KR20190089090A

KR20190089090A - Pd-l1 항체와 이를 이용한 치료 및 진단

Info

Publication number: KR20190089090A
Application number: KR1020197021196A
Authority: KR
Inventors: 강 리; 징 송; 통 장; 위청 리; 지잉 렌; 양선 강
Original assignee: 베이진 엘티디
Priority date: 2014-07-03
Filing date: 2015-07-01
Publication date: 2019-07-29
Also published as: CN110156892B; EP3160505A1; WO2016000619A1; JP2017522905A; US20180215825A1; KR20170023102A; KR102003754B1; CN106604742A; CN110156892A; JP2019172677A; KR102130600B1; EP3160505A4; US10544225B2; TW201625681A; TW202019970A; US20230279117A1; TWI687438B; TWI726608B; US11512132B2; US20200283527A1

Abstract

본 발명은 Programmed Death-1(PD1, PdcL1)와 특이적으로 결합하는 항체-항원 결합 도메인에 관한 것으로, 자세하게는 특정 CDR 조합으로 구성된 도메인에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 특정 시스템으로 명명된 특정 항체(Ab), 중쇄(HC) 또는 경쇄(LC)의 CDR로 구성된 도메인에 관한 것이다.
또한 본 발명은 PD-L1에 매개된 면역 내 세포 시그널링 및 활성을 억제하는 항체에 관한 것으로, PD-L1 매개 기능에 의해 조절되는 암, 전염병 또는 다른 병리학적 질병을 치료 또는 진단하기 위한 이들 항체의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 조성물은 human PD-1의 부적절하거나 유해한 발현 및/또는 병인론 또는 병리의 구성 요소 인 암, 신경 퇴행성 및 감염성, 특히 바이러스성 질병 및 기타 상태의 치료에 유용하다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 anti-PD-L1 단백질로 암을 치료하거나 이를 필요로 하는 대상에서 종양 진행을 억제하는 방법을 제공하고, 인간화된 anti-PD-1 mAb는 질병 진행 특히, 암 및 바이러스 감염을 이끄는 PD-L1 매개의 세포내 시그널링에 의한 면역세포 억제 관련 인간 질병을 치료하기 위한 치료제로서 사용된다.

Description

PD-L1 항체와 이를 이용한 치료 및 진단{Anti-PD-L1 Antibodies and Their Use as Therapeutics and Diagnostics}

본 발명은 Programmed Death-1(PD1, PdcL1)와 특이적으로 결합하는 항체-항원 결합 도메인에 관한 것으로, 자세하게는 특정 CDR 조합으로 구성된 도메인에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 특정 시스템으로 명명된 특정 항체(Ab), 중쇄(HC) 또는 경쇄(LC)의 CDR로 구성된 도메인에 관한 것이다.

또한 본 발명은 PD-L1에 매개된 면역 내 세포 시그널링 및 활성을 억제하는 항체에 관한 것으로, PD-L1 매개 기능에 의해 조절되는 암, 전염병 또는 다른 병리학적 질병을 치료 또는 진단하기 위한 이들 항체의 용도에 관한 것이다.

PD-L1은 원래 B7 protein family의 member(B7-H1)로 복제되었다(Dong et al., 1999 Nature Med 5:1365). PD-L1은 Programmed Death-1(PD-1) 수용체에 결합하며 T-cell의 증식과 발현을 억제하는 음성 조절 시그널링 기전(negative regulatory signaling pathway)을 활성화한다(Freeman et. al. 2000 J ExpMed 192:1027). 따라서, PD-1 ligand 1(PD-L1 또는 CD274)이라고도 부른다. 지금까지 동정된 PD-L1(B7-H1) 및 PD-L2(B7-DC) 서열은 PD-1과 반응하여 TCR 및 CD28로 매개된 T-cell 활성, 성장 인자(growth factor) 및 IL-2 또는 IFN-γ와 같은 사이토카인을 억제 및 음성 신호전달(negative signal transduction)을 유도한다(Riley et. al. 2009 Immunol Rev 229:114).

Human PD-L1 유전자는 290개의 아미노산 잔기의 전체 단백질을 인코딩하며(NCBI accession NP_054862.1) PD-L1이 세포 표면에 발현된 후 제거되는 주요 펩타이드를 포함한다. PD-L1 전체 길이의 계산된 분자량은 33 kD이다. 하지만, glycosylation 때문에 Western blot에서 관찰되는 분자량은 50 kD 이다.

PD-L1은 인체의 심장, 폐, 흉성 및 혈관내피세포에서 본질적으로 발현되며 인체 내 다른 많은 조직과 항원제시세포(Antigen Presenting Cells), 말초혈액단핵세포(Peripheral Blood Monocytes) 및 다른 면역세포를 포함하는 세포 타입에서 낮은 수치로 발현된다(Freeman et. al. 2000 J Exp Med 192:1027; Eppihimer et. al. 2002 Microcirculation 9:133). 대다수의 세포 타입은 IFN-γ, IL-12 및 타입 I 인터페론에 의해 자극되면 PD-L1의 수치가 높게 발현된다(Bald et. al. 2014 Cancer Discov 4:674-687; Planes et. al. 2014 J Virol 88:6672-6689).

암세포 내 PD-L1 발현의 비정상적인 상향조절(up-regulation)은 각기 다른 종류의 조직과 폐(Konishi et. al. 2004 Clin Cancer Res 10:5094), 간(Shi et. al. 2008 Int J Cancer 128:887; Gao et. a, 2009 Clin Cancer Res 15:971), 위(Wu et. al., 2006 Acta Histochem 108:19), 신장(Thompson et. al., 2004 Proc Natl Acad Sci 101:17174; Thompson et. al., 2007 Clin Cancer Res 13:1757), 유방(Ghebeh et. al. 2006 Neoplasia 8:190), 난소(Hamanishi et. al. 2007 Proc Natl Acad Sci 104:3360), 췌장(Nomi et. al. 2007 Clin Cancer Res 13:2151), 멜라닌 세포(Hino et. al. 2010 Cancer 116:1757) 및 식도(Ohigashi et. al. 2005 Clin Cancer Res 11:2947)와 같은 기관과 관련한 다양한 암에서 보고되었다. 이러한 암에서 증가된 PD-L1의 발현은 환자 생존의 나쁜 예후와 관련이 있다.

B7-H1Ig 또는 anti-PD-L1 항체에 의해 PD-L1과 PD-1 수용체의 결합이 차단되면 T-cell의 증식과 기능적 활성을 자극하며(Dong et. al. 1999 Nature Med 5:1365; Freeman et. al. 2000 J Exp Med 192:1027; Tamura et. al. 2001 Blood 97:1809; Iwai et. al. 2002 PNAS 99:12293), 종양 성장과 바이러스 감염에 대한 면역반응이 강화된다(Iwai et. al. 2002 PNAS 99:12293). 상기 연구보고에 따라 PD-L1/PD-1 시그널링의 억제는 인체 내 암 세포의 성장 뿐만 아니라 바이러스 감염 및 확산에 대한 면역반응을 활성화 시킨다. 일반적인 간세포 감염 바이러스인 HBV 및 HCV는 간세포 내 PD-1 리간드의 과발현을 유도하고 T-effector 세포 내 PD-1 시그널링을 활성화하여 결과적으로 바이러스 감염의 T 세포 고갈(exhaustion)과 관용을 이끈다(Boni et. al. 2007 J Virol 81:4215; Golden-Mason et. al. 2008 J Immunol 180;3637). 마찬가지로 유사한 메커니즘에 의해 HIV 감염은 종종 인간의 면역체계를 회피한다. 길항근 분자(antagonist molecule)에 의해 유도된 PD-L1 시그널링의 치료조절은 암과 만성 바이러스 감염을 근절하기 위해 면역세포의 관용을 회복하고 재활성 시킨다(Blank et. al. 2005 Cancer Immunol Immunother 54:307; Okazaki et. al. 2007 Int Immunol 19:813).

또한, 최근에는 PD-L1이 PD-1과의 결합 대신 B7-1(B7 family member의 종류로 CD80으로 알려져 있음)과 특정 상호작용을 하는 것으로 보고되었다(Butte et. al. 2007 Immunity 27:111). PD-L1과 CD80이 상호작용을 할 경우 T 세포의 기능과 활성이 음성 조절되고 마우스 내 PD-L1과 CD80의 상호작용을 차단할 경우 OVA 항원에 대한 면역반응이 강화되는 것이 상기 보고의 근거이다(Park et. al. 2010 Blood 116:1291). 따라서, PD-L1의 PD-1 및 CD80에 대한 결합을 동시에 차단하는 것이 암 및 바이러스 감염에 대한 부가적인 또는 시너지 효과를 행사할 수 있다.

본 발명은 PD-L과 매개된 시그널링 및 기능의 억제에 의한 면역 활성 방법 및 이와 관련된 조성물을 제공한다. 하나의 측면에서, human PD-L1과 특이적으로 결합하며 본 발명에 기술된 상보성결정부(CDR) 서열을 포함하는 항원-항체 결합 도메인을 제공한다. CDR은 PD-L1과 특이적 결합 및 기능성을 보유하는 (CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3) 및 (CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3)서열을 포함하는 중쇄 가변부(Vh) 및 경쇄 가변부(Vk)로 재조합에 용이하다.

특정 실시양태에서, 도메인은 (a)-(r)에서 선택된 CDR1, CDR2 및 CDR3의 조합을 포함하고, 항체(Ab), 중쇄(HC) 또는 경쇄(LC) 및 유도된 CDR 조합에서 CDR 명명법(Kabat, IMGT 또는 composite)은 아래 표 첫 번째 열에 나타낸 바와 같고, 굵은 글씨체의 잔기는 Kabat 시스템, 밑줄 친 글씨체의 잔기는 IMGR 시스템에 따른 것이 특징이다:

특정 실시양태에서, 도메인은 (a)-(o)에서 선택된 CDR1, CDR2 및 CDR3 조합을 포함하는 중쇄 가변부(Wh) 및 (p)-(r)로부터 선택된 CDR1, CDR2 및 CDR3 조합을 포함하는 경쇄 가변부(Vk)를 포함한다.

다른 특정 실시양태에서, 도메인은 아래와 같은 (c),　(f),　(i),　(l),　(o)　및　(r)로부터 선택된 CDR1,　CDR2 및　CDR3 조합을 포함한다:

또 다른 특정 실시양태에서, 도메인은 아래와 같은 서열을 포함하는 중쇄 가변부(Vh) 또는 경쇄 가변부(Vk)를 포함한다.

mu333 vh (서열번호 6);

mu333 vk (서열번호 8);

hu333-1A vh (서열번호 15);

hu333-1A vk (서열번호 16);

hu333-2B vh (서열번호 17);

hu333-3A2 vh (서열번호 18);

hu333-3C2 vh (서열번호 19);

hu333-3H2 vh (서열번호 20);

hu333-4A2 vh (서열번호 21);

hu333-4B2 vh (서열번호 22); 또는

hu333-4B2 vk (서열번호 23);

또 다른 특정 실시양태에서, 도메인은 아래와 같은 서열을 포함하는 중쇄 가변부(Vh) 및 경쇄 가변부(Vk)를 포함한다:

mu333 vh 및 vk (서열번호 6 및 8);

hu333-1A vh 및 vk (서열번호 15 및 16);

hu333-2B vh 및 vk (서열번호 17 및 16);

hu333-3A2 vh 및 vk (서열번호 18 및 23);

hu333-3C2 vh 및 vk (서열번호 19 및 23);

hu333-3H2 vh 및 vk (서열번호 20 및 23);

hu333-4A2 vh 및 vk (서열번호 21 및 23); 또는

hu333-4B2 vh 및 vk (서열번호 22 및 23);

또 다른 특정 실시양태에서, 도메인은 아래와 같은 서열을 포함하는 중쇄 가변부(Vh) 또는 경쇄 가변부(Vk)를 포함한다:

hu333-4B2 vh (서열번호 22); 또는

hu333-4B2 vk (서열번호 23);

hu333-4A2 vh 및 vk (서열번호 21 및 23); 또는

hu333-4B2 vh 및 vk (서열번호 22 및 23);

또 다른 특정 실시양태에서, 도메인은 PD-L1 잔기: D26 및 R113과 특이적으로 결합한다.

또한, 본 발명에서는 항체, 특히 단일클론 항체와 PD-L1 결합 도메인을 포함하는 F(ab) 또는 F(ab)2를 제공한다.

또한, 본 발명에서는 PD-L1 항원 결합 도메인을 코딩하는 핵산을 포함하는 발현벡터와 상기 도메인을 포함하는 세포 및 세포를 포함하는 비인간 동물을 제공한다.

또한, 본 발명의 핵산은 발현을 위해 이종 전사 조절 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있으며, 그러한 벡터, 세포 등에 도입 될 수 있다.

또한, 본 발명은 암 또는 바이러스 감염이 있거나 PD-L1 길항제를 필요로 하는 인간에게 도메인을 투여함으로써 대상 도메인을 사용하는 방법을 제공한다.

본 발명의 조성물은 human PD-1의 부적절하거나 유해한 발현 및/또는 병인론 또는 병리의 구성 요소 인 암, 신경 퇴행성 및 감염성, 특히 바이러스성 질병 및 기타 상태의 치료에 유용하다 . 따라서, 본 발명은 본 발명의 anti-PD-L1 단백질로 암을 치료하거나 이를 필요로 하는 대상에서 종양 진행을 억제하는 방법을 제공하고, 인간화된 anti-PD-1 mAb는 질병 진행 특히, 암 및 바이러스 감염을 이끄는 PD-L1 매개의 세포내 시그널링에 의한 면역세포 억제 관련 인간 질병을 치료하기 위한 치료제로서 사용된다.

본 발명은 더 나아가서는, 암을 치료하거나 종양 진행을 억제하는 약물의 제조를 위한 폴리뉴클레오타이드의 용도를 제공한다.

도 1은 전체 길이의 PD-L1 (top), PD-L1/Fc (middle) 및 PD-L1/His (bottom)에 대한 도식도이다. ECD: extracellular domain. L: linker. Fc: ?4Fc fragment from human IgG4. H: His tag. N: N-terminus. C: C-terminus.
도 2는 murine mAbs를 이용하여 농도에 따른 purified human PD-L1/His 결합력을 ELISA로 측정한 결과(A) 및 세포표면의 PD-L1 발현을 FACS로 측정한 결과이다. 음성대조군인 murine mAbs 및 mouse IgG는 각 도면의 좌측 위에 표시되었다.
(A) ELISA plate는 웰(well)당 100 ng의 PD-L1/His로 코팅되었다. ELISA를 이용한 결합 시그널 세기 값은 OD450의 Y축으로 측정하였다. mAbs 또는 mouse IgG의 농도는 X축에 표시되었다.
(B) HEK293/PD-L1 세포는 murine anti-PD-L1 mAbs 또는 대조 mouse IgG의 연속 희석법으로 염색하였다. FACS 분석을 이용한 결합 시그널 세기 값은 평균형광강도(MFI; mean fluorescence intensity)로 측정하였다. mAbs 또는 mouse IgG의 농도는 X축에 표시되었다.
도 3은 HEK293/OS8/PD-L1 세포의 공배양 후 HuT78/PD-1 세포에서 murine anti-PD-L1의 농도를 따른 IL-2의 분비량을 나타낸 것이다. Baseline은 mouse IgG(mIgG)의 전체 농도군에서 측정된 IL-2 분비량의 평균 값을 나타낸 것이다. 각 point는 중복 data의 평균 값을 나타낸 것이다. Top line은 프리즘으로 도출된 회귀선에 근거한 IL-2 최대 값을 나타낸 것이다.
도 4는 HEK293/PD-L1 세포의 공배양 후 HuT78/P3Z 세포에서 murine anti-PD-L1 억제제의 농도를 따른 IL-2의 분비량을 나타낸 것이다. PD-L1과 P3Z 키메릭 수용체의 결합은 P3Z 키메릭 수용체의 활성과 IL-2의 분비로 이어진다.
도 5는 murine anti-PD-L1의 농도에 따른 비오틴과 PD-1/Fc의 결합을 나타낸 것이다. 고정된 양의 비오틴-PD-1-ECD/Fc는 X축에 표시된 높은 농도의 anti-PD-L1 mAbs와 혼합된다. FACS로 분석된 MFI 값은 Y축에 나타내었다. Mouse Gig (mug)는 음성 대조군으로 사용되었다.
도 6은 murine anti-PD-L1의 농도에 따른 비오틴과 CD80/Fc의 결합을 나타낸 것이다. 고정된 양의 비오틴-CD80-ECD/Fc는 X축에 표시된 높은 농도의 anti-PD-L1 mAbs와 혼합된다. FACS로 분석된 MFI 값은 Y축에 나타내었다. Mouse IgG(muIgG)는 음성 대조군으로 사용되었다.
도 7은 건강한 기증자들(Donor 3 (A) 및 Donor 17(B))로부터 채취한 1차 Human PBMCs 내 Human PD-L1 Fabs 항체로 유도된 IFN-γ 분비량을 나타낸 것이다. PBMCs는 HEK293/OS8/PD-L1 세포와 하루 밤 동안 공배양 하였다. 배지 내 IFN-γ는 ELISA로 분석하였고, BSA는 음성 대조군으로 사용되었다.
도 8은 Wild type의 인간 PD-L1 mAbs Fabs 항체(IgG1 wt) 또는 변이된 Human IgG1(IgG1mc 및 IgG1mf)과 C1q의 결합력을 나타낸 것이다. MaxiSorp ELISA에 50μl로 연속 희석(X축)된 Human PD-L1 mAbs Fabs 항체가 코팅되었다. Human C1q의 결합력(Y축)은 Human C1q에 반응하는 특정 단일클론 항제를 이용하여 ELISA OD₄₅₀ 값으로 측정되었다.
도 9는 Wild type의 인간 PD-L1 mAbs Fabs 항체(IgG1 wt) 또는 변이된 Human IgG1(IgG1mc 및 IgG1mf)으로 유도된 항체의존세포매개세포독성(Antibody-dependent cell-cytotoxicity(ADCC))을 나타낸 것이다. FcγRⅢA로 형질전환된 Human NK92MI 세포는 효과기(effector) 세포로 사용되며 HEK293/PD-L1 세포는 표적(target) 세포로 사용된다. 독성 %(Y축)는 실시예 5에 설명된 lactate dehydrogenase(LDH) release assay에 근거하여 계산되었다.
도 10은 Wild type의 인간 PD-L1 mAbs Fabs 항체(IgG1 wt) 또는 변이된 Human IgG1(IgG1mc 및 IgG1mf)의 보체의존세포독성(Complement-dependent cytotoxicity; CDC) 활성을 나타낸 것이다. Daudi/PD-L1 세포는 표적(target) 세포로 사용되며 건강한 기증자의 human sera는 보체 결합의 근원으로 사용된다. Rituximab(Roche)는 classical CDC assay에서 양성 대조군으로 사용되었다. CDC %(Y축)는 실시예 5에 설명된 cell-titer glow assay에 근거하여 계산되었다.
도 11은 건강한 기증자들(Donor 3 (A) 및 Donor 17(B))로부터 채취한 1차 Human PBMCs 내 Human PD-L1 mAbs 항체로 유도된 IFN-γ 분비량을 나타낸 것이다. PBMCs는 HEK293/OS8/PD-L1 세포와 하루 밤 동안 공배양 하였다. 배지 내 IFN-γ는 ELISA로 분석하였고, Human IgG는 음성 대조군으로 사용되었다.
도 12는 농도에 따른 PD-L1 mAbs 항체와 (A) purified human PD-L1/His, (B) cynomolgus monkey PD-L1/His 및 (C) mouse PD-L1/His와의 결합력을 ELISA로 측정한 것이다. MaxiSorp ELISA plate는 각기 50μl의 human, monkey 및 mouse PD-L1/His로 코팅되었다. PD-L1 mAbs 항체의 농도는 X축에 표시되었다. 결합 시그널 세기는 OD₄₅₀ 값(Y축)으로 표시되었다.
도 13은 PD-L1 mAbs 항체의 에피토프와의 결합을 ELISA(윗면) 및 Western blot(아래면)으로 도면도면화 한 것을 나타낸 것이다. hu333-4B2-IgG1과 변이 PD-L1의 결합 활성(A), Y1-IgG1과 변의 PD-L1의 결합 활성(B) 및 PD-L1 mAbs 항체와 D₂₆A변이 PD-L1의 결합 활성(C)을 나타내었다. Wild type 또는 변이 PD-L1/His 단백질을 포함한 배지는 ELISA 및 Western blot을 이용한 결합 활성 측정에 사용되었다. ^**변이 PD-L1의 mAb 결합 활성이 wild type 대비 25-50% 감소한 것을 표시하였다. ^***변이 PD-L1의 mAb 결합 활성이 wild type 대비 25% 이하로 감소한 것을 표시하였다.
도 14는 ELISA를 이용한 Human serum 단백질과 PD-L1 항원의 혼합물과 PD-L1 mAbs 항체의 binding assay를 나타낸 것이다. (A) Human serum과 PD-L1/His 단백질의 혼합물과 murine mAb 또는 murine 키메릭 mAb의 결합을 농도별로 나타낸 것이다. PBS로 연속 희석한 PD-L1/His 단백질이 96-well MaxiSorp ELISA plate에 코팅되었고 human serum pool(3명의 건강한 기증자)을 최종 농도 5%가 되게끔 추가하였다. 3 μg/ml mAbs를 각 well에 첨가한 후, 상온에서 1시간 배양하였다. (B) 각각의 mAb군과 음성 대조군 곡선의 왼쪽 면(코팅의 대부분은 human serum 단백질로 되었으며 PD-L1/His는 거의 없음)에서 data point 3개의 평균 OD₄₅₀ 값을 막대그래프로 나타낸 것이다.
도 15는 hu333-4B20IgG1mf 또는 대조군의 암 성장 곡선을 나타낸 것이다. Human 암세포 A41과 건강한 기증자의 PBMCs를 이식한 NOD/SCID 마우스에 10 mg/kg 농도의 hu333-4B2-IgG1mf를 일주일에 두 번씩 처치 하였다.

PD-L1은 PD-L1 또는 PD-L2의 리간드에 의해 결합되었을 때, 면역세포내 시그널링 억제를 개시한다.

암 성장 및 바이러스 감염의 경우, PD-1 시그널의 활성은 면역관용을 촉진하여 암 또는 바이러스 감염 세포가 면역 감시(surveillance) 및 암전이 또는 바이러스 증가로부터 벗어나게 한다. 치료제에 의한 PD-L1 매개 세포 신호 전달의 억제는 T 세포, B 세포 및 NK 세포를 비롯한 면역 세포를 활성화시켜 암세포 성장 또는 바이러스 감염을 억제하는 면역 세포 기능을 향상시키고 인간 질병을 치료를 위해 면역 감시 및 면역 기억 기능을 회복시킨다.

본 발명은 면역세포 내 PD-L1 유도 시그널을 위한 길항제인 항체를 제공한다. Murine anti-PD-L1 항체는 프레임 워크 영역에서 인간 항체와 고도의 유사성으로 인간화되었다. 변형 된 인간 IgG 변이체 형태로 제조된 전체 항체는 효과기 기능 및 물리 화학적 특성의 측면에서 고유 한 특징을 갖는다. 개시된 anti-PD-L1 항체는 암 치료, 바이러스 감염 및 악화 된 면역관용에 기계적으로 관여하는 기타 인간 질병을 조절하는 치료 용도에 적합하다.

문맥 상 달리 표시되지 않는 한, "항체"라는 용어는 가장 넓은 의미로 사용되며 특히 PD-L1을 인식하는 항체(전체 길이의 단일클론 항체 포함) 및 항체 단편을 포함한다. 항체 분자는 일반적으로 단일 특이성을 지니지만, 단일 특이성, 이종 특이성 또는 다특이성을 지닐 수도 있다. 항체 분자는 특이적 결합 부위인 항원내 특정 항원결정인자 또는 에피토프에 결합한다. "항체 단편"은 전체 길이의 항체, 일반적인 항원 결합 또는 그의 가변부 영역을 포함한다. 항체 단편의 예로 Fab, Fab', F (ab').sub.2 및 Fv 단편； 다이어바디(diabodies)； 선형(linear) 항체； 단일쇄 항체 분자； 및 항체 단편 내 다가특이성 항체 형태를 포함한다.

천연 및 조작된 항체 구조는 e.g. Strohl et al., Therapeutic antibody engineering: Current and future advances driving the strongest growth area in the pharmaceutical industry, Woodhead Publishing Series in Biomedicine No. 11, Oct 2012； Holliger et al. Nature Biotechnol 23, 1126-1136(2005)； Chames et al. Br J Pharmacol. 2009 May； 157 (2):220-233에 나타난 바와 같이 당 업계에 잘 알려져 있다.

단일클론 항체(MAbs)는　Kohler　et　al(1975)；　U.S.　Pat.　No.　4,376,110；　Ausubel　et　al(1987-1999)；　Harlow　et　al(1988) 및　Colligan　et　al(1993)와 같은 방법으로 수득할 수 있다. 본 발명의 mAb는 IgG,　IgM,　IgE,　IgA 및　이의　하위분류(subclass)를 포함하는 면역글로불린 부류일 수 있다. mAb를 생산하는 하이브리도마는 in vitro 또는　in　vivo에서 배양될 수 있다. 높은 역가의 mAb는 고농도의 mAb를 함유하는 복수 액체를 생성하기 위해 pristine-primed Balb/c와 같은 마우스에 개개의 하이브리도마로부터 얻은 세포를 복강 주사하여 in vivo 내 생산에서 얻을 수 있다. Isotype IgM　또는　IgG는 당업자에게 공지 된 컬럼 크로마토그래피 방법을 사용하여 복수(ascites) 액체 또는 배양 상층액으로부터 정제 될 수 있다. 　

"분리 된 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산"이라는 용어는 자연 발생 상태에서 그 서열을 둘러싸고 있는 서열로부터 분리 된 폴리뉴클레오타이드 절편 또는 단편, 예를 들어 단편과 정상적으로 인접한 서열로부터 제거 된 DNA 단편, 예를 들어 단편 자연적으로 발생하는 게놈에서 단편에 인접한 서열을 포함한다. 따라서, 이 용어는 예를 들어, 벡터, 자립 복제 플라스미드 또는 바이러스, 또는 원핵 생물 또는 진핵 생물의 게놈 DNA에 혼입되거나 또는 별도의 분자로서 존재하는 재조합 DNA(예를 들어, cDNA 또는 PCR 또는 제한 효소 분해에 의해 생성 된 게놈 또는 cDNA 단편)를 포함 할 수 있다. 또한 추가 폴리펩티드 서열을 코딩하는 하이브리드 유전자의 일부인 재조합 DNA를 포함한다.

"Construct(구조물 또는 체)"는 게놈이 가능한. 임의의 원천으로부터 유래 된 플라스미드, 코스미드(cosmid), 바이러스, 자발적으로 복제하는 폴리뉴클레오타이드 분자, 파지 또는 선형 또는 환형 단일 가닥 또는 이중 가닥 DNA 또는 RNA 폴리뉴클레오타이드 분자와 같은 임의의 재조합 폴리 뉴클레오타이드 분자를 의미한다. 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 분자가 기능적으로 작동 가능한 방식으로 연결되어있는 폴리뉴클레오타이드 분자 즉 작동 가능하게 연결된 분자를 포함할 수 있다. 재조합 구조물은 전형적으로 의도된 숙주 세포에서 폴리뉴클레오타이드의 전사를 지시 할 전사 개시 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 포함 할 수 있다. 이종(heterologous) 및 비 이종(non-heterologous; i.e.,　endogenous)프로모터 모두가 본 발명의 핵산의 발현을 지시하는데 사용될 수 있다.

"벡터"는 형질전환, 즉 숙주 세포 내로 이종 DNA의 도입을 위해 사용될 수있는 임의의 재조합 폴리뉴클레오타이드 구조물을 의미한다. 한 유형의 벡터는 "플라스미드(plasmid)"이며, 이것은 원형 이중 가닥 DNA 루프를 말하며, 이 루프에 추가 DNA 세그먼트가 연결될 수 있다. 또 다른 유형의 벡터는 바이러스 벡터이며, 추가 DNA 절편은 바이러스 게놈에 연결 될 수 있다. 특정 벡터는 도입 된 숙주 세포(예를 들어, 세균성 복제 기원 및 에피솜(episomal) 포유동물 벡터를 갖는 박테리아 벡터)에서 자율 복제 할 수 있다. 다른 벡터 (예를 들어, 비-에피솜 포유류 벡터)는 숙주 세포 내로 도입 될 때 숙주 세포의 게놈에 통합되어 숙주 게놈과 함께 복제된다. 또한, 특정 벡터는 작동 가능하게 연결된 유전자의 발현을 지시 할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "발현 벡터"로 지칭된다.

본 발명의 "발현 벡터"는 숙주 세포 내로 형질전환, 형질전환 또는 형질도입 될 때 목적 유전자를 복제 및 발현 할 수 있는 핵산 분자를 말한다. 발현 벡터는 벡터의 유지를 보장하고, 원한다면 숙주 내에서 증폭을 제공하기 위해 하나 이상의 표현형 선택성 마커 및 복제 기점을 포함한다. 더 나아가 발현 벡터는 세포 내 폴리펩타이드의 발현을 증진시킬 수 있다. 적합한 발현 벡터는 예를 들어 상업적으로 입수 가능한 pBR322 또는 다양한 pUC 플라스미드로부터 유도된 플라스미드 일 수 있다. 다른 발현 벡터는 박테리오파지, 파지미드 또는 코스미드 발현 벡터로부터 유도 될 수 있다.

서열목록

본 발명은 다음의 실시예에 의해 더욱 예시된다. 이들 실시예는 단지 예시적인 목적으로만 제공된다. 이들은 본 발명의 범위 또는 내용을 어떤 방식으로도 한정하는 것으로 해석되지 않는다.

실시예 1. PD-L1 단일클론 항체의 생성

Murine anti-human PD-L1 단일클론 항체(mAbs)는 하이브리도마 융합 기술(Kohler and Milstein 1975 Nature 256:495-497; Mechetner 2007 Methods Mol Biol 378:1-13)을 응용하여 생성되었다. MAbs에 높은 결합 활성을 보이는 효소를 측정하는 immunosorbent assay(ELISA)와 fluorescence-activated cell sorting(FACS) assay는 새로운 특성을 확인하는 세포 기반 functional assay 중에서 선택되었다.

PD-L1 및 CD80 재조합 단백질

전체 길이의 human PD-L1 cDNA는 공지된 서열(NCBI reference sequence NM_014143.3)(서열번호 1 및 2)을 기반으로 GeneScript(난징, 중국)에서 합성되었다. Human PD-L1(서열번호 3 및 4)의 1-239 아미노산(AA)으로 구성된 세포외도메인은 PCR로 증폭된 후 PD-L1-ECD/Fc 및 PD-L1-ECD/His(PD-L1/Fc 및 PD-L1/His로 생략)의 2개의 재조합 PD-L1 융합체로 되는 human IgG4의 Fc region 또는 His tag와 융합된 C 말단기를 포함하는 pcDNA3.1 발현벡터로 클로닝 되었다. PD-L1 융합 단백질의 개략도는 도 1에 나타내었다. 제조사의 지침(Invitrogen)에 따라 일시적 주입법(transient transfection)으로 재조합 PD-L1 융합 단백질은 293-F 세포에 발현되었다. 분비된 재조합 단백질을 포함하는 배지를 모은 후 15000xg에서 30분간 원심 분리하였다. PD-L1/Fc는 Protein G Sepharose Fast Flow 컬럼(Cat. No. 17061805, GE Life Science, 상하이, 중국)을 이용하여 정제하였다. PD-L1/His는 Ni-Sepharose Fast Flow affinity 크로마토그래피(Cat. No. 17531801, GE Life Sciences)를 통해 정제하였고, HiLoad 16/60 Superdex 200 컬럼(Cat. No. 17106901, GE Life Sciences)을 이용해 사이즈 배제 크로마토그래피를 수행하였다. PD-L1/Fc와 PD-L1/His 단백질은 인산완충생리식염수(phosphate buffered saline; PBS)로 투석한 후 시료를 조금씩 나눠 -80℃ 냉동고에서 보관하였다.

전체 길이의 PD-1 cDNA를 포함하는 발현 플라스미드는 Origene(Cat. No. SC117011, NCBI Accession Nl: NM_0050018.1, 베이징, 중국)에서 구입하였다. PD-1의 1-168 아미노산(AA)으로 구성된 세포외도메인은 PCR 증폭 후 human IgG4 중연쇄기의 Fc 도메인 즉, PD-1/Fc와 융합한 C 말단기를 포함하는 pcDNA3.1 발현 벡터(Invitrogen, 칼즈배드, CA, USA)로 클로닝 되었다. Huma CD80(B7-1) cDNA는 GeneScript를 이용하여 공지된 서열(NCBI access number NM_005191.3)에 따라 합성되었다. CD80의 세포외도메인(AA1-242)은 C말단기에서 human Fc와 융합되었고 선행기술(US8735553) 방법에 따라 유사 포유류 발현 벡터에 클로닝 되었다. 융합단백질은 CD80-ECD/Fc 또는 CD80/Fc로 명명하였다.

PD-L1를 발현하는 안정한 세포주

PD-L1를 발현하는 안정한 세포주는 PD-L1이 들어있는 HEK293(ATCC, 매너서스, VA, USA)을 포함하는 pcDNA3.1 플라스미드의 형질전환으로 셋팅되었으며 600 μg/mL hygromycin(Cat. No. 10687-010, Invitrogen) 함유 배지를 선택하여 사용하였다. 단일 클론은 배양 dish 표면에서 단일 클로니를 골라내어 분리하였다. 모든 클론은 PD-L1 항체(Cat. No. 17-5983, eBioscience, 샌디에이고, USA)를 이용한 FACS 분석과 Western blot을 통해 스크린 되며, 상위 발현 클론은 FACS 결합 분석과 functional assay를 이용하여 스크린 되었다.

면역화 및 하이브리도마 클론 생산

Murine anti-human PD-L1 단일항체는 하이브리도마 융합 기술을 이용하여 생산되었다. 모든 동물 실험은 BeiGene Animal Care and Use Procedure에 따라 수행되었다. 10~12주 주령의 Balb/c 마우스(HFK Bioscience, 베이징, 중국)에 5~10μg PD-L1/Fc와 100μl 보조제(Cat.No. KX0210041, KangBiQuan, 베이징, 중국)를 3번 피하주사 및/또는 복강주사로 접종함으로써 면역화하였다. 2번째 면역화 2주 후에 수집한 마우스 혈청이 ELISA 및 FACS로 분석한 PD-L1의 결합력이 높았다. 상기 결과는 표 1 및 2에 나타내었다. 마우스에서 높은 anti-PD-L1 결합력을 보인 혈청 희석배수는 선택되었고, PBS로 희석한 PD-L1/Fc를 50μg 복강주사 하였을 때, boosting 효과가 있었다. Boosting 3일 후, 비장세포를 분리하여 표준실험법(Mechetner et. al. 2007 Methods Mol Biol 378:1-13)과 약간의 변형실험으로 murine 골수종 세포주 SP2/0(ATCC)와 융합하였다.

ELISA assay를 이용한 연속 희석 마우스 혈청과 PD-L1/His 단백질의 결합 활성

마우스 혈청 희석 배수	ELISA binding (OD450)
마우스 혈청 희석 배수	Immunized mouse #1	Immunized mouse #2	Immunized mouse #3
1:300	5.749	5.546	5.586
1:900	5.651	4.978	4.453
1:8100	4.166	2.853	2.137
1:24300	2.641	1.539	0.896
1:72900	1.287	0.498	0.212
1:218700	0.282	0.065	0.056

FACS assay를 이용한 연속 희석 마우스 혈청과 HEK293/PD-L1 세포의 결합 활성

마우스 혈청 희석 배수	FACS binding (MFI)
마우스 혈청 희석 배수	Immunized mouse #1	Immunized mouse #2	Immunized mouse #3
1:300	2657.7	1675.8	1499
1:900	1485.9	681.6	560.5
1:8100	355.6	274.7	175.7
1:24300	73.9	107.1	54.9
1:72900	33.9	26.9	19.8

ELISA 및 FACS를 이용한 murine mAbs의 PD-L1 결합 활성 측정

변형 ELISA assay(Flanagan 2007 Methods Mol Biol 378:33-52)를 이용하여 하이브리도마 클론의 상층액의 PD-L1 결합 활성을 스크리닝 하였다. 간단하게 설명하면, PD-L1/His 50-200ng을 50μl의 PBS에 희석한 후 96-welll ELISA plate(JinCanHua, 선전, 중국) 각각의 well에 코팅하였다. 3% bovine serum albumin 함유 TBST(20 mM Tris, 150 mM NaCl, 0.05% Tween20, pH7.5) 용액으로 blocking 한 후, 하이브리도마 클론의 배양 상층액으로 배양하였고, HRP-conjugated horse anti-mouse IgG 항제(Cat. No. 7076S, Cell Signaling Technology) 및 tetramethylbenzidine(TMB)(Cat. No. PA107-01, TianGen, 베이징, 중국)은 plate 리더기의 450nm 흡광도에서 결합 시그널은 측정하기 위하여 사용되었다. ELISA-positive 클론은 형광 활성 세포 분류기(FACS)에 의해 검증되었다. PD-L1 발현 세포인 HEK293/PD-L1(10⁵cells/well)은 V-bottom plates(Cat. No. 3897, Corning)에서 하이브리도마 클론의 상층액으로 배양하였다. PD-L1 항체와 결합하는 세포표면은 Dylight 649-conjugated goat anti-mouse IgG 항체(Cat. No. 405312, Biolegend, 샌디에이고, CA, USA)를 이용해 검출하였으며 세포 형광은 Guava EasyCyte 8HT flow cytometer(Millipore, USA)를 이용하여 측정하였다.

ELISA 및 FACS assay에서 양성을 보인 하이브리도마 클론은 항체의 유용한 기능 활성을 증명하기위하여 human cell을 기반으로 한 functional assay를 수행하였다. 양성 기능성 활성을 보인 하이브리도마 클론은 클로닝되었으며 특징화되었다.

클로닝 및 Serum - free 또는 낮은 농도의 serum 포함한 하이브리도마 세포의 적합 배지

ELISA, FACS 및 functional assay를 이용한 첫 번째 스크리닝에서 양성인 하이브리도마 클론은 한계희석법으로 클로닝되었다. 각각의 오리지날 클론의 세 가지 아클론은 FACS 및 functional assay에서 선택 및 확정되었다. Functional assay로 선택된 아클론은 단일클론 항체를 이용하여 검증되었다. 상위 아클론은 정제 및 특징화를 위하여 0-3% fetal bovine serum 함유 CDM4MAb 배지(Cat. No. SH30801.02, Hyclone)에서 성장 적응 시켰다.

정제된 항체의 결합 활성 측정

항체 발현 플라스미드(Cat. No. R79007, Invitrogen)로 일과적 형질전환시킨 하이브리도마 세포 또는 293-F 세포는 CDM4MAb 배지(Cat. No. SH30801.02, Hyclone) 또는 FreestyleTM 293 발현 배지(Cat. No. 12338018)로 CO₂ 포함 37℃에서 5-7일 배양하였다. 채취된 배지는 전체 세포와 세포 debris를 제거하기 위하여 정제 전에 10,000xg에서 30분간 원심분리하고, 0.22μm 멤브레인에서 필터링 하였다. Murine 또는 재조합 항체를 함유하는 상층액은 기기 사용법에 따라 Protein A 컬럼(Cat. No. 17127901, GE Life Sciences)에 처리하여 결합시킨 후 PBS로 세척하고, 20 mM citrate, 150 mM NaCl 함유 산성 용액(pH3.5)으로 용출하였다. 용출물은 1 M Tris pH8.0를 이용하여 중화하였다. 상기 방법은 90% 이상의 항체 수율을 얻을 수 있다. 응집체를 제거하기 위하여 Protein A-affinity로 정제된 항체를 PBS로 투석하거나 HiLoad 16/60 Superdex 200 컬럼(Cat. No. 17531801, GE LifeSciences)으로 정제하였다. 단백질 농도는 bovine IgG 표준 용액(Cat. No. 23212, Thermo Scientific)을 이용한 Bradford assay(Cat. No. 1856210, Thermo Scientific, 록퍼드, IL, USA) 또는 280nm 흡광도를 이용하여 측정하였다. 최종 항체 전처리물은 -80?에서 나누어 보관하였다.

정제된 단일클론 항체의 결합 활성은 앞선 설명에 따라 ELISA 및 FACS assay로 측정하였다. ELISA 및 FACS의 농도별 결합 활성(곡선)은 mAb 효능과 비교에 사용되었다. Murine mAbs의 2가지 대표 결과는 도 2 및 표 3에 나타내었다. Murine mAb333(mu333)은 ELISA 및 FACS assay 각각의 실험에서 (50% 활성을 보이는 효과 농도)값이 0.036 μg/mL 및 0.099 μg/mL으로 농도에 따른 결합활성을 보였다. Mu277은 ELISA(EC₅₀=0.031 μg/mL)에서 Mu333과 유사한 결합 활성을 보였으나, FACS(EC₅₀=0.371 μg/mL) 실험에서는 낮은 결합 활성을 보였다. 반대로 mouse IgG(muIgG) 대조군은 2가지 실험에서 PD-L1과 결합하지 않았다.

ELISA 및 FACS assay를 이용한 anti-PD-L1 mAbs의 농도별 결합력 측정

항체	ELISA EC50 (μg/mL)	Top OD450	FACS EC50 (μg/mL)	Top MFI
mu333	0.036	4.026	0.099	1101
mu277	0.031	3.730	0.371	793
muIgG	N/A	N/A	N/A	N/A
OD450: ELISA assay에서 450nm의 흡광도 MFI: FACS analysis에서 평균형광강도 N/A: 미검출

실시예 2. Anti -PD-L1 항체의 functional 활성

안정 세포주의 생성

Human T cell 기반 functional assay를 위한 안정적 세포주는 US8735553 특허에서 설명되었다. 간단하게 설명하면, 융합단백질 발현 플라스미드인 OS8은 anti-human CD3 mAb OKT3의 scFv 및 막관통영역과 세포질도메인을 포함하는 마우스 CD8α의 C말단 도메인을 포함하여 생성되었다. OS8은 T 세포 수용체를 직접 활성화시키는 막 고정 T 세포 결합체로서 기능 할 수 있다. OS8과 PD-L1을 동시에 발현하는 안정적 세포주는 10-14일간의 hygromycin 또는 G418 선택에 따른 HEK293 세포 내 2 가지 발현 형태의 동시 형질전환에 의해 생성되었다. 상기 세포주는 HEK293/OS8/PD-L1이라 명명하였다. Human T 세포주와 유사한 HuT78/PD-1은 human PD-1을 발현하였다. 그리고 human T 세포주인 HuT78/P3Z의 정반대 시그널링은 human PD-1의 세포외 및 막관통영역과 human CD3의 세포질영역의 융합에 의해 만들어진 키메릭 PD-1 발현체(P3Z)를 이용하여 안정적 형질전환으로 생성되었다. 상기 방법에 따라, P3Z는 PD-1 리간드(PD-L1 또는 PD-L2)와의 결합시 T 세포를 활성화시키는 막 결합 수용체를 암호화 하였다. 세포주는 선행기술(Fuller 2001 Curr Protoc Mol Biol, Chapter 11:Unit 11.8)에 따라 한계희석법으로 클로닝되었다.

HuT78 /PD-1 세포 내 IL -1 분비에 의한 PD-L1 항체의 기능

PD-L1에 의해 유도된 PD-1 시그널링을 막을 수 있는 anti-PD-L1 항체를 결정하기 위하여, HEK293/OS8/PD-L1 세포를 HuT78/PD-1 세포(1-3x10⁴ per well)와 평저 plate에 200μl의 RPMI1640 성장배지와 37℃ 조건에서 공배양 하기 전에 15분 동안 anti-PD-L1 mAbs와 전배양하였다. 공배양 16-18시간 후에 상층액을 채취하였다. IL-2는 human IL-2 Ready-Set-Go-ELISA kit(Cat. No. 88-7025, eBiosciences, 샌디에이고, CA)를 이용하여 ELISA로 분석하였다. 상기 방법에 따라, anti-PD-L1 항체를 이용한 PD-L1-PD-1의 억제는 TCR 시그널링과 IL-2 생산을 증가하였다.

표 4에 나타낸 바와 같이, ELISA 및 FACS에서 결합 양성을 보인 하이브리도마 클론의 상층액은 functional assay를 이용하여 분석하였다. ELISA 및 FACS로 실험한 PD-L1과 결합하는 클론의 소량 만이 PD-L1-PD-1 시그널링을 억제하고 이에 따라 IL-2 생산이 증가하였다. 나머지 클론은 fresh 배지로만 구성된 음성대조군과 비교하여 IL-2 생산이 증가하지 않거나 조금만 증가하였다. 상기 실험에서는, OD450 컷오프 값을 2.5로 셋팅하였으며, 이 수치보다 높은 수치의 IL-2 생산을 자극하는 클론은 길항제 기능을 가지는 것으로 여겨진다(표 4). 참고 anti-PD-L1 mAb(Y1)는 공지 데이터(US 2010/0203056 A1)를 기반으로 합성되었으며 human 및 mouse의 Y1 항체는 Y1-muIgG1 또는 Y1-huIgG1을 생성하는 mouse 또는 human IgG1κ 불변부와 Y1 가변부와 융합함으로써 생성되었다. Y1-muIgG1의 기능은 상기 실험으로 확인하였다.

HEK293/OS8/PD-L1와 HuT78/PD-1*의 공배양 내 anti-PD-L1 하이브리도마 클론의 기능 검사

Sample/Clone ID	OD450 in IL-2 ELISA assay
음성 대조군: only 배지	1.30 ± 0.06
mu31	1.28 ± 0.03
mu32	1.33 ± 0.02
mu33	1.24 ± 0.01
mu34	1.19 ± 0.12
mu35	1.27 ± 0.02
mu36	2.95 ± 0.22
mu37	3.10 ± 0.11
mu38	1.33 ± 0.44
mu39	2.94 ± 0.45
mu310	1.90 ± 0.01
mu311	1.38 ± 0.08
mu312	1.40 ± 0.07
mu313	1.49 ± 0.07
mu314	1.26 ± 0.01
mu315	1.36 ± 0.11
mu316	1.23 ± 0.12
mu317	1.72 ± 0.12
mu318	2.21 ± 0.06
mu319	1.38 ± 0.05
mu320	1.32 ± 0.10
mu321	1.33 ± 0.02
mu322	1.34 ± 0.10
mu323	1.52 ± 0.06
mu324	3.09 ± 0.11
mu325	1.44 ± 0.02
mu326	1.35 ± 0.19
mu327	2.55 ± 0.36
mu328	3.10 ± 0.47
mu329	1.43 ± 0.07
mu330	1.46 ± 0.11
mu331	1.37 ± 0.07
mu332	1.44 ± 0.05
mu333	3.01 ± 0.23
mu334	3.22 ± 0.09
mu335	3.03 ± 0.15
mu336	3.12 ± 0.24
mu337	1.28 ± 0.06
mu338	1.34 ± 0.05

*기능성 클론은 굵은 글씨로 표기하였음

정제된 murine anti-PD-L1은 저해활성의 정량측정을 위하여 동일 실험법으로 비교하였다. 도 3은 농도에 따른 murine-anti-PD-L1 mAbs의 대표 곡선을 나타내었다. 표 5는 mAbs를 유도할 수 있는 EC50과 IL-2의 최대 농도를 나타내었다. Mu333은 PD-L1-PD-1 시그널링의 효과적인 길항제이며 낮은 EC50에서 효과적인 IL-2 생산을 유도하였다. 반대로, mu333 보다 낮은 저해 활성을 갖는 mAbs 및 mu277 중 하나는 농도에 따른 곡선, 상위 시그널의 한도 및 EC50값이 결정되었다. 음성대조군인 muIgG는 PD-L1/PD-1 시그널링 억제할 수 없고 IL-2 생산을 자극할 수 없다.

HEK293/OS8/PD-L1 세포와 HuT78/PD-1 세포의 공배양 내 anti-PD-L1 mAbs로 유도된 IL-2 분비

항체	Baseline (pg/mL)	Top line (pg/mL)	EC₅₀ (μg/mL)
mu333	37	436	0.092
mu277	37	225	0.510
muIgG	37	N/A	N/A
Baseline: 모든 실험에서 muIgG로 유도된 IL-2 분비량의 평균 농도, 도 3A Top line: Prizm Software의 회귀 계산에 근거한 IL-2의 최대 분비량(pg/mL), 도 3A N/A: 미검출

HuT78 / P3Z 세포 내 IL -2 분비의 반대 시그널링에 따른 PD-L1 항체의 기능

HuT78/P3Z세포 내 PD-1 관련 TCR 시그널링은 앞선 설명에 따라 반대가 되었다. 상기 실험의 HEK293/PD-L1 세포는 HuT78/P3Z 세포와 평저 plate에 37℃ 조건에서 공배양 하기 전에 15분 동안 정제된 PD-L1 항체와 전배양하였다. 공배양 16-18시간 후에 상층액을 채취하였고 IL-2 생산량은 앞선 설명과 같이 ELISA로 분석하였다.

Murine anti-PD-L1 mAbs의 저해 활성은 농도에 따라 IL-2 분비의 감소하는 것이 직접적으로 연관되어 측정되었다. 상기 결과와 같이, Mu333은 HuT78 세포의 P3Z 키메릭 수용체와 PD-L1의 결합을 방지함으로써 IL-2 분비를 억제하는 효과를 가졌다. 표 6 및 도 6과 같이, mu333은 mu277의 IC50(최대 활성을 50% 억제하는 mAb의 농도)보다 좋은 효과를 보였으며, 상기 결과 같이 T 세포 내 조절 시그널링을 획득하였다. 음성대조군인 muIgG는 IL-2 생산을 유도하는 PD-L1/P3Z를 억제를 할 수 없었다.

HEK293/PD-L1 세포와 HuT78/P3Z 세포의 공배양 내 anti-PD-L1 mAbs로 유도된 IL-2 분비 억제

항체	IC₅₀ (μg/mL)	Maximum inhibition^*
mu333	0.021	100%
mu277	0.331	100%
muIgG	N/A	N/A
^*Maximum inhibition은 anti-PD-L1 mAbs가 최대 농도(10 μg/mL)로 첨가된 배양물에 의한 저해 백분율(%)로 계산됨 N/A: 미검출

PD-L1을 발현하는 세포 표면과 결합하는 PD-1의 경쟁적 억제

Anti-PD-L1 항체가 PD-L1과 결합하는 PD-1과의 경쟁을 확인하기 위하여, HEK293/PD-L1 세포(1x10⁵ cells per well)를 V-bottom 96-well plate에서 PD-L1 항체와 biotin-conjugated PD-1/Fc 융합단백질의 혼합물과 배양하였다. PD-1/Fc의 비오틴화는 제조사의 실험법(Cat. No. 21327, Thermo Sci)에 따라 EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin 시약을 이용하여 수행하였다. 항체에 의한 PD-L1과 PD-1의 상호작용 억제는 Streptavidin-APC 포함 프로브를 측정하는 MFI를 이용하여 분석하였다. 상기 방법을 이용하여, anti-PD-L1 mAbs의 기능적 세기를 측정하였다. 도 5 및 표 7과 같이, murine mAbs는 PD-L1과 경쟁적으로 결합하여 FACS assay에서 PD-L1의 세포 표면과 결합하는 Biotin-PD-1에 의해 증가하는 MFI를 억제시켰다. Mu333의 IC₅₀값은 0.463 μg/mL으로 IC50값이 2.172 μg/mL인 mu277 보다 높은 억제효과를 보였다. 반대로, 대조군 항체인 murine IgG는 억제효과를 보이지 않았다(도 5).

HEK293 세포 내 PD-L1과 PD-1 결합의 억제

항체	IC₅₀ (μg/mL)	Maximum inhibition
mu333	0.463	100%
mu277	2.172	98%
muIgG	N/A	N/A
Maximum inhibition은 anti-PD-L1 mAbs가 최대 농도(10 μg/mL)로 첨가된 배양물에 의한 저해 백분율(%)로 계산됨 N/A: 미검출

PD-L1을 발현하는 세포 표면과 결합하는 CD80의 경쟁적 억제

PD-1과 PD-L1의 상호작용은 B7-1 또는 대안명이 CD80과 같은 다른 B7 family 단백질과도 결합한다(Butte M.J.2007 Immunity 27:111-122). Anti-PD-L1 항체가 CD80과 경쟁적으로 PD-L1과 결합하는 것을 확인하기 위하여, HEK293/PD-L1 세포를 PD-L1 항체와 biotin-conjugated CD80/Fc 융합단백질의 혼합물과 함께 배양하였다. 상기 방법은 anti-PD-L1 항체에 의해 PD-L1과 biotin-CD80/Fc의 결합이 저해됨에 따라 결합 시그널(MFI 값)이 감소하였다. 도 6 및 표 8과 같이, mu333은 PD-L1과의 결합이 CD80에 의해 최대 100% 저해되었고, mu277의 IC50값인 0.162 μg/mL과 비교하여 매우 낮은 IC50 수치(0.052 μg/mL)를 보였다. 반대로, murine IgG는 경쟁 효과가 없었다(도 6).

HEK293 세포 표면에 발현된 PD-L1과 CD80 결합의 억제

항체	IC₅₀ (μg/mL)	Maximum inhibition
mu333	0.052	100%
mu277	0.162	99%
muIgG	N/A	N/A
Maximum inhibition은 anti-PD-L1 mAbs가 최대 농도(10 μg/mL)로 첨가된 배양물에 의한 저해 백분율(%)로 계산됨 N/A: 미검출

실시예 3. Murine anti -PD-L1 항체의 서열 분석

Murine 하이브리도마 클론에서 선택된 가변부의 클로닝 및 서열은 일반적인 실험법과 일부 변형(Kontermann and Dubel, 2010 Antibody Engineering, Vol 1:2-14)하여 수행하였다. 간단하게 설명하면, 하이브리도마 세포를 수확한 후 PBS로 세척하고 겉두레 로터의 1500 rpm 원심분리로 수득하였다. 총 세포의 RNA는 제조사의 실험법에 따라 Ultrapure RNA kit(Cat. No. CW0581, CW Biotech, 베이징, 중국)를 이용하여 분리하였다.

첫 번째, cDNA 가닥은 reverse transcriptase(Cat. No. AH301-02, TransGen, 베이지, 중국)를 사용하여 합성하였다. 중연쇄기(Vh) 및 murine mAbs의 L사슬 다변수(Vκ)의 PCR 증폭은 PCR reagent kit(Cat. No. AP221-12, TransGen, 베이징, 중국)를 사용하여 수행하였고 murine Vh 및 Vκ 클로닝을 위한 특정 프라이머는 선행기술(Brocks 2001 Mol Med 7:461-469)를 참고하였다. PCR 생산물은 qEASY-Blunt 클로닝 벡터(Cat. No. CB101-02, TransGen)로 서브클로닝되었으며 GeneWiz(베이징, 중국)에 의해 서열화하였다. Vh 및 Vκ의 아미노산 서열은 DNA 서열 결과에 의해 추정되었다. Murine mAbs는 homology 서열의 비교와 homology 서열을 기반으로 한 그룹과 에피토프-맵핑 결과에 의해 분석되었다(실시예 7). 상보성결정변수(Complementary Determinant Regions; CDRs)는 서열 주석과 인터넷 기반(http://www.imgt.org/IMGT_vquest/share/textes/index.html)으로 하는 서열 분석에 의한 Kabat(Wu and Kabat 1970 J Exp. Med. 132:211-250) 및 IMGT(Lefranc 1999 Nucleic Acids Research 27:209-212) 시스템을 기반으로 정의되었다.

mu333의 CDR 서열

MAbs	CDR1	서열번호	CDR2	서열번호	CDR3	서열번호
mu333, Vh	GFSLT SYG VH	9	V IWAGGST NYNSALMS	10	AK PYGNSAMDY	11
mu333, Vk	KAS QDVGIV VA	12	WAS IRHT	13	QQYSNYPLYT	14
Note:굵은 글씨의 CDR 서열은 Kabat 시스템에 의해 정의되었고, 밑줄 친 CDR 서열은 IMGT 시스템에 의해 정의됨

실시예 4. Murine anti - human PD-L1 mAb의 인간화( humanization )

Murine mAb의 3D 구조 시뮬레이션

3차원 구조는 CDR 루프 구조를 지지하는데 중요한 프레임워크 잔기(Framework residues)를 인식할 수 있게 mu333의 가변부가 시뮬레이션 되었다. 잠재적으로 중요한 프레임워크 잔기는 1차 항체 인간화에서 오리지날 murine 잔기로 유지되었다. 항체방법(Morea et al. Methods 2000 20:267-279)으로 이전에 사용된 구조 모델링 방법은 항체의 캐노니컬 구조(Al-Lazikani et al. 1997 Journal of Molecular Biology 273:927-948)로 알려져 있는 anti-PD-L1 mAb mu333의 3D 구조를 시뮬레이션하는 것으로 구현되었다.

간단하게 설명하면, mu333의 각각의 가변부(Vk 및 Vh) 서열은 고해상도(해상도 2.5 angstrom 이하). 구조를 갖는 공지서열에서 가장 동질성이 높은 항체를 동정할 수 있는 PDB 데이터데이타 베이스(Protein Data Bank, http:// blast.ncbi.nlm.nih.gov/)를 이용하여 서열을 비교하였다. Mu333 모델링(표 10)을 위해 선택된 구조 형판들(templates)은 L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3, H-CDR1 및 H-CDR2 내 동일한 캐노니컬 루프 구조를 갖는다. 다른 종류의 면역 글로불린에서 비롯되는 V 및 Vh 형판은 Vk-Vh 계면 잔기의 하이브리드 구조 형태를 위하여 주 사슬 원자의 최소 자승법에 의해 함께 팩킹되어 Swiss-모델 프로그램(Kiefer et al. 2009 Nucleic Acids Research 37, D387-D392)에 의한 상동성 구조 모델링으로 사용되었다. 특정 곁사슬(Side chain) 형태는 주사슬(Main chain) 형태가 유지되는 동안 조정되었다. 모체 구조 및 모델링 된 구조가 동일한 잔기를 갖는 부위에서, 측쇄 구조가 유지되었다. 잔기가 다른 부위에서, 측쇄 구조는 주형 구조, 회천 라이브러리(Rotamer libraries) 및 포장 고려 사항에 기초하여 모델링되었다. 상동성 모델은 PLOP 프로그램(Jacobson et al. 2002 Journal of Physical Chemistry 106:11673-11680)을 이용하여 상동성 모델이 모든 원자 에너지를 최소화하고 Vk 및 Vh 계면의 최적화를 개선하였다. 이 단계는 입체 화학을 향상시키기 위해 수행되었으며, 특히 서로 다른 항체의 세그먼트(Segments)가 함께 결합 된 영역에서 입체 화학을 향상시키기 위해 수행되었다. Mu333 가변부의 3D 구조 모델은 인간화 및 엔지니어링 프로세스 기반의 구조를 위해 사용되었다.

항체 구조의 시뮬레이션에 사용되는 구조 형판

항체 chain	Template 구조의 PDB 코드	서열 상동성	서열 유사성
mu333 Vk	1H8N	92%	94%
mu333 Vh	3VFG	88%	91%

MAb 인간화 및 엔지니어링

anti-PD-L1 mAb의 인간화를 위하여, human 생식계열의 IgG 유전자는 IMGT(http://www.imgt.org/IMGT_vquest/share/textes/index.html) 및 NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/) 내 human 면역 글로불린 유전자 데이터베이스의 서열비교를 통해 mu333 가변부의 cDNA 서열과 높은 상동성이 보이는 서열을 검색하여 선별하였다. Human IGVH 및 IGVκ 유전자는 사용 빈도가 높은(Glanville 2009 PNAS 106:20216-20221) 모든 인간 항체에 존재하고 인간화(Humanization)하기로 선택한 mu333과 높은 상동성을 보였다.

인간화(Humanization)는 CDR-이식(Methods in Molecular Biology, Vol 248: Antibody Engineering, Methods and Protocols, Humana Press)에 의해 수행되며 인간화 항체(hu333s)는 자체 개발한 발현 벡터를 이용하여 human Fab 형태를 디자인 하였다. 인간화 초기에 3D 구조 시뮬레이션에 의해 murine의 돌연변이를 인간의 프레임워크 잔기 내 아미노산으로 전환하였고, CDRs의 캐노니컬 구조 유지에 중요한 murine 프레임워크 잔기 구조는 인간화 항체333(hu333-1A, 서열번호 15 및 16)의 1차 버전으로 유지되었다. 특히, mu333 Vk의 CDRs는 인간 생식계열 가변유전자인 IGVK1-5의 프레임워크로 이식되었고, murine 프레임워크 잔기는 유지되었다(서열번호 16). Mu333 포의 CDRs는 인간 생식계열 가변유전자인 IGVH3-7의 프레임워크로 이식되었고, murine 프레임워크 잔기 중 V₂₄, L₆₇, K₇₁ 및 V₇₈(서열번호 15) 4가지는 유지되었다.

이식된 모든 CDRs는 hu333-1A (Table 9 and 서열번호 15 및 16) 내 Kabat의 CDR 정의를 기반으로 하였다. Hu333 변이에 따르면, Kabat H-CDR2의 N 말단기 절반 만이 이식되었고, N말단기 절반은 3D 구조 시뮬레이션에 따라 항원 결합에 중요한 것으로 간주되었다(표 14).

Hu333-1A는 human IgG CH-1 및 kappa 사슬의 불변부를 각각 포함하는 자체 개발 벡터를 이용하여 적응이 용이한 서브 클로닝 부위를 갖는 human Fab 형태를 형성하였다. IgG2a-CH1에 결합 된 hu333-1A는 정제를 용이하게 하기 위해 8xHis 펩타이드로 C- 말단에 표지되었다. C₂₃₂S and C₂₃₃S (Kabat residue numbering, Kabat et al. Sequence of proteins of immunologic interest, 5^th ed Bethesda, MD, NIH 1991) 돌연변이는 이황화 결합 교환을 방지하고 IgG2a 형태의 human IgG2를 안정화시키기 위해 IgG2 중쇄에 돌연변이를 도입 하였다(Lightle et al. 2010 Protein Sci 19(4): 753-762). 두 구조는 Fab 성숙 서열의 상류에 신호 펩타이드를 포함하고 있다. Hu333-1A Fab의 분비 발현은 상기 2가지 구조를 293-F 세포에 공형질전환하고 6-7일 배양 후 수확함으로써 얻을 수 있다. His8-tagged Fabs는 Ni-sepharose Fast Flow 컬럼(Cat. No. 17531801, GE Life Sciences)과 HiLoad 16/60 Superdex200 컬럼(Cat. No. 17106901, GE Life Sciences)을 이용한 사이즈 배제 크로마토그래피를 통해 발현 배양물의 상층액으로부터 정제하였다. 정제된 Fabs는 PBS를 이용하여 0.5-5 mg/mL 농도로 만들고 80^oC 냉동고에 나누어 보관하였다.

Anti-PD-L1 Fabs의 친화력을 측정하기 위하며, SPR assay를 BIAcore^TM T-200 (GE Life Sciences)을 이용하여 수행하였다. 간단하게 설명하면, human PD-L1/His는 활성된 CM5 바이오센터 칩(Cat. No. BR100530, GE Life Sciences)과 결합하고 1M ethanolamine으로 미반응 그룹을 차단하여 약 100-200 response units (RU)을 수득하였다. 0.12nM에서 90nM으로 연속 희석한 Fab 시료를 주사하였고, SPR running 용액(10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0.05% Tween20, pH7.4)에 30?L/minute 단위로 혼합하여 human PD-L1/His의 결합 반응을 blank flow-cell에서 RU 값을 뺌으로써 계산되었다. 관계율(Association rates; k _on) 및 해리율(dissociation rates; k _off)은 일대일 Langmuir 결합 모델(BIA Evaluation Software, GE Life Sciences)을 사용하여 계산되었다. 평형해리상수(K _d)는 k _off/k _on의 비율로 계산되었다.

Hu333 Fabs의 기능적(functional) 활성은 앞선 설명의 경쟁적 PD-1 assay를 통하여 확인되었다. SPR 측정 및 functional assay의 data는 표 11에 요약되었다. Hu333-1A Fab는 빠른 k _on (1.61 x 106 M-1s-1) 및 매우 느린 k _off (1.59 x 10-5 s-1)로 나타낸 PD-L1에 대해 매우 높은 친 화성(Kd = 9.88 pM)을 나타내었다. 이 실험에서 해리 시간의 5-15 분 동안 코팅 된 PD-L1으로부터의 hu333-1A Fab의 해리는 매우 느리거나 사실상 해리가 없는 것으로 관찰되었다. PD-L1에 대한 hu333-1A Fab의 친화력은 SPR 기술의 검출 한계에 근접하는 것으로 드러났다. hu333-1A Fab의 이러한 높은 친화도는 시험 된 모든 기능 분석에서 높은 효능과 일치 하였다(표 11). Hu333-1A에 이어, Vh 4의 프레임워크 영역에 있는 4 개의 murine 잔기에 상응하는 인간 생식계열 잔기로 각각 변환하는 개개의 돌연변이를 만들었다. 동시에 인간화 수치의 개선을 위하여, 인간 생식계열 잔기에 상응하는 murine 서열로부터 H-CDR2(Kabat? definition)의 C말단 부위도 바꾸었다(표 14, hu333-2B). 4가지 인간화 Fab의 명시는 표 13에 나타난 바와 같이 hu333-2A(Vh에서 V₂₄A), hu333-2B(Vh에서 L₆₇F), hu333-2C (Vh에서 K₇₁R) 및 H-CDR2가 변경된 hu333-2D(Vh에서 V₇₈L)이었다. 모든 인간환 돌연변이는 특정 부위에 돌연변이를 일으킨 mutagenesis kit kit(Cat. No. FM111-02, TransGen, 베이징, 중국)를 포함한 프라이머를 사용하여 만들었다. 확인하고자 하는 돌연변이는 서열 분석에 의해 확인되었다. 이러한 hu333 Fabs은 앞서 설명한 결합 및 functional assay에 의해 발현, 정제 및 실험되었다. Hu333-1A, hu333-2A, hu333-2C 및 hu333-2D과 비교하여 결합 친화력과 기능성이 상당히 감소되었다(데이터는 표시되지 않음). Hu333-2B(서열번호 16 및 17) 만이 hu333-1A에 대해 유사한 결합 및 기능적 활성을 보였다(표 11). 정리하면, hu333-2B(서열번호 16 및 17)는 강력한 결합 친화도 및 기능적 활성을 유지하면서 프레임워크 영역에서 높은 수준의 인간화에 이르렀다.

SPR 및 functional assay를 이용한 Hu333-1A와 hu333-2B Fabs의 비교

Assay/Parameter		hu333-1A Fab	hu333 2B Fab
BiaCore SPR	K_on(M^-1s^-1)	1.61×10⁶	1.36×10⁶
	K_off(s^-1)^*	1.59×10^-5	2.09×10^-6
	K_d(pM)^*	9.88	1.54
PD-1 binding competition(FACS)	IC₅₀(μg/ml)	0.057	0.062
PD-1 binding competition(FACS)	Max inhibition	100%	100%
CD80 binding competition(FACS)	IC₅₀(μg/ml)	0.049	0.055
CD80 binding competition(FACS)	Max inhibition	99%	99%
IL-2 release in HuT78/PD-1^#	IC₅₀(μg/ml)	4.066	0.054
IL-2 release in HuT78/PD-1^#	Max inhibition	1369	1436
IL-2 release in HuT78/P3Z^§	IC₅₀(μg/ml)	0.012	1.011
IL-2 release in HuT78/P3Z^§	Max inhibition	100%	100%
^*K_off는 SPR 실험에서 5-15분의 해리 시간 동안 정확하게 측정하기에는 너무 느릴 수 잇다. 따라서, 본 실험의 기기 및 셋팅에서 사용된 친화력은 너무 강해서 정확하게 결정될 수 없다. ^#HuT78/PD-1 내 IL-2 분비: HEK293/OS8/PD-L1 세포와 공배양한 HuT78/PD-1 세포 내 Fabs에 의해 유도된 IL-2 분비, ^§HEK293/PD-L1 세포와 공배양한 HuT78/P3Z 세포 내 Fabs에 의해 유도된 IL-2 분비

인간에서 치료용 항체로 사용될 수 있는 hu333에 대한 최상의 Vh 및 Vk 서열 구성을 개발하기 위해, 기능적 활성을 CDRs 내 돌연변이 및 기능적 활성을 유지하는 물리 화학적 안정성, 아미노산 조성물, 계획된 등전점(pIs), 발현 수준, 항체의존세포매개세포독성(ADCC) 및 보체의존성세포독성(CDC)과 같은 항체 분자의 특징을 고려한 프레임워크 영역을 hu333에 적용하는 설계를 하였다.

Hu333-1A의 Vh에서 탈이온화된 부위인 NS_76-77을 NT76-77로 돌연변이시켜 hu333-3A2를 생성시켰다(서열번호 18 및 23). Hu333-3A2-Vh의 V60은 V60A로 돌연변이되었으며, 이는 소수성의 표면 노출이 감소 된 주요 인간 IGVH3 유전자의 공통 서열과 일치한다. 상기 돌연변이는 hu333-3C2로 명명하였다(서열번호 19 및 23). 다른 탈아마이드 부위인 NS73-74는 hu333-3C2의 형판에서 TS73-74로 돌연변이 되었으며 이는 또한 주요 human IGVH3 유전자의 공통 서열과 일치하였다. 후자는 hu333-3H2으로 명명하였다(서열번호 20 및 23). 유용한 기능적 활성은 결합 친화도에 대해 약간의 변화 만이 있었다. 한편, 상기 설계된 hu333 돌연변이는 더 나은 물리화학적 특성을 가졌다.

SPR 및 functional assay를 이용한 hu333-3A2, hu333-3C2 및hu333-3H2 Fabs의 비교

Assay/Parameter		hu333-3A2 Fab	hu333-3C2 Fab	hu333-3H2 Fab
BiaCore SPR	K_on(M^-1s^-1)	1.28×10⁶	1.42×10⁶	1.32×10⁶
	K_off(s^-1)^*	2.2×10^-7	1.15×10^-5	4.61×10^-5
	K_d(pM)^*	0.17	8.09	34.9
PD-1 binding competition(FACS)	IC₅₀(μg/ml)	0.068	0.065	0.071
PD-1 binding competition(FACS)	Max inhibition	100%	100%	100%
CD80 binding competition(FACS)	IC₅₀(μg/ml)	0.044	0.073	0.064
CD80 binding competition(FACS)	Max inhibition	99%	99%	99%
IL-2 release in HuT78/PD-1^#	IC₅₀(μg/ml)	0.057	0.046	0.057
IL-2 release in HuT78/PD-1^#	Max inhibition	2551	3124	3016
IL-2 release in HuT78/P3Z^§	IC₅₀(μg/ml)	0.014	0.013	0.014
IL-2 release in HuT78/P3Z^§	Max inhibition	95%	100%	100%
^*K_off는 SPR 실험에서 5-15분의 해리 시간 동안 정확하게 측정하기에는 너무 느릴 수 잇다. 따라서, 본 실험의 기기 및 셋팅에서 사용된 친화력은 너무 강해서 정확하게 결정될 수 없다. ^#HuT78/PD-1 내 IL-2 분비: HEK293/OS8/PD-L1 세포와 공배양한 HuT78/PD-1 세포 내 Fabs에 의해 유도된 IL-2 분비, ^§HEK293/PD-L1 세포와 공배양한 HuT78/P3Z 세포 내 Fabs에 의해 유도된 IL-2 분비

Vh의 CDR3에서 마지막 탈아미드화 부위를 제거하기 위해, hu333-3A2 및 hu333-3H2의 형판에서 각각 NS_101- ₁₀₂를 TS_101-102로 돌연변이 시켰다. 생성 된 인간화 단일클론 항체는 hu333-4A2(서열번호 21 및 23) 및 hu333-4B2 (서열번호 22 및 23)로 명명된 human IgG1 Fab 형태로 형성되었다. Hu333-4A2 및 hu333-4B2의 결합 및 functional assay 실험결과는 타겟(PD-1 및 CD80)에 결합하여 PD-L1 결합을 차단하고 PD-L1 및 PD-1의 하위 시그널링을 억제하는 유사한 친화도 및 기능적 활성을 나타내었다(표 13 및 표 14). Hu333-3B2, -3D2, -3E2, -3G2 및 -3I2를 만드는 과정에서 생성된 몇 가지 돌연변이는 몇 가지 고려 사항에 대한 추가 개발에서 제외되었다 (데이터는 표시되지 않음). 상기 mAb의 CDR을 mu333의 CDR과 비교하여 표 14에 나타내었다.

SPR 및 functional assay를 이용한 hu333-4A2와 hu333-4B2 Fabs의 비교

Assay/Parameter		hu333-4A2 Fab	hu333-4B2 Fab
BiaCore SPR	K_on(M^-1s^-1)	3.88×10⁶	3.78×10⁶
	K_off(s^-1)^*	1.03×10^-5	1.32×10^-5
	K_d(pM)^*	2.65	3.50
PD-1 binding competition(FACS)	IC₅₀(μg/ml)	0.050	0.053
PD-1 binding competition(FACS)	Max inhibition	100%	100%
CD80 binding competition(FACS)	IC₅₀(μg/ml)	0.045	0.062
CD80 binding competition(FACS)	Max inhibition	100%	100%
IL-2 release in HuT78/PD-1^#	IC₅₀(μg/ml)	0.050	0.058
IL-2 release in HuT78/PD-1^#	Top line(pg/ml)	227.5	215.5
IL-2 release in HuT78/P3Z^§	IC₅₀(μg/ml)	0.005	0.016
IL-2 release in HuT78/P3Z^§	Max inhibition	100%	100%
^*K_off는 SPR 실험에서 5-15분의 해리 시간 동안 정확하게 측정하기에는 너무 느릴 수 잇다. 따라서, 본 실험의 기기 및 셋팅에서 사용된 친화력은 너무 강해서 정확하게 결정될 수 없다. ^#HuT78/PD-1 내 IL-2 분리: HEK293/OS8/PD-L1 세포와 공배양한 HuT78/PD-1 세포 내 Fabs에 의해 유도된 IL-2 분비, ^§HEK293/PD-L1 세포와 공배양한 HuT78/P3Z 세포 내 Fabs에 의해 유도된 IL-2 분비

선택된 333 mAbs 중 CDRs의 비교

mAbs	CDR1	서열번호	CDR2	서열번호	CDR3	서열번호
mu333, vh	GFSLTSYGVH	9	VIWAGGSTNYNSALMS	10	AKPYGNSAMDY	11
hu333-1A, vh	GFSLTSYGVH	9	VIWAGGSTNYNSALMS	10	AKPYGNSAMDY	11
hu333-2B, vh	GFSLTSYGVH	9	VIWAGGSTNYVDSVKG	24	AKPYGNSAMDY	11
hu333-3A2, vh	GFSLTSYGVH	9	VIWAGGSTNYVDSVKG	24	AKPYGNSAMDY	11
hu333-3C2, vh	GFSLTSYGVH	9	VIWAGGSTNYADSVKG	25	AKPYGNSAMDY	11
hu333-3H2, vh	GFSLTSYGVH	9	VIWAGGSTNYADSVKG	25	AKPYGNSAMDY	11
hu333-4A2, vh	GFSLTSYGVH	9	VIWAGGSTNYVDSVKG	24	AKPYGTSAMDY	26
hu333-4B2, vh	GFSLTSYGVH	9	VIWAGGSTNYADSVKG	25	AKPYGTSAMDY	26
mu333, vk	KASQDVGIVVA	12	WASIRHT	13	QQYSNYPLYT	14
hu333-1A, vk	KASQDVGIVVA	12	WASIRHT	13	QQYSNYPLYT	14
hu333-2B, vk	KASQDVGIVVA	12	WASIRHT	13	QQYSNYPLYT	14
hu333-3A2. vk	KASQDVGIVVA	12	WASIRHT	13	QQYSNYPLYT	14
hu333-3C2, vk	KASQDVGIVVA	12	WASIRHT	13	QQYSNYPLYT	14
hu333-3H2, vk	KASQDVGIVVA	12	WASIRHT	13	QQYSNYPLYT	14
hu333-4A2, vk	KASQDVGIVVA	12	WASIRHT	13	QQYSNYPLYT	14
hu333-4B2, vk	KASQDVGIVVA	12	WASIRHT	13	QQYSNYPLYT	14
Note: 밑줄 친 아미노산 잔기는 murine 서열로부터 human 서열 또는 물리화학적 특성을 개선한 변이체 서열로 변화한 것임

상기에 나타낸 바와 같이 모든 인간화 단일클론 항체는 제조사의 실험법에 따라 피콜 림프구 분리 배지(Histopaque-1077; Cat. No. 10771, Sigma, St. Louis, USA)를 이용한 밀도 구배 원심분리로 수득한 건강한 기증자의 primary 인간 면역 세포인 말초 혈액 단핵 세포(PBMCs) 기능적 효과도 확인하였다. PBMSs는 assay 이전에 40 ng/mL anti-CD3 mAb OKT3(Cat. No. 16-0037, eBioscience, San Diego, CA, USA)으로 3일간 반응 시켰다. 활성화된 PBMC의 대분분은 주로 T 세포(50-70%), B 세포, NK 세포(15-30%) 및 단핵구(2-10%)로 구성되었다. TCR/CD3 복합체의 결합시 PD-L1 발현 종양 세포에 대한 T 세포의 반응을 구현하기 위해, 활성화 된 PBMC를 96-well plate의 각 well에서 HEK293/OS8/PD-L1 세포와 함께 배양 하였다. 배양 상층액을 수확하기 전에 단일클론 항체를 첨가하여 15-18시간 동안 공배양 한 후, Ready-Set-Go ELISA 키트(Cat. No. 88-7316, eBiosciences)를 사용하여 IFN-γ 수치를 측정함으로써 anti-PD-L1 mAb의 기능적 효과를 분석하였다. ELISA 키트(Cat. No. 88-7316, eBiosciences).

도 7에 나타난 바와 같이, hu333-2B, hu333-3A2, hu333-3C2, hu333-4A2 및 hu333-4B2는 모두 농도 의존적으로 IFN-γ 분비를 증가시켰다. 이와 대조적으로, 음성 대조군 인 bovine serum albumin(BSA)에는 그러한 효과가 없었다. 두 명의 다른 기증자의 PBMC를 사용하여 반복 실험하였다. 대조군(mAb가 없는)과 mAb 치료군의 IFN-γ 분비량은 기증자 마다 달랐지만, IFN-γ 분비의 증가율은 모든 hu333에서 투여량 농도에 따라 유사하게 유지되었다.

실시예 5. 변형된 human IgG1 불변부와의 융합에 따른 효과기 기능 없는 재조합 anti -PD-L1 mAbs의 생성

변형된 human IgG1 불변부의 디자인

PD-L1은 T 세포, B 세포, 수지상 세포, 대식세포, 간엽 줄기 세포 및 골수 유래 비만 세포, 조혈 세포 및 폐, 간세포, 췌도, 췌장 synctiotrophoblast 및 혈관 내피와 같은 폐와 같은 조직을 비롯한 광범위한 정상적인 인간 세포에서 발현된다 endothelium (Keir et. al. 2006 J Exp Med 203:883-895, Keir et. al. 2008 Ann Rev Immunol 26:677-704, Mu et. al. 2011 Medical Oncology 28:682-688). Human wild type IgGγFc 부분에 연결된 PD-L1 차단 항체는 예를 들어 중요한 장기에 원치 않는 독성을 유발할 수 있는 항체의존성세포매개세포독성(ADCC) 및 보체의존성세포독성(CDC)과 같은 Fc 작용 매개체 기능을 유도 할 것으로 기대된다. 중요한 장기에 원치 않는 독성을 유발할 수 있다.

최적의 물리 화학적 특성을 유지하면서 anti-PD-L1mAbs와 관련된 효과기 기능을 제거하기 위해, 본 발명자는 돌연변이 된 IgG1 불변부 영역에 Vh 서열을 연결함으로써 hu333-4A2 및 hu333-4B2 완전 항체를 제조하고, Fcγ 수용체(FcγRs) 결합 또는 C1q 결합 활동을 일으켜 ADCC 및 CDC 효과기 기능을 약화 시키거나 제거한다. FcγR 및 C1q와의 상호 작용에 관여하는 IgG1 Fc의 영역은 문헌에서 광범위하게 연구되어왔다(Tao et al. 1993 J Exp Med 178:661-7; Cole et al. 1997 J Immunol 159:3613-21; Armour et. al. 1999 Eur J Immunol 29:2613-2624; Idusogie et. al. 2000 J of Immunol 164:4178-4184; Shields et. al. 2001 J of Biol Chem 276: 6591-6604; Lund et. al. 2002 Immunol Letters 82:57-65; reviewed by Strohl et. al. 2009 Current Opinion in Biotechnology 20:685-691). 종합적으로, 상기 data는 FcγR에 결합하기 위한 하부 경첩 영역(EU 명명법에 기초한 AA232-238)와 C1q에 결합하기 위한 C_H2도메인의 구조건 군집 영역(EU 명명법에 기초한 D270, K322, P329 및 P331)에 포인트를 가진다. 반면에, IgG2는 경첩 영역에서 IgG1로부터 일부 서열 변이를 가지며, 이것은 Fcγ RIIA_H131을 제외한 대부분의 FcγR에 약한 결합 또는 결합이 없기 때문이다. 실제로, 일부 IgG2 서열을 포함 대부분의 IgG1 경첩 서열을 갖는 IgG1 / IgG2 하이브리드(IgG1Db)는 대부분의 FcγR 및 약독화된 ADCC 및 CDC 효과기 기능에 대한 결합 활성을 상당히 감소시키는 것으로 입증되었다(Armour et. al. 1999 Eur J Immunol 29:2613-2624).

우수한 의약 및 물리 화학적 성질을 고려한 돌연변이 유발의 합리적인 설계에 의해, 각각의 hu333-4A2 및 hu333-4B2 전체 항체의 가변 영역에 융합된 상기 경첩 영역 및 Fc 영역에 다수의 돌연변이 IgG1을 생성시켰다. Functional assay에서 유리한 특징을 갖는 2개의 IgG1 돌연변이인 IgG1mc 및 IgG1mf를 wild-type IgG와 비교하여 표 15에 나타내었다. IgG1mc(서열번호 28)는 상기 IgG1/IgG2 하이브리드로부터 V234A, G237A 및 P239A의 추가 돌연변이 조합을 포함하였다. V234A와 G237A의 돌연변이는 FcγRIIA와 FcγRIIB에 대한 결합을 더 감소시키기 위해 Fc / FcγR 결합 계면에서 표면 소수성 측쇄를 감소 시키도록 설계되었다(Lund et. al. 1992 Mol Immunol 29:53-59, Lund et. al.1996 J Immunol 157:4963-4969, Wines et. al. 2000 J Immunol 164:5313-5318). P₂₃₉A 돌연변이는 C1q 결합과 CDC를 더욱 감소 시키도록 설계되었다(Idusogie et. al. 2000 J of Immunol 164:4178-4184). IgG1mf(서열번호 29)는 아미노산 잔기 G237이 변이되지 않았다는 것을 제외하고는 IgG1mc와 유사 하였다. 재조합 전체 길이의 anti-PD-L1 항체, hu333-4A2-IgG1mc(서열번호 30 및 32), hu333-4B2-IgG1mc(서열번호 31 및 32) 및 hu333-4B2-IgG1mf(서열번호 32 및 33)을 HEK293-F 세포에서 발현시키고 앞서 기술 한 바와 같이 정제 하였다.

IgG1 변이체의 서열 변형

...

231

232

233

234

235

236

237

238

...

329

330

331

...

IgG1wt

...

A

P

E

L

G

P

...

P

A

P

...

IgG2wt

...

A

P

V

A

-

G

P

...

P

A

P

...

IgG4wt

...

A

P

E

F

L

G

P

...

P

S

...

IgG1mc

...

A

P

A

-

A

P

...

A

P

...

IgG1mf

...

A

P

A

-

G

P

...

A

P

...

아미노산 numbering은 EU system 을 기반으로 함.
변형된 IgG1 서열은 밑줄로 표기함

ELISA assay를 이용한 FcγR과 C1q의 결합력 측정

IgG 매개 효과기 기능이 FcγRs 또는 보체 성분 C1q에 결합하는 항체-항원 복합체에 이어 발동된다는 것이 보고 되어져 있다(Nimmerjahn et. al. 2008 Nature Rev Immunol 8:34-47). 예를 들어, ADCC는 항체가 세포 표면 표적 단백질에 결합한 다음 효과기 세포에 발현 된 FcrIIIIA에 결합 될 때 개시된다. CDC는 항체가 C1q 단백질에 결합함으로써 세포 표면 표적을 교차 결합시킬 때 활성화되어 보체 복합체 형성 및 활성화 및 표적 세포 용해의 단계적 연쇄반응을 유도한다. FcγR 및 C1q과 결합하는 ADCC, CDC 및 효과기 기능과 매개된 다른 항체의 생화학 실험은 ADCC 및 CDC의 기본 지표로 작용할 수 있다. 주요 FcγR 및 FcγRI, FcγRIIA_H131, FcγRIIA_R131, FcγRIIIA_F158, FcγRIIIA_V158, FcγRIIB 및 FcγRIIIB를 포함하는 모든 다형성 변이체에 대한 변형된 불변부 영역과 anti- PD-D L1의 결합을 체계적으로 평가 하였다.

앞서 설명한 바와 같이 FcγR의 세포외도메인은 C 말단기 His tag와 융합되었다. 재조합 단백질은 일과적 형질전환에 의해 293-F 세포에서 발현되며 Ni-Sepharose 컬럼 및 gel filtration 컬럼을 이용하여 정제되었다. 2-5 μg/mL의 FcγR는 Nunc MaxiSorp ELISA plate(Cat. No. 442404, Nunc, Thermo Fisher)에 코팅되며 FcγRIIB and FcγRIIIB만 예외적으로 Ni-chelate plate를 사용하였다(Cat. No. 15242, Pierce, Thermo Fisher). Well의 세척 및 blocking 후 예비 형성된 면역 복합체를 각 well에 첨가하고 실온에서 1 내지 2 시간 동안 배양 하였다. 60ng/mL streptavidin-HRP, 60 ng/mL biotinylated-F(ab')₂ goat anti-human IgG (Cat. No. 109-066-097, Jackson ImmunoRes, West Grove, PA, USA) 및 1-5 μg/mL IgG1 Fc 변이체를 포함한 예비 면역-복합체는 blocking buffer 내 인간화된 anti-PD-L1(hu333-4A2 or hu333-4B2)과 융합되었다. 4시간 동안 plate 세척 후, 결합 시그널은 Immobilon Chemiluminescence Substrate A/B(Cat. No. WBKLS0500, Millipore)를 이용한 화학발광에 의해 검출되었다. 다양한 FcγR에 결합하는 hu333-4A2-IgG1mc(서열번호 30 및 32), hu333-4B2-IgG1mc (서열번호 31 and 32) 및 hu333-4B2-IgG1mf(서열번호 32 및 33)는 표 16에 정리되어 있다. Hu333-4A2-IgG1wt와 비교하여 세 가지 IgG1 돌연변이 hu333 mAbs는 FcγR에 대한 결합 활성이 매우 낮았으며, 이는 상기 3 개의 모든 hu333 mAb가 FcγR에 의해 매개되는 작용기 기능이 현저히 감소됨을 시사한다.

ELISA를 이용한 IgG1 변이체와 FcγRs의 결합

FCγRs	hu333-4A2-IgG1wt		hu333-4A2-IgG1mc		hu333-4B2-IgG1mc		hu333-4B2-IgG1mf
FCγRs	화학발광	상대적 결합력	화학발광	상대적 결합력	화학발광	상대적 결합력	화학발광	상대적 결합력
FcγRⅠ	42714	100%	136	0.3%	230	0.5%	175	0.4%
FcγRⅡA_H131	54599	100%	61	0.1%	64	0.1%	82	0.1%
FcγRⅡA_R131	50189	100%	138	0.3%	114	0.2%	158	0.3%
FcγRⅢA_F158	36402	100%	262	0.7%	252	0.7%	279	0.8%
FcγRⅢA_V158	57805	100%	323	0.6%	246	0.4%	225	0.4%
FcγRⅡB	136565	100%	2900	2.1%	2715	2.0%	2069	1.5%
FcγRⅢB	40352	100%	2256	5.6%	2009	5.0%	1751	4.3%
화학발광 신호는 PheraStar FS microplate 리더기(BMG Labtech)로 측정하였음; 각각의 FcγR의 상대적 결합력(%)은 hu333-4A2-IgG1wt 결합력의 화학발광 신호로 표준화 되었음.

FACS를 이용한 FcγR 결합력 측정Ⅲ

FcγR에 대한 다양한 IgG1 형태(wt, IgG1mc, IgG1mf, 서열번호 27-29)와 인간화된 anti-PD-L1의 결합은 유동 세포 계측법에 의해 결정되었다. 요약하면, 인간 FcγR을 발현하는 일련의 안정한 HEK293 형질전환이 확립되었다. 이들 안정한 세포주는 FcγRI, FcγRIIA_H131, FcγRIIA_R131, FcγRIIB, FcγRIIIA_F158 또는 FcγRIIIA_V158을 각각 발현 하였다. FcγR(즉, FcγRI 및 FcγRIIIA)의 복합 서브유닛은 FcRγ 서브유닛과 함께 발현되었다. 2차 항체(goat anti-human IgG F(ab')₂-Alexa Fluor 488, Cat. No. 109-546-097, Jackson ImmunoResearch, 웨스트 그로브, PA, USA)를 사용하여 단량체 anti-FcγR을 발현하는 HEK293 세포에 대한 IgG1 변이체(표 17)와 PD-L1 mAb의 결합을 측정하였다. 예상대로, IgG1wt 형식의 hu333-4A2(hu333-4A2-IgG1wt)는 FcγRI, FcγRIIA_H131 및 FcγRIIIA_V158에 대한 강한 결합 시그널(MFI) 및 FcγRIIA_R131, FcγRIIB 및 FcγRIIIA_F158에 대한 약하지만 유의 한 결합 시그널을 갖는다(표 17). 변형된 IgG1 변이체(hu333-4A2-IgG1mc, hu333-4B2-IgG1mc 및 hu333-4B2-IgG1mf, 서열 번호 30-33)는 background에 가까운 결합 신호를 상당히 감소시켰다.

FACS를 이용한 단량체 IgG1 변이체와 FcγR의 결합 세기 측정

mAbs	FcγRI	FcγRIIA_H131	FcγRIIA_R131	FcγRIIB	FcγRIIIA_F158	FcγRIIIA_V158
hu333-4A2-IgG1wt	1169.42	40.52	15.14	19.00	29.45	91.65
hu333-4A2-IgG1mc	4.29	5.78	3.80	3.71	5.20	3.87
hu333-4B2-IgG1mc	4.78	6.16	3.64	4.49	5.42	4.14
hu333-4B2-IgG1mf	4.56	6.12	3.99	3.73	5.09	3.91
MFI: FACS 분석을 이용한 평균형광강도 세기

항체가 면역 결합체의 형태로 훨씬 더 큰 강도로 FcγR에 결합하는 것으로 나타났는데 이는 다가 효과 때문이다(Bruhns et. al. 2009 Blood 113:3716-3725). 이러한 결합은 단량체 γFc와 대부분의 FcγRs 사이의 결합력이 매우 약하기 때문에 생리적인 조건이 보다 적절하다고 생각된다. 또한, 인간 면역 시스템은 혈청 내 높은 수준으로 존재하는 단량체 IgG에 의한 FcγR의 비특이적인 활성화를 피하기 위하여 상기 메커니즘을 이용한다. 면역 복합체의 형태로 FcγRs와의 결합을 평가하기 위해, 다양한 IgG1 돌연변이 형태인 인간화된 10 ㎍/mL 333 mAb를 FcγR가 발현된 HEK293세포를 배양 하기 전에 FACS buffer 내 다가 면역-복합체에 3 ㎍/mL biotin-PD-L1/His 및 1.5 g/mL neutravidin을 pre-mix 하였다. Goat anti-human IgG F(ab')₂-Alexa Fluor 488(Cat. No. 109-546-097, Jackson ImmunoResearch)는 결합 측정에 사용되었다. 표 18에 나타난 바와 같이, 예비 형성된 hu333-4A2-IgG1wt 면역-복합체는 FcγRs와 낮은 친화력으로 결합되며 단량체 IgG1보다 높은 세기를 보였다(표 18 및 17). 또한, IgG1 돌연변이(hu333-4A2-IgG1mc, hu333-4B2-IgG1mc 및 hu333-4B2-IgG1mf, 서열 번호 30-33)에서 선택된 anti-PD-L1 mAbs는 background에 가깝게 결합 시그널이 유의하게 감소하였다.

종합하면, 변형된 IgG1 형태 내 인간화 된 333은 FcγR에 대한 결합이 거의 없기 때문에, 생리 학적 조건 하에서 FcγRβ 매개 효과기 기능이 거의 없어야 한다.

FACS를 이용한 면역-복합체인 IgG1 변이체와 FcγRs의 결합 세기(MFI^*) 측정

mAbs	FcγRI	FcγRIIA_H131	FcγRIIA_R131	FcγRIIB	FcγRIIIA_F158	FcγRIIIA_V158
hu333-4A2-IgG1wt	3261.14	599.41	159.32	539.42	74.15	308.98
hu333-4A2-IgG1mc	7.00	7.53	5.38	5.05	6.44	5.43
hu333-4B2-IgG1mc	7.01	8.09	5.28	5.03	6.81	4.89
hu333-4B2-IgG1mf	7.11	7.27	4.92	5.00	6.76	4.83
MFI: FACS 분석을 이용한 평균형광 강도

ELISA를 기반으로 한 C1q 결합 분석은 조금의 변형을 갖는 통상적인 ELISA 방법에 의해 수행되었다. 간략하게, wild-type 또는 변형된 IgG1 불변부 영역에 융합된 인간화 333 항체의 표시된 양을 Maxisorp ELISA 플레이트 상에 코팅 하였다. Blocking과 세척 후, well에 2 μg/mL의 human C1q(Cat. No. A400, Quidel, 샌디에이고, USA)를 첨가하여 상온에서 2시간 동안 배양하였다. 세척 후 결합한 C1q는 human C1q(Cat. No. A201, Quidel) 및 HRP conjugated anti-murine IgG(Cat. No. A0168, Sigma, Shanghai, China)에 대한 murine 단일클론 항체를 이용하여 검출하였다. 도 8에 나타난 바와 같이, hu333-4A2-IgG1wt와는 반대로 hu333-4A2-IgG1mc(서열번호 30 및 32), hu333-4B2-IgG1mc(서열번호 31 및 32) 및 hu333-4B2-IgG1mf(서열번호 32 및 33)를 포함한 변형된 IgG1 Fc의 세 가지 mAbs에 대한 C1q 결합은 검출되지 않았다. 상기 data는 IgG1mc(서열 번호 28) 또는 IgG1mf 형태(서열 번호 29) 내 인간화된 333 항체는 CDC 효과기 기능이 매우 낮거나 없음을 확인하였다.

ADCC

Classical 항체 의존성 세포 독성(ADCC)은 FcγRIIIA (CD16)에 결합하는 항체에 의한 NK 세포의 활성화를 포함한다. 선택된 인간 IgG1 변이체에 융합된 인간화된 anti-PD-L1이 ADCC를 유도 하는지를 시험하기 위해, NK92MI 세포(Cat. No. CRL-2408, ATCC)로부터 CD16을 포함하는 발현 플라스미드(V158 대립 유전자) 및 FcRγ 유전자를 효과기 세포로 사용하고, PD-L1이 발현하는 HEK293 세포주인 HEK293/PD-L1을 표적 세포로 사용하였다. Hu333-IgG1 변이체(0.0001-1 ㎍/ml)의 존재하에 96-well V-bottom plate에서 표적 세포(10⁴cells/well,E:T=10)와 함께 효과기 세포(10⁵ cells/well)를 공배양 하였다. (0.0001-1 ㎍/ml)로 5 시간 동안 처리 하였다. HEK293 / PD-L1 세포에 대해 작용하는 NK92MI / CD16 세포의 세포독성을 CytoTox 96 비-방사성 세포 독성 검정 키트(Promega, Madison, WI)를 사용하여 락테이트 탈수소 효소(LDH) 방출 분석에 의해 측정 하였다. 특정 용해는 다음 방정식에 의해 결정되었다.

% Specific lysis = (Experimental - Effector Spotaneous - Target Spotaneous) / (Target Maximum - Target Spotaneous) × 100

IgG1mc 및 IgG1mf 형태의 hu333이 FcγRIIIA(상기 섹션 참조)에 대한 결합을 갖지 않거나 상당히 감소시킨 사실과 일치하여, 상기 ADCC 분석은 hu333-4B2-IgG1mc(서열번호 31 및 32) 및 hu333- 4B2-IgG1mf(서열번호 32 및 33)는 ADCC의 베이스 레벨 수준만을 가졌다. 대조적으로, wild-type IgG1 Fc를 갖는 333-4A2-IgG1wt는 1㎍/mL의 농도에서 20 % 특이적 세포용해를 유도 하였다(도 9).

CDC

일반적으로 Human IgG1 항체는 특정 classical 기전을 통해 보체의존성세포독성(CDC)을 유도한다. 선택된 IgG1 돌연변이 형태(IgG1mc 및 IgG1mf)에서 인간화된 anti-PD-L1 이 CDC를 유발하는지 여부는 PD-L1이 발현하는 B 세포주, Daudi / PD-L1 및 건강한 기증자로부터의 새로운 인간 혈청 CDC에 필요한 모든 구성 요소로부터 결정된다. CDC에 의한 세포용해는 Celltiter glo assay 키트(Promega)로 측정되었다. 요약하면, IDaudi/PD-L1 세포(2x10⁴ cells/well)는 최종 volume 120?L인 96-well flat-bottom plate 내 최종 농도가 16.6%가 되게 normal human serum을 첨가하기 전에 anti-PD-L1 Abs(0.001-10 μg/mL) 함유 serum-free RPMI1640 (Invitrogen)으로 37℃에서 15분간 배양하였다. 37℃에서 밤새 배양 후, 세포를 용해시키고 ATP 농도를 분석 하였다. Daudi 세포가 CD20을 구성적으로 발현하기 때문에 anti-CD20 mAb Rituximab(Roche)을 양성 대조군으로 사용하였다. ATP의 양은 배양액에 존재하는 세포의 수에 정비례한다. 형광 수치는 96-well 형광 측정기(PHERA Star FS, BMG LABTECH)를 사용하여 측정하였다. 결과는 생존 세포의 수에 비례하는 상대 형광 단위(RFU)로 표현하였다. CDC 활성은 다음과 같이 계산하였다: % CDC activity = [(RFU test - RFU background) / (RFU at total cell lysis - RFU background)] x 100. 도 10에 나타난 바와 같이, Rituximab는 CD20⁺ Daudi/PD-L1 세포 내 robust CDC에 의해 유도되었다. 반대로, hu333-4B2-IgG1mc(서열번호 31 및 32)와 hu333-4B2-IgG1mf(서열번호 32 및 33)는 CDC를 보이지 않았다. Wild type IgG1 Fc가 포함된 Ab 333-4A2-IgG1wt 적은 양이나 CDC 활성을 위한 베이스 라인인 0.3 μg/mL 수치 이상이었다. 이러한 data는 IgG1mc 및 IgG1mf Fc 형태가 보체 성분 C1q에 대한 결합을 거의 또는 거의 감소시키지 않았다는 사실과 일치 하였다(이전 섹션 참조).

실시예 6. 변형된 IgG1 형태 내 인간화된 mAb 333의 기능적 활성

상기 기재된 변형 IgG1 포맷의 3 가지 인간화 mAb는 세포-기반 결합 분석 및 기능적 평가에서 특성화되었다. 표 19는 hu333-4A2-IgG1mc, hu333-4B2-IgG1mc 및 hu333-4B2-IgG1mf에 대한 연구 결과를 요약 한 것이다(서열번호 30 내지 33).

FACS 결합 분석은 이전 섹션에서 설명한대로 수행하였다. 항체의 연속 희석액을 HEK293/PD-L1 세포와 함께 배양하고, goat anti-human IgG F(ab') 2-Alexa Fluor 488(Cat. No. 109-546-097, Jackson ImmunoResearch)을 사용하여 결합을 측정하였다. HEK293 세포의 표면에 발현된 천연 PD-L1 단백질에 대한 선택된 단일클론 항체의 농도 의존성 결합 활성이 관찰되었다. 표 19에 나타낸 바와 같이, hu333-4A2-IgG1mc, hu333-4B2-IgG1mc 및 hu333-4B2-IgG1mf는 EC50(50 % 활성에서의 유효 농도)이 0.1 ㎍/mL 부근에서 HEK293/PD-L1 세포와 유사한 투여 량 의존성 결합 활성을 나타냈다.

FACS 기반 경쟁 분석은 앞서 설명한 바와 같이 수행 하였다. 표 19에 나타낸 결과는 hu333-4A2-IgG1mc, hu333-4B2-IgG1mc 및 hu333-4B2-IgG1mf가 PD-1/Fc (0.167- 0.174 μg/mL의 IC₅₀) 및 CD80/Fc(0.078-0.118 μg/mL의 IC₅₀)을 HEK293/PD-L1 세포에 거의 동일하게 결합시켰다.

정제된 anti-PD-L1 단일클론 항체의 기능을 앞서 기술 한 바와 같이 HuT78/PD-1 및 HEK293/OS8/PD-L1 동시 배양 시스템에서 평가하였다. 표 19에 나타낸 바와 같이, 인간화된 333 mAb는이 공존 배양 시스템에서 PD-L1/PD-1 신호 전달의 강력한 길항제였으며 증가된 IL-2 분비를 유도하였다. FACS 기반 경쟁 분석의 결과와 일치하여, hu333-4A2-IgG1mc, hu333-4B2-IgG1mc 및 hu333-4B2-IgG1mf는 EC50에 근접한 수치(0.075-0.087 ㎍/mL) 및 IL-2 유도의 최대 수치(287-300 pg/mL)와 유사한 효능을 보였다.

또한, 정제된 anti-PD-L1 mAb의 기능성은 HuT78/P3Z 및 HEK293/PD-L1이 기재된 바와 같이 공배양 된 역 시그널링 시스템에서 평가하였다. 일관되게, 인간화된 333 mAb는 공배양 시스템에서 PD-L1/P3Z 시그널링의 강력한 억제제 였고, PD-L1 / P3Z 결합에 의해 유도된 IL-2 분비를 억제하였다. 또한, hu333-4A2-IgG1mc, hu333-4B2-IgG1mc 및 hu333-4B2-IgG1mf의 효능 분석은 IC50(0.037-0.045 ㎍/mL) 및 최대 억제 수준(99 %)과 유사하였다(표 19).

세포 기반의 hu333-4A2-IgG1mc,hu333-4B2-IgG1mc 및 hu333-4B2-IgG1mf 활성

Assay/Parameter		hu333-4A2-IgG1mc	hu333-4B2-IgG1mc	hu333-4B2-IgG1mf
FACS binding	EC₅₀(μg/ml)	0.098	0.092	0.102
FACS binding	Top MFI*	1363	1391	1342
PD-1 binding competition(FACS)	IC₅₀(μg/ml)	0.172	0.167	0.174
PD-1 binding competition(FACS)	Max Inhibition	100%	100%	100%
CD80 binding competition(FACS)	IC₅₀(μg/ml)	0.078	0.103	0.118
CD80 binding competition(FACS)	Max Inhibition	100%	100%	100%
IL-2 release in HuT78/PD-1^*	EC₅₀(μg/ml)	0.087	0.084	0.075
IL-2 release in HuT78/PD-1^*	Top line(pg/ml)	299	300	287
IL-2 release in HuT78/P3Z^§	IC₅₀(μg/ml)	0.045	0.039	0.037
IL-2 release in HuT78/P3Z^§	Max Inhibition	99%	99%	99%
^*MFI: FACS 분석을 이용한 평균형광강도 세기. ^#HuT78/PD-1 내 IL-2 분비: HEK293/OS8/PD-L1 세포와 공배양한 HuT78/PD-1 세포 내 Fabs에 의해 유도된 IL-2 분비, ^§HEK293/PD-L1 세포와 공배양한 HuT78/P3Z 세포 내 Fabs에 의해 유도된 IL-2 분비

hu-333 항체가 일차 인간 면역 세포에 기능적 효과를 발휘하는지 확인하기 위해 T 세포(50-70 %), B 세포, NK 세포(15-30%) 및 단핸구세포(2-10%)를 주성분으로 하는 PBMC를 이용하여 항체의 기능을 분석하였다. 제조사의 지시에 따라 피콜 림프구 분리 배지(Histopaque-1077, Cat. No. 10771, Sigma)를 사용하여 밀도 구배 원심 분리에 의해 건강한 기증자로부터 인간 PBMC를 채취 하였다. 인간 혈액의 채취는 BeiGene의 내부 절차에 따라 수행되었다. 이 후, PBMC를 분석 전 3 일 동안 40 ng/mL의 anti-CD3 mAb OKT3(Cat. No. 16-0037, eBioscience, CA)로 자극하였다. TCR/CD3 복합체의 결합시 PD-L1 발현 종양세포에 대한 예비 활성화 된 T 세포의 반응을 모방하기 위해 PBMC(1x104 cells)를 96-well flat-bottom plate 각 well에 HEK293/OS8/PD-L1 세포(3x10⁴ cells)와 공배양 하였다. anti-PD-L1의 제시 농도는 배양물에 첨가하였다. 15-18 시간의 공배양 후, 배양 상등액을 T 세포 활성화 및 다른 면역 세포 활성화의 가장 두드러진 지표 인 Ready-Set-Go! ELISA 키트(Cat. No. 88-7316, eBiosciences)를 사용하여 IFN-γ 수치를 분석하였다(Thakur 등, 2012 Vaccine 30 : 4907-4920). 도 11에 나타난 바와 같이, 예비 활성화된 PBMC 및 HEK293/OS8/PD-L1 세포의 공배양에서 단일클론 항체인 hu333-4A2-IgG1mc 또는 hu333-4B2-IgG1mf의 존재는 농도 의존적으로 IFN-γ 생성을 증가시켰다. 대조군으로 huIgG는 IFN-γ 분비를 자극하는 효과가 없었다. Hu333-4A2-IgG1mc 및 hu333-4B2-IgG1mf의 효력은 parental murin 항체 mu333-IgG와 비교 가능하였다. 다른 기증자들 사이에서 항체 치료 없이 베이스 라인 수치의 IFN-γ가 분비되었지만 hu333-4A2-IgG1mc, hu333-4B2-IgG1mf 및 mu333-IgG에 의해 PBMC 치료에 의한 IFN-γ 분비는 항체 치료의 0.01~10 ㎍/mL 범위로 통계적으로 유의하게 증가하였다(기증자에 따라 10 ㎍/mL에서 약 5-8 배 유도).

종합하면, 이러한 data는 hu333-4A2-IgG1mc, hu333-4B2-IgG1mc 및 hu333-4B2-IgG1mf가 PD-L1/PD-1 상호작용을 차단하는 길항체 및 모든 세포주와 primary 면역 cell-based assay의 하위 시그널임을 입증하였다.

그것들은 기능적 활동과 효능면에서 매우 유사했는데, 이는 서열이 매우 유사하고(프레임 워크 영역의 작은 차이 만), 동일한 결합 에피토프를 공유하고 매우 유사한 결합 친화도 및 특이성을 가졌기 때문이다(아래 섹션 참조).

실시예 7. 인간화된 anti -PD-L1 mAbs의 결합 친화도 및 특이성

다른 종에서 anti -PD-L1 mAbs와 PD-L1 단백질의 결합 특이성

인간, cynomolgus 원숭이(Macaca fascicularis) 및 마우스(Mus musculus) PD-L1을 표적 단백질로 사용하여 mAb hu333 (hu333-4A2-IgG1mc, hu333-4B2-IgG1mc 및 hu333-4B2-IgG1mf)에 대한 결합 특이성을 조사하였다. 원숭이 PD-L1/His 및 쥐 PD-L1/His를 전술 한 바와 같이 인간 PD-L1/His와 유사한 방식으로 발현 및 정제 하였다. Y1은 공개 된 특허(US 2010/0203056 A1)에 따라 합성되고 human IgG1mc 변이체와 융합된 참고문헌의 기능성 anti-PD-L1 mAb이다. 합성된 전체 길이의 단일클론 항체를 Y1-IgG1mc로 명명 하였다. ELISA 분석은 이전 섹션에서 기술한 것과 동일한 방식으로 본질적으로 수행되었다. 간략하게, 200ng의 PD-L1 단백질을 Nunc MaxiSorp ELISA 플레이트(Cat. No. 442404, Nunc, Thermo Fisher)의 각 well에 코팅하였다. 세척 및 blocking 후, 지시 된 농도의 anti-PD-L1 mAb를 첨가하고, 실온에서 1 시간 동안 배양하였다. 세척 후, HRP-conjugated goat anti-human Fc 항체(Cat. No. A0170, Sigma)를 사용하여 결합 된 anti-PD-L1 mAb를 검출하였다. 도 12에 나타낸 바와 같이, hu333-4A2-IgG1mc(서열번호 30 및 32), hu333-4B2-IgG1mc(서열번호 31 및 32) 및 hu333-4B2-IgG1mf(서열번호 32 및 33)와 농도 의존적인 human 및 monkey PD-L1은 결합하나, 면역화된 human PD-L1/Fc로부터 높은 상동성(96%)을 가지는 인간 및 원숭이 PD-1을 생성하는 오리지날 mu333을 포함하는 murine PD-L1은 결합하지 않았다. 이와 반대로, 인간, 원숭이 및 마우스의 모든 PD-L1 단백질은 Y1-IgG1mc와 결합하였다.

SPR을 이용한 인간화된 anti -PD-L1 Fabs의 친화도 측정

Vh 및 Vk가 human IgG1-CH1 및 카파 체인의 불변부 영역의 N말단에 융합된 human IgG1 Fab 형태로서 Hu333-4A2(서열번호 21 및 23), hu333-4B2(서열번호 22 및 23) 및 기준 항체 Y1을 제조하였다. 정제를 용이하게 하기 위해 IgG1-CH1을 C말단 His6 태그에 융합시켰다. 재조합 Fab의 발현 및 정제는 앞서 설명한대로 수행하였다.

anti-PD-L1 Fab의 친화력 측정을 위해 SPR 분석은 앞에서 설명한대로 BIAcoreTM T-200 기기(GE Life Sciences, Shanghai, China)를 사용하여 수행되었다. 결합속도(k _on )와 해리속도(k _off )는 일대일 Langmuir 결합 모델(BIA 평가 소프트웨어, GE Life Sciences)을 사용하여 계산되었다. 평형 해리 상수(K _d )는 k _off / k _on 의 비율로 계산되었다.

anti-PD-L1 Fab의 SPR-determined 결합 친화도는 표 20에 나타내었다. Hu-333-4A2 및 hu333-4B2 Fab는 Y1 Fab보다 더 높은 친화성으로 human PD-L1에 결합하는데, 이것은 보다 빠른 k _on 에 의해 나타났으며, k _off 와 훨씬 작은 Kd 값을 나타내었다. Hu333-4A2 및 hu333-4B2 Fab는 human PD-L1에 대한 결합과 거의 동일하게 monkey PD-L1에 결합한다. 대조적으로, Y1 Fab는 human PD-L1에 대한 결합에 비해 약 100 배 더 낮은 친화력으로 monkey PD-L1에 결합한다(human PD-L1에 대해 0.18 nM 및 monkey PD-L1에 대해 16.2 nM의 K _d ).

SPR을 이용한 human 및 monkey PD-L1과 anti-PD-L1 Fab의 친화도

Binding kinetics/parameter		hu-333-4A2 Fab	hu333-4B2 Fab	Y1 Fab
human PD-L1의 친화도	K_on(M^-1s^-1)	3.88×10⁶	3.78×10⁶	4.97×10⁵
	K_off(s^-1)^*	1.03×10^-5	1.32×10^-5	9.00×10^-5
	K_d ^*	2.65 pM	3.50 pM	0.18 nM
monkey PD-L1의 친화도	K_on(M^-1s^-1)	3.19×10⁶	3.20×10⁶	2.35×10⁶
	K_off(s^-1)^*	0.93×10^-5	0.80×10^-5	3.79×10^-3
	K_d ^*	2.91 pM	2.5 pM	16.2 nM
^*K_off는 SPR 실험에서 5-15분의 해리 시간 동안 정확하게 측정하기에는 너무 느릴 수 잇다. 따라서, 본 실험의 기기 및 셋팅에서 사용된 hu333-4A2 Fab 및 hu333-4B2 Fab에 대한 친화력은 너무 강해서 정확하게 결정될 수 없다.

anti -PD-L1 mAbs의 에피토프 맵핑

PD-1 / PD-L1 복합체의 결정 구조에 관한 이전의 보고는 수용체 PD-1과 직접 상호작용하는 PD-L1의 임계 아미노산(AA) 잔기를 보고하였다(Zhang et. al. 2004 Immunity 20:337-347; Lin et. al. 2008 PNAS 105:3011-3016; Lazar-Molnar et. al. 2008 PNAS 105:10483-10488). 포인트 돌연변이 분석을 통해, PD-1 서열에 대한 8 개의 AA 잔기가 PD-1에 결합하는데 필요한 것으로 확인되었다. 구조 유도 돌연변이 분석의 정보에 기초하여, 우리는 기능적 단일클론 항체가 PD-L1 매개 시그널링을 차단하는 가장 효과적인 방법은 8개의 중요한 AA 잔기에 결합함으로써 PD-1과 경쟁하기 때문에 PD-1 수용체와의 결합에 필요한 에피토프를 사용하는 것이다. 이 가설을 탐구하고 기능적 PD-L1 단일클론 항체에 의한 작용 메커니즘을 이해하기 위해, 8개의 중요한 Aa 각각을 Ala, 즉 F19A, I54A, R113A, M115A, D122A, Y123A, K124A 및 R125A(AA residue numbering based on Lin et. al. 2008 PNAS 105:3011-3016)을 만들었다. Wild-type PD-L1/His(도 1)는 Fast Mutagenesis kit(Cat. No. FM111, Transgen Biotech, Beijing, China)를 사용하여 rolling-circle 돌연변이 유발을 위한 주형으로 사용되었다. 모든 돌연변이는 pcDNA 기반 발현 벡터에서 서브 클로닝되었고 서열분석 되었다. 돌연변이 및 wild-type PD-L1/His 단백질은 앞서 설명한대로 일과적 형질전환에 의해 발현되었다. 배양 4 내지 6 일 후에 조건화 배지(CM)를 채취하고, 품질 및 양의 관점에서 PD-L1/His 단백질 발현을 확인하기 위해 Western blot으로 분석 하였다. 상층액(CM)은 세포 debris 을 제거한 후, ELISA 분석 또는 에피토프-맵핑을위한 Western blot에서 직접 사용 하였다.

Wild-type 및 돌연변이 PD-L1/His를 사용하는 ELISA 분석을 수행하여 anti-PD-L1 mAb의 결합 에피토프를 분석하였다. 항체 결합 에피토프의 비교를 위해, 몇몇 murine mAb 및 참조 항체 Y1-IgG1(US 2010/0203056 A1에 따른 human IgG1 카파 불변부 영역과 융합)이 연구에 포함되었다. mAbs의 동일한 ELISA 분석을 위하여 wild-type 또는 돌연변이 PD-L1/His를 함유하는 동일한 양의 CM을 96-well plate에 코팅 하였다. ELISA 결과는 wild-type PD-L1 결합 시그널의 평균 ELISA 판독 값을 기준으로 표준화 하였다. 특이적 돌연변이 PD-L1에 대한 ELISA 결합 신호를 특정 돌연변이 PD-L1에 대한 가장 높은 항체 결합 판독 값(100%로 설정)에 대해 정규화하여 PD-L1 돌연변이 간의 발현 변이를 균일하게 하였다. Data 분석의 편의를 위해, 특정 PD-L1 돌연변이체에 대한 단일클론 항체의 ELISA 결합 신호가 wild-type PD-L1에 비해 50 % 이하로 떨어졌을 때, 해당 아미노산 돌연변이로 인해 결합 기능이 현저하게 손상된 것으로 정의되었다. 마찬가지로, 특정 돌연변이 체에 대한 단일클론 항체의 ELISA 결합 시그널이 25 % 미만으로 떨어지면, 이는 매우 중요하게 정의되었다.

도 13a에 나타난 바와 같이, PD-L1의 아미노산 잔기 R113은 PD-L1에 대한 hu333-4B2-IgG1 결합에 중요하며, 이의 돌연변이는 PD-L1에 대한 hu333-4B2-IgG1 결합을 현저히 손상시켰다. 한편, 기준 항체 Y1-IgG1은 특유의 결합 에피토프를 갖는다. F19, I54, D122 및 Y123은 모두 R113 이외의 그의 결합에 대한 중요한 에피토프였다(도 13B). 본 연구에서 다른 anti-PD-L1 mAb에서도 결합 항원 결정기의 상이한 시그니처가 관찰되었다(데이터는 나타내지 않음). Hu333-4B2-IgG1 및 Y1-IgG1 항체에 대한 항원 단백질이 변성된 것을 western blot의 data로 확인하였다.

상기 핵심 결합 에피토프 돌연변이와 별개로, 돌연변이 D₂₆A를 만들었다. ELISA 및 western blot 결과는 PD-L1의 돌연변이 D26A가 mAb mu333, hu333-4B2-IgG1 및 Y1-IgG1을 포함하는 모든 기능성 anti-PD-L1 mAb의 결합 활성을 유의하게 억제하였지만, mu260와 같은 비-기능성 항체의 활성은 억제하지 못하였다(도 13C). 표 21에 요약 된 바와 같이, mu333 및 그의 유도체 인간화 mAb와 유사하게, hu333-4B2는 human PD-L1, D26 및 R113의 2개의 주요 아미노산 잔기(에피토프)에 결합하였다; 대조적으로, 단일클론 항체 Y1은 적어도 6개의 아미노산 잔기에 결합하였다.

에피토프-맵핑 결과 요약

mAb	F19A	D26A	I54A	R113A	M115A	D122A	Y123A	K124A	R125A
hu333-4B2-IgG1		**		***
Y1-IgG1	**	**	**	***		**	**

** Mutations inhibited > 50% binding comparing to wildtype PD-L1.

*** Mutations inhibited > 75% binding comparing to wildtype PD-L1.

에피토프 맵핑 연구를 통해, anti-PD-L1 mAb가 결합 친화력, 결합 특이성 및 기능 활성에 큰 영향을 미칠 수 있는 분자 인식을 통해 상이한 에피토프 특성에 결합 할 수 있음을 입증하였다. Hu333-4A2 및 hu333-4B2는 human PD-L1에만 결합 할 수 있지만(도 12A), 마우스 PD-L1에는 결합 할 수 없었다(도 12C); 대조적으로, Y1은 human 및 mouse PD-L1이 26 %의 서열 차이를 갖지만, human 및 mouse PD-L1 모두에 결합하였다(도 12A 및 12C).

human serum단백질의 비특이성 결합

도 14a의 x축에 도시 된 바와 같이, mAb mu333이 인간 혈청 단백질에 비특이적으로 결합 하는지를 확인하기 위해, 5 % 인간 혈청(건강한 기증자) 및 다양한 농도의 PD-L1/His 항원으로 코팅 된 96-well Nunc Maxisorp ELISA plate를 사용하여 ELISA 연구를 수행하였다. 동일한 양의 murine PD-L1 Ab 또는 murine IgG1 카파 불변부 영역과 융합된 Y1 가변부 도메인으로 만들어진 키메라 Y1(Y1-muIgG1으로 명명 됨)을 ELISA 반응에 첨가하고, 결합을 anti-mouse Fc-HRP(Cat. No. A9309, Sigma). 음성 대조군으로 항체가 없는 PBS 완충액을 포함시켰다(도 14).

도 14에 나타난 바와 같이, mu333의 O.D. 베이스 값(매우 낮은 항원 농도에서의 판독)은 음성 대조군과 거의 동일하고, Y1-muIgG1의 O.D. 베이스 값 에 대한 판독은 음성 대조군(PBS)보다 4 배 더 높으며, 결합 선택성에서 mu333 및 YI-mIgG1 사이의 미분적 특성을 나타낸다. 인간 혈청 대신에 소 태아 혈청(fetal bovine serum, FBS)을 사용한 유사한 분석법으로 인간화된 mAb hu333-4B2-IgG1mc 및 hu333-4B2-IgG1mf를 또한 비특이적 결합에 대해 평가하였다. 부모 마우스 하이브리도마 mAb를 연상시키는 hu333-4B2-IgG1mc 및 hu333-4B2-IgG1mf는 FBS에 결합하지 않았다(데이터는 나타내지 않음).

실시예 8. 약동학(Pharmacokinetics)

마우스 내 hu333 - 4B2 - IgG1mf의 약동학

모든 동물 연구는 BeiGene 동물 관리 및 사용 절차에 따라 수행되었다. 인간화된 mAb hu333-4B2-IgG1mf(서열번호 32 및 33)의 약동학을 연구하기 위해 10 내지 12 주령의 암컷 Balb/c 누드 마우스(18-25g)를 사용하였다. 마우스에게 단일 정맥(i.v.) 또는 피하(s.c.)주사로서 mAb hu333-4B2-IgG1mf의 10mg/kg을 투약하였다. 정맥 내 주사를 꼬리 정맥을 통해 투여하고, 피하 주사를 옆구리에 투여하였다. 각 주사 그룹에서 마우스를 다른 하위 그룹으로 분리하고 각 하위 그룹에서 특정 시점에 혈액 혈청을 수집하였다. 정맥주사 그룹에서는 주사 2일 전, 주사 후 15분, 30분, 60분, 90분, 6시간, 24시간 및 2, 3, 4, 5, 7, 10, 14, 21 그리고 28일에 한번 혈청을 채취하였다. 피하주사 그룹은 주사 2일 전, 주사 후 1.5시간, 6시간, 24시간 및 2, 3, 4, 5, 7, 10, 14, 21 그리고 28일에 한번 혈청을 채취하였다.

Human PD-L1/His 단백질을 사용하여 ELISA로 hu333-4B2-IgG1mf의 혈청 수준을 측정 하였다. 간단히 요약하면, Nunc MaxiSorp ELISA plate(Cat. No. 442404, Nunc, Thermo Fisher)를 3 μg/mL human PD-L1/His 단백질을 well 당 100 μL로 밤새 4 ℃에서 코팅하였다. Plate를 실온에서 1시간 동안 3% 소 혈청 알부민, 0.05 % Tween 20 PBS(blocking 완충액)로 차단시켰다. 세척 후, 연속 희석 된 혈청 샘플 및 정제 된 hu333-4B2-IgG1mf 표준 물질을 첨가하고 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 세척 후, 연속 희석 된 혈청 샘플 및 정제 된 hu333-4B2-IgG1mf 표준 물질을 첨가하고 실온에서 1 시간 동안 배양하였다. 세척 후, 결합 된 hu333-4B2-IgG1mf를 HRP-conjugated goat anti-human Fc 항체(Cat. No. A0170, Sigma)를 사용하여 검출하고 TMB 기질(Cat. No. T0440, Sigma)을 사용하여 발색시켰다. 표준 곡선을 비선형 회귀를 사용하여 적응시키고 표준 곡선 및 희석 인자로부터 hu333-4B2-IgG1mf의 혈청 농도를 추론하였다.

시간에 따른 hu333-4B2-IgG1mf의 혈청 농도의 변화 datas는 i.v. 및 s.c. 복용량에 대한비-보체 모델을 이용하여 분석하였다(WinNonlin, Pharsight). 간극, 분포 양, 반감기, 평균 체류 시간 및 생체 이용률은 WinNonlin data 피팅에서 추론되었다.

마우스에서의 hu333-4B2-IgG1mf의 약동학을 표 22에 요약하였다. 투여 후, hu333-4B2-IgG1mf(서열번호 32 및 33) 농도를 2상의 방법(biphasic manner)으로 혈청으로부터 제거하였다. 말단 반감기는 약 10-14일이었다. 10 mg/kg의 복강 주사 후, 마우스에 대해 하루에 7.9 mL/day/kg 농도가 허락되었다. 피하 주사 후, 혈청 중의 hu333-4B2-IgG1mf의 최대 농도는 복강주사 후의 30-50%에 해당되는 농도였다. 10 mg/kg 의 피하주주 및 복강주사 후 AUC는 90 %의 생체 이용률을 나타내었다. 이들 모든 PK 파라미터는 전형적인 인간화 단일클론 항체의 파라미터와 유사하여 hu333-4B2-IgG1mf(서열번호 32 및 33)가 마우스에서 우수한 생체 내 안정성을 가짐을 나타내었다.

Cynomolgus 원숭이 내 hu333 - 4B2 - IgG1mc의 약동학

Hu333-4B2-IgG1mc(서열번호 31 및 32)의 약동학은 cynomolgus 원숭이에서 연구되었다. 인간화된 333이 사람과 원숭이 PD-L1에 거의 동일한 친화력을 가지고 결합됨에 따라, cynomolgus monkeys의 약동학적 프로파일은 인간의 약동학적 프로파일을 예측하는데 매우 유익할 수 있다. 약물 투여 및 혈청 채취는 3D BioOptima의 Animal Care and Use Procedure에 따라 3D BioOptima Co. Ltd(Suzhou, China)에서 수행되었다. 간략하게, 3-5세의 수컷 원숭이 2마리에 단일클론 항체로서 10 mg/kg의 단일클론 항체 hu333-4B2-IgG1mc를 복강주사 하였다. 혈액 샘플(~1mL)은 주사 전 2일, 5 분, 30 분, 2 시간, 6 시간, 12 시간, 24 시간, 36 시간 그리고 주사 후 2, 3, 5, 7, 10, 15, 22, 30일 후에 채취하였다.

ELISA에 기초한 생체 분석 및 약동학적 분석은 상기와 같이 수행되었다. 각 시점에서 원숭이 2마리의 평균 혈청 농도를 투여 후 22 일 및 30 일의 시점을 제외하고는 피팅에 사용하였고, 두 가지 시점에 대한 원숭이의 약물 면역반응 때문에 상기 data는 원숭이 1마리에만 해당되며 다른 원숭이는 클리어런스가 가속화되었고 hu333-4B2-IgG1mc 혈청 수치가 측정되지 않았다.

hu333-4B2-IgG1mc의 시간에 따른 혈청 농도 data는 복강주사 비-보체 모델을 이용하여 분석하였다.

누드마우스에서 피하/복강 주사 후 hu333-4B2-IgG1mc 의 약동학

Parameter	10 mg/kg i.v.	10 mg/kg s.c.
C_max (mg/mL)	250	70.6
Vss/W (mL/kg)	105	N/A
CL/W (mL/day/kg)	7.9	N/A
T_1/2 terminal (day)	9.6	11.3
AUC_o _- _inf (mg/mL*day)	1266	1147
MRT (day)	13.3	16.5
생체이용률 (%)	N/A	90%
Cmax, 최대 농도; V/ss/W, 정상 상태 분포량; CL/W, 혈청 clearance; T_1/2 수명의 절반; AUC, 곡선 아래 영역; MRT, 표준 신체 체류 시간; N/A: 미검출

Cynomolgus 원숭이에서 복강 주사후 hu333-4B2-IgG1mc의 약동학

	10 mg/kg i.v.
C_max (mg/mL)	283.4
Vss/W (mL/kg)	80
CL/W (mL/day/kg)	6.4
T_1/2 terminal (day)	9
AUC_o _- _inf (mg/mL*day)	1527
MRT (day)	11.7
Cmax, 최대 농도; V/ss/W, 정상 상태 분포량; CL/W, 혈청 clearance; T_1/2 수명의 절반; AUC, 곡선 아래 영역; MRT, 표준 신체 체류 시간

Cynomolgus 원숭이에서 hu333-4B2-IgG1mc의 약동학은 표 23에 요약되어있다. 투여 후, hu333-4B2-IgG1mc 농도는 2상 방식으로 혈청에서 제거되었다. 말단 반감기는 약 9일이었다. 10 mg/kg의 복강 주사 후, cynomolgus 원숭이에서 CL/W(mL/day/kg) 수치는 6.4 mL/day/kg 이었다. 복강 주사 후, hu333-4B2-IgG1mc의 피크 농도는 투여 5분 후에 283 ㎍/mL였다. 이러한 PK 매개 변수는 인간의 정상적인 약동학 행동을 예측한 cynomolgus monkeys에서 정상적인 hu333-4B2-IgG1mc의 약동학 특성을 보였다(Deng et. al. 2011 mAbs 3:61-66).

실시예 9. 동종 마우스 암 모델 동물실험에서 인간화된 anti -PD-L1 mAb의 암 성장 저해 vivo

T- 세포주 및 PBMC 기반의 실험 결과, anti-PD-L1 mAb는 사람 암 세포로 이종 이식된 면역 손상된 마우스를 사용하는 마우스 암 모델에서 작동하여 인간 PBMC 이식과 mAb 치료는 in vivo에서 암 세포 성장을 저해하였다. 동종 마우스 암 모델은 다음과 같이 설계되었다. 암컷 NOD/SCID 마우스(6-7 주)를 cyclophosphamide로 전처리 하였다. 인간말초혈액단핵세포(PBMC)를 건강한 지원자의 혈액으로부터 단리한 후 A431 표피 암종 세포(Cat. No. CRL-1555 ATCC) 및 매트 리겔과 혼합하고, 동물의 우측 앞부분에 피하주사 하였다. 세포 접종 후 0일부터 시작하여, 동물을 그룹당 8마리의 마우스를 갖는 3그룹으로 무작위 배정 하였다. 마우스를 비히클(PBS) 또는 10 mg / kg hu333-4B2-IgG1mf(서열번호 32 및 33)로 매주 2회 (BIW i.p.) 4주간 치료하였다. 개별 동물 체중 및 종양 체적을 매주 2 회 기록하였고, 연구기간 동안 독성 임상 징후가 있는지 매일 모니터링 하였다. 종양 체적은 다음 공식을 사용하여 계산되었다 : [D × (d2)] / 2, 여기서 D는 종양의 큰 직경을 나타내고, d는 작은 직경을 나타낸다. 모든 동물 연구는 Beigene Animal Care and Use Procedure에 따라 수행되었다.

도 15에 나타낸 바와 같이, anti-PD-L1 mAb(hu333-4B2-IgG1mf) 처리 군에서, A431 종양의 성장은 PBS 처리 군에 비해 느렸다. 결과적으로 anti-PD-L1 mAb가 생체 내 암 모델에서 종양 세포 성장을 억제하기 위해 인간 면역 세포를 활성화시킬 수 있음을 나타내었으며 이는 이전 섹션에서 기술 된 시험 관내 실험 결과와 일치하였다.

본 발명은 상기 특정 실시예의 모든 조합을 포함한다. 본 발명의 추가적인 실시예 및 전체 적용 범위는 이하에 주어진 상세한 설명으로부터 명백할 것이다. 그러나, 본 발명의 바람직한 실시예를 나타내는 상세한 설명 및 특정 예는 본 발명의 사상 및 범위 내의 다양한 변경 및 수정이 본 발명의 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명하게 될 것이므로 단지 예시로서 주어진 것으로 해석해야 한다. 모든 간행물, 특허 및 본 명세서에 인용된 특허출원, 여기에 인용된 문헌은 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참고로 인용되었다.

<110> BeiGene Li, Kang Song, Jing Zhang, Tong Li, Yucheng Ren, Zhiying Kang, Yanshen <120> ANTI-PD-L1 ANTIBODIES AND THEIR USE AS THERAPEUTICS AND DIAGNOSTICS <130> Pi19-B193 <160> 33 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 870 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atgaggatat ttgctgtctt tatattcatg acctactggc atttgctgaa cgcatttact 60 gtcacggttc ccaaggacct atatgtggta gagtatggta gcaatatgac aattgaatgc 120 aaattcccag tagaaaaaca attagacctg gctgcactaa ttgtctattg ggaaatggag 180 gataagaaca ttattcaatt tgtgcatgga gaggaagacc tgaaggttca gcatagtagc 240 tacagacaga gggcccggct gttgaaggac cagctctccc tgggaaatgc tgcacttcag 300 atcacagatg tgaaattgca ggatgcaggg gtgtaccgct gcatgatcag ctatggtggt 360 gccgactaca agcgaattac tgtgaaagtc aatgccccat acaacaaaat caaccaaaga 420 attttggttg tggatccagt cacctctgaa catgaactga catgtcaggc tgagggctac 480 cccaaggccg aagtcatctg gacaagcagt gaccatcaag tcctgagtgg taagaccacc 540 accaccaatt ccaagagaga ggagaagctt ttcaatgtga ccagcacact gagaatcaac 600 acaacaacta atgagatttt ctactgcact tttaggagat tagatcctga ggaaaaccat 660 acagctgaat tggtcatccc agaactacct ctggcacatc ctccaaatga aaggactcac 720 ttggtaattc tgggagccat cttattatgc cttggtgtag cactgacatt catcttccgt 780 ttaagaaaag ggagaatgat ggatgtgaaa aaatgtggca tccaagatac aaactcaaag 840 aagcaaagtg atacacattt ggaggagacg 870 <210> 2 <211> 290 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Arg Ile Phe Ala Val Phe Ile Phe Met Thr Tyr Trp His Leu Leu 1 5 10 15 Asn Ala Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr 20 25 30 Gly Ser Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu 35 40 45 Asp Leu Ala Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile 50 55 60 Ile Gln Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His Ser Ser 65 70 75 80 Tyr Arg Gln Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn 85 90 95 Ala Ala Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr 100 105 110 Arg Cys Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val 115 120 125 Lys Val Asn Ala Pro Tyr Asn Lys Ile Asn Gln Arg Ile Leu Val Val 130 135 140 Asp Pro Val Thr Ser Glu His Glu Leu Thr Cys Gln Ala Glu Gly Tyr 145 150 155 160 Pro Lys Ala Glu Val Ile Trp Thr Ser Ser Asp His Gln Val Leu Ser 165 170 175 Gly Lys Thr Thr Thr Thr Asn Ser Lys Arg Glu Glu Lys Leu Phe Asn 180 185 190 Val Thr Ser Thr Leu Arg Ile Asn Thr Thr Thr Asn Glu Ile Phe Tyr 195 200 205 Cys Thr Phe Arg Arg Leu Asp Pro Glu Glu Asn His Thr Ala Glu Leu 210 215 220 Val Ile Pro Glu Leu Pro Leu Ala His Pro Pro Asn Glu Arg Thr His 225 230 235 240 Leu Val Ile Leu Gly Ala Ile Leu Leu Cys Leu Gly Val Ala Leu Thr 245 250 255 Phe Ile Phe Arg Leu Arg Lys Gly Arg Met Met Asp Val Lys Lys Cys 260 265 270 Gly Ile Gln Asp Thr Asn Ser Lys Lys Gln Ser Asp Thr His Leu Glu 275 280 285 Glu Thr 290 <210> 3 <211> 717 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 atgaggatat ttgctgtctt tatattcatg acctactggc atttgctgaa cgcatttact 60 gtcacggttc ccaaggacct atatgtggta gagtatggta gcaatatgac aattgaatgc 120 aaattcccag tagaaaaaca attagacctg gctgcactaa ttgtctattg ggaaatggag 180 gataagaaca ttattcaatt 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Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 28 <211> 329 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> huIgG1mc pro <400> 28 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Pro Ala Ala Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 115 120 125 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 130 135 140 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 145 150 155 160 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 165 170 175 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 180 185 190 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 195 200 205 Ala Leu Ala Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 210 215 220 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu 225 230 235 240 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 245 250 255 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 260 265 270 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 275 280 285 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 290 295 300 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 305 310 315 320 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 <210> 29 <211> 329 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> huIgG1mf pro <400> 29 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser 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Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu 225 230 235 240 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 245 250 255 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 260 265 270 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 275 280 285 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 290 295 300 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 305 310 315 320 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 <210> 30 <211> 446 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hu333-4A2-IgG1mc HC pro <400> 30 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr 20 25 30 Gly Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Trp Ala Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Val Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Lys Pro Tyr Gly Thr Ser Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 115 120 125 Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys 130 135 140 Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 145 150 155 160 Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser 165 170 175 Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser 180 185 190 Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn 195 200 205 Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His 210 215 220 Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Ala Ala Ala Pro Ser Val Phe 225 230 235 240 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 245 250 255 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 260 265 270 Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 275 280 285 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 290 295 300 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 305 310 315 320 Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Ala Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 325 330 335 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 340 345 350 Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 355 360 365 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 370 375 380 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 385 390 395 400 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 405 410 415 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 420 425 430 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 31 <211> 446 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hu333-4B2-IgG1mc HC pro <400> 31 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr 20 25 30 Gly Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Trp Ala Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Lys Pro Tyr Gly Thr Ser Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 115 120 125 Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys 130 135 140 Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 145 150 155 160 Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser 165 170 175 Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser 180 185 190 Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn 195 200 205 Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His 210 215 220 Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Ala Ala Ala Pro Ser Val Phe 225 230 235 240 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 245 250 255 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 260 265 270 Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 275 280 285 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 290 295 300 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 305 310 315 320 Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Ala Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 325 330 335 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 340 345 350 Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 355 360 365 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 370 375 380 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 385 390 395 400 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 405 410 415 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 420 425 430 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 32 <211> 215 <212> PRT <213> Artificial Sequence 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Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser 180 185 190 Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn 195 200 205 Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His 210 215 220 Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Ala Ala Gly Pro Ser Val Phe 225 230 235 240 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 245 250 255 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 260 265 270 Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 275 280 285 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 290 295 300 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 305 310 315 320 Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Ala Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 325 330 335 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 340 345 350 Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 355 360 365 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 370 375 380 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 385 390 395 400 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 405 410 415 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 420 425 430 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445

Claims

인간 PD-L1에 결합하고, 하기의 군에서 선택되는 상보성결정부(CDRs)를 포함하는 항체-항원 결합 도메인을 포함하는 항체를 포함하는 암 치료용 약제:
(a) 서열번호 9의 중쇄 CDR1, 서열번호 25의 중쇄 CDR2, 서열번호 26의 중쇄 CDR3 및 서열번호 12의 경쇄 CDR1, 서열번호 13의 경쇄 CDR2, 서열번호 14의 경쇄 CDR3;
(b) 서열번호 9의 중쇄 CDR1, 서열번호 24의 중쇄 CDR2, 서열번호 26의 중쇄 CDR3 및 서열번호 12의 경쇄 CDR1, 서열번호 13의 경쇄 CDR2, 서열번호 14의 경쇄 CDR3; 및
(c) 서열번호 9의 중쇄 CDR1, 서열번호 10의 중쇄 CDR2, 서열번호 11의 중쇄 CDR3 및 서열번호 12의 경쇄 CDR1, 서열번호 13의 경쇄 CDR2, 서열번호 14의 경쇄 CDR3.
제1항에 있어서, 상기 항체-항원 결합 도메인은
서열번호 9의 중쇄 CDR1, 서열번호 25의 중쇄 CDR2, 서열번호 26의 중쇄 CDR3; 또는
서열번호 12의 경쇄 CDR1, 서열번호 13의 경쇄 CDR2, 서열번호 14의 경쇄 CDR3;를 포함하는 것을 특징으로 하는 암 치료용 약제.
제1항에 있어서, 상기 항체-항원 결합 도메인은 아래 서열을 포함하는 중쇄 가변부(Vh) 및 경쇄 가변부(Vk)를 포함하는 것을 특징으로 하는 암 치료용 약제:
hu333-4B2 vh 및 vk (서열번호 22 및 23);
hu333-4A2 vh 및 vk (서열번호 21 및 23);
mu333 vh 및 vk (서열번호 6 및 8); 또는
hu333-1A vh 및 vk (서열번호 15 및 16).
제1항에 있어서, 상기 항체-항원 결합 도메인은 아래 서열을 포함하는 중쇄 가변부(Vh) 및 경쇄 가변부(Vk)를 포함하는 것을 특징으로 하는 암 치료용 약제:
hu333-4B2 vh (서열번호 22); 및
hu333-4B2 vk (서열번호 23).
인간 PD-L1에 결합하는 항체-항원 결합 도메인을 포함하는 항체를 포함하는 PD-L1 발현 암 치료용 약학 조성물로서,
상기 항체-항원 결합 도메인은 하기의 군에서 선택되는 상보성결정부(CDRs)를 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물:
(a) 서열번호 9의 중쇄 CDR1, 서열번호 25의 중쇄 CDR2, 서열번호 26의 중쇄 CDR3 및 서열번호 12의 경쇄 CDR1, 서열번호 13의 경쇄 CDR2, 서열번호 14의 경쇄 CDR3;
(b) 서열번호 9의 중쇄 CDR1, 서열번호 24의 중쇄 CDR2, 서열번호 26의 중쇄 CDR3 및 서열번호 12의 경쇄 CDR1, 서열번호 13의 경쇄 CDR2, 서열번호 14의 경쇄 CDR3; 또는 및
(c) 서열번호 9의 중쇄 CDR1, 서열번호 10의 중쇄 CDR2, 서열번호 11의 중쇄 CDR3 및 서열번호 12의 경쇄 CDR1, 서열번호 13의 경쇄 CDR2, 서열번호 14의 경쇄 CDR3.
제5항에 있어서, 상기 항체-항원 결합 도메인은
서열번호 9의 중쇄 CDR1, 서열번호 25의 중쇄 CDR2, 서열번호 26의 중쇄 CDR3; 및
서열번호 12의 경쇄 CDR1, 서열번호 13의 경쇄 CDR2, 서열번호 14의 경쇄 CDR3;를 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제5항에 있어서, 상기 항체-항원 결합 도메인은 아래 서열을 포함하는 중쇄 가변부(Vh) 및 경쇄 가변부(Vk)를 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물:
hu333-4B2 vh 및 vk (서열번호 22 및 23);
hu333-4A2 vh 및 vk (서열번호 21 및 23);
mu333 vh 및 vk (서열번호 6 및 8); 또는
hu333-1A vh 및 vk (서열번호 15 및 16).
제5항에 있어서, 상기 항체-항원 결합 도메인은 아래 서열을 포함하는 중쇄 가변부(Vh) 및 경쇄 가변부(Vk)를 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물:
hu333-4B2 vh (서열번호 22); 및
hu333-4B2 vk (서열번호 23).
제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 폐암, 간암, 위암, 신장암, 유방암, 난소암, 췌장암, 흑색종 또는 식도암인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 항-PD-1 항체와 조합하여 치료되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.