CN117881701A

CN117881701A - 抗cll-1抗体及其用途

Info

Publication number: CN117881701A
Application number: CN202280050576.1A
Authority: CN
Inventors: 成恩实; 权静雅; 金荣光; 金柱嬉; 朴景珍; 朴秀明; 成炳济; 柳炳敏; 李宝罗; 李守娟; 李世奈; 李良顺; 李恩姬; 林良美; 全宰亨; 郑镇沅
Original assignee: Aibile Biological Co ltd
Current assignee: Aibile Biological Co ltd
Priority date: 2021-07-20
Filing date: 2022-07-20
Publication date: 2024-04-12

Abstract

提供了抗CLL‑1抗体及其用途，根据一个方面的抗CLL‑1抗体，它能以高结合亲和力与CLL‑1结合，并能引起T细胞的激活，因此它能有效地用于预防或治疗表达CLL‑1的癌症。

Description

抗CLL-1抗体及其用途

技术领域

相关申请的交叉引用

本申请基于2021年7月20日提交的韩国临时专利申请号10-2021-0095142以及2021年12月10日提交的韩国临时专利申请号10-2021-0176638，并要求其优先权，其公开内容通过援引整体并入本文。

提供了抗CLL-1抗体及其用途。

背景技术

急性髓细胞性白血病(AML)是成年患者中最常见且致命的血液恶性肿瘤，其中大多数都预后不良。由于疾病的异质性、特异性靶抗原的缺乏以及在常规治疗后介导复发的白血病干细胞(LSC)的存在，导致AML仍然难以治疗。

CLEC12A(C型凝集素结构域家族12成员A；也称为C型凝集素样分子-1[CLL-1]、CD371、树突状细胞相关凝集素2[DCAL2]、髓样抑制性C型凝集素样受体[MICL]和杀伤细胞凝集素样受体-1[KLRL1])是一种在～90％的新诊断和复发AML上表达的髓样分化抗原。它是一种II型跨膜糖蛋白，其包括细胞外C-末端凝集素结构域、跨膜区和N-末端细胞质尾。

基于单克隆抗体(mAb)的疗法已经成为癌症的重要治疗方式。白血病非常适合于这种方法，因为血液、骨髓、脾和淋巴结中的恶性细胞的可及性以及造血分化的各种谱系和阶段的明确定义的免疫表型，其允许鉴定抗原靶标。对大多数急性髓细胞性白血病(AML)的研究都集中在CD33上。然而，未经偶联的抗CD33 mAb林妥珠单抗(lintuzumab)的应答具有针对AML的中等单一药剂和活性，并且当与常规化疗组合时，在两个随机试验中未能改善患者结果。

本领域需要靶向包括CLL-1的AML的安全且有效的药物，用于诊断和治疗CLL-1相关病症，诸如癌症。本发明满足了这一需求并提供了其他益处。

发明内容

技术问题

本公开的一方面提供了一种分离的抗CLL-1或其抗原结合片段。

本公开的另一方面提供了一种编码抗CLL-1抗体的分离的核酸。

本公开的另一方面提供了一种包括该分离的核酸的载体。

本公开的另一方面提供了一种包括该载体的宿主细胞。

本公开的另一方面提供了一种包括该抗CLL-1抗体的药物组合物。

本公开的另一个方面提供了一种治疗或预防有此需要的患者的癌症的方法，其包括向患者给药有效量的抗CLL-1抗体。

本公开的另一方面提供了抗CLL-1抗体在制备用于治疗或预防癌症的药物中的用途。

本公开的另一方面提供了抗CLL-1抗体用于治疗或预防癌症的用途。

技术方案

本公开的一方面提供了一种分离的抗CLL-1抗体或其抗原结合片段，包括：(a)VHCDR1，其包括选自由SEQ ID NO:1、2和3组成的组的氨基酸序列；(b)VH CDR2，其包括选自由SEQ ID NO:4、5和6组成的组的氨基酸序列；(c)VH CDR3，其包括选自由SEQ ID NO:7、8、9、10和11组成的组的氨基酸序列；(d)VL CDR1，其包括选自由SEQ ID NO:12、13、14和15组成的组的氨基酸序列；(e)VL CDR2，其包括选自由SEQ ID NO:16、17和18组成的组的氨基酸序列；以及(f)VL CDR3，其包括选自由SEQ ID NO:19、20、21和22组成的组的氨基酸序列。

在实施方式中，抗CLL-1抗体或其片段可以包括重链恒定区，其包括选自由SEQ IDNO:23和24组成的组的氨基酸序列。

在实施方式中，抗CLL-1抗体或其片段可以包括轻链恒定区，其包含由SEQ ID NO:55组成的氨基酸序列。

在实施方式中，抗CLL-1抗体或其片段可以包括重链恒定区，其包括选自由SEQ IDNO:23和24组成的组的氨基酸序列；和轻链恒定区，其包括由SEQ ID NO:55组成的氨基酸序列。

在实施方式中，抗CLL-1抗体或其片段可以包括重链可变区，其包括选自由SEQ IDNO:25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35和74组成的组的氨基酸序列。

在实施方式中，抗CLL-1抗体或其片段可以包括轻链可变区，其包括选自由SEQ IDNO:36、37、38、39、40、41、42、43、44和75组成的组的氨基酸序列。

在实施方式中，抗CLL-1抗体或其片段可以包括重链可变区，其包括选自由SEQ IDNO:25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35和74组成的组的氨基酸序列；和轻链可变区，其包括选自由SEQ ID NO:36、37、38、39、40、41、42、43、44和75组成的组的氨基酸序列。

在实施方式中，抗CLL-1抗体或其片段可以包括重链，其包括由SEQ ID NO:45组成的氨基酸序列。

在实施方式中，抗CLL-1抗体或其片段可以包括轻链，其包括由SEQ ID NO:46组成的氨基酸序列。

在实施方式中，抗CLL-1抗体或其片段可以包括重链，其包括由SEQ ID NO:45组成的氨基酸序列；和轻链，其包括由SEQ ID NO:46组成的氨基酸序列。

在实施方式中，抗CLL-1抗体或其片段可以包括重链可变区的CDRH1、CDRH2和CDRH3以及轻链可变区的CDRL1、CDRL2和CDRL3的序列，其为以下的任意一种：(a)CDRH1、CDRH2和CDRH3分别为SEQ ID NO:1、4和7，并且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别为SEQ ID NO:12、16和19；(b)CDRH1、CDRH2和CDRH3分别为SEQ ID NO:2、5和8，并且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别为SEQ ID NO:13、17和20；(c)CDRH1、CDRH2和CDRH3分别为SEQ ID NO:3、6和9，并且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别为SEQ ID NO:14、18和21；(d)CDRH1、CDRH2和CDRH3分别为SEQ ID NO:1、4和10，并且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别为SEQ ID NO:15、16和22；以及(e)CDRH1、CDRH2和CDRH3分别为SEQ ID NO:2、5和11，并且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别为SEQ ID NO:13、17和20。

在实施方式中，抗CLL-1抗体或其抗原结合片段可以是小鼠抗体、嵌合抗体、人源化抗体或全人抗体。

在实施方式中，抗CLL-1抗体或其抗原结合片段可以选自由以下组成的组：全IgG、Fab、Fab'、F(ab')2、xFab、scFab、dsFv、Fv、scFv、scFv-Fc、scFab-Fc、双抗体、微抗体、scAb、dAb、半IgG及其组合。

在实施方式中，抗CLL-1抗体或其抗原结合片段可以是IgG的形式，优选IgG1。

在实施方式中，抗CLL-1抗体或其抗原结合片段可以是Fab分子。

在实施方式中，抗CLL-1抗体或其抗原结合片段可以具有一种或多种以下特征：(a)与人CLL-1结合；(b)与食蟹猴CLL-1结合；(c)与人外周血单核细胞(PBMC)表面的CLL-1结合；(d)与食蟹猴PBMC表面的CLL-1结合；和(e)与癌细胞表面的CLL-1结合。

在实施方式中，细胞毒性剂可以与抗CLL-1抗体或抗原结合片段的至少一部分偶联。

在实施方式中，细胞毒性剂可以通过接头与抗CLL-1抗体或抗原结合片段附着。

在实施方式中，接头可以是被蛋白酶可切割的。

在实施方式中，抗CLL-1抗体可以用作药物。

在实施方式中，抗CLL-1抗体可以用于治疗或预防癌症。

本公开的另一方面提供了包括式Ab-(L-D)p的免疫偶联物，其中：(a)Ab是权利要求1所述的抗CLL-1抗体；(b)L是接头；(c)D是细胞毒性剂；以及(d)p的范围为1至8。

本公开的另一方面提供了一种包括该分离的核酸的载体。

本公开的另一方面提供了一种包括该载体的宿主细胞。

在实施方式中，该药物组合物可以用于治疗或预防癌症。

在实施方式中，癌症可以是实体癌或血癌。

在实施方式中，癌症可以选自由以下组成的组：白血病、直肠癌、子宫内膜癌、肾母细胞瘤、基底细胞癌、鼻咽癌、骨肿瘤、食道癌、淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、滤泡状甲状腺癌、肝细胞癌、口腔癌、肾细胞癌、多发性骨髓瘤、间皮瘤、骨肉瘤、骨髓增生异常综合征、间叶性肿瘤、软组织肉瘤、脂肪肉瘤、胃肠间质瘤、恶性外周神经鞘瘤(MPNST)、尤文肉瘤、平滑肌肉瘤、间叶性软骨肉瘤、淋巴肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、畸胎瘤、神经母细胞瘤、髓母细胞瘤、胶质瘤、良性皮肤肿瘤、伯基特淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)、套细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、神经外胚层肿瘤、上皮性肿瘤、皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)、外周T细胞淋巴瘤(PTCL)、胰腺癌、血液恶性肿瘤、肾癌、肿瘤血管、乳腺癌、肾癌、卵巢癌、上皮性卵巢癌、胃癌、肝癌、肺癌、结直肠癌、胰脏癌、皮肤癌、膀胱癌、睾丸癌、子宫癌、前列腺癌、小细胞肺癌(SCLC)、非小细胞肺癌(NSCLC)、成神经细胞瘤、脑癌、结肠癌、鳞状细胞癌、黑色素瘤、骨髓瘤、宫颈癌、甲状腺癌、头颈癌和肾上腺癌。

在实施方式中，白血病可以选自由以下组成的组：急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、毛细胞白血病、骨髓增生异常综合征(MDS)、慢性髓细胞性白血病(CML)和急性髓细胞性白血病(AML)，优选地为AML。

在实施方式中，癌症可以是表达CLL-1的癌症。

有益效果

根据一个方面的抗CLL-1抗体，它能以高结合亲和力与CLL-1结合，并能引起T细胞的激活，因此它能有效地用于预防或治疗表达CLL-1的癌症。

附图说明

图1是示出根据使用huCLL1-His作为配体的实施方式的三种嵌合抗体的配体结合活性的图表。

图2是示出根据使用hFc-huCLL1作为配体的实施方式的三种嵌合抗体的配体结合活性的图表。

图3是示出根据使用50ng/孔的hFc-食蟹猴CLL1作为配体的实施方式的三种嵌合抗体的配体结合活性的图表。

图4是示出根据使用100ng/孔的hFc-食蟹猴CLL1作为配体的实施方式的三种嵌合抗体的配体结合活性的图表。

图5是示出根据实施方式的嵌合抗体和人源化抗体hu16C6的配体结合活性的图表。

图6是示出根据实施方式的嵌合抗体和人源化抗体hu33C2的配体结合活性的图表。

图7是示出根据实施方式的各种人源化抗体hu33C2的配体结合活性的图表。

图8是示出根据实施方式的嵌合抗体在CLL1阴性细胞和各种表达CLL1的癌细胞中的细胞结合活性的图表。

图9是示出根据实施方式的嵌合抗体在HL60中的细胞结合活性的图表。

图10是示出根据实施方式的嵌合抗体在U937中的细胞结合活性的图表。

图11是示出根据实施方式的嵌合抗体在过表达食蟹猴CLL-1的HEK293E中的细胞结合活性的图表。

图12是示出根据实施方式的嵌合抗体和各种人源化抗体hu33C2的细胞结合活性的图表。

图13是显示根据实施方式的嵌合抗体和各种人源化抗体hu16C6的细胞结合活性的图表。

图14是示出根据实施方式的ch84A2、hu16C6和hu33C2的ADCC的图表。

图15是示出根据实施方式的ADC在EOL-1中的细胞增殖抑制活性的图表。

图16是示出根据实施方式的ADC在THP-1中的细胞增殖抑制活性的图表。

图17是示出根据实施方式的双特异性抗体在表达CLL1的癌细胞中的细胞结合活性的图表。

图18是示出根据实施方式的双特异性抗体的细胞结合活性的图表。

图19是示出根据实施方式的双特异性抗体的T细胞激活的图表。

图20是示出根据实施方式的双特异性抗体在HL-60中的T细胞激活和细胞裂解活性的图表。

图21是示出根据实施方式的双特异性抗体在U937中的T细胞激活和细胞裂解活性的图表。

图22是示出根据实施方式的双特异性抗体的抗原依赖性细胞裂解活性的图表。

图23是示出根据实施方式的双特异性抗体在U937异种移植物模型中的体内功效的图表。

图24是示出在HL60-Lu原位AML模型中给药根据实施方式的双特异性抗体的BLI(生物发光指数)的图像。

图25是示出在HL60-Lu原位AML模型中给药根据实施方式的双特异性抗体的BLI的定量分析结果的图表(统计分析：双向ANOVA(邦费罗尼(Bonferroni)多重比较检验)，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001)。

图26是示出在HL60-Lu原位AML模型中给药根据实施方式的双特异性抗体的BLI(生物发光指数)的图像。

图27是示出在HL60-Lu原位AML模型中给药根据实施方式的双特异性抗体的BLI的定量分析的图表(***＝P<0.005)。

图28是示出在给药根据实施方式的双特异性抗体后通过FACS测量骨髓中肿瘤细胞的结果的图表。

图29是示出在给药根据实施方式的双特异性抗体后通过IHC染色测量骨髓中肿瘤细胞的结果的图表。

图30是示出根据实施方式的双特异性抗体在AML母细胞(blast)中的细胞裂解的活性的图表。

图31是示出根据实施方式的双特异性抗体在AML母细胞中的T细胞激活的活性的图表。

具体实施方式

定义

除非另有定义，本文使用的技术和科学术语具有与本发明所属领域中通常使用的相同含义。出于解释本说明书的目的，将应用以下定义，并且只要适当，以单数使用的术语也将包括复数，反之亦然。

本文的术语“抗体”以最广泛的意义使用，并且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、单特异性和多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出所需的抗原结合活性。

如本文所用，术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体的群体中获得的抗体，即组成该群体的单个抗体是相同的和/或结合相同的表位，除了可能的变体抗体，例如含有天然存在的突变的变异抗体或在单克隆抗体制剂的生产过程中产生的变异抗体，这些变体通常少量地存在。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂的每种单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。

如本文所用，术语“单特异性”抗体表示具有一个或多个结合位点的抗体，每个结合位点结合相同抗原的相同表位。术语“双特异性”意味着抗体能够特异性结合至少两种不同的抗原决定簇，例如两个结合位点，其每个结合位点由一对抗体重链可变结构域(VH)和抗体轻链可变结构域(VL)形成，以结合不同的抗原或同一抗原上的不同表位。这种双特异性抗体是1+1形式。其它双特异性抗体形式是2+1或1+2形式(包括第一抗原或表位的两个结合位点和第二抗原或表位的一个结合位点)或2+2形式(包括第一抗原或表位的两个结合位点和第二抗原或表位的两个结合位点)。通常，双特异性抗体包括两个抗原结合位点，其每个位点对不同的抗原决定簇具有特异性。

当前申请中所用的术语“价的”表示在抗体或抗体片段中存在特定数量的结合结构域。因此，术语“单价的”、“二价的”、“四价的”和“六价的”分别表示抗体中存在一个结合结构域、两个结合结构域、四个结合结构域和六个结合结构域。根据本发明的双特异性抗体至少是“二价的”，并且可以是“三价的”或“多价的”(例如，“四价的”或“六价的”)。在特定方面，本发明的抗体具有两个或更多个结合位点，并且是双特异性的。也就是说，即使在有两个以上结合位点的情况下(即，抗体是三价或多价的)，抗体也可以是双特异性的。

术语“全长抗体”、“完整抗体”和“全抗体”在本文中可互换使用，以指具有与天然抗体结构基本相似的结构的抗体。“天然抗体”指具有不同结构的天然免疫球蛋白分子。例如，天然IgG类抗体是大约150,000道尔顿的异源四聚糖蛋白，其由二硫键连接的两条轻链和两条重链组成。从N-末端到C-末端，每条重链都有一个可变区(VH)，也称为可变重结构域或重链可变结构域，紧接着是三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)，也称为重链恒定区。类似地，从N-末端到C-末端，每条轻链具有一个可变区(VL)，也称为可变轻结构域或轻链可变结构域，紧接着是轻链恒定结构域(CL)，也称为轻链恒定区。抗体的重链可以归为五种类型(称为α(IgA)、δ(IgD)、ε(IgE)、γ(IgG)或μ(IgM))中的一种，其中的一些可以进一步被分为亚型，例如γ1(IgG1)、γ2(IgG2)、γ3(IgG3)、γ4(IgG4)、α1(IgA1)和α2(IgA2)。根据其恒定结构域的氨基酸序列，抗体的轻链可以归为两种类型(称为kappa(κ)和lambda(λ))中的一种。

如上所述，可变区允许抗体选择性识别并特异性结合抗原上的表位。也就是说，抗体的VL结构域和VH结构域或互补决定区(CDR)的子集组合形成了定义三维抗原结合位点的可变区。这种四元抗体结构形成存在于Y的每个臂的末端的抗原结合位点。更特别地说，抗原结合位点由VH和VL链的各自上的三个CDR(即CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3)限定。在某些情况下，例如，在源自骆驼科物种或基于骆驼科免疫球蛋白工程改造的某些免疫球蛋白分子的情况下，完整的免疫球蛋白分子可以仅由重链组成，没有轻链。参见，例如，Hamers-Casterman et al.,Nature 363:446-448(1993)。

术语“CDR-H”、“HCDR”和“CDRH”在本文中可互换使用，以指CDR的VH链(例如，CDR-H1、HCDR1和CDRH1是指CDR的VH1)。术语“CDR-L”、“LCDR”和“CDRL”在本文中可互换使用，以指CDR的VL链(例如，CDR-L1、LCDR1和CDRL1是指CDR的VL1)。

在天然存在的抗体中，在每个抗原结合结构域中所存在的六个“互补决定区”或“CDR”为短的、不连续的氨基酸序列，当抗体在水性环境中呈现其三维构型时，其被经特异性定位以形成抗原结合结构域。抗原结合结构域中的其余氨基酸，称为“框架”区，显示出较小的分子间变异性。框架区大部分采用β-折叠构型，并且CDR形成连接β-折叠结构的环，在某些情况下形成β-折叠结构的一部分。因此，框架区通过链间非共价相互作用形成支架，该支架向CDR提供了正确方向的定位。由经定位的CDR形成的抗原结合结构域定义了与免疫反应性抗原上的表位互补的表面。这种互补表面促进了抗体与其同源表位的非共价结合。对于任何给定的重链或轻链可变区，本领域普通技术人员可以容易地分别鉴定包括CDR和框架区的氨基酸，因为它们已经被精确定义(参见www.bioinf.org.uk:Dr.AndrewC.R.Martin's Group；"Sequences of Proteins of Immunological Interest,"Kabat,E.,et al.,U.S.Department of Health and Human Services,(1983)；以及Chothia andLesk,J.MoI.Biol.,196:901-917(1987))。

在本领域中使用和/或接受的术语有两种或更多种定义的情况下，除非有明确的相反说明，否则本文所用的术语的定义旨在包括所有这类含义。具体的实例是使用术语“互补决定区”(“CDR”)来描述在重链和轻链多肽的可变区内发现的非连续抗原结合位点。这一特定区域已由Kabat et al.,U.S.Dept.of Health and Human Services,"Sequences ofProteins of Immunological Interest"(1983)以及Chothia et al.,J.MoI.Biol.196:901-917(1987)进行了描述，其通过援引整体并入本文。根据Kabat和Chothia的CDR定义当相互比较时包括氨基酸残基的重叠或子集。不过，应用任一定义来指代抗体或其变体的CDR都在本文定义和使用的术语的范围内。作为比较，下表(表1)列出了涵盖上述引用的参考文献的各篇所定义的CDR的合适氨基酸残基。涵盖特定CDR的确切残基数目将根据CDR的序列和大小而变化。在给定抗体的可变区氨基酸序列的情况下，本领域技术人员可以常规地确定哪些残基包括特定的CDR。

【表1】

	Kabat	Chothia
			CDR-H1	31-35	26-32
CDR-H2	50-65	52-58
			CDR-H3	95-102	95-102
CDR-L1	24-34	26-32
			CDR-L2	50-56	50-52
CDR-L3	89-97	91-96

Kabat et al.还定义了适用于任何抗体的可变结构域序列的编号系统。本领域普通技术人员可以明确地将这种“Kabat编号”系统指定到任何可变结构域序列，而不依赖于序列本身以外的任何实验数据。如本文所用，“Kabat编号”指由Kabat et al.,U.S.Dept.ofHealth and Human Services,"Sequence of Proteins of Immunological Interest"(1983)所列出的编号系统。

本文所公开的抗体可以来自任何动物来源，包括鸟类和哺乳动物。优选地，抗体是人、鼠、驴、兔、山羊、豚鼠、骆驼、美洲驼、马或鸡的抗体。

如本文所用，术语“重链恒定区”包括源自免疫球蛋白重链的氨基酸序列。如上所述，本领域普通技术人员将理解的是，可以对重链恒定区进行修饰，使得它们在氨基酸序列上不同于天然存在的免疫球蛋白分子。

本文公开的抗体的重链恒定区可以源自不同的免疫球蛋白分子。例如，多肽的重链恒定区可以包括源自IgG1分子的CH1结构域和源自IgG3分子的铰链区。在另一实例中，重链恒定区可以包括铰链区，该铰链区部分源自IgG1分子，部分源自IgG3分子。在另一实例中，重链部分可以包括嵌合铰链，该嵌合铰链部分源自IgG1分子，部分源自IgG4分子。

如本文所用，术语“轻链恒定区”包括源自抗体轻链的氨基酸序列。优选地，轻链恒定区包括恒定κ结构域或恒定λ结构域中的至少一个。

“轻链-重链对”是指轻链和重链的集合，它们能够通过在轻链的CL结构域和重链的CH1结构域之间的二硫键形成二聚体。

“抗体片段”或“抗原结合片段”是指完整抗体以外的分子，其包括完整抗体的一部分，该部分与完整抗体所结合的抗原结合。免疫功能性免疫球蛋白片段包括Fab、Fab'、F(ab')₂、xFab、scFab、dsFv、Fv、scFv、scFv-Fc、scFab-Fc、双抗体、微抗体、scAb、dAb、半IgG或其组合，但不限于此。在Fab、Fab'、F(ab')₂、xFab和scFab中使用的术语“Fab”可以包括传统的Fab片段和PCT/CN2018/106766(Wuxibody)中描述的嵌合Fab样结构域。此外，它可以源自任何哺乳动物，包括人、小鼠、大鼠、骆驼或兔，但不限于此。抗体的功能部分，诸如本文所述的一个或多个CDR，可以通过共价键与二级蛋白或小分子化合物连接，从而用作针对特定靶标的靶向治疗剂。术语“抗体片段”包括适配体、spiegelmers和双抗体。术语“抗体片段”还包括任何合成或基因工程蛋白质，其通过结合特定抗原形成复合物而起到类似抗体的作用。

抗体片段可以通过各种技术制备，包括但不限于完整抗体的蛋白水解酶切以及通过重组宿主细胞(例如，大肠杆菌(E.coli)或噬菌体)的产生，如本文所述。

木瓜蛋白酶对完整抗体的酶切产生两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，其包含重链和轻链各自的可变结构域，以及轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。因此，如本文所用，术语“Fab片段”指包括轻链片段的抗体片段，所述轻链片段包括VL结构域和轻链的恒定结构域(CL)，以及VH结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。Fab'片段与Fab片段的不同之处在于在重链CH1结构域的羧基末端添加了几个残基，所述残基包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab'-SH是Fab'片段，其中恒定区的一个或多个半胱氨酸残基带有游离巯基。胃蛋白酶处理产生F(ab')₂片段，其具有两个抗原结合位点(两个Fab片段)和Fc区的一部分。在本文中，“F(ab')₂片段”包括两条轻链以及两条重链，所述重链包括可变区、CH1以及CH1和CH2结构域之间的恒定区的一部分，如上所述，从而在两条重链之间形成链内二硫键。因此，F(ab')₂片段由两个Fab'片段组成，并且这两个Fab'片段通过它们之间的二硫键彼此相遇。

术语“交叉Fab片段(cross-Fab fragment)”或“xFab片段”或“交换型Fab片段(crossover Fab fragment)”是指Fab片段，其中重链和轻链的可变区或恒定区互换。交换型Fab分子可以由两种不同链组成，并且被包括在本发明的双特异性抗体中：一方面，Fab重链和轻链的可变区互换，即交换型Fab分子包括由轻链可变区(VL)和重链恒定区(CH1)组成的肽链，以及由重链可变区(VH)和轻链恒定区(CL)组成的肽链。这种交换型Fab分子也被称为CrossFab_(VLVH)。另一方面，当Fab重链和轻链的恒定区互换时，交换型Fab分子包括由重链可变区(VH)和轻链恒定区(CL)组成的肽链，以及由轻链可变区(VL)和重链恒定区(CH1)组成的肽链。这种交换型Fab分子也被称为CrossFab_(CLCH1)。

“单链Fab片段”或“scFab”是由以下组成的多肽：抗体重链可变结构域(VH)、抗体恒定结构域1(CH1)、抗体轻链可变结构域(VL)、抗体轻链恒定结构域(CL)和接头，其中，所述抗体结构域和所述接头在N-末端至C-末端方向上具有以下顺序中的一种：a)VH-CH1-接头-VL-CL，b)VL-CL-接头-VH-CH1，c)VH-CL-接头-VL-CH1或d)VL-CH1-接头-VH-CL；并且其中所述接头是至少30个氨基酸的多肽，优选在32至50个氨基酸之间。所述单链Fab片段通过在CL结构域和CH1结构域之间的天然二硫键来稳定。此外，这些单链Fab分子可以通过经由半胱氨酸残基的插入(例如，根据Kabat编号，可变重链中的第44位和可变轻链中的第100位)而产生链间二硫键来进一步稳定。

“交换型单链Fab片段”或“x-scFab”是由以下组成的多肽：抗体重链可变结构域(VH)、抗体恒定结构域1(CH1)、抗体轻链可变结构域(VL)、抗体轻链恒定结构域(CL)和接头，其中，所述抗体结构域和所述接头在N-末端至C-末端方向上具有以下顺序中的一种：a)VH-CL-接头-VL-CH1和b)VL-CH1-接头-VH-CL；其中VH和VL一起形成特异性结合抗原的抗原结合结构域，并且其中所述接头是至少30个氨基酸的多肽。此外，这些x-scFab分子可以通过经由半胱氨酸残基的插入(例如，根据Kabat编号，可变重链中的第44位和可变轻链中的第100位)而产生链间二硫键来进一步稳定。

“Fv区”是一种包括重链和轻链各自的可变区但不包含恒定区的抗体。scFv是Fv通过柔性接头相连的。scFv-Fc是Fc与scFv相连的。微抗体是CH3与scFv相连的。双抗体包括两个scFv的分子。“单链可变区片段”或“scFv”指免疫球蛋白的重链(VH)和轻链(VL)的可变区的融合蛋白。在一些方面，这些区域用十至约25个氨基酸的短接头肽连接。接头可以富含甘氨酸以获得柔性，富含丝氨酸或苏氨酸以获得溶解性，并且可以将VH的N-末端与VL的C-末端连接起来，反之亦然。尽管去除了恒定区并引入了接头，这种蛋白质仍保留了原始免疫球蛋白的特异性。ScFv分子是本领域已知的，并在例如美国专利号5,892,019中进行了描述。

“短链抗体(scAb)”是包括一个重链的可变区或轻链的恒定区的单个多肽链，其中重链和轻链可变区通过柔性接头连接。短链抗体可以参考例如美国专利号5,260,203，其在本文中通过引用公开。

“结构域抗体(dAb)”是仅包括重链的可变区或轻链的可变区的免疫功能性免疫球蛋白片段。在一种实施方式中，VH区的两个或更多个通过肽接头以共价键连接，以形成二价的结构域抗体。这种二价的结构域抗体的两个VH区可以靶向相同或不同的抗原。

根据本发明的术语“全长IgG”被定义为包括基本上完全的IgG，然而其不一定具有完整IgG的所有功能。为避免疑问，全长IgG包含两条重链和两条轻链。每条链包含恒定区(C)和可变区(V)，这些区域可以被分为指定的CH1、CH2、CH3、VH和CL、VL的结构域。IgG抗体经由Fab部分中所包含的可变区结构域与抗原结合，并且在结合后可以通过恒定结构域(主要是通过Fc部分)与免疫系统的分子和细胞相互作用。术语“可变区结构域”、“可变区”、“可变结构域”、“VH/VL对”、“VH/VL”、“Fab部分”、“Fab臂”、“Fab”或“臂”在本文中可互换使用。根据本发明的全长抗体涵盖了其中可能存在提供所需特征的突变的IgG分子。这种突变不应该是任何区域的实质部分的缺失。然而，其中一个或多个氨基酸残基缺失而基本上不改变所得IgG分子的结合特性的IgG分子被囊括在术语“全长IgG”中。例如，这种IgG分子可以具有1至10个氨基酸残基之间的一种或多种缺失，优选在非CDR区域，其中所缺失的氨基酸对于IgG的结合特异性不是必需的。

全长IgG抗体是优选的，因为它们具有有利的半衰期，并且出于免疫原性的原因，需要尽可能接近完全自体的(人)分子。根据本发明，使用了双特异性IgG抗体。在优选实施方式中，使用了双特异性全长IgG1抗体。IgG1因其在人体内循环半衰期较长而受到青睐。为了防止人类中的任何免疫原性，优选地，根据本发明的双特异性IgG抗体是人IgG1。术语“双特异性”(bs)意味着抗体的一条臂结合第一抗原，而第二条臂结合第二抗原，其中所述第一和第二抗原不相同。根据本发明，所述第一和第二抗原实际上是位于两种不同细胞类型上的两种不同分子。术语“(抗体的)一条臂”优选地意为全长IgG抗体的一个Fab部分。通过募集和激活内源性免疫细胞来介导细胞毒性的双特异性抗体是下一代抗体治疗剂的新兴类别。这可以通过在一个分子中结合对于靶细胞(即，肿瘤细胞)和效应细胞(即，T细胞、NK细胞和巨噬细胞)的抗原结合特异性来实现(Cui et al.JBC 2012(287)28206-28214；Kontermann,MABS2012(4)182-197；Chames and Baty,MABS 2009(1)539-547；Moore etal.Blood 2011(117)4542-4551；Loffler et al.2000Blood 95:2098；Zeidler etal.1999J.Immunol.163:1246)。根据本发明，提供了双特异性抗体，其中一条臂结合异常(肿瘤)细胞上的CLL-1抗原，而第二条臂结合免疫效应细胞上的抗原。

如本文所用，术语“抗原结合结构域”或“抗原结合位点”指特异性结合抗原决定簇的抗体的一部分或抗体片段。更特别地，术语“抗原结合结构域”指包括特异性结合并与抗原的部分或全部互补的区域的抗体的一部分。当抗原很大时，抗体或抗体片段可能只与抗原的特定部分结合，该部分被称为表位。抗原结合结构域可以由例如一个或多个可变结构域(也称为可变区)提供。优选地，抗原结合结构域包括抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)。一方面，抗原结合结构域能够结合其抗原并阻断或部分地阻断其功能。特异性结合CCL-1或CD3的抗原结合结构域包括本文进一步定义的抗体及其片段。此外，抗原结合结构域可以包括支架抗原结合蛋白，例如，基于设计的重复蛋白或设计的重复结构域的结合结构域(参见，例如WO 2002/020565)。

如本文所用，术语“抗原决定簇”与“抗原”和“表位”同义，并且指多肽大分子上的与抗原结合部分结合形成抗原结合部分-抗原复合物的位点(例如，氨基酸的连续片段或由不连续氨基酸的不同区域组成的构象构型)。有用的抗原决定簇可以在例如肿瘤细胞的表面上、病毒感染细胞的表面上、其他患病细胞的表面上、免疫细胞的表面上、游离于血清中和/或细胞外基质(ECM)中找到。除非另有说明，本文中用作抗原的蛋白质可以是来自任何脊椎动物来源的任何天然形式的蛋白质，所述脊椎动物来源包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如人类)和啮齿类动物(例如小鼠和大鼠)。在特定实施方式中，抗原是人类蛋白质。当在本文中提到特定蛋白质时，该术语涵盖“全长的”未加工的蛋白质以及细胞中加工产生的任何形式的蛋白质。该术语还包括蛋白质的天然变体，例如，剪接变体或等位基因变体。

“特异性结合”是表示该结合对抗原是选择性的，并且可以与不想要的或非特异性的相互作用区分开。抗体或抗体片段的结合特异性抗原的能力可以通过酶联免疫吸附测定(ELISA)或其他本领域技术人员熟悉的技术来测量，例如表面等离子共振(SPR)技术(在BIAcore仪器上分析)(Liljeblad etal.,Glyco J 17,323-329(2000))和传统的结合测定(Heeley,Endocr Res 28,217-229(2002))。

“亲和力”或“结合亲和力”是指分子(例如，抗体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如，抗原)之间的非共价相互作用的总体强度。除非另有说明，如本文所用，“结合亲和力”是指内在结合亲和力，其反映了结合对(例如，抗体和抗原)的成员之间1∶1的相互作用。分子X对其配偶体Y的亲和力一般可以用解离常数(Kd)来表示，其为解离和结合速率常数(分别为，koff和kon)的比率。因此，只要速率常数的比率保持不变，等效亲和力可以包括不同的速率常数。亲和力可以通过本领域已知的常用方法来测量，包括本文所述的方法。测量亲和力的一种特殊方法是表面等离子共振(SPR)。

如本文所用，术语抗体的“高亲和力”是指抗体对靶抗原的Kd为10^-9M或更低，甚至更特别是10^-10M或更低。术语抗体的“低亲和力”是指抗体所具有的Kd为10^-8或更高。

“亲和力成熟”抗体是指与不具备这种改变的亲本抗体相比，在一个或多个高变区(HVR)中具有一个或多个改变的抗体，这种改变导致抗体对抗原的亲和力提高。

术语“特异性结合CLL-1和CD3的双特异性抗体”、“对CLL-1和CD3具有特异性的双特异性抗体”或“抗CLL-1/抗CD3抗体”在本文中可互换使用，并且是指能够以足够的亲和力结合CLL-1和CD3的双特异性抗体，使得该抗体作为靶向CLL-1和CD3的诊断剂和/或治疗剂是有用的。

术语“C型凝集素样分子-1(CLL-1)”，也作为MICL或CLEC12A被熟知，其是一种II型跨膜糖蛋白并且是参与免疫调节的C型凝集素样受体大家族的成员。CLL-1先前已经从髓源性细胞中被鉴定出来。CLL-1的胞内结构域包含基于免疫酪氨酸的抑制基序(ITIM)和YXXM基序。多种细胞上的包含ITIM受体的磷酸化通过蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-1、SHP-2和SHIP的募集导致对激活途径的抑制。YXXM基序具有针对PI-3激酶的p85亚单位的潜在SH2结构域结合位点，13其与细胞激活途径有关，揭示了CLL-1作为髓样细胞上抑制和激活分子的潜在双重作用。事实上，CLL-1与SHP-1和SHP-2的关联已经在转染的骨源性细胞系中得到实验证明。

造血细胞中CLL-1的表达模式受到限制。它尤其在源自外周血和骨髓的髓样细胞以及大多数AML母细胞中被找到。最近的一项研究表明，CLL-1也存在于AML中的CD34+/CD38-隔室(compartment)中的大多数白血病干细胞上，但在正常和再生骨髓对照的CD34+/CD38-细胞中不存在，这有助于区分正常细胞和白血病干细胞。(参见，例如，Zhao et al.,Haematologica95:71-78(2010)；Bakker et al.,Cancer Res.64:8443-8450(2004))。许多物种的CLL-1的核苷酸和蛋白质序列是已知的。例如，人类序列可以在Genbank登录号AF247788.1和Uniprot登录号Q5QGZ9中找到。

术语“抗CCL-1抗体”、“与CCL-1结合的抗体”和“包括与CCL-1结合的抗原结合结构域的抗体”是指能够以足够的亲和力结合CCL-1，尤其是细胞表面表达的CCL-1多肽的抗体，使得该抗体作为靶向CCL-1的诊断剂和/或治疗剂是有用的。在一个方面，根据例如通过放射免疫测定法(RIA)或流式细胞术(FACS)或通过使用生物传感器系统诸如Biacore系统的表面等离子体共振测定法所测定的，抗CCL-1抗体与无关的非CCL-1蛋白的结合程度小于约10％的该抗体与CCL-1结合程度。在某些方面，与人CCL-1结合的抗原结合蛋白与人PD1的结合亲和力的K_D值≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如，10^- ⁸M或更小，例如，10^-8M至10^-13M，例如，10^-9M至10^-13M)。术语“抗CCL-1抗体”还涵盖能够结合CCL-1和不同抗原的双特异性抗体。

术语“CLL-1”和“CLL1”在本文中可互换使用。

如本文所用，术语“免疫效应细胞”或“效应细胞”是指哺乳动物免疫系统中天然细胞库内的细胞，其可以被激活以影响靶细胞的生存力。免疫效应细胞不仅包括淋巴细胞谱系的细胞，诸如自然杀伤(NK)细胞、包括细胞毒性T细胞的T细胞，或B细胞，还包括髓细胞谱系的细胞，其也可被视为免疫效应细胞，诸如单核细胞或巨噬细胞、树突状细胞和中性粒细胞。因此，所述效应细胞优选为NK细胞、T细胞、B细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞或嗜中性粒细胞。根据本发明，将效应细胞募集到异常细胞意指将免疫效应细胞带到异常靶细胞附近，使得效应细胞可以直接杀死它们所被募集到的异常细胞或间接启动对它们所被募集到的异常细胞的杀死。为了避免非特异性相互作用，优选本发明的双特异性抗体特异性识别免疫效应细胞上的抗原，与体内其他细胞相比，这些免疫效应细胞至少过量表达这些抗原。免疫效应细胞上存在的靶抗原可以包括CD3、CD16、CD25、CD28、CD64、CD89、NKG2D和NKp46，优选地，免疫效应细胞上的抗原是T细胞上表达的CD3或其功能等同物(功能等同物将是在T细胞上具有相似分布和相似功能(在种类上，而不是必须在数量上)的CD3样分子)。如本文所用，术语“CD3”还涵盖CD3的功能等同物。免疫效应细胞上的最优选的抗原是CD3ε链。这种抗原已被证明在将T细胞募集到异常细胞的方面非常有效。因此，根据本发明的双特异性IgG抗体优选包含特异性识别CD3ε的一条臂。

除非另有说明，术语“CD3”指来自任何脊椎动物来源的任何天然CD3，所述脊椎动物来源包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如，人)、非人灵长类动物(例如，食蟹猴)和啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠)。该术语包括“全长的”未加工的CD3以及在细胞中加工产生的任何形式的CD3。该术语还包括CD3的天然变体，例如，剪接变体或等位基因变体。在一种实施方式中，CD3是人CD3，特别是人CD3的ε亚单位(CD3ε)。人CD3ε的氨基酸序列显示在UniProt(www.uniprot.org)登录号P07766(189版本)或NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov/)RefSeq NP_000724.1中。食蟹猴[长尾猕猴(Macaca fascicularis)]CD3ε的氨基酸序列显示在NCBIGenBank号BAB71849.1中。

术语“抗CD3抗体”、“与CD3结合的抗体”和“包括与CD3结合的抗原结合结构域的抗体”是指能够以足够的亲和力结合CD3的抗体，使得该抗体作为靶向CD3的诊断剂和/或治疗剂是有用的。在一个方面，根据例如通过放射免疫测定法(RIA)所测定的，抗CD3抗体与不相关的非CD3蛋白的结合程度小于约10％的该抗体与CD3结合程度。在某些方面，与CD3结合的抗体的解离常数(Kd)≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如，10^-8M或更小，例如，10^-8M至10^-13M，例如，10^-9M至10^-13M)。在某些方面，抗CD3抗体与CD3的表位结合，该表位在不同物种的CD3中均是保守的。术语“抗CD3抗体”还涵盖能够结合CD3和不同抗原的双特异性抗体。

术语“小鼠”抗体旨在包括具有可变区的抗体，所述可变区中的框架区和CDR区均源自小鼠种系免疫球蛋白序列。此外，如果抗体包含恒定区，该恒定区也源自小鼠种系免疫球蛋白序列。本公开的小鼠抗体可以包括不由小鼠种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或定点诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。

术语“嵌合”抗体是指其中重链和/或轻链的一部分来自特定的来源或物种，而重链和/或轻链的剩余部分来自不同的来源或物种的抗体。

抗体的“类别”指其重链所具有的恒定结构域或恒定区的类型。有五大类的抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且其中的一些可以被进一步分为亚类(同种型)，例如IgG₁、IgG₂、IgG₃、IgG₄、IgA₁和IgA₂。将与不同类别的免疫球蛋白相对应的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。

“人源化”抗体指包括来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方式中，人源化抗体将包括基本上所有的至少一个、通常两个可变结构域，其中所有或基本上所有的HVR(例如，CDR)对应于非人类抗体的那些，并且所有或基本上所有的FR对应于人抗体的那些。

人源化抗体任选可以包括源自人抗体的抗体恒定区的至少一部分。抗体(例如，非人抗体)的“人源化形式”是指已经经历人源化的抗体。本发明所涵盖的其它形式的“人源化抗体”是其中该恒定区已经从原始抗体的恒定区经另外修饰或改变以产生根据本发明的特性，特别是关于C1q结合和/或Fc受体(FcR)结合的抗体。

“人”抗体是一种所具有的氨基酸序列对应于由人或人细胞产生的抗体的氨基酸序列或来自利用了人抗体库或其它人抗体编码序列的非人来源的抗体的氨基酸序列的抗体。人抗体这一定义明确地排除了包括非人抗原结合残基的人源化抗体。

术语“Fc结构域”或“Fc区”在本文中用于定义包含恒定区的至少一部分的免疫球蛋白重链的C-末端区。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。尽管IgG重链的Fc区的边界可能略有不同，但人IgG重链的Fc区通常被定义为从Cys226或从Pro230延伸到重链的羧基末端。然而，由宿主细胞产生的抗体可能经历从重链的C-末端对一个或多个，特别是一个或两个氨基酸的翻译后切割。因此，由宿主细胞通过表达编码全长重链的特定核酸分子而产生的抗体可以包括全长重链，或者它可以包括全长重链的切割变体(本文也称为“切割变体重链”)。这可能是重链的最后两个C-末端氨基酸是甘氨酸(G446)和赖氨酸(K447，根据KabatEU索引编号)的情况。因此，Fc区的C-末端赖氨酸(Lys447)，或C-末端甘氨酸(Gly446)和赖氨酸(K447)可以存在，也可以不存在。除非另有说明，否则本文中所指的包括Fc结构域(或本文定义的Fc结构域的亚单位)的重链的氨基酸序列没有C-末端甘氨酸-赖氨酸二肽。在本发明的一种实施方式中，包括在根据本发明的抗体或双特异性抗体中的包括本文所说明的Fc结构域的亚单位的重链包括额外的C-末端甘氨酸-赖氨酸二肽(G446和K447，根据Kabat的EU索引编号)。在本发明的一种实施方式中，包括在根据本发明的抗体或双特异性抗体中的包括本文所说明的Fc结构域的亚单位的重链包括额外的C-末端甘氨酸残基(G446，根据Kabat的EU索引编号)。本发明的组合物，诸如本文所述的药物组合物，包括本发明的抗体或双特异性抗体群。抗体或双特异性抗体群可以包括具有全长重链的分子和具有切割的变体重链的分子。抗体或双特异性抗体群可以由具有全长重链的分子和具有切割的变体重链的分子的混合物组成，其中至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的抗体或双特异性抗体具有切割的变体重链。在本发明的一种实施方式中，包括本发明的抗体或双特异性抗体的群的组合物包括抗体或双特异性抗体，所述抗体或双特异性抗体包括重链，所述重链包括如本文所说明的Fc结构域的亚单位以及额外的C-末端甘氨酸-赖氨酸二肽(G446和K447，根据Kabat的EU索引编号)。在本发明的一种实施方式中，包括本发明的抗体或双特异性抗体的群的组合物包括抗体或双特异性抗体，所述抗体或双特异性抗体包括重链，所述重链包括如本文所说明的Fc结构域的亚单位以及额外的C-末端甘氨酸残基(G446，根据Kabat的EU索引编号)。在本发明的一种实施方式中，这种组合物包括由以下组成的抗体或双特异性抗体的群：包括包含本文说明的Fc结构域的亚单位的重链的分子；包括包含如本文所说明的Fc结构域的亚单位以及额外的C-末端甘氨酸残基(G446，根据Kabat的EU索引编号)的重链的分子；以及包括包含本文所说明的Fc结构域的亚单位和额外的C-末端甘氨酸-赖氨酸二肽(G446和K447，根据Kabat的EU索引编号)的重链的分子。除非本文另有说明，否则Fc区或恒定区中氨基酸残基是根据EU编号系统进行编号，所述EU编号系统也称为EU索引，如Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5thEd.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1991(另见上文)中所述。如本文所用，Fc结构域的“亚单位”指形成能够稳定地自我缔合的二聚Fc结构域的两个多肽中的一个，即包括免疫球蛋白重链C-末端恒定区的多肽。例如，IgG Fc结构域的亚单位包括IgG CH2和IgG CH3恒定结构域。

“促进Fc结构域的第一和第二亚单位结合的修饰”是对肽骨架的操作或对Fc结构域亚单位的翻译后修饰，其减少或防止包括Fc结构域亚单位的多肽与相同多肽缔合形成同源二聚体。本文所用的促进缔合的修饰特别地包括对期望缔合的两个Fc结构域的亚单位(即Fc结构域的第一和第二亚单位)中的每一个进行单独的修饰，其中所述修饰彼此互补以促进两个Fc结构域亚单位的结合。例如，促进缔合的修饰可以改变两个Fc结构域亚单位之一或两者的结构或电荷，从而使它们的缔合分别在空间上或静电上有利。因此，(异)二聚化发生在包括第一Fc结构域亚单位的多肽和包括第二Fc结构域亚单位的多肽之间，在融合到亚单位的每一个的其他成分(例如抗原结合部分)不相同的意义上，该(异)二聚化可能是不相同的。在一些实施方式中，促进缔合的修饰包括在Fc结构域中的氨基酸突变，特别是氨基酸置换。在特定的实施方式中，促进缔合的修饰包括在Fc结构域的两个亚单位的每一个中的单独的氨基酸突变，特别是氨基酸置换。

术语“肽接头”是指包括一个或多个氨基酸，通常约2至20个氨基酸的肽。肽接头是本领域已知的或在本文中有所描述的。合适的非免疫原性接头肽是，例如，(G₄S)_n、(SG₄)_n或G₄(SG₄)_n肽接头，其中，“n”一般是1至10之间的数，通常是2至4之间的数，特别是2，即，该肽不仅选自由GGGGS(SEQ ID NO:58)、GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:59)、SGGGGSGGGG(SEQ ID NO:60)和GGGGSGGGGSGGGG(SEQ ID NO:61)组成的组，而且还包括序列GSPGSSSSGS(SEQ ID NO:62)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:63)、GSGSGSGS(SEQ ID NO:64)、GSGSGNGS(SEQ ID NO:65)、GGSGSGSG(SEQ ID NO:66)、GGSGSG(SEQ ID NO:67)、GGSG(SEQ ID NO:68)、GGSGNGSG(SEQ ID NO:69)、GGNGSGSG(SEQ ID NO:70)和GGNGSG(SEQ ID NO:71)。

术语“效应子功能”指归因于抗体的Fc区的那些生物活性，其随抗体同种型而变化。抗体效应子功能的实例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)、Fc受体结合、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)、细胞因子分泌、由抗原呈递细胞对免疫复合物介导的抗原摄取、细胞表面受体(例如，B细胞受体)的下调以及B细胞激活。

如本文所用，术语“进行工程改造、经工程改造的、工程改造”被认为包括对肽骨架的任何操作或对天然存在的或重组的多肽或其片段的翻译后修饰。工程改造包括对氨基酸序列、糖基化模式或单个氨基酸的侧链基团的修饰，以及这些方法的组合。

如本文所用，术语“氨基酸突变”意在包括氨基酸置换、缺失、插入和修饰。只要最终构建体具有所需要的特征，例如，与Fc受体的结合减少，或与另一种肽的缔合增加，就可以进行置换、缺失、插入和修饰的任何组合来获得最终构建体。氨基酸序列缺失和插入包括氨基酸的氨基末端的和/或羧基末端的缺失和插入。特别的氨基酸突变是氨基酸置换。为了改变例如Fc区的结合特性，特别优选非保守氨基酸置换，即用具有不同结构和/或化学特性的另一个氨基酸取代一个氨基酸。氨基酸置换包括用非天然存在的氨基酸或用二十种标准氨基酸的天然存在的氨基酸衍生物(例如，4-羟脯氨酸、3-甲基组氨酸、鸟氨酸、高丝氨酸、5-羟基赖氨酸)进行的置换。可以使用本领域熟知的遗传或化学方法产生氨基酸突变。遗传方法可以包括定点诱变、PCR、基因合成等。预期的是，通过基因工程改造以外的方法(诸如化学修饰)改变氨基酸侧链基团的方法也可以是有用的。本文中可以使用各种名称来表示相同的氨基酸突变。例如，将Fc结构域的第329位的脯氨酸置换成甘氨酸可以表示为329G、G329、G329、P329G或Pro329Gly。

就参考多肽序列而言的“氨基酸序列同一性百分比(％)”被定义为，在不将任何保守置换考虑为序列同一性的一部分的情况下，进行比对序列并引入间隙(如果必要)以获得最大百分比序列同一性之后，候选序列中与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。用于确定氨基酸序列同一性百分比的比对可以通过本领域技术人员熟知的各种方法实现，例如，使用可公开获得的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、Clustal W、Megalign(DNASTAR)软件或FASTA程序包。本领域技术人员可以确定用于比对序列的合适参数，包括在被比较序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。然而，出于本文的目的，使用FASTA包版本36.3.8c或更高版本的ggsearch程序和BLOSUM50比较矩阵来产生氨基酸序列同一性值％。FASTA程序包由W.R.Pearson and D.J.Lipman(1988),"Improved Toolsfor Biological Sequence Analysis",PNAS 85:2444-2448；W.R.Pearson(1996)"Effective protein sequence comparison"Meth.Enzymol.266:227-258；以及Pearsonet.al.(1997)Genomics 46:24-36编写，并且可从http://fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/fasta_down.shtml公开获取。或者，可将在http://fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/index.cgi获得的公共服务器可用于比较序列，使用ggsearch(global protein:protein)程序和默认选项(BLOSUM50；开放：-10；ext：-2；Ktup＝2)以确保执行全局而非局部比对。氨基酸同一性百分比在输出比对标题中给出。

“免疫偶联物”是与一种或多种异源分子(包括但不限于细胞毒性剂)偶联的抗体。

如本文所用，术语“多肽”旨在涵盖单个“多肽”以及多个“多肽”，并且指由通过酰胺键(也称为肽键)线性连接的单体(氨基酸)组成的分子。术语“多肽”指两个或更多个氨基酸的任何一条或多条链，而不是指特定长度的产物。因此，肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白质”、“氨基酸链”或用于指两个或更多个氨基酸的一条链或多条链的任何其他术语都包括在“多肽”的定义中，并且术语“多肽”可以用来代替这些术语中的任何一个，或者与这些术语中的任何一个互换。术语“多肽”也旨在指多肽的表达后修饰的产物，包括但不限于糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、用已知保护/封闭基团进行的衍生化、蛋白水解切割或用非天然氨基酸进行的修饰。多肽可以从天然生物来源衍生或通过重组技术产生，但不一定是从指定的核酸序列翻译而来。它可以以任何方式产生，包括通过化学合成。术语“多肽”还涵盖多肽的变体和多肽的衍生物。此外，“多肽片段”是指与全长蛋白质相比，具有氨基末端氨基酸序列缺失、羧基末端氨基酸序列缺失和/或内部缺失的多肽。与全长蛋白质相比，该片段还可以包括经修饰的氨基酸。在一种实施方式中，片段的长度可以为约5至900个氨基酸，例如，长度为至少5、6、8、10、14、20、50、70、100、110、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850个或更多个氨基酸。考虑到本发明的目的，有用的多肽片段包括包含抗原结合结构域的抗体的免疫功能片段。在CLL-1或CD3结合抗体的情况下，这种有用的片段包括包含重链或轻链的1、2或3的CDR序列，或者包含重链或轻链的可变区或恒定区的抗体链的全部或一部分，但不限于此。

如本文所用，多肽(诸如例如抗原结合片段、蛋白质或抗体)的“变体”是指与另一种多肽序列相比，其中一个或多个氨基酸残基被插入、缺失、添加和/或置换的多肽，并且包括融合多肽。此外，蛋白质变体包括通过蛋白酶切割、磷酸化或其他翻译后修饰而修饰的变体，但保持本文公开的抗体的生物活性，例如，与CLL-1的特异性结合和生物活性。变体可以与本文公开的抗体或其抗原结合片段的序列具有约99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、81％或80％的同一性。

如本文所用，术语多肽的“衍生物”意指通过与其它化学部分偶联而化学修饰的多肽，其不同于插入、缺失、添加或置换变体。

如本文所用，与多肽或多核苷酸相关的术语“重组”意指不是天然存在的多肽或多核苷酸的形式，其非限制性实例可以通过将通常不会一起出现的多核苷酸或多肽组合而创建。

“同源性”或“同一性”或“相似性”是指两个肽之间或两个核酸分子之间的序列相似性。同源性可以通过比较每个序列中的位置来确定，所述位置可以为了比较的目的而比对。当经比较序列中的位置被相同的碱基或氨基酸占据时，那么该分子在该位置是同源的。序列间的同源性的程度与序列共有的匹配或同源位置数量存在函数关系。“不相关”或“非同源”序列与本公开内容的序列中的一个具有小于40％的同一性，尽管优选小于25％的同一性。

当比对时，多核苷酸或多核苷酸区域(或多肽或多肽区域)与另一个序列具有一定百分比(例如，60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％)的“序列同一性”意味着在比较两个序列时那个百分比的碱基(或氨基酸)是相同的。

术语“多核苷酸”指分离的核酸分子或构建体，例如信使RNA(mRNA)、病毒衍生的RNA或质粒DNA(pDNA)。多核苷酸可以包括传统的磷酸二酯键或非传统的键(例如，酰胺键，诸如在肽核酸(PNA)中发现的)。术语“核酸分子”指多核苷酸中存在的任何一个或多个核酸片段，例如，DNA或RNA片段。

“分离的”核酸分子或多核苷酸是指从其天然环境中移出的核酸分子、DNA或RNA。例如，为了本发明的目的，将在载体中所包含的编码多肽的重组多核苷酸认为是分离的。分离的多核苷酸的进一步实例包括异源宿主细胞中所维持的重组多核苷酸或溶液中纯化的(部分或基本上)多核苷酸。分离的多核苷酸包括在通常包含多核苷酸分子的细胞中所包含的多核苷酸分子，但该多核苷酸分子存在于染色体外或与其天然染色体位置不同的染色体位置。分离的RNA分子包括本发明的体内或体外RNA转录物，以及正链和负链形式，以及双链形式。根据本发明的分离的多核苷酸或核酸还包括这种合成产生的分子。此外，多核苷酸或核酸可以是或可以包括调控元件，诸如启动子、核糖体结合位点或转录终止子。如本文所用，术语“分离的”也指当通过重组DNA技术产生时基本上不包含细胞物质、病毒物质或培养基的核酸或肽，或当化学合成时基本上不包含化学前体或其它化学物质的核酸或肽。术语“分离的”在本文中也用于指从其他细胞蛋白质或组织中分离的细胞或多肽。分离的多肽意指涵盖纯化的和重组的多肽。

“编码[例如，本发明的抗体或双特异性抗体]的分离的多核苷酸(或核酸)”是指编码抗体重链和轻链(或其片段)的一种或多种多核苷酸分子，其包括在单一载体或单独载体中的这种或多个这种多核苷酸分子，以及存在于宿主细胞中一个或多个位置处的这种或多个这种核酸分子。

术语“表达盒”指重组或合成产生的多核苷酸，具有一系列允许特定核酸在靶细胞中转录的特定核酸元件。重组表达盒可以掺入到质粒、染色体、线粒体DNA、质体DNA、病毒或核酸片段中。通常，表达载体的重组表达盒部分，除了其他序列外，还包括待转录的核酸序列和启动子等序列。在某些实施方式中，表达盒包括编码本发明的抗体或双特异性抗体或其片段的多核苷酸序列。

术语“载体”或“表达载体”是指一种DNA分子，其用于在细胞中引入并指导与其可操作缔合的特定基因的表达。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体，以及掺入到宿主细胞基因组中的载体，该载体已被引入到宿主细胞中。本发明的表达载体包括表达盒。表达载体允许转录大量稳定的mRNA。一旦表达载体进入细胞内，由基因编码的核糖核酸分子或蛋白质就通过细胞转录和/或翻译机制产生。在一种实施方式中，本发明的表达载体包括表达盒，该表达盒包括编码本发明的抗体或双特异性抗体或其片段的多核苷酸序列。

术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且是指已经引入有外源核酸的细胞，其包括这些细胞的子代。宿主细胞包括“转化体”和“转化细胞”，其包括原代转化细胞及在不考虑传代的次数的情况下的从其衍生的子代。子代细胞在核酸含量方面可以与亲代细胞不完全相同，但可以包含突变。本文包括在原始转化细胞中筛选或选择的具有相同功能或生物活性的突变体子代。宿主细胞是可用于产生本发明的抗体或双特异性抗体的任何类型的细胞系统。宿主细胞不仅包括培养细胞，例如哺乳动物培养细胞，诸如HEK细胞、CHO细胞、BHK细胞、NS0细胞、SP2/0细胞、YO骨髓瘤细胞、P3X63小鼠骨髓瘤细胞、PER细胞、PER.C6细胞或杂交瘤细胞、酵母细胞、昆虫细胞和植物细胞，仅举几个例子，还包括包含在转基因动物、转基因植物或培养的植物或动物组织中的细胞。“激活性Fc受体”是一种Fc受体，其在与抗体的Fc结构域结合后引发信号转导事件，该事件刺激带有受体的细胞以执行效应子功能。人类激活性Fc受体包括FcγRIIIa(CD16a)、FcγRI(CD64)、FcγRIIa(CD32)和FcαRI(CD89)。

抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)是引起免疫效应细胞对抗体包被的靶细胞的裂解的免疫机制。靶细胞是包括Fc区的抗体或其衍生物通常经由Fc区的N-端的蛋白质部分而特异性结合的细胞。如本文所用，术语“降低的ADCC”被定义为给定时间内在靶细胞周围培养基中于给定抗体浓度下，通过上述ADCC机制所裂解的靶细胞数量的减少，和/或在给定时间内通过ADCC的机制实现给定数量的靶细胞的裂解所需的靶细胞周围培养基中的抗体浓度的增加。ADCC的降低是相对于使用相同的标准生产、纯化、配制和储存方法(本领域技术人员已知)，由相同类型的宿主细胞产生的相同抗体介导的ADCC而言的，但其尚未经工程改造。例如，由在其Fc结构域中包括降低ADCC的氨基酸置换的抗体介导的ADCC的减少是相对于由在Fc结构域中没有该氨基酸置换的相同抗体介导的ADCC而言的。用于测量ADCC的合适测定方法在本领域是公知的(参见，例如，PCT公开号WO 2006/082515或者PCT公开号WO 2012/130831)。

药剂的“有效量”是指在给药的细胞或组织中引起生理变化所必需的量。

药剂(例如，药物组合物)的“治疗有效量”是指以必要的剂量和时间内达到所需治疗或预防效果的有效量。治疗有效量的药剂例如消除、减少、延迟、最小化或预防疾病的副作用。

“个体”、“受试者”或“患者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于，家养动物(例如，牛、羊、猫、狗和马)、灵长类动物(例如，人类和非人灵长类动物诸如猴子)、兔子和啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠)。特别地，所述个体、受试者或患者是人。

术语“药物组合物”是指其以这种形式使得其中所包含活性成分的生物活性有效，并且不包含对给药有该组合物的受试者具有不可接受的毒性的额外成分的制剂。

“药学上可接受的载体”是指药物组合物中除活性成分以外且对受试者无毒的成分。药学上可接受的载体包括但不限于，缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。

如本文所用，“治疗(treatment)”(及其语法变体，诸如“治疗(treat)”或“治疗(treating)”)是指试图在受治疗的个体中改变疾病的自然病程的临床干预，并且可以为了预防而进行或在临床病理过程中进行。理想的治疗效果包括但不限于，预防疾病的发生或复发、缓解症状、减少疾病的任何直接或间接病理后果、预防转移、降低疾病进展的速度、疾病状态的改善或减轻以及缓解或改善预后。在一些实施方式中，本发明的抗体或双特异性抗体用于延缓疾病的发展或减缓疾病的进展。

术语“药品说明书”用于指通常在治疗产品的商业包装中所包括的说明书，其包括关于适应症、用法、剂量、给药、联合疗法、禁忌症和/或关于使用这种治疗性产品的警告的信息。

抗CLL-1抗体

抗CLL-1抗体可以包括抗CLL-1抗体或其抗原结合片段作为CCL-1靶向部分。抗CCL-1抗体或其抗原结合片段可以表现出对CCL-1的强效结合和抑制活性，并可以用于治疗和诊断用途。

在一种实施方式中，抗CLL-1抗体或其片段可以是能够对人CLL-1蛋白具有特异性。

在一种实施方式中，抗CLL-1抗体或其片段可以包括：(a)VH CDR1，其包括选自由SEQ ID NO:1、2和3组成的组的氨基酸序列；(b)VH CDR2，其包括选自由SEQ ID NO:4、5和6组成的组的氨基酸序列；(c)VH CDR3，其包括选自由SEQ ID NO:7、8、9、10和11组成的组的氨基酸序列；(d)VL CDR1，其包括选自由SEQ ID NO:12、13、14和15组成的组的氨基酸序列；(e)VL CDR2，其包括选自由SEQ ID NO:16、17和18组成的组的氨基酸序列；以及(f)VLCDR3，其包括选自由SEQ ID NO:19、20、21和22组成的组的氨基酸序列。

根据本发明的一种实施方式，在抗体或抗原结合片段的重链和轻链可变区中所包括的抗CLL-1的CDR序列如下表2中所示。

【表2】

在一种实施方式中，上表(表2)中公开的轻链的各可变区的CDR和重链的各可变区的CDR可以自由组合。

在一些实施方式中，抗体或其片段可以包括不超过一个、不超过两个或不超过三个置换。

在一种实施方式中，抗CLL-1抗体或其片段可以包括重链恒定区，其包括选自由SEQ ID NO:23和24组成的组的氨基酸序列；或与选自由SEQ ID NO:23和24组成的组的氨基酸序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的肽。

在一种实施方式中，抗CLL-1抗体或其片段可以包括轻链恒定区，其包括由SEQ IDNO:55组成的氨基酸序列。

在一种实施方式中，抗CLL-1抗体或其片段可以包括重链恒定区，其包括选自由SEQ ID NO:23和24组成的组的氨基酸序列；和轻链恒定区，其包括由SEQ ID NO:55组成的氨基酸序列。

在一种实施方式中，抗CLL-1抗体或其片段可以包括重链可变区，其包括选自由SEQ ID NO:25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35和74组成的组的氨基酸序列；或与选自由SEQ ID NO:25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35和74组成的组的氨基酸序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的肽。

在一种实施方式中，抗CLL-1抗体或其片段可以包括轻链可变区，其包括选自由SEQ ID NO:36、37、38、39、40、41、42、43、44和75组成的组的氨基酸序列；或与选自由SEQ IDNO:36、37、38、39、40、41、42、43、44和75组成的组的氨基酸序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的肽。

在一种实施方式中，抗CLL-1抗体或其片段可以包括重链可变区，其包括选自由SEQ ID NO:25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35和74组成的组的氨基酸序列；和轻链可变区，其包括选自由SEQ ID NO:36、37、38、39、40、41、42、43、44和75组成的组的氨基酸序列。

在一种实施方式中，抗CLL-1抗体或其片段可以包括重链，其包括由SEQ ID NO:45组成的氨基酸序列；或与由SEQ ID NO:45组成的氨基酸序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的肽。

在一种实施方式中，抗CLL-1抗体或其片段可以包括轻链，其包括由SEQ ID NO:46组成的氨基酸序列；或与由SEQ ID NO:46组成的氨基酸序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的肽。

在一种实施方式中，抗CLL-1抗体或其片段可以包括重链，其包括由SEQ ID NO:45组成的氨基酸序列；和轻链，其包括由SEQ ID NO:46组成的氨基酸序列。

在一种实施方式中，抗体或抗原结合片段的重链恒定区、重链和轻链可变区、重链和轻链可以在下表中举例说明(表3)。

【表3】

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在其他实施方式中，上表(表3)中公开的重链和轻链可变区可以自由组合用于制备各种形式的抗体。

本文公开的重链和轻链可变区中的每一个都可以与靶向性的各种重链和轻链恒定区结合，以分别形成完整抗体的重链和轻链。此外，与像这样的恒定区结合的重链和轻链序列中的每一个也可以组合形成完整的抗体结构。

抗体重链和轻链的任何可变区可以连接到恒定区的至少一部分。可以根据是否需要抗体依赖性细胞介导的细胞毒性、抗体依赖性细胞吞噬作用和/或补体依赖性细胞毒性等来选择恒定区。例如，人同种型IgG1和IgG3具有补体依赖性细胞毒性，而人同种型IgG2和IgG4不具有细胞毒性。人IgG1和IgG3也诱导比人IgG2和IgG4更强的细胞介导的效应子功能。例如，重链可变区可以结合IgG的恒定区，诸如IgG1、IgG2、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgG4，并且轻链可变区可结合κ或λ恒定区。对于恒定区，可以根据需要使用合适的恒定区，例如，可以使用源自人或小鼠的恒定区。在一种实施方式中，使用了人重链恒定区IgG1。在其他实施方式中，作为轻链恒定区，可以使用人λ区。

本文公开的任何可变区可以与恒定区结合，从而形成重链和轻链序列。在一种实施方式中，本文公开的重链可变区可以与人IgG1恒定区结合以形成重链(全长)。在其他实施方式中，本文公开的轻链可变区可以与人λ恒定区结合以形成轻链(全长)。轻链和重链可以以各种组合形式来组合，从而形成由两条轻链和两条重链组成的完整抗体。

在其他实施方式中，抗体可以包括或基本上由重链和轻链的组合组成，所述轻链和重链由以下序列表示：SEQ ID NO:45；和SEQ ID NO:46。

然而，与本文公开的可变区组合的这种恒定区序列是示例性的，并且本领域技术人员将知道可以使用其他恒定区，其包括IgG1重链恒定区、IgG3或IgG4重链恒定区、任何κ或λ轻链恒定区、针对稳定性、表达、可制造性或其他靶向特性而修饰的恒定区等。

在一些实施方式中，抗CLL-1抗体的抗原结合片段可以是包括抗体的重链CDR和/或轻链CDR的任何片段，并且例如，它可以选自，但不限于由以下组成的组：Fab、Fab'、F(ab')₂、xFab、Fd(包括重链可变区和CH1结构域)、Fv(重链可变区和/或轻链可变区)、单链Fv(scFv；包括或基本上由任意顺序的重链可变区和轻链可变区以及在重链可变区和轻链可变区之间的肽接头组成)、单链抗体、二硫键连接的Fvs(sdFv)、scFab(单链Fab)、scFab-Fc(包括scFab和Fc区)、半IgG(包括一条轻链和一条重链)等。

本发明可以包括与本文公开的一种或多种氨基酸序列具有基本序列同一性的一种或多种氨基酸序列。基本同一性意味着保留本文公开的存在序列变异的效果。

在一些实施方式中，抗CLL-1抗体或其抗原结合片段可以是小鼠抗体、嵌合抗体、人源化抗体或全人抗体。

在一种实施方式中，抗CLL-1抗体或其抗原结合片段可以与一种或多种多肽融合以形成融合蛋白。一种或多种多肽可以是抗体或抗原。在一种实施方式中，融合蛋白可以是多特异性抗体的形式(例如，双特异性抗体)。

在一种实施方式中，本公开提供了融合蛋白，其包括(a)本文所述的一种或多种单域抗体或其抗原结合片段(例如，本文所述的一种或多种CDR)，以及(b)一种或多种额外的多肽。例如，融合蛋白可以包括本文所述的一种或多种单域抗体和本文所述的恒定区或Fc区。在一种实施方式中，本文所述的一种或多种单域抗体或其抗原结合片段(例如，本文所述的一种或多种CDR)可以与抗体或抗原非共价或共价偶联，例如融合。

抗CD3抗体

抗CD3抗体可以包括抗CD3抗体或其抗原结合片段作为CD3靶向部分。抗CD3抗体或其抗原结合片段可以表现出对CD3的强效结合和抑制活性，并可以用于治疗和诊断用途。

在一种实施方式中，抗CD3抗体或其片段可以式能够对人CD3蛋白，优选人CD3E多肽具有特异性。

在一种实施方式中，抗CD3抗体或其片段可以包括：(a)VH CDR1，其包括由SEQ IDNO:47组成的氨基酸序列；(b)VH CDR2，其包括由SEQ ID NO:48组成的氨基酸序列；(c)VHCDR3，其包括由SEQ ID NO:49组成的氨基酸序列；(d)VL CDR1，其包括由SEQ ID NO:50组成的氨基酸序列；(e)VL CDR2，其包括由SEQ ID NO:51组成的氨基酸序列；以及(f)VL CDR3，其包括由SEQ ID NO:52组成的氨基酸序列。

在一种实施方式中，上文公开的轻链的各可变区的CDR和重链的各可变区的CDR可以自由组合。

在一种实施方式中，抗CD3抗体或其片段可以包括重链，其包括由SEQ ID NO:53组成的氨基酸序列或与由SEQ ID NO:53组成的氨基酸序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的肽；以及轻链，其包括由SEQ ID NO:54组成的氨基酸序列或与由SEQ ID NO:54组成的氨基酸序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的肽。

在其他实施方式中，上文公开的重链和轻链可变区可以自由组合用于制备各种形式的抗体。

在其他实施方式中，抗体可以包括或基本上由重链和轻链的组合组成，所述轻链和重链由以下序列表示：SEQ ID NO:53；和SEQ ID NO:54。

在一些实施方式中，抗CD3抗体的抗原结合片段可以是包括抗体的重链CDR和/或轻链CDR的任何片段，并且例如，它可以选自，但不限于由以下组成的组：Fab、Fab'、F(ab')₂、xFab、Fd(包括重链可变区和CH1结构域)、Fv(重链可变区和/或轻链可变区)、单链Fv(scFv；包括或基本上由任意顺序的重链可变区和轻链可变区以及重链可变区和轻链可变区之间的肽接头组成)、单链抗体、二硫键连接的Fvs(sdFv)、scFab(单链Fab)、scFab-Fc(包括scFab和Fc区)、半IgG(包括一条轻链和一条重链)等。

本发明包括与本文公开的一种或多种氨基酸序列具有基本序列同一性的一种或多种氨基酸序列。基本同一性意味着保留本文公开的存在序列变异的效果。

在一种实施方式中，本公开提供了融合蛋白，其包括(i)本文所述的一种或多种单域抗体或其抗原结合片段(例如，本文所述的一种或多种CDR)，以及(ii)一种或多种额外的多肽。例如，融合蛋白可以包括本文所述的一种或多种单域抗体和本文所述的恒定区或Fc区。在一种实施方式中，本文所述的一种或多种单域抗体或其抗原结合片段(例如，本文所述的一种或多种CDR)可以与抗体或抗原非共价或共价偶联，例如融合。

抗CLL-1/抗CD3双特异性抗体

抗CLL-1抗体/抗CD3双特异性抗体可以包括抗CLL-1抗体或其抗原结合片段；和抗CD3抗体或其抗原结合片段。抗CLL-1抗体/抗CD3双特异性抗体可以用于治疗和诊断用途。

在一种实施方式中，在双特异性抗体中包括CLL-1靶向部分和CD3靶向部分。。

在一种实施方式中，抗CLL-1抗体或其抗原结合片段和抗CD3抗体或其抗原结合片段可以直接相互融合或通过肽接头相互融合。

在一种实施方式中，抗CLL-1抗体或其抗原结合片段和抗CD3抗体或其抗原结合片段中的每一个可以独立地是Fab分子。

在一种实施方式中，所述Fab分子可以是人Fab分子或包含TCR恒定区的嵌合Fab样结构域。在一种实施方式中，所述Fab分子可以是嵌合的或人源化的。

在一种实施方式中，(a)抗CLL-1抗体或其抗原结合片段可以在抗CLL-1抗体或其抗原结合片段的Fab重链的C-末端处与抗-CD3抗体或其抗原结合片段的Fab重链的N-末端融合，或者(b)抗CD3抗体或其抗原结合片段可以在抗CD3抗体或其抗原结合片段的Fab重链的C-末端处与抗CLL-1抗体或其抗原结合片段的Fab重链的N-末端融合。

在一种实施方式中，抗CLL-1/抗CD3双特异性抗体可以包括Fc结构域，该Fc结构域包括第一亚单位和第二亚单位。

在一种实施方式中，Fc结构域可以是具有或不具有额外突变的人Fc结构域。在Fc结构域中的这种额外突变可以包括使ADCC活性无效的N297A突变或促进正确抗体配对的KIH(杵-臼)突变，但不限于此。

在一种实施方式中，抗CLL-1抗体或其抗原结合片段和抗CD3抗体或其抗原结合片段可以各自是Fab分子；并且(a)抗CD3抗体或其抗原结合片段可以在抗CD3抗体或其抗原结合片段的Fab重链的C-末端处与Fc结构域的第一亚单位的N-末端融合，以及(b)抗CLL-1抗体或其抗原结合片段可以在抗CLL-1抗体或其抗原结合片段的Fab重链的C-末端处与Fc结构域的第二亚单位的N-末端融合。

在一种实施方式中，抗CLL-1抗体或其抗原结合片段可以是第一抗CLL-1抗体或其抗原结合片段，并且还包括第二抗CLL-1抗体或其抗原结合片段。

在一种实施方式中，第一抗CLL-1抗体或其抗原结合片段、抗CD3抗体或其抗原结合片段以及第二抗CLL-1抗体或其抗原结合片段(如果存在的话)可以各自是Fab分子；或是(a)抗CD3抗体或其抗原结合片段可以在抗CD3抗体或其抗原结合片段的Fab重链的C-末端处与第一抗CLL-1抗体或其抗原结合片段的Fab重链的N-末端融合，并且第一抗CLL-1抗体或其抗原结合片段可以在第一抗CLL-1抗体或其抗原结合片段的Fab重链的C-末端处与Fc结构域的第一亚单位的N-末端融合，或是(b)第一抗CLL-1抗体或其抗原结合片段可以在第一抗CLL-1抗体或其抗原结合片段的Fab重链的C-末端处与抗CD3抗体或其抗原结合片段的Fab重链的N-末端融合，并且抗CD3抗体或其抗原结合片段可以在抗CD3抗体或其抗原结合片段的Fab重链的C-末端处与Fc结构域的第一亚单位的N-末端融合；并且第二抗CLL-1抗体或其抗原结合片段(如果存在的话)可以在第二抗CLL-1抗体或其抗原结合片段的Fab重链的C-末端处与Fc结构域的第二亚单位的N-末端融合。

在一种实施方式中，第一抗CLL-1抗体或其抗原结合片段、抗CD3抗体或其抗原结合片段以及第二抗CLL-1抗体或其抗原结合片段各自是Fab分子；第一抗CLL-1抗体或其抗原结合片段在第一抗CLL-1抗体或其抗原结合片段的Fab重链的C-末端处与抗CD3抗体或其抗原结合片段的Fab重链的N-末端融合，并且抗CD3抗体或其抗原结合片段在抗CD3抗体或其抗原结合片段的Fab重链的C-末端处与Fc结构域的第一亚单位的N-末端融合；并且第二抗CLL-1抗体或其抗原结合片段(如果存在的话)在第二抗CLL-1抗体或其抗原结合片段的Fab重链的C-末端处与Fc结构域的第二亚单位的N-末端融合。由于这种结构中被掩蔽的CD3结合位点，导致双特异性抗体可以强烈地诱导T细胞激活和IFN-g和IL-2的细胞因子表达，但微弱地诱导CRS相关的细胞因子诸如TNF-a和IL-6，因此显示出较少的瘤外毒性(off-tumor toxicity)。

在一种实施方式中，第一抗CLL-1抗体或其抗原结合片段和第二抗CLL-1抗体或其抗原结合片段彼此可以是相同的。

在一种实施方式中，双特异性抗体可以能够同时结合CLL-1和CD3，其是激活性T细胞抗原。在一种实施方式中，双特异性抗体可以能够通过同时结合CLL-1和CD3来交联T细胞和靶细胞。在一种实施方式中，这种同时结合导致靶细胞的裂解，特别是表达CLL-1的肿瘤细胞。在一种实施方式中，这种同时结合导致T细胞的激活。在其它实施方式中，这种同时结合导致T淋巴细胞，特别是细胞毒性T淋巴细胞的细胞应答，所述细胞应答选自以下的组：增殖、分化、细胞因子分泌、细胞毒性效应分子释放、细胞毒性活性以及激活标志物的表达。

在一种实施方式中，双特异性抗体可以能够将T细胞的细胞毒性活性重新导向至靶细胞。在特定实施方式中，所述重新导向不依赖于由靶细胞引起的MHC介导的肽抗原呈递和/或T细胞的特异性。特别地，根据本发明的实施方式的任一项所述的T细胞是细胞毒性T细胞。在一些实施方式中，T细胞是CD4⁺或CD8⁺T细胞，特别是CD8⁺T细胞。

在一种实施方式中，根据实施方式的双特异性抗体可以在U937和HL-60细胞系存在下诱导细胞因子表达、颗粒酶B和/或穿孔素。

偶联物

本发明提供了免疫偶联物，其包括与一种或多种治疗剂偶联(化学键合)的如本文所述的抗CLL-1抗体或抗CLL-1/抗CD3双特异性抗体，所述治疗剂诸如细胞毒性剂、化疗剂、药物、生长抑制剂、毒素(例如，蛋白毒素，细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素或其片段)或放射性同位素。

在一种实施方式中，免疫偶联物是抗体-药物偶联物(ADC)，其中抗体与一种或多种上述治疗剂偶联。通常使用接头将抗体连接到治疗剂的一种或多种上。在PharmacolReview 68:3-19(2016)中阐述了ADC技术的概述，包括治疗剂、药物和接头的实例。

在另一实施方式中，免疫偶联物可以包括与酶活性毒素或其片段偶联的如本文所述的抗体，包括但不限于，白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌)、蓖麻毒素A链、相思子毒素A链、蒴莲根毒素(modeccin)A链、α-八叠球菌(alpha-sarcin)、油桐(Aleurites fordii)蛋白、石竹素(dianthin)蛋白、美洲商陆(Phytolacaamericana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜抑制剂、麻风树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥阜草(sapaonaria officinalis)抑制剂、白树毒素(gelonin)、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依诺霉素(enomycin)以及单端孢霉烯族化合物(tricothecenes)。

在另一种实施方式中，免疫偶联物可以包括与放射性原子偶联形成放射性偶联物的如本文所述的抗体。多种放射性同位素可用于产生放射性偶联物。实例包括At²¹¹、I¹³¹、I¹²⁵、Y⁹⁰、Re¹⁸⁶、Re¹⁸⁸、Sm¹⁵³、Bi²¹²、P³²、Pb²¹²以及Lu的放射性同位素。当将放射性偶联物用于检测时，它可以包括用于闪烁造影(scintigraphic)研究的放射性原子，例如tc99m或I123，或者用于核磁共振(NMR)成像(也称为磁共振成像，mri)的自旋标记，诸如碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。

抗体和细胞毒性剂的偶联物可以使用多种双官能蛋白质偶联剂来制备，诸如丙酸N-羟基琥珀酰亚胺3-(2-吡啶二巯基)酯(SPDP)、4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(SMCC)、亚氨基硫杂环戊烷(iminothiolane)(IT)、亚氨酸酯的双官能衍生物(诸如盐酸己二亚胺酸二甲酯(dimethyl adipimidate HCl))、活性酯(诸如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、醛(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺(bis(p-azidobenzoyl)hexanediamine))、双重氮衍生物(诸如双-(对-重氮鎓苯甲酰基)-乙二胺(bis-(p-diazoniumbenzoyl)-ethylenediamine))、二异氰酸酯(诸如甲苯2,6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(诸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。例如，蓖麻毒素免疫毒素可以如Vitetta et al.,Science 238:1098(1987)中所述制备。碳-14标记的三胺五乙酸1-异硫氰基苄基-3-甲基二亚乙基酯(MX-DTPA)是用于放射性核苷酸与抗体偶联的示例性螯合剂。参见WO94/11026。接头可以是促进细胞毒性药物在细胞中释放的“可裂解接头”。例如，可以使用酸不稳定接头、肽酶敏感型接头、光不稳定接头、二甲基接头或含二硫化物的接头(Chariet al.,Cancer Res.52:127-131(1992))；美国专利号5,208,020)。

本文明确考虑了免疫偶联物或ADC但不限于用交联剂制备的这种偶联物，所述交联剂包括但不限于BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺基(sulfo)-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC、和磺基-SMPB和SVSB(琥珀酰亚胺基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)，其是商购可得的(例如，从PierceBiotechnology,Inc.,Rockford,Ill.,U.S.A处购得)。

可以被结合细胞毒性剂还包括，例如，吡咯并苯并二氮杂(PBD)、单甲基澳瑞他汀E(Monomethyl Auristatin)(MMAE)、单甲基澳瑞他汀F(MMAF)、喜树碱、多柔比星、顺铂、维拉帕米、氟尿嘧啶、奥沙利铂、柔红霉素、依立替康、拓扑替康、紫杉醇、卡铂、吉西他滨、甲氨蝶呤、多西他赛、阿西维辛、阿柔比星、阿考达唑(acodazole)、山油柑碱、阿多来新(adozelesin)、阿拉诺新(alanosine)、阿地白介素(aldesleukin)、别嘌醇钠(allopurinolsodium)、六甲嘧胺(altretamine)、氨鲁米特(aminoglutethimide)、氨萘非特、安普利近(ampligen)、安吖啶、雄激素、蛇形菌素(anguidine)、甘氨酸阿非迪霉素(aphidicolinglycinate)、亮氨酸溶肉瘤素(asaley)、天冬酰胺酶、5-氮杂胞苷、硫唑嘌呤、卡介苗(BCG)、贝氏抗叶酸药(Baker's Antifol)、β-2-脱氧硫代鸟苷、盐酸比生群(bisantrene HCl)、硫酸博来霉素、白消安、丁硫氨酸亚砜胺(buthionine sulfoximine)、BWA 773U82、BW502U83/HCl、BW 7U85甲磺酸酯、赛瑞酰胺(ceracemide)、卡贝替姆(carbetimer)、卡铂(carboplatin)、卡莫司汀(carmustine)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、氯喹喔啉磺酰胺(chloroquinoxaline-sulfonamide)、氯脲霉素(chlorozotocin)、色霉素A3(chromomycinA3)、顺铂(cisplatin)、克拉立滨(cladribine)、皮质类固醇(corticosteroid)、短小棒状杆菌(Corynebacterium parvum)、CPT-11、克立那托(crisnatol)、环胞苷、环磷酰胺、阿糖胞苷、色他巴(cytembena)、道比什马来酸酯(dabis maleate)、达卡巴嗪(dacarbazine)、更生霉素(dactinomycin)、盐酸柔红霉素(daunorubicin HCl)、脱氮尿苷(deazauridine)、右雷佐生、二去水半乳糖醇、地吖醌(diaziquone)、二溴卫矛醇(dibromodulcitol)、膜海鞘素B(didemnin B)、二乙基二硫代氨基甲酸酯(diethyldithiocarbamate)、肌苷二醛、二氢-5-氮杂胞嘧啶核苷(dihydro-5-azacytidine)、刺霉素(echinomycin)、依达曲沙(edatrexate)、依地福新(edelfosine)、依氟鸟氨酸(eflomithine)、Elliott溶液(Elliott’s solution)、依沙芦星(elsamitrucin)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、磷酸雌二醇氮芥(estramustine phosphate)、雌激素、依他硝唑(etanidazole)、ethiofos、依托泊苷、法曲唑(fadrazole)、法扎拉滨(fazarabine)、芬维A胺(fenretinide)、非格司亭(filgrastim)、非那雄胺(finasteride)、黄酮乙酸(flavoneacetic acid)、氟尿苷(floxuridine)、磷酸氟达拉滨(fludarabine phosphate)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)、氟洛索^TM(Fluosol^TM)、氟他胺(flutamide)、硝酸镓、吉西他滨、乙酸戈舍瑞林(goserelin acetate)、hepsulfam、六亚甲基二乙酰胺(hexamethylenebisacetamide)、高三尖杉酯碱(homoharringtonine)、硫酸肼、4-羟雄固烯二酮(4-hydroxyandrostenedione)、羟基脲、盐酸依达比星(idarubicin HCl)、异环磷酰胺、干扰素α、干扰素β、干扰素γ、白细胞介素-1α和白细胞介素1β(interleukin-1alpha and beta)、白细胞介素-3、白细胞介素-4、白细胞介素-6、4-ipomeanol、异丙铂(iproplatin)、异维甲酸(isotretinoin)、甲酰四氢叶酸钙(leucovorin calcium)、乙酸亮脯利特(leuprolideacetate)、左旋咪唑(levamisole)、脂质体柔红霉素(liposomal daunorubicin)、脂质体封装多柔比星(liposome encapsulated doxorubicin)、洛莫司汀(lomustine)、氯尼达明(lonidamine)、美登素(maytansine)、盐酸氮芥、美法仑(melphalan)、美诺立尔(menogaril)、美巴龙(merbarone)、6-巯基嘌呤(6-mercaptopurine)、美司钠(mesna)、卡介苗的甲醇提取物、甲氨喋呤(methotrexate)、N-甲基甲酰胺(N-methylformamide)、米非司酮(mifepristone)、丙脒腙(mitoguazone)、丝裂霉素C(mitomycin-C)、米托坦(mitotane)、米托蒽醌盐酸盐(mitoxantrone hydrochloride)、单核细胞/巨噬细胞集落刺激因子(monocyte/macrophagecolony-stimulating factor)、纳必隆(nabilone)、萘福昔定(nafoxidine)、新制癌菌素(neocarzinostatin)、乙酸奥曲肽(octreotide acetate)、奥马铂(ormaplatin)、奥沙利铂(oxaliplatin)、紫杉醇、pala、喷司他丁(pentostatin)、哌嗪二酮、哌泊溴烷(pipobroman)、吡柔比星(pirarubicin)、吡曲克辛(piritrexim)、盐酸吡罗蒽醌(piroxantrone hydrochloride)、PIXY-321、普卡霉素(plicamycin)、卟非姆钠(porfimer sodium)、泼尼莫司汀(prednimustine)、丙卡巴肼(procarbazine)、孕激素、吡唑呋喃菌素(pyrazofurin)、雷佐生(razoxane)、沙格司亭(sargramostim)、司莫司汀(semustine)、锗螺胺(spirogermanium)、螺莫司汀(spiromustine)、链黑菌素(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、磺氯苯脲(sulofenur)、苏拉明钠(suraminsodium)、他莫昔芬(tamoxifen)、泰索帝(taxotere)、替加氟(tegafur)、替尼泊甙(teniposide)、对苯二甲酸脒(terephthalamidine)、替罗昔隆(teroxirone)、硫鸟嘌呤(thioguanine)、塞替派(thiotepa)、胸苷注射剂(thymidine injection)、噻唑呋林(tiazofurin)、拓泊替康(topotecan)、托瑞米芬(toremifene)、维甲酸(tretinoin)、盐酸三氟拉嗪(trifluoperazine hydrochloride)、曲氟尿苷(trifluridine)、三甲曲沙(trimetrexate)、肿瘤坏死因子(TNF)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)、硫酸长春碱(vinblastine sulfate)、硫酸长春新碱(vincristinesulfate)、长春地辛(vindesine)、长春瑞滨(vinorelbine)、长春利定(vinzolidine)、吉雄864(Yoshi 864)、佐柔比星，其药学上可接受的盐以及其混合物，等等。

糖基化变体

在某些实施方式中，本文提供的抗体可以被改变以增加或降低抗体被糖基化的程度。抗体的糖基化位点的添加或缺失可以通过改变氨基酸序列来方便地完成，从而建立或移除一个或多个糖基化位点。

当抗体包括Fc区时，附着于其上的寡糖可以被改变。由哺乳动物细胞产生的天然抗体通常包括分支的双触角型寡糖，其通常通过N-键附着于Fc区的CH2结构域的Asn297。参见，例如，Wright et al.TIBTECH 15:26-32(1997)。寡糖可以包括各种碳水化合物，例如，甘露糖、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸，以及在双触角型寡糖结构的“茎”中附着于GlcNAc的岩藻糖。在一些实施方式中，为了产生具有某些改良特性的抗体变体，可以对本发明抗体中的寡糖进行修饰。

在一种实施方式中，提供了具有非岩藻糖基化寡糖的抗体变体，所述非岩藻糖基化寡糖也就是一种缺少(直接或间接)附着于Fc区的岩藻糖的寡糖结构。这种非岩藻糖基化寡糖(也称为“无岩藻糖基化”寡糖)特别是一种N-连接的寡糖，其缺少附着于双触角型寡糖结构的茎中第一GlcNAc的岩藻糖残基。在一种实施方式中，提供了与天然或亲本抗体相比，在Fc区具有增加比例的非岩藻糖基化寡糖的抗体变体。例如，非岩藻糖基化寡糖的比例可以是至少约20％，至少约40％，至少约60％，至少约80％，或甚至约100％(即，不存在岩藻糖基化寡糖)。例如，如WO 2006/082515中所述，通过MALDI-TOF质谱法测量的非岩藻糖基化寡糖的百分比是相对于附着于Asn 297的所有寡糖(例如复合物、杂合物和高甘露糖结构)的总和，缺少岩藻糖残基的寡糖的(平均)量。Asn297是指位于Fc区的大约第297位的天冬酰胺残基(Fc区残基的EU编号)；然而，由于抗体中较小的序列变异，Asn297也可以位于第297位的上游或下游约±3个氨基酸处，即294和300位之间。这种在Fc区具有增加比例的非岩藻糖基化寡糖的抗体可以具有改善的FcγRIIIa受体结合和/或改善的效应子功能，特别是改善的ADCC功能。参见，例如，US2003/0157108；US2004/0093621。

能够产生具有减少的岩藻糖基化的抗体的细胞系的实例包括缺乏蛋白质岩藻糖基化的Lec13 CHO细胞(Ripka et al.Arch.Biochem.Biophys.249:533-545(1986)；US2003/0157108；和WO 2004/056312，尤其是在实施例11中)、以及敲除细胞系，诸如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因、FUT8、敲除CHO细胞(参见，例如，Yamane-Ohnuki etal.Biotech.Bioeng.87:614-622(2004)；Kanda,Y.et al.,Biotechnol.Bioeng.,94(4):680-688(2006)；以及WO2003/085107)，或GDP-岩藻糖合成或转运蛋白活性降低或消失的细胞(参见，例如，US2004259150、US2005031613,、US2004132140、US2004110282)。

在进一步实施方式中，提供了具有二等分寡糖的抗体变体，例如，其中附着于抗体的Fc区的双触角型寡糖被GlcNAc二等分。如上所述，这种抗体变体可以具有降低的岩藻糖基化和/或改善的ADCC功能。这种抗体变体的实例描述于，例如，Umana et al.,NatBiotechnol 17,176-180(1999)；Ferrara et al.,Biotechn Bioeng 93,851-861(2006)；WO 99/54342；WO 2004/065540，WO 2003/011878。

还提供了在附着于Fc区的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体变体。这种抗体变体可以具有改善的CDC功能。这种抗体变体描述于，例如，WO 1997/30087；WO 1998/58964；以及WO 1999/22764。

Fc结构域

在特定实施方式中，本发明的抗体或双特异性抗体可以包括由第一亚单位和第二亚单位组成的Fc结构域。应当理解，本文描述的与抗体或双特异性抗体相关的Fc结构域的特征同样适用于包括在本发明抗体中的Fc结构域。

抗体或双特异性抗体的Fc结构域可以由一对包括免疫球蛋白分子的重链结构域的多肽链组成。例如，免疫球蛋白G(IgG)分子的Fc结构域是二聚体，其每个亚单位包括CH2和CH3 IgG重链恒定结构域。Fc结构域的两个亚单位能够彼此稳定缔合。在一种实施方式中，本发明的抗体或双特异性抗体包括不超过一个Fc结构域。

在一种实施方式中，抗体或双特异性抗体的Fc结构域可以是IgG Fc结构域。在另一种具体实施方式中，Fc结构域可以是人Fc结构域。

促进异二聚化的Fc结构域修饰

根据本发明的抗体或双特异性抗体可以包括不同的抗原结合部分，其可以融合至Fc结构域的两个亚单位中的一个或另一个，因此Fc结构域的两个亚单位通常被包括在两个不同的多肽链中。这些多肽的重组共表达以及随后的二聚化导致两种多肽的若干种可能的组合。为了在重组生产中改善抗体或双特异性抗体的产量和纯度，因此在抗体或双特异性抗体的Fc结构域中有利地引入了促进所需多肽缔合的修饰。

因此，在具体实施方式中，根据本发明的抗体或双特异性抗体的Fc结构域可以包括促进Fc结构域的第一和第二亚单位缔合的修饰。人IgG Fc结构域的两个亚单位之间的最广泛的蛋白质-蛋白质相互作用的位点在Fc结构域的CH3结构域中。因此，在一种实施方式中，所述修饰可以在Fc结构域的CH3结构域中。

为了增强异二聚化，在Fc结构域的CH3结构域中存在若干种修饰方法，其皆被充分地描述于，例如，WO 96/27011、WO 98/050431、EP 1870459、WO 2007/110205、WO 2007/147901、WO 2009/089004、WO 2010/129304、WO 2011/90754、WO 2011/143545、WO2012058768、WO 2013157954、WO 2013096291。通常，在所有这些方法中，Fc结构域的第一亚单位的CH3结构域和Fc结构域的第二亚单位的CH3结构域都以互补的方式经工程改造以使得每个CH3结构域(或包括它的重链)不能再与其自身同源二聚化，而是被迫与经互补工程改造的其他CH3结构域异二聚化(使得第一和第二CH3结构域异二聚化，并且在两个第一或两个第二CH3结构域之间没有形成同源二聚体)。这些用于改善重链异二聚化的不同方法被认为是与抗体或双特异性抗体中的重-轻链修饰(例如，在一个结合臂中的VH和VL交换/置换，以及在CH1/CL界面中引入带有相反电荷的带电氨基酸的置换)相结合的不同选择，其减少了重/轻链错配和本-周型(Bence Jones-type)副产物。

在具体实施方式中，所述促进Fc结构域的第一和第二亚单位结合的修饰是所谓的“杵-臼(knob-into-hole)”修饰，包括Fc结构域的两个亚单位之一中的“杵(knob)”修饰和Fc结构域的两个亚单位中的另一个中的“臼(hole)”修饰。

所述杵-臼技术被描述于，例如，美国专利号5,731,168；7,695,936；Ridgway etal.,Prot Eng 9,617-621(1996)和Carter,J Immunol Meth 248,7-15(2001)。通常，该方法包括在第一种多肽的界面上引入一个突起(“杵”)以及在第二种多肽的界面上引入一个相应的空腔(“臼”)，如此突起可以位于空腔中，从而促进异二聚体的形成并阻碍同二聚体的形成。通过用更大的侧链(例如，酪氨酸或色氨酸)替换第一多肽界面的小氨基酸侧链来构建突起。通过用更小的氨基酸侧链(例如，丙氨酸或苏氨酸)替换较大的氨基酸侧链，从而在第二种多肽的界面上建立起与突起大小相同或相似的补偿性空穴。

降低Fc受体结合和/或效应子功能的Fc结构域修饰

Fc结构域赋予抗体或双特异性抗体有利的药物代谢动力学特性，包括有助于在靶组织中良好累积的长血清半衰期和有利的组织-血液分布比。然而，同时它可能导致抗体或双特异性抗体对表达Fc受体的细胞不期望的靶向，而不是优选靶向携带抗原的细胞。此外，Fc受体信号传导途径的共激活可以导致细胞因子释放，其与T细胞激活特性(例如，在双特异性抗体的实施方式中，其中第二抗原结合部分与激活性T细胞抗原结合)和抗体或双特异性抗体的长半衰期组合，这导致细胞因子受体的过度激活和全身给药后的严重副作用。对T细胞以外的(带有Fc受体的)免疫细胞的激活甚至可以降低双特异性抗体(特别是其中第二抗原结合部分结合激活性T细胞抗原的双特异性抗体)的效力，这是由于例如NK细胞对T细胞的潜在破坏。

因此，在具体实施方式中，与天然IgG₁ Fc结构域相比，根据本发明的抗体或双特异性抗体的Fc结构域可以表现出降低的对Fc受体的结合亲和力和/或降低的效应子功能。在一种这样的实施方式中，所述Fc结构域(或包括所述Fc结构域的抗体或双特异性抗体)表现出低于50％，优选低于20％，更优选低于10％，最优选低于5％的相比于天然IgG₁ Fc结构域(或包括天然IgG₁ Fc结构域的抗体或双特异性抗体)对Fc受体的结合亲和力，和/或与天然IgG₁ Fc结构域结构域(或包含天然IgG₁ Fc结构域的抗体或双特异性抗体)相比，低于50％，优选低于20％，更优选低于10％，最优选低于5％的效应子功能。在一种实施方式中，所述Fc结构域(或包括所述Fc结构域的抗体或双特异性抗体)基本上不与Fc受体结合和/或基本上不诱导效应子功能。在特定实施方式中，Fc受体是Fcγ受体。在一种实施方式中，Fc受体可以是人Fc受体。在一种实施方式中，Fc受体可以是激活性Fc受体。在具体实施方式中，Fc受体可以是激活性人Fcγ受体，更具体地说是人FcγRIIIa、FcγRI或FcγRIIa，最具体地说是人FcγRIIIa。在一种实施方式中，效应子功能可以是选自CDC、ADCC、ADCP和细胞因子分泌的组种一种或多种。在特定实施方式中，效应子功能可以是ADCC。在一种实施方式中，与天然IgG₁ Fc结构域对新生Fc受体(FcRn)的结合亲和力相比，所述Fc结构域可以表现出基本相似的结合亲和力。当所述Fc结构域(或包括所述Fc结构域的抗体或双特异性抗体)表现出大于约70％，特别是大于约80％，更特别是大于约90％的天然IgG₁ Fc结构域(或包括天然IgG₁ Fc结构域的抗体或双特异性抗体)对FcRn的结合亲和力时，则实现了基本相似的对FcRn的结合。

在某些实施方式中，与未经工程改造的Fc结构域相比，所述Fc结构域可以被工程改造以具有降低的对Fc受体的结合亲和力和/或降低的效应子功能。在特定实施方式中，抗体或双特异性抗体的Fc结构域可以包括降低Fc结构域的对Fc受体的结合亲和力和/或效应子功能的一个或多个氨基酸突变。通常，Fc结构域的两个亚单位中的每一个都存在相同的一个或多个氨基酸突变。在一种实施方式中，氨基酸突变可以降低Fc结构域对Fc受体的结合亲和力。在一种实施方式中，氨基酸突变可以将Fc结构域对Fc受体的结合亲和力降低至少2倍、至少5倍或至少10倍。在存在降低Fc结构域对Fc受体的结合亲和力的一个以上氨基酸突变的实施方式中，这些氨基酸突变的组合可以将Fc结构域对Fc受体的结合亲和力降低至少10倍、至少20倍或甚至至少50倍。在一种实施方式中，包括工程改造的Fc结构域的抗体或双特异性抗体表现出低于20％，特别是低于10％，更特别是低于5％的相较于包括未经工程改造的Fc结构域的抗体或双特异性抗体对Fc受体的结合亲和力。在特定实施方式中，Fc受体可以是Fcγ受体。在一些实施方式中，Fc受体可以是人Fc受体。

在一些实施方式中，Fc受体可以是激活性Fc受体。在具体实施方式中，Fc受体可以是激活性人Fcγ受体，更具体地说是人FcγRIIIa、FcγRI或FcγRIIa，最具体地说是人FcγRIIIa。优选地，与这些受体中每一个的结合降低。在一些实施方式中，对补体成分的结合亲和力，特别是对C1q的结合亲和力也降低。在一种实施方式中，对新生Fc受体(FcRn)的结合亲和力没有降低。当所述Fc结构域(或包括所述Fc结构域的抗体或双特异性抗体)表现出大于约70％的未经工程改造的形式的Fc结构域(或包括所述非工程化形式的Fc结构域的抗体或双特异性抗体)对FcRn的结合亲和力时，实现了基本上相似的对FcRn的结合，即保持了Fc结构域对所述受体的结合亲和力。Fc结构域或包括所述Fc结构域的本发明的双特异性抗体可以表现出大于约80％的并且甚至大于约90％的这种亲和力。在某些实施方式中，与未经工程改造的Fc结构域相比，双特异性抗体的Fc结构域可以经工程改造以具有降低的效应子功能。降低的效应子功能可以包括但不限于以下一种或多种：降低的补体依赖性细胞毒性(CDC)、降低的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、降低的抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)、降低的细胞因子分泌、降低的由抗原呈递细胞的免疫复合物介导的抗原摄取、降低的与NK细胞的结合、降低的与巨噬细胞的结合、降低的与单核细胞的结合、降低的与多形核细胞的结合、降低的诱导凋亡的直接信号传导、降低的靶结合抗体的交联、降低的树突状细胞成熟或降低的T细胞引发。在一种实施方式中，降低的效应子功能可以是选自降低的CDC、降低的ADCC、降低的ADCP和降低的细胞因子分泌的组中的一种或多种。在特定实施方式中，降低的效应子功能可以是降低的ADCC。在一种实施方式中，降低的ADCC可以低于20％的未经工程改造的Fc结构域(或包括未经工程改造的Fc结构域的双特异性抗体)诱导的ADCC。

在一种实施方式中，降低Fc结构域对Fc受体的结合亲和力和/或效应子功能的氨基酸突变可以是氨基酸置换。在一种实施方式中，Fc结构域可以包括在选自E233、L234、L235、N297、P331和P329(根据Kabat EU索引编号)的位置处的氨基酸置换。在更具体实施方式中，进一步的氨基酸置换可以是E233P、L234A、L235A、L235E、N297A、N297D或P331S，优选L234A或/和L235A。

组合物、制剂以及给药途径

在进一步的方面，本发明提供了例如用于任何以下治疗方法的包括任何抗体或双特异性抗体的药物组合物。在一种实施方式中，药物组合物包括本文提供的任何抗体或双特异性抗体和药学上可接受的载体。在另一种实施方式中，药物组合物包括本文提供的任何抗体或双特异性抗体和至少一种额外的治疗剂，例如，如下所述。

进一步提供了以适于体内给药的形式制备本发明的抗体或双特异性抗体的方法，该方法包括(a)获得根据本发明的抗体或双特异性抗体，和(b)将抗体或双特异性抗体与至少一种药学上可接受的载体进行配制，由此抗体或双特异性抗体的制剂被配制用于体内给药。

本发明的药物组合物包括溶解或分散在药学上可接受的载体中的治疗有效量的抗体或双特异性抗体。短语“药学上或药理学上可接受的”是指在所用的剂量和浓度下通常对接受者无毒的分子实体和组合物，即当适当地向动物诸如例如人给药时，不会产生不利的、过敏的或其它不良反应。鉴于本公开内容，对包含抗体或双特异性抗体和任选的额外的活性成分的药物组合物的制备对于本领域技术人员来说是已知的，如雷明顿药物科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)，第18版.Mack Printing Company,1990所举例说明的，通过援引并入本文。此外，对于动物(例如，人)给药，应当理解的是，制剂应当符合FDA生物标准品办公室(FDA Office of Biological Standards)或其他国家相应机构所要求的无菌性、热原性、一般安全性和纯度标准。优选的组合物是冻干制剂或水性溶液。如本文所用，“药学上可接受的载体”包括本领域普通技术人员已知的任何和所有溶剂、缓冲剂、分散介质、包衣、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如，抗菌剂、抗真菌剂)、等渗剂、吸收延迟剂、盐、防腐剂、抗氧化剂、蛋白质、药物、药物稳定剂、聚合物、凝胶、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、染料等物质及其组合(参见，例如，雷明顿药物科学，第18版，Mack Printing Company,1990,pp.1289-1329，通过援引并入本文)。除了与活性成分不相容的一些常规载体之外，其在治疗性组合物或药物组合物中的用途也在考虑之列。

本发明的抗体或双特异性抗体(和任何额外的治疗剂)可以通过任何合适的方式给药，包括肠胃外、肺内和鼻内给药，并且如果需要进行局部治疗，还可以通过病灶内给药。胃肠外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下给药。可以通过任何合适的途径给药，例如，通过注射，诸如静脉内或皮下注射，部分取决于给药是短暂的还是长期的。

肠胃外组合物包括那些设计用于注射给药的组合物，例如皮下、真皮内、病灶内、静脉内、动脉内肌内、鞘内或腹膜内注射。对于注射，本发明的抗体或双特异性抗体可以配制在水性溶液中，优选地配制在生理相容的缓冲剂中，诸如Hanks溶液、林格氏溶液或生理盐水缓冲剂。该溶液可以包含配方剂(formulatory agent)，诸如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。或者，抗体或双特异性抗体可以是粉末形式，用于在使用前与合适的负载体(例如无菌无热原水)构建(constitution)。根据需要，通过将所需量的本发明的抗体或双特异性抗体掺入到具有下文列举的各种其它成分的适当溶剂中来制备无菌注射溶液。无菌可以容易地实现，例如，通过无菌过滤膜过滤。通常，通过将各种无菌的活性成分掺入到包含基本分散介质和/或其它成分的无菌负载体中来制备分散剂。在用于制备无菌注射溶液、悬浮液或乳液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥或冷冻干燥技术，其从预先无菌过滤的液体介质中产生活性成分加上任何其它所需成分的粉末。如果必要的话，液体介质应该被适当地缓冲，并且在用足够的盐水或葡萄糖注射之前，首先使液体稀释剂等渗。该组合物在生产和储存条件下必须是稳定的，并能防止微生物诸如细菌和真菌的污染作用。应当理解，内毒素污染物应当最低限度保持在安全水平，例如低于0.5ng/mg蛋白质。合适的药学上可接受的载体包括但不限于，缓冲剂诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(诸如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯(alkyl parabens)诸如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂诸如EDTA；糖类诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐反荷离子诸如钠；金属络合物(例如，锌-蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂诸如聚乙二醇(PEG)。水性注射剂悬浮剂可以包含增加悬浮粘度的化合物，诸如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇、右旋糖酐等。任选地，悬浮剂还可以包含合适的稳定剂或增加化合物溶解度的剂，以允许制备高度浓缩的溶液。此外，可以将活性化合物的悬浮剂制成合适的油性注射悬浮剂。合适的亲脂性溶剂或负载体包括脂肪油诸如芝麻油，或合成脂肪酸酯，诸如乙基纤维素或甘油三酯，或脂质体。包括本发明的抗体或双特异性抗体的药物组合物可以通过常规的混合、溶解、乳化、封装、包埋或冻干方法来制备。可以使用有助于将蛋白质加工成可药用的制剂的一种或多种生理上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或助剂以常规方式配制药物组合物。合适的制剂取决于所选择的给药途径。

治疗方法和组合物

本文提供的任何抗体或双特异性抗体可以用于治疗方法。本发明的抗体或双特异性抗体可以用作免疫治疗剂，例如在癌症的治疗中。

为了用于治疗方法，本发明的抗体或双特异性抗体将以符合良好医疗实践的方式进行配制、服药和给药。在这种情况下需要考虑的因素包括所治疗的特定疾患、所治疗的特定哺乳动物、个体患者的临床病症、疾患的原因、药剂的递送部位、给药方法、给药时间表以及医师已知的其他因素。

一方面，提供了本发明的抗体或双特异性抗体，用于用作药物的用途。在进一步的方面，提供了本发明的抗体或双特异性抗体，用于治疗疾病的用途。在某些实施方式中，提供了本发明的抗体或双特异性抗体，用于治疗的方法的用途。

在一种实施方式中，本发明提供了如本文所述的抗体或双特异性抗体，用于在有需要的个体中治疗疾病的用途。在某些实施方式中，本发明提供了抗体或双特异性抗体，用于治疗患有疾病的个体的方法中的用途，包括向该个体给药治疗有效量的抗体或双特异性抗体。在一种实施方式中，疾病可以是癌症。在某些实施方式中，方法还包括向个体给药治疗有效量的至少一种额外的治疗剂，例如，如果待治疗的疾病是癌症，则给药抗癌剂。在进一步的实施方式中，本发明提供了如本文所述的抗体或双特异性抗体，用于诱导靶细胞(特别是肿瘤细胞)的裂解的用途。在某些实施方式中，本发明提供了抗体或双特异性抗体，用于诱导个体中靶细胞(特别是肿瘤细胞)裂解的方法中的用途，包括向个体给药有效量的抗体或双特异性抗体以诱导靶细胞的裂解。根据任何上述实施方式的“个体”是哺乳动物，优选人。

在一种实施方式中，待治疗的疾病可以是癌症。

在一种实施方式中，癌症可以是实体癌或血癌。

在一种实施方式中，癌症可以选自由以下组成的组：白血病、直肠癌、子宫内膜癌、肾母细胞瘤、基底细胞癌、鼻咽癌、骨肿瘤、食道癌、淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、滤泡状甲状腺癌、肝细胞癌、口腔癌、肾细胞癌、多发性骨髓瘤、间皮瘤、骨肉瘤、骨髓增生异常综合征、间叶性肿瘤、软组织肉瘤、脂肪肉瘤、胃肠间质瘤、恶性外周神经鞘瘤(MPNST)、尤文肉瘤、平滑肌肉瘤、间叶性软骨肉瘤、淋巴肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、畸胎瘤、神经母细胞瘤、髓母细胞瘤、胶质瘤、良性皮肤肿瘤、伯基特淋巴瘤(Burkitt'slymphoma)、套细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、神经外胚层肿瘤、上皮性肿瘤、皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)、外周T细胞淋巴瘤(PTCL)、胰腺癌、血液恶性肿瘤、肾癌、肿瘤血管、乳腺癌、肾癌、卵巢癌、上皮性卵巢癌、胃癌、肝癌、肺癌、结直肠癌、胰脏癌、皮肤癌、膀胱癌、睾丸癌、子宫癌、前列腺癌、小细胞肺癌(SCLC)、非小细胞肺癌(NSCLC)、成神经细胞瘤、脑癌、结肠癌、鳞状细胞癌、黑色素瘤、骨髓瘤、宫颈癌、甲状腺癌、头颈癌和肾上腺癌。

在一种实施方式中，白血病可以选自由以下组成的组：急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、毛细胞白血病、骨髓增生异常综合征(MDS)、慢性髓细胞性白血病(CML)和急性髓细胞性白血病(AML)，优选地为AML。

在一种实施方式中，癌症可以是表达CLL-1的癌症。

技术人员容易认识到，在许多情况下，抗体或双特异性抗体可能不提供治愈效果，而可能仅提供部分的有益效果。在一些实施方式中，具有一些有益效果的生理变化也被认为是治疗上有益的。因此，在一些实施方式中，提供生理变化的抗体或双特异性抗体的量被认为是“有效量”或“治疗有效量”。需要治疗的受试者、患者或个体通常是哺乳动物，更特别地是人。

在一些实施方式中，将有效量的本发明的抗体或双特异性抗体给药于细胞。在其他实施方式中，将治疗有效量的本发明的抗体或双特异性抗体给药于个体用于治疗疾病。

为了预防或治疗疾病，本发明的抗体或双特异性抗体的适当剂量(当单独使用或与一种或多种其他治疗剂组合使用时)将取决于待治疗的疾病的类型、给药途径、患者的体重、抗体或双特异性抗体的类型、疾病的严重程度和病程、给药抗体或双特异性抗体是用于预防还是治疗目的、既往或并发的治疗性干预、患者的临床病史和对抗体或双特异性抗体的反应，以及主治医生的判断。在任何情况下，负责给药的医师将确定组合物中一种或多种活性成分的浓度和对于个体受试者的一种或多种合适剂量。本文考虑了各种给药方案，包括但不限于在不同时间点的单次或多次给药、推注药给药和脉冲输注。

抗体或双特异性抗体适合于一次性或在一系列治疗期间给药于患者。根据疾病的类型和严重程度，可以向患者给药约1ng/kg至100mg/kg的抗体或双特异性抗体。

此后，将通过实施例详细描述本公开。

以下实施例仅旨在说明本公开，而不应理解为限制本公开。

实施例1：抗CLL-1抗体的制备

1.1.通过小鼠免疫筛选单克隆抗体

为了制备抗CLL-1抗体，进行了小鼠免疫以筛选单克隆抗体。

简而言之，将两组小鼠(来自Charles River Laboratories，Hollister，CA的SJL和Balb/c小鼠)通过与具有N-末端人IgG1 Fc融合蛋白的人和食蟹猴CLL1混合进行免疫(小鼠是内部繁育的，抗原的氨基酸序列如表4所示)。

通过ELISA(酶联免疫吸附测定)筛选和FACS(荧光激活细胞分选)分析，筛选出三个杂交瘤克隆作为人和食蟹猴CLL1交叉反应克隆。这三个克隆分别是来自免疫Balb/c小鼠组的16C6、33C2和84A2。此外，所有克隆都与表达CLL1的细胞系(U937，HL60)和过表达CLL-1的细胞系(食蟹猴CLL1和人CLL1在HEK293E细胞中过表达)阳性结合。

【表4】

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1.2.来自杂交瘤细胞的单克隆抗体测序和抗体嵌合

为了对来自实施例1.1中免疫的Balb/c小鼠组的16C6、33C2和84A2进行测序，对来自杂交瘤细胞的单克隆抗体进行测序。

简而言之，按照Trizol试剂的技术手册(Ambion,目录号:15596-026)，从杂交瘤细胞中分离鼠16C6、33C2和84A2的总RNA。然后使用同种型特异性反义引物或通用引物通过RT-PCR将总RNA逆转录成cDNA。通过使用cDNA末端快速扩增(RACE)技术对VH(可变重链)和VL(可变轻链)的抗体片段进行扩增。将扩增的抗体片段克隆到克隆载体中，并且然后进行测序。三个CLL1阳性克隆的可变区和CDR显示在表5、表6和表7中。在表中，HCDR是重链中的CDR，LCDR是轻链中的CDR。

【表5】

【表6】

【表7】

为了产生嵌合抗体，鼠抗体的VH和VL分别与人IgG1重链恒定区和人κ轻链恒定区结合，并被克隆到表达载体中。通过在人IgG1中引入一个以上的突变或改变(例如，使ADCC活性无效的N297A(也称为“NA”))来修饰嵌合抗体的恒定区。然后，通过使用定点诱变，对三个克隆的三个经修饰的嵌合抗体进行额外的修饰，以移除翻译后修饰(PTM)或N-糖基化残基。如上所述的16C6、33C2和84A2的经修饰的序列显示在表8、表9和表10中。在下文中，ch16C6是指包括具有N297A突变体的重链的16C6或16C6(NA)的嵌合抗体，ch33C2是指包括具有N297A突变体的重链的33C2或33C2(NA)的嵌合抗体，以及ch84C2是指包括具有N297A突变体的重链和具有N12S突变体的轻链的84C2或ch84A2(NA/N12S)的嵌合抗体。

【表8】

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【表9】

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【表10】

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1.3.抗体人源化

为了将实施例1.2的嵌合抗体人源化，进行了同源建模。

简而言之，通过同源建模，获得鼠抗体的建模结构，并分析回复突变所需的残基。选择与小鼠的受体框架具有最高序列同一性的VH和VL的人受体框架。然后，将鼠抗体的互补决定区(CDR)移植到人受体框架中。接下来，对移植的抗体进行合理的回复突变设计。制备设计的人源化抗体并评估其结合特性。在众多小鼠和嵌合克隆中，选择16C6和33C2作为先导候选抗体。特别地，具有嵌合抗体的CDR(即，PTM或N-糖基化残基已经通过额外的修饰被移除)的人源化抗体被命名为16C6(M14)和33C2(M12)。16C6、16C6(M14)、33C2和33C2(M12)的人源化重链和轻链的序列如表11-14中所示。在下文中，hu16C6和hu16C6(M14)分别指16C6和16C6(M14)的人源化抗体，hu33C2和33C2(M12)分别指33C2和33C2(M12)的人源化抗体。

【表11】

【表12】

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【表13】

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【表14】

实施例2.抗CLL-1单特异性抗体活性的评价

2.1.配体结合活性试验(ELISA)

使用huCLL1-His和hFc-huCLL1作为配体，通过ELISA分析实施例1.2的抗体候选物以比较配体结合活性。

简而言之，将抗原(配体)在4℃下包被过夜。将抗原包被的平板用在PBS中的1％BSA在4℃下封闭2hr，并与抗体在4℃下孵育2hrs。为了查明每种抗体的EC₅₀(nM)，从浓度为50nM至0.2pM的抗体溶液制备4倍系列稀释液，将稀释的抗体处理到每个孔中，并用1XPBST洗涤平板。然后将与HRP(辣根过氧化物酶)(赛默(Thermo)，31414)偶联的山羊抗人IgG F(ab')2交叉吸附的第二抗体加入至每个孔中，并在4℃下孵育1hr。洗涤后，将TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)底物(西格玛(Sigma)，T0440)加入至每个孔中，通过ELISA板读数器测量450nm处的OD。结果如图1和图2中所示。

如图1和2中所示，证实了根据实施方式的所有三种嵌合抗体都与人CLL1-His和hFc-人CLL1抗原强有力地结合。

连续地，以与上述相同的方式，使用50ng/孔和100ng/孔的hFc-食蟹猴CLL1作为配体蛋白(ligandin)，通过ELISA分析实施例1.2的抗体候选物以比较配体结合活性。将基因泰克(Genentech)的抗CLL-1抗体6E7用作参照。结果如图3和图4中所示。

如图3和4中所示，证实了无论抗原浓度如何，根据一种实施方式的所有三种嵌合抗体都与hFc-食蟹猴CLL1强有利地结合。此外，证实了根据实施方式的所有三种嵌合抗体具有比基因泰克的抗体6E7更强的配体结合活性。

以与上述相同的方式对实施例1.2的嵌合抗体和实施例1.3的人源化抗体的配体结合活性进行比较。结果如图5、6和7中所示。

如图5至7所示，根据实施方式的人源化抗体表现出与根据实施方式的嵌合抗体相当的结合亲和力。由于鼠或嵌合抗体的人源化通常导致结合亲和力降低或甚至导致结合亲和力丧失，这些结果证明根据实施方式的人源化抗体是有利的。

2.2.细胞结合活性试验(FACS)

为了评价细胞结合特性，通过使用FACS在CLL1阴性细胞(HEK293E和Jurkat)和各种表达CLL1的癌细胞中对实施例1.2的嵌合抗体候选物进行分析。

简而言之，将细胞与抗体在4℃下孵育1hr。首先，用测定缓冲剂(在PBS中的1％BSA)来洗涤细胞。然后，向每个孔中加入与FITC(异硫氰酸荧光素)(西格玛，F9512)偶联的抗人IgG Fc，并在4℃下孵育1hr。洗涤后，通过BD FACS Calibur(BD Biosciences)测量FITC的MFI(中值荧光强度)。结果如表15和图8中所示。

【表15】

如表15和图8中所示，证实了根据实施方式的所有嵌合抗体在各种表达CLL1的细胞系中具有结合效力。

接着，以与上述相同的方式，通过使用FACS在HL60和U937(表达CLL1的肿瘤细胞系)中对实施例1.2的三种嵌合抗体的细胞结合特性进行评估。结果如图9和图10中所示。

如图9和10中所示，证实了根据实施方式的所有嵌合抗体在白血病细胞系中具有结合效力，尤其是ch16C6和ch33C2克隆显示出优异的结合效力。

接着，以与上述相同的方式，通过使用FACS在CynoCLL1_HEK293E中对实施例1.2的三种嵌合抗体的细胞结合特性进行评估。将基因泰克的抗CLL-1抗体6E7用作参照。结果如图11中所示。

如图11中所示，证实了根据实施方式的所有嵌合抗体在过表达食蟹猴CLL-1的HEK293E中具有比6E7更高的结合效力。此外，证实了根据实施方式的所有三种嵌合抗体具有比基因泰克的抗体6E7更高的细胞结合活性。

为了比较实施例1.2的嵌合抗体和实施例1.3的人源化候选物的抗原结合特性，使用PL21细胞系以与上述相同的方式对上述抗体进行分析。结果如图12和图13中所示。

如图12和13中所示，根据实施方式的人源化抗体表现出与根据实施方式的嵌合抗体相当的细胞结合活性。

2.3.抗体依赖性细胞毒性(ADCC)评价

为了在通过效应子介导的免疫杀死肿瘤细胞中评估根据实施方式的抗CLL-1抗体的体外活性，使用了ADCC报告基团生物测定试剂盒(Promega，G7102)。

简而言之，在实验当天，将靶细胞(HEK293-huCLL-1、HEK293，其是表达外源性人CLL-1的细胞系)接种到96孔白色平底的板中的测定缓冲剂(具有0.5％低IgG FBS的RPMI1640)中。然后将抗体的系列稀释液加入至平板中。将ADCC效应细胞加入到每个孔中，并将平板在37℃下于CO₂培养箱中孵育6hrs。孵育后，将板在室温下放置约10分钟，然后将Bio-Glo荧光素酶测定试剂(普洛麦格(Promega)，G7940)加入至每个孔中。用PHERAster FS BMGLABTECH测量发光程度，以分析ADCC诱导的程度。使用GraphPad Prism 8用4参数模型拟合剂量反应曲线。结果如图14中所示。

图14是示出根据实施方式的ch84A2、hu16C6和hu33C2的ADCC的图表。

如图14所示，证实了根据实施方式的抗体hu16C6(VH1/VL1(M14))、hu33C2(VH3/VL6(M12))、ch84A2(N12S)通过效应细胞诱导ADCC。并且hu16C6(VH1/VL1(M14))、hu33C2(VH3/VL6(M12))、ch84A2(N12S)的EC50分别为130.1pM、140.5pM和416.5pM。

2.4.ADC(抗体药物偶联物)的细胞毒活性的评价

为了评价包括实施例1.2的嵌合抗体的ADC的细胞毒性，使用嵌合抗体制备了各种ADC，并分析其细胞增殖抑制活性。

简而言之，将现有抗体轻链的第205位的缬氨酸(V)(根据Kabat编号，这也适用于下文)突变为半胱氨酸(C)，并使其与还原剂诸如二硫苏糖醇(DTT)反应，以在抗体轻链V205C(V205C T)上产生巯基基团，并且抗体通过巯基基团和药物之间产生的硫醚键与药物偶联。在下文中，对于每种嵌合抗体，制备的三种ADS被称为“ch16C6(V205C)-T-AB009”、“ch33C2(V205C)-T-AB009”、“ch84A2(V205C)-T-AB009”。此外，使用基因泰克的抗CLL-1抗体6E7作为参照，并且以相同的方式制备6E7的ADC(在下文中，称为“6E7(N54A/V205C)-T-AB009”)。

然后，使用商业上可获得的癌细胞系(EOL-1，THP-1细胞系(ATCC))测量上面所制备的ADC的癌细胞增殖抑制活性。在96孔板中，每个孔接种有每种癌细胞系的5000个细胞。培养24小时后，用浓度为5至100000pM的ADC(系列稀释三倍)处理它们，如表16中所示。六天后，使用WST-8(同仁化学分子科技公司(dojin do Molecular Technology Inc.))染料测量活细胞的数量。结果如表17、图15和16中所示。

【表16】

【表17】

如表17、图15和16中所示，证实了抗CLL-1单克隆抗体16C6、33C2和84A2在EOL-1和THP-1细胞系中比6E7具有更高的杀死癌细胞的能力。

实施例3.抗CLL-1/抗CD3双特异性抗体的制备。

选择实施例1.3中制备的抗CLL-1克隆hu33C2(VH3/VL6(M12))和PCT/CN2018/106618中公开的CD3克隆来制备抗CLL-1/抗CD3双特异性抗体。根据PCT/CN2018/106766中公开的WuXiBody产生方法来制备双特异性抗体。

简而言之，将VLA-CL的DNA片段插入到含有CMV启动子和人轻链信号肽的线性化载体中。将VHB-CH1(33C2)-(G₄S)₃-VHA-CH1(CD3)或VHB-CH1(33C2)-(G₄S)₂-VHA-CH1(CD3)的DNA片段插入到包含具有杵(knob)突变的人IgG1恒定区CH2-CH3的线性化载体中。将VHB-CH1的DNA片段插入至包含带有臼(hole)和N297A突变的人IgG1恒定区CH2-CH3的线性化载体中。两个载体都包含CMV启动子和人抗体重链信号肽。将VHB-CL的DNA片段插入到包含CMV启动子和人轻链信号肽的线性化载体中。其中VLA-CL是抗CD3抗体的轻链可变结构域(VLA)-抗CD3抗体的轻链恒定结构域(CL)，VHB-CH1是抗CLL-1抗体的重链可变结构域(VHB)-抗CLL-1抗体重链的第一恒定结构域(CH1)，G₄S是由GGGGS的氨基酸序列组成的肽接头，VHA-CH1是抗CD3抗体的重链可变结构域(VHB)-抗CD3抗体的重链的第一个恒定结构域(CH1)，VHB-CL是抗CLL-1抗体的重链可变结构域(VHB)-抗CLL-1抗体的轻链恒定结构域(CL)。

用于表达抗CD3的轻链部分:抗CD3的重链部分:抗CLL1的重链部分:抗CLL1的轻链部分的DNA比例为4∶1∶1∶2。在300mL的细胞培养基中制备了2.94×10⁶/mL的生存力高于95％的Expi293F细胞。将质粒DNA和ExpiFectamine^TM293试剂混合，然后加入到细胞培养基中。将细胞培养物在平台振荡器中以150rpm的转速孵育。使温度保持在37℃，同时CO₂水平保持在8％。孵育六天后，通过在25℃下以4000rpm离心10分钟来沉淀细胞。收集上清液用于纯化和凝胶电泳。将上清液上样到SDS-PAGE凝胶上，按照NuPAGE^TM的说明，与抗体样品一起使用4％至12％Bis-Tris蛋白质凝胶(赛默飞世尔(ThermoFisher))，PageRuler^TM未染色蛋白质梯(赛默飞世尔)来测定抗体的分子量。将每种变体的剩余上清液用于随后的纯化。用1mL的MabSelect Sure树脂预填充蛋白A柱。在上样细胞培养基之前，用0.1M的pH 7.0的Tris平衡该柱。随后，在上样后，用0.1M的pH 7.0的Tris洗涤该柱，并用0.1M的pH 3.5的柠檬酸盐洗脱该柱。然后通过加入0.1M的pH 9.0的Tris中和经洗脱的溶液。然后将样品在PBS缓冲剂(生工生物工程(Sangon Biotech)，B548117-0500)中透析。最后，通过0.2μm过滤器过滤抗体，并在1.5mL试管中无菌地分成0.2mL或0.5mL的等分试样。将抗体冷冻，储存在-80℃下，并由ABL运输或在Wuxi Biologics的体外测定。

总之，产生了两种双特异性抗体，它们仅在接头类型((G4S)2或(G4S)3)上不同。将具有(G4S)2接头的双特异性抗体标记为R2，并且将具有(G4S)3的双特异性抗体标记为R3。双特异性抗体的氨基酸序列如表18中所示。在下文中，也将具有R2接头的双特异性抗体称为33C2/CD3-R2，并且还将具有R3接头的双特异性抗体称为33C2/CD3-R3。

【表18】

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实施例4.抗CLL1/抗CD3双特异性抗体的活性的评价

4.1.在表达CLL-1的细胞中的结合活性的评价(FACS)

为了评价实施例3的双特异性抗体的肿瘤抗原结合特性，通过使用FACS分析哺乳动物细胞中表达的33C2/CD3-R2和33C2/CD3-R3的靶向CLL1的部分与CLL1的结合能力。

简而言之，将CLL1阳性细胞(U937和HL60)与33C2/CD3-R2和33C2/CD3-R3抗体一起孵育。用FACS缓冲剂(在PBS中的1％ BSA)洗涤后，将PE-抗人IgG抗体加入至每个孔中，并在4℃下孵育60min。通过FACS Calibur对PE(藻红蛋白)的MFI(中值荧光强度)进行评价。将BsAb空白/CD3用作对照组，其在一个臂上具有抗CD3抗原结合片段，在另一个臂上没有抗原结合片段。将Merus的抗CLL-1/抗CD3双特异性抗体MCLA-117用作参照。结果如图17和表19中所示。

【表19】

双特异性抗体	HL-60(EC50)	U937(EC50)
			33C2/CD3-R2	0.09nM	0.23nM
33C2/CD3-R3	0.09nM	0.25nM
			MCLA-117	35.09nM	4.53nM
空白/CD3	-	-

如图17和表19中所示，证实了根据实施方式的双特异性抗体在CLL1阳性癌细胞系中的结合活性显著高于MCLA-117抗体在CLL1阳性癌细胞系中的结合活性。

4.2.在表达CD3的细胞中的结合活性的评价(FACS)

为了评价实施例3的双特异性抗体的CD3结合特性，通过使用FACS分析33C2/CD3-R2和33C2/CD3-R3的靶向CD3的部分与表达CD3的哺乳动物细胞的结合活性。

简而言之，将表达CD3的Jurkat细胞系与33C2/CD3-R2和33C2/CD3-R3抗体一起孵育。用FACS缓冲剂(在PBS中的1％ BSA)洗涤后，将PE-抗人IgG抗体加入至每个孔中，并在4℃下孵育60min。通过FACS Calibur对PE的MFI(中值荧光强度)进行评价。结果如图18中所示。

如图18中所示，证实了根据实施方式的双特异性抗体以剂量依赖性方式强有力地结合表达CD3的Jurkat细胞系。

4.3.在不同CLL1表达条件下双特异性抗体的体外T细胞激活

为了研究33C2/CD3-R2和33C2/CD3-R3双特异性抗体(BsAb)的CLL1特异性T细胞激活活性，使用利用了AML细胞系(U937和HL-60)的Promega试剂盒。

简而言之，将U937或HL-60癌细胞的2×10⁴个细胞接种到含有10％FBS的罗斯维尔公园肿瘤研究所(Roswell Park Memorial Institute，RPMI)-1640培养基的96孔板中。加入BsAb和1×10⁵个TCR/CD3效应细胞(激活T细胞的核因子，NFAT)。在37℃和5％ CO₂气氛中孵育6小时后评估T细胞激活。然后，加入Bio-Glo试剂(Promega)，并用发光板读数器测量发光。将BsAb U1R2用作阴性对照，一种具有抗Claudin18.2(无关抗体)和抗CD3抗原结合片段的双特异性抗体。结果如图19和表20中所示。

【表20】

双特异性抗体	HL-60(EC50)	U937(EC50)
			33C2/CD3-R2	0.03nM	0.016nM
33C2/CD3-R3	0.04nM	0.016nM
			U1R2	-	-

如图19和表20中所示，根据实施方式的双特异性抗体以剂量依赖性方式显著诱导CLL1特异性T细胞激活，而对照组BsAb没有该作用。

4.4.不同的表达CLL1的AML细胞系中双特异性抗体的T细胞激活和细胞溶解活性

为了研究实施例3的双特异性抗体的T细胞激活和细胞溶解活性，在AML细胞系(U937或HL60)中进行了FACS。

简而言之，将U937或HL60悬浮靶细胞(2×10⁴个细胞)接种到96孔U底板上。将各种浓度的BsAb或对照分子(U1R2)和人纯化的T细胞(从PBMC纯化)以5∶1的效应子∶靶表比例加入到平板中。48hrs后，通过流式细胞术对T细胞激活和剩余CD33阳性靶细胞的数量进行定量。特异性细胞裂解的百分比的计算如下：

100-[100x(用BsAb处理的靶细胞数)/用PBS处理的靶细胞数]。

用细胞表面CD25和CD69水平作为T细胞激活的标志物，通过流式细胞术分析T细胞。将BsAb空白/CD3用作对照组，并且将Merus的抗CLL-1/抗CD3双特异性抗体MCLA-117用作参照。HL60和U937中EC50的结果分别显示在图20和21以及表21和22中。

【表21】

【表22】

如图20和21以及表21和22中所示，证实了根据实施方式的双特异性抗体比MCLA-117更显著地以剂量依赖性方式诱导CLL1特异性T细胞激活(通过CD25和CD69上调测量)和癌细胞裂解，而对照组BsAb没有该作用。

4.5.不同的表达CLL1的细胞系中的体外细胞毒性

为了确定根据实施方式的双特异性抗体促进抗原依赖性裂解的能力，分析了在FarRed标记的U937或HL60中的BsAb的体外细胞毒性。

简而言之，将FarRed标记的U937或HL60悬浮靶细胞(1.5x10⁴个细胞)接种到96孔U底板上。将各种浓度的BsAb或对照分子(U1R2)和从各种供体获得的人PBMC效应细胞以10∶1或5∶1的效应子∶靶物比例加入平板中。所有实验一式三份地进行。48hrs后，在流式细胞术中使用Zombie Violet^TMFixable Viability试剂盒(BioLegend，目录号423114)评估靶细胞杀伤。特异性细胞裂解的百分比的计算如下：

100x[FarRed pos死细胞/(FarRed pos活细胞+FarRed pos死细胞)]

结果如表23和图22中所示。

【表23】

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如图22和表23中所示，证实根据实施方式的双特异性抗体以浓度依赖性方式显著诱导CLL1阳性U937和HL60细胞的T细胞介导的裂解，而对照组BsAb(U1R2)没有该作用。

4.6.异种移植物模型(U937模型)中的体内功效

在皮下U937异种移植物模型中评价实施例3的双特异性抗体的功效。

具体而言，在具有U937皮下异种移植物的NOG小鼠中评价了体内抗肿瘤活性。简要的实验方案如下：

肿瘤细胞系：U937

小鼠：NOG组＝9

肿瘤细胞s.c.注射：5x10⁶个细胞/头

在第5天i.p.注射扩增T细胞：1x10⁷个细胞/头，供体(ABL02T)(E:T＝2:1)

在第6天i.p.注射扩增hIgG1(Fc封闭)

在第7天开始药物(BsAb)i.p.注射(1mpk，2QW(每周两次)，共6次)

分组：在第7天；

第1组(对照组)：PBS(负载体)；

第2组：33C2/CD3-R2；以及

第3组：33C2/CD3-R3

在第5、7、10、13、17、20和24天测量肿瘤大小、中值肿瘤生长抑制(％TGI)和体重。

由于双特异性抗体的CD3臂与小鼠CD3没有交叉反应性，在第5天将人T细胞腹膜内注射入小鼠中，之后以1mg/kg的剂量每周两次给药33C2/CD3-R2(第2组)和33C2/CD3-R3(第3组)或PBS(负载体)(第1组)，持续3周。测量小鼠的肿瘤大小(mm³)(＝(W)x(L)x(H)x0.5)、中值肿瘤生长抑制(％TGI)和体重，结果如图23中所示。

如图23中所示，证实了在实验组(组2和组3)和对照组(组1)中小鼠的体重均没有显著变化。此外，证实了与实验组(33C2/CD3-R2、33C2/CD3-R3BsAb处理的小鼠)相比，对照组具有显著更高的肿瘤体积。值得注意的是，根据实施方式的双特异性抗体在U937异种移植物模型中诱导了完全的肿瘤消退。

4.7.异种移植物模型(HL60-Lu原位AML模型)的体内功效

在IV HL60-Lu原位AML模型中进行实施例3的双特异性抗体的功效评价。

具体而言，在具有HL60-Lu IV(静脉内)异种移植物的NOG小鼠中评价了体内抗肿瘤活性。简要的实验方案如下：

肿瘤细胞系：HL 60luc

小鼠：NOG组＝9

肿瘤细胞I.V.注射：1x10⁷个细胞/头

在第5天i.p.注射扩增T细胞：1.5x10⁷个细胞/头，供体(ABL14)(E:T＝1.5:1)

在第6天i.p.注射hIgG1(Fc封闭)，30mpk

在第7天开始药物(BsAb)i.p.注射(2QW(每周两次)，共7次)

分组：在第7天；

第1组(对照组)：PBS(负载体)；

第2组：33C2/CD3-R2；以及

第3组：33C2/CD3-R3

在第7、14、21和28天进行BLI(生物发光指数)。

在HL60-Lu原位AML模型中对根据实施方式的双特异性抗体的功效进行了评估。特别地，在建立的播散性HL60-luc模型中，在IV注射后证实AML细胞归巢至骨髓后，开始33C2/CD3-R2或33C2/CD3-R3处理。

简而言之，为了产生全身性荧光素酶标记的HL60原位模型，在第0天在尾静脉中静脉注射1×10⁷个HL60-luc细胞。在第6天，根据生物发光强度将动物随机分成7组。从第7天开始，每周两次以0.5mg/kg的剂量对小鼠腹膜内注射33C2/CD3-R2、33C2/CD3-R3或负载体，总共7次剂量。在第7、14、21和28天进行BLI(生物发光指数)分析，结果显示在图24中，其定量分析显示在图25中。在第14、21和28天还测量了中值TGI，结果如表24所示。

图25是示出在HL60-Lu原位AML模型中给药根据实施方式的双特异性抗体的BLI的定量分析结果的图表(统计分析：双向ANOVA(邦费罗尼多重比较检验)，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001)。

【表24】

中值TGI(％)	33C2/CD3-R2	33C2/CD3-R3
			第14天	94	89
第21天	95	91
			第28天	90	80

如图24和25以及表24中所示，证实了在第28天，如通过生物发光所评估的，与用负载体处理的小鼠相比，给药0.5mg/kg的根据实施方式的双特异性抗体显著抑制了肿瘤生长(分别为90％和80％)。通过生物发光观察，还证实了根据实施方式的双特异性抗体的给药导致了显著降低的骨髓、脊柱和后肢中的肿瘤负荷。

4.8.异种移植物模型(HL60-Lu原位AML模型)的有效剂量的评价

除了双特异性抗体的给药剂量变为0.5mg/kg、0.05mg/kg和0.005mg/kg之外，以与实施例4.7相同的方式对33C2/CD3-R3双特异性抗体在HL60-Lu原位AML模型中的有效剂量进行了评价。

在第7、14、21和28天进行BLI(生物发光指数)分析，结果显示在图26中，以及其定量分析显示在图27中，还测量了第14、21和28天的中值TGI，结果显示在表25中。此外，通过使用流式细胞分析和IHC染色来测量骨髓中的肿瘤细胞，结果分别显示在图28和29中。

【表25】

中值TGI(％)	第14天	第21天	第28天
				33C2/CD3-R2：0.5mpk	86	91	86
33C2/CD3-R2：0.05mpk	60	78	60
				33C2/CD3-R2：0.005mpk	13	32	31

如图26和27以及表25中所示，证实了在第28天，如通过生物发光所评估的，与用负载体处理的小鼠相比，给药0.5mg/kg、0.05mg/kg、0.005mg/kg的根据实施方式的双特异性抗体显著抑制了肿瘤生长(分别为91％，78％和32％)。通过生物发光观察，还证实了根据实施方式的双特异性抗体的给药导致了以剂量依赖方式的显著降低的骨髓、脊柱和后肢中的肿瘤负荷。

如图28和29中所示，证实了通过给药根据实施方式的双特异性抗体，骨髓中的肿瘤细胞显著减少。这些结果意味着根据实施方式的抗体也可以抑制癌症转移。

4.9.来自原发性患者的AML母细胞中的T细胞激活和细胞毒性

为了研究实施例3的双特异性抗体的活性，使用从原发性患者获得的PBMC的AML母细胞。AML母细胞对应于比动物模型或细胞系更接近临床环境的条件。

首先，使用Ficoll(GE Healthcare)通过密度梯度离心分离PBMC，用抗体染色，并在分离后立即使用FACS LSR Fortessa(BD Biosciences)进行分析，以研究来自4名原发性患者的AML母细胞中的CLL1和CD33的表达。使用FlowJo(BD Biosciences)和GraphPadPrism ver.9(GraphPad Software公司)软件来分析数据。相对于AML母细胞群的每个IgG阴性对照染色，确定阳性细胞百分比和相对MFI。总血细胞和AML母细胞中CLL1和CD3的表达结果如表26中所示。

【表26】

在4名患者AML样品中，就阳性细胞百分比和MFI(平均荧光强度)两者而言，AML母细胞中中值CLL1表达与CD33的相似。

使用来自11名AML患者的PBMC，在体外细胞毒性试验中评估了根据实施方式的双特异性抗体诱导细胞毒性和T细胞激活的能力。

简而言之，将如上从AML患者的新鲜血液中分离的AML PBMC(2x10⁵)一式三份地接种到96孔U形底板上。从50nM开始以10倍系列稀释将BsAb加入至平板。将U1R2作为对照组。72小时后，通过流式细胞仪分析CLL1阳性AML母细胞的细胞裂解(％)和T细胞激活(％)，并且结果分别显示在图30和31中。

图30是示出根据实施方式的双特异性抗体在AML母细胞中的细胞裂解的活性的图表。

如图30中所示，证实了根据实施方式的双特异性抗体以浓度依赖性方式在AML母细胞中诱导显著的细胞毒性(EC50：0.07至0.2nM)。如图31中所示，证实了如上所示的细胞毒性结果也与4名患者样品中T细胞激活增加(EC50:0.0003至0.04nM)相关。这些数据表明，根据实施方式的双特异性抗体在更类似于体内条件的离体环境中能有效杀死CLL1阳性AML细胞。

Claims

1.一种分离的抗CLL-1抗体或其抗原结合片段，包括：

(a)VH CDR1，其包括选自由SEQ ID NO:1、2和3组成的组的氨基酸序列；

(b)VH CDR2，其包括选自由SEQ ID NO:4、5和6组成的组的氨基酸序列；

(c)VH CDR3，其包括选自由SEQ ID NO:7、8、9、10和11组成的组的氨基酸序列；

(d)VL CDR1，其包括选自由SEQ ID NO:12、13、14和15组成的组的氨基酸序列；

(e)VL CDR2，其包括选自由SEQ ID NO:16、17和18组成的组的氨基酸序列；以及

(f)VL CDR3，其包括选自由SEQ ID NO:19、20、21和22组成的组的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的抗CLL-1抗体，

其中，所述抗CLL-1抗体或其片段包括重链恒定区，所述重链恒定区包括选自由SEQ IDNO:23和24组成的组的氨基酸序列。

3.根据权利要求1或2所述的抗CLL-1抗体，

其中，所述抗CLL-1抗体或其片段包括轻链恒定区，所述轻链恒定区包括由SEQ ID NO:55组成的氨基酸序列。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的抗CLL-1抗体，

其中，所述抗CLL-1抗体或其片段包括重链可变区，所述重链可变区包括选自由SEQ IDNO:25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35和74组成的组的氨基酸序列。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的抗CLL-1抗体，

其中，所述抗CLL-1抗体或其片段包括轻链可变区，所述轻链可变区包括选自由SEQ IDNO:36、37、38、39、40、41、42、43、44和75组成的组的氨基酸序列。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的抗CLL-1抗体，

其中，所述抗CLL-1抗体或其片段包括重链，所述重链包括由SEQ ID NO:45组成的氨基酸序列。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的抗CLL-1抗体，

其中，所述抗CLL-1抗体或其片段包括轻链，所述轻链包括由SEQ ID NO:46组成的氨基酸序列。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的抗CLL-1抗体，

其中，所述抗CLL-1抗体或其片段包括所述重链可变区的CDRH1、CDRH2和CDRH3以及所述轻链可变区的CDRL1、CDRL2和CDRL3的序列，其为以下的任一种：

(a)CDRH1、CDRH2和CDRH3分别为SEQ ID NO:1、4和7，并且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别为SEQ ID NO:12、16和19；

(b)CDRH1、CDRH2和CDRH3分别为SEQ ID NO:2、5和8，并且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别为SEQ ID NO:13、17和20；

(c)CDRH1、CDRH2和CDRH3分别为SEQ ID NO:3、6和9，并且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别为SEQ ID NO:14、18和21；

(d)CDRH1、CDRH2和CDRH3分别为SEQ ID NO:1、4和10，并且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别为SEQ ID NO:15、16和22；以及

(e)CDRH1、CDRH2和CDRH3分别为SEQ ID NO:2、5和11，并且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别为SEQ ID NO:13、17和20。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的抗CLL-1抗体，

其中，所述抗CLL-1抗体或其抗原结合片段是小鼠抗体、嵌合抗体、人源化抗体或全人抗体。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的抗CLL-1抗体，

其中，所述抗CLL-1抗体或其抗原结合片段选自由以下组成的组：全IgG、Fab、Fab'、F(ab')2、xFab、scFab、dsFv、Fv、scFv、scFv-Fc、scFab-Fc、双抗体、微抗体、scAb、dAb、半IgG及其组合。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的抗CLL-1抗体，

其为IgG1的形式。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的抗CLL-1抗体，

其中，所述抗CLL-1抗体或其抗原结合片段是Fab分子。

13.根据权利要求1到12中任一项所述的抗CLL-1抗体，其中，所述抗CLL-1抗体或抗原结合片段具有以下特征中的一个或多个：

(a)与人CLL-1结合；

(b)与食蟹猴CLL-1结合；

(c)与人外周血单核细胞(PBMC)表面的CLL-1结合；

(d)与食蟹猴PBMC表面的CLL-1结合；以及

(e)与癌细胞表面的CLL-1结合。

14.根据权利要求1至13中任一项所述的抗CLL-1抗体，

将细胞毒性剂与所述抗CLL-1抗体或抗原结合片段的至少一部分偶联。

15.根据权利要求14所述的抗CLL-1抗体，

其中，将所述细胞毒性剂通过接头与所述抗CLL-1抗体或抗原结合片段附着。

16.根据权利要求15所述的抗CLL-1抗体，

其中，所述接头是被蛋白酶可切割的。

17.根据权利要求1至16中任一项所述的抗CLL-1抗体，用于用作药物的用途。

18.根据权利要求1至17中任一项所述的抗CLL-1抗体，用于治疗或预防癌症的用途。

19.一种包括式Ab-(L-D)p的免疫偶联物，其中：(a)Ab是根据权利要求1至16中任一项所述的抗CLL-1抗体；(b)L是接头；(c)D是细胞毒性剂；并且(d)p的范围为1至8。

20.一种编码根据权利要求1至16中任一项所述的抗CLL-1抗体的分离的核酸。

21.一种包括权利要求20所述的分离的核酸的载体。

22.一种包括根据权利要求21所述的载体的宿主细胞。

23.一种药物组合物，包括权利要求1至16中任一项所述的抗CLL-1抗体。

24.根据权利要求23所述的药物组合物，用于治疗或预防癌症。

25.根据权利要求24所述的药物组合物，其中，所述癌症是表达CLL-1的癌症。

26.根据权利要求24或25所述的药物组合物，

其中，所述癌症选自由以下组成的组：白血病、直肠癌、子宫内膜癌、肾母细胞瘤、基底细胞癌、鼻咽癌、骨肿瘤、食道癌、淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、滤泡状甲状腺癌、肝细胞癌、口腔癌、肾细胞癌、多发性骨髓瘤、间皮瘤、骨肉瘤、骨髓增生异常综合征、间叶性肿瘤、软组织肉瘤、脂肪肉瘤、胃肠间质瘤、恶性外周神经鞘瘤(MPNST)、尤文肉瘤、平滑肌肉瘤、间叶性软骨肉瘤、淋巴肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、畸胎瘤、神经母细胞瘤、髓母细胞瘤、胶质瘤、良性皮肤肿瘤、伯基特淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、神经外胚层肿瘤、上皮性肿瘤、皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)、外周T细胞淋巴瘤(PTCL)、胰腺癌、血液恶性肿瘤、肾癌、肿瘤血管、乳腺癌、肾癌、卵巢癌、上皮性卵巢癌、胃癌、肝癌、肺癌、结直肠癌、胰脏癌、皮肤癌、膀胱癌、睾丸癌、子宫癌、前列腺癌、小细胞肺癌(SCLC)、非小细胞肺癌(NSCLC)、成神经细胞瘤、脑癌、结肠癌、鳞状细胞癌、黑色素瘤、骨髓瘤、宫颈癌、甲状腺癌、头颈癌和肾上腺癌。

27.根据权利要求26所述的药物组合物，

其中，所述白血病选自由以下组成的组：急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、毛细胞白血病、骨髓增生异常综合征(MDS)、慢性髓细胞性白血病(CML)和急性髓细胞性白血病(AML)。

28.一种治疗或预防有此需要的患者的癌症的方法，包括向所述患者给药有效量的根据权利要求1至16中任一项所述的抗CLL-1抗体。

29.根据权利要求1至16中任一项所述的抗CLL-1抗体在制备用于治疗或预防癌症的药物中的用途。