KR20240035504A - 항-cll-1 항체 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

항-CLL-1 항체 및 이의 용도가 제공되며, 일 양상의 항-CLL-1 항체에 따르면, 이는 CLL-1에 높은 결합 친화도로 결합할 수 있고, T 세포의 활성화를 유도할 수 있으므로, CLL-1을 발현하는 암을 예방 또는 치료하는데 효과적으로 사용될 수 있다.

Description

항-CLL-1 항체 및 이의 용도
관련 출원에 대한 상호-참조
본 출원은 한국 특허청에 2021년 7월 20일자로 출원된 한국 특허 가출원 제10-2021-0095142호, 및 2021년 12월 10일자로 출원된 한국 특허 가출원 제10-2021-0176638호에 기초하고, 우선권을 주장하며, 이들의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 통합된다.
항-CLL-1 항체 (anti-CLL-1 antibodies) 및 이의 용도를 제공한다.
급성 골수성 백혈병 (Acute Myeloid leukemia: AML)은 성인 환자에서 가장 흔하고 치명적인 혈액 악성종양으로, 대부분의 환자는 예후가 좋지 않다. AML은 질병의 이질성, 특정 표적 항원의 부족, 및 기존 치료 후 재발을 매개하는 백혈병 줄기세포 (leukemic stem cell: LSC)의 존재로 인해 여전히 치료가 어렵다.
CLEC12A (C-type lectin domain family 12 member A; 또한 CLL-1 (C-type lectin-like molecule-1), CD371, DCAL2 (dendritic cell-associated lectin 2), MICL (myeloid inhibitory C-type lectin-like receptor) 및 KLRL1 (killer cell lectin like receptor-1)로 알려져 있음)는 새로 진단된 AML 및 재발된 AML의 ~90%에서 발현되는 골수성 분화 항원 (myeloid differentiation antigen)이다. 이는 세포외 C-말단 렉틴 도메인, 막횡단 영역 및 N-말단 세포질 테일을 포함하는 타입 II 막횡단 당단백질이다.
모노클로날 항체 (mAb)-기반 요법은 암에 대한 중요한 치료 방식이 되었다. 백혈병은 이러한 접근법에 매우 적합하며, 이는 혈액, 골수, 비장 및 림프절에 있는 악성 세포에 대해 접근 가능하고, 항원 표적을 식별할 수 있는 다양한 계통과 조혈 분화 단계의 면역표현형 (immunophenotypes)이 잘 정의되어 있기 때문이다. 급성 골수성 백혈병 (AML)에 대한 대부분의 연구는 CD33에 중점을 두었다. 그러나, 비접합된 항-CD33 mAb 린투주맙 (lintuzumab)에 대한 반응은 AML에 대한 단일 약제로, 보통의 활성을 나타내었고, 기존 화학요법과 병용한 2건의 무작위 임상 시험 (randomized trials)에서 환자 예후를 개선하지 못하였다.
CLL-1 관련 질환 (CLL-1-associated conditions), 예컨대 암의 진단 및 치료를 위해 CLL-1을 포함하는 AML을 표적으로 하는 안전하고 효과적인 약제에 대한 필요성이 당해 기술 분야에 존재한다. 본 발명은 이러한 요구를 충족시키고 또 다른 이점을 제공한다.
본 개시내용의 일 양상은 단리된 항-CLL-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
본 개시내용의 다른 양상은 항-CLL-1 항체를 코딩하는 단리된 핵산 (nucleic acid)을 제공한다.
본 개시내용의 다른 양상은 단리된 핵산을 포함하는 벡터 (vector)를 제공한다.
본 개시내용의 다른 양상은 벡터를 포함하는 숙주 세포 (host cell)를 제공한다.
본 개시내용의 다른 양상은 항-CLL-1 항체를 포함하는 약학 조성물 (pharmaceutical composition)을 제공한다.
본 개시내용의 다른 양상은 환자에게 유효량의 항-CLL-1 항체를 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 환자에서 암을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
본 개시내용의 다른 양상은 암을 치료 또는 예방하기 위한 약제 (medicament)의 제조에 있어서 항-CLL-1 항체의 용도를 제공한다.
본 개시내용의 다른 양상은 암을 치료 또는 예방하기 위한 항-CLL-1 항체의 용도를 제공한다.
본 개시내용의 일 양상은 하기를 포함하는, 단리된 항-CLL-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다: (a) 서열 번호: 1, 2 및 3으로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1; (b) 서열 번호: 4, 5 및 6으로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2; (c) 서열 번호: 7, 8, 9, 10 및 11로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3; (d) 서열 번호: 12, 13, 14 및 15로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1; (e) 서열 번호: 16, 17 및 18로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2; 및 (f) 서열 번호: 19, 20, 21 및 22로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3.
일 실시양태에서, 항-CLL-1 항체 또는 이의 단편은 서열 번호: 23 및 24로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함할 수 있다.
일 실시양태에서, 항-CLL-1 항체 또는 이의 단편은 서열 번호: 55로 구성된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변 영역을 포함할 수 있다.
일 실시양태에서, 항-CLL-1 항체 또는 이의 단편은 서열 번호: 23 및 24로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역; 및 서열 번호: 55로 구성된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변 영역을 포함할 수 있다.
일 실시양태에서, 항-CLL-1 항체 또는 이의 단편은 서열 번호: 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 및 74로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함할 수 있다.
일 실시양태에서, 항-CLL-1 항체 또는 이의 단편은 서열 번호: 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 및 75로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다.
일 실시양태에서, 항-CLL-1 항체 또는 이의 단편은 서열 번호: 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 및 74로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역; 및 서열 번호: 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 및 75로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변 영역을 포함할 수 있다.
일 실시양태에서, 항-CLL-1 항체 또는 이의 단편은 서열 번호: 45로 구성된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함할 수 있다.
일 실시양태에서, 항-CLL-1 항체 또는 이의 단편은 서열 번호: 46으로 구성된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함할 수 있다.
일 실시양태에서, 항-CLL-1 항체 또는 이의 단편은 서열 번호: 45로 구성된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및 서열 번호: 46으로 구성된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함할 수 있다.
일 실시양태에서, 항-CLL-1 항체 또는 이의 단편은 중쇄 가변 영역의 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3 및 경쇄 가변 영역의 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3의 서열을 포함할 수 있고, 이는 하기 중 하나이다: (a) CDRH1, CDRH2 및 CDRH3은 각각 서열 번호: 1, 4, 및 7이고, CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3은 각각 서열 번호: 12, 16 및 19임; (b) CDRH1, CDRH2 및 CDRH3은 각각 서열 번호: 2, 5, 및 8이고, CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3은 각각 서열 번호: 13, 17 및 20임; (c) CDRH1, CDRH2 및 CDRH3은 각각 서열 번호: 3, 6, 및 9이고, CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3은 각각 서열 번호: 14, 18 및 21임; (d) CDRH1, CDRH2 및 CDRH3은 각각 서열 번호: 1, 4, 및 10이고, CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3은 각각 서열 번호: 15, 16 및 22임; 및 (e) CDRH1, CDRH2 및 CDRH3은 각각 서열 번호: 2, 5, 및 11이고, CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3은 각각 서열 번호: 13, 17 및 20임.
일 실시양태에서, 항-CLL-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 마우스 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 또는 완전 인간 항체일 수 있다.
일 실시양태에서, 항-CLL-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 전체 IgG (whole IgG), Fab, Fab', F(ab')2, xFab, scFab, dsFv, Fv, scFv, scFv-Fc, scFab-Fc, 디아바디 (diabody), 미니바디 (minibody), scAb, dAb, half-IgG 및 이의 조합으로 구성된 그룹으로부터 선택될 수 있다.
일 실시양태에서, 항-CLL-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 IgG, 바람직하게는 IgG1의 형태일 수 있다.
일 실시양태에서, 항-CLL-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 Fab 분자일 수 있다.
일 실시양태에서, 항-CLL-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 하기 특성 중 하나 이상을 가질 수 있다: (a) 인간 (human) CLL-1에의 결합; (b) 시노몰구스 원숭이 (cynomolgus monkey) CLL-1에의 결합; (c) 인간 말초 혈액 단핵구 (peripheral blood mononucleocyte: PBMC) 표면 상의 CLL-1에의 결합; (d) 시노몰구스 원숭이 PBMC 표면 상의 CLL-1에의 결합; 및 (e) 암세포 표면 상의 CLL-1에의 결합.
일 실시양태에서, 세포독성제 (cytotoxic agent)는 항-CLL-1 항체 또는 항원-결합 단편의 적어도 일부에 접합될 수 있다.
일 실시양태에서, 세포독성제는 항-CLL-1 항체 또는 항원-결합 단편에 링커 (linker)를 통해 부착될 수 있다.
일 실시양태에서, 링커는 프로테아제 (protease)에 의해 절단될 수 있다.
일 실시양태에서, 항-CLL-1 항체는 약제로서 사용하기 위한 것일 수 있다.
일 실시양태에서, 항-CLL-1 항체는 암을 치료 또는 예방하는데 사용하기 위한 것일 수 있다.
본 개시내용의 다른 양상은 식 Ab-(L-D)p를 포함하는 면역접합체 (immunoconjugate)를 제공하며, 여기서: (a) Ab는 청구항 1의 항-CLL-1 항체이고; (b) L은 링커이고; (c) D는 세포독성제이고; (d) p는 1 내지 8의 범위이다.
본 개시내용의 다른 양상은 항-CLL-1 항체를 코딩하는 단리된 핵산을 제공한다.
본 개시내용의 다른 양상은 단리된 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다.
본 개시내용의 다른 양상은 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
본 개시내용의 다른 양상은 항-CLL-1 항체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
본 개시내용의 다른 양상은 환자에게 유효량의 항-CLL-1 항체를 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 환자에서 암을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
본 개시내용의 다른 양상은 암을 치료 또는 예방하기 위한 약제의 제조에 있어서 항-CLL-1 항체의 용도를 제공한다.
본 개시내용의 다른 양상은 암을 치료 또는 예방하기 위한 항-CLL-1 항체의 용도를 제공한다.
일 실시양태에서, 약학 조성물은 암을 치료 또는 예방하기 위한 것일 수 있다.
일 실시양태에서, 암은 고형암 (solid cancer) 또는 혈액암 (blood cancer)일 수 있다.
일 실시양태에서, 암은 백혈병, 직장암, 자궁내막암, 신장모세포종 (nephroblastoma), 기저 세포 암종, 비인두암, 골종양, 식도암, 림프종, 호지킨 림프종 (Hodgkin's lymphoma), 비-호지킨 림프종 (non-Hodgkin's lymphoma), 갑상선 여포암 (follicular thyroid cancer), 간세포 암종, 구강암, 신세포 암종, 다발성 골수종, 중피종, 골육종, 골수이형성 증후군 (myelodysplastic syndrome), 중간엽 종양, 연조직 육종, 지방 육종, 위장관 기질 종양 (gastrointestinal stromal tumor), 악성 말초 신경초 종양 (malignant peripheral nerve sheath tumor: MPNST), 유잉 육종 (ewing sarcoma), 평활근 육종, 중간엽 연골육종, 림프육종, 섬유육종, 횡문근육종, 기형종, 신경모세포종, 수모세포종, 신경교종, 양성 피부 종양, 버킷 림프종 (Burkitt's lymphoma), 외투 세포 림프종 (mantle cell lymphoma), 미만성 거대 B 세포 림프종 (diffuse large B cell lymphoma: DLBCL), 소포 림프종 (follicular lymphoma), 변연부 림프종 (marginal zone lymphoma), 신경외배엽 종양, 상피 종양, 피부 T-세포 림프종 (cutaneous T-cell lymphoma: CTCL), 말초 T 세포 림프종 (peripheral T cell lymphoma: PTCL), 췌장암, 혈액 악성종양 (haematological malignancies), 신장암, 종양 혈관계 (tumor vasculature), 유방암, 신장암, 난소암, 상피성 난소암, 위암, 간암, 폐암, 결장직장암, 췌장암, 피부암, 방광암, 고환암, 자궁암, 전립선암, 소세포 폐암 (small cell lung cancer: SCLC), 비-소세포 폐암 (non-small cell lung cancer: NSCLC), 신경모세포종, 뇌암, 결장암, 편평세포 암종, 흑색종, 골수종, 자궁경부암, 갑상선암, 두경부암 및 부신암으로 구성된 그룹으로부터 선택될 수 있다.
일 실시양태에서, 백혈병은 급성 림프구성 백혈병 (acute lymphoblastic leukemia: ALL), 만성 림프구 백혈병 (chronic lymphocytic　leukemia: CLL), 털세포 백혈병 (hairy-cell leukemia), 골수이형성 증후군 (myelodysplastic syndrome: MDS), 만성 골수성 백혈병 (chronic myelogenous leukemia: CML) 및 급성 골수성 백혈병 (acute myeloid leukemia: AML)으로 구성된 그룹으로부터 선택될 수 있고, 바람직하게는 AML일 수 있다.
일 실시양태에서, 암은 CLL-1을 발현하는 암일 수 있다.
일 양상의 항-CLL-1 항체에 따르면, 이는 CLL-1에 높은 결합 친화도로 결합할 수 있고, T 세포의 활성화를 유도할 수 있으므로, CLL-1을 발현하는 암을 예방 또는 치료하는데 효과적으로 사용될 수 있다.
도 1은 huCLL1-His를 리간드로 사용하는 일 실시양태에 따른 3가지 키메라 항체의 리간드 결합 활성을 보여주는 그래프이다.
도 2는 hFc-huCLL1을 리간드로 사용하는 일 실시양태에 따른 3가지 키메라 항체의 리간드 결합 활성을 보여주는 그래프이다.
도 3은 hFc-시노몰구스 CLL1 50 ng/well을 리간드로 사용하는 일 실시양태에 따른 3가지 키메라 항체의 리간드 결합 활성을 보여주는 그래프이다.
도 4는 hFc-시노몰구스 CLL1 100 ng/well을 리간드로 사용하는 일 실시양태에 따른 3가지 키메라 항체의 리간드 결합 활성을 보여주는 그래프이다.
도 5는 일 실시양태에 따른 키메라 항체 및 인간화 항체 hu16C6의 리간드 결합 활성을 보여주는 그래프이다.
도 6은 일 실시양태에 따른 키메라 항체 및 인간화 항체 hu33C2의 리간드 결합 활성을 보여주는 그래프이다.
도 7은 일 실시양태에 따른 다양한 인간화 항체 hu33C2의 리간드 결합 활성을 보여주는 그래프이다.
도 8은 CLL1 음성 세포 및 다양한 CLL1-발현 암세포에서 일 실시양태에 따른 키메라 항체의 세포 결합 활성을 보여주는 그래프이다.
도 9는 HL60에서 일 실시양태에 따른 키메라 항체의 세포 결합 활성을 보여주는 그래프이다.
도 10은 U937에서 일 실시양태에 따른 키메라 항체의 세포 결합 활성을 보여주는 그래프이다.
도 11은 시노몰구스 CLL-1을 과발현하는 HEK293E에서 일 실시양태에 따른 키메라 항체의 세포 결합 활성을 보여주는 그래프이다.
도 12는 일 실시양태에 따른 키메라 항체 및 다양한 인간화 항체 hu33C2의 세포 결합 활성을 보여주는 그래프이다.
도 13은 일 실시양태에 따른 키메라 항체 및 다양한 인간화 항체 hu16C6의 세포 결합 활성을 보여주는 그래프이다.
도 14는 일 실시양태에 따른 ch84A2, hu16C6 및 hu33C2의 ADCC를 보여주는 그래프이다.
도 15는 EOL-1에서 일 실시양태에 따른 ADC의 세포 증식 억제 활성을 보여주는 그래프이다.
도 16은 THP-1에서 일 실시양태에 따른 ADC의 세포 증식 억제 활성을 보여주는 그래프이다.
도 17은 CLL1 발현 암세포에서 일 실시양태에 따른 이중특이적 항체의 세포 결합 활성을 보여주는 그래프이다.
도 18은 일 실시양태에 따른 이중특이적 항체의 세포 결합 활성을 보여주는 그래프이다.
도 19는 일 실시양태에 따른 이중특이적 항체의 T 세포 활성화를 보여주는 그래프이다.
도 20은 HL-60에서 일 실시양태에 따른 이중특이적 항체의 T 세포 활성화 및 세포 용해 활성을 보여주는 그래프이다.
도 21은 U937에서 일 실시양태에 따른 이중특이적 항체의 T 세포 활성화 및 세포 용해 활성을 보여주는 그래프이다.
도 22는 일 실시양태에 따른 이중특이적 항체의 항원-의존적 세포 용해 활성을 보여주는 그래프이다.
도 23은 U937 이종이식 모델 (U937 xenograft model)에서 일 실시양태에 따른 이중특이적 항체의 인 비보 효능 (in vivo efficacy)을 보여주는 그래프이다.
도 24는 HL60-Lu 동소 AML 모델 (HL60-Lu orthotopic AML model)에서 일 실시양태에 따른 이중특이적 항체 투여에서의 BLI (Bioluminescence index)를 보여주는 이미지이다.
도 25는 HL60-Lu 동소 AML 모델에서 일 실시양태에 따른 이중특이적 항체 투여에서의 BLI의 정량 분석 결과를 보여주는 그래프이다 (통계 분석: Two-way ANOVA (Bonferroni's multiple comparisons test), *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001).
도 26은 HL60-Lu 동소 AML 모델에서 일 실시양태에 따른 이중특이적 항체 투여에서의 BLI (Bioluminescence index)를 보여주는 이미지이다.
도 27은 HL60-Lu 동소 AML 모델에서 일 실시양태에 따른 이중특이적 항체 투여에서의 BLI의 정량 분석을 보여주는 그래프이다 (***= P < 0.005).
도 28은 일 실시양태에 따른 이중특이적 항체 투여 후에 골수내 종양 세포를 FACS로 측정한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 29는 일 실시양태에 따른 이중특이적 항체 투여 후에 골수내 종양 세포를 IHC 염색으로 측정한 결과를 보여주는 이미지이다.
도 30은 AML 모세포 (AML blasts)에서 일 실시양태에 따른 이중특이적 항체의 세포 용해 활성을 보여주는 그래프이다.
도 31은 AML 모세포에서 일 실시양태에 따른 이중특이적 항체의 T 세포 활성화의 활성을 보여주는 그래프이다.
정의
달리 정의하지 않는 한, 본원에서 사용된 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 일반적으로 사용되는 의미와 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서를 해석할 목적으로, 하기 정의가 적용될 것이며, 적절한 경우 단수로 사용된 용어는 또한 복수를 포함할 것이며, 그 반대의 경우도 마찬가지이다.
본원에서 용어 "항체 (antibody)"는 가장 넓은 의미로 사용되며, 목적하는 항원-결합 활성을 나타내는 한, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 단일특이적 및 다중특이적 항체 (예: 이중특이적 항체), 및 항체 단편을 포함하지만 이에 한정되지 않는 다양한 항체 구조를 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "모노클로날 항체 (monoclonal antibody)"는 실질적으로 동종인 항체 집단으로부터 수득된 항체를 지칭하며, 즉 해당 집단을 포함하는 개별 항체들은 동일하고 및/또는 동일한 에피토프에 결합하며, 단 가능한 변이 항체는 자연 발생 돌연변이를 함유하거나 또는 모노클로날 항체 제제의 생산 중에 발생하는 것을 포함하며, 이러한 변이는 일반적으로 소량으로 존재한다. 전형적으로 상이한 결정기 (에피토프)에 대한 서로 다른 항체를 포함하는 폴리클로날 항체 제제와 달리, 모노클로날 항체 제제의 각 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정기에 대해 작용한다.
본원에서 사용된 용어 "단일특이적 (monospecific)" 항체는 하나 이상의 결합 부위를 갖는 항체를 의미하며, 이들 각각은 동일한 항원의 동일한 에피토프에 결합한다. 용어 "이중특이적 (bispecific)"은 항체가 적어도 2개의 구별되는 항원 결정기에 특이적으로 결합할 수 있는 것을 의미하며, 예를 들어 항체 중쇄 가변 도메인 (VH) 및 항체 경쇄 가변 도메인 (VL)의 쌍에 의해 각각 형성된 2개의 결합 부위가 상이한 항원 또는 동일한 항원 상의 상이한 에피토프에 결합한다. 이러한 이중특이적 항체는 1+1 형식이다. 다른 이중특이적 항체 형식은 2+1 또는 1+2 형식 (제1 항원 또는 에피토프에 대한 2개의 결합 부위 및 제2 항원 또는 에피토프에 대한 1개의 결합 부위를 포함함) 또는 2+2 형식 (제1 항원 또는 에피토프에 대한 2개의 결합 부위 및 제2 항원 또는 에피토프에 대한 2개의 결합 부위를 포함함)이다. 전형적으로, 이중특이적 항체는 2개의 항원 결합 부위를 포함하며, 이들 각각은 서로 다른 항원 결정기에 대해 특이적이다.
본 출원 내에서 사용되는 용어 "결합가 (valent)"는 항체 또는 항체 단편에서 결합 도메인의 명시된 수의 존재를 나타낸다. 따라서, 용어 "1가 (monovalent)", "2가 (bivalent)", "4가 (tetravalent)", 및 "6가 (hexavalent)"는 항체에서 각각 1개의 결합 도메인, 2개의 결합 도메인, 4개의 결합 도메인, 및 6개의 결합 도메인의 존재를 나타낸다. 본 발명에 따른 이중특이적 항체는 적어도 "2가 (bivalent)"이고, "3가 (trivalent)" 또는 "다가 (multivalent)" (예를 들어, "4가 (tetravalent)" 또는 "6가 (hexavalent)")일 수 있다. 특정 일 양상에서, 본 발명의 항체는 2개 이상의 결합 부위를 갖고, 이중특이적이다. 즉, 항체는 2개 초과의 결합 부위가 존재하는 경우 (즉, 항체가 3가 또는 다가인 경우)에도 이중특이적일 수 있다.
용어 "전장 항체 (full length antibody)", "온전한 항체 (intact antibody)" 및 "전체 항체 (whole antibody)"는 천연 항체 구조와 실질적으로 유사한 구조를 갖는 항체를 지칭하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다. "천연 항체 (native antibodies)"는 다양한 구조를 갖는 자연 발생 면역글로불린 분자를 지칭한다. 예를 들어, 천연 IgG-클래스 항체는 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄가 디설파이드-결합된, 약 150,000 달톤 (daltons)의 이종사량체 당단백질 (heterotetrameric glycoproteins)이다. N-말단에서 C-말단까지, 각 중쇄는 가변 중쇄 도메인 또는 중쇄 가변 도메인으로 불리는 가변 영역 (variable region: VH), 그 다음에 중쇄 불변 영역으로 불리는 3개의 불변 도메인 (CH1, CH2 및 CH3)을 갖는다. 유사하게, N-말단에서 C-말단까지, 각 경쇄는 가변 경쇄 도메인 또는 경쇄 가변 도메인으로 불리는 가변 영역 (VL), 그 다음에 경쇄 불변 영역으로 불리는 경쇄 불변 도메인 (CL)을 갖는다. 항체의 중쇄는 α (IgA), δ (IgD), ε (IgE), γ (IgG), 또는 μ (IgM)로 불리는 5가지 타입 중 하나로 지정될 수 있으며, 이 중 일부는 서브타입, 예를 들어 γ1 (IgG1), γ2 (IgG2), γ3 (IgG3), γ4 (IgG4), α1 (IgA1) 및 α2 (IgA2)로 추가로 분류될 수 있다. 항체의 경쇄는 이의 불변 도메인의 아미노산 서열에 기반하여, 카파 (κ) 및 람다 (λ)로 불리는 2가지 타입 중 하나로 지정될 수 있다.
상기 나타낸 바와 같이, 가변 영역은 항체가 항원 상의 에피토프를 선택적으로 인식하고 이에 특이적으로 결합하도록 한다. 즉, 항체의 VL 도메인 및 VH 도메인, 또는 상보성 결정 영역 (CDR)의 서브세트를 조합하여 3차원 항원-결합 부위를 정의하는 가변 영역을 형성한다. 이러한 4차 항체 구조는 Y의 각 암 (arm)의 말단에 존재하는 항원-결합 부위를 형성한다. 보다 구체적으로, 항원-결합 부위는 각각의 VH 및 VL 사슬 상의 3개의 CDR에 의해 정의된다 (즉, CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3). 일부 경우에, 예를 들어 소정의 면역글로불린 분자는 낙타과 종 (camelid species)으로부터 유래되거나, 또는 낙타과 (camelid) 면역글로불린에 기반하여 조작된 경우, 완전 면역글로불린 분자는 경쇄 없이 중쇄 단독으로 구성될 수 있다. 예를 들어, Hamers-Casterman et al., Nature 363: 446-448 (1993)를 참조한다.
용어 "CDR-H", "HCDR" 및 "CDRH"는 CDR의 VH 사슬을 지칭하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다 (예를 들어, CDR-H1, HCDR1 및 CDRH1은 CDR의 VH1을 지칭한다). 용어 "CDR-L", "LCDR" 및 "CDRL"은 CDR의 VL 사슬을 지칭하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다 (예를 들어, CDR-L1, LCDR1 및 CDRL1은 CDR의 VL1을 지칭한다).
자연 발생 항체에서, 각 항원-결합 도메인에 존재하는 6개의 "상보성 결정 영역 (complementarity determining region)" 또는 "CDR"은 항체가 수성 환경에서 3차원 입체배열을 취하기 때문에 항원-결합 도메인을 형성하기 위해 특이적으로 위치하는, 짧은 비-인접한 아미노산 서열이다. "프레임워크 (framework)" 영역으로 지칭되는, 항원-결합 도메인에서 나머지 아미노산은 더 적은 분자간 변동성을 나타낸다. 프레임워크 영역은 주로 β-시트 입체배열 (β-sheet conformation)을 채택하고, CDR은 연결되는 루프를 형성하며, 일부 경우에는 β-시트 구조의 일부를 형성한다. 따라서, 프레임워크 영역은 사슬간, 비-공유 상호작용에 의해 정확한 배향으로 CDR을 위치시키는 스캐폴드 (scaffold)를 형성하는 작용을 한다. 위치된 CDR에 의해 형성된 항원-결합 도메인은 면역반응성 항원 상의 에피토프에 상보적인 표면을 정의한다. 이러한 상보적인 표면은 동족 에피토프에 대한 항체의 비-공유 결합을 촉진한다. 임의의 해당 중쇄 또는 경쇄 가변 영역에 대해 CDR 및 프레임워크 영역을 각각 포함하는 아미노산은 당업자에 의해 쉽게 식별할 수 있으며, 이들은 정확하게 정의되어 있기 때문이다 (www.bioinf.org.uk: Dr. Andrew C.R. Martin's Group; "Sequences of Proteins of Immunological Interest," Kabat, E., et al., U.S. Department of Health and Human Services, (1983); and Chothia and Lesk, J. MoI. Biol., 196: 901-917 (1987) 참조).
당해 기술 분야에서 사용되고 및/또는 허용되는 용어에 대해 2개 이상의 정의가 존재하는 경우에, 본원에서 사용된 용어의 정의가 명백하게 반대로 언급하지 않는 한 이러한 모든 의미를 포함하는 것으로 의도된다. 구체적인 예로는 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드 모두의 가변 영역 내에서 발견되는 비-인접 항원-결합 부위를 서술하기 위한 용어 "상보성 결정 영역" ("CDR")을 사용한다. 이러한 특정 영역은 Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983) 및 Chothia et al., J. MoI. Biol. 196: 901-917 (1987)에 서술하였고, 이의 전문은 본원에 참조로 통합된다. Kabat 및 Chothia에 따른 CDR 정의는 서로 비교하는 경우 아미노산 잔기의 중복 또는 서브세트를 포함한다. 그럼에도 불구하고, 항체 또는 이의 변이체의 CDR을 지칭하기 위한 정의의 적용은 본원에서 정의되고 사용되는 용어의 범위 내에 있는 것으로 의도된다. 상기 인용된 각 참조문헌에 의해 정의된 CDR을 포함하는 적절한 아미노산 잔기는 비교로서 하기 표 (표 1)에 제시한다. 특정 CDR을 포함하는 정확한 잔기 수는 CDR의 서열 및 크기에 따라 가변될 것이다. 당업자는 항체의 가변 영역 아미노산 서열을 고려하여 잔기가 특정 CDR을 포함하는지를 일상적으로 결정할 수 있다.
Kabat 등은 또한 임의의 항체에 적용할 수 있는 가변 도메인 서열에 대한 넘버링 시스템을 정의하였다. 당업자는 서열 자체를 넘어선 임의의 실험 데이터에 의존하지 않고, "Kabat 넘버링 (Kabat numbering)" 시스템을 임의의 가변 도메인 서열에 명확하게 배정할 수 있다. 본원에서 사용된, "Kabat 넘버링"은 Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest" (1983)에 제시된 넘버링 시스템을 지칭한다.
본원에 개시된 항체는 조류 (birds) 및 포유동물 (mammals)을 포함하는 임의의 동물 기원으로부터 유래될 수 있다. 바람직하게는, 항체는 인간, 뮤린 (murine), 당나귀, 토끼, 염소, 기니피그, 낙타, 라마, 말 또는 닭의 항체이다.
본원에서 사용된, 용어 "중쇄 불변 영역 (heavy chain constant region)"은 면역글로불린 중쇄로부터 유래된 아미노산 서열을 포함한다. 상기 제시된 바와 같이, 중쇄 불변 영역은 변형되어 자연 발생 면역글로불린 분자로부터의 아미노산 서열이 가변될 수 있다는 것을 당업자는 이해할 것이다.
본원에 개시된 항체의 중쇄 불변 영역은 상이한 면역글로불린 분자로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드의 중쇄 불변 영역은 IgG1 분자로부터 유래된 CH1 도메인 및 IgG3 분자로부터 유래된 힌지 영역 (hinge region)을 포함할 수 있다. 다른 예에서, 중쇄 불변 영역은 IgG1 분자로부터 일부 유래되고, IgG3 분자로부터 일부 유래되는 힌지 영역을 포함할 수 있다. 다른 예에서, 중쇄 부분은 IgG1 분자로부터 일부 유래되고, IgG4 분자로부터 일부 유래되는 키메라 힌지 (chimeric hinge)를 포함할 수 있다.
본원에서 사용된, 용어 "경쇄 불변 영역 (light chain constant region)"은 항체 경쇄로부터 유래된 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, 경쇄 불변 영역은 불변 카파 도메인 또는 불변 람다 도메인 중 적어도 하나를 포함한다.
"경쇄-중쇄 쌍 (light chain-heavy chain pair)"은 경쇄의 CL 도메인 및 중쇄의 CH1 도메인 간의 디설파이드 결합을 통해 이량체를 형성할 수 있는 경쇄 및 중쇄의 집합체 (collection)를 지칭한다.
"항체 단편 (antibody fragment)" 또는 "항원-결합 단편 (antigen-binding fragment)"은 온전한 항체 이외의 분자를 지칭하며, 이는 온전한 항체가 결합하는 항원에 결합하는 온전한 항체의 일부를 포함한다. 면역학적으로 기능성인 면역글로불린 단편에는 Fab, Fab', F(ab')2, xFab, scFab, dsFv, Fv, scFv, scFv-Fc, scFab-Fc, 디아바디, 미니바디, scAb, dAb, half-IgG 또는 이의 조합을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. Fab, Fab', F(ab')2, xFab 및 scFab에서 사용된 용어 "Fab"에는 전통적인 Fab 단편 및 PCT/CN2018/106766 (Wuxibody)에 기재된 키메라 Fab-유사 도메인을 포함할 수 있다. 또한, 이는 인간, 마우스, 래트, 낙타과 또는 토끼를 포함하지만 이에 한정되지 않는 임의의 포유동물로부터 유래될 수 있다. 항체의 기능적 부분 예컨대 본원에 기재된 하나 이상의 CDR은 2차 단백질 또는 소분자 화합물과 공유 결합에 의해 연결될 수 있으며, 이에 의해 특정 표적에 대한 표적 치료제로서 사용될 수 있다. 용어 "항체 단편 (antibody fragment)"은 압타머 (aptamers), 스피에겔머 (spiegelmers) 및 디아바디 (diabodies)를 포함한다. 용어 "항체 단편 (antibody fragment)"은 또한 특정 항원에 결합하여 복합체를 형성함으로써 항체와 같이 작용하는 임의의 합성 또는 유전자 조작된 단백질을 포함한다.
항체 단편은 본원에 기재된 바와 같이, 온전한 항체의 단백질분해 소화 (proteolytic digestion) 뿐만 아니라 재조합 숙주 세포 (예를 들어 대장균 (E. coli) 또는 파지 (phage))에 의한 생산을 포함하지만 이에 한정되지 않는 다양한 기술에 의해 제조될 수 있다.
온전한 항체의 파파인 소화 (Papain digestion)는 2개의 동일한 항원-결합 단편을 생성하며, 이는 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 및 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)을 함유하는 "Fab" 단편으로 불린다. 따라서, 본원에서 사용된, 용어 "Fab 단편 (Fab fragment)"은 경쇄의 VL 도메인 및 불변 도메인 (CL)을 포함하는 경쇄 단편, 및 중쇄의 VH 도메인 및 제1 불변 도메인 (CH1)을 포함하는 항체 단편을 지칭한다. Fab' 단편은 항체 힌지 영역으로부터 하나 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카복시 말단에 몇 개의 잔기를 추가한다는 점에서 Fab 단편과 상이하다. Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)가 유리 티올기를 갖는 Fab' 단편이다. 펩신 처리는 2개의 항원-결합 부위 (2개의 Fab 단편) 및 Fc 영역의 일부를 갖는 F(ab')2 단편을 생성한다. 본원에서, "F(ab')2 단편"은 전술한 바와 같이, 2개의 경쇄, 및 가변 영역, CH1 및 CH1과 CH2 도메인 사이의 불변 영역의 일부를 포함하는 2개의 중쇄를 포함하고, 이에 의해 2개의 중쇄 사이에 사슬내 디설파이드 결합 (intrachain disulfide bond)을 형성한다. 따라서, F(ab')2 단편은 2개의 Fab' 단편으로 구성되고, 2개의 Fab' 단편은 이들 간의 디설파이드 결합에 의해 서로 결합한다.
용어 "교차-Fab 단편 (cross-Fab fragment)" 또는 "xFab 단편 (xFab fragment)" 또는 "교차 Fab 단편 (crossover Fab fragment)"은 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 또는 불변 영역이 교환된 Fab 단편을 지칭한다. 교차 Fab 분자의 2가지 상이한 사슬 조성이 가능하며, 본 발명의 이중특이적 항체에 포함되고: 한편으로는 Fab 중쇄 및 경쇄의 가변 영역이 교환되며, 즉 교차 Fab 분자는 경쇄 가변 영역 (VL) 및 중쇄 불변 영역 (CH1)으로 구성된 펩티드 사슬, 및 중쇄 가변 영역 (VH) 및 경쇄 불변 영역 (CL)으로 구성된 펩티드 사슬을 포함한다. 이러한 교차 Fab 분자는 또한 CrossFab(VLVH)라고 한다. 반면, Fab 중쇄 및 경쇄의 불변 영역이 교환되는 경우, 교차 Fab 분자는 중쇄 가변 영역 (VH) 및 경쇄 불변 영역 (CL)으로 구성된 펩티드 사슬, 및 경쇄 가변 영역 (VL) 및 중쇄 불변 영역 (CH1)으로 구성된 펩티드 사슬을 포함한다. 이러한 교차 Fab 분자는 또한 CrossFab(CLCH1)이라고 한다.
"단일 사슬 Fab 단편 (single chain Fab fragment)" 또는 "scFab"는 항체 중쇄 가변 도메인 (VH), 항체 불변 도메인 1 (CH1), 항체 경쇄 가변 도메인 (VL), 항체 경쇄 불변 도메인 (CL) 및 링커로 구성된 폴리펩티드이고, 상기 항체 도메인 및 상기 링커는 N-말단에서 C-말단 방향으로 하기 순서: a) VH-CH1-링커-VL-CL, b) VL-CL-링커-VH-CH1, c) VH-CL-링커-VL-CH1 또는 d) VL-CH1-링커-VH-CL 중 하나를 가지며; 상기 링커는 적어도 30개의 아미노산, 바람직하게는 32 내지 50개의 아미노산을 갖는 폴리펩티드이다. 상기 단일 사슬 Fab 단편은 CL 도메인 및 CH1 도메인 사이의 천연 디설파이드 결합을 통해 안정화된다. 또한, 이들 단일 사슬 Fab 분자는 시스테인 잔기 (예를 들어, Kabat 넘버링에 따른 가변 중쇄에서 위치 44 및 가변 경쇄에서 위치 100)의 삽입을 통한 사슬간 디설파이드 결합의 생성에 의해 추가로 안정화될 수 있다.
"교차 단일 사슬 Fab 단편 (crossover single chain Fab fragment)" 또는 "x-scFab"는 항체 중쇄 가변 도메인 (VH), 항체 불변 도메인 1 (CH1), 항체 경쇄 가변 도메인 (VL), 항체 경쇄 불변 도메인 (CL) 및 링커로 구성된 폴리펩티드이고, 상기 항체 도메인 및 상기 링커는 N-말단에서 C-말단 방향으로 하기 순서: a) VH-CL-링커-VL-CH1 및 b) VL-CH1-링커-VH-CL 중 하나를 가지며; 상기 VH 및 VL은 함께 항원에 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인을 형성하고, 상기 링커는 적어도 30개의 아미노산을 갖는 폴리펩티드이다. 또한, 이들 x-scFab 분자는 시스테인 잔기 (예를 들어, Kabat 넘버링에 따른 가변 중쇄에서 위치 44 및 가변 경쇄에서 위치 100)의 삽입을 통한 사슬간 디설파이드 결합의 생성에 의해 추가로 안정화될 수 있다.
"Fv 영역 (Fv region)"은 중쇄 및 경쇄의 각 가변 영역을 포함하지만, 불변 영역은 포함하지 않는 항체이다. scFv는 Fv가 가요성 링커에 의해 연결된 것이다. scFv-Fc는 Fc가 scFv에 연결된 것이다. 미니바디 (minibody)는 CH3이 scFv에 연결된 것이다. 디아바디 (diabody)는 scFv의 2개의 분자를 포함한다. "단일-사슬 가변 단편 (single-chain variable fragment)" 또는 "scFv"는 면역글로불린의 중쇄 (VH) 및 경쇄 (VL)의 가변 영역의 융합 단백질을 지칭한다. 일부 양상에서, 상기 영역은 10 내지 약 25개의 아미노산을 갖는 짧은 링커 펩티드와 연결된다. 링커는 가요성을 위해 글리신이 풍부할 수 있고, 용해도를 위해 세린 또는 트레오닌이 풍부할 수 있으며, VH의 N-말단을 VL의 C-말단과 연결할 수 있거나, 또는 그 반대로 연결할 수 있다. 이러한 단백질은 불변 영역의 제거 및 링커의 도입에도 불구하고, 원래의 면역글로불린의 특이성을 유지한다. ScFv 분자는 당해 기술 분야에 알려져 있고, 예를 들어 미국 특허 제5,892,019호에 기재되어 있다.
"단쇄 항체 (short-chain antibody: scAb)"는 중쇄 및 경쇄 가변 영역이 가요성 링커에 의해 연결된 중쇄의 하나의 가변 영역 또는 경쇄 불변 영역을 포함하는 단일 폴리펩티드 사슬이다. 단쇄 항체는 예를 들어 미국 특허 제5,260,203호를 참조할 수 있으며, 이는 본원에 참조로 개시된다.
"도메인 항체 (domain antibody: dAb)"는 중쇄의 가변 영역 또는 경쇄의 가변 영역 만을 포함하는 면역학적으로 기능성인 면역글로불린 단편이다. 일 실시양태에서, 2개 이상의 VH 영역은 펩티드 링커에 의해 공유 결합으로 연결되어, 2가 도메인 항체를 형성한다. 이러한 2가 도메인 항체의 2개의 VH 영역은 동일하거나 또는 상이한 항원을 표적으로 할 수 있다.
본 발명에 따른 용어 "전장 IgG (full length IgG)"는 본질적으로 완전한 IgG를 포함하는 것으로 정의되지만, 이는 온전한 IgG의 모든 기능을 가질 필요는 없다. 의심의 여지를 없애기 위해, 전장 IgG에는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 함유한다. 각 사슬에는 불변 (C) 및 가변 (V) 영역을 함유하며, 이는 CH1, CH2, CH3, VH, 및 CL, VL로 지정된 도메인으로 나눌 수 있다. IgG 항체는 Fab 부분에 함유된 가변 영역 도메인을 통해 항원에 결합하고, 결합 후에 불변 도메인을 통해, 대부분 Fc 부분을 통해 면역계의 세포 및 분자와 상호작용할 수 있다. 용어 '가변 영역 도메인 (variable region domain)', '가변 영역 (variable region)', '가변 도메인 (variable domain)', 'VH/VL 쌍 (VH/VL pair)', 'VH/VL', 'Fab 부분 (Fab portion)', 'Fab 암 (Fab arm)', 'Fab' 또는 '암 (arm)'은 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 본 발명에 따른 전장 항체는 목적하는 특징을 제공하는 돌연변이가 존재할 수 있는 IgG 분자를 포함한다. 이러한 돌연변이는 임의의 영역의 상당 부분이 결실되어서는 안된다. 그러나, 생성된 IgG 분자의 결합 특성을 본질적으로 변경시키지 않고, 하나 또는 여러 개의 아미노산 잔기가 결실된 IgG 분자는 용어 "전장 IgG"에 포함된다. 예를 들어, 이러한 IgG 분자는 바람직하게는 비-CDR 영역에서 1 내지 10개의 아미노산 잔기가 하나 이상 결실될 수 있으며, 여기서 아미노산의 결실은 IgG의 결합 특이성에 필수적인 것은 아니다.
전장 IgG 항체는 이의 반감기가 유리하고, 면역원성을 위해 완전 자가 (인간) 분자에 최대한 가깝게 유지해야 하기 때문에 선호된다. 본 발명에 따르면, 이중특이적 IgG 항체가 사용된다. 바람직한 일 실시양태에서, 이중특이적 전장 IgG1 항체가 사용된다. IgG1은 인간에서 이의 순환 반감기가 긴 것에 기반하여 선호된다. 인간에서 임의의 면역원성을 방지하기 위해, 본 발명에 따른 이중특이적 IgG 항체는 인간 IgG1인 것이 바람직하다. 용어 '이중특이적 (bispecific)' (bs)은 항체의 하나의 암이 제1 항원에 결합하는 반면에, 제2 암은 제2 항원에 결합하는 것을 의미하며, 여기서 상기 제1 항원 및 제2 항원은 동일하지 않다. 본 발명에 따르면, 상기 제1 항원 및 제2 항원은 실제로 2가지 서로 다른 세포 타입에 위치하는 2가지 서로 다른 분자이다. 용어 '[항체의] 하나의 암'은 바람직하게는 전장 IgG 항체의 하나의 Fab 부분을 의미한다. 내인성 면역 세포를 동원하고 활성화하여 세포독성을 매개하는 이중특이적 항체는 대두되는 차세대 항체 치료제 부류이다. 이는 표적 세포 (즉, 종양 세포) 및 이펙터 세포 (즉, T 세포, NK 세포 및 대식세포)에 대한 항원 결합 특이성을 하나의 분자로 조합함으로써 달성될 수 있다 (Cui et al. JBC 2012 (287) 28206-28214; Kontermann, MABS 2012 (4) 182-197; Chames and Baty, MABS 2009 (1) 539-547; Moore et al. Blood 2011 (117) 4542-4551; Loffler et al. 2000 Blood 95:2098; Zeidler et al. 1999 J. Immunol. 163:1246). 본 발명에 따르면, 하나의 암이 이상 (종양) 세포 상의 CLL-1 항원에 결합하는 반면에, 제2 암은 면역 이펙터 세포 상의 항원에 결합하는 이중특이적 항체를 제공한다.
본원에서 사용된, 용어 "항원 결합 도메인 (antigen binding domain)" 또는 "항원-결합 부위 (antigen-binding site)"는 항원 결정기에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편의 부분을 지칭한다. 보다 구체적으로, 용어 "항원-결합 도메인"은 항원의 일부 또는 전부에 특이적으로 결합하고 이에 상보적인 영역을 포함하는 항체의 부분을 지칭한다. 항원이 큰 경우에, 항체 또는 항체 단편은 항원의 특정 부분에만 결합할 수 있으며, 이러한 부분을 에피토프 (epitope)라고 한다. 항원 결합 도메인은 예를 들어 하나 이상의 가변 도메인 (또한, 가변 영역이라고 함)에 의해 제공될 수 있다. 바람직하게는, 항원 결합 도메인은 항체 경쇄 가변 영역 (VL) 및 항체 중쇄 가변 영역 (VH)을 포함한다. 일 양상에서, 항원 결합 도메인은 이의 항원에 결합하여 그 기능을 차단하거나 또는 부분적으로 차단할 수 있다. CCL-1 또는 CD3에 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인에는 본원에 추가로 정의된 항체 및 이의 단편을 포함한다. 또한, 항원 결합 도메인은 스캐폴드 항원 결합 단백질, 예를 들어 디자인된 반복 단백질 또는 디자인된 반복 도메인에 기반하는 결합 도메인을 포함할 수 있다 (예를 들어 WO 2002/020565 참조).
본원에서 사용된, 용어 "항원 결정기 (antigenic determinant)"는 "항원 (antigen)" 및 "에피토프 (epitope)"와 동의어이며, 항원 결합 모이어티가 결합하여 항원 결합 모이어티-항원 복합체를 형성하는 폴리펩티드 거대분자 상의 부위 (예를 들어, 아미노산의 연속 스트레치 (contiguous stretch) 또는 비연속적인 아미노산의 상이한 영역으로 구성된 입체형태적 구성)를 지칭한다. 유용한 항원 결정기는 예를 들어 종양 세포의 표면, 바이러스-감염된 세포의 표면, 기타 이환된 세포의 표면, 면역 세포의 표면, 무혈청 혈액에서, 및/또는 세포외 기질 (extracellular matrix: ECM)에서 발견될 수 있다. 본원에서 항원으로서 유용한 단백질은 달리 명시하지 않는 한, 포유동물 예컨대 영장류 (예를 들어, 인간) 및 설치류 (예를 들어, 마우스 및 래트)를 포함하는 임의의 척추동물 공급원 유래의 임의의 천연 형태의 단백질일 수 있다. 특정 일 실시양태에서, 항원은 인간 단백질이다. 본원에서 특정 단백질을 언급하는 경우, 이러한 용어는 "전장", 처리되지 않은 단백질 뿐만 아니라, 세포에서 처리되어 생성되는 모든 형태의 단백질을 포함한다. 이러한 용어는 또한 단백질의 자연 발생 변이체, 예를 들어 스플라이스 변이체 또는 대립유전자 변이체를 포함한다.
"특이적 결합 (specific binding)"은 결합이 항원에 대해 선택적이고, 목적하지 않거나 또는 비-특이적 상호작용과 구분할 수 있음을 의미한다. 특정 항원에 결합하는 항체 또는 항체 단편의 능력은 효소-결합 면역흡착 분석 (enzyme-linked immunosorbent assay: ELISA) 또는 당업자에게 친숙한 다른 기술, 예를 들어 표면 플라스몬 공명 (Surface Plasmon Resonance: SPR) 기술 (BIAcore 기기에서 분석됨) (Liljeblad et al., Glyco J 17, 323-329 (2000)), 및 전통적인 결합 분석 (Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002))을 통해 측정할 수 있다.
"친화도 (affinity)" 또는 "결합 친화도 (binding affinity)"는 분자 (예: 항체) 및 이의 결합 파트너 (예: 항원)의 단일 결합 부위 사이의 비-공유 상호작용의 총합의 강도를 의미한다. 달리 명시하지 않는 한, 본원에서 사용된, "결합 친화도"는 결합 쌍의 구성원 (예를 들어, 항체 및 항원) 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 고유 결합 친화도를 지칭한다. 분자 X의 이의 파트너 Y에 대한 친화도는 일반적으로 해리 상수 (Kd)로 표시될 수 있으며, 이는 해리 속도 상수 및 결합 속도 상수 (각각 koff 및 kon)의 비율이다. 따라서, 동등한 친화도 (equivalent affinities)는 속도 상수들의 비율이 동일하게 유지되는 한, 서로 다른 속도 상수를 포함할 수 있다. 친화도는 본원에 기재된 방법을 포함하는, 당해 기술 분야에 알려진 일반적인 방법으로 측정할 수 있다. 친화도를 측정하는 특정 방법은 표면 플라즈몬 공명 (SPR)이다.
본원에서 사용된, 용어 항체의 "고친화도 (high affinity)"는 항체가 표적 항원에 대해 Kd를 10-9 M 이하, 더욱 구체적으로 10-10 M 이하로 갖는 것을 의미한다. 용어 항체의 "저친화도 (low affinity)"는 항체가 Kd를 10-8 이상으로 갖는 것을 의미한다.
"친화도 성숙 (affinity matured)" 항체는 항체의 항원에 대한 친화도를 개선하는 변경을 포함하지 않는 모체 항체와 비교하여, 하나 이상의 초가변 영역 (HVR)에서 이러한 변경을 하나 이상 갖는 항체를 지칭한다.
용어 "CLL-1 및 CD3에 특이적으로 결합하는 이중특이적 항체", "CLL-1 및 CD3에 특이적인 이중특이적 항체" 또는 "항-CLL-1/항-CD3 항체"는 본원에서 상호교환적으로 사용되며, CLL-1 및 CD3을 표적으로 하는 항체가 진단제 및/또는 치료제로서 유용할 수 있는 충분한 친화도로 CLL-1 및 CD3에 결합할 수 있는 이중특이적 항체를 지칭한다.
용어 "C-타입 렉틴-유사 분자-1 (C-type lectin-like molecule-1: CLL-1)"은 또한 MICL 또는 CLEC12A로 알려져 있고, 타입 II 막횡단 당단백질 및 면역 조절에 관여하는 C-타입 렉틴-유사 수용체의 큰 패밀리의 구성원이다. CLL-1은 이전에 골수-유래 세포로부터 확인되었다. CLL-1의 세포내 도메인에는 면역티로신-기반 억제 모티프 (immunotyrosine-based inhibition motif: ITIM) 및 YXXM 모티프를 함유한다. 다양한 세포에서 ITIM-함유 수용체의 인산화는 단백질 티로신 포스파타제 SHP-1, SHP-2 및 SHIP의 동원을 통한 활성화 경로의 억제를 초래한다. YXXM 모티프는 PI-3 키나제, 13의 p85 서브-유닛에 대한 잠재적인 SH2 도메인-결합 부위를 가지며, 이는 세포 활성화 경로에 관련되어 골수 세포에 대한 억제 및 활성화 분자로서 CLL-1의 잠재적인 이중 역할을 나타낸다. 실제로, CLL-1의 SHP-1 및 SHP-2와의 결합은 형질감염된 골수-유래 세포주에서 실험적으로 입증되었다.
조혈 세포에서 CLL-1의 발현 패턴은 제한된다. 이는 구체적으로 말초 혈액 및 골수로부터 유래한 골수 세포 뿐만 아니라, 대부분의 AML 모세포에서 발견된다. 최근 연구에 따르면, CLL-1은 또한 AML에서 CD34+/CD38- 구획에 있는 대부분의 백혈병 줄기세포에는 존재하지만, 정상 및 재생 골수 대조군에서 CD34+/CD38- 세포에는 부재하며, 이는 정상 세포 및 백혈병 줄기세포를 구분하는데 도움이 되는 것으로 나타났다. (예를 들어, Zhao et al., Haematologica 95:71-78 (2010); Bakker et al., Cancer Res. 64:8443-8450 (2004) 참조). 많은 종에 대한 CLL-1의 뉴클레오티드 및 단백질 서열이 알려져 있다. 예를 들어, 인간 서열은 Genbank accession number AF247788.1 및 Uniprot accession number Q5QGZ9로 찾을 수 있다.
용어 "항-CCL-1 항체", "CCL-1에 결합하는 항체" 및 "CCL-1에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하는 항체"는 CCL-1을 표적으로 하는 항체가 진단제 및/또는 치료제로서 유용할 수 있는 충분한 친화도로 CCL-1, 특히 세포 표면에서 발현된 CCL-1 폴리펩티드에 결합할 수 있는 항체를 지칭한다. 일 양상에서, 항-CCL-1 항체의 비-관련 비-CCL-1 단백질에 대한 결합 정도는, 예를 들어 방사성면역분석 (RIA) 또는 유세포 분석 (FACS) 또는 Biacore 시스템과 같은 바이오센서 시스템을 사용하는 표면 플라스몬 공명 분석에 의한 측정 시에, 항체의 CCL-1에 대한 결합의 약 10% 미만이다. 소정의 양상에서, 인간 CCL-1에 결합하는 항원 결합 단백질은 인간 PD1에의 결합에 대한 결합 친화도의 KD 값이 ≤1 μM, ≤100 nM, ≤10 nM, ≤1 nM, ≤0.1 nM, ≤0.01 nM, 또는 ≤0.001 nM (예를 들어, 10-8　M 이하, 예를 들어 10-8　M 내지 10-13　M, 예를 들어 10-9　M 내지 10-13　M)이다. 용어 "항-CCL-1 항체"는 또한 CCL-1 및 상이한 항원에 결합할 수 있는 이중특이적 항체를 포함한다.
용어 "CLL-1" 및 "CLL1"은 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
본원에서 사용된 용어 "면역 이펙터 세포 (immune effector cell)" 또는 "이펙터 세포 (effector cell)"는 포유동물 면역계 세포의 자연적인 레퍼토리 내에 있는 세포로서, 활성화되면 표적 세포의 생존력에 영향을 미칠 수 있는 세포를 지칭한다. 면역 이펙터 세포로는 림프계 (lymphoid lineage) 세포 예컨대 자연 살해 (NK) 세포, 세포독성 T 세포를 포함하는 T 세포, 또는 B 세포를 포함할 뿐만 아니라, 골수계 (myeloid lineage) 세포 예컨대 단핵구 또는 대식세포, 수지상 세포 및 호중구성 과립구가 면역 이펙터 세포로서 간주될 수 있다. 그러므로, 상기 이펙터 세포는 바람직하게는 NK 세포, T 세포, B 세포, 단핵구, 대식세포, 수지상 세포 또는 호중구성 과립구이다. 본 발명에 따르면, 이펙터 세포를 이상 세포로 동원한다는 것은 면역 이펙터 세포를 이상 표적 세포에 가깝게 위치시켜서 이펙터 세포가 동원된 이상 세포를 직접 사멸하거나, 또는 간접적으로 사멸을 개시할 수 있음을 의미한다. 비특이적 상호작용을 피하기 위해, 본 발명의 이중특이적 항체는 이들 면역 이펙터 세포에 의해 적어도 과발현되는 면역 이펙터 세포 상의 항원을 신체의 다른 세포에 비해 특이적으로 인식하는 것이 바람직하다. 면역 이펙터 세포에 존재하는 표적 항원은 CD3, CD16, CD25, CD28, CD64, CD89, NKG2D 및 NKp46을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 면역 이펙터 세포 상의 항원은 T 세포에서 발현되는 CD3, 또는 이의 기능적 등가물 (기능적 등가물은 T-세포 상에 유사하게 분포하고 유사한 기능 (종류와 관련된 것으로, 양과 관련된 것은 필수적이지 않음)을 갖는 CD3-유사 분자일 수 있음)이다. 본원에서 사용된, 용어 "CD3"은 또한 CD3의 기능적 등가물을 포함한다. 면역 이펙터 세포에서 가장 바람직한 항원은 CD3ε 사슬이다. 이 항원은 T 세포를 이상 세포로 동원하는데 매우 효과적인 것으로 나타났다. 그러므로, 본 발명에 따른 이중특이적 IgG 항체는 바람직하게는 CD3ε을 특이적으로 인식하는 하나의 암을 함유한다.
용어 "CD3"은 달리 명시하지 않는 한, 포유동물 예컨대 영장류 (예를 들어, 인간), 비-인간 영장류 (예를 들어, 시노몰구스 원숭이) 및 설치류 (예를 들어, 마우스 및 래트)를 포함하는, 임의의 척추동물 공급원으로부터 유래된 임의의 천연 CD3을 지칭한다. 상기 용어는 "전장"의 처리되지 않은 CD3 뿐만 아니라, 세포에서 처리로 인해 발생하는 모든 형태의 CD3을 포함한다. 상기 용어는 또한 CD3의 자연 발생 변이체, 예를 들어 스플라이스 변이체 또는 대립유전자 변이체를 포함한다. 일 실시양태에서, CD3은 인간 CD3, 구체적으로 인간 CD3의 엡실론 서브-유닛 (CD3ε)이다. 인간 CD3ε의 아미노산 서열은 UniProt (www.uniprot.org) accession no. P07766 (version 189), 또는 NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov/) RefSeq NP_000724.1로 제시된다. 시노몰구스 [Macaca fascicularis] CD3ε의 아미노산 서열은 NCBI GenBank no. BAB71849.1로 제시된다.
용어 "항-CD3 항체", "CD3에 결합하는 항체" 및 "CD3에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하는 항체"는 CD3을 표적으로 하는 항체가 진단제 및/또는 치료제로서 유용할 수 있는 충분한 친화도로 CD3에 결합할 수 있는 항체를 의미한다. 일 양상에서, 항-CD3 항체의 비-관련된 비-CD3 단백질에 대한 결합 정도는 예를 들어 방사성면역분석 (RIA)에 의한 측정 시에, 항체의 CD3에 대한 결합의 약 10% 미만이다. 소정의 실시양태에서, CD3에 결합하는 항체는 해리 상수 (Kd)가 ≤1 μM, ≤100 nM, ≤10 nM, ≤1 nM, ≤0.1 nM, ≤0.01 nM, 또는 ≤0.001 nM (예를 들어, 10-8　M 이하, 예를 들어 10-8　M 내지 10-13　M, 예를 들어 10-9　M 내지 10-13　M)이다. 소정의 양상에서, 항-CD3 항체는 서로 다른 종 유래의 CD3 중에서 보존된 CD3의 에피토프에 결합한다. 용어 "항-CD3 항체"는 또한 CD3 및 다른 항원에 결합할 수 있는 이중특이적 항체를 포함한다.
용어 "마우스 (mouse)" 항체는 프레임워크 및 CDR 영역 모두가 마우스 생식세포 계열 면역글로불린 서열로부터 유래되는 가변 영역을 갖는 항체를 포함하는 것으로 의도된다. 더욱이, 항체가 불변 영역을 함유하는 경우, 불변 영역은 또한 마우스 생식세포 계열 면역글로불린 서열로부터 유래된다. 본 개시내용의 마우스 항체는 마우스 생식세포 계열 면역글로불린 서열에 의해 코딩되지 않은 아미노산 잔기 (예를 들어, 인 비트로 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이 유발에 의해 또는 인 비보 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다.
용어 "키메라 (chimeric)" 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 공급원 또는 종으로부터 유래되고, 나머지 중쇄 및/또는 경쇄가 상이한 공급원 또는 종으로부터 유래되는 항체를 지칭한다.
항체의 "클래스 (class)"는 항체의 중쇄가 보유하는 불변 도메인 또는 불변 영역의 타입을 지칭한다. 항체에는 IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM의 5가지 주요 클래스가 있으며, 이들 중 일부는 서브클래스 (이소타입), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2로 추가로 분류될 수 있다. 면역글로불린의 다양한 클래스에 해당하는 중쇄 불변 도메인을 각각 α, δ, ε, γ 및 μ라고 한다.
"인간화 (humanized)" 항체는 비-인간 HVR 유래의 아미노산 잔기 및 인간 FR 유래의 아미노산 잔기를 포함하는 키메라 항체를 지칭한다. 소정의 실시양태에서, 인간화 항체는 적어도 1개, 전형적으로 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이며, 여기서 HVR (예를 들어, CDR)의 전부 또는 실질적으로 전부는 비-인간 항체의 HVR에 해당하고, FR의 전부 또는 실질적으로 전부는 인간 항체의 FR에 해당한다.
인간화 항체는 선택적으로 인간 항체로부터 유래된 항체 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 항체, 예를 들어 비-인간 항체의 "인간화 형태 (humanized form)"는 인간화를 수행한 항체를 지칭한다. 본 발명에 포함되는 "인간화 항체 (humanized antibodies)"의 다른 형태는 본 발명에 따른 특성을 생성하기 위해, 특히 C1q 결합 및/또는 Fc 수용체 (FcR) 결합과 관련하여, 불변 영역이 원래 항체의 불변 영역으로부터 추가로 변형 또는 변경된 것이다.
"인간 (human)" 항체는 인간 또는 인간 세포에 의해 생산되거나 또는 인간 항체 레퍼토리 또는 다른 인간 항체-코딩 서열을 활용하는 비-인간 공급원으로부터 유래된 항체의 아미노산 서열에 해당하는 아미노산 서열을 보유하는 항체이다. 인간 항체의 이러한 정의는 특히 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화 항체를 제외한다.
본원에서 용어 "Fc 도메인" 또는 "Fc 영역"은 불변 영역의 적어도 일부를 함유하는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하는데 사용된다. 상기 용어에는 천연 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함한다. IgG 중쇄의 Fc 영역의 경계는 약간 가변될 수 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 일반적으로 Cys226 또는 Pro230으로부터, 중쇄의 카복실-말단까지 정의가 확장된다. 그러나, 숙주 세포가 생산한 항체는 중쇄의 C-말단으로부터 하나 이상, 특히 하나 또는 2개의 아미노산의 번역 후 절단을 수행할 수 있다. 그러므로, 숙주 세포가 전장 중쇄를 코딩하는 특정 핵산 분자의 발현에 의해 생성하는 항체는 전장 중쇄를 포함할 수 있거나, 또는 전장 중쇄의 절단된 변이체 (또한 본원에서는 "절단된 변이체 중쇄"로서 지칭됨)를 포함할 수 있다. 이는 중쇄의 마지막 2개의 C-말단 아미노산이 글리신 (G446) 및 리신 (K447, Kabat EU index에 따른 넘버링)인 경우일 수 있다. 그러므로, Fc 영역의 C-말단 리신 (Lys447), 또는 C-말단 글리신 (Gly446) 및 리신 (K447)이 존재할 수 있거나, 또는 존재하지 않을 수 있다. Fc 도메인 (또는 본원에 정의된 Fc 도메인의 서브-유닛)을 포함하는 중쇄의 아미노산 서열은 달리 명시하지 않는 한 C-말단 글리신-리신 디펩티드 없이 본원에서 표시된다. 본 발명의 일 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체 또는 이중특이적 항체에 포함된, 본원에 명시된 Fc 도메인의 서브-유닛을 포함하는 중쇄는 추가의 C-말단 글리신-리신 디펩티드 (G446 및 K447, Kabat EU index에 따른 넘버링)를 포함한다. 본 발명의 일 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체 또는 이중특이적 항체에 포함된, 본원에 명시된 Fc 도메인의 서브-유닛을 포함하는 중쇄는 추가의 C-말단 글리신 잔기 (G446, Kabat EU index에 따른 넘버링)를 포함한다. 본 발명의 조성물, 예컨대 본원에 기재된 약학 조성물은 본 발명의 항체 또는 이중특이적 항체의 집단을 포함한다. 항체 또는 이중특이적 항체의 집단은 전장 중쇄를 갖는 분자 및 절단된 변이체 중쇄를 갖는 분자를 포함할 수 있다. 항체 또는 이중특이적 항체의 집단은 전장 중쇄를 갖는 분자 및 절단된 변이체 중쇄를 갖는 분자의 혼합물로 구성될 수 있으며, 여기서 항체 또는 이중특이적 항체의 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80% 또는 적어도 90%는 절단된 변이체 중쇄를 갖는다. 본 발명의 일 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 이중특이적 항체의 집단을 포함하는 조성물은 추가의 C-말단 글리신-리신 디펩티드 (G446 및 K447, Kabat EU index에 따른 넘버링)와 본원에 명시된 Fc 도메인의 서브-유닛을 포함하는 중쇄를 포함하는 항체 또는 이중특이적 항체를 포함한다. 본 발명의 일 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 이중특이적 항체의 집단을 포함하는 조성물은 추가의 C-말단 글리신 잔기 (G446, Kabat EU index에 따른 넘버링)와 본원에 명시된 Fc 도메인의 서브-유닛을 포함하는 중쇄를 포함하는 항체 또는 이중특이적 항체를 포함한다. 본 발명의 일 실시양태에서, 이러한 조성물은 본원에 명시된 Fc 도메인의 서브-유닛을 포함하는 중쇄를 포함하는 분자; 추가의 C-말단 글리신 잔기 (G446, Kabat EU index에 따른 넘버링)와 본원에 명시된 Fc 도메인의 서브-유닛을 포함하는 중쇄를 포함하는 분자; 및 추가의 C-말단 글리신-리신 디펩티드 (G446 및 K447, Kabat EU index에 따른 넘버링)와 본원에 명시된 Fc 도메인의 서브-유닛을 포함하는 중쇄를 포함하는 분자를 포함하는 항체 또는 이중특이적 항체의 집단을 포함한다. 본원에서 달리 명시하지 않는 한, Fc 영역 또는 불변 영역에서 아미노산 잔기의 넘버링은 EU 넘버링 시스템 (또한, EU index로 불림)에 따르며, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991에 기재된 바와 같다 (또한, 상기 참조). 본원에서 사용된 Fc 도메인의 "서브-유닛 (sub-unit)"은 이량체 Fc 도메인을 형성하는 2개의 폴리펩티드 중 하나, 즉 안정한 자가-결합이 가능한 면역글로불린 중쇄의 C-말단 불변 영역을 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. 예를 들어, IgG Fc 도메인의 서브-유닛은 IgG CH2 및 IgG CH3 불변 도메인을 포함한다.
"Fc 도메인의 제1 및 제2 서브-유닛의 결합을 촉진하는 변형"은 펩티드 백본의 조작 또는 Fc 도메인 서브-유닛의 번역 후 변형으로, 이는 Fc 도메인 서브-유닛을 포함하는 폴리펩티드와 동일한 폴리펩티드가 결합하여 동종이량체를 형성하는 것을 감소 또는 방지한다. 본원에서 사용된 결합을 촉진하는 변형은 특히 결합하고자 하는 2개의 Fc 도메인 서브-유닛 (즉, Fc 도메인의 제1 및 제2 서브-유닛) 각각에 대한 별개의 변형을 포함하며, 여기서 변형은 서로 상보적이므로 2개의 Fc 도메인 서브-유닛의 결합을 촉진한다. 예를 들어, 결합을 촉진하는 변형은 Fc 도메인 서브-유닛 중 하나 또는 둘 다의 구조 또는 전하를 변경하여 각각 입체적으로 또는 정전기적으로 유리한 결합을 만들 수 있다. 따라서, (이종)이량체화는 제1 Fc 도메인 서브-유닛을 포함하는 폴리펩티드 및 제2 Fc 도메인 서브-유닛을 포함하는 폴리펩티드 사이에서 일어나며, 이는 추가 성분이 각 서브-유닛 (예를 들어, 항원 결합 모이어티)에 융합된다는 점에서 동일하지 않을 수 있다. 일부 실시양태에서, 결합을 촉진하는 변형은 Fc 도메인의 아미노산 돌연변이, 구체적으로 아미노산 치환을 포함한다. 특정 일 실시양태에서, 결합을 촉진하는 변형은 Fc 도메인의 2개의 서브-유닛 각각에 별도의 아미노산 돌연변이, 구체적으로 아미노산 치환을 포함한다.
용어 "펩티드 링커 (peptide linker)"는 하나 이상의 아미노산, 전형적으로 약 2 내지 20개의 아미노산을 포함하는 펩티드를 지칭한다. 펩티드 링커는 당해 기술 분야에 알려져 있거나, 또는 본원에 기재되어 있다. 적합한 비-면역원성 링커 펩티드는 예를 들어 (G4S)n, (SG4)n　또는 G4(SG4)n　펩티드 링커이며, 여기서 "n"은 일반적으로 1 내지 10, 전형적으로 2 내지 4의 수, 구체적으로 2이고, 즉 상기 펩티드는 GGGGS (서열 번호: 58) GGGGSGGGGS (서열 번호: 59), SGGGGSGGGG (서열 번호: 60) 및 GGGGSGGGGSGGGG (서열 번호: 61)로 구성된 그룹으로부터 선택되고, 또한 서열 GSPGSSSSGS (서열 번호: 62), GGGGSGGGGSGGGGS　(서열 번호: 63), GSGSGSGS (서열 번호: 64), GSGSGNGS (서열 번호: 65), GGSGSGSG (서열 번호: 66), GGSGSG (서열 번호: 67), GGSG (서열 번호: 68), GGSGNGSG (서열 번호: 69), GGNGSGSG (서열 번호: 70) 및 GGNGSG (서열 번호: 71)를 포함한다.
용어 "이펙터 기능 (effector functions)"은 항체 이소타입에 따라 가변되는 항체의 Fc 영역에 기인하는 생물학적 활성을 의미한다. 항체 이펙터 기능의 예로는 C1q 결합 및 보체 의존적 세포독성 (complement dependent cytotoxicity: CDC), Fc 수용체 결합, 항체-의존적 세포-매개 세포독성 (antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity: ADCC), 항체-의존적 세포 포식작용 (antibody-dependent cellular phagocytosis: ADCP), 사이토카인 분비, 항원 제시 세포에 의한 면역 복합체-매개 항원 흡수, 세포 표면 수용체 (예를 들어, B 세포 수용체)의 하향 조절, 및 B 세포 활성화를 포함한다.
본원에서 사용된, 용어 "조작하다, 조작된, 조작하는"은 펩티드 백본의 임의의 조작 또는 자연 발생 또는 재조합 폴리펩티드 또는 이의 단편의 번역 후 변형을 포함하는 것으로 간주된다. 조작 (engineering)에는 아미노산 서열, 글리코실화 패턴, 또는 개별 아미노산의 측쇄 기의 변형뿐만 아니라, 이러한 접근법의 조합을 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "아미노산 돌연변이 (amino acid mutation)"는 아미노산의 치환, 결실, 삽입 및 변형을 포함하는 것을 의미한다. 치환, 결실, 삽입 및 변형의 임의의 조합을 통해 최종 구조체에 도달할 수 있으며, 단 최종 구조체는 목적하는 특성, 예를 들어 Fc 수용체에 대한 결합 감소 또는 다른 펩티드와의 결합 증가를 포함해야 한다. 아미노산 서열의 결실 및 삽입에는 아미노- 및/또는 카복시-말단의 결실 및 아미노산의 삽입을 포함한다. 특정 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환이다. 예를 들어, Fc 영역의 결합 특성을 변경하려는 목적으로, 비-보존적 아미노산 치환, 즉 하나의 아미노산을 구조적 및/또는 화학적 특성이 상이한 다른 아미노산으로 대체하는 것이 특히 바람직하다. 아미노산 치환에는 비-자연 발생 아미노산 또는 20개의 표준 아미노산의 자연 발생 아미노산 유도체 (예: 4-하이드록시프롤린, 3-메틸히스티딘, 오르니틴, 호모세린, 5-하이드록시리신)에 의한 대체를 포함한다. 아미노산 돌연변이는 당해 기술 분야에 잘 알려진 유전적 또는 화학적 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 유전적 방법에는 부위-지정 돌연변이 유발, PCR, 유전자 합성 등을 포함할 수 있다. 유전자 조작 이외의 방법 예컨대 화학적 변형에 의해 아미노산의 측쇄 기를 변경하는 방법이 또한 유용할 수 있다고 사료된다. 동일한 아미노산 돌연변이를 나타내기 위해 다양한 지정 (designations)이 본원에서 사용될 수 있다. 예를 들어, Fc 도메인의 위치 329에서의 프롤린으로부터 글리신까지의 치환은 329G, G329, G329, P329G, 또는 Pro329Gly로 표시될 수 있다.
참조 폴리펩티드 서열에 대한 "퍼센트 (%) 아미노산 서열 동일성"은 서열들을 정렬하고, 필요한 경우 최대 서열 동일성 퍼센트를 달성하기 위해 갭 (gaps)을 도입한 후에, 서열 동일성의 일부로서 보존적 치환을 고려하지 않고, 후보 서열에서의 아미노산 잔기가 참조 폴리펩티드 서열에서의 아미노산 잔기와 동일한 퍼센트로 정의된다. 퍼센트 아미노산 서열 동일성을 결정하기 위한 정렬은 당해 기술 분야 내에 있는 다양한 방식으로, 예를 들어 공개적으로 이용 가능한 컴퓨터 소프트웨어 예컨대 BLAST, BLAST-2, Clustal W, Megalign (DNASTAR) 소프트웨어 또는 FASTA 프로그램 패키지를 사용하여 달성할 수 있다. 당업자는 비교되는 서열들의 전체 길이에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여, 서열들을 정렬하기 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 그러나, 본원의 목적을 위해, % 아미노산 서열 동일성 값은 BLOSUM50 비교 매트릭스와 함께, FASTA 패키지 버전 36.3.8c 또는 이후 버전의 ggsearch 프로그램을 사용하여 생성된다. FASTA 프로그램 패키지는 W. R. Pearson and D. J. Lipman (1988), "Improved Tools for Biological Sequence Analysis", PNAS 85:2444-2448; W. R. Pearson (1996) "Effective protein sequence comparison" Meth. Enzymol. 266:227-258; 및 Pearson et. al. (1997) Genomics 46:24-36에 기재되어 있으며, http://fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/fasta_down.shtml에서 공개적으로 이용 가능하다. 대안적으로, http://fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/index.cgi에서 액세스할 수 있는 공개 서버를 사용하여 서열들을 비교할 수 있으며, 로컬 정렬이 아닌 글로벌 정렬이 수행되도록 ggsearch (global protein:protein) 프로그램 및 디폴트 옵션 (BLOSUM50; open: -10; ext: -2; Ktup=2)을 사용할 수 있다. 아미노산 동일성 퍼센트 (%)는 출력 정렬 헤더 (output alignment header)에 제공된다.
"면역접합체 (immunoconjugate)"는 세포독성제를 포함하지만 이에 한정되지 않는, 하나 이상의 이종 분자(들)에 접합된 항체이다.
본원에서 사용된, 용어 "폴리펩티드 (polypeptide)"는 단수의 "폴리펩티드" 뿐만 아니라 복수의 "폴리펩티드들"을 포함하는 것으로 의도되고, 아미드 결합 (또한, 펩티드 결합으로 알려져 있음)에 의해 선형으로 연결된 단량체 (아미노산)를 포함하는 분자를 지칭한다. 용어 "폴리펩티드"는 2 이상의 아미노산의 임의의 사슬 또는 사슬들을 지칭하며, 특정 길이의 생성물을 지칭하는 것은 아니다. 따라서, 펩티드, 디펩티드, 트리펩티드, 올리고펩티드, "단백질", "아미노산 사슬", 또는 2 이상의 아미노산의 사슬 또는 사슬들을 지칭하는데 사용된 임의의 다른 용어는 "폴리펩티드"의 정의 내에 포함되고, 용어 "폴리펩티드"는 이들 용어 중 어느 것 대신에, 또는 이와 상호교환적으로 사용될 수 있다. 용어 "폴리펩티드"는 또한 글리코실화, 아세틸화, 인산화, 아미드화, 알려진 보호기/차단기에 의한 유도체화, 단백질분해 절단, 또는 비-자연 발생 아미노산에 의한 변형을 포함하지만 이에 한정되지 않는, 폴리펩티드의 발현 후 변형의 생성물을 지칭하는 것으로 의도된다. 폴리펩티드는 천연 생물학적 공급원으로부터 유래되거나 또는 재조합 기술에 의해 생성될 수 있지만, 반드시 지정된 핵산 서열로부터 번역되는 것은 아니다. 이는 화학적 합성을 포함하는, 임의의 방식으로 생성될 수 있다. 용어 "폴리펩티드"는 또한 폴리펩티드의 변이체 및 폴리펩티드의 유도체를 포함한다. 더욱이, "폴리펩티드 단편 (polypeptide fragment)"은 전체-길이의 단백질과 비교하여, 아미노 말단의 아미노산 서열의 결실, 카복실 말단의 아미노산 서열의 결실 및/또는 내부 결실을 갖는 폴리펩티드를 의미한다. 이러한 단편은 또한 전체-길이의 단백질과 비교하여 변형된 아미노산을 포함할 수 있다. 일 실시양태에서, 상기 단편은 약 5 내지 900개의 아미노산 길이, 예를 들어 적어도 5, 6, 8, 10, 14, 20, 50, 70, 100, 110, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850개 또는 초과의 아미노산 길이일 수 있다. 본 발명의 목적을 고려하여, 유용한 폴리펩티드 단편은 항원-결합 도메인을 포함하는 항체의 면역학적으로 기능성인 단편을 포함한다. CLL-1 또는 CD3 결합 항체의 경우, 이러한 유용한 단편은 1, 2 또는 3개의 중쇄 또는 경쇄를 포함하는 CDR 서열, 또는 중쇄 또는 경쇄의 가변 영역 또는 불변 영역을 포함하는 항체 사슬의 전부 또는 일부를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
본원에서 사용된, 폴리펩티드의 "변이체 (variant)" 가령 예를 들어 항원-결합 단편, 단백질 또는 항체는 하나 이상의 아미노산 잔기가 다른 폴리펩티드 서열과 비교하여 삽입, 결실, 부가 및/또는 치환된 폴리펩티드이며, 융합 폴리펩티드를 포함한다. 또한, 단백질 변이체는 단백질 효소 절단, 인산화 또는 다른 번역 후 변형에 의해 변형되지만, 본원에 개시된 항체의 생물학적 활성, 예를 들어 CLL-1에 대한 특이적 결합 및 생물학적 활성을 유지하는 것을 포함한다. 변이체는 본원에 개시된 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 서열에 대해 약 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 82%, 81%, 또는 80% 동일할 수 있다.
본원에서 사용된, 폴리펩티드의 "유도체 (derivative)"라는 용어는 다른 화학적 모이어티와의 접합을 통해 화학적으로 변형된 폴리펩티드를 의미하며, 이는 삽입, 결실, 부가 또는 치환된 변이체와는 상이하다.
본원에서 사용된, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드에 관련된 용어 "재조합체 (recombinant)"는 자연에 존재하지 않는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 형태를 의미하며, 이의 비-제한적인 예는 통상적으로 함께 존재하지 않는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 조합함으로써 형성될 수 있다.
"상동성 (homology)" 또는 "동일성 (identity)" 또는 "유사성 (similarity)"은 2개의 펩티드들 간의, 또는 2개의 핵산 분자들 간의 서열 유사성을 지칭한다. 상동성은 비교 목적으로 정렬될 수 있는 각 서열에서의 위치를 비교함으로써 결정될 수 있다. 비교된 서열에서의 위치가 동일한 염기 또는 아미노산에 의해 점유되는 경우, 분자는 해당 위치에서 상동이다. 서열들 간의 상동성 정도는 서열들에 의해 공유된 위치가 일치하거나 또는 상동인 수의 함수이다. "비-관련된 (unrelated)" 또는 "비-상동성 (non-homologous)" 서열은 본 개시내용의 서열 중 하나의 서열과 40% 미만의 동일성, 바람직하게는 25% 미만의 동일성을 공유한다.
폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 영역 (또는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 영역)이 다른 서열에 대해 소정의 퍼센트 (예를 들어, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%)의 "서열 동일성 (sequence identity)"을 갖는다는 것은 2개의 서열을 비교하는데 있어서 이들을 정렬하는 경우 염기 (또는 아미노산)이 해당 퍼센트 만큼 동일한 것을 의미한다.
용어 "폴리뉴클레오티드"는 단리된 핵산 분자 또는 구조체, 예를 들어 메신저 RNA (mRNA), 바이러스-유래 RNA, 또는 플라스미드 DNA (pDNA)를 지칭한다. 폴리뉴클레오티드는 기존의 포스포디에스테르 결합 또는 비-기존의 결합 (예를 들어, 아미드 결합, 예컨대 펩티드 핵산 (PNA)에서 발견되는 아미드 결합)을 포함할 수 있다. 용어 "핵산 분자 (nucleic acid molecule)"는 폴리뉴클레오티드에 존재하는 임의의 하나 이상의 핵산 세그먼트, 예를 들어 DNA 또는 RNA 단편을 지칭한다.
"단리된 (isolated)" 핵산 분자 또는 폴리뉴클레오티드는 이의 자연 환경으로부터 채취된 핵산 분자, DNA 또는 RNA를 의미한다. 예를 들어, 벡터에 함유된 폴리펩티드를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 목적을 위해 단리된 것으로 간주된다. 단리된 폴리뉴클레오티드의 추가 예로는 이종 숙주 세포에서 유지되는 재조합 폴리뉴클레오티드 또는 용액 중 정제된 (부분적으로 또는 실질적으로) 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 단리된 폴리뉴클레오티드는 일반적으로 폴리뉴클레오티드 분자를 함유하는 세포에 함유된 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하지만, 폴리뉴클레오티드 분자는 염색체외 (extrachromosomally) 또는 천연 염색체 위치와 상이한 염색체 위치에 존재한다. 단리된 RNA 분자에는 본 발명의 인 비보 또는 인 비트로 RNA 전사체 뿐만 아니라, 양성 및 음성 가닥 형태, 및 이중-가닥 형태를 포함한다. 본 발명에 따른 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 핵산에는 합성으로 생성된 분자를 추가로 포함한다. 또한, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 조절 요소 예컨대 프로모터, 리보솜 결합 부위, 또는 전사 종결인자일 수 있거나 또는 이를 포함할 수 있다. 본원에서 사용된 용어 "단리된"은 또한 핵산 또는 펩티드에 재조합 DNA 기술에 의해 생성되는 경우 세포 물질, 바이러스 물질 또는 배양 배지가 실질적으로 존재하지 않거나, 또는 화학적으로 합성되는 경우 화학 전구체 또는 다른 화학물질이 실질적으로 존재하지 않는 것을 지칭한다. 용어 "단리된"은 또한 세포 또는 폴리펩티드가 다른 세포 단백질 또는 조직으로부터 단리되는 것을 지칭하기 위해 본원에서 사용된다. 단리된 폴리펩티드는 정제된 폴리펩티드 및 재조합 폴리펩티드 모두를 포함하는 것을 의미한다.
"[예를 들어, 본 발명의 항체 또는 이중특이적 항체]를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드 (또는 핵산)"는 단일 벡터 또는 개별 벡터 내의 폴리뉴클레오티드 분자(들)를 포함하여 항체 중쇄 및 경쇄 (또는 이의 단편)를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 분자, 및 숙주 세포에서 하나 이상의 위치에 존재하는 이러한 핵산 분자(들)를 지칭한다.
용어 "발현 카세트 (expression cassette)"는 표적 세포에서 특정 핵산의 전사를 가능하게 하는 일련의 명시된 핵산 요소를 사용하여, 재조합 또는 합성으로 생성된 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 재조합 발현 카세트는 플라스미드, 염색체, 미토콘드리아 DNA, 플라스미드 DNA, 바이러스, 또는 핵산 단편으로 혼입될 수 있다. 전형적으로, 발현 벡터의 재조합 발현 카세트 부분은 특히 전사될 핵산 서열 및 프로모터를 포함한다. 소정의 실시양태에서, 상기 발현 카세트는 본 발명의 항체 또는 이중특이적 항체 또는 이의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
용어 "벡터 (vector)" 또는 "발현 벡터 (expression vector)"는 세포에서 작동 가능하게 결합된 특정 유전자를 도입하고 발현시키는데 사용되는 DNA 분자를 지칭한다. 상기 용어에는 자가-복제 핵산 구조로서의 벡터 뿐만 아니라 숙주 세포의 게놈에 혼입되어 도입된 벡터를 포함한다. 본 발명의 발현 벡터는 발현 카세트를 포함한다. 발현 벡터는 다량의 안정한 mRNA의 전사를 가능하게 한다. 발현 벡터가 세포 내부에 존재하는 경우, 유전자에 의해 코딩되는 리보핵산 분자 또는 단백질이 세포 전사 및/또는 번역 기계에 의해 생성된다. 일 실시양태에서, 본 발명의 발현 벡터는 본 발명의 항체 또는 이중특이적 항체 또는 이의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함한다.
용어 "숙주 세포 (host cell)", "숙주 세포주 (host cell line)" 및 "숙주 세포 배양물 (host cell culture)"은 상호교환적으로 사용되며, 외인성 핵산이 도입된 세포 (이러한 세포의 자손 포함)를 지칭한다. 숙주 세포에는 계대 횟수에 관계없이 일차 형질전환 세포 및 그로부터 유래된 자손을 포함하는 "형질전환체 (transformants)" 및 "형질전환 세포 (transformed cells)"를 포함한다. 자손은 핵산 함량이 모세포와 완전히 동일하지 않을 수 있지만, 돌연변이를 함유할 수 있다. 원래 형질전환된 세포에서 선별되거나 또는 선택된 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이 자손이 본원에 포함된다. 숙주 세포는 본 발명의 항체 또는 이중특이적 항체를 생성하는데 사용될 수 있는 임의의 타입의 세포 시스템이다. 숙주 세포에는 배양 세포, 예를 들어 포유동물 배양 세포, 예컨대 HEK 세포, CHO 세포, BHK 세포, NS0 세포, SP2/0 세포, YO 골수종 세포, P3X63 마우스 골수종 세포, PER 세포, PER.C6 세포 또는 하이브리도마 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 및 식물 세포를 포함하고, 유전자이식 동물, 유전자이식 식물 또는 배양 식물 또는 동물 조직 내에 포함된 세포를 포함한다. "활성화 Fc 수용체 (activating Fc receptor)"는 항체의 Fc 도메인과 결합한 후 수용체-보유 세포가 이펙터 기능을 수행하도록 자극하는 신호전달 이벤트를 유도하는 Fc 수용체이다. 인간 활성화 Fc 수용체에는 FcγRIIIa (CD16a), FcγRI (CD64), FcγRIIa (CD32), 및 FcαRI (CD89)를 포함한다.
항체-의존적 세포-매개 세포독성 (Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity: ADCC)은 면역 이펙터 세포에 의해 항체-코팅된 표적 세포가 용해되는 면역 기전이다. 상기 표적 세포는 Fc 영역을 포함하는 항체 또는 이의 유도체가 일반적으로 Fc 영역의 N-말단에 있는 단백질 부분을 통해 특이적으로 결합하는 세포이다. 본원에서 사용된, 용어 "ADCC 감소"는 상기 정의된 ADCC의 기전에 의해, 표적 세포를 둘러싼 배지 중에 주어진 항체 농도에서, 주어진 시간 내에 용해되는 표적 세포 수의 감소, 또는 ADCC의 기전에 의해, 주어진 시간 내에 주어진 수의 표적 세포의 용해를 달성하는데 필요한 표적 세포를 둘러싼 배지 중에 항체 농도의 증가로 정의된다. 해당 ADCC는 동일한 표준 생산, 정제, 제제화 및 저장 방법 (당업자에게 알려져 있음)을 사용하여 동일한 타입의 숙주 세포가 생산한 동일한 항체에 의해 매개되는 ADCC에 비해 감소하였지만, 조작되지 않았다. 예를 들어, Fc 도메인에 ADCC를 감소시키는 아미노산 치환을 포함하는 항체에 의해 매개되는 ADCC는 Fc 도메인에 이러한 아미노산 치환이 없는 동일한 항체에 의해 매개되는 ADCC에 비해 감소하였다. ADCC를 측정하는데 적합한 분석은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다 (예를 들어, PCT publication no. WO 2006/082515 또는 PCT publication no. WO 2012/130831 참조).
약제의 "유효량 (effective amount)"은 약제가 투여된 세포 또는 조직에서 생리학적 변화를 초래하는데 필요한 양을 의미한다.
약제, 예를 들어 약학 조성물의 "치료적으로 유효한 양 (therapeutically effective amount)"은 목적하는 치료 또는 예방 결과를 달성하는데 필요한 기간 동안 투약에서 효과적인 양을 의미한다. 예를 들어 약제의 치료적으로 유효한 양은 예를 들어 질병의 유해 효과를 제거, 감소, 지연, 최소화 또는 방지한다.
"개체 (individual)", "대상체 (subject)" 또는 "환자 (patient)"는 포유동물이다. 포유동물에는 가축 (예를 들어, 소, 양, 고양이, 개 및 말), 영장류 (예를 들어, 인간 및 비-인간 영장류 예컨대 원숭이), 토끼 및 설치류 (예를 들어, 마우스 및 래트)를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 특히, 개체, 대상체 또는 환자는 인간이다.
용어 "약학 조성물 (pharmaceutical composition)"은 그 안에 함유된 활성 성분의 생물학적 활성이 유효해지는 형태로, 상기 조성물이 투여된 대상체에게 허용할 수 없을 정도로 독성이 있는 추가 성분들을 함유하지 않는 제제를 지칭한다.
"약학적으로 허용 가능한 담체 (pharmaceutically acceptable carrier)"는 약학 조성물 중에 활성 성분 이외의 성분으로, 대상체에게 독성이 없는 성분을 지칭한다. 약학적으로 허용 가능한 담체에는 완충제, 부형제, 안정화제 또는 보존제를 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
본원에서 사용된, "치료 (treatment)" (및 이의 문법적 변형 예컨대 "치료하다 (treat)" 또는 "치료하는 (treating)")는 치료받는 개체에서 질병의 자연스런 과정을 변경하려는 시도로서의 임상적 중재를 의미하며, 예방 또는 임상 병리 과정 중에 수행할 수 있다. 치료의 바람직한 효과에는 질병의 발생 또는 재발의 방지, 증상의 완화, 질병의 직접적 또는 간접적 병리학적 결과의 감소, 전이의 방지, 질병 진행 속도의 감소, 질병 상태의 개선 또는 완화, 및 예후의 관해 또는 개선을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 이중특이적 항체는 질병 발병의 지연 또는 질병 진행의 지체에 사용된다.
용어 '패키지 설명서 (package insert)'는 치료제의 상업적 패키지에 관례적으로 포함되는 지침으로, 적응증, 사용법, 투여량, 투여, 병용 요법, 해당 치료제의 사용과 관련된 금기 사항 및/또는 경고에 대한 정보를 함유한다.
항-CLL-1 항체
항-CLL-1 항체는 CCL-1 표적화 모이어티로서 항-CLL-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함할 수 있다. 항-CCL-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 CCL-1에 대한 강력한 결합 및 억제 활성을 나타낼 수 있으며, 치료 및 진단 용도에 유용할 수 있다.
일 실시양태에서, 항-CLL-1 항체 또는 이의 단편은 인간 CLL-1 단백질에 대한 특이성을 가질 수 있다.
일 실시양태에서, 항-CLL-1 항체 또는 이의 단편은 (a) 서열 번호: 1, 2 및 3으로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1; (b) 서열 번호: 4, 5 및 6으로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2; (c) 서열 번호: 7, 8, 9, 10 및 11로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3; (d) 서열 번호: 12, 13, 14 및 15로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1; (e) 서열 번호: 16, 17 및 18로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2; 및 (f) 서열 번호: 19, 20, 21 및 22로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에 따른 항체 또는 항원-결합 단편의 중쇄 및 경쇄 가변 영역에 포함되는 항-CLL-1의 CDR 서열은 하기 표 2에 제시한다.
일 실시양태에서, 상기 표 (표 2)에 개시된 경쇄의 각 가변 영역의 CDR 및 중쇄의 각 가변 영역의 CDR은 자유롭게 조합될 수 있다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 단편은 치환을 1개 이하, 2개 이하, 또는 3개 이하로 포함할 수 있다.
일 실시양태에서, 항-CLL-1 항체 또는 이의 단편은 서열 번호: 23 및 24로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역; 또는 서열 번호: 23 및 24로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 펩티드를 포함할 수 있다.
일 실시양태에서, 항-CLL-1 항체 또는 이의 단편은 서열 번호: 55로 구성된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변 영역을 포함할 수 있다.
일 실시양태에서, 항-CLL-1 항체 또는 이의 단편은 서열 번호: 23 및 24로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역; 및 서열 번호: 55로 구성된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변 영역을 포함할 수 있다.
일 실시양태에서, 항-CLL-1 항체 또는 이의 단편은 서열 번호: 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 및 74로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 또는 서열 번호: 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 및 74로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 펩티드를 포함할 수 있다.
일 실시양태에서, 항-CLL-1 항체 또는 이의 단편은 서열 번호: 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 및 75로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는 서열 번호: 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 및 75로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 펩티드를 포함할 수 있다.
일 실시양태에서, 항-CLL-1 항체 또는 이의 단편은 서열 번호: 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 및 74로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열 번호: 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 및 75로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다.
일 실시양태에서, 항-CLL-1 항체 또는 이의 단편은 서열 번호: 45로 구성된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 또는 서열 번호: 45로 구성된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 펩티드를 포함할 수 있다.
일 실시양태에서, 항-CLL-1 항체 또는 이의 단편은 서열 번호: 46으로 구성된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 또는 서열 번호: 46으로 구성된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 펩티드를 포함할 수 있다.
일 실시양태에서, 항-CLL-1 항체 또는 이의 단편은 서열 번호: 45로 구성된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및 서열 번호: 46으로 구성된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함할 수 있다.
일 실시양태에서, 항체 또는 항원-결합 단편의 중쇄 불변 영역, 중쇄 및 경쇄 가변 영역, 중쇄 및 경쇄는 하기 표 (표 3)에 예시될 수 있다.
다른 실시양태에서, 상기 표 (표 3)에 개시된 중쇄 및 경쇄의 가변 영역들을 자유롭게 조합하여 다양한 형태의 항체를 제조할 수 있다.
본원에 개시된 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 각각 다양한 표적화 중쇄 및 경쇄 불변 영역에 결합하여 온전한 항체의 중쇄 및 경쇄를 각각 형성할 수 있다. 또한, 이와 같은 불변 영역에 결합된 중쇄 및 경쇄 서열이 각각 또한 조합되어 온전한 항체 구조를 형성할 수 있다.
항체의 중쇄 및 경쇄의 임의의 가변 영역은 불변 영역의 적어도 일부에 연결될 수 있다. 불변 영역은 항체-의존적 세포-매개 세포독성, 항체-의존적 세포 포식작용 및/또는 보체-의존적 세포독성 등이 필요한지 여부에 따라 선택될 수 있다. 예를 들어, 인간 이소타입 IgG1 및 IgG3은 보체-의존적 세포독성을 갖고, 인간 이소타입 IgG2 및 IgG4는 세포독성을 갖지 않는다. 인간 IgG1 및 IgG3은 또한 인간 IgG2 및 IgG4보다 더 강한 세포-매개 이펙터 기능을 유도한다. 예를 들어, 중쇄 가변 영역은 IgG 예컨대 IgG1, IgG2, IgG2a, IgG2b, IgG3 및 IgG4의 불변 영역에 결합할 수 있고, 경쇄 가변 영역은 카파 또는 람다 불변 영역에 결합할 수 있다. 불변 영역의 경우, 필요에 따라 적절한 것이 사용될 수 있으며, 예를 들어 인간 또는 마우스-유래의 것이 사용될 수 있다. 일 실시양태에서, 인간 중쇄 불변 영역 IgG1이 사용된다. 다른 실시양태에서, 경쇄 불변 영역으로서, 인간 람다 영역이 사용될 수 있다.
본원에 개시된 임의의 가변 영역은 불변 영역에 결합되고, 이에 의해 중쇄 및 경쇄 서열을 형성할 수 있다. 일 실시양태에서, 본원에 개시된 중쇄 가변 영역은 인간 IgG1 불변 영역에 결합되어, 중쇄 (전체-길이)를 형성할 수 있다. 다른 실시양태에서, 본원에 개시된 경쇄 가변 영역은 인간 람다 불변 영역에 결합되어, 경쇄 (전체-길이)를 형성할 수 있다. 경쇄 및 중쇄는 다양한 조합으로 조합되고, 이에 의해 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄로 구성된 온전한 항체를 형성할 수 있다.
다른 실시양태에서, 항체는 중쇄 및 경쇄의 조합을 포함하거나 또는 이로 필수적으로 구성될 수 있고, 이는 서열 번호: 45; 및 서열 번호: 46의 서열로 표시된다.
그러나, 본원에 개시된 가변 영역과 조합되는 이러한 불변 영역 서열이 예시되며, 당업자는 IgG1 중쇄 불변 영역, IgG3 또는 IgG4 중쇄 불변 영역, 임의의 카파 또는 람다 경쇄 불변 영역, 안정성, 발현, 제조 가능성 또는 다른 표적화 특성을 위해 변형된 불변 영역 등을 포함하는 다른 불변 영역이 사용될 수 있음을 알 것이다.
일부 실시양태에서, 항-CLL-1 항체의 항원-결합 단편은 항체의 중쇄 CDR 및/또는 경쇄 CDR을 포함하는 임의의 단편일 수 있고, 예를 들어 이는 Fab, Fab', F(ab')2, xFab, Fd (중쇄 가변 영역 및 CH1 도메인 포함), Fv (중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역), 단일-사슬 Fv (scFv; 임의의 순서의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역, 및 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역 사이의 펩티드 링커를 포함하거나 또는 이로 필수적으로 구성됨), 단일-사슬 항체, 디설파이드-연결된 Fv (sdFv), scFab (단일 사슬 Fab), scFab-Fc (scFab 및 Fc 영역 포함), half-IgG (1개의 경쇄 및 1개의 중쇄 포함) 및 유사물로 구성된 그룹으로부터 선택될 수 있지만 이에 한정되지 않는다.
본 발명은 본원에 개시된 하나 이상의 아미노산 서열과 실질적인 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 실질적인 동일성 (substantial identity)은 서열 변이가 존재하는 경우에도 본원에 개시된 효과를 유지하는 것을 의미한다.
일부 실시양태에서, 항-CLL-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 마우스 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 또는 완전 인간 항체일 수 있다.
일 실시양태에서, 항-CLL-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 폴리펩티드(들)과 융합하여 융합 단백질을 형성할 수 있다. 폴리펩티드(들)는 항체 또는 항원일 수 있다. 일 실시양태에서, 융합 단백질은 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체)의 형태일 수 있다.
일 실시양태에서, 본 개시내용은 (a) 본원에 기재된 하나 이상의 단일 도메인 항체 또는 이의 항원-결합 단편 (예를 들어, 본원에 기재된 하나 이상의 CDR), 및 (b) 하나 이상의 추가 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 예를 들어, 융합 단백질은 본원에 기재된 하나 이상의 단일 도메인 항체 및 본원에 기재된 불변 영역 또는 Fc 영역을 포함할 수 있다. 일 실시양태에서, 본원에 기재된 하나 이상의 단일 도메인 항체 또는 이의 항원-결합 단편 (예를 들어, 본원에 기재된 하나 이상의 CDR)은 항체 또는 항원에 비-공유결합으로 또는 공유결합으로 접합, 예를 들어 융합될 수 있다.
항-CD3 항체
항-CD3 항체는 CD3 표적화 모이어티로서 항-CD3 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함할 수 있다. 항-CD3 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 CD3에 대한 강력한 결합 및 억제 활성을 나타낼 수 있으며, 치료 및 진단 용도에 유용할 수 있다.
일 실시양태에서, 항-CD3 항체 또는 이의 단편은 인간 CD3 단백질, 바람직하게는 인간 CD3E 폴리펩티드에 대한 특이성을 가질 수 있다.
일 실시양태에서, 항-CD3 항체 또는 이의 단편은 (a) 서열 번호: 47로 구성된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1; (b) 서열 번호: 48로 구성된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2; (c) 서열 번호: 49로 구성된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3; (d) 서열 번호: 50으로 구성된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1; (e) 서열 번호: 51로 구성된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2; 및 (f) 서열 번호: 52로 구성된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함할 수 있다.
일 실시양태에서, 상기 개시된 경쇄의 각 가변 영역의 CDR 및 중쇄의 각 가변 영역의 CDR은 자유롭게 조합될 수 있다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 단편은 치환을 1개 이하, 2개 이하, 또는 3개 이하로 포함할 수 있다.
일 실시양태에서, 항-CD3 항체 또는 이의 단편은 서열 번호: 53으로 구성된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 또는 서열 번호: 53으로 구성된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 펩티드; 및 서열 번호: 54로 구성된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 또는 서열 번호: 54로 구성된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 펩티드를 포함할 수 있다.
다른 실시양태에서, 상기 개시된 중쇄 및 경쇄의 가변 영역들을 자유롭게 조합하여 다양한 형태의 항체를 제조할 수 있다.
본원에 개시된 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 각각 다양한 표적화 중쇄 및 경쇄 불변 영역에 결합하여 온전한 항체의 중쇄 및 경쇄를 각각 형성할 수 있다. 또한, 이와 같은 불변 영역에 결합된 중쇄 및 경쇄 서열이 각각 또한 조합되어 온전한 항체 구조를 형성할 수 있다.
항체의 중쇄 및 경쇄의 임의의 가변 영역은 불변 영역의 적어도 일부에 연결될 수 있다. 불변 영역은 항체-의존적 세포-매개 세포독성, 항체-의존적 세포 포식작용 및/또는 보체-의존적 세포독성 등이 필요한지 여부에 따라 선택될 수 있다. 예를 들어, 인간 이소타입 IgG1 및 IgG3은 보체-의존적 세포독성을 갖고, 인간 이소타입 IgG2 및 IgG4는 세포독성을 갖지 않는다. 인간 IgG1 및 IgG3은 또한 인간 IgG2 및 IgG4보다 더 강한 세포-매개 이펙터 기능을 유도한다. 예를 들어, 중쇄 가변 영역은 IgG 예컨대 IgG1, IgG2, IgG2a, IgG2b, IgG3 및 IgG4의 불변 영역에 결합할 수 있고, 경쇄 가변 영역은 카파 또는 람다 불변 영역에 결합할 수 있다. 불변 영역의 경우, 필요에 따라 적절한 것이 사용될 수 있으며, 예를 들어 인간 또는 마우스-유래의 것이 사용될 수 있다. 일 실시양태에서, 인간 중쇄 불변 영역 IgG1이 사용된다. 다른 실시양태에서, 경쇄 불변 영역으로서, 인간 람다 영역이 사용될 수 있다.
본원에 개시된 임의의 가변 영역은 불변 영역에 결합되고, 이에 의해 중쇄 및 경쇄 서열을 형성할 수 있다. 일 실시양태에서, 본원에 개시된 중쇄 가변 영역은 인간 IgG1 불변 영역에 결합되어, 중쇄 (전체-길이)를 형성할 수 있다. 다른 실시양태에서, 본원에 개시된 경쇄 가변 영역은 인간 람다 불변 영역에 결합되어, 경쇄 (전체-길이)를 형성할 수 있다. 경쇄 및 중쇄는 다양한 조합으로 조합되고, 이에 의해 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄로 구성된 온전한 항체를 형성할 수 있다.
다른 실시양태에서, 항체는 중쇄 및 경쇄의 조합을 포함하거나 또는 이로 필수적으로 구성될 수 있고, 이는 서열 번호: 53; 및 서열 번호: 54의 서열로 표시된다.
그러나, 본원에 개시된 가변 영역과 조합되는 이러한 불변 영역 서열이 예시되며, 당업자는 IgG1 중쇄 불변 영역, IgG3 또는 IgG4 중쇄 불변 영역, 임의의 카파 또는 람다 경쇄 불변 영역, 안정성, 발현, 제조 가능성 또는 다른 표적화 특성을 위해 변형된 불변 영역 등을 포함하는 다른 불변 영역이 사용될 수 있음을 알 것이다.
일부 실시양태에서, 항-CD3 항체의 항원-결합 단편은 항체의 중쇄 CDR 및/또는 경쇄 CDR을 포함하는 임의의 단편일 수 있고, 예를 들어 이는 Fab, Fab', F(ab')2, xFab, Fd (중쇄 가변 영역 및 CH1 도메인 포함), Fv (중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역), 단일-사슬 Fv (scFv; 임의의 순서의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역, 및 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역 사이의 펩티드 링커를 포함하거나 또는 이로 필수적으로 구성됨), 단일-사슬 항체, 디설파이드-연결된 Fv (sdFv), scFab (단일 사슬 Fab), scFab-Fc (scFab 및 Fc 영역 포함), half-IgG (1개의 경쇄 및 1개의 중쇄 포함) 및 유사물로 구성된 그룹으로부터 선택될 수 있지만 이에 한정되지 않는다.
본 발명은 본원에 개시된 하나 이상의 아미노산 서열과 실질적인 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 아미노산 서열을 포함한다. 실질적인 동일성은 서열 변이가 존재하는 경우에도 본원에 개시된 효과를 유지하는 것을 의미한다.
일 실시양태에서, 본 개시내용은 (i) 본원에 기재된 하나 이상의 단일 도메인 항체 또는 이의 항원-결합 단편 (예를 들어, 본원에 기재된 하나 이상의 CDR), 및 (b) 하나 이상의 추가 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 예를 들어, 융합 단백질은 본원에 기재된 하나 이상의 단일 도메인 항체 및 본원에 기재된 불변 영역 또는 Fc 영역을 포함할 수 있다. 일 실시양태에서, 본원에 기재된 하나 이상의 단일 도메인 항체 또는 이의 항원-결합 단편 (예를 들어, 본원에 기재된 하나 이상의 CDR)은 항체 또는 항원에 비-공유결합으로 또는 공유결합으로 접합, 예를 들어 융합될 수 있다.
항-CLL-1/항-CD3 이중특이적 항체
항-CLL-1 항체/항-CD3 이중특이적 항체는 항-CLL-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편; 및 항-CD3 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함할 수 있다. 항-CLL-1 항체/항-CD3 이중특이적 항체는 치료 및 진단 용도에 유용할 수 있다.
일 실시양태에서, 이중특이적 항체는 CLL-1 표적화 모이어티 및 CD3 표적화 모이어티를 포함한다.
일 실시양태에서, 항-CLL-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편 및 항-CD3 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 직접 또는 펩티드 링커를 통해 서로 융합될 수 있다.
일 실시양태에서, 항-CLL-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편 및 항-CD3 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 각각 독립적으로 Fab 분자일 수 있다.
일 실시양태에서, 상기 Fab 분자는 인간 Fab 분자 또는 TCR 불변 영역을 함유하는 키메라 Fab-유사 도메인일 수 있다. 일 실시양태에서, 상기 Fab 분자는 키메라 또는 인간화될 수 있다.
일 실시양태에서, (a) 항-CLL-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 항-CLL-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 Fab 중쇄의 C-말단에서 항-CD3 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합될 수 있거나, 또는 (b) 항-CD3 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 항-CD3 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 Fab 중쇄의 C-말단에서 항-CLL-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합될 수 있다.
일 실시양태에서, 항-CLL-1/항-CD3 이중특이적 항체는 제1 서브-유닛 및 제2 서브-유닛을 포함하는 Fc 도메인을 포함할 수 있다.
일 실시양태에서, Fc 도메인은 추가의 돌연변이가 존재하거나 또는 부재하는 인간 Fc 도메인일 수 있다. Fc 도메인에서 이러한 추가 돌연변이로는 ADCC 활성이 존재하지 않는 N297A 돌연변이 또는 정확한 항체 페어링을 촉진하는 KIH (knob-into-hole) 돌연변이를 포함할 수 있지만, 이에 한정되지 않는다.
일 실시양태에서, 항-CLL-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편 및 항-CD3 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 각각 Fab 분자일 수 있고; (a) 항-CD3 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 항-CD3 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 제1 서브-유닛의 N-말단에 융합될 수 있고, (b) 항-CLL-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 항-CLL-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 제2 서브-유닛의 N-말단에 융합될 수 있다.
일 실시양태에서, 항-CLL-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 제1 항-CLL-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편일 수 있고, 제2 항-CLL-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 추가로 포함할 수 있다.
일 실시양태에서, 제1 항-CLL-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 항-CD3 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 및 존재하는 경우 제2 항-CLL-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 각각 Fab 분자일 수 있고; (a) 항-CD3 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 항-CD3 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 Fab 중쇄의 C-말단에서 제1 항-CLL-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합될 수 있고, 제1 항-CLL-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 제1 항-CLL-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 제1 서브-유닛의 N-말단에 융합될 수 있거나, 또는 (b) 제1 항-CLL-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 제1 항-CLL-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 Fab 중쇄의 C-말단에서 항-CD3 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합될 수 있고, 항-CD3 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 항-CD3 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 제1 서브-유닛의 N-말단에 융합될 수 있고; 제2 항-CLL-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 존재하는 경우 제2 항-CLL-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 제2 서브-유닛의 N-말단에 융합될 수 있다.
일 실시양태에서, 제1 항-CLL-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 항-CD3 항체 또는 이의 항원-결합 단편 및 제2 항-CLL-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 각각 Fab 분자이고; 제1 항-CLL-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 제1 항-CLL-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 Fab 중쇄의 C-말단에서 항-CD3 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되고, 항-CD3 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 항-CD3 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 제1 서브-유닛의 N-말단에 융합되고; 제2 항-CLL-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 존재하는 경우 이는 제2 항-CLL-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 제2 서브-유닛의 N-말단에 융합된다. 이러한 구조의 차폐된 CD3 결합 부위로 인해, 이중특이적 항체는 T 세포 활성화 및 IFN-γ 및 IL-2의 사이토카인 발현을 강력하게 유도할 수 있지만, CRS-관련 사이토카인 예컨대 TNF-α 및 IL-6을 약하게 유도하므로, 종양외 독성 (off-tumor toxicity)이 적은 것을 보여준다.
일 실시양태에서, 제1 항-CLL-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 및 제2 항-CLL-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서로 동일할 수 있다.
일 실시양태에서, 이중특이적 항체는 활성화 T 세포 항원인 CLL-1 및 CD3에 동시에 결합할 수 있다. 일 실시양태에서, 이중특이적 항체는 CLL-1 및 CD3에 동시에 결합함으로써 T 세포 및 표적 세포를 가교시킬 수 있다. 일 실시양태에서, 이러한 동시 결합은 표적 세포, 구체적으로 CLL-1 발현 종양 세포의 용해를 초래한다. 일 실시양태에서, 이러한 동시 결합은 T 세포의 활성화를 초래한다. 다른 실시양태에서, 이러한 동시 결합은 T 림프구, 구체적으로 세포독성 T 림프구의 세포 반응을 초래하며, 상기 세포 반응은 증식, 분화, 사이토카인 분비, 세포독성 이펙터 분자 방출, 세포독성 활성, 및 활성화 마커의 발현의 그룹으로부터 선택된다.
일 실시양태에서, 이중특이적 항체는 T 세포의 세포독성 활성을 표적 세포에 재지시 (re-directing)할 수 있다. 특정 일 실시양태에서, 상기 재지시 (re-direction)는 표적 세포에 의한 MHC-매개 펩티드 항원 제시 및/또는 T 세포의 특이성과 무관하다. 구체적으로, 본 발명의 임의의 실시양태에 따른 T 세포는 세포독성 T 세포 (cytotoxic T cell)이다. 일부 실시양태에서, T 세포는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포, 구체적으로 CD8+ T 세포이다.
일 실시양태에서, 일 실시양태에 따른 이중특이적 항체는 U937 및 HL-60 세포주의 존재하에 사이토카인 발현, 그랜자임 B 및/또는 퍼포린을 유도할 수 있다.
접합체
본 발명은 본원에 기재된 항-CLL-1 항체 또는 항-CLL-1/항-CD3 이중특이적 항체가 하나 이상의 치료제 예컨대 세포독성제, 화학요법제, 약물, 성장 억제제, 독소 (예: 단백질 독소, 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소적으로 활성인 독소, 또는 이의 단편) 또는 방사성 동위원소에 접합된 (화학적으로 결합된) 면역접합체 (immunoconjugates)를 제공한다.
일 실시양태에서, 면역접합체는 항체-약물 접합체 (antibody-drug conjugate: ADC)로, 여기서 항체가 전술한 치료제 중 하나 이상에 접합된다. 항체는 전형적으로 하나 이상의 치료제에 링커를 사용하여 연결된다. 치료제 및 약물 및 링커의 예를 포함한 ADC 기술의 개요는 Pharmacol Review　68:3-19 (2016)에 제시되어 있다.
다른 실시양태에서, 면역접합체는 디프테리아 A 사슬 (diphtheria A chain), 디프테리아 독소의 비-결합 활성 단편, 외독소 A 사슬 (슈도모나스 아에루기노사 (Pseudomonas aeruginosa) 유래), 리신 A 사슬 (ricin A chain), 아브린 A 사슬 (abrin A chain), 모데신 A 사슬 (modeccin A chain), 알파-사르신 (alpha-sarcin),　알레우리테스 포르디이 (Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 (dianthin) 단백질,　피톨라카 아메리카나 (Phytolaca americana) 단백질 (PAPI, PAPII, 및 PAP-S),　모모르디카 카란티아 (momordica charantia) 억제제, 쿠르신 (curcin), 크로틴 (crotin),　사파오나리아 오피시날리스 (sapaonaria officinalis) 억제제, 겔로닌 (gelonin), 미토겔린 (mitogellin), 레스트릭토신 (restrictocin), 페노마이신 (phenomycin), 에노마이신 (enomycin), 및 트리코테센 (tricothecenes)을 포함하지만 이에 한정되지 않는 효소적으로 활성인 독소 또는 이의 단편에 접합된 본원에 기재된 항체를 포함할 수 있다.
다른 실시양태에서, 면역접합체는 본원에 기재된 항체가 방사성 원자에 접합되어 형성된 방사성접합체 (radioconjugate)를 포함할 수 있다. 방사성접합체 생산에는 다양한 방사성 동위원소가 이용 가능하다. 예로는 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 및 Lu의 방사성 동위원소를 포함한다. 방사성접합체를 검출에 사용하는 경우, 신티그래픽 연구 (scintigraphic studies)를 위한 방사성 원자로, 예를 들어 tc99m 또는 I123, 핵자기공명 (NMR) 영상 (또한, 자기 공명 영상 (magnetic resonance imaging), mri로 알려짐)을 위한 스핀 표지로, 예컨대 요오드-123, 요오드-131, 인듐-111, 불소-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 가돌리늄, 망간 또는 철을 포함할 수 있다.
항체 및 세포독성제의 접합체는 다양한 이관능성 단백질 커플링제 예컨대 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트 (SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸) 사이클로헥산-1-카복실레이트 (SMCC), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이관능성 유도체 (예컨대 디메틸 아디피미데이트 HCl), 활성 에스테르 (예컨대 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예컨대 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예컨대 비스(p-아지도벤조일) 헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예컨대 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예컨대 톨루엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 불소 화합물 (예컨대 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 리신 면역독소 (ricin immunotoxin)는 Vitetta et al.,　Science　238:1098 (1987)에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아네이토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산 (MX-DTPA)은 방사성핵종 (radionucleotide)을 항체에 접합시키기 위한 예시되는 킬레이트제이다. WO94/11026을 참조한다. 링커는 세포 내에서 세포독성 약물의 방출을 촉진하는 "절단 가능한 링커 (cleavable linker)"일 수 있다. 예를 들어, 산-불안정성 링커, 펩티다제-민감성 링커, 광불안정성 링커, 디메틸 링커 또는 디설파이드-함유 링커 (Chari et al.,　Cancer Res.　52:127-131 (1992); U.S. Pat. No. 5,208,020)를 사용할 수 있다.
본원의 면역접합체 또는 ADC는 BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, 설포-EMCS, 설포-GMBS, 설포-KMUS, 설포-MBS, 설포-SIAB, 설포-SMCC, 및 설포-SMPB, 및 SVSB (succinimidyl-(4-vinylsulfone)benzoate) (이는 상업적으로 이용 가능함 (예를 들어, Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, Ill., U.S.A))를 포함하지만 이에 한정되지 않는 가교제 시약으로 제조된 접합체가 고려되지만 이에 한정되지 않는다.
접합될 수 있는 세포독성제는 또한 예를 들어 피롤로벤조디아제핀 (PBD), 모노메틸 아우리스타틴 E (MMAE), 모노메틸 아우리스타틴 F (MMAF), 캄프토테신, 독소루비신, 시스플라틴, 베라파밀, 플루오로우라실, 옥살리플라틴, 다우노루비신, 이리노테칸, 토포테칸, 파클리탁셀, 카보플라틴, 젬시타빈, 메토트렉세이트, 도세탁셀, 아시비신, 아클라루비신, 아코다졸, 아크로니신, 아도젤레신, 알라노신, 알데스류킨, 알로푸리놀 나트륨, 알트레타민, 아미노글루테티미드, 아모나피드, 앰플리겐, 암사크린, 안드로겐, 안귀딘, 아피디콜린 글리시네이트, 아살리, 아스파라기나제, 5-아자시티딘, 아자티오프린, BCG (Bacillus Calmette-Guerin), Baker 안티폴 (Baker's Antifol), 베타-2-데옥시티오구아노신, 비산트렌 HCl, 블레오마이신 설페이트, 부설판, 부티오닌 설폭시민, BWA 773U82, BW 502U83/HCl, BW 7U85 메실레이트, 세라세미드, 카베티머, 카보플라틴, 카무스틴, 클로람부실, 클로로퀴녹살린-설폰아미드, 클로로조토신, 크로모마이신 A3, 시스플라틴, 클라드리빈, 코르티코스테로이드, 코리네박테리움 파르붐, CPT-11, 크리스나톨, 사이클로시티딘, 사이클로포스파미드, 시타라빈, 시템베나, 다비스 말레에이트, 다카바진, 닥티노마이신, 다우노루비신 HCl, 데아자우리딘, 덱스라족산, 디안하이드로갈락티톨, 디아지쿠온, 디브로모둘시톨, 디뎀닌 B, 디에틸디티오카바메이트, 디글리코알데히드, 디하이드로-5-아자시티딘, 에키노마이신, 에다트렉세이트, 에델포신, 에플로미틴, 엘리엇 용액 (Elliott's solution), 엘사미트루신, 에피루비신, 에소루비신, 에스트라무스틴 포스페이트, 에스트로겐, 에타니다졸, 에티오포스, 에토포시드, 파드라졸, 파자라빈, 펜레티니드, 필그라스팀, 피나스테리드, 플라본 아세트산, 플록수리딘, 플루다라빈 포스페이트, 5-플루오로우라실, FluosolTM, 플루타미드, 갈륨 니트레이트, 젬시타빈, 고세렐린 아세테이트, 헵설팜, 헥사메틸렌 비스아세트아미드, 호모해링토닌 (homoharringtonine), 하이드라진 설페이트, 4-하이드록시안드로스텐디온, 하이드록시우레아, 이다루비신 HCl, 이포스파미드, 인터페론 알파, 인터페론 베타, 인터페론 감마, 인터루킨-1 알파 및 베타, 인터루킨-3, 인터루킨-4, 인터루킨-6, 4-이포메아놀, 이프로플라틴, 이소트레티노인, 류코보린 칼슘, 류프롤리드 아세테이트, 레바미솔, 리포솜 다우노루비신, 리포솜 캡슐화된 독소루비신, 로무스틴, 로니다민, 메이탄신, 메클로레타민 염산염, 멜팔란, 메노가릴, 메르바론, 6-머캅토퓨린, 메스나, 바실러스 칼메트-구린 (Bacillus calmette-guerin)의 메탄올 추출물, 메토트렉세이트, N-메틸포름아미드, 미페프리스톤, 미토구아존, 미토마이신-C, 미토탄, 미톡산트론 염산염, 단핵구/대식세포 콜로니-자극 인자, 나빌론, 나폭시딘, 네오카지노스타틴, 옥트레오티드 아세테이트, 오르마플라틴, 옥살리플라틴, 파클리탁셀, 팔라, 펜토스타틴, 피페라진디온, 피포브로만, 피라루비신, 피리트렉심, 피록산트론 염산염, PIXY-321, 플리카마이신, 포르피머 나트륨, 프레드니무스틴, 프로카바진, 프로게스틴, 피라조푸린, 라족산, 사르그라모스팀, 세무스틴, 스피로게르마늄, 스피로무스틴, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 설로페누르, 수라민 나트륨, 타목시펜, 탁소테레, 테가푸르, 테니포시드, 테레프탈아미딘, 테록시론, 티오구아닌, 티오테파, 티미딘 주사, 티아조푸린, 토포테칸, 토레미펜, 트레티노인, 트리플루오페라진 염산염, 트리플루리딘, 트리메트렉세이트, 종양 괴사 인자 (TNF), 우라실 머스타드, 빈블라스틴 설페이트, 빈크리스틴 설페이트, 빈데신, 비노렐빈, 빈졸리딘, 요시 864 (Yoshi 864), 조루비신, 이들의 약학적으로 허용 가능한 염, 및 이들의 혼합물 등을 포함한다.
글리코실화 변이체
소정의 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 항체가 글리코실화되는 정도를 증가시키거나 또는 감소시키기 위해 변경될 수 있다. 항체에 대한 글리코실화 부위의 추가 또는 결실은 하나 이상의 글리코실화 부위가 형성되거나 또는 제거되도록 아미노산 서열을 변경함으로써 편리하게 달성될 수 있다.
항체가 Fc 영역을 포함하는 경우, 이에 부착된 올리고사카라이드는 변경될 수 있다. 포유동물 세포에 의해 생성된 천연 항체는 전형적으로 Fc 영역의 CH2 도메인의 Asn297에 N-연결에 의해 일반적으로 부착된 분지형 바이안테나리 올리고사카라이드 (branched, biantennary oligosaccharide)를 포함한다. 예를 들어, Wright et al.　TIBTECH　15:26-32 (1997)를 참조한다. 올리고사카라이드는 다양한 탄수화물, 예를 들어 만노스, N-아세틸 글루코사민 (GlcNAc), 갈락토스 및 시알산 뿐만 아니라, 바이안테나리 올리고사카라이드 구조의 "줄기 (stem)"에서 GlcNAc에 부착된 푸코스를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 소정의 개선된 특성을 갖는 항체 변이체를 형성하기 위해 본 발명의 항체에서 올리고사카라이드의 변형을 수행할 수 있다.
일 실시양태에서, 비-푸코실화 올리고사카라이드, 즉 Fc 영역에 (직접 또는 간접적으로) 부착된 푸코스가 결여된 올리고사카라이드 구조를 갖는 항체 변이체가 제공된다. 이러한 비-푸코실화 올리고사카라이드 (또한 "아푸코실화 (afucosylated)" 올리고사카라이드로 지칭됨)는 특히 바이안테나리 올리고사카라이드 구조의 줄기에서 제1 GlcNAc에 부착된 푸코스 잔기가 결여된 N-연결 올리고사카라이드이다. 일 실시양태에서, 천연 또는 모체 항체와 비교하여, Fc 영역에서 비-푸코실화 올리고사카라이드의 비율이 증가된 항체 변이체가 제공된다. 예를 들어, 비-푸코실화 올리고사카라이드의 비율은 적어도 약 20%, 적어도 약 40%, 적어도 약 60%, 적어도 약 80%, 또는 심지어 약 100%일 수 있다 (즉, 푸코실화 올리고사카라이드가 존재하지 않음). 비-푸코실화 올리고사카라이드의 퍼센트는 예를 들어 WO 2006/082515에 기재된 바와 같이, MALDI-TOF 질량 분광분석법으로 측정 시에, Asn 297에 부착된 모든 올리고사카라이드 (예를 들어, 복합체, 혼성체 및 고 만노스 구조)의 합에 대한, 푸코스 잔기가 결여된 올리고사카라이드의 (평균) 양이다. Asn297은 Fc 영역에서 약 위치 297 (Fc 영역 잔기의 EU numbering)에 위치한 아스파라긴 잔기를 지칭하지만; 그러나, Asn297은 또한 항체에서 경미한 서열 변화로 인해, 위치 297의 상류 또는 하류의 약 ±3개의 아미노산, 즉 위치 294 내지 300 사이에 위치할 수 있다. Fc 영역에서 비-푸코실화 올리고사카라이드의 비율이 증가된 이러한 항체는 FcγRIIIa 수용체 결합이 개선되고 및/또는 이펙터 기능, 구체적으로 ADCC 기능이 개선될 수 있다. 예를 들어, US 2003/0157108; US 2004/0093621을 참조한다.
푸코실화가 감소된 항체를 생산할 수 있는 세포주의 예로는 단백질 푸코실화가 결핍된 Lec13 CHO 세포 (Ripka et al.　Arch. Biochem. Biophys.　249:533-545 (1986); US 2003/0157108; 및 WO 2004/056312, 특히 실시예 11), 및 녹아웃 세포주 (knockout cell lines), 예컨대 알파-1,6-푸코실트란스퍼라제 유전자, FUT8, 녹아웃 CHO 세포 (knockout CHO cells) (예를 들어, Yamane-Ohnuki et al.　Biotech. Bioeng.　87:614-622 (2004); Kanda, Y. et al.,　Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006); 및 WO2003/085107 참조), 또는 GDP-푸코스 합성 또는 수송체 단백질의 활성이 감소되거나 또는 폐지된 세포 (예를 들어, US2004259150, US2005031613, US2004132140, US2004110282 참조)를 포함한다.
추가 일 실시양태에서, 이등분된 올리고사카라이드 (bisected oligosaccharides)를 갖는 항체 변이체가 제공되며, 예를 들어 항체의 Fc 영역에 부착된 바이안테나리 올리고사카라이드는 GlcNAc에 의해 이등분된다. 이러한 항체 변이체는 전술한 바와 같이 푸코실화가 감소되고 및/또는 ADCC 기능이 개선될 수 있다. 이러한 항체 변이체의 예로는 예를 들어 Umana et al., Nat Biotechnol 17, 176-180 (1999); Ferrara et al., Biotechn Bioeng 93, 851-861 (2006); WO 99/54342; WO 2004/065540, WO 2003/011878에 기재되어 있다.
Fc 영역에 부착된 올리고사카라이드에 적어도 하나의 갈락토스 잔기를 갖는 항체 변이체가 또한 제공된다. 이러한 항체 변이체는 CDC 기능이 개선될 수 있다. 이러한 항체 변이체는 예를 들어 WO 1997/30087; WO 1998/58964; 및 WO 1999/22764에 기재되어 있다.
Fc 도메인
특정 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 이중특이적 항체는 제1 서브-유닛 및 제2 서브-유닛으로 이루어진 Fc 도메인을 포함할 수 있다. 항체 또는 이중특이적 항체와 관련하여 본원에 기재된 Fc 도메인의 특징은 본 발명의 항체에 포함된 Fc 도메인에도 동등하게 적용될 수 있는 것으로 이해된다.
항체 또는 이중특이적 항체의 Fc 도메인은 면역글로불린 분자의 중쇄 도메인을 포함하는 한 쌍의 폴리펩티드 사슬로 구성될 수 있다. 예를 들어, 면역글로불린 G (IgG) 분자의 Fc 도메인은 이량체이며, 각 서브-유닛은 CH2 및 CH3 IgG 중쇄 불변 도메인을 포함한다. Fc 도메인의 2개의 서브-유닛은 서로 안정하게 결합할 수 있다. 일 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 이중특이적 항체는 1개 이하의 Fc 도메인을 포함한다.
일 실시양태에서, 항체 또는 이중특이적 항체의 Fc 도메인은 IgG Fc 도메인일 수 있다. 추가의 특정 일 실시양태에서, Fc 도메인은 인간 Fc 도메인일 수 있다.
이종이량체화를 촉진하는 Fc 도메인 변형
본 발명에 따른 항체 또는 이중특이적 항체는 다양한 항원 결합 모이어티를 포함할 수 있으며, 이는 Fc 도메인의 2개의 서브-유닛들 중 하나 또는 다른 하나에 융합될 수 있으므로, Fc 도메인의 2개의 서브-유닛은 전형적으로 2개의 비-동일한 폴리펩티드 사슬에 포함된다. 이러한 폴리펩티드들의 재조합 공동-발현 및 후속하는 이량체화는 2개의 폴리펩티드의 여러 가능한 조합을 유도한다. 재조합 생산에서 항체 또는 이중특이적 항체의 수율 및 순도를 개선하기 위해, 항체 또는 이중특이적 항체의 Fc 도메인에 목적하는 폴리펩티드의 결합을 촉진하는 변형을 도입하는 것이 유리할 것이다.
따라서, 특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체 또는 이중특이적 항체의 Fc 도메인은 Fc 도메인의 제1 서브-유닛 및 제2 서브-유닛의 결합을 촉진하는 변형을 포함할 수 있다. 인간 IgG Fc 도메인의 2개의 서브-유닛들 간의 가장 광범위한 단백질-단백질 상호작용의 부위는 Fc 도메인의 CH3 도메인에 존재한다. 따라서, 일 실시양태에서, 상기 변형은 Fc 도메인의 CH3 도메인에 존재할 수 있다.
이종이량체화를 수행하기 위해 Fc 도메인의 CH3 도메인에서의 변형을 위한 여러 접근법이 존재하며, 이는 예를 들어 WO 96/27011, WO 98/050431, EP 1870459, WO 2007/110205, WO 2007/147901, WO 2009/089004, WO 2010/129304, WO 2011/90754, WO 2011/143545, WO 2012058768, WO 2013157954, WO 2013096291에 잘 기재되어 있다. 전형적으로, 이러한 모든 접근법에서, Fc 도메인의 제1 서브-유닛의 CH3 도메인 및 Fc 도메인의 제2 서브-유닛의 CH3 도메인은 모두 상보적인 방식으로 조작되어 각 CH3 도메인 (또는 이를 포함하는 중쇄)은 더 이상 그 자체와 동종이량체화할 수 없지만, 상보적으로 조작된 다른 CH3 도메인과 이종이량체화를 수행한다 (그러므로 제1 및 제2 CH3 도메인은 이종이량체화되고, 2개의 제1 또는 2개의 제2 CH3 도메인들 사이의 동종이량체는 형성되지 않는다). 중쇄 이종이량체화를 개선하기 위한 이러한 다양한 접근법이 항체 또는 이중특이적 항체에서 중쇄/경쇄 미스페어링 (heavy/light chain mispairing) 및 Bence Jones-타입 부산물을 감소시키는 중쇄-경쇄 변형 (예를 들어, 하나의 결합 암에서 VH 및 VL 교환/대체, 및 CH1/CL 계면에서 반대 전하로 하전된 아미노산의 치환 도입)과 조합된 다양한 대안으로서 고려된다.
특정 일 실시양태에서, Fc 도메인의 제1 및 제2 서브-유닛들의 결합을 촉진하는 상기 변형은 소위 "노브-인투-홀 (knob-into-hole)" 변형으로, 이는 Fc 도메인의 2개의 서브-유닛 중 하나에 "노브 (knob)" 변형 및 Fc 도메인의 2개의 서브-유닛 중 다른 하나에 "홀 (hole)" 변형을 포함한다.
상기 노브-인투-홀 기술 (knob-into-hole technology)은 예를 들어 U.S. Pat. Nos.　5,731,168; 7,695,936; Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 (1996) and Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001)에 기재되어 있다. 일반적으로, 상기 방법은 제1 폴리펩티드의 계면에 돌기 ("노브")를 도입하고, 제2 폴리펩티드의 계면에는 상응하는 공동 ("홀")을 도입하여, 돌기를 공동에 위치시켜서 이종이량체 형성을 촉진하고 동종이량체 형성을 방해하는 것을 포함한다. 돌기는 제1 폴리펩티드의 계면으로부터 작은 아미노산 측쇄를 더 큰 측쇄 (예를 들어, 티로신 또는 트립토판)로 대체하여 제작한다. 제2 폴리펩티드의 계면에서 큰 아미노산 측쇄를 더 작은 측쇄 (예를 들어, 알라닌 또는 트레오닌)로 대체함으로써 돌기와 동일하거나 또는 유사한 크기를 갖는 대상 공동을 형성한다.
Fc 수용체 결합 및/또는 이펙터 기능을 감소시키는 Fc 도메인 변형
Fc 도메인은 유리한 조직-혈액 분포 비율 및 표적 조직에서 우수한 축적에 기여하는 긴 혈청 반감기를 포함하는 유리한 약동학적 특성 (pharmacokinetic properties)을 항체 또는 이중특이적 항체에 부여한다. 그러나, 동시에 항체 또는 이중특이적 항체가 바람직한 항원-보유 세포보다는 Fc 수용체를 발현하는 세포를 표적화하는 바람직하지 않은 결과를 초래할 수 있다. 더욱이, Fc 수용체 신호전달 경로의 공동-활성화는 사이토카인 방출을 유도할 수 있으며, 이는 T 세포 활성화 특성 (예를 들어, 제2 항원 결합 모이어티가 활성화 T 세포 항원에 결합하는 이중특이적 항체의 실시양태에서) 및 항체 또는 이중특이적 항체의 긴 반감기와 조합하여, 전신 투여 시에 사이토카인 수용체의 과도한 활성화 및 심각한 부작용을 초래할 수 있다. T 세포 이외의 (Fc 수용체-보유) 면역 세포의 활성화는 T 세포, 예를 들어 NK 세포에 의한 잠재적 파괴로 인해 이중특이적 항체 (구체적으로 제2 항원 결합 모이어티가 활성화 T 세포 항원에 결합하는 이중특이적 항체)의 효능을 감소시킬 수 있다.
따라서, 특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체 또는 이중특이적 항체의 Fc 도메인은 천연 IgG1 Fc 도메인과 비교하여, Fc 수용체에 대한 결합 친화도의 감소 및/또는 이펙터 기능의 감소를 나타낼 수 있다. 이러한 일 실시양태에서, Fc 도메인 (또는 상기 Fc 도메인을 포함하는 항체 또는 이중특이적 항체)은 천연 IgG1 Fc 도메인 (또는 천연 IgG1 Fc 도메인을 포함하는 항체 또는 이중특이적 항체)과 비교하여 Fc 수용체에 대한 결합 친화도의 50% 미만, 바람직하게는 20% 미만, 더 바람직하게는 10% 미만, 가장 바람직하게는 5% 미만, 및/또는 천연 IgG1 Fc 도메인 (또는 천연 IgG1 Fc 도메인을 포함하는 항체 또는 이중특이적 항체)과 비교하여 이펙터 기능의 50% 미만, 바람직하게는 20% 미만, 더 바람직하게는 10% 미만, 가장 바람직하게는 5% 미만을 나타낸다. 일 실시양태에서, Fc 도메인 (또는 상기 Fc 도메인을 포함하는 항체 또는 이중특이적 항체)은 Fc 수용체에 실질적으로 결합하지 않고 및/또는 이펙터 기능을 유도하지 않는다. 특정 일 실시양태에서, Fc 수용체는 Fcγ 수용체이다. 일 실시양태에서, Fc 수용체는 인간 Fc 수용체일 수 있다. 일 실시양태에서, Fc 수용체는 활성화 Fc 수용체일 수 있다. 특정 일 실시양태에서, Fc 수용체는 활성화 인간 Fcγ 수용체, 더 구체적으로 인간 FcγRIIIa, FcγRI 또는 FcγRIIa, 가장 구체적으로 인간 FcγRIIIa일 수 있다. 일 실시양태에서, 이펙터 기능은 CDC, ADCC, ADCP 및 사이토카인 분비의 그룹으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다. 특정 일 실시양태에서, 이펙터 기능은 ADCC일 수 있다. 일 실시양태에서, Fc 도메인은 천연 IgG1 Fc 도메인과 비교하여, 신생아 Fc 수용체 (FcRn)에 대해 실질적으로 유사한 결합 친화도를 나타낼 수 있다. FcRn에 대해 실질적으로 유사한 결합은 Fc 도메인 (또는 상기 Fc 도메인을 포함하는 항체 또는 이중특이적 항체)이 FcRn에 대한 천연 IgG1 Fc 도메인 (또는 천연 IgG1 Fc 도메인을 포함하는 항체 또는 이중특이적 항체)의 결합 친화도의 약 70% 초과, 구체적으로 약 80% 초과, 더 구체적으로 약 90% 초과를 나타내는 경우 달성된다.
소정의 실시양태에서, Fc 도메인은 비-조작된 Fc 도메인과 비교하여, Fc 수용체에 대한 결합 친화도가 감소되고 및/또는 이펙터 기능이 감소되도록 조작될 수 있다. 특정 실시양태에서, 항체 또는 이중특이적 항체의 Fc 도메인은 Fc 수용체에 대한 Fc 도메인의 결합 친화도 및/또는 이펙터 기능을 감소시키는 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 포함할 수 있다. 전형적으로, 동일한 하나 이상의 아미노산 돌연변이가 Fc 도메인의 2개의 서브-유닛 각각에 존재한다. 일 실시양태에서, 아미노산 돌연변이는 Fc 수용체에 대한 Fc 도메인의 결합 친화도를 감소시킬 수 있다. 일 실시양태에서, 아미노산 돌연변이는 Fc 수용체에 대한 Fc 도메인의 결합 친화도를 적어도 2배, 적어도 5배, 또는 적어도 10배 만큼 감소시킬 수 있다. Fc 수용체에 대한 Fc 도메인의 결합 친화도를 감소시키는 하나 초과의 아미노산 돌연변이가 존재하는 실시양태에서, 이들 아미노산 돌연변이들의 조합은 Fc 수용체에 대한 Fc 도메인의 결합 친화도를 적어도 10배, 적어도 20배, 심지어는 적어도 50배 만큼 감소시킬 수 있다. 일 실시양태에서, 조작된 Fc 도메인을 포함하는 항체 또는 이중특이적 항체는 비-조작된 Fc 도메인을 포함하는 항체 또는 이중특이적 항체와 비교하여, Fc 수용체에 대한 결합 친화도의 20% 미만, 구체적으로 10% 미만, 더 구체적으로 5% 미만을 나타낸다. 특정 일 실시양태에서, Fc 수용체는 Fcγ 수용체일 수 있다. 일부 실시양태에서, Fc 수용체는 인간 Fc 수용체일 수 있다.
일부 실시양태에서, Fc 수용체는 활성화 Fc 수용체일 수 있다. 특정 일 실시양태에서, Fc 수용체는 활성화 인간 Fcγ 수용체, 더 구체적으로 인간 FcγRIIIa, FcγRI 또는 FcγRIIa, 가장 구체적으로 인간 FcγRIIIa일 수 있다. 바람직하게는, 이들 수용체들 각각에 대한 결합이 감소된다. 일부 실시양태에서, 보체 성분에 대한 결합 친화도, 특히 C1q에 대한 결합 친화도가 또한 감소된다. 일 실시양태에서, 신생아 Fc 수용체 (FcRn)에 대한 결합 친화도는 감소되지 않는다. FcRn에 대한 실질적으로 유사한 결합, 즉 Fc 도메인의 상기 수용체에 대한 결합 친화도의 보존은 Fc 도메인 (또는 상기 Fc 도메인을 포함하는 항체 또는 이중특이적 항체)이 FcRn에 대한 Fc 도메인의 비-조작된 형태 (또는 Fc 도메인의 비-조작된 형태를 포함하는 항체 또는 이중특이적 항체)의 결합 친화도의 약 70% 초과를 나타내는 경우 달성된다. Fc 도메인, 또는 상기 Fc 도메인을 포함하는 본 발명의 이중특이적 항체는 이러한 친화도의 약 80% 초과, 심지어 약 90% 초과를 나타낼 수 있다. 소정의 실시양태에서, 이중특이적 항체의 Fc 도메인은 비-조작된 Fc 도메인과 비교하여, 이펙터 기능이 감소되도록 조작될 수 있다. 이펙터 기능의 감소는 하기 중 하나 이상을 포함할 수 있지만 이에 한정되지 않는다: 보체 의존적 세포독성 (CDC) 감소, 항체-의존적 세포-매개 세포독성 (ADCC) 감소, 항체-의존적 세포 포식작용 (ADCP) 감소, 사이토카인 분비 감소, 항원-제시 세포에 의한 면역 복합체-매개 항원 흡수 감소, NK 세포에 대한 결합 감소, 대식세포에 대한 결합 감소, 단핵구에 대한 결합 감소, 다형핵 세포 (polymorphonuclear cells)에 대한 결합 감소, 아폽토시스를 유도하는 직접 신호전달 감소, 표적-결합된 항체의 가교 감소, 수지상 세포 성숙 감소, 또는 T 세포 프라이밍 감소. 일 실시양태에서, 이펙터 기능 감소는 CDC 감소, ADCC 감소, ADCP 감소, 및 사이토카인 분비 감소의 그룹으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다. 특정 일 실시양태에서, 이펙터 기능 감소는 ADCC 감소일 수 있다. 일 실시양태에서, ADCC 감소는 비-조작된 Fc 도메인 (또는 비-조작된 Fc 도메인을 포함하는 이중특이적 항체)에 의해 유도된 ADCC의 20% 미만일 수 있다.
일 실시양태에서, Fc 수용체에 대한 Fc 도메인의 결합 친화도 및/또는 이펙터 기능을 감소시키는 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환일 수 있다. 일 실시양태에서, Fc 도메인은 E233, L234, L235, N297, P331 및 P329 (Kabat EU index에 따른 넘버링)의 그룹으로부터 선택된 위치에 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 보다 구체적인 실시양태에서, 추가의 아미노산 치환은 E233P, L234A, L235A, L235E, N297A, N297D 또는 P331S, 바람직하게는 L234A 또는/및 L235A일 수 있다.
조성물, 제제 및 투여 경로
추가 일 양상에서, 본 발명은 예를 들어 하기 치료 방법 중 어느 하나에 사용하기 위한, 임의의 항체 또는 이중특이적 항체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 일 실시양태에서, 약학 조성물은 본원에 제공된 임의의 항체 또는 이중특이적 항체 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다. 다른 실시양태에서, 약학 조성물은 본원에 제공된 임의의 항체 또는 이중특이적 항체 및 예를 들어 하기 기재된 바와 같은 적어도 하나의 추가 치료제를 포함한다.
또한, 인 비보 투여에 적합한 형태로 본 발명의 항체 또는 이중특이적 항체를 생산하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 (a) 본 발명에 따른 항체 또는 이중특이적 항체를 수득하는 단계, 및 (b) 항체 또는 이중특이적 항체를 적어도 하나의 약학적으로 허용 가능한 담체와 제제화하여, 이에 의해 항체 또는 이중특이적 항체의 제제를 인 비보 투여를 위해 제제화하는 단계를 포함한다.
본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체에 용해되거나 또는 분산된 항체 또는 이중특이적 항체를 치료적으로 유효한 양으로 포함한다. 문구 "약학적으로 또는 약리학적으로 허용 가능한 (pharmaceutical or pharmacologically acceptable)"은 사용된 투여량 및 농도에서 수용자에게 일반적으로 무독성인, 즉 동물, 가령 예를 들어 적절하게는 인간에게 투여되는 경우 유해, 알레르기 또는 다른 불리한 반응을 일으키지 않는 분자 엔티티 (molecular entities) 및 조성물을 지칭한다. 항체 또는 이중특이적 항체 및 선택적으로 추가 활성 성분을 함유하는 약학 조성물의 제조는 본원에 참조로 통합된 Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990에 예시되는 바와 같이, 본 개시내용에 비추어 당업자에게 알려져 있다. 더욱이, 동물 (예를 들어, 인간)에게 투여하는 경우, 제제는 FDA Office of Biological Standards 또는 다른 국가의 해당 당국에서 요구하는 무균성, 발열성, 일반 안전성 및 순도 표준을 충족해야 한다는 것을 이해할 것이다. 바람직한 조성물은 동결건조 제제 또는 수용액이다. 본원에서 사용된, "약학적으로 허용 가능한 담체"는 임의 및 모든 용매, 완충제, 분산 매질, 코팅제, 계면활성제, 항산화제, 보존제 (예: 항박테리아제, 항진균제), 등장화제, 흡수 지연제, 염, 보존제, 항산화제, 단백질, 약물, 약물 안정화제, 폴리머, 겔, 결합제, 부형제, 붕해제, 활택제, 감미제, 풍미제, 염료, 예컨대 당업자에게 알려진 물질 및 이의 조합 (예를 들어, 본원에 참조로 통합된 Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990, pp. 1289-1329 참조)을 포함한다. 임의의 기존의 담체가 활성 성분에 적합하지 않은 경우를 제외하고, 치료 또는 약학 조성물에서 이의 사용이 고려된다.
본 발명의 항체 또는 이중특이적 항체 (및 임의의 추가 치료제)는 비경구, 폐내 및 비강내를 포함하는 임의의 적합한 수단으로 투여할 수 있고, 국소 치료를 목적하는 경우 병변내 투여할 수 있다. 비경구 주입에는 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하 투여를 포함한다. 투약 (dosing)은 투여가 단기 또는 만성인지 여부에 부분적으로 의존하는, 임의의 적합한 경로, 예를 들어 주사, 예컨대 정맥내 또는 피하 주사로 수행할 수 있다.
비경구 조성물에는 주사, 예를 들어 피하, 피내, 병변내, 정맥내, 동맥내, 근육내, 척수강내 또는 복강내 주사에 의한 투여를 위해 디자인된 것을 포함한다. 주사의 경우, 본 발명의 항체 또는 이중특이적 항체는 수용액, 바람직하게는 생리학적으로 적합한 완충제, 예컨대 Hanks 용액, Ringer 용액, 또는 생리 식염수 완충액에서 제제화할 수 있다. 용액은 제제화제 (formulatory agents) 예컨대 현탁화제, 안정화제 및/또는 분산화제를 함유할 수 있다. 대안적으로, 항체 또는 이중특이적 항체는 사용 전에, 적합한 비히클, 예를 들어 무-발열원 멸균수로 구성하기 위한 분말 형태일 수 있다. 멸균 주사용 용액은 필요에 따라 하기에 열거된 다양한 다른 성분과 함께 적절한 용매 중에 본 발명의 항체 또는 이중특이적 항체를 필요한 양으로 혼입시켜서 제조한다. 멸균은 예를 들어 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 쉽게 달성할 수 있다. 일반적으로, 분산액은 다양한 멸균 활성 성분을 염기성 분산 매질 및/또는 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클에 혼입하여 제조한다. 멸균 주사용 용액, 현탁액 또는 에멀젼의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법으로는 진공-건조 또는 동결-건조 기술로, 이전 멸균-여과된 액체 매질로부터의 임의의 추가 목적하는 성분과 활성 성분의 분말을 수득한다. 액체 매질은 필요한 경우 적절하게 완충시키고, 액체 희석제는 먼저 충분한 식염수 또는 글루코스로 등장성으로 만든 후에 주사해야 한다. 조성물은 제조 및 보관 조건하에 안정해야 하며, 미생물 예컨대 박테리아 및 진균의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다. 내독소 오염은 안전한 수준, 예를 들어 단백질을 0.5 ng/mg 미만으로, 최소한으로 유지해야 한다는 것을 이해할 것이다. 적합한 약학적으로 허용 가능한 담체에는 완충제 예컨대 포스페이트, 시트레이트, 및 다른 유기산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 보존제 (예컨대 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤잘코늄 클로라이드; 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 사이클로헥사놀; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 폴리머 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 리신; 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함하는 모노사카라이드, 디사카라이드, 및 다른 탄수화물; 킬레이트제 예컨대 EDTA; 당 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대 이온 예컨대 나트륨; 금속 복합체 (예를 들어, Zn-단백질 복합체); 및/또는 비이온성 계면활성제 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 수성 주사 현탁액은 현탁액의 점도를 증가시키는 화합물, 예컨대 소듐 카복시메틸 셀룰로스, 소르비톨, 덱스트란 등을 함유할 수 있다. 선택적으로, 현탁액은 또한 적합한 안정화제 또는 고농축 용액을 제조할 수 있도록 화합물의 용해도를 증가시키는 활성제를 함유할 수 있다. 추가로, 활성 화합물의 현탁액은 적절한 유성 주사 현탁액으로 제조할 수 있다. 적합한 친유성 용매 또는 비히클에는 지방 오일 (fatty oils) 예컨대 참깨 오일, 또는 합성 지방산 에스테르, 예컨대 에틸 클리트 (ethyl cleats) 또는 트리글리세리드, 또는 리포솜을 포함한다. 본 발명의 항체 또는 이중특이적 항체를 포함하는 약학 조성물은 기존의 혼합, 용해, 유화, 캡슐화, 포획 또는 동결건조 공정에 의해 제조할 수 있다. 약학 조성물은 단백질을 약학적으로 사용할 수 있는 제제로 가공하는 것을 촉진하는 하나 이상의 생리학적으로 허용 가능한 담체, 희석제, 부형제 또는 보조제를 사용하여 통상적인 방식으로 제제화할 수 있다. 적절한 제제는 선택한 투여 경로에 따라 달라진다.
치료 방법 및 조성물
본원에 제공된 임의의 항체 또는 이중특이적 항체를 치료 방법에 사용할 수 있다. 본 발명의 항체 또는 이중특이적 항체는 예를 들어 암 치료에서 면역요법제로서 사용할 수 있다.
치료 방법에 사용하는 경우, 본 발명의 항체 또는 이중특이적 항체는 우수한 의료 행위와 일치하는 방식으로 제제화, 투약, 투여할 것이다. 이러한 맥락에서 고려해야 할 요인에는 치료할 특정 장애, 치료할 특정 포유동물, 개별 환자의 임상 병태, 장애 원인, 약제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 일정, 및 의사에게 알려진 기타 요인을 포함한다.
일 양상에서, 약제 (medicament)로서 사용하기 위한 본 발명의 항체 또는 이중특이적 항체를 제공한다. 추가 양상에서, 질병 치료에 사용하기 위한 본 발명의 항체 또는 이중특이적 항체를 제공한다. 소정의 실시양태에서, 치료 방법에 사용하기 위한 본 발명의 항체 또는 이중특이적 항체를 제공한다.
일 실시양태에서, 본 발명은 질병의 치료가 필요한 개체에서 질병 치료에 사용하기 위한 본원에 기재된 항체 또는 이중특이적 항체를 제공한다. 소정의 실시양태에서, 본 발명은 치료적으로 유효한 양의 항체 또는 이중특이적 항체를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 질병을 가진 개체를 치료하는 방법에 사용하기 위한 항체 또는 이중특이적 항체를 제공한다. 일 실시양태에서, 질병은 암일 수 있다. 소정의 실시양태에서, 상기 방법은 치료적으로 유효한 양의 적어도 하나의 추가 치료제, 예를 들어 치료할 질병이 암인 경우 항암제를 개체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 추가 실시양태에서, 본 발명은 표적 세포, 구체적으로 종양 세포의 용해를 유도하는데 사용하기 위한 본원에 기재된 항체 또는 이중특이적 항체를 제공한다. 소정의 실시양태에서, 본 발명은 개체에게 유효량의 항체 또는 이중특이적 항체를 투여하여 표적 세포의 용해를 유도하는 단계를 포함하는, 개체에서 표적 세포, 구체적으로 종양 세포의 용해를 유도하는 방법에 사용하기 위한 항체 또는 이중특이적 항체를 제공한다. 임의의 상기 실시양태에 따른 "개체 (individual)"는 포유동물, 바람직하게는 인간이다.
일 실시양태에서, 치료할 질병은 암일 수 있다.
일 실시양태에서, 암은 고형암 또는 혈액암일 수 있다.
일 실시양태에서, 암은 백혈병, 직장암, 자궁내막암, 신장모세포종, 기저 세포 암종, 비인두암, 골종양, 식도암, 림프종, 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종, 갑상선 여포암, 간세포 암종, 구강암, 신세포 암종, 다발성 골수종, 중피종, 골육종, 골수이형성 증후군, 중간엽 종양, 연조직 육종, 지방 육종, 위장관 기질 종양, 악성 말초 신경초 종양 (MPNST), 유잉 육종, 평활근 육종, 중간엽 연골육종, 림프육종, 섬유육종, 횡문근육종, 기형종, 신경모세포종, 수모세포종, 신경교종, 양성 피부 종양, 버킷 림프종, 외투 세포 림프종, 미만성 거대 B 세포 림프종 (DLBCL), 소포 림프종, 변연부 림프종, 신경외배엽 종양, 상피 종양, 피부 T-세포 림프종 (CTCL), 말초 T 세포 림프종 (PTCL), 췌장암, 혈액 악성종양, 신장암, 종양 혈관계, 유방암, 신장암, 난소암, 상피성 난소암, 위암, 간암, 폐암, 결장직장암, 췌장암, 피부암, 방광암, 고환암, 자궁암, 전립선암, 소세포 폐암 (SCLC), 비-소세포 폐암 (NSCLC), 신경모세포종, 뇌암, 결장암, 편평세포 암종, 흑색종, 골수종, 자궁경부암, 갑상선암, 두경부암 및 부신암으로 구성된 그룹으로부터 선택될 수 있다.
일 실시양태에서, 백혈병은 급성 림프구성 백혈병 (ALL), 만성 림프구 백혈병 (CLL), 털세포 백혈병, 골수이형성 증후군 (MDS), 만성 골수성 백혈병 (CML) 및 급성 골수성 백혈병 (AML)으로 구성된 그룹으로부터 선택될 수 있고, 바람직하게는 AML일 수 있다.
일 실시양태에서, 암은 CLL-1을 발현하는 암일 수 있다.
당업자는 많은 경우에 항체 또는 이중특이적 항체가 치유를 제공하지는 않지만 단지 부분적인 유익만을 제공할 수 있다는 것을 쉽게 인식한다. 일부 실시양태에서, 일부 유익을 갖는 생리적 변화는 또한 치료적으로 유익한 것으로 간주된다. 따라서, 일부 실시양태에서, 생리학적 변화를 제공하는 항체 또는 이중특이적 항체의 양은 "유효량" 또는 "치료적으로 유효한 양"으로 간주된다. 치료가 필요한 대상체, 환자 또는 개체는 전형적으로 포유동물, 더 구체적으로 인간이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 이중특이적 항체의 유효량을 세포에 투여한다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 이중특이적 항체의 치료적으로 유효한 양을 질병 치료를 위해 개체에게 투여한다.
질병의 예방 또는 치료를 위해, 본 발명의 항체 또는 이중특이적 항체의 적절한 투여량 (단독으로 사용되거나 또는 하나 이상의 다른 추가 치료제와 병용되는 경우)은 치료할 질병의 타입, 투여 경로, 환자의 체중, 항체 또는 이중특이적 항체의 타입, 질병의 중증도 및 경과, 항체 또는 이중특이적 항체가 예방 또는 치료 목적으로 투여되는지 여부, 이전 또는 동시 치료 중재, 환자의 임상 병력, 및 항체 또는 이중특이적 항체에 대한 반응, 및 주치의의 재량에 의존할 것이다. 투여를 담당하는 의사는 어떤 경우에도 개별 대상체에 대한 조성물내 활성 성분(들)의 농도 및 적절한 용량(들)을 결정할 것이다. 단일 또는 다양한 시점에 걸친 다중 투여, 볼루스 투여 (bolus administration), 및 펄스 주입 (pulse infusion)을 포함하지만 이에 한정되지 않는 다양한 투약 일정이 본원에서 고려된다.
항체 또는 이중특이적 항체는 환자에게 한번에 또는 일련의 치료에 걸쳐 적절하게 투여한다. 질병의 타입 및 중증도에 따라, 약 1 ng/kg 내지 100 mg/kg의 항체 또는 이중특이적 항체를 환자에게 투여할 수 있다.
이하, 본 개시내용은 실시예에서 상세히 설명될 것이다.
하기 실시예는 단지 본 개시내용을 예시하기 위한 것이며, 본 개시내용을 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예 1: 항-CLL-1 항체의 제조
1.1. 마우스 면역화를 통한 모노클로날 항체 스크리닝
항-CLL-1 항체를 제조하기 위해, 마우스 면역화를 수행하여 모노클로날 항체를 스크리닝하였다.
간략하게, 2개의 마우스 그룹 (SJL 및 Balb/c 마우스, Charles River Laboratories, Hollister, CA)을 인간 및 시노몰구스 CLL1과 N-말단 인간 IgG1 Fc 융합 단백질을 혼합하여 면역화하였다 (마우스는 자체 생산하였고, 항원의 아미노산 서열은 표 4에 나타내었다).
ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) 스크리닝 및 FACS (fluorescence-activated cell sorting) 분석을 통해, 3개의 하이브리도마 클론을 인간 및 시노몰구스 CLL1 교차-반응성 클론으로 스크리닝하였다. 3개의 클론은 면역화된 Balb/c 마우스 그룹 유래의 16C6, 33C2 및 84A2이었다. 또한, 모든 클론은 CLL1 발현 세포주 (U937, HL60) 및 CLL-1을 과발현하는 세포주 (시노몰구스 CLL1 및 인간 CLL1이 HEK293E 세포에서 과발현됨)에 양성으로 결합하였다.
1.2. 하이브리도마 세포로부터 모노클로날 항체의 서열 분석 및 항체 키메라화
실시예 1.1.에서 면역화된 Balb/c 마우스 그룹으로부터 16C6, 33C2 및 84A2를 서열 분석하기 위해, 하이브리도마 세포로부터 모노클로날 항체를 서열 분석하였다.
간략하게, 뮤린 (murine) 16C6, 33C2 및 84A2의 전체 RNA를 Trizol 시약 (Ambion, Cat. No.: 15596-026)의 기술 매뉴얼에 따라 하이브리도마 세포로부터 단리하였다. 그 다음에 이소타입-특이적 안티센스 프라이머 또는 범용 프라이머를 사용하여 RT-PCR을 통해 전체 RNA를 cDNA로 역전사시켰다. VH (가변 중쇄) 및 VL (가변 경쇄)의 항체 단편을 cDNA 말단의 급속 증폭 (rapid amplification of cDNA ends: RACE) 기술을 사용하여 증폭시켰다. 증폭된 항체 단편을 클로닝 벡터 (cloning vectors)로 클로닝한 다음에, 서열 분석을 수행하였다. 3개의 CLL1 양성 클론의 가변 영역 및 CDR을 표 5, 표 6 및 표 7에 제시한다. 표에서, HCDR은 중쇄의 CDR이고, LCDR은 경쇄의 CDR이다.
키메라 항체를 생성하기 위해, 뮤린 항체의 VH 및 VL을 인간 IgG1 중쇄 불변 영역 및 인간 카파 경쇄 불변 영역과 각각 조합하고, 발현 벡터로 클로닝하였다. 키메라 항체의 불변 영역은 인간 IgG1에 하나 초과의 돌연변이 또는 변경 (예를 들어 ADCC 활성이 존재하지 않는 N297A (또한 'NA'라고 함))을 도입하여 변형시켰다. 그 다음에, 부위-지정 돌연변이 유발을 사용하여 N-글리코실화 잔기 또는 번역 후 변형 (post translational modification: PTM)을 제거하기 위해 3개 클론의 3개의 변형된 키메라 항체를 추가로 변형시켰다. 상기 기재된 16C6, 33C2 및 84A2의 변형된 서열을 표 8, 표 9 및 표 10에 제시한다. 이하, ch16C6은 N297A 돌연변이체를 갖는 중쇄를 포함하는 16C6 또는 16C6(NA)의 키메라 항체를 의미하고, ch33C2는 N297A 돌연변이체를 갖는 중쇄를 포함하는 33C2 또는 33C2(NA)의 키메라 항체를 의미하며, ch84C2는 N297A 돌연변이체를 갖는 중쇄 및 N12S 돌연변이체를 갖는 경쇄를 포함하는 84C2 또는 ch84A2 (NA/N12S)의 키메라 항체를 의미한다.
1.3. 항체 인간화
실시예 1.2.의 키메라 항체를 인간화하기 위해, 상동성 모델링 (homology modeling)을 수행하였다.
간략하게, 상동성 모델링을 통해, 뮤린 항체의 모델링된 구조를 수득하고, 역돌연변이 (back mutation)에 필요한 잔기를 분석하였다. 마우스 대응물과 최대 서열 동일성을 갖는 VH 및 VL에 대한 인간 수용체 프레임워크를 선택하였다. 그 다음에, 뮤린 항체의 상보성-결정 영역 (CDR)을 인간 수용체 프레임워크로 이식하였다. 다음, 이식된 항체의 합리적인 역돌연변이 디자인을 수행하였다. 디자인된 인간화 항체를 생산하고, 이들의 결합 특성을 평가하였다. 마우스 및 키메라화 클론 중에서, 16C6 및 33C2를 선두 후보 항체로 선택하였다. 특히, 키메라 항체의 CDR을 갖는 인간화 항체 (즉, 추가적 변형에 의해 PTM 또는 N-글리코실화 잔기가 제거됨)를 16C6(M14) 및 33C2(M12)로 명명한다. 16C6, 16C6(M14), 33C2 및 33C2(M12)의 인간화 중쇄 및 경쇄의 서열을 표 11 내지 14에 제시한다. 이하, hu16C6 및 hu16C6(M14)은 각각 16C6 및 16C6(M14)의 인간화 항체를 의미하고, hu33C2 및 33C2(M12)는 각각 33C2 및 33C2(M12)의 인간화 항체를 의미한다.
실시예 2. 항-CLL-1 단일특이적 항체의 활성 평가
2.1. 리간드 결합 활성 테스트 (ELISA)
실시예 1.2.의 항체 후보물질들은 huCLL1-His 및 hFc-huCLL1을 리간드로서 사용하여 ELISA로 리간드 결합 활성을 비교하는 분석을 수행하였다.
간략하게, 항원 (리간드)을 4℃에서 밤새 코팅하였다. 항원이 코팅된 플레이트를 PBS에 용해된 1% BSA로 4℃에서 2시간 동안 차단하고, 항체와 4℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 각 항체의 EC50 (nM)을 알아보기 위해, 항체 용액을 4배 연속 희석으로 50 nM 내지 0.2 pM의 농도로 제조하고, 희석된 항체를 각 웰에 대해 처리하고, 상기 플레이트를 1XPBST로 세척하였다. 그 다음에 HRP (horseradish peroxidase) (Thermo, 31414)와 접합된 염소 항-인간 IgG F(ab')2 교차-흡착된 2차 항체를 각 웰에 첨가하고, 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세척 후에, TMB (3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘) 기질 (Sigma, T0440)을 각 웰에 첨가하고, 450 nm에서 OD를 ELISA 플레이트 리더 (ELISA plate reader)로 측정하였다. 그 결과는 도 1 및 도 2에 제시한다.
도 1은 huCLL1-His를 리간드로 사용하는 일 실시양태에 따른 3가지 키메라 항체의 리간드 결합 활성을 보여주는 그래프이다.
도 2는 hFc-huCLL1을 리간드로 사용하는 일 실시양태에 따른 3가지 키메라 항체의 리간드 결합 활성을 보여주는 그래프이다.
도 1 및 도 2에 나타낸 바와 같이, 일 실시양태에 따른 3가지 키메라 항체 모두는 인간 CLL1-His 및 hFc-인간 CLL1 항원 모두에 강하게 결합한 것을 확인하였다.
계속해서, 실시예 1.2.의 항체 후보물질들은 상기 기재된 방식과 동일한 방식으로 hFc-시노몰구스 CLL1 50 ng/well 및 100 ng/well을 리간드로 사용하여 ELISA로 리간드 결합 활성을 비교하는 분석을 수행하였다. Genentech의 항-CLL-1 항체 6E7을 참조로 사용하였다. 그 결과는 도 3 및 도 4에 제시한다.
도 3은 hFc-시노몰구스 CLL1 50 ng/well을 리간드로 사용하는 일 실시양태에 따른 3가지 키메라 항체의 리간드 결합 활성을 보여주는 그래프이다.
도 4는 hFc-시노몰구스 CLL1 100 ng/well을 리간드로 사용하는 일 실시양태에 따른 3가지 키메라 항체의 리간드 결합 활성을 보여주는 그래프이다.
도 3 및 도 4에 나타낸 바와 같이, 일 실시양태에 따른 3가지 키메라 항체 모두는 항원 농도에 상관없이 hFc-시노몰구스 CLL1에 강하게 결합한 것을 확인하였다. 또한, 일 실시양태에 따른 3가지 키메라 항체 모두는 Genentech의 항체 6E7보다 더 강한 리간드 결합 활성을 갖는 것을 확인하였다.
실시예 1.2.의 키메라 항체 및 실시예 1.3.의 인간화 항체의 리간드 결합 활성을 상기 기재된 것과 동일한 방식으로 비교하였다. 그 결과는 도 5, 6 및 7에 제시한다.
도 5는 일 실시양태에 따른 키메라 항체 및 인간화 항체 hu16C6의 리간드 결합 활성을 보여주는 그래프이다.
도 6은 일 실시양태에 따른 키메라 항체 및 인간화 항체 hu33C2의 리간드 결합 활성을 보여주는 그래프이다.
도 7은 일 실시양태에 따른 다양한 인간화 항체 hu33C2의 리간드 결합 활성을 보여주는 그래프이다.
도 5 내지 도 7에 나타낸 바와 같이, 일 실시양태에 따른 인간화 항체는 일 실시양태에 따른 키메라 항체의 결합 친화도와 동등한 결합 친화도를 나타낸다. 뮤린 또는 키메라 항체의 인간화는 통상 결합 친화도를 감소시키거나 또는 결합 친화도를 심지어 손실하기 때문에, 이러한 결과는 일 실시양태에 따른 인간화 항체가 유리하다는 것을 입증하였다.
2.2. 세포 결합 활성 테스트 (FACS)
세포 결합 특성을 평가하기 위해, 실시예 1.2.의 키메라 항체 후보물질을 FACS를 사용하여 CLL1 음성 세포 (HEK293E 및 Jurkat) 및 다양한 CLL1 발현 암세포에서 분석하였다.
간략하게, 세포를 항체와 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 먼저, 세포를 분석 완충액 (PBS 중 1% BSA)으로 세척하였다. 그 다음에, FITC (Fluorescein isothiocyanate) (Sigma, F9512)와 접합된 항-인간 IgG Fc를 각 웰에 첨가하고, 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세척 후에, FITC의 MFI (Median Fluorescence Intensity)를 BD FACS Calibur (BD Biosciences)로 측정하였다. 그 결과는 표 15 및 도 8에 제시한다.
도 8은 CLL1 음성 세포 및 다양한 CLL1-발현 암세포에서 일 실시양태에 따른 키메라 항체의 세포 결합 활성을 보여주는 그래프이다.
표 15 및 도 8에 나타낸 바와 같이, 일 실시양태에 따른 키메라 항체 모두는 다양한 CLL1-발현 세포주에서 결합 효능 (binding potency)을 갖는 것을 확인하였다.
계속해서, 실시예 1.2.의 3가지 키메라 항체의 세포 결합 특성을 CLL1-발현 종양 세포주인 HL60 및 U937에서 상기 기재된 것과 동일한 방식으로 FACS를 사용하여 평가하였다. 그 결과는 도 9 및 10에 제시한다.
도 9는 HL60에서 일 실시양태에 따른 키메라 항체의 세포 결합 활성을 보여주는 그래프이다.
도 10은 U937에서 일 실시양태에 따른 키메라 항체의 세포 결합 활성을 보여주는 그래프이다.
도 9 및 도 10에 나타낸 바와 같이, 일 실시양태에 따른 키메라 항체 모두는 백혈병 세포주에서 결합 효능을 가지며, 특히 ch16C6 및 ch33C2 클론이 우수한 결합 효능을 갖는 것을 확인하였다.
계속해서, 실시예 1.2.의 3가지 키메라 항체의 세포 결합 특성을 상기 기재된 것과 동일한 방식으로 FACS를 사용하여 CynoCLL1_HEK293E에서 평가하였다. Genentech의 항-CLL-1 항체 6E7을 참조로 사용하였다. 그 결과는 도 11에 제시한다.
도 11은 시노몰구스 CLL-1을 과발현하는 HEK293E에서 일 실시양태에 따른 키메라 항체의 세포 결합 활성을 보여주는 그래프이다.
도 11에 나타낸 바와 같이, 일 실시양태에 따른 키메라 항체 모두는 시노몰구스 CLL-1을 과발현하는 HEK293E에서 6E7보다 더 높은 결합 효능을 갖는 것을 확인하였다. 또한, 일 실시양태에 따른 3가지 키메라 항체 모두는 Genentech의 항체인 6E7보다 더 높은 세포 결합 활성을 갖는 것을 확인하였다.
실시예 1.2.의 키메라 항체 및 실시예 1.3.의 인간화 후보물질의 항원 결합 특성들을 비교하기 위해, 항체를 상기 기재된 것과 동일한 방식으로 PL21 세포주를 사용하여 분석하였다. 그 결과는 도 12 및 도 13에 제시한다.
도 12는 일 실시양태에 따른 키메라 항체 및 다양한 인간화 항체 hu33C2의 세포 결합 활성을 보여주는 그래프이다.
도 13은 일 실시양태에 따른 키메라 항체 및 다양한 인간화 항체 hu16C6의 세포 결합 활성을 보여주는 그래프이다.
도 12 및 도 13에 나타낸 바와 같이, 일 실시양태에 따른 인간화 항체는 일 실시양태에 따른 키메라 항체의 세포 결합 활성과 동등한 세포 결합 활성을 나타내었다.
2.3. 항체-의존적 세포 세포독성 (ADCC) 평가
이펙터-매개 면역을 통한 종양 세포 사멸에서 일 실시양태에 따른 항-CLL-1 항체의 인 비트로 활성을 평가하기 위해, ADCC 리포터 생물분석 키트 (ADCC reporter bioassay kit) (Promega, G7102)를 사용하였다.
간략하게, 표적 세포 (HEK293-huCLL-1, HEK293, 이는 외인성 인간 CLL-1을 발현하는 세포주임)를 실험 당일에 분석 완충액 (0.5% 낮은 IgG FBS을 포함하는 RPMI 1640) 중에 96-웰 평면 백색 바닥 플레이트로 플레이팅하였다. 그 다음에 항체의 일련의 희석물을 상기 플레이트에 첨가하였다. ADCC 이펙터 세포를 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 CO2 인큐베이터에서 37℃에서 6시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후에, 플레이트를 실온에서 약 10분 동안 정치시킨 다음에, Bio-Glo 루시퍼라제 분석 시약 (Promega, G7940)을 각 웰에 첨가하였다. ADCC 유도 정도를 분석하기 위해 PHERAster FS BMG LABTECH로 발광 정도를 측정하였다. 용량-반응 곡선 (dose-response curve)은 GraphPad Prism 8을 사용하여 4-파라미터 모델로 피팅하였다. 그 결과는 도 14에 제시한다.
도 14는 일 실시양태에 따른 ch84A2, hu16C6 및 hu33C2의 ADCC를 보여주는 그래프이다.
도 14에 나타낸 바와 같이, 일 실시양태에 따른 항체 hu16C6 (VH1/VL1(M14)), hu33C2 (VH3/VL6 (M12)), ch84A2 (N12S)는 이펙터 세포에 의해 ADCC를 유도하는 것을 확인하였다. 또한, hu16C6 (VH1/VL1(M14)), hu33C2 (VH3/VL6 (M12)), ch84A2 (N12S)의 EC50은 각각 130.1 pM, 140.5 pM, 및 416.5 pM이었다.
2.4. ADC (Antibody Drug Conjugation)의 세포독성 활성의 평가
실시예 1.2.의 키메라 항체를 포함하는 ADC의 세포독성을 평가하기 위해, 상기 키메라 항체를 사용하여 다양한 ADC를 제조하고, 이의 세포 증식 억제 활성을 분석하였다.
간략하게, 기존 항체 경쇄의 위치 205에서의 발린 (V) (Kabat 넘버링에 따르며, 이는 또한 하기에도 적용됨)을 시스테인 (C)으로 돌연변이시키고, 환원제 예컨대 디티오트레이톨 (DTT)과 반응시켜서 항체 경쇄 V205C 상에 티올 기를 생성하고 (V205C T), 티올기와 약물 사이에 생성된 티오에테르 결합에 의해 항체를 약물과 접합시켰다. 이하, 각 키메라 항체에 대해 제조된 3개의 ADS를 "ch16C6(V205C)-T-AB009", "ch33C2(V205C)-T-AB009", "ch84A2(V205C)-T-AB009"로 지칭하였다. 또한, Genentech의 항-CLL-1 항체 6E7을 참조로 사용하였고, 동일한 방식으로 6E7의 ADC를 제조하였다 (이하, "6E7(N54A/V205C)-T-AB009"로 지칭함).
그 다음에, 상기 제조된 ADC의 암세포 증식 억제 활성을 상업적으로 이용 가능한 암 세포주 (EOL-1, THP-1 세포주 (ATCC))를 사용하여 측정하였다. 96-웰 플레이트에서, 각 웰에 각 암 세포주 5000개의 세포를 시딩하였다. 24시간 동안 배양한 후에, 이들을 표 16에 나타낸 바와 같이 5 내지 100000 pM 농도 (3배 연속 희석)의 ADC로 처리하였다. 6일 후에, WST-8 (Dojindo Molecular Technology Inc.) 염료를 사용하여 살아 있는 세포의 수를 측정하였다. 그 결과는 표 17, 도 15 및 도 16에 제시한다.
도 15는 EOL-1에서 일 실시양태에 따른 ADC의 세포 증식 억제 활성을 보여주는 그래프이다.
도 16은 THP-1에서 일 실시양태에 따른 ADC의 세포 증식 억제 활성을 보여주는 그래프이다.
표 17, 도 15 및 도 16에 나타낸 바와 같이, 항-CLL-1 모노클로날 항체인 16C6, 33C2 및 84A2는 EOL-1 및 THP-1 세포주에서 6E7보다 암세포를 사멸하는 능력이 개선된 것을 확인하였다.
실시예 3. 항-CLL-1/항-CD3 이중특이적 항체의 제조.
실시예 1.3.에서 제조된 항-CLL-1 클론 hu33C2 (VH3/VL6 (M12)), 및 PCT/CN2018/106618에 개시된 CD3 클론을 선택하여, 항-CLL-1/항-CD3 이중특이적 항체를 제조하였다. 이중특이적 항체는 PCT/CN2018/106766에 개시된 WuXiBody 생성방법 (WuXiBody generation method)에 따라 생산하였다.
간략하게, VLA-CL의 DNA 단편을 CMV 프로모터 및 인간 경쇄 신호 펩티드를 함유하는 선형화된 벡터에 삽입하였다. VHB-CH1 (33C2)-(G4S)3-VHA-CH1 (CD3) 또는 VHB-CH1 (33C2)-(G4S)2-VHA-CH1 (CD3)의 DNA 단편을 노브 돌연변이 (knob mutations)가 있는 인간 IgG1 불변 영역 CH2-CH3을 함유하는 선형화된 벡터에 삽입하였다. VHB-CH1의 DNA 단편을 홀 및 N297A 돌연변이가 있는 인간 IgG1 불변 영역 CH2-CH3을 함유하는 선형화된 벡터에 삽입하였다. 벡터들 모두는 CMV 프로모터 및 인간 항체 중쇄 신호 펩티드를 함유하였다. VHB-CL의 DNA 단편을 CMV 프로모터 및 인간 경쇄 신호 펩티드를 함유하는 선형화된 벡터에 삽입하였다. 여기서 VLA-CL은 항-CD3 항체의 경쇄 가변 도메인 (VLA) - 항-CD3 항체의 경쇄 불변 도메인 (CL)이고, VHB-CH1은 항-CLL-1 항체의 중쇄 가변 도메인 (VHB) - 항-CLL-1 항체의 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)이고, G4S는 GGGGS의 아미노산 서열로 구성된 펩티드 링커이고, VHA-CH1은 항-CD3 항체의 중쇄 가변 도메인 (VHB) - 항-CD3 항체의 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)이고, VHB-CL은 항-CLL-1 항체의 중쇄 가변 도메인 (VHB) - 항-CLL-1 항체의 경쇄 불변 도메인 (CL)이다.
항-CD3 부분의 경쇄: 항-CD3 부분의 중쇄: 항-CLL1 부분의 중쇄: 항-CLL1 부분의 경쇄의 발현을 위한 DNA 비율은 4:1:1:2이었다. 생존율이 95% 초과인 Expi293F 세포 2.94x106/mL를 세포 배양 배지 300 mL에서 제조하였다. 플라스미드 DNA 및 ExpiFectamine™293 시약을 혼합한 다음에, 세포 배양 배지에 첨가하였다. 세포 배양물을 플랫폼 진탕기 (platform shaker)에서 회전 속도 150 rpm으로 인큐베이션하였다. 온도를 37℃로 유지하고, CO2 수준을 8%로 유지하였다. 6일 동안 인큐베이션한 후에, 세포를 4000 rpm으로 25℃에서 10분 동안 원심분리하여 펠렛화하였다. 정제 및 겔 전기영동을 위해 상등액을 수집하였다. 상등액을 NuPAGETM 4 % 내지 12 %의 비스-트리스 단백질 겔 (Bis-Tris Protein Gels, ThermoFisher)의 지침에 따라 SDS-PAGE 겔에 로딩하고, PageRulerTM Unstained Protein Ladder (ThermoFisher)를 항체 샘플과 함께 사용하여 항체의 분자량을 결정하였다. 각 변이체의 나머지 상등액을 후속하는 정제에 사용하였다. 단백질 A 컬럼에 1 mL의 MabSelect Sure 수지를 사전-패킹하였다. 세포 배양 배지를 로딩하기 전에 상기 컬럼을 pH 7.0의 0.1M Tris로 평형화하였다. 이어서 로딩 후에, pH 7.0의 0.1M Tris로 컬럼을 세척하고, pH 3.5의 0.1M 시트레이트로 용출시켰다. 그 다음에, pH 9.0의 0.1M Tris를 첨가하여 용출된 용액을 중화시켰다. 그 다음에 샘플을 PBS 완충액 (Sangon Biotech, B548117-0500)에서 투석하였다. 마지막으로, 항체를 0.2 μm 필터를 통해 여과하고, 1.5 mL 튜브에 0.2 mL 또는 0.5 mL의 분취량으로 무균으로 분할하였다. 항체를 동결시키고, -80℃에서 보관하고, ABL로 배송하고, WuXi Biologics에서 인 비트로 분석을 수행하였다.
결론적으로, 링커의 타입 ((G4S)2 또는 (G4S)3)만이 상이한 이중특이적 항체의 2가지 종류를 제조하였다. (G4S)2 링커를 갖는 이중특이적 항체는 R2로 표시하고, (G4S)3을 갖는 이중특이적 항체는 R3으로 표시하였다. 이중특이적 항체의 아미노산 서열은 표 18에 제시한다. 이하, R2 링커를 갖는 이중특이적 항체는 또한 33C2/CD3-R2로 지칭하고, R3 링커를 갖는 이중특이적 항체는 또한 33C2/CD3-R3으로 지칭한다.
실시예 4. 항-CLL1/항-CD3 이중특이적 항체의 활성 평가
4.1. CLL-1-발현 세포에서 결합 활성 평가 (FACS)
실시예 3의 이중특이적 항체의 종양 항원 결합 특성을 평가하기 위해, 포유동물 세포에서 발현된 CLL1에 대한 33C2/CD3-R2 및 33C2/CD3-R3의 CLL1 표적화 부분의 결합 능력을 FACS를 사용하여 분석하였다.
간략하게, CLL1 양성 세포 (U937 및 HL60)를 33C2/CD3-R2 및 33C2/CD3-R3 항체와 인큐베이션하였다. FACS 완충액 (PBS 중 1% BSA)으로 세척한 후에, PE-항-인간 IgG 항체를 각 웰에 첨가하고, 4℃에서 60분 동안 인큐베이션하였다. PE (phycoerythrin)의 MFI (Median Fluorescence Intensity)를 FACS Calibur로 평가하였다. 한쪽 암에는 항-CD3 항원-결합 단편을 갖고 다른 쪽 암에는 항원-결합 단편이 존재하지 않는 BsAb mock/CD3을 대조군으로 사용하였다. Merus의 항-CLL-1/항-CD3 이중특이적 항체 MCLA-117을 참조로 사용하였다. 그 결과는 도 17 및 표 19에 제시한다.
도 17은 CLL1 발현 암세포에서 일 실시양태에 따른 이중특이적 항체의 세포 결합 활성을 보여주는 그래프이다.
도 17 및 표 19에 나타낸 바와 같이, CLL1 양성 암 세포주에서 일 실시양태에 따른 이중특이적 항체의 결합 활성은 MCLA-117 항체의 결합 활성보다 유의미하게 더 높은 것을 확인하였다.
4.2. CD3-발현 세포에서 결합 활성 평가 (FACS)
실시예 3의 이중특이적 항체의 CD3 결합 특성을 평가하기 위해, CD3 발현 포유동물 세포에 대한 33C2/CD3-R2 및 33C2/CD3-R3의 CD3 표적화 부분의 결합 활성을 FACS를 사용하여 분석하였다.
간략하게, CD3 발현 Jurkat 세포주를 33C2/CD3-R2 및 33C2/CD3-R3 항체와 인큐베이션하였다. FACS 완충액 (PBS 중 1% BSA)으로 세척한 후에, PE-항-인간 IgG 항체를 각 웰에 첨가하고, 4℃에서 60분 동안 인큐베이션하였다. PE의 MFI (Median Fluorescence Intensity)를 FACS Calibur로 평가하였다. 그 결과는 도 18에 제시한다.
도 18은 일 실시양태에 따른 이중특이적 항체의 세포 결합 활성을 보여주는 그래프이다.
도 18에 나타낸 바와 같이, 일 실시양태에 따른 이중특이적 항체는 CD3 발현 Jurkat 세포주에 용량-의존적 방식으로 강하게 결합한 것을 확인하였다.
4.3. 다양한 CLL1-발현 조건에서 이중특이적 항체의 인 비트로 T 세포 활성화
33C2/CD3-R2 및 33C2/CD3-R3 이중특이적 항체 (BsAbs)의 CLL1-특이적 T 세포 활성화 활성을 조사하기 위해, AML 세포주 (U937 및 HL-60)를 사용하는 Promega 키트를 사용하였다.
간략하게, U937 또는 HL-60 암세포의 2x104개 세포를 10% FBS가 포함된 Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 배지 중에 96-웰 플레이트에 시딩하였다. BsAbs 및 1x105 TCR/CD3 이펙터 세포 (Nuclear factor of activated T-cells, NFAT)를 첨가하였다. T-세포 활성화는 5% CO2 대기에서 37℃에서 6시간 동안 인큐베이션한 후에 평가하였다. 그 다음에, Bio-Glo 시약 (Promega)을 첨가하고, 발광 플레이트 리더로 발광을 측정하였다. 항-Claudin18.2를 갖는 이중특이적 항체 (비관련 항체)인 BsAbs U1R2, 및 항-CD3 항원-결합 단편을 음성 대조군으로 사용하였다. 그 결과는 도 19 및 표 20에 제시한다.
도 19는 일 실시양태에 따른 이중특이적 항체의 T 세포 활성화를 보여주는 그래프이다.
도 19 및 표 20에 나타낸 바와 같이, 일 실시양태에 따른 이중특이적 항체는 CLL1-특이적 T-세포 활성화를 용량-의존적 방식으로 유의미하게 유도한 반면에, 대조군 BsAb에서는 효과가 없었다.
4.4. 다양한 CLL1 발현 AML 세포주에서 이중특이적 항체의 T 세포 활성화 및 세포용해 활성
실시예 3의 이중특이적 항체의 T 세포 활성화 및 세포용해 활성을 조사하기 위해, AML 세포주 (U937 또는 HL60)에서 FACS를 수행하였다.
간략하게, U937 또는 HL60 현탁 표적 세포 (2x104 세포)를 96-웰 U 바닥 플레이트에 시딩하였다. 다양한 농도의 BsAbs 또는 대조군 분자 (U1R2) 및 인간 정제된 T 세포 (PBMC로부터 정제됨)를 5:1의 이펙터:표적 비율로 플레이트에 첨가하였다. 48시간 후에, T 세포 활성화 및 남아있는 CD33 양성 표적 세포의 수를 유세포 분석으로 정량화하였다. 특정 세포 용해의 퍼센트를 하기와 같이 계산하였다:
100-[100x(BsAbs로 처리한 표적 세포의 수)/(PBS로 처리한 표적 세포의 수)].
CD25 및 CD69의 세포 표면 수준을 T 세포 활성화 마커로서 사용하여 T 세포를 유세포 분석으로 분석하였다. BsAbs mock/CD3을 대조군으로 사용하고, Merus의 항-CLL-1/항-CD3 이중특이적 항체 MCLA-117을 참조로서 사용하였다. HL60 및 U937에서의 EC50 결과는 각각 도 20 및 도 21, 및 각각 표 21 및 표 22에 제시한다.
도 20은 HL-60에서 일 실시양태에 따른 이중특이적 항체의 T 세포 활성화 및 세포 용해 활성을 보여주는 그래프이다.
도 21은 U937에서 일 실시양태에 따른 이중특이적 항체의 T 세포 활성화 및 세포 용해 활성을 보여주는 그래프이다.
도 20 및 도 21, 및 표 21 및 표 22에 나타낸 바와 같이, 일 실시양태에 따른 이중특이적 항체는 MCLA-117보다 CLL1-특이적 T-세포 활성화 (CD25 및 CD69 상향조절로 측정함) 및 암세포 용해를 용량-의존적 방식으로 유의미하게 유도하였고, 대조군 BsAb에는 효과가 없었음을 확인하였다.
4.5. 다양한 CLL1 발현 세포주에서 인 비트로 세포독성
항원-의존적 용해를 촉진하는 일 실시양태에 따른 이중특이적 항체의 능력을 결정하기 위해, FarRed-표지된 U937 또는 HL60에서 BsAbs의 인 비트로 세포독성을 분석하였다.
간략하게, FarRed-표지된 U937 또는 HL60 현탁 표적 세포 (1.5x104 세포)를 96-웰 U 바닥 플레이트에 시딩하였다. 다양한 농도의 BsAbs 또는 대조군 분자 (U1R2) 및 다양한 공여자로부터 입수한 인간 PBMC 이펙터 세포를 10:1 또는 5:1의 이펙터:표적 비율로 플레이트에 첨가하였다. 모든 실험은 3중으로 수행하였다. 48시간 후에, 유세포 분석에서 Zombie Violet™Fixable Viability 키트 (BioLegend, Cat#423114)를 사용하여 표적 세포 사멸을 평가하였다. 특정 세포 용해의 퍼센트는 하기와 같이 계산하였다:
100 x [FarRed pos 사멸 세포/(FarRed pos 살아 있는 세포 + FarRed pos 사멸 세포)]
그 결과는 표 23 및 도 22에 제시한다.
도 22는 일 실시양태에 따른 이중특이적 항체의 항원-의존적 세포 용해 활성을 보여주는 그래프이다.
도 22 및 표 23에 나타낸 바와 같이, 일 실시양태에 따른 이중특이적 항체는 CLL1-양성 U937 및 HL60 세포의 T 세포-매개 용해를 농도-의존적 방식으로 유의미하게 유도한 반면에, 대조군 BsAb (U1R2)에서는 효과가 없었음을 확인하였다.
4.6. 이종이식 모델 (U937 모델)에서 인 비보 효능
실시예 3의 이중특이적 항체의 효능을 피하 U937 이종이식 모델 (subcutaneous U937 xenograft model)에서 평가하였다.
구체적으로, U937 피하 이종이식편을 가진 NOG 마우스에서 인 비보 항종양 활성을 평가하였다. 간략한 실험 계획은 하기와 같다:
종양 세포주: U937
마우스: NOG 그룹=9
종양 세포 s.c. 주사: 5x106 세포/head
5일차 확장 T 세포 i.p. 주사: 1x107 세포/head, 공여자 (ABL02T) (E:T=2:1)
6일차 hIgG1(Fc block) i.p. 주사
7일차 약물 (BsAbs) i.p. 주사 시작 (1 mpk, 2QW (twice per week), 총 6회)
그룹화: 7일차;
그룹 1 (대조군): PBS (비히클);
그룹 2: 33C2/CD3-R2; 및
그룹 3: 33C2/CD3-R3
종양 크기, 종양 성장 억제 중앙값 (%TGI), 및 체중을 5, 7, 10, 13, 17, 20, 및 24일차에 측정하였다.
이중특이적 항체의 CD3 암 (arm)은 마우스 CD3과 교차-반응성이 없기 때문에, 인간 T 세포를 5일차에 마우스 복강내로 주사한 후에, 33C2/CD3-R2 (그룹 2) 및 33C2/CD3-R3 (그룹 3), 또는 PBS (비히클) (그룹 1)를 1 mg/kg의 용량으로 3주 동안 1주당 2회 투여하였다. 종양 크기 (mm3) (=(W)x(L)x(H)x0.5), 종양 성장 억제 중앙값 (%TGI), 및 마우스의 체중을 측정하고, 그 결과는 도 23에 제시한다.
도 23은 U937 이종이식 모델에서 일 실시양태에 따른 이중특이적 항체의 인 비보 효능을 보여주는 그래프이다.
도 23에 나타낸 바와 같이, 마우스의 체중은 실험 그룹 (그룹 2 및 그룹 3) 및 대조군 (그룹 1) 모두에서 유의미하게 변화하지 않은 것을 확인하였다. 또한, 대조군은 실험 그룹인 33C2/CD3-R2, 33C2/CD3-R3 BsAbs-처리 마우스와 비교하여, 종양 부피가 유의미하게 더 큰 것을 확인하였다. 특히, 일 실시양태에 따른 이중특이적 항체는 U937 이종이식 모델에서 완전한 종양 퇴행을 유도하였다.
4.7. 이종이식 모델 (HL60-Lu 동소 AML 모델)에서 인 비보 효능
실시예 3의 이중특이적 항체의 효능 평가를 IV HL60-Lu 동소 AML 모델 (IV HL60-Lu orthotopic AML model)에서 수행하였다.
구체적으로, 인 비보 항종양 활성은 HL60-Lu IV (정맥내) 이종이식편을 가진 NOG 마우스에서 평가하였다. 간략한 실험 계획은 하기와 같다:
종양 세포주: HL 60luc
마우스: NOG 그룹 = 9
종양 세포 I.V. 주사: 1x107 세포/head
5일차 확장 T 세포 i.p. 주사: 1.5x107 세포/head, 공여자 (ABL14) (E:T=1.5:1)
6일차 hIgG1 (Fc block) i.p. 주사, 30 mpk
7일차 약물 (BsAbs) i.p. 주사 시작 (2QW (twice per week), 총 7회)
그룹화: 7일차;
그룹 1 (대조군): PBS (비히클);
그룹 2: 33C2/CD3-R2; 및
그룹 3: 33C2/CD3-R3
BLI (Bioluminescence index)를 7, 14, 21, 및 28일차에 수행하였다.
일 실시양태에 따른 이중특이적 항체의 효능 평가를 HL60-Lu 동소 AML 모델에서 수행하였다. 구체적으로, 확립된 파종성 HL60-luc 모델에서, 33C2/CD3-R2 또는 33C2/CD3-R3 치료는 IV 주사 후에 AML 세포의 골수로의 귀소가 확인된 후에 개시하였다.
간략하게, 전신 루시퍼라제 표지된 HL60 동소 모델을 생성하기 위해, 1×107 HL60-luc 세포를 0일차에 꼬리 정맥에 정맥내 주사하였다. 동물을 6일차에 생물발광 세기에 따라 7개의 그룹으로 무작위로 배정하였다. 7일차부터 시작하여, 마우스에게 0.5 mg/kg의 33C2/CD3-R2, 33C2/CD3-R3 또는 비히클을 1주 2회 복강내 주사로 총 7회 용량을 투여하였다. BLI (Bioluminescence index) 분석을 7, 14, 21, 및 28일차에 수행하였고, 그 결과는 도 24에 제시하고, 이의 정량 분석은 도 25에 제시한다. TGI 중앙값을 또한 14, 21, 및 28일차에 측정하였고, 그 결과는 표 24에 제시한다.
도 24는 HL60-Lu 동소 AML 모델에서 일 실시양태에 따른 이중특이적 항체 투여에서의 BLI (Bioluminescence index)를 보여주는 이미지이다.
도 25는 HL60-Lu 동소 AML 모델에서 일 실시양태에 따른 이중특이적 항체 투여에서의 BLI의 정량 분석 결과를 보여주는 그래프이다 (통계 분석: Two-way ANOVA (Bonferroni's multiple comparisons test), *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001).
도 24 및 도 25, 및 표 24에 나타낸 바와 같이, 일 실시양태에 따른 이중특이적 항체 0.5 mg/kg 투여는 28일차에 비히클-처리 그룹과 비교하여, 생물발광으로 평가한 결과 종양 성장을 유의미하게 (각각 90%, 및 80%) 억제한 것을 확인하였다. 또한, 일 실시양태에 따른 이중특이적 항체의 투여는 생물발광으로 관찰 시에 골수, 척추 및 뒷다리에서 종양 부담이 유의미하게 감소한 것을 확인하였다.
4.8. 이종이식 모델 (HL60-Lu 동소 AML 모델)에서 유효 용량 평가
HL60-Lu 동소 AML 모델에서 33C2/CD3-R3 이중특이적 항체의 유효 용량 평가를 실시예 4.7.에서와 동일한 방식으로 수행하였고, 단 이중특이적 항체의 투여 용량을 0.5 mg/kg, 0.05 mg/kg, 및 0.005 mg/kg으로 변경하였다.
BLI (Bioluminescence index) 분석을 7, 14, 21, 및 28일차에 수행하였고, 그 결과는 도 26에 제시하고, 이의 정량 분석은 도 27에 제시하고, 14, 21, 및 28일차에 TGI 중앙값을 또한 측정하고, 그 결과는 표 25에 제시한다. 또한, 유세포 분석 및 IHC 염색을 사용하여 골수내 종양 세포를 측정하고, 그 결과는 각각 도 28 및 도 29에 제시한다.
도 26은 HL60-Lu 동소 AML 모델에서 일 실시양태에 따른 이중특이적 항체 투여에서의 BLI (Bioluminescence index)를 보여주는 이미지이다.
도 27은 HL60-Lu 동소 AML 모델에서 일 실시양태에 따른 이중특이적 항체 투여에서의 BLI의 정량 분석을 보여주는 그래프이다 (***= P < 0.005).
도 28은 일 실시양태에 따른 이중특이적 항체 투여 후에 골수내 종양 세포를 FACS로 측정한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 29는 일 실시양태에 따른 이중특이적 항체 투여 후에 골수내 종양 세포를 IHC 염색으로 측정한 결과를 보여주는 이미지이다.
도 26 및 도 27, 및 표 25에 나타낸 바와 같이, 일 실시양태에 따른 이중특이적 항체 0.5 mg/kg, 0.05 mg/kg, 0.005 mg/kg 투여는 28일차에 비히클-처리한 마우스와 비교하여, 생물발광으로 평가한 결과 종양 성장을 유의미하게 (각각 91%, 78%, 및 32%) 억제한 것을 확인하였다. 또한, 일 실시양태에 따른 이중특이적 항체의 투여는 생물발광으로 관찰 시에, 골수, 척추 및 뒷다리에서 종양 부담이 용량-의존적 방식으로 유의미하게 감소한 것을 확인하였다.
도 28 및 도 29에 나타낸 바와 같이, 일 실시양태에 따른 이중특이적 항체의 투여로 골수내 종양 세포가 유의미하게 감소한 것을 확인하였다. 이러한 결과는 일 실시양태에 따른 항체가 또한 암 전이를 억제할 수 있음을 의미한다.
4.9. 원발성 환자 유래의 AML 모세포에서 T 세포 활성화 및 세포 독성
실시예 3의 이중특이적 항체의 활성을 조사하기 위해, 원발성 환자로부터 입수한 PBMC 유래의 AML 모세포 (AML blasts)를 사용하였다. AML 모세포는 동물 모델 또는 세포주보다 임상 환경에 더 가까운 조건에 해당한다.
먼저, PBMC를 Ficoll (GE Healthcare)을 사용하여 밀도-구배 원심분리로 단리하고, 항체로 염색하고, 단리 직후 FACS LSR Fortessa (BD Biosciences)를 사용하여 분석하여 4명의 원발성 환자 유래의 AML 모세포에서 CLL1 및 CD33의 발현을 조사하였다. 데이터는 FlowJo (BD Biosciences) 및 GraphPad Prism ver.9 (GraphPad Software, Inc.) 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. AML 모세포 집단의 각 IgG 음성 대조군 염색에 대해 양성 세포 퍼센트 및 상대 MFI를 결정하였다. 전체 혈액 세포 및 AML 모세포에서 CLL1 및 CD3의 발현 결과는 표 26에 제시한다.
4명의 AML 환자 샘플에서, AML 모세포에서 CLL1 발현 중앙값은 양성 세포의 퍼센트 및 MFI (Mean Fluorescence intensity) 측면 모두에서 CD33의 발현 중앙값과 유사하였다.
세포독성 및 T 세포 활성화를 유도하는 일 실시양태에 따른 이중특이적 항체의 능력을 엑스 비보 세포독성 분석에서 11명의 AML 환자 유래의 PBMC를 사용하여 평가하였다.
간략하게, 전술한 바와 같이 AML 환자 유래의 신선한 혈액으로부터 단리된 AML PBMCs (2x105)를 96-웰 U-바닥 플레이트에 3중으로 시딩하였다. BsAbs를 50 nM으로부터 10배 연속 희석하여 플레이트에 첨가하였다. U1R2는 대조군으로 사용하였다. 72시간 후에, CLL1 양성 AML 모세포의 세포 용해 (%) 및 T 세포 활성화 (%)를 유세포 분석으로 분석하고, 그 결과는 각각 도 30 및 도 31에 제시한다.
도 30은 AML 모세포에서 일 실시양태에 따른 이중특이적 항체의 세포 용해 활성을 보여주는 그래프이다.
도 31은 AML 모세포에서 일 실시양태에 따른 이중특이적 항체의 T 세포 활성화의 활성을 보여주는 그래프이다.
도 30에 나타낸 바와 같이, 일 실시양태에 따른 이중특이적 항체는 AML 모세포에서 세포독성을 농도-의존적 방식으로 유의미하게 유도한 것을 확인하였다 (EC50: 0.07 내지 0.2 nM). 도 31에 나타낸 바와 같이, 전술한 바와 같은 세포독성 결과는 또한 4명의 환자 샘플에서 T-세포 활성화 증가 (EC50: 0.0003 내지 0.04 nM)와 상관관계가 있었음을 확인하였다. 이들 데이터는 일 실시양태에 따른 이중특이적 항체가 인 비보 조건과 더욱 유사한 엑스 비보 환경에서 CLL1 양성 AML 세포를 사멸하는데 효과적이었음을 나타낸다.

Claims (29)

  1. 하기를 포함하는, 단리된 항-CLL-1 항체 (anti-CLL-1 antibody) 또는 이의 항원-결합 단편:
    (a) 서열 번호: 1, 2 및 3으로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1;
    (b) 서열 번호: 4, 5 및 6으로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2;
    (c) 서열 번호: 7, 8, 9, 10 및 11로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3;
    (d) 서열 번호: 12, 13, 14 및 15로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1;
    (e) 서열 번호: 16, 17 및 18로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2; 및
    (f) 서열 번호: 19, 20, 21 및 22로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 항-CLL-1 항체 또는 이의 단편은 서열 번호: 23 및 24로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함하는 항-CLL-1 항체.
  3. 청구항 1 또는 2에 있어서,
    상기 항-CLL-1 항체 또는 이의 단편은 서열 번호: 55로 구성된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변 영역을 포함하는 항-CLL-1 항체.
  4. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항-CLL-1 항체 또는 이의 단편은 서열 번호: 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 및 74로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항-CLL-1 항체.
  5. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항-CLL-1 항체 또는 이의 단편은 서열 번호: 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 및 75로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-CLL-1 항체.
  6. 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항-CLL-1 항체 또는 이의 단편은 서열 번호: 45로 구성된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 항-CLL-1 항체.
  7. 청구항 1 내지 6 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항-CLL-1 항체 또는 이의 단편은 서열 번호: 46으로 구성된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항-CLL-1 항체.
  8. 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항-CLL-1 항체 또는 이의 단편은 중쇄 가변 영역의 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3, 및 경쇄 가변 영역의 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3의 서열을 포함하고,
    (a) CDRH1, CDRH2 및 CDRH3은 각각 서열 번호: 1, 4 및 7이고, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3은 각각 서열 번호: 12, 16 및 19이거나;
    (b) CDRH1, CDRH2 및 CDRH3은 각각 서열 번호: 2, 5 및 8이고, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3은 각각 서열 번호: 13, 17 및 20이거나;
    (c) CDRH1, CDRH2 및 CDRH3은 각각 서열 번호: 3, 6 및 9이고, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3은 각각 서열 번호: 14, 18 및 21이거나;
    (d) CDRH1, CDRH2 및 CDRH3은 각각 서열 번호: 1, 4 및 10이고, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3은 각각 서열 번호: 15, 16 및 22이거나; 또는
    (e) CDRH1, CDRH2 및 CDRH3은 각각 서열 번호: 2, 5 및 11이고, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3은 각각 서열 번호: 13, 17 및 20인 항-CLL-1 항체.
  9. 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항-CLL-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 마우스 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 또는 완전 인간 항체인 항-CLL-1 항체.
  10. 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항-CLL-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 전체 IgG, Fab, Fab', F(ab')2, xFab, scFab, dsFv, Fv, scFv, scFv-Fc, scFab-Fc, 디아바디 (diabody), 미니바디 (minibody), scAb, dAb, half-IgG 및 이의 조합으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 항-CLL-1 항체.
  11. 청구항 1 내지 10 중 어느 한 항에 있어서,
    IgG1의 형태인 항-CLL-1 항체.
  12. 청구항 1 내지 11 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항-CLL-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 Fab 분자인 항-CLL-1 항체.
  13. 청구항 1 내지 12 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-CLL-1 항체 또는 항원-결합 단편은 하기 특징 중 하나 이상을 갖는 항-CLL-1 항체:
    (a) 인간 (human) CLL-1에의 결합;
    (b) 시노몰구스 원숭이 (cynomolgus monkey) CLL-1에의 결합;
    (c) 인간 말초 혈액 단핵구 (peripheral blood mononucleocyte: PBMC) 표면 상의 CLL-1에의 결합;
    (d) 시노몰구스 원숭이 PBMC 표면 상의 CLL-1에의 결합; 및
    (e) 암세포 표면 상의 CLL-1에의 결합.
  14. 청구항 1 내지 13 중 어느 한 항에 있어서,
    세포독성제 (cytotoxic agent)가 상기 항-CLL-1 항체 또는 항원-결합 단편의 적어도 일부에 접합되는 항-CLL-1 항체.
  15. 청구항 14에 있어서,
    상기 세포독성제가 상기 항-CLL-1 항체 또는 항원-결합 단편에 링커를 통해 부착되는 항-CLL-1 항체.
  16. 청구항 15에 있어서,
    상기 링커는 프로테아제 (protease)에 의해 절단 가능한 것인 항-CLL-1 항체.
  17. 청구항 1 내지 16 중 어느 한 항에 있어서, 약제 (medicament)로서 사용하기 위한 항-CLL-1 항체.
  18. 청구항 1 내지 17 중 어느 한 항에 있어서, 암을 치료 또는 예방하는데 사용하기 위한 항-CLL-1 항체.
  19. 식 Ab-(L-D)p를 포함하는 면역접합체 (immunoconjugate)로서, (a) Ab는 청구항 1 내지 16 중 어느 한 항의 항-CLL-1 항체이고; (b) L은 링커이며; (c) D는 세포독성제이고; (d) p는 1 내지 8의 범위인 면역접합체.
  20. 청구항 1 내지 16 중 어느 한 항의 항-CLL-1 항체를 코딩하는 단리된 핵산.
  21. 청구항 20의 단리된 핵산을 포함하는 벡터.
  22. 청구항 21의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  23. 청구항 1 내지 16 중 어느 한 항의 항-CLL-1 항체를 포함하는 약학 조성물.
  24. 청구항 23에 있어서, 암을 치료 또는 예방하기 위한 약학 조성물.
  25. 청구항 24에 있어서, 상기 암은 CLL-1을 발현하는 암인 것인 약학 조성물.
  26. 청구항 24 또는 25에 있어서,
    상기 암은 백혈병, 직장암, 자궁내막암, 신장모세포종 (nephroblastoma), 기저 세포 암종, 비인두암, 골종양, 식도암, 림프종, 호지킨 림프종 (Hodgkin's lymphoma), 비-호지킨 림프종 (non-Hodgkin's lymphoma), 갑상선 여포암 (follicular thyroid cancer), 간세포 암종, 구강암, 신세포 암종, 다발성 골수종, 중피종, 골육종, 골수이형성 증후군 (myelodysplastic syndrome), 중간엽 종양, 연조직 육종, 지방 육종, 위장관 기질 종양 (gastrointestinal stromal tumor), 악성 말초 신경초 종양 (malignant peripheral nerve sheath tumor: MPNST), 유잉 육종 (ewing sarcoma), 평활근 육종, 중간엽 연골육종, 림프육종, 섬유육종, 횡문근육종, 기형종, 신경모세포종, 수모세포종, 신경교종, 양성 피부 종양, 버킷 림프종 (Burkitt's lymphoma), 외투 세포 림프종 (mantle cell lymphoma), 미만성 거대 B 세포 림프종 (diffuse large B cell lymphoma: DLBCL), 소포 림프종 (follicular lymphoma), 변연부 림프종 (marginal zone lymphoma), 신경외배엽 종양, 상피 종양, 피부 T-세포 림프종 (cutaneous T-cell lymphoma: CTCL), 말초 T 세포 림프종 (peripheral T cell lymphoma: PTCL), 췌장암, 혈액 악성종양 (haematological malignancies), 신장암, 종양 혈관계 (tumor vasculature), 유방암, 신장암, 난소암, 상피성 난소암, 위암, 간암, 폐암, 결장직장암, 췌장암, 피부암, 방광암, 고환암, 자궁암, 전립선암, 소세포 폐암 (small cell lung cancer: SCLC), 비-소세포 폐암 (non-small cell lung cancer: NSCLC), 신경모세포종, 뇌암, 결장암, 편평세포 암종, 흑색종, 골수종, 자궁경부암, 갑상선암, 두경부암 및 부신암으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 약학 조성물.
  27. 청구항 26에 있어서,
    상기 백혈병은 급성 림프구성 백혈병 (acute lymphoblastic leukemia: ALL), 만성 림프구 백혈병 (chronic lymphocytic　leukemia: CLL), 털세포 백혈병 (hairy-cell leukemia), 골수이형성 증후군 (myelodysplastic syndrome: MDS), 만성 골수성 백혈병 (chronic myelogenous leukemia: CML) 및 급성 골수성 백혈병 (acute myeloid leukemia: AML)으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 약학 조성물.
  28. 청구항 1 내지 16 중 어느 한 항의 항-CLL-1 항체의 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 환자에서 암을 치료 또는 예방하는 방법.
  29. 암을 치료 또는 예방하기 위한 약제의 제조에서, 청구항 1 내지 16 중 어느 한 항의 항-CLL-1 항체의 용도.
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JP6471095B2 (ja) * 2012-09-27 2019-02-20 メルス ナムローゼ フェンノートシャップ Ｔ細胞エンゲージャーとしての二重特異性ＩｇＧ抗体
TW201718647A (zh) * 2015-06-16 2017-06-01 建南德克公司 抗-cll-1抗體及使用方法
WO2017010874A1 (en) * 2015-07-10 2017-01-19 Merus N.V. Human cd3 binding antibody
WO2019139888A1 (en) * 2018-01-09 2019-07-18 H. Lee Moffitt Cancer Center And Research Institute Inc. Compositions and methods for targeting clec12a-expressing cancers
CN111116753A (zh) * 2018-10-30 2020-05-08 上海泰因生物技术有限公司 一种双特异性抗体的制备方法
JP2022521036A (ja) * 2018-12-20 2022-04-05 メルス ナムローゼ フェンノートシャップ ＣＬＥＣ１２ＡｘＣＤ３二重特異性抗体及び疾患の治療方法
CN114641503A (zh) * 2019-09-13 2022-06-17 纪念斯隆-凯特琳癌症中心 抗cd371抗体及其用途

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