DE19882755B4

DE19882755B4 - Ein Fusionsprotein des hEGF und des humanen Angiogenins und ein Verfahren zu dessen Herstellung

Info

Publication number: DE19882755B4
Application number: DE19882755T
Authority: DE
Inventors: Myung Hwan Park; Seung Kook Sungnam Park; Jong Myung Sungnam Yoon; Seung Hee Sungnam Han; Oh Byung Sungnam Kwon; Seung Ho Kim; Young Man Sungnam Kim; Tai Young Suwon Koo; Byoung Kwang Sungnam Lee
Original assignee: Daewoong Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Daewoong Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1997-11-01
Filing date: 1998-10-30
Publication date: 2004-11-18
Anticipated expiration: 2018-10-31
Also published as: US6541619B1; KR100236977B1; KR19990037999A; AU9764698A; WO1999023112A1; JP2001521733A; DE19882755T1

Abstract

Ein Fusionsprotein bestehend aus dem humanen Epidermalen Wachstumsfaktor hEGF, dem humanen Angiogenin, und Linker, welche aus 0 bis 20 Aminosäuren zusammengesetzt sind.

Description

Hintergrund der Erfindung Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Fusionsprotein des humanen epidermalen Wachstumsfaktors ("hEGF") und des humanen Angiogenins und ein Verfahren zur Herstellung des Fusionsproteins. Im Besonderen betrifft die Erfindung ein Fusionsprotein des hEGF, das Krebszellen aufspürt, die den hEGF-Rezeptor auf hohem Niveau exprimieren, gefolgt von der Aufnahme in die Zellen, und Angiogenin, das Cytotoxizität besitzt, indem Ribonukleinsäuren nach dessen Aufnahme abgebaut werden. Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung des Fusionsproteins, wobei E.coli-Zellen verwendet werden, die mit einem Expressionsvektor transformiert werden, der für ein Gen des Fusionsproteins codiert, sowie seine therapeutische Anwendung als Antikrebsmittel.

Umweltverschmutzung und eine Erhöhung der Bevölkerungsgruppe mit höherem Alter verursachen eine Erhöhung der Krebsrate um 5 % pro Jahr. Krebs rangiert als erste der Haupttodesursachen unter anderen Krankheiten und Unfällen.

Die Chemotherapie wird weithin als effektive Behandlung verwendet, um Krebs vorzubeugen und zu heilen. Es ist jedoch bekannt, daß die Chemotherapie verschiedene Nebenwirkungen hervorruft, z.B. der Angriff auf normale Zellen, sowohl als auch auf die Krebszellen. Aufgrund der niedrigen Spezifität für Krebszellen und der Toxizität für die normalen Zellen wurden zahlreiche Versuche unternommen, um Antikrebsmittel mit hoher Spezifität und niedriger Toxizität zu entwickeln. Die Beispiele solcher Ansätze schließen ein: die Suche nach einem Arzneimittel mit einer neuen Wirkungsweise, die Entwicklung von Arzneimitteldarreichungssyste men und Drug-Targeting, und die Verwendung eines zweiten Wirkstoffes, um die Aktivität des primären Antikrebsmittels zu unterstützen.

Kürzlich wurde ein neues Verfahren des Drug-Targeting untersucht, das selektiv wirksam gegen Krebszellen ist, wobei eine chemische Substanz an einen Träger gebunden ist, der eine starke Affinität zu den Krebszellen besitzt. Als eine vielversprechende Lösung wurde von Antikörpern berichtet, die gegen Krebszellenspezifische Antigene gerichtet sind, solche wie Alfa-Fetoprotein, die an chemische Substanzen gebunden werden, wie Ricin, das Diphtherie-Toxin, Pseudomonas-Toxin oder Radioisotope (siehe: K. Shikoro et al., Br. Med. Bull., 40:233-239 (1984); Vijay et al., Nature, 339:394-397 (1989); USP 4,545,985; Peter et al., Cancer Res., 54: 1008 (1994)). Die Antikörper-gebundenen chemischen Substanzen besitzen jedoch einige Nachteile, solche wie das Problem in die Zellen zu gelangen, die Antigenizität der Antikörper selbst, die Bindung an normale Zellen, und eine geringe Bindungseffizienz aufgrund des relativ hohen Molekulargewichtes der Antikörper (siehe: Pastan et al., Cell, 47: 641-648 (1986); Hurwitz et al., Cancer Res., 35: 1175-1181 (1975); Delabye et al., J. Clin. Invest., 77: 301-311 (1986); Buchegger et al., J. Exp. Med., 158: 413-427 (1986); Buchegger et al., Cancer, 58: 655-661 (1986).

Ein anderer Ansatz, zur Entwicklung eines Antikrebsmittels wurde unter Verwendung von Polyaminosäuren als Träger unternommen, weil Polyaminosäuren nicht cytotoxisch für normale Zellen sind. Nachdem das Mittel einen Komplex durch Bindung an die Polyaminosäuren gebildet hat, wird es aufgrund der in den Krebszellen vorhandenen Enzyme abgelöst. Diese Strategie konnte jedoch die vorgenannten Probleme nicht lösen (siehe: Kato et al., J. Med. Chem., 27: 1602-1607 (1984); EP 112 720 ; USP 4,485,093).

Als einer der Ansätze für das Antikrebs-Drug-Targeting, wurde die Bildung eines Proteinkomplexes zwischen einem toxischen Protein und einem Peptid oder einem Protein intensiv erforscht, das in der Lage ist, an die intrazellulären Rezeptoren zu binden, obwohl dieser Ansatz nicht erfolgreich war. Solche Peptide oder Proteine waren TGF (Tumorwachstumsfaktor), MSH (Melanocyten-stimulierendes Hormon), Somatostatin, Glucagon, Insulin, Transferrin, LDL (Lipoprotein geringer Dichte), Calcitonin, Alpha-2-Makroglobulin, Bradykinin, und EGF (siehe: USP 4,545,985; Shimizu et al., FEBS Letters, 118: 274-278 (1980) Cawley et al., Cell, 22: 563-570 (1980); Simpson et al., Cell, 29: 469-473 (1982); WO 85/00369; WO 83/04030; USP 4,528,186; EP 46,039 ; EP 128,733 ; WO 85/01284; EP 131,868 ; USP 3,917,824).

Auch wurden gentechnisch erzeugte Fusionsproteine von Peptiden und Cytotoxinen durch Bindung an das Diphtherie-Toxin, an TRH (thyrotropin releasing hormone, Thyrotrophin), TRF (Transferrin), MSH und LDL hergestellt. Die Verwendung dieser Fusionsproteine war jedoch aufgrund von Schwierigkeiten hinsichtlich der Aufrechterhaltung der Rezeptorbindungsaktivität der Trägerproteine begrenzt (siehe: Bacha et al., J. Biol. Chem., 258: 1565-1570 (1983); Okeefe et al., J. Biol. Chem., 260: 932-937 (1985); Murphy et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 83: 8258-8262 (1986); japanische Patentveröffentlichung Nr. (Sho) 60-163824.

Die Toxizität eines Proteinkomplexes aus EGF und einer cytotoxischen Substanz wurde dabei aufgrund der Toxizität der cytotoxischen Substanz selbst nicht erniedrigt und führte zur Immunotoxizität durch die Antikörperbildung gegen die chemische Substanz (siehe: WO 88/00837). Die EP 467,536 beschreibt daß gentechnisch hergestelltes TGF, das an das modifizierte Pseudomonas Exotoxin A fusioniert wurde, gezielt gegen Blasenkrebs verwendet werden kann. Die Antigenizität des von dem Mikroorganismus stammenden Toxins konnte jedoch nicht überwunden werden.

Wie oben erläutert, wird die Forschung bezüglich der cytotoxischen Mittel oder der von Mikroorganismen stammenden Toxine, die mit monoklonalen Antikörpern fusioniert werden, die Moleküle auf der Oberfläche von Krebszellen erkennen (siehe USP 4,664,911; USP 4,545,985) oder die Untersuchung von Fusionsproteinen, die durch Fusion eines aus neoplastischem Gewebe stammenden Wachstumsfaktors und einem aus Mikroorganismen stammenden Toxin (siehe Jill et al., J. Biol. Chem., 266: 21118 (1991); Daniel et al., Cell, 22: 563-570 (1980); Caudhary et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84: 4538-4542 (1987)) noch weitergeführt. Bisher war die Forschung jedoch ergebnislos, da sie die Probleme, die durch die Toxizität der Proteine, die Kontamination durch chemische Substanzen, die Immunotoxizität aufgrund der Antikörperbildung, die unspezifische Bindung von Antikörpern, und durch die Schwierigkeiten ein Fusionsprotein mit großem Molekulargewicht zu den Zielzellen zu leiten (siehe: Chung et al., Mol. Cells, 6: 125-132 (1996)) noch lösen muß.

Eine erste Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein Fusionsprotein des hEGF und Angiogenins bereitzustellen, das das Wachstum von Krebszellen, die den EGF-Rezeptor exprimieren, selektiv hemmt.

Eine andere Aufgabe ist es, ein Verfahren zur Herstellung eines Fusionsproteins bereitzustellen, indem rekombinante Mikroorganismen verwendet werden, die mit einem Expressionsvektor transformiert wurden, enthaltend das für das Fusionsprotein codierende Gen.

Eine andere Aufgabe ist es, ein Antikrebsmittel bereitzustellen, umfassend das Fusionsprotein als aktiven Wirkstoff.

Zusammenfassung der Erfindung

Die technische Aufgabe wird gelöst durch ein Fusionsprotein bestehend aus dem humanen Epidermalen Wachstumsfaktor hEGF, dem humanen Angiogenin, und Linker, welche aus 0 bis 20 Aminosäuren zusammengesetzt sind.

Bevorzugt, ist der C-Terminus des humanen Epidermalen Wachstumsfaktors mit dem N-Terminus des humanen Angiogenins verbunden. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind der humane Epidermale Wachstumsfaktor und das humane Angiogenin in einem molekularen Verhältnis von 1 : 0,5 bis 2 miteinander fusioniert. Besonders bevorzugt ist der Linker ausgewählt aus der Gruppe Glycin, (Glycin)₄-Serin, und [(Glycin)₄-Serin]₂.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Fusionsproteins ist die Aminosäuresequenz des Fusionsproteins ausgewählt aus der Gruppe SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:31 und SEQ ID NO:32.

Die Aufgabe wird weiterhin gelöst durch ein Gen, das eines der vorgenannten erfindungsgemäßen Fusionsproteine codiert. Bevorzugt ist die Nukleotidsequenz des Gens ausgewählt aus der Gruppe SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:29 und SEQ ID NO:30.

Weiterhin wird die Aufgabe gelöst durch einen Expressionsvektor enthaltend das zuvor genannte erfindungsgemäße Gen. Bevorzugt ist der Expressionsvektor. ausgewählt aus der Gruppe pTE4081, pTE4082, pTE4083, pTE4084, pTE4089, pTE40810, pTE40815 und pTE40816.

Die technische Aufgabe wird zudem gelöst durch einen Mikroorganismus, der mit dem zuvor genannten erfindungsgemäßen Expressionsvektor transformiert wurde. Bevorzugt ist der Mikroorganismus E.coli JM- 101 und mit dem Plasmid pTE4083 (KCCM-10106) transformiert. In einer alternativen Ausführungsform ist der Mikroorganismus vorzugsweise E.coli JM- 101 und mit dem Plasmid pTE4084 (KCCM-10107) transformiert.

Die technische Aufgabe wird auch gelöst durch ein Verfahren zur Herstellung eines Fusionsproteins, umfassend die Schritte: Induktion der Expression des zuvor beschriebenen erfindungsgemäßen Fusionsproteins in einem der zuvor genannten erfindungsgemäßen Mikroorganismen, und Erhalten des rekombinanten Fusionsproteins.

Die technische Aufgabe wird zudem gelöst durch ein Antikrebsmittel, enthaltend das erfindungsgemäße Fusionsprotein enthaltend das Verfahrensprodukt des zuvor beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahrens als aktiven Wirkstoff und pharmazeutisch akzeptable Träger.

Die Erfinder haben den Versuch unternommen, die vorgenannten Probleme der Immunotoxizität, die durch die Antikörperbildung entstand, und die niedrige Zieleffizienz aufgrund des hohen Molekulargewichtes von mindestens 50 kDa, zu lösen. Sie haben schließlich ein gentechnisch erzeugtes Fusionsprotein mit niedrigem Molekulargewicht entwickelt, bestehend aus hEGF und Angiogenin, die beide natürlicherweise im menschlichen Körper vorkommen und keine Toxizität nach Verabreichung einer Überdosis zeigen. Weiterhin stellten die Erfinder eine große Menge des Fusionsproteins durch Klonierung und Expression eines Fusionsgens in Bakterien her, das für hEGF und Angiogenin codiert. Dessen Wirksamkeit ist verglichen mit den herkömmlichen Antikrebsmitteln wesentlich verbessert worden, hinsichtlich, daß: 1) es das Wachstum der Krebszellen, die den hEGF-Rezeptor exprimieren, selektiv hemmt; 2) es keine schädliche Wirkungen auf das Wachstum normaler Zellen aufweist; 3) es keine Toxizität der herkömmlichen chemischen Antikrebsmittel zeigt; und 4) es keine ernsten Probleme durch Bildung von Antikörpern gegen das Fusionsprotein verursacht.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Der Gegenstand und die Merkmale der vorliegenden Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung, die in Verbindung mit den anliegenden Zeichnungen gegeben wird, ersichtlich, wobei:

1 eine Plasmidkarte eines Expressionsvektors pTE105 ist.

2 ein schematisches Diagramm ist, das die Strategie der Konstruktion eines rekombinanten Vektors pRSang beschreibt.

3 ein schematisches Diagramm ist, das die Strategie der Konstruktion eines rekombinanten Vektors pTEang beschreibt.

4 ein schematisches Diagramm ist, das die Strategie der Konstruktion eines rekombinanten Vektors pTE4081 beschreibt, der das Fusionsprotein Angiogenin-Glycin-hEGF exprimiert.

5 ein schematisches Diagramm ist, das die Strategie der Konstruktion eines rekombinanten Vektors pTE4082 beschreibt, der das Fusionsprotein Angiogenin-(Glycin)₄-Serin-hEGF exprimiert.

6 ein schematisches Diagramm ist, das die Strategie der Konstruktion eines rekombinanten Vektors pTE4083 beschreibt, der das Fusionsprotein hEGF-Angiogenin exprimiert.

7 ein schematisches Diagramm ist, das die Strategie der Konstruktion eines rekombinanten Vektors pTE4084 beschreibt, der das Fusionsprotein hEGF-Glycin-Angiogenin exprimiert.

8 ein schematisches Diagramm ist, das die Strategie der Konstruktion eines rekombinanten Vektors pTE4089 beschreibt, der das Fusionsprotein hEGF-(Glycin)₄-Serin-Angiogenin exprimiert.

9 ein schematisches Diagramm ist, das die Strategie der Konstruktion eines rekombinanten Vektors pTE40810 beschreibt, der das Fusionsprotein hEGF-[(Glycin)₄-Serin]₂-Angiogenin exprimiert.

10 ein schematisches Diagramm ist, das die Strategie der Konstruktion eines rekombinanten Vektors pTE40815 beschreibt, der das Fusionsprotein Angiogenin-(Glycin)₄-Serin-hEGF-(Glycin)₄-Serin-Angiogenin exprimiert.

11 ein schematisches Diagramm ist, das die Strategie der Konstruktion eines rekombinanten Vektors pTE40816 beschreibt, der das Fusionsprotein hEGF-(Glycin)₄-Serin-Angiogenin-(Glycin)₄-Serin-hEGF exprimiert.

12(A) eine Photographie einer Bakterienkultur von E.coli JM 101 Transformanten ist, die durch die SDS-PAGE-Technik analysiert wurden.

12(B) eine Photographie einer Western-Blot Analyse von 12(A) ist.

13(A) eine Photographie einer SDS-PAGE und einer Western-Blot Analyse einer Bakterienkultur von E.coli JM 101 ist, die mit einem rekombinanten Vektor pTE4089 transformiert wurde.

13(B) eine Photographie einer SDS-PAGE und einer Western-Blot Analyse einer Bakterienkultur von E.coli JM 101 ist, die mit einem rekombinanten Vektor pTE40810 transformiert wurde.

14(A) eine Photographie ist, die die Größe der Tumore der Mäuse der Kontrolle zeigt.

14(B) eine Photographie ist, die die Größe der Tumore der Mäuse zeigt, die durch Injektion von hEGF-(Glycin)₄-Serin-Angiogenin behandelt wurden.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Ein Fusionsprotein, das in der vorliegenden Erfindung neu entwickelt wurde, wird durch die Verbindung eines Tracerproteins (Leitprotein), das hEGF, und einem toxischen Protein, das Angiogenin, das zu der Ribonuklease-Superfamilie gehört, hergestellt, mit der Hilfe eines geeigneten Linkers, um die korrekte Faltung eines jeden Proteinmoleküls zu erlauben.

Als Ergebnis, besteht das Fusionsprotein aus drei Bestandteilen: einem Tracer, das hEGF, der die Krebszellen aufspürt; einem Cytotoxin, dem Angiogenin, das diese abtötet; und einem Linker, der das hEGF und das Angiogenin verbindet, um ihre biologischen Aktivitäten zu gewährleisten. Diesbezüglich wirkt das hEGF als Mittel, um das Fusionsprotein zu den Krebszellen zu leiten, die den hEGF-Rezeptor exprimieren, und dann in Form eines Fusionsproteins aufgenommen zu werden; das Angiogenin wirkt als Mittel zum Abtöten der Krebszellen durch Abbau der Ribonukleinsäuren, nachdem die Aufnahme des Tracers durch die Krebszellen erfolgt ist; und das Linkerpeptid verbindet den Tracer (d.h. das hEGF) mit dem Cytotoxin (d.h. das Angiogenin) und erhält ihre Tertiärstruktur aufrecht.

Wie oben beschrieben, stellt die vorliegende Erfindung ein neues Fusionsprotein bereit, das die Probleme der herkömmlichen Antikrebsmittel, solche wie die niedrige Zieleffizienz, die Kontamination mit chemischen Substanzen während des Herstellung, die Antigenizität des Fusionsproteins, die Toxizität des Cytotoxins, erfolgreich löst.

In der Vergangenheit haben Fusionsproteine, die als Antikrebsmittel verwendet wurden, eine Toxizität gezeigt, die von der Antikörperbildung herrührte, die innerhalb von 1 Woche nach der Verabreichung erfolgte, und auf der Antigenizität des als Tracer verwendeten Antikörpers oder der Toxizität des von einem Mikroorganismus stammenden Cytotoxins beruht. Insbesondere im Falle der Fusionsproteine, die aus Diphtherie- oder Pseudomonas-Toxinen erzeugt wurden, waren die Fusionsproteine nicht mehr gegen die Krebszellen wirksam, da die meisten Patienten bereits Antikörper gegen die Fusionsproteine vor der Verabreichung der Arzneimittel entwickelt hatten.

Auf der anderen Seite, kommen die im erfindungsgemäßen Fusionsprotein verwendeten Moleküle, Tracer und Cytotoxin, bereits im menschlichen Körper vor, so daß das Cytotoxin die Cytotoxizität nur zeigt, wenn es durch den Tracer zur Zielzelle geleitet wird und dann in die Zelle aufgenommen wird, wobei das Cytotoxin seinerseits keine Toxizität außerhalb der Zellen aufweist.

Im Allgemeinen, wird bevorzugt ein Fusionsprotein geringer Größe zu verwendet, um die Zieleffizienz des Fusionsproteins gegen die Krebszellen zu erhöhen. Bei der vorliegenden Erfindung, wurde die Zieleffizienz durch die Verwendung von Proteinen mit geringem Molekulargewicht sehr stark verbessert, nämlich des 6 kD hEGF und des 14,4 kD Angiogenin. Unter Berücksichtigung, daß die herkömmlichen Fusionsproteine mindestens 50 kD aufweisen, ist das 20,4 kD (6 kD + 14,4 kD) Fusionsprotein gemäß der Erfindung bezüglich seines Molekulargewichtes überraschend klein.

Zusätzlich, wendeten die Erfinder kein chemisches Verfahren an, um die Probleme bezüglich der Proteindenaturierung und Kontamination während der chemischen Konjugation zu vermeiden, sondern führten stattdessen ein gentechnisches Verfahren ein, das die Gene eines Tracers und eines Cytotoxins durch einen geeigneten Linker miteinander verbunden werden. Anschließend wird das Fusionsprotein in rekombinanten Mikroorganismen hergestellt, die damit transformiert wurden. In diesem Verfahren ist jede Proteinkomponente in einem molekularen Verhältnis von 1 : 1 oder 1 : 0,5 – 2 (Tracer : toxischem Protein) gebunden. Als Linker wird vorzugsweise ein Peptid bestehend aus einer angemessenen Anzahl von Aminosäuren verwendet, um die Aktivität jeder Proteinkomponente aufrecht zu erhalten. So werden Peptide bestehend aus 0 bis 20 Aminosäuren, besonders bevorzugt Glycin, (Glycin)₄-Serin, oder [(Glycin)₄-Serin]₂ verwendet.

Als Tracer-Protein, ist es nicht nur möglich humanes EGF sondern auch EGF von Tieren, TGF, ihre Derivate und jedes andere Peptid oder Protein mit geringem Molekulargewicht zu verwenden, das in der Lage ist an hEGF-Rezeptoren zu binden. Als Cytotoxin ist es nicht nur möglich Angiogenin zu verwenden, das intrazelluläre RNA abbaut, sondern jede humane Ribonuklease, EDN (aus Eosinophilen stammendes Neurotoxin) und ihre Derivate, die zur Ribonuklease-Superfamilie gehören. Das Cytotoxin kann an den N-Terminus oder an den C-Terminus des Tracer-Moleküls gebunden werden, obwohl es bevorzugt ist den N-Terminus des Cytotoxins an den C-Terminus des Tracers zu binden.

Die Merkmale des hEGF, das als Tracer in dem erfindungsgemäßen Fusionsprotein verwendet wird, sind wie folgt:

1. Es ist nur selektiv wirksam gegen Krebszellen, die hEGF-Rezeptoren auf hohem Niveau exprimieren, und nicht gegenüber den normalen Zellen.
2. Es ist für ein breites Spektrum von Krebsarten anwendbar, solange hEGF-Rezeptoren auf hohem Niveau in den Krebszellen exprimiert werden.
3. Es dirigiert ein Cytotoxin effizient ins Ziel, da es in die Krebszellen in Form eines Fusionsproteins aufgenommen wird.
4. Es ist ein 6 kD großes Protein bestehend aus 53 Aminosäuren, das klein genug ist, um mit Leichtigkeit in die Zellen einzudringen.
5. Es ist leicht mit einem Cytotoxin zu fusionieren, da es nicht einer posttranslationalen Modifikation unterworfen ist.

Die Merkmale des Angiogenins, das als Cytotoxin in dem erfindungsgemäßen Fusionsprotein verwendet wird, sind wie folgt:

1. Es ruft keine Antikörperbildung hervor, da es aus dem Menschen stammt (es liegt mit 0,4 μg/ml im menschlichen Blut vor).
2. Es besitzt in den Zellen tRNase-Aktivität und weist nur innerhalb der Zellen nach der Aufnahme eine Toxizität auf.
3. Es besitzt eine geringe Größe (ein 14,4 kD Protein bestehend aus 123 Aminosäuren) im Vergleich mit anderen Toxinen aus Mikroorganismen, solche wie das Diphtherie-Toxin und das Pseudomonas-Toxin, oder Toxine aus Pflanzen solche wie Ricin, so daß es mit Leichtigkeit zu dem Ziel gebracht werden kann.

Die Verwendung des Fusionsproteins mit den vorgenannten Merkmalen ist breit, so als Antikrebsmittel für Krebsarten, die hEGF-Rezeptoren exprimieren, solche wir Blasenkrebs, Lungenkrebs, Hirntumore, Brustkrebs, Hautkrebs und Prostatakrebs.

Als Verfahren zur Verabreichung von Arzneimitteln enthaltend ein Fusionsprotein gemäß der Erfindung als Wirkstoff, wird die parenterale Verabreichung (z.B. die rektale Verabreichung, subkutane Injektion, i.v. Injektion) bevorzugt, obwohl auch oral verabreicht werden kann. Die Arzneimittel können in Form von Tabletten, Kapseln, Pillen, Granula, feines Pulver, Sublingualtabletten, Dragees, Salbe, Zäpfchen, Sirup und Suspension hergestellt werden. Die Arzneimittel können pharmazeutisch akzeptable Träger enthalten, solche wie Verdünnungsmittel, Zerfallhilfsmittel, Grundstoffe, isotonische Agenzien, Bindemittel, Puffer, Beschichtungsmittel, Adsorbentien, Gleitmittel, Lösungsmittel, Stabilisierungsmittel, Antioxidantien, Konservierungsmittel, Süßstoffe, Emulgatoren, Farbstoffe usw.

Im besonderen, sind die pharmazeutisch akzeptablen Träger die folgenden:
Als Verdünnungsmittel gibt es Stärke und Stärkederivate (z.B. Dextrin, Carboxymethylstärke), Cellulose und Cellulosederivate (z.B. Methylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose), Zucker (z.B. Galaktose, Fruktose, Glukose), Kieselsäure und Silikate (z.B. natürlich vorkommendes Aluminiumsilikat, Magnesiumsilikat), Carbonate (Calciumcarbonat, Magnesiumcarbonat, Natriumhydrogencarbonat), synthetische Hydrotalcite, Polyoxyethylen-Derivate, Aluminium-Magnesium Hydroxid, Glycerinmonostearat, Sorbitanmonoölsäure, usw.
Als Bindemittel gibt es Stärke und Stärkederivate (z.B. α-Stärke, Dextrin), Cellulose und Cellulosederivate (Ethylcellulose, Natriumcarboxymethylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose), Gummiarabikum, Gelatine, Zucker (z.B. Glukose, Fruktose), Ethanol, Tragantgummi, Polyvinylalkohol, usw.
Als Zerfallshilfsmittel gibt es Stärke und Stärkederivate (Carboxymethylstärke, Hydroxypropylstärke), Cellulose und Cellulose-Derivate (Natriumcarboxymethylcellulose, kristalline Cellulose, Hydroxypropylmethylcellulose), Carbonate (Calciumcarbonat, Calciumhydrogencarbonat), Gelatine, Tragantgummi, Zucker, usw.
Als Gleitmittel gibt es, Stearinsäure, Calciumstearat, Magnesiumstearat, Talk, Kieselsäure und Silikate (z.B. hartes Kieselsäureanhydrid, natürlich vorkommendes Aluminiumsilikat), Titanoxid, Calciumhydrogenphosphat, getrocknetes Aluminiumhydroxidgel, Macrogol, usw.
Als Konservierungsmittel gibt es, p-Hydroxybenzoat, Sulfite, (z.B. Natriumpyrosulfite, Natriumsulfit), Phosphate (z.B. Natriumphosphat, Calciumpolyphosphat, Natriumpolyphosphat, Natriummetaphosphat), Alkohol (z.B. Chlorbutanol, Benzylalkohol), Benzalkoniumchlorid, Benzethoniumchlorid, Phenol, Cresol, Chlorcresol, Dehydracetsäure, Natriumsalz der Dehydracetsäure, Glycerin, Sorbinsäure, Zucker usw.
Als Antioxidantien gibt es Sulfit (z.B. Natriumsulfit, Natriumhydrogensulfit), Rongalit, Erythorbinsäure, L-Ascorbinsäure, Cystein, Thioglycerin, Butylhydroxyanisol, Propylgallussäure, Ascorbylpalmitat, Dibutylhydroxytoluol, D1-α-Tocopherol.
Als isotonische Mittel gibt es, Glukose, Glycerin, Dextrin, Natriumchlorid, Natriumnitrit, Kaliumnitrit, usw.
Als Puffer gibt es, Natriumcarbonat, HCl, Phosphate, Borsäure, usw.
Als Beschichtungsmittel gibt es, Cellulosederivate (z.B. Hydroxypropylcellulose, Celluloseacetatphthalat, Hydroxypropylmethylcellulosephthalat), Schellack, Polyvinylpyrrolindon, Polyvinylpyridin (z.B. Poly-2-vinylpyridin, Poly-2-vinyl-5-ethylpyridin), Polyvinylacetyldiethylaminoacetat, Polyvinylalkoholphthalat, Methacrylat, Methacrylat-Copolymer, usw.
Als Süßstoffe gibt es Zucker (Glukose, Fruktose, Lactose), Natriumsaccharin, Zuckeralkohol, usw.
Als Lösungsmittel gibt es Ethylendiamin, Nicotinamid, Natriumsaccharin, Citronensäure, Natriumcitrat, Natriumbenzoat, Polyvinylpyrrolindon, Polysolvate, Sorbitanfettsäureester, Glycerin, Propylenglykol, Benzylalkohol, usw.
Als Grundsubstanzen gibt es Fett (Schweinefett), Pflanzenöl (z.B. Olivenöl, Sesamöl) tierisches Fett, Lanolinsäure, Petrolatum, Paraffin, Wachs, Harz, Bentonit, Glycerin, Glykolöl, Fettalkohole (z.B. Stearylalkohol, Cetylalkohol), usw.
Als Dispergiermittel gibt es, Gummiarabikum, Tragantgummi, Cellulosederivate (Methylcellulose), Polystearate, Sorbitansesquioleat, Aluminiummonostearinsäure, Natriumalginat, Polysorbat, Sorbitanfettsäureester, usw.
Als Stabilisierungsmittel gibt es, Sulfite (Natriumsulfit), Stickstoff, Kohlendioxid, usw.

Die Arzneimittel enthalten das erfindungsgemäße Fusionsprotein in einer Konzentration von 0,01 bis 100 % (w/w), obwohl die Menge entsprechend der Dosierungsform der Arzneimittel variiert.

Die Verabreichungsdosis hängt vom Körpergewicht des Patienten, von der Schwere der Krankheit und von der Beurteilung des Arztes ab. Es ist jedoch allgemein ratsam 0,01 bis 10 mg/kg Körpergewicht pro Tag, vorzugsweise 0,42 bis 2 mg bei Injektionen zu verabreichen. Bei anderen Darreichungsformen als die Injektion ist es ratsam, die Konzentration des im Blut zirkulierenden Fusionsproteins in die Betrachtung einzubeziehen.

Die tägliche Dosis kann einmal oder mehrere Male entsprechend der Schwere der Krankheit und entsprechend der Beurteilung des Arztes verabreicht werden.

Die vorliegende Erfindung wird in den folgenden Beispielen weiter erläutert wird, die den Schutzumfang der Erfindung nicht begrenzen sollen.
Die Konzentrationsangaben "mM" und "μM" beziehen sich auf mMol/l bzw. μMol/l.
Beispiel 1: Die Konstruktion eines Gens, das für hEGF und Angiogenin codiert
Um das hEGF-Gen zu präparieren (SEQ ID NO:3) wurde ein Expressionsvektor pTED (siehe: koreanische Patentveröffentlichung Nr. 96-53539, KFCC-10925) konstruiert mittels gerichteter Mutagenese des Expressionsvektors pTE105 (siehe: 1, koreanische Patentveröffentlichung Nr. 96-6121, KCCM-10027) und wurde als Quelle für das hEGF-Gen verwendet.
Das humane Angiogenin-Gen (SEQ ID NO: 1) wurde mittels PCR gewonnen, deren Parameter die folgenden waren: 30 pMole eines Primers (SEQ ID NO: 5) enthaltend eine EcoR I-Restriktionsschnittstelle und 30 pMole eines anderen Primers (SEQ ID NO:6) enthaltend eine Hind III-Schnittstelle, wurden zu einer cDNA-Bibliothek hinzugefügt, die aus einer menschlichen Leber gewonnen wurde, und schließlich in einem Premix-Top-Reaktionsgefäß gemischt (Premix^TM-TOP, Cat#K2010, Bioneer Corp., Korea; enthaltend 1 Unit Polymerase, 250 μM Mixing-Lösung, 40 μM KCl, 1,5 μM MgCl₂, und 50 μM Tris-HCl (pH 9,0)), danach wurde das Endvolumen durch Zugabe von destilliertem Wasser auf 20 μl erhöht, und 30 μl Mineralöl wurde obenauf gegeben, um die Verdunstung der Lösung zu verhindern. Die DNA wurde in einer PCR-Reaktion mit 35 Zyklen amplifiziert, die jeweils für 5 Minuten bei 94 °C, 2 Minuten bei 58 °C, 30 Sekunden bei 72 °C, 1 Minute bei 94 °C und schließlich 20 Sekunden bei 72 °C durchgeführt wurden.
Als Ergebnis wurde ein 380 bp PCR-Produkt erhalten, in das das humane Angiogenin-Gen (SEQ ID NO:1) und eine EcoR I- und eine Hind III-Restriktionsschnittstelle eingefügt wurden. Die PCR-Produkte wurden mit EcoR I und Hind III geschnitten und mit einem 2943 bp DNA-Fragment gemischt, das aus einer EcoR I/Hind III-Restriktionsspaltung des pRSETA (Invitrogen, USA) erhalten wurde, um kohäsive bindende Enden zu erzeugen. Die DNA-Fragmente wurden unter Inkubation mit 0,5 μl T4-DNA-Ligase bei 16 °C für 18 Stunden miteinander ligiert.
Das erhaltene Plasmid wurde pRSang benannt und zur Transformation von E.coli BL21(DE3) verwendet. Die 2 zeigt schematisch die Strategie der Konstruktion des rekombinanten Vektors pRSang.
Beispiel 2: Konstruktion eines Expressionsvektors pTEang für humanes Angiogenin
Das humane Angiogenin-Gen wurde in einen Expressionsvektor pTED(KFCC-10925) eingefügt, der in Beispiel 1 erhalten wurde, um das Angiogenin-Gen unter Kontrolle des OmpA(tac-Promotor)-Systems zu exprimieren. Für die PCR-Reaktion wurden zwei Primer verwendet: ein Primer (SEQ ID NO:7) enthält eine Das I-Restriktionsschnittstelle, und der andere Primer (SEQ ID NO:8) enthält eine Ava I und eine Pst I-Restriktionsschnittstelle, und im Angiogenin-Gen an der Position 122 ein aus dem Codon Arg(CGT) umgewandeltes Codon für die Aminosäure Arg(CGC), und enthält ein zusätzliches Gly-Codon an Position 124 im Angiogenin-Gen. Der rekombinante Vektor pRSang wurde als Template verwendet. Die Reaktion wurde mit 100 ng pRSang, 100 pM von jedem Primer, 2 mM von jedem dNTP (insgesamt 8 mM), Reaktionslösung enthaltend Mg²⁺, und 1 Unit PFU-Polymerase, durchgeführt. Das Endvolumen wurde auf 100 μl erhöht. Die DNA wurde in 32 Zyklen amplifiziert, wobei jeder Zyklus bei 94 °C für 1 Minute, 58 °C für 1 Minute, und 72 °C für 70 Sekunden durchgeführt wurde, und anschließend wurde für 5 Minuten bei 72 °C inkubiert. Ein amplifiziertes 391 bp PCR-Produkt wurde in einem 1%igen (w/v) Agarosegel mittels Elektrophorese aufgetrennt, aus dem Gel ausgeschnitten, aufgereinigt, und dann nach einer Restriktionsspaltung mit Das I und Pst I nochmals aufgereinigt.
Ein 391 bp PCR-Produkt, das mit Das I/Pst I geschnitten wurde, wurde mit einem 2777 bp DNA-Fragment gemischt, das von dem mit Das I/Pst I geschnittenen und danach aufgereinigten Plasmidvektor pTED gewonnen wurde. Diese beiden DNA-Fragmente wurden mit 0,5 μl T4-Ligase bei 16 °C für 18 Stunden zusammen ligiert. Das ligierte Plasmid wurde pTEang genannt und zur Transformation von E.coli JM 101 verwendet. Um die korrekte Insertion des Angiogenin-Gens in den Plasmidvektor pTEang zu überprüfen, wurde dieser mit Ava I, Sma I, und AlwN I geschnitten. 3 zeigt schematisch die Strategie der Konstruktion des rekombinanten Vektors pTEang.
Angiogenin wurde auf hohem Niveau in Form von Einschlusskörperchen in gleicher Weise, wie oben erwähnt, exprimiert außer, daß der Primer (SEQ ID NO: 7) mit einem anderen Primer (SEQ ID NO: 16) enthaltend eine Nde I Restriktions-Schnittstelle, ersetzt wurde.
Beispiel 3: Konstruktion eines Expressionsvektors pTE4081 enthaltend ein Fusionsgen von Angiogenin und hEGF(I)
Um ein Fusionsgen von Angiogenin und hEGF herzustellen, wurde ein Expressionsvektor pTE4081 konstruiert, enthaltend das Gen für Angiogenin und hEGF, indem ein des aus dem Beispiel 1 erhaltenden Plasmid pTED, welches das EGF-Gen enthält, mit einem Plasmid pTEang, welches das Angiogenin-Gen enthält, das in Beispiel 2 erhalten wurde, miteinander fusioniert wurden. 4 zeigt schematisch die Strategie der Konstruktion des rekombinanten Vektors pTE4081.
Im Einzelnen, wurde ein Plasmid pTED enthaltend das EGF-Gen mit Blp I und Pst I geschnitten und dann in einem 1,5 %igen (w/v) Agarosegel aufgetrennt, um ein 149 bp DNA-Fragment, welches das aufgereinigte EGF-Gen enthält, zu erhalten. pTEang enthaltend Angiogenin wurde mit Ava I und Pst I geschnitten und in einem 0,8 %igen (w/v) Agarosegel aufgetrennt, um ein 3156 bp DNA-Fragment, welches das aufgereinigte Angiogenin-Gen enthält, zu bekommen.
Der Linker wurde wie folgt hergestellt: 100 pMole eines Oligomers (SEQ ID NO: 9), 100 pMole eines anderen Oligomers (SEQ ID NO: 10), 1,5 μl 10 nM ATP, 15 Unit T₄-Polynukleotidkinase wurden gemischt und für 1 Stunde bei 37 °C und dann 5 Minuten bei 95 °C inkubiert, um die 5'-Enden zu phosphorylieren. Die phosphorylierten Oligomere wurden durch Erhitzen auf 95 °C für 5 Minuten und durch langsames Abkühlen auf 30 °C für 3 Stunden zusammengefügt, um 5'- und 3'-Enden zu erhalten, die an Ava I- und Bgl II-Enden binden. Der phosphorylierte Linker wurde mit einem 149 bp DNA-Fragment, welches das EGF-Gen enthält, und einem 3156 bp DNA-Fragment enthaltend das Angiogenin-Gen gemischt. Die drei DNA-Fragmente wurden durch Inkubation mit 0,5 μl T₄-Ligase bei 16 °C für 18 Stunden ligiert. Dieses rekombinante Plasmid pTE4081 wurde zur Transformation von E.coli JM101 verwendet. Die korrekte Insertion von Angiogenin und EGF in den Plasmidvektor pTE4081 wurde durch Restriktionsspaltungen mit Das I, AlwN I, Nsi I und Sma I bestätigt. Um die genaue Insertion zu bestätigen, wurde das rekombinante Plasmid unter Verwendung der Sanger Dideoxynukleotid-Sequenz-Analyse sequenziert (siehe: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Edition, Sambrook et al., 13.6 – 13.10).
Beispiel 4: Konstruktion eines Expressionsvektors pTE4082 enthaltend ein Fusionsgen von Angiogenin und hEGF(II)
Um ein Fusionsgen von Angiogenin und hEGF herzustellen, wurde ein Expressionsvektor pTE4082 konstruiert, welches die Gene für Angiogenin und EGF enthalten, indem das in Beispiel 3 erhaltene DNA-Fragment, welches das EGF-Gen enthält, ein DNA-Fragment enthaltend das Angiogenin-Gen, und ein Linker (SEQ ID NO: 11 und SEQ ID NO: 12) fusioniert wurden. 5 zeigt schematisch die Strategie der Konstruktion des rekombinanten Vektors pTE4082. Der Expressionsvektor pTE4082 wurde analog zu Beispiel 3 konstruiert außer, daß unterschiedliche Linker (SEQ ID NO: 11) und SEQ ID NO: 12) verwendet wurden. Die korrekte Insertion der Gene in den Expressionsvektor wurde auf gleiche Weise wie in Beispiel 5 bestätigt.
Beispiel 5: Konstruktion eines Expressionsvektors pTE4083 enthaltend ein Fusionsgen aus Angiogenin und hEGF(III)
Ein Expressionsvektor enthaltend ein Fusionsgen aus hEGF und Angiogenin wurde hergestellt, indem ein 2929 bp DNA-Fragment, das durch Afl II/Pst I Restriktionsspaltung des pTE105 erhalten wurde und ein über PCR amplifiziertes Fragment enthaltend Angiogenin, miteinander fusioniert wurden. Für die PCR-Reaktion wurde pTEang als Template verwendet, und zwei Primer (SEQ ID NO: 13 und SEQ ID NO: 14) wurden hinzugefügt. 6 zeigt schematisch die Strategie der Konstruktion von pTE4083.
Im Einzelnen, wurde pTE105, welches das hEGF-Gen enthält, mit Afl II und Pst I gespalten und auf einem 0,8 %igen (w/v) Agarosegel mittels Elektrophorese aufgetrennt. Ein 2929 bp Fragment, welches das hEGF-Gen enthält, wurde aus dem Gel ausgeschnitten und danach aufgereinigt. Eine PCR-Reaktion wurde durchgeführt unter Verwendung des pTEang enthaltend das Angiogenin-Gen als Template, eines Primers (SEQ ID NO: 13) enthaltend eine Afl II-Schnittstelle, und eines Primers (SEQ ID NO: 14), welches eine Pst I-Schnittstelle enthält. Die PCR-Reaktion wurde mit 100 ng pTEang, 100 pMole von jedem Primer, 2 mM von jedem dNTP, Reaktionslösung enthaltend Mg²⁺ und 1 Unit PFU-Polymerase durchgeführt. Das Endvolumen wurde auf 100 μl erhöht. Die PCR-Parameter waren wie folgt: 32 Zyklen, jeder Zyklus bei 94 °C für 1 Minute, 58 °C für 1 Minute, 72 °C für 70 Sekunden, und 94 °C für 30 Sekunden, und schließlich wurde für 5 Minuten bei 72 °C inkubiert. Ein amplifiziertes 407 bp PCR-Produkt, welches das Angiogenin-Gen enthält, wurde in einem 1 %igen (w/v) Agarosegel aufgetrennt, aus dem Gel aufgereinigt und mit Afl II und Pst I geschnitten.
Das vorgenannte mit Afl II und Pst I geschnittene 2929 PCR-Produkt, welches das hEGF-Gen enthält, und das mit Afl II und Pst I geschnittene 407 bp PCR-Produkt enthaltend das Angiogenin-Gen, wurden gemischt und dann einer Ligation unterworfen, wobei mit 0,5 μl T4-DNA Ligase bei 16 °C für 18 Stunden inkubiert wurde, um pTE4083 zu erzeugen. Das Plasmid pTE4083 wurde zur Transformation von E.coli JM 101 verwendet. Die korrekte Insertion des Angiogenin-Gens und des hEGF-Gens in den Plasmidvektor pTE4083 wurde durch Restriktionsspaltung unter Verwendung von AlwN I, BspM I, Afl II und Pst I bestätigt. Schließlich wurde die genaue Insertion mit der Sanger Dideoxynukleotid-Sequenz-Analyse nochmals bestätigt.
Die mit dem Plasmid pTE4083 transformierten E.coli JM 101 Zellen, wurden als E.coli JM101-Plasmid pTE4083 bezeichnet und bei dem Korean Culture Center of Microorganisms (KCCM), einer internationalen Hinterlegungsstelle in 134 Shinchon-Dong, Seodaemun-Ku, Seoul, Korea, unter der Nummer KCCM-10106 am 4. September 1997 hinterlegt.
Beispiel 6: Konstruktion eines Expressionsvektors pTE4084 enthaltend ein Fusionsgen aus Angiogenin und hEGF(IV)
Ein anderer Expressionsvektor pTE4084 enthaltend ein Fusionsgen von Angiogenin und hEGF wurden auf ähnliche wie in Beispiel 5 erzeugt außer, daß ein 410 bp DNA-Fragment enthaltend das Angiogenin-Gen unter Verwendung von zwei Primern (SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 15) amplifiziert wurde. Die 7 zeigt schematisch die Strategie der Konstruktion des rekombinanten Vektors pTE4084. Die korrekte Insertion der Gene in den Vektor wurde auf gleiche Weise bestätigt, wie in Beispiel 5.
Die mit dem Plasmid pTE4084 transformierten E.coli JM 101 Zellen, wurden als E.coli JM101-Plasmid pTE4084 bezeichnet und bei dem Korean Culture Center of Microorganisms (KCCM), einer internationalen Hinterlegungsstelle in 134 Shinchon-Dong, Seodaemun-Ku, Seoul, Korea, unter der Nummer KCCM-10107 am 4. September 1997 hinterlegt.
Beispiel 7: Konstruktion eines Expressionsvektors pTE4089 enthaltend ein Fusionsgen von Angiogenin und hEGF(V)
Drei DNA-Fragmente wurden miteinander ligiert, um einen Expressionsvektor pTE4089 zu erzeugen, enthaltend ein Fusionsgen von Angiogenin und hEGF. Das erste 3001 bp Fragment enthält den Teil mit dem Angiogenin-Gen und dem hEGF-Gen, das durch Spaltung des pTE4083 mit Nsi I/BstE II erhalten wurde. Das zweite Nsi I/BamHI Fragment enthält einen Teil des hEGF-Gens, das mittels PCR-Amplifikation unter Verwendung des pTE4083 als Template und zwei Primern (SEQ ID NO: 25 und SEQ ID NO: 26) präpariert wurde. Das letzte BamH I/BstE II Fragment enthält einen Teil des Angiogenin-Gens, das mittels PCR-Amplifikation unter Verwendung des pTE4083 als Template und zwei Primern (SEQ ID NO: 14 und SEQ ID NO: 27) präpariert wurde. 8 zeigt schematisch die Strategie der Konstruktion des rekombinanten Vektors pTE4089.
Im Einzelnen wurde pTE4083 enthaltend Angiogenin und hEGF mit Nsi I und BstE II gespalten. Ein 3001 bp DNA-Fragment enthaltend hEGF und den Teil mit dem Angiogenin-Gen wurden in einem 0,8 %igen (w/v) Agarosegel aufgetrennt.
Ein DNA-Fragment enthaltend den Teil des hEGF-Gens wurde mittels PCR-Amplifikation unter Verwendung des pTE4083 als Template und einem Primer enthaltend eine Nde I-Restriktionsschnittstelle (SEQ ID NO: 25) und einem anderen Primer enthaltend eine BamH I-Restriktionsschnittstelle (SEQ ID NO: 26) präpariert. Die PCR-Reaktion wurde mit 100 ng pTE4083 (1 μl), 100 pMole von jedem Primer, 2 mM von jedem dNTP, Reaktionslösung enthaltend Mg²⁺, und 1 Unit PFU-Polymerase durchgeführt. Das Volumen der Reaktionsmischung wurde auf 100 erhöht. Der PCR-Ansatz wurde für 1 Minute bei 94 °C vorerhitzt und für 30 Sekunden bei 94 °C denaturiert, für 1 Minute bei 58 °C annealt und die Polymerisierungsreaktion für 2 Minuten bei 72 °C durchgeführt. Denaturierung, Annealing und Polymerisation wurden in 35 Zyklen wiederholt und dann wurde die DNA für 5 Minuten bei 72 °C amplifiziert.
Ein DNA-Fragment, welches den Teil des Angiogenin-Gens enthält, wurde mittels PCR-Reaktion in gleicher Weise wie oben beschrieben präpariert, unter Verwendung eines Primers, enthaltend eine BamH I-Restriktionsschnittstelle (SEQ ID NO: 27), und eines anderen Primers, enthaltend eine Pst I-Restriktionsschnittstelle (SEQ ID NO: 14). Ein 171 bp hEGF-Fragment wurde mittels PCR und ein 400 bp Angiogenin-Fragment wurden in einem 1 %igen (w/v) Agarosegel aufgetrennt, aufgereinigt und dann mit BamH I gespalten.
Beide Fragmente wurden nach der Restriktionsspaltung des hEGF mit Nsi I und des Angiogenins mit BstE II nochmals aufgetrennt und aufgereinigt.
Ein 3001 bp Fragment enthaltend hEGF und Angiogenin, ein 108 bp Fragment, das über eine PCR-Reaktion präpariert wurde, und ein 236 bp Angiogenin-Fragment wurden mit 0,5 μl T₄ DNA-Ligase gemischt und dann für 18 Stunden bei 16 °C inkubiert, um pTE4089 herzustellen, das zur Transformation von E.coli JM 101 verwendet wurde. Die korrekte Insertion des Angiogenins und des hEGF in den Plasmidvektor pTE4089 wurde mittels Restriktionsspaltung mit AlwN I, BspM I, BamH I, Afl II und Pst I, gefolgt von einer Elektrophorese in einem 1 %igen (w/v) Agarosegel, bestätigt. Schließlich wurde die Sanger Dideoxynukleotid-Sequenzanalyse verwendet, um die korrekte Insertion zu gewährleisten (siehe: SEQ ID NO: 23).
Beispiel 8: Konstruktion eines Expressionsvektors pTE40810 enthaltend ein Fusionsgen von Angiogenin und hEGF(VI)
Ein anderer Expressionsvektor pTE40810 enthaltend ein Fusionsgen von Angiogenin und hEGF wurde auf gleiche Weise wie in Beispiel 7 hergestellt außer, daß ein 415 bp DNA-Fragment unter Verwendung eines anderen Primers (SEQ ID NO: 28) amplifiziert wurde und danach mit BamH I/BstE II gespalten wurde, um ein 251 bp Fragment für die DNA-Ligation zu erzeugen. Die 9 zeigt schematisch die Strategie der Konstruktion des rekombinanten Vektors pTE40810. Die korrekte Insertion des Fusionsgens wurde auf gleiche Weise wie in Beispiel 7 bestätigt (siehe: SEQ ID NO: 24).
Beispiel 9: Konstruktion eines Expressionsvektors pTE40815 enthaltend ein Fusionsgen Angiogenin-hEGF-Angiogenin
Um ein Fusionsgen Angiogenin-hEGF-Angiogenin herzustellen, wurde zunächst ein 3313 bp Vektor-Fragment durch Auftrennung des mit Pst I/Afl II geschnittenen pTE4082, das in Beispiel 4 erhalten wurde, aus einem 0,8 %igen (w/v) Agarosegel erhalten. Ein 416 bp Fragment eines Fusionsgens enthaltend Angiogenin, ein Linker und das 3'-Ende des hEGF wurde durch Auftrennung des mit Afl II/Pst I geschnittenen pTE4089, der in Beispiel 7 erhalten wurde, in einem 1,2 %igen (w/v) Agarosegel erhalten.
Ein 416 bp Fragment und ein 3313 bp Fragment wurden miteinander gemischt und mit 0,5 μl T₄ DNA-Ligase für 18 Stunden bei 16 °C ligiert, um pTE40815 zu erzeugen. Die 10 zeigt schematisch die Strategie der Konstruktion von pTE40815. Ein Plasmid pTE40815 wurde zur Transformation von E.coli JM101 verwendet. Die korrekte Insertion des Fusionsgens Angiogenin-hEGF-Angiogenin in den Plasmidvektor pTE40815 wurde mittels Restriktionsspaltung mit AlwN I, BspM I, BamHI, Afl II und Pst I bestätigt. Schließlich wurde die genaue Insertion mit der Sanger Dideoxynukleotid-Sequenz-Analyse bestätigt (siehe: SEQ ID NO: 29).
Beispiel 10: Konstruktion eines Expressionsvektors pTE40816 enthaltend ein Fusionsgen hEGF-Angiogenin-hEGF
Um ein Fusionsgen hEGF-Angiogenin-hEGF zu erzeugen, wurde ein 3195 bp Vektorfragment des mit Pst I/BstE II geschnittenen pTE4089, der in Beispiel 7 erhalten wurde, durch Auftrennung in einem 0,8 %igen (w/v) Agarosegel erhalten. Ein 324 bp Fragment des Fusionsgens enthaltend hEGF, einen Linker und das 3'-Ende des Angiogenins wurden durch Auftrennung des mit Pst I/BstE II geschnittenen pTE4082, der in Beispiel 4 erhalten wurde, in einem 1,2 %igen (w/v) Agarosegel erhalten. Ein 324 bp Fragment und ein 3195 bp Fragment wurden zusammen gemischt und mit 0,5 μl T₄ DNA-Ligase für 18 Stunden bei 16 °C ligiert, um pTE40816 zu erzeugen. 11 zeigt schematisch die Strategie der Konstruktion des rekombinanten Vektors pTE40816. Ein Plasmid pTE40816 wurde zur Transformation von E.coli JM 101 verwendet. Die korrekte Insertion eines Fusionsgens hEGF-Angiogenin-hEGF in den Plasmidvektor pTE40816 wurde durch Restriktionsspaltung mit AlwN I, BspM I, BamH I, Afl II und Pst I bestätigt. Schließlich wurde die genaue Insertion mit der Sanger Dideoxynukleotid-Sequenz-Analyse bestätigt (siehe: SEQ ID NO: 30).
Beispiel 11: Expression eines Fusionsproteins von Angiogenin und hEGF in transformierten E.coli JM 101-Zellen
E.coli JM 101-Zellen, die mit aus den Beispielen 3 bis 8 erhaltenen pTE4081, pTE4082, pTE4083, pTE4084, pTE4089 oder pTE40810 transformiert wurden, wurden in 2 ml Tetracyclin-LB Medien angeimpft und für dann 18 Stunden bei 37 °C inkubiert, um Start-Kulturen zu erhalten. 100 ml Tetracyclin-LB Medien wurden mit 2 ml der Start-Kulturen beimpft und bei 37 °C inkubiert. Als die optische Dichte von O.D.₆₀₀ 0,7 – 1,0 erreicht wurde, wurde IPTG (Isopropyl-β-Galaktosid) in einer Endkonzentration von 1 mM hinzugegeben, um die Expression des Fusionsgens zu induzieren. Nach Zugabe des IPTG mit einer Endkonzentration von 1 mM wurde die Kultur für weitere 20 Stunden inkubiert. Die Bakterienkultur wurde durch Zentrifugation für 15 Minuten bei 7.000 g bei 4 °C abgeerntet, mittels SDS-PAGE und Western-Blot unter Verwendung eines Anti-hEGF-Antikörpers und eines Anti-Angiogenin-Antikörpers analysiert (siehe: 12(A), 12(B), 13(A) und 13(B)).
12(A) zeigt das erhaltene Ergebnis der SDS-PAGE der Bakterienkulturen von mit pTE4081, pTE4082, pTE4083 oder pTE4084 transformierten E.coli JM 101-Zellen. 12(B) zeigt das Ergebnis des Western-Blots der SDS-PAGE unter Verwendung eines Anti-hEGF-Antikörpers. In den 12(A) und 12(B), stellen dar: Spur 1: den Molekulargewichtsstandard; Spur 2: Überstand der E.coli JM 101-Kultur, transformiert mit pTE4081; Spur 3: Überstand der E.coli JM 101-Kultur, transformiert mit pTE4082; Spur 4: Überstand der E.coli JM 101-Kultur, transformiert mit pTE4083; Spur 5: Überstand der E.coli JM 101-Kultur, transformiert mit pTE4084.
13(A) zeigt die Ergebnisse der SDS-PAGE und Western-Blot Analyse der Bakterienkultur E.coli JM 101 transformiert mit pTE4089. 13(B) zeigt das Ergebnis der SDS-PAGE und Western-Blot Analyse der Bakterienkultur E.coli JM 101 transformiert mit pTE40810. In 13(A) stellen dar: Spur M Molekulargewichtsstandard; Spur a: SDS-PAGE des Überstandes der Kultur der IPTG-induzierten E.coli JM 101-Transformanten; Spur b: Western-Blot Analyse unter Verwendung eines Anti-hEGF-Antikörpers; Spur c: Western-Blot Analyse unter Verwendung eines Anti-Angiogenin-Antikörpers. In 13(B) stellen dar: Spur M: der Molekulargewichtsstandard; Spur a: SDS-PAGE des Überstandes der Kultur der E.coli JM 101-Transformanten vor der IPTG-Induktion; Spur b: SDS-PAGE des Überstandes der E.coli JM 101 Transformanten nach der IPTG-Induktion; Spuren c und d: Western-Blot Analyse unter Verwendung eines Anti-hEGF-Antikörpers; und Spuren e und f: Western-Blot Analyse unter Verwendung eines Anti-Angiogenin-Antikörpers.
Wie in den 12(A), 12(B), 13(A) und 13(B) gezeigt, wird ein Fusionsprotein von Angiogenin (SEQ ID NO:2) und hEGF (SEQ ID NO:4) auf hohem Niveau exprimiert. Daher ist es vernünftig anzunehmen, daß eine genügende Menge des Fusionsproteins von Angiogenin und hEGF in E.coli JM 101-Zellen, die mit pTE40815 (aus Beispiel 9 erhalten) und mit pTE40816 (aus Beispiel 10 erhalten) transformiert wurden, ebenfalls auf hohem Niveau exprimiert werden.
Beispiel 12: Aufreinigung eines Fusionsproteins und Aminosäuresequenzierung
LB-Medien wurden mit E.coli angeimpft, die mit einem der in Beispiel 11 beschriebenen Expressionsvektoren transformiert wurden, (d.h. pTE4081, pTE4082, pTE4083, pTE4084, pTE4089, pTE40810, pTE40815 und pTE40816), werden anschließend bei 37 °C bis zum Erreichen einer OD₆₀₀ von 1,0 angezogen, IPTG mit einer Endkonzentration von 1 mM hinzugefügt, um die Expression eines Fusionsproteins zu induzieren und schließlich für weitere 20 Stunden angezogen. Die Bakterienkultur wurde durch Zentrifugation abgeerntet, um Zellpellets zu erhalten. Die Zellen wurden mit Lysozym oder mit einem osmotischen Schock lysiert, um das Protein zu erhalten, das anschließend in einer 14 %igen SDS-PAGE aufge trennt wurde. Das gewünschte Protein wurde mittels Western-Blot Analyse bestätigt. Eine übertragene Proteinbande wurde aus der PVDF-Membran ausgeschnitten und dann für die Aminosäureseqenzierung mit einem Proteinextraktions-Kit extrahiert. Im Einzelnen wurden die Proteine im SDS-PAGE-Gel auf eine PVDF-Membran übertragen und mit Ponceau S gefärbt. Die Bande, die das Fusionsprotein darstellt, wurde mit einer Rasierklinge ausgeschnitten, um das Protein zu extrahieren. Das Protein wurde zur Aminosäuresequenzierung unter Verwendung eines Aminosäuresequenz-Analysieres nach dem Standardverfahren eingesetzt.
Die SEQ ID. NO: 17-20, 21-22 und 31-32 wurden den Fusionsproteinen zugeordnet. Die SEQ ID NO:17 ist die Aminosäuresequenz des Fusionsproteins Angiogenin-Glycin-EGF, das von pTE4081 exprimiert wird. Die SEQ ID NO:18 ist die Aminosäuresequenz des Fusionsproteins Angiogenin-(Glycin)₄-Serin-EGF, das von pTE4082 exprimiert wird. Die SEQ ID NO:19 ist die Aminosäuresequenz des Fusionsproteins EGF-Angiogenin, das von pTE4083 exprimiert wird. Die SEQ ID NO:20 ist die Aminosäuresequenz des Fusionsproteins EGF-Glycin-Angiogenin, das von pTE4084 exprimiert wird. Die SEQ ID NO:21 ist die Aminosäuresequenz des Fusionsproteins EGF-(Glycin)₄-Serin-Angiogenin, das von pTE4089 exprimiert wird. Die SEQ ID NO:22 ist die Aminosäuresequenz des Fusionsproteins EGF-[(Glycin)₄-Serin]₂-Angiogenin, das von pTE40810 exprimiert wird. Die SEQ ID NO:31 ist die Aminosäuresequenz des Fusionsproteins Angiogenin-(Glycin)₄-Serin-EGF-(Glycin)₄-Serin-Angiogenin, das von pTE40815 exprimiert wird, und die SEQ ID NO:32 ist die Aminosäuresequenz des Fusionsproteins EGF-(Glycin)₄-Serin-Angiogenin-(Glycin)₄-Serin-EGF, das von pTE40816 exprimiert wird.
Eine Probe enthaltend EGF-(Glycin)₄-Serin-Angiogenin wurde einer Chromatographie unter Verwendung einer Heparin-Sepharose-Säule (Heparin-Sepharose CL-4B, Pharmacia Biotech. Inc., USA) unterworfen, um die gebundenen Proteine mit einem Phosphat-Puffer enthaltend 1 M NaCl zu eluieren. Die Fraktionen wurden zusammengefaßt und einer Chromatographie unter Verwendung einer DEAE-Sephadex-Säule (DEAE-Sephadex A-25, Pharmacia Biotech. Inc., USA) unterworfen und die aufgereinigten Proteine wurden in einem Phosphat-Puffer, enthal tend 0,4 – 0,7 M NaCl, an das Säulenmaterial gebunden, um die Rezeptorbindungsaktivitäten und tRNase-Aktivitäten zu bestimmen.
Beispiel 13: Rezeptorbindungsaktivität der Fusionsproteine
Die Bindungsaktivität der Fusionsproteine wurde mit der kompetetiven Bindung zwischen einer Probe und EGF gemessen, das mit einem Isotop markiert wurde, wobei ¹²⁵I-EGF und die Probe mit A431-Zellen (ATCC: CRL-1555) zusammengeführt wurden, die auf ihrer Oberfläche EGF-Rezeptoren auf hohem Niveau exprimieren. Im Einzelnen, wurden A431-Zellen auf 24-Tröge-Mikrotiterplatten mit 4×10⁴ Zellen/ml ausgebracht und so lange angezogen, bis die Zellen dicht gewachsen waren. Danach wurden sie in 10 %igem (v/v) Formaldehyd fixiert. Anschließend wurden 20 μl des ¹²⁵I-markierten EGF und der Probenlösung in jeden Trog hinzugefügt, um an die Rezeptoren kompetetiv zu binden. Ungebundenes EGF wurde ausgewaschen und die Zellen wurden in den Trögen abgelöst, um die Radioaktivität mit einem γ-Zähler zu messen. Die Cpm-Werte (counts per minute) wurden in Bindungsaktivität in % übertragen und die Standardkurve wurde mit der Konzentration der Kontrolle und der Bindungsaktivität in % erhalten. Die Bindungsaktivität der Probe wurde durch Ersetzen des %-Wertes der Bindungsaktivität der Probe in der Standardkurve entschieden und mit der Bindungsaktivität von EGF verglichen (siehe: Tabelle 1).
Tabelle 1. Rezeptorbindungsaktivitäten der Fusionsproteine
Wie in Tabelle 1 dargestellt wird, ist die Bindungsaktivität des Fusionsproteins an EGF-Rezeptoren größer als 90 % und unterscheidet sich kaum von der des EGF.
Beispiel 14: RNase-Aktivität des Fusionsproteins
50 μl einer Probe enthaltend ein Fusionsprotein wurden mit 50 einer Hefe-t-RNA-Mischung enthaltend Reaktionspuffer bestehend aus 120 mM HEPES, 120 mM NaCl und 0,004 % BSA gemischt und für 2 Stunden bei 37 °C inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe eines gleichen Volumen 6 %iger Perchlorsäure unterbrochen. Anschließend wurde das Reaktionsgemisch für 10 Minuten zentrifugiert und dazu verwendet, um die optische Dichte bei 260 nm zu messen, wobei daraus die Standardkurve zur Messung der RNase-Aktivität erstellt wurde. Die Aktivitäten der Proben werden mit jenen des Angiogenins verglichen (siehe: Tabelle 2).
Tabelle 2 RNase-Aktivität der Fusionsproteine
Wie klar in Tabelle 2 gezeigt wird, verbessern sich die RNase-Aktivitäten der Fusionsproteine wenn sich die Länge des Linkers vergrößert.
Beispiel 15: Cytotoxizität der Fusionsproteine gegenüber Krebszellen in vitro
Um die Aktivität der Fusionsproteine in vitro abschätzen zu können, wird eine Brustkrebs-Zellinie (MCF-7(ATCC-HTB22) in mit 10 % FBS ergänztem DMEM angezogen. Die Zellen werden auf 96-Tröge-Mikrotiterplatten mit 1×10⁴ Zellen/ml ausgebracht und für 1 Tag angezogen. Das Medium wurde mit Serum-freiem Medium enthaltend, die Kontrolle, die Probe und 5-Fluor-Uracil (als Vergleich) ersetzt und für weitere 2 Tage angezogen. Die Überlebensrate wurde mit MTT(3-(3,4-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazoliumbromid) gemessen und der IC₅₀-Wert berechnet (siehe: Tabelle 3).
Tabelle 3: Cytotoxizität der Fusionsproteine auf die Brustkrebszellen
Wie in Tabelle 3 klar gezeigt wird, sind die Zellen nachgewiesenermaßen wirksam, um die Krebszellen abzutöten.
Beispiel 16: Toxizität der Fusionsproteine
Um die Toxizität der Fusionsproteine in vitro abzuschätzen, werden CHO-K1 (ATCC-CCL61)-Zellen, die keine hEGF-Rezeptoren exprimieren, in mit 10 % FBS ergänztem F-12 Medium angezogen. Die Zellen wurden in 96-Tröge-Mikrotiterplatten bei 1×10⁴ Zellen/ml für 1 Tag angezogen. Sie erhielten Serumfreies Medium enthaltend die Kontrolle und die Proben und wurden für 2 weitere Tage angezogen. Die Überlebensrate der Zellen wurde mit MTT auf analoge Weise wie in Beispiel 15 gemessen (siehe: Tabelle 4).
Tabelle 4: Cytotoxizitäten der Fusionsproteine auf CHO-K1-Zellen
Wie in der Tabelle 4 klar gezeigt wird, weisen die Fusionsproteine keine Toxizität gegenüber Zellen auf, die keine hEGF-Rezeptoren exprimieren.
Beispiel 17: Anti-Krebs-Wirkung der Fusionsproteine in vivo
Um die Anti-Krebs-Wirkungen der Fusionsproteine in vivo abzuschätzen, werden 2×10⁷ A431-Zellen in 0,2 ml subkutan in den abdominalen Bereich von immundefizienten Nacktmäusen (20 – 25 g Körpergewicht) übertragen. Als die richtige Größe der Tumore gebildet worden war, wurden die Tumore aus der Maus unter sterilen Bedingungen entfernt und in Stücke zu 2-3 mm geschnitten, um mit einer Troca subkutan übertragen zu werden. Als die Größe des transplantierten Tumors in den Nacktmäusen 80 ml erreicht hatte, wurden die Mäuse in 5 Gruppen (6 Mäuse in einer Gruppe) eingeteilt, um mit i.v.-Injektionen behandelt zu werden. 100 μg Fusionsprotein und Angiogenin pro kg Körpergewicht wurden mittels i.v.-Injektion jeden dritten Tag für 4 Wochen verabreicht. Nach der letzten Injektion, wurde der Bereich der Tumor-Oberfläche mit einer Noniusschublehre gemessen. Die Tumorzellen wurden nach 4 Wochen ausgeschnitten und das Gewicht gemessen (siehe Tabelle 5). Die 14(A) und 14(B) sind Photographien, die die Größe der Tumore aus Mäusen zeigen, denen mit Injektionen PBS (phosphatgepufferte Salzlösung), beziehungsweise hEGF-(Glycin)₄-Serin-Angiogenin verabreicht wurden, wobei jede Zahl den Tumor anzeigt, der aus der behandelten Maus nach einem 3-Tage-Intervall nach der letzten Verabreichung entnommen wurde. Tabelle 5: Antikrebs-Wirkungen der Fusionsproteine in vivo
A. Durchschnittliche Tumor-Oberfläche am Tag der Verabreichung
B. Durchschnittliche Tumor-Oberfläche nach 4 Wochen
Wie in Tabelle 5 klar ersichtlich, wird das Wachstum der Tumore in den Mäusen, die die Fusionsproteine erhalten haben, im Vergleich mit den Tumoren die lediglich Angiogenin erhalten haben, dramatisch gehemmt. Tod oder Symptome, die durch Nebenwirkungen verursacht wurden, wurden nicht beobachtet, während die hemmende Wirkung auf das Tumorwachstum selbst mit bloßem Auge beobachtet werden konnte.
Akuter Toxizitätstest (mit Überdosis)
Der akute Toxizitätstest mit Überdosis wurde durchgeführt, um die niedrige Toxizität der Fusionsproteine gemäß der vorliegenden Erfindung zu bestätigen: Das Fusionsprotein, das in dem obigen Beispiel hergestellt und als "EGF-(Glycin)₄- Serin-Angiogenin" beschrieben wurde, wurde in den abdominalen Bereich von männlichen Mäusen (ICR-Maus, 20 – 25 g Körpergewicht, 5 Mäuse in einer Gruppe) zu 0,1 bis 100 mg/kg injiziert. Anschließend wurden die Mäuse in Käfigen gehalten und auf das Auftreten allgemeiner Symptome hin beobachtet. Nach 7 Tagen, wurde die Zahl der toten Mäuse gezählt. Die mittlere tödliche Dosis (LD₅₀, mg/kg) war jedoch nicht meßbar, da nur 1 Maus in der Gruppe starb, die 100 mg/kg erhalten hatte. Als Ergebnis ist offensichtlich, daß die Toxizität des Fusionsproteins überraschend niedrig ist, da der LD₅₀-Wert viel höher als 100 mg/kg ist.
Wie oben klar veranschaulicht und dargestellt wurde, stellt die vorliegende Erfindung ein Fusionsprotein zur Verfügung, das gegenüber den herkömmlichen als Antikrebsmittel verwendeten Fusionsproteinen unter den folgenden Gesichtspunkten überlegen ist: erstens, überwindet es das Problem bezüglich der Immunocytotoxizität, weil die von Menschen stammenden Proteinbestandteile keine Antikörperbildung hervorrufen; zweitens, tötet es mit einem Unterschied von Faktor 1000 bezüglich des IC₅₀, trotz des kleineren Molekulargewichtes, selektiv die Krebszellen ab, obwohl jeder Bestandteil selbst keine Wirkung auf die Krebszellen aufweist. Daher kann das Fusionsprotein gemäß der Erfindung zur Behandlung von Tumoren, die hEGF-Rezeptoren auf hohem Niveau exprimieren, praktisch angewandt werden.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Ein Fusionsprotein bestehend aus dem humanen Epidermalen Wachstumsfaktor hEGF, dem humanen Angiogenin, und Linker, welche aus 0 bis 20 Aminosäuren zusammengesetzt sind.
Das Fusionsprotein nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der C-Terminus des humanen Epidermalen Wachstumsfaktors mit dem N-Terminus des humanen Angiogenins verbunden ist.
Das Fusionsprotein nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der humane Epidermale Wachstumsfaktor und das humane Angiogenin in einem molekularen Verhältnis von 1 : 0,5 bis 2 miteinander fusioniert sind.
Das Fusionsprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Linker ausgewählt ist aus der Gruppe Glycin, (Glycin)₄-Serin, und [(Glycin)₄-Serin]₂.
Das Fusionsprotein nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Aminosäuresequenz des Fusionsproteins ausgewählt ist aus der Gruppe SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:31 und SEQ ID NO:32.
Ein Gen, das eines der Fusionsproteine der Ansprüche 1 bis 5 codiert.
Das Gen nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleotidsequenz des Gens ausgewählt ist aus der Gruppe SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:29 und SEQ ID NO:30.
Ein Expressionsvektor enthaltend das Gen nach Anspruch 6 oder 7.
Der Expressionsvektor nach Anspruch 8, der ausgewählt ist aus der Gruppe pTE4081, pTE4082, pTE4083, pTE4084, pTE4089, pTE40810, pTE40815 und pTE40816.
Ein Mikroorganismus, der mit dem Expressionsvektor nach Anspruch 8 transformiert wurde.
Mikroorganismus nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß er das Plasmid pTE4083 (KCCM-10106) enthält und daß der Mikroorganismus E.coli JM-101 ist.
Mikroorganismus nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß er das Plasmid pTE4084 (KCCM-10107) enthält und daß der Mikroorganismus E.coli JM-101 ist.
Ein Verfahren zur Herstellung eines Fusionsproteins, umfassend die Schritte: Induktion der Expression des Fusionsproteins in dem Mikroorganismus gemäß einem der Ansprüche 10 bis 12, und Erhalten des rekombinanten Fusionsproteins.
Ein Antikrebsmittel, enthaltend das Fusionsprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder das Verfahrensprodukt nach Anspruch 13 als aktiven Wirkstoff und pharmazeutisch akzeptable Träger.