CN104830884A - 一种携带IL-15/sIL-15Ra融合基因的微环DNA表达载体的构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种携带IL-15/sIL-15Ra融合基因的微环DNA表达载体的构建方法。该方法包括：1）IL-15/sIL-15Ra融合基因的获取；2）融合基因重组亲本质粒的构建；以及3）融合基因微环DNA的诱导和纯化。具体而言，通过分别克隆IL-15和sIL-15Ra基因，利用重组PCR技术将两个基因融合，构建重组亲本质粒后转化大肠杆菌，通过甩环和纯化，获得携带IL-15/sIL-15Ra融合基因的微环DNA表达载体。本发明首次将IL-15/sIL-15Ra融合基因重组于微环DNA，与传统方法相比，获得更加方便，功能也更加稳定，增加了生物安全性。
Description
技术领域
本发明属于生物工程领域，具体涉及一种携带IL-15/sIL-15Ra融合基因的微环DNA表达载体的构建方法。
背景技术
IL-15是1994年Grabstein等在检测猴肾表皮细胞系CV-1/EBVA上清液时发现的一种可溶性细胞因子，它能维持CTLL-2细胞的增殖，具有许多与IL-2相似的生物活性，因而受到广泛关注。研究发现，IL-15和它的可溶性受体sIL-15Ra形成复合物后，能够更有效地与IL-15R/IL-2R β、γ亚基结合，并且在血清中的半衰期可以由原来的30分钟延长到20小时，其生物活性也可以提高至少50倍。体外研究表明，IL-15/sIL-15Ra复合物可以极大地促进CD8+T、NK、NKT的增殖和功能，因此又被称为超级白介素-15（Hyper-IL-15）。多项研究表明，该复合物在多种肿瘤模型中表现出比IL-15更强的抗肿瘤效应，全身性给予IL-15/sIL-15Ra复合物可以明显消退已建立的胰腺癌和转移性黑色素瘤。
微环DNA（minicircle DNA，MC）表达载体是传统质粒在大肠杆菌中通过位点特异性重组得到的一种新型超螺旋表达框。在携带真核表达框的亲本质粒两侧插入重组酶识别位点，诱导体内相关重组酶表达，该重组酶将识别位点中的DNA序列切断，亲本质粒（parental plasmid，PP）被分成2个超螺旋分子，一个是具有复制功能的小质粒（miniplasmid，MP），另一个是携带真核表达框的微环DNA。微环DNA表达载体没有复制起始点和抗性标记等细菌序列，增加了生物安全性，它比传统载体在生物体内的表达时间长，表达效率高。经实验证明，带有目的基因的微环DNA表达载体可用于体内外各种实验，其在生物体内的存在时间要比传统质粒要长的多，比如利用传统质粒转入的基因，2周后在体内就基本检测不到了，而以微环质粒为载体的目的基因在3周的时候还能在体内检测到。
但是，现有技术中还没有将IL-15/sIL-15Ra融合基因整合于微环DNA表达载体中的相关报道。
发明内容
针对上述情况，本发明的目的在于提供一种携带IL-15/sIL-15Ra融合基因的微环DNA表达载体的构建方法。
具体而言，通过分别克隆小鼠的IL-15和sIL-15Ra基因，利用重组PCR技术将两个基因融合在一起，构建IL-15/sIL-15Ra融合基因的重组亲本质粒，转化大肠杆菌后，通过甩环和纯化，获得携带IL-15/sIL-15Ra融合基因的微环DNA表达载体。
为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种携带IL-15/sIL-15Ra融合基因的微环DNA表达载体的构建方法，其包括以下步骤：
1）IL-15/sIL-15Ra融合基因的获取：
从小鼠组织中提取总RNA，逆转录成cDNA，设计引物并按下法合成IL-15/sIL-15Ra融合基因：首先以cDNA为模板，利用引物对1和引物对2分别扩增出表达IL-15和sIL-15Ra的两个基因片段，其次以表达IL-15和sIL-15Ra的两个基因片段为模板，利用引物对3和引物对4分别扩增出带有重叠序列的表达IL-15和sIL-15Ra的两个基因片段，最后通过重叠PCR技术将二者采用包含45至90个碱基的软链接连接起来，得到IL-15/sIL-15Ra融合基因，并以其为模板，利用引物对5扩增出带有酶切位点的IL-15/sIL-15Ra融合基因，通过纯化、回收及测序，得到序列正确的带有酶切位点的IL-15/sIL-15Ra融合基因；
其中：引物对1中的正向引物为SEQ ID NO:1，反向引物为SEQ ID NO:2；引物对2中的正向引物为SEQ ID NO:3，反向引物为SEQ ID NO:4；引物对3中的正向引物为SEQ ID NO:5，反向引物为SEQ ID NO:6；引物对4中的正向引物为SEQ ID NO:7，反向引物为SEQ ID NO:8；引物对5中的正向引物为SEQ ID NO:9，反向引物为SEQ ID NO:10，所述引物的序列如下所示（以下划线标注的碱基对应扩增后基因片段中的重叠序列，以下划线及斜体标注的碱基对应扩增后融合基因中酶切位点的序列）：
SEQ ID NO:1：5'-ATGAAAATTTTGAAA-3'；
SEQ ID NO:2：5'-TCAGGACGTGTTGATGAACA-3'；
SEQ ID NO:3：5'-GGCACCACGTGTCCACCTC-3'；
SEQ ID NO:4：5'-TCATTTCGTCATTTTGGAACTGTGG-3'；
SEQ ID NO:5：5'-ATGAAAATTTTGAAA-3'；
SEQ ID NO:6：5'-AGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACCTCAGGACGTGTTGATGAACA-3'；
SEQ ID NO:7：5'-GGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGGGCACCACGTGTCCACCTC-3'；
SEQ ID NO:8：5'-TCATTTCGTCATTTTGGAACTGTGG-3'；
SEQ ID NO:9：5'- GAATTC CCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGACAACTGGATAGATGTA-3'；
SEQ ID NO:10：5'- GGATCC TCATTTCGTCATTTTGGAACTGTGG-3'；
2）IL-15/sIL-15Ra融合基因重组亲本质粒的构建：
将步骤1）中序列正确的带有酶切位点的IL-15/sIL-15Ra融合基因插入到微环亲本克隆载体中，转化感受态大肠杆菌后筛选阳性菌落，抽取质粒后，通过测序获得序列正确的IL-15/sIL-15Ra融合基因重组亲本质粒；
3）IL-15/sIL-15Ra融合基因微环DNA的诱导和纯化：
将步骤2）中获得的序列正确的IL-15/sIL-15Ra融合基因重组亲本质粒转化至大肠杆菌菌体，首先将菌体接种于TB培养基中，摇菌过夜，次日加入LB培养基，然后分次向菌液中添加阿拉伯糖以诱导微环DNA的产生，随时检测pH值并保持在7.0~8.5的范围之内，诱导完毕后进行质粒抽提和纯化，得到携带IL-15/sIL-15Ra融合基因的微环DNA表达载体。
上述技术方案中，步骤1）中所述组织为肌肉组织，通过Trizol法提取其中的总RNA。
上述技术方案中，步骤1）中所述软链接包含78个碱基。
上述技术方案中，步骤2）中所述微环亲本克隆载体为pMC.CMV-MCS-SV40polyA载体。
上述技术方案中，步骤2）中采用双酶切法将序列正确的IL-15/sIL-15Ra融合基因插入到微环亲本克隆载体中，优选使用EcoRI内切酶和BamHI内切酶。
上述技术方案中，步骤2）中所述感受态大肠杆菌为感受态DH5α大肠杆菌。
上述技术方案中，步骤3）中所述大肠杆菌为大肠杆菌ZYCY10P3S2T。
上述技术方案中，步骤3）中分3~5次向菌液中添加阿拉伯糖，各次之间的间隔为1~3小时。
上述技术方案中，步骤3）中所述阿拉伯糖与菌液之间的重量体积比为3~6g:1L。
由于上述技术方案的运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：
（1）本发明首次将IL-15/sIL-15Ra融合基因重组于微环DNA，与体外将IL-15和IL-15Ra两种细胞因子混合或两种质粒的共转染等传统方法相比，IL-15/sIL-15Ra融合基因的获得更加方便，其功能也更加稳定；
（2）在生物体内表达时，携带IL-15/sIL-15Ra融合基因的微环DNA由于没有复制起始点和抗性标记等细菌序列，故而增加了生物安全性；
（3）经实验证明，携带IL-15/sIL-15Ra融合基因的微环DNA可用于各种体内外实验，其在生物体内存在的时间要比传统质粒更长。
附图说明
图1为IL-15、sIL-15Ra以及IL-15/sIL-15Ra融合基因的2%琼脂糖凝胶电泳图，其中A中的M代表Marker，1代表表达IL-15的基因片段，2代表表达sIL-15Ra的基因片段，B中的M代表Marker，1代表IL-15/sIL-15Ra融合基因。由此可知，表达IL-15的基因片段与表达sIL-15Ra的基因片段成功地连接在一起，形成了IL-15/sIL-15Ra融合基因。
图2为携带IL-15/sIL-15Ra融合基因的T载体的BamHI/EcoRI双酶切鉴定电泳图以及测序比对图，其中A中的M代表Marker，1中的小片段（约1000bp）是IL-15/sIL-15Ra融合基因，大片段（大于2000bp）是T载体，B中的方框部分代表软链接。结果显示，获得的IL-15/sIL-15Ra融合基因的序列完全正确。
图3为IL-15/sIL-15Ra融合基因重组亲本质粒的构建和酶切鉴定图，其中A中的M代表marker，1和2代表携带IL-15/sIL-15Ra融合基因的T载体的酶切产物，3和4代表微环亲本克隆载体的酶切产物，B中的M代表marker，3、4、6和7为阳性克隆，1、2和5为阴性克隆。结果显示，IL-15/sIL-15Ra融合基因重组亲本质粒构建成功。
图4为携带IL-15/sIL-15Ra融合基因微环DNA表达载体的电泳鉴定图，其中M代表Marker，1和2均代表IL-15/sIL-15Ra融合基因重组亲本质粒甩环后产物的电泳情况，PP代表亲本质粒，MC代表IL-15/sIL-15Ra融合基因微环DNA表达载体。结果显示，成功获得了IL-15/sIL-15Ra融合基因微环DNA质粒。
具体实施方式
下面将结合附图及实施例对本发明做出进一步的描述。
实施例一：IL-15/sIL-15Ra融合基因的获取。
1、总RNA的提取：
首先采用颈椎脱臼法处死小鼠，取小鼠肌肉组织置于研钵中，加入Trizol裂解液2ml，反复研磨，以便将肌肉组织溶于Trizol中；将该液体转移至1.5ml的EP管中，1ml/管；每管加入0.2ml氯仿，混匀，室温孵育样本3~5min；4℃下12000g离心15min；离心后转移上层无色水相至EP管，加入0.5ml异丙醇，混匀，冰浴10min；4℃下12000g离心10min，小心移去上清液；加入75%乙醇1ml，颠倒混匀，4℃下7500g离心5min，清洗两次；彻底弃上清，略干燥后，将RNA溶解在20μl无RNase水中，于-80℃保存，操作过程中所用耗材均预先用DEPC浸泡，并经高压灭菌处理。
2、逆转录合成cDNA：
以4μl步骤1中所提取的总RNA为模板，1μl Oligo dT为下游引物，加入双蒸水补足体系至12μl，离心混匀，70℃ 5min，立即置于冰上冷却；加入5×逆转录缓冲液4μl，RNase抑制剂1μl，10mM dNTP 2μl，离心混匀，于37℃放置5min，加入莫洛尼鼠白血病逆转录酶（MMLV）1μl，42℃ 60min，70℃ 10min，于4℃保存所得cDNA。
3、引物设计和融合基因合成：
根据小鼠IL-15（NM_008357.1）cDNA序列、IL-15Ra（NM_008358.1）胞外端cDNA序列和插入IL-15/sIL-15Ra融合基因的亲本质粒结构设计引物（上海生工合成，引物序列参见表1）。
首先以步骤2中获得的逆转录产物cDNA为模板，利用引物对1（作为正向引物的SEQ ID NO:1和作为反向引物的SEQ ID NO:2）及引物对2（作为正向引物的SEQ ID NO:3和作为反向引物的SEQ ID NO:4）分别扩增出表达IL-15和sIL-15Ra的两个基因片段，其次以表达IL-15和sIL-15Ra的两个基因片段为模板，利用引物对3（作为正向引物的SEQ ID NO:5和作为反向引物的SEQ ID NO:6，以下划线标注的碱基对应扩增后基因片段中的重叠序列）及引物对4（作为正向引物的SEQ ID NO:7和作为反向引物的SEQ ID NO:8，以下划线标注的碱基对应扩增后基因片段中的重叠序列）分别扩增出带有重叠序列的表达IL-15和sIL-15Ra的两个基因片段，最后通过重叠PCR技术将二者用长度为78个碱基的软链接连接起来，得到IL-15/sIL-15Ra融合基因，并以其为模板，利用引物对5（作为正向引物的SEQ ID NO:9和作为反向引物的SEQ ID NO:10，以下划线及斜体标注的碱基对应扩增后融合基因中酶切位点的序列）扩增出带有EcoRI及BamHI切酶位点的IL-15/sIL-15Ra融合基因。
PCR反应体系如下所示：10×Taq缓冲液5μl，MgCl2 4μl，10mM dNTP 1μl，10μM上下游引物各1μl，模板cDNA 5μl，Taq DNA聚合酶1μl，双蒸水补充至总体积50μl。
扩增条件如下所示：94℃预变性5min，94℃变性60s，56℃退火60s，72℃延伸60s，扩增34个循环，72℃延伸10min。
取20μl上述PCR产物，按照凝胶回收试剂盒中的说明进行纯化和回收，结果参见图1。然后取纯化回收的PCR产物与pMD 19-T载体（TAKARA公司，simple版）按以下体系进行连接：PCR产物4μl，pMD 19-T载体1μl，Solution I（包含于pMD 19-T载体试剂盒中）5μl，于4℃连接过夜。将此连接产物转化至DH5α感受态大肠杆菌，涂于含有X-gal和IPTG的蓝白斑筛培养板上，于37℃培养过夜。16h后，取白色阳性菌落于5ml含有抗生素（氨苄青霉素75μg/ml）的液体LB中，于37℃摇菌过夜。16h后，按照质粒小抽试剂盒中的说明抽提质粒。取所得质粒，按照以下体系进行酶切鉴定：质粒5μl，10×缓冲液2μl，EcoRI内切酶1μl，BamHI内切酶1μl，双蒸水11μl，于37℃水浴2~3h。最后将初步酶切鉴定结果为阳性的相应质粒送检测序，以选择序列正确的cDNA克隆，结果参见图2。
实施例二：IL-15/sIL-15Ra融合基因重组亲本质粒的构建。
取实施例一中序列正确的pMD 19-T-IL-15/sIL-15Ra质粒及真核表达载体pMC.CMV-MCS-SV40polyA（购自SBI公司），进行EcoRI、BamHI内切酶双酶切，酶切体系如下：质粒5μl，10×缓冲液2μl，BamHI内切酶1μl，EcoRI内切酶1μl，双蒸水11μl，于37℃水浴2~3h。将酶切产物进行电泳，按照凝胶回收试剂盒中的说明进行回收，将双酶切所得的IL-15/sIL-15Ra和pMC.CMV-MCS-SV40polyA大片段进行连接，连接体系如下：pMC.CMV-MCS-SV40polyA载体2μl，IL-15/sIL-15Ra 6μl，T4连接酶1μl，10×连接缓冲液1μl，于4℃连接过夜。将连接产物转化至感受态DH5α大肠杆菌，均匀涂布于含有抗生素的培养板上，于37℃培养过夜。16h后，取阳性菌落于5ml含有抗生素的液体LB中，于37℃摇菌过夜。16h后，按照质粒小抽试剂盒中的说明抽提质粒，酶切鉴定后，将鉴定为阳性的质粒送测序，获得序列正确的pMC.CMV-MCS-SV40polyA-IL-15/sIL-15Ra融合基因重组亲本质粒，结果参见图3图。
实施例三：IL-15/sIL-15Ra融合基因微环DNA表达载体的获取。
1、重组亲本质粒的转化：
将实施例二中序列正确的pMC.CMV-MCS-SV40polyA-IL-15/sIL-15Ra重组亲本质粒转化至ZYCY10P3S2T E. coli菌体，然后均匀涂布于含有抗生素的培养板上，于37℃培养过夜。16h后，取阳性菌落置于5ml含有抗生素（卡纳霉素75μg/ml）的液体LB中，于37℃摇菌过夜。16h后，按照质粒小抽试剂盒中的说明抽提质粒，酶切鉴定后，将鉴定结果为阳性的质粒送至上海生工测序。
2、IL-15/sIL-15Ra融合基因微环DNA表达载体的诱导和纯化：
经过转化过程，获得了含有IL-15/sIL-15Ra融合基因重组亲本质粒的ZYCY10P3S2T E. coli菌体，要获得微环质粒还需要阿拉伯糖的诱导和后续的纯化。首先将菌体接种于400mL TB培养基中，37℃下摇菌（250rpm）过夜，次日加入400mL LB培养基，每2个小时添加4mL阿拉伯糖水溶液（浓度为3g/10mL），总共添加三次，以诱导微环DNA的产生，并且随时检测pH，以保持菌液呈弱碱性（7.0~8.5）。诱导结束后，按照Invitrogen大抽试剂盒的说明书，进行质粒的大量抽提和纯化，得到IL-15/sIL-15Ra融合基因微环DNA，结果参见图4。
Claims (9)
1.一种携带IL-15/sIL-15Ra融合基因的微环DNA表达载体的构建方法，其包括以下步骤：
1）IL-15/sIL-15Ra融合基因的获取：
从小鼠组织中提取总RNA，逆转录成cDNA，设计引物并按下法合成IL-15/sIL-15Ra融合基因：首先以cDNA为模板，利用引物对1和引物对2分别扩增出表达IL-15和sIL-15Ra的两个基因片段，其次以表达IL-15和sIL-15Ra的两个基因片段为模板，利用引物对3和引物对4分别扩增出带有重叠序列的表达IL-15和sIL-15Ra的两个基因片段，最后通过重叠PCR技术将二者采用包含45至90个碱基的软链接连接起来，得到IL-15/sIL-15Ra融合基因，并以其为模板，利用引物对5扩增出带有酶切位点的IL-15/sIL-15Ra融合基因，通过纯化、回收及测序，得到序列正确的带有酶切位点的IL-15/sIL-15Ra融合基因；
其中：引物对1中的正向引物为SEQ ID NO:1，反向引物为SEQ ID NO:2；引物对2中的正向引物为SEQ ID NO:3，反向引物为SEQ ID NO:4；引物对3中的正向引物为SEQ ID NO:5，反向引物为SEQ ID NO:6；引物对4中的正向引物为SEQ ID NO:7，反向引物为SEQ ID NO:8；引物对5中的正向引物为SEQ ID NO:9，反向引物为SEQ ID NO:10，所述引物的序列如下所示：
SEQ ID NO:1：5'-ATGAAAATTTTGAAA-3'；
SEQ ID NO:2：5'-TCAGGACGTGTTGATGAACA-3'；
SEQ ID NO:3：5'-GGCACCACGTGTCCACCTC-3'；
SEQ ID NO:4：5'-TCATTTCGTCATTTTGGAACTGTGG-3'；
SEQ ID NO:5：5'-ATGAAAATTTTGAAA-3'；
SEQ ID NO:6：5'-AGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACCTCAGGACGTGTTGATGAACA-3'；
SEQ ID NO:7：5'-GGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGGGCACCACGTGTCCACCTC-3'；
SEQ ID NO:8：5'-TCATTTCGTCATTTTGGAACTGTGG-3'；
SEQ ID NO:9：5'- GAATTC CCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGACAACTGGATAGATGTA-3'；
SEQ ID NO:10：5'- GGATCC TCATTTCGTCATTTTGGAACTGTGG-3'；
2）IL-15/sIL-15Ra融合基因重组亲本质粒的构建：
将步骤1）中序列正确的带有酶切位点的IL-15/sIL-15Ra融合基因插入到微环亲本克隆载体中，转化感受态大肠杆菌后筛选阳性菌落，抽取质粒后，通过测序获得序列正确的IL-15/sIL-15Ra融合基因重组亲本质粒；
3）IL-15/sIL-15Ra融合基因微环DNA的诱导和纯化：
将步骤2）中获得的序列正确的IL-15/sIL-15Ra融合基因重组亲本质粒转化至大肠杆菌菌体，首先将菌体接种于TB培养基中，摇菌过夜，次日加入LB培养基，然后分次向菌液中添加阿拉伯糖以诱导微环DNA的产生，随时检测pH值并保持在7.0~8.5的范围之内，诱导完毕后进行质粒抽提和纯化，得到携带IL-15/sIL-15Ra融合基因的微环DNA表达载体。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤1）中所述组织为肌肉组织，通过Trizol法提取其中的总RNA。
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤1）中所述软链接包含78个碱基。
4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤2）中所述微环亲本克隆载体为pMC.CMV-MCS-SV40polyA载体。
5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤2）中采用双酶切法将序列正确的IL-15/sIL-15Ra融合基因插入到微环亲本克隆载体中。
6.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤2）中所述感受态大肠杆菌为感受态DH5α大肠杆菌。
7.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤3）中所述大肠杆菌为大肠杆菌ZYCY10P3S2T。
8.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤3）中分3~5次向菌液中添加阿拉伯糖，各次之间的间隔为1~3小时。
9.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤3）中所述阿拉伯糖与菌液之间的重量体积比为3~6g:1L。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| EXSB | Decision made by sipo to initiate substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20150812 |
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |