JP2017093457A - 多量体il−15可溶性融合分子並びにその製造及び使用方法 - Google Patents
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- C12N5/0602—Vertebrate cells
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- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
- C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
- C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
- C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
- C07K2319/21—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a His-tag
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
- C07K2319/22—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a Strep-tag
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
Abstract
【解決手段】第1融合タンパク質はインターロイキン−15(IL−15)ポリペプチド又はその機能的断片と共有結合している生物活性ポリペプチドである。第2融合タンパク質は、可溶性インターロイキン−15受容体アルファ(IL−15Rα)ポリペプチド又はその機能的断片と共有結合している第2生物活性ポリペプチドである。第1及び第2融合タンパク質の一方又は両方は、免疫グロブリンFcドメイン又はその機能的断片を更に包含して;第1融合タンパク質は第2融合タンパク質の可溶性IL−15Rαドメインと結合して可溶性融合タンパク質IL−15N72D:IL−15RαSu/Fc複合体を形成する複合体。
【選択図】なし
Description
本願はその全ての内容が参照により本明細書に取り込まれている、2010年9月21日に出願された米国仮特許出願第61/384,817号及び2011年8月26日に出願された米国仮特許出願第61/527,911号の優先権を主張する。
本願の研究支援は、保健社会福祉省、長官に代表されるアメリカ合衆国によって実施された。
b)細胞中又は培地中に第1融合タンパク質を発現するのに十分な条件下で第1宿主細胞を培地中で培養すること、
c)宿主細胞又は培地から第1融合タンパク質を精製すること、
d)第2融合タンパク質をコードする適切な調節配列を有するDNAベクターを第2宿主細胞内へ導入すること、
e)細胞中又は培地中に第2融合タンパク質を発現するのに十分な条件下で第2宿主細胞を培地中で培養すること、
f)宿主細胞又は培地から第2融合タンパク質を精製すること、及び
g)第1融合タンパク質の1L−15ドメインと第2融合タンパク質の可溶性1L−15Rαの間を結合させるのに十分な条件下で第1及び第2融合タンパク質を混合して可溶性融合タンパク質複合体を形成すること:
の工程を包含する。
a)第1融合タンパク質をコードする適切な調節配列を有するDNAベクター及び第2融合タンパク質をコードする適切な調節配列を有するDNAベクターを宿主細胞内へ導入すること、
b)細胞中又は培地中に融合タンパク質を発現して第1融合タンパク質の1L−15ドメインと第2融合タンパク質の可溶性1L−15Rαドメインの間を結合させるのに十分な条件下で宿主細胞を培地中で培養して可溶性融合タンパク質複合体を形成すること、
c)宿主細胞又は培地から可溶性融合タンパク質複合体を精製すること:
の工程を包含する。
a)第1及び第2融合タンパク質をコードする適切な調節配列を有するDNAベクターを宿主細胞内へ導入すること、
b)細胞中又は培地中に融合タンパク質を発現して第1融合タンパク質の1L−15ドメインと第2融合タンパク質の可溶性1L−15Rαドメインの間を結合させるのに十分な条件下で宿主細胞を培地中で培養して、可溶性融合タンパク質複合体を形成して、そして特許請求の範囲第46項に記載の核酸によってコードされるポリペプチドの間にジスルフィド結合を形成させること、
c)宿主細胞又は培地から可溶性融合タンパク質複合体を精製すること:
の工程を包含している。
a)複数の細胞を本発明の可溶性融合タンパク質複合体と接触させること(ここで複数の細胞は、IL−15ドメインによって認識されるIL−15R鎖を有する免疫細胞、又はFcドメインによって認識されるFc受容体鎖を有している免疫細胞、及び少なくとも1つの生物活性ポリペプチドによって認識される抗原を有している標的細胞を更に包含する)、
b)標的細胞上の抗原と免疫細胞上のIL−15R又はFc受容体鎖との間に特定の結合複合体(架橋)を形成して、免疫細胞を十分に結合させて活性化すること、及び
c)結合して活性化した免疫細胞によって標的細胞を死滅させること:
の工程を包含している。
a)疾患関連抗原を認識する生物活性ポリペプチドを有している本発明の可溶性融合タンパク質複合体を患者に投与すること;
b)抗原発現病的細胞と免疫細胞を発現しているIL−15R又はFc受容体との間で、免疫細胞を局在化するのに十分な、特定結合複合体(架橋)を形成すること;及び
c)病的細胞を損傷又は殺傷させて患者における疾患を十分に予防又は治療すること:
の工程を包含している。
a)IL−15R鎖又はFc受容体鎖を有している免疫細胞を、疾患関連抗原を認識する生物活性ポリペプチドを包含している本発明の可溶性融合タンパク質複合体と混合すること;
b)免疫細胞と融合タンパク質複合体との混合物を患者にとうよすること;
c)抗原発現病的細胞と免疫細胞を発現しているIL−15R又はFc受容体との間で、特定結合複合体(架橋)を形成して免疫細胞を十分に局在化させこと;及び
c)患者における疾患を予防又は治療するのに十分に異常細胞を損傷又は殺傷すること:
d)病的細胞を損傷又は殺傷させて患者における疾患を十分に予防又は治療すること:
の工程を包含している。
a)細胞又は組織を、抗原と可溶性融合タンパク質複合体の生物活性ポリペプチドとの間で特定結合複合体を形成する条件下で、検出可能な標識を包含している本発明の可溶性融合タンパク質複合体の少なくと1つと接触させること;
b)抗原と結合しなかった可溶性融合タンパク質複合体の何れをも除去するのに適している条件下で細胞又は組織を洗浄すること;及び
c)抗原を含有している細胞又は組織の指標として特定結合複合体を検出すること:
の工程を包含している。
すなわち、本発明は、以下の(1)から(108)に関する。
(1)少なくとも2つの可溶性融合タンパク質を含んでなる、可溶性融合タンパク質複合体であって、第1の融合タンパク質が、インターロイキン−15(IL−15)ポリペプチド(b)又はその機能的断片と共有結合している第1生物活性ポリペプチド(a)を含み、そして、第2の融合タンパク質が、可溶性インターロイキン−15受容体アルファ(IL−15Rα)ポリペプチド(d)又はその機能的断片と共有結合している第2生物活性ポリペプチド(c)を含み、第1及び第2融合タンパク質の一方又は両方が更に免疫グロブリンFcドメイン又はその機能的断片を含み、第1融合タンパク質のIL−15ドメインが第2融合タンパク質の可溶性IL−15Rαドメインと結合して可溶性融合タンパク質複合体を形成している、可溶性融合タンパク質複合体。
(2)第1及び第2生物活性ポリペプチドの一方が第1可溶性T細胞受容体(TCR)又はその機能的断片を含んでいる、前記(1)に記載の可溶性融合タンパク質複合体。
(3)他方の生物活性ポリペプチドが、前記(2)に記載の第1可溶性TCR又はその機能的断片を含み、それによって増大した結合活性を有する多価TCR融合タンパク質複合体を作製する、前記(2)に記載の可溶性融合タンパク質複合体。
(4)他方の生物活性ポリペプチドが第1可溶性TCRと異なる第2可溶性TCR又はその機能的断片を含んでいる、前記(2)に記載の可溶性融合タンパク質複合体。
(5)TCRが特定抗原の認識に特異的である、前記(2)〜(4)に記載の可溶性融合タンパク質複合体。
(6)TCRが、α及びβ鎖TCRを含んでいるヘテロ二量体である、前記(2)〜(4)に記載の可溶性融合タンパク質複合体。
(7)TCRが1本鎖TCRポリペプチドを含んでいる、前記(2)〜(4)に記載の可溶性融合タンパク質複合体。
(8)1本鎖TCRが、ペプチドリンカー配列によってTCR V−β鎖と共有結合しているTCR V−α鎖を含んでいる、前記(7)に記載の可溶性融合タンパク質複合体。
(9)1本鎖TCRが、TCR V−β鎖と共有結合している可溶性TCR Cβ鎖断片を更に含んでいる、前記(8)に記載の可溶性融合タンパク質複合体。
(10)1本鎖TCRが、TCR V−α鎖と共有結合している可溶性TCR Cα鎖断片を更に含んでいる、前記(8)又は(9)に記載の可溶性融合タンパク質複合体。
(11)第1生物活性ポリペプチドが、TCRαポリペプチド又はその機能的断片を含み、そして第2生物活性ポリペプチドが、TCRβポリペプチド又はその機能的断片を含んでいる、前記(1)に記載の可溶性融合タンパク質複合体。
(12)第1及び第2生物活性ポリペプチドの一方又は両方が、抗体又はその機能的断片を含んでいる、前記(1)に記載の可溶性融合タンパク質複合体。
(13)抗体が、特定抗原の認識に特異的である、前記(12)に記載の可溶性融合タンパク質複合体。
(14)抗体が、1本鎖抗体又は1本鎖Fvである、前記(12)又は(13)に記載の可溶性融合タンパク質複合体。
(15)1本鎖抗体が、ポリペプチドリンカー配列によって免疫グロブリン重鎖可変領域と共有結合している免疫グロブリン軽鎖可変領域を含んでいる、前記(14)に記載の可溶性融合タンパク質複合体。
(16)第1生物活性ポリペプチドが抗体重鎖ポリペプチド又はその機能的断片を含み、そして第2生物活性ポリペプチドが抗体軽鎖ポリペプチド又はその機能的断片を含んでいる、前記(1)に記載の可溶性融合タンパク質複合体。
(17)IL−15ポリペプチドが、天然のIL−15ポリペプチドとは異なるアミノ酸配列を含んでいるIL−15変異体である、前記(1)に記載の可溶性融合タンパク質複合体。
(18)IL−15変異体が、IL−15アゴニスト又はアンタゴニストとして機能する、前記(17)に記載の可溶性融合タンパク質複合体。
(19)IL−15変異体が、天然のIL−15ポリペプチドと比較して、IL−15RβγC受容体に対する増大した又は減少した結合活性を有している、前記(17)に記載の可溶性融合タンパク質複合体。
(20)IL−15変異体の配列が、天然のIL−15配列と比較して少なくとも1つのアミノ酸変化を有している、前記(17)〜(19)の何れかに記載の可溶性融合タンパク質複合体。
(21)アミノ酸変化が、IL−15Rβ及び/又はIL−15RγCと相互作用するIL−15のドメイン中のアミノ酸置換又は欠失である、前記(20)に記載の可溶性融合タンパク質複合体。
(22)アミノ酸変化が、成熟ヒトIL−15配列(配列番号51)の6、8、10、61、65、72、92、101、104、105、108、109、111、又は112位における1つ又はそれ以上のアミノ酸置換又は欠失である、前記(20)に記載の可溶性融合タンパク質複合体。
(23)アミノ酸変化が、成熟ヒトIL−15配列の6位のIをSに、8位のDをN若しくはAに、61位のDをAに、65位のNをAに、72位のNをRに、104位のVをPに、又は108位のQをAに置換すること、又はこれらの置換の何れかの組み合わせである、前記(22)に記載の可溶性融合タンパク質複合体。
(24)アミノ酸変化が、IL−15アンタゴニスト活性又は天然のIL−15ポリペプチドと比較してIL−15RβγC受容体に対する減少した結合活性を有するIL−15変異体をもたらす、前記(23)に記載の可溶性融合タンパク質複合体。
(25)アミノ酸変化が、成熟ヒトIL−15配列の72位でNをDに置換することである、前記(20)に記載の可溶性融合タンパク質複合体。
(26)アミノ酸変化が、IL−15アゴニスト活性又は天然のIL−15ポリペプチドと比較してIL−15RβγC受容体に対する増大した結合活性を有するIL−15変異体をもたらす、前記(25)に記載の可溶性融合タンパク質複合体。
(27)Fcドメイン又はその機能的断片が、IgG Fcドメイン、ヒトIgG1 Fcドメイン、ヒトIgG2 Fcドメイン、ヒトIgG3 Fcドメイン、ヒトIgG4 Fcドメイン、IgA Fcドメイン、IgD Fcドメイン、IgE Fcドメイン、及びIgM Fcドメインからなる群より選ばれるFcドメインを含んでいる、前記(1)に記載の可溶性融合タンパク質複合体。
(28)Fcドメインが、変化した相補体又はFc受容体結合特性を有するFcドメインをもたらすアミノ酸変化を含んでいる、前記(27)に記載の可溶性融合タンパク質。
(29)アミノ酸変化が、IgG1CH2の234及び235位のロイシン残基の(抗体コンセンサス配列に基づいてナンバリング)(すなわち、...PELLGG ...)アラニン残基による置換(すなわち、...PEAAGG ...)、IgG1CH2の332位のリジン残基の(抗体コンセンサス配列に基づいてナンバリング)(すなわち、...KCKSL ...)アラニン残基による置換(すなわち、...KCASL ...)、又はこれらの何れかの組合わせからなる群より選ばれる、前記(28)に記載の可溶性融合タンパク質。
(30)第1生物活性ポリペプチドが、ポリペプチドリンカー配列によってIL−15ポリペプチド(又はその機能的断片)と共有結合している、前記(1)〜(29)に記載の可溶性融合タンパク質複合体。
(31)第2生物活性ポリペプチドが、ポリペプチドリンカー配列によってIL−15Rαポリペプチド(又はその機能的断片)と共有結合している、前記(1)〜(30)に記載の可溶性融合タンパク質複合体。
(32)IL−15Rαポリペプチド(又はその機能的断片)が、ポリペプチドリンカー配列によってFcドメイン(又はその機能的断片)と共有結合している、前記(1)〜(31)に記載の可溶性融合タンパク質複合体。
(33)TCRドメインに対する抗原が、MHC又はHLA分子中で提示されるペプチド抗原を含んでいる、前記(5)に記載の可溶性融合タンパク質複合体。
(34)ペプチド抗原が、腫瘍関連ポリペプチド又はウィルスがコードするポリペプチドに由来している、前記(33)に記載の可溶性融合タンパク質複合体。
(35)抗体ドメインに対する抗原が、細胞表面受容体又はリガンドを含んでいる、前記(13)に記載の可溶性融合タンパク質複合体。
(34)抗体ドメインに対する抗原が、CD抗原、サイトカイン又はケモカインの受容体又はリガンド、成長因子受容体又はリガンド、細胞接着分子、MHC/MHC様分子、Fc受容体、Toll様受容体、NK受容体、TCR、BCR、陽性/陰性同時刺激受容体又はリガンド、死受容体又はリガンド、腫瘍関連抗原、或いはウィルスがコードする抗原を含んでいる、前記(13)又は(35)に記載の可溶性融合タンパク質複合体。
(35)IL−15Rαポリペプチドが、IL−15ポリペプチドを結合することができるIL−15受容体アルファの細胞外ドメインを含んでいる、前記(1)〜(34)に記載の可溶性融合タンパク質複合体。
(36)IL−15Rαポリペプチドが、IL−15Rαsushiドメイン又はIL−15RαΔE3ドメインの何れかを含んでいる、前記(1)〜(35)の何れかに記載の可溶性融合タンパク質複合体。
(37)前記(1)〜(36)の何れかに記載の第2可溶性融合タンパク質複合体と共有結合している前記(1)〜(36)の何れかに記載の第1可溶性融合タンパク質複合体を含んでなる、可溶性融合タンパク質複合体。
(38)第1可溶性融合タンパク質複合体が、第2可溶性融合タンパク質複合体と同じである、前記(37)に記載の可溶性融合タンパク質複合体。
(39)第1可溶性融合タンパク質複合体が、第2可溶性融合タンパク質複合体と異なる、前記(37)に記載の可溶性融合タンパク質複合体。
(40)第1可溶性融合タンパク質複合体が、ジスルフィド結合で第2可溶性融合タンパク質複合体と共有結合している、前記(37)に記載の可溶性融合タンパク質複合体。
(41)ジスルフィド結合が、第1可溶性融合タンパク質複合体の第2ポリペプチドのFcドメインを第2可溶性融合タンパク質複合体の第2ポリペプチドのFcドメインに共有結合させる、前記(40)に記載の可溶性融合複合体。
(42)前記(1)〜(36)の何れかに記載の第1融合タンパク質をコードする核酸配列。
(43)前記(1)〜(36)の何れかに記載の第2融合タンパク質をコードする核酸配列。
(44)核酸配列が融合タンパク質をコードする配列に操作可能に結合しているプロモータ、翻訳開始シグナル、及びリーダー配列を更に含んでいる、前記(42)又は(43)に記載の核酸配列。
(45)前記(42)に記載の核酸配列を含んでなる、DNAベクター。
(46)前記(43)に記載の核酸配列を含んでなる、DNAベクター。
(47)前記(42)及び(43)に記載の核酸配列を含んでなる、DNAベクター。
(48)前記(42)に記載の配列、前記(43)に記載の配列、及び前記(42)及び(43)に記載の配列の群から選ばれる核酸配列を含んでなる、細胞。
(49)方法が、a)第1融合タンパク質をコードする前記(45)に記載のDNAベクターを第1宿主細胞内に導入すること、b)細胞又は培地中に第1融合タンパク質を発現するのに十分な条件下で培地中で第1宿主細胞を培養すること、c)宿主細胞又は培地から第1融合タンパク質を精製すること、d)第2融合タンパク質をコードする前記(46)に記載のDNAベクターを第2宿主細胞内に導入すること、e)細胞又は培地中に第2融合タンパク質を発現するのに十分な条件下で培地中で第2宿主細胞を培養すること、及びf)宿主細胞又は培地から第2融合タンパク質を精製すること、及びg)第1融合タンパク質のIL−15ドメインと第2融合タンパク質の可溶性IL−15Rαドメインの間を結合させるのに十分な条件下で第1及び第2融合タンパク質を混合して可溶性融合タンパク質複合体を形成すること、を含んでなる、前記(1)に記載の可溶性融合タンパク質複合体を製造する方法。
(50)前記(46)に記載の核酸から発現されたポリペプチド間にジスルフィド結合を形成させるのに十分な条件下で第1及び第2融合タンパク質を混合することを更に含み、ここで前記(37)に記載の可溶性融合タンパク質複合体を形成する、前記(49)に記載の方法。
(51)方法が、a)第1融合タンパク質をコードする前記(45)に記載のDNAベクター及び第2融合タンパク質をコードする前記(46)に記載のDNAベクターを宿主細胞に導入すること、b)細胞又は培地中に融合タンパク質を発現して、第1融合タンパク質のIL−15ドメインと第2融合タンパク質の可溶性IL−15Rαドメインの間を会合させて可溶性融合タンパク質複合体の形成を可能にするのに十分な条件下で宿主細胞を培地中で培養すること、c)宿主細胞又は培地から可溶性融合タンパク質複合体を精製すること、を含んでなる、前記(1)に記載の可溶性融合タンパク質複合体を製造する方法。
(52)前記(46)に記載の核酸から発現されたポリペプチド間にジスルフィド結合を形成させるのに十分な条件下で第1及び第2融合タンパク質複合体を混合することを更に含み、ここで前記(37)に記載の可溶性融合タンパク質複合体を形成する、前記(51)に記載の方法。
(53)方法が、a)第1及び第2融合タンパク質をコードする前記(47)に記載のDNAベクターを宿主細胞内に導入すること、b)細胞又は培地中に融合タンパク質を発現して、第1融合タンパク質のIL−15ドメインと第2融合タンパク質の可溶性IL−15Rαドメインの間を会合させて可溶性融合タンパク質複合体の形成を可能にする、及び前記(46)に記載の核酸によってコードされるポリペプチドの間にジスルフィド結合を形成させるのに十分な条件下で宿主細胞を培地中で培養すること、c)宿主細胞又は培地から可溶性融合タンパク質複合体を精製することを含んでなる、前記(1)に記載の可溶性融合タンパク質複合体を製造する方法。
(54)前記(46)に記載の核酸から発現されたポリペプチド間にジスルフィド結合を形成させるのに十分な条件下で第1及び第2融合タンパク質を混合することを更に含み、ここで前記(37)に記載の可溶性融合タンパク質複合体を作成する、前記(53)に記載の方法。
(55)方法が、a)複数の細胞を前記(1)〜(41)に記載の可溶性融合タンパク質複合体と接触させること(ここで複数の細胞は更に、前記(1)に記載のIL−15ドメインによって認識されるIL−15R鎖を担持している免疫細胞又は前記(1)に記載のFcドメインによって認識されるFc受容体鎖を担持している免疫細胞、及び前記(1)に記載の生物活性ポリペプチドの少なくとも1つによって認識される抗原を担持している標的細胞を含んでいる)、b)標的細胞上の抗原と、免疫細胞上のIL−15R又はFc受容体鎖の間に、免疫細胞を結合及び活性化するのに十分に、特異的結合複合体(架橋)を形成すること;及びc)結合した活性化免疫細胞によって標的細胞を殺傷することを含んでなる、標的細胞を殺傷する方法。
(56)標的細胞が、腫瘍細胞又はウィルス感染細胞である、前記(55)に記載の方法。
(57)生物活性ポリペプチドがTCRを含んでいる、前記(55)又は(56)に記載の方法。
(58)標的細胞上の抗原が、MHC又はHLA分子内に提示され、TCRによって認識される、腫瘍又はウィルスによってコードされるペプチド抗原を含んでいる、前記(57)に記載の方法。
(59)免疫細胞が、T細胞、LAK細胞、NK細胞、マクロファージ、単球又は顆粒球である、前記(55)に記載の方法。
(60)疾患細胞が疾患関連抗原を発現している、患者の疾患を予防又は治療する方法であって、方法が、a)疾患関連抗原を認識する生物活性ポリペプチドを含んでいる前記(1)〜(41)の何れかに記載の可溶性融合タンパク質複合体を患者に投与すること、b)抗原発現疾患細胞と免疫細胞を発現しているIL−15R又はFc受容体の間に免疫細胞を局在化するのに十分に特異的結合複合体(架橋)を形成すること、及びc)患者の疾患を予防又は治療するのに十分に疾患細胞を損傷又は殺傷すること、を含んでなる、方法。
(61)疾患細胞が疾患関連抗原を発現している、患者の疾患を予防又は治療する方法であって、方法が、a)IL−15R鎖又はFc受容体鎖を担持している免疫細胞を疾患関連抗原を認識する生物活性ポリペプチドを含んでいる前記(1)〜(41)の何れかに記載の可溶性融合タンパク質複合体と混合すること、b)免疫細胞−融合タンパク質複合体混合物を患者に投与すること、c)抗原発現疾患細胞と免疫細胞を発現しているIL−15R又はFc受容体の間に免疫細胞を局在化するのに十分に特異的結合複合体(架橋)を形成すること、及びd)患者の疾患を予防又は治療するのに十分に疾患細胞を損傷又は殺傷することを含んでなる、方法。
(62)疾患が癌又はウィルス感染症である、前記(60)又は(61)に記載の方法。
(63)疾患関連抗原がペプチド/MHC複合体である、前記(60)又は(61)に記載の方法。
(64)前記(1)〜(41)の何れかに記載の可溶性融合タンパク質複合体の有効量を哺乳動物に投与することを含んでなる、哺乳動物における免疫応答を刺激する方法。
(65)前記(1)〜(41)の何れかに記載の可溶性融合タンパク質複合体の有効量を哺乳動物に投与することを含んでなる、哺乳動物における免疫応答を抑制する方法。
(66)少なくとも1つの可溶性融合タンパク質複合体が検出可能な標識を含んでいる、前記(1)〜(41)の何れかに記載の可溶性融合タンパク質複合体。
(67)検出可能な標識が、ビオチン、ストレプタビジン、酵素又はその触媒活性断片、放射性核種、ナノ粒子、常磁性金属イオン、又は蛍光性、リン光性若しくはケミルミネセント分子である、前記(66)に記載の可溶性融合タンパク質複合体。
(68)方法が、a)抗原と可溶性融合タンパク質複合体の生物活性ポリペプチドの間に特異的結合複合体を形成する条件下で、細胞又は組織を前記(66)に記載の少なくとも1つの可溶性融合タンパク質複合体と接触させること、b)抗原に結合しなかった何れの可溶性融合タンパク質複合体も除去するのに適している条件下で細胞又は組織を洗浄すること、及びc)抗原を含有している細胞又は組織の指標であるとして、特異的結合複合体を検出することを含んでなる、細胞又は組織上に提示される抗原を含有している細胞又は組織を検出する方法。
(69)生物活性ポリペプチドがTCRを含み、そして抗原がTCRによって認識されるMHC又はHLA分子内に提示されるペプチド抗原を含んでいる、前記(68)に記載の方法。
(70)抗原提示のコピー数が細胞当り多くて1000コピーである、前記(68)又は(69)に記載の方法。
(71)方法がインビボ、インビトロ、又はエクスビボで行われる、前記(68)〜(70)の何れかに記載の方法。
(72)第1可溶性融合タンパク質複合体と第2可溶性融合タンパク質複合体の二量体を形成すること(ここで、それぞれの融合タンパク質複合体の第1生物活性ポリペプチドと第2生物活性ペプチドの結合部位は同一又は異なっている)を含んでなる、前記(2)又は(12)に記載の可溶性融合タンパク質複合体の分子当りの結合活性を増大する方法。
(73)分子当りの結合活性が、10%又はそれ以上、20%又はそれ以上、30%又はそれ以上、40%又はそれ以上、50%又はそれ以上、60%又はそれ以上、或いは70%又はそれ以上増大する、前記(72)に記載の方法。
(74)第1可溶性融合タンパク質複合体と第2可溶性融合タンパク質複合体の二量体を形成することを含んでなる、前記(2)又は(12)に記載の可溶性融合タンパク質複合体の分子当りのIL−15活性を増大する方法。
(75)方法が、a)IL−15をコードする第1DNAベクター及びIL−15Rα融合タンパク質をコードする第2DNAベクターを宿主細胞内に導入すること、b)IL−15とIL−15Rα融合タンパク質を発現するのに十分な条件下で宿主細胞を培地中で培養すること、及びc)IL−15:IL−15Rα融合タンパク質複合体を宿主細胞又は培地から精製することを含んでなる、インターロイキン−15(IL−15):インターロイキン−15受容体アルファ(IL−15Rα)融合タンパク質複合体を製造する方法。
(76)IL−15Rα融合タンパク質複合体が、生物活性ポリペプチドと共有結合している可溶性IL−15Rαを含んでいる、前記(75)に記載の方法。
(77)生物活性ポリペプチドが、IgGの重鎖定常ドメインである、前記(76)に記載の方法。
(78)生物活性ポリペプチドが、IgGの重鎖定常ドメインのFcドメインである、前記(76)に記載の方法。
(79)IL−15が、第2生物活性ポリペプチドと共有結合しているIL−15を含んでいる、前記(75)に記載の方法。
(80)方法が、a)IL−15をコードする第1DNA及びIL−15Rα/Fc融合タンパク質をコードする第2DNAを宿主細胞内に導入すること、b)IL−15とIL−15Rα/Fc融合タンパク質を発現するのに十分な条件下で宿主細胞を培地中で培養すること、及びc)IL−15:IL−15Rα/Fc複合体を宿主細胞又は培地から精製することを含んでなる、IL−15Rα/Fc融合タンパク質を含んでいるIL−15:IL−15Rα複合体を製造する方法。
(81)方法が、a)IL−15とIL−15Rα/Fc融合タンパク質を宿主細胞内で同時発現すること、b)IL−15とIL−15Rα/Fc融合タンパク質を発現するのに十分な条件下で、宿主細胞を培地中で培養すること、及びc)IL−15:IL−15Rα/FC融合タンパク質複合体を宿主細胞又は培地から精製することを含んでなる、IL−15Rα/FC融合タンパク質を含んでいるIL−15:IL−15Rα融合タンパク質複合体を製造する方法。
(82)IL−15:IL−15Rα複合体を宿主細胞又は培地から精製することが、IL−15:IL−15Rα融合タンパク質複合体を特異的に結合する親和性試薬上にIL−15:IL−15Rα複合体を捕獲することを含んでいる、前記(75)〜(81)の何れかに記載の方法。
(83)IL−15Rα融合タンパク質が、IL−15Rα/Fc融合タンパク質及びFcドメインと特異的に結合する親和性試薬を含んでいる、前記(82)に記載の方法。
(84)親和性試薬が、プロテインA又はプロテインGである、前記(83)に記載の方法。
(85)親和性試薬が抗体である、前記(82)又は(83)に記載の方法。
(86)IL−15:IL−15Rα複合体を宿主細胞又は培地から精製することが、イオン交換クロマトグラフィーを含んでいる、前記(75)〜(85)の何れかに記載の方法。
(87)IL−15:IL−15Rα複合体を宿主細胞又は培地から精製することが、サイズ排除クロマトグラフィーを含んでいる、前記(75)〜(86)の何れかに記載の方法。
(88)IL−15Rαが、IL−15RαSushi(IL−15RαSu)を含んでいる、前記(75)〜(87)の何れかに記載の方法。
(89)IL−15が突然変異IL−15である、前記(75)〜(88)の何れかに記載の方法。
(90)突然変異IL−15が、IL−15N72Dを含んでいる、前記(89)に記載の方法。
(91)宿主細胞が哺乳動物の細胞である、前記(75)〜(90)の何れかに記載の方法。
(92)IL−15:IL−15Rα複合体のIL−15結合部位が完全に占有されている、前記(75)〜(91)の何れかに記載の方法。
(93)IL−15:IL−15RαSu/Fc複合体の両方のIL−15結合部位が完全に占有されている、前記(88)に記載の方法。
(94)IL−15:IL−15Rα複合体が、複合体の電荷又はサイズ特性に基づいて精製される、前記(75)〜(93)の何れかに記載の方法。
(95)a)宿主細胞内でIL−15N72DとIL−15RαSu/Fc融合タンパク質を同時発現すること、b)IL−15N72DとIL−15RαSu/Fc融合タンパク質を発現するのに十分な条件下で宿主細胞を培地中で培養すること、及びc)IL−15N72D:IL−15RαSu/Fc融合タンパク質複合体を宿主細胞又は培地から精製すること(ここで、IL−15N72D:IL−15RαSu/Fc複合体の両方のIL−15結合部位は完全に占有されている)を含んでなる、IL−15N72D:IL−15RαSu/Fc融合タンパク質複合体を製造する方法。
(96)完全に占有されているIL−15N72D:IL−15RαSu/Fc融合タンパク質複合体を、複合体の電荷特性に基づいてアニオン交換クロマトグラフィーで精製する、前記(95)に記載の方法。
(97)完全に占有されているIL−15N72D:IL−15RαSu/Fc融合タンパク質複合体を、低イオン強度で中性pHの緩衝液を用いる結合条件及びイオン強度を上昇させる緩衝液を用いる溶出条件で、4級アミンに基づく樹脂を用いて精製する、前記(95)に記載の方法。
(98)IL−15又はIL−15突然変異体をコードする第1ポリヌクレオチド及びIL−15受容体融合タンパク質をコードする第2ポリヌクレオチドを含んでなる、細胞。
(99)細胞が、IL−15N72Dをコードする第1発現ベクター及びIL−15RαSu/Fc融合タンパク質をコードする第2発現ベクターを含んでいる、前記(98)に記載の細胞。
(100)二量体IL−15RαSu/Fc及び2つのIL−15N72D分子を含んでなる、単離された完全に占有されているIL−15N72D:IL−15RαSu/Fc複合体。
(101)複合体が、少なくとも90〜95%又はそれ以上精製された完全に占有されている複合体である、前記(100)に記載の複合体。
(102)複合体が、5.6〜6.5の間の等電点を有している、前記(100)に記載の複合体。
(103)約114kDaの分子量を有している、前記(100)に記載の複合体。
(104)IL−15N72D及び/又はIL−15RαSu/Fc融合タンパク質がグリコシル化されている、前記(100)に記載の複合体。
(105)前記(75)〜(97)の何れかに記載の方法に従って産生された、単離された完全に占有されているIL−15N72D:IL−15RαSu/Fc複合体。
(106)方法が、前記(100)〜(105)の何れかに記載の完全に占有されているIL−15N72D:IL−15RαSu/Fc複合体を対象に投与することを含んでなる、対象における免疫応答を調節する方法。
(107)免疫応答を増大又は減少する、前記(106)に記載の方法。
(108)方法が、前記(100)〜(105)の何れかに記載の完全に占有されているIL−15N72D:IL−15RαSu/Fc複合体を対象に投与することを含んでなる、腫瘍を有している対象における免疫応答を増強する方法。
その他の実施態様は以下の開示から明確になるだろう。
以下の定義は以下の明細書で用いられている特定の用語に対して提供されている。
本明細書の可変基の定義の何れかにおける化学基を列挙するリストは、何れかの単一基又は列挙されている基の組合わせとしての可変基の定義を包含する。本明細書の可変基又は態様についての実施態様の列挙は、何れかの単一の実施態様又は他の実施態様又はその部分との組み合わせとしての実施態様を包含する。
IgGクラスの免疫グロブリンはヒト血液中に最も豊富にあるタンパク質である。これらの血中半減期は21日もの長期に達する。融合タンパク質は、IgGのFc領域と、各種サイトカイン及び可溶性受容体のような、別のタンパク質のドメインとの結合体であると報告されている(例えば、Capon et al., Nature, 337:525-531, 1989; Chamow et al., Trends Biotechnol., 14:52-60, 1996); 米国特許第5,116,964号及び同第5,541,087号を参照されたい)。原型の融合タンパク質はIgGFcのヒンジ領域でシステイン残基を介して結合しているホモ二量体タンパク質であって、重鎖可変及びCH1ドメイン並びに軽鎖のないIgG分子と類似の分子をもたらす。Fcドメインを含む融合タンパク質の二量体特性は、別の分子との高次相互作用(すなわち、2価又は二重特異性結合)をもたらす点で好都合である。構造的相同性に起因して、Fc融合タンパク質は類似のアイソタイプを有するヒトIgGのそれに相当するインビボの薬物動態プロファイルを示す。IL−15又はIL−15融合タンパク質の血中半減期を引き延ばすためにそして/又はその生物活性を増大するために、本発明に開示又は記載されているヒト重鎖IgGタンパク質のFc部分と共有結合しているIL−15Rαと非共有結合しているIL−15を含有している融合タンパク質複合体を作成することが望ましい。
T細胞はその他の免疫細胞型(多形核球、好酸球、好塩基球、マスト細胞、B細胞、NK細胞)と共に免疫系の細胞要素を構成する、細胞のサブグループである。生理的条件下で、T細胞は免疫監視において並びに外来抗原の排除において機能する。しかしながら、病的条件下では、T細胞が疾患の原因及び伝播において重要な役割を果すという強力な証拠がある。これらの疾患において、中枢又は末梢における、T細胞免疫寛容の破綻は自己免疫疾患の原因における基本的な過程である。
本発明の可溶性融合タンパク質及び共役分子複合体は少なくとも2つの可溶性融合タンパク質を含んでいる。ある特定の実施態様では、第1融合タンパク質は、インターロイキン−15(IL−15)又はその機能的断片と共有結合している第1生物活性ポリペプチドを含み;第2融合タンパク質は可溶性インターロイキン−15受容体α(IL−15Rα)ポリペプチド又はその機能的断片と共有結合している第2生物活性ポリペプチドを含み、そしてここで第1融合タンパク質のIL−15ドメインは第2融合タンパク質の可溶性IL−15Rαドメインと結合して可溶性融合タンパク質複合体を形成する。本発明の融合タンパク質複合体は第1及び第2融合タンパク質の一方又は両方と結合している免疫グロブリンFcドメイン又はその機能的断片も含んでいる。Fcドメインが第1及び第2融合タンパク質と結合するFcドメインが相互作用して融合タンパク質複合体を形成することが好ましい。このような複合体は免疫グロブリンFcドメイン間にジスルフィド結合を形成することにより安定化させることができる。ある特定の実施態様では、本発明の可溶性融合タンパク質複合体は、IL−15ポリペプチド、IL−15変異体又はその機能的断片及び可溶性IL−15Rαポリペプチド又はその機能的断片を包含し、そこではIL−15及びIL−15Rαポリペプチドの一方又は両方が免疫グロブリンFcドメイン又はその機能的断片を更に包含している。
本発明の融合複合体は、IL−15又はIL−15Rαドメインと生物活性ポリペプチドの間に挿入されたフレキシブルなリンカー配列も包含していることが好ましい。リンカー配列は、IL−15又はIL−15Rαドメインに対する生物活性ポリペプチドの効果的な位置決めが両方のドメインに機能活性を持たせるようにしなければならない。生物活性ポリペプチドがTCRである場合の実施態様では、リンカー配列は、T細胞受容体が提示MHCペプチド複合体を認識できるように、そしてエフェクター分子を望ましい位置へ送達できるように、TCR分子結合溝を位置付ける。エフェクター分子の良好な提示は、T細胞を培養してこれを増殖すること、T細胞を本発明のTCR融合複合体と接触させること、そしてTCR融合複合体が細胞の更なる発生を阻害するか否かを評価することの連続工程を含んでいるインビトロアッセイを包含している、以下に開示されているアッセイによって確認されるように、細胞がT細胞増殖を誘発又は阻害するか、或いは特定部位に対する免疫応答を開始するか阻害するかの何れかの細胞の活性を調節することができる。
本発明は更に、核酸配列及び特に本発明の融合タンパク質をコードするDNA配列を提供する。好ましくは、DNA配列は、ファージ、ウィルス、プラスミド、ファージミド、コスミド、YAC、又はエピソームのような細胞外複製に適しているベクターによって担持されている。特に、所望の融合タンパク質をコードするDNAベクターを本明細書に記載されている調製方法を促進して有意量の融合タンパク質を得るために用いることができる。DNA配列を適切な発現ベクター、すなわち、挿入されるタンパク質をコードする配列の転写及び翻訳に必須の要素を含有しているベクターに挿入できる。各種の宿主−ベクター系を、タンパク質をコードする配列を発現するために用いることができる。これらは、ウィルスに感染した哺乳動物細胞系(例えば、ワクシニアウィルス、アデノウィルス等);ウィルスに感染した昆虫細胞系(例えば、バキュロウィルス);酵母ベクターを含有している酵母、又はバクテリオファージDNA、プラスミドDNA或いはコスミドDNAで形質転換された細菌のような微生物を包含する。用いた宿主−ベクター系に応じて、多数の適切な転写及び翻訳要素のうちの何れか1つを用いることができる。概して前記Sambrook et al., 及び前記Ausubel et al., を参照されたい。
本発明のタンパク質融合複合体を発現するために多数の戦略を用いることができる。例えば、上記の融合タンパク質構築物を、構築物を挿入し次いでライゲーションするために、ベクターに切れ目を入れる制限酵素を用いるような公知の方法によって適切なベクターに組み込むことができる。次いで融合タンパク質の発現のために、遺伝子構築物を含有しているベクターを適切な宿主に導入する。概要は、前記の Sambrook etal. を参照されたい。適切なベクターの選択は、クローニングプロトコルに関する因子に基づいて経験的に行うことができる。例えば、ベクターは用いられている宿主に適合し、そしてこれに対して適切なレプリコンを有していなければならない。更に、ベクターは、発現されるべき融合タンパク質複合体をコードするDNA配列を収容できなければならない。適切な宿主細胞は真核及び原核細胞を包含し、容易に形質転換できて培養培地中で迅速な成長を示すものが好ましい。特に好ましい宿主細胞は、E.coli、Bacillus subtillus等のような原核細胞、及び動物細胞及び酵母株、例えば、S.cerevisiaeのような真核細胞を包含する。哺乳動物の細胞、特にJ588、NSO、SP2−O又はCHOが一般に好ましい。その他の適切な宿主は、例えば、Sf9のような昆虫細胞を包含する。従来の培養条件が用いられる。前記の Sambrook を参照されたい。次いで、安定に形質転換された又はトランスフェクトされた細胞株を選択できる。本発明の融合タンパク質複合体を発現する細胞を公知の手順によって確認できる。例えば、免疫グロブリンと結合している融合タンパク質複合体の発現は、結合した免疫グロブリンに特異的なELISA及び/又はイムノブロッティングによって確認できる。IL−15又はIL−15Rαドメインに結合している生物活性ポリペプチドを含有している融合タンパク質の発現を検出するためのその他の方法は実施例に開示されている。
T2分子(T2M)と呼ばれる融合タンパク質は多鎖ポリペプチドから成っている(図1)。本発明の一実施態様では、これらのポリペプチドの1つは、国際特許公開第WO2008143794号公報(参照により本明細書に取り込まれている)に開示されているようにタンパク質結合ドメインとIL−15(又IL−15変異体)の間の融合を含んでいる。T2の第2ポリペプチドはタンパク質結合ドメイン、IL−15Rαドメイン及び免疫グロブリンドメインの間の融合を含んでいる。或いは、タンパク質結合ドメイン−IL−15融合タンパク質は、更に免疫グロブリンドメインと結合してもよい。好ましい免疫グロブリンドメインは他の免疫グロブリンドメインと相互作用して多鎖タンパク質を形成できるようにする領域を含んでいる。例えば、IgG1、CH2−CH3のような、免疫グロブリンの重鎖領域は相互作用してFc領域を作成できる。好ましい免疫グロブリンドメインはFc受容体又は相補体タンパク質結合活性を包含する、エフェクター機能を有し、そして又はグリコキシル化部位を有する領域も含んでいる。ある実施態様では、T2分子の免疫グロブリンドメインは、Fc受容体又は相補体の結合活性若しくはグリコキシル化を減少又は補強して、それにより得られるタンパク質の生物活性に影響を及ぼす突然変異を含んでいる。例えば、Fc受容体との結合を減少する突然変異を含んでいる免疫グロブリンドメインはFc受容体担持細胞に対する低い結合活性を有するT2分子を作成するために用いることができ、これはTCR−特異抗原を認識又は検出するように設計された試薬に対して有利であろう。
5’−TGTTGGGAATTCATCACGTGCCCTC−3’(配列番号6)
及びバックプライマ−:
5’−TGGTGTGAATTCTCTAATGCATTTGAGACTGG−3’(配列番号7)
を用いて、次のPCR条件下でKOD HOT Start DNAポリメラーゼ(EMD)によって増幅した:95C、2分、1サイクル;95C、20秒、65C、20秒;70C、20秒、35サイクル;72C、10分、1サイクル。ヒトIL−15RαSushi遺伝子のPCR産物をゲルで精製してEcoRIで消化した。この遺伝子をEcoRIで消化してあるpMC−c264scTCR/huIgG1内にライゲートした。ヒトIL−15RαSushiドメインをコードするDNA断片のpMC−c264scTCR/huIgG1内へのクローニングは以下の配列を含んでいるc264scTCR/huIL15RαSushi−huIgG1融合遺伝子をもたらした:3’−免疫グロブリン重鎖リーダー−264TCR V-α−ペプチドリンカー−264TCR V-β−ヒトTCR C-β−ヒトIL−15RαSushi−ヒトIgG1重鎖。図2に示されている、正確なヒトIL15RαSushi遺伝子挿入を含有している得られたベクター(pMC.c264scTCR−Su/IgG1.PUR)を診断PCRに基づいて同定し、そしてDNAシークエンシングで再確認した。c264scTCR/huIL−15RαSushi/huIgG1遺伝子及びタンパク質はそれぞれ図3及び図4に示される。
5’GTACGACTTAATTAACTCGAGCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGTTATGG3’(配列番号8)
及びバックプライマー:
5’CTTCCCGTTAACCCACCAGCTCAGCTCCACGTG3’(配列番号9)
を用いて増幅した。
5’CTGGTGGGTTAACGGGAAGGAGGTGCACAGTGGGGTC3’(配列番号10)
及びバックプライマー:
5’GAGGGCACGTGATGTCTGCTCTACCCCAGGCCTC3’(配列番号11)
を用いて増幅した。
5’GTAGAGCAGACATCACGTGCCCTCCCCCCATG3’(配列番号12)
及びバックプライマー:
5’CCTTGGTGCTAGCTCTAATACATTTGAGACTGGGGGTTGTCC3’(配列番号13)
を用いて増幅した。
5’CCAGTCTCAAATGTATTAGAGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTC3’(配列番号14)
及びバックプライマー:
5’GTAATATTCTAGACGCGTTCATTATTTACCAGGAGACAGGGAGAGGCTCTTC3’(配列番号15)
を用いて増幅した。
5’CTGGTGGGTTAACGGGAAGGAGGTGCACAGTGGGGTC3’(配列番号10)
及びバックプライマー:
5’CCTTGGTGCTAGCTCTAATACATTTGAGACTGGGGGTTGTCC3’(配列番号13)
を用いるPCRによって遺伝子断片を作成した。
5’CTGGTGGGTTAACGGGAAGGAGGTGCACAGTGGGGTC3’(配列番号10)
及びバックプライマー:
5’GTAATATTCTAGACGCGTTCATTATTTACCAGGAGACAGGGAGAGGCTCTTC3’(配列番号15)
を用いるPCRによってTCRβc/huIL15RαSushi/huIgG1融合遺伝子を作成するための鋳型の役割を果した。
1)c264scTCR/huIL15+c264scTCR/huIL15RαSushi、
2)c264scTCR/huIL15D8A+c264scTCR/huIL15RαSushi、及び
3)c264scTCR/huIL15D8N+c264scTCR/huIL15RαSushi。
160nMの精製したc264scTCRhuIL15融合タンパク質及び160nMの精製したc264scTCRhuIL15RαSushi融合タンパク質を4℃で3時間培養して、これらの複合体を生成した。次いで染色する、細胞を洗浄緩衝液(0.5%のBSAと0.05%のアジ化ナトリウムを含有しているPBS)で1度洗浄して、0.5μgのビオチニル化マウスモノクローナル抗ヒトTCR Cβ抗体(BF1)で100μLの洗浄緩衝液中、4℃で30分間染色した。細胞を1度洗浄して、0.5μgのR−フィコエリトリン共役ストレプタビジンで100μLの洗浄緩衝液中、4℃で30分間染色した。細胞を洗浄してフローサイトメトリーで分析するために再懸濁した、
5’GACTTCAAGCTTAATTAAGCCACCATGGACAGACTTACTTCTTC3’(配列番号16)
及びバックプライマー:
5’−CTTCCCGTTAACCCACCAGCTCAGCTCCACGTG−3’(配列番号9)
を用いて増幅した。
5’CTGGTGGGTTAACGGGAAGGAGGTGCACAGTGGGGTC3’(配列番号10)
及びバックプライマー:
5’CACCCAGTTGTCTGCTCTACCCCAGGCCTC3’(配列番号17)
を用いて増幅した。
5’CTGGGGTAGAGCAGACAACTGGGTGAATGTAATAAGTGATTTG3’(配列番号18)
及びバックプライマー:
5’CCTCATGCATTCGAATCCGGATCATTAAGAAGTGTTGATGAACATTTGG3’(配列番号19)
を用いて増幅した。
5”CTGGTGGGTTAACGGGAAGGAGGTGCACAGTGGGGTC3’(配列番号10)
及びバックプライマー:
5’CCTCATGCATTCGAATCCGGATCATTAAGAAGTGTTGATGAACATTTGG3’(配列番号19)
を用いるPCRによって遺伝子断片を生成した。
発現ベクターを、いくつかの異なる形質転換、トランスフェクション又は形質導入方法によって多様な宿主細胞株内に導入することができる。このような一方法では、CHO−K1細胞(5×105)を6ウェルのプレートに播種してCO2インキュベータ中で1晩培養した。細胞を、c264scTCR/huIL15N72D融合遺伝子を含有している発現ベクター5μgで、10μLのMirus TransIT−LT1試薬(Mirus)を用いて製造会社のプロトコールに従ってトランスフェクトした。トランスフェクション後1日目に細胞を4mg/mLのG418(Invitrogen)を用いて選択した。G418耐性細胞を増殖し、TCR/IL15融合タンパク質発現細胞を限界希釈法で3回サブクローンして産生細胞株を、捕獲抗体、抗ヒトTCR Cβ抗体(BFI)及び検出抗体であって既に記載されている(出願公開第WO2008143794号公報を参照されたい)ビオチニル化抗ヒトIL−15抗体(BAM247、R&D Systems)を用いるTCR及びhuIL15特異的ELISAによって、培養培地中に分泌される可溶性融合タンパク質のレベルに基づいてスクリーニングした。次いで、c264scTCR/IL15N72D産生細胞株を、c264scTCR/huIL15RαSushi−huIgG1融合遺伝子を含有している偽型レトロウィルスベクターで以下のようにして形質導入した。
c264scTCR/huIL15N72D及びc264scTCR/huIL15RαSushi/huIgG1を発現する細胞株を生育条件(すなわち、小規模培養フラスコ、スピナー、若しくは撹拌フラスコ、又は大規模の中空繊維、ウェーブバッグ若しくは撹拌タンク生物反応器、又は同等の培養容器及び反応器中で、25〜37℃で5〜28日間)下で培養して、培養培地中に可溶性タンパク質としてT2分子を産生した。T2分子を精製するために、培養培地をpH調節してセファロースに共有結合させた抗TCR抗体(BF1)を含有している免疫親和性カラムに付した。カラムを洗浄して、T2分子を0.5Mのクエン酸ナトリウム、pH4.0で溶出した。溶出したタンパク質を濃縮して緩衝液をリン酸緩衝食塩液(PBS)に交換し、次いでrプロテインA−セファロースカラムに付した。洗浄工程に続いて、タンパク質を0.5Mのクエン酸ナトリウム、pH4.0で溶出し、次いでPBSに緩衝液を交換した。得られたタンパク質をクーマシー−染色SDS−PAGE及びサイズ排除クロマトグラフィーで特性化した。
T2分子のドメインの結合活性を特性化してこれらの活性をその他の融合タンパク質のそれと比較するためにインビトロアッセイを実施した。IgG1ドメインを特性化するために、マイクロタイターウェルを抗ヒトIgG1抗体でコーティングして、c264scTCR/huIL15N72D及びc264scTCR/huIL15RαSushi/huIgG1鎖から成る、等モル量の精製したT2タンパク質、又は精製した c264scTCR/huIgG1融合タンパク質をウェルに適用した。結合及び洗浄工程に続いて、結合したタンパク質を標準的なELISA条件下で抗ヒトIgG1抗体を用いて検出した。
T2分子のIL−15ドメインの活性も評価した。マイクロタイターウェルを抗ヒトIL−15抗体でコーティングして、c264scTCR/huIL15N72D及びc264scTCR/huIL15RαSushi/huIgG1鎖から成る、精製したT2タンパク質、又は精製したc264scTCR/huIL15N72D融合タンパク質の等モル量をウェルに適用した。結合及び洗浄工程に続いて、結合したタンパク質を標準的なELISA条件下で抗ヒトIL−15抗体で検出した。
T2分子のIgG1 Fcドメインの結合活性を細胞結合アッセイで特性化した。Fcガンマ受容体担持U937細胞を33nMのT2タンパク質(c264scTCR/huIL15N72D及びc264scTCR/huIL15RαSushi/huIgG1鎖から成る)、c264scTCR/huIgG1又はA2AL9scTCR/IgG1(陰性コントロール)と20分間培養した。細胞を1度洗浄して、PE−共役p53(aa 264−272)ペプチド/HLA−A2四量体と培養した。U937細胞表面上のFcガンマ受容体への結合を、図19Aに示すように、フローサイトメトリーで分析した。タンパク質の濃度範囲を用いる同様なU937結合試験も実施して、染色細胞に対する平均蛍光強度を図19Bにプロットした。
T2タンパク質の細胞上のペプチド/MHC標的との結合活性を評価するために、HLA−A2陽性T2細胞を各種の量のp53aa264−272ペプチドでパルスした。次いで、細胞をそれぞれ83nMのT2タンパク質(c264scTCR/huIL15N72D及びc264scTCR/huIL15RαSushi/huIgG1鎖から成る)、c264scTCR/huIgG1又はA2AL9scTCR/IgG1(陰性コントロール)と培養した。細胞をビオチニル化抗TCR Ab(BF1)及びストレプタビジン−PEと培養した。次いで、細胞を、図21Aに示すようにフローサイトメトリーで分析した。染色細胞に対する平均蛍光強度を図21Bにプロットした。
上で示したように、T2分子のIL−15、IL−15Rα及びIgG成分と融合した複数の異なったTCRドメインを有することは有用である。これは、1つ以上の抗原標的活性を単一の多鎖タンパク質内に存在させることができる。この手法の実行可能性を明らかにするために、c264scTCR−Sushi−hIgG1−pMSGVc及びc149scTCR−hIL15N72D−pMSGVn発現ベクターをIMDM−10培地で培養したCHO細胞内に同時トランスフェクトした。室温で6日間トランスフェクト体を培養した後、培養上澄液を採取した。c149scTCR/huIL15N72D及びc264scTCR/huIL15RαSushi/huIgG1のT2分子をELISAで特性化した。c264scTCR/huIL15RαSushi/huIgG1及びc264 scTCR/huIL15N72Dの精製したT2分子をコントロールとして用いた。TCRドメインを評価する1つのアッセイでは、ウェルを抗ヒトTCR Ab(BF1)でコーティングし、融合タンパク質を添加して、結合したタンパク質をビオチニル化抗ヒトTCR Ab(W4F−BN)で検出した。
IL−15による治療可能性の主な制約はインビボにおけるサイトカインの非常に短い生物学的半減期である。動物モデルにおけるT2分子の生物学的薬物動態特性を評価するために、HLA−A2/Kbトランスジェニックマウス(5匹マウス/時点)に精製したT2タンパク質(c264scTCR/huIL15N72D及びc264scTCR/huIL15RαSushi/huIgG1鎖から成る)135μg/マウスを静脈内注射した。このc264scTCRが制限されている、HLA−A2.1の存在がタンパク質の薬物動態に影響を与え、そして他の非ヒトモデルより薬物動態より関連性のある「ヒト化」観点をもたらすはずであるので、HLA−A2/Kbトランスジェニックマウスモデルを選択した。この試験で、注射後0、1、4、8、24、48、72、及び96時間点で血液を採取して血清中のT2タンパク質の濃度をELISAで測定した。2つの異なったELISA形態を用いた:1)ヤギ抗ヒトIgG Ab捕獲及び抗ヒトTCR Ab(W4F−BN)検出、又は2)ヤギ抗ヒトIgG Ab捕獲及び抗ヒトIL−15Ab検出。これらのアッセイは無傷タンパク質及び多鎖タンパク質複合体の安定性の評価を可能にする。
T2分子の治療効果を確認するために、ヌードマウスにおいてp53+HLA−A2+A375メラノーマ細胞株を有する原発腫瘍増殖モデルにおける抗腫瘍活性を試験した。腫瘍細胞をヌードマウスに皮下注射して、腫瘍を治療開始前に100mm3まで生育させた。腫瘍担持マウスに、32μg/用量(1.6mg/kg)のc264scTCR/huIL15N72D及びc264scTCR/huIL15RαSushi/huIgG1鎖から成るT2タンパク質、32μg/用量(1.6mg/kg)のc264scTCR/huIL2、又は60μg/用量(3mg/kg)の264scTCR/huIgG1を静脈内注射した。マウスを1日おきに1週間処置し(3回注射)、9日の休息期間に続いてその後1日おきに更に一週間処置した(3回注射)。試験中に、腫瘍の生育を測定して腫瘍容量をプロットした(図27)。結果をPBSのみで処置したマウスにおけるA375腫瘍の生育と比較した。
国際出願公開第WO2008143794号公報に開示されているように、IL−15Rβγ鎖と相互作用するその能力を増大又は減少してその生物活性に影響を及ぼす突然変異を1L−15ドメインに導入することができる。例えば、上で示したように、N72D置換はIL−15の生物活性を5〜10倍増大することができる。別の例では、アンタゴニスト機能をもたらすIL−15の活性を減少することが有用である。T2分子形態に関連するこのような突然変異の効果を試験するために、IL−15ドメインの8位(すなわち、D8N)及び65位(すなわち、N65D)の置換を含んでいるc264scTCR/huIL15構築物を作成してc264scTCR/huIL15RαSushi/huIgG1タンパク質と同時発現した。c264scTCR/huIL15変異体及びc264scTCR/huIL15RαSushi/huIgG1鎖の得られた複合体を、実施例5に記載されているように32Dβ細胞を用いるIL−15生物活性について試験した。図28に示したように、IL−15D8N及びN65D変異を含んでいるT2分子は、IL−15N72Dドメイン又はc264scTCR/huIL15融合を含んでいるT2分子と比較して32Dβ細胞増殖をサポートするそれらの能力の有意な減少を示した。実施例5の結果と一致して、IL−15N72Dドメインを含んでいるT2分子はc264scTCR/huIL15N72D又はc264scTCR/huIL15融合体の何れかよりもより高いIL−15活性を示した。
いくつかの適用では、T2複合体を用いて特異抗原を標的化する必要はない。このような分子では、TCR結合ドメインのような抗原特異的ドメインは突然変異によって又は完全に欠失させることによって不活性化できる。本明細書に記載されている方法を用いて、T2MΔTCRと称するhuIL15RαSushi/huIgG1及びhuIL15 D8N鎖を含むような分子の活性を、c264scTCR/huIL15RαSushi/huIgG1及びc264scTCR/huIL15N72D鎖を含むT2分子(T2Mと称する)及びhuIgG1鎖を欠失しているT2分子(c264scTCR/huIL15RαSushi及びc264scTCR/huIL15N72D、T2MΔIg又はc264scTCR二量体と称する)と比較した。実施例5に記載されているように32Dβ細胞生育をサポートする能力を試験したときに、T2MΔTCRは組み換えヒトIL−15を用いて観察されたものの>24倍である非常に強いIL−15活性を示した(図33A)。
T2分子の免疫刺激活性を更に特性化するために、T2M、T2MΔTCR、IgG1 CH1ドメインを欠失しているT2MΔTCR(T2MΔTCRΔCH1)、Fc−LALA突然変異を有するT2M(T2MLALA)及びIL−15D8N突然変異を有するT2(T2MD8N)をC57BL/6マウスにおいてNK及びCD8T細胞の増殖を誘発するそれらの能力について試験した。更に、c264scTCR/huIL15N72D、c264scTCR/huIL15RαSushi及びc264scTCR/huIL15N72D+c264scTCR/huIL15RαSushi複合体を評価した。
多重結合ドメインのスカフォールドとして作用するIL−15とIL−15Rα/IgGFcの融合ドメインの能力を更に特性化するために、huIL15N72Dと結合したH−2Kb−制限OVAaa257−264ペプチド(SIINFEKL(配列番号20))に特異的な1本鎖TCRドメイン(OT1scTCR)とhuIL15RαSushi/huIgG1融合と結合した1本鎖CD8α/βドメインを含む、融合タンパク質複合体(OT1−CD8−T2M)を作成した。1本鎖CD8α/βドメインは、(G4S)4ペプチドリンカー(配列番号21)を介してネズミCD8βの細胞外ドメインと結合しているネズミCD8αの細胞外ドメインを含んでいる。CD8が、TCR特異的ペプチド/MHC接合部と遠位のMHC分子内の部位と結合することが十分に特性化される。従って、OT1−CD8−T2M複合体のOTscTCRとscCD8α/βドメインの両方がOVAaa257−264/H−2Kb−分子上の異なった部位で相互作用すると期待される。
(ペプチド/MHCクラスI(pMHCI)四量体の製造)−
上記のようなC57BL/6マウスリンパ球から抽出した全RNAから、ネズミH−2Kb遺伝子をクローンした。細胞外領域をHLA−A*0201コード配列(31)を置き換えるHLA−A*0201重鎖発現ベクター(31)内にライゲートした。β2m、HLA−A*0201及びH−2Kb発現ベクターを個々にE.coli内に形質転換し、記載(31)のようにして組み替えタンパク質の発現を誘発して、不溶性封入体として発現した。ペプチドと共に複合体活性及び溶解性タンパク質を、http://www.microbiology.emory.edu/altman/ jdaWebSite_v3/ptetPrepOverview.shtmlに記載されているリフォールディング方法で得た。p53(aa264−272)及び(aa149−157)ペプチド/HLA−A*0201試薬をそれぞれA2/p53.264−272及びA2/p53.149−157と称し、OVA(aa257−264)ペプチド/2KbをKb/OVA。257−264と称する。
免役プレート(Maxisorb, Nunc, Rochester, NY)を、c264scTCR融合タンパク質を捕獲するための(BF1)8A3.31mAbで、或いはOT1scTCR融合タンパク質を捕獲するためのH57−597mAbでコーティングした。洗浄した後、結果の部に詳述したような各種プローブを用いてタンパク質を検出した。次いで、ABTS(2,2’−アジノビス[3−エチルベンゾチアゾリン−6−スルホン酸]−ジアンモニウム塩)基質を加えて、96ウェルプレートリーダー(Versamax, Sunnyvale, CA)を用いて405nmにおける吸光度を測定した。
c264scTCR融合タンパク質複合体を特性化するために、T2細胞をペプチド負荷エンハンサー(PLE、Altor BioScience Corp., Miramar, FL)の存在下、37℃で2時間p53(aa264−272)ペプチドでパルスした。OT1scTCR融合タンパク質複合体について、ネズミリンパ腫EL4細胞を100μg/mlのOVAペプチド及びPLEで37℃で6時間パルスした。各種のbirA融合タンパク質(SA−PEと複合した)を加えて4℃で1時間培養した。サンプルを2回洗浄して、CellQuestソフトウェア(BD Biosciences, San Jose, CA)を用いてFACScanフローサイトメトリーで分析した。
先に記載されている(25)ようにして細胞増殖を測定した。すなわち、32Dβ細胞(1×105細胞/ウェル)を、等モル濃度のTCR/hIL−15RαSuの存在下又は非存在下で、濃度を増大させたscTCR/hIL−15又はscTCR−hIL15突然変異タンパク質と37℃で48時間培養した。細胞増殖試薬WST−1(Roche Applied Science, Indianapolis, IN)を製造会社の手順に従って細胞増殖の最後の4時間の間に添加した。代謝的に活性な細胞によるWST−1の着色フォルマザン色素への変換を440nmにおける吸光度測定によって確認した。Prizm4ソフトウェア(GraphPad Software, La Jolla, CA)で適合させる非線形回帰可変傾斜曲線によって実験データから作成した用量依存曲線でEC50を確認した。
Ot1scTCR融合タンパク質のそれらの同種pMHCIとの親和定数を、BIAcore 2000計器(GE Healthcare, Piscataway, NJ)で表面プラズモン共鳴(SPR)手法を用いて確定した。ビオチニル化pMHCI複合体を、HBS緩衝液(10mMのHEPES、150mMのNaCL、3.4mMのEDTA、0.005%のp20界面活性剤、pH7.4)中2μg/mlのタンパク質を流速10μl/分で注入して、SA5センサーチップ(GE Healthcare, Piscataway, NJ)のストレプタビジンでコーティングした表面上に固定化した。これは固定化したpMHCI複合体の1000〜1200RUをもたらした。
c264scTCR/hIL−15と称する生物活性な、二元機能を有する融合タンパク質は、hIL−15のN末端を3つのドメイン、p53(aa264−257)ペプチド抗原(c264scTCR)に特異的なHLA−A*0201−制限キメラTCRと融合することによって生成できることを先に示した(25)(図36A)。c264scTCR及びヒトIL−15Rαのsushi結合ドメイン(aa1−66)(hIL−15RαSu)を用いて同様な融合タンパク質を構築し、これはhIL−15結合に応答可能な構造要素を含有することが示されている。この融合タンパク質は遺伝子学的にbirAペプチドタグと結合してストレプタビジンの存在下でビオチニル化及びそれに続く多量体化を可能にする(32)。この融合タンパク質をc264scTCR/hIL−15RαSu/birAと称し、そのCHO細胞からの発現及び精製はc264scTCR/hIL−15のそれと同様であった(25)。これらの融合タンパク質は細胞培養上澄液のリットル当りミリグラムのレベルで容易に産生できる(データは示されていない)。
CD8分子がOT1 TCRとその同種OVAペプチド/H2−Kb複合体の間の相互作用に極めて重要な役割を果していることが先に明らかにされているので(35〜37)、hIL−15:hIL−15RαSuスカフォールドは、細胞表面で発現されるOVAペプチド/H−2Kbに対するOT1TCR結合親和性を、そして細胞及び接着分子非存在条件下でCD8分子が増大するか否かを評価する機会をもたらす。これを実施するために、最初に、フレキシブルなリンカーを用いてネズミCD8のα及びβ鎖の細胞外ドメインを融合して1本鎖形態のネズミCD8分子(scCD8)を作成した。この融合遺伝子をレトロウィルス発現ベクター中でhIL−15RαSu/birAと融合した。次いで、組み換えレトロウィルスをOT1scTCR/hIL−15融合タンパク質を発現しているCHO細胞株を感染するために用いた。ヘテロ二量体融合タンパク質複合体を培養した組み替えCHO細胞の上澄液から抗TCR抗体ベースのアフィニティークロマトグラフィーを上記のように用いて精製した。この精製したタンパク質を捕獲試薬として抗TCR抗体及びプローブとしてビオチニル化抗mCD8α又は抗mCD8βmAbの何れかを用いるELISAに付した。
上で示したように、hIL−15及びhIL−15RαドメインのN−末端は複合体の遠位末端にあり、このスカフォールドが多鎖タンパク質のポリペプチドと融合するために適しているか否かという問題を提起している。hIL−15及びhIL−15RαSuスカフォールドを用いて可溶性で、生物活性なヘテロ二量体TCRα/βを構築できるか否かを確認するために、細胞外OT1 TCR Vα−Cα及びVβ−CβドメインのC−末端をそれぞれ、hIL−15及びhIL−15RαSu/birAのN−末端に結合した。公表されているα/βTCRの結晶構造に基づくと、適切に折り畳まれたOT1 TCRα/β分子のTCR Cα及びCβ C−末端アミノ酸は〜18Å離れていると推測される(42)。OT1 TCRα/hIL−15及びOT1 TCRβ/hIL−15αSu/birA融合遺伝子を2つの別々の発現ベクター内にクローンしてCHO細胞内に同時にトランスフェクトした。分泌された融合タンパク質複合体を上記のように抗TCR Cβ mAbアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製した。還元条件下のクーマシー染色SDS−PAGEで分析すると、精製されたタンパク質のバンドが、2つの融合分子それぞれの計算された単量体MW(40kDa)と一致して、50kDaに移動した(データは示されていない)。
c264scTCR二量体のhIL−15:hIL−15RαドメインのIL−15受容体(IL−15RβγC)結合能力をhIL−15Rβ及びネズミγC(mγC)鎖を担持している32Dβ細胞を用いるフローサイトメトリー分析で評価した。これらの検討は野生型hIL−15ドメインを含有しているc264scTCR二量体を、更にhIL−15Rβ鎖との結合を増強する(N72D)又は減少する(D8N)ことが先に示されている(25)IL−15突然変異タンパク質ドメインを有する二量体も用いて実施した。また、本発明者らは、これらの突然変異がhIL−15:hIL−15RαSu複合体の形成に影響を及ぼさないことを明らかにしている(25)。c264scTCR二量体と培養した後、32Dβ細胞を抗TCR mAbで染色して細胞に結合している融合タンパク質二量体を検出した。図41Aに示したように、32Dβ細胞はhIL−15野生型又はhIL−15N72Dドメインを含有しているc264scTCR二量体によって確実に染色されたが、hIL−15D8Nドメインを含有しているものでは染色されず、複合体のIL15:IL−15RαSu部分が予測されたIL−15RβγC結合活性を保持していることを示唆した。
T2分子、IgG1 CH1ドメインを欠失しているT2M(T2MΔCH1)及び非標的化T2MΔTCRΔCH1タンパク質複合体の更なるインビボ効果を確認するために、腫瘍担持免疫正常C57BLマウスにおいて毒性及び抗腫瘍活性を試験した。B16(5×105/マウス)又はEG7(1×106/マウス)ネズミ腫瘍細胞をC57BL/6NHsdマウスに試験0日目に皮下に注射した。試験1、4、8及び11日目に腫瘍担持マウスに、51又は25.5μg/用量のT2タンパク質(c264scTCR/huIL15N72D及びc264scTCR/huIL15RαSushi/huIgG1鎖から成る)、47.7μg/用量のT2MΔCH1(c264scTCR/huIL15N72D及びc264scTCR/huIL15RαSushi/huIgG1CH2−CH3鎖から成る)(T2タンパク質の51μg/用量と等モル)、16.6又は8.3μg/用量のT2MΔTCRΔCH1(huIL15N72D及びhuIL15RαSushi/huIgG1CH2−CH3鎖から成る)(それぞれT2タンパク質の51及び25.5μg/用量と等モル)、又は1.2μg/用量のrhIL−15(T2タンパク質の25.5μg/用量と等モル)を静脈内に注射した。試験期間中、動物の体重及び腫瘍の容量を測定して結果をプロットした(図44A−B及び45A−B)。
同様な標的化IL−15:IL−15Rα−Fc複合体を更に特性化するために、c264scTCR/huIL−15及びc264scTCR/huIL−15Rα/IgG1 Fc融合タンパク質を同時発現する組み換えCHO細胞株を作成した。ある場合は、ヒトIgG1ドメインは全重鎖定常(CH1−CH2−CH3)を包含し、第2の場合は、CH2−CH3ドメイン(すなわち、ΔCH1)又はFCドメインを上記のようにして用いた。ヒトIgG1 CH2−CH3ドメイン又はFcドメインのタンパク質配列を図46に示す。簡単にするために、この実施例では、得られたc264scTCR/huIL15N72Dスーパーアゴニスト:c264scTCR/huIL15Rα/IgG1 CH1−CH2−CH3複合体をT2分子(T2M)と、そしてc264scTCR/huIL15N72Dスーパーアゴニスト:c264scTCR/huIL15Rα/IgG1 CH2−CH3複合体をT2M2(上記のようにT2MΔCH1とも)と称する。これらの複合体の利点はFcドメインを介する二量体化及びIL−15とIL−15Rαドメインの間の相互作用が、IL−15Rβγ陽性細胞及びFc受容体(FcR)陽性細胞と結合可能な四量体標的化分子を生ずることである。また、これらのドメインそれぞれの活性を同種受容体との相互作用を減少する突然変異体によって分析できる。組み替えCHO細胞による可溶性発現の後、これらの複合体を抗TCR CβmAb−セファロース及びプロテインAセファロースを用いるアフィニティークロマトグラフィーで精製して均質にした。サイズ排除クロマトグラフィーが、無傷の複合体について期待されているサイズに分子が移動したことを示した。
更なる疾患標的分子を作成するためのhuIL−15:huIL−15RαSuスカフォールドの有用性を明らかにするために、抗ヒトCD20単鎖抗体のC−末端をhuIL−15N72D及びhuIL−15RαSu/huIgG1 CH2−CH3(Fc)鎖のN末端と結合して構築物を作成した。抗ヒトCD20単鎖抗体(抗CD20scAb)配列は柔軟なリンカー配列を介して結合しているリツキシマブ抗体の重鎖及び軽鎖Vドメインのコード領域を包含している。抗CD20scAb/hIL−15N72D構築物の核酸及びタンパク質配列をそれぞれ、図53及び54に示す。抗CD20scAb/huIL−15RαSu/huIgG1 Fc構築物の核酸及びタンパク質配列をそれぞれ、図55及び56に示す。これらの配列を上記のような発現ベクター内にクローンして発現ベクターをCHO細胞内にトランスフェクトした。2つの構築物の同時発現が、可溶性抗CD20 scAb/huIL−15N72D:抗CD20 scAb/huIL−15RαSu/huIgG1 Fc複合体(抗CD20 scAb T2Mと称する)の形成及び分泌を可能にして、これをプロテインAアフィニティークロマトグラフィーを用いてCHO細胞培養上澄液から精製した。
以前の研究は組み替えIL−15は哺乳動物の細胞によって発現されにくいことを示している(A. Ward et al., Protein Expr Purif 68 (2009) 42-48)。しかしながら、IL−15Rαを用いる細胞内複合体形成はERにおいてIL−15分解を抑制することが報告されている(C. Bergamaschi et al., J Biol Chem 283 (2008) 4189-4199)。従って、IL−15は、これをIL−15Rαと同時発現するとより高いレベルで産生できると仮定された。N末端にいわゆる「sushi」ドメイン(Su)を含んでいる、可溶性IL−15Rα断片はサイトカイン結合に関与する殆どの構造要素を担持することが知られている。可溶性IL−15RαSu(その膜貫通ドメインを含まない)とIL−15は溶液中で非常に安定なヘテロ二量体複合体を形成でき(複合体のKd=100pM(G. Bouchaud et al., J Mol Biol 382 (2008) 1-12))、そしてこれらの複合体はIL−15Rβγc複合体を介して免疫応答を調節(すなわち、刺激又は阻害)できる(E. Mortier et al., J Biol Chem 281 (2006) 1612-1619; M.P. Rubinstein et al., Proc Natl Acad Sci U S A 103 (2006) 9166-9171; T.A. Stoklasek et al., J Immunol 177 (2006) 6072-6080; G. Bouchaud et al., J Mol Biol 382 (2008) 1-12)。従って、IL−15N72D及びIL−15RαSu/Fcから成る複合体の産生のために選択した(図64を参照されたい)。IL−15RαSuドメインをヒトIgG−Fc領域と遺伝的に融合して精製及び鎖間ジスルフィド結合による二量体化を促進した。IL−15N72DとIL−15RαSu/Fcを同時発現するために、2つの個別レトロウィルスに基づく発現ベクター、pMSGV−IL−15RαSu/Fc及びpMSGV−IL−15N72Dを構築して、CHO細胞に同時にトランスフェクトした。組み替えCHO細胞を、2つの発現ベクターによってもたらされたネオマイシン及びピューロマイシン耐性要素に基づいて選択し、次いで、限定希釈クローニングを用いて個々の生産細胞株を作成した。無血清規定培地中で、ELISAに基づき、IL−15N72D:IL−15RαSu/Fc複合体を約100mg/L産生できるクローンを同定した。この結果は、IL−15が哺乳動物細胞中でIL−15RαSuドメインと同時発現されると高レベルで発現され得るということを明らかにした。
IL−15RαSu/FcとIL−15N72Dを組み替えCHO細胞内で同時発現して細胞内で構築すると、細胞培養上澄液内に4つの異なったタンパク質の形態が予測された:1)2つのIL−15N72Dサブユニットで完全に占有されている二量体IL−15RαSu/Fc分子、2)1つのIL−15N72Dサブユニットで部分的に占有されている二量体IL−15RαSu/Fc分子、3)IL−15結合がない少量の遊離ホモ二量体IL−15RαSu/Fc分子、及び4)遊離IL−15N72D。IL−15N72DはFc領域を欠失しているので、培養上澄液中の全てのFcを担持する融合タンパク質から遊離IL−15N72Dを分離するためにrプロテインAに基づくアフィニティー精製工程を用いた。
IL−15及びインビトロで構築されたIL15:IL−15Rα/Fc複合体は、マウスにこれらのタンパク質を腹腔内注射したときに、それぞれ1時間及び20時間の血清半減期を有していたことが先に報告されている(T.A. Stoklasek et al., J Immunol 177 (2006) 6072-6080)。IL−15及び同時に発現させた、精製したIL−15:IL−15αSu/Fc複合体を静脈内に投与したときに同様に挙動するか否かを評価するために、それらの薬物動態パラメータをCD−1マウスで確認した。静脈内投与は、ヒトにおいてIL−15:IL−15αSu−Fc複合体に関して用いられる薬剤送達のルートであると思われるので静脈内投与を選択した。雌のマウスに1.0mg/kgのIL−15:IL−15αSu/Fc又は0.28mg/kgのIL−15(等モル用量)を静脈内に注射して、IL−15については注射後15分から8時間、そしてIL−15N72D:IL−15αSu/Fcについては30分から72時間の様々な時点に血液を採取した。IL−15N72D:IL−15αSu/Fcの血清濃度を2つのELISA形態、無傷の複合体を検出する第1法(抗IL−15AB検出)及びIL−15αSu/Fc融合タンパク質のみを検出する別法(抗ヒトIgG FcAb検出)を用いて評価した。IL−15の濃度は標準的なIL−15特異的ELISAで評価した。
同時発現及び精製されたIL−15N72D:IL−15RαSu/Fc複合体の生物活性をIL−15依存性32Dβ細胞増殖アッセイを用いて評価した。このアッセイのために、インビトロで構築した(IVA)IL−15N72D:IL−15RαSu/Fc複合体(IL−15N72D:IL−15RαSu/Fc IVA)もIL−15N72DとIL−15RαSu/Fcを1:1の比で40℃で30分混合して作成した。図68に示すように、IL−15N72D:IL−15RαSu/Fc複合体は32Dβ細胞の生育をサポートするIL−15N72D:IL−15RαSu/Fc IVAと同等の活性を有していた。IL−15N72D:IL−15RαSu/Fc複合体は15.61pMのEC50を示し、そしてIL−15N72D:IL−15RαSu/Fc IVAは15.83pMのEC50を示した。このことは、同時発現されたIL−15N72D:IL−15RαSu/Fc複合体は細胞内で適切に処理されて精製後も完全なIL−15活性を保持していることを明らかにしている。従って、本明細書に提示されている方法は、個々に産生したインビトロ構築及びある場合はリフォールディングタンパク質を用いる現在の戦略よりもcGMPグレードの臨床材料を作成するための優れた手段を示している。
IL−15RαSu/Fc融合遺伝子をヒトIL−15Rα(ヒトIL−15Rαのa
a1−66)のsushiドメイン及びヒトIgG1Fc断片をコードするDNA鋳型の
オーバーラップPCR増幅によって構築した。シグナルペプチド−IL−15RαSuコ
ード領域(R.L. Wong et al., Protein Eng Des Sel 24 (2011) 373-383)及びヒトIg
G1−Fc遺伝子断片(L.A. Mosquera et al., J Immunol 174 (2005) 4381-4388)をプ
ライマー対:
BA494:5’−GACTTCAAGCTTAATTAAGCCACCATGGAC
AGACTTACTTCTTC−3’(配列番号16);
BA550R:5’−GTGAGTTTTGTCACAAGATTTCGGCTCTC
TAATGCATTTGAGACTGGGGGTTG−3’(配列番号22)、及び
BA550F:5’GAGCCGAAATCTTGTGACAAAACTCAC−3’(配列番号23);
BA393R:5’−GTAATATTCTAGACGCGTTCATTATTTAC
CAGGAGACAGGGAGAGGCTCTTC−3’(配列番号15)
をそれぞれ用いて増幅した。得られたIL−15RαSu/Fc融合遺伝子をピューロマ
イシン耐性発現ベクターpMSGV−1(M.S. Hughes et al., Hum Gene Ther 16 (2005
) 457-472)内にライゲートして発現ベクターpMSGV−IL−15RαSu/Fcを
構築した。
IL−15N72DとIL−15RαSu/Fcの融合タンパク質(図64を参照されたい)を同時発現するために、pMSGV−IL−15RαSu/FcとpMSGV−IL−15N72DをCHO細胞内に同時にトランスフェクトした後、2mg/mLのG418(Hyclone, Logan, UT)と10μg/mLのピューロマイシン(Hyclone, Logan, UT)を含有している培地中で選択した。IL−15RαSu/Fc融合タンパク質も、コントロールとして組み換えヒト野生型IL−15(IL−15wt)を負荷するのに用いるために、別にCHO細胞で発現させた。融合タンパク質の産生のために、組み替えCHO細胞を無血清規定培地(SFM4CHO、Hyclone, Logan, UT)中で37℃で生育した。培養物の生育細胞密度が最大に達したとき、可溶性複合体を蓄積するために培養温度を30℃に下げた。次いで、培養物の生育細胞密度が約10%生育細胞に達したときに培養上澄液を採取した。
組み替えCHO細胞培養培地を遠心分離し、濾過して細胞と残骸を除去してから、1MのTris−HCl(pH8.0)で上澄液をpH8.0に調整した。可溶性IL−15N72D:IL−15RαSu/Fc融合タンパク質複合体をアフィニティー及びイオン交換クロマトグラフィーに基づくプロセスの2工程を用いて精製した。
精製したタンパク質を異なったタイプのゲル電気泳動方法で分析した。これはNuPAGE12%Bis−Trisゲル(還元及び非還元条件下)、4〜20%Tris−グリシンゲル(自然条件)、及びIEF pH3〜10ゲル(pI確認用)を包含する。これら全てはInvitrogen (Carlsbad, CA)から供給された。実験方法は製造会社の記載のように実施した。泳動用緩衝液としてPBS(Hyclone, Logan, UT)を用いるSuperdex 200 HR 10/30 (GE Healthcare Bio-Sciences)クロマトグラフィーを純度を試験するため及びタンパク質の分子量を推定するために用いた。
興味深いタンパク質バンドを、PVDF膜上にブロットしてポンソーS溶液で染色する、SDS−PAGEで分離した。N−末端アミノ酸配列決定をエドマン分解法(Molecular Structure Facility, UC Davis, Davis, CA)を用いて実施した。
精製したIL−15RαSu/FcにIL−15wt(E.coli中で産生してリフォールディングした、J. Yovandich, NCI, Fredrick, MD より提供された)を様々な比で15時間4℃で負荷した。培養後、IL−15wt:IL−15RαSu/Fc複合体を上記のようにrプロテインAアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製した。精製した複合体を、2つのELISA形態、無傷の複合体を検出する1つの方法(抗ヒトIgGFcで捕獲して抗IL−15で検出する)及びIL−15αSu/Fc融合タンパク質のみを検出するもう1つの方法(抗ヒトIgGFcで捕獲して抗ヒトIgGFcで検出する)を用いて評価した。無傷IL−15wt:IL−15αSu/Fc複合体とIL−15RαSu/Fcタンパク質濃度の間の比は、複合体のIL−15結合部位の占有率を反映している。[占有率(%)=無傷複合体(ng/mL)/IL−15RαSu/Fc(ng/mLI)×100%]。次いで、完全に占有されている複合体(IL−15RαSu/FcとIL−15wtを1:3の比で前もって結合した)を精製後に精製したIL−15N72D:IL−15RαSu/Fc融合タンパク質複合体の占有率を定量化するための標準として用いた。
先に記載されている(X. Zhu et al., J Immunol 183 (2009) 3598-3607)ように、IL−15依存性32Dβ細胞株を用いるインビトロ細胞増殖アッセイを、精製した複合体とIL−15wtタンパク質のIL−15生物活性を評価するために用いた。
IL−15N72D:IL−15RαSu/Fc複合体及びIL−15wtの薬物動態プロファイルを雌のCD−1マウス(1時点当りマウス4匹、Harlan, Indianapolis, IN)において、IL−2について先に記載されている(H. J. Belmont et al., Clin Immunol 121 (2006) 29-39)ようにして評価した。IL−15N72D:IL−15RαSu/Fc複合体の血清濃度を上記のような2つのELISA形態で評価した。IL−15wt濃度を抗IL−15捕獲剤(MAB647; R&D Systems, Minneapolis, MN)及び抗IL−15検出剤(BAM247; R&D Systems, Minneapolis, MN)を用いるELISAで評価した。それぞれのELISA形態からのIL−15N72D:IL−15RαSu/Fc濃度はPK Solution 2.0 (Summit Research Services, Montrose, CO)を用いる1分画モデルと一致した。IL−15wtで処置したマウスから得られたデータは2分画モデルとして最もよくモデル化された。
C57BL/6マウス(雄、6週齢、Harlan, Indianapolis, IN)にIL−15N72D:IL−15RαSu/Fc融合複合体1mg/kg又はヒトIL−15wt0.28mg/kg(等モル用量)それぞれの、或いは陰性コントロールとしてPBSの単回用量を静脈内に注射した。処置後4日目に、プール血液(1群当り5匹のマウス)及び脾細胞を採取した。ヒストパック(Sigma, St. Louis, MO)を用いて血液からPBMCを単離した。次いで、PBMC及び脾細胞をPEで標識した抗CD19、PEで標識した抗CD335(NKp46)、FITCで標識した抗CD4及びFITCで標識した抗CD8抗体(BioLegend, San Diego, CA)で染色した。染色した細胞をFACScanフローサイトメトリー(BD Bioscience, San Jose, CA)で分析した。全ての動物実験はAltor’s IACUC承認プロトコールに従って実施された。
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Claims (29)
- 2つのIL−15受容体融合ポリペプチドからなる二量体、及びIL−15配列の72位でNからDへの置換を含有してなるIL−15変異体ポリペプチド(IL−15N72D)の2分子を含んでなり、
IL−15受容体融合ポリペプチドはそれぞれ、免疫グロブリンFcドメインに融合したIL−15Rαsushi結合ドメイン(IL−15RαSu/Fc)を含有してなり、
IL−15Rαsushi結合ドメインはそれぞれ、IL−15N72Dポリペプチドと結合している、
IL−15結合部位が完全に占有されているIL−15N72D:IL−15RαSu/Fc複合体。 - IL−15N72D及び/又はIL−15RαSu/Fc融合タンパク質がグリコシル化されている、請求項1に記載の複合体。
- 請求項1又は2に記載の複合体をコードする配列を含んでなる、核酸。
- 請求項3に記載の核酸を含んでなる、DNAベクター。
- 請求項3に記載の核酸を含んでなる、細胞。
- 請求項1又は2に記載の完全に占有されているIL−15N72D:IL−15RαSu/Fc複合体を含んでなる、対象における免疫応答を増大又は減少するための医薬組成物。
- 請求項1又は2に記載の完全に占有されているIL−15N72D:IL−15RαSu/Fc複合体を含んでなる、腫瘍を有している対象における免疫応答を増強するための医薬組成物。
- 請求項1又は2に記載の完全に占有されているIL−15N72D:IL−15RαSu/Fc複合体を含んでなる、ウィルス感染に対する免疫応答を増強するための医薬組成物。
- 少なくとも2つの可溶性融合タンパク質を含んでなる、可溶性融合タンパク質複合体であって、
第1の融合タンパク質が、(a)第1生物活性ポリペプチド、及びそれと共有結合している(b)インターロイキン−15(IL−15)ポリペプチド又はその機能的断片を含み;そして
第2の融合タンパク質が、(c)第2生物活性ポリペプチド、及びそれと共有結合している(d)可溶性インターロイキン−15受容体アルファ(IL−15Rα)ポリペプチド又はその機能的断片を含み、
第1及び第2融合タンパク質の一方又は両方が、更に免疫グロブリンFcドメイン又はその機能的断片を含み、
第1融合タンパク質のIL−15ドメインが、第2融合タンパク質の可溶性IL−15Rαドメインと結合して可溶性融合タンパク質複合体を形成し、該IL−15ポリペプチドは成熟IL−15配列の72位でNからDへの置換を有するIL−15変異体(IL−15N72D)であり、該IL−15RαポリペプチドはIL−15Rαsushi結合ドメインを含んでいる、
可溶性融合タンパク質複合体。 - 第1及び第2生物活性ポリペプチドの一方が第1可溶性T細胞受容体(TCR)若しくはその機能的断片を含んでいる、又は、他方の生物活性ポリペプチドが第1可溶性TCRと異なる第2可溶性TCR若しくはその機能的断片を含んでいる、請求項9に記載の可溶性融合タンパク質複合体。
- Fcドメインに融合したIL−15Rαsushi結合ドメイン(IL−15RαSu/Fc)及びN72D突然変異を含むIL−15変異体ポリペプチド(IL−15N72D)を含んでなる(IL−15N72D:IL−15RαSu/Fc複合体)、請求項9に記載の可溶性融合タンパク質複合体。
- 請求項9〜11の何れか一項に記載の第1融合タンパク質をコードする配列を有する、核酸。
- 請求項9〜11の何れか一項に記載の第2融合タンパク質をコードする配列を有する、核酸。
- 請求項12に記載の核酸を含んでなる、DNAベクター。
- 請求項13に記載の核酸を含んでなる、DNAベクター。
- 請求項12及び13に記載の核酸を含んでなる、DNAベクター。
- 請求項12に記載の核酸、請求項13に記載の核酸、及び、請求項12及び13に記載の核酸の群から選ばれる核酸を含んでなる、細胞。
- 方法が、
a)第1融合タンパク質をコードする請求項14に記載のDNAベクターを第1宿主細胞内に導入すること、
b)細胞又は培地中に第1融合タンパク質を発現するのに十分な条件下で、培地中で第1宿主細胞を培養すること、
c)宿主細胞又は培地から第1融合タンパク質を精製すること、
d)第2融合タンパク質をコードする請求項15に記載のDNAベクターを第2宿主細胞内に導入すること、
e)細胞又は培地中に第2融合タンパク質を発現するのに十分な条件下で、培地中で第2宿主細胞を培養すること、
f)宿主細胞又は培地から第2融合タンパク質を精製すること、及び
g)第1融合タンパク質のIL−15ドメインと第2融合タンパク質の可溶性IL−15Rαドメインの間を結合させるのに十分な条件下で、第1及び第2融合タンパク質を混合して可溶性融合タンパク質複合体を形成すること、
を含んでなる、請求項9〜11の何れか一項に記載の可溶性融合タンパク質複合体を製造する方法。 - 方法が、
a)第1融合タンパク質をコードする請求項14に記載のDNAベクター及び第2融合タンパク質をコードする請求項15に記載のDNAベクターを宿主細胞に導入すること、
b)細胞又は培地中に融合タンパク質を発現させ、第1融合タンパク質のIL−15ドメインと第2融合タンパク質の可溶性IL−15Rαドメインの間を会合させて可溶性融合タンパク質複合体の形成を可能にするのに十分な条件下で、宿主細胞を培地中で培養すること、及び
c)宿主細胞又は培地から可溶性融合タンパク質複合体を精製すること、
を含んでなる、請求項9〜11の何れか一項に記載の可溶性融合タンパク質複合体を製造する方法。 - 方法が、
a)複数の細胞を請求項9〜11の何れか一項に記載の可溶性融合タンパク質複合体と接触させること、該複数の細胞は更に、請求項9に記載のIL−15ドメインによって認識されるIL−15R鎖を担持している免疫細胞又は請求項9に記載のFcドメインによって認識されるFc受容体鎖を担持している免疫細胞、及び請求項9に記載の生物活性ポリペプチドの少なくとも1つによって認識される抗原を担持している標的細胞を含んでいる、
b)標的細胞上の抗原と、免疫細胞上のIL−15R又はFc受容体鎖の間に、免疫細胞を結合及び活性化するのに十分に、特異的結合複合体(架橋)を形成すること、及び
c)結合した活性化免疫細胞によって標的細胞を殺傷すること、
を含んでなる、インビトロで標的細胞を殺傷する方法。 - 疾患関連抗原を認識する生物活性ポリペプチドを含んでいる請求項9〜11の何れか一項に記載の可溶性融合タンパク質複合体を含んでなる、疾患細胞が疾患関連抗原を発現している、患者の疾患を予防又は治療するための医薬組成物。
- IL−15R鎖又はFc受容体鎖を担持している免疫細胞を、疾患関連抗原を認識する生物活性ポリペプチドを含んでいる請求項9〜11の何れか一項に記載の可溶性融合タンパク質複合体と混合することによって得られる免疫細胞−融合タンパク質複合体混合物を含んでなる、疾患細胞が疾患関連抗原を発現している、患者の疾患を予防又は治療するための医薬組成物。
- 疾患が癌又はウィルス感染症である、請求項21又は22に記載の医薬組成物。
- 請求項9〜11の何れか一項に記載の可溶性融合タンパク質複合体を含んでなる、哺乳動物における免疫応答を刺激又は抑制するための医薬組成物。
- Fcドメインに融合したIL−15Rαsushi結合ドメインを含有してなるIL−15受容体融合ポリペプチド(IL−15RαSu/Fc)、及びN72D突然変異を含むIL−15変異体ポリペプチド(IL−15N72D)をコードする配列を有する、核酸。
- 請求項25に記載の核酸を含んでなる、DNAベクター。
- 方法が、
a)N72D突然変異を含むIL−15変異体ポリペプチド(IL−15N72D)をコードする第1のDNA及びFcドメインに融合したIL−15Rαsushi結合ドメインを含有してなるIL−15RαSu/Fc融合タンパク質をコードする第2のDNAを宿主細胞に導入すること、
b)IL−15N72D及びIL−15RαSu/Fc融合タンパク質を発現させるのに十分な条件下で、宿主細胞を培地中で培養すること、及び
c)宿主細胞又は培地からIL−15N72D:IL−15RαSu/Fc融合タンパク質複合体を精製すること、
を含んでなる、IL−15N72D:IL−15RαSu/Fc融合タンパク質複合体を製造する方法。 - 方法が、
a)N72D突然変異を含むIL−15変異体ポリペプチド(IL−15N72D)及びFcドメインに融合したIL−15Rαsushi結合ドメインを含有してなるIL−15RαSu/Fc融合タンパク質を宿主細胞で共発現すること、
b)IL−15N72D及びIL−15RαSu/Fc融合タンパク質を発現させるのに十分な条件下で、宿主細胞を培地中で培養すること、及び
c)宿主細胞又は培地からIL−15N72D:IL−15RαSu/Fc融合タンパク質複合体を精製すること、
を含んでなり、
ここで、該IL−15N72D:IL−15RαSu/Fc複合体の2つのIL−15結合部位は完全に占有されている、
IL−15N72D:IL−15RαSu/Fc融合タンパク質複合体を製造する方法。 - N72D突然変異を含むIL−15変異体(IL−15N72D)をコードする第1のポリヌクレオチド、及びFcドメインに融合したIL−15Rαsushi結合ドメインを含有してなるIL−15受容体融合タンパク質(IL−15RαSu/Fc)をコードする第2のポリヌクレオチドを含有してなる、細胞。
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