KR101323845B1 - 외막소포체를 유효성분으로 포함하는 항암용 약제학적 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 (a) 외막 단백질(outer membrane proteins, OMPs); (b) 상기 외막 단백질에 결합된 암-타겟팅 리간드; 및 (c) 항암제를 포함하는 암 치료용 외막소포체(outer membrane vesicles, OMVs) 및 이를 유효성분으로 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 외막소포체를 통한 항암제 전달 시스템은 종래의 리포좀-매개된 방법과 비교하여 보다 효율적으로 항암제를 세포 내로 운반할 수 있으며, 매우 편리하게 대량 생산이 가능하기 때문에 저렴한 생산비용을 요구한다. 따라서, 본 발명의 외막소포체를 이용한 조성물은 종래의 암 치료용 방법(예컨대, 리포좀-매개된 약물전달시스템)과 비교하여 보다 효율적이고 특이적으로 암 치료에 적용할 수 있다.

Description

외막소포체를 유효성분으로 포함하는 항암용 약제학적 조성물{Pharmaceutical Compositions for Treatment of Cancer Comprising Outer Membrane Vesicles as an Active Ingredient}
본 발명은 암-타겟팅 리간드를 포함하는 외막소포체(outer membrane vesicles, OMVs) 및 이의 용도에 관한 것이다.
암, 종양, 종양-관계된 질환들 및 종양성 질환은 매우 심각하여 종종 삶을 위협하는 상태를 유발한다. 빠른-증식성 세포 성장으로 특징지워지는 상술한 질병들의 치료에 효과적인 치료제의 동정하기 위한 수많은 연구들이 진행되어 왔다. 상기 치료제는 환자의 생존을 연장시키고 종양성과 연관된 빠른-증식성 세포 성장을 억제하며 종양성의 퇴행에 효과적이다. 일반적으로, 외과적 수술 및 방사선 치료법이 암의 치료를 위해 일차적으로 실시되며, 생존율이 낮을 지라도 특정 암에 대한 화학치료법은 암의 치료에 효과적이다.
현재, 화학치료법, 방사선치료법 및 면역치료법을 포함하는 대부분의 암 치료법은 암 세포에서 간접적으로 아팝토시스를 유도함으로써 기능한다. 정상적인 아팝토틱 기작의 결점으로 인해 아팝토시스를 실행하지 않는 암 세포의 무능력은 화학치료법, 방사선치료법 또는 면역치료법-유도된 아팝토시스에 대한 저항성의 증가와 연관되어 있다. 아팝토시스 결점으로 인하여 최근 치료 프로토콜에 대한 다른 기원의 인간 암의 일차적인 또는 획득된 저항성이 암 치료법에서 주된 문제이다(Lowe, et al., Carcinogenesis, 21: 485(2000); Nicholson, Nature, 407: 810(2000)).
보다 효과적인 암 치료를 개선하기 위한 시도로, 단일클론항체의 특이적 타겟팅을 통한 치료법이 1970년대에 개발되었다. 현재, 최소한 15종 이상의 단일클론항체가 인간을 위한 용도로 승인되어 있다. 세포-특이적 마커와의 상호작용에 기반한 항체는 여러 가지 기작에 따라 직접적인 세포독성을 나타낼 수 있는데, 예를 들어, 성장인자 수용체들의 차단(Baselga, J. and Mendelsohn, J. Pharmacol. Ther., 64: 127154(1994)), 아팝토시스의 유도(Trauth, B. C., et al., Science, 245: 301305(1989)), 항-이디오타입 항체의 형성(Fagerberg, J., et al., Cancer Immunol. Immunother., 38: 149159(1994)) 또는 항체-의존성 세포독성(antibody-dependent cellular cytotoxicity, ADCC; Steplewski, Z., et al., Science, 221: 865867(1983)) 및 보체-매개된 세포독성(complement-dependent cytotoxicity, CDC; Ballare, C., et al., Cancer Immunol. Immunother., 41: 1522(1995)) 같은 간접적인 효과 등을 포함한다. 한편, 항체에 의해 유도된 세포독성은 불충분한 경우가 많아 다양한 독성물질들[예컨대, 방사선 동위원소 및 화학치료제(chemotherpeutic drugs)]과 함께 사용하여 치료효능을 증대시킨다. 최근에, 약 20-30%의 유방암에서 과다발현되는 인간 표피성장인자 수용체 2(human epidermal growth factor 2, HER2/neu)를 타겟팅하는 인간화된 단일클론항체인 트라스투주맙(trastuzumab, Herceptin)이 유방암 치료법에 이용되고 있다(WO 2006/098978 A1; WO 2009/042618 A1). 하지만, 유방암 치료제로서 트라스투주맙은 승인을 받았음에도 불구하고 많은 부작용을 초래한다. 예를 들어, 열, 구역질, 구토, 주입 반응, 설사, 감염, 증가된 감기, 두통, 피로, 호흡곤란, 발진, 호중성 백혈구 감소, 빈혈 및 근육통 등이 대표적인 부작용이다.
비록 단일클론항체가 종양 타겟팅을 위한 매우 매력적인 특성을 제공할 지라도, 단일클론항체는 고비용, 다양한 부작용 및 제한적인 효과를 나타낼 뿐 아니라, 큰 크기로 인하여 혈액 내 제거의 어려움, 간 유입 및 낮은 조직 침투율을 나타내는 단점을 가진다. 이를 극복하기 위해, F(ab), 디아바디(diabody), scFv, Fv 및 다양한 단일 도메인 항체 같은 항체 단편들을 이용하는 방법들이 개발되었다. 이러한 항체 단편을 이용한 접근방법은 몇 가지 제한점을 가지지만 매우 유용하다. 가수분해 및 수명(shelf-life) 같은 안정성 문제를 해결하기 위해, 트리넥틴(trinectins), 안티칼린(anticalins) 및 애피바디(affibody) 리간드 같은 다른 단백질 스캐폴드에 기반된 노력들이 시도되고 있다.
한편, 백신 운반 시스템으로서 많이 이용되는 것이 바이러스 리포좀을 이용하는 방법이다. 바이러스 리포좀은 특정 타겟으로 핵산을 운반하도록 지시하는 동시에 체액 및 세포질 소기관 내에 존재하는 핵산-분해 효소에 대한 보호 기능을 할 수 있다. 종양 항원은 종양세포와 정반대인 반 정상 세포의 백그라운드에서 발현된다. 핵산 백신화는 암 백신 디자인의 유용한 수단일 수 있는 항원 발현의 분자적인 면역-생리학적 조작 가능성을 제공한다. 외래 DNA 분자를 리포좀으로 성공적으로 세포 내로 운반한 예는 Nicolau 및 Sene, Biochim. Biophys. Acta, 721:185-190(1982) 및 Nicolau et al., Methods Enzymol., 149:157-176(1987)에 개시되어 있다. 한편, 리포좀을 이용한 동물세포의 형질전환에 가장 많이 이용되는 시약으로는 Lipofectamine(Gibco BRL)이 있다. 또한, 리포좀 내에 항암제를 넣어서 암세포에 전달하는 방법이 이용되고 있다. 하지만, 리포좀을 이용한 항암제의 운반은 항암제의 누출을 초래할 가능성이 매우 큰 단점이 있다.
그람-음성 박테리아의 외막은 매우 역동적이고 성장 중에 소포체(vesicles)을 생산하여 주변 환경으로 배출시킨다. 블렙스(blebs)라고도 불리는 외막소포체(outer membrane vesicles, OMVs)는 많은 외막단백질 및 리포폴리사카라이드를 포함하여 항원성 프로파일(antigenic profile)에 기여한다. 이러한 외막소포체의 항원성은 인간 및 동물의 면역반응을 유발하여 그람-음성 박테리아에 의해 유발되는 질병[예컨대, 네이세리아 메닌기티이스(Neisseria meningitidis)에 의해 유발되는 수막구균성 뇌수막염(meningococcal meningitis)]의 치료에 유용하였다. 하지만, 종래의 캡슐형 폴리사카라이드-기반된 백신의 단점을 효과적으로 극복하기 위한 상기 외막소포체-기반된 백신에 대한 수많은 시도들은 보다 넓은 스펙트럼의 박테리아 감염성 질환을 치료하는 데 중점을 두고 있는 실정이다.
상술한 바와 같이, 종래의 암 치료법은 독성 및 한계점을 가지기 때문에 보다 효과적인 암 치료수단을 개발하는 것이 시급히 요구되고 있는 실정이다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 암 세포에 특이적으로 항암제를 전달할 수 있는 신규한 방법을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 그람-음성 박테리아로부터 유래한 외막소포체(outer membrane vesicles, OMVs)의 표면에 암-타겟팅 리간드를 제시(presentation)시켜 암 세포를 특이적으로 인지할 수 있는 외막소포체를 제조하고, 이를 이용한 항암제 운반 시스템을 개발하여 보다 효율적이고 특이적으로 암 치료에 적용할 수 있다는 것을 발견함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 암 치료용 외막소포체(outer membrane vesicles, OMVs)를 제공한다.
본 발명의 다른 목적은 항암용 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 암-타겟팅용 재조합 벡터를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 항암제를 세포에 운반하는 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 외막 단백질(outer membrane proteins, OMPs); (b) 상기 외막 단백질에 결합된 암-타겟팅 리간드; 및 (c) 항암제를 포함하는 암 치료용 외막소포체(outer membrane vesicles, OMVs)를 제공한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 상기 외막소포체의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 항암용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a)(ⅰ) 박테리아의 사이토라이신 A(Cly A); 및 (ⅱ) 상기 외막 단백질과 결합된 애피바디(affibody)로 이루어진 융합단백질; 및 (b) 상기 융합단백질에 작동적으로 연결된(operatively linked) 프로모터 서열을 포함하는 암-타겟팅용 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 항암제를 포함하는 상술한 외막소포체를 세포에 접촉시키는 단계를 포함하는 항암제를 세포에 운반하는 방법을 제공한다.
본 발명자들은 암 세포에 특이적으로 항암제를 전달할 수 있는 신규한 방법을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 그람-음성 박테리아로부터 유래한 외막소포체의 표면에 암-타겟팅 리간드를 제시시켜 암 세포를 특이적으로 인지할 수 있는 외막소포체를 제조하고, 이를 이용한 항암제 운반 시스템을 개발하여 보다 효율적이고 특이적으로 암 치료에 적용할 수 있다는 것을 발견하였다.
암은 세포들이 정상 한계를 넘은 분열을 통해 비조절성 성장을 보이고 주변 조직으로 확장하여 파괴하는 침투(invasion)를 나타내며, 림프 또는 혈액을 통해 몸의 다른 부위로 암세포가 퍼지는 전이를 야기하는 질환이다. 이러한 암의 악성적인 특징들은 자가-제한적이고 침투 또는 전이하지 않는 양성 종양과 암을 구분짓는다.
약 90-95%의 암은 환경적인 요인(environmental factors)에 의해 발병하고 5-10% 정도만이 유전에 의해 발생한다. 일반적으로, 암을 유발하는 환경적인 요인은 다음과 같다: 담배(25-30%), 식사 및 비만(30-35%), 감염(15-20%), 방사선, 스트레스, 운동 부족 및 환경적 오염물. 상기 환경적인 요인은 세포의 유전물질에서 비정상성을 야기하거나 또는 증가시킨다. 암의 존재는 증상에 기반하거나 또는 방사선을 통해 의심될 수 있다. 하지만, 암의 확실한 진단은 생검검체(biopsy specimen)의 현미경 분석을 필요로 한다. 따라서, 암 환자의 생존 및 삶의 질을 개선하기 위해 타겟-특이적인 항암 치료용 신규 물질의 디자인 및 개발이 시급히 요구되고 있다.
본 발명은 항암 치료용 신규한 백신 플랫폼, 바람직하게는 외막소포체(outer membrane vesicles, OMVs)-기반된 항암용 약제학적 조성물을 제공한다.
외막소포체(OMVs)는 전형적으로 50-250 nm의 직경을 가지는 구형 이중층 소포체이다. 외막소포체는 그람-음성 박테리아에 의해 특징적으로 생산된다(Beveridge, 1999). 외막소포체를 생산하는 박테리아 종의 예는 에스체리키아(Escherichia), 세라티아(Serratia), 네이세리아(Neisseria), 해모필러스(Haemophilus), 살모넬라(Salmonella), 시겔라(Shigella), 레기오넬라(Legionella), 부콜데리아(Burkholderia), 헬리코박터(Helicobacter), 프로테우스(Proteus) 또는 슈도모나스(Pseudomonas)를 포함한다. 외막소포체는 세포 성장 동안 박테리아 표면에서 끊임없이 분리되고 그 종류가 매우 다양하지만, 일반적으로 리포폴리사카라이드(LPS), 세포막간 단백질(periplasmic proteins), 외막단백질(outer membrane proteins, OMPs), 인지질, DNA, DNA-결합 단백질 및 병원성 인자들(예컨대, 알칼린 포스파타제, 포스포리파제 C(PLC), 엑소톡신 A, DNase, 헤몰라이신, 프로엘라스타제, 프로테아제 및 펩티도글라이칸 하이드롤라제, 등)을 포함한다.
상술한 외막소포체의 많은 구성성분들은 강력한 항원으로서 기능할 수 있다. 외막소포체는 세포막간 효소 운반, DNA 운반, 박테리아 부착(adherence) 및 면역시스템의 회피를 포함하는 여러 가지 병원성 기작에 중요한 기능을 하는 것을 제안되었다(Horstman & Kuehn, 2000). 또한, 몇몇 연구들은 네이세리아 고노호에(Neisseria gonorrhoeae) 및 해모필러스 인플루엔자(Haemophilus influenza)에 의해 배출된 소포체들이 성장하는 균주로부터 DNA를 배출하여 수용체 세포에 DNA를 전달할 수 있다는 것을 규명하였으며, 에스체리키아 콜라이 O157:H7이 핵산 및 시가 톡신을 포함하는 외막소포체를 배출하는 것으로 밝혔다(Kolling and Matthews, 1999). 이 외에도, 그람-음성 박테리아으로부터 배출된 외막소포체는 박테리아의 병원성에 필요한 많은 병원성 인자들을 타겟 조직 주변의 환경에 배출하여 박테리아 부착 및 침투를 촉진시키며, 다른 박테리아에 직접적인 효과를 나타낸다.
또한, 박테리아 외막소포체(bacterial OMVs)는 표면-발현된 인자들을 통해 진핵세포 및 다른 박테리아와 상호작용하고 병원성 인자들의 운반을 매개하는 것으로 알려져 있다(Ketsy and Kuehn, 2004). 예를 들어, 장독소형대장균(ETEC, enterotoxigenic E. coli) 소포체의 표면에 LPS와 연결된 열-민감성 엔테로록신(LT)은 작은 구멍(caveolae)를 통해 내재화를 유발하고 진핵세포를 감염시키는 촉매-활성 LT를 운반한다(Horstman &. Kuehn, 2000).
본 발명은 상술한 외막소포체-매개된 운반 시스템을 암 치료에 이용한다. 본 발명의 외막소포체는 (a) 외막 단백질(outer membrane proteins, OMPs); (b) 상기 외막 단백질에 결합된 암-타겟팅 리간드; 및 (c) 항암제를 포함한다.
본 명세서의 용어 “외막소포체”는 양친매성 이중막을 포함하는 구형 지질 구조를 가지는 소포체를 의미하며, 바람직하게는 그람-음성 박테리아로부터 유래한다. 본 발명의 외막소포체는 다양한 생활성 제제(bioactive agents; 예를 들어, 항암제)를 포함할 수 있다. 또한, 상기 양친매성 이중막은 지질 이중막을 포함한다.
본 발명의 외막소포체는 다음과 같은 장점을 가진다: (a) 작은 사이즈(예컨대, 20-250 nm); (b) 견고한 막 구조(예컨대, 리포좀과 달리 누출의 가능성이 낮음); (c) 효과적인 항암제의 로딩(예컨대, 외막소포체와 항암제의 공동 혼합을 통해 자연스럽게 외막소포체 내로 항암제의 로딩); (d) 대량생산의 용이성 및 저렴한 생산비용(예컨대, 박테리아 배양을 통해 분리/농축이 간편함); 및 (e) 보관의 용이성(예컨대, 동결건조를 통해 보관이 편리함).
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 외막소포체의 크기는 20-250 nm이고, 보다 바람직하게는 20-200 nm이며, 보다 더 바람직하게는 20-150 nm이고, 가장 바람직하게는 20-100 nm이다.
또한, 본 발명의 유효성분인 외막소포체는 다음과 같이 제조될 수 있다: (a) 암-타겟팅용 재조합 벡터를 제조하는 단계; (b) 상기 재조합 벡터를 박테리아에 형질전환시키는 단계; 및 (c) 상기 박테리아의 배양액으로부터 외막소포체를 분리/농축시키는 단계.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 외막소포체는 다음과 같이 제조될 수 있다: (a)(ⅰ) 박테리아의 외막단백질; 및 (ⅱ) 상기 외막 단백질과 결합된 암-타겟팅 리간드로 이루어진 융합단백질; 및 (b) 상기 융합단백질에 작동적으로 연결된(operatively linked) 프로모터 서열을 포함하는 재조합 벡터를 제조하는 단계; (b) 상기 재조합 벡터를 그람-음성 박테리아에 형질전환시키는 단계; 및 (c) 상기 박테리아의 배양액으로부터 외막소포체를 분리/농축시키는 단계.
보다 바람직하게는, (a)(ⅰ) 박테리아의 사이토라이신 A(Cly A); 및 (ⅱ) 상기 사이토라이신 A과 결합된 애피바디(affibody)로 이루어진 융합단백질; 및 (b) 상기 융합단백질에 작동적으로 연결된(operatively linked) 프로모터 서열을 포함하는 재조합 벡터를 제조하는 단계; (b) 상기 재조합 벡터를 대장균(E. coli)에 형질전환시키는 단계; 및 (c) 상기 대장균 배양액으로부터 외막소포체를 분리/농축시키는 단계를 포함한다.
가장 바람직하게는, (a)(ⅰ) 박테리아의 사이토라이신 A(Cly A); 및 (ⅱ) 상기 사이토라이신 A과 결합된 HER2(human epidermal growth factor 2)에 결합할 수 있는 애피바디(affibodyHER2)로 이루어진 융합단백질; 및 (b) 상기 융합단백질에 작동적으로 연결된(operatively linked) 프로모터 서열을 포함하는 재조합 벡터를 제조하는 단계; (b) 상기 재조합 벡터를 대장균(E. coli)에 형질전환시키는 단계; 및 (c) 상기 대장균 배양액으로부터 외막소포체를 분리/농축시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 융합단백질은 링커를 추가적으로 포함한다. 상기 링커는 박테리아 외막단백질(바람직하게는, 사이토라이신 A)과 암-타겟팅 리간드[바람직하게는, HER2에 결합할 수 있는 애피바디(affibodyHER2)]의 연결할 뿐 아니라, 상기 융합단백질의 발현을 확인하기 위한 표지자로서도 기능한다. 본 발명의 링커는 상기 융합단백질의 기능(예컨대, 암-타겟팅 기능)을 저해하지 않는 한 당업계에서 이용되는 어떠한 링커도 이용할 수 있으며, 예를 들면 c-Myc 택(tag), 6×His(6-Histidine) 택, HA(Hemagglutinin) 택, S-택, SBP 택, GST(glutathione-S-transferase) 택, MBP(maltose binding protein) 택 및 GFP(green fluorescence protein) 택을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 융합단백질을 구성하는 성분들의 아미노산 서열은 서열목록 제1서열 내지 서열목록 제5서열에 기재되어 있다.
바람직하게는, 본 발명의 재조합 벡터는 (ⅰ) 상술한 본 발명의 발현대상물질(예컨대, 융합단백질)을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; (ⅱ) 상기 (ⅰ)의 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 연결되며 원핵세포, 바람직하게는 그람-음성 박테리아에서 작용하여 RNA 분자를 형성시키는 프로모터를 포함하며, 보다 바람직하게는 (ⅰ) 상술한 본 발명의 (a)(ⅰ) 박테리아의 외막단백질; 및 (ⅱ) 상기 외막단백질과 결합된 암-타겟팅 리간드로 이루어진 융합단백질의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 뉴클레오타이드 서열; (ⅱ) 상기 (ⅰ)의 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 연결되며 원핵세포, 바람직하게는 그람-음성 박테리아에서 작용하여 RNA 분자를 형성시키는 프로모터를 포함하고, 보다 더 바람직하게는 (ⅰ) 상술한 본 발명의 (a)(ⅰ) 박테리아의 사이토라이신 A; 및 (ⅱ) 상기 사이토라이신 A과 결합된 암-타겟팅 리간드로 이루어진 융합단백질의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 뉴클레오타이드 서열; (ⅱ) 상기 (ⅰ)의 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 연결되며 원핵세포, 바람직하게는 그람-음성 박테리아에서 작용하여 RNA 분자를 형성시키는 프로모터를 포함하고, 가장 바람직하게는, (ⅰ) 상술한 본 발명의 (a)(ⅰ) 박테리아의 사이토라이신 A; 및 (ⅱ) 상기 사이토라이신 A과 결합된 HER2에 결합할 수 있는 애피바디(affibodyHER2)로 이루어진 융합단백질의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 뉴클레오타이드 서열; (ⅱ) 상기 (ⅰ)의 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 연결되며 원핵세포, 바람직하게는 그람-음성 박테리아에서 작용하여 RNA 분자를 형성시키는 프로모터를 포함하는 재조합 발현벡터를 포함한다.
본 발명의 재조합 발현벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵세포 또는 진핵세포를 숙주세포로 하여 구축될 수 있으며, 바람직하게는 원핵세포이다. 예를 들어, 원핵세포는 박테리아를 포함하고, 보다 바람직하게는 그람-음성 박테리아이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 형질전환용 숙주세포로 이용될 수 있는 원핵세포는 그람-음성 박테리아이고, 보다 바람직하게는, 에스체리키아, 세라티아, 네이세리아, 해모필러스, 살모넬라, 시겔라, 레기오넬라, 부콜데리아, 헬리코박터, 프로테우스 또는 슈도모나스 종이며, 보다 더 바람직하게는 에스체리키아, 네이세리아, 해모필러스, 살모넬라 또는 시겔라 종이고, 보다 더욱 더 바람직하게는 에스체리키아 종이며, 가장 바람직하게는 대장균(Escherichia coli)이다.
본 명세서에서 용어 “프로모터”는 코딩 서열 또는 기능적 RNA의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다. 본 발명의 제조합 발현벡터에서 발현대상물질-코딩 뉴클레오타이드 서열은 상기 프로모터에 작동적으로 연결된다. 본 명세서에서 용어 “작동적으로 결합된(operatively linked)”은 핵산 발현 조절 서열(예: 프로모터 서열, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열 사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 번역을 조절하게 된다.
본 발명의 벡터가 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예컨대, tac 프로모터, lac 프로모터, lac UV5 프로모터, lpp 프로모터, pL λ 프로모터, pR λ 프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로머터, trp 프로모터, T7 프로모터, 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 보다 더 바람직하게는, 본 발명에서 이용되는 숙주 세포는 에스체리키아 종이며, 가장 바람직하게는 E. coli이다. 또한, 숙주 세포로서 E. coli가 이용되는 경우, E. coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위(Yanofsky, C., J. Bacteriol., 158: 1018-1024(1984)) 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터(pL λ 프로모터, Herskowitz, I. and Hagen, D., Ann. Rev. Genet., 14: 399-445(1980))가 조절 부위로서 이용될 수 있다. 한편, 본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드(예: pET28b, pRS316, pSC101, ColE1, pBR322, pUC8/9, pHC79, pUC19 등), 파지(예: λgt4λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스(예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.
바람직하게는, 상술한 발현대상물질은 융합단백질로서 박테리아의 외막단백질 및 암-타겟팅 리간드를 포함한다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 박테리아의 외막단백질은 ClyA, OmpA, OmpC, OmpF, OmpG, OmpN, OmpR, OmpW, OmpX, FecA, FhuA, FhuE, HlpA, HtrE, InvE, LamB, MltA, MltB, MltC, MltD, PgpB, PhoE, PhoP, RfaY, YbfM, YbiL 또는 YeaF 외막단백질을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 가장 바람직하게는, 본 발명의 융합단백질은 사이토라이신 A와 HER2에 결합할 수 있는 애피바디(affibodyHER2)를 포함한다.
본 명세서에서 용어 “암-타겟팅 리간드”는 그람-음성 박테리아로부터 유래한 외막소포체의 표면에 제시되는 암-표적화 리간드로서, 암, 종양, 종양-관련된 질환의 환자들의 세포에서 과다발현되는 막 단백질(예컨대, 수용체)에 결합할 수 있는 리간드를 의미한다. 본 발명에서 이용될 수 있는 암-타겟팅 리간드는 타겟팅 모이어티, 앱타머, 펩타이드, 항체, 항체 단편, 비타민, 약물, 뉴트라세티컬, 탄수화물, 단백질, 수용체, 접착 분자, 당단백질, 당 잔기, 글라이코사미노글라이칸 또는 이의 조합을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용될 수 있는 암-타겟팅 리간드는 타겟팅 모이어티이며, 보다 바람직하게는 애피바디(affibody) 또는 바이포달 펩타이드 바인더(bipodal peptide binder)이고, 가장 바람직하게는 HER2에 결합할 수 있는 애피바디(affibodyHER2) 또는 바이포달 펩타이드 바인더이다.
애피바디 분자는 스웨덴 생명공학 회사인 애피바디 AB에 의해 개발된 작은 단백질로, 스타필로코커스 단백질 A(staphylococcal protein A, SPA)의 IgG-결합 도메인으로부터 유래한 Z 도메인의 58개의 아미노산 잔기에 기반하고(Nilsson, B, et al., Protein Engineering, 1: 107-133(1987)), 서로 다른 상호작용 타겟을 이용하여 임의적인 분자 라이브러리로부터 선택되었다(W095/19374; W000/63243; Nord, K, et al., Prot Eng, 8: 601-608(1995); Nord, K, et al., Nature Biotechnology, 15: 772-777(1997)). 상기 Z 도메인의 시스테인-부재 3개의 헬릭스 번들 도메인(three-helix bundle domain)은 스캐폴드(scaffold)로 이용되며, 애피바디 변이체들은 디스플레이 기술(예컨대, 파아지 디스플레이)을 이용하여 소망하는 분자를 타겟팅하도록 선택될 수 있다. 따라서, 애피바디는 수많은 타겟 단백질 또는 펩타이드에 높은 친화도로 결합하고 단일클론항체를 모방하도록 제조할 수 있기 때문에 생화학 연구에 이용될 수 있으며 강력한 생약 물질(biopharmaceutical drugs)로 개발될 수 있다. 저분자량(7 kDa)을 가지는 애피바디의 간단하고 강력한 구조는 폭넓은 적용에 적합하다. 예를 들어, 애피바디의 효능은 생물공학(bioprocess)- 및 실험실-스케일의 생분리과정에 적용될 수 있으며(Nord, et al., 2000, 2001; Gr, et al., 2002), 수용체 상호작용 억제에 적용될 수 있다(Sandstr, et al., 2003). 따라서, 애피바디 리간드는 치료제로서의 가능성을 가진다.
본 명세서의 용어 “바이포달 펩타이드 바인더(bipodal peptide binder, BPB)”는 (i) 가닥간(interstrand) 비공유결합이 형성되는 패러럴(parallel), 안티패러럴(antiparallel) 또는 패러럴(parallel)과 안티패러럴(antiparallel) 아미노산 가닥들을 포함하는 구조 안정화 부위(structure stabilizing region); (ⅱ) 상기 구조 안정화 부위의 양 말단에 결합되어 있고 무작위적으로 선택된 각각 n 및 m개의 아미노산을 포함하는 타겟 결합 부위 I(target binding region I) 및 타겟 결합 부위 Ⅱ(target binding region Ⅱ)를 포함한다.
상기 BPB의 대한 상세한 설명은 WO 2010/047515 A2에 개시되어 있으며, 이 특허문헌은 본 명세서에 참조로 삽입된다.
BPB에서, 구조안정화 부위는 패러럴, 안티패러럴 또는 패러럴과 안티패러럴 아미노산 가닥들을 포함하며, 가닥간(interstrand) 수소결합, 정전기적 상호작용, 소수성상호작용, 반데르 발스 상호작용, 파이-파이 상호작용, 양이온-파이 상호작용 또는 이들의 조합에 의한 비공유결합이 형성되는 단백질 구조 모티프들을 포함한다. 가닥간 수소결합, 정전기적 상호작용, 소수성상호작용, 반데르 발스 상호작용, 파이-파이 상호작용, 양이온-파이 상호작용 또는 이들의 조합에 의한 형성되는 비공유결합은 구조안정화 부위의 견고성(rigidity)에 기여한다.
선택적으로, 구조화안정화 부위에 공유결합이 있을 수 있다. 예를 들어, 구조화안정화 부위에 이황화결합을 형성시켜 구조안정화 부위의 견고성을 더 증가시킬 수 있다. 이러한 공유결합에 의한 견고성 증가는 바이포달 펩타이드 바인더의 타겟에 대한 특이도 및 친화도를 고려하여 부여한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 구조 안정화 부위의 아미노산 가닥들은 링커로 연결되어 있다. 링커는 패러럴, 안티패러럴 또는 패러럴과 안티패러럴 아미노산 가닥들을 연결한다. 예컨대, 패러럴 방식으로 정렬된 최소 2개의 가닥(바람직하게는 2개의 가닥), 안티패러럴 방식으로 정렬된 최소 2개의 가닥(바람직하게는 2개의 가닥), 패러럴 및 안티패러럴 방식으로 정렬된 최소 3개의 가닥(바람직하게는 3개의 가닥)을 링커가 연결하게 된다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 링커는 턴 서열 또는 펩타이드 링커이다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 턴 서열은 β-턴, γ-턴, α-턴, π-턴 또는 ω-loop이다. 가장 바람직하게는, 본 발명에서 이용되는 턴 서열은 β-턴이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 구조안정화 부위는 β-헤어핀, 링커로 연결된 β-쉬트 또는 링커로 연결된 루이신 지퍼이고, 보다 바람직하게는 구조안정화 부위는 β-헤어핀 또는 링커로 연결된 β-쉬트이며, 가장 바람직하게는 β-헤어핀이다. β-헤어핀 콘포메이션을 갖는 펩타이드를 구조안정화 부위로 이용하는 경우, 가장 바람직하게는 트립토판 지퍼를 이용한다.
상술한 구조안정화 부위의 양 말단에는 무작위 아미노산 서열이 결합된다. 상기 무작위 아미노산 서열이 타겟 결합 부위 I 및 타겟 결합 부위 Ⅱ를 형성한다. 본 발명의 가장 큰 특징 중 하나는, 구조안정화 부위의 양쪽 말단에 타겟 결합 부위 I 및 타겟 결합 부위 Ⅱ를 연결하여 바이포달 방식으로 펩타이드 바인더를 제작하는 것이다. 타겟 결합 부위 I 및 타겟 결합 부위 Ⅱ는 서로 협동적으로(cooperatively) 타겟에 결합함으로써, 타겟에 대한 친화도를 크게 증가시킨다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 구조 안정화 부위, 타겟 결합 부위 I 또는 타겟 결합 부위 Ⅱ(보다 바람직하게는, 구조안정화 부위, 보다 더 바람직하게는 구조안정화 부위의 링커)에 추가적으로 기능성 분자가 결합되어 있다. 상기 기능성 분자의 예는 검출가능한 신호를 발생시키는 레이블, 화학약물, 바이오약물, 세포막투과 펩타이드(CPP) 또는 나노입자를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
한편, neu, HER2/neu 또는 c-erbB-2로도 불리는 HER2 원종양유전자(proto-oncogene)는 185 kDa의 세포 표면 수용체 단백질이다(Hynes, N. E., et al., Biochim Biophys Acta, 1198: 165-184(1994)). 정상 세포는 작은 양의 HER2 단백질을 조직-특이적인 패턴으로 세포막에 발현한다. HER2는 리간드와의 복합체에서 HER1(epidermal growth factor receptor, EGFR), HER3 및 HER4와 헤테로다이머를 형성하고 이를 통해 활성화된 HER2 수용체-전달 성장 시그널을 세포 외로부터 핵으로 전달하는 것으로 알려져 있다(Sundaresan. S., et al., Curr Oncol Rep, 1: 16-22(1999)). 종양세포에서, DNA 복제 시스템의 오류는 유전자 증폭과정으로 알려진 단일 염색체 상의 멀티카피 유전자의 존재를 초래할 수 있다. HER2 유전자의 증폭은 증가된 전사로 이어진다. 그 결과, 증가된 HER2 mRNA 레벨은 HER2 단백질 레벨의 증가를 초래하여 종양세포의 표면에 HER2 단백질의 과다발현을 야기시킨다. HER2의 과다발현은 정상세포에서 발견되는 레벨보다 10배 내지 100배까지 증가한다. 따라서, HER2 유전자의 증폭은 정상세포의 암 표현형으로의 형질전환에 포함된다(Sundaresan. S., et al., Curr Oncol Rep, 1: 16-22(1999)).
본 발명에 따르면, 본 발명의 외막소포체는 (a) 박테리아의 외막 단백질인 사이토라이신 A; (b) 상기 사이토라이신 A에 결합된 HER2에 결합할 수 있는 애피바디(affibodyHER2); 및 (c) 상기 사이토라이신 A과 애피바디를 결합시키는 링커(바람직하게는, myc 택)를 외막소포체의 표면에 포함한다(참고: 도 1b). 따라서, 본 발명의 외막소포체의 표면에 제시되는 HER2에 결합할 수 있는 애피바디(affibodyHER2)를 통해 HER2 단백질이 과다발현되는 암세포 또는 종양세포에 특이적으로 결합할 수 있다.
본 발명은 상술한 외막소포체와 적합한 항암제를 혼합함으로써 간편하게 항암제를 로딩할 수 있다. 본 발명에서 외막소포체에 로딩될 항암제는 당업계에서 이용되는 다양한 항암제를 포함하며, 예를 들어 화학치료제(chemotherapeutic agents), 항-암 작은 분자(anti-cancer small molecules), 항체, 또는 암 세포에 특이적인 생물학 제제(biological agents)를 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 본 발명에서 이용될 수 있는 화학치료제는 알킬화제(alkylating agents), 대사길항제(antimetabolites) 및 인터칼레이팅 제제(intercalating)를 포함하는 당업계에서 이용되는 다양한 화학치료제를 포함할 수 있으며, 예를 들어, 도세탁셀(docetaxel), 5-플루오로우라실(5-fluorouracil), 6-머캅토퓨린(6-mercaptopurin), 사이토신-아라비노시드(cytosine-arabinoside), 플루다라빈(fludarabine), 메토트렉세이트(methotrexate), 독소루비신(doxorubicin), 에피루비신(epirubicin), 아멕린(amekrin), 시스플라틴(cisplatin), 카르보플라틴(carboplatin), 프로카르바진(procarbazine), 메클로레타민(mechlorethamine), 사이클로포스파미드(cyclophosphamide), 이포스파미드(ifosfamide), 멜팔란(melphalan), 클로라부실(chlorambucil), 비술판(bisulfan), 니트로소우레아(nitrosourea), 디악티노마이신(dactinomycin), 다우노루비신(daunorubicin), 블레오마이신(bleomycin), 플리코마이신(plicomycin), 미토마이신(mitomycin), 에토포시드(etoposide), 탁목시펜(tamoxifen), 파클리탁셀(paclitaxel), 트랜스플라티눔(transplatinum), 아드리아마이신(adriamycin), 빈크리스틴(vincristin) 또는 빈블라스틴(vinblastin)이며, 가장 바람직하게는 도세탁셀이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물에 의해 치료될 수 있는 암은 유방암, 구강암, 전립선암, 직장암, 비-소세포 폐암, 구순암, 간암, 폐암, 항문암, 신장암, 외음부암, 구인두암(oropharyngeal cancer), 비강/부비동암(nasal cavity and paranasal sinus cancer), 비인두암, 요도암, 소장암, 담도암, 방광암, 난소암, 후두암, 식도암, 담낭암, 대장암, 두경부암, 부갑상선암, 음경암, 질암, 갑상선암, 췌장암, 편평세포암, 호치킨 림프종(Hodgkin's lymphoma), 백혈병-관련된 질환, 균상 식육종(mycosis fungoides) 또는 골수이형성증후군을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 약제학적 조성물은 (a) 상술한 본 발명의 외막소포체의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이다. 본 명세서에서 용어 “약제학적 유효량”은 상술한 항암제의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.
본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 한편, 본 발명의 약제학적 조성물의 경구 투여량은 바람직하게는 성인 기준으로 1일 당 0.0001-100 ㎎/㎏이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 암-타겟팅 리간드를 포함하는 외막소포체(outer membrane vesicles, OMVs) 및 이의 용도에 관한 것이다.
(b) 본 발명의 외막소포체는 (ⅰ) 외막 단백질(outer membrane proteins, OMPs); (ⅱ) 상기 외막 단백질에 결합된 암-타겟팅 리간드; 및 (ⅲ) 항암제를 포함한다.
(c) 본 발명의 외막소포체를 통한 항암제 전달 시스템은 종래의 리포좀-매개된 방법과 비교하여 보다 효율적으로 항암제를 세포 내로 운반할 수 있으며, 매우 편리하게 대량 생산이 가능하기 때문에 저렴한 생산비용을 요구한다.
(d) 따라서, 본 발명의 외막소포체를 이용한 조성물은 종래의 암 치료용 방법(예컨대, 리포좀-매개된 약물전달시스템)과 비교하여 보다 효율적이고 특이적으로 암 치료에 적용할 수 있다.
도 1a는 본 발명에서 이용되는 clyA-myc-AffibodyHER2 컨스트럭트의 벡터 맵을 나타내는 도면이다. 본 실험에서는 T7 프로모터를 이용하여 pET28b 발현 벡터에 사이토라이신 A(ClyA)를 클로닝시킨 다음, myc 택을 포함한 AffibodyHER2을 서브클로닝하여 최종적으로 사이토라이신-myc-애피바디(AffibodyHER2) 컨스트럭트를 완성하였다.
도 1b는 본 발명의 암-치료용 외막소포체의 제조과정을 개략적으로 보여주는 모식도이다. 상기 clyA-myc-AffibodyHER2 컨스트럭트를 E. coli에 형질전환시켜 상기 컨스트럭트를 포함하는 외막소포체를 얻고, 항암제인 도세탁셀(docetaxel)을 로딩하여 항암제가 로딩된 외막소포체를 얻었다.
도 2a는 IPTG를 이용한 유도를 통해 E. coli에서 과발현된 clyA-myc-AffibodyHER2 단백질의 SDS-PAGE 전기영동 젤 사진이다.
도 2b는 상기 E.coli로부터 정제된 외막소포체에서 발현된 ClyA-myc-AffibodyHER2 단백질의 웨스턴 블롯팅 결과이다. 웨스턴 블롯팅 결과는 항-myc 단일클론항체(Abcam)을 이용하여 실시하였다.
도 3a는 상기 clyA-myc-AffibodyHER2 컨스트럭트가 발현된 외막소포체의 평균 크기를 ELS 8000으로 측정한 결과이며, 도 3b는 외막소포체의 형태를 TEM으로 관찰한 결과이다.
도 4a는 분리한 외막소포체를 이용하여 affibodyHER2의 기능이 제대로 존재하는지 HER2 결합 테스트를 진행한 것이다. HER2 타겟팅이 있는 외막소체(OMV-affibodyHER2)가 없는 외막소포체(OMV) 비해 3.5배 정도 HER2 단백질에 잘 붙음을 알 수 있었다.
도 5a-5c는 본 발명의 외막소포체의 세포 결합 테스트를 실시한 결과이다. 도 5a는 HER2 단백질이 과발현하는 SKOV3 세포에서 본 발명의 외막소포체가 AffibodyHER2를 매개로 특이적으로 결합하는 것을 면역염색법을 통하여 확인한 결과이다.
도 5b는 대조군 실험으로, SKOV3 세포에 상기 clyA-myc-AffibodyHER2 컨스트럭트가 발현되지 않은 외막소포체를 처리한 결과이며 실험 방법은 상술한 바와 같다.
도 5c는 HER2 단백질을 발현하지 않는 HELA 세포에 본 발명의 외막소포체를 처리한 결과이며, 실험방법은 동일하다.
도 5a-c는 본 발명의 외막소포체가 암세포막에 발현하는 HER2 단백질에 특이적으로 결합함을 나타낸다.
도 6은 HER2 타겟팅이 있는 외막소포체(OMV-affibodyHER2)와 타겟팅이 없는 외막소포체(OMV)의 도세탁셀의 세포 흡수율을 측정한 것이다. HER2 단백질이 과발현된 세포인 BT-474에 타겟팅 컨스트럭트를 포함하는 외막소포체가 더 잘 결합하여 도세탁셀이 2.5배 이상 세포 안으로 더 잘 들어감을 확인할 수 있었다.
도 7은 HER2 타겟팅이 있는 외막소포체(OMV-affibodyHER2)와 타겟팅이 없는 외막소포체(OMV)의 세포 독성을 측정한 것이다. 타겟팅이 있는 외막소체가 HER2 단백질이 과발현되어 있는 BT-474 세포를 10배 정도 더 효과적으로 죽임을 확인할 수 있었다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실험 방법
ClyA 단백질과 타겟팅 그룹 결합 시스템 제작
E. coli K12 w3110 균주에서 clyA 유전자를 얻기 위해서 w3110 균주에서 염색체 DNA를 cell sv mini kit(geneall)를 이용하여 정제하였다. 두 개의 프라이머인 정방향 프라이머(5’-CTAGGCTAGCATGACTGAAATCGTT-3’) 및 역방향 프라이머(5’-GATCGGATCCGACTTCAGGTACCTC-3’)를 이용하여 PCR 반응(94℃, 5분; 30 사이클- 58℃, 30초; 72℃, 1분 30초; 및 94℃, 30초)을 통해 clyA 인서트를 제작한 후 PCR 정제 키트(GeneAll, ExpinTM PCR SV)를 이용하여 정제하였다. 상기 clyA 유전자 인서트를 pET28b 벡터에 연결하기 위해 clyA 유전자 인서트와 pET28b 벡터에 제한효소 처리를 실시하였다. 약 2 ㎍의 인서트 DNA를 NheI(NEB)와 BamHI(NEB)으로 4시간씩 반응시킨 후 PCR 정제 키트를 이용하여 정제하였다. 그리고, 약 2 ㎍의 pET28b 벡터를 NheI(NEB)와 BamHI(NEB)으로 3시간씩 반응시키고 CIP(Calf Intestinal Alkaline Phosphatase; NEB)를 1시간 동안 처리한 후 PCR 정제 키트를 이용하여 정제하였다. 이후, T4 DNA 리가제(Bioneer)를 이용하여 벡터 대 인서트를 1:3의 몰비로 18℃에서 10시간 동안 라이게이션시킨 후 XL-1 컴피턴트 세포에 형질전환시켜 카나마이신 한천 배지에 도말하였다. 한천 평판 배지에서 자란 집락(colonies)을 5 ml의 LB 배지에 접종하여 37℃에서 200 rpm의 속도로 섞어주면서 하룻밤 동안 배양한 후, 플라스미드 제조 키트(GeneAll, ExprepTM Plasmid SV Mini)를 이용하여 플라스미드를 정제하였다. 클로닝의 성공 여부를 평가하기 위해, 시퀀싱을 실시하였다. 다음으로, HER2에 결합하는 애피바디(affibody)를 clyA 유전자 뒤에 넣기 위해서, 다음의 프라이머를 이용하였다: 정방향 프라이머, 5’- AATGAATTCTCTTCCTCATCGGGTTCTTCCTCATCGGGTGAACAAAAACTCATC-3’; 및 역방향 프라이머, 5’-AATAAGCTTTCATTTTGGTGCTTGTGC-3’. 그 결과, 타겟팅 유전자인 HER2 애피바디 인서트를 제조하였다. 인서트 및 clyA가 들어가 있는 pET28b 벡터를 제한효소 EcoRI(NEB)와 HindIII(NEB)로 절단한 후, T4 DNA 리가제를 이용하여 라이게이션하였다. ClyA-myc-AffibodyHER2 컨스트럭트의 클로닝을 시퀀싱으로 확인하였다.
암 타겟팅용 외막소포체 정제 및 ClyA-Affibody HER2 의 발현 실험
상술한 바와 같이 제작된 ClyA-AffibodyHER2를 도입한 E. coli에서 회수한 외막소포체(outer membrane vesicles, OMVs)에서 ClyA-AffibodyHER2가 제대로 발현되어 존재하는 지를 알아보기 위하여 웨스턴 블롯팅을 실시하였다. 먼저, ClyA-AffibodyHER2가 발현된 외막소포체를 정제하기 위해 ClyA-AffibodyHER2를 클로닝한 pET28b 벡터를 BL21 세포에 형질전환시킨 후 카나마이신 한천 배지에 도말하였다. 한천 평판 배지에서 자란 집락을 카나마이신(25 ㎍/ml)을 포함하는 LB 배지(5 ml)에 접종한 뒤 37℃에서 200 rpm의 속도로 섞어주면서 하룻밤 동안 배양하였다. 상기 배양액을 50 ml LB 배지(25 ㎍/ml의 카나마이신 포함)로 옮겨 3시간 동안 추가적으로 배양시켰다. 상기 성장한 E. coli 배양액을 2 L LB 배지(25 ㎍/ml의 카나마이신 포함)을 넣어 OD = 0.6-0.8까지 배양하였다. 이후, 0.2 mM 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드(IPTG)(Gold biotechnology)를 첨가하고 37℃에서 200 rpm의 속도로 섞어주면서 12시간 동안 배양하였다. 5,000×g로 20분 동안 원심분리를 통해 침전된 세포들을 제거하고 상등액을 수거하였다. E. coli를 0.2 ㎛ 필터(NALGENE)를 이용하여 완벽히 제거하고 ClyA-AffibodyHER2 외막소포체를 모은 뒤, SDS-PAGE로 단백질을 전기영동하고 항-myc 단일클론항체(Abcam)를 사용하여 웨스턴 블롯팅을 실시하였다.
OMV-affibody HER2 외막소포체의 크기 측정
타겟팅용 외막소포체(OMV-affibodyHER2)의 크기를 ELS 8000(Otsuka Electronics)와 TEM(Philips Electronic Instrument Corp., Mahwah,NJ)을 이용하여 측정하였다. TEM 그리드에 정제된 타겟팅용 외막소포체를 넣은 후, 5% 우라닐 아세테이트(Sigma)로 염색을 하여 타겟팅용 외막소포체의 모양과 크기를 관찰하였다.
HER2 단백질에 대한 타겟팅 실험
상기 affibodyHER2의 기능이 제대로 존재하는 지 여부를 확인하기 위해, 분리한 외막소포체를 이용하여 HER2 결합 테스트를 실시하였다. HER2 단백질(5 ㎍/ml; Bender Medsystems Inc)과 대조군인 VEGF(5 ㎍/ml; R&D system)를 각각 96-웰 ELISA 플레이트에 50 ㎕/웰씩 넣고 4℃에서 하룻밤 동안 방치하였다. 다음 날, 모든 웰을 0.05% PBST로 3회 세척하고 PBS로 희석한 2% 탈지분유로 상온에서 2시간 동안 블롯킹한 후, 용액을 모두 제거하고 0.05% PBST로 3회 세척하였다. ClyA-HER2_affibody가 발현되어 있는 타겟팅용 외막소포체(OMV-affibodyHER2)와 대조군 본래의 외막소포체를 100 ㎕씩을 HER2 단백질이 부착된 웰과 VEGF 단백질이 부착된 웰에 분주하고 27 oC에서 1시간 30분 정치하였다. 0.05% PBST 용액으로 5번 세척한 다음 anti-myc 단일클론항체(Abcam)를 1:1000으로 희석하여 27℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 그 다음, 0.05% PBST로 5번 세척한 후 HRP-컨쥬게이션된 항-IgG 항체(GE Healthcare)를 1:5,000으로 희석하여 27℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 0.05% PBST로 5번 세척한 후 TMB 용액 100 ㎕를 분주하여 발색반응을 유도한 다음 100 ㎕의 1M HCl를 첨가하여 반응을 중지시켰다. 450 nm에서 흡광도를 측정하여 OMV-affibodyHER2가 대조군 본래 OMV에 비해 HER2 단백질에 더 잘 붙는지를 확인하였다.
세포에 있는 HER2 단백질에 대한 타겟팅 실험
인간 SKOV-3 세포 및 HeLa 세포를 80% 컨플루언스로 커버 슬립에 배양시킨 후, OMV-affibodyHER2와 대조군인 OMV를 1시간 동안 4℃에서 세포와 반응시켰다. 이후, PBS로 세 번에 걸쳐서 세척한 후 4% 파라포름알데하이드로 세포를 고정시켰다. 그 다음, 항-myc 항체(abcam)과 항-이차항체-FITC를 이용하여 OMV를 검출하고, Leica TCS SP2 AOBS 공초점 현미경(Mannheim, Germany)을 이용하여 세포를 관찰하였다.
항암제를 외막소포체에 투입
외막소포체를 이용한 항암 효과를 확인하기 위해, 외막소포체 내에 항암제인 도세탁셀(Docetaxel; Toronto Research Chemicals Inc)을 채웠다. 우선, OMV-affibodyHER2를 얻기 위해서 E.coli를 50 ml LB 배지에서 배양시킨 후 카나마이신(25 ㎍/ml)을 포함하는 2L LB에 첨가하여 OD = 0.6-0.8까지 배양하였다. 배양액에 0.2 mM IPTG를 첨가하여 37℃에서 200 rpm의 속도로 섞어주면서 12시간 동안 배양시켰다. 5,000×g로 20분 동안 원심분리시켜 침전된 세포들을 제거한 후, 상등액을 모두 수거하였다. 0.2 ㎛ 필터를 이용하여 E.coli를 완벽하게 제거하고 외막소포체를 모아 농축한 후, 40,000 rpm으로 한시간 동안 원심 분리를 하여 타겟팅용 외막소포체를 모았다. 외막소포체 100 ㎍과 20% 에탄올에 녹인 도세탁셀 100 ㎍을 혼합한 다음, 0.2 ㎛ 필터와 Superdex 75 컬럼(GE Healthcare)을 이용하여 프리 도세탁셀을 제거하였다. 도세탁셀 로딩 양을 측정하기 위해, 외막소포체에 2% 트라이톤 X-100(USB Corp.)을 넣어 용해시키고 90% 에틸 아세테이트로 도세탁셀을 분리한 후, HPLC를 이용하여 도세탁셀의 양을 측정하였다.
세포흡수 실험
HER2_affibody가 발현되어 있는 외막소포체(OMV-affibodyHER2)와 대조군 본래 외막소포체의 세포 흡수 정도를 측정하기 위해, HER2-양성 세포주인 BT-474 유방암 세포주와 HER2-음성 세포주인 MCF-7 유방암 세포주(ATCC,Manassas,VA)에서 세포 흡수 실험을 실시하였다. BT-474 세포와 MCF-7 세포를 5×104 세포/웰로 96-웰 플레이트에 넣어 24시간 동안 배양시킨 후, 도세탁셀 100 ng/ml이 들어 있는 HER2_affibody 외막소포체와 본래 외막소포체를 첨가하여 37℃에서 2시간 동안 추가적으로 반응시키고 PBS로 4번 세척하였다. 세포 안에 들어간 도세탁셀의 양을 측정하기 위해, 트립신(InvitrogenTM)을 넣어 세포를 모은 다음 0.1% SDS를 넣어 세포를 용해시키고 ACN(Fisher Scientific)을 넣었다. 이후, 13,000 rpm으로 5분 동안 원심분리시켜 얻은 상등액에서 HPLC를 이용하여 도세탁셀의 양을 측정하였다.
세포독성 실험
도세탁셀을 로딩한 HER2 타겟팅 외막소포체의 세포독성 실험을 위해, HER2-양성 세포주인 BT-474 유방암 세포와 HER2-음성 세포주인 MCF-7 유방암 세포를 이용하여 MTT 테스트를 실시하였다. BT-474 세포와 MCF-7 세포를 5×103 세포/웰로 96-웰 플레이트에 넣어 24시간 동안 배양시킨 후, 1000 ng/ml, 100 ng/ml, 10 ng/ml 또는 1 ng/ml의 HER2_affibody를 포함하는 외막소포체(OMV-affibodyHER2)와 대조군인 본래 외막소포체를 첨가하고 48시간 후에 MTT 용액(Sigma)을 처리하여 세포독성 억제 정도를 측정하였다.
실험 결과
ClyA와 타겟팅 그룹의 결합 시스템 제작
ClyA 단백질은 OMV 내에 풍부하게 존재하는 단백질로써 다량체를 이루면서 외막에 분포하며 타겟팅 그룹을 c-말단에 연결하여 외막소포체의 표면에 외래의 단백질이나 펩타이드를 발현되게 할 수 있다. 특히, HER2의 특이적으로 강하게 붙는 affibody 단백질을 결합하여 암을 표적할 수 있는 외막소포체를 아래 그림과 같이 제작하였다. Myc-택은 발현 실험을 테스트 하기 위해 융합시킨 서열이다.
OMV 정제 및 OMV 내의 발현 테스트
OMV 내에 ClyA-myc-AffibodyHER2의 발현 정도를 실험하기 위해서 정제한 OMV를 웨스턴 블롯을 하였다. 첫번째 항체는 항-myc 단일클론항체를 이용하였고 두번째 항체는 항-IgG-HRP 다클론항체를 이용하여 실험을 하였다. 도 1에서 볼 수 있듯이, IPTG로 유도된 ClyA-myc-AffibodyHER2가 OMV 안에 많이 존재함을 알 수 있다. 따라서, 이 실험을 통해서 OMV 내에 ClyA-myc-AffibodyHER2가 존재함을 알 수 있다.
외막소포체(OMV-affibody HER2 )의 크기 측정
OMV-affibodyHER2의 외막소포체의 크기를 측정하기 위해, ELS 8000을 이용하였다. 그 결과, 본 발명의 외막소포체의 크기는 43 ± 10 nm였다. 외막소포체의 정확한 크기와 모양을 알기 위해, TEM을 실시하였다. TEM 사진 결과, 본 발명의 외막소포체는 20-50 nm로 둥근 모양을 가지고 있음을 확인하였다.
타겟팅 실험
분리한 외막소포체를 이용하여 투여된 affibodyHER2가 제대로 존재하고 기능하는 지 여부를 확인하기 위해, HER2 결합 테스트를 실시하였다. 도에서 확인할 수 있듯이, HER2 타겟팅이 있는 외막소포체(OMV-affibodyHER2)가 없는 외막소포체(OMV) 단독과 비교하여 3.5배 정도 HER2 단백질에 잘 결합한다는 것을 확인할 수 있었다. 또한, HER2 타겟팅이 있는 외막소포체(OMV-affibodyHER2)가 대조군인 VEGF 단백질에는 안 붙음을 알 수 있다.
세포내 결합 테스트
HER2-양성 세포주인 SKOV-3 및 HER2-음성 세포주인 HeLa 세포를 이용하여 OMV-affibodyHER2가 특이적으로 HER2에 결합하는 지 여부를 확인하였다. 도에서 볼 수 있듯이, OMV-AffibodyHER2가 OMV에 비해 SKOV-3에 많이 붙음을 알 수 있었다. 또한, HER2-음성 세포주인 HeLa 세포에는 OMV-affiobdyHER2가 붙지 않았다. 이를 통해, 세포 상에서도 특이적으로 HER2를 인식할 수 있음을 확인하였다.
세포 유입(Cellular uptake) 실험
HER2 타겟팅이 있는 외막소포체(OMV-affibodyHER2)와 타겟팅이 없는 외막소포체 (OMV)의 도세탁셀의 세포 흡수율을 측정하였다. 도에서 확인할 수 있듯이, 타겟팅이 있는 외막소포체가 HER2-양성 세포인 BT-474에서 2.5배 이상 도세탁셀이 더 잘 세포 안으로 들어감을 확인할 수 있었다.
세포 독성 실험
HER2 타겟팅이 있는 외막소포체(OMV-affibodyHER2)와 타겟팅이 없는 외막소포체 (OMV)의 세포 독성을 측정하였다. 도 에서 볼 수 있듯이, 타겟팅이 있는 외막소포체가 HER2-양성 세포주인 BT-474에 10배 정도 더 효과적으로 암세포 죽임을 확인할 수 있다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명 의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (16)

  1. (a) 외막 단백질(outer membrane proteins, OMPs)인 서열목록 제1서열의 사이토라이신 A(cytolysin A); (b) 링커를 통해 상기 외막 단백질에 결합된 암-타겟팅 리간드; 및 (c) 항암제를 포함하는 암 치료용 외막소포체(outer membrane vesicles, OMVs).
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 외막소포체는 그람-음성 박테리아로부터 유래한 것을 특징으로 하는 외막소포체.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 그람-음성 박테리아는 대장균(Escherichia coli)인 것을 특징으로 하는 외막소포체.
  4. 삭제
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 암-타겟팅 리간드는 애피바디(affibody) 또는 바이포달 펩타이드 바인더(bipodal peptide binder)인 것을 특징으로 하는 외막소포체.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 애피바디는 서열목록 제2서열의 HER2(human epidermal growth factor receptor 2)에 결합할 수 있는 애피바디(affibodyHER2)인 것을 특징으로 하는 외막소포체.
  7. 삭제
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 항암제는 도세탁셀(docetaxel)인 것을 특징으로 하는 외막소포체.
  9. 제 1 항에 있어서, 상기 외막소포체의 크기는 20-50 nm인 것을 특징으로 하는 외막소포체.
  10. 제 1 항에 있어서, 상기 암은 유방암, 구강암, 전립선암, 직장암, 비-소세포 폐암, 구순암, 간암, 폐암, 항문암, 신장암, 외음부암, 구인두암(oropharyngeal cancer), 비강/부비동암(nasal cavity and paranasal sinus cancer), 비인두암, 요도암, 소장암, 담도암, 방광암, 난소암, 후두암, 식도암, 담낭암, 대장암, 두경부암, 부갑상선암, 음경암, 질암, 갑상선암, 췌장암, 편평세포암, 호치킨 림프종(Hodgkin's lymphoma), 백혈병-관련된 질환, 균상 식육종(mycosis fungoides) 또는 골수이형성증후군인 것을 특징으로 하는 외막소포체.
  11. (a) 상기 제 1 항 내지 제 3 항, 제 5 항, 제 6 항, 그리고 제 8 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항의 외막소포체의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 항암용 약제학적 조성물.
  12. (a)(ⅰ) 서열목록 제1서열의 박테리아의 사이토라이신 A(Cly A); 및 (ⅱ) 상기 사이토라이신 A와 링커를 통해 결합된 서열목록 제2서열의 HER2(human epidermal growth factor receptor 2)에 결합할 수 있는 애피바디(affibodyHER2)로 이루어진 융합단백질; 및 (b) 상기 융합단백질에 작동적으로 연결된(operatively linked) 프로모터 서열을 포함하는 암-타겟팅용 재조합 벡터.
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