PT1189634E - Tratamento de cancro da próstata com anticorpos anti-erbb2. - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "Tratamento de cancro da próstata com anticorpos anti-ErbB2" Campo do invento 0 presente invento refere-se ao tratamento de cancro da próstata com anticorpos anti-ErbB2.

Antecedentes do invento A família ErbB de receptores tirosina-quinase constitui um conjunto de mediadores importantes do crescimento, diferenciação e sobrevivência celulares. A família de receptores inclui quatro membros distintos incluindo receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR ou ErbBl), HER2 (ErbB2 ou pl85neu), HER3 (ErbB3) e HER4 (ErbB4 ou tyro2) . 0 EGFR, codificado pelo gene erbBl, tem sido implicado como causador de malignidade humana. Nomeadamente, observou-se expressão aumentada de EGFR em cancro da mama, bexiga, pulmão, cabeça, pescoço e estômago assim como em glioblastomas. A expressão aumentada do receptor EGFR é muitas vezes associada à produção aumentada do ligando de EGFR, o factor de crescimento por transformação alfa (TGF-α), pelas mesmas células de tumor resultando na activação do receptor por uma via de estimulação autócrina. Baselga e Mendelsohn Pharmac. Ther. 64:127-154 (1994). Avaliaram-se anticorpos monoclonais dirigidos contra o EGFR ou seus ligandos, TGF-α e EGF, como agentes terapêuticos no tratamento de tais malignidades. Consultar, por exemplo, Baselga e Mendelsohn., supra; Masui et al. Câncer Research 44:1002-1007 (1984); e Wu et al. J. Clin. Invest. 95:1897-1905 (1995). O segundo membro da família ErbB, pl85neu, foi originalmente identificado como o produto do gene de transformação de neuroblastomas de ratos tratados quimicamente. A forma activada do proto-oncogene neu resulta de uma mutação pontual (valina para ácido glutâmico) na região transmembranar da proteína codificada. Observa-se amplificação do homólogo humano de neu em cancros da mama e do ovário e correlaciona-se com um prognóstico fraco (Slamon et al., 2

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Science, 235:177-182 (1987); Slamon et al., Science, 244:707-712 (1989); e patente U.S. n.° 4 968 603). Até à data não se relataram quaisquer análogos de mutações pontuais do proto-oncogene neu para tumores humanos. A sobre-expressão de ErbB2 (frequente mas não uniformemente devido a amplificação génica) tem sido também observada noutros carcinomas incluindo carcinomas do estômago, endométrio, glândula salivar, pulmão, rim, cólon, tiróide, pâncreas e bexiga. Consultar, entre outros, King et al., Science, 229:974 (1985); Yokota et al.,

Lancet: 1:765-767 (1986); Fukushigi et al., Mol Cell Biol., 6:955-958 (1986); Geurin et al., Oncogene Res., 3:21-31 (1988); Cohen et al., Oncogene, 4:81-88 (1989); Yonemura et al., Câncer Res., 51:1034 (1991); Borst et al., Gynecol. Oncol., 38:364 (1990); Weiner et al., Câncer Res., 50:421-425 (1990); Kern et al., Câncer Res., 50:5184 (1990); Park et al., Câncer Res., 49:6605 (1989); Zhau et al., Mol. Carcinog., 3:354-357 (1990); Aasland et al. Br. J. Câncer 57:358-363 (1988); Williams et al. Pathiobiology 59:46-52 (1991); e McCann et al., Câncer, 65:88-92 (1990). O ErbB2 pode ser sobre-expresso em cancro da próstata (Gu et al. Câncer Lett. 99:185-189 (1996); Ross et al. Hum. Pathol. 28:827-833 (1997); Ross et al. Câncer 79:2162-2170 (1997); e Sadasivan et al. J. Urol. 150:126-131 (1993)). Descreveram-se anticorpos dirigidos contra os produtos proteicos de pl85neu de rato e ErbB2 humano. Drebin e colaboradores desenvolveram anticorpos contra o produto do gene neu de rato, pl85neu. Consultar, por exemplo, Drebin et al., Cell 41:695-706 (1985); Myers et al., Meth. Enzym. 198:277-290 (1991); e W094/22478. Drebin et al.

Oncogene 2:273-277 (1988) relatam que misturas de anticorpos reactivos com duas regiões distintas de ρΐδδ'101' resultam em efeitos antitumorais sinérgicos sobre células NIH-3T3 transformadas com neu implantadas em ratinhos nus. Consultar também patente U.S. 5 824 311 concedida a 20 de Outubro de 1998.

Hudziak et al., Mol. Cell. Biol. 9(3):1165-1172 (1989) descrevem a geração de um painel de anticorpos anti-ErbB2 que se caracterizaram utilizando a linha celular de tumor da mama humano SKBR3. Determinou-se a proliferação celular relativa das células SKBR3 após exposição aos anticorpos por coloração com violeta de cristal das monocamadas após 72 horas. Utilizando este ensaio, obteve-se inibição máxima com o 3

ΕΡ 1 189 634 /PT anticorpo denominado 4D5 que inibiu a proliferação celular em 56%. Outros anticorpos do painel reduziram a proliferação celular em menor grau neste ensaio. Verificou-se adicionalmente que o anticorpo 4D5 sensibilizava linhas celulares de tumor da mama que sobre-expressam ErbB2 para os efeitos citotóxicos de TNF-α. Consultar também patente U.S. n.° 5 677 171 concedida a 14 de Outubro de 1997. Os anticorpos anti-ErbB2 discutidos em Hudziak et al. são adicionalmente caracterizados em Fendly et al. Câncer Research 50:1550-1558 (1990): Kous et al, In Vltro 26(3):59A (1990); Sarup et al. Growth Regulation 1:72-82 (1991); Shepard et al. J. Clin.

Immunol. 11(3):117-127 (1991); Kumar et al. Mol. Cell. Biol. 11(2):979-986 (1991); Lewis et al. Câncer Immunol. Immunother. 37:255-263 (1993): Pietras et al. Oncogene 9:1829-1838 (1994); Vitetta et al. Câncer Research 54:5301-5309 (1994); Sliwkowski et al. J. Biol. Chem. 269(20):14661-14665 (1994); Scott et al. J. Biol. Chem. 266:14300-5 (1991); D'souza et al. Proc. Natl. Acad Sei. 91:7202-7206 (1994): Lewis et al. Câncer Research 56:1457-1465 (1996): e Schaefer et al. Oncogene 15:1385-1394 (1997).

Uma versão humanizada recombinante do anticorpo 4D5 anti-ErbB2 murino (huMAb4D5-8, rhuMAb HER2 ou HERCEPTIN®; patente U.S. n.° 5 821 337) é clinicamente activa em doentes com cancros da mama metastáticos que sobre-expressam ErbB2 que receberam terapia anti-cancro extensiva prévia (Baselga et al., J. Clin. Oncol. 14:737-744 (1996)). O HERCEPTIN® recebeu aprovação de comercialização do Organismo para Controlo de Alimentos e Medicamentos dos E.U.A. ("Food and Drug Administration") a 25 de Setembro de 1998 para o tratamento de doentes com cancro da mama metastático cujos tumores sobre-expressam a proteina ErbB2. WO 99/31140 refere-se ao tratamento de doenças caracterizadas pela sobre-expressão de ErbB2. Mais especificamente, ao tratamento de doentes humanos susceptiveis ou diagnosticados com cancro que sobre-expressam ErbB2, com uma combinação de um anticorpo anti-ErbB2 e um agente quimioterapêutico diferente de atraciclina, por exemplo doxorrubicina ou epirrubicina. 4

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Descreveram-se outros anticorpos anti-ErbB2 com propriedades diferentes em Tagliabue et al. Int. J. Câncer 47:933-937 (1991); MeKenzie et al. Oncogene 4:543-548 (1989); Maier et al. Câncer Res. 51:5361-5369 (1991); Bacus et al. Molecular Carcinogenesis 3:350-362 (1990): Stancovski et al. PNAS (USA) 88:8691-8695 (1991); Bacus et al. Câncer Research 52:2580-2589 (1992); Xu et al. Int. J. Câncer 53:401-408 (1993); W094/00136; Kasprzyk et al. Câncer Research 52:2771-2776 (1992); Hancock et al. Câncer Res. 51 :4575-4580 (1991); Shawver et al. Câncer Res. 54:1367-1373 (1994); Arteaga et al. Câncer Res. 54:3758-3765 (1994); Harwerth et al. J. Biol. Chem. 267:15160-15167 (1992): patente U.S. n.° 5 783 186: e Klapper et al. Oncogene 14:2099-2109 (1997).

Utilizou-se um anticorpo scFv intracelular dirigido contra ErbB2 para regular negativamente a expressão membranar deste receptor nas linhas celulares DU145, LNCaP e PC3 (Myers et al. Proceedings of the American Association for Câncer Research Annual Meeting, 37(0): 342, n.° 2334 (1996)).

Em Skrepnik et al. J. Urology 161: 984-989 (1999) trataram-se utilizando uma oncotoxina, xenoenxertos subcutâneos em ratinhos cultivados a partir de linhas celulares DU145 e PC3. A oncotoxina incluía um anticorpo anti-erbB2 incluído num domínio de anticorpo de cadeia única acoplado com uma parte da exotoxina A de Pseudomonas, que inibia a síntese de proteínas em células alvo.

Utilizou-se um anticorpo biespecífico (MDX-H210) incluindo um local de reconhecimento para ErbB2 em combinação com GM-CSF num ensaio clínico de fase II para o tratamento de cancro da próstata (James et al. Brit J. Câncer 78(2): 19, 056 (1998)). O rastreio por homologia resultou na identificação de dois outros membros da família de receptores ErbB; ErbB3 (patentes US 5 183 884 e 5 480 968 assim como Kraus et al. PNAS (USA) 86:9193-9197 (1989)) e ErbB4 (pedido de patente EP 599 274; Plowman et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 90:1746-1750 (1993); e Plowman et al., Nature. 366:473-475 (1993)). Ambos estes receptores apresentam expressão aumentada em pelo menos algumas linhas celulares de cancro da mama. 5

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Os receptores ErbB encontram-se geralmente em diferentes combinações em células e pensa-se que a heterodimerização aumenta a diversidade de respostas celulares a diferentes ligandos de ErbB (Earp et al. Breast Câncer Research and Treatment 35: 115-132 (1995)). 0 EGFR liga-se a seis ligandos; factor de crescimento epidérmico (EGF), factor de crescimento por transformação alfa (TGF-α), anfirregulina, factor de crescimento epidérmico de ligação a heparina (HB-EGF), betacelulina e epirregulina (Groenen et al. Growth Factors 11:235-257 (1994)). Uma família de proteínas herregulina resultante de splicing alternativo de um único gene são ligandos para ErbB3 e ErbB4. A família da herregulina inclui as herregulinas alfa, beta e gama (Holmes et al., Science, 256:1205-1210 (1992); patente U.S. 5 641 869; e Schaefer et al. Oncogene 15:1385-1394 (1997)); factores de diferenciação neu (NDF), factores de crescimento glial (GGF); actividade de indução de receptor de acetilcolina (ARIA); e factor derivado de neurónios motores e sensoriais (SMDF). Para uma revisão consultar Groenen et al. Growth Factors 11:235-257 (1994);

Lemke, G. Molec. & Cell. Neurosci. 7:247-262 (1996) e Lee et al. Pharm. Rev. 47:51-85 (1995). Recentemente identificaram-se mais três ligandos de ErbB; neurregulina-2 (NRG-2) que se relata ligar quer ErbB3 quer ErbB4 (Chang et al. Nature 387 509-512 (1997); e Carraway et al. Nature 387:512-516 (1997)); neurregulina-3 que liga ErbB4 (Zhang et al. PNAS (USA) 94(18):9562-7 (1997)); e neurregulina-4 que liga ErbB4 (Harari et al. Oncogene 18:2681-2689 (1999)) hb-egf, betacelulina e epirregulina também se ligam a ErbB4.

Embora o EGF e o TGFa não se liguem a ErbB2, o EGF estimula o EGFR e o ErbB2 para formarem um heterodímero que activa EGFR e resulta na transfosforilação de ErbB2 no heterodímero. A dimerização e/ou a transfosforilação parecem activar a tirosina-quinase ErbB2. Consultar Earp et al., supra. Igualmente, quando ErbB3 é co-expressa com ErbB2, forma-se um complexo de sinalização activo e anticorpos dirigidos contra ErbB2 são capazes de dissociar este complexo (Sliwkowski et al., J. Bíol. Chem., 269(20):14661-14665 (1994)). Adicionalmente, a afinidade de ErbB3 para herregulina (HRG) é aumentada para um estado de afinidade superior quando co-expressa com ErbB2. Consultar também, Levi et al., Journal of Neuroscience 15: 1329-1340 (1995); Morrissey et al., Proc. 6

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Natl. Acad. Sei. USA 92: 1431-1435 (1995); e Lewis et al., Câncer Res.r 56:1457-1465 (1996) relativamente ao complexo de proteína ErbB2-ErbB3. ErbB4, tal como ErbB3, forma um complexo de sinalização activo com ErbB2 (Carraway e Cantley, Cell 78:5-8 (1994)) .

Sumário do invento

Num primeiro aspecto, o presente invento proporciona a utilização de um anticorpo que liga ErbB2 e bloqueia a activação por ligandos de um receptor ErbB com uma eficácia 50-100% maior que o anticorpo monoclonal humanizado huMAb4D5-8 tal como revelado na patente US 5 821 337, para o fabrico de um medicamento para tratar cancro da próstata (por exemplo cancro da próstata independente de androgénio) num ser humano. O anticorpo bloqueia a ligação do anticorpo monoclonal 2C4 a ErbB2 e de preferência bloqueia activação por TGF-α de proteína-quinase activada por mitogénio (MAPK). O invento proporciona adicionalmente a utilização de um agente quimioterapêutico (por exemplo um taxano) e de um anticorpo que liga ErbB2 e bloqueia activação por ligandos de um receptor ErbB com uma eficácia 50-100% maior que o anticorpo monoclonal humanizado huMAb4D5-8 tal como revelado na patente US 5 821 337, para o fabrico de um medicamento para tratar cancro da próstata num humano. O anticorpo bloqueia a ligação do anticorpo monoclonal 2C4, obtenível do depósito ATCC HB 12697, a ErbB2.

Pode utilizar-se administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo que liga ErbB2 para tratar cancro da próstata dependente de androgénio num ser humano e opcionalmente resulta num índice aumentado de antigénio específico da próstata (PSA) em seres humanos. O anticorpo, tal como o anticorpo monoclonal 2C4 (por exemplo 2C4 humanizado), é tal que bloqueia activação por ligandos de um receptor ErbB2. Um agente quimioterapêutico, de preferência um taxano, pode ser adicionalmente administrado ao ser humano. O invento, num aspecto adicional, proporciona um artigo de fabrico incluindo um recipiente e uma composição nele contida em que a composição inclui um anticorpo que liga ErbB2 e 7

ΕΡ 1 189 634 /PT bloqueia a activação por ligandos de um receptor ErbB com uma eficácia 50-100% maior que o anticorpo monoclonal humanizado huMAb4D5-8 tal como revelado na patente US 5 821 337 e incluindo adicionalmente um folheto incluso indicando que a composição pode ser utilizada para tratar cancro da próstata, por exemplo cancro da próstata dependente de androgénio, em que o anticorpo bloqueia a ligação do anticorpo monoclonal 2C4, obtenivel do depósito ATCC HB 12697, a ErbB2. O folheto incluso indica além disso, opcionalmente, tratamento do doente com um agente quimioterapêutico tal como taxano.

Descrição sucinta dos desenhos

As figuras IA e 1B representam o mapeamento de epitopos dos resíduos 22-645 contidos no domínio extracelular (ECD) de ErbB2 (sequência de aminoácidos incluindo sequência de sinalização, apresentada na figura IA; SEQ ID NO:13) tal como determinados por análise de mutantes de truncagem e mutagénese dirigida ao local (Nakamura et al. J. of virology 67(10):6179-6191 (1993): e Renz et al. J. Cell Biol. 125(6):1395-1406 (1994)). As diferentes truncagens ou mutações pontuais de ErbB2-ECD foram preparadas a partir de ADNc utilizando tecnologia de reacção em cadeia com polimerase. Os mutantes ErbB2 foram expressos como proteínas de fusão gD num plasmídeo de expressão de mamífero. Este plasmídeo de expressão utiliza o promotor/facilitador de citomegalovírus com sinais de terminação e de poliadenilação de SV40 localizados a jusante do ADNc inserido. O ADN plasmídico foi transfectado para células 293. Um dia após a transfecção, marcaram-se metabolicamente as células durante a noite em DMEM isento de metionina e cisteína com baixo teor de glucose contendo soro fetal de bovino dialisado a 1% e 25 pCi de cada um de 35S-metionina e 35S-cisteína. Recolheram-se os sobrenadantes e adicionaram-se quer os anticorpos monoclonais anti-ErbB2 quer anticorpos de controlo ao sobrenadante e incubou-se 2-4 horas a 4°C. Precipitaram-se os complexos, aplicaram-se num gel de gradiente de tricina-SDS a 10-20% e submeteu-se a electroforese a 100 V. Efectuou-se electrotransferência do gel para uma membrana e analisou-se por autorradiografia. Tal como apresentado na figura 1B os anticorpos anti-ErbB2 7C2, 7F3, 2C4, 7D3, 3E8, 4D5, 2H11 e 3H4 ligam-se a diferentes epitopos do ECD de ErbB2. 8

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As figuras 2A e 2B apresentam o efeito de anticorpos monoclonais anti-ErbB2, 2C4 e 7F3, sobre a activação de rHRGpi de células MCF7. A figura 2A apresenta curvas dose-resposta para inibição por 2C4 ou 7F3 de estimulação de HRG da fosforilação de tirosina. A figura 2B apresenta curvas dose-resposta para a inibição da ligação de rHRGpli77-244 marcado com 125I a células MCF-7 por 2C4 ou 7F3. A figura 3 representa a inibição de ligação especifica de η^β1ΐ77-244 marcado com 125I a um painel de linhas celulares tumorais humanas pelos anticorpos monoclonais anti-ErbB2 2C4 ou 7F3. Os controlos de anticorpo monoclonal são anticorpos monoclonais murinos dos isotipos correspondentes que não bloqueiam a ligação de rHRG. A ligação não especifica de rHRGpii77-244 marcado com I foi determinada a partir de incubações paralelas efectuadas na presença de rHRGpl 100 nM. Os valores para ligação não especifica de rHRGpii77-244 marcado com 125I foram inferiores a 1% do total para todas as linhas celulares ensaiadas.

As figuras 4A e 4B apresentam o efeito dos anticorpos monoclonais 2C4 e 4D5 na proliferação de células MDA-MB-175 (figura 4A) e SK-BR-3 (figura 4B). Cultivaram-se células MDA-MB-175 e SK-BR-3 em placas de 96 poços e deixaram-se aderir durante 2 horas. A experiência foi efectuada em meio contendo soro a 1%. Adicionaram-se anticorpos anti-ErbB2 ou meio sozinho e incubaram-se as células durante 2 horas a 37°C. Subsequentemente adicionou-se rHRGpi (1 nM) ou meio sozinho e incubaram-se as células durante 4 dias. Lavaram-se as monocamadas e coraram-se/fixaram-se com violeta de cristal a 0,5%. Para determinar a proliferação celular mediu-se a absorvância a 540 nm.

As figuras 5A e 5B apresentam o efeito do anticorpo monoclonal 2C4, anticorpo HERCEPTIN® ou um anticorpo anti-EGFR sobre a associação dependente da herregulina (HRG) de ErbB2 com ErbB3 em células MCF7 que expressam níveis baixos/normais de ErbB2 (figura 5A) e células SK-BR-3 que expressam niveis elevados de ErbB2 (figura 5B); consultar exemplo 2 adiante.

As figuras 6A e 6B comparam as actividades do anticorpo monoclonal 2C4 murino intacto (mu 2C4) e um fragmento Fab 9 ΕΡ 1 189 634 /PT quimérico de 2C4. A figura 6A apresenta a inibição da ligação de I-HRG a células MCF-7 por Fab quimérico de 2C4 ou anticorpo monoclonal murino intacto 2C4. Cultivaram-se células MCF7 em placas de 24 poços (lxlO5 células/poço) e cresceram-se até cerca de 85% da confluência durante dois dias. Conduziram-se experiências de ligação tal como descrito em Lewis et al. Câncer Research 56:1457-1465 (1996). A figura 6B apresenta a inibição da activação de rHRGpl de fosforilação de tirosina pl80 em células MCF-7 efectuado tal como descrito em Lewis et al. Câncer Research 56:1457-1465 (1996).

As figuras 7A e 7B representam alinhamentos da sequência de aminoácidos dos domínios variável leve (VL) (figura 7A) e variável pesado (VH) (figura 7B) do anticorpo monoclonal murino 2C4 (SEQ ID N0:1 e 2, respectivamente); os domínios VL e Vh da versão Fab humanizada 574 (SEQ ID N0:3 e 4, respectivamente) e esqueletos de consenso de VL e VH humanos (hum κΐ, capa subgrupo leve I; humIII, subgrupo pesado III) (SEQ ID N0:5 e 6, respectivamente). Os asteriscos identificam diferenças entre a versão Fab humanizada 574 e o anticorpo monoclonal murino 2C4 ou entre a versão Fab humanizada 574 e o esqueleto humano. As Regiões Determinantes de Complementaridade (CDR) estão entre parêntesis.

As figuras 8A a C apresentam a ligação de Fab quimérico de 2C4 (Fab.v 1) e diferentes variantes de 2C4 humanizadas, ao domínio extracelular (ECD) de ErbB2 tal como determinado por ELISA no exemplo 3. A figura 9 é um diagrama de fitas dos domínio VL e VH do anticorpo monoclonal 2C4 com o esqueleto CDR branco marcado (Ll, L2, L3, Hl, H2, H3) . Apresentam-se igualmente as cadeias laterais VH avaliadas por mutagénese durante a humanização (consultar exemplo 3, tabela 2). A figura 10 representa o efeito do anticorpo monoclonal 2C4 ou HERCEPTIN® sobre a activação mediada por EGF, TGF-α ou HRG da proteína-quinase activada por mitogénio (MAPK).

As figuras 11A a H representam a resposta de xenoenxertos de tumores a tratamento com HERCEPTIN® (H, ), controlo (C, o), TAXOL® (T, A) e combinação HERCEPTIN®/TAXOL® (H/T, 0). 10

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Apresentam-se as resposta dos tumores independentes de androgénio CWR22R e CWRSA6 (figuras 11A e B, respectivamente) e dos tumores dependentes de androgénio CWR22 e LNCaP (figuras 11C e D, respectivamente), a HERCEPTIN® e ao controlo. Apresenta-se a resposta dos tumores a HERCEPTIN®, TAXOL®, HERCEPTIN® e TAXOL® e controlo na figura 11E (CWR22); figura 11F (LNCaP); figura 11G (CWR22R); e figura 11H (CWRSA6). Apresentam-se os resultados como volume médio de tumor +/- EP.

As figuras 12A e 12B representam respostas relativas de indices de antigénio específico da próstata (PSA) de animais com xenoenxertos de cancro da próstata dependente de androgénio tratados com HERCEPTIN®. Na figura 12A, o índice de PSA foi medido no modelo de xenoenxerto LNCaP antes do tratamento e nos dias 9 e 21 após início do tratamento e expresso relativamente a valores anteriores ao tratamento. Na figura 12B, mediu-se o índice de PSA no modelo de xenoenxerto CWR22 antes do tratamento e anos dias 9 e 21 após início do tratamento e expressou-se relativamente a valores anteriores ao tratamento. Apresentam-se resultados com PSA médio relativo +/- EP. A figura 13 representa a resposta do tumor dependente de androgénio CWR22 à terapia com anticorpo de controlo (C, A), HERCEPTIN® (H, o) ou anticorpo monoclonal 2C4 (2, ). A administração de 2C4 designada por *; a administração de HERCEPTIN® designada por +. A figura 14 representa a resposta do tumor dependente de androgénio CWR22 à terapia com TAXOL® sozinho (T, o), anticorpo monoclonal 2C4 sozinho (2, ) ou uma combinação de anticorpo monoclonal 2C4 e TAXOL® (2/T, A). A administração de 2C4 designada por *; a administração de TAXOL® (6,25 mg/kg) designada por +. A figura 15 representa a resposta do tumor independente de androgénio CWR22R à terapia com anticorpo de controlo (C, A), HERCEPTIN® (H, o) ou anticorpo monoclonal 2C4 (2, ). A administração de anticorpo monoclonal 2C4 designada por +; a administração de HERCEPTIN® designada por +. 11

ΕΡ 1 189 634 /PT A figura 16 representa a resposta do tumor independente de androgénio CWR22R à terapia com TAXOL® sozinho (T, o), anticorpo monoclonal 2C4 sozinho (2, ) ou uma combinação de anticorpo monoclonal 2C4 e TAXOL® (2/T, A). A administração de 2C4 designada por *; a administração de TAXOL® (6,25 mg/kg) designada por +. A figura 17 representa a resposta do tumor independente de androgénio CWRSA6 à terapia com anticorpo de controlo (C. A), HERCEPTIN® (H, o) ou anticorpo monoclonal 2C4 (2, ). A administração de anticorpo monoclonal 2C4 designada por +; a administração de HERCEPTIN® designada por +. A figura 18 representa a resposta do tumor independente de androgénio CWRSA6 à terapia com TAXOL® sozinho (T, o), anticorpo monoclonal 2C4 sozinho (2, ) ou uma combinação de anticorpo monoclonal 2C4 e TAXOL® (2/T, A) . A administração de 2C4 designada por *; a administração de TAXOL® (6,25 mg/kg) designada por +. A figura 19 representa a expressão relativa de ARNm de TGF-α por células CWR22R ou CWR22 tal como determinada por PCR quantitativa em tempo real. A figura 20 representa a expressão relativa de ARNm de HB-EGF por células CWR22R ou CWR22 tal como determinada por PCR quantitativa em tempo real. A figura 21 representa o efeito do tratamento com anticorpo monoclonal anti-ErbB2 sobre o crescimento de xenoenxertos de cancro da próstata. O crescimento do tumor é normalizado relativamente a tumores de controlo no final de cada experiência quando se sacrificaram animais de controlo. Os valores apresentados para CWR22 correspondem ao dia 23 após a formação de um tumor palpável; para LNCaP, ao dia 51; para CWR22R, ao dia 22; para CWR22SA6, ao dia 33. A figura 22 representa o efeito do tratamento com anticorpo monoclonal anti-ErbB2 sobre o indice de PSA. Define-se o índice de PSA como a quantidade de PSA sérico normalizado para o volume do tumor. 12

ΕΡ 1 189 634 /PT A figura 23 avalia a actividade de anticorpo monoclonal humanizado recombinante (rhuMAb 2C4), um seu fragmento Fab em PEG e 2C4 murino, sobre o xenoenxerto de próstata independente de androgénio CWR22R. A figura 24 representa a resposta à dose de rhuMAb 2C4 sobre o xenoenxerto de próstata independente de androgénio CWR22R. A figura 25 representa a resposta à dose de rhuMAb 2C4 sobre o xenoenxerto de próstata independente de androgénio MSKPC6. A figura 26 representa a resposta à dose de 2C4 e 7C2 sobre o xenoenxerto de próstata independente de androgénio (CWR22). A figura 27 representa o volume do tumor em xenoenxertos CWR22R tratados com TAXOL® e anticorpos anti-ErbB2, 2C4 e 10,2.

Descrição detalhada das concretizações preferidas I. Definições

Um "receptor ErbB" é uma proteina-tirosina-quinase receptora que pertence à familia de receptores ErbB e inclui receptores EGFR, ErbB2, ErbB3 e ErbB4 e outros membros desta familia que sejam identificados no futuro. 0 receptor ErbB incluirá geralmente um dominio extracelular, que pode ligar um ligando de ErbB; um dominio transmembranar lipófilo; um dominio de tirosina-quinase intracelular conservado; e um dominio de sinalização no terminal carboxilo apresentando vários resíduos de tirosina que podem ser fosforilados. 0 receptor ErbB pode ser um receptor ErbB de "sequência nativa" ou uma sua "variante de sequência de aminoácidos". De preferência o receptor ErbB é receptor ErbB humano de sequência nativa.

As expressões "ErbB 1", "receptor de factor de crescimento epidérmico" e "EGFR" utilizam-se aqui indiferentemente e referem-se a EGFR tal como revelado, por exemplo, em Carpenter et al. Ann. Rev. Biochem. 56:881-914 (1987), incluindo as suas 13

ΕΡ 1 189 634 /PT formas mutantes de ocorrência natural (por exemplo um mutante de deleção de EGFR tal como em Humphrey et al. PNAS (USA) 87:4207-421 (1990)). erbBl refere-se ao gene que codifica o produto proteinico EGFR.

As expressões "ErbB2" e "HER2" utilizam-se aqui indiferentemente e referem-se à proteína HER2 humana descrita, por exemplo, em Semba et al., PNAS (USA) 82:6497-6501 (1985) e Yamamoto et al. Nature 319:230-234 (1986) (número de acesso

Genebank X03363) . A expressão "eri>B2" refere-se ao gene que codifica ErbB2 humano e "neu" refere-se ao gene que codifica pl85neu de rato. O ErbB2 preferido é ErbB2 humano de sequência nativa. "ErbB3" e "HER3" referem-se ao polipéptido receptor tal como revelado, por exemplo, nas patentes US 5 183 884 e 5 480 968 assim como Kraus et al. PNAS (USA) 86:9193-9197 (1989) .

As expressões "ErbB4" e "HER4" referem-se aqui ao polipéptido receptor tal como revelado, por exemplo, no pedido de patente EP n.° 599 274; Plowman et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90:1746-1750 (1993); e Plowman et al., Nature, 366:473-475 (1993), incluindo as suas isoformas, por exemplo, tal como revelado em W099/19488 publicado a 22 de Abril de 1999 . "Ligando de ErbB" significa um polipéptido que se liga e/ou activa um receptor ErbB. O ligando de ErbB de especial interesse aqui é um ligando de ErbB humano de sequência nativa tal como o factor de crescimento epidérmico (EGF) (Savage et al., J. Biol. Chem. 247:7612-7621 (1972)); factor de crescimento por transformação alfa (TGF-α) (Marquardt et al., Science 223:1079-1082 (1984)); anfirregulina também conhecida como schwanoma ou factor de crescimento autócrino queratinócito (Shoyab et al. Science 243:1074-1076 (1989); Kimura et al. Nature 348:257-260 (1990); e Cook et al. Mol. Cell. Biol. 11:2547-2557 (1991)); betacelulina (Shing et al., Science 259:1604-1607 (1993); e Sasada et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 190:1173 (1993)); factor de crescimento epidérmico de ligação a heparina (HB-EGF) (Higashiyama et al., Science 251:936-939 (1991)); epirregulina (Toyoda et al., J. 14

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Biol. Chem. 270:7495-7500 (1995); e Komurasaki et al. Oncogene 15:2841-2848 (1997)); uma herregulina (consultar adiante); neurregulina-2 (NRG-2) (Carraway et al., Nature 387:512-516 (1997)); neurregulina-3 (NRG-3) (Zhang et al.. Proc. Natl. Acad. Sei. 94:9562-9567 (1997)); neurregulina-4 (NRG-4) (Harari et al. Oncogene 18: 2681-2689 (1999)); ou cripto (CR-1) (Kannan et al. J. Biol. Chem. 272(6):3330-3335 (1997)). Ligandos de ErbB que ligam EGFR incluem EGF, TGF-a, anfirregulina, betacelulina, HB-egf e epirregulina. Os ligandos de ErbB que ligam ErbB3 incluem herregulinas. Os ligandos de ErbB capazes de ligar ErbB4 incluem betacelulina, epirregulina, HB-EGF, NRG-2, NRG-3, NRG-4 e herregulinas. "Herregulina" (HRG) quando aqui utilizado refere-se a um polipéptido codificado pelo produto do gene herregulina tal como revelado na patente U.S. 5 641 869 ou Marchionni et al., Nature, 362:312-318 (1993). Constituem exemplos de herregulinas, entre outros, herregulina-a, herregulina-βΐ, herregulina-p2 e herregulina-p3 (Holmes et al., Science, 256:1205-1210 (1992); e patente U.S. 5 641 869); factor de diferenciação neu (NDF) (Peles et al. Cell 69: 205-216 (1992)); actividade de indução de receptor de acetilcolina (ARIA) (Falis et al. Cell 72:801-815 (1993)); factores de crescimento glial (GGF) (Marchionni et al., Nature, 362:312-318 (1993)); factor derivado de neurónios motores e sensoriais (SMDF) (Ho et al. J. Biol. Chem. 270:14523-14532 (1995)); γ-herregulina (Schaefer et al. Oncogene 15:1385-1394 (1997)). A expressão inclui fragmentos e/ou variantes de sequência de aminoácidos biologicamente activos de um polipéptido de sequência nativa HRG, tal como um seu fragmento de domínio do tipo EGF (por exemplo HRGpii77-244 ) .

Um "hetero-oligómero ErbB" é aqui um oligómero associado de forma não covalente incluindo pelo menos dois receptores ErbB diferentes. Tais complexos podem formar-se quando uma célula que expressa dois ou mais receptores ErbB é exposta a um ligando de ErbB e pode ser isolada por imunoprecipitação e analisada por SDS-PAGE tal como descrito em Sliwkowski et al., J. Biol. Chem., 269(20):14661-14665 (1994), por exemplo.

Constituem exemplos de tais hetero-oligómeros ErbB, entre outros, complexos EGFR-ErbB2, ErbB2-ErbB3 e ErbB3-ErbB4. Além disso, o hetero-oligómero ErbB pode incluir dois ou mais 15

ΕΡ 1 189 634 /PT receptores ErbB2 combinados com um receptor ErbB diferente, tal como ErbB3, ErbB4 ou EGFR. Outras proteínas, tal como uma subunidade de receptor de citoquina (por exemplo gpl30) podem incluir-se no hetero-oligómero. "Activação por ligandos de um receptor ErbB" significa transdução de sinal (por exemplo o sinal produzido pela fosforilação de resíduos de tirosina de um receptor ErbB ou de um polipéptido substrato por um domínio de quinase intracelular do receptor ErbB) mediada por ligação de um ligando de ErbB a um hetero-oligómero ErbB incluindo o receptor ErbB de interesse. De um modo geral, tal envolverá a ligação de um ligando de ErbB a um hetero-oligómero ErbB que activa um domínio de quinase de um ou mais dos receptores ErbB no hetero-oligómero e assim resulta na fosforilação de resíduos de tirosina em um ou mais dos receptores ErbB e/ou fosforilação de resíduos de tirosina em polipéptido(s) substrato(s) adicional(ais). A activação do receptor ErbB pode ser quantificada utilizando diferentes ensaios de fosforilação de tirosina.

Um polipéptido de "sequência nativa" é aquele que apresenta a mesma sequência de aminoácidos que um polipéptido (por exemplo, receptor ErbB ou ligando de ErbB) derivado da natureza. Tais polipéptidos de sequência nativa podem ser isolados da natureza ou podem ser produzidos por meios recombinantes ou sintéticos. Assim, um polipéptido de sequência nativa pode apresentar a sequência de aminoácidos do polipéptido humano de ocorrência natural, do polipéptido murino ou de um polipéptido de qualquer outra espécie de mamífero. A expressão "variante de sequência de aminoácidos" refere-se a polipéptidos apresentando sequências de aminoácidos que diferem em alguma extensão de um polipéptido de sequência nativa. Habitualmente, as variantes de sequência de aminoácidos apresentarão pelo menos cerca de 70% de homologia com pelo menos um domínio de ligação ao receptor de um ligando de ErbB nativo ou com pelo menos um domínio de ligação ao ligando de um receptor ErbB nativo e de preferência serão pelo menos cerca de 80% homólogos, e com maior preferência pelo menos cerca de 90% homólogos, a tais domínios 16

ΕΡ 1 189 634 /PT de ligação ao receptor ou ao ligando. As variantes de sequência de aminoácidos apresentam substituições, deleções e/ou inserções em determinadas posições no interior da sequência de aminoácidos da sequência de aminoácidos nativa.

Define-se "homologia" como a percentagem de residuos na sequência de aminoácidos variante que são idênticos após alinhamento das sequências e introdução de hiatos, caso necessário, para atingir a percentagem máxima de homologia. São bem conhecidos na arte métodos e programas de computador para o alinhamento. Constitui um exemplo de tal programa de computador o "Align 2", que tem como autor Genentech, Inc., que foi apresentado com a documentação para o utilizador no United States Copyright Office, Washington, DC 20559, a 10 de Dezembro de 1991. A expressão "anticorpo" é aqui utilizada no seu sentido mais lato e abrange especificamente anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, anticorpos multiespecificos (por exemplo anticorpos biespecificos) formados a partir de pelo menos dois anticorpos intactos e fragmentos de anticorpo, desde que apresentem a actividade biológica pretendida. A expressão "anticorpo monoclonal" tal como aqui utilizada refere-se a um anticorpo obtido de uma população de anticorpos substancialmente homogéneos, ou seja, os anticorpos individuais que formam a população são idênticos com excepção de possíveis mutações de ocorrência natural que podem estar presentes em pequenas quantidades. Os anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo dirigidos contra um único local antigénico. Além disso, contrariamente às preparações de anticorpos policlonais que incluem diferentes anticorpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticorpo monoclonal é dirigido contra um único determinante no antigénio. Além da sua especificidade, os anticorpos monoclonais são vantajosos na medida em que podem ser sintetizados sem contaminações por outros anticorpos. O adjectivo "monoclonal" indica o carácter do anticorpo como sendo obtido de uma população de anticorpos substancialmente homogénea e não deve ser entendido como necessitando da produção do anticorpo por qualquer método em particular. Por exemplo, os anticorpos monoclonais para serem utilizados de 17

ΕΡ 1 189 634 /PT acordo com o presente invento podem ser produzidos pelo método do hibridoma pela primeira vez descrito por Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), ou podem ser produzidos por métodos de ADN recombinante (consultar, por exemplo, patente U.S. n.° 4 816 567). Os "anticorpos monoclonais" podem também ser isolados a partir de bibliotecas de anticorpos sobre fagos utilizando as técnicas descritas em Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) e Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991), por exemplo.

Os anticorpos monoclonais incluem especificamente aqui anticorpos "quiméricos" nos quais uma parte da cadeia pesada e/ou leve é idêntica ou homóloga às sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma espécie particular ou pertencentes a uma classe ou subclasse particular de anticorpos, enquanto que a(s) cadeia(s) remanescente(s) é/são idêntica(s) ou homóloga(s) às sequências correspondentes em anticorpos derivados de outras espécies ou pertencentes a outra classe ou subclasse de anticorpos, assim como fragmentos de tais anticorpos desde que apresentem a actividade biológica pretendida (patente U.S. n.° 4 816 567; e Morrison et al.,

Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 81:6851-6855 (1984)). Os anticorpos quiméricos de interesse aqui incluem anticorpos "primatizados" incluindo sequências de ligação ao antigénio de domínio variável derivadas de um primata não humano (por exemplo macacos do Velho Mundo, macacos, etc.) e sequências de regiões constantes humanas. "Fragmentos de anticorpo" incluem uma parte de um anticorpo intacto de preferência incluindo a sua região variável ou de ligação ao antigénio. Constituem exemplos de fragmentos de anticorpo, entre outros, fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 e Fv; diacorpos; anticorpos lineares; moléculas de anticorpo de cadeia simples; e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmento(s) de anticorpo.

Um anticorpo "intacto" é aquele que inclui uma região variável de ligação ao antigénio assim como um domínio constante de cadeia leve (CL) e domínios constantes de cadeia pesada, CH1, CH2 e CH3. Os domínios constantes podem ser domínios constantes de sequência nativa (por exemplo domínios constantes de sequência nativa humana) ou uma sua variante de 18

ΕΡ 1 189 634 /PT sequência de aminoácidos. De preferência, o anticorpo intacto tem uma ou mais funções efectoras.

As "funções efectoras" do anticorpo referem-se às actividades biológicas que se podem atribuir à região Fc (uma região Fc de sequência nativa ou variante de sequência de aminoácidos de região Fc) de um anticorpo. Constituem exemplos de funções efectoras de anticorpo, entre outros, ligação de Clq; citotoxicidade dependente do complemento; ligação de receptor Fc; citotoxicidade mediada pela célula e dependente de anticorpo (ADCC); fagocitose; regulação negativa de receptores da superfície celular (por exemplo receptor de células B; BCR), etc.

Dependendo da sequência de aminoácidos do domínio constante das suas cadeias pesadas, os anticorpos intactos podem ser atribuídos a diferentes "classes". Existem cinco classes principais de anticorpos intactos: IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM e vários de entre estes podem ser adicionalmente subdivididos em "subclasses" (isotipos), por exemplo, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA e IgA2. Os domínios constantes de cadeia pesada que correspondem às diferentes classes de anticorpos denominam-se α, δ, ε, γ e μ, respectivamente. São bem conhecidas as estruturas de subunidades e configurações tridimensionais das diferentes classes de imunoglobulinas. "Citotoxicidade mediada por células e dependente de anticorpos" e "ADCC" referem-se a uma reacção mediada por células na qual células citotóxicas não específicas que expressam receptores Fc (FcR) (por exemplo células assassinas naturais (NK), neutrófilos e macrófagos) reconhecem um anticorpo ligado numa célula alvo e subsequentemente causam a lise da célula alvo. As células primárias para mediar ADCC, células NK, expressam apenas FcyRIII, enquanto que os monócitos expressam FcyRI, FcyRII e FcyRIII. A expressão de FcR em células hematopoiéticas encontra-se resumida na tabela 3 da página 464 de Ravetch e Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991). Para avaliar a actividade de ADCC de uma molécula de interesse, pode efectuar-se um ensaio de ADCC in vitro, tal como o descrito na patente US 5 500 362 ou 5 821 337. Constituem células efectoras úteis para tais ensaios células mononucleares de sangue periférico (PBMC) e 19

ΕΡ 1 189 634 /PT células assassinas naturais (NK). Alternativa ou adicionalmente, pode avaliar-se a actividade de ADCC da molécula de interesse in vivo, por exemplo, num modelo animal tal como o revelado em Clynes et al. pnas (USA) 95:652-656 (1998) . "Células efectoras humanas" são leucócitos que expressam um ou mais FcR e desempenham funções efectoras. De preferência, as células expressam pelo menos fcyRIII e desempenham função efectora ADCC. Constituem exemplos de leucócitos humanos que medeiam ADCC, células mononucleares de sanque periférico (PBMC), células assassinas naturais (NK), monócitos, células T citotóxicas e neutrófilos; sendo preferidas as PBMC e as células NK. As células efectoras podem ser isoladas de uma sua fonte nativa, por exemplo de sanque ou PBMC tal como aqui descrito.

As expressões "receptor Fc" ou "FcR" são utilizadas para descrever um receptor que se liga à região Fc de um anticorpo. 0 FcR preferido é um FcR de sequência nativa humana. Além disso, um FcR preferido é aquele que liga um anticorpo IgG (um receptor gama) e inclui receptores das subclasses FcyRI, FcyRII e FcyRIII incluindo variantes alélicas e formas de splicing alternativo desses receptores. Os receptores FcyRIl incluem FcyRIIA (um "receptor de activação") e FcyRIIB (um "receptor de inibição"), que apresentam sequências de aminoácidos semelhantes que diferem principalmente nos seus dominios citoplasmáticos. 0 receptor FcyRIIA de activação contém um motivo de activação baseado em tirosina imunorreceptor (ITAM) no seu domínio citoplasmático. 0 receptor FcyRIIB de inibição contém um motivo de inibição baseado em tirosina imunorreceptor (ITIM) no seu domínio citoplasmático. (consultar a revisão M. in Daêron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)). Os FcR são revistos em Ravetch e Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capei et al.,

Immunomethods 4:25-34 (1994); e de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995). Outros FcR, incluindo aqueles que vierem a ser identificados no futuro, são aqui abrangidos pela expressão "FcR". A expressão também inclui o receptor neonatal, FcRn, que é responsável pela transferência de IgG maternas para o feto (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) e Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)). 20

ΕΡ 1 189 634 /PT "Citotoxicidade dependente do complemento" ou "CDC" refere-se à capacidade de uma molécula lisar um alvo na presença de complemento. A via de activação do complemento é iniciada pela ligação de uma primeira componente do sistema do complemento (Clq) a uma molécula (por exemplo, um anticorpo) complexada com um antigénio cognato. Para avaliar a activação do complemento pode efectuar-se um ensaio CDC, por exemplo tal como descrito em Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996). "Anticorpos nativos" são habitualmente glicoproteínas heterotetraméricas com cerca de 150 000 Daltons, compostas por duas cadeias leves (L) idênticas e duas cadeias pesadas (H) idênticas. Cada cadeia leve está ligada a uma cadeia pesada por uma ligação dissulfureto covalente, enquanto que o número de ligações dissulfureto varia entre as cadeias pesadas de diferentes isotipos de imunoglobulina. Cada cadeia pesada e leve também apresenta pontes dissulfureto intracadeia regularmente espaçadas. Cada cadeia pesada apresenta numa extremidade um domínio variável (VH) seguido por vários domínios constantes. Cada cadeia leve tem um domínio variável numa extremidade (VL) e um domínio constante na sua outra extremidade. O domínio constante de cadeia leve está alinhado com o primeiro domínio constante da cadeia pesada e o domínio variável de cadeia leve está alinhado com o domínio variável de cadeia pesada. Pensa-se que resíduos específicos de aminoácidos formam uma interface entre os domínios variáveis de cadeia leve e de cadeia pesada. A expressão "variável" refere-se ao facto de que determinadas partes dos domínios variáveis têm sequências que diferem extensivamente entre os anticorpos e são utilizadas na ligação e especificidade de cada anticorpo em particular relativamente ao seu antigénio específico. Contudo, a variabilidade não está igualmente distribuída através dos domínios variáveis de anticorpos. Está concentrada em três segmentos denominados regiões hipervariáveis tanto nos domínios variáveis de cadeia leve como de cadeia pesada. As partes mais altamente conservadas dos domínios variáveis denominam-se regiões de esqueleto ou estruturais (FR) . Os domínios variáveis das cadeias nativas pesada e leve incluem quatro FR cada, adoptando na sua vasta maioria um configuração 21

ΕΡ 1 189 634 /PT em folha β, ligados entre si por três regiões hipervariáveis que formam ansas que ligam as estruturas em folha β, fazendo nalguns casos parte da mesma. As regiões hipervariáveis em cada cadeia são mantidas juntas em grande proximidade pelos FR e conjuntamente com as regiões hipervariáveis da outra cadeia contribuem para a formação de um local de ligação ao antigénio de anticorpos (consultar Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Maryland (1991)). Os dominios constantes não estão directamente envolvidos na ligação de um anticorpo a um antigénio, mas apresentam diversas funções efectoras tal como participação do anticorpo em citotoxicidade celular dependente do anticorpo (ADCC). A expressão "região hipervariável" quando aqui utilizada refere-se aos residuos de aminoácidos de um anticorpo que são responsáveis por ligação ao antigénio. A região hipervariável inclui geralmente residuos de aminoácidos de uma "região determinante da complementaridade" ou "CDR" (por exemplo residuos 24-34 (Ll), 50-56 (L2) e 89-97 (L3) no domínio variável de cadeia leve e 31-35 (Hl), 50-65 (H2) e 95-102 (H3) no domínio variável de cadeia pesada; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Maryland (1991)) e/ou os resíduos de uma "ansa hipervariável" (por exemplo resíduos 26-32 (Ll), 50-52 (L2) e 91-96 (L3) no domínio variável de cadeia leve e 26-32 (Hl), 53-55 (H2) e 96-101 (H3) no domínio variável de cadeia pesada; Chothia e Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). Resíduos de "região de esqueleto" ou "FR" são os resíduos do domínio variável que são diferentes dos resíduos da região hipervariável tal como aqui definida. A digestão de anticorpos com papaína produz dois fragmentos de ligação ao antigénio idênticos, denominados fragmentos "Fab", cada um com um único local de ligação ao antigénio e um fragmento "Fc" residual, cujo nome reflecte a sua capacidade para cristalizar facilmente. O tratamento com pepsina origina um fragmento F(ab')2 que tem dois locais de ligação ao antigénio e é ainda capaz de ligar cruzadamente o antigénio. 22

ΕΡ 1 189 634 /PT Ο "Fv" é o fragmento de anticorpo mínimo que contém um local completo de reconhecimento do antigénio e de ligação ao antigénio. Esta região consiste num dímero de uma cadeia pesada e um domínio variável de cadeia leve em associação forte e não covalente. É nesta configuração que as três regiões hipervariáveis de cada domínio variável interagem para definir um local de ligação ao antigénio à superfície de um dímero VH-VL. Colectivamente, as seis regiões hipervariáveis conferem ao anticorpo a especificidade de ligação ao antigénio. Contudo, mesmo um único domínio variável (ou metade de um Fv incluindo apenas três regiões hipervariáveis específicas para um antigénio) tem a capacidade de reconhecer e ligar um antigénio, apesar de o fazer com menor afinidade do que o local de ligação completo. 0 fragmento Fab contém igualmente o domínio constante de cadeia leve e o primeiro domínio constante (CHI) de cadeia pesada. Os fragmentos Fab' diferem dos fragmentos Fab por adição de alguns resíduos no terminal carboxilo do domínio CHl de cadeia pesada incluindo uma ou mais cisteínas da região de charneira do anticorpo. Fab'-SH é a designação aqui utilizada para Fab' no qual o(s) resíduo (s) de cisteína dos domínios constantes apresentam pelo menos um grupo tiol livre. Os fragmentos de anticorpo F(ab')2 foram originalmente produzidos na forma de pares de fragmentos Fab' que apresentam cisteínas de charneira entre si. São igualmente conhecidos outros acoplamentos químicos de fragmentos de anticorpo.

As "cadeias leves" de anticorpos de quaisquer espécies de vertebrados podem ser atribuídas a um de dois tipos claramente distintos denominados capa (k) e lambda (λ), com base na sequência de aminoácidos dos seus domínios constantes.

Os fragmentos de anticorpo "Fv de cadeia simples" ou "scFv" incluem os domínios VH e VL do anticorpo, em que estes domínios se encontram presentes numa cadeia polipeptídica única. De preferência, o polipéptido Fv inclui adicionalmente um ligante polipeptídico entre os domínios VH e VL que permite que scFv forme a estrutura pretendida para ligação ao antigénio. Para uma revisão de scFv consultar Pluckthun em The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg e Moore ed., Springer-Verlag, Nova Iorque, p. 269-315 (1994). 23

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Descrevem-se fragmentos scFv de anticorpo anti-ErbB2 em W093/16185; patente U.S. n.° 5 571 894; e patente U.S. n.° 5 587 458. A expressão "diacorpos" refere-se a pequenos fragmentos de anticorpo com dois locais de ligação ao antigénio, cujos fragmentos contêm um domínio variável pesado (VH) ligado a um domínio variável leve (VL) na mesma cadeia polipeptídica (VH - VL) . Utilizando um ligante que é demasiado pequeno para permitir o emparelhamento entre os dois domínios na mesma cadeia, forçam-se os domínios a emparelhar com os domínios complementares de outra cadeia e criar dois locais de ligação ao antigénio. Descrevem-se diacorpos mais completamente em, por exemplo, EP 404 097; WO 93/11161; e Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90:6444-6448 (1993).

Formas "humanizadas" de anticorpos não humanos (por exemplo de roedores) são anticorpos quiméricos que contêm uma sequência mínima derivada da imunoglobulina não humana. Na sua maioria, os anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo recebedor) no qual resíduos de uma região hipervariável do recebedor são substituídos por resíduos de uma região hipervariável de uma espécie não humana (anticorpo dador) tal como de ratinho, rato, coelho ou primata não humano apresentando a especificidade, afinidade e capacidade pretendidas. Nalguns casos, substituem-se resíduos da região de esqueleto (FR) da imunoglobulina humana por resíduos não humanos correspondentes. Além disso, os anticorpos humanizados podem incluir resíduos que não se encontram no anticorpo recebedor ou no anticorpo dador. Estas modificações são efectuadas para refinar adicionalmente o desempenho do anticorpo. De um modo geral, o anticorpo humanizado incluirá substancialmente todos, de pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis, em que todas ou substancialmente todas as ansas hipervariáveis correspondem às de uma imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas as FR são as de uma sequência de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado incluirá opcionalmente também pelo menos uma parte de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente a de uma imunoglobulina humana. Para detalhes adicionais, consultar Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., 24

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Nature 332:323-329 (1988); e Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992).

Os anticorpos humanizados anti-ErbB2 incluem huMAb4D5-l, huMAb4D5-2, huMAb4D5-3, huMAb4D5-4, huMAb4D5-5, huMAb4D5-6, huMAb4D5-7 e huMAb4D5-8 (HERCEPTIN®) tal como descrito na tabela 3 da patente U.S. 5 821 337; 520C9 humanizado (W093/21319) e 2C4 humanizado tal como aqui se descreve adiante.

Um anticorpo "isolado" é aquele que foi identificado e separado e/ou recuperado de uma componente do seu ambiente natural. As componentes contaminantes dos seu ambiente natural são materiais que interfeririam com as utilizações de diagnóstico ou terapêuticas para o anticorpo e podem incluir enzimas, hormonas e outros solutos proteináceos ou não proteináceos. Em concretizações preferidas, o anticorpo será purificado (1) até mais de 95% em peso do anticorpo tal como determinado pelo método de Lowry e com maior preferência mais do que 99% em peso, (2) num grau suficiente para obter pelo menos 15 residuos de sequência de aminoácidos N-terminal ou interna por utilização de um sequenciador de copo rotativo, ou (3) até à homogeneidade por SDS-PAGE sob condições redutoras ou não redutoras utilizando coloração com azul de Coomassie ou, de preferência, com prata. Anticorpo isolado inclui o anticorpo in situ no interior de células recombinantes dado que pelo menos uma componente do ambiente natural do anticorpo não estará presente. Habitualmente, contudo, o anticorpo isolado será preparado através de pelo menos uma etapa de purificação.

Um anticorpo "que liga" um antigénio de interesse, por exemplo antigénio ErbB2, é aquele que é capaz de ligar tal antigénio com afinidade suficiente para que o anticorpo seja útil como agente terapêutico tomando como alvo uma célula que expressa o antigénio. Quando o anticorpo é tal que liga ErbB2, este ligará habitualmente ErbB2 com preferência relativamente a outros receptores ErbB e pode ser tal que não reaja significativamente de modo cruzado com outras proteínas tais como EGFR, ErbB3 ou ErbB4. Em tais concretizações, a extensão da ligação do anticorpo a essas proteínas que não ErbB2 (por exemplo, ligação de superfície celular a receptor endógeno) 25

ΕΡ 1 189 634 /PT será menos de 10% tal como determinado por análise de separação celular activada por fluorescência (FACS) ou radioimunoprecipitação (RIA). Algumas vezes, o anticorpo anti-ErbB2 não reagirá significativamente de forma cruzada com a proteína neu de rato, por exemplo, tal como descrito em Schecter et al. Nature 312:513 (1984) e Drebin et al., Nature 312:545-548 (1984) .

Um anticorpo que "bloqueia" a activação por ligandos de um receptor ErbB é aquele que reduz ou evita tal activação tal como aqui definido acima, em que o anticorpo é capaz de bloquear a activação por ligandos do receptor ErbB de modo substancialmente mais eficaz do que o anticorpo monoclonal 4D5, por exemplo praticamente de modo tão eficaz como os anticorpos monoclonais 7F3 ou 2C4 ou seus fragmentos Fab e de preferência praticamente de modo tão eficaz como o anticorpo monoclonal 2C4 ou um seu fragmento Fab. Por exemplo, o anticorpo que bloqueia a activação por ligandos de um receptor ErbB pode ser aquele que é cerca de 50-100% mais eficaz que 4D5 a bloquear a formação de um hetero-oligómero ErbB. O bloqueio da activação por ligandos de um receptor ErbB pode ocorrer por quaisquer meios, por exemplo por interferência com: ligação do ligando a um receptor ErbB, formação do complexo de ErbB, actividade de tirosina-quinase de um receptor ErbB num complexo de ErbB e/ou fosforilação de resíduo(s) de tirosina-quinase num receptor ErbB ou por este. Constituem exemplos de anticorpos que bloqueiam a activação por ligandos de um receptor ErbB, entre outros, os anticorpos monoclonais 2C4 e 7F3 (que bloqueiam a activação por HRG dos hetero-oligómeros ErbB2/ErbB3 e ErbB2/ErbB4; e a activação por EGF, TGF-α, anfirregulina, HB-EGF e/ou epirregulina de um hetero-oligómero EGFR/ErbB2); e os anticorpos L26, L96 e L288 (Klapper et al. Oncogene 14:2099-2109 (1997)), que bloqueiam a ligação de EGF e NDF a células T47D que expressam EGFR, ErbB2, ErbB3 e ErbB4.

Um anticorpo apresentando uma "característica biológica" de um designado anticorpo, tal como o anticorpo monoclonal designado 2C4, é aquele que apresenta uma ou mais características biológicas desse anticorpo que o distinguem de outros anticorpos que ligam o mesmo antigénio (por exemplo ErbB2). Por exemplo, um anticorpo com uma característica 26

ΕΡ 1 189 634 /PT biológica de 2C4 pode bloquear a activação por HRG de um hetero-oligómero ErbB, incluindo ErbB2 e ErbB3 ou ErbB4; bloquear a activação por EGF, TGF-α, HB-EGF, epirregulina e/ou anfirregulina de um receptor ErbB incluindo EGFR e ErbB2; bloquear activação mediada por EGF, TGF-α e/ou HRG de MAPK; e/ou ligar o mesmo epítopo no domínio extracelular de ErbB2 do que o ligado por 2C4 (por exemplo, que bloqueia a ligação do anticorpo monoclonal 2C4 a ErbB2).

Salvo indicação em contrário, a expressão "anticorpo monoclonal 2C4" refere-se a um anticorpo que tem resíduos de ligação ao antigénio do anticorpo 2C4 murino dos exemplos que se seguem ou dele derivados. Por exemplo, o anticorpo monoclonal 2C4 pode ser anticorpo monoclonal murino 2C4 ou uma sua variante, tal como 2C4 humanizado, apresentando resíduos de aminoácidos de ligação ao antigénio do anticorpo monoclonal 2C4. Proporcionam-se exemplos de anticorpos 2C4 humanizados no exemplo 3 adiante. Salvo indicação em contrário, a expressão "rhuMAb 2C4" quando aqui utilizada refere-se a um anticorpo incluindo as sequências variável leve (VL) e variável pesada (VH) de SEQ ID N0:3 e 4, respectivamente, fundidas a sequências de região constante leve e pesada humana de igGl (alotipo não A) opcionalmente expressas por células de ovário de hamster chinês (CHO).

Salvo indicação em contrário, a expressão "anticorpo monoclonal 4D5" refere-se a um anticorpo que apresenta resíduos de ligação ao antigénio do anticorpo 4D5 murino ou deste derivados (ATCC CRL 10463). Por exemplo, o anticorpo monoclonal 4D5 pode ser anticorpo monoclonal 4D5 murino ou uma sua variante, tal como 4D5 humanizado, apresentando resíduos de ligação ao antigénio do anticorpo monoclonal 4D5 murino. Constituem exemplos de anticorpos 4D5 humanizados, entre outros, huMAb4D5-l, huMAb4D5-2, huMAb4D5-3, huMAb4D5-4, huMAb4D5-5, huMAb4D5-6, huMAb4D5-7 e huMAb4D5-8 (HERCEPTIN®) tal como na patente US 5 821 337, sendo huMAb4D5-8 (HERCEPTIN®) o anticorpo humanizado 4D5 preferido.

Um "agente de inibição do crescimento" quando aqui utilizado refere-se a um composto ou uma composição que inibem o crescimento de uma célula, especialmente uma célula de cancro que expressa ErbB quer in vitro quer in vivo. Assim, o 27

ΕΡ 1 189 634 /PT agente de inibição do crescimento pode ser aquele que reduz significativamente a percentagem de células que expressam ErbB na fase S. Constituem exemplos de agentes de inibição do crescimento, entre outros, agentes que bloqueiam a progressão do ciclo celular (numa fase diferente da fase S), tal como agentes que induzem paragem G1 e paragem na fase M. Constituem bloqueadores de fase M clássicos, entre outros, as vincas (vincristina e vinblastina), taxanos e inibidores de topo II tais como doxorrubicina, epirrubicina, daunorrubicina, etoposido e bleomicina. Os agentes que param G1 também efectuam alguma paragem em fase S, por exemplo, agentes alquilantes de ADN tais como tamoxifeno, prednisona, dacarbazina, mecloretamina, cisplatina, metotrexato, 5-fluorouracilo e ara-C. Pode obter-se informação adicional em The Molecular Basis of Câncer, Mendelsohn e Israel, ed., capitulo 1, intitulado "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" por Murakami et al. (WB Saunders: Filadélfia, 1995), especialmente p. 13.

Constituem exemplos de anticorpos "de inibição do crescimento" os que se ligam a ErbB2 e inibem o crescimento de células de cancro que sobre-expressam ErbB2. Anticorpos anti-ErbB2 de inibição de crescimento preferidos inibem o crescimento de células de tumor da mama SK-BR-3 em cultura de células em mais de 20% e de preferência mais de 50% (por exemplo desde cerca de 50% a cerca de 100%) a uma concentração de anticorpo de cerca de 0,5 a 30 pg/ml, em que a inibição de crescimento é determinada seis dias após exposição das células SK-BR-3 ao anticorpo (consultar patente U.S. n.° 5 677 171 concedida a 14 de Outubro de 1997) . O ensaio de inibição do crescimento de células SK-BR-3 descreve-se mais detalhadamente nessa patente e aqui adiante.

Um anticorpo que "induz morte celular" é aquele que faz com que uma célula viável se torne inviável. A célula é geralmente aquela que expressa o receptor ErbB2, especialmente quando a célula sobre-expressa o receptor ErbB2. De preferência, a célula é uma célula de cancro, por exemplo uma célula de mama, ovário, estômago, endométrio, glândula salivar, pulmão, rim, cólon, tiróide, pâncreas ou bexiga. In vitro, a célula pode ser uma célula SK-BR-3, BT474, Calu3, MDA-MB-453, MDA-MB-361 ou SKOV3. A morte celular in vitro pode 28

ΕΡ 1 189 634 /PT ser determinada na ausência de células de complemento e de efector imunitário para distinguir morte celular induzida por citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpo (ADCC) ou citotoxicidade dependente do complemento (CDC). Assim, o ensaio à morte celular pode ser efectuado utilizando soro inactivado pelo calor (ou seja na ausência de complemento) e na ausência de células efectoras imunológicas. Para determinar se o anticorpo é capaz de induzir morte celular, pode avaliar-se a perda de integridade da membrana tal como avaliada pela absorção de iodeto de propidio (PI), azul de tripano (consultar Moore et al. Cytotechnology 17:1-11 (1995)) ou 7AAD relativamente a células não tratadas. Os anticorpos indutores de morte celular preferidos são os que induzem absorção de PI no ensaio de absorção de PI em células BT474 (consultar adiante).

Um anticorpo que "induz apoptose" é aquele que induz morte celular programada tal como determinada por ligação de anexina V, fragmentação de ADN, encolhimento celular, dilatação do retículo endoplasmático, fragmentação celular e/ou formação de vesiculas na membrana (denominadas corpos apoptóticos). A célula é habitualmente aquela que sobre-expressa o receptor ErbB2. De preferência a célula é uma célula de tumor, por exemplo uma célula de mama, ovário, estômago, endométrio, glândula salivar, pulmão, rim, cólon, tiróide, pâncreas ou bexiga. In vitro, a célula pode ser uma célula SK-BR-3, BT474, célula Caiu 3, MDA-MB-453, MDA-MB-361 ou SK0V3. Estão disponíveis vários métodos para avaliar os eventos celulares associados com apoptose. Por exemplo, pode medir-se a translocação de fosfatidilserina (PS) por ligação de anexina; a fragmentação do ADN pode ser avaliada através de escadeamento de ADN; e pode avaliar-se a condensação nuclear/de cromatina conjuntamente com a fragmentação do ADN por qualquer aumento de células hipodiplóides. De preferência, o anticorpo que induz apoptose é aquele que resulta em indução de cerca de 2 a 50 vezes, de preferência cerca de 5 a 50 vezes e com maior preferência cerca de 10 a 50 vezes, de ligação de anexina relativamente a células não tratadas num ensaio de ligação de anexina utilizando células BT474 (consultar adiante). Algumas vezes o anticorpo pró-apoptótico será aquele que bloqueia adicionalmente a activação por ligandos de ErbB de um receptor ErbB (por exemplo anticorpo 7F3); ou seja, o 29

ΕΡ 1 189 634 /PT anticorpo partilha uma característica biológica com o anticorpo monoclonal 2C4. Noutras situações, o anticorpo é aquele que não bloqueia significativamente a activação por ligandos de ErbB de um receptor ErbB (por exemplo 10,2). Além disso, o anticorpo pode ser como 7C2 que, ao mesmo tempo que induz apoptose, não induz uma grande redução da percentagem de células na fase S (por exemplo aquele que reduz apenas cerca de 0-10% da percentagem dessas células relativamente ao controlo). O "epitopo 2C4" é a região no dominio extracelular de ErbB2 à qual o anticorpo 2C4 se liga. De modo a pesquisar anticorpos que se ligam ao epitopo 2C4, pode efectuar-se um ensaio de rotina de bloqueio cruzado tal como o descrito em Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor

Laboratory, Ed Harlow e David Lane (1988). Alternativamente, pode efectuar-se o mapeamento de epitopos para avaliar se o anticorpo se liga ao epitopo 2C4 de ErbB2 (por exemplo qualquer de um ou mais residuos na região de cerca do resíduo 22 a cerca do residuo 584 de ErbB2, inclusive; consultar figuras 1A-B). O "epitopo 4D5" é a região do dominio extracelular de ErbB2 à qual o anticorpo 4D5 (ATCC CRL 10463) se liga. Este epitopo está perto do dominio transmembranar de ErbB2. De modo a pesquisar anticorpos que se ligam ao epitopo 4D5, pode efectuar-se um ensaio de rotina de bloqueio cruzado tal como o descrito em Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow e David Lane (1988).

Alternativamente, pode efectuar-se o mapeamento de epitopos para avaliar se o anticorpo se liga ao epitopo 4D5 de ErbB2 (por exemplo qualquer de um ou mais residuos na região de cerca do residuo 529 a cerca do residuo 625, inclusive; consultar figuras 1A-B). O "epitopo 3H4" é a região no dominio extracelular de ErbB2 à qual o anticorpo 3H4 se liga. Este epitopo inclui os residuos desde cerca de 541 a cerca de 599, inclusive, na sequência de aminoácidos do dominio extracelular de ErbB2; consultar figuras 1A-B. 30

ΕΡ 1 189 634 /PT Ο "epítopo 7C2/7F3" é a região do terminal N do domínio extracelular de ErbB2 à qual os anticorpos 7C2 e/ou 7F3 (ambos depositados na ATCC, consultar adiante) se ligam. De modo a pesquisar anticorpos que se ligam ao epítopo 7C2/7F3, pode efectuar-se um ensaio de rotina de bloqueio cruzado tal como o descrito em Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow e David Lane (1988) .

Alternativamente, pode efectuar-se o mapeamento de epítopos para avaliar se o anticorpo se liga ao epítopo 7C2/7F3 de ErbB2 (por exemplo qualquer de um ou mais resíduos na região de cerca do resíduo 22 a cerca do resíduo 53 de ErbB2; consultar figuras 1A-B). "Tratamento" refere-se tanto a tratamento terapêutico como a medidas profiláticas ou preventivas. Os indivíduos com necessidade de tratamento incluem os que já apresentam a doença assim como aqueles nos quais a doença deve ser evitada. Assim, o mamífero a tratar aqui pode ter sido diagnosticado como apresentando a doença ou pode estar predisposto ou susceptível à doença. "Mamífero" para os objectivos de tratamento refere-se a qualquer animal classificado como um mamífero, incluindo humanos, animais domésticos, de quinta, de jardim zoológico, de desporto, ou animais de companhia, tais como cães, cavalos, gatos, vacas, etc. De preferência, o mamífero é humano. A expressão "quantidade terapeuticamente eficaz" refere-se a uma quantidade de um fármaco eficaz para tratar uma doença num mamífero. No caso do cancro, a quantidade terapeuticamente eficaz do fármaco pode reduzir o número de células de cancro; reduzir o tamanho do tumor; inibir (ou seja, abrandar em alguma extensão e de preferência parar) a infiltração de células de cancro em órgãos periféricos; inibir (ou seja, abrandar em alguma extensão e de preferência parar) a metástase do tumor; inibir em alguma extensão crescimento de tumor; e/ou aliviar em alguma extensão um ou mais dos sintomas associados ao cancro. Na extensão em que o fármaco pode evitar crescimento e/ou matar células de cancro existentes, pode ser citostático e/ou citotóxico. Para terapia de cancro a eficácia pode, por exemplo, ser medida por avaliação do tempo até 31

ΕΡ 1 189 634 /PT progressão da doença (TTP) e/ou determinar a taxa de resposta (RR) ·

As expressões "cancro" e "canceroso" referem-se ou descrevem a condição fisiológica em mamíferos que é tipicamente caracterizada por crescimento celular desregulado. Constituem exemplos de cancro, entre outros, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma e leucemia ou malignidades linfóides. Constituem exemplos mais específicos de tais cancros, entre outros, cancro de células escamosas (por exemplo cancro de células escamosas epiteliais), cancro de pulmão incluindo cancro de pulmão de células pequenas, cancro de pulmão de células não pequenas, adenocarcinoma do pulmão, carcinoma escamoso do pulmão, cancro do peritoneu, cancro hepatocelular, cancro gástrico ou estomacal incluindo cancro gastrointestinal, cancro pancreático, glioblastoma, cancro cervical, cancro dos ovários, cancro do figado, cancro da bexiga, hepatoma, cancro da mama, cancro do cólon, cancro rectal, cancro colorrectal, carcinoma do endométrio ou uterino, carcinoma da glândula salivar, cancro do rim ou renal, cancro da próstata, cancro da vulva, cancro da tiróide, carcinoma hepático, carcinoma anal, carcinoma peniano, assim como cancro da cabeça e do pescoço.

Um "cancro que expressa ErbB" é aquele que inclui células que apresentam proteina ErbB presente na sua superfície celular. Um "cancro que expressa ErbB" é aquele que produz níveis suficientes de ErbB2 na respectiva superfície celular, de modo que um anticorpo anti-ErbB2 se pode ligar e apresentar um efeito terapêutico relativamente ao cancro.

Um cancro "caracterizado por activação excessiva" de um receptor ErbB é aquele no qual a extensão de activação do receptor ErbB em células de cancro excede significativamente o nível de activação desse receptor em células não cancerosas do mesmo tipo de tecido. Tal activação excessiva pode resultar de sobre-expressão do receptor ErbB e/ou níveis maiores que o normal de um ligando de ErbB disponível para activação do receptor ErbB nas células de cancro. Tal activação excessiva pode causar e/ou ser causada pelo estado maligno de uma célula de cancro. Nalgumas concretizações, o cancro será submetido a um ensaio de diagnóstico ou prognóstico para determinar se 32 ΕΡ 1 189 634 /PT está a ocorrer amplificação e/ou sobre-expressão de um receptor ErbB que resulta em tal activação excessiva do receptor ErbB. Alternativa ou adicionalmente o cancro pode ser submetido a um ensaio de diagnóstico ou prognóstico para determinar se está a ocorrer amplificação e/ou sobre-expressão de um ligando de ErbB no cancro que resulta de tal activação excessiva do receptor. Num subconjunto de tais cancros, a activação excessiva do receptor pode resultar de uma via de estimulação autócrina.

Numa via de estimulação "autócrina", ocorre auto-estimulação em virtude da célula de cancro produzir tanto um ligando de ErbB como o seu receptor ErbB cognato. Por exemplo, o cancro pode expressar ou sobre-expressar EGFR e também expressar ou sobre-expressar um ligando de EGFR (por exemplo EGF, TGF-α ou HB-EGF). Noutra concretização, o cancro pode expressar ou sobre-expressar ErbB2 e também expressar ou sobre-expressar uma herregulina (por exemplo γ-HRG).

Um cancro que "sobre-expressa" um receptor ErbB é aquele que tem niveis significativamente mais elevados de um receptor ErbB, tal como ErbB2, na respectiva superfície celular, comparativamente a uma célula não cancerosa do mesmo tipo de tecido. Tal sobre-expressão pode ser causada por amplificação génica ou por transcrição ou tradução aumentadas. A sobre-expressão de receptor ErbB pode ser determinada num ensaio de diagnóstico ou prognóstico por avaliação de níveis aumentados da proteína ErbB presentes à superfície de uma célula (por exemplo através de um ensaio imuno-histoquímico; IHC) . Alternativa ou adicionalmente, podem medir-se níveis de ácido nucleico que codifica ErbB na célula, por exemplo através de fluorescência de hibridação in situ; (FISH; consultar W098/45479 publicado em Outubro de 1998), ou técnicas de transferência de Southern ou de reacção em cadeia com polimerase (PCR), tal como PCR quantitativa em tempo real (RT-PCR). Pode igualmente estudar-se a sobre-expressão de receptor ErbB por medição de antigénio libertado (por exemplo, domínio extracelular ErbB) num fluido biológico tal como soro (consultar, por exemplo, patente U.S. n.° 4 933 294 concedida a 12 de Junho de 1990; WO91/05264 publicado a 18 de Abril de 1991; patente U.S. 5 401 638 concedida a 28 de Março de 1995; e Sias et al. J. Immunol. Methods 132: 73-80 (1990)). Além dos 33

ΕΡ 1 189 634 /PT ensaios anteriores, estão disponíveis ao perito na arte diferentes ensaios in vivo. Por exemplo, podem expor-se células no interior do corpo do doente a um anticorpo que é opcionalmente marcado com um marcador detectável, por exemplo um isótopo radioactivo e pode avaliar-se ligação de um anticorpo a células no doente, por exemplo por detecção externa de radioactividade ou por análise de uma biópsia retirada de um doente previamente exposto ao anticorpo.

Contrariamente, um cancro que "não é caracterizado por sobre-expressão do receptor ErbB2" é aquele que, num ensaio de diagnóstico, não expressa níveis superiores ao normal de um receptor ErbB2 comparativamente a uma célula não cancerosa do mesmo tipo de tecido.

Um cancro que "sobre-expressa" um ligando de ErbB é aquele que produz níveis significativamente mais elevados desse ligando comparativamente com uma célula não cancerosa do mesmo tipo de tecido. Tal sobre-expressão pode ser causada por amplificação génica ou por transcrição ou tradução aumentadas. A sobre-expressão do ligando de ErbB pode ser determinada por meios diagnósticos por avaliação dos níveis do ligando (ou ácido nucleico que o codifica) no doente, por exemplo numa biópsia de tumor ou por diferentes ensaios de diagnóstico tais como IHC, FISH, transferência de Southern, PCR ou ensaios in vivo descritos acima.

Um cancro "independente de hormonas" é aquele cuja proliferação não é dependente da presença de uma hormona que se liga a um receptor expresso por células no cancro. Tais cancros não apresentam regressão clínica por administração de estratégias farmacológicas ou cirúrgicas que reduzam a concentração de hormona no tumor ou perto deste. Constituem exemplos de cancros independentes de hormona, entre outros, cancro da próstata independente de androgénio, cancro da mama independente de estrogénio, cancro do endométrio e cancro do ovário. Tais cancros podem começar como tumores dependentes de hormona e progredir de um estágio sensível a hormona para um tumor refractário a hormona após terapia anti-hormonal. A expressão "agente citotóxico" tal como aqui utilizada refere-se a um substância que inibe ou evita a função de 34

ΕΡ 1 189 634 /PT células e/ou causa destruição de células. Pretende-se que a expressão inclua isótopos radioactivos (por exemplo At211, I131, 1125^ y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 e isótopos radioactivos de Lu), agentes quimioterapêuticos e toxinas tais como toxinas de moléculas pequenas ou toxinas activas enzimaticamente de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal, incluindo seus fragmentos e/ou variantes.

Um "agente quimioterapêutico" é um composto químico útil no tratamento do cancro. Constituem exemplos de agentes quimioterapêuticos, entre outros, agentes alquilantes tais como tiotepa e ciclofosfamida (CYTOXAN™); alquilsulfonatos tais como bussulfano, improssulfano e pipossulfano; aziridinas tais como benzodopa, carboquona, meturedopa e uredopa; etileniminas e metilamelaminas incluindo altretamina, trietilenomelamina, trietilenofosforamida, trietilenotiofosforamida e trimetilolomelamina; mostardas de azoto tais como clorambucilo, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, cloridrato de óxido de mecloretamina, melfalano, novembiquina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostarda de uracilo; nitrosureias tais como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina; antibióticos tais como aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azasserina, bleomicinas, cactinomicina, caliqueanucina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorrubicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorrubicina, epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicinas, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorrubicina; anti-metabolitos tais como metotrexato e 5-fluorouracilo (5-FU); análogos de ácido fólico tais como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina tais como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tais como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina, 5-FU; androgénios tais como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; anti-adrenérgicos tais como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; regenerador 35

ΕΡ 1 189 634 /PT de ácido fólico tal como ácido frolínico; aceglatona; glicosida de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elfornitina; acetato de eliptinio; etoglúcido; nitrato de gálio; hidroxiureia; lentinano; lonidamina; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamol; nitracrina; pentostatina; fenamet; pirarrubicina; ácido podofilinico; 2-etil-hidrazida; procarbazina; PSK®; razoxano; sizofiran; espirogermanio; ácido tenauzónico; triaziquona; 2,2',2"-triclorotrietilamina; uretano; vindesina; dacarbazina; análogos de vinblastina; mitomicina navelbina; daunomicina; inibidor de carboplatina; ifosfamida; vinorrelbina; teniposido; ibandronato; CPT-11; difluorometilornitina manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinósido ("Ara-C"); ciclofosfamida; tiotepa; taxanos, por exemplo paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, New Jersey) e docetaxel (TAXOTERE®, Rhône-Poulenc Rorer, Antony, França); clorambucilo; gencitabina; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; platina tais como cisplatina e platina; etoposido (VP-16); C; mitoxantrona; vincristina; leucovorina (LV), novantrona; aminopterina; xeloda; topoisomerase RFS 2000; (DMFO); ácido retinóico; esperamicinas; capecitabina; e sais, ácidos ou derivados farmaceuticamente aceitáveis de qualquer dos supramencionados. Também se incluem nesta definição agentes anti-hormonais que actuam para regular ou inibir acção de hormonas sobre tumores tais como anti-estrogénios incluindo por exemplo tamoxifeno, raloxifeno, 4(5)-imidazóis inibidores de aromatase, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, ceoxifeno, LY117018, onapristona e toremifeno (Fareston); e anti-androgénios tais como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolideo e goserelina; e sais, ácidos ou derivados farmaceuticamente aceitáveis de qualquer dos supramencionados. A expressão "citoquina" é uma expressão genérica para proteínas libertadas por uma população de células que actuam sobre outra célula como mediadores intercelulares. Constituem exemplos de tais citoquinas, linfoquinas, monoquinas e hormonas polipeptidicas tradicionais. Incluem-se nas citoquinas hormona de crescimento tal como hormona de crescimento humana, de crescimento humana N-metionilo e hormona de crescimento bovina; hormona paratiróide; tiroxina; 36

ΕΡ 1 189 634 /PT insulina; pro-insulina; relaxina; pro-relaxina; hormonas de glicoproteina tal como hormona foliculo estimulante (FSH), hormona estimuladora da tiróide (TSH) e hormona luteinizante (LH); factor de crescimento hepático, factor de crescimento de fibroblastos; prolactina; lactogénio da placenta; factor de necrose tumoral α e β; substância inibidora mulleriana; péptido associado a gonadotropina de ratinho; inibina; activina; factor de crescimento endotelial vascular; integrina; trombopoietina (TPO); factores de crescimento de nervos tais como NGF-β; factor de crescimento de plaquetas; factores de crescimento de transformação (TGF) tais como TGF-a e TGF-β; factor de crescimento do tipo insulina I e II; eritropoietina (EPO); factores osteoindutores; interferões tais como interferão α, β e γ; factores de estimulação de colónias (CSF) tais como CSF de macrófagos (M-CSF); CSF granulócito-macrófago (GM-CSF); e CSF granulócito (G-CSF); interleucinas (IL) tal como IL-1, IL-Ια, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12; um factor de necrose tumoral tal como TNF-α ou TNF-β; e outros factores polipeptidicos incluindo LIF e ligando kit (KL). Tal como aqui utilizada, a expressão citoquina inclui proteínas de fontes naturais ou de cultura de células recombinantes e equivalentes biologicamente activos de citoquinas de sequência nativa.

Tal como aqui utilizada, a expressão "fármaco dirigido a EGFR" refere-se a um agente terapêutico que se liga ao receptor EGFR e opcionalmente, inibe a activação do receptor EGFR. Constituem exemplos de tais agentes, entre outros, anticorpos e moléculas pequenas que se ligam a EGFR. Constituem exemplos de anticorpos que se ligam a EGFR, entre outros, MAb 579 (ATCC CRL HB 8506), MAb 455 (ATCC CRL HB8507), MAb 225 (ATCC CRL 8508), MAb 528 (ATCC CRL 8509) (consultar patente US 4 943 533, Mendelsohn et al.) e suas variantes, tal como 225 quimerizado (C225) e 225 humano remodelado (H225) (consultar WO 96/40210, Imclone Systems Inc.); anticorpos que se ligam a EGFR mutante do tipo II (patente US 5 212 290); anticorpos humanizados e quiméricos que ligam EGFR como descrito na patente US 5 891 996; e anticorpos humanos que ligam EGFR (consultar WO98/50433, Abgenix). O anticorpo anti-EGFR pode ser conjugado com um agente citotóxico, gerando assim um imunoconjugado (consultar, por exemplo, EP659 439A2, Merck Patent GmbH). Constituem exemplos de moléculas pequenas 37

ΕΡ 1 189 634 /PT que se ligam a EGFR, entre outros, ZD1839 (Astra Zeneca), CP-358774 (OSl/Pfizer) e AG1478.

Um "agente anti-angiogénico" refere-se a um composto que bloqueia ou interfere em algum grau no desenvolvimento de vasos sanguíneos. 0 factor anti-angiogénico pode, por exemplo, ser uma molécula pequena ou anticorpo que se liga a um factor de crescimento ou receptor de factor de crescimento envolvido na promoção de angiogénese. 0 factor anti-angiogénico aqui preferido é um anticorpo que se liga ao factor de crescimento endotelial vascular (VEGF). A expressão "pró-fármaco" tal como utilizada neste pedido refere-se a um precursor ou uma forma derivada de uma substância farmaceuticamente activa que é menos citotóxica para células de tumor comparativamente com o fármaco progenitor e é capaz de ser activada enzimaticamente ou convertida na forma progenitora mais activa. Consultar, por exemplo, Wilman, "Prodrugs in Câncer Chemotherapy", Biochemical Society Transactions, 14:375-382, 615th Meeting,

Belfast (1986) e Stella et al., "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery", Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.), p. 247-267, Humana Press (1985). Os "pró-fármacos" deste invento incluem, entre outros, pró-fármacos contendo fosfato, pró-fármacos contendo tiofosfato, pró-fármacos contendo sulfato, pró-fármacos contendo péptidos, pró-fármacos com modificação em D-aminoácidos, pró-fármacos glicosilados, pró-fármacos contendo β-lactama, pró-fármacos contendo fenoxiacetamina opcionalmente substituídos ou pró-fármacos contendo fenilacetamida opcionalmente substituídos, pró-fármacos 5-fluorocitosina e outros pró-fármacos 5-fluorouridina que podem ser convertidos no fármaco livre citotóxico mais activo. Constituem exemplos de fármacos citotóxicos que podem ser derivatizados para uma forma de pró-fármacos para utilização neste invento, entre outros, os agentes quimioterapêuticos descritos acima.

Um "lipossoma" é uma pequena vesícula composta por diferentes tipos de lípidos, fosfolípidos e/ou tensioactivos que é útil para entrega de um fármaco (tal como os anticorpos anti-ErbB2 aqui revelados e opcionalmente, um agente quimioterapêutico) a um mamífero. As componentes do lipossoma 38

ΕΡ 1 189 634 /PT estão habitualmente dispostos numa formação em bicamada, semelhante à disposição de lipidos das membranas biológicas. A expressão "folheto incluso" utiliza-se em referência às instruções habitualmente incluídas em embalagens comerciais de produtos terapêuticos que contém informação sobre as indicações, utilização, dosagem, administração, contra indicações e/ou avisos relativos à utilização de tais produtos terapêuticos.

Um "cardioprotector" é um composto ou composição que evita ou reduz disfunção do miocárdio (ou seja cardiomiopatia e/ou insuficiência cardíaca congestiva) associada a administração de um fármaco, tal como um antibiótico antraciclina e/ou um anticorpo anti-ErbB2 a um doente. 0 cardioprotector pode, por exemplo, bloquear ou reduzir um efeito cardiotóxico mediado por radical livre e/ou evitar ou reduzir lesão de stress oxidativo. Constituem exemplos de cardioprotectores abrangidos pela presente definição, entre outros, o agente quelante de ferro dexrazoxano (ICRF-187) (Seifert et al. The Annals of Pharmacotherapy 28:1063-1072 (1994)); um agente de diminuição de lipidos e/ou antioxidante tal como probucol (Singal et al. J. Mol. Cell Cardiol. 27:1055-1063 (1995)); amifostina (éster de di-hidrogenofosfato de aminotiol 2-[(3-aminopropil)amino]-etanotiol, também denominado WR-2721 e a sua forma de absorção celular desfosforilada denominada WR-1065) e ácido S—3—(3— metilaminopropilamino)propilfosforotióico (WR-151327), consultar Green et al. Câncer Research 54:738-741 (1994); digoxina (Bristow, M.R. em Bristow MR, ed. Drug-Induced Heart Disease. Nova Iorque: Elsevier 191-215 (1980)); bloqueadores beta tal como metoprolol (Hjalmarson et al. Drugs 47:Supl 4:31-9 (1994); e Shaddy et al. Am. Heart J. 129:197-9 (1995)); vitamina E; ácido ascórbico (vitamina C) ; sequestrantes de radicais livres tais como ácido oleanólico, ácido ursólico e N-acetilcisteína (NAC); compostos de armadilha de spin tal como alfa-fenil-terc-butilnitrona (PBN); (Paracchini et al., Anticancer Res. 13:1607-1612(1993)); compostos seleno-orgânicos tal como P251 (Elbesen); e semelhantes. II. Produção de anticorpos anti-ErbB2

Segue-se uma descrição relativa a exemplos de técnicas para a produção dos anticorpos utilizados de acordo com o presente invento. O antigénio ErbB2 utilizado para produção de anticorpos pode ser, por exemplo, uma forma solúvel do domínio 39

ΕΡ 1 189 634 /PT extracelular de ErbB2 ou uma sua parte, contendo o epítopo pretendido. Alternativamente, podem utilizar-se células que expressam ErbB2 na sua superfície celular (por exemplo células NIH-3T3 transformadas para sobre-expressar ErbB2; ou uma linha celular de carcinoma tal como células SKBR3, consultar Stancovski et al. PNAS (USA) 88:8691-8695 (1991)) para gerar anticorpos. Outras formas de ErbB2 úteis para gerar anticorpos serão óbvias para os peritos na arte. (i) Anticorpos policlonais

Os anticorpos policlonais são de preferência desenvolvidos em animais por injecções subcutâneas (sc) ou intraperitoneais (ip) múltiplas do antigénio relevante e de um adjuvante. Pode ser útil conjugar o antigénio relevante com uma proteína que é imunogénica na espécie a imunizar, por exemplo, hemocianina de lapa gigante, albumina de soro, tiroglobulina bovina ou inibidor de tripsina de soja, utilizando um agente bifuncional ou de derivatização, por exemplo, éster maleimidobenzoilsulfosuccinimida (conjugação através de residuos de cisteina), N-hidroxisuccinimida (através de resíduos de lisina), glutaraldeído, anidrido succínico, SOCl2, ou R1N=C=NR, em que R e R1 são grupos alquilo diferentes.

Imunizam-se animais contra o antigénio, conjugados imunogénicos ou derivados por combinação, por exemplo, de 100 pg ou 5 pg da proteína ou conjugado (para coelhos ou ratinhos, respectivamente) com 3 volumes de adjuvante completo de Freund e injecção da solução por via intradérmica em múltiplos locais. Um mês depois os animais recebem reforços com 1/5 a 1/10 da quantidade original do péptido ou conjugado em adjuvante completo de Freund por injecção subcutânea em múltiplos locais. Sete a 14 dias depois sangram-se os animais e ensaia-se o soro quanto ao título de anticorpo. Os animais recebem reforços até o título estabilizar. De preferência, o animal recebe reforços com conjugado do mesmo antigénio, mas conjugado com uma proteína diferente e/ou através de um reagente de reticulação diferente. Podem também produzir-se conjugados em cultura de células recombinantes na forma de fusões de proteínas. Igualmente, utilizam-se adequadamente agentes de agregação tal como alúmen para aumentar a resposta imunológica. 40 ΕΡ 1 189 634 /PT (ii) Anticorpos monoclonais

Obtêm-se anticorpos monoclonais de uma população de anticorpos substancialmente homogénea, ou seja, os anticorpos individuais que constituem a população são idênticos excepto relativamente a possíveis mutações de ocorrência natural que podem estar presentes em pequenas quantidades. Assim, o adjectivo "monoclonal" indica o carácter do anticorpo como não sendo uma mistura de anticorpos distintos.

Por exemplo, os anticorpos monoclonais pode ser preparados utilizando o método do hibridoma descrito pela primeira vez por Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), ou podem ser preparados por métodos de ADN recombinante (patente U.S. 4 816 567) .

No método do hibridoma, imuniza-se um ratinho ou outro animal hospedeiro apropriado, tal como um hamster, como aqui descrito acima para desenvolver linfócitos que produzem ou são capazes de produzir anticorpos que se ligarão especificamente à proteina utilizada para a imunização. Alternativamente, os linfócitos podem ser imunizados in vitro. Fundem-se então os linfócitos com células de mieloma utilizando um agente de fusão adequado, tal como polietilenoglicol, para formar uma célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, p.59-103 (Academic Press, 1986)).

As células de hibridoma assim preparadas são cultivadas e crescidas num meio de cultura adequado que contém de preferência uma ou mais substâncias que inibem o crescimento ou sobrevivência das células progenitoras de mieloma não fundidas. Por exemplo, se as células de mieloma progenitoras não apresentam a enzima hipoxantina-guanina-fosforribosil-transferase (HGPRT ou HPRT), o meio de cultura para os hibridomas incluirá tipicamente hipoxantina, aminopterina e timidina (meio HAT), substâncias estas que evitam o crescimento de células deficientes em HGPRT.

Constituem células de mieloma preferidas aquelas que fundem eficientemente, suportam a produção de anticorpo estável e a nivel elevado pelas células produtoras de anticorpo seleccionadas e são sensíveis a um meio tal como o 41

ΕΡ 1 189 634 /PT meio HAT. Entre estas, constituem linhas celulares de mieloma preferidas as linhas de mieloma murino, tais como as derivadas de tumores de ratinho MOPC-21 e MPC-11 disponíveis em Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Califórnia, EUA e as células SP-2 ou X63-Ag8-653 disponíveis na American Type Culture Collection, Rockville, Maryland EUA. Foram também descritas linhas celulares de mieloma humano e heteromieloma ratinho-humano para a produção de anticorpos monoclonais humanos (Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); e Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, p. 51-63 (Mareei Dekker, Inc., New York, 1987)).

Ensaia-se o meio de cultura no qual as células de hibridoma crescem relativamente à produção de anticorpos monoclonais dirigidos contra o antigénio. De preferência, determina-se a especificidade de ligação dos anticorpos monoclonais produzidos pelas células de hibridoma por imunoprecipitação ou por um ensaio de ligação in vitro, tal como radioimunoensaio (RIA) ou ensaio de imunossorção com enzimas ligadas (ELISA). A afinidade de ligação do anticorpo monoclonal pode, por exemplo, ser determinada pela análise de Scatchard de Munson et ai., Anal. Biochem., 107:220 (1980).

Após identificação das células de hibridoma que produzem anticorpos com a especificidade, afinidade e/ou actividade pretendidas, podem subclonar-se os clones por procedimentos de diluição limitante e cultivar-se por métodos padrão (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, p. 59-103 (Academic Press, 1986)). Constituem meios de cultura adequados para este objectivo, entre outros, por exemplo, meio D-MEM ou RPMI-1640. Adicionalmente, as células de hibridoma podem ser crescidas in vivo como tumores ascíticos num animal.

Os anticorpos monoclonais excretados pelos subclones são adequadamente separados do meio de cultura, fluido ascítico ou soro por procedimentos de purificação de anticorpo convencionais tais como, por exemplo, cromatografia em proteína A-Sepharose, hidroxilapatite, electroforese em gel, diálise ou cromatografia de afinidade. 42

ΕΡ 1 189 634 /PT Ο ADN que codifica os anticorpos monoclonais é facilmente isolado e sequenciado utilizando procedimentos convencionais (por exemplo, utilizando sondas oligonucleotidicas que são capazes de se ligar especificamente a genes que codificam as cadeias pesada e leve de anticorpos murinos). As células de hibridoma servem como uma fonte preferida de um tal ADN. Uma vez isolado, o ADN pode ser introduzido em vectores de expressão, que são então transfectados para células hospedeiras tais como células de E. coli, células COS de simio, células de ovário de hamster chinês (CHO) ou células de mieloma que não produziriam de outro modo proteina anticorpo, para obter a sintese de anticorpos monoclonais nas células hospedeiras recombinantes. Constituem artigos de revisão sobre expressão recombinante em bactérias do ADN que codifica o anticorpo, entre outros, Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262 (1993) e Pluckthun, Immunol. Revs., 130:151-188 (1992) .

Numa concretização adicional, podem isolar-se anticorpos monoclonais ou fragmentos de anticorpo de bibliotecas de anticorpos em fagos produzidas utilizando as técnicas descritas em McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990).

Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) e Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991) descrevem o isolamento de anticorpos murinos e humanos, respectivamente, utilizando bibliotecas de fagos. Publicações subsequentes descrevem a produção de anticorpos humanos de elevada afinidade (gama de nM) por mistura de cadeias (Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)), assim como infecção combinatória e recombinação in vivo como uma estratégia para construir bibliotecas de fagos muito grandes (Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res., 21:2265-2266 (1993)). Assim, estas técnicas constituem alternativas viáveis a técnicas tradicionais de hibridoma de anticorpos monoclonais para isolamento de anticorpos monoclonais. O ADN pode ser também modificado, por exemplo, por substituição da sequência de codificação dos domínios constantes de cadeia pesada e de cadeia leve humanas em vez das sequências murinas homólogas (patente U.S. 4 816 567; e Morrison, et al., Proc. Natl Acad. Sei. USA, 81:6851 (1984)), ou por ligação covalente à sequência de codificação da 43

ΕΡ 1 189 634 /PT imunoglobulina que codifica toda ou parte da sequência de codificação de um polipéptido que não imunoglobulina.

Tipicamente tais polipéptidos que não de imunoglobulina são substituídos pelos domínios constantes de um anticorpo, ou são substituídos pelos domínios variáveis de um local de combinação com o antigénio de um anticorpo para criar um anticorpo bivalente quimérico incluindo um local de combinação com o antigénio apresentando especificidade para um antigénio e outro local de combinação com o antigénio apresentando especificidade para um antigénio diferente. (iii) Anticorpos humanizados Têm sido descritos na arte métodos para humanizar anticorpos. De preferência, um anticorpo humanizado tem introduzidos um ou mais resíduos de aminoácidos de uma fonte que não é humana. Estes resíduos de aminoácido não humanos são muitas vezes referidos como resíduos "importados", que são tipicamente retirados de um domínio variável "importado". A humanização pode ser essencialmente efectuada seguindo o método de Winter e colaboradores (Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)), por substituição de sequências da região hipervariável pelas sequências correspondentes de um anticorpo humano. Assim, tais anticorpos "humanizados" são anticorpos quiméricos (patente U.S. 4 816 567) em que substancialmente menos que um domínio variável humano intacto foi substituído pela sequência correspondente de uma espécie não humana. Na prática, os anticorpos humanizados são tipicamente anticorpos humanos nos quais alguns resíduos da região hipervariável e possivelmente alguns resíduos FR são substituídos por resíduos de locais análogos em anticorpos de roedores. A escolha de domínios variáveis humanos, tanto leves como pesados, para utilizar para produzir os anticorpos humanizados é muito importante para reduzir a antigenicidade. De acordo com o denominado método do "melhor ajuste", a sequência do domínio variável de um anticorpo de roedor é rastreada contra a biblioteca completa de sequências de domínios variáveis humanos. A sequência humana que estiver mais próxima da do 44

ΕΡ 1 189 634 /PT roedor é então aceite como a região de esqueleto (FR) humana para o anticorpo humanizado (Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)). Outro método utiliza uma região de esqueleto especifica derivada de uma sequência de consenso de todos os anticorpos humanos de um subgrupo particular de cadeias leves ou pesadas. O mesmo esqueleto pode ser utilizado para vários anticorpos humanizados diferentes (Cárter et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151:2623 (1993)). É ainda importante que os anticorpos sejam humanizados com retenção de afinidade elevada para com o antigénio e outras propriedades biológicas favoráveis. Para atingir este objectivo, de acordo com um método preferido, preparam-se anticorpos humanizados por um processo de análise das sequências progenitoras e diferentes produtos humanizados conceptuais utilizando modelos tridimensionais das sequências progenitora e humanizada. Os modelos tridimensionais de imunoglobulina estão habitualmente disponíveis e são familiares aos peritos na arte. Estão disponíveis programas de computador que ilustram e apresentam estruturas conformacionais tridimensionais prováveis de sequências de imunoglobulina candidatas seleccionadas. A inspecção destas apresentações permite a análise do papel provável dos resíduos no funcionamento da sequência de imunoglobulina candidata, ou seja, a análise de resíduos que influenciam a capacidade da imunoglobulina candidata se ligar ao seu antigénio. Deste modo, os resíduos FR podem ser seleccionados e combinados a partir das sequências recebedoras e de importação de modo a que a característica pretendida do anticorpo, tal como afinidade aumentada para o(s) antigénio(s) alvo, seja atingida. De um modo geral, os resíduos da região hipervariável estão directa e mais substancialmente envolvidos na influência da ligação ao antigénio. O exemplo 3 que se segue descreve produção de anticorpos humanizados anti-ErbB2 exemplificativos que ligam ErbB2 e bloqueiam activação por ligandos de um receptor ErbB. O anticorpo humanizado de particular interesse aqui bloqueia a activação de MAPK mediada por EGF, TGF-α e/ou HRG essencialmente de modo tão eficaz como o anticorpo monoclonal 45

ΕΡ 1 189 634 /PT 2C4 murino (ou um seu fragmento Fab) e/ou liga ErbB2 essencialmente de modo tão eficaz como o anticorpo monoclonal 2C4 murino (ou um seu fragmento Fab). 0 anticorpo humanizado do presente documento pode, por exemplo, incluir residuos de região hipervariável não humana incorporados num dominio pesado variável humano e pode incluir adicionalmente uma substituição da região de esqueleto (FR) numa posição seleccionada do grupo que consiste de 69H, 71H e 73H, utilizando o sistema de numeração de dominio variável estabelecido por Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Maryland (1991). Numa concretização, o anticorpo humanizado inclui substituições em FR em duas ou todas as posições 69H, 71H e 73H.

Um exemplo de anticorpo humanizado de interesse aqui inclui os residuos determinantes de complementaridade do dominio pesado variável, GFTFRDYTMX, em que x é de preferência D OU S (SEQ ID NO: 7), DVNPNSGGSIYNQRFKG (SEQ ID NO: 8) ; e/ou NLGPSFYFDY (SEQ ID NO:9), incluindo opcionalmente modificações de aminoácidos desses residuos de CDR, por exemplo em que as modificações essencialmente mantêm ou melhoram a afinidade do anticorpo. Por exemplo, a variante de anticorpo de interesse pode ter cerca de um a cerca de sete ou cerca de cinco substituições de aminoácidos nas sequências CDR pesadas variáveis anteriores. Tais variantes de anticorpo podem ser preparadas por maturação por afinidade, por exemplo, tal como se descreve adiante. 0 anticorpo humanizado mais preferido inclui a sequência de aminoácidos do dominio pesado variável em SEQ ID NO:4.

0 anticorpo humanizado pode incluir residuos determinantes de complementaridade do dominio leve variável, KASQDVSIGVA (SEQ ID NO: 10), SASYX^X3, em que X1 é de preferência R ou L; X2 é de preferência Y ou E; e X3 é de preferência T ou S (SEQ ID NO: 11); e QQYYIYPYT (SEQ ID NO: 12), por exemplo adicionalmente aos residuos de CDR do dominio pesado variável do parágrafo precedente. Tais anticorpos humanizados incluem opcionalmente modificações de aminoácidos dos residuos de CDR anteriores, por exemplo em que as modificações essencialmente mantêm ou melhoram a afinidade do anticorpo. Por exemplo, a variante de anticorpo de interesse pode ter desde cerca de um 46

ΕΡ 1 189 634 /PT a cerca de sete ou cerca de cinco substituições de aminoácidos nas sequências de CDR leves variáveis anteriores. Tais variantes de anticorpo podem ser preparadas por maturação de afinidade, por exemplo, tal como se descreve adiante. 0 anticorpo humanizado mais preferido inclui a sequência de aminoácidos do dominio leve variável de SEQ ID NO:3. 0 presente pedido também abrange anticorpos maturados por afinidade que ligam ErbB2 e bloqueiam activação por ligandos de um receptor ErbB. 0 anticorpo progenitor pode ser um anticorpo humano ou um anticorpo humanizado, por exemplo, aquele que inclua as sequências variáveis leves e/ou pesadas de SEQ ID N0:3 e 4, respectivamente (ou seja variante 574). 0 anticorpo maturado por afinidade liga-se de preferência ao receptor ErbB2 com uma afinidade superior à do 2C4 murino ou da variante 574 (por exemplo com afinidade melhorada em cerca de duas ou cerca de quatro vezes, até cerca de 100 vezes ou cerca de 1000 vezes, por exemplo como ensaiado utilizando um dominio extracelular de ErbB2 (ECD) (ELISA). Constituem exemplos de resíduos de CDR variáveis pesadas para substituição, entre outros, H28, H30, H34, H35, H64, H96, H99 ou combinações de dois ou mais (por exemplo dois a três, quatro, cinco, seis ou sete desses resíduos). Constituem exemplos de resíduos de CDR leves variáveis para alteração, entre outros, L28, L50, L53, L56, L91, L92, L93, L94, L96, L97 ou combinações de dois ou mais (por exemplo dois a três, quatro, cinco ou até cerca de dez desses resíduos).

Estão abrangidas várias formas do anticorpo humanizado ou maturado por afinidade. Por exemplo, anticorpo humanizado ou maturado por afinidade pode ser um fragmento de anticorpo, tal como um Fab, que é opcionalmente conjugado com um ou mais agente(s) citotóxico(s) de modo a gerar um imunoconjugado. Alternativamente, o anticorpo humanizado ou maturado por afinidade pode ser anticorpo intacto, tal como um anticorpo IgGl intacto. (iv) Anticorpos humanos

Em alternativa à humanização, podem gerar-se anticorpos humanos. Por exemplo, é agora possível produzir animais transgénicos (por exemplo, ratinhos) que são capazes, por 47

ΕΡ 1 189 634 /PT imunização, de produzir um repertório completo de anticorpos humanos na ausência de produção endógena de imunoglobulinas. Por exemplo, descreveu-se que a deleção homozigótica de um gene da região de junção da cadeia pesada do anticorpo (Jh) em ratinhos mutantes de linha germinal resulta em inibição completa da produção endógena de anticorpo. A transferência da gama de genes de imunoglobulina de linha germinal humana para tais ratinhos mutantes de linha germinal resultará na produção de anticorpos humanos por provocação com antigénio. Consultar, por exemplo, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993); e patentes U.S. 5 591 669, 5 589 369 e 5 545 807.

Alternativamente, pode utilizar-se tecnologia de exibição em fagos (McCafferty et al., Nature 348:552-553 (1990)) para produzir anticorpos e fragmentos de anticorpos humanos in vitro, de repertórios de genes do domínio variável (V) de imunoglobulina a partir de dadores não imunizados. De acordo com esta técnica, os genes do dominio V do anticorpo são clonados em enquadramento de leitura com um gene da proteína do envelope principal ou secundária de um bacteriófago filamentoso, tal como Ml3 ou fd e apresentados como fragmentos de anticorpo funcionais na superfície de uma partícula fágica. Devido à partícula filamentosa conter uma cópia do ADN em cadeia simples do genoma do fago, as selecções baseadas nas propriedades funcionais do anticorpo também resultam na selecção do gene que codifica o anticorpo apresentando essas propriedades. Assim, o fago mimetiza algumas das propriedades da célula B. Pode efectuar-se exibição em fagos em vários formatos; para uma revisão consultar, por exemplo, Johnson, Kevin S. e Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993). Podem utilizar-se várias fontes de segmentos do gene V para exibição em fagos. Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) isolaram várias matrizes de anticorpos anti-oxazolona a partir de uma biblioteca combinatória aleatória pequena de genes v derivados dos baços de ratinhos imunizados. Pode construir-se um repertório de genes V de dadores humanos não imunizados e podem isolar-se anticorpos para uma matriz diversificada de antigénios (incluindo auto-antigénios) seguindo essencialmente as técnicas descritas por Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 48

ΕΡ 1 189 634 /PT (1991), ou Griffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993).

Consultar, igualmente as patentes U.S. 5 565 332 e 5 573 905.

Tal como discutido acima, podem gerar-se anticorpos humanos por células B activadas in vitro (consultar patentes U.S. 5 567 610 e 5 229 275).

Descrevem-se anticorpos humanos anti-ErbB2 na patente U.S. 5 772 997 concedida a 30 de Junho de 1998 e wo 97/00271 publicado a 3 de Janeiro de 1997. (v) Fragmentos de anticorpo Têm sido desenvolvidas várias técnicas para a produção de fragmentos de anticorpo. Tradicionalmente, estes fragmentos eram derivados através de digestão proteolitica de anticorpos intactos (consultar, por exemplo, Morimoto et al., Journal of Bíochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992); e

Brennan et al., Science, 229:81 (1985)). Contudo, estes fragmentos podem ser agora produzidos directamente por células hospedeiras recombinantes. Por exemplo, os fragmentos de anticorpo podem ser isolados a partir das bibliotecas de anticorpos em fagos discutidas acima. Alternativamente, podem recuperar-se fragmentos Fab'-SH directamente de E. coli e acoplar-se quimicamente para formar fragmentos F(ab')2 (Cárter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). De acordo com outra abordagem, podem isolar-se fragmentos F(ab')2 directamente a partir de cultura de células recombinantes. Outras técnicas para a produção de fragmentos de anticorpo serão óbvias para o perito na arte. Noutras concretizações, o anticorpo escolhido é um fragmento Fv de cadeia simples (scFv). Consultar WO 93/16185; patente U.S. 5 571 894; e patente U.S. 5 587 458. O fragmento de anticorpo pode também ser um "anticorpo linear", por exemplo, tal como descrito na patente U.S. 5 641 870 por exemplo. Tais fragmentos de anticorpo lineares podem ser monoespecíficos ou biespecificos. (vi) Anticorpos biespecificos

Os anticorpos biespecificos são anticorpos que apresentam especificidades de ligação para pelo menos dois tipos de epitopos diferentes. Exemplos de anticorpos biespecificos 49

ΕΡ 1 189 634 /PT podem ligar-se a dois epítopos diferentes da proteína ErbB2. Outros de tais anticorpos podem combinar um local de ligação ErbB2 com local(ais) de ligação para EGFR, ErbB3 e/ou ErbB4. Alternativamente, pode combinar-se um braço anti-ErbB2 com um braço que se liga a uma molécula desencadeadora num leucócito tal como uma molécula receptora de células T (por exemplo CD2 ou CD3), ou receptores Fc para IgG (FcyR), tais como FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) e FcyRIII (CD 16) de modo a focar os mecanismos de defesa celular na célula que expressa ErbB2. Podem também utilizar-se anticorpos biespecíficos para localizar agentes citotóxicos em células que expressam ErbB2. Estes anticorpos apresentam um braço de ligação de ErbB2 e um braço que liga o agente citotóxico (por exemplo saporina, anti-interferão-α, alcaloide de vinca, cadeia A de ricina, metotrexato ou haptenos de isótopo radioactivo). Podem preparar-se anticorpos biespecíficos na forma de anticorpos completos ou fragmentos de anticorpo (por exemplo anticorpos biespecíficos F(ab')2). WO 96/16673 descreve um anticorpo biespecífico anti-ErbB2/anti-FcYRIII e a patente U.S. 5 837 234 revela um anticorpo biespecífico anti-ErbB2/anti-FcYRl. Apresenta-se um anticorpo biespecífico anti-ErbB2/Fca em WO98/02463. A patente U.S. 5 821 337 revela um anticorpo biespecífico anti-

ErbB2/anti-CD3 . São conhecidos na arte métodos de produzir anticorpos biespecíficos. A produção tradicional de anticorpos biespecíficos completos baseia-se na co-expressão de dois pares cadeia pesada - cadeia leve de imunoglobulina, em que as duas cadeias apresentam especificidades diferentes (Millstein et al., Nature, 305:537-539 (1983)). Devido à distribuição aleatória de cadeias leves e pesadas de imunoglobulina, estes hibridomas (quadromas) produzem uma mistura potencial de 10 moléculas de anticorpo diferentes, dos quais apenas uma tem a estrutura biespecífica correcta. A purificação da molécula correcta, que é habitualmente efectuada por etapas de cromatografia de afinidade, é bastante complicada e os rendimentos de produto são reduzidos. Revelam-se procedimentos semelhantes em WO 93/08829 e em Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991). 50

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De acordo com uma abordagem diferente, fundem-se domínios variáveis de anticorpo com as especificidades de ligação pretendidas (locais de combinação anticorpo-antigénio) a sequências de domínios constantes de imunoglobulinas. A fusão preferida é aquela com um domínio constante de cadeia pesada de imunoglobulina incluindo pelo menos parte das regiões de charneira, CH2 e CH3. Prefere-se que contenha a primeira região constante de cadeia pesada (CHI) contendo o local necessário para ligação da cadeia leve presente em pelo menos uma das fusões. Os ADN que codificam as fusões de cadeia pesada de imunoglobulina e caso pretendido, a cadeia leve de imunoglobulina, são inseridos em vectores de expressão independentes e são co-transfectados para um organismo hospedeiro adequado. Tal proporciona grande flexibilidade no ajuste das proporções recíprocas dos três fragmentos de polipéptido em concretizações nas quais razões diferentes das três cadeias de polipéptido na construção proporcionam os rendimentos óptimos. É contudo possível inserir as sequências de codificação para dois ou todas as três cadeias de polipéptido num vector de expressão quando a expressão de pelo menos duas cadeias de polipéptido em razões iguais resulta em rendimentos elevados ou quando as razões não têm qualquer significado especial.

Numa concretização preferida desta abordagem, os anticorpos biespecíficos são compostos de uma cadeia pesada de imunoglobulina híbrida com uma primeira especificidade de ligação num braço e um par de cadeia pesada - cadeia leve híbrido de imunoglobulina (proporcionando uma segunda especificidade de ligação) no outro braço. Verificou-se que esta estrutura assimétrica facilita a separação do composto biespecífico pretendido de combinações de cadeias de imunoglobulina não pretendidas, dado que a presença de uma cadeia leve de imunoglobulina em apenas uma metade da molécula biespecífica proporciona um modo fácil de separação. Esta abordagem é revelada em WO 94/04690. Para detalhes adicionais sobre a geração de anticorpos biespecíficos consultar, por exemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986).

De acordo com outra abordagem descrita na patente U.S. 5 731 168, a interface entre um par de moléculas de anticorpo pode ser concebida racionalmente para maximizar a percentagem 51

ΕΡ 1 189 634 /PT de heterodímeros que são recuperados de cultura de células recombinantes. A interface preferida inclui pelo menos uma parte do domínio CH3 de um domínio constante de anticorpo. Neste método, uma ou mais cadeias laterais de aminoácidos pequenos da interface da primeira molécula de anticorpo são substituídas por cadeias laterais maiores (por exemplo tirosina ou triptofano). Criam-se "cavidades" compensatórias de tamanho idêntico ou semelhante ao da(s) cadeia(s) lateral(ais) grande(s) na interface da segunda molécula de anticorpo por substituição das cadeias laterais de aminoácidos grandes por outras mais pequenas (por exemplo alanina ou treonina). Tal proporciona um mecanismo para aumentar o rendimento do heterodímero relativamente a produtos finais não pretendidos tais como homodímeros.

Os anticorpos biespecíficos incluem anticorpos reticulados ou "heteroconjugados". Por exemplo, um dos anticorpos no heteroconjugado pode ser acoplado a avidina e o outro a biotina. Tais anticorpos foram propostos para que, por exemplo, células do sistema imunológico tenham como alvo células indesejáveis (patente U.S. 4 676 980) e para tratamento de infecção por VIH (WO 91/00360, WO 92/200373 e EP 03089) . Podem produzir-se anticorpos heteroconjugados utilizando quaisquer métodos de reticulação convenientes. São bem conhecidos na arte agentes de reticulação adequados e são revelados na patente U.S. 4 676 980, conjuntamente com várias técnicas de reticulação.

Também se descreveram na literatura técnicas para gerar anticorpos biespecificos a partir de fragmentos de anticorpo. Por exemplo, podem preparar-se anticorpos biespecificos utilizando ligação química. Brennan et al.r Science, 229: 81 (1985) descrevem um procedimento em que se clivam proteoliticamente anticorpos intactos para gerar fragmentos F(ab')2· Estes fragmentos são reduzidos na presença do agente de complexação de ditiol, arsenieto de sódio, para estabilizar ditióis vicinais e evitar a formação de dissulfureto intermolecular. Os fragmentos Fab' gerados são então convertidos nos derivados tionitrobenzoato (TNB). Um dos derivados Fab'-TNB é então reconvertido ao Fab'-tiol por redução com mercaptoetilamina e é misturado com uma quantidade equimolar de outro derivado Fab'-TNB para formar o anticorpo 52

ΕΡ 1 189 634 /PT biespecífico. Os anticorpos biespecíficos produzidos podem ser utilizados como agentes para a imobilização selectiva de enzimas.

Progressos recentes facilitaram a recuperação directa de fragmentos Fab'-SH a partir de E. coli, que podem ser acoplados quimicamente para formar anticorpos biespecíficos. Shalaby et al., J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992) descrevem a produção de uma molécula de anticorpo biespecífico F(ab)2 completamente humanizado. Cada fragmento Fab' foi excretado independentemente de E. coli e submetido a acoplamento quimico dirigido in vitro para formar o anticorpo biespecífico. 0 anticorpo biespecifico assim formado foi capaz de se ligar a células que sobre-expressam o receptor ErbB2 e células T humanas normais, assim como desencadear a actividade litica de linfócitos citotóxicos humanos contra alvos de tumor da mama humanos.

Foram também descritas diversas técnicas para produzir e isolar fragmentos de anticorpo biespecíficos directamente a partir de cultura de células recombinantes. Por exemplo, produziram-se anticorpos biespecíficos utilizando cremalheiras de leucina. Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992) . Ligaram-se os péptidos de cremalheira de leucina das proteínas Fos e Jun às partes Fab' de dois anticorpos diferentes por fusão génica. Reduziram-se os homodímeros de anticorpo na região de charneira para formar monómeros e seguidamente reoxidaram-se para formar os heterodímeros de anticorpo. Este método pode também ser utilizado para a produção de homodímeros de anticorpo. A tecnologia de "diacorpo" descrita por Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90:6444-6448 (1993) proporcionou um mecanismo alternativo para produzir fragmentos de anticorpo biespecifico. Os fragmentos incluem um domínio variável de cadeia pesada (VH) ligado a um domínio variável de cadeia leve (VL) por um ligante que é demasiado curto para permitir emparelhamento entre os dois domínios da mesma cadeia. Consequentemente os domínios VH e VL de um fragmento são forçados a emparelhar com os domínios VH e VL complementares de outro fragmento, formando assim dois locais de ligação ao antigénio. Foi também relatada outra estratégia para produzir fragmentos de anticorpo biespecíficos por utilização de 53

ΕΡ 1 189 634 /PT dímeros de Fv de cadeia simples (sFv). Consultar Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994).

Estão abrangidos anticorpos com mais de duas valências. Por exemplo, podem preparar-se anticorpos triespecificos. Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991). (vil) Outras modificações da sequência de aminoácidos

Estão abrangidas modificação(ões) da sequência de aminoácidos dos anticorpos anti-ErbB2 aqui descritos. Por exemplo, pode ser desejável melhorar a afinidade de ligação e/ou outras propriedades biológicas do anticorpo. Preparam-se variantes de sequência de aminoácidos do anticorpo anti-ErbB2 por introdução de alterações de nucleótidos adequadas no ácido nucleico do anticorpo anti-ErbB2 ou por síntese peptídica. Tais modificações incluem, por exemplo, deleções e/ou inserções e/ou substituições de resíduos dentro das sequências de aminoácidos do anticorpo anti-ErbB2. Efectua-se qualquer combinação de deleção, inserção e substituição para obter a construção final, desde que a construção final apresente as características pretendidas. As alterações de aminoácidos podem também alterar os processos pós-tradução do anticorpo anti-ErbB2, tal como a alteração do número ou da posição dos locais de glicosilação.

Um método útil para a identificação de determinados resíduos ou regiões do anticorpo anti-ErbB2 que são localizações preferidas para mutagénese denomina-se "mutagénese por varrimento de alaninas" tal como descrito por Cunningham e Wells Science, 244:1081-1085 (1989). Aqui, identifica-se um resíduo ou grupo de resíduos alvo (por exemplo, resíduos carregados tais como arg, asp, his, lys e glu) e substituem-se por aminoácidos neutros ou carregados negativamente (com maior preferência alanina ou polialanina) para afectar a interacção dos aminoácidos com o antigénio ErbB2. As localizações de aminoácidos que demonstrem sensibilidade funcional às substituições são então refinadas por introdução de mais variantes ou de outras variantes nos, ou pelos, locais de substituição. Assim, embora o local para introduzir uma variação na sequência de aminoácidos seja predeterminado, não é necessário que a natureza da mutação por 54

ΕΡ 1 189 634 /PT si só seja predeterminada. Por exemplo, para analisar o desempenho de uma mutação num determinado local, efectua-se o varrimento de ala ou mutagénese aleatória no codão ou região alvo e rastreiam-se as variantes de anticorpo anti-ErbB2 expressas quanto à actividade pretendida.

As inserções na sequência de aminoácidos incluem fusões no terminal amino e/ou carboxilo na gama de comprimentos desde um resíduo até polipéptidos contendo cem ou mais resíduos, bem como inserções intra-sequência de um único ou múltiplos resíduos de aminoácidos. Constituem exemplos de inserções terminais, entre outras, um anticorpo anti-ErbB2 com um resíduo metionilo no terminal N ou o anticorpo fundido a um polipéptido citotóxico. Constituem outras variantes de inserção da molécula de anticorpo anti-ErbB2, entre outras, a fusão no terminal N ou C do anticorpo anti-ErbB2 a uma enzima (por exemplo, por ADEPT) ou um polipéptido que aumenta a semivida sérica do anticorpo.

Constitui outro tipo de variante, uma variante de substituição de aminoácido. Estas variantes contêm pelo menos um resíduo de aminoácido na molécula de anticorpo anti-ErB2 que foi substituído por um resíduo diferente. Os locais de maior interesse para mutagénese de substituição incluem as regiões hipervariáveis, mas também se consideram as alterações de FR . Apresentam-se substituições conservativas na tabela I no título "substituições preferidas". Se tais substituições resultarem numa alteração da actividade biológica, podem ser introduzidas alterações mais substanciais, denominadas "substituições exemplificativas" na tabela 1 ou como descrito mais detalhadamente adiante em relação a classes de aminoácidos, e os produtos podem ser rastreados. 55

ΕΡ 1 189 634 /PT

Tabela 1

Resíduo Original Substituições Exenqplificativas Substituições Preferidas Ala (A) vai; leu; ile vai Arg (R) lys; gin; asn lys Asn (N) gin; his; asp, lys; arg gin Asp (D) glu; asn glu Cys (C) ser; ala ser Gin (Q) asn; glu asn Glu (E) asp; gin asp Gly (G) ala ala His (H) asn; gin; lys; arg arg Ile (I) leu; vai; met; ala; phe; norleucina leu Leu (L) norleucina; ile; vai; met; ala; phe ile Lys (K) arg; gin; asn arg Met (M) leu; phe; ile leu Phe (F) leu; vai; ile; ala; tyr tyr Pro (P) ala ala Ser (S) thr thr Thr(T) ser ser Trp (W) tyr; phe tyr Tyr (Y) trp; phe; thr; ser phe Vai (V) ile; leu; met; phe; ala; norleucina leu

Conseguem-se modificações substanciais das propriedades biológicas do anticorpo por selecção de substituições que diferem significativamente no seu efeito de manutenção (a) da estrutura do esqueleto do polipéptido na área da substituição, por exemplo, numa conformação em folha ou em hélice, (b) da carga ou hidrofobicidade da molécula no local alvo, ou (c) do tamanho da cadeia lateral. Os resíduos de ocorrência natural são divididos em grupos com base em propriedades comuns da cadeia lateral: (1) hidrófobos: norleucina, met, ala, vai, leu, ile; (2) hidrófilos neutros: cys, ser, thr; (3) ácidos: asp, glu; 56

ΕΡ 1 189 634 /PT (4) básicos: asn, gin, his, lys, arg; (5) resíduos que influenciam a orientação da cadeia: gly, pro; e (6) aromáticos: trp, tyr, phe.

As substituições não conservativas abrangerão permuta de um membro de uma das classes por um de outra classe.

Pode também ser substituído qualquer resíduo de cisteína que não esteja envolvido na manutenção da conformação adequada do anticorpo anti-ErB2, em geral por serina, para melhorar a estabilidade à oxidação da molécula e evitar reticulação aberrante. Contrariamente, pode(m) adicionar-se ligação(ões) de cisteína ao anticorpo para melhorar a sua estabilidade (nomeadamente quando o anticorpo é um fragmento de anticorpo, tal como um fragmento Fv).

Um tipo de variante de substituição particularmente preferido envolve a substituição de um ou mais resíduos da região hipervariável de um anticorpo progenitor (por exemplo um anticorpo humanizado ou humano). Em geral, a(s) variante(s) resultante (s) seleccionada(s) para desenvolvimento adicional apresentarão propriedades biológicas melhoradas relativamente ao anticorpo progenitor do qual foram geradas. Um meio conveniente para gerar tais variantes de substituição envolve a maturação de afinidade utilizando exibição em fagos. Sucintamente, mutam-se vários locais da região hipervariável (por exemplo, 6-7 locais) para gerar todas as substituições amino possíveis em cada local. As variantes de anticorpo assim geradas são apresentadas de uma forma monovalente em partículas de fagos filamentosos como fusões com o produto do gene III de M13 empacotado dentro de cada partícula. As variantes apresentadas por fagos são então rastreadas quanto à sua actividade biológica (por exemplo, afinidade de ligação) tal como aqui revelado. De modo a identificar locais da região hipervariável candidatos para modificação, pode efectuar-se mutagénese por varrimento de alaninas para identificar resíduos da região hipervariável que contribuem significativamente para a ligação ao antigénio. Alternativa ou adicionalmente, pode ser benéfico analisar uma estrutura cristalina do complexo antigénio-anticorpo para identificar pontos de contacto entre o anticorpo e ErbB2 humano. Tais 57

ΕΡ 1 189 634 /PT resíduos de contacto e resíduos nas suas vizinhanças são candidatos para substituição de acordo com as técnicas aqui elaboradas. Uma vez geradas tais variantes, sujeita-se o painel de variantes a rastreio, tal como aqui descrito, e podem seleccionar-se anticorpos com melhores propriedades num ou mais ensaios relevantes para desenvolvimento adicional.

Outro tipo de variante de aminoácidos do anticorpo altera o padrão de glicosilação original do anticorpo. Por alteração pretende-se significar deleção de uma ou mais partes de hidrato de carbono presentes no anticorpo e/ou adição de um ou mais locais de glicosilação que não se encontram presentes no anticorpo. A glicosilação de anticorpos é tipicamente ligada a N ou ligada a 0. A ligação a N refere-se à ligação da porção hidrato de carbono à cadeia lateral de um resíduo de asparagina. As sequências tripeptídicas asparagina-X-serina e asparagina-X-treonina, em que x é qualquer aminoácido excepto prolina, são as sequências de reconhecimento para ligação enzimática da porção hidrato de carbono à cadeia lateral da asparagina. Assim, a presença de qualquer destas sequências tripeptídicas num polipéptido cria um potencial local de glicosilação. A glicosilação ligada a 0 refere-se à ligação de um dos açúcares N-acetilgalactosamina, galactose ou xilose a um hidroxiaminoácido, mais frequentemente serina ou treonina, embora também se possa utilizar 5-hidroxiprolina ou 5-hidroxilisina. A adição de locais de glicosilação ao anticorpo é conseguida convenientemente por alteração da sequência de aminoácidos de modo a que contenha uma ou mais das sequências tripeptídicas descritas acima (para locais de glicosilação ligada a N). A alteração pode também ser efectuada por adição ou substituição por um ou mais resíduos de serina ou treonina na sequência do anticorpo original (para locais de glicosilação ligada a 0) .

As moléculas de ácido nucleico que codificam variantes de sequência de aminoácidos do anticorpo anti-ErB2 são preparadas por vários métodos conhecidos na arte. Estes métodos incluem, entre outros, isolamento de uma fonte natural (no caso de 58 ΕΡ 1 189 634 /PT variantes de sequência de aminoácidos de ocorrência natural) ou preparação por mutagénese mediada por oligonucleótidos (ou dirigida ao local), mutagénese por PCR e mutagénese por cassetes de uma variante preparada anteriormente ou de uma versão não variante do anticorpo anti-ErB2.

Pode ser desejável modificar o anticorpo do invento relativamente à função efectora, por exemplo de modo a melhorar a citotoxicidade mediada por células dependente de antigénios (ADCC) e/ou citotoxicidade dependente do complemento (CDC) do anticorpo. Tal pode conseguir-se por introdução de uma ou mais substituições de aminoácidos numa região Fc do anticorpo. Alternativa ou adicionalmente, pode(m) ser introduzido(s) resíduo(s) de cisteína na região Fc, permitindo assim a formação de ligações dissulfureto intercadeias nesta região. 0 anticorpo homodimérico assim gerado pode apresentar capacidade de internalização melhorada e/ou morte celular mediada por complemento e citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC) aumentadas. Consultar Caron et al., J. Exp Med. 176:1191-1195 (1992) e Shopes, B. J. Irmunol. 148:2918-2922 (1992). Podem também preparar-se anticorpos homodiméricos com actividade antitumoral aumentada utilizando agentes de reticulação heterobifuncionais, tal como descrito em Wolff et ai. Câncer Research 53:2560-2565 (1993). Alternativamente, pode modificar-se um anticorpo por engenharia genética com duas regiões Fc e pode consequentemente apresentar capacidades de lise do complemento e ADCC melhoradas. Consultar Stevenson et al. Antl-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989) .

Para aumentar a semivida sérica do anticorpo, pode incorporar-se um epítopo de receptor selvagem no anticorpo (especialmente um fragmento de anticorpo) tal como descrito em Patente U.S. 5 739 277, por exemplo. Tal como aqui utilizada, a expressão "epítopo de ligação de receptor selvagem" refere-se a um epítopo da região Fc de uma molécula de IgG (por exemplo, igGi, lgG2, lgG3 ou igG4) que é responsável por aumentar a semivida sérica in vivo da molécula de IgG. 59

ΕΡ 1 189 634 /PT (νίίί) Rastreio de anticorpos com as propriedades pretendidas

Descreveram-se acima técnicas para gerar anticorpos. Adicionalmente, podem seleccionar-se anticorpos com determinadas caracteristicas biológicas, como pretendido.

Para identificar um anticorpo que bloqueia a activação por ligandos de um receptor ErbB, pode determinar-se a capacidade do anticorpo bloquear a ligação de ligando de ErbB a células que expressam o receptor ErbB (por exemplo em conjugação com outro receptor ErbB com o qual o receptor ErbB de interesse forma um hetero-oligómero ErbB). Por exemplo, podem incubar-se células que expressam naturalmente, ou transfectadas para expressar, receptores ErbB do hetero-oligómero ErbB com o anticorpo e seguidamente expostas a ligando de ErbB marcado. Pode então ser avaliada a capacidade do anticorpo anti-ErB2 bloquear a ligação ao receptor ErbB no receptor hetero-oligómero ErbB.

Por exemplo, a inibição da ligação de HRG a linhas celulares de tumor da mama MCF7 por anticorpos anti-ErB2 pode ser efectuada utilizando culturas de MCF7 em monocamada em gelo num formato de placa de 24 poços, essencialmente como descrito no exemplo 1, adiante. Podem adicionar-se anticorpos anti-ErB2 monoclonais a cada poço e incubar-se durante 30 minutos. Pode adicionar-se então rHRGpli77-224 marcado com

1 ? S I (25 pm) e continuar-se a incubação durante 4 a 16 horas. Podem preparar-se curvas dose-resposta e calcular-se um valor de IC50 para o anticorpo de interesse. Numa concretização, o anticorpo que bloqueia a activação por ligandos de um receptor ErbB apresentará uma IC50 para inibição da ligação de HRG a células MCF7 neste ensaio de cerca de 50 nM ou inferior, com maior preferência 10 nM ou inferior. Quando o anticorpo é um fragmento de anticorpo tal como um fragmento Fab, a IC50 para inibição da ligação de HRG a células MCF7 neste ensaio pode, por exemplo, ser cerca de 100 nM ou inferior, com maior preferência 50 nM ou inferior.

Alternativa ou adicionalmente, pode avaliar-se a capacidade do anticorpo anti-ErB2 bloquear a fosforilação de tirosina estimulada por ligando de ErbB de um receptor ErbB presente num hetero-oligómero ErbB. Por exemplo, as células 60

ΕΡ 1 189 634 /PT que expressam endogenamente os receptores ErbB, ou transfectadas para os expressar, podem ser incubadas com o anticorpo e seguidamente ensaiadas para actividade de fosforilação de tirosina dependente de ligando de ErbB, utilizando uma anti-fosfotirosina monoclonal (que se encontra conjugada opcionalmente com um marcador detectável). Também se encontra disponível o ensaio de activação do receptor quinase descrito em Patente U.S. 5 766 863 para determinar a activação e bloqueio dessa actividade do receptor ErbB por um anticorpo.

Numa concretização, pode rastrear-se quanto a um anticorpo que inibe a estimulação HRG de fosforilação de tirosina pl80 em células MCF7, essencialmente como descrito no exemplo 1 adiante. Por exemplo, as células MCF7 podem ser plaqueadas em placas de 24 poços e podem adicionar-se anticorpos monoclonais a ErbB2 em cada poço e incubar durante 30 minutos à temperatura ambiente; seguidamente pode adicionar-se rHRGpii77-244 a cada poço até uma concentração final de 0,2 nM e pode continuar-se a incubação durante 8 minutos. Pode aspirar-se o meio de cada poço e podem parar-se as reacções por adição de 100 μΐ de tampão de amostra de SDS (SDS a 5%, DTT 25 mM e Tris-HCl 25 mM, pH 6,8). Cada amostra (25 μΐ) pode ser sujeita a electroforese num gel de gradiente de 4-12% (Novex) e seguidamente transferida por electroforese para membrana de difluoreto de polivinilideno. Podem desenvolver-se transferências imunológicas anti-fosfotirosina (a 1 pg/ml) e pode quantificar-se a intensidade da banda reactiva predominante a Mr -180 000 por densitometria de reflectância. O anticorpo seleccionado de preferência inibirá significativamente a estimulação de fosforilação de tirosina pl80 a cerca de 0-35% do controlo neste ensaio. Pode preparar-se uma curva dose-resposta para inibição de estimulação HRG de fosforilação de tirosina pl80, tal como determinada por densitometria de reflectância, e pode calcular-se uma IC50 para o anticorpo de interesse. Numa concretização, o anticorpo que bloqueia a activação por ligandos de um receptor ErbB apresentará uma IC50 para inibir estimulação HRG de fosforilação de tirosina pl80 neste ensaio de cerca de 50 nM ou inferior, com maior preferência de 10 nM ou inferior. Quando o anticorpo é um fragmento de anticorpo tal como um fragmento Fab, o IC50 para inibir estimulação HRG de fosforilação de tirosina pl80 neste ensaio pode, por 61

ΕΡ 1 189 634 /PT exemplo, ser cerca de 100 nM ou inferior, com maior preferência 50 nM ou inferior.

Pode também avaliar-se os efeitos de inibição de crescimento do anticorpo em células MDA-MB-175, por exemplo, essencialmente como descrito em Schaefer et al. Oncogene 15:1385-1394 (1997). De acordo com este ensaio, podem tratar-se células MDA-MB-175 com um anticorpo anti-ErbB2 monoclonal (10 pg/mL) durante 4 dias e corarem-se com violeta de cristal. A incubação com um anticorpo anti-ErB2 pode demonstrar um efeito de inibição de crescimento nesta linha celular semelhante ao apresentado para o anticorpo monoclonal 2C4. Numa concretização adicional, HRG exógeno não reverterá significativamente esta inibição. De preferência, o anticorpo será capaz de inibir proliferação celular de células MDA-MB-175 numa extensão superior ao anticorpo monoclonal 4D5 (e opcionalmente numa extensão superior ao anticorpo monoclonal 7F3), tanto na presença como na ausência de HRG exógeno.

Numa concretização, o anticorpo anti-ErbB2 de interesse pode bloquear a associação dependente de herregulina de ErbB2 com ErbB3, em células MCF7 e SK-BR-3, tal como determinado numa experiência de co-imunoprecipitação, tal como a descrita no exemplo 2, de um modo substancialmente mais eficaz do que o anticorpo monoclonal 4D5 e, opcionalmente, de um modo substancialmente mais eficaz do que o anticorpo monoclonal 7F3.

Alternativa ou adicionalmente, pode determinar-se a capacidade do anticorpo bloquear activação mediada por EGF, TGF-α e/ou HRG de proteína-quinase activada por mitogénio (MAPK), por exemplo, tal como apresentado no exemplo 4 adiante. Pode seleccionar-se um anticorpo que bloqueia activação mediada por EGF, TGF-α e/ou HRG de proteína-quinase activada por mitogénio (MAPK) numa extensão superior a HERCEPTIN® ou anticorpo monoclonal 4D5. Além disso, o anticorpo de interesse pode bloquear activação mediada por EGF, TGF-α e/ou HRG de proteína-quinase activada por mitogénio (MAPK) numa extensão superior ao anticorpo monoclonal 7F3.

Para identificar anticorpos anti-ErbB2 inibidores de crescimento, podem rastrear-se anticorpos que inibem o 62

ΕΡ 1 189 634 /PT crescimento de células de cancro que sobre-expressam ErbB2. Numa concretização, o anticorpo inibidor de crescimento seleccionado é capaz de inibir o crescimento de células SK-BR-3 em cultura celular em cerca de 20-100% e de preferência em cerca de 50-100%, a uma concentração de anticorpo de cerca de 0,5 a 30 pg/ml. Para identificar tais anticorpos, pode efectuar-se ensaio SK-BR-3 descrito em Patente U.S. 5 677 171. De acordo com este ensaio, cultivam-se células SK-BR-3 numa mistura 1:1 de F12 e meio DMEM suplementado com soro bovino fetal a 10%, glutamina e penicilina estreptomicina. Plaqueiam-se as células SK-BR-3 a 20 000 células numa placa de cultura celular de 35 mm (2 ml/placa de 35 mm). Adiciona-se 0,5 a 30 pg/ml do anticorpo anti-ErbB2 por placa. Após seis dias, conta-se o número de células, comparativamente a células não tratadas utilizando um contador celular electrónico COULTER™. Os anticorpos que inibem crescimento das células SK-BR-3 em cerca de 20-100% ou cerca de 50-100% podem ser seleccionados como anticorpos de inibição de crescimento.

Para seleccionar anticorpos que induzem morte celular, pode avaliar-se a perda de integridade membranar tal como indicada por absorção de, por exemplo, PI, azul de tripano ou 7AAD relativamente ao controlo. O ensaio preferido é o ensaio de absorção de PI utilizando células BT474. De acordo com este ensaio, cultivam-se células BT474 (que podem ser obtidas na American Type Culture Collection (Rockville, Maryland)) em meio Eagle modificado por Dulbecco (D-MEM):F-12 de Ham (50:50) suplementado com FBS inactivada por calor a 10% (Hyclone) e L-glutamina 2 mM. (Assim, efectua-se o ensaio na ausência de complemento e células de efector imunológico). Inoculam-se células BT474 a uma densidade de 3 x 106 por placa, em placas de 100 x 20 mm e deixam-se ligar durante a noite. Remove-se então o meio e substitui-se por meio fresco sozinho ou meio contendo o anticorpo monoclonal adequado a 10 pg/ml. As células são incubadas durante um período de tempo de 3 dias. Após cada tratamento, lavam-se as monocamadas com PBS e soltam-se por tripsinização. Centrifugam-se então as células a 1200 rpm durante 5 minutos a 4°C, ressuspende-se o sedimento em 3 ml de tampão de ligação de Ca2+ gelado (Hepes 10 mM, pH 7,4, NaCl 140 mM, CaCl2 2,5 mM) e separa-se em alíquotas para 12 x 75 tubos de 35 mm com tampa e coador (1 ml por tubo, 63

ΕΡ 1 189 634 /PT 3 tubos por grupo de tratamento) para remoção de aglomerados de células. Os tubos recebem então PI (10 pg/ml). As amostras podem ser analisadas utilizando um citómetro de fluxo FACSCAN™ e o utilitário FACSCONVERT™ CellQuest (Becton Dickinson). Os anticorpos que induzem níveis estatisticamente significativos de morte celular, tal como determinada por absorção de PI, podem ser seleccionados como anticorpos indutores de morte celular.

De modo a seleccionar anticorpos que induzem apoptose, encontra-se disponível um ensaio de ligação de anexina utilizando células BT474. Cultivam-se células BT474 e inoculam-se em placas, tal como discutido no parágrafo anterior. Remove-se então o meio e substitui-se com meio fresco sozinho ou meio contendo anticorpo monoclonal a 10 pg/ml. Após um período de incubação de três dias, lavam-se as monocamadas com PBS e soltam-se por tripsinização. Centrifugam-se então as células, ressuspendem-se em tampão de ligação de Ca2+ e separam-se em alíquotas para tubos, tal como descrito acima para o ensaio de morte celular. Os tubos recebem então anexina marcada (por exemplo anexina V-FTIC) (1 pg/ml). Podem analisar-se as amostras utilizando um citómetro de fluxo FACSCAN™ e utilitário FACSCONVERT™ CellQuest (Becton Dickinson). Os anticorpos que induzem niveis estatisticamente significativos de ligação de anexina relativamente ao controlo são seleccionados como anticorpos indutores de apoptose.

Além do ensaio de ligação de anexina, encontra-se disponível um ensaio de coloração de ADN utilizando células BT474. De modo a efectuar este ensaio, incubam-se células BT474 que foram tratadas com o anticorpo de interesse, tal como descrito nos dois parágrafos anteriores, com HOECHST 33342™ a 9 pg/ml durante 2 h a 37°C, seguidamente analisam-se num citómetro de fluxo EPICS ELITE™ (Coulter Corporation) utilizando utilitário MODFIT LT™ (Verity Software House) . Os anticorpos que induzem uma alteração na percentagem de células apoptóticas 2 ou mais vezes superior (e de preferência 3 ou mais vezes superior) a células não tratadas (até 100% de células apoptóticas) podem ser seleccionados como anticorpos pro-apoptóticos utilizando este ensaio. 64

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Para rastrear anticorpos que se ligam a um epítopo em ErbB2 ligado a um anticorpo de interesse, pode efectuar-se um ensaio de bloqueio cruzado de rotina, tal como descrito em Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow e David Lane (1988) . Alternativa ou adicionalmente, pode efectuar-se mapeamento de epítopo por métodos conhecidos na arte (consultar, por exemplo figuras IA e 1B, do presente documento). (ix) Imunoconjugados 0 invento também se refere a terapia com imunoconjugados incluindo um anticorpo conjugado a um agente citotóxico tal como um agente quimioterapêutico, toxina (por exemplo, uma pequena molécula de toxina ou uma toxina activa enzimaticamente de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal, incluindo seus fragmentos e/ou variantes) ou um isótopo radioactivo (ou seja, um radioconjugado).

Os agentes quimioterapêuticos úteis para gerar tais imunoconjugados foram descritos acima. São também aqui considerados conjugados de um anticorpo e uma ou mais moléculas pequenas de toxinas, tais como uma caliqueamicina, uma maitansina (Patente U.S. 5 208 020), um tricoteno e CC1065.

Numa concretização preferida do invento, o anticorpo é conjugado a uma ou mais moléculas de maitansina (por exemplo, cerca de 1 a cerca de 10 moléculas de maitansina por molécula de anticorpo). A maitansina pode, por exemplo, ser convertida a May-SS-Me que pode ser reduzida a May-SH3 e reagida com anticorpo modificado (Chari et al. Câncer Research 52: 127-131 (1992)) para gerar um imunoconjugado de anticorpo maitansinóide.

Outro imunoconjugado de interesse inclui um anticorpo anti-ErB2 conjugado a uma ou mais moléculas de caliqueamicina. A família de antibióticos de caliqueamicina é capaz de produzir quebras em ADN em cadeia dupla a concentrações sub-picomolar. Constituem análogos estruturais de caliqueamicina que podem ser utilizados, entre outros, γι1, c^1, c^1, N-acetil- 65

ΕΡ 1 189 634 /PT γι1, PSAG e Θ11 (Hinman et al. Câncer Research 53: 3336-3342 (1993) e Lode et al. Câncer Research 58: 2925-2928 (1998)).

Constituem toxinas enzimaticamente activas e seus fragmentos que podem ser utilizados, entre outros, cadeia A de difteria, fragmentos activos não ligantes de toxina da difteria, cadeia A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadeia A de ricina, cadeia A de abrina, cadeia A de modecina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII e PAP-S), inibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, inibidor de Sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina e os tricotecenos. Consultar, for exemplo, WO 93/21232 publicada a 28 de Outubro de 1993. 0 presente invento abrange adicionalmente um imunoconjugado formado entre um anticorpo e um composto com actividade nucleolítica (por exemplo, uma ribonuclease ou uma ADN endonuclease, tal como uma desoxirribonuclease; ADNase).

Encontram-se disponíveis uma variedade de isótopos radioactivos para a produção de anticorpos anti-ErB2 radioconjugados. Constituem exemplos, entre outros, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 e isótopos radioactivos de Lu.

Os conjugados do anticorpo e agente citotóxico podem ser preparados utilizando vários agentes de acoplamento de proteínas bifuncionais, tais como N-succinimidil-3-(2-piridilditiol)propionato (SPDP), succinimidil-4-(N- maleimidometil)ciclo-hexano-l-carboxilato, iminotiolano (IT), derivados bifuncionais de imidoésteres (tal como dimetiladipimidato HCL), ésteres activos (tal como dissuccinimidilsuberato), aldeídos (tal como glutaraldeido), compostos bis-azido (tal como bis (p-azidobenzoil)-hexanodiamina), derivados bis-diazónio (tal como bis-(p-diazoniobenzoil)etilenodiamina), diisocianatos (tal como tolueno-2,6-diisocianato) e compostos de flúor bis-activos (tal como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzeno). For exemplo, pode preparar-se uma imunotoxina de ricina tal como descrito em Vitetta et al. Science 238: 1098 (1987). Constitui um exemplo 66

ΕΡ 1 189 634 /PT de um agente quelante para conjugação de radionucleótido ao anticorpo ácido l-isotiocianatobenzil-3- metildietilenotriaminopenta-acético (MX-DTPA) marcado com carbono 14. Consultar WO94/11026. 0 ligante pode ser um "ligante clivável" facilitando a libertação do fármaco citotóxico na célula. For exemplo, pode ser utilizado um ligante lábil a ácido, ligante sensível a peptidase, ligante dimetilo ou ligante contendo dissulfureto (Chari et al. Câncer Research 52: 127-131 (1992)).

Alternativamente, pode ser preparada uma proteína de fusão incluindo o anticorpo anti-ErbB2 e o agente citotóxico, por exemplo por técnicas recombinantes ou síntese de péptidos.

Ainda numa outra concretização, o anticorpo pode ser conjugado a um "receptor" (tal como estreptavidina) para utilização em pré-direccionamento a alvos tumorais, em que o conjugado anticorpo-receptor é administrado ao doente, seguido de remoção do conjugado não ligado de circulação utilizando um agente de depuração e seguidamente administração de um "ligando" (por exemplo avidina) que está conjugado a um agente citotóxico (por exemplo, um radionucleótido). (x) Terapia de pro-fármaco mediada por enzima dependente de anticorpos (ADEPT)

Os anticorpos do presente invento podem também ser utilizados em ADEPT por conjugação do anticorpo com uma enzima activadora de pro-fármaco que converte um pro-fármaco (por exemplo, um agente quimioterapêutico peptidilo, consultar WO81/01145) a um fármaco anti-cancro activo. Consultar, por exemplo, WO 88/07378 e Patente U.S. 4 975 278. A componente enzima do imunoconjugado útil para ADEPT inclui qualquer enzima capaz de actuar num pro-fármaco de modo a convertê-lo na sua forma mais activa, citotóxica.

Constituem enzimas que são úteis no método deste invento, entre outras, fosfatase alcalina, útil para converter pro-fármacos contendo fosfato em fármacos livres; arilsulfatase, útil para converter pro-fármacos contendo sulfato em fármacos livres; citosina-desaminase, útil para converter 67

ΕΡ 1 189 634 /PT 5-fluorocitosina não tóxica no fármaco anticanceroso 5-fluorouracilo; proteases, tais como protease de Serratia, termolisina, subtilisina, carboxipeptidases e catepsinas (tais como catepsinas B e L), que são úteis para converter pro-fármacos contendo péptidos em fármacos livres; D-alanilcarboxipeptidases, úteis para converter pro-fármacos contendo substituintes de D-aminoácidos; enzimas que clivam hidratos de carbono tais como β-galactosidase e neuraminidase, úteis para converter pro-fármacos glicosilados em fármacos livres; β-lactamase, útil para converter fármacos derivatizados com β-lactamas em fármacos livres; e penicilina-amidases, tais como penicilina V-amidase ou penicilina G-amidase, úteis para converter fármacos derivatizados nos seus azotos amina com grupos fenoxiacetilo ou fenilacetilo, respectivamente, em fármacos livres. Alternativamente, podem ser utilizados anticorpos com actividade enzimática, também conhecidos na arte como "abzimas", para converter os pro-fármacos do invento em fármacos activos livres (consultar, por exemplo, Massey, Nature 328: 457-458 (1987)). Os conjugados anticorpo-abzima podem ser preparados tal como aqui descrito para entrega da abzima a uma população de células tumorais.

As enzimas deste invento podem ser ligadas covalentemente aos anticorpos anti-ErbB2 por técnicas bem conhecidas na arte, tal como a utilização de reagentes de reticulação heterobifuncionais discutidos acima. Alternativamente, as proteínas de fusão incluindo pelo menos a região de ligação ao antigénio de um anticorpo do invento ligado a pelo menos uma parte funcionalmente activa de uma enzima do invento podem ser construídas utilizando técnicas de ADN recombinante bem conhecidas na arte (consultar, por exemplo, Neuberger et al., Nature, 312: 604-608 (1984). (xi) Outras modificações de anticorpos

Consideram-se aqui outras modificações do anticorpos. Por exemplo, o anticorpo pode ser ligado a um de vários polímeros não proteináceos, por exemplo, polietilenoglicol, polipropilenoglicol, polioxialcilenos ou copolímeros de polietilenoglicol e polipropilenoglicol. O anticorpo também pode ser encapsulado em microcápsulas preparadas, por exemplo, 68

ΕΡ 1 189 634 /PT por técnicas de coacervação ou por polimerização interfacial (por exemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulose ou gelatina e microcápsulas de poli(metilmetacilato), respectivamente), em sistemas de entrega de fármacos coloidais (por exemplo, lipossomas, microesferas de albumina, microemulsões, nanoparticulas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Revelam-se tais técnicas em Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a edição, Oslo, A., Ed., (1980).

Os anticorpos anti-ErbB2 aqui revelados podem também ser formulados como imunolipossomas. Preparam-se lipossomas contendo o anticorpo por métodos conhecidos na arte, tal como descrito em Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 82:3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl Acad. Sei. USA, 77:4030 (1980); Patentes U.S. 4 485 045 e 4 544 545; e W097/38731 publicada a 23 de Outubro de 1997. Revelam-se lipossomas com tempo de circulação aumentado em Patente U.S. 5 013 556.

Podem gerar-se lipossomas particularmente úteis pelo método de evaporação de fase reversa, com uma composição lipídica incluindo fosfatidileolina, colesterol e fosfatidiletanolamina derivatizada com PEG (PEG-PE). Extrudem-se os lipossomas através de filtros de porosidade definida para obter lipossomas com o diâmetro pretendido. Podem conjugar-se fragmentos Fab' do anticorpo do presente invento a lipossomas tal como descrito em Martin et al. J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982) através de uma reacção de permuta de dissulfureto. Opcionalmente, está contido dentro do lipossoma um agente quimioterapêutico. Consultar Gabizon et al. J. National Câncer Inst. 81(19)1484 (1989). III. Formulações farmacêuticas

As formulações terapêuticas dos anticorpos utilizados de acordo com o presente invento são preparadas para armazenamento por mistura de um anticorpo com o grau de pureza pretendido com transportadores, excipientes ou estabilizantes farmaceuticamente aceitáveis opcionais (Remington' s Pharmaceutical Sciences 16a edição, Osol, A. Ed. (1980)), na forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas. Os transportadores, excipientes ou estabilizantes aceitáveis são 69

ΕΡ 1 189 634 /PT não tóxicos para os recebedores nas dosagens e concentrações utilizadas e incluem tampões tais como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes (tais como cloreto de octadecildimetilbenzilamónio; cloreto de hexametónio; cloreto de benzalcónio, cloreto de benzetónio; fenol, álcool butilico ou benzílico; alquilparabenos, tais como metilparabeno ou propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclo-hexanol; 3-pentanol; e m-cresol); polipéptidos de baixo peso molecular (inferior a cerca de 10 residuos); proteínas, tal como albumina do soro, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrófilos, tal como polivinilpirrolidona; aminoácidos tais como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina ou lisina; monossacáridos, dissacáridos e outros hidratos de carbono incluindo glucose, manose ou dextrinas; agentes quelantes tais como EDTA; açúcares tais como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol; contra-iões formadores de sais tais como sódio; complexos metálicos (por exemplo complexos de proteínas de Zn); e/ou tensioactivos não iónicos tais como TWEEN™, PLURONICS™ ou polietilenoglicol (PEG). Descrevem-se formulações liofilizadas de anticorpo anti-ErbB2 preferidas em WO 97/04801, expressamente aqui incorporada por referência. A formulação aqui pode também conter mais do que um composto activo tal como necessário para a indicação específica a ser tratada, de preferência com actividades complementares que não apresentam efeitos adversos entre si. Por exemplo, pode ser desejável proporcionar adicionalmente anticorpos que se ligam a EGFR, ErbB2 (por exemplo, um anticorpo que se liga a um epítopo diferente em ErbB2), ErbB3, ErbB4 ou factor endotelial vascular (VEGF) na formulação única. Alternativa ou adicionalmente, a composição pode ainda incluir um agente quimioterapêutico, agente citotóxico, citoquina, agente de inibição de crescimento, agente anti-hormonal e/ou cardioprotector. Tais moléculas encontram-se adequadamente presentes em combinação em quantidades que são eficazes para o objectivo pretendido.

Os ingredientes activos podem também ser encapsulados em microcápsulas preparadas, por exemplo, por técnicas de coacervação ou por polimerização interfacial, por exemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulose ou gelatina e 70

ΕΡ 1 189 634 /PT microcápsulas de poli(metilmetacilato), respectivamente, em sistemas de entrega de fármacos coloidais (por exemplo, lipossomas, microesferas de albumina, microemulsões, nanopartícuias e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Tais técnicas revelam-se em Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edição, Osol, A. Ed. (1980) .

Podem ser preparadas preparações de libertação controlada. Constituem exemplos adequados de preparações de libertação controlada, entre outros, matrizes semipermeáveis de polímeros hidrófobos sólidos contendo o anticorpo, cujas matrizes se encontram sob a forma de artigos enformados, por exemplo filmes ou microcápsulas. Constituem exemplos de matrizes de libertação controlada, entre outros, poliésteres, hidrogéis (por exemplo, poli(2-hidroxietilmetacrilato) ou poli(álcool vinílico)), polilactidos (Patente U.S. 3 773 919), copolímeros de ácido L-glutâmico e γ-etil-L-glutamato, etileno-acetato de vinilo não degradável, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradáveis, tais como o LUPRON DEPOT™ (microesferas injectáveis compostas de copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico e acetato de leuprolida) e ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico.

As formulações para serem utilizadas em administração in vivo devem ser estéreis. Tal é facilmente efectuado por filtração através de membranas de filtração estéreis. IV. Tratamento com os anticorpos anti-ErbB2

De acordo com o presente invento, o anticorpo anti-ErbB2 é utilizado para o fabrico de um medicamento para tratar cancro da próstata, tal como cancro da próstata independente de androgénio ou cancro da próstata dependente de androgénio. Quando o cancro a ser tratado é cancro da próstata dependente ou independente de androgénio, a expressão do androgénio (por exemplo andosterona ou testosterona) e/ou seu receptor cognato no tumor pode ser avaliada utilizando qualquer um dos vários ensaios disponíveis, por exemplo tal como descrito acima. Alternativa ou adicionalmente, pode diagnosticar-se um doente como tendo cancro da próstata independente de androgénio pelo facto de já não responder a terapia anti-androgénio e o doente pode ser diagnosticado como tendo cancro da próstata 71

ΕΡ 1 189 634 /PT dependente de androgénio caso responda a terapia anti-androgénio. 0 cancro incluirá geralmente células que expressam ErbB2, de modo que o anticorpo anti-ErbB2 é capaz de se ligar a elas. Embora o cancro possa ser caracterizado por sobre-expressão do receptor ErbB2, o presente pedido proporciona adicionalmente um método para tratar cancro que não é considerado como um cancro que sobre-expressa ErbB2. Para determinar expressão de ErbB2 no cancro estão disponíveis vários ensaios de diagnóstico/prognóstico. Numa concretização, a sobre-expressão de ErbB2 pode ser analisada por IHC, por exemplo utilizando HERCEPTEST® (Dako). Podem sujeitar-se secções de tecido embebidas em parafina de uma biópsia de tumor ao ensaio IHC e segundo um critério de intensidade de coloração de proteína ErbB2, da seguinte forma:

Pontuação 0 Não se observa qualquer coloração ou observa-se coloração da membrana em menos de 10% das células de tumor.

Pontuação 1+ Detecta-se uma coloração de membrana ténue/dificilmente perceptível em mais de 10% das células de tumor. As células só são coradas em parte da sua membrana.

Pontuação 2+ Observa-se uma coloração completa da membrana fraca a moderada em mais de 10% das células de tumor.

Pontuação 3+ Observa-se uma coloração completa da membrana moderada a forte em mais de 10% das células de tumor.

Os tumores com pontuações 0 ou 1+ para avaliação de sobre-expressão de ErbB2 podem ser caracterizados como não sobre-expressando ErbB2, enquanto que os tumores com pontuações de 2+ ou 3+ podem ser caracterizados como sobre-expressando ErbB2.

Alternativa ou adicionalmente, podem efectuar-se ensaios FISH tais como INFORM™ (vendido por Ventana, Arizona) ou PATHVISION™ (Vysis, Illinois) em tecido de tumor embebido em 72

ΕΡ 1 189 634 /PT parafina, fixado com formalina para determinar a extensão (caso exista) de sobre-expressão de ErbB2 no tumor. O cancro da próstata a ser tratado aqui pode ser um caracterizado por activação excessiva de um receptor ErbB, por exemplo EGFR. Tal activação excessiva pode ser atribuída a sobre-expressão ou produção aumentada do receptor ErbB ou de um ligando de ErbB. Numa concretização do invento, será efectuado um ensaio de diagnóstico ou prognóstico para determinar se o cancro do doente é caracterizado por activação excessiva de um receptor ErbB. Por exemplo, pode determinar-se amplificação de gene ErbB e/ou sobre-expressão de um receptor ErbB no cancro. Encontram-se disponíveis na arte vários ensaios para determinar tal amplificação/sobre-expressão e incluem os ensaios IHC, FISH e antigénios libertados descritos acima. Alternativa ou adicionalmente, podem ser determinados os níveis de um ligando de ErbB, tal como TGF-α, no tumor ou a ele associado de acordo com procedimentos conhecidos. Tais ensaios podem detectar proteína e/ou ácido nucleico que a codifica na amostra a ser ensaiada. Numa concretização, os niveis de ligando de ErbB no tumor podem ser determinados utilizando imuno-histoquímica (IHC): consultar, por exemplo. Scher et al. Clin. Câncer Research 1:545-550(1995). Alternativa ou adicionalmente, podem avaliar-se os niveis de ácido nucleico que codifica o ligando de ErbB na amostra a ser ensaiada: por exemplo através de FISH, hibridação de Southern ou técnicas de PCR.

Além disso, pode avaliar-se a sobre-expressão ou a amplificação de receptor ErbB ou ligando de ErbB utilizando um ensaio de diagnóstico in vivo, por exemplo por administração de uma molécula (tal como um anticorpo) que liga a molécula a ser detectada e está marcada com um marcador detectável (por exemplo, um isótopo radioactivo) e rastreio externo do doente para localização do marcador.

Em determinadas concretizações, administra-se ao doente um imunoconjugado incluindo o anticorpo anti-ErbB2 conjugado com um agente citotóxico. De preferência, o imunoconjugado e/ou proteína ErbB2 à qual está ligado é/são internalizado(s) pela célula, resultando numa eficácia terapêutica aumentada do imunocon jugado na morte de células de cancro a que se liga. 73

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Numa concretização preferida, o agente citotóxico tem como alvo ou interfere com o ácido nucleico na célula de cancro. Constituem exemplos de tais agentes citotóxicos, entre outros, maitansinóides, caliqueamicinas, ribonucleases ribonucleases e ADN endonucleases.

Os anticorpos anti-ErbB2 ou imunoconjugados são administrados a um doente humano, de acordo com métodos conhecidos, tal como administração intravenosa, por exemplo, como um bolo ou por infusão continua ao longo de um período de tempo, por vias intramuscular, intraperitoneal, intracerobroespinal, subcutânea, intra-articular, intra-sinovial, intratecal, oral, tópica ou inalação. Prefere-se a administração intravenosa ou subcutânea do anticorpo.

Podem ser combinados outros regimes terapêuticos com a administração do anticorpo anti-ErbB2. A administração combinada inclui co-administração, utilizando formulações independentes ou uma única formulação farmacêutica e administração consecutiva em qualquer ordem, em que de preferência há um período de tempo em que ambos (ou todos) os agentes activos exercem simultaneamente as suas actividades biológicas.

Numa concretização preferida, trata-se o doente com dois anticorpos anti-ErbB2 diferentes. For exemplo, o doente pode ser tratado com um primeiro anticorpo anti-ErbB2 que bloqueia a activação por ligandos de um receptor ErbB de modo 50-100% mais eficaz do que o anticorpo humanizado monoclonal huMab4D5-8 tal como revelado em patente US 5 821 337 ou um anticorpo com uma característica biológica de anticorpo monoclonal 2C4 bem como um segundo anticorpo anti-ErbB2 que é inibidor do crescimento (por exemplo HERCEPTIN®) ou um anticorpo anti-ErbB2 que induz apoptose de uma célula que sobre-expressa ErbB2 (por exemplo 7C2, 7F3 ou suas variantes humanizadas). De preferência tal terapia combinada resulta num efeito de sinergia terapêutica.

Pode também ser desejável combinar administração do anticorpo ou anticorpos anti-ErbB2 com administração de um anticorpo dirigido contra outro antigénio associado a tumor. O outro anticorpo neste caso pode, por exemplo, ligar-se a EGFR, 74

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ErbB3, ErbB4, ou factor de crescimento endotelial vascular (VEGF).

Numa concretização, o presente invento envolve a utilização de um anticorpo (ou anticorpos) anti-ErbB2 e um ou mais agentes quimioterapêuticos ou agentes de inibição de crescimento, incluindo co-administração de cocktails de diferentes agentes quimioterapêuticos. Os agentes quimioterapêuticos preferidos incluem taxanos (tais como paclitaxel e docetaxel) e/ou antibióticos de antraciclina. Os calendários de preparação e dosagem para tais agentes quimioterapêuticos podem ser utilizados de acordo com as instruções do fabricante ou como determinado empiricamente pelo perito na arte. Os calendários de preparação e dosagem para tal quimioterapia são também descritos em Chemotherapy Service Ed., M.C. Perry. Williams e Wilkins, Baltimore, Maryland (1992 ) . 0 anticorpo pode ser combinado com um composto anti-hormonal; por exemplo, um composto anti-estrogénio, tal como tamoxifeno; uma anti-progesterona, tal como onapristona (consultar EP 616 812); ou um anti-androgénio, tal como flutamida, em dosagens conhecidas para tais moléculas. Quando o cancro a ser tratado é cancro independente de androgénio, o doente pode ser anteriormente sujeito a terapia anti-androgénio e, após o cancro se tornar independente de androgénio, o anticorpo anti-ErbB2 (e opcionalmente outros agentes tal como aqui descrito) podem ser administrados ao doente.

Por vezes, pode ser benéfico co-administrar também um cardioprotector (para evitar ou reduzir disfunção do miocárdio associada com a terapia) ou uma ou mais citoquinas ao doente. Além dos regimes terapêuticos anteriores, o doente pode ser sujeito a remoção cirúrgica de células de cancro e/ou terapia de radiação. As dosagens adequadas para qualquer dos agentes co-administrados anteriores são as actualmente utilizadas e podem ser diminuídas devido à acção combinada (sinergia) do agente e anticorpo anti-ErbB2.

Para a prevenção ou tratamento de doença, a dosagem adequada de anticorpo dependerá do tipo de doença a ser 75

ΕΡ 1 189 634 /PT tratada, tal como definida acima, a gravidade e decurso da doença, se o anticorpo é administrado com objectivos preventivos ou terapêuticos, terapia prévia, a história clinica do doente e resposta ao anticorpo e da discrição do médico assistente. 0 anticorpo é adequadamente administrado ao doente numa só vez ou ao longo de uma série de tratamentos. Dependendo do tipo e gravidade da doença, cerca de 1 pg/kg a 15 mg/kg (por exemplo 0,1-20 mg/kg) de anticorpo é uma dosagem candidata inicial para administração ao doente, por exemplo, numa ou em mais administrações independentes ou por infusão continua. Uma dosagem diária típica pode encontrar-se na gama de cerca de 1 pg/kg a 100 mg/kg ou mais, dependendo dos factores supramencionados. Para administrações repetidas ao longo de vários dias ou mais longas, dependendo da condição, o tratamento é mantido até ocorrer uma supressão pretendida dos sintomas da doença. Um regime de dosagem preferido inclui administração de uma dose de carga inicial de cerca de 4 mg/kg, seguido por uma dose de manutenção semanal de cerca de 2 mg/kg do anticorpo anti-ErbB2. No entanto, podem ser úteis outros regimes de dosagem. O progresso desta terapia é facilmente monitorizado por técnicas e ensaios convencionais. A proteína de anticorpo pode ser administrada ao doente ou o anticorpo pode ser administrado por terapia génica. Consultar, for exemplo, WO96/07321 publicada a 14 de Março de 1996 relativa à utilização de terapia génica para gerar anticorpos intracelulares.

Existem duas abordagens principais para introduzir o ácido nucleico (opcionalmente contido num vector) nas células do doente; in vivo e ex vivo. Para entrega in vivo, injecta-se o ácido nucleico directamente no doente, usualmente no local onde o anticorpo é necessário. Para tratamento ex vivo, removem-se as células do doente, introduz-se o ácido nucleico nestas células isoladas e administram-se as células modificadas ao doente quer directamente, quer, por exemplo, encapsuladas em membranas porosas que são implantadas no doente (consultar, por exemplo Patentes U.S. 4 892 538 e 5 283 187) . Existem várias técnicas disponíveis para introduzir ácido nucleicos em células viáveis. As técnicas variam dependendo se o ácido nucleico é transferido para células cultivadas in vitro, ou células in vivo do hospedeiro 76

ΕΡ 1 189 634 /PT pretendido. As técnicas adequadas para a transferência de ácido nucleico para células de mamífero in vitro incluem a utilização de lipossomas, electroporação, micro-injecção, fusão celular, DEAE-dextrano, o método de precipitação de fosfato de cálcio, etc. Um vector utilizado usualmente para entrega ex vivo do gene é um retrovírus.

As técnicas de transferência de ácido nucleico in vivo actualmente preferidas incluem transfecção com vectores virais (tais como adenovírus, vírus de Herpes simplex I ou vírus adeno-associado) e sistemas baseados em lípidos (constituem lípidos úteis para transferência mediada por lípido do gene, por exemplo, DOTMA, DOPE e DC-Chol). Em algumas situações é desejável proporcionar a fonte de ácido nucleico com um agente que tenha como alvo as células alvo, tal como um anticorpo específico para uma proteína de membrana de superfície celular ou a célula alvo, um ligando para um receptor na célula alvo, etc. Quando se utilizam lipossomas, podem utilizar-se proteínas que se ligam a uma proteína de membrana de superfície celular associada com endocitose para dirigir ao alvo e/ou para facilitar a absorção, por exemplo proteínas de cápside ou seus fragmentos trópicos para um determinado tipo celular, anticorpos para proteínas que sofrem internalização em ciclização e proteínas que têm como alvo uma localização intracelular e aumentam a semivida intracelular. A técnica de endocitose mediada por receptor é descrita, por exemplo, por Wu et al., J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987); e Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87:3410-3414 (1990). Para uma revisão sobre protocolos de marcação génica e terapia génica actualmente conhecidos consultar Anderson et al., Science 256:808-813 (1992). Consultar também WO 93/25673 e as referências aí citadas. V. Artigos de fabrico

Noutra concretização do invento, proporciona-se um artigo de fabrico contendo materiais úteis para o tratamento de cancro da próstata. O artigo de fabrico inclui um recipiente e uma etiqueta ou folheto incluso ou associado ao recipiente. Constituem recipientes adequados, por exemplo, balões, frascos, seringas, etc. Os recipientes podem ser formados por vários materiais, tais como vidro ou plástico. O recipiente 77

ΕΡ 1 189 634 /PT contém uma composição que é eficaz para tratar a condição e pode ter uma entrada de acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode ser um saco para solução intravenosa ou um frasco com uma tampa perfurável por uma agulha de injecção hipodérmica). Pelo menos um agente activo na composição é anticorpo anti-ErbB2. A etiqueta ou folheto incluso indica que a composição é utilizada para tratar cancro da próstata, cancro da próstata independente de androgénio, ou cancro da próstata dependente de androgénio. Além disso, o artigo de fabrico pode incluir (a) um primeiro recipiente com uma composição nele contida, em que a composição inclui um primeiro anticorpo que liga ErbB2 e inibe o crescimento de células de cancro que sobre-expressam ErbB2: e (b) um segundo recipiente com uma composição nele contida, em que a composição inclui um segundo anticorpo que liga ErbB2 e bloqueia a activação por ligandos de um receptor ErbB de modo 50-100% mais eficaz do que anticorpo monoclonal humanizado humMab4D5-8, tal como revelado em patente US 5 821 337. O artigo de fabrico nesta concretização do invento pode incluir adicionalmente um folheto incluso indicando que as composições de primeiro e segundo anticorpo podem ser utilizadas para tratar cancro da próstata. Alternativa ou adicionalmente, o artigo de fabrico pode ainda incluir um segundo (ou terceiro) recipiente contendo um tampão farmaceuticamente aceitável, tal como água bacteriostática para injecção (BWFI), solução salina tamponada de fosfato, solução de Ringer e solução de dextrose. Pode ainda incluir adicionalmente outros materiais desejáveis sob o ponto de vista comercial e de utilizador, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas e seringas. VI. Depósito de Materiais

As seguintes linhas celulares de hibridoma foram depositadas em American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, EUA (ATCC):

Designação do Anticorpo N.2 ATCC Data do Depósito 7C2 7F3 4D5 2C4 ATCC HB-12215 17 de Outubro, 1996 ATCC HB-1221 17 de Outubro, 1996 ATCC CRL 10463 24 de Maio, 1990 ATCC HB 12697 8 de Abril, 1999 78

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Ilustram-se detalhes adicionais do invento através dos seguintes exemplos não limitativos.

Exemplo 1

Produção e caracterização de anticorpo monoclonal 2C4

Os anticorpos monoclonais murinos 2C4, 7F3 e 4D5 que se ligam especificamente ao domínio extracelular de ErbB2 foram produzidos tal como descrito em Fendly et al., Câncer Research 50:1550-1558 (1990). Sucintamente, produziram-se células NIH 3t3/HER2-340o (que expressam aproximadamente 1 x 105 moléculas de ErbB2/célula) tal como descrito em Hudziak et al Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 84:7158-7163 (1987), recolheram-se com solução salina tamponada de fosfato (PBS) contendo EDTA 25 mM e utilizaram-se para imunizar ratinhos BALB/c. OS ratinhos receberam injecções i.p. de 107 células em 0,5 ml de PBS nas semanas 0, 2, 5 e 7. Aos ratinhos com anti-soros que imunoprecipitam ErbB2 marcado com q n P administraram-se injecções i.p. de um extracto de membrana ErbB2 purificado em aglutinina-Sepharose (WGA) de gérmen de trigo nas semanas 9 e 13. Tal foi seguido por uma injecção i.v. de 0,1 ml da preparação ErbB2 e fundiram-se esplenócitos com a linha de mieloma de ratinho X63-Ag8.653. Rastrearam-se os sobrenadantes de hibridoma para ligação a ErbB2 por ELISA e radioimunoprecipitação.

Determinaram-se os epítopos ErbB2 ligados por anticorpos monoclonais 4D5, 7F3 e 2C4 por análise de ligação competitiva (Fendly et al. Câncer Research 50:1550-1558 (1990)).

Efectuaram-se estudos de bloqueio cruzado em anticorpos por fluorescência directa em células intactas por utilização de máquina de rastreio PANDEX™ para quantificar a fluorescência. Conjugou-se cada anticorpo monoclonal com isotiocianato de fluoresceína (FITC), utilizando procedimentos estabelecidos (Wofsy et al. Selected Methods in Cellular Immunology, p. 287, Mishel e Schiigi (ed.) São Francisco: w.j. Freeman Co. (1980)). As monocamadas confluentes de células NIH 3T3/HER2-34oo foram tripsinizadas, lavadas uma vez e ressuspensas a 1, 75 x 106 células/ml em PBS frio contendo albumina de soro bovina (BSA) a 0,5% e NaN3 a 0,1%. Adicionou-se uma concentração final de partículas de látex a 79

ΕΡ 1 189 634 /PT 1% (IDC, Portland, Oregon) para reduzir entupimento das membranas da placa PANDEX™. Adicionaram-se células em suspensão, 20 μΐ, e 20 μΐ de anticorpos monoclonais purificados (100 pg/ml a 0,1 pg/ml) aos poços da placa PANDEX™ e incubaram-se em gelo durante 30 minutos. Adicionou-se uma diluição predeterminada de anticorpos monoclonais marcados com FITC em 20 μΐ a cada poço, incubaram-se durante 30 minutos, lavaram-se e quantificou-se a fluorescência por PANDEX™. Considerou-se que os anticorpos monoclonais partilham um epitopo quando cada um deles bloqueia a ligação do outro 50% ou mais em comparação com controlo de anticorpo monoclonal irrelevante. Nesta experiência, aos anticorpos monoclonais 4D5, 7F3 e 2C4 foram atribuídos os epítopos I, G/F e F, respectivamente.

As características de inibição de crescimento de anticorpos monoclonais 2C4, 7F3 e 4D5 foram avaliadas utilizando a linha celular de tumor da mama SK-BR-3 (consultar Hudziak et al. Molec. Cell. Biol. 9(3):1165-1172 (1989)). Sucintamente, soltaram-se células SK-BR-3 por utilização de tripsina a 0,25% (vol/vol) e suspenderam-se em meio completo a uma densidade de 4 x 105 células por ml. Plaquearam-se alíquotas de 100 μΐ (4 x 104 células) para placas de microdiluição de 96 poços, deixaram-se as células aderir e adicionou-se então 100 μΐ de meio sozinho ou de meio contendo anticorpo monoclonal (concentração final de 5 pg/ml). Após 72 horas, lavaram-se as placas duas vezes com pbs (pH 7,5), coraram-se com violeta de cristal (0,5% em metanol) e analisaram-se para proliferação celular relativa, tal como descrito em Sugarman et al. Science 230:943-945 (1985). Os anticorpos monoclonais 2C4 e 7F3 inibiram a proliferação celular relativa de SK-BR-3 em cerca de 20% e cerca de 38%, respectivamente, comparativamente a cerca de 56% de inibição atingida com anticorpo monoclonal 4D5.

Avaliaram-se os anticorpos monoclonais 2C4, 4D5 e 7F3 para a sua capacidade de inibir fosforilação de tirosina estimulada por HRG de proteínas na gama de Mr 180 000 de lisados de células inteiras de células MCF7 (Lewis et al. Câncer Research 56:1457-1465 (1996)). Relatou-se que as células MCF7 expressam todos os receptores ErbB conhecidos, mas em níveis relativamente baixos. Dado que ErbB2, ErbB3 e ErbB4 têm 80

ΕΡ 1 189 634 /PT tamanhos moleculares praticamente iguais, não é possível distinguir qual das proteínas se torna fosforilada na tirosina quando se avaliam por análise de hibridação de Western lisados de células completas. No entanto, estas células são ideais para ensaios de fosforilação de tirosina HRG porque nas condições de ensaio utilizadas, na ausência de HRG adicionado exogenamente, elas exibem níveis baixos a não detectáveis de proteínas de fosforilação de tirosina na gama de Mr 180 000.

Plaquearam-se células MCF7 em placas de 24 poços e adicionaram-se anticorpos monoclonais para ErbB2 em cada poço e incubaram-se durante 30 minutos à temperatura ambiente; seguidamente adicionou-se rHRGpli77_244 a cada poço até uma concentração final de 0,2 nM e continuou-se a incubação durante 8 minutos. Aspirou-se cuidadosamente o meio de cada poço e pararam-se as reacções por adição de 100 μΐ de tampão de amostra de SDS (SDS a 5%, DTT 25 mM e Tris-HCl 25 mM, pH 6,8). Sujeitou-se cada amostra (25 μΐ) a electroforese num gel de gradiente 4-12% (Novex) e seguidamente transferiu-se por electroforese para membrana de difluoreto de polivinilideno. Revelaram-se as transferências imunológicas anti-fosfotirosina (4G10, de UBI, utilizada a 1 pg/ml) e quantificou-se a intensidade da banda reactiva predominante a Mr-180 000 por densitometria de reflectância, tal como descrito previamente (Holmes et al. Science 256:1205-1210 (1992); Sliwkowski et al. J. Biol. Chem. 269:14661-14665 (1994))

Os anticorpos monoclonais 2C4, 7F3 e 4D5 inibiram significativamente a geração de um sinal de fosforilação de tirosina induzida por HRG a Mr 180 000. Na ausência de HRG, nenhum destes anticorpos foi capaz de estimular fosforilação de tirosina de proteínas na gama Mr 180 000. Igualmente, estes anticorpos não sofrem reacção cruzada com EGFR (Fendly et al. Câncer Research 50:1550-1558 (1990)), ErbB3 ou ErbB4. Os anticorpos 2C4 e 7F3 inibiram significativamente estimulação por HRG de fosforilação de tirosina pl80 a <25% do controlo. O anticorpo monoclonal 4D5 foi capaz de bloquear a estimulação por HRG de fosforilação de tirosina em -50%. A figura 2A apresenta curvas de dose-resposta para inibição por 2C4 ou 7F3 de estimulação por HRG de fosforilação de tirosina pl80, tal como determinada por densitometria de reflectância. Por 81

ΕΡ 1 189 634 /PT avaliação destas curvas de inibição utilizando um ajuste de quatro parâmetros obteve-se um IC50 de 2,8 í 0,7 nM e 29,0 ± 4,1 nM para 2C4 e 7F3, respectivamente. A inibição de ligação de HRG a linhas celulares de tumor da mama MCF7 pelos anticorpos anti-ErB2 foi efectuada com culturas em monocamada em gelo num formato de placa de 24 poços (Lewis et al. Câncer Research 56:1457-1465 (1996)).

Adicionaram-se anticorpos anti-ErbB2 monoclonais a cada poço e incubaram-se durante 30 minutos. Adicionou-se rHRGpl 177-224 1 o c (25 pm) marcado com I e continuou-se a incubaçao durante 4 a 16 horas. A figura 2B proporciona curvas de dose-resposta para inibição por 2C4 ou 7F3 de ligação de HRG a células MCF7. Incubaram-se várias concentrações de 2C4 ou 7F3 com células MCF7 na presença de rHRGβl marcado com 125I e apresentam-se as curvas de inibição na figura 2B. Por análise destes dados obteve-se um IC50 de 2,4 ± 0,3 nM e 19,0 ± 7,3 nM para 2C4 e 7F3, respectivamente. Uma inibição máxima de -74% para 2C4 e 7F3 esteve de acordo com os dados de fosforilação de tirosina.

Para determinar se o efeito dos anticorpos anti-ErbB2 observado em células MCF7 era um fenómeno geral, incubaram-se linhas celulares de tumor humano com 2C4 ou 7F3 e determinou-se 0 grau de ligação especifica de ηΗΒΟβΙ marcado com 125I (Lewis et al. Câncer Research 56:1457 1465 (1996)). Os resultados deste estudo apresentam-se na figura 3. A ligação de rHRG31 marcado com 121l pôde ser inibida significativamente por 2C4 ou 7F3 em todas as linhas celulares, com a excepção da linha celular de cancro da mama MDA-MB-468, para a qual se relatou que expressa pouco ou nenhum ErbB2. Para as restantes linhas celulares, relatou-se que expressam ErbB2, com o nivel de expressão de ErbB2 variando grandemente entre essas linhas celulares. De facto, a gama de expressão de ErbB2 nas linhas celulares ensaiadas varia mais de 2 ordens de grandeza. Por exemplo, BT-20, MCF7 e Caov3 expressam ~104 receptores ErbB2/célula, enquanto que BT-474 e SK-BR-3 expressam ~106 receptores ErbB2/célula. Dada a vasta gama de expressão ErbB2 nestas células e os dados anteriores, concluiu-se que a interacção entre ErbB2 e ErbB3 ou ErbB4, foi por si só uma interacção de elevada afinidade que ocorre na superfície da membrana plasmática. 82

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Avaliaram-se os efeitos de inibição de crescimento de anticorpos monoclonais 2C4 e 4D5 em células MDA-MB-175 e SK-BR-3 na presença ou ausência de rHRGpl exógeno (Schaefer et âl. Oncogene 15:1385-1394 (1997)). Os niveis de ErbB2 em células MDA-MB-175 são 4-6 vezes maiores do que o nível verificado em células epiteliais de mama normal e o receptor ErbB2-ErbB4 é fosforilado na tirosina constitutivamente em células MDA-MB-175. Trataram-se as células MDA-MB-175 com anticorpos anti-ErbB2 monoclonais 2C4 e 4D5 (10 pg/mL) durante 4 dias. Num ensaio de coloração com violeta de cristal, a incubação com 2C4 apresentou um efeito de inibição de crescimento forte nesta linha celular (figura 4A). O HRG exógeno não reverteu significativamente esta inibição. Por outro lado, 2C4 não revelou qualquer efeito inibidor na linha celular SK-BR-3 que sobre-expressa ErbB2 (figura 4B). O anticorpo monoclonal 2C4 foi capaz de inibir proliferação celular de células MDA-MB-175 numa extensão maior do que o anticorpo monoclonal 4D5, tanto na presença como na ausência de HRG exógeno. A inibição de proliferação celular por 4D5 é dependente do nível de expressão de ErbB2 (Lewis et al. Câncer Immunol. Immunother. 37:255-263 (1993)). Foi possível detectar uma inibição máxima de 66% em células SK-BR-3 (figura 4B). No entanto, este efeito pôde ser revertido por HRG exógeno.

Exemplo 2 A associação de ErbB2 com ErbB3 dependente de HRG é bloqueada por anticorpo monoclonal 2C4 A capacidade de ErbB3 se associar com ErbB2 foi ensaiada numa experiência de co-imunoprecipitação. Inocularam-se 1,0 x 106 células MCF7 ou SK-BR-3 em placas de cultura de tecidos de seis poços em DMEM/meio de Ham F12 50:50 contendo soro bovino fetal (FBS) a 10% e HEPES 10 mM, pH 7,2 (meio de cultura) e deixou-se ligar durante a noite. Privaram-se as células durante duas horas em meio de cultura sem soro antes de iniciar a experiência

Lavaram-se as células rapidamente com solução salina tamponada de fosfato (PBS) e seguidamente incubaram-se com 100 nM do anticorpo indicado diluído em albumina de soro bovina (BSA) a 0,2% p/v, meio RPMI, com HEPES 10 mM, pH 7,2 83

ΕΡ 1 189 634 /PT (tampão de ligação) ou com tampão de ligação sozinho (controlo) . Após uma hora à temperatura ambiente, adicionou-se HRG a uma concentração final de 5 nM a metade dos poços ( + ) . Adicionou-se um volume igual de tampão de ligação aos outros poços (-) . Continuou-se a incubação durante aproximadamente 10 minutos.

Removeram-se os sobrenadantes por aspiração e lisaram-se as células em rpmi, hepes 10 mM, pH 7,2, triton x-100™ a 1,0% v/v, CHAPS 1,0% p/v (tampão de lise), contendo PMSF 0,2 mM, leupeptina a 10 pg/ml e aprotinina 10 TU/ml. Os Usados foram depurados de material insolúvel por centrifugação.

Imunoprecipitou-se ErbB2 utilizando um anticorpo monoclonal acoplado covalentemente a um gel de afinidade (Affi-Prep 10, Bio-Rad). Este anticorpo (Ab-3, Oncogene Sciences) reconhece um epítopo de domínio citoplasmático. A imunoprecipitação foi efectuada por adição de 10 μΐ de pasta de gel contendo aproximadamente 8,5 pg de anticorpo imobilizado a cada lisado e deixaram-se as amostras misturar à temperatura ambiente durante duas horas. Os géis foram então recolhidos por centrifugação. Lavaram-se os géis em lote três vezes com tampão de lise para remover material não ligado. Adicionou-se então o tampão de amostra de SDS e aqueceram-se brevemente as amostras num banho de água em ebulição.

Correram-se os sobrenadantes em géis de poliacrilamida 4-12% e electrotransferiram-se para membranas de nitrocelulose. Avaliou-se a presença de ErbB3 por sondagem das transferências com um anticorpo policlonal contra um seu epítopo de domínio citoplasmático (c—17, Santa Cruz Biotech). Visualizaram-se as transferências utilizando um substrato quimioluminescente (ECL, Amersham).

Tal como apresentado nas pistas de controlo das figuras 5A e 5B, para células MCF7 e SK-BR-3, respectivamente, ErbB3 encontrava-se presente num imunoprecipitado ErbB2 somente quando as células foram estimuladas com HRG. Se as células fossem primeiramente incubadas com anticorpo monoclonal 2C4, o sinal ErbB3 era abolido em células MCF7 (figura 5A, pista 2C4+) ou substancialmente reduzida em células SK-BR-3 (figura 5B, pista 2C4+). Tal como apresentado nas 84

ΕΡ 1 189 634 /PT figuras 5A-B, o anticorpo monoclonal 2C4 bloqueia associação de ErbB3 com ErbB2 dependente de herregulina tanto em células MCF7 como em células SK-BR-3 de um modo substancialmente mais eficaz do que HERCEPTIN®. A pré-incubação com HERCEPTIN® diminuiu o sinal de ErbB3 em lisados MCF7 mas apresentou pequeno ou nenhum efeito na quantidade de ErbB3 co-precipitado de lisados SK-BR-3. A pré-incubação com um anticorpo contra o receptor EGF (Ab-1, Oncogene Sciences) não teve qualquer efeito na capacidade de ErbB3 para co-imunoprecipitar com ErbB2 em qualquer das linhas celulares.

Exemplo 3

Anticorpos 2C4 humanizados e variantes de anticorpo 2C4 maturadas por afinidade

Os domínios variáveis de anticorpo monoclonal murino 2C4 foram primeiramente clonados para um vector que permite produção de um fragmento Fab quimérico ratinho/humano. Isolou-se ARN total a partir de células de hibridoma utilizando um kit de extracção de ARN de Stratagene seguindo os protocolos do fabricante. Os domínios variáveis foram amplificados por RT-PCR, purificados em gel e inseridos num derivado de um plasmídeo baseado em pUCl 19 contendo um domínio constante capa humano e um domínio CHi humano, tal como previamente descrito (Cárter et al. PNAS (USA) 89:4285 (1992); e patente U.S. 5 821 337). 0 plasmídeo resultante foi transformado para a estirpe de E. coli 16C9 para expressão do fragmento Fab. 0 crescimento de culturas, indução de expressão de proteína e purificação de fragmento Fab foram tal como descrito previamente (Werther et al. J. Immunol. 157:4986-4995 (1996); Presta et al. Câncer Research 57: 4593-4599 (1997)).

Comparou-se o fragmento Fab 2C4 quimérico purificado com o anticorpo progenitor murino 2C4 relativamente à sua capacidade de inibir ligação de 125I-HRG a células MCF7 e inibir activação por rHRG de fosforilação de tirosina pl80 em células MCF7. Tal como apresentado na figura 6A, o fragmento Fab 2C4 quimérico é muito eficaz a destruir a formação do local de ligação ErbB2-ErbB3 de afinidade elevada na linha celular de cancro humano, MCF7. O valor de IC50 relativo calculado para 2C4 murino intacto é de 4,0 ± 0,4 nM, enquanto que o valor para o fragmento Fab é de 7,7 ± 1,1 nM. Tal como ilustrado na figura 85

ΕΡ 1 189 634 /PT 6Β, ο fragmento Fab 2C4 monovalente quimérico é muito eficaz a destruir a activação de ErbB2-ErbB3 dependente de HRG. O valor de IC50 calculado para anticorpo monoclonal 2C4 intacto murino é de 6,0 + 2 nM, enquanto que o valor para o fragmento Fab é de 15,0 ± 2 nM. A sequenciação de ADN do clone quimérico permitiu a identificação dos resíduos CDR (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Maryland (1991)) (figuras 7A e B) . Utilizando mutagénese de oligonucleótidos dirigida ao local, introduziram-se todas estas seis regiões CDR num esqueleto humano completo (VL capa subgrupo I e VH subgrupo III) contido em plasmídeo VX4 tal como descrito previamente (Presta et al., Câncer Research 57: 4593-4599 (1997)). A proteína do "CDR permutado" resultante foi expressa e purificada tal como acima. Efectuaram-se estudos de ligação para comparar as duas versões. Sucintamente, revestiu-se uma placa nunc maxisorp™ com 1 micrograma por ml do domínio extracelular de ErbB2 (ECD; produzido tal como descrito em WO 90/14357) em tampão carbonato 50 mM, pH 9,6, durante a noite a 4°C e seguidamente bloqueou-se com diluente de ELISA (BSA a 0,5%, polissorbato 20 a 0,05%, PBS) à temperatura ambiente durante 1 hora. Incubaram-se diluições em série de amostras em diluente de ELISA em placas durante 2 horas. Após lavagem, detectou-se fragmento Fab ligado com anticorpo capa murino anti-humano biotinilado (ICN 634771) seguido por peroxidase de rábano conjugada com estreptavidina (Sigma) e utilizando 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, Maryland) como substrato. Leu-se a absorvância a 450 nm. Tal como apresentado na figura 8A, perdeu-se toda a ligação na construção do fragmento Fab humano com CDR permutado.

Para repor a ligação do Fab humanizado, construíram-se mutantes utilizando ADN de CDR permutado como molde. Utilizando um modelo gerado por computador (figura 9), conceberam-se estas mutações para alterar os resíduos da região de esqueleto humano para os seus correspondentes murinos nas posições em que a alteração pode afectar as 86

ΕΡ 1 189 634 /PT conformações da CDR ou da interface anticorpo-antigénio.

Apresentam-se os mutantes na tabela 2.

Tabela 2

Designação de Mutações FR do 2C4 Humanizado Mutante n.2 Substituições na Região de Esqueleto (FR) 560 ArgH7lVal 561 AspH73Arg 562 ArgH7lVal, AspH73Arg 568 ArgH7lVal, AspH73Arg, AlaH49Gly 569 ArgH7lVal, AspH73Arg, PheH67Ala 570 ArgH7lVal, AspH73Arg, AsnH76Arg 571 ArgH7lVal, AspH73Arg, LeuH78Val 574 ArgH7lVal, AspH73Arg, IleH69Leu 56869 ArgH7lVal, AspH73Arg, AlaH49Gly, PheH67Ala

Apresentam-se nas figuras 8A-C as curvas de ligação de vários mutantes. A versão 574 de Fab humanizado, com as alterações ArgH71 Vai, AspH73Arg e IleH69Leu, parece apresentar ligação restaurada ao fragmento Fab 2C4 quimérico original. Podem ser modificados resíduos FR e/ou CDR adicionais, tais como L2, L54, L55, L56, H35 e/ou H48 (por exemplo substituídos da seguinte forma - IleL2Thr; ArgL54Leu; TyrL55Glu; ThrL56Ser; AspH35Ser; e ValH48lle) de modo a refinar adicionalmente ou melhorar ligação do anticorpo humanizado. Alternativa ou adicionalmente, o anticorpo humanizado pode ser maturado por afinidade (consultar acima) de modo a melhorar ou refinar adicionalmente a sua afinidade e/ou outras actividades biológicas. 0 2C4 humanizado versão 574 foi maturado por afinidade utilizando um método de exibição em fagos. Sucintamente, clonou-se Fab 2C4.574 humanizado para um vector de exibição em fagos como uma fusão de genelll. Quando as partículas de fago são induzidas por infecção com fago auxiliador M13K07, esta fusão permite que o Fab seja exposto no terminal N da proteína de fibra de cauda de fago, genelll (Baca et al. J Biol Chem. 272:10678 (1997)). 87

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Construíram-se bibliotecas individuais para cada uma das 6 CDR identificadas acima. Nestas bibliotecas, os aminoácidos nas CDR que foram identificados utilizando um modelo gerado por computador (figura 9) como sendo potencialmente significativos para a ligação a ErbB2 foram tornados aleatórios utilizando oligos contendo "NNS" como os seus codões. As bibliotecas foram então submetidas a ciclos de selecção contra ECD de ErbB2 que revestem placas NUNC MAXISORP™ com leite em pó a 3% em PBS com TWEEN 20® (MPBST) a 0,2% utilizado em vez de todas as soluções de bloqueio. De modo a seleccionar fagos com afinidades superiores à de 2C4.574, nos ciclos de selecção 3, 4 e 5, adicionou-se ECD de ErbB2 solúvel ou Fab 2C4.574 solúvel durante as etapas de lavagem como competidor. Os tempos de lavagem foram alargados a 1 hora à temperatura ambiente.

Após 5 ciclos de selecção, analisaram-se novamente os clones individuais por fago-ELISA. Os clones individuais foram cultivados em placas de cultura de tecidos, com fundo em u, Costar de 96 poços e os fagos foram induzidos por adição de fago auxiliador. Após crescimento durante a noite, sedimentaram-se as células de E. coli e transferiram-se os sobrenadantes contendo fagos para placas de 96 poços, onde os fagos foram bloqueados com MPBST durante 1 h à temperatura ambiente. Bloquearam-se também placas NUNC MAXISORP™ revestidas com ECD de ErbB2 com MPBST como acima. Incubaram-se os fagos bloqueados nas placas durante 2 horas. Após lavagem, detectaram-se fagos ligados utilizando anticorpo monoclonal anti-Ml3 conjugado a peroxidase de rábano (Amersham Pharmacia Biotech, Inc. 27-9421-01) diluído 1:5000 em MPBST, seguido por 3,3',5,5',-tetrametilbenzidina como substrato. Leu-se a absorvância a 450 nm.

Os 48 clones de cada biblioteca que apresentaram sinais mais elevados foram submetidos a sequenciação do ADN. Os clones cujas sequências ocorriam mais frequentemente foram subclonados para o vector descrito acima que permite expressão de Fab solúveis. Estes Fab foram induzidos, as proteínas purificadas e os Fab purificados foram analisados para ligação por ELISA tal como descrito acima e comparou-se a ligação ao da versão 2C4.574 humanizada de partida. 88

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Após serem identificadas mutações interessantes em CDR individuais, construiram-se mutantes adicionais com várias combinações destas e ensaiaram-se como acima. Os mutantes que apresentaram ligação melhorada relativamente a 574 estão descritos na tabela 3.

Tabela 3

Designação de mutantes derivados por maturação por afinidade de 2C4.574 Nome do Mutante Alteração de 574 Mutante/574* H3.A1 serH99trp, metH341eu 0,380 L2.F5 serL50trp, tyrL53gly, metH341eu 0, 087 H1.3.B3 thrH28gln, thrH30ser, metH341eu 0,572 L3.G6 tyrL92pro, ileL931ys, metH341eu 0,569 L3.G11 tyrL92ser, metH341eu ileL93arg, tyrL94gly, 0,561 L3.29 tyrL92phe, tyrL96asn, metH341eu 0, 552 L3.36 tyrL92phe, metH341eu tyrL941eu, tyrL96pro, 0,215 654 serL50trp, metH341eu 0,176 655 metH34ser 0,542 659 serL50trp, metH34ser 0,076 L2.F5.H3.A serL50trp, serH99trp tyrL53gly, metH341eu, 0,175 L3G6.H3.AI tyrL92pro, serH99trp ileL931ys, metH341eu, 0,218 H1.3.B3.H3.A1 thrH28gln, serH99trp thrH30ser, metH341eu, 0,306 L3.G11.H3.A1 tyrL92ser, metH341eu, ileL93arg, tyrL94gly, serH99trp 0,248 654.H3.AI serL50trp, metH341eu, serH99trp 0,133 654.L3.G6 serL50trp, ileL931ys metH341eu, tyrL92pro, 0,213 654.L3.29 serL50trp, tyrL96asn metH341eu, tyrL92phe, 0,236 654.L3.36 serL50trp, tyrL941eu, metH351eu, tyrL92phe, tyrL96pro 0,141 *A razão entre a quantidade de mutante necessária para obter DO médio da curva padrão e a quantidade de 574 necessária para obter DO médio da curva padrão num ELISA de ErbB2-ECD, Um valor inferior a 1,0 indica que o mutante liga ErbB2 melhor do que 574. 89

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Foram também construídos os seguintes mutantes e estão actualmente em avaliação: 659.L3.G6 serL50trp, metH34ser, tyrL92pro, ileL931ys 659.L3.G11 serL50trp, metH34ser, tyrL92ser, ileL93arg, tyrL94gly 659.L3.29 serL50trp, metH34ser, tyrL92phe, tyrL96asn 659.L3.36 serL50trp, metH34ser, tyrL92phe, tyrL941eu, tyrL96pro L2F5.L3G6 serL50trp, tyrL53gly, metH341eu, tyrL92pro, ileL931ys L2F5.L3G11 serL50trp, ileL93arg, tyrL53gly, tyrL94gly metH341eu, tyrL92ser, L2F5.L29 serL50trp, tyrL53gly, metH341eu, tyrL92phe, tyrL96asn L2F5.L36 serL50trp, tyrL941eu, tyrL53gly, tyrL96pro metH341eu, tyrL92phe, L2F5.L3G6.655 serL50trp, tyrL53gly, metH35ser, tyrL92pro, ileL931ys L2F5.L3G11.655 serL50trp, ileL93arg, tyrL53gly, tyrL94gly metH34ser, tyrL92ser, L2F5.L29.655 serL50trp, tyrL53gly, metH34ser, tyrL92phe, tyrL96asn L2F5.L36 .655 serL50trp, tyrL941eu, tyrL53gly, tyrL96pro metH34ser, tyrL92phe,

Estão actualmente a ser construídos os seguintes mutantes, sugeridos por um rastreio de homologia: 678 thrH30ala 679 thrH30ser 680 lysH64arg 681 leuH96val 682 thrL97ala 683 thrL97ser 684 tyrL96phe 685 tyrL96ala 686 tyrL91phe 687 thrL56ala 688 glnL28ala 689 glnL28glu

Os aminoácidos preferidos em H34 serão metionina. Pode ser efectuada uma alteração para leucina caso se verifique ocorrer oxidação nesta posição. 90

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Verificou-se que AsnH52 e asnH53 são altamente preferidos para ligação. A alteração destes resíduos para alanina ou ácido aspártico diminui fortemente a ligação.

Foi preparado um anticorpo intacto incluindo Fab humanizado versão 574 com uma região constante de cadeia pesada de igGl humano (consultar patente U.S. 5 821 337). O anticorpo intacto é produzido por células de ovário de hamster chinês (CHO).

Exemplo 4

0 anticorpo monoclonal 2C4 bloqueia activação de MAPK mediada por EGF, TGF-ct ou HRG

Muitos receptores de factor de crescimento sinalizam através da via de proteína-quinase activada por mitogénio (MAPK). Estas quinases de especificidade dupla são um dos principais objectivos finais em vias de transdução de sinal que desencadeiam finalmente a divisão de células de cancro. A capacidade do anticorpo monoclonal 2C4 ou HERCEPTIN® para inibirem activação de MAPK por EGF, TGF-α ou HRG foi avaliada da seguinte forma.

Plaquearam-se células MCF7 (105 células/poço) em meio contendo soro em placas de cultura de células de 12 poços. No dia seguinte, removeu-se o meio celular e adicionou-se meio fresco contendo soro a 0,1% a cada poço. Este procedimento foi então repetido no dia seguinte e antes do ensaio o meio foi substituído por tampão de ligação isento de soro (Jones et ai. J. Biol. Chem. 273:11667-74 (1998); e Schaefer et al. J. Biol. Chem. 274:859-66 (1999)). Deixaram-se as células equilibrar à temperatura ambiente e seguidamente incubaram-se durante 30 minutos com 0,5 mL de HERCEPTIN® ou anticorpo monoclonal 2C4 200 nM. Trataram-se então as células com EGF 1 nM, TGF-a 1 nM ou HRG 0,2 nM durante 15 minutos. Parou-se a reacção por aspiração do meio reaccional seguido de adição de 0,2 mL de tampão de amostra de SDS-PAGE contendo DTT a 1%. A activação de MAPK foi avaliada por hibridação de Western utilizando um anticorpo anti-MAPK activo (Promega) tal como previamente descrito (Jones et al. J. Biol. Chem. 273:11667-74 (1998)). 91

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Tal como apresentado na figura 10, o anticorpo monoclonal 2C4 bloqueia significativamente a activação de MAPK mediada por EGF, TGF-α e HRG numa maior extensão do que HERCEPTIN®. Estes dados sugerem que o anticorpo monoclonal 2C4 se liga a uma superfície de ErbB2 que é utilizada para a sua associação com EGFR ou ErbB3 e assim evita a formação do complexo de receptor de sinalização.

Exemplo 5

Efeito de HERCEPTIN® no crescimento de cancro da próstata humano dependente de androgénio e independente de androgénio O efeito de monoterapia de HERCEPTIN® em modelos de xenoenxerto de cancro da próstata dependente de androgénio e independente de androgénio e a combinação de HERCEPTIN® com paclitaxel foi estudado em modelos pré-clinicos de cancro da próstata humano. Utilizaram-se os modelos de xenoenxerto de cancro da próstata humano CWR22 e LNCaP dependentes de androgénio e as sublinhas de cancro da próstata humano independente de androgénio CWR22 (Nagabhushan et al. Câncer Res. 56:3042-3046 (1996); Wainstein et al. Câncer Res. 54:6049-6052 (1994); e Stearns et al. Prostate 36:56-58 (1998)) .

MATERIAIS E MÉTODOS

Estudos animais. Obtiveram-se ratinhos BALB/c atimicos nus de quatro a seis semanas de idade machos e fêmeas de National Câncer Institute-Frederick Câncer Center e mantiveram-se em gaiolas ventiladas pressurizadas no Sloan-Kettering Institute. Inocularam-se s.c. animais macho com 1 x 106 células LNCaP ou tecido de tumor triturado de CWR22 dependente de androgénio e as fêmeas receberam as sublinhas CWR22R, ou CWR22SA 1, CWRSA4, CWRSA6 independentes de androgénio, que foram obtidas por selecção de tumores para novo crescimento e PSA de soro aumentada após remoção de androgénio. Todas as linhas foram injectadas conjuntamente com membrana basal reconstituída (Matrigel; Collaborative Research, Bedford, Massachusetts) tal como previamente descrito (Nagabhushan et al. Câncer Res. 56:3042-3046 (1996); Wainstein et al. Câncer Res. 54:6049-6052 (1994); e Sato et al. Câncer Res. 57:1584-1589 (1997)). Para 92

ΕΡ 1 189 634 /PT manter os níveis de testosterona no soro, implantaram-se s.c. os ratinhos macho com comprimidos de testosterona de 12,5 mg de libertação controlada (Innovative Research of America, Sarasota, Florida) antes de receber inoculação de células de tumor. Os tratamentos consistirem de injecção i.p. de HERCEPTIN® 20 mg/kg em PBS duas vezes por semana durante pelo menos 3 semanas e/ou paclitaxel (TAXOL®, Bristol Myers-Squibb Company, Princeton, New Jersey) s.c. de baixa dosagem (6,25 mg/kg s.c., 5x/semana x 3 semanas) ou de elevada dosagem (12,5 mg/kg s.c., 5x/semana x 2 semanas) em solução salina estéril. Aos ratinhos de controlo foi administrado apenas veículo. Mediram-se os tumores em intervalos de 3-4 dias com craveiras de nónio e calcularam-se os volumes de tumor pela fórmula: p/6 x maior diâmetro x (menor diâmetro)2. Os animais com tumores estabelecidos por palpação com um volume de pelo menos 65 mm3 foram atribuídos aos grupos de tratamento.

Determinação do estado de ErbB2 dos xenoenxertos. Ensaiaram-se os xenoenxertos para expressão de ErbB2 por imuno-histoquímica utilizando os kits DAKO ErbB2 (HERCEPTEST®, DAKO Corporation, Carpinteria, Califórnia). As amostra foram pontuadas cegamente por comparação com controlos padrão nos padrões do kit DAKO e pontuadas da seguinte forma: 0 (sem coloração ou coloração da membrana em menos de 10% das células de tumor), 1+ (coloração ténue da membrana em mais de 10% das células de tumor), 2+ (coloração da membrana completa fraca a moderada em >10% das células) ou 3+ (coloração da membrana completa moderada a forte em >10% de células). Considerou-se uma pontuação de 0 ou 1+ negativa para sobre-expressão de ErbB2, enquanto que 2+ ou 3+ indicaram sobre-expressão de ErbB2. Efectuou-se análise FISH utilizando kits Oncor (sistema de detecção de gene ErbB2 INFORM®, Oncor Inc., Gaithersburg, Maryland). Avaliou-se um mínimo de 100 células de tumor em cada tumor para número de cópias de gene ErbB2 nuclear (Ross et al. Hum. Pathol. 28:827-833 (1997)).

Determinação de valores de PSA de soro. Recolheram-se amostras de sangue (-50 ml) de ratinhos machos em tubos separadores de soro Microtainer (Becton Dickinson, Franklin Lakes, New Jersey) por incisão superficial da veia da cauda dorsal, antes da terapia e nos dias 9 e 21 do tratamento. Determinaram-se então valores de PSA do soro utilizando o 93

ΕΡ 1 189 634 /PT ensaio imunorradiométrico de PSA Tandem-R (Hybritech, São Diego, Califórnia).

Análise estatística. Compararam-se diferenças emparelhadas entre os volumes de tumor dos grupos de tratamento ao longo do tempo utilizando um ensaio de permutação. A hipótese nula para este ensaio é que o tratamento não apresenta efeito diferencial nos volumes de tumor ao longo do tempo. A estatística utilizada para ensaiar a hipótese foi a soma dos quadrados das diferenças entre volume de tumor médio somados ao longo de todos os pontos temporais. SS.DEV: = Σί*-χ·) /=1

Utilizou-se SS_Dev de modo a capturar diferenças médias entre grupos de tratamento em cada ponto temporal. Esta estatística reflecte quantitativamente a diferença entre as trajectórias de volume de tumor médio dos dois grupos de tratamento.

RESULTADOS

Coloração histoquímica de ErbB2 e número de cópias do gene ErbB2 dos xenoenxertos da próstata. Os padrões de expressão de ErbB2 dos xenoenxertos da próstata, dependentes de androgénio e independentes de androgénio, foram analisados por imuno-histoquímica (IHC) e FISH. Os tumores CWR22 dependentes de androgénio progenitores demonstraram coloração de ErbB2 2+ e os tumores LNCaP coloração de ErbB2 3+. As sublinhas de CWR22 independentes de androgénio demonstraram coloração para ErbB2 2+ (CWRSAl), 3+ (CWRSA4) , 2+ (CWRSA6) e 1+ (CWR22R) . Todos OS tumores apresentaram um número de cópias do gene ErbB2 de 2-4 (gama normal) por FISH.

Efeitos de HERCEPTIN® em xenoenxertos de cancro da próstata estabelecidos. Efectuaram-se experiências em animais para avaliar a eficácia de HERCEPTIN® em xenoenxertos de cancro da próstata dependente de androgénio e independente de androgénio, bem estabelecidos. Utilizaram-se os modelos CWR22, LNCaP, CWR22R e CWRSA6 para estas experiências porque proporcionam curvas de crescimento reprodutíveis. Administrou-se HERCEPTIN® intraperitonealmente (i.p.) a uma 94

ΕΡ 1 189 634 /PT dose de 20 mg/kg duas vezes por semana após estabelecimento do xenoenxerto. Não se observou qualquer efeito de HERCEPTIN® em crescimento de tumor, em qualquer dos tumores independentes de androgénio comparativamente a controlos (CWR22R, p=0,60, n=10, figura 11 A; CWRSA6, p=0,63, n=10, figura 11B) . O anticorpo anti-ErbB2 murino, 4D5, também não apresentou qualquer efeito em crescimento de tumor na linha CWR22R independente de androgénio (p=0,21, n=10). Contrariamente, HERCEPTIN® apresentou uma inibição de crescimento significativa em ambos os modelos de xenoenxerto dependentes de androgénio, CWR22 (68% de inibição de crescimento; p<0,03, n=12, figura 11C) e LNCaP (89% de inibição de crescimento; p=0,002, n=12, figura 11D).

Efeitos de HERCEPTIN® combinada com TAXOL® em xenoenxertos de tumor estabelecidos. Quando se co-administrou paclitaxel e HERCEPTIN® a animais, ocorreu uma redução acentuada do volume de tumor relativamente a controlo, tanto para tumores dependentes de androgénio, como independentes de androgénio (CWR22 98% de inibição de crescimento, p<0,01, figura 11E; CWR22R 92% de inibição de crescimento, p<0,01, figura 11G; LNCaP 94% de inibição de crescimento, p=0,006, figura 11F; CWRSA6 77% de inibição de crescimento, p<0,01, figura 11H) .

Verificou-se inibição de crescimento aumentada com a combinação de HERCEPTIN® e paclitaxel comparativamente ao agente sozinho no final do periodo de tratamento nos animais com os xenoenxertos dependentes de androgénio (figuras 11E-H): o grupo CWR22 (volumes médios de tumor, n=6 em cada grupo, paclitaxel 408 mm3, HERCEPTIN® 520 mm3, paclitaxel e HERCEPTIN® 76 mm3; p<0,03 paclitaxel contra paclitaxel e HERCEPTIN®) e o grupo LNCaP (volumes de tumor médios, n=6 em cada grupo, paclitaxel 233 mm3, HERCEPTIN® 163 mm3, paclitaxel e HERCEPTIN® 82 mm3; p<0,03 paclitaxel contra paclitaxel e HERCEPTIN®). Além disso, ocorreu inibição de crescimento aumentada com a combinação de HERCEPTIN® e paclitaxel relativamente a agente sozinho no final do periodo de tratamento, nos animais com xenoenxertos independentes de androgénio (figuras 11E-H): o grupo CWRSA6 (volumes de tumor médios, n=5 em cada grupo, paclitaxel 1496 mm3, HERCEPTIN® 2941 mm3, paclitaxel e HERCEPTIN® 687 mm3; p<0,001 paclitaxel contra paclitaxel e HERCEPTIN®) e o grupo CWR22R (volumes de tumor médios, n=5 em cada grupo, paclitaxel 1273 mm3, 95

ΕΡ 1 189 634 /PT HERCEPTIN® 3811 mm3, paclitaxel e HERCEPTIN® 592 mm3; p=0,095 paclitaxel contra paclitaxel e HERCEPTIN®).

Efeitos de HERCEPTIN® em índice de PSA nos animais tratados com xenoenxertos dependentes de androgénio. Tal como apresentado nas figuras 12A e B, há um aumento significativo no índice de antigénio específico de próstata (PSA) (ng PSA/ml de soro/mm3 de tumor) em grupos dependentes de androgénio tratados com HERCEPTIN® comparativamente a controlo (CWR22, 1864% contra -4%, p<0,0001, figura 12A; LNCaP, 232% contra -68%, p<0, 0001, figura 12B) . Também ocorreu uma aumento do índice de PSA após tratamento combinado com HERCEPTIN® e paclitaxel comparativamente a valores pré-tratamento.

CONCLUSÕES

Nestes sistemas modelo de cancro da próstata, HERCEPTIN® sozinha apresenta actividade clínica apenas em tumores dependentes de androgénio e apresenta pelo menos um efeito aditivo no crescimento, em combinação com paclitaxel, tanto em tumores dependentes de androgénio, como independentes de androgénio. A resposta a HERCEPTIN® não se correlacionou com os níveis de PSA, já que o índice de PSA aumentou drasticamente no grupo tratado com HERCEPTIN®, embora tenha permanecido constante no grupo de controlo.

Exemplo 6

Efeito do anticorpo monoclonal 2C4 no crescimento do cancro da próstata humano dependente de androgénio e independente de androgénio

Avaliou-se o efeito de um anticorpo que bloqueia a activação por ligandos de um receptor ErbB, no cancro da próstata humano. Nomeadamente, determinou-se a resposta de xenoenxertos de tumores a HERCEPTIN®, anticorpo monoclonal 2C4, paclitaxel e tratamento combinado com 2C4/paclitaxel utilizando o tumor dependente de androgénio CWR22 e os tumores independentes de androgénio CWR22R e CWRSA6 descritos no exemplo 5 acima. Os anticorpos e o paclitaxel foram administrados tal como descrito no exemplo 5. 96

ΕΡ 1 189 634 /PT A resposta do tumor dependente de androgénio CWR22 à terapia apresenta-se nas figuras 13 e 14. Os resultados apresentam-se como volume de tumor médio ± EP. Os volumes de tumor dos animais apresentados na figura 13 demonstram que o HERCEPTIN® apresenta actividade clinica neste modelo dependente de androgénio, tal como o anticorpo monoclonal 2C4. A combinação de anticorpo monoclonal 204 e TAXOL® demonstra inibição do crescimento aumentada comparativamente a 2C4 ou TAXOL® sozinhos (figura 14; p=0,003). A resposta dos tumores independentes de androgénio CWR22R e CWRSA6 à terapia com HERCEPTIN®, anticorpo monoclonal 2C4, paclitaxel ou ao tratamento combinado com 2C4/paclitaxel apresenta-se nas figuras 15-18. Os resultados apresentam-se como volume médio de tumor ± EP. Os volumes de tumor dos animais apresentados nas figuras 15 e 17 demonstram que o HERCEPTIN® tem pouca ou nenhuma actividade clinica nestes modelos independentes de androgénio, enquanto que o anticorpo monoclonal 2C4 apresenta actividade clinica nestes modelos. A combinação de anticorpo monoclonal 2C4 e TAXOL® demonstra inibição de crescimento aumentada comparativamente com anticorpo monoclonal 2C4 ou TAXOL® sozinhos (figuras 16 e 18; p=0,002).

Expressou-se um fragmento Fab' do rhuMAb 2C4 em E. coli e conjugou-se com polietilenoglicol (PEG) ramificado de 20 kD tal como descrito em WO98/37200. A capacidade do anticorpo 2C4 murino (20 mg/kg), rhuMAb 2C4 (20 mg/kg) e do fragmento Fab em PEG (PEG-Fab; 20 ou 40 mg/kg) para tratar cancro da próstata independente de androgénio in vivo foi avaliada utilizando o xenoenxerto CWR22R acima. Todas as injecções foram administradas IP (N= 5) . Os resultados destes estudos apresentam-se na figura 23. Estes dados demonstram que a inibição do tumor verificada com 2C4 no modelo CWR22R não necessita de uma anticorpo intacto, bivalente. Dado que estes fragmentos Fab não contêm Fc, pode provavelmente excluir-se um mecanismo imunológico tal como ADCC. Estes resultados são consistentes com os apresentados na figura 6 utilizando um sistema in vítro e versões quiméricas do Fab 2C4. A observação que 2C4 inibe o crescimento de tumores na forma de um fragmento monovalente também credibiliza a noção que esta inibição resulta do bloqueio da capacidade de ErbB2 para 97

ΕΡ 1 189 634 /PT formar heterodímeros com outros membros da família ErbB e assim inibe iniciação dos eventos de sinalização a jusante.

Efectuaram-se estudos de dose-resposta utilizando rhuMAb 4D5 nos xenoenxertos de próstata independentes de androgénio CWR22R e MSKPC6 (Agus et al. Câncer Research 59: 4761-4764 (1999)). Administrou-se IP aos animais: controlo; 6 mg/kg de dose de carga e seguidamente 3 mg/kg duas vezes por semana; 20 mg/kg de dose de carga e seguidamente 10 mg/kg duas vezes por semana; ou 60 mg/kg de dose de carga e seguidamente 30 mg/kg duas vezes por semana. Os resultados destes estudos apresentam-se nas figuras 24 e 25. Estes dados demonstram gue 2C4 suprime o crescimento de xenoenxertos de tumor independente de androgénio de uma forma dependente da dose. Além disso, estes resultados confirmam adicionalmente que esta inibição do crescimento do tumor é devida ao tratamento com 2C4 e não a artefactos experimentais.

Apresenta-se um resumo de resultados típicos destes estudos dos exemplos 5 e 6 na figura 21.

Exemplo 7 Níveis de tgf-<x e HB-EGF em cancro da próstata humano dependente e independente de androgénio

Neste exemplo avaliaram-se os níveis de ARNm de TGF-α e HB-EGF em células CWR22 (dependentes de androgénio) e células CWR22R (independentes de androgénio).

MATERIAIS E MÉTODOS

Preparação de ARNm. Processou-se tecido tumoral congelado de acordo com o protocolo de Qiagen (Qiagen Maxi Kit n.° 75163) . Sucintamente, efectuou-se a homogeneização do tecido num homogeneizador Brinkman Polytron (Pt-3000) equipado com o gerador de pt-da 3012/2 TS utilizando impulsos de 15 segundos e seguidamente pausas de 30 segundos. Repetiu-se este processo três vezes e carregou-se o extracto numa coluna Qiagen e lavou-se de acordo com as especificações do fabricante. Eluíram-se as colunas com 1 mL de água isenta de ARNase e determinou-se o teor de ARN por absorvância a 260 nm. Dado que 98

ΕΡ 1 189 634 /PT ο TGF-α e ο HB-EGF são expressos na linha celular MDA-MB-231, utilizou-se o ARN total destas células como padrão para a quantificação de TGF-α e HB-EGF. PCR quantitativa em tempo real. Quantificou-se o ARNm de TGF-α e HB-EGF utilizando PCR quantitativa em tempo real ou a técnica TaqMan tal como descrito anteriormente (Gibson et al. Genome Research 6: 986-994 (1996); e Heid et al. Genomic

Research 6:986-994 (1996)). As sequências dos conjuntos iniciador/sonda utilizados para esta análise apresentam-se adiante: TGF-a F 5'-GGACAGCACTGCCAGAGA -3' (SEQ ID NO:14) R 5'-CAGGTGATTACAGGCCAAGTAG -3' (SEQ ID NO:15) P 5'FAM-CCTGGGTGTGCCACAGACCTTCA-TAMRA-p-3' (SEQ ID NO:16) HB-EGF: F 5'-TGAAGTTACCTCCAGGTTGGT-3' (SEQ ID NO:17) R 5'-AGACACATTCTGTCCATTTTCAA-3' (SEQ ID NO:18) P 5'-FAM-CAAGCTGCAAAGTGCCTTGCTCAT-TAMRA-p-3' (SEQ ID NO:19) em que F e R são os iniciadores directo e inverso, respectivamente, e P é a sonda marcada com fluorescência. Utilizou-se β-actina como um gene de expressão basal. Os conjuntos iniciador/sonda para β-actina são: β-actina F 5'-ATGTATCACAGCCTGTACCTG-3' (SEQ ID NO:20) R 5'-TTCTTGGTCTCTTCCTCCTTG-3' (SEQ ID NO:21) P 5'FAM-AGGTCTAAGACCAAGGAAGCACGCAA-TAMRA-p-3' (SEQ ID NO: 22)

Efectuou-se a análise TaqMan num formato padrão de placas de 96 poços. Construiram-se curvas padrão utilizando 0,6-150 ng de ARNm para a análise de TGF-α e HB-EGF e 9,4-150 ng para a β-actina. Efectuou-se cada diluição em duplicado. Para as amostras de tumor, utilizaram-se 100 ng para todos os genes analisados. 99

ΕΡ 1 189 634 /PT

RESULTADOS

Tal como apresentado nas figuras 19-20, a linha de tumor da próstata independente de androgénio, CWR22R, expressou níveis significativamente maiores dos ligandos de EGFR, TGF-a e HB-EGF, comparativamente com a linha celular dependente de androgénio, CWR22. Especificamente, o TGF-α foi expresso em níveis 8-9 vezes superiores no tumor CWR22R do que no tumor CWR22. De igual modo, o HB-EGF foi expresso ~19 vezes mais em CWR22R do que em CWR22.

Exemplo 8

Efeito de 2C4 ou HERCEPTIN® sobre o índice PSA em animais com xenoenxertos dependentes de androgénio

Tal como apresentado na figura 22, o índice PSA (definido como ng de PSA/mL de soro/mm3 de tumor) foi medido nos animais dependentes de androgénio no dia 21 perto do final do tratamento. Ocorreu um aumento significativo do índice PSA nos animais tratados com HERCEPTIN®, dependentes de androgénio, enquanto que os animais de controlo apresentaram uma diminuição do índice de PSA (LNCaP: controlo =0,6 relativamente ao valor de pré-tratamento, grupo de HERCEPTIN® = 2,35 relativamente ao valor de pré-tratamento no dia 21; CWR22: controlo =1,0 relativamente ao valor de pré-tratamento, grupo de HERCEPTIN® = 18 relativamente ao valor de pré-tratamento no dia 21). O índice PSA relativo diminuiu no grupo LNCaP não tratado, presumivelmente devido a aumento de necrose com o aumento do tamanho de tumor. Contrariamente, não ocorreu qualquer efeito significativo do 2C4 sobre o índice PSA de tumores tratados comparativamente com os controlos. Sem nos limitarmos a qualquer teoria, uma explicação possível para este fenómeno pode estar relacionada com o grau de activação de ErbB2 em células de cancro da próstata. A activação de ErbB2 pode causar crescimento independente de androgénio por comunicação cruzada com a via de sinalização de receptor de androgénio (Craft et al. Nature Med. 5:280-285 (1999)). Nos nossos sistemas modelo, a ligação de HERCEPTIN® a ErbB2 levou a um aumento da excreção celular de PSA de uma forma independente de androgénio (Agus et al. Câncer Res. 59:4761-4764 (1999)). Este resultado apoia 100

ΕΡ 1 189 634 /PT adicionalmente a noção de comunicação cruzada entre ErbB2 e as vias de sinalização de receptor de androgénio.

Exemplo 9

Efeito do anticorpo anti-ErbB2 7C2 em xenoenxertos dependentes e independentes de androgénio O efeito do anticorpo monoclonal 7C2 (ATCC hb-12215) que induz apoptose em células que sobre-expressam ErbB2 foi comparado com o anticorpo monoclonal 2C4 no xenoenxerto CWR22 dependente de androgénio. Ambos os anticorpos foram doseados a 20 mg/kg duas vezes por semana. Tal como apresentado na figura 26, tal como o 2C4 e o HERCEPTIN®, o 7C2 é também eficaz no tratamento do cancro da próstata dependente de androgénio. O efeito de 7C2 sobre o cancro da próstata independente de androgénio foi também avaliado utilizando o xenoenxerto CWR22R. A figura 27 demonstra que 7C2 sozinho não foi eficaz neste modelo, mas foi eficaz quando combinado com TAXOL®.

Exemplo 10

Terapia do cancro da próstata metastàtico reincidente ou refractário O rhuMAb 2C4 é um anticorpo monoclonal humanizado completo (produzido em células CHO) dirigido contra ErbB2. O rhuMAb 2C4 bloqueia a associação de ErbB2 com outros membros da família ErbB inibindo assim a sinalização intracelular através da via do ErbB. Contrariamente ao HERCEPTIN®, o rhuMAb 2C4 não só inibe o crescimento de tumores que sobre-expressam ErbB2 como também bloqueia o crescimento de tumores que necessitam de sinalização dependente de ligandos de ErbB. O rhuMAb 2C4 é indicado como um agente único para tratamento de doentes de cancro da próstata refractário a hormonas (independente de androgénio). Os objectivos finais principais para eficácia incluem sobrevivência global comparativamente com os melhores cuidados disponíveis (Mitoxantrona/Prednisona), quando utilizado como um agente único, e segurança. Os objectivos de eficácia secundários 101

ΕΡ 1 189 634 /PT incluem: intervalo de tempo de progressão da doença, velocidade de resposta, qualidade de vida, dor e/ou duração da resposta. Administra-se rhuMAb 2C4 intravenosamente (IV) uma vez por semana ou a intervalos de três semanas a 2 ou 4 mg/kg, respectivamente, até progressão da doença. O anticorpo é fornecido como uma formulação liquida em multi-doses (20 mL de enchimento numa concentração de 20 mg/mL ou concentração superior). O rhuMAb 2C4 é também indicado em combinação com quimioterapia para tratamento de doentes de cancro da próstata refractário a hormonas (independente de androgénio). Os objectivos finais principais para eficácia incluem sobrevivência global comparativamente a quimioterapia e segurança. Os objectivos finais de eficácia secundários incluem: intervalo de tempo de progressão da doença, velocidade de resposta, qualidade de vida, dor e/ou duração da resposta. Administra-se RhuMAb 2C4 intravenosamente (IV) uma vez por semana ou a intervalos de três semanas a 2 ou 4 mg/kg, respectivamente, até progressão da doença. O anticorpo é fornecido como uma formulação liquida em multi-doses (20 mL de enchimento a uma concentração de 20 mg/mL ou concentração superior).

Constituem exemplos de fármacos que podem ser combinados com o anticorpo anti-ErB2 (que bloqueia activação por ligandos de um receptor ErbB2) para tratar cancro da próstata (por exemplo cancro da próstata independente de androgénio), entre outros, inibidor de farnesil-transferase; um agente anti-angiogénico (por exemplo um anticorpo anti-VEGF); um fármaco dirigido a EGFR (por exemplo C225 ou ZD1839); outro anticorpo anti-ErbB2 (por exemplo um anticorpo anti-ErbB2 de inibição de crescimento, tal como HERCEPTIN®, ou um anticorpo anti-ErbB2 que induz apoptose tal como 7C2 ou 7F3, incluindo suas variantes humanizadas e/ou maturadas por afinidade); uma citoquina (por exemplo IL-2, IL-12, G-CSF ou GM-CSF); um anti-androgénio (tal como flutamida ou acetato de ciproterona); leuprolida; suramina; um agente quimioterapêutico tal como vinblastina, estramustina, mitoxantrona, liarozole (um agente de bloqueio do metabolismo do ácido retinóico), ciclofosfamida, antibióticos de antraciclina tal como doxorrubicina, um taxano (por exemplo paclitaxel ou 102

ΕΡ 1 189 634 /PT docetaxel), ou metotrexato, ou qualquer combinação dos supracitados, tal como vinblastina/estramustina ou ciclofosfamida/doxorrubicina/metotrexato; prednisona; hidrocortisona; ou suas combinações. Podem ser administradas doses padrão destes vários fármacos, por exemplo 40 mg/m2/semana de docetaxel (TAXOTERE®); 6 (AUC) de carboplatina; e 200 mg/m2 de paclitaxel (TAXOL®).

Listagem de Sequências <110> Genentech, Inc. et al. <120> TRATAMENTO DO CANCRO DA PRÓSTATA COM ANTICORPOS ANTI-ErbB2 <130> P1760R1PCT <141> 2000-06-23 <150> US 60/141,315 <151> 1999-06-25 <160> 22

<210> 1 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus < 4 0 0 > 1

Asp Thr Vai Met Thr Gin Ser His Lys Ile Met Ser Thr Ser Vai 1 5 10 15 Gly Asp Arg Vai Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asp Vai Ser 20 25 30 Ile Gly Vai Ala Trp Tyr Gin Gin Arg Pro Gly Gin Ser Pro Lys 35 40 45 Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Vai Pro Asp 50 55 60 Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile 65 70 75 Ser Ser Vai Gin Ala Glu Asp Leu Ala Vai Tyr Tyr Cys Gin Gin 80 85 90 Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu 95 100 105

Ile Lys

<210> 2 <211> 119 <212> PRT <213> Mus musculus 103

ΕΡ 1 189 634 /PT < 4 0 0 > 2

Glu Vai Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Glu Leu Vai Lys Pro Gly 15 10 15

Thr Ser Vai Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr 20 25 30

Asp Tyr Thr Met Asp Trp Vai Lys Gin Ser His Gly Lys Ser Leu 35 40 45

Glu Trp Ile Gly Asp Vai Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr 50 55 60

Asn Gin Arg Phe Lys Gly Lys Ala Ser Leu Thr Vai Asp Arg Ser 65 70 75

Ser Arg Ile Vai Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Phe Glu Asp 80 85 90

Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr 95 100 105

Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr Leu Thr Vai Ser Ser 110 115 <210> 3 <211> 107 <212> PRT <213> artificial < 4 0 0 > 3

Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai 1 5 10 15 Gly Asp Arg Vai Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asp Vai Ser 20 25 30 Ile Gly Vai Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 35 40 45 Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Vai Pro Ser 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin 80 85 90 Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Vai Glu 95 100 105 Ile Lys <210> 4 <211> 119 <212> PRT <213> artificial < 2 2 0 >

<221> artificial <222> 1-119 <223> Fab 574 VH 104 ΕΡ 1 189 634 /PT < 4 0 0 > 4

Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr 20 25 30 Asp Tyr Thr Met Asp Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45 Glu Trp Vai Ala Asp Vai Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr 50 55 60 Asn Gin Arg Phe Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Vai Asp Arg Ser 65 70 75 Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90 Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr 95 100 105 Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 110 115 <210> 5 <211> 107 <212> PRT <213> artificial < 4 0 0 > 5

Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai 1 5 10 15

Gly Asp Arg Vai Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser Ile Ser 20 25 30

Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 35 40 45

Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Vai Pro Ser 50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75

Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin 80 85 90

Tyr Asn Ser Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Vai Glu 95 100 105

Ile Lys <210> 6 <211> 119 <212> PRT <213> artificial 105 ΕΡ 1 189 634 /PT < 4 0 0 > 6

Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly 15 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 20 25 30

Ser Tyr Ala Met Ser Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45

Glu Trp Vai Ala Vai Ile Ser Gly Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr 50 55 60

Ala Asp Ser Vai Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser 65 70 75

Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90

Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Arg Vai Gly Tyr Ser Leu 95 100 105

Tyr Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 110 115 <210> 7 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus < 2 2 0 > <221> incerta <222> 10 <223> aminoácido desconhecido < 4 0 0 > 7 Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr Thr Met Xaa 1 5 10 <210> 8 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus < 4 0 0 > 8 Asp Vai Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr 1 5 10 <210> 9 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus < 4 0 0 > 9 Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10 15 106

ΕΡ 1 189 634 /PT <210> 10 <211> 11

< 212 > PRT <213> Mus musculus < 4 0 0 > 10

Lys Ala Ser Gin Asp Vai Ser Ile Gly Vai Ala 15 10

<210> 11 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus < 2 2 0 > <221> incerta <222> 5-7 <223> aminoácido desconhecido < 4 0 0 > 11

Ser Ala Ser Tyr Xaa Xaa Xaa 1 5

<210> 12 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus < 4 0 0 > 12

Gin Gin Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr Thr 1 5 <210> 13 <211> 645 <212> PRT <213> humana 107

ΕΡ 1 189 634 /PT : 4 0 0 > 13 Met Glu Leu Ala Ala Leu Cys Arg Trp Gly Leu Leu Leu Ala Leu 1 S 10 15 Leu Pro Pro Gly Ala Ala Ser Thr Gin Vai Cys Thr Gly Thr Asp 20 25 30 Met Lys Leu Arg Leu Pro Ala Ser Pro Glu Thr His Leu Asp Met 35 40 45 Leu Arg His Leu Tyr Gin Gly Cys Gin Vai Val Gin Gly Asn Leu 50 55 60 Glu Leu Thr Tyr Leu Pro Thr Asn Ala Ser Leu Ser Phe Leu Gin 65 70 75 Asp Ile Gin Glu Vai Gin Gly Tyr Vai Leu Ile Ala His Asn Gin 80 85 90 Vai Arg Gin Vai Pro Leu Gin Arg Leu Arg Ile Val Arg Gly Thr 95 100 105 Gin Leu Phe Glu Asp Asn Tyr Ala Leu Ala Val Leu Asp Asn Gly 110 115 120 Asp Pro Leu Asn Asn Thr Thr Pro Vai Thr Gly Ala Ser Pro Gly 125 130 135 Gly Leu Arg Glu Leu Gin Leu Arg Ser Leu Thr Glu Ile Leu Lys 140 145 150 Gly Gly Vai Leu Ile Gin Arg Asn Pro Gin Leu Cys Tyr Gin Asp 155 160 165 Thr Ile Leu Trp Lys Asp Ile Phe His Lys Asn Asn Gin Leu Ala 170 175 180 Leu Thr Leu Ile Asp Thr Asn Arg Ser Arg Ala Cys His Pro Cys 185 190 195 Ser Pro Met Cys Lys Gly Ser Arg Cys Trp Gly Glu Ser Ser Glu 200 205 210 Asp Cys Gin Ser Leu Thr Arg Thr Vai Cys Ala Gly Gly Cys Ala 215 220 225 Arg Cys Lys Gly Pro Leu Pro Thr Asp Cys Cys His Glu Gin Cys 230 235 240 108

ΕΡ 1 189 634 /PT

Ala Ala Gly Cys Thr Gly Pro Lys His Ser Asp Cys Leu Ala Cys 245 250 255 Leu His Phe Asn His Ser Gly Ile Cys Glu Leu His Cys Pro Ala 260 265 270 Leu Vai Thr Tyr Asn Thr Asp Thr Phe Glu Ser Met Pro Asn Pro 275 280 285 Glu Gly Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ser Cys Vai Thr Ala Cys Pro 290 295 300 nv>v Asn fTV,-v- Leu Ssr Thr Λ. ¢-1-. V.l rOit Ρλι* JCi. O-, r r- '-y => Thr Leu Vai ÍV ro ^J 305 310 315 Pro Leu His Asn Gin Glu Vai Thr Ala Glu Asp Gly Thr Gin Arg 320 325 330 Cys Glu Lys Cys Ser Lys Pro Cys Ala Arg Vai Cys Tyr Gly Leu 335 340 345 Gly Met Glu His Leu Arg Glu Vai Arg Ala Vai Thr Ser Ala Asn 350 355 360 Ile Gin Glu Phe Ala Gly Cys Lys Lys Ile Phe Gly Ser Leu Ala 3 65 nn _» t V 375 Phe Leu Pro Glu Ser Phe Asp Gly Asp Pro Ala Ser Asn Thr Ala 380 385 390 Pro Leu Gin Pro Glu Gin Leu Gin Vai Phe Glu Thr Leu Glu Glu 395 400 405 Ile Thr Gly Tyr Leu Tyr Ile Ser Ala Trp Pro Asp Ser Leu Pro 410 415 420 Asp Leu Ser Vai Phe Gin Asn Leu Gin Vai Ile Arg Gly Arg Ile 425 430 435 Leu His Asn Gly Ala Tyr Ser Leu Thr Leu Gin Gly Leu Gly Ile 440 445 450 Ser Trp Leu Gly Leu Arg Ser Leu Arg Glu Leu Gly Ser Gly Leu 455 460 465 Ala Leu Ile His His Asn Thr His Leu Cys Phe Vai His Thr Vai 470 475 480 Pro Trp Asp Gin Leu Phe Arg Asn Pro His Gin Ala Leu Leu His 485 490 495 Thr Ala Asn Arg Pro Glu Asp Glu Cys Vai Gly Glu Gly Leu Ala 500 505 510 Cys His Gin Leu Cys Ala Arg Gly His Cys Trp Gly Pro Gly Pro 515 520 525 Thr Gin Cys Vai Asn Cys Ser Gin Phe Leu Arg Gly Gin Glu Cys 530 535 540 Vai Glu Glu Cys Arg Vai Leu Gin Gly Leu Pro Arg Glu Tyr Vai 545 550 555

Asn Ala Arg His Cys Leu Pro Cys His Pro Glu Cys Gin Pro Gin 109

ΕΡ 1 189 634 /PT 560 565 570 Asn Gly Ser Vai Thr Cys Phe Gly Pro Glu Ala Asp Gin Cys Vai 575 580 585 Ala Cys Ala His Tyr Lys Asp Pro Pro Phe Cys Vai Ala Arg Cys 590 595 600 Pro Ser Gly Vai Lys Pro Asp Leu Ser Tyr Met Pro Ile Trp Lys 605 610 615 Phe Pro Asp Glu Glu Gly Ala Cys Gin Pro Cys Pro Ile Asn Cys 620 625 630 Thr His Ser Cys Vai Asp Leu Asp Asp Lys Gly Cys Pro Ala Glu 635 640 645 <210> 14 <211> 18

< 212 > ADN <213> artificial < 4 0 0 > 14 ggacagcact gccagaga 18 <210> 15 <211> 22 <212> ADN <213> artificial < 4 0 0 > 15 caggtgatta caggccaagt ag 22 <210> 16 <211> 23 <212> ADN <213> artificial < 4 0 0 > 16 cctgggtgtg ccacagacct tca 23 <210> 17 <211> 21 <212> ADN <213> artificial < 4 0 0 > 17 tgaagttacc tccaggttgg t 21 <210> 18 <211> 23 <212> ADN <213> artificial < 4 0 0 > 18 agacacattc tgtccatttt caa 23 110

ΕΡ 1 189 634 /PT <210> 19 <211> 24

< 212 > ADN <213> artificial < 4 0 0 > 19 caagctgcaa agtgccttgc tcat 24 <210> 20 <211> 21 <212> ADN <213> artificial <400> 20 atgtatcaca gcctgtacct g 21 <210> 21 <211> 21 <212> ADN <213> artificial < 4 0 0 > 21 ttcttggtct cttcctcctt g 21 <210> 22 <211> 26 <212> ADN <213> artificial <400> 22 aggtctaaga ccaaggaagc acgcaa 26

Lisboa

Claims (21)

1. ΕΡ 1 189 634 /PT 1/3 REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de um anticorpo que liga ErbB2 e bloqueia a activação por ligandos de um receptor ErbB de um modo 50-100% mais eficaz do que o anticorpo monoclonal humanizado huMAb4D5-8, tal como revelado na patente US 5 821 337, para o fabrico de um medicamento para tratar cancro da próstata num ser humano, em que o anticorpo bloqueia a ligação do anticorpo monoclonal 2C4 obtenivel do depósito na ATCC hb 12697, a ErbB2.
2. 2. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o cancro da próstata é cancro da próstata independente de androgénio.
3. 3. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o anticorpo bloqueia a activação por TGF-α de proteina-quinase activada por mitogénios (MAPK).
4. 4. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o anticorpo bloqueia a formação de um hetero-oligómero ErbB.
5. 5. Utilização de acordo com a reivindicação 4, em que o anticorpo inclui o anticorpo monoclonal 2C4 obtenível do depósito na ATCC HB12697 ou o 2C4 humanizado.
6. 6. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o anticorpo é um fragmento de anticorpo.
7. 7. Utilização de acordo com a reivindicação 6, em que o fragmento de anticorpo é um fragmento Fab.
8. 8. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o anticorpo não se encontra conjugado com um agente citotóxico.
9. 9. Utilização de acordo com a reivindicação 6, em que o fragmento de anticorpo não se encontra conjugado com um agente citotóxico.
10. 10. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o anticorpo se encontra conjugado com um agente citotóxico. ΕΡ 1 189 634 /PT 2/3
11. 11. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o cancro da próstata é cancro da próstata dependente de androgénio.
12. 12. Utilização de acordo com a reivindicação 11, em que o medicamento inclui adicionalmente um taxano.
13. 13. Utilização de acordo com a reivindicação 11, em que a administração do medicamento resulta num aumento do índice de antigénio específico de próstata (PSA) no ser humano.
14. 14. Utilização de acordo com a reivindicação 11, em que o anticorpo inclui o anticorpo monoclonal 2C4 obtenível do depósito na ATCC HB 12697 ou o 2C4 humanizado.
15. 15. Utilização de um agente quimioterapêutico e de um anticorpo que liga ErbB2 e bloqueia a activação por ligandos de um receptor ErbB de um modo 50-100% mais eficaz do que o anticorpo monoclonal humanizado huMAb4D5-8 tal como revelado na patente US 5 821 337, para o fabrico de um medicamento para tratar cancro da próstata num ser humano, em que o anticorpo bloqueia a ligação do anticorpo monoclonal 2C4 obtenível do depósito na ATCC HB 12697, a ErbB2.
16. 16. Utilização de acordo com a reivindicação 15, em que o agente quimioterapêutico é um taxano.
17. 17. Artigo de fabrico incluindo um recipiente e uma composição nele contida, em que a composição inclui um anticorpo que liga ErbB2 e bloqueia a activação por ligandos de um receptor ErbB de um modo 50-100% mais eficaz do que o anticorpo monoclonal humanizado huMAb4D5-8 tal como revelado na patente US 5 821 337, e incluindo adicionalmente um folheto incluso indicando que a composição pode ser utilizada para tratar cancro da próstata, em que o anticorpo bloqueia a ligação do anticorpo monoclonal 2C4 obtenível do depósito na ATCC HB 12697, a ErbB2.
18. 18. Artigo de fabrico de acordo com a reivindicação 17, em que o cancro da próstata é cancro da próstata independente de androgénio. ΕΡ 1 189 634 /PT 3/3
19. 19. Artigo de fabrico de acordo com a reivindicação 17, em que o folheto incluso indica adicionalmente o tratamento do doente com um agente quimioterapêutico.
20. 20. Artigo de fabrico de acordo com a reivindicação 19, em que o agente quimioterapêutico é um taxano.
21. 21. Artigo de fabrico de acordo com a reivindicação 17, em que o cancro da próstata é cancro da próstata dependente de androgénio. Lisboa,