CN1462176A - 通过扰乱Ran/Ran－粘合蛋白介导的细胞过程而产生高产量,超多产转基因植物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及由扰乱Ran/Ran－粘合蛋白介导的细胞过程而产生高产量，超多产转基因植物的方法。特别是，本发明涉及一种通过过量表达有义或反义Ran或不同Ran－粘合蛋白以修饰涉及这些蛋白的生物过程而产生转基因植物的方法。这些基因技术提供了发展具有经济价值超高产的农作物的途径，其生物量和产量比现在可以获得的野生型的提高1.5－2.5倍。这些大小或长度的增加可以在许多转基因植物的器官包括叶，茎，花，根和种子中看到。

Description

通过扰乱Ran/Ran-粘合蛋白介导的细胞过程 而产生高产量，超多产转基因植物的方法

技术领域

本发明描述了一种通过扰乱Ran/Ran粘合蛋白介导的细胞过程而产生高产量的超多产的转基因植物的方法。尤其是，本发明涉及到一种通过过量表达有义(sense)或反义(antisense，anti-)Ran或各种Ran-粘合蛋白以修饰涉及这些蛋白的生物过程而产生转基因植物的方法。这些基因技术提供了发展具有经济价值的转基因植物的途径，转基因植物出产的超多产农作物源于它们的大小或长度的增加，正如所见的转基因植物的器官包括叶、茎、花、根和种子那样。

背景技术

Ran(Ras-相关的核)是在核中的一种唯一特优种定位的少量GTP-粘合蛋白。它在同族的Ran-粘合蛋白(RanBPs)的帮助下，在调节蛋白的核转运和细胞循环过程中扮演着重要的角色。

通过相互作用(粘合)的蛋白来完成Ran的GTP-或GDP-界态的调整，如RCC1(一种Ran核的鸟嘌呤核苷交换因子)，Ran-GTP酶-活性蛋白(RanGAP)，Ran-粘合蛋白1(RanBP1，一种RanGAP的辅因子)，以及Mogl(一种鸟嘌呤核苷释放因子)(Kahana，J.A.，and Cleveland，D.W.，(1999)J.Cell Biol.146，1205-1210)。RCC1是一种鸟嘌呤核苷的交换因子(GEF)，它将Ran-界的GDP与GTP交换，Ran-GAP是一种Ran-GTP酶活性蛋白，它可以催化Ran的GTP酶的活性，RanBP1是一种辅因子，它通过稳定Ran-GTP状态辅助Ran-GAP的活性(Hopper，A.K.Traglia，H.M.，and Dunst，R.W.(1990)J.Cell Biol，111，309-321；Koepp，D.M.，and Silver，P.A.(1996)Cell87，1-4)。这样RanBPs导致了在细胞分裂的初期在细胞质和核质中Ran-GTP和Ran-GDP分配不平衡。特别是，Ran-GTP大量地形成于核孔复合物的核质边上并且Ran-GDP主要形成于复合物的细胞质边上(Kahana，J.A.，andCleveland，D.W.(1999)J.Cell Biol.146，1205 1210)。

有丝分裂的细胞复制，增加了2倍染色体的数量，均匀地传递它们到子细胞。有丝分裂的过程由前期、中期，后期和末期组成。Ran/RanBP信号的转导路径与RanBP1，RanBPM，RCC1和RanGAP等等相一致，并且最近显示在如使用动物细胞和酵母作为生物模型的实验过程中扮演临界角色。RCC1维持在核中的Ran-GTP于高水平，同时RanBP1或RanGAP在相同的核中增加Ran-GDP水平。RanBPM以Ran-GTP依赖的方式促进了染色体微管纺锤体的形成(Wilde，A.，and Zheng，Y.(1999)Science 284，1359-1362)。这些纺锤体移动染色体到相反的一极，从而促进了细胞周期的前进和分裂(Nakamura，M.，Masuda，H.，Horri，J.，Kuma，K.I.，Yokoyama，N.，Ohba，T.，Nishitani，H.，Miyata，T.，Tanaka，M.，and Nishimoto，T.(1998)J.Cell.Biol.143，1041-1052)。

在酵母中RanBP1对有丝分裂的影响在各种研究中已经被报道了(Battistoni，A.，Guar guaglini，G.，Degrassi，F.，Pittoggi，C.，Palena，A.，Matteo，G.D.，Pisano，C.，Cundari，E.，and Lavia，P.C.(1 997)J.Cell Sci.110，2345-2357；He，X.，Hayashi，N.，Walcott，N.G.，Azuma，Y.，Patterson，T.E.，Bischoff，F.R.，Nishimoto，T.，and Sazer，S.(1998)Genetics 148，645-656；Kalab，P.，Pu，R.T.，and Dasso M.(1999)Curr.Biol.9，481-484)。据报道在酵母中AtRanBP1c的过量表达抑制了正常隔膜的形成(Xia et al.，1996，Paint J.10(4)：761-769)；细胞核被浓缩并且肌动蛋白的排列变得不规则。

另外，Ouspenski报道了一种RanBP1的突变型(yrb1-21)造成了常规排列的缺损和有丝分裂纺锤体的形成，这样抑制了正常的有丝分裂的进行。(Ouspenski，1.1.(1998)Exp.Cell Res.244，171-183)。

还说明了植物的Ran具有和当Ran在酵母中过量表达时酵母的相似的功能。这暗示了在植物中的Ran/RanBP途径的生物功能可能与酵母或哺乳动物细胞的相类似。Ach和Gruissem说明了番茄的Ran蛋白在功能上与酵母Ran-类蛋白相类似(Ach，R.A.and Gruissem，W.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91，5863-5867).

另外，拟南芥菜中Ran1、Ran2和Ran3的序列和它们的粘合蛋白，AtRanBP1a和AtRanBP1b最近被确定。它们的表达模式和生化特性也被报道了(Haizel，T.，Merkle，T.，Pay，A.，Fejes，E.，and Nagy，F.(1997)Plant J.11(1)，93-103)。然而，直到现在在植物中这些蛋白的功能从没有被深入地研究过。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种通过分子遗传技术展示了较高特性的，也就是具有高产和超多产能力的产生转基因植物的方法。

本发明的另一个目的是提供通过上述方法可以被转化到农作物的重组载体。

本发明的另一个目的是提供通过上述方法可以被转化到农作物的基因。

为了实现上述目的，本发明提供了Ran的碱基序列，如SEQ.ID.No.1所示。

另外，本发明也提供了AtRanBP1b的碱基序列，如SEQ.ID.No.2所示。

另外，本发明也提供了AtRanBP1c的碱基序列，如SEQ.ID.No.3所示。

另外，本发明也提供了反义AtRanBP1b的碱基序列，如SEQ.ID.No.4所示，其抑制了内源的AtRanBP1b基因的表达。

另外，本发明也提供了反义AtRanBP1c的碱基序列，如SEQ.ID.No.5所示，其抑制了内源的AtRanBP1c基因的表达

本发明也提供了一种具有如SEQ.ID.No.4所示的反义AtRanBP1b的碱基序列或一部分反义AtRanBP1b的碱基序列的重组载体。

本发明也提供了一种具有如SEQ.ID.No.5所示的反义AtRanBP1c的碱基序列或一部分反义AtRanBP1c的碱基序列的重组载体。

本发明也提供了一种重组载体，其所具有的基因从包括Ran，AtRanBP1a，AtRanBP1b，AtRanBP1c，RanGAP，RanBPM，RCG1和RanBP1在内的Ran和Ran-粘合蛋白所组成的组中选择。

本发明也提供了一种在Ran-介导的细胞过程中与具有基因的有义(sense)或反义(antisense)碱基序列的重组载体转化的转基因植物。

本发明也提供了一种产生转基因植物的方法，与在Ran-介导的细胞过程中包含基因的有义或反义碱基序列的重组载体转化，或通过T-DNA或转座子导入到基因中。

附图说明

图1显示为pLBJ21/PsRan载体结构的示意图。

图2显示为pLBJ21/AtRanBP1b载体结构的示意图。

图3显示为pLBJ21/AtRanBP1c载体结构的示意图。

图4显示为pLBJ21/反义(antisense，anti-)AtRanBP1b载体结构的示意图。

图5显示为pLBJ21/反义AtRanBP1c载体结构的示意图。

图6显示为转基因拟南芥菜(pLBJ21/PsRan)基因组DNA(southern)印迹分析图。

图7显示为转基因拟南芥菜(pLBJ21/反义AtRanBP1c)基因组DNA印迹分析图。

图8显示为转基因拟南芥菜(pLBJ21/PsRan)RNA(northern)印迹分析图。

图9显示为转基因拟南芥菜(pLBJ21/反义AtRanBP1c)RNA印迹分析图。

图10显示为本发明的转基因拟南芥菜(pLBJ21/PsRan)的根部长度与野生型植物的根部长度的比较图。

图11显示为本发明的转基因拟南芥菜(pLBJ21/反义AtRanBP1c)的根部长度与野生型植物的根部长度的比较图。

图12显示为本发明的转基因拟南芥菜(pLBJ21/反义AtRanBP1b)的种子大小与野生型植物的种子大小的比较图。

图13显示为本发明的转基因拟南芥菜(pLBJ21/反义AtRanBP1b)的花的大小与野生型植物的花的大小的比较图。

图14显示为本发明的转基因拟南芥菜(pLBJ21/反义AtRanBP1b)的叶的大小与野生型植物的叶的大小的比较图。

图15显示为本发明的转基因植物pLBJ21/反义AtRanBP1b的成年植物的大小与野生型植物成年植物大小的比较图。

图16显示为本发明的转基因番茄(pLBJ21/AtRanBP1b)的成年植物的大小与野生型植物的成年植物大小比较图。

图17显示为本发明的转基因番茄(pLBJ21/AtRanBP1b)的叶的大小与野生型植物的叶的大小的比较图。

图18显示为本发明的转基因番茄(pLBJ21/AtRanBP1b)的枝的大小与野生型植物的枝的大小的比较图。

图19显示为本发明的转基因番茄(pLBJ21/AtRanBP1b)未成熟的果实大小与野生型植物的未成熟的果实大小的比较图。

具体实施方式

本发明将被更详细地说明。

植物中Ran或Ran-BP的结构至今从没有被研究过。本发明人揭示出植物的Ran和AtRanBP1c在生长素-诱导的细胞循环过程的调节中是至关重要的。本发明人揭示了转基因植物在Ran或AtRanBP1c水平改变，从而根部细胞的有丝分裂对生长素的敏感得以增加。该修饰的结果是转基因植物具有长根。本发明还揭示了AtRanBP1b是一种减数分裂和有丝分裂过程中重要的调整者，并透露了AtRanBP1b在植物细胞分裂的从中期到间期控制细胞的周期过程。通过本发明已经生产了在AtRanBP1b的水平改变的转基因植物，并且这些植物已经表现出支撑一种大的植物显型和产生显著的高产量的产品。该大植物显型在其后的文件中被定义。

本发明确定了通过过量表达或抑制属于Ran-介导的细胞过程中的一组蛋白的有义或反义序列，产生超多产转基因植物、高产量农作物的方法。

属于Ran-介导的细胞过程的蛋白和本发明的靶子是Ran(Haizel et al.，1997，Plant J11(1)193-103)和Ran粘合蛋白。所希望的是：Ran粘合蛋白从由AtRanBPla(Haizel et al.，1997，Plant J11(1)：93-103)，AtRanBP1b(Haizelet al.，1997，Plant J11(1)：93-103)，AtRanBP1c(AT5 in Xia et al.，1996，Plant J.10(4)：761-769)，RanGAP(Merril et al.，1999 Science，283：1742-1745)，RanBPM(Nakamura et al.，1998，J.Cell.Biol.，143(4)：1041-1052)，RCCl(Fruno et al.，1991，Genomic，11(2)：459-461)，和RanBP1(Ouspenski et al.，1995，J.Biol.Chem..，270(5)：1975-1978)组成的蛋白组中优选。AtRanBP1a，AtRanBP1b和AtRanBP1c是发现于拟南芥菜中的Ran-粘合蛋白，RanGAP，RanBPM，RCC1和RanBP1是发现于动物或酵母等中的Ran-粘合蛋白。Ran蛋白的氨基酸序列在生物体中被完好保存；在植物中90％或更多是相互一致的，70％或更多与酵母(Merkle et al.，1994，Plant J.6(4)：555-565)的氨基酸序列相互一致。植物中AtRanBP1的DNA序列80％或更多是相互一致的，对于其他生物体则60％或更多是相同的(Haizel et al.，1997，Plant J.11(1)：93-103)。在另一方面，CST20的氨基酸序列，酵母的RanBP1，大约有50％与老鼠的RanBP1的是相同的(Ouspenski et al.，1995，JBC 270(5)：1975-1978)。老鼠的RanBPM的氨基酸序列和人的几乎是相同的，并且大约有30％和酵母的是相同的(Nakamura et al.，1998，J.Cell.Biol.，143(4)：1041-149)。Drosophilae的RanGAP的氨基酸序列有34％到36％和酵母中的以及老鼠的RanGAP的氨基酸序列是相同的(Merril et al.，1999，Science，12：283-287)。这样，Ran可以说是一种70％或更多氨基酸序列相同的同族蛋白，AtRanBP1b或AtRanBP1c可以说是一种氨基酸序列的相同率为50％或更多的同族蛋白。因此，其他RanBPs如RanGAP，RCC1，和RanBPM是氨基酸序列相同率为35％或更多的一组蛋白。

许多Ran-粘合蛋白具有一段氨基酸序列称作Ran-粘合域(RanBD)，Ran蛋白粘合到其上(Beddow et al.，1995，PNAS，92：3328-3332)。该Ran-粘合域通过粘合到Ran蛋白帮助GTP的水解(Novoa et al.，1999，Mol.Biol.Cell.，10：2175-2190)。

因此，在Ran-介导细胞过程的有关的一组蛋白由含有Ran-粘合域的一组蛋白组成。

另外，本发明提供了通过过量表达、抑制或剔除这些基因采用修饰的Ran或Ran-粘合蛋白(RanBP)水平而产生转基因植物的方法。这些转基因植物可以通过过量表达Ran或RanBP，通过利用互补反义RNA的表达抑制内源基因，或使用各种植物启动子，利用相关双链RNA(RNA干涉)的表达抑制内源基因而产生。这些植物也可以通过使用UV-处理、EMS-处理、或转座子来剔除基因而产生。其反义方法是一种通过在生物体中表达互补链(反义)到靶基团使靶基因的mRNA和反义mRNA之间产生结合而抑制靶基因的mRNA的翻译的方法，从而导致靶基因的mRNA不能被翻译成蛋白。

番茄和拟南芥菜通常在植物的分子生物学领域内用作模型植物。在本发明中，转基因番茄或拟南芥菜是通过转化重组载体过量表达或抑制Ran或Ran-粘合蛋白而产生的。这些重组载体包括任何可以表达Ran或Ran-粘合蛋白的有义或反义序列、或在同时可以表达蛋白基因的有义和反义序列的基因表达的启动子。

为产生如上所述的转基因植物，如SEQ.ID.NO.1所示并且是一种豌豆的Ran蛋白的PsRan，从黄化豌豆幼芽库中克隆并且被插入到载体pLBJ21中以构造重组载体pLBJ21/PsRan.。这个载体被保藏在韩国典型生物保藏中心，保藏号为KCTC0837BP。载体pBJ21是一种pKYLX71衍生质粒，该衍生质粒上在pKYLX71的表达盒的多克隆区域的HindIII识别位点变为EcoRI识别位点(Schardl，C.L.，Byrd，A.D.，Benzion，G.，Altschuler M.A.，Hilderbrand，D.F.，and Hunt，A.G.(1987)Gene 61，1-11，1987；Lloyd，A.M.N Walbot，V.，and Davis，R.W.(1992)Science 258，1773-1775)。在本发明中其为二元载体，并在本发明中被用作转化载体。

另外，AtRanBP1b(如SEQ.ID.NO.2所示)和AtRanBP1c(如SEQ.ID.NO.3所示)被插入到载体pLBJ21中，并被保藏在韩国典型生物保藏中心，保藏号分别为pLBJ21/AtRanBP1b KCTC 0838BP和pLBJ21/AtRanBP1c KCTC0839BP。

三种重组载体pLBJ21/PsRan，pLBJ21/AtRanBP1b和pLBJ21/AtRanBP1c被转化到拟南芥菜中。选择转基因株系以特征化转基因显型。转基因pLBJ21/PsRan(KCTC 0837BP)拟南芥菜表现为长根和大的植株显型。与pLBJ21/AtRanBP1b(KCTC 0838BP)转化的转基因拟南芥菜表现为大的植株显型。与pLBJ21/AtRanBP1c(KCTC 0839BP)转化的转基因拟南芥菜表现为长根，种子重量增加和大的植株显型。

另外，为了产生抑制属于Ran-介导的细胞过程中的基因的转基因植物，反义碱基序列到AtRanBP1b和AtRanBP1c被分别设计。使用标准序列表的软件程序，反义AtRanBP1b碱基序列在SEQ.ID.NO.4中描述和反义AtRanBP1c碱基序列在SEQ.ID.NO.5中描述。Ran-介导的细胞过程被抑制的转基因植物，能够采用具有SEQ.ID.NO.4或SEQ.ID.NO.5的完整反义序列或部分碱基序列的重组载体而产生。应用的核苷序列在长度上为50对碱基对(bp)或更多。在转基因植物中同时表达基因的有义和反义碱基序列、抑制属于Ran-介导的细胞过程中的内源基因这一情况下，序列优选在长度上为26bp或更多(Parrish et al.，2000 Molecular Cell 6：1077-1087；Chuang et al.，Proc.Natl.Acad.Sci，USA 97：4985-4990)。

在本发明中，将反义AtRanBP1b或AtranBP1c插入到pLBJ21载体以构建两种重组载体。构建的重组载体pLBJ21/反义AtRanBP1b的保藏号为KCTC 0850BP，重组载体pLBJ21/反义AtRanBP1c的保藏号为KCTC0851BP。

两种重组载体pLBJ21/反义AtRanBP1b和pBLJ21/反义AtRanBP1c被转化到拟南芥菜中，并观察转化体的显型。其结果为，由重组载体pLBJ21/反义AtRanBP1b(KCTC 0850BP)转化的转基因拟南芥菜表现为大的植物显型；实际上，所有植物体的尺寸都增加。例如，叶的面积，茎的厚度，种子的体积和重量，植株的高度，花的尺寸，毛状体的长度，和每个种子的重量都有明显的增加。重组载体PLBJ21/反义AtRanBP1c(KCTC 0851BP)转化的转基因拟南芥菜表现为长主根显型，并具有如上所述同样的大植株。

对在pLBJ21/反义AtRanBP1c转化的拟南芥菜植株中的生长素进行敏感测试。生长素是一种植物激素促进了花粉的萌生，花粉管的延伸，侧根和花蓓蕾的形成，萌芽或来自愈合组织的根的产生，以及分裂细胞的分裂和生长。在本发明中，检测影响细胞分裂和生长的对生长素敏感是否在转化的植株中发生了变化。通常，当侧根的生长受到抑制时，在根中的低浓度(10^-6-10^-7M)生长素可以促进根细胞分裂和并发根的生长，然而高浓度的(10^-6-10^-5M)的生长素的作用则相反。

本发明的pBLJ21/反义AtRanBP1c转化的转基因拟南芥菜表现为对生长素的超敏感；甚至低浓度的生长素如从外部提供的pM也抑制根的生长，促进侧根开始分化。与野生型植株形成对照，对相同浓度的生长素没有反应。野生型的植株中，10^-7M的生长素促进了侧根的分化。由于本发明的转基因植物增加了生长素敏感性，因此，通常不能促进野生型根生长的非常低浓度的内源生长素，实际上促进了通过本发明遗传修饰的植物根的生长。

另外，本发明产生了pBLJ21/反义AtRanBP1b(KCTC0850BP)，pBLJ21/反义AtRanBP1c(KCTC 0851BP)，pBLJ21/PSRan(KCTC 0837BP)，pBLJ21/AtRanBP1b(KCTC0838BP)，或pLBJ21/AtRanBP1c(KCTC0839BP)转化的番茄。

Ran-介导的细胞过程被修饰的转基因植物表现出长根、大尺寸的种子和大个体的显型。因此，通过如上所述生产在本发明的Ran-介导的细胞过程中被修饰的转基因植物的方法能发展获得优种。

将对照下列相关实施例更详细地说明本发明。然而，下列实施例解释本发明但并不限于此。

实施例1.表达PsRan蛋白的转基因植物。

(1)PsRan基因的克隆

使用由拟南介菜Cdna BANK(ARBC，Ohio)提供的ATTS1902克隆中的EcoRI/Xhol基因片段作为探针，筛选豌豆幼芽cDNA表达文库得到PsRan基因。

(2)含有PsRan基因的重组载体的构建

将PsRan cDNA克隆到pBluescript SK+(Strategene，CA)载体的EcoRI和XhoI位点。用限制酶EcoRI和XhoI消化所述基因，然后克隆到已用相同限制酶消化好的pLBJ21载体中以此构建CaMV35S启动子引导表达PsRan的pLBJ21/PsRan，如图1所示。通过电穿孔(Koncz，C.，和Schell，J.(1986)MoI.Gen.Genet.204，383-396)将融合载体导入含有pMP90质粒的根癌农杆菌GV3101从而将重组载体转化到植物中。

(3)转化了pLBJ21/PsRan的拟南芥菜的制备

利用农杆菌介导的转化方法(Valvekens等，D.，Montagu，M.V.，和Lijsebettens，m.v.(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85，5536-5540)将pLBJ21/PsRan导入拟南芥菜根部外植体。在发芽培养基(Valvekens等，D.，Montagu，M.V.，和Lijsebettens，M.V.(1998)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA85，5536-5540)上培养初级转化子的T1种子，并用50ug/L卡那霉素选择转化子。从所选的T1植物上收获T2种子，并在同样的培养基上培育来确认纯合的T2种子。确认的T2种子用于观察转基因植物的性状。

实施例2.表达AtRanBP1b蛋白的转基因植物

(1)AtRanBP1b基因的克隆

以PsRan为诱饵用酵母二元杂交筛选方法在拟南芥菜cDNA文库中克隆Ran结合蛋白。具体来说，以含有启始ATG密码子的SEQ ID No.3和含有终止密码子的SEQ ID No.4作为引物经PCR方法扩增全长PsRan。用EcoRl和BamHl消化所扩增的PsRan，然后亚克隆到经相同限制酶预降解的pGBT9载体(Clonetech，CA)中。将重组的pGBT9/PsRan载体与亚克隆到pACT中的拟南芥cDNA文库共转化到啤酒酵母Y190中，然后根据公开在Clonetech上的酵母二元杂交筛选中描述的方法克隆Ran结合蛋白质AtRanBP1b。

(2)含有AtRanBP1b基因的重组载体、pLBJ21/AtRanBP1b的构建

通过实施例1中描述的同一方法构建pLBJ21/AtRanBP1b重组载体，不同的是用AtRanBP1b代替PsRan，如图2所示。具体来说，用含有ATG的SEQ.ID.No.8和SEQ.ID.No.9引物经PCR扩增全长AtRanBP1b，然后用Xhol/Xbal消化所扩增的基因。将消化好的AtRanBP1b片段亚克隆到经相同酶消化的pLBJ21中来构建如图2所示的重组载体pLBJ21/AtRanBP1b。将重组载体如上所述经电穿孔导入农杆菌。

(1)转化了pLBJ21/AtRanBP1b的拟南芥的制备

通过与实施例1所描述的同样方法制备转化了pLBJ21/AtRanBP1b的拟南芥植物。

实施例3.表达AtRanBP1c基因的转基因植物

(1)AtRanBP1c基因的克隆

通过实施例2(1)中描述的酵母二元杂交筛选方法克隆AtRanBP1c。

(2)含有AtRanBP1c基因的重组载体、pLBJ21/AtRanBP1c的构建

通过实施例2(2)描述的同样方法构建pLBJ21/AtRanBP1c重组载体，不同的是用AtRanBP1c代替AtRanBP1b，如图3所示。利用引物SEQ.ID.No.10和SEQ.ID.No.11经PCR扩增全长AtRanBP1c。

(3)转化了pLBJ21/AtRanBP1c的拟南芥植物的制备

通过与实施例1所描述的同样方法制备转化了pLBJ21/AtRanBP1c的拟南芥植物。

实施例4.表达反义AtRanBP1b的转基因植物

(1)反义AtRanBP1b碱基序列的制备

利用在AtRanBP1b的3′末端cDNA带有一个Xhol酶识别位点的引物1SEQ.ID.No.12和5′末端cDNA带有Xbal识别位点的引物2 SEQ.ID.No.13，由拟南芥菜总RNA经RT-PCR扩增全长AtRanBP1b。

(2)含有反义AtRanBP1b碱基序列的重组载体pLBJ21/反义AtRanBP1b的构建。

用Xhol/Xbal消化RT-PCR所扩增的AtRanBP1b来制备含有反义AtRanBP1b碱基序列的DNA片段，其方向从Xhol到Xbal。然后，将所述DNA片段克隆到用Xhol/Xbal消化的pLBJ21区域来构建CaMV35S启动子引导的过量表达反义AtRanBP1b的pLBJ21/反义AtRanBP1b，如图4所示。经电穿孔(Koncz，C.，和Schell，J.(1986)Mol.Gen.Genet.204，383-396)将pLBJ21/反义AtRanBP1b导入含有pMP90质粒的根癌农杆菌GV3101。

(3)转化了pLBJ21/反义AtRanBP1b的转基因植物的制备

通过与实施例1所描述的同样方法制备转化了pLBJ21/反义AtRanBP1b的转基因植物。

实施例5.表达反义AtRanBP1c的转基因植物

(1)反义AtRanBP1c碱基序列的制备

通过实施例4(1)描述的相同方法经RT-PCR扩增全长AtRanBP1c。RT-PCR中使用引物SEQ.ID.No.14和SEQ.ID.No.15。

(2)含有反义AtRanBP1c碱基序列的重组载体的构建

用实施例4所述的相同方法构建pLBJ21/反义AtRanBP1c重组载体，不同的是用AtRanBP1c代替AtRanBP1b，如图5所示。

(3)转化了pLBJ21/反义AtRanBP1c的拟南芥菜的制备

通过实施例1所述的相同的方法制备转化了pLBJ21/反义AtRanBP1c的拟南芥菜植物。

实施例6到10

通过实施例1到5所述的相同的方法将pLBJ21/PsRan，pLBJ21/AtRanBP1b，pLBJ21/AtRanBP1c，pLBJ21/反义AtRanBP1b，和pLBJ21/反义AtRanBP1c重组载体转化番茄，不同的是用番茄的子叶代替拟南芥菜根外植体。

实验1转基因植物的鉴定

(i)基因组Southern分析

为了鉴定转化到以上实施例所述的转基因植物的基因是否稳定地导入了植物的染色体，用转基因植物的基因组DNA进行Southern分析。

从3周龄的植物中分离基因组DNA，并用EcoRI降解。通过电泳在0.8％的琼脂糖凝胶上分离降解的DNA，并转移到zeta-probe膜(Biorad)上。该膜于65℃在0.25M磷酸钠(pH7.2)和7％SDS中预培养30分钟。在培养溶液中加入[a^-32P]dATP-CaMV 35S启动子(消化Xbal/HindIII的pBI221载体的片段)探针，并将膜继续在65℃培养20小时。培养后，将膜用含有20mM磷酸钠，pH7.2，和5％SDS的溶液洗涤，最后用含有1％SDS的相同溶液在65℃洗涤1小时。然后将膜曝光来检测插入的转基因。结果，携带CaMV35S启动子和转基因的转化植物得以确认。

图6和7显示了两个不同转基因种系的Southern印迹分析。

图6显示转化了pLBJ21/PsRan的拟南芥菜的DNA凝胶印迹分析(Southern印迹分析)照片，图7显示转化了pLBJ21/反义AtRanBP1c的拟南芥菜的DNA凝胶印迹分析照片。如图6和7所示，我们制备了许多pLBJ21/PsRan和pLBJ21/反义AtRanBP1c转基因植物，其转基因插入了不同的染色体(例如，在有义PsRan-1，-4，-6，-7，-8植物基因组中，CaMV35S片段被不同长度的不同条带鉴定)。

(i)RNA的Northern印迹分析

如上所示已经证实基因被导入了这些转基因植物，为了鉴定导入的基因能否表达，进一步对它们进行Northern印迹分析。

为此，用Trizol试剂(Gibco BRL)溶液提取转基因植物的RNA，并在含有6％甲醛的1.2％琼脂糖凝胶上电泳分离。然后用有义或反义核酸探针PsRan，AtRanBP1b或AtRanBP1c做Northern印迹分析。所述探针是用转录试剂盒MAXlscript T3/T7(Ambion，TX)制备的。Northern杂交后，将RNA对加强屏曝光并显影以便测量相应RNA的表达。

图8显示转化了pLBJ21/PsRan的植物的Northern印迹分析照片，图9显示转化了pLBJ21/反义AtRanBP1c的植物的Northern印迹分析照片。如图8和9所示，转基因在转基因拟南芥菜植物中被过表达。此外，如图9所示，证实了表达反义AtRanBP1c表达时，在相应转基因植物中内源AtRanBP1c的表达被抑制。

实验2 5个不同转基因拟南芥菜种系的表现型

(i)根长度的表现型

按照实施例1到5测量拟南芥菜根的长度，结果示于表1和2。

	根平均长度(mm)
		野生型	5±1.5
pLBJ21/PsRan-1	6±1.8
		pLBJ21/PsRan-4	15±4
pLBJ21/PsRan-7	13±3.6

                  表1

	根平均长度(mm)
		野生型	7.5±1.5
pLBJ21/反义AtRanBP1c-1	12±2.3
		pLBJ21/反义AtRanBP1c-2	20±4.1
pLBJ21/反义AtRanBP1c-3	18±4.3
		pLBJ21/反义AtRanBP1c-5	9±1.2

                         表2

如图8，表1和表2所示，过表达PsRan的转基因拟南芥菜(pLBJ21/PsRan-4)和转基因拟南芥菜(pLBJ21/PsRan-7)的根长度比野生型植物的或不过量表达PsRan基因的转基因拟南芥菜(pLBJ21/PsRan-1)的大。另外，pLBJ21/反义AtRanBP1c转化的拟南芥菜的根也比野生型植株的长。

图10显示的为pLBJ21/PsRan-7转化的拟南芥菜的根的照片，和其他对照植株。pLBJ21/PsRan-7转基因的根的长度比野生型或pLBJ21转化的拟南芥菜的大。

图11显示的为pLBJ21/反义AtRanBP1c转化的拟南芥菜的根的长度的照片。清楚的看到pLBJ21/反义AtRanBP1c转化的拟南芥菜的根的长度比野生型的大。

解剖分析上述实施例中5种不同的转基因拟南芥菜株系，用Navishins溶液固定根组织(Mauseth，J.D.，Montenegro，G.，and Walckowiak，A.M.(1984)Can.J.Bor.62，847-857)。固定后，植物组织通过标准的乙醇步骤被干燥。乙醇导入到石蜡前用二甲苯交换，并且然后将组织切成7μm并染色以用标准亮的显微镜观察。每24小时用解剖学使用的40X放大率的显微镜和尺计算每个根。从转基因植物或野生型植物的生长平均数计算尖端生长率的平均数。用SAS程序来进行统计分析，用千分尺在6.3X放大率的物镜下操作进行测量。野生型的拟南芥菜用来比较分析。

下列表3中显示了转基因植株和pLBJ21/反义AtRanBP1c之一和野生型之间存在的用显微镜可以观察到的解剖上的不同。

	根长度的平均数(mm)	％野生型
			实施例5	9.0	164

                           表3

如上述表3所述的pLBJ21/反义AtRanBP1c转化的转基因植物的根的长度的平均数大约是野生型的1.6倍。这种长根的显型归于表皮，皮层和内皮的长度的平均数的增加，如表4所示。

	细胞长度平均数(μm)		细胞宽度平均数(μm)
					细胞组织	实施例5(pLBJ21/反义AtRanBP1c)	％野生型植株	实施例5(pLBJ21/反义AtRanBP1c)	％野生型植株
表皮	157.0	173	14.8	103
					皮层	146.0	151	28.0	116
内皮	107.0	130	15.9	98

                        表4

	根尖端细胞的生长
				增加的长度(μm)/天	％野生型实施例
野生型	505	100
			实施例5	750	149

                             表5

另外，如表5所示，转基因植物的根尖端细胞的生长率大约是野生型的1.5倍。

(ii)计算转基因植物的IAA敏感性

为了检查转基因植物对IAA(吲哚乙酸)的反应，用普通的漂白溶液将转基因拟南芥菜(pLBJ21/反义AtRanBP1c)的种子表面灭菌15分钟。然后将它们用已灭菌的水清洗，然后在空气中干燥。准备好萌芽培养基(GM-蔗糖)的盘子，并将种子放于其中，在4℃培养72小时，这样萌芽将同时出现。各种浓度的IAA被加入到盘中，并将培养基转移到培养室在相同的条件下生长。种子萌芽并生长10天(Modified from Knee and Hangarter，1996)10天后，测量并观察根的长度和形状。实施例中的转基因植物的这些与野生型的比较，并把结果列于下面的表6中。

生长素n(M)	实施例5的根的长度的平均数±标准偏差(mm)	野生型根的长度的平均数；对照载体的根的长度的平均数(mm)
			0	19.5±0.9	9.6；7.3
10-10	7.5±3.9	9.1；10.8
			10-11	8.2±1.8	6.5；8.1
10-12	8.7±2.7	6.4；11.8
			10-13	14.5±3.1	6.8；6.7
10-14	13.3±1.9	7.6；11.0

                                表6

在野生型植物的根中，通过应用10^-10M-10^-6M的生长素通常可以促进生长，超过上述范围的浓度则抑制其生长。如表6中所示，转基因植物对生长素的敏感性已经大大地增加了。因此，根部的生长甚至通过应用10^-10M-10^-12M的生长素而被严重抑制。在实施例5的转基因植物的细胞分裂中发生的体细胞分裂的失败导致了抑制根的生长。从其中，明显的看出非常低浓度的内源生长素(低于10^-10M-10^-12M)促进了实施例5中转基因植物的主根的生长。

(iii)比较转基因植物种子的大小

按照实施例1到5的5种不同的转基因株系产生的T3种子的获得和重量。结果显示于表7中。

转基因植物	重量/100种子	标准偏差
			野生型	1.76×10-5g	1.69×10-6
PLBJ21/PsRan-1	2.06×10-5g	1.67×10-6
			PLBJ21/PsRan-2	2.08×10-5g	8.37×10-7
PLBJ21/PsRan-3	2.08×10-5g	1.64×10-6
			PLBJ21/PsRan-4	2.00×10-5g	1.87×10-6
PLBJ21/PsRan-5	2.35×10-5g	2.16×10-6
			PLBJ21/PsRan-6	2.24×10-5g	1.82×10-6
PLBJ21/反义AtRanBP1c-1	2.20×10-5g	2.74×10-6
			PLBJ21/反义AtRanBPIc-2	2.22×10-5g	2.39×10-6
PLBJ21/反义AtRanBP1c-3	2.82×10-5g	2.86×10-6
			PLBJ21/反义AtRanBP1c-5	2.72×10-5g	8.37×10-7
PLBJ21/反义AtRanBP1b-4	3.48×10-5g	2.23×10-6
			PLBJ21/反义AtRanBP1b-5	3.71×10-5g	2.04×10-6

                             表7

如表7所示，本发明的转基因植物产生的种子比野生型的种子重量增加了1.2到2倍或更多。特别是，pLBJ21/反义AtRanBP1b转化的拟南芥菜产生的种子的重量是野生型的2倍，另外，本发明的转基因植物表现为叶面积，茎厚度和每个植物的种子数量的增加。

图12是反义AtRanBP1b/pLBJ21植物产生的比野生型大的种子的照片。

(vi)比较转基因植物的叶面积、胚轴长度和干重

pLBJ21/反义AtRanBp1b转化的一种拟南芥菜在MS培养物中发芽，拟南芥菜在4叶期的特征在发芽2周后观察。这些实验的结果列于表8中。

	pLBJ21/反义AtRanBP1b	野生型
			干重(μg)	8.0(±1.39)	3.5(±0.22)
叶的长度(mm)	4.44(±0.13)	2.10(±0.05)
			叶的面积(mm2)	1.96(±0.07)	1.4(±0.03)
胚轴长度(mm)	4.95(±0.06)	4.15(±0.12)

                            表8

另外，我们计算种子的产生量，花的大小，和节间长度。植物在按50∶50的比例混合腐殖质和蛭石的土壤中在生长室中生长7到9周，生长条件为23℃，60％的湿度，以及12小时的黑暗和12小时的光。包含5％氮，10％磷酸溶液和5％钾溶液的肥料液一周两次加入到植物中。计算植物的特征并将结果列于表9中。

	pLBJ21/反义AtRanBP1b	野生型
			每个长角果种子的数量	30.24(±1.97)	28.43(±1.5)
每个植物中长角果的数量	63.2(±4.3)	38.4(±3.8)
			比较野生型花的大小，短轴％	156(±5.4)	100
比较野生型花的大小，长轴％	170(±6.5)	100
			第1节间直径(mm)	0.57(±0.03)	0.26(±0.03)
第3节间的长度(cm)	1.22(±0.1)	0.87(±0.08)

                             表9

如图13，14和15所示，pLBJ21/反义AtRanBP1b转化的拟南芥菜的花的大小、叶的大小和植株的大小比野生型大。

实验3.转基因番茄的显型

在按照实施例6到10的转基因番茄中，pLBJ21/AtRanBP1b转化的转基因番茄的特征列于表10中。

	pLBJ21/AtRanBP1b	野生型
			植物的高度(cm)	180±6.3	110±4.8
茎的直径(mm)	11.42±1.3	7.6±1.2
			叶的长轴(mm)	116±5.3	85±3.8
2cm×2cm的叶样品的干重(mg)	110±5	62±1
			叶的厚度(mm)	0.58±0.02	0.27±0.02
未成熟的果实的直径(mm)	39±2.6	30±1.8
			每1g的叶中的叶绿素的含量(mg/ml溶媒)	0.58±0.08	0.42±0.07

                              表10

如表10所示，pLBJ21/AtRanBP1b转化的转基因番茄的生物量的特性，如植株高度，叶的厚度、重量和大小，每单位重量的叶绿素的容量和茎的直径都明显的增加了。另外，未成熟的果实的直径增加是因为叶的光合能力的增加。如图16，17，18和19所示，转基因番茄的成熟体的大小，成熟叶的大小，茎的厚度和未成熟的果实的大小比对比的野生型植株大。

成体或种子大小或根的长度增加的转基因植物可以通过过量表达Ran和RanBPs或抑制它们的表达而获得。由本发明的5种重组载体转化的农作物可以增加它们的产量，这样可以应用于高产量、超多产的品种的发展。

                        序列表<110>KIM，soo hwan<120>Protocols for generation of high yield，super-productivetransgenic plants disturbed in Ran/RanBP-mediated cellular process<130>dp012427<150>KR 10-2000-50067<151>2000-08-28<150>KR 10-2001-51820<151>2001-08-27<160>15<170>Kopatentin 1.71<210>1<211>874<212>DNA<213>从豌豆中分离的PaRan<400>1cgcaacctag cttttcctcc ataatcgatt attccattca tttcaatggc cttgcctaat    60cagcaaacag ttgattatcc tagtttcaag cttgtgatcg tcggtgacgg tggcacagga   120aaaacaactt tcgtaaagag gcatcttact ggagaatttg agaagaaata tgaaccaact   180attggtgttg aagtgcatcc attggatttc ttcacaaagt gtggtaagat tcgtttctac   240tgctgggata ctgctggtca agagaagttt ggtggtctca gagatggata ctatattcat   300ggacagtgtg ctattataat gtttgatgtt actgcacggc tgacatacaa gaatgtccct   360acttggcacc gtgatctttg ccgggtctgt gaaaacatcc caattgttct ttgtggaaac   420aaggttgatg tgaagaacag gcaagtgaag gcaaagcagg ttaccttcca caggaagaaa   480aatttgcagt actatgaaat atcagctaag agcaactaca actttgagaa gcctttcctg   540tatcttgcca ggaaacttgc aggtgatcct aatttgcact ttgtagaatc tcctgcactg   600gctccaccag aagttcaaat tgatattgct ttacaacaaa ggcatgagaa tgagattctt   660gaggctgcta atcagcccct tcctgatgat gatgacgatg cttttgaata ggaaggacct   720tcgagagtgc tggcctatgt gtgttgattt gtgccgttat atgctgtaat gttatgtgtt   780ttgtggttga accgttgaca tttttttgat atagatttat ggatttcaat catcatgtga   840ttgagttgtt ttaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa                               874<210>2<211>1075<212>DNA<213>从拟南芥菜中分离的AtRanBP1b<400>2gaaaccaact cagagcaaaa gcttgatttg acactatggc gagcattagc aacgagcccg    60agcgtgagaa cagagacgaa gaagagactg gagccaacga agatgaagac accggtgctc   120aggttgctcc tatcgtcagg cttgaagaag tcgccgtcac caccggtgaa gaagacgaag   180acaccatcct cgatctgaaa tcgaagttgt atcgatttga taaagatgga agtcagtgga   240aggagagagg tgctggtact gttaagtttg tgaaacatag agtttctggg aagattcgtc   300tcgttatgag gcaatcgaaa actttgaaga tctgtgctaa tcatcttgtt ggatcgggta   360tgagtgttca ggaacacgct gggaatgata agtcttgtgt atggcacgct cgtgatttct   420ccgatggtga attgaaggat gagctcttct gtatccggtt tggttcagtt gagaattgca   480aagcatttat gcaaaagttc aaggaagtag ctgaatctga agaagagaaa gaagagagca    540aagatgcctc tgataccgct ggtcttcttg agaagttaac agtggaagag aaggaaagtg    600agaagaaacc agtggagaag gcagaggaaa acaaaaagag tgaagctgtt gaagaaaaga    660aaacagagga gtctgttccc tcagcttaag atgcatgctt acacacacat acggccaggt    720aatcaatagc ctgatgtgtt ttaaatccat cgaaggaaga cttggctttt attttcaaat    780tgaatacatg ttttgagtcg tgttgagagt ctatattttt agtgtcacaa aagtgtcaca    840ggtgacattt tgcatatgcg agattgattt tcgagcttgt ttgggtttca ttatctggaa    900gaaaaaaaga gtgtattttg agctctctta tgattttttt ttggaaaaag tgtggactca    960agagaagatt ttattttgag ttcacaaaaa tttgtatgca tggatgattc gcgtgttctc   1020tttttaatgc cagtcgtgtt attgaatcaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa        1075<210>3<211>962<212>DNA<213>从拟南芥菜中分离的AtRanBP1c<400>3gtcgacccac gcgtccggaa gttgcagagc acacacacac actttcaagt ttcaatacag     60agatggcgag cactgagcca gagcgtgaga accgtgaaga tgaaaccgaa gtcaacgaag    120atgaagacac cggagctcag gtagctccga tcgttaggct tgaagaggtt gcagtcacca    180ccggcgaaga agatgaagac gccgtcctcg atctgaaatc gaagatgtat cgattcgata    240aagaagggaa ccaatggaag gagagaggag ctggaactgt gaagttattg aagcataagg    300aaactggaaa agttcgtctt gttatgagac aatctaaaac cctaaagatc tgtgccaatc      360acctcatttc gtctgggatg agtgttcagg aacatagtgg gaatgaaaag tcttgtttat      420ggcacgctac tgatttctcc gacggcgagt tgaaagatga gcttttctgc attcgatttg      480cttccattga gaattgcaaa acatttatgg agaagttcac tgaaatagct gaaagccagc      540aagtagggaa agagagcacc cagggcgacg aggctgctgg tttaatagag aatctttcgg      600ttgaggaaaa tataagtgag gagaaagcca aggaagcaga agagaaagag cctgcaaagg      660aagataaaga aacaaaaaag gagaaggtag aagaagagaa gaaaacagag gcaagcactt      720aagtgatcaa attaaaattg gttgttggca tcactaagtg tgctttgctt tattttaata      780tattatactt ggcactgaac atgatggtag cttcaaaagt ttgagtcttt gcgctgtgtt      840agagaaagag aatcttaaga ttttttttta tgttgttgct gtgtaagtgt ttgactattg      900tgtcgtctct ttactgtgtc aatttggttt aagataataa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa      960aa                                                                     962<210>4<211>1073<212>DNA<213>AtRanBP1b的反义序列<400>4tttttttttt tttttttttt tttttgattc aataacacga ctggcattaa aaagagaaca       60cgcgaatcat ccatgcatac aaatttttgt gaactcaaaa taaaatcttc tcttgagtcc      120acactttttc caaaaaaaaa tcataagaga gctcaaaata cactcttttt ttcttccaga      180taatgaaacc caaacaagct cgaaaatcaa tctcgcatat gcaaaatgtc acctgtgaca      240cttttgtgac actaaaaata tagactctca acacgactca aaacatgtat tcaatttgaa      300aataaaagcc aagtcttcct tcgatggatt taaaacacat caggctattg attacctggc      360cgtatgtgtg tgtaagcatg catcttaagc tgagggaaca gactcctctg ttttcttttc      420ttcaacagct tcactctttt tgttttcctc tgccttctcc actggtttct tctcactttc      480cttctcttcc actgttaact tctcaagaag accagcggta tcagaggcat ctttgctctc      540ttctttctct tcttcagatt cagctacttc cttgaacttt tgcataaatg ctttgcaatt      600ctcaactgaa ccaaaccgga tacagaagag ctcatccttc aattcaccat cggagaaatc      660acgagcgtgc catacacaag acttatcatt cccagcgtgt tcctgaacac tcatacccga      720tccaacaaga tgattagcac agatcttcaa 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       PCT/R0/134表微生物或其它生物材料的保藏证明

     (PCT条约13bis)

微生物或其它生物材料的保藏证明

(PCT条约13bis)

微生物或其它生物材料的保藏证明

(PCT条约13bis)

微生物或其它生物材料的保藏证明

(PCT条约13bis)微生物或其它生物材料的保藏证明

(PCT条约13bis)

Claims (24)

1、一种从豌豆中分离的PaRan序列SEQ.ID.NO.1。

2、一种从拟南芥菜中分离的AtRanBP1b序列SEQ.ID.NO.2。

3、一种从拟南芥菜中分离的AtRanBP1c序列SEQ.ID.NO.3。

4、一种AtRanBP1b的反义(antisense，anti-)序列SEQ.ID.NO.4，其抑制AtRanBP1b基因的表达。

5、一种AtRanBP1c的反义序列SEQ.ID.NO.5，其抑制AtRanBP1c基因的表达。

6、一种包括AtRanBP1b反义序列SEQ.ID.NO.4或部分AtRanBP1b反义序列的重组载体。

7、按照权利要求6的重组载体，其中重组载体是pLBJ21/反义(antisense)AtRanBP1b(KCTC0850BP)。

8、一种包括部分AtRanBP1c反义序列或AtRanBP1c反义序列SEQ.ID.NO.5的重组载体。

9、按照权利要求8的重组载体，其中重组载体是pLBJ21/反义AtRanBP1c(KCTC0851BP)。

10、一种包括从Ran，AtRanBP1a，AtRanBP1b，AtRanBP1c，RanGAP，RanBPM，RCC1和RanBP1中选择的基因的重组载体。

11、按照权利要求10的重组载体，其中重组载体从pLBJ21/PsRan(KCTC0837BP)，pLBJ21/AtRanBP1b(KCTC 0838BP)和pLBJ21/AtRanBP1c(KCTC0839BP)中选择。

12、一种包括参与Ran-介导的细胞过程的有义(sense)或反义基因序列的转基因载体转化的重组植物。

13、按照权利要求12的转基因植物，其中基因选自Ran，AtRanBP1a，AtRanBP1b，AtRanBP1c，RanGAP，RanBPM，RCC1和RanBP1。

14、按照权利要求12的转基因植物，其中重组载体是权利要求6所述的重组载体、权利要求8所述的重组载体或权利要求10所述的重组载体。

15、按照权利要求12的转基因植物，其中转基因植物选自由pLBJ21/反义AtRanBP1b(KCTC0850BP)，pLBJ21/反义AtRanBP1c(KCTC0851BP)，pLBJ21/PsRan(KCTC 0837BP)，pLBJ21/AtRanBP1b(KCTC 0838BP)和pLBJ21/AtRanBP1c(KCTC 0839BP)转化的植物组成的组。

16、一种产生转基因植物的方法，包括将包含参与Ran-介导的细胞过程的基因的重组载体转化到植物中，或从中剔除这些基因的步骤。

17、按照权利要求16的方法，其中重组载体包括或者可以同时表达基因的有义或反义序列或者可以同时表达RNA的有义或反义序列的启动子。

18、按照权利要求16的方法，其中基因选自Ran，AtRanBP1a，AtRanBP1b，AtRanBP1c，RanGAP，RanBPM，RCC1和RanBP1。

19、按照权利要求18的方法，其中Ran是一种70％或更多与氨基酸相同的蛋白。

20、按照权利要求18的方法，其中AtRanBP1b或AtRanBP1c是一种50％或更多与氨基酸相同的蛋白。

21、按照权利要求18的方法，其中AtRanBP1a，RanGAP，RanBPM，RCC1或RanBP1是一种35％或更多与氨基酸相同的蛋白。

22、按照权利要求16的方法，其中基因由Ran-粘合域组成。

23、按照权利要求16的方法，其中反义序列是全部或部分反义序列。

24、按照权利要求16的方法，其中剔除方法是一种从由转座子，UV-处理，和EMS-处理组成的组中选择的方法。

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