MXPA06000654A - Materiales y metodos para la modulacion de los polipeptidos similares al inhibidor de la cinasa dependiente de la ciclina en el maiz. - Google Patents

Abstract

Moleculas de acidos nucleicos aisladas o purificadas, que codifican polipeptidos que tienen actividad similar al inhibidor de la cinasa dependiente de la ciclina (CDK); vectores; celulas hospederas; polipeptidos que tienen una actividad similar al inhibidor de la CDK; constructos de acidos nucleicos para la supresion de la actividad similar al inhibidor de la CDK; metodos para suprimir y sobrerregular la expresion de uno o mas genes similares al inhibidor de la CDK en una celula, tejido, organo o planta de maiz, una celula, tejido, organo o planta de maiz en la cual la expresion de un gen similar al inhibidor de la CDK se ha suprimido o sobrerregulado de acuerdo con tales metodos; y una semilla (y el aceite y la harina de la misma) obtenida de una planta en la cual la expresion de uno o mas genes similares al inhibidor de la CDK se ha suprimido o sobrerregulado.

Description

MATERIALES Y METODOS PARA LA MODULACION DE LOS POLIPEPTIDOS SIMILARES AL INHIBIDOR DE LA CINASA DEPENDIENTE DE LA CICLINA EN EL MAIZ Esta solicitud reclama el beneficio de la Solicitud Provisional de E.U.A. No. 60/486,935, presentada el 7/14/2003, la cual se incorpora en la presente como referencia en su totalidad.

CAMPO TECNICO DE LA INVENCION La presente invención se relaciona con moléculas de ácido nucleico aisladas o purificadas que codifican poiipéptidos que tienen actividad similar al inhibidor de la cinasa dependiente de la ciclina (CDK), moléculas de ácido nucleico complementarias y antisentido, vectores, células hospederas, poiipéptidos que tienen actividad similar al inhibidor de la CDK y materiales y métodos para suprimir y sobrerregular la expresión de uno o más genes similares al inhibidor de la CDK en el maíz.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION La activación/inactivación de la CDK por las ciclinas, dirige la transición entre las diferentes fases del ciclo celular. La actividad de la CDK también se regula por los inhibidores de la CDK conocidos como KRP (proteínas relacionadas con Kip, en donde "Kip" es la abreviatura para "proteínas inhibidoras de la cinasa"). Se conocen otros inhibidores de la CDK de los sistemas de plantas y animales, como CKI, ICK, Cip e Ink (De Veylder, 2001, Plant Cell, 13:1653-1667) y KIS (Jasinski et al., J. Cell. Sci., 1 5:973-982 (2002)). Los inhibidores de la CDK se han identificado en plantas, incluyendo Arabidopsis y tabaco. Los inhibidores dé la CDK de las plantas tienen aproximadamente 35 aminoácidos en el término carboxi, homólogos al dominio de unión de la ciclina/CDK amino terminal de los inhibidores de la CDK de animales de los tipos p21Cip1/p27Kip1/p57Kip2. Fuera de la región carboxi terminal, los inhibidores de la CDK de plantas identificados hasta ahora son estructuralmente diferentes.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La supresión de la expresión de un gen similar al inhibidor de la CDK puede resultar en la proliferación celular incrementada y/o en un índice mitótico incrementado. La supresión de la expresión de un gen similar al inhibidor de la CDK también puede resultar en aceite incrementado y rendimiento incrementado. La presente invención proporciona moléculas de ácido nucleico aisladas o purificadas que codifican los polipéptidos similares al inhibidor de la CDK del maíz. En una modalidad, la molécula comprende (i) la secuencia nucleotídica de la SEQ ID NO: 1 [ZmKRPI ; "Zm" indica Zea mays; "KRP" indica la proteína relacionada con las Kip; el número es la designación dada a un gen particular], (ii) una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 [ZmKRPI], (iii) una secuencia nucleotídica que codifica una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente 70% idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 [ZmKRPI] y que tiene una actividad similar al inhibidor de la CDK, o (iv) un fragmento de cualquiera de (i)-(iii), en donde el fragmento comprende al menos aproximadamente 35 nucleótidos contiguos. En otra modalidad, la molécula comprende (i) la secuencia nucleotídica de la SEQ ID NO: 3 [ZmKRP2], (ii) una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4 [ZmKRP2], (¡ii) una secuencia nucleotídica que codifica una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente 70% idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4 [ZmKRP2] y que tiene una actividad similar al inhibidor de la CDK, o (iv) un fragmento de cualquiera de (i)-(iii), en donde el fragmento comprende al menos aproximadamente 35 nucleótidos contiguos. En aún otra modalidad, la molécula consiste esencialmente de (i) la secuencia nucleotídica de la SEQ ID NO: 7 [ZmKRP4], (¡i) una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8 [ZmKRP4], o (¡ii) una secuencia nucleotídica que codifica una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente 70% idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8 [ZmKRP4] y que tiene una actividad similar al inhibidor de la CDK.

En aún otra modalidad, la molécula comprende (i) la secuencia nucleotídica de la SEQ ID NO: 9 [ZmKRP5], (ii) una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10 [ZmKRP5], (¡¡j) una secuencia nucleotídica que codifica una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente 70% idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10 [ZmKRP5] y que tiene una actividad similar al inhibidor de la CDK, o (iv) un fragmento de cualquiera de (i)-(iii), en donde el fragmento comprende al menos aproximadamente 20 nucleótidos contiguos. En una modalidad adicional, la molécula consiste esencialmente de (i) la secuencia nucleotídica de la SEQ ID NO: 11 [ZmKRP6], (¡i) una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 12 [ZmKRP6], (iii) una secuencia nucleotídica que codifica una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente 70% idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 12 [ZmKRP6] y que tiene una actividad similar al inhibidor de la CDK, o (iv) un fragmento de cualquiera de (i)-(iii), en donde el fragmento comprende al menos aproximadamente 390 nucleótidos contiguos. En vista de lo anterior, la presente invención proporciona además vectores que comprenden las moléculas de ácido nucleico descritas anteriormente. También se proporcionan células hospederas que comprenden las moléculas de ácido nucleico aisladas o purificadas, opcionalmente en la forma de vectores.

También en vista de lo anterior, la presente invención proporciona polipéptidos aislados o purificados codificados por las moléculas de ácido nucleico descritas anteriormente. También se proporcionan las moléculas de ácido nucleico aisladas o purificadas, opcionalmente en la forma de un vector, que comprenden o consisten esencialmente de secuencias complementarias y antisentido a algunas de las moléculas descritas anteriormente, SEQ ID NOS: 13, 15 y 17 y las secuencias nucleotídicas que codifican las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOS: 6, 14, 16 y 18. Cuando la secuencia es la SEQ ID NO: 1 , codifica la SEQ ID NO: 2, es la SEQ ID NO: 3, o codifica la SEQ ID NO: 4, la secuencia complementaria o antisentido comprende al menos 35 nucleótidos contiguos. Se proporcionan además constructos de ácido nucleico que comprenden al menos una secuencia nucleotídica transcribible, la expresión de la cual resulta en la supresión de una secuencia nucleotídica endógena seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 1 [ZmKRPI], una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 [ZmKRPI], SEQ ID NO: 3 [ZmKRP2], y una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4 [ZmKRP2], sola o en combinación adicional con al menos otra secuencia nucleotídica, la expresión de la cual resulta en la supresión de una secuencia nucleotídica endógena seleccionada del grupo que consiste de la SEQ ID NO: 5 [ZmKRP3], una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6 [ZmKRP3], SEQ ID NO: 7 [ZmKRP4], una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8 [ZmKRP4], SEQ ID NO: 9 [ZmKRP5], una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10 [ZmKRP5], SEQ ID NO: 11 [ZmKRP6], una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 12 [ZmKRP6], SEQ ID NO: 13 [ZmKRP7], una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14 [ZmKRP7], SEQ ID NO: 15 [ZmKRP8], una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 16 [ZmKRP8], SEQ ID NO: 17 [ZmKRP9], y una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 18 [ZmKRP9], en donde, cuando el constructo de ácidos nucleicos comprende dos o más secuencias nucleotídicas transcribibles, las secuencias nucleotídicas pueden estar presentes en cualquier orden en el constructo de ácidos nucleicos y pueden ser policistrónicas, en donde cada secuencia nucleotídica transcribible comprende al menos aproximadamente 100 nucleótidos contiguos, y en donde la expresión de cada secuencia nucleotídica transcribible induce opcionalmente la supresión del gen. En otra modalidad, el constructo de ácidos nucleicos comprende al menos una secuencia nucleotídica transcribible, la expresión de la cual resulta en la supresión de una secuencia de ácidos nucleicos endógena, seleccionada de la SEQ ID NO: 7 [ZmKRP4] y/o la SEQ ID NO: 17 [ZmKRP9], cualquiera o ambas de las secuencias nucleotídicas transcribibles en combinación además con al menos otra secuencia nucleotídica transcribible, la expresión de la cual resulta en la supresión de una secuencia nucleotídica endógena seleccionada del grupo que consiste de: (i) SEQ ID NO: 1 [ZmKRPI] o una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 [ZmKRPI], (ii) SEQ ID NO: 3 [ZmKRP2] o una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4 [ZmKRP2], (iii) SEQ ID NO: 5 [ZmKRP3] o una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6 [ZmKRP3], con la condición de que la secuencia nucleotídica transcribible no corresponde completamente a los nucleótidos 175-342 de ía SEQ ID NO: 5, (iv) SEQ ID NO: 9 [ZmKRP5] o una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10 [ZmKRP5], con la condición de que la secuencia nucleotídica transcribible no corresponde completamente a los nucleótidos 450-570 de la SEQ ID NO: 9, (v) SEQ ID NO: 1 [ZmKRP6] o una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 12 [ZmKRP6], con la condición de que la secuencia nucleotídica transcribible no corresponde completamente a los nucleótidos 380-765 de la SEQ ID NO: 1 , (vi) SEQ ID NO: 13 [ZmKRP7] o una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14 [ZmKRP7], con la condición de que la secuencia nucleotídica transcribible no corresponde completamente a los nucleótidos 335-718 de la SEQ ID NO: 13 y (vii) SEQ ID NO: 15 [ZmKRP8] o una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 16 [ZmKRP8], con la condición de que la secuencia nucleotídica transcribible no corresponde completamente a los nucleótidos 350-405 ó 420-698 de la SEQ ID NO: 15, en donde las secuencias nucleotídicas transcribibles pueden estar presentes en cualquier orden en el constructo de ácidos nucleicos y pueden ser policistrónicas, en donde cada secuencia nucleotídica transcribible comprende al menos aproximadamente 100 nucleótidos contiguos, y en donde la expresión de cada secuencia nucleotídica transcribible induce opcionalmente la supresión del gen. En aún otra modalidad, el constructo de ácidos nucleicos comprende al menos una secuencia nucleotídica transcribible, la expresión de la cual resulta en la supresión de una secuencia nucleotídica endógena seleccionada del grupo que consiste de: (i) SEQ ID NO: 1 [ZmKRPI] o una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 [ZmKRPI], (ii) SEQ ID NO: 3 [ZmKRP2] o una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4 [ZmKRP2], (iii) SEQ ID NO: 5 [ZmKRP3] o una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6 [ZmKRP3], con la condición de que la secuencia nucleotídica transcribíble no corresponde completamente a los nucleótidos 175-342 de la SEQ ID NO: 5, (iv) SEQ ID NO: 9 [ZmKRP5] o una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10 [ZmKRP5], con la condición de que la secuencia nucleotídica transcribíble no corresponde completamente a los nucleótidos 450-570 de la SEQ ID NO: 9, (v) SEQ ID NO: 11 [ZmKRP6] o una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 12 [ZmKRP6], con la condición de que la secuencia nucleotídica transcribíble de la SEQ ID NO: 11 no corresponde completamente a los nucleótidos 380-765 de la SEQ ID NO: 11, (vi) SEQ ID NO: 13 [ZmKRP7] o una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14 [ZmKRP7], con la condición de que la secuencia nucleotídica transcribíble no corresponde completamente a los nucleótidos 335-718 de la SEQ ID NO: 13, (vii) SEQ ID NO: 15 [ZmKRP8] o una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 16 [ZmKRP8], con la condición de que la secuencia nucleotídica transcribíble no corresponde completamente a los nucleótidos 350-405 ó 420-698 de la SEQ ID NO: 15 y (viii) SEQ ID NO: 17 [ZmKRP9] o una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 18 [ZmKRP9], con la condición de que la secuencia nucleotídica transcribíble no corresponde completamente a los nucleótidos 1-183 de la SEQ ID NO: 17, en donde las secuencias nucleotídicas transcribibles pueden estar presentes en cualquier orden en el constructo de ácidos nucleicos y pueden ser policistrónicas, en donde cada secuencia nucleotídica transcribible comprende al menos aproximadamente 100 nucleótidos contiguos, y en donde la expresión de cada secuencia nucleotídica transcribible induce opcionalmente la supresión del gen. Se proporciona también un método para suprimir la expresión de uno o más genes similares al inhibidor de la CDK en una célula de maíz, un tejido de maíz, un órgano de maíz, o una planta de maíz. El método comprende poner en contacto la célula de maíz, el tejido de maíz, el órgano de maíz o la planta de maíz con un constructo de ácidos nucleicos descrito anteriormente. A este respecto, también se proporciona una célula de maíz, un tejido de maíz, un órgano de maíz o una planta de maíz, en el cual la expresión de un gen similar al inhibidor de la CDK se ha suprimido de acuerdo con tal método. También se proporciona una semilla obtenida a partir de una planta en la cual la expresión de uno o más genes similares al inhibidor de la CDK se ha suprimido.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS La Figura 1 es la alineación de la secuencia de aminoácidos de los polipéptidos de la presente invención, con las secuencias publicadas de los inhibidores de CDK de Arabidopsis. Las secuencias de Arabidopsis son como se indican en el Ejemplo 1. La Figura 2 es el mapa del constructo de pMON7 270. La Figura 3 es el mapa del constructo de pMON71279. Las Figuras 4A y 4B son un diagrama esquemático de un constructo intermediario de ARNds que muestra las regiones y direcciones del iniciador (fig. 4A) y los procedimientos de montaje (fig. 4B). Las Figuras 5A y 5B son un diagrama esquemático del constructo intermediario de ARNds que muestra las regiones y direcciones del iniciador (fig. 5A) y los procedimientos de montaje (fig. 5B).

BREVE DESCRIPCION DE LAS SECUENCIAS La SEQ ID NO: 1 es la secuencia nucleotídica de ZmKRPI . La SEQ ID NO: 2 es la secuencia de aminoácidos de ZmKRPI . La SEQ ID NO: 3 es la secuencia nucleotídica de ZmKRP2. La SEQ ID NO: 4 es la secuencia de aminoácidos de ZmKRP2. La SEQ ID NO: 5 es la secuencia nucleotídica de ZmKRP3. La SEQ ID NO: 6 es la secuencia de aminoácidos de ZmKRP3.

La SEQ ID NO: 7 es la secuencia nucleotídica de ZmKRP4. La SEQ ID NO: 8 es la secuencia de aminoácidos de ZmKRP4. La SEQ ID NO: 9 es la secuencia nucleotídica de ZmKRP5. La SEQ ID NO: 10 es la secuencia de aminoácidos de ZmKRP5. La SEQ ID NO: 1 es la secuencia nucleotídica de ZmKRP6. La SEQ ID NO: 12 es la secuencia de aminoácidos de ZmKRP6. La SEQ ID NO: 3 es la secuencia nucleotídica de ZmKRP7. La SEQ ID NO: 14 es la secuencia de aminoácidos de ZmKRP7. La SEQ ID NO: 15 es la secuencia nucleotídica de ZmKRP8. La SEQ ID NO: 16 es la secuencia de aminoácidos de ZmKRP8. La SEQ ID NO: 17 es la secuencia nucleotídica de ZmKRP9. La SEQ ID NO: 18 es la secuencia de aminoácidos de ZmKRP9. La SEQ ID NO: 19 es la secuencia nucleotídica de 200 pares de bases (pb) del extremo 3' de ZmKRPI (F1). La SEQ ID NO: 20 es la secuencia nucleotídica de 200 pb de cerca del extremo 3' de ZmKRP2 (F2). La SEQ ID NO: 21 es la secuencia nucleotídica de 200 pb del extremo 3' de ZmKRP3 (F3). La SEQ ID NO: 22 es la secuencia nucleotídica de 200 pb del extremo 3' de ZmKRP4 (F4). La SEQ ID NO: 23 es la secuencia nucleotídica de 200 pb del extremo 3' de ZmKRP5 (F5).

La SEQ ID NO: 24 es la secuencia nucleotídica de 200 pb de cerca del extremo 3' de ZmKRP6 y ZmKRP7 (F6). La SEQ ID NO: 25 es la secuencia nucleotídica de 200 pb de cerca del extremo 3' de ZmKRP8 (F7). La SEQ ID NO: 26 es la secuencia nucleotídica de 183 pb del extremo 3' de ZmKRP8 (F8). La SEQ ID NO: 27es la secuencia nucleotídica del fragmento del intrón ZmDnaK. La SEQ ID NO: 28 es la secuencia nucleotídica del iniciador P1-Stul. La SEQ ID NO: 29 es la secuencia nucleotídica del iniciador P1-2R. La SEQ ID NO: 30 es la secuencia nucleotídica del iniciador P2-3. La SEQ ID NO: 31 es la secuencia nucleotídica del iniciador P4-Bgl. La SEQ ID NO: 32 es la secuencia nucleotídica del iniciador P3-4. La SEQ ID NO: 33 es la secuencia nucleotídica del iniciador P5-Bam. La SEQ ID NO: 34 es la secuencia nucleotídica del iniciador P5-Bgl.

La SEQ ID NO: 35 es la secuencia nucleotídica del iniciador P1-SseBam. La SEQ ID NO: 36 es la secuencia nucleotídica del iniciador Pi-Bgl. La SEQ ID NO: 37 es la secuencia nucleotídica del iniciador Pi-Bam. La SEQ ID NO: 38 es la secuencia nucleotídica del iniciador P5-Nco. La SEQ ID NO: 39 es la secuencia nucleotídica del iniciador P5-6. La SEQ ID NO: 40 es la secuencia nucleotídica del iniciador P6-7. La SEQ ID NO: 41 es la secuencia nucleotídica del iniciador P8-Bgl. La SEQ ID NO: 42 es la secuencia nucleotídica del iniciador P7-8. La SEQ ID NO: 43 es la secuencia nucleotídica del iniciador P8-i. La SEQ ID NO: 44 es la secuencia nucleotídica de la reglón no traducida (UTR) 5' de ZmKRPl. La SEQ ID NO: 45 es la secuencia nucleotídica de la UTR 3' de ZmKRPl La SEQ ID NO: 46 es la secuencia nucleotídica de la UTR 5' de ZmKRP2.

La SEQ ID NO: 47 es la secuencia nucleotídica de la UTR 3' de ZmKRP2. La SEQ ID NO: 48 es la secuencia nucleotídica de la UTR 3' de ZmKRP3. La SEQ ID NO: 49 es la secuencia nucleotídica de la UTR 5' de ZmKRP4. La SEQ ID NO: 50 es la secuencia nucleotídica de la UTR 3' de ZmKRP4. La SEQ ID NO: 51 es la secuencia nucleotídica de la UTR 5' de ZmKRP5. La SEQ ID NO: 52 es la secuencia nucleotídica de la UTR 3' de ZmKRP5. La SEQ ID NO: 53 es la secuencia nucleotídica de la UTR 5' de ZmKRP6. La SEQ ID NO: 54 es la secuencia nucleotídica de la UTR 3' de ZmKRP6. La SEQ ID NO: 55 es la secuencia nucleotídica de la UTR 5' de ZmKRP7. La SEQ ID NO: 56 es la secuencia nucleotídica de la UTR 3' de ZmKRP7. La SEQ ID NO: 57 es la secuencia nucleotídica de la UTR 5' de ZmKRP8.

La SEQ ID NO: 58 es la secuencia nucleotídica de la UTR 3' de ZmKRP9. La SEQ ID NO: 59 es una secuencia conservada de la región C terminal del ciertos polipéptidos.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION La supresión de la expresión de un gen similar al inhibidor de la CDK, puede resultar en una proliferación celular incrementada y/o en un índice mitótico incrementado. Por ejemplo, el incremento en la proliferación celular puede resultar en un tamaño del embrión incrementado y en un incremento de la cantidad de aceite. La supresión de la expresión de un gen similar al inhibidor de la CDK, también puede resultar en un rendimiento incrementado. Muchas características agronómicas pueden afectar el "rendimiento". Por ejemplo, éstas podrían incluir, de manera no exclusiva, la altura de la planta, número vainas, posición de la vaina en la planta, número de internodos, incidencia de fragmentos de vaina, tamaño del grano, eficiencia de la nodulación y fijación del nitrógeno, eficiencia de la asimilación de nutrientes, resistencia a las agresiones bióticas y abióticas, asimilación de carbono, arquitectura de la planta, resistencia a encamarse, por ciento de germinación de las semillas, vigor de las plántulas y características juveniles. Por ejemplo, éstas podrían incluir, de manera no exclusiva, la eficiencia de la germinación (incluyendo germinación en condiciones con agresiones), velocidad de crecimiento (incluyendo velocidad de crecimiento en condiciones con agresiones), número de espigas, número de semillas por espiga, tamaño de la semilla, composición de la semilla (almidón, aceite, proteína), características del relleno de la semilla. El "rendimiento" puede medirse de muchas maneras, éstas pueden incluir el peso de prueba, el peso de la semilla, el número de semillas por planta, el peso de la semilla, el número de semillas por unidad de área (es decir, semillas o peso de las semillas, por acre), busheis por acre, tonelaje por acre, toneladas por acre, kilo por hectárea. En una modalidad, una planta de la presente invención puede exhibir una característica mejorada que es un componente del rendimiento. Una característica mejorada es una característica o fenotipo de una planta, que se cambia de una manera que podría considerarse como una mejora agronómica cuando se compara con una planta no transgénica de un genotipo igual, o muy similar. La presente invención proporciona, entre otras cosas, moléculas de ácido nucleico aisladas o purificadas, que codifican polipéptidos de maíz que tienen una actividad similar al inhibidor de la CDK. Por "actividad similar al inhibidor de la CDK" se quiere decir la capacidad para reducir la actividad de la CDK en un ensayo de histona H1 cinasa (véase, el Ejemplo 14). De manera preferida, la actividad de la CDK se reduce por al menos aproximadamente 10%, de manera más preferida, al menos aproximadamente 20%, aún de manera más preferida, al menos aproximadamente 30%, incluso de manera más preferida, al menos aproximadamente 40%, 50%, 60%, 70% u 80%, y de manera más preferida, al menos aproximadamente 90% o más. Por "aislado", se quiere decir que se ha retirado de su medio natural. Si es un ácido nucleico, aislado significa la separación de un ácido nucleico de otras moléculas de ácido nucleico y la separación sustancial de otro material celular y cualquier medio de cultivo, si se produce mediante técnicas recombinantes o precursores químicos, si se sintetiza. Por "purificado", se quiere decir que se ha incrementado en pureza, en donde "pureza" es un término relativo, y no debe considerarse como pureza absoluta. "Moléculas de ácido nucleico", pretende abarcar un polímero de ADN (por ejemplo, ADNc o ADN genómico) o ARN (por ejemplo, ARNm), es decir, un polinucleótido, el cual puede ser una sola hebra o de doble hebra, que puede comprender oligonucleótidos de ADN/ARN quiméricos, y que pueden contener nucleotidos no naturales o alterados. En una modalidad, se proporciona una molécula de ácido nucleico aislada o purificada que comprende (i) la secuencia nucleotídica de la SEQ ID NO: 1 [ZmKRPI], (ii) una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 [ZmKRPI], (¡ii) una secuencia nucleotídica que codifica una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente 70% (o 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 99%) idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 [ZmKRPI] y que tiene una actividad similar al inhibidor de la CDK, o (iv) un fragmento de cualquiera de (i)-(iii), en donde el fragmento comprende al menos aproximadamente 35 (o 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 o más) nucleótidos contiguos. En otra modalidad, se proporciona una molécula de ácido nucleico aislada o purificada que comprende (i) la secuencia nucleotídica de la SEQ ID NO: 3 [ZmKRP2], (ii) una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4 [ZmKRP2], (iii) una secuencia nucleotídica que codifica una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente 70% (o 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 99%) idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4 [ZmKRP2] y que tiene una actividad similar al inhibidor de la CDK, o (iv) un fragmento de cualquiera de (i)-(i¡¡), en donde el fragmento comprende al menos aproximadamente 35 (o 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 o más) nucleótidos contiguos. En aún otra modalidad, la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada o purificada que consiste esencialmente de (i) la secuencia nucleotídica de la SEQ ID NO: 7 [ZmKRP4], (ii) una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8 [ZmKRP4], o (iii) una secuencia nucleotídica que codifica una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente 70% (o 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 99%) idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8 [ZmKRP4] y que tiene una actividad similar al inhibidor de la CDK. En aún otra modalidad, la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada o purificada que comprende (i) la secuencia nucleotídica de la SEQ ID NO: 9 [ZmKRP5], (ii) una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10 [ZmKRP5], (iii) una secuencia nucleotídica que codifica una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente 70% (o 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 99%) idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10 [ZmKRP5] y que tiene una actividad similar al inhibidor de la CDK, o (iv) un fragmento de cualquiera de (i)-(iii), en donde el fragmento comprende al menos aproximadamente 120 (o 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200 o más) nucleótidos contiguos. También se proporciona una molécula de ácido nucleico aislada o purificada que comprende (i) la secuencia nucleotídica de la SEQ ID NO: 11 [ZmKRP6], (ii) una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 12 [ZmKRP6], (iii) una secuencia nucleotídica que codifica una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente 70% (o 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 99%) idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 12 [ZmKRP6] y que tiene una actividad similar al inhibidor de la CDK, y (iv) un fragmento de cualquiera de (i)-(iv), en donde el fragmento comprende al menos aproximadamente 390 (o 400, 405, 410, 415, 420, 425, 430, 435, 440, 445, 450, 455, 460, 465, 470, 475, 480, 485, 490, 495, 500 o más) nucleótidos contiguos. Tales moléculas de ácido nucleico pueden amplificarse utilizando ADNc, ARNm o ADN genómico como un patrón y iniciadores oligonucleotídicos apropiados, de acuerdo con las técnicas de amplificación estándar de PCR. De manera alterna, pueden sintetizarse utilizando técnicas sintéticas estándar, tales como un sintetizador automatizado de ADN. Las moléculas de ácido nucleico aisladas o purificadas anteriores, están caracterizadas, en parte, en términos de "porcentaje de identidad de la secuencia". A este respecto, una molécula de ácido nucleico dada puede compararse con una molécula de ácido nucleico descrita anteriormente (es decir, la secuencia de referencia), alineando de manera óptima las secuencias de ácidos nucleicos sobre una ventana de comparación, en donde la porción de la secuencia polinucleotídica en la ventana de comparación puede comprender adiciones o supresiones (es decir, huecos), en comparación con la secuencia de referencia, que no comprende adiciones o supresiones, para la alineación óptima de las dos secuencias. El porcentaje de identidad de la secuencia se calcula determinando el número de posiciones en las cuales aparecen las bases de ácidos nucleicos idénticas en ambas secuencias, es decir, el número de posiciones coincidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes entre el número total de posiciones en la ventana de comparación, y multiplicando el resultado por 100, para proporcionar el porcentaje de identidad de la secuencia. La alineación óptima de las secuencias para la comparación puede realizarse mediante implementaciones computarizadas de algoritmos conocidos. Las alineaciones de la secuencia y los cálculos del por ciento de identidad pueden realizarse mediante el Algoritmo Clustal (Higgins et al., CABIOS, 5 (2): 151 -153 (1989)), utilizando los parámetros predeterminados del programa Megalign de la serie de cálculo de bioinformática LASARGENE (DNASTAR Inc., Madison, Wl), referida aquí posteriormente como "Algoritmo Clustal W". Otras implementaciones computarizadas incluyen GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el Paquete Wisconsin GCG (Accelrys, San Diego, CA), o BlastN y BlastX, disponibles del Centro Nacional de Información de Biotecnología, Bethesda, MD). Además, la alineación puede realizarse mediante inspección. Las secuencias se comparan típicamente utilizando BESTFIT o BlastN con los parámetros predeterminados. Un método preferido para determinar la identidad es el Algoritmo Clustal W, de acuerdo con los parámetros expuestos en el Ejemplo 1. Alguien con experiencia ordinaria en la técnica apreciará, sin embargo, que las dos secuencias polinucleotídicas pueden ser sustancialmente diferentes a nivel de los ácidos nucleicos, aunque codifiquen secuencias de aminoácidos sustancialmente similares, sino idénticas, debido a la degeneración del código genético. La presente invención pretende abarcar tales secuencias polinucleotídicas. A este respecto, deberá notarse que los fragmentos de las moléculas de ácido nucleico descritas anteriormente, pueden utilizarse como sondas para identificar otras secuencias polinucleotídicas. Una molécula de ácido nucleico aislada o purificada que comprende o consiste esencialmente de una secuencia complementaria o antisentido (o fragmento de la misma), tal como una que comprende al menos aproximadamente 35 nucleótidos contiguos), a una molécula de ácido nucleico aislada o purificada descrita anteriormente, así como a las SEQ ID NOS: 13, 15 y 17, y también se proporcionan las secuencias nucleotídicas que codifican las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOS: 6, 14, 16 y 18. La molécula de ácido nucleico aislada o purificada está opcionalmente en la forma de un vector. Si se desea, una molécula de ácido nucleico aislada o purificada descrita anteriormente, puede enlazarse de manera operativa a un promotor. Los promotores incluyen, de manera no exclusiva, promotores que funcionan en células de bacterias, bacteriófagos, plástidos o plantas, incluyendo promotores que se expresan de manera preferida en el tejido reproductor masculino. Cualquier promotor adecuado puede utilizarse como se describe a continuación en la presente. Los ejemplos de tales promotores incluyen, de manera no exclusiva, el promotor SILKY1 del maíz (Ambrose et al., Molec. Cell, 5(3):569-579 (2000)), el promotor NTM19 del tabaco (Oldenhof et al., Plant Molec. Biol., 31 :213-225 (1996); Patente de E.U.A. 6,407,314; y WO 97/30166), el promotor NPG1 del tabaco {véase, por ejemplo, la Publicación de la Solicitud de E.U.A. 2003/0061635), el promotor PCA55 del maíz (véase, por ejemplo, WO 92/13957), el promotor AP3 de Arabidopsis (Zhou et al., Planta, 215:248-257 (2002)), y el promotor Bgp1 de Brassica (Zhou et al. (2002), infra). Otros ejemplos incluyen un promotor preferido de la antera, tal como aquél de LAT52 (Twell et al., Molec. Gen. Genet, 217(2-3) :240-245 (1989); y Twell et al., Genes Dev., 5(3):496-507 (1991)) o el RA8 del arroz (Jeon et al., Plant Mol. Biol., 39(1):35-44 (1999)), un promotor preferido del polen, tal como aquél del maíz Zm13 (Guerrero et al., Molec. Gen. Genet, 224:161-168 (1993)) o el arroz PS1 (Zou ef al., Amer. J. Bol, 81(5):552-561 (1994)), y un promotor preferido de la microespora, tal como aquél de apg (preferido de la antera; Twell ef al., Sex. Plant. Repro., 6:2 7-224 ( 993)). En algunos casos, puede ser deseable un promotor que se exprese de manera preferida en el tejido reproductor masculino de! maíz {véase, por ejemplo, el Ejemplo 5). Si se desea, una molécula de ácido nucleico aislada o purificada puede enlazarse de manera operativa a un promotor. Los promotores de la presente invención incluyen generalmente, de manera no exclusiva, promotores que funcionan en células de bacterias, bacteriófagos o plantas. Los promotores útiles para la expresión bacteriana son los promotores lacZ, Sp6, T7, T5 o glg C de E. coli. Los promotores útiles para las células de plantas incluyen el promotor de la globulina {véase, por ejemplo, Belanger y Kriz, Genet, 129:863-872 (1991)), el promotor gamma de la zeína Z27 {véase, por ejemplo, Lopes et al., Mol. Gen. Genet, 247:603-613 (1995)), el promotor L3 de la oleosina (Patente de E.U.A. 6,433,252), el promotor PER1 de la cebada (Stacey ef al., Plant Mol. Biol., 31 :1205-1216 (1996), los promotores preferidos del embrión tales como P-Zm.CEP1 , P-Zm.CPC214, P-Zm.CPC214tr1 , P-Zm.CPC214tr2 o P-Os.CPC214 (Solicitud Provisional de E.U.A. No. 60/531 ,483), incorporada en la presente como referencia, promotores USP (Publicación de la Solicitud de E.U.A. No. 2003/229918), incorporada en la presente como referencia, el promotor 7Sa, el promotor 7S ' (véase, por ejemplo, Beachy eí al., EMBO J., 4:3047 (1985) o Schuler eí al., Nucleic Acid Res., 10(24):8225-8244 (1982)), el promotor CaMV 35S (Odell eí al., Nature, 313:810 (1985)), el CaMV 19S (Lawton eí al., Plant Mol. Biol., 9:31 F (1987)), nos (Ebert eí al., PNAS U.S.A., 84:5745 (1987)), Adh (Walker eí al., PNAS U.S.A., 84:6624 (1987)), sucrosa sintasa (Yang eí al., PNAS U.S.A. 87:4144 (1990)), tubulina, actina (Wang eí al., Mol. Cell. Biol., 12:3399 (1992)), cab (Sullivan eí al., Mol. Gen. Genet, 215:431 (1989)), el promotor de la PEPCasa (Hudspeth eí al., Plant Mol. Biol., 12:579 (1989)), o aquéllos asociados con el complejo del gen R (Chandler eí al., The Plant Cell, 1 :1175 (1989)). El promotor del Virus del Mosaico de la Escrofularia (FMV) (Richins eí al., Nucleic Acids Res., 20:8451 (1987)), los promotores de arcelina, jitomate E8, patatina, ubiquitina, mannopina sintasa (mas), glicinina (Gly) de proteína de semilla de soya y la proteína del almacenamiento vegetativo de soya (vsp) son otros ejemplos de promotores útiles. En una modalidad preferida, el promotor utilizado se expresa en gran medida en el tejido del germen y/o de la aleurona. Los promotores preferidos conocidos para funcionar en el maíz y en otras plantas, incluyen los promotores para las oleosinas (por ejemplo, el promotor L3, Patente de E.U.A. 6,433,252), el promotor de la globulina (véase, por ejemplo, Belanger y Kriz, Genet, 129:863-872, 1991), el promotor de peroxirredoxina de cebada (Perl , Stacy eí al., Plant Mol. Biol., 31:1205-1216, Acceso #X96551), los promotores preferidos del embrión tales como P-Zm.CEP1 , P-Zm.CPC214, P- Zm.CPC214tr1, P-Zm.CPC214tr2 o P-Os.CPC214 (Solicitud Provisional de E.U.A. No. 60/531 ,483), incorporada en la presente como referencia, o el promotor de la MIP sintasa del maíz (WO 01/40440 A2). Los ejemplos de promotores altamente expresados en el endosperma incluyen promotores de genes que codifican zeínas, las cuales son un grupo de proteínas de almacenamiento encontradas en el endosperma de maíz. Se han aislado clonas genómicas para los genes de la zeína (Pedersen et al., Cell, 29:1015-1026 (1982) y Russell et al., Transgenlc Res., 6(2): 157-168 (1997)), y pueden utilizarse los promotores de estas clonas, incluyendo los genes de 15 kD, 16 kD, 19 kD, 22 kD y 27 kD genes. Otros promotores preferidos, conocidos por funcionar en el maíz y en otras plantas, incluyen los promotores para los siguientes genes: waxy (almidón sintasa unida al gránulo), Bríttle y Shrunken 2 (ADP glucosa pirofosforilasa), Shrunken 1 (sucrosa sintasa), enzimas ramificantes I y II, almidón sintasas, enzimas desramificantes, oleosinas, glutelinas, sucrosa sintasas (Yang et al., PNAS U.S.A., 87:4144-4148 (1990)), BetU (capa de transferencia del endosperma basal) y globulina! Otros promotores útiles en la práctica de la invención que son conocidos por alguien con experiencia en la técnica, también están contemplados por la invención. Además, los mejoradores o duplicados de los mejoradotes de la transcripción, pueden utilizarse para incrementar la expresión de un promotor particular. Los ejemplos de tales mejoradotes incluyen, de manera no exclusiva, el intrón 1 Adh (Callis et al., Genes Develop., 1 :1183 (1987)), un intrón de actina de arroz (McEIroy et al., Mol. Gen. Genet, 231 (1):150-160 (1991)) (Patente de E.U.A. 5,641 ,876), el intrón de la sucrosa sintasa (Vasil et al., Plant Physiol., 91 :5175(1989)), un intrón HSP70 de maíz (Rochester et al., EMBO J., 5:451-458 (1986)) un elemento TMV omega (Gallie et al., The Plant Cell, 1 :301 (1999)), el mejorador CaMV 35S o un mejorador de la octopina sintasa (Last et al., Patente de E.U.A. 5,290,924). Puesto que la secuencia de ADN entre el sitio de inicio ds la transcripción y el Inicio de la secuencia codificante, es decir, la secuencia líder no traducida, puede influenciar la expresión del gen, alguien también podría desear emplear una secuencia líder particular. Puede emplearse cualquier secuencia líder disponible para alguien con experiencia en la técnica. Las secuencias líder preferidas dirigen los niveles óptimos de expresión del gen unido, por ejemplo, incrementando o manteniendo la estabilidad del ARNm o evitando el inicio inapropiado de la traducción (Joshi, Nucí. Acid Res., 15:6643 (1987)). La elección de tales secuencias es a discreción de aquellos con experiencia en la técnica. Están contempladas las secuencias que se derivan de genes que se expresan altamente en plantas superiores, y en la soya, maíz y cañóla en particular. Un promotor inducible puede encenderse o apagarse por un agente agregado exógeno, de manera que la expresión de un ácido nucleico enlazado de manera operativa también se enciende o apaga. Por ejemplo, un promotor bacteriano, tal como el promotor Ptac, puede inducirse a niveles variables de expresión del gen, dependiendo del nivel de isotiopropilgalactosida agregada a las células bacterianas transformadas. En las plantas, los promotores inducibles pueden utilizarse en aquellos casos en donde la expresión de un gen dado se desea después de que una planta hospedera a alcanzado la madurez. Tales promotores inducibles incluyen promotores del choque por calor, promotores de respuesta a las agresiones y promotores inducibles químicamente. Los casetes de expresión de la invención también incluirán una secuencia cercana al extremo 3' del cásete que actúa como una señal para terminar la transcripción de un ácido nucleico heterólogo y que dirige la poliadenilación del ARNm resultante. Esto se refiere comúnmente como las regiones no traducidas 3' o UTR 3'. Algunos elementos 3' que pueden actuar como señales de terminación de la transcripción incluyen aquéllos del gen de la nopalina sintasa de Agrobacterium tumefaciens (Bevan et al., Nucí. Acid Res., 11 :369 (1983)), una región no traducida 3' de napina (Kridl et al., Seed Sci Res., 1 :209-219 (1991)), una región no traducida 3' de globulina (Belanger y Kriz, Genetics, 129:863-872 (1991)), o una de un gen de maíz, tal como Z27 (Lopes et al., Mol Gen Genet, 247:603-613 (1995)). Otros elementos 3' conocidos por alguien con experiencia en la técnica, también pueden utilizarse en los vectores de la invención. La presente invención proporciona además un vector que comprende una molécula de ácido nucleico aislada o modificada descrita anteriormente. Una molécula de ácido nucleico como la descrita anteriormente puede clonarse en un vector adecuado y puede utilizarse para transformar o transfectar cualquier hospedero adecuado. La sección de los vectores y métodos para construirlos. La selección de los vectores y métodos para construirlos se conocen comúnmente por las personas con experiencia ordinaria en la técnica, y se describen en las referencias técnicas generales (véase, en general, "Recombinant DNA Part D", Methods in Enzymology, Vol. 153, Wu y Grossman, eds., Academic Press (1987)). De manera deseada, el vector comprende secuencias reguladoras, tales como los codones de inicio y terminación de la transcripción y la traducción, los cuales son específicos para el tipo de hospedero (por ejemplo, bacterias, hongos o plantas), en el cual pueden introducirse los vectores, conforme sea apropiado, y tomando en consideración si el vector es ADN o ARN. Los constructos de vectores, que son circulares o lineales, pueden prepararse para contener una secuencia de ácido nucleico completa como se describió anteriormente o una porción de la misma, ligada a un sistema de replicación funcional en una célula hospedera procariótica o eucariótica. Los sistemas de replicación pueden derivarse de ColE1, 2 plásmido 2 ??µ, fago ?, fago filamentoso f1 , especies de Agrobacterium (por ejemplo, Ag. tumefaciens y Ag. rhizogenes), y lo similar. Además del sistema de replicación y el ácido nucleico insertado, el constructo puede incluir uno o más genes marcadores, que permiten la selección de hospederos transformados o transfectados. Los genes marcadores incluyen resistencia a biocidas, por ejemplo, resistencia a antibióticos, metales pesados, herbicidas; efe., un complemento en un hospedero auxoírópico para proporcionar prototrofía y lo similar.

Los vectores adecuados incluyen aquéllos diseñados para la propagación o expresión o ambas. Un vector de clonación preferido se selecciona del grupo que consiste de la serie pUC, la serie pBluescript (Stratagene, LaJolla, CA), la serie pET (Novagen, adison, Wl), la serie pGEX (Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia), y la serie pEX (Clonetech, Palo Alto, CA). También pueden utilizarse vectores de bacteriófagos, tales como XGT10, ?T?? ? , XZapll (Stratagene), ? EMBL4 y ? NM1149. Los ejemplos de vectores de expresión de plantas incluyen pBI101 , pBI101.2, pBI101.3, pBI121 y pBIN19 (Clonetech, Palo Alto, CA). Los ejemplos de vectores de expresión de levadura incluyen pYES2.1 , pYES2 y otros derivados de pYES (Invitrogen, Carlsbad, CA). Un vector de expresión de planta puede comprender un promotor nativo o no nativo enlazado de manera operativa a una molécula de ácido nucleico descrita anteriormente. La selección de los promotores, por ejemplo, fuerte, débil, inducible, específico del tejido (es decir, expresado de manera específica preferida en un tejido), específico del órgano (es decir, expresado de manera específica o preferida en un órgano) y específico del desarrollo (es decir, expresado de manera específica o preferida durante una etapa particular de desarrollo), está dentro de la experiencia en la técnica. De manera similar, la combinación de una molécula de ácido nucleico como la descrita anteriormente con un promotor, también está dentro de la experiencia en la técnica (véase, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989)). Si se desea sobrerregular la expresión de un gen similar a un inhibidor de la CDK, es decir, incrementar la expresión de un gen similar al inhibidor de la CDK por cualquier medio, tal como por aproximadamente dos veces, diez veces, 100 veces o más a nivel del ARNm o nivel de proteína, se prefiere hacerlo introduciendo un gen que codifique un polipéptido similar al inhibidor de la CDK como se proporciona en la presente. El gen se introduce de manera preferida por medio de un vector. Se prefiere que mucho del inhibidor se exprese en el tejido de interés. Pueden introducirse múltiples copias adicionales del gen en la célula de planta, tejido de planta, el órgano de la planta o una planta o un vector que comprende un promotor fuerte, tal como un promotor, el cual se expresa de manera preferida o específica en el tejido reproductor masculino, se introduce en la célula de planta, el tejido de planta, el órgano de la planta o la planta, de manera que el gen se expresa a una velocidad más alta, generando por lo tanto más ARNm, lo cual a su vez, se traduce en más de la proteína codificada. Como se utiliza en la presente, "supresión" o "que suprime", significa cualquiera de los métodos bien conocidos para suprimir un transcripto o una proteína de un gen, incluyendo la supresión postranscripcional de un gen y la supresión transcripcional. La supresión postranscripcional del gen es mediada por el ARN transcrito que tiene homología con un gen seleccionado para la supresión. El ARN transcrito del transgen de supresión, de manera preferida tiene un componente de doble hebra para efectuar lo que se llama interferencia del ARN (ARNi). La supresión transcripcional está mediada por un ARN transcrito de doble hebra que tiene homología con una secuencia promotora de ADN para efectuar lo que se llama la supresión trans del promotor. Más particularmente, la supresión postranscripcional del gen por el ARN de doble hebra puede resultar de la transformación de la planta con constructos de ADN antisentido, como se describe por Shewmaker et al. (Patentes de E.U.A. 5,107,065 y 5,759,829), de la transformación de una planta con un constructo de ADN orientado hacia el sentido como se describe por Jorgensen et al. (Patentes de E.U.A. 5,283,184 y 5,231 ,020), o con un constructo de ARNi, como se describe por Redenbaugh et al. (Safety Assessment of Genetically Engineered Flavr Savr™ Tomato, CRC Press, Inc., 1992), por Goldbach et al. (EP 0426195 A1 , 1991), por Sijen et al. (The Plant Cell, 8:2277-2294, 1996), por Waterhouse et al. (WO 99/53050), por Graham et al. (WO 99/49029), por Lowe et al. (Publicación de la Solicitud de E.U.A. No. 2003/0175965 A1), por Fillatti (Publicación de Patente de E.U.A. No. 10/465,800), por Plaetinck et al. (Publicación de la Solicitud de E.U.A. No. 2003/0061626 A1), por Liu et al. (Patente de E.U.A. 6,326,193), por Agrawal et al. (WO 94/01550), por Werner et al. (WO 98/05770), por Oeller (Publicación de la Solicitud de E.U.A. No. 2002/0048814 A1), por Gutterson et al. (Publicación de la Solicitud de E.U.A. No. 2003/0018993 A1), y por Glassman et al. (Publicación de la Solicitud de E.U.A. No. 2003/0036197 A1).

Todas las patentes, solicitudes y publicaciones internacionales descritas anteriormente que describen materiales y métodos para la supresión del gen postranscripcional en las plantas, se incorporan en la presente como referencia. La supresión transcripcional tal como una supresión trans del promotor puede efectuarse expresando un constructo de ADN que comprende un promotor enlazado de manera operativa a repeticiones invertidas del ADN promotor para un gen objetivo. Los constructos útiles para la supresión del gen mediada por la supresión trans del promotor, se describen por Mette et al., The EMBO Journal, 18(1):241-148, 1999 y Mette et al., The EMBO Journal, 9(19):5194-5201 , 2000, ambas de las cuales se incorporan en la presente como referencia. Un método preferido de la supresión postranscripcional del gen en las plantas emplea ARN transcrito orientado en la dirección sentido u orientado en la dirección antisentido, el cual está estabilizado, por ejemplo, con una estructura terminal de horquilla. Un constructo de ADN preferido para efectuar la supresión postranscripcional del gen se transcribe a un segmento del ARN orientado en la dirección antisentido que tiene homología con un gen seleccionado para la supresión, en donde el segmento de ARN antisentido es seguido en el extremo 3' por un segmento de ARN más corto, contiguo, complementario, en la orientación sentido. El uso de oligonucleótidos de ARN antisentido autoestabilizados en plantas se describe en la WO 94/01550 (Agrawal et al.). Véase también WO 98/05770 (Werner et al.), en donde el ARN antisentido se estabiliza mediante repeticiones que forman horquillas de poli(CG) nucleótidos. Véase también la Publicación de la Solicitud de E.U.A. No. 2002/0048814 A1 (Oeller), en donde el ARN sentido o antisentido se estabiliza mediante una cola de poli(T)-poli(A). Véase también la Publicación de la Solicitud de E.U.A. No. 2003/0018993 A1 (Gutterson et al.), en donde el ARN sentido o antisentido se estabiliza mediante una repetición invertida de una subsecuencia de un gen NOS. Véase también la Publicación de la Solicitud de E.U.A. No. 2003/0036197 A1 (Glassman et al.), en donde el ARN que tiene homología con un objetivo se estabiliza por 2 regiones de ARN complementarias. Todas las patentes, solicitudes y publicaciones internacionales descritas anteriormente, que describen los materiales y métodos para emplear ARN estabilizado y su uso en la supresión de genes en plantas, se incorpora en la presente como referencia. La supresión transcripcional tal como la supresión trans de promotor puede efectuarse expresando un constructo de ADN que comprende un promotor enlazado de manera operativa a repeticiones invertidas del ADN promotor para un gen objetivo. Los constructos útiles para tal supresión del gen mediada por la supresión trans del promotor se describen por Mette et al., The EMBO Journal, 18(1):241-148, 1999 y Mette et al., The EMBO Journal, 19(19):5194-5201 , 2000, ambas de las cuales se incorporan en la presente como referencia. Aún otro método es el uso de un muíante negativo dominante. Por ejemplo, un muíante negativo dominante de un polipéptido que tiene una actividad similar al inhibidor de la CDK como se describe en la presente, puede generarse suprimiendo completa o parcialmente la secuencia codificante C terminal, en particular toda o parte de la secuencia codificante C terminal que está altamente conservada entre los polipéptidos descritos en la presente. El mutante resultante puede enlazarse de manera operativa a un promotor, tal como un promotor específico del embrión de maíz, por ejemplo, y clonarse en un vector para la introducción en una planta de maíz o parte de la misma. Véase, por ejemplo, Jasinski et al., Plant Physiol., 130:1871-1882 (2002)). También se ha reportado que las ribozimas tienen uso como medios para inhibir la expresión de los genes endógenos en las plantas (véase, por ejemplo, Merlo et al., Plant Cell, 10(10): 1603-1622 (1998)). Es posible diseñar ribozimas que se aparean específicamente con virtualmente cualquier ARN objetivo y escinden la cadena principal de fosfodiéster en una ubicación específica, inactivando funcionalmente por lo tanto el ARN objetivo. Al llevar a cabo esta escisión, la ribozima no se altera en sí misma, y por lo tanto, es capaz de reciclar y escindir otras moléculas, haciéndola una enzima verdadera. La inclusión de las secuencias de ribozima dentro de los ARN antisentido les confiere actividad de escisión del ARN, incrementando por lo tanto la actividad de los constructos. El diseño y uso de las ribozimas específicas del ARN objetivo se describe en Haseloff et al., Nature, 334:585-591 (1988). De manera preferida, la ribozima comprende al menos aproximadamente 20 nucleótidos continuos complementarios a la secuencia objetivo en cada lado del sitio activo de la ribozima. De manera alterna, pueden utilizarse sistemas genéticos inversos, los cuales son bien conocidos en la técnica, para generar y aislar mutantes suprimidos o nulos. Un sistema tal, el Trait Utility System for Corn, es decir, TUSC, se basa en sistemas exitosos de otros organismos (Baiiinger et al., PNAS U.S. A., 86:9402-9406 (1989); Kaiser et al., PNAS U.S. A. 87:1686-1690 (1990); y Rushforth et al., Mol. Cell. Biol., 13:902-910 (1993)). La característica central del sistema es identificar las inserciones del transposón Mu dentro de una secuencia de ADN de interés, anticipando que al menos algunos de estos alelos de inserción serán mutantes. Para desarrollar el sistema en el maíz, se recolectó el ADN de una gran población de existencias del transposón Mutador, que a continuación se autopolinizaron para producir la semilla F2. Para encontrar las inserciones del transposón Mu dentro de una secuencia de ADN específica, la colección de las muestras de ADN se selecciona vía PCR utilizando un iniciador específico del gen y un iniciador que se recoce a las repeticiones invertidas de los transposones Mu. Se espera un producto de la PCR sólo cuando el ADN patrón viene de una planta que contiene una inserción del transposón Mu dentro del gel objetivo. Una vez que tal muestra del ADN se identifica, la semilla F2 de la planta correspondiente se selecciona para un alelo de inserción del transposón. Las mutaciones de inserción del transposón de un gen an1 se han obtenido vía el procedimiento TUSC (Bensen et al., Plant Cell, 7:75-84 (1995)). Este sistema es aplicable a otras especies de plantas, modificado a veces conforme es necesario de acuerdo con el conocimiento y experiencia en la técnica. La mutagénesis insercional del T-ADN puede utilizarse para generar mutaciones ¡nsercionales en uno de los genes mencionados anteriormente para afectar de manera adversa la expresión de un gen dado. Las líneas de plantas marcadas con T-ADN pueden seleccionarse utilizando PCR. Por ejemplo, un iniciador puede diseñarse para un extremo del T-ADN y otro iniciador puede diseñarse para el gen de interés y ambos iniciadores pueden utilizarse en la PCR. Si no se obtiene un producto de la PCR, entonces no hay inserción en el gen de interés. En contraste, si se obtiene un producto de la PCR, entonces hay una inserción en el gen de interés. Las mutaciones insercionales, sin embargo, con frecuencia generan alelos nulos, los cuales pueden ser letales. De manera alterna, si hay más de un gen que codifica una enzima dada, una mutación en uno de los genes puede no resultar en una expresión disminuida de la enzima codificada por el gen. Otro método alterno para disminuir la expresión de un gen dado, es utilizar un compuesto que inhiba la expresión de uno de los genes mencionados anteriormente o que inhiba la actividad de la proteína codificada por uno de los genes mencionados anteriormente. A este respecto, pueden utilizarse rayos x, radiación gamma, así como mutágenos químicos, tales como sulfonato de etil metilo (EMS) o ácido dimetil butírico (DMB). Además de lo anterior, puede utilizarse la tecnología de reemplazo del gen para incrementar o disminuir la expresión de un gen dado.

La tecnología de reemplazo del gen se basa en la recombínación homologa (véase, Schnable et al., Curr. Opinions Plant Biol., 1 :123 (1998)). El ácido nucleico de la enzima de interés puede manipularse mediante mutagénesis (por ejemplo, inserciones, supresiones, duplicaciones o reemplazos), para incrementar o disminuir la función enzimática. La secuencia alterada puede introducirse en el genoma para reemplazar el gen existente, por ejemplo, del tipo silvestre, vía recombinación homologa (Puchta y Hohn, Trends Plant Sci., 1 :340 (1996); Kempin et al., Nature, 389:802 (1997)). La actividad de un polipéptido similar al inhibidor de la CDK dado puede medirse in vitro. Por ejemplo, puede medirse la capacidad de un polipéptido similar a un inhibidor de la CDK dado para evitar la fosforilación de las histonas H1 por la CDK (véase, por ejemplo, el Ejemplo 14). Si un polipéptido similar al inhibidor de la CDK dado afecta o no la expresión de otros genes, puede determinarse utilizando una planta transgénica, por ejemplo. Conforme la tecnología de circuito integrado de microarreglo se establece y se vuelve disponible (DeRisi et al., Science, 278:680-686 (1997)), el efecto de una alteración genética dada en la expresión de todos los genes identificados del maíz puede determinarse utilizando circuitos integrados de microarreglo. Pueden realizarse estudios de radiomarcadores metabólicos para medir la generación de diferentes colecciones del producto in vivo. En tales estudios, los precursores marcados radiactivamente se proporcionan a los tejidos intactos y la marca radioactiva se verifica conforme el precursor se metaboliza. Comparando las plantas del tipo silvestre y las plantas que tienen actividades reducidas de uno de los genes del polipéptido similar a un inhibidor de la CDK, puede determinarse el efecto de la reducción en un polipéptido similar a un inhibidor de la CDK dado. En vista de lo anterior, la presente invención proporciona una célula hospedera que comprende una molécula de ácido nucleico aislada o modificada descrita anteriormente, opcionalmente en la forma de un vector. Los hospederos adecuados incluyen células de bacterias, levadura y plantas, incluyen E. coli, B. subtílis, A. tumefaciens, S. cerevisiae y N. crassa. Los hospederos de E. coli incluyen TB-1 , TG-2, DH5 , XL-Blue MRF' (Stratagene, Austin, TX), SA2821 , Y1090 y TG02. Las células de planta incluyen células de maíz. También en vista de lo anterior, la presente invención proporciona un polipéptido aislado o purificado codificado por una molécula de ácido nucleico aislada o purificada descrita anteriormente. El polipéptido comprende de manera preferida un extremo amino y un extremo carboxilo. El polipéptido puede comprender D aminoácido, L aminoácidos o una mezcla de D y L aminoácidos. La forma D de los aminoácidos, sin embargo, es particularmente preferida, puesto que se espera que una proteína comprendida de D aminoácidos tenga una mayor retención de su actividad biológica in vivo, dado que los D aminoácidos no se reconocen por las proteasas naturales. Pueden hacerse alteraciones de una secuencia nativa de aminoácidos para producir polipéptidos variantes, mediante una variedad de medios conocidos por aquellos con experiencia ordinaria en la técnica. Por ejemplo, pueden introducirse de manera conveniente sustituciones de aminoácidos en los polipéptidos al momento de la síntesis. De manera alterna, pueden introducirse mutaciones específicas del sitio ligando en un vector de expresión un oligonucleótido sintetizado que comprende el sitio modificado. De manera alterna, pueden utilizarse procedimientos de mutagénesis dirigida al oligonucleótido, específica del sitio, tales como los descritos en Walder et al., Gene, 42:133 (1986); Bauer et al., Gene, 37:73 ( 985); y en las Patentes de E.U.A. 4,518,584 y 4,737,462. Esta dentro del conocimiento del experto ordinario, seleccionar los aminoácidos sintéticos y naturales que efectúan sustituciones conservadoras o neutras para cualesquier aminoácidos naturales particulares. El experto con experiencia ordinaria, de manera deseable, considerará el contexto en el cual se hace cualquier sustitución de un aminoácido particular, además de considerar la hidrofobicidad o polaridad de la cadena lateral, el tamaño general de la cadena lateral y el valor de pK de las cadenas laterales con carácter ácido o básico bajo condiciones fisiológicas. Por ejemplo, la lisina, arginina e histidina con frecuencia se sustituyen de manera adecuada unas por otras, y con más frecuencia la arginina y la histidina. Como se conoce en la técnica, esto es debido a que los tres aminoácidos tienen cadenas laterales básicas, mientras que el valor de pK de las cadenas laterales de la lisina y la arginina, es mucho más cercano uno del otro (aproximadamente 0 y 12) que a la histidina (aproximadamente 6). De manera similar, la glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina con frecuencia se sustituyen de manera adecuada unas con otras, con la condición de que la glicina con frecuencia no se sustituye de manera adecuada con otros miembros del grupo. Esto es debido a que cada uno de estos aminoácidos es relativamente hidrofóbico cuando se incorpora en un polipéptido, pero la carencia de la glicina de un carbono a permite los ángulos de rotación phi y psi (alrededor del carbono a), de manera que los residuos con mucha más libertad conformacional que la glicina pueden provocar cambios en ia conformación o la estructura secundaria que no ocurren con frecuencia cuando los otros aminoácidos se sustituyen unos con otros. Otros grupos de aminoácidos frecuentemente sustituidos de manera adecuada unos con otros incluyen, de manera no exclusiva, el grupo que consiste de ácido glutámico y aspártico; el grupo que consiste de fenilalanina, tirosina y triptofano; y el grupo que consiste de serina, treonina y opcionalmente, tirosina. Además, el experto con experiencia ordinaria puede agrupar fácilmente aminoácidos sintéticos con aminoácidos naturales. Si se desea, los polipéptidos pueden modificarse, por ejemplo, mediante glucosilación, amidación, carboxilación o fosforilación o mediante la creación de sales de adición de ácido, amidas, ésteres, en particular ésteres C terminales y derivados de N acilo de los polipéptidos de la invención. Los polipéptidos también pueden modificarse para crear derivados de proteína formando complejos covalentes o no covalentes con otras porciones, de acuerdo con los métodos conocidos en la técnica. Los complejos unidos de manera covalente, pueden prepararse enlazando las porciones químicas a los grupos funcionales en las cadenas laterales de los aminoácidos que comprenden los polipéptidos, o en el término N o C. De manera deseable, tales modificaciones y conjugaciones no afectan de manera adversa la actividad de los polipéptidos (y las variantes de los mismos). Aunque tales modificaciones y conjugaciones pueden tener una actividad mayor o menor, la actividad de manera deseable, no se niega, y es característica del polipéptido inalterado. Los polipéptidos (y fragmentos, variantes y proteínas de fusión), pueden prepararse mediante varias técnicas convencionales. El polipéptido puede aislarse o purificarse de una fuente natural o de una fuente recombinante. Por ejemplo, en el caso de proteínas recombinantes, un fragmento de ADN que codifica una proteína deseada puede subclonarse en un vector apropiado utilizando técnicas de genética molecular bien conocidas (véase, por ejemplo, Maniatis et al., Molecular Cloninq: A Laboratorv Manual, 2a ed. (Cold Spring Harbor Laboratory, 989), y otras referencias citadas en la presente bajo "EJEMPLOS"). El fragmento puede transcribirse y la proteína traducirse posteriormente in vitro. También pueden emplearse equipos comercialmente disponibles (por ejemplo, tales como los fabricados por Clontech, Palo Alto, CA; Amersham Life Sciences, Inc., Arlington Heights, IL; InVitrogen, San Diego, CA, y lo similar). Opcionalmente, puede emplearse la reacción en cadena de la polimerasa en la manipulación de ácidos nucleicos. Tales polipéptidos también pueden sintetizarse utilizando un sintetizador de péptidos automatizado, de acuerdo con los métodos conocidos en la técnica. De manera alterna, el polipéptido (y los fragmentos, variantes y proteínas de fusión), puede sintetizarse utilizando técnicas estándar de síntesis de péptidos bien conocidas por aquellos con experiencia ordinaria en al técnica (por ejemplo, como se resume en Bodanszky, Principies of Peptide Synthesis, (Springer-Verlag, Heidelberg: 1984)). En particular, el polipéptido puede sintetizarse utilizando el procedimiento de síntesis en fase sólida (véase, por ejemplo, Merrifield, J. Am. Chem. Soc, 85:2149-54 (1963); Barany et al., Int. J. Peptide Protein Res., 30:705-739 (1987); y la Patente de E.U.A. 5,424,398). Si se desea, esto puede hacerse utilizando un sintetizador de péptidos automatizado. El retiro de los grupos que bloquean los aminoácidos de t-butiloxicarbonilo (t-BOC) o 9-fluorenilmetiloxicarboniIo (Fmoc), y la separación de la proteína de la resina, puede lograrse medíante, por ejemplo, el tratamiento ácido a temperatura reducida. La mezcla que contiene el polipéptido puede extraerse a continuación, por ejemplo, con éter dietílico, para eliminar los compuestos orgánicos no peptídicos, y la proteína sintetizada puede extraerse del polvo de resina (por ejemplo, con aproximadamente 25% peso/volumen de ácido acético). Después de la síntesis del polipéptido, puede hacerse opcionalmente una purificación adicional (por ejemplo, utilizando HPLC), con el fin de eliminar cualesquier proteínas, polipéptidos, péptidos o aminoácidos libres incompletos. El análisis del aminoácido y/o de HPLC puede realizarse en el polipéptido sintetizado para validar su identidad. Para otras aplicaciones de acuerdo con la invención, puede ser preferible producir el polipéptido como parte de una proteína de fusión más grande, ya sea mediante conjugación química o a través de medios genéticos, tal como se conoce por aquellos con experiencia ordinaria en la técnica. A este respecto, la presente invención también proporciona una proteína de fusión que comprende el polipéptido aislado o purificado (o un fragmento del mismo), o una variante del mismo y uno o más de otros polipéptidos/proteínas que tienen cualesquier propiedades deseadas o funciones efectoras. Las moléculas de ácido nucleico, vectores y polipéptidos pueden utilizarse en métodos de agricultura y varios ensayos de selección {véase, por ejemplo, WO 02/28893 y la Patente de E.U.A. 6,215,048). Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico puede utilizarse para expresar, por ejemplo, vía un vector, un polipéptido similar a un inhibidor de la CDK en una célula hospedera, para detectar el ARNm que codifica un polipéptido similar a un inhibidor de la CDK en una muestra biológica, para detectar una alteración genética en un gen que codifica un polipéptido similar a un inhibidor de la CDK, tal como vía un Southern blot, para suprimir un polipéptido similar a un inhibidor de la CDK, o para sobrerregular un polipéptido similar a un inhibidor de la CDK para volver estéril una planta macho o una enana, o para inhibir la formación de ciertos órganos, por ejemplo. Los polipéptidos pueden utilizarse para compensar las deficiencias en los polipéptidos similares al inhibidor de la CDK o para la presencia de polipéptidos similares al inhibidor de la CDK mutados, que tienen actividad reducida o no tienen actividad en una planta de maíz, o para tratar niveles excesivos del sustrato, sean directo o indirectos, para los polipéptidos similares al inhibidor de la CDK en una planta de maíz. De manera alterna, los polipéptidos pueden utilizarse para seleccionar agentes para la capacidad de modular su actividad. En vista de lo anterior, la presente invención proporciona varios constructos de ácidos nucleicos, que pueden utilizarse para suprimir un polipéptido similar a un inhibidor de la CDK. En una modalidad, el constructo de ácidos nucleicos comprende al menos una secuencia nucleotídica transcribible, la expresión de la cual resulta en la supresión de una secuencia nucleotídica endógena seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 1 [ZmKRPI], una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 [ZmKRPI], SEQ ID NO: 3 [ZmKRP2], y una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4 [ZmKRP2], sola o en combinación con al menos otra secuencia nucleotídica transcribible, la expresión de la cual resulta en la supresión de una secuencia nucleotídica endógena seleccionada del grupo que consiste de la SEQ ID NO: 5 [ZmKRP3], una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6 [ZmKRP3], SEQ ID NO: 7 [ZmKRP4], una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8 [ZmKRP4J, SEQ ID NO: 9 [ZmKRP5], una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10 [ZmKRP5], SEQ ID NO: 11 [ZmKRP6], una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 12 [ZmKRP6], SEQ ID NO: 13 [ZmKRP7], una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14 [ZmKRP7], SEQ ID NO: 15 [ZmKRP8], una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 16 [ZmKRP8], SEQ ID NO: 17 [ZmKRP9], y una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 18 [ZmKRP9], en donde, cuando el constructo de ácidos nucleicos comprende dos o más secuencias nucleotídicas transcribibles, las secuencias nucleotídicas pueden estar presentes en cualquier orden en el constructo de ácidos nucleicos y pueden ser policistrónicas, en donde cada secuencia nucleotídica transcribible comprende al menos aproximadamente 100 (o 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 375, 400, 425, 450, 500, 750, 1 ,000, 1 ,500, 2,000 o más) nucleótidos contiguos, y en donde la expresión de cada secuencia nucleotídica transcribible induce opcionalmente la supresión del gen. Por "opcionalmente", se quiere decir que cada secuencia nucleotídica transcribible, independiente de cualquiera y todas las otras secuencias nucleotídicas presentes en el constructo, induce la supresión del gen o no induce la supresión del gen. De manera alterna, el constructo de ácidos nucleicos comprende secuencias nucleotídicas transcribibles, la expresión de las cuales resulta en la supresión de las secuencias nucleotídicas endógenas: (i) SEQ ID NO: 1 [ZmKRPI] o una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 [ZmKRPI], (i¡) SEQ ID NO: 3 [ZmKRP2] o una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4 [ZmKRP2], (iii) SEQ ID NO: 5 [ZmKRP3] o una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6 [ZmKRP3], (iv) SEQ ID NO: 7 [ZmKRP4] o una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8 [ZmKRP4], (v) SEQ !D NO: 9 [ZmKRP5] o una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10 [ZmKRP5], (vi) SEQ ID NO: 11 [ZmKRP6] o una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 12 [ZmKRP6], (vii) SEQ ID NO: 13 [ZmKRP7] o una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14 [ZmKRP7], (viii) SEQ ID NO: 15 [ZmKRP8] o una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 16 [ZmKRP8], y (¡x) SEQ ID NO: 17 [ZmKRP9] o una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 18 [ZmKRP9]. En otra modalidad, el constructo de ácidos nucleicos comprende al menos una secuencia nucleotídica transcribióle, la expresión de la cual resulta en la supresión de una secuencia nucleotídica endógena de la SEQ ID NO: 7 [ZmKRP4] y/o la SEQ ID NO: 17 [ZmKRP9], ya sea una o ambas en combinación adicional con al menos otra secuencia nucleotídica transcribible, la expresión de la cual resulta en la supresión de una secuencia nucleotídica endógena seleccionada del grupo que consiste de: (i) SEQ ID NO: 1 [ZmKRPI] o una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 [ZmKRP2], (ii) SEQ ID NO: 3 [ZmKRP2] o una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4 [ZmKRP2], (iii) SEQ ID NO: 5 [ZmKRP3] o una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6 [ZmKRP3], con la condición de que la secuencia nucleotídica transcribible no corresponde completamente a los nucleótidos 175-342 de la SEQ ID NO: 5, (¡v) SEQ ID NO: 9 [ZmKRP5] o una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10 [ZmKRP5], con la condición de que la secuencia nucleotídica transcribible no corresponde completamente a los nucleótidos 450-570 de la SEQ ID NO: 9, (v) SEQ ID NO: 11 [ZmKRP6] o una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 12 [ZmKRP6], con la condición de que la secuencia nucleotídica transcribible no corresponde completamente a los nucleótidos 380-765 de la SEQ ID NO: 11, (vi) SEQ ID NO: 13 [ZmKRP7J o una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14 [ZmKRP7], con la condición de que la secuencia nucleotídica transcribible no corresponde completamente a los nucleótidos 335-718 de la SEQ ID NO: 13 y (vii) SEQ ID NO: 15 [ZmKRP8] o una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 16 [ZmKRP8], con la condición de que la secuencia nucleotídica transcribióle no corresponde completamente a los nucleótidos 350-405 ó 420-698 de la SEQ ID NO: 15, en donde las secuencias nucleotídicas transcríbales pueden estar presentes en cualquier orden en el constructo de ácidos nucleicos y pueden ser policistrónicas, en donde cada secuencia nucleotídica transcribible comprende al menos aproximadamente 100 (o 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 750, 1 ,000, 1 ,500, 2,000 o más) nucleótidos contiguos, y en donde la expresión de cada secuencia nucleotídica transcribible induce opcionalmente la supresión del gen. Como se utiliza en la presente, supresión del gen se refiere a la reducción de la expresión del gen a través de varias técnicas incluyendo, de manera no exclusiva, tecnologías de supresión sentido, antisentido, ARNds y de ribozima. En aún otra modalidad, el constructo de ácidos nucleicos comprende al menos una secuencia nucleotídica transcribible, la expresión de la cual resulta en la supresión de una secuencia nucleotídica endógena seleccionada del grupo que consiste de: (i) SEQ ID NO: 1 [ZmKRPI] o una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 [ZmKRPI], (ii) SEQ ID NO: 3 [ZmKRP2] o una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4 [ZmKRP2], (iii) SEQ ID NO: 5 [ZmKRP3] o una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6 [ZmKRP3], con la condición de que la secuencia nucleotídica transcribible no corresponde completamente a los nucleótidos 175-342 de la SEQ ID NO: 5, (iv) SEQ ID NO: 9 [ZmKRP5] o una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10 [ZmKRP5], con la condición de que la secuencia nucleotídica transcribible no corresponde completamente a los nucleótidos 450-570 de la SEQ ID NO: 9, (v) SEQ ID NO: 11 [ZmKRP6] o una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 12 [ZmKRP6], con la condición de que la secuencia nucleotídica transcribible de la SEQ ID NO: 1 no corresponde completamente a los nucleótidos 380-765 de la SEQ ID NO: 11, (vi) SEQ ID NO: 13 [ZmKRP7] o una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14 [ZmKRP7], con la condición de que la secuencia nucleotídica transcribible no corresponde completamente a los nucleótidos 335-718 de la SEQ ID NO: 13, (vii) SEQ ID NO: 15 [ZmKRP8] o una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 16 [ZmKRP8], con la condición de que la secuencia nucleotídica transcribible no corresponde completamente a los nucleótidos 350-405 ó 420-698 de la SEQ ID NO: 15 y (viii) SEQ ID NO: 17 [ZmKRP9] o una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 18 [ZmKRP9], con la condición de que la secuencia nucleotídica transcribible no corresponde completamente a los nucleótidos 1-183 de la SEQ ID NO: 17, en donde las secuencias nucleotídicas transcribióles pueden estar presentes en cualquier orden en el constructo de ácidos nucleicos y pueden ser policistrónicas, en donde cada secuencia nucleotídica transcribible comprende al menos aproximadamente 100 (o 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 500, 750, 1,000, 1,500, 2,000 o más) nucleótidos contiguos, y en donde la expresión de cada secuencia nucleotídica transcribible induce opcionalmente el silenciamiento del gen. Por "no corresponde completamente", se quiere decir que al menos uno, de manera preferida, al menos aproximadamente tres nucleótidos, corresponden a los nucleótidos fuera de los intervalos designados de nucleótidos. Con respecto a los constructos de ácidos nucleicos anteriores, esa al menos una secuencia nucleotídica transcribible, la expresión de la cual resulta en la supresión, puede ser de una secuencia no codificante. Por ejemplo, la secuencia no codificante puede ser un intrón, una secuencia nucleotídica de una región del promotor, una secuencia nucleotídica de una región no traducida 5', una secuencia nucleotídica de una región no traducida 3', o un fragmento de cualquiera de lo anterior. Los ejemplos de tales secuencias incluyen aquéllas de las SEQ ID NOS: 44-58. Los constructos anteriores son ejemplares y no pretenden ser limitantes. En los constructos de supresión, por ejemplo, ZmKRPI o ZmKRP2, pueden inhibirse solos o juntos. A este respecto, ZmKRPI o ZmKRP2 pueden inhibirse solos o juntos, en combinación adicional con cualquiera de ZmKRP3, ZmKRP4, ZmKRP5, ZmKRP6, ZmKRP7, ZmKRPS y ZmKRP9. Por conveniencia, la abreviatura "ZmKRP" se ha suprimido de las siguientes listas de combinaciones. Por ejemplo, 1,2y3; 1,2y4; 1,2y5; 1, 2 y 6; 1,2 y 7; 1,2 y 8; 1,2 y 9; 1 y 3; 1 y 4; 1 y 5; 1 y 6; 1 y 7; 1 y 8; 1 y 9; 2 y 3; 2 y 4; 2 y 5; 2 y 6; 2 y 7; 2 y 8; 2 y 9; 1,3 y 4; 1,3 y 5; 1,3 y 6; 1,3 y 7; 1,3 y 8; 1, 3 y 9; 2, 3 y 4; 2, 3 y 5; 2, 3 y 6; 2, 3 y 7; 2, 3 y 8; 2, 3 y 9; 1, 4 y 5; 1, 4 y 6; 1, 4 y 7; 1, 4 y 8; 1, 4 y 9; 1, 5 y 6; 1, 5 y 7; 1, 5 y 8; 1, 5 y 9; 2, 4 y 5; 2, 4 y 6; 2, 4 y 7; 2, 4 y 8; 2, 4 y 9; 1 , 5 y 6; 1 , 5 y 7; , 5 y 8; 1 , 5 y 9; 2, 5 y 6; 2, 5 y 7; 2, 5 y 8; 2, 5 y 9; 1, 6 y 7; 1, 6 y 8; 1, 6 y 9; 2, 6 y 7; 2, 6 y 8; 2, 6 y 9; 1, 7 y 8; 1,7 y 9; 2, 7 y 8; 2, 7 y 9; 1,8 y 9; 2, 8 y 9; 1,3, 4 y 5; 1,3,4y6; 1,3, 4 y 7; 1, 3, 4 y 8; 1, 3, 4 y 9; 2, 3, 4 y 5; 2, 3, 4 y 6; 2, 3, 4 y 7; 2, 3, 4 y 8; 2, 3, 4 y 9; 1, 4, 5 y 6; 1, 4, 5 y 7; 1, 4, 5 y 8; 1, 4, 5 y 9; 2, 4, 5 y 7; 2, 4, 5 y 8; 2, 4, 5 y 9; 1, 5, 6 y 7; 1, 5, 6 y 8; 1, 5, 6 y 9; 2, 5, 6 y 7; 2, 5, 6 y 8; 2, 5, 6 y 9; 1, 6, 7 y 8; 1, 6, 7 y 9; 2, 6, 7 y 8; 2, 6, 7 y 9; 1, 7, 8 y 9; 2, 7, 8 y 9; 1, 3, 4, 5 y 6; 1, 3, 4, 5 y 7; 1, 3, 4, 5 y 8; 1, 3, 4, 5 y 9; 2, 3, 4, 5 y 6; 2, 3, 4, 5 y 7; 2, 3, 4, 5 y 8; 2, 3, 4, 5 y 9; 1, 3, 4, 5, 6 y 7; 1, 3, 4, 5, 6 y 8; 1, 3, 4, 5, 6 y 9; 2, 3, 4, 5, 6 y 7; 2, 3, 4, 5, 6 y 8; 2, 3, 4, 5, 6 y 9; 1, 3, 4, 5, 6, 7 y 8; 1, 3, 4, 5, 6, 7 y 9; 2, 3, 4, 5, 6, 7 y 8; 2, 3, 4, 5, 6, 7 y 9; 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8 y 9; 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 y 9; 1, 2, 3 y 4; 1,2, 3 y 5; 1,2, 3 y 6; 1,2, 3 y 7; 1,2, 3 y 8; 1,2, 3 y 9; 1,2, 4 y 5; 1,2,4 y 6; 1,2, 4 y 7; 1,2, 4 y 8; 1,2, 4 y 9; 1,2, 5 y 6; 1,2, 5 y 7; 1,2, 5 y 8; 1,2,5 y 9; 1,2, 6 y 7; 1,2, 6 y 8; 1, 2, 6 y 9; 1, 2, 7 y 8; 1,2, 7 y 9; 1,2, 8 y 9; 1,2, 3, 4 y 5; 1, 2, 3, 4 y 6; 1, 2, 3, 4 y 7; 1, 2, 3, 4 y 8; 1, 2, 3, 4 y 9; 1, 2, 4, 5 y 6; 1, 2, 4, 5 y 7; 1, 2, 4, 5 y 8; 1, 2, 4, 5 y 9; 1, 2, 5, 6 y 7; 1, 2, 5, 6 y 8; 1, 2, 5, 6 y 9; 1,2, 6, 7 y 8; 1,2, 6, 7 y 9; 1,2, 7, 8 y 9; 1,2, 3, 4, 5 y 6; 1,2,3, 4, 5 y 7; 1, 2, 3, 4, 5 y 8; 1, 2, 3, 4, 5 y 9; 1, 2, 3, 4, 5, 6 y 7; 1, 2, 3, 4, 5, 6 y 8; 1, 2, 3, 4, 5, 6 y 9; 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 y 8; 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 y 9; o 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 y 9, pueden inhibirse. Además, los constructos pueden comprender las secuencias nucleotídicas en cualquier orden. Las secuencias nucleotídicas también pueden variar en longitud. En los constructos de supresión, ZmKRP4 o ZmKRP9 pueden inhibirse solos o juntos. A este respecto, ZmKRP4 o ZmKRP9 pueden inhibirse solos o juntos, en combinación adicional con cualquiera de ZmKRPI, ZmKRP2, ZmKRP3, ZmKRP5, ZmKRP6, ZmKRP7 y ZmKRP8. Por ejemplo, 4 y 1; 4 y 2; 4 y 3; 4 y 5; 4 y 6; 4 y 7; 4 y 8; 4, 1 y 2; 4, 1 y 3; 4, 1 y 5; 4, 1 y 6; 4, 1 y 7; 4, 1 y 8; 4, 1,2 y 3; 4, 1,2 y 5; 4, 1,2 y 6; 4, 1,2 y 7; 4, 1,2 y 8; 4, 1,2, 3 y 5; 4, 1, 2, 3 y 6; 4, 1, 2, 3 y 7; 4, 1, 2, 3 y 8; 4, 1, 2, 3, 5 y 6; 4, 1, 2, 3, 5 y 7; 4, 1, 2, 3, 5 y 8; 4, 1, 2, 3, 5, 6 y 7; 4, 1, 2, 3, 5, 6 y 8; 4, 1, 2, 3, 5, 6, 7 y 8; 4, 2 y 3; 4, 2 y 5; 4, 2 y 6; 4, 2 y 7; 4, 2 y 8; 4, 3 y 5; 4, 3 y 6; 4, 3 y 7; 4, 3 y 8; 4, 5 y 6; 4, 5 y 7; 4, 5 y 8; 4, 6 y 7; 4, 6 y 8; 4, 7 y 8; 4, 2, 3 y 5; 4, 2, 3 y 6; 4, 2, 3 y 7; 4, 2, 3 y 8; 4, 3, 5 y 6; 4, 3, 5 y 7; 4, 3, 5 y 8; 4, 3, 6 y 7; 4, 3, 6 y 8; 4, 5, 6 y 7; 4, 5, 6 y 8; 4, 6, 7 y 8; 4, 2, 3, 5 y 6; 4, 2, 3, 5 y 7; 4, 2, 3, 5 y 8; 4, 2, 3, 5, 6 y 7; 4, 2, 3, 5, 6 y 8; 4, 2, 3, 5, 6, 7 y 8; 9 y 1 ; 9 y 2; 9 y 3; 9 y 5; 9 y 6; 9 y 7; 9 y 8; 9, 1 y 2; 9, 1 y 3; 9, 1 y 5; 9, 1 y 6; 9, 1 y 7; 9, 1 y 8; 9, 1 , 2 y 3; 9, 1 , 2 y 5; 9, 1,2 y 6; 9, 1, 2 y 7; 9, 1, 2 y 8; 9, 1, 2, 3 y 5; 9, 1, 2, 3 y 6; 9, 1,2, 3 y 7; 9, 1,2, 3 y 8; 9, 1,2,3, 5 y 6; 9, 1,2, 3, 5 y 7; 9, 1,2, 3, 5 y 8; 9, 1,2, 3, 5, 6 y 7; 9, 1, 2, 3, 5, 6 y 8; 9, 1, 2, 3, 5, 6, 7 y 8; 9, 2 y 3; 9, 2 y 5; 9, 2 y 6; 9, 2 y 7; 9, 2 y 8; 9, 3 y 5; 9, 3 y 6; 9, 3 y 7; 9, 3 y 8; 9, 5 y 6; 9, 5 y 7; 9, 5 y 8; 9, 6 y 7; 9, 6 y 8; 9, 7 y 8; 9, 2, 3 y 5; 9, 2, 3 y 6; 9, 2, 3 y 7; 9, 2, 3 y 8; 9, 3, 5 y 6; 9, 3, 5 y 7; 9, 3, 5 y 8; 9, 3, 6 y 7; 9, 3, 6 y 8; 9, 5, 6 y 7; 9, 5, 6 y 8; 9, 6, 7 y 8; 9, 2, 3, 5 y 6; 9, 2, 3, 5 y 7; 9, 2, 3, 5 y 8; 9, 2, 3, 5, 6 y 7; 9, 2, 3, 5, 6 y 8; 9, 2, 3, 5, 6, 7 y 8; 4, 9 y 1 ; 4, 9 y 2; 4, 9 y 3; 4, 9 y 5; 4, 9 y 6; 4, 9 y 7; 4, 9 y 8; 4, 9, 1 y 2; 4, 9, 1 y 3; 4, 9, 1 y 5; 4, 9, 1 y 6; 4, 9, 1 y 7; 4, 9, 1 y 8; 4, 9, 1 , 2 y 3; 4, 9, 1 , 2 y 5; 4, 9, 1 , 2 y 6; 4, 9, 1 , 2 y 7; 4, 9, 1 , 2 y 8; 4, 9, 1 , 2, 3 y 5; 4, 9, 1 , 2, 3 y 6; 4, 9, 1 , 2, 3 y 7; 4, 9, 1 , 2, 3 y 8; 4, 9, 1 , 2, 3, 5 y 6; 4, 9, 1 , 2, 3, 5 y 7; 4, 9, 1 , 2, 3, 5 y 8; 4, 9, 1, 2, 3, 5, 6 y 7; 4, 9, 1 , 2, 3, 5, 6 y 8; 4, 9, 1 , 2, 3, 5, 6, 7 y 8; 4, 9, 2 y 3; 4, 9, 2 y 5; 4, 9, 2 y 6; 4, 9, 2 y 7; 4, 9, 2 y 8; 4, 9, 3 y 5; 4, 9, 3 y 6; 4, 9, 3 y 7; 4, 9, 3 y 8; 4, 9, 5 y 6; 4, 9, 5 y 7; 4, 9, 5 y 8; 4, 9, 6 y 7; 4, 9, 6 y 8; 4, 9, 7 y 8; 4, 9, 2, 3 y 5; 4, 9, 2, 3 y 6; 4, 9, 2, 3 y 7; 4, 9, 2, 3 y 8; 4, 9, 3, 5 y 6; 4, 9, 3, 5 y 7; 4, 9, 3, 5 y 8; 4, 9, 3, 6 y 7; 4, 9, 3, 6 y 8; 4, 9, 5, 6 y 7; 4, 9, 5, 6 y 8; 4, 9, 6, 7 y 8; 4, 9, 2, 3, 5 y 6; 4, 9, 2, 3, 5 y 7; 4, 9, 2, 3, 5 y 8; 4, 9, 2, 3, 5, 6 y 7; 4, 9, 2, 3, 5, 6 y 8; o 4, 9, 2, 3, 5, 6, 7 y 8, pueden inhibirse. Además, los constructos pueden comprender las secuencias nucleotídicas en cualquier orden. Las secuencias nucleotídicas también pueden variar en longitud. Cualquiera de los constructos anteriores puede comprender además un promotor, el cual se expresa de manera preferida o específica en el germen y/o la aleurona de un grano de maíz y el promotor está enlazado de manera operativa a al menos una secuencia nucleotídica. El promotor puede ser un promotor de oleosina, tal como L3, un promotor de globulina, o un promotor Perl, por ejemplo. En los constructos de supresión anteriores, la al menos una secuencia nucleotídica transcribible, la expresión de la cual resulta en la supresión, puede ser una secuencia no codificante. La secuencia no codificante puede ser un intrón, una secuencia nucleotídica de una región del promotor, una secuencia nucleotídica de una región no traducida 5', una secuencia nucleotídica de una región no traducida 3', o un fragmento de cualquiera de lo anterior. Los ejemplos de tales secuencias incluyen aquéllas de las SEQ ID NOS: 44-58. Los constructos anteriores pueden hacerse de acuerdo con métodos conocidos en la técnica (véase, en general, "Recombinant DNA Part D," Methods in Enzymology, Vol. 153, Wu y Grossman, eds., Academic Press (1987), y las referencias citadas en la presente bajo "EJEMPLOS"). Los métodos adecuados de construcción se ejemplifican en los Ejemplos expuestos en la presente. Las técnicas para poner en contacto una célula de planta, un tejido de planta, un órgano de planta o una planta con un constructo de ácidos nucleicos, tal como un vector, de manera que el constructo de ácidos nucleicos es captado por una célula de planta, sola o como parte de un tejido de planta, un órgano de planta o una planta, y expresado en la misma, se conocen en la técnica. Tales métodos involucran técnicas de cultivo del tejido de planta, por ejemplo. En la presente, "poner en contacto", significa que la célula, tejido, órgano o planta se pone en contacto con el constructo de ácidos nucleicos o el vector en una manera tal que el vector entra en la célula y se expresa en la misma.

La célula de planta, el tejido de planta, el órgano de planta o la planta pueden ponerse en contacto con el vector mediante cualquier medio adecuado como se conoce en la técnica. De manera preferida, se produce una planta transgénica que expresa la proteína deseada. Varios métodos para la introducción de una secuencia polinucleotídica deseada que codifica la proteína deseada en las células de la planta incluyen, de manera no exclusiva: (1) métodos físicos tales como microinyección (Capecchi, Cell, 22(2):479-488 (1980)), electroporación (Fromm et al., PNAS U.S.A., 82(17):5824-5828 (1985); Patente de E.U.A. 5,384,253), y suministro mediado por microproyectiles (tecnología de biolística o pistola génica) (Christou et al., Bio/Technology, 9:957 (1991); Fynan et al., PNAS U.S.A. 90(24): 11478-11482 (1993)); (2) métodos de suministro mediados por un virus (Clapp, Clin. Perinatol., 20(1): 155-168 (1993); Lu et al., J. Exp. Med., 178(6):2089-2096 (1993); Eglitis y Anderson, Biotechniques, 6(7):608-614 (1988); y (3) métodos de transformación mediados por Agrobacteríum; (Fraley et al., PNAS U.S.A. , 80:4803 (1983). Los métodos más comúnmente utilizados para la transformación de células de plantas son el procedimiento de transferencia de ADN mediado por Agrobacterium) y él procedimiento mediado por biolística o bombardeo de microproyectiles (es decir, la pistola génica). La transformación mediada por Agrobacterium se logra a través del uso de bacterias del suelo diseñadas genéticamente que pertenecen al género Agrobacterium. Varias especies de Agrobacterium median la transferencia de un ADN específico conocido como "T-ADN", ei cual puede diseñarse genéticamente para transportar cualquier pieza deseada de ADN en muchas especies de plantas. Los eventos principales que marcan el procedimiento de patogénesis mediada por el T-ADN son: inducción de genes de virulencia, procesamiento y transferencia del T-ADN. Este procedimiento es el objeto de muchas revisiones (Ream, Ann. Rev. Phytopathol., 27:583-618 (1989); Howard y Citovsky, Bioassays, 12:103-108 (1990); Kado, Crít. Rev. Plant Sci., 10:1-32 (1991); Zambryski, Annual Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 43:465-490 (1992); Gelvin, In Transgenic Plants, Kung y Wu, eds., Academic Press, San Diego, pp. 49-87 (1993); Binns y Howitz, In Bacterial Pathoqenesis of Plants and Animáis (Dang, ed.). Berlín: Springer Verlag, pp. 1 19-138 (1994); Hooykaas y Beijersbergen, Ann. Rev. Phytopathol., 32:157-179 (1994); Lessl y Lanka, Cell, 77:321-324 (1994); y Zupan y Zambryski, Annual Rev. Phytopathol., 27:583-618 (1995)). La transformación genética de plantas mediada por Agrobacteríum involucra varios pasos. El primer paso en el cual el Agrobacterium virulento y las células de plantas se ponen primero en contacto unos con otros, se llama generalmente "inoculación". La solución que contiene Agrobacterium se retira a continuación del contacto con el tejido extirpado mediante drenado o aspiración. Después de la inoculación, el Agrobacterium y las células/tejidos de planta se dejan crecer juntos durante un periodo de varias horas a varios días o más bajo condiciones adecuadas para el crecimiento y la transferencia del T-ADN. Este paso se denomina "cocultivo". Después del cocultivo y el suministro del T-ADN, las células de plantas se tratan con agentes bactericidas o bacteriostáticos para destruir el Agrobacteríum restante en contacto con el tejido extirpado y/o en el recipiente que contiene el tejido extirpado. Si esto se hace en ausencia de cualesquier agentes selectivos para promover el crecimiento preferencial de las células de planta transgénicas versus no transgénicas, entonces esto se refiere típicamente como el paso de "retardo". Si se hace en la presencia de células de planta transgénicas que favorecen la presión selectiva, entonces se refiere como el paso de "selección". Cuando se utiliza un "retardo", éste es seguido típicamente por uno o más pasos de "selección". Tanto los pasos de "retardo" como de "selección" incluyen típicamente agentes bactericidas o bacteriostáticos para destruir cualesquier células restantes de Agrobacteríum debido a que el crecimiento de las células de Agrobacteríum es indeseable después del procedimiento de infección (inoculación y cocultivo). Varias cepas del tipo silvestre y desarmadas de Agrobacteríum tumefaciens y Agrobacteríum rhizogenes que hospedan plásmidos Ti o Ri, pueden utilizarse para la transferencia génica en las plantas. Los hospederos de Agrobacteríum contienen los plásmidos Ti y Ri desarmados, que no contienen los oncogenes que causan la tumorigénesis o rizogénesis, respectivamente, que se utilizan como los vectores y que contienen los genes de interés que son introducidos posteriormente en las plantas. Las cepas preferidas incluyen, de manera no exclusiva, cepa C58 de Agrobacteríum tumefaciens, una cepa del tipo nopalina que se utiliza para mediar la transferencia del ADN en una célula de planta, cepas del tipo octopina tal como LBA4404 o cepas del tipo succinamopina, por ejemplo, EHA 01 o EHA105. La molécula de ácido nucleico, preparada como una composición de ADN in vitro, se introduce en un hospedero adecuado tal como E. coli y se hace corresponder con el Agrobacteríum, o se transforma directamente en el Agrobacteríum competente. Estas técnicas son bien conocidas por aquellos con experiencia en la técnica. El Agrobacteríum puede prepararse ya sea inoculando un líquido tal como medio de Luria Burtani (LB) directamente de una solución patrón de glicerol o rayando el Agrobacteríum en un medio solidificado de una solución patrón de glicerol, dejando que las bacterias crezcan bajo las condiciones selectivas apropiadas, generalmente de aproximadamente 26°C - 30°C, o aproximadamente 28°C, y tomando una sola colonia o un pequeño rizo de Agrobacteríum de la placa e inoculando un medio de cultivo líquido que contiene los agentes selectivos. Aquellos con experiencia en la técnica están familiarizados con los procedimientos para el crecimiento y las condiciones de cultivo adecuadas para el Agrobacteríum, así como con los procedimientos de inoculación posteriores. La densidad del cultivo de Agrobacteríum utilizado para la inoculación y la proporción de células de Agrobacteríum a tejido extirpado puede variar de un sistema al siguiente, y por lo tanto, se espera la optimización de estos parámetros para cualquier método de transformación. Típicamente, un cultivo de Agrobacteríum se inocula de una placa rayada o de una solución patrón de glicerol y se cultiva durante la noche y las células bacterianas se lavan y resuspenden en medio de cultivo adecuado para la inoculación del tejido extirpado. Con respecto al bombardeo de microproyectiles (Patentes de E.U.A. 5,550,318; 5,538,880; 5,610,042; y WO 95/06128; cada una de las cuales se incorpora específicamente en la presente como referencia en su totalidad), las partículas se recubren con ácidos nucleicos y se suministran a las células mediante una fuerza de propulsión. Las partículas ejemplares incluyen aquéllas comprendidas de tungsteno, platino y de manera preferida, oro. Se contempla que, en algunos casos, la precipitación del ADN en partículas de metal no sería necesaria para el suministro del ADN a una célula receptora utilizando el bombardeo de microproyectiles. Sin embargo, se contempla que las partículas puedan contener ADN, más que recubrirse con ADN. Así, se propone que las partículas recubiertas con ADN pueden incrementar el nivel de suministro del ADN vía el bombardeo de partículas, pero no son en sí mismas, necesarias. Para el bombardeo, las células en suspensión se concentran en filtros o en un medio de cultivo sólido. De manera alterna, los embriones inmaduros u otras células objetivo pueden arreglarse en un medio de cultivo sólido. Las células a ser bombardeadas se colocan a una distancia apropiada por debajo de la placa de detención de los macroproyectiles. Una modalidad ilustrativa de un método para suministrar ADN a células de plantas mediante aceleración, es el Sistema de Suministro de Partículas Biolísticas (BioRad, Hercules, CA), que puede utilizarse para impulsar partículas recubiertas con ADN o células a través de una malla, tal como una malla de acero inoxidable o una malla de Nytex, en una superficie de un filtro cubierta con células de plantas monocotiledóneas cultivadas en suspensión. La malla dispersa las partículas de manera que no son suministradas a las células receptoras en grandes agregados. Se cree que una malla interpuesta entre el aparato de proyectiles y las células a ser bombardeadas, reduce el tamaño del agregado de los proyectiles y puede contribuir a una frecuencia más alta de transformación, reduciendo el daño infringido a las células receptoras por los proyectiles que son demasiado grandes. Las técnicas de bombardeo con microproyectiles son ampliamente aplicables, y pueden utilizarse para transformar virtualmente cualquier especie de planta. Los ejemplos de especies que pueden transformarse mediante bombardeo con microproyectiles incluyen especies monocotiledóneas, tales como maíz (WO 95/06128), cebada, trigo (Patente de E.U.A. 5,563,055, incorporada específicamente en la presente como referencia en su totalidad), arroz, avena, centeno, caña de azúcar y sorgo; así como varias dicotiledóneas incluyendo tabaco, soya (Patente de E.U.A. 5,322,783, incorporada específicamente en la presente como referencia en su totalidad), girasol, cacahuate, algodón, jitomate y legumbres en general (Patente de E.U.A. 5,563,055, incorporada específicamente en la presente como referencia en su totalidad).

Para seleccionar o calificar las células de plantas transformadas sin importar la metodología de transformación, el ADN introducido en la célula contiene un gen que funciona en un tejido de planta regenerabie para producir un compuesto que confiere al tejido de la planta resistencia a un compuesto de otra manera tóxico. Los genes de interés para utilizarse como un marcador seleccionable, clasificable o calificable incluyen, de manera no exclusiva, GUS, proteína verde fluorescente (GFP), luciferasa (LUX), genes de tolerancia a los antibióticos o herbicidas. Los ejemplos de genes de resistencia a los antibióticos incluyen las penicilinas, canamicina (y neomicina, G418 y bleomicina); metotrexato (y trimetoprim); cloramfenicol; canamicina y tetraciclina. Los genes marcadores seleccionabas particularmente preferidos para utilizarse en la presente invención incluyen genes que confieren resistencia a compuestos tales como antibióticos, como canamicina (nptll), higromicina B (aph IV), y gentamicina (aac3 y aacC4) (Dekeyser et al., Plant Physiol., 90:217-223 (1989)), y herbicidas, como glifosato (Della-Cioppa et al., Bío/Technology, 5:579-584 (1987)). Otros dispositivos de selección también pueden implementarse, incluyendo, de manera no exclusiva, tolerancia a la fosfinotricina, bialafos y mecanismos de selección positiva (Joersbo et al., Mol. Breed., 4:111-117 (1998)) y están considerados dentro del alcance de la presente invención. Las células de plantas transformadas, las cuales se derivan mediante cualquiera de las técnicas de transformación anteriores, pueden cultivarse para regenerar una planta completa, la cual posee el fenotipo transformado deseado. Puede utilizarse cualquier medio de cultivo de la planta adecuado. Los ejemplos de los medios adecuados incluirían de manera no exclusiva, medio basado en MS (Murashige y Skoog, Physiol. Plant, 15:473-497, 1962), o medio basado en N6 (Chu et al., Scientia Sínica, 18:659, 1975), suplementado con reguladores adicionales del crecimiento de la planta, incluyendo, de manera no exclusiva, auxinas, citocininas, ABA y giberelinas. Aquellos con experiencia en la técnica están familiarizados con la variedad de medios de cultivo del tejido, los cuales, cuando se suplementan de manera apropiada, mantienen el crecimiento y el desarrollo del tejido de la planta y son adecuados para la transformación y regeneración de la planta. Estos medios de cultivo del tejido pueden comprarse como una preparación comercial, o prepararse a la medida y modificarse. Aquellos con experiencia en la técnica están conscientes de que el medio y los suplementos del medio tales como nutrientes y reguladores del crecimiento para utilizarse en la transformación y regeneración y otras condiciones de cultivo, tales como la intensidad de la luz durante la incubación, el pH, y las temperaturas de incubación, pueden optimizarse para la variedad particular de interés. Alguien con experiencia ordinaria en la técnica apreciará que, después de que el cásete de expresión se incorpora de manera estable en las plantas transgénicas y se confirma que es operable, puede introducirse en otras plantas mediante cruce sexual. Puede utilizarse cualquiera de varias técnicas estándar de reproducción, dependiendo de las especies a ser cruzadas. En vista de lo anterior, la presente invención proporciona un método para suprimir la expresión de uno o más genes similares al inhibidor de la CDK en una célula de maíz, un tejido de maíz, un órgano de maíz o una planta de maíz. El método comprende poner en contacto la célula de maíz, el tejido de maíz, el órgano de maíz o la planta de maíz con un constructo de ácidos nucleicos como se describió anteriormente. Así, la presente invención proporciona además una célula de maíz, un tejido de maíz, un órgano de maíz o una planta de maíz, en el cual la expresión de un gen similar al inhibidor de la CDK se ha suprimido de acuerdo con tal método. También se proporciona una semilla obtenida de tal planta y el aceite y |a harina obtenida de tal semilla. La presente invención también proporciona un recipiente para más de aproximadamente 10,000, de manera más preferida aproximadamente 20,000, y aún de manera más preferida aproximadamente 40,000 semillas, en donde más que aproximadamente 10%, de manera más preferida aproximadamente 25%, de manera más preferida aproximadamente 50%, y aún de manera más preferida aproximadamente 75% o de manera más preferida aproximadamente 90% de las semillas, son semillas derivadas de una planta de la presente invención. La presente invención también proporciona un recipiente para más de aproximadamente 10 kg, de manera más preferida aproximadamente 25 kg, y aún de manera más preferida aproximadamente 50 kg de semilla, en donde más que aproximadamente 10%, de manera más preferida aproximadamente 25%, de manera más preferida aproximadamente 50%, y aún de manera más preferida aproximadamente 75% o de manera más preferida aproximadamente 90% de las semillas son semillas derivadas de una planta de la presente invención. Cualquiera de las plantas o partes de la misma de la presente invención pueden procesarse para producir un alimento, harina, proteína o preparación oleosa. Una parte de la planta particularmente preferida para este propósito es una semilla. En una modalidad preferida, el alimento, harina, proteína o preparación oleosa se diseña para animales rumiantes. Los métodos para producir el alimento, harina, proteína y preparaciones oleosas se conocen en la técnica. Véanse, por ejemplo, las Patentes de E.U.A. 4,957,748; 5,100,679; 5,219,596; 5,936,069; 6,005,076; 6,146,669; y 6,156,227. En una modalidad preferida, la preparación de proteína es una preparación alta en proteínas. Tal preparación alta en proteínas de manera preferida tiene un contenido de proteínas mayor que el 5% peso/volumen, de manera más preferida, 10% peso/volumen, y aún de manera más preferida, 15%) peso/volumen. En una modalidad adicional, la harina de la presente invención puede mezclarse con otras harinas. En una modalidad preferida, la harina producida de las plantas de la presente invención o generada mediante un método de la presente invención, constituye más que aproximadamente 0.5%, aproximadamente 1%, aproximadamente 5%, aproximadamente 10%, aproximadamente 25%, aproximadamente 50%, aproximadamente 75%, o aproximadamente 90% en volumen o peso del componente harinoso de cualquier producto. En otra modalidad, la preparación de harina puede combinarse y puede constituir más que aproximadamente 10%, aproximadamente 25%, aproximadamente 35%, aproximadamente 50%, o aproximadamente 75% de la combinación en volumen. La presente invención proporciona además un método para sobrerregular la expresión de uno o más genes similares al inhibidor de la CDK en una célula de maíz, un tejido de maíz, un órgano de maíz o una planta de maíz. El método comprende poner en contacto una célula, tejido, órgano o planta de maíz con al menos un constructo de ácidos nucleicos que comprende al menos una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 1 [ZmKRPI], una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 [ZmKRPI], SEQ ID NO: 3 [ZmKRP2], una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4 [ZmKRP2], SEQ ID NO: 7 [ZmKRP4], una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8 [ZmKRP4], SEQ ID NO: 9 [ZmKRP5], una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10 [ZmKRP5], SEQ ID NO: 11 [ZmKRP6], y una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 12 [ZmKRP6], en donde, cuando una célula, tejido u órgano se pone en contacto con el constructo de ácidos nucleicos, el método comprende además generar una planta de la célula, tejido u órgano, en donde la expresión de uno o más genes similares al inhibidor de la CDK está sobrerregulada en una célula, tejido, órgano o planta de maíz. El método puede comprender poner en contacto la célula, tejido, órgano o planta con más de un constructo de ácidos nucleicos y cada constructo de ácidos nucleicos comprende una secuencia nucleotídica diferente. El ácido nucleico puede comprender un promotor que se expresa de manera preferida en el tejido reproductor masculino del maíz, en donde el promotor está enlazado de manera operativa a al menos una secuencia nucleotídica. Un ejemplo de tal promotor es el promotor SILKY1 del maíz y otros como se describió en la presente anteriormente. La expresión preferida en el tejido reproductor masculino del maíz, puede resultar en la generación de una planta de maíz masculina estéril.

EJEMPLOS La presente invención se describe además en el contexto de los siguientes ejemplos. Estos ejemplos sirven para ilustrar además la presente invención, y no pretenden limitar el alcance de la invención.

I EJEMPLO 1 Este ejemplo describe la identificación de los inhibidores de la CDK del maíz. Se realizaron búsquedas iniciales con tBLASTn (Altschul ef al., Nuc. Acid Res., 25:3389-3402 (1997)) de la base de datos EST propiedad de Monsanto, utilizando secuencias disponibles al público de genes similares al inhibidor de la CDK de Arabidopsis AtKRPI ("At" indica Arabidopsis thaliana; KRP1 es como se definió anteriormente; GenBank #AAC49698), AÍKRP2 (GenBank #CAB76424), AtKRP3 (GenBank #CAC41617), AtKRP4 (GenBank #CAC416 8), AtKRP5 (GenBank #CAC416 9), AtKRP6 (GenBank #CAC41620) y AtKRP7 (GenBank #CAC41621). Además, se utilizó la siguiente secuencia conservada de la región C terminal de los polipéptidos anteriores en una búsqueda con tBLASTn: (PTTAEIEDFFSEAEEQQQKQFIEKYNFDIVNDEPLEGRYEWVKLKP) [SEQ ID NO: 59]. Como resultado de las búsquedas con BLAST, se identificaron siete cúmulos de secuencias del maíz, como que tienen homología con los genes similares al inhibidor de la CDK de Arabidopsis mencionados anteriormente. Como se utiliza en la presente, "cúmulos de secuencia", se refiere a un grupo de secuencias EST con regiones superpuestas de homología. Las clonas representativas para cada cúmulo tenían una secuencia de longitud completa de doble hebra, y se utilizaron para investigar con BLAST nuevamente las bases de datos EST propiedad de Monsanto. Se identificaron 2 cúmulos adicionales de esta segunda búsqueda con BLAST y las clonas representativas fueron de secuencia de longitud completa de doble hebra. El análisis de la secuencia de ADN indicó la presencia de al menos 9 diferentes cúmulos similares al inhibidor de la CDK en el maíz. Estos 9 cúmulos y sus clonas representativas (nombradas ZmKRPI hasta ZmKRP9), se resumen en el Cuadro 1.

CUADRO 1 Cúmulos similares al inhibidor de la CDK del maíz y clonas EST representativas y ORF de la SEQ ID NO: ID DEL CUMULO ID DE LA CLONA Descripción ORF DE LA SELECCIONADA SEQ ID NO: ZEA A-21 JUN01- LIB3732-047-Q1-N6-G6 ZmKRPI 1 CUMULO89801 1 ZEAMA-04OCT00- LIB3279-047-P1-K1-A7 ZmKRP2 3 CUMULO67903 1 ZEA A-21JUN01- LIB3606-029-Q1-K6-B4 ZmKRP3 5 CUMUL0115879 1 ZEAMA-21JUN01- LIB4759-013- 1-K1-B5 ZmKRP4 7 CUMUL031652 2 ZEA A-06JUN02- LIB3898-003-Q1-N6-D10 ZmKRP5 9 CUMULO620952 1 ZEAMA-21JUN01- LIB143-038-Q1-E1-G6 mKRP6 11 CUMULO301 55 ZEAMA-21JUN01- 700088048H1 ZmKRP7 13 CUMULO301 41 ZEAMA-21JUN01- LIB3587-222-Q1-K6-H9 ZmKRP8 15 CUMULO301 46 ZEAMA-08NOV01- LIB4574-012-Q1-K1-H11 ZmKRP9 17 CU UL033142 4 Las regiones codificantes y las secuencias de aminoácidos de las clonas representativas de estos 9 cúmulos se muestran en el listado de secuencia como las SEQ ID NOS: 1-18. Los marcos abiertos de lectura (ORF) de longitud completa se identificaron para ZmKRPI , 2, 4, 5 y 6, mientras que los ORF parciales se identificaron para ZmKRP3, 7, 8 y 9. Las alineaciones de la secuencia de proteínas indicaron que las KRP de maíz comparten pequeñas regiones conservadas con ICK/KRP de Arabidopsis, especialmente en las regiones C terminales (Figura 1). Además, algunas KRP del maíz tuvieron una alta identidad de la secuencia unas con otras. Por ejemplo, ZmKRP6 y ZmKRP7 fueron 90% idénticas, mientras que ZmKRPI y ZmKRP2 fueron 84% idénticas. Otros miembros de ZmKRP compartieron únicamente 16-50% de identidad. Las alineaciones de la secuencia y los cálculos del por ciento de identidad se realizaron mediante el Algoritmo Clustal W.

EJEMPLO 2 Este ejemplo describe la identificación los inhibidores de la CDK seleccionados para la supresión en los embriones de maíz. La base de datos de ADNc de maíz propiedad de Monsanto, se interrogó utilizando secuencias de ADN de las regiones codificantes de KRP del maíz identificadas en el Ejemplo 1 (SEQ ID NOS: 1 , 3, 5, 7, 9, 11 , 13, 15 y 17), utilizando el protocolo BLASTn para CDK. Esto se hizo para determinar cuales secuencias estaban representadas en las bibliotecas de ADNc para desarrollar tejidos de grano/embrión, así como varios tejidos que no son de grano. Las secuencias de ADNc que corresponden a ZmKRP , ZmKRP2, ZmKRP4, ZmKRP6, ZmKRP7 y ZmKRP9 (SEQ ID NOS: 1 , 2, 4, 6, 7 y 9), se identificaron en las bibliotecas de ADNc del grano o el embrión. Las secuencias de ADNc que corresponden a ZmKRP3, ZmKRP5 y ZmKRP8, se encontraron únicamente en las bibliotecas generadas a partir de bibliotecas que no son de grano. Estos resultados indicaron que al menos el grupo de genes representados por las secuencias encontradas en las bibliotecas de ADNc del grano o el embrión necesitan seleccionarse para la supresión. Sin embargo, la falla para identificar las secuencias de ADNc que corresponden a un gen dado en las bibliotecas de granos, no excluye la posibilidad de la expresión en el grano, puesto que una secuencia puede no estar representada en una biblioteca dada. Debido a que los 9 genes pueden expresarse en el embrión, todos se seleccionaron para la supresión utilizando un constructo de supresión de ARNds.

EJEMPLO 3 Este ejemplo describe la construcción de vectores para la supresión específica del tejido de los genes ZmKRP y la transformación de plantas de maíz con estos vectores.

Para suprimir los 9 genes similares al inhibidor de la CDK del maíz identificados en el Ejemplo 1 , se utilizó una estrategia de ARNds. Para construir el constructo de ARNds para suprimir los 9 genes ZmKRP (ZmKRPI- 9), se seleccionaron fragmentos (F) de 200 pares de bases de la región de extremo 3' de cada gen (F1 a F7, SEQ ID NOS: 19 a 25), excepto para ZmKRP9, en donde se seleccionaron 183 pares de bases (SEQ ID NO: 26) y se conectaron de una manera policistrónica. Puesto que ZmKRP6 y ZmKRP7 son idénticos en esta región 3' de 200 pares de bases, se utilizó un fragmento para seleccionar la supresión de ambos genes (F6). Para hacer el constructo final de expresión del maíz, se generaron primero dos constructos intermediarios. La construcción de los 2 constructos intermediarios de ARNds, se muestra esquemáticamente en las Figuras 4A hasta 5B. Cada constructo intermediario de ARNds contenía 4 de los fragmentos del extremo 3' tanto en la orientación sentido como antisentido, separados por una región del intrón interpuesta. El primer constructo intermediario contuvo las secuencias F1 hasta F4, y el segundo contuvo las secuencias F5 hasta F8. Las dos estructuras tallo-espira, con los promotores respectivos y las UTR 3', se combinaron en un vector de expresión del maíz (Figura 2), y se utilizaron para la transformación del maíz, utilizando el método de transformación con Agrobacterium descrito en el Ejemplo 10. Para construir el constructo intermediario de ARNds que contiene las secuencias F1 a F4, las conexiones sentido de F1 a F4, las conexiones antisentido de F1 a F4 y el fragmento del intrón ZmDnaK (gen que codifica para HSP70) (SEQ ID NO: 27) (véase, por ejemplo, la Patente de E.U.A. 5,424,412; Rochester er a/., EMBO J., 5:451-458 (1986)), se generaron individualmente mediante PCR y se montaron utilizando un método de clonación direccional BamHI/BglII (Figuras 4A y 4B). Los métodos de PCR siguieron los protocolos estándar expuestos por el fabricante (Roche Applied Science, Indianápolis, IN), y agregando DMSO al 5%, a menos que se indique de otra manera. El DMSO se agregó debido al alto contenido de GC del ADN del maíz. El fragmento F1 se amplificó mediante PCR a partir del ADN de la clona ZmKRPI EST utilizando los iniciadores P1-Stul (SEQ ID NO: 28) y P1-2R (SEQ ID NO: 29). Los iniciadores se exponen en el Cuadro 2 y se muestran en las Figuras 5A y 5B. El fragmento F1 se purificó a continuación utilizando la metodología estándar bien conocida en la técnica. El fragmento F1-2 se generó utilizando amplificación por PCR utilizando el producto de la PCR F1 purificado, mezclando con una cantidad equivalente del ADN de la clona ZmKRP2 EST como patrón, y P1-Stul (SEQ ID NO: 28) y P2-3 (SEQ ID NO: 30) como iniciadores. El producto de la PCR F1-2 se purificó sobre gel utilizando metodología estándar, De manera similar, F3 y F4 se conectaron mediante PCR utilizando los iniciadores P4-Bgl (SEQ ID NO: 31), P3-4 (SEQ ID NO: 32), y P5-Bam (SEQ ID NO: 33), resultando en un producto de la PCR F3-4. Los productos F1-2 y F3-4 se conectaron mediante PCR posteriormente utilizando los iniciadores P1-Stul, P2-3 y P5-Bam (SEQ ID NO: 33). El producto de la PCR resultante, F1-4, se purificó y clonó en un vector, utilizando el sistema de clonación Topo-TA (Invitrogen, Carlsbad, CA). La clona resultante, F14B3-sentido, tuvo una secuencia de longitud completa y de doble hebra. El fragmento F1-4 se amplificó a continuación mediante PCR de la clona F14B3-sentido, utilizando los iniciadores P5-Bgl (SEQ ID NO: 34) y P1-SseBam (SEQ ID NO: 35), para generar el fragmento antisentido. El producto de la PCR resultante se clonó nuevamente utilizando el sistema de clonación Topo-TA para formar la clona F14B3-antisentido. Esta clona se confirmó mediante secuenciamiento utilizando la metodología estándar.

CUADRO 2 Iniciadores utilizados en la construcción del vector de ARNds ZmKRP PCR/CONEXIONES INICIADORES SEQ ID NO P5-Nco 38 F5-6 y F7-8 P6-7 40 P8-i 43 P5-Nco 38 F5-8 e Intrón ZmDnaK P8-i 43 Pi-Bam 37 El intrón ZmDnaK (véase, por ejemplo, la Patente de E.U.A. 5,424,412), se amplificó mediante PCR a partir del vector de expresión de la planta pMON70091 , que contiene un promotor de zeína Z27 (Lopes et al., Mol. Gen. Genet, 247:603-613 (1995) y el intrón ZmDnaK utilizando los iniciadores Pi-Bgl (SEQ ID NO: 36) y Pi-Bam (SEQ ID NO: 37). El producto de la PCR, DnaK-1 , se clonó utilizando el sistema de clonación Topo-TA. Esta clona se confirmó mediante el secuenciamiento de longitud completa de doble hebra. Los fragmentos F1-4 sentido, el intrón ZmDnaK y el F1-4 antisentido se montaron de una manera paso a paso. Primero, el intrón ZmDnaK se escindió del constructo DnaK-1 descrito anteriormente, utilizando Bglll y BamHI. A continuación, este intrón se ligó al sitio BamHI del constructo F14B3-sentido, de manera que el sitio Bglll del intrón ZmDnaK/BamHI-BglII se ligó al sitio BamHI (introducido por el iniciador P5-Bam) en el extremo 3' de F1-4. Esta reacción de ligado proporcionó el constructo F14ln2. En segundo lugar, el fragmento F1-4 se escindió de la clona F14B3-antisentido con Bglll y BamHI, y el fragmento F1-4/Bglll-BamHI se ligó al sitio BamHI de F14ln2, de manera que el sitio Bglll de F1-4/Bglll-BamHI está ligado al sitio BamHI (introducido por ei iniciador PirBam) en el extremo 3' del intrón ZmDnaK. Esta reacción de ligado, proporcionó el constructo F142c1. Finalmente, el segmento completo de ADN que contiene el fragmento F1-4 sentido; el intrón ZmDnaK; el fragmento F1-4 antisentido se escindió de la clona F142c1 utilizando Stul y Sse8387l, y se clonó en pMON80611. pMON80611 es un vector binario para la transformación con Agrobacterium de plantas. Contiene bordes izquierdo y derecho para la transferencia del T-ADN, un cásete marcador seleccionable de planta, que consiste del promotor 35s mejorado: :gen marcador de resistencia al glifosato::UTR 3' nos (Patente de E.U.A. 5,627,061), y las secuencias del cásete de expresión de planta, que incluye un promotor L3 de oleosina (Patente de E.U.A. 6,433,252) y una UTR 3' de globulina del maíz (véase, por ejemplo, Belanger y Kriz, Genet, 129:863-872, (1991)), con sitios de clonación disponibles para la expresión de un gen de interés. El cásete de expresión resultante se nombró WWZHEN03.0024. El constructo de ARNds de ese intermediario que contiene los fragmentos F5 a F8 se generó a continuación. Las conexiones sentido de F5 a F8, las conexiones antisentido de F5 a F8 y el intrón ZmDnaK (SEQ ID NO: 27), se generaron individualmente mediante PCR y se montaron utilizando ya sea PCR o el método de clonación direccional BamHI/BglII, como se describió anteriormente y se muestra en las Figuras 5A y 5B. Los iniciadores utilizados en esas conexiones de PCR se listan en el Cuadro 2 y las Figuras 5A y 5B. El segmento montado que comprende F5-8 sentido; el intrón ZmDnaK; F5-8 antisentido, se clonó a continuación al vector pMON80611 para generar el segundo cásete de expresión WWZHEN03.0023. Para combinar WWZHEN03.0023 y WWZHEN03.0024, el segmento Ascl-Fsel de 4528 pb de WWZHEN03.0023, que comprende a F5-8 sentido; el intrón ZmDnaK; F5-8 antisentido, se purificó sobre gel (Qiagen Inc., Valencia, CA), y se ligó a WWZHEN03.0024 digerido con Mlul y Fsel para generar el constructo final de la transformación del maíz pMON71270 (Figura 2). Un constructo de supresión de ZmKRP accionado por el promotor Perl , se hizo a partir de dos constructos de ARNds intermediario WWZHEN03.0023 y WWZHDN03.0024 (anterior). Primero, el segmento que comprende F1-4 sentido; intrón ZmDnaK; F1-4 antisentido se escindió de WWZHDN03.0024 mediante digestión con Sfil y Sse8387l, y a continuación se clonó a los sitios Sfil y Sse8387l del vector pMON68290, que contiene Perl para generar WWZHEN03.0041. De manera similar, el segmento que comprende F5-8 sentido; el intrón ZmDnaK; F5-8 antisentido se escindió de WWZHEN03.0023 mediante la digestión con Sfil y Sse8387l, y a continuación se clonó a los sitios Sfil y Sse8387l del vector pMON68290, que contiene Perl para generar WWZHEN03.0042. Para combinar WWZHEN03.0041 y WWZHEN03.0042, el segmento AscI de 4481 pb de WWZHEN03.0042, que comprende F5-8 sentido; el intrón ZmDnaK; F5-8 antisentido, se purificó sobre gel (Qiagen Inc., Valencia, CA), y se ligó a WWZHEN03.0041 , digerido con Mlul para generar el constructo final de transformación del maíz pMON71279 (Figura 3).

EJEMPLO 4 Este ejemplo expone la construcción de vectores de transformación de plantas para la supresión de uno o más genes ZmKRP en el maíz. Se generaron constructos de supresión específicos de la semilla adicionales, utilizando fragmentos de tamaño alterno, que varían de 50 pares de bases al gen de longitud completa, y ya sea solos o en varias combinaciones. A manera de ejemplo, se generó un constructo de ARNds utilizando un fragmento de 200 pares de bases de ZmKRPI enlazado de manera operativa al promotor L3 (oleosina) del maíz. El fragmento F1 y el intrón ZmDnaK se generaron como se describió anteriormente en el Ejemplo 3. Los dos fragmentos se ligaron para generar un intermediario F1 ; fragmento del intrón ZmDnaK. Una alícuota del fragmento F1 aislado y purificado se amplifica a continuación mediante PCR para generar el F1 antisentido. El F1 antisentido se liga a continuación al intermediario F1 ; fragmento del intrón ZmDnaK para generar un constructo F1 de ARNds; el intrón ZmDnaK; F1 antisentido. El constructo se clona a continuación en un vector corriente abajo del promotor L3 (oleosina) del maíz. De manera alterna, el constructo se clona en un vector corriente debajo de un promotor tal como P-Zm.CEP1 , P-Zm.CPC214, P-Zm.CPC2 4tr1 , P-Zm.CPC214tr2, P-Os.CPC214 y P-Hv.PER1 , así como otros promotores preferidos del embrión, conocidos por aquellos con experiencia en la técnica. Se generaron constructos similares con ZmKRP2, ZmKRP3, ZmKRP4, ZmKRP5, ZmKRP6, ZmKRP7, ZmKRP8 y ZmKRP9. Se producen plantas transgénicas de maíz. La semilla transgénica se analiza de estos constructos para identificar las alteraciones en la masa del germen, la masa del grano, la proliferación celular, los niveles de aceite del grano completo, los niveles de proteína del grano completo (% de peso seco), la composición de aminoácidos del grano completo, los niveles de aminoácidos libres y la composición de los micronutrientes, como se expone en los ejemplos que siguen. Los fragmentos del gen ZmKRP utilizados en los constructos de ARNds, que resultan en alteraciones en cualquiera de las propiedades mencionadas anteriormente, se combinan a continuación, dependiendo del fenotipo deseado de la planta transformada, en un solo constructo policistrónico de ARNds, el cual se transforma a continuación en maíz utilizando la transformación con Agrobacterium; las plantas transgénicas se generan como se describe en el Ejemplo 10.

EJEMPLO 5 Este ejemplo describe como puede suprimirse la expresión de los genes endógenos similares al inhibidor de la CDK en la planta, utilizando la tecnología antisentido. El nivel de ZmKRPI generado en una célula de una planta de maíz puede disminuir introduciendo en el genoma un transgen que expresa un ARN antisentido del polipéptido ZmKRPI . Por ejemplo, el ADNc de ZmKRPI o un fragmento del mismo de al menos 100 pb de longitud, se clona en el vector de expresión de la planta pMON80611 en la orientación antisentido, que acciona la expresión bajo el control del promotor L3 y que contiene la UTR 3' de la globulina (Belanger y Kriz, Genet, 129:863-872 (1991)). El vector resultante se transforma en el genoma de una planta de maíz como se describe en el Ejemplo 10. Pueden introducirse múltiples copias del gen antisentido en un genoma. Otros genes similares al inhibidor de la CDK, por ejemplo ZmKRP2, pueden hacerse en constructos antisentido y expresarse de manera separada o en combinaciones, como se describió anteriormente para ZmKRPl .

EJEMPLO 6 Este ejemplo describe como puede suprimirse la expresión de los genes endógenos similares al inhibidor de la CDK en una planta, utilizando la tecnología de la ribozima. El nivel del ARNm de ZmKRPl generado en una célula de una planta de maíz puede disminuir introduciendo en el genoma un transgen que expresa una ribozima seleccionada contra un ARNm que codifica un polipéptido de ZmKRPl El constructo de ribozima se genera clonando al menos 24 pb del ADNc de ZmKRPl con una secuencia de ribozima agregada adyacente al AUG objetivo del gen endógeno (Merlo et al., Plant Cell, 10(10):1603-1622 (1998)) en el pMON806 1 , que acciona la expresión del promotor L3 y contiene una TTR 3' de globulina (Belanger y Kriz, Genet, 129:863-872 (1991)). El constructo resultante se transforma en una planta de maíz como se describe en el Ejemplo 10. Pueden introducirse múltiples copias de los genes ZmKRP que contienen ribozima en un genoma, como se describe en el Ejemplo 10. Los genes que contienen ribozima seleccionados contra una combinación de otros polipéptidos de ZmKRP (como se describió aquí anteriormente), pueden introducirse en un genoma, como se describió anteriormente para ZmKRPI , de manera que múltiples genes ZmKRP se suprimen simultáneamente.

EJEMPLO 7 Este ejemplo describe como puede suprimirse la expresión de los genes endógenos inhibidores de la CDK en una planta, utilizando la tecnología de recombinación homologa. El nivel de ZmKRPI generado en una célula de una planta de maíz puede disminuir mediante un método de reemplazo de un gen, vía la recombinación homologa. En este método, el gen ZmKRPI endógeno se reemplaza mediante un gen ZmKRPI mutagenizado. El gen mutagenizado codifica un ZmKRPI que es menos eficiente, o completamente deficiente, en la inhibición de la CDK, que uno codificado por el gen endógeno reemplazado. El gen que produce ZmKRPI se mutageniza por una o más supresiones, inserciones, duplicaciones o reemplazos nucleotídicos. El gen mutagenizado se funde a un gen marcador seleccionabie y se transforma en una célula de una planta de maíz, como se describe en el Ejemplo 10. Los eventos de recombinación homologa que pueden resultar en el reemplazo del gen se seleccionan basándose en el gen marcador seleccionabie (Puchta et al., Trends Plant Sc , 1 :340 (1996); Kempin et al., Nature, 389:802 (1997)). Los reemplazos de genes se confirman mediante análisis Southern blot o mediante PCR y secuenciamiento del ADN. De la misma manera descrita anteriormente, otros genes inhibidores de la CDK pueden suprimirse, de manera independiente o en combinaciones.

EJEMPLO 8 Este ejemplo describe como puede suprimirse la expresión de los genes endógenos inhibidores de la CDK en una planta, utilizando la tecnología de supresión sentido. El nivel del polipéptido de ZmKRPI generado en una célula de una planta disminuye mediante la supresión sentido. Por ejemplo, el ADNc que codifica para un polipéptido de ZmKRPI se fusiona a las secuencias reguladoras transcripcionales o traduccionales corriente arriba (5') tales como Perl y/o corriente abajo (3') y el gen quimérico se clona en un vector de transformación apropiado que porta un gen marcador seleccionabie y el vector se transforma en una célula de una planta de maíz como se describe en el Ejemplo 10. Los transformantes se seleccionan basándose en la presencia de un gen marcador (por ejemplo, resistencia al glifosato). Los transformantes se confirman mediante análisis Southern blot del ADN de los transformantes putativos. La mayoría de los organismos transgénicos que se derivarán de tales experimentos, expresarán el transgen sin afectar la expresión endógena. Sin embargo, en algunos pocos casos, tanto el transgen como el gen endógeno serán suprimidos. Para identificar estas plantas suprimidas sentido, se analizarán los extractos de ARN o de proteína de al menos 60 plantas transgénicas, para la presencia del ARNm de ZmKRP o el polipéptido, respectivamente. Otros genes similares al inhibidor de la CDK pueden utilizarse, solos o en varias combinaciones.

EJEMPLO 9 Este ejemplo expone un método para generar plantas de maíz masculinas estériles, expresando los inhibidores de la CDK del maíz en el tejido reproductor masculino. El promotor SILKY1 del maíz se enlaza de manera operativa a ZmKRP , ZmKRP2, ZmKRP4, ZmKRP5 y ZmKRP6 en constructos de expresión separados, que contienen las UTR 3' nos (Bevan et al., Nucí. Acid Res., 11 :369 (1983)) (existen otras posibilidades) y un marcador seleccionable de resistencia al glifosato. (Véase, Patente de E.U.A. 5,627,061). Uno o más de los casetes de expresión resultantes se/son transformados en el maíz utilizando el protocolo de transformación con Agrobacterium expuesto en el Ejemplo 10 y se generan las plantas transgénicas. La esterilidad masculina se determina realizando ensayos de germinación del polen (Walden, D.B. (1994), ¡n vitro Pollen Germination (pp 723-724), The Maize Handbook, Freeling, M. y Walbot, V. eds, Springer-Verlag, New York, Inc.), si está presente el polen. Además, la viabilidad del polen se prueba mediante la capacidad del polen transgénico de fertilizar óvulos de plantas no transgénicas y de producir semillas viables que alojen el transgen. Las plantas transgénicas estériles se mantienen fertilizando las plantas transgénicas con polen donador no transgénico.

EJEMPLO 10 Este ejemplo describe la transformación de las plantas de maíz con constructos que contienen las secuencias similares al inhibidor de la CDK del maíz. Los vectores de transformación descritos anteriormente se utilizan para transformar las plantas de maíz utilizando el siguiente procedimiento. Las plantas de maíz se cultivan en un invernadero bajo las prácticas estándar. Se hace la polinización controlada. El Agrobacterium ABI que contiene un vector en una solución patrón de glicerol se raya en un medio LB sólido, suplementado con los antibióticos canamicina (50mg/L), espectinomicina (50 mg/L), estreptomicina (50 mg/L) y cloramfenicol (25 mg/L) y se incuban a 28°C durante 2 días. Dos días antes de la inoculación con Agrobacterium de los embriones inmaduros del maíz, una colonia o un rizo pequeño de Agrobacterium de la placa de Agrobacterium se recoge e inocula en 25 mL de medio LB líquido suplementado con 100 mg/L de espectinomicina y 50 mg/L de canamicina en un matraz de 250 mL. El matraz se coloca en un agitador a aproximadamente 150 rpm y 26°C durante la noche. El cultivo de Agrobacterium se diluye a continuación (1 a 5) en el mismo medio líquido y se coloca nuevamente en el agitador. Varias horas más tarde, un día antes de la inoculación, las células de Agrobacterium se centrifugan a 3500 rpm durante 15 minutos. El gránulo de células de bacterias se resuspende en caldo de inducción con 200 µ? de acetosiringona y 50 mg/L de espectinomicina y 25 mg/L de canamicina y la densidad celular se ajusta a 0.2 a O.D.66o- El cultivo celular de bacterias (50 mL en cada matraz de 250 mL) se pone entonces nuevamente en el agitador y se cultiva durante la noche. En la mañana del día de la inoculación, las células de bacterias se centrifugan y se lavan con medio 1/2MS VI líquido (Cuadro 3) suplementado con 200 µ? de acetosiringona. Después de una centrifugación más, el gránulo de células de bacterias se resuspende en medio ½ MS PL (Cuadro 3) con 200 µ? de acetosiringona (Cuadro 3) y la densidad celular se ajustó a 1.0 a O.D66o para la inoculación. Los reactivos están comercialmente disponibles y pueden comprarse de varios proveedores (véase, por ejemplo, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO).

CUADRO 3 Medio utilizado 1 Componente ½ MS VI ½ MS PL Medio de MS de Inducción MSW50 MS/6BA MSOD cocultivo Sales de MS 68.5g/l 68.5g/l 2.2 g/l 4.4 g/l 4.4 g/l 4.4 g/l 4.4 g/l Sucrosa 20 g/l 68.6g/l 20 g/l 30 g/l 30 g/l 30 g/l — Maltosa — — — — — _ 20 g/l Glucosa 10 g/l 36 g/l 10 g/l — — — 10 g/l l-Prolina 115 115 mg/l 115 mg/l 1.36 g/l 1.38 g/l 1.36 g/l Casaminoácidos mg/l - 50 mg/l 500 mg/l 50 mg/l _ - 2 mg/l 2 mg/l — 2 mg/l — — Glicina 2 mg/l — — — — — 150 l-Asparagina - 100 mg/l 100 mg/l — 100 mg/l — mg/l mio-lnositol 100 0.5 mg/l 0.5 mg/l 1.3 mg/l 0.5 mg/l 1.3 100 Acido Nicotinico mg/l 0.5 mg/l 0.5 mg/l 0.25 mg/l 0.5 mg/l mg/l mg/l Piridoxina-HCI 0.5 0.1 mg/l 0.6 mg/l 0.25 mg/l 0.6 mg/l 0.25 1.3 Tiamina-HCI mg/l — - 0.25 mg/l — mg/l mg/l Pentbtenato de Ca 0.5 — 3 mg/l 0.5 mg/l 0.5 mg/l 0.25 0.25 2,4-D mg/l - 2.2 mg/l — mg/l mg/l Picloram 0.1 — 1.7 mg/l .7 mg/l — 0.25 0.25 Nitrato de Plata mg/l — - — mg/l mg/l BAP — - 0.25 — — mg/l — 3.5 — — mg/l — 1EI medio ½ MSVI y ½ MSPL se utilizaron como un líquido. El medio de cocultivo se solidificó con 5.5 mg/l de agarosa EEO inferior. Todos los otros medios se solidificaron con 7 g/l de Fitagar para la selección con NPTII y con 3 g/l de fitagel para la selección con glifosato.

Se utilizó una línea de maíz de primera categoría (LH244) para la transformación, con relación a esta invención. Las espigas que contienen los embriones inmaduros se recolectaron aproximadamente 10 días después de la polinización y se mantuvieron en refrigeración a 4°C hasta el uso (hasta 5 días posrecolección). El tamaño preferido del embrión para este método de transformación es de -1.0-2.0 mm. Este tamaño se alcanza usualmente 10 días después de la polinización dentro del invernadero, con las condiciones de crecimiento de una temperatura promedio de 30.55°C (87°F) , duración del día de 14 horas con iluminación suplementaria proporcionada por lámparas de Sodio de Alta presión GE de 1000 Watts. Los embriones inmaduros se aislaron de las espigas esterilizadas en la superficie y se dejaron caer directamente en la suspensión de células de Agrobacterium en un tubo de microcentrífuga de 1.5 mL. El aislamiento dura continuamente durante 15 minutos. El tubo se apartó entonces durante 5 minutos, lo cual hace al tiempo de inoculación para los embriones individuales de 5 a 20 minutos. Después de que la suspensión de células de Agrobacterium se retira utilizando una pipeta de transferencia estéril de punta fina, los embriones inmaduros se transfieren a un medio de cocultivo (Cuadro 3). Los embriones se colocan en el medio con el escutelo orientado hacia arriba. Los embriones se cultivaron en una incubadora oscura (23°C) durante aproximadamente 24 horas. Los embriones se transfieren a continuación en medio MS modificado (MSW50, Cuadro 3) suplementado con glifosato 0.1 ó 0.25 mM y · 250 mg/L de carbenicilina para inhibir el Agrobacterium en cajas de Petri (100 mm x 25 mm). Los cultivos se incubaron en una sala de cultivo oscura a 27°C durante 2-3 semanas. Todas las piezas de los callos se transfieren entonces individualmente en el primer medio de regeneración (MS/6BA, Cuadro 3) suplementado con el mismo nivel de glifosato. Los cultivos se cultivan en este medio y en una sala de cultivo con un fotoperiodo de 16 horas de luz/8 horas de oscuridad y 27°C durante 5-7 días. A continuación, se transfieren al segundo medio de regeneración (MSOD, Cuadro 3) en una caja de petri (100 mm x 25 mm) durante aproximadamente 2 semanas. Todas las piezas de los callos con brotes regenerantes y tejido viviente se transfieren al mismo medio contenido en las fitocharolas para que los brotes crezcan adicionalmente antes de ser movidos al suelo. Esto toma 2-4 semanas. El medio de regeneración (MS6BA y MSOD) es suplementado todo con 250 mg/L de carbenicilina y con glifosato 0.1 ó 0.25 mM. * Estas plántulas en desarrollo se transfieren a continuación al suelo, endurecido en una cámara de crecimiento a 27°C, 80% de humedad y con intensidad de luz baja durante aproximadamente 1 semana, y a continuación se transfieren a un invernadero y crecen bajo las condiciones estándar del invernadero. Las plantas del invernadero se analizan a continuación para los niveles de expresión, así como para los niveles de aceite y proteínas.

EJEMPLO 11 Este ejemplo describe los análisis de expresión de las plantas transgénicas. El análisis de expresión del ARN se utiliza para verificar la falta de expresión o la supresión de los inhibidores de la CDK en las plantas transgénicas. Como se utiliza en esta solicitud, "falta de expresión" significa una expresión espacial o temporal diferente a la expresión endógena, por ejemplo, sobreexpresión y expresión ectópica. El ARN se extrae mediante un protocolo estándar (Wadsworth et al, Analytical Biochemistry, 172(1):279-283 (1988)). Para determinar la falta de expresión o la supresión de los genes ZmKRP en los tejidos embrionarios del maíz, se realizó un análisis TaqMan utilizando el Equipo y Protocolo de Reactivos de la Mezcla Maestra de TaqMan One-Step RT-PCR (#4310299 rev. C) (Applied Biosystems, Foster City CA). El ADNc se sintetiza (Equipo de Síntesis de ADNc PCR SMART, #K1052-1 , Clonetech Laboratories, Inc.) y la PCR estándar que utiliza iniciadores específicos del gen y electroforesis sobre gel de azarosa para visualizar los productos de la PCR.

EJEMPL0 12 Este ejemplo proporciona los procedimientos analíticos para determinar el contenido de aceite y de proteínas, las diferencias de masa, la composición de los aminoácidos, los niveles de aminoácidos libres y el contenido de micronutrientes de las plantas de maíz transgénicas. Los niveles de aceite (en una base de masa y como el por ciento del peso del tejido) de graos de maíz únicos de la primera generación, y el germen y el endosperma disecados se determinaron mediante resonancia magnética nuclear (RMN) 1H de baja resolución (Tiwari et al., JAOCS, 51 :104- 109 (1974); o Rubel, JAOCS, 71 :1057-1062 (1994)), por lo que los tiempos de relajación de la ARN de las muestras de los granos únicos se midieron, y los niveles de aceite se calcularon basándose en los análisis de regresión utilizando una curva estándar generada de los análisis de los granos de maíz con niveles variables de aceite, determinados gravimétricamente después de una extracción acelerada con solventes. Se realizó un análisis de una sola vía de la varianza y la prueba T de Student (JMP, versión 4.04, SAS Institute Inc., Cary, NC, EUA) para identificar las diferencias significativas entre los granos transgénicos y los no transgénicos, como se determina mediante PCR específica del transgen. Los niveles de aceite y los niveles de proteína en las semillas de la segunda generación se determinan mediante espectroscopia NIT, por lo que se miden los espectros NIT de las muestras de las semillas coleccionadas, recolectadas de las plantas individuales, y los niveles de aceite y proteína se calcularon basándose en el análisis de regresión utilizando una curva estándar generada de los análisis de los granos de maíz con niveles variables de aceite o proteína, como se determina gravimétricamente después de la extracción acelerada con solventes o el análisis elemental (%N), respectivamente. Se realizaron análisis de una vía de la varianza y la prueba T de Student para identificar las diferencias significativas en el aceite (% del peso del grano) y la proteína (% del peso del grano) entre la semilla de las plantas positivas al marcador y negativas al marcador. Los niveles de aminoácidos libres se analizaron de cada uno de los eventos transgénicos utilizando el siguiente procedimiento. Las semillas de cada una de las plantas transgénicas se trituraron individualmente en un polvo fino y aproximadamente 50 mg del polvo resultante se transfirieron a un tubo de centrifuga prepesado. El peso exacto de la muestra se registra y se agrega 1.0 mi de ácido tricloroacético al 5% a cada tubo de la muestra. Las muestras se mezclan a temperatura ambiente mediante un vórtice y a continuación se centrifugan durante 15 minutos a 14,000 rpm en una microcentrífuga Eppendorf (Modelo 5415C, Brinkmann Instrument, Westbury, NY). Se retira una alícuota del sobrenadante y se analiza mediante HPLC (Agilent 1100) utilizando el procedimiento expuesto en la Publicación Técnica de Agilent "Amino Acid Analysis Usíng the Zorbax Eclipse-AAA Columns and the Agilent 1100 HPLC", Marzo 17, 2000. La determinación cuantitativa de los aminoácidos totales del maíz se realiza mediante el siguiente método. Los granos se trituran y aproximadamente 60 mg de la harina resultante se hidrolizan en ácido utilizando HCI 6 N bajo reflujo a 100°C durante 24 horas. Las muestras se secan y reconstituyen en HCI 0.1 N, seguido por la derivación en precolumna 9 con a-ftalaldehído (???? para el análisis por HPLC. Los aminoácidos se separan mediante una columna para HPLC en fase inversa Zorbax Eclipse XDB-C18 en un HPLC Agilent 1100 (Agilent, Palo Alto, CA). Los aminoácidos se detectan mediante fluorescencia. La cisteína, prolina, asparagina, glutamina y triptofano no se incluyen en esta selección de los aminoácidos (Henderson et al., "Rapid, Accurate, Sensitive and Reproducible HPLC Analysis of Amino acids, Amino Acid Analysis Using Zorbax Eclipse-AAA Columns and the Agilent 1100 HPLC," Agilent Publication (2000); véase, también, "Measurement of Acid-Stable Amino Acids," Método AACC 07-01 (American Association of Cereal Chemists, Métodos Aprobados, 9a edición (LCCC# 95-75308)). El triptofano total se mide en los granos de maíz utilizando el método de la hidrólisis alcalina como se describió (Métodos Aprobados de la American Association of Cereal Chemists -10a edición, AACC ed, (2000) 07-20 Measurement of Tryptophan - Alakline Hydrolysis). Los niveles de tocoferol y tocotrienol se probaron mediante métodos bien conocidos en la técnica. Brevemente, 10 mg de tejido de semilla se agregaron a 1 g de microperlas (Biospec Product Inc, Barlesville, OK) en un tubo estéril de microfuga, al cual se le habían agregado 500 µ? de pirogalol al 1% (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)/etanol. La mezcla se agitó durante 3 minutos en un mini Beadbeater (Biospec) en la velocidad "rápida", a continuación se filtró a través de un filtro de 0.2 µ?t? en un tubo de un tomador de muestras automático. Los extractos filtrados se analizaron mediante HPLC utilizando una columna de HPLC de sílice Zorbax (4.6 9 mmx250 mm) con detección fluorescente, una excitación a 290 nm, una emisión a 336 nm, y paso de banda y ranuras. La composición del solvente y las condiciones de trabajo son como se listan a continuación con el solvente A como hexano y el solvente B como éter metil-t-butílico. El volumen de inyección es de 20 µ?, la velocidad de flujo es de 1.5 ml/minuto y el tiempo de la corrida es de 12 minutos a 40°C. El gradiente del solvente es 90% del solvente A, 10% del solvente B durante 10 minutos; 25% del solvente A, 75% del solvente B durante 11 minutos y 90% del solvente A, 10% del solvente B durante 12 minutos. Los estándares del tocoferol en pirogalol al 1 %/etanol se corren para comparación (a-tocoferol, ?-tocoferol, ß-tocoferol, d-tocoferol y tocoferol (tocol)). Las curvas estándar para el alfa, beta, delta y gamma tocoferol se calculan utilizando el programa Chemstation (Hewlett Packard). Los estándares del tocotrienol en pirogalol al 1%/etanol se corren para comparación (a-tocotrienol, ?-tocotrienol, ß-tocotrienol, d-tocotrienol). Las curvas estándar para el for a-, ß-, d- y ?-tocotrienol se calculan utilizando el programa Chemstation (Hewlett Packard). Los niveles de carotenoides dentro de los granos transgénicos de maíz se determinan mediante un protocolo estándar (Craft, Meth. Enzymol., 213:185-205 (1992)). Los plastiquinoles y las filoquinonas se determinan mediante protocoles estándar (Threlfall eí al., Methods ¡n Enzymology, XVIII, parte C, 369-396 (1971); y Ramadan et al., Eur. Food Res. Technol., 214(6):521-527 (2002)).

Los resultados de los eventos que contienen p ON71270 se muestran en el Cuadro 4.

Los ejemplos del aceite y el tamaño del órgano, incrementados, se demuestran en varios eventos. Los miligramos de aceite por germen se incrementó en dos eventos independientes, ZM_S86578 (p=0.05) y ZM_S86487 (p=0.1). Los miligramos de aceite por grano (p=0.05) y el aceite del grano como un porcentaje del peso seco (p=0.01 ) se incrementaron ambos en el evento ZM_S86481. El aceite del germen como un porcentaje del peso seco se incrementó en tres eventos independientes, ZM_S86521 (p=0.1), ZM_S86548 (p=0.01) y ZM_S86578 (p=0.05). El peso del germen (peso seco en gramos) (p=0.1) y el peso del germen como un porcentaje del peso total del grano (p=0.1) se incrementaron en el evento ZM_S86487. Los resultados de los eventos que contienen pMON7 279 se muestran en el Cuadro 5. 10 Los ejemplos del aceite y el tamaño del órgano incrementados se demuestran en varios eventos. El peso del germen (peso seco en g) se incrementó en tres eventos independientes, ZM_S105183 (p=0.01), ZM_S105166 (p=0.05) y ZM_S106973 (p=0.01). Los miligramos de aceite por germen se incrementó en tres eventos independientes, ZM_S105183 (p=0.01), ZM_S105185 (p=0.05) y ZM_S106979 (p=0.01). El peso del germen como un porcentaje del peso total del grano se incrementó en dos eventos independientes, ZM_S105 83 (p=0.1) y ZM_S106940 (p=0.1). Los miligramos de aceite por grano se incrementaron en dos eventos independientes, ZM_S105166 (p=0.1) y ZM_S106979 (p=0.05). El aceite del grano como un porcentaje del peso seco se incrementó en el evento ZM_S106985 (p=0.1). El peso del grano (peso seco en g) se incrementó en dos eventos independientes ZM_S105166 (p=0.05) y ZM_S106979 (p=0.01). Los resultados muestran que las semillas que alojan el pMON7 270, y otros constructos descritos en los Ejemplos 3 y 4, tienen al menos uno de los siguientes fenotipos: masa incrementada del germen (como un por ciento del peso del grano), niveles incrementados de aceite en el grano entero (como un por ciento del peso del grano), calidad mejorada de la proteína (lisina, triptofano, treonina, ¡soleucina y metionina incrementados, por ejemplo), aminoácidos libres (hacia arriba o hacia abaja) o contenido incrementado de micronutrientes, incluyendo tocoferoles, tocotrienoles, carotenoides, plastiquinoles y filoquinonas.

EJEMPLO 13 Este ejemplo describe los análisis histológicos de los tejidos de las plantas transgénicas de maíz. Los granos maduros o en desarrollo de maíz fresco o congelado se cortaron sagitalmente. Los cortes de tejido de 1 mm o más delgados se tiñen durante 1 a 2 minutos en una solución de azul de anilina al 0.01% C.l. 42755 (Baker, Phillipsburg, N.J.) en amortiguador de fosfato 0.1M, pH 8.0. Las muestras se enjuagaron en amortiguador de fosfato 0.1 M, pH 8.0, y se examinaron con un microscopio fluorescente estándar utilizando un cubo violeta estrecho Nikon V-4 (EX 380-420nm, DM 430 nm, BA 450 nm) o un fuente de luz ultravioleta (EX330-380, DM400, BA420). De manera alterna, las muestras pueden visualizarse utilizando un microscopio confocal utilizando un láser de ion Argón (longitud de onda de emisión 488 nm y 514 nm). El azul de anilina tiñe las paredes celulares y los núcleos de las plantas (Smith y McCully, Stain Technology, 53(2):79-85 (1978)). El tamaño de la célula se determina utilizando una herramienta de contorneo en el programa Nikon EZ C-1. Aproximadamente 25 a 50 células se contornean y el área que ocupan las células se registra y se calcula el área promedio por célula. Los análisis histológicos de los eventos que contienen pMON71270 proporcionaron 3 eventos que demostraron un incremento significativo en el número de células, como se caracteriza por más células por unidad de área en el embrión (1.3x, 1.7x, 2.4x, p=0.05) sin reducción en la masa del embrión. Los análisis histológicos de los eventos que contienen pMON71279 proporcionaron 3 eventos con el número de células del tipo silvestre por unidad de área (1.1x, 0.97x, 0.96x, p=0.05), pero debido a la masa incrementada del embrión, proporcionaron un incremento en el número total de células por embrión. Para determinar los índices mitóticos, los tejidos del maíz se fijan, se tiñen con una sonda fluorescente, se aclaran y se forma su imagen utilizando microscopía fluorescente o microscopía láser de exploración confocal (CLSM). El índice mitótico se determina contando el número de células en un área que están en prometafase, metafase o anafase y se reporta como un porcentaje. Por ejemplo, el tejido de maíz puede fijarse en formalina, ácido propiónico y etanol, se tine con yoduro de propidio y se aclaran con xileno (Running et al., Confocal Microscopy of the Shoot Apex, Methods in Cell Biology, 49:217-229 (1995)).

EJEMPLO 14 Este ejemplo describe como medir la actividad del inhibidor de la CDK. Los extractos de proteína de los tejidos de la planta transgénica o no transgénica, se enriquecen con CDK utilizando la resina p13Suc1 (Oncogene Sciences, Cambridge, MA), y se realizan ensayos de histona H1 cinasa (Wang et al., Plant J., 15:501-510 (1998)). Los tejidos de la planta transgénica con actividad incrementada del inhibidor de la CDK tienen una actividad reducida de la cinasa, mientras que los tejidos de la planta transgénica con actividad reducida del inhibidor de la CDK tienen actividad incrementada de la cinasa. Las siguientes referencias se incorporan específicamente en la presente como referencia: Birren et al., Genome Analysis: A Laboratory Manual Series, Volume 1, Analyzing DNA, Coid Spring Harbor Laboratory Press, Coid Spring Harbor, NY (1997), Birren et al., Genome Analysis: A Laboratory Manual Series, Volumen 2, Detecting Genes, Coid Spring Harbor Laboratory Press, Coid Spring Harbor, NY (1998), Birren et al., Genome Analysis: A Laboratory Manual Series, Volume 3, Cloning Systems, Coid Spring Harbor Laboratory Press, Coid Spring Harbor, NY (1999), Birren et al., Genome Analysis: A Laboratory Manual Series, Volumen 4, Mapping Genomes, Coid Spring Harbor Laboratory Press, Coid Spring Harbor, NY ( 999), Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Coid Spring Harbor Laboratory Press, Coid Spring Harbor, NY (1988), Harlow et al., Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1999), Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989), Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Blology, John Wiley & Sons, Inc., NY (1999), y Croy, Plant Molecular Biology Labfase, BIOS Scientific Publications, Ltd. (RU) y Blackwell Scientific Publications (RU) (1993). Todas las referencias, incluyendo las publicaciones, solicitudes de patente y patentes citadas en la presente, se incorporan por lo tanto como referencia, al mismo grado como si cada referencia se indicara de manera individual y específica como incorporada como referencia y se expusiera en su totalidad en la presente. Aunque esta invención se ha descrito con un énfasis en las modalidades preferidas, será evidente para aquellos con experiencia ordinaria en la técnica que pueden prepararse y utilizarse variaciones en las modalidades preferidas, y que la invención puede practicarse de otra manera que la descrita específicamente en la presente. La presente invención pretende incluir tales variaciones y prácticas alternas. En consecuencia, esta invención incluye todas las modificaciones abarcadas dentro del espíritu y alcance de la invención, como se define por las siguientes reivindicaciones. El uso de los términos "un, una" y "el, la" y las referencias similares en el contexto para describir la invención (especialmente en el contexto de las siguientes reivindicaciones) debe considerarse que cubre tanto el singular como el plural, a menos que se indique de otra manera en la presente o se contradiga claramente por el contexto. Los términos "que comprende", "que tiene", "incluyendo" y "que contiene" deben considerarse como términos de extremo abierto (es decir, significan "incluyendo, de manera no exclusiva,") a menos que se indique de otra manera. La exposición de los intervalos de los valores en la presente, pretende simplemente servir como un método corto para referirse de manera individual a cada valor que caiga dentro del intervalo, a menos que se indique de otra manera en la presente, y cada valor separado está incorporado en la especificación como si se expusiera de manera individual en la presente. Todos los métodos descritos en la presente pueden realizarse en cualquier orden adecuado, a menos que se indique de otra manera en la presente o se contradiga claramente de otra manera por el contexto. El uso de cualquiera y todos los ejemplos, o de un lenguaje' ejemplar (por ejemplo, "tal como") proporcionado en la presente, pretende simplemente ¡luminar mejor la invención y no plantea una limitación en el alcance de la invención, a menos que se reclame de otra manera. Ningún lenguaje en la especificación debe considerarse como que indica un elemento no reclamado como esencial para la práctica de la invención. Las modalidades preferidas de la invención se describen en la presente, incluyendo el mejor modo conocido por los inventores para llevar a cabo la invención. Las variaciones de estas modalidades preferidas pueden volverse evidentes para aquellos con experiencia ordinaria en la técnica, tras la lectura de la descripción anterior. Los inventores esperan que los expertos empleen tales variaciones conforme sea apropiado, y los inventores pretenden que la invención sea practicada de otra manera que como se describe de manera específica en la presente. En consecuencia, esta invención incluye todas las modificaciones y equivalentes de la materia expuesta en las reivindicaciones anexas a la presente, como se permite por la ley aplicable. Además, cualquier combinación de los elementos descritos anteriormente en todas las variaciones posibles de los mismos, está abarcada por la invención, a menos que se indique de otra manera en la presente o se contradiga claramente de otra manera por el contexto.

Claims (3)

NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES

1- Una molécula de ácido nucleico aislada o purificada que comprende ADN, seleccionada del grupo que consiste de: (i) las secuencias nucleotídicas de las SEQ ID NO: 1 , 3 y 9 y ADN que tienen al menos aproximadamente 70% de identidad de la secuencia con las mismas, (ii) las secuencias nucleotídicas que codifican una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 2, 4 y 10; (iii) las secuencias nucleotídicas que codifican una secuencia de aminoácido que es al menos aproximadamente 70% idéntica con las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 2, 4 y 10 y que tienen actividad similar al inhibidor de la CDK, y (iv) el fragmento de cualquiera de (i)-(üi), en donde el fragmento comprende al menos 35 nucleótidos contiguos de las SEQ ID NOs: 1 ó 3 o al menos 120 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO: 9.

2 - La molécula de ácido nucleico aislada o purificada de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque está enlazada de manera operativa a un promotor que se expresa de manera preferida en el tejido reproductor masculino del maíz. 3.- La molécula de ácido nucleico aislada o purificada de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada además porque el promotor es el promotor SILKY1 del maíz, el promotor NTM19 del tabaco, el promotor PCA55 del maíz, el promotor NPG1 del tabaco, el promotor AP3 de Arabidopsis, el promotor Bgp1 de Brassica, un promotor preferido de la antera, un promotor preferido del polen o un promotor preferido de la microespora. 4. - Un vector que comprende una molécula de ácido nucleico aislada o purificada como la que se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-3. 5. - Una célula hospedera que comprende la molécula de ácido nucleico aislada o purificada como la que se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-3, opcionalmente en la forma de un vector. 6. - Una molécula de ácido nucleico aislada o purificada que comprende la secuencia complementaria o antisentido de la molécula de ácido nucleico aislada o purificada como la que se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-3 y en donde la molécula de ácido nucleico aislada o purificada está opcionalmente en la forma de un vector. 7. - Un polipéptido aislado o purificado que es codificado por la molécula de ácido nucleico aislada o purificada como la que se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-3. 8.- Un constructo de ácidos nucleicos que comprende al menos una secuencia nucleotídica transcribible, la expresión de la cual resulta en la supresión de un ácido nucleico endógeno, seleccionado del grupo que consiste de: la SEQ ID NO: 1 [ZmKRPI], una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 [ZmKRPI], SEQ ID NO: 3 [ZmKRP2], y una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4 [ZmKRP2], sola o en combinación adicional con al menos otra secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 5 [ZmKRPS], una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6 [ZmKRP3], SEQ ID NO: 7 [ZmKRP4], una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8 [ZmKRP4], SEQ ID NO: 9 [ZmKRP5], una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10 [ZmKRP5], SEQ ID NO: 11 [ZmKRP6], una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 12 [ZmKRP6], SEQ ID NO: 13 [ZmKRP7], una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14 [ZmKRP7], SEQ ID NO: 15 [ZmKRP8], una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 16 [ZmKRP8], SEQ ID NO: 17 [ZmKRP9], y una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 18 [ZmKRP9], en donde, cuando el constructo de ácidos nucleicos comprende dos o más secuencias nucleotídicas transcribibles, las secuencias nucleotídicas pueden estar presentes en cualquier orden en el constructo de ácidos nucleicos y pueden ser policistrónicas, en donde cada secuencia nucleotídica transcribible comprende al menos aproximadamente 100 nucleótidos contiguos, y en donde la expresión de cada secuencia nucleotídica transcribible induce opcionalmente la supresión del gen. 9. - El constructo de ácidos nucleicos de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque comprende un promotor que se expresa de manera preferida en el germen y/o la aleurona de un grano de maíz y el promotor está enlazado de manera operativa a al menos una secuencia nucleotídica transcribible. 10. - El constructo de ácidos nucleicos de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque el promotor es un promotor de oleosina de maíz, un promotor de globulina del maíz, un promotor de la MIP sintasa del maíz, un promotor Perl de la cebada, un promotor preferido del embrión, tal como P-Os.CPC214 del arroz o un promotor preferido del embrión tal como P-Zm.CEP1 , P-Zm.CPC214, P-Zm.CPC214tr1 , o P-Zm.CPC214tr2 del maíz. 11. - El constructo de ácidos nucleicos de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque la al menos una secuencia nucleotídica transcribible es una secuencia no codificante. 12. - El constructo de ácidos nucleicos de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizado además porque la secuencia no codificante es un intrón, una secuencia nucleotídica de una región del promotor, una secuencia nucleotídica de una región no traducida 5', una secuencia nucleotídica de una región no traducida 3', o un fragmento de cualquiera de lo anterior. 13. - Un constructo de ácidos nucleicos que comprende al menos una secuencia nucleotídica transcribible, la expresión de la cual resulta en la supresión de una secuencia nucleotídica endógena, seleccionada de la SEQ ID NO: 7 [ZmKRP4] y/o la SEQ ID NO: 7 [ZmKRP9], cualquiera de una o ambas de las secuencias nucleotídicas transcribibles está en combinación adicional con al menos otra secuencia nucleotídica transcribible, la expresión de la cual resulta en la supresión de un ácido nucleico endógeno, seleccionado del grupo que consiste de: (i) SEQ ID NO: 1 [ZmKRPI] o una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 [ZmKRPI], (ii) SEQ ID NO: 3 [ZmKRP2] o una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4 [ZmKRP2], (¡ii) SEQ ID NO: 5 [ZmKRP3], con la condición de que la secuencia nucleotídica transcribible no corresponde completamente a los nucleótidos 175-342 de la SEQ ID NO: 5, (iv) SEQ ID NO: 9 [ZmKRP5] o una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10 [ZmKRP5], con la condición de que la secuencia nucleotídica transcribible no corresponde completamente a los nucleótidos 450-570 de la SEQ ID NO: 9, (v) SEQ ID NO: 1 [ZmKRP6] o una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 12 [ZmKRP6], con la condición de que la secuencia nucleotídica transcribible no corresponde completamente a los nucleótidos 380-765 de la SEQ ID NO: 11 , (vi) SEQ ID NO: 13 [ZmKRP7] o una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14 [ZmKRP7], con la condición de que la secuencia nucleotídica transcribible no corresponde completamente a los nucleótidos 335-718 de la SEQ ID NO: 13 y (vií) SEQ ID NO: 15 [ZmKRP8] o una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 16 [ZmKRP8], con la condición de que la secuencia nucleotídica transcribible no corresponde completamente a los nucleótídos 350-405 ó 420-698 de la SEQ ID NO: 15, en donde las secuencias nucleotídicas transcribibles pueden estar presentes en cualquier orden en el constructo de ácidos nucleicos y pueden ser policistrónicas, en donde cada secuencia nucleotídica transcribible comprende al menos aproximadamente 100 nucleótidos contiguos, y en donde la expresión de cada secuencia nucleotídica transcribible induce opcionalmente la supresión del gen. 14.- El constructo de ácidos nucleicos de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado además porque comprende un promotor que se expresa de manera preferida en el germen y/o la aleurona de un grano de maíz, y el promotor está enlazado de manera operativa a al menos una secuencia nucleotídica transcribible. 15.- El constructo de ácidos nucleicos de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque el promotor es un promotor de oleosina de maíz, un promotor de globulina del maíz, un promotor de la MIP sintasa del maíz, un promotor Perl de la cebada, un promotor preferido del embrión, tal como P-Os.CPC214 del arroz o un promotor preferido del embrión tal como P-Zm.CEP1, P-Zm.CPC214, P-Zm.CPC214tr1, o P-Zm.CPC214tr2 del maíz. 16.- El constructo de ácidos nucleicos de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1

3-15, caracterizado además porque la al \ 116 menos una secuencia nucleoíídica transcribible es una secuencia no codificante. 17. - El constructo de ácidos nucleicos de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque la secuencia no codificante es un intrón, una secuencia nucleotídica de una región del promotor, una secuencia nucleotídica de una región no traducida 5', una secuencia nucleotídica de una región no traducida 3', o un fragmento de cualquiera de lo anterior. 18. - Un constructo de ácido nucleicos que comprende al menos una secuencia nucleotídica transcribible, la expresión de la cual resulta en la supresión de un ácido nucleico endógeno, seleccionado del grupo que consiste de: (i) SEQ ID NO: 1 [ZmKRPI] o una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 [ZmKRPI], (ii) SEQ ID NO: 3 [ZmKRP2] o una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4 [ZmKRP2], (¡ii) SEQ ID NO: 5 [ZmKRP3] o una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6 [ZmKRP3], con la condición de que la secuencia nucleotídica transcribible no corresponde completamente a los nucleótidos 175-342 de la SEQ ID NO: 5, (iv) SEQ ID NO: 9 [ZmKRP5] o una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10 [ZmKRP5], con la condición de que la secuencia nucleotídica transcribible no corresponde completamente a los nucleótidos 450-570 de la SEQ ID NO: 9, (v) SEQ ID NO: [ZmKRP6] o una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 12 [ZmKRP6], con la condición de que la secuencia nucieotídica transcribible de la SEQ ID NO: 11 no corresponde completamente a los nucleótidos 380-765 de la SEQ ID NO: 1 , (vi) SEQ ID NO: 13 [ZmKRP7J o una secuencia nucieotídica que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14 [ZmKRP7], con la condición de que la secuencia nucieotídica transcribible no corresponde completamente a los nucleótidos 335-718 de la SEQ ID NO: 13, (vii) SEQ ID NO: 15 [ZmKRP8] o una secuencia nucieotídica que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 16 [ZmKRP8], con la condición de que la secuencia nucieotídica transcribible no corresponde completamente a los nucleótidos 350-405 ó 420-698 de la SEQ ID NO: 15 y (vüi) SEQ ID NO: 17 [ZmKRP9] o una secuencia nucieotídica que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 18 [ZmKRP9], con la condición de que la secuencia nucieotídica transcribible no corresponde completamente a los nucleótidos 1-183 de la SEQ ID NO: 17, en donde las secuencias nucleotídicas transcribibles pueden estar presentes en cualquier orden en el constructo de ácidos nucleicos y pueden ser policistrónicas, en donde cada secuencia nucieotídica transcribible comprende al menos aproximadamente 100 nucleótidos contiguos, y en donde la expresión de cada secuencia nucieotídica transcribible induce opcionalmente la supresión del gen. 19.- El constructo de ácidos nucleicos de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado además porque comprende un promotor que se expresa de manera preferida en el germen y/o la aleurona de un grano de maíz, y el promotor está enlazado de manera operativa a al menos una secuencia nucleotídica transcribible. 20.- El constructo de ácidos nucleicos de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado además porque el promotor es un promotor de oleosina de maíz, un promotor de globulina del maíz, un promotor de la MIP sintasa del maíz, un promotor Perl de la cebada, un promotor preferido del embrión, tal como P-Os.CPC214 del arroz o un promotor preferido del embrión tal como P-Zm.CEP1 , P-Zm.CPC214, P-Zm.CPC214tr1, o P-Zm.CPC214tr2 del maíz. 21.- El constructo de ácidos nucleicos de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18-20, caracterizado además porque la al menos una secuencia nucleotídica transcribible es una secuencia no codificante. 22.- El constructo de ácidos nucleicos de conformidad con la reivindicación 2 , caracterizado además porque la secuencia no codificante es un intrón, una secuencia nucleotídica de una región del promotor, una secuencia nucleotídica de una región no traducida 5', una secuencia nucleotídica de una región no traducida 3', o un fragmento de cualquiera de lo anterior. 23.- Un método para suprimir la expresión de uno o más genes similares al inhibidor de la CDK en una célula de maíz, un tejido de maíz, un órgano de maíz o una planta de maíz, caracterizado porque comprende poner en contacto la célula de maíz, el tejido de maíz, el órgano de maíz o la planta de maíz con un constructo de ácidos nucleicos como el que se define en las reivindicaciones 8, 14 ó 18. 24. - El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado además porque la supresión se logra mediante la supresión antisentido, la supresión sentido, ARNds, ribozlma o una combinación de los mismos. 25. - El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado además porque el constructo de ácidos nucleicos comprende un promotor que se expresa de manera preferida en el germen y/o la aleurona de un grano de maíz, y el promotor está enlazado de manera operativa a al menos una secuencia nucleotídica. 26. - El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado además porque el promotor es un promotor de oleosina de maíz, un promotor de globulina del maíz, un promotor de la MIP sintasa del maíz, un promotor Perl de la cebada, un promotor preferido del embrión, tal como P-Os.CPC214 del arroz o un promotor preferido del embrión tal como P-Zm.CEPI , P-Zm.CPC214, P-Zm.CPC214tr1 , o P-Zm.CPC214tr2 del maíz. 27. - Una célula de maíz, un tejido de maíz, un órgano de maíz o una planta de maíz, en los cuales, la expresión de un gen similar al inhibidor de la CDK se ha suprimido de acuerdo con el método que se describe en la reivindicación 23. 28. - Una semilla obtenida de una planta como la que se define en la reivindicación 27. 29. - El aceite obtenido de la semilla que se reclama en la reivindicación 28. 30. - El harina obtenida de la semilla que se reclama en la reivindicación 28. 31. - El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado además porque la supresión resulta en aceite incrementado.