ES2282120T3 - Tratamiento del cancer de prostata con anticuerpos anti-erbb2. - Google Patents

Abstract

Utilización de un anticuerpo que se une a ErbB2 y que bloquea la activación de ligando de un receptor ErbB 50% a 100% más eficazmente que el anticuerpo monoclonal humanizado huMAb4D5-8 tal como se da a conocer en la patente US nº 5.821.337 para la preparación de un medicamento para el tratamiento del cáncer de próstata en un ser humano, en el que el anticuerpo bloquea la unión del anticuerpo monoclonal 2C4 obtenible del depósito ATCC nº HB 12697 a ErbB2.

Description

Tratamiento del cáncer de próstata con anticuerpos anti-ErbB2.

Campo de la invención

La presente invención se refiere al tratamiento del cáncer de próstata con anticuerpos anti-ErbB2.

Antecedentes de la invención

La familia ErbB de receptores tirosina quinasa son importantes mediadores del crecimiento, diferenciación y supervivencia celulares. La familia de receptores incluye cuatro elementos diferentes, incluyendo el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR o ErbB1), HER2 (ErbB2 o p185^{neu}), HER3 (ErbB3) y HER4 (ErbB4 o tiro2).

EGFR, codificada por el gen ErbB1, se ha implicado causalmente en la malignidad humana. En particular, la expresión incrementada de EGFR se ha observado en cáncer de mama, vejiga, pulmón, cabeza, cuello y estómago, así como en glioblastomas. La expresión incrementada del receptor EGFR con frecuencia se asocia a la producción incrementada del ligando de EGFR, transformando el factor de crecimiento alfa (TGF-\alpha) por las mismas células tumorales, resultando en la activación del receptor por una ruta estimulatoria autocrina (Baselga y Mendelsohn, Pharmac. Ther. 64:127-154, 1994). Se han evaluado los anticuerpos monoclonales contra el EGFR o sus ligandos, TGF-\alpha y EGF, como agentes terapéuticos en el tratamiento de estas malignidades. Ver, por ejemplo, Baselga y Mendelsohn, supra; Masui et al., Cancer Research 44:1002-1007, 1984; y Wu et al., J. Clin. Invest. 95:1897-1905, 1995.

El segundo elemento de la familia de ErbB, p185^{neu}, se identificó originalmente como el producto del gen transformante de neuroblastomas de ratas tratadas químicamente. La forma activada del protooncogén neu resulta de una mutación puntual (valina a ácido glutámico) en la región transmembranal de la proteína codificada. La amplificación del homólogo humano de neu se observa en los cánceres de mama y de ovario y se correlaciona con un mal prognóstico (Slamon et al., Science 235:177-182, 1987; Slamon et al., Science 244:707-712, 1989, y patente US nº 4.968.603). Hasta el momento no se ha informado de ninguna mutación puntual análoga a aquélla en el protooncogén neu para los tumores humanos. La sobreexpresión de ErbB2 (frecuentemente aunque no uniformemente debida a la amplificación génica) también ha sido observada en otros carcinomas, incluyendo los carcinomas de estómago, endometrio, glándula salivar, pulmón, riñón, colon, tiroides, páncreas y vejiga. Ver, entre otros, King et al., Science 229:974, 1985; Yokota et al., Lancet 1:765-767, 1986; Fukushigi et al., Mol. Cell Biol. 6:955-958, 1986; Geurin et al., Oncogene Res. 3:21-31, 1988; Cohen et al., Oncogene 4:81-88, 1989; Yonemura et al., Cancer Res. 51:1034, 1991; Borst et al., Gynecol. Oncol. 38:365, 1990; Weiner et al., Cancer Res. 50:421-425, 1990; Kern et al., Cancer Res. 50:5184, 1990; Park et al., Cancer Res. 49:6605, 1989; Zhau et al., Mol. Carcinog. 3:354-357, 1990; Aasland et al., Br. J. Cancer 57:358-363, 1988; Williams et al., Pathiobiology 59:46-52, 1991, y McCann et al., Cancer 65:88-92, 1990. ErbB2 puede encontrarse sobreexpresado en el cáncer de próstata (Gu et al., Cancer Lett. 99:185-189, 1996; Ross et al., Hum. Pathol. 28:827-833, 1997; Ross et al. Cancer 79:2162-2170, 1997, y Sadasivan et al., J. Urol. 150:126-131, 1993). Se han descrito anticuerpos dirigidos contra los productos proteicos p185^{neu} de rata y ErbB2 humano. Drebin y colaboradores han cultivado anticuerpos contra el producto del gen neu de rata, p185^{neu}. Ver, por ejemplo Drebin et al., Cell 41:695-706, 1985; Myers et al., Meth. Enzym. 198:277-290, 1991; y patente WO nº 94/22478. Drebin et al., Oncogene 2:273-277, 1988, informan de que las mezclas de anticuerpos reactivos con dos regiones diferentes de p185^{neu} resulta en efectos antitumorales sinérgicos en células NIH-3T3 transformadas con neu implantadas en ratones desnudos. Ver también la patente US nº 5.824.311, publicada el 20 de octubre de 1998.

Hudziak et al., Mol. Cell Biol. 9(3):1165-1172, 1989, describen la generación de un panel de anticuerpos anti-ErbB2 que se caracterizaron utilizando la línea humana de células tumorales SKBR3. Se determinó la proliferación celular relativa de las células SKBR3 tras la exposición a los anticuerpos mediante tinción con crista violeta de las monocapas tras 72 horas. Con este ensayo se obtuvo la inhibición máxima con el anticuerpo denominado 4D5, que inhibió la proliferación celular en un 56%. Otros anticuerpos en el panel redujeron la proliferación celular en menor grado en este ensayo. El anticuerpo 4D5 se descubrió además que sensibiliza las líneas celulares de tumor de mama que sobreexpresaban ErbB2 frente a los efectos citotóxicos de TNF-\alpha. Ver también la patente US nº 5.677.171, publicada el 14 de octubre de 1997. Los anticuerpos anti-ErbB2 comentados en Hudziak et al. se caracterizan adicionalmente en Fendly et al. Cancer Research 50:1550-1558, 1990; Kous et al., In vitro 26(3):59a, 1990; Sarup et al., Growth Regulation 1:72-82, 1991; Shepard et al., J. Clin. Immunol. 11(3):117-127, 1991; Kumar et al., Mol. Cell Biol. 11(2):979-986, 1991; Lewis et al., Cancer Immunol. Immunother. 37:255-263, 1993; Pietras et al., Oncogene 9:1829-1838, 1994; Vitetta et al., Cancer Research 54:5301-5309, 1994; Sliwkowski et al, J. Biol. Chem. 269(20):14661-14665, 1994; Scott et al., J. Biol. Chem. 266:14300-5, 1991; D’souza et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 91:7202-7206, 1994; Lewis et al., Cancer Research 56:1457-1465, 1996, y Schaefer et al., Oncogene 15:1385-1394, 1997.

Una versión humanizada recombinante del anticuerpo anti-ErbB2 murino 4D5 (huMAb4D5-8, rhuMAb HER2 o HERCEPTIN®, patente US nº 5.821.337) es clínicamente activa en pacientes con cánceres de mama metastásicos que sobreexpresan ErbB2 que han recibido previamente terapia anticáncer extensiva (Baselga et al., J. Clin. Oncol. 14:737-744, 1996). HERCEPTIN® recibió la autorización de comercialización de la Food and Drug Administration el 25 de septiembre de 1998 para el tratamiento de pacientes con cáncer de mama metastásico cuyos tumores sobreexpresan la proteína ErbB2.

La patente WO nº 99/31140 se refiere al tratamiento de trastornos caracterizados por la sobreexpresión de ErbB2. Más específicamente, el tratamiento de pacientes humanos susceptibles o diagnosticados de cáncer que sobreexpresa ErbB2 con una combinación de un anticuerpo anti-ErbB2 y un agente quimioterapéutico distinto de una antraciclina, por ejemplo doxorubicina o epirubicina.

Se han descrito otros anticuerpos anti-ErbB2 con diversas propiedades en Tagliabue et al., Int. J. Cancer 47:933-937, 1991; MeKenzie et al., Oncogene 4:543-548, 1989; Maier et al., Cancer Res. 51:5361-5369, 1991; Bacus et al., Molecular Carcinogenesis 3:350-362, 1990; Stancovski et al., PNAS (USA) 88:8691-8695, 1991; Bacus et al., Cancer Research 52:2771-2776, 1992; Hancock et al., Cancer Res. 51:4575-4580, 1991; Shawver et al., Cancer Res. 54:1367-1373, 1994; Arteaga et al., Cancer Res. 54:3758-3765, 1994; Harwerth et al., J. Biol. Chem. 267:15160-15167, 1992; patente US nº 5.783.186 y Klapper et al., Oncogene 14:2099-2109, 1997.

Se ha utilizado un anticuerpo scFv intracelular dirigido contra ErbB2 para regular negativamente la expresión membranal de este receptor en las líneas celulares DU145, LNCaP y PC3 (Myers et al., Proceedings of the American Association for Cancer Research Annual Meeting 37(0):342, nº 2334, 1996).

En Skrepnik et al., J. Urology 161:984-989, 1999, se trataron xenoinjertos subcutáneos en ratones cultivados a partir de las líneas celulares DU145 y PC3 con una oncotoxina. La oncotoxina comprendía un anticuerpo anti-erbB2 contenido dentro de un dominio de anticuerpo de una cadena asociado a una parte de la exotoxina A de Pseudomonas, que inhibió la síntesis de proteínas en las células diana.

Se ha utilizado un anticuerpo biespecífico (MDX-H210) que comprende un sitio de reconocimiento para ErbB2 en combinación con GM-CSF en un ensayo clínico de fase II para el tratamiento del cáncer de próstata (James et al., Brit. J. Cancer 78(2):19, 056, 1998).

El cribado de homología ha resultado en la identificación de dos otros miembros de la familia de receptores ErbB: ErbB3 (patentes US nº 5.183.884 y nº 5.480.968, así como Kraus et al., PNAS (USA) 86:9193-9197, 1989, y ErbB4 (solicitud de patente EP nº 599.274; Plowman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:1746-1750, 1993, y Plowman et al., Nature 366:473-475, 1993). Ambos receptores muestran expresión incrementada en por lo menos algunas líneas celulares de cáncer de mama.

Los receptores ErbB se encuentran generalmente en diversas combinaciones en las células y se cree que la heterodimerización incrementa la diversidad de las respuestas celulares frente a una diversidad de ligandos de ErbB (Earp et al., Breast Cancer Research and Treatment 35:115-132, 1995). EGFR se une a seis ligandos diferentes: factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor alfa de crecimiento transformante (TGF-\alpha), anfiregulina, factor de crecimiento epidérmico de unión a heparina (HB-EGF), betacelulina y epiregulina (Groenen et al., Growth Factors 11:235-257, 1994). Una familia de proteínas heregulina resultante del procesamiento alternativo de un solo gen son los ligandos para ErbB3 y ErbB4. La familia heregulina incluye las heregulinas alfa, beta y gamma (Holmes et al., Science 256:1205-1210, 1992; patente US nº 5.641.869, y Schaefer et al., Oncogene 15:1385-1394, 1997; factores de diferenciación de neu (NDFs), factores de crecimiento glial (GGFs), actividad inductora del receptor de acetilcolina (ARIA), y factor derivado de neuronas sensoriales y motoras (SMDF). Para una revisión, ver Groenen et al., Growth Factors 11:235-257, 1994; Lemke, G. Molec. & Cell. Neurosci. 7:247-262, 1996, y Lee et al., Pharm. Rev. 47:51-85, 1995). Recientemente se han identificado tres ligandos adicionales de ErbB: neuregulina-2 (NRG-2), que se informa que se une a ErbB3 o a ErbB4 (Chang et al., Nature 387:509-512, 1997, and Carraway et al., Nature 387:512-516, 1997), neuregulina-3, que se une a ErbB4 (Zhang et al., PNAS (USA) 94(18):9562-7, 1997), y neuregulina-4, que se une a ErbB4 (Harari et al., Oncogene 18:2681-2689, 1999), HB-EGF, betacelulina y epiregulina también se unen a ErbB4.

Aunque EGF y TGF\alpha no se unen a ErbB2. EGF estimula a EGFR y a ErbB2 para formar un heterodímero, que activa a EGFR y resulta en la transfosforilación de ErbB2 en el heterodímero. Aparentemente la dimerización y/o transfosforilación activan la tirosina quinasa de ErbB2 (ver Earp et al., supra). Análogamente, cuando ErbB3 se sobreexpresa con ErbB2, se forma un complejo de señalización activo y los anticuerpos dirigidos contra ErbB2 son capaces de alterar este complejo (Sliwkowski et al., J. Biol. Chem. 269(20):14661-14665, 1994). Además, la afinidad de ErbB3 para la heregulina (HRG) se incrementa hasta un estado de afinidad más elevado cuando se coexpresa con ErbB2 (ver también Levi et al., Journal of Neuroscience 15:1329-1340, 1995; Morrissey et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:1431-1435, 1995, y Lewis et al., Cancer Res. 56:1457-1465, 1996) con respecto al complejo proteico ErbB2-ErbB3. ErbB4, al igual que ErbB3, forma un complejo de señalización activo con ErbB2 (Carraway y Cantley, Cell 78:5-8, 1994).

Descripción resumida de la invención

En un primer aspecto, la presente invención proporciona la utilización de un anticuerpo que se une a ErbB2 y bloquea la activación de ligando de un receptor ErbB 50% a 100% más eficazmente que el anticuerpo monoclonal humanizado huMAb4D5-8, tal como se da a conocer en la patente US nº 5.821.337 para la preparación de un medicamento para el tratamiento del cáncer de próstata (por ejemplo el cáncer de próstata andrógeno-independiente) en el ser humano. El anticuerpo bloquea la unión del anticuerpo monoclonal 2C4 a ErbB2 y preferentemente bloquea la activación por TGF-\alpha de la proteína quinasa activada por mitógeno (MAPK).

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La invención proporciona además la utilización de un agente quimioterapéutico (por ejemplo un taxano) y de un anticuerpo que se une a ErbB2 y bloquea la activación de ligando de un receptor ErbB 50% a 100% más eficazmente que el anticuerpo monoclonal humanizado huMAb4D5-8, tal como se da a conocer en la patente US nº 5.821.337 para la preparación de un medicamento para el tratamiento del cáncer de próstata en el ser humano. El anticuerpo bloquea la unión del anticuerpo monoclonal 2C4, obtenible del depósito ATCC nº HB 12697, a ErbB2.

La administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo que se une a ErbB2 puede utilizarse para tratar el cáncer de próstata andrógeno-dependiente en el ser humano, y opcionalmente resulta en un índice incrementado de antígeno específico de próstata (PSA) en ser humano. El anticuerpo es uno que, al igual que el anticuerpo monoclonal 2C4 (por ejemplo 2C4 humanizado), bloquea la activación de ligando de un receptor ErbB2. Puede administrarse adicionalmente un agente quimioterapéutico, preferentemente un taxano, en el ser humano.

La invención, en un aspecto adicional, proporciona un producto de fabricación que comprende un recipiente y una composición contenida en el mismo, en la que la composición comprende un anticuerpo que se une a ErbB2 y bloquea la activación de ligando de un receptor ErbB 50% a 100% más eficazmente que el anticuerpo monoclonal humanizado huMAb4D5-8, tal como se da a conocer en la patente US nº 5.821.337, y que además comprende material impreso dentro del paquete que indica que la composición puede utilizarse para tratar el cáncer de próstata, por ejemplo el cáncer de próstata andrógeno-dependiente, en la que el anticuerpo bloquea la unión del anticuerpo monoclonal 2C4, obtenible del depósito ATCC nº HB 12697, a ErbB2. El material impreso en el paquete opcionalmente indica además el tratamiento del paciente con un agente quimioterapéutico, tal como taxano.

Breve descripción de los dibujos

Las figuras 1A y 1B ilustran el mapaje de los residuos 22 a 645 dentro del dominio extracelular (ECD) de ErbB2 (la secuencia de aminoácidos, incluyendo la secuencia de señal, mostrada en la fig. 1A, SEC ID nº 13) según se determina mediante análisis de mutantes por truncado y mutagénesis sitio-dirigida (Nakamura et al., J. of Virology 67(10):6179-6191, 1993, y Renz et al., J. Cell Biol. 125(6):1395-1406, 1994). Se prepararon los diversos fragmentos truncados o las mutaciones puntuales de ErbB2-ECD a partir de ADNc utilizando tecnología de reacción en cadena de la polimerasa. Los mutantes de ErbB2 se expresaron como proteínas de fusión gD en un plásmido de expresión de mamífero. Este plásmido de expresión utiliza el promotor/intensificador de citomegalovirus con señales de terminación y de poliadenilación de SV40 situados corriente abajo del ADNc insertado. Se transfectó plásmido de ADN en células 293. Un día después de la transfección las células se marcaron metabólicamente durante la noche en metionina y DMEM bajo en glucosa libre de cisteína que contenía suero de feto bovino al 1% dializado y 25 \muCi de metionina-^{35}S y de cisteína-^{35}S. Se recolectaron los sobrenadantes y se añadieron los anticuerpos monoclonales anti-ErbB2 o anticuerpos de control al sobrenadante y se incubaron 2 a 4 horas a 4ºC. Se precipitaron los complejos, se aplicaron a un gel de gradiente de SDS-tricina al 10%-20% y se sometieron a electroforesis a 100 V. El gel se transfirió eléctricamente a una membrana y se analizó mediante autorradiografía. Tal como se muestra en la fig. 1B, los anticuerpos anti-ErbB2 7C2.7F3.2C4, 7D3, 3E8, 4D5, 2H11 y 3H4 se unen a diversos epítopos ErbB2 ECD.

Las figuras 2A y 2B muestran el efecto de los anticuerpos monoclonales anti-ErbB2 2C4 y 7F3 sobre la activación de rHRG\beta1 en células MCF7. La fig. 2A muestra las curvas de dosis-respuesta para la inhibición por 2C4 o 7F3 de la estimulación por HRG de la fosforilación de tirosinas. La fig. 2B muestra las curvas de dosis-respuesta para la inhibición de la unión de rHRG\beta1_{177-244} marcada con ^{125}I a las células MCF-7 por 2C4 o 7F3.

La figura 3 ilustra la inhibición de la unión de rHRG\beta1_{177-244} marcada con ^{125}I a un panel de líneas celulares de tumores humanos por los anticuerpos monoclonales anti-ErbB2 2C4 o 7F3. Los controles de anticuerpo monoclonal son anticuerpos monoclonales murinos de isotipo correspondiente que no bloquean la unión de rHRG. Se determinó la unión no específica de rHRG\beta1_{177-244} marcada con ^{125}I a partir de incubaciones paralelas realizadas en presencia de rHRG\beta1 100 nM. Los valores para la unión no específica de rHRG\beta1_{177-244} marcada con ^{125}I fueron inferiores a 1% del total para todas las líneas celulares sometidas a ensayo.

Las figuras 4A y 4B muestran el efecto de los anticuerpos monoclonales 2C4 y 4D5 sobre la proliferación de células de MDA-MB-175 (fig. 4A) y SK-BR-3 (fig. 4B). Se sembraron placas de 96 pocillos con células MDA-MB-175 y SK-BR-3 y se dejó que se adhiriesen durante 2 horas. El experimento se llevó a cabo en medio que contenía 1% de suero. Se añadieron anticuerpos anti-ErbB2 o medio solo y las células se incubaron durante 2 horas a 37ºC. Posteriormente, se añadió rHRG\beta1 (1 nM) o medio solo y las células se incubaron durante 4 días. Las monocapas se lavaron y se tiñeron/fijaron con cristal violeta al 0,5%. Para determinar la proliferación celular, se midió la absorbancia a 540 nm.

Las figuras 5A y 5B muestran el efecto de anticuerpo monoclonal 2C4, anticuerpo HERCEPTIN® o anticuerpo anti-EGFR sobre la asociación dependiente de heregulina (HRG) de ErbB2 con ErbB3 en células MCF7 que expresaban niveles bajos/normales de ErbB2 (fig. 5A) y células SK-BR-3 que expresaban niveles elevados de ErbB2 (fig. 5B); ver el Ejemplo 2 posteriormente.

Las figuras 6A y 6B comparan las actividades de anticuerpo monoclonal murino intacto 2C4 (2C4 mu) y un fragmento Fab 2C4 quimérico. La fig. 6A muestra la inhibición de la unión de HRG-^{125}I a células MCF-7 de Fab 2C4 o anticuerpo monoclonal murino 2C4 intacto. Se sembraron placas de 24 pocillos con células MCF7 (1 x 10^{5} células/pocillo) y se cultivaron hasta una confluencia del 85% durante 2 días. Se llevaron a cabo experimentos de unión tal como se describe en Lewis et al., Cancer Research 56:1457-1465, 1996. La fig. 6B ilustra la inhibición de la activación de rHRG\beta1 de la fosforilación de las tirosinas de p180 en células MCF-7 llevada a cabo tal como se describe en Lewis et al., Cancer Research 56:1457-1465, 1996.

Las figuras 7A y 7B ilustran alineaciones de las secuencias de aminoácidos de los dominios variables ligero (V_{L}) (fig. 7A) y pesado (V_{H}) (fig. 7B) del anticuerpo monoclonal murino 2C4 (SEC ID nº 1 y 2, respectivamente); los dominios V_{L} y V_{H} de Fab humanizado versión 574 (SEC ID nº 3 y 4, respectivamente) y estructuras de consenso de las V_{L} y V_{H} humanas (\kappa1 hum, kappa ligera subgrupo I; humIII, subgrupo pesado III) (SEC ID nº 5 y 6, respectivamente). Los asteriscos identifican diferencias entre la Fab humanizada versión 574 y el anticuerpo monoclonal murino 2C4 o entre Fab humanizada versión 574 y la estructura humana. Las regiones determinantes de complementariedad (CDRs) se encuentran entre paréntesis.

Las figuras 8A a C muestra la unión de Fab 2C4 quimérico (Fab.v1) y de varias variantes de 2C4 humanizadas al dominio extracelular (ECD) de ErbB2 según se determina mediante ELISA en el Ejemplo 3.

La figura 9 es un diagrama de cintas de los dominios V_{L} y V_{H} del anticuerpo monoclonal 2C4 con el esqueleto CDR blanco etiquetado (L1, L2, L3, H1, H2, H3). También se muestran las cadenas laterales de VH evaluadas mediante mutagénesis durante la humanización (ver el Ejemplo 3, Tabla 2).

La figura 10 ilustra el efecto del anticuerpo monoclonal 2C4 o HERCEPTIN® sobre la activación mediada por EGF, TGF-\alpha o HRG de la proteína quinasa activada por mitógeno (MAPK).

Las figuras 11A a H ilustran la respuesta de los tumores xenoinjertados frente a los tratamientos de HERCEPTIN® (H, \blacksquare), de control (C, o), TAXOL® (T, \ding{115}) y la combinación HERCEPTIN®/TAXOL® (H/T, \lozenge). Se muestran las respuestas de los tumores andrógeno-independientes CWR22R y CWRSA (figs. 11A y B, respectivamente) y los tumores andrógeno-dependientes CWR22 y LNCaP (figs. 11C y D, respectivamente) frente a HERCEPTIN® y al control. Se muestra la respuesta de los tumores frente a HERCEPTIN®, TAXOL®, HERCEPTIN®/TAXOL® y el control en la fig. 11E (CWR2), fig. 11F (LNCaP), fig. 11G (CWR22R) y fig. 11H (CWRSA6). Los resultados se proporcionan como volumen medio del tumor \pm SE.

Las figuras 12A y 12B ilustran la respuesta índice relativa de antígeno específico de la próstata (PSA) de animales con xenoinjertos de cáncer de próstata andrógeno-dependiente tratados con HERCEPTIN®. En la fig. 12A, se midió el índice PSA en el modelo de xenoinjerto LNCaP previamente al tratamiento y en los días 9 y 21 tras iniciar el tratamiento y expresado relativamente a los valores pretratamiento. En la fig. 12B, se midió el índice PSA en el modelo de xenoinjerto CWR22 previamente al tratamiento y en los días 9 y 21 tras iniciar el tratamiento y expresado relativamente a los valores pretratamiento. Los resultados se proporcionan como medias respecto a PSA \pm SE.

La figura 13 ilustra la respuesta del tumor andrógeno-dependiente CWR22 frente a la terapia con anticuerpo de control (C, \ding{115}), HERCEPTIN®, (H, o) o anticuerpo monoclonal 2C4 (2, \blacksquare). La administración de 2C4 se indica por "*"; la administración de HERCEPTIN® se indica por "+".

La figura 14 ilustra la respuesta del tumor andrógeno-dependiente CWR22 frente a la terapia con TAXOL® solo (T, o), anticuerpo monoclonal 2C4 solo (2, \blacksquare) o una combinación de anticuerpo monoclonal 2C4 y TAXOL® (2/T, \ding{115}). La administración de 2C4 se indica por "*"; la administración de TAXOL® (6,25 mg/kg) se indica por "+".

La figura 15 ilustra la respuesta del tumor andrógeno-dependiente CWR22R frente a la terapia con TAXOL® solo (T, o), anticuerpo monoclonal 2C4 solo (2, \blacksquare) o una combinación de anticuerpo monoclonal 2C4 y TAXOL® (2/T, \ding{115}), HERCEPTIN® (H, o) o anticuerpo monoclonal 2C4 (2, \blacksquare). La administración de anticuerpo monoclonal 2C4 se indica por "+"; la administración de HERCEPTIN® se indica por "+".

La figura 16 ilustra la respuesta del tumor andrógeno-independiente CWR22R frente a la terapia con TAXOL® solo (T, o), anticuerpo monoclonal 2C4 solo (2, \blacksquare) o una combinación de anticuerpo monoclonal 2C4 y TAXOL® (2/T, \ding{115}). La administración de 2C4 se indica por "*"; la administración de TAXOL® (6,25 mg/kg) se indica por "+".

La figura 17 ilustra la respuesta del tumor andrógeno-independiente CWRSA6 frente a la terapia con anticuerpo de control (C, A), HERCEPTIN® (H, o) o anticuerpo monoclonal 2C4 (2, \blacksquare). La administración de anticuerpo monoclonal 2C4 se indica por "+"; la administración de HERCEPTIN® se indica por "+".

La figura 18 ilustra la respuesta del tumor andrógeno-independiente CWRSA6 frente a la terapia con anticuerpo de control (C, A), HERCEPTIN® (H, o) o anticuerpo monoclonal 2C4 (2, \blacksquare) o una combinación de anticuerpo monoclonal 2C4 y TAXOL® (2/T, \ding{115}). La administración de 2C4 se indica por "*"; la administración de TAXOL® (6,25 mg/kg) se indica por "+".

La figura 19 ilustra la expresión relativa de ARNm de TGF-\alpha por células CWR22R o CWR22 según se ha determinado mediante PCR cuantitativa en tiempo real.

La figura 20 ilustra la expresión relativa de ARNm de HB-EGF por células CWR22R o CWR22 según se ha determinado mediante PCR cuantitativa en tiempo real.

La figura 21 ilustra el efecto del tratamiento con anticuerpo monoclonal anti-ErbB2 sobre el crecimiento de los xenoinjertos de cáncer de próstata. El crecimiento tumoral se normaliza respecto a los tumores de control al final de cada experimento al sacrificar los animales de control. Los valores mostrados para CWR22 corresponden al día 23 tras la formación de un tumor palpable; para LNCaP, hasta el día 51; para CWR22R, hasta el día 22; para CWR22SA6, hasta el día 33.

La figura 22 muestra el efecto del tratamiento con anticuerpo monoclonal anti-ErbB2 sobre el índice PSA. El índice PSA se define como la cantidad de PSA sérica normalizada respecto al volumen del tumor.

La figura 23 evalúa la actividad del anticuerpo monoclonal humanizado recombinante (rhuMAb 2C4), un fragmento Fab pegilado del mismo, y 2C4 murino, sobre el xenoinjerto de CWR22R de próstata andrógeno-independiente.

La figura 24 ilustra la respuesta de dosis de rhuMAb 2C4 sobre el xenoinjerto CWR22R de próstata andrógeno-independiente.

La figura 25 ilustra la respuesta de dosis de rhuMAb 2C4 sobre el xenoinjerto MSKPC6 de próstata andrógeno-independiente.

La figura 26 ilustra la respuesta de dosis de 2C4 y 7C2 en el xenoinjerto de próstata andrógeno-dependiente (CWR22).

La figura 27 ilustra el volumen tumoral en xenoinjertos de CWR22R tratados con TAXOL® y anticuerpos 2C4 y 7C2 anti-ErbB2.

Descripción detallada de las realizaciones preferentes I. Definiciones

Un "receptor ErbB" es un receptor de proteína tirosina quinasa que pertenece a la familia de los receptores ErbB e incluye los receptores EGFR, ErbB2, ERbB3 y ErbB4 y otros elementos de esta familia que se identifiquen en el futuro. El receptor ErbB generalmente comprende un dominio extracelular, que puede unirse a un ligando de ErbB, un dominio transmembranal lipofílico, un dominio intracelular conservado de tirosina quinasa; y un dominio de señalización carboxilo-terminal que incluye varios residuos tirosina que pueden fosforilarse. El receptor ErbB puede ser un receptor ErbB de "secuencia nativa" o una "secuencia variante de aminoácidos" de la misma. Preferentemente, el receptor ErbB es un receptor ErbB humano de secuencia nativa.

Los términos "ErbB 1", "receptor de factor de crecimiento epidérmico" y "EGFR" se utilizan intercambiablemente en la presente invención y se refieren a EGFR tal como se da a conocer, por ejemplo, en Carpenter et al., Ann. Rev. Biochem. 56:881-914, 1987, incluyendo formas mutantes de origen natural del mismo (por ejemplo un EGFR mutante por deleción, tal como en Humphrey et al., PNAS (USA) 87:4207-421, 1990). El término "erbB1" se refiere al gen que codifica el producto proteína EGFR.

Las expresiones "ErbB2" y "HER2" se utilizan intercambiablemente en la presente invención y se refieren a la proteína HER2 humana descrita, por ejemplo, en Semba et al., PNAS (USA) 82:6497-6501, 1985, y Yamamoto et al., Nature 319:230-234, 1986 (número de acceso de Geneban X0333). El término "erbB2" se refiere al gen que codifica el ErbB2 humano y "neu" se refiere al gen que codifica p185^{neu} de rata. El ErbB2 preferente es el ERbB2 humano de secuencia nativa.

"ErbB3" y "HER3" se refieren al receptor polipéptido tal como se da a conocer, por ejemplo, en las patentes US nº 5.183.884 y nº 5.480.968, así como Kraus et al., PNAS (USA) 86:9193-9197, 1989.

Los términos "ErbB4" y "HER4" en la presente invención se refieren al receptor polipéptido tal como se da a conocer en la solicitud de patente EP nº 599.274; Plowman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:1746-1750, 1993; y Plowman et al., Nature 366:473-475, 1993, incluyendo las isoformas del mismo, por ejemplo tal como se da a conocer en la patente WO nº 99/19488, publicada el 22 de abril de 1999.

La expresión "ligando de ErbB" se refiere a un polipéptido que se une y/o activa un receptor ErbB. El ligando de ErbB de particular interés en la presente invención es un ligando de ErbB humano de secuencia nativa, tal como factor de crecimiento epidérmico (EGF) (Savage et al., J. Biol. Chem. 247:7612-7621, 1972), factor alfa de crecimiento transformante (TGF-\alpha) (Marquardt et al., Science 223:1079-1082, 1984), anfiregulina, también conocido como schwanoma o factor de crecimiento autocrino de queratinocitos (Shoyab et al., Science 243:1074-1076, 1989; Kimura et al., Nature 348:257-260, 1990, y Cook et al., Mol. Cell Biol. 11:2547-2557, 1991), betacelulina (Shing et al., Science 259:1604-1607, 1993, y Sasada et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 190:1173, 1993), factor de crecimiento epidérmico de unión a heparina (HB-EGF) (Higashiyama et al., Science 251:936-939, 1991), epiregulina (Toyoda et al., J. Biol. Chem. 270:7495-7500, 1993, y Komurasaki et al., Oncogene 15:2841-2848, 1997), una heregulina (ver posteriormente), neuregulina-2 (NRG-2) (Carraway et al., Nature 387:512-516, 1997), neuregulina-3 (NRG-3) (Zhang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 94:9562-9567, 1997), neuregulina-4 (NRG-4) (Harari et al., Oncogene 18:2681-2689, 1999), o cripto (CR-1) (Kannan et al., J. Biol. Chem. 272(6):3330-3335, 1997). Entre los ligandos de ErbB que se unen a EGFR se incluyen las heregulinas. Entre los ligandos de ErbB capaces de unirse a ErbB4 se incluyen betacelulina, epiregulina, HB-EGF, NRG-2, NRG-3, NRG-4 y heregulinas.

El término "heregulina" (HRG) se utiliza en la presente invención para referirse a un polipéptido codificado por el producto del gen heregulina tal como se da a conocer en la patente US nº 5.641.869 o en Marchionni et al., Nature 362:312-318, 1993. Entre los ejemplos de heregulinas se incluyen heregulina-\alpha, heregulina-\beta1, heregulina-\beta2 y heregulina-\beta3 (Holmes et al., Science 256:1205-1210, 1992, y patente US nº 5.641.869), factor de diferenciación neu (NDF) (Peles et al., Cell 69:205-216, 192), actividad inductora de receptor de acetilcolina (ARIA) (Falls et al., Cell 72:801-815, 1993), factores de crecimiento glial (GGFs) (Marchionni et al., Nature 362:312-318, 1993), factor derivado de neuronas sensoriales y motoras (SMDF) (Ho et al., J. Biol. Chem. 270:14523-14532, 1995), heregulina-\gamma (Schaefer et al., Oncogene 15:1385-1394, 1997). El término incluye fragmentos biológicamente activos y/o secuencias variantes de aminoácidos de un polipéptido HRG de secuencia nativa, tal como un fragmento de dominio similar a EGF del mismo (por ejemplo HRG\beta1_{177-244}).

El término "heterooligómero ErbB" en la presente invención se refiere a un oligómero asociado no covalentemente que comprende por lo menos dos receptores ErbB diferentes. Estos complejos pueden formarse cuando se expone una célula que expresa dos o más receptores ErbB a un ligando de ErbB, y pueden aislarse mediante inmunoprecipitación y analizarse mediante SDS-PAGE, tal como se describe en Sliwkowski et al., J. Biol. Chem. 269(20):14661-14665, 1994, por ejemplo. Entre los ejemplos de estos heterooligómeros ErbB se incluyen los complejos EGFR-ErbB2, ErbB2-ErbB3 y ErbB3-ErbB4. Además, el heterooligómero ErbB puede comprender dos o más receptores ErbB2 combinados con un receptor ErbB diferente, tal como ErbB3, ERbB4 o EGFR. Pueden incluirse en el heterooligómero otras proteínas, tales como una subunidad de receptor de citoquina (por ejemplo gp30).

La expresión "activación de ligando de un receptor ErbB" se refiere a la transducción de señales (por ejemplo la causada por un dominio intracelular de quinasa de un receptor ErbB que fosforila residuos tirosina en el receptor ErbB o un sustrato polipéptido) mediada por la unión de ligando de ErbB a un heterooligómero ErbB que comprende el receptor ErbB de interés. Generalmente, esto implicará la unión de un ligando de ErbB a un heterooligómero de ErbB que activa un dominio de quinasa de uno o más de los receptores ErbB en el heterooligómero y de esta manera resulta en la fosforilación de los residuos tirosina en uno o más de los receptores ErbB y/o la fosforilación de los residuos tirosina en uno o más polipéptidos de sustrato adicionales. La activación del receptor ErbB puede cuantificarse utilizando diversos ensayos de fosforilación de tirosinas.

Un polipéptido de "secuencia nativa" es una que presenta la misma secuencia de aminoácidos que un polipéptido (por ejemplo un receptor ErbB o un ligando de ErbB) de origen natural. Estos polipéptidos de secuencia nativa pueden aislarse de la naturaleza o pueden producirse por medios recombinantes o sintéticos. De esta manera, un polipéptido de secuencia nativa puede presentar la secuencia de aminoácidos de un polipéptido humano, de un polipéptido murino, o de un polipéptido de cualquier otra especie de mamífero de origen natural.

La expresión "secuencia de aminoácidos variante" se refiere a polipéptidos que presentan secuencias de aminoácidos que difieren en algún grado de un polipéptido de secuencia nativa. Habitualmente, las secuencias de aminoácidos variantes que presentan una homología de por lo menos aproximadamente 70% con por lo menos un dominio de unión a receptor de un ligando de ErbB nativo o con por lo menos un dominio de unión a ligando de un receptor ErbB nativo, y preferentemente presentará una homología de por lo menos aproximadamente 80%, más preferentemente de por lo menos aproximadamente 90%, con dicho receptor o dominios de unión a ligando. Las secuencias de aminoácidos variantes presentan sustituciones, deleciones y/o inserciones en determinadas posiciones dentro de la secuencia de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos nativa.

El término "homología" se define como el porcentaje de residuos en la secuencia de aminoácidos variante que es idéntico tras alinear las secuencias e introducir huecos, en caso necesario, para conseguir el porcentaje máximo de homología. Los procedimientos y programas informáticos para la alineación son bien conocidos de la técnica. Uno de estos programas informáticos es "Align 2", el autor del cual es Genentech, Inc., que ha sido presentado como documentación de usuario en la United States Copyright Office, Washington, DC 20559, el 10 de diciembre de 1991.

El término "anticuerpo" en la presente invención se utiliza en el sentido más amplio y específicamente cubre anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo anticuerpos biespecíficos) formados a partir de por lo menos dos anticuerpos intactos, y fragmentos de anticuerpo, con la condición de que muestren la actividad biológica deseada.

La expresión "anticuerpo monoclonal" tal como se utiliza en la presente invención se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por posibles mutaciones de origen natural que pueden encontrarse presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, estando dirigidos contra un único sitio antigénico. Además, en contraste con las preparaciones de anticuerpos policlonales que incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un solo determinante en el antígeno. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales resultan ventajosos en que pueden sintetizarse sin contaminación con otros anticuerpos. El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo de que se obtiene a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea, y no debe interpretarse como que requiere la producción del anticuerpo mediante cualquier procedimiento particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que deben utilizarse de acuerdo con la presente invención pueden prepararse mediante el procedimiento de hibridoma, descrito por primera vez por Kohler et al., Nature 256:495, 1975, o pueden prepararse mediante procedimientos de ADN recombinante (ver, por ejemplo, la patente US nº 4.816.567). Los "anticuerpos monoclonales" también pueden aislarse a partir de bibliotecas de anticuerpos fágicos utilizando las técnicas descritas en Clackson et al., Nature 352:624-628, 1991, y en Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597, 1991, por ejemplo.

Los anticuerpos monoclonales en la presente invención específicamente incluyen anticuerpos "quiméricos" en los que una parte de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homóloga a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o pertenecientes a una clase o subclase particular de anticuerpo, mientras que el resto de la cadena o cadenas es idéntico u homólogo a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie o pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpos, así como fragmentos de dichos anticuerpos, con la condición de que presenten la actividad biológica deseada (patente US nº 4.816.567, y Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855, 1984). Entre los anticuerpos quiméricos de interés se incluyen anticuerpos "primatizados" que comprenden secuencias de dominio variable de unión a antígeno derivadas de un primate no humano (por ejemplo monos del Viejo Mundo, primates, etc.) y secuencias de regiones constantes humanas.

La expresión "fragmentos de anticuerpo" comprende una parte de un anticuerpo intacto, preferentemente comprende la región de unión a antígeno o región variable del mismo. Entre los ejemplos de los fragmentos de anticuerpo se incluyen los fragmentos Fab, Fab’, F(ab’)_{2} y Fv, diacuerpos, anticuerpos lineales, moléculas de anticuerpo de una cadena, y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de uno o más fragmentos de anticuerpo.

Un anticuerpo "intacto" es uno que comprende una región variable de antígeno de unión, así como un dominio constante de cadena ligera (C_{L}) y dominios constantes de cadena pesada, CH1, CH2 y CH3. Los dominios constantes pueden ser dominios constantes de secuencia nativa (por ejemplo dominios constantes de secuencia nativa humana) o secuencias de aminoácidos variantes de los mismos. Preferentemente, el anticuerpo intacto presenta una o más funciones efectoras.

Las "funciones efectoras" de anticuerpos se refieren a aquellas actividades biológicas atribuibles a la región Fc (una región Fc de secuencia nativa o región Fc de secuencia de aminoácidos nativa) de un anticuerpo. Entre los ejemplos de funciones efectoras de anticuerpo se incluyen la unión a Clq, la citotoxicidad dependiente del complemento, la unión de receptor Fc, la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC), la fagocitosis, la regulación negativa de los receptores de superficie celular (por ejemplo receptor de célula B, BCR), etc.

Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas, pueden asignarse los anticuerpos intactos a diferentes "clases". Existen cinco clases principales de anticuerpos intactos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varios de ellos pueden dividirse además en "subclases" (isotipos), por ejemplo IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA y IgA2. Los dominios constantes de cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de anticuerpos se denominan \alpha, \delta, \xi, \gamma, \mu, respectivamente. Las estructuras de subunidad y las configuraciones tridimensionales de las diferentes clases de inmunoglobulinas son bien conocidas.

Las expresiones "citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos" y "ADCC" se refieren a la reacción mediada por células en la que las células citotóxicas no específicas que expresan receptores Fc (FcRs) (por ejemplo las células asesinas naturales (NK), los neutrófilos y los macrófagos) reconocen los anticuerpos unidos a una célula diana y posteriormente causan la lisis de la célula diana. Las células principales que median la ADCC, las células NK, únicamente expresan Fc\gammaRIII, mientras que los monocitos expresan Fc\gammaRI, Fc\gammaRII y Fc\gammaRIII. La expresión de FcR en las células hematopoyéticas se resume en la Tabla 3 en la página 464 de Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-92, 1991. Con el fin de evaluar la actividad ADCC de una molécula de interés, puede llevarse a cabo un ensayo ADCC in vitro, tal como el descrito en las patentes US nº 5.500.362 o nº 5.821.337. Entre las células efectoras útiles para estos ensayos se incluyen las células mononucleares sanguíneas periféricas (PBMC) y las células asesinas naturales (NK). Alternativamente, o adicionalmente, puede evaluarse in vivo la actividad ADCC de la molécula de interés, por ejemplo en un modelo animal, tal como el dado a conocer en Clynes et al., PNAS (USA) 95:652-656, 1998.

Las "células efectoras humanas" son leucocitos que expresan una o más FcRs y llevan a cabo funciones efectoras. Preferentemente, las células expresan por lo menos Fc\gammaRIII y llevan a cabo la función efectora de ADCC. Entre los ejemplos de leucocitos humanos que median en la ADCC se incluyen las células mononucleares sanguíneas periféricas (PBMC), las células asesinas naturales (NK), los monocitos, las células T citotóxicas y los neutrófilos; siendo preferentes las PBMCs y las células NK. Las células efectoras pueden aislarse de una fuente nativa de las mismas, por ejemplo de sangre o de PBMCs, tal como se describe en la presente invención.

Los términos "receptor Fc" o "FcR" se utilizan para describir un receptor que se une a la región Fc de un anticuerpo. El FcR preferente es un FcR humano de secuencia nativa. Además, un FcR preferente es uno que se une a un anticuerpo IgG (un receptor gamma) e incluye receptores de las subclases Fc\gammaRI, Fc\gammaRII y Fc\gammaRIII, incluyendo variantes alélicas y formas procesadas alternativamente de estos receptores. Entre los receptores Fc\gammaRII se incluyen Fc\gammaRIIA (un "receptor activador") y Fc\gammaRIIB (un "receptor inhibidor"), que presentan secuencias de aminoácidos similares que difieren principalmente en los dominios citoplasmáticos de los mismos. El receptor activador Fc\gammaRIA contiene un motivo de activación de inmunoreceptor basado en tirosinas (ITAM) en su dominio citoplasmático. El receptor inhibidor Fc\gammaRIIB contiene un motivo de inhibición de inmunoreceptor basado en tirosinas (ITIM) en su dominio citoplasmático (ver revisión en M. Daëron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-2034, 1997). Los FcRs se revisan en Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-92, 1991; Capel et al., Immunomethods 4:25-34, 1994, y de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41, 1995. Otros FcRs, incluyendo aquellos que deben identificarse en el futuro, se encuentran comprendidos por el término "FcR" en la presente invención. El término también incluye el receptor neonatal, FcRn, que es responsable de la transferencia de IgGs maternales al feto (Guyer et al., J. Immunol. 117:587, 1976, y Kim et al., J: Immunol. 24:249, 1994).

La expresión "citotoxicidad dependiente del complemento" o "CDC" se refiere a la capacidad de una molécula de lisar una diana en presencia de complemento. La ruta de activación del complemento se inicia con la unión del primer componente del sistema del complemento (C1q) a una molécula (por ejemplo un anticuerpo) acomplejado con un antígeno cognado. Para evaluar la activación del complemento, puede llevarse a cabo un ensayo CDC, por ejemplo tal como se describe en Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163, 1996.

Los "anticuerpos nativos" habitualmente son glucoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150.000 daltons compuestas de dos cadenas ligeras idénticas (L) y dos cadenas pesadas idénticas (H). Cada cadena ligera se une a una cadena pesada mediante un enlace disulfuro covalente, mientras que el número de enlaces disulfuro varía entre las cadenas pesadas de diferentes isotipos de inmunoglobulina. Cada cadena pesada y ligera también presenta puentes disulfuro intracadena regularmente espaciados. Cada cadena pesada presenta en un extremo un dominio variable (V_{H}) seguido de varios dominios constantes. Cada cadena ligera presenta un dominio variable en un extremo (V_{L}) y un dominio constante en su otro extremo. El dominio constante de la cadena ligera se encuentra alineada con el primer dominio constante de la cadena pesada, y el dominio variable de cadena ligera se encuentra alineada con el dominio variable de la cadena pesada. Se cree que unos residuos aminoácidos particulares forman una interfase entre los dominios variables de cadena ligera y de cadena pesada.

El término "variable" se refiere al hecho de que determinadas partes de los dominios variables difieren extensivamente en secuencia entre anticuerpos y se utilizan en la unión y especificidad de cada anticuerpo particular para su antígeno particular. Sin embargo, la variabilidad no se encuentra uniformemente distribuida en los dominios variables de los anticuerpos. Se concentra en tres segmentos denominados regiones hipervariables en los dominios variables de tanto las cadenas ligeras como las pesadas. Las partes más altamente conservadas de los dominios variables se denominan las regiones marco (FRs). Los dominios variables de las cadenas pesadas y ligeras nativas comprenden cada una de ellas cuatro FRs, adoptando mayoritariamente una configuración de lámina \beta, conectadas por tres regiones hipervariables, que forman bucles que conectan, y en algunos casos forman parte, de la estructura de lámina \beta. Las regiones hipervariables en cada cadena se mantienen juntas en estrecha proximidad por los FRs y, con las regiones hipervariables de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión a antígeno de los anticuerpos (ver Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a edición, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991). Los dominios constantes no se encuentran implicados directamente en la unión de un anticuerpo a un antígeno, pero muestran diversas funciones efectoras, tales como la participación del anticuerpo en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC).

La expresión "región hipervariable" cuando se utiliza en la presente invención se refiere a los residuos aminoácidos de un anticuerpo que son responsables de la unión de antígeno. La región hipervariable generalmente comprende residuos aminoácidos de una "región determinante de complementariedad" o "CDR" (por ejemplo los residuos 24 a 34 (L1), 50 a 56 (L2) y 89 a 97 (L3) en el dominio variable de cadena ligera y 31 a 35 (H1), 50 a 65 (H2) y 95 a 102 (H3) en el dominio variable de cadena pesada; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a edición, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) y/o aquellos residuos de un "bucle hipervariable" (por ejemplo los residuos 26 a 32 (L1), 50 a 52 (L2) y 91 a 96 (L3) en el dominio variable de cadena ligera y 26 a 32 (H1), 53 a 55 (H2) y 96 a 101 (H3) en el dominio variable de cadena pesada; Chothia y Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917, 1987. La "región marco" o residuos "FR" son aquellos residuos de dominio variable diferentes de los residuos de región hipervariable según se definen en la presente invención.

La digestión con papaína de los anticuerpos produce dos fragmentos idénticos de unión a antígeno denominados fragmentos "Fab", cada uno de ellos con un único sitio de unión de antígeno, y un fragmento "Fc" residual, cuyo nombre indica su capacidad de cristalizar con facilidad. El tratamiento con pepsina rinde un fragmento F(ab’)_{2} que presenta dos sitios de unión a antígeno y todavía es capaz de entrecruzarse con un antígeno.

"Fv" es un fragmento de anticuerpo mínimo que contiene un sitio completo de reconocimiento de antígeno y de unión de antígeno. Esta región consiste de un dímero de un dominio variable de cadena pesada y de cadena ligera en asociación no covalente estrecha. Es en esta configuración que las tres regiones hipervariables de cada dominio variable interaccionan definiendo un sitio de unión a antígeno sobre la superficie del dímero V_{H}-V_{L}. Colectivamente las seis regiones hipervariables proporcionan especificidad de unión de antígeno al anticuerpo. Sin embargo, incluso un solo dominio variable (o la mitad de un Fv que comprende únicamente tres regiones hipervariables específicas para un antígeno) presenta la capacidad de reconocer y unirse al antígeno, aunque con una afinidad menor que el sitio de unión completo.

El fragmento Fab también contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab’ difieren de los fragmentos Fab en la adición de unos cuantos residuos en el extremo carboxi del dominio CH1 de la cadena pesada, incluyendo una o más cisteínas de la región bisagra del anticuerpo. Fab’-SH es la denominación en la presente invención para Fab’ en la que el residuo o residuos cisteína de los dominios constantes portan por lo menos un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpo F(ab’)_{2} originalmente se produjeron como pares de fragmentos Fab’ que presentaban cisteínas de bisagra entre ellas. También son conocidos otros acoplamientos químicos entre fragmentos de anticuerpos.

Las "cadenas ligeras" de los anticuerpos de cualquier especie de vertebrado pueden clasificarse en dos tipos claramente diferenciados, denominados kappa (\kappa) y lambda (\lambda), basándose en las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes.

Los fragmentos de anticuerpo "Fv de una cadena" o "scFv" comprende los dominios V_{H} y V_{L} del anticuerpo, en el que estos dominios se encuentran presentes en una sola cadena polipeptídica. Preferentemente, el polipéptido Fv comprende además un línker polipéptido entre los dominios V_{H} y V_{L} que permite que scFv forme la estructura deseada para la unión de antígeno. Para una revisión de scFv, ver Plücthun, en: The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore, editores, Springer-Verlag, New York, páginas 269 a 315 (1994). Los fragmentos scFv del anticuerpo anti-ErbB2 se describen en la patente WO nº 93/16185, patentes US nº 5.571.894 y nº 5.587.458.

El término "diacuerpos" se refiere a fragmentos anticuerpos pequeños con dos sitios de unión de antígeno, comprendiendo dichos fragmentos un dominio pesado variable (V_{H}) conectado a un dominio ligero variable (V_{L}) en la misma cadena polipeptídica (V_{H}-V_{L}). Mediante la utilización de un línker excesivamente corto para permitir el apareamiento entre los dominios en la misma cadena, se fuerza que los dominios se apareen con los dominios complementarios de otra cadena y creen dos sitios de unión de antígeno. Los diacuerpos se describen más completamente en, por ejemplo, la patente EP nº 404.097, la patente WO nº 9/11161, y en Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448, 1993.

Las formas "humanizadas" de los anticuerpos no humanos (por ejemplo de roedor) son anticuerpos quiméricos que contienen una secuencia mínima derivada de una inmunoglobulina no humana. En su mayoría, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en el que los residuos de una región hipervariable del receptor se sustituyen por residuos procedentes de una región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donante), tal como ratón, rata, conejo o primate no humano, que presenta la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos de la región marco (FR) de la inmunoglobulina humana se sustituyen por residuos no humanos correspondientes. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donante. Estas modificaciones se llevan a cabo para refinar adicionalmente el comportamiento del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprende sustancialmente la totalidad de por lo menos un dominio variable y típicamente dos de ellos, en el que la totalidad o sustancialmente la totalidad de los bucles hipervariables corresponden a aquellos de una inmunoglobulina no humana y la totalidad o sustancialmente la totalidad de los FRs pertenecen a una secuencia de inmunoglobulina humana. La inmunoglobulina humana opcionalmente también comprende por lo menos una parte de una región constante de inmunoglobulina (Fc), típicamente la de una inmunoglobulina humana. Para más detalles, ver Jones et al., Nature 321:522-525, 1986; Riechmann et al., Nature 332:323-329, 1988, y Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596, 1992.

Entre los anticuerpos anti-ErbB2 humanizados se incluyen huMAb4D5-1, huMAb4D5-2, huMAb4D5-3,
huMAb4D5-4, huMAb4D5-5, huMAb4D5-6, huMAb4D5-7 y huMAb4D5-8 (HERCEPTIN®), tal como se describe en la Tabla 3 de la patente US nº 5.821.337, 520C9 (patente WO nº 93/21319) humanizado y 2C4 humanizado tal como se describe posteriormente en la presente invención.

Un anticuerpo "aislado" es un anticuerpo que ha sido identificado y separado y/o recuperado de un componente de su ambiente natural. Los componentes contaminantes de su ambiente natural son materiales que interferirían con los usos diagnósticos y terapéuticos para el anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteináceos o no proteináceos. En las realizaciones preferentes, el anticuerpo se purifica (1) hasta una pureza superior al 95% en peso de anticuerpo según determinación por el procedimiento de Lowry, y más preferentemente superior al 99% en peso, (2) en grado suficiente para obtener por lo menos 15 residuos de secuencia de aminoácidos N-terminal o interna mediante la utilización de un secuenciador de taza giratoria, o (3) hasta la homogeneidad mediante SDS-PAGE bajo condiciones reductoras o no reductoras utilizando azul de Coomassie o, preferentemente, tinción de plata. El anticuerpo aislado se incluye el anticuerpo in situ dentro de células recombinantes debido a que por lo menos un componente del ambiente natural del anticuerpo no se encuentra presente. Habitualmente, sin embargo, el anticuerpo aislado se prepara mediante por lo menos una etapa de purificación.

Un anticuerpo "que se une" a un antígeno de interés, por ejemplo el antígeno ErbB2, es un anticuerpo capaz de unirse a ese antígeno con suficiente afinidad para que el anticuerpo resulte útil como agente terapéutico que presenta como diana una célula que expresa el antígeno. En el caso de que el anticuerpo sea uno que se une a ErbB2, habitualmente se une preferentemente a ErbB2 y no a los otros receptores ErbB y puede ser uno que no reacciona cruzadamente en grado significativo con otras proteínas, tales como EGFR, ErbB3 o ErbB4. En estas realizaciones, el grado de unión del anticuerpo a estas proteínas diferentes de ErbB2 (por ejemplo la unión de la superficie celular a un receptor endógeno) será inferior al 10% según determinación por análisis de separación celular activada por fluorescencia (FACS) o mediante radioinmunoprecipitación (RIA). En ocasiones, el anticuerpo anti-ErbB2 no reacciona cruzadamente en grado significativo con la proteína neu de rata, por ejemplo tal como se describe en Schecter et al., Nature 312:513, 1984 y en Drebin et al., Nature 312:545-548, 1984.

Un anticuerpo que "bloquea" la activación de ligando de un receptor ErbB es un anticuerpo que reduce o previene dicha activación tal como se ha definido anteriormente en la presente invención, en el que el anticuerpo es capaz de bloquear la activación de ligando del receptor ErbB de manera sustancialmente más eficaz que el anticuerpo monoclonal 4D5, por ejemplo aproximadamente tan eficazmente como los anticuerpos monoclonales 7F3 o 2C4 o fragmentos Fab de los mismos, y preferentemente aproximadamente tan eficazmente como el anticuerpo monoclonal 2C4 o un fragmento Fab del mismo. Por ejemplo, el anticuerpo que bloquea la activación de ligando de un receptor ErbB puede ser uno que es aproximadamente 50% a 100% más eficaz que 4D5 en la formación de bloqueo de un heterooligómero ErbB. El bloqueo de la activación de ligando de un receptor ErbB puede producirse por cualquier medio, por ejemplo interfiriendo con: la unión de ligando a un receptor ErbB, la formación de complejo de ErbB, la actividad de tirosina quinasa de un receptor ErbB en un complejo ErbB y/o la fosforilación de uno o más residuos de tirosina quinasa en o por un receptor ErbB. Entre los ejemplos de anticuerpos que bloquean la activación de ligando de un receptor ErbB se incluyen los anticuerpos monoclonales 2C4 y 7F3 (que bloquean la activación por HRG de los heterooligómeros ErbB2/ErbB3 y ErbB2/ErbB4 y la activación por EGF, TGF-\alpha, anfiregulina, HB-EGF y/o epiregulina de un heterooligómero EGFR/ErbB2), y los anticuerpos L26, L96 y L288 (Klapper et al., Oncogene 14:2099-2109, 1997) que bloquean la unión de EGF y de NDF a las células T47D que expresan EGFR, ErbB2, ErbB3 y ErbB4.

Un anticuerpo que presenta una "característica biológica" de un anticuerpo designado, tal como el anticuerpo monoclonal designado 2C4, es un anticuerpo que posee una o más de las características biológicas de ese anticuerpo que lo distinguen de otros anticuerpos que se unen al mismo antígeno (por ejemplo ErbB2). Por ejemplo, un anticuerpo con una característica biológica de 2C4 puede bloquear la activación por HRG de un heterooligómero ErbB que comprende ErbB2 y ErbB3 o ErbB4; bloquear la activación por EGF, TGF-\alpha, HB-EGF, epiregulina y/o anfiregulina de un receptor ErbB que comprende EGFR y ErbB2; bloquear la activación de MAPK mediada por EGF, TGF-\alpha y/o HRG; y/o unir en el dominio extracelular de ErbB2 el mismo epítopo al que se une 2C4 (lo que bloquea la unión del anticuerpo monoclonal 2C4 a ErbB2).

A menos que se indique lo contrario, la expresión "anticuerpo monoclonal 2C4" se refiere a un anticuerpo que presenta residuos de unión a antígeno o derivados de anticuerpo 2C4 murino de los Ejemplos posteriormente. Por ejemplo, el anticuerpo monoclonal 2C4 puede ser un anticuerpo 2C4 monoclonal murino o una variante del mismo, tal como un 2C4 humanizado, que posee residuos aminoácidos de unión a antígeno del anticuerpo monoclonal murino 2C4. Se proporcionan ejemplos de anticuerpos 2C4 humanizados en el Ejemplo 3 posteriormente. A menos que se indique lo contrario, la expresión "rhuMAb 2C4" cuando se utiliza en la presente invención se refiere a un anticuerpo que comprende las secuencias variable ligera (V_{L}) y variable pesada (V_{H}) de las SEC ID nº 3 y 4, respectivamente, fusionadas con las secuencias de región constante de IgG1 (no alotipo A) humanas ligera y pesada opcionalmente expresadas por una célula de ovario de hámster chino (CHO).

A menos que se indique lo contrario, la expresión "anticuerpo monoclonal 4D5" se refiere a un anticuerpo que presenta residuos de unión de antígeno de anticuerpo 4D5 murino o derivados del mismo (ATCC nº CRL 10463). Por ejemplo, el anticuerpo monoclonal 4D5 puede ser el anticuerpo monoclonal murino 4D5 o una variante del mismo, tal como un 4D5 humanizado, que posea residuos de unión de antígeno del anticuerpo monoclonal murino 4D5. Entre los anticuerpos 4D5 humanizados ejemplares se incluyen huMAb4D5-1, huMAb4D5-2, huMAb4D5-3, huMAb4D5-4, huMAb4D5-5, huMAb4D5-6, huMAb4D5-7 y huMAb4D5-8 (HERCEPTIN®) tal como en la patente US nº 5.821.337, siendo huMAb4D5-8 (HERCEPTIN®) un anticuerpo 4D5 humanizado preferente.

La expresión "agente inhibidor del crecimiento" cuando se utiliza en la presente invención se refiere a un compuesto o composición que inhibe el crecimiento de una célula, especialmente una célula cancerosa que expresa ErbB in vitro o in vivo. De esta manera, el agente inhibidor del crecimiento puede ser un agente que reduzca significativamente el porcentaje de células que expresan ErbB en la fase S. Entre los agentes inhibidores del crecimiento se incluyen agentes que bloquean la progresión del ciclo celular (en un momento aparte de la fase S), tal como agentes que inducen la detención de G1 y de la fase M. Entre los bloqueantes clásicos de la fase M se incluyen las vincas (vincristina y vinblastina), taxanos e inhibidores de topo II, tales como doxorubicina, epirubicina, daunorubicina, etopósido y bleomicina. Aquellos agentes que detienen G1 también se desbordan hacia la detención de la fase S, por ejemplo agentes alquilantes del ADN, tales como tamoxifeno, prednisona, dacarbazina, mecloretamina, cisplatino, metotrexato, 5-fluorouracilo y ara-C. Puede encontrarse más información en The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn e Israel, editores, capítulo 1, titulado "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs", por Murakami et al. (WB Saunders: Philadelphia, 1995), especialmente en la página 13.

Son ejemplos de anticuerpos "inhibidores del crecimiento" aquellos que se unen a ErbB2 e inhiben el crecimiento de las células cancerosas que sobreexpresan ErbB2. Los anticuerpos anti-ErbB2 inhibidores del crecimiento preferentes inhiben el crecimiento de las células de tumor mamario SK-BR-3 en cultivo celular en más del 20%, y preferentemente en más del 50% (por ejemplo entre aproximadamente 50% y aproximadamente 100%) a una concentración de anticuerpo de aproximadamente 0,5 a 30 \mug/ml, en el que la inhibición del crecimiento se determina seis días después de la exposición de las células SK-BR-3 al anticuerpo (ver la patente US nº 5.677.171, publicada el 14 de octubre de 1997). El ensayo de inhibición del crecimiento de las células SK-BR-3 se describe en más detalle en dicha patente y posteriormente en la presente invención.

Un anticuerpo que "induce la muerte celular" es un anticuerpo que causa que una célula viable se convierta en no viable. La célula generalmente es una célula que expresa el receptor ErbB2, especialmente en la que la célula sobreexpresa el receptor ErbB2. Preferentemente, la célula es una célula cancerosa, por ejemplo una célula de mama, ovario, estómago, endometrio, glándula salival, pulmón, riñón, colon, tiroides, páncreas o vejiga. In vitro, la célula puede ser una célula SK-BR-3, BT474, Calu 3, MDA-MB-453, MDA-MB-361 o SKOV3. La muerte celular in vitro puede determinarse en la ausencia de complemento y de células efectoras inmunológicas para distinguir la muerte celular inducida por citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) de la citotoxicidad dependiente de complemento (CDC). De esta manera, el ensayo de muerte celular puede llevarse a cabo utilizando suero inactivado por calor (es decir, en ausencia de complemento) y en ausencia de células efectoras inmunológicas. Para determinar si el anticuerpo es capaz de inducir muerte celular, puede evaluarse la pérdida de integridad de la membrana mediante la incorporación de yoduro de propidio (PI), azul de tripán (ver Moore et al., Cytotechnology 17:1-11, 1995) o 7AAD en comparación con las células no tratadas. Laos anticuerpos inductores de muerte celular preferentes son aquellos que inducen la incorporación de PI en el ensayo de incorporación de PI en células BT474 (ver posteriormente).

Un anticuerpo que "induce la apoptosis" es un anticuerpo que induce la muerte celular programada según se determina a partir de la unión de la anexina V, de la fragmentación del ADN, del encogimiento celular, de la dilatación del retículo endoplasmático, de la fragmentación celular y/o de la formación de vesículas membranales (denominadas cuerpos apoptóticos). La célula habitualmente es una célula que sobreexpresa el receptor ErbB2. Preferentemente, la célula es una célula tumoral, por ejemplo una célula de mama, ovario, estómago, endometrio, glándula salival, pulmón, riñón, colon, tiroides, páncreas o vejiga. In vitro, la célula puede ser una célula SK-BR-3, BT474, Calu 3, MDA-MB-453, MDA-MB-361 o SKOV3. Se encuentran disponibles diversos procedimientos para evaluar los sucesos celulares asociados con la apoptosis. Por ejemplo, la translocación de la fosfatidil-serina (PS) puede medirse mediante la unión de la anexina; la fragmentación del ADN puede evaluarse mediante análisis de "laddering" y condensación nuclear/de la cromatina junto con la fragmentación del ADN puede evaluarse mediante cualquier incremento en las células hipodiploides. Preferentemente, el anticuerpo que induce la apoptosis es uno que resulta en una inducción de aproximadamente 2 a 50 veces, preferentemente de aproximadamente 5 a 50 veces, y más preferentemente de aproximadamente 10 a 50 veces, de la unión de anexina respecto a la célula no tratada en un ensayo de unión de anexina utilizando células BT474 (ver posteriormente). Ocasionalmente el anticuerpo proapoptótico es uno que bloquea adicionalmente la activación del ligando de ErbB de un receptor ErbB (por ejemplo el anticuerpo 7F3), es decir, el anticuerpo comparte una característica biológica con el anticuerpo monoclonal 2C4. En otras situaciones, el anticuerpo es uno que no bloquea significativamente la activación del ligando de ErbB de un receptor ErbB (por ejemplo 7C2). Además, el anticuerpo puede ser uno similar a 7C2 que, aunque induce la apoptosis, no induce una gran reducción del porcentaje de células en fase S (por ejemplo, uno que únicamente induce una reducción de aproximadamente 0% a 10% en el porcentaje de estas células respecto al control).

El "epítopo 2C4" es la región en el dominio extracelular de ErbB2 a la que se une el anticuerpo 2C4. Con el fin de cribar los anticuerpos que se unen al epítopo 2C4, puede llevarse a cabo un ensayo rutinario de bloqueo cruzado, tal como el descrito en Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed. Harlow y David Lane, 1988. Alternativamente, puede llevarse a cabo el mapaje de epítopos para evaluar si el anticuerpo se une al epítopo 2C4 de ErbB2 (por ejemplo cualquier o cualesquier residuos en la región comprendida entre aproximadamente el residuo 22 y aproximadamente el residuo 584 de ErbB2, inclusive; ver las figs. 1ª-b).

El "epítopo 4D5" es la región en el dominio extracelular de ERbB2 a la que se une el anticuerpo 4D5 (ATCC nº CRL 10463). Este epítopo se encuentra próximo al dominio transmembranal de ErbB2. Para el cribado de anticuerpos que se unen al epítopo 4D5, puede llevarse a cabo un ensayo rutinario de bloqueo cruzado, tal como el descrito en Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed. Harlow y David Lane, 1988. Alternativamente, puede llevarse a cabo mapaje de epítopos para evaluar si el anticuerpo se une al epítopo 4D5 de ErbB2 (por ejemplo cualquier o cualesquier residuos en la región comprendida entre aproximadamente el residuo 529 y aproximadamente el residuo 625, inclusive; ver las figs. 1A-B).

El "epítopo 3H4" es la región en el dominio extracelular de ErbB2 a la que se une el anticuerpo 3H4. Este epítopo incluye los residuos comprendidos entre aproximadamente 541 y aproximadamente 599, inclusive, en la secuencia de aminoácidos del dominio extracelular de ErbB2; ver las figs. 1ª-B.

El "epítopo 7C2-7F3" es la región en el extremo N-terminal del dominio extracelular de ErbB2 a la que se unen los anticuerpos 7C2 y/o 7F3 (cada uno de los cuales se encuentra en depósito en la ATCC, ver posteriormente). Para cribar los anticuerpos que se unen al epítopo 7C2/7F3, puede llevarse a cabo un ensayo rutinario de bloqueo cruzado, tal como el descrito en Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed. Harlow y David Lane, 1988. Alternativamente, puede llevarse a cabo el mapaje de epítopos para establecer si el anticuerpo se une al epítopo 7C2/7F3 en ErbB2 (por ejemplo, cualquier o cualesquier residuos en la región comprendida entre aproximadamente el residuo 22 y aproximadamente el residuo 53 de ErbB2; ver las figs. 1A-B).

El término "tratamiento" se refiere tanto al tratamiento terapéutico como a medidas profilácticas y preventivas. Entre aquellos que requieren tratamiento se incluyen aquellos que ya presentan el trastorno, y también aquellos en los que debe prevenirse el trastorno. Por lo tanto, el mamífero que debe tratarse en la presente invención se puede haber diagnosticado que presenta el trastorno o puede presentar una predisposición o susceptibilidad al trastorno.

El término "mamífero" con fines de tratamiento se refiere a cualquier animal clasificado como mamífero, incluyendo seres humanos, animales domésticos y de granja, animales de zoológico, de competición o mascotas, tales como perros, caballos, gatos, vacas, etc. Preferentemente, el mamífero es un ser humano.

La expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad de un fármaco eficaz para tratar una enfermedad o trastorno en un mamífero. En el caso del cáncer, la cantidad terapéuticamente eficaz del fármaco puede reducir el número de células cancerosas; reducir el tamaño tumoral; inhibir (es decir, enlentecer en algún grado y preferentemente detener) la infiltración de células cancerosas en órganos periféricos; inhibir (es decir, enlentecer en algún grado y preferentemente detener) la metástasis tumoral; inhibir, en algún grado, el crecimiento tumoral; y/o aliviar en algún grado uno o más de los síntomas asociados con el cáncer. En la medida en que el fármaco puede evitar el crecimiento y/o eliminar las células cancerosas existentes, puede ser citostático y/o citotóxico. Para la terapia del cáncer, puede medirse la eficacia, por ejemplo, mediante la evaluación del tiempo hasta la progresión de la enfermedad (TTP) y/o mediante la determinación de la tasa de respuesta (RR).

Los términos "cáncer" y "cancerosa" se refieren o describen la condición fisiológica en mamíferos que se caracteriza típicamente por el crecimiento celular no regulado. Entre los ejemplos de cáncer se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma, y leucemia o malignidades linfoides. Entre los ejemplos más particulares de estos cánceres se incluyen el cáncer de células escamosas (por ejemplo el cáncer de células escamosas epiteliales), el cáncer de pulmón, incluyendo el cáncer de pulmón de células pequeñas, el cáncer de pulmón de células no pequeñas, adenocarcinoma del pulmón y carcinoma escamoso del pulmón, cáncer del peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer gástrico o de estómago, incluyendo cáncer gastrointestinal, cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer cervical, cáncer ovárico, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer rectal, cáncer colorrectal, carcinoma de endometrio o de útero, carcinoma de glándula salivar, cáncer de riñón o renal, cáncer de próstata, cáncer vulval, cáncer de tiroides, carcinoma hepático, carcinoma anal, carcinoma peneano, así como cáncer de cabeza y cuello.

Un "cáncer que expresa ErbB" es un cáncer que comprende células que presenta proteína ErbB presente en su superficie celular. Un "cáncer que expresa ErbB" es un cáncer que produce niveles suficientes de ErbB2 en la superficie de las células del mismo, de manera que un anticuerpo anti-erbB2 puede unirse a las mismas y presentar un efecto terapéutico con respecto al cáncer.

Un cáncer "caracterizado por una activación excesiva" de un receptor ErbB es un cáncer en el que el grado de activación del receptor ErbB en las células de cáncer excede significativamente el nivel de activación de ese receptor en células no cancerosas del mismo tipo de tejido. Esta activación excesiva puede resultar de la sobreexpresión del receptor ErbB y/o niveles superiores a los normales de un ligando de ErbB disponible para activar el receptor ErbB en las células de cáncer. Esta activación excesiva puede causar y/o se causada por el estado maligno de una célula de cáncer. En algunas realizaciones, el cáncer se somete a un ensayo diagnóstico o prognóstico para determinar si se produce una amplificación y/o sobreexpresión de un receptor ErbB que resulta en dicha activación excesiva del receptor ErbB. Alternativamente, o adicionalmente, el cáncer puede someterse a un ensayo diagnóstico o prognóstico para determinar si se produce una amplificación y/o sobreexpresión de un ligando de ErbB en el cáncer atribuible a la activación excesiva del receptor. En un subconjunto de estos cánceres, la activación excesiva del receptor puede resultar de una ruta estimulatoria autocrina.

En una ruta estimulatoria "autocrina", se produce la autoestimulación en virtud de que la célula de cáncer produce tanto un ligando de ErbB como su receptor ErbB cognado. Por ejemplo, el cáncer puede expresar o sobreexpresar EGFR y también expresar o sobreexpresar un ligando de EGFR (por ejemplo EGF, TGF-\alpha o HB-EGF). En otra realización, el cáncer puede expresar o sobreexpresar ErbB2 y también expresar o sobreexpresar una heregulina (por ejemplo HRG-\gamma).

Un cáncer que "sobreexpresa" un receptor ErbB es un cáncer que presenta niveles significativamente más elevados de un receptor ErbB, tal como ErbB2, en la superficie celular del mismo, en comparación con una célula no cancerosa del mismo tipo de tejido. Esta sobreexpresión puede estar causada por amplificación génica o por una transcripción o traducción incrementada. La sobreexpresión del receptor ErbB puede determinarse en un ensayo diagnóstico o prognóstico mediante la evaluación de niveles incrementados de la proteína ErbB presentes en la superficie de una célula (por ejemplo mediante un ensayo inmunohistoquímico; IHC). Alternativamente, o adicionalmente, pueden medirse los niveles de ácidos nucleicos codificante de ErbB en la célula, por ejemplo mediante hibridación fluorescente in situ (FISH; ver la patente WO nº 98/45479, publicada en octubre de 1998), transferencia southern o técnicas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR), tal como PCR cuantitativa en tiempo real (PCR-RT). También puede estudiarse la sobreexpresión del receptor ErbB mediante la medición del antígeno desprendido (por ejemplo el dominio extracelular de ErbB) en un líquido biológico, tal como suero (ver, por ejemplo, la patente US nº 4.933.294, publicada el 12 de junio de 1990; patente WO nº 91/05264, publicada el 18 de abril de 1991; patente US nº 5.401.638, publicada el 28 de marzo de 1995; y Sias et al., J. Immunol. Methods 132:73-80, 1990). Aparte de los ensayos anteriormente indicados, se encuentran disponibles diversos ensayos in vivo para el médico experto. Por ejemplo, pueden exponerse las células en el cuerpo del paciente a un anticuerpo que opcionalmente se marca con un marcaje detectable, por ejemplo un isótopo radioactivo, y puede evaluarse la unión del anticuerpo a células en el paciente, por ejemplo mediante escaneo externo para radioactividad o mediante análisis de una biopsia extraída de un paciente previamente expuesto al anticuerpo.

A la inversa, un cáncer que "no se caracteriza por la sobreexpresión de receptor ErbB2" es un cáncer que, en un ensayo diagnóstico, no expresa niveles superiores a los normales del receptor ErbB2 en comparación con una célula no cancerosa del mimo tipo de tejido.

Un cáncer que "sobreexpresa" un ligando de ErbB es un cáncer que produce niveles significativamente superiores de ese ligando en comparación con una célula no cancerosa del mismo tipo de tejido. Esta sobreexpresión puede estar causada por la amplificación génica o por una transcripción o traducción incrementada. La sobreexpresión del ligando de ErbB puede determinarse diagnósticamente mediante la evaluación de los niveles del ligando (o ácido nucleico codificante del mismo) en el paciente, por ejemplo en una biopsia tumoral o mediante diversos ensayos diagnósticos, tales como los ensayos IHC, FISH, transferencia southern, PCR o ensayos in vivo indicados anteriormente.

Un cáncer "hormono-independiente" es un cáncer en el que la proliferación del mismo no depende de la presencia de una hormona que se una a un receptor expresado por las células cancerosas. Estos cánceres no experimentan regresión clínica tras la administración de estrategias farmacológicas o quirúrgicas que reducen la concentración de hormona en el tumor o en la proximidad del mismo. Entre los ejemplos de cánceres hormono-independientes se incluyen el cáncer de próstata andrógeno-independiente, el cáncer de mama estrógeno-independiente, el cáncer de endometrio y el cáncer de ovario. Estos cánceres pueden iniciarse como tumores hormono-dependientes y progresar desde un estadio hormono-sensible hasta un tumor hormono-refractario tras la terapia antihormonal.

La expresión "agente citotóxico" tal como se utiliza en la presente invención se refiere a una sustancia que inhibe o previene el funcionamiento de las células y/o causa la destrucción de las células. La expresión pretende incluir isótopos radioactivos (por ejemplo At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 e isótopos radioactivos de Lu), agentes quimioterapéuticos y toxinas, tales como toxinas de molécula pequeña o toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, incluyendo fragmentos y/o variantes de los mismos.

Un "agente quimioterapéutico" es un compuesto químico útil en el tratamiento del cáncer. Entre los ejemplos de agentes quimioterapéuticos se incluyen agentes alquilantes, tales como tiotepa y ciclofosfamida (CYTOXAN^{TM}); alquilsulfonatos, tales como busulfán, improsulfán y piposulfán; aziridinas, tales como benzodopa, carboquona, meturedopa y uredopa; etileniminas y metilamelaminas, incluyendo altretamina, tretilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida y trimetilolmelamina; mostazas nitrogenadas, tales como clorambucilo, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, óxido de hidrocloruro de mecloretamina, melfalán, novembichin, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza uracilo; nitrosoureas, tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina; antibióticos, tales como aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, caliqueanucina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorubicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorubicina, epirubicina, esorubicina, idarubicina, marcelomicina, mitomicinas, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peptomicina, potfiromicina, puromicina, qulamicina, rodorubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; antimetabolitos, tales como metotrexato y 5-fluorouracilo (5-FU); análogos de ácido fólico, tales como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina, tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tiogunina; análogos de pirimidina, tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, dideoxiurina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina, 5-FU; andrógenos, tales como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; antiadrenales, tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; reabastecedor de ácido fólico, tal como ácido frolínico; aceglatona; glucósido de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquon; elfornitina; acetato de eliptinio; etoglúcido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentina; lonidamina; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamol; nitracrina; pentostatina; fenamet; pirarubicina; ácido podofilínico; 2-etilhidrazida; procarbazina; PSK®; razoxano; sizofiran; espirogeranio; ácido tenuazónico; triaziquona; 2,2’,2’’-triclorotrietilamina; uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobroman; gacitosina; arabinósido ("Ara-C"); ciclofosfamida; tiotepa; taxanos, por ejemplo paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ) y docetaxel (TAXOTERE®, Rhône-Poulenc Rorer, Antony, Francia); clorambucilo; gemcitabina; 6-tioguanina; mercaptopurin; metotrexato; análogos del platino, tales como cisplatino y carboplatino; vinblastina; platino; etopósido (VP-16); ifosfamida; mitomicina C; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina; navelbina; leucovorina (LV), novantrona; tenipósido; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; CPT-11; inhibidor de topoisomerasa RFS 2000; difluormetillornitina (DMFO); ácido retinoico; esperamicinas; capecitabina; y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriormente indicados. También se incluye en la presente definición se encuentran los agentes antihormonales que actúan regulando o inhibiendo la acción hormonal sobre los tumores, tales como los antiestrógenos, incluyendo, por ejemplo, tamoxifeno, raloxifeno, 4(5)-imidazol inhibidores de aromatasa, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, queoxifeno, LY117018, onapristona y toremifeno (Fareston) y antiandrógenos, tales como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprólido y goserelina, y sales, ácidos y derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriormente indicados.

El término "citoquina" es un término genérico para las proteínas liberadas por una población celular que actúa sobre otra célula como mediadores intercelulares. Son ejemplos de estas citoquinas las linfoquinas, monoquinas y hormonas polipéptido tradicionales. Se incluyen entre las citoquinas, hormonas de crecimiento, tales como la hormona de crecimiento humana, N-metionil hormona de crecimiento humana y hormona de crecimiento bovina; hormona paratiroidea; tiroxina; insulina; proinsulina; relaxina; prorelaxina; hormonas glucoproteicas, tales como la hormona folículo-estimulante (FSH), hormona estimulante del tiroides (TSH) y hormona luteinizante (LH); factor de crecimiento hepático; factor de crecimiento fibroblástico; prolactina; lactógeno placentario; factor \alpha y \beta de necrosis tumoral; sustancia inhibidora mulleriana; péptido asociado a gonadotropina de ratón; inhibina; activina; factor de crecimiento vascular endotelial; integrina; trombopoyetina (TPO); factores de crecimiento nervioso, tales como NGF-\beta; factor de crecimiento de plaquetas; factores de crecimiento transformantes (TGFs), tales como TGF-\alpha, \beta y \gamma, factores estimulantes de colonias (CSFs); interleuquinas (ILs), tales como IL-1, IL-1\alpha, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12; un factor de necrosis tumoral, tal como TNF-\alpha o TNF-\beta; y otros factores polipéptido, incluyendo LIF y ligando de kit (KL). Tal como se utiliza en la presente invención, el término citoquina incluye proteínas de fuentes na-
turales o de cultivo celular recombinante y equivalentes biológicamente activas de las citoquinas de secuencia nativa.

Tal como se utiliza en la presente invención, la expresión "fármaco de diana EGFR" se refiere a un agente terapéutico que se une al receptor EGFR y, opcionalmente, inhibe la activación del receptor EGFR. Entre los ejemplos de estos agentes se incluyen anticuerpos y moléculas pequeñas que se unen a EGFR. Entre los ejemplos de anticuerpos que se unen a EGFR se incluyen MAb 579 (ATCC nº CRL HB 8506), MAb 455 (ATCC nº CRL HB8507), MAb 225 (ATCC nº CRL 8508), MAb 528 (ATCC nº CRL 8509) (ver la patente US nº 4.943.533, Mendelsohn et al.) y variantes de los mismos, tales como 225 quimerizado (C225) y 225 humano reconfigurado (H225) (ver la patente WO nº 96/40210, Imclone Systems Inc.); Anticuerpos que se unen a EGFR mutante de tipo II (patente US nº 5.212.290); anticuerpos humanizados y quiméricos que se unen a EGFR tal como se describe en la patente US nº 5.891.996; y anticuerpos humanos que se unen a EGFR (ver la patente WO nº 98/50433, Abgenix). El anticuerpo anti-EGFR puede conjugarse con un agente citotóxico, generando de esta manera un inmunoconjugado (ver, por ejemplo, la patente EP nº 659.439A2, Merck Patent GmbH). Entre los ejemplos de moléculas pequeñas que se unen a EGFR se incluyen ZD1839 (Astra Zeneca), CP-358774 (OSI/Pzifer) y AG1478.

Un "agente antiangiogénico" se refiere a un compuesto que bloquea o interfiere en algún grado en el desarrollo de los vasos sanguíneos. El factor antiangiogénico puede, por ejemplo, ser una molécula pequeña o anticuerpo que se une a un factor de crecimiento o receptor de factor de crecimiento implicado en la estimulación de la angiogénesis. El factor antiangiogénico preferente en la presente invención es un anticuerpo que se une a factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF).

El término "profármaco" tal como se utiliza en la presente solicitud se refiere a una forma precursora o derivada de una sustancia farmacéuticamente activa que es menos citotóxica para las células tumorales en comparación con el fármaco parental y es capaz de resultar activada o convertida enzimáticamente en la forma parental más activa. Ver, por ejemplo, Wilman, "Prodrugs in Cancer Chemotherapy", Biochemical Society Transactions 14, páginas 375-382, 615th Meeting Belfast, 1986, y Stella et al., "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Druge Delivery", Directed Drug Delivery, Borchardt et al. (ed.), páginas 247-267, Humana Press, 1985. Entre los profármacos de la presente invención se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, profármacos que contienen fosfato, profármacos que contienen tiofosfato, profármacos que contienen sulfato, profármacos que contienen péptidos, profármacos modificados por D-aminoácido, profármacos glucosilados, profármacos que contienen \beta-lactamo, profármacos que contienen fenoxiacetamida opcionalmente sustituidos o profármacos que contienen fenilacetamida opcionalmente sustituidos, 5-fluorocitosina y otros profármacos 5-fluorouridina que pueden convertirse en el fármaco libre de citotóxico más activo. Entre los ejemplos de fármacos citotóxicos que pueden derivatizarse en una forma profármaco para la utilización en la presente invención se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, aquellos agentes quimioterapéuticos indicados anteriormente.

Un "liposoma" es una vesícula pequeña compuesta de diversos tipos de lípidos, fosfolípidos y/o surfactante que resultan útiles para la administración de un fármaco (tal como los anticuerpos anti-ErbB2 dados a conocer en la presente invención y, opcionalmente, un agente quimioterapéutico) a un mamífero. Los componentes del liposoma comúnmente se disponen en una formación de bicapa, de manera similar a la disposición de los lípidos en las membranas biológicas.

La expresión "material impreso dentro del paquete" se refiere a instrucciones incluidas habitualmente en los paquetes comerciales de productos terapéuticos, que contienen información sobre las indicaciones, uso, dosis, administración, contraindicaciones y/o advertencias referentes a la utilización de estos productos terapéuticos.

Un "cardioprotector" es un compuesto o composición que previene o re la disfunción miocárdica (es decir la cardiomiopatía y/o insuficiencia cardíaca congestiva) asociada a la administración de un fármaco, tal como un antibiótico antraciclina y/o un anticuerpo anti-ErbB2, a un paciente. El cardioprotector puede, por ejemplo, bloquear o reducir un efecto cardiotóxico mediado por radical libre y/o prevenir o reducir el daño por estrés oxidativo. Entre los ejemplos de cardioprotectores abarcados por la presente definición se incluyen el agente quelante de hierro dexrazoxano (ICRF-187) (Seifert et al., The Annals of Pharmacotherapy 28:1063-1072, 1994; un agente reductor de lípidos y/o un antioxidante, tal como el probucol (Singal et al., J. Mol. Cell Cardiol. 27:1055-1063, 1995), amifostina (éster de aminotiol 2-[(3-aminopropil)amino]etanotiol-dihidrogeno fosfato, también denominada WR-2721, y la forma de incorporación celular desfosforilada del mismo, denominada WR-1065) y ácido S-3-(3-metilaminopropilamino)propilfosforotioico (WR-151327), ver Green et al., Cancer Research 54:738-741, 1994; digoxina (Bristow, M.R. En: Bristow, M.R., editor, Drug-Induced Heart Disease, New York: Elsevier, 191-215, 1980), beta-bloqueantes, tales como metoprolol (Hjalmarson et al., Drugs 47:suppl. 4:31-9, 1994; y Shaddy et al., Am. Heart J. 129:197-9, 1995; vitamina E; ácido ascórbico (vitamina C); secuestradores de radicales libres, tales como el ácido oleanólico, ácido ursólico y N-acetilcisteína (NAC); compuestos estabilizantes de radicales, tales como la alfa-fenil-terc-butil nitrona (PBN), (Paracchini et al., Anticancer Res. 13:1607-1612, 1993); compuestos selenoorgánicos, tales como P251 (Elbesen), y similares.

II. Producción de anticuerpos anti-ErbB2

A continuación se proporciona una descripción sobre las técnicas ejemplares para la producción de los anticuerpos utilizados de acuerdo con la presente invención. El antígeno ErbB2 que debe utilizarse para la producción de anticuerpos puede ser, por ejemplo, una forma soluble del dominio extracelular de ErbB2 o una parte del mismo, que contiene el epítopo deseado. Alternativamente, pueden utilizarse células que expresan ErbB2 en su superficie celular (por ejemplo células NIH-3T3 transformadas para sobreexpresar ErbB2, o una línea celular de carcinoma, tal como las células SKBR3, ver Stancovski et al., PNAS (USA) 88:8691-8695, 1991), para generar anticuerpos. Otras formas de ErbB2 útiles para generar anticuerpos resultarán evidentes para los expertos en la materia.

(i) Anticuerpos policlonales

Preferentemente se cultivan anticuerpos policlonales en animales mediante múltiples inyecciones subcutáneas (sc) o intraperitoneales (ip) del antígeno relevante y un adyuvante. Puede resultar útil conjugar el antígeno relevante con una proteína que es inmunogénica en la especie que debe inmunizarse, por ejemplo la hemocianina de lapa californiana, albúmina sérica, tiroglobulina bovina o inhibidor de tripsina de soja utilizando un agente bifuncional o derivatizante, por ejemplo el éster de maleimidobenzoil sulfosuccinimida (conjugación a través de residuos de cisteína), N-hidroxisuccinimida (a través de residuos de lisina), glutaraldehído, anhídrido succínico, SOCl_{2} o R^{1}N=C=NR, en la que R y R^{1} son diferentes grupos alquilo.

Se inmunizan animales frente al antígeno, conjugados inmunogénicos o derivados combinando, por ejemplo, 100 \mug o 5 \mug de la proteína o conjugado (para conejos o ratones, respectivamente) con 3 volúmenes de adyuvante completo de Freund e inyectando la solución intradérmicamente en múltiples sitios. Un mes después, se proporciona un refuerzo a los animales con 1/5 a 1/10 de la cantidad original de péptido o conjugado en adyuvante completo de Freund mediante inyección subcutánea en múltiples sitios. Siete a catorce días después, se extrae sangre de los animales y el suero se somete a ensayo para el título de anticuerpo. Se proporciona refuerzo a los animales hasta que el título alcanza un nivel de saturación. Preferentemente, el animal recibe un refuerzo con el conjugado del mismo antígeno, aunque conjugado con una proteína diferente y/o mediante un reactivo de entrecruzamiento diferente. También pueden prepararse conjugados en cultivo celular recombinante en forma de fusiones de proteínas. Además, se utilizan convenientemente agentes agregantes, tales como alum, para potenciar la respuesta inmunológica.

(ii) Anticuerpos monoclonales

Se obtienen anticuerpos monoclonales a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea, es decir, los anticuerpos individuales que comprende la población son idénticos excepto por posibles mutaciones de origen natural que pueden encontrarse presentes en cantidades menores. De esta manera, el modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo: no es una mezcla de anticuerpos discretos.

Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales pueden prepararse utilizando el procedimiento de hibridoma, descrito por primera vez por Kohler et al., Nature 256:495, 1975, o pueden prepararse mediante procedimientos de ADN recombinante (patente US nº 4.816.567).

En el procedimiento de hibridoma, se inmuniza un ratón u otro animal huésped apropiado, tal como un hámster, tal como se ha descrito anteriormente en la presente memoria, para inducir que los linfocitos produzcan o sean capaces de producir anticuerpos que se unan específicamente a la proteína utilizada para la inmunización. Alternativamente, pueden inmunizarse linfocitos in vitro. A continuación, los linfocitos se fusionan con células de mieloma utilizando un agente de fusión adecuado, tal como polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, páginas 59-103, Academic Press, 1986).

Las células de hibridoma preparadas de esta manera se siembran y se cultivan en un medio de cultivo adecuado que contiene preferentemente una o más sustancias que inhiben el crecimiento o la supervivencia de las células de mieloma parental no fusionadas. Por ejemplo, si las células de mieloma parental carecen del enzima hipoxantina guanina fosforibosil transferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas típicamente incluirá hipoxantina, aminopterina y timidina (medio HAT), sustancias que previenen el crecimiento de las células deficientes de HGPRT.

Las células de mieloma preferentes son aquéllas que se fusionan eficientemente, soportan la producción estable de nivel elevado de anticuerpo por las células productoras de anticuerpos seleccionadas, y son sensibles a un medio, tal como el medio HAT. Entre éstas, las líneas celulares de mieloma preferentes son las líneas de mieloma murino, tales como aquéllas derivadas de los tumores de ratón MOPC-21 y MPC-11, disponibles del Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California, USA, y las células SP-2 o X63-Ag8-653, disponibles de la American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA. También se han descrito líneas celulares de mieloma humano y heteromieloma de ratón-humano, para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (Kozbor, J. Immunol. 133:3001, 1984; y Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, páginas 51 a 63, Marcel Dekker, Inc., New York, 1987).

El medio de cultivo en el que se cultivan las células de hibridoma se somete a ensayo para la producción de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno. Preferentemente, la especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales producidos por células de hibridoma se determina mediante inmunoprecipitación o mediante un ensayo de unión in vitro, tal como radioinmunoensayo (RIA) o ensayo de inmunosorción ligado a ensayo (ELISA).

La afinidad de unión del anticuerpo monoclonal puede determinarse, por ejemplo, mediante el análisis de Scatchard de Munson et al., Anal. Biochem. 107:220, 1980.

Tras identificar las células de hibridoma que producen anticuerpos de la especificidad, afinidad y/o actividad deseadas, los clones pueden subclonarse mediante procedimientos de dilución limitante y cultivarse mediante procedimientos estándar (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, páginas 59-103, Academic Press, 1986). Entre los medios de cultivo adecuados para este propósito se incluyen, por ejemplo, medio D-MEM o RPMI-1640. Además, las células de hibridoma pueden cultivarse in vivo como tumores ascites en un animal.

Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones se preparan convenientemente a partir del medio de cultivo, líquido ascites o suero mediante procedimientos convencionales de purificación de anticuerpos tales como, por ejemplo, proteína A-sefarosa, cromatografía de hidroxilapatito, electroforesis en gel, diálisis o cromatografía por afinidad.

El ADN codificante de los anticuerpos monoclonales se aísla y se secuencia con facilidad utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo mediante la utilización de sondas de oligonucleótidos que son capaces de unirse específicamente a genes codificantes de las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos murinos). Las células de hibridoma sirven como una fuente preferente de este ADN. Tras su aislamiento, el ADN puede introducirse en vectores de expresión, que después se transfectan en células huésped, tales como células de E. coli, células COS de simio, células de ovario de hámster chino (CHO) o células de mieloma que de otra manera no producen proteína anticuerpo, con el fin de obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células huésped recombinantes. Entre los artículos de revisión sobre la expresión recombinante en bacterias de ADN codificante del anticuerpo se incluyen Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol. 5:256-262, 1993, y Plückthun, Immunol. Revs. 130:151-188, 1992.

En una realización adicional, pueden aislarse anticuerpos monoclonales o fragmentos de anticuerpos de bibliotecas fágicas de anticuerpos generadas utilizando las técnicas descritas en McCafferty et al., Nature 348:552-554, 1990. Clackson et al., Nature 352:624-628, 1991, y Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597, 1991, describen el aislamiento de anticuerpos murinos y humanos, respectivamente, utilizando bibliotecas fágicas. Las publicaciones posteriores describen la producción de anticuerpos humanos de afinidad elevada (intervalo de nM) mediante intercambio de cadenas (Marks et al., Bio/Technology 10:779-783 1992), así como mediante infección combinatorial y recombinación in vivo como estrategia para construir bibliotecas fágicas muy grandes (Waterhouse et al., Nucl. Acids Res. 21:2265-2266, 1993). De esta manera, estas técnicas son alternativas viables frente a las técnicas tradicionales de hibridoma de anticuerpos monoclonales para el aislamiento de anticuerpos monoclonales.

El ADN también puede modificarse, por ejemplo mediante sustitución de la secuencia codificante de los dominios constantes de cadena pesada y de cadena ligera humanas en lugar de las secuencias murinas homólogas (patente US nº 4.816.567, y Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851, 1984) o uniendo covalentemente a la secuencia codificante de la inmunoglobulina la totalidad o parte de la secuencia codificante de un polipéptido no inmunoglobulina.

Típicamente estos polipéptidos no inmunoglobulina se sustituyen por los dominios constantes de un anticuerpo, o se sustituyen por los dominios variables de un sitio de combinación con antígeno de un anticuerpo par crear un anticuerpo bivalente quimérico que comprende un sitio de combinación de antígeno con especificidad paran antígeno y otro sitio de combinación de antígeno con especificidad para un antígeno diferente.

(iii) Anticuerpos humanizados

Los procedimientos para humanizar anticuerpos no humanos han sido descritos en la técnica. Preferentemente, en un anticuerpo humanizado se han introducido uno o más residuos aminoácidos procedentes de una fuente que es no humana. Estos residuos aminoácidos no humanos con frecuencia se denominan residuos "importados", que típicamente se obtiene de un dominio variable "importado". La humanización esencialmente puede llevarse a cabo siguiendo el procedimiento de Winter y colaboradores (Jones et al., Nature 321:522-525, 1986; Riechmann et al., Nature 332:323-327, 1988; Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536, 1988) mediante la sustitución de las secuencias de región hipervariable por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. Por consiguiente, estos anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (patente US nº 4.816.567) en los que se ha sustituido sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son anticuerpos típicamente humanos en los que se sustituyen algunos residuos de región hipervariable y posiblemente algunos residuos de FR por residuos de sitios análogos en anticuerpos de roedor.

La selección de dominios variables humanos, tanto ligeros como pesados, destinados a ser utilizados en la preparación de los anticuerpos humanizados es muy importante para reducir la antigenicidad. Según el denominado procedimiento de "ajuste óptimo", se criba la secuencia del dominio variable del anticuerpo de roedor frente a la biblioteca completa de secuencias de dominio variable humanas conocidas. La secuencia humana más similar a la del roedor seguidamente se acepta como la región marco humana (FR) para el anticuerpo humanizado (Sims et al., J. Immunol. 151:2296, 1993; Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901, 1987). Otro procedimiento utiliza una región marco particular derivada de la secuencia de consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo particular de cadenas ligera o pesada. Puede utilizarse el mismo marco para varios anticuerpos humanizados diferentes (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285, 1992; Presta et al., J. Immunol. 151:2623, 1993).

También es importante que los anticuerpos se humanicen conservando la afinidad elevada para el antígeno y otras propiedades biológicas favorables. Para conseguir este objetivo, según un procedimiento preferente, se preparan anticuerpos humanizados mediante un procedimiento de análisis de las secuencias parentales y diversos productos humanizados conceptuales utilizando modelos tridimensionales de las secuencias parentales y humanizadas. Los modelos tridimensionales de inmunoglobulina se encuentran disponibles comúnmente y resultarán familiares para los expertos en la materia. Se encuentran disponibles programas informáticos que ilustran y muestran estructuras conformacionales tridimensionales probables de secuencias de inmunoglobulina candidatas. La inspección de estas visualizaciones permite analizar el papel probable de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir, el análisis de residuos que influyen sobre la capacidad de la inmunoglobulina candidata de unirse a su antígeno. De esta manera, los residuos FR pueden seleccionarse y combinarse de las secuencias receptora e importada de manera que la característica de anticuerpo deseada, tal como la afinidad incrementada para el antígeno o antígenos diana, se consiga. En general, los residuos de región hipervariable se encuentran implicados directamente y más sustancialmente en la influencia sobre la unión de antígeno.

El Ejemplo 3 posteriormente describe la producción de anticuerpos anti-ErbB2 humanizados ejemplares que se unen a ErbB2 y bloquean la activación de ligando de un receptor ErbB. El anticuerpo humanizado de interés particular en la presente invención bloquea la activación por EGF, TGF-\alpha y/o HRG de MAPK esencialmente con igual eficacia que el anticuerpo monoclonal murino 2C4 (o un fragmento Fab del mismo). El anticuerpo humanizado de la presente invención puede comprender, por ejemplo, residuos de región hipervariable no humana incorporados en un dominio pesado variable humano y puede comprender además una sustitución de región marco (FR) en una posición seleccionada de entre el grupo que consiste de 69H, 71H y 73H, que utiliza el sistema de numeración de dominio variable proporcionado en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a edición, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991. En una realización, el anticuerpo humanizado comprende sustituciones de FR en dos o todas de entre las posiciones 69H, 71H y 73H.

Un anticuerpo humanizado ejemplar de interés en la presente invención comprende residuos determinantes de complementariedad de dominio pesado variable GFTFRDYTMX, en la que X preferentemente es D o S (SEC ID nº 7), DVNPNSGGSIYNQRFKG (SEC ID nº 8) y/o NLGPSFYFDY (SEC ID nº 9), comprendiendo opcionalmente modificaciones de aminoácidos de aquellos residuos de CDR, por ejemplo en la que las modificaciones esencialmente mantienen o mejoran la afinidad del anticuerpo. Por ejemplo, la variante de anticuerpo de interés puede presentar entre aproximadamente una y aproximadamente siete o aproximadamente cinco sustituciones de aminoácidos en las secuencias CDR pesadas variables. Estas variantes de anticuerpo pueden prepararse mediante maduración de afinidad, por ejemplo tal como se describe posteriormente. El anticuerpo humanizado más preferente comprende la secuencia de aminoácidos de dominio pesado variable en la SEC ID nº 4.

El anticuerpo humanizado puede comprender residuos determinantes de complementariedad de dominio ligero variable KASQDVSIGVA (SEC ID nº 10), SASYX1X2X3, en la que X^{1} es preferentemente R o L; X^{2} es preferentemente Y o E; y X^{3} es preferentemente T o S (SEC ID nº 11), y QQYYIYPYT (SEC ID nº 12), por ejemplo además de aquellos residuos CDR de dominio pesado variable en el párrafo anterior. Estos anticuerpos humanizados opcionalmente comprenden modificaciones de aminoácidos de los residuos CDR anteriormente indicados, por ejemplo en las que las modificaciones esencialmente mantienen o mejoran la afinidad del anticuerpo. Por ejemplo, la variante de anticuerpo de interés puede presentar entre aproximadamente una y aproximadamente siete o aproximadamente cinco sustituciones de aminoácidos en las secuencias CDR ligeras variables anteriormente indicadas. Estas variantes de anticuerpo pueden prepararse mediante maduración por afinidad, por ejemplo tal como se describe posteriormente. El anticuerpo humanizado más preferente comprende la secuencia de aminoácidos de dominio ligero variable en la SEC ID nº 3.

La presente solicitud también contempla anticuerpos madurados por afinidad, que se unen a ErbB2 y bloquean la activación de ligando de un receptor ErbB. El anticuerpo parental puede ser un anticuerpo humano o un anticuerpo humanizado, por ejemplo un anticuerpo que comprenda las secuencias variables ligera y/o pesada de SEC ID nº 3 y 4, respectivamente (es decir la variante 574). El anticuerpo madurado por afinidad preferentemente se une al receptor ErbB2 con una afinidad superior a la de 2C4 murina o la variante 574 (por ejemplo una afinidad mejorada entre aproximadamente dos o aproximadamente cuatro veces, y aproximadamente 100 veces o aproximadamente 1.000 veces, por ejemplo tal como se evalúa mediante una ELISA de ErbB2-dominio extracelular (ECD)). Entre los residuos CDR pesados variables para la sustitución se incluyen H28, H30, H34, H35, H64, H96, H99 o combinaciones de dos o más (por ejemplo dos, tres, cuatro, cinco, seis o siete de estos residuos). Entre los ejemplos de residuos CDR ligeros variables se incluyen L28, L50, L53, L56, L91, L92, L93, L94, L96, L97 o combinaciones de dos o más (por ejemplo dos a tres, cuatro, cinco o hasta aproximadamente diez de estos residuos).

Se contemplan diversas formas del anticuerpo humanizado o madurado por afinidad. Por ejemplo, el anticuerpo humanizado o madurado por afinidad puede ser un fragmento de anticuerpo, tal como Fab, que opcionalmente se conjuga con uno o más agentes citotóxicos con el fin de generar un inmunoconjugado. Alternativamente, el anticuerpo humanizado o madurado por afinidad puede ser un anticuerpo intacto, tal como un anticuerpo IgG1 intacto.

(iv) Anticuerpos humanos

Como alternativa a la humanización, pueden generase anticuerpos humanos. Por ejemplo, ahora resulta posible producir animales transgénicos (por ejemplo ratones) que son capaces, tras la inmunización, de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de producción endógena de inmunoglobulinas. Por ejemplo, se ha descrito que la deleción homocigótica del gen de la región de unión (J_{H}) de la cadena pesada de anticuerpo en ratones quiméricos y mutantes de línea germinal resulta en la inhibición completa de la producción endógena de anticuerpo. La transferencia de la serie génica de inmunoglobulina de línea germinal humana en estos ratones mutantes de línea germinal resulta en la producción de anticuerpos humanos tras el reto con antígeno. Ver, por ejemplo, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2551, 1993; Jakobovits et al., Nature 362:255-258, 1993; Bruggermann et al., Year in Immuno. 7:33, 1993 y las patentes US nº 5.591.669, nº 5.589.369 y nº 5.545.807.

Alternativamente, la tecnología de expresión fágica McCafferty et al., Nature 348:552-553, 1990) puede utilizarse para producir anticuerpos humanos y fragmentos de anticuerpo in vitro, a partir de los repertorios génicos de dominio variable (V) de inmunoglobulina de donantes no inmunizados. De acuerdo con esta técnica, se clonan los genes del dominio del anticuerpo V en el mismo marco de lectura en un gen de proteína de envoltura mayor o menos de un bacteriófago filamentoso, tal como M13 o fd, y se expresa como fragmentos de anticuerpo funcional sobre la superficie de la partícula fágica. Debido a que la partícula filamentosa contiene una copia de ADN de una cadena del genoma fágico, las selecciones basadas en las propiedades funcionales del anticuerpo también resultan en la selección del gen que codifica el anticuerpo que muestra estas propiedades. De esta manera, el fago imita algunas de las propiedades de la célula B. La expresión fágica puede llevarse a cabo en una diversidad de formatos; para su revisión, ver, por ejemplo, Johnson, Kevin S. y Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571, 1993. Pueden utilizarse varias fuentes de segmentos de gen V para la expresión fágica. Clackson et al., Nature 352:624-628, 1991, aislaron una serie diversas de anticuerpos anti-oxazolona de una biblioteca combinatorial aleatoria pequeña de genes V derivada de los bazos de ratones inmunizados. Puede construirse un repertorio de genes V de los donantes humanos no inmunizados y pueden aislarse anticuerpos contra una serie diversa de antígenos (incluyendo autoantígenos) siguiendo esencialmente las técnicas descritas por Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597, 1991, o Griffith et al., EMBO J. 12:725-734, 1993. Ver también las patentes US nº 5.565.332 y nº 5.573.905.

Tal como se ha comentado anteriormente, las células B activadas in vitro también pueden generar anticuerpos humanos (ver las patentes US nº 5.567.610 y nº 5.229.275).

Se describen anticuerpos anti-ErbB2 humanos en la patente US nº 5.772.997 publicada el 30 de junio de 1998 y la patente WO nº 97/00271 publicada el 3 de enero de 1997.

(v) Fragmentos de anticuerpo

Se han desarrollado diversas técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpo. Tradicionalmente, estos fragmentos se derivaban mediante digestión proteolítca de anticuerpos intactos (ver, por ejemplo, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117, 1992, y Brennan et al., Science 229:81, 1985). Sin embargo, estos fragmentos ahora pueden producirse directamente en células huésped recombinantes. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpo pueden aislarse de las bibliotecas fágicas de anticuerpo comentadas anteriormente. Alternativamente, pueden recuperarse directamente fragmentos Fab’-SH de E. coli y acoplarse químicamente para formar fragmentos F(ab’)_{2} (Carter et al., Bio/Technology 10:163-167, 1992). Según otro enfoque, los fragmentos F(ab’)_{2} pueden aislarse directamente de un cultivo de células huésped recombinantes. Otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpo resultarán evidentes para el médico experto. En otras realizaciones, el anticuerpo de elección es un fragmento Fv de cadena única (scFv). Ver la patente WO nº 93/16185, las patentes US nº 5.571.894 y nº 5.587.458. El fragmento de anticuerpo también puede ser un "anticuerpo lineal", por ejemplo tal como se describe en la patente US nº 5.641.870, por ejemplo. Estos fragmentos lineales de fragmento pueden ser monoespecíficos o biespecíficos.

(vi) Anticuerpos biespecíficos

Los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos que presentan especificidades de unión para por lo menos dos epítopos diferentes. Los anticuerpos biespecíficos ejemplares pueden unirse a dos epítopos diferentes de la proteína ErbB2. Otros de estos anticuerpos pueden combinarse en un sitio de unión de ErbB2 con el sitio o sitios de unión de EGFR, ErbB3 y/o ErbB4. Alternativamente, puede combinarse un brazo anti-ErbB2 con un brazo que se une a una molécula desencadenante en un leucocito, tal como una molécula de receptor de célula T (por ejemplo CD2 o CD3), o receptores Fc de IgG (Fc\gammaR), tal como Fc\gammaRI (CD64), Fc\gammaRII (CD32) y Fc\gammaRIII (CD16), de manera que se centran los mecanismos de defensa celular en la célula que expresa ErbB2. También pueden utilizarse los anticuerpos biespecíficos para localizar agentes citotóxicos en células que expresan ErbB2. Estos anticuerpos poseen un brazo de unión a ErbB2 y un brazo que une el agente citotóxico (por ejemplo saporina, anti-interferón \alpha, alcaloide vinca, cadena A de ricina, metotrexato o isótopo radioactivo hapteno). Pueden prepararse anticuerpos biespecíficos como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpo (por ejemplo anticuerpos biespecíficos F(ab’)_{2}).

La patente WO nº 96/16673 describe un anticuerpo biespecífico anti-ERbB2/anti-FC\gammaRIII y la patente US nº 5.837.234 da a conoce un anticuerpo biespecífico anti-ErbB2/anti-FC\gammaRI. Se muestra un anticuerpo biespecífico anti-ErbB2/Fc\alpha en la patente WO nº 98/02463. La patente US nº 5.821.337 enseña un anticuerpo biespecífico anti-ErbB2/anti-CD3.

Los procedimientos para preparar anticuerpos biespecíficos son conocidos de la técnica. La producción tradicional de anticuerpos biespecíficos de longitud completa se basa en la coexpresión de dos pares de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina, en los que las dos cadenas presentan diferentes especificidades (Millstein et al., Nature 305:537-539, 1983). Debido a la selección aleatoria de cadenas pesada y cadena ligera, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de 10 moléculas de anticuerpo diferentes, de las que únicamente una presenta la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta, que habitualmente se realiza mediante etapas de cromatografía de afinidad, resulta bastante pesada, y los rendimientos de producto son reducidos. Se dan a conocer procedimientos similares en la patente WO nº 93/08829 y en Traunecker et al., EMBO J. 10:3655-3659, 1991.

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De acuerdo a un enfoque diferente, se fusionan dominios variable de anticuerpo con las especificidades de unión deseadas (sitios de combinación de anticuerpo-antígeno) a secuencias de dominio constante de inmunoglobulina. La fusión preferentemente es con un dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina, que comprende por lo menos parte de la bisagra, regiones CH2 y CH3. Resulta preferente que la primera región constante de cadena pesada (CH1) que contiene el sitio necesario para la unión de cadena ligera, presente en por lo menos una de las fusiones. Los ADNs codificantes de las fusiones de cadena pesada de inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados, y se cotransfectan en un organismo huésped adecuado. Esto permite una mayor flexibilidad en el ajuste de las proporciones mutuas de los tres fragmentos de polipéptido en realizaciones en las que las proporciones desiguales de las tres cadenas de polipéptido utilizadas en la construcción proporcionan los rendimientos óptimos. Sin embargo, resulta posible insertar las secuencias codificantes de dos o de la totalidad de las tres cadenas polipeptídicas en un vector de expresión cuando la expresión de por lo menos dos cadenas polipeptídicas en proporciones iguales resulta en rendimientos elevados o cuando las proporciones no resultan de particular significación.

En una realización preferente de este enfoque, los anticuerpos biespecíficos están compuestos de una cadena pesada de inmunoglobulina híbrida con una primera especificidad de unión en un brazo, y una pareja de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina híbrida (que proporciona una segunda especificidad de unión) en el otro brazo. Se descubrió que esta estructura asimétrica facilita la separación del compuesto biespecífico deseado de combinaciones de cadena de inmunoglobulina no deseadas, debido a que la presencia de una cadena ligera de inmunoglobulina en sólo la mitad de las moléculas biespecíficas proporciona un modo sencillo de separación. Este enfoque se da a conocer en la patente WO nº 94/04690. Para más detalles respecto a la generación de anticuerpos biespecíficos, ver, por ejemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology 121:210, 1986.

Según otro enfoque descrito en la patente US nº 5.731.168, la interfase entre un par de moléculas de anticuerpo puede manipularse para maximizar el porcentaje de heterodímeros que se recuperan de un cultivo celular recombinante. La interfase preferente comprende por lo menos una parte del dominio CH3 de un dominio constante de anticuerpo. En este procedimiento, se sustituyen una o más cadenas laterales pequeñas de aminoácidos de la interfase de la primera molécula de anticuerpo por cadenas laterales mayores (por ejemplo tirosina o triptófano). Se crean "cavidades" compensatorias de tamaño idéntico o similar a la cadena lateral grande (s) en la interfase de la segunda molécula de anticuerpo mediante la sustitución de las cadenas laterales grandes de aminoácidos por cadenas más pequeñas (por ejemplo alanina o treonina). Esto proporciona un mecanismo para incrementar el rendimiento del heterodímero respecto a otros productos finales no deseados, tales como homodímeros.

Entre los anticuerpos biespecíficos se incluyen los anticuerpos entrecruzados o "heteroconjugados". Por ejemplo, uno de los anticuerpos en el heteroconjugado puede acoplarse a la avidina, y el otro a biotina. Estos anticuerpos se han propuesto, por ejemplo, que dirigen células del sistema inmunológico a células no deseadas (patente US nº 4.676.980) y para el tratamiento de la infección por VIH (patentes WO nº 91/00360, nº 92/200373 y EP nº 03089). Pueden prepararse anticuerpos heteroconjugados utilizando cualquier procedimiento de entrecruzamiento conjugado. Son conocidos de la técnica agentes de entrecruzamiento adecuados, y se dan a conocer en la patente US nº 4.676.980 junto con varias técnicas de entrecruzamiento.

También se han descrito en la literatura técnicas para generar anticuerpos biespecíficos a partir de fragmentos de anticuerpos. Por ejemplo, pueden prepararse anticuerpos biespecíficos utilizando el enlace químico. Brennan et al., Science 229:81, 1985, describe un procedimiento en el que se cortan proteolíticamente anticuerpos intactos para generar fragmentos F(ab’)_{2}. Estos fragmentos se reducen en la presencia del agente arsenito sódico acomplejante de ditiol para estabilizar los ditioles próximos y previenen la formación de disulfuros intermoleculares. Los fragmentos Fab’ generados seguidamente se convierten en derivados tionitrobenzoato (TNB). Uno de los derivados Fab’-TNB seguidamente se reconvierten en el Fab’-tiol mediante reducción con mercaptoetilamina y se mezcla con una cantidad equimolar del otro derivado Fab’-TNB para formar el anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos biespecíficos producidos pueden utilizarse como agentes para la inmovilización selectiva de enzimas.

Los últimos avances han facilitado la recuperación directa de fragmentos Fab’-SH a partir de E. coli, que puede acoplarse químicamente para formar anticuerpos biespecíficos. Shalaby et al., J. Exp. Med. 175:217-225, 1992, describen la producción de una molécula de anticuerpos biespecíficos F(ab)_{2} completamente humanizado. Cada fragmento Fab’ fue secretado separadamente por E. coli y se sometió al acoplamiento químico dirigido in vitro para formar el anticuerpo biespecífico. El anticuerpo biespecífico formado de esta manera era capaz de unirse a células que sobreexpresaban el receptor ErbB2 y a células T humanas normales, así como de desencadenar la actividad lítica de los linfocitos citotóxicos humanos contra las dianas de tumor mamario humano.

También se han descrito diversas técnicas para preparar y aislar fragmentos de anticuerpo biespecífico directamente partir de un cultivo celular recombinante. Por ejemplo, se han producido anticuerpos biespecíficos utilizando cremalleras de leucina (Kostelny et al., J. Immunol. 148(5):1547-1553, 1992). Los péptidos de cremallera de leucina de las proteínas Fos y Jun se ligaron a las partes Fab’ de dos anticuerpos diferentes mediante fusión génica. Los anticuerpos homodímeros se redujeron en la región bisagra para formar monómeros y después se reoxidaron para formar los anticuerpos heterodímeros. Este procedimiento también puede utilizarse para la producción de anticuerpos homodímeros. La tecnología de "diacuerpos" descrita por Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448, 1993, ha proporcionado un mecanismo alternativo para preparar fragmentos de anticuerpo biespecífico. Los fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (V_{H}) conectado a un dominio variable de cadena ligera (V_{L}) mediante un línker que es excesivamente corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios en la misma cadena. Por consiguiente, los dominios V_{H} y V_{L} de un fragmento se ven forzados a aparearse con los dominios V_{L} y V_{H} complementarios de otro fragmento, formando de esta manera dos sitios de unión de antígeno. También se ha informado de otra estrategia para preparar fragmentos de anticuerpo biespecífico mediante la utilización de Fv dímeros de una cadena (sFv) (ver Gruber et al., J. Immunol. 152:5368, 1994).

Se contemplan anticuerpos con más de dos valencias. Por ejemplo, pueden prepararse anticuerpos triespecíficos (Tutt et al., J. Immunol. 147:60, 1991).

(vii) Otras modificaciones de secuencia de aminoácidos

Se contemplan una o más modificaciones de secuencia de aminoácidos de los anticuerpos anti-ErbB2 descritos en la presente invención. Por ejemplo, puede resultar deseable mejorar la afinidad de unión y/o otras propiedades biológicas del anticuerpo. Las variantes de secuencias de aminoácidos del anticuerpo anti-ErbB2 se preparan mediante la introducción de cambios de nucleótidos apropiados en el ácido nucleico del anticuerpo anti-ErbB2 o mediante síntesis de péptidos. Entre estas modificaciones se incluyen, por ejemplo, deleciones y/o inserciones y/o sustituciones de residuos dentro de las secuencias de aminoácidos del anticuerpo anti-ErbB2. Se lleva a cabo cualquier combinación de deleción, inserción y sustitución para conseguir el constructo final, con la condición de que éste posea las características deseadas. Los cambios de aminoácidos también pueden alterar los procesos post-traduccionales del anticuerpo anti-ErbB2, tales como cambiar el número o posición de los sitios de glucosilación.

Un procedimiento útil para la identificación de determinados residuos o regiones del anticuerpo anti-ErbB2 que son localizaciones preferentes para la mutagénesis se denomina "mutagénesis por escaneo de alaninas", tal como describen Cunningham y Wells, Science 244:1081-1085, 1989. En esta referencia, se identifican un residuo o grupo de residuos diana (por ejemplo residuos cargados, tales como arg, asp, his, lys y glu) y se sustituyen por un aminoácido neutro o negativamente cargado (más preferentemente alanina o polialanina) para afectar a la interacción de los aminoácidos con antígeno ErbB2. Aquellas localizaciones de aminoácido que demuestran sensibilidad funcional a las sustituciones seguidamente se refinan mediante la introducción de variantes adicionales u otras variantes en, o para, los sitios de sustitución. De esta manera, mientras que el sitio para introducir una variación de secuencia de aminoácidos se encuentra predeterminado, la naturaleza de la mutación per se no resulta necesario que se encuentre predeterminada. Por ejemplo, para analizar el rendimiento de una mutación en un sitio dado, se lleva a cabo escaneo de alaninas o mutagénesis aleatoria en el codón o región diana y las variantes expresadas de anticuerpo anti-ErbB2 se criban para la actividad deseada.

Entre las inserciones de secuencia de aminoácidos se incluyen fusiones amino-terminales y/o carboxi-terminales de longitud comprendida entre un residuo y polipéptidos que contienen cien o más residuos, así como inserciones intrasecuencia de uno o múltiples residuos aminoácidos. Entre los ejemplos de inserciones terminales se incluyen un anticuerpo anti-ErbB2 con un residuo metionilo N-terminal o el anticuerpo fusionado con un polipéptido citotóxico. Entre las otras variantes de inserción de la molécula de anticuerpo anti-ErbB2 se incluyen la fusión del extremo N o C-terminal del anticuerpo anti-ErbB2 con un enzima (por ejemplo para ADEPT) o un polipéptido que incrementa la vida media en suero del anticuerpo.

Otro tipo de variante es una variante de sustitución de aminoácido. Estas variantes presentan por lo menos un residuo aminoácido en la molécula de anticuerpo anti-ErbB2 sustituida por un residuo diferente. Entre los sitios de mayor interés para la mutagénesis por inserción se incluyen las regiones hipervariables, aunque también se contemplan las alteraciones de FR. Se muestran las sustituciones conservadoras en la Tabla I bajo el encabezamiento de "sustituciones preferentes". Si estas sustituciones resultan en un cambio de actividad biológica, entonces pueden introducirse más cambios sustanciales, denominados "sustituciones ejemplares" en la Tabla 1, o tal como se describe adicionalmente después en referencia a las clases de aminoácidos, y cribarse los productos.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 1

100

Se consiguen modificaciones sustanciales de las propiedades biológicas del anticuerpo seleccionando sustituciones que difieren significativamente en su efecto sobre el mantenimiento de: (a) la estructura del esqueleto polipeptídico en el área de la sustitución, por ejemplo con una conformación de hoja o de hélice, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio diana, o (c) el volumen de la cadena lateral. Los residuos de origen natural se dividen en grupos basándose en propiedades comunes de las cadenas laterales:

(1) hidrofóbicos: norleucina, met, ala, val, leu, ile;

(2) hidrofílico neutro: cys, ser, thr;

(3) ácido: asp, glu;

(4) básico: asn, gln, his, lys, arg;

(5) residuos que influyen sobre la orientación de cadena: gly, pro, y

(6) aromáticos: trp, tyr, phe.

Las sustituciones no conservadoras implican intercambiar un elemento de una de estas clases por otra clase.

Cualquier residuo cisteína no implicado en el mantenimiento de la conformación apropiada del anticuerpo anti-ErbB2 también puede sustituirse, generalmente con serina, para mejorar la estabilidad oxidativa de la molécula y prevenir el entrecruzamiento aberrante. A la inversa, pueden añadirse uno o más enlaces cisteína al anticuerpo para mejorar su estabilidad (particularmente en el caso de que el anticuerpo sea un fragmento de anticuerpo, tal como un fragmento Fv).

Un tipo particularmente preferente de variante por sustitución implica sustituir una o más residuos de región hipervariable de un anticuerpo parental (por ejemplo un anticuerpo humanizado o humano). Generalmente, la variante o variantes resultantes seleccionadas para desarrollarlos adicionalmente presentan propiedades biológicas mejoradas respecto al anticuerpo parental a partir del que se generan. Una manera conveniente para generar estas variantes por sustitución implica la maduración por afinidad mediante expresión fágica. Brevemente, se mutan varios sitios de región hipervariable (por ejemplo 6 ó 7 sitios) para generar todas las sustituciones amino posibles en cada sitio. Las variantes de anticuerpo generadas de esta manera se expresan de una manera monovalente a partir de partículas fágicas filamentosas como fusiones con el producto del gen III de M13 empaquetado dentro de cada partícula. A continuación, las variantes expresadas en fago se criban para su actividad biológica (por ejemplo afinidad de unión) tal como se da a conocer en la presente invención. Con el fin de identificar los sitios de región hipervariable candidatos para la modificación, la mutagénesis por escaneo de alaninas puede llevarse a cabo para identificar residuos de región hipervariable que contribuyen significativamente a la unión de antígeno. Alternativamente, o adicionalmente, puede resultar beneficioso analizar una estructura cristalina del complejo de antígeno-anticuerpo para identificar los puntos de contacto entre el anticuerpo y la ErbB2 humano. Estos residuos de contacto y los residuos vecinos son candidatos para la sustitución de acuerdo con las técnicas detalladas en la presente invención. Tras generar estas variantes, el panel de variantes se somete a cribado tal como se describe en la presente invención y pueden seleccionarse para su desarrollo adicional anticuerpos con propiedades superiores en uno o más ensayos relevantes.

Otro tipo de variante de aminoácido del anticuerpo altera el patrón original de glucosilación del anticuerpo. El término "alteración" se refiere a la deleción de uno o más grupos carbohidrato encontrados en el anticuerpo y/o añadiendo uno o más sitios de glucosilación que no se encuentran presentes en el anticuerpo.

La glucosilación de anticuerpos típicamente se encuentra N-ligada o O-ligada. El término "N-ligado" se refiere a la unión del grupo carbohidrato con la cadena lateral de un residuo asparagina. Las secuencias de tripéptido asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, en las que X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para la unión enzimática del grupo carbohidrato a la cadena lateral de asparagina. De esta manera, la presencia de cualquiera de estas secuencias tripéptido en un polipéptido crea un sitio de glucosilación potencial. La expresión "glucosilación O-ligada" se refiere a la unión de uno de los azúcares N-acetilgalactosamina, galactosa o xilosa a un ácido hidroxiamino, más comúnmente serina o treonina, aunque también puede utilizarse 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina.

La adición de sitios de glucosilación al anticuerpo se consigue convenientemente alterando la secuencia de aminoácidos de manera que contiene una o más de las secuencias tripéptido anteriormente indicadas (para los sitios de glucosilación N-ligados). La alteración también puede prepararse mediante la adición o sustitución de uno o más residuos de serina o treonina con la secuencia del anticuerpo original (para los sitios de glucosilación O-ligados).

Las moléculas de ácidos nucleicos codificantes de las variantes de secuencia de aminoácidos del anticuerpo anti-ErbB2 se preparan mediante una diversidad de procedimientos conocidos de la técnica. Entre estos procedimientos se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, el aislamiento a partir de una fuente natural (en el caso de variantes de secuencias de aminoácidos de origen natural) o la preparación mediante mutagénesis mediada por oligonucleótidos (o sitio-dirigida), mutagénesis por PCR, y mutagénesis por inserción de casete de una variante preparada anteriormente o una versión no variante del anticuerpo anti-ErbB2.

Puede resultar deseable modificar el anticuerpo de la invención con respecto a la función efectora, por ejemplo para potenciar la citotoxicidad mediada por células antígeno-dependiente (ADCC) y/o la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) del anticuerpo. Esto puede conseguirse mediante la introducción de una o más sustituciones de aminoácidos en una región Fc del anticuerpo. Alternativamente o adicionalmente, el residuo o residuos de cisteína pueden introducirse en la región Fc, permitiendo de esta manera la formación de enlaces disulfuro intercadena en esta región. El anticuerpo homodimérico generado de esta manera puede presentar una capacidad de internalización mejorada y/o eliminación celular mediada por el complemento y citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) incrementadas (ver Caron et al., J. Exp. Med. 176:1191-1195, 1992, y Shopes, B., J. Immunol. 148.2918-2922, 1992). También pueden prepararse anticuerpos homodiméricos con actividad antitumoral incrementada utilizando entrecruzadores heterobifuncionales, tal como se describe en Wolff et al., Cancer Research 53:2560-2565, 1993. Alternativamente, puede manipularse un anticuerpo que presenta regiones Fc duales y puede presentar de esta manera capacidades incrementadas de lisis del complemento y ADCC (ver Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3:219-230, 1989).

Para incrementar la vida media en suero del anticuerpo, puede incorporarse un epítopo de unión a receptor de reciclaje en el anticuerpo (especialmente en un fragmento de anticuerpo), tal como se describe en la patente US nº 5.739.277, por ejemplo. Tal como se utiliza en la presente invención, la expresión "epítopo de unión de receptor de reciclaje" se refiere a un epítopo de la región Fc de una molécula IgG (por ejemplo IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4) que es responsable del incremento de la vida media in vivo en suero de la molécula IgG.

(viii) Cribado para anticuerpos con las propiedades deseadas

Las técnicas para generar anticuerpos han sido descritas anteriormente. Además, se pueden seleccionar anticuerpos con determinadas características biológicas, según se desee.

Para identificar los anticuerpos que bloquean la activación de ligando de un receptor ErbB, puede determinarse la capacidad del anticuerpo de bloquear la unión del ligando de ErbB a células que expresan el receptor ErbB (por ejemplo en conjugación con otro receptor ErbB con el que el receptor ErbB de interés forma un heterooligómero ErbB). Por ejemplo, pueden incubarse células que expresan naturalmente, o que han sido transfectadas para expresar, receptores ErbB del heterooligómero ErbB con el anticuerpo y después exponerse a ligando de ErbB marcado. La capacidad del anticuerpo anti-ErbB2 de bloquear la unión de ligando al receptor ErbB en el heterooligómero ErbB seguidamente puede evaluarse.

Por ejemplo, la inhibición de la unión de HRG a líneas celulares de tumor mamario MCF7 por los anticuerpos anti-ErbB2 puede llevarse a cabo utilizando cultivos de monocapas de MCF7 en hielo en un formato de placa de 24 pocillos esencialmente tal como se describe en el Ejemplo 1 posteriormente. Pueden añadirse anticuerpos monoclonales anti-ErbB2 a cada pocillo e incubarse durante 30 minutos. A continuación puede añadirse rHRG\beta1_{177-224} marcado con ^{125}I (25 pM), y continuar con la incubación durante 4 a 16 horas. Pueden prepararse curvas de dosis-respuesta y calcularse un valor de IC_{50} para el anticuerpo de interés. En una realización, el anticuerpo que bloquea la activación de ligando de un receptor ErbB presentará una IC_{50} para inhibir la unión de HRG a las células MCF7 en este ensayo de aproximadamente 50 nM o menos, más preferentemente de 10 nM o menos. En el caso de que el anticuerpo sea un fragmento de anticuerpo, tal como un fragmento Fab, la IC_{50} para inhibir la unión de HRG a las células MCF7 en este ensayo puede ser de, por ejemplo, aproximadamente 100 nM o menos, más preferentemente de 50 nM o menos.

Alternativamente, o adicionalmente, puede evaluarse la capacidad del anticuerpo anti-ErbB2 de bloquear la fosforilación de tirosinas estimulada por ligando de ErbB de un receptor ErbB presente en un heterooligómero ErbB. Por ejemplo, las células que expresan endógenamente los receptores ErbB o transfectadas para expresarlos, pueden incubarse con el anticuerpo y después someterse a ensayo para la actividad de fosforilación de tirosinas dependiente de ligando de ErbB utilizando un anticuerpo monoclonal antifosfotirosina (que opcionalmente se encuentre conjugado con un marcaje detectable). El ensayo de activación de receptor quinasa descrito en la patente US nº 5.766.863 también se
encuentra disponible para determinar la activación del receptor ErbB y el bloqueo de esta actividad por un anticuerpo.

En una realización, puede cribarse para un anticuerpo que inhibe la estimulación por HRG de la fosforilación de tirosinas de p180 en células MCF7 esencialmente tal como se describe en el Ejemplo 1 posteriormente. Por ejemplo, pueden sembrase células MCF7 en placas de 24 pocillos y pueden añadirse anticuerpos monoclonales contra ErbB2 en cada pocillo hasta una concentración final de 0,2 nM, y se puede continuar con la incubación durante 8 minutos. El medio puede aspirarse de cada pocillo, y las reacciones puede detenerse mediante la adición de 100 \mul de tampón SDS de muestra (5% de SDS, DTT 25 mM y Tris-HCl 25 mM, pH 6,8). Puede someterse a electroforesis cada muestra (25 \mul) en un gel en gradiente de 4% a 12% (Novex) y después transferirse electroforéticamente a una membrana de difluoruro de polivinilideno. Pueden revelarse membranas inmunológicas antifosfotirosina (a 1 \mug/ml), y puede cuantificarse la intensidad de la banda reactiva predominante a M_{r} \sim 180.000 mediante densitometría de reflectancia. El anticuerpo seleccionado preferentemente inhibe significativamente la estimulación de la fosforilación de tirosinas de p180 hasta aproximadamente 0% a 35% del control en este ensayo. Puede prepararse una curva de dosis-respuesta para la inhibición de la estimulación por HRG de la fosforilación de tirosinas de p180 según se determina mediante densitometría de reflectancia y calcularse una IC_{50} para el anticuerpo de interés. En una realización, el anticuerpo que bloquea la activación de ligando de un receptor ErbB presenta una IC_{50} de inhibición de la estimulación por HRG de la fosforilación de tirosinas de p180 en este ensayo hasta aproximadamente 50 nM o menos, más preferentemente de 10 nM o menos. En el caso de que el anticuerpo sea un fragmento de anticuerpo, tal como un fragmento FAb, la IC_{50} para inhibir la estimulación por HRG de la fosforilación de tirosinas de p180 en este ensayo puede ser, por ejemplo, de aproximadamente 100 nM o menos, más preferentemente de 50 nM o menos.

También puede evaluarse los efectos inhibidores del crecimiento del anticuerpo en células MDA-MB-175, por ejemplo esencialmente tal como describen Schaefer et al., Oncogene 15:1385-1394, 1997. De acuerdo con este ensayo, pueden tratarse células MDA-MB-175 con un anticuerpo monoclonal anti-ErbB2 (10 \mug/ml) durante 4 días y teñirse con cristal violeta. La incubación con un anticuerpo anti-ErbB2 puede mostrar un efecto inhibidor del crecimiento sobre esta línea celular similar al mostrado por el anticuerpo monoclonal 2C4. En una realización adicional, la HRG exógena no invierte significativamente esta inhibición. Preferentemente, el anticuerpo es capaz de inhibir la proliferación celular de las células MDA-MB-175 en mayor grado que el anticuerpo monoclonal 4D5 (y opcionalmente en mayor grado que el anticuerpo monoclonal 7F3), tanto en presencia como en ausencia de HRG exógena.

En una realización, el anticuerpo anti-ErbB2 de interés puede bloquear la asociación heregulina-dependiente de ErbB2 con ErbB3 en células tanto MCF7 como SK-BR-3 según se determina en un experimento de coinmunoprecipitación, tal como el descrito en el Ejemplo 2 sustancialmente con más eficacia que el anticuerpo monoclonal 4D5 y, opcionalmente, sustancialmente con mayor eficacia que el anticuerpo monoclonal 7F3.

Alternativamente, o adicionalmente, puede determinarse la capacidad del anticuerpo que bloquea la activación mediada por EGF, TGF-\alpha y/o HRG de la proteína quinasa activada por mitógeno (MAPK), por ejemplo tal como se muestra en el Ejemplo 4 posteriormente. Puede seleccionarse un anticuerpo que bloquea la activación mediada por EGF, TGF-\alpha y/o HRG de la proteína quinasa activada por mitógeno (MAPK) en mayor grado que HERCEPTIN® o que anticuerpo monoclonal 4D5. Además, el anticuerpo de interés puede bloquear la activación mediada por EGF, TGF-\alpha y/o HRG de la proteína quinasa activada por mitógeno (MAPK) en mayor grado que el anticuerpo monoclonal 7F3.

Para identificar los anticuerpos anti-ErbB2 inhibidores del crecimiento, puede cribarse para anticuerpos que inhiben el crecimiento de las células cancerosas que sobreexpresan ErbB2. En una realización, el anticuerpo inhibidor del crecimiento de elección es capaz de inhibir el crecimiento de las células SK-BR-3 en cultivo celular aproximadamente en 20% a 100%, y preferentemente en aproximadamente 50% a 100% a una concentración de anticuerpo de aproximadamente 0,5 a 30 \mug/ml. Para identificar estos anticuerpos, puede llevarse a cabo el ensayo SK-BR-3 descrito en la patente US nº 5.677.171. De acuerdo con este ensayo, se cultivar células SK-BR-3 en una mezcla 1:1 de medio F12 y DMEM suplementado con suero de feto bovino al 10%, glutamina y penicilina-estreptomicina. Las células SK-BR-3 se siembran a 20.000 células en una placa de cultivo celular de 35 mm (2 ml/placa de 35 mm). Se añade por placa 0,5 a 30 \mug/ml del anticuerpo anti-ErbB2. Tras seis días, se cuenta el número de células, comparado con las células no tratadas, utilizando un contador de células electrónico COULTER^{TM}. Pueden seleccionarse como anticuerpos inhibidores del crecimiento aquellos anticuerpos que inhiben el crecimiento de las células SK-BR-3 en aproximadamente 20% a 100% o en aproximadamente 50% a 100%.

Para seleccionar para anticuerpos que inducen la muerte celular, puede evaluarse la pérdida de integridad membranal según indica, por ejemplo, la incorporación de PI, de azul de tripán o de 7AAD, respecto al control. El ensayo preferente es el ensayo de incorporación de PI utilizando células BT474. De acuerdo con este ensayo, se cultivan células BT474 (que pueden obtenerse de la American Type Culture Collection (Rockville, MD)) en medio de Eagle modificado por Dulbecco (D-MEM):F-12 de Ham (50:50) suplementado con FBS inactivado por calor a 10% (Hyclone) y L-glutamina 2 mM (de esta manera, el ensayo se lleva a cabo en ausencia de complemento y de células inmunológicas efectoras). Se siembran células BT474 a una densidad de 3 x 10^{6} por placa en placas de 100 x 20 mm y se deja que se enganchen durante la noche. A continuación, se extrae el medio y se sustituye por medio fresco solo o medio que contiene 10 \mug/ml del anticuerpo monoclonal apropiado. Las células se incuban durante un periodo de tiempo de 3 días. Tras cada tratamiento, las monocapas se lavan con PBS y se desenganchan mediante tripsinización. Después, las células se centrifugan a 1.200 rpm durante 5 minutos a 4ºC, el pellet se resuspende en 3 ml de tampón de unión de Ca^{2+} helado (Hepes 10 mM, pH 7,4, NaCl 140 mM, CaCl_{2} 2,5 mM) y se divide en alícuotas en 12 x 75 tubos de 35 mm de tapas con filtro (1 ml por tubo, 3 tubos por grupo de tratamiento) para la eliminación de los agregados celulares. Seguidamente, los tubos reciben PI (10 \mug/ml). Las muestras pueden analizarse utilizando un citómetro de flujo FACSCAN^{TM} y software FACSCONVERT^{TM} de CellQuest (Becton Dickinson). Aquellos anticuerpos que inducen los niveles estadísticamente significativas de muerte celular según se determina mediante la incorporación de PI como anticuerpos inductores de muerte celular.

Con el fin de seleccionar para anticuerpos que inducen apoptosis, se encuentra disponible un ensayo de unión de anexina utilizando células BT474. Las células BT474 se cultivan y se siembran en placas tal como se comenta en el párrafo anterior. A continuación, se extrae el medio y se sustituye por medio fresco solo o medio que contiene 10 \mug/ml del anticuerpo monoclonal. Tras un periodo de incubación de tres días, se lavan las monocapas con PBS y se separan mediante tripsinización. Después, las células se centrifugan, se resuspenden en tampón de unión de Ca^{2+} y se introducen alícuotas en tubos, tal como se comenta anteriormente para el ensayo de muerte celular. A continuación, los tubos reciben anexina marcada (por ejemplo anexina V-FTIC) (1 \mug/ml). Las muestras pueden analizarse utilizando un citómetro de flujo FACSCAN^{TM} y el software FACSCONVERT^{TM} de CellQuest (Becton Dickinson). Aquellos anticuerpos que inducen niveles estadísticamente significativos de unión de anexina respecto al control se seleccionan como anticuerpos inductores de apoptosis.

Además del ensayo de unión de anexina, se encuentra disponible un ensayo de tinción de ADN utilizando células BT474. Con el fin de llevar a cabo este ensayo, las células BT474 que han sido tratadas con el anticuerpo de interés tal como se describe en los dos párrafos anteriores se incuban con 9 \mug/ml de HOECHST 33342^{TM} durante 2 horas a 37ºC, después se analizan en un citómetro de flujo EPICS ELITE^{TM} (Coulter Corporation) utilizando software MODFIT LT^{TM} (Verit Software House). Los anticuerpos que inducen un cambio en el porcentaje de células apoptóticas 2 veces o más (y preferentemente 3 veces o más) mayor que las células no tratadas (hasta el 100% de células apoptóticas) pueden seleccionarse como anticuerpo pro-apoptóticos utilizando este ensayo.

Para cribar para anticuerpos que se unen a un epítopo en ErbB2 unido por un anticuerpo de interés, puede llevarse a cabo un ensayo de bloqueo cruzado rutinario, tal como el descrito en Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed. Harlow y David Lane (1988). Alternativamente, o adicionalmente, puede llevarse el mapaje de epítopos mediante procedimientos conocidos de la técnica (ver, por ejemplo, las figs. 1A y 1B en la presente invención).

(ix) Inmunoconjugados

La invención también se refiere a la terapia con inmunoconjugados que comprenden un anticuerpo conjugado con un agente citotóxico, tal como un agente quimioterapéutico, toxina (por ejemplo una toxina de molécula pequeña o una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, incluyendo fragmentos y/o variantes de la misma), o un isótopo radioactivo (es decir, un radioconjugado).

Se han descrito anteriormente los agentes quimioterapéuticos útiles en la generación de estos inmunoconjugados.

Los conjugados de un anticuerpo y una o más toxinas de molécula pequeña, tales como una calicheamicina, una maytansina (patente US nº 5.208.020), un tricoteno, y CC1065 también se contemplan en la presente invención.

En una realización preferente de la invención, el anticuerpo se conjuga con una o más moléculas de maitansina (por ejemplo entre aproximadamente 1 y aproximadamente 10 moléculas de maitansina por molécula de anticuerpo). La maitansina puede, por ejemplo, convertirse en May-SS-Me que puede reducirse a May-SH3 y hacerse reaccionar con anticuerpo modificado (Chari et al., Cancer Research 52:127-131, 1992) para generar un inmunoconjugado maitansinoide-anticuerpo.

Otro inmunoconjugado de interés comprende un anticuerpo anti-ErbB2 conjugado con una o más moléculas de calicheamicina. La familia calicheamicina de antibióticos es capaz de producir roturas del ADN de doble cadena a concentraciones subpicomolares. Entre los análogos estructurales de la calicheamicina que pueden utilizarse se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, \gamma_{1}^{I}, \alpha_{2}^{I}, \alpha_{3}^{I}, N-acetil-\gamma_{1}^{I}, PSAG y \theta^{I}_{1} (Hinman et al., Cancer Research 53:3336-3342, 1993, y Lode et al., Cancer Research 58:2925-2928, 1998).

Entre las toxinas enzimáticamente activas y fragmentos de las mismas que pueden utilizarse se incluyen la cadena A de la difteria, fragmentos activos no ligantes de la toxina de la difteria, cadena A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadena A de ricina, cadena A de abrina, cadena A de modecina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII y PAP-S), inhibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de Sapaonaria officinalis, gelinina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y los tricotecenos. Ver, por ejemplo, la patente WO nº 93/21232, publicada el 28 de octubre de 1993.

La presente invención contempla además un inmunoconjugado formado entre un anticuerpo y un compuesto con actividad nucleolítica (por ejemplo una ribonucleasa o una ADN endonucleasa, tal como una desoxiribonucleasa; ADNasa).

Se encuentran disponibles una diversidad de isótopos radioactivos utilizando una diversidad de agentes de acoplamiento de proteína bifuncionales, tales como N-succinimidil-3-(2-piridilditiol)propionato (SPDP), succinimidil-4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato, iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como adipimidato de dimetilo, HCL), ésteres activos (tales como suberato de disccuinimidilo), aldehídos (tales como glutaladehído), compuestos bis-azido (tales como bis(p-azidobenzoil)hexanodiamina), derivados bis-diazonio (tales como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilendiamina), diisocianatos (tales como 2,6-diisocianato de tolieno) y compuestos de flúor bis-activos (tales como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Por ejemplo, puede prepararse una inmunotoxina ricina tal como se describe en Vitetta et al., Science 238:1098, 1098. El ácido 1-isotiocianatobencil-3-metildietilen-triaminopentaacético (MX-DTPA) marcado con carbono-14 es un agente quelante ejemplar para la conjugación de radionucleótidos al anticuerpo. Ver la patente WO nº 94/11026. El línker puede ser un "línker cortable", facilitando la liberación del fármaco citotóxico en la célula. Por ejemplo, puede utilizarse un línker sensible a peptidasa lábil frente a ácidos, un línker dimetilo o un línker que contenga disulfuros (Chari et al., Cancer Research 52:127-131,
1992).

Alternativamente, puede prepararse una proteína de fusión que comprende el anticuerpo anti-ErbB2 y agente citotóxico, por ejemplo mediante técnicas recombinantes o síntesis de péptidos.

En todavía otra realización, el anticuerpo puede conjugarse con un "receptor" (tal como estreptavidina) para la utilización en la predianización tumoral, en la que el conjugado de anticuerpo-receptor se administra al paciente seguido de la extracción del conjugado no unido de la circulación utilizando un agente de eliminación y después la administración de un "ligando" (por ejemplo avidina) que se conjuga con un agente citotóxico (por ejemplo un radionucleótido).

(x) Terapia con profármaco mediada por enzima dependiente de anticuerpo (ADEPT)

Los anticuerpos de la presente invención también pueden utilizarse en ADEPT conjugando el anticuerpo con un enzima activador de profármaco que convierte un profármaco (por ejemplo un agente quimioterapéutico peptidilo, ver la patente WO nº 81/01145) con un fármaco anticáncer activo. Ver, por ejemplo, la patente WO nº 88/07378 y patente US nº 4.975.278.

El componente enzima del inmunoconjugado útil para ADEPT incluye cualquier enzima capaz de actuar sobre un profármaco de manera que lo convierte en su forma citotóxica más activa.

Entre los enzimas que resultan útiles en el procedimiento de la presente invención se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, fosfatasa alcalina útil para convertir los profármacos que contienen fosfato en fármacos libres; arilsulfatasa, útil para convertir los profármacos que contienen sulfato en fármacos libres; citosina desaminasa, útil para convertir la 5-fluorocitosina no tóxica en fármaco anticáncer, 5-fluorouracilo; proteasas, tales como la proteasa de Serratia, termolisina, subtilisina, carboxipeptidasas y catepsinas (tales como las catepsinas B y L), que resultan útiles para convertir los profármacos que contienen péptidos en fármacos libres; D-alanilcarboxipeptidasas, útiles para convertir profármacos que contienen sustituyentes D-aminoácidos; enzimas que cortan carbohidratos, tales como la \beta-galactosidasa y neuraminidasa útiles para convertir los profármacos glucosilados en fármacos libres; \beta-lactamasa, útil para convertir fármacos derivatizados con \beta-lactamos en fármacos libres; y penicilina amidasas, tales como penicilina V amidasa o penicilina G amidasa, útiles para convertir fármacos derivatizados en sus nitrógenos de amina con grupos fenoxiacetilo o fenilacetilo, respectivamente, en fármacos libres. Alternativamente, pueden utilizarse anticuerpos con actividad enzimática, también conocidos en la técnica como "abzimas" para convertir los profármacos de la invención en fármacos activos libres (ver, por ejemplo, Massey, Nature 328:457-458, 1987). Pueden prepararse conjugados de anticuerpo-abzima tal como se describe en la presente invención para la administración del abzima en una población de células tumorales.

Los enzimas de la presente invención pueden unirse covalentemente a los anticuerpos anti-ErbB2 mediante técnicas bien conocidas de la técnica, tales como la utilización de los reactivos de entrecruzamiento heterobifuncionales comentados anteriormente. Alternativamente, pueden construirse proteínas de fusión que comprenden por lo menos la región de unión de antígeno de un anticuerpo de la invención ligados a por lo menos una parte funcionalmente activa de un enzima de la invención utilizando técnicas de ADN recombinantes bien conocidas de la técnica (ver, por ejemplo, Neuberger et al., Nature 312:604-608, 1984).

(xi) Otras modificaciones de anticuerpos

En la presente invención se contemplan otras modificaciones del anticuerpo. Por ejemplo, el anticuerpo puede unirse a una diversidad de polímeros no proteicos, por ejemplo polietilenglicol, polipropilenglicol, polioxialquilenos o coplímeros de polietilenglicol polipropilenglicol. El anticuerpo también puede atraparse en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial (por ejemplo hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y microcápsulas de poli(metilmetacrilato), respectivamente) en sistemas coloidales de administración de fármacos (por ejemplo liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Estas técnicas se dan a conocer en Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16a edición, Oslo, A., editor, 1980.

Los anticuerpos anti-ErbB2 dados a conocer en la presente invención también pueden formularse como inmunoliposomas. Los liposomas que contienen anticuerpos se preparan mediante procedimientos conocidos de la técnicas, tales como los descritos en Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688, 1985; Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030, 1980; patentes US nº 4.485.045 y nº 4.544.545, y la patente WO nº 97/38731 publicada el 23 de octubre de 1997. Se dan a conocer liposomas con tiempo de circulación incrementado en la patente US nº 5.013.556.

Pueden generarse liposomas particularmente útiles mediante el procedimiento de evaporación en fase reversa con una composición de lípidos que comprende fosfatidilcolina, colesterol y fosfatidiletanolamina derivatizada con PEG (PEG-PE). Se extruyen los liposomas a través de filtros de tamaño de poro definido para rendir los liposomas con el diámetro deseado. Pueden conjugarse fragmentos Fab’ del anticuerpo de la presente invención con los liposomas tal como se describe en Martin et al., J. Biol. Chem. 257:286-288, 1982 a través de una reacción de intercambio de disulfuro. Se contiene opcionalmente un agente quimioterapéutico dentro del liposoma. Ver Gabizon et al., J. National Cancer Inst. 81(6):1484, 1989.

III. Formulaciones farmacéuticas

Se preparan formulaciones terapéuticas de los anticuerpos utilizados de acuerdo con la presente invención para el almacenamiento mediante mezcla de un anticuerpo con el grado deseado de pureza con portadores, excipientes o estabilizantes opcionales farmacéuticamente aceptables (Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16a edición, Osol, A., editor, 1980) en la forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los portadores, excipientes o estabilizantes aceptables son no tóxicos para los receptores a las dosis y concentraciones utilizadas, e incluyen tampones, tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes, incluyendo ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencil-amonio, cloruro de hexametonio, cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquilparabenes, tales como metil o propil-parabén, catecol, resorcinol, ciclohexanol, 3-pentanol y m-cresol); polipéptidos de peso molecular reducido (menos de aproximadamente 10 residuos), proteínas, tales como albúmina sérica, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos, tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos, y otros carbohidratos, incluyendo glucosa, manosa, o dextrinas; agentes quelantes, tales como EDTA; azúcares, tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sal, tales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo complejos de Zn-proteína) y/o surfactantes no iónicos, tales como TWEEN^{TM}, PLURONICS^{TM} o polietilenglicol (PEG). Las formulaciones de anticuerpo anti-ErbB2 liofilizado preferentes se describen en la patente WO nº 97/04801, incorporadas expresamente en la presente invención como referencia.

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La formulación de la presente invención también puede contener más de un compuesto activo según resulte necesario para la indicación particular que se está tratando, preferentemente aquellos con actividades complementarias que no se afecten adversamente entre sí. Por ejemplo, puede resultar deseable proporcionar adicionalmente anticuerpos que se unan a EGFR, ErbB2 (por ejemplo un anticuerpo que se una a un epítopo diferente sobre ErbB2), ErbB3, ErbB4 o factor endotelial vascular (VEGF) en la misma formulación. Alternativamente, o adicionalmente, la composición puede comprender además un agente quimioterapéutico, un agente citotóxico, citoquina, agente inhibidor del crecimiento, agente antihormonal y/o cardioprotector. Estas moléculas se encuentran convenientemente presentes en combinación en cantidades que resulten efectivas para el fin pretendido.

Los ingredientes activos también pueden atraparse en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial, por ejemplo microcápsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina y poli(metilmetacrilato), respectivamente, en sistemas coloidales de administración de fármaco (por ejemplo liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Estas técnicas se dan a conocer en Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16a edición, Osol, A., editor, 1980.

Pueden prepararse preparaciones de liberación sostenida. Entre los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida se incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen el anticuerpo, matrices que se encuentran en la forma de artículos conformados, por ejemplo películas o microcápsulas. Entre los ejemplos de matrices de liberación sostenida se incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo poli(2-hidroxietil-metacrilato) o poli(alcohol vinílico), poliláctidos (patente US nº 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutámico y \gamma-etil-L-glutamato, acetato de etileno-vinilo no degradable, copolímeros degradables de ácido láctico-ácido glicólico, tales como DEPOT^{TM} de LUPRON (microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprólido) y ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico.

Las formulaciones que deben utilizarse para la administración in vivo deben ser estériles. Esto se consigue fácilmente mediante filtración a través de membranas de filtración estéril.

IV. Tratamiento con los anticuerpos anti-ErbB2

Según la presente invención, el anticuerpo anti-ErbB2 se utiliza para la preparación de un medicamento para tratar el cáncer de próstata, tal como cáncer de próstata andrógeno-independiente o cáncer de próstata andrógeno-dependiente. En el caso de que el cáncer que deba tratarse sea un cáncer de próstata independiente o dependiente de andrógeno, la expresión del andrógeno (por ejemplo andosterona o testosterona) y/o su receptor cognado en el tumor puede evaluarse utilizando cualquiera de los diversos ensayos disponibles, por ejemplo tal como se ha descrito anteriormente. Alternativamente, o adicionalmente, un paciente puede diagnosticarse que presenta cáncer de próstata andrógeno-independiente porque ya no responde a la terapia anti-andrógeno y el paciente diagnosticado con cáncer de próstata andrógeno-dependiente puede ser un paciente que responde a la terapia anti-andrógeno. El cáncer generalmente comprende células que expresan ErbB2, de manera que el anticuerpo anti-ErbB2 es capaz de unirse a las mismas. Aunque el cáncer puede caracterizarse por la sobreexpresión del receptor ErbB2, la presente solicitud proporciona además un procedimiento para tratar el cáncer que no se considera un cáncer que sobreexpresa ErbB2. Para determinar la expresión de ErbB2 en el cáncer, diversos ensayos diagnósticos/prognósticos se encuentran disponibles. En una realización, la sobreexpresión de ErbB2 puede analizarse mediante IHC, por ejemplo utilizando HERCEPTEST® (Dako). Pueden someterse al ensayo HIC secciones de tejido incluidas en parafina procedentes de una biopsia de tumor y clasificadas de acuerdo a criterios de intensidad de tinción de proteína ErbB2 de la manera siguiente:

Puntuación 0

no se observa tinción o se observa tinción de membrana en menos de 10% de las células tumorales

Puntuación 1+

se detecta una tinción membranal leve/apenas perceptible en más del 10% de las células tumorales. Las células sólo se tiñen en parte de su membrana.

Puntuación 2+

se observa una tinción membranal completa débil a moderada en más del 10% de las células tumorales

Puntuación 3+

se observa una tinción membranal completa moderada a fuerte en más del 10% de las células tumorales

Aquellos tumores con puntuaciones de 0 o 1+ para la evaluación de la sobreexpresión de ErbB2 pueden caracterizarse como que no sobreexpresan ErbB2, mientras que aquellos tumores con puntuaciones de 2+ o 3+ pueden caracterizarse como que sobreexpresan ErbB2.

Alternativamente, o adicionalmente, los ensayos FISH, tales como el INFORM^{TM} (comercializados por Ventana, Arizona) o PATHVISION^{TM} (Vysis, Illinois) pueden llevarse a cabo en tejido tumoral fijado en formalina incluido en parafina para determinar el grado (si se produce) de sobreexpresión de ErbB2 en el tumor.

El cáncer de próstata que debe tratarse en la presente invención puede ser un cáncer caracterizado por la activación excesiva de un receptor ErbB, por ejemplo EGFR. Esta activación excesiva puede atribuirse a la sobreexpresión o producción incrementada del receptor ErbB o de un ligando de ErbB. En una realización de la invención, puede llevarse a cabo un ensayo diagnóstico o prognóstico para determinar si el cáncer del paciente se caracteriza por la activación excesiva de un receptor ErbB. Por ejemplo, puede determinarse la amplificación del gen de ErbB y/o la sobreexpresión de un receptor ErbB en el cáncer. Se encuentran disponibles en la técnica diversos ensayos para determinar esta amplificación/sobreexpresión y entre ellos se incluyen los ensayos IHC, FISH y de antígeno desprendido indicados anteriormente. Alternativamente, o adicionalmente, pueden determinarse los niveles de un ligando de ErbB, tal como TGF-\alpha, en el tumor o asociado al mismo, de acuerdo a procedimientos conocidos. Estos ensayos pueden detectar proteínas y/o ácidos nucleicos codificante de las mismas en la muestra que debe someterse a ensayo. En una realización, pueden determinarse los niveles de ligando de ErbB en el tumor utilizando inmunohistoquímica (IHC); ver, por ejemplo, Scher et al., Clin. Cancer Research 1:545-550, 1995. Alternativamente, o adicionalmente, pueden evaluarse los niveles de ácido nucleico codificante de ligando de ErbB en la muestra que debe someterse a ensayo, por ejemplo mediante FISH, transferencia southern o técnicas de PCR.

Además, la sobreexpresión o amplificación de receptor ErbB o de ligando de ErbB puede evaluarse utilizando un ensayo diagnóstico in vivo, por ejemplo administrando una molécula (tal como un anticuerpo) que se une a la molécula que debe detectarse y que se etiqueta con un marcaje detectable (por ejemplo un isótopo radioactivo) y escaneando externamente el paciente para localizar el marcaje.

En determinadas realizaciones, se administra al paciente un inmunoconjugado que comprende el anticuerpo anti-ErbB2 conjugado con un agente citotóxico. Preferentemente, el inmunoconjugado y/o la proteína ErbB2 a la que se encuentra unido resultan internalizados por la célula, resultando en una eficacia terapéutica incrementada del inmunoconjugado en la eliminación de la célula cancerosa a la que se une. En una realización preferente, el agente citotóxico se dirige o interfiere con el ácido nucleico en la célula cancerosa. Entre los ejemplos de estos agentes citotóxicos se incluyen maitansinoides, calicheamicinas, ribonucleasas y ADN endonucleasas.

Los anticuerpos anti-ErbB2 o inmunoconjugados se administran a un paciente humana de acuerdo a procedimientos conocidos, tales como la administración intravenosa, por ejemplo en forma de bolo o mediante infusión continua a lo largo de un periodo de tiempo, mediante vías intramuscular, intraperitoneal, intracerebroespinal, subcutánea, intraarticular, intrasinovial, intratecal, oral, tópica o por inhalación. Resulta preferente la administración intravenosa o subcutánea del anticuerpo.

Pueden combinarse otros regímenes terapéuticos con la administración del anticuerpo anti-ErbB2. La administración combinada incluye la coadministración, utilizando formulaciones separadas o una única formulación farmacéutica, y la administración consecutiva en cualquier orden, en la que preferentemente existe un periodo de tiempo durante el que ambos (o la totalidad) de los agentes activos ejercen simultáneamente sus actividades biológicas.

En una realización preferente, el paciente se trata con dos anticuerpos anti-ErbB2 diferentes. Por ejemplo, el paciente puede tratarse con un primer anticuerpo anti-ErbB2 que bloquea la activación de ligando de un rector ErbB con una eficacia 50% a 100% mayor que el anticuerpo monoclonal humanizado huMab4D5-8 tal como se da a conocer en la patente US nº 5.821.337 o un anticuerpo que presenta una característica biológica del anticuerpo monoclonal 2C4, así como un segundo anticuerpo anti-ErbB2 que es inhibidor del crecimiento (por ejemplo HERCEPTIN®) o un anticuerpo anti-ErbB2 que induce la apoptosis de una célula que sobreexpresa ErbB2 (por ejemplo 7C2, 7F3 o variantes humanizadas de los mismos). Preferentemente esta terapia combinada resulta en un efecto terapéutico sinérgico.

También puede resultar deseable combinar la administración del anticuerpo o anticuerpos anti-ErbB2 con la administración de un anticuerpo dirigido contra otro antígeno asociado a tumor. El otro anticuerpo en este caso puede unirse, por ejemplo, a EGFR, ErbB3, ErbB4 o factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF).

En una realización, la presente invención implica la utilización de un anticuerpo (o anticuerpos) anti-ErbB2 y uno o más agentes quimioterapéuticos o agentes inhibidores del crecimiento, incluyendo la coadministración de cócteles de diferentes agentes quimioterapéuticos. Entre los agentes quimioterapéuticos preferentes se incluyen taxanos (tales como el paclitaxel y el docetaxel) y/o antibióticos antraciclina. La preparación y programas de dosificación para esta quimioterapia también se describen en Chemotherapy Service, Ed. M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 1992.

El anticuerpo puede combinarse con un compuesto anti-hormonal, por ejemplo un compuesto anti-estrógeno, tal como el tamoxifeno; una anti-progesterona, tal como la onapristona (ver la patente EP nº 616.812), o un anti-andrógeno, tal como la flutamida, en dosis conocidas para estas moléculas. En el caso de que el cáncer que debe tratarse sea un cáncer andrógeno-independiente, el paciente puede haber sido sometido previamente a terapia anti-andrógenos y, tras convertirse el cáncer en andrógeno-independiente, administrarse al paciente el anticuerpo anti-ErbB2 (y opcionalmente otros agentes indicados en la presente invención).

En ocasiones, puede resultar beneficioso coadministrar también un cardioprotector (para prevenir o reducir la disfunción miocárdica asociada a la terapia) o una o más citoquinas al paciente. Además de a los regímenes terapéuticos anteriores, el paciente puede someterse a la eliminación quirúrgica de las células de cáncer y/o a terapia de radiación. Las dosis adecuadas para cualquiera de los agentes coadministrados anteriormente indicados son aquéllas utilizadas en la actualidad y pueden reducirse debido a la acción combinada (sinergia) del agente y el agente anti-ErbB2.

Para la prevención o tratamiento de las enfermedades, la dosis apropiada de anticuerpo dependerá del tipo de enfermedad que debe tratarse, tal como se ha definido anteriormente, la severidad y el curso de la enfermedad, si el anticuerpo se administra con fines preventivos o terapéuticos, la terapia anterior, el historial clínico del paciente y la respuesta al anticuerpo y el criterio del médico responsable. El anticuerpo se administra convenientemente al paciente en un tiempo o a lo largo de una serie de tratamientos. Dependiendo del tipo y la severidad de la enfermedad aproximadamente 1 \mug/kg a 15 mg/kg (por ejemplo 0,1 a 20 mg/kg) de anticuerpo es una dosis candidata inicial para la administración al paciente, sea, por ejemplo, mediante una o más administraciones separadas, o mediante infusión continua. Una dosis diaria típica puede encontrarse comprendida entre aproximadamente 1 \mug/kg y 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores anteriormente indicaos. Para las administraciones repetidas a lo largo de varios días o más, dependiendo de la condición, el tratamiento se sostiene hasta que se produce una supresión deseada de los síntomas de la enfermedad. Un régimen de dosificación preferente comprende administrar una dosis de carga inicial de aproximadamente 4 mg/kg, seguido de una dosis semanal de mantenimiento de aproximadamente 2 mg/kg del anticuerpo anti-ErbB2. Sin embargo, pueden resultar útiles otros regímenes de dosificación. El seguimiento del progreso de aplicar esta terapia se lleva a cabo con facilidad utilizando técnicas y ensayos convencionales.

La proteína anticuerpo se administra al paciente, o el anticuerpo puede administrarse mediante terapia génica. Ver, por ejemplo, la patente WO nº 96/07321, publicada el 14 de marzo de 1996, referente a la utilización de terapia génica para generar anticuerpos intracelulares.

Existen dos enfoques principales a la introducción del ácido nucleico (opcionalmente contenido en un vector en las células del paciente: in vivo y ex vivo. Para la administración in vivo, el ácido nucleico se inyecta directamente en el paciente, habitualmente en el sitio en el que se requiere el anticuerpo. Para el tratamiento ex vivo, se extraen las células del paciente, se introduce el ácido nucleico en estas células aisladas y las células modificadas se administran al paciente directamente o, por ejemplo, encapsulado dentro de membranas porosas que se implantan en el paciente (ver, por ejemplo, las patentes US nº 4.892.538 y nº 5.283.187). Se dispone de una diversidad de técnicas para introducir ácidos nucleicos en células viables. Las técnicas varían dependiendo de si el ácido nucleico se transfiere al interior de células cultivadas in vitro, o in vivo en las células del huésped pretendido. Entre las técnicas adecuadas para la transferencia de ácido nucleico en células de mamífero in vitro se incluyen la utilización de liposomas, la electroporación, la microinyección, la fusión celular, DEAE-dextrano, el procedimiento de precipitación con fosfato de calcio, etc. Un vector utilizado comúnmente para la administración ex vivo del gen es un retrovirus.

Entre las técnicas de transferencia de ácido nucleico in vivo preferentes en la actualidad se incluyen la transfección con vectores víricos (tales como adenovirus, virus Herpes simplex I o virus adenoasociados) y sistemas basados en lípidos (son lípidos útiles para la transferencia mediada por lípidos del gen, DOTMA, DOPE y DC-Chol, por ejemplo). En algunas situaciones resulta deseable proporcionar la fuente de ácido nucleico con un agente que reconozca las células diana, tal como un anticuerpo específico para una proteína membranal de superficie celular o para la célula diana, para un ligando para un receptor en la célula diana, etc. En el caso de que se utilicen liposomas, pueden utilizarse las proteínas que se unen a una proteína membranal de superficie celular asociada con la endocitosis para la dianización y/o para facilitar la incorporación, por ejemplo proteínas de cápside o fragmentos de las mismas trópicas para un tipo celular particular, anticuerpos para proteínas que experimentan internalización durante el ciclado, y proteínas que dirigen la localización intracelular y potencian la vida media intracelular. Se describe la técnica de la endocitosis mediada por receptor, por ejemplo por Wu et al., J. Biol. Chem. 262:4429-4432, 1987, y Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:3410-3414, 1990. Para una revisión de los protocolos conocidos actualmente de marcaje génico y terapia génica, ver Anderson et al., Science 256:808-813, 1992. Ver también la patente WO nº 93/25673 y las referencias citadas en la misma.

V. Artículos de fabricación

En otra realización de la invención, se proporciona un artículo de fabricación que contiene materiales útiles para el tratamiento del cáncer de próstata. El artículo de fabricación comprende un recipiente y una etiqueta o material impreso dentro del paquete sobre el recipiente o asociado con el mismo. Entre los recipientes adecuados se incluyen, por ejemplo botellas, viales, jeringas, etc. Los recipientes pueden formarse con una diversidad de materiales, tales como vidrio o plástico. El recipiente contiene una composición que resulta eficaz para tratar la condición y puede presentar una abertura de acceso estéril (por ejemplo el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial con un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica). Por lo menos un agente activo en la composición es el anticuerpo anti-ErbB2. El marcaje o material impreso en el paquete indica que la composición se utiliza para tratar el cáncer de próstata, el cáncer de próstata andrógeno-independiente, o el cáncer de próstata andrógeno-dependiente. Además, el artículo de fabricación puede comprender: (a) un primer recipiente con una composición contenida en el mismo, en el que la composición comprende un primer anticuerpo que se une a ErbB2 e inhibe el crecimiento de las células cancerosas que sobreexpresa ErbB2; y (b) un segundo recipiente con una composición contenida en el mismo, en el que la composición comprende un segundo anticuerpo que se une a ErbB2 y bloquea la activación de ligando de un receptor ErbB 50% a 100% más eficazmente que el anticuerpo monoclonal humanizado humMab4D5-8 tal como se da a conocer en la patente US nº 5.821.337. El artículo de fabricación en la presente realización de la invención puede comprende además un impreso en el paquete que indica que las primera y segunda composiciones de anticuerpo pueden utilizarse para tratar el cáncer de próstata. Alternativamente, o adicionalmente, el artículo de fabricación puede comprender además un segundo (o tercer) recipiente que comprende un tampón farmacéuticamente aceptable, tal como agua bacteriostática para inyección (BWFI), solución salina tamponada con fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. Además puede incluir otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas y jeringas.

VI. Depósito de materiales

Las líneas celulares de hibridoma siguientes se han depositado en la American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, USA (ATCC):

Denominación del anticuerpo	ATCC nº	Fecha de depósito
7C2	ATCC HB-12215	17 de octubre de 1996
7F3	ATCC HB-1221	17 de octubre de 1996
4D5	ATCC CRL 10463	24 de mayo de 1990
2C4	ATCC HB 12697	8 de abril de 1999

Se ilustran detalles adicionales de la invención mediante los Ejemplos no limitativos siguientes.

Ejemplo 1 Producción y caracterización de anticuerpo monoclonal 2C4

Los anticuerpos monoclonales murinos 2C4, 7F3 y 4D5 que se unen específicamente al dominio extracelular de ErbB2 se produjeron tal como se describe en Fendly et al., Cancer Research 50:1550-1558, 1990. Brevemente, las células NIH 3T3/HER2-3400 (que expresan aproximadamente 1 x 10^{5} moléculas de ErbB2/célula) producidas tal como se describe en Hudziak et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 84:7158-7163, 1987, se recolectaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contiene EDTA 25 mM y se utilizaron para inmunizar ratones BALB/c. Los ratones recibieron inyecciones i.p. de 10^{7} células en 0,5 ml de PBS en las semanas 0, 2, 5 y 7. Los ratones con antisueros que inmunoprecipitaron ErbB2 marcado con ^{32}P recibieron inyecciones i.p. de un extracto membranal de ErbB2 purificado en aglutinina de germen de trigo-sefarosa (WGA) en las semanas 9 y 13. A continuación, se llevó a cabo una inyección i.v. de 0,1 ml de la preparación de ErbB2 y los esplenocitos se fusionaron con la línea de mieloma de ratón X63-Ag8.653. Se cribaron los sobrenadantes de hibridoma para la unión de ErbB2 mediante ELISA y radioinmunoprecipitación.

Se determinaron los epítopos de ErbB2 que se unen a los anticuerpos monoclonales 4D5, 7F3 y 2C4 mediante análisis de unión competitiva (Fendly et al., Cancer Research 50:1550-1558, 1990). Se realizaron estudios de bloqueo cruzado en anticuerpos mediante fluorescencia directa en células intactas utilizando la máquina de cribado PANDEX^{TM} para cuantificar la fluorescencia. Cada anticuerpo monoclonal se conjugó con isotiocianato de fluoresceína (FITC) utilizando procedimientos establecidos (Wofsy et al., Selected Methods in Cellular Immunology, página 287, Mishel y Schiigi (editores), San Francisco: W.J. Freeman Co., 1980). Se tripsinizaron monocapas confluyentes de NIH 3T3/HER2-3 400, se lavaron una vez, y se resuspendieron a 1,75 x 10 6 células/ml en PBS frío que contenía albúmina de suero bovino al 0,5% (BSA) y NaN_{3} al 0,1%. Se añadió una concentración final de 1% de partículas de látex (IDC, Portland, OR) para reducir el atascamiento de las placas de membrana PANDEX^{TM}. Se añadieron células en suspensión, 20 \mul, y 20 \mul de anticuerpos monoclonales purificados (100 \mug/ml a 0,1 \mug/ml) a pocillos de placa PANDEX^{TM} y se incubaron en hielo durante 30 minutos. Se añadió a cada pocillo una dilución predeterminada de anticuerpos monoclonales marcados con FITC en 20 \mul, se incubaron durante 30 minutos, se lavaron, y la fluorescencia se cuantificó con el PANDEX^{TM}. Se consideró que los anticuerpos monoclonales compartían un epítopo si cada uno bloqueaba la unión del otro en un 50% o más en comparación con un anticuerpo monoclonal de control irrelevante. En este experimento, los anticuerpos monoclonales 4D5, 7F3 y 2C4 se asignaron los epítopos I, G/F y f, respectivamente.

Se evaluaron las características inhibidoras del crecimiento de los anticuerpos monoclonales 2C4, 7F3 y 4D5 utilizando la línea celular de tumor de mama, SK-BR-3 (ver Hudziak et al., Molec. Cell Biol. 9(3):1165-1172, 1989). Brevemente, las células SK-BR-3 se desengancharon utilizando tripsina al 0,25% (v/v) y se suspendieron en medio completo a una densidad de 4 x 10^{5} células por ml. Se sembraron alícuotas de 100 \mul (4 x 10^{4} células) placas de microdilución de 96 pocillos, las células se dejó que se adhiriesen, y después se añadieron 100 \mul de medios solos o medios que contienen anticuerpo monoclonal (concentración final: 5 \mug/ml). Tras 72 horas, las placas se lavaron dos veces con PBS (pH 7,5), se tiñeron con cristal violeta (0,5% en metanol) y se analizaron para la proliferación celular relativa tal como se describe en Sugarman et al., Science 230:943-945, 1985. Los anticuerpos monoclonales 2C4 y 7F3 inhibieron la proliferación celular relativa de SK-BR-3 en aproximadamente 20% y aproximadamente 38%, respecti-
vamente, en comparación con una inhibición de aproximadamente 56% alcanzada con el anticuerpo monoclonal 4D5.

Los anticuerpos monoclonales 2C4, 4D5 y 7F3 se evaluaron para su capacidad para inhibir la fosforilación de tirosinas de proteínas estimulada por HRG en el rango de M_{r} 180.000 a partir de lisados de células completas de células MCF7 (Lewis et al., Cancer Research 56:1457-1465, 1996). Se informa que las células MCF7 expresen todos los receptores ErbB conocidos, pero a niveles relativamente reducidos. Debido a que ErbB2, ErbB3 y ErbB4 presentan tamaños moleculares prácticamente idénticos, no resulta posible distinguir qué proteína se está fosforilando en las tirosinas cuando se evalúan los lisados de células completas mediante análisis de transferencia western. Sin embargo, estas células son ideales para los ensayos de fosforilación de tirosinas por HRG debido a que bajo las condiciones de ensayo utilizadas, en ausencia de HRG añadió exógenamente, muestran niveles bajos a indetectables de fosforilación de tirosinas de proteínas en el rango de M_{r} 180.000.

Las células MCF7 se sembraron en placas de 24 pocillos y se añadieron anticuerpos monoclonales contra ErbB2 a cada pocillo y se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente; después se añadió rHRG\beta1_{177-244} a cada pocillo hasta una concentración final de 0,2 nM, y se continuó con la incubación durante 8 minutos. Se aspiró el medio cuidadosamente de cada pocillo, y se detuvieron las reacciones mediante la adición de 100 \mul de tampón SDS de muestra (5% de SDS, DTT 25 mM y Tris-HCl 25 mM, pH 6,8). Cada muestra (25 \mul) se sometió a electroforesis en un gel en gradiente de 4% a 12% (Novex) y después se transfirió electroforéticamente a membrana de difluoruro de polivinilideno. Se revelaron membranas de inmunotransferencia antifosfotirosina (4G10, de UBI, utilizada a 1 \mug/ml), y se cuantificó la intensidad de la banda reactiva predominante a Mr-180.000 mediante densitometría de reflectancia, tal como se ha descrito anteriormente (Holmes et al., Science 256:1205-1210, 1992; Sliwkowski et al., J. Biol. Chem. 269:14661-14665, 1994).

Los anticuerpos monoclonales 2C4, 7F3 y 4D5, inhibieron significativamente la generación de una señal de fosforilación de tirosinas inducida por HRG a M_{r} 180.000. En ausencia de HRG, ninguno de estos anticuerpos fue capaz de estimular la fosforilación de tirosinas de proteínas en el rango de M_{r} 180.000. Además, estos anticuerpos no reaccionan cruzadamente con EGFR (Fendly et al., Cancer Research 50:1550-1558, 1990), ErbB3 o ErbB4. Los anticuerpos 2C4 y 7F3 inhibieron significativamente la estimulación por HRG de la fosforilación de tirosinas de p180 a <25% del control. El anticuerpo monoclonal 4D5 fue capaz de bloquear la estimulación por HRG de la fosforilación de tirosinas en -50%. La fig. 2A muestra las curvas de dosis-respuesta para la inhibición de 2C4 o 7F3 de la estimulación por HRG de la fosforilación de tirosinas de p180 según se determina mediante densitometría de reflectancia. La evaluación de estas curvas de inhibición utilizando un ajuste de 4 parámetros rindió una IC_{50} de 2,8 \pm 0,7 nM y 29,0 \pm 4,1 nM para 2C4 y 7F3, respectivamente.

La inhibición de la unión de HRG a líneas celulares de tumor mamario MCF7 por los anticuerpos anti-ErbB2 se llevaron a cabo con cultivos monocapa en hielo en un formato de placa de 24 pocillos (Lewis et al., Cancer Research 56:1457-1465, 1996). Se añadieron anticuerpos monoclonales anti-ErbB2 a cada pocillo y se incubaron durante 30 minutos. Se añadió rHRG\beta1_{177-244} marcado con ^{125}I (25 pm) y se continuó con la incubación durante 4 a 16 horas. La fig. 2B proporciona curvas de dosis-respuesta para la inhibición por 2C4 o 7F3 de la unión por HRG a células MCF7. Se incubaron concentraciones variables de 2C4 o 7F3 con células MCF7 en la presencia de rHRG\beta1 marcado con ^{125}I, y las curvas de inhibición se muestran en la fig. 2B. El análisis de estosatos rindió una IC_{50} de 2,4 \pm 0,3 nM y 19,0 \pm 7,3 nM para 2C4 y 7F3, respectivamente. Una inhibición máxima de -74% para 2C4 y 7F3 es consistente con los datos de fosforilación de tirosinas.

Para determinar si el efecto de los anticuerpos anti-ErbB2 observados en células MCF7 era un fenómeno general, se incubaron líneas celulares tumorales humanas con 2C4 o 7F3 y se determinó el grado de unión específica de rHRG\beta1 marcada con ^{125}I (Lewis et al., Cancer Research 56:1457-1465, 1996). Los resultados de este estudio se muestran en la fig. 3. La unión de rHRG\beta1 marcado con ^{125}I pudo ser inhibida significativamente por 2C4 o 7F3 en todas las líneas celulares, con la excepción de la línea celular de cáncer de mama MDA-MB-468, que se ha informado que expresa poco o nada de ErbB2. Las líneas celulares restantes se informa que expresan ErbB2, variando ampliamente el nivel de expresión de ErbB2 en estas líneas celulares. De hecho, el intervalo de expresión de ErbB2 en las líneas celulares sometidas a ensayo varía en más de 2 órdenes de magnitud. Por ejemplo, BT-20, MCF7 y Caov3 expresan \sim10^{4} receptores ErbB2/célula, mientras que BT-474 y SK-BR-3 expresan \sim10^{6} receptores ErbB2/célula. Dado el amplio abanico de expresión de ErbB2 en estas células y los datos anteriormente proporcionados, se concluyó que la interacción entre ErbB2 y ErbB3 o ErbB4, era en sí misma una interacción de afinidad elevada que tiene lugar en la superficie de la membrana plasmática.

Se evaluaron los efectos inhibidores del crecimiento de los anticuerpos monoclonales 2C4 y 4D5 sobre las células MDA-MB-175 y SK-BR-3 en presencia o en ausencia de rHRG\beta1 exógeno (Schaefer et al., Oncogene 15:1385-1394, 1997). Los niveles de ErbB2 en células MDA-MB-175 son 4 a 6 veces superiores que el nivel encontrado en células epiteliales de mama normales y el receptor ErbB2-ErbB4 se fosforila constitutivamente en las tirosinas en las células MDA-MB-175. Las células MDA-MB-175 se trataron con los anticuerpos monoclonales anti-ErbB2 2C4 y 4D5 (10 \mug/ml) durante 4 días. En un ensayo de tinción con cristal violeta, la incubación con 2C4 mostró un fuerte efecto inhibidor del crecimiento en esta línea celular (fig. 4A). La HRG exógena no revertió significativamente esta inhibición. Por otra parte, 2C4 no reveló ningún efecto inhibidor sobre la línea celular SK-BR-3 sobreexpresante de ErbB2 (Fig. 4B). El anticuerpo monoclonal 2C4 fue capaz de inhibir la proliferación celular de las células MDA-MB-175 en mayor grado que el anticuerpo monoclonal 4D5, tanto en presencia como en ausencia de HRG exógena. La inhibición de la proliferación celular por 4D5 depende del nivel de expresión de ErbB2 (Lewis et al., Cancer Immunol. Immunother. 37:255-263, 1993). Se pudo detectar una inhibición máxima del 66% en las células SK-BR-3 (fig. 4B). Sin embargo, este efecto pudo ser superado por la HRG exógena.

Ejemplo 2 La asociación dependiente de HRG de ErbB2 con ErbB3 se ve bloqueada por el anticuerpo monoclonal 2C4

La capacidad de ErbB3 de asociarse a ErbB2 se sometió a ensayo en un experimento de coinmunoprecipitación. Se sembraron 1,0 x 10^{6} de células MCF7 o SK-BR-3 en placas de seis pocillos de cultivo de tejido en medio 50:50 DMEM/Ham F12 que contenía suero de feto bovino (FBS) al 10% y HEPES 10 mM, pH 7,2 (medio de crecimiento) y se dejó que se enganchasen durante la noche. Las células se dejaron en ayuno durante dos horas en medio de crecimiento sin suero previamente al inicio del experimento.

Las células se lavaron brevemente con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y después se incubaron con 100 nM del anticuerpo indicado diluido en albúmina de suero bovino (BSA) al 0,2% p/v, medio RPMI, con HEPES 10 mM, pH 7,2 (tampón de unión) o con tampón de unión solo (control). Tras una hora a temperatura ambiente, se añadió HRG a una concentración final de 5 nM a la mitad de los pocillos (+). Se añadió un volumen similar de tampón de unión a los demás pocillos (-). Se continuó con la incubación durante aproximadamente 10 minutos.

Se extrajeron los sobrenadantes mediante aspiración y las células se lisaron en RPMI, HEPES 10 mM, pH 7,2, TRITON X-100^{TM} al 1,0% v/, CHAPS (tampón de lisis) al 1,0% p/v, que contenía PMSF 0,2 mM, 10 \mug/ml de leupeptina y 10 TU/ml de aprotinina. Los lisados se clarificaron de material insoluble mediante centrifugación.

Se inmunoprecipitó ErbB2 utilizando un anticuerpo monoclonal acoplado covalentemente a un gel de afinidad (Affi-Prep 10, Bio-Rad). Este anticuerpo (Ab-3, Oncogene Sciences) reconoce un epítopo de dominio citoplasmático. Se llevó a cabo la inmunoprecipitación añadiendo 10 \mul de suspensión de gel que contiene aproximadamente 8,5 \mug de anticuerpo inmovilizado a cada lisado, y las muestras se dejaron mezclar a temperatura ambiente durante dos horas. A continuación, los geles se recogieron mediante centrifugación. Los geles se lavaron por lotes tres veces con tampón de lisis para eliminar el material no unido. Después, se añadió tampón de muestra SDS y las muestras se calentaron brevemente en un baño de agua hirviendo.

Se corrieron sobrenadantes en geles de poliacrilamida al 4%-12% y se electrotransfirieron a membranas de nitrocelulosa. La presencia de ErbB3 se evaluó sondeando las membranas con un anticuerpo policlonal contra un epítopo de dominio citoplasmático del mismo (c-17, Santa Cruz Biotech). Las membranas se visualizaron utilizando un sustrato quimioluminiscente (ECL, Amersham).

Tal como se muestra en los carriles de control de las figs. 5A y 5B, para las células MCF7 y SK-BR-3, respectivamente, ErbB3 se encontraba presente en un inmunoprecipitado de ErbB2 sólo al estimular las células con HRG. Si en primer lugar se incubaban las células con anticuerpo monoclonal 2C4, se eliminó la señal de ErbB3 en las células MCF7 (fig. 5A, carril 2C4+) o se redujo sustancialmente en las células SK-BR-3 (fig. 5B, carril 2C4+). Tal como se muestra en las figs. 5A-B, el anticuerpo monoclonal 2C4 bloquea la asociación dependiente de heregulina de ErbB3 con ErbB2 tanto en las células MCF7 como SK-BR-3 sustancialmente más eficazmente que HERCEPTIN®. La preincubación con HERCEPTIN® redujo la señal de ErbB3 en lisados de MCF7 pero presentó poco o ningún efecto sobre la cantidad de ErbB3 coprecipitado de lisados SK-BR-3. La preincubación con un anticuerpo contra el receptor EGF (Ab-1, Oncogene Sciences) no presentó ningún efecto sobre la capacidad de ErbB3 de coinmunoprecipitar con ErbB2 en ninguna de las líneas celulares.

Ejemplo 3 Anticuerpos 2C4 humanizados y variantes de anticuerpo 2C4 madurados por afinidad

Los dominios variables del anticuerpo monoclonal murino 2C4 en primer lugar se clonaron en un vector que permite la producción de un fragmento Fab quimérico ratón/humano. Se aisló el ARN total de las células de hibridoma utilizando un kit de extracción de ARN Stratagene siguiendo los protocolos del fabricante. Los dominios variables se amplificaron mediante PCR-RT, se purificaron en gel y se insertaron en un derivado de un plásmido basado en pUC1 19 que contenía un dominio constante kappa humano y un dominio CH1 humano tal como se ha descrito anteriormente (Carter et al., PNAS (USA) 89:4285, 1992, y la patente US nº 5.821.337). El plásmido resultante se transformó en la cepa 16C9 de E. coli para la expresión del fragmento Fab. El crecimiento de los cultivos, la inducción de la expresión de proteínas y la purificación del fragmento Fab fueron tal como se ha descrito anteriormente (Werther et al., J. Immunol. 157:4986-4995, 1996; Presta et al., Cancer Research 57:4593-4599, 1997). Se comparó el fragmento Fab 2C4 quimérico purificado con el anticuerpo 2C4 parental murino con respecto a su capacidad de inhibir la unión de ^{125}I-HRG a las células MCF7 y de inhibir la activación por rHRG de la fosforilación de tirosinas de p180 en células MCF7. Tal como se muestra en la fig. 6A, el fragmento Fab 2C4 quimérico resulta muy eficaz en la alteración de la formación del sitio de unión ErbB2-ErbB3 de elevada afinidad en la línea celular de cáncer de mama humano, MCF7. El valor de IC_{50} relativo para la 2C4 murina intacta calculado fue de 4,0 \pm 0,4 nM, mientras que el valor para el fragmento Fab era de 7,7 \pm 1,1 nM. Tal como se ilustra en la fig. 6B, el fragmento Fab 2C4 quimérico monovalente resulta muy eficaz para alterar la activación de ErbB2-ErbB3 dependiente de HRG. El valor de IC_{50} calculado para el anticuerpo
monoclonal murino 2C4 intacto es de 6,0 \pm 2 nM, mientras que el valor para el fragmento Fab es de 15,0 \pm 2,0 nM.

La secuenciación del ADN del clon quimérico permitió la identificación de los residuos de CDR (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a edición, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991 (figs. 7A y B). Mediante la utilización de la mutagénesis sitio-dirigida de oligonucléotidos, se introdujeron la totalidad de las seis regiones CDR en un marco humano completo (V_{L} kappa subgrupo I y V_{H} subgrupo III) contenido en el plásmido VX4 tal como se ha descrito anteriormente (Presta et al., Cancer Research 57:4593-4599, 1997). Se expresó y purificó proteína del "intercambio de CDR" resultante tal como se ha indicado anteriormente. Se llevaron a cabo estudios de unión para comparar las dos versiones. Brevemente, se recubrió una placa MAXISORP^{TM} de NUNC con 1 microgramo por ml de dominio extracelular de ErbB2 (ECD; producido tal como se describe en la patente WO nº 90/14357) en tampón carbonato 50 mM, pH 9,6 durante la noche a 4ºC, y después se bloqueó con diluyente de ELISA (BSA al 0,5%, polisorbato 20 al 0,05%, PBS) a temperatura ambiente durante 1 hora. Se incubaron diluciones en serie de muestras en diluyente de ELISA en las placas durante 2 horas. Tras lavar, se detectó el fragmento Fab unido con anticuerpo kappa antihumano murino biotinilado (ICN 634771) seguido de peroxidasa de rábano conjugada con estreptavidina (Sigma) y utilizando 3,3’,5,5’-tetrametil bencidina (Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, MD) como sustrato. Se leyó la absorbancia a 450 nm. Tal como se muestra en la fig. 8A se perdió toda la unión al construir el fragmento Fab humano de intercambio de CDR.

Para restaurar la unión del Fab humanizado, se construyeron mutantes utilizando ADN del intercambio de CDR como molde. Utilizando un modelo generado por ordenador (fig. 9), estas mutaciones se diseñaron para cambiar los residuos de región marco humana en sus contrapartidas murinas en posiciones en las que el cambio podría afectar las conformaciones del CDR o la interfase anticuerpo-antígeno. Los mutantes se muestran en la Tabla 2.

TABLA 2

Denominación de las mutaciones de FR de 2C4 humanizado
Nº de mutante	Sustituciones en región marco (FR)
560	ArgH71Val
561	AspH73Arg
562	ArgH71Val, AspH73Arg
568	ArgH71Val, AspH73Arg, AlaH49Gly
569	ArgH71Val, AspH73Arg, PheH67Ala
570	ArgH71Val, AspH73ARg, AsnH76ARg
571	ArgH71Val, AspH73Arg, LeuH78Val
574	ArgH71Val, AspH73Arg, IleH69Leu
56869	ArgH71Val, AspH73Arg, AlaH49Gly, PheH67Ala

Se muestran las curvas de unión para los diversos mutantes en las figs. 8A-C. El Fab humanizado versión 574, con los cambios ArgH71Val, AspH73Arg e IleH69Leu, aparentemente presenta propiedades de unión restauradas respecto al fragmento Fab 2C4 quimérico original. Pueden modificarse residuos de FR y/o de CDR adicionales, tales como L2, L54, L55, L56, H35 y/o H48 pueden modificarse (por ejemplo sustituidas de la manera siguiente: IleL2Th; ArgL54Leu; TyrL55Glu; ThrL56Ser; AspH35Ser y ValH48Ile) con el fin de refinar o potenciar adicionalmente la unión del anticuerpo humanizado. Alternativamente, o adicionalmente, el anticuerpo humanizado puede madurarse por afinidad (ver anteriormente) con el fin de mejorar o refinar adicionalmente su afinidad y/o otras actividades biológicas.

El 2C4 humanizado versión 574 se maduró por afinidad utilizando un procedimiento de expresión fágica. Brevemente, se clonó el Fab 2C4.574 humanizado en un vector de expresión fágica en forma de una fusión de gen III. Cuando se inducen mediante infección las partículas fágicas utilizando el fago ayudante M13KO7, esta fusión permite expresar el Fab en el extremo N-terminal de la proteína de fibra de cola fágica, gen III (Baca et al., J. Biol. Chem. 272:10678, 1997).

Se construyeron bibliotecas individuales para cada uno de los 6 CDRs identificados anteriormente. En estas bibliotecas, los aminoácidos en los CDRs identificados utilizando un modelo generado por ordenador (fig. 9) como potencialmente significativos en la unión a ErbB2 se aleatorizaron utilizando oligos que contenían "NNS" como sus codones. A continuación, las bibliotecas se cribaron contra ECD de ErbB2 recubierto en placas de MAXISORP^{TM} de NUNC con 3% de leche seca en PBS con TWEEN 20® al 0,2% (MPBST) utilizado en lugar de todas las soluciones de bloqueo. Con el fin de seleccionar para los fagos con afinidades superiores a la de 2C4.574, en las rondas de cribado 3, 4 y 5, se añadió ErbB2-ECD o Fab 2C4.574 soluble durante las etapas de lavado como competidor. Se extendieron los tiempos de lavado a 1 hora a temperatura ambiente.

Tras 5 rondas de cribado, se analizaron nuevamente clones individuales mediante ELISA de fago. Se cultivaron clones individuales en placas de cultivo de tejido de fondo en U de 96 pocillos, y los fagos se indujeron mediante la adición de fago ayudante. Tras el crecimiento durante la noche, se peletizaron las células de E. coli, y se transfirieron los sobrenadantes que contenían fago a placas de 96 pocillos en las que el fago se bloqueó con MPBST durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas MAXISORP^{TM} de NUNC recubiertas con ErbB2-ECD se bloquearon también con MPBST tal como se ha indicado anteriormente. Los fagos bloqueados se incubaron en las placas durante 2 horas. Tras lavar, se detectó el fago unido utilizando anticuerpo monoclonal anti-M13 conjugado con peroxidasa de rábano (Amersham Pharmacia Biotech, Inc. 27-9421-01) diluida 1:5.000 en MPBST, seguido de 3,3’,5,5’-tetrametil bencidina como sustrato. Se leyó la absorbancia a 450 nm.

Se secuenció el ADN de los 48 clones de cada biblioteca que proporcionaron las señales más altas. Aquellos clones cuyas secuencias se encontraron con más frecuencia se subclonaron en el vector descrito anteriormente que permite la expresión de Fabs solubles. Estos Fabs se indujeron, las proteínas se purificaron y los Fabs purificados se analizaron para la unión mediante ELISA tal como se ha descrito anteriormente y la unión se comparó con la de 2C4.versión 574 humanizado de partida.

Tras identificar las mutaciones interesantes en los CDRs individuales, se construyeron y sometieron a ensayo tal como se ha indicado anteriormente mutantes adicionales que eran diversas combinaciones de ellos. Los mutantes que proporcionaron una unión mejorada comparado con 574 se describen en la Tabla 3.

TABLA 3 Denominación de los mutantes derivados de la maduración por afinidad de 2C4.574

1

2

\newpage

También se han construido los mutantes siguientes, y en la actualidad se encuentran bajo evaluación:

200

Los mutantes siguientes, sugeridos por un escaneo de homología, se encuentran bajo construcción en la actualidad:

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+\hfil#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 678 \+  \hskip3cm  \+ thrH30ala\cr  679 \+ \+ thrH30ser\cr  680 \+
\+ lysH64arg\cr  681 \+ \+ leuH96val\cr  682 \+ \+ thrL97ala\cr  683
\+ \+ thrL97ser\cr  684 \+ \+ tyrL96phe\cr  685 \+ \+ tyrL96ala\cr 
686 \+ \+ tyrL91phe\cr  687 \+ \+ thrL56ala\cr  688 \+ \+
glnL28ala\cr  689 \+ \+
glnL28glu\cr}

El aminoácido preferente en H34 sería metionina. Puede realizarse un cambio a leucina si se observa oxidación en esta posición.

Se encontró que AsnH52 y AsnH53 resultaban fuertemente preferentes para la unión. El cambio de estos residuos a alanina o a ácido aspártico redujo drásticamente la unión.

Se ha preparado un anticuerpo intacto que comprende Fav versión 574 humanizado con una región constante de cadena pesada de IgG1 humana (ver la patente US nº 5.821.337). Las células de ovario de hámster chino (CHO) producen el anticuerpo intacto.

Ejemplo 4 El anticuerpo monoclonal 2C4 bloquea la activación mediada por EGF, TGF-\alpha o HRG de MAPK

Muchos receptores de factor de crecimiento señalizan a través de la ruta de la proteína quinasa activada por mitógeno (MAPK). Estas quinasas de doble especificidad son uno de los puntos de valoración claves en las rutas de transducción de señales que finalmente desencadenan la división de las células cancerosas. La capacidad del anticuerpo monoclonal 2C4 o de HERCEPTIN® de inhibir la activación por EGF, TGF-\alpha o HRG de MAPK se evaluó de la manera siguiente.

Se sembraron en placa células MCF7 (10^{5} células/pocillo) en medio que contenía suero en placas de cultivo celular de 12 pocillos. Al día siguiente, se extrajeron los medios celulares y se añadió a cada pocilo medio fresco que contenía 0,1% de suero. A continuación, se repitió este procedimiento al día siguiente y previamente al ensayo se sustituyó el medio con tampón de unión libre de suero (Jones et al., J. Biol. Chem. 273:11667-74, 1998; y Schaefer et al., J. Biol. Chem. 274:859-66, 1999). Se dejó que las células se equilibrasen a la temperatura ambiente y después se incubaron durante 30 minutos con 0,5 ml de HERCEPTIN® 200 Nm o anticuerpo monoclonal 2C4. Después, las células se trataron con EGF 1 nM, TGF-\alpha 1 nM o HRG 0,2 nM durante 15 minutos. Se detuvo la reacción aspirando el medio celular y después añadiendo 0,2 ml de tampón de muestra SDS-PAGE que contenía 1% de DTT. Se evaluó la activación de MAPK mediante transferencia western utilizando un anticuerpo anti-MAPK activo (Promega) tal como se ha descrito anteriormente (Jones et al., J. Biol. Chem. 273:11667-74, 1998).

Tal como se muestra en la fig. 10, el anticuerpo monoclonal 2C4 bloquea significativamente la activación mediada por EGF, TGF-\alpha y HRG de MAPK en mayor grado que HERCEPTIN®. Estos datos sugieren que el anticuerpo monoclonal 2C4 se une a una superficie de ErbB2 que se utiliza por su asociación con EGFR o ErbB3 y de esta manera previene la formación del complejo de receptor de señalización.

Ejemplo 5 Efecto de HERCEPTIN® sobre el crecimiento del cáncer de próstata humano andrógeno-dependiente y andrógeno-independiente

El efecto de la monoterapia de HERCEPTIN® en los modelos de xenoinjerto de cáncer de próstata andrógeno-dependiente y andrógeno-independiente y la combinación de HERCEPTIN® con paclitaxel se estudiaron en modelos preclínicos de cáncer de próstata humano. Se utilizaron modelos de xenoinjerto de cáncer de próstata humano CWR22 y LNCap andrógeno-dependiente y sublíneas andrógeno-independientes de CWR22 (Nagabhushan et al., Cancer Res. 56:3042-3046, 1996; Wainstein et al., Cancer Res. 54:6049-6052, 1994, y Stearns et al., Prostate 36:56-58, 1998).

Materiales y métodos

Estudios animales. Se obtuvieron ratones BALB/c atímicos machos y hembra de cuatro a seis semanas del National Cancer Institute-Frederick Cancer Center y se mantuvieron en jaulas ventiladas presurizadas en el Sloan-Kettering Institute. Se inocularon s.c. animales macho con 1 x 10^{6} células LNCaP o tejido tumoral triturado de CWR22 andrógeno-dependiente, y las hembras recibieron las sublíneas andrógeno-independientes CWR22R o CWR22SA 1, CWRSA4, CWRSA6 que se obtuvieron seleccionando tumores para el recrecimiento y PSA sérico incrementado tras la retirada de los andrógenos. Todas las líneas se inyectaron untas con membrana basal reconstituida (Matrigel; Collaborative Research, Bedford, MA) tal como se ha descrito anteriormente (Nagabhushan et al., Cancer Res. 56:3042-3046, 1996; Wainstein et al., Cancer Res. 54:6049-6052, 1994; y Sato et al., Cancer Res. 57:1584-1589, 1997). Para mantener los niveles de testosterona séricos, se implantaron en ratones macho 12,5 mg de pellets de liberación sostenida de testosterona (Innovative Research of America, Sarasota, FL) s.c. antes de recibir la inoculación de células tumorales. Los tratamientos consistieron de la inyección i.p. dos veces por semana de 20 mg/kg de HERCEPTIN® en PBS durante no menos de 3 semanas y/o paclitaxel (TAXOL®, Bristol Myers-Squibb Company, Princeton, NJ) s.c. a dosis baja (6,25 mg/kg s.c., 5x/semana x 3 semanas) o a dosis elevada (12,5 mg/kg s.c., 5x/semana x 2 semanas) en solución salina estéril. Los ratones de control recibieron vehículo solo. Los tumores se midieron cada 3-4 días con calibrador Vernier y se calcularon los volúmenes de tumor mediante la fórmula: p/6 x diámetro mayor x (diámetro menor)^{2}. Se asignaron a los grupos de tratamiento los animales con tumores establecidos según palpación de volumen superior a 65 mm^{3}.

Determinación del estatus ErbB2 de los xenoinjertos. Los xenoinjertos se sometieron a ensayo para la expresión de ERbB2 mediante inmunohistoquímica utilizando los kits ERbB2 de DAKO (HERCEPTEST®, DAKO Corporation, Carpinteria, CA). Las muestras se puntuaron ciegamente comparando con controles estándar en los estándares del kit DAKO y se puntuaron de la manera siguiente: 0 (no tinción, o tinción de membrana en menos del 10% de las células tumorales), 1+ (tinción leve de las membranas en más del 10% de las células tumorales), 2+ (tinción débil a moderada completa de las membranas en >10% de las células) o 3+ (tinción moderada a fuerte completa de las membranas en >10% de las células). Se consideró que una puntuación de 0 o de 1+ era negativa para la sobreexpresión de ErbB2, mientras que 2+ o 3+ indicaban la sobreexpresión de ErbB2. Se realizó análisis FISH utilizando los kits Oncor (sistema de detección de gen ErbB2 INFORM®, Oncor Inc., Gaithersburg, MD). Se evaluó un mínimo de 100 células tumorales en cada tumor para el número de copia del gen nuclear ErbB2 (Ross et al., Hum. Pathol. 28:827-833, 1997).

Determinación de los valores séricos de PSA. Se recogieron muestras de sangre (-50 ml) de ratones macho en tubos microtainer separadores de suero (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) mediante incisión superficial de la vena dorsal de la cola previamente a la terapia, y en los días 9 y 21 de tratamiento. A continuación, se determinaron los valores de PSA de suero utilizando el ensayo inmunoradiométrico Tandem-R de PSA (Hybritech, San Diego, CA).

Análisis estadístico. Se compararon las diferencias por pares entre los volúmenes de tumor de los grupos de tratamiento a lo largo del tiempo utilizando un ensayo de permutación. La hipótesis nula para este ensayo es quel tratamiento no presenta ningún efecto diferencial sobre los volúmenes de tumor a lo largo del tiempo. El estadístico utilizado para someter a ensayo la hipótesis era la suma de las diferencias al cuadrado entre el volumen tumoral medio sumado en todos los puntos del tiempo.

3

Se utilizó SS_Dev con el fin de capturar las diferencias medias entre grupos de tratamiento en cada punto del tiempo. Este estadístico refleja la magnitud de las diferencias entre las trayectorias del volumen tumoral medio de los dos grupos de tratamiento.

Resultados

Tinción inmunohistoquímica de ErbB2 y número de copia del gen ErbB2 de los xenoinjertos de próstata. Se examinaron mediante inmunohistoquímica (IHC) y FISH los patrones de expresión de ErbB2 de los xenoinjertos de próstata andrógeno-dependientes y andrógeno-independientes. Los tumores CWR22 andrógeno-dependientes parentales mostraron tinción 2+ de ErbB2 y los tumores LNCaP, tinción 3+ de ErbB2. Las sublíneas andrógeno-independientes de CWR22 mostraron tinción 2+ (CWRSA1), 3+ (CWRSA4), 2+ (CWRSA6) y 1+ (CWR22R) para ErbB2. Todos los tumores presentaban un número de copia (intervalo normal) del gen ErbB2 2-4 según FISH.

Efectos de HERCEPTIN® sobre los xenoinjertos de cáncer de próstata. Se llevaron a cabo experimentos animales para evaluar la eficacia de HERCEPTIN® en xenoinjertos de cáncer de próstata andrógeno-dependientes y andrógeno-independientes. Se utilizaron las modelos CWR22, LNCaP, CWR22R y CWRSA6 para estos experimentos debido a que proporcionan curvas de crecimiento reproducibles. Se administró HERCEPTIN® intraperitonealmente (i.p.) a una dosis de 20 mg/kg dos veces por semana tras el establecimiento del xenoinjerto. No se observó ningún efecto de HERCEPTIN® sobre el crecimiento tumoral en cualquiera de los tumores andrógeno-independientes en comparación con los controles (CWR22R, p=0,60, n=10, fig. 11A; CWRSA6, p=0,63, n=10, fig. 11B). El anticuerpo anti-ErbB2 murino, 4D5, tampoco presentó ningún efecto sobre el crecimiento tumoral en la línea andrógeno-independiente CWR22R (p=0,21, n=10). En contraste, HERCEPTIN® no mostró inhibición significativa del crecimiento en ambos modelos de xenoinjerto andrógeno-dependeinte: CWR22 (68% de inhibción del crecimiento, p<0,03, n=12, fig. 11C) y LNCaP (inhibición del crecimiento del 89%, p=0,002, n=12, fig. 11D).

Efectos de HERCEPTIN® en combinación con TAXOL® sobre xenoinjertos tumorales establecidos. Al coadministrar paclitaxel y HERCEPTIN® a animales, se observó una reducción marcada del volumen tumoral frente al control en tumores tanto andrógeno-dependientes como andrógeno-independientes (CWR22, inhibición del crecimiento del 98%, p<0,01, fig. 11E; CWR22R, inhibición delcrecimiento del 92%, p<0,01, fig. 11G; LNCaP, inhibición del crecimiento del 94%, p=0,006, fig. 11F; CWRSA6, inhibición del crecimiento del 77%, p<0,01, fig. 11H). Se observó una inhibición del crecimiento incrementada con la combinación de HERCEPTIN® y paclitaxel en comparación con cada agente por sí solo al final del periodo de tratamiento en los animales con xenoinjertos andrógeno-dependientes (figs. 11E-H): el grupo CWR22 (volúmenes tumorales medos, n=6 en cada grupo, paclitaxel 408 mm^{3}, HERCEPTIN® 520 mm^{3}, paclitaxel y HERCEPTIN® 76 mm^{3}; p<0,03 paclitaxel frente a paclitaxel y HERCEPTIN®) y el grupo de LNCaP (volúmenes tumorales medios, n=6 en cada grupo, paclitaxel 233 mm^{3}, HERCEPTIN® 163 mm^{3}, paclitaxely HERCEPTIN® 82 mm^{3}; p<0,03, paclitaxel frente a paclitaxel y HERCEPTIN®). Además, se observó una inhibición del crecimiento incrementada con la combinación de HERCEPTIN® y paclitaxel frente a cada agente por sí solo al final del periodo de tratamiento en los animales con xenoinjertos andrógeno-independientes (figs. 11E-H): el grupo CWRSA6 (volúmenes tumorales medios, n=5 en cada grupo, paclitaxel 1.496 mm^{3}, HERCEPTIN® 2.941 mm^{3}, paclitaxel y HERCEPTIN® 687 mm^{3}, p<0,001 paclitaxel frente a paclitaxel y HERCEPTIN®) y el grupo CWR22R (volúmenes tumorales medios, n=5 en cada grupo, paclitaxel 1.273 mm^{3}, HERCEPTIN® 3.811 mm^{3}, paclitaxel y HERCEPTIN® 592 mm^{3}; p=0,095 frente a paclitaxel y HERCEPTIN®).

Efectos del HERCEPTIN® sobre el índice PSA en los animales tratados con xenoinjertos andrógeno-dependientes. Tal como se muestra en las figs. 12A y B, se observó un incremento significativo del índice de antígeno específico de la próstata (PSA) (ng de PSA/ml de suero/mm3 de tumor) en grupos andrógeno-dependientes tratados con HERCEPTIN® en comparación con el control (CWR22, 1.864% frente a -4%, p<0,0001, fig. 12A; LNCaP, 232% frente a -68%, p<0,001, fig. 12B). También se observó un incremento del índice PSA tras el tratamiento de combinación con HERCEPTIN® y paclitaxel en comparación con los valores de pretratamiento.

Conclusiones

En estos sistemas modelo de cáncer de próstata, HERCEPTIN® solo presenta actividad clínica únicamente en los tumores andrógeno-dependientes y presenta un efecto por lo menos aditivo sobre el crecimiento, en combinación con paclitaxel, en tumores tanto andrógeno-dependientes como andrógeno-independientes. La respuesta frente al HERCEPTIN® no se correlacionaba con los niveles de PSA, ya que el índice PSA se incrementó marcadamente en el grupo tratado con HERCEPTIN®, permaneciendo constante en el grupo de control.

Ejemplo 6 Efecto del anticuerpo monoclonal 2C4 sobre el cáncer de próstata humano andrógeno-dependientes y andrógeno-independiente

Se evaluó el efecto de un anticuerpo, que bloquea la activación de ligando de un receptor ErbB, sobre el cáncer de próstata humano. En particular, la respuesta de los tumores de xenoinjerto frente a HERCEPTIN®, anticuerpo monoclonal 2C4, paclitaxel y el tratamiento de combinación 2C4/paclitaxel se determinó utilizando el tumor andrógeno-dependiente CWR2 y los tumores CWR22R y CWRSA6 andrógeno-independientes descritas en el Ejemplo 5 anteriormente. Se administraron los anticuerpos y el paclitaxel tal como se describe en el Ejemplo 5.

La respuesta del tumor CWR22 andrógeno-dependiente frente a la terapia se muestra en las figs. 13 y 14. Los resultados se proporcionan como volumen tumoral medio \pm SE. Los volúmenes tumorales de los animales ilustrados en la fig. 13 demuestran que HERCEPTIN® presenta actividad clínica en este modelo andrógeno-dependiente, de la misma manera que el anticuerpo monoclonal 2C4. La combinación de anticuerpo monoclonal 2C4 y TAXOL® demuestra una inhibición incrementada del crecimiento cuando se compara 2C4 o TAXOL® por sí solos (fig. 14, p=0,003).

La respuesta de los tumores andrógeno-independientes CWR2R y CWRSA6 frente a la terapia con HERCEPTIN®, anticuerpo monoclonal 2C4, paclitaxel o el tratamiento de combinación 2C4/paclitaxel se muestra en las figs. 15 a 18. Los resultados se proporcionan como volumen tumoral medio \pm SE. Los volúmenes tumorales de los animales ilustrados en las figs. 15 y 17 demuestran que HERCEPTIN® presenta poca o ninguna actividad clínica en estos modelos andrógeno-independientes, mientras que el anticuerpo monoclonal 2C4 presenta actividad clínica en estos modelos. La combinación de anticuerpo monoclonal 2C4 y TAXOL® demuestra una inhibición del crecimiento incrementada en comparación con anticuerpo monoclonal 2C4 o TAXOL® por sí solos (figs. 16 y 18, p=0,002).

Se expresó en E. coli un fragmento Fab’ de rhuMAb 2C4 y se conjugó con polietilenglicol ramificado de 20 kD (PEG), tal como se describe en la patente WO nº 98/37200. Se evaluó la capacidad del anticuerpo 2C4 murino (20 mg/kg), rhuMAb 2C4 (20 mg/kg) y el fragmento Fab pegilado (PEG-Fab; 20 ó 40 mg/kg) de tratar el cáncer de próstata andrógeno-independiente in vivo, utilizando el xenoinjerto CWR22R anteriormente indicado. Todas las inyecciones se proporcionaron IP (N=5). Los resultados de estos estudios se muestran en la fig. 23. Estos datos demuestran que la inhibición tumoral observada con 2C4 en el modelo CWR22R no requiere un anticuerpo bivalente intacto. Debido a que estos fragmentos Fab no contienen Fc, un mecanismo inmunológico, tal como ADCC, probablemente pueden descartarse. Estos resultados son consistentes con los mostrados en la fig. 6 utilizando un sistema in vitro y versiones quiméricas del Fab 2C4. La observación de que 2C4 inhibe el crecimiento tumoral en forma de fragmento monovalente también presta credibilidad a la idea de que esta inhibición es un resultado de bloquear la capacidad de ErbB2 de heterodimerizarse con otros miembros de la familia ErbB y de esta manera inhibe el inicio de sucesos de señalización corriente abajo.

Los estudios de respuesta de dosis se llevaron a cabo utilizando rhuMAb 4D5 en los xenoinjertos CWR22R y MSKPC6 (Agus et al., Cancer Research 59:4761-4764, 1999) andrógeno-independientes. Los animales recibieron dosis IP de: control, dosis de carga de 6 mg/kg y después 3 mg/kg dos veces por semana; 20 mg/kg de dosis de carga y después 10 mg/kg dos veces por semana; o 60 mg/kg de dosis de carga y después 30 mg/kg dos veces por semana. Los resultados de estos estudios se muestran en las figs. 24 y 25. Estos datos demuestran que 2C4 suprime el crecimiento de los xenoinjertos tumorales andrógeno-independientes de una manera dosis-dependiente. Además, estos resultados confirman adicionalmente que esta inhibición del crecimiento tumoral se debe al tratamiento con 2C4 y que no es un artefacto experimental.

Se muestra en la fig. 21 un resumen de los resultados típicos de los estudios en los Ejemplos 5 y 6.

Ejemplo 7 Niveles de TGF-\alpha y de HB-EGF en el cáncer de próstata humano andrógeno-dependiente y andrógeno-independiente

Se evaluaron en el presente ejemplo los niveles de ARNm de TGF-\alpha y de HB-EGF en las células CWR22 (andrógeno-dependientes) y las células CWR22R (andrógeno-independientes).

Materiales y métodos

Preparación de ARNm. Se proceso tejido tumoral congelado de acuerdo con el protocolo Qiagen (kit Qiagen Maxi nº 75163). Brevemente, se realizó la homogeneización de tejido con un homogeneizador Brinkman Polytron (Pt-3000) dotado de un generador PT-DA 3012/2 TS utilizando pulsos de 15 segundos seguidos de pausas de 30 segundos. Este procedimiento se repitió tres veces y el extracto se cargó en una columna Qiagen y se lavó siguiendo las especificaciones del fabricante. Las columnas se eluyeron con 1 ml de agua libre de ARNasa y se determinó el contenido de ARN a partir de la absorbancia a 260 nm. Debido a que se expresan TGF-\alpha y HB-EGF en la línea celular MDA-MB-231, se utilizó ARN total de estas células como estándar para la cuantificación de TGF-\alpha y de HB-EGF.

PCR cuantitativa en tiempo real. Se cuantificó el ARNm de TGF-\alpha y HB-EGF utilizando PCR cuantitativa en tiempo real o técnica TaqMan tal como se ha descrito previamente (Gibson et al., Genome Research 6:986-994, 1996, y Heid et al., Genomic Research 6:986-994, 1996). La secuencia de los conjuntos de cebador/sonda utilizados para este análisis se muestran a continuación:

TGF-\alpha

F

5’-GGACAGCACTGCCAGAGA-3’ (SEC ID nº 14)

R

5’-CAGGTGATTACAGGCCAAGTAG-3’ (SEC ID nº 15)

P

5’FAM-CCTGGGTGTGCCACAGACCTTCA-TAMRA-p-3’ (SEC ID nº 16)

HB-EGF:

F

5’-TGAAGTTACCTCCAGGTTGGT-3’ (SEC ID nº 17)

R

5’-AGACACATTCTGTCCATTTTCAA-3’ (SEC ID nº 18)

P

5’-FAM-CAAGCTGCAAAGTGCCTTGCTCAT-TAMRA-p-3’ (SEC ID nº 19)

en las que F y R son los cebadores sentido e inverso, respectivamente, y P es la sonda marcada fluorescentemente. \beta-actina se utilizó como gen de mantenimiento. Los conjuntos de cebador/sonda para la \beta-actina:

\beta-actina

F

5’-ATGTATCACAGCCTGTACCTG-3’ (SEC ID nº 20)

R

5’-TTCTTGGTCTCTTCCTCCTTG-3’ (SEC ID nº 21)

P

5’FAM-AGGTCTAAGACCAAGGAAGCACGCAA-TAMRA-p-3’ (SEC ID nº 22)

Se llevó a cabo análisis TaqMan en un formato estándar de placa de 96 pocillos. Se construyeron curvas estándar utilizando 0,6 a 150 ng de ARNm para el análisis de TGF-\alpha y HB-EGF y 9,4 a 150 ng para la \beta-actina. Se realizó cada dilución por duplicado. Para las muestras de tumor, se utilizaron 100 ng para todos los genes analizados.

Resultados

Tal como se muestra en las figs. 19-20, la línea de tumor de próstata andrógeno-independiente, CWR22R, expresó niveles significativamente superiores de los ligandos de EGF, TGF-\alpha y HB-EGF en comparación con la línea celular andrógeno-dependiente CWR22. Específicamente, se expresó TGF-\alpha a niveles 8-9 superiores en el tumor CWR22R que el tumor CWR22. De manera similar, HB-EGF se expresó \sim19 veces más en CWR22R que CWR22.

Ejemplo 8 Efecto de 2C4 o de HERCEPTIN® sobre el índice PSA en animales con xenoinjertos andrógeno-dependientes

Tal como se muestra en la fig. 22, se midió el índice PSA (definido como ng de PSA/ml de suero/mm^{3} de tumor) en los animales andrógeno-dependientes el día 21, cerca del final del tratamiento. Se produjo un incremento significativo del índice PSA en los animales andrógeno-dependientes tratados con HERCEPTIN®, mientras que los animales de control mostraron una reducción del índice PSA (LNCaP; control=0,6 respecto al valor de pretratamiento, grupo HERCEPTIN®=2,35 respecto al valor de pretratamiento en el día 21; CWR22: control=1,0 respecto al valor de pretratamiento, grupo HERCEPTIN®=18 respecto al valor de pretratamiento en el día 21). El índice PSA relativo se redujo en el grupo no tratado LNCaP, presumiblemente como consecuencia de la necrosis incrementada que se produce al incrementarse el tamaño del tumor. En contraste, no se produjo ningún efecto significativo de 2C4 sobre el índice PSA de los tumores tratados en comparación con los controles. Sin limitarse a ninguna teoría, una posible explicación para este fenómeno puede relacionarse con el grado de activación de ErbB2 en las células de cáncer de próstata. La activación de ErbB2 puede causar el crecimiento andrógeno-independiente mediante comunicación cruzada con la ruta de señalización del receptor de andrógeno (Craft et al., Nature Med. 5:280-285, 1999). En nuestros sistemas modelo, la unión de HERCEPTIN® a ErbB2 conduce a la secreción celular incrementada de PSA de una manera andrógeno-independiente (Agus et al., Cancer Res. 59:4761-4764, 1999). Este resultado apoya adicionalmente la idea de la comunicación cruzada entre las rutas de señalización de ErbB2 y del receptor de andrógeno.

Ejemplo 9 Efecto del anticuerpo 7C2 anti-ErbB2 sobre los xenoinjertos andrógeno-dependientes y andrógeno-independientes

Se comparó el efecto del anticuerpo monoclonal 7C2 (ATCC nº HB-12215) que induce la apoptosis de las células sobreexpresantes de ErbB2 con el del anticuerpo monoclonal 2C4 en el xenoinjerto CWR22 andrógeno-dependiente. Se administraron ambos anticuerpos en dosis de 20 mg/kg dos veces por semana. Tal como se muestra en la fig. 26, al igual que 2C4 y HERCEPTIN®, 7C2 también resulta eficaz en el tratamiento del cáncer de próstata andrógeno-dependiente. También se evaluó el efecto de 7C2 sobre el cáncer de próstata andrógeno-independiente utilizando el xenoinjerto CWR22R. La fig. 27 muestra que 7C2 por si solo no resultó eficaz en este modelo, pero que resultó eficaz en combinación con TAXOL®.

Ejemplo 10 Terapia del cáncer de próstata metastásico reincidente o refractario

RhuMAb 2C4 es un anticuerpo monoclonal humanizado de longitud completa (producido en células CHO) dirigido contra ErbB2. RhuMAb 2C4 bloquea la asociación de ErbB2 con otros miembros de la familia ErbB, inhibiendo de esta manera la señalización intracelular a través de la ruta de ErbB. En contaste con HERCEPTIN®, rhuMAb 2C4 no sólo inhibe el crecimiento de los tumores sobreexpresantes de ErbB2, sino que también bloquea el crecimiento de tumores que requieren la señalización dependiente de ligando de ErbB.

RhuMAb 2C4 está indicado como agente único para el tratamiento de los pacientes de cáncer de próstata refractario a hormonas (andrógeno-independiente). Entre los puntos de valoración primarios para la eficacia se incluyen la supervivencia global en comparación con los mejores cuidados disponibles (mitoxantrona/prednisona), utilizados como único agente, y la seguridad. Entre los puntos de valoración de eficacia secundarios se incluyen: tiempo hasta la progresión de la enfermedad, tasa de respuesta, calidad de vida, dolor y/o duración de la respuesta. Se administró RhuMAb 2C4 intravenosamente (IV) semanalmente o cada tres semanas a 2 ó 4 mg/kg, respectivamente, hasta la progresión de la enfermedad. Se suministró el anticuerpo en forma de formulación líquida multidosis (20 ml de llenado a una concentración de 20 mg/ml o a una concentración superior).

Entre los ejemplos de fármacos que pueden combinarse con el anticuerpo anti-ErbB2 (que bloquea la activación de ligando de un receptor ErbB2) para tratar el cáncer de próstata (por ejemplo cáncer de próstata andrógeno-independiente) se incluyen un inhibidor de farnesil transferasa, un agente anti-angiogénico (por ejemplo un anticuerpo anti-VEGF), un fármaco dirigido por EGFR (por ejemplo C225 o ZD1839), otro anticuerpo anti-ErbB2 (por ejemplo un anticuerpo anti-ErbB2 inhibidor del crecimiento, tal como HERCEPTIN® o un anticuerpo anti-ErbB2 que induce la apoptosis, tal como 7C2 o 7F3, incluyendo las variantes humanizadas y/o maduradas por afinidad de las mismas); una citoquina (por ejemplo IL-2, IL-12, G-CSF o GM-CSF), un anti-andrógeno (tal como flutamida o acetato de ciproterona), leuprólido, suramina, un agente quimioterapéutico, tal como vinblastina, estramustina, mitoxantrona, liarozol (un agente bloqueante del metabolismo del ácido retinoico), ciclofosfamida, antibióticos antraciclina, tales como doxorubina, un taxano (por ejemplo paclitaxel o docetaxel) o metotrexato, o cualquier combinación de los mimos, tales como vinblastina/estramustina, o ciclofosfamida/doxorubicina/metotrexato, prednisona, hidrocortisona, o combinaciones de los mismos. Pueden administrarse dosis estándar de estos diversos fármacos, por ejemplo 40 mg/m^{2}/semana de docetal (TAXOTERE®); 6 (AUC) carboplatino, y 200 mg/m^{2} de paclitaxel (TAXOL®).

<110> Genentech, Inc. et al.

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<120> TRATAMIENTO DEL CÁNCER DE PRÓSTATA CON ANTICUERPOS ANTI-ErbB2

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<130> P1760R1PCT

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<141> 2000-06-23

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<150> US 60/141.315

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<151> 1999-06-25

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<160> 22

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<210> 1

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<211> 107

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<212> PRT

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<213> Mus musculus

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<400> 1

4

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<210> 2

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<211> 119

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<212> PRT

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<213> Mus musculus

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<400>2

5

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<210> 3

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<211> 107

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<212> PRT

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<213> artificial

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<400> 3

6

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<210> 4

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<211> 119

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<212> PRT

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<213> artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<221> artificial

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<222> 1-119

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<223> Fab 574 VH

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<400> 4

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7

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<210> 5

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<211> 107

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<212> PRT

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<213> artificial

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<400> 5

8

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<210> 6

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<211> 119

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<212> PRT

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<213> artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

9

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<213> Mus musculus

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<221> no determinado

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<222> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<223> aminoácido desconocido

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

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\sa{Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tys Thr Met Xaa}

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

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<211> 17

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<212> PRT

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<213> Mus musculus

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<400> 8

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\sa{Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe}

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

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<211> 10

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<212> PRT

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<213> Mus musculus

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

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\sa{Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr}

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

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<211> 11

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<212> PRT

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<213> Mus musculus

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

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\sa{Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly Val Ala}

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> no determinado

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<222> 5-7

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<223> aminoácido desconocido

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

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\sa{Ser Ala Ser Tyr Xaa Xaa Xaa}

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Mus musculus

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

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\sa{Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr Thr}

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

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<211> 645

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<212> PRT

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<213> humano

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<400> 13

10

11

12

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<210> 14

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<211> 18

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<212> ADN

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<213> artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

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\hskip-.1em\dddseqskip

ggacagcact gccagaga

\hfill

18

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

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<211> 22

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<212> ADN

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<213> artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

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\hskip-.1em\dddseqskip

caggtgatta caggccaagt ag

\hfill

22

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

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<211> 23

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<212> ADN

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<213> artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

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\hskip-.1em\dddseqskip

cctggtgtg ccacagacct tca

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

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<212> ADN

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<213> artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

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\hskip-.1em\dddseqskip

tgaagttacc tccaggttgg t

\hfill

21

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

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<211> 23

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<212> ADN

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<213> artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

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\hskip-.1em\dddseqskip

agacacattc tgtccatttt caa

\hfill

23

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

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<211> 24

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<212> ADN

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<213> artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

caagctgcaa agtgccttgc tcat

\hfill

24

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

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<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

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\hskip-.1em\dddseqskip

atgtatcaca gcctgtacct g

\hfill

21

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

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<211> 21

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<212> ADN

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<213> artificial

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<400> 21

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ttcttggtct cttcctcctt g

\hfill

21

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

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<211> 26

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<212> ADN

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<213> artificial

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<400> 22

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aggtctaaga ccaaggaagc acgcaa

\hfill

26

Claims (21)

1. Utilización de un anticuerpo que se une a ErbB2 y que bloquea la activación de ligando de un receptor ErbB 50% a 100% más eficazmente que el anticuerpo monoclonal humanizado huMAb4D5-8 tal como se da a conocer en la patente US nº 5.821.337 para la preparación de un medicamento para el tratamiento del cáncer de próstata en un ser humano, en el que el anticuerpo bloquea la unión del anticuerpo monoclonal 2C4 obtenible del depósito ATCC nº HB 12697 a ErbB2.

2. Utilización según la reivindicación 1, en la que el cáncer de próstata es cáncer de próstata andrógeno-independiente.

3. Utilización según la reivindicación 1, en la que el anticuerpo bloquea la activación por TGF-\alpha de la proteína quinasa activada por mitógeno (MAPK).

4. Utilización según la reivindicación 1, en la que el anticuerpo bloquea la formación de un heterooligómero ErbB.

5. Utilización según la reivindicación 4, en la que el anticuerpo comprende anticuerpo monoclonal 2C4 obtenible del depósito ATCC nº HB12697 o de 2C4 humanizado.

6. Utilización según la reivindicación 1, en la que el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo.

7. Utilización según la reivindicación 6, en la que el fragmento de anticuerpo es un fragmento Fab.

8. Utilización según la reivindicación 1, en la que el anticuerpo no se encuentra conjugado con un agente citotóxico.

9. Utilización según la reivindicación 6, en la que el fragmento de anticuerpo no se encuentra conjugado con un agente citotóxico.

10. Utilización según la reivindicación 1, en la que el anticuerpo se encuentra conjugado con un agente citotóxico.

11. Utilización según la reivindicación 1, en la que el cáncer de próstata es cáncer de próstata andrógeno-dependiente.

12. Utilización según la reivindicación 11, en la que el medicamento comprende además un taxano.

13. Utilización según la reivindicación 11, en la que la administración del medicamento resulta en un índice de antígeno específico de próstata (PSA) incrementado en el ser humano.

14. Utilización según la reivindicación 11, en la que el anticuerpo comprende anticuerpo monoclonal 2C4 obtenible del depósito ATCC nº HB 12697 o 2C4 humanizado.

15. Utilización de un agente quimioterapéutico y un anticuerpo que se une a ErbB2 y bloquea la activación de ligando de un receptor ErbB 50% a 100% más eficazmente que el anticuerpo monoclonal humanizado huMAb4D5-8 tal como se da a conocer en la patente US nº 5.821.337 para la preparación de un medicamento para el tratamiento del cáncer de próstata en un ser humano, en el que el anticuerpo bloquea unión del anticuerpo monoclonal 2C4 obtenible del depósito ATCC nº HB 12697 a ErbB2.

16. Utilización según la reivindicación 15, en la el agente quimioterapéutico es un taxano.

17. Artículo de fabricación que comprende un recipiente y una composición contenida en el mismo, en el que la composición comprende un anticuerpo que se une a ErbB2 y bloquea la activación de ligando de un receptor ErbB 50% a 100% más eficazmente que el anticuerpo monoclonal humanizado huMAb4D5-8 tal como se da a conocer en la patente US nº 5.821.337, y que comprende además material impreso en el paquete que indica que la composición puede utilizarse para tratar el cáncer de próstata, en el que el anticuerpo bloquea la unión de anticuerpo monoclonal 2C4 obtenible del depósito ATCC nº 12697 a ErbB2.

18. Artículo de fabricación según la reivindicación 17, en el que el cáncer de próstata es cáncer de próstata andrógeno-independiente.

19. Artículo de fabricación según la reivindicación 17, en el que el material impreso en el paquete indica además tratar el paciente con un agente quimioterapéutico.

20. Artículo de fabricación según la reivindicación 19, en el que el agente quimioterapéutico es un taxano.

21. Artículo de fabricación según la reivindicación 17, en el que el cáncer de próstata es cáncer de próstata andrógeno-dependiente.