KR100444371B1

KR100444371B1 - Ｒａｎ／ＲａｎＢＰ 단백질 조절기작이 저해된 초대형 다수확 재조합 식물의 제조방법

Info

Publication number: KR100444371B1
Application number: KR10-2001-0051820A
Authority: KR
Inventors: 김수환
Original assignee: (주)바이오녹스
Priority date: 2000-08-28
Filing date: 2001-08-27
Publication date: 2004-08-16
Also published as: KR20020018033A; ZA200301806B

Abstract

본 발명은 Ran/RanBP 단백질 조절 기작이 저해된 초대형 다수확 재조합 식물의 제조방법에 관한 것으로서, Ran 단백질 조절 기작에 관계하는 단백질들을 과다 발현시키거나 억제시킨 재조합 식물을 제조하여 몸체, 종자 크기, 뿌리 등이 천연형에 비해 1.5-2.5배가 증가된 유전자 변형식물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 Ran 단백질 조절 기작이 저해된 재조합 식물의 제조방법을 제공함으로써 농작물의 생산량 향상과 육종개발의 가능성을 제시한다.

Description

Ｒａｎ／ＲａｎＢＰ 단백질 조절 기작이 저해된 초대형 다수확 재조합 식물의 제조방법{Protocols for generation of high yield, super-productive transgenic plants disturbed in Ran/RanBP - mediated cellular process}

본 발명은 Ran/RanBP 단백질 조절 기작이 저해된 초대형 다수확 재조합 식물의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 Ran 또는 Ran 단백질의 기능에 관계하는 여러 가지 단백질을 과발현시키거나 안티센스로 작용하는 염기서열을 식물체 내에서 발현시켜 식물체내의 Ran 단백질과 Ran 결합단백질이 관여하는 생물학적 과정을 변형시킴으로써 초대형 우량품종을 개발하는 재조합 식물의 제조방법에 관한 것이다.

Ran(Ras-related nuclear protein)은 핵내에 존재하는 유일한 작은 GTP 결합단백질이며, Ran 결합단백질(RanBP)라고 부르는 Ran 결합단백질의 도움을 받아 세포물질의 핵내외의 이동(nuclear transport) 또는 체세포에서의 세포분열 진행에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.

Ran의 생물학적 활동을 매개해 주는 RanBP에는 RanGAP, RanBP1, RCC1, RanBPM, 뉴클레오포린(nucleoporin) 등의 다수의 단백질 등이 있으며, 이 이차 단백질들은 Ran의 GTP나 GDP 결합상태를 유도 또는 유지시킴으로써 Ran의 생물학적 활성을 조절한다(Kahana, J. A., and Cleveland, D. W.(1999) J. Cell Biol. 146, 1205-1210). RCC1은 Ran에 결합한 GDP를 GTP로 바꾸어주는 구아닌 뉴클레오티드 교환 인자(Guanine nucleotide excha nge factor: GEF)이며, RanGAP은 Ran의GTPase활동을 촉매하는 Ran-GTPase 활성화 단백질이고, RanBP1은 Ran-GTP상태를 안정화시킴으로써 RanGAP의 활동을 도와주는 공동인자(cofactor)이다(Hopper, A. K., Traglia, H. M., and Dunst, R. W.(1990) J. Cell Biol. 111, 309-321; Koepp, D. M., and Silver, P. A.(1996) Cell 87, 1-4). 이러한 Ran 결합단백질들에 의해 Ran-GTP와 RanGDP는 세포분열 전기에(prophase) 세포질과 핵질에서 불균형한 비율로 분포하게 되며 Ran-GTP는 핵공체의(nuclear pore complex) 핵질 방향에 우위적으로, Ran-GDP는 핵공체의 세포질 방향에 주로 위치한다(Kahana, J. A., and Cleveland, D. W. (1999) J. Cell Biol. 146, 1205-1210).

세포는 필요시 염색체의 숫자를 2배로 증가시키고 체세포 분열의 여러 단계(전기(prophase), 중기(metaphase), 후기(anaphase), 말기(telophase))와 세포질분열(cytokinesis)을 거쳐, 딸세포(daughter cell)에 다시 공평하게 나누어 전달하는 세포분열을 하게 되는데, RanBP1, RanBPM, RCC1, RanGAP 등은 이러한 과정에서 Ran과 함께 핵심적인 역할을 하는 것으로 최근에 동물세포와 효모를 이용한 실험에서 밝혀졌다. RCC1은 핵내에서 Ran-GTP의 농도를 높게 유지시키고, 세포 분열시 핵에 존재하는 RanBP1 또는 RanGAP 등은 핵내의 Ran-GDP 농도를 높이 유지하도록 하며, 그 활동이 Ran-GTP에 의존적인 RanBPM은 염색체 주위에 마이크로튜블(microtubule)로 이루어진 방추체(spindle) 형성이 잘 되도록 하여(Wilde, A.,and Zheng, Y. (1999) Science 284, 1359-1362), 궁극적으로 염색체들이 서로 반대극(opposite pole)으로 이동하는 세포분열이 이루어지게 한다.(Nakamura, M., Masuda, H., Horii, J., Kuma, K. I., Yokoyama, N., Ohba, T., Nishitani, H., Miyata, T.,Tanaka, M., and Nishimoto, T.(1998) J. Cell. Biol. 143, 1041-1052)

Ran 결합단백질 중 RanBP1 돌연변이가 효모(yeast)의 체세포 분열 등에 미치는 영향은 지금까지 여러 논문에서 보고되어 왔다(Battistoni, A., Guar guaglini, G., Degrassi, F., Pittoggi, C., Palena, A., Matteo, G. D., Pisano, C., Cundari, E., and Lavia, P. C. (1997) J. Cell Sci. 110, 2345-2357; He, X., Hayashi, N., Walcott, N. G., Azuma, Y., Patterson, T. E., Bischoff, F. R., Nishimoto, T., and Sazer, S. (1998) Genetics 148, 645-656 ; Kalab, P., Pu, R. T., and Dasso, M. (1999) Curr. Biol. 9, 481-484). 또한 AtRanBP1c 단백질을 효모내에서 과다 생산했을 때 세포분열 과정에서 정상적인 격막(septum) 형성이 저해되고(Xia et al., 1996) Plant J. 10(4): 761-769), 핵이 응집(condense)되면서 액틴(actin)배열이 흐트러짐이 보고되었다.

또한 오스펜스키(Ouspenski)는 그의 논문에서 RanBP1 돌연변이체 (yrb1-21)은 체세포 분열 과정에서 방추체 형성과 배치방향에 문제가 생겨 세포분열이 진행되지 않는다고 보고하였다(Ouspen ski, I. I. (1998) Exp. Cell Res. 244, 171-183).

Ran 신호 과정에서 Ran과 Ran 결합단백질의 관계는 동물과 효모에서 연구되고 있고, 식물 Ran은 효모에서 발현시 세포학적 기능이 비슷한 것으로 보고되었다. 에크와 그루이셈(Ach, R. A., and Gruissem, W. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 5863-5867)은 토마토 Ran 단백질이 효모의 Ran 계열 단백질과 유사하게 작용함을 제안하였다.

또한 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)에서 Ran1, Ran2, Ran3의 염기서열이 밝혀졌으며 Ran에 결합하는 단백질 AtRanBP1a, AtRanBP1b가 보고되었고(Haizel, T., Merkle, T., Pay, A., Fejes, E., and Nagy, F. (1997) Plant J. 11(1), 93-103), AtRanBP1c 단백질 또한 최근에 보고되었다(Xia et al., 1996, Plant J. 10(4): 761-769). 하지만 상기 단백질들의 식물에서의 정확한 기능은 이제까지 연구가 되어진바가 없다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 유전공학적인 방법으로 농작물의 생산량이 증가되거나 우수한 육종을 가지는 재조합 식물 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 상기의 방법으로 농작물에 형질전환이 가능한 재조합 벡터를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 상기의 방법으로 농작물에 형질전환이 가능한 유전자서열을 제공하는 것을 목적으로 한다

도 1은 본 발명의 pLBJ21/Ran(또는 pLBJ21/PsRan) 벡터의 제조 모식도를 나타낸 것이고,

도 2는 본 발명의 pLBJ21/AtRanBP1b 벡터의 제조 모식도를 나타낸 것이고,

도 3은 본 발명의 pLBJ21/AtRanBP1c 벡터의 제조 모식도를 나타낸 것이고,

도 4는 본 발명의 pLBJ21/안티센스 AtRanBP1b 벡터의 제조 모식도를 나타낸 것이고,

도 5는 본 발명의 pLBJ21/안티센스 AtRanBP1c 벡터의 제조 모식도를 나타낸 것이고,

도 6은 재조합 애기장대(pLBJ21/PsRan)의 게놈서든 분석을 나타낸 것이고,

도 7은 재조합 애기장대(pLBJ21/안티센스 AtRanBP1c)의 게놈서든 분석을 나타낸 것이고,

도 8은 재조합 애기장대(pLBJ21/PsRan)의 RNA의 노던 블롯 분석을 나타낸 것이고,

도 9는 재조합 애기장대(pLBJ21/안티센스 AtRanBP1c)의 RNA의 노던 블롯 분석을 나타낸 것이고,

도 10은 재조합 애기장대(pLBJ21/PsRan)와 천연형 식물의 뿌리 길이정도를 비교한 것이고,

도 11은 재조합 애기장대(pLBJ21/안티센스 AtRanBP1c)와 천연형 식물의 뿌리 길이정도를 비교한 것이고,

도 12는 재조합 애기장대(pLBJ21/안티센스 AtRanBP1b)와 천연형 식물의 종자크기를 비교한 것이고,

도 13은 재조합 애기장대(pLBJ21/안티센스 AtRanBP1b)와 천연형 식물의 꽃의 크기를 비교한 것이고,

도 14는 재조합 애기장대(pLBJ21/안티센스 AtRanBP1b)와 천연형 식물의 잎의 크기를 비교한 것이고,

도 15는 본 발명의 pLBJ21/ AtRanBP1b로 형질전환된 애기장대와 천연형 식물의 성체의 크기를 비교한 것이고,

도 16은 재조합 토마토(pLBJ21/ AtRanBP1b)와 천연형 식물의 성체의 크기를 비교한 것이고,

도 17은 재조합 토마토(pLBJ21/AtRanBP1b)와 천연형 식물의 잎의 크기를 비교한 것이고,

도 18은 재조합 토마토(pLBJ21/AtRanBP1b)와 천연형 식물의 가지의 크기를 비교한 것이고,

도 19는 재조합 토마토(pLBJ21/AtRanBP1b)와 천연형 식물의 미성숙 과실의크기를 비교하여 사진으로 나타낸 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 서열번호 1의 Ran 염기서열을 제공한다.

또한 본 발명은 서열번호 2의 AtRanBP1b 염기서열을 제공한다.

또한 본 발명은 서열번호 3의 AtRanBP1c 염기서열을 제공한다.

또한 본 발명은 AtRanBP1b 유전자의 발현을 저지하는 서열번호 4의 안티센스AtRanBP1b 염기서열을 제공한다.

또한 본 발명은 AtRanBP1c 유전자의 발현을 저지하는 서열번호 5의 안티센스 AtRanBP1c 염기서열을 제공한다.

또한 본 발명은 서열번호 4의 안티센스 AtRanBP1b 염기서열 또는 안티센스 AtRanBP1b 염기서열 일부를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

또한 본 발명은 서열번호 5의 안티센스 AtRanBP1c 염기서열 또는 안티센스 AtRanBP1 염기서열 일부를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

또한 본 발명은 Ran, AtRanBP1a, AtRanBP1b, AtRanBP1c, RanGAP, RanBPM, RCC1, 및 RanBP1로 이루어지는 군으로부터 선택되어진 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

또한 본 발명은 Ran 조절 기작에 관계하는 유전자의 센스염기서열 또는 안티센스염기서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 식물을 제공한다.

또한 본 발명은 Ran 조절 기작에 관계하는 유전자의 센스염기서열 또는 안티센스염기서열을 포함하는 재조합 벡터를 식물에 형질전환시키거나 낫 아웃(knock-out)시켜 제조하는 유전자 변형 식물의 제조방법을 제공한다.또한 본 발명은 서열번호 4의 AtRanBP1b 서열 또는 안티센스 방향으로 서열번호 4의 AtRanBP1b 서열의 기능적 부분을 포함하는 식물 발현 벡터를 제공한다. 상기 식물 발현 벡터는 pLBJ21/안티센스 AtRanBP1b (KCTC0850BP)가 바람직하다.또한 본 발명은 RanGAP, RanBPM, RCC1, 및 RanBP1으로 이루어진 그룹에서 선택된 유전자의 개방 해독 프레임(ORF)를 포함하는 식물 발현 벡터를 제공한다.또한 본 발명은 상기의 식물 발현 벡터를 포함하는 식물 세포를 제공하며, 상기의 식물세포를 다수개로 포함하는 유전자 변형 식물을 제공한다.또한 본 발명은 Ran 또는 Ran 결합단백질에 의해 조절되는 식물 뿌리에서의 하나 이상의 생물학적 공정을 조절하기 위한 방법에 있어서, 상기 방법은 아라비도프시스 식물세포 이외의 식물세포를 Ran 단백질을 인코딩하는 제1 핵산을 센스 방향으로 구성하는 제1 발현 구조체 또는 Ran 결합 단백질을 인코딩하는 제2 핵산을 안티센스 방향으로 구성하는 제2 발현 구조체로 형질전환하고, 상기 변형된 식물세포로부터 유전자 변형 식물을 재생하고 및 상기 유전자 변형 식물을 상기 제1 또는 제2 핵산이 발현되고 하나 이상의 조절된 생물학적 공정을 가진 유전자변형 식물이 획득되는 조건에서 발육시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다. 상기에서, 상기 식물 뿌리에 상기 하나 이상의 생물학적 공정의 조절로 상기 유전자 변형 식물의 기본 뿌리의 길이가 성장하는 것이 바람직하다. 또한 상기 생물학적 공정이 옥신 유도 세포 주기 진행인 것이 바람직하며, 상기 옥신에 대한 상기 생물학적 공정은 감도가 증가하는 것이 바람직하다. 상기 옥신은 외인적으로 적용된 옥신이 바람직하다.또한 본 발명은 Ran 또는 Ran 결합단백질에 의해 조절되는 식물 뿌리이외 하나이상의 식물조직에서 하나 이상의 생물학적 공정을 조절하기 위한 방법에 있어서, 상기 방법은 아라비도프시스 식물세포 이외의 식물세포를 Ran 단백질을 인코딩하는 제1 핵산을 센스 방향으로 구성하는 제1 발현 구조체 또는 Ran 결합 단백질을 인코딩하는 제2 핵산을 안티센스 방향으로 구성하는 제2 발현 구조체로 형질전환하고, 상기 변형된 식물세포로부터 유전자 변형 식물을 재생하고 및 상기 유전자 변형 식물을 상기 제1 또는 제2 핵산이 발현되고 하나 이상의 조절된 생물학적 공정을 가진 유전자변형 식물이 획득되는 조건에서 발육시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다. 상기 생물학적 공정은 옥신 유도 세포 주기 진행인 것이 바람직하고, 상기 하나 이상의 생물학적 공정의 조절로 상기 하나 이상의 식물 조직의 표현형이 변형되는 것이 바람직하다. 또한 상기 변형된 표현형이 상기 하나 이상의 식물 조직의 크기의 증가인 것이 바람직하며, 상기 하나 이상의 식물 조직이 잎, 줄기, 씨앗, 꽃 및 사상체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다. 상기에서, 상기 하나 이상의 식물조직이 씨앗이고, 상기 변형된 표현체는 적어도 상기 유전자 변형 식물에 의해 생산된 개개 씨앗의 무게 증가 및 각 유전자 변형 식물에 의해 생산된 씨앗 수의 증가의 하나인 것이 더욱 바람직하다.또한 본 발명은 하나 이상의 식물 조직에 있어 옥신에 대한 감도를 증가시키기 위한 방법에 있어서, 상기 방법은 Ran 단백질을 인코딩하는 제1 핵산을 센스 방향으로 구성하는 제1 발현 구조체 또는 Ran 결합 단백질을 인코딩하는 제2 핵산을 안티센스 방향으로 구성하는 제2 발현 구조체를 겸비한 식물 세포를 변형하고, 상기 변형된 식물세포로부터 유전자 변형 식물을 재생하고 및 상기 제1 또는 제2 핵산이 발현되고 옥신에 대한 증가된 감도를 가진 유전자 변형 식물이 획득되는 조건에서 상기 유전자 변형 식물을 발육시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다. 상기 하나 이상의 식물 조직은 뿌리인 것이 바람직하고, 상기 식물이 아라비도프시스이고 상기 증가된 감도로 인하여 10^-10M 내지 10^-12M 미만의 옥신 농도에서 기본 뿌리의 발육이 향상되는 것이 바람직하다.또한 본 발명은 유전자 변형되지 않은 야생 식물과 비교하여 뿌리 이외에 하나 이상의 조직에서 큰 표현형을 가진 유전자 변형 식물에 있어서, 상기 유전자 변형 식물은 Ran 단백질을 인코딩하는 제1 핵산을 센스 방향으로 구성하는 제1 발현 구조체 또는 Ran 결합 단백질을 인코딩하는 제2 핵산을 안티센스 방향으로 구성하는 제2 발현 구조체를 겸비한 식물 세포를 변형하고, 상기 변형된 식물세포로부터 유전자 변형 식물을 재생하고 및 상기 제1 또는 제2 핵산이 발현되고 상기 하나 이상의 조직에서 큰 표현형을 가진 유전자변형 식물이 획득되는 조건에서 상기 유전자 변형 식물을 발육시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법에 의해 획득된 식물을 제공한다.또한 본 발명은 아라비도프시스 식물 이외에, 유전자 변형되지 않은 야생 식물과 비교하여 뿌리 이외에 하나 이상의 조직에서 큰 표현형을 가진 유전자 변형 식물에 있어서, 상기 유전자 변형 식물은 Ran 단백질을 인코딩하는 제1 핵산을 센스 방향으로 구성하는 제1 발현 구조체 또는 Ran결합 단백질을 인코딩하는 제2 핵산을 안티센스 방향으로 구성하는 제2 발현 구조체를 겸비한 식물 세포를 변형하고, 상기 변형된 식물세포로부터 유전자 변형 식물을 재생하고 및 상기 제1 또는 제2 핵산이 발현되고 상기 하나 이상의 조직에서 큰 표현형을 가진 유전자변형 식물이 획득되는 조건에서 상기 유전자 변형 식물을 발육시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법에 의해 획득된 식물을 제공한다.

이하 본 발명을 상세하게 설명한다.

Ran 또는 Ran 결합단백질들의 식물에서의 정확한 기능은 이제까지 연구가 되어진바가 없다. 본 발명자는 식물의 Ran과 AtRanBP1c 단백질이 식물호르몬의 하나인 옥신에 의한 세포분열진행조절에 중요한 역할을 함을 밝혔으며, 식물의 Ran과 AtRanBP1c의 식물내 양을 조절하여 옥신에 대한 식물의 민감성을 변화시킴으로써식물뿌리의 성장을 촉진하거나 바이오메스를 증가시키는 변형식물을 개발하였다. 또한 본 발명자는 애기장대의 AtRanBP1b가 식물의 유사분열과 체세포분열에 깊이 관여하여 분열이 중기분열에서 간기분열로 진행되는 과정을 조정함을 밝혔고, 식물의 AtRanBP1b의 양을 변화시켜 식물의 바이오메스와 전체 수확량을 증가시키는 변형식물을 개발하였다.

이에 본 발명은 Ran 조절기작에 관계하는 단백질의 센스염기서열 또는 안티센스염기서열을 과다 발현시켜 식물의 몸체, 종자의 크기, 뿌리 길이가 증가된 유전자 변형 식물을 제조하였고, 아울러 농작물의 육종 개발에 토대가 되는 유전자 변형 식물 제조방법을 확립하였다.

상기 Ran 조절 기작에 관계하는 단백질은 Ran(Haizel et al., 1997, Plant J 11(1): 93-103)과 Ran 결합단백질이며 Ran 결합단백질은 AtRanBP1a(Haizel et al., 1997, Plant J 11(1): 93-103), AtRanBP1b (Haizel et al., 1997, Plant J 11(1): 93-103), AtRanBP1c(AT5 in Xia et al., 1996, Plant J. 10(4): 761-769), RanGAP(Merril et al., 1999 Science, 283: 1742-1745), RanBPM(Nakamura et al., 1998, J. Cell. Biol., 143(4): 1041-1052), RCC1(Fruno et al., 1991, Genomic, 11(2):459-461), 및 RanBP1(Ouspenski et al., 1995, J. Biol. chem., 270(5): 1975-1978)로 이루어지는 군으로부터 선택되어지는 것이 바람직하다. 상기 AtRanBP1a, AtRanBP1b, AtRanBP1c는 아라비돕시스에서 알려진 Ran 결합단백질이며, RanGAP, RanBPM, RCC1, 및 RanBP1은 동물 또는 효모 등에서 밝혀진 Ran 결합단백질이다. Ran은 그 아미노산 서열이 생물 종간에 잘 보존되어 있어서 식물간은 90 %이상, 식물과 효모 등과는 70 % 이상이 같은 아미노산 서열을 가진다.(Merkle et al., 1994, Plant J. 6(4): 555-565) 또한 RanBP1과 아라비돕시스의 AtRanBP1도 그 서열이 비교적 잘 보존되어 있어 AtRanBP1은 식물간에는 80 %이상 다른 생물체의 RanBP1과는 60 %이상 그 서열이 같다.(Haizel et al., 1997, Plant J. 11(1): 93-103). 한편, 효모의 RanBP1인 CST20은 쥐의 RanBP1과 50 % 정도 그 아미노산 서열이 일치한다.(Ouspenski et al., 1995, JBC 270(5): 1975-1978) RanBPM의 경우는 쥐와 사람의 단백질 아미노산 서열이 거의 같고 효모와는 30 %정도 같은 것으로 보인다.(Nakamura et al., 1998, J. Cell. Biol., 143(4):1041-149) 초파리의 RanGAP의 경우 효모와 쥐의 RanGAP과는 34 내지 36 %의 아미노산 서열이 일치한다.(Merril et al, 1999, Science, 12:283-287) 그러므로 Ran은 70 %이상의 아미노산상 상동성을 가지는 단백질이 바람직하고, AtRanBP1b 또는 AtRanBP1c는 50 %이상의 아미노산 상동성을 가지는 단백질이 바람직하다. 상기 동일성을 가지는 단백질은 생체내 동일한 기능을 가진다. 또한 그외 Ran 결합단백질 군(AtRanBP1a, RanGAP, RCC1, RanBPM)은 35 %이상의 아미노산 상동성을 가지는 단백질이 바람직하다.

또한 Ran 결합단백질은 Ran 결합부위(RanBD)라고 하는 Ran이 결합하는 아미노산 서열을 가지고 있어(Beddow et al., 1995, PNAS, 92:3328-3332), Ran이 결합하여 GTP를 분해하는 것을 도와준다(Novoa et al., 1999, Mol. Biol. Cell., 10: 2175-2190). 따라서, 상기 Ran 조절기작에 관계하는 단백질은 Ran 결합부위를 포함하는 단백질을 포함한다.

또한 본 발명은 Ran 조절 기작에 관계하는 단백질의 발현을 증가 또는 억제시키거나 낫아웃(knock-out)시켜 제조된 유전자 변형식물 제조방법을 제공한다. 상기 유전자 변형 식물은 여러 가지 식물용 프로모터를 이용한 Ran 또는 Ran 결합단백질의 과다발현, 안티센스 과다발현, RNA 인터퍼런스(interference) 등으로 제조하는 것이고, 또한 UV 처리, EMS 처리 또는 트렌스포존(Trasposom)방법을 이용한 낫아웃(Knock-out) 방법으로 가능하다. 상기 방법 중 안티센스 방법은 목적하는 유전자의 상보쇄(안티센스)를 동일한 생물체내에서 발현시킴으로써 목적하는 유전자의 mRNA와 안티센스 mRNA의 결합을 발생시키고, 이로 인하여 목적하는 유전자의 mRNA가 단백질로 번역되지 못하게 하여 목적하는 단백질의 발현을 억제시키는 방법이다.

본 발명은 토마토와 식물 생물학 분야에서 연구 재료로 널리 이용되고 있는 애기장대(Arabidopsis)를 이용하여 Ran 단백질의 발현을 조절하는 재조합 벡터에 의한 유전자 변형식물 제조방법을 제공한다. 상기 재조합 벡터는 유전자에 대한 센스 및 안티센스 염기서열 또는 센스 RNA와 안티센스 RNA를 동시 발현 할 수 있는 프로모터를 포함하는 재조합 벡터이다.

먼저 콩(Pisum Sativum)의 Ran 단백질인 PsRan(서열번호 1)을 에티올레티드 완두콩 싹(etiolated pea plumule) 라이브러리로부터 클로닝하고 pLBJ21벡터에 삽입하여 재조합 벡터 pLBJ21/PsRan을 제조하고, 생명공학연구소 유전자은행 기탁기관에 기탁번호 KCTC0837BP로 기탁하였다. 상기 pLBJ21벡터는 pKYLX71(Schardl, C. L., Byrd, A. D., Benzion, G., Altschuler M. A., Hildebrand, D. F., and Hunt,A. G. (1987) Gene 61, 1-11, 1987; Lloyd, A. M., Walbot, V., and Davis, R.W. (1992) Science 258, 1773-1775)의 발현 카세트 부분의 멀티 클로닝 부위에서 HindIII 인식 부위를 EcoRI 인식 부위로 변환시킨 pKYLX71 유도체 플라스미드로서, 바이너리 벡터로 작용하여 본 발명의 형질전환 수단으로 이용하였다.

또한 AtRanBP1b(서열번호 2)와 AtRanBP1c(서열번호 3)도 pLBJ21벡터에 삽입하여 pLBJ21/AtRanBP1b(기탁번호 KCTC0838BP)와 pLBJ21/AtRanBP1c(기탁번호 KCTC0839BP)로 기탁하였다.

상기 pLBJ21/PsRan, pLBJ21/AtRanBP1b, 및 pLBJ21/ AtRanBP1c 3종의 재조합 벡터는 애기장대에 형질전환하여 형질전환체를 선별하고 재조합 식물의 표현형을 비교, 관찰하였다. 그 결과 재조합 애기장대(pLBJ21/PsRan(KCTC0837BP))는 긴 뿌리 표현형 및 큰 크기의 식물(big-sized plant) 표현형을, 재조합 애기장대(pLBJ21/AtRanBP1b(KCTC0838BP))는 큰 크기의 식물(big-sized plant) 표현형을, 재조합 애기장대(pLBJ21/AtRanBP1c(KCTC0839BP))는 긴 뿌리 표현형 및 증가된 종자무게 표현형과 큰 크기의 식물(big-sized plant) 표현형을 나타내었다.

또한 Ran 조절기작에 관계하는 유전자를 억제한 유전자 변형식물을 제조하기 위하여 Ran 결합단백질인 AtRanBP1b와 AtRanBP1c의 각각 안티센스 염기서열을 고안하였다. 상기 안티센스 염기서열은 서열목록작성 소프트웨어로 서열번호 4의 안티센스 AtRanBP1b를 기재하였고, 서열번호 5의 안티센스 AtRanBP1c를 기재하였다. 상기 서열번호 4와 서열번호 5의 안티센스 서열은 전체 서열을 모두 벡터에 재조합하거나 일부의 염기서열을 포함하는 재조합 벡터를 제조함으로써 Ran 조절기작에관계하는 유전자를 억제하는 유전자 변형식물을 제조할 수 있다. 상기 일부의 염기서열은 50 bp 이상이 바람직하다. 유전자의 센스 염기서열과 안티센스 염기서열을 동시 발현시켜 RNA 인터퍼런스(interference)을 일으키는 방법의 경우, Ran 조절기작에 관계하는 유전자를 억제한 유전자 변형식물을 제조하기 위해 그 길이가 26 bp 이상이 바람직하다(Parrish et al., 2000 Molecular Cell 6: 1077-1087; Chuang et al.,Proc. Natl. Acad. Sci, USA 97: 4985-4990).

본 발명에서는 안티센스 AtRanBP1b와 안티센스 AtRanBP1c를 각각 pLBJ21 벡터에 삽입하여 2종의 재조합 벡터를 제조하였고, 상기에서 제조한 재조합 벡터 pLBJ21/안티센스 AtRanBP1b는 기탁기관에 기탁번호 KCTC0850BP로 기탁하였고, 재조합 벡터 pLBJ21/안티센스 AtRanBP1c는 기탁번호 KCTC0851BP로 기탁하였다.

상기 pLBJ21/안티센스 AtRanBP1b, 및 pLBJ21/안티센스 AtRanBP1c 2종의 재조합 벡터를 애기장대에 형질전환시키고 형질전환체의 표현형을 관찰한 결과, 재조합 애기장대(pLBJ21/안티센스 AtRanBP1b(KCTC0850BP))는 빅 플랜트(big-plant: 잎면적, 줄기 두께, 종자의 부피와 무게, 식물 당 종자수가 증가됨)표현형을, 재조합 애기장대(pLBJ21/안티센스 AtRanBP1c(KCTC0851BP))는 긴 원뿌리 생장 및 빅 플랜트(big-plant: 잎면적, 줄기 두께, 종자의 부피와 무게, 식물 당 종자수가 증가됨)표현형을 나타내었다.

또한 재조합 애기장대(pLBJ21/안티센스 AtRanBP1c)에 대한 옥신의 민감도를 실험하였다. 옥신은 화분(花粉)의 발아, 화분관의 신장 촉진, 곁뿌리와 꽃눈의 형성, 캘러스(callus)로부터의 싹이나 뿌리의 형성, 및 분열세포의 분열과 신장을 촉진시키는 식물 호르몬이며, 본 발명에서는 위의 형질전환된 식물이 세포의 분열과 생장에 영향을 미치는 옥신 호르몬에 대한 감수성이 바뀌었는지를 실험하였다. 통상적으로 뿌리에서 낮은 농도의 옥신(10^-6- 10^-7M)은 뿌리 분열세포의 분열과 성장을 촉진시키고 곁뿌리 성장은 억제하는 것으로 알려져 있으나, 반대로 높은 농도(10^-6- 10^-5M)의 옥신은 뿌리에 대해 정 반대 작용을 한다.

본 발명의 재조합 애기장대(pBLJ21/안티센스 AtRanBP1c)는 옥신에 민감하게 반응하여 외부에서 공급된 pM정도의 낮은 농도의 옥신으로도 뿌리의 생장이 저해되고, 곁뿌리 분화 개시가 촉진된다. 대조적으로, 천연형의 식물에서는 pM 정도의 옥신 농도에서는 아무런 반응이 일어나지 않으며 10^-7M 옥신에서 곁뿌리 분화가 촉진되었다. 상기의 결과에서 본 발명의 유전자 변형식물은 옥신에 대한 민감도가 증가되어 일반적으로는 천연형에서는 뿌리 성장을 촉진시키지 않는 아주 낮은 농도의 체내 옥신(Endogenous auxin)이 뿌리성장을 촉진시킴을 볼 수 있었다.

또한 pLBJ21/안티센스 AtRanBP1b(기탁번호: KCTC0850BP), pLBJ21/안티센스 AtRanBP1c(기탁번호: KCTC0851BP), pLBJ21/PsRan(기탁번호 KCTC 0837BP), pLBJ21/AtRanBP1b(기탁번호 KCTC 0838BP), 또는 pLBJ21/AtRanBP1c(기탁번호 KCTC0839BP)를 토마토에 형질도입하여 재조합 식물을 제조하였다.

본 발명의 재조합 식물들은 긴 뿌리, 큰 종자, 큰 몸체 등의 표현형을 보이게 되어 상기의 언급한 본 발명의 Ran 조절 기작이 변형된 재조합 식물 제조방법으로 우수한 육종을 개발할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1] PsRan 단백질을 발현하는 재조합 식물

(1) PsRan 유전자의 클로닝

애기장대 cDNA bank(ARBC, Ohio)에서 제공받은 ATTS1902 클론의 EcoRI/XhoI 유전자 조각을 프로브로 완두콩 싹 cDNA 발현 라이브러리를 스크니링하여 PsRan 유전자를 획득하였다.

(2) PsRan 유전자를 포함하는 재조합 벡터제조

상기 (1)의 PsRan cDNA는 pBluescript SK+(Strategene, CA) 벡터의 EcoRI과 XhoI 위치에 클론되어 있다. 상기 유전자를 제한 효소 EcoRI/XhoI로 자른 후 같은 제한효소로 잘린 pLBJ21 벡터에 삽입하여 CaMV35S 프로모터 하에 PsRan을 발현하는 융합 벡터를 도 1의 도시한 바와 같이 제조하였다. 융합 벡터는 pMP90 플라스미드를 포함하는 아그로박테리움(Agro bacterium tumefaciens GV3101)에 일렉트로포레이션(electroporation : Koncz, C., and Schell, J. (1986) Mol. Gen. Genet. 204, 383-396)으로 도입하여 식물로 재조합 벡터를 전달하는 매개체를 제조하였다.

(3) 재조합 애기장대(pLBJ21/PsRan) 제조

상기의 pLBJ21/PsRan은 아그로박테리움을 매개로 하여 애기장대의 뿌리 외식편(Vale kens, D., Montagu, M. V., and Lijsebettens, M. V. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 5536-5540) 형질전환하였다. 최초 형질전환체의 T1 씨앗을 발아 배지(GM; Germination Medium, Valekens, D., Montagu, M. V., and Lijsebettens, M. V. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 5536-5540)에서 배양하였고 50 ㎍/L의 카나마이신(kanamycin)으로 형질전환체를 선별하였다. 선별한 T1 식물에서 T2씨앗을 회수하고, 동일한 배지에서 배양하여 상동의 T2 씨앗(homozygotes)을 확인하였다. 확인된 T2 씨앗으로 형질전환 식물의 특징을 관찰하였다.

[실시예 2] AtRanBP1b 단백질을 발현하는 재조합 식물

(1) AtRanBP1b 유전자의 클로닝

AtRanBP1b 유전자는 PsRan을 바이트(bait)로 사용하여 애기장대 cDNA library에서 결합단백질을 클론하기 위하여 이스트 투 하이브리드(two-hybrid screening) 방법을 사용하였다. 구체적으로, 완전체(Full- length) PsRan은 최초 ATG 코돈을 포함한 서열번호 6의 프라이머와 정지 코돈이 포함된 서열번호 7의 프라이머를 사용하여 PCR방법으로 증폭하였다. 증폭된 PsRan은 EcoRI과 BamHI으로 자른 후 같은 제한 효소로 잘린 pGBT9 vector(clonetech, CA)에 서브클로닝하였다. pGBT9/PsRan 융합벡터는 pACT에 서브클론된 애기장대 cDNA 라이브러리와 함께 효모(Saccharomyces cerevisiae Y190)에 공동 형질전환(cotransformation)한 후 클론텍(Clonetech)에서 발행된 이스트 투 하이브리드 스크니링 책자에서 기술된 방법에 따라 PsRan 결합단백질인 AtRanBP1b를 클로닝하였다.

(2) AtRanBP1b 유전자를 포함하는 재조합 벡터제조

상기 실시예 1의 PsRan대신 AtRanBP1b를 사용하고 실시예 1의 재조합 벡터방법과 동일하게 수행하여 도 2의 도시한 바와 같이 pLBJ21/AtRanBP1b 재조합 벡터를 제조하였다. 이를 다시 설명하면, ATG를 포함한 서열번호 8의 프라이머와 서열번호 9의 프라이머를 이용하여 완전체 AtRanBP1b를 PCR로 증폭한 뒤 증폭된 유전자는 XhoI/XbaI으로 절단하였다. 절단된 AtRanBP1b 조각은 같은 효소로 미리 잘린 pLBJ21에 서브클로닝하여 도 2의 재조합 벡터 pLBJ21/AtRanBP1b를 제조하였다. 이러한 재조합벡터는 일렉트로포레이션을 이용하여 아그로박테리아에 도입하였다.

(3) 재조합 애기장대(pLBJ21/AtRanBP1b)제조

상기 pLBJ21/AtRanBP1b 재조합 벡터를 실시예 1의 재조합 식물제조 방법과 동일하게 수행하여 재조합 애기장대(pLBJ21/AtRanBP1b)를 제조하였다.

[실시예 3] AtRanBP1c 단백질을 발현하는 재조합 식물

(1) AtRanBP1c유전자의 클로닝

상기 실시예 2의 (1)에서 기술한 방법(yeast two-hybrid screening)으로 AtRanBP1c를 클로닝하였다.

(2) AtRanBP1c 유전자를 포함하는 재조합 벡터제조

상기 실시예 2의 (2)에서 AtRanBP1b 대신 AtRanBP1c를 사용하고 실시예 1의 재조합 벡터 방법과 동일하게 수행하여 도 3의 도시한 바와 같이 pLBJ21/AtRanBP1c 재조합 벡터를 제조하였다. 완전체(Full-length) AtRan BP1c는 서열번호 10의 프라이머와 서열번호 11의 프라이머를 이용하여 PCR증폭하였다.

(3) 재조합 애기장대(pLBJ21/AtRanBP1c)제조

상기 pLBJ21/AtRanBP1c 재조합 벡터를 실시예 1의 재조합 식물제조 방법과동일하게 수행하여 재조합 애기장대(pLBJ21/AtRanBP1c)를 제조하였다.

[실시예 4] 안티센스 AtRanBP1b를 발현하는 재조합 식물

(1) 안티센스 AtRanBP1b 염기서열의 제조

AtRanBP1b의 3' 말단 cDNA에는 XhoI 효소 인식 부위를 첨가해 주는 서열번호 12의 프라이머와, 5' 말단 cDNA에는 XbaI 효소 인식 부위를 첨가해 주는 서열번호 13의 프라이머를 이용하여 완전체 AtRanBP1b를 애기장대 전체 RNA에서 RT-PCR로 증폭시켰다.

(2) 안티센스 AtRanBP1b 염기서열을 포함하는 재조합 벡터제조

상기의 RT-PCR로 증폭된 AtRanBP1b를 XhoI/XbaI으로 자른 뒤 XhoI에서 XbaI 방향으로 안티센스 AtRanBP1b의 염기서열을 가지는 DNA 조각을 준비하였다. 그 후 pLBJ21의 XhoI/XbaI로 잘린 부위에 삽입하여 CaMV35S 프로모터 하에 안티센스 AtRanBP1b를 과다 발현하는 융합 벡터를 도 4의 도시한 바와 같이 제조하였다. 융합 벡터는 pMP90 플라스미드를 포함하는 아그로박테리움(Agrobacterium tumefaciens GV3101)에 일렉트로포레이션(electroporation : Koncz, C., and Schell, J. (1986) Mol. Gen. Genet. 204, 383-396)으로 도입하여 식물로 재조합 벡터를 전달하는 매개체를 제조하였다.

(3) 재조합 애기장대(pLBJ21/안티센스 AtRanBP1b)제조

상기 pLBJ21/안티센스 AtRanBP1b 재조합 벡터를 실시예 1의 재조합 식물제조 방법과 동일하게 수행하여 재조합 애기장대(pLBJ21/안티센스 AtRanBP1b)를 제조하였다.

[실시예 5] 안티센스 AtRanBP1c를 발현하는 재조합 식물

(1) 안티센스 AtRanBP1c 염기서열의 제조

상기 실시예 4의 (1)과 같은 방법으로 완전체(full-length) AtRan BP1c를 RT-PCR로 증폭하였다. 상기 RT-PCR에 사용한 프라이머는 서열번호 14와 서열번호 15이다.

(2) 안티센스 AtRanBP1c 염기서열을 포함하는 재조합 벡터제조

상기 실시예 4의 AtRanBP1b 대신 AtRanBP1c를 사용하고 실시예 4의 재조합 벡터 방법과 동일하게 수행하여 도 5의 도시한 바와 같이 pLBJ21/안티센스 AtRanBP1c 재조합 벡터를 제조하였다.

(3) 재조합 애기장대(pLBJ21/안티센스 AtRanBP1c)제조

상기 pLBJ21/AtRanBP1c 재조합 벡터를 실시예 1의 재조합 식물제조 방법과 동일하게 수행하여 재조합 애기장대(pLBJ21/안티센스 AtRanBP1c)를 제조하였다.

[실시예 6-10]

상기 실시예 1 내지 5에서와 동일한 방법으로, 상처낸 토마토의 자엽에 재조합 벡터를 도입하여, 재조합 토마토(pLBJ21/PsRan), 재조합 토마토(pLBJ21/AtRanBP1b), 재조합 토마토(pLBJ21/AtRanBP1c), 재조합 토마토(pLBJ21/안티센스 AtRanBP1b), 재조합 토마토(pLBJ21/안티센스 AtRanBP1c)를 제조하였다.

[실험예 1] 재조합 식물의 검증

(ⅰ) 게놈서든 분석(Genomic Southern analysis)

상기 실시예들의 총 10종 재조합 식물에 형질도입한 유전자가 식물의 염색체내에 안정적으로 도입되었는지를 검증하기 위하여 재조합 식물의 게놈을 서든 분석하였다.

발아한 3주 째의 재조합 식물에서 게놈 DNA를 분리하고 EcoRI으로 잘라 0.8 % 아가로즈 젤상에서 전기영동하여 제타 프로브 막으로(zeta- probe membrane : Biorad) DNA를 이동시켰다. 막은 0.25 M 소듐 포스페이트(pH 7.2)와 7 % SDS에서 65 ℃로 30분간 전 처리하고 [α-³²P]dATP-CaMV 35S 프로모터(pBI221벡터의 XbaI/HindIII로 잘린 조각)를 프로브로 첨가하여 65 ℃에서 20시간 반응시켰다. 반응 후 막은 20 mM 소듐 포스페이트, pH 7.2, 및 5 % SDS가 혼합된 용액으로 세척하였고 동일한 용액에 1 % SDS를 첨가하여 65 ℃에서 1시간 동안 세척하였다. 그 후 막은 감광시켜 프로브로 탐침됨을 확인하였다. 서든블롯 결과 CaMV 35S 프로모터를 포함하고 있는 재조합 식물을 선별하였다.

그 중 2종의 재조합 식물의 서든블롯 결과를 도 6과 도 7에 나타내었다. 도 6은 재조합 애기장대(pLBJ21/PsRan)의 DNA에 대한 서든블롯 사진이고, 도 7은 재조합 애기장대(pLBJ21/안티센스 AtRanBP1c)의 DNA에 대한 서든블롯 사진이다. 상기 도 6 및 도 7의 결과로, pLBJ21/PsRan가 각각의 재조합 애기장대의 서로 다른 염색체상에 삽입되었음을 알 수 있었다.(예: Sense PsRan-1, -4, -6, -7, -8 에 서로 다른 크기의 밴드 위치에서 CaMV 프로모터가 검출되었음).

(ⅱ) RNA의 노던 블롯 분석(Northern blotting analysis)

상기에서 선별한 재조합 식물에서 재조합 유전자의 RNA 발현여부를 확인하기 위하여 노던블롯을 실시하였다.

재조합 식물의 RNA를 트라졸(TRIzol reagent, Gibco BRL)용액으로 분리하고 6 % 포름알데하이드가 포함된 1.2 % 아가로즈 젤에서 전기영동한 후, PsRan, AtRanBP1b, 또는 AtRanBP1c의 센스 또는 안티센스 리보프로브(riboprobe)를 이용하여 노던 블롯을 수행하였다. 상기 프로브는 전사키트인, MAXIscript T3/T7(Ambion, TX)을 이용하여 제조하였다. 노던 블롯 후 인텐시파이 스크린(intensifying screen)에 감광시켜 인화하여 각 형질도입한 단백질의 RNA가 전사되고 있음을 확인하였다.

도 8은 재조합 애기장대(pLBJ21/PsRan)의 노던 블롯 사진이고, 도 9는 재조합 애기장대(pLBJ21/안티센스 AtRanBP1c)의 노던 블롯 사진이다. 상기 도 8 및 도 9에서, 재조합 애기장대에서 재조합 유전자들이 과다발현되고 있음을 알 수 있다. 또한 재조합 애기장대(pLBJ21/안티센스 AtRanBP1c)에서는 안티센스 AtRanBP1c가 발현되어 AtRanBP1c의 발현을 저해함을 확인하였다.(도 9)

[실험예 2] 5종의 재조합 애기장대의 표현형

(ⅰ) 뿌리길이 표현형

상기 실시예 1 내지 5의 재조합 애기장대의 뿌리길이를 측정하여 하기 표 1 및 표 2에 나타내었다.

	뿌리 길이 평균(mm)
천연형	5 ±1.5
pLBJ21/PsRan-1	6 ±1.8
pLBJ21/PsRan-4	15 ±4
pLBJ21/PsRan-7	13 ±3.6

	뿌리 길이 평균(mm)
천연형	7.5±1.5
pLBJ21/안티센스 AtRanBP1c-1	12±2.3
pLBJ21/안티센스 AtRanBP1c-2	20±4.1
pLBJ21/안티센스 AtRanBP1c-3	18±4.3
pLBJ21/안티센스 AtRanBP1c-5	9±1.2

도 8, 표 1 및 표 2에서, PsRan이 과다 발현된 재조합 애기장대(pLBJ21/PsRan-4) 또는 재조합 애기장대(pLBJ21/PsRan-7)는 그렇지 않은 재조합 애기장대(pLBJ21/PsRan-1) 또는 천연형에 비하여 뿌리성장이 우수함을 알 수 있다. 이는 재조합 애기장대(pLBJ21/안티센스 AtRanBP1c)에서도 관찰되었다.

도 10은 재조합 애기장대(pLBJ21/PsRan)의 뿌리길이를 나타낸 사진으로, 천연형 또는 비교군(pLBJ21 재조합 식물)에 비하여 pLBJ21/PsRan-7 재조합 애기장대의 뿌리성장이 우수함을 알 수 있다.

도 11은 재조합 애기장대(pLBJ21/안티센스 AtRanBP1c)의 뿌리길이를 나타낸 사진으로, 천연형에 비하여 뿌리가 긴 형질을 나타냄을 알 수 있다.

조직 해부학적 분석을 위하여 나비신 용액(Navishins solution, Mauseth, J.D., Montenegro, G., and Walckowiak, A. M. (1984) Can. J. Bot. 62, 847-857)에 뿌리 절편을 고정하였다. 고정 후 식물 조직은 표준화된 에탄올 단계를 통해 건조하였다. 에탄올은 파라핀에 넣기 전에 크실렌(xylene)으로 교체한 후, 조직을 7 um으로 절단하고 염색하여 표준 밝은 범위 현미경으로 관찰하였다. 각 뿌리의측정은 24시간마다 니콘사의 40배율의 해부용 현미경과 룰러(ruler)를 사용하여 실시하였다. 평균 길이(apical) 생장 비율은 재조합 식물이나 야생형의 식물 당 평균으로 계산하였다. 통계는 SAS 프로그램으로 처리하였고 측정은 6.3배 대물렌즈에서 마이크로미터 눈금자를 통하여 실시하였고, 천연형의 애기장대를 비교예로 하여 분석하였다.

하기 표 3은 재조합 애기장대(pLBJ21/안티센스 AtRanBP1c-1)와 천연형의 뿌리 표현형의 현미경 해부학적 차이를 비교한 것이다.

	뿌리 길이 평균(mm)	% 천연형
실시예 5	9.0	164

상기 표 3의 재조합 애기장대(pLBJ21/안티센스 AtRanBP1c)는 그 원뿌리 길이가 평균 1.6배정도로 천연형에 비해 길었다. 이는 하기 표 4(뿌리 조직의 해부학적 비교)에서 알 수 있듯이 외피(Epidermis), 코텍스(cortex), 및 내피세포의 평균 길이가 증가함으로써 생긴 현상이다.

	세포 길이 평균치(um)	세포 너비 평균치(um)
세포 조직	실시예 5	% 비교예	실시예 5	%비교예
표피	157.0	173	14.8	103
피층	146.0	151	28.0	116
내피	107.0	130	15.9	98

	뿌리 정단세포 성장
	성장 길이(um)/일(day)	%비교예
천연형	505	100
실시예 5	750	149

또한 재조합 애기장대(pLBJ21/안티센스 AtRanBP1c)의 뿌리 정단세포(rootapical cell)의 성장속도가 천연형에 비해 1.5배정도 빠른 것 을 알 수 있었다.(표 5)

(ⅱ) 인돌 아세트산에 대한 민감성 측정

인돌 아세트산(IAA ; indole acetic acid)에 대한 반응을 보기 위해 실시예 1 내지 5의 재조합 애기장대 중 재조합 애기장대(pLBJ21/안티센스 AtRanBP1c) 씨앗을 30 % 통상의 표백 용액으로 15분간 표면 멸균하고 멸균수로 세척 후 공기 중에 건조시켰다. 여러 개의 발아 배지(GM-슈크로즈)의 플레이트를 준비하여 씨앗을 놓고 발아가 동시에 일어나도록 72시간 동안 발아를 촉진시켰다. 플레이트에 다양한 농도의 인돌 아세트산을 첨가하고 동일 조건의 성장 챔버로 이동시켜 10일간 배양하였다(Modified from Knee and Hangarter, 1996). 10일이 지난 후 뿌리 길이와 뿌리 형태들을 관찰하였다. 결과는 천연형과 비교하여 하기 표 6에 나타내었다.

옥신(M)	실시예 5의 뿌리길이평균 ±표준편차(mm)	천연형 평균뿌리길이;벡터대조군의 평균뿌리길이(mm)
0	19.5 ±0.9	9.6 ; 7.3
10^-10	7.5 ±3.9	9.1 ; 10.8
10^-11	8.2 ±1.8	6.5 ; 8.1
10^-12	8.7 ±2.7	6.4 ; 11.8
10^-13	14.5 ±3.1	6.8 ; 6.7
10^-14	13.3 ±1.9	7.6 ; 11.0

천연형의 식물뿌리의 경우 통상적으로 뿌리는 10^-10M - 10^-6M의 옥신에 의해서 뿌리성장이 촉진되고, 그 이상 농도의 옥신에 의해서는 뿌리성장이 억제되는 이중적 반응을 나타낸다. 상기 표 6을 분석해보면, 상기 유전자 변형식물의 경우 옥신에 대한 민감도가 크게 증가하여서 이미 10^-10- 10^-12M의 옥신에 의해서도 뿌리 성장이 심각하게 억제됨을 알 수 있다. 이러한 뿌리성장 억제는 상기 실시예 5의 재조합식물의 분열세포에서의 체세포분열의 중단 때문에 생기는 것으로 관찰되었으며 이는 역으로 체내의 아주 낮은 농도의 옥신(10^-10- 10^-12M 미만)이 상기 실시예 5의 재조합식물에서의 원뿌리 성장을 촉진시켰음을 알 수 있다.

(iii) 종자크기 비교

상기 실시예 1 내지 5의 재조합 애기장대 가운데 3종의 T3 세대의 종자를 수확하여 그 무게를 조사하여 하기 표 7에 나타내었다.

재조합식물	무게/100개의 종자	표준편차
천연형	1.76 x 10^-5g	1.69 x 10^-6
pLBJ21/PsRan-1	2.06 x 10^-5g	1.67 x 10^-6
pLBJ21/PsRan-2	2.08 x 10^-5g	8.37 x 10^-7
pLBJ21/PsRan-3	2.08 x 10^-5g	1.64 x 10^-6
pLBJ21/PsRan-4	2.00 x 10^-5g	1.87 x 10^-6
pLBJ21/PsRan-5	2.35 x 10^-5g	2.16x 10^-6
pLBJ21/PsRan-6	2.24 x 10^-5g	1.82 x 10^-6
pLBJ21/안티센스 AtRanBP1b-1	2.20 x 10^-5g	2.74 x 10^-6
pLBJ21/안티센스 AtRanBP1b-2	2.22 x 10^-5g	2.39 x 10^-6
pLBJ21/안티센스 AtRanBP1c-1	2.82 x 10^-5g	2.86 x 10^-6
pLBJ21/안티센스 AtRanBP1c-2	2.72 x 10^-5g	8.37 x 10^-7
pLBJ21/안티센스 AtRanBP1c-3	3.48 x 10^-5g	2.23 x 10^-6
pLBJ21/안티센스 AtRanBP1c-4	3.71 x 10^-5g	2.04 x 10^-6

상기 표 7에서 보는 바와 같이 본 발명의 재조합식물들은 천연형에 비해 1.2 내지 2배정도로 무게가 증가된 종자를 만들어 냄을 알 수 있다. 특히 재조합 애기장대(pLBJ21/안티센스 AtRanBP1b)은 천연형에 비해 그 무게가 2배가 넘는 종자를만들었다. 또한, 재조합 식물은 잎의 면적, 줄기의 두께, 식물 당 종자의 수가 모두 증가된 표현형을 보여주었다.

도 12는 천연형 식물의 종자와 재조합 애기장대(pLBJ21/안티센스 AtRanBP1b)의 종자를 나타낸 사진으로, 재조합 애기장대(pLBJ21/안티센스 AtRanBP1b)의 종자가 월등히 큼을 알 수 있다.

(VI) 재조합식물의 잎면적, 하배축(hypocotyl)길이 및 건조무게 비교

재조합 애기장대(pLBJ21/안티센스 AtRanBP1c)를 MS 배지에서 발아, 2주간 키운 후 네 개의 잎을 가진 단계에서 식물의 여러 특징 관찰하였고, 그 결과는 표 8에 나타내었다.

	pLBJ21/안티센스 AtRanBP1c	천연형
건조무게 (㎍)	8.0(±1.39)	3.5 (±0.22)
잎길이 (mm)	4.44 (±0.13)	2.10 (±0.05)
잎넓이 (mm)	1.96 (±0.07)	1.4 (±0.03)
하배축길이 (mm)	4.95 (±0.06)	4.15 (±0.12)

또한 재조합 애기장대(pLBJ21/안티센스 AtRanBP1c)를 키운 후 종자 수확량, 꽃의 크기, 절간(internode) 길이 등을 측정하였다. 식물은 부엽토와 질석(vermiculite)이 50:50으로 섞힌 흙에서 7-9주 키웠으며, 성장챔버는 온도 23 ℃도, 습도 60 %, 그리고 밤/낮의 길이 12시간/12시간을 유지하였다. 일주일에 두차례 액비(질소 5 %, 수용성인산 10 %, 수용성가리 5 %)를 제공하였다. 식물의 성장에 따른 특징을 측정하여 표 9에 나타내었다.

	pLBJ21/안티센스 AtRanBP1c	천연형
장각과(Silique) 당 종자수 (개)	30.24(±1.97)	28.43 (±1.5)
식물당 장각과(Silique) 수 (개)	63.2 (±4.3)	38.4(±3.8)
천연형 대비 꽃의 크기, 단축 (%)	156 (± 5.4)	100
천연형 대비 꽃의 크기, 장축 (%)	170 (± 6.5)	100
1st 절간 직경 (mm)	0.57 (±0.03)	0.26 (±0.03)
3rd 절간 길이(cm)	1.22 (±0.1)	0.87 (±0.08)

천연형과 재조합 애기장대(pLBJ21/안티센스 AtRanBP1b)의 꽃의 크기(도 13), 성체잎의 크기(도 14), 식물의 성체의 전체크기(도 15)를 천연형과 비교하였다. 그 결과, 재조합 애기장대(pLBJ21/안티센스 AtRanBP1b)가 천연형에 비하여 큰 형질을 나타냄을 알 수 있었다.

[실험예 3] 재조합 토마토의 표현형

실시예 6 내지 10의 재조합 토마토 중 재조합 토마토(pLBJ21/ AtRanBP1b)의 여러 특징을 표 10에 나타내었다.

	pLBJ21/ AtRanBP1b	천연형
지상부로부터의 키 (Cm)	180±6.3	110 ±4.8
줄기직경 (mm)	11.42 ±1.3	7.6 ±1.2
잎의 장축길이 (mm)	116 ± 5.3	85 ± 3.8
2 Cm x 2 Cm 잎의 비건조무게 (mg)	110 ± 5	62 ± 1
잎두께 (mm)	0.58 ±0.02	0.27 ±0.02
미성숙과실의 가로직경 (mm)	39 ±2.6	30 ±1.8
1g 잎의 클로로필 함량 (mg/ml 용매)	0.58 ±0.08	0.42 ±0.07

표 10에서, 재조합 토마토(pLBJ21/ AtRanBP1b)는 재조합 애개장대와 동일하게 바이오메스(키, 잎의 무게, 두께, 크기, 단위 무게당 클로로필 함량 및 줄기의 직경)가 현저히 증가하였다. 또한 잎에서 증가된 광합성으로 미성숙 과일의 가로 직경이 증가되었다. 천연형과 재조합 토마토(pLBJ21/ AtRanBP1b)의 성체의 전체크기(도 16), 성체잎의 크기(도 17), 식물의 가지 크기(도 18), 미성숙 과실의 크기 (도 19)를 천연형과 비교한 결과, 천연형에 비해 증가된 형질을 나타내었다.

상기 언급한 바와 같이 Ran과 Ran 결합단백질들을 과다 발현시키거나 억제시킴으로써 몸체나 종자의 크기가 증가되거나 뿌리 길이가 증가된 재조합 식물을 획득할 수 있었다. 또한 본 발명의 5종의 재조합 벡터를 농작물에 형질전환시킴으로써 농작물의 생산량 증대나 육종 개발에 활용 가능하다.

<110> KIM, soo hwan <120> Protocols for generation of high yield, super-productive transgenic plants disturbed in Ran/RanBP - mediated cellular process <130> dp012427 <150> KR 10-2000-50067 <151> 2000-08-28 <160> 15 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 874 <212> DNA <213> PaRan isolated from Pisum sativum <400> 1 cgcaacctag cttttcctcc ataatcgatt attccattca tttcaatggc cttgcctaat 60 cagcaaacag ttgattatcc tagtttcaag cttgtgatcg tcggtgacgg tggcacagga 120 aaaacaactt tcgtaaagag gcatcttact ggagaatttg agaagaaata tgaaccaact 180 attggtgttg aagtgcatcc attggatttc ttcacaaagt gtggtaagat tcgtttctac 240 tgctgggata ctgctggtca agagaagttt ggtggtctca gagatggata ctatattcat 300 ggacagtgtg ctattataat gtttgatgtt actgcacggc tgacatacaa gaatgtccct 360 acttggcacc gtgatctttg ccgggtctgt gaaaacatcc caattgttct ttgtggaaac 420 aaggttgatg tgaagaacag gcaagtgaag gcaaagcagg ttaccttcca caggaagaaa 480 aatttgcagt actatgaaat atcagctaag agcaactaca actttgagaa gcctttcctg 540 tatcttgcca ggaaacttgc aggtgatcct aatttgcact ttgtagaatc tcctgcactg 600 gctccaccag aagttcaaat tgatattgct ttacaacaaa ggcatgagaa tgagattctt 660 gaggctgcta atcagcccct tcctgatgat gatgacgatg cttttgaata ggaaggacct 720 tcgagagtgc tggcctatgt gtgttgattt gtgccgttat atgctgtaat gttatgtgtt 780 ttgtggttga accgttgaca tttttttgat atagatttat ggatttcaat catcatgtga 840 ttgagttgtt ttaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa 874 <210> 2 <211> 1075 <212> DNA <213> AtRanBP1b isolated from Arabidopsis thaliana <400> 2 gaaaccaact cagagcaaaa gcttgatttg acactatggc gagcattagc aacgagcccg 60 agcgtgagaa cagagacgaa gaagagactg gagccaacga agatgaagac accggtgctc 120 aggttgctcc tatcgtcagg cttgaagaag tcgccgtcac caccggtgaa gaagacgaag 180 acaccatcct cgatctgaaa tcgaagttgt atcgatttga taaagatgga agtcagtgga 240 aggagagagg tgctggtact gttaagtttg tgaaacatag agtttctggg aagattcgtc 300 tcgttatgag gcaatcgaaa actttgaaga tctgtgctaa tcatcttgtt ggatcgggta 360 tgagtgttca ggaacacgct gggaatgata agtcttgtgt atggcacgct cgtgatttct 420 ccgatggtga attgaaggat gagctcttct gtatccggtt tggttcagtt gagaattgca 480 aagcatttat gcaaaagttc aaggaagtag ctgaatctga agaagagaaa gaagagagca 540 aagatgcctc tgataccgct ggtcttcttg agaagttaac agtggaagag aaggaaagtg 600 agaagaaacc agtggagaag gcagaggaaa acaaaaagag tgaagctgtt gaagaaaaga 660 aaacagagga gtctgttccc tcagcttaag atgcatgctt acacacacat acggccaggt 720 aatcaatagc ctgatgtgtt ttaaatccat cgaaggaaga cttggctttt attttcaaat 780 tgaatacatg ttttgagtcg tgttgagagt ctatattttt agtgtcacaa aagtgtcaca 840 ggtgacattt tgcatatgcg agattgattt tcgagcttgt ttgggtttca ttatctggaa 900 gaaaaaaaga gtgtattttg agctctctta tgattttttt ttggaaaaag tgtggactca 960 agagaagatt ttattttgag ttcacaaaaa tttgtatgca tggatgattc gcgtgttctc 1020 tttttaatgc cagtcgtgtt attgaatcaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 1075 <210> 3 <211> 962 <212> DNA <213> AtRanBP1c isolated from Arabidopsis thaliana <400> 3 gtcgacccac gcgtccggaa gttgcagagc acacacacac actttcaagt ttcaatacag 60 agatggcgag cactgagcca gagcgtgaga accgtgaaga tgaaaccgaa gtcaacgaag 120 atgaagacac cggagctcag gtagctccga tcgttaggct tgaagaggtt gcagtcacca 180 ccggcgaaga agatgaagac gccgtcctcg atctgaaatc gaagatgtat cgattcgata 240 aagaagggaa ccaatggaag gagagaggag ctggaactgt gaagttattg aagcataagg 300 aaactggaaa agttcgtctt gttatgagac aatctaaaac cctaaagatc tgtgccaatc 360 acctcatttc gtctgggatg agtgttcagg aacatagtgg gaatgaaaag tcttgtttat 420 ggcacgctac tgatttctcc gacggcgagt tgaaagatga gcttttctgc attcgatttg 480 cttccattga gaattgcaaa acatttatgg agaagttcac tgaaatagct gaaagccagc 540 aagtagggaa agagagcacc cagggcgacg aggctgctgg tttaatagag aatctttcgg 600 ttgaggaaaa tataagtgag gagaaagcca aggaagcaga agagaaagag cctgcaaagg 660 aagataaaga aacaaaaaag gagaaggtag aagaagagaa gaaaacagag gcaagcactt 720 aagtgatcaa attaaaattg gttgttggca tcactaagtg tgctttgctt tattttaata 780 tattatactt ggcactgaac atgatggtag cttcaaaagt ttgagtcttt gcgctgtgtt 840 agagaaagag aatcttaaga ttttttttta tgttgttgct gtgtaagtgt ttgactattg 900 tgtcgtctct ttactgtgtc aatttggttt aagataataa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 960 aa 962 <210> 4 <211> 1073 <212> DNA <213> antisense sequence for AtRanBP1b <400> 4 tttttttttt 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cgatttcaga tcgaggatgg tgtcttcgtc 900 ttcttcaccg gtggtgacgg cgacttcttc aagcctgacg ataggagcaa cctgagcacc 960 ggtgtcttca tcttcgttgg ctccagtctc ttcttcgtct ctgttctcac gctcgggctc 1020 gttgctaatg ctcgccatag tgtcaaatca agcttttgct ctgagttggt ttc 1073 <210> 5 <211> 923 <212> DNA <213> antisense sequence for AtRanBP1c <400> 5 tttttttttt tttttttttt ttttattatc ttaaaccaaa ttgacacagt aaagagacga 60 cacaatagtc aaacacttac acagcaacaa cataaaaaaa aatcttaaga ttctctttct 120 ctaacacagc gcaaagactc aaacttttga agctaccatc atgttcagtg ccaagtataa 180 tatattaaaa taaagcaaag cacacttagt gatgccaaca accaatttta atttgatcac 240 ttaagtgctt gcctctgttt tcttctcttc ttctaccttc tccttttttg tttctttatc 300 ttcctttgca ggctctttct cttctgcttc cttggctttc tcctcactta tattttcctc 360 aaccgaaaga ttctctatta aaccagcagc ctcgtcgccc tgggtgctct ctttccctac 420 ttgctggctt tcagctattt cagtgaactt ctccataaat gttttgcaat tctcaatgga 480 agcaaatcga atgcagaaaa gctcatcttt caactcgccg tcggagaaat cagtagcgtg 540 ccataaacaa gacttttcat tcccactatg ttcctgaaca ctcatcccag acgaaatgag 600 gtgattggca cagatcttta gggttttaga ttgtctcata acaagacgaa cttttccagt 660 ctctccttcc attggttccc ttctttatcg aatcgataca tcttcgattt cagatcgagg 720 acggcgtctt catcttcttc gccggtggtg actgcaacct cttcaagcct aacgatcgga 780 gctacctgag ctccggtgtc ttcatcttcg ttgacttcgg tttcatcttc acggttctca 840 cgctctggct cagtgctcgc catctctgta ttgaaacttg aaagtgtgtg tgtgtgctct 900 gcaacttccg gacgcgtggg tcg 923 <210> 6 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer for PsRan <400> 6 attcgaattc atggccttgc ctaatc 26 <210> 7 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer for PsRan <400> 7 cgcgggatcc tctgaaggtc cttccta 27 <210> 8 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer for AtRanBP1b <400> 8 tttctcgaga tggcgagcat tagcaacgag c 31 <210> 9 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer for AtRanBP1b <400> 9 aaatctagaa cacgcgaatc atccatgcat ac 32 <210> 10 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> 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Claims

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pLBJ12/PsRan(KCTC0837BP), pLBJ12/AtRanBP1b(KCTC0838BP), pLBJ12/AtRanBP1c(KCTC0839BP), pLBJ12/안티센스 AtRanBP1b(KCTC0850BP) 및 pLBJ12/안티센스 AtRanBP1c(KCTC0851BP)로 이루어진 군으로부터 선택된 벡터로 형질전환된 식물 세포.
제 4항의 식물세포로부터 재생되며, 식물조직배양법에 의하여 무성생식되는 유전자 변형 식물.
Ran 또는 Ran 결합단백질에 의해 조절되는 식물 뿌리에서의 뿌리 길이 및/또는 옥신 반응성을 조절하기 위한 방법에 있어서,

상기 방법은 아라비도프시스 식물세포 이외의 식물세포를 Ran 단백질을 인코딩하는 제1 핵산을 센스 방향으로 구성하는 제1 발현 구조체 또는 Ran 결합 단백질을 인코딩하는 제2 핵산을 안티센스 또는 센스 방향으로 구성하는 제2 발현 구조체로 형질전환하고;

상기 변형된 식물세포로부터 유전자 변형 식물을 재생하고; 및

상기 유전자 변형 식물을 상기 제1 또는 제2 핵산이 발현되고 변이된 뿌리 길이 및/또는 옥신 반응성을 갖는 식물이 획득되는 조건에서 발육시키는 단계를 포함하는 방법.
제 6항에 있어서, 상기 뿌리 길이는 기본 뿌리의 길이가 성장하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 6항에 있어서, 상기 옥신 반응성은 옥신 유도성 세포주기 진행인 방법.
제 8항에 있어서, 상기 옥신 반응성은 식물의 옥신 감도가 증가하는 것인 방법.
제 9항에 있어서, 상기 옥신이 외인적으로 적용된 옥신인 것을 특징으로 하는 방법.
Ran 또는 Ran 결합단백질에 의해 조절되는 식물 뿌리이외 하나이상의 식물조직에서 식물 조직 크기 및/또는 옥신 반응성을 조절하기 위한 방법에 있어서,

상기 방법은 아라비도프시스 식물세포 이외의 식물세포를 Ran 단백질을 인코딩하는 제1 핵산을 센스 방향으로 구성하는 제1 발현 구조체 또는 Ran 결합 단백질을 인코딩하는 제2 핵산을 안티센스 또는 센스 방향으로 구성하는 제2 발현 구조체로 형질전환하고;

상기 변형된 식물세포로부터 유전자 변형 식물을 재생하고 및

상기 유전자 변형 식물을 상기 제1 또는 제2 핵산이 발현되고 변이된 식물 조직 크기 및/또는 옥신 반응성을 가진 식물이 획득되는 조건에서 발육시키는 단계

를 포함하는 방법.
제 11항에 있어서, 상기 옥신 반응성은 옥신 유도성 세포주기 진행인 방법.
제 11항에 있어서, 상기 방법은 하나 이상의 식물 조직의 표현형이 변형되는 것인 방법.
제 13항에 있어서, 상기 표현형 변형은 식물 조직의 크기의 증가인 방법.
제 13항에 있어서, 상기 식물 조직은 잎, 줄기, 씨앗, 꽃 및 사상체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제 13항에 있어서,

상기 식물조직은 씨앗이고; 및

상기 표현형 변형은 씨앗의 무게 증가 및 씨앗 수의 증가중 어느 하나인 것인 방법.
하나 이상의 식물 조직에 있어 옥신에 대한 감도를 증가시키기 위한 방법에 있어서,

상기 방법은 Ran 단백질을 인코딩하는 제1 핵산을 센스 방향으로 구성하는 제1 발현 구조체 또는 Ran 결합 단백질을 인코딩하는 제2 핵산을 안티센스 또는 센스 방향으로 구성하는 제2 발현 구조체를 겸비한 식물 세포를 변형하고;

상기 변형된 식물세포로부터 유전자 변형 식물을 재생하고; 및

상기 제1 또는 제2 핵산이 발현되고 옥신에 대한 증가된 감도를 가진 유전자 변형 식물이 획득되는 조건에서 상기 유전자 변형 식물을 발육시키는 단계

를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 17항에 있어서, 상기 하나 이상의 식물 조직이 뿌리인 것을 특징으로 하는 방법.
제 18항에 있어서, 상기 식물이 아라비도프시스이고 상기 증가된 감도로 인하여 10^-10M 내지 10^-12M 미만의 옥신 농도에서 기본 뿌리의 발육이 향상되는 것을 특징으로 하는 방법.
유전자 변형되지 않은 야생 식물과 비교하여 뿌리 이외에 하나 이상의 조직에서 변이된 표현형을 가지며 식물조직배양법에 의하여 무성생식되는 유전자 변형 식물에 있어서,

상기 유전자 변형 식물은 Ran 단백질을 인코딩하는 제1 핵산을 센스 방향으로 구성하는 제1 발현 구조체 또는 Ran 결합 단백질을 인코딩하는 제2 핵산을 안티센스 또는 센스 방향으로 구성하는 제2 발현 구조체를 겸비한 식물 세포를 변형하고;

상기 변형된 식물세포로부터 유전자 변형 식물을 재생하고; 및

상기 제1 또는 제2 핵산이 발현되고 상기 하나 이상의 조직에서 크기가 증가된 표현형을 가진 유전자변형 식물이 획득되는 조건에서 상기 유전자 변형 식물을 발육시키는 단계를 포함하는 방법에 의하여 제조되며; 및

상기 유전자 변형 식물은 잎면적 증가, 줄기두께 증가, 종자의 부피 증가, 종자의 무게 증가 및 종자의 수 증가로 이루어진 군으로부터 선택된 표현형을 갖는 것인 식물.
유전자 변형되지 않은 야생 식물과 비교하여 옥신 감도가 증가되며 식물조직배양법에 의하여 무성생식되는 유전자 변형 식물에 있어서,

상기 유전자 변형 식물은 Ran 단백질을 인코딩하는 제1 핵산을 센스 방향으로 구성하는 제1 발현 구조체 또는 Ran 결합 단백질을 인코딩하는 제2 핵산을 센스 또는 안티센스 방향으로 구성하는 제2 발현 구조체를 겸비한 식물 세포를 변형하고;

상기 변형된 식물세포로부터 유전자 변형 식물을 재생하고; 및

상기 제1 또는 제2 핵산이 발현되고 옥신 감도가 증가된 표현형을 가진 유전자변형 식물이 획득되는 조건에서 상기 유전자 변형 식물을 발육시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 획득된 식물.
Ran 단백질을 인코딩하는 제1 핵산을 센스 방향으로 구성하는 제1 발현 구조체 또는 Ran 결합 단백질을 인코딩하는 제2 핵산을 센스 또는 안티센스 방향으로 구성하는 제2 발현 구조체를 포함하는 유전자 변형 식물 세포.
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