KR100236977B1 - 인간 상피세포 성장인자와 인간 안지오게닌의 융합독소단백질 및 그의 제조방법 - Google Patents

인간 상피세포 성장인자와 인간 안지오게닌의 융합독소단백질 및 그의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 인간 상피세포 성장인자수용체(human epidermal growth gactor, hEGF)가 과량 발현된 암세포를 추적하여 세포내로 국재화(internalize)되는 성질을 갖는 인간 상피세포 성장인자(hEGF)와, 세포내로 국재화되었을때 그 세포의 리보핵산을 분해하여 세포독성을 나타내는 인간 안지오게닌을 유전공학적으로 융합하여 제조한 융합독소단백질, 그 융합단백질의 코딩 유전자를 포함하는 발현벡터로 대장균을 형질전환시켜 전기 독소융합단백질을 대량으로 제조하는 방법 및 전기 융합독소단백질의 항암제로서의 용도를 제공하는 것이다. 본 발명의 융합독소단백질을 이루는 각 구성단백질 모두는 인체 유래의 단백질로서 항체를 형성하지 않아 면역독성이 없으며, 또한 각 구성단백질 자체만으로는 암세포에 대한 활성이 거의 없으나, 이들이 융합된 단백질은 분자량이 작으면서도 암세포에만 IC50에서 1000배 이상의 차이로 선택적으로 작용하여 암세포만을 괴사시킬 수 있기 때문에, 종래의 항암제에 비해 독성이 전혀 없이 hEGF 수용체를 과량 발현하는 암을 치료할 수 있다.

Description

인간 상피세포 성장인자와 인간 안지오게닌의 융합독소단백질 및 그의 제조방법
본 발명은 인간 상피세포 성장인자(human epidermal growth gactor, hEGF)와 리보뉴클레아제 계통(RNase superfamily)의 단백질인 인간 안지오게닌(angiogenin)의 융합독소단백질 및 그의 제조방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 인간 상피세포 성장인자 수용체가 과량 발현된 암세포를 추적하여 세포내로 국재화(internalize)되는 성질을 갖는 인간 상피세포 성장인자(hEGF)와, 세포내로 국재화되었을 때 그 세포의 리보핵산을 분해하여 세포독성을 나타내는 인간 안지오게닌을 유전공학적으로 융합하여 제조한 융합독소단백질, 그 융합단백질의 코딩 유전자를 포함하는 발현벡터로 대장균을 형질전환시켜 전기 독소융합단백질을 대량으로 제조하는 방법 및 전기 융합독소단백질의 항암제로서의 용도를 제공하는 것이다.
환경의 악화와 노년인구의 증가로 암 발생률이 매년 5% 이상 증가하고 있으며, 인구 십만명당 사망원인을 살펴보면, 암이 111명, 뇌혈관질환이 80명, 불의의 사고가 69명, 심장질환이 44명, 간 질환이 29명 등의 순서로, 암으로 인한 사망이 가장 큰 비중을 차지한다.
이들 암을 예방 및 치료하기 위한 항암요법으로는 주로 화학요법제가 많이 개발되어 사용되고 있지만, 이들은 암세포외에도 정상 세포를 공격하여 상당한 독성을 나타내고 있다. 암세포에 대한 특이성이 낮고 정상 세포에 대한 독성 때문에, 새로운 작용기전을 갖는 약물의 탐색, 새로운 유도체의 개발, 보조치료제의 사용, 약물전달체계의 개발, 미사일 요법제(drug targeting)등 여러 분야에서 부작용이 적은 항암제의 개발이 시도되고 있다.
최근에는, 화학 요법제를 암세포에 친화성이 있는 담체에 결합시켜 화학요법제가 암세포에만 선택적으로 작용하도록 하는 미사일 요법이 개발되어 주목을 받고 있다. 항암 미사일 요법제로서는 알파 훼토프로틴과 같은 암세포 특이 항원에 대한 항체에 화학요법제나 리신, 디프테리아 톡신, 슈도모나스 톡신 등의 독성 단백질, 또는 방사성 동위원소를 연결시킨 경우가 보고되고 있다(참조 : K. Shikoro et al., Br. Med. Bull., 40 : 233-239(1984); Vijay et al., Nature, 339 : 394-397(1989); USP 4,545,985; Peter et al., Cancer Res., 54 : 1008(1994)). 그러나, 이들 항체 복합체는 세포내로 들어가기가 어렵고, 항체 자체가 항원성이 있으며, 항체가 정상세포와 결합할 수도 있고, 항체의 분자가 크기 때문에 그에 결합되는 약물의 비율이 낮다는 단점이 있었다(참조 : Pastan et al., Cell, 47 : 641-648(1986); Hurwitz et al., Cancer Res., 35 : 1175-1181(1975); Delabye et al., J. Clin. Invest., 77 : 301-311(1986); Buchegger et al., J. Exp. Med., 158 : 413-427(1986); Buchegger et al., Cancer, 58 : 655-661(1986)).
다른 시도의 항암 미사일 요법제로서, 정상세포에 독성을 주지 않는 폴리아미노산을 담체로 이용하여 약물을 결합시킨 후, 직접 또는 항체에 결합시켜 암세포에 있는 효소에 의해 약물이 유리되도록 하는 항암제가 개발되었으나, 항체에 의해 발생하는 상술한 문제점 모두를 해결하지는 못하였다(참조 : Kato et al., J. Med. Chem., 27 : 1602-1607(1984); EP 112,720; USP 4,485,093).
또 다른 시도의 항암 미사일 요법제로서, 세포내 수용체와 결합하는 펩타이드나 단백질 예를 들면, TGF(tumor growth factor), MSH(Melanocyte stimulating hormone), 소마토스타틴(somatostatin), 글루카곤(glucagon), 인슐린(insulin), 트랜스페린(transferin), LDL(low density lipoprotein), 칼시토닌(calcitonin), 알파 2 마크로글로불린(alpha 2 macroglobulin), 브라디카닌(bradikinin), EGF 등에 독성 단백질을 결합시키는 연구도 진행되었으나, 독소단백질 자체의 독성으로 그다지 큰 성과를 거두지 못하고 있다(참조 : USP 4,545,985; Shimizu et al., FEBS Letters, 118 : 274-278(1980); Cawley et al., Cell, 22 : 563-570(1980); Simpson et al., Cell, 29 : 469-673(1982); WO85/00369; WO83/04030; USP 4,528,186; EP 46,039; EP 128,733; WO85/01284; EP 131,868; USP 3,917,824).
또한, 최근에는 펩타이드와 사이토톡신의 유전공학적 융합 단백질, 이를 테면 TRH(Thyrotropin releasing hormone), TRF(Transferin), MSH, LDL 등과 디프테리아 톡신과의 융합단백질이 제조되었지만, 담체 펩타이드의 수용체 결합 활성을 유지시켜야 하는 한계로 인하여 그 사용이 제한되어 왔다(참조 : Bacha et al., J. Biol. Chem., 258 : 1565-1570(1983); Okeefe et al., J. Biol. Chem., 260 : 932-937(1985); Murphy et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 83 : 8258-8262(1986); 일본 특허공고 (소)60-163824).
한편, WO88/00837에서는 상피세포 성장인자와 세포독성 화학물질 또는 세포독성 화학물질이 결합된 폴리머와의 결합체를 개시하고 있으나, 세포독성화학물질 또는 그의 결합 폴리머 자체가 독성을 나타내고, 심지어 화학물질에 대한 항체가 형성되어, 종래 항암제의 독성을 크게 개선했다고 볼 수 없었다. EP 467,536에서는 유전공학적으로 TGF-α에 슈도모나스 엑소톡신 A의 변형된 형태를 융합하여, 방광암(bladder cancer)을 표적으로 하는 융합단백질을 개시하고 있으나, 미생물 유래의 독소에 대한 항원성을 극복하지 못하였다. 또한, 일본 특허공고 (소)63-41418에서는 화학물질을 링커로 사용하여 상피세포 성장인자와 녹농균독소를 결합시킨 융합체를 제조하였는데, 녹농균독소의 독성에 대한 문제가 여전히 해결되지 못하고 있다. EP 11111에서는 분자량이 작은 성장인자에 화학물질을 화학적으로 연결한 암세포 지향성의 항암제를 개시하고 있는데, 이는 화학물질이 단백질의 베타-아미노기나 카복실기에 비특이적으로 결합하여 제조된 것으로, 화학반응중의 오염, 단백질의 변성 및 융합체 자체의 불균질성으로 인한 문제점이 제기되어 왔다.
이상과 같이, 암세포 표면의 종양표지인자에 대한 단일클론항체와 세포독성물질(cytotoxic agent) 또는 미생물 유래 독소가 융합된 독소단백질(참조 : USP 4,664,911; USP 4,545,985), 종양 유래 성장인자와 미생물 유래 독소가 융합된 독소단백질(참조 : Jill et al., J. Biol. Chem., 266 : 21118(1991); Daniel et al., Cell, 22 : 563-570(1980); Chaudhary et al., PNAS, 84 : 4538-4542(1987))에 대한 연구가 진행되고 있으나, 독소단백질 자체의 독성, 융합과정에서의 화학물질 오염, 이들 융합체 자체에 대한 항체형성으로 인한 면역독성의 유발과 항체의 비특이적 결합, 융합체의 큰 분자량으로 인한 암세포까지의 운반 곤란성 때문에 만족할만한 성과를 거두지 못하였다(참조 : Chung et al., Mol. Cells, 6 : 125-132(1996)).
이에, 본 발명자들은 상술한 문제점을 해결한 미사일 요법제용 융합단백질을 개발하고자, 종래 항암 미사일 요법제의 문제점이 되고 있는 항체형성 문제 및 분자의 크기가 큼으로 인한 표적효율(targeting efficiency)의 저하를 피하기 위하여, 암세포 표면의 EGF 수용체를 추적하는 추적단백질과 추적된 암세포를 괴사(cell-killing)시키는 안지오게닌 세포독소를 모두 인체 유래의 단백질로 함으로써 항체를 형성하지 않도록 하였으며, 또한 추적 기능과 괴사기능을 유지하는 최소한의 단백질만으로 융합독소단백질을 제조하여, 즉 통상적인 항암 미사일 요법제의 전체 분자크기가 50kD 이상인데 비하여, 본 발명의 융합독소단백질은 20.4kD 미만이 되도록 한 후, 이를 유전공학적으로 제조하였다. 즉, 융합독소단백질을 구성하는 hEGF와 안지오게닌 두 분자는 모두 인체내에 정상적으로 존재하는 물질로서 과량투여로도 독성을 나타내지 않을 뿐만 아니라, 구성분자들의 분자량이 작아 한 분자로 융합된 상태로도 일반 단백질보다 분자량이 크지 않은 바, 본 발명의 구성분자들의 융합체 유전자를 클로닝하여 대장균에서 발현하여 대량의 융합단백질을 제조하였다.
이렇게 제조된 융합독소단백질은 정상세포의 성장에는 영향을 미치지 않으면서, hEGF 수용체를 발현하는 각종 암세포의 성장을 선택적으로 저해하고, 또한 종래 항암제가 갖는 독성 및 간에서의 대사 등과 같은 체내수송시의 손실, 융합단백질 자체에 대한 항체형성 등의 문제점 없이, hEGF 수용체를 과량 발현하는 암을 치료할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
결국, 본 발명의 주된 목적은 hEGF 수용체를 발현하는 암세포의 성장을 선택적으로 저해하는, 유전공학적으로 제조된 hEGF와 인간 안지오게닌의 융합독소단백질을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 전기 융합독소단백질의 코딩 유전자를 포함하는 발현벡터로 대장균을 형질전환시켜, 전기 융합단백질을 대량으로 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 전기 융합독소단백질을 유효성분으로 포함하는 항암제를 제공하는 것이다.
제1도는 발현벡터 pTE105의 유전자 지도를 나타낸다.
제2도는 재조합 벡터 pRSang의 구축과정을 도식적으로 나타낸 그림이다.
제3도는 재조합 벡터 pTEang의 구축과정을 도식적으로 나타낸 그림이다.
제4도는 안지오게닌-글리신-hEGF의 융합단백질을 발현하는 재조합 벡터 pTE4081의 구축과정을 도식적으로 나타낸 그림이다.
제5도는 안지오게닌-(글리신)4세린-hEGF의 융합단백질을 발현하는 재조합 벡터 pTE4082의 구축과정을 도식적으로 나타낸 그림이다.
제6도는 hEGF-안지오게닌의 융합단백질을 발현하는 재조합 벡터 pTE4083의 구축과정을 도식적으로 나타낸 그림이다.
제7도는 hEGF-글리신-안지오게닌의 융합단백질을 발현하는 재조합 벡터 pTE4084의 구축과정을 도식적으로 나타낸 그림이다.
제8도는 hEGF-(글리신)4세린-안지오게닌의 융합단백질을 발현하는 재조합 벡터 pTE4089의 구축과정을 도식적으로 나타낸 그림이다.
제9도는 hEGF-[(글리신)4세린]2-안지오게닌의 융합단백질을 발현하는 재조합 벡터 pTE40810의 구축과정을 도식적으로 나타낸 그림이다.
제10도는 안지오게닌-(글리신)4세린-hEGF-(글리신)4세린-안지오게닌의 융합단백질을 발현하는 재조합 벡터 pTE40815의 구축과정을 도식적으로 나타낸 그림이다.
제11도는 hEGF-(글리신)4세린-안지오게닌-(글리신)4세린-hEGF의 융합단백질을 발현하는 재조합 벡터 pTE40816의 구축과정을 도식적으로 나타낸 그림이다.
제12(a)도는 대장균 JM101 형질전환체의 세포 배양액을 SDS-PAGE한 결과를 나타내는 전기영동 사진이다.
제12(b)도는 제12(a)도의 SDS-PAGE를 웨스턴블럿 분석한 결과를 나타내는 전기영동 사진이다.
제13(a)도는 재조합 벡터 pTE4089를 포함한 대장균 JM101 형질전환체의 세포 배양액을 SDS-PAGE 및 웨스턴블럿 분석한 결과를 나타내는 전기영동 사진이다.
제13(b)도는 재조합 벡터 pTE40810을 포함한 대장균 JM101 형질전환체의 세포 배양액을 SDS-PAGE 및 웨스턴블럿 분석한 결과를 나타내는 전기영동 사진이다.
제14(a)도는 대조군 마우스군의 종양의 크기를 나타내는 사진이다.
제14(b)도는 hEGF-(글리신)4세린-안지오게닌 투여군의 종양괴 크기를 나타내는 사진이다.
이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다.
본 발명의 융합독소단백질은 추적단백질인 hEGF 분자와 리보뉴클레아제 계통의 독소단백질인 안지오게닌 분자가 펩타이드 결합으로 연결되어 있는데, 이러한 펩타이드 결합시 두 분자가 직접 또는 적절한 연결부위(linker)를 사이에 두고 결합하여, 각각이 원래의 3차구조(folding)를 형성하기에 용이한 형태로 결합된 것이다. 즉, 본 발명의 융합독소단백질은 암세포를 추적하는 부분과 암세포를 사멸시키는 부분, 이 두 부분이 각자의 작용을 나타내도록 연결시켜주는 부분을 합하여 3부분으로 구성되며, 추적단백질 부분은 융합단백질을 hEGF 수용체로 타겟팅하여 암세포내로 국재화시키는 작용을 하고, 안지오게닌 부분은 추적단백질 부분에 의해 암세포내로 국재화되어 리보핵산을 분해하여 암세포를 괴사시키는 작용을 하며, 링커부분은 추적단백질과 독소단백질인 안지오게닌이 각각의 3차구조를 유지하도록 두분자를 결합시키는 역할을 하도록 고안되었다.
따라서, 본 발명은 종래 항암 미사일 요법제의 문제점인 독소단백질의 독성, 융합체의 항원성, 융합체의 큰 분자량으로 인한 암세포까지의 운반 곤란성(타겟팅의 저효율) 및 제조상의 화학물질 오염 등의 문제점을 해결한 신규의 융합독소단백질을 제공한다.
즉, 종래 항암물질을 암 부위로의 타겟팅을 위한 융합독소단백질의 경우, 추적단백질로 사용하는 항체 또는 세포독소로 사용하는 미생물 유래 독소의 항원성으로 인하여, 체내 투여후 통상 1주일 이내에 항체가 형성되어 항암치료율이 떨어지고 독성을 나타낸다. 특히, 미생물 유래 독소인 디프테리아 톡신이나 녹농균독소의 경우, 상당수의 환자가 항암 융합독소단백질 투여 이전에 이들에 대한 항체를 가지고 있어, 투여된 항암 융합독소단백질이 제대로 약효를 나타내지 못하게 된다.
반면, 본 발명의 추적단백질과 독소단백질은 둘다 인체에 정상적으로 존재하는 것이기 때문에, 추적단백질이 독소단백질을 운반하여 암세포내로 국재화되었때만 독소단백질이 세포독성을 나타내고, 세포밖에서는 전혀 독성을 나타내지 않는다.
또한, 융합독소단백질이 암세포 부위로 적절히 타겟팅되기 위해서는 융합독소단백질의 크기가 작을수록 암세포로의 전달이 유리한데, 종래의 융합독소단백질들은 모두 50kD 이상의 거대한 분자들이기 때문에, 암세포로의 타겟팅 효율이 낮은 문제점을 가지고 있었지만, 본 발명에서는 6kD 추적단백질(hEGF)과 14.4kD 안지오게닌이 연결된 20.4kD의 융합독소단백질을 제공하므로, 타겟팅 효율이 획기적으로 증대된다.
아울러, 본 발명에서의 융합독소단백질은 화학적 반응이 아닌 유전공학적 방법 즉, 추적단백질과 독소단백질의 각 유전자를 합성하고, 이를 적절한 연결체를 사용하여 또는 직접 결합시킨 다음, 그를 포함하는 발현벡터로 대장균을 형질전환시켜 제조되기 때문에, 화학적 융합시 발생할 수 있는 미량 화학물질의 오염 및 구성 단백질의 변성에 대한 문제점을 해결하였다. 이때, 각 구성 유전자가 1개씩 결합되는 것이 바람직하지만, 이에 한정되지 않고 한 유전자를 1개 이상 결합시키는 것 또한 가능하다. 예를 들면, 각 구성단백질의 융합 분자수 비율은 1 : 0.5~2, 바람직하게는 1 : 1(추적단백질 : 안지오게닌)이다. 연결체는 융합독소단백질의 각 구성 단백질이 그의 활성을 유지하기에 적절한 아미노산의 종류와 갯수로 이루어진 펩타이드, 바람직하게는 0 내지 20개의 아미노산으로 구성된 펩타이드, 보다 바람직하게는 글리신, (글리신)4세린 또는 [(글리신)4세린]2의 펩타이드이다.
상기에서, 추적단백질은 hEGF가 바람직하지만, 이에 한정되지 않고 동물 EGF, TGF, 이들의 유도체 등과 같이 hEGF 수용체와 결합할 수 있는 저분자량의 펩타이드나 단백질이면 어느 것이나 가능하다. 독소단백질은 세포내에서 RNA를 분해할 수 있는 안지오게닌이 바람직하지만, 이에 한정되지 않고 리보뉴클레아제 계통에 속하는 인간 리보핵산분해효소, EDN(eosinophil derived neurotoxin), 이들의 유도체 또한 가능하다. 추적단백질의 N 말단 또는 C 말단에 독소단백질이 결합될 수 있는데, 추적단백질의 C 말단에 독소단백질의 N 말단이 결합되는 것이 바람직하다.
본 발명의 바람직한 추적단백질인 hEGF의 특징을 요약하면, 다음과 같다 :
① 정상세포에는 전혀 무해하고, 암세포 특히 hEGF 수용체가 과량 발현되는 암세포에만 극히 선택적으로 작용한다;
② hEGF 수용체가 과량 발현되는 암종에 대해서는 모두 적용가능하여 적용범위가 넓다;
③ 융합단백질 형태로 세포내로 국재화하기 때문에 독소단백질을 효과적으로 암세포내로 수송한다;
④ 암세포내로 잘 투과될 만큼 충분히 크기가 작다(53개의 아미노산으로 구성된 약 6kD의 단백질); 및,
⑤ 번역후 수식을 받지 않아 유전자 수준에서 독소단백질과 손쉽게 융합 가능하다.
한편, 본 발명의 바람직한 독소단백질인 안지오게닌의 특징을 요약하면, 다음과 같다 :
① 인간 유래 폴리펩타이드이므로 항체 형성을 유도하지 않는다(인간의 정상혈액내 0.4 마이크로그람/밀리리터);
② 세포내에서 tRNase 활성을 나타내므로, 세포내로 국재화되었을 때만 독소역할을 할 수 있다; 및,
③ 다른 미생물 유래 독소(디프테리아 톡신, 수도모나스 엑소톡신)나 식물 유래 독소(Ricin)에 비해 운반에 용이할 만큼 충분히 크기가 작다(123개의 아미노산으로 구성된 14.4kD 단백질).
이와 같은 특징을 갖는 본 발명의 융합독소단백질은 정상세포의 성장에는 영향을 미치지 않으면서, hEGF 수용체를 발현하는 각종 암세포, 예를 들면 방광암, 폐암, 전립선암, 뇌암, 유방암, 피부암 등의 성장을 선택적으로 저해하는 기능을 가지고 있으므로, 전술한 암종의 치료를 위한 항암제로서 유용하다.
본 발명의 융합독소단백질을 유효성분으로 함유하는 항암제는 비경구적으로(예를 들면, 정맥주사, 피하주사, 경피흡수, 직장투약 등) 투약되는 것이 바람직하지만 경구적으로(복용 또는 흡입) 투약되는 것 또한 가능하며, 전기 약제는 사용목적에 따라 정제, 캡슐제, 과립제, 파인 서브틸래(fine subtilae)제, 분제, 설하 정제(sublingual tablet), 좌약제, 연고제, 주사제, 유탁액제, 현탁액제, 약물처리된 시럽제 등 여러 형태로 제조될 수 있다. 상기 여러 형태의 약제는 부형제, 결합제, 붕괴제(disintegrator), 윤활제, 방부제, 항산화제, 등장제(isotonic agent), 완충제, 피막제, 감미제, 용해제, 기제(base), 분산제, 안정제, 착색제 등 상기 제형에 관용되는 약학적으로 허용되는 담체(carrier)를 포함한다.
상기 약학적으로 허용되는 담체의 구체적인 예는 다음과 같다.
부형제로는 녹말 및 녹말 유도체(예를 들면, 덱스트린, 카르복시메틸녹말(carboxymethyl starch) 등), 셀룰로오스 및 셀룰로오스 유도체(예를 들면, 메틸셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스 등), 당(예를 들면, 젖당, 설탕, 포도당 등), 규산(silicic acid) 및 규산염(예를 들면, 천연적으로 존재하는 규산알루미늄, 규산마그네슘 등), 탄산염(예를 들면, 탄산 칼슘, 탄산 마그네슘, 탄산수소나트륨 등), 수산화 알루미늄 마그네슘, 합성 히드로탤사이트(hydrotalcite), 폴리옥시에틸렌 유도체, 글리세린 모노스테아레이트(glycerin monostearate) 또는 솔비탄 모노올레산(sorbitan monooleic acid) 등이 있다.
결합제로는 녹말 및 녹말 유도체(예를 들면, 알파 녹말, 덱스트린 등), 셀룰로오스 및 셀룰로오스 유도체(예를 들면, 에틸셀룰로오스, 소듐 카르복시메틸셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스 등), 아라비아 고무, 트라가칸드 고무, 젤라틴, 당(예를 들면, 포도당, 설탕 등), 에탄올 또는 폴리비닐알코올 등이 있다.
붕해제로는 녹말 및 녹말 유도체(예를 들면, 카르복시메틸녹말, 히드록시프로필녹말 등), 셀룰로오스 및 셀룰로오스 유도체(예를 들면, 소듐 카르복시메틸셀룰로오스, 셀룰로오스 결정, 히드록시프로필메틸셀룰로오스 등), 탄산염(예를 들면, 탄산칼슘, 탄산수소칼슘 등), 트라가칸드 고무, 젤라틴 또는 당 등이 있다.
활탁제로는 스테아르산, 스테아르산칼슘, 스테아르산마그네슘, 활석, 규석 및 규산염(예를 들면, 경질 무수규산, 천연적으로 존재하는 규산알루미늄 등), 산화티탄, 인산수소칼슘, 건조 수산화알루미늄 겔, 맥로골(macrogol) 등이 있다.
방부제로는 p-히드록시벤조산염, 아황산염(예를 들면, 아황산나트륨, 피로아황산 나트륨(sodium pyrosulfites) 등), 인산염(예를 들면, 인산나트륨, 폴리인산칼슘, 폴리인산나트륨, 메타인산나트륨(sodium methaphosphate) 등), 알코올(예를 들면, 클로로부탄올, 벤질알코올 등), 벤즈알코늄클로라이드(benzalkonium chloride), 벤즈에토늄클로라이드(benzethonium chloride), 페놀, 크레졸, 염화크레졸, 디히드로아세트산, 디히드로아세트산나트륨, 글리세린 소르브산(sorbic acid) 또는 당 등이 있다.
항산화제로는 아황산염(예를 들면, 아황산나트륨, 아황산수소나트륨 등), 롱갈라이트(rongalite), 에리토르브산(erythorbic acid), L-아스코르브산, 시스테인, 티오글리세롤(thioglycerol), 부틸히드록시아니졸(buthylhydroxyanisol), 디부틸히드록시톨루엔, 프로필갈산(propylgallic acid), 아스코르빌팔미테이트(ascorbyl palmitate), 또는 dl-α-토코페롤 등이 있다.
등장제로는 염화나트륨, 질산나트륨, 질산칼륨, 덱스트린, 글리세린 또는 포도당 등이 있다.
완충제로는 탄산나트륨, 염산, 붕산 또는 인산염(예를 들면, 인산수소나트륨)등이 있다.
피막제로는 셀룰로오스 유도체(예를 들면, 히드록시프로필셀룰로오스, 셀룰로오스 아세테이트 프탈레이트, 히드록시프로필메틸셀룰로오스 프탈레이트 등), 쉘락(shellac), 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐피리딘(예를 들면, 폴리-2-비닐피리딘, 폴리-2-비닐-5-에틸피리딘 등), 폴리비닐아세틸 디에틸아미노아세테이트, 폴리비닐알코올 프탈레이트, 메타크릴레이트(methacrylate), 메타크릴레이트 공중합체 등이 있다.
감미제로는 당(예를 들면, 포도당, 설탕, 젖당 등), 소듐 사카린 또는 당알코올 등이 있다.
용해제로는 에틸렌디아민, 니코틴아미드, 소듐 사카린, 구연산, 구연산염, 벤조산나트륨, 폴리비닐피롤리돈, 폴리솔베이트(polysolvate), 솔비탄(sorbitan) 지방산 에스테르, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 벤질알코올 등이 있다.
기제로는 지방(예를 들면, 라아드 등), 식물성 기름(예를 들면, 올리브유, 참기름 등), 동물성 기름, 라놀린산(lanolin acid), 광유(petrolatum), 파라핀, 왁스, 수지(resin), 벤토나이트(bentonite), 글리세린, 글리콜유 또는 고급알코올(예를 들면, 스테아릴알코올, 세탄올(cetanol) 등이 있다.
분산제로는 아라비아 고무, 트라가칸드 고무, 셀룰로오스 유도체(예를 들면, 메틸셀룰로오스 등), 스테아르산 폴리에스테르, 솔비탄 세스퀴올레산염(sorbitan sesquioleate), 모노스테아르산알루미늄, 알기산나트륨(sodium alginate), 폴리솔베이트 또는 솔비탄 지방산 에스테르 등이 있다.
안정제로는 아황산염(아황산수소나트륨 등), 질소 또는 이산화탄소 등이 있다.
전기 약물의 제조에 있어서 본 발명의 융합독소단백질의 함량은 약제의 형태에 따라 다르지만, 바람직하게는 0.01 내지 100중량%의 농도로 포함된다.
본 발명 항암제의 투여량은 환자의 체중, 각 질환의 정도 및 의사의 판단 등에 따라 다양하다. 그러나, 일반적으로 주사제로 투여의 경우에는 체중 1kg당 하루에 유효성분 0.01 내지 10mg, 바람직하게는 0.02 내지 2mg이 투여될 수 있고, 주사제 이외의 투여의 경우에는 융합단백질의 혈중농도가 주사제에 준하는 농도가 유지되도록 고려하여 투여될 수 있다.
상술한 일일 투여량은 1회 또는 수회에 나누어 투여할 수 있으며, 질환의 정도 및 의사의 판단에 따라 적절히 조절이 가능하다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 설명하기 위한 것으로, 이들 실시예에 의해 본 발명의 범위가 한정되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자들에게 있어서 자명할 것이다.
[실시예 1]
[hEGF, 인간 안지오게닌을 암호화하는 유전자의 제조]
hEGF 유전자(서열번호 3)를 제조하기 위하여, 서열번호 3의 서열을 포함하고 제1도와 같은 유전자 지도를 갖는 발현벡터 pTE105(참조 : 대한민국 특허 공고 제96-6121호, KCCM 10027)에 부위특이적 돌연변이를 유발시켜 발현벡터 pTED(참조 : 대한민국 특허출원 제96-53539호, KFCC 10925)를 제조하고, 그를 hEGF 유전자원으로 사용하였다.
한편, 인간 안지오게닌 유전자(서열번호 1)를 제조하기 위하여, EcoRI 제한효소 부위를 포함하는 서열번호 5의 염기서열을 갖는 프라이머와 HindIII 제한효소 부위를 포함하는 서열번호 6의 염기서열을 갖는 프라이머를 각각 30피코몰이 되도록 사람의 간 cDNA 라이브러리에 첨가하고, 이를 프리믹스-탑(PremixRM-Top, Cat#K2010, 주식회사바이오니아, 1유니트의 중합효소, 250마이크로몰의 혼합용액, 40마이크로몰의 염화칼륨, 1.5 마이크로몰의 염화마그네슘 및 50밀리몰의 트리스-염산(pH 9.0)으로 구성) 튜브에 넣고, 물을 첨가하여 최종 부피를 20 마이크로리터로 조정하여 잘 혼합하였다. 여기에 30 마이크로리터의 미네랄오일을 첨가하여 용액의 증발을 방지하였다. 중합효소 연쇄반응은 94℃에서 5분, 58℃에서 2분, 72℃에서 30초, 94℃에서 1분의 순서대로 35회 반복시키고, 최종단계에서는 72℃에서 20초간 반응시켜 DNA를 증폭시켰다.
그 결과, 서열번호 1의 인간 안지오게닌 유전자와 EcoRI 및 HindIII 제한효소 부위가 삽입된 약 380bp의 PCR 산물을 획득하였다. 이어, EcoRI과 HindIII 제한효소로 절단하여 PCR 산물을 얻고, pRSETA(Invitrogen, USA)을 제한효소 EcoRI과 HindIII로 절단하여 얻은 2943bp의 큰 DNA 절편과 잘 혼합한 다음, T4 DNA 연결효소 0.5 마이크로리터를 첨가하여 16℃에서 18시간 동안 반응시킴으로써 이들을 접합하였다.
이렇게 접합된 플라스미드를 pRSang이라 명명하고, 대장균 BL21(DE3)을 형질전환시켰다. 제2도는 재조합 벡터 pRSang의 구축과정을 도식적으로 나타낸 그림이다.
[실시예 2]
[인간 안지오게닌의 발현벡터 pTEang의 제조]
안지오게닌 유전자를 OmpA(tac 프로모터) 시스템하에서 발현시키기 위하여, 실시예 1에서 얻은 발현벡터 pTED에 안지오게닌 유전자를 삽입하고자 하였다. 우선, DsaI 제한효소 부위를 포함하는 서열번호 7의 염기서열을 갖는 프라이머와, 안지오게닌의 122번 아미노산 Arg(CGT)를 Arg(CGC)로 변형시키고, 124번에 Gly를 첨가하며, AvaI 제한효소 부위와 PstI 제한효소 부위를 삽입시킨 서열번호 8의 염기서열을 갖는 프라이머를 한쌍으로 이용하고, 재조합 벡터 pRSang를 주형으로 하여 PCR을 수행하였다. 이때, PCR은 pRSang 100 나노그램, 각 프라이머 100 피코몰씩, dNTPs 혼합용액 8 밀리몰(각 2 밀리몰), Mg2+가 포함된 반응용액, PFU(폴리머라제) 1 유니트를 넣고, 물을 가하여 최종 부피 100 마이크로리터로 조정하고 잘 혼합하였다. 그런 다음, 94℃에서 1분, 58℃에서 1분, 72℃에서 70초, 94℃에서 30초의 순서대로 32회 반복시키고, 최종단계에서는 72℃에서 5분간 반응시켜 DNA를 증폭시켰다. 증폭되어진 PCR 산물(약 391bp)를 1% 아가로즈 겔 전기영동하여 분리, 정제한 후, DsaI 제한효소와 PstI 제한효소로 절단하여 재 분리, 정제하였다.
상기의 DsaI/PstI 제한효소로 절단된 PCR 산물(약 391bp)과 DsaI/PstI 제한효소로 절단하여 분리, 정제한 플라스미드 벡터 pTED의 2777bp DNA절편을 잘 혼합한 다음, T4 DNA 연결효소 0.5마이크로리터를 첨가하여 16℃에서 18시간 동안 반응시켜 이들을 접합하였다.
이렇게 접합된 플라스미드를 pTEang이라 명명하고, 대장균 JM101을 형질전환시켰다. 플라스미드 벡터 pTEang에 안지오게닌이 제대로 삽입되었는지를 제한효소 AvaI, SmaI, AlwNI으로 절단하여 확인하였다. 제3도는 재조합 벡터 pTEang의 구축과정을 도식적으로 나타낸 그림이다.
한편, 상기에서 서열번호 7의 염기서열을 갖는 프라이머를 NdeI 제한효소 부위를 포함하는 서열번호 16의 프라이머로 교체하는 것을 제외하고는 동일한 방법에 의해, 봉입체(inclusion body) 형태의 안지오게닌을 대량으로 얻었다.
[실시예 3]
[안지오게닌과 hEGF의 융합유전자를 포함하는 발현벡터 pTE4081의 제조(I)]
안지오게닌과 hEGF의 융합유전자를 제조하기 위하여, 실시예 1에서 얻은 EGF 유전자를 포함하는 플라스미드 pTED, 실시예 2에서 얻은 안지오게닌 유전자를 포함하는 플라스미드 pTEang, 서열번호 9와 서열번호 10의 염기서열을 갖는 연결부위를 조합하여, 안지오게닌과 EGF의 융합유전자를 포함하는 발현벡터 pTE4081을 제조하였다(참조 : 제4도). 제4도는 재조합 벡터 pTE4081의 구축과정을 도식적으로 나타낸 그림이다.
보다 구체적으로 설명하면, EGF 유전자를 포함하는 플라스미드 pTED를 제한효소 BlpI과 PstI으로 절단하고, 1.5% 아가로즈 겔 전기영동하여 분리, 정제한 EGF 유전자 함유의 DNA 절편 149bp를 획득하였고, 한편으로 안지오게닌 유전자를 포함하는 플라스미드 pTEang를 제한효소 AvaI과 PstI으로 절단하고, 0.8% 아가로즈 겔 전기영동하여 분리, 정제한 안지오게닌 유전자 함유의 DNA 절편 약 3156bp를 획득하였다.
연결부위는 서열번호 9의 염기서열을 갖는 올리고머와 서열번호 10의 염기서열을 갖는 올리고머 각 100피코몰에, 각각 10 나노몰 ATP 1.5 마이크로리터, T4 폴리뉴클레오타이드 키나제 15 유니트를 가하고 물을 첨가하여 최종부피 30 마이크로리터로 조정한 후, 37℃에서 1시간, 95℃에서 5분 반응시켜서, 5´말단에 포스페이트를 붙였다. 이 포스페이트가 붙은 각 올리고머들을 혼합하여, 95℃에서 5분 반응시키고 30℃까지 3시간 이상에 걸쳐서 천천히 식혀주어 어닐링시킴으로서, 제한효소 AvaI과 BglII 부위를 갖는 연결부위를 제조하였다.
상기에서 얻은 EGF 유전자 함유의 DNA 절편 149bp, 안지오게닌 유전자 함유의 DNA 절편 약 3156bp와 제한효소 AvaI과 BlpI 부위를 갖는 연결부위를 잘 혼합한 다음, T4 DNA 연결효소 0.5 마이크로리터를 넣고 16℃에서 18시간 동안 반응시켜서 이들을 접합시켰다.
이렇게 접합된 플라스미드 pTE4081로 대장균 JM101을 형질전환시켰다. 플라스미드 벡터 pTE4081에 안지오게닌과 EGF의 융합유전자가 제대로 삽입되었는지를 제한효소 DsaI, AlwNI, NsiI, SmaI으로 절단하여 확인하였다. 최종적으로, 생거(Sanger)의 다이디옥시 뉴클레오티드 서열 분석법을 이용하여(참조 : Molecular cloning a laboratory manual 2nd ed. Sambrook et al., 13.6-13.10), 안지오게닌과 EGF의 융합유전자가 정확히 삽입되었음을 다시 한번 확인하였다.
[실시예 4]
[안지오게닌과 hEGF의 융합유전자를 포함하는 발현벡터 pTE4082의 제조(II)]
안지오게닌과 hEGF의 융합유전자를 제조하기 위하여, 실시예 3에서 얻은 hEGF 유전자 함유의 DNA 절편, 안지오게닌 유전자 함유의 DNA 절편, 서열번호 11과 서열번호 12의 염기서열을 갖는 연결부위를 조합하여, 안지오게닌과 hEGF의 융합유전자를 포함하는 발현벡터 pTE4082를 제조하였다(참조 : 제5도). 제5도는 재조합 pTE4082의 구축과정을 도식적으로 나타낸 그림이다.
발현벡터 pTE4082는 연결부위의 염기서열이 서열번호 11과 서열번호 12인 점을 제외하고는, 실시예 3과 동일한 방법에 의해 구축되었다.
아울러, 융합 유전자의 정확한 삽입도 실시예 5와 동일한 방법에 의해 확인되었다.
[실시예 5]
[안지오게닌과 hEGF의 융합유전자를 포함하는 발현벡터 pTE4083의 제조(III)]
안지오게닌과 hEGF의 융합유전자를 제조하기 위하여, 실시예 1의 플라스미드 pTE105를 제한효소 AflII와 PstI으로 절단하여 얻은 EGF 유전자 함유의 DNA 절편 2929bp, 실시예 2에서 얻은 플라스미드 pTEang를 서열번호 13번과 14번 염기서열을 갖는 각 프라이머에 의한 PCR 증폭시켜 얻은 안지오게닌 유전자 함유의 DNA 절편을 조합하여, 안지오게닌과 hEGF의 융합유전자를 포함하는 발현벡터 pTE4083를 제조하였다(참조 : 제6도). 제6도는 재조합 벡터 pTE4083의 구축과정을 도식적으로 나타낸 그림이다.
보다 구체적으로 설명하면, hEGF 유전자를 포함하는 플라스미드 pTE105를 제한효소 AflII와 PstI으로 절단하고, 0.8% 아가로즈 겔 전기영동하여 hEGF 유전자 함유의 DNA 절편 2929bp를 분리, 정제하였다. 한편으로, AflII 제한효소 부위를 포함하는 서열번호 13의 염기서열을 갖는 프라이머와 PstI 제한효소 부위를 갖는 서열번호 14의 염기서열을 갖는 프라이머를 한쌍으로 이용하고, 안지오게닌 유전자를 포함하는 플라스미드 pTEang를 주형으로 하여 PCR 수행하였다. 이때, PCR은 pTEang 100 나노그램, 각 프라이머 100 피코몰씩, dNTPs 혼합용액 8밀리몰(각 2밀리몰), Mg2+가 포함된 반응용액, PFU(폴리머라제) 1유니트를 넣고, 물을 가하여 최종 부피 100 마이크로리터로 조정하고 잘 혼합하였다. 그런 다음, 94℃에서 1분, 58℃에서 1분, 72℃에서 70초, 94℃에서 30초의 순으로 32회 반복시키고, 최종단계에서는 72℃에서 5분간 반응시켜 DNA를 증폭시켰다. 증폭된 PCR 산물(약 407bp, 안지오게닌 유전자 함유의 DNA 절편)을 1% 아가로즈 겔 전기영동하여 분리, 정제한 후, AflII 제한효소와 PstI 제한효소로 절단하여 재 분리, 정제하였다.
상기의 AflII/PstI 제한효소로 절단된 PCR 산물(약 2929bp, hEGF 유전자 함유의 DNA 절편)과 AflII/PstI 제한효소로 절단하여 분리, 정제한 PCR 산물(약 407bp, 안지오게닌 유전자 함유의 DNA 절편)을 잘 혼합한 다음, T4 DNA 연결효소 0.5 마이크로리터를 첨가하여 16℃에서 18시간 동안 반응시켜 이들을 접합하였다.
이렇게 접합된 플라스미드 pTE4083로 대장균 JM101을 형질전환시켰다. 플라스미드 벡터 pTE4083에 안지오게닌과 hEGF의 융합유전자가 제대로 삽입되었는지를 제한효소 AlwNI, BspMI, AflII, PstI으로 절단하여 확인하였다. 최종적으로, 생거(Snager)의 다이디옥시 뉴클레오티드 서열 분석법을 이용하여, 안지오게닌과 hEGF의 융합유전자가 정확히 삽입되었음을 다시 한번 확인하였다.
상기의 플라스미드 pTE4083로 형질전환된 대장균 JM101을 E. coli JM101-plasmid pTE4083이라 명명하고, 1997년 9월 4일 국제기탁기관인 사단법인 한국종균협회 부설 한국미생물보존센터(KCCM)에 기탁번호 KCCM-10106으로 기탁하였다.
[실시예 6]
[안지오게닌과 hEGF의 융합유전자를 포함하는 발현벡터 pTE4084의 제조(IV)]
안지오게닌과 hEGF의 융합유전자를 포함하는 또 다른 발현벡터 pTE4084는 서열번호 14와 15의 프라이머를 사용하여 안지오게닌 유전자 함유의 DNA 절편(약 410bp)을 증폭시킨다는 점을 제외하고는, 실시예 5와 동일한 방법에 의해 구축되었다(참조 : 제7도). 제7도는 재조합 벡터 pTE4084의 구축과정을 도식적으로 나타낸 그림이다.
아울러, 융합 유전자의 정확한 삽입도 실시예 5와 동일한 방법에 의해 확인하였다.
상기의 플라스미드 pTE4084로 형질전환된 대장균 JM101을 E. coli JM101-plasmid pTE4084라 명명하고, 1997년 9월 4일 국제기탁기관인 사단법인 한국종균협회 부설 한국미생물보존센터(KCCM)에 기탁번호 KCCM-10107로 기탁하였다.
[실시예 7]
[안지오게닌과 hEGF의 융합유전자를 포함하는 발현벡터 pTE4089의 제조(V)]
안지오게닌과 hEGF의 융합유전자를 제조하기 위하여, 실시예 5의 플라스미드 pTE4083를 제한효소 NsiI과 BstEII로 절단하여 얻은 hEGF 및 안지오게닌의 일부를 포함하는 DNA 절편 3001bp와, 전기 플라스미드 pTE4083을 서열번호 25번과 26번 염기서열을 갖는 한쌍의 프라이머로 PCR 증폭시켜 얻은 hEGF 유전자 일부를 포함한 NsiI/BamHI DNA 절편과, 그리고 플라스미드 pTE4083을 서열번호 27번과 14번 염기서열을 갖는 한쌍의 프라이머로 PCR 증폭시켜 얻은 안지오게닌 유전자 일부를 포함한 BamHI/BstEII DNA 절편을 조합하여, hEGF와 안지오게닌의 융합유전자를 포함하는 발현벡터 pTE4089를 제조하였다(참조 : 제8도). 제8도는 재조합 벡터 pTE4089의 구축과정을 도식적으로 나타낸 그림이다.
보다 구체적으로 설명하면, hEGF 및 안지오게닌 유전자를 포함하는 플라스미드 pTE4083를 제한효소 NsiI과 BstEII로 절단하고, 0.8% 아가로즈 겔 전기영동하여 hEGF 및 안지오게닌 유전자 일부를 포함하는 3001bp의 DNA 절편을 분리하였다.
한편으로, NdeI 제한효소 부위를 포함하는 서열번호 25의 염기서열을 갖는 프라이머와 BamHI 제한효소 부위를 포함하는 서열번호 26의 염기서열을 갖는 프라이머를 한쌍으로 이용하고, 전기 플라스미드 pTE4083을 주형으로 하여 PCR 증폭시켜, hEGF 유전자 일부를 포함하는 DNA 절편을 얻었다. 이때, PCR은 pTE4083 100나노그램(1 마이크로리터), 각 프라이머 100 피코몰씩, dNTPs 혼합용액 8밀리몰(각 2밀리몰), Mg2+가 포함된 반응용액, PFU(폴리머라제) 1 유니트를 넣고, 물을 첨가하여 최종 부피 100 마이크로리터로 조정하고 충분히 혼합하였다. 그런 다음, 94℃에서 1분 반응후, 94℃에서 30초, 58℃에서 1분, 72℃에서 2분의 순으로 35회 반복시키고, 최종단계에서는 72℃에서 5분간 반응시켜 DNA를 증폭시켰다.
또한, BamHI 제한효소 부위를 포함하는 서열번호 27의 염기서열을 갖는 프라이머와 PstI 제한효소 부위를 포함하는 서열번호 14의 염기서열을 갖는 프라이머를 한쌍으로 이용하여 상기와 동일한 방법으로 PCR을 수행하여, 안지오게닌 유전자 일부를 포함하는 DNA 절편을 얻었다.
상기에서 증폭된 PCR 산물인 hEGF 절편(약 171bp) 및 안지오게닌 절편(약 400bp)을 1% 아가로즈 겔 전기영동하여 분리·정제하고, BamHI 제한효소로 절단한 다음, hEGF 절편은 NsiI 제한효소로, 안지오게닌 절편은 BstEII 제한효소로 절단하여, 재분리·정제하였다.
상기의 hEGF 및 안지오게닌 유전자를 포함하는 3001bp의 DNA절편, PCR 산물인 hEGF 절편(108bp) 및 안지오게닌 절편(236bp)을 잘 혼합한 다음, T4 DNA 연결효소 0.5 마이크로리터를 첨가하여 16℃에서 18시간 동안 반응시켜 이들을 접합하였다.
이렇게 접합된 플라스미드 pTE4089로 대장균 JM101을 형질전환시켰다. 플라스미드 벡터 pTE4089에 안지오게닌과 hEGF의 융합유전자가 바르게 삽입되었는지를 제한효소 AlwNI, BspMI, BamHI, AflII, PstI으로 절단하고 1% 아가로즈 겔 전기영동하여 확인하였다. 최종적으로, 생거(Sanger)의 다이디옥시 뉴클레오티드 서열 분석법을 이용하여, 안지오게닌과 hEGF의 융합유전자가 정확히 삽입되었음을 다시 한번 확인하였다(참조 : 서열번호 23).
[실시예 8]
[안지오게닌과 hEGF의 융합유전자를 포함하는 발현벡터 pTE40810의 제조(VI)]
안지오게닌과 hEGF의 융합유전자를 포함하는 다른 발현벡터 pTE40810은 서열번호 27의 프라이머 대신에 서열번호 28의 프라이머를 사용하여 안지오게닌 유전자 일부를 함유한 약 415bp의 DNA절편을 증폭시키며, 그를 BamHI/BstEII 제한효소로 절단하여 약 251bp의 DNA절편을 유전자의 조합에 사용한다는 점을 제외하고는, 실시예 7과 동일한 방법에 의해 구축되었다(참조 : 제9도). 제9도는 재조합 벡터 pTE40810의 구축과정을 도식적으로 나타낸 그림이다.
아울러, 융합 유전자의 정확한 삽입도 실시예 7과 동일한 방법에 의해 확인하였다(참조 : 서열번호 24).
[실시예 9]
[안지오게닌-hEGF-안지오게닌의 융합유전자를 포함하는 발현벡터 pTE40815의 제조]
안지오게닌-hEGF-안지오게닌의 융합유전자를 제조하기 위하여, 실시예 4의 플라스미드 pTE4082를 제한효소 PstI과 AflII로 각각 처리한 후, 0.8% 아가로즈 전기영동하여 3313bp의 벡터 절편을 수득하였다. 별도로, 실시예 7의 플라스미드 pTE4089를 제한효소 AflII와 PstI로 각각 처리한 후, 1.2% 아가로즈 전기영동하여, hEGF의 3´말단 아미노산과 링커를 암호화하는 DNA 및 안지오게닌의 DNA를 포함하는 융합유전자 절편(416bp)을 수득하였다.
상기의 안지오게닌과 hEGF의 융합유전자를 포함하는 3313bp의 벡터 절편과, 상기 융합유전자 절편(416bp)을 잘 혼합한 다음, T4 DNA 연결효소 0.5 마이크로리터를 첨가하여 16℃에서 18시간 동안 반응시켜 이들을 접합하였다(참조 : 제10도). 제10도는 재조합 벡터 pTE40815의 구축과정을 도식적으로 나타낸 그림이다.
이렇게 접합된 플라스미드 pTE40815로 대장균 JM101을 형질전환시켰다. 플라스미드 벡터 pTE40815에 안지오게닌-hEGF-안지오게닌의 융합유전자가 바르게 삽입되었는지를 제한효소 AlwNI, BspMI, BamHI, AflII, PstI으로 절단하고 1% 아가로즈 겔 전기영동하여 확인하였다. 최종적으로, 생거(Snager)의 다이디옥시 뉴클레오티드 서열 분석법을 이용하여, 안지오게닌-hEGF-안지오게닌의 융합유전자가 정확히 삽입되었음을 다시 한번 확인하였다(참조 : 서열번호 29).
[실시예 10]
[hEGF-안지오게닌-hEGF의 융합유전자 발현벡터 pTE40816의 제조]
hEGF-안지오게닌-hEGF의 융합유전자를 제조하기 위하여, 실시예 7의 플라스미드 pTE4089를 제한효소 PstI과 BstEII로 각각 처리한 후, 0.8% 아가로즈 전기영동하여 3195bp의 벡터 절편을 수득하였다. 별도로, 실시예 4의 플라스미드 pTE4082를 제한효소 PstI과 BstEII로 각각 처리한 후, 1.2% 아가로즈 전기영동하여 안지오게닌의 3´말단 아미노산과 링커를 암호화하는 DNA 및 hEGF의 DNA를 포함하는 융합유전자 절편(324bp)을 수득하였다.
상기의 hEGF와 안지오게닌의 융합유전자를 포함하는 3195bp의 벡터 절편과, 상기 융합유전자 절편(324bp)을 잘 혼합한 다음, T4 DNA 연결효소 0.5마이크로리터를 첨가하여 16℃에서 18시간 동안 반응시켜 이들을 접합하였다(참조 : 제11도). 제11도는 재조합 벡터 pTE40816의 구축과정을 도식적으로 나타낸 그림이다.
이렇게 접합된 플라스미드 pTE40816으로 대장균 JM101을 형질전환시켰다. 플라스미드 벡터 pTE40816에 hEGF-안지오게닌-hEGF의 융합유전자가 바르게 삽입되었는지를 제한효소 AlwNI, BspMI, BamHI, AflII, PstI으로 절단하고 1% 아가로즈 겔 전기영동하여 확인하였다. 최종적으로, 생거(Snager)의 다이디옥시 뉴클레오티드 서열 분석법을 이용하여, 안지오게닌-hEGF-안지오게닌의 융합유전자가 정확히 삽입되었음을 다시 한번 확인하였다(참조 : 서열번호 30).
[실시예 11]
[대장균 JM101 형질전환체에서의 안지오게닌과 hEGF의 융합단백질 발현]
상기 실시예 3~6 및 실시예 7과 8에서 제조한 발현벡터 pTE4081, pTE4082, pTE4083, pTE4084, pTE4089, pTE40810로 형질전환된 대장균 JM101을 3밀리리터 테트라사이클린-LB배지에 접종하여 37℃에서 18시간 동안 배양하고, 이 배양액 2밀리리터를 100밀리리터 테트라사이클린-LB배지에 다시 접종하여 37℃에서 배양하다가, 600nm에서 흡광도가 0.7~1.0일 때 최종농도가 1밀리몰이 되도록 이소프로필 β-D-티오갈락토피라노시드(IPTG, Sigma Chemical Co., USA)를 첨가하여 융합단백질의 발현을 유도하였다.
IPTG를 첨가한 후 20시간 더 배양한 다음, 배양액을 수거하고 4℃에서 7,000g로 15분 동안 원심분리하여 상층액만을 모은 뒤, SDS-PAGE하고 나아가 항-hEGF 항체 또는 항-안지오게닌 항체를 이용한 웨스턴블럿 분석을 실시하였다(참조 : 제12(a)도 및 제12(b)도, 제13(a)도 및 제13(b)도).
제12(a)도는 pTE4081, pTE4082, pTE4083 또는 pTE4084를 포함한 대장균 JM101 형질전환체의 세포 배양액을 SDS-PAGE한 결과를 나타내고, 제12(b)도는 항-hEGF 항체를 이용하여 제12(a)도의 SDS-PAGE를 웨스턴블럿 분석한 결과를 나타낸다.
제12(a)도 및 제12(b)도에서, 제1레인은 분자량 마커, 제2레인은 발현 벡터 pTE4081로 형질전환된 대장균 JM101의 배양 상층액, 제3레인은 발현벡터 pTE4082로 형질전환된 대장균 JM101의 배양 상층액, 제4레인은 발현벡터 pTE4083로 형질전환된 대장균 JM101의 배양 상층액, 제5레인은 발현벡터 pTE4084로 형질전환된 대장균 JM101의 배양 상층액을 각각 나타낸다.
제13(a)도는 pTE4089를 포함한 대장균 JM101 형질전환체의 세포 배양액을 SDS-PAGE 및 웨스턴블럿 분석한 결과를 나타내고, 제13(b)도는 pTE40810을 포함한 대장균 JM101 형질전환체의 세포 배양액을 SDS-PAGE 및 웨스턴블럿 분석한 결과를 나타낸다. 제13(a)도에서, 제M레인은 분자량 마커, 제a레인은 IPTG 유도후의 형질전환체의 배양 상층액을 SDS-PAGE한 결과이고; 제b레인은 항-hEGF 항체를 이용한 SDS-PAGE의 웨스턴블럿 분석한 결과이며; 및, 제c레인은 항-안지오게닌 항체를 이용한 SDS-PAGE의 웨스턴블럿 분석한 결과이다. 제13(b)도에서, 제M레인은 분자량 마커, 제a레인은 IPTG 유도전의 형질전환체의 배양 상층액을 SDS-PAGE한 결과이며, 제b레인은 IPTG 유도후의 형질전환체의 배양 상층액을 SDS-PAGE한 결과이고; 제c레인 및 제d레인은 항-hEGF 항체를 이용한 SDS-PAGE의 웨스턴블럿 분석한 결과이며; 및, 제e레인 및 제f레인은 항-안지오게닌 항체를 이용한 SDS-PAGE의 웨스턴블럿 분석한 결과이다.
제12(a)도 및 제12(b)도, 제13(a)도 및 제13(b)도에서 보듯이, 안지오게닌(서열번호 2)과 hEGF(서열번호 4)의 융합단백질이 대량으로 발현됨을 알 수 있었다.
아울러, 이러한 결과로부터 상기 실시예 9 및 10에서 제조한 발현벡터 pTE40815 및 pTE40816으로 형질전환된 대장균 JM101에서도 안지오게닌과 hEGF의 융합단백질이 충분히 발현될 것으로 예상되었다.
[실시예 12]
[융합단백질의 정제 및 아미노산 서열의 결정]
실시예 11에서 8가지 발현벡터로 형질전환된 융합단백질 발현균주를 LB배지에 접종하고, OD600가 약 1.0될때까지 37℃에서 배양한 후, 1mM IPTG로 발현을 유도하여 20시간 배양한 다음, 배양액을 수거하여 원심분리하고 세포 펠렛(cell pellet)을 얻어 라이소자임 또는 삼투압충격법으로 단백질을 유리시켰다. 얻어진 단백질을 14% SDS-PAGE로 분리한 후, 웨스턴 블럿으로 활성을 나타내는 부분을 확인하고, 그에 상당하는 SDS-PAGE 겔 부분(PVDF membrane)을 면도칼로 잘라내어, 용출키트로 단백질을 용출시켜 아미노산 서열 분석의 시료로 사용하였다. 즉, 아미노산 서열분석은 전기영동한 겔을 PVDF 막(membrane)으로 옮긴 후, 폰슈 에스(Ponseau S)로 염색하여 융합단백질 부분을 면도칼로 오려내어 융합단백질을 용출시킨 후 아미노산 자동서열 분석기에 적용하여 표준작동방법에 의해 분석하였다.
이렇게 분석한 융합단백질의 아미노산 서열은 서열번호 17~20, 21~22 및 31~32에 나타내었다. 서열번호 17은 발현벡터 pTE4081에서 발현된 융합단백질인 안지오게닌-글리신-EGF의 아미노산 서열이고, 서열번호 18은 발현벡터 pTE4082에서 발현된 융합단백질인 안지오게닌-(글리신)4세린-EGF의 아미노산 서열이며, 서열번호 19는 발현벡터 pTE4083에서 발현된 융합단백질인 EGF-안지오게닌의 아미노산 서열이고, 서열번호 20은 발현벡터 pTE4084에서 발현된 융합단백질인 EGF-글리신-안지오게닌의 아미노산 서열이며, 서열번호 21은 발현벡터 pTE4089에서 발현된 융합단백질인 EGF-(글리신)4세린-안지오게닌의 아미노산 서열이고, 서열번호 22는 발현벡터 pTE40810에서 발현된 융합단백질인 EGF-[(글리신)4세린]2-안지오게닌의 아미노산 서열이며, 서열번호 31은 발현벡터 pTE40815에서 발현된 융합단백질인 안지오게닌-(글리신)4세린-EGF-(글리신)4세린-안지오게닌의 아미노산 서열이고, 서열번호 32는 발현벡터 pTE40816에서 발현된 융합단백질인 EGF-(글리신)4세린-안지오게닌-(글리신)4세린-EGF의 아미노산 서열을 각각 나타낸다.
또한, EGF-(글리신)4세린-안지오게닌을 포함하는 시료는 헤파린-세파로즈 칼럼 크로마토그래피(heparin-sepharose CL-4B, Pharmacia Biotech. Inc., USA)를 수행하여 헤파린에 결합된 단백질을 1몰 염화나트륨 함유 인산 완충액으로 유리하고, 이렇게 얻은 분획을 디이에이이-세파덱스(DEAE-Sephadex A-25, Pharmacia Biotech. Inc., USA) 칼럼 크로마토그래피하여 레진에 결합된 단백질을 0.4~0.7몰 염화나트륨 함유 인산완충액으로 유리시켜 추가 정제한 후, 하기 실시예들의 활성 측정을 위한 시료로 사용하였다.
[실시예 13]
[발현된 융합단백질의 수용체 결합 활성]
세포표면에 과량 발현된 EGF 수용체를 갖고 있는 A431 세포(ATCC; CRL-1555)에 일정한 농도의125I-표지 EGF와 시료 혹은 표준품을 함께 첨가하여, 경쟁적으로 수용체에 결합되는 정도를 측정하였다. 즉, A431 세포를 4×104세포/ml 농도로 24공(well) 플레이트에 분주하고 컨플루언트(confluent)하게 배양한 후, 10% 포름알데히드로 고정하였다. 이어,125I-표지 EGF와 시료를 각공당 20㎕씩을 첨가하여 EGF를 경쟁적으로 수용체에 결합시킨 후, 결합하지 않은 EGF를 세척해 내고 세포를 탈리시켜 세포에 결합한 방사능 량을 γ-카운터로 측정하였다. 결합정도인 cpm값을 % 결합능으로 환산하고, 표준품의 농도와 % 결합능으로 표시되는 표준곡선을 구하였다. 이 표준곡선에 시료의 % 결합능 값을 대입하여 시료의 수용체 결합활성을 결정하였으며, EGF 자체의 결합활성과 비교하였다(참조 : 표 1).
Figure kpo00002
상기 표 1에서 보듯이, 본 발명에서 제조된 융합독소단백질의 hEGF 수용체 결합능력은 90% 이상으로 EGF에 비해 큰 차이가 없음을 알 수 있었다.
[실시예 14]
[발현된 융합단백질의 RNase 활성]
120mM HEPES, 120mM NaCl, 0.004% BSA를 함유하는 반응 완충용액과 동일 부피의 효모 t-RNA의 혼합액 50㎕에 시료 50㎕을 혼합한 후, 37℃에서 2시간 반응시키고 동일부피의 6% 과염소산으로 반응을 중단시켰다. 이어, 10분간 원심분리한 상층액에 대해 260nm에서 흡광도를 측정하였다. 이로부터 표준곡선을 작성하여 시료의 RNase 활성을 측정하고, 안지오게닌 활성과 비교하였다(참조 : 표 2).
Figure kpo00003
상기 표 2에서 보듯이, 본 발명에서 제조된 융합독소단백질의 RNase 활성은 결합링커의 길이가 길수록 안지오게닌 본래의 RNase 활성이 유지되는 것을 알 수 있었다.
[실시예 15]
[융합독소단백질의 암세포에 대한 세포독성(실험실적 조건)]
실험실적 조건(in vitro)에서의 융합단백질의 활성을 평가하기 위해, 유방암 세포주인 MCF-7(ATCC; HTB22)은 10% FBS를 포함한 DMEM에 배양하였다. 배양세포를 각공당 1×104세포의 농도로 96공 플레이트에서 1일 추가배양한 후, 표준물질과 시료, 비교물질인 5-플로로우라실(Fluorouracil)을 포함하는 무혈청배지로 교체하여 2일간 배양하고, MTT(3-(3,4-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)로 세포생존률을 측정하여 세포에 대한 IC50을 계산하였다(참조 : 표 3).
Figure kpo00004
상기 표 3에서 보듯이, 본 발명에서 제조된 융합독소단백질은 암세포를 매우 효과적으로 치사시킴을 알 수 있었다.
[실시예 16]
[발현된 융합독소단백질의 독성]
실험실적 조건(in vitro)에서의 세포독성을 평가하기 위해, hEGF 수용체가 발현되지 않는 세포주인 CHO K-1(ATCC; CCL61)을 10% FBS를 포함한 F-12배지에 배양하였다. 배양세포를 각공당 1×104세포의 농도로 96공 플레이트에서 1일 추가배양한 후, 표준물질과 시료를 포함하는 무혈청배지로 교체하여 2일간 배양하고, MTT로 세포생존률을 측정하였다(참조 : 표 4).
Figure kpo00005
상기 표 4에서 보듯이, 본 발명에서 제조된 융합독소단백질은 hEGF 수용체를 과량 발현하지 않는 정상세포에 대해 매우 안정적임을 알 수 있었다.
[실시예 17]
[융합독소단백질에 대한 생체내(in vivo)에서의 항암효과]
생체내 조건(in vitro)에서의 융합단백질의 활성을 평가하기 위해, 면역 결핍마우스(체중 20~25g의 누드 마우스(nude mouse))의 복부피하에 A431 배양세포를 2×107(0.2ml)씩 이식하였다. 적당한 크기의 종양괴가 형성되면, 무균조작하에서 마우스로부터 종양을 적출하여 2~3mm의 균일한 조각으로 만든 후 트로카(troca)를 이용해 피하에 이식하였다. 이 종양을 이식한 누드 마우스에서 종양괴의 면적이 약 80 밀리리터에 달하면, 마우스를 1군당 6마리로 나누어서, 상기 실시예에서 제조된 융합독소단백질과 안지오게닌 등을 안지오게닌 양으로서 100마이크로그람/체중 킬로그람씩 3일 간격으로 4주간 정맥투여하여 종양괴 크기의 변화를 관찰하였다. 최종투여후 종양괴의 면적을 버어니어캘리퍼스로 측정하였고, 최종적으로 4주후 암세포를 절제하여 종양괴의 무게를 측정하였다(참조 : 하기 표 5). 제14(a)도는 융합독소단백질이나 안지오게닌 대신에 PBS(phosphate buffered saline)를 정맥투여한 마우스(대조군)의 종양괴 크기를 나타내는 사진이고, 제14(b)도는 hEGF-(글리신)4세린-안지오게닌 투여군의 종양괴 크기를 나타내는 사진이다.
Figure kpo00006
상기 표 5에서 보듯이, 본 발명의 융합독소단백질을 투여받은 마우스군은 종양괴의 성장이 안지오게닌만을 투여받은 마우스군보다 현저히 억제됨을 알 수 있었다. 아울러, 실험기간동안 별다른 부작용 증례나 사망예는 관찰되지 않았고, 종양괴의 성장억제작용이 육안으로도 관찰되었다.
[급성독성 검사]
본 발명의 융합독소단백질의 낮은 독성을 확인하기 위하여, 다음과 같은 방법으로 급성독성 검사를 실시하였다.
방법 : 상기 실시예에서 제조된 융합독소단백질(EGF-(글리신)4세린-안지오게닌)을 수컷의 생쥐(ICR mouse, 체중은 20~25g이고, 한 군 당 5마리의 쥐를 대상으로 하였다)에 0.1 내지 100mg/kg의 투여량으로 복강내 투여하였다. 그런 다음, 전기 쥐를 케이지에 가두고, 일반적인 증상을 관찰하며 7일후 죽은 쥐의 수를 측정하였을때, 100mg/kg 투여군에서만 1마리 사망하여 7일째 50% 치사량(LD50: mg/kg)을 결정할 수 없었다.
그 결과, 본 발명의 융합독소단백질의 LD50은 100mg/kg 이상으로 나타났는바, 본 발명의 융합독소단백질은 매우 낮은 독성을 가짐을 명백히 알 수 있었다.
이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명의 융합독소단백질을 이루는 각 구성단백질 모두는 인체 유래의 단백질로서 항체를 형성하지 않아 면역독성이 없으며, 또한 각 구성단백질 자체만으로는 암세포에 대한 활성이 거의 없으나, 이들이 융합된 단백질은 분자량이 작으면서도 암세포에만 IC50에서 1000배 이상의 차이로 선택적으로 작용하여 암세포만을 괴사시킬 수 있기 때문에, 종래의 항암제에 비해 독성이 전혀 없이 hEGF 수용체를 과량 발현하는 암을 치료할 수 있다.
Figure kpo00007
Figure kpo00008
Figure kpo00009
Figure kpo00010
Figure kpo00011
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Figure kpo00022
Figure kpo00023
Figure kpo00024
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Figure kpo00027
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Figure kpo00029
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Figure kpo00033
Figure kpo00034
Figure kpo00035
Figure kpo00036
Figure kpo00037

Claims (14)

  1. 인간 상피세포 성장인자(human epidermal growth factor, hEGF), 인간 안지오게닌 및 0 내지 20개의 아미노산으로 구성된 전기 두 단백질의 연결체(linker)로 이루어진 융합단백질.
  2. 제1항에 있어서, 융합단백질은 인간 상피세포 성장인자의 C 말단에 인간 안지오게닌의 N 말단이 결합된 형태인 것을 특징으로 하는 융합단백질.
  3. 제1항에 있어서, 인간 상피세포 성장인자와 인간 안지오게닌의 융합 분자수 비율은 1 : 0.5~2인 것을 특징으로 하는 융합단백질.
  4. 제1항에 있어서, 연결체(linker)는 글리신, (글리신)4세린 및 [(글리신)4세린]2으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 융합단백질.
  5. 제1항에 있어서, 융합단백질의 아미노산 서열은 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 31 및 서열번호 32로 표시되는 아미노산 서열로 구성된 그룹으로부터 선택되는 1종인 것을 특징으로 하는 융합단백질.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 융합단백질을 암호화하는 유전자.
  7. 제6항에 있어서, 유전자 서열은 서열번호 23, 서열번호 24, 서열번호 29 및 서열번호 30으로 표시되는 염기서열로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 유전자.
  8. 제6항의 유전자를 포함하는 발현벡터.
  9. 제8항에 있어서, 발현벡터는 pTE4081, pTE4082, pTE4083, pTE4084, pTE4089, pTE40810, pTE40815 및 pTE40816으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 1종인 것을 특징으로 하는 발현벡터.
  10. 제8항의 발현벡터로 형질전환된 미생물.
  11. 제10항에 있어서, 형질전환된 미생물은 E. coli JM101-plasmid pTE4083(KCCM-10106) 또는 E. coli JM101-plasmid pTE4084(KCCM-10107)인 것을 특징으로 하는 미생물.
  12. 제10항의 형질전환된 미생물을 배양하여 융합단백질의 발현을 유도한 다음, 발현된 재조합 융합단백질을 수득하는 공정을 포함하는 융합단백질의 제조방법.
  13. 제12항의 방법으로 제조된 융합단백질.
  14. 제1항 내지 제5항중 어느 한 항 또는 제13항의 융합단백질을 유효성분으로 하고, 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 항암제.
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