CN103103198A - 具有增强的产量相关性状的伸展蛋白受体样激酶受调节表达的植物和用于产生该植物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明一般地涉及分子生物学领域并涉及用于通过调节编码GRP(生长相关蛋白)的核酸在植物中表达而改进多种植物生长特征的方法。本发明还涉及具有编码GRP的核酸的受调节表达的植物，其中所述植物相对于对应野生型植物或其他对照植物具有改良的生长特征。本发明还提供用于本发明方法中的构建体。GRP可以是如下蛋白之一：伸展蛋白受体样激酶(ERLK)、F-框WD40(FBXW)多肽、RAN-结合蛋白(RANBP)、金色2-样转录因子（GLK)、REVδ同源域亮氨酸拉链结构域多肽、CLE蛋白质和种子产量调节物蛋白质。
Description
本申请是申请日为2007年5月30日、发明名称为“具有增强的产量相关性状的伸展蛋白受体样激酶受调节表达的植物和用于产生该植物的方法”的中国专利申请200780028066.X(国际申请号PCT/EP2007/055238)的分案申请。
本发明一般地涉及分子生物学领域并涉及用于通过调节编码GRP(生长相关蛋白)的核酸在植物中表达而改进多种植物生长特征的方法。本发明还涉及具有编码GRP的核酸的受调节表达的植物，其中所述植物相对于对应野生型植物或其他对照植物具有改良的生长特征。本发明还提供用于本发明方法中的构建体。
持续增长的世界人口和农业用可耕地供应萎缩刺激了有关增加农业效率的研究。常规的作物及园艺学改良手段利用选择育种技术以鉴定具有期望特征的植物。然而，此类选择育种技术具有几个缺陷，即这些技术一般耗费很多劳动并且产生这样的植物，其经常含有异源性遗传组分，其可能不总是导致从亲代植物中传递的所希望性状。分子生物学进展已经允许人类改良动物及植物的种质。植物的遗传工程使得可以分离和操作遗传物质(一般处于DNA或RNA形式)并且随后引入该遗传物质至植物中。此类技术具有给予作物或植物多种经济学、农学或园艺学改良性状的能力。
具有特殊经济意义的性状是增加的产量。产量通常定义为来自作物的经济价值的可测量结果。该结果可以就数量和/或品质方面进行定义。产量直接取决于几个因素，例如器官的数目和大小、植物构造(例如枝条的数目)、种子产生、叶衰老等。根发育、养分摄入量、胁迫耐受性和早期萌发势（early vigor）也可以是决定产量的重要因素。优化前述因素因而可以 对增加作物产量有贡献。
种子产量是特别重要的性状，因为众多植物的种子对人与动物营养是重要的。作物如玉米、稻、小麦、卡拉诺油菜和大豆占超过一半的人类总热量摄入，无论通过直接消费种子本身或通过消费基于加工的种子而产生的肉产品。作物也是糖、油及工业加工中所用众多类型代谢物的来源。种子含有胚(新苗和新根的起源)和胚乳(萌发期间及幼苗早期生长期间用于胚生长的营养来源)。种子发育涉及多种基因并且需要代谢物从根、叶和茎转移至正在生长的种子中。胚乳尤其同化糖类、油和蛋白质的代谢前体并且将它们合成为贮藏大分子以灌满籽粒。
对于众多作物的另一个重要性状是早期萌发势。改进早期萌发势是现代稻育种计划在温带和热带稻品种上的重要目标。长根在水栽稻中对于正确土壤固定是重要的。在将稻直接播种至被淹没田地的情况下，以及在植物必须从水中迅速出苗的情况下，较长的茎与萌发势相关。在实施条播的情况下，较长的中胚轴和胚芽鞘对于良好出苗是重要的。将早期萌发势人工改造到植物内的能力将在农业中是极其重要的。例如，不良的早期萌发势已经限制了基于玉米带种质(Corn Belt germplasm)的玉蜀黍(Zea mayes L.)杂种在欧洲大西洋地区的引种。
另一重要性状是改进的非生物胁迫耐受性。非生物胁迫是世界范围作物损失的主要原因，对于大多数主要作物植物而言降低平均产量超过50%(Wang等、Planta(2003)218:1-14)。非生物胁迫可以由干旱、盐度、极端温度、化学毒性和氧化胁迫引起。提高植物对非生物胁迫耐受性的能力将在世界范围对农民是极大经济优势并且会允许在不利条件期间及在作物栽培否则是不可能的陆地上栽培作物。
作物产量因而可以通过优化前述因素之一而增加。
取决于最终用途，对某些产量性状的改良可能优先于其他产量性状。例如对于应用如饲料或木材生产或生物燃料资源而言，增加植物营养体部分可能是希望的，而对于应用如面粉、淀粉或油生产而言，增加种子参数可能是尤其希望的。即便在种子参数当中，某些参数可以更优先于其他参 数，这取决于应用。多种机制可以对增加种子产量有贡献，无论形式为增加的种子大小或是增加的种子数目。
增加植物中产量(种子产量和/或生物量)的一种方法可以是通过调节植物的内在生长机制如细胞周期，或参与植物生长或参与防御机制的多种信号途径。
现已发现可以通过调节编码GRP(目的生长相关蛋白)的核酸在植物中表达而改进植物中的多种生长特征。GRP可以是如下蛋白质之一：伸展蛋白受体样激酶(ERLK)、F-框WD40(FBXW)多肽、RAN-结合蛋白(RANBP)、金色2-样转录因子（Golden2-like Transcription Factor，GLK)、REVδ同源域亮氨酸拉链结构域多肽、CLE蛋白质和种子产量调节物(Seed Yield Regulator，SYR)蛋白质。
背景技术
伸展蛋白受体样激酶
受体样激酶(RLK)参与将胞外信号传递至细胞内。RLK蛋白质具有始于N-末端，带有被加工的分泌信号的模块结构、胞外结构域、单个跨膜结构域和胞质激酶结构域。动物受体样激酶大多具有酪氨酸激酶活性，而植物RLK通常具有Ser/Thr激酶特异性，或者有时候可能具有双重特异性。在动物中，大多数RLK作为生长因子受体起作用，而植物受体样激酶可能在多种过程中发挥功能，所述过程包括发育、激素感知或病原体反应。有关植物受体样激酶的发育功能如分生组织发育、花粉-雌蕊相互作用、激素信号传导、配子体发育、细胞形态发生和分化、器官形态、器官脱落和体细胞胚胎发生等的综述，由Becraft(Annu.Rev.Cell Dev.Biol.,18,163-192,2002)提供。
或者，受体样激酶可以依据其胞外或胞内结构域的结构进行分类(Shiu和Bleecker,Proc.Natl.Acad.Sci.美国98,10763-10768,2001)。图1给出概述。PERK RLK和ERLK具有富含脯氨酸的胞外结构域，该结构域具有一般用于伸展蛋白和富含羟脯氨酸的细胞壁蛋白质的基序。伸展蛋白是 一组在植物细胞壁中发现的富含羟脯氨酸的糖蛋白。它们通常富含羟脯氨酸(Hyp)、丝氨酸，以及Val、Tyr、His和Lys的组合。伸展蛋白中典型的基序是SPx基序，其中x代表（羟）脯氨酸重复的数目，一般是2、3、4或更多。伸展蛋白最多可占细胞壁干重的20%。它们是高度糖基化的，可能反映了它们与细胞壁糖类的相互作用。它们的功能中对机械压力的应答是加强细胞壁(例如，在有害物攻击期间、风中植物弯曲期间等)。伸展蛋白基序也可在伸展蛋白受体样激酶的小组(例如拟南芥At5g56890基因)中发现。Shiu和Bleeker(2001)在拟南芥中鉴定了5个家族成员；在稻和其他物种中发现了多个直向同源物(Shiu等，Plant Cell16,1220-1234,2004)。然而伸展蛋白RLK尚未表征。
F-框WD40多肽(FBXW)
植物必须针对外部和内部的刺激调节它们的新陈代谢，以保证最佳生长。这些细胞过程中涉及的调节蛋白的水平常由蛋白酶解机制控制。在此方面，最重要的选择性蛋白质降解途径是依赖遍在蛋白的蛋白酶解途径。该途径在植物、动物和酵母中是保守的，它控制错折叠的多肽和短寿蛋白质的降解。后者是调控诸如防御反应和胁迫反应、细胞周期进展或信号传导的重要调控蛋白质。将要降解的蛋白质共价标记几个遍在蛋白单元。遍在蛋白化的蛋白质随后被26S的蛋白酶体识别，所述26S的蛋白酶体降解目标蛋白质但是再循环遍在蛋白单体。目标蛋白质的选择和随后的遍在蛋白化发生在不同的步骤中。涉及的三类蛋白质基于它们的连续作用，已被命名为E1至E3。E1酶，也称为遍在蛋白活化酶，其消耗ATP而“活化”游离的遍在蛋白分子，并以硫酯键与遍在蛋白复合。接着，活化的遍在蛋白分子从E1酶转移至遍在蛋白缀合的酶E2的半胱氨酸。该E2酶一般与称为遍在蛋白蛋白连接酶的E3酶连接。遍在蛋白连接酶催化遍在蛋白从遍在蛋白缀合的酶转移至目标蛋白质，所述目标蛋白质最终由聚遍在蛋白链标记。E2酶和E3酶的复合体确定待遍在蛋白化的蛋白质的特异性。而在不同的组织中，存在一个或仅几个E1酶，存在几个可以和几个E3酶结合的E2种类。 遍在蛋白蛋白连接酶本身也是不同蛋白质的复合物。迄今，已知5种不同类型的E3酶。其中，SCF复合物在调控过程中起主要作用(Ciechanover(1998)EMBO J.17:7151-7160;Hershko和Ciechanover(1998)Annu.Rev.Biochem.67:425-479)。该复合物由四个亚基组成：cdc53/滞蛋白、Skp1、Rbx1和F-框蛋白质。Skp1蛋白质，以及滞蛋白和Rbx1形成SCF复合物的核心连接酶单元。在该复合物中，Rbx1负责结合负有活化的遍在蛋白的E2酶。F-框蛋白质N-末端包含40-50个氨基酸的简并基序，称为F-框，在人细胞周期蛋白F之后命名。该F-框蛋白质负责和SCF复合物的Skp1亚基连接。在C-末端，不同的蛋白质相互作用结构域确定结合的目标蛋白质。此类蛋白质相互作用结构域之一是WD40重复结构域。
与其他生物相比，在拟南芥中F-框蛋白质代表迄今为止在植物中发现的最大的超家族中的一个(Gagne等，(2002)Proc Natl Acad Science99:11519-11524;Kuroda等，(2002)Plant Cell Physiol43(10):1073-85)。但是，仅两个F-框蛋白质含有WD40重复结构域，而在其他生物的F-框蛋白质中发现了多个WD40重复结构域。WD40重复(也称为β-转导素重复)是短的约40个氨基酸的基序，通常以Trp-Asp(W-D)二肽结束。包含WD40重复的蛋白质(或WD40蛋白质)具有4至16个重复单元(其全部为WD40结构域)，所有这些被认为形成环化的β-螺旋桨式（propeller）结构。所有WD40蛋白质的基本共同功能是调整多-蛋白质复合物的装配，其中重复单元作为蛋白质相互作用的刚性支架。蛋白质的特异性通过重复自身表面（outside）的序列确定。
公开的欧洲专利申请EP 1033405提供来自拟南芥的编码部分FBXW多肽(N-末端氨基酸序列，长约350个核苷酸)的DNA序列(SEQ ID NO:39903)。
RAN-结合蛋白质(RANBP)
Ran是小的信号传导GTP酶(GTP结合蛋白质)，其参与核质转运。已报导拟南芥中的Ran结合蛋白质、At-RanBP1a、At-RanBP1b、 AtRanbp1c与GTP-结合形式的拟南芥Ran1、Ran2和Ran3蛋白质相互作用(Haizel T、Merkle T、Pay A、Fejes E、Nagy F.Characterization of proteins that interact with the GTP-bound form of the regulatory GTPase Ran in Arabidopsis.Plant J.1997年1月;11(1):93-103)。所有的RanBP1蛋白质含有大约150个氨基酸残基的Ran结合结构域。Ran BP1以高亲和性直接与RanGTP结合。该结构域稳定GTP-结合形式的Ran(Ras-样核小GTP酶)。
国际专利申请WO02/18538描述了具有破坏的RAN/Ran-结合蛋白质介导的细胞过程的转基因植物；这被报导产生具有增加的产量和生物量的植物。
金色2-样(GLK)转录因子
植物中可发生两种光合循环：最常见的是C3植物的卡尔文循环，其中3-磷酸甘油酸是最稳定的产物，核酮糖二磷酸是CO2的受体。第二种循环是C4植物中的Hatch-Smack途径，其中草酰乙酸盐是最稳定的产物，烯醇丙酮酸磷酸是CO2的受体。在C3草类中，仅叶肉细胞是光合作用的，而在C4植物中，维管束鞘（bundle sheet）和叶肉细胞均是光合作用的。C4植物呈现区室化的光合作用，叶肉细胞通过烯醇丙酮酸磷酸羧激酶、丙酮酸磷酸二激酶和苹果酸脱氢酶进行碳固定，并将苹果酸转移至维管束鞘细胞，在维管束鞘细胞中苹果酸脱羧基为丙酮酸，释放的碳之后在卡尔文循环中进一步加工。因而，在C4植物中存在3类叶绿体：C3植物的典型叶绿体存在于某些组织中，且在某些发育阶段中存在，而在维管束鞘中和叶肉细胞中存在形态迥异的叶绿体。玉米中叶绿体的起源需要两个转录调节物：金色2(G2)和金色-样(GLK)(Rossini等,Plant Cell13,1231-1244,2001)的参与。
转录因子通常定义为显示序列特异性DNA结合，并能够激活和/或抑制转录的蛋白质。拟南芥基因组编码至少1533个转录调节子，这占其估计的基因总数的约5.9%(Riechmann等，Science290,2105-2109，2000)。 玉米金色(G2)基因是GARP转录因子组的代表，所述GARP转录因子组除金色2外，由拟南芥接受响应调节物（Accepting Response Regulator）-B(ARR-B)和来自衣藻（chlamydomonas）的Psr1定义。所有GLK蛋白质分类为GARP家族的成员。GLK基因是单源的，且基因复制独立发生在单子叶植物和双子叶植物中。GLK蛋白质一般包含GARP DNA结合结构域和C-末端金色2框。拟南芥GLK蛋白质在叶绿体的发育中是多余的(Fitter等,Plant J.31,713-727,2002)。另外，该基因的功能在球蒴藓（Physcomitrella patens）和拟南芥中是保守的，这表明GLK-介导的叶绿体发育的调节是植物中古老的调节机制(Yasumura等,Plant Cell17,1894-1907,2005)。在G2的情况中，大多数转录因子的四个确定的特征中的三个已在异源系统中得到实验证实。G2定位于核(Hall等,1998)，能够反式激活报道基因的表达，并可以同源二聚化，以及和ZmGLK1异源二聚化(Rossini等,2001).
REVδ(Δ)同源域亮氨酸拉链结构域(REVΔHDZip/START)
本发明涉及使用特定类型的转录因子增加植物的产量。转录因子多肽通常定义为显示序列特异性DNA结合亲和性，并能够激活和/或抑制转录的蛋白质。同源域亮氨酸拉链(HDZip)多肽组成转录因子家族，其特征在于存在DNA-结合结构域(同源域，HD)和邻近的亮氨酸拉链(Zip)基序。该同源域通常包含大约60个保守氨基酸残基，所述氨基酸残基形成结合DNA的螺旋1-环-螺旋2-转角-螺旋3。此DNA结合位点通常为假回文结构（pseudopalindromic）。亮氨酸拉链邻近于同源域的C-末端（在一些情况下有几个氨基酸的重叠），包括几个七个氨基酸的重复(至少4个)，其中通常每隔6个氨基酸就出现亮氨酸(偶尔为缬氨酸或异亮氨酸)。亮氨酸拉链对于蛋白质二聚化非常重要。二聚化是DNA结合的前提条件(Sessa等(1993)EMBO J12(9):3507-3517)，并且可以发生在两个相同的HDZip多肽之间(同源二聚体)，或者两个不同的HDZip多肽之间(异源二聚体)。
同源域编码基因存在于所有真核细胞中，并构成拟南芥中至少89个成 员的基因家族。亮氨酸拉链多肽本身也见于来自除植物外的真核细胞的多肽中。不过，在同一个多肽中同源域和亮氨酸拉链两者同时存在却是植物所特有的(在拟南芥89个成员中的至少47个中发现)，并且除了维管植物之外，还已经在藓类植物(moss)中遇到(Sakakibara等(2001)Mol Biol Evol18(4):491-502)。
基于序列相似性标准，已将拟南芥HDZip基因分为四个不同的类别：HDZip I至IV(Sessa等，(1994)，在:Puigdomene P、Coruzzi G(编著),Springer,Berlin Heidelberg New York,第411–426页)。在拟南芥中，至少有5个III类HDZip多肽(REVOLUTA(REV/IFL)、PHABULOSA(PHB)、PHAVOLUTA(PHV)、CORONA(CNA/AtHB15)和AtHB8)，所有的一般都很大(大于800个氨基酸)。类似地，在稻中已鉴定了至少5个III类HDZip多肽。
除了同源域和亮氨酸拉链，III类HDZip多肽C-末端至亮氨酸拉链还包含用于脂质/sterol结合的START（类固醇生成急性调节(STAR)相关脂质转移）结构域，以及未知功能的突出（extensive）C-末端区(CTR，超过多肽长度的一半)(Schrick等，(2004)Genome Biology5:R41)另外，在编码III类HDZip多肽的mRNA转录物的START结构域的编码转录物区中发现微小RNA的互补位点(MIR165/166)，所述微小RNA用于调控通过miRNA-介导的转录物剪切(Williams等，(2005)Development132:3657-3668)。
在拟南芥中，REV、PHB和PHV多肽已显示参与茎端分生组织和腋生分生组织的形成和功能，三种双向结构(例如胚或叶)的图式形成（patterning），以及维管发育(木质化输导（lignified conducting）和支持组织的分化)。在拟南芥中，系统发育分析揭示这三种密切相关的III类HDZip多肽形成REV进化枝，剩余的III类HDZip多肽(CAN和AtHB8)属于CNA进化枝(Floyd等，(2006)Genetics173:373-388)。当在系统发育分析中组合稻和拟南芥时，两种稻III类HDZip多肽（OsHox10和OsREV多肽）聚簇于REV多肽。
拟南芥phb、phv、can和athb8的功能失去突变是显性的（aphenotypic）(Baima等，(2001)Plant Physiol126:643-655;Prigge等，(2005)Plant Cell17:61-76)，但是rev的功能失去突变形成缺陷侧生分生组织和花分生组织，且发育为异常的茎维管结构和卷曲的(外卷的)叶(Otsuga等，(2001)Plant J.25,223-236;Talbert等，(1995)Development121:2723-2735)。
由于在跨越MIR165/166结合位点(在START结构域中)的序列中的核苷酸取代，玉米中显性等位基因卷曲的叶1(rld1)(Juarez等，(2004)Nature428:84-88)、拟南芥中的phb-d和phv-d(McConnell等，(2001)Nature411:709-713)，以及拟南芥中的rev-d(Emery等，(2003)Curr Biol13:1768-1774)表现相似的突变表型(卷曲的叶)。
在授权的美国专利US7056739(以及相应的国际专利申请WO01/33944)中描述了用包含编码SEQ ID NO:2(该授权的美国专利)所示的REV多肽的拟南芥REV核酸序列的转基因转化的植物和植物细胞。该转基因被报导为还包含与编码多肽SEQ ID NO:2的核酸序列有效连接的异源启动子。通过使用CaMV启动子，转基因拟南芥植物超量表达REV核酸序列，表现出增加的叶、茎和种子大小。提供来自番茄、稻、玉米和大麦的部分III类HDZip基因组序列和cDNA5’末端序列。描述了设计用于分别在稻和玉米中降低内源拟南芥、稻和玉米III类HDZip多肽表达，以再现rev功能失去表型的载体的实例。
在国际专利申请WO2004/063379中提供了拟南芥REV多肽的两种玉米III类HDZip多肽直向同源物的核酸序列。描述了在植物细胞中通过抑制mRNA转录物的表达来调节III类HDZip多肽的水平的方法。
在Mendel Biotechnology公司存放的许多国际和美国专利申请中，拟南芥REV多肽为内参G438。T-DNA插入REV基因座后降低的REVOLUTA活性导致转基因拟南芥植物具有减少的分枝和降低的木质素含量，而增加的REVOLUTA活性(使用病毒CaMV启动子)导致转基因拟南芥植物在大致中期具有比野生型植物后期稍大而平的叶。
CLE-样多肽
虽然植物中细胞与细胞的通讯主要通过植物激素发生，所述植物激素例如生长素、脱落酸、油菜素类固醇、赤霉酸、乙烯，但是现在认识到肽类激素是信号传导事件的重要介质。肽类激素组例如包含系统素、植物硫酸肽、ENOD40、RALF、CLAVATA3、SCR肽和POLARIS。
CLE-样多肽形成的多肽家族包含拟南芥CLAVATA3和玉米ESR多肽，并共享所述多肽的同源性。假设这些多肽作为配体参与信号传导事件。
植物的根和地上部分分别源自活化的根顶端分生组织(RAM)和茎顶端分生组织(SAM)。这些结构含有允许生长成所有植物细胞类型和组织的多能细胞。在SAM中，虽然中央区（central zone）中的细胞比外周区中的细胞分裂慢，存在中央区中茎细胞的分裂和外周区中细胞分化的平衡。CLAVATA3(CLV3)是CLV3/ESR(CLE)配体基因家族的成员，并由SAM的茎细胞分泌，由此活化CLAVATA1-CLAVATA2受体二聚体并导致WUSCHEL(WUS)基因的受限表达。WUS是同源域转录因子并促进茎细胞的形成；其是茎细胞繁殖所需的。另一方面，CLV3是防止茎细胞不受控制的繁殖所需的。CLV3和WUS因此形成控制茎细胞数目和SAM结构的反馈环。Wus突变体不能发育出茎顶端分生组织，而clv3突变体发育出非常大的茎顶端分生组织。
CLE配体基因家族的另一个成员是CLE2，其功能类似与CLV3，分泌在生长和发育过程的不同途径中活化的信号分子。CLE2和CLE家族成员的其他成员由Cock和McCormick(Plant Physiol.126,939-942,2001)首次表征。所有CLE家族成员均是短的多肽(大约7至9kDa)，具有疏水性N-末端序列(假定的信号肽或信号锚)。推定的成熟多肽的主体是高度碱性的(平均pI9.49±1.57)，它们的整条链均是亲水的，在C-末端或其附近有保守区。该保守区可能参与蛋白质-蛋白质的相互作用。假设CLE家族的成员，例如CLV3和CLE2，由蛋白酶处理为分泌的短肽。虽然CLE蛋白质在长度、电荷和亲水性上具有总体相似性，但在氨基酸序列水平上 是高度不同的。据报导CLE2通过加入NO3 -诱导(Scheible等,Plant Physiol.136,2483-2499,2004)。其他的功能性特征(Strabala等,Plant Physiol.140,1331-1344,2006)揭示拟南芥中CLE2超量表达导致具有极推迟的开花时间(大约40天，而对照植物为20天)的矮化植物，但其相对于对照具有更长的根。CLE2的超量表达也模拟wus表型。CLE2的类似表型也在CLE3、CLE5、CLE6中CLE7观察到。这些蛋白质也是结构相关的。但是，没有可获得的cle2突变体或CLE2减量调节数据的表型信息。
WO01/96582描述了配体-样蛋白质(LLP)或其功能片段用于调节植物表型或构造的用途。优选的LLP或片段包含氨基酸基序XRXXXXGXXXXHX(其中X可以是任意氨基酸)，更优选的LLP或片段包含氨基酸基序KRXXXXGXXPXHX。该文件还描述多种LLP的异位表达导致不育的转基因植物，或植物最多具有下降的能育性。同样，LLP的反义表达产生具有下降的能育性的转基因植物(每长角果中更少的种子数量)。
WO03/093450公开了CLAVATA3-样肽在植物中调节细胞分裂、分化和发育的用途，尤其是调节分生组织发育的用途。假设在开花之前CLV3-样肽降低的活性可导致额外的叶的产生，由此提供具有更多能量产生的植物，并因此增加产量，或增加心皮具有的种子数目，或产生更厚的茎，或改变植物的果实。但是就CLV3表达的减量调节仅提供了假设性的实例，未给出真实的实验数据。另外，所公开的CLV3-样肽落入WO01/96582公开的LLP种类，因为它们包含基序XRXXXXGXXXXHX，因此显示的是减量调节的表达导致植物具有下降的能育性。
类似地，当来自植物寄生线虫大豆孢囊线虫（Heterodera glycines）的CLE-样蛋白质在拟南芥中超量表达时，转基因植物产生花，但这种花不开放或缺少中央雌蕊群，且根系变短。
因此存在的问题是诸如LLP或CLV3-样的CLE-样多肽如何用于增强产量相关性状。
种子产量调节物
SYR是迄今仍未被表征的新蛋白。SYR与名称为ARGOS的拟南芥蛋白质显示一定的同源性(在DNA水平上大约48%的序列同一性，在蛋白质水平上大约45%的序列同一性)(Hu等,Plant Cell15,1951-1961,2003;US2005/0108793)。Hu等推定ARGOS是具独特功能的蛋白质且由单个基因编码。拟南芥中ARGOS过表达的主要表型是增加的叶生物量和延迟的开花。相反，稻中SYR过表达主要增加种子产量，而叶生物量和开花时间未明显改变。
发明简述
现已惊奇地发现在植物中调节编码伸展蛋白受体样激酶(ERLK)或其部分的核酸的表达产生了相对于对照植物具有增强的产量相关性状的植物，其中所述部分包含至少激酶结构域和跨膜结构域。
因此，本发明提供相对于对照植物增强植物产量相关性状的方法，其包括在植物中调节编码ERLK蛋白质或其部分的核酸的表达。
现已惊奇地发现在植物中增加编码FBXW多肽的核酸的表达产生了相对于合适的对照植物具有增加的产量的植物。因此，根据本发明的另一实施方案，提供相对于合适的对照植物增加产量的方法，其包括在植物中增加编码FBXW多肽的核酸的表达。
研究了RAN-结合蛋白增强产量相关性状的用途后，本申请的发明人发现启动子的选择是重要的考虑因素。他们发现组成型启动子控制下在植物（稻）中表达RAN-结合蛋白对产量相关表型没有任何影响。然而他们惊讶的发现种子特异性启动子，尤其是胚乳特异性启动子控制下在植物中表达RAN-结合蛋白成功的增加了植物的产量。
因此，本发明也提供相对于对照植物增强植物产量相关性状的方法，其包括优先在植物种子或种子部分中调节编码RANBP的核酸的表达。
现已发现在植物中调节编码金色2样（GLK）蛋白质的核酸的表达产 生了相对于对照植物具有增强的产量相关性状的植物。
因此，本发明在另一实施方案中提供相对于对照植物增强植物产量相关性状的方法，其包括在植物中调节编码GLK蛋白质或其部分的核酸的表达。
同样令人惊讶的发现，使用REVδ同源域亮氨酸拉链结构域(HDZip)/类固醇生成急性调节(STAR)相关脂质转化结构域(START)核酸序列降低植物中内源REV基因的表达，产生相对于对照植物具有增加的产量的植物。本发明因此提供另一个实施方案方法，其通过使用REVAHDZip/START核酸序列降低植物中内源REV基因的表达，相对于对照植物增加植物产量。
现已发现在植物中调节编码CLE样多肽的核酸的表达产生了相对于对照植物具有增强的产量相关性状的植物。
因此，本发明在另一实施方案中提供相对于对照植物增强植物产量相关性状的方法，其包括在植物中调节编码CLE样多肽或其部分的核酸的表达。
现已惊奇地发现在植物中调节编码种子产量调节物蛋白质(此后称为SYR)的核酸的表达产生了相对于对照植物，当在非生物胁迫条件下生长而具有提高的非生物胁迫耐受性的植物。
因此，本发明提供相对于对照植物，在非生物胁迫条件下增强植物产量相关性状的方法，其包括在植物中调节编码SYR多肽的核酸的表达。
定义
多肽/蛋白质
术语“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用并且指处于任意长度聚合形式中通过肽键连接的氨基酸。
多核苷酸/核酸/核酸序列/核苷酸序列
术语“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”、“核酸”、“核酸分子”在本文中可互换使用并且指处于任意长度非分支聚合形式中的核苷酸，即 核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或这二者组合。
对照植物
选择合适的对照植物是实验设置的惯用部分并且可以包括对应的野生型植物或无目的基因的对应植物。对照植物一般是与待评估植物相同的植物物种或甚至是相同的变种。对照植物也可以是待评估植物的失效合子。失效合子是由于分离丢失转基因的个体。如本文中所用的“对照植物”不仅指整株植物，还指植物部分，包括种子及种子部分。
同源物
蛋白质的“同源物”包括这样的肽、寡肽、多肽、蛋白质及酶，它们相对于非修饰的上述蛋白质具有氨基酸取代、缺失和/或插入并且与所述肽、寡肽、多肽、蛋白质及酶来源的非修饰蛋白质具有相似生物学活性和功能活性。
缺失指从蛋白质中移除一个或多个氨基酸。
插入指一个或多个氨基酸残基在蛋白质中预定位点内的引入。插入可以包含单个或多个氨基酸的氨基端融合和/或羧基端融合以及序列内插入。通常，在氨基酸序列内部的插入会比氨基端融合或羧基端融合更小，约1-10个残基级别。氨基端或羧基端融合蛋白或融合肽的实例包括如酵母双杂交系统中所用转录激活物的结合结构域或激活结构域、噬菌体外壳蛋白、(组氨酸)-6-标签、谷胱甘肽S-转移酶-标签、蛋白A、麦芽糖结合蛋白、二氢叶酸还原酶、Tag·100表位、c-myc表位、
-表位、lacZ、CMP(钙调蛋白结合肽)、HA表位、蛋白C表位和VSV表位。
取代指以具有相似特性(如相似疏水性、亲水性、抗原性、形成或破坏α-螺旋结构或β-折叠结构的倾向)的其他氨基酸替换蛋白质的氨基酸。氨基酸取代一般是单个残基的，不过可以是簇集性的，这取决于置于多肽的功能性约束；插入通常会是约1-10个氨基酸残基级别。氨基酸取代优选地是保守性氨基酸取代。保守性取代表是本领域众所周知的(见例如Creighton(1984)Proteins.W.H.Freeman and Company（编著）和下表1)。
表1：保守性氨基酸取代的实例
| 残基 | 保守性取代 | 残基 | 保守性取代 |
| Ala | Ser | Leu | Ile；Val |
| Arg | Lys | Lys | Arg；Gln |
| Asn | Gln；His | Met | Leu；Ile |
| Asp | Glu | Phe | Met；Leu；Tyr |
| Gln | Asn | Ser | Thr；Gly |
| Cys | Ser | Thr | Ser；Val |
| Glu | Asp | Trp | Tyr |
| Gly | Pro | Tyr | Trp；Phe |
| His | Asn；Gln | Val | Ile；Leu |
| Ile | Leu，Val |
氨基酸取代、缺失和/或插入可以使用本领域众所周知的肽合成技术如固相肽合成法等或通过重组DNA操作而轻易地进行。用于操作DNA序列以产生蛋白质的取代、插入或缺失变体的方法是本领域众所周知的。例如，用于在DNA中的预定位点处产生取代突变的技术是本领域技术人员众所周知的并且包括M13诱变法、T7-Gen体外诱变法(USB，Clevelaand，OH)、QuickChange位点定向诱变法(Stratagene，San Diego，CA)、PCR-介导的位点定向诱变或其他位点定向诱变法。
衍生物
“衍生物”包括这样的肽、寡肽、多肽，其中与天然发生形式的蛋白质(如目的蛋白)的氨基酸序列相比，它们包含以非天然发生的氨基酸残基对氨基酸的取代或非天然发生的氨基酸残基的添加。蛋白质的“衍生物”也包含这样的肽、寡肽、多肽，其中与多肽的天然发生形式的氨基酸序列相比，它们包含天然发生的改变(糖基化、酰化、异戊二烯化、磷酸化、肉豆蔻酰化、硫酸盐化等)氨基酸残基或非天然的改变氨基酸残基。与衍生物所来源的氨基酸序列相比，该衍生物可以也包含与所述氨基酸序列共价或非共价结合的一个或多个非氨基酸取代基或添加(例如报道分子或其他配体)，如为促进检测该衍生物而结合的报道分子，和与天然发生的蛋白质的氨基酸序列相对比的非天然发生的氨基酸残基。另外，“衍生物”也包括蛋白质的天然 发生形式和诸如FLAG、HIS6或硫氧还蛋白(标签肽的综述参见Terpe,Appl.Microbiol.Biotechnol.60,523-533,2003)的标签肽的融合物。
直向同源物/旁系同源物
直向同源物和旁系同源物包含用来描述基因祖先关系的进化概念。旁系同源物是相同物种内起源于先祖基因复制的基因，直向同源物是来自不同生物的起源于物种形成的基因，也源自相同的先祖基因。
结构域
术语”结构域"指沿进化相关蛋白质的序列比对结果而在特定位置处保守的一组氨基酸。尽管在其他位置处的氨基酸可以在同源物之间变动，然而在特定位置处的高度保守的氨基酸指示在蛋白质的结构、稳定性或功能方面可能是必需的氨基酸。结构域因通过在蛋白质同源物家族的比对序列中的高保守程度而被鉴定，它们可以用作鉴定物以确定任意的所讨论多肽是否属于先前已鉴定的多肽家族。
基序/共有序列/标签
术语”基序”或“共有序列”或“标签”指在进化相关蛋白质的序列中的短保守区。基序往往是结构域的高度保守部分，不过也可以仅包括结构域的部分，或可以位于保守结构域之外(若基序的全部氨基酸位于定义的结构域之外)。
杂交
如本文中所定义的术语”杂交"是其中基本上同源的互补核苷酸序列相互复性的过程。杂交过程可以完全在溶液中进行，即两种互补性核酸均处于溶液中。杂交过程也可以在互补性核酸之一固定到基质如磁珠、琼脂糖（Sepharose）小珠或任何其他树脂的情况下发生。杂交过程也可以在互补性核酸之一固定至固相支持体如硝酸纤维素膜或尼龙膜上或通过例如照相平版印刷术固定至例如硅酸玻璃支持物(后者称作核酸阵列或微阵列或称作核酸芯片)上的情况下进行。为使杂交发生，通常将核酸分子热变性或化学变性以使双链解链成为两条单链和/或去除来自单链核酸的发夹或其他二级结构。
术语”严格性”指在其中发生杂交的条件。杂交的严格性受条件如温度、盐浓度、离子强度和杂交缓冲液组成影响。通常，将低严格性条件选择为在确定的离子强度及pH时低于特定序列热解链温度(Tm)约30℃。中等严格性条件是此时温度低于Tm约20℃并且高严格性条件是此时温度低于Tm约10℃。高严格性杂交条件一般用于分离与靶核酸序列具有高序列相似性的杂交序列。然而，核酸可以在序列上偏离并且因遗传密码子的简并性而依旧编码基本上相同的多肽。因而有时候可能需要中等严格性杂交条件以鉴定此类核酸分子。
Tm是在确定的离子强度及pH时的温度，在所述温度下50%的靶序列与完全匹配的探针杂交。Tm取决于溶液条件和探针的碱基组成及长度。例如，较长的序列在较高温度下特异性地杂交。从低于Tm约16℃直至32℃获得最大杂交速率。一价阳离子在溶液中的存在降低了两条核酸链间的静电排斥，因而促进杂交分子形成；这种作用对于高达0.4M的钠浓度是明显的(对于更高浓度，这种效应可以忽略)。甲酰胺降低DNA-DNA和DNA-RNA双链体的解链温度，每百分数甲酰胺降低0.6-0.7℃，并且添加50%甲酰胺允许在30-45℃进行杂交，虽然杂交速率会降低。碱基对错配降低了杂交速率及双链体的热稳定性。平均而言并且对于大的探针来说，每%碱基错配Tm下降约1℃。取决于杂交分子的类型，Tm可以使用下列等式计算：
1)DNA-DNA杂交体(Meinkoth和Wahl，Anal.Biochem.，138：267-284，1984)：
Tm81.5℃+16.6xlog10[Na+]a+0.41x%[G/Cb]–500x[Lc]-1–0.61x%甲酰胺
2)DNA-RNA或RNA-RNA杂交体：
Tm79.8+18.5(log10[Na+]a)+0.58(%G/Cbb)+11.8(%G/Cb)2-820/Lc
3)寡DNA或寡RNAd杂交体：
对于<20个核苷酸：Tm2(ln)
对于20–35个核苷酸：Tm22+1.46(ln)
a或对于其他一价阳离子，但是仅在0.01–0.4M范围内是精确的。
b仅对于%GC在30%-75%范围内是精确的。
cL=双链体的长度（以碱基对计）。
doligo，寡核苷酸；ln，＝引物的有效长度=2×(G/C数)+(A/T数)。
可以众多已知技术的任何一种控制非特异性结合，例如用含蛋白质的溶液封闭薄膜、添加异源性RNA、异源性DNA及SDS至杂交缓冲液并且用RNA酶处理。对于非同源性探针，一系列杂交可以通过改变以下条件之一进行：(i)渐进地降低复性温度(例如从68℃至42℃)或(ii)渐进地降低甲酰胺浓度(例如从50%至0%)。技术人员了解杂交期间可以加以改变和将维持或改变严格性条件的多种参数。
除杂交条件之外，杂交特异性一般还取决于杂交后洗涤的功能。为除去因非特异性杂交所致的背景，样品用稀释的盐溶液洗涤。此类洗涤的关键因素包括最终洗涤溶液的离子强度及温度：盐浓度越低并且洗涤温度越高，则洗涤的严格性越高。洗涤条件一般在杂交严格性上或低于杂交严格性而进行。阳性杂交产生至少两倍于背景信号的信号。通常，用于核酸杂交分析法或基因扩增检测方法的合适严格性条件如上所述。也可以选择更严格或更不严格的条件。技术人员了解洗涤期间可以加以改变和将维持或改变严格性条件的多种参数。
例如，用于长度大于50个核苷酸的DNA杂交分子的常见高严格性杂交条件包括在65℃于1×SSC中或在42℃于1×SSC和50%甲酰胺中杂交，随后在65℃于0.3×SSC中洗涤。用于长度大于50个核苷酸的DNA杂交分子的中等严格性杂交条件的实例包括在55℃于4×SSC中或在40℃于6×SSC和50%甲酰胺中杂交，随后在50℃于2×SSC中洗涤。杂交分子的长度是杂交核酸的预期长度。当序列已知的核酸杂交时，可以通过比对序列并鉴定本文中所述的保守区而确定杂交分子长度。1×SSC是0.15MNaCl和15mM柠檬酸钠；杂交溶液和洗涤溶液可以额外地包含5×Denhardt试剂、0.5-1.0%SDS、100μg/ml变性的片段化鲑精DNA、0.5%焦磷酸钠。
为了定义严格性水平的目的，可以参考Sambrook等(2001)Molecular Cloning：a laboratory manual，第三版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，CSH，New York或参考Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，N.Y.(1989和每年更新版本)。
剪接变体
如本文中所用的术语”剪接变体”包含其中已经切除、替换、移位或添加所选内含子和/或外显子或其中内含子已经缩短或加长的核酸序列的变体。此类变体将是其中基本上保留了蛋白质的生物学活性的一种变体；这可以通过选择性保留蛋白质的功能性片段而实现。此类剪接变体可以在自然界中找到或可以人工制造。用于预测和分离此类剪接变体的方法是本领域众所周知的(见例如Foissac和Schiex(2005)，BMC Bioinformatics.6：25)。
等位变体
等位基因或等位变体是给定基因的替代形式，位于相同染色体位置内。等位变体包含单核苷酸多态性(SNP)和小插入/缺失多态性(INDEL)。INDEL的尺寸通常小于100bp。SNP和INDEL形成在大部分生物的天然发生性多态性株系中序列变体的最大集合。
基因改组/定向进化
基因改组或定向进化的组成为：反复DNA改组，随后适当筛选和/或选择以产生编码具有改良生物学活性的蛋白质的核酸或其部分的变体(Castle等，(2004)Science304(5674):1151-4；美国专利5,811,238和6,395,547)。
调节元件/调控序列/启动子
术语“调节元件”、“调控序列”和“启动子”均在本文中可互换使用并且在广义上意指能够实现与之连接的序列表达的调节性核酸序列。术语”启动子”一般指位于基因转录起点上游并参与识别及结合RNA聚合酶和其他蛋白质，因而指导有效连接的核酸转录的核酸调控序列。前述术语包括从典型的真核基因组基因(包括对于精确转录启动所需的TATA盒，具有或没 有CCAAT盒序列)中衍生的转录调节序列和应答发育刺激和/或外部刺激或以组织特异性方式改变基因表达的额外调节元件(如，上游激活序列、增强子和沉默子)。本术语还包括典型的原核基因的转录调节序列，在此情况下它可以包括–35盒序列和/或–10盒转录调节序列。术语“调节元件”也包含赋予、激活或增强核酸分子在细胞、组织或器官中表达的合成的融合分子或衍生物。
“植物启动子”包含介导编码序列区段在植物细胞中表达的调节元件。因此，植物启动子不需要是植物来源的，而是可以源自病毒或微生物，例如来自侵袭植物细胞的病毒。“植物启动子”也可以源自植物细胞，例如来自用待于本发明方法中表达及在本文中描述的核酸序列所转化的植物。这也适用于其他“植物”调节性信号，如“植物”终止子。用于本发明方法中的核苷酸序列的启动子上游可以由一个或多个核苷酸取代、插入和/或缺失而受到修饰，但不干扰启动子、可读框(ORF)或3'调节区如终止子或远离ORF的其他3'调节区的功能性或活性。启动子的活性还有可能因修饰该启动子的序列或由更活跃的启动子、甚至来自异源生物的启动子彻底替换该启动子而增加。为在植物中表达，如上所述，核酸分子必须有效连接至或包含合适的启动子，其中所述的启动子在正确时间点上并以所需要的空间表达模式表达基因。
为鉴定功能性等效启动子，候选启动子的启动子强度和/或表达模式可以通过将该启动子与报道基因有效连接并分析该报道基因在植物多种组织的表达水平和模式而进行分析。合适的公知报道基因包括例如β-葡糖醛酸糖苷酶或β-半乳糖苷酶。启动子活性通过测量β-葡糖醛酸糖苷酶或β-半乳糖苷酶的酶活性进行分析。启动子强度和/或表达模式随后可以与参考启动子(如本发明方法中所用的一种启动子)的启动子强度和/或表达模式比较。备选地，启动子强度可以使用本领域已知方法如Northern印迹法及放射自显影图的密度计分析法、定量实时PCR或RT-PCR(Heid等，1996Genome Methods6：986-994)，通过定量mRNA水平或通过将本发明方法中所用核酸的mRNA水平与持家基因(如18S rRNA)的mRNA水平比较而分析。 通常“弱启动子”意指驱动编码序列在低水平上表达的启动子。“低水平”意指在每个细胞约1/10,000转录物至约1/100,000转录物、至约1/500,0000转录物的水平上。相反，“强启动子”驱动编码序列在高水平、或在每个细胞约1/10转录物至约1/100转录物、至约1/1,000转录物上表达。
有效连接
如本文中所用的术语”有效连接”指启动子序列与目的基因之间功能性地连接，以至于启动子序列能够启动目的基因转录。
组成型启动子
“组成型启动子”指在生长和发育的大部分、但不必全部阶段期间和在大部分环境条件下在至少一个细胞、组织或器官内有转录活性的启动子。下表2a给出组成型启动子的实例。
表2a：组成型启动子的实例
遍在启动子
遍在启动子在生物基本上所有组织或细胞内有活性。
发育调节性启动子
发育调节性启动子在某个发育期期间或在经历发育变化的植物部分内有活性。
诱导性启动子
诱导性启动子在应答化学品(综述见Gatz1997，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.，48：89-108)、环境刺激或物理刺激时具有受诱导或增加的转录启动，或可以是“胁迫诱导性的”，即当植物暴露于多种胁迫条件时受到激活，或是“病原体诱导性的”，即当植物暴露于多种病原体时受到激活。
器官特异性/组织特异性启动子
器官特异性或组织特异性启动子是能够优先在某些器官官或组织如叶、根、种子组织等内启动转录的启动子。例如，“根特异性启动子”是在植物根中优势地具有转录活性的启动子，在植物的任何其他部分内基本上无活性，尽管在植物的这些其他部分内允许任何泄露表达。能够仅在某些细胞中启动转录的启动子在本文中称作“细胞特异的”。
种子特异性启动子主要在种子组织中转录激活，但不必仅在种子组织中激活（渗漏表达的情况下）。种子特异性启动子可以在种子发育和/或萌发期间激活。一些种子特异性启动子可以是胚乳、糊粉和/或胚特异性的。种子特异性启动子的实例示于下表2b，胚乳特异性启动子的实例示于下表2c。种子特异性启动子的其他实例由Qing Qu和Takaiwa(Plant Biotechnol.J.2,113-125,2004)给出，该文献的公开完整引入本文作为参考。
表2b：种子特异性启动子的实例
表2c:胚乳特异性启动子的实例
如本文中所定义的绿色组织特异性启动子是主要在绿色组织中具有转 录活性的启动子，在植物的任何其他部分内基本上无活性，尽管在植物的这些其他部分内允许任何泄露表达。
组织特异性启动子的另一个实例是分生组织特异性启动子，其主要在分生性组织中具有转录活性，在植物的任何其他部分内基本上无活性，尽管在植物的这些其他部分内允许任何泄露表达。
终止子
术语”终止子”包括这样的调控序列，其是在转录单位末端的DNA序列，发出对初级转录物进行3’加工并多聚腺苷化以及终止转录的信号。终止子可以衍生自天然基因、来自多种其他植物基因或来自T-DNA。待添加的终止子可以来自例如胭脂碱合酶或章鱼碱合酶基因或备选地来自其他植物基因或较不优选地来自任何其他真核基因。
调节
术语”调节”就表达或基因表达而言意指这样的过程，其中表达水平与对照植物相比因所述基因的表达而改变，优选地，表达水平增加。原先未受调节的表达可以是结构RNA(rRNA、tRNA)或mRNA的任何类型表达，随后是翻译。术语“调节活性”应当意指本发明核酸序列或所编码蛋白质的表达的任何变化，这导致植物增加的产量和/或增加的生长。
表达
术语“表达”或“基因表达”意指因特定一种或多种基因或基因构建体的转录。术语“表达”或“基因表达”尤其意指一种或多种基因或基因构建体转录成结构RNA(rRNA、tRNA)或mRNA，有或没有随后mRNA翻译成蛋白质。此过程包括DNA转录、加工得到的mRNA产物。
增加的表达/过量表达
如本文中所用的术语”增加的表达”或“过量表达”意指对于原有野生型表达水平是额外的任何形式表达。
在本领域内详细记载了用于增加基因或基因产物表达的方法并且它们包括例如，由适宜启动子驱动的过量表达、使用转录增强子或翻译增强子。可以在非异源形式的多核苷酸的适宜位置(一般是上游)内引入作为启动子 或增强子元件的分离核酸，以便增量调节编码目的多肽的核酸的表达。例如，内源性启动子可以通过突变、缺失和/或取代而在体内改变(见Kmiec，美国5,565,350；Zarling等，WO9322443)，或可以将分离的启动子以相对于本发明基因的正确方向及距离引入植物细胞，以便控制基因表达。
若需要多肽表达，通常希望在多核苷酸编码区的3’末端包括多聚腺苷化区。多聚腺苷化区可以来自天然基因、来自多种其他植物基因或来自T-DNA。待添加的3’末端序列可以来自例如胭脂碱合酶或章鱼碱合酶基因或备选地来自另一植物基因或更不优选来自任何其他真核基因。
内含子序列也可以添加至5'非翻译区(UTR)或部分编码性序列的编码序列上，以增加在胞浆内积累的成熟信息的量。已经证实可剪接内含子在植物表达构建体和动物表达构建体中转录单位内的包含在mRNA水平及蛋白质水平上增加基因表达至多达1000倍(Buchman和Berg(1988)Mol.Cell biol.8：4395-4405；Callis等(1987)Gens Dev1：1183-1200)。基因表达的此类内含子增强作用一般在位于转录单位5'末端附近时最强烈。使用玉米内含子Adh1-S内含子1、2和6、Bronze-1内含子是本领域已知的。对于一般信息，见：The Maize Handbook，第116章，编者Freeling和Walbot，Springer，N.Y.(1994)。
内源基因
本文中提及的“内源”基因不仅仅指如在植物中以其天然形式(即没有任何人类干预)存在的所讨论基因，还指处于分离形式的随后(再)引入植物(转基因)的相同基因(或基本上同源的核酸/基因)。例如，含有这种转基因的转基因植物可以遭遇转基因表达大幅降低和/或内源基因表达的大幅降低。
分离的基因
分离的基因可分离自生物体，或者是人造的，例如通过化学合成。
降低的表达
本文中提及的“降低的表达”或表达的“降低或基本去除”意指内源基因表达和/或多肽水平和/或多肽活性相对于对照植物的降低。与对照植物 相比，降低或基本去除以递增优选顺序是至少10%、20%、30%、40%或50%、60%、70%、80%、85%、90%,或95%、96%、97%、98%、99%或更多的降低。
为了降低或基本去除内源基因在植物中的表达，需要核酸序列的足够长度的基本上连续的核苷酸。为了开展基因沉默，这个长度可以是少至20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10个或更少的核苷酸，或者该长度可以多至整个基因(包括5’和/或3’UTR，在部分或全长中)。基本上连续的核苷酸片段可以来自编码目的蛋白的核酸(靶基因)或来自能够编码目的蛋白的直向同源物、旁系同源物或同源物的任何核酸。优选地，基本上连续的核苷酸片段能够与靶基因(有义链或反义链)形成氢键，更优选地，基本上连续的核苷酸片段以递增优选顺序与靶基因(有义链或反义链)具有50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、100%的序列同一性。编码(功能性)多肽的核酸序列不是本文中所讨论用于降低或基本去除内源基因表达的多种方法所需的。
表达的这种降低或基本去除可以使用常规工具和技术完成。用于降低或基本去除内源基因表达的优选方法是在植物中引入并表达这样的遗传构建体，其中核酸(在此情况下是来自目的基因或任何核酸的一段基本上连续的核苷酸序列，其中所述的任何核酸能够编码任何一种目的蛋白的直向同源物、旁系同源物或同源物)克隆至所述的遗传构建体内作为由间隔区(非编码性DNA)隔开的(部分或完全的)反向重复序列。
在这种优选的方法中，使用核酸或其部分(在此情况下是从目的基因或从任何核酸中衍生的一段基本上连续的核苷酸序列，其中所述的任何核酸能够编码目的蛋白的直向同源物、旁系同源物或同源物)的反向重复序列(优选能够形成发夹结构)，通过RNA介导的沉默作用而降低或基本上去除内源基因的表达。反向重复序列在包含调控序列的表达载体中克隆。非编码性DNA核酸序列(间隔序列，例如基质附着区片段(MAR)、内含子、多接头等)位于形成反向重复序列的两个反向核酸之间。在反向重复序列转录后，形成具有(部分或完全)自身互补结构的嵌合RNA。这种双链RNA结 构称作发夹RNA(hpRNA)。hpRNA由植物加工成为siRNA，其被掺入RNA诱导性沉默复合物(RISC)中。RISC进一步切开mRNA转录物，因而大幅度降低待翻译成多肽的mRNA转录物的数目。对于其他一般细节，见例如Grierson等(1998)WO98/53083；Waterhouse等(1999)WO99/53050)。
本发明方法的实施不依赖在植物中引入并表达其中克隆入核酸作为反向重复序列的遗传构建体，而是几种公知“基因沉默”方法的任何一种或多种可以用来实现相同的效果。
一种用于降低内源基因表达的如此方法是RNA介导的基因表达沉默(减量调节)。沉默作用在这种情况下由基本上与内源性靶基因相似的双链RNA序列(dsRNA)在植物中触发。这种dsRNA被植物进一步加工成约20到约26个核苷酸，称作短干扰性RNA(siRNA)。siRNA被掺入RNA诱导性沉默复合物(RISC)内，其中所述的RISC进一步切割内源性靶基因的mRNA转录物，因而大幅度降低待翻译成多肽的mRNA转录物的数目。优选地，双链RNA序列对应于靶基因。
RNA沉默方法的另一个实例包括以有义方向引入核酸序列或其部分(在此情况下是从目的基因或从任何核酸中衍生的一段基本上连续的核苷酸，其中所述的任何核酸能够编码目的蛋白的直向同源物、旁系同源物或同源物)至植物内。“有义方向”指与其mRNA转录物同源的DNA序列。因而将向植物中引入该核酸序列的至少一个拷贝。这种额外的核酸序列会降低内源基因表达，产生已知为共抑制作用的现象。当核酸序列的几个额外拷贝引入植物时，基因表达的降低将更明显，因为高转录物水平与共抑制作用的触发之间存在正相关。
RNA沉默方法的另一个实例包括使用反义核酸序列。"反义"核酸序列包含与编码蛋白质的"有义"核酸序列互补，即与双链cDNA分子的编码链互补，或与mRNA转录物序列互补的核苷酸序列。反义核酸序列优选地与待沉默的内源基因互补。互补性可以位于基因的“编码区”和/或”非编码区”内。术语”编码区"指包含被翻译成氨基酸残基的密码子的核苷酸序列区。术语”非编码区"指分布在编码区两侧的被转录但不翻译成氨基酸的 5’和3’序列(也称作5'和3'非翻译区)。
反义核酸序列可以根据Watson和Crick碱基配对规则设计。反义核酸序列可以与整个核酸序列互补(在此情况下是从目的基因或从任何核酸中衍生的一段基本上连续的核苷酸，其中所述的任何核酸能够编码目的蛋白的直向同源物、旁系同源物或同源物)，不过也可以是仅与核酸序列的一部分(包括mRNA5’和3’UTR)反义的寡核苷酸。例如，反义寡核苷酸序列可以与围绕编码多肽的mRNA转录物的翻译起点周围的区域互补。合适的反义寡核苷酸序列的长度是本领域已知的并且可以从长度约50、45、40、35、30、25、20、15或10个核苷酸或更少的核苷酸开始。本发明的反义核酸序列可以利用本领域已知方法，使用化学合成和酶连接反应而构建。例如，反义核酸序列(例如反义寡核苷酸序列)可以使用天然发生的核苷酸或多种修饰的核苷酸化学地合成，其中所述修饰的核苷酸被设计旨在增加分子的生物学稳定性或增加反义核酸序列与有义核酸序列之间所形成双链体的物理稳定性，例如，可以使用硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸。可以用来产生反义核酸序列的修饰核苷酸的实例是本领域众所周知的。已知的核苷酸修饰包括甲基化、环化和'加帽'及用类似物(如肌苷)取代一个或多个天然发生的核苷酸。其他的核苷酸修饰是本领域众所周知的。
这种反义核酸序列可以使用其中核酸序列已经以反义方向加以亚克隆(即从插入的核酸中转录的RNA将与目的靶核酸呈反义方向)的表达载体以生物学方式产生。优选地，反义核酸序列在植物中的产生借助稳定整合的核酸构建体进行，其中所述的核酸构建体包含启动子、有效连接的反义寡核苷酸和终止子。
用于本发明方法中沉默作用的核酸分子(无论向植物中引入或在原位产生)与编码多肽的mRNA转录物和/或基因组DNA杂交或结合，以便例如通过抑制转录和/或翻译而抑制蛋白质表达。杂交可以通过形成稳定双链体的常规核苷酸互补性所致，或在结合于DNA双链体的反义核酸序列的情况下，因双螺旋大沟内特异性相互作用所致。反义核酸序列可以通过转化或在特定组织部位直接注射而引入植物。备选地，反义核酸序列可以为 了靶向所选择的细胞而受到修饰并且随后系统性施用。例如，对于系统性施用，反义核酸序列可以被修饰以便它们特异结合表达在所选择的细胞表面上的受体或抗原，例如通过连接反义核酸序列至与细胞表面受体或抗原结合的肽或抗体。反义核酸序列也可以使用本文中所述的载体送递至细胞内。
根据另一方面，反义核酸序列是α-异头核酸序列。α异头核酸序列与互补性RNA形成特定双链杂交分子，其中与惯常b-单元相反，所述链相互平行(Gaultier等(1987)Nucl Ac Res15：6625-6641)。反义核酸序列也可以包含2'-o-甲基核糖核苷酸(Inoue等(1987)Nucl Ac Res15，6131-6148)或嵌合RNA-DNA类似物(Inoue等(1987)FEBS Lett.215，327-330)。
内源基因表达的降低或基本去除也可以使用核酶而进行。核酶是具有核糖核酸酶活性的催化性RNA分子，能够切割与其具有互补区域的单链核酸序列，如mRNA。因此，核酶(例如锤头核酶(在Haselhoff和Gerlach(1988)Nature334，585-591中描述)可以用来催化性地切割编码多肽的mRNA转录物，因而大幅度降低待翻译成多肽的mRNA转录物的数目。可以设计对核酸序列具特异性的核酶(见例如：Cech等美国专利号4,987,071；和Cech等美国专利号5,116,742)。备选地，对应于核酸序列的mRNA转录物可以用来从RNA分子库中选出具有特异性核糖核酸酶活性的催化性RNA(Bartel和Szostak(1993)Science261，1411-1418)。核酶用于植物中基因沉默的用途是本领域已知的(例如Atkins等(1994)WO94/00012；Lenne等(1995)WO95/03404；Lutziger等(2000)WO00/00619；Prinsen等(1997)WO97/13865和Scott等(1997)WO97/38116)。
基因沉默也可以通过插入诱变(例如T-DNA插入或转座子插入)或通过如Angell和Baulcombe((1999)Plant J.20(3)：357-62)、(Amplicon VIGS WO98/36083)或Baulcombe(WO99/15682)及其他人描述的策略而实现。
当在内源基因上存在突变和/或在随后引入植物的分离的基因/核酸上存在突变时，基因沉默也可以发生。降低或基本去除可以由无功能的多肽引起。例如，多肽可以与多种相互作用性蛋白质结合；一个或多个突变和/ 或截短因而可以提供仍能够结合相互作用性蛋白质(如受体蛋白质)但不能表现其正常功能的多肽(如起信号作用的配体)。
另一种基因沉默的方法是靶定与基因调节区(例如启动子和/或增强子)互补的核酸序列以形成阻止基因在靶细胞中转录的三螺旋结构。见Helene，C.，Anticancer Drug Res.6，569-84，1991；Helene等，Ann.N.Y.Acad.Sci.660，27-361992和Maher，L.J.Bioassays14，807-15，1992。
其他方法，如使用针对内源性多肽的抗体以抑制此多肽在植物中的功能，或干扰所述多肽参与的信号途径，对于技术人员将是众所周知的。尤其，可以构思的是人造分子可以用于抑制靶多肽的生物学功能，或用于干扰靶多肽参与其中的信号途径。
备选地，可以建立筛选程序以鉴定在植物群体中基因的天然变体，其中所述的变体编码具有降低活性的多肽。此类天然变体也可以用于例如进行同源重组。
人工和/或天然的微小RNA(miRNA)可以用来敲除基因表达和/或mRNA翻译。内源性miRNA是通常19-24个核苷酸长度的单链小RNA。它们的主要功能是调节基因表达和/或mRNA翻译。大多数的植物微小RNA(miRNA)与其靶序列具有完全的或接近完全的互补性。然而，存在具有多达5个错配的天然靶标。它们由切酶家族的双链特异性RNA酶从具有特征性折回结构的较长的非编码性RNA中加工而来。在加工时，它们通过与RNA诱导性沉默复合物(RISC)的主要成分Argonaute蛋白质结合而掺入该复合体。MiRNA充当RISC的特异性成分，因此它们与细胞质中的靶核酸(大多是mRNA)碱基配对。后续的调节事件包括靶mRNA切割和破坏和/或翻译抑制。miRNA过量表达的作用因此在靶基因降低的mRNA水平上得到反映。
通常21个核苷酸长度的人工微小RNA(amiRNAs)可以遗传改造以特异性地负调节单个或多个目的基因的基因表达。植物微小RNA靶的选择的决定因素是本领域众所周知的。用于靶识别的经验参数已经确定并且可以用来辅助设计特定的amiRNA，(Schwab等,Dev.Cell8,517-527,2005)。 用于设计并产生amiRNA及其前体的便利工具也是公众可获得的(Schwab等,Plant Cell18,1121-1133,2006)。
为最佳性能，用于降低内源基因在植物中表达的基因沉默技术需要使用来自单子叶植物的核酸序列以转化单子叶植物，和使用来自双子叶植物的核酸序列以转化双子叶植物。优选地，将来自任何给定植物物种的核酸序列引入同一个物种内。例如，将来自稻的核酸序列转化至稻植物。然而，并非绝对要求待引入的核酸序列起源于与该核酸序列将要引入的植物相同的植物物种。只要内源性靶基因与待引入的核酸之间存在相当大的同源性就足够了。
上文描述的是用于降低或基本去除内源基因在植物中表达的多种方法的实例。本领域技术人员会轻易地能够调整前述用于沉默的方法以至于例如通过利用合适启动子而实现降低内源基因在整株植物或在其部分中的表达。
选择性标记(基因)/报道基因
“选择性标记”、“选择性标记基因”或“报道基因”包括向细胞赋予表型的任何基因，其中在所述的细胞内表达所述基因以促进鉴定和/或选择用本发明的核酸构建体所转染或转化的细胞。这些标记基因能够通过一系列不同原理鉴定核酸分子的成功转移。合适的标记可以选自赋予抗生素耐药性或除草剂抗性、引入新代谢性状或允许目视选择的标记。选择性标记基因的实例包括赋予抗生素耐药性的基因(如使新霉素和卡那霉素磷酸化的nptII或使潮霉素磷酸化的hpt或赋予对例如博来霉素、链霉素、四环素、氯霉素、氨苄青霉素、庆大霉素、遗传霉素(Geneticin)(G418)、壮观霉素或杀稻瘟素的抗性的基因)、赋予除草剂抗性的基因(例如提供
抗性的bar；提供草甘膦抗性的aroA或gox或赋予对例如咪唑啉酮、膦丝菌素或磺脲类的抗性的基因)或提供代谢性状的基因(如允许植物使用甘露糖作为唯一碳源的manA或利用木糖的木糖异构酶或抗营养标记如2-脱氧葡萄糖抗性)。目视标记基因的表达导致形成颜色(例如β-葡糖醛酸糖苷酶、GUS或β-半乳糖苷酶与其有色底物例如X-Gal)、发光(如萤光素/萤光素酶 系统)或荧光(绿色荧光蛋白GFP及其衍生物)。这个名单仅代表少数的可能标记。技术人员熟悉此类标记。取决于生物和选择方法，优选不同的标记。
已知当核酸稳定或瞬时整合至植物细胞时，仅小部分的细胞摄取外来DNA并且根据需要将其整合至细胞基因组，这取决于所用表达载体和使用的转染技术。为鉴定并选择这些整合子，通常将编码选择性标记(如上文所述之一)的基因连同目的基因一起引入宿主细胞。这些标记可以在其中这些基因因例如常规方法所致的缺失而无功能的突变体中使用。此外，编码选择性标记的核酸分子可以引入宿主细胞中，与在包含编码本发明多肽或本发明方法中所用多肽的序列在同一载体上，或在单独的载体上。已经用引入的核酸稳定转染的细胞可以通过选择进行鉴定(例如具有整合的选择性标记的细胞存活而其他细胞死亡)。
因为一旦已经成功引入了核酸，则转基因宿主细胞中不再需要或不希望有标记基因，尤其抗生素耐药性基因和除草剂抗性基因，因此用于引入核酸的本发明方法有利地使用能够去掉或切除这些标记基因的技术。一种如此方法称作共转化法。共转化法使用同时用于转化的两种载体，一种载体携带本发明的核酸而另一种载体携带标记基因。高比例的转化体接受，或在植物的情况下，包含(高达40%或更多的转化体)这两种载体。在用农杆菌(Agrobacterium)转化的情况下，转化体通常仅接受载体的一部分，即侧翼有T-DNA的序列，它通常代表表达盒。标记基因随后可以通过进行杂交而从转化的植物中去掉。在另一种方法中，整合至转座子的标记基因用来与想要的核酸一起进行转化(称作Ac/Ds技术)。转化体可以与转座酶来源植物杂交或转化体用导致转座酶表达的核酸构建体瞬时或稳定地转化。在一些情况下(大约10%)，转座子在已经成功发生转化时跳出宿主细胞的基因组并丢失。在其他更多情况下，转座子跳至不同位置。在这些情况下，标记基因必须通过进行杂交而去除。在微生物学中，开发了实现或促进检测这类事件的技术。另一有利的方法依赖于重组系统；此方法的优势在于不必通过杂交去除。该类型的最知名系统称作Cre/lox系统。Cre1是去掉位于loxP序列之间序列的重组酶。若标记基因整合于loxP序列之 间，则通过重组酶表达已经成功发生转化时，标记基因被去除。其他重组系统是HIN/HIX、FLP/FRT和REP/STB系统(Tribble等，J.Biol.Chem.，275，2000：22255-22267；Velmurugan等，J.Cell Biol.，149，2000：553-566)。有可能将本发明核酸序列以位点特异性方式整合至植物基因组。这些方法自然也可以应用至微生物如酵母、真菌或细菌。
转基因的/转基因/重组
为本发明目的，“转基因的”、“转基因”或“重组”就核酸序列而言意指包含此核酸序列的表达盒、基因构建体或载体或用本发明的核酸序列、表达盒或载体转化的生物，这些构建均通过重组方法产生，其中
(a)编码用于本发明方法中的蛋白质的核酸序列，或
(b)与本发明核酸序列有效连接的遗传调控序列，例如启动子，或
(c)(a)和(b)
不处于其天然遗传环境中或已经通过遗传操作方法修饰，修饰有可能采用例如取代、添加、缺失、倒位或插入一个或多个核苷酸残基的形式。天然遗传环境理解为意指来源植物中的天然基因组基因座或染色体基因座或在基因组文库中存在。在基因组文库的情况下，核酸序列的天然遗传环境优选地得到保留，至少部分地得以保留。该环境分布在核酸序列的至少一侧并且具有至少50bp，优选至少500bp，特别优选至少1000bp，最优选至少5000bp的序列长度。天然发生的表达盒–例如核酸序列的天然启动子与编码本发明方法中所用多肽的对应核酸序列的天然发生的组合，如上文所定义–在这种表达盒通过非天然的合成(“人工”)方法(如诱变处理)而受到修饰时，变成转基因表达盒。合适方法例如在US5,565,350或WO00/15815中描述。
为本发明目的，转基因植物因此如上理解为意指本发明方法中所用的核酸不位于所述植物基因组中该核酸的天然基因座内，所述核酸有可能同源或异源地表达。然而如所提及，转基因还意指尽管本发明核酸或在本发明方法中所用核酸处于植物基因组中该核酸的天然位置内，然而其序列相对于天然序列而言已经受到修饰，和/或所述天然序列的调节序列已经受到 修饰。转基因优选地理解为意指本发明核酸在基因组中的非天然基因座内表达，即发生核酸的同源表达或优选异源表达。在本文中提到了优选的转基因植物。
转化
如本文中所提及的术语“引入”或“转化”包括外源性多核苷酸转移至宿主细胞内，无论用于转化的方法是什么。能够后续克隆性增殖(无论通过器官发生或胚胎发生)的植物组织可以用本发明的遗传构建体转化并且可以从中再生整株植物。选择的具体组织将取决于可用于并且最适于正进行转化的具体物种的克隆性增殖系统。示例性组织靶包括叶盘、花粉、胚、子叶、下胚轴、大配子体、愈伤组织、现存分生组织(例如顶端分生组织、腋芽和根分生组织)和诱导的分生组织(例如子叶分生组织和下胚轴分生组织)。多核苷酸可以瞬时或稳定地引入宿主细胞并且可以非整合地维持，例如作为质粒。备选地，多核苷酸可以整合至宿主基因组内。产生的转化植物细胞随后可以用来以本领域技术人员已知的方式再生出转化植物。
外来基因转化至植物基因组内称作转化。植物物种的转化现在是相当常规的技术。有利地，几种转化方法中的任一方法可以用来将目的基因引入合适的祖先细胞。用于从植物组织或植物细胞中转化并再生出植物所述的方法可以用于瞬时转化或用于稳定转化。转化方法包括使用脂质体、电穿孔法、增加游离DNA摄入的化学品、DNA直接注射至植物、粒子枪轰击法、使用病毒或花粉的转化法和显微投射法(microprojection)。转化方法可以选自用于原生质体的钙/聚乙二醇法(Krens，F.A.等，(1982)Nature296，72-74；Negrutiu I等(1987)Plant Mol Biol8：363-373)；原生质体的电穿孔法(Shillito R.D.等(1985)Bio/Technol3，1099-1102)；对植物材料的微量注射法(Crossway A等，(1986)Mol.Gen Genet202：179-185)；DNA或RNA涂布的粒子轰击法(Klein TM等，(1987)Nature327：70)、(非整合性)病毒感染法等。转基因植物，包括转基因作物植物，优选地通过农杆菌介导的转化法产生。有利的转化方法是在植物中（in planta）的转化法。为此目的，例如有可能使农杆菌作用于植物种子或有可能用农杆菌接种植 物的分生组织。根据本发明已经证明使转化的农杆菌混悬液作用于完整植物或至少作用于花原基是特别有利的。植物随后继续培育直至获得所处理植物的种子(Clough和Bent，Plant J.(1998)16，735–743)。用于农杆菌介导的稻转化的方法包括用于稻转化的公知方法，如在任一以下文献中描述的那些方法：欧洲专利申请EP 1198985 A1，Aldemita和Hodges(Planta199：612-617，1996)；Chan等(Plant Mol Biol22(3)：491-506，1993)，Hiei等(Plant J6(2)：271-282，1994)，其公开内容在本文中引入作为参考，如同完全给出那样。在玉米转化的情况下，优选的方法如Ishida等(Nat.Biotechnol14(6)：745-50，1996)或Frame等(Plant Physiol129(1)：13-22，2002)描述，其公开内容在本文中如充分所述那样引入作为参考。所述方法通过举例方式进一步由B.Jenes等，Techniques for Gene Transfer,在：Transgenic Plants，第1卷，Engineering and Utilization，编者S.D.Kung和R.Wu，Academic Press(1993)128-143及在Potrykus Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Molec.Biol.42(1991)205-225)中描述。待表达的核酸或构建体优选地克隆至适于转化根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的载体，例如pBin19(Bevan等，Nucl.Acids Res.12(1984)8711)。由这种载体转化的农杆菌随后可以按照已知方式用于转化植物，例如作为模型使用的植物，如拟南芥(拟南芥属于本发明的范围，不视为作物植物)或作物植物，例如烟草植物，通过在农杆菌溶液中浸泡擦伤的叶或切碎的叶并随后将它们在合适的培养基内培育。植物通过根癌农杆菌的转化例如由
和Willmitzer在Nucl.Acid Res.(1988)16，9877中描述或尤其从F.F.White，Vectors for Gene Transfer in Higher Plants；在Transgenic Plants，第1卷，Engineering and Utilization，编者S.D.Kung和R.Wu，Academic Press，1993，第15-38页中获知。
除了转化体细胞(其随后必须再生成完整植物)之外，还有可能转化植物分生组织的细胞及特别转化发育成配子的那些细胞。在这种情况下，转化的配子遵循天然的植物发育过程，产生转基因植物。因此，例如拟南芥种子用农杆菌处理并且从发育植物中获得种子，其中一定比例的所述植物 受到转化并且因此是转基因的[Feldman，KA和Marks MD(1987)Mol Gen Genet208：274-289；Feldmann K(1992)。在：编者C Koncz，N-H Chua和J Shell，Methods in Arabidopsis Research.Word Scientific，Singapore，第274-289页]。替代性方法基于反复去掉花序并使莲座叶丛中心中的切除部位与转化的农杆菌温育，因而转化的种子同样可以在较晚的时间点获得(Chang(1994)Plant J.5：551-558；Katavic(1994)Mol Gen Genet，245：363-370)。然而，尤其有效的方法是改良的真空渗入法，如“花浸染”法。在拟南芥真空渗入法的情况下，完整植物在减压下用农杆菌混悬液处理[Bechthold，N(1993)。C R Acad Sci Paris Life Sci，316：1194-1199]，而在“花浸染法”的情况下，正在发育的花组织与表面活性剂处理的农杆菌混悬液短暂温育[Clough，SJ和Bent，AF(1998)The Plant J.16，735-743]。在两种情况下收获了一定比例的转基因种子，并且这些种子可以通过在如上所述的选择条件下培育而与非转基因种子区分。此外，质体的稳定转化是有利的，因为质体在大部分作物中以母体方式遗传，降低或消除了转基因经花粉流动风险。叶绿体基因组的转化一般通过已在Klaus等，2004[Nature Biotechnology22(2)，225-229]中示例性加以展示的方法实现。简而言之，待转化的序列连同选择性标记基因一起克隆至与叶绿体基因组同源的侧翼序列之间。这些同源的侧翼序列指导位点特异性整合至原质体系内。已经对众多不同植物物种描述了质体转化并且综述可以出自Bock(2001)在基础研究和植物生物技术中的转基因质体(Transgenic plastids in basic research and plant biotechnology).J Mol Biol.2001年9月21日；312(3)：425-38或Maliga，P(2003)质体转化技术商业化进展（Progress towards commercialization of plastid transformation technology）.Trends Biotechnol.21，20-28。进一步生物技术进展最近已经以无标记质体转化体的形式作了报道，所述无标记质体转化体可以通过瞬时共整合的标记基因产生(Klaus等，2004，Nature Biotechnology22(2)，225-229)。
T-DNA激活标注
T-DNA激活标注(Hayashi等Science(1992)1350-1353)涉及在目的基因的基因组区域内或基因编码区上游或下游10kb处以如此结构插入T-DNA(通常含有启动子(也可以是翻译增强子或内含子))，使得启动子指导被靶定基因的表达。通常，由靶定基因的天然启动子对所述靶定基因表达的调节作用遭到破坏并且该基因处在新引入的启动子控制下。启动子一般嵌入在T-DNA中。这种T-DNA随机地插入植物基因组，例如通过农杆菌感染，并导致在所插入T-DNA附近的基因的改良表达。因靠近所引入启动子的基因的改良表达，产生的转基因植物表现显性表型。
TILLING
术语“TILLING”是“基因组内定向诱导的局部损伤”的缩写且意指用于产生和/或鉴定核酸诱变技术，其中所述的核酸编码具有修饰表达和/或活性的蛋白质。TILLING还允许选择携带此类突变变体的植物。这些突变变体可以显示在强度方面或在位置方面或在时间方面改良的表达(例如若突变影响启动子)。这些突变变体可以显示比由处于其天然形式的基因所显出活性更高的活性。TILLING将高密度诱变与高通量筛选方法组合。一般在TILLING中遵循的步骤是：(a)EMS诱变(Redei GP和Koncz C(1992)在Methods in Arabidopsis Research，Koncz C，Chua NH，Schell J，Singapore编著，World Scientific Publishing Co，第16–82页；Feldmann等，(1994)在Meyerowitz EM，Somerville CR编著，Arabidopsis.Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，第137-172页；Lightner J和Caspar T(1998)在J Martinez-Zapater，J Salinas编者，Methods on Molecular Biology第82卷.Humana Press，Totowa，NJ，第91-104页)；(b)个体的DNA制备和汇集；(c)PCR扩增目的区；(d)变性和复性以允许形成异源双链体；(e)DHPLC，其中将异源双链体是否在汇集物中的存在检测为色谱图中的一个额外峰；(f)鉴定突变个体；和(g)对突变PCR产物测序。用于TILLING的方法是本领域众所周知的(McCallum等，(2000)Nat Biotechnol18：455-457；综述见Stemple(2004)Nat Rev Genet5(2)：145-50)。
同源重组
同源重组允许选择的核酸在基因组中于确定的所选择位置内引入。同源重组是在生物科学中常规地用于低等生物如酵母或苔藓剑叶藓(Physcomitrella)的标准技术。用于在植物中开展同源重组的方法已经不仅对模式植物(Offringa等(1990)EMBO J9(10)：3077-84)而且对作物植物例如稻(Terada等(2002)Nat Biotech20(10)：1030-4；Iida和Terada(2004)Curr Opin Biotech15(2)：132-8)进行了描述。
产量
术语”产量”通常意指经济价值的可测量结果，一般与指定作物、与面积并与时间段有关。单个植物部分基于它们的数目、大小和/或重量而直接对产量有贡献，或实际产量是对于某作物和一年的每英亩产量，这通过总产量(包括收获的和评估的产量)除以种植的英亩数而确定。术语植物的“产量”涉及该植物的营养生物量(根和/或茎生物量)、生殖器官和/或繁殖体(例如种子)。
早期萌发势
“早期萌发势”指尤其在植物生长早期期间活跃、健康、良好平衡的生长，且可以因植物适应性增加而产生，其原因在于例如植物更好地适应其环境(即优化能源的使用和苗与根之间的分配)。具有早期萌发势的植物也显示增加的幼苗存活和更好的作物建立，这往往导致高度均匀的田块(作物整齐地生长，即大多数植物在基本上相同的时间上达到发育的各阶段)和往往更好及更高的产量。因而，早期萌发势可以通过多种因子如千粒重、萌发百分数、出苗百分数、幼苗生长、幼苗高度、根长度、根及苗生物量和众多其他因素而确定。
增加/改善/增强
术语“增加”、”改善”或“增强”是可互换的并且应当在本申请含义上指与如本文中定义的对照植物相比至少5%、6%、7%、8%、9%或10%、优选至少15%或20%、更优选地25%、30%、35%或40%更多的产量和/或生长。
种子产量
增加的种子产量本身可以表现为下列一种或多种指标：a)种子生物量(种子总重量)增加，这可以基于单粒种子和/或每株植物和/或每公顷或每英亩；b)每株植物增加的花数；c)增加的(饱满)种子数；d)增加的种子饱满率(其表述为饱满种子数与种子总数之间的比率)；e)增加的收获指数，其表述为可收获部分(如种子)产量与总生物量的比率；和f)增加的千粒重(TKW)，这从计数的饱满种子数及其总重量外推而来。增加的TKW可以因增加的种子大小和/或种子重量所致，并且也可以因胚和/或胚乳尺寸的增加所致。
种子产量的增加也可以表现为种子大小和/或种子体积的增加。此外，种子产量的增加本身也可以自我表现为种子面积和/或种子长度和/或种子宽度和/或种子周长的增加。增加的产量也可以产生改良的结构，或可以因改良的结构而出现。
绿度指数
文中所用的“绿度指数”计算自植物的数字图像。对于属于图像上对应的植物目标的每一像素，计算绿度值与红度值的比值(在编码颜色的RGB模式中)。绿度指数表示为绿与红的比值超过给定阈值的像素百分比。在正常生长条件下、在盐胁迫生长条件下以及在可获得营养物减少的生长条件下，植物的绿度指数在开花前的末次取像时测量。与之相反，在干旱胁迫生长条件下，植物的绿度指数在干旱前的初次取像时测量。
植物
如本文中所用的术语”植物”包含整株植物、植物的祖先及后代和植物部分，包括种子、枝条、茎、叶、根(包括块茎)、花和组织及器官，其中每种所提及对象包含目的基因/核酸。术语”植物”也包含植物细胞、悬浮培养物、愈伤组织、胚、分生组织区、配子体、孢子体、花粉和小孢子，同样每种提及的对象包含目的基因/核酸。
特别用于本发明方法中的植物包括属于植物界（Viridiplantae）超家族的全部植物，尤其单子叶植物和双子叶植物，包括选自以下的饲用或饲料豆类、观赏植物、粮食作物、树或灌木：槭树属物种(Acer spp.)、猕猴 桃属物种(Actinidia spp.)、秋葵属物种(Abelmoschus spp.)、剑麻(Agave sisalana)、冰草属物种(Agropyron spp.)、匍匐剪股颖(Agrostis stolonifera)、葱属物种(Allium spp.)、苋属物种(Amaranthus spp.)、欧洲海滨草(Ammophila arenaria)、凤梨(Ananas comosus)、番荔枝属物种(Annona spp.)、芹菜(Apium graveolens)、落花生属物种(Arachis spp.)、木波罗属物种(Artocarpus spp.)、石刁柏(Asparagus officinalis)、燕麦属物种(Avena spp.)(例如燕麦(Avena sativa)、野燕麦(Avena fatua)、比赞燕麦(Avena byzantina)、Avena fatua var.sativa、杂种燕麦(Avena hybrida)、阳桃(Averrhoa carambola)、箣竹属(Bambusa sp.)、冬瓜(Benincasa hispida)、巴西栗(Bertholletia excelsea)、甜菜(Beta vulgaris)、芸苔属物种(Brassica spp.)(例如欧洲油菜(Brassica napus)、芜青物种(Brassica rapa ssp.)[卡诺拉油菜、油菜(oilseed rape)、蔓青(turnip rape)])、Cadaba farinosa、茶(Camellia sinensis)、美人蕉(Canna indica)、大麻(Cannabis sativa)、辣椒属物种(Capsicum spp.)、Carex elata、番木瓜(Carica papaya)、大果假虎刺(Carissa macrocarpa)、山核桃属物种(Carya spp.)、红花(Carthamus tinctorius)、栗属物种(Castanea spp.)、美洲木棉(Ceiba pentandra)、苦苣(Cichorium endivia)、樟属物种(Cinnamomum spp.)、西瓜(Citrullus lanatus)、柑橘属物种(Citrus spp.)、椰子属物种(Cocos spp.)、咖啡属物种(Coffea spp.)、芋头(Colocasia esculenta)、非洲梧桐属物种(Cola spp.)、黄麻属(Corchorus sp.)、芫荽(Coriandrum sativum)、榛属物种(Corylus spp.)、山楂属物种(Crataegus spp.)、番红花(Crocus sativus)、南瓜属物种(Cucurbita spp.)、香瓜属物种(Cucumis spp.)、菜蓟属(Cynara spp.物种)、胡萝卜(Daucus carota)、山马蝗属物种(Desmodium spp.)、龙眼(Dimocarpus longan)、薯蓣属物种(Dioscorea spp.)、柿树属物种(Diospyros spp.)、稗属物种(Echinochloa spp.)、油棕属(Elaeis)(例如油棕(Elaeis guineensis)、美洲油棕Elaeis(oleifera))、穇子(Eleusine coracana)、蔗茅属(Erianthus sp.)、枇杷(Eriobotrya japonica)、桉属(Eucalyptus sp.)、红仔果(Eugenia uniflora)、荞麦属物种(Fagopyrum spp.)、水青冈属物种(Fagus spp.)、苇状羊茅(Festuca arundinacea)、无花果(Ficus carica)、金桔属物种(Fortunella spp.)、草莓属物种(Fragaria spp.)、银杏(Ginkgo biloba)、大豆属(Glycine spp.)(例如大豆、大豆(Soja hispida)或大豆(Soja max))、陆地棉(Gossypium hirstum)、向日葵属(Helianthus spp.)(例如向日葵(Helianthus annuus))、长管萱草(Hemerocallis fulva)、木槿属物种(Hibiscus spp.)、大麦属(Hordeum spp.)(例如大麦(Hordeum vulgare))、甘薯(Ipomoea batatas)、核桃属物种(Juglans spp.)、莴苣(Lactuca sativa)、山黧豆属物种(Lathyrus spp.)、兵豆(Lens culinaris)、亚麻(Linum usitatissimum)、荔枝(Litchi chinensis)、百脉根属物种(Lotus spp.)、棱角丝瓜(Luffa acutangula)、羽扇豆属物种(Lupinus spp.)、Luzula sylvatica、番茄属(Lycopersicon spp.)(例如番茄(Lycopersicon esculentum、Lycopersicon lycopersicum、Lycopersicon pyriforme))、硬皮豆属物种(Macrotyloma spp.)、苹果属物种(Malus spp.)、凹缘金虎尾(Malpighia emarginata)、牛油果(Mammea americana)、芒果(Mangifera indica)、木薯属物种(Manihot spp.)、人心果(Manilkara zapota)、苜蓿(Medicago sativa)、草木樨属物种(Melilotus spp.)、薄荷属物种(Mentha spp.)、芒(Miscanthus sinensis)、苦瓜属物种(Momordica spp.)、黑桑(Morus nigra)、芭蕉属物种(Musa spp.)、烟草属物种(Nicotiana spp.)、木犀榄属物种(Olea spp.)、仙人掌属物种(Opuntia spp.)、鸟足豆属物种(Ornithopus spp.)、稻属物种(Oryza spp.)(例如稻、阔叶稻(Oryza latifolia))、稷(Panicum miliaceum)、柳枝稷(Panicum virgatum)、鸡蛋果(Passiflora edulis)、欧防风(Pastinaca sativa)、狼尾草属物种(Pennisetum sp.)、鳄梨属物种(Persea spp.)、芹菜（Petroselinum crispum)、虉草(Phalaris arundinacea)、菜豆属物种(Phaseolus spp.)、猫尾草(Phleum pratense)、刺葵属物种(Phoenix spp.)、南方芦苇(Phragmites australis)、酸浆属物种(Physalis spp.)、松属物种(Pinus spp.)、阿月浑子(Pistacia vera)、豌豆属物种(Pisum spp.)、早熟禾属物种(Poa spp.)、杨属物种(Populus spp.)、牧豆草属物种(Prosopis spp.)、李属物种(Prunus spp.)、番石榴属物种(Psidium spp.)、石榴(Punica granatum)、西洋梨(Pyrus communis)、栎属物种(Quercus spp.)、萝卜(Raphanus sativus)、波叶大黄(Rheum rhabarbarum)、茶藨子属物种(Ribes spp.)、蓖麻(Ricinus communis)、悬钩子属物种(Rubus spp.)、甘蔗属物种(Saccharum spp.)、柳属物种(Salix sp.)、接骨木属物种(Sambucus spp.)、黑麦(Secale cereale)、胡麻属物种(Sesamum spp.)、白芥属物种(Sinapis sp.)、茄属(Solanum spp.)(例如马铃薯(Solanum tuberosum)、红茄(Solanum integrifolium)或番茄(Solanum lycopersicum))、两色蜀黍(Sorghum bicolor)、菠菜属物种(Spinacia spp.)、蒲桃属物种(Syzygium spp.)、万寿菊属物种(Tagetes spp.)、酸豆(Tamarindus indica)、可可树(Theobroma cacao)、车轴草属物种(Trifolium spp.)、Triticosecale rimpaui、小麦属(Triticum spp.)(例如普通小麦(Triticum aestivum)、硬粒小麦(Triticum durum)、圆柱小麦(Triticum turgidum)、Triticum hybernum、马卡小麦(Triticum macha)、普通小麦(Triticum sativum)或普通小麦(Triticum vulgare))、小金莲花(Tropaeolum minus)、金莲花(Tropaeolum majus)、越桔属物种(Vaccinium spp.)、野碗豆属物种(Vicia spp.)、豇豆属物种(Vigna spp.)、香堇(Viola odorata)、葡萄属物种(Vitis spp.)、玉蜀黍、Zizania palustris、枣属物种(Ziziphus spp.)等等。
发明详述
ERLK
现已发现在植物中调节编码伸展蛋白受体样激酶(ERLK)或其部分的核酸的表达产生了相对于对照植物具有增强的产量相关性状的植物，其中所述部分包含至少激酶结构域和跨膜结构域。
因此，本发明的第一实施方案提供相对于对照植物增强植物产量相关性状的方法，其包括在植物中调节编码ERLK蛋白质或其部分的核酸的表达。
用于调节(优选增加)编码伸展蛋白受体样激酶(ERLK)或其部分的核酸表达的优选方法是在植物中引入并表达编码此类ERLK蛋白质的核酸， 其中所述部分包含至少激酶结构域和跨膜结构域。
在此之后“用于本发明方法中的蛋白质”的任何引用意指如本文中所定义的ERLK多肽。在此之后“用于本发明方法中的核酸”的任何引用意指能够编码此类ERLK多肽的核酸。待引入植物(并且因而用于实施本发明方法)的核酸是编码现在所述类型蛋白质的任意核酸，下文又称作“ERLK核酸”或“ERLK基因”。
用于本发明方法中的ERLK蛋白质是Shiu和Bleeker(2001)定义的ERLK蛋白质。术语“ERLK蛋白质”或“伸展蛋白受体样激酶”意指包含激酶结构域和跨膜结构域的N-末端的蛋白质(参见用于示意性概述的图1和图2)。ERLK蛋白质优选还包含N-末端分泌信号序列以及任选的胞外结构域。用于本发明的ERLK蛋白质激酶结构域（和/或其他结构域）优选分类为Shiu和Bleeker(2001)定义的伸展蛋白受体样激酶。
术语“结构域”和“基序”在文中的“定义”部分定义。存在用于鉴定结构域的专业数据库，如SMART(Schultz等(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.美国95，5857-5864；Letunic等(2002)Nucleic Acids Res30，242-244)、InterPro(Mulder等，(2003)Nucl.Acids.Res.31，315-318)、Prosite(Bucher 和Bairoch(1994)，A generalized profile syntax for biomolecular sequences motifs and its function in automatic sequence interpretation（用于生物分子序列基序的广义图谱语法及其在自动化序列判读中的功能），(在)ISMB-94；第二届分子生物学智能系统国际会议文集.Altman R.，Brutlag D.，Karp P.，Lathrop R.，Searls D.编著，第53-61页，AAAI Press，Menlo Park；Hulo等，Nucl.Acids.Res.32：D134-D137,(2004))或Pfam(Bateman等，Nucleic Acids Research30(1)：276-280(2002))。用于计算机芯片上分析蛋白质序列的一组工具可在ExPASY蛋白质组学服务器上获得(瑞士生物信息学研究所(Gasteiger等，ExPASy：the proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis（用于深入认识和分析蛋白质的蛋白组学服务器），Nucleic Acids Res.31：3784-3788(2003))。结构域也可以使用常规技术如通过序列比对而鉴定。
用于比对序列用于比较的方法是本领域众所周知的，此类方法包括GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。GAP使用Needleman和Wunsch算法((1970)J Mol Biol48:443-453)以找到使匹配数最大化并使空位数最小化的两个完整序列的全局性(即覆盖完整序列的)比对。BLAST算法(Altschul等(1990)J Mol Biol215:403-10)计算序列同一性百分数并执行对两个序列间相似性的统计分析。用于执行BLAST分析的软件是公众通过国家生物技术信息中心(NCBI)可获得的。同源物可以使用例如ClustalW多重序列比对算法(1.83版本)以默认配对比对参数和评分方法（以百分数计）而轻易地鉴定。相似性和同一性的全局百分数也可以使用在MatGAT软件包中可获得的方法之一而确定(Campanella等，BMC Bioinformatics.2003Jul10；4:29.MatGAT：用蛋白质或DNA序列而产生相似性/同一性矩阵的应用)。可以进行细微手工编著以优化保守基序之间的比对，如本领域技术人员显而易见。此外除了使用全长序列以鉴定同源物，也可以使用特定结构域(如激酶结构域)。使用上文提及的程序，使用默认参数，针对整个核酸序列或氨基酸序列或针对选择的结构域或保守基序测定了序列同一性值。
用于本发明方法中的ERLK蛋白质中的激酶结构域是蛋白质Tyr激酶型结构域(Pfam登录号PF07714、InterPro登录号IPR001245)。活性位点对应PROSITE标签PS00109，具有下列共有模式:
[LIVMFYC]-{A}-[HY]-×-D-[LIVMFY]-[RSTAC]-{D}-{PF}-N-[LIVMFYC](3)，
其中D是活性位点的部分。该模式的体系（syntax）是根据用于Prosite数据库的习惯并在PROSITE手册中解释。
优选地，激酶结构域通过序列基序1(SEQ ID NO:6)的存在进一步表征:
(M/L)L(S/G/R)R(L/M)(H/R/Q)(H/S/C)(R/P)(N/Y)L(L/V)XL(I/L/V)G
其中X可以是任意氨基酸，优选是K、N、A、S、G、E中的一个。优选地，基序1具有序列LLSR(L/M)(H/R/Q)(C/S)PYL(L/V)(E/G/A)L(L/I)；最优选基序1具有序列LLSRLQCPYLVELLG。
优选地，激酶结构域也包含序列基序2(SEQ ID NO:7):
L(Y/D/N)(W/F)X(A/V/T)R(L/M)(L/R/G)IA(L/V)
其中X可以是任意氨基酸，优选是D、N、E、K、P、Q或G中的一个,
序列基序3(SEQ ID NO:8):
A(R/K)(A/G)L(A/E)(Y/F)LHE,
序列基序4(SEQ ID NO:9):
(V/I)IHR(D/N)(F/L)K(S/A/G/C)(S/T)N(I/V)LL(E/D)
其中第6位的氨基酸优选不是I、V或M，
序列基序5(SEQ ID NO:10):
(K/R)V(S/A/T)DFG(L/M/S)
中的一个或多个。
优选地，序列基序2具有序列LDW(G/Q/P/E)(A/T)R(L/M)(R/G)IA(L/V)，更优选地，序列基序2具有序列LDW(G/Q)(T/A)RL(R/G)IAL，最优选地，序列基序2具有序列LDWGARLRIAL。序列基序3优选具有序列ARALEFLHE。序列基序4优选具有序列VIHR(D/N)(F/L)K(S/C)(S/T)NILLD，最优选地，该序列是VIHRNFKCTNILLD。序列基序5优选具有序列(K/R)VSDFG(L/M)，该序列最优选是KVSDFGL。
优选地，用于本发明方法中的ERLK蛋白质的激酶结构域与SEQ ID NO:2的激酶结构域(如SEQ ID NO:57所给出的)具有一定序列同一性，所述序列同一性按照增加的优选顺序为至少39%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%。激酶结构域可以使用如上列出的用于蛋白质鉴定的数据库和工具，和/或用于待比较的序列比对的方法进行鉴定。在一些情况下，可以调整默认参数以调节搜索的严格性。例如使用BLAST，可以提高用于报告针对数据库序列的匹配的统计显著性阈值(称作“期望”值)以显示严格性较低的匹配。这样，可以鉴定几乎精确的短匹配。
跨膜结构域长约为15至30个氨基酸，并通常包含形成α螺旋的疏水 残基。它们一般基于疏水性预测(例如Klein等,Biochim.Biophys.Acta815,468,1985；或Sonnhammer等,In J.Glasgow、T.Littlejohn、F.Major、R.Lathrop、D.Sankoff和C.Sensen编著，Proceedings of the Sixth International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology，第175-182页,Menlo Park,CA,1998,AAAI Press).
ERLK蛋白质的胞外结构域如果存在，具有（但不是必须）一个或多个SPx基序。分泌信号序列的结构及其切割位点的预测是本领域熟知的。
另外，用于本发明方法中的ERLK蛋白质(至少以其天然形式)一般，但不是必须具有激酶活性。因此，具有降低的激酶活性或不具有激酶活性的ERLK蛋白质同样可用于本发明的方法中。本领域的技术人员使用常规工具和技术可容易的确定激酶活性的存在。为了确定受体样激酶的激酶活性，一些测定是可用的(例如Current Protocols in Molecular Biology,1和2卷,Ausubel等(1994),Current Protocols)。简要的，激酶测定通常包括(1)使激酶蛋白质接触含有待磷酸化的靶位点的底物多肽；(2)适当的条件下，在适当激酶缓冲液中进行靶位点的磷酸化；(3)在恰当的反应期后将磷酸化的产物从未磷酸化的底物中分离出来。激酶活性的存在或缺乏是通过磷酸化靶标的存在或缺乏来确定的。另外，可以进行定量测量。纯化的受体样激酶，或者含有或富含受体样激酶的细胞提取物可以用作激酶蛋白质的来源。备选的，可以使用Zhao等(Plant Mol.Biol.26,791-803,1994)的方法，其中稻类受体激酶的胞质结构域在大肠杆菌（Escherichia coli）中表达并测定激酶活性。作为底物，小肽是尤其适合的。肽在磷酸化位点基序中必须含有一个或多个丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基。可以在Biochimica et Biophysica Acta1314,191-225,(1996)中找到磷酸化位点的汇编。此外，肽底物可以优选具有净正电荷，以利于结合到磷酸纤维素滤器上(可用于将磷酸化的肽从未磷酸化的肽中分离出来并且检测磷酸化的肽)。如果不知道磷酸化位点基序，可以使用常规酪氨酸激酶底物。例如，“Src相关肽”(RRLIEDAEYAARG)是许多受体和非受体酪氨酸激酶的底物。为了确定合成肽磷酸化的动力参数，需要肽浓度的范围。对于起始反应，可使用 0.7-1.5mM的肽浓度。对于每种激酶，重要的是要确定活性的最佳缓冲液、离子强度和pH。标准5×激酶缓冲液通常含有5mg/ml BSA(防止激酶与测定管吸附的牛血清蛋白)、150mM Tris-Cl(pH7.5)、100mM MgCl2。绝大部分酪氨酸激酶需要二价阳离子，尽管一些酪氨酸激酶(例如胰岛素-、IGF-1-和PDGF受体激酶)需要MnCl2替代MgCl2(或除了MgCl2外还需要MnCl2)。根据经验为每种蛋白激酶确定二价阳离子的最佳浓度。常用的磷酰基（phophoryl）基团供体是放射性标记的[γ-32P]ATP(通常是0.2mM终浓度)。在肽中掺入的32P可以通过在闪烁计数器中的硝化纤维素干垫上测量活性来确定。
本发明通过用由SEQ ID NO:1代表的编码多肽序列SEQ ID NO:2的核酸序列转化的植物加以说明，然而，本发明的实施不限于这些序列。本发明方法可以使用如文中定义的任意ERLK-编码核酸或ERLK多肽有利地进行。
编码ERLK多肽的核酸的实例在文中实施例1的表A中给出。这类核酸可用于实施本发明的方法。实施例1的表A中给出的氨基酸序列是SEQ ID NO:2所示的ERLK多肽的直向同源物和旁系同源物的实例，术语“直向同源物”和“旁系同源物”如文中所定义。其他直向同源物和旁系同源物可以通过开展所谓交互性blast搜索而容易地鉴定。这通常涉及第一BLAST，其中所述的第一BLAST包括提交查询序列(例如使用实施例1的表A中列出的任一序列)用于针对任一序列数据库(如公众可用的NCBI数据库)的BLAST搜索。当从核苷酸序列开始时，一般使用BLASTN或TBLASTX(使用标准默认值)，并且当从蛋白质序列开始时，可以使用BLASTP或TBLASTN(使用标准默认值)。任选地可以筛选BLAST结果。随后提交筛选结果和非筛选结果的全长序列以针对来自生物的序列进行反向BLAST(第二BLAST)，其中查询序列来自所述的生物(其中在查询序列是SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14的情况下，第二BLAST因而将针对拟南芥序列)。随后比较第一和第二BLAST搜索的结果。若来自第一BLAST的 高阶位命中源自与查询序列从其中衍生的物种相同的物种，反向BLAST随后理想地在最高命中的查询序列中产生，则鉴定到旁系同源物；若第一BLAST的中的高阶位命中不源自与查询序列从其中衍生的物种相同的物种，并且优选地在反向BLAST时产生属于最高命中之列的查询序列，则鉴定到直向同源物。
高阶位命中是具有低E-值的那些命中。E-值越低，评分越显著(或换句话说，此命中因偶然而发生的几率越低)。E-值的计算是本领域众所周知的。除了E-值外，比较结果还由同一性百分数记分。同一性百分数指两个所比较核酸(或多肽)序列之间在特定长度范围内的相同核苷酸(或氨基酸)数目。在大型家族的情况下，可以使用ClustalW，随后使用邻接树法以便帮助显示相关基因的聚类和以便鉴定直向同源物和旁系同源物。
核酸变体也可以用于实施本发明的方法。此类核酸变体的实例包括编码实施例1的表A中给出的任一氨基酸序列的同源物和衍生物的核酸，术语“同源物”和“衍生物”如文中所定义。也可用于本发明方法中的是编码实施例1的表A中给出的任一氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的同源物和衍生物的核酸。用于本发明方法中的同源物和衍生物与它们衍生自的未修饰的蛋白质具有基本相同的生物和功能活性。
用于实施本发明方法的其他核酸变体包括编码ERLK多肽的核酸的部分、与编码ERLK多肽的核酸杂交的核酸、编码ERLK多肽的核酸的剪接变体、编码ERLK多肽的核酸的等位变体，以及通过基因改组获得的编码ERLK多肽的核酸的变体。术语杂交序列、剪接变体、等位变体和基因改组如文中所述。
编码ERLK多肽的核酸不需要是全长核酸，因为本发明方法的实施不依赖使用全长核酸序列的使用。本发明提供在植物中增强产量相关性状的方法，其包括在植物中引入和表达实施例1的表A中给出的核酸序列中任一个的部分，或实施例1的表A中给出的氨基酸序列中任一个的直向同源物、旁系同源物或同源物的编码核酸的部分。优选地，该部分编码的多肽从N-末端到C-末端至少包括(i)跨膜结构域和(ii)伸展蛋白受体样激酶型 (ERLK-型)激酶结构域。
核酸的部分可以例如通过对该核酸产生一个或多个缺失而制备。所述的部分可以以分离的形式加以使用或它们可以与其他编码性(或非编码性)序列融合，以便例如产生组合几种活性的蛋白质。当与其他编码序列融合时，翻译时产生的所得多肽可以比对该蛋白质部分所预测的多肽更大。
用于本发明方法中的部分编码文中定义的ERLK多肽，其具有激酶结构域（如上所述）并与实施例1的表A中给出的任意氨基酸序列所示的ERLK蛋白质具有基本相同的生物学活性。优选地，此部分是在实施例1的表A中给出的任何一种核酸的部分，或实施例1的表A中给出的氨基酸序列中任一个的直向同源物或旁系同源物的编码核酸的部分。此部分的长度优选为至少800、850、900、950、1000、1050、1100、1150,1200、1250、1300个连续核苷酸，其中所述的连续核苷酸是实施例1的表A中给出的任何一种核酸序列，或是实施例1的表A中给出的氨基酸序列中任一个的直向同源物或旁系同源物的编码核酸。最优选地，此部分是核酸SEQ ID NO:1的部分。
用于本发明方法中的另一核酸变体是能够在降低的严格条件下、优选在严格条件下与编码如文中所定义的ERLK多肽的核酸杂交，或与如文中所定义的部分杂交的核酸。
本发明提供用于在植物中增强产量相关性状的方法，其包括在植物中引入并表达能够与实施例1的表A中给出的任何一种核酸杂交的核酸，或包括在植物中引入并表达如此核酸，其能够与实施例1的表A中给出的任意核酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的编码核酸杂交的核酸。
用于本发明方法中的杂交序列编码文中定义的ERLK多肽，其具有ERLK-型激酶结构域和跨膜结构域（如上所述）并与实施例1的表A中给出的氨基酸序列具有基本相同的生物学活性。杂交序列一般长度为至少800个核苷酸，优选长度为至少1000个核苷酸，进一步优选长度为至少1200个核苷酸，最优选长度为至少1300个核苷酸。优选地，杂交序列能够与实施例1的表A中给出的任一核酸杂交或与任一这些序列的部分杂交，其中 所述的部分如上文所定义，或者其中杂交序列能够与实施例1的表A中给出的任一氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的编码核酸杂交，或与探针或衍生自其的探针杂交。最优选地，杂交序列能够与如SEQ ID NO:1所代表的核酸，或与其部分或探针杂交。
设计探针的方法是本领域熟知的。探针长度一般小于1000bp，优选小于500bp。通常，用于诸如Southern印记的DNA-DNA杂交的探针长度在100至500bp之间变化，而用于诸如PCR扩增的DNA-DNA杂交的探针中的杂交区一般短于50个核苷酸但长于10个核苷酸。
用于本发明方法中的另一种核酸变体是编码如上文所定义的ERLK多肽的剪接变体，剪接变体如文中所定义。
本发明提供用于在植物中增强产量相关性状的方法，其包括在植物中引入并表达实施例1的表A中给出的任何一种核酸的剪接变体，或实施例1的表A中给出的任意氨基酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的编码核酸的剪接变体。
优选的剪接变体是由SEQ ID NO:1代表的核酸的剪接变体，或编码SEQ ID NO:2的直向同源物或旁系同源物的核酸的剪接变体。
用于实施本发明方法的另一种核酸变体是编码如上文所定义的ERLK多肽的核酸的等位变体，等位变体如文中所定义。
本发明提供用于在植物中增强产量相关性状的方法，其包括在植物中引入并表达实施例1的表A中给出的任何一种核酸的等位变体，或包括在植物中引入并表达实施例1的表A中给出的任意氨基酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的编码核酸的等位变体。
用于本发明方法中的等位变体具有与ERLK多肽SEQ ID NO:2和实施例1的表A中所示的任意氨基酸基本相同的生物学活性。等位变体天然存在，且包含在本发明方法中的是这些天然等位基因的用途。优选地，等位变体是SEQ ID NO:1的等位变体，或编码SEQ ID NO:2的直向同源物或旁系同源物的核酸的等位变体。
用于本发明方法中的另一核酸变体是通过基因改组而获得的核酸变 体。基因改组或定向进化也可以用来产生编码如上文定义的ERLK多肽的核酸的变体；术语“基因改组”如文中所定义。
本发明提供用于在植物中增强产量相关性状的方法，其包括在植物中引入并表达实施例1的表A中给出的任何一种核酸的变体，或包括在植物中引入并表达如此核酸的变体，其中所述的核酸编码实施例1的表A中给出的任意氨基酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物，所述变体核酸通过基因改组获得。
另外，核酸变体也可以通过位点定向诱变获得。几种方法可用于实现位点定向诱变，最常见的是基于PCR的方法(Current Protocols in Molecular Biology.Wiley编著)。
编码ERLK多肽的核酸可以来自任何自然来源或人工来源。核酸可以从其天然形式就组成和/或基因组环境方面通过人类有意操作而加以修饰。编码ERLK多肽的核酸优选地来自植物，还优选来自双子叶植物，更优选来自十字花科，该核酸最优选来自拟南芥。
本发明方法的实施产生具有增强的产量相关性状的植物。尤其本发明方法的实施产生相对于对照植物而具有增加的产量、尤其是增加的种子产量的植物。在本文中的“定义”部分中更详细地描述了术语“产量”和“种子产量”。
在本文中对增强的产量相关性状的参考意指植物的一个或多个部分的生物量(重量)增加，所述的部分可以包括地上(可收获)部分和/或地下(可收获)部分。尤其，此类可收获部分是种子和叶生物量，并且本发明方法的实施产生相对于对照植物具有增加的叶生物量和增加的种子产量的植物。
以玉米为例，产量增加可以表现为下列一种或多种指标：每公顷或英亩生长的（establish）植物数的增加、每株植物穗数的增加、行数的增加、每行粒数、粒重、千粒重、玉米穗长度/直径、种子饱满率的增加(其中种子饱满率是饱满种子数除以种子总数并乘以100)及其他。以稻为例，产量增加本身可以表现为下列一种或多种指标的增加：每公顷或英亩植物数、每株植物圆锥花序数、每圆锥花序小穗数、每圆锥花序花(小花)数(其表达 为饱满种子数对原圆锥花序数之比)、种子饱满率的增加(其中种子饱满率是饱满种子数除以种子总数并乘以100)、千粒重的增加及其他。
本发明提供相对于对照植物，增加植物产量，尤其是增加植物叶生物量和增加种子产量的方法，所述方法包括在植物中调节编码如文中所定义的ERLK多肽的核酸的表达，优先增加其表达。
由于本发明的转基因植物具有增加的产量，因而相对于对照植物的生长速率，这些植物有可能在其生活周期中的对应阶段上表现增加的生长速率(在其生活周期的至少部分期间)。
增加的生长速率可以对于植物的一个或多个部分(包括种子)是特异性的，或可以基本上遍及整株植物。具有增加的生长速率的植物可以具备较短的生活周期。植物的生活周期可以视为意指从干燥成熟种子成长至植物已经产生与起始材料相似的干燥成熟种子的阶段所需要的时间。这个生活周期可以受下列因素影响，如早期萌发势、生长速率、绿度指数、开花时间和种子成熟速度。生长速率的增加可以在植物生活周期中的一个或多个阶段上或在基本上整个植物生活周期期间发生。在植物生活周期中的早期期间增加的生长速率可以反映增强的萌发势。生长速率的增加可以改变植物的收获周期，允许植物较晚播种和/或较早收获，否则这将不可能(相似的作用可以用较早的开花时间获得)。若生长速率充分地增加，可以允许进一步播种相同植物物种的种子(例如播种并收获稻植物，随后播种并收获其他稻植物，全部稻植物均在一个常规生长时段内)。类似地，若生长速率足够地增加，可以允许进一步播种不同植物物种的种子(例如播种并收获玉米植物，随后例如播种并任选收获大豆、马铃薯或任何其他合适植物)。从相同的根茎中收获额外次数在一些作物植物的情况中也是可能的。改变植物的收获周期可以导致每英亩的年生物量产量的增加(因任何特定植物可以生长并收获的次数(如在一年中)增加)。生长速率的增加也可以允许比其野生型对应物在更广泛的地理区域内培育转基因植物，因为对培育作物的区域限制往往由栽种时节(早季)或在收获时期(晚季)的不利环境条件所决定。若缩短收获周期，则可以避开这类不利条件。生长速率可以通过从生长曲 线中得到多种参数而确定，此类参数可以是：T-Mid(植物达到其50％最大尺寸所花费的时间)和T-90(植物达到其50％最大尺寸所花费的时间)，等等。
根据本发明的优选特征，本发明方法的实施产生相对于对照植物而具有增加的生长速率的植物。因而根据本发明，提供增加植物生长速率的方法，所述方法包括调节表达、优选增加本文中所定义的编码ERLK多肽的核酸在植物中的表达。
与对照植物相比，无论植物处于非胁迫条件下还是植物暴露于多种胁迫下，都发生产量和/或生长速率的增加。植物一般通过生长得更慢而对暴露于胁迫作出应答。在严重胁迫条件下，植物甚至可以完全停止生长。另一方面，轻微胁迫在本文中定义为植物对其暴露的任何胁迫，其中所述的胁迫未导致植物完全停止生长而没有恢复生长的能力。与非胁迫条件下的对照植物相比，轻微胁迫在本发明意义中导致受胁迫植物生长降低小于40%、35%或30%，优选小于25%、20%或15%，更优选小于14%、13%、12%、11%或10%或更低。由于农业实践(灌溉、施肥、杀虫剂处理)上的进步，在栽培作物植物中并不经常遇到严重胁迫。因此，由轻微胁迫诱导的受损生长往往是农业上不希望的特征。轻微胁迫是植物暴露的常见生物性和/或非生物性(环境)胁迫。非生物胁迫可以因干旱或水涝、厌氧胁迫、盐胁迫、化学毒性、氧化胁迫和热、寒冷或冰冻温度所致。非生物胁迫可以是由水胁迫(尤其因为干旱)、盐胁迫、氧化胁迫或离子胁迫引起的渗透胁迫。生物胁迫一般是由病原体如细菌、病毒、真菌和昆虫引起的那些胁迫。
尤其，本发明的方法可以在非胁迫条件下或在轻微干旱条件下实施以产生相对于对照植物而具有增加的产量的植物。如在Wang等(Planta(2003)218：1-14)中报道，非生物胁迫导致不利地影响植物生长及生产力的一系列形态学变化、生理学变化、生物化学变化和分子变化。已知干旱、盐度、极端温度和氧化胁迫是相互联系的并可以通过相似机制而诱导生长损害及细胞损害。Rabbani等(Plant Physiol(2003)133：1755-1767) 描述了干旱胁迫与高盐度胁迫间极高程度的“串话”。例如，干旱和/或盐化作用主要表现为渗透胁迫，导致细胞内稳态和离子分布的破坏。经常伴随高温或低温、盐度或干旱胁迫的氧化胁迫可以造成功能性蛋白和结构蛋白变性。因此，这些多样的环境胁迫常常激活相似的细胞信号传导途径和细胞应答，如产生胁迫蛋白质、增量调节抗氧化物质、积累相容性溶质和生长抑制。如本文中所用的术语”非胁迫”条件是允许植物最佳生长的环境条件。本领域技术人员清楚对于给定地点的正常土壤条件和气候条件。
本发明方法的实施相对于在相当条件下培育的合适对照植物，赋予在非胁迫条件下或在轻微干旱条件下培育的植物增加的产量。因而根据本发明，提供用于在非胁迫条件下或在轻微干旱条件下培育的植物中增加产量的方法，所述方法包括增加编码ERLK多肽的核酸在植物中表达。
本发明方法的实施产生相对于在相当条件下培育的对照植物，在营养缺乏条件下、尤其在氮缺乏条件下培育的具有增加产量的植物。因而本发明提供用于在营养缺乏条件下培育的植物中增加产量的方法，所述方法包括增加编码ERLK多肽的核酸在植物中的表达。营养缺乏可以因营养物的缺乏或过量所致，所述营养物例如是氮、磷酸盐及其他含磷化合物、钾、钙、镉、镁、锰、铁和硼等。
本发明包括可通过本发明方法获得的植物或其部分(包括种子)。该植物或其部分包含编码如上文定义的ERLK多肽的核酸转基因。
本发明还提供遗传构建体和载体以促进在植物中引入和/或表达编码ERLK多肽的核酸。该基因构建体可以插入适于转化至植物内并适于在转化的细胞中表达目的基因的市售载体。本发明也提供如文中所定义的基因构建体在本发明方法中的用途。
更具体地，本发明提供构建体，其包含
(a)编码如上文定义的ERLK多肽的核酸；
(b)能够驱动(a)的核酸序列表达的一个或多个调控序列；和任选地
(c)转录终止序列。
优选地，编码ERLK多肽的核酸如上文所定义。术语“调控序列”和“终 止序列”如上文所定义。
植物用包含如上所述的任意核酸的载体转化。本领域技术人员非常了解为成功转化、选择和增殖含有目的序列的宿主细胞而必须于载体上存在的遗传元件。目的序列与一种或多种调控序列(至少与启动子)有效连接。
有利地，任何类型的天然或合成启动子可以用来驱动核酸序列的表达。组成型启动子尤其可用于本方法中。各种启动子类型的定义参见文中的“定义”部分。优选的组成型启动子是也实质上遍在表达的组成型启动子。其他启动子优选来自植物，更优选来自单子叶植物。最优选是使用GOS2启动子，其与来自稻的GOS2启动子基本类似或相同(SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:58)。
应当明白本发明的适用性不限于由SEQ ID NO:1代表的ERLK多肽编码核酸，同时本发明的适用性也不限于在组成型启动子驱动时表达ERLK多肽编码核酸。其他组成型启动子的实例参见文中“定义”部分的表2a。
任选地，一种或多种终止子序列可以在引入植物的构建体中使用。额外的调节元件可以包括转录增强子以及翻译增强子。本领域技术人员会知道可以在实施本发明中适用的终止子序列和增强子序列。如定义部分所述，内含子序列也可以添加至5'非翻译区(UTR)或编码序列中，以增加在胞浆内积累的成熟信息的量。其他调控序列(除启动子、增强子、沉默子、内含子序列、3’UTR和/或5’UTR区之外)可以是蛋白质和/或RNA稳定化元件。本领域技术人员会知道或可以轻易地获得此类序列。
本发明的遗传构建体还可以包括在特定细胞类型中维持和/或复制所需的复制起点序列。一个实例是当需要将遗传构建体在细菌细胞中维持为附加型遗传元件(例如质粒或粘粒分子)时。优选的复制起点包括，但不限于fl-ori和colE1。
为检测如在本发明方法中所用核酸序列的成功转移和/或选择包含这些核酸的转基因植物，使用标记基因(或报道基因)是有利的。因而，遗传构建体可以任选地包含选择性标记基因。文中的“定义”部分更加详细的描 述了选择性标记。该标记基因当其不再需要时，可从转基因细胞移除或切除。移除标记的技术是本领域已知的，有用的技术描述于上面的“定义”部分。
本发明也提供产生转基因植物的方法，其中所述转基因植物相对于对照植物具有增强的产量相关性状，其包括在植物中引入和表达编码如上文中所定义的ERLK多肽的任意核酸。
更具体地，本发明提供用于产生具有增强的产量相关性状，尤其是增加的叶生物量和种子生物量的转基因植物的方法，所述方法包括：
(i)在植物或植物细胞中引入和表达ERLK多肽编码核酸；和
(ii)在促进植物生长和发育的条件下培育植物细胞。
(i)的核酸可以是能够编码文中定义的ERLK多肽的任意核酸。
核酸可以直接引入植物细胞或引入植物本身(包括引入组织、器官或植物的任何其他部分)。根据本发明的优选特征，核酸优选地通过转化引入植物。文中的“定义”部分更加详细的描述了术语“转化”。
遗传修饰的植物细胞可通过本领域技术人员熟悉的所有方法再生。合适的方法可见于S.D.Kung和R.Wu、Potrykus或
和Willmitzer的上述出版物。
通常在转化后，选择一种或多种标记存在的植物细胞或细胞群体，其中所述的标记由与目的基因一起共转移的植物可表达的基因编码，随后将转化的材料再生成整株植物。为了选择转化的植物，在转化中获得的植物材料原则上接受选择条件处理，以至于转化的植物可以与未转化的植物区分。例如，以上文所述方式获得的种子可以播种，在初始培育时期后，通过喷雾进行合适的选择。另一种可能性包括在使用合适选择剂的琼脂平板上生长种子(根据需要在消毒之后)，使得仅转化的种子可以生长成植物。或者，转化的植物通过上述那些选择性标记的存在筛选。
在DNA转移和再生后，推测的转化植物可以例如使用Southern分析对目的基因的存在、拷贝数和/或基因组构造进行评价。备选或额外地，新引入DNA的表达水平可以使用Northern和/或Western分析进行监测， 这两种技术是本领域技术人员众所周知的。
产生的转化植物可以通过多种方法加以增殖，如通过克隆增殖法或经典育种技术。例如，第一代(或T1)转化植物可以进行自交，选择纯合的第二代(或T2)转化体，并且T2植物通过经典育种技术进一步增殖。产生的转化生物可以采取多种形式。例如，它们可以是转化细胞和非转化细胞的嵌合体；克隆转化体(例如被转化以含有表达盒的全部细胞)；转化组织和未转化组织的移植体(例如在植物中，与未转化嫩枝嫁接的转化的根状茎)。
本发明明确地扩展至通过文中所述的任意方法产生的任何植物细胞或植物，并扩展至全部植物部分及其繁殖体。本发明进一步扩展至包含已经通过任意前述方法产生的原代转化或转染细胞、组织、器官或整株植物的后代，唯一要求是后代表现与通过本发明方法中的亲代所产生的那些后代相同的一种或多种基因型特征和/或表型特征。
本发明也包括宿主细胞，其含有编码如上文所定义的ERLK多肽的分离的核酸。本发明优选的宿主细胞是植物细胞。宿主植物对于本发明方法中所用核酸或载体、表达盒或构建体或载体而言原则上有利地是能够合成本发明方法中所用多肽的全部植物。
本发明方法有利地适用于任何植物。本发明还包括通过本发明的方法获得的植物。本发明因此提供通过本发明的方法获得的植物、其植物部分或植物细胞，所述植物、其部分或细胞包含编码如上文所定义的ERLK蛋白质的核酸转基因。特别用于本发明方法中的植物包括属于植物界超家族的全部植物，尤其单子叶植物和双子叶植物，包括饲用或饲料豆类、观赏植物、粮食作物、树或灌木。根据本发明优选的实施方案，植物是作物植物。作物植物的实例包括大豆、向日葵、卡诺拉油菜、苜蓿、油菜、棉花、番茄、马铃薯和烟草。还优选地，植物是单子叶植物。单子叶植物的实例包括甘蔗。更优选地，植物是谷物。谷物的实例包括稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、黑小麦、高粱和燕麦。
本发明也扩展至植物的可收获部分如，但不限于种子、叶、果实、花、茎、根、根状茎、块茎和球茎。本发明进一步涉及来自自、优选直接来自 这种植物的可收获部分中的产物，如干燥颗粒或粉末、油、脂肪及脂肪酸、淀粉或蛋白质。
根据本发明的优选特征，受调节的表达是增加的表达。增加核酸、基因或基因产物的表达的方法在现有技术中充分记载，并且实例在定义给出。
如上文提及，用于调节(优选增加)编码ERLK多肽的核酸表达的优选方法是在植物中引入并表达编码ERLK多肽的核酸；然而实施所述方法的作用即增强产量相关性状也可以使用众所周知的其他技术实现，所述技术包括但不限于T-DNA激活标注、TILLING、同源重组。这些技术的描述在定义给出。
本发明也包括编码文中所述ERLK多肽的核酸的用途和这些ERLK多肽的用途，其用于增强植物中的任意上述产量相关性状。
编码文中所述ERLK多肽的核酸或ERLK多肽本身可以用于育种程序中，其中鉴定到可以遗传地与编码ERLK多肽的基因连接的DNA标记。所述的核酸/基因或ERLK多肽本身可以用来定义分子标记。这种DNA或蛋白质标记随后可以在育种程序中用来选择具有本发明方法中如上文所定义的增强的产量相关性状的植物。
编码ERLK多肽的核酸/基因的等位变体也可以用于标记辅助的育种程序中。这种育种程序有时需要通过使用例如EMS诱变法对植物进行诱变处理而引入等位基因变异；备选地，该程序可以从非人为引起的所谓“自然”起源的一组等位变体开始。随后进行等位变体的鉴定，例如通过PCR法。此后是用于选择所讨论及导致增加产量的序列的优异等位变体的步骤。一般通过监测含有所讨论序列的不同等位变体的植物的生长性能而实施选择。可以在温室中或田间监测生长性能。其他任选步骤包括将鉴定了优异等位变体的植物与另一种植物杂交。这可以用来例如产生目标表型特征的组合。
编码ERLK多肽的核酸也可以用作探针以便对基因进行遗传作图或物理作图，所述探针作为所述基因的一部分及与这些基因关联的性状的标记。此类信息可以用于植物育种中，以便开发具有想要表型的株系。编码 ERLK多肽的核酸的这种用途仅需要具有至少15个核苷酸长度的核酸序列。编码ERLK多肽的核酸可以用作限制性片段长度多态性(RFLP)标记。限制性消化的植物基因组DNA的Southern印迹(Sambrook J，Fritsch EF和Maniatis T(1989)Molecular Cloning，A Laboratory Manual)可以用ERLK编码核酸探测。产生的结合图式随后可以使用计算机程序如MapMaker(Lander等(1987)Genomics1：174-181)进行遗传分析以构建遗传图。此外，该核酸可以用来探测含有经限制性内切核酸酶处理的一组个体的基因组DNA的Southern印迹，其中所述的一组个体代表具有确定的遗传杂交的亲代和后代。DNA多态性的分离被标出并用来计算编码ERLK多肽的核酸在使用这个群体先前所获得的遗传图中的位置(Botstein等(1980)Am.J.Hum.Genet.32：314-331)。
在Bernatzky和Tanksley(1986)Plant Mol.Biol.Reporter4：37-41中描述了植物基因衍生的探针的产生和其在遗传作图中的用途。众多出版物描述了使用以上所提及的方法学或其改良方法对特定cDNA克隆的遗传作图。例如，F2互交群、回交群、随机交配群、邻近纯合系和其他个体群体可以用于作图。此类方法学是本领域技术人员众所周知的。
所述核酸探针也可以用于物理作图(即序列在物理图上的排列；见Hoheisel等在：Non-mammalian Genomic Analyasis：A Practical Guide，Academic press1996，第319-346页及其中引用的参考文献)。
在另一实施方案中，核酸探针可以在直接荧光原位杂交(FISH)作图法(Trask(1991)Trends Genet.7：149-154)中使用。尽管当前的FISH作图法支持使用大型克隆(几个kb至几百个kb；见Laan等(1995)Genome Res.5：13-20)，然而灵敏度的改善可以允许使用更短探针进行FISH作图。
用于遗传作图及物理作图的多种基于核酸扩增的方法可以使用所述核酸而实施。实例可见于文中的“定义”部分。实例包括等位基因特异性扩增(Kazazian(1989)J.Lab.Clin.Med11:95-96)、PCR扩增片段的多态性(CAPS;Sheffield等,(1993)Genomics16:325-332)、等位基因特异性连接(Landegren等,(1988)Science241:1077-1080)、核苷酸延伸反应(Sokolov (1990)Nucleic Acid Res.18:3671)、放射杂交作图(Walter等,(1997)Nat.Genet.7:22-28)和Happy作图(Dear和Cook,(1989)Nucleic Acid Res.17:6795-6807)。为实施这些方法，使用核酸序列设计和产生用于扩增反应或引物延伸反应的引物对。这类引物的设计是本领域技术人员众所周知的。使用基于PCR的遗传作图的方法，可能需要鉴定跨越相应于本发明核酸序列区域作图的亲本之间DNA序列的差异。然而，这对作图方法通常不是必要的。
本发明方法产生具有如前文所述的具有增强的产量相关性状的植物。这些性状也可以与经济上有利的其他性状组合，如其他的产量增加性状，对其他非生物胁迫和生物性胁迫的耐受性，调节多种构造性特征和/或生物化学特征和/或生理学特征的性状。
FBW40
现已惊奇地发现增加编码FBXW多肽的核酸在植物中的表达产生了相对于对照植物而具有增强的产量相关性状的植物。因而，本发明提供相对于对照植物增强植物产量相关性状的方法，其包括增加编码FBXW多肽的核酸在植物中的表达。
用于增加编码FBXW多肽的核酸表达的优选方法是在植物中引入并表达编码FBXW多肽的核酸。
在此之后“用于本发明方法中的蛋白质”的任何引用意指如本文中所定义的FBXW多肽。在此之后“用于本发明方法中的核酸”的任何引用意指能够编码此类FBXW多肽的核酸。待引入植物(并且因而用于实施本发明方法)的核酸是编码现在所述类型蛋白质的任意核酸，下文又称作“FBXW核酸”或“FBXW基因”。
文中所定义的术语“FBXW多肽”意指多肽，其包含：(i)F-框；(ii)包含至少一个WD40重复的WD40结构域；(iii)SEQ ID NO:97所示的基序1;和(iv)SEQ ID NO:98所示的基序2。
优选地，基序1的序列是：
WK(E/K)(F/V/L)Y(C/R/G)ERWGXP，X代表任意氨基酸。
基序1中最保守的氨基酸是XLXFGXXXYFXWKXXYXERWGXP，并且基序2中最保守的氨基酸是SLXFEXPWLVSXSXDG(其中X是各位置不同的氨基酸的特定子集，如SEQ ID NO:97和SEQ ID NO:98所示)。其中基序1和基序2允许在任何位置有一个或多个保守性改变，和/或允许在任何位置有一个、两个或三个非保守性改变。
任选地，FBXW多肽可包含下列中的一个或多个：(a)SEQ ID NO:99所示的基序3;(b)SEQ ID NO:100所示的基序4;和(c)SEQ ID NO:101所示的基序5。其中基序3至5允许在任何位置有一个或多个保守性改变，和/或允许在任何位置有一个或两个非保守性改变。
上文定义的FBXW多肽的实例由SEQ ID NO:60所示，其包含：(i)F-框；(ii)包含至少一个WD40重复的WD40结构域；(iii)SEQ ID NO:97所示的基序1;和(iv)SEQ ID NO:98所示的基序2；并且任选包含下列中的一个或多个：(a)SEQ ID NO:99所示的基序3;(b)SEQ ID NO:100所示的基序4;和(c)SEQ ID NO:101所示的基序5(图5是表示SEQ ID NO:60中不同结构域及其相关位置的草图)。其他此类实例由SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68或SEQ ID NO:70，或上述任意SEQ ID NO的直向同源物或旁系同源物中的任一个所示。本发明通过用SEQ ID NO:59所示的编码多肽SEQ ID NO:60的拟南芥序列转化的植物举例说明。SEQ ID NO:62(由SEQ ID NO:61编码，来自稻)、SEQ ID NO:64(由SEQ ID NO:63编码，来自蒺藜苜蓿),SEQ ID NO:66(由SEQ ID NO:65编码，来自普通小麦),SEQ ID NO:68(由SEQ ID NO:67编码，来自美洲山杨（Populus tremuloides）)和SEQ ID NO:70(由SEQ ID NO:69编码，来自玉蜀黍)是多肽SEQ ID NO:60的直向同源物。
直向同源物和旁系同源物（该术语如上文所定义）可以通过开展所谓交互性blast搜索而容易地找到。这一般涉及通过第一BLAST进行，其中所述的第一BLAST包括查询序列(例如SEQ ID NO:59或SEQ ID NO:60)针对任何序列数据库(如公众可用的NCBI数据库)进行BLAST搜索。当从 核苷酸序列开始时，可以使用BLASTN或TBLASTX(使用标准默认值)，并且当从多肽序列开始时，可以使用BLASTP或TBLASTN(使用标准默认值)。任选地可以筛选BLAST结果。随后将筛选结果和非筛选结果的全长序列针对来自生物的序列进行反向BLAST搜索(第二BLAST)，其中查询序列来自所述的生物(其中在查询序列是SEQ ID NO:59或SEQ ID NO:60的情况下，第二BLAST因而将针对拟南芥序列)。随后比较第一和第二BLAST搜索的结果。若来自第一BLAST的高阶位命中源自与查询序列从其中衍生的物种相同的物种，反向BLAST随后理想地产生查询序列作为最高命中，则鉴定到旁系同源物；若高阶位命中不源自与查询序列从其中衍生的物种相同的物种，并且优选地在反向BLAST时产生属于最高命中之列的查询序列，则鉴定到直向同源物。高阶位命中是具有低E-值的那些命中。E-值越低，评分越显著(或换句话说，此命中因偶然而发生的几率越低)。E-值的计算是本领域众所周知的。除了E-值外，比较结果还由同一性百分数记分。同一性百分数指两个所比较核酸(或多肽)序列之间在特定长度范围内的相同核苷酸(或氨基酸)数目。对直向同源物和旁系同源物鉴定的详述实例在实施例8中给出。在大型家族的情况下，可以使用ClustalW，随后使用邻接树法以便帮助显示相关基因的聚类和以便鉴定直向同源物和旁系同源物。优选地，用于本发明方法中的FBXW多肽与SEQ ID NO:60具有一定序列同一性，所述序列同一性按照增加的优选顺序为至少45%、50%、55%、65%,70%、75%、80%、85%、90%,95%或98%(计算示于实施例9)。FBXW多肽之间呈现相对低的保守氨基酸序列同一性，虽然它们的多肽结构（包括F-框和WD40结构域）相当保守。SEQ ID NO:102和SEQ ID NO:103(均包含在SEQ ID NO:60中)所示的FBXW多肽的两个较保守区之间的序列保守性按照增加的优选顺序为至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或98%同一性(计算示于实施例9)。
SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:70中的任一个所代表的多肽或任意前述 SEQ ID NO的直向同源物或旁系同源物均包含(i)F-框；(ii)包含至少一个WD40重复的WD40结构域；(iii)SEQ ID NO:97所示的基序1;和(iv)SEQ ID NO:98所示的基序2。
术语"结构域"和“基序”定义如上。存在用于鉴定结构域的专业数据库。在FBXW多肽中的F-框和WD40重复可以使用例如SMART(Schultz等(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.美国95，5857-5864；Letunic等(2002)Nucleic Acids Res30，242-244；由德国海德堡的EMBL拥有)、InterPro(Mulder等，(2003)Nucl.Acids.Res.31，315-318；由英国的欧洲生物信息研究所(EBI)拥有)、Prosite(Bucher和Bairoch(1994)，用于生物分子序列基序的广义图谱语法及其在自动化序列判读中的功能，(In)ISMB-94；第二届分子生物学智能系统国际会议文集.Altman R.，Brutlag D.，Karp P.，Lathrop R.，Searls D.编著，第53-61页，AAAIPress，Menlo Park；Hulo等，Nucl.Acids.Res.32：D134-D137,(2004))、作为一项服务向科学界提供的ExPASy蛋白质组服务器(由瑞士的瑞士生物信息学研究所(SIB)拥有)或Pfam(Bateman等，Nucleic Acids Research30(1)：276-280(2002)，由英国的Sanger研究所拥有)加以鉴定。F-框包含40至50个残基，其中不变的位置很少。这种严格共有序列的缺乏使用搜索算法要点（essential）鉴定。F-框在InterPro数据库中命名为IPR001810、在Pfam数据库中命名为PF00646并且在PROSITE数据库中命名为PS50181。WD40结构域中包含的WD40重复一般为大约40个氨基酸。正如F-框，除了通常（但不是必须）以Trp-Asp(W-D)二肽结尾的该重复具有很少不变的位置。使用搜索算法的鉴定基本相当。WD40重复在InterPro数据库中命名为IPR001680、在Pfam数据库中命名为PF00400并且在PROSITE数据库中命名为PS50082。根据PFAM算法，WD40结构域通常包含4至16个重复(PF00400重复)，优选包含5-10个重复，更优选包含6-8个重复，最优选包含7个重复。WD40结构域在InterPro数据库中命名为IPR0011046。
用于比对序列进行比较的方法包括GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA 和TFASTA。GAP使用Needleman和Wunsch算法((1970)J Mol Biol 48:443-453)以找到使匹配数最大化并使空位数最小化的两个完整序列的比对。BLAST算法(Altschul等(1990)J Mol Biol215:403-10)计算序列同一性百分数并执行对两个序列间相似性的统计分析。用于执行BLAST分析的软件是公众通过国家生物技术信息中心可获得的。同源物可以使用例如在京都大学生物信息学中心（Kyoto University Bioinformatics Center）的GenomeNet服务器上可获得的ClustalW多重序列比对算法(1.83版本)，用默认配对比对参数和以百分数计的评分方法而轻易地鉴定。可以进行细微手工编著以优化保守基序之间的比对，如本领域技术人员显而易见。在一些情况下，可以调整默认参数以调节搜索法的严格性。例如使用BLAST，可以提高用于报告针对数据库序列的匹配的统计显著性阈值(称作“期望”值)以显示严格性较低的匹配。以这种方式，可以鉴定几乎精确的短匹配。以这种方式可以鉴定如SEQ ID NO:97所代表的基序1和如SEQ ID NO:98所代表的基序2，其中所述的基序均包含于在用于本发明方法中的FBXW多肽内(图6)。允许在基序1和基序2内的任意位置上的一个或多个保守性改变，和/或在任意位置上的一个、两个或三个非保守性改变。基序3至5(分别由SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:100和EQ ID NO:101所示)可同样鉴定(图6)。允许在基序3至5内的任意位置上的一个或多个保守性改变，和/或在任意位置上的一个或两个非保守性改变。
编码由SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:70的任一种所示多肽或任一前述SEQ IDNO的直向同源物或旁系同源物的核酸不必是全长核酸，因为本发明方法的实施不依赖使用全长核酸序列。另外，在实施本发明方法中适用的核酸的实例包括但不限于由SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:67或SEQ ID NO:69的任一种所示的那些核酸。核酸变体也可以在实施本发明的方法中使用。此类变体的实例包括天然存在的或通过DNA操作获得的核酸的部分、杂交序列、剪接变体、等位变体。
部分可以例如通过对编码如上文所定义的FBXW多肽的核酸产生一个或多个缺失而制备。所述的部分可以以分离的形式加以使用或它们可以与其他编码性(或非编码性)序列融合，以便例如产生结合几种活性的蛋白质。当与其他编码序列融合时，翻译时产生的所得多肽可以比对FBXW部分所预测的多肽更大。用于本发明方法中的部分编码(如上文所述的)FBXW多肽，其中所述多肽具有与任一SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:70所示的FBXW多肽或任一前述SEQ ID NO的直向同源物或旁系同源物基本上相同的生物学活性。部分的实例可以包括这样的核苷酸，其编码的多肽包含(i)F-框；(ii)包含至少一个WD40重复的WD40结构域；(iii)SEQ ID NO:97所示的基序1;和(iv)SEQ ID NO:98所示的基序2。部分可任选包括下列中的一个或多个：(a)SEQ ID NO:99所示的基序3;(b)SEQ ID NO:100所示的基序4;和(c)SEQ ID NO:101所示的基序5。所述的部分一般是至少500个核苷酸长度、优选至少750个核苷酸长度、更优选至少1000个核苷酸长度并且最优选至少1500个核苷酸长度。优选地，所述部分是如SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:67或SEQ ID NO:69的任一种所示的核酸的部分。最优选地，该部分是如SEQ ID NO:59所示的核酸的部分。
用于本发明方法中的另一种核酸变体是能够在降低的严格性条件下、优选在严格条件下与编码如本文中所定义的FBXW多肽的核酸杂交，或与如本文中所定义的部分杂交的核酸。
术语“杂交”在上面的定义部分定义。用于本发明方法中的杂交序列编码这样的多肽，其包含：(i)F-框；(ii)包含至少一个WD40重复的WD40结构域；(iii)SEQ ID NO:97所示的基序1;和(iv)SEQ ID NO:98所示的基序2，并且与SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:70所示的FBXW多肽，或任一前述SEQ ID NO的直向同源物或旁系同源物具有基本上相同的生物学活性。所述杂交序列一般是至少250个核苷酸长度、优选至少500个核苷酸长度、 更优选至少750个核苷酸长度并且最优选至少1000个核苷酸长度。优选地，所述杂交序列是能够与由SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:67或SEQ ID NO:69所示的任一核酸杂交或与任一前述序列的部分杂交的序列，其中所述的部分如上文定义。最优选地，所述杂交序列能够与SEQ ID NO:59或与其部分杂交。
编码FBXW多肽的部分缺乏一个或多个以下部分：(i)F-框；(ii)包含至少一个WD40重复的WD40结构域；(iii)SEQ ID NO:97所示的基序1;和(iv)SEQ ID NO:98所示的基序2，例如可用作下述杂交方法中的探针，以获得用于实施本发明方法的部分，所述部分包括(i)F-框；(ii)包含至少一个WD40重复的WD40结构域；(iii)SEQ ID NO:97所示的基序1;和(iv)SEQ ID NO:98所示的基序2的全部。用于杂交方法的实例由以下所示：来自葡萄（Vitis vinifera）的SEQ ID NO:71(NCBI EST CF210354、CF413646和CF213082的叠连群)、来自Senecio cambrensis的SEQ ID NO:73(NCBI EST DY662683.1)、来自向日葵的SEQ ID NO:75(NCBI EST DY916708)、来自乳浆大戟（Euphorbia esula）的SEQ ID NO:77(NCBI EST DV129599)、来自番茄的SEQ ID NO:79(NCBI EST BI931509)、来自Aquilegia formosa x Aquilegia pubescens的SEQ ID NO:81(NCBI EST DT753991.1)、来自陆地棉的SEQ ID NO:83(NCBI EST DT466472)、来自两色蜀黍的SEQ ID NO:85(NCBI EST CF770159)、来自牵牛（Ipomea nil）的SEQ ID NO:87(NCBI EST BJ574759.1)、来自马铃薯的SEQ ID NO:89(NCBI EST CX161187)、来自菱叶凤尾蕉（Zamia fischeri）的SEQ ID NO:91(NCBI EST DY032229)、来自鳄梨（Persea americana）的SEQ ID NO:93(NCBI EST CK756534)和来自大豆的SEQ ID NO:95(NCBI EST CD418593.1)。
用于本发明方法中的另一种核酸变体是编码如上文所定义的FBXW多肽的剪接变体。优选的剪接变体是编码由SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:70任一个所示的FBXW多肽的核酸的剪接变体，或是编码任一前述SEQ ID NO的直向同源物或旁系同源物的剪接变体。其他优选的是由SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:67或SEQ ID NO:69中的任一个所示的核酸的剪接变体。最优选的是由SEQID NO:59所示的核酸的剪接变体。
用于实施本发明方法的另一种核酸变体是编码如上文所定义的FBXW多肽的核酸的等位变体。等位变体天然存在，且包含在本发明方法中的是这些天然等位基因的用途。用于本发明方法中的等位变体具有与FBXW多肽SEQ ID NO:60和实施例8的表G中所示的任意氨基酸基本相同的生物学活性。等位变体可以是编码由SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:70任一个所示的FBXW多肽的核酸的等位变体，或是编码任一前述SEQ IDNO的直向同源物或旁系同源物的核酸的等位变体。其他优选是由SEQ IDNO:59、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:67或SEQ ID NO:69中的任一个所示的核酸的等位变体。最优选的是由SEQ ID NO:59所示的核酸的等位变体。
用于本发明方法中的另一核酸变体是通过基因改组而获得的核酸变体。基因改组或定向进化也可以用来产生编码如上文定义的FBXW多肽的核酸的变体。
另外，核酸变体也可以例如通过位点定向诱变获得。几种方法可用于实现位点定向诱变，最常见的是基于PCR的方法(Current Protocols in Molecular Biology.Wiley编著)。
还用于本发明方法中的是这样的核酸，其编码由SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:70所示的任何一种氨基酸的同源物，或任一前述SEQ ID NO的直向同源物或旁系同源物的同源物。术语“同源物”、“直向同源物”和“旁系同源物”如上文所定义。
还用于本发明方法中的是这样的核酸，其编码由SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO: 70所示的任何一种氨基酸的衍生物，或任一前述SEQ ID NO的直向同源物或旁系同源物的衍生物。
编码FBXW多肽的核酸可以来自任何自然来源或人工来源。核酸可以根据就组成和/或基因组环境方面通过人类有意操作而对天然形式加以修饰。优选地，编码FBXW多肽的核酸来自植物，还优选来自双子叶植物，更优选来自十字花科，该核酸最优选地来自拟南芥。
本发明还提供遗传构建体和载体以促进在植物中引入和/或表达用于本发明方法中的核酸序列。
因而，提供基因构建体，其包含：
(i)编码如上文所定义的FBXW多肽的核酸；
(ii)与(i)的核酸有效连接的一种或多种调控序列。
本发明方法中所用的构建体可以使用本领域技术人员众所周知的重组DNA技术构建。该基因构建体可以插入适于转化至植物内并适于在转化的细胞中表达目的基因的市售载体。本发明也提供如文中所定义的基因构建体在本发明方法中的用途。
植物用包含目的序列的载体(即编码FBXW多肽的核酸)转化。技术人员非常了解为成功转化、选择和增殖含有目的序列的宿主细胞而必须于载体上存在的遗传元件。目的序列有效地与一种或多种调控序列(至少与启动子)连接。
有利地，任何类型的启动子(不论是天然的或合成的)可以用来驱动核酸序列的表达。
根据本发明的一个优选特征，编码FBXW多肽的核酸与组成型启动子(调控序列)有效连接。该组成型启动子优选地是GOS2（也称为SUI1或eIF1(真核起始因子1)）启动子，更优选地，该组成型启动子是稻GOS2启动子，该组成型启动子还优选地由基本上与SEQ ID NO:104或SEQ ID NO58相似的核酸序列所示，该组成型启动子最优选地如SEQ ID NO:104或SEQ ID NO58所示。
应当明白本发明的适用性不限于编码由SEQ ID NO:59所示的FBXW 多肽的核酸，同时本发明的适用性也不限于由GOS2启动子驱动时编码FBXW多肽的这种核酸的表达。
用于增加核酸或基因或基因产物表达的额外调节元件可以包括转录增强子以及翻译增强子。本领域技术人员会知道可以在实施本发明中适用的终止子序列和增强子序列。此类调控元件的实例是引入5’非翻译区的内含子。任选地，一种或多种终止子序列(也是调控序列)可以在引入植物的构建体中使用。
其他调控序列(除启动子、增强子、沉默子、内含子序列、3’UTR和/或5’UTR区之外)可以是蛋白质和/或RNA稳定化元件。本领域技术人员会知道或可以轻易地获得此类序列。
本发明的遗传构建体还可以包括需要用于在特定细胞类型中维持和/或复制的复制序列起点。一个实例是当需要将遗传构建体在细菌细胞中维持为附加型遗传元件(例如质粒或粘粒分子)时。优选的复制起点包括，但不限于fl-ori和colE1。
为检测如在本发明方法中所用核酸序列的成功转移和/或选择包含这些核酸的转基因植物，使用标记基因(或报道基因)是有利的。因而，遗传构建体可以任选地包含选择性标记基因。该标记基因当其不再需要时，可从转基因细胞移除或切除。移除标记的技术是本领域已知的，有用的技术描述于上面的“定义”部分。
本发明也提供用于产生相对于合适的对照植物具有增加产量的转基因植物的方法，其包括在植物中引入并表达编码如上文所定义的FBXW多肽的核酸。
更具体地，本发明提供用于产生相对于合适的对照植物具有增加产量的转基因植物的方法，所述方法包括：
(i)在植物细胞中引入并表达编码FBXW多肽的核酸；和
(ii)在促进植物生长和发育的条件下培育植物细胞。
核酸可以直接引入植物细胞或引入植物本身(包括引入组织、器官或植物的任何其他部分)。根据本发明的优选特征，核酸优选地通过转化引入植 物。文中所指的术语“转化”如上所定义。
通常在转化后，对植物细胞或细胞群体选择一种或多种标记的存在，其中所述的标记由与目的基因一起共转移的植物可表达基因编码，随后将转化的材料再生成整株植物。遗传修饰的植物细胞可通过本领域技术人员熟悉的所有方法再生。合适的方法可见于S.D.Kung和R.Wu、Potrykus或
和Willmitzer的上述出版物。为选择转化的植物，在转化中获得的植物材料原则上接受选择条件处理，以至于转化的植物可以与未转化的植物区分。例如。以上文所述方式获得的种子可以播种，在初始培育时期后，通过喷雾进行合适的选择处理。另一种可能性包括在使用合适选择剂的琼脂平板上培育种子(根据需要在消毒之后)，以至于仅转化的种子可以生长成植物。备选地，对转化的植物筛选选择性标记(如上文所述的那些选择性标记)的存在。
在DNA转移和再生后，推测的转化植物可以例如使用Southern分析对目的基因的存在、拷贝数和/或基因组构造进行评价。备选或额外地，新引入DNA的表达水平可以使用Northern和/或Western分析，或定量PCR监测，全部技术是本领域内普通技术人员众所周知的。
产生的转化植物可以通过多种方法加以增殖，如通过克隆性增殖法或经典育种技术。例如，第一代(或T1)的转化植物可以自花传粉产生纯化的第二代(或T2)转化体，并且T2植物通过经典育种技术进一步繁殖。
产生的转化生物可以采取多种形式。例如，它们可以是转化细胞和非转化细胞的嵌合体；克隆性转化体(例如受转化以含有表达盒的全部细胞)；转化组织和未转化组织的移植体(例如在植物中，与未转化嫩枝嫁接的转化的根茎)。
本发明明确地扩展至通过本文中所述的任一方法产生的任何植物细胞或植物，并扩展至全部植物部分及其繁殖体。本发明进一步扩展至包含已经通过任一前述方法产生的原代转化或转染细胞、组织、器官或整株植物的后代，唯一要求是后代表现与通过本发明方法中的亲代所产生的那些后代相同的基因型特征和/或表型特征。
本发明也包括宿主细胞,其含有编码如上文所定义的FBXW多肽的分离核酸。本发明优选的宿主细胞是植物细胞。宿主植物对于本发明方法中所用核酸或载体、表达盒或构建体或载体而言原则上有利地是能够合成本发明方法中所用多肽的全部植物。
本发明也扩展至植物的可收获部分如，但不限于种子、叶、果实、花、茎、根、根状茎、块茎和球茎。本发明进一步涉及来自自、优选直接来自这种植物的可收获部分中的产物，如干燥颗粒或粉末、油、脂肪及脂肪酸、淀粉或蛋白质。
根据本发明的优选特征，受调节的表达是增加的表达。增加核酸、基因或基因产物的表达的方法在本领域充分记载，实例在定义部分提供。
如上文提及，用于调节(优选增加)编码FBXW多肽的核酸表达的优选方法是在植物中引入并表达编码FBXW多肽的核酸；然而实施所述方法的作用即增强产量相关性状也可以使用众所周知的其他技术实现，所述技术包括但不限于T-DNA激活标注、TILLING、同源重组。这些技术的描述在定义给出。
本发明方法的实施产生具有增强的产量相关性状的植物。本发明方法的实施尤其产生相对于对照植物，具有增加的产量，尤其是增加的种子产量的植物。术语“产量”和“种子产量”在文中“定义”部分更加详细的描述。
在本文中对增强的产量相关性状的引用意指植物的一个或多个部分的生物量(重量)增加，所述的部分可以包括地上(可收获)部分和/或地下(可收获)部分。具体地，此类可收获部分是种子，本发明方法的实施尤其产生相对于对照植物的种子产量，具有增加的种子产量的植物。
以玉米为例，产量增加可以表现为下列一种或多种指标：每公顷或英亩植物数的增加、每株植物穗数的增加、行数的增加、每行粒数、粒重、千粒重、玉米穗长度/直径、种子饱满率的增加(其中种子饱满率是饱满种子数除以种子总数并乘以100)及其他。以稻为例，产量增加本身可以表现为下列一种或多种指标的增加：每公顷或英亩植物数、每株植物圆锥花序数、每圆锥花序小穗数、每圆锥花序花(小花)数(其表达为饱满种子数对原 圆锥花序数之比)、种子饱满率的增加(其中种子饱满率是饱满种子数除以种子总数并乘以100)、千粒重的增加及其他。
由于本发明的转基因植物具有增加的产量，因而相对于对照植物的生长速率，这些植物有可能在其生活周期中的对应阶段上表现增加的生长速率(在其生活周期的至少部分期间)。
增加的生长速率可以对于植物的一个或多个部分(包括种子)是特异性的，或可以基本上遍及整株植物。具有增加的生长速率的植物可以具备较短的生活周期。植物的生活周期可以视为意指从干燥成熟种子成长至植物已经产生与起始材料相似的干燥成熟种子的阶段所需要的时间。这个生活周期可以受下列因素影响，如早期萌发势、生长速率、绿度指数、开花时间和种子成熟速度。生长速率的增加可以在植物生活周期中的一个或多个阶段上或在基本上整个植物生活周期期间发生。在植物生活周期中的早期期间增加的生长速率可以反映增强的萌发势。生长速率的增加可以改变植物的收获周期，允许植物较晚播种和/或较早收获，否则这将不可能(相似的作用可以用较早的开花时间获得)。若生长速率充分地增加，可以允许进一步播种相同植物物种的种子(例如播种并收获稻植物，随后播种并收获其他稻植物，全部稻植物均在一个常规生长时段内)。类似地，若生长速率足够地增加，可以允许进一步播种不同植物物种的种子(例如播种并收获玉米植物，随后例如播种并任选收获大豆、马铃薯或任何其他合适植物)。从相同的根茎中收获额外次数在一些作物植物的情况中也是可能的。改变植物的收获周期可以导致每英亩的年生物量产量的增加(因任何特定植物可以生长并收获的次数(如在一年中)增加)。生长速率的增加也可以允许比其野生型对应物在更广泛的地理区域内培育转基因植物，因为对培育作物的区域限制往往由栽种时节(早季)或在收获时期(晚季)的不利环境条件所决定。若缩短收获周期，则可以避开这类不利条件。生长速率可以通过从生长曲线中得到多种参数而确定，此类参数可以是：T-Mid(植物达到其50％最大尺寸所花费的时间)和T-90(植物达到其50％最大尺寸所花费的时间)，等等。
根据本发明的优选特征，本发明方法的实施产生相对于对照植物而具有增加的生长速率的植物。因而根据本发明，提供增加植物生长速率的方法，所述方法包括调节表达、优选增加本文中所定义的编码FBXW多肽的核酸在植物中的表达。
与对照植物相比，无论植物处于非胁迫条件下还是植物暴露于多种胁迫下，都发生产量和/或生长速率的增加。植物一般通过生长得更慢而对暴露于胁迫作出应答。在严重胁迫条件下，植物甚至可以完全停止生长。另一方面，轻微胁迫在本文中定义为植物对其暴露的任何胁迫，其中所述的胁迫未导致植物完全停止生长而没有恢复生长的能力。与非胁迫条件下的对照植物相比，轻微胁迫在本发明意义中导致受胁迫植物生长降低小于40%、35%或30%，优选小于25%、20%或15%，更优选小于14%、13%、12%、11%或10%或更低。由于农业实践(灌溉、施肥、杀虫剂处理)上的进步，在栽培作物植物中并不经常遇到严重胁迫。因此，由轻微胁迫诱导的受损生长往往是农业上不希望的特征。轻微胁迫是植物暴露的常见生物性和/或非生物性(环境)胁迫。非生物胁迫可以因干旱或水涝、厌氧胁迫、盐胁迫、化学毒性、氧化胁迫和热、寒冷或冰冻温度所致。非生物胁迫可以是由水胁迫(尤其因为干旱)、盐胁迫、氧化胁迫或离子胁迫引起的渗透胁迫。生物胁迫一般是由病原体如细菌、病毒、真菌和昆虫引起的那些胁迫。
尤其，本发明的方法可以在非胁迫条件下或在轻微干旱条件下实施以产生相对于对照植物而具有增加的产量的植物。如在Wang等(Planta(2003)218：1-14)中报道，非生物胁迫导致不利地影响植物生长及生产力的一系列形态学变化、生理学变化、生物化学变化和分子变化。已知干旱、盐度、极端温度和氧化胁迫是相互联系的并可以通过相似机制而诱导生长损害及细胞损害。Rabbani等(Plant Physiol(2003)133：1755-1767)描述了干旱胁迫与高盐度胁迫间极高程度的“串话”。例如，干旱和/或盐化作用主要表现为渗透胁迫，导致细胞内稳态和离子分布的破坏。经常伴随高温或低温、盐度或干旱胁迫的氧化胁迫可以造成功能性蛋白和结构蛋白 变性。因此，这些多样的环境胁迫常常激活相似的细胞信号途径和细胞应答，如产生胁迫蛋白质、增量调节抗氧化物质、积累相容性溶质和生长抑制。如本文中所用的术语”非胁迫”条件是允许植物最佳生长的环境条件。本领域技术人员清楚对于给定地点的正常土壤条件和气候条件。
本发明方法的实施相对于在相当条件下培育的合适对照植物，赋予在非胁迫条件下或在轻微干旱条件下培育的植物增加的产量。因而根据本发明，提供用于在非胁迫条件下或在轻微干旱条件下培育的植物中增加产量的方法，所述方法包括增加编码FBXW多肽的核酸在植物中表达。
本发明方法的实施产生相对于在相当条件下培育的对照植物，在营养缺乏条件下、尤其在氮缺乏条件下培育的具有增加产量的植物。因而本发明提供用于在营养缺乏条件下培育的植物中增加产量的方法，所述方法包括增加编码FBXW多肽的核酸在植物中的表达。营养缺乏可以因营养物的缺乏所致，所述营养物例如是氮、磷酸盐及其他含磷化合物、钾、钙、镉、镁、锰、铁和硼等。
本发明方法有利地适用于任何植物。特别用于本发明方法中的植物包括属于植物界超家族的全部植物，尤其单子叶植物和双子叶植物，包括选自以下的饲用或饲料豆类、观赏植物、粮食作物、树或灌木。根据本发明优选的实施方案，植物是作物植物。作物植物的实例包括大豆、向日葵、卡诺拉油菜、苜蓿、油菜、棉花、番茄、马铃薯和烟草。还优选地，植物是单子叶植物。单子叶植物的实例包括甘蔗。更优选地，植物是谷物。谷物的实例包括稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、黑小麦、高粱和燕麦。
本发明还包括通过本发明的方法获得的植物。本发明因此提供通过本发明的方法获得的植物、部分或细胞，所述植物、部分或细胞包含编码如上文所定义的FBXW多肽的核酸转基因。
本发明也包括编码FBXW多肽的核酸的用途，其用于相对于合适的对照植物的产量，增加植物的产量。
一种此类用途涉及增加植物的产量，所述产量如上文所定义。产量可以尤其包括以下中的一种或多种：增加的种子产量、增加的（饱满）种子 数、增加的千粒重(TKW)、增加的收获指数和增加的种子饱满率。
编码FBXW多肽的核酸可以用于育种程序中，其中鉴定到可以遗传地与编码FBXW多肽的基因连接的DNA标记。编码FBXW多肽的核酸可以用来定义分子标记。这种标记随后可以在育种程序中用来选择具有增强的种子产量的植物。编码FBXW多肽的核酸例如可以是由SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:67或SEQ ID NO:69中任一个所示的核酸。
编码FBXW多肽的核酸的等位变体也可以用于标记辅助的育种程序中。这种育种程序有时需要通过使用例如EMS诱变法对植物作诱变处理而引入等位基因变异；备选地，该程序可以从非人为引起的所谓“自然”起源的一组等位变体开始。随后进行等位变体的鉴定，例如通过PCR法。此后是用于选择所讨论及导致增加种子产量的序列的优异等位变体的步骤。一般通过监测含有所讨论序列的不同等位变体的植物的生长性能而实施选择，所述不同等位变体例如SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:67或SEQ ID NO:69中任一个的不同等位变体。可以在温室中或田间监测生长性能。其他任选步骤包括将鉴定了优异等位变体的植物与另一种植物杂交。这可以用来例如产生目标表型特征的组合。
编码FBXW多肽的核酸也可以用作探针以便对基因进行遗传作图或物理作图，所述探针作为所述基因的一部分及与这些基因关联的性状的标记。此类信息可以用于植物育种中，以便开发具有想要表型的株系。编码FBXW多肽的核酸的这种用途仅需要具有至少15个核苷酸长度的核酸序列。编码FBXW多肽的核酸可以用作限制性片段长度多态性(RFLP)标记。限制性消化的植物基因组DNA的Southern印迹(Sambrook J，Fritsch EF和Maniatis T(1989)Molecular Cloning，A Laboratory Manual)可以用编码FBXW多肽的核酸探测。产生的结合图式随后可以使用计算机程序如MapMaker(Lander等(1987)Genomics1：174-181)进行遗传分析以构建遗传图。此外，该核酸可以用来探测含有经限制性内切核酸酶处理的一组个 体的基因组DNA的Southern印迹，其中所述的一组个体代表具有确定的遗传杂交的亲代和后代。DNA多态性的分离被标出并用来计算编码FBXW多肽的核酸在使用这个群体先前所获得的遗传图中的位置(Botstein等(1980)Am.J.Hum.Genet.32：314-331)。
在Bernatzky和Tanksley(GENETICS112(4):887-898,1986)中描述了植物基因衍生的探针的产生和其在遗传作图中的用途。众多出版物描述了使用以上所提及的方法学或其改良方法对特定cDNA克隆的遗传作图。例如，F2互交群、回交群、随机交配群、邻近纯合系(NIL)和其他个体群体可以用于作图。此类方法学是本领域技术人员众所周知的。
所述核酸探针也可以用于物理作图(即序列在物理图上的排列；见Hoheisel等在：Non-mammalian Genomic Analyasis：A Practical Guide，Academic press1996，第319-346页及其中引用的参考文献)。
在另一实施方案中，核酸探针可以在直接荧光原位杂交(FISH)作图法(Trask(1991)Trends Genet.7：149-154)中使用。尽管当前的FISH作图法支持使用大型克隆(几个kb至几百个kb；见Laan等(1995)Genome Res.5：13-20)，然而灵敏度的改善可以允许使用更短探针进行FISH作图。
用于遗传作图及物理作图的多种基于核酸扩增的方法可以使用所述核酸而实施。实例包括等位基因特异的扩增法(Kazazian(1989)J.Lab.Clin.Med11：95-96)、PCR扩增片段的多态性(CAPS；Sheffield等(1993)Genomics16：325-332)、等位基因特异性连接(Landegren等(1988)Science241：1077-1080)、核苷酸延伸反应(Sokolov(1990)Nucleic Acid Res.18：3671)、放射杂交作图(Walter等(1997)Nat.Genet.7：22-28)和Happy作图法(Dear和Cook(1989)Nucleic Acid Res.17：6795-6807)。对于这些方法，使用一种核酸的序列来设计并产生在扩增反应或在引物延伸反应中使用的引物对。此类引物的设计是本领域技术人员众所周知的。在使用基于PCR遗传作图的方法中，可能必须鉴定在对应于当前核酸序列的区域内作图交叉亲代间的DNA序列差异。然而，这对于作图法而言通常不是必需的。
本发明方法产生具有增强的产量的植物，如前文所述。这些性状也可 以与经济有利的其他性状组合，如其他的产量增强性状、对其他非生物胁迫和生物性胁迫的耐受性、调节多种构造特征和/或生物化学特征和/或生理学特征的性状。
RANBP
研究了RAN-结合蛋白增强产量相关性状的用途后，本申请的发明人发现启动子的选择是重要的考虑因素。他们发现组成型启动子控制下在植物（稻）中表达RAN-结合蛋白对产量相关表型没有任何影响。然而他们惊讶的发现种子特异性启动子，尤其是胚乳特异性启动子控制下在植物中表达RAN-结合蛋白成功的增加了植物的产量。
因此，本发明提供相对于对照植物增强植物产量相关性状的方法，其包括优先在植物种子或种子部分中调节编码RANBP的核酸的表达。
用于调节(优选增加)编码RANBP的核酸在植物种子或植物部分中的表达的优选方法是在植物中引入并表达在种子特异性启动子控制下的编码RANBP的核酸。
下文中“本发明方法中所用的蛋白质”的任何引用意指文中定义的RANBP多肽。下文中“本发明方法中所用的核酸”的任何引用意指能够编码此类RANBP多肽的核酸。待引入植物(并且因而用于实施本发明方法中)的核酸是编码现在所述类型蛋白质的任意核酸，下文又称作“RANBP核酸”或“RANBP基因”。
待引入植物(并且因而用于实施本发明方法中)的合适的核酸包括编码RANBP的任意核酸，所述RANBP具有基序I:KSC V/L WHAXDF A/S DGELK D/E EXF，其中‘X’是任意氨基酸，允许在任何位置有零个或一个保守性改变，和/或允许在任何位置有零个、一个、两个或三个非保守性改变。
在RANBP来自单子叶植物的情况下，基序I的C-末端通常以‘AIRFG’结尾，而在RANBP来自双子叶植物的情况下，基序I的C-末端通常以‘CIRFA’结尾。
用于本发明方法中的RANBP-编码核酸还可以包括(除了基序I)任意一个或多个下列基序。
1.SEQ ID NO:139或145所示的基序II，或与SEQ ID NO:139或145所示的基序II具有一定序列同一性的基序，所述序列同一性按照增加的优选顺序为至少60%、70%、80%、90%或更高的百分比；
2.SEQ ID NO:140或146所示的基序III，或与SEQ ID NO:140或146所示的基序III具有一定序列同一性的基序，所述序列同一性按照增加的优选顺序为至少70%、80%、90%或更高的百分比；
3.SEQ ID NO:141或147所示的基序IV，允许在任何位置有零个或一个保守性改变，和/或允许在任何位置有零个或一个非保守性改变；
4.SEQ ID NO:142或148所示的基序V，或与SEQ ID NO:142或148所示的基序V具有一定序列同一性的基序，所述序列同一性按照增加的优选顺序为至少70%、80%、90%或更高的百分比;
5.SEQ ID NO:143或149所示的基序VI，允许在任何位置有零个或一个保守性改变，和/或允许在任何位置有零个或一个非保守性改变;
6.SEQ ID NO:144或150所示的基序VII，或与SEQ ID NO:144或150所示的基序VII具有一定序列同一性的基序，所述序列同一性按照增加的优选顺序为至少60%、70%、80%、90%或更高的百分比。
前述基序指沿进化相关蛋白质的序列比对结果而在特定位置处保守的氨基酸。尽管在其他位置处的氨基酸可以在同源物之间变动，然而在特定位置处的高度保守的氨基酸指示在蛋白质的结构、稳定性或活性方面可能是必需的氨基酸。结构域因通过在蛋白质同源物家族的比对序列中的高保守程度而被鉴定，它们可以用作鉴定物以确定任意的所讨论多肽是否属于先前已鉴定的多肽家族（在本情况下，是RNABP家族）。
上述各基序可以使用用于比对序列用于比较的方法容易地进行鉴定。在一些情况下，可以调整默认参数以调节搜索法的严格性。例如使用BLAST，可以提高用于报告针对数据库序列的匹配的统计显著性阈值(称作“期望”值)以显示严格性较低的匹配。以这种方式，可以鉴定几乎精确的 短匹配。
用于比对序列用于比较的方法是本领域众所周知的，此类方法包括GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。GAP使用Needleman和Wunsch算法((1970)J Mol Biol48:443-453)以找到使匹配数最大化并使空位数最小化的两个序列(覆盖整个序列的)的全局比对。BLAST算法(Altschul等(1990)J Mol Biol215:403-10)计算序列同一性百分数并执行对两个序列间相似性的统计分析。用于执行BLAST分析的软件是公众通过国家生物技术信息中心(NCBI)可获得的。同源物可以使用例如ClustalW多重序列比对算法(1.83版本)以默认配对比对参数和单位是百分数的评分方法而轻易地鉴定。相似性和同一性的全局百分数也可以使用在MatGAT软件包中可获得的方法之一而确定(Campanella等，BMC Bioinformatics.2003年7月10日；4:29.MatGAT：用蛋白质或DNA序列而产生相似性/同一性矩阵的应用)。可以进行细微手工编著以优化保守基序之间的比对，如本领域技术人员显而易见。此外除了使用全长序列以鉴定同源物，也可以使用特定结构域。使用上文提及的程序，使用默认参数，针对整个核酸序列、氨基酸序列、针对选择的结构域，或一个或多个保守基序测定了序列同一性值。
所有RanBP1蛋白质含有大约150个氨基酸残基的Ran结合结构域。存在用于鉴定结构域的专业数据库。RANBP中的结构域可使用如SMART(Schultz等(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.美国95，5857-5864；Letunic等(2002)Nucleic Acids Res30，242-244)、InterPro(Mulder等，(2003)Nucl.Acids.Res.31，315-318)、Prosite(Bucher和Bairoch(1994)，用于生物分子序列基序的广义图谱语法及其在自动化序列判读中的功能，(在)ISMB-94；第二届分子生物学智能系统国际会议文集.Altman R.，Brutlag D.，Karp P.，Lathrop R.，Searls D.编著，第53-61页，AAAIPress，Menlo Park；Hulo等，Nucl.Acids.Res.32：D134-D137,(2004))或Pfam(Bateman等，Nucleic Acids Research30(1)：276-280(2002))鉴定。用于计算机芯片上分析蛋白质序列的一组工具可在ExPASY蛋白质组学服 务器上获得(Swiss Institute of Bioinformatics(Gasteiger等，ExPASy：用于深入认识和分析蛋白质的蛋白组学服务器，Nucleic Acids Res.31：3784-3788(2003))。结构域或基序也可使用常规技术，例如通过序列比对鉴定。
本发明通过用SEQ ID NO:113所示的编码多肽SEQ ID NO:114或SEQ ID NO:115的来自玉蜀黍的RANBP转化的植物举例说明（参见实施例部分）。本发明也通过用SEQ ID NO:116所示的编码多肽SEQ ID NO:117或SEQ ID NO:118的来自拟南芥的RANBP转化的植物举例说明。
当然本发明的实施不限于使用前述序列，本发明方法可以使用如上文中定义的编码包含基序I的RANBP的任意核酸实施。编码包含基序I的RANBP的此类核酸的实例包括编码SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:117和SEQ ID NO:118的同源物、直向同源物和旁系同源物的核酸。此类同源物、直向同源物和旁系同源物的实例包括实施例14的表P中列出的序列。
直向同源物和旁系同源物可以通过开展所谓交互性blast搜索而容易地找到。这一般涉及第一BLAST，其中所述的第一BLAST包括查询序列(例如SEQ ID NO:113、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:117或SEQ ID NO:118)针对任一序列数据库(如公众可用的NCBI数据库)进行BLAST搜索。当从核苷酸序列开始时，一般使用BLASTN或TBLASTX(使用标准默认值)，并且当从蛋白质序列开始时，可以使用BLASTP或TBLASTN(使用标准默认值)。任选地可以筛选BLAST结果。随后将筛选结果和非筛选结果的全长序列针对来自生物的序列进行反向BLAST搜索(第二BLAST)，其中查询序列来自所述的生物(其中在查询序列是SEQ ID NO:113、SEQ ID NO:114或SEQ ID NO:115的情况下，第二BLAST将针对玉蜀黍序列；其中在查询序列是SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:117或SEQ ID NO:118的情况下，第二BLAST将针对拟南芥序列)。随后比较第一和第二次BLAST搜索的结果。若来自第一BLAST的高阶位命中源自与查询序列从其中衍生的物种相同的物种，那 么反向BLAST随后理想地产生查询序列作为最高命中，则鉴定到旁系同源物；若第一次BLAST中的高阶位命中不源自与查询序列从其中衍生的物种相同的物种，并且优选地在反向BLAST时产生属于最高命中之列的查询序列，则鉴定到直向同源物。
高阶位命中是具有低E-值的那些命中。E-值越低，评分越显著(或换句话说，此命中因偶然而发生的几率越低)。E-值的计算是本领域众所周知的。除了E-值外，比较结果还由同一性百分数记分。同一性百分数指两个所比较核酸(或多肽)序列之间在特定长度范围内的相同核苷酸(或氨基酸)数目。在大型家族的情况下，可以使用ClustalW，随后使用邻接树法以便帮助显示相关基因的聚类和以便鉴定直向同源物和旁系同源物。
核酸变体也可以用于实施本发明的方法。此类核酸变体的实例包括编码实施例14的表P中给出的任一氨基酸序列的同源物和衍生物的核酸，术语“同源物”和“衍生物”如文中所定义。也可用于本发明方法中的是编码实施例14的表P中给出的任一氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的同源物和衍生物的核酸。用于本发明方法中的同源物和衍生物与它们衍生自的未修饰的蛋白质具有基本相同的生物和功能活性。
一般的，编码包含至少基序I的RANBP的核酸与SEQ ID NO:113或116所示的核酸序列具有一定序列同一性，所述序列同一性按照增加的优选顺序为至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更高的百分比。
也可用于本发明方法中的是编码SEQ ID NO114、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:117或SEQ ID NO118所示氨基酸的衍生物的核酸，或编码SEQ ID NO114、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:117或SEQ ID NO118的直向同源物或旁系同源物的衍生物的核酸。
编码表P中序列所代表的多肽的核酸，或编码任意这些SEQ ID NO的直向同源物或旁系同源物的核酸不需要是全长核酸，因为本发明方法的实施不依赖使用全长核酸序列的使用。适用于实施本发明方法的核酸的实例包括但不限于实施例14的表P中所示的那些。核酸变体也可用于实施 本发明的方法。此类核酸变体的实例包括编码RANBP的核酸的部分、编码RANBP的核酸的剪接变体、与编码RANBP的核酸杂交的序列、编码RANBP的核酸的等位变体和通过基因改组设计的编码RANBP的核酸的变体。术语剪接变体和等位变体如上所述。
编码RANBP的核酸的部分可以例如通过对该核酸产生一个或多个缺失而制备。所述的部分可以以分离的形式加以使用或它们可以与其他编码性(或非编码性)序列融合，以便例如产生组合几种活性的蛋白质。当与其他编码序列融合时，翻译时产生的所得多肽可以比对RANBP部分所预测的多肽更大。
用于本发明方法中的部分编码这样的多肽，其包含如上文所述的基序I并且与表P中列出的序列所代表的RANBP，或前述任意SEQ ID NO的直向同源物或旁系同源物具有基本上相同的生物学活性。该部分一般具有至少200个连续核苷酸长度、优选至少300个连续核苷酸长度、更优选至少400个连续核苷酸长度。优选地，该部分是表P中列出的任一序列所代表的核酸的部分。最优选地，该部分是如SEQ ID NO:113或SEQ ID NO:116所代表的核酸的部分。
本发明提供用于增强植物中产量相关性状的方法，其包括优先在植物种子或种子部分中引入并表达表P中列出的任一序列所代表的核酸的部分。
用于本发明方法中的另一种核酸变体是能够在降低的严格性条件下、优选在严格条件下与编码如本文中所定义的RANBP的核酸杂交，或与如本文中所定义的部分杂交的核酸。
用于本发明方法中的杂交序列编码这样的多肽，其包含基序I并且与表P中列出的任意序列所代表的RANBP具有基本上相同的生物学活性，或与前述任意SEQ ID NO的直向同源物或旁系同源物具有基本上相同的生物学活性。该杂交序列一般具有至少200个连续核苷酸长度、优选至少300个连续核苷酸长度、更优选至少400个连续核苷酸长度。优选地，该杂交序列是能够与表P中列出的序列所代表的任意核酸杂交或与任意前述 序列的部分杂交的序列，其中所述的部分如上文定义。最优选地，杂交序列能够与如SEQ ID NO:113或SEQ ID NO:116所代表的核酸杂交或与其部分杂交。
本发明提供用于在植物中增强产量相关性状的方法，其包括优先在植物种子或种子部分中引入并表达能够与编码表P中列出的任意序列所代表的RANBP的核酸杂交的核酸，或包括优先在植物种子或种子部分中引入并表达能够与如此核酸的杂交的核酸，其中所述的核酸编码前述任意SEQ ID NO的直向同源物、旁系同源物或同源物。
用于本发明方法中的另一种核酸变体是编码本文上述所定义的RANBP的剪接变体。本发明提供用于在植物中增强产量相关性状的方法，其包括优先在植物种子或种子部分中引入并表达编码表P中列出的任意序列所代表的RANBP的核酸的剪接变体，或编码前述任意SEQ ID NO的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸的剪接变体。
优选的剪接变体是编码由SEQ ID NO:114、SEQ ID NO115、SEQ ID NO:117或SEQ ID NO:118任一个所示的RANBP的核酸的剪接变体。其他优选的是由表P中列出的序列的任一个所示的核酸的剪接变体。最优选的是由SEQ ID NO:113或SEQ ID NO:116所示的核酸的剪接变体。
用于实施本发明方法的另一种核酸变体是编码如上文所定义的RANBP的核酸的等位变体。等位变体天然存在，且包含在本发明方法中的是这些天然等位基因的用途。
本发明提供用于在植物中增强产量相关性状的方法，其包括优先在植物种子或种子部分中引入并表达编码表P中列出的任意序列所代表的RANBP的核酸的等位变体，或包括在植物中引入并表达编码前述任意SEQ ID NO的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸的等位变体。
等位变体可以是编码由SEQ ID NO:114、SEQ ID NO115、SEQ ID NO:117或SEQ ID NO:118任一个所示的RANBP的核酸的等位变体，或编码前述任意SEQ ID NO的直向同源物或旁系同源物的核酸的等位变体。其他优选的是由表P中列出的序列的任一个所示的核酸的等位变体。最优 选的是由SEQ ID NO:113或SEQ ID NO:116所示的核酸的等位变体。
用于本发明方法中的另一核酸变体是通过基因改组而设计和/或获得的核酸变体。基因改组或定向进化也可以用来产生编码如上文定义的RANBP的核酸的变体。
本发明提供用于在植物中增强产量相关性状的方法，其包括优先在植物种子或种子部分中引入并表达表P中列出的任意序列的变体，所述变体核酸通过基因改组而设计和/或获得。
另外，核酸变体也可以例如通过位点定向诱变获得。几种方法可用于实现位点定向诱变，最常见的是基于PCR的方法(Current Protocols in Molecular Biology.Wiley编著)。
编码RANBP的核酸可以来自任何自然来源或人工来源。核酸可以根据就组成和/或基因组环境方面通过人类有意操作而对天然形式加以修饰。根据一个优选的实施方案，编码RANBP的核酸来自植物，优选来自单子叶植物，更优选来自禾本科（Poaceae），更优选来自玉蜀黍属（Zea），最优选地来自玉蜀黍。
根据另一个优选的实施方案，编码RANBP的核酸来自植物，优选来自双子叶植物，更优选来自十字花科，该核酸更优选地来自拟南芥。
本发明也包括通过本发明的方法获得的植物或其部分。该植物或其部分包括与种子特异性启动子有效连接的编码RANBP的核酸转基因。
本发明还提供遗传构建体和载体以促进在植物中引入和/或表达用于本发明方法中的核酸序列。
因而，提供基因构建体，其包含：
（i）编码如上文所定义的包含基序I的RANBP的核酸；
（ii）与（i）的核酸有效连接的种子特异性启动子。
本发明方法中所用的构建体可以使用本领域技术人员众所周知的重组DNA技术构建。该基因构建体可以插入适于转化至植物内并适于在转化的细胞中表达目的基因的载体，其中所述载体可以通过商业途径获得。本发明因而提供如上文所定义的基因构建体在本发明方法中的用途。
植物用包含目的序列的载体(即编码RANBP的核酸)转化。技术人员非常了解为成功转化、选择和增殖含有目的序列的宿主细胞而必须于载体上存在的遗传元件。目的序列有效地与一种或多种调控序列(至少与启动子)连接。术语“调控序列”、“控制序列”和“启动子”在本文中均可以互换使用，并定义如上。
编码的RANBP的核酸与种子特异性启动子有效连接，即主要在种子组织表达的启动子，但是由于启动子渗漏表达在植物中的其他部分有残留表达。进一步优选的，种子特异性启动子分离自编码种子储存蛋白质的基因，尤其是分离自编码胚乳特异性启动子的基因。胚乳特异性启动子意指任意能够优先驱动目的基因在胚乳组织中表达的启动子。文中“优先”驱动在胚乳组织中的表达的引用意指，相对于由于启动子渗漏表达在植物中的其他部分的任意残留表达，驱动任意与其相连的序列主要在胚乳组织表达的启动子。例如，谷醇溶蛋白在胚乳中显示强表达，在分生组织有渗漏（表达），尤其在茎分生组织和/或分生组织中的辨别中心（discrimination centre）中有渗漏（表达）。胚乳特异性启动子最优选分离自谷醇溶蛋白基因，例如SEQ ID NO:155所示的稻谷醇溶蛋白RP6(Wen等,(1993)Plant Physiol101(3):1115-6)启动子，或是与稻谷醇溶蛋白启动子具有相似的强度的启动子和/或，与稻谷醇溶蛋白启动子具有相似的表达模式的启动子。也可用于实施本发明方法的其他胚乳特异性启动子的实例示于上面的表2c。
应当明白本发明的适用性不限于由SEQ ID NO:113或SEQ ID NO:116所示的编码RANBP的核酸，同时本发明的适用性也不限于由谷醇溶蛋白启动子驱动时编码RANBP的核酸的表达。也可以用来执行本发明方法的其他种子特异性启动子的实例示于上面的表2b。
任选地，一种或多种终止子序列(也是调控序列)可以在引入植物的构建体中使用。额外的调节元件可以包括转录增强子以及翻译增强子。本领域技术人员会知道可以在实施本发明中适用的终止子序列和增强子序列。其他调控序列可以是蛋白质和/或RNA稳定化元件，除启动子、增强子、 沉默子、内含子序列、3’UTR和/或5’UTR区之外。本领域技术人员会知道或可以轻易地获得此类序列。
本发明的遗传构建体还可以包括需要用于在特定细胞类型中维持和/或复制的复制起点序列。一个实例是当需要将遗传构建体在细菌细胞中维持为附加型遗传元件(例如质粒或粘粒分子)时。优选的复制起点包括，但不限于fl-ori和colE1。
为检测如在本发明方法中所用核酸序列的成功转移和/或选择包含这些核酸的转基因植物，使用标记基因(或报道基因)是有利的。因而，遗传构建体可以任选地包含选择性标记基因。该标记基因当其不再需要时，可从转基因细胞移除或切除。移除标记的技术是本领域已知的，有用的技术描述于上面的“定义”部分。
本发明也提供相对于对照植物产生具有增强的产量相关性状的转基因植物的方法，其包括优先在植物种子或种子部分中引入并优先表达编码如上文所定义的包含基序I的RANBP的核酸。
更具体地，本发明提供用于产生具有增强的产量相关性状的转基因植物的方法，所述方法包括：
(i)在植物细胞中引入并表达与种子特异性启动子有效连接的编码包含基序I的RANBP（如文中所定义）的核酸；和
(ii)在促进植物生长和发育的条件下培育植物细胞。
核酸可以直接引入植物细胞或引入植物本身(包括引入组织、器官或植物的任何其他部分)。根据本发明的优选特征，核酸优选地通过转化而引入植物。
文中所用的术语“转化”如上文所述。
遗传修饰的植物细胞可通过本领域技术人员熟悉的所有方法再生。合适的方法可见于S.D.Kung和R.Wu、Potrykus或
和Willmitzer的上述出版物。
通常在转化后，对植物细胞或细胞群体选择一种或多种标记的存在，其中所述的标记由与目的基因一起共转移的植物可表达基因编码，随后将 转化的材料再生成整株植物。为了选择转化的植物，在转化中获得的植物材料原则上接受选择条件处理，以至于转化的植物可以与未转化的植物区分。例如，以上文所述方式获得的种子可以播种，在初始培育时期后，通过喷雾进行合适的选择。另一种可能性包括在使用合适选择剂的琼脂平板上生长种子(根据需要在消毒之后)，使得仅转化的种子可以生长成植物。或者，转化的植物通过上述那些选择性标记的存在筛选。
在DNA转移和再生后，推测的转化植物可以例如使用Southern分析对目的基因的存在、拷贝数和/或基因组构造进行评价。备选或额外地，新引入DNA的表达水平可以使用Northern和/或Western分析或定量PCR进行监测，全部技术是本领域内普通技术人员众所周知的。
产生的转化植物可以通过多种方法加以增殖，如通过克隆性增殖法或经典育种技术。例如，第一代(或T1)转化植物可以进行自交以产生纯合的第二代(或T2)转化体，并且T2植物通过经典育种技术进一步增殖。
产生的转化生物可以采取多种形式。例如，它们可以是转化细胞和非转化细胞的嵌合体；克隆性转化体(例如受转化以含有表达盒的全部细胞)；转化组织和未转化组织的移植体(例如在植物中，与未转化嫩枝嫁接的转化的根状茎)。
本发明明确地扩展至通过本文中所述的任一方法产生的任何植物细胞或植物，并扩展至全部植物部分及其繁殖体。本发明进一步扩展至包含已经通过任一前述方法产生的原代转化或转染细胞、组织、器官或整株植物的后代，唯一要求是后代显示出与通过本发明方法中的亲代所产生的那些后代相同的基因型特征和/或表型特征。
本发明也包括宿主细胞，其含有分离的包含基序I的RANBP的核酸。本发明优选的宿主细胞是植物细胞。宿主植物对于本发明方法中所用核酸或载体、表达盒或构建体或载体而言原则上有利地是能够合成本发明方法中所用多肽的全部植物。
本发明也扩展至植物的可收获部分，如不限于种子、叶、果实、花、茎、根、根状茎、块茎和球茎。本发明进一步涉及来自、优选直接来自这 种植物的可收获部分中的产物，如干燥颗粒或粉末、油、脂肪及脂肪酸、淀粉或蛋白质。
根据本发明的优选特征，受调节的表达是增加的表达。增加核酸、基因或基因产物的表达的方法在现有技术中充分记载，并且实例在定义给出。
如上文提及，用于优先在植物种子或种子部分调节(优选增加)编码RANBP的核酸表达的优选方法是在植物中引入并表达编码RANBP的核酸；然而实施所述方法的作用即增强产量相关性状也可以使用众所周知的其他技术实现，所述技术包括但不限于T-DNA激活标注、TILLING、同源重组。这些技术的描述在定义给出。
本发明的作用也可以使用同源重组法再现。靶标核酸优选是在植物中控制编码RANBP的核酸的天然表达的区域。种子特异性启动子引入该区域，基本代替其部分或全部。
本发明方法的实施产生具有增强的产量性状的植物。本发明方法的实施尤其产生相对于对照植物，具有增加的产量，特别是增加的生物量和种子产量的植物。术语“产量”和“种子产量”在文中的“定义”部分详细描述。
在本文中对增强的产量相关性状的引用意指植物的一个或多个部分的生物量(重量)增加，所述的部分可以包括地上(可收获)部分和/或地下(可收获)部分。具体地，此类可收获部分是地上部分生物量和种子，并且本发明方法的实施导致植物具有增加的生物量和，相对于对照植物的种子产量的增加的种子产量。
以玉米为例，产量增加可以表现为下列一种或多种指标：每公顷或英亩植物数的增加，每株植物穗数的增加、行数的增加、每行粒数、粒重、千粒重、玉米穗长度/直径、种子饱满率的增加(其中种子饱满率是饱满种子数除以种子总数并乘以100)及其他。以稻为例，产量增加本身可以表现为下列一种或多种指标的增加：每公顷或英亩植物数、每株植物圆锥花序数、每圆锥花序小穗数、每圆锥花序花(小花)数(其表达为饱满种子数对原圆锥花序数之比)、种子饱满率的增加(其中种子饱满率是饱满种子数除以种子总数并乘以100)、千粒重的增加及其他。
本发明提供产生相对于对照植物，具有增加的产量，特别是增加的种子产量的植物的方法，所述方法包括在植物中调节编码文中定义的RANBP多肽的核酸的表达，优选增加表达。
由于本发明的转基因植物具有增加的产量，因而相对于对比植物的生长速率，这些植物有可能在其生活周期中的对应阶段上表现增加的生长速率(在其生活周期的至少部分期间)。增加的生长速率可以对于植物的一个或多个部分(包括种子)是特异性的，或可以基本上遍及整株植物。具有增加的生长速率的植物可以具备较短的生活周期。植物的生活周期可以视为意指从干燥成熟种子成长至植物已经产生与起始材料相似的干燥成熟种子的阶段所需要的时间。这个生活周期可以受下列因素影响，如早期萌发势、生长速率、绿度指数、开花时间和种子成熟速度。生长速率的增加可以在植物生活周期中的一个或多个阶段上或在整个植物生活周期期间发生。增加的生长速率在植物生活周期中的早期期间可以反映增强的萌发势。生长速率的增加可以改变植物的收获周期，允许植物较晚播种和/或较早收获，否则这将不可能(相似的作用可以用较早的开花时间获得)。若生长速率充分地增加，可以允许进一步播种相同植物物种的种子(例如播种并收获稻植物，随后播种并收获其他稻植物，全部稻植物均在一个常规生长时段内)。类似地，若生长速率足够地增加，可以允许进一步播种不同植物物种的种子(例如播种并收获玉米植物，随后例如播种并任选收获大豆、马铃薯或任何其他合适植物)。从相同的根茎中收获额外次数在一些作物植物的情况中也是可能的。改变植物的收获周期可以导致每英亩的年生物量产量的增加(因任何特定植物可以生长并收获的次数(如在一年中)增加)。生长速率的增加也可以允许比其野生型对应物在更广泛的地理区域内培育转基因植物，因为对培育作物的区域限制往往由栽种时节(早季)或在收获时期(晚季)的不利环境条件所决定。若缩短收获周期，则可以避开这类不利条件。生长速率可以通过从生长曲线中得到多种参数而确定，此类参数可以是：T-Mid(植物达到其50％最大尺寸所花费的时间)和T-90(植物达到其50％最大尺寸所花费的时间)，等等。
根据本发明的优选特征，本发明方法的实施产生相对于对照植物而具有增加的生长速率的植物。因而根据本发明，提供增加植物生长速率的方法，所述方法包括调节表达、优选增加本文中所定义的编码RANBP多肽的核酸在植物中的表达。
与对照植物相比，无论植物处于非胁迫条件下还是植物暴露于多种胁迫下，都发生产量和/或生长速率的增加。植物一般通过生长得更慢而对暴露于胁迫作出应答。在严重胁迫条件下，植物甚至可以完全停止生长。另一方面，轻微胁迫在本文中定义为植物对其暴露的任何胁迫，其中所述的胁迫未导致植物完全停止生长而没有恢复生长的能力。与非胁迫条件下的对照植物相比，轻微胁迫在本发明意义中导致受胁迫植物生长降低小于40%、35%或30%，优选小于25%、20%或15%，更优选小于14%、13%、12%、11%或10%或更低。由于农业实践(灌溉、施肥、杀虫剂处理)上的进步，在栽培作物植物中并不经常遇到严重胁迫。因此，由轻微胁迫诱导的受损生长往往是农业上不希望的特征。轻微胁迫是植物暴露的常见生物性和/或非生物性(环境)胁迫。非生物胁迫可以因干旱或水涝、厌氧胁迫、盐胁迫、化学毒性、氧化胁迫和热、寒冷或冰冻温度所致。非生物胁迫可以是由水胁迫(尤其因为干旱)、盐胁迫、氧化胁迫或离子胁迫引起的渗透胁迫。生物胁迫一般是由病原体如细菌、病毒、真菌和昆虫引起的那些胁迫。
尤其，本发明的方法可以在非胁迫条件下或在轻微干旱条件下实施以产生相对于对照植物而具有增加的产量的植物。如在Wang等(Planta(2003)218：1-14)中报道，非生物胁迫导致不利地影响植物生长及生产力的一系列形态学变化、生理学变化、生物化学变化和分子变化。已知干旱、盐度、极端温度和氧化胁迫是相互联系的并可以通过相似机制而诱导生长损害及细胞损害。Rabbani等(Plant Physiol(2003)133：1755-1767)描述了干旱胁迫与高盐度胁迫间极高程度的“串话”。例如，干旱和/或盐化作用主要表现为渗透胁迫，导致细胞内稳态和离子分布的破坏。经常伴随高温或低温、盐度或干旱胁迫的氧化胁迫可以造成功能性蛋白和结构蛋白 变性。因此，这些多样的环境胁迫常常激活相似的细胞信号途径和细胞应答，如产生胁迫蛋白质、增量调节抗氧化物质、积累相容性溶质和生长抑制。如本文中所用的术语”非胁迫”条件是允许植物最佳生长的环境条件。本领域技术人员清楚对于给定地点的正常土壤条件和气候条件。
本发明方法的实施相对于在相当条件下培育的合适对照植物，赋予在非胁迫条件下或在轻微干旱条件下培育的植物增加的产量。因而根据本发明，提供用于增加在非胁迫条件下或在轻微干旱条件下培育的植物中产量的方法，所述方法包括增加编码RANBP多肽的核酸在植物中的表达。
本发明方法的实施产生在营养缺乏条件下、尤其在氮缺乏条件下培育的相对于在相当条件下培育的合适对照植物具有增加产量的植物。因而本发明提供用于在营养缺乏条件下培育的植物中增加产量的方法，所述方法包括增加编码RANBP多肽的核酸在植物中的表达。营养缺乏可以因营养物的缺乏所致，如氮、磷酸盐及其他含磷化合物、钾、钙、镉、镁、锰、铁和硼等。
本发明方法有利地适用于任何植物。特别用于本发明方法中的植物包括属于植物界超家族的全部植物，尤其单子叶植物和双子叶植物，包括饲用或饲料豆类、观赏植物、粮食作物、树或灌木。根据本发明优选的实施方案，植物是作物植物。作物植物的实例包括大豆、向日葵、卡诺拉油菜、苜蓿、油菜、棉花、番茄、马铃薯和烟草。还优选地，植物是单子叶植物。单子叶植物的实例包括甘蔗。更优选地，植物是谷物。谷物的实例包括稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、黑小麦、高粱和燕麦。
本发明也包括编码RANBP的核酸的用途和RANBP本身的用途，用于增强植物中产量相关性状。
编码RANBP的核酸或RANBP本身可以用于育种程序中，其中鉴定到可以遗传地与编码RANBP的基因连接的DNA标记。所述的核酸/基因或RANBP本身可以用来定义分子标记。这种DNA或蛋白质标记随后可以在育种程序中用来选择具有本发明方法中如上文所定义的增加产量的植物。
编码RANBP的核酸/基因的等位变体也可以用于标记辅助的育种程序中。这种育种程序有时需要通过使用例如EMS诱变法对植物作诱变性处理而引入等位基因变异；备选地，该程序可以从非人为造成的所谓“自然”起源的一组等位变体开始。随后进行等位变体的鉴定，例如通过PCR法。此后是用于选择所讨论及导致增加产量的序列的优异等位变体的步骤。一般通过监测含有所讨论序列的不同等位变体的植物的生长性能而实施选择。可以在温室中或田间监测生长性能。其他任选步骤包括使其中优异等位变体被鉴定的植物与另一种植物杂交。这可以用来例如产生目标表型特征的组合。
编码RANBP的核酸也可以用作为探针以便对基因进行遗传作图或物理作图，它们作为所述基因的一部分的基因及用作与那些基因连锁的性状的标记。此类信息可以用于植物育种中，以便开发具有想要表型的株系。RANBP编码核酸的这种用途仅需要具有至少15个核苷酸长度的核酸序列。RANBP编码核酸可以用作限制性片段长度多态性(RFLP)标记。限制性消化的植物基因组DNA的DNA印迹(Sambrook J，Fritsch EF和Maniatis T(1989)Molecular Cloning，A Laboratory Manual)可以用RANBP编码核酸探测。产生的结合图式随后可以使用计算机程序如MapMaker(Lander等(1987)Genomics1：174-181)进行遗传分析以构建遗传图。此外，该核酸可以用来探测含有经限制性内切酶核酸处理的一组个体的基因组DNA的DNA印迹，其中所述的一组个体代表具有确定的遗传杂交的亲代和后代。DNA多态性的分离被标出并用来计算RANBP编码核酸在使用这个群体先前所获得的遗传图中的位置(Botstein等(1980)Am.J.Hum.Genet.32：314-331)。
在Bematzky和Tanksley(1986)Plant Mol.Biol.Reporter4：37-41中描述了植物基因衍生的探针的产生和其在遗传作图中的用途。众多出版物描述了使用以上所提及的方法学或其改良方法对特定cDNA克隆的遗传作图。例如，F2互交群、回交群、随机交配群、邻近纯合系和其他个体群体可以用于作图。此类方法学是本领域技术人员众所周知的。
所述核酸探针也可以用于物理作图(即序列在物理图上的排列；见Hoheisel等在：Non-mammalian Genomic Analyasis：A Practical Guide，Academic press1996，第319-346页及其中引用的参考文献)。
在另一实施方案中，核酸探针可以在直接荧光原位杂交(FISH)作图法(Trask(1991)Trends Genet.7：149-154)中使用。尽管当前的FISH作图法支持使用大型克隆(几个kb至几百个kb；见Laan等(1995)Genome Res.5：13-20)，然而灵敏度的改善可以允许使用更短探针进行FISH作图。
用于遗传作图及物理作图的多种基于核酸扩增的方法可以使用所述核酸而实施。实例包括等位基因特异的扩增法(Kazazian(1989)J.Lab.Clin.Med11：95-96)、PCR扩增片段的多态性(CAPS；Sheffield等(1993)Genomics16：325-332)、等位基因特异性连接(Landegren等(1988)Science241：1077-1080)、核苷酸延伸反应(Sokolov(1990)Nucleic Acid Res.18：3671)、放射杂交作图(Walter等(1997)Nat.Genet.7：22-28)和Happy作图法(Dear和Cook(1989)Nucleic Acid Res.17：6795-6807)。对于这些方法，使用一种核酸的序列来设计并产生在扩增反应或在引物延伸反应中使用的引物对。此类引物的设计是本领域技术人员众所周知的。在使用基于PCR遗传作图的方法中，可能必须鉴定在对应于当前核酸序列的区域内作图交叉亲代间的DNA序列差异。然而，这对于作图法而言通常不是必需的。
本发明方法产生具有增强的产量相关性状的植物，如前文所述。这些性状也可以与经济有利的其他性状组合，所述性状如如其他的产量增强性状、对其他非生物胁迫和生物性胁迫的耐受性、调节多种构造性特征和/或生物化学特征和/或生理学特征的性状。
GLK
现已发现调节编码金色2-样(GLK)蛋白质的核酸在植物中表达产生了相对于对照植物而具有增强的产量相关性状的植物。
因此，本发明提供相对于对照植物增强植物产量相关性状的方法，其包括在植物中调节编码GLK蛋白质或其部分的核酸的表达。
用于调节(优选增加)编码金色2-样蛋白质(GLK)的核酸表达的优选方法是在植物中引入并表达编码此类GLK蛋白质的核酸。
在此之后“用于本发明方法中的蛋白质”的任何引用意指如本文中所定义的GLK多肽。在此之后“用于本发明方法中的核酸”的任何引用意指能够编码此类GLK多肽的核酸。待引入植物(并且因而用于实施本发明方法)的核酸是编码现在所述类型蛋白质的任意核酸，下文又称作“GLK核酸”或“GLK基因”。
待引入植物(并且因而用于实施本发明方法中)的核酸是编码GLK蛋白质（图11）的任意核酸。术语“GLK蛋白质”或“金色2-样蛋白质”意指转录调节物蛋白质，其包括GARP DNA-结合结构域(Tamai等,Plant Cell Physiol.43,99-107,2002)。假定GARP结构域是负责核定位和DNA结合的多功能结构域(Hosoda等,Plant Cell14,2015-2021,2002).GLK蛋白质优选还包括富含酸性氨基酸的N-末端区、大约100个氨基酸的富含碱性氨基酸的中央部分，以及富含Pro残基的C-末端结构域。该C-末端区优选还包含GARP C-末端(GCT)结构域(Rossini等，2001)。
术语“结构域”和“基序”如定义部分所定义。存在用于鉴定结构域的专业数据库。金色2-样转录调节物中的GARP结构域可使用如SMART(Schultz等(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.美国95，5857-5864；Letunic等(2002)Nucleic Acids Res30，242-244)、InterPro(Mulder等，(2003)Nucl.Acids.Res.31，315-318)、Prosite(Bucher和Bairoch(1994)，用于生物分子序列基序的广义图谱语法及其在自动化序列判读中的功能，(在)ISMB-94；第二届分子生物学智能系统国际会议文集.Altman R.，Brutlag D.，Karp P.，Lathrop R.，Searls D.编著，第53-61页，AAAIPress，Menlo Park；Hulo等，Nucl.Acids.Res.32：D134-D137,(2004))或Pfam(Bateman等，Nucleic Acids Research30(1)：276-280(2002))鉴定。用于计算机芯片上分析蛋白质序列的一组工具可在ExPASY蛋白质组学服务器上获得(在Swiss Institute of Bioinformatics上驻留(Gasteiger等，ExPASy：用于深入认识和分析蛋白质的蛋白组学服务器，Nucleic Acids Res.31：3784-3788(2003))。结构域或基序也可使用常规技术，例如通过序列比对鉴定。
GARP DNA结合结构域(Tamai等，2002)优选具有三个或更多个下列共有序列：
GARP共有序列1(SEQ ID NO:161):
(K/R)(P/M/V/A)(R/K/M)(V/L)(V/D)W(S/T/I/N)(V/AP/S/T/C/H/Q/D)(E/Q/T/D/S)L(H/D)(R/K/Q/A/H/D/E/L/I)(K/R/Q/S/C/V/A/H)F(V/L/I)(A/K/Q/E/H/D/N/R/S)(A/V/C)(V/G/L/I)(N/E/A/Q/D/G/T/I/K/H)(Q/E/H/L/I/M/K/R/S)L
GARP共有序列2(SEQ ID NO:162):
G(I/V/L/P/S/H/Q/A/G)(D/E/K/H/Q/N/A)
GARP共有序列3(SEQ ID NO:163):
(A/T)(V/I/Y/F/T)P(K/S)(K/R/T/Q/L/S/G/A)(I/V/L)(L/M/R/K)(D/E/Q/K/R/S)(L/I/F/H/V/M/T/R/A)(M/I/L)(N/K/G/S/D/Q/E)
GARP共有序列4(SEQ ID NO:164):
(V/I/M/T/E/L/S/N)(E/D/G/N/Y/K/H/Q/P)(N/G/K/T/S/C/R/D)(I/L)(T/D/A/S)(R/N/I/L/V)(E/H/D/S/A/Y/F)(N/E/H)
GARP共有序列5(SEQ ID NO:165):
(V/I/L)(A/K)SHLQ(K/M/I)(Y/F)(R/V)
更优选地，GARP共有序列分别具有以下序列：
1：(K/R)(P/M/V/A)(R/K/M)(V/L)(V/D)W(S/T/I)(V/A/P)(E/Q)LH(R/K/Q)(K/R/Q)FV(A/K/Q/E/H/D)A(V/G)(N/E/A)(Q/E/H)L
2：G(I/V/L)(D/E/K)
3：A(V/I/Y/F)P(K/S)(K/R/T)I(L/M)(D/E/Q)(L/I)M(N/K/G/S)
4：(V/I/M/T/E)(E/D/G/N/Y/K/H/Q/P)(N/G/K/T/S/C/R)(I/L)(T/D)R(E/H)N
5：(V/I)ASHLQK(Y/F)R
更优选地，GARP共有序列分别具有以下序列：
1：K(P/V/A)KVDWTPELHR(K/R)FV(Q/E/H)A(V/G)E(Q/E)L
2：G(I/V/L)(D/E)
3：A(V/Y/F)PSRILE(L/I)M(N/G)
4：(V/I/M/T/E)(E/D/N/Y/K/H/Q)(S/C/R)LTRHN
5：(V/I)ASHLQKYR
更优选地，GARP共有序列分别具有以下序列：
1：K(V/A)KVDWTPELHRRFVQA(V/G)E(Q/E)L
2：G(I/V/L)D
3：AVPSRILE(L/I)MG
4：(I/M/T/E)(E/D/N/Y)(S/C/R)LTRHN
5：IASHLQKYR
最优选地，GARP共有序列分别具有以下序列：
1：KAKVDWTPELHRRFVQAVEQL
2：GID
3：AVPSRILEIMG
4：IDSLTRHN
5：IASHLQKYR
任选地，GARP共有序列5后面是另一个保守基序(共有序列6,SEQ ID NO:166)：
SHR(K/R)H(L/M)(L/A/M/I)ARE(A/G/V)EA(A/G)(S/N/T)W
优选该共有序列6具有序列：
SHRKH(L/M)(L/M/I)ARE(A/G/V)EA(A/G)(S/N)W
更优选共有序列6具有序列：
SHRKHMIAREAEAASW
MYB结构域基序可以，但不需出现在GARP结构域(图12)中。该MYB结构域对应Pfam登录号PF00249和InterPro登录号IPR001005，并含有Prosite模式PS00037(W-[ST]-{W}-{PTLN}-E-[DE]-{GIYS}-{GYPH}-[LIV].)或Prosite模式PS00334(W-x(2)-[LI]-[SAG]-x(4,5)-R-{RE}-x(3)-{AG}-x(3)-[YW]-x(3)-[LIVM].)或Prosite模式PS50090。
用于本发明中的GLK优选(但不是必须)还包含GCT结构域(Rossini等,2001)。该GCT结构域的共有序列在SEQ ID NO:167中给出:
(H/Q)(P/L)S(N/K/S)E(S/V)(I/V/L)DAAIG(D/E)(V/A)(I/L)(S/T/A/V)(N/K/R)PW(L/T)P(L/P)PLGL(K/N)PP(S/A)(V/M/L)(D/E/G)(G/S)V(M/I)(T/A/S/G)EL(Q/H/E)(R/K)(Q/H)G(V/I)(S/N/P/A)(N/E/T/K)(V/I)P(P/Q)
优选地，该GCT共有结构域具有序列：
(H/Q)PS(N/K/S)ESIDAAIGD(V/A)L(S/T/V)KPW(L/T)PLPLGLKPPS(V/L)(D/G)SV(M/I)(S/G)EL(Q/H/E)RQG(V/I)(P/A)(N/K)(V/I)P(P/Q)
更优选地，该GCT共有结构域具有序列：
QPSSESIDAAIGDVLSKPWLPLPLGLKPPSVDSVMGELQRQGVANVPP
已知GLK蛋白质在N－末端区(从N-末端到GARP结构域的起点,图11,图12)具有高于平均酸性氨基酸（D和E）含量的酸性氨基酸含量，该含量按照增加的优选顺序为高于12%、15%、20%，但低于30%。N－末端区中D和E的含量一般为大约23%，而蛋白质中D和E的平均含量为大约11.9%(表3)。相似的，始于GARP结构域末端，包含GCT结构的C－末端区富含Pro残基。然而蛋白质的平均Pro含量为4.8%，在SEQ ID NO:157的该C－末端区中Pro含量是25.4%。该区域中P的含量在10至30%之间变化。(范围:PpGLK1:11.23、PpGLK2:11.17、ZmG2:20.73、ZmGLK1:23.30、AtGLK2：17.6%、AtGLK1:20.13)
表3:SWISS PROT中蛋白质的平均蛋白质组成(2004年7月)
| 残基 | 摩尔% | 残基 | 摩尔% |
| A=Ala | 7.80 | M=Met | 2.37 |
| C=Cys | 1.57 | N=Asn | 4.22 |
| D=Asp | 5.30 | P=Pro | 4.85 |
| E=Glu | 6.59 | Q=Gln | 3.93 |
| F=Phe | 4.02 | R=Arg | 5.29 |
| G=Gly | 6.93 | S=Ser | 6.89 |
| H=His | 2.27 | T=Thr | 5.46 |
| I=Ile | 5.91 | V=Val | 6.69 |
| K=Lys | 5.93 | W=Trp | 1.16 |
| L=Leu | 9.62 | Y=Tyr | 3.09 |
文中定义的GLK蛋白质的实例包括SEQ ID NO157所示的蛋白质，但是术语“GLK蛋白质”也包括前述SEQ ID NO:157的直向同源物或旁系同源物。本发明通过用SEQ ID NO:156所示的编码多肽SEQ ID NO:157的稻序列转化的植物举例说明。SEQ ID NO:169(来自稻，由SEQ ID NO:168编码)是多肽SEQ ID NO:157的旁系同源物，而来自拟南芥的SEQ ID NO:171和173(由SEQ ID NO:170和172编码)、来自球蒴藓的SEQ ID NO:175和177(由SEQ ID NO:174和176编码)、来自玉蜀黍的SEQ ID NO:179和181(由SEQ ID NO:178和180编码)、来自普通小麦的部分序列SEQ ID NO:183，和来自两色蜀黍的部分序列SEQ ID NO:189是蛋白质SEQ ID NO:157的直向同源物的实例。SEQ ID NO:193代表蛋白质SEQ ID NO:157的变体。
直向同源物和旁系同源物可以通过开展所谓交互性blast搜索而容易地找到。这可通过第一BLAST进行，其中所述的第一BLAST包括查询序列(例如SEQ ID NO:156或SEQ ID NO:157)针对任一序列数据库(如公众可用的NCBI数据库)进行BLAST搜索。当从核苷酸序列开始时，可以使用BLASTN或TBLASTX(使用标准默认值)，并且当从蛋白质序列开始时，可以使用BLASTP或TBLASTN(使用标准默认值)。任选地可以筛选BLAST结果。随后将筛选结果和非筛选结果的全长序列针对来自生物的序列进行反向BLAST搜索(第二BLAST)，其中查询序列来自所述的生物(其中在查询序列是SEQ ID NO:156或SEQ ID NO:157的情况下，第二BLAST将因此针对稻序列)。随后比较第一和第二次BLAST搜索的结果。若来自第二BLAST的高阶位命中源自与查询序列从其中衍生的物种相同的物种，则鉴定到旁系同源物；若高阶位命中不源自与查询序列从其中衍生的物种相同的物种，则鉴定到直向同源物。优选的直向同源物是SEQ IDNO:156或SEQ ID NO:157的直向同源物。高阶位命中是具有低E-值的那些命中。E-值越低，评分越显著(或换句话说，此命中因偶然而发生的几率越低)。E-值的计算是本领域众所周知的。除了E-值外，比较结果还由同一性百分数记分。同一性百分数指两个所比较核酸(或多肽)序列之间在特定长度范围内的相同核苷酸(或氨基酸)数目。该值优选大于50，更优选大于100，并优选E-值小于e-5，更优选小于e-6。在大型家族的情况下，可以使用ClustalW，随后使用邻接树法的结果以便帮助显示相关基因的聚类和以便鉴定直向同源物和旁系同源物。
同源物（或同源蛋白质、包括直向同源物和旁系同源物）使用本领域熟知的常规技术可以容易地鉴定，例如通过序列比对鉴定。用于比对序列用于比较的方法是本领域众所周知的，此类方法包括GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。GAP使用Needleman和Wunsch算法((1970)J Mol Biol48:443-453)以找到使匹配数最大化并使空位数最小化的两个完整序列的比对。BLAST算法(Altschul等(1990)J Mol Biol215:403-10)计算序列同一性百分数并执行对两个序列间相似性的统计分析。用于执行BLAST分析的软件是公众通过国家生物技术信息中心(NCBI)可获得的。同源物可以使用例如ClustalW多重序列比对算法(1.83版本)以默认配对比对参数和评分方法（以百分数计）而轻易地鉴定。相似性和同一性的全局百分数也可以使用在MatGAT软件包中可获得的方法之一而确定(Campanella等，BMC Bioinformatics.4，29)。可以进行细微手工编著以优化保守基序之间的比对，如本领域技术人员显而易见。此外除了使用全长序列以鉴定同源物，也可以使用特定结构域(如GARP结构域或GCT结构域)。
优选地，用于本发明方法中的GLK蛋白质与蛋白质SEQ ID NO:157具有一定序列同一性，所述序列同一性按照增加的优选顺序为至少30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%。或者，同源物中的序列同一性可以使用特定结构域(如GARP结构域或GCT结构域)确定。使用上面列出的蛋白质鉴定数据库和工具，和/或比较的序列比对的方法可以鉴定和绘出GARP或GCT结构域。在一些情况下，可以调整默认参数以调节搜索的严格性。例如使用BLAST，可以提高用于报告针对数据库序列的匹配的统计显著性阈值(称作“期望”值)以显示严格性较低的匹配。这样，可以鉴定几乎精确的短匹配。
详述同源物鉴定的实例在实施例21中给出。实施例22中显示的矩阵显示GARP或GCT结构域上的相似性和同一性（黑体），其中的值自然高于考虑全长蛋白质时的值。
编码SEQ ID NO157、SEQ ID NO:193中任一个所示的多肽，或前述任意SEQ ID NO的直向同源物或旁系同源物的核酸不需要是全长核酸，因为本发明方法的实施不依赖使用全长核酸序列的使用。另外，适用于实施本发明方法的核酸的实例不限于实施例21的表Q中列出的那些。核酸变体也可以用于实施本发明的方法。此类变体的实例包括天然存在的或通过DNA操作获得的核酸的部分、杂交序列、剪接变体、等位变体。
文中所用术语“部分”意指编码多肽的DNA的一段，所述多肽包含至少上文所述的GARP结构域，并且优选从N-末端到C-末端包含(i)在GARP结构域前面有富含酸性核酸（D或E）的区域，(ii)GARP结构域的C-末端区，其富含Pro残基并优选包含GCT结构域。
部分可以例如通过对编码如上文所定义的GLK蛋白质的核酸产生一个或多个缺失而制备。所述的部分可以以分离的形式加以使用或它们可以与其他编码性(或非编码性)序列融合，以便例如产生结合几种活性的蛋白质。当与其他编码序列融合时，翻译时产生的所得多肽可以比对GLK部分所预测的多肽更大。用于本发明方法中的部分编码(如上文所述的)GARP结构域，其中所述多肽具有与任一SEQ ID NO:157、SEQ ID NO:193所示的GLK蛋白质或任一前述SEQ ID NO的直向同源物或旁系同源物基本上相同的生物学活性。所述的部分一般是至少800个核苷酸长度、优选至少900个核苷酸长度、更优选至少1000个核苷酸长度并且最优选至少1100个核苷酸长度。优选地，所述部分是如实施例21的表Q中列出的任一核酸的部分。最优选地，该部分是如SEQ ID NO:156所示的核酸的部分。
本发明提供用于增强植物中产量相关性状的方法，其包括在植物中引入并表达实施例21的表Q中给出的任一核酸序列的部分，或编码实施例21的表Q中给出的任意氨基酸序列的直向同源物、旁系同源物、同源物的核酸的部分。
用于本发明方法中的另一种核酸变体是能够在降低的严格性条件下、优选在严格条件下与编码如上文中所定义的GLK蛋白质的核酸杂交，或 与如上文中所定义的部分杂交的核酸。
用于本发明方法中的杂交序列编码这样的多肽，其包含富含酸性核酸（D或E）的N-末端区、GARP结构域和GARP结构域的C-末端区，其富含Pro残基并优选包含GCT结构域（如上所述），并与任意SEQ ID NO:157、SEQ ID NO:193所示GLK蛋白质具有基本上相同的生物学活性，或与前述任意SEQ ID NO的直向同源物或旁系同源物具有基本上相同的生物学活性。该杂交序列一般具有至少800个连续核苷酸长度、优选至少900个连续核苷酸长度、更优选至少1000个连续核苷酸长度，最优选至少1100个连续核苷酸长度。优选地，该杂交序列是能够与实施例21的表Q中列出的序列所代表的任意核酸（或衍生的探针）杂交或与任意前述序列的部分杂交的序列，其中所述的部分如上文定义。最优选地，杂交序列能够与如SEQ ID NO:156与其部分（或探针）杂交。设计探针的方法是本领域熟知的。探针长度一般小于1000bp，优选小于500bp。通常，用于诸如Southern印记的DNA-DNA杂交的探针长度在100至500bp之间变化，而用于诸如PCR扩增的DNA-DNA杂交的探针中的杂交区一般短于50个核苷酸但长于10个核苷酸。本发明提供用于在植物中增强产量相关性状的方法，其包括在植物中引入并表达能够与编码实施例21的表Q中给出的任一核酸杂交的核酸，或包括在植物中引入并表达能够与如此核酸的杂交的核酸，其中所述的核酸编码实施例21的表Q中给出的任意核酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物。
用于本发明方法中的另一种核酸变体是编码如上文所定义的GLK蛋白质的剪接变体。
优选的剪接变体是编码由SEQ ID NO:157、SEQ ID NO:193中任一个所示的GLK蛋白质的核酸的剪接变体，或是编码任一前述SEQ ID NO的直向同源物或旁系同源物的剪接变体。其他优选的剪接变体是由实施例21的表Q中列出的序列中任一个所示的核酸的剪接变体。最优选的剪接变体是由SEQ ID NO:156所示的核酸的剪接变体。
本发明提供用于在植物中增强产量相关性状的方法，其包括在植物中 引入并表达实施例21的表Q中给出的任一核酸序列的剪接变体，或编码实施例21的表Q中给出的任意氨基酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸的剪接变体。
用于实施本发明方法的另一种核酸变体是编码如上文所定义的GLK蛋白质的核酸的等位变体。等位变体天然存在，且包含在本发明方法中的是这些天然等位基因的用途。等位变体可以是编码由SEQ ID NO:157、SEQ ID NO:193任一个所示的GLK蛋白质的核酸的等位变体，或是编码任一前述SEQ ID NO的直向同源物或旁系同源物的核酸的等位变体。其他优选的等位变体的核酸是由实施例21的表Q中列出的任一个序列所示的核酸的等位变体。最优选的等位变体的核酸是由SEQ ID NO:156所示的核酸的等位变体，例如SEQ ID NO:192。
本发明提供用于在植物中增强产量相关性状的方法，其包括在植物中引入并表达实施例21的表Q中给出的任一核酸序列的等位变体，或包括在植物中引入并表达编码实施例21的表Q中给出的任意氨基酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸的等位变体。
用于本发明方法中的另一核酸变体是通过基因改组而获得的核酸变体。基因改组或定向进化也可以用来产生编码如上文定义的GLK蛋白质的核酸的变体。本发明提供用于在植物中增强产量相关性状的方法，其包括在植物中引入并表达实施例21的表Q中给出的任一核酸序列的变体，或包括在植物中引入并表达编码实施例21的表Q中给出的任意氨基酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸的变体，所述变体通过基因改组获得。
另外，核酸变体也可以例如通过位点定向诱变获得。几种方法可用于实现位点定向诱变，最常见的是基于PCR的方法(Current Protocols in Molecular Biology.Wiley编著)。优选的突变体是导致组织身份（tissue identity）从C3组织结构转变为C4植物的克兰茨解剖（结构）的那些突变体。
还用于本发明方法中的是这样的核酸，其编码由SEQ ID NO:157、 SEQ ID NO:193所示的任何一种氨基酸的同源物，或任一前述SEQ ID NO的直向同源物或旁系同源物的同源物。
还用于本发明方法中的是这样的核酸，其编码由SEQ ID NO:157、SEQ ID NO:193所示的任何一种氨基酸的衍生物，或任一前述SEQ ID NO的直向同源物或旁系同源物的衍生物。
另外，用于本发明方法中的GLK蛋白质(至少以其天然形式)一般，但不是必须具有转录调节活性。因此，具有降低的转录调节活性或不具有转录调节活性的GLK蛋白质同样可用于本发明的方法中。本领域的技术人员使用常规工具和技术可容易的确定DNA结合活性或转录活性的存在。为了确定GLK蛋白质的DNA结合活性，一些测定是可用的(例如Current Protocols in Molecular Biology,第1和2卷,Ausubel等，(1994),Current Protocols)，具体地，包含GARP结构域的转录因子的DNA结合测定由Hosoda等，(2002)描述，其包括PCR-辅助的DNA结合位点选择和DNA凝胶移位结合试验。或者可以使用Tamai等，(2002)的方法，其中在试验中使用拟南芥GPRI1来驱动lacZ报道基因的转录；Rossini等，2001还描述了酵母GAL4反式激活试验。
编码GLK蛋白质的核酸可以来自任何自然来源或人工来源。核酸可以从其天然形式就组成和/或基因组环境方面通过人类有意操作而加以修饰。GLK蛋白质编码核酸优选地来自植物，还优选来自单子叶植物，更优选来自禾本科，该核酸最优选来自稻。
本发明还提供遗传构建体和载体以促进在植物中引入和/或表达用于本发明方法中的核酸序列。
因而，提供基因构建体，其包含：
（i）编码如上文所定义的GLK蛋白质的核酸；
（ii）与(i)的核酸有效连接的一种或多种调控序列。
本发明方法中所用的构建体可以使用本领域技术人员众所周知的重组DNA技术构建。该基因构建体可以插入适于转化至植物内并适于在转化的 细胞中表达目的基因的市售载体。本发明也提供如文中所定义的基因构建体在本发明方法中的用途。优选地，该基因构建体用于在植物中驱动GLK的表达。
植物用包含目的序列的载体(即编码GLK蛋白质的核酸)转化。技术人员非常了解为成功转化、选择和增殖含有目的序列的宿主细胞而必须于载体上存在的遗传元件。目的序列有效地与一种或多种调控序列(至少与启动子)连接。
有利地，任何类型的启动子可以用来驱动核酸序列的表达。优选地，GLK编码核酸或其变体与组成型启动子有效连接。组成型启动子在生长及发育的大部分、但非全部阶段期间并且在大部分环境条件下至少在一个细胞、组织或器官中有转录活性。优选的组成型启动子是遍在表达的组成型启动子。更优选地，启动子来自植物、还优选来自单子叶植物。最优选的是使用GOS2启动子(来自稻)(SEQ ID NO:160或SEQ ID NO:58)。应当明白本发明的适用性不限于由SEQ ID NO:156或SEQ ID NO:192代表的GLK编码核酸，同时本发明的适用性也不限于由GOS2启动子驱动时编码GLK蛋白质的核酸的表达。也可以用来驱动编码GLK蛋白质的核酸表达的其他组成型启动子的实例在上面的定义部分中显示。
任选地，一种或多种终止子序列可以在引入植物的构建体中使用。其他调节元件可以包括转录增强子以及翻译增强子。本领域技术人员会知道可以在实施本发明中适用的终止子序列和增强子序列。如定义部分所述，内含子序列也可以添加至5'非翻译区(UTR)或编码序列中，以增加在胞浆内积累的成熟信息的量。其他调控序列(除启动子、增强子、沉默子、内含子序列、3’UTR和/或5’UTR区之外)可以是蛋白质和/或RNA稳定化元件。本领域技术人员会知道或可以轻易地获得此类序列。
本发明的遗传构建体还可以包括需要用于在特定细胞类型中维持和/或复制的复制序列起点。一个实例是当需要将遗传构建体在细菌细胞中维持为附加型遗传元件(例如质粒或粘粒分子)时。优选的复制起点包括，但不限于f1-ori和colE1。
为检测如在本发明方法中所用核酸序列的成功转移和/或选择包含这些核酸的转基因植物，使用标记基因(或报道基因)是有利的。因而，遗传构建体可以任选地包含选择性标记基因。选择性标记在文中的“定义”部分中详细描述。该标记基因当其不再需要时，可从转基因细胞移除或切除。移除标记的技术是本领域已知的，有用的技术描述于上面的定义部分。
本发明也提供用于产生相对于对照植物具有改变的产量相关形状的转基因植物的方法，其包括在植物中引入并表达编码如上文所定义的GLK多肽的核酸。
更具体地，本发明提供用于产生具有改变的产量相关形状的转基因植物的方法，所述方法包括：
(i)在植物细胞中引入并表达编码GLK蛋白质的核酸；和
(ii)在促进植物生长和发育的条件下培育植物细胞。
核酸可以直接引入植物细胞或引入植物本身(包括引入组织、器官或植物的任何其他部分)。根据本发明的优选特征，核酸优选地通过转化引入植物。术语“转化”在文中的定义部分中详细描述。
通常在转化后，对植物细胞或细胞群体选择一种或多种标记的存在，其中所述的标记由与目的基因一起共转移的植物可表达基因编码，随后将转化的材料再生成整株植物。为选择转化的植物，在转化中获得的植物材料原则上接受选择条件处理，以至于转化的植物可以与未转化的植物区分。例如。以上文所述方式获得的种子可以播种，在初始培育时期后，通过喷雾进行合适的选择处理。另一种可能性包括在使用合适选择剂的琼脂平板上培育种子(根据需要在消毒之后)，以至于仅转化的种子可以生长成植物。备选地，对转化的植物筛选选择性标记(如上文所述的那些选择性标记)的存在。
在DNA转移和再生后，推测的转化植物可以例如使用Southern分析对目的基因的存在、拷贝数和/或基因组构造进行评价。备选或额外地，新引入DNA的表达水平可以使用Northern和/或Western分析，或定量PCR监测，全部技术是本领域内普通技术人员众所周知的。
产生的转化植物可以通过多种方法加以增殖，如通过克隆性增殖法或经典育种技术。例如，第一代(或T1)的转化植物可以自身产生纯合的第二代(或T2)转化体，并且T2植物通过经典育种技术进一步繁殖。
产生的转化生物可以采取多种形式。例如，它们可以是转化细胞和非转化细胞的嵌合体；克隆性转化体(例如受转化以含有表达盒的全部细胞)；转化组织和未转化组织的移植体(例如在植物中，与未转化嫩枝嫁接的转化的根茎)。
本发明明确地扩展至通过本文中所述的任一方法产生的任何植物细胞或植物，并扩展至全部植物部分及其繁殖体。本发明进一步扩展至包含已经通过任一前述方法产生的原代转化或转染细胞、组织、器官或整株植物的后代，唯一要求是后代表现与通过本发明方法中的亲代所产生的那些后代相同的基因型特征和/或表型特征。
本发明也包括宿主细胞,其含有编码如上文所定义的GLK蛋白质的分离核酸。本发明优选的宿主细胞是植物细胞。宿主植物对于本发明方法中所用核酸或载体、表达盒或构建体或载体而言原则上有利地是能够合成本发明方法中所用多肽的全部植物。
本发明也扩展至植物的可收获部分如，但不限于种子、叶、果实、花、茎、根、根状茎、根、块茎和球茎。本发明进一步涉及来自自、优选直接来自这种植物的可收获部分中的产物，如干燥颗粒或粉末、油、脂肪及脂肪酸、淀粉或蛋白质。
根据本发明的优选特征，受调节的表达是增加的表达。增加核酸、基因或基因产物的表达的方法在本领域充分记载，实例在定义部分提供。
如上文提及，用于调节(优选增加)编码GLK蛋白质的核酸表达的优选方法是在植物中引入并表达编码GLK蛋白质的核酸；然而实施所述方法的作用即改变产量相关性状也可以使用众所周知的其他技术实现，所述技术包括但不限于T-DNA激活标注、TILLING、同源重组。这些技术中的一些的描述在定义给出。
本发明方法的实施产生具有增强的产量相关性状的植物。本发明方法 的实施尤其产生相对于对照植物，具有增加的产量，尤其是增加的种子产量的植物。术语“产量”和“种子产量”在文中“定义”部分更加详细的描述。
在本文中对增强的产量相关性状的引用意指植物的一个或多个部分的生物量(重量)增加，所述的部分可以包括地上(可收获)部分和/或地下(可收获)部分。具体地，此类可收获部分是地上部分生物量和/或种子，本发明方法的实施尤其产生相对于对照植物的种子产量和/或生物量，具有增加的种子产量和/或增加的地上部分生物量的植物。
以玉米为例，产量增加可以表现为下列一种或多种指标：每公顷或英亩生长的植物数的增加、每株植物穗数的增加、行数的增加、每行粒数、粒重、千粒重、玉米穗长度/直径、种子饱满率的增加(其中种子饱满率是饱满种子数除以种子总数并乘以100)及其他。以稻为例，产量增加本身可以表现为下列一种或多种指标的增加：每公顷或英亩植物数、每株植物圆锥花序数、每圆锥花序小穗数、每圆锥花序花(小花)数(其表达为饱满种子数对原圆锥花序数之比)、种子饱满率的增加(其中种子饱满率是饱满种子数除以种子总数并乘以100)、千粒重的增加及其他。
本发明提供相对于对照植物，增加植物的产量，尤其是地上部分生物量和/或种子产量的方法，所述方法包括调节编码文中定义的GLK多肽的核酸在植物中的表达，优选增加表达。
由于本发明的转基因植物具有增加的产量，因而相对于对照植物的生长速率，这些植物有可能在其生活周期中的对应阶段上表现增加的生长速率(在其生活周期的至少部分期间)。
增加的生长速率可以对于植物的一个或多个部分(包括种子)是特异性的，或可以基本上遍及整株植物。具有增加的生长速率的植物可以具备较短的生活周期。植物的生活周期可以视为意指从干燥成熟种子成长至植物已经产生与起始材料相似的干燥成熟种子的阶段所需要的时间。这个生活周期可以受下列因素影响，如早期萌发势、生长速率、绿度指数、开花时间和种子成熟速度。生长速率的增加可以在植物生活周期中的一个或多个阶段上或在基本上整个植物生活周期期间发生。在植物生活周期中的早期 期间增加的生长速率可以反映增强的萌发势。生长速率的增加可以改变植物的收获周期，允许植物较晚播种和/或较早收获，否则这将不可能(相似的作用可以用较早的开花时间获得)。若生长速率充分地增加，可以允许进一步播种相同植物物种的种子(例如播种并收获稻植物，随后播种并收获其他稻植物，全部稻植物均在一个常规生长时段内)。类似地，若生长速率足够地增加，可以允许进一步播种不同植物物种的种子(例如播种并收获玉米植物，随后例如播种并任选收获大豆、马铃薯或任何其他合适植物)。从相同的根茎中收获额外次数在一些作物植物的情况中也是可能的。改变植物的收获周期可以导致每英亩的年生物量产量的增加(因任何特定植物可以生长并收获的次数(如在一年中)增加)。生长速率的增加也可以允许比其野生型对应物在更广泛的地理区域内培育转基因植物，因为对培育作物的区域限制往往由栽种时节(早季)或在收获时期(晚季)的不利环境条件所决定。若缩短收获周期，则可以避开这类不利条件。生长速率可以通过从生长曲线中得到多种参数而确定，此类参数可以是：T-Mid(植物达到其50％最大尺寸所花费的时间)和T-90(植物达到其50％最大尺寸所花费的时间)，等等。
根据本发明的优选特征，本发明方法的实施产生相对于对照植物而具有增加的生长速率的植物。因而根据本发明，提供增加植物生长速率的方法，所述方法包括调节表达、优选增加本文中所定义的编码GLK多肽的核酸在植物中的表达。
与对照植物相比，无论植物处于非胁迫条件下还是植物暴露于多种胁迫下，都发生产量和/或生长速率的增加。植物一般通过生长得更慢而对暴露于胁迫作出应答。在严重胁迫条件下，植物甚至可以完全停止生长。另一方面，轻微胁迫在本文中定义为植物对其暴露的任何胁迫，其中所述的胁迫未导致植物完全停止生长而没有恢复生长的能力。与非胁迫条件下的对照植物相比，轻微胁迫在本发明意义中导致受胁迫植物生长降低小于40%、35%或30%，优选小于25%、20%或15%，更优选小于14%、13%、12%、11%或10%或更低。由于农业实践(灌溉、施肥、杀虫剂处理)上的 进步，在栽培作物植物中并不经常遇到严重胁迫。因此，由轻微胁迫诱导的受损生长往往是农业上不希望的特征。轻微胁迫是植物暴露的常见生物性和/或非生物性(环境)胁迫。非生物胁迫可以因干旱或水涝、厌氧胁迫、盐胁迫、化学毒性、氧化胁迫和热、寒冷或冰冻温度所致。非生物胁迫可以是由水胁迫(尤其因为干旱)、盐胁迫、氧化胁迫或离子胁迫引起的渗透胁迫。生物胁迫一般是由病原体如细菌、病毒、真菌和昆虫引起的那些胁迫。
尤其，本发明的方法可以在非胁迫条件下或在轻微干旱条件下实施以产生相对于对照植物而具有增加的产量的植物。如在Wang等(Planta(2003)218：1-14)中报道，非生物胁迫导致不利地影响植物生长及生产力的一系列形态学变化、生理学变化、生物化学变化和分子变化。已知干旱、盐度、极端温度和氧化胁迫是相互联系的并可以通过相似机制而诱导生长损害及细胞损害。Rabbani等(Plant Physiol(2003)133：1755-1767)描述了干旱胁迫与高盐度胁迫间极高程度的“串话”。例如，干旱和/或盐化作用主要表现为渗透胁迫，导致细胞内稳态和离子分布的破坏。经常伴随高温或低温、盐度或干旱胁迫的氧化胁迫可以造成功能性蛋白和结构蛋白变性。因此，这些多样的环境胁迫常常激活相似的细胞信号途径和细胞应答，如产生胁迫蛋白质、增量调节抗氧化物质、积累相容性溶质和生长抑制。如本文中所用的术语”非胁迫”条件是允许植物最佳生长的环境条件。本领域技术人员清楚对于给定地点的正常土壤条件和气候条件。
本发明方法的实施相对于在相当条件下培育的合适对照植物，赋予在非胁迫条件下或在轻微干旱条件下培育的植物增加的产量。因而根据本发明，提供用于在非胁迫条件下或在轻微干旱条件下培育的植物中增加产量的方法，所述方法包括增加编码GLK多肽的核酸在植物中表达。
本发明方法的实施产生相对于在相当条件下培育的对照植物，在营养缺乏条件下、尤其在氮缺乏条件下培育的具有增加产量的植物。因而本发明提供用于在营养缺乏条件下培育的植物中增加产量的方法，所述方法包括增加编码GLK多肽的核酸在植物中的表达。营养缺乏可以因营养物的 缺乏所致，所述营养物例如是氮、磷酸盐及其他含磷化合物、钾、钙、镉、镁、锰、铁和硼等。
本发明方法有利地适用于任何植物。特别用于本发明方法中的植物包括属于植物界超家族的全部植物，尤其单子叶植物和双子叶植物，包括选自以下的饲用或饲料豆类、观赏植物、粮食作物、树或灌木。根据本发明优选的实施方案，植物是作物植物。作物植物的实例包括大豆、向日葵、卡诺拉油菜、苜蓿、油菜、棉花、番茄、马铃薯和烟草。还优选地，植物是单子叶植物。单子叶植物的实例包括甘蔗。更优选地，植物是谷物。谷物的实例包括稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、黑小麦、高粱和燕麦。
本发明还包括通过本发明的方法获得的植物。本发明因此提供通过本发明的方法获得的植物、其植物部分或植物细胞，所述植物、其部分或细胞包含编码如上文所定义的GLK蛋白质的核酸转基因。
本发明也包括编码GLK蛋白质的核酸的用途和GLK多肽的用途，其用于改变产量相关性状。
发现编码GLK多肽的核酸，或GLK蛋白质自身可以用于育种程序中，其中鉴定到可以遗传地与GLK蛋白质编码基因连接的DNA标记。核酸和/或基因，或GLK蛋白质自身可以用来定义分子标记。这种DNA或蛋白质标记随后可以在育种程序中用来在本发明方法中选择具有增加的产量的植物，所述增加的产量如上文所定义。
GLK蛋白质编码核酸和/或基因的等位变体也可以用于标记辅助的育种程序中。这种育种程序有时需要通过使用例如EMS诱变法对植物作诱变处理而引入等位基因变异；备选地，该程序可以从非人为引起的所谓“自然”起源的一组等位变体开始。随后进行等位变体的鉴定，例如通过PCR法。此后是用于选择所讨论及导致增加产量的序列的优异等位变体的步骤。一般通过监测含有所讨论序列的不同等位变体的植物的生长性能而实施选择。可以在温室中或田间监测生长性能。其他任选步骤包括将鉴定了优异等位变体的植物与另一种植物杂交。这可以用来例如产生目标表型特征的组合。
编码GLK蛋白质的核酸也可以用作探针以便对基因进行遗传作图或物理作图，所述探针作为所述基因的一部分及与这些基因关联的性状的标记。此类信息可以用于植物育种中，以便开发具有想要表型的株系。GLK编码核酸的这种用途仅需要具有至少15个核苷酸长度的核酸序列。GLK编码核酸可以用作限制性片段长度多态性(RFLP)标记。限制性消化的植物基因组DNA的Southern印迹(Sambrook J，Fritsch EF和Maniatis T(1989)Molecular Cloning，A Laboratory Manual)可以用GLK编码核酸探测。产生的结合图式随后可以使用计算机程序如MapMaker(Lander等(1987)Genomics1：174-181)进行遗传分析以构建遗传图。此外，该核酸可以用来探测含有经限制性内切核酸酶处理的一组个体的基因组DNA的Southern印迹，其中所述的一组个体代表具有确定的遗传杂交的亲代和后代。DNA多态性的分离被标出并用来计算GLK编码核酸在使用这个群体先前所获得的遗传图中的位置(Botstein等(1980)Am.J.Hum.Genet.32：314-331)。
在Bernatzky和Tanksley(Plant Mol.Biol.Reporter4:37-41,1986))中描述了植物基因衍生的探针的产生和其在遗传作图中的用途。众多出版物描述了使用以上所提及的方法学或其改良方法对特定cDNA克隆的遗传作图。例如，F2互交群、回交群、随机交配群、邻近纯合系和其他个体群体可以用于作图。此类方法学是本领域技术人员众所周知的。
所述核酸探针也可以用于物理作图(即序列在物理图上的排列；见Hoheisel等在：Non-mammalian Genomic Analyasis：A Practical Guide，Academic press1996，第319-346页及其中引用的参考文献)。
在另一实施方案中，核酸探针可以在直接荧光原位杂交(FISH)作图法(Trask(1991)Trends Genet.7：149-154)中使用。尽管当前的FISH作图法支持使用大型克隆(几个kb至几百个kb；见Laan等(1995)Genome Res.5：13-20)，然而灵敏度的改善可以允许使用更短探针进行FISH作图。
用于遗传作图及物理作图的多种基于核酸扩增的方法可以使用所述核酸而实施。实例包括等位基因特异的扩增法(Kazazian(1989)J.Lab.Clin. Med11：95-96)、PCR扩增片段的多态性(CAPS；Sheffield等(1993)Genomics16：325-332)、等位基因特异性连接(Landegren等(1988)Science241：1077-1080)、核苷酸延伸反应(Sokolov(1990)Nucleic Acid Res.18：3671)、放射杂交作图(Walter等(1997)Nat.Genet.7：22-28)和Happy作图法(Dear和Cook(1989)Nucleic Acid Res.17：6795-6807)。对于这些方法，使用一种核酸的序列来设计并产生在扩增反应或在引物延伸反应中使用的引物对。此类引物的设计是本领域技术人员众所周知的。在使用基于PCR遗传作图的方法中，可能必须鉴定在对应于当前核酸序列的区域内作图交叉亲代间的DNA序列差异。然而，这对于作图法而言通常不是必需的。
本发明方法产生具有改变的产量相关性状的植物，如前文所述。这些性状也可以与经济有利的其他性状组合，如其他的产量增强性状、对其他非生物胁迫和生物性胁迫的耐受性、调节多种构造特征和/或生物化学特征和/或生理学特征的性状。
REV DHDZip/START
现已惊讶地发现使用REVδ同源域亮氨酸拉链结构域(HDZip)/类固醇生成急性调节(STAR)相关脂质转化结构域(START)核酸序列降低植物中内源REV基因的表达产生了相对于对照植物而具有增加的产量的植物。因此，本发明提供相对于对照植物增加植物产量的方法，其通过使用REVΔHDZip/START核酸序列降低植物中内源REV基因的表达。
有利地，本发明方法的实施产生相对于对照植物具有增强的产量相关性状的植物，具体地是增加的产量，更具体地是是增加的种子产量和/或增加的生物量。术语“产量”和“种子产量”在文中“定义”部分更加详细的描述。增加的生物量通过增加的根生物量证明其自身。增加的根生物量可由于增加的根的数量、增加的根粗（root thickness）和/或增加的根长度。
术语“增加的产量”也指植物的一个或多个部分的生物量(重量)增加，所述的部分可以包括地上(可收获)部分和/或地下(可收获)部分。此类可收 获部分包括营养生物量和/或种子，本发明方法的实施产生相对于对照植物的产量，具有增加的种子产量（营养生物量和/或种子）的植物。
因此，本发明提供增加种子产量和/或植物生物量的方法，所述方法包括使用REVΔHDZip/START核酸序列降低植物中内源REV基因的表达。
具体地，增加的种子产量选自下列一种或多种：(i)增加的种子重量；(ii)增加的饱满种子数；(iii)增加的种子饱满率；(iv)增加的收获指数；和(v)增加的各种子长度。
以玉米为例，产量增加可以表现为下列一种或多种指标：每公顷或英亩生长的植物数的增加、每株植物穗数的增加、行数的增加、每行粒数、粒重、千粒重、玉米穗长度/直径、种子饱满率的增加(其中种子饱满率是饱满种子数除以种子总数并乘以100)及其他。以稻为例，产量增加本身可以表现为下列一种或多种指标的增加：每公顷或英亩植物数、每株植物圆锥花序数、每圆锥花序小穗数、每圆锥花序花(小花)数(其表达为饱满种子数对原圆锥花序数之比)、种子饱满率的增加(其中种子饱满率是饱满种子数除以种子总数并乘以100)、千粒重的增加及其他。
本发明提供相对于对照植物增加植物的产量，尤其是种子产量的方法，所述方法调节编码如文中定义的REVΔHDZip/START多肽在植物中的表达，优选增加表达。
由于本发明的转基因植物具有增加的产量，因而相对于对照植物的生长速率，这些植物有可能在其生活周期中的对应阶段上表现增加的生长速率(在其生活周期的至少部分期间)。
增加的生长速率可以对于植物的一个或多个部分(包括种子)是特异性的，或可以基本上遍及整株植物。具有增加的生长速率的植物可以具备较短的生活周期。植物的生活周期可以视为意指从干燥成熟种子成长至植物已经产生与起始材料相似的干燥成熟种子的阶段所需要的时间。这个生活周期可以受下列因素影响，如早期萌发势、生长速率、绿度指数、开花时间和种子成熟速度。生长速率的增加可以在植物生活周期中的一个或多个 阶段上或在基本上整个植物生活周期期间发生。在植物生活周期中的早期期间增加的生长速率可以反映增强的萌发势。生长速率的增加可以改变植物的收获周期，允许植物较晚播种和/或较早收获，否则这将不可能(相似的作用可以用较早的开花时间获得)。若生长速率充分地增加，可以允许进一步播种相同植物物种的种子(例如播种并收获稻植物，随后播种并收获其他稻植物，全部稻植物均在一个常规生长时段内)。类似地，若生长速率足够地增加，可以允许进一步播种不同植物物种的种子(例如播种并收获玉米植物，随后例如播种并任选收获大豆、马铃薯或任何其他合适植物)。从相同的根茎中收获额外次数在一些作物植物的情况中也是可能的。改变植物的收获周期可以导致每英亩的年生物量产量的增加(因任何特定植物可以生长并收获的次数(如在一年中)增加)。生长速率的增加也可以允许比其野生型对应物在更广泛的地理区域内培育转基因植物，因为对培育作物的区域限制往往由栽种时节(早季)或在收获时期(晚季)的不利环境条件所决定。若缩短收获周期，则可以避开这类不利条件。生长速率可以通过从生长曲线中得到多种参数而确定，此类参数可以是：T-Mid(植物达到其50％最大尺寸所花费的时间)和T-90(植物达到其50％最大尺寸所花费的时间)，等等。
根据本发明的优选特征，本发明方法的实施产生相对于对照植物而具有增加的生长速率的植物。因而根据本发明，提供增加植物生长速率的方法，所述方法包括调节表达、优选增加本文中所定义的编码REVΔHDZip/START多肽的核酸在植物中的表达。
与对照植物相比，无论植物处于非胁迫条件下还是植物暴露于多种胁迫下，都发生产量和/或生长速率的增加。植物一般通过生长得更慢而对暴露于胁迫作出应答。在严重胁迫条件下，植物甚至可以完全停止生长。另一方面，轻微胁迫在本文中定义为植物对其暴露的任何胁迫，其中所述的胁迫未导致植物完全停止生长而没有恢复生长的能力。与非胁迫条件下的对照植物相比，轻微胁迫在本发明意义中导致受胁迫植物生长降低小于40%、35%或30%，优选小于25%、20%或15%，更优选小于14%、13%、 12%、11%或10%或更低。由于农业实践(灌溉、施肥、杀虫剂处理)上的进步，在栽培作物植物中并不经常遇到严重胁迫。因此，由轻微胁迫诱导的受损生长往往是农业上不希望的特征。轻微胁迫是植物暴露的常见生物性和/或非生物性(环境)胁迫。非生物胁迫可以因干旱或水涝、厌氧胁迫、盐胁迫、化学毒性、氧化胁迫和热、寒冷或冰冻温度所致。非生物胁迫可以是由水胁迫(尤其因为干旱)、盐胁迫、氧化胁迫或离子胁迫引起的渗透胁迫。生物胁迫一般是由病原体如细菌、病毒、真菌和昆虫引起的那些胁迫。
尤其，本发明的方法可以在非胁迫条件下或在轻微干旱条件下实施以产生相对于对照植物而具有增加的产量的植物。如在Wang等(Planta(2003)218：1-14)中报道，非生物胁迫导致不利地影响植物生长及生产力的一系列形态学变化、生理学变化、生物化学变化和分子变化。已知干旱、盐度、极端温度和氧化胁迫是相互联系的并可以通过相似机制而诱导生长损害及细胞损害。Rabbani等(Plant Physiol(2003)133：1755-1767)描述了干旱胁迫与高盐度胁迫间极高程度的“串话”。例如，干旱和/或盐化作用主要表现为渗透胁迫，导致细胞内稳态和离子分布的破坏。经常伴随高温或低温、盐度或干旱胁迫的氧化胁迫可以造成功能性蛋白和结构蛋白变性。因此，这些多样的环境胁迫常常激活相似的细胞信号途径和细胞应答，如产生胁迫蛋白质、增量调节抗氧化物质、积累相容性溶质和生长抑制。如本文中所用的术语”非胁迫”条件是允许植物最佳生长的环境条件。本领域技术人员清楚对于给定地点的正常土壤条件和气候条件。
本发明方法的实施相对于在相当条件下培育的合适对照植物，赋予在非胁迫条件下或在轻微干旱条件下培育的植物增加的产量。因而根据本发明，提供用于在非胁迫条件下或在轻微干旱条件下培育的植物中增加产量的方法，所述方法包括增加编码REVΔHDZip/START多肽的核酸在植物中表达。
本发明方法的实施产生相对于在相当条件下培育的对照植物，在营养缺乏条件下、尤其在氮缺乏条件下培育的具有增加产量的植物。因而本发 明提供用于在营养缺乏条件下培育的植物中增加产量的方法，所述方法包括增加编码REVΔHDZip/START多肽的核酸在植物中的表达。营养缺乏可以因营养物的缺乏所致，所述营养物例如是氮、磷酸盐及其他含磷化合物、钾、钙、镉、镁、锰、铁和硼等。
本文中提及的“内源”REV基因不仅仅指如在植物中以其天然形式(即没有任何人类干预)发现的REV基因，还指随后引入植物的分离的REV核酸序列。例如，根据本发明的方法，含有REV转基因的转基因植物可以遭遇转基因表达大幅降低和/或内源REV基因表达的大幅降低。
术语“表达”或“基因表达”意指因特定一种或多种特定基因，或特定基因构建体的转录。术语“表达”或“基因表达”尤其意指一种或多种基因，或基因构建体转录成结构RNA(rRNA、tRNA)或mRNA，有或没有随后mRNA翻译成蛋白质。此过程包括DNA转录和加工得到的mRNA产物。
表达的“减少”或“降低”在文中可互换使用，对于本发明的方法，意指分别相对于对照植物中发现的REV基因的表达和/或REV多肽的水平和/或REV多肽的活性，使用REVΔHDZip/START核酸序列减少但不是消除内源REV基因的表达和/或REV多肽的水平和/或REV多肽的活性。REV基因的表达和/或REV多肽的水平和/或REV多肽的活性的减少在本申请中意指相对于文中定义的对照植物，小于至少10%、20%、30%、40%或50%，优选至少60%、70或80%，更优选85%、90%或95%的REV基因的表达和/或REV多肽的水平和/或REV多肽的活性。优选地，使用REVΔHDZip/START核酸序列减少内源REV基因的表达导致一种或多种表型性状的出现。
这种内源REV基因表达的减少可通过使用一种或多种熟知的“基因沉默”方法（更多细节参见定义部分）实现。文中所用的术语基因的“沉默”意指内源REV基因表达的减少但不是消除。
用于通过RNA介导的沉默来减少植物中内源REV基因表达的一个优选方法是使用REVΔHDZip/START核酸序列的反向重复，优选是能够形成发夹结构的反向重复。该反向重复克隆进入包含控制序列的表达载体。 非编码DNA核酸序列(间隔臂，例如基质粘附区片段(MAR)、内含子、多聚接头等)位于形成反向重复的两个反向REVΔHDZip/START核酸序列之间。在反向重复转录之后，形成具有自身互补结构的嵌合RNA(部分或全部)。此双链RNA结构称为发夹RNA(hpRNA)。HpRNA被植物加工为siRNA，其被掺入到RISC中。RISC还切割编码REV多肽的mRNA转录物，由此减少待翻译为REV多肽的mRNA转录物的数目。例如参见Grierson等(1998)WO98/53083;Waterhouse等(1999)WO99/53050。
内源REV基因表达的降低也可以通过在REV基因的基因座内或基因组的其他位置引入遗传修饰。如本文中所定义的基因的基因座意指这样的基因组区域，其包括目的基因和编码区上游或下游10kb。
此遗传修饰可以例如通过下列方法中的任一个（或多个）引入：T-DNA标注、TILLING、位点定向诱变、定向进化、同源重组法。在引入遗传修饰后是对内源REV基因降低的表达进行选择的步骤，其中降低的表达产生相对于对照植物具有增加的产量的植物。
T-DNA标注涉及在目的基因的基因组区域内或基因编码区上游或下游10kb处以如此结构插入T-DNA，使得T-DNA降低（但不是消除）靶定基因的表达。
同源重组允许选择的核酸在基因组中于确定的所选择位置内引入。备选地，可以建立筛选程序以鉴定在植物群体中REV基因的天然变体，其中所述的变体编码具有降低活性的REV多肽。此类天然变体也可以用于例如进行同源重组。
T-DNA标注、TILLING、位点定向诱变法和定向进化是能够产生REV核酸序列的新等位基因和变体的技术的实例，所述变体编码具有降低的活性的REV多肽。
其他方法，如使用针对内源REV多肽的抗体以抑制此多肽在植物中的功能，或干扰所述REV多肽参与的信号途径，对于技术人员将是众所周知的。
为最佳性能，使用REVΔHDZip/START核酸序列降低内源REV基 因在植物中表达的RNA介导的沉默技术需要使用来自单子叶植物的核酸序列以转化单子叶植物，和使用来自双子叶植物的核酸序列以转化双子叶植物。优选地，将来自任何给定植物物种的REVΔHDZip/START核酸序列引入同一个物种内。例如，将来自稻的REVΔHDZip/START核酸序列转化至稻植物。REVΔHDZip/START核酸序列不需要引入相同的植物物种。
在本文中对“核酸序列”的引用意指聚合形式的任一长度的双链或单链的脱氧核糖核苷酸聚合物或核糖核苷酸聚合物，或其类似物，它们具有天然核糖核苷酸的本质特征，因为它们可以以以类似于天然存在的多核苷酸的方式与核酸杂交。
文中“REVΔHDZip/START”核酸序列的引用意指从REV核酸序列基本排除编码HDZip和START结构域的部分之外的足够长度的基本上连续的核苷酸。为了实施基因沉默，这可以小如20个或更少的核苷酸，或者可以大如REVΔHDZip/START核酸序列(包括5’和/或3’UTR，在部分或全长中)。本领域的技术人员将会意识到在实施本发明的方法中，来自REV核酸序列，编码HDZip和START结构域的足够长度的基本上连续的核苷酸基本被排除。这可以是小如10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个核苷酸。这可以大如编码HDZip和START结构域的完整核酸序列。文中核酸序列“编码HDZip和START结构域”意指包含密码子的核酸序列的区域，所述密码子翻译成HDZip和START结构域的氨基酸残基(所述结构域不是完整性和功能性需要的)。本领域的技术人员将会意识到来自REV核酸序列的基本上连续的核苷酸可通过几个核苷酸（一般不超过20个核苷酸）覆盖（overlap）HDZip和START结构域的边界。实施本发明的方法还将排除的是将同时降低至少一个其他内源基因表达的核酸序列，无论该其他内源基因编码的多肽是否包含HDZip和START结构域。编码（功能性）多肽的核酸序列对于上述讨论的实质性降低内源REV基因表达的各种方法是不需要的。
REV是本领域已知的(最近描述于Floyd等，((2006)Genetics173: 373-388)，并且可用于本发明方法中的是REVΔHDZip/START核酸序列。
其他REVΔHDZip/START核酸序列也可用于本发明的方法中，并且其可由本领域的技术人员容易地鉴定。REV多肽可通过一些已知特征（见下）中地一个或多个地存在鉴定。鉴定REV多肽后，本领域的技术人员使用常规技术可容易地得到对应的编码REVΔHDZip/START核酸序列，并使用其足够长度的连续核苷酸来实施上述一个或多个基因沉默方法。
文中定义的术语“REV多肽”意指落入Sessa等，((1994)In:Puigdomene P,Coruzzi G(ed),Springer,Berlin Heidelberg New York,第411–426页)描述的III类HDZip多肽的多肽。REV多肽从N-末端到C-末端包含：(i)用于DNA结合的同源域(HD)结构域；(ii)用于蛋白质-蛋白质相互作用的亮氨酸拉链；(iii)用于脂质/sterol结合的START结构域，和(iv)未定义功能的C-末端区(CTR)。
REV多肽使用本领域熟知的常规技术可以容易地鉴定，例如通过序列比对鉴定。用于比对序列用于比较的方法是本领域众所周知的，此类方法包括GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。GAP使用Needleman和Wunsch算法((1970)J Mol Biol48:443-453)以找到使匹配数最大化并使空位数最小化的两个完整序列的比对。BLAST算法(Altschul等(1990)JMol Biol215:403-10)计算序列同一性百分数并执行对两个序列间相似性的统计分析。用于执行BLAST分析的软件是公众通过国家生物技术信息中心可获得的。包含同源域、亮氨酸拉链、START结构域和CTR的REV多肽可以使用例如ClustalW多重序列比对算法(1.83版本)以默认配对比对参数和单位是百分数的评分方法而轻易地鉴定。可以进行细微手工编著以优化比对，如本领域技术人员显而易见。估计种系发生（或共同祖先）的系统树可使用邻接树构建算法(Neighbour-Joining tree building algorithm，在EBI)构建，以便帮助显示相关基因的聚类和以便鉴定直向同源物和旁系同源物。文中定义的REV多肽意指任意多肽，当其用于构建III类HDZip多肽系统树（例如图15和16描述的系统树）时，落入REV进化枝(包含REV、PHB和PHV)而不是CORONA进化枝(包含 ATHb8和CNA)，更具体地，其落入REV分支(而不是PHB/PHV分支)。鉴定REV多肽(落入REV分支)后，本领域技术人员使用常规技术将容易地得到对应的编码REVΔHDZip/START的核酸序列，并使用其足够长度的连续核苷酸来实施上述一个或多个基因沉默方法。
直向同源物和旁系同源物可以通过开展所谓交互性blast搜索而容易地找到。这可通过第一BLAST进行，其中所述的第一BLAST包括查询序列(例如SEQ ID NO:198或SEQ ID NO:199)针对任一序列数据库(如公众可用的NCBI数据库)进行BLAST搜索。当从核苷酸序列开始时，可以使用BLASTN或TBLASTX(使用标准默认值)，并且当从多肽序列开始时，可以使用BLASTP或TBLASTN(使用标准默认值)。任选地可以筛选BLAST结果。随后将筛选结果和非筛选结果的全长序列针对来自生物的序列进行反向BLAST搜索(第二BLAST)，其中查询序列来自所述的生物(其中在查询序列是SEQ ID NO:1198或SEQ ID NO:199的情况下，第二BLAST将因此针对稻序列)。高阶位命中是具有低E-值的那些命中。除了E-值外，比较结果还由同一性百分数记分。同一性百分数指两个所比较核酸(或多肽)序列之间在特定长度范围内的相同核苷酸(或氨基酸)数目。详述直向同源物和旁系同源物的鉴定的实例在实施例27中给出。所有REV多肽包含CTR，所述CTR与SEQ ID NO:197所示的REV多肽的CTR具有一定序列同一性，所述序列同一性按照增加的优选顺序为至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或98%。优选地，REV多肽的CTR由SEQ ID NO:197所示。更优选地，SEQ ID NO:194编码的REV多肽的CTR的部分用于实施本发明的方法。在图16中，REV多肽的直向同源物和旁系同源物聚簇在一起。
术语"结构域"和“基序”定义如上。文中定义的术语“区域”意指始于START结构域末端，终于REV多肽终止密码子的氨基酸序列。
存在用于鉴定结构域的专业数据库，REV多肽中的HD和START结构域可以使用例如SMART、InterPro、Prosite或Pfam鉴定。HD包含大约60个残基，START结构域包含大约210个残基。在InterPro数 据库中，HD数据库中命名为IPR001356、在Pfam数据库中命名为PF00046并且在PROSITE数据库中命名为PS50071。在InterPro数据库中，START结构域命名为IPR002913,在Pfam数据库中命名为PF01852且在PROSITE数据库中命名为PS50848。例如在SEQ ID NO:199中，HD Pfam entry跨越第27位至第87位氨基酸，START结构域Pfam entry跨越第163位至第376位氨基酸。因此CTR始于第377位氨基酸并终于终止密码子(在第840位)。亮氨酸拉链预测和heptad鉴定可使用诸如2ZIP的特定软件，其结合标准的卷曲螺旋预测算法和特征亮氨酸重复的大致搜索(Bornberg-Bauer等，(1998)Computational Approaches to Identify Leucine Zippers,Nucleic Acids Res.,26(11):2740-2746)其驻留在柏林的Max Planck Institute for Molecular Genetics的服务器上）进行。例如，亮氨酸拉链SEQ ID NO:199包含五个亮氨酸重复，且跨越第91位至第127位氨基酸。
另外，REV多肽也可以因能够结合DNA及与其他蛋白质相互作用而是可鉴定的。DNA结合活性及蛋白质-蛋白质相互作用可以使用本领域众所周知的技术而轻易地在体外或在体内确定。用于DNA结合活性的体外测定法的实例包括：使用HD DNA结合结构域的凝胶阻滞分析(West等，(1998)Nucl Acid Res26(23)：5277-87)，或酵母单杂交分析。用于蛋白质-蛋白质相互作用的体外测定法的实例是酵母双杂交分析(Fields和Song(1989)Nature340：245-6)。
因而一旦利用一种或几种如上所述特征而鉴定REV多肽，本领域技术人员可以容易地得到对应的REVΔHDZip/START核酸序列，并使用该核酸的足够长度的基本连续核苷酸来实施任何一种或多种上文所述的基因沉默方法(用于基本降低内源性REV基因表达)。
优选用于本发明方法中的是SEQ ID:194所示的编码稻REV多肽的部分的核酸序列，或SEQ ID:196所示的编码相同稻REV多肽的CTR的核酸序列。REVΔHDZip/START核酸序列包含编码REV多肽直向同源物或旁系同源物的核酸序列。SEQ ID NO:199的REV多肽旁系同源物的实 例由SEQ ID NO:201，稻Orysa_HOX10(由SEQ ID NO:200编码，NCBI登录号AY425991.1)所示。REV多肽直向同源物的实例由以下序列所示：SEQ ID NO:203，拟南芥Arath_REV(由SEQ ID NO:202编码，NCBI登录号AF188994)、SEQ ID NO:205玉蜀黍Zeama_HDIII RLD1(卷曲的叶1;由SEQ ID NO:204编码，NCBI登录号AY501430.1)、SEQ ID NO:207毛果杨（Populus trichocarpa）Poptr_HDIII(由SEQ ID NO:206编码，NCBI登录号AY919617)、SEQ ID NO:209蒺藜苜蓿Medtr_HDIII(由SEQ ID NO:208编码，NCBI登录号AC138171.17)、SEQ ID NO:211甘蔗Sacof_HDIII部分(由SEQ ID NO:210编码，NCBI登录号CA125167.1CA217027.1CA241276.1CA124509.1的叠连群)、SEQ ID NO:213普通小麦Triae_HDIII(部分;由SEQ ID NO:212编码，NCBI登录号CD905903BM135681.1BQ578798.1CJ565259.1的叠连群)、SEQ ID NO:215大麦Horvu_HDIII(部分,由SEQ ID NO:214编码，NCBI登录号BU996988.1BJ452342.1BJ459891.1的叠连群)，和SEQ ID NO:217黄条早竹（Phyllostachys praecox）Phypr_HDIII(部分;由SEQ ID NO:216编码，NCBI登录号DQ013803)。本申请实施例27(和表Z)中描述了鉴定可用于实施本发明方法的核酸序列的方法。
用于实施本发明方法的REVΔHDZip/START核酸序列的来源可以是任意植物来源或人工来源。为最佳性能，用于降低内源REV基因表达的基因沉默技术需要使用来自单子叶植物的REVΔHDZip/START核酸序列以转化单子叶植物，使用来自双子叶植物的REVΔHDZip/START核酸序列以转化双子叶植物。优选地，将来自禾本科植物的REVΔHDZip/START核酸序列转化入禾本科植物。还优选地，来自稻的REVΔHDZip/START核酸序列转化进入稻植物。REVΔHDZip/START核酸序列不需要引入相同的植物物种。最优选地，来自稻的REVΔHDZip/START核酸序列是SEQID NO:194或SEQ ID NO:196的足够长度的基本上连续的核苷酸，或来自如此核酸序列的REVΔHDZip/START核酸序列的足够长度的基本上连续的核苷酸，其中所述的核酸序列编码REV多肽的直向同源物或旁系同源 物。如上文提及，本领域技术人员会充分了解什么将构成旨在开展上文所定义任一基因沉默方法的基本上连续的核苷酸的足够长度，这种长度可以在一些情况下是20个或更少的基本上连续的核苷酸。
本发明还提供遗传构建体和载体以促进引入和/或表达用于本发明方法中的核苷酸序列。
因而，提供降低内源REV基因在植物中的表达的基因构建体，其包含能够一种或多种调控序列、REVΔHDZip/START核酸序列，和任选的转录终止序列。优选地，调控序列是组成型启动子。
用于降低内源REV基因在植物中的表达的优选构建体是包含REVΔHDZip/START核酸序列反向重复序列(其优选能够形成发夹结构)的构建体，其中所述的反向重复序列处在组成型启动子控制下。
本发明方法中所用的构建体可以使用本领域技术人员众所周知的重组DNA技术构建。该基因构建体可以插入适于转化至植物内并适于在转化的细胞中表达目的基因的市售载体。本发明因此也提供如上文中所定义的基因构建体的用途。
目的序列有效地与一种或多种能够增加植物中的表达的调控序列(至少与启动子)连接。有利地，任何类型的启动子可以用来驱动核酸序列的表达。
在一个实施方案中，REVΔHDZip/START核酸序列与组成型启动子有效连接。优选的组成型启动子是遍在启动子并主要在全部植物中表达。优选地，组成型启动子主要由SEQ ID NO:218或SEQ ID NO:58所示，更优选地，能够优先在全部植物中表达核酸序列的启动子是GOS2启动子，最优选的GOS2启动子来自稻(SEQ ID NO:218或SEQ ID NO:58)。应当明白本发明的适用性不限于由SEQ ID NO:194代表的REV ΔHDZip/START核酸，同时本发明的适用性也不限于由GOS2启动子驱动时REVΔHDZip/START核酸的表达。可用于本发明方法中的另一种组成型启动子是高速泳动族蛋白启动子(SEQ ID NO:293,PRO0170)。也可以用来驱动编码REVΔHDZip/START核酸序列表达的其他组成型启动子 的实例在定义部分中显示。
任选地，一种或多种终止子序列可以在引入植物的构建体中使用。
本发明的遗传构建体还可以包括需要用于在特定细胞类型中维持和/或复制的复制序列起点。一个实例是当需要将遗传构建体在细菌细胞中维持为附加型遗传元件(例如质粒或粘粒分子)时。优选的复制起点包括，但不限于f1-ori和colE1。
为检测如在本发明方法中所用核酸序列的成功转移和/或选择包含这些核酸的转基因植物，使用标记基因(或报道基因)是有利的。因而，遗传构建体可以任选地包含选择性标记基因。选择性标记在文中的“定义”部分中详细描述。该标记基因当其不再需要时，可从转基因细胞移除或切除。移除标记的技术是本领域已知的，有用的技术描述于上面的定义部分。
本发明也包含相对于对照植物具有增加的产量的植物，其含有通过本发明的方法获得的植物部分和植物细胞，所述植物部分和植物细胞使用REVΔHDZip/START核酸序列而具有降低内源REV基因的表达。
本发明也提供用于产生相对于对照植物具有增加的产量的转基因植物的方法，所述转基因植物使用REVΔHDZip/START核酸序列而具有降低内源REV基因的表达。
更具体地，本发明提供相对于对照植物产生具有增加的产量的转基因植物的方法，所述方法包括：
(i)在植物、植物部分和植物细胞中引入并表达遗传构建体，所述构建体包含一个或多个调控序列，其用于使用REVΔHDZip/START核酸序列而在植物中降低内源REV基因的表达；和
(ii)在促进植物生长和发育的条件下培育植物、植物部分和植物细胞。
优选地，引入植物中的构建体是包含REVΔHDZip/START核酸序列反向重复序列(其优选能够形成发夹结构)的构建体，其中所述的反向重复序列处在组成型启动子控制下。
核酸可以直接引入植物细胞或引入植物本身(包括引入组织、器官或植物的任何其他部分)。根据本发明的优选特征，核酸通过转化引入植物。
遗传修饰的植物细胞可通过本领域技术人员熟悉的所有方法再生。合适的方法可见于S.D.Kung和R.Wu、Potrykus或
和Willmitzer的上述出版物。
通常在转化后，对植物细胞或细胞群体选择一种或多种标记的存在，其中所述的标记由与目的基因一起共转移的植物可表达基因编码，随后将转化的材料再生成整株植物。为选择转化的植物，在转化中获得的植物材料原则上接受选择条件处理，以至于转化的植物可以与未转化的植物区分。例如。以上文所述方式获得的种子可以播种，在初始培育时期后，通过喷雾进行合适的选择处理。另一种可能性包括在使用合适选择剂的琼脂平板上培育种子(根据需要在消毒之后)，以至于仅转化的种子可以生长成植物。备选地，对转化的植物筛选选择性标记(如上文所述的那些选择性标记)的存在。
在DNA转移和再生后，推测的转化植物可以例如使用Southern分析对目的基因的存在、拷贝数和/或基因组构造进行评价。备选或额外地，新引入DNA的表达水平可以使用Northern和/或Western分析，或定量PCR监测，全部技术是本领域内普通技术人员众所周知的。
产生的转化植物可以通过多种方法加以增殖，如通过克隆性增殖法或经典育种技术。例如，第一代(或T1)的转化植物可以自身产生纯化的第二代(或T2)转化体，并且T2植物通过经典育种技术进一步繁殖。
产生的转化生物可以采取多种形式。例如，它们可以是转化细胞和非转化细胞的嵌合体；克隆性转化体(例如受转化以含有表达盒的全部细胞)；转化组织和未转化组织的移植体(例如在植物中，与未转化嫩枝嫁接的转化的根茎)。
上述生长特征有利地在任何植物中修饰。本发明方法有利地适用于任何植物。特别用于本发明方法中的植物包括属于植物界超家族的全部植物，尤其单子叶植物和双子叶植物，包括选自以下的饲用或饲料豆类、观赏植物、粮食作物、树或灌木。根据本发明优选的实施方案，植物是作物植物。作物植物的实例包括大豆、向日葵、卡诺拉油菜、苜蓿、油菜、棉花、番 茄、马铃薯和烟草。还优选地，植物是单子叶植物。单子叶植物的实例包括甘蔗。更优选地，植物是谷物。谷物的实例包括稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、黑小麦、高粱和燕麦。
其他有利的植物选自菊科(Asteraceae)如向日葵属(Helianthus)、万寿菊属例如物种向日葵[向日葵(sunflower)]、香叶万寿菊(Tagetes lucida)、万寿菊(Tagetes erecta)或细叶万寿菊(Tagetes tenuifolia)[Marigold]、十字花科(Brassicaceae)如芸苔属(Brassica)、拟南芥属(Arabadopsis)例如物种欧洲油菜、芜芜青[卡诺拉油菜、油菜、蔓青]或拟南芥；豆科(Fabaceae)如大豆属例如物种大豆、大豆(Soja hispida)或大豆(Soja max)[大豆]；亚麻科(Linaceae)如亚麻属(Linum)例如物种亚麻[亚麻(flax、linseed)]；禾本科如大麦属(Hordeum)、黑麦属(Secale)、燕麦属(Avena)、高粱属(Sorghum)、稻属(Oryza)、玉蜀黍属(Zea)、小麦属(Triticum)例如物种大麦[大麦]；黑麦[rye]、燕麦、野燕麦、比赞燕麦、Avena fatua var.sativa、杂种燕麦[oat]、两色蜀黍[高粱、粟]、稻、阔叶稻[稻]、玉蜀黍[玉米、玉米]、普通小麦、硬粒小麦、圆柱小麦、Triticum hybernum、马卡小麦、普通小麦(Triticum sativum)或普通小麦(Triticum vulgare)[小麦、面包小麦、普通小麦]；茄科(Solanaceae)如茄属(Solanum)、番茄属(Lycopersicon)例如马铃薯[马铃薯]、番茄(Lycopersicon esculentum、Lycopersicon lycopersicum、Lycopersicon pyriforme、Solanum integrifolium或Solanum lycopersicum)[西红柿(tomato)]。
本发明明确地扩展至通过本文中所述的任一方法产生的任何植物细胞或植物，并扩展至全部植物部分及其繁殖体。本发明进一步扩展至包含已经通过任意前述方法产生的原代转化或转染细胞、组织、器官或整株植物的后代，唯一要求是后代表现与通过本发明方法中的亲代所产生的那些后代相同的基因型特征和/或表型特征。
本发明也扩展至植物的可收获部分如，但不限于种子、叶、果实、花、茎、根、根状茎、块茎和球茎。本发明进一步涉及来自自、优选直接来自这种植物的可收获部分中的产物，如干燥颗粒或粉末、油、脂肪及脂肪酸、 淀粉或蛋白质。
本发明也包括REVΔHDZip/START核酸序列的用途，用于降低植物、植物部分或植物细胞中内源REV基因的表达，以增加如上文所定义的植物产量。
CLE
现已发现调节编码CLE-样多肽的核酸在植物中表达产生了相对于对照植物而具有增强的产量相关性状的植物。
因此，本发明提供相对于对照植物增强植物产量相关性状的方法，其包括在植物中调节编码CLE-样多肽的核酸或其部分的表达。
“参考”、“参考植物”、“对照”、“对照植物”、“野生型”或“野生型植物”尤其是这样的细胞、组织、器官、植物或其部分，其不是根据本发明方法产生的。因此，术语“野生型”、”对照”或“参考”是可相互交换的并且可以是未根据本文中所述的本发明方法加以修饰或处理的植物的细胞或一部分，如细胞器或组织、或植物。因此，用作野生型、对照或参考的植物的细胞或部分如细胞器或者植物尽可能地对应于细胞、植物或其部分，并且在除本发明方法的结果以外的其他任何特性上与本发明的主题尽可能相同。因此，将野生型、对照或参考相同地或尽可能相同地处理，也即仅如此条件或特性可以不同，其中所述的条件或特性不影响所测试特性的品质。换句话说，这意味野生型指这样的植物(1)其携带基因或等位基因的未改变或未调整形式，或指(2)用于得到本发明方法所产生植物的起始材料/植物。
优选地，在野生型植物与由本发明方法产生的植物之间的任何比较在相似的条件下进行。术语”相似的条件”意指全部条件，例如培养条件或生长条件、分析条件(如缓冲液组成、温度、底物、病原体株系、浓度等)在待比较的实验之间保持相同。
“参考”、“对照”或“野生型”优选是这样的对象，例如细胞器、细胞、组织、植物，其未根据本文中所述的本发明方法加以调整、修饰或处理并且在任何其他特性上尽可能与本发明的主题相似。参考、对照或野生型在 其基因组、转录物组、蛋白质组或代谢物组上尽可能与本发明的主题相似。优选地，术语“参考-”、“对照-”或“野生型-”的细胞器、细胞、组织或植物涉及这样的细胞器、细胞、组织或植物，其与本发明细胞器、细胞、组织或植物或其部分遗传上几乎相同，优选95％，更优选98%、甚至更优选99.00%、尤其99.10%、99.30%、99.50%、99.70%、99.90%、99.99%、99.999%或更高，最优选地，“参考”、“对照”或“野生型”优选地是这样的对象，例如细胞器、细胞、组织或植物，其与根据本发明方法使用的植物、细胞、细胞器在遗传上相同，除核酸分子或由所述核酸分子编码的基因产物根据本发明方法受到改变、调整或修饰之外。
术语”调节”就表达或基因表达而言意指这样的过程，其中表达水平与对照植物相比因所述基因的表达而改变，优选地，表达水平增加。原先未受调节的表达可以是结构RNA(rRNA、tRNA)或mRNA的任何类型表达，随后是翻译。术语“调节活性”应当意指本发明核酸序列或所编码蛋白质的表达的任何变化，这导致植物增加的产量和/或增加的生长。
用于调节(优选降低)编码CLE-样多肽的核酸表达的优选方法是在植物中引入并表达遗传构建体，其中克隆了作为反向重复（部分或全部）的编码此类CLE-样多肽的核酸，其通过间隔臂（非编码DNA）分隔。
在此之后“用于本发明方法中的蛋白质”的任何引用意指如本文中所定义的POI多肽。在此之后“用于本发明方法中的核酸”的任何引用意指能够编码此类POI多肽的核酸。待引入植物(并且因而用于实施本发明方法)的核酸是编码现在所述类型蛋白质的任意核酸，下文又称作“POI核酸”或“POI基因”。
CLE-样多肽编码基因是本领域已知的(参见例如Cock和McCormick(Plant Physiol.126,939-942,2001)，并且可用于本发明方法中的是编码CLE-样多肽或其部分的核酸。
文中定义的术语“CLE-样多肽”意指与SEQ ID NO:233同源的多肽。CLE-样多肽包含N-末端信号序列和保守基序(Cock和McCormick,2001:Figure21)，也称为CLE结构域(Strabala等,2006)，其位于该多肽的C- 末端或在C-末端附近。未处理的多肽长度一般在60至140个氨基酸，并具有高等电点，优选高于pI7.0，更优选高于pI8.0，最优选高于pI9.0(例如，SEQ ID NO:233所示的蛋白质具有的pI为10.46)。切除信号肽后，CLE-样多肽可在C-末端部分通过蛋白酶解进一步加工，优选在CLE结构域的N-末端部分的保守Arg残基上切割，由此产生主要包含CLE结构域的生物活性短肽(Ni和Clark,Plant Physiol.140,726-733,2006)。
术语“结构域”和“基序”如定义部分所定义。存在用于鉴定结构域的专业数据库。CLE-样多肽中的CLE结构域可使用如SMART(Schultz等(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.美国95，5857-5864；Letunic等(2002)NucleicAcids Res30，242-244)、InterPro(Mulder等，(2003)Nucl.Acids.Res.31，315-318)、Prosite(Bucher和Bairoch(1994)，用于生物分子序列基序的广义图谱语法及其在自动化序列判读中的功能，(在)ISMB-94；第二届分子生物学智能系统国际会议文集.Altman R.，Brutlag D.，Karp P.，Lathrop R.，Searls D.编著，第53-61页，AAAIPress，Menlo Park；Hulo等，Nucleic Acids.Res.32：D134-D137,(2004))或Pfam(Bateman等，Nucleic Acids Research30(1)：276-280(2002))鉴定。用于计算机芯片上分析蛋白质序列的一组工具可在ExPASY蛋白质组学服务器上获得(由Swiss Institute of Bioinformatics拥有(Gasteiger等，ExPASy：用于深入认识和分析蛋白质的蛋白组学服务器，Nucleic Acids Res.31：3784-3788(2003))。然而，CLE结构域也可使用推定的CLE-样多肽和本领域已知的CLE-样多肽(例如Cock和McCormick(2001)，或Strabala等(2006)公开的那些)的序列比对容易地鉴定。
CLE结构域优选具有以下共有序列(SEQ ID NO:237):
(S/E/R/M/P/L)(K/E/D/R/S)R(K/I/L/R/F/Q/V/M)(V/I/S/L)(P/L/R)(R/T/Q/C/N/G/K/S)(N/G)(S/P)(D/N/Y)P(I/L/Q/R/Y/H)(H/L/I)(H/N).更优选地，CLE结构域具有以下共有序列(SEQ ID NO:238):
(S/P)(R/E/K)R(M/L/I)(V/S/I)P(Q/G/C/T/S)GP(N/D)P(L/Q/H)H(H/N).
最优选地，CLE结构域具有序列:
SRRMVPQGPNPLHN.
CLE结构域包含多个高度保守的氨基酸，包括蛋白酶解处理需要的Arg残基(SEQ ID NO:233中的Arg73，参见图21和22)，和两个或三个Pro残基。
优选用于本发明方法中的是编码至少部分如SEQ ID:233所示的CLE-样多肽的核酸，或编码SEQ ID:233的同源物的至少部分的核酸。CLE-样多肽的实例包括SEQ ID NO:233，并且还包括SEQ ID:233的同源物(含直向同源物和旁系同源物)。本发明通过用SEQ ID NO:232所示的编码多肽SEQ ID NO:233的甘蔗序列转化的稻植物举例说明。来自杨树的SEQ ID NO:240、来自稻SEQ ID NO:242、来自拟南芥的SEQ ID NO:246和来自欧洲油菜的SEQ ID NO:248代表SEQ ID NO:233的直向同源物。SEQ ID NO:246和SEQ ID NO:250互为旁系同源物。
直向同源物和旁系同源物可以通过开展所谓交互性blast搜索而容易地找到。这可通过第一BLAST进行，其中所述的第一BLAST包括查询序列(例如SEQ ID NO:241或SEQ ID NO:242)针对任一序列数据库(如公众可用的NCBI数据库)进行BLAST搜索。当从核苷酸序列开始时，可以使用BLASTN或TBLASTX(使用标准默认值)，并且当从蛋白质序列开始时，可以使用BLASTP或TBLASTN(使用标准默认值)。任选地可以筛选BLAST结果。随后将筛选结果和非筛选结果的全长序列针对来自生物的序列进行反向BLAST搜索(第二BLAST)，其中查询序列来自所述的生物(其中在查询序列是241或SEQ ID NO:242的情况下，第二BLAST将因此针对稻序列)。随后比较第一和第二次BLAST搜索的结果。若来自第二BLAST的高阶位命中源自与查询序列从其中衍生的物种相同的物种，则鉴定到旁系同源物；若高阶位命中不源自与查询序列从其中衍生的物种相同的物种，则鉴定到直向同源物。优选的直向同源物是SEQ ID NO:232或SEQ ID NO:233的直向同源物。高阶位命中是具有低E-值的那些命中。E-值越低，评分越显著(或换句话说，此命中因偶然而发生的几率越低)。E-值的计算是本领域众所周知的。除了E-值外，比较结果还由同一性百分 数记分。同一性百分数指两个所比较核酸(或多肽)序列之间在特定长度范围内的相同核苷酸(或氨基酸)数目。该值优选大于50，更优选大于100，并优选E-值小于e-5，更优选小于e-6。在大型家族的情况下，可以使用ClustalW，随后使用邻接树法的结果以便帮助显示相关基因的聚类和以便鉴定直向同源物和旁系同源物。
同源物（或同源蛋白质、包括直向同源物和旁系同源物）使用本领域熟知的常规技术可以容易地鉴定，例如通过序列比对鉴定。用于比对序列用于比较的方法是本领域众所周知的，此类方法包括GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。GAP使用Needleman和Wunsch算法((1970)J Mol Biol48:443-453)以找到使匹配数最大化并使空位数最小化的两个完整序列的比对。BLAST算法(Altschul等(1990)J Mol Biol215:403-10)计算序列同一性百分数并执行对两个序列间相似性的统计分析。用于执行BLAST分析的软件是公众通过国家生物技术信息中心(NCBI)可获得的。同源物可以使用例如ClustalW多重序列比对算法(1.83版本)以默认配对比对参数和评分方法（以百分数计）而轻易地鉴定。相似性和同一性的全局百分数也可以使用在MatGAT软件包中可获得的方法之一而确定(Campanella等，BMC Bioinformatics.4，29)。可以进行细微手工编著以优化保守基序之间的比对，如本领域技术人员显而易见。此外除了使用全长序列以鉴定同源物，也可以使用特定结构域(如CLE结构域)。在下面以百分比描述的序列同一性值使用上述程序，利用默认参数，在完整核酸或氨基酸序列上确定。
优选地，用于本发明方法中的CLE-样多肽与多肽SEQ ID NO:233具有一定序列同一性，所述序列同一性按照增加的优选顺序为至少30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%。或者，同源物中的序列同一性可以使用特定结构域(如CLE结构域)确定。使用上面列出的蛋白质鉴定数据库和工具，和/或比较的序列比对的方法可以鉴定和绘出CLE结构域。在一些情况下，可以调整默认参数以调节搜索的严格性。例如使用BLAST， 可以提高用于报告针对数据库序列的匹配的统计显著性阈值(称作“期望”值)以显示严格性较低的匹配。这样，可以鉴定几乎精确的短匹配。
文中所用的术语CLE-样核酸意指编码如上所定义的CLE-样多肽的任意核酸，或其互补物。CLE-样核酸不需要是全长核酸，因为本发明方法的实施不依赖使用全长核酸序列的使用。另外，适用于实施本发明方法的核酸的实例包括但不限于SEQ ID NO:232、SEQ ID NO:239、SEQ ID NO:241、SEQ ID NO:243、SEQ ID NO:245或SEQ ID NO:247中任一个所代表的那些。核酸变体也可以在实施本发明的方法中使用。此类变体的实例包括天然存在的或通过DNA操作获得的核酸的部分、杂交序列、剪接变体、等位变体。
对“CLE-样”核酸序列引用意指来自CLE-样核酸序列的足够长度的基本连续核苷酸。为了实施基因沉默，这可以小如20、19、18、17、16、15、14、13、12,11、10个或更少的核苷酸，或者可以大如CLE-样核酸序列(包括5’和/或3’UTR，在部分或全长中)。编码（功能性）多肽的核酸序列对于上述讨论的实质性降低内源CLE-样基因表达的各种方法是不需要的。
文中所用术语CLE-样核酸的“部分”意指编码至少部分CLE-样多肽的DNA的一段，或其互补物；但也可以是CLE多肽编码cDNA的5’或3’非翻译区(UTR)的部分，或其互补物；或可以是完整5’或3’UTR，或其互补物。文中所用术语cDNA意指不但包括编码序列，还包括对应mRNA的5’和3’UTR的非编码序列。
术语“片段”、“序列的片段”或“序列的部分”、“部分”或“其部分”意指所提及的原始序列的截短序列。截短序列(核酸序列或蛋白质序列)可以在长度上大幅地变化；最小尺寸是具有足够尺寸的序列以对序列提供所提及的原始序列的至少相当功能和/或活性或与本发明的或本发明方法中所用的核酸分子在严格条件下杂交，而最大尺寸并非关键的。在一些应用中，最大尺寸通常基本上不大于对原始序列提供想要的活性和/或功能而需要的尺寸。相当的功能意指原始序列至少40%、45%或50%、优选至少60%、 70%、80%或90%或更高的功能。
部分可以例如通过对编码如上文所定义的CLE-样多肽的核酸产生一个或多个缺失而制备。所述的部分可以以分离的形式加以使用或它们可以与其他编码性(或非编码性)序列融合。所述的部分一般是至少100个核苷酸长度、优选至少200、250个核苷酸长度、更优选至少300、350个核苷酸长度并且最优选至少400或450个核苷酸长度。优选地，所述部分是如SEQ ID NO:232、SEQ ID NO:239、SEQ ID NO:241、SEQ ID NO:243、SEQ ID NO:245或SEQ ID NO:247中任一个所示核酸的部分。最优选地，该部分是如SEQ ID NO:232所示的核酸的部分。用于本发明方法中的CLE-样核酸的优选部分是与内源目的CLE-样基因的转录序列或其互补物具有高同源性，而与内源非目的CLE-样基因的转录序列（或其互补序列）具有低同源性或没有同源性的部分。
用于本发明方法中的另一种核酸变体是能够在降低的严格性条件下、优选在严格条件下与编码如上文中所定义的CLE-样多肽的核酸杂交，或与如上文中所定义的部分杂交的核酸。
用于本发明方法中的杂交序列编码至少部分如上文所定义的CLE-样多肽，或能够与编码CLE-样多肽的mRNA或cDNA的5’或3’UTR杂交。所述杂交序列一般是至少100个核苷酸长度、优选至少200个核苷酸长度、更优选至少300个核苷酸长度并且最优选至少400个核苷酸长度。优选地，所述杂交序列是能够与由SEQ ID NO:232、SEQ ID NO:239、SEQ ID NO:241、SEQ ID NO:243、SEQ ID NO:245或SEQ ID NO:247所示的任一核酸（或衍生的探针）杂交或与任一前述序列的部分杂交的序列，其中所述的部分如上文定义。最优选地，所述杂交序列能够与SEQ ID NO:232或与其部分（或探针）杂交。设计探针的方法是本领域熟知的。探针长度一般小于500、400、300、200bp，优选小于100bp。通常，用于诸如Southern印记的DNA-DNA杂交的探针长度在100至500bp之间变化，而用于诸如PCR扩增的DNA-DNA杂交的探针中的杂交区一般短于50个核苷酸但长于10个核苷酸，它们优选长为15、20、25、30、35、40、 45或50bp。
用于本发明方法中的另一种核酸变体是编码如上文所定义的CLE-样多肽的剪接变体。优选的剪接变体是编码由SEQ ID NO:223所示的CLE-样多肽的核酸的剪接变体，或是编码SEQ ID NO:223的直向同源物或旁系同源物的剪接变体。其他优选的剪接变体是由SEQ ID NO:232、SEQ ID NO:239、SEQ ID NO:241、SEQ ID NO:243、SEQ ID NO:245或SEQ ID NO:247中任一个所示的核酸的剪接变体。最优选的剪接变体是由SEQ ID NO:232所示的核酸剪接变体。
用于实施本发明方法的另一种核酸变体是编码如上文所定义的CLE-样蛋白质的核酸的等位变体。等位变体天然存在，且包含在本发明方法中的是这些天然等位基因的用途。等位变体可以是编码由SEQ ID NO:223所示的CLE-样多肽的核酸的等位变体，或是编码任一前述SEQ ID NO的直向同源物或旁系同源物的核酸的等位变体。其他优选的等位变体是由SEQ ID NO:232、SEQ ID NO:239、SEQ ID NO:241、SEQ ID NO:243、SEQ ID NO:245或SEQ ID NO:247中任一个所示的核酸的的等位变体。最优选的等位变体是核酸由SEQ ID NO:232所示的核酸的等位变体。
本发明提供用于在植物中增强产量相关性状的方法，其包括在植物中引入并表达实施例33的表HH中给出的任一核酸序列的部分、杂交序列、剪接变体或等位变体，或包括在植物中引入并表达编码实施例33的表HH中给出的任意氨基酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸的部分、杂交序列、剪接变体或等位变体。
用于本发明方法中的另一核酸变体是通过基因改组而获得的核酸变体。基因改组或定向进化也可以用来产生编码如上文定义的CLE-样多肽的核酸的变体。另外，核酸变体也可以通过位点定向诱变获得。几种方法可用于实现位点定向诱变，最常见的是基于PCR的方法(Current Protocols in Molecular Biology.Wiley编著)。
还用于本发明方法中的是这样的核酸，其编码由SEQ ID NO:223所 示的任何一种氨基酸的同源物，或其直向同源物或旁系同源物的同源物；以及这样的核酸，其编码由SEQ ID NO:223所示的多肽的衍生物，或其直向同源物或旁系同源物的衍生物。
另外，用于本发明方法中的CLE-样核酸(至少以其天然形式)一般，但不是必须编码具有信号活性（signalling activity）的多肽。
优选地，当CLE-样核酸编码的多肽在植物中超量表达时导致wus-样表型。更优选地，当CLE-样多肽在拟南芥中超量表达时导致如Strabala等(2006)所定义的Aii表型。更优选地，当CLE-样核酸作为反向重复在SEQ ID NO:236所示的启动子控制下在稻中表达时导致增加的种子产量，例如增加的种子总重量。
编码CLE-样多肽的核酸可以来自任何自然来源或人工来源。核酸可以从其天然形式就组成和/或基因组环境方面通过人类有意操作而加以修饰。CLE-样多肽编码核酸优选地来自植物，还优选来自单子叶植物，更优选来自禾本科，该核酸最优选来自甘蔗。
本发明还提供遗传构建体和载体以促进在植物中引入和/或表达用于本发明方法中的核酸序列。
因而，提供基因构建体，其包含：
（i）如上文所定义的CLE-样核酸或其部分；
（ii）与(i)的核酸有效连接的一种或多种调控序列。
优选的构建体是包含CLE-样核酸反向重复（优选能够形成发夹结构）的构建体，所述反向重复在种子特异性启动子的控制下。
本发明方法中所用的构建体可以使用本领域技术人员众所周知的重组DNA技术构建。该基因构建体可以插入适于转化至植物内并适于在转化的细胞中转录目的基因的市售载体。本发明也提供如文中所定义的基因构建体在本发明方法中的用途。
植物用包含目的序列的载体转化。技术人员非常了解为成功转化、选择和增殖含有目的序列的宿主细胞而必须于载体上存在的遗传元件。目的序列有效地与一种或多种调控序列(至少与启动子)连接。
有利地，任何类型的启动子可用于本发明的方法中。优选的启动子尤其是在组织及器官中、在种子细胞如胚乳细胞及发育胚的细胞中引起基因表达的那些启动子。合适的启动子是油菜的油菜籽蛋白基因启动子(US5,608,152)、蚕豆(Vicia faba)USP启动子(Baeumlein等，Mol Gen Genet，1991，225(3)：459-67)、拟南芥油质蛋白启动子(WO98/45461)、菜豆(Phaseolus vulgaris)菜豆蛋白启动子(US5,504,200)、芸苔属植物(Brassica)Bce4启动子(WO91/13980)、豆类arc5启动子、胡萝卜DcG3启动子或豆科植物(Legumin)B4启动子(LeB4；Baeumlein等，1992，Plant Journal，2(2)：233-9)和导致在单子叶植物如玉米、大麦、小麦、黑麦、稻等内的种子特异性表达的启动子。有利的种子特异性启动子是蔗糖结合蛋白启动子(WO00/26388)、菜豆蛋白启动子和油菜籽蛋白启动子。必须加以考虑的合适启动子是大麦lpt2或lpt1基因启动子(WO95/15389和WO95/23230)和在WO99/16890中描述的启动子(来自大麦的大麦醇溶蛋白基因、稻的谷蛋白基因、稻的水稻素基因、稻的谷醇溶蛋白基因、小麦的麦醇溶蛋白基因、小麦的谷蛋白基因、玉米的玉米醇溶蛋白基因、燕麦的谷蛋白基因、高粱kasirin基因和黑麦的裸麦醇溶蛋白基因的启动子)。其他合适的启动子是Amy32b、Amy6-6和Aleurain[US5,677,474]、Bce4(油菜)[US5,530,149]、大豆球蛋白(大豆)[EP571741]、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(大豆)[JP06/62870]、ADR12-2(大豆)[WO98/08962]、异柠檬酸裂合酶(油菜)[US 5,689,040]或α-淀粉酶(大麦)[EP 781 849]。可用于在植物中表达基因的其他启动子是叶特异性启动子，如在DE-A 19644478中描述的那些启动子或光调节启动子如，例如豌豆petE启动子。
优选地，CLE-样核酸或其变体有效连接于种子特异性启动子。种子特异性启动子主要在种子组织中转录激活，但不必仅在种子组织中激活（渗漏表达的情况下）。种子特异性启动可以在种子发育和/或萌发期间激活。种子特异性启动在本领域众所周知。优选地，种子特异性启动是胚乳特异性启动子。更优选地，该启动子是稻谷醇溶蛋白RP6或功能等同的启动子。最优选地，该启动子序列由SEQ ID NO:236所示。应当清楚，本发明的实 用性不局限于SEQ ID NO:232所示的CLE-样核酸，本发明的实用性也不局限于受种子特异性启动子驱动的CLE-样核酸的转录。其他种子特异性启动子（包括胚乳特异性启动子）如上文所列出的。
任选地，一种或多种终止子序列可以在引入植物的构建体中使用。内含子序列也可以添加至5'非翻译区(UTR)或编码序列中，以增加在胞浆内积累的成熟信息的量。其他调控序列(除启动子、增强子、沉默子、内含子序列、3’UTR和/或5’UTR区之外)可以是蛋白质和/或RNA稳定化元件。本领域技术人员会知道或可以轻易地获得此类序列。
本发明的遗传构建体还可以包括需要用于在特定细胞类型中维持和/或复制的复制序列起点。一个实例是当需要将遗传构建体在细菌细胞中维持为附加型遗传元件(例如质粒或粘粒分子)时。优选的复制起点包括，但不限于f1-ori和colE1。
为检测和/或选择如在序列方案中描述及在本发明方法中使用的核酸序列的成功转移，使用标记基因(＝报道基因)是有利的。因此遗传构建体可任选包括可选择性标记基因。这些标记基因能够通过一系列不同原理而鉴定核酸分子的成功转移，例如借助荧光、发光或在人眼睛可觉察的光的波长范围内通过目测鉴定、通过除草剂抗性或抗生素耐药性、通过所谓营养标记(营养缺陷标记)或抗营养性标记、通过酶分析法或通过植物激素。可以提及的此类标记的实例是GFP(=绿色荧光蛋白)；萤光素/萤光素酶系统、β-半乳糖苷酶与其有色底物例如X-Gal、对例如咪唑啉酮、草甘膦、膦丝菌素或磺脲类的除草剂抗性、对例如博来霉素、潮霉素、链霉素、卡那霉素、四环素、氯霉素、氨苄青霉素、庆大霉素、遗传霉素(G418)、壮观霉素或杀稻瘟素等的抗生素耐药性、营养标记如对甘露糖或木糖的利用或抗营养性标记，如对2-脱氧葡萄糖的抗性。植物中优选的可选择性标记包括那些赋予除草剂如草甘膦或草丁膦抗性的标记。其他合适的标记为例如编码参与例如糖或氨基酸生物合成通路基因的标记，如β-半乳糖苷酶、ura3或ilv2。编码基因如荧光素酶、gfp或其他荧光基因的标记同样适用。这些标记和前述标记可在突变体中使用，所述突变体中原有的这些基因没 有功能，例如由于常规方法而缺失。这个名单仅代表少数的可能标记。技术人员非常熟悉此类标记。取决于生物和选择方法，优选不同的标记。
在本发明优选的实施方案中，CLE-样蛋白质调节的表达是CLE-样蛋白质降低的表达，优选是内源CLE-样蛋白质降低的表达。
本文中提及的“内源”CLE-样基因不仅仅指如在植物中以其天然形式(即没有任何人类干预)发现的CLE-样基因，还指随后引入植物的分离的CLE-样核酸序列。例如，根据本发明的方法，含有CLE-样转基因的转基因植物可以遭遇转基因表达大幅降低和/或内源CLE-样基因表达的大幅降低。
用于降低内源CLE-样蛋白质表达的优选方法是使用表达载体，其中编码CLE-样多肽的CLE-样核酸序列作为由间隔区(非编码性DNA)隔开的(部分或完全的)反向重复序列加以克隆。
表达的“减少”或“降低”或“减量调节”在文中可互换使用，并定义如上。优选地，降低的表达不是表达的完全消除。优选地，使用CLE-样核酸序列减少内源CLE-样基因的表达导致一种或多种表型性状的出现。
这种内源CLE-样基因表达的减少可通过使用一种或多种熟知的如上所述的“基因沉默”方法实现。
用于通过RNA介导的沉默来减少植物中内源CLE-样基因表达的优选方法是使用CLE-样核酸或其部分的反向重复，优选是能够形成发夹结构的反向重复。该反向重复克隆进入包含控制序列的表达载体。非编码DNA核酸序列(间隔臂，例如基质粘附区片段(MAR)、内含子、多聚接头等)位于形成反向重复的两个反向CLE-样核酸之间。在反向重复转录之后，形成具有自身互补结构的嵌合RNA(部分或全部)。此双链RNA结构称为发夹RNA(hpRNA)。HpRNA被植物加工为siRNA，其被掺入到RISC中。RISC还切割编码CLE-样多肽的mRNA转录物，由此基本减少待翻译为CLE-样多肽的mRNA转录物的数目。例如参见Grierson等(1998)WO98/53083;Waterhouse等(1999)WO99/53050。
优选地，将来自任何给定植物物种的CLE-样核酸序列引入同一个物 种内。例如，将来自稻的CLE-样核酸序列转化至稻植物。然而，并非绝对要求待引入的CLE-样核酸序列起源于与该核酸序列将要引入的植物相同的植物物种，如实施例部分所示，其中甘蔗序列被引入稻中以获得期望的效果。只要内源CLE-样靶基因与待引入的CLE-样核酸之间存在相当大的同源性就足够了。
内源CLE-样基因表达的降低也可以通过在CLE-样基因的基因座内或基因组的其他位置引入遗传修饰。如本文中所定义的基因的基因座意指这样的基因组区域，其包括目的基因和编码区上游或下游10kb。
此遗传修饰可以例如通过下列方法中的任一个（或多个）引入：T-DNA标注、TILLING、位点定向诱变、定向进化、同源重组法。在引入遗传修饰后是对内源CLE-样基因降低的表达进行选择的步骤，其中降低的表达产生相对于对照植物具有增加的产量的植物。
位点定向诱变和随机诱变可用于产生CLE-样核酸序列的变体，所述变体编码具有降低的活性的CLE-样多肽。几种方法可用于实现位点定向诱变，最常见的是基于PCR的方法(Current Protocols in Molecular Biology.Wiley编著)。
定向进化也可用于产生CLE-样核酸序列的变体，所述变体编码具有降低的活性的CLE-样多肽。
T-DNA标注、TILLING、位点定向诱变和定向进化是能够产生CLE-样核酸序列的新等位基因和变体的技术的实例，所述变体编码具有降低的活性的CLE-样多肽。
同源重组法允许在所选核酸基因组的明确选择的位置引入。待靶定的核酸可以是编码具有降低的活性的CLE-样多肽的等位基因，以用于取代内源基因，且需要靶定CLE-样基因的基因座。
备选地，可以建立筛选程序以鉴定在植物群体中CLE-样基因的天然变体，其中所述变体编码具有降低活性的CLE-样多肽。此类天然变体也可以用于例如进行同源重组。
本发明方法有利地适用于任何植物。特别用于本发明方法中的植物包 括属于植物界超家族的全部植物，尤其单子叶植物和双子叶植物，包括选自以下的饲用或饲料豆类、观赏植物、粮食作物、树或灌木。根据本发明优选的实施方案，植物是作物植物。作物植物的实例包括大豆、向日葵、卡诺拉油菜、苜蓿、油菜、棉花、番茄、马铃薯和烟草。还优选地，植物是单子叶植物。单子叶植物的实例包括甘蔗。更优选地，植物是谷物。谷物的实例包括稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、黑小麦、高粱和燕麦。
其他有利的植物选自菊科(Asteraceae)如向日葵属(Helianthus)、万寿菊属例如物种向日葵[向日葵(sunflower)]、香叶万寿菊(Tagetes lucida)、万寿菊(Tagetes erecta)或细叶万寿菊(Tagetes tenuifolia)[Marigold]、十字花科(Brassicaceae)如芸苔属(Brassica)、拟南芥属(Arabadopsis)例如物种欧洲油菜、芜芜青[卡诺拉油菜、油菜、蔓青]或拟南芥。豆科(Fabaceae)如大豆属例如物种大豆、大豆(Soja hispida)或大豆(Soja max)[大豆]。亚麻科(Linaceae)如亚麻属(Linum)例如物种亚麻[亚麻(flax、linseed)]；禾本科如大麦属(Hordeum)、黑麦属(Secale)、燕麦属(Avena)、高粱属(Sorghum)、稻属(Oryza)、玉蜀黍属(Zea)、小麦属(Triticum)例如物种大麦[大麦]；黑麦[rye]、燕麦、野燕麦、比赞燕麦、Avena fatua var.sativa、杂种燕麦[oat]、两色蜀黍[高粱、粟]、稻、阔叶稻[稻]、玉蜀黍[玉米、玉米]、普通小麦、硬粒小麦、圆柱小麦、Triticum hybernum、马卡小麦、普通小麦(Triticum sativum)或普通小麦(Triticum vulgare)[小麦、面包小麦、普通小麦]；茄科(Solanaceae)如茄属(Solanum)、番茄属(Lycopersicon)例如马铃薯[马铃薯]、番茄(Lycopersicon esculentum、Lycopersicon lycopersicum、Lycopersicon pyriforme、Solanum integrifolium或Solanum lycopersicum)[西红柿(tomato)]。
本发明还包括通过本发明的方法获得的植物。本发明因此提供通过本发明的方法获得的植物、部分或细胞，所述植物、部分或细胞包含编码如上文所定义的CLE-样蛋白质的核酸转基因。
本发明还提供产生相对于对照植物具有改变的产量相关性状的植物的方法，其包括在植物中引入和表达如上文中所定义的CLE-样核酸，所述 核酸可用于如上所讨论的减量调节方法中。
宿主植物对于本发明方法中所用核酸或载体、表达盒或构建体或载体而言原则上有利地是能够合成本发明方法中所用多肽的全部植物。
更具体地，本发明提供用于产生具有改变的产量相关性状的转基因植物的方法，所述方法包括：
(i)在植物细胞中引入并表达CLE-样核酸，所述CLE-样核酸在用于减量调节CLE-样基因表达的构建体中；和
(ii)在促进植物生长和发育的条件下培育植物细胞。
核酸可以直接引入植物细胞或引入植物本身(包括引入组织、器官或植物的任何其他部分)。根据本发明的优选特征，核酸优选地通过转化而引入植物。用于减量调节CLE-样基因表达，并引入植物细胞或植物中的构建体进一步优选包含CLE-样核酸或其部分的反向重复。
外来基因转移进入植物基因组中称为转化。为实施转化，利用转化方法以及由植物组织或植物细胞再生植物的方法来进行瞬时或稳定转化。有利的转化法是植物原位(in planta)转化。为此，有可能例如使农杆菌作用于植物种子，或用农杆菌接种植物分生组织。根据本发明，证明使转化农杆菌悬液作用于完整植株或至少花原基尤为有利。随后培养植物，直至获得所处理植物的种子(Clough和Bent,Plant J.(1998)16,735–743)。为选择转化的植物，通常将在转化过程中获得的植物材料置于选择性条件中，从而可将转化植物与非转化植物区分开来。例如，可以种植以上述方式获得的种子，并在最初的生长周期之后，通过喷雾对其进行选择。另一可能性包括使用合适的选择剂，将种子，适用的情况下是在授粉之后，种植在琼脂板上，从而仅转化的种子能够长成植物。其他有利的转化方法、特别是植物转化方法，为技术人员所公知，并在下文描述。
通常在转化后，对植物细胞或细胞群体选择一种或多种标记的存在，其中所述的标记由与目的基因一起共转移的植物可表达基因编码，随后将转化的材料再生成整株植物。
如所提到的那样，用本发明表达载体转化的农杆菌也可以以其自身已 知的方法来转化植物，如实验植物，像拟南芥或作物植物，例如像谷类、玉米、燕麦、黑麦、大麦、小麦、大豆、稻、棉花、甜菜、芸苔、向日葵、亚麻、大麻、马铃薯、烟草、番茄、胡萝卜、甜椒、油菜籽油菜、木薯淀粉、木薯、竹芋、万寿菊、苜蓿、生菜和多种树木、坚果和葡萄藤物种，特别是含油作物植物，如大豆、花生、蓖麻油植物、向日葵、玉米、棉花、亚麻、油菜籽油菜、椰子、油椰、红花(Carthamus tinctorius)、可可豆，例如通过在农杆菌溶液中水浴划破的叶子或叶节，随后在合适的培养基中培养之。
遗传修饰的植物细胞可通过本领域技术人员熟悉的所有方法再生。合适的方法可见于S.D.Kung和R.Wu、Potrykus或
和Willmitzer的上述出版物。为选择转化的植物，在转化中获得的植物材料原则上接受选择条件处理，以至于转化的植物可以与未转化的植物区分。例如。以上文所述方式获得的种子可以播种，在初始培育时期后，通过喷雾进行合适的选择处理。另一种可能性包括在使用合适选择剂的琼脂平板上培育种子(根据需要在消毒之后)，以至于仅转化的种子可以生长成植物。备选地，对转化的植物筛选选择性标记(如上文所述的那些选择性标记)的存在。
在DNA转移和再生后，推测的转化植物可以例如使用Southern分析对目的基因的存在、拷贝数和/或基因组构造进行评价。备选或额外地，目标CLE-样基因的表达水平的减量调节可以使用Northern和/或Western分析或定量PCR进行监测，全部技术是本领域内普通技术人员众所周知的。
产生的转化植物可以通过多种方法加以增殖，如通过克隆性增殖法或经典育种技术。例如，第一代(或T1)转化植物可以进行自交以产生纯合的第二代(或T2)转化体，并且T2植物通过经典育种技术进一步增殖。
产生的转化生物可以采取多种形式。例如，它们可以是转化细胞和非转化细胞的嵌合体；克隆性转化体(例如受转化以含有表达盒的全部细胞)；转化组织和未转化组织的移植体(例如在植物中，与未转化嫩枝嫁接的转化的根状茎)。
本发明明确地扩展至通过本文中所述的任一方法产生的任何植物细胞或植物，并扩展至全部植物部分及其繁殖体。本发明进一步扩展至包含已经通过任一前述方法产生的原代转化或转染细胞、组织、器官或整株植物的后代，唯一要求是后代显示出与通过本发明方法中的亲代所产生的那些后代相同的基因型特征和/或表型特征。
本发明也包括宿主细胞，其含有分离的CLE-样核酸。本发明优选的宿主细胞是植物细胞。宿主植物对于本发明方法中所用核酸或载体、表达盒或构建体或载体而言原则上有利地是能够合成本发明方法中所用多肽的全部植物。
本发明也扩展至植物的可收获部分，如不限于种子、叶、果实、花、茎、根、根状茎、块茎和球茎。本发明进一步涉及来自、优选直接来自这种植物的可收获部分中的产物，如干燥颗粒或粉末、油、脂肪及脂肪酸、淀粉或蛋白质。
有利地，本发明方法的实施产生相对于对照植物具有增强的产量相关性状的植物，具体地是增加的产量，更具体地是是增加的种子产量和/或增加的生物量。
本发明方法的实施产生具有增强的产量相关性状的植物。本发明方法的实施尤其产生相对于对照植物，具有增加的产量，尤其是增加的种子产量的植物。术语“产量”和“种子产量”在文中“定义”部分更加详细的描述。
在本文中对增强的产量相关性状的引用意指植物的一个或多个部分的生物量(重量)增加，所述的部分可以包括地上(可收获)部分和/或地下(可收获)部分。具体地，此类可收获部分是种子和/或生物量，本发明方法的实施尤其产生相对于对照植物的种子产量，具有增加的种子产量的植物。
以玉米为例，产量增加可以表现为下列一种或多种指标：每公顷或英亩生长的植物数的增加，每株植物穗数的增加、行数的增加、每行粒数、粒重、千粒重、玉米穗长度/直径、种子饱满率的增加(其中种子饱满率是饱满种子数除以种子总数并乘以100)及其他。以稻为例，产量增加本身可以表现为下列一种或多种指标的增加：每公顷或英亩植物数、每株植物圆 锥花序数、每圆锥花序小穗数、每圆锥花序花(小花)数(其表达为饱满种子数对原圆锥花序数之比)、种子饱满率的增加(其中种子饱满率是饱满种子数除以种子总数并乘以100)、千粒重的增加及其他。
本发明提供相对于对照植物增加植物的产量，尤其是种子产量的方法，所述方法调节编码如文中定义的CLE-样多肽在植物中的表达，优选增加表达。
由于本发明的转基因植物具有增加的产量，因而相对于对比植物的生长速率，这些植物有可能在其生活周期中的对应阶段上表现增加的生长速率(在其生活周期的至少部分期间)。
增加的生长速率可以对于植物的一个或多个部分(包括种子)是特异性的，或可以基本上遍及整株植物。具有增加的生长速率的植物可以具备较短的生活周期。植物的生活周期可以视为意指从干燥成熟种子成长至植物已经产生与起始材料相似的干燥成熟种子的阶段所需要的时间。这个生活周期可以受下列因素影响，如早期萌发势、生长速率、绿度指数、开花时间和种子成熟速度。生长速率的增加可以在植物生活周期中的一个或多个阶段上或在基本上整个植物生活周期期间发生。在植物生活周期中的早期期间增加的生长速率可以反映增强的萌发势。生长速率的增加可以改变植物的收获周期，允许植物较晚播种和/或较早收获，否则这将不可能(相似的作用可以用较早的开花时间获得)。若生长速率充分地增加，可以允许进一步播种相同植物物种的种子(例如播种并收获稻植物，随后播种并收获其他稻植物，全部稻植物均在一个常规生长时段内)。类似地，若生长速率足够地增加，可以允许进一步播种不同植物物种的种子(例如播种并收获玉米植物，随后例如播种并任选收获大豆、马铃薯或任何其他合适植物)。从相同的根茎中收获额外次数在一些作物植物的情况中也是可能的。改变植物的收获周期可以导致每英亩的年生物量产量的增加(因任何特定植物可以生长并收获的次数(如在一年中)增加)。生长速率的增加也可以允许比其野生型对应物在更广泛的地理区域内培育转基因植物，因为对培育作物的区域限制往往由栽种时节(早季)或在收获时期(晚季)的不利环境条件所决定。 若缩短收获周期，则可以避开这类不利条件。生长速率可以通过从生长曲线中得到多种参数而确定，此类参数可以是：T-Mid(植物达到其50％最大尺寸所花费的时间)和T-90(植物达到其50％最大尺寸所花费的时间)，等等。
根据本发明的优选特征，本发明方法的实施产生相对于对照植物而具有增加的生长速率的植。因而根据本发明，提供用于增加植物生长速率的方法，所述方法包括调节、优选增加编码CLE-样多肽的核酸在植物中的表达，如本文所述。
与对照植物相比，无论植物处于非胁迫条件下还是植物暴露于多种胁迫下，都发生产量和/或生长速率的增加。植物一般通过生长得更慢而对暴露于胁迫作出应答。在严重胁迫条件下，植物甚至可以完全停止生长。另一方面，轻微胁迫在本文中定义为植物对其暴露的任何胁迫，其中所述的胁迫未导致植物完全停止生长而没有恢复生长的能力。与非胁迫条件下的对照植物相比，轻微胁迫在本发明意义中导致受胁迫植物生长降低小于40%、35%或30%，优选小于25%、20%或15%，更优选小于14%、13%、12%、11%或10%或更低。由于农业实践(灌溉、施肥、杀虫剂处理)上的进步，在栽培作物植物中并不经常遇到严重胁迫。因此，由轻微胁迫诱导的受损生长往往是农业上不希望的特征。轻微胁迫是植物暴露的常见生物性和/或非生物性(环境)胁迫。非生物胁迫可以因干旱或水涝、厌氧胁迫、盐胁迫、化学毒性、氧化胁迫和热、寒冷或冰冻温度所致。非生物胁迫可以是由水胁迫(尤其因为干旱)、盐胁迫、氧化胁迫或离子胁迫引起的渗透胁迫。生物胁迫一般是由病原体如细菌、病毒、真菌和昆虫引起的那些胁迫。
尤其，本发明的方法可以在非胁迫条件下或在轻微干旱条件下实施以产生相对于对照植物而具有增加的产量的植物。如在Wang等(Planta(2003)218：1-14)中报道，非生物胁迫导致不利地影响植物生长及生产力的一系列形态学变化、生理学变化、生物化学变化和分子变化。已知干旱、盐度、极端温度和氧化胁迫是相互联系的并可以通过相似机制而诱 导生长损害及细胞损害。Rabbani等(Plant Physiol(2003)133：1755-1767)描述了干旱胁迫与高盐度胁迫间极高程度的“串话”。例如，干旱和/或盐化作用主要表现为渗透胁迫，导致细胞内稳态和离子分布的破坏。经常伴随高温或低温、盐度或干旱胁迫的氧化胁迫可以造成功能性蛋白和结构蛋白变性。因此，这些多样的环境胁迫常常激活相似的细胞信号途径和细胞应答，如产生胁迫蛋白质、增量调节抗氧化物质、积累相容性溶质和生长抑制。如本文中所用的术语“非胁迫”条件是允许植物最佳生长的环境条件。本领域技术人员清楚对于给定地点的正常土壤条件和气候条件。
本发明方法的实施相对于在相当条件下培育的对照植物，赋予在非胁迫条件下或在轻微干旱条件下培育的植物增加的产量。因而根据本发明，提供用于增加在非胁迫条件下或在轻微干旱条件下培育的植物中产量的方法，所述方法包括增加编码CLE-样多肽的核酸在植物中的表达。
本发明方法的实施产生相对于在相当条件下培育的对照植物，在营养缺乏条件下、尤其在氮缺乏条件下培育的具有增加产量的植物。因而本发明提供用于在营养缺乏条件下培育的植物中增加产量的方法，所述方法包括增加编码CLE-样多肽的核酸在植物中的表达。营养缺乏可以因营养物的缺乏所致，所述营养物例如是氮、磷酸盐及其他含磷化合物、钾、钙、镉、镁、锰、铁和硼等
本发明也包括CLE-样核酸在改变产量相关形状中的用途。
编码CLE-样多肽的核酸可以用于育种程序中，其中鉴定到可以遗传地与CLE-样基因连接的DNA标记。该核酸/基因可以用来定义分子标记。这种DNA标记随后可以在育种程序中用来选择如上文所定义的在本发明方法中具有增加的产量的植物。
CLE-样核酸/基因的等位变体也可以用于标记辅助的育种程序中。这种育种程序有时需要通过使用例如EMS诱变法对植物作诱变性处理而引入等位基因变异；备选地，该程序可以从非人为造成的所谓“自然”起源性的一组等位变体开始。随后进行等位变体的鉴定，例如通过PCR法。此后是用于选择所讨论的及导致增加产量的序列的优异等位变体的步骤。一 般通过监测含有所讨论序列的不同等位变体的植物的生长性能而实施选择。可以在温室中或田间监测生长性能。其他任选步骤包括使其中优异等位变体被鉴定的植物与另一种植物杂交。这可以用来例如产生目标表型特征的组合。
CLE-样核酸也可以用作为探针以便对基因进行遗传作图或物理作图，所述探针作为所述基因的一部分及用作与那些基因连锁的性状的标记。此类信息可以用于植物育种中，以便开发具有想要表型的株系。CLE-样核酸的这种用途仅需要具有至少15个核苷酸长度的核酸序列。CLE-样核酸可以用作限制性片段长度多态性(RFLP)标记。限制性消化的植物基因组DNA的DNA印迹(Sambrook J，Fritsch EF和Maniatis T(1989)Molecular Cloning，A Laboratory Manual)可以用CLE-样核酸探测。产生的结合图式随后可以使用计算机程序如MapMaker(Lander等(1987)Genomics1：174-181)进行遗传分析以构建遗传图。此外，该核酸可以用来探测含有经限制性内切核酸酶处理的一组个体的基因组DNA的DNA印迹，其中所述的一组个体代表具有确定遗传杂交的亲代和后代。DNA多态性的分离被标出并用来计算CLE-样核酸在先前使用这个群体获得的遗传图中的位置(Botstein等(1980)Am.J.Hum.Genet.32：314-331)。
在Bernatzky和Tanksley(Plant Mol.Biol.Reporter4:37-41,1986)中描述了植物基因衍生的探针的产生和其在遗传作图中的用途。众多出版物描述了使用以上所提及的方法学或其改良方法对特定cDNA克隆的遗传作图。例如，F2互交群、回交群、随机交配群、邻近纯合系和其他个体群体可以用于作图。此类方法学是本领域技术人员众所周知的。
所述核酸探针也可以用于物理作图(即序列在物理图上的排列；见Hoheisel等在：Non-mammalian Genomic Analyasis：A Practical Guide，Academic press1996，第319-346页及其中引用的参考文献)。
在另一实施方案中，核酸探针可以在直接荧光原位杂交(FISH)作图法(Trask(1991)Trends Genet.7：149-154)中使用。尽管当前的FISH作图法支持使用大型克隆(几个kb至几百个kb；见Laan等(1995)Genome Res.5： 13-20)，然而灵敏度的改善可以允许使用更短探针进行FISH作图。
用于遗传作图及物理作图的多种基于核酸扩增的方法可以使用所述核酸而实施。实例包括等位基因特异的扩增法(Kazazian(1989)J.Lab.Clin.Med11：95-96)、PCR扩增片段的多态性(CAPS；Sheffield等(1993)Genomics16：325-332)、等位基因特异性连接(Landegren等(1988)Science 241：1077-1080)、核苷酸延伸反应(Sokolov(1990)Nucleic Acid Res.18：3671)、放射杂交作图(Walter等(1997)Nat.Genet.7：22-28)和Happy作图法(Dear和Cook(1989)Nucleic Acid Res.17：6795-6807)。对于这些方法，使用一种核酸的序列来设计并产生在扩增反应或在引物延伸反应中使用的引物对。此类引物的设计是本领域技术人员众所周知的。在使用基于PCR遗传作图的方法中，可能必须鉴定在对应于当前核酸序列的区域内作图交叉亲代间的DNA序列差异。然而，这对于作图法而言通常不是必需的。
本发明方法产生具有如前文所述的改变的产量相关形状的植物。这些性状也可以与经济上有利的其他性状组合，如其他的产量增强性状，对其他非生物胁迫和生物性胁迫的耐受性，调节多种构造性特征和/或生物化学特征和/或生理学特征的性状。
SYR
令人惊讶的是，现已发现在植物中调节编码SYR多肽的核酸的表达产生了在生物胁迫条件下生长时，相对于对照植物具有增强的产量相关性状的植物。本发明的第一实施方案提供在生物胁迫条件下生长时，相对于对照植物增强植物产量相关性状的方法，其包括在植物中调节编码SYR多肽的核酸的表达。
用于调节(优选增加)编码SYR多肽的核酸表达的优选方法是在植物中引入并表达编码SYR多肽的核酸。
在此之后“用于本发明方法中的蛋白质”的任何引用意指如本文中所定义的SYR多肽。在此之后“用于本发明方法中的核酸”的任何引用意指能够编码此类SYR多肽的核酸。待引入植物(并且因而用于实施本发明方法)的 核酸是编码现在所述类型蛋白质的任意核酸，下文又称作“SYR核酸”或“SYR基因”。
文中所定义的术语“SYR蛋白质或其同源物”意指约65至约200个氨基酸的多肽，其包含(i)富含亮氨酸结构域，其类似蛋白质C-末端中间的亮氨酸拉链，所述富含亮氨酸结构域是(ii)在前为三肽，其序列为YFS(保守基序1a,SEQ ID NO:256)，或YFT(保守基序1b,SEQ ID NO:257)，或YFG(保守基序1c,SEQ ID NO:258)或YLG(保守基序1d,SEQ ID NO:259)，和(iii)之后为保守基序2((V/A/I)LAFMP(T/S),SEQ ID NO:260)。优选地，保守基序2是(A/V)LAFMP(T/S)，最优选地，该保守基序是VLAFMPT。“SYR蛋白质或其同源物”还优选具有以保守基序3(SYL或PYL,SEQ ID NO:261)结尾的保守C-末端肽。SYR蛋白质或其同源物的富含亮氨酸结构域长度约为38至48个氨基酸，紧接起始于保守基序1并紧接终止于保守基序2，且包含至少30%的亮氨酸。富含亮氨酸结构域优选具有类似亮氨酸拉链基序(L-X6-L-X6-L-X6-L，其中X6是6个连续氨基酸的序列)的基序。SYR蛋白质的优选实例由SEQ ID NO:252所示，其结构域的概述在图24中给出。应当注意的是术语“SYR蛋白质或其同源物”不包含来自拟南芥的ARGOS蛋白质(SEQ ID NO:276)。
进一步优选地，SYR蛋白质具有两个跨膜结构域，该蛋白质的N-末端部分和C-末端部分位于内部，跨膜结构域之间的部分位于外部。
备选的，SYR蛋白质的同源物与SEQ ID NO:252所示的氨基酸具有一定整体序列同一性（overall sequence identity），所述整体序列同一性按照增加的优选顺序为至少27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、 93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%，前提是同源蛋白质包含保守基序1(a、b、c或d)、2和3，且富含亮氨酸结构域如上所述。整体序列同一性使用全局性比对算法确定，所述全局性比对算法例如GAP程序(GCG Wisconsin Package,Accelrys)中的Needleman Wunsch算法，优选用默认参数。
术语“结构域”和“基序”在文中的“定义”部分定义。存在用于鉴定结构域的专业数据库，如SMART(Schultz等(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.美国95，5857-5864；Letunic等(2002)Nucleic Acids Res30，242-244)、InterPro(Mulder等，(2003)Nucl.Acids.Res.31，315-318)、Prosite(Bucher 和Bairoch(1994)，用于生物分子序列基序的广义图谱语法及其在自动化序列判读中的功能，(在)ISMB-94；第二届分子生物学智能系统国际会议文集.Altman R.，Brutlag D.，Karp P.，Lathrop R.，Searls D.编著，第53-61页，AAAI Press，Menlo Park；Hulo等，Nucl.Acids.Res.32：D134-D137,(2004))或Pfam(Bateman等，Nucleic Acids Research30(1)：276-280(2002))。用于计算机芯片上分析蛋白质序列的一组工具可在ExPASY蛋白质组学服务器上获得(瑞士生物信息学研究所(Gasteiger等，ExPASy：用于深入认识和分析蛋白质的蛋白组学服务器，Nucleic Acids Res.31：3784-3788(2003))。结构域也可以使用常规技术如通过序列比对而鉴定。
用于比对序列用于比较的方法是本领域众所周知的，此类方法包括GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。GAP使用Needleman和Wunsch算法((1970)J Mol Biol48:443-453)以找到使匹配数最大化并使空位数最小化的两个完整序列的全局性(即覆盖完整序列的)比对。BLAST算法(Altschul等(1990)J Mol Biol215:403-10)计算序列同一性百分数并执行对两个序列间相似性的统计分析。用于执行BLAST分析的软件是公众通过国家生物技术信息中心(NCBI)可获得的。同源物可以使用例如ClustalW多重序列比对算法(1.83版本)以默认配对比对参数和评分方法（以百分数计）而轻易地鉴定。相似性和同一性的全局百分数也可以使用 在MatGAT软件包中可获得的方法之一而确定(Campanella等，BMCBioinformatics.2003Jul10；4:29.MatGAT：用蛋白质或DNA序列而产生相似性/同一性矩阵的应用)。可以进行细微手工编著以优化保守基序之间的比对，如本领域技术人员显而易见。此外除了使用全长序列以鉴定同源物，也可以使用特定结构域。使用上文提及的程序，使用默认参数，针对整个核酸序列或氨基酸序列或针对选择的结构域或保守基序测定了序列同一性值。
跨膜结构与长为约15至30个氨基酸，并通常包含形成α螺旋的疏水性残基。它们一般基于疏水性推测(例如Klein等，Biochim.Biophys.Acta 815,468,1985；或Sonnhammer等，In J.Glasgow,T.Littlejohn、F.Major、R.Lathrop、D.Sankoff和C.Sensen编著，Proceedings of the Sixth International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology,第175-182页，Menlo Park,CA,1998.AAAI Press.).
落入定义“SYR蛋白质或其同源物”内的蛋白质的实例在实施例部分的表II中给出，包括来自多种单子叶植物的序列，例如稻(SEQ ID NO:252、SEQ ID NO:262和SEQ ID NO:263)、玉米(SEQ ID NO:264)、小麦(SEQ ID NO:265)、大麦(SEQ ID NO:266)、甘蔗(SEQ ID NO:267和SEQ ID NO:268)、高粱(SEQ ID NO:269)；和来自双子叶植物的序列，例如拟南芥(SEQ ID NO:270和SEQ ID NO:271)、葡萄(SEQ ID NO:272)、柑橘(SEQ ID NO:273)或番茄(SEQ ID NO:274和SEQ ID NO:275)。预计富含亮氨酸结构域对于蛋白质的功能是重要的，因此具有富含亮氨酸结构域，但没有保守基序1或2的蛋白质也可用于本发明的方法中；此类蛋白质的实例由SEQ ID NO:284和285给出。
应当理解术语“SYR蛋白质或其同源物”不限于SEQ ID NO:252所示的序列，或SEQ ID NO:262或SEQ ID NO:275所列的同源物，也不限于满足以下标准的任何约65至约200个氨基酸的多肽，所述标准为包含如上定义的富含亮氨酸结构域，前面为保守三肽基序1(a、b、c或d)，后面为保守基序2，优选后面为保守基序3；或与序列SEQ ID NO:252具有 至少38%序列同一性的序列也适用于本发明的方法中。
SYR蛋白质或其同源物的活性可通过在稻中，在GOS2启动子控制下表达SYR蛋白质或其同源物而测定，相对于对应的野生型植物，所述SYR蛋白质或其同源物在生长在氮缺乏条件下的植物中产生增加的生物量和/或种子产量，而不延迟开花时间。这种种子产量的增加可通过多种方式测定，例如作为增加的种子总重量、饱满种子数或千粒重来测定。
本发明通过用由SEQ ID NO:251代表的编码多肽序列SEQ ID NO:252的核酸序列转化的植物加以说明，然而，本发明的实施不限于这些序列；本发明方法可以使用如文中定义的任意SYR-编码核酸或SYR多肽有利地进行。
编码SYR多肽的核酸的实例在文中实施例38的表II中给出。这类核酸可用于实施本发明的方法。实施例38的表II中给出的氨基酸序列是SEQ ID NO:252所示的SYR多肽的直向同源物和旁系同源物的实例，术语“直向同源物”和“旁系同源物”如文中所定义。其他直向同源物和旁系同源物可以通过开展所谓交互性blast搜索而容易地找到。这通常涉及第一BLAST，其中所述的第一BLAST包括提交查询序列(例如使用实施例38的表II中列出的任一序列)用于针对任一序列数据库(如公众可用的NCBI数据库)的BLAST搜索。当从核苷酸序列开始时，一般使用BLASTN或TBLASTX(使用标准默认值)，并且当从蛋白质序列开始时，可以使用BLASTP或TBLASTN(使用标准默认值)。任选地可以筛选BLAST结果。随后提交筛选结果和非筛选结果的全长序列以针对来自生物的序列进行反向BLAST(第二BLAST)，其中查询序列来自所述的生物(其中在查询序列是SEQ ID NO:251或SEQ ID NO:252的情况下，第二BLAST因而将针对稻序列)。随后比较第一和第二BLAST搜索的结果。若来自第一BLAST的高阶位命中源自与查询序列从其中衍生的物种相同的物种，反向BLAST随后理想地在最高命中的查询序列中产生，则鉴定到旁系同源物；若第一BLAST的中的高阶位命中不源自与查询序列从其中衍生的物种相同的物种，并且优选地在反向BLAST时产生属于最高命中之列的查询序列，则 鉴定到直向同源物。
高阶位命中是具有低E-值的那些命中。E-值越低，评分越显著(或换句话说，此命中因偶然而发生的几率越低)。E-值的计算是本领域众所周知的。除了E-值外，比较结果还由同一性百分数记分。同一性百分数指两个所比较核酸(或多肽)序列之间在特定长度范围内的相同核苷酸(或氨基酸)数目。在大型家族的情况下，可以使用ClustalW，随后使用邻接树法以便帮助显示相关基因的聚类和以便鉴定直向同源物和旁系同源物。
核酸变体也可以用于实施本发明的方法。此类核酸变体的实例包括编码实施例38的表II中给出的任一氨基酸序列的同源物和衍生物的核酸，术语“同源物”和“衍生物”如文中所定义。也可用于本发明方法中的是编码实施例38的表II中给出的任一氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的同源物和衍生物的核酸。用于本发明方法中的同源物和衍生物与它们衍生自的未修饰的蛋白质具有基本相同的生物和功能活性。
用于实施本发明方法的其他核酸变体包括编码SYR多肽的核酸的部分、与编码SYR多肽的核酸杂交的核酸、编码SYR多肽的核酸的剪接变体、编码SYR多肽的核酸的等位变体，以及通过基因改组获得的编码SYR多肽的核酸的变体。术语杂交序列、剪接变体、等位变体和基因改组如文中所述。
编码SYR多肽的核酸不需要是全长核酸，因为本发明方法的实施不依赖使用全长核酸序列的使用。本发明提供在植物中增强产量相关性状的方法，其包括在植物中引入和表达实施例38的表II中给出的核酸序列中任一个的部分，或实施例38的表II中给出的氨基酸序列中任一个的直向同源物、旁系同源物或同源物的编码核酸的部分。
核酸的部分可以例如通过对该核酸产生一个或多个缺失而制备。所述的部分可以以分离的形式加以使用或它们可以与其他编码性(或非编码性)序列融合，以便例如产生组合几种活性的蛋白质。当与其他编码序列融合时，翻译时产生的所得多肽可以比对该蛋白质部分所预测的多肽更大。
用于本发明方法中的部分编码文中定义的SYR多肽，其与实施例38 的表II中给出的意氨基酸序列具有基本相同的生物学活性。优选地，此部分是在实施例38的表II中给出的任何一种核酸的部分，或实施例38的表II中给出的氨基酸序列中任一个的直向同源物或旁系同源物的编码核酸的部分。此部分的长度优选为至少150、200、250、300、350、400、450、500、550、600个连续核苷酸，其中所述的连续核苷酸是实施例38的表II中给出的任何一种核酸序列，或是实施例38的表II中给出的氨基酸序列中任一个的直向同源物或旁系同源物的编码核酸。最优选地，此部分是核酸SEQ ID NO:251的部分。优选地，该部分编码约65至约200个氨基酸的多肽，包含如上定义的富含亮氨酸结构域，前面为保守三肽基序1(a、b、c或d)，后面为保守基序2，优选后面为保守基序3；或与序列SEQ ID NO:252具有至少38%序列同一性。
用于本发明方法中的另一核酸变体是能够在降低的严格条件下、优选在严格条件下与编码如文中所定义的SYR多肽的核酸杂交，或与如文中所定义的部分杂交的核酸。
本发明提供用于在植物中增强产量相关性状的方法，其包括在植物中引入并表达能够与实施例38的表II中给出的任何一种核酸杂交的核酸，或包括在植物中引入并表达如此核酸，其能够与实施例38的表II中给出的任意核酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的编码核酸杂交的核酸。
用于本发明方法中的杂交序列编码文中定义的SYR多肽，其与实施例38的表II中给出的任意氨基酸序列具有基本相同的生物学活性。优选地，杂交序列能够与实施例38的表II中给出的任一核酸杂交或与任一这些序列的部分杂交，其中所述的部分如上文所定义，或者其中杂交序列能够与实施例38的表II中给出的任意氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的编码核酸杂交。最优选地，杂交序列能够与如SEQ ID NO:251所代表的核酸，或与其部分杂交。
优选地，杂交序列编码约65至约200个氨基酸的多肽，包含如上定义的富含亮氨酸结构域，前面为保守三肽基序1(a、b、c或d)，后面为保 守基序2，优选后面为保守基序3；或与序列SEQ ID NO:252具有至少38%序列同一性。
用于本发明方法中的另一种核酸变体是编码如上文所定义的SYR多肽的剪接变体，剪接变体如文中所定义。
本发明提供用于在植物中增强产量相关性状的方法，其包括在植物中引入并表达实施例38的表II中给出的任何一种核酸的剪接变体，或实施例38的表II中给出的任意氨基酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的编码核酸的剪接变体。
优选的剪接变体是由SEQ ID NO:251代表的核酸的剪接变体，或编码SEQ ID NO:252的直向同源物或旁系同源物的核酸的剪接变体。优选地，剪接变体编码的氨基酸序列是约65至约200个氨基酸的多肽，包含如上定义的富含亮氨酸结构域，前面为保守三肽基序1(a、b、c或d)，后面为保守基序2，优选后面为保守基序3；或与序列SEQ ID NO:252具有至少38%序列同一性。
用于实施本发明方法的另一种核酸变体是编码如上文所定义的SYR多肽的核酸的等位变体，等位变体如文中所定义。
本发明提供用于在植物中增强产量相关性状的方法，其包括在植物中引入并表达实施例38的表II中给出的任何一种核酸的等位变体，或包括在植物中引入并表达实施例38的表II中给出的任意氨基酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的编码核酸的等位变体。
用于本发明方法中的等位变体具有与SYR多肽SEQ ID NO:252和实施例38的表II中所示的任意氨基酸基本相同的生物学活性。等位变体天然存在，且包含在本发明方法中的是这些天然等位基因的用途。优选地，等位变体是等位变体SEQ ID NO:251或编码SEQ ID NO:252的直向同源物或旁系同源物的核酸的等位变体。优选地，等位变体编码的氨基酸序列是约65至约200个氨基酸的多肽，包含如上定义的富含亮氨酸结构域，前面为保守三肽基序1(a、b、c或d)，后面为保守基序2，优选后面为保守基序3；或与序列SEQ ID NO:252具有至少38%序列同一性。
基因改组或定向进化也可以用来产生编码如上文定义的SYR多肽的核酸的变体；术语“基因改组”如文中所定义。
本发明提供用于在植物中增强产量相关性状的方法，其包括在植物中引入并表达实施例38的表II中给出的任何一种核酸的变体，或包括在植物中引入并表达如此核酸的变体，其中所述的核酸编码实施例38的表II中给出的任意氨基酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物，所述变体核酸通过基因改组获得。
优选地，通过基因改组获得的变体编码的氨基酸序列是约65至约200个氨基酸的多肽，包含如上定义的富含亮氨酸结构域，前面为保守三肽基序1(a、b、c或d)，后面为保守基序2，优选后面为保守基序3；或与序列SEQ ID NO:252具有至少38%序列同一性。
另外，核酸变体也可以通过位点定向诱变获得。几种方法可用于实现位点定向诱变，最常见的是基于PCR的方法(Current Protocols in Molecular Biology;Wiley编著)。
编码SYR多肽的核酸可以来自任何自然来源或人工来源。核酸可以从其天然形式就组成和/或基因组环境方面通过人类有意操作而加以修饰。编码SYR多肽的核酸优选地来自植物，还优选来自单子叶植物，更优选来自禾本科，该核酸最优选来自稻。
本发明方法的实施产生在非生物胁迫下生长，相对于对照植物具有增强的非生物胁迫抗性（或非生物胁迫耐受性，该术语可互换使用）的植物，所述增强的非生物胁迫抗性导致增强的产量相关性状。尤其本发明方法的实施产生相对于对照植物而具有增加的产量、尤其增加的种子产量和增加的生物量的植物。在本文中的“定义”部分中更详细地描述了术语“产量”和“种子产量”。
在本文中对增强的产量相关性状的参考意指植物的一个或多个部分的生物量(重量)增加，所述的部分可以包括地上(可收获)部分和/或地下(可收获)部分。尤其，此类可收获部分是种子，并且本发明方法的实施产生相对于对照植物的种子产量，具有增加的种子产量的植物。
以玉米为例，产量增加可以表现为下列一种或多种指标：每公顷或英亩生长的植物数的增加、每株植物穗数的增加、行数的增加、每行粒数、粒重、千粒重、玉米穗长度/直径、种子饱满率的增加(其中种子饱满率是饱满种子数除以种子总数并乘以100)及其他。以稻为例，产量增加本身可以表现为下列一种或多种指标的增加：每公顷或英亩植物数、每株植物圆锥花序数、每圆锥花序小穗数、每圆锥花序花(小花)数(其表达为饱满种子数对原圆锥花序数之比)、种子饱满率的增加(其中种子饱满率是饱满种子数除以种子总数并乘以100)、千粒重的增加及其他。
本发明提供相对于对照植物，导致在非生物胁迫条件下生长的植物产量增加，尤其是植物种子产量增加和/或生物量增加的方法，所述方法包括在植物中调节编码如文中所定义的SYR多肽的核酸的表达，优先增加其表达。
由于本发明的转基因植物具有增加的产量，因而相对于对照植物的生长速率，这些植物有可能在其生活周期中的对应阶段上表现增加的生长速率(在其生活周期的至少部分期间)。除了增加产量的能力，增加的营养摄取效率也有助于产量增加。据观察本发明的植物显示更高的营养摄取效率。当植物处于胁迫条件下时，增加的营养摄取效率使得植物生长更好。
增加的生长速率可以对于植物的一个或多个部分(包括种子)是特异性的，或可以基本上遍及整株植物。具有增加的生长速率的植物可以具备较短的生活周期。植物的生活周期可以视为意指从干燥成熟种子成长至植物已经产生与起始材料相似的干燥成熟种子的阶段所需要的时间。这个生活周期可以受下列因素影响，如早期萌发势、生长速率、绿度指数、开花时间和种子成熟速度。生长速率的增加可以在植物生活周期中的一个或多个阶段上或在基本上整个植物生活周期期间发生。在植物生活周期中的早期期间增加的生长速率可以反映增强的萌发势。生长速率的增加可以改变植物的收获周期，允许植物较晚播种和/或较早收获，否则这将不可能(相似的作用可以用较早的开花时间获得)。若生长速率充分地增加，可以允许进一步播种相同植物物种的种子(例如播种并收获稻植物，随后播种并收获其 他稻植物，全部稻植物均在一个常规生长时段内)。类似地，若生长速率足够地增加，可以允许进一步播种不同植物物种的种子(例如播种并收获玉米植物，随后例如播种并任选收获大豆、马铃薯或任何其他合适植物)。从相同的根茎中收获额外次数在一些作物植物的情况中也是可能的。改变植物的收获周期可以导致每英亩的年生物量产量的增加(因任何特定植物可以生长并收获的次数(如在一年中)增加)。生长速率的增加也可以允许比其野生型对应物在更广泛的地理区域内培育转基因植物，因为对培育作物的区域限制往往由栽种时节(早季)或在收获时期(晚季)的不利环境条件所决定。若缩短收获周期，则可以避开这类不利条件。生长速率可以通过从生长曲线中得到多种参数而确定，此类参数可以是：T-Mid(植物达到其50％最大尺寸所花费的时间)和T-90(植物达到其50％最大尺寸所花费的时间)，等等。
根据本发明的优选特征，本发明方法的实施产生当生长在非生物胁迫条件下，相对于对照植物而具有增加的生长速率的植物。因而根据本发明，提供增加非生物胁迫条件下的植物生长速率的方法，所述方法包括调节、优选增加本文中所定义的编码SYR多肽的核酸在植物中的表达。
与对照植物相比，当植物暴露于多种非生物胁迫下，发生产量和/或生长速率的增加。植物一般通过生长得更慢而对暴露于胁迫作出应答。在严重胁迫条件下，植物甚至可以完全停止生长。另一方面，轻微胁迫在本文中定义为植物对其暴露的任何胁迫，其中所述的胁迫未导致植物完全停止生长而没有恢复生长的能力。与非胁迫条件下的对照植物相比，轻微胁迫在本发明意义中导致受胁迫植物生长降低小于40%、35%或30%，优选小于25%、20%或15%，更优选小于14%、13%、12%、11%或10%或更低。由于农业实践(灌溉、施肥、杀虫剂处理)上的进步，在栽培作物植物中并不经常遇到严重胁迫。因此，由轻微胁迫诱导的受损生长往往是农业上不希望的特征。轻微胁迫是植物暴露的常见生物性和/或非生物性(环境)胁迫。非生物胁迫可以因干旱或水涝、厌氧胁迫、盐胁迫、化学毒性、氧化胁迫和热、寒冷或冰冻温度所致。非生物胁迫可以是由水胁迫(尤其因为 干旱)、盐胁迫、氧化胁迫或离子胁迫引起的渗透胁迫。在特定实施方案中，非生物性胁迫是一种或多种营养物的可用性降低，所述营养物是植物生长和发育需要吸收的营养物。生物胁迫一般是由病原体如细菌、病毒、真菌和昆虫引起的那些胁迫。
尤其，本发明的方法可以在胁迫条件下（优选在一种或多种营养物的可用性降低的条件下）或在轻微干旱条件下实施以产生相对于对照植物而具有增加的产量的植物。如在Wang等(Planta(2003)218：1-14)中报道，非生物胁迫导致不利地影响植物生长及生产力的一系列形态学变化、生理学变化、生物化学变化和分子变化。已知干旱、盐度、极端温度和氧化胁迫是相互联系的并可以通过相似机制而诱导生长损害及细胞损害。Rabbani等(Plant Physiol(2003)133：1755-1767)描述了干旱胁迫与高盐度胁迫间极高程度的“串话”。例如，干旱和/或盐化作用主要表现为渗透胁迫，导致细胞内稳态和离子分布的破坏。经常伴随高温或低温、盐度或干旱胁迫的氧化胁迫可以造成功能性蛋白和结构蛋白变性。因此，这些多样的环境胁迫常常激活相似的细胞信号途径和细胞应答，如产生胁迫蛋白质、增量调节抗氧化物质、积累相容性溶质和生长抑制。如本文中所用的术语”非胁迫”条件是允许植物最佳生长的环境条件。本领域技术人员清楚对于给定地点的正常土壤条件和气候条件。
本发明方法的实施相对于在相当条件下培育的合适对照植物，赋予在非生物胁迫条件下或在轻微干旱条件下培育的植物增加的产量。因而根据本发明，提供用于在非生物胁迫条件下或在轻微干旱条件下培育的植物中增加产量的方法，所述方法包括增加编码SYR多肽的核酸在植物中表达。
本发明方法的实施产生相对于在相当条件下培育的对照植物，在营养缺乏条件下、尤其在氮缺乏条件下培育的具有增加产量的植物。因而本发明提供用于在营养缺乏条件下培育的植物中增加产量的方法，所述方法包括增加编码SYR多肽的核酸在植物中的表达。营养缺乏可以因营养物的缺乏所致，所述营养物例如是氮、磷酸盐及其他含磷化合物、钾、钙、镉、镁、锰、铁和硼等
本发明包括可通过本发明方法获得的植物或其部分(包括种子)。该植物或其部分包含编码如上文定义的SYR多肽的核酸转基因。
本发明还提供遗传构建体和载体以促进在植物中引入和/或表达编码SYR多肽的核酸。该基因构建体可以插入适于转化至植物内并适于在转化的细胞中表达目的基因的市售载体。本发明也提供如文中所定义的基因构建体在本发明方法中的用途。
更具体地，本发明提供构建体，其包含
(a)编码如上文定义的SYR多肽的核酸；
(b)能够驱动(a)的核酸序列表达的一个或多个调控序列；和任选地
(c)转录终止序列。
优选地，编码SYR多肽的核酸如上文所定义。术语“调控序列”和“终止序列”如上文所定义。
植物用包含如上所述的任意核酸的载体转化。本领域技术人员非常了解为成功转化、选择和增殖含有目的序列的宿主细胞而必须于载体上存在的遗传元件。目的序列与一种或多种调控序列(至少与启动子)有效连接。
有利地，任何类型的天然或合成启动子可以用来驱动核酸序列的表达。组成型启动子尤其可用于本方法中。各种启动子类型的定义参见文中的“定义”部分。
应当明白本发明的适用性不限于由SEQ ID NO:251代表的SYR多肽编码核酸，同时本发明的适用性也不限于在组成型启动子驱动时表达SYR多肽编码核酸。
组成型启动子优选是GOS2启动子，GOS2启动子优选来自稻。更优选地，该组成型启动子由基本上与SEQ ID NO:255或SEQ ID NO：58相似的核酸序列所示，该组成型启动子最优选地如255或SEQ ID NO：58所示。有用的组成型启动子的其他实例参见文中“定义”部分的表2a。
任选地，一种或多种终止子序列可以在引入植物的构建体中使用。额外的调节元件可以包括转录增强子以及翻译增强子。本领域技术人员会知道可以在实施本发明中适用的终止子序列和增强子序列。如定义部分所述， 内含子序列也可以添加至5'非翻译区(UTR)或编码序列中，以增加在胞浆内积累的成熟信息的量。其他调控序列(除启动子、增强子、沉默子、内含子序列、3’UTR和/或5’UTR区之外)可以是蛋白质和/或RNA稳定化元件。本领域技术人员会知道或可以轻易地获得此类序列。
本发明的遗传构建体还可以包括在特定细胞类型中维持和/或复制所需的复制起点序列。一个实例是当需要将遗传构建体在细菌细胞中维持为附加型遗传元件(例如质粒或粘粒分子)时。优选的复制起点包括，但不限于f1-ori和colE1。
为检测如在本发明方法中所用核酸序列的成功转移和/或选择包含这些核酸的转基因植物，使用标记基因(或报道基因)是有利的。因而，遗传构建体可以任选地包含选择性标记基因。文中的“定义”部分更加详细的描述了选择性标记。
已知当核酸稳定或瞬时整合至植物细胞时，仅小部分的细胞摄取外来DNA并且根据需要将其整合至细胞基因组，这取决于所用表达载体和使用的转染技术。为鉴定并选择这些整合子，通常将编码选择性标记(如上文所述之一)的基因连同目的基因一起引入宿主细胞。这些标记可以在其中这些基因因例如常规方法所致的缺失而无功能的突变体中使用。此外，编码选择性标记的核酸分子可以引入宿主细胞中，与在包含编码本发明多肽或本发明方法中所用多肽的序列在同一载体上，或在单独的载体上。已经用引入的核酸稳定转染的细胞可以通过选择进行鉴定(例如具有整合的选择性标记的细胞存活而其他细胞死亡)。标记基因当其不再需要时，可从转基因细胞移除或切除。移除标记的技术是本领域已知的，有用的技术描述于上面的定义部分。
本发明也提供产生转基因植物的方法，其中在非生物胁迫条件下，所述转基因植物相对于对照植物具有增强的产量相关性状，其包括在植物中引入和表达任意编码如上文中所定义的SYR多肽的核酸。
更具体地，本发明提供用于产生具有增强的产量相关性状，尤其是增加的（种子）产量和/或增加的生物量的转基因植物的方法，所述方法包括：
(i)在植物或植物细胞中引入和表达SYR多肽编码核酸；和
(ii)在促进植物生长和发育的条件下培育植物细胞。
(i)的核酸可以是能够编码文中定义的SYR多肽的任意核酸。
核酸可以直接引入植物细胞或引入植物本身(包括引入组织、器官或植物的任何其他部分)。根据本发明的优选特征，核酸优选地通过转化引入植物。文中的“定义”部分更加详细的描述了术语“转化”。
遗传修饰的植物细胞可通过本领域技术人员熟悉的所有方法再生。合适的方法可见于S.D.Kung和R.Wu、Potrykus或
和Willmitzer的上述出版物。
通常在转化后，选择一种或多种标记存在的植物细胞或细胞群体，其中所述的标记由与目的基因一起共转移的植物可表达的基因编码，随后将转化的材料再生成整株植物。为了选择转化的植物，在转化中获得的植物材料原则上接受选择条件处理，以至于转化的植物可以与未转化的植物区分。例如，以上文所述方式获得的种子可以播种，在初始培育时期后，通过喷雾进行合适的选择。另一种可能性包括在使用合适选择剂的琼脂平板上生长种子(根据需要在消毒之后)，使得仅转化的种子可以生长成植物。或者，转化的植物通过上述那些选择性标记的存在筛选。
在DNA转移和再生后，推测的转化植物可以例如使用Southern分析对目的基因的存在、拷贝数和/或基因组构造进行评价。备选或额外地，新引入DNA的表达水平可以使用Northern和/或Western分析进行监测，这两种技术是本领域技术人员众所周知的。
产生的转化植物可以通过多种方法加以增殖，如通过克隆增殖法或经典育种技术。例如，第一代(或T1)转化植物可以进行自交，选择纯合的第二代(或T2)转化体，并且T2植物通过经典育种技术进一步增殖。产生的转化生物可以采取多种形式。例如，它们可以是转化细胞和非转化细胞的嵌合体；克隆转化体(例如被转化以含有表达盒的全部细胞)；转化组织和未转化组织的移植体(例如在植物中，与未转化嫩枝嫁接的转化的根状茎)。
本发明明确地扩展至通过文中所述的任意方法产生的任何植物细胞或 植物，并扩展至全部植物部分及其繁殖体。本发明进一步扩展至包含已经通过任意前述方法产生的原代转化或转染细胞、组织、器官或整株植物的后代，唯一要求是后代表现与通过本发明方法中的亲代所产生的那些后代相同的一种或多种基因型特征和/或表型特征。
本发明也包括宿主细胞，其含有编码SYR多肽的分离的核酸。本发明优选的宿主细胞是植物细胞。宿主植物对于本发明方法中所用核酸或载体、表达盒或构建体或载体而言原则上有利地是能够合成本发明方法中所用多肽的全部植物。
本发明方法有利地适用于任何植物。特别用于本发明方法中的植物包括属于植物界超家族的全部植物，尤其单子叶植物和双子叶植物，包括饲用或饲料豆类、观赏植物、粮食作物、树或灌木。根据本发明优选的实施方案，植物是作物植物。作物植物的实例包括大豆、向日葵、卡诺拉油菜、苜蓿、油菜、棉花、番茄、马铃薯和烟草。还优选地，植物是单子叶植物。单子叶植物的实例包括甘蔗。更优选地，植物是谷物。谷物的实例包括稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、黑小麦、高粱和燕麦。
本发明也扩展至植物的可收获部分如，但不限于种子、叶、果实、花、茎、根状茎、块茎和球茎。本发明进一步涉及来自自、优选直接来自这种植物的可收获部分中的产物，如干燥颗粒或粉末、油、脂肪及脂肪酸、淀粉或蛋白质。
根据本发明的优选特征，受调节的表达是增加的表达。增加核酸、基因或基因产物的表达的方法在现有技术中充分记载，并且实例在定义给出。
如上文提及，用于调节(优选增加)编码SYR多肽的核酸表达的优选方法是在植物中引入并表达编码SYR多肽的核酸；然而实施所述方法的作用即增强产量相关性状也可以使用众所周知的其他技术实现，所述技术包括但不限于T-DNA激活标注、TILLING、同源重组。这些技术的描述在定义给出。
本发明也包括编码文中所述SYR多肽的核酸的用途和这些SYR多肽的用途，其用于增强生长在非生物胁迫条件下的植物中的任意上述产量相 关性状。
编码文中所述SYR多肽的核酸或SYR多肽本身可以用于育种程序中，其中鉴定到可以遗传地与编码SYR多肽的基因连接的DNA标记。所述的核酸/基因或SYR多肽本身可以用来定义分子标记。这种DNA或蛋白质标记随后可以在育种程序中用来选择具有本发明方法中如上文所定义的增强的产量相关性状的植物。
编码SYR多肽的核酸/基因的等位变体也可以用于标记辅助的育种程序中。这种育种程序有时需要通过使用例如EMS诱变法对植物进行诱变处理而引入等位基因变异；备选地，该程序可以从非人为引起的所谓“自然”起源的一组等位变体开始。随后进行等位变体的鉴定，例如通过PCR法。此后是用于选择所讨论及导致增加产量的序列的优异等位变体的步骤。一般通过监测含有所讨论序列的不同等位变体的植物的生长性能而实施选择。可以在温室中或田间监测生长性能。其他任选步骤包括将鉴定了优异等位变体的植物与另一种植物杂交。这可以用来例如产生目标表型特征的组合。
编码SYR多肽的核酸也可以用作探针以便对基因进行遗传作图或物理作图，所述探针作为所述基因的一部分及与这些基因关联的性状的标记。此类信息可以用于植物育种中，以便开发具有想要表型的株系。编码SYR多肽的核酸的这种用途仅需要具有至少15个核苷酸长度的核酸序列。编码SYR多肽的核酸可以用作限制性片段长度多态性(RFLP)标记。限制性消化的植物基因组DNA的Southern印迹(Sambrook J，Fritsch EF和Maniatis T(1989)Molecular Cloning，A Laboratory Manual)可以用SYR编码核酸探测。产生的结合图式随后可以使用计算机程序如MapMaker(Lander等(1987)Genomics1：174-181)进行遗传分析以构建遗传图。此外，该核酸可以用来探测含有经限制性内切核酸酶处理的一组个体的基因组DNA的Southern印迹，其中所述的一组个体代表具有确定的遗传杂交的亲代和后代。DNA多态性的分离被标出并用来计算编码SYR多肽的核酸在使用这个群体先前所获得的遗传图中的位置(Botstein等 (1980)Am.J.Hum.Genet.32：314-331)。
在Bernatzky和Tanksley(1986)Plant Mol.Biol.Reporter4：37-41中描述了植物基因衍生的探针的产生和其在遗传作图中的用途。众多出版物描述了使用以上所提及的方法学或其改良方法对特定cDNA克隆的遗传作图。例如，F2互交群、回交群、随机交配群、邻近纯合系和其他个体群体可以用于作图。此类方法学是本领域技术人员众所周知的。
所述核酸探针也可以用于物理作图(即序列在物理图上的排列；见Hoheisel等在：Non-mammalian Genomic Analyasis：A Practical Guide，Academic press1996，第319-346页及其中引用的参考文献)。
在另一实施方案中，核酸探针可以在直接荧光原位杂交(FISH)作图法(Trask(1991)Trends Genet.7：149-154)中使用。尽管当前的FISH作图法支持使用大型克隆(几个kb至几百个kb；见Laan等(1995)Genome Res.5：13-20)，然而灵敏度的改善可以允许使用更短探针进行FISH作图。
用于遗传作图及物理作图的多种基于核酸扩增的方法可以使用所述核酸而实施。实例可见于文中的“定义”部分。实例包括等位基因特异性扩增(Kazazian(1989)J.Lab.Clin.Med11:95-96)、PCR扩增片段的多态性(CAPS;Sheffield等,(1993)Genomics16:325-332)、等位基因特异性连接(Landegren等,(1988)Science241:1077-1080)、核苷酸延伸反应(Sokolov (1990)Nucleic Acid Res.18:3671)、放射杂交作图(Walter等,(1997)Nat.Genet.7:22-28)和Happy作图(Dear和Cook,(1989)Nucleic Acid Res.17:6795-6807)。为实施这些方法，使用核酸序列设计和产生用于扩增反应或引物延伸反应的引物对。这类引物的设计是本领域技术人员众所周知的。使用基于PCR的遗传作图的方法，可能需要鉴定跨越相应于本发明核酸序列区域作图的亲本之间DNA序列的差异。然而，这对作图方法通常不是必要的。
本发明方法产生具有如前文所述的具有增强的产量相关性状的植物。这些性状也可以与经济上有利的其他性状组合，如其他的产量增加性状，对其他非生物胁迫和生物性胁迫的耐受性，调节多种构造性特征和/或生物 化学特征和/或生理学特征的性状。
附图描述
ERLK
图1给出受体激酶蛋白组的概述，所述受体激酶蛋白根据它们的胞外区分类(Shiu和Bleecker,2001)。标记为TM的竖线指示跨膜结构域。在左边，给出各个蛋白质的基因座名称或MAtDB名称。RLCK代表受体-样胞质激酶，RLK代表受体-样激酶。根据SMART和Pfam数据库给予结构域名称。
图2显示用于本发明中的ERLK蛋白质(SEQ ID NO:2)的结构域结构：黑体示出低复杂性结构域、下划线示出跨膜结构域、斜线示出激酶结构域。该分析由SMART作出。
图3给出SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54和SEQ ID NO:56所列出的蛋白质的多重比对。该比对用CLUSTAL W(1.83)作出，权重距阵：BLOSUM、空位开放罚分：11、空位延伸罚分：1。
图4显示双元载体p030的图，其用于在稻中增加GOS2启动子(SEQ ID NO:58)控制下的拟南芥ERLK-编码核酸的表达。
FBXW
图5是植物中FBXW多肽结构的示意图。显示不同特征的相关位置：F-框(PFAM PF00646)、WD40结构域(如在PFAM PF00400中，具有7个单独的WD40重复)和如SEQ ID NO:97至101分别表示的基序1至5。
图6显示植物FBXW多肽的序列多重比对，其使用CLUSTALW(1.83)(在Kyoto University Bioinformatics Center的GenomeNet服务器上)和默认值(Blosum62为权重距阵、空位开放罚分为10、空位延伸罚分为0.05)。 框出F-框和WD40重复。基序1和基序2由波形括号标出。基序3、4和5由黑框示出。
图7显示双元载体p1017，其用于在稻中增加GOS2启动子(SEQ ID NO:58)控制下的编码FBXW多肽的拟南芥核酸的表达。RANBP。
图8显示上文所定义的RANBP多肽的比对。该序列使用Vector NTI软件包中的AlignX程序(InforMax,Bethesda,MD)进行比对。多重比对使用空位开放罚分10和空位延伸罚分0.01进行。需要时，实施细微手工编著以便更好地定位一些保守区。示出基序II、III、IV、V、VI和VII。
图9显示双元载体p072，其用于在稻中增加谷醇溶蛋白启动子(内参PRO0090)控制下的玉蜀黍RANBP-编码核酸的表达。
图10显示双元载体p074，其用于在稻中增加谷醇溶蛋白启动子(内参PRO0090)控制下的拟南芥RANBP-编码核酸的表达。
GLK
图11给出玉米和稻GLK基因的图形概述(Rossini等,2001)。水平线代表未翻译的转率区(UTR)。框代表示出的编码区的不同结构域。NLS是预测的核定位信号、DBD是预测的DNA结合结构域，其包含GARP结构域。白色三角形指出所有四个基因中存在的内含子的位置；黑色三角形指出未在G2基因中发现的内含子的位置。注意虽然预测OsGLK1具有核定位（信号），但不可能很准确的预测NLS序列的存在。
图12显示用于本发明中的GLK蛋白质(SEQ ID NO:157)的结构域结构。GARP结构域(黑体)与MYB结构域(斜体表示，由SMART鉴定)具有一些相似性；GCT结构域具有下划线。
图13给出SEQ ID NO:157(OsGLK1)、SEQ ID NO:169(OsGLK2)、SEQ ID NO:171(AtGLK1)、SEQ ID NO:173(AtGLK2)、SEQ ID NO:175(PpGLK1)、SEQ ID NO:177(PpGLK2)、SEQ ID NO:179(ZmGLK1)、SEQ ID NO:181(ZmG2)、SEQ ID NO:183(TaGLK1)、SEQ ID NO:185(AcGLK1)、SEQ ID NO:189(SbGLK1)、SEQ ID NO:193(OsGLK1var)所列出的蛋白质的多重比对。该比对用CLUSTALW(1.83)作出，权重距 阵：BLOSUM、空位开放罚分：10、空位延伸罚分：0.05。
图14显示双元载体p045的图，其用于在稻中增加GOS2启动子(SEQ ID NO:58)控制下的稻GLK-编码核酸的表达。
REVΔHDZip/START
图15显示III类HDZip多肽的系统发生图。有两个单子叶REV多肽(稻)，它们和一个双子叶REV多肽(拟南芥)聚簇在一起。圆形指示可用于实施本发明方法的REV核酸序列ΔHDZip/START的REV多肽的进化枝。在Floyd等，(2006)Genetics173(1):373-88之后。
图16使用CLUSTAL W(1.83)(在Kyoto University Bioinformatics Center的GenomeNet服务器上)和默认值(Blosum62为权重距阵、空位开放罚分为10、空位延伸罚分为0.05)对来自拟南芥（共5个）和稻（共5个）的所有III类HDZip多肽（包括REV多肽直向同源物和旁系同源物的实例，参见实施例27）的序列多重比对后的邻近连接树（Neighbour-joining tree）结果。REV分支的多肽以波形括号示出，并以黑线从其他4个III类HDZip多肽中分开。圆形指示REV分支进入点（out point）。
图17图示全长REV多肽。REV多肽从N-末端到C-末端包括：(i)用于DNA结合的同源域(HD)结构域；(ii)用于蛋白质-蛋白质相互作用的亮氨酸拉链(Zip)；(iii)用于脂质/sterol结合的START结构域(包含miRNA互补结合位点，mir165/166)，和(iv)未定义功能的C-末端区(CTR)。例如，在SEQ ID NO:199所示的来自稻的一个REV多肽中，HD跨越第27位至第87位氨基酸，亮氨酸拉链跨越第91位至第127位氨基酸，START结构域跨越第166位至第376位氨基酸，且CTR跨越第377位至第840位氨基酸。
图18是可用于实施本发明方法的REV ΔHDZip/START核酸序列的全长REV多肽的序列多重比对，其使用CLUSTAL W(1.83)(在Kyoto University Bioinformatics Center的GenomeNet服务器上)和默认值(Blosum62为权重距阵、空位开放罚分为10、空位延伸罚分为0.05)。黑 框框出同源域、亮氨酸拉链、START结构域和CTR。
图19是可用于实施本发明方法的REVΔHDZip/START核酸序列的REV多肽（全长或部分多肽，如实施例27中列出的）的CTR的序列多重比对，其使用CLUSTAL W(1.83)(在Kyoto University Bioinformatics Center的GenomeNet服务器上)和默认值(Blosum62为权重距阵、空位开放罚分为10、空位延伸罚分为0.05)。
图20代表双元载体p0443和p0448，它们用于分别使用SEQ ID NO:194（编码来自REV多肽的部分CTR）所示的REVΔHDZip/START核酸序列，以及SEQ ID NO:198（编码完整REV多肽）所示的REV核酸序列，以降低稻中内源REV基因的表达。核酸序列作为反向重复克隆，其通过非编码区（此处为来自烟草的基质附着区(MAR)）分开，目标为获得具有发夹构象的mRNA。在两个不同的质粒中，组成型启动子(PRO0129)均控制核酸序列SEQ ID NO:194和SEQ ID NO:198的表达。
CLE
图21显示CLE-样多肽SEQ ID NO:233的结构域结构：斜体是信号序列，蛋白酶解加工所需的保守Arg残基以黑体示出(此处为Arg73)，CLE结构域有下划线。
图22给出CLE-样多肽的多重比对：序列排列（alignment）下面的单点表示保守性较低的取代，冒号表示高度保守性取代，星号表示所有序列中的保守残基。
图23代表双元载体p068，其用于稻中的内源基因沉默，优选使用在胚乳特异性启动子(PRO90)控制下的具有发夹结构的编码CLE-样多肽的核酸序列或其部分。
SYR NUE
图24给出SEQ ID NO:252中存在的保守基序的概述。富含亮氨酸的结构域有下划线，保守基序1、2和3以黑体示出，呈斜体的序列代表推定的N-糖基化位点和推定的蛋白激酶C磷酸化位点。
图25显示多个SYR蛋白质的多重比对。星号表示相同的氨基酸残基， 冒号代表高度保守性取代，点代表保守性较低的取代。根据来自图1的信息，SEQ ID NO:252中的各个结构域和保守基序可容易的在其他SYR蛋白质中鉴定。
图26显示双元载体pGOS2::SYR，其用于在稻中转录和表达稻GOS2启动子控制下的稻SYR核酸。
图27详述了用于实施本发明方法的序列的实例，或用于分离此类序列的序列的实例。序列可来自低质量测序的公共EST集合。作为结果，可期望几个核酸取代。5’和3’UTR均可用于实施本发明的方法。SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:58涉及ERLK；SEQ ID NO:58至SEQ ID NO:112涉及FBXWD40；SEQ ID NO:113至SEQ ID NO:155涉及RANBP；SEQ ID NO:156至SEQ ID NO:193和SEQ ID NO:58涉及GLK；SEQ ID NO:194至SEQ ID NO:231和SEQ ID NO:58涉及REV ΔHDZip/START;SEQ ID NO:232至SEQ ID NO:250涉及CLE；SEQ ID NO:58和SEQ ID NO:251至SEQ ID NO:292涉及SYR。SEQ ID NO:276代表ARGOS蛋白序列(GenBank登录号AY305869)。
实施例
本发明现在将参考仅作为说明的下列实施例加以描述。下列实施例不意图彻底定义或限制本发明范围。
DNA操作：除非另外声明，重组DNA技术根据(Sambrook(2001)Molecular Cloning：a laboratory manual，第三版Cold Spring Harbor Laboratory Press，CSH，New York)中或Ausubel等(1994)，Current Protocols in Molecular Biology，Current Protocols第1和2卷中描述的标准方法进行。用于植物分子工作的标准材料和方法在由BIOS Scientific Publications Ltd(UK)和Blackwell Scientific Publications(UK)出版的R.D.D.Croy的Plant Molecular Biology Labfax(1993)中描述。
实施例1：鉴定ERLK蛋白质SEQ ID NO:2在拟南芥、稻和其他植 物物种中的同源物
使用数据库序列搜索工具，如基本局部比对工具(BLAST)(Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403-410；和Altschul等(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-3402)在国家生物技术信息中心的Entrez核苷酸数据库中所维护的那些序列内鉴定到与本发明方法中所用核酸序列相关的(全长cDNA、EST或基因组)序列。该程序一般用来通过核酸序列或多肽序列与序列数据库比较并通过计算匹配的统计学显著性而找到序列间具有局部相似性的区域。对本发明核酸所编码的多肽使用TBLASTN算法，采用默认设置和过滤以忽略低复杂性序列抵消。分析的结果通过配对性比较显示，并根据几率评分(E-值)排序，其中该评分反映特定比对结果因偶然而发生的概率(E-值越低，命中的显著性越高)。除了E-值外，比较还通过同一性百分数进行记分。同一性百分数指两个所比较核酸(或多肽)序列之间在特定长度范围内的相同核苷酸(或氨基酸)数目。在一些情况下，可以调整默认参数以调节搜索法的严格性。
来自多种植物物种的稻序列和EST序列也可从其他数据库获得，例如KOME(Knowledge-based Oryza Molecular biological Encyclopedia;Kikuchi等，Science301,376-379,2003)、Sputnik(Rudd,S.,Nucleic Acids Res.,33:D622-D627,2005)或Eukaryotic Gene直向同源物数据库(EGO，基因组研究所（The Institute for Genomic Research）拥有)。这些数据库可用BLAST工具搜索。SEQ ID NO:11至SEQ ID NO:56是SEQ ID NO:2同源物的核酸和蛋白质序列，它们使用SEQ ID NO:2作为查询序列从上述数据库获得。
表A:与本发明方法中所用核酸序列(SEQ ID NO:1)相关的核酸序列，和相应的推导多肽
实施例2:确定ERLK蛋白质的激酶结构域之间的全局相似性和同一性
ERLK蛋白质的激酶结构域之间的相似性百分数和同一性百分数使用MatGAT(矩阵全局比对工具)软件(BMC Bioinformatics.20034:29.MatGAT：使用蛋白质序列或DNA序列产生相似性/同一性矩阵的应用.Campanella JJ，Bitincka L，Smalley J；软件由Ledion Bitincka所有)加以确定。MatGAT软件产生针对DNA序列或蛋白质序列的相似性/同一性矩阵，无需数据的预比对。使用Myers和Miller全局比对算法(空位开口罚分12和空位延伸罚分2)，该程序执行一系列配对比对，使用例如Blosum62(对于多肽)计算相似性和同一性并且随后将结果置于距离矩阵中。序列相似性在分界线的下半部分中显示，序列同一性在对角分界线的上半部分中显示。SEQ ID NO:2的序列在矩阵中显示为第1号。
在表C中显示针对ERLK多肽的激酶结构域的全局相似性和同一性的软件分析结果。激酶结构域使用SMART工具绘出，获得的序列在表B中列出。同一性百分数在对角线之上给出（黑体）并且相似性百分数在对角线之下给出（正常字体）。在CDS845(SEQ ID NO:2)ERLK旁系同源物和直向同源物的激酶结构域间的同一性百分数范围是30-68.8%。
表B:用SMART分析获得的和用于MATGAT分析中的激酶结构域序列
表C：
实施例3:克隆本发明方法中所用核酸序列
DNA操作：除非另外声明，重组DNA技术根据(Sambrook(2001)Molecular Cloning：a laboratory manual，第三版Cold Spring Harbor Laboratory Press，CSH，New York)中或Ausubel等(1994)，Current Protocols in Molecular Biology，Current Protocols第1和2卷中描述的标准方法进行。用于植物分子工作的标准材料和方法在由BIOS Scientific Publications Ltd(UK)和Blackwell Scientific Publications(UK)出版的R.D.D.Croy的Plant Molecular Biology Labfax(1993)中描述。
本发明方法中所用的核酸序列通过PCR，使用定制的拟南芥幼苗cDNA文库(在MV Sport6.0内；Invitrogen，Paisley，UK)作为模板进行扩增。使用Hifi Taq DNA聚合酶，在标准条件下利用在50μlPCR混合物中的200ng模板进行PCR。所用的引物是prm2500(SEQ ID NO:3；有义，起始密码子为粗体字：
5’ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcacaatggaaaacaaaagccatagc3’)和prm2501(SEQ ID NO:4；反义，互补：
5′ggggaccactttgtacaagaaagctgggtaaacaaaagagtgtcatggca3′)，其中所述引物包括用于Gateway重组的AttB位点。扩增的PCR片段也使用标准方法予以纯化。随后实施Gateway方法的第一步骤，即BP反应，在此期间PCR片段与pDONR201质粒发生体内重组以产生根据Gateway命名的“进入克隆”p031。质粒pDONR201作为
技术的部分从Invitrogen购买。
实施例4:表达载体构建
进入克隆p031随后在LR反应中与p05050(一种用于稻转化的目的载体)一起使用。这种载体在T-DNA边界内含有作为功能性元件的：植物选择性标记；筛选标记表达盒和意图与已经克隆于所述进入克隆中的目的核酸序列发生LR体内重组的Gateway盒。稻非病毒组成型启动子，GOS2 启动子(SEQ ID NO:58)位于这种Gateway盒的上游。
在LR重组步骤后，将产生的表达载体p030(图4)转化至农杆菌菌株LBA4044并随后转化至稻植物内。
实施例5：植物转化
稻转化
含有表达载体的农杆菌用来转化稻植物。将稻的日本栽培品种Nipponbare的成熟干燥种子脱壳。通过在70%乙醇中温育一分钟，随后在2%HgCl2中30分钟，随后用无菌蒸馏水洗涤6次15分钟而实施消毒。消毒的种子随后在含有2,4-D的培养基(愈伤组织诱导培养基)上萌发。在黑暗中温育4周后，将来自小盾片的愈伤组织切下并在同一种培养基上增殖。2周后，愈伤组织通过在同一种培养基上传代培养另外2周而繁殖或增殖。胚发生性愈伤组织片在新鲜培养基上传代培养3日，之后共培育(以增强细胞分裂活性)。
含有表达载体的农杆菌菌株LBA4404用于共培育。农杆菌接种在含有适宜抗生素的AB培养基上并在28℃培养3日。随后将细菌收集并重悬在液体共培育培养基中至密度(OD600)约1。将混悬液随后转移至培养皿并将愈伤组织在该混悬液内浸泡15分钟。愈伤组织组织随后在滤纸上吸干并转移至固化的共培育培养基上并且在黑暗中于25℃温育3日。共培育的愈伤组织在黑暗中于28℃在选择剂存在下于含有2,4-D的培养基上培育4周。在此时段期间，形成迅速生长的抗性愈伤组织岛。在这种材料转移至再生培养基并在光线下温育后，胚发生潜力释放并且苗在随后4-5周发育。将苗从愈伤组织中切下并且在含有植物生长素的培养基上温育2-3周，其中将苗从所述的培养基上转移至土壤。硬化的苗在高湿度和短日照下于温室中培育。
对于一个构建体，产生大约35个独立T0稻转化体。将原代转化体从组织培养箱转移至温室。在定量PCR分析以验证T-DNA插入物的拷贝数后，仅保留表现选择剂耐受性的单拷贝转基因植物用于收获T1种子。种 子随后在移植后3-5月收获。本方法以超过50%的比率产生单一基因座转化体(Aldemita和Hodges1996，Chan等1993，Hiei等1994)。
玉米转化
玉米的转化根据对Ishida等(1996.Nature Biotech14（6）：745-50)描述方法的改良方法进行。在玉米中的转化是基因型依赖的并且仅特定的基因型可操作用于转化和再生。近交系A188(明尼苏达大学)或以A188作为亲本的杂种是用于转化的供体材料的良好来源，但是其他基因型也可以成功地使用。玉米穗从玉米植物中在授粉后大约11日(DAP)收获，此时不成熟胚的长度是大约1至1.2mm。不成熟胚与含有表达载体的根癌农杆菌共培育并且转基因植物通过器官发生而恢复。切下的胚在愈伤组织诱导培养基上、随后在玉米再生培养基上培育，其中所述的再生培养基含有选择剂(例如咪唑啉酮，但可以使用多种选择性标记)。培养板在25℃于光照下培养2-3周，或直至苗发育。将绿色苗从每个胚转移至玉米生根培养基并在25℃培养2-3周，直至根发育。将生根的苗移植至温室的土壤中。从表现选择剂耐受的并含有单拷贝的T-DNA插入物的植物中产生T1种子。
小麦转化
小麦的转化用Ishida等Ishida等(1996)Nature Biotech14(6):745-50描述的方法进行。通常在转化中使用(可从墨西哥CIMMYT获得的)栽培品种Bobwhite。不成熟胚与含有表达载体的根癌农杆菌共培育并且转基因植物通过器官发生而恢复。在与农杆菌温育后，胚在愈伤组织诱导培养基上、随后在再生培养基上体外培育，其中所述的再生培养基含有选择剂(例如咪唑啉酮，但可以使用多种选择性标记)。培养平板在25℃于光照下培养2-3周，或直至苗发育。将绿色苗从每个胚转移至生根培养基并在25℃培养2-3周，直至根发育。将生根的苗移植至温室的土壤中。从表现选择剂耐受的并含有单拷贝的T-DNA插入物的植物中产生T1种子。
大豆转化
根据对Texas A&M美国专利5,164,310中所述方法的改良方法转化大豆。几个商业大豆品种对于通过这种方法的转化是可行的。栽培品种 Jack(从Illinois种子基金会可获得)通常用于转化。对大豆种子消毒以便体外播种。从7日龄幼苗中切下下胚轴、胚根和一片子叶。进一步培育上胚轴和余下的子叶以发育腋生节。将这些腋生节切下并与含有表达载体的根癌农杆菌温育。在共培育处理之后，将外植体洗涤并转移至选择培养基。将再生的苗切下并置于苗伸长培养基上。将长度不超过1cm的苗置于生根培养基上直至根发育。将生根的苗移植至温室的土壤中。从表现选择剂耐受的并含有单拷贝T-DNA插入物的植物中产生T1种子。
油菜籽/卡诺拉油菜转化
使用5-6日龄幼苗的子叶柄和下胚轴作为用于组织培养的外植体并且根据Babic等(1998，Plant Cell Rep17:183-188)转化。商业栽培品种Westar(Agriculture Canada)是用于转化的标准品种，但是也可以使用其他品种。对卡诺拉油菜种子作表面消毒以便体外播种。从体外幼苗中切下具有附着子叶的子叶柄外植体，并以(含有表达载体的)农杆菌通过叶柄外植体的切口端浸入细菌混悬液而接种。外植体随后在含有3mg/l BAP、3%蔗糖、0.7%植物琼脂(Phytagar)的MSBAP-3培养基上在23℃，16小时光照下培养2天。在与农杆菌共培育2日后，将叶柄外植体转移至含有的3mg/l BAP、头孢噻肟、羧苄青霉素或特美汀(300mg/l)的MSBAP-3培养基上持续7日，并且随后在含头孢噻肟、羧苄青霉素或特美汀和选择剂的MSBAP-3培养基上培养，直至苗再生。当苗具有5–10mm长度时，将苗切下并转移至苗伸长培养基(含0.5mg/l BAP的MSBAP-0.5)。将长度大约2cm的苗转移至用于根诱导的生根培养基(MS0)。将生根的苗移植至温室的土壤中。从表现选择剂耐受性并含有单拷贝T-DNA插入物的植物中产生T1种子。
苜蓿转化
苜蓿的再生性克隆使用(McKersie等，1999Plant Physiol119:839–847)的方法加以转化。苜蓿的再生和转化是基因型依赖性的并且因而需要再生植物。已经描述了获得再生性植物的方法。例如，这些再生性植物可以选自栽培品种Rangelander(Agriculture Canada)或如Brown DCW与A Atanassov(1985.Plant Cell Tissue Culture4:111-112)描述的任何其他商业苜蓿品种。备选地，RA3品种(威斯康星大学)已经被选择用于组织培养中(Walker等，1978Am J Bot65:654-659)。将叶柄外植体与含有表达载体的根癌农杆菌C58C1pMP90(McKersie等，1999Plant Physiol119:839–847)或LBA4404的过夜培养物共培育。外植体在黑暗中在含有288mg/L Pro、53mg/L硫代脯氨酸、4.35g/L K2SO4和100μm乙酰丁香酮的SH诱导培养基上共培育3天.外植体在半浓缩Murashige-Skoog培养基(Murashige和Skoog，1962)中洗涤并平板接种在不含乙酰丁香酮而含有合适选择剂和合适抗生素以抑止农杆菌生长的相同SH诱导培养基上。在数周后，将体细胞胚转移至不含生长调节剂、不含抗生素而含有50g/L蔗糖的BOi2Y发育培养基中。体细胞胚随后在半浓缩Murashige-Skoog培养基上萌发。
将生根的幼苗移植至花钵内并且在温室中培育。从表现选择剂耐受性并含有单拷贝T-DNA插入物的植物中产生T1种子。
实施例6：评价方法
6.1评价准备
产生大约30个独立的T0稻转化体。原代转化体从组织培养箱转移至温室用于生长和收获T1种子。留下7个事件，其中所述事件的T1后代对转基因的存在/不存在以3:1比例分离。对于这些事件中的每一事件，通过监测目视标记表达而选择含有转基因的大约10株T1幼苗(杂合子和纯合子)和缺少转基因的大约10株T1幼苗(失效合子)。转基因植物和对应的失效合子在随机位置上并排培育。温室条件是短日照(12小时光照)，在光线下28℃和在黑暗中22℃以及相对湿度70%。
4个T1事件在T2世代中按照如用于T1世代的相同评价方法作进一步评估，但每个事件采用更多的个体。使植物从播种期直至成熟期通过数字成像箱数次。在每一时间点上，对每株植物从至少6个不同角度拍摄数字图像(2048x1536像素，1600万颜色)。
6.2统计学分析：t-检验和F-检验
使用双因子ANOVA(方差分析)作为统计模型用于植物表型特征的整体评价。对用本发明基因转化的全部事件的全部植物的所有测量参数实施F检验。实施F检验以检查基因对于全部转化事件的作用并验证基因的整体作用(又称作全局基因作用)。用于真实全局基因作用的显著性的阈值对于F检验设置在5%概率水平上。显著性F检验值标示基因作用，意味着不仅仅基因的存在或位置才造成表型上的差异。
实施例7:评价结果
植物地上部分面积(或叶生物量)通过计数在来自植物地上部分的数字图像上区别于背景的像素的总数而测定。该值对在相同时间点上从不同角度拍摄的画面进行平均化并且通过校正转化成以平方mm表达的物理表面值。实验证实以这种方式测量的地上部分植物面积与地上植物部分的生物量相关。地上部分面积是在植物已经达到其最大叶生物量的时间点。
将成熟的主圆锥花序收获、计数、装袋、加条形码标记并且随后在干燥箱内在37℃干燥3日。随后将圆锥花序脱粒并且收集及计数全部种子。使用吹气装置分开饱满粒与空粒。弃去空粒并再次对剩余部分计数。饱满粒在分析天平上称重。饱满种子数通过计数分离步骤后的饱满粒数而确定。种子总产量通过称量从植物中收获的全部饱满粒而测量。
如在表D至表F中所示，与合适的对照植物相比，地上部分生物量、种子产量、饱满种子数、在编码ERLK蛋白质的核酸的表达增加的转基因植物中增加。显示了来自T1和T2世代的结果。
表D显示在编码ERLK蛋白质的核酸的表达增加的转基因稻的T1和T2世代中，地上部分生物量增加的百分数以及这种增加根据F-检验的统计关联性。
表D:
表E显示在编码ERLK蛋白质的核酸的表达增加的转基因稻的T1和T2世代中，种子总产量（种子总重量）增加的百分数以及这种增加根据F-检验的统计关联性。
表E：
表F显示在编码ERLK蛋白质的核酸的表达增加的转基因稻的T1和T2世代中，饱满种子数增加的百分数以及这种增加根据F-检验的统计关联性。
表F：
FBXW
实施例8：鉴定与本发明方法中所用核酸序列相关的序列
使用数据库序列搜索工具，如基本局部比对工具(BLAST)(Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403-410；和Altschul等(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-3402)在国家生物技术信息中心的Entrez核苷酸数据库中所维护的那些序列内鉴定到与本发明方法中所用核酸序列相关的(全长cDNA、EST或基因组)序列。该程序用来通过核酸序列或多肽序列与序列数据库比较并通过计算匹配的统计学显著性而找到序列间具有局部相似性的区域。对本发明核酸所编码的多肽使用TBLASTN算法，采用默认设置和过滤以忽略低复杂性序列抵消。分析的结果通过配对性比较显示，并根据几率评分(E-值)排序，其中该评分反映特定比对结果因偶然而发生的概率(E-值越 低，命中的显著性越高)。除了E-值外，比较还通过同一性百分数进行记分。同一性百分数指两个所比较核酸(或多肽)序列之间在特定长度范围内的相同核苷酸(或氨基酸)数目。在一些情况下，可以调整默认参数以调节搜索法的严格性。
下表提供与执行本发明方法中所用核酸序列相关的核酸序列列表。
表G：与本发明方法中所用核酸序列(SEQ ID NO:59)相关的核酸序列，和对应的推导多肽
实施例9:确定FBXW多肽及其如SEQ ID NO:102和SEQ ID NO:103所示的保守区（均包含在SEQ ID NO:60中）之间的全局相似性和同一性
使用本领域可获得的方法之一MatGAT(矩阵全局比对工具)软件(BMC Bioinformatics.20034:29.MatGAT：使用蛋白质序列或DNA序列产生相似性/同一性矩阵的应用.Campanella JJ，Bitincka L，Smalley J；软件由Ledion Bitincka所有)确定全长FBXW多肽序列之间的全局相似性百分数和同一性百分数。MatGAT软件产生针对DNA序列或蛋白质序列的相似性/同一性矩阵，无需数据的预比对。使用Myers和Miller全局比对算法(空位开口罚分12和空位延伸罚分2)，该程序执行一系列配对比对，使用例如Blosum62(对于多肽)计算相似性和同一性并且随后将结果置于距离矩阵中。序列相似性在分界线的下半部分中显示，序列同一性在对角分界线的上半部分中显示。SEQ ID NO:60的序列来自拟南芥(code Arath_FBXW)。
比较中所用的参数是：
记分矩阵：Blosum62
第一空位：12
延伸性空位：2
在表H中显示针对FBXW多肽全长的全局相似性和同一性的软件分析结果。同一性百分数在对角线之上给出并且相似性百分数在对角线之下给出。在FBXW旁系同源物和直向同源物间的同一性百分数范围是45-80%，反映所述旁系同源物和直向同源物间相对低的序列同一性保守。 表H：用于在FBXW多肽全长上的全局相似性和同一性的MatGAT结果
在表I和J中显示针对FBXW多肽的保守区1(如SEQ ID NO:102所示，包含在SEQ ID NO:60中)和2(SEQ ID NO:103，包含在SEQ ID NO:60中)的全局相似性和同一性的软件分析结果。同一性百分数在对角线之上给出并且相似性百分数在对角线之下给出。在FBXW旁系同源物和直向同源物的保守区1(如SEQ ID NO:102)和保守区2(如SEQ ID NO:103)间的同一性百分数范围是65-100%（同一性百分数范围是85-100%）。
表I：用于在FBXW多肽的保守区1(如SEQ ID NO:102)上的全局相似性和同一性的MatGAT结果
表J：用于在FBXW多肽的保守区2(如SEQ ID NO:103)上的全局相似性和同一性的MatGAT结果
实施例10:克隆本发明方法中所用的核酸序列
DNA操作：除非另外声明，重组DNA技术根据(Sambrook(2001)Molecular Cloning：a laboratory manual，第三版Cold Spring Harbor Laboratory Press，CSH，New York)中或Ausubel等(1994)，Current Protocols in Molecular Biology，Current Protocols第1和2卷中描述的标准方法进行。用于植物分子工作的标准材料和方法在由BIOS Scientific Publications Ltd(UK)和Blackwell Scientific Publications(UK)出版的R.D.D.Croy的Plant Molecular Biology Labfax(1993)中描述。
本发明方法中所用的核酸序列通过PCR，使用定制的拟南芥混合组织cDNA文库(在pCMV Sport6.0内；Invitrogen，Paisley，UK)作为模板进行扩增。使用Hifi Taq DNA聚合酶，在标准条件下利用在50μlPCR混合物中的200ng模板进行PCR。所用的引物是prm06999(SEQ ID NO:105；有义，AttB1位点是小写字体：
5’-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaaacaATGAATCGTTTTTCTCGTTT3’)
和prm07000(SEQ ID NO:106；反义，互补，AttB2位点是小写字体：
5’ggggaccactttgtacaagaaagctgggtATCCAATCTTATCGCTTAGG3’)，
其中所述引物包括用于Gateway重组的AttB位点。扩增的PCR片段也使用标准方法予以纯化。随后实施Gateway方法的第一步骤，即BP反应，在此期间PCR片段与pDONR201质粒发生体内重组以产生根据Gateway命名的“进入克隆”p08433。质粒pDONR201作为技术的部分从Invitrogen购买。
实施例11:表达载体构建
进入克隆p08433随后在LR反应中与p00640(一种用于稻转化的目的载体)一起使用。这种载体在T-DNA边界内含有作为功能性元件的：植物选择性标记；筛选标记表达盒和意图与已经克隆于所述进入克隆中的目的核酸序列发生LR体内重组的Gateway盒。用于组成型表达的稻GOS2启动子(SEQ ID NO:58)(PRO0129)位于这种Gateway盒的上游。
在LR重组步骤后，将产生的表达载体p15973(图7)转化至农杆菌菌株LBA4044并随后转化至稻植物内。允许转化的稻植物生长并随后对下文所述参数进行检验。
实施例12：评价方法
12.1评价准备
产生大约35个独立的T0稻转化体。原代转化体从组织培养箱转移至温室用于生长和收获T1种子。留下7个事件，其中所述事件的T1后代对 转基因的存在/不存在以3:1比例分离。对于这些事件中的每一事件，通过监测目视标记表达而选择含有转基因的大约10株T1幼苗(杂合子和纯合子)和缺少转基因的大约10株T1幼苗(失效合子)。转基因植物和对应的失效合子在随机位置上并排培育。温室条件是短日照(12小时光照)，在光线下28℃和在黑暗中22℃以及相对湿度70%。
4个T1事件在T2世代中按照如用于T1世代的相同评价方法作进一步评估，但每个事件采用更多的个体。使植物从播种期直至成熟期通过数字成像箱数次。在每一时间点上，对每株植物从至少6个不同角度拍摄数字图像(2048x1536像素，1600万颜色)。
12.2统计分析：F-检验
使用双因子ANOVA(方差分析)作为统计模型用于植物表型特征的整体评价。对用本发明基因转化的全部事件的全部植物的所有测量参数实施F检验。实施F检验以检查基因对于全部转化事件的作用并验证基因的整体作用(又称作全局基因作用)。用于真实全局基因作用的显著性的阈值对于F检验设置在5%概率水平上。显著性F检验值标示基因作用，意味着不仅仅基因的存在或位置才造成表型上的差异。
实施例13：评价结果
植物地上部分面积(或叶生物量)通过计数在来自植物地上部分的数字图像上区别于背景的像素的总数而测定。该值对在相同时间点上从不同角度拍摄的画面进行平均化并且通过校正转化成以平方mm表达的物理表面值。实验证实以这种方式测量的地上部分植物面积与地上植物部分的生物量相关。地上部分面积是在植物已经达到其最大叶生物量的时间点。
将成熟的主圆锥花序收获、计数、装袋、加条形码标记并且随后在干燥箱内在37℃干燥3日。随后将圆锥花序脱粒并且收集及计数全部种子。使用吹气装置分开饱满粒与空粒。弃去空粒并再次对剩余部分计数。饱满粒在分析天平上称重。饱满种子数通过计数分离步骤后的饱满粒数而确定。种子总产量通过称量从植物中收获的全部饱满粒而测量。每株植物种子总 数通过计数从植物中收获的壳粒数目而测量。从计数的饱满种子数及其总重量外推出千粒重(TKW)。收获指数(HI)在本发明中定义为种子总产量与地上部分面积(mm2)之间的比，乘以系数106。如本发明中定义的每圆锥花序的总花数是种子总数与成熟主圆锥花序的数目之间的比率。如本发明中定义的种子饱满率是饱满种子数对种子(或小花)总数的比例(表述为%)。
如在表K至表O中所示，与合适的对照植物相比，地上部分生物量、每个圆锥花序的花数、种子产量、种子总数、饱满种子数、千粒重(TKW)和收获指数在编码FBXW多肽的核酸的表达增加的转基因植物中增加。显示了来自T1和T2世代的结果。
表K显示具有种子总产量（种子总重量）增加的转基因事件的数目、这种增加的百分数以及这种增加根据F-检验的统计关联性。
表K：在编码FBXW多肽的核酸表达增加的转基因稻的T1和T2世代中具有种子总产量增加的转基因事件的数目、这种增加的百分数和F-检验的P值。
表L显示具有饱满种子数增加的转基因事件的数目、这种增加的百分数以及这种增加根据F-检验的统计关联性。
表L：在编码FBXW多肽的核酸表达增加的转基因稻的T1和T2世代中具有饱满种子数增加的转基因事件的数目、这种增加的百分数和F-检验的P值。
表M显示具有收获指数增加的转基因事件的数目、这种增加的百分数以及这种增加根据F-检验的统计关联性。
表M：在编码FBXW多肽的核酸表达增加的转基因稻的T1和T2世代中具有收获指数增加的转基因事件的数目、这种增加的百分数和F-检验的P值。
表N显示具有千粒重(TKW)增加的转基因事件的数目、这种增加的百分数以及这种增加根据F-检验的统计关联性。
表N：在编码FBXW多肽的核酸表达增加的转基因稻的T1和T2世代中具有千粒重(TKW)增加的转基因事件的数目、这种增加的百分数和F-检验的P值。
表O显示具有种子饱满率增加的转基因事件的数目、这种增加的百分数以及这种增加根据F-检验的统计关联性。
表O：在编码FBXW多肽的核酸表达增加的转基因稻的T1和T2世代中具有种子饱满率增加的转基因事件的数目、这种增加的百分数和F-检验的P值。
RANBP
实施例14：鉴定与本发明方法中所用核酸序列相关的序列
使用数据库序列搜索工具，如基本局部比对工具(BLAST)(Altschul等 (1990)J.Mol.Biol.215：403-410；和Altschul等(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-3402)在国家生物技术信息中心(NCBI)的Entrez核苷酸数据库中所维护的那些序列内鉴定到与本发明方法中所用核酸序列相关的(全长cDNA、EST或基因组)序列。该程序用来通过核酸序列或多肽序列与序列数据库比较并通过计算匹配的统计学显著性而找到序列间具有局部相似性的区域。例如，本发明所用核酸编码的多肽使用TBLASTN算法，采用默认设置和过滤以忽略低复杂性序列抵消。分析的结果通过配对性比较显示，并根据几率评分(E-值)排序，其中该评分反映特定比对结果因偶然而发生的概率(E-值越低，命中的显著性越高)。除了E-值外，比较还通过同一性百分数进行记分。同一性百分数指两个所比较核酸(或多肽)序列之间在特定长度范围内的相同核苷酸(或氨基酸)数目。在一些情况下，可以调整默认参数以调节搜索法的严格性。例如可以增加E-值以显示严格性较小的匹配。以这种方式，可以鉴定短的几乎精确的匹配。
表P提供与执行本发明方法中所用核酸序列相关的核酸序列列表。
表P：与本发明方法中所用核酸序列(SEQ ID NO:113)相关的核酸序列，和对应的推导多肽
在一些情况下，相关序列已经由研究所如基因组研究所(TIGR)试验性汇编并向公众公开。真核生物基因直向同源物(EGO)数据库可以用来此类的相关序列，这可通过关键词搜索通过使用BLAST算法利用目的核酸或多肽序列进行。
实施例15：克隆本发明方法中所用玉蜀黍RANBP编码核酸序列
本发明方法中所用的核酸序列通过PCR，使用玉米胚乳cDNA文库作为模板进行扩增。使用Hifi Taq DNA聚合酶，在标准条件下利用在50μlPCR混合物中的200ng模板进行PCR。所用的引物是prm06703(SEQ ID NO:151；有义，起始密码子为粗体字，AttB1位点是斜体：
5′-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaaacaatggcggacaaggagc-3’)和prm06704(SEQ ID NO:152；反义，互补，AttB2位点是斜体：
5’ggggaccactttgtacaagaaagctgggtagtgcaacc acaccaactact3’)，
其中所述引物包括用于Gateway重组的AttB位点。扩增的PCR片段也使用标准方法予以纯化。随后实施Gateway方法的第一步骤，即BP反应，在此期间PCR片段与pDONR201质粒发生体内重组以产生根据Gateway命名的“进入克隆”。质粒pDONR201作为
技术的部分从Invitrogen购买。
实施例16:表达载体构建
进入克隆随后在LR反应中与用于稻转化的目的载体一起使用。这种载体在T-DNA边界内含有作为功能性元件的：植物选择性标记；筛选标记表达盒和意图与已经克隆于所述进入克隆中的目的核酸序列发生LR体内重组的Gateway盒。用于胚特异性表达(内参PRO90)的谷醇溶蛋白启动子(SEQ ID NO:155)位于这种Gateway盒的上游。
在LR重组步骤后，将产生的表达载体p072(图9)转化至农杆菌菌株LBA4044并随后转化至稻植物内。允许转化的稻植物生长并随后对下文所述参数进行检验。
实施例17：克隆本发明方法中所用拟南芥RANBP编码核酸序列
本发明方法中所用的核酸序列通过PCR，使用拟南芥cDNA文库(在MV Sport6.0内；Invitrogen，Paisley，UK)作为模板进行扩增。使用Hifi Taq DNA聚合酶，在标准条件下利用在50μlPCR混合物中的200ng模板进行PCR。所用的引物是6491(SEQ ID NO:153；有义，起始密码子为粗体字，AttB1位点是斜体：5’-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcacaatggcgagcattagcaac3’)和6492(SEQ ID NO:154；反义，互补，AttB2位点是斜体：5′ggggaccactttgtacaagaaagctgggtgcatcttaagctgagggaac3’)，
其中所述引物包括用于Gateway重组的AttB位点。扩增的PCR片段也使用标准方法予以纯化。随后实施Gateway方法的第一步骤，即BP反应，在此期间PCR片段与pDONR201质粒发生体内重组以产生根据Gateway命名的“进入克隆”。质粒pDONR201作为技术的部分从Invitrogen购买。
实施例18:表达载体构建
进入克隆随后在LR反应中与用于稻转化的目的载体一起使用。这种载体在T-DNA边界内含有作为功能性元件的：植物选择性标记；筛选标记表达盒和意图与已经克隆于所述进入克隆中的目的核酸序列发生LR体内重组的Gateway盒。用于胚特异性表达的谷醇溶蛋白启动子(SEQ ID NO:155)(内参PRO90)位于这种Gateway盒的上游。
在LR重组步骤后，将产生的表达载体p074(图10)转化至农杆菌菌株LBA4044并随后转化至稻植物内。允许转化的稻植物生长并随后对下文所述参数进行检验。
实施例19：评价方法
19.1评价准备
产生大约30个独立的T0稻转化体。原代转化体从组织培养箱转移至温室用于生长和收获T1种子。留下7个事件，其中所述事件的T1后代对转基因的存在/不存在以3:1比例分离。对于这些事件中的每一事件，通过监测目视标记表达而选择含有转基因的大约10株T1幼苗(杂合子和纯合子)和缺少转基因的大约10株T1幼苗(失效合子)。转基因植物和对应的失效合子在随机位置上并排培育。温室条件是短日照(12小时光照)，在光线下28℃和在黑暗中22℃以及相对湿度70%。
4个T1事件在T2世代中按照如用于T1世代的相同评价方法作进一步评估，但每个事件采用更多的个体。使植物从播种期直至成熟期通过数字成像箱数次。在每一时间点上，对每株植物从至少6个不同角度拍摄数字图像(2048x1536像素，1600万颜色)。
19.2统计分析：t检验和F-检验
使用双因子ANOVA(方差分析)作为统计模型用于植物表型特征的整体评价。对用本发明基因转化的全部事件的全部植物的所有测量参数实施F检验。实施F检验以检查基因对于全部转化事件的作用并验证基因的整体作用(又称作全局基因作用)。用于真实全局基因作用的显著性的阈值对于F检验设置在5%概率水平上。显著性F检验值标示基因作用，意味着不仅仅基因的存在或位置才造成表型上的差异。
为检查基因在事件中的作用，即株系特异性作用，使用来自转基因植物和对应的无效植物的数据集在每个事件内进行t检验。”无效植物”或“无效分离子”或“失效合子”是以与转基因植物相同的方式受到处理，但是转基因已经从中发生分离的植物。无效植物也可以描述为纯合阴性转化植物。用于t检验的显著性的阈值设置在10%概率水平上。一些事件的结果可以高于或低于这个阈值。这基于如此假设，即基因可能仅在基因组中某些位置内具有作用，并且这种位置依赖性作用的出现并非罕见。这种基因作用 在本文中又称作“基因的株系作用”。p-值通过t-值与t-分布比较或备选地通过F-值与F-分布比较而获得。该p-值随后给出无效假设(即转基因的作用不存在)是正确的概率。
实施例20：评价结果
相对于对照植物中的各项，表达在谷醇溶蛋白启动子控制下的玉米RANBP的转基因稻植物产生增加的平均种子重量、饱满种子数、收获指数、生物量、饱满率、千粒重(TKW)、种子平均面积、种子平均长度和种子平均宽度。具体而言，在T1世代中TKW增加，并该增加在T2植物世代中得到确认。发现具有来自F-检验的p-值>0.00001的该增加是统计学显著的。同样值得注意的是，相对于对照植物饱满率增加，在T1世代中的该增加在T2植物世代中得到确认。同样发现具有来自F-检验的p-值为0.001的该增加是统计学显著的。
相对数据
相对于对照植物，表达在组成型GOS2启动子控制下的玉米RANBP的转基因稻植物未产生产量的实质性不同。相对于对照植物，转基因植物的平均种子重量、饱满种子数、收获指数、生物量、饱满率或千粒重(TKW)没有增加。
相对于对照植物中的各项，表达在谷醇溶蛋白启动子控制下的拟南芥RANBP的转基因稻植物产生增加的生物量、平均种子重量、饱满种子数、每个圆锥花序的花数、收获指数、饱满率和千粒重。
GLK
实施例21:在拟南芥、稻和其他植物物种中鉴定GLK蛋白质SEQ ID NO:157的同源物
使用数据库序列搜索工具，如基本局部比对工具(BLAST)(Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403-410；和Altschul等(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-3402)在国家生物技术信息中心的Entrez核苷酸数据库中所维护 的那些序列内鉴定到与本发明方法中所用核酸序列相关的(全长cDNA、EST或基因组)序列。该程序一般用来通过核酸序列或多肽序列与序列数据库比较并通过计算匹配的统计学显著性而找到序列间具有局部相似性的区域。对本发明核酸所编码的多肽使用TBLASTN算法，采用默认设置和过滤以忽略低复杂性序列抵消。分析的结果通过配对性比较显示，并根据几率评分(E-值)排序，其中该评分反映特定比对结果因偶然而发生的概率(E-值越低，命中的显著性越高)。除了E-值外，比较还通过同一性百分数进行记分。同一性百分数指两个所比较核酸(或多肽)序列之间在特定长度范围内的相同核苷酸(或氨基酸)数目。在一些情况下，可以调整默认参数以调节搜索法的严格性。
来自多种植物物种的稻序列和EST序列也可从其他数据库获得，例如KOME(Knowledge-based Oryza Molecular biological Encyclopedia;Kikuchi等，Science301,376-379,2003)、Sputnik(Rudd,S.,Nucleic Acids Res.,33:D622-D627,2005)或Eukaryotic Gene直向同源物数据库(EGO，基因组研究所（The Institute for Genomic Research）拥有)。这些数据库可用BLAST工具搜索。SEQ ID NO:168至SEQ ID NO:193是SEQ ID NO:157同源物的核酸和蛋白质序列，它们使用SEQ ID NO:157作为查询序列从上述数据库获得。
表Q:与用于本发明方法中的核酸序列(SEQ ID NO:156)相关的核酸序列及对应的推导多肽。
| 植物来源 | 核酸SEQ ID NO | 蛋白质SEQ ID NO |
| OsGLK | 156 | 157 |
| OSJNBa0086P08.18 | 168 | 169 |
| 拟南芥GLK1 | 170 | 171 |
| 拟南芥GLK2 | 172 | 173 |
| 小立碗藓Glk1 | 174 | 175 |
| 小立碗藓Glk2 | 176 | 177 |
| 玉蜀黍ZmGLK1 | 178 | 179 |
[1050]
| 玉蜀黍ZmGLK2 | 180 | 181 |
| 普通小麦TaGLK1 | 182 | 183 |
| 洋葱AcGLK1 | 184 | 185 |
| 大麦HvGLK2 | 186 | 187 |
| 两色蜀黍SbGLK1 | 188 | 189 |
| 甘蔗oGLK2 | 190 | 191 |
| 稻OsGLK1 | 192 | 193 |
实施例22：确定GLK蛋白质之间的全局相似性和同一性。
全长GLK蛋白质序列和GLK蛋白质GARP或GCT结构域之间的相似性百分数和同一性百分数使用MatGAT(矩阵全局比对工具)软件(BMC Bioinformatics.20034:29.MatGAT：使用蛋白质序列或DNA序列产生相似性/同一性矩阵的应用.Campanella JJ，Bitincka L，Smalley J；软件由Ledion Bitincka所有)加以确定。MatGAT软件产生针对DNA序列或蛋白质序列的相似性/同一性矩阵，无需数据的预比对。使用Myers和Miller全局比对算法(空位开口罚分12和空位延伸罚分2)，该程序执行一系列配对比对，使用例如Blosum62(对于多肽)计算相似性和同一性并且随后将结果置于距离矩阵中。序列相似性在分界线的下半部分中显示，序列同一性在对角分界线的上半部分中显示。
GARP和GCT结构域使用多重比对示出，且获得的序列在表R和S中列出。在表T至V中显示针对全长蛋白质序列和GLK蛋白质GARP或GCT结构域的全局相似性和同一性的软件分析结果。序列SEQ ID NO:157在距阵中以数字6(OsGLK1)示出。同一性百分数在对角线之上给出（黑体）并且相似性百分数在对角线之下给出（正常字体）。在SEQ ID NO:157的GLK旁系同源物和直向同源物的全长序列的同一性百分数范围是30-98.7%。当使用GARP结构域的序列代替全长序列时，这些百分比要高很多。
表R:用蛋白质序列比对获得的和用于MATGAT分析中的GARP结构域序列：
| ZmG2 | KVKVDWTPELHRRFVQAVEQLGIDKAVPSRILEIMGTDCLTRHNIASHLQKYRSHR |
| ZmGLK1 | KAKVDWTPELHRRFVQAVEELGIDKAVPSRILEIMGIDSLTRHNIASHLQKYRSHR |
| OsGLK2 | KVKVDWTPELHRRFVQAVEQLGIDKAVPSRILELMGIECLTRHNIASHLQKYRSHR |
| PpGLK2 | KAKVDWTPELHRRFVHAVEQLGVEKAYPSRILELMGVQCLTRHNIASHLQKYRSHR |
| PpG1k1 | KAKVDWTPELHRRFVHAVEQLGVEKAFPSRILELMGVQCLTRHNIASHLQKYRSHR |
| OsGLK1 | KAKVDWTPELHRRFVQAVEQLGIDKAVPSRILEIMGIDSLTRHNIASHLQKYRSHR |
| AtGLK2 | KPKVDWTPELHRKFVQAVEQLGVDKAVPSRILEIMNVKSLTRHNVASHLQKYRSHR |
| AtGLK1 | KVKVDWTPELHRRFVEAVEQLGVDKAVPSRILELMGVHCLTRHNVASHLQKYRSHR |
| AcGLK1 | KAKVDWTPELHRRFVQAVEQLGVDKAVPSRILELMGIDCLTRHNIASHLQKYRSHR |
表S:用蛋白质序列比对获得的和用于MATGAT分析中的GCT结构域序列：
表T:全长序列的MATGAT距阵
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | |
| 1.ZmG2 | 43.9 | 53.6 | 29.4 | 29.7 | 45.0 | 38.8 | 40.0 | 44.8 | |
| 2.ZmGLK1 | 54.3 | 42.1 | 32.0 | 33.2 | 68.3 | 39.5 | 40.9 | 68.5 | |
| 3.OsGLK2 | 63.2 | 54.8 | 32.9 | 31.3 | 46.9 | 37.6 | 40.5 | 46.9 | |
| 4.PpGLK2 | 43.5 | 45.1 | 46.8 | 78.7 | 33.3 | 31.3 | 34.3 | 33.5 | |
| 5.PpGIk1 | 42.9 | 44.4 | 43.5 | 85.1 | 33.6 | 30.9 | 32.9 | 34.2 | |
| 6.OsGLK1 | 57.7 | 75.6 | 56.5 | 45.5 | 46.4 | 40.7 | 45.1 | 98.7 | |
| 7.AtGLK2 | 49.5 | 49.9 | 47.0 | 42.2 | 41.9 | 50.8 | 46.1 | 40.3 | |
| 8.AtGLK1 | 51.8 | 52.2 | 52.0 | 45.8 | 43.6 | 58.7 | 58.6 | 45.1 | |
| 9.OsGLK1var | 57.9 | 75.6 | 56.7 | 44.5 | 46.8 | 99.3 | 50.5 | 58.7 |
[1061] 表U:GARP结构域的MATGAT距阵
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | |
| 1.ZmG2 | 92.9 | 94.6 | 85.7 | 85.7 | 94.6 | 85.7 | 89.3 | 92.9 | |
| 2.ZmGLK1 | 94.6 | 91.1 | 83.9 | 83.9 | 98.2 | 85.7 | 83.9 | 92.9 | |
| 3.OsGLK2 | 98.2 | 96.4 | 87.5 | 87.5 | 92.9 | 83.9 | 91.1 | 94.6 | |
| 4.PpGLK2 | 91.1 | 92.9 | 94.6 | 98.2 | 85.7 | 82.1 | 89.3 | 91.1 | |
| 5.PpGIk1 | 91.1 | 92.9 | 94.6 | 100.0 | 85.7 | 82.1 | 89.3 | 91.1 | |
| 6.0sGLK1 | 94.6 | 100.0 | 96.4 | 92.9 | 92.9 | 87.5 | 85.7 | 94.6 | |
| 7.AtGLK2 | 91.1 | 94.6 | 94.6 | 91.1 | 91.1 | 94.6 | 87.5 | 85.7 | |
| 8.AtGLK1 | 96.4 | 94.6 | 98.2 | 92.9 | 92.9 | 94.6 | 92.9 | 91.1 | |
| 9.AcGLK1 | 96.4 | 98.2 | 98.2 | 94.6 | 94.6 | 98.2 | 92.9 | 96.4 |
表V:GCT结构域的MATGAT距阵
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | |
| 1.ZmG2 | 48.2 | 56.3 | 26.7 | 28.5 | 47.6 | 38.0 | 37.0 | |
| 2.ZmGLK1 | 58.6 | 44.0 | 32.4 | 33.9 | 72.7 | 41.0 | 44.3 | |
| 3.OsGLK2 | 65.0 | 57.6 | 33.6 | 32.0 | 51.6 | 40.6 | 42.5 | |
| 4.PpGLK2 | 41.9 | 47.0 | 44.0 | 88.6 | 32.4 | 33.8 | 35.0 | |
| 5.PpGIk1 | 42.3 | 45.7 | 42.4 | 93.2 | 35.2 | 32.6 | 34.5 | |
| 6.OsGLK1 | 61.3 | 81.1 | 60.5 | 44.1 | 49.6 | 44.2 | 48.9 | |
| 7.AtGLK2 | 48.6 | 48.5 | 48.6 | 43.2 | 43.2 | 52.3 | 47.3 | |
| 8.AtGLK1 | 50.9 | 55.5 | 54.7 | 49.2 | 46.6 | 61.8 | 57.1 |
实施例23：克隆本发明方法中所用核酸序列
DNA操作：除非另外声明，重组DNA技术根据(Sambrook(2001)Molecular Cloning：a laboratory manual，第三版Cold Spring Harbor Laboratory Press，CSH，New York)中或Ausubel等(1994)，Current Protocols in Molecular Biology，Current Protocols第1和2卷中描述的标准方法进行。用于植物分子工作的标准材料和方法在由BIOS Scientific Publications Ltd(UK)和Blackwell Scientific Publications(UK)出版的 R.D.D.Croy的Plant Molecular Biology Labfax(1993)中描述。
本发明方法中所用的核酸序列通过PCR，使用定制的稻幼苗cDNA文库(在pCMV Sport6.0内；Invitrogen，Paisley，UK)作为模板而扩增。在标准条件下使用Hifi Taq DNA聚合酶，利用在50μl PCR混合物中的200ng模板进行PCR。所用引物是prm2251(SEQ ID NO:158；有义，起始密码子为粗体字：
5’ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcacaatgcttgccgtgtcgc 3′)和prm2252(SEQ ID NO:159；反义，互补：
5′ggggaccactttgtacaagaaagctgggtaatatcatccacacgctgga 3’)，其包括用于Gateway重组的AttB位点。扩增的PCR片段也使用标准方法予以纯化。随后实施Gateway方法的第一步骤，即BP反应，在此期间PCR片段与pDONR201质粒发生体内重组以产生根据Gateway命名的“进入克隆”，p034。质粒pDONR201作为技术的构成部分从Invitrogen购买。
实施例24：表达载体构建
进入克隆p031随后在LR反应中与p00640(一种用于稻转化的目的载体)一起使用。这种载体在T-DNA边界内含有作为功能性元件的：植物选择性标记；筛选标记表达盒和意图与已经克隆于所述进入克隆内的目的核酸序列发生LR体内重组的Gateway盒。稻非病毒组成型启动子，GOS2启动子(SEQ ID NO:58)（PRO0129）位于这种Gateway盒的上游。
在LR重组步骤后，将产生的表达载体p045(图14)转化至农杆菌菌株LBA4044并且随后转化至稻植物。允许转化的稻植物生长并随后对下文所述参数进行检验。
实施例25：评价方法
25.1评价准备
产生大约30个独立的T0稻转化体。原代转化体从组织培养箱转移至 温室用于生长和收获T1种子。留下4个事件，其中所述事件的T1后代对转基因的存在/不存在以3:1比例分离。对于这些事件中的每一事件，通过监测目视标记表达而选择含有转基因的大约10株T1幼苗(杂合子和纯合子)和缺少转基因的大约10株T1幼苗(失效合子)。转基因植物和对应的失效合子在随机位置上并排培育。温室条件是短日照(12小时光照)，在光线下28℃和在黑暗中22℃以及相对湿度70%。
4个T1事件在T2世代中按照如用于T1世代的相同评价方法作进一步评估，但每个事件采用更多的个体。使植物从播种期直至成熟期通过数字成像箱数次。在每一时间点上，对每株植物从至少6个不同角度拍摄数字图像(2048x1536像素，1600万颜色)。
25.2统计学分析：t-检验和F-检验
使用双因子ANOVA(方差分析)作为统计模型用于植物表型特征的整体评价。对用本发明基因转化的全部事件的全部植物的所有测量参数实施F检验。实施F检验以检查基因对于全部转化事件的作用并验证基因的整体作用(又称作全局基因作用)。用于真实全局基因作用的显著性的阈值对于F检验设置在5%概率水平上。显著性F检验值标示基因作用，意味着不仅仅基因的存在或位置才造成表型上的差异。
实施例26：评价结果
植物地上部分面积(或叶生物量)通过计数在来自植物地上部分的数字图像上区别于背景的像素的总数而测定。该值对在相同时间点上从不同角度拍摄的画面进行平均化并且通过校正转化成以平方mm表达的物理表面值。实验证实以这种方式测量的地上部分植物面积与地上植物部分的生物量相关。地上部分面积是在植物已经达到其最大叶生物量的时间点。
将成熟的主圆锥花序收获、计数、装袋、加条形码标记并且随后在干燥箱内在37℃干燥3日。随后将圆锥花序脱粒并且收集及计数全部种子。使用吹气装置分开饱满粒与空粒。弃去空粒并再次对剩余部分计数。饱满 粒在分析天平上称重。饱满种子数通过计数分离步骤后的饱满粒数而确定。种子总产量通过称量从植物中收获的全部饱满粒而测量。每株植物种子总数通过计数从植物中收获的壳粒数目而测量。
如在表W至表Y中所示，与合适的对照植物相比，地上部分生物量、种子产量和饱满种子数在编码GLK蛋白质的核酸的表达增加的转基因植物中增加。显示了来自T1和T2世代的结果。
表W显示在编码GLK蛋白质的核酸的表达增加的转基因稻的T1和T2世代中，地上部分生物量的增加百分比，以及这种增加根据F-检验的统计关联性。
表W：
表X显示在编码GLK蛋白质的核酸的表达增加的转基因稻的T1和T2世代中，种子总产量（种子总重量）增加的百分数以及这种增加根据F-检验的统计关联性。
表X：
表Y显示在编码GLK蛋白质的核酸的表达增加的转基因稻的T1和T2世代中，饱满种子数增加的百分数以及这种增加根据F-检验的统计关联性。
表Y：
REVΔHDZip/START
实施例27:鉴定与本发明方法中所用核酸序列相关的序列
使用数据库序列搜索工具，如基本局部比对工具(BLAST)(Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403-410；和Altschul等(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-3402)在国家生物技术信息中心的Entrez核苷酸数据库中所维护的那些序列内鉴定到与本发明方法中所用核酸序列相关的(全长cDNA、EST或基因组)序列。该程序用来通过核酸序列或多肽序列与序列数据库比较并通过计算匹配的统计学显著性而找到序列间具有局部相似性的区域。对本发明核酸序列所编码的多肽使用TBLASTN算法，采用默认设置和过滤以忽略低复杂性序列抵消。分析的结果通过配对性比较显示，并根据几率评分(E-值)排序，其中该评分反映特定比对结果因偶然而发生的概率(E-值越低，命中的显著性越高)。除了E-值外，比较还通过同一性百分数进行记分。同一性百分数指两个所比较核酸(或多肽)序列之间在特定长度范围内的相同核苷酸(或氨基酸)数目。在一些情况下，可以调整默认参数以调节搜索法的严格性。
表Z提供与执行本发明方法中所用核酸序列相关的核酸序列列表。
表Z：与本发明方法中所用核酸序列(SEQ ID NO:194)相关的核酸序列，和对应的推导多肽
实施例28:确定REV多肽的CTR之间的全局相似性和同一性
使用本领域可获得的方法之一MatGAT(矩阵全局比对工具)软件(BMC Bioinformatics.20034:29.MatGAT：使用蛋白质序列或DNA序列产生相似性/同一性矩阵的应用.Campanella JJ，Bitincka L，Smalley J；软件由Ledion Bitincka所有)确定REV多肽的CTR之间的全局相似性百分数和同一性百分数。MatGAT软件产生针对DNA序列或蛋白质序列的相似性/同一性矩阵，无需数据的预比对。使用Myers和Miller全局比对 算法(空位开口罚分12和空位延伸罚分2)，该程序执行一系列配对比对，使用例如Blosum62(对于多肽)计算相似性和同一性并且随后将结果置于距离矩阵中。序列相似性在分界线的下半部分中显示，序列同一性在对角分界线的上半部分中显示。
比较中所用的参数是：
记分矩阵：Blosum62
第一空位：12
延伸性空位：2
在表AA中显示针对REV多肽的CTR之间的全局相似性和同一性的软件分析结果。同一性百分数在对角线之上给出并且相似性百分数在对角线之下给出。在REV多肽旁系同源物和直向同源物的CTR间的同一性百分数范围是30-70%，反映所述旁系同源物和直向同源物在HDZip和START结构域之外相对低的序列同一性保守。
表AA：用于REV多肽旁系同源物和直向同源物的CTR之间的全局相似性和同一性的MatGAT结果
所有REV多肽包含CTR，所述CTR与SEQ ID NO:197所示的REV多肽的CTR具有一定序列同一性，所述序列同一性按照增加的优选顺序为至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或98%。
实施例29:基因克隆
DNA操作：除非另外声明，重组DNA技术根据(Sambrook(2001)Molecular Cloning：a laboratory manual，第三版Cold Spring Harbor Laboratory Press，CSH，New York)中或Ausubel等(1994)，Current Protocols in Molecular Biology，Current Protocols第1和2卷中描述的标准方法进行。用于植物分子工作的标准材料和方法在由BIOS Scientific Publications Ltd(UK)和Blackwell Scientific Publications(UK)出版的R.D.D.Croy的Plant Molecular Biology Labfax(1993)中描述。
Orysa_REV全长基因SEQ ID NO:198通过PCR，使用定制的稻cDNA文库(Invitrogen，Paisley，UK)作为模板进行扩增。将提取自幼苗的RNA逆转录后，将cDNA克隆至pCMV Sport6.0。在质粒提取后，将200ng模板用于50μlPCR混合物中。PCR扩增所用的引物是prm01983(SEQID NO:221；有义，起始密码子是黑体，AttB1位点是斜体：
5’-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaaacaatggcggcggcggtgg-3’)和prm01984(SEQ ID NO:222；反义，互补，AttB2位点是斜体：
5′-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtggattttgggtcacacgaaggacca-3’)，其中所述引物包括用于Gateway重组的AttB位点。在标准条件中使用Hifi Taq DNA聚合酶进行PCR。扩增的PCR片段也使用标准方法予以纯化。随后实施Gateway方法的第一步骤，即BP反应，在此期间PCR片段与pDONR201质粒发生重组以产生根据Gateway命名的“进入克隆”p04562。质粒pDONR201作为
技术的部分从Invitrogen购买。
Orysa_REV基因SEQ ID NO:194的稻部分CTR(REVΔHDZip/START)使用如上的PCR扩增，引物为prm03263(SEQ ID NO: 219:
5’ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttgtgctaaggcatccatgctac3’)和prm03264(SEQ ID NO:220:
5’ggggaccactttgtacaagaaagctgggtgcaccttccatgctacagcttg3’)。
克隆后得到的进入克隆号是p04436。
实施例30:载体构建
进入克隆p04562和p04436随后在LR反应中与p01519(一种用于发夹构建体稻转化的目的载体)一起使用。这种载体在T-DNA边界内含有作为功能性元件的：植物选择性标记；筛选标记表达盒，和意图发生LR体内重组（因此来自进入克隆的目的序列以有义和反义方向整合，以形成发夹结构）的两个Gateway盒，所述两个Gateway盒是反向重复并被MAR（烟草的基质附着区约300bp的片段）分开。用于组成型表达的稻GOS2启动子(SEQ ID NO:58)(PRO0129)位于这种Gateway盒的上游。
在LR重组步骤后，将产生的表达载体p0443(具有Orysa_REV的部分CTR；SEQ ID NO:194)和p0448(具有全长Orysa_REV;包含在SEQ ID NO:198中)(见图20)分别转化至农杆菌菌株LBA4044并随后转化至稻植物内。允许转化的稻植物生长并随后对实施例31所述参数进行检验。
实施例31：评价方法
31.1评价准备
产生大约15-20个独立T0稻转化体。将原代转化体从组织培养箱转移至温室用于生长并收获T1种子。留下包含全长Orysa_REV的发夹构建体的5个事件，包含Orysa_REV的部分CTR的发夹构建体的6个事件，其中所述事件的T1后代对转基因的存在/不存在以3:1比例分离。对于这些事件中的每一事件，通过监测目视标记表达而选择到含有转基因的大约10株T1幼苗(杂合子和纯合子)和缺少转基因的大约10株T1幼苗(失效合子)。将选择的T1植物转移至温室。每个植物接受唯一的条形码标签以明确地将表型分型数据与对应的植物联系起来。选择的T1植物在10cm直径 花钵中的土壤上于下列环境设置下培育：光周期=11.5小时，日光密度=30,000lux或更高，昼间温度=28℃或更高，夜间温度=22℃，相对湿度=60-70%。转基因植物和对应的失效合子（对照植物）在随机位置上并排培育。
5个T1事件在T2世代中按照如用于T1世代的相同评价方法作进一步评估（如果在第一次评估中获得了阳性结果），但每个事件采用更多的个体。使植物从播种期直至成熟期通过数字成像箱数次。在每一时间点上，对每株植物从至少6个不同角度拍摄数字图像(2048x1536像素，1600万颜色)。
31.2统计分析：F-检验
使用双因子ANOVA(方差分析)作为统计模型用于植物表型特征的整体评价。对用本发明基因转化的全部事件的全部植物的所有测量参数实施F检验。实施F检验以检查基因对于全部转化事件的作用并验证基因的整体作用(又称作全局基因作用)。用于真实全局基因作用的显著性的阈值对于F检验设置在5%概率水平上。显著性F检验值标示基因作用，意味着不仅仅基因的存在或位置才造成表型上的差异。
实施例32:评价结果
植物地上部分面积(或叶生物量)通过计数在来自植物地上部分的数字图像上区别于背景的像素的总数而测定。该值对在相同时间点上从不同角度拍摄的画面进行平均化并且通过校正转化成以平方mm表达的物理表面值。实验证实以这种方式测量的地上部分植物面积与地上植物部分的生物量相关。地上部分面积是在植物已经达到其最大叶生物量的时间点。
通过将植物生长在特别设计的具有透明底以允许观察根的花盆中，来测定植物的地下部分（在本实施例中主要是根）。在植物生长过程中通过花盆的底部用数码相机记录图像。使用从适宜的软件产生的图像推导出根的特征，例如总投影面积（其可与总的根体积相关）、平均直径和高于某个粗度阈值的根的长度(粗根的长度)。
将成熟的主圆锥花序收获、计数、装袋、加条形码标记并且随后在干燥箱内在37℃干燥3日。随后将圆锥花序脱粒并且收集及计数全部种子。使用吹气装置分开饱满粒与空粒。弃去空粒并再次对剩余部分计数。饱满粒在分析天平上称重。饱满种子数通过计数分离步骤后的饱满粒数而确定。种子总产量通过称量从植物中收获的全部饱满粒而测量。每株植物种子总数通过计数从植物中收获的壳粒数目而测量。从计数的饱满种子数及其总重量外推出千粒重(TKW)。使用与图像分析软件偶联的定制装置（由两个主要组件，称重和成像装置，组成）测量单个种子的参数（包括宽度、长度、面积、重量）。收获指数(HI)在本发明中定义为种子总产量与地上部分面积(mm2)之间的比，乘以系数106。如本发明中定义的每圆锥花序的总花数是种子总数与成熟主圆锥花序的数目之间的比率。如本发明中定义的种子饱满率是饱满种子数对种子(或小花)总数的比例(表述为%)。
32.1测量使用SEQ ID NO:194所示的REVΔHDZip/START核酸序列而具有内源REV基因降低的表达的转化体的产量相关参数
如在表BB至表EE中所示，与对照植物相比，种子产量、饱满种子数、种子饱满率和收获指数在使用REVΔHDZip/START核酸序列而具有内源REV基因降低的表达的转基因植物中增加。显示了来自T1和T2世代的结果。
表BB显示具有种子总产量（种子总重量）增加的转基因事件的数目、这种增加的百分数以及这种增加根据F-检验的统计关联性。
表BB：在使用REVΔHDZip/START核酸序列而具有内源REV基因降低的表达的转基因稻的T1和T2世代中，具有种子产量增加的转基因事件的数目、这种增加的百分数和F-检验的P值。
表CC显示具有饱满种子数增加的转基因事件的数目、这种增加的百 分数以及这种增加根据F-检验的统计关联性。
表CC：在使用REVΔHDZip/START核酸序列而具有内源REV基因降低的表达的转基因稻的T1和T2世代中，具有饱满种子数增加的转基因事件的数目、这种增加的百分数和F-检验的P值。
表DD显示具有种子饱满率增加的转基因事件的数目、这种增加的百分数以及这种增加根据F-检验的统计关联性。
表DD：在使用REV ΔHDZip/START核酸序列而具有内源REV基因降低的表达的转基因稻的T1和T2世代中，具有种子饱满率增加的转基因事件的数目、这种增加的百分数和F-检验的P值。
表EE显示具有收获指数增加的转基因事件的数目、这种增加的百分数以及这种增加根据F-检验的统计关联性。
表EE：在使用REV ΔHDZip/START核酸序列而具有内源REV基因降低的表达的转基因稻的T1和T2世代中，具有收获指数增加的转基因事件的数目、这种增加的百分数和F-检验的P值。
仅在一个评估中测定另外两个参数：
1）平均各种子长度
2）平均根粗
如表FF所示，与对照植物相比，在使用REVΔHDZip/START核酸序列而具有内源REV基因降低的表达的转基因稻中，平均各种子长度和平均根粗均显著增加。
表FF：在使用REV ΔHDZip/START核酸序列而具有内源REV基因降低的表达的转基因稻的单一世代中，具有收获指数增加的转基因事件的数目和F-检验的P值。
32.2测量使用如SEQ ID NO:198所示的编码全长Orysa_REV多肽的核酸序列而具有内源REV多肽降低的表达的转化体的产量相关参数：
对于使用编码全长Orysa_REV多肽的核酸序列而具有内源REV多肽降低的表达的转化稻，进行如上所述的相同评估方法。如表GG所示，测定的所有参数均是强烈而显著的阴性。
表GG：在使用编码全长Orysa_REV多肽的核酸序列而具有内源REV基因降低的表达的转基因稻的T1世代中，具有地上部分生物量、种子总产量、饱满种子数、每个圆锥花序的花数、收获指数、第一个圆锥花序数和植物高度降低的转基因事件的数目、这种降低的百分数和F-检验的P值。
| 参数 | 显示增加的事件数 | %差异 | F检验的P值 |
| 地上部分生物量 | 5个中有5个 | -40 | <0.0001 |
| 种子总产量 | 5个中有5个 | -65 | <0.0001 |
| 饱满种子数 | 5个中有5个 | -64 | <0.0001 |
| 每个圆锥花序的花数 | 5个中有5个 | -39 | <0.0001 |
| 收获指数 | 5个中有5个 | -53 | <0.0001 |
| 第一个圆锥花序数 | 5个中有5个 | -39 | <0.0001 |
| 植物高度 | 5个中有5个 | -13 | 0.0006 |
通过包含降低内源REV基因表达的发夹构建体的保守区(例如the HDZip和START结构域)，其他类的III HDZip基因也降低。
CLE
实施例33:鉴定与本发明方法中所用核酸序列相关的序列
使用数据库序列搜索工具，如基本局部比对工具(BLAST)(Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403-410；和Altschul等(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-3402)在国家生物技术信息中心的Entrez核苷酸数据库中所维护的那些序列内鉴定到与本发明方法中所用核酸序列相关的(全长cDNA、EST或基因组)序列。该程序用来通过核酸序列或多肽序列与序列数据库比较并通过计算匹配的统计学显著性而找到序列间具有局部相似性的区域。对本发明核酸序列所编码的多肽使用TBLASTN算法，采用默认设置和过滤以忽略低复杂性序列抵消。分析的结果通过配对性比较显示，并根据几率评分(E-值)排序，其中该评分反映特定比对结果因偶然而发生的概率(E-值越低，命中的显著性越高)。除了E-值外，比较还通过同一性百分数进行记分。同一性百分数指两个所比较核酸(或多肽)序列之间在特定长度范围内的相同核苷酸(或氨基酸)数目。在一些情况下，可以调整默认参数以调节搜索法的严格性。
表HH提供与执行本发明方法中所用核酸序列相关的核酸序列列表。
表HH：与本发明方法中所用核酸序列(SEQ ID NO:232)相关的核酸序列，和对应的推导多肽
| 植物来源 | 核酸SEQ ID NO: | 蛋白质SEQ ID NO: |
| 甘蔗CLE-样 | 232 | 233 |
| 毛果杨x美洲黑杨CLE-样 | 239 | 240 |
| 稻CLE-样 | 241 | 242 |
| 甘蔗CLE-样 | 243 | 244 |
| 拟南芥CLE2-样 | 245 | 246 |
| 欧洲油菜CLE-样 | 247 | 248 |
| 拟南芥CLAVATA3 | 249 | 250 |
实施例34:基因克隆
甘蔗CLE-样基因使用引物prm05843(SEQ ID NO:234；有义，起始密码子是黑体，AttB1位点是斜体：
5’-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaaacaatgaggatgttcttccgg-3′)和prm05844(SEQ ID NO:235；反义，互补，AttB2位点是斜体：
5’-ggggaccactttgtacaagaaagctgggttcctctcatctgttgtggag-3’)，其中所述引物包括用于Gateway重组的AttB位点，通过PCR扩增。在标准条件中使用Hifi Taq DNA聚合酶进行PCR。PCR片段也使用标准方法予以纯化。随后实施Gateway方法的第一步骤，即BP反应，在此期间PCR片段与pDONR201质粒发生体内重组以产生根据Gateway命名的“进入克隆”p066。质粒pDONR201作为
技术的部分从Invitrogen购买。
实施例35：载体构建
进入克隆p066随后在LR反应中与p01519(一种用于反义构建体稻转化的目的载体)一起使用。这种载体在T-DNA边界内含有作为功能性元件的：植物选择性标记；筛选标记表达盒，和意图发生LR体内重组（因此来自进入克隆的目的序列以有义和反义方向整合）的Gateway盒。稻谷醇溶蛋白启动子(SEQ ID NO:236)（PRO090）位于这种Gateway盒的上游。
在LR重组步骤后，将产生的表达载体p068(图23)转化至农杆菌菌株LBA4044并且随后转化至稻植物。允许转化的稻植物生长并随后对实施例36所述参数进行检验。
实施例36:对CLE-样以反义方向转化的植物的评价方法
产生大约15-20个独立T0稻转化体。将原代转化体从组织培养箱转移至温室用于生长并收获T1种子。留下6个事件，其中所述事件的T1后代对转基因的存在/不存在以3:1比例分离。对于这些事件中的每一事件，通过监测目视标记表达而选择到含有转基因的大约10株T1幼苗(杂合子和纯合子)和缺少转基因的大约10株T1幼苗(失效合子)。将选择的T1植物转移至温室。每个植物接受唯一的条形码标签以明确地将表型分型数据与 对应的植物联系起来。选择的T1植物在10cm直径花钵中的土壤上于下列环境设置下培育：光周期=11.5小时，日光密度=30,000lux或更高，昼间温度=28℃，夜间温度=22℃，相对湿度=60-70%。转基因植物和对应的失效合子在随机位置上并排培育。使植物从播种期直至成熟期通过数字成像箱数次。在每一时间点上，对每株植物从至少6个不同角度拍摄数字图像(2048x1536像素，1600万颜色)。
植物地上部分面积(或叶生物量)通过计数在来自植物地上部分的数字图像上区别于背景的像素的总数而测定。该值对在相同时间点上从不同角度拍摄的画面进行平均并且通过校正转化成由平方mm表示的物理表面值。实验证实以这种方式测量的地上部分植物面积与地上植物部分的生物量相关。Areamax是在植物已经达到其最大叶生物量的时间点上地方部分面积。
将成熟的主要圆锥花序收获、装袋、加条形码标记并且随后在干燥箱内在37℃干燥3日。随后将圆锥花序脱粒并且收集全部种子。使用吹气装置分开饱满粒与空粒。在分离后，随后使用市售计数机对两个种子批次计数。弃去空粒。饱满粒在分析天平上称重并且种子的横截面积使用数字成像法测量。这种方法产生以下的种子相关参数集合：
每个圆锥花序的花数是估计植物上每个圆锥花序小花的平均数目的参数，该参数来自种子总数除以第一个圆锥花序数。最高圆锥花序以及垂直排列时与最高圆锥花序重叠的全部圆锥花序被视为第一圆锥花序并以手工方式计数。饱满种子数通过计数分离步骤后的饱满粒数而确定。种子总产量(种子总重量)通过称量从植物中收获的全部饱满粒而测量。每株植物种子总数通过计数从植物中收获的壳粒数目而测量并且对应于每株植物的小花数目。使用图像分析软件，这些参数以自动化方式来自数字图像并通过统计学分析。使用由两个主要部分(称量装置和成像装置及与之连接的用于图像分析的软件)构成的定制仪器测量各个种子参数(包括宽度、长度、面积、重量)。收获指数在本发明中定义为种子总产量（g）与地上部分面积(mm2)之间的比，乘以系数106。
使用对非平衡设计作出校正的双因子ANOVA(方差分析)作为统计模型用于植物表型特征的总体评价。对用所述基因转化的全部事件的全部植物的全部测量参数实施F检验。实施F检验以检查基因对于全部转化事件的作用并验证基因的整体作用(又称作“基因全局作用”)。若F检验的值显示该数据是显著的，则可以得出存在“基因”作用的结论，意味着不仅仅基因的存在或位置才造成所述作用。对于F检验，用于真实全局基因作用的显著性的阈值设置在5%概率水平。
为检查基因在事件中的作用，即株系特异性作用，使用来自转基因植物和对应的无效植物的数据集在每个事件内进行t检验。“无效植物”或“无效分离子”或“失效合子”是以与转基因植物相同的方式受到处理，但是转基因已经从中发生分离的植物。无效植物也可以描述为纯合阴性转化植物。用于t检验的显著性的阈值设置在10%概率水平上。一些事件的结果可以高于或低于这个阈值。这基于如此假设，即基因可能仅在基因组中某些位置内具有作用，并且这种位置依赖性作用的出现并非罕见。这种基因作用在本文中又称作“基因的株系作用”。p-值通过t-值与t-分布比较或备选地通过F-值与F-分布比较而获得。该p-值随后给出无效假设(即转基因的作用不存在)是正确的概率。
实施例37：测量反义构建体转化体的产量相关参数：
在如上所述对种子分析时，本发明人发现与缺少CLE-样转基因的植物相比，用反义CLE-样基因构建体转化的植物具有更高种子产量，其表达为饱满种子数、种子总重量、种子总数和收获指数。尤其是种子总重量和种子总数在T1和T2世代植物中均显著增加。
SYR NUE
实施例38:鉴定SEQ ID NO:251和SEQ ID NO:252相关的序列
使用数据库序列搜索工具，如基本局部比对工具(BLAST)(Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403-410；和Altschul等(1997)Nucleic Acids Res. 25：3389-3402)在国家生物技术信息中心(NCBI)的Entrez核苷酸数据库中所维护的那些序列内鉴定到与SEQ ID NO:251和/或蛋白质序列SEQ ID NO:252相关的(全长cDNA、EST或基因组)序列。该程序用来通过核酸序列或多肽序列与序列数据库比较并通过计算匹配的统计学显著性而找到序列间具有局部相似性的区域。SEQ ID NO:251编码的多肽使用TBLASTN算法，采用默认设置和过滤以忽略低复杂性序列抵消。分析的结果通过配对性比较显示，并根据几率评分(E-值)排序，其中该评分反映特定比对结果因偶然而发生的概率(E-值越低，命中的显著性越高)。除了E-值外，比较还通过同一性百分数进行记分。同一性百分数指两个所比较核酸(或多肽)序列之间在特定长度范围内的相同核苷酸(或氨基酸)数目。在一些情况下，可以调整默认参数以调节搜索法的严格性。
除了可在NCBI获得的公众可用核酸序列之外，还按照如上文所述的相同方法搜索专用序列数据库。
表II提供与SEQ ID NO:251所示的核酸序列和SEQ ID NO:252所示的蛋白质序列相关的核酸和蛋白质序列列表。
表II：与本发明方法中所用核酸序列(SEQ ID NO:251)相关的核酸序列，和对应的推导多肽
实施例39:相关多肽序列的比对
来自Vector NTI(Invitrogen)的AlignX基于进行性比对的流行Clustal算法(Thompson等(1997)Nucleic Acids Res25：4876-4882；Chenna等(2003)，Nucleic Acids Res31：3497-3500)。可以使用邻接聚类算法构建系统发生树。默认值是空位开口罚分10，空位延伸罚分0.1并且选择的权重矩阵是Blosum62(若比对多肽)。
在图25中显示使用在鉴定实施本发明方法中所用多肽中相关的多肽的多重序列比对结果。富含亮氨酸的重复和保守基序可在各序列中容易的鉴定。
实施例40：用于实施本发明方法的多肽序列之间全局同一性百分数的计算
使用本领域可获得的方法之一MatGAT(矩阵全局比对工具)软件(BMC Bioinformatics.20034:29.MatGAT：使用蛋白质序列或DNA序列产生相似性/同一性矩阵的应用.Campanella JJ，Bitincka L，Smalley J；软件由Ledion Bitincka所有)确定用于实施本发明方法的全长多肽序列之 间全局相似性百分数和同一性百分数。MatGAT软件为DNA序列或蛋白质序列产生相似性/同一性矩阵，无需数据的预比对。该程序使用Myers和Miller全局比对算法(空位开口罚分12和空位延伸罚分2)执行一系列逐对比对，使用例如Blosum62(对于多肽)计算相似性和同一性并且随后将结果置于距离矩阵中。序列相似性在分界线的下半部分中显示，序列同一性在对角分界线的上半部分中显示。
比较中所用的参数是：
记分矩阵：Blosum62
第一空位：12
延伸空位：2
多肽序列(排除部分多肽序列)全长上的全局相似性和同一性软件分析结果在表JJ中显示。同一性百分数在对角线之上给出并且相似性百分数在对角线之下给出。
与SEQ ID NO:252相比，用于实施本发明方法的多肽序列之间的同一性百分数可以低到27%氨基酸同一性。
表JJ：多肽序列全长上的全局相似性和同一性的MatGAT结果
实施例41:用于实施本发明方法的多肽序列的拓扑学预测(亚细胞定位，跨膜…)
TargetP1.1预测真核蛋白质的亚细胞定位。位置分配是基于任何氨基端前序列的预测的存在：叶绿体转运肽(cTP)、线粒体靶向肽(mTP)或分泌途径信号肽(SP)。作为最终预测基础的记分并不实际是概率，并且它们未必合为一体。然而，具有最高记分的位置根据TargetP是最有可能的，并且记分之间的关系(可靠性类别)可以是预测的肯定性的一个指标。可靠性类别(RC)是1-5，其中1表示最强预测。TargetP在丹麦技术大学的服务器上维护。
对于预测含有氨基端前序列的序列，也可以预测潜在的切割位点。
选择了众多参数，如生物组(非植物或植物)、临界设置(无、临界的预定义设置或临界的用户指定设置)和对切割位点预测的计算(是或否)。
如SEQ ID NO:252所代表的多肽序列的TargetP1.1分析的结果在表KK中显示。已经选择“植物”生物组，未定义临界值并且需要转运肽的预测长度。如SEQ ID NO:252所代表的多肽序列的亚细胞定位可以是线粒体，但应当注意到的是可靠性（reliability）级别是5(即，最低的可靠性类别)。
表KK：如SEQ ID NO:252所代表的多肽序列的TargetP1.1分析
| 长度(AA) | 105 |
| 叶绿体转运肽 | 0.025 |
| 线粒体转运肽 | 0.552 |
| 分泌途径信号肽 | 0.009 |
| 其他亚细胞靶向 | 0.416 |
| 预测的位置 | 线粒体 |
| 可靠性类别 | 5 |
通过驻留在丹麦技术大学生物序列分析中心的服务器上的TMHMM程序鉴定到两个跨膜结构域。N-末端位于内部的可能性是0.997。定位（orientation）的更多细节在表LL中给出:
表LL:TMHMM2.0的结果
众多其他算法可以用来执行此类分析，包括：
●在丹麦技术大学（Technical University of Denmar）服务器上驻留的ChloroP1.1；
●在澳大利亚布里斯班昆士兰大学分子生物科学研究所(Institute for Molecular Bioscience,University of Queensland,Brisbane,Australia)的服务器上驻留的蛋白质Prowler亚细胞定位预测程序(Protein Prowler Subcellular Localisation Predictor)第1.2版；
●在加拿大阿尔伯塔省埃德蒙顿市阿尔伯塔大学（University of Alberta,Edmonton,Alberta,Canada）的服务器上驻留的PENCE Proteme Analyst PA-GOSUB2.5；
实施例42:基因克隆
DNA操作：除非另外声明，重组DNA技术根据(Sambrook(2001)Molecular Cloning：a laboratory manual，第三版Cold Spring Harbor Laboratory Press，CSH，New York)中或Ausubel等(1994)，Current Protocols in Molecular Biology，Current Protocols第1和2卷中描述的标准方法进行。用于植物分子工作的标准材料和方法在由BIOS Scientific Publications Ltd(UK)和Blackwell Scientific Publications(UK)出版的R.D.D.Croy的Plant Molecular Biology Labfax(1993)中描述。
稻SYR基因通过PCR，使用稻幼苗cDNA文库(Invitrogen，Paisley，UK)作为模板而扩增。将提取自幼苗的RNA逆转录后，将cDNA克隆至 pCMV Sport6.0。库的插入序列平均大小是1.5kb并且克隆的最初数目是1.59×107cfu量级。在6×1011cfu/ml的第一轮扩增后测定原始滴度是9.6×105cfu/ml。在质粒提取后，将200ng模板用于50μlPCR混合物中。将引物prm08170(SEQ ID NO:253；有义，起始密码子为粗体字，AttB1位点为斜体：
5’-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaaacaatggaaggtgtaggtgctagg-3’)和prm08171(SEQ ID NO:254；反义，互补，AttB2位点为斜体字：
5’-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtcaaaaacaaaaataaattcccc-3’)，用于PCR扩增，其中所述引物包括用于Gateway重组的AttB位点。在标准条件中使用Hifi Taq DNA聚合酶进行PCR。还使用标准方法扩增并纯化正确大小的PCR片段。随后实施Gateway方法的第一步骤，即BP反应，在此期间PCR片段与pDONR201质粒发生体内重组以产生根据Gateway命名的“进入克隆”，pSYR。质粒pDONR201作为
技术的部分从Invitrogen购买。
实施例43:载体构建
进入克隆pSYR随后在LR反应中与用于稻转化的目的载体一起使用。这种载体在T-DNA边界内含有作为功能性元件的：植物选择性标记；筛选标记表达盒和意图与已经克隆于所述进入克隆中的目的序列发生LR体内重组的Gateway盒。用于组成型表达的稻GOS2启动子(SEQ ID NO:58)位于这种Gateway盒的上游。制备相似的载体构建体，但具有的是高迁移率族蛋白启动子(HMGP,SEQ ID NO:283或SEQ ID NO:293)，代替GOS2启动子。
在LR重组步骤后，将产生的表达载体pGOS2::SYR(具有GOS2启动子)和pHMGP::SYR(具有HMGP启动子)(图25)转化至农杆菌菌株LBA4044并随后转化至稻植物内，所述两种启动子均用于组成型SYR表达。
实施例44:对以稻GOS2启动子或HMGP启动子控制下的SYR所转化植物的评价方法
44.1评价准备
产生大约15-20个独立T0稻转化体。将原代转化体从组织培养箱转移至温室用于生长并收获T1种子。留下8个事件，其中所述事件的T1后代对转基因的存在/不存在以3:1比例分离。对于这些事件中的每一事件，通过监测目视标记表达而选择到含有转基因的大约10株T1幼苗(杂合子和纯合子)和缺少转基因的大约10株T1幼苗(失效合子)。将选择的T1植物转移至温室。每个植物接受唯一的条形码标签以明确地将表型分型数据与对应的植物联系起来。选择的T1植物在10cm直径花钵中的土壤上于下列环境设置下培育：光周期=11.5小时，日光密度=30,000lux或更高，昼间温度=28℃或更高，夜间温度=22℃，相对湿度=60-70%。转基因植物和对应的失效合子在随机位置上并排培育。使植物从播种期直至成熟期通过数字成像箱数次。在每一时间点上，对每株植物从至少6个不同角度拍摄数字图像(2048x1536像素，1600万颜色)。
氮利用效率筛选
在除营养液以外正常的条件下在花盆土中培养来自T2种子的稻植物。从植物移植到成熟一直用特定的营养液对花盆浇水，所述营养液的氮(N)含量降低，通常低7到8倍。其余的栽培(植物成熟、种子收获)与不在非生物胁迫条件下培养的植物相同。记录生长和产量阐述参数，作为生长在正常条件下的细节。
44.2统计分析：F-检验
使用双因子ANOVA(方差分析)作为统计模型用于植物表型特征的整体评价。对用本发明基因转化的全部事件的全部植物的所有测量参数实施F检验。实施F检验以检查基因对于全部转化事件的作用并验证基因的整体作用(又称作全局基因作用)。用于真实全局基因作用的显著性的阈值对于F检验设置在5%概率水平上。显著性F检验值标示基因作用，意味着不仅仅基因的存在或位置才造成表型上的差异。
由于进行的两种实验具有重叠事件，因此进行组合分析。这可用于检查两种实验中效应的一致性，并且如果情况果真如此，其可用于从两种实验中收集证据从而增加结论的可信性。使用的方法是考虑到数据的多级结构(即实验-事件-分离子)的混合模型方法。通过比较卡方分布的似然比测试来获得p值。
44.3测量的参数
生物量相关参数的测量
植物地上面积(或者说叶生物量)通过计数区别于背景的地上植物部分数码图像的像素总数而确定。此值取同一时间点从不同的角度拍摄的照片的平均值，并通过校准转换为以平方毫米表示的物理表面值(physical surface value)。实验表明通过这种方法测量的地上植物面积与植物地上部分的生物量相关。地上面积是在植物达到其最大叶生物量的时间点测定的面积。根生物量的增加表达为根总生物量(测量为植物生命周期中观察到的最大根生物量)的增加。
种子相关参数的测量
收获成熟的初级圆锥花序、计数、装袋、贴上条形码标记，然后在烤箱中于37℃干燥三天。随后将圆锥花序脱粒，收集并计数所有的种子。使用鼓风装置将饱满谷壳和空壳分开。弃去空壳，再次计数剩下的部分。在分析天平上称重饱满的谷壳。通过计数在分离步骤之后剩下的饱满谷壳数确定饱满种子的数目。通过称量所有从植物中收获的饱满谷壳来测量种子总产率。从计数的饱满种子数目和它们的总重推断得出千粒重(TKW)。
实施例45:测量在营养缺乏条件下生长的pGOS2::SYR转化体的产量相关参数：
在如上所述对种子分析时，本发明人发现与缺少SYR转基因的植物相比，用pGOS2::SYR基因构建体转化，并生长在营养缺乏胁迫下的植物具有更高种子产量，其表达为饱满种子数（增加大于5%）、种子总重量（增加大于5%）和TKW（增加大于2.5%）。还观察到枝条生物量（大于5%）和根生物量（几个株系大于5%）的增加。
Claims (15)
1.用于相对于对照植物增加植物中非生物胁迫抗性的方法，其包括调节编码SYR多肽的核酸在植物中的表达，所述SYR多肽包含富含亮氨酸结构域，所述富含亮氨酸结构域的前面是保守的三肽基序1(SEQ ID NO:256、257、258或259中的一个)，后面是保守基序2(SEQ ID NO:260)，其中所述增加的非生物胁迫抗性是相对于对照植物增加的营养摄取效率。
2.根据权利要求1的方法，其中所述SYR多肽与SEQ ID NO:252所示的SYR多肽具有一定序列同一性，所述序列同一性按照增加的优选顺序为至少27%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更高的序列同一性。
3.根据权利要求1或2的方法，其中所述编码SYR多肽的核酸由表II中给出的任一核酸SEQ ID NO或其部分所代表，或是能够与在表II中给出的任一核酸SEQ ID NO杂交的序列。
4.根据权利要求1-3中任一项的方法，其中所述核酸序列编码表II中给出的任意SEQ ID NO的直向同源物或旁系同源物。
5.根据前述任一项权利要求的方法，其中所述SYR蛋白质还包含保守基序3（SEQ ID NO：261）。
6.根据前述任一项权利要求的方法，其中所述营养摄取效率导致增加的种子产量和/或增加的生物量。
7.根据权利要求6的方法，其中所述增加的种子产量包含至少增加的种子总重量；千粒重和/或增加的饱满种子数。
8.根据权利要求6的方法，其中所述增加的生物量是增加的枝条生物量和/或增加的根生物量。
9.根据前述任一项权利要求的方法，其中所述增加的营养摄取效率在轻度干旱条件下发生。
10.根据前述任一项权利要求的方法，其中所述调节表达通过在植物引入并表达编码SYR多肽的核酸来实现。
11.根据权利要求10的方法，其中所述核酸与组成型启动子有效连接，优选与GOS2启动子有效连接。
12.根据前述任一项权利要求的方法，其中所述编码SYR多肽的核酸是植物来源的，优选来自单子叶植物，还优选来自禾本科，更优选来自稻属，最优选地来自稻。
13.构建体在制备具有增加的非生物胁迫抗性的植物的方法中的用途，所述构建体包含：
(a)编码如权利要求1-5中任一项所定义的SYR多肽的核酸；
(b)能够驱动(a)的核酸序列表达的一种或多种调控序列；和任选地
(c)转录终止序列,
其中所述调控序列中的一种是组成型启动子，优选是GOS2启动子，并且其中增加的非生物胁迫抗性是相对于对照植物增加的营养摄取效率。
14.编码SYR多肽的核酸在用于相对于对照植物，增加植物中非生物胁迫抗性的方法中的用途，其中增加的非生物胁迫抗性是相对于对照植物增加的营养摄取效率。
15.根据权利要求14的用途，其中所述增加的营养摄取效率导致增加的种子产量和/或增加的生物量。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20130515 |