
180 185 190
Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu
195 200 205
Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr
210 215 220
Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr
225 230 235 240
Val Ser Ala Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu
245 250 255
Asp Leu Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser
260 265 270
Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu
275 280 285
Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp
290 295 300
Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asp Ser Leu Ser Ser Asn
305 310 315 320
Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu
325 330 335
Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met
340 345 350
Phe Ile Asn Thr Ser
355
<210> 45
<211> 1689
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成多核苷酸
<400> 45
atggattttc aggtgcagat tatcagcttc ctgctaatca gtgcttcagt cataatgtcc 60
agaggacaaa ttgttctctc ccagtctcca gcaatcctgt ctgcatctcc aggggagaag 120
gtcacaatga cttgcagggc cagctcaagt gtaagttaca tccactggtt ccagcagaag 180
ccaggatcct cccccaaacc ctggatttat gccacatcca acctggcttc tggagtccct 240
gttcgcttca gtggcagtgg gtctgggact tcttactctc tcacaatcag cagagtggag 300
gctgaagatg ctgccactta ttactgccag cagtggacta gtaacccacc cacgttcgga 360
ggggggacca agctggaaat caaaagtgga ggtggcggat ccggaggtgg aggttctggt 420
ggaggtggga gtcaggtaca actgcagcag cctggggctg agctggtgaa gcctggggcc 480
tcagtgaaga tgtcctgcaa ggcttctggc tacacattta ccagttacaa tatgcactgg 540
gtaaaacaga cacctggtcg gggcctggaa tggattggag ctatttatcc cggaaatggt 600
gatacttcct acaatcagaa gttcaaaggc aaggccacat tgactgcaga caaatcctcc 660
agcacagcct acatgcagct cagcagcctg acatctgagg actctgcggt ctattactgt 720
gcaagatcga cttactacgg cggtgactgg tacttcratg tctggggcgc agggaccacg 780
gtcacmgtct ctgcaatcac gtgccctccc cccatgtccg tggaacacgc agacatctgg 840
gtcaagagct acagcttgta ctccagggag cggtacattt gtaactctgg tttcaagcgt 900
aaagccggca cgtccagcct gacggagtgc gtgttgaaca aggccacgaa tgtcgcccac 960
tggacaaccc ccagtctcaa atgcattaga gagccgaaat cttgtgacaa aactcacaca 1020
tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca 1080
aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac 1140
gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat 1200
aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc 1260
ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac 1320
aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa 1380
ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg 1440
acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg 1500
cagccggaga acaactacaa gaccacgcct cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc 1560
ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc 1620
tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac tacacgcaga agagcctctc cctgtctcct 1680
ggtaaataa 1689
<210> 46
<211> 540
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成多肽
<400> 46
Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile
20 25 30
His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Ser Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln
115 120 125
Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys
130 135 140
Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Lys
145 150 155 160
Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr Pro Gly
165 170 175
Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu
180 185 190
Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu
195 200 205
Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr
210 215 220
Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr
225 230 235 240
Val Ser Ala Ile Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp
245 250 255
Ile Trp Val Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys
260 265 270
Asn Ser Gly Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys
275 280 285
Val Leu Asn Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu
290 295 300
Lys Cys Ile Arg Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
305 310 315 320
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
325 330 335
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
340 345 350
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
355 360 365
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
370 375 380
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
385 390 395 400
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
405 410 415
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
420 425 430
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
435 440 445
Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
450 455 460
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
465 470 475 480
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
485 490 495
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
500 505 510
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
515 520 525
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
530 535 540
<210> 47
<211> 1050
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成多核苷酸
<400> 47
atggattttc aggtgcagat tatcagcttc ctgctaatca gtgcttcagt cataatgtcc 60
agaggacaaa ttgttctctc ccagtctcca gcaatcctgt ctgcatctcc aggggagaag 120
gtcacaatga cttgcagggc cagctcaagt gtaagttaca tccactggtt ccagcagaag 180
ccaggatcct cccccaaacc ctggatttat gccacatcca acctggcttc tggagtccct 240
gttcgcttca gtggcagtgg gtctgggact tcttactctc tcacaatcag cagagtggag 300
gctgaagatg ctgccactta ttactgccag cagtggacta gtaacccacc cacgttcgga 360
ggggggacca agctggaaat caaacgtacg gttgctgcac catctgtctt catcttcccg 420
ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 480
tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 540
caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 600
acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 660
ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgtaactg ggtgaatgta 720
ataagtgatt tgaaaaaaat tgaagatctt attcaatcta tgcatattga tgctacttta 780
tatacggaaa gtgatgttca ccccagttgc aaagtaacag caatgaagtg ctttctcttg 840
gagttacaag ttatttcact tgagtccgga gatgcaagta ttcatgatac agtagaaaat 900
ctgatcatcc tagcaaacga cagtttgtct tctaatggga atgtaacaga atctggatgc 960
aaagaatgtg aggaactgga ggaaaaaaat attaaagaat ttttgcagag ttttgtacat 1020
attgtccaaa tgttcatcaa cacttcttaa 1050
<210> 48
<211> 327
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成多肽
<400> 48
Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile
20 25 30
His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130 135 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys
210 215 220
Ile Glu Asp Leu Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr
225 230 235 240
Glu Ser Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe
245 250 255
Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile
260 265 270
His Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asp Ser Leu Ser
275 280 285
Ser Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu
290 295 300
Glu Glu Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val
305 310 315 320
Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser
325
<210> 49
<211> 1608
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成多核苷酸
<400> 49
atgggttgga gtctcatctt gctcttcctt gtcgctgttg ctacacgtgt cctgtcccag 60
gtacaactgc agcagcctgg ggctgagctg gtgaagcctg gggcctcagt gaagatgtcc 120
tgcaaggctt ctggctacac atttaccagt tacaatatgc actgggtaaa acagacacct 180
ggtcggggcc tggaatggat tggagctatt tatcccggaa atggtgatac ttcctacaat 240
cagaagttca aaggcaaggc cacattgact gcagacaaat cctccagcac agcctacatg 300
cagctcagca gcctgacatc tgaggactct gcggtctatt actgtgcaag atcgacttac 360
tacggcggtg actggtactt cgatgtctgg ggcgcaggga ccacggtcac cgtctctgca 420
gctagcacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 480
ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 540
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 600
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 660
tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttatcacg 720
tgccctcccc ccatgtccgt ggaacacgca gacatctggg tcaagagcta cagcttgtac 780
tccagggagc ggtacatttg taactctggt ttcaagcgta aagccggcac gtccagcctg 840
acggagtgcg tgttgaacaa ggccacgaat gtcgcccact ggacaacccc cagtctcaaa 900
tgcattagag agcccaaatc ttgtgacaaa actcacacat gcccaccgtg cccagcacct 960
gaactcctgg ggggaccgtc agtcttcctc ttccccccaa aacccaagga caccctcatg 1020
atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg gtggtggacg tgagccacga agaccctgag 1080
gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg 1140
gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac 1200
tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag gtctccaaca aagccctccc agcccccatc 1260
gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc 1320
ccatcccggg atgagctgac caagaaccag gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc 1380
tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag agcaatgggc agccggagaa caactacaag 1440
accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc tccttcttcc tctacagcaa gctcaccgtg 1500
gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg 1560
cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc ctgtctcctg gtaaataa 1608
<210> 50
<211> 516
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成多肽
<400> 50
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly
100 105 110
Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Ile Thr Cys Pro Pro
210 215 220
Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val Lys Ser Tyr Ser Leu
225 230 235 240
Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly Phe Lys Arg Lys Ala
245 250 255
Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn Lys Ala Thr Asn Val
260 265 270
Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile Arg Glu Pro Lys Ser
275 280 285
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
290 295 300
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
305 310 315 320
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
325 330 335
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
340 345 350
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
355 360 365
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
370 375 380
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
385 390 395 400
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
405 410 415
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val
420 425 430
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
435 440 445
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
450 455 460
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
465 470 475 480
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
485 490 495
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
500 505 510
Ser Pro Gly Lys
515

Claims (110)

1.一种可溶性融合蛋白质复合物包括至少二种可溶性融合蛋白质，其中
第一融合蛋白质包括(a)共价性连结至(b)介白素(IL-15)多肽或其功能性片段的第一生物活性多肽；及
第二融合蛋白质包括(c)共价性连结至(d)可溶性介白素-15受体α(IL-15Rα)多肽或其功能性片段的第二生物活性多肽；
其中所述第一及第二融合蛋白质的一者或二者进一步包括免疫球蛋白Fc结构域或其功能性片段；
其中所述第一融合蛋白质的IL-15结构域结合至所述第二融合蛋白质的可溶性IL-15Rα结构域以形成可溶性融合蛋白质复合物。
2.根据权利要求1的可溶性融合蛋白质复合物，其中所述第一及第二生物活性多肽的一者包括第一可溶性T细胞受体(TCR)或其功能片段。
3.根据权利要求2的可溶性融合蛋白质复合物，其中所述生物活性多肽的另一者包括权利要求2的所述第一可溶性TCR或其功能性片段，藉此创造具有增加的结合活性的多价TCR融合蛋白质复合物。
4.根据权利要求2的可溶性融合蛋白质复合物，其中所述另一生物活性多肽包括第二可溶性TCR或其功能性片段，其不同于所述第一可溶性TCR。
5.根据权利要求2至4的可溶性融合蛋白质复合物，其中所述TCR是特异辨识特定抗原。
6.根据权利要求2至4的可溶性融合蛋白质复合物，其中所述TCR式包括α及β链TCR的异源二聚物。
7.根据权利要求2至4的可溶性融合蛋白质复合物，其中所述TCR包括单链TCR多肽。
8.根据权利要求7的可溶性融合蛋白质复合物，其中所述单链TCR包括通过肽连结子序列共价性连结至TCR V-β链的TCR V-α链。
9.根据权利要求8的可溶性融合蛋白质复合物，其中所述单链TCR进一步包括共价性连结至TCR V-β链的TCR Cβ链片段。
10.根据权利要求8或9的可溶性融合蛋白质复合物，其中所述单链TCR进一步包括共价性连结至TCR V-α链的TCR Cα链片段。
11.根据权利要求1的可溶性融合蛋白质复合物，其中所述第一生物活性多肽包括TCRα多肽或其功能性片段及第二生物活性多肽包括TCRβ多肽或其功能性片段。
12.根据权利要求1的可溶性融合蛋白质复合物，其中所述第一及第二生物活性多肽的一者或二者包括抗体或其功能性片段。
13.根据权利要求12的可溶性融合蛋白质复合物，其中所述抗体是特异辨识特定抗原。
14.根据权利要求12或13的可溶性融合蛋白质复合物，其中所述抗体是单链抗体或单链Fv。
15.根据权利要求14的可溶性融合蛋白质复合物，其中所述单链抗体包括通过多肽连结子序列共价性连结至免疫球蛋白重链可变结构域的免疫球蛋白轻链可变结构域。
16.根据权利要求1的可溶性融合蛋白质复合物，其中所述第一生物活性多肽包括抗体重链多肽或其功能性片段，及所述第二生物活性多肽包括抗体轻链多肽或其功能性片段。
17.根据权利要求1的可溶性融合蛋白质复合物，其中所述IL-15多肽是相较于原始IL-15多肽为包括不同氨基酸序列的IL-15变体。
18.根据权利要求17的可溶性融合蛋白质复合物，其中所述IL-15变体作用为IL-15激动剂或拮抗剂。
19.根据权利要求17的可溶性融合蛋白质复合物，其中所述IL-15变体相较于所述原始IL-15多肽对于IL-15RβγC受体具有增加的或减少的结合活性。
20.根据权利要求17至19任一项的可溶性融合蛋白质复合物，其中所述IL-15变体的序列相较于所述原始IL-15序列具有至少一个氨基酸改变。
21.根据权利要求20的可溶性融合蛋白质复合物，其中所述氨基酸改变是在与IL-15Rβ及/或IL-15RγC互动的IL-15结构域中的氨基酸取代或删除。
22.根据权利要求20的可溶性融合蛋白质复合物，其中所述氨基酸改变是在成熟人类IL-15序列(序列编号：1)的位置6、8、10、61、65、72、92、101、104、105、108、109、111或112的一个或多个氨基酸取代或删除。
23.根据权利要求20的可溶性融合蛋白质复合物，其中所述氨基酸改变是取代于所述成熟人类IL-15序列的位置6的I为S，位置8的D为N或A，位置61的D为A，位置65的N为A，位置72的N为R，位置104的V为P或位置108的Q为A，或这些取代的任何组合。
24.根据权利要求23的可溶性融合蛋白质复合物，其中所述氨基酸改变造成IL-15变体，所述变体相较于所述原始IL-15多肽具有IL-15拮抗剂活性或对于IL-15RβγC受体具有降低的结合活性。
25.根据权利要求20的可溶性融合蛋白质复合物，其中所述氨基酸改变是取代于所述成熟人类IL-15序列的位置72的N为D。
26.根据权利要求25的可溶性融合蛋白质复合物，其中所述氨基酸改变造成IL-15变体，所述变体相较于所述原始IL-15多肽具有IL-15激动剂活性或对于IL-15RβγC受体具有增加的结合活性。
27.根据权利要求1的可溶性融合蛋白质复合物，其中所述Fc结构域或其功能性片段包括选自IgG Fc结构域、人类IgGl Fc结构域、人类IgG2Fc结构域、人类IgG3Fc结构域、人类IgG4Fc结构域、IgA Fc结构域、IgD Fc结构域、IgE Fc结构域及IgM Fc结构域所成群组的Fc结构域。
28.根据权利要求27的可溶性融合蛋白质复合物，其中所述Fc结构域包括氨基酸改变，所述氨基酸改变造成具有经改换的补体或Fc受体结合性质的Fc结构域。
29.根据权利要求28的可溶性融合蛋白质复合物，其中所述氨基酸改变是选自下述所成群组：在所述IgGl CH2的位置234及235(根据抗体共有序列编号)的亮氨酸残基(也就是...P E L L G G...)经丙氨酸残基取代(也就是...P E A A G G...)、在所述IgGl CH2的位置322(根据抗体共有序列编号)的赖氨酸残基(也就是...K C K S L...)经丙氨酸残基取代(也就是...K C A S L...)；或其任何组合。
30.根据权利要求1至29的可溶性融合蛋白质复合物，其中所述第一生物活性多肽是通过多肽连结子序列共价性连结至IL-15多肽(或其功能片段)。
31.根据权利要求1至30的可溶性融合蛋白质复合物，其中所述第二生物活性多肽是通过多肽连结子序列共价性连结至IL-15Rα多肽(或其功能性片段)。
32.根据权利要求1至31的可溶性融合蛋白质复合物，其中所述IL-15Rα多肽(或其功能性片段)通过多肽连结子序列共价性连结至Fc结构域(或其功能性片段)。
33.根据权利要求5的可溶性融合蛋白质复合物，其中针对所述TCR结构域的所述抗原包括呈现在MHC或HLA分子的肽抗原。
34.根据权利要求33的可溶性融合蛋白质复合物，其中所述肽抗原是源自肿瘤相关多肽或病毒编码多肽。
35.根据权利要求13的可溶性融合蛋白质复合物，其中针对所述抗体结构域的所述抗原包括细胞表面受体或配体。
36.根据权利要求13或35的可溶性融合蛋白质复合物，其中针对所述抗体结构域的所述抗原包括CD抗原、细胞激素或趋化激素受体或配体、生长因子受体或配体、细胞粘附分子、MHC/类MHC分子、Fc受体、类Toll受体、NK受体、TCR、BCR、阳性/阴性共刺激受体或配体、死亡受体或配体、肿瘤相关抗原或病毒编码抗原。
37.根据权利要求1至34的可溶性融合蛋白质复合物，其中所述IL-15Rα多肽包括能用于结合IL-15多肽的所述IL-15受体α的细胞外结构域。
38.根据权利要求1至35任一项的可溶性融合蛋白质复合物，其中所述IL-15Rα多肽包括IL-15Rαsushi结构域或IL-15RαΔE3结构域。
39.一种可溶性融合蛋白质复合物，包括共价性连结至权利要求1至38任一项的第二可溶性融合蛋白质复合物的权利要求1至38任一项的第一可溶性融合蛋白质复合物。
40.根据权利要求39的可溶性融合蛋白质复合物，其中所述第一可溶性融合蛋白质复合物是相同于所述第二可溶性融合蛋白质复合物。
41.根据权利要求39的可溶性融合蛋白质复合物，其中所述第一可溶性融合蛋白质复合物是不同于所述第二可溶性融合蛋白质复合物。
42.根据权利要求39的可溶性融合蛋白质复合物，其中所述第一可溶性融合蛋白质复合物是通过双硫键共价性连结至所述第二可溶性融合蛋白质复合物。
43.根据权利要求42的可溶性融合复合物，其中所述双硫键共价性连结所述第一可溶性融合蛋白质复合物的第二多肽的Fc结构域至所述第二可溶性融合蛋白质复合物的第二多肽的Fc结构域。
44.一种核酸序列，编码权利要求1至38任一项的第一融合蛋白质。
45.一种核酸序列，编码权利要求1至38任一项的第二融合蛋白质。
46.根据权利要求44或45的核酸序列，其中所述核酸序列进一步包括操作性连结至编码所述融合蛋白质的所述序列的启动子、转录起始信号及前导序列。
47.一种DNA载体，包括权利要求44的核酸序列。
48.一种DNA载体，包括权利要求45的核酸序列。
49.一种DNA载体，包括权利要求44与45的核酸序列。
50.一种细胞，包括选自权利要求44的序列、权利要求45的序列及权利要求44及权利要求45的序列所成群组的核酸序列。
51.一种制造权利要求1的可溶性融合蛋白质复合物的方法，所述方法包括：
a)将编码第一融合蛋白质的权利要求47的DNA载体导入第一宿主细胞，
b)在足以在所述细胞或媒质中表现所述第一融合蛋白质的条件下，在所述媒质中培养所述第一宿主细胞；
c)自所述宿主细胞或所述媒质纯化所述第一融合蛋白质，
d)将编码第二融合蛋白质的权利要求48的DNA载体导入第二宿主细胞，
e)在足以在细胞或媒质中表现第二融合蛋白质的条件下，在所述媒质中培养所述第二宿主细胞；及
f)自所述宿主细胞或所述媒质纯化所述第二融合蛋白质，及
g)在足以使第一融合蛋白质的IL-15结构域与第二融合蛋白质的可溶性IL-15Rα结构域结合的条件下，混合所述第一及第二融合蛋白质以形成所述可溶性融合蛋白质复合物。
52.根据权利要求51的方法，进一步包括在足以使自权利要求48的核酸所表现的多肽之间形成双硫键的条件下混合所述第一及第二融合蛋白质，其中制得权利要求39的可溶性融合蛋白质复合物。
53.一种制造权利要求1的可溶性融合蛋白质复合物的方法，所述方法包括：
a)将编码第一融合蛋白质的权利要求47的DNA载体及编码第二融合蛋白质的权利要求48的DNA载体导入宿主细胞，
b)在足以在所述细胞或媒质中表现所述融合蛋白质以及使所述第一融合蛋白质的IL-15结构域与所述第二融合蛋白质的可溶性IL-15Rα结构域之间结合的条件下，在所述媒质中培养所述宿主细胞以形成所述可溶性融合蛋白质复合物；
c)自所述宿主细胞或所述媒质纯化所述可溶性融合蛋白质复合物。
54.根据权利要求53的方法，进一步包括在足以使权利要求48的核酸所表现的多肽之间形成双硫键的条件下，混合所述第一及第二融合蛋白质，其中制得权利要求39的可溶性融合蛋白质。
55.一种制造权利要求1的可溶性融合蛋白质复合物的方法，所述方法包括：
a)将编码第一及第二融合蛋白质的权利要求49的DNA载体导入宿主细胞，
b)在足以在所述细胞或媒质中表现所述融合蛋白质以及使所述第一融合蛋白质的IL-15结构域与所述第二融合蛋白质的可溶性IL-15Rα结构域之间结合以形成所述可溶性融合蛋白质复合物，且使权利要求48的核酸所编码的多肽之间形成双硫键的条件下，在所述媒质中培养所述宿主细胞；
c)自所述宿主细胞或所述媒质纯化所述可溶性融合蛋白质复合物。
56.根据权利要求55的方法，进一步包括在足以使权利要求48的核酸所表现的多肽之间形成双硫键的条件下混合所述第一及第二融合蛋白质，其中制得权利要求39的可溶性融合蛋白质复合物。
57.一种杀标靶细胞的方法，所述方法包括：
a)将多种细胞与权利要求1至43的可溶性融合蛋白质复合物接触，其中所述多种细胞进一步包括带有权利要求1的IL-15结构域所辨识的IL-15R链的免疫细胞或带有权利要求1的Fc结构域所辨识的Fc受体链的免疫细胞，以及带有至少一权利要求1的生物活性多肽所辨识抗原的所述标靶细胞，
b)在所述标靶细胞的所述抗原及所述免疫细胞的所述IL-15R或Fc受体链之间形成特异结合复合物(桥)，足以结合及活化所述免疫细胞；及
c)通过所结合的活化免疫细胞杀所述标靶细胞。
58.根据权利要求57的方法，其中所述标靶细胞是肿瘤细胞或病毒感染细胞。
59.根据权利要求57或58的方法，其中所述生物活性多肽包括TCR。
60.根据权利要求59的方法，其中所述标靶细胞的抗原包括呈现在MHC或HLA分子且为所述TCR所辨识的肿瘤或病毒编码肽抗原。
61.根据权利要求57的方法，其中所述免疫细胞是T细胞、LAK细胞、NK细胞、巨噬细胞、单核球或颗粒球。
62.一种在患者中用以预防或治疗疾病的方法，其中所述疾病细胞表现疾病相关抗原，所述方法包括：
a)对所述患者投药权利要求1至43任一项的可溶性融合蛋白质复合物，所述可溶性融合蛋白质复合物包括辨识所述疾病相关抗原的生物活性多肽；
b)在抗原表现疾病细胞与IL-15R或Fc受体表现免疫细胞之间形成特异结合复合物(桥)足以定位免疫细胞；及
c)足以预防或治疗所述患者疾病地损伤或杀疾病细胞。
63.一种在患者中用以预防或治疗疾病的方法，其中所述疾病细胞表现疾病相关抗原，所述方法包括：
a)混合带有IL-15R链或Fc受体链的免疫细胞与权利要求1至43 任一项的可溶性融合蛋白质复合物，所述可溶性融合蛋白质复合物包括辨识疾病相关抗原的生物活性多肽，
b)对所述患者投药免疫细胞-融合蛋白质复合物混合物；
c)在抗原表现疾病细胞与IL-15R或Fc受体表现免疫细胞之间形成特异结合复合物(桥)足以定位免疫细胞；及
d)足以预防或治疗所述患者疾病地损伤或杀所述疾病细胞。
64.根据权利要求62或63的方法，其中所述疾病是癌症或病毒感染。
65.根据权利要求62或63的方法，其中所述疾病相关抗原是肽/MHC复合物。
66.一种在哺乳动物中刺激免疫回应的方法，包括对所述哺乳动物投药有效量的权利要求1至43任一项的可溶性融合蛋白质复合物。
67.一种在哺乳动物中压抑免疫回应的方法，包括对所述哺乳动物投药有效量的权利要求1至43任一项的可溶性融合蛋白质复合物。
68.根据权利要求1至43任一项的可溶性融合蛋白质复合物，其中可溶性融合蛋白质的至少一者包括可侦测标记。
69.根据权利要求68的可溶性融合蛋白质复合物，其中所述可侦测标记是生物素、链霉亲和速、酵素或其催化活性片段、放射性核素、纳米粒子、顺磁金属离子或荧光、磷光或化学冷光分子。
70.一种侦测细胞或组织的方法，所述细胞或组织包括呈现在所述细胞或组织的抗原，所述方法包括：
a)使细胞或组织与权利要求68的至少一可溶性融合蛋白质复合物在所述抗原与所述可溶性融合蛋白质复合物的生物活性多肽之间形成特异结合复合物的条件下接触，
b)在适合移除未与所述抗原结合的任何可溶性融合蛋白质复合物的条件下清洗所述细胞或组织；及
c)侦测所述特异结合复合物作为包括所述抗原的细胞或组织的指示。
71.根据权利要求70的方法，其中所述生物活性多肽包括TCR及所述抗原包括为所述TCR所辨识的呈现在MHC或HLA分子的肽抗原。
72.根据权利要求70或71的方法，其中所呈现的所述抗原的拷贝数是每个细胞1000或更少拷贝。
73.根据权利要求70至72任一项的方法，其中所述方法是实施在体内、体外或离体。
74.一种增加权利要求2或12的可溶性融合蛋白质复合物的每分子结合活性的方法，包括形成第一可溶性融合蛋白质复合物及第二可溶性融合蛋白质复合物的二聚物，其中各融合蛋白质复合物的第一生物活性多肽及第二生物活性肽的结合位点是相同或不同。
75.根据权利要求74的方法，其中所述每分子结合活性是增加10％或更多、20％或更多、30％或更多、40％或更多、50％或更多、60％或更多或70％或更多。
76.一种增加权利要求2或12的可溶性融合蛋白质复合物的每分子IL-15活性的方法，包括形成第一可溶性融合蛋白质复合物及第二可溶性融合蛋白质复合物的二聚物。
77.一种制造介白素-15(IL-15)：介白素-15受体α(IL-15Rα)融合蛋白质复合物的方法，所述方法包括：
a)将编码IL-15的第一DNA载体及编码IL-15Rα融合蛋白质的第二DNA载体导入宿主细胞；
b)在足以表现所述IL-15与所述IL-15Rα融合蛋白质的条件下在媒质中培养所述宿主细胞；及
c)自所述宿主细胞或所述媒质中纯化所述IL-15：IL-15Rα融合蛋白质复合物。
78.根据权利要求77的方法，其中所述IL-15Rα融合蛋白质包括共价性连结至生物活性多肽的可溶性IL-15Rα。
79.根据权利要求78的方法，其中所述生物活性多肽是IgG的重链恒定结构域。
80.根据权利要求78的方法，其中所述生物活性多肽是IgG的重链恒定结构域的Fc结构域。
81.根据权利要求77的方法，其中所述IL-15包括共价性连结至第二生物活性多肽的IL-15。
82.一种制造IL-15：IL-15Rα复合物的方法，所述IL-15：IL-15Rα复合物包括IL-15Rα/Fc融合蛋白质，其中所述方法包括：
a)将编码IL-15的第一DNA及编码IL-15Rα/Fc融合蛋白质的第二DNA导入宿主细胞；
b)在足以表现所述IL-15与所述IL-15Rα/Fc融合蛋白质的条件下在媒质中培养所述宿主细胞；及
c)自所述宿主细胞或所述媒质中纯化所述IL-15：IL-15Rα/Fc复合物。
83.一种制造IL-15：IL-15Rα融合蛋白质复合物的方法，所述融合蛋白质复合物包括IL-15Rα/Fc融合蛋白质，其中所述方法包括：
a)在宿主细胞中共表现IL-15与IL-15Rα/Fc融合蛋白质；
b)在足以表现所述IL-15与所述IL-15Rα/Fc融合蛋白质的条件下在媒质中培养所述宿主细胞；及
c)自所述宿主细胞或所述媒质纯化所述IL-15：IL-15Rα/Fc融合蛋白质复合物。
84.根据权利要求77至83任一项的方法，其中自所述宿主细胞或所述媒质纯化所述IL-15：IL-15Rα复合物包括在特异性结合所述IL-15：IL-15Rα融合蛋白质复合物的亲和试剂捕集所述IL-15：IL-15Rα复合物。
85.根据权利要求84的方法，其中所述IL-15Rα融合蛋白质包括IL-15Rα/Fc融合蛋白质，且所述亲和试剂特异性结合所述Fc结构域。
86.根据权利要求85的方法，其中所述亲和试剂是蛋白质A或蛋白质G。
87.根据权利要求84或85的方法，其中所述亲和试剂是抗体。
88.根据权利要求77至87任一项的方法，其中自所述宿主细胞或媒质纯化所述IL-15：IL-15Rα复合物包括离子交换层析。
89.根据权利要求77至88任一项的方法，其中自所述宿主细胞或媒质纯化所述IL-15：IL-15Rα复合物包括尺寸排除层析。
90.根据权利要求77至89任一项的方法，其中所述IL-15Rα包括IL-15RαSushi(IL-15RαSu)。
91.根据权利要求77至90任一项的方法，其中所述IL-15是变体IL-15。
92.根据权利要求91的方法，其中所述变体IL-15包括IL-15N72D。
93.根据权利要求77至92任一项的方法，其中所述宿主细胞是哺乳动物细胞。
94.根据权利要求77至93任一项的方法，其中所述IL-15：IL-15Rα复合物的IL-15结合位点是完全被占有。
95.根据权利要求90的任一项方法，其中所述IL-15：IL-15RαSu/Fc复合物的二IL-15结合位点是完全被占有。
96.根据权利要求77至95任一项的方法，其中所述IL-15：IL-15Rα复合物是根据所述复合物电荷或尺寸性质纯化。
97.一种制造IL-15N72D：IL-15RαSu/Fc融合蛋白质复合物的方法，包括：
a)在宿主细胞中共表现IL-15N72D与IL-15RαSu/Fc融合蛋白质；
b)在足以表现IL-15N72D与IL-15RαSu/Fc融合蛋白质的条件下在媒质中培养所述宿主细胞；及
c)自宿主细胞或媒质中纯化所述IL-15N72D：IL-15RαSu/Fc融合蛋白质复合物，其中所述IL-15N72D：IL-15RαSu/Fc复合物的二IL-15结合位点是完全被占有。
98.根据权利要求97的方法，其中所述完全被占有的IL-15N72D：IL-15RαSu/Fc融合蛋白质复合物是根据复合物电荷性质通过阴离子交换层析纯化。
99.根据权利要求97的方法，其中所述完全被占有的IL-15N72D：IL-15RαSu/Fc融合蛋白质复合物是利用具有结合条件的四级胺系树脂而纯化，该结合条件应用低离子强度中性pH缓冲液及应用增加离子强度缓冲液的洗提条件。
100.一种细胞，包括编码IL-15或IL-15变体的第一多核苷酸及编码IL-受体融合蛋白质的第二多核苷酸。
101.根据权利要求100的细胞，其中所述细胞包括编码IL-15N72D的第一表现载体及编码IL-15RαSu/Fc融合蛋白质的第二表现载体。
102.一种经单离的完全被占有的IL-15N72D：IL-15RαSu/Fc复合物，包括二聚性IL-15RαSu/Fc及二个IL-15N72D分子。
103.根据权利要求102的复合物，其中所述复合物是至少90至95％或更高纯化的完全被占有的复合物。
104.根据权利要求102的复合物，其中所述复合物具有介于5.6至6.5之间的等电点。
105.根据权利要求102的复合物，具有约114kDa的分子量。
106.根据权利要求102的复合物，其中所述IL-15N72D及/或IL-15RαSu/Fc融合蛋白质是经糖基化的。
107.一种经单离的完全被占有的IL-15N72D：IL-15RαSu/Fc复合物，是根据权利要求77至99任一项的方法制造。
108.一种在个体中调节免疫回应的方法，所述方法包括对所述个体投药权利要求102至107任一项的完全被占有的IL-15N72D：IL-15RαSu/Fc复合物。
109.根据权利要求108的方法，其中所述免疫回应是增加或减少。
110.一种在具有瘤形成的个体中增强免疫回应的方法，所述方法包括对所述个体投药权利要求102至107任一项的完全被占有的IL-15N72D：IL-15RαSu/Fc复合物。
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