DE69630313T3

DE69630313T3 - Mit monoklonalem antikörper anti-her2 induzierte apoptosis

Info

Publication number: DE69630313T3
Application number: DE69630313.2T
Authority: DE
Inventors: Tsutomu Arakawa; Yoshiko KITA
Original assignee: Amgen Inc
Current assignee: Amgen Inc
Priority date: 1995-12-05
Filing date: 1996-12-04
Publication date: 2014-08-14
Anticipated expiration: 2016-12-05
Also published as: PT865448E; PT1375520E; JP2002502230A; AU1278497A; EP0865448A1; EP0865448B2; MX9804358A; US8444990B2; EP0865448B1; ES2208773T5; US20020164334A1; US7354583B2; SI0865448T2; DE69630313T2; DK0865448T3; IL124689A; SI0865448T1; ATE251644T1; CA2236913A1; AU723492B2

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine pharmazeutische Zusammensetzung umfassend einen Anti-Her2-Antikörper oder ein Fragment davon, welcher bzw. welches in Her2 exprimierenden Zellen Apoptose induziert.
Hintergrund der Erfindung
Das Her2-Onkogen kodiert ein membran-assoziiertes Glycoprotein, das als p185^HER-2 bezeichnet wird und Tyrosinkinaseaktivität besitzt. Her2 ist ein Mitglied der Subfamilie des epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) Rezeptors, welche den EGF-Rezeptor und Her3- und Her4-Rezeptoren mit einschließt (Kraus et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 9193–9197 (1989); Plowman et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 1746–1750 (1993)). Die Her2-Sequenz wurde durch Semba et al. beschrieben (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 6497–6501 (1985)); Coussens et al. (Science 230, 1132–1139 (1985)) und King et al. (Science 229, 974–976 (1985)). Über ein verwandtes Rattengen wurde von Schecter et al. berichtet (Nature 312, 515–516 (1984)).
Verschiedene Gruppen beschrieben eine gesteigerte Expression des Her2-Onkogens in Tumorzellen und Zelllinien (Coussens et al., supra; King et al., supra). Die gesteigerte Expression von Her2 resultiert aus der Genamplifikation oder gesteigerten Expression des Singlecopy-Gens. Diese Beobachtungen legen nahe, dass Her2 in humanem Krebsgewebe überexprimiert sein kann. Slamon und Kollegen (Slamon et al. Science 235, 177–182 (1987); Slamon et al. Science 244, 707–712 (1989)) untersuchte die Expressionswerte von Her2 in Tumoren, welche einer großen Probe von Brust- und Eierstockkrebspatienten entnommen wurde. Es wurde festgestellt, dass fast 30% dieser Patienten eine Amplifikation und Überexpression des Her2-Gens aufwiesen, was mit einer schlechten klinischen Prognose (erhöhter Rückfall und niedrige Überlebensrate) insbesondere in knoten-positiven Brustkrebszellen assoziiert wurde. Die durch Slamon et al. berichteten Zusammenhänge wurden in einer Reihe von Studien bestätigt (siehe beispielsweise Ro et al. Cancer Res. 49, 6941–6944 (1989); Walker et al. Brit. J. Cancer 60, 426–429 (1989); Wright et al. Cancer Res. 49, 2087–2090 (1989); Berchuck et al. Cancer Res. 50, 4087–4091 (1990); Kallioniemi et al. Int. J. Cancer 49, 650–655 (1991); Rilke et al. Int. J. Cancer 49, 44–49 (1991)).
Die Anwesenheit bestimmter Faktoren wie beispielsweise der Her2-Überexpression, die ein Indiz für eine schlechte Prognose sind, können nahelegen, dass eine begleitende Therapie nach der chirurgischen Entfernung des Tumors angebracht ist. Die begleitende Therapie kann Chemotherapie in hohen Dosen und autologe Knochenmarkstransplantation mit einschließen. Es wurde kürzlich berichtet (Muss et al. N. Engl. J. Med. 330, 1260–1266 (1994)), dass Brustkrebspatienten, welche einen Tumor mit Her2-Überexpression aufwiesen, durch die begleitende Therapie signifikante Verbesserungen zeigten.
Durch Analogie mit anderen Rezeptorproteintyrosinkinasen kann angenommen werden, dass ein Ligand für Her2 die Rezeptorphosphorylierung stimuliert. Von einer Reihe von Polypeptidfaktoren wurde berichtet, dass sie die Tyrosinphosphorylierung von Her2 steigern und von denen man annimmt, dass sie ein Ligand sind (Wen et al. Cell 64, 559–572 (1992); Holmes et al. Science 256, 1205–1210; Marchionni et al. Nature 362, 312–318 (1993); Falls et al. Cell 72, 801–815 (1993)). Gleichwohl gibt es keinen Beweis dafür, dass irgendwelche dieser Faktoren wirkliche Liganden sind, welche direkt an Her2 binden und die Rezeptorphosphorylierung stimulieren. Ein Ansatz, um die Abwesenheit eines Liganden zu umgehen ist es, einen ligandenähnlichen monoklonalen Antikörper (mAb) zu erzeugen. Verschiedene Gruppen haben Anti-Her2 mAbs unter Verwendung entweder eines Zelloberflächen-Her2-Rezeptors oder einer aufgereinigten extrazellulären Domäne des Her2-Rezeptors erzeugt (Yarden, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 2569–2573 (1990); Hanwerth et al. Br. J. Cancer 68, 1140–1145 (1993); Srinivas et al. Cancer Immunol. Immunother. 36, 397–402 (1993); Stancovaski et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 8691–8695 (1991)). Diese mAbs stimulierten die Tyrosinphosphorylierung von Her2 von überexprimierenden Zellen, waren jedoch in Bezug auf die Bindung und auf die Phosphorylierung von jeweils Her2, Her3 oder Her4 oder in Bezug auf die Kinaseaktivierung in Her2 transfizierten Zellen nicht vollständig charakterisiert.
Wachstumsinhibierende Effekte von Anti-Her2 mAbs auf Brustkrebszellen wurden kürzlich beschrieben (Tagliabue et al. Int. J. Cancer 47, 933–937 (1991); Hudziak et al. Mol. Cell. Biol. 9, 1165–1172 (1989); Drevin et al. Oncogene 2, 387–394 (1988); Fendly et al. Cancer Res. 50, 1550–1558 (1990); Hanwerth et al., supra; siehe ebenfalls Zusammenfassung von Vitetta und Uhr, Cancer Res. 54, 5301–5309 (1994)), jedoch wurden diese Effekte als zytostatisch interpretiert, da die Entfernung des Antikörpers eine Wiederaufnahme des Zellwachstums erlaubte. Xu et al. (Int. J. Cancer 53, 401–408 (1993)) berichtet von Anti-Her2-Antikörpern, welche auf das Anker-unabhängige Tumorzellwachstum zytotoxisch wirken.
Von einem Anti-EGF-Rezeptor mAb wurde berichtet, dass er auf der humanen kolorektalen karzinomen Zelllinie DiFi, welche den EGF-Rezeptor überexprimiert, Apoptose induziert und dass er morphologische Änderungen bei Konzentrationen von 5 bis 20 nM induziert. Diese Effekte wurden sowohl als Blockierung der EGF-Bindung an den kognaten Rezeptor durch Kompetierung von mAb als auch als Fehlen der mAb-mitogenen Aktivität interpretiert (Wu et al. J. Clin. Invest. 95, 1897–1905 (1995)).
Apoptose oder programmierter Zelltod ist eine Form des Zelltods, die durch Zellschrumpfung und DNA-Fragmentierung charakterisiert wird. Das Zusammenbrechen des Zellkerns tritt auf, wenn das Chromation in einzelne oder multiple mononuklosomale Einheiten fragmentiert wird, ein Prozess, der durch eine endogene Endonuklease vermittelt wird. Apoptose unterscheidet sich vom nekrotischen Zelltod, welcher in einem Anschwellen der Zelle und einer Freisetzung der intrazellulären Komponenten resultiert (Kerr et al. Br. J. Cancer 26, 239–257 (1972); Wyllie et al. Int. Rev. Cytol. 68, 251–306 (1980); Wyllie Nature 284, 555–556 (1980)). Apoptotische Zellen, ohne die Freisetzung solcher Komponenten, sind phagozytosiert und daher degradiert (Savill et al. Nature 343, 170–173 (1990)). Apoptose resultiert daher in einem effizienten Prozess zur Eliminierung nicht erwünschter Zellen durch den wirtseigenen Abwehrmechanismus.
Deshane J. et al. (”Intracellular antibody knockout of the erbB2 oncoprotein achieves targeted eradication of tumor targets by induction of apoptosis”, J. Invest. Med., Band 32, No. Suppl. 2, April 1995, Seite 328A) bezeiht sich auf einen intrazellulären Antikörper-Knockout des erbB-2-Onkoproteins und die gezielte Auslöschung von Tumortargets durch die Induktion von Apoptose während dieses Prozesses. Deshane et al. verwenden Genkonstrukte, die so geplant sind, dass sie die einzelkettigen Immunoglobuline (sFvs) mit Anti-erbB-2-Spezifität für die intrazelluläre Expression eines Anti-erbB-2-Antikörpers kodieren.
Grim J. et al. (”Induction of apoptotic cell death in erbB-2 overexpressing tumor cells of diverse histologic subtypes mediated by intracellular localization of an anti-erbB-2 sFv.”, Cancer Gene Therapy, Spalte 1, Nr. 4, Dezember 1994, Seiten 333–334) bezieht sich auf die Induktion von apoptotischem Zelltod in erbB-2 überexprimierenden Tumorzellen verschiedener histologischer Subtypen, welche durch intrazelluläre Lokalisation eines Anti-erbB-2-SSV vermittelt wird. Das Genkonstrukt in Grim J. et al. wird mit Hilfe des Adenovirus-Polylysin (AdpL) Verfahrens der Karzinomzelllinie SKOV3 aus humanen Eierstöcken übermittelt und die intrazelluläre Expression eines Anti-erbB2 einzelkettigen Antikörpers führt zu einer Down-Regulierung der Zelloberflächenexpression von erbB-2 und der Induktion von Apoptose in den Tumorzellen.
Curiel O. (”Strategies to accomplish targeted tumor cell cytotoxicity”, Gene Therapy, Band 2, No. Suppl. 1, November 1995, S. 520) bezieht sich auf Strategien zur Erreichung gezielter Tumorzellzytotoxizität. Curiel O. beschreibt die intrazelluläre Expression eines einzelkettigen Antikörpers (sFv) Anti-erbB-2 sFvs und die Induktion von Apoptose.
WO 94/00136 A (6. Januar 1994) bezieht sich auf die Verwendung einer Kombination Anti-erbB-2 monoklonaler Antikörper für die Vorbeugung und Behandlung humaner bösartiger Tumore durch die Induktion von Apoptose.
Kita Y. et al., (”ErbB receptor activation, cell morphology changes, and apoptosis induced by anti-Her2 monoclonal antibodies”, Bioch. Biophys. Res. Comm., Band 226, Nr. 1, 4. September 1996, Seiten 59–69) bezieht sich auf die erbB-Rezeptoraktivierung, Änderungen der Zellmorphologie und Apoptose, die durch Anti-Her2 monoklonale Antikörper induziert wird.
WO 96/07321 A (14. März 1996) bezieht sich auf Verfahren zur Modulierung der Proteinfunktion in Zellen unter Verwendung intrazellulärer Antikörperhomologe.
Es ist eine Aufgabe der Erfindung, eine pharmazeutische Zusammensetzung bereitzustellen umfassend einen Antikörper gegen Her2 oder ein Fragment davon, welcher bzw. welches Apoptose in Her2 exprimierenden Zellen induziert, und damit solche Zellen für die Entfernung aus dem Wirt ”markiert”. Die Antikörper sind für die Induzierung von Apoptose in Tumoren verwendbar. Dies stellt eine wesentliche Verbesserung gegenüber gegenwärtig verfügbaren Antikörpertherapien gegen Krebs dar, welche üblicherweise das Töten von Tumorzellen mittels eines Antikörpers in Verbindung mit einem zytotoxischen Agens miteinschließen. Zytotoxische Agenzien produzieren im Allgemeinen unerwünschte Nebeneffekte, welche, falls schwerwiegend, zu einer Verminderung oder Unterbrechung der Behandlung führen können. Der vorliegende Ansatz erlaubt das Töten von Tumorzellen durch das Immunsystem des Wirts, wodurch die Effekte zytotoxischer Agenzien und die durch solche Agenzien induzierte Tumorzellennekrose vermieden werden.
Zusammenfassung der Erfindung
Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist eine pharmazeutische Zusammensetzung umfassend einen Anti-Her2-Antikörper oder ein Fragment davon, welcher bzw. welches in Her2 exprimierenden Zellen Apoptose induziert, in einer Menge, welche ausreichend ist, um Apoptose zu induzieren, in einer Mischung mit einem pharmazeutisch geeigneten Hilfsmittel. Es wurde festgestellt, dass ein Antikörper, der die Phosphorylierung von Her2-Rezeptoren in Zelllinien stimuliert, ebenfalls den unerwarteten Effekt der Induzierung von Änderungen in Her2 exprimierenden Zellen besitzt, die für Apoptose charakteristisch sind. Diese Änderungen schließen DNA-Fragmentierung und den Verlust der Entwicklungsfähigkeit mit ein und werden innerhalb von 24 Stunden in der behandelten Zellpopulation beobachtet. Ein solcher Antikörper ist zur Markierung von Her2 überexprimierenden Zellen zur Eliminierung durch den Abwehrmechanismus des Wirtes verwendbar.
In einer bevorzugten Ausführungsform erkennt der oben dargestellte Antikörper ein Epitop auf einem Her2-Polypeptid, welches durch den monoklonalen Antikörper erkannt wird, der durch die hybridome Zelllinie ATCC No. HB-12078 erzeugt wird. Das Epitop unterscheidet sich von Epitopen, die durch andere Antikörper erkannt werden, welche ebenfalls an Her2 binden, jedoch nicht Apoptose induzieren, was nahe legt, dass die Region von Her2, welche mit dem Antikörper interagiert, für die Auslösung einer apoptotischen Antwort wichtig ist. Antikörper, die Apoptose induzieren, können als Volllängen-Antikörper vorliegen, die intakte variable und konstante Regionen oder Fragmente davon besitzen, welche die Her2-Bindung und Apoptose beibehalten. Die Antikörper können durch hybridome Zelllinien oder durch rekombinante DNA-Verfahren hergestellt werden.
Bevorzugt ist der Antikörper der oben erklärten Zusammensetzung ein monoklonaler Antikörper und noch bevorzugter ein humanisierter Antikörper. Ebenfalls bevorzugt ist ein wie oben dargestellter Antikörper, der ein humaner Antikörper ist.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst eine hybridome Zelllinie, die in der Lage ist, einen monoklonalen Anti-Her2-Antikörper, welcher in Her2 exprimierenden Zellen Apoptose induziert, zu erzeugen.
Eine ebenfalls bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist eine pharmazeutische Zusammensetzung, wie sie oben erläutert wurde, wobei das Fragment ein F(ab)- oder Fab'-Fragment ist. Bevorzugt wird der Antikörper der Zusammensetzung durch die hybridome Zelllinie ATCC No. HB-12078 gemäß der vorliegenden Erfindung erzeugt.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls die hybridome Zelllinie ATCC No. HB-12078 zur Verfügung und einen Antikörper, der durch die hybridome Zelllinie ATCC No. HB-12078 erzeugt wurde.
Bevorzugt sind die Her2 exprimierenden Zellen Tumorzellen. Noch bevorzugter stammen die Tumorzellen aus Brust-, Eierstock-, Prostata-, gastritischen und kolorektalem Krebs.
Von einer Reihe an Krebsarten einschließlich Brust-, Eierstock-, Prostata- und kolorektalem Krebs wird vorhergesagt, dass sie stärker invasiv und damit stärker letal sind, wenn sie Überexprimierung von Her2 aufweisen. Die Verbindung zwischen Her2-Expression und einer schlechten Prognose (verstärkter Rückfall und höhere Mortalität) in bestimmten Krebsarten hat Her2 zu einem attraktiven Target für Krebstherapeutika werden lassen.
Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung einer wie oben erläuterten pharmazeutischen Zusammensetzung als Medikament zur Behandlung von Krebs. Das Medikament induziert bevorzugt Apoptose.
Beschreibung der Figuren
1. Bindung von mAb74 an glycosylierte und deglycosylierte sHer2 mittels Western Blot Analyse. (a) Ausmaß der Her2-Deglycosylierung durch CHO-Färbung nach nicht reduzierender SDS-PAGE; (b) Bindung von mAb74 an glycosylierte und deglycosylierte Her2, wie mittels Western Blot nach nicht reduzierender SDS-PAGE analysiert.
2. Her2 und Her3 Tyrosinphosphorylierung, die durch mAb-Stimulation in SKBR3 induziert wurde. SKBR3-Zellen wurden in einer Platte mit 48 Vertiefungen für 5 Minuten bei 37°C 18 Stunden vor der mAb-Stimulierung eingebracht. Die Zellen wurden mit SDS-Probenpuffer gelöst. Die gelösten Proben wurden auf 6% Polyacrylamidgelen einer Elektrophorese unterzogen, gefolgt von einem Western Blot und einer Sondierung mit Anti-Phosphotyrosin-Antikörper. (a) Alle mAb-Konzentrationen betrugen 250 nM in DMEM. 2 nM neu Differenzierungsfaktor –α (NDFα) wurde als positive Kontrolle verwendet. (b) mAb-Dosisabhängigkeit der Tyrosinphosphorylierung.
3. Inhibierung der durch mAb induzierten Rezeptortyrosinphosphorylierung durch löslichen Her2-Rezeptor. Der Phosphorylierungsassay ist dem in 2 beschriebenen ähnlich. Die Zellen wurden mit 250 nM mAb mit unterschiedlichen Konzentration an sHer2 inkubiert.
4. Rezeptortyrosinphosphorylierung von transfizierten Zelllinien, Her2/32D und HEG/32D, durch mAb-Stimulierung induziert. Für den Phosphorylierungsassay wurden die Zellen durch Zentrifugation pelletiert, mit PBS gewaschen und anschließend mit 100 μl 250 nM mAbs in RPMI für 5 Minuten bei 37°C inkubiert, gefolgt von einer Quenchreaktion durch die Zugabe von 1 ml eiskaltem PBS und Zentrifugation bei 4°C. Der Überstand wurde entfernt und SDS Probenpuffer wurde zu dem zentrifugierten Pellet hinzugegeben. Die Probe wurde einer 6%igen SDS-PAGE unterzogen, gefolgt von einem Western Blot und einer Sondierung mit Anti-PTY. Eine A431 basal phosphorylierte Probe wurde als Positivkontrolle verwendet.
5. Durch mAbs induzierte zellmorphologische Änderung. Die Zellen (a–d, Her2/MCF7; e, f, MDAMB453 wurden in 1% FBS in Kulturmedium mit oder ohne mAb gezüchtet. Nach 5 Tagen wurden die Zellen beobachtet und fotografiert. (a, e) Kontrolle (ohne mAb); (b) 250 nM mAb74; (c) 250 nM mAb83; (d) 250 nM mAb42b; (f) 100 nM mAb74.
6. Detektion von apoptotischen Zellen mit einem modifizierten TUNEL-Verfahren. MDAMB453 (a–d) Zellen oder Her2/MCF7 (e, f) Zellen wurden mit oder ohne mAbs in 1%igem FBS-Kulturmedium für einen Tag inkubiert, gefolgt von einem Apoptoseassay. (a, e) Kontrolle (ohne mAb); (b) 50 nM mAb74; (c, f) 500 nM mAb74; (d) 500 nM mAb42b.
Genaue Beschreibung der Erfindung
Monoklonale Antikörper (mAbs), welche an Her2 binden, wurden durch Immunisierung von Mäusen mit aufgereinigtem löslichen Her2 erzeugt. Lösliches Her2 wurde exprimiert und wie in Beispiel 1 beschreiben, aufgereinigt. MAbs, welche an lösliches Her2 in enzym-verknüpften Immunsorbentassays (EIA) binden, wurden einer Verdünnungsklonierung und einem erneuten Screening durch EIA und BIAcore zur Bindung an Her2 (Beispiel 2) unterworfen. Zehn Klone wurden für die weitere Analyse ausgewählt. Es wurde festgestellt, dass aufgereinigte Antikörper aus diesen Klonen bevorzugt lösliches Her2 binden und geringe oder keine Bindung an lösliches Her3 und Her4 zeigen. Die biologischen Effekte ausgewählter Antikörper wurden bei der Rezeptordimerisierung, Rezeptorphosphorylierung und Änderungen in der Zellphysiologie studiert. Alle getesteten Antikörper bildeten 2:1 (Rezeptor:Antikörper) Komplexe mit Her2 (Beispiel 4). Drei verschiedene Antikörper stimulierten Phosphorylierung von Her2- und Her3-Rezeptoren auf SKBR3-Zellen und Her2-, Her3- und Her4-Rezeptoren auf MDAMB453-Zellen. Die Phosphorylierung aller Rezeptoren wurde durch lösliches Her2 inhibiert, was nahe legt, dass die ligandenähnlichen Effekte der mAbs direkt durch Her2 vermittelt werden.
Ein Antikörper, mAb74 erzeugte dramatische Änderungen in der Physiologie der Her2 exprimierenden Zellen (Beispiele 5 und 6). Behandlung von MCF7-Zellen, die mit dem Her2-Gen voller Länge transfiziert wurden oder die Behandlung von MDAMB453-Zellen, welche natürlicherweise Her2 exprimieren, mit mAb74 resultierte in einer deutlichen Änderung der Zellmorphologie und extensiven Zelltod. Ein anderer Antikörper, mAb83, zeigten einen moderaten Effekt auf die Zellmorphologie. In solchen nicht entwicklungsfähigen Zellen wurde Apoptose induziert, wie durch extensive DNA-Fragmentierung bewiesen. Gleichwohl entkam eine Subpopulation an Zellen der Aktivität von mAb74 und wurde nicht apoptotisch.
Die Erfindung stellt eine pharmazeutische Zusammensetzung umfassend einen Anti-Her2-Antikörper oder ein Fragment davon zur Verfügung, welcher bzw. welches in Her2 exprimierenden Zellen Apoptose induziert, in einer Menge, welche ausreichend ist, um Apoptose zu induzieren, in einer Mischung mit einem pharmazeutisch geeigneten Hilfsmittel. Wie hier verwendet, beschreibt der Begriff ”Apoptose” programmierten Zelltod, welcher durch nuklearen Zusammenbruch und DNA-Abbau charakterisiert wird. Zellen, die Apoptose in Antwort auf die pharmazeutische Zusammensetzung der Erfindung durchleben, werden mindestens Her2 auf der Zelloberfläche und optional Her3 und Her4 besitzen. Es wird bevorzugt, dass die Zellen oder Gewebe, die als Ziel verwendet werden, Werte der Expression von Her2 besitzen, die größer sind als der normale basale Wert. Die Her2-Überexpression kann mindestens 10% höher sein als der normale basale Wert, und noch bevorzugter 20% höher, oder noch bevorzugter 30% höher. Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff ”Her2-Überexpression” auf jeden Wert der Her2-Expression, der größer als der normale basale Wert ist. Wie im Abschnitt angedeutet, der den Stand der Technik beschreibt, werden verschiedene Krebsarten durch Her2-Überexpression charakterisiert. Ein basaler Wert der Her2-Expression ist typischerweise ein solcher, der in nicht-kanzerogenen Geweben und Zellen gemessen wird, die Her2 exprimieren.
Antikörper in der pharmazeutischen Zusammensetzung der Erfindung binden an ein Epitop von Her2 in einer Weise, dass eine Bindung in Her2-Dimerisierung, Her-Phosphorylierung und Zellapoptose resultiert. Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff ”Epitop” auf eine Region von Her2, die durch einen Antikörper gebunden wird, welche gegen Bindung durch einen zweiten Antikörper geschützt ist. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Epitop durch die Bindung von mAb74 an Her2 definiert. Dieses Epitop unterscheidet sich von Epitopen, die durch andere Anti-Her2-Antikörper erkannt wird (siehe Tab. 1). Es ist bemerkenswert, dass andere Anti-Her2-Antikörper die Her2-Dimerisierung und Phosphorylierung induzieren, jedoch keine Apoptose, und Epitope von Her2 erkennen, die unterschiedlich von denen sind, die durch mAb74 erkannt werden.
Die Antikörper in der pharmazeutischen Zusammensetzung der Erfindung können polyklonal oder monoklonal oder Fragmente davon sein. Murine polyklonale und monoklonale Antikörper werden durch immunologische Standardverfahren erzeugt. Antikörperfragmente umfassen solche Antikörper, die mit Her2 spezifisch interagieren und Apoptose in Zellen und Geweben induzieren, die Her2 exprimieren. Wie unten in den Beispielen angedeutet, gibt es eine Beziehung zwischen apoptotischer Aktivität von mAb74 und Her2-Rezeptorphosphorylierung und Dimerisierung. Es ist daher bevorzugt, dass die Antikörperfragmente in der pharmazeutischen Zusammensetzung der Erfindung ihre bivalente Struktur beibehalten, welche wahrscheinlich die Rezeptordimerisierung und Aktivierung fördert. Ebenfalls mit umfasst sind Antikörper, die durch rekombinante Mittel erzeugt wurden, wie beispielsweise chimäre Antikörper (variable Region und konstante Region aus verschiedenen Spezies abgeleitet) und CDR-veränderte Antikörper (komplementäre Bestimmungsregion aus einer unterschiedlichen Spezies abgeleitet), wie im US-Patent Nr. 4,816,567 und 5,225,539 beschrieben. Die Antikörper in der pharmazeutischen Zusammensetzung sind bevorzugt mindestens teilweise humanen Ursprungs. Diese schließen humanisierte Antikörper mit ein, die typischerweise durch rekombinante Verfahren erzeugt werden, wobei die humanen Sequenzen einen Teil oder die Gesamtheit des Antikörpers umfassen. Ebenfalls mit umfasst sind vollständig humane Antikörper, die in genetisch-veränderten Mäusen erzeugt wurden (siehe PCT-Anmeldung Nr. 93/12227).
Antikörper in der pharmazeutischen Zusammensetzung der Erfindung können ebenfalls eine messbare Markierung besitzen, die an ihnen angebracht wurde. Die Markierung kann eine Fluoreszenz-, enzymatische, Affinitäts- oder Isotopenmarkierung sein. Beispiele schließen Fluoresceinisothiocyanat (FITC) zur Detektion mittels Fluoreszenz mit ein, Meerrettichperoxidase, welche die Detektion durch Spaltung eines chromogenen Substrats erlaubt, Radioisotope wie beispielsweise I¹²⁵ zur Detektion mittels Autoradiografie und Avidin/Biotin zur Antikörperdetektion und Affinitätsaufreinigung von Antigenen und Antigen-tragenden Zellen.
Ebenfalls von der Erfindung mit umfasst sind hybridome Zelllinien, die einen monoklonalen Antikörper erzeugen, wobei der Antikörper Apoptose in Her2 exprimierenden Zellen und Geweben induziert. In einer Ausführungsform erzeugt das Hybridom einen monoklonalen Antikörper, welcher ein Epitop auf Her2 in solchen Weise erkennt, dass ein Antikörper-Her2-Komplex zur Induktion von Apoptose führt. Bevorzugt erzeugt das Hybridom einen Antikörper, der das Epitop von Her2 erkennt, welches durch mAb74 erkannt wird. Die hybridome Zelllinie, welche mAb74 erzeugt, wurde bei der American Type Culture Collection, Rockville, MD am 4. April 1996 unter der Hinterlegungsnummer ATCC No. HB-12078 hinterlegt.
Verschiedene Krebsarten werden durch erhöhte Werte der Her2-Expression charakterisiert, einschließlich Brust-, Eierstock-, Prostata-, Magen- und kolorektalen Krebsarten (Press et al. in Effects of Therapy an Biology an Kinetics of the Residual Tumor, Teil A: Preclinical Aspects, Seiten 209–221 (1990); Fukushige et al. Mol. Cell. Biol. 6, 955–958 (1986); Bargmann et al. in The Oncogene Handbook, Seiten 107–119 (1988)). Eine Beziehung zwischen einer schlechten Prognose und der Her2-Überexpression in kanzerogenem Gewebe wurde berichtet. Patienten mit einer schlechten Prognose besitzen üblicherweise eine größere Rückfallrate und ein häufigeres Auftreten der Mortalität. Solche Patienten können häufig einen Vorteil aus einer aggressiven Behandlungskur ziehen, die hohe Dosen an Chemotherapie mit einschließt. Eine solche Therapie ist teuer und kann für den Patienten Risiken mit sich bringen. Es wurde vorgeschlagen, dass Anti-Her2-Antikörper in einer Krebsbehandlungskur verwendet werden, um Tumorwachstum zu inhibieren, wobei die Antikörper in Verbindung mit zytotoxischen Agenzien verwendet werden. Ein Ansatz schließt Kombinationen von Anti-Her2-Antikörpern und chemotherapeutischen Agenzien (wie beispielsweise Cisplatin, 5-Fluorourazil und andere) mit ein, um den zytotoxischen Effekt von chemotherapeutischen Wirkstoffen zu verstärken (dieser Effekt wird als Antikörper-abhängige zelluläre Zytotoxizität, oder ADCC bezeichnet).
Ein weiterer Ansatz verwendet Immuntoxine oder Konjugate von Antikörpern mit zytotoxischen Agenzien wie beispielsweise verschiedenen Toxine der A-Kette, Ribosomen-inaktivierenden Proteinen und Ribonukleasen. Ein anderer Ansatz schließt die Verwendung von bispezifischen Antikörpern mit ein, die so gestaltet wurden, dass sie zelluläre Mechanismen für das Töten von Tumoren induzieren (siehe beispielsweise US-Patent Nr. 4,676,980 und 4,954,617 ).
Die Antikörper der pharmazeutischen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung wirken an sich gegenüber Her2 exprimierenden Zellen durch die Induzierung der Apoptose toxisch. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann vorteilhafterweise in der Behandlung von Krebs verwendet werden, der durch Her2-Überexpression charakterisiert wird, wie beispielsweise Brust-, Eierstock-, Magen-, Prostata- und kolorektalen Krebsarten. Die Verwendung der pharmazeutischen Zusammensetzung besitzt dadurch signifikante Vorteile gegenüber früheren Ansätzen, dass die Verabreichung von zytotoxischen Agenzien vermieden werden kann, die auf alle wachsenden Zellen zerstörerisch wirken. Es wird vorweggenommen, dass die Verwendung der pharmazeutischen Zusammensetzung allein zur Behandlung von Krebs unerwünschte Nebeneffektive sehr stark reduziert, die mit der Verabreichung von hohen Dosen zytotoxischer Agenzien oder Kombinationen einer Chemotherapie/Antikörperkombinationstherapie verbunden sind. Falls ein zytotoxisches Agens verwendet wird, wird alternativ erwartet, dass die Verwendung der vorliegenden pharmazeutischen Zusammensetzung in Verbindung mit zytotoxischen Agenzien dahingehend von Vorteil ist, dass weniger zytotoxisches Agens verwendet werden kann, um den gleichen therapeutischen Effekt zu erzielen. Ein Antikörper wie beispielsweise mAb74 kann alleine oder in Kombination mit anderen Anti-Her2-Antikörpern verabreicht werden, die Apoptose induzieren.
Es wird erwartet, dass die Verabreichungsroute für die pharmazeutische Zusammensetzung der Erfindung parenteral sein wird. Die Verabreichung kann eine subkutane, intravenöse oder intramuskuläre Injektion sein und kann eine einzelne Bolusinjektion sein oder über kontinuierliche Infusion erfolgen. Die Menge des zu verwendenden Antikörpers wird von der Natur und der Schwere des Krankheitszustandes abhängen, liegt jedoch im Allgemeinen im Bereich von etwa 0,1 μg/kg Körpergewicht bis etwa 100 mg/kg Körpergewicht.
Die Erfindung stellt eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, die eine therapeutisch effektive Menge eines Anti-Her2-Antikörpers umfasst, welcher Apoptose induziert, zusammen mit einem pharmazeutisch geeigneten Hilfsstoff. Der Hilfsstoff wird aus einem oder mehreren Lösungsmitteln, Trägern, Konservierungsstoffen, Emulgatoren, Antioxidanzien und/oder Stabilisatoren ausgewählt. Pharmazeutisch geeignete Hilfsstoffe sind einem Fachmann bekannt und werden extensiv in Remingtons's Pharmaceutical Sciences, 18. Ausgabe, Hrsg. A. R. Gennaro, Hrsg. Mack, Easton, PA (1990) zusammengefasst. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen sind steril, nicht pyrogen und für die Injektion geeignet. Wie hier verwendet bezieht sich eine ”therapeutisch effektive Menge” auf eine solche Menge an Antikörpern, die einen therapeutischen Effekt für einen gegebenen Zustand und einen Verabreichungsplan bereitstellt. In der vorliegenden Erfindung ist ein therapeutischer Effekt die Induktion von Apoptose in Tumoren, die durch Her2-Überexpression charakterisiert sind. Die in der Zusammensetzung verwendeten Antikörper sind bevorzugt solche, welche keine Immunantwort auslösen, wenn sie einem Patienten verabreicht werden, der eine Behandlung benötigt. In einer Ausführungsform sind die Antikörper humane oder humanisierte Antikörper, welche unter Verwendung von Verfahren hergestellt werden können, die einem Fachmann bekannt sind.
Die folgenden Beispiele bieten eine bessere Beschreibung der Erfindung, sollen jedoch den Schutzbereich der Erfindung nicht einschränken.
BEISPIEL 1
Herstellung von Her2, Her3 und Her4 extrazellulären Domänen
Klonierung und Expression der Her2 extrazellulären Domäne (lösliches Her2)
Ein lösliches Her2-Rezeptorkonstrukt wurde wie folgt hergestellt. Ein cDNA-Klon von Her2 in voller Länge auf dem Plasmid pLJ (pLJ wurde in Korman et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 2150–2054 (1987) beschrieben) wurde mit AatII verdaut, welches einmalig an der Position 2107 der Her2 DNA-Sequenz schneidet (Nummerierung wie in Coussens et al., supra). Das linearisierte Plasmid wurde mit HindIII geschnitten, welches 5' des initiierenden ATG schneidet, um ein ungefähr 2200 Basenpaar langes Fragment freizusetzen. Dieses Fragment wurde in pDSRα2 5'-HindIII an 3'SalI unter Verwendung eines Oligonukleotidlinkers (AatII-SalI) kloniert, welche eine in-frame FLAG-Sequenz und ein Translationsterminationscodon enthält. Die resultierende cDNA kodiert die Her2 extrazelluläre Ligandenbindungsdomäne, die von den Aminosäureresten 1–653 reicht, die an die FLAG-Sequenz (unterstrichen) fusioniert ist:
Thr Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys STOP
Dieses Konstrukt wurde in CHOd-Zellen transfiziert. Einzelne Zellklone wurden aus der ausgewählten Population entnommen und auf die Produktion von löslichem Her2 durch sowohl Anti-FLAG als auch Anti-Her2 Western Blot-Analyse geprüft.
Klonierung und Expression der Her3 extrazellulären Domäne (lösliches Her3)
Ein cDNA-Klon, der die Her3-Sequenz in voller Länge enthält, wurde durch Screening einer cDNA-Bibliothek isoliert, die aus SKBR3 hergestellt wurde (American Type Tissue Collection, Bethseda, MD, ATCC HTB 30). Die Bibliothek wurde in 49 Pools aufgeteilt, von denen jeder 3200 individuelle Klone enthielt. Von jedem Pool wurde Plasmid-DNA auf Nitrozellulosefilter transferiert (Schleicher & Schuell, Keene, NH). Zwei Oligonukleotidsonden, die zu den 3'-Enden der Her3-Sequenzen korrespondieren
wurden synthetisiert und zum Screening der SKBR3 cDNA Bibliotheksfilter verwendet. Die Hybridisierung wurde in 6 × SSC 50 mM Natriumphosphat (pH 6,8), 0,1% Natriumpyrophosphat, 0,2% SDS, 2mM EDTA, 2 × Denhardt's Lösung und 50 mg/ml Lachssperma-DNA bei 42°C für 16 Stunden durchgeführt. Die Filter wurden anschließend bei 42°C mit 2 × SSC, 0,2% SDS, 2 mM EDTA für 30 Minuten gewaschen und auf Röntgenfilmen bei –80°C für 2 Tage exponiert.
Zehn Pools, die bei der Hybridisierung positive Signale ergaben, wurden weiter durch Polymerasekettenreaktions (PCR) Analyse charakterisiert, um festzustellen, ob diese ebenfalls die Her3 5'-Sequenz kodieren. Plasmid-DNA aus jedem Pool wurde mit Hilfe von Oligonukleotidprimern amplifiziert, die mit dem 5'-Ende der Her3-Sequenzen korrespondieren:
Die PCR wurde 40 Zyklen lang durchgeführt; mit jedem Zyklus bei 94°C, 30 Sekunden; 50°C, 30 Sekunden; und 72°C, 30 Sekunden. Drei der zehn Pools enthielten eine Her3 cDNA voller Länge. Die drei Pools wurden erneut durch die Koloniehybridisierungsprozedur von Lin et al. gescreent (Gene 44, 201–209. (1986)), bis einzelne Klone aus jedem Pool erhalten werden konnten. Die cDNA-Sequenzierung führte zu einer Sequenz, die identisch zu der publizierten war (Kraus et al., supra).
Das Plasmid pJT2-Her3 wurde zur PCR-Amplifikation der löslichen Her3-Domäne unter Verwendung der folgenden Primer verwendet:
Nach Verdauung mit den Restriktionsenzymen XbaI und SalI wurde das 1,9 kb PCR-Fragment in pDSRα2 subkloniert (PCT-Anmeldung Nr. WO 91/05795 ), welches mit XbaI und SalI geschnitten wurde. Die Her3-Sequenzen im erhaltenen Plasmid wurden mittels DNA-Sequenzierung bestätigt. Das Plasmid pDSRα2/Her3 wurde verwendet, um CHOd^–-Zellen für die Expression von löslichem Her3 zu transfizieren.
Klonierung und Expression der Her4 extrazellulären Domäne (lösliches Her4)
Ein Her4 cDNA-Klon voller Länge wurde durch Screening einer cDNA-Bibliothek von humanem fötalen Hirn erhalten (Stratagene, San Diego, CA). Zwei Her4 cDNA-Sonden wurden durch PCR-Amplifikation aus cDNA aus humanem Hirn hergestellt (Clontech Laboratories, Ind., Palo Alto, CA). Die cDNA probe-1 korrespondiert zu den Sequenzen des 5'-Endes von Her4, welche die Aminosäurereste 32 bis 177 kodieren und die cDNA probe-2 korrespondiert zu den Sequenzen des 3'-Endes von Her4, welche die Aminosäurereste 1137 bis 1254 kodieren (Plowman et al., supra). Ungefähr 4 × 10⁶ pfu der cDNA-Bibliothek aus humanem fötalen Hirn wurden sequenziell mit der Sonde des Her4 5'-Endes und der Sonde des Her4 3'-Endes gescreent. Die Hybridisierungslösung enthielt 6 × SSC, 50 mM Natriumphosphat (pH 6,8), 0,2% SDS, 2 mM EDTA, 0,1% Natriumpyrophosphat, 2 × Denhardt's Lösung, 50 mg/ml Lachssperma-DNA und 50% Formamid. Die Hybridisierung wurde bei 42°C für 16 Std. durchgeführt. Die Filter wurden bei 67°C mit 2 × SSC, 0,2% SDS, 2 mM EDTA für 60 Minuten gewaschen und anschließend auf Röntgenfilmen bei –80°C über Nacht exponiert. Die Autoradiografie der Filter zeigte, dass 12 Klone an die Sonde des 5'-Endes hybridisierten und weitere 5 Klone an die Sonde des 3'-Endes hybridisierten. Einzelne Klone wurden durch erneutes Ausplattieren aufgereinigt, durch Sondenhybridisierung wie oben beschrieben gescreent und die positiven Klone wurden sequenziert.
Von allen sequenzierten positiven cDNA-Klonen wurde festgestellt, dass sie teilweise Her4 cDNA-Klone sind. Von den Sequenzen wurde festgestellt, dass sie identisch zu der veröffentlichten Her4-Sequenz (Plowman et al. supra) sind, mit Ausnahme einer kurzen Deletion/Austausch in der extrazellulären Domäne. Die Aminosäuren 626 bis 648 der veröffentlichten Her3-Sequenz (NGPTSHDCIYYPWTGHSTLPQHA) wurden durch die Peptidsequenz IGSSIEDCIGLMD ausgetauscht. Das G an der Aminosäureposition 573 der Sequenz von Plowman wurde ebenfalls durch ein D ausgetauscht.
Da keiner der 17 Klone die cDNA von Her4 in voller Länge enthielt, wurden zwei überlappende Klone miteinander fusioniert, um einen Her4-Rezeptor voller Länge unter Verwendung von Techniken zu erzeugen, wie sie in Maniatis et al. beschrieben wurden (Molekular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbour Laboratory, (1982)). Ein Klon kodierte die Aminosäurereste von 1 bis 738 in Her4 und ein anderer kodierte die Aminosäurereste von 588 bis 1298. Diese beiden überlappenden Klone wurden durch einen Restriktionsenzymverdau des Plasmids pBluescriptSK freigesetzt und im Plasmid pGEM4 zusammengesetzt, um eine Her4 cDNA voller Länge zu erzeugen.
Ein löslicher Her4-Rezeptor wurde durch PCR-Amplifikation eines 700 Basenpaar langen Her4 DNA-Fragment konstruiert, welches die Aminosäuren 409 bis 639 der cDNA von Her4 voller Länge kodiert. Die Sequenzen der beiden Primer, die in dieser Amplifikation verwendet wurden, waren
Die PCR wurde 25 Zyklen lang durchgeführt; mit jedem Zyklus bei 94°C, 30 Sekunden; 55°C, 30 Sekunden; und 72°C, 30 Sekunden. Dieses 700 Basenpaar PCR-Produkt wurde mittels Agarosegelelektrophorese aufgereinigt. Das Plasmid pGEM4/Her4 wurde mit NotI und BstEII gespalten, um zwei Fragmente zu erzeugen: ein Fragment enthaltend das Plasmid pGEM4 und die cDNA des Her4 5'-Endes, welche die extrazelluläre Domäne des Rezeptors von den Aminosäuren 1 bis 420 kodiert; und ein zweites Fragment, welches von den Aminosäuren 421 von Her4 bis zum Ende des Her4-Moleküls reicht. Diese beiden DNA-Fragmente wurden in Agarosegel aufgetrennt und das 5'-Fragment von pGEM4/Her4 wurde zurückgewonnen. Das 700 bp Her4 PCR-Fragment wurde mit BstEII und NotI verdaut und mit dem Fragment des pGEM4/Her4 5'-Endes ligiert. Die erhaltene cDNA kodiert die extrazelluläre Domäine des Her4-Rezeptors, welche die Aminosäurereste von 1 bis 639 umfasst. Der durch PCR amplifizierte Anteil wurde sequenziert, um zu bestätigen, dass keine PCR-Fehler auftraten.
Das lösliche Her4 cDNA-Konstrukt wurde aus dem Plasmid pGEM4 freigesetzt, in das Plasmid pDSRa2 insertiert und in CHOd^–-Zellen unter Verwendung von Standardverfahren transfiziert (Maniatis et al., supra). Einzelne Zellklone wurden aus der ausgewählten Population entnommen und mittels BIAcore Analyse auf die Erzeugung von löslichem Her4 überprüft.
Aufreinigung von sHer2-, sHer3- und sHer4-Rezeptoren.
Eingestelltes Medium von CHO-Zellen, die lösliches Her2 (sHer2) exprimieren, wurde 12,5-fach unter Verwendung einer Pellicon tangentialen Fließultrafiltrationsvorrichtung (Amicon) konzentriert, welche mit einer 50 K MWCO Filterkassette (Filtron Technology) verbunden war, und das Konzentrat wurde mit drei Volumina an 20 mM Kaliumphosphat, 100 mM NaCl, pH 6,8 diafiltriert. Das diafiltrierte Konzentrat wurde mit Hydroxylapatit (Calbiochem) in Diafiltrationspuffer äquilibriert. Die nicht gebundene Fraktion wurde mit einem gleichen Volumen an Wasser verdünnt und anschließend auf eine Q-Sepharose Fastflowsäule gegeben (Pharmacia), welche mit 10 mM Kaliumphosphat, 50 mM NaCl, pH 7,0 äquilibriert wurde. Die Säule wurde mit einem linearen Gradienten von 50–600 mM NaCl eluiert. Es wurde ein Pool aus den Fraktionen hergestellt, die > 95% sHer2 enthielten. sHer3 und sHer4 wurden ebenfalls in einer dem oben beschriebenen Verfahren ähnlichen Art und Weise aus eingestellten Medien von CHO-Zellen aufgereinigt, die diese Proteine exprimieren. Aufgrund seines höheren pI-Werts wurde sHer3 an eine Q-Sepharosesäule gebunden und eluiert, wobei die Säule mit 10 mM Kaliumphosphat, 50 mM NaCl, pH 7,5 äquilibriert wurde.
BEISPIEL 2
Herstellung von Anti-Her2 Antikörpern
Verfahren zur Immunisierung von Tieren, Herstellung von Fusionen und das Screening von Hybridomen und aufgereinigten Antikörpern wurde generell durchgeführt wie in Harlow und Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988) beschrieben.
Enzym-verknüpfter Immunosorbent Assay (EIA).
Platten mit 96 Vertiefungen wurden mit 2 μg/ml sHer2, 2 μg/ml sHer3 oder 2 μg/ml sHer4 in einem Karbonat-Bikarbonatpuffer beschichtet. Nach Blockierung wurde eingestelltes Hybridomamedium zu den Platten zugegeben und für 2 Stunden inkubiert. Das Medium wurde abgesaugt und die Platten wurden gewaschen vor der Zugabe von Kaninchen-Anti-Maus IgG Antikörper, der mit Meerrettich-Peroxidase (Boehringer Mannheim) konjugiert ist. Nach einstündigen Inkubation wurden die Platten abgesaugt und fünfmal gewaschen. Der gebundene Antikörper wurde mit ABTS-Farbreagens (Kirkegaard und Perry Labs., Inc.) detektiert. Das Ausmaß der Antikörperbindung wurde durch Beobachtung des Anstiegs der Absorption bei 405 nm bestimmt.
Klonierung und Bestimmung von IgG Subtypen. Die Klonierung einzelner Zellen wurde in einer Platte mit 96 Vertiefungen unter Verwendung eines limitierten Verdünnungsverfahrens durchgeführt. Eingestelltes Medium von Einzelzellklonen wurde unter Verwendung des oben beschriebenen EIA-Verfahrens auf Antikörpererzeugung gescreent. Die stärksten Antikörper erzeugenden Klone wurden zur Vermehrung des Zellwachstums und anschließend zur Bestimmung des Subtyps und zu Kompetitionsstudien ausgewählt.
BIAcore Analyse. Aufgereinigtes sHer2, sHer3 oder sHer4 wurde kovalent an einen Sensorchip CM5 über die primäre Amingruppe gekoppelt unter Verwendung von 40 μl des Rezeptors in 10 mM Natriumacetat, pH 4,0 (10 μg Rezeptor pro ml). Die nicht reagierten Gruppen auf dem Sensorchip wurden mittels einer Injektion von 50 μl 1 M Ethanolaminhydrochlorid (Pharmacia Biosensor AB) blockiert. Jede Analyserunde bestand aus einer Injektion von 40 μl Hybridoma-Überstand (oder aufgereinigten mABs), gefolgt von einer Injektion an 10 μl 10 mM HCl, um den Chip zu regenerieren. Die Bindung der mABs wurde durch einen Wechsel in der SPR beobachtet und in Resonanzeinheiten (RU) gemessen. Für die meisten Proteine korrespondieren 1000 RU zu einer Oberflächenkonzentration von ungefähr 1 ng/mm².
Herstellung und Screening von hybridomen Zelllinien. 7 balb/C-Mäuse wurden subkutan dreimal in dreiwöchigen Intervallen mit 10 μg löslichem Her2 injiziert. Das Protein wurde mit RIBI-Adjuvans emulgiert. Die Serumtiter für Her2 wurden nach 8 Wochen bewertet und die beiden Mäuse mit den höchsten Titern ausgewählt und diesen wurde eine finale i. v.-Injektion von 10 μg löslichem Her2 verabreicht. Drei Tage später wurden die beiden Mäuse euthanisiert und die Milz wurde entfernt, in einem Stomacher-Gewebezerkleinerer zerkleinert und filtriert, und einzelne Zellen wurden gewonnen. Nach drei Waschschritten wurden die Milzzellen gezählt, mit Myelomzellen aus Maus (SP2/0) in einem Verhältnis von 3:1 (Milz: SP2/0) gemischt und in der Anwesenheit von 50% PEG (MW 1500) fusioniert. Die fusionierten Zellen wurden in einer Gesamtheit von 10 Platten mit 96 Vertiefungen bei einer Milzzellkonzentration von 1,25 × 10⁵ pro Vertiefung in einem Medium ausplattiert, welches aus DMEM:RPMI (1:1), 10% FBS und 10% ORIGEN besteht. Die Auswahl von fusionierten Zellen wurde in HAT-Selektionsmedium durchgeführt. Die Kulturmedien wurden durch EIA auf Antikörper gegen Her2 gescreent, nachdem entwicklungsfähige Zellkolonien ungefähr 30% der Vertiefung belegt hatten.
68 positive Ergebnisse wurden aus 960 Vertiefungen identifiziert. Zellen aus 43 Vertiefungen wurden durch limitierende Verdünnung zur Erzeugung von Einzel-Zellkolonien kloniert. Vertiefungen, die einzelne Kolonien enthielten, wurden markiert und wenn 30% der Oberfläche der Vertiefung zugewachsen waren, auf Anti-Her2 Antikörper mittels EIA und BIAcore überprüft. Die finale Anzahl an Einzelzellklonen betrug 26, welche 20 originale Hauptvertiefungen repräsentiert.
In Abhängigkeit der Bindung von hybridomen Überständen an sHer2, wie dieses durch EIA und BIAcore geprüft wurde, wurden 10 Klone zur weiteren Untersuchung ausgewählt. 5 × 10⁶ Zellen aus jedem der 10 Klone wurden in geprimte balb/C-Mäuse injiziert, und Ascites-Flüssigkeit wurde nach ungefähr 10 Tagen gesammelt. Die Immunoglobuline wurden über ihre Affinität auf einer Protein A MAPS II Säule (BioRad) aufgereinigt. Die IgG aufgereinigten Antikörper wurden durch EIA auf ihre Bindung an Her2, Her3 und Her4 wie oben beschrieben untersucht. Die Bindungskapazität wurden mit 10 ng/ml oder 100 μg/ml an mAbs bewertet. Die Bindung der Antikörper von sHer2 war bei einer Antikörperkonzentration von 10 ng/ml leicht zu erkennen, während die Bindung an sHer3 und sHer4 zu vernachlässigen war, selbst bei einer Antikörperkonzentration von 100 μg/ml. Die Daten zeigen, dass alle Klone mit der Ausnahme von mab83 stark an sHer2 ohne nachweisbare Bindung an sHer3 und sHer4 binden.
Die IgG-Subtypen wurden von hybridomen Überständen unter Verwendung eines Isotyp Ab-Stat-Kits (Sangstate Medical Corp.) bestimmt und die Ergebnisse sind in Tabelle I gezeigt.
Bindung von mAbs an sHer2, sHer3 und sHer4
Die Bindung von mAbs an sHer2 auf einem BIAcore Chip wurde unter Verwendung von 10 ug/ml mAbs untersucht und in Resonanzeinheiten (RU) bewertet. Wie in Tabelle I gezeigt, zeigten zwei Klone (52 und 58) mehr als 1000 RU, zwei Klone (35 und 42B) zeigten um die 700 RU, zwei Klone (43A und 74) zeigten um die 300 RU, zwei Klone (83 und 97) zeigten um die 100 RU, und zwei Klone (29 und 86) zeigten weniger als 100 RU. Die Ergebnisse deuteten einen breiten Bereich der Affinität zwischen den zehn Klonen an. Es wurde keine nachweisbare Bindung von Anti-sHer2 mAbs an sHer3 und sHer4 beobachtet. Diese Ergebnisse zusammen mit den EIA-Daten bestätigen, dass die gegen sHer2 erzeugten mAbs spezifisch an sHer2 mit geringer oder keiner Bindung an sHer3 und sHer4 binden.
Epitopkompetitionsassay. Die Epitopspezifität von Anti-Her2 mABs wurde durch die Bindung von Paaren monoklonaler Antikörper simultan an sHer2 bestimmt, welches auf einem BIAcore-Chip immobilisiert wurde. Gegen verschiedene Epitope gerichtete mABs sollten unabhängig voneinander binden, wobei mABs, welche gegen nahe verwandte Epitope gerichtet sind, sterisch miteinander in der Bindung interferieren sollten. Der erste mAB wurde dreimal in einem Volumen von 40 μl bei einer Konzentration von 10 μg/ml auf die immobilisierte sHer2-Oberfläche injiziert. 40 μl des zweiten Antikörpers wurden anschließend injiziert und die Fähigkeit zur simultanen Bindung an sHer2 wurde bewertet. Die Biosensoroberfläche wurde durch die Injektion von 10 μl 50 mM HCl regeneriert. Die Bindung wurde ebenfalls analysiert, als die Injektionssequenz von jedem Paar an Antikörpern umgekehrt wurde. Diese Analyse teilte die mAbs in vier verschiedene Gruppen von Epitopspezifitäten, wie sie in Tabelle 1 gezeigt werden. Zwischen der Epitopgruppierung und der Phosphorylierungsaktivität gab es offensichtlich keine Beziehung mit der Ausnahme von mAb74, welches im Vergleich zu anderen mAbs ein einzigartiges Epitop zu haben scheint.
BEISPIEL 3
Charakterisierung des mAb74 Epitops auf Her2
Der Effekt der Glycosylierung auf die Interaktion von mAb74 mit sHer2 wurde wie folgt bestimmt. 60 μg von sHer2 in 20 mM BTP, 40 mM NaCl, pH 7,4 wurden für fünf Minuten in einem kochenden Wasserbad in der Anwesenheit von 0,4% SDS denaturiert. Nach der Denaturierung wurde NP-40 (Boehringer Mannheim) zu 2% v/v zugegeben und die Reaktion wurde mit einem gleichen Volumen an DI H₂O vor der Zugabe von 3 Einheiten rekombinanter N-Glycanase (Genzym) verdünnt. Man ließ die Reaktion unter sanftem Schütteln bei 37°C für 20 Stunden weiterlaufen.
Ein Detektionssystemkit von ECL Glycoprotein (Amersham Life Science) wurde verwendet, um das Ausmaß der Deglycosylierung zu bestimmen. 0,25 μg von jeweils sHer2 und deglycosyliertem sHer2 wurden auf einem 4–20%-igem Gel (Novex) unter nichtreduzierenden Bedingungen laufen gelassen und anschließend auf Nitrocellulose (Schleicher & Schuell) für eine Stunde bei 90 Volt in einem Bio-Rad Mini PROTEAN II Apparat (BioRad) unter Kühlung geblottet. Nach dem Blotten wurde die Membran mit 10 mM Natriummetaperiodat für 20 Minuten behandelt, anschließend mit 300 nM Biotinhydrazid für 60 Minuten, beides in 100 mM Natriumacetat, pH 5,5 bei Raumtemperatur.
Nach jedem Schritt wurde die Membran mit dreimaligem Wechseln der PBS-Lösung gewaschen. Fettfreie Trockenmilch (Carnation) wurde zu PBS bei einer Konzentration von 5% (Gew./Vol.) zugegeben und über Nacht bei 4°C inkubiert, um nichtspezifische Bindungen zu blockieren. Die Membran wurde bei Raumtemperatur mit Streptavidin Meerrettichperoxidase inkubiert, welche mit ECL-Detektionsreagenzien für eine Minute konjugiert wurde. Der Blot wurde auf Hyperfilm-ECL exponiert (Amersham Life Science). Es wurde keine Proteinbande in der deglycosylierten Probe beobachtet (1A), was andeutet, dass eine vollständige Deglycosylierung stattfand.
Intakte und deglycosylierte sHer2 (jeweils 25 ng) wurden auf ein 4–20%-iges Gel (Novex) geladen und unter reduzierenden und nicht-reduzierenden Bedingungen laufengelassen. Das Gel wurde eine Stunde bei 90 Volt geblottet, mit 5% fettfreier Trockenmilch geblockt und mit 0,4 μg/ml mAb74, gefolgt von 1/5000 Anti-Maus-konjugierter Meerrettichperoxidase nach drei 10 minütigen Waschschritten in PBS 0,1%, Tween 20 detektiert. Ein ECL-Kit (Amersham Life Science) wurde zur Detektion verwendet. Es wurde beobachtet, dass mAb74 sowohl an glycosyliertes als auch an deglycosyliertes sHer2 unter nicht-reduzierenden Bedingungen (1B) bindet. Unter reduzierenden Bedingungen wurde keine Antikörperbindung beobachtet.
BEISPIEL 4
Dimerisierung von Her2 durch Anti-Her2-Antikörper
Typischerweise besitzen Antikörper zwei Bindungsstellen für Antigene, so dass erwartet werden kann, dass Antikörper, welche Rezeptoren binden, die Rezeptordimerisierung fördern können. Es wurde Größenausschlusschromatographie (SEC) mit Lichtstreuungsdetektion verwendet, um die Stöchiometrie der an Her2 bindenden Anti-Her2-Antikörper zu bestimmen. Die Verwendung von SEC mit Online-Lichtstreuung besitzt gegenüber SEC alleine Vorteile bei der Bestimmung des Molekulargewichts oder der Stöchiometrie eines Proteinkompexes. Während die Elutionsposition eines Proteins oder eines Komplexes ein Anzeichen für ein Molekulargewicht unter Verwendung konventioneller SEC ist, ist die Messung der Lichtstreuung unabhängig von der Elutionsposition eines Proteins oder eines Komplexes. Weiterhin reflektiert das Molekulargewicht aus der Lichtstreuung lediglich die Polypeptide wider, falls der Extinktionskoeffizient des Polypeptids allein in der Analyse verwendet wird. Das Online-Lichtstreuungs/Größenausschlusschromatographiesystem verwendet drei Detektoren in Serie: einen Lichtstreuungsdetektor (Wyatt Minidawn), einen Brechungsindexdetektor (Polymer Laboratories PL-RI), und einen UV Absorptionsmonitor bei 280 nm (Knauer A293). Eine Superdex 200 (Pharmacia) SEC Säule, welche mit Dulbecco's Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) äquilibriert wurde, und eine 100 μl Probenschleife wurden verwendet. Das System arbeitete bei einer Flussrate von 0,5 ml/min. Die Komplexe von Anti-sHer2 mAb und sHer2 wurden durch Mischen von 55 μl 1,5 mg/ml mAb35, 0,8 mg/ml mAb52, 1,2 mg/ml mAb58, 1,6 mg/ml mAb42, 0,84 mg/ml mAb74 und 0,89 mg/ml mAb83 mit 55 μl 2,0, 2,0, 1,3, 2,0, 2,0 bzw. 2,0 mg/ml sHer2 hergestellt. Die Komplexe der oben genannten mAbs und sHer3 wurden in einer ähnlichen Art und Weise hergestellt. 100 μl Proben von jedem Komplex wurden in eine Superdex 200 Säule injiziert und die Elution wurde mit Hilfe von Detektoren zur Lichtstreuung, für den Brechungsindex und UV-Absorption beobachtet.
Für einen Glycoproteinkomplex ist das Molekulargewicht seines Polypeptids proportional zu (uv) (LS)/[e_p(RI)²] (Takagi J. Chromatogr. 506, 409–446 (1990); Arakawa et al. Arch. Biochem. Biophs. 308, 267–273 (1994); Philo et al. J. Biol. Chem. 269, 27840–27846 (1994)), wobei uv, LS und RI die Signale des Detektors für die Absorption, die Lichtstreuung und für den Brechungsindex sind und e_p der Extinktionskoeffizient des Polypeptids ist (die Absorption von 1 mg/ml Lösung für 1 cm Pfadlänge). Für einen Komplex mit einer bekannten Stöchiometrie (A_mB_n) kann sein Extinktionskoeffizient mit Hilfe der Gleichung ε_p = (m × ε_A × M_A + n × ε_B × M_B)/(m × M_A + n × M_B) berechnet werden, wobei ε_A, ε_B, M_A und M_B der Extinktionskoeffizient und das Molekulargewicht des Polypeptids von entweder Protein A oder Protein B ist.
Um das Molekulargewicht und die Stöchiometrie eines Glycoproteinkomplexes zu erhalten, muss man dessen Extinktionskoeffizienten berechnen. Gleichwohl kann der Extinktionskoeffizient eines Komplexes nicht berechnet werden, bis dessen Stöchiometrie bekannt ist. Um dieses Problem zu lösen, wird ein in sich konsistentes Verfahren verwendet, das verschiedene Möglichkeiten für die Stöchiometrie des Komplexes annimmt. Für jede angenommene Stöchiometrie wird ein Extinktionskoeffizient und ein korrespondierendes experimentelles Molekulargewicht berechnet. Die Stöchiometrie mit der besten Konsistenz zwischen dem experimentellen und dem theoretischen Molekulargewicht wird schließlich als die korrekte Stöchiometrie für den Komplex ausgewählt. Die Ergebnisse dieses Verfahrens werden in Tabelle 2 gezeigt. Tabelle II Bindung von mAb an sHer2, bestimmt durch SEC/Lichtstreuung
Die experimentellen Molekulargewichte (unter Ausschluß von Kohlenwasserstoffen) für die Komplexe stimmen am meisten mit den theoretischen Werten überein, die 2 sHer2 pro 1 mAb für jeden der 5 getesteten mAbs annehmen. Dies beweist, dass diese Antikörper Her2 dimerisieren können, welches auf der Zelloberfläche exprimiert wird. Gleichwohl schließen die beobachteten Ergebnisse nicht die Möglichkeit einer 1 sHer2:2 mAb Komplexbildung aus, wenn der mAb im Überschuss vorhanden ist, da sHer2 und die mAbs in einem Verhältnis von 2:1 gemischt wurden. Für die Mischung von sHer2 und mAb83 wurde kein Komplex beobachtet. Dies kann durch eine schwache Bindung und Komplexdissoziation während des chromatographischen Verfahrens verursacht sein. Die Proben, welche sHer2 mAb mit einem molaren Verhältnis von 2:1 enthalten, eluierten als einzelner Peak, was die Bildung eines 2 sHer2:1 mAb Komplexes ohne Dissoziierung während der Elution nahe legt.
Um zu verifizieren, dass diese Antikörper nicht Her3 dimerisieren, wurden ähnliche Experimente unter Verwendung von Mischungen von mAbs und sHer3 durchgeführt. Zwischen sHer3 und irgendeinem der mAbs wurden keine Komplexe beobachtet.
BEISPIEL 5
Rezeptorphosphorylierung durch Anti-Her2-Antikörper
In Platten mit 48 Vertiefungen wurden anhaftende Zellen (SKBR3 oder MDAMB453) gezüchtet und mit DMEM zwei- bis dreimal gewaschen. Die Suspensionszellen (32D, Her2/32D, HEG/32D) wurden mit Hilfe der Zentrifugation pelletiert und mit PBS gewaschen. HEG/32D ist eine mit einem chimären Her2/EGF-Rezeptor (HEG) transfizierte Zelllinie, welche eine extrazelluläre Domäne von Her2 besitzt, die von den Aminosäureresten 1–653 reicht und intrazelluläre und Transmembrandomänen des EGF-Rezeptors besitzt, die von den Aminosäureresten 646–1210 reichen. Eine mAb-Lösung und Liganden-Kontrolllösung wurde zu der Vertiefung zugegeben oder zum pelletierten Röhrchen und für 5 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Lösung wurde entfernt und die Zellen wurden mit SDS-Probenpuffer gelöst. Die Proben wurden einer SDS-PAGE unterzogen, gefolgt von einem Western Blot und einer Sondierung mit Anti-Phosphotyrosin.
Zwölf Klone von Anti-sHer2 mAbs wurden auf die Stimulierung der Rezeptortyrosinphosphorylierung in SKBR3-Zellen getestet. Wie in 2-a dargestellt, zeigten mAb74, 52 und 83 eine starke Stimulierung der Tyrosinphosphorylierung von 180–185 kDa-Proteinen in SKBR3-Zellen, in welchen sowohl Her2 als auch Her3 identifiziert wurden. Die Phosphorylierung war dosisabhängig (2-b). Wie in 3 dargestellt, wurde die Phosphorylierung von SKBR3-Zellen durch mAb74, 52 und 83 mit sHer2 inhibiert. Um zu bestimmen, welcher Rezeptor phosphoryliert wird, wurden Her2 und Her3 aus SKBR3 immunopräzipitiert, und Her2, Her3 und Her4 wurden aus MDAMB453 nach mAb-Inkubation immunopräzipitiert und durch Western Blots analysiert, die mit Anti-Phosphotyrosin sondiert wurden. Her2 und Her3 in SKBR3 oder Her2, Her3 und Her4 in MDAMB453 waren alle tyrosinphosphoryliert.
Ein ähnlicher Assay wurde mit den transfizierten Zelllinien Her2/CHO und Her2/32D durchgeführt, um die direkte Interaktion von mAb und Her2 zu untersuchen. Bei den mAbs52, 74 und 83 fand keine Stimulierung der Phophorylierung von Her2 in Her2/CHO und Her2/32D transfizierten Zellen statt (4 zeigt ausschließlich Daten für Her2/32D-Zellen. Im Gegensatz dazu wurde der chimäre Her2/EGF Rezeptor in HEG/32D phosphoryliert (4). Ein anschließendes Experiment wurde unter Verwendung einer Her2/32D Transfektante durchgeführt, welche Her2 mit Werten exprimiert, die zu solchen des chimären HEG Rezeptors vergleichbar sind, welcher in 4 gezeigt wird. Unter diesen Bedingungen stimuliert mAb74 die Her2-Phosphorylierung in Her2/32D-Zellen. Die Ergebnisse legen nahe, dass mAb74 die Her2-Kinase durch Homodimerisierung in Her2/32D-Zellen aktiviert, jedoch diese durch Heterodimerisierung in SKBR3-Zellen aktivieren kann.
BEISPIEL 6
Änderung der Zellmorphologie und Apoptose, die durch Anti-Her2-Antikörper induziert wird
Änderung der Zellmorphologie. Zellen wurden in 5 cm Schalen bis zu einer etwa 20%-igen Konfluenz eingebracht und mABs wurden nach 18 Stunden zugegeben. Nach 5 Tagen wurden die Zellen mit Hilfe von Lichtmikroskopie beobachtet, fotografiert und gezählt.
Her2/MCF7-Zellen wurden mit 250 nM mAb42b, mAb83 und mAb74 inkubiert. Nach 5 Tagen Inkubation verursachte mAb74 einen extensiven Zelltod und eine dramatische Änderung der Zellmorphologie, primär eine Dehnung der Zelle, wie in 5 gezeigt. mAb83 verursachte eine moderate Änderung der Zellmorphologie und 42b verursachte eine kleine Änderung. Die Anzahl an entwicklungsfähigen Zellen nach der Inkubation mit mAb74 mit Her2/MCF7-Zellen für einen Zeitraum von 5 Tagen betrug nur 36% im Vergleich zur Kontrolle, welche ohne mAB-Inkubation durchgeführt wurde. mAb74 verursachte ebenfalls Veränderungen der Zellmorphologie in MDAMB43-Zellen (5F).
Zellapoptose. Die Zellen wurden in ein Chamber Slide (Nunc) mit 8 Vertiefungen eingebracht bis zu einer Konfluenz von 60–70% und nach 18 Stunden wurde das Kulturmedium in 1% FBS-enthaltendes Medium mit oder ohne mAb geändert. Am Tag 1 wurden die Zellen mit 4% neutral-gepuffertem Formalin (NBF) fixiert, gefolgt von drei Waschschritten mit PBS. Nachdem die Zellen getrocknet waren, wurde Apoptose unter Verwendung eines modifizierten TUNEL-Verfahrens detektiert. TUNEL detektiert 3'-OH DNA-Enden, die durch DNA-Fragmentierung erzeugt werden, durch das Markieren der Enden mit Digoxigenin-konjugiertem dUTP unter Verwendung eines terminalen Deoxynucleotidyltransfers und einem anschließenden Inkubieren mit Meerrettichperoxidase (HRP), welche mit Anti-Digoxigenin konjugiert ist. Gebundenes HRP wurde mit dem Substrat 3-Amino-9-ethylcarbazol (Sigma) detektiert. Die meisten Reagenzien wurden aus dem Apop Tag in situ Apoptose Detektionskit (Oncor) verwendet. Die HRP-konjugierten Antikörper stammten von Boehringer Mannheim.
Wir haben festgestellt, dass mAb74 den stärksten Effekt auf die Rezeptortyrosinphosphorylierung (1A), die Änderung der Zellmorphologie (5) und den Zelltod besitzt. Um den Mechanismus des durch mAB74 verursachten Zelltods aufzuklären, haben wird die Apoptose durch ein modifiziertes TUNEL-Verfahren untersucht. Wie in 6 dargestellt, zeigten mit mAb74 inkubierte Zellen im Zeitraum von einem Tag Apoptose, wie sie durch Rotlicht unter Verwendung des TUNEL-Verfahrens detektiert wurde, während eine Inkubation mit mAb42b in MDAMB453 und Her2/MCF7 (MCF7-Zellen, transfiziert mit Her2 voller Länge) kaum apoptotisch war. Die Anzahl von apoptotischen Zellen, welche mit 50 nM mAB74 induziert wurden, betrug etwa 10% der Anzahl, die durch 500 nM mAb74 induziert wurde, was andeutet, dass die Apoptose durch mAb74 dosisabhängig ist (6). mAb74 induzierte ebenfalls Apoptose in Her2/MCF7-Zellen. Nach 5 Tagen der Inkubation mit mAb74 waren in der Kultur immer noch lebende Zellen vorhanden, jedoch konnte keine Apoptose festgestellt werden, was nahe legt, dass apoptotische Zellen abgetrennt wurden und lebende Zellen keinen apoptotischen Prozess durchlaufen. Die überlebenden Zellen durchliefen morphologische Änderungen wie beispielsweise solche, die in 5 gezeigt wurden. Sequenzprotokoll

Claims

Pharmazeutische Zusammensetzung umfassend einen Anti-Her2-Antikörper oder ein Fragment davon, welcher bzw. welches in Her2 exprimierenden Zellen Apoptose induziert, in einer Menge, welche ausreichend ist, um Apoptose zu induzieren, in einer Mischung mit einem pharmazeutisch geeigneten Hilfsmittel.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, in welcher der Antikörper ein Epitop auf einem Her2-Polypeptid erkennt, welches durch den monoklonalen Antikörper erkannt wird, der durch die hybridome Zelllinie ATCC Nr. HB-12078 erzeugt wird.
Hybridome Zelllinie, die in der Lage ist, einen monoklonalen Anti-Her2-Antikörper zu erzeugen, welcher in Her2 exprimierenden Zellen Apoptose induziert.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei das Fragment ein F(ab) oder ein Fab' Fragment ist.
Antikörper, der durch die hybridome Zelllinie ATCC Nr. HB-12078 erzeugt wird.
Hybridome Zelllinie ATCC Nr. HB-12078.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei die Her2 exprimierenden Zellen Tumorzellen sind.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei die Tumorzellen aus Brust-, Eierstock-, Prostata-, Magen- und kolorektalem Krebs stammen.
Verwendung einer pharmazeutischen Zusammensetzung gemäß Anspruch 1 als ein Medikament zur Behandlung von Krebs.
Verwendung gemäß Anspruch 9, wobei das Medikament Apoptose induziert.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei der Antikörper ein humanisierter Antikörper ist.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei der Antikörper ein humaner Antikörper ist.