CN113366018A - 用于治疗疾病的CLEC12AxCD3双特异性抗体和方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及治疗个体的CLEC12A阳性癌症构件及方法。在一些实施方案中，该方法包括以结合CDS及CLEC12A的双特异性抗体的两次或更多次施用来治疗对其有需要的个体，其中在第一次施用中施用该双特异性抗体的第一量并且其中在每次后续施用中该双特异性抗体的量比该第一次施用中的该双特异性抗体的量高。在一些实施方案中，每隔一段时间提供CLEC12A阳性癌症治疗方法并且保留造血干细胞腔室的给药方案允许正常CLEC12A阳性造血细胞的恢复。

Description

用于治疗疾病的CLEC12AxCD3双特异性抗体和方法

本发明涉及抗体领域，特别涉及治疗抗体领域。此类抗体可用于治疗人类。更具体地，本发明涉及用于治疗癌症的抗体且优选为双特异性抗体。

背景技术

急性骨髓性白血病(AML)为全世界第三常见的白血病，但在过去的四十年中疾病成果的进步不大(Arrighi，Soulas等人的2003乙文，Lowenberg，Ossenkoppele等人的2009，Burnett，Wetzler等人的2011乙文)。AML于欧洲成年人的年发生率为每100,000位中5至8位。在美国每年每100,000人有4至5位新诊断为AML，并且每年有10,000人死于AML。年轻成年人的五年存活大约是40％，但于年长的患者此随着年龄明显下降至小于25％。于诱导性化学治疗后达到形态完全缓解的大多数患者随后于三年内再发(Juliusson，Lazarevic等人的2012，Oran and Weisdorf2012)。这些患者因而迫切需要开发具有更有效的作用模式的新制剂。

发明内容

本发明聚焦在AML原始细胞及白血病的干细胞(LSCs)上特异性表达的抗原，其为C型凝集素域家族12成员A或CLEC12A(还称为人类骨髓抑制性C型凝集素、hMICL、C一个凝集素样分子1、CLL-1或CD371(Bakker，van den Oudenrijn等人的2004乙文，vanRhenen，vanDongen等人的2007乙文)。CLEC12A为不论亚型的90％-95％重新(denovo)或再发的AML病例的白血病细胞上表达的骨髓分化抗原(Bakker，van den Oudenrijn等人的2004乙文，Zhao，Singh等人的2010乙语，Larsen，Roug等人的2012乙文)。CLEC12A选择性地表达于CD34POSCD38NEG LSCs上，但根据活体外及活体内证据，其于正常的造血干细胞(HSCs)、红血球祖细胞或巨核细胞上不表达(van Rhenen，van Dongen等人的2007，Kikushige和Miyamoto 2013)。

在本发明中已显示CLEC12AxCD3双特异性抗体诱导有效的T细胞介导的CLEC12A靶向及选择性地根除白血病细胞(包括白血病的干细胞)而不影响正常的HSCs，借此允许于治疗后迅速地重建正常的造血作用且从而限制血液毒性。

许多T细胞衔接器格式面临包括血清半生期很短、免疫原性及在制造方面困难的问题(Brinkmann and Kontermann 2017)。本发明的CLEC12AxCD3双特异性抗体的血清半生期很优良。本发明的构件及方法不会明显诱导针对治疗剂的免疫反应。

本发明提供一种治疗个体的CLEC12A阳性癌症的方法，该方法包括以结合CD3和CLEC12A的双特异性抗体的两次或更多次施用来治疗有需要的该个体，其中在第一次施用中施用该双特异性抗体的第一量并且其中于每次后续施用中该双特异性抗体的量比该第一次施用的该双特异性抗体的量高。

本发明还提供一种结合CD3和CLEC12A的双特异性抗体供用于一种治疗个体的CLEC12A阳性癌症的方法中，其中该治疗包括结合CD3和CLEC12A的双特异性抗体的两次或更多次施用，其中在第一次施用中施用该双特异性抗体的第一量并且其中于每次后续施用中该双特异性抗体的量比该第一次施用的该双特异性抗体的量高。

在一个方面中本发明提供一种从个体清除CLEC12A阳性造血细胞，优选CLEC12A阳性恶性细胞，并且以正常细胞再植(repopulating)该个体的该造血系统的方法，该方法包括每隔一段时间施用结合CD3和CLEC12A的双特异性抗体给有需要的该个体借此杀灭CLEC12A阳性恶性细胞，并且刺激该个体的造血干细胞和/或造血祖细胞以用新生的造血干细胞衍生细胞，包括CLEC12A阳性细胞被再植该造血系统。造血干细胞驻留在骨髓中。不良的CLEC12A阳性细胞存在会剥夺健康细胞的营养并占据腔室而借此限制粒细胞、巨噬细胞干细胞-其自身会产生嗜碱性球、嗜中性粒细胞、嗜酸性球及单核细胞血球细胞-的正常生长及发展。通过通过本文所述的双特异性抗体的施用方式而从骨髓腔室移去不良的CLEC12A阳性细胞，透过增加骨髓腔室内供健康的造血干细胞生长、存活及分化成下游的CLEC12A阳性及CLEC12A阴性健康的细胞，例如嗜碱性球、嗜中性粒细胞、嗜酸性球及单核细胞血球细胞的营养及空间的供应，而刺激健康的造血干细胞的补充。

个体优选为一经诊断具有急性骨髓性白血病(AML)、骨髓增生异常综合征(MDS)、骨髓纤维化或骨髓增生性肿瘤母细胞期(myeloproliferative neoplasm blast phase，MPN-BP)的个体。

还提供一种制备用于要治疗CLEC12A阳性癌症的个体的自体骨髓细胞移植物的方法，该方法包括在适合杀灭CLEC12A阳性细胞的条件下以结合CD3和CLEC12A的双特异性抗体培育该个体的骨髓细胞制备物，并且随后从该培育采集骨髓细胞。

本发明进一步提供一种治疗个体的CLEC12A阳性癌症的方法，该方法包括在适合杀灭CLEC12A阳性细胞的条件下以结合CD3和CLEC12A的双特异性抗体培育该个体的骨髓细胞制备物，以造血系统消融疗法(ablative therapy)来治疗该个体且提供包括该培育的骨髓细胞的骨髓细胞移植物给该个体。

进一步提供一种提供个体一保留(sparing)造血干细胞的癌症治疗的方法，该方法包括施用结合CD3和CLEC12A的双特异性抗体给有需要的该个体。该个体优选有一种CLEC12A阳性癌症。

附图说明

图1：CLEC12AxCD3双特异性抗体特异地结合CLEC12A^POS和CD3^POS标靶细胞。(A)CLEC12AxCD3双特异性抗体与CLEC12A和CD3的结合系依流式细胞术以一组肿瘤细胞系来判定。HL60：CLEC12A^POS前骨髓性细胞系；CLEC12A-CHO-K1：稳定表达人类CLEC12A的CHO-K1细胞系(经参考抗CLEC12A抗体验证，数据未显示)；CHO-K1：CLEC12A^NEG亲代CHO-K1细胞系；Jurkat E6.1：CD3^POST细胞系；J.RT-T3.5：CD3^NEGT细胞系。(B)正常末梢血液依流式细胞术的CLEC12AxCD3双特异性抗体结合解析。分析亚群的圈选策略为CD4 T细胞：CD4^POS；CD8 T细胞：CD8^POS；NK细胞：CD3^NEGCD56^POS；NKT细胞：CD3^POSCD56^POS；B细胞：CD19^POS；骨髓树突细胞(DC)：BDCA1^POSCD19^NEG；粒细胞：根据SSC-FSC；单核细胞：CD14^POSCD33^POS。(C)正常的骨髓CD34^POS祖细胞腔室内的依流式细胞术的CLEC12AxCD3双特异性抗体结合。HSC：造血干细胞；MPP：多潜能祖细胞；CMP：共同骨髓祖细胞；GMP：粒细胞-巨噬细胞祖细胞；MEP：巨核细胞-红血球祖细胞；CLP：共同淋巴祖细胞。显示关于抗体MF4327及MF5196及格式化为最终Fc格式的同型对照IgG(沈默的Fc效应子功能)的资料。

图2：抗体MF4327xMF5196介导CLEC12A特异性的T细胞活化及重新导向这些T细胞以诱导CLEC12A^POS HL60细胞的裂解。从健康的供体衍生的休眠的T细胞系通过负向选择被纯化且在抗体MF4327xMF5196、MockxCD3、对照IgG或PBS存在下、与CFSE标记的HL60细胞共培养。(A-B)细胞系与1000ng/mL IgG浓度的所示的IgGs-全部都有WT Fc效应子功能-以5∶1的E∶T比率一起共培育。具WT Fc效应子功能的抗体MF4327xMF5196原型诱导T细胞活化(A)及标靶细胞裂解(B)的能力系于24/48/72小时后通过流式细胞术、相对于PBS条件来定量。显示的数据从＞10位测试的健康的供体中代表性的二位。(C-E)细胞系与一系列的IgG浓度的所示的IgGs-全部都有沈默的Fc效应子功能-以5∶1的E∶T比率共培育。抗体MF4327xMF5196(受默的Fc效应子功能)诱导CD4及CD8 T细胞活化(C，D)及标靶细胞裂解(E)的能力系于48小时后通过流式细胞术、相对于PBS条件来定量。显示的数据是从3次独立的分析中测试总共6位供体的一位代表性供体。

图3：抗体MF4327xMF5196诱导CLEC12A介导的单核细胞裂解及发炎细胞因子释放，以及具有诱导CLEC12A抗原特异性T细胞增殖的能力。

(A-C)健康的供体衍生的PBMC样本与所示的浓度范围的抗体MF4327xMF5196或MockxCD3共培养且与PBS条件相比。T细胞活化(A)、通过自体T细胞的单核细胞裂解(B)和B细胞裂解(C)系于48小时之后使用移动式细胞测量术来评估。(D)从健康的供体衍生的单核细胞系通过负向选择被纯化且与CFSE标记的休眠自体T细胞以5∶1的E∶T比率、加上1,000ng/mL的抗体MF4327xMF5196及MockxCD3抗体(抗CD3 IgG格式化为WT Fc效应子功能)共培养历时5天。T细胞增殖是通过CFSE-阳性T细胞减少来证明。(E)健康的供体衍生的PBMCs是以1，000ng/mL抗体MF4327xMF5196、MockxCD3或抗CD3(CD3)抗体被培养48小时。随后，收获上清液、使用人类10-plex Luminex设定来测量这些上清液内的人类细胞因子电平。可检测到六种细胞因子所示的细胞因子电平。A-D中显示的数据是来自一位单一供体且为来自多个独立实验的4位独立的供体的代表。E中显示的数据来自两位代表性的健康PBMC供体，每位供体具有多次重复测定，从而测试来自8位健康供体的PBMC。

图4：抗体MF4327xMF5196保留正常的骨髓祖细胞发展完整的骨髓及红血球谱系的潜力。来自健康的供体骨髓的CD34^POS造血祖细胞与自体预活化的T细胞系以10∶1的E∶T比率、在200ng/mL抗体MF4327xMF5196或MockxCD3存在下共培养16小时。A)使用定量流式细胞术设置，针对所示的细胞部分、抗体MF4327xMF5196诱导的裂解系相对于非IgG条件来判定。各数据点表示一独立的骨髓供体的三复本测试的平均值(n＝4)。图10中描述圈选策略。B)抗体MF4327xMF5196于细胞毒性分析16小时后对于不同的CD34^POS骨髓族群的影响的分析，显示三位供体的绝对数。CD34^POS祖细胞的图选描绘于图11中。不同的测试条件的绝对数定量化是通过整合以移动计数荧光(flow count fluorospheres)所判定的总CD34^POS细胞的频率及绝对计数来计算。资料显示二重复测量的平均。C)散点图显示抗体MF4327xMF5196于所示条件的细胞毒性分析16小时后、对于CLEC12A-和/或CD123表达亚群的影响，图选CD34^POSLIN^NEG细胞。显示二位之中的一位代表性供体。D)来自四位不同的供体的CD34^POS细胞于细胞毒性分析16小时后、以抗体MF4327xMF5196产生粒细胞-巨噬细胞群落(CFU-GM)、红血球暴发集落形成单位(BFU-E)及巨核细胞群落(CFU-Mk)的能力，是在半固体培养基内培养二周之后被定量。对照培养为非IgG治疗的共培养或单独接种的CD34^POS细胞。各数据点表示每位供体的三复本培养(CFU-GM及BFU-E)或四复本(CFU-Mk)的平均值。E)D中描述的二周MethoCult培养的CD15^POSCD33^POS及CD14^POSCD36^POSCD33^POS细胞含量的流式细胞术分析。资料显示针对三位不同的供体的总CD33^POS细胞之中的单核及骨髓性细胞的频率。HSC：造血干细胞；MPP：多潜能祖细胞；CMP：共同骨髓祖细胞；GMP：粒细胞-巨噬细胞祖细胞；MEP：巨核细胞-红血球祖细胞；CLP：共同淋巴祖细胞。使用成对司徒顿试验来进行统计分析。*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。

图5：抗体MF4327xMF5196通过自体T细胞有效地诱导CLEC12A^POS原发性AML原始细胞的重新导向裂解

自临床缓解的AML患者末梢血液分离的休眠CD3^POS T细胞系与AML诊断采集的CFSE标记的CLEC12A^POS自体原发性AML原始细胞共培养48小时。E∶T比率为5∶1且添加浓度1,000ng/mL的IgGs：抗体MF4327xMF5196、MockxCD3或对照IgG(全部都有WT Fc效应子功能)。每种IgG相对于PBS条件所诱导的AML原始细胞裂解程度是使用流式细胞术来定量。(A)图显示取得AML原始细胞样本及自体T细胞的AML期别。(B)原发性AML原始细胞样本上CLEC12A抗原的表达(AML原始细胞定义为CD45^+/-SSC^+/-)。直方图显示各患者样本的抗CLEC12A IgG结合，并且淋巴细胞以灰色表示及AML原始细胞以黑色表示。根据CLEC12A阴性淋巴细胞部分来设置CLEC12A阳性圈选；提供CLEC12A阳性原始细胞百分比。(C-D)AML患者的CD4^POS(C)及CD8^POS T细胞(D)的活化状态。(E)与所示的IgG培育时通过自体原发性T细胞、CLEC12A^POS原发性AML原始细胞介导的细胞毒性(相对于PBS)。显示数据为三位AML患者的样本(患者7-9，参见表III)以三复本测试的平均±SE。数据是相对于PBS、通过ANOVA被分析：**P＜0.01，***P＜0.001。

图6：抗体MF4327xMF5196于原发性AML样本内诱导AML原始细胞杀灭

于AML诊断取得的原发性AML患者样本是于补充细胞因子混合物的培养基内培养10天以支持AML原始细胞存活。添加200ng/mL的抗体MF4327xMF5196或MockxCD3抗体。针对每位患者，显示CD45xCD33图；第0天的活的图选(1ivegate)及第10天的每种IgG。以红色显示T细胞、以蓝色显示AML原始细胞(定义为CD45^+/-SSC^+/-)，及表示出T细胞及AML原始细胞的百分比。第0天直方图显示出每位患者的AML原始细胞细胞的CLEC12A表达电平。使用抗CLEC12A抗体染色以黑色显示以及使用同型对照抗体的染色以灰色显示。

图7：通过流式细胞术用来定量HL60标靶细胞裂解的圈选策略。通过流式细胞术来测量固定体积的细胞。根据FSC-SSC解析来图选活细胞(左手图)。于活的图选之中，接着图选CFSE^POS HL60细胞(右手图)。图选之中CFSE^POS活的HL60标靶细胞的绝对数系如材料及方法节中所述用来计算HL60标靶细胞裂解的百分比。上图显示无细胞毒性的PBS条件，而下图显示抗体MF4327xMF5196条件其中观察到HL60细胞毒性。

图8：以基于PBMC的单核细胞细胞毒性分析中用来定量细胞毒性的图选策略。如同所示图选出单核细胞(CD14^POS)、CD4(CD4^POSCD3^POS)及CD8 POSCD3^POS)T细胞，以及B细胞(CD19^POS)。固定体积的分析培养基测量的单核细胞及B细胞的绝对数系被定量且如材料及方法节中所述用来计算测试IgG条件诱导(下组)相对于PBS对照条件(上组)的细胞毒性百分比。确定的CD4^POS及CD8^POS T细胞亚群在T细胞族群内，以及其的活化状态系使用活化标识CD69来判定，相对于PBS对照条件。

图9：抗体MF4327xMF5196双特异性IgG的活性为E∶T比率-依赖性的健康的供体衍生的休眠T细胞系在抗体MF4327xMF5196、MockxCD3或对照IgG存在下与CFSE标记的HL60细胞共培养。于48小时共培养后判定于1,000ng/mL IgG、递增的E∶T比率对于HL60标靶细胞裂解的效应。

图10：用于定量健康的供体骨髓CD34^POS祖细胞的恢复的圈选策略。A)如所示来图选总CD34^POS细胞、CLEC12A^POS、CLEC12A^NEGCD10^NEG及CLEC12A^NEGCD10^NEG细胞。根据FSC及SSC面积及宽度来图选第一单一细胞，然后根据FSC-SSC解析及7AAD阴性来定义活细胞。于活细胞中，从共培养的T、使用CD34及CD5来图选CD34^POS细胞。于总CD34^POS细胞之中，细胞根据CLEC12A及CD10表达而分为三个族群。针对CD34^POS族群的定量化，于获取过程前添加已知浓度的固定体积的流动计数荧光给每种样本。每mL细胞的绝对数系根据荧光及细胞比率来计算。B)散点图显示一位代表性供体于的所有测试条件不同CD34^POS族群。

图11：用于判定不同的CD34^POS祖细胞的同一性及相对比率的圈选策略。根据FSC及SSC面积及宽度来圈选第一单一细胞，然后根据FSC-SSC解析及7AAD阴性来定义活细胞。于活细胞中，圈选谱系阴性CD34^POS细胞，接着FSC-SSC反向图选。细胞随后分为CD38^POS和CD38^NEG腔室。在CD34^POSCD38^POS腔室中，根据CD10表达来图选CLPs。缺少CD10表达的细胞根据CD123及CD45RA表达进一步分成CMP、MEP和GMP。针对一些供体，使用CD135而不是CD123来定义这些三个族群。于CD34^POSCD38^NEG腔室中，根据CD90及CD45RA表达来定义HSC及MPP。用荧光-减一对照来确认圈选。HSC：造血干细胞；MPP：多潜能祖细胞；CMP：共同骨髓祖细胞；GMP：粒细胞-巨噬细胞祖细胞；MEP：巨核细胞-红血球祖细胞；CLP：共同淋巴祖细胞。

图12：抗体MF4327xMF5196以等效率重新导向AML患者T细胞和健康的供体T细胞以特异性裂解CLEC12A^POS AML细胞系。从六位健康的供体或六位临床缓解AML患者(患者1-6；患者特征参见表III)的末梢血液分离休眠CD3^POS T细胞。分离的T细胞系在1,000ng/mL抗体MF4327xMF5196、MockxCD3 IgG或对照IgG存在下(全部都有WT Fc效应子功能)、与CFSE标记的HL60标靶细胞以5∶1的E∶T比率共培养48小时。(A-B)从健康的供体(HD)或AML患者获取、随后用于HL60标靶细胞裂解的T细胞CD3^POS部分内，CD4^POS T细胞(A)及CD8^POS T细胞(B)的亚群组成的可测式细胞测量术分析。T_CM：中央记忆T细胞；T_初始的：初始的

T细胞；T_EMRA+：有重新获得的CD45RA的效应子-记忆细胞；T_EM：效应子记忆T细胞。(C-E)所示的IgGs及T细胞来源的CD4^POS T细胞(C)及CD8^POS T细胞(D)的活化以及HL60标靶细胞裂解(E)，通过流式细胞术来分析且与PBS条件相比。各圆形表示以三复本测试的单一T细胞供体的平均值。数据系相对于PBS、通过ANOVA被分析：*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。

图13：SSC^lowCD45^dimCD34⁺CD38^-CLEC12A^+/-细胞二次平板培养所产生的细胞的形态及JAK2V617F突变状态。重新平板培养的CLEC12A梅-吉姆沙(May-Giemsa)染色阳性细胞，挑选个别的群落并测试JAK2驱动突变。

图14a：抗体MF4327xMF5196治疗的患者的IL-6电平。在给药前、输注结束4小时及24小时之后以PG/ml来测量。给药发生于第1天、第4天、第8天及第22天。患者于第1天接受1mg的初次剂量，接着于第4天接受3mg及于第8天接受15mg的逐步调升剂量，以及于第15天接受25mg的全剂量。还判定治疗周期结束(第28天)时的细胞因子电平。

图14b：抗体MF4327xMF5196治疗的患者的IL-8电平。在给药前、输注结束4小时及24小时之后以PG/ml来测量。给药发生于第1天、第4天、第8天及第22天。患者于第1天接受1mg的初次剂量，接着于第4天接受3mg及于第8天接受15mg的逐步调升剂量，以及于第15天接受25mg的全剂量。还判定治疗周期结束(第28天)时的细胞因子电平。

图14c：抗体MF4327xMF5196治疗的患者的TNFα电平。在给药前、输注结束4小时及24小时之后以PG/ml来测量。给药发生于第1天、第4天、第8天及第22天。患者于第1天接受1mg的初次剂量，接着于第4天接受3mg及于第8天接受15mg的逐步调升剂量，以及于第15天接受25mg的全剂量。还判定治疗周期结束(第28天)时的细胞因子电平。

图14d：抗体MF4327xMF5196治疗的患者的IFNγ电平。在给药前、输注结束4小时及24小时之后以PG/ml来测量。给药发生于第1天、第4天、第8天及第22天。患者于第1天接受1mg的初次剂量，接着于第4天接受3mg及于第8天接受15mg的逐步调升剂量，以及于第15天接受25mg的全剂量。还判定治疗周期结束(第28天)时的细胞因子电平。

图15a：抗体MF4327xMF5196治疗的患者的IL-6电平。在给药前、输注结束4小时及24小时之后以PG/ml来测量。给药发生于第1天、第4天、第8天及第22天。患者于第1天接受3mg的初次剂量，接着于第4天接受10mg及于第8天接受25mg的逐步调升剂量，以及于第15天接受40mg的全剂量。还判定治疗周期结束(第28天)时的细胞因子电平。

图15b：抗体MF4327xMF5196治疗的患者的IL-8电平。在给药前、输注结束4小时及24小时之后以PG/ml来测量。给药发生于第1天、第4天、第8天及第22天。患者于第1天接受3mg的初次剂量，接着于第4天接受10mg及于第8天接受25mg的逐步调升剂量，以及于第15天接受40mg的全剂量。还判定治疗周期结束(第28天)时的细胞因子电平。

图15c：抗体MF4327xMF5196治疗的患者的TNFα电平。在给药前、输注结束4小时及24小时之后以PG/ml来测量。给药发生于第1天、第4天、第8天及第22天。患者于第1天接受3mg的初次剂量，接着于第4天接受10mg及于第8天接受25mg的逐步调升剂量，以及于第15天接受40mg的全剂量。还判定治疗周期结束(第28天)时的细胞因子电平。

图15d：抗体MF4327xMF5196治疗的患者的IFNγ电平。在给药前、输注结束4小时及24小时之后以PG/ml来测量。给药发生于第1天、第4天、第8天及第22天。患者于第1天接受3mg的初次剂量，接着于第4天接受10mg及于第8天接受25mg的逐步调升剂量，以及于第15天接受40mg的全剂量。还判定治疗周期结束(第28天)时的细胞因子电平。

图16a：抗体MF4327xMF5196治疗的患者的IL-6电平。在给药前、输注结束4小时及24小时之后以PG/ml来测量。给药发生于第1天、第4天、第8天及第22天。患者于第1天接受5mg的初次剂量，接着于第4天接受15mg及于第8天接受25mg的逐步调升剂量，以及于第15天接受60mg的全剂量。还判定治疗周期结束(第28天)时的细胞因子电平。

图16b：抗体MF4327xMF5196治疗的患者的IL-8电平。在给药前、输注结束4小时及24小时之后以PG/ml来测量。给药发生于第1天、第4天、第8天及第22天。患者于第1天接受5mg的初次剂量，接着于第4天接受15mg及于第8天接受25mg的逐步调升剂量，以及于第15天接受60mg的全剂量。还判定治疗周期结束(第28天)时的细胞因子电平。

图16c：抗体MF4327xMF5196治疗的患者的TNFα电平。在给药前、输注结束4小时及24小时之后以PG/ml来测量。给药发生于第1天、第4天、第8天及第22天。患者于第1天接受5mg的初次剂量，接着于第4天接受15mg及于第8天接受25mg的逐步调升剂量，以及于第15天接受60mg的全剂量。还判定治疗周期结束(第28天)时的细胞因子电平。

图16d：抗体MF4327xMF5196治疗的患者的IFNγ电平。在给药前、输注结束4小时及24小时之后以PG/ml来测量。给药发生于第1天、第4天、第8天及第22天。患者于第1天接受5mg的初次剂量，接着于第4天接受15mg及于第8天接受25mg的逐步调升剂量，以及于第15天接受60mg的全剂量。还判定治疗周期结束(第28天)时的细胞因子电平。

具体实施方式

治疗性单克隆抗体(mAbs)的给药通常基于体型大小。这是因为基于体型大小的给药会减少药物暴露中的个体间变异性的概念。然而，多数mAbs为标靶特异性且有比较大的治疗范围及通常很小的药物动力学变异性体型大小贡献。另一方面取决于抗体类型、抗体的标靶特异性及其他因子，抗体会展现严重的中靶及脱靶副作用。其中更严重的一些为集体称为细胞因子释放症候群(CRS)的病况。细胞因子释放症候群是一种全身性发炎反应症候群的形式，其出现为一些疾病或感染的并发症，以及已知存在为一些抗体药物及授受性T细胞疗法的不良效应。严重情况还已称为“细胞因子风暴”。

自从第一种单株抗体药物，莫罗单抗(muromonab-CD3)批准后就已经知道为抗体治疗可能的不良效应的CRS，莫罗单抗造成CRS。然而，该问题在2006年促效CD28结合抗体TGN 1412的第I期临床试验后被认为是严重的。全部六位健康的志愿者展现严重的CRS且病得很重。

近来，注意到在CD3抗体的背景下、以CD3/CD19和CD3/CD123双特异性抗体进行的临床试验已被搁置(Johnson A.Oct 9，2018及Sheridan C，2016)。

在本发明中发现施用初次剂量作为第一次施用接着结合CD3和CLEC12A的抗体全剂量是有效的且要治疗CLEC12A阳性癌症的个体耐受良好。不希望受理论束缚，但据信以较低的剂量启动-较低的剂量以一个或多个步骤递增至全剂量-在这方面是有帮助的。激活剂量通常给予一次但也能给予二次，或以许多次施用更多次。初次剂量可接着逐步增量剂量的逐步调升给药直到达到全剂量为止。抗体的第一量优选为初次剂量。抗体剂量施用通常是定期给予。启动和后续的启动或逐步调升施用，设如果超过一次，之间的时间间隔可在1-7天之间变化，但通常是一天或三天。后续的逐步调升剂量施用，设如果超过一次，之间的时间间隔可在3-7天之间变化，但通常是三天。全剂量施用之间的时间间隔通常是一周。第一启动施用及后续的逐步调升施用，如果有的话，之间的时间间隔通常是三天。最后一次施用及后续的全剂量施用，如果有的话，之间的时间间隔可在3-7天之间变化，但通常是三天。第一次施用及后续的全剂量施用之间的时间间隔通常是七天。剂量施用通常每天计算。初次剂量、逐步调升剂量或全剂量为一天给予的量。实际的施用可能需要一些时间。通常但未必为在一个或多个小时的时间内的输注。

现有技术中，剂量递增研究主要是于临床试验执行以快速地找到有效剂量以及避免患者不必要的暴露于亚治疗剂量(Tourneau，Michiels等人的2009)。在本发明中的初次剂量不是要给来快速地找到治疗剂量及避免患者暴露于亚治疗剂量。反而其是给予个体作为给药方案的一部分，该给药方案是设计来治疗个体而在达到全剂量时同时降低治疗族群的发生率和/或副作用的程度。

本发明提供一种治疗个体的CLEC12A阳性癌症的方法，该方法包括以结合CD3和CLEC12A的双特异性抗体的两次或更多次施用来治疗有需要的该个体，其中在第一次施用中施用该双特异性抗体的第一量并且其中在后续施用中该双特异性抗体的量比该第一次施用的该双特异性抗体的量高。于该两次或更多次施用的该第二次中该施用的双特异性抗体的量优选比该第一次施用的该双特异性抗体的量高，以及，在超过二次施用的情况下，比该两次或更多次施用的第三次的该双特异性抗体的量低，在该第二次施用含括一逐步调升剂量时。设如果该第二次施用为一全剂量，则该第二及第三次施用的该施用的双特异性抗体的量是相等的。于该两次或更多次施用的该第三次中该施用的双特异性抗体的量优选比该两次或更多次施用的该第二次的该双特异性抗体的量高，以及，在该第三次施用含括一逐步调升剂量的情况下，比该两次或更多次施用的第四次的量低。于该递增量的双特异性抗体的该施用之后，即于该启动及逐步调升阶段之后，该双特异性抗体于每次的该后续施用中优选以一基本上恒定的剂量来施用。该基本上恒定的剂量还称为全剂量。

在每次的该后续施用中该基本上恒定的剂量优选为至少15mg的该双特异性抗体。该基本上恒定的剂量每次后续施用优选为至少或等于20、25、30、35、40、45、50、55mg，以及优选介于60-600mg之间，例如介于60-120；60-180；60-200；60-240；60-480；120-240；120-480；240-480；或240-600mg之间的该双特异性抗体。

该双特异性抗体的该第一量优选为9mg或更小，例如介于1-9mg之间或介于1-5mg之间，优选为3mg或更小，例如介于1-3mg之间，更优选为大约1mg，还更优选为大约3mg，最佳为大约5mg。

该递增量的抗体的施用优选于施用之间以3至4天之间的时间间隔来完成。抗体的基本上恒定量的施用日之间的时间间隔优选为6-8天，优选为7天。

双特异性抗体的第一量优选为双特异性抗体的亚治疗量。双特异性抗体的亚治疗量为当以每周施用来施用时通常不会产生治疗效应的抗体量。

在一个实施方案中，在治疗的第1天给予介于1-9mg之间的双特异性抗体的第一量。在治疗的第3、4或5天给予介于3-20mg之间，优选为介于10-20mg之间的第一逐步调升剂量；在治疗的第7、8或9天给予介于15-30mg之间，优选为介于20-30mg之间的第二逐步调升剂量；以及在治疗的第14、15或16天给予介于25-600mg之间的全剂量。

在一个实施方案中，在治疗的第1天给予1mg的双特异性抗体的第一量。在治疗的第4天给予3mg的第一逐步调升剂量；在治疗的第8天给予15mg的第二逐步调升剂量；以及在治疗的第15天给予25mg的全剂量。

在一个实施方案中，在治疗的第1天给予3mg的双特异性抗体的第一量。在治疗的第4天给予15mg的逐步调升剂量；以及在治疗的第8天给予25mg的全剂量。

在一个实施方案中，在治疗的第1天给予5mg的双特异性抗体的第一量。在治疗的第4天给予15mg的逐步调升剂量；以及在治疗的第8天给予25mg的全剂量。

在一个实施方案中，在治疗的第1天给予3mg的双特异性抗体的第一量。在治疗的第4天给予10mg的第一逐步调升剂量；在治疗的第8天给予25mg的第二逐步调升剂量；以及在治疗的第15天给予40mg的全剂量。

在一个实施方案中，在治疗的第1天给予3mg的双特异性抗体的第一量。在治疗的第4天给予15mg的第一逐步调升剂量；在治疗的第8天给予25mg的第二逐步调升剂量，在治疗的第15天给予40mg的全剂量。

在另一个实施方案中，在治疗的第1天给予5mg的双特异性抗体的第一量。在治疗的第4天给予10mg的第一逐步调升剂量；在治疗的第8天给予25mg的第二逐步调升剂量；以及在治疗的第15天给予40mg的全剂量。

在另一个实施方案中，在治疗的第1天给予5mg的双特异性抗体的第一量。在治疗的第4天给予15mg的第一逐步调升剂量；在治疗的第8天给予25mg的第二逐步调升剂量以及在治疗的第15天给予40mg的全剂量。

在另一个实施方案中，在治疗的第1天给予3mg的双特异性抗体的第一量。在治疗的第4天给予10mg的第一逐步调升剂量；在治疗的第8天给予25mg的第二逐步调升剂量；以及在治疗的第15天给予60mg的全剂量。

在另一个实施方案中，在治疗的第1天给予3mg的双特异性抗体的第一量。在治疗的第4天给予15mg的第一逐步调升剂量；在治疗的第8天给予25mg的第二逐步调升剂量；以及在治疗的第15天给予60mg的全剂量。

在另一个实施方案中，在治疗的第1天给予5mg的双特异性抗体的第一量。在治疗的第4天给予10mg的第一逐步调升剂量；在治疗的第8天给予25mg的第二逐步调升剂量；以及在治疗的第15天给予60mg的全剂量。

在另一个实施方案中，在治疗的第1天给予5mg的双特异性抗体的第一量。在治疗的第4天给予15mg的第一逐步调升剂量；在治疗的第8天给予25mg的第二逐步调升剂量；以及在治疗的第15天给予60mg的全剂量。

在另一个实施方案中，在治疗的第1天给予3mg的双特异性抗体的第一量。在治疗的第4天给予10mg的第一逐步调升剂量；在治疗的第8天给予25mg的第二逐步调升剂量，在治疗的第15天给予120mg的全剂量。

在另一个实施方案中，在治疗的第1天给予3mg的双特异性抗体的第一量。在治疗的第4天给予15mg的第一逐步调升剂量；在治疗的第8天给予25mg的第二逐步调升剂量，在治疗的第15天给予120mg的全剂量。

在另一个实施方案中，在治疗的第1天给予5mg的双特异性抗体的第一量。在治疗的第4天给予10mg的第一逐步调升剂量；在治疗的第8天给予25mg的第二逐步调升剂量，在治疗的第15天给予120mg的全剂量。

在另一个实施方案中，在治疗的第1天给予5mg的双特异性抗体的第一量。在治疗的第4天给予15mg的第一逐步调升剂量；在治疗的第8天给予25mg的第二逐步调升剂量，在治疗的第15天给予120mg的全剂量。

在另一个实施方案中，在治疗的第1天给予3mg的双特异性抗体的第一量。在治疗的第4天给予10mg的第一逐步调升剂量；在治疗的第8天给予25mg的第二逐步调升剂量，在治疗的第15天给予240mg的全剂量。

在另一个实施方案中，在治疗的第1天给予3mg的双特异性抗体的第一量。在治疗的第4天给予15mg的第一逐步调升剂量；在治疗的第8天给予25mg的第二逐步调升剂量，在治疗的第15天给予240mg的全剂量。

在另一个实施方案中，在治疗的第1天给予5mg的双特异性抗体的第一量。在治疗的第4天给予10mg的第一逐步调升剂量；在治疗的第8天给予25mg的第二逐步调升剂量，在治疗的第15天给予240mg的全剂量。

在另一个实施方案中，在治疗的第1天给予5mg的双特异性抗体的第一量。在治疗的第4天给予15mg的第一逐步调升剂量；在治疗的第8天给予25mg的第二逐步调升剂量，在治疗的第15天给予240mg的全剂量。

在另一个实施方案中，在治疗的第1天给予3mg的双特异性抗体的第一量。在治疗的第4天给予10mg的第一逐步调升剂量；在治疗的第8天给予25mg的第二逐步调升剂量，在治疗的第15天给予400mg的全剂量。

在另一个实施方案中，在治疗的第1天给予3mg的双特异性抗体的第一量。在治疗的第4天给予15mg的第一逐步调升剂量；在治疗的第8天给予25mg的第二逐步调升剂量，在治疗的第15天给予400mg的全剂量。

在另一个实施方案中，在治疗的第1天给予5mg的双特异性抗体的第一量。在治疗的第4天给予10mg的第一逐步调升剂量；在治疗的第8天给予25mg的第二逐步调升剂量，在治疗的第15天给予400mg的全剂量。

在另一个实施方案中，在治疗的第1天给予5mg的双特异性抗体的第一量。在治疗的第4天给予15mg的第一逐步调升剂量；在治疗的第8天给予25mg的第二逐步调升剂量，在治疗的第15天给予400mg的全剂量。

在另一个实施方案中，在治疗的第1天给予3mg的双特异性抗体的第一量。在治疗的第4天给予10mg的第一逐步调升剂量；在治疗的第8天给予25mg的第二逐步调升剂量，在治疗的第15天给予600mg的全剂量。

在另一个实施方案中，在治疗的第1天给予3mg的双特异性抗体的第一量。在治疗的第4天给予15mg的第一逐步调升剂量；在治疗的第8天给予25mg的第二逐步调升剂量，在治疗的第15天给予600mg的全剂量。

在另一个实施方案中，在治疗的第1天给予5mg的双特异性抗体的第一量。在治疗的第4天给予10mg的第一逐步调升剂量；在治疗的第8天给予25mg的第二逐步调升剂量，在治疗的第15天给予600mg的全剂量。

在另一个实施方案中，在治疗的第1天给予5mg的双特异性抗体的第一量。在治疗的第4天给予15mg的第一逐步调升剂量；在治疗的第8天给予25mg的第二逐步调升剂量，在治疗的第15天给予600mg的全剂量。

设如果由一剂量至另一剂量，诸如例如由25mg至240mg，的步骤似乎造成CRS症状，则剂量方案可改动成包括一个或多个另外的逐步调升剂量，例如120mg。也可决定延长逐步调升剂量和/或全剂量之间的时间间隔。这些原理可用于本文所公开的任一剂量方案。

本发明使用一种特异性施用方法，优选有离散的时间间隔。施用方案经设计以提供有效且安全的全剂量。在一方面中安全剂量目的在于防止及最小化细胞因子释放症候群(CRS)的严重性及发生率。

优选的施用方案包括施用一个或多个施用的初次剂量，一个或多个逐步调升剂量其中该剂量随着剂量增量增高直到达到全剂量为止。增量优选是逐步的。在一方面中增量是等增量直到达到全剂量或维持剂量为止。然而，已发现与低或非常低的初次剂量和/或首次逐步调升剂量开始相比，以较高初次剂量和/或较高的首次逐步调升剂量开始会导致全剂量较不严重的副作用，诸如例如细胞因子释放。换句话说，以较高的激活剂量开始会比以较低的激活剂量开始更有效地减轻细胞因子释放。示例性较高的激活剂量为例如3或5mg。较低的激活剂量为例如1mg。

全剂量通常在治疗期间是固定的，但可取决于个体个别的治疗和/或副作用反应而向上或向下调整。

一个或多个逐步调升剂量优选于第一周或第二周施用期间给予。在一个实施方案中每3天给予第一启动施用及逐步调升施用(D1-D4-D8)，接着每7天全剂量施用(每周一次)。于第8天(D8)的剂量可与全剂量相等。全剂量优选从第8-15天开始，取决于逐步调升施用的次数。

在本发明的一方面中一个或多个抗体施用伴随着乙酰胺酚及抗组织胺的预治疗和/或伴随治疗。抗组织胺优选为H1拮抗剂。H1拮抗剂抑制抗组织胺于H₁受体的作用。乙酰胺酚及抗组织胺的治疗优选在抗体施用同一天给予且优选在抗体施用之前。乙酰胺酚及抗组织胺的治疗优选随着每种抗体施用来给予。

提供一种结合CD3和CLEC12A的双特异性抗体供用于一种治疗个体的CLEC12A阳性癌症的方法中，其中该治疗包括结合CD3和CLEC12A的双特异性抗体的两次或更多次施用，其中在第一次施用中施用该双特异性抗体的第一量并且其中于每次后续施用中该双特异性抗体的量比该第一次施用的该双特异性抗体的量高。本发明进一步提供一种结合CD3和CLEC12A的双特异性抗体用于制造用于治疗个体的CLEC12A阳性癌症的一药物的用途，其中在第一次施用中施用该双特异性抗体的第一量并且其中于每次后续施用中该双特异性抗体的量比该第一次施用的该双特异性抗体的量高。

进一步提供一种从个体清除CLEC12A阳性造血细胞且以正常CLEC12A阳性细胞再植该个体的该造血系统的方法，该方法包括每隔一段时间施用结合CD3和CLEC12A的双特异性抗体给有需要的该个体借此刺激该个体的造血干细胞以用新生的造血干细胞衍生细胞，包括CLEC12A阳性细胞被再植该造血系统。该个体优选为一具有AML、骨髓增生性肿瘤母细胞期(MPN-BP)、骨髓纤维化(MF)或骨髓增生异常综合征(MDS)的个体。于优选的实施方案中该个体具有骨髓增生性肿瘤母细胞期(MPN-BP)、骨髓纤维化(MF)或骨髓增生异常综合征(MDS)。发现正常的造血干细胞主要是CLEC12A阴性。于祖细胞部分中CLEC12A表达局限于粒细胞-巨噬细胞祖细胞(GMP)细胞及一部分的共同骨髓祖细胞(CMP)及巨核细胞-红血球祖细胞(MEP)细胞。于清除CLEC12A阳性细胞后，此类未清除的CMP及MEP仍然能生成GMP及BFU-E(红血球)及CFU-Mk(巨核细胞)。如本文所述的CD3xCLEC12A双特异性抗体的治疗能移去恶性细胞，而保持造血干细胞及祖细胞的潜力未改变。这些在如本文所述的抗体治疗后受到刺激而以新的健康的细胞，包括CLEC12A阳性细胞来再植造血系统。受刺激的细胞还生产新分化的CLEC12A阴性细胞。这可以通过该抗体的治疗来实现，从而在与使用CD19或CD123或其他的标靶的CD3衔接器进场相比时至少降低了从造血系统移去CLEC12A阳性细胞的免疫的影响。再植时间至少比其他的CD3衔接器方式例如CD19及CD123更短。此外与其他CD3衔接器格式相比时，因为本发明治疗保留了CFU-Mk及BFU-E祖细胞，所以也保留了该造血系统的血小板生产能力及红血球生产能力。

还提供一种从个体清除CLEC12A阳性造血细胞且以正常CLEC12A阳性细胞再植该个体的该造血系统的方法，该方法包括每隔一段时间施用结合CD3和CLEC12A的双特异性抗体给有需要的该个体借此诱导该个体的造血干细胞和/或造血祖细胞以用新生的造血干细胞衍生CLEC12A阳性细胞被再植该造血系统。

进一步提供一种用于刺激个体的粒细胞及单核细胞发展的方法，该方法包括每隔一段时间施用结合CD3和CLEC12A的双特异性抗体给有需要的该个体借此诱导CLEC12A阴性造血干细胞或祖细胞发展粒细胞及单核细胞。每隔一段时间施用优选遵循如上文所述的时间间隔。给药时间表优选如本文所述。

该个体优选为具有AML、骨髓增生性肿瘤母细胞期(MPN-BP)、骨髓纤维化(MF)或骨髓增生异常综合征(MDS)的个体。于优选的实施方案中该个体具有骨髓增生性肿瘤母细胞期(MPN-BP)、骨髓纤维化(MF)或骨髓增生异常综合征(MDS)。

还提供一种制备用于要治疗CLEC12A阳性癌症的个体的自体骨髓细胞移植物的方法，该方法包括在适合杀灭CLEC12A阳性细胞的条件下以结合CD3和CLEC12A的双特异性抗体培育该个体的骨髓细胞制备物，并且随后从该培育采集骨髓细胞。进一步提供一种治疗个体的CLEC12A阳性癌症的方法，该方法包括在适合杀灭CLEC12A阳性细胞的条件下以结合CD3和CLEC12A的双特异性抗体培育该个体的骨髓细胞制备物，以造血系统消融疗法来治疗该个体且提供包括该培育的骨髓细胞的骨髓细胞移植物给该个体。自体移植物内从移植物的骨髓或血液衍生的T细胞重新靶向以由自体移植物消除CLEC12A阳性细胞。一种如本文所公开的CD3和CLEC12A双特异性抗体即使在很低的效应子标靶细胞比率，包括在1∶3-1∶97范围内以及在图6及表II反映的电平下都是有效的。如本文所述的适合杀灭CLEC12A阳性细胞的条件需要T细胞例如自体T细胞或预活化的T细胞存在。由于以许多当代的骨髓收获法通常还采集到的大量的血液存在，所以这些细胞通常会存在于骨髓制备物内。消融疗法为一种治疗其由于疗法而导致细胞破坏。许多化学疗法及其他抗肿瘤疗法还杀灭正常的细胞。骨髓是较敏感的器官之一。造血系统消融疗法在本发明的背景下系一种有附加作用或副作用的疗法(或治疗)其中该疗法或治疗杀灭“正常的”或“健康的”造血系统的很大部分。骨髓通常在以造血系统消融疗法治疗患者前采集。此骨髓于疗法刺激该个体的造血系统的再植完成之后移植回该个体。为防止异常细胞还被移植，此骨髓制备物通常清除异常细胞。分选CD34阳性细胞在异常细胞不是CD34阳性时为一种方法。这些清除方法通常导致移去超出必要的细胞而导致比该个体的造血系统可能的再植更慢。本发明的清除方法有效地从骨髓制备物移去异常细胞而让再植更快速。

在本发明的实施方案中提供一种提供个体一保留(sparing)造血干细胞的癌症治疗的方法，其中该方法包括施用结合CD3和CLEC12A的双特异性抗体给有需要的该个体。在一些实施方案中该个体有一种CLEC12A阳性癌症。

一种如本文所公开的双特异性抗体优选施用为静脉灌注。灌注通常需要大约2-4小时但更长及更短施用还是可能的。灌注通常不会持续超过12小时的期间。

每次施用到达到基本上恒定量为止的抗体量的增量还称为单一的患者的剂量递增方案或患者内剂量递增。

为了使本说明书更容易理解，首先定义某些术语。在整个详细说明中阐明附加的定义。除非另有说明，否则本文所使用的所有技术和科学术语系与本领域技术人员所通常了解的意义相同，并且使用熟知的免疫学、蛋白化学、生物化学、重组DNA技术及药理学方法。

当使用于本文中，除非上下文另外明确指定，否则单数形式“一(a)”、“一(an)”及“该”包括复数的指示制品。使用术语“包括(including)”及其它形式，例如“包括(include)、包括(includes)和包括(included)”系非限制性的。

当使用于本文中，术语“CLEC12A”是指C型凝集素域家族12成员A。CLEC12A还称为C型凝集素蛋白CLL-1；MICL；树突细胞缔合凝集素2；C型凝集素超家族；骨髓抑制性C型凝集素样受体；C型凝集素样分子1；DCAL2；CLL1；C型凝集素样分子1；DCAL-2；杀手细胞凝集素样受体次家族L，成员1(KLRL1)；CD371(分化群371)(Bakker，van den Oudenrijn等人的2004；GenBankTM登录序号：AY547296；Zhang W.等人的GenBankTM登录序号：AF247788；Marshall，Willment等人的2004；GenBankTM登录序号：AY498550；Han，Zhang等人的2004；Chen，Floyd等人的2006.GenBankTM登录序号：AY426759；Chen，Floyd等人的2006.Ids：HGNC：31713；Entrez Gene：160364；Ensembl：ENSG00000172322；OMIM：612088；UniProtKB：Q5QGZ9。

CLEC12A是一种抗原，其表达在急性骨髓性白血病(AML)中的白血病原始细胞上及白血病干细胞上，包括CD34阴性或CD34低表达的白血病干细胞(边缘族群(sidepopulation))(Bakker，van den Oudenrijn等人的2004；van Rhenen，van Dongen等人的2007；Moshaver，van Rhenen等人，2008)，以及于骨髓增生异常综合征(MDS)中(Bakker，vanden Oudenrijn等人的2004，及Toft-Peterson，Nederby等人，2016)。CLEC12A的表达另外被认为局限于造血谱系，特别是末梢血液及骨髓内的骨髓谱系，即粒细胞、单核细胞及树突细胞祖细胞。更重要地是，CLEC12A不存在于正常的造血干细胞上。在本文谈及CLEC12A的处，其是指人类CLEC12A(SEQ ID NO：1)，除非另有特别说明。

术语CLEC12A意指本文所述的所有变异体(例如剪接和突变)及其保有骨髓表达解析(在表面表达电平及mRNA电平两者)的同功型，包括如Bakker，van den Oudenrijn等人的2004及Marshall，Willment等人的2004乙文所述。虽然主要提供登录序号作为另外的鉴别方法，但实际的蛋白序列可能，诸如因为编码基因突变而变化，例如在一些癌症及类似癌症中发生的此类。

术语“CD3”(分化群3)是指由CD3γ链(SwissProt P09693)、CD3δ链(SwissProtP04234)、CD3ε链(SwissProt P07766)和CD3ζ链同型二聚体(SwissProt P20963)组成的蛋白错合物。CD3ε以各种别名而闻名，其中一些为：“CD3e分子，ε(CD3-TCR错合物)”；“CD3e抗原，ε多肽(TiT3错合物)”；T细胞表面抗原T3/Leu-4ε链；T3E；T细胞抗原受体错合物，T3的ε亚单位；CD3e抗原；CD3-ε3；IMD18；TCRE。CD3E基因的Ids为HGNC：1674；Entrez Gene：916；Ensembl：ENSG00000198851；OMIM：186830及UniProtKB：P07766。这些链与T细胞受体(TCR)缔合且ζ链于T淋巴细胞内产生活化讯息。TCR、ζ链和CD3分子一起组成TCR错合物。CD3表达于T细胞上。在本文谈及CD3的处，其是指人类CD3(SEQ ID NO：2-5)，除非另有特别说明。

当使用于本文中术语“抗体系”是指一种蛋白质分子其属于免疫球蛋白类的蛋白质，其含有一个或多个域与抗原上的表位结合，其中这些域系衍生自一抗体的可变区域或与一抗体的可变区域共享序列同源性。抗体典型由基本结构单元组成-各基本结构单元有二重链及二轻链。治疗用途的抗体优选尽可能接近待治疗个体的天然抗体(诸如人类个体的人类抗体)。如本发明的抗体不限于任何特定格式或其生产方法。

“双特异性抗体”为一种如本文所述的抗体，其中该抗体的一域与第一抗原结合而该抗体的第二域与第二抗原结合，其中该第一与第二抗原不是完全相同的。术语“双特异性抗体”还包括抗体其中一重链可变区域/轻链可变区域(VH/VL)组合结合一抗原上的第一表位及第二VH/VL组合结合第二表位。该术语进一步包括抗体其中VH能特异性识别第一抗原，并且与免疫球蛋白可变区域的VH配对的VL能特异性识别第二抗原。生成的VH/VL对会结合抗原1或抗原2。这些所谓的“二合一抗体系”系于例如WO2008/027236、WO2010/108127及Schaefer，Haber等人，2011乙文内有描述。如本发明的双特异性抗体不限于任何特定双特异性格式或其生产方法。

当使用于本文中术语“共同的轻链”是指双特异性抗体内的二个轻链(或其VL部分)。该二个轻链(或其VL部分)可能完全相同或有一些氨基酸序列差异却不影响全长抗体的结合特异性。“共同的”还指氨基酸序列不是完全相同的该轻链的功能等效物。该轻链存在有许多变异体其内有出现不影响功能结合区域形成的突变(缺失、替换、插入和/或添加)。本发明的轻链也可为上文指明的轻链，其具有0至10个，优选0至5个氨基酸插入、缺失、取代、加入或其的组合。要制备或找到不是完全相同但仍然在功能上相等的轻链系落在例如本文所使用的共同的轻链的定义范围内，诸如通过导入且测试保留型氨基酸变化来进行，当与重链等等配对时，区域内的氨基酸变化不会对结合特异性起作用或只是起部分作用等等。

如本发明的术语“全长IgG”或“全长抗体系”系定义为包括基本上完整的IgG，然而其不一定具有完整的IgG的全部功能。为避免疑义，全长IgG含有二重链及二轻链。各链含有恒定(C)及可变异(V)区域，其能细分为命名为CH1、CH2、CH3、VH及CL、VL的域。IgG抗体系经由Fab部分内含的可变区域域与抗原结合，并且于结合后能经由恒定域，主要是经由Fc部分，来与分子及免疫系统的细胞交互作用。如本发明的全长抗体包括其中可能存在提供所期望特征的突变的IgG分子。全长IgG不应有任何区域的实质部分的缺失。然而，术语“全长IgG”包括其中缺失一或数个氨基酸残基，但没有实质改变产生的IgG分子的结合特征的IgG分子。举例来说，此IgG分子能有1至10个之间的氨基酸残基缺失，优选于非CDR区域内，其中缺失的氨基酸对IgG的结合特异性不是必需的。

本文的氨基酸残基的“同一性百分比(％)”是定义为为了进行最佳比较而排列比对序列后，候选序列的氨基酸残基与一选定序列的氨基酸残基为同一的百分比。要比较的两个序列中的任何一个可引入间隙以使两个序列的排列比对达成最大。此排列比对可以在要比较的全长序列上进行。任择地，排列比对可以于较短的长度上进行，例如大约20、大约50、大约100或更多核苷酸/碱基或氨基酸。序列同一性为两个序列于报告的排列比对区域之间同一的匹配的百分比。

序列的比较及两个序列之间的序列同一性百分比的测定可使用数学算法完成。熟习此项技术者会知道可用数种不同的计算机程序来排比二个序列且判定二个序列之间的同一性(Kruskal，J.B.，1983)。二个氨基酸序列之间的序列同一性百分比可使用供用于二个序列排比的尼德曼与温施算法(Needleman and Wunsch algorithm)来测定。(Needlemanand Wunsch，1970)。尼德曼-温施算法已在电脑程式NEEDLE中被执行。关于本发明，可使用来自EMBOSS软件包的NEEDLE程序(版本2.8.0或更高，Rice，Longden等人，2000；http：//emboss.bioinformatics.nl/)。针对蛋白质序列，EBLOSUM62使用于替代矩阵(substitution matrix)。所使用的选择性参数是10之间隙-开放惩罚(gap-open penalty)以及0.5之间隙扩展惩罚(gap extension penalty)。

于以上所述的程序NEEDLE进行排比后，查询序列与本发明的序列之间的序列同一性百分比可计算如下：排比中于二个序列内显示为同一的氨基酸或同一的核苷酸的对应位置的数目除以排比中减去间隙总数后的排比总长度。

因一种抗体通常仅识别抗原的一表位，并且此一表位也可存在于其他化合物，如本发明“特异地识别”一抗原例如，CLEC12A或CD3，的抗体也可识别其他化合物，如果此其他化合物含有同类的表位。因此就抗原与抗体的交互作用而言，术语“特异地识别”不排除抗体与含有同类表位的其他化合物的结合。

术语“表位”或“抗原决定位”是指一抗原上与免疫球蛋白或抗体特异性结合的地址。表位可由相邻的氨基酸或由蛋白的三级折叠并列的不连续氨基酸(所谓的线形或构形表位)形成。自相邻的、线形氨基酸形成的表位通常在暴露于变性溶剂时得以保持，而由三级折叠形成的表位，构形通常在用变性溶剂处理时有所损失。表位在独特的空间构形中通常包括3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸。判定表位的空间构形的方法系熟悉此艺者已知的且包括本领域的技术例如x射线结晶学、HDX-MS及二维核磁共振、肽扫描(pepscan)及丙胺酸扫描，取决于表位的性质(参见诸如Morris G.E.，1996)。

当使用于本文中术语“异常细胞”包括肿瘤细胞，更具体地血液来源的肿瘤细胞，还包括白血病前期细胞例如造成骨髓增生异常综合征(MDS)的细胞及白血病细胞例如急性骨髓性白血病(AML)肿瘤细胞或慢性骨髓性白血病(CML)细胞。

当使用于本文中术语“免疫效应子细胞”或“效应子细胞”是指哺乳动物免疫系统内的细胞天然库内的细胞，其能被活化以影响标靶细胞的生存力。免疫效应子细胞包括淋巴谱系细胞例如自然杀手(NK)细胞、T细胞包括胞毒型T细胞或B细胞，并且包括骨髓谱系细胞，例如单核细胞或巨噬细胞、树突细胞及嗜中性粒细胞。因此，该效应子细胞优选为NK细胞、T细胞、B细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞及或嗜中性粒细胞。募集效应子细胞至异常细胞意指使免疫效应子细胞接近异常标靶细胞以使得效应子细胞能直接杀灭异常细胞或间接发起杀灭异常细胞。

当使用于本文中，术语“个体”及“患者”系可互换使用且是指哺乳动物例如人类、小鼠、大鼠、仓鼠、天竺鼠、兔、猫、狗、猴、牛、马、猪等(例如，有癌症的患者，例如人类患者)。

当使用于本文中，术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”及“治疗(treatment)”是指在个体上进行任何类型的干预或过程或向该个体施用活性剂或活性剂组合，并且目的在于逆转、减轻、改良、抑制或减慢或预防与疾病相关联的症状、并发症、病况或生物化学指标的进展、发展、严重性或复发。

当使用于本文中，“有效的治疗”或“正面治疗反应”是指产生有益效应的治疗，例如减轻疾病或障碍，如癌症的至少一症状。有益效应能以比基线有所改善的方式呈现，包括比根据该方法的疗法起始前所进行的测量或观察有改善。例如，有益效应能以减慢、稳定、中止或逆转癌症于处于任何临床阶段的个体内的进展的方式呈现，如由疾病的临床或诊断症状或癌症标识减少或消除来证明。有效的治疗可，例如减小肿瘤尺寸、减少循环的肿瘤细胞存在、降低或预防肿瘤转移、减慢或阻止肿瘤生长和/或预防或延迟肿瘤复发或再发。

术语“治疗量”是指提供所期望的生物、治疗和/或预防结果的制剂或制剂组合的量。该结果可为减少、改良、缓和、衰减、延迟和/或减轻疾病的一个或多个征象、症状或原因，或生物系统任何其他所期望改变。在一些实施方案中，治疗量为足以延迟肿瘤发展的量。在一些实施方案中，治疗量为足以预防或延迟肿瘤复发的量。治疗量能以一次或多次施用被施用。药物或组合物的治疗量可以：(i)降低癌细胞的数目；(ii)缩小肿瘤尺寸；(iii)在一定程度上抑制、减缓、减慢且可中止癌细胞浸润至周边器官内；(iv)抑制肿瘤转移；(v)抑制肿瘤生长；(vi)预防或延迟肿瘤发生和/或复发；和/或(vii)在一定程度上缓解癌症相关联的一个或多个症状。在一示例中，“治疗量”是CLEC12A/CD3双特异性抗体的量，其减少癌症(例如癌细胞数目减少)或减慢癌症的进展，例如急性骨髓性白血病、骨髓增生异常综合征或慢性骨髓性白血病。

如本文所公开供用于本文所提供的方法的双特异性抗体包括双特异性抗体，其包括结合CLEC12A的重链可变区域/轻链可变区域(VH/VL)组合及结合CD3的第二VH/VL组合。

供用于CLEC12A/CD3双特异性抗体的合适的CLEC12A重链可变(VH)区域包括结合CLEC12A的此类。在优选实施方案中，CLEC12A/CD3双特异性抗体的CLEC12A VH区域结合肿瘤细胞上表达的CLEC12A。供用于CLEC12A/CD3双特异性抗体的示例性CLEC12A VH区域系公开于，例如WO2017/010874、WO2014/051433及WO2005/000894内(其的各自并入本文中以作为参考资料)。

在一些实施方案中，用于肿瘤细胞上的CLEC12A的该CLEC12A/CD3双特异性抗体的结合亲和力比对CD3的结合亲和力更高至少2倍、4倍、6倍、10倍、20倍、30倍、40倍或50倍。在某些实施方案中，用于CLEC12A的该CLEC12A/CD3双特异性抗体的CLEC12A结合亲和力系介于大约1×10e-6M及1×10e-10M之间、介于大约1×10e-7M及1×10e-10M之间，或介于大约1×10e-8与1×10e-10之间。在一些实施方案中，用于CLEC12A的该CLEC12A/CD3双特异性抗体的CLEC12A结合亲和力为至少1x10-e8 M，优选为至少1×10-e9 M。在某些实施方案中，用于CLEC12A的该CLEC12A/CD3双特异性抗体的结合亲和力在大约1×10e-8M与1×10e-9M之间，包括例如，大约2×10e-9M、大约3×10e-9M、大约4×10e-9M、大约5×10e-9M、大约6×10e-9M、大约7×10e-9M、8×10e-9M或大约9×10e-9M，以及用于CD3的该CLEC12A/CD3双特异性抗体的结合亲和力为低至少30倍、低至少40倍或低至少50倍。

在某些实施方案中，该CLEC12A/CD3双特异性抗体的CD3 VH区域以显著低于小鼠类抗CD3抗体，mOKT3的亲和力(KD)的亲和力与人类T细胞系上细胞表面表达的CD3/TCR结合。在一些实施方案中，该CLEC12A/CD3双特异性抗体的CD3 VH区域以至少1x10-e6 M的结合亲和力结合CD3。在一些实施方案中，该双特异性抗体的CD3结合亲和力介于大约1×10e-6M及1×10e-10M之间。在一些实施方案中，该双特异性抗体的CD3 VH区域的CD3结合亲和力介于大约1×10e-7M-1×10e-8M之间。

在一些实施方案中，该CLEC12A/CD3双特异性抗体包括结合人类CLEC12A的第一重链可变区域，其中该重链可变区域包括：

(a)如果氨基酸序列SGYTFTGY(SEQ ID NO：9)的重链CDR1、包括氨基酸序列IINPSGGS(SEQ ID NO：10-)的重链CDR2，以及包括氨基酸序列GTTGDWFDY(SEQ ID NO：11)的重链CDR3；

(b)包括氨基酸序列SGYTFTSY(SEQ ID NO：13)的重链CDR1、包括氨基酸序列IINPSGGS(SEQ ID NO：14)的重链CDR2，和包括氨基酸序列GNYGDEFDY(SEQ ID NO：15)的重链CDR3；或

(c)包括氨基酸序列SGYTFTGY(SEQ ID NO：17)的重链CDR1、包括氨基酸序列WINPNSGG(SEQ ID NO：18)的重链CDR2，和包括氨基酸序列DGYFADAFDY(SEQ ID NO：19)的重链CDR3。

可允许与所述的CDR序列有1、2或3个氨基酸残基的保留型变异同时保有同类的结合活性(于种类方面，不一定系数量)。因此，该重链CDR 1、2及3序列优选含有的序列与所述的CDR序列偏离不超过三个，优选为不超过二个，更优选为不超过一个氨基酸。在某些实施方案中，该重链CDR 1、2及3序列与所述的CDR序列为同一的。

在一些实施方案中，该CLEC12A/CD3双特异性抗体包括结合人类CLEC12A的重链可变区域，其中该重链可变区域包括SEQ ID NO：12、16或20内列出的VH区域的HCDR1、HCDR2及HCDR3。

在一些实施方案中，该CLEC12A/CD3双特异性抗体包括结合人类CLEC12A的重链可变区域，其中该重链可变区域包括与SEQ ID NO：12、16或20内列出的氨基酸序列为至少90％，优选为至少95％，更优选为至少97％，更优选为至少98％，更优选为至少99％同一性或100％同一性一氨基酸序列。

例如，在一些实施方案中，结合人类CLEC12A的该双特异性抗体的重链可变区域于三个CDR序列以外的该重链可变区域的序列内可具有0-10个，优选0-5个氨基酸插入、缺失、取代、加入，或其的组合。在一些实施方案中，该重链可变区域就所示的氨基酸序列而言包括由0至9、由0至8、由0至7、由0至6、由0至5、由0至4，优选为由0至3，优选为由0至2，优选为由0至1且优选为0个氨基酸插入、缺失、取代、加入，或其的组合。

在某些实施方案中，该CLEC12A/CD3双特异性抗体包括结合人类CLEC12A的重链可变区域，其中该重链可变区域包括选自于SEQ ID NO：12、16及20的氨基酸序列。

合适用于该CLEC12A/CD3双特异性抗体的CD3重链可变(VH)区域包括能结合CD3γ链、CD3δ链、CD3ε链，或CD3δ/CD3ε或CD3γ/CD3ε的组合的此类。在一些实施方案中，该双特异性抗体的CD3 VH区域结合CD3ε链。在一些实施方案中，该CD3 VH区域绑定的CD3。在一些实施方案中，该CD3 VH区域结合人类CD3ε链。

用于该CLEC12A/CD3双特异性抗体的示例性CD3结合区域系公开于WO2017/010874、WO2014/051433及WO2005/118635内(其的各自并入本文中以作为参考数据)。

在某些实施方案中，该CLEC12A/CD3双特异性抗体包括结合人类CD3的重链可变区域，其中该重链可变区域包括：

(a)包括氨基酸序列GFTFSSYG(SEQ ID NO：21)的重链CDR1、包括氨基酸序列IWYNGRKQ(SEQ ID NO：22)的重链CDR2，及包括氨基酸序列GTGYNWF(SEQ ID NO：23)的重链CDR3；

(b)包括氨基酸序列GFTFSSYG(SEQ ID NO：21)的重链CDR1、包括氨基酸序列IWYSGSKKN(SEQ ID NO：30)的重链CDR2，及包括氨基酸序列GTGYNWFDP(SEQ ID NO：23)的重链CDR3；

(c)包括氨基酸序列GFTFSSYG(SEQ ID NO：21)的重链CDR1、包括氨基酸序列IWYHGRKQ(SEQ ID NO：32)的重链CDR2，及包括可串格串GT000(SEQ ID NO：23)的重链CDR3；

(d)包括氨基酸序列GFTFSSYG(SEQ ID NO：21)的重链CDR1、包括氨基酸序列IWYHARKQ(SEQ ID NO：34)的重链CDR2，及包括氨基酸序列GTGYNWFDP(SEQ ID NO：23)的重链CDR3；

(e)包括氨基酸序列GFTFSSYG(SEQ ID NO：21)的重链CDR1、包括氨基酸序列IWYNARKQ(SEQ ID NO：36)的重链CDR2，及包括氨基酸序列GTGYNWFDP(SEQ ID NO：23)的重链CDR3；

(g)包括氨基酸序列GFTFSSYG(SEQ ID NO：21)的重链CDR1、包括氨基酸序列IWYNTRKQ(SEQ ID NO：45)的重链CDR2，及包括氨基酸序列GTGYNWFDP(SEQ ID NO：23)的重链CDR3；

(h)包括氨基酸序列GFTFSSYG(SEQ ID NO：21)的重链CDR1、包括氨基酸序列IWYDGKNT(SEQ ID NO：47)的重链CDR2，及包括氨基酸序列GTGYNWFDP(SEQ ID NO：23)的重链CDR3；

(i)包括氨基酸序列GFTFSSYG(SEQ ID NO：21)的重链CDR1、包括氨基酸序列IYYDGSRT(SEQ ID NO：49)的重链CDR2，及包括氨基酸序列GTGYNWFDP(SEQ ID NO：23)的重链CDR3；或

(j)包括氨基酸序列GFTFSSYG(SEQ ID NO：21)的重链CDR1、包括氨基酸序列IWHDGRKT(SEQ ID NO：51)的重链CDR2，及包括氨基酸序列GTGYNWFDP(SEQ ID NO：23)的重链CDR3。

该包括氨基酸序列GFTFSSYG(SEQ ID NO：21)的CDR1是基于IMGT来定义。该CDR1可包括如根据Kabat来定义的氨基酸序列SYGMH(SEQ ID NO：60)。

所述的CDR序列可有1、2或3个氨基酸残基变异同时保有同类的结合活性(于种类方面，不一定系数量)。因此，该重链CDR 1、2及3序列优选含有的序列与所述的CDR序列偏离不超过三个，优选不超过二个，更优选不超过一个氨基酸。在某些实施方案中，该重链CDR1、2及3序列与所述的CDR序列为同一的。

在一些实施方案中，该CLEC12A/CD3双特异性抗体包括结合人类CD3的重链可变区域，其中该重链可变区域包括SEQ ID NO：24-29、31、33、35、37-44、46、48、50及52内列出的VH区域的HCDR1、HCDR2及HCDR3。

在一些实施方案中，该CLEC12A/CD3双特异性抗体包括结合人类CD3的重链可变区域，其中该重链可变区域包括与SEQ ID NO：24-29、31、33、35、37-44、46、48、50及52内列出的VH区域序列之一的氨基酸序列为至少90％，优选为至少95％，更优选为至少97％，更优选为至少98％，更优选为至少99％同一性或100％同一性。

在某些实施方案中，该CLEC12A/CD3双特异性抗体包括结合人类CD3的重链可变区域，其中该重链可变区域包括与SEQ ID NO：37-44内列出的序列VH区域之一的氨基酸序列为至少90％，优选为至少95％，更优选为至少97％，更优选为至少98％，更优选为至少99％同一性或100％同一性。

例如，在一些实施方案中，结合人类CD3的该双特异性抗体的重链可变区域于三个CDR序列以外的该重链可变区域的序列内可具有0至10个，优选0至5个氨基酸插入、缺失、取代、加入，或其的组合。在一些实施方案中，该重链可变区域就所示的氨基酸序列而言包括由0至9、由0至8、由0至7、由0至6、由0至5、由0至4，优选为由0至3，优选为由0至2，优选为由0至1且优选为0个氨基酸插入、缺失、取代、加入，或其的组合。

保有CLEC12A或CD3结合的所公开的氨基酸序列的附加的变异体可，例如由噬菌体展示库获得，该噬菌体展示库含有重排的人类IGKV1-39/IGKJ1 VL区域(de Kruif，Kramer等人的2010)，以及一批并入氨基酸取代至本文所公开的CLEC12A或CD3 VH区域的氨基酸序列内的VH区域，如前所述(诸如US 2016/0368988)。可选择编码结合CLEC12A或CD3的Fab区域的噬菌体且通过流式细胞术来分析，及定序以鉴别保有抗原结合、有氨基酸取代、插入、缺失或加入的变异体。例如，如US 2016/0368988中所述，CD3 VH区域可于位置A50被取代且由S、Y、M或Q被修饰；D 59可由L、I、V、F、R、A、N、H、S、T、Y或E，优选为Y或E被取代；A61可由N、I、H、Q、L、R、Y、E、S、T、D、K、V被取代；以及F105可由Y或M被替换。可容易地找到耐受的氨基酸取代。

在某些实施方案中，该CLEC12A/CD3双特异性抗体包括结合人类CD3的重链可变区域，其中该重链可变区域包括选自于SEQ ID NO：24-29、31、33、35、37-44、46、48、50或52的氨基酸序列。

在某些实施方案中，该CLEC12A/CD3双特异性抗体包括结合人类CD3的重链可变区域，其中该重链可变区域包括选自于SEQ ID NO：37-44的氨基酸序列。

在某些实施方案中，该CLEC12A/CD3双特异性抗体包括结合人类CLEC12A的第一重链可变区域，其中该第一VH区域包括与SEQ ID NO：12、16及20内列出的VH区域氨基酸序列为至少90％，优选为至少95％，更优选为至少97％，更优选为至少98％，更优选为至少99％同一性或100％同一性一氨基酸序列；及结合人类CD3的第二重链可变区域，其包括，其中该第二VH区域包括与SEQ ID NO：37-44内列出的VH区域序列中一者的氨基酸序列为至少90％，优选为至少95％，更优选为至少97％，更优选为至少98％，更优选为至少99％同一性或100％同一性一氨基酸序列。

在某些实施方案中，该CLEC12A/CD3双特异性抗体包括结合人类CLEC12A的第一重链可变区域及结合人类CD3的第二重链可变区域，其中

(a)该第一重链可变区域包括：

(i)包括氨基酸序列SGYTFTGY(SEQ ID NO：9)的重链CDR1、包括氨基酸序列IINPSGGS(SEQ ID NO：10)的重链CDR2，以及包括氨基酸序列GTTGDWFDY(SEQ ID NO：11)的重链CDR3；

(ii)包括氨基酸序列SGYTFTSY(SEQ ID NO：13)的重链CDR1、包括氨基酸序列IINPSGGS(SEQ ID NO：14)的重链CDR2，以及包括氨基酸序列GNYGDEFDY(SEQ ID NO：15)的重链CDR3；或

(iii)如果氨基酸序列SGYTFTGY(SEQ ID NO：17)的重链CDR1、包括氨基酸序列WINPNSGG(SEQ ID NO：18)的重链CDR2，以及包括氨基酸序列DGYFADAFDY(SEQ ID NO：19)的重链CDR3；和

(b)该第二重链可变区域包括，

(i)包括氨基酸序列GFTFSSYG(SEQ ID NO：21)的重链CDR1、包括氨基酸序列IWYNGRKQ(SEQ ID NO：22)的重链CDR2，及包括氨基酸序列GTGYNWFDP(SEQ ID NO：23)的重链CDR3；

(ii)包括氨基酸序列GFTFSSYG(SEQ ID NO：21)的重链CDR1、包括氨基酸序列IWYSGSKKN(SEQ ID NO：30)的重链CDR2，及包括氨基酸序列GTGYNWFDP(SEQ ID NO：23)的重链CDR3；

(iii)包括氨基酸序列GFTFSSYG(SEQ ID NO：21)的重链CDR1、包括氨基酸序列IWYHGRKQ(SEQ ID NO：32)的重链CDR2，及包括氨基酸序列GTGYNWFDP(SEQ ID NO：23)的重链CDR3；

(iv)包括氨基酸序列GFTFSSYG(SEQ ID NO：21)的重链CDR1、包括氨基酸序列IWYHARKQ(SEQ ID NO：34)的重链CDR2，及包括氨基酸序列GTGYNWFDP(SEQ ID NO：23)的重链CDR3；

(v)包括氨基酸序列GFTFSSYG(SEQ ID NO：21)的重链CDR1、包括氨基酸序列IWYNARKQ(SEQ ID NO：36)的重链CDR2，及包括氨基酸序列GTGYNWFDP(SEQ ID NO：23)的重链CDR3；

(vi)包括氨基酸序列GFTFSSYG(SEQ ID NO：21)的重链CDR1、包括氨基酸序列IWYNTRKQ(SEQ ID NO：45)的重链CDR2，及包括氨基酸序列GTGYNWFDP(SEQ ID NO：23)的重链CDR3；

(vii)包括氨基酸序列GFTFSSYG(SEQ ID NO：21)的重链CDR1、包括氨基酸序列IWYDGKNT(SEQ ID NO：47)的重链CDR2，及包括氨基酸序列GTGYNWFDP(SEQ ID NO：23)的重链CDR3；

(viii)包括氨基酸序列GFTFSSYG(SEQ ID NO：21)的重链CDR1、包括氨基酸序列IYYDGSRT(SEQ ID NO：49)的重链CDR2，以及包括氨基酸序列GTGYNWFDP(SEQ ID NO：23)的重链CDR3；或

(ix)包括氨基酸序列GFTFSSYG(SEQ ID NO：21)的重链CDR1、包括氨基酸序列IWHDGRKT(SEQ ID NO：51)的重链CDR2，及包括氨基酸序列GTGYNWFDP(SEQ ID NO：23)的重链CDR3。

在某些实施方案中，该CLEC12A/CD3双特异性抗体包括结合人类CLEC12A的第一重链可变区域，其中该第一VH区域包括包括氨基酸序列SGYTFTGY(SEQ ID NO：9)的重链CDR1、包括氨基酸序列IINPSGGS(SEQ ID NO：10)的重链CDR2，和包括氨基酸序列GTTGDWFDY(SEQID NO：11)的重链CDR3；以及第二重链可变区域，其中该第二VH区域包括包括氨基酸序列GFTFSSYG(SEQ ID NO：21)的重链CDR1、包括氨基酸序列IWYNARKQ(SEQ ID NO：36)的重链CDR2，及包括氨基酸序列GTGYNWFDP(SEQ ID NO：23)的重链CDR3。

在某些实施方案中，该CLEC12A/CD3双特异性抗体包括结合人类CLEC12A的第一重链可变区域，其中该第一VH区域的氨基酸序列是选自于SEQ ID NO：12、16及20；及结合人类CD3的第二重链可变区域，其中该第二VH区域的氨基酸序列是选自于SEQ ID NO：24-29、31、33、35、37-44、46、48、50及52。

在某些实施方案中，该CLEC12A/CD3双特异性抗体包括结合人类CLEC12A的第一重链可变区域，其中该第一VH区域的氨基酸序列是SEQ ID NO：12；及结合人类CD3的第二重链可变区域，其中该第二VH区域的氨基酸序列是选自于SEQ ID NO：37-44。

在一个实施方案中，该CLEC12A/CD3双特异性抗体包括结合人类CLEC12A的第一重链可变区域，其中该第一VH区域的氨基酸序列是列于SEQ ID NO：12内；及结合人类的第二重链可变区域，其中该第二VH区域的氨基酸序列是列于SEQ ID NO：37内。

该CLEC12A/CD3双特异性抗体的VH/VL CLEC12A结合区域和CD3结合区域的VH/VL结合区域的轻链可变区域与亲代CLEC12A单特异性抗体的VL区域和/或亲代CD3单特异性抗体的VL区域可以是相同的，或一个或两个VH/VL区域组合可使用任择的VL区域，只要该双特异性抗体保有与CLEC12A和CD3抗原二者的结合。

在一些实施方案中，该CLEC12A/CD3双特异性抗体的VH/VL CLEC12A结合区域的VL区域与VH/VL CD3结合区域的VL区域相似。在某些实施方案中，第一及第二VH/VL区域组合内的VL区域是同一的。

在某些实施方案中，该CLEC12A/CD3双特异性抗体的一个或两个VH/VL结合区域的轻链可变区域包括共同的轻链。在一些实施方案中，该一个或两个VH/VL结合区域的该共同的轻链可变区域包括生殖系列O12可变区域V节段。在某些实施方案中，该一个或两个VH/VL结合区域的该轻链可变区域包括κ轻链V节段IgVκ1-39*01。IgVκ1-39为免疫球蛋白可变异κ1-39基因的简称。该基因也被称为免疫球蛋白κ可变异1-39；IGKV139；IGKV1-39；O12a或O12。该基因的External Ids为HGNC：5740；Entrez Gene：28930；Ensembl：ENSG00000242371。串组串编号：56提供V区域的氨基酸序列。V区域能与五个J区域的一者组合。优选的J区域为jk1及jk5，以及联结的序列是表示为IGKV1-39/jk1及IGKV1-39/jk5；替换名称为IgVκ1-39*01/IGJκ1*01或IgVκ1-39*01/IGJκ5*01(根据imgt.org的IMGT数据库万维信息域名。在某些实施方案中，该一个或两个VH/VL结合区域的轻链可变区域包括κ轻链IgVκ1-39*01/IGJκ1*01或IgVκ1-39*01/IGJκ1*05(定定号：57和SEQ ID NO：58)。

在一些实施方案中，该CLEC12A/CD3双特异性抗体的一个或两个VH/VL结合区域的该轻链可变区域包括包括氨基酸序列QSISSY(SEQ ID NO：53)的LCDR1、包括氨基酸序列AAS的LCDR2，及包括氨基酸序列QQSYSTP(SEQ ID NO：55)的LCDR3(即，根据IMGT的IGKV1-39的CDRs)。在一些实施方案中，该CLEC12A/CD3双特异性抗体的一个或两个VH/VL结合区域的该轻链可变区域包括包括氨基酸序列QSISSY(SEQ ID NO：53)的LCDR1、包括氨基酸序列AASLQS(SEQ ID NO：54)的LCDR2，及包括氨基酸序列QQSYSTP(SEQ ID NO：55)的LCDR3。

在一些实施方案中，该CLEC12A/CD3双特异性抗体的一个或两个VH/VL结合区域包括轻链可变区域，其包括与SEQ ID NO：57内列出的氨基酸序列为至少90％，优选为至少95％，更优选为至少97％，更优选为至少98％，更优选为至少99％同一性或100％同一性一氨基酸序列。在一些实施方案中，该CLEC12A/CD3双特异性抗体的一个或两个VH/VL结合区域包括轻链可变区域，其包括与SEQ ID NO：58内列出的氨基酸序列为至少90％，优选为至少95％，更优选为至少97％，更优选为至少98％，更优选为至少99％同一性或100％同一性的氨基酸序列。

例如，在一些实施方案中，该CLEC12A/CD3双特异性抗体的一个或两个VH/VL结合区域的可变异轻链就SEQ ID NO：57或SEQ ID NO：58而言，可具有0至10个，优选0至5个氨基酸插入、缺失、取代、加入或其的组合。在一些实施方案中，该CLEC12A/CD3双特异性抗体的一个或两个VH/VL结合区域的轻链可变区域就所示的氨基酸序列而言包括由0至9、由0至8、由0至7、由0至6、由0至5、由0至4，优选为由0至3，优选为由0至2，优选为由0至1且优选为0个氨基酸插入、缺失、取代、加入，或其的组合。

在其它的实施方案中，该CLEC12A/CD3双特异性抗体的一个或两个VH/VL结合区域的轻链可变区域包括SEQ ID NO：57或SEQ ID NO：58的氨基酸序列。在某些实施方案中，该CLEC12A/CD3双特异性抗体的二个VH/VL结合区域包括同一的VL区域。在一个实施方案中，该CLEC12A/CD3双特异性抗体的二个VH/VL结合区域的VL包括SEQ ID NO：57内列出的氨基酸序列。在一个实施方案中，该CLEC12A/CD3双特异性抗体的二个VH/VL结合区域的VL包括SEQ ID NO：58内列出的氨基酸序列。

供用于本文所公开的方法的CLEC12A/CD3双特异性抗体可以许多格式提供。本领域已知许多不同格式的双特异性抗体，并且Kontermann，Brinkmann，2015，2018及Spiess，Zhai等人，2015)已有评论，其的各自并入本文中以作为参考资料。例如，不是具有二个VH/VL组合的古典抗体的双特异性抗体格式，具有包括重链可变区域及一轻链可变区域的至少一可变异域。此可变异域可链接一单链Fv片段、单一体型(monobody)、VH及提供第二结合活性的Fab片段。

在一些实施方案中，本文提供的方法中使用的CLEC12A/CD3双特异性抗体一般属于人类IgG亚类(例如，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)。在某些实施方案中，该抗体属于人类IgG1亚类。因为全长IgG抗体有利的半生期以及出于低免疫原性的原因，所以其为优选的。因此，在某些实施方案中，CLEC12A/CD3双特异性抗体为全长IgG分子。在一个实施方案中，CLEC12A/CD3双特异性抗体为全长IgG1分子。

因此，在某些实施方案中，CLEC12A/CD3双特异性抗体包括可结芯片段(Fc)。CLEC12A/CD3双特异性抗体的Fc优选包括人类恒定区域。CLEC12A/CD3双特异性抗体的恒定区域或Fc与天然存在的人类抗体的恒定区域可含有一个或多个差异，优选不超过10个，优选不超过5个氨基酸差异。例如，在某些实施方案中，双特异性抗体的各个Fab臂可进一步包括Fc区域，该Fc区域包括促进双特异性抗体形成的修饰、影响Fc介导的效应子功能的修饰，和/或于此所描述的其他特征。

在优选实施方案中，CLEC12A/CD3双特异性全长抗体具有突变下部铰链和/或CH2域以使得该双特异性IgG抗体与Fcγ(Fcγ)受体的交互作用降低。当使用于本文中，术语“以使得该双特异性IgG抗体与Fcγ受体的交互作用降低”意指该CLEC12A/CD3双特异性抗体与Fcγ受体的交互作用降低了，设如果此Fcγ受体存在于该抗体的附近。在某些实施方案中，该CLEC12A/CD3双特异性抗体与Fc受体的交互作用基本上被破坏了。Fcγ受体结合降低的双特异性抗体之前已经有描述过(US 2014/0120096，并入本文中以作为参考数据)。

在某些实施方案中，该CLEC12A/CD3双特异性抗体包括突变下部铰链和/或CH2域加上在氨基酸位置235和/或236(EU编号)的至少一取代。优选地，氨基酸位置235及236二者均取代。如US 2014/0120096内所述，这些地址的取代基本上能防止抗体与肿瘤细胞或效应子细胞上存在的Fc受体之间的交互作用。因此，在某些实施方案中，该CLEC12A/CD3双特异性抗体包括一种包括L235G和/或G236R取代的突变CH2和/或下部铰链域。优选地，L235G及G236R二者均取代。任择地，本技术领域的娴熟技术人员可导入包括取代234F、235E和/或331S的下部铰链和/或CH2域突变(Oganesyan，Gao等人的2008)。优选地，所有三种取代都导入此替代方案内。

双特异性抗体通常由表达编码抗体的核酸的细胞来生产。因此，在一些实施方案中，本文所公开的双特异性CLEC12A/CD3抗体是借由提供一种细胞来生产，该细胞包括编码该双特异性CLEC12A/CD3抗体的重及轻链可变区域及恒定区域的一种或多种核酸。该细胞优选为动物细胞，更优选为哺乳动物细胞，更优选为灵长类动物细胞，最佳为人类细胞。一种合适的细胞为能包括且优选生产该CLEC12A/CD3双特异性抗体的任何细胞。

适合抗体生产的细胞为本领域已知的且包括融合瘤细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NS0细胞或PER-C6细胞。各种机构及公司已经开发出用于大规模生产抗体的细胞系，诸如供临床使用。这些细胞系的非限制性示例为CHO细胞、NS0细胞或PER.C6细胞。在一特别佳的实施方案中该细胞为人类细胞。优选为一种由腺病毒E1区域或其功能等效物转形的细胞。此一细胞系的优选示例为PER.C6细胞系或其效物。在一特别佳实施方案中该细胞为CHO细胞或其变异体。优选为一种利用麸醯胺酸合成酶(GS)载体系统用于表达抗体的变异体。在一特别佳的实施方案中，该细胞为CHO细胞。

在一些实施方案中，细胞表达组成该CLEC12A/CD3双特异性抗体的不同的轻及重链。在某些实施方案中，细胞表达二种不同的重链及至少一轻链。在一个特别佳的实施方案中，细胞表达如本文所述的共同的轻链以降低不同的抗体种类数目(不同的重和轻链组合)。例如，个别的VH区域是使用本领域已知的生产双特异性IgG方法选殖至表达载体的内(WO2013/157954；并入本文中以作为参考资料)，联合重排的人类IGKV1 39/IGKJ1(huVκ139)轻链。该huVκ1 39先前显示出能与一种以上的重链配对借此产生不同特异性的抗体，其促进双特异性分子产生(de Kruif，Kramer等人的2009；WO2009/157771)。

一种表达共同的轻链及等量的二种重链的抗体生产细胞通常生产50％双特异性抗体及25％的每种单特异性抗体(即有同一的重轻链组合)。已经公开数种方法有利于生产双特异性抗体而不是生产个别的单特异性抗体。这件事通常是通过修饰重链的恒定区域以使得其有利异质二聚合(即与另一重/轻链组合的重链进行二聚合)超过同质二聚合来达成。于优选的实施方案中本发明的双特异性抗体包括具有兼容的异质二聚合域的二个不同的免疫球蛋白重链。本领域中已有描述各种兼容的异质二聚合域。兼容的异质二聚合域优选为兼容的免疫球蛋白重链CH3异质二聚合域。本领域描述了各种可完成这些重链的异质二聚合的方法。

US 9,248,181及US 9,358,286中公开一种用于生产CLEC12A/CD3双特异性抗体的优选方法。具体地，基本上只生产双特异性全长IgG分子的优选的突变为第一CH3域的氨基酸取代L351K及T366K(EU编号)(“KK-变异体”重链)以及第二域的氨基酸替换L351D和L368E(DE-变异体“重链)，或反的还然。如前所述，DE-变异体及KK-变异体优先配对形成异二聚体(所谓的“DEKK”双特异性分子)。由于完全相同的重链之间的CH3-CH3界面的带电残基之间强大的排斥作用，所以DE-变异体重链的同质二聚合(DEDE同型二聚体)或KK-变异体重链的同质二聚合(KKKK同型二聚体)几乎不会发生。

因此，在一个实施方案中包括结合CLEC12A的可变异域的重链/轻链组合，包括了该重链的DE变异体。在此实施方案中包括结合CD3的可变异域的重链/轻链组合，包括了该重链的KK变异体。

候选CLEC12A/CD3 IgG双特异性抗体能使用任何合适的分析来测试结合作用。例如，HPB-ALL细胞上膜表达的CD3的结合作用是通过流式细胞术来评估(根据如前于WO2014/051433所述的FACS程序来执行)。在一个实施方案中，候选CLEC12A/CD3双特异性抗体与HPBALL细胞上的CD3的结合作用是通过根据本领域已知的标准程序来执行的流式细胞术来证明。与细胞表达的CD3的结合作用可使用转染CD3δ/ε或CD3γ/ε的CHO细胞来确认。候选双特异性IgG1与CLEC12A的结合作用是使用一种CLEC12A表达构建物转染的CHO细胞被判定；分析内包括一种CD3单特异性抗体及一种CLEC12A单特异性抗体，及不相干的IgG1同型对照mAb作为对照(诸如，结合CD3及另一种抗原例如破伤风毒素(TT)的抗体)。

候选CLEC12A/CD3双特异性抗体的CD3和CLEC12A Fabs对于其的标靶的亲和力能通过表面电浆子共振(SPR)技术、使用BIAcore T100来测量。简言的，抗人类IgG小鼠单株抗体(Becton and Dickinson，cat.Nr.555784)是使用游离胺化学(NHS/EDC)偶合至CM5传感器芯片表面。继而捕捉bsAb于传感器表面上。随后，一浓度范围的重组纯化的抗原人类CLEC12A(Sino Biological Inc，cat.Nr.11896-H07H)与人类CD3δε-Fc蛋白于传感器表面移动来测量缔合及解离速率。在每周期之后，通过HCl脉冲使传感器表面再生且再次捕捉bsAb。从得到的感应图，使用BIAevaluation软件来判定缔合及解离速率以及结合人类CD3和CLEC12A的亲和力，如前所述(诸如US2016/0368988)。

一种CLEC12A/CD3双特异性抗体的T细胞刺激能力可以一分析来判定，其是使用根据WO2014/051433及US2016/0368988中描述的程序获得的健康的供体休眠T细胞。例如，一种候选CLEC12A/CD3双特异性抗体是以纯化的健康的供体休眠T细胞与来自白血病衍生的HL60细胞系的细胞以10∶1或5∶1的效应子∶标靶细胞比率、于10％胎牛血清(FBS)或10％正常的人类血清(HS)内培育历时二天来测试。结果表达为CD4阳性或CD8阳性T细胞族群内的CD69阳性或CD25阳性细胞百分比。

CLEC12A/CD3双特异性抗体诱导标靶细胞裂解的能力可以一分析来测试，其是使用白血病细胞例如羧基荧光素二乙酸酯琥珀酰亚胺酯(carboxyfluorescein diacetatesuccimidyl ester，CFSE)标记的HL-60细胞且与来自健康的供体的T细胞共培养，根据WO2014/051433及US 2016/0368988中描述的程序。存活的CFSE阳性细胞系可由移动式细胞测量术来定量，以及结果表达为关于PBS对照条件的特异性裂解的百分比。

在一方面中提供一种药学组合物，其包括CLEC12A/CD3双特异性抗体及药学上可接受的载体。当使用于本文中，术语“药学上可接受的”意指由政府管理机构核准或列于美国药典或其他通常公认的药典内供用于动物中，更特定言的于人类中，以及包括生理上可兼容的任何及所有溶剂、盐类、分散媒介、包衣、抗细菌剂及抗真菌剂、等渗透压性及吸收延迟剂及类似物。术语“载体”是指一种随着该化合物施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。这些药学载体可为无菌液体，例如水及油，包括石油、动物、植物油或合成来源的此类油，例如花生油、大豆油、矿油、芝麻油、甘油蓖麻醇酸酯及其类似物。可利用水或食盐水溶液及右旋糖和甘油水溶液作为载体，特别是用于可注射的溶液。供非经肠施用的液体组合物可调配供注射或连续灌注的施用。注射或灌注的施用途径包括膀胱内、肿瘤内、静脉内、腹膜内、肌肉内、鞘内及皮下。取决于施用途径(诸如例如，静脉、皮下、关节内及类似物)活性化合物可涂覆一材料以防护化合物不受酸及其他可能使化合物不活化的自然条件作用。

合适供施用人类患者的药学组合物通常被调配例如于液体载体内供非经肠施用，或合适先还原(reconstitution)成液体溶液或悬浮液供静脉施用。组合物可调配呈剂量单位型式以易于施用及剂量均一。

还包括固体制备物用于使用前立刻转换成液体制备物供口或非经肠施用。这些液体型式包括溶液、悬浮液及乳剂。

本文提供的组合物及方法对于活化患者内的一T细胞或T细胞是特别有用的。该患者有癌症或处于患癌症的风险。后者为处于癌症缓解及癌症复发、再发或转移的风险的患者。因此，该组合物及方法可用于治疗各种的骨髓恶性肿瘤(malignancies)，包括骨髓性白血病及骨髓来源的白血病前期疾病。因此，可根据本文提供的方法治疗的疾病包括骨髓性白血病(如AML及CML)或白血病前期疾病如骨髓增生异常综合征(MDS)(且进展至AML)、骨髓纤维化(MF)或骨髓增生性肿瘤母细胞期(MPN-BP)。

当使用于本文中，该双特异性抗体CLEC12A/CD3双特异性抗体可组合另治疗分子。此组合施用(共同施用)包括该CLEC12A/CD3双特异性抗体及IL-15部分呈相同或不同的剂量型式的同时施用、分别施用或相继施用。因此，在一些实施方案中，一种CLEC12A/CD3双特异性抗体可用于一种用于活化个体内的T细胞的方法，其中该CLEC12A/CD3双特异性抗体是与一IL-15部分同时、分别或相继施用。在其他的实施方案中，一种CLEC12A/CD3双特异性抗体可用于治疗个体的癌症，其中该CLEC12A/CD3双特异性抗体可与一IL-15部分同时、分别或相继施用。

在其他的实施方案中，一种CLEC12A/CD3双特异性抗体可用于制造用于活化个体的T细胞的药物，其中该CLEC12A/CD3双特异性抗体是与一IL-15部分同时、分别或相继施用。一种包括CLEC12A/CD3双特异性抗体及IL-15部分的产品可为一种组合制备物供同时、分别或相继使用于活化个体的T细胞。在其他的实施方案中，一种CLEC12A/CD3双特异性抗体可用于制造用于治疗个体的癌症的一药物，其中该CLEC12A/CD3双特异性抗体可与IL-15部分同时、分别或相继施用。一种包括CLEC12A/CD3双特异性抗体及IL-15部分的产品可为一种组合制备物供同时、分别或相继使用于治疗个体的癌症。

IL-15部分可依照合适的剂量、途径(例如静脉内、腹膜内、肌肉内、鞘内或皮下)施用。

该CLEC12A/CD3双特异性抗体及IL-15部分能以单一调配物同时施用。任择地，该CLEC12A/CD3双特异性抗体及IL-15部分能调配供用于分别施用，其中其是并行或相继施用。

在一些实施方案中，该IL-15部分及该CLEC12A/CD3双特异性抗体是同时施用。

在一个实施方案中，一个菜单单项，单一剂量的IL-15部分及单一剂量的该CLEC12A/CD3双特异性抗体。在一些实施方案中，该CLEC12A/CD3双特异性抗体及IL-15部分将会重复施用，持续一个疗程。例如，在某些实施方案中，多重(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多)剂量的IL-15部分及多重(如2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多)剂量的CLEC12A/CD3双特异性抗体是施用给有需要治疗的个体。

在一些实施方案中，IL-15部分及CLEC12A/CD3双特异性抗体的施用可以每周进行，于该方案中，其可以于同一天(例如同时)施用，或一个接一个(例如，于另一者之前或之后一或多分钟、小时或天)。当分别施用时，该CLEC12A/CD3双特异性抗体及IL-15部分可以，但不一定根据相同的施用(即给药)程序来施用。该IL-15部分的治疗有效的剂量的施用可以比CLEC12A/CD3双特异性抗体更常或更不常施用。在某些实施方案中，该IL-15部分及该CLEC12A/CD3双特异性抗体的每剂量施用可以于同一天，或任择地，该IL-15部分可以于该CLEC12A/CD3抗体之前或之后1天或更多天施用。

为了方便，如果需要的话，总每日剂量可以分开且于期间内分批施用。也可以使用间歇疗法(例如，3周中的1周或4周中的3周)。

在一些实施方案中，本文提供的方法中使用的该IL-15部分为重组人类IL-15(rhIL-15)。在某些实施方案中，以每天大约0.125μg/kg至每天2.0μg/kg的剂量施用rhIL-15。在某些实施方案中，以每天0.125、0.25、0.5、1.0或2.0μg/kg施用rhIL-15。在某些实施方案中，该rhIL-15是借由静脉速注施用。在其他的实施方案中，该rhIL-15是通过连续静脉灌注(CIV)施用。在某些实施方案中，该rhIL-15是通过CIV于2至10天、5至10天或7至10天之间内施用。在一个实施方案中，该rhIL-15是通过CIV施用10天。在相关的实施方案中，该rhIL-15是于大约30及60天之间的治疗周期内施用，其中该rhIL-15于每周期最初的5至10天是通过CIV被施用。

在一些实施方案中，根据本文提供的方法施用的该IL-15部分为可溶性IL-15受体或受体片段(sIL-15Ra)。在其他的实施方案中，该IL-15部分为包括IL-15及sIL-15Ra的错合物，例如，如US9,255,141及US9,328,159中所述。在某些实施方案中，该IL-15/IL-15Ra错合物是以大约0.1μg/kg至大约20μg/kg、大约10μg/kg至大约20μg/kg、大约20μg/kg至大约40μg/kg，或大约25μg/kg至50μg/kg的剂量施用给个体。

在某些实施方案中，该IL-15部分是皮下施用的IL-15/IL-15Ra。在一些实施方案中，该IL-15/IL-15Ra错合物是以每天、每隔一天、每3、4、5、6或7天的频率施用。在某些实施方案中，每周施用IL-15/IL-15Ra 1、2、3、4、5、6或7天。在某些实施方案中，第一周期及每后续周期的剂量为0.1μg/kg至1μg/kg、1μg/kg至5μg/kg或5μg/kg至10μg/kg。在另一个实施方案中，第一周期及每后续周期的第一剂量为0.1μg/kg至0.5μg/kg、1μg/kg至2μg/kg、1μg/kg至3μg/kg、2μg/kg至5μg/kg或2μg/kg至4μg/kg。在另一个实施方案中，第一周期及每后续周期的剂量为0.1μg/kg、0.25μg/kg、0.5μg/kg、1μg/kg、1.25μg/kg、1.5μg/kg、1.75μg/kg、2μg/kg、2.25μg/kg、2.5μg/kg、2.75μg/kg、3μg/kg、3.25μg/kg、3.5μg/kg、4μg/kg、4.25μg/kg、4.5μg/kg、4.75μg/kg或5μg/kg。在一个实施方案中，该IL-15/IL-15Ra错合物是按照28天周期被施用其中该IL-15/IL-15Ra错合物是每周皮下施用三次连续二周。

在此外其他的实施方案中，本文提供的方法中使用的该IL-15部分为长效型的IL-15，例如，IL-15及水溶性聚合物的复合物(conjugate)，例如于WO2015815373内所述。本领域技术人员可判定足够于IL-15受体(“IL-15R”)提供临床相关的促效剂活性的长效、IL-15促效剂的量。在一些实施方案中，IL-15聚合物复合物是以由大约0.001mg/kg至大约10mg/kg，优选由大约0.001至大约5mg/kg的剂量施用。在某些实施方案中，IL-15聚合物复合物是以大约0.03mg/kg至大约3mg/kg的剂量施用。在某些实施方案中，IL-15聚合物复合物是以大约0.03mg/kg、大约0.1mg/kg、大约0.3mg/kg或大约3.0mg/kg的剂量施用。在其他的实施方案中，IL-15聚合物复合物是以大约0.0025mg/kg、大约0.008mg/kg、大约0.01mg/kg、大约0.025mg/kg、0.05mg/kg或大约0.25mg/kg的剂量施用。

只要临床医生监督的患者照护认为该治疗方法有效，即，患者对治疗有响应，本文所述的治疗方法通常会持续。表示治疗方法有效的非限制性参数可包括下列中的一者或多者：肿瘤细胞减少；抑制肿瘤细胞增殖；肿瘤细胞消除；无恶化存活期；合适的肿瘤标识适当的响应(如果适用)；NK(天然杀手)细胞数目增高；CLEC12A特异性T细胞数目增高；及CLEC12A特异性记忆T细胞数目增高。

关于施用该CLEC12A/CD3双特异性抗体的频率，本领域技术人员将能够判定适当的频率。例如，临床医生能决定相对很少施用该CLEC12A/CD3双特异性抗体(如每二周一次)以及在患者耐受时逐步缩短剂量之间的期间。当施用IL-15部分时，这些制剂的频率可以类似的方式来判定。根据包括所主张的方法的疗程有关的示例性时间长短包括：大约1周；2周；大约3周；大约4周；大约5周；大约6周；大约7周；大约8周；大约9周；大约10周；大约11周；大约12周；大约13周；大约14周；大约15周；大约16周；大约17周；大约18周；大约19周；大约20周；大约21周；大约22周；大约23周；大约24周；大约7个月；大约8个月；大约9个月；大约10个月；大约11个月；大约12个月；大约13个月；大约14个月；大约15个月；大约16个月；大约17个月；大约18个月；大约19个月；大约20个月；大约21个月；大约22个月；大约23个月；大约24个月；大约30个月；大约3年；大约4年；大约5年；永恒(例如持续的维持疗法)。上述期间可能与一或多回/周期治疗有关。

本文提供的治疗方法的功效可使用任何合适的手段来评估。在一个实施方案中，组合治疗的临床功效是使用骨髓内的AML原始细胞减少来分析作为客观反应准则。根据本文公开的方法治疗的患者，诸如人类优选经历癌症的至少一种征象的改善。在一些实施方案中，可能发生下列中的一者或多者：可降低癌细胞的数目；预防或延迟癌症复发；癌症相关联的一个或多个症状可在一定程度上得到缓解。此外，判定T细胞介导的标靶细胞裂解的活体外分析(如WO2017/010874中所述)能用自个体分离的AML肿瘤原始细胞来执行。

在一些实施方案中，于如本文所述的治疗后不再可检测到肿瘤细胞。在一些实施方案中，个体是部分或完全缓解。在某些实施方案中，个体的整体存活期、中位数存活率、和/或无恶化存活期增高。

本发明的治疗(例如CLEC12A/CD3双特异性抗体)或连同一IL-15部分的组合治疗，也可与因其针对要治疗的癌症的特殊用途而选出的其他知名疗法联合使用。本发明的组合与已知的药学上可接受的制剂于适当时可以任择地相继使用。

供安全且有效的施用化学治疗剂的方法为熟习此项技术者已知的。此外，其的施用于标准文献中有说明。例如，许多的化学治疗剂的施用于Physicians′Desk Reference(PDR)，例如，1996版(Medical Economics Company，Montvale，N.J.07645-1742，USA)中有说明；其的揭露内容并入至该处以作为参考资料。

施用化学治疗剂和/或放射线疗法可取决于待治疗的疾病及化学治疗剂和/或放射线疗法对该疾病的已知效应而变化，对于熟习此项技术者会是显而易见的。并且，根据熟练的临床医生的知识，治疗程序(例如施给药量的量及次数)可基于施用的治疗剂观察到的对患者的效应，以及基于该疾病对施用的治疗剂观察到的反应而变化。

本文所述的所有文件及参考资料，包括Genbank登录、专利及公开的专利申请案以及网站，是各自明确并入本文以作为参考资料，如同其是全部或部分写在本文件中。

现在参照下列实施例来说明本发明，此类仅用于帮助且不是要限制本发明。虽然已详细说明本发明且参考其的特定实施方案，但可以对其进行各种改变及修饰而不偏离其精神与范围对于本领域中具有技术者会是显而易见的。

为了清晰和简洁的描述，本文所述的特征为相同或独立实施方案的一部分，然而，会了解到本发明的范围可包括具有所述的全部或某些特征的组合的实施方案。

实施例

实施例1

材料及方法

流式细胞术

使用Coulter FC500，Cyan-ADP，Gallios或NAVIOSTM流式细胞仪(BeckmanCoulter)或FACS CantoA(BD Biosciences)来执行移动式细胞测量术。数据为Flowjo软件(TreeStar Inc)或Kaluza

(Beckman Coulter)被分析。原始细胞根据CD45/SSC和CD3(针对T细胞)、排除淋巴细胞而定义为SSC+/-CD45DIM和/或CD45POS细胞。

1.抗体MF4327xMF5196相对于同型对照IgG于细胞系上的特异性结合模式是用于抗人类IgG-PE抗体来显现的非复合的抗体被评估。

2.使用Oregon Green-复合的IgG批次组合以a)CD1c-PE、CD19-ECD、CD3-PECY5、CD56-PECY7(Beckman Coulter)、CD8-AF700、CD4-Pacific blue、CD45-Krome orange；或b)CD303-PE、CD304-PE、CD14-ECD、CD33-PECY5、CD16-PECY7及CD45-Krome orange来测试抗体MF4327xMF5196双特异性抗体相对于同型对照IgG于健康的供体衍生的末梢血液样本内的特异性结合模式。

3.使用PE-复合的IgG批次组合以谱系(CD3、CD14、CD16、CD19、CD20、CD56)-FITC、CD38-ECD、7AAD、CD34-PECY7、CD10-APC、CD45RA-AF 7700、CD135a-BV421、CD90-BV510及CLEC12A-PE(R&D Systems)来测试健康的供体衍生的骨髓样本的CD34POS部分的抗体MF4327xMF5196双特异性抗体相对于同型对照IgG的特异性结合模式。

4.以HL60细胞进行的细胞毒性分析中的T细胞活化是使用CD25-PE、7AAD、CD3-PECY7、CD69-APC、CD8-AF700及CD4-BV421被判定。

5.单核细胞细胞毒性是使用CD14-FITC、CD16-PE、CD19-ECD、7AAD、CD3-PECY7、CD69-APC及CD8-AF700来定量。

6.为了定量T细胞增殖，T细胞是用7AAD、CD3-PECY7、CD8-AF700及CD4-BV421来显现。

7.使用a)CLEC12A-PE(Biolegend)、7AAD、CD34-PECY7、CD10-APC-AF750及CD5-BV421；及b)用CD90-FITC、CLEC12A-PE(Biolegend)/IgG2a-PE、CD38-ECD、7AAD、CD34-PECY7、CD10-APC、CD45 RA-AF700、CD123-BV421或CD135a-BV421及谱系(CD3、CD14、CD16、CD19、CD20、CD56)-BV510来定量CD34POS骨髓祖细胞的细胞毒性。

8.用AML原始细胞及纯化的T细胞进行的细胞毒性分析中使用的AML原始细胞上的CLEC12A表达是使用a)CLEC12A-PE(R&D Systems)、CD14-ECD、CD33-PECY5、CD38-PECY7、CD117-APC、CD19-AF700、CD34-BV421及CD45-krome orange；或b)CLEC12A-PE(R&DSystems)、CD19-ECD、CD3-PECY5、CD56-PECY7(Biolegend)、CD8-AF700、CD4-BV421及CD45-krome orange来定量。

9.于使用AML原始细胞及纯化的T细胞的细胞毒性分析的抗体MF4327xMF5196的功效是使用a)CD197-AF488、CD4-PE、CD45RO-ECD、7AAD、CD3-PECY7、CD8-AF700及CD45RA-太平洋蓝；及b)CD25-PE、CD4-ECD、7AAD、CD3-PECY7、CD117-APC、CD8-AF700、CD34-BV421及CD45-krome orange来定量。

10.AML原始细胞上的CLEC12A表达是使用a)(1，000ng/mL条件)CD14-FITC、CLEC12A-PE(R&D Systems)/IgG2b-PE、CD34-ECD、7AAD、CD33-PECY7、CD8-AF700、CD4-BV421及CD45-krome orange；或b)(200ng/mL条件)CD14-FITC、CLEC12A-PE(R&D Systems)、CD34-ECD、CD4-PECY5.5、CD117-APC、CD8-AF700、CD33-APC AF750及CD45-krome orange被判定。

11.抗体MF4327xMF5196于原发性AML原始细胞样本内的功效是使用a)(1，000ng/mL条件)CD14-FITC、CD34-ECD、7AAD、CD33-PECY7、CD3-APC、CD8-AF700、CD4-BV421及CD45-krome orange；或b)(200ng/mL条件)CD3-FITC、7AAD、CD4-PECY7、CD8-AF647、CD45RA-AF700、CD33-APC AF750及CD45-krome orange被评估。

双特异性抗体

如实施例及实施例提及的图中使用的抗体MF4327xMF5196为具有序列表概要内的SEQ ID：NO 56的IgVk1-39*01的共同的轻链可变区域、对CLEC12A和CD3有特异性的全长人类IgG1双特异性抗体。其具有MF4327的重链可变区域及序列表概要描述的MF5196的重链可变区域。抗体的恒定部分可以为效应子功能沉默的或不如所示者。负对照抗体为针对破伤风类毒素的cLC单特异性抗体(TTxTT IgG，同型对照(de Kruif，Kramer等人的2009))及针对破伤风类毒素和CD3的cLC双特异性抗体(MockxCD3或TTxCD3 IgG，使用如抗体MF4327XMF5196相同的CD3 Fab)；阳性对照抗体为针对CD3的二价cLC单特异性抗体(CD3xCD3，还使用如抗体MF4327xMF5196相同的CD3 Fab)。于起始的双特异性抗体批次方面，静电工程处理的重链用于暂时生产，导致＞95％纯度的双特异性IgG1(Gunasekaran，Pentony等人的2010)。稍后的批量生产是使用重链Fc工程处理其中于CH3界面处导入含括带电残基的专属突变(proprietary mutations)(De Nardis，Hendriks等人的2017)。除非另有规定，否则抗体MF4327xMF5196、MockxCD3及TTxTT IgG的IgG批次一旦导入变化至CH2区域内便缺乏Fc效应子功能。

亲和力测量

抗体MF4327xMF5196是经由小鼠抗人类IgG单株抗体(BD Biosciences)而固定于CM5芯片(GE Healthcare)上。随后使用Biacore T100仪器(GE Healthcare)使重组纯化的CLEC12A-His(Sino Biologicals)或重组CD3δε-Fc蛋白在表面移动。

体内药物动力学研究

c57b1/6J小鼠接受单一静脉剂量的1mg/kg抗体MF4327xMF5196。各种时间点的抗体MF4327xMF5196血清电平是使用抗人类IgG ELISA(ZeptoMetrix)来定量。

细胞系

HL60细胞(DSMZ)培养于含有2mM 1-麸酰胺酸及10％FBS(Integro)的IMDM(GIBCOInvitrogen，21980-065)内。CHO-K1(DSMZ)、Jurkat E6.1(LGC)及J.RT-T3.5(LGC)细胞系维持于补充2mM 1-麸酰胺酸及10％FBS(ThermoFisher Scientific)的DMEM/F12(GIBCOInvitrogen，11320-033)内。CLEC12A-CHO-K1细胞系是通过稳定嵌入编码人类CLEC12A的pcDNA3.1+载体(ThermoFisher Scientific)来产生。

临床样本

AML患者样本(表III)及健康的供体的骨髓是根据赫尔辛基宣言及RUMC机构指导方针及规定来获得。为了储存于液态氮，使细胞再悬浮于含有7％二甲亚砜(DMSO；Sigma-Aldrich，W387509)及10％胎牛血清(FBS，Integro)的IMDM培养基内。解冻后，细胞于含有250μg/mL DNAse(Roche，11284932001)及1.25mM MgCl₂的10％人类血清(HS，PAAlaboratories)内培育10min。随后，用超量的培养基清洗细胞。

纯化的T细胞的细胞毒性分析

通过密度梯度离心以从健康的供体或AML患者采集的末梢血液(PB)分离人类末梢血液单核细胞(PBMCs)(患者特征参见表III)。CD3^POST细胞系通过使用磁性细胞分选(MACS，Miltenyi，130-096-535)的负向选择而从新鲜分离或冷冻保存的PBMCs被纯化。细胞毒性分析于补充10％AB+HS(Sanquin)的IMDM内、于96孔平盘(NuncTM，ThermoFisher Scientific)进行。除非另有规定，否则使用10⁵个T细胞。使用CFSE标记的HL60或原发性AML原始细胞标靶细胞(ThermoFisher Scientific，C11-57)。在CFSE标记前，AML原始细胞是于补充100ng/mL GM-CSF(Immunotools，11343125)、100ng/mL G-CSF(Amgen Inc，

)、50ng/mLIL-3(Cellgenix)、25ng/mL SCF(Immunotools，11343325)及20ng/mL Flt3L(Immunotools，11343305)的分析培养基内预培养过夜。随后，T细胞及标靶细胞系在抗体MF4327xMF5196或对照IgGs存在下、于同样的细胞因子补充分析培养基内共培养。于24-72小时之后，T细胞活化及剩余的CFSE^POS标靶细胞的数目是通过流式细胞术来定量(关于圈选策略参见图7)。特异性裂解的百分比计算如下：特异性裂解(％)＝100-[(100×有IgG的条件的标靶细胞数目)/(于没有IgG的条件的平均标靶细胞数目)]。

基于PBMC的单核细胞细胞毒性分析

PBMCs(2×10⁵)是在抗体MF4327xMF5196或对照IgGs存在下、于有10％AB+HS的IMDM内培育48小时。收获前，离心(500g，5分钟)分析平盘来收集上清液用于细胞因子定量化。于2-8℃之后续培育1小时之后，细胞不清洗而于分析培养基内被染色。单核细胞、B细胞及自然杀手(NK)细胞的特异性裂解是由每分析孔采集固定体积、可由流式细胞术来定量(图8)。

T细胞增殖分析

CFSE标记的CD3^POS T细胞与CD14^POS MACS-纯化的(Miltenyi，130-050-201)自体单核细胞是以5∶1的E∶T比率、在有或没有测试IgG的情况下、于有10％AB+HS的IMDM内共培养。于5天之后，增殖的T细胞部分是通过流式细胞术以显现为CFSE^LOWT细胞。

细胞因子分析

培养上清液内的IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、GM-CSF、TNF-α及IFN-γ的电平是使用

平台(Life Technologies，LHC0001)来测量。

健康的供体骨髓细胞的细胞毒性测定

CD3^POS T细胞和CD34^POS库是使用MACS(分别为Miltenyi，130-046-702及130-050-101)、通过正向选择而从健康的供体骨髓单核细胞(获自骨科患者或购买于Lonza，2M-125C)分离。生成预活化的T细胞系通过于补充10％HS A+(Sanquin血库)及30IU/mL IL-2(Chiron，

)的IMDM内、在预涂覆抗CD3(1μg/mL，BD Bioscience，555329)及抗CD28(2μg/mL，BD Bioscience，555725)的平盘内活化纯化的T细胞6天，接着于有30IU/mLIL-2的平盘内休眠过夜。隔天，预活化的T细胞与自体CD34POS细胞系于抗体MF4327xMF5196或对照条件存在下、在96孔平盘(Corning Costar，3799)内、于补充10％A+HS的IMDM中、以10∶1的E∶T比率共培养。于16小时之后，抗体MF4327xMF5196的影响是通过流式细胞术以及如以下所述的群落群落形成单位(CFU)分析来定量各种CD34^POS祖细胞族群。关于移动式细胞测量术的定量化，使用移动数荧光(Beckman Coulter，7547053)。关于图选策略参见图10和图11。

群落形成单位(CFU)测定

T细胞和CD34^POS细胞的共培养物于清洗后根据制造商的指示、接种于MethoCultGF H84435(Stemcell Technologies，84435)内用于分析红血球及单核-骨髓性细胞群落生长物以及于MegaCult^TM-C(有添加的人类低密度脂蛋白(40μg/mL，02698)的细胞因子(04971)的完整套组，二者均来自Stemcell Technologies)内用于分析巨核细胞群落形成。关于MethoCult及MegaCult^TM-C分析二者，根据没有IgG条件的CD34^POS细胞计数来接种二种不同的浓度的共培养物，以及抗体MF4327xMF5196-及对照IgG治疗的共培养物接种等体积的细胞。关于MethoCult分析，非IgG治疗条件的1×10³及5×10²CD34^POS细胞以三复本接种于35mm培养皿(Corning，430165)内，以及关于MegaCult-C分析，二室培养玻片的每室接种7.5×10³及2.5×10³CD34^POS细胞且各条件制备二玻片。于13-15天培养后评分红血球、单核-骨髓性细胞及巨核细胞群落的数目，以及收获随后MethoCult培养且是通过流式细胞术来分析单核及骨髓性细胞的标志。

原发性AML样本的细胞毒性测定

原发性AML患者样本(5×10⁵个细胞)是于含有10％AB+HS、2.5ng/mL GM-CSF、12.5ng/mL G-CSF(Neupogen，Amgen)、6.25ng/mL IL-3(Immunotools，11340035)、3.0ng/mLSCF及2.5ng/mL Flt3L IMDM内、在抗体MF4327xMF5196或对照双特异性IgG存在下培养。于24小时之后，添加20ng/mL IL-15(Miltenyi，130-095-766)至培养物。于10天之后，通过流式细胞术来定量AML原始细胞裂解及T细胞扩增。

人类AML患者中抗体MF4327xMF5196的给药方案。

首次于人类研究中探索MF4327xMF5196抗体作为单一制剂，其是于3-6位患者群使给药量递增。患者接受经设计提供有效且安全的剂量的施用方案的抗体。该抗体以2-4小时输注来施用。按时间间隔来计划治疗。设计施用方案以防止并最小化细胞因子释放症候群(CRS)的严重性及发生率。

治疗方案具有第一周期应用的组份(于最初的28天期间)。初次剂量(C1D1)；逐步调升及固定的全给药(C1D4，C1D8，C1D15)以及使用治疗前给药。激活剂量：以低剂量(1mg，3mg，5mg)给予第一次施用(C1D1)。逐步调升给药：于C1D1后给予逐步增加剂量之后续剂量直到给予计划的全剂量为止。逐步调升给药包括于第一周期间更频繁的施用。于第一周每3天给予治疗(D1-D4-D8)然后每7天给予治疗(每周一次)。固定的全给药：于第15天给予全剂量以及从那时给予固定的全剂量治疗。治疗前给药：于每种MF4327xMF5196抗体剂量前给予包括乙酰胺酚及抗组织胺(抗H1)。

第一周期之后，以每周一次的方案继续全剂量给予(第1-8-15-22天)。输注一直伴随治疗前给药于2-4小时内给予。

在一群内，患者于第1天接受1mg的初次剂量，接着于第4天接受3mg及于第8天接受15mg的逐步调升剂量，以及于第15天接受25mg的全剂量。

在另一群内，患者于第1天接受3mg的初次剂量，接着于第4天接受10mg及于第8天接受25mg的逐步调升剂量，以及于第15天接受40mg的全剂量。

在另外一群内，患者于第1天接受5mg的初次剂量，接着于第4天接受15mg及于第8天接受25mg的逐步调升剂量，以及于第15天接受60mg的全剂量。

跟踪患者对治疗的反应，包括分析每剂量前以及于输注结束之后4小时和24小时的细胞因子电平。

结果

抗体MF4327xMF5196特异地结合正常的造血腔室内的CLEC12A^POS和CD3^POS细胞

抗体MF4327xMF5196为经开发要治疗CLEC12a阳性癌细胞，例如AML内存在者的T细胞-靶向双特异性抗体。其结合T细胞上的CD3及AML原始细胞及LSCs上的CLEC12A。抗体MF4327xMF5196根据共同的轻链(cLC)双特异性IgG格式而为人类全长IgG1双特异性抗体。

使用肿瘤细胞系的流式细胞术显示出抗体MF4327xMF5196特异性结合CLEC12A和CD3(图1A)。经由其CLEC12A臂，其结合CLEC12A^POS HL60细胞以及转染人类CLEC12A的CHO-K1细胞，但不结合亲代CHO-K1细胞。经由其CD3臂，其结合CD3^POS JurkatE6.1细胞，但不结合CD3^NEG Jurkat J.RT-T3.5细胞。

抗体MF4327xMF5196对于其标靶蛋白的亲和力针对CLEC12A为3nM及针对CD3为177nM，其是使用重组蛋白、依表面电浆子共振技术来判定。为了调查抗体MF4327xMF5196的工程处理的Fc区域对于药物动力学(PK)是否有可能的影响，所以测定抗体MF4327xMF5196于C57BL/6J小鼠内的活体内半生期且发现为226小时(9.4天)。此半生期落在人类IgG1抗体于啮齿动物体内通常观察到的活体内半生期范围内，表示人类cLC双特异性抗体的特异性设计对于IgG的非特异性消除途径没有效应。

正常末梢血液内的抗体MF4327xMF5196的结合解析分析显示抗体MF4327xMF5196结合CD3表达CD4^POS及CD8^POS T细胞以及结合CD3^POSCD56^POS NK T(NKT)细胞(图1B)。与先前报道的CLEC12A表达解析一致(Bakker，van den Oudenrijn等人的2004，Marshall，Willment等人的2004，Lahoud，Proietto等人的2009)，抗体MF4327xMF5196还结合单核细胞、骨髓树突细胞(mDC)、浆细胞树突细胞(pDC)及粒细胞，但不结合自然杀手(NK)细胞或B细胞(图1B且数据未显示)。于一个可使用的骨髓内，抗体MF4327xMF5196于CD34^POS祖细胞腔室内的结合解析(图1C)还与报道的CLEC12A表达解析(van Rhenen，van Dongen等人的2007)类似。抗体MF4327xMF5196一致地结合粒细胞-巨噬细胞祖细胞(GMP)细胞，而其只结合小部分的共同骨髓祖细胞(CMP)及巨核细胞-红血球祖细胞(MEP)亚群。值得注意的是，于包括多潜能祖细胞(MPP)及多潜能的造血干细胞(HSC)的CD34^POSCD38^NEG腔室内未观察到抗体MF4327xMF5196结合。

抗体MF4327xMF5196诱导CLEC12A特异性T细胞活化及CLEC12A^POSHL60细胞裂解

接着，我们以细胞毒性分析来判定CLEC12AxCD3双特异性IgG抗体诱导CLEC12A抗原特异性T细胞活化及CLEC12A^POS标靶细胞裂解的能力。效应子细胞为健康的供体衍生的休眠T细胞而标靶细胞为CLEC12A^POS HL60细胞。于此分析中，有野生型(WT)Fc区域(完整的Fc效应子功能)的MF4327xMF5196双特异性抗体与格式化为WT Fc区域的MockxCD3对照IgG作比较。MF4327xMF5196双特异性抗体于24及48小时后诱导CD4及CD8T细胞上CD69(图2A)及CD25上调(数据未显示)。T细胞介导的HL60细胞裂解于24小时之后已经很明显且于48小时之后测量到＞95％HL60细胞的细胞毒性(图2B)。标靶细胞裂解与效应子与标靶比率(E∶T比率)有相关性且于5∶1或更高的E∶T比率裂解最大(图9)。值得注意的是，CLEC12AxCD3诱导的裂解活性为CLEC12A抗原介导的(图2A，B)；MockxCD3对照过一段时间才观察到一些T细胞活化及HL60标靶细胞裂解。然而，这表明具WT Fc的双特异性IgG格式能在不需要CLEC12A结合的下诱导Fcγ受体介导的T细胞活化(图2A及B，72小时)。

具有沉默的Fc效应子功能的抗体MF4327xMF5196诱导CLEC12A^POSAML细胞系的特异 性裂解

为了防止双特异性抗体MF4327xMF5196诱导非特异性Fcγ受体介导的细胞裂解，通过导入变化至二个IgG1重链的CH2区域内来产生缺乏Fc效应子功能的双特异性IgG格式。各种减轻Fc效应子功能的手段为本领域已知的。与CD16、CD32及C1q结合，以及与CD64的结合减少达＞200倍是经由Fc工程处理来修饰CH2域内的残基来达成。于使用正常的休眠T细胞及CLEC12A^POS HL60细胞的细胞毒性分析中，抗体MF4327xMF5196诱导CD4T细胞及CD8 T细胞上的CD69(图2C)及CD25(图2D日上调。抗体MF4327xMF5196诱导的活性的最敏感的读出为CD8 T细胞上的CD69上调且平均半最大有效浓度(EC₅₀)为44ng/mL(表I)。更重要的是，抗体MF4327xMF5196诱导T细胞介导的HL60细胞裂解且100ng/mL及以上的浓度有＞80％的裂解，以及68ng/mL的平均EC₅₀(图2E，表I)。虽然具野生型Fc效应子功能的MockxCD3抗体于第2天已看见CD4及CD8 T细胞活化(图2A，1000ng/mL)，但Fcγ受体沈默的MockxCD3抗体于48小时后没有观察到T细胞活化，即使在8000ng/mL(图2C-D)。此全部一起显示通过Fcγ受体沈默的抗体MF4327xMF5196诱导的T细胞的细胞毒性(图2C-E)为CLEC12A抗原特异性的。

这些资料共同证明了具有降低的Fc效应子功能的抗体MF4327xMF5196介导CLEC12A特异性T细胞活化且有效地重新导向这些T细胞以诱导CLEC12A^POS HL60细胞裂解的能力。

抗体MF4327xMF5196诱导自体T细胞特异性裂解CLEC12A^POS单核细胞

抗体MF4327xMF5196通过休眠自体T细胞诱导重新导向的CLEC12A^POS单核细胞裂解的能力是以PBMC培养物来判定。抗体MF4327xMF5196诱导CD4细胞及CD8 T细胞的活化(图3A)，并且裂解单核细胞(从100ng/mL，图3B)。重要的是，抗体MF4327xMF5196诱导的活性是CLEC12A特异性，因MockxCD3对照于高达10，000ng/mL的浓度都不会诱导可观察的T细胞活化或单核细胞裂解(图3A-B)。此外，抗体MF4327xMF5196活化的细胞毒性T细胞的裂解的活性是对CLEC12A抗原表达细胞有选择性，因B细胞及NK细胞部分不受影响，即使在最高测试的抗体MF4327xMF5196浓度(图3C且数据未显示)。

这些数据证明抗体MF4327xMF5196经由自体T细胞的重新导向及活化能有效地诱导CLEC12A-限制性重新导向的CLEC12A^POS单核细胞裂解。

CLEC12A特异性诱导细胞因子释放及T细胞增殖

接着，研究抗体MF4327xMF5196于单核细胞与自体休眠T细胞共培育后诱导T细胞增殖的能力。100及1，000ng/mL的抗体MF4327xMF5196有效地诱导CD4及CD8 T细胞二者的CLEC12A特异性增殖(图3D)。于共培养5天之后，MockxCD3对照没有诱导任何T细胞增殖，再次证明抗体MF4327xMF5196功能为CLEC12A特异性的。

接着，于1，000ng/mL的抗体MF4327xMF5196暴露48小时后测量这些PBMC培养物内的细胞因子电平。抗体MF4327xMF5196诱导10-200pg/mL的范围内的IL-1β、TNF-α、IFN-γ、IL-6及IL-10释放，以及在10，000-30，000pg/mL的范围内的IL-8释放(图3E)。一般而言，抗体MF4327xMF5196诱导的细胞因子电平比抗CD3二价单特异性抗体刺激后获得的此类更低。抗体MF4327xMF5196诱导的细胞因子释放为CLEC12A特异性的，因在MockxCD3对照存在下缺少细胞因子释放或细胞因子释放是有限。

这些资料证明抗体MF4327xMF5196能在自体T细胞与CLEC12A^POS单核细胞共培育后诱导增殖及释放细胞因子。

抗体MF4327xMF5196诱导的正常的CD34+细胞靶向保留红血球及巨核细胞分化以 及保有发展单核-骨髓性细胞谱系的潜力

因CLEC12A表达于正常的CD34^POS腔室内的单核-骨髓性细胞祖细胞腔室内，所以我们目的在评估抗体MF4327xMF5196对于正常造血作用的影响。为此，以健康的供体骨髓衍生的CD34^POS细胞及预活化的自体T细胞来执行细胞毒性分析。使用预活化的T细胞以拥有很短的16小时细胞毒性分析窗口，其使CD34^POS细胞的活体外分化对于分析结果的影响最小。我们观察到抗体MF4327xMF5196特异性裂解＞86％的CLEC12A^POSCD34^POS细胞，而CLEC12A^NEGCD10^POS或CD10^NEC细胞部分不受影响(图4A)。各种CD34^POS祖细胞部分的详细分析表明抗体MF4327xMF5196靶向CLEC12A表达GMP(三倍减少，图4B)。抗体MF4327xMF5196没有显著影响部分表达CLEC12A的细胞部分(CMP及MEP)也没有显著影响CLEC12A阴性HSC、MPP及共同淋巴祖细胞(CLP)。有趣的是，抗体MF4327xMF5196仅裂解一部分的CD123^POS细胞，显示一大亚群的CD123^POSCLEC12A^NEG细胞不受抗体MF4327xMF5196影响，包括CMPs一亚群(图4C)。

接着，正常的CD34^POS细胞部分于抗体MF4327xMF5196诱导重新导向裂解后、产生单核细胞、粒细胞、红血球及巨核细胞的能力是使用CFU分析来评估功能电平。来自骨髓CD34^POS造血祖细胞的红血球(BFU-E；暴发集落形成单位-红血球)或巨核细胞(CFU-Mk；群落形成单位-巨核细胞)群落的生长物不受抗体MF4327xMF5196影响(图4D)。值得注意的是，尽管抗体MF4327xMF5196诱导的重新导向裂解造成GMPs很大的减少，但粒细胞-巨噬细胞群落(CFU-GM)生长物于功能电平只观察到24％适度的减少。有趣的是，GM-祖细胞，不受抗体MF4327xMF5196影响，保有其发展CD14^POSCD36^POSCD33^POS单核细胞及CD15^POSCD33^POS骨髓性细胞二者的能力(图4E)，依CFU-GM群落的流式细胞术分析来判定。

汇总这些数据表明抗体MF4327xMF5196不影响红血球巨核细胞的发展。此外，虽然其有效地根除CLEC12A^POSCD34^POS祖细胞，但于抗体MF4327xMF5196治疗后仍保有粒细胞及单核细胞发展的潜力。

抗体MF4327xMF5196通过自体T细胞诱导原发性AML原始细胞的重新导向裂解

接着，我们判定抗体MF4327xMF5196诱导AML患者衍生的T细胞裂解CLEC12A^POS标靶细胞的能力。形态临床缓解的AML患者的T细胞腔室显示出正常的初始、中央记忆(CM)、效应子记忆(EM)及有重新取得的CD45RA的效应子记忆细胞(EMRA+)组成(图12A、B和表III，患者1-6)。分析AML患者T细胞介导CLEC12A^POS标靶细胞的抗体MF4327xMF5196的细胞毒性的能力显示，在AML患者衍生的T细胞及健康的供体衍生的T细胞于诱导抗体MF4327xMF5196介导的T细胞活化及CLEC12A^POS细胞裂解的能力之间没有差异(图12C-E)。

抗体MF4327xMF5196通过自相同的AML患者采集的休眠自体T细胞、诱导原发性AML原始细胞的CLEC12A特异性裂解的能力是在稍晚的时间点判定(图5A，表III中列出的患者，患者7-9)。在诊断获得的原发性AML++++功能含有大部分的(＞80％)的用于的原发性(图5B)。AML原始细胞系与临床缓解期间取得的自体休眠T细胞以5∶1的E∶T比率共培养48小时。抗体MF4327xMF5196诱导有力的CLEC12A特异性CD4及CD8 T细胞活化以及＞70％AML原始细胞裂解(图5C-E)。这些资料显示抗体MF4327xMF5196能通过自体T细胞有效地诱导CLEC12A^POS原发性AML原始细胞裂解。

抗体MF4327xMF5196以低的E∶T比率、于诊断样本内重新导向原发性AML原始细胞 的裂解

我们继而判定抗体MF4327xMF5196通过于诊断时采集的原发性AML样本内的自体T细胞、诱导AML原始细胞裂解的能力。于测试的原发性AML样本(表III中列出，患者10-19)中，T细胞的数目与AML原始细胞的数目相比的下为相对稀缺的，导致低的有效E∶T比率(1∶3-1∶97，表II)。FACS分析揭露患者于CLEC12A表达方面的异质性(表II)。原发性AML样本是在细胞因子混合物存在下培养10天以支持分析期间AML原始细胞及T细胞的存活。在培养10天之后，中位数AML原始细胞的恢复在缺少抗体MF4327xMF5196的情况下为41％-1591％。在培养一开始时添加抗体MF4327xMF5196及MockxCD3对照IgG一次。T细胞扩增及AML原始细胞裂解是于第7天及第10天通过流式细胞术来定量。抗体MF4327xMF5196不仅有效地诱导CLEC12A介导的T细胞扩增(扩增倍数范围6-157)，其还于第7天及第10天诱导AML原始细胞裂解(图6)。于第10天，抗体MF4327xMF5196于10/11的患者样本内已有效地诱导AML原始细胞裂解(23％-98％)。虽然MockxCD3对照抗体于一些样本内还减少肿瘤细胞数目，但此类样本内的T细胞活化的电平远低于抗体MF4327xMF5196观察到的此类(抗体MF4327xMF5196vsMockxCD3的T细胞扩增中位数48vs 2倍)。值得注意的是，抗体MF4327xMF5196即使在效应子与标靶比率非常低的AML样本内还是活性的(图6及表II)。针对一个没有观察到原始细胞裂解的AML样本(患者16)，T细胞扩增的电平也只有15倍，与10个抗体MF4327xMF5196有反应的样本观察到的T细胞扩增中位数48倍相比。

最后，抗体MF4327xMF5196通过AML患者骨髓样本内存在的T细胞、有效地诱导CLEC12A介导的AML原始细胞的裂解，即使在非常低的E∶T比率，并且还激起有力的T细胞增殖。

抗体MF4327xMF5196给药方案于人类AML患者导致减轻的细胞因子电平

测量抗体MF437xMF5196治疗后的患者细胞因子电平。

图14显示由第1天接受1mg的初次剂量，接着于第4天接受3mg及于第8天接受15mg的逐步调升剂量，以及于第15天接受25mg的全剂量的患者获得的资料。

图15显示由第1天接受3mg的初次剂量，接着于第4天接受10mg及于第8天接受25mg的逐步调升剂量，以及于第15天接受40mg的全剂量的患者获得的资料。

图16显示由第1天接受5mg的初次剂量，接着于第4天接受15mg及于第8天接受25mg的逐步调升剂量，以及于第15天接受60mg的全剂量的患者获得的资料。

总的说来，在某些患者中的资料显示出，施用激活剂量及逐步调升剂量会减轻施用全剂量时的细胞因子释放。对于各种群内的某些患者，于启动、逐步调升及全剂量的全部期间内观察到有限的细胞因子释放(数据未显示)。

讨论

实施例提及的抗体MF4327xMF5196为全长抗体。CLEC12AxCD3双特异性人类IgG1抗体的Fc效应子沈默版本显示出能通过靶向AML原始细胞及白血病干细胞(LSCs)上的CLEC12A来治疗全部的AML亚型。抗体MF4327xMF5196为有力的双特异性抗体其有效地活化且重新导向T细胞以裂解CLEC12A表达细胞例如AML细胞。于10/11的原发性AML患者样本内，此CLEC12AxCD3 T细胞衔接器通过重新导向驻留的自体T细胞来有效地诱导CLEC12A介导的AML原始细胞的裂解。于此拟体内细胞因子支持系统内，AML样本是在抗体MF4327xMF5196存在下培养7-10天。此分析以两种方式确立抗体MF4327xMF5196的功效：其表明抗体MF4327xMF5196有诱导这些样本内的AML患者T细胞扩增的能力，以及显示出此类抗体MF4327xMF5196重新导向的T细胞能通过细胞裂解重新导向对AML原始细胞的细胞裂解活性(表II中所示)。抗体MF4327xMF5196能诱导显著的T细胞扩增及原始细胞裂解，即使于起始E∶T比率很低(1∶45-1∶97)或CLEC12A表达电平相对低的此类AML样本内。于拟体内分析中抗体MF4327xMF5196相对于MockxCD3条件的比较表明抗体MF4327xMF5196诱导的活性是CLEC12A抗原介导的；与MockxCD3于9/10原发性AML样本内的最小活性相比，观察到抗体MF4327xMF5196的有力的T细胞增殖及AML原始细胞细胞裂解。没反应的一个样本其缺少AML原始细胞裂解及有力的抗体MF4327xMF5196诱导的T细胞扩增(患者16)二者，可能有严重的T细胞官能不良。

虽然许多起始的实验使用健康的供体T细胞，但细胞毒性分析还使用AML患者衍生的T细胞来执行以测试抗体MF4327xMF5196重新导向疾病背景T细胞的能力。AML T细胞的特定缺陷已有报道，包括损伤的免疫突触形成及降低的T细胞共刺激能力(Wendelbo，Nesthus等人的2004，Le Dieu，Taussig等人的2009)。于此，显示抗体MF4327xMF5196能重新导向形态临床缓解获得的AML患者衍生的T细胞(n＝6)，如其重新导向健康的供体衍生的T细胞一般有效地诱导CLEC12A特异性的CLEC12A^POS肿瘤细胞裂解。此外，于10/11的AML样本内发现抗体MF4327xMF5196能于原发性重新AML样本内有效地重新导向自体T细胞以裂解AML原始细胞。于此，证明AML患者衍生的T细胞能以HSC保留方式及以低的E∶T比率、由全长IgG CD3-衔接双特异性IgG而被功能上活化，导致T细胞活化及增殖。这些经由抗体MF4327xMF5196的自体T细胞功能活化有效地放大效应子T细胞腔室，因而促进更有利的E∶T比率用于有效根除患者的AML原始细胞及LSCs。

于正常的骨髓方面，抗体MF4327xMF5196结合限制于骨髓性腔室，因抗体MF4327xMF5196能CLEC12A特异性靶向，保留了骨髓的其他区域。于此，显示抗体MF4327xMF5196于骨髓内一致地结合GMP细胞，而其仅结合小部分的CMP及MEP亚群。更重要的是，抗体MF4327xMF5196不会结合包括多潜能HSCs的CD34^POSCD38^NEG腔室。与CMP及MEP部分上的CLEC12A表达较少一致，抗体MF4327xMF5196于我们的活体外CFU分析中显示出不会影响红血球或巨核细胞谱系的发展。此外，虽然抗体MF4327xMF5196于拟体内细胞毒性分析中降低CLEC12A^POS GMP细胞的数目，但于跟进的CFU分析中观察到抗体MF4327xMF5196治疗后剩余的CD34^POS骨髓细胞能产生单核及骨髓性细胞谱系二者，允许由CD34^POSCLEC12A^NEG祖细胞，包括HSCs及MPPs产生单核-骨髓性细胞生长物，抗体MF4327xMF5196治疗没有明显的影响其(van Rhenen，van Dongen等人的2007，Notta，Zandi等人的2016，Bill，van KootenNiekerk等人的2018)。

预期抗体MF4327xMF5196施用给患者后的血液毒性可能会限于嗜中性白血球减少症及单核细胞计数减少。本结果证明抗体MF4327xMF5196重新导向裂解后，嗜中性粒细胞及单核细胞可从剩余的CD34^POS细胞再植宿主。于抗体MF4327xMF5196治疗后再植造血细胞的潜力与靶向CD33或CD123的治疗可能的情况形成对比(Aigner，Feulner等人的2013，Al-Hussaini，Rettig等人的2016)。与CLEC12A相比，CD33和CD123更广泛地表达于正常的CD34^POS祖细胞，包括CMPs、GMPs及多潜能HSCs之上(Taussig，Pearce等人的2005)。本发明显示CLEC12A靶向保留了CD123定向疗法标靶的正常的CD123^POS CMPs。人化小鼠的活体内研究业已显示CD33和CD123靶向嵌合抗原受体(CAR)转导的T细胞诱导CD34^POSCD38^NEG干细胞部分的裂解(Pizzitola，Anjos-Afonso等人的2014，Kenderian，Ruella等人的2015)。结果是，靶向CD33和CD123疗法引起了对血液毒性的担忧：这些疗法除了HSC根除-其会阻止正常的造血腔室的有效重建-的风险的外，此外可能会诱导血小板减少症、嗜中性白血球减少症及贫血。

抗体MF4327xMF5196的Fc区域已经修饰以预防结合FcγR及C1q，而不影响结合FcRn受体。单核细胞分析的结果的确显示出抗体MF4327xMF5196诱导T细胞活化以及相关的细胞因子释放局限于CLEC12A表达细胞。Fc沈默减弱了CD3^POS和/或CLEC12A^POS细胞的典型的抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)及C1q介导的补体依赖性细胞毒性(CDC)。现在的数据显示抗体MF4327xMF5196活化的T细胞选择性地裂解CLEC12A^POS细胞(例如PBMC培养内的B细胞及NK细胞不受影响)。

小鼠的研究确认一种全长IgG1抗体MF4327xMF5196，有正常的9-10天的FcRn介导的活体内半生期。这意味着-不像其他T细胞衔接器概念-患者体内的抗体MF4327xMF5196有效的全身电平能通过每周静脉施用来达成。

抗体MF4327xMF5196选择性地靶向骨髓性原始细胞同时保留正常的HSCs。根据其根除残余的LSCs的潜力，认为管理AML的微量残存疾病(MRD)须考虑抗体MF4327xMF5196。

实施例2

骨髓增生性肿瘤母细胞期(MPN-BP)患者的CLEC12A阴性及CLEC12A阳性CD34+干及祖细胞的研究。

从MPN-BP患者骨髓采集细胞。CD34+细胞系根据前散射(FSC)、侧散射(SSC)、CD45、CD34、CD38及CLEC12A表达来图选。具低SSC及CD45^dim、CD34⁺、CD38的细胞根据CLEC12A表达分选成二部分。细胞系平板培养于补充SCF、IL-3、IL-6、EPO、G-CSF及GM-CSF的MethoCult^TMH4435 Enriched(STEMCELL technologies)内且培育12-14天。挑选群落且重新平板培养于补充SCF、IL-3、IL-6、EPO、G-CSF及GM-CSF的MethoCult^TM H4435 Enriched(STEMCELL technologies)内且再培育12-14天。第一次平板培养的结果为CLEC12A阴性部分每1500个平板培养的细胞有20个大群落(40个细胞或更多)及10个小群落(每群落<40个细胞)。CLEC12A阳性部分每1500个平板培养的细胞没有大群落及有32个小群落。CLEC12A阴性部分的平板内的群落于重新平板培养实验中不能产生二次群落，每1500个接种的细胞为零个大或小群落。另一方面重新平板培养来自CLEC12A第一次平板培养的细胞导致每1500个细胞有44个小群落，这些中大约80％为JAK2驱动突变阳性，参见图13。

概要

来自MPN-BP患者的CD34posCD38-CLEC12A-细胞于原代培养内只能产生造血群落(CFU-GM)，其主要是CFU-GM。相比的下，MPN-PB患者内表达CLEC12A的CD34-CD38-干细胞能产生原始细胞群落、其可连续重新平板培养且因而含有白血病起始的能力。

分化的CLEC12A表达可用来从有MPN-BP的患者识别、根除和/或分离白血病起始细胞(LIC)。一种如本文所公开的CD3-CLEC12A双特异性抗体可用来根除MPN-PB内的这些LIC，以减少MPN急性期细胞的数目并借此使有MPN-BP患者的疾病减轻。

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序列表概要

表I：抗体MF4327xMF5196诱导的T细胞活化及标靶细胞裂解的平均EC₅₀值

抗体MF4327xMF5196 EC₅₀值以HL60细胞毒性分析来判定。数据来自6位健康的供体。

Claims (15)

1.一种治疗个体的CLEC12A阳性癌症的方法，所述方法包括以结合CD3和CLEC12A的双特异性抗体的两次或更多次施用来治疗对其有需要的个体，其中在第一次施用中施用所述双特异性抗体的第一量并且其中在后续施用中所述双特异性抗体的量比所述第一次施用中的所述双特异性抗体的量高。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一量为双特异性抗体的亚治疗量。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述两次或更多次施用中的所述第二次施用中施用的双特异性抗体的量比所述第一次施用中的所述双特异性抗体的量高，以及比所述两次或更多次施用中的第三次施用中的所述双特异性抗体的量低。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述两次或更多次施用中的所述第三次施用中施用的双特异性抗体的量比所述两次或更多次施用中的所述第二次施用中的双特异性抗体的量高，以及比所述两次或更多次施用中的第四次施用中的量低。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中在施用递增量的所述双特异性抗体后，所述双特异性抗体在每次后续施用中以基本上恒定的剂量来施用。

6.根据权利要求5所述的方法，其中在每次后续施用中的所述基本上恒定的剂量为至少15mg的所述双特异性抗体。

7.根据权利要求6所述的方法，其中在每次后续施用中的所述基本上恒定的剂量为至少60mg的所述双特异性抗体。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述双特异性抗体的所述第一量为9mg或更小。

9.一种结合CD3和CLEC12A的双特异性抗体，所述双特异性抗体用于治疗个体的CLEC12A阳性癌症的方法中，其中所述治疗包括结合CD3和CLEC12A的双特异性抗体的两次或更多次施用，其中在第一次施用中施用所述双特异性抗体的第一量并且其中在每次后续施用中所述双特异性抗体的量比所述第一次施用中的所述双特异性抗体的量高。

10.一种从个体清除CLEC12A阳性造血细胞且以正常CLEC12A阳性细胞再植所述个体的造血系统的方法，所述方法包括每隔一段时间向对其有需要的个体施用结合CD3和CLEC12A的双特异性抗体，由此杀灭CLEC12A阳性恶性细胞，并且刺激所述个体的造血干细胞和/或造血祖细胞以用新生的造血干细胞衍生的CLEC12A阳性细胞来再植所述造血系统。

11.所述个体优选为经诊断患有急性骨髓性白血病(AML)、骨髓增生异常综合征(MDS)、骨髓纤维化(MF)或骨髓增生性肿瘤母细胞期(MPN-BP)的个体。

12.一种制备用于要治疗CLEC12A阳性癌症的个体的自体骨髓细胞移植物的方法，所述方法包括在适合杀灭CLEC12A阳性细胞的条件下以结合CD3和CLEC12A的双特异性抗体培育所述个体的骨髓细胞制备物，并且随后从所述培育中采集骨髓细胞。

13.一种治疗个体的CLEC12A阳性癌症的方法，所述方法包括在适合杀灭CLEC12A阳性细胞的条件下以结合CD3和CLEC12A的双特异性抗体培育所述个体的骨髓细胞制备物，以造血系统消融疗法来治疗所述个体并且向所述个体提供包括所述培育的骨髓细胞的骨髓细胞移植物。

14.一种向个体提供保留造血干细胞的癌症治疗的方法，所述方法包括向对其有需要的个体施用结合CD3和CLEC12A的双特异性抗体。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述个体患有CLEC12A阳性癌症。

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