JP2004517638A - 機能的核酸の同定方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は所望の表現型に機能的に関連した核酸分子を同定するための方法に関する。
Description
【０００１】
本発明は所望の表現型と機能的に関連する核酸分子を同定するための方法に関する。
【０００２】
アポトーシスの実行装置について多くの情報が集められている（Ｈｅｎｇａｒｔｎｅｒ， Ｎａｔｕｒｅ ４０７ （２０００）， ７７０−７７６）。しかしながらアポトーシスの開始をコントロールするシグナルについてのデータは最近になって蓄積され始めたにすぎない（Ｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ４０７ （２０００）， ７７７−７８３）。アポトーシス関連遺伝子又は他の特異的な表現型と関連する遺伝子を同定するための従来の方法は時間がかかるものであった。例えばＨｕｄｚｉａｋ他（Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ １２９ （１９９０）， １２９−１３４）は腫瘍壊死因子−αを使用してＮＩＨ ３Ｔ３繊維芽細胞における形質転換及びｍｅｔ癌原遺伝子増幅のための選択方法を記載している。この方法を、他のチロシンキナーゼを含むびまん性腫瘍成長に関連する他の遺伝子産物を同定するために使用してよいことが示唆されている。しかしながら、かかる遺伝子の同定のための迅速又は信頼性のある方法は提供されていない。
【０００３】
本発明によれば機能的核酸分子を同定するための新規の方法が提供される。この方法はゲノム進化の概念をベースとしており、従って突然変異誘発及び／又はゲノム再配置工程に引き続いて所望の表現型を表す細胞クローンを選択することを必要とする。バイオインフォマティクス指向の遺伝子ソーティングに関連する引き続いてのトランスクリプトーム分析によって、選択された細胞特性のためだけでなく、付与される細胞表現型を左右する全シグナル経路のために重要な遺伝子の包括的な同定が可能である。この方法は、選択方法が利用可能な広範な細胞特性に対して使用できる。
【０００４】
このように本発明の対象は以下の工程：
（ａ）親細胞のポピュレーションを準備し、その際、該細胞ポピュレーションが実質的に所望の表現型を欠損し、
（ｂ）場合により前記の細胞ポピュレーションに細胞ゲノムの再配置及び／又は突然変異をもたらす処置を施し、
（ｃ）前記の（ｂ）からの細胞ポピュレーションに所望の表現型のための選択処置を施し、
（ｄ）前記の所望の表現型を表す細胞を同定し、かつ場合により特徴付け、
（ｅ）前記の所望の表現型を表す細胞からタンパク質及び／又はｍＲＮＡを得て、
（ｆ）前記の所望の表現型を表す細胞において遺伝子発現を調査し、
（ｇ）前記の所望の表現型を表す細胞における遺伝子発現と所望の表現型を実質的に欠損している細胞における遺伝子発現とを比較する
を含む、所望の表現型と機能的に関連する核酸分子を同定するための方法である。
【０００５】
本発明の方法において実質的に任意の型の親細胞（例えば細胞系統又は初代細胞）を使用できる。最も重要なことには、これらの細胞が所望の選択特性を欠損するか、又は僅かに弱くその特性を表すべきである。出発細胞の有利な例は真核細胞、例えば哺乳動物細胞、特にヒトの細胞である。
【０００６】
細胞、有利には所望の表現型を表す細胞クローンを作成するために、親細胞に細胞ゲノムの再配置及び／又は突然変異をもたらす処置を施してよい。この工程は親細胞の誘導を含む、ゲノム再配置及び／又は突然変異誘発する進化処置である。形質転換された細胞、例えば腫瘍細胞、例えばＨｅｌａ細胞又は不安定性に対する低い閾値を有する正常細胞、例えば不死化細胞、例えばＮＩＨ ３Ｔ３細胞の場合には特に誘導は必要ない。それというのもこれらの細胞は常にゲノム再配置及び突然変異誘発のプロセスにあるからである。親細胞培養を、クローン又は有利には多ウェルプレート、例えば９６ウェルマイクロタイタープレート中に細分された培養の形のいずれかで選択条件にさらすことで十分であり、又は選択に致死的条件を要する場合には細胞単層の曝露で十分である。しかしながら実質的に安定なゲノムを有する親細胞を使用してもよいことに留意すべきである。しかしながらこれらの細胞は所望のゲノム再配置及び／又は突然変異誘発を得るために特定の誘導を必要とする。
【０００７】
有利な実施態様において、該方法の工程（ｂ）は突然変異誘発処置を含む。この突然変異誘発処置は放射線照射、例えばＵＶ又はγ−線による照射、化学的突然変異誘発、例えばＮ−メチルマレイミド又はエチルマレイミドでの処理による化学的突然変異誘発又はその組み合わせから選択できる。
【０００８】
細胞ゲノムの再配置及び突然変異を達成した後に細胞ポピュレーションに所望の表現型についての選択処置を施す。選択の後に、細胞、例えば所望の表現型を表す個々の細胞クローンを同定し、かつ場合により特徴付けする。前記の同定は形態学的測定法及び／又はセルソーティング法、例えば蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）による方法を含んでよい。これらの細胞を増大させ、引き続き所望の表現型／特性を検証及び／又は定量してよい。
【０００９】
引き続き所望の表現型を表す細胞からタンパク質及び／又はｍＲＮＡを得る。この材料を、所望の表現型を表す細胞における遺伝子発現を調査するため及び前記の細胞における遺伝子発現と所望の表現型を実質的に欠損している細胞における遺伝子発現とを比較するために使用してよい。
【００１０】
有利な実施態様において、所望の表現型を表す細胞からｍＲＮＡを得る。該ｍＲＮＡを選択された遺伝的に改変された細胞クローンから抽出し、かつ直接又は別の核酸、例えばｃＤＮＡ又はｃＲＮＡへの変換の後のいずれかに核酸アレイとのハイブリダイゼーションのためのプローブとして使用してよい。該アレイとのハイブリダイゼーションのために使用される核酸、例えばｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ又はｃＲＮＡは通常、アレイにおける部位特異的ハイブリダイゼーションを測定するために標識されている。該アレイは固体担体、例えばフィルタ、チップ、スライドなどであり、該担体上の特定の位置に複数の種々の核酸分子をそこに固定されて有する。核酸アレイはゲノムＤＮＡアレイ、ｃＤＮＡアレイ及びオリゴヌクレオチドアレイから選択されてよい。有利には機能的な細胞性ポリペプチド又はその一部、より有利にはキナーゼ、ホスファターゼ、酵素及び受容体から選択されるポリペプチドをコードする核酸を有するアレイを使用してよい。選択される細胞クローンにおける遺伝子発現の尺度としてのアレイ上でのハイブリダイゼーションは公知の方法により、例えばホスホイメージャーを使用する画像分析によって測定できる。幾つかのケースにおいて細胞の所望の新規の特性は、例えば細分化された培養の調整培地の大規模高処理量アッセイ分析によって測定できる。
【００１１】
ｍＲＮＡ分析による発現プロファイリングに加えて又はその代替として、親細胞系統及び同定されたクローン又はそれらの上清と比較された、同定されたクローンのタンパク質含量における差異を測定するプロテオミクスアプローチを適当な方法、例えば２Ｄゲル電気泳動によって実施してよい。親細胞系統及び同定されたクローンにおける濃度が異なるタンパク質は２Ｄゲル中で異なって染色されたスポットを示す。更にリン酸化のようなタンパク質変性はこの方法によって検出できる。一度、タンパク質混合物の複雑性を低減させるために該分析工程の前に細胞性タンパク質の分離を実施してもよい。例えばカラムクロマトグラフィー工程を実施してよく、該工程はキナーゼ（ＡＴＰカラムを使用する親和性クロマトグラフィーによって）又はグリコシル化されたタンパク質（レクチンカラムを使用して）を精製し、次いでこれを更に２Ｄゲル電気泳動によって分離してよい。タンパク質濃度の差異を分析するためのいかなる別の方法（タンパク質チップ、質量分析）を使用してもよい。
【００１２】
所望の表現型を表す細胞における遺伝子発現結果を所望の表現型を実質的に欠損する細胞における、有利には親細胞における遺伝子発現と比較する。更に該遺伝子発現結果をクラスター検出プログラムによって分析してよい。この分析は所望の細胞表現型を与える遺伝子発現における複数の可能な変化を明らかにする。
【００１３】
本発明の方法の用途は非常に広範であり、かつ実質的に選択できかつ／又はアッセイで測定できる全ての細胞特性を含む。例えば所望の表現型は癌細胞特性、例えば浸潤性、転移、接触阻害の欠損、細胞外基質所要量の欠損、成長因子の独立性、血管形成誘導、免疫防御の回避、抗アポトーシス及び／又は腫瘍マーカーレベルの増大から選択されてよい。
【００１４】
特に有利な実施態様において、所望の表現型は抗アポトーシスである。別の用途は、公知の腫瘍マーカーについて癌細胞をソーティングすることによる癌関連遺伝子の解明である。しばしば腫瘍マーカーは結果であり、細胞の腫瘍原性の原因ではなく、従って医薬物質ターゲットとして適さない。しかしながら該マーカーと癌表現型との相関が確立されているので、増大するマーカー発現について細胞をソーティングすることはまた該マーカーに連係し、癌表現型を引き起こす遺伝子をソーティングすることにもなる。これらの遺伝子は親細胞系統及びソーティングされた細胞における発現プロフィールを比較することによって同定でき、かつ該遺伝子は潜在的な医薬物質ターゲットである。
【００１５】
選択的に、所望の表現型は他の特性、例えば分泌性タンパク質、例えばインスリン、成長ホルモン、インターフェロンなどの産生、病原、例えばウイルス、例えばＨＣＶ、ＨＢＶ又は他の病原に対する感受性又は抵抗性、老化及び細胞機能の調節、すなわち特定の細胞機能を調節する遺伝子の同定、例えばアップレギュレートされたインスリン受容体活性を有する細胞クローンについてのスクリーニングを含むインスリン受容体活性の負のレギュレーターの同定から選択されてよい。
【００１６】
更に有利な実施態様はシグナル伝達経路の要素の同定、一般にそれぞれのシグナルをより良好に伝達できる細胞をソーティングすることである。例えば特にＥＧＦ受容体ファミリー、例えばＥＧＦＲ、ＨＥＲ２及びＨＥＲ３の受容体の受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）のシグナル伝達経路の要素の同定は適当な受容体タンパク質、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を、それぞれの受容体のリガンドによる刺激に応答するプロモーター（例えばＥＧＦ刺激のためのｃ−ｆｏｓプロモーターなど）のコントロール下に発現する細胞系統を作成することによって実施できる。次いでリガンドによる受容体の刺激はＧＦＰの転写をもたらし、かつ例えばＦＡＣＳ機器によって検出可能な増大した緑色蛍光が引き起こされる。最も高い蛍光誘導を示す細胞のソーティングは親細胞ポピュレーションよりも強力にリガンド指向シグナルに応答する細胞を富化する。両方の細胞ポピュレーションの発現パターンの分析は、変動する発現がシグナルと異なる反応を担い、従ってシグナル伝達経路に影響を及ぼす遺伝子を同定する。この戦略は蛍光出力を生成できるいかなるシグナルにも適用できる。
【００１７】
以下に、本発明をｃＤＮＡアレイを使用する抗アポトーシス性核酸の同定に関してより詳細に記載する。しかしながらこの実施態様は本発明の方法についての概略にすぎず、限定として解釈すべきではないことを留意すべきである。
【００１８】
アポトーシスの調節に関連する核酸を同定するために、本発明の方法をアポトーシス感受性細胞及びアポトーシス抵抗性細胞において分化的に発現される遺伝子の同定のために使用した。
【００１９】
アポトーシスをＦａｓ活性化によってヒトの子宮頚癌細胞系統ＨｅｌａＳ３において誘導した。Ｆａｓの活性化はカスパーゼ−８の自己触媒的な活性化をもたらし、従ってアポトーシスを引き起こす。Ｆａｓ活性化のために親細胞を抗Ｆａｓ抗体と一緒にインキュベートした。
【００２０】
選択処置の後に、僅か少量の生細胞が存在した。これらの細胞は親細胞系統よりも高いアポトーシスへの抵抗性を有した。生存細胞をクローンとして増幅させた。ｍＲＮＡをこれらのクローン及び親細胞系統から単離し、引き続きｃＤＮＡに逆転写した。次いでｃＤＮＡアレイをクローン及び親細胞系統からのｃＤＮＡとハイブリダイズさせ、こうしてアレイ上で遺伝子発現を測定した。アレイ上の配列は有利にはキナーゼ及びホスファターゼをコードする約１０００の遺伝子から得た。親細胞系統の発現及びクローンの発現を比較することによって、増大された発現を示す（２倍を上回る増大）約２００の遺伝子がクローンの少なくとも１０％で同定された。これらはクローンのアポトーシス抵抗性と関連する核酸である（第１表及び第２表）。第１表はアポトーシス抵抗性クローンで誘導される遺伝子のリストであり、抗アポトーシス機能に連係していない。第２表は従来公知の抗アポトーシス機能を有するアポトーシス抵抗性クローンにおいて誘導される遺伝子のリストである。
【００２１】
親細胞系統、例えばＨｅｌａＳ３及び所望の表現型を有するクローン、例えばアポトーシス抵抗性クローンにおいて分化的に発現される遺伝子の同定のための改善された方法、例２に記載されるような評価方法を適用してよい。親細胞系統で分析される各核酸について複数の測定値を測定し、そこから平均値及び標準偏差を計算できる。例えばＲＮＡを少なくとも２回、少なくとも２つの独立した調製において親細胞から単離してよい。各調製からの材料を少なくとも２つの核酸アレイとのハイブリダイゼーションのために使用する。アレイ上に生じるスポットに関する前記の値の平均を計算し、かつ標準偏差を決定する。所望のクローンからの材料を１つの核酸アレイとハイブリダイズさせる。その値が予定されたカットオフを上回る場合に、遺伝子が所望のクローンにおいて分化的に発現されたと考慮する。アップレギュレートされた遺伝子についてのカットオフは有利には親細胞のそれぞれの値の平均と２倍の標準偏差との和である。ダウンレギュレートされた遺伝子についてのカットオフは有利には親細胞のそれぞれの値の平均からの２倍の標準偏差の差である。この方法を使用して、該実験方法において固有のエラーを校正できる。核酸アレイの調製の間に生じるこれらの誤差が標準偏差を決定するので、標準偏差からはずれる所望のクローンのいかなる値も分化的に発現された遺伝子を表す。従ってまた任意のカットオフを使用することによって検出できない遺伝子発現における小さな差異も検出できる。この改善された評価方法によって得られた値を第５表に示す。
【００２２】
このように本願の対象は第１表、第２表及び第５表、有利には第１表及び第５表に示されるような核酸及びこれらの核酸によってコードされるポリペプチドの、診断的用途及び治療的用途、アポトーシス過程の不全に関連する疾患、例えば腫瘍のための“ターゲット”としての使用である。更に該核酸及び遺伝子産物はアポトーシス性／抗アポトーシス処置の新規のモジュレーター、特に医薬物質の同定のためのスクリーニング法におけるターゲットとして適当である。該医薬物質は生体分子、例えば該遺伝子産物に対する抗体、酵素インヒビター又は低分子の非生物学的な医薬物質であってよい。医薬物質スクリーニングの方法は細胞ベースの系を含み、その際、目的の標的核酸を過剰発現する細胞を使用するか、又は該方法は分子ベースの系を含み、その際、目的のポリペプチドを部分的に精製された又は実質的に精製及び単離された形で使用する。特定のスクリーニング方法は当業者に公知であり、本願に詳細に記載する必要はない。しかしながら高い処理量のスクリーニングアッセイは使用してよいことを留意すべきである。
【００２３】
更に細胞系統にわたる発現パターンは類似している遺伝子の幾つかの群又はクラスターが同定された。アポトーシス抵抗性クローンのクラスターを第３表に示す。扁平上皮癌細胞系統におけるクラスターを第４表に示す。かかるクラスターの同定は診断的用途及び／又は治療的用途並びにスクリーニング法における活性剤の特定の組み合わせの使用を可能にする。このように本発明の有利な実施態様によれば、幾つかのターゲットの存在及び／又は活性を調節可能な医薬物質の組み合わせを効能を増大させるために使用できる。
【００２４】
更に本発明の方法は所望の表現型と関連する遺伝子及び特に遺伝子クラスターの発現プロフィールの作成を可能にする。これらの発現プロフィールを特定の生物学的試料（該試料は患者、例えばヒトの患者、特に腫瘍患者から得られる体液又は組織試料であってよい）における発現プロフィールと比較してよい。本発明による方法によって得られる発現プロフィールと生物学的試料における発現プロフィールとの比較は特に個々の患者に適合された改善された診断、モニタリング及び／又は治療の戦略の進展を可能にする。
【００２５】
これらの実験において、クローンにおける増大された発現を有するタンパク質の触媒活性の阻害がアポトーシスの促進された増大をもたらすことが裏付けられた。また親細胞系統においてもその阻害は増大されたアポトーシスをもたらした。このことはクローンのアポトーシス抵抗性について同定された核酸及びタンパク質の重要性を概説し、かつ阻害特異性を裏付けている。
【００２６】
更に本発明を以下の実施例及び図面においてより詳細に記載する。
【００２７】
図１はアップレギュレートされたキナーゼの阻害を示している。
【００２８】
細胞をＦＣＳを含まず、かつ１００ｎｇ／ｍｌの抗Ｆａｓ抗体ＣＨ−１１で処理された、インヒビターを含む及び含まないハムＦ１２培地中で増殖させた。アポトーシスを実施例に記載されるようなＦＡＣＳ分析によって測定した。ＳＵ５４０２：１０μＭ、ＡＧ１２９５：１μＭ、ＳＢ２０３５８０：１０μＭ、ＰＤ９８０５９：２５μＭ。
【００２９】
図２は優性阻害型突然変異体及びアンチセンス構築物によるｐｙｋ−２の阻害を示している。
【００３０】
図３はクローンのアポトーシス感受性を示している。７０％の集密的な細胞を２４時間、ＦＣＳを含まない培地中で飢餓状態にし、引き続き１００ｎｇ／ｍｌのＣＨ−１１を添加した。１６時間のインキュベーション後に細胞核を低張バッファー中で染色し、かつＦＡＣＳによって分析した。ｓｕｂ−Ｇ１ピークのパーセンテージを導き出した。ＦＣＳ無しでのアポトーシス率をＦＣＳありでの率から減算した。
【００３１】
図４は他のアポトーシスインデューサーでのアポトーシス感受性を示している。７０％の集密的な細胞を２４時間ＦＣＳを含まない培地中で飢餓状態にし、引き続き１０μｇ／ｍｌのシスプラチナム又はＴＮＦ−αと０．１μｇ／ｍｌのシクロヘキシミドを細胞に添加した。１６時間後に細胞核をヨウ化プロピジウムで染色し、かつＦＡＣＳによって分析した。５０ｎＭのタキソールを３時間で細胞に添加し、引き続き培地を１０％のＦＣＳを有する新鮮な培地によって交換した。２日後にｓｕｂ−Ｇ２細胞のパーセンテージを導き出した。ＦＣＳ無しでのアポトーシス率をＦＣＳありでの率から減算した。この値をそれぞれのＨｅｌａＳ３細胞のパーセンテージとして表現した。
【００３２】
ウイルス上清をフェニックスＡ（Ｐｈｏｅｎｉｘ Ａ）パッケージング細胞系統及びベクターｐＬＸＳＮ中にクローニングされたそれぞれのクローニングされた構築物（ｐｙｋ−２野生型又はｐｙｋ−２ＫＭ突然変異体を発現する）を使用して作成した。ＨｅｌａＳ３及びクローン１４を一晩感染させた。培地を翌日に交換し、２日後に細胞を２４時間ＦＣＳを含まない培地中で飢餓状態にし、それから一晩１００ｎｇ／ｍｌのＣＨ−１１を添加した。アポトーシスを図１に記載されるように測定した。
【００３３】
例１
１．材料及び方法
１．１ アポトーシス抵抗性クローンの選択
子宮頚癌細胞系統ＨｅｌａＳ３（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２．２）を１０ｃｍの細胞培養皿（１０５細胞）で１０％のＦＣＳを含有するハムＦ１２成長培地にプレーティングした。翌日に該培地を１００ｎｇ／ｍｌのアポトーシス活性化抗Ｆａｓ抗体ＣＨ−１１（Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ）を補ったＦＣＳ不含の培地と交換した。３日後に殆どの細胞が死んだら、培地をもう一度抗体を含まない１０％のＦＣＳを含有する培地と交換した。生存している細胞を３週間クローンとして培養した。該クローンをピックアップし、かつ増幅させた。
【００３４】
１．２ アポトーシスアッセイ
親細胞系統ＨｅｌａＳ３から又はクローンからそれぞれ得られるウェルあたり５００００細胞を１２ウェル細胞培養皿中で２日間、１０％のＦＣＳを含有するハムＦ１２培地中で増殖させた。３日目に、該細胞を１ｍｌのハムＦ１２培地で２回洗浄し、かつ次いで培地を１ｍｌのハムＦ１２培地と交換した。翌日に該培地にそれぞれのインヒビター及び１００〜２００ｎｇ／ｍｌのＣＨ−１１を供給した。その翌日に培地をデカンテーションし、かつエッペンドルフチューブに移した。該細胞を２００μｌのＰＢＳで１回洗浄し、該ＰＢＳをそれぞれのエッペンドルフチューブに移した。次いで残りの細胞をまたそれぞれのエッペンドルフチューブにＰＢＳ中のＥＤＴＡ／トリプシンでの処理後に移した。該細胞を遠心分離によってペレット化させ、５００μｌの低張バッファー（０．１％のクエン酸ナトリウム、０．１％のトライトンＸ１００、２０μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウム）中で懸濁し、かつ４℃で２〜２４時間インキュベートした。得られた細胞核をＦＡＣＳによって分析した。
【００３５】
１．３ ＦＡＣＳ（蛍光活性化セルソーティング）−アポトーシス性核の測定のための分析
単一核のヨウ化プロピジウム蛍光をＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）サイトメーターを使用して測定した。前方散乱光（ＦＳＣ）及び側方散乱光（ＳＳＣ）を同時に記録した。ＦＳＣピークを１０２４チャンネルの線形スケールでのチャンネル５００で、かつ赤色蛍光ピークを対数スケールのチャンネル２００で調節した。ＦＳＣカットオフ値を、供給物なしのネガティブコントロールの最も大きな核の９５％にゲーティングすることによって測定した。これらの核をＧ１／Ｇ０ピークとチャンネル１０の間の副二倍体（ｓｕｂｄｉｐｌｏｉｄ）シグナルが存在する場合にアポトーシス性として分類した。
【００３６】
１．４ ｃＤＮＡの調製
全ＲＮＡを、グアニジニウムイソチオシアネートによって細胞を溶解し、かつ引き続き酸フェノールで抽出することによって単離した（分子生物学における最近のプロトコール）。ｍＲＮＡを標準的方法によってオリゴ−ｄＴセルロースに結合させることによって単離した（分子生物学における最近のプロトコール）。
【００３７】
Ｃａｐファインダープライマー（ＣＡＰ ｆｉｎｄｅｒ ｐｒｉｍｅｒ）Ｋ１及びＫ２（クロンテック Ｉｎｃ．， ＵＳＡ）及びＡＭＶ逆転写酵素（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用して逆転写によってｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、かつＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製した。３μｇのｍＲＮＡから、一本鎖ＤＮＡ及び一本鎖ＲＮＡからなる５０μｌのｃＤＮＡを得た。
【００３８】
１．５ ｃＤＮＡアレイの調製
ｐ−Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ中にクローニングされたｃＤＮＡをナイロンメンブレン上にＢｉｏＧｒｉｄスポッター（ＢｉｏＲｏｂｏｔｉｃｓ， ＵＫ）でスポッティングした。２５０ｎｇのＤＮＡを１スポットあたりに使用した。約二分の一の遺伝子について、２つ以上のプローブを使用し、かつ各プローブを２回スポッティングした。以下の記号を使用した：
ＹＫ＝チロシンキナーゼ
ＳＴＫ＝セリン／トレオニンキナーゼ
ＰＰ＝ホスファターゼ
Ｌｉｇ＝リガンド
ＵＫ＝未知のキナーゼ
ＵＰ＝未知のホスファターゼ
ＯＴ＝その他
例：
ＹＫ＿１ｂ＿Ａｂｌ＿２＝チロシンキナーゼ１，プローブｂ、スポット２
１．６ ｃＤＮＡの放射活性標識
５μｌのｃＤＮＡをメガプライムラベリングキット（Ｍｅｇａｐｒｉｍｅ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ Ｋｉｔ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用して５０μのＣｉα３３Ｐ−ＡＴＰで標識し、ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製した。こうして得られたｃＤＮＡをＣＯＴ−ＤＮＡ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）とハイブリダイズさせて、ｃＤＮＡアレイに非特異的に結合しうる繰り返し配列をブロッキングした。
【００３９】
１．７ ｃＤＮＡアレイのハイブリダイゼーション
ｃＤＮＡアレイをプレハイブリダイゼーション溶液（５０×デンハルト、１０×ＳＳＣ、０．２５ＭのＮａ３ＰＯ４、ｐＨ６．８、５０ｍＭのＮａ４Ｐ２Ｏ７、０．１ｍｇ／ｍｌのｔＲＮＡ（パン酵母、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）中で６８℃において４時間又は一晩プレハイブリダイゼーションさせた。
【００４０】
引き続きｃＤＮＡアレイをハイブリダイゼーションバッファー（５×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍｌのｔＲＮＡ）中で標識されたｃＤＮＡと１６時間ハイブリダイズさせた。該ｃＤＮＡアレイを以下のように洗浄した：
２×２０分Ｗ１（２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ）４２℃
１×２０分Ｗ２（０．２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ）４２℃
１×６０分Ｗ２ ６５℃
ｃＤＮＡアレイをホスホイメージャープレート（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ）上で４８時間さらし、かつ引き続きホスホイメージャー（Ｂａｓ−２５００， Ｆｕｊｉｆｉｌｍ）上で分析した。
【００４１】
１．８ ｃＤＮＡアレイの分析
フィルタ上のスポット容量をアレイヴィジョンソフトウェア（Ａｒｒａｙ Ｖｉｓｉｏｎ ｓｏｆｔｗａｒｅ）（Ｖ５．１， Ｉｍａｇｉｎｇ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．）を使用して測定した。全ての更なる計算はエクセル（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｃｏｒｐ．）で実施した。
【００４２】
ｃＤＮＡアレイのより良好な内部比較のために、規格化法を以下のように実施した：アレイ上の各スポットからバックグラウンド（アレイのｐ−Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ値の平均）を減算し、かつアレイ中の全てのスポット容量の和によって除算した。こうして得られた値を１００００で乗じた。
【００４３】
親細胞系統ＨｅｌａＳ３及びアポトーシス抵抗性クローンにおいて分化的に発現される遺伝子の同定のために、クローンの値及び親細胞系統の種々のアレイ（参照アレイ）の平均値からの商を計算した。０．１未満の全ての規格化された値を該計算のために０．１に設定した。０とは異なる全ての値の９０％は前記の値より高かった。それぞれの遺伝子を、パーセンテージが少なくとも１００％と異なる場合に分化的に発現されたと定義した。かかる遺伝子だけを分析し、その際、該アレイ上のそれぞれのスポットについての参照アレイ上の値の偏差は十分に小さかった。以下のフィルタをこれらの遺伝子を除外するために使用した。
【００４４】
参照アレイ及びそれぞれのクローンの１つのスポットについての値が２．５より小さい場合に、参照アレイの互いの偏差は０．２〜５の範囲でなければならない。
【００４５】
参照アレイの値が２．５より小さく、クローンの値が２．５より大きいか、又はその逆の場合に、参照アレイの互いの偏差は０．３〜３の範囲である必要がある。
【００４６】
参照アレイの値及びクローンの値の両方が２．５より大きい場合に、参照アレイの互いの偏差は０．５〜２の範囲である必要がある。
【００４７】
１．９ 遺伝子クラスタリング
遺伝子クラスタリングのためにプログラムＣｌｕｓｔｅｒ（Ｍｉｃｈａｅｌ Ｅｉｓｅｎ， Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）を使用した。クローンの値及び親細胞系統のそれぞれのアレイの平均値からの商を使用した。参照アレイ上の値で高い偏差を示すスポットを排除した。この目的のために、誘導された遺伝子の同定で既に適用されたフィルタを使用した。１９２２個のスポットから１４５１が残った。これらの値を対数的にクラスターに移行し、かつ更にクローンの少なくとも８０％の値が０と異なるスポット上でフィルタした。こうして得られる５２０個のスポットを階層的クラスタアルゴリズムを介して分析した。
【００４８】
発現パターン及びクラスターの全体の類似性は１と−１との間の値を有する相関係数に反映する。１の相関係数は、発現パターンが同一であることを意味し、０はこれらが完全に独立していることを意味し、かつ−１は互いの反対であることを意味する。
【００４９】
２．結果
２．１ アポトーシス抵抗性クローンはＣＨ−１１抗体を使用してＨｅｌａＳ３の選択によって得られる
４０個のクローンがＣＨ−１１抗体での選択の後に得られた。これらのクローンの２０個をＣＨ−１１に対するその感受性に関して試験した。クローンが抵抗性である程度は個々のクローンの間で異なるが、そのどれもが完全にアポトーシス抵抗性でなく、このことはアポトーシス機関が機能的であることを示唆している。これらのクローンはＴＮＦ−α及びシスプラチンによって誘導されるアポトーシスに屈折性を有している。
【００５０】
２．２ 多くの遺伝子がアポトーシス抵抗性クローンにおいて増大された発現を示す
第１表及び第２表はアポトーシス抵抗性クローンにおいて増大された発現を示す遺伝子のリストを示している。更にそれぞれのクローンのジーンバンクのアクセッション番号、発現が増大された発現についてのカットオフを上回るクローンの数及びカットオフを上回る平均パーセンテージが示されている。
【００５１】
殆どの分析された遺伝子はタンパク質ホスファターゼ及びキナーゼ、すなわち細胞調節のために重要な酵素をコードしている。
【００５２】
こうして決定された誘導されたクローンの幾つかは依然としてアポトーシス及び／又は腫瘍形成に関連していない（第１表）。他の遺伝子、例えばＣＡＭＫＫ（カルモジュリン依存性キナーゼキナーゼ）、ＥＧＦＲ（上皮成長因子受容体）、Ｂｃｒ（ブレークポイントクラスター領域）、ＦＧＦＲ−１（繊維芽細胞成長因子受容体１）、Ｎｉｋ（ＮＦκＢ−相互作用キナーゼ）及びＤＡＰＫ（死に関連するプロテインキナーゼ）は既にアポトーシス関連遺伝子として公知である。
【００５３】
２．３ 遺伝子クラスタリングは共通して調節される遺伝子の群を示す
発現データのクラスタリングによって、共通してアップレギュレート又はダウンレギュレートされる遺伝子の群が見いだされた。共通の調節は遺伝子の共通の機能を示唆している。こうして単一のアポトーシス調節遺伝子だけでなく、複数の遺伝子からなるシグナル伝達カスケードも見いだされる。アポトーシス抵抗性クローンにおいて同定されるクラスターを第３表に示す。遺伝子のクラスタリングはアップレギュレートされた遺伝子をグループ化することを可能にし、かつ単一の遺伝子だけの代わりに種々の抗アポトーシスシグナル経路を導き出すことを可能にする。アポトーシス抵抗性クローンに見いだされたクラスターはまた扁平上皮細胞癌細胞系統の発現データに部分的に見いだされうる（第４表）。スクリーニングによって生理学的に関連するアポトーシスクラスターは腫瘍発達のために重要であり、従って医薬物質ターゲットとして提供できることを見いだすことができることを示唆している。
【００５４】
クラスター１は多くのクローン、例えばＣＡＭＫＫ、ＵＫ１１（未知のキナーゼ１１）、ＰＴＰα（タンパク質チロシンホスファターゼα）及びＰＲＫ（増殖関連キナーゼ）において誘導される幾つかの遺伝子を有する。
【００５５】
クラスター２は高度に相関した発現を示す３つの遺伝子、すなわちセリン／トレオニンホスファターゼＶＨ２、ＴＩＭＰ（メタロプロテイナーゼ１）及びＭＭＰ−１５（基質メタロプロテイナーゼ１５）を有する。興味深いことに、酵素（ＭＭＰ−１５）及び潜在的なインヒビター（ＴＩＭＰ−１）は共通して調節される。
【００５６】
クラスター３はとりわけ膜結合チロシンホスファターゼＬａｒ及びプロアポトーシス性セリン／トレオニンキナーゼＤＡＰキナーゼを含む。
【００５７】
クラスター４において、ＢＣＲ、ｐ３８の潜在的なインヒビター及びＪＮＫシグナル経路及びｐ３８のアクチベーター、すなわちＭＡＰＫＫ−３（マイトジェン活性化キナーゼキナーゼ３）は共通して調節される。
【００５８】
２．４ 誘導された遺伝子の阻害はアポトーシスを増大させる
誘導された遺伝子が事実アポトーシスのモジュレーターであることを示すために、選択された酵素を特異的インヒビターによって阻害し、かつアポトーシスを誘導した。以下の酵素のためのインヒビターを使用した：
− ＳＵ５４０２はＦＧＦ受容体を阻害するが、定義されたＦＧＦ受容体のために特異的でない
− ＡＧ１２９５はＰＤＧＦ受容体を阻害する
− ＳＢ２０３５８０はｐ３８ＭＡＰキナーゼを阻害する
ＰＤ９８０５９はＭＡＰキナーゼキナーゼ１を阻害し、またこれはＭＡＰキナーゼＥＲＫ１及びＥＲＫ２を活性化する。このインヒビターはＳＢ２０３５８０のためのコントロールとして使用される。それというのもＳＢ２０３５８０もＥＲＫ１及びＥＲＫ２を部分的に阻害するからである。更にＥＲＫ２は該クローンにおいて増大された発現を示す。ＨｅｌａＳ３、クローン１４及びクローン２０（部分的）のための結果を図１に示す。
【００５９】
ＨｅｌａＳ３細胞におけるＦＧＦ受容体の阻害は約５０％のアポトーシスにおける増大をもたらすことが判明した。クローン１４及び５において、ＳＵ５４０２はそれぞれ約３００％又は５０％の増大をもたらす。このように２つのＦＧＦ受容体（クローン１４、ＦＧＦＲ−１及びＦＧＦＲ−３）の増大された発現を有するクローンにおいて、ＦＧＦ受容体の阻害はアポトーシスの高められた増大をもたらす。ＦＧＦ受容体のいかなる増大された発現も示さないクローン５において、アポトーシスにおける増大は親細胞系統ＨｅｌａＳ３に匹敵する。
【００６０】
ＰＤＧＦ受容体の阻害はＨｅｌａＳ３において約３０％の増大をもたらす。ＰＤＧＦ受容体の増大された発現を示すクローン１４において、該阻害は多くのアポトーシス細胞の二倍化をもたらす。それに対して、いかなる検出可能なＰＤＧＦ受容体も含有しないクローン５はＡＧ１２９５での処理後にアポトーシスの３０％だけの増大を示す。
【００６１】
ｐ３８ＭＡＰキナーゼを阻害する。それというのもＢＣＲ、ｐ３８ＭＡＰキナーゼシグナル経路のインヒビター及びｐ３８アクチベーターであるＭＡＰＫＫ−３（ＭＥＫ−３）は該クローンにおいて増大された発現を示すからである。更に両方の遺伝子は１つのクラスターにグループ化される。
【００６２】
ＨｅｌａＳ３におけるｐ３８阻害はアポトーシスの２５％の増大をもたらす。増大されたＭＥＫ−３を示すクローン１４において、ｐ３８の阻害はアポトーシスの６０％の増大をもたらす。それに対してＭＥＫ−１の阻害はアポトーシス率の二倍化をもたらす。ＨｅｌａＳ３と比較された、ｐ３８の阻害後のアポトーシスの増大及びＭＥＫ−１の阻害後の一定のアポトーシスはＥＲＫ１／２の阻害及びｐ３８の付加的な阻害によって説明できる。
【００６３】
ＨｅｌａＳ３と類似のレベルでＭＥＫ−３を発現するクローン２０において、ＳＢ２０３５８０での処理だけがアポトーシスの僅かな増大をもたらすにすぎない。それに対してＰＤ９８０５９での処理はアポトーシス率を三倍にする。このようにＳＢ２０３５８０はこの系において特異的に作用し、ｐ３８の阻害後のアポトーシスの増大における差異はｐ３８アクチベーターＭＥＫ−３の発現と相関している。
【００６４】
これらの阻害実験は結果的に、本発明のアポトーシスに関連する遺伝子を同定する方法が効果的であることを裏付けている。
【００６５】
２．５ 優性阻害型突然変異体又はアンチセンス鎖の導入による阻害
アポトーシス抵抗性クローンにおいてアップレギュレートされるそれぞれの酵素を、優性阻害型突然変異体又はアンチセンス鎖を導入することによって阻害することもできる。図２は、例えば野生型のｐｙｋ−２が、ＨｅｌａＳ３への増大の際に増大された抵抗性を与えることを示している。ｐｙｋ−２のより高度な発現を有するクローン１４において、野生型酵素の導入は効果的でないが、酵素の活性中心においてメチオニンに突然変異されたリジンを有する突然変異体（ｐｙｋ−２ＫＭ）は該クローンの表現型を回復する。アンチセンス構築物は相応の効果を有するが、より弱い効果を有する。
【００６６】
例２
実験法を例１に記載されるように実施した。
【００６７】
親細胞系統ＨｅｌａＳ３及びアポトーシス抵抗性クローンで分化的に発現される遺伝子の同定のために、以下の評価法を適用した。親細胞系統ＨｅｌａＳ３のｃＤＮＡアレイ上の各スポットについて、４つの値を以下のように決定した。ＲＮＡをＨｅｌａＳ３から２つの独立した調製において２回単離した。各ＲＮＡ調製物を使用してｃＤＮＡを合成し、かつ各ｃＤＮＡを２つのｃＤＮＡアレイとハイブリダイズさせた。ｃＤＮＡアレイ上に生じるスポットについてのこれらの４つの値の平均を計算し、かつ標準偏差を測定した。各アポトーシス抵抗性クローンのｃＤＮＡを１つのｃＤＮＡアレイとハイブリダイズさせた。遺伝子は、その値が以下のカットオフを上回る場合にアポトーシス抵抗性クローン中で分化的に発現されたと考慮した。アップレギュレートされた遺伝子のカットオフはそれぞれのＨｅｌａＳ３値の平均と２倍の標準偏差との和であった。従って、ダウンレギュレートされた遺伝子のカットオフはそれぞれのＨｅｌａＳ３値の平均から２倍の標準偏差を引いたものであった。アップ又はダウンレギュレートの規模をカットオフを上回る／下回るパーセンテージとして表した。例えばアップレギュレートされる遺伝子についてのカットオフを１００％上回る値はカットオフと比較して２倍の誘導を意味し、かつダウンレギュレートされた遺伝子についてのカットオフを１００％下回る値は抵抗性クローンでのその値の二分を意味する。
【００６８】
遺伝子クラスタリングのためにプログラムＣｌｕｓｔｅｒ（Ｍｉｃｈａｅｌ Ｅｉｓｅｎ， Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）を使用してよい。４つの参照アレイ及び２０個のアポトーシス抵抗性クローンのアレイの正規化された値を使用した。２４個の調査されるアレイの少なくとも２０で１より大きい値を有する遺伝子をフィルタし、かつ以下の計算のために使用した。遺伝子クラスタリングのためにプログラムＣｌｕｓｔｅｒ（Ｍｉｃｈａｅｌ Ｅｉｓｅｎ， Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）を使用してよい。４つの参照アレイ及び２０個のアポトーシス抵抗性クローンのアレイの正規化された値を使用した。２４個の調査されるアレイの少なくとも２０個において１より大きい値を有する遺伝子はフィルタし、かつ以下の計算のために使用した。値がクラスタリングが信頼できないバックグラウンドに非常に近い遺伝子のクラスタリングを回避するために、１のカットオフを利用した。こうして２４００個のスポットから、階層型クラスターアルゴリズムを介して分析された５２０が残った。
【００６９】
結果を第５表に示す。
【００７０】
【外１】
【００７１】
【外２】
【００７２】
【外３】
【００７３】
【外４】
【００７４】
【外５】
【００７５】
【外６】
【００７６】
【外７】
【００７７】
【外８】
【００７８】
【外９】
【００７９】
【外１０】
【００８０】
【表１】
【００８１】
【表２】
【００８２】
【表３】
【００８３】
【表４】
【００８４】
【表５】
【００８５】
【表６】
【００８６】
【表７】
【００８７】
【表８】
【００８８】
【表９】
【００８９】
【表１０】
【００９０】
【表１１】
【００９１】
【表１２】
【００９２】
【表１３】
【００９３】
【表１４】
【００９４】
【表１５】
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１はアップレギュレートされたキナーゼの阻害を示している。
【図２】
図２は優性阻害型突然変異体及びアンチセンス構築物によるｐｙｋ−２の阻害を示している。
【図３】
図３はクローンのアポトーシス感受性を示している。
【図４】
図４は他のアポトーシスインデューサーとのアポトーシス感受性を示している。
本発明は所望の表現型と機能的に関連する核酸分子を同定するための方法に関する。
【０００２】
アポトーシスの実行装置について多くの情報が集められている（Ｈｅｎｇａｒｔｎｅｒ， Ｎａｔｕｒｅ ４０７ （２０００）， ７７０−７７６）。しかしながらアポトーシスの開始をコントロールするシグナルについてのデータは最近になって蓄積され始めたにすぎない（Ｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ４０７ （２０００）， ７７７−７８３）。アポトーシス関連遺伝子又は他の特異的な表現型と関連する遺伝子を同定するための従来の方法は時間がかかるものであった。例えばＨｕｄｚｉａｋ他（Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ １２９ （１９９０）， １２９−１３４）は腫瘍壊死因子−αを使用してＮＩＨ ３Ｔ３繊維芽細胞における形質転換及びｍｅｔ癌原遺伝子増幅のための選択方法を記載している。この方法を、他のチロシンキナーゼを含むびまん性腫瘍成長に関連する他の遺伝子産物を同定するために使用してよいことが示唆されている。しかしながら、かかる遺伝子の同定のための迅速又は信頼性のある方法は提供されていない。
【０００３】
本発明によれば機能的核酸分子を同定するための新規の方法が提供される。この方法はゲノム進化の概念をベースとしており、従って突然変異誘発及び／又はゲノム再配置工程に引き続いて所望の表現型を表す細胞クローンを選択することを必要とする。バイオインフォマティクス指向の遺伝子ソーティングに関連する引き続いてのトランスクリプトーム分析によって、選択された細胞特性のためだけでなく、付与される細胞表現型を左右する全シグナル経路のために重要な遺伝子の包括的な同定が可能である。この方法は、選択方法が利用可能な広範な細胞特性に対して使用できる。
【０００４】
このように本発明の対象は以下の工程：
（ａ）親細胞のポピュレーションを準備し、その際、該細胞ポピュレーションが実質的に所望の表現型を欠損し、
（ｂ）場合により前記の細胞ポピュレーションに細胞ゲノムの再配置及び／又は突然変異をもたらす処置を施し、
（ｃ）前記の（ｂ）からの細胞ポピュレーションに所望の表現型のための選択処置を施し、
（ｄ）前記の所望の表現型を表す細胞を同定し、かつ場合により特徴付け、
（ｅ）前記の所望の表現型を表す細胞からタンパク質及び／又はｍＲＮＡを得て、
（ｆ）前記の所望の表現型を表す細胞において遺伝子発現を調査し、
（ｇ）前記の所望の表現型を表す細胞における遺伝子発現と所望の表現型を実質的に欠損している細胞における遺伝子発現とを比較する
を含む、所望の表現型と機能的に関連する核酸分子を同定するための方法である。
【０００５】
本発明の方法において実質的に任意の型の親細胞（例えば細胞系統又は初代細胞）を使用できる。最も重要なことには、これらの細胞が所望の選択特性を欠損するか、又は僅かに弱くその特性を表すべきである。出発細胞の有利な例は真核細胞、例えば哺乳動物細胞、特にヒトの細胞である。
【０００６】
細胞、有利には所望の表現型を表す細胞クローンを作成するために、親細胞に細胞ゲノムの再配置及び／又は突然変異をもたらす処置を施してよい。この工程は親細胞の誘導を含む、ゲノム再配置及び／又は突然変異誘発する進化処置である。形質転換された細胞、例えば腫瘍細胞、例えばＨｅｌａ細胞又は不安定性に対する低い閾値を有する正常細胞、例えば不死化細胞、例えばＮＩＨ ３Ｔ３細胞の場合には特に誘導は必要ない。それというのもこれらの細胞は常にゲノム再配置及び突然変異誘発のプロセスにあるからである。親細胞培養を、クローン又は有利には多ウェルプレート、例えば９６ウェルマイクロタイタープレート中に細分された培養の形のいずれかで選択条件にさらすことで十分であり、又は選択に致死的条件を要する場合には細胞単層の曝露で十分である。しかしながら実質的に安定なゲノムを有する親細胞を使用してもよいことに留意すべきである。しかしながらこれらの細胞は所望のゲノム再配置及び／又は突然変異誘発を得るために特定の誘導を必要とする。
【０００７】
有利な実施態様において、該方法の工程（ｂ）は突然変異誘発処置を含む。この突然変異誘発処置は放射線照射、例えばＵＶ又はγ−線による照射、化学的突然変異誘発、例えばＮ−メチルマレイミド又はエチルマレイミドでの処理による化学的突然変異誘発又はその組み合わせから選択できる。
【０００８】
細胞ゲノムの再配置及び突然変異を達成した後に細胞ポピュレーションに所望の表現型についての選択処置を施す。選択の後に、細胞、例えば所望の表現型を表す個々の細胞クローンを同定し、かつ場合により特徴付けする。前記の同定は形態学的測定法及び／又はセルソーティング法、例えば蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）による方法を含んでよい。これらの細胞を増大させ、引き続き所望の表現型／特性を検証及び／又は定量してよい。
【０００９】
引き続き所望の表現型を表す細胞からタンパク質及び／又はｍＲＮＡを得る。この材料を、所望の表現型を表す細胞における遺伝子発現を調査するため及び前記の細胞における遺伝子発現と所望の表現型を実質的に欠損している細胞における遺伝子発現とを比較するために使用してよい。
【００１０】
有利な実施態様において、所望の表現型を表す細胞からｍＲＮＡを得る。該ｍＲＮＡを選択された遺伝的に改変された細胞クローンから抽出し、かつ直接又は別の核酸、例えばｃＤＮＡ又はｃＲＮＡへの変換の後のいずれかに核酸アレイとのハイブリダイゼーションのためのプローブとして使用してよい。該アレイとのハイブリダイゼーションのために使用される核酸、例えばｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ又はｃＲＮＡは通常、アレイにおける部位特異的ハイブリダイゼーションを測定するために標識されている。該アレイは固体担体、例えばフィルタ、チップ、スライドなどであり、該担体上の特定の位置に複数の種々の核酸分子をそこに固定されて有する。核酸アレイはゲノムＤＮＡアレイ、ｃＤＮＡアレイ及びオリゴヌクレオチドアレイから選択されてよい。有利には機能的な細胞性ポリペプチド又はその一部、より有利にはキナーゼ、ホスファターゼ、酵素及び受容体から選択されるポリペプチドをコードする核酸を有するアレイを使用してよい。選択される細胞クローンにおける遺伝子発現の尺度としてのアレイ上でのハイブリダイゼーションは公知の方法により、例えばホスホイメージャーを使用する画像分析によって測定できる。幾つかのケースにおいて細胞の所望の新規の特性は、例えば細分化された培養の調整培地の大規模高処理量アッセイ分析によって測定できる。
【００１１】
ｍＲＮＡ分析による発現プロファイリングに加えて又はその代替として、親細胞系統及び同定されたクローン又はそれらの上清と比較された、同定されたクローンのタンパク質含量における差異を測定するプロテオミクスアプローチを適当な方法、例えば２Ｄゲル電気泳動によって実施してよい。親細胞系統及び同定されたクローンにおける濃度が異なるタンパク質は２Ｄゲル中で異なって染色されたスポットを示す。更にリン酸化のようなタンパク質変性はこの方法によって検出できる。一度、タンパク質混合物の複雑性を低減させるために該分析工程の前に細胞性タンパク質の分離を実施してもよい。例えばカラムクロマトグラフィー工程を実施してよく、該工程はキナーゼ（ＡＴＰカラムを使用する親和性クロマトグラフィーによって）又はグリコシル化されたタンパク質（レクチンカラムを使用して）を精製し、次いでこれを更に２Ｄゲル電気泳動によって分離してよい。タンパク質濃度の差異を分析するためのいかなる別の方法（タンパク質チップ、質量分析）を使用してもよい。
【００１２】
所望の表現型を表す細胞における遺伝子発現結果を所望の表現型を実質的に欠損する細胞における、有利には親細胞における遺伝子発現と比較する。更に該遺伝子発現結果をクラスター検出プログラムによって分析してよい。この分析は所望の細胞表現型を与える遺伝子発現における複数の可能な変化を明らかにする。
【００１３】
本発明の方法の用途は非常に広範であり、かつ実質的に選択できかつ／又はアッセイで測定できる全ての細胞特性を含む。例えば所望の表現型は癌細胞特性、例えば浸潤性、転移、接触阻害の欠損、細胞外基質所要量の欠損、成長因子の独立性、血管形成誘導、免疫防御の回避、抗アポトーシス及び／又は腫瘍マーカーレベルの増大から選択されてよい。
【００１４】
特に有利な実施態様において、所望の表現型は抗アポトーシスである。別の用途は、公知の腫瘍マーカーについて癌細胞をソーティングすることによる癌関連遺伝子の解明である。しばしば腫瘍マーカーは結果であり、細胞の腫瘍原性の原因ではなく、従って医薬物質ターゲットとして適さない。しかしながら該マーカーと癌表現型との相関が確立されているので、増大するマーカー発現について細胞をソーティングすることはまた該マーカーに連係し、癌表現型を引き起こす遺伝子をソーティングすることにもなる。これらの遺伝子は親細胞系統及びソーティングされた細胞における発現プロフィールを比較することによって同定でき、かつ該遺伝子は潜在的な医薬物質ターゲットである。
【００１５】
選択的に、所望の表現型は他の特性、例えば分泌性タンパク質、例えばインスリン、成長ホルモン、インターフェロンなどの産生、病原、例えばウイルス、例えばＨＣＶ、ＨＢＶ又は他の病原に対する感受性又は抵抗性、老化及び細胞機能の調節、すなわち特定の細胞機能を調節する遺伝子の同定、例えばアップレギュレートされたインスリン受容体活性を有する細胞クローンについてのスクリーニングを含むインスリン受容体活性の負のレギュレーターの同定から選択されてよい。
【００１６】
更に有利な実施態様はシグナル伝達経路の要素の同定、一般にそれぞれのシグナルをより良好に伝達できる細胞をソーティングすることである。例えば特にＥＧＦ受容体ファミリー、例えばＥＧＦＲ、ＨＥＲ２及びＨＥＲ３の受容体の受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）のシグナル伝達経路の要素の同定は適当な受容体タンパク質、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を、それぞれの受容体のリガンドによる刺激に応答するプロモーター（例えばＥＧＦ刺激のためのｃ−ｆｏｓプロモーターなど）のコントロール下に発現する細胞系統を作成することによって実施できる。次いでリガンドによる受容体の刺激はＧＦＰの転写をもたらし、かつ例えばＦＡＣＳ機器によって検出可能な増大した緑色蛍光が引き起こされる。最も高い蛍光誘導を示す細胞のソーティングは親細胞ポピュレーションよりも強力にリガンド指向シグナルに応答する細胞を富化する。両方の細胞ポピュレーションの発現パターンの分析は、変動する発現がシグナルと異なる反応を担い、従ってシグナル伝達経路に影響を及ぼす遺伝子を同定する。この戦略は蛍光出力を生成できるいかなるシグナルにも適用できる。
【００１７】
以下に、本発明をｃＤＮＡアレイを使用する抗アポトーシス性核酸の同定に関してより詳細に記載する。しかしながらこの実施態様は本発明の方法についての概略にすぎず、限定として解釈すべきではないことを留意すべきである。
【００１８】
アポトーシスの調節に関連する核酸を同定するために、本発明の方法をアポトーシス感受性細胞及びアポトーシス抵抗性細胞において分化的に発現される遺伝子の同定のために使用した。
【００１９】
アポトーシスをＦａｓ活性化によってヒトの子宮頚癌細胞系統ＨｅｌａＳ３において誘導した。Ｆａｓの活性化はカスパーゼ−８の自己触媒的な活性化をもたらし、従ってアポトーシスを引き起こす。Ｆａｓ活性化のために親細胞を抗Ｆａｓ抗体と一緒にインキュベートした。
【００２０】
選択処置の後に、僅か少量の生細胞が存在した。これらの細胞は親細胞系統よりも高いアポトーシスへの抵抗性を有した。生存細胞をクローンとして増幅させた。ｍＲＮＡをこれらのクローン及び親細胞系統から単離し、引き続きｃＤＮＡに逆転写した。次いでｃＤＮＡアレイをクローン及び親細胞系統からのｃＤＮＡとハイブリダイズさせ、こうしてアレイ上で遺伝子発現を測定した。アレイ上の配列は有利にはキナーゼ及びホスファターゼをコードする約１０００の遺伝子から得た。親細胞系統の発現及びクローンの発現を比較することによって、増大された発現を示す（２倍を上回る増大）約２００の遺伝子がクローンの少なくとも１０％で同定された。これらはクローンのアポトーシス抵抗性と関連する核酸である（第１表及び第２表）。第１表はアポトーシス抵抗性クローンで誘導される遺伝子のリストであり、抗アポトーシス機能に連係していない。第２表は従来公知の抗アポトーシス機能を有するアポトーシス抵抗性クローンにおいて誘導される遺伝子のリストである。
【００２１】
親細胞系統、例えばＨｅｌａＳ３及び所望の表現型を有するクローン、例えばアポトーシス抵抗性クローンにおいて分化的に発現される遺伝子の同定のための改善された方法、例２に記載されるような評価方法を適用してよい。親細胞系統で分析される各核酸について複数の測定値を測定し、そこから平均値及び標準偏差を計算できる。例えばＲＮＡを少なくとも２回、少なくとも２つの独立した調製において親細胞から単離してよい。各調製からの材料を少なくとも２つの核酸アレイとのハイブリダイゼーションのために使用する。アレイ上に生じるスポットに関する前記の値の平均を計算し、かつ標準偏差を決定する。所望のクローンからの材料を１つの核酸アレイとハイブリダイズさせる。その値が予定されたカットオフを上回る場合に、遺伝子が所望のクローンにおいて分化的に発現されたと考慮する。アップレギュレートされた遺伝子についてのカットオフは有利には親細胞のそれぞれの値の平均と２倍の標準偏差との和である。ダウンレギュレートされた遺伝子についてのカットオフは有利には親細胞のそれぞれの値の平均からの２倍の標準偏差の差である。この方法を使用して、該実験方法において固有のエラーを校正できる。核酸アレイの調製の間に生じるこれらの誤差が標準偏差を決定するので、標準偏差からはずれる所望のクローンのいかなる値も分化的に発現された遺伝子を表す。従ってまた任意のカットオフを使用することによって検出できない遺伝子発現における小さな差異も検出できる。この改善された評価方法によって得られた値を第５表に示す。
【００２２】
このように本願の対象は第１表、第２表及び第５表、有利には第１表及び第５表に示されるような核酸及びこれらの核酸によってコードされるポリペプチドの、診断的用途及び治療的用途、アポトーシス過程の不全に関連する疾患、例えば腫瘍のための“ターゲット”としての使用である。更に該核酸及び遺伝子産物はアポトーシス性／抗アポトーシス処置の新規のモジュレーター、特に医薬物質の同定のためのスクリーニング法におけるターゲットとして適当である。該医薬物質は生体分子、例えば該遺伝子産物に対する抗体、酵素インヒビター又は低分子の非生物学的な医薬物質であってよい。医薬物質スクリーニングの方法は細胞ベースの系を含み、その際、目的の標的核酸を過剰発現する細胞を使用するか、又は該方法は分子ベースの系を含み、その際、目的のポリペプチドを部分的に精製された又は実質的に精製及び単離された形で使用する。特定のスクリーニング方法は当業者に公知であり、本願に詳細に記載する必要はない。しかしながら高い処理量のスクリーニングアッセイは使用してよいことを留意すべきである。
【００２３】
更に細胞系統にわたる発現パターンは類似している遺伝子の幾つかの群又はクラスターが同定された。アポトーシス抵抗性クローンのクラスターを第３表に示す。扁平上皮癌細胞系統におけるクラスターを第４表に示す。かかるクラスターの同定は診断的用途及び／又は治療的用途並びにスクリーニング法における活性剤の特定の組み合わせの使用を可能にする。このように本発明の有利な実施態様によれば、幾つかのターゲットの存在及び／又は活性を調節可能な医薬物質の組み合わせを効能を増大させるために使用できる。
【００２４】
更に本発明の方法は所望の表現型と関連する遺伝子及び特に遺伝子クラスターの発現プロフィールの作成を可能にする。これらの発現プロフィールを特定の生物学的試料（該試料は患者、例えばヒトの患者、特に腫瘍患者から得られる体液又は組織試料であってよい）における発現プロフィールと比較してよい。本発明による方法によって得られる発現プロフィールと生物学的試料における発現プロフィールとの比較は特に個々の患者に適合された改善された診断、モニタリング及び／又は治療の戦略の進展を可能にする。
【００２５】
これらの実験において、クローンにおける増大された発現を有するタンパク質の触媒活性の阻害がアポトーシスの促進された増大をもたらすことが裏付けられた。また親細胞系統においてもその阻害は増大されたアポトーシスをもたらした。このことはクローンのアポトーシス抵抗性について同定された核酸及びタンパク質の重要性を概説し、かつ阻害特異性を裏付けている。
【００２６】
更に本発明を以下の実施例及び図面においてより詳細に記載する。
【００２７】
図１はアップレギュレートされたキナーゼの阻害を示している。
【００２８】
細胞をＦＣＳを含まず、かつ１００ｎｇ／ｍｌの抗Ｆａｓ抗体ＣＨ−１１で処理された、インヒビターを含む及び含まないハムＦ１２培地中で増殖させた。アポトーシスを実施例に記載されるようなＦＡＣＳ分析によって測定した。ＳＵ５４０２：１０μＭ、ＡＧ１２９５：１μＭ、ＳＢ２０３５８０：１０μＭ、ＰＤ９８０５９：２５μＭ。
【００２９】
図２は優性阻害型突然変異体及びアンチセンス構築物によるｐｙｋ−２の阻害を示している。
【００３０】
図３はクローンのアポトーシス感受性を示している。７０％の集密的な細胞を２４時間、ＦＣＳを含まない培地中で飢餓状態にし、引き続き１００ｎｇ／ｍｌのＣＨ−１１を添加した。１６時間のインキュベーション後に細胞核を低張バッファー中で染色し、かつＦＡＣＳによって分析した。ｓｕｂ−Ｇ１ピークのパーセンテージを導き出した。ＦＣＳ無しでのアポトーシス率をＦＣＳありでの率から減算した。
【００３１】
図４は他のアポトーシスインデューサーでのアポトーシス感受性を示している。７０％の集密的な細胞を２４時間ＦＣＳを含まない培地中で飢餓状態にし、引き続き１０μｇ／ｍｌのシスプラチナム又はＴＮＦ−αと０．１μｇ／ｍｌのシクロヘキシミドを細胞に添加した。１６時間後に細胞核をヨウ化プロピジウムで染色し、かつＦＡＣＳによって分析した。５０ｎＭのタキソールを３時間で細胞に添加し、引き続き培地を１０％のＦＣＳを有する新鮮な培地によって交換した。２日後にｓｕｂ−Ｇ２細胞のパーセンテージを導き出した。ＦＣＳ無しでのアポトーシス率をＦＣＳありでの率から減算した。この値をそれぞれのＨｅｌａＳ３細胞のパーセンテージとして表現した。
【００３２】
ウイルス上清をフェニックスＡ（Ｐｈｏｅｎｉｘ Ａ）パッケージング細胞系統及びベクターｐＬＸＳＮ中にクローニングされたそれぞれのクローニングされた構築物（ｐｙｋ−２野生型又はｐｙｋ−２ＫＭ突然変異体を発現する）を使用して作成した。ＨｅｌａＳ３及びクローン１４を一晩感染させた。培地を翌日に交換し、２日後に細胞を２４時間ＦＣＳを含まない培地中で飢餓状態にし、それから一晩１００ｎｇ／ｍｌのＣＨ−１１を添加した。アポトーシスを図１に記載されるように測定した。
【００３３】
例１
１．材料及び方法
１．１ アポトーシス抵抗性クローンの選択
子宮頚癌細胞系統ＨｅｌａＳ３（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２．２）を１０ｃｍの細胞培養皿（１０５細胞）で１０％のＦＣＳを含有するハムＦ１２成長培地にプレーティングした。翌日に該培地を１００ｎｇ／ｍｌのアポトーシス活性化抗Ｆａｓ抗体ＣＨ−１１（Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ）を補ったＦＣＳ不含の培地と交換した。３日後に殆どの細胞が死んだら、培地をもう一度抗体を含まない１０％のＦＣＳを含有する培地と交換した。生存している細胞を３週間クローンとして培養した。該クローンをピックアップし、かつ増幅させた。
【００３４】
１．２ アポトーシスアッセイ
親細胞系統ＨｅｌａＳ３から又はクローンからそれぞれ得られるウェルあたり５００００細胞を１２ウェル細胞培養皿中で２日間、１０％のＦＣＳを含有するハムＦ１２培地中で増殖させた。３日目に、該細胞を１ｍｌのハムＦ１２培地で２回洗浄し、かつ次いで培地を１ｍｌのハムＦ１２培地と交換した。翌日に該培地にそれぞれのインヒビター及び１００〜２００ｎｇ／ｍｌのＣＨ−１１を供給した。その翌日に培地をデカンテーションし、かつエッペンドルフチューブに移した。該細胞を２００μｌのＰＢＳで１回洗浄し、該ＰＢＳをそれぞれのエッペンドルフチューブに移した。次いで残りの細胞をまたそれぞれのエッペンドルフチューブにＰＢＳ中のＥＤＴＡ／トリプシンでの処理後に移した。該細胞を遠心分離によってペレット化させ、５００μｌの低張バッファー（０．１％のクエン酸ナトリウム、０．１％のトライトンＸ１００、２０μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウム）中で懸濁し、かつ４℃で２〜２４時間インキュベートした。得られた細胞核をＦＡＣＳによって分析した。
【００３５】
１．３ ＦＡＣＳ（蛍光活性化セルソーティング）−アポトーシス性核の測定のための分析
単一核のヨウ化プロピジウム蛍光をＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）サイトメーターを使用して測定した。前方散乱光（ＦＳＣ）及び側方散乱光（ＳＳＣ）を同時に記録した。ＦＳＣピークを１０２４チャンネルの線形スケールでのチャンネル５００で、かつ赤色蛍光ピークを対数スケールのチャンネル２００で調節した。ＦＳＣカットオフ値を、供給物なしのネガティブコントロールの最も大きな核の９５％にゲーティングすることによって測定した。これらの核をＧ１／Ｇ０ピークとチャンネル１０の間の副二倍体（ｓｕｂｄｉｐｌｏｉｄ）シグナルが存在する場合にアポトーシス性として分類した。
【００３６】
１．４ ｃＤＮＡの調製
全ＲＮＡを、グアニジニウムイソチオシアネートによって細胞を溶解し、かつ引き続き酸フェノールで抽出することによって単離した（分子生物学における最近のプロトコール）。ｍＲＮＡを標準的方法によってオリゴ−ｄＴセルロースに結合させることによって単離した（分子生物学における最近のプロトコール）。
【００３７】
Ｃａｐファインダープライマー（ＣＡＰ ｆｉｎｄｅｒ ｐｒｉｍｅｒ）Ｋ１及びＫ２（クロンテック Ｉｎｃ．， ＵＳＡ）及びＡＭＶ逆転写酵素（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用して逆転写によってｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、かつＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製した。３μｇのｍＲＮＡから、一本鎖ＤＮＡ及び一本鎖ＲＮＡからなる５０μｌのｃＤＮＡを得た。
【００３８】
１．５ ｃＤＮＡアレイの調製
ｐ−Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ中にクローニングされたｃＤＮＡをナイロンメンブレン上にＢｉｏＧｒｉｄスポッター（ＢｉｏＲｏｂｏｔｉｃｓ， ＵＫ）でスポッティングした。２５０ｎｇのＤＮＡを１スポットあたりに使用した。約二分の一の遺伝子について、２つ以上のプローブを使用し、かつ各プローブを２回スポッティングした。以下の記号を使用した：
ＹＫ＝チロシンキナーゼ
ＳＴＫ＝セリン／トレオニンキナーゼ
ＰＰ＝ホスファターゼ
Ｌｉｇ＝リガンド
ＵＫ＝未知のキナーゼ
ＵＰ＝未知のホスファターゼ
ＯＴ＝その他
例：
ＹＫ＿１ｂ＿Ａｂｌ＿２＝チロシンキナーゼ１，プローブｂ、スポット２
１．６ ｃＤＮＡの放射活性標識
５μｌのｃＤＮＡをメガプライムラベリングキット（Ｍｅｇａｐｒｉｍｅ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ Ｋｉｔ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用して５０μのＣｉα３３Ｐ−ＡＴＰで標識し、ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製した。こうして得られたｃＤＮＡをＣＯＴ−ＤＮＡ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）とハイブリダイズさせて、ｃＤＮＡアレイに非特異的に結合しうる繰り返し配列をブロッキングした。
【００３９】
１．７ ｃＤＮＡアレイのハイブリダイゼーション
ｃＤＮＡアレイをプレハイブリダイゼーション溶液（５０×デンハルト、１０×ＳＳＣ、０．２５ＭのＮａ３ＰＯ４、ｐＨ６．８、５０ｍＭのＮａ４Ｐ２Ｏ７、０．１ｍｇ／ｍｌのｔＲＮＡ（パン酵母、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）中で６８℃において４時間又は一晩プレハイブリダイゼーションさせた。
【００４０】
引き続きｃＤＮＡアレイをハイブリダイゼーションバッファー（５×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍｌのｔＲＮＡ）中で標識されたｃＤＮＡと１６時間ハイブリダイズさせた。該ｃＤＮＡアレイを以下のように洗浄した：
２×２０分Ｗ１（２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ）４２℃
１×２０分Ｗ２（０．２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ）４２℃
１×６０分Ｗ２ ６５℃
ｃＤＮＡアレイをホスホイメージャープレート（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ）上で４８時間さらし、かつ引き続きホスホイメージャー（Ｂａｓ−２５００， Ｆｕｊｉｆｉｌｍ）上で分析した。
【００４１】
１．８ ｃＤＮＡアレイの分析
フィルタ上のスポット容量をアレイヴィジョンソフトウェア（Ａｒｒａｙ Ｖｉｓｉｏｎ ｓｏｆｔｗａｒｅ）（Ｖ５．１， Ｉｍａｇｉｎｇ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．）を使用して測定した。全ての更なる計算はエクセル（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｃｏｒｐ．）で実施した。
【００４２】
ｃＤＮＡアレイのより良好な内部比較のために、規格化法を以下のように実施した：アレイ上の各スポットからバックグラウンド（アレイのｐ−Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ値の平均）を減算し、かつアレイ中の全てのスポット容量の和によって除算した。こうして得られた値を１００００で乗じた。
【００４３】
親細胞系統ＨｅｌａＳ３及びアポトーシス抵抗性クローンにおいて分化的に発現される遺伝子の同定のために、クローンの値及び親細胞系統の種々のアレイ（参照アレイ）の平均値からの商を計算した。０．１未満の全ての規格化された値を該計算のために０．１に設定した。０とは異なる全ての値の９０％は前記の値より高かった。それぞれの遺伝子を、パーセンテージが少なくとも１００％と異なる場合に分化的に発現されたと定義した。かかる遺伝子だけを分析し、その際、該アレイ上のそれぞれのスポットについての参照アレイ上の値の偏差は十分に小さかった。以下のフィルタをこれらの遺伝子を除外するために使用した。
【００４４】
参照アレイ及びそれぞれのクローンの１つのスポットについての値が２．５より小さい場合に、参照アレイの互いの偏差は０．２〜５の範囲でなければならない。
【００４５】
参照アレイの値が２．５より小さく、クローンの値が２．５より大きいか、又はその逆の場合に、参照アレイの互いの偏差は０．３〜３の範囲である必要がある。
【００４６】
参照アレイの値及びクローンの値の両方が２．５より大きい場合に、参照アレイの互いの偏差は０．５〜２の範囲である必要がある。
【００４７】
１．９ 遺伝子クラスタリング
遺伝子クラスタリングのためにプログラムＣｌｕｓｔｅｒ（Ｍｉｃｈａｅｌ Ｅｉｓｅｎ， Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）を使用した。クローンの値及び親細胞系統のそれぞれのアレイの平均値からの商を使用した。参照アレイ上の値で高い偏差を示すスポットを排除した。この目的のために、誘導された遺伝子の同定で既に適用されたフィルタを使用した。１９２２個のスポットから１４５１が残った。これらの値を対数的にクラスターに移行し、かつ更にクローンの少なくとも８０％の値が０と異なるスポット上でフィルタした。こうして得られる５２０個のスポットを階層的クラスタアルゴリズムを介して分析した。
【００４８】
発現パターン及びクラスターの全体の類似性は１と−１との間の値を有する相関係数に反映する。１の相関係数は、発現パターンが同一であることを意味し、０はこれらが完全に独立していることを意味し、かつ−１は互いの反対であることを意味する。
【００４９】
２．結果
２．１ アポトーシス抵抗性クローンはＣＨ−１１抗体を使用してＨｅｌａＳ３の選択によって得られる
４０個のクローンがＣＨ−１１抗体での選択の後に得られた。これらのクローンの２０個をＣＨ−１１に対するその感受性に関して試験した。クローンが抵抗性である程度は個々のクローンの間で異なるが、そのどれもが完全にアポトーシス抵抗性でなく、このことはアポトーシス機関が機能的であることを示唆している。これらのクローンはＴＮＦ−α及びシスプラチンによって誘導されるアポトーシスに屈折性を有している。
【００５０】
２．２ 多くの遺伝子がアポトーシス抵抗性クローンにおいて増大された発現を示す
第１表及び第２表はアポトーシス抵抗性クローンにおいて増大された発現を示す遺伝子のリストを示している。更にそれぞれのクローンのジーンバンクのアクセッション番号、発現が増大された発現についてのカットオフを上回るクローンの数及びカットオフを上回る平均パーセンテージが示されている。
【００５１】
殆どの分析された遺伝子はタンパク質ホスファターゼ及びキナーゼ、すなわち細胞調節のために重要な酵素をコードしている。
【００５２】
こうして決定された誘導されたクローンの幾つかは依然としてアポトーシス及び／又は腫瘍形成に関連していない（第１表）。他の遺伝子、例えばＣＡＭＫＫ（カルモジュリン依存性キナーゼキナーゼ）、ＥＧＦＲ（上皮成長因子受容体）、Ｂｃｒ（ブレークポイントクラスター領域）、ＦＧＦＲ−１（繊維芽細胞成長因子受容体１）、Ｎｉｋ（ＮＦκＢ−相互作用キナーゼ）及びＤＡＰＫ（死に関連するプロテインキナーゼ）は既にアポトーシス関連遺伝子として公知である。
【００５３】
２．３ 遺伝子クラスタリングは共通して調節される遺伝子の群を示す
発現データのクラスタリングによって、共通してアップレギュレート又はダウンレギュレートされる遺伝子の群が見いだされた。共通の調節は遺伝子の共通の機能を示唆している。こうして単一のアポトーシス調節遺伝子だけでなく、複数の遺伝子からなるシグナル伝達カスケードも見いだされる。アポトーシス抵抗性クローンにおいて同定されるクラスターを第３表に示す。遺伝子のクラスタリングはアップレギュレートされた遺伝子をグループ化することを可能にし、かつ単一の遺伝子だけの代わりに種々の抗アポトーシスシグナル経路を導き出すことを可能にする。アポトーシス抵抗性クローンに見いだされたクラスターはまた扁平上皮細胞癌細胞系統の発現データに部分的に見いだされうる（第４表）。スクリーニングによって生理学的に関連するアポトーシスクラスターは腫瘍発達のために重要であり、従って医薬物質ターゲットとして提供できることを見いだすことができることを示唆している。
【００５４】
クラスター１は多くのクローン、例えばＣＡＭＫＫ、ＵＫ１１（未知のキナーゼ１１）、ＰＴＰα（タンパク質チロシンホスファターゼα）及びＰＲＫ（増殖関連キナーゼ）において誘導される幾つかの遺伝子を有する。
【００５５】
クラスター２は高度に相関した発現を示す３つの遺伝子、すなわちセリン／トレオニンホスファターゼＶＨ２、ＴＩＭＰ（メタロプロテイナーゼ１）及びＭＭＰ−１５（基質メタロプロテイナーゼ１５）を有する。興味深いことに、酵素（ＭＭＰ−１５）及び潜在的なインヒビター（ＴＩＭＰ−１）は共通して調節される。
【００５６】
クラスター３はとりわけ膜結合チロシンホスファターゼＬａｒ及びプロアポトーシス性セリン／トレオニンキナーゼＤＡＰキナーゼを含む。
【００５７】
クラスター４において、ＢＣＲ、ｐ３８の潜在的なインヒビター及びＪＮＫシグナル経路及びｐ３８のアクチベーター、すなわちＭＡＰＫＫ−３（マイトジェン活性化キナーゼキナーゼ３）は共通して調節される。
【００５８】
２．４ 誘導された遺伝子の阻害はアポトーシスを増大させる
誘導された遺伝子が事実アポトーシスのモジュレーターであることを示すために、選択された酵素を特異的インヒビターによって阻害し、かつアポトーシスを誘導した。以下の酵素のためのインヒビターを使用した：
− ＳＵ５４０２はＦＧＦ受容体を阻害するが、定義されたＦＧＦ受容体のために特異的でない
− ＡＧ１２９５はＰＤＧＦ受容体を阻害する
− ＳＢ２０３５８０はｐ３８ＭＡＰキナーゼを阻害する
ＰＤ９８０５９はＭＡＰキナーゼキナーゼ１を阻害し、またこれはＭＡＰキナーゼＥＲＫ１及びＥＲＫ２を活性化する。このインヒビターはＳＢ２０３５８０のためのコントロールとして使用される。それというのもＳＢ２０３５８０もＥＲＫ１及びＥＲＫ２を部分的に阻害するからである。更にＥＲＫ２は該クローンにおいて増大された発現を示す。ＨｅｌａＳ３、クローン１４及びクローン２０（部分的）のための結果を図１に示す。
【００５９】
ＨｅｌａＳ３細胞におけるＦＧＦ受容体の阻害は約５０％のアポトーシスにおける増大をもたらすことが判明した。クローン１４及び５において、ＳＵ５４０２はそれぞれ約３００％又は５０％の増大をもたらす。このように２つのＦＧＦ受容体（クローン１４、ＦＧＦＲ−１及びＦＧＦＲ−３）の増大された発現を有するクローンにおいて、ＦＧＦ受容体の阻害はアポトーシスの高められた増大をもたらす。ＦＧＦ受容体のいかなる増大された発現も示さないクローン５において、アポトーシスにおける増大は親細胞系統ＨｅｌａＳ３に匹敵する。
【００６０】
ＰＤＧＦ受容体の阻害はＨｅｌａＳ３において約３０％の増大をもたらす。ＰＤＧＦ受容体の増大された発現を示すクローン１４において、該阻害は多くのアポトーシス細胞の二倍化をもたらす。それに対して、いかなる検出可能なＰＤＧＦ受容体も含有しないクローン５はＡＧ１２９５での処理後にアポトーシスの３０％だけの増大を示す。
【００６１】
ｐ３８ＭＡＰキナーゼを阻害する。それというのもＢＣＲ、ｐ３８ＭＡＰキナーゼシグナル経路のインヒビター及びｐ３８アクチベーターであるＭＡＰＫＫ−３（ＭＥＫ−３）は該クローンにおいて増大された発現を示すからである。更に両方の遺伝子は１つのクラスターにグループ化される。
【００６２】
ＨｅｌａＳ３におけるｐ３８阻害はアポトーシスの２５％の増大をもたらす。増大されたＭＥＫ−３を示すクローン１４において、ｐ３８の阻害はアポトーシスの６０％の増大をもたらす。それに対してＭＥＫ−１の阻害はアポトーシス率の二倍化をもたらす。ＨｅｌａＳ３と比較された、ｐ３８の阻害後のアポトーシスの増大及びＭＥＫ−１の阻害後の一定のアポトーシスはＥＲＫ１／２の阻害及びｐ３８の付加的な阻害によって説明できる。
【００６３】
ＨｅｌａＳ３と類似のレベルでＭＥＫ−３を発現するクローン２０において、ＳＢ２０３５８０での処理だけがアポトーシスの僅かな増大をもたらすにすぎない。それに対してＰＤ９８０５９での処理はアポトーシス率を三倍にする。このようにＳＢ２０３５８０はこの系において特異的に作用し、ｐ３８の阻害後のアポトーシスの増大における差異はｐ３８アクチベーターＭＥＫ−３の発現と相関している。
【００６４】
これらの阻害実験は結果的に、本発明のアポトーシスに関連する遺伝子を同定する方法が効果的であることを裏付けている。
【００６５】
２．５ 優性阻害型突然変異体又はアンチセンス鎖の導入による阻害
アポトーシス抵抗性クローンにおいてアップレギュレートされるそれぞれの酵素を、優性阻害型突然変異体又はアンチセンス鎖を導入することによって阻害することもできる。図２は、例えば野生型のｐｙｋ−２が、ＨｅｌａＳ３への増大の際に増大された抵抗性を与えることを示している。ｐｙｋ−２のより高度な発現を有するクローン１４において、野生型酵素の導入は効果的でないが、酵素の活性中心においてメチオニンに突然変異されたリジンを有する突然変異体（ｐｙｋ−２ＫＭ）は該クローンの表現型を回復する。アンチセンス構築物は相応の効果を有するが、より弱い効果を有する。
【００６６】
例２
実験法を例１に記載されるように実施した。
【００６７】
親細胞系統ＨｅｌａＳ３及びアポトーシス抵抗性クローンで分化的に発現される遺伝子の同定のために、以下の評価法を適用した。親細胞系統ＨｅｌａＳ３のｃＤＮＡアレイ上の各スポットについて、４つの値を以下のように決定した。ＲＮＡをＨｅｌａＳ３から２つの独立した調製において２回単離した。各ＲＮＡ調製物を使用してｃＤＮＡを合成し、かつ各ｃＤＮＡを２つのｃＤＮＡアレイとハイブリダイズさせた。ｃＤＮＡアレイ上に生じるスポットについてのこれらの４つの値の平均を計算し、かつ標準偏差を測定した。各アポトーシス抵抗性クローンのｃＤＮＡを１つのｃＤＮＡアレイとハイブリダイズさせた。遺伝子は、その値が以下のカットオフを上回る場合にアポトーシス抵抗性クローン中で分化的に発現されたと考慮した。アップレギュレートされた遺伝子のカットオフはそれぞれのＨｅｌａＳ３値の平均と２倍の標準偏差との和であった。従って、ダウンレギュレートされた遺伝子のカットオフはそれぞれのＨｅｌａＳ３値の平均から２倍の標準偏差を引いたものであった。アップ又はダウンレギュレートの規模をカットオフを上回る／下回るパーセンテージとして表した。例えばアップレギュレートされる遺伝子についてのカットオフを１００％上回る値はカットオフと比較して２倍の誘導を意味し、かつダウンレギュレートされた遺伝子についてのカットオフを１００％下回る値は抵抗性クローンでのその値の二分を意味する。
【００６８】
遺伝子クラスタリングのためにプログラムＣｌｕｓｔｅｒ（Ｍｉｃｈａｅｌ Ｅｉｓｅｎ， Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）を使用してよい。４つの参照アレイ及び２０個のアポトーシス抵抗性クローンのアレイの正規化された値を使用した。２４個の調査されるアレイの少なくとも２０で１より大きい値を有する遺伝子をフィルタし、かつ以下の計算のために使用した。遺伝子クラスタリングのためにプログラムＣｌｕｓｔｅｒ（Ｍｉｃｈａｅｌ Ｅｉｓｅｎ， Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）を使用してよい。４つの参照アレイ及び２０個のアポトーシス抵抗性クローンのアレイの正規化された値を使用した。２４個の調査されるアレイの少なくとも２０個において１より大きい値を有する遺伝子はフィルタし、かつ以下の計算のために使用した。値がクラスタリングが信頼できないバックグラウンドに非常に近い遺伝子のクラスタリングを回避するために、１のカットオフを利用した。こうして２４００個のスポットから、階層型クラスターアルゴリズムを介して分析された５２０が残った。
【００６９】
結果を第５表に示す。
【００７０】
【外１】
【外２】
【外３】
【外４】
【外５】
【外６】
【外７】
【外８】
【外９】
【外１０】
【表１】
【表２】
【表３】
【表４】
【表５】
【表６】
【表７】
【表８】
【表９】
【表１０】
【表１１】
【表１２】
【表１３】
【表１４】
【表１５】
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１はアップレギュレートされたキナーゼの阻害を示している。
【図２】
図２は優性阻害型突然変異体及びアンチセンス構築物によるｐｙｋ−２の阻害を示している。
【図３】
図３はクローンのアポトーシス感受性を示している。
【図４】
図４は他のアポトーシスインデューサーとのアポトーシス感受性を示している。
Claims (31)
- 以下の工程：
（ａ）親細胞のポピュレーションを準備し、その際、前記細胞ポピュレーションが実質的に所望の表現型を欠損し、
（ｂ）場合により前記の細胞ポピュレーションに細胞ゲノムの再配置及び／又は突然変異をもたらす処置を施し、
（ｃ）前記の（ｂ）からの細胞ポピュレーションに所望の表現型のための選択処置を施し、
（ｄ）前記の所望の表現型を表す細胞を同定し、かつ場合により特徴付け、
（ｅ）前記の所望の表現型を表す細胞からタンパク質及び／又はｍＲＮＡを得て、
（ｆ）前記の所望の表現型を表す細胞において遺伝子発現を調査し、
（ｇ）前記の所望の表現型を表す細胞における遺伝子発現と所望の表現型を実質的に欠損している細胞における遺伝子発現とを比較する
を含む、所望の表現型と機能的に関連した核酸分子を同定するための方法。 - 所望の表現型を癌細胞特性から選択する、請求項１記載の方法。
- 癌細胞特性が浸潤性、転移、接触阻害の欠損、細胞外基質所要量の欠損、成長因子の独立性、血管形成誘導、免疫防御の回避、抗アポトーシス及び／又は腫瘍マーカーレベルの増大から選択される、請求項２記載の方法。
- 所望の表現型が抗アポトーシスである、請求項２記載の方法。
- 所望の表現型が分泌されるタンパク質の産生、病原に対する感受性又は抵抗性、老化、細胞機能の調節及びシグナル伝達経路の調節から選択される、請求項１記載の方法。
- 常にゲノム再配置及び突然変異誘発のプロセスにある親細胞を選択する、請求項１から５までのいずれか１項記載の方法。
- 親細胞が不死化細胞又は形質転換された細胞である、請求項６記載の方法。
- 実質的に安定なゲノムを有する親細胞を選択する、請求項１から５までのいずれか１項記載の方法。
- 工程（ｂ）が突然変異誘発処置を含む、請求項８記載の方法。
- 前記の突然変異誘発処置が放射線照射、化学的突然変異誘発及びその組み合わせから選択される、請求項９記載の方法。
- 工程（ｄ）がセルソーティング処置を含む、請求項１から１０までのいずれか１項記載の方法。
- 前記のセルソーティング処置が蛍光活性化セルソーティング処置（ＦＡＣＳ）である、請求項１１記載の方法。
- 工程（ｅ）でｍＲＮＡを得ること及び該ｍＲＮＡ又はそれから生成される核酸を核酸アレイとハイブリダイズさせることを含む、請求項１から１２までのいずれか１項記載の方法。
- ｍＲＮＡから生成される核酸がｃＤＮＡ及びｃＲＮＡからなる群から選択される、請求項１３記載の方法。
- 前記の核酸アレイが、複数の異なる核酸分子を固定されて有する固体担体を含む、請求項１３又は１４記載の方法。
- 前記の核酸アレイがゲノムＤＮＡアレイ、ｃＤＮＡアレイ及びオリゴヌクレオチドアレイのアレイから選択される、請求項１３から１５までのいずれか１項記載の方法。
- 前記の核酸アレイがキナーゼ、ホスファターゼ、酵素及び受容体から選択される機能的な細胞性ポリペプチド又はその部分をコードする核酸を含む、請求項１３から１６までのいずれか１項記載の方法。
- 工程（ｅ）においてタンパク質を得ること及び所望の表現型を表す細胞におけるその細胞含量を分析することを含む、請求項１から１２までのいずれか１項記載の方法。
- 前記の分析が２Ｄゲル電気泳動、質量分析及び／又はタンパク質アレイへの結合を含む、請求項１８記載の方法。
- 分析の前にタンパク質混合物の複合性を低下させるために前処理工程を実施する、請求項１８又は１９記載の方法。
- 更に、所望の表現型と関連する複数の遺伝子（遺伝子クラスター）の同定を含む、請求項１から２０までのいずれか１項記載の方法。
- 更に、規定の遺伝子又は遺伝子クラスターと所望の表現型との関連を調査する確認工程を含む、請求項１から２１までのいずれか１項記載の方法。
- 確認工程が優性阻害型突然変異体の作成を含む、請求項２２記載の方法。
- 更に、所望の表現型と関連する規定の遺伝子又は遺伝子クラスターについて試験物質の活性を測定するスクリーニング処置を含む、請求項１から２３までのいずれか１項記載の方法。
- 所望の表現型と関連する遺伝子又は遺伝子クラスターの発現プロフィールの作成のための、請求項１から２４までのいずれか１項記載の方法の使用。
- 発現プロフィールを生物学的試料における発現プロフィールと比較する、請求項２５記載の使用。
- 試料をヒトの患者から得る、請求項２６記載の使用。
- ターゲットとしての、第１表、第２表及び第５表に示される核酸又はその断片又は前記の核酸によってコードされるペプチド又はポリペプチド又は断片の使用。
- 診断的用途のための請求項２８記載の使用。
- 治療的用途のための請求項２８記載の使用。
- 新規の医薬物質を同定するためのスクリーニング処置のための請求項２８記載の使用。
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