JP2001521733A - ヒト上皮増殖因子とヒトアンギオゲニンの融合タンパク質およびその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 この発明はヒト上皮増殖因子（ｈＥＧＦ）受容体を発現する癌細胞を追跡した後に細胞内にインターナリゼーションされるｈＥＧＦと、インターナリゼーションされた際に該細胞のリボ核酸を分解し細胞毒性を示すヒトアンギオゲニンを遺伝子工学的に作製された融合タンパク質；該融合タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクターで大腸菌を形質転換して、融合タンパク質を大量に製造する方法；および前記融合タンパク質の抗癌剤としての医薬用途を提供する。この発明の融合タンパク質を成す各構成タンパク質は全てヒト由来で抗体を形成しないため免疫毒性がない。かつ各構成タンパク質自体のみでは癌細胞に対する活性がほとんどない反面、それらが融合すると、融合タンパク質は分子量が小さいながら癌細胞にのみＩＣ_５０において１０００倍以上の差で選択的に作用し癌細胞のみを殺せるため、毒性を与えずｈＥＧＦ受容体を高レベルで発現する癌を治療することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 発明の背景 技術分野 本発明は、ヒト上皮増殖因子（ｈｕｍａｎ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔ
ｈ ｆａｃｔｏｒ、ｈＦＧＦ）とヒトアンギオゲニン（ａｎｇｉｏｇｅｎｉｎ）
の融合タンパク質およびその融合タンパク質の調整方法に関する。より具体的に
は、本発明はヒト上皮増殖因子受容体を高いレベルにおいて発現する癌細胞を追
跡し、続いてインターナリゼーション（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）する
ヒト上皮増殖因子（ｈＥＧＦ）およびインターナリゼーションにおいて、リボ核
酸を分解し細胞毒性を出すアンギオゲニンの融合タンパク質と、該融合タンパク
質の遺伝子をコードする発現ベクターで形質転換した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を
使用して、前記融合タンパク質を製造する方法およびその抗癌剤としての医薬上
の用途を提供する。

【０００２】 従来技術 環境汚染と高齢者人口の増加に伴い、発癌率が毎年５％ずつ上昇しており、癌
が他の疾患および事故の中で死亡原因の一位を占めている。

【０００３】 癌を予防および治療するための有効な方法としては化学療法が広く用いられて
いるが、化学療法は例えば、癌細胞だけではなく正常細胞をも攻撃する、種々の
副作用を引き起こすことが知られている。癌細胞に対し特異性が低く、正常細胞
に対し毒性を有するために、高い特異性および低い毒性を有する抗癌剤の開発に
数多くの努力がなされてきた。そのような努力の例として、新規の作用機序を有
する薬物の探索、ドラッグデリバリーシステムおよびドラッグターゲッティング
の開発、初期抗癌剤の作用を補助する補助治療剤の使用、などが含まれる。

【０００４】 最近、癌細胞に強い親和性を有する担体に結合させた化学薬剤を用いて癌細胞
に選択的に作用するドラッグターゲッティングの新しい方法が研究されている。
有望な解決として、アルファフェトプロテインのような癌細胞に特異的な抗原に
対する抗体に化学薬剤、リシン、ジフテリア毒素、シュードモナス毒素または放
射性同位体等を結合する事例が報告されている（参照：Ｋ．Ｓｈｉｋｏｒｏら、
Ｂｒ．Ｍｅｄ．Ｂｕｌｌ．、４０：２３３−２３９（１９８４）；Ｖｉｊａｙら
、Ｎａｔｕｒｅ、３３９：３９４−３９７（１９８９）；：ＵＳＰ４，５４５，
９８５；Ｐｅｔｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、５４：１００８（１９９４）
）。しかしながら、抗体結合化学薬剤は例えば、細胞内に入り難く、抗体自体に
抗原性が有り、抗体が正常細胞と結合し、かつ抗体の分子量が大きいために結合
能力が低いという短所を有していた（参照：Ｐａｓｔａｎら、Ｃｅｌｌ、 ４７
：６４１−６４８（１９８６）；Ｈｕｒｗｉｔｚら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、
３５：１１７５−１１８１（１９７５）；Ｄｅｌａｂｙｅら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉ
ｎｖｅｓｔ．、７７：３０１−３１１（１９８６）；Ｂｕｃｈｅｇｇｅｒら、Ｊ
．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１５８：４１３−４２７（１９８６）；Ｂｕｃｈｅｇｇｅ
ｒら、Ｃａｎｃｅｒ、５８：６５５−６６１（１９８６）。

【０００５】 他の試みとして、ポリアミノ酸は正常細胞に毒性を与えないので、ポリアミノ
酸を担体として用いて抗癌剤を開発した。薬剤にポリアミノ酸を結合させて複合
体を形成した後、癌細胞に存在する酵素により薬剤をその複合体から分離した。
しかし、この方法で前記詳述の問題点を解決することはできなかった（参照：Ｋ
ａｔｏら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、２７：１６０２−１６０７（１９８４）；
ＥＰ１１２，７２０；ＵＳＰ４，４８５，０９３）。

【０００６】 抗癌ドラッグターゲッティングのもう一つの試みとして、細胞内受容体に結合
でいるペプチドまたはタンパク質、とサイトトキシンとのタンパク質複合体を調
製する研究も行われているが、まだ成功していない。そのようなペプチドまたは
タンパク質の例として、ＴＧＦ（腫瘍成長因子）、ＭＳＨ（メラニン細胞刺激ホ
ルモン）、ソマトスタチン、グルカゴン、インシュリン、トランスフェリン、Ｌ
ＤＬ（低密度リポタンパク質）、カルシトニン、α−２−マクログロブリン、ブ
ラジキニン、ＥＧＦ等がある（参照：ＵＳＰ４，５４５，；Ｓｈｉｍｉｚｕら、
ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ、１１８：２７４−２７８（１９８０）；Ｃａｗｌｅ
ｙら、Ｃｅｌｌ、２２：５６３−５７０（１９８０）；Ｓｉｍｐｓｏｎら、Ｃｅ
ｌｌ、２９：４６９−４７３；ＷＯ８５／００３６９；ＷＯ／０４０３０；ＵＳ
Ｐ４，５２８，１８６；ＥＰ４６，０３９；ＥＰＫ−１２８，７３３；ＷＯ８５
／０１２８４；ＥＰ１３１，８６８；ＵＳＰ３，９１７，８２４）。

【０００７】 また、ジフテリア毒素とＴＲＨ（甲状腺刺激ホルモン刺激ホルモン、ＴＲＦ（
トランスフェリン）、ＭＳＨおよびＬＤＬとを結合させることにより、ペプチド
とサイトトキシンの遺伝子工学的融合タンパク質を生成した。しかし、担体であ
るペプチドの受容体結合活性の保持の問題点でその融合タンパク質の使用が限ら
れてきた（参照：Ｂａｃｈａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５８：１５６５
−１５７０（１９８３）；Ｏｋｅｅｆｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６０
：９３２−９３７（１９８５）；Ｍｕｒｐｈｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ、８３：８２５８−８２６２（１９８６）；日本特公昭６
０−１６３８２４号公報）。

【０００８】 細胞毒性化学物質自身が毒性および化学物質に対する抗体形成による免疫毒性
のために、ＥＧＦタンパク質複合体および細胞毒性化学物質の毒性は低くならな
かった（参照：ＷＯ８８／００８３７）。ＥＰ４６７，５３６では遺伝子工学的
にＴＧＦに改変型シュードモナスエキソトキシンＡを融合し、膀胱癌（ｂｌａｄ
ｄｅｒ ｃａｎｃｅｒ）の標的として使用することができる。しかし、微生物由
来の毒素抗原性を克服することはできなかった。日本特公昭６３−４１４１８号
公報では化学物質をリンカーとして用いたＥＧＦとシュードモナス毒素のタンパ
ク質コンジュゲートが開示されている。シュードモナス毒素の毒性の問題がまだ
解決されていない。ＥＰ１１，１１１では分子量の小さい成長因子に化学物質を
化学的にコンジュゲートして調製した抗癌剤を示しているが、これは化学物質が
タンパク質のβ−アミノ末端やカルボキシル末端に非特異的に結合され調製され
たものである。しかし、従来技術では化学反応中の汚染、タンパク質の変性、お
よびそのコンジュゲート自体の不均質性の点において、まだ十分ではないことが
分かっている。

【０００９】 上記のように、癌細胞の表面上の分子を認識するモノクローン抗体と融合した
細胞毒性物質（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ａｇｅｎｔ）、または微生物由来の毒素（
参照：ＵＳＰ４，６６４，９１１；ＵＳＰ４，５４５，９８５）または腫瘍性組
織由来の成長因子と微生物由来毒素を融合して生成した融合タンパク質（参照：
Ｊｉｌｌら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６６：２１１１８（１９９１）；Ｄ
ａｎｉｅｌら、Ｃｅｌｌ、２２：５６３−５７０（１９８０）；Ｃｈａｕｄｈａ
ｒｙら、ＰＮＡＳ、８４：４５３８−４５４２（１９８７））に関する研究が現
在も行われているが、タンパク質自体の毒性、化学物質の汚染、抗体形成による
免疫毒性と抗体の非特異的結合、大きい分子量をもつ融合タンパク質を標的癌細
胞まで運搬する困難さのため、満足な結果を得ることはできなかった（参照：Ｃ
ｈｕｎｇら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌｓ、６：１２５−１３２（１９９６））。

【００１０】 発明の要約 本発明者らは前記の問題点である抗体形成による免疫毒性の問題、および少な
くとも５０ｋＤの大きい分子量のための低いターゲッティング効率（ｔａｒｇｅ
ｔｉｎｇｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）の問題を解決するため、人体内で正常的に存在
する物質であるｈＥＧＦとアンギオゲニンによって構成され、過量を投与しても
毒性を与えず、分子量が小さい融合タンパク質を遺伝子工学的に開発した。さら
に、本発明者らはｈＥＧＦおよびアンギオゲニンをコードする融合体遺伝子をク
ローニングし、細菌内で発現して大量の融合タンパク質を製造した。 上記のよ
うに調製した融合タンパク質の効率性は：１）ｈＥＧＦ受容体を発現する癌細胞
の成長を選択的に阻害し；２）正常細胞の成長には有害な影響を及ぼさず；３）
従来の化学抗癌剤の毒性を与えず；４）融合タンパク質に対する抗体形成による
問題点が全く生じないという点において、従来の抗癌剤と比較して著しく改善さ
れた。

【００１１】 従って、本発明の主な目的は、ｈＥＧＦ受容体を発現する癌細胞の成長を選択
的に阻害する、ｈＥＧＦとアンギオゲニンとの融合タンパク質を提供することで
ある。

【００１２】 本発明の他の目的は、前記融合タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベク
ターで形質転換させた組換え微生物を用いて、前記融合タンパク質を製造する方
法を提供することである。

【００１３】 本発明の他の目的は、前記融合タンパク質を有効成分として含む抗癌剤を提供
することである。

【００１４】 上述した本発明の目的および特徴は、添付図面と共に後述の記載によりさらに
明確になる。

【００１５】 発明の詳細な説明 本発明において新たに開発された融合タンパク質は、ｈＥＧＦのトレーサーと
リボヌクレアーゼスーパーファミリーに属するアンギオゲニンの毒性タンパク質
が適当なリンカーによって結合し、適した３次折りたたみ（ｆｏｒｌｄｉｎｇ）
を許容するように形成されたものである。結果として、本発明の融合タンパク質
は：癌細胞を追跡するｈＥＧＦのトレーサー成分；癌細胞を殺すアンギオゲニン
細胞毒性成分；またこのｈＥＧＦおよびアンギオゲニンが各々生物学的活性をも
つように連結するリンカー成分、の３つからなっている。この点に関しては、ｈ
ＥＧＦは、融合タンパク質をｈＥＧＦ受容体を発現する癌細胞にターゲッティン
グする機能を持ち、続いて融合タンパク質の形でインターナリゼーションする。
アンギオゲニンはトレーサーによりインターナリゼーションにおいて、リボ核酸
を分解し癌細胞を殺す機能を持ち、リンカーペプチドは例えばｈＥＧＦなどのト
レーサーと例えばアンギオゲニンなどのサイトトキシンに結合し、３次構造を維
持する。

【００１６】 上記のように、本発明は従来の抗癌剤の問題点である低効率のターゲッティン
グ、製造中の化学物質汚染、融合タンパク質の抗原性、サイトトキシンの毒性等
の問題点をうまく解決した新規の融合タンパク質を提供する。

【００１７】 従来、抗癌剤として用いた融合タンパク質は、トレーサーとして用いる抗体の
抗原性、または微生物由来のサイトトキシンの毒性のため、投与後、１週間以内
に抗体が形成され毒性を表していた。特にジフテリア毒素やシュードモナス毒素
で作られた融合タンパク質の場合、相当数の患者が投薬する前に融合タンパク質
に対する抗体を持っており、投与された融合タンパク質は癌細胞に対し、もはや
有効ではない。

【００１８】 一方、本発明の融合タンパク質において働くトレーサーとサイトトキシンは通
常人体に存在するもので、トレーサーがサイトトキシンを標的細胞に運び、細胞
内にインターナリゼーションした時にのみサイトトキシンが細胞毒性を表し、細
胞の外では、全く毒性を表さない。

【００１９】 一般に、融合タンパク質の癌細胞へのターゲッティング効率を上げるためには
融合タンパク質のサイズが小さいほど好ましい。本発明においては、低分子量タ
ンパク質、６ｋＤのトレーサー（ｈＥＧＦ）と１４．４ｋＤのアンギオゲニンを
用いることによってターゲッティング効率をはるかに改善した。しかしながら、
従来の融合タンパク質は少なくとも５０ｋＤであったことを考慮すると、本発明
の２０．４ｋＤ（６ｋＤ＋１４．４ｋＤ）の融合タンパク質はその分子量におい
て著しく小さい。

【００２０】 更に、化学的結合中の化学物質汚染およびタンパク質の変性の問題点を解決す
るため、本発明の融合タンパク質は化学的反応ではなく遺伝子工学的手法、すな
わちトレーサーとサイトトキシンの遺伝子を適当なリンカー融合した後、それを
用いて形質転換した遺伝子組換え微生物により製造する。 この過程において、
各タンパク質成分は、分子比１：０．５〜２、好ましくは１：１（トレーサー：
毒性タンパク質（アンギオゲニン））で結合させる。 リンカーとして融合タン
パク質の各タンパク質成分がその活性を維持するのに適当数のアミノ酸からなる
ペプチド、好ましくは０〜２０個のアミノ酸からなるペプチド、最も好ましくは
グリシン、（グリシン）_４セリンまたは｛（グリシン）_４セリン｝_２のペプチド
を用いる。

【００２１】 トレーサーとしては、ｈＥＧＦに限らず動物ＥＧＦ、ＴＧＦ、これらの誘導体
およびｈＥＧＦ受容体と結合し得る低分子量のペプチドやタンパク質を用いるこ
とができる。サイトトキシンとしては細胞内でＲＮＡを分解するアンギオゲニン
に限らずリボヌクレアーゼスーパーファミリーに属するヒトリボ核酸分解酵素、
ＥＤＮ（好酸球由来神経毒）、およびこれらの誘導体も使用可能である。トレー
サーのＮ末端またはＣ末端にサイトトキシンが結合することがあるが、トレーサ
ーのＣ末端にサイトトキシンのＮ末端が結合するのがより好ましい。

【００２２】 本発明の融合タンパク質におけるトレーサーとして使用するｈＥＧＦの特徴は
以下とおりである： 正常細胞には全く作用せず、ｈＥＧＦ受容体が高いレベルで発現される 癌細胞にのみに選択的に作用する； 癌細胞内でｈＥＧＦ受容体が高いレベルで発現される癌腫の広い適用範 囲で適用可能である； 融合タンパク質の形で癌細胞内にインターナリゼーションするため、サ イトトキシンを効率的に運搬する； 細胞内に透過され易いほど、サイズが小さい（５３個のアミノ酸からな る）６ｋＤのタンパク質である；および、 翻訳後修飾されないため、サイトトキシンと容易に融合できる。

【００２３】 本発明の融合タンパク質におけるサイトトキシンとして使用するアンギオゲニ
ンの特徴は以下のとおりである： ヒト由来であるため、抗体形成を誘導しない（ヒト血液中０．４μｇ／ ｍｌで存在）； 細胞内でｔＲＮａｓｅ活性を表すので、インターナリゼーションした細 胞内でのみ毒素の役目をする；および、 他の微生物由来の毒素（例えばジフテリア毒素、シュードモナス毒素） や植物誘導毒素（例えばリシン）に比べ、標的に容易に運搬できるよう、充分サ
イズが小さい（１２３個のアミノ酸からなる１４．４ｋＤタンパク質）。

【００２４】 上記特徴を有する融合タンパク質は、ｈＥＧＦ受容体を発現する癌、例えば膀
胱癌、肺癌、前立腺癌、脳癌、乳癌、皮膚癌等のための抗癌剤として広く有用で
ある。

【００２５】 本発明の融合タンパク質を有効成分として含む薬剤は、非経口投薬（例えば、
点滴注射、皮下注射、直腸投薬など）されるのが好ましいが、経口投薬も可能で
ある。前記薬剤はカプセル剤、錠剤、ピル、果粒剤、ファインサブティレ剤（ｆ
ｉｎｅ ｓｕｂｔｉｌａｅ）、舌下錠剤（ｓｕｂｌｉｎｇｕａｌ ｔａｂｌｅｔ
）、、糖衣錠、傷薬剤、シロップ剤、懸濁液剤などの形で調製することができる
。 上記の薬剤は例えば、希釈剤、崩壊剤（ｄｉｓｉｎｔｅｇｒａｔｏｒ）、基
剤（ｂａｓｅ）、等張剤（ｉｓｏｔｏｎｉｃ ａｇｅｎｔ）、結合剤、緩衝剤、
吸収剤、潤滑剤、皮膜剤、溶剤、安定化剤、抗酸化剤、防腐剤、甘味剤、乳化剤
（ｅｍｕｌｓｉｆｙｉｎｇ ａｇｅｎｔ）、着色剤などを薬学上許容されうる担
体として含む。

【００２６】 上記薬学上許容されうる担体の具体的な例は次の通りである。

【００２７】 希釈剤にはスターチ、およびスターチ誘導体（例えば、デキストリン、カルボ
キシメチルスターチなど）、セルロースおよびセルロース誘導体（例えば、メチ
ルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースなど）、糖（例えば、ガラ
クトース、果糖、グルコースなど）、ケイ酸およびケイ酸塩（例えば、天然的に
存在するケイ酸アルミニウム、ケイ酸マグネシウムなど）、炭酸塩（例えば、炭
酸カルシウム、炭酸マグネシウム、炭酸水素ナトリウムなど）、水酸化アルミニ
ウムマグネシウム、合成ハイドロタルサイト（ｈｙｄｒｏｔａｌｃｉｔｅ）、ポ
リオキシエチレン誘導体、グリセリンモノステアリン酸、またはソルビタンモノ
オレイン酸などがある。

【００２８】 結合剤にはスターチおよびスターチ誘導体（例えば、アルファスターチ、デキ
ストリンなど）、セルロースおよびセルロース誘導体（例えば、エチルセルロー
ス、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロ
ースなど）、アラビアゴム、トラガカントゴム、ゼラチン、糖（例えば、グルコ
ース、果糖など）、エタノール、またはポリビニルアルコールなどがある。

【００２９】 崩壊剤にはスターチおよびスターチ誘導体（例えば、カルボキシメチルスター
チ、ヒドロキシプロピルスターチなど）、セルロースおよびセルロース誘導体（
例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、セルロース結晶、ヒドロキシ
プロピルメチルセルロースなど）、炭酸塩（例えば、炭酸カルシウム、炭酸水素
カルシウムなど）、トラガカントゴム、ゼラチン、または糖などがある。

【００３０】 潤滑剤にはステアリン酸、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウ
ム、タルク（ｔａｌｃ）、ケイ酸およびケイ酸塩（例えば、硬質無水物ケイ酸、
天然的に存在するケイ酸アルミニウムなど）、チタン酸化物、リン酸水素カルシ
ウム、乾燥水酸化アルミニウムゲル、マクロゴールなどがある。

【００３１】 防腐剤にはｐ−ヒドロキシベンゾアート、亜硫酸塩（例えば、亜硫酸ナトリウ
ム、ピロ亜硫酸ナトリウムなど）、リン酸塩（例えば、リン酸ナトリウム、ポリ
リン酸カルシウム、ポリリン酸ナトリウム、メタリン酸ナトリウムなど）、アル
コール（例えば、クロロブタノール、ベンジルアルコールなど）、ベンズアルコ
ニウム塩化物、ベンゼトニウム塩化物、フェノール、クレゾール、塩化クレゾー
ル、ジヒドロ酢酸、ジヒドロ酢酸ナトリウム、グリセリン、ソルビン酸、または
糖などがある。

【００３２】 抗酸化剤には亜硫酸塩（例えば、亜硫酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウムな
ど）、ロンガリト（ｒｏｎｇａｌｉｔｅ）、エリソルビン酸、Ｌ−アスコルビン
酸、システイン、チオグリセロール、ブチルヒドロキシアニソル（ｂｕｔｈｙｌ
ｈｙｄｒｏｘｙａｎｉｓｏｌ）、ジブチルヒドロキシトルエン、プロピル没食子
酸（ｐｒｏｐｙｌｇａｌｌｉｃ ａｃｉｄ）、アスコルビルパルミチン酸塩（ａ
ｓｃｏｒｂｙｌ ｐａｌｍｉｔａｔｅ）、またはｄ１−α−トコフェロールなど
がある。

【００３３】 等張剤には塩化ナトリウム、亜硝酸ナトリウム、亜硝酸カリウム、デキストリ
ン、グリセリン、またはグルコースなどがある。

【００３４】 緩衝剤には炭酸ナトリウム、塩酸、ホウ酸、またはリン酸塩などがある。

【００３５】 皮膜剤にはセルロース誘導体（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、セル
ロースアセテートフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート
など）、シェラック（ｓｈｅｌｌａｃ）、ポリビニルピロリドン、ポリビニルピ
リジン（例えば、ポリ−２−ビニルピリジン、ポリ−２−ビニル−５−エチルピ
リジンなど）、ポリビニルアセチルジエチルアミノアセテート、ポリビニルアル
コールフタレート、メタクリル酢酸（ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ）、メタクリレ
ートコポリマーなどがある。

【００３６】 甘味剤には糖（例えば、グルコース、果糖、乳糖など）、サッカリンナトリウ
ム、または糖アルコールなどがある。

【００３７】 溶剤にはエチレンジアミン、ニコチンアミド、サッカリンナトリウム、クエン
酸、クエン酸ナトリウム、安息香酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、ポリソ
ルベート（ｐｏｌｙｓｏｌｖａｔｅ）、ソルビタン（ｓｏｒｂｉｔａｎ）脂肪酸
エステル、グリセリン、プロピレングリコール、またはベンジルアルコールなど
がある。

【００３８】 基剤には脂肪（例えば、ラードなど）、植物性油（例えば、オリーブ油、ゴマ
油など）、動物性油、ラノリン酸（ｌａｎｏｌｉｎ ａｃｉｄ）、ワセリン、パ
ラフィン、ワックス、樹脂、ベントナイト、グリセリン、グリコール油、または
脂肪族アルコール（例えば、ステアリルアルコール、セタノールなど）がある。

【００３９】 分散剤にはアラビアゴム、トラガカントゴム、セルロース誘導体（例えば、メ
チルセルロースなど）、ステアリン酸ポリエステル、ソルビタンセスキオレト（
ｓｏｒｂｉｔａｎ ｓｅｓｑｕｉｏｌｅａｔｅ）、モノステアリン酸アルミニウ
ム、アルギン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ａｌｇｉｎａｔｅ）、ポリソルベー
ト、またはソルビタン脂肪酸エステルなどがある。

【００４０】 安定剤には亜硫酸塩（亜硫酸ナトリウムなど）、窒素または二酸化炭素などが
ある。

【００４１】 前記薬物の調製におき、本発明の融合タンパク質は剤型によって相違であるが
、０．０１〜１００重量％の濃度で含まれる。

【００４２】 投与量は患者の体重、疾病の程度および医者の判断などによる。しかし、一般
的に注射剤を投与する場合は、１日に体重１ｋｇ当たり０．０１〜１０ｍｇ、好
ましくは０．０２〜２ｍｇがを投与することができ、注射剤以外を投与する場合
は、融合タンパク質の血中濃度が注射剤に準ずる濃度を維持するように考慮して
投与することができる。

【００４３】 上述の１日投与量は疾病の程度および医者の判断によって、１回、または数回
に渡って投与することができる。

【００４４】 以下、実施例を通して本発明をさらに具体的に説明する。但し、これら実施例
等に本発明の記述的範囲を限定するものではない。

【００４５】 実施例１：ｈＥＧＦ、ヒトアンギオゲニンをコーディングする遺伝子の構築 ｈＥＧＦ遺伝子（配列番号３）を調製するために、発現ベクターｐＴＥ１０５
（図１、大韓民国特許公告第９６−６１２１号、ＫＣＣＭ−１００２７参照）に
部位特異的突然変異を誘発させ発現ベクターｐＴＥＤ（大韓民国特許出願第９６
−５３５３９号、ＫＦＣＣ−１０９２５参照）を構築し、それをｈＥＧＦ遺伝子
源として用いた。

【００４６】 一方、ヒトアンギオゲニン遺伝子（配列番号１）を調製するために、ＥｃｏＲ
Ｉ制限酵素部位を含む配列番号５のプライマーとＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位を
含む配列番号６のプライマー各々３０ピコモルをヒトの肝ｃＤＮＡライブラリー
に添加し、これをプリミックス−トップ（Ｐｒｅｍｉｘ^ＴＭ−Ｔｏｐ、Ｃａｔ＃
Ｋ２０１０、（株）バイオニア（韓国）、１ユニットのポリメラーゼ、２５０μ
Ｍの混合溶液、４０μＭの塩化カリウム、１．５μＭの塩化マグネシウムおよび
５０ｍＭのトリス−塩酸（ｐＨ９．０）を含有する）チューブに入れ、蒸留水を
添加して最終容量を２０μｌまで増やし、ここに３０μｌのミネラルオイルを上
部に添加し、溶液の蒸発を防止した。 ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は９４
℃で５分、５８℃で２分、７２℃で３０秒、９４℃で１分の順で３５回繰り返し
、最終段階では７２℃で２０秒反応させＤＮＡを増幅させた。

【００４７】 その結果、配列番号１のヒトアンギオゲニン遺伝子とＥｃｏＲＩおよびＨｉｎ
ｄＩＩＩ制限酵素部位が挿入された約３８０ｂｐのＰＣＲ産物を取得した。次い
で、ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素でＰＣＲ産物切断し、ｐＲＳＥＴＡ（
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）を制限酵素ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで制限
消化して得た２９４３ｂｐのＤＮＡ断片とよく混合し、付着末端を形成した。Ｔ
４ＤＮＡリガーゼ０．５μｌとともに１６℃で１８時間インキュベートすること
により、２つのＤＮＡ断片を連結した。

【００４８】 この最終プラスミドをｐＲＳａｎｇと命名し、これを用いて大腸菌ＢＬ２１（
ＤＥ３）を形質転換した。図２は組換えベクターｐＲＳａｎｇの構築過程を表し
た概略図である。

【００４９】 実施例 ２： ヒトアンギオゲニンの発現ベクターｐＴＥａｎｇの構築 アンギオゲニン遺伝子をＯｍｐＡ（ｔａｃプロモーター）システム下で発現さ
せるため、実施例１から得た発現ベクターｐＴＥＤ（ＫＦＣＣ−１０９２５）に
ヒトアンギオゲニン遺伝子を挿入した。ＤｓａＩ制限酵素部位を含む配列番号７
のプライマーと、アンギオゲニンの１２２番アミノ酸Ａｒｇ（ＣＧＴ）がＡｒｇ
（ＣＧＣ）に変換され、また１２４番にＧｌｙが付加された、ＡｖａＩ制限酵素
部位とＰｓｔＩ制限酵素部位を含む配列番号８のプライマーとの２個のプライマ
ーに用い、組換えベクターｐＲＳａｎｇを鋳型にしてＰＣＲを行った。この際、
ＰＣＲはｐＲＳａｎｇ１００ｎｇ、各プライマー１００ｐＭずつ、ｄＮＴＰｓ混
合溶液８ｍＭ（各２ｍＭ）、Ｍｇ２＋を含む反応溶液、ＰＦＵ（ポリメラーゼ）
１ユニットを入れ、最終容量を１００μｌまで増やした。次いで９４℃で１分、
５８℃で１分、７２℃で７０秒の順で３２回繰り返し、最終段階では７２℃で５
分反応させＤＮＡを増幅した。 増幅されたＰＣＲ産物（３９１ｂｐ）を１％（
ｗ／ｖ）のアガロースゲル電気泳動により分離、精製した後、ＤｓａＩ／Ｐｓｔ
Ｉ制限酵素で消化して再び分離、精製した。

【００５０】 上記ＤｓａＩ／ＰｓｔＩ制限酵素で切断されたＰＣＲ産物（３９１ｂｐ）とＤ
ｓａＩ／ＰｓｔＩ制限酵素で切断して精製されたプラスミドベクターｐＴＥＤの
２７７７ｂｐＤＮＡ断片とを混合した後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ０．５μｌを添加
し１６℃で１８時間反応させることにより、これら２つのＤＮＡ断片を連結した
。このように連結されたプラスミドをｐＴＥａｎｇと命名し、これを用いて大腸
菌ＪＭ１０１を形質転換した。プラスミドベクターｐＴＥａｎｇにアンギオゲニ
ンが正しく挿入されたかどうかを、制限酵素ＡｖａＩ、ＳｍａＩ、Ａ１ｗＮＩで
切断して確認した。 図３は組換えベクターｐＴＥａｎｇの構築過程を表した概
略図である。

【００５１】 一方、上記配列番号７のプライマーをＮｄｅＩ制限酵素部位を含む配列番号１
６の別のプライマーと交換すること以外は、上記と同様の方法により封入体（ｉ
ｎｃｌｕｓｉｏｎ ｂｏｄｙ）の形のアンギオゲニンを大量に発現した。

【００５２】 実施例 ３： アンギオゲニンとｈＥＧＦの融合遺伝子を含む 発現ベクターｐＴＥ４０８１の構築（Ｉ） アンギオゲニンとｈＥＧＦの融合遺伝子を構築するために、実施例１から得た
ＥＧＦ遺伝子を含むプラスミドｐＴＥＤ、実施例２から得たアンギオゲニン遺伝
子を含むプラスミドｐＴＥａｎｇを融合することにより、アンギオゲニンとＥＧ
Ｆ遺伝子を含む発現ベクターｐＴＥ４０８１を構築した。図４は組換えベクター
ｐＴＥ４０８１の構築過程を表した概略図である。

【００５３】 より具体的に説明すると、ｈＥＧＦ遺伝子を含むプラスミドｐＴＥＤを制限酵
素ＢｌｐＩとＰｓｔＩで切断し、１．５％アガロースゲル電気泳動により分離し
て、精製ＥＧＦ遺伝子を含むＤＮＡ断片（１４９ｂｐ）を取得した。一方、アン
ギオゲニン遺伝子を含むプラスミドｐＴＥａｎｇを制限酵素ＡｖａＩとＰｓｔＩ
で切断し、０．８％アガロースゲル電気泳動により分離して、精製アンギオゲニ
ン遺伝子を含むＤＮＡ断片（３１５６ｂｐ）を取得した。

【００５４】 リンカーは各１００ピコモルの配列番号９のオリゴマーと配列番号１０の別の
オリゴマーに、１．５μｌの１０ｎＭＡＴＰと１５ユニットのＴ４ポリヌクレオ
チドキナーゼを混合し、３７℃で１時間、９５℃で５分インキュベートし、５’
末端をリン酸化した。リン酸化されたオリゴマー等を９５℃で５分加熱し、３０
℃になるまで３時間かけ徐々に冷やしアニーリングすることにより、制限酵素Ａ
ｖａＩとＢｇｌＩＩ部位と付着する５’および３’末端を調製した。上記ＥＧＦ
遺伝子を含むＤＮＡ断片（１４９ｂｐ）、アンギオゲニン遺伝子を含むＤＮＡ断
片（３１５６ｂｐ）と上記リン酸化リンカーとを混合した後、Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼ０．５μｌとともに１６℃で１８時間インキュベートすることにより、これら
のＤＮＡ断片を連結した。この組換え体プラスミドｐＴＥ４０８１を用いて大腸
菌ＪＭ１０１を形質転換した。 プラスミドベクターｐＴＥ４０８１にアンギオ
ゲニンとＥＧＦの融合遺伝子が正しく挿入されたかどうか制限酵素ＤｓａＩ、Ａ
ｌｗＮＩ、ＮｓｉＩ、ＳｍａＩで切断して確認した。最終的に、Ｓａｎｇｅｒの
ジデオキシヌクレオチド配列分析法を用い（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎ
ｇ ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ ｅｄ．Ｓａｍｂｒｏｏ
ｋ ｅｔ ａｌ．，１３．６−１３．１０参照）、組換え体プラスミドを配列決
定して融合遺伝子が正しく挿入されたかどうか確認した。

【００５５】 実施例 ４： アンギオゲニンとｈＥＧＦの融合遺伝子を含む 発現ベクターｐＴＥ４０８２の構築（ＩＩ） アンギオゲニンとｈＥＧＦの融合遺伝子を構築するために、実施例３から得た
ＥＧＦ遺伝子を含むＤＮＡ断片、アンギオゲニン遺伝子を含むＤＮＡ断片、リン
カー（配列番号１１と配列番号１２）を融合させることにより、アンギオゲニン
とＥＧＦの融合遺伝子を含む発現ベクターｐＴＥ４０８２を調製した。 図５は
組換えベクターｐＴＥ４０８２の構築過程を表した概略図である。発現ベクター
ｐＴＥ４０８２は、別のリンカー（配列番号１１と配列番号１２）を用いたこと
以外は、実施例３と同様の方法により構築した。さらに、遺伝子の正しい挿入も
実施例５と同様の方法により確認された。

【００５６】 実施例 ５： アンギオゲニンとｈＥＧＦの融合遺伝子を含む 発現ベクターｐＴＥ４０８３の構築（ＩＩＩ） プラスミドｐＴＥ１０５を制限酵素ＡｆｌＩＩとＰｓｔＩで切断して得たＤＮ
Ａ断片（２９２９ｂｐ）、プラスミドｐＴＥａｎｇを鋳型とし、かつ配列番号１
３と配列番号１４のプライマーを用いてＰＣＲ増幅させて得られたアンギオゲニ
ン遺伝子を含むＤＮＡ断片を融合することにより、アンギオゲニンとｈＥＧＦの
融合遺伝子を含む発現ベクターｐＴＥ４０８３を調製した。図６は組換えベクタ
ーｐＴＥ４０８３の構築過程を表した概略図である。

【００５７】 より具体的に説明すると、ｈＥＧＦ遺伝子を含むプラスミドｐＴＥ１０５を制
限酵素ＡｆｌＩＩとｐｓｔＩで切断し、０．８％アガロースゲル電気泳動により
ｈＥＧＦ遺伝子を含むＤＮＡ断片（２９２９ｂｐ）を分離、精製した。一方、Ａ
ｆｌＩＩ制限酵素部位を含む配列番号１３のプライマーとＰｓｔＩ制限酵素部位
を有する配列番号１４のプライマーを一対に用い、アンギオゲニン遺伝子を含む
プラスミドｐＴＥａｎｇを鋳型にしてＰＣＲを行った。 この際、ＰＣＲはｐＴ
Ｅａｎｇ １００ｎｇ、各プライマー１００ピコモルずつ、各ｄＮＴＰ２ｍＭ、
Ｍｇ２＋を含む反応溶液、ＰＦＵ（ポリメラーゼ）１ユニットを入れ、最終容量
を１００μｌまで増やした。 次いでＰＣＲパラメータ：９４℃で１分、５８℃
で１分、７２℃で７０秒、９４℃で３０秒の順で３２回繰り返し、最終段階では
７２℃で５分反応させＤＮＡを増幅させた。増幅されたＰＣＲ産物（４０７ｂｐ
、アンギオゲニン遺伝子を含むＰＣＲ産物）を１％（ｗ／ｖ）のアガロースゲル
電気泳動にかけて分離し、ゲルから精製した後、ＡｆｌＩＩ制限酵素とｐｓｔＩ
制限酵素で消化した。

【００５８】 上記ＡｆｌＩＩ／ＰｓｔＩ制限酵素で切断されたｈＥＧＦ遺伝子を含むＰＣＲ
産物（２９２９ｂｐ）とＡｆｌＩＩ／ＰｓｔＩ制限酵素で切断されたアンギオゲ
ニン遺伝子を含むＰＣＲ産物（４０７ｂｐ）を混合した後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ
０．５μｌを添加し１６℃で１８時間インキュベートすることにより、これらを
連結し、ｐＴＥ４０８３を作製した。プラスミドｐＴＥ４０８３で大脳菌ＪＭ１
０１を形質転換した。 プラスミドベクターｐＴＥ４０８３にアンギオゲニンと
ｈＥＧＦの融合遺伝子が正しく挿入されたかどうか制限酵素ＡｌｗＮＩ、Ｂｓｐ
ＭＩ、ＡｆｌＩＩ、ＰｓｔＩで切断して確認した。 最終的に、Ｓａｎｇｅｒの
ジデオキシヌクレオチド配列分析法を用い、遺伝子が正しく挿入されたかどうか
確認した。

【００５９】 上記プラスミドｐＴＥ４０８３で形質転換された大腸菌ＪＭ１０１をＥ．ｃｏ
ｌｉ ＪＭ１０１−ｐｌａｓｍｉｄ ｄＴＥ４０８３と命名し、１９９７年９月
４日に、国際寄託機関の韓国種菌協会附設微生物保存センター（ＫＣＣＭ）（１
３４Ｓｈｉｎｃｈｏｎ−Ｄｏｎｇ，Ｓｅｏｄａｅｍｕｎ−ｋｕ，Ｓｅｏｕｌ，Ｋ
ｏｒｅａ）に、ＫＣＣＭ−１０１０６として寄託している。

【００６０】 実施例 ６： アンギオゲニンとｈＥＧＦの融合遺伝子を含む 発現ベクターｐＴＥ４０８４の構築（ＩＶ） アンギオゲニンとｈＥＧＦの融合遺伝子を含む他の発現ベクターｐＴＥ４０８
４は、配列番号１４と配列番号１５の２つのプライマーを用いアンギオゲニン遺
伝子を含むＤＮＡ断片（４１０ｂｐ）を増幅させること以外は、実施例５と同様
の方法により構築された。図７は組換えベクターｐＴＥ４０８４の構築過程を表
した概略図である。さらに、遺伝子の正しい挿入も実施例５と同様の方法により
確認した。

【００６１】 上記プラスミドｐＴＥ４０８４で形質転換された大腸菌ＪＭ１０１をＥ．ｃｏ
ｌｉ ＪＭ１０１−ｐＴＥ４０８４と命名し、１９９７年９月４日に、国際寄託
機関の韓国種菌協会附設微生物保存センター（ＫＣＣＭ）（住所は上記と同じ）
に、ＫＣＣＭ−１０１０７として寄託している。

【００６２】 実施例 ７： アンギオゲニンとｈＥＧＦの融合遺伝子を含む 発現ベクターｐＴＥ４０８９の構築（Ｖ） プラスミドｐＴＥ４０８３を制限酵素ＮｓｉＩとＢｓｔＥＩＩ切断して得たｈ
ＥＧＦ遺伝子およびアンギオゲニン遺伝子の一部を含む第一のＤＮＡ断片（３０
０１ｂｐ）と、鋳型としての前記プラスミドｐＴＥ４０８３を配列番号２５と配
列番号２６の一対のプライマーでＰＣＲ増幅して得たｈＥＧＦ遺伝子の一部を含
む第二のＮｓｉＩ／ＢａｍＨＩ ＤＮＡ断片と、また鋳型としてのプラスミドｐ
ＴＥ４０８３を配列番号２７と配列番号１４の一対のプライマーでＰＣＲを増幅
して得たアンギオゲニン遺伝子の一部を含む第三のＢａｍＨＩ／ＢｓｔＥＩＩＤ
ＮＡ断片とを連結融合し、ｈＥＧＦとアンギオゲニンの融合遺伝子を含む発現ベ
クターｐＴＥ４０８９を調製した。図８は組換えベクターｐＴＥ４０８９の構築
過程を表した概略図である。

【００６３】 より具体的に説明すると、ｈＥＧＦおよびアンギオゲニン遺伝子を含むプラス
ミドｐＴＥ４０８３を制限酵素ＮｓｉＩとＢｓｔＥＩＩ切断し、０．８％（ｗ／
ｖ）アガロースゲル電気泳動にかけてｈＥＧＦおよびアンギオゲニン遺伝子の一
部を含む３００１ｂｐのＤＮＡ断片を分離した。

【００６４】 一方、ＮｄｅＩ制限酵素部位を含む配列番号２５のプライマーとＢａｍＨＩ制
限酵素部位を含む配列番号２６のプライマーを一対に用い、前記プラスミドｐＴ
Ｅ４０８３を鋳型にしてＰＣＲ増幅し、ｈＥＧＦ遺伝子の一部を含むＤＮＡ断片
を取得した。 この際、ＰＣＲはｐＴＥ４０８３ １００ｎｇ（１μｌ）、各プ
ライマー１００ピコモルずつ、ｄＮＴＰ各２ｍＭ、Ｍｇ２＋を含む反応溶液、Ｐ
ＦＵ（ポリメラーゼ）１ユニットを入れ、最終容量を１００μｌに変性した。
次いで混合物を９４℃で１分予め加熱した後、９４℃で３０秒変性、５８℃で１
分アニーリング、７２℃で２分重合の順で３５回繰り返し、最終段階では７２℃
で５分ＤＮＡを増幅した。

【００６５】 かつ、ＢａｍＨＩ制限酵素部位を含む配列番号２７のプライマーとＰｓｔＩ制
限酵素部位を含む配列番号１４の別のプライマーを一対に用い、上記と同様の方
法でＰＣＲを行うことにより、アンギオゲニン遺伝子の一部を含むＤＮＡ断片を
取得した。上記増幅されたＰＣＲ産物のｈＥＧＦ断片（１７１ｂｐ）およびアン
ギオゲニン断片（４００ｂｐ）を１％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動にかけ
て分離、精製した後、ＢａｍＨＩ制限酵素で消化した。

【００６６】 ｈＥＧＦ断片はＮｓｉＩ制限酵素で、アンギオゲニン断片はＢｓｔＥＩＩ制限
酵素で切断して再び分離、精製した。

【００６７】 上記ｈＥＧＦおよびアンギオゲニン遺伝子を含む３００１ｂｐのＤＮＡ断片、
ＰＣＲ産物の断片（１０８ｂｐ）およびアンギオゲニン断片（２３６ｂｐ）をＴ
４ＤＮＡリガーゼ０．５μｌ中に混合した後、１６℃で１８時間インキュベート
することにより、ｐＴＥ４０８９を作製し、ｐＴＥ４０８９で大腸菌ＪＭ１０１
を形質転換した。プラスミドベクターｐＴＥ４０８９にアンギオゲニンとｈＥＧ
Ｆの融合遺伝子が正しく挿入されたかどうか制限酵素Ａ１ｗＮＩ、ＢｓｐＭＩ、
ＢａｍＨＩ、ＡｆｌＩＩ、ＰｓｔＩで切断し、１％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電
気泳動にかけて確認した。最終的に、Ｓａｎｇｅｒのジデオキシヌクレオチド配
列分析法を用い、アンギオゲニンとｈＥＧＦの融合遺伝子が正しく挿入されたか
どうか確認した（配列番号２３参照）。

【００６８】 実施例 ８： アンギオゲニンとｈＥＧＦの融合遺伝子を含む 発現ベクターｐＴＥ４０８１０の構築（ＶＩ） アンギオゲニンとｈＥＧＦの融合遺伝子を含む他の発現ベクターｐＴＥ４０８
１０は、配列番号２８の別のプライマーを用いて４１５ｂｐのＤＮＡ断片を増幅
させ、それをＢａｍＨＩ／ＢｓｔＥＩＩ制限酵素で切断して２５１ｂｐのＤＮＡ
断片を得てＤＮＡ連結反応に用いたこと以外は、実施例７と同様の方法により構
築された。図９は組換えベクターｐＴＥ４０８１０の構築過程を表した概略図で
ある。さらに、融合遺伝子の正しい挿入も実施例７と同様の方法により確認した
（配列番号２４参照）。

【００６９】 実施例 ９： アンギオゲニンｈＥＧＦ−アンギオゲニンの融合遺伝子を含む 発現ベクターｐＴＥ４０８１５の構築 アンギオゲニンｈＥＧＦ−アンギオゲニンの融合遺伝子を調製するために、実
施例４のプラスミドｐＴＥ４０８２を制限酵素ＰｓｔＩとＡｆｌＩＩで処理した
後、０．８％（ｗ／ｖ）アガロース電気泳動にかけて３３１３ｂｐのベクター断
片を取得した。一方、実施例７のプラスミドｐＴＥ４０８９を制限酵素ＡｆｌＩ
ＩとＰｓｔＩで処理した後、１．２％（ｗ／ｖ）アガロース電気泳動にかけてｈ
ＥＧＦ３’末端アミノ酸、リンカーおよびアンギオゲニンを含む融合遺伝子断片
（４１６ｂｐ）を取得した。

【００７０】 上記３３１３ｂｐのベクター断片と、上記融合遺伝子断片（４１６ｂｐ）を混
合した後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ０．５μｌを用いて１６℃で１８時間連結反応す
ることにより、ｐＴＥ４０８１５を生成した。図１０は組換えベクターｐＴＥ４
０８１５の構築過程を表した概略図である。プラスミドｐＴＥ４０８１５で大腸
菌ＪＭ１０１を形質転換した。プラスミドベクターｐＴＥ４０８１５にアンギオ
ゲニンｈＥＧＦ−アンギオゲニンの融合遺伝子が正しく挿入されたかどうか制限
酵素Ａ１ｗＮＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢａｍＨＩ、ＡｆｌＩＩ、ＰｓｔＩで切断して確
認した。最終的に、Ｓａｎｇｅｒのジデオキシヌクレオチド配列分析法を用い、
融合遺伝子が正しく挿入されたかどうか確認した（配列番号２９参照）。

【００７１】 実施例 １０： ｈＥＧＦ−アンギオゲニンｈＥＧＦの融合遺伝子を含む 発現ベクターｐＴＥ４０８１６の構築 ｈＥＧＦ−アンギオゲニンｈＥＧＦの融合遺伝子を調製するために、実施例７
のプラスミドｐＴＥ４０８９を制限酵素ＰｓｔＩとＢｓｔＥＩＩ処理した後、０
．８％（ｗ／ｖ）アガロース電気泳動にかけて３１９５ｂｐのベクター断片を取
得した。一方、実施例４のプラスミドｐＴＥ４０８２を制限酵素ＰｓｔＩとＢｓ
ｔＥＩＩで各々処理した後、１．２％（ｗ／ｖ）アガロース電気泳動にかけてア
ンギオゲニンの３’末端、リンカー、およびｈＥＧＦを含む融合遺伝子断片（３
２４ｂｐ）を取得した。上記３１９５ｂｐのベクター断片と、上記融合遺伝子断
片（３２４ｂｐ）を混合した後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ０．５μｌを添加し１６℃
で１８時間連結反応することにより、ｐＴＥ４０８１６を作製した。図１１は組
換えベクターｐＴＥ４０８１６の構築過程を表した概略図である。プラスミドｐ
ＴＥ４０８１６で大腸菌ＪＭ１０１を形質転換した。プラスミドベクターｐＴＥ
４０８１６にｈＥＧＦ−アンギオゲニンｈＥＧＦの融合遺伝子が正しく挿入され
たかどうか制限酵素Ａ１ｗＮＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢａｍＨＩ、ＡｆｌＩＩ、Ｐｓｔ
Ｉで切断して確認した。 最終的に、Ｓａｎｇｅｒのジデオキシヌクレオチド配
列分析法を用い、融合遺伝子が正しく挿入されたかどうか確認した（配列番号３
０参照）

【００７２】 実施例１１： 大腸菌ＪＭ１０１形質転換体におけるアンギオゲニンｈＥＧＦの 融合タンパク質発現 上記実施例３〜８で調製した発現ベクターｐＴＥ４０８１，ｐＴＥ４０８２、
ｐＴＥ４０８３，ｐＴＥ４０８４、ｐＴＥ４０８９、ｐＴＥ４０８１０で形質転
換された大腸菌ＪＭ１０１を２ｍｌのテトラサイクリン−ＬＢ培地に蒔き３７℃
で１８時間培養した後、該培養液２ｍｌを１００ｍｌのテトラサイクリン−ＬＢ
培地に再び蒔き、３７℃で培養し６００ｎｍでの吸光度が０．７〜１．０に達し
た時、最終濃度が１ｍＭになるまでイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシ
ド（ＩＰＴＧ）を添加することにより融合タンパク質の発現を誘導した。ＩＰＴ
Ｇ（最終濃度／ｍＭ）を添加してさらに２０時間培養した後、４℃、７，０００
ｇで１５分間遠心分離して培養液を回収し、次いで、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、抗−ｈ
ＥＧＦ抗体および抗−アンギオゲニン抗体を用いたウエスタン・ブロッティング
を行った（図１２（Ａ）および図１２（Ｂ）、図１３（Ａ）および図１３（Ｂ）
参照）。

【００７３】 図１２（Ａ）は、ｐＴＥ４０８１、ｐＴＥ４０８２、ｐＴＥ４０８３、または
ｐＴＥ４０８４を含む大腸菌ＪＭ１０１形質転換体の細胞培養液のＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥの結果を示し、図１２（Ｂ）は、抗−ｈＥＧＦ抗体を用い、ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅのウエスタン・ブロッティングの結果を示す。図１２（Ａ）および図１２（Ｂ
）において、レーン１は分子量マーカー、レーン２は発現ベクターｐＴＥ４０８
１で形質転換された大腸菌ＪＭ１０１の培養上澄液、レーン３は発現ベクターｐ
ＴＥ４０８２で形質転換された大腸菌ＪＭ１０１の培養上澄液、レーン４は発現
ベクターｐＴＥ４０８３で形質転換された大腸菌ＪＭ１０１の培養上澄液、レー
ン５は発現ベクターｐＴＥ４０８４で形質転換された大腸菌ＪＭ１０１の培養上
澄液を表す。

【００７４】 図１３（Ａ）は、ｐＴＥ４０８９を含む大腸菌ＪＭ１０１形質転換体の細胞培
養液をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタン・ブロッティングの結果を示し、図１
３（Ｂ）は、ｐＴＥ４０８１０を含む大賜菌ＪＭ１０１形質転換体の細胞培養液
をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタン・ブロッティングの結果を示す。 図１３
（Ａ）において、レーンＭは分子量マーカー、レーンａはＩＰＴＧ誘導後の大腸
菌ＪＭ１０１形質転換体の培養上澄液のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果；レーンｂは抗
−ｈＥＧＦ抗体を用いたウエスタン・ブロッティングの結果；および、レーンｃ
は抗−アンギオゲニン抗体を用いたウエスタン・ブロッティングの結果である。
図１３（Ｂ）において、レーンＭは分子量マーカー、レーンａはＩＰＴＧ誘導前
の大腸菌ＪＭ１０１形質転換体の培養上澄液のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果；レーン
ｂはＩＰＴＧ誘導後の大腸菌ＪＭ１０１形質転換体の培養上澄液のＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥの結果；レーンｃおよびレーンｄは抗−ｈＥＧＦ抗体を用いたウエスタン・
ブロッティングの結果；レーンｅおよびレーンｆは抗−アンギオゲニン抗体を用
いたウエスタン・ブロッティングの結果である。

【００７５】 図１２（Ａ）および図１２（Ｂ）、図１３（Ａ）および図１３（Ｂ）からアン
ギオゲニン（配列番号２）とｈＥＧＦ（配列番号４）の融合タンパク質が大量発
現されることが分かった。したがって、上記結果より実施例９および実施例１０
からそれぞれ調製した発現ベクターｐＴＥ４０８１５およびｐＴＥ４０８１６で
形質転換された大腸菌ＪＭ１０１からも、アンギオゲニンとｈＥＧＦの融合タン
パク質が充分な量で高レベルに発現されることが予想された。

【００７６】 実施例 １２： 融合タンパク質の精製およびアミノ酸配列の決定 実施例１１に記載の発現ベクター（ｐＴＥ４０８１、４０８２、４０８３、４
０８４、４０８９、４０８１０、４０８１５および４０８１６）のうち一つの発
現ベクターで形質転換された大腸菌株をＬＢ培地に蒔き、Ｏ．Ｄ．６００が約１
．０になるまで３７℃で培養した後、１ｍＭ（終濃度）のＩＰＴＧで結合タンパ
ク質の発現を誘導しさらに２０時間培養した。次いで、細菌培養液を遠心分離よ
り回収し、細胞ペレットを取得してリゾチーム、または浸透圧衝撃法で細胞を溶
解した。得られたタンパク質を１４％のＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した後、ウエス
タン・ブロッティングで所望のタンパク質を確認し、転写されたタンパク質バン
ドをＰＶＤＦから切り出し、タンパク質抽出キットでタンパク質を抽出しアミノ
酸配列分析の試料として用いた。すなわち、アミノ酸配列は、電気泳動（ＳＤＳ
−ＰＡＧＥ）したゲルをＰＶＤＦ膜に移し、Ｐｏｎｓｅａｕ Ｓで染めて融合タ
ンパク質を示すバンドをかみそりで切り出し融合タンパク質を抽出した後、アミ
ノ酸自動配列分析を使用し標準操作方法により分析した。

【００７７】 このように分析した融合タンパク質のアミノ酸配列は配列番号１７〜２０、２
１〜２２、３１〜３２に表した。 配列番号１７は発現ベクターｐＴＥ４０８１
で発現された融合タンパク質であるアンギオゲニングリシン−ＥＧＦのアミノ酸
配列であり、配列番号１８は発現ベクターｐＴＥ４０８２で発現された融合タン
パク質であるアンギオゲニン（グリシン）４セリン−ＥＧＦのアミノ酸配列であ
り、配列番号１９は発現ベクターｐＴＥ４０８３で発現された融合タンパク質で
あるＥＧＦ−アンギオゲニンのアミノ酸配列であり、配列番号２０は発現ベクタ
ーｐＴＥ４０８４で発現された融合タンパク質であるＥＧＦ−グリシン−アンギ
オゲニンのアミノ酸配列であり、配列番号２１は発現ベクターｐＴＥ４０８９で
発現された融合タンパク質であるＥＧＦ−（グリシン）_４セリン−アンギオゲニ
ンのアミノ酸配列であり、配列番号２２は発現ベクターｐＴＥ４０８１０で発現
された融合タンパク質であるＥＧＦ−｛（グリシン）_４セリン｝_２−アンギオゲ
ニンのアミノ酸配列であり、配列番号３１は発現ベクターｐＴＥ４０８１５で発
現された融合タンパク質であるアンギオゲニン（グリシン）_４セリン−ＥＧＦ−
（グリシン）_４セリン−アンギオゲニンのアミノ酸配列であり、配列番号３２は
発現ベクターｐＴＥ４０８１６で発現された融合タンパク質であるＥＧＦ−（グ
リシン）_４セリン−アンギオゲニン（グリシン）_４セリン−ＥＧＦのアミノ酸配
列である。

【００７８】 さらに、ＥＧＦ−（グリシン）_４セリン−アンギオゲニンを含む試料はヘパリ
ン−セファロスカラムクロマトグラフィー（ｈｅｐａｒｉｎ−Ｓｅｐｈａｒｏｓ
ｅ ＣＬ−４Ｂ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）を
行い、ヘパリンに結合されたタンパク質を１Ｍ塩化ナトリウムを含むリン酸緩衝
液で溶出し、得られた画分をプールしＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ（Ａ−２５、
Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）カラムクロマトグラ
フィーにかけ、樹脂に結合されたタンパク質を０．４〜０．７Ｍ塩化ナトリウム
を含むリン酸緩衝液で溶出精製した後、受容体結合活性およびｔＲＮａｓｅ活性
を測定した。

【００７９】 実施例 １３： 融合タンパク質の受容体結合活性 細胞表面に高レベルで発現されたＥＧＦ受容体を有しているＡ４３１細胞（Ａ
ＴＣＣ：ＣＲＬ−１５５５）に^１２５Ｉ−標識のＥＧＦと試料を共に添加し、思
料と同位体元素標識ＥＧＦとの間の競合的結合により融合タンパク質の結合活性
を測定した。 すなわち、Ａ４３１細胞を４×１０^４細胞／ｍｌの濃度で２４ウ
エル（ｗｅｌｌ）プレートに蒔いて細胞がコンフルエントになるまで培養した後
、１０％（ｖ／ｖ）ホルムアルデヒドで固定した。 次いで、^１２５Ｉ−標識の
ＥＧＦと試料溶液を各ウエルに２０μｌずつ添加し、競合的に受容体に結合させ
た後、結合しなかったＥＧＦを洗い細胞をウエルから脱着し、細胞に結合した放
射能量をγ−カウンターで測定した。 ｃｐｍの値を％結合活性に変換し、対照
の濃度と％結合活性で示される標準曲線を得た。 該標準曲線に試料の％結合活
性の値を代入し試料の受容体結合活性を決定し、ＥＧＦ自体の結合活性と比較し
た（表１参照）。

【００８０】

【表１】

【００８１】 上記表１から分かるように、本融合タンパク質のｈＥＧＦ受容体結合活性
は９０％以上で、ＥＧＦに比べあまり差がないことが分かった。

【００８２】 実施例 １４： 融合タンパク質のＲＮａｓｅ活性 １２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１２０ｍＭのＮａＣｌ、０．００４％のＢＳＡを含
む酵母ｔ−ＲＮＡの混合液５０μｌに試料５０μｌを入れ攪拌した後、３７℃で
２時間反応インキュベートし、同じ容量の６％の過塩素酸で反応を中断した。次
いで、反応混合物を１０分間遠心分離し、これを用いて２６０ｎｍで吸光度を測
定した。 これに基づき、標準曲線を作成して試料のＲＮａｓｅ活性を測定し、
アンギオゲニン活性と比較した（表２参照）。

【００８３】

【表２】

【００８４】 上記表２から分かるように、本融合タンパク質のＲＮａｓｅ活性は結合リンカ
ーのサイズが長いほど改善された。

【００８５】 実施例 １５： ｉｎ ｖｉｖｏでの癌細胞に対する融合タンパク質の細胞毒性 ｉｎ ｖｉｔｒｏでの融合タンパク質の活性を評価するため、乳癌細胞株のＭ
ＣＦ−７（ＡＴＣＣ ＨＴＢ２２）は１０％のＦＢＳを含むＤＭＥＭで培養した
。培養細胞を１ｍｌ当たり１×１０４の細胞濃度で９６ウエルプレートで１日培
養した後、培地を、試料、対照、および５−フルオロウラシル（比較のため）を
含む無血清培地に交換し２日間培養し、ＭＴＴ（３−（３，４−ｄｉｍｅｔｈｙ
ｌｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ）−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉ
ｕｍｂｒｏｍｉｄｅ）で細胞生存率を測定し、ＩＣ_５０を計算した（表３参照）
。

【００８６】

【表３】

【００８７】 上記表３から分かるように、本融合タンパク質は癌細胞を非常に効果的に殺す
ことが示された。

【００８８】 実施例 １６： 融合タンパク質の細胞毒性 ｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞毒性を評価するため、ｈＥＧＦ受容体を発現しない
細胞株であるＣＨＯ Ｋ−１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ６１）を１０％のＦＢＳを含む
Ｆ−１２培地で培養した。 培養細胞を１ｍｌ当たり１×１０^４の細胞濃度で９
６ウエルプレートで１日培養した後、対照と試料を含む無血清培地に交換しさら
に２日間培養し、ＭＴＴで細胞生存率を測定した（表４参照）。

【００８９】

【表４】

【００９０】 上記表４から分かるように、本融合タンパク質は、ｈＥＧＦ受容体を発現しな
い細胞に対し毒性を示さなかった。

【００９１】 実施例 １７： ｉｎ ｖｉｖｏでの毒性融合タンパク質の抗癌効果 ｉｎ ｖｉｖｏでの融合タンパク質の抗癌活性を評価するため、免疫不全マウ
ス（体重２０〜２５ｇ）の腹部皮下にＡ４３１培養細胞を２×１０^７個（０．２
ｍｌ）移植した。 適当なサイズの腫瘍塊が形成されると、無菌操作下マウスよ
り腫瘍を摘出し２〜３ｍｍ片に切った後、套管針（ｔｒｏｃａ）を用い皮下に移
植した。 該腫瘍を移植したヌードマウスにおいて腫瘍塊の大きさが約８０ｍｌ
に達すると静脈内注射用にマウスを５群（１群当たり６匹）に分け、融合タンパ
ク質とアンギオゲニン１００μｇ／ｋｇ体重ずつ３日間隔で４週間静脈内投与し
た。最終投与後、腫瘍表面の面積をバーニヤカリパスで測定し、４週後最終的に
癌細胞を切り出し腫瘍塊の重量を測定した（表５参照）。 図１４（Ａ）はＰＢ
Ｓ（リン酸緩衝塩水）を投与したマウスの腫瘍塊のサイズを示す写真であり、図
１４（Ｂ）はｈＥＧＦ−（グリシン）_４セリン−アンギオゲニン投与群の腫瘍塊
のサイズを示す写真である。

【００９２】

【表５】

【００９３】 上記表５から分かるように、本融合タンパク質を投与されたマウス群において
の腫瘍塊の成長は、アンギオゲニンのみを投与されたマウス群に比べ著しく抑制
されることが分かった。 さらに、実験期間中、副作用による症状や死亡例は観
察されなかったし、腫瘍塊の成長抑制作用が肉眼でも観察された。

【００９４】 急性毒性検査 本発明の融合タンパク質の低い毒素を確認するため、次のような方法で急性毒
性検査を行った：上記実施例から調製された融合タンパク質（ＥＧＦ−（グリシ
ン）_４セリン−アンギオゲニン）を雄性のマウス（ＩＣＲマウス、体重は２０〜
２５ｇ、１群当たり５匹のマウス）に０．１〜１００ｍｇ／ｋｇの投与量で腹部
に注射した。次いで、該マウスをケージに入れ一般的な症状を観察しながらたに
すぎなかったため中央致死量（ＬＤ_５０：ｍｇ／ｋｇ）を決定することができな
かった。その結果、本発明の融合タンパク質のＬＤ_５０は１００ｍｇ／ｋｇより
想到高いことから、本発明の融合タンパク質は非常に低い毒性を有することが明
らかになった。

【００９５】 以上詳細に説明し、立証した通り、本発明の融合タンパク質は、第１に各構成
タンパク質は全てヒト由来のタンパク質で抗体を形成しないため免疫毒性の問題
がなく、第２に各構成タンパク質自体のみでは癌細胞に対する活性がほとんどな
い反面、これらの融合タンパク質は分子量が小さいながら癌細胞にのみＩＣ_５０
において１０００倍の差で選択的に作用し癌細胞のみを殺せるため、従来の抗癌
剤としての融合タンパク質に比べて優れている。したがって、本発明の融合タン
パク質は、高レベルでｈＥＧＦ受容体を発現する腫瘍の治療に実際に使用可能で
ある。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 発現ベクターｐＴＥ１０５のプラスミド地図である。

【図２】組換えベクターｐＲＳａｎｇの構築過程を描写する概略図である。

【図３】組換えベクターｐＴＥａｎｇの構築過程を描写する概略図である。

【図４】アンギオゲニングリシン−ｈＥＧＦの融合タンパク質を発現する組
換えベクターｐＴＥ４０８１の構築過程を描写する概略図である。

【図５】アンギオゲニン（グリシン）_４セリン−ｈＥＧＦの融合タンパク質
を発現する組換えベクターｐＴＥ４０８２の構築過程を描写する概略図である。

【図６】ｈＥＧＦ−アンギオゲニンの融合タンパク質を発現する組換えベク
ターｐＴＥ４０８３の構築過程を描写する概略図である。

【図７】ｈＥＧＦ−グリシン−アンギオゲニンの融合タンパク質を発現する
組換えベクターｐＴＥ４０８４の構築過程を描写する概略図である。

【図８】ｈＥＧＦ−（グリシン）_４セリン−アンギオゲニンの融合タンパク
質を発現する組換えベクターｐＴＥ４０８９の構築過程を描写する概略図である
。

【図９】ｈＥＧＦ−｛（グリシン）_４セリン｝_２−アンギオゲニンの融合タ
ンパク質を発現する組換えベクターｐＴＥ４０８１０の構築過程を描写する概略
図である。

【図１０】アンギオゲニン（グリシン）_４セリン−ｈＥＧＦ−（グリシン）
_４セリン−アンギオゲニンの融合タンパク質を発現する組換えベクターｐＴＥ４
０８１５の構築過程を描写する概略図である。

【図１１】ｈＥＧＦ−（グリシン）_４セリン−アンギオゲニン（グリシン）
_４セリン−ｈＥＧＦの融合タンパク質を発現する組換えベクターｐＴＥ４０８１
６の構築過程を描写する概略図である。

【図１２】（Ａ）は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した大腸菌ＪＭ１０１形質転
換体の細菌培養株の電気泳動写真である。（Ｂ）は、（Ａ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ
をウエスタン・ブロッティング分析した電気泳動写真である。

【図１３】（Ａ）は、組換えベクターｐＴＥ４０８９で形質転換した大腸菌
ＪＭ１０１の細菌培養株をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタン・ブロッティング
分析した電気泳動写真である。（Ｂ）は、組換えベクターｐＴＥ４０８１０で形
質転換した大腸菌ＪＭ１０１の細菌培養株をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタン
・ブロッティング分析した電気泳動写真である。

【図１４】（Ａ）は、対照のマウスにおいての腫瘍サイズを示す写真である。（
Ｂ）は、ｈＥＧＦ−（グリシン）_４セリン−アンギオゲニン投与マウスにおいて
の腫瘍サイズを示す写真である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 19/00 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，Ｕ Ｓ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 パーク，セウン−クック 大韓民国 462−120 キュンギ−ドウ，サ ンナム，ジョーンウォン−ク，サンダエウ ォン−ドン サン19−４，サンホ アパー トメント 409 (72)発明者 ヨーン，ジョン−ミュン 大韓民国 462−150 キュンギ−ドウ，サ ンナム，ジョーンウォン−ク，エウンハエ ン−ドン，ヒュンダエ アパートメント 106−1506 (72)発明者 ハン，セウン−ヒー 大韓民国 462−152 キュンギ−ドウ，サ ンナム，ジョーンウォン−ク，エウンハエ ン ２−ドン，ヒュンダエ ジュコン ア パートメント 203−410 (72)発明者 ウォン，オー−ビュン 大韓民国 462−121 キュンギ−ドウ，サ ンナム，ジョーンウォン−ク，サンダエウ ォン １−ドン，1573 (72)発明者 キム，セウン−ホー 大韓民国 138−169 ソウル，ソンパ− ク，カラック ボン−ドン，ウーサン ア パートメント ８−901 (72)発明者 キム，ヤン−マン 大韓民国 462−152 キュンギ−ドウ，サ ンナム，ジョーンウォン−ク，エウンハエ ン ２−ドン，エウンハエン ジュコン アパートメント 123−302 (72)発明者 クー，タイ−ヤン 大韓民国 440−320 キュンギ−ドウ，ス ウォン，ジャンガン−ク，ユルゲオン−ド ン，276−８ (72)発明者 リー，ビョン−ワン 大韓民国 463−500 キュンギ−ドウ，サ ンナム，バンダン−ク，クミ−ドン，ハヤ ンマエウル 502−1003 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA21 BA80 CA04 DA06 EA04 GA11 GA19 HA01 HA12 4B064 AG02 CA02 CA19 CC24 DA05 4B065 AA26X AA93Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA44 4C084 AA02 AA03 AA07 BA01 BA22 CA53 DB53 NA14 ZB262 4H045 AA10 AA20 AA30 BA10 BA41 CA40 DA20 EA28 FA74

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ヒト上皮増殖因子と、ヒトアンギオゲニンと０〜２０個のアミ
   ノ酸からなるリンカーとからなる融合タンパク質。
2. 【請求項２】ヒト上皮増殖因子のＣ末端にヒトアンギオゲニンのＮ末端が結
   合されていることを特徴とする請求項１記載の融合タンパク質。
3. 【請求項３】ヒト上皮増殖因子とヒトアンギオゲニンが分子比１：０．５〜
   ２で融合されていることを特徴とする請求項１記載の融合タンパク質。
4. 【請求項４】リンカーがグリシン、（グリシン）_４セリンおよび｛（グリシ
   ン）_４セリン｝_２からなる群より選択されることを特徴とする請求項１記載の融
   合タンパク質。
5. 【請求項５】融合タンパク質のアミノ酸配列が配列番号１７、配列番号１８
   、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号３１お
   よび配列番号３２からなる群より選択されることを特徴とする請求項１記載の融
   合タンパク質。
6. 【請求項６】請求項１〜５のいずれか１項に記載の融合タンパク質の１つを
   コードする遺伝子。
7. 【請求項７】前記遺伝子のヌクレオチド配列が配列番号２３、配列番号２４
   、配列番号２９および配列番号３０からなる群より選択されることを特徴とする
   請求項６記載の遺伝子。
8. 【請求項８】請求項６記載の遺伝子を含む発現ベクター。
9. 【請求項９】ｐＴＥ４０８１、ｐＴＥ４０８２、ｐＴＥ４０８３、ｐＴＥ４
   ０８４、ｐＴＥ４０８９、ｐＴＥ４０８１０、ｐＴＥ４０８１５およびｐＴＥ４
   ０８１６からなる群より選択されることを特徴とする請求項８記載の発現ベクタ
   ー。
10. 【請求項１０】請求項８記載の発現ベクターで形質転換された微生物。
11. 【請求項１１】Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０１−ｐｌａｓｍｉｄ ｐＴＥ４０８
    ３（ＫＣＣＭ−１０１０６）。
12. 【請求項１２】Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０１−ｐｌａｓｍｉｄ ｐＴＥ４０８
    ４（ＫＣＣＭ−１０１０７）。
13. 【請求項１３】請求項１０記載の微生物から融合タンパク質の発現を誘導し
    、組換え融合タンパク質を取得する工程を含む、融合タンパク質の製造方法。
14. 【請求項１４】請求項１３記載の方法により製造された融合タンパク質。
15. 【請求項１５】有効成分としての請求項１〜５のいずれか１項または請求項
    １４に記載の融合タンパク質と、薬学的に許容される担体とを含む抗癌剤。