CN111808866A

CN111808866A - 一种石榴PgWUS基因及其应用

Info

Publication number: CN111808866A
Application number: CN202010715702.3A
Authority: CN
Inventors: 苑兆和; 赵玉洁; 葛大鹏; 王永伟; 李变变
Original assignee: Nanjing Forestry University
Current assignee: Nanjing Forestry University
Priority date: 2020-07-23
Filing date: 2020-07-23
Publication date: 2020-10-23

Abstract

本发明提供了一种石榴PgWUS基因及其应用，涉及基因工程领域，该石榴PgWUS基因的碱基序列如SEQ ID No.2所示。本发明在石榴全基因组数据的基础上，克隆了植物干细胞决定基因PgWUS全长编码序列，通过表达分析，证明了PgWUS基因在石榴花发育过程中对完全花和不完全花器官发育有很大影响。该PgWUS基因与石榴后期花器官成熟发育相关，为研究植物生殖发育的调控基因提供了一种新的途径。

Description

一种石榴PgWUS基因及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体而言，涉及一种石榴PgWUS基因及其应用。

背景技术

在植物生长发育过程中，茎尖分生组织分化出叶片、茎等，而到一定时期开始生殖生长分化出花器官，此生物学过程对植物具有重要意义。

WUS基因编码一类转录因子，是WUSCHEL-related homeobox(WOX)家族成员，主要在茎尖分生组织和花分生组织中表达，被认为是决定干细胞命运的基因。在茎尖分生组织内，WUS与CLAVATA3(CLV3)形成一个负反馈调节环，参与调控茎尖分生组织干细胞的发育，并维持顶端分生组织干细胞分化与去分化的动态平衡。

WUS(WUSCHEL)基因被认为是重要的植物干细胞调控基因，编码291个氨基酸。诱导性表达WUS基因能使某些组织或器官在不添加任何外源激素的情况下诱导体细胞胚发生，且这种诱导作用在添加适量的外源生长素时更加明显。WUS也和其他基因调控有关，如与HAN、ULT1、STIP、AG、BARD1及亮氨酸拉链转录因子，如CORONA(CNA)、PHABULOSA(PHB)和PHAVOLUTA(PHV)等协同作用，通过精确的调控，使周围细胞具有干细胞的特征。

石榴(Punicagranatum L.)属于千屈菜科石榴属，是集经济、营养、药用、观赏和生态价值于一体的优良果树。石榴有完全花和不完全花两种类型，完全花基部有明显的膨大，外形筒状，可发育成果实；而不完全花基部较小，外形钟状，花后脱落，不结实。石榴不完全花雌蕊败育是由于胚珠发育异常，不能形成卵细胞所致。目前，关于植物WUS基因功能的研究主要集中在模式植物拟南芥，石榴PgWUS基因相关研究未见报道。鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种石榴PgWUS基因及其应用。

本发明解决的技术问题是采用以下技术方案实现的：

第一方面，实施例提供了一种石榴PgWUS基因，其碱基序列如SEQ ID No.2所示。

第二方面，实施例提供了一种石榴PgWUS蛋白，其由前述实施例所述的PgWUS基因编码，所述石榴PgWUS蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

第三方面，实施例提供了一种重组载体，其含有前述实施例所述的石榴PgWUS基因。

第四方面，实施例提供了一种宿主细胞，其含有前述实施例所述的重组载体。

第五方面，实施例提供了前述实施例所述的石榴PgWUS基因在调控植物花器官的发育中的应用。

第六方面，实施例提供了前述实施例所述的石榴PgWUS基因在制备转基因植物中的应用。

第七方面，实施例提供了一种引物对，其用于扩增前述实施例所述的石榴PgWUS基因。

有益效果：

本发明实施例提供了一种石榴PgWUS基因及其应用，该石榴PgWUS基因的碱基序列如SEQ ID No.2所示，通过表达分析，证明了PgWUS基因在石榴花发育过程中对完全花和不完全花器官发育有很大影响，尤其与石榴后期花器官成熟发育相关。该PgWUS基因为研究植物生殖发育的调控基因提供了一种新的途径。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实施例的步骤3中的PCR产物的电泳图；

图2为本发明实施例的步骤4中的PCR产物的电泳图；

图3为本发明验证例中的PgWUS基因在两性花及功能性雄花中的表达中的表达分析结果图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

本发明实施例提供了一种石榴PgWUS基因，其碱基序列如SEQ ID No.2所示。该PgWUS基因在石榴花发育过程中，尤其在花发育后期，对完全花和不完全花器官成熟发育具有显著影响。需要说明的是，本实施例提供的所述石榴PgWUS基因为一种分离的核酸。

具体地，所述石榴PgWUS基因的核苷酸序列为：ATGGAACAACCTCAGCAGCATCATCAGCAACTGAACGAAGATGCCAACGGCGGCAGCAAAGGTGGAGGCGGTGGCGGAGGCAGCAGCTTACTCTGCAGGCAGAGCAGCACGCGGTGGACCCCGACGACGGAACAGATACGCATCCTCAAGGACCTCTACTACAACTACGGGGTGCGGTCGCCCAGCGCCGATCAGATACAGCGGATCTCCGCCCGGCTCCGGCAGTACGGCAAGATCGAGGGCAAGAACGTGTTCTACTGGTTCCAGAACCACAAGGCCCGCGAGCGCCAGAAGAAGCGCTTCGTCCCCGACCACCACCCCAACCCTAACCCTCTTCACCACCTCCCGGCCGCTGCCAACTCTTTCGGTCCCTCCGCTGAGAGCAAACTCGGCGATCTGCCGGTTCATCATGACAACAAGTACCCGAACTTCGGGAGTGCTATCGGACTGCCTTCTTCTTCATCGTCTGCTGCTACCCCAGCTGGTCTGGTGGCTTTTGGACAGATGGCTAACTATGGATATGGTTCCACGGCCACCATGGAAAAGAATTTTAGAAATTGTTCCATATCATCCAGTTGCGGTGGCGGTGGGAGCCCCGGCGTCGGAGGATCCATGAGTCACAATTTCGGATGGATTGCAGTCGACCCGTACCCATATTCTTCTCGCTCTATCTTTGACAAGCAAGGCTGCAATGTCAACGAAGAACATGATGAACAGGAAGAGGAGGAAGAGGATGAAGAAAGAAACTCCGCTCGCGAGATCGAGACACTACCGCTTTTCCCAATGCATGACAACATCAACGGCTTTTGCGGGATCAAGCACAACACGGATGGAGGTCCTGGTATTTGGTACGATGATGTCTTCATGGGCAGCTCTCGTACTTCCCTCGAGCTCAGCCTCAACTCCTACACTGCCATGTCCCCGAGTTCGCCCTAG。

本发明实施例还提供了一种石榴PgWUS蛋白，其由前述实施例所述的PgWUS基因编码，所述石榴PgWUS蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

具体地，石榴PgWUS蛋白的氨基酸序列为：MEQPQQHHQQLNEDANGGSKGGGGGGGSSLLCRQSSTRWTPTTEQIRILKDLYYNYGVRSPSADQIQRISARLRQYGKIEGKNVFYWFQNHKARERQKKRFVPDHHPNPNPLHHLPAAANSFGPSAESKLGDLPVHHDNKYPNFGSAIGLPSSSSSAATPAGLVAFGQMANYGYGSTATMEKNFRNCSISSSCGGGGSPGVGGSMSHNFGWIAVDPYPYSSRSIFDKQGCNVNEEHDEQEEEEEDEERNSAREIETLPLFPMHDNINGFCGIKHNTDGGPGIWYDDVFMGSSRTSLELSLNSYTAMSPSSP。

本发明实施例提供了一种重组载体，其含有前述任一实施方式所述的石榴PgWUS基因。

具体地，重组载体包括以下任一载体：目的基因克隆载体(保存和克隆目的基因，如E.coli质粒)、中间克隆载体(由大肠质粒插入T-DNA片段及目的基因、标记基因等构建而成，是构建中间表达载体的基础质粒)、中间表达载体(含有植物特异性启动子的中间载体，作为构建转化载体的质粒)和/或植物基因转化载体(用于目的基因导入植物细胞的载体)。

本发明实施例提供了一种宿主细胞，其含有如前述实施例所述的重组载体。

本发明实施例提供了如前述实施例所述的石榴PgWUS基因在调控植物花器官的发育中的应用。

在可选实施方式中，所述植物为石榴。

在可选实施方式中，所述调控植物花器官的发育为调控石榴雄蕊的发育和/或雌蕊的败育。

本发明实施例还提供了如前述实施方式所述的石榴PgWUS基因在制备转基因植物中的应用。

在一些实施方式中，所述应用包括将前述实施方式所述的石榴PgWUS基因转入植物组织中，筛选转基因植物。

需要说明的是，在上述应用中，通过间接转化法和/或DNA直接转化法将分离的核酸用于制备转基因植物的应用均属于本申请的保护范围内。间接转化法包括农杆菌介导法和病毒介导法，DNA直接转化法包括基因枪法、电击法、花粉管道通道法、化学物质诱导法、显微注射法和脂质体法。

此外，本发明实施例还提供了一种引物对，其用于扩增前述任一实施例所述的石榴PgWUS基因。

需要说明的是，用于检测上述石榴PgWUS基因中任一区域(包括全长区域)的引物对均属于本申请的保护范围内。

优选地，所述引物对的序列如SEQ ID No.3～4所示或如SEQ ID No.5～6所示。

实施例

本实施例提供了一种石榴PgWUS基因。

1.RNA的提取和cDNA的合成

实验材料采自南京林业大学白马基地石榴资源圃五年生石榴母株。

参照百泰克(Bio Corporation)RP3302 RNA提取试剂盒分离提取不同发育阶段石榴花RNA，然后使用PrimeScript^TMRT reagent KitwithgDNA Eraser(TaKaRa)试剂盒对提取的RNA进行cDNA合成反应，操作方法包括去除基因组反应和反转录反应。

cDNA的20μL反应体系中包含50ng RNA，反转录条件为37℃，15min；85℃，5s。之后将反转录产物于-20℃或更低温度保存备用。

2.基因的克隆

通过RT-PCR进行对步骤1的cDNA克隆，PCR扩增所用的聚合酶为PV2，在50μL体系中加入以下成分：高保真聚合酶(PV2)1μL，2X Mix 25μL，模板2μL，加灭菌水至50μL。

PCR反应条件为：(a)95℃，3min；(b)95℃，25s；62℃，20s；72℃，40s；共25个循环；(c)72℃，1min。

扩增基因编码区全长的引物为PgWUS-S和PgWUS-A，序列如下；

PgWUS-S:5’-ATGGAACAACCTCAGCAGCATCATC-3’(SEQ ID No.3)；

PgWUS-A:5’-CTAGGGCGAACTCGGGGACATGGCA-3’(SEQ ID No.4)。

将扩增得到的PCR产物经过1％琼脂糖凝胶电泳分离后用DNA凝胶回收试剂盒(TSINGKE)进行分离纯化，并送公司测序。

PgWUS基因开放阅读框为936bp，共编码311个氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，碱基序列如SEQ ID No.2所示。

3.荧光定量Real-time RT-PCR

用荧光定量Real-time RT-PCR对步骤2得到的PgWUS基因进行表达分析。

荧光定量PCR所用cDNA模板稀释成10ng/μL，聚合酶为TB GreenPremix Ex Taq(TliRNaseH Plus)，仪器为7500Real-Time PCR System(Applied Biosystems)。PgActin为实验的内参基因。

PCR的反应体系为：TB Green Premix Ex Taq 10μL，ROX Reference DyeⅡ0.4μL，上游引物和下游引物各0.4μL，cDNA模板2μL，加灭菌水至20μL。

PCR反应程序为：(1)95℃，30s；(2)95℃，5s；60℃，34s；共40个循环；(3)95℃，15s；60℃，1min；95℃，15s。

PgWUS荧光定量PCR所用引物序列为：

QPgWUS-S:5’-CCAACTCTTTCGGTCCCT-3’(SEQ ID No.5)；

QPgWUS-A:5’-TCCATAGTTAGCCATCTGTCC-3’(SEQ ID No.6)。

内参基因PgActin所用引物序列为：

QPgActin-S:5’-AGTCCTCTTCCAGCCATCTC-3’；

QPgActin-A:5’-CACTGAGCACAATGTTTCCA-3’。

将PCR产物进行电泳，电泳结果如图1所示。

4.载体构建

将步骤3得到的PCR产物用于载体构建。

4.1重组连接实验

用EcoRI/XbaI处理SAK277质粒,进行胶回收(SAK277质粒的XbaI甲基化，转化JM110感受态以去甲基化)。

重组反应体系为：4μL3.3中胶回收产物、3.5μLSAK277(线性化载体)和2.5μL重组酶。

重组反应条件为：50℃水浴25min，放置2-3min使温度降低，然后进行转化及菌液涂布实验，37℃温育过夜。

4.2菌落筛选实验

a.挑取过夜平板中单菌落；b.用WUS1-1和WUS1-14引物进行菌落PCR；c.电泳鉴定阳性克隆(结果参照附图2)；d.随机选择4个阳性菌用4mL单管37℃摇床培养过夜。

WUS1-1和WUS1-14引物的序列如下：

WUS1-1:5’-ACGCTCGACACTAGTGGATCCAAAGAATTCATGGAACAACCTCAGCAGCATCATCAGCAACTGAACGAAGATGCCAACGGCGGCAGCAAA-3’；

WUS1-14:5’-TCGCATATCTCATTAAAGCAGGACTCTAGACTAGGGCGAACTCGGGGACATGGCAGTGTAGGAGTTGAGGCTGAGCTCGA-3’。

4.3提取质粒送测

过夜菌液提取质粒，并送测序。阳性菌液用WUS-VE-seqF和WUS-VE-seqR引物测序，获得正确质粒。

WUS-VE-seqF和WUS-VE-seqR引物的序列如下：

WUS-VE-seqF：5’-GACGCACAATCCCACTATCC-3’；

WUS-VE-seqR：5’-TAAGGATCTGAGCTACACAT-3’。

验证例

验证实施例提供的石榴PgWUS基因在石榴功能性雄花和两性花的表达模式。

通过荧光定量PCR验证PgWUS基因在石榴功能性雄花和两性花的表达模式。使用BioTeke植物总RNA提取试剂盒(离心柱型)分别提取‘泰山红’石榴两性花和功能性雄花八个发育阶段花器官总RNA，利用反转录试剂盒获得cDNA(PrimeScript^TMRT reagent Kitwith gDNA Eraser，TaKa Ra)，以cDNA为模板对不同发育阶段中石榴PgWUS基因的表达情况进行分析。

结果请参照附图3，石榴花为两性花原基，发育过程中，部分花芽雌蕊败育形成单性花即功能性雄花。功能性雄花基部较小，花外形钟状，花后脱落，不结果；两性花的基部有明显的膨大，外形筒状，发育成果实。

由图3可知，石榴PgWUS基因在石榴功能性雄花和两性花发育过程中都有表达，且在石榴功能性雄花和两性花发育后期的表达量有明显的增高，表明石榴PgWUS基因可能在石榴花的后期花器官成熟发育过程中发挥着重要的作用，与花后期的膨大有关。

从图3也可得知，在石榴花的发育过程中，不同发育时期石榴PgWUS基因的表达量具有显著差异。在花的发育后期，石榴PgWUS基因在石榴功能性雄花和两性花的发育后期表达量具有差异性，即相对于两性花，石榴PgWUS基因在功能性雄花后期发育中的表达量较高，表明石榴PgWUS基因与功能性雄花雄蕊的发育和雌蕊败育有关。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 南京林业大学

<120> 一种石榴PgWUS基因及其应用

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 311

<212> PRT

<213> Punica granatum L

<400> 1

Met Glu Gln Pro Gln Gln His His Gln Gln Leu Asn Glu Asp Ala Asn

1 5 10 15

Gly Gly Ser Lys Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ser Leu Leu Cys

20 25 30

Arg Gln Ser Ser Thr Arg Trp Thr Pro Thr Thr Glu Gln Ile Arg Ile

35 40 45

Leu Lys Asp Leu Tyr Tyr Asn Tyr Gly Val Arg Ser Pro Ser Ala Asp

50 55 60

Gln Ile Gln Arg Ile Ser Ala Arg Leu Arg Gln Tyr Gly Lys Ile Glu

65 70 75 80

Gly Lys Asn Val Phe Tyr Trp Phe Gln Asn His Lys Ala Arg Glu Arg

85 90 95

Gln Lys Lys Arg Phe Val Pro Asp His His Pro Asn Pro Asn Pro Leu

100 105 110

His His Leu Pro Ala Ala Ala Asn Ser Phe Gly Pro Ser Ala Glu Ser

115 120 125

Lys Leu Gly Asp Leu Pro Val His His Asp Asn Lys Tyr Pro Asn Phe

130 135 140

Gly Ser Ala Ile Gly Leu Pro Ser Ser Ser Ser Ser Ala Ala Thr Pro

145 150 155 160

Ala Gly Leu Val Ala Phe Gly Gln Met Ala Asn Tyr Gly Tyr Gly Ser

165 170 175

Thr Ala Thr Met Glu Lys Asn Phe Arg Asn Cys Ser Ile Ser Ser Ser

180 185 190

Cys Gly Gly Gly Gly Ser Pro Gly Val Gly Gly Ser Met Ser His Asn

195 200 205

Phe Gly Trp Ile Ala Val Asp Pro Tyr Pro Tyr Ser Ser Arg Ser Ile

210 215 220

Phe Asp Lys Gln Gly Cys Asn Val Asn Glu Glu His Asp Glu Gln Glu

225 230 235 240

Glu Glu Glu Glu Asp Glu Glu Arg Asn Ser Ala Arg Glu Ile Glu Thr

245 250 255

Leu Pro Leu Phe Pro Met His Asp Asn Ile Asn Gly Phe Cys Gly Ile

260 265 270

Lys His Asn Thr Asp Gly Gly Pro Gly Ile Trp Tyr Asp Asp Val Phe

275 280 285

Met Gly Ser Ser Arg Thr Ser Leu Glu Leu Ser Leu Asn Ser Tyr Thr

290 295 300

Ala Met Ser Pro Ser Ser Pro

305 310

<210> 2

<211> 936

<212> DNA

<213> Punica granatum L

<400> 2

atggaacaac ctcagcagca tcatcagcaa ctgaacgaag atgccaacgg cggcagcaaa 60

ggtggaggcg gtggcggagg cagcagctta ctctgcaggc agagcagcac gcggtggacc 120

ccgacgacgg aacagatacg catcctcaag gacctctact acaactacgg ggtgcggtcg 180

cccagcgccg atcagataca gcggatctcc gcccggctcc ggcagtacgg caagatcgag 240

ggcaagaacg tgttctactg gttccagaac cacaaggccc gcgagcgcca gaagaagcgc 300

ttcgtccccg accaccaccc caaccctaac cctcttcacc acctcccggc cgctgccaac 360

tctttcggtc cctccgctga gagcaaactc ggcgatctgc cggttcatca tgacaacaag 420

tacccgaact tcgggagtgc tatcggactg ccttcttctt catcgtctgc tgctacccca 480

gctggtctgg tggcttttgg acagatggct aactatggat atggttccac ggccaccatg 540

gaaaagaatt ttagaaattg ttccatatca tccagttgcg gtggcggtgg gagccccggc 600

gtcggaggat ccatgagtca caatttcgga tggattgcag tcgacccgta cccatattct 660

tctcgctcta tctttgacaa gcaaggctgc aatgtcaacg aagaacatga tgaacaggaa 720

gaggaggaag aggatgaaga aagaaactcc gctcgcgaga tcgagacact accgcttttc 780

ccaatgcatg acaacatcaa cggcttttgc gggatcaagc acaacacgga tggaggtcct 840

ggtatttggt acgatgatgt cttcatgggc agctctcgta cttccctcga gctcagcctc 900

aactcctaca ctgccatgtc cccgagttcg ccctag 936

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atggaacaac ctcagcagca tcatc 25

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ctagggcgaa ctcggggaca tggca 25

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ccaactcttt cggtccct 18

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tccatagtta gccatctgtc c 21

Claims

1.一种石榴PgWUS基因，其特征在于，其碱基序列如SEQ ID No.2所示。

2.一种石榴PgWUS蛋白，其特征在于，其由如权利要求1所述的PgWUS基因编码，所述石榴PgWUS蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

3.一种重组载体，其特征在于，其含有如权利要求1所述的石榴PgWUS基因。

4.一种宿主细胞，其特征在于，其含有如权利要求3所述的重组载体。

5.如权利要求1所述的石榴PgWUS基因在调控植物花器官的发育中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述植物为石榴。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述调控植物花器官的发育为调控石榴雄蕊的发育和/或雌蕊的败育。

8.如权利要求1所述的石榴PgWUS基因在制备转基因植物中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用包括将所述石榴PgWUS基因转入植物组织中，筛选转基因植物。

10.一种引物对，其特征在于，其用于扩增如权利要求1所述的石榴PgWUS基因；

优选地，所述引物对的序列如SEQ ID No.3～4所示或SEQ ID No.5～6所示。