DE602004008273T2 - Pegylierte lösliche gp130-dimere, die sich als medikament eignen - Google Patents

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Polypeptiddimer, umfassend zwei lösliche gp130 Moleküle, wobei mindestens eines der löslichen gp130 Moleküle kovalent mit Polyethylenglycol verbunden ist. Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine pharmazeutische Zusammensetzung, die das Dimer enthält, und verschiedene medizinische Verwendungen.
  • Das pleiotropische Cytokin Interleukin-6 (IL-6) zeigt ein großes Spektrum an biologischen Funktionen, von denen die Stimulation von B-Zellen und Einleitung der Akutphasenproteinsynthese in der Leber am bemerkenswertesten sind. IL-6 übt seine Wirkung auf Zielzellen über die Bindung an einen IL-6-spezifischen Oberflächenrezeptor („IL-6R” oder „gp80") aus. Dieser Rezeptor/Ligand-Komplex erleichtert die Homodimerisierung von gp130, der zweiten Untereinheit des IL-6 Rezeptorkomplexes. Die Dimerisierung von gp130 führt zur Transduktion eines IL-6 Signals. Lösliche Formen von IL-6R (sIL-7R), die durch zwei Mechanismen erzeugt werden (alternatives Splicing und Shedding), sind auch in der Lage, die gp130 Dimerisierung und Signalisierung bei Komplexierung mit IL-6 auszulösen.
  • Da der cytoplasmatische Anteil von IL-6R nicht zur Signaltransduktion beiträgt, kann die Signalisierung durch ein gp130 Homodimer mit IL-6 im Komplex mit membrangebundenem oder löslichem IL-6R hervorgerufen werden. Das Vorhandensein von sIL-6R führt allerdings zu einer Sensibilisierung von auf IL-6 reagierenden Zellen im Hinblick auf den Ligand, wie zuvor für die humanen Hepatomzellen HepG2 beschrieben. Außerdem ist gezeigt worden, dass zweifellos IL-6 abhängige Hybridomzellen sich nicht in Reaktion auf sehr geringe Mengen an IL-6 ver mehren, wenn in Kulturmedien vorhandenes sIL-6R kontinuierlich entfernt wird.
  • Anfänglich als Interleukin-6 Signaltransducer beschrieben ist gp130 eine Transducerkette, die sich viele Cytokine, wie beispielsweise IL-6, IL-11, Leukämie inhibierender Faktor (LIF), Onkostatin M (OSM) und der ziliäre neurotrophe Faktor (CNTF) teilen. Alle diese Cytokine wirken über einen zweiteiligen oder dreiteiligen Rezeptorkomplex, in dem die Signalisierung durch Homodimierisierung (für IL-6) oder Heterodimerisierung mit LIF-Rb/gp130 Protein (für IL-11, LIF, OSM und CNTF) von gp130 ausgelöst wird. Diese Cytokine vermitteln daher in unterschiedlichen Geweben ähnliche biologische Aktivitäten.
  • Während gp130 auf nahezu allen Zelltypen gefunden werden kann, zeigt das IL-6R eine viel eingeschränktere Expression. Die Freisetzung von sIL-6R durch eine Zellart macht andere Zellen, die nur gp130 exprimieren, für IL-6 empfänglich. Dieses Szenario wird als trans-Signalisierung bezeichnet. Tatsächlich werden mehrere zelluläre Aktivitäten beschrieben, die den Komplex von sIL-6R und IL-6 erfordern und mit IL-6 allein nicht festzustellen sind. Es wird im humanen Plasma lösliches gp130 Protein in hohen Konzentrationen gefunden. Kürzlich ist das Designer-Cytokin hyper-LL-6 (H-IL-6), bei dem der C-Terminus von sIL-6R über einen flexiblen Peptidlinker kovalent mit dem N-Terminus von reifem IL-6 verbunden ist, beschrieben worden. Wie mit dem Komplex von IL-6/sIL-6R zu sehen, wirkt H-IL-6 auch auf Zellen, die nur gp130 exprimieren. Im Gegensatz zu den separaten Komponenten IL-6 und sIL-6R reicht eine 100- bis 1000-fach niedrigere Konzentration dieses Fusionsmoleküls aus, um vergleichbare biologische Signale hervorzurufen.
  • Zur Behandlung von verschiedenen Krankheiten, wie beispielsweise Morbus Crohn usw., könnte die spezifische Blockierung von IL-6 Reak tionen abhängig von löslichem IL-6R zur Behandlung erwünscht sein. Unglücklicherweise sind die bisher für diesen Zweck zur Verfügung stehenden Verbindungen durch mehrere Nachteile, wie niedrige Produktionsrate, hohe Clearancerate, geringe Halbwertzeit usw., gekennzeichnet.
  • Daher bestand das der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende technische Problem darin, Mittel zur Verfügung zu stellen, die zur Behandlung von Erkrankungen geeignet waren, bei denen die spezifische Blockierung von IL-6 Reaktionen abhängig von sIL-6R eine günstige Wirkung haben könnten, die die Nachteile der Mittel des Standes der Technik überwinden.
  • Die Lösung des technischen Problems wird durch Vorsehen der in den Ansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen erzielt. Während der zur vorliegenden Erfindung führenden Experimente wurde festgestellt, dass ein PEGyliertes lösliches gp130 Dimer wirksam die antiapoptotische Wirkung von sIL-6R von LPMC von Morbus Crohn (CD) Patienten hemmt und dass so die Verbindung zur Behandlung der Erkrankung und verwandten Krankheiten, wie beispielsweise Kolitis oder rheumatoide Arthritis, nützlich ist. Morbus Crohn ist eine chronische entzündliche Erkrankung des Gastrointestinaltrakts, die durch häufig auftretende Rückfälle einer akuten Entzündung gekennzeichnet ist. Eine mit einer Infektion, Verletzung oder anderen Faktoren verbundene Entzündung ruft schnell die Akutphasenreaktion (APR) hervor, die durch die Erzeugung von Akutphasenproteinen (APPs) gekennzeichnet ist. Die APR führt hauptsächlich zu einem Anstieg der vaskulären Permeabilität und zu Fieber. APPs können abhängig vom Cytokin, das ihre Expression und Aktivierung reguliert, in zwei unterschiedliche Gruppen unterteilt werden. Die Cytokine der IL-6 Familie regeln die durch STAT3 Aktivierung vermittelte Expression von APP Genen des Typs II hoch. IL-6 trägt auch zum Anstieg der APP Niveaus vom Typ I bei, die hauptsächlich durch IL-1 reguliert werden. Eine starke STAT3 Aktivierung (d.h. Tyrosinphosphorylierung) ist in Kolongeweben von IBD Patienten beschrieben worden. Außerdem wurde bei IL-6 KO Mäusen die STAT3 Aktivierung deutlich reduziert, die bei diesen Mäusen von einer verringerten Entwicklung experimenteller Kolitis begleitet war (Suzuki u.a., 3 Exp Med, 2001, 193:471). Diese Befunde zeigen an, dass die IL-6/IL-6R-vermittelte STAT3 Aktivierung eine zentrale Rolle bei der Entwicklung und Fortdauer einer Kolitis spielt. Bei einer anderen entzündlichen Erkrankung, der rheumatoiden Arthritis (RA), zeigte sich, dass STAT3 wichtig für das Überleben von synovialen RA Fibroblasten ist (Krause u.a., J Immunol, 2002, 169:6610). Es wurde daher darauf hingewiesen, dass STAT3 ein gutes Ziel für die Gentherapie darstellen könnte. Die konstitutive STAT3 Aktivierung ist bekanntermaßen auch ein „Krebs erzeugender" Faktor und wird beispielsweise von der Hochregulation von antiapoptotischen Proteinen, wie beispielsweise Bcl-2 oder Bcl-XL, begleitet (Turkson u.a., Oncogene, 2000, 19:6613). Es wurde festgestellt, dass das PEGylierte lösliche gp130-Dimer die Aktivität von STAT3 deutlich verringerte. Weiterhin wurde festgestellt, dass die Wirksamkeit von sgp130PEG deutlich höher war bei der Reduzierung der IL-6/IL-6R/gp130-vermittelten Signaltranduktionsprozesse und Krankheitsparameter als die von sgp130Fc der EP 00 108 691.7 . Darüber hinaus war die Halbwertszeit von sgp130PEG etwa 2-fach höher als die des sgp130Fc Moleküls. Außerdem konnte eine niedrigere sgp130PEG Dosis in therapeutischen Ansätze verwendet werden, um dieselben Ergebnisse wie mit sgp130Fc zu erhalten. Demgemäß bedeuten diese Ergebnisse für sgp130PEG weniger Nebenwirkungen, eine geringere Belastung für die Patienten, eine verringerte Anwendungshäufigkeit und niedrigere Therapiekosten.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1: Schematische Darstellung von sgp130PEG und sgp130 HisPEG
  • 2: Nukleotidsequenz und entsprechende kodierte Proteinsequenz der ersten drei extrazellulären Domänen (D1-D3) von humanem gp130 (sgp130 (D1-D3))
  • 3: Nukleotidsequenz und entsprechende kodierte Proteinsequenz von humanem Herpesvirus 8 (HHV8) stammenden viralen Interleukin-6 (vIL-6).
  • 4: Analyse der Apoptose in Lamina propria mononuklearen Zellen (LPMC) von Morbus Crohn Patienten
    LPMC wurden isoliert und wie im Beispiel 1 beschrieben für 48 Stunden in Gegenwart oder bei Fehlen von je 10 μg/ml neutralisierendem anti-IL-6 Antikörper, sgp130Fc und sgp130PEG kultiviert. Die Apoptose wurde durch Färben der Zellen mit Annexin V und Propidiumiodid und anschließende FACS Analyse bestimmt. Der prozentuale Anteil von apoptotischen (Annexin V-positiven und Propidiumiodid-negativen) Zellen wird gezeigt.
  • 5: Proliferation von BAF/gp130 Zellen in Reaktion auf (A) 5 ng/ml hyper-IL-6 (H-IL-6) oder (B) 100 ng/ml IL-6 + 50 ng/ml sIL-6R und entweder steigende Mengen an sgp130Fc oder sgp130PEG Die Proliferation wurde durch Feststellen der [3H]-Thymidin-Einführung in einem Szintillationszähler bestimmt.
  • 6: A) Aktivierung eines STAT3 gesteuerten Reportergenplasmids nach einer H-IL-6 Behandlung und Hemmung der STAT3 Aktivität durch sgp130Fc oder sgp130PEG (jeweils 10 μg/ml). B) Konzentrationsabhängige Runterregulation der mittels H-IL-6 induzierten STAT3 Aktivierung entweder durch sgp130Fc oder sgp130PEG.
  • 7: Nukleotidsequenz und entsprechende Proteinsequenz der ersten drei extrazellulären Domänen (D1-D3) von humanem gp130 (sgp130(D1-D3).1).
  • 8:
  • A) Analyse der Apoptose in Lamina propria mononukleären Zellen (LPMC) von Morbus Crohn Patienten.
    LMPC wurden isoliert und wie im Beispiel 1 beschrieben für 48 Stunden in Gegenwart oder bei Fehlen von je 10 μg/ml neutralisierendem anti-IL-6 Antikörper, sgp130Fc und sgp130PEG kultiviert. Die Apoptose wurde durch Färben der Zellen mit Annexin V und Propidiumiodid und anschließende FACS Analyse bestimmt. Der prozentuale Anteil von apoptotischen (Annexin V-positiven und Propidiumiodid-negativen) Zellen wird gezeigt. B) Es wurde dasselbe Experiment, wie in 4A beschrieben, durchgeführt mit der Ausnahme, dass sgp130Dimer oder sgp130TagPEG anstelle von anti-IL-6 Antikörper, sgp130Fc und sgp130PEG verwendet wurden.
  • 9: Proliferation von BAF/gp130 Zellen in Reaktion auf (A) 5 ng/ml hyper-IL-6 (H-IL-6) oder (B) 100 ng/ml IL-6 + 50 ng/ml sIL-6R und steigende Mengen entweder an sgp130TagPEG oder sgp130Dimer. Die Proliferation wurde durch Feststellen einer [3H]-Thymidin-Einführung in einem Szintillationszähler bestimmt.
  • 10: A) Aktivierung eines mittels STAT3 gesteuerten Reportergenplasmids nach einer H-IL-6 Behandlung und Hemmung einer STAT3 Aktivität durch sgp130dimer oder sgp130TagPEG (jeweils 10 μg/ml). B) Die konzentrationsabhängige Runterregulation einer mit H-IL-6 induzierten STAT3 Aktivierung entweder durch sgp130dimer oder sgp130TagPEG.
  • Daher betrifft die vorliegende Erfindung ein Polypeptiddimer, umfassend zwei lösliche gp130 Moleküle, wobei mindestens eines der, vorzugsweise beide, löslichen gp130 Moleküle kovalent mit Polyethylenglycol verbunden ist (sind).
  • Die Polypeptiddimeren der vorliegenden Erfindung können mit bekannten Verfahren konstruiert werden. Der Begriff „löslich", wie er hier verwendet wird, betrifft ein gp130 Molekül, dem die intrazelluläre Domäne und vorzugsweise die transmembrane Domäne fehlt. Die verwendeten Domänen können aus den extrazellulären Domänen D1-D3 von gp130 bestehen oder sie können aus Mutanten oder Fragmenten davon bestehen, die die Fähigkeit beibehalten, die Aktivität des agonistischen Komplexes IL-6/sIL-6R zu hemmen. Die PEGylierung der sgp130 Moleküle kann zum Beispiel gemäß den Verfahren durchgeführt werden, die für humanes IFN-γ, IFN-α, IFN-β, IL-15 oder IL-2 beschrieben sind (Tang u.a., Sheng Wu Hua Xue Yu Sheng Wu Wu Li Xue Bao (Shanghai), (1996), 28:312; Youngster u.a., Curr Pharm Des (2002), 8:2139; Grace u.a., J Interferon Cytokine Res (2001), 21:1103; Pepinsky u.a., J Pharmacol Exp Ther (2001), 297:1059; Pettit u.a., J Biol. Chem (1997), 272:2312; Goodson u.a. Biotechnology NY (1990), 8:343; Katre; J Immunol (1990), 144:209). Vorzugsweise ist das dem löslichen Teil von gp130 entsprechende Polypeptid das einzige biologisch aktive Polypeptid des Polypeptiddimers der vorliegenden Erfindung, d.h. es enthält keine weiteren Polypeptidanteile wie eine Fc Domäne und/oder Fibronectin(FN)III.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Polypeptiddimer der vorliegenden Erfindung dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eines der zwei löslichen gp130 Moleküle die Aminosäuresequenz umfasst, wie in der 2 oder 3 gezeigt.
  • In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das Polypeptiddimer der vorliegenden Erfindung dadurch gekennzeichnet, dass beide der zwei löslichen gp130 Moleküle die Aminosäuresequenz umfassen, wie in der 2 oder 3 gezeigt.
  • Jede Art von Polyethylenglycol ist für die vorliegende Erfindung geeignet, vorausgesetzt, dass das PEG-Polypeptiddimer noch in der Lage ist, IL-6 Reaktionen abhängig von sIL-6R zu blockieren, das gemäß Verfahren, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, untersucht werden kann, z.B. dem im Beispiel 1 beschriebenen Verfahren. Vorzugsweise ist das Polyethylenglycol des Polypeptiddimers der vorliegenden Erfindung PEG 1000, 2000, 3000, 5000, 10000, 15000, 20000 oder 40000, wobei PEG 20000 oder 40000 besonders bevorzugt ist.
  • Zur Bildung des Dimers sind die beiden löslichen gp130 Moleküle miteinander über eine oder mehrere Disulfidbrücken verbunden. Dies kann zum Beispiel durch eine rekombinante Expression erreicht werden, wobei die Nukleinsäuresequenz, die sgp130 kodiert, ein oder mehr Cysteinreste kodierende Kodons zwischen dem Stoppkodon und dem Kodon enthält, das den C-terminalen Aminosäurerest von sgp130 kodiert. Alternativ kann zur Erzeugung des Dimers eine flexible Linkerdomäne verwendet werden, wobei die Monomere vorzugsweise hintereinander („Schwanz-an-Schwanz") fusioniert sind. Dieser Linker kann vollständig künstlich sein (z.B. Polyglycin-Repeats, die in einem bestimmten Intervall durch Serin, Alanin und/oder Threonin unterbrochen sein können) oder von natürlich auftretenden Proteinen „geliehen" sein, wie beispielsweise die Gelenkregion von humanem IgG. Darüber hinaus können die Moleküle des Dimers z.B. durch His-His-His-His-His-His (His6), FLAG, Strep-Taq, grün fluoreszierendes Protein (GFP), cmyc„ Glutathion S-Transferase (GST), HA, Calmodulin bindendes Peptid (CBP) oder andere Epitope markiert sein, für die Antikörper zur Verfügung stehen, um eine schnelle Reinigung durch geeignete Chroma tographiesysteme, Detektion z.B. durch Western Blotting oder ELISA, Immunpräzipitation oder Aktivitätserschöpfung/Blockierung in Bioassays zu ermöglichen.
  • In einer weiteren alternativen Ausführungsform sind die beiden löslichen gp130 Moleküle miteinander durch „verzweigte" PEGs miteinander verbunden, die mindestens ein PEG und zwei reaktive Gruppen in einer genauen Entfernung voneinander umfassen.
  • Eine Auswahl von Mitteln kann dazu verwendet werden, Mutationen von sgp130 zu erzeugen und zu identifizieren, die die gewünschten Eigenschaften aufweisen. Es kann eine willkürliche Mutagenese der sgp130 kodierenden DNA mittels Standardverfahren gefolgt von der Analyse der Produktsammlung angewendet werden, um mutierte Cytokine mit den gewünschten Eigenschaften zu identifizieren. Die Mutagenese mittels Gentechnik ist umfassend verwendet worden, um den strukturellen Aufbau von funktionellen Domänen von rekombinanten Proteinen zu erhellen. Mehrere unterschiedliche Ansätze sind in der Literatur zum Durchführen einer Deletion oder Substitutionsmutagenese durchgeführt worden. Die erfolgreichsten scheinen die Alaninscanningmutagenese (Cunningham und Wells, Science 244 (1989), 1081-1085) und die Homolog-Scanning-Mutagenese (Cunningham u.a., Science 243 (1989), 1330-1336) zu sein.
  • Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung werden vorzugsweise rekombinant unter Verwendung eines Polynukleotids, das ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung kodiert, und von Vektoren, vorzugsweise Expressionsvektoren, die die Polynukleotide enthalten, hergestellt. Zur Herstellung der Polypeptide der Erfindung werden die Polynukleotide von bestehenden Klonen erhalten, d.h. kodieren vorzugsweise das natürlich auftretende Polypeptid oder einen Teil davon. Polypeptide, die durch irgendein Polynukleotid kodiert sind, das unter sehr stringenten oder mäßig stringenten Bedingungen an das Komplement der nativen DNA oder RNA (im Hinblick auf die Definitionen siehe Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y.) hybridisiert, solange das Polypeptid die biologische Aktivität der nativen Sequenz beibehält, sind auch zur Herstellung des/der Polypeptids/Polypeptide der vorliegenden Erfindung von Nutzen.
  • Die rekombinanten Vektoren können gemäß Verfahren konstruiert werden, die dem Fachmann bekannt sind; siehe zum Beispiel Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989), N.Y. Eine Vielzahl von Expressionsvektor/Wirts-Systemen kann angewendet werden, um Sequenzen zu enthalten und zu exprimieren, die die sgp130 Polypeptide der vorliegenden Erfindung kodieren. Diese umfassen Mikroorganismen, wie beispielsweise Bakterien, die mit rekombinanten Bakteriophagen, Plasmid oder Cosmid DNA Expressionsvektoren transformiert sind; Hefe, die mit Hefeexpressionsvektoren transformiert ist; Insektenzellsystemen, die mit Virusexpressionsvektoren infiziert sind (z.B. Baculovirus); Pflanzenzellsysteme, die mit Virusexpressionsvektoren (z.B. Blumenkohlmosaikvirus; CaMV; Tabakmosaikvirus, TMV) oder mit bakteriellen Expressionsvektoren (z.B. Ti oder pBR322 Plasmiden) transformiert sind; oder Tierzellsysteme, sind aber nicht darauf beschränkt.
  • Die „Kontrollelemente" oder „regulatorischen Sequenzen" sind die nicht translatierten Regionen der Vektor-Enhancer, Promotoren, 5'- und 3'-untranslatierten Regionen, die mit zellulären Wirtsproteinen in Wechselwirkung stehen, um die Transkription und Translation durchzuführen. Solche Elemente können hinsichtlich ihrer Beanspruchbarkeit und Spezifität variieren. Abhängig vom Vektorsystem und verwendeten Wirt kann jede Zahl von geeigneten Transkriptions- und Translationselementen, einschließlich konstitutiven und induzierbaren Promotoren, verwendet werden. Zum Beispiel können beim Klonieren in bakterielle Systeme induzierbare Promotoren, wie beispielsweise der Hybrid lacZ-Promotor des Bluescript-RTM.-Phagemids (Stratagene, LaJolla, Kalifornien) oder das pSport1-TM. Plasmid (Gibco BRL) und dergleichen verwendet werden. Der Baculovirus Polyhedrinpromotor kann für Insektenzellen verwendet werden. Promotoren oder Enhancer, die von den Genomen von Pflanzenzellen (z.B. Hitzeschock, RUBISCO; und Speicherproteingene) oder von Pflanzenviren (z.B. virale Promotoren oder Leader-Sequenzen) stammen, können in den Vektor kloniert werden. In Säugetierzellsystemen sind Promotoren von Säugetier-Genen oder von Säugetierviren bevorzugt. Wenn es notwendig ist, eine Zelllinie zu erzeugen, die mehrere Kopien der die sgp130 Polypeptide kodierenden Sequenz enthält, können auf SV40 oder EBV basierende Vektoren mit einem geeigneten auswahlbaren Marker verwendet werden.
  • In bakteriellen Systemen kann eine Anzahl von Expressionsvektoren abhängig von der für das Polypeptiddimer der vorliegenden Erfindung beabsichtigten Verwendung ausgewählt werden. Vektoren, die zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, umfassen den pSKK Expressionsvektor zur Expression in Bakterien, sind aber nicht darauf beschränkt.
  • In der Hefe Saccharomyces cerevisiae kann eine Anzahl von Vektoren, die konstitutive oder induzierbare Promotoren, wie beispielsweise alpha-Faktor, Alkoholoxidase und PGH, enthalten, verwendet werden; zur Übersicht siehe Grant u.a. (1987) Methods Enzymol. 153:516-544.
  • In den Fällen, in denen Pflanzenexpressionsvektoren verwendet werden, kann die Expression von Sequenzen, die den Antikörper der vorliegenden Erfindung kodieren, durch eine Anzahl von Promotoren gesteuert werden. Zum Beispiel können virale Promotoren, wie beispielsweise die 35S und 19S Promotoren von CaMV, allein oder in Kombination mit der Omega-Leader-Sequenz von TMV (Takamatsu, N. (1987) EMBO J. 6:307-311) verwendet werden. Alternativ können Pflanzenpromotoren, wie beispielsweise die kleine Untereinheit von RUBISCO oder Hitzeschockpromotoren verwendet werden (Coruzzi, G. u.a. (1984) EMBO J. 3:1671-1680; Broglie, R. u.a. (1984) Science 224:838-843; und Winter, J.. u.a. (1991) Results Probl. Cell Differ. 17:85-105). Diese Konstrukte können durch direkte DNA Transformation oder pathogen vermittelte Transfektion in Pflanzenzellen eingeführt werden. Solche Verfahren werden in einer Anzahl von allgemein verfügbaren Abhandlungen beschrieben (siehe zum Beispiel Hobbs, S. und Murry, L.E. in McGraw Hill Yearbook of Science and Technology (1992) McGraw Hill, New York, N.Y.; Seiten 191-196).
  • Ein Insektensystem kann auch verwendet werden, um die sgp130 Moleküle der vorliegenden Erfindung zu exprimieren. Zum Beispiel wird in einem solchen System, das Autographa californica nuclear polyhedrosis Virus (AcNPV) als Vektor zur Expression von fremden Genen in Spodoptera frugiperda Zellen oder in Trichoplusia Larven verwendet. Die Sequenzen können in eine nicht wesentliche Region des Virus, wie beispielsweise das Polyhedrin-Gen, kloniert werden und unter die Kontrolle des Polyhedrinpromotors gestellt werden. Die erfolgreiche Einführung des sgp130 kodierenden Gens macht das Polyhedrin-Gen inaktiv und erzeugt ein rekombinantes Virus, dem das Hüllprotein fehlt. Die rekombinanten Viren können dann verwendet werden, um zum Beispiel S. frugiperda Zellen oder Trichoplusia Larven zu infizieren, in denen APOP exprimiert sein kann (Engelhard, E.K. u.a. (1994) Proc. Nat. Acad. Sci. 91:3224-3227).
  • In Säugetierwirtszellen kann eine Zahl von auf Viren beruhenden Expressionssystemen verwendet werden. In den Fällen, in denen ein Adenovirus als Expressionsvektor verwendet wird, können Sequenzen, die das/die Polypeptid(e) der vorliegenden Erfindung kodieren, in einen Adenovirustranskriptions/Translations-Komplex ligiert werden, der aus dem late Promotor und der dreiteiligen Leader-Sequenz besteht. Die Einführung in eine nicht wesentliche E1 oder E3 Region des Virusgenoms kann verwendet werden, um ein lebensfähiges Virus zu erhalten, das in der Lage ist, den Antikörper in infizierten Wirtszellen zu exprimieren (Logan, J. und Shenk, T. (1984), Proc. Natl. Acad. Sci. 81:3655-3659). Darüber hinaus können Transkriptionsenhancer, wie beispielsweise der Rous-Sarkom-Virus (RSV) Enhancer, verwendet werden, um die Expression in Säugetierwirtszellen zu erhöhen.
  • Humane künstliche Chromosome (HACs) können auch dazu benutzt werden, um die größeren Fragmente der DNA als die, die in einem Plasmid enthalten und exprimiert sein können, abzugeben. HACs von 5 bis 10 M werden konstruiert und über herkömmliche Abgabeverfahren für therapeutische Zwecke abgegeben (Liposome, polykationische Aminpolymere oder Vesikel).
  • Spezifische Initiationssignale können auch verwendet werden, um eine wirksamere Translation zu erzielen. Solche Signale umfassen das ATG Initiationskodon und benachbarte Sequenzen. In den Fällen, in denen Sequenzen, die das sgp130, sein Initiationskodon, und stromaufwärtige Sequenzen kodieren, in den geeigneten Expressionsvektor eingeführt werden, können keine zusätzlichen transkriptionalen oder translationalen Kontrollsignale benötigt werden. Allerdings sollten in den Fällen, in denen nur die Kodierungssequenz eingeführt wird, exogene translationale Kontrollsignale, die das ATG Initiationskodon beinhalten, vorgesehen werden. Weiterhin sollte sich das Initiationskodon im richtigen Leserahmen befinden, um eine Translation des gesamten Inserts sicherzustellen. Die exogenen translationalen Elemente und Initiationskodons können verschiedenen, sowohl natürlichen als auch synthetischen, Ursprungs sein. Die Wirksamkeit der Expression kann durch den Einschluss von Enhancern verstärkt werden, die für das bestimmte Zellsystem, das verwendet wird, geeignet sind, wie beispielsweise die in der Literatur beschriebenen (Scharf, D. u.a. (1994) Results Probl. Cell Differ. 20:125-162).
  • Außerdem kann ein Wirtszellstamm für seine Fähigkeit zur Modulation der Expression der eingeführten Sequenzen oder zur Verarbeitung der exprimierten Polypeptidketten in der gewünschten Weise ausgewählt werden. Die posttranslationale Verarbeitung, die eine „Prepro" Form des Polypeptids spaltet, kann auch verwendet werden, um die richtige Einführung, Faltung und/oder Funktion zu erleichtern. Unterschiedliche Wirtszellen, die einen bestimmten zellulären Aufbau und charakteristische Mechanismen für posttranslationale Aktivitäten aufweisen (z.B. CHO, HeLa, MDCK, HEK293 und W138), sind von der American Type Culture Collection erhältlich (ATCC; Bethesda, MD.) und können ausgewählt werden, um die richtige Modifikation und Verarbeitung der fremden Polypeptidketten sicherzustellen.
  • Für die langfristige Produktion rekombinanter Polypeptide in hoher Ausbeute ist die stabile Expression bevorzugt. Zum Beispiel können Zelllinien, die stabil sgp130 Ketten exprimieren, mittels Expressionsvektoren transformiert werden, die virale Replikationsursprünge und/oder endogene Expressionselemente und ein selektierbares Marker-Gen auf demselben oder auf einem getrennten Vektor enthalten können. Im Anschluss an die Einführung des Vektors können Zellen für 1-2 Tage in einem angereicherten Medium wachsen gelassen werden, bevor sie auf selektive Medien gegeben werden. Der Zweck des selektierbaren Markers ist es, eine Resistenz gegenüber der Selektion zu verleihen, und sein Vorhandensein ermöglicht das Wachstum und die Gewinnung von Zellen, die erfolgreich die eingeführten Sequenzen exprimieren. Resistente Klone von stabil transformierten Zellen können mittels Gewebekulturverfahren, die für den Zelltyp geeignet sind, vermehrt werden.
  • Nach der Einführung des/der rekombinanten Vektors/Vektoren werden die Wirtszellen in einem selektiven Medium, das auf das Wachstum der Vektor enthaltenden Zellen selektiert, wachsen gelassen. Jede Zahl von Selektionssystemen kann verwendet werden, um transformierte Zelllinien zu gewinnen. Diese umfassen die Herpex simplex Virus Thymidinkinase (Wigler, M. u.a., (1977), Cell 11:223-32) und Adeninphosphorosyltransferase (Lowy, I. u.a. (1980) Cell 22:817-23)-Gene, die in tk.sup.- bzw. aprt.sup.-Zellen verwendet werden können, sind aber nicht darauf beschränkt. Desweiteren Antimetabolite zur Selektion; zum Beispiel dhfr, das Resistenz gegenüber Methotrexat verleiht (WIGLER; M. u.a. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. 77:3567-70); npt, das Resistenz gegenüber dem Aminglycosidneomycin und G-418 verleiht (Colbere-Garapin, F. u.a. (1981) J. Mol. Biol. 150:1-14), und als oder pat, die Resistenz gegenüber Chlorsulfuron bzw. Phosphinotricinacetyltransferase verleihen (Murry, siehe oben). Zusätzliche selektierbare Gene sind beschrieben worden, zum Beispiel trpB, das es Zellen ermöglicht, Indol anstelle von Tryptophan zu verwenden, oder hisD, das es Zellen ermöglicht, Histinol anstelle von Histidin zu verwenden (Hartman, S.C. und R.C. Mulligan (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:8047-51). In letzter Zeit hat die Verwendung von sichtbaren Markern an Popularität gewonnen, wobei solche Marker, wie Anthocyanine, beta-Glucuronidase und sein Substrat GUS und Luciferase und sein Substrat Luciferin, breite Anwendung nicht nur zur Identifizierung von Transformanten sondern auch zur Quantifizierung der Menge an transienter oder stabiler Proteinexpression finden, die einem spezifischen Vektorsystem zugeschrieben werden kann (Rhodes, C.A. u.a. (1995) Methods Mol. Biol. 55:121-131).
  • Die Reinigung der rekombinanten Polypeptide wird durch eines der für diesen Zweck bekannten Verfahren durchgeführt, d.h. jedes herkömmliche Verfahren, das Extraktion, Präzipitation, Chromatographie, Elektrophorese oder dergleichen beinhaltet. Ein weiteres Reinigungsver fahren, das verwendet werden kann, ist Affinitätschromatographie mittels monoklonalen Antikörpern, die das Zielpolypeptid binden und die auf einer Gelmatrix erzeugt und immobilisiert werden, die in einer Säule enthalten ist. Unreine Präparate, die das rekombinante Polypeptid enthalten, werden durch die Säule geleitet. Das Polypeptid wird durch den spezifischen Antikörper an die Säule gebunden, während die Verunreinigungen hindurchgehen. Nach dem Waschen wird das Polypeptid durch eine Änderung des pH-Werts oder der Ionenstärke aus dem Gel eluiert und dann, wenn es als Monomer hergestellt ist, dimerisiert und PEGyliert.
  • Demgemäß betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur Herstellung des Polypeptiddimers der vorliegenden Erfindung, umfassend das Kultivieren einer Wirtszelle, die mit einer DNA Sequenz, die ein Monomer des Polypeptids kodiert, transformiert wird, das Gewinnen des Polypeptidmonomers oder -dimers aus der Wirtszelle oder der Kultur und das PEGylieren der Monomere oder Dimere.
  • Die Polypeptiddimere der vorliegenden Erfindung sind zur Behandlung und/oder Verhinderung von allen Symptomatiken nützlich, bei denen die Aktivität des agonistischen Komplexes IL-6/sIL6R gehemmt werden muss. Zum Beispiel umfassen die therapeutischen Verwendungen der Polypeptiddimere der vorliegenden Erfindung folgendes:
    • (a) IL-6 scheint direkt am multiplen Myelom beteiligt zu sein, indem es entweder autokrin oder parakrin wirkt, um die Tumorbildung zu fördern. Weiterhin schaffen die erhöhten IL-6 Niveaus unerwünschte sekundäre Wirkungen, wie beispielsweise Knochenresorption, Hyperkalziämie und Kachexie. In diesen Fällen ist es bekannt, dass sIL-6R Zielzellen für IL-6 sensibilisiert. Daher sind die Polypeptiddimeren der Erfindung, wie hier beschrieben, sowohl für die sekundären Wirkungen als auch für das Hemmen des Tumorwachstums nützlich.
    • (b) Bei Autoimmunerkrankungen: die pathogene Bedeutung von IL-6 bei Autoimmunkrankheiten ist von vielen Autoren in der Literatur nachgeprüft worden (siehe zum Beispiel Yoshizaki u.a., Semin. Immunol. 4(3) (1992), 155-166), daher kann eine Interferenz mit IL-6 Signaltransduktion für die Autoimmunerkrankungstherapie nützlich sein (Nishimoto u.a., Intern. Med. 38(2) (1999), 178-182). Beispiele für solche Symptomatiken sind systemischer Lupus erythematodes, Hashimoto-Thyreoiditis, Sklerodermie, rheumatoide Arthritis, multiple Sklerose, Autoimmunepithelitis, Diabetes mellitus, Sjögren-Syndrom, Polymyositis, Glomerulonephritis und andere entzündliche Erkrankungen, wie beispielsweise Psoriasis und Morbus Crohn.
    • (c) Bei Osteoporose, die durch Senken der Östrogenspiegel bei Frauen nach den Wechseljahren oder durch Ovariektomie verschlimmert werden kann, scheint IL-6 ein kritischer Vermittler der Osteoklastogenese zu sein, was zur Knochenresorption führt. Es ist wichtig, dass IL-6 nur eine wichtige Rolle im Östrogen erschöpften Zustand zu spielen scheint und ist offensichtlich minimal an dem normalen Knochenerhalt beteiligt. Damit übereinstimmend zeigt der experimentelle Nachweis, dass funktionsblockierende Antikörper für IL-6 die Zahl der Osteoklasten reduzieren können. Während die Östrogenersatztherapie auch verwendet wird, scheinen Nebenwirkungen aufzutreten, die ein erhöhtes Risiko für Endometrium- und Brustkrebs beinhalten können. Daher sind die Polypeptiddimere der vorliegenden Erfindung zur Reduzierung der Osteoklastogenese auf normale Niveaus spezifischer.
    • (d) IL-6 kann ein Vermittler des Tumornekrosefaktors (TNF) sein, der zu einer Kachexie in Verbindung mit AIDS und Krebs führt, vielleicht durch Reduzierung der Lipoproteinlipaseaktivität in adipösem Gewebe. Demgemäß wären die hier beschriebenen Polypeptiddimere der Erfindung zur Erleichterung oder Reduzierung der Kachexie bei solchen Patienten nützlich.
    • (e) Bakterielle und virale Infektionen: Das Vorhandensein des humanen Herpes-Virus 8 (HHV8) ist in über 91 % von Kaposi-Sarkom(KS)-Läsionen gezeigt worden. Außerdem ist das Virus bei primärem Effusionslymphom (PEL) und bei Patienten mit einer multizentrischen Castleman Erkrankung (MCD) identifiziert worden. Verblüffenderweise wurde gezeigt, dass dendritische Knochenmarkszellen von Patienten mit multiplem Myelom (MM) durch HHV8 infiziert wurden. Seit dieser Zeit ist die Verbindung von HHV8 mit MM das Thema leidenschaftlicher Debatten, die kürzlich wieder belebt wurden. Das Genom von HHV8 kodiert für mehrere Proteine mit signifikanten Homologien für humane antiapoptotische Proteine, Chemokine und Cytokine, einschließlich einer vitalen Form von Interleukin-6 (vIL-6) mit 25 % Homologie für humanes IL-6. vIL-6 hat, wie gezeigt wurde, biologische Aktivitäten, die an humanes IL-6 erinnern, d.h. die Stimulation der Proliferation von Maushybridomzellen und humanen Myelomzellen. Erst kürzlich ist bei Mäusen gezeigt worden, denen vIL-6 transfizierte NIH3T3 Zellen injiziert wurden, dass vIL-6 eine Angiogenese und Hämatopoese induzierte. Es wurde daraus geschlossen, dass durch diese Funktionen vIL-6 eine wichtige Rolle bei der Pathogenese von mit HHV8 verbundenen Erkrankungen spielte. Der Beitrag von IL-6R zur vIL-6 Signalisierung ist kontrovers diskutiert worden. Eine Gruppe, die verunreinigte Überstände von mit vIL-6 transfizierten COS-7 Zellen verwendete, hat gezeigt, dass die STAT Aktivität in Zellen induziert wurde, die gp130, aber kein IL-6R, exprimierten. Im Gegensatz dazu stellte eine andere Gruppe fest, dass die Aktivität von vIL-6 durch einen IL-6 Rezeptorantagonisten reduziert wurde, was für eine Beteiligung von IL-6R an der vIL-6 Signalisierung spricht.
  • Daher betrifft die vorliegende Erfindung auch eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine wirksame Menge an Polypeptiddimer der vorliegenden Erfindung, vorzugsweise in Kombination mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger, enthält. „Pharmazeutisch annehmbar" soll jeden Träger umfassen, der die Wirksamkeit der biologischen Aktivität des Wirkstoffs nicht stört und der für den Wirt, an den er verabreicht wird, nicht toxisch ist. Beispiele für geeignete pharmazeutische Träger sind auf dem Fachgebiet bekannt und umfassen phosphatgepufferte Kochsalzlösungen, Wasser, Emulsionen, wie beispielsweise Öl/Wasser-Emulsionen, verschiedene Arten von Netzmitteln, sterile Lösungen usw. Solche Träger können durch herkömmliche Verfahren formuliert werden und dem Lebewesen in einer wirksamen Dosis verabreicht werden.
  • Eine „wirksame Menge" betrifft eine Menge an Wirkstoff, die ausreicht, um den Verlauf und die Schwere der Krankheit zu beeinflussen, was zu einer Verringerung oder einem Rückgang einer solchen Symptomatik führt.
  • Eine „wirksame Dosis", die zur Behandlung und/oder Verhinderung dieser Erkrankungen oder Krankheiten nützlich ist, kann mit Verfahren bestimmt werden, die dem Fachmann bekannt sind (siehe beispielsweise Fingl u.a., The Pharmacological Basis of Therapeutics, Goodman und Gilman, Hrsg. Macmillan Publishing Co., New York, Seite 1-46 (1975)).
  • Die Verabreichung der geeigneten Zusammensetzungen kann auf verschiedene Weise, z.B. durch intravenöse, intraperitoneale, subkutane, intramuskuläre, topische oder intradermale Verabreichung, erfolgen. Der Verabreichungsweg hängt natürlich von der Therapieart und der Art der in der pharmazeutischen Zusammensetzung enthaltenen Verbindung ab. Der Dosierungsplan wird durch den behandelnden Arzt und anderen klinischen Faktoren bestimmt. Wie auf dem medizinischen Fachgebiet bekannt ist, hängen die Dosierungen für einen Patienten von vielen Faktoren ab, einschließlich den Körpermaßen des Patienten, der Körperoberfläche, dem Alter, dem Geschlecht, der besonderen zu verabreichenden Verbindung, der Zeit und dem Verabreichungsweg, der Therapieart, dem allgemeinen Gesundheitszustand und anderen Medikamenten, die gleichzeitig verabreicht werden.
  • Bevorzugte medizinische Verwendungen der Polypeptiddimeren der oben beschriebenen vorliegenden Erfindung sind die Behandlung/Verhinderung einer Knochenresorption, Hyperkalziämie, Kachexie, von Tumoren, Autoimmunerkrankungen, wie beispielsweise Morbus Crohn, und bakteriellen oder viralen Infektionen.
  • Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Erfindung näher.
  • Beispiel 1: Material und Methoden
  • (A) Materialien
  • DMEM, RPMI-1640, Penicillin, Streptomycin und Gentamycin wurden von Gibco (Eggenstein, Deutschland) gekauft. FCS wurde von Biochrom (Berlin, Deutschland) erhalten. DEAE Dextran stammte von Sigma (Taufkirchen, Deutschland). Restriktionsenzyme, T4-DNA Ligase und Polynukleotidkinase kamen von New England Biolabs (Schwalbach, Deutschland). [3H]-Thymidin, ECL-Reagenzien und Röntgenfilme wurden von Amersham Bioscience (Freiburg, Deutschland) erhalten. Der „QuikChange site-directed" Mutagenesekit stammte von Cell Signalling Technology (Frankfurt, Deutschland). BAF/gp130 Zellen, rekombinantes IL-6 und hyper-IL-6t (H-1 L-6), ein Fusionsprotein, das IL-6 + sIL-6R umfasst (Rakemann u.a., J. Biol. Chem. 274 (1999), 1257), wurden von Stefan Rose-John (Direktor des Instituts für Biochemie, Kiel, Deutschland) erhalten. Humanes sgp130Fc wurde wie beschrieben hergestellt (Atreya u.a., Nat. Med. 6 (2000), 583).
  • (B) Kultur und Transfektion von Zellen
  • BAF/gp130 Zellen wurden in DMEM bei 37°C, 5 % CO2 in einer mit Wasser gesättigten Atmosphäre wachsen gelassen. Die Zellkulturmedien wurden mit 10 % FCS, 100 mg/l Streptomycin und 60 mg/l Penicillin ergänzt. BAF/gp130 Zellen wurden in Gegenwart von 10 ng/ml H-IL-6 kultiviert.
  • (C) Konstruktion von sgp130(D1-D3) und sgp130(D1-D3)His Expressionsplasmiden
  • Die Klonierung der Ligandenbindungsdomänen von gp130(D1-D3) wurde durch Amplifizierung der Kodierungssequenz von gp130 von den Basen 1 bis 978 (entsprechend den Aminosäuren Met 1 bis Pro 326 (2)) durch PCR gemäß Standardprotokollen durchgeführt. pSVLsgp130-Fc (Atreya u.a., Nat. Med. 6 (2000), 583) wurde als Matrize verwendet. Das sich ergebende DNA Fragment wurde auf einem 1 Agarosegel gereinigt, mit einem Qiagen MiniElute Kit isoliert und in die Expressionsplasmide pQE60, pQE70 (Qiagen), pBAD/Myc-His (Invitrogen), pET-3, pET-11, pCAL-c und pCAL-kc (Stratagene) kloniert. Alle Konstrukte wurden durch Restriktionsverdau identifiziert und die Inserts wurden mit Standardverfahren sequenzverifiziert.
  • (D) Konstruktion von sgp130(D1-D3) Pn Expressionsplasmiden
  • Polypeptide unterschiedlicher Länge (Pn), die ein oder mehr Cysteinreste enthielten, wurden dem C-Terminus von sgp130(D1-D3) durch ortsgerichtete Mutagenese gemäß den Standardklonierungsverfahren zugesetzt. Alle Konstrukte wurden durch Restriktionsverdau identifiziert und die Inserts wurden sequenzverifiziert.
  • (E) Konstruktion von vIL-6-His Expressionsplasmiden
  • Die cDNA für vIL-6 wurde durch PCR (Kodierungssequenz in 3) mittels frisch isolierter humaner genomischer DNA als Matrize amplifiziert. Für die Expression von vIL-6-His in COS-7 Zellen wurde die viL-6 cDNA in die Säugetierexpressionsplasmide pEFilmyc-His, pUB6N5-His (Invitrogen) oder pQE-TriSystem (Qiagen) vor dem Polyhistidin(His)-Tag eingeführt. Für die Expression von vIL-6-His in Bakterien wurde vIl-6 cDNA in einen prokaryontischen Expressionsvektor (pQE60, pQE70 (Qiagen), pBAD/My-His (Invitrogen), pET-3, pET-11, pCAL-c oder pCAL-kc (Stratagene) vor einem Polyhistidin-Tag eingeführt. Alle Konstrukte wurden durch Restriktionsverdau identifiziert und die Inserts wurden mit Standardverfahren sequenzverifiziert.
  • (F) Reinigung von viL-6-His
  • Rekombinantes viL-6-His wurde, wie von Müllberg u.a.; J. Immunol. 164 (2000), 4672) beschrieben, gereinigt.
  • (G) Reinigung von sgp130(D1-D3)-Pn (Verfahren 1)
  • Gereinigtes rekombinantes vIL-6-His wurde an eine Ni-NTA Agarosesäule (Qiagen) wie folgt gebunden: Das Säulenmaterial wurde mit 5 Bettvolumen eines 50 mM Phosphatpuffers (pH 7,5), 500 mM NaCl und 20 mM Imidazol (Äquilibrierungspuffer, EB) äquilibriert. vIL-6-His wurde auf die Säule geladen und ungebundenes Protein wurde durch Waschen mit 5 Bettvolumen EB entfernt. Eine Proteinsuspension, enthaltend sgp130(D1-D3)-Pn, wurde auf die Säule geladen und die Säule wurde anschließend mit 10 Bettvolumen EB gewaschen. Schließlich wurde sgp130(D1-De3)-Pn mit einem Citratpuffer (pH 1,4) eluiert und das Eluat wurde sofort neutralisiert. Das Eluat wurde durch Mono-Q Schnellprotein-Flüssigchromatographie (Pharmacia) gereinigt und gegen PBS dialysiert.
  • (H) Reinigung von sgp130 (D1-D3)-Pn (Verfahren 2)
  • Prokaryontische Expressionsplasmide, die sgp130(D1-D3)-Pn und vIL-6-His kodierten, wurden in bakterielle Stämme TOP10 (Invitrogen), XL1-Blue, BL21(DE3) (Stratagene), M15 (pREP4] oder SG13009 [pREP4] (Qiagen) kotransfiziert. 24 Stunden nach der Transformation wurde die Proteinproduktion mit 1 mM Isopropyl-6-D-thiogalactopyranosid (IPTG) gestartet und die Proteine wurden 6 Stunden später extrahiert. Der Proteinextrakt wurde auf eine Ni-NTA Agarosesäule geladen, die zuvor mit 5 Bettvolumen EB äquilibriert worden war. Ungebundene Proteine wurden durch Waschen der Säule mit 10 Bettvolumen EB entfernt. Gp130(D1-D3)-Pn wurde schließlich eluiert, gereinigt und wie oben beschrieben dialysiert.
  • (I) Reinigung von sgp130(D1-D3)-His
  • sgp130(D1-D3)-His wurde mit demselben Verfahren wie für vIL-6-His beschrieben gereinigt.
  • (J) PEGylierung von sgp130(D1-D3)-Pn
  • In den letzten Jahren ist ein wachsendes Interesse für die kovalente Modifikation von biologischen Makromolekülen durch Polyethylenglycol (PEG) entstanden. Diese Art von Modifikation ist äußerst wichtig für die pharmazeutischen und biotechnologischen Anwendungen. Die PEGylierung (die kovalente Anlagerung von PEG) führt zum Beispiel zur Abschirmung von antigenen oder immunogenen Epitopen. Darüber hinaus reduziert sie die Rezeptor vermittelte Aufnahme durch das retikuloendotheliale System oder verhindert das Erkennen und den Abbau durch proteolytische Enzyme (5). Die PEGylierung von Proteinen erhöht, wie gezeigt wurde, ihre Bioverfügbarkeit durch Verringerung der renalen Filtration. sp130(D1-D3) enthält 9 Cystein(C)-Reste, wobei 8 an den Disulfidbrücken beteiligt sind (C28-C54, C48-C103, C134-C144, C172-C182). Das letzte C301 enthält eine freie Sulfydrylgruppe und ist daher für die ortspezifische PEGylierung geeignet. Die Modifikation von sgp130(D1- D3) wurde durch Zugabe eines 3-fachen molaren Überschusses von mPEG-MAL, Molekulargewicht 20,000 (Nektar Therapeutics, San Carlos, CA, USA) zu sgp130(D1-D2)-Pn bei pH 7,2 angewendet. Die Reaktion wurde 60 Minuten lang bei Raumtemperatur durchgeführt und das Produkt wurde durch einen abschließenden Gelfiltrationsschritt gemäß Standardbedingungen isoliert. PEGyliertes sgp130(D1-D3)-His wurde durch Inkubieren des Proteins mit einem 3-fachen molaren Überschuss von verzweigtem mPEG(MAL)2, Molekulargewicht 20,0000 (Nektar) bei pH 7,2 bei Raumtemperatur für 90 Minuten angewendet. Das Produkt wurde anschließend gemäß Standardverfahren gelfiltriert.
  • (K) Isolierung und Stimulierung von Lamina propria mononuklearen Zellen (LPMC)
  • LPMC wurden in vollständigem Medium kultiviert, das aus RPMI-1640 mit 3 mM 1-Glutamin, 10 mM HEPES Puffer, 10 μg/ml Gentamycin, 100 U/ml Penicillin, 100 U/ml Streptomycin, 50 μM 2-Mercaptoethanol und 10 % wärmeinaktiviertes FCS bestand. Die Zellen wurden mit 10 μg/ml C-reaktivem Protein (Sigma), 50 ng/ml Phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA) und 10 μg/ml Phytohämagglutimin (PHA) (Sigma) in Gegenwart oder bei Fehlen von sgp130Fc, neutralisierenden IL-6R spezifischen Antikörper (zur Verfügung gestellt von Professor Dr. Rose-John, Universität Kiel, Deutschland), sgp130PEG oder sgp130TagPEG in Konzentrationen von 1 bis 10 μg/ml, wie in den Figuren angegeben, stimuliert. Nach 48 Stunden wurden die Zellen mit Annexin V und Propidiumiodid mittels des ApoAlert Annexin V-FITC Apoptosedetektionskits gefärbt (BD Bioscience, Heidelberg, Deutschland) und mittels FACS analysiert.
  • (L) Proliferationsassays
  • BAF/gp130 Zellen wurden ausgiebig mit PBS gewaschen, um Wachstumsfaktoren zu entfernen, und in cytokinfreiem Medium resuspen diert. 5 × 103 Zellen pro Loch einer 96er Platte wurden in einem Endvolumen von 100 μl mit Cytokinen und steigenden Mengen an sgp130Fc oder sgp130PEG oder sgp130TagPEG, wie in den Figuren angegeben, für 68 Stunden kultiviert und anschließend mit 0,25 mCi [3H]-Thymidin für 4 Stunden pulsmarkiert. Die Zellen wurden auf Glasfiltern geerntet und eingeführtes [3H]-Thymidin wurde durch Szintillationszählung bestimmt.
  • (M) Luciferase-Reportergen-Assay
  • BAF31gp130 Zellen wurde mit den Reportergenplasmiden pSTAT3-TA-Luc (BD Bioscience, Heidelberg, Deutschland) und pCMV-Luc kotransfiziert und für 24 Stunden inkubiert. Die transfizierten Zellen wurden dann mit 5 ng/ml H-IL-6 bei Fehlen oder in Gegenwart von 10 μg/ml sgp130Fc, sgp130PEG bzw. sgp130TagPEG für weitere 20 Stunden inkubiert. Die Extraktion und Detektion der Luciferaseaktivität wurde mittels des Dual-Luciferase-Reportergen-Assays von Promega (Mannheim, Deutschland) gemäß der Anleitung des Herstellers und durch eine Messung in einem MicroLumatPlus LB96V Mikroplattenluminometer durchgeführt (EG&G Berthold, Wellesley, MA, USA).
  • (N) Konstruktion von sgp130(D1-D3).1 und sgp130(D1-D3)-Tag Expressionsplasmiden
  • Die Klonierung der Ligandenbindungsdomänen von gp130(D1-D3).1 wurde durch Amplifizierung der Kodierungssequenz von gp130 von den Basen 70 bis 966 (entsprechend den Aminosäuren Leu 24 bis Tyr 322 (2)) mittels PCR gemäß Standardprotokollen durchgeführt. pSVLsgp130-Fc (2) wurde als Matrize genommen. Das sich ergebende DNA Fragment wurde auf einem 1 % Agarosegel gereinigt, mit einem Qiagen MiniElute-Kit isoliert und in ein geeignetes Expressionsplasmid kloniert. Für die markierten Proteinexpression wurden Vektoren verwendet, die das geeignete Tag, wie beispielsweise His( 4-6), FLAG, Step-Tag, GFP, GST, HA CBP oder andere Epitope umfassen, für die Antikörper verfügbar sind. Alternativ wurde das gewünschte Tag direkt hinter die sgp130(D1-D3).1 cDNA kloniert. Alle Konstrukte wurden durch Restriktionsverdau identifiziert und die Inserts wurden durch Standardverfahren sequenzverifiziert.
  • (O) Konstruktion von sgp130-Pn Expressionsplasmiden
  • Polypeptide von unterschiedlicher Länge (Pn), die ein oder mehr Cysteinreste enthielten, wurden dem C-Terminus von sgp130 durch ortsgerichtete Mutagenese der entsprechenden Expressionsplasmide gemäß der Anleitung des Herstellers zugesetzt. Alle Konstrukte wurden durch Restriktionsverdau identifiziert und die Inserts wurden mittels Standardverfahren sequenzverifiziert.
  • (P) Konstruktion von vIL-6-His Expressionsplasmiden
  • Die cDNA für vIL-6 wurde mit PCR (Kodierungssequenz in 3) mittels frisch isolierter humaner genomischer DNA als Matrize amplifiziert. Für die Expression von vIL-6-His in COS-7 Zellen wurde die vIL-6 cDNA in ein geeignetes Säugetierexpressionsplasmid vor einem Polyhistidin (His) Tag eingeführt, Z.B. pcDNA3.1/myc-His, pEF1/myc-His, pUB6/V5-His (Invitrogen), pQE-TriSystem (Qiagen) oder andere. Für die Expression von vIl-6-His in Bakterien wurde die vIL-6 cDNA in einen geeigneten prokaryontischen Expresssionvektor vor einem Polyhistidin-Tag eingeführt, Z.B. pQE60, pQE70 (Qiagen), pBAD/Myc-His (Invitrogen), pET-3, pET-11, pCAL-c, pCAL-kc (Stratagene) oder andere. Alle Konstrukte wurden durch Restriktionsverdau identifiziert und die Inserts wurden durch Standardverfahren sequenzverifiziert.
  • (Q) Reinigung von sgp130-Pn (Verfahren I)
  • Virales Inerleukin-6 (vIL-6) (4) bindet, wie gezeigt wurde, spezifisch an gp130 ohne weitere Notwendigkeit für den IL-6 Rezeptor (IL-6R) (3). Diese Wechselwirkung von vIL-6 wurde verwendet, um sgp130 durch eine vIL-6-His Affinitätssäule zu reinigen. Gereinigtes rekombi nantes vIL-6-His wurde wie folgt an eine Ni-NT Agarosesäule (Qiagen) gebunden: Das Säulenmaterial wurde mit 5 Bettvolumen 50 mM Phosphatpuffer (pH 7,5), 500 mM NaCl und 20 mM Imidazol äquilibriert (Äquilibrierungspuffer, EB). vIL-6-His wurde auf die Säule geladen und ungebundenes Protein wurde durch Waschen mit 5 Bettvolumen EB entfernt. Eine Proteinsuspension, die sgp130-Pn enthielt, wurde auf die Säule geladen und die Säule wurde anschließend mit 10 Bettvolumen EB gewaschen. Schließlich wurde sgp130-Pn durch einen Citratpuffer, pH 1,4, eluiert. Das Eluat wurde sofort neutralisiert, mit einer Mono-Q Schnellrotein-Flüssigchromatographie (Pharmacia) gereinigt und gegen PBS dialysiert.
  • (R) Reinigung von sgp130-Pn (Verfahren II)
  • Prokaryontische Expressionsplasmide, die gp130-Pn und vIL-6-His kodieren, wurden in geeignete bakterielle Stämme kotransifziert, z.B. TOP10 (Invitrogen), XL1-Blue, BL21(DE3) (Stratagene), M15 [pREP4], SG13009 [pREP4] (Qiagen) oder andere. 24 Stunden nach der Transformation wurde die Proteinproduktion mit 1 mM Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) gestartet, und die Proteine wurden 6 Stunden später extrahiert. Das Proteinextrakt wurde auf eine Ni-NTA Agarosesäule geladen, die zuvor mit 5 Bettvolumen EB äquilibriert worden war. Ungebundene Proteine wurden durch Waschen der Säule mit 10 Bettvolumen EB entfernt. gp130-Pn wurde schließlich eluiert, gereinigt und dialysiert, wie zuvor beschrieben.
  • (S) Reinigung von sgp130Tag
  • sgp130Tag (mit Tag = His6) wurde durch dasselbe Verfahren, wie für vIL-6-His beschrieben, gereinigt. Im Falle eines anderen Tag, wie beispielsweise His( 4-6), FLAG, Step-Tag, GFP, GST, HA CBP oder anderen Epitopen, für die Antikörper zur Verfügung stehen, wurde das sgp130Taq Molekül mit einem geeigneten Antikörper getrennt, der auf einer Matrix, wie beispielsweise Agarose, immobilisiert wurde.
  • (T) PEGylierung von sgp130
  • Während der letzten Jahre gibt es ein wachsendes Interesse an der kovalenten Modifikation von biologischen Makromolekülen durch Polyethylenglycol (PEG). Die Modifikationsart ist für pharmazeutische und biotechnologische Anwendungen äußerst wichtig. Die PEGylierung (die kovalente Anlagerung von PEG) führt zum Beispiel zum Abschirmen von antigenen oder immunogenen Epitopen. Darüber hinaus reduziert es die rezeptorvermittelte Aufnahme durch das retikuloendotheliale System oder verhindert das Erkennen und den Abbau durch proteolytische Enzyme (5). Die PEGylierung von Proteinen erhöht, wie sich gezeigt hat, ihre Bioverfügbarkeit durch Reduzierung der renalen Filtration.
  • sgp130 enthält 9 Cystein(C)-Reste, wobei 8 in Disulfidbrücken enthalten sind (C28-C54, C48-C103, C134-C144, C172-C182). Das letzte C301 enthält eine freie Sulfhydrylgruppe und ist daher zur ortsspezifischen PEGylierung geeignet. Die Modifikation von sgp130 wurde angewendet, indem ein 3-facher molarer Überschuss an mPEG-MAL, Molekulargewicht 20,000 (Nektar Therapeutics, San Carlos, CA, USA) zu sgp130-Pn bei pH 7,2 zugegeben wurde. Die Reaktion wurde 60 Minuten lang bei Raumtemperatur durchgeführt und das Produkt wurde durch einen abschließenden Gelfiltrationsschritt gemäß Standardbedingungen isoliert. PEGyliertes sgp130Tag wurde durch Inkubation des Proteins mit einem 3-fachen molaren Überschuss an mPEG(MAL)2, Molekulargewicht 20,000 bei pH 7,2 bei Raumtemperatur für 90 Minuten erzeugt. Das Produkt wurde anschließend gemäß Standardverfahren gelfiltriert.
  • Beispiel 2: sgp130PEG und sgp130TagPEG hemmen die antiapoptotische Wirkung von sIL-6R auf LPMC von Morbus Crohn (CD) Patienten
  • Ein neutralisierender, gegen IL-6R gerichteter Antikörper war in der Lage, Apoptose in Lamina propria T-Zellen von CD Patienten hervorzurufen (Atreya u.a., 2000). Die Wirkung von anti-IL-6R mAb wurde auch in drei unterschiedlichen Kolitismodellen gezeigt, d.h. scid-Mäuse, rekonstruiert mit CD62L+ CDr45RBhoch CD4+ T-Zellen, IL-10 defiziente Mäuse und mit Trinitrobenzolsulfonsäure (TNBS) behandelte Mäuse. In allen Fällen wurde die Kolitisaktivität auf ein ähnliches Niveau wie das nach einer anti-TNF mAb Behandlung beobachtete runterreguliert (Atreya u.a., 2000). Das Ziel dieses Versuchs war es zu zeigen, ob das sgp130PEG und sgp130TagPEG der vorliegenden Erfindung diese Wirksamkeit haben wie z.B. sgp130Fc, bei der Induzierung von Apoptose in LPMC.
  • LPMC wurden in Gegenwart von neutralisierendem anti-IL-6R Antikörper, sgp130Fc, sgp130PEG oder sgp130TagPEG unter Bedingungen kultiviert, die im Beispiel 1 beschrieben sind. Apoptotische Zellen wurden als Annexin V-positive, Propidiumiodid-negative Zellen durch FACS Analyse bestimmt. Unbehandelte Proben enthielten ungefähr 60 % apoptotische Zellen, während die Behandlung mit anti-IL-6 Antikörper, sgp130Fc, sgp130PEG oder sgp130TagPEG zu einem Anstieg der apoptotischen Zellen zwischen 11 % bis 16 % führte. Ein unPEGyliertes sgp130Dimer war weniger wirksam, was die Wichtigkeit der PEGylierung für die biologische Aktivität des Moleküls zeigt (4 und 8).
  • Beispiel 3: Hemmung der IL-6/sILl-6R abhängigen Proliferation von BAF/3 Zellen
  • Die IL-3 abhängige pre-B Zelllinie BAF/3 exprimiert nicht gp130 und ist daher nicht in der Lage, auf ILl-6 oder IL-6/sIL-6R zu reagieren. Im Gegensatz dazu sind BAF/3 Zellen, die stabil mit humaner gp130 cDNA (BAF/gp130) transfiziert waren, in der Lage, bei Fehlen von IL-3 in Reaktion auf IL-6/sIL-6R oder hyper-IL-6 (H-IL-6) zu wachsen. BAF/gp130, das entweder mit IL6-/sIL-6R (5A und 9A) oder H- IL-6 (5B und 9B) simuliert war, wurde mit steigenden Mengen an sgp130Fc, sgp130PEG oder sgp130TagPEG behandelt und die Wirkung von beiden sgp130 Molekülen auf die Proliferation der Zellen wurde gemessen. In beiden Experimenten führten steigende Mengen an sgp130Fc, sgp130PEG oder sgp130TagPEG zu einer wichtigen Reduzierung der [3H]-Thymidin-Einführung. Allerdings wurde eine halbmaximale Einführung (punktierte Linie bei ~ 7,500 cpm) erreicht, wenn 7,5 bis 10 ng/ml sgp130Fc den Zellen zugegeben wurde. Im Gegensatz dazu wurde dieselbe Einführungsreduzierung bereits bei einer sgp130PEG und sgp130TagPEG Konzentration von 1 bis 5 ng/ml festgestellt. Dies zeigt, dass die Behandlung mit sgp130PEG und sgp130TagPEG bei einem Faktor von 1,5 bis 3 besser funktionierte als es sgp130Fc tat. Darüber hinaus wurde in Bild B unPEGyliertes sgp130dimer verwendet, um die wichtige Rolle der PEGylierung für die biologische Aktivität des Proteins zu zeigen.
  • Beispiel 4: sgp130PEG hemmt die mit H-IL-6 induzierte STAT3 Aktivierung in BAF/pg130 Zellen
  • Der latente cytoplasmatische Transkriptionsfaktorsignaltransducer und Aktivator der Transkription (STAT)3 wird, wie bekannt ist, in mehreren unterschiedlichen Zellarten durch IL-6 Behandlung aktiviert. Die Funktion von STAT3 ist intensiv in verschiedenen Zelltypen untersucht worden. Diese umfassen die Induktion einer Akutphasenreaktion in Hepatomzellen, die Stimulation der Proliferation in B-Lymphozyten, die Aktivierung der abschließenden Differenzierung und das Wachstum der Arrestinmonozyten und das Aufrechterhalten der Pluripotenz von embryonalen Stammzellen (Übersicht in Levy und Lee, J. Clin. Invest. 109 (2002), 1143). Um zu bestimmen, ob eine IL-6-induzierte STAT3 Aktivierung durch sgp130PEG oder sgp130TagPEG beeinflusst wird, wurden BAF/gp130 Zellen mit pSTAT3-TA-Luc transfiziert, wie im Beispiel 1 beschrieben. 24 Stunden später wurden die Zellen mit 5 ng/ml H-IL- 6 bei Fehlen oder in Gegenwart von 10 μg/ml sgp130Fc, sgp130PEG bzw. sgp130TagPEG für weitere 20 Stunden behandelt. Die Zellen wurden extrahiert und die Glühwürmchen-Luciferase-Aktivität wurde bestimmt. Die relative Luciferase-Aktivität in Zellen, die nur mit H-IL-6 behandelt wurden, wurde auf 100 % gesetzt (6A und 10A). Im Gegensatz dazu wurde die STAT3 Aktivität auf 26 % reduziert (sgp130Fc). Im zweiten Versuch wurde die Dosisabhängigkeit der zuvor beschriebenen Wirkung bestimmt, indem die Zellen mit steigenden Mengen an sgp130Fc, sgp130PEG bzw. sgp130TagPEG behandelt wurden (6B und 10B). Eine halbmaximale Aktivierung von STAT3 wurde mit sgp130PEG und sgp130TagPEG in einer Konzentration von 2,5 μg/ml bestimmt, während dieselbe Wirkung mit sgp130Fc in einer Konzentration von ungefähr 7,5 μg/ml zu sehen ist. Auch hier war, wie zuvor gezeigt, die Wirksamkeit von sgp130PEG und sgp130TagPEG ungefähr 2- bis 3-fach höher als die mit sgp130Fc beobachtete.

Claims (13)

  1. Polypeptiddimer, umfassend zwei lösliche gp130 Moleküle, wobei mindestens eines der löslichen gp130 Moleküle kovalent mit Polyethylenglycol verbunden ist und wobei jedes der löslichen gp130 Moleküle aus den extrazellulären Domänen D1-D3 von gp130 oder Mutanten oder Fragmenten der extrazellulären Domänen D1-D3, die die Fähigkeit zur Hemmung der Aktivität des agonistischen Komplexes Il-6/sIL-6R beibehalten, besteht.
  2. Polypeptiddimer nach Anspruch 1, wobei jedes der löslichen gp130 Moleküle kovalent mit Polyethylenglycol verbunden ist.
  3. Polypeptiddimer nach Anspruch 1 oder 2, wobei mindestens eines der beiden löslichen gp130 Moleküle die Aminosäuresequenz umfasst, wie in der 2 gezeigt.
  4. Polypeptiddimer nach Anspruch 3, wobei jedes der löslichen gp130 Moleküle die Aminosäuresequenz umfasst, wie in der 2 gezeigt.
  5. Polypeptiddimer nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die beiden löslichen gp130 Moleküle über ein oder mehr Disulfidbrücken miteinander verbunden sind.
  6. Polypeptiddimer nach Anspruch 1 bis 4, wobei die beiden löslichen gp130 Moleküle miteinander über ein verzweigtes Polyethylenglycol miteinander verbunden sind.
  7. Polypeptiddimer nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die beiden löslichen gp130 Moleküle über einen flexiblen Peptidlinker miteinander verbunden sind.
  8. Polynukleotid, kodierend das Polypeptiddimer nach einem der Ansprüche 1 bis 7 oder ein Monomer des Dimers.
  9. Expressionsvektor, enthaltend ein Polynukleotid nach Anspruch 8.
  10. Wirtszelle, enthaltend einen Expressionsvektor nach Anspruch 9.
  11. Verfahren zur Herstellung des Polypeptiddimers nach einem der Ansprüche 1 bis 7, umfassend das Kultivieren einer Wirtszelle nach Anspruch 10, das Gewinnen des Polypeptidmonomers oder -dimers aus der Wirtszelle oder der Kultur und das PEGylieren der Monomeren oder Dimeren.
  12. Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend ein Polypeptiddimer nach einem der Ansprüche 1 bis 7.
  13. Verwendung eines Polypeptiddimers nach einem der Ansprüche 1 bis 7 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung oder Vermeidung einer Knochenresorption, Hyperkaiziämie, Kachexie, einem Tumor, einer Autoimmunerkrankung, einer entzündlichen Erkrankung einer bakteriellen oder viralen Infektion.
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