KR20030021093A

KR20030021093A - 곤충세포를 이용하여 인간 상피세포성장인자와 인간안지오게닌의 융합단백질 및 그의 유도체를 생산하는 방법

Info

Publication number: KR20030021093A
Application number: KR1020010054590A
Authority: KR
Inventors: 박승국; 한승희; 권오병
Original assignee: 주식회사 대웅
Priority date: 2001-09-05
Filing date: 2001-09-05
Publication date: 2003-03-12

Abstract

본 발명은 곤충세포를 이용하여 인간 상피세포성장인자(human epidermal growth factor: hEGF)와 인간 안지오게닌(human angiogenin)의 융합단백질 및 그의 유도체를 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 의하면, 융합단백질 유전자를 포함하는 재조합 베큘로바이러스 도너 플라스미드를 작제하고, 그를 대장균에 형질전환시켜 수득한 재조합 베크미드로부터 베큘로바이러스를 제조하여, 전기 베큘로바이러스를 곤충세포에 감염시킨 다음, 전기 곤충세포를 배양하면, 발현되는 융합단백질은 세포외로 대량 분비되며, 세포 배양액으로부터 융합단백질을 효율적으로 정제할 수 있다.

Description

곤충세포를 이용하여 인간 상피세포성장인자와 인간 안지오게닌의 융합단백질 및 그의 유도체를 생산하는 방법{A Method for Production of Fusion Proteins of Human Epidermal Growth Factor and Human Angiogenin and their Analogs in Insect Cell}

본 발명은 곤충세포를 이용하여 인간 상피세포성장인자(human epidermal growth factor: hEGF, 이하 'hEGF')와 인간 안지오게닌(human angiogenin, 이하, '안지오게닌')의 융합단백질 및 그의 유도체를 생산하는 방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 hEGF와 안지오게닌이 융합된 융합단백질 유전자를 포함하는 재조합 베큘로바이러스 도너 플라스미드, 전기 재조합 베큘로바이러스 도너 플라스미드로 형질전환된 미생물, 전기 재조합 베큘로바이러스 도너 플라스미드로부터 작제된 재조합 베크미드, 전기 재조합 베크미드를 포함하는 재조합 베큘로바이러스 및 전기 재조합 베큘로바이러스를 곤충세포에 감염시키고, 그를 배양하여 융합단백질 및 그의 유도체를 생산하는 방법에 관한 것이다.

환경의 악화와 노년인구의 증가로 인해 암 발생률은 매년 5% 이상 증가하고 있으며, 인구 십만명당 사망원인은 암 111명, 뇌혈관질환 80명, 불의의 사고 69명, 심장질환 44명, 간 질환 29명으로 암으로 인한 사망이 가장 큰 비중을 차지하고 있다.

이에, 암을 예방 및 치료하기 위한 항암요법으로 주로 화학요법제가 많이 개발되어 이용되고 있지만, 암 세포에 대한 낮은 특이성과 정상세포에 대한 독성때문에, 새로운 작용기전을 갖는 약물의 탐색, 새로운 유도체의 개발, 보조치료제의 이용, 약물전달체계의 개발, 미사일 요법제(drug targeting) 등의 부작용이 적은 항암제 개발이 여러 분야에서 시도되고 있다.

최근에는, 화학 요법제를 암세포에 친화성이 있는 담체에 결합시켜 화학 요법제가 암세포에만 선택적으로 작용하도록 하는 미사일 요법이 개발되어 주목을 받고 있다. 항암 미사일 요법제의 하나의 시도로서, 알파-페토프로테인(α-fetoprotein) 등의 암세포 특이 항원에 대한 항체에 화학 요법제나 리신, 디프테리아 톡신, 슈도모나스 톡신 등의 독성 단백질, 또는 방사성 동위원소를 결합시킨 경우가 보고되었다(참조: K, Shikoro et al., Br. Med. Bull., 40:233-239 (1984); Vijay et al., Nature, 339:394-397 (1989); USP 4,545,985; Peter et al., Cancer Res., 54:1008 (1994)). 그러나, 이들 항체 복합체는 세포로의 진입이 어렵고, 항체 자체가 항원성이 있으며, 항체가 정상세포와 결합할 수도 있고, 항체 분자가 크기 때문에, 그에 결합되는 약물의 비율이 낮다는 단점이 있었다(참조: Pastan et al., Cell, 47:641-648 (1986); Hurwitz et al., Cancer Res., 35:1175-1181 (1975); Delabye et al., J. Clin. Invest., 77:301-311 (1986); Buchegger et al., J. Exp. Med., 158:413-427 (1986); Buchegger et al., Cancer, 58:655-661 (1986)).

항암 미사일 요법제의 다른 시도로서, 정상세포에는 독성을 주지 않는 폴리아미노산을 담체로 이용하여 약물과 결합시킨 후, 암세포에 있는 효소에 의해 약물이 유리되도록 하는 항암제가 개발되었으나, 항체에 의해 발생하는 상기의 문제점모두를 해결하지는 못하였다(참조: Kato et al., J. Med. Chem., 27:1602-1607 (1984); EP 112,720; USP 4,485,093).

항암 미사일 요법제의 또 다른 시도로서, 세포내 수용체와 결합하는 펩타이드나 단백질, 예를 들면 TGF(tumor growth factor), MSH(melanocyte stimulating hormone), 소마토스타틴(somatostatin), 글루카곤(glucagon), 인슐린(insulin), 트랜스페린(transferrin), LDL(low density lipoprotein), 칼시토닌(calcitonin), 알파-2 마크로글로불린(α-2 macroglobulin), 브라디키닌(bradykinin) 및 EGF 등에 독소 단백질을 결합시키는 연구도 진행되었으나, 정상 세포에 대한 독소 단백질 자체의 독성때문에 그다지 큰 성과를 거두지는 못하였다(참조: USP 4,545,985; Shimizu et al., FEBS Letters, 118:274-278 (1980); Cawley et al., Cell, 22:563-570 (1980); Simpson et al., Cell, 29:469-673 (1982); WO85/00369; WO83/04030; USP 4,528,186; EP 46,039; EP 128,733; WO85/01284; EP 131,868; USP 3,917,824).

최근에는, 펩타이드와 사이토톡신의 유전공학적 융합단백질, 예를 들면, TRH(thyrotropin releasing hormone), TRF(transferrin), MSH 및 LDL 등과 디프테리아 톡신과의 융합단백질이 제조되었지만, 담체 펩타이드의 수용체 결합 활성을 유지시켜야 하므로 그 이용이 제한되어 있다(참조: Bacha et al., J. Biol. Chem., 258:1565-1570 (1983); Okeefe et al., J. Biol. Chem., 260:932-937 (1985); Murphy et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 83:8258-8262 (1986); 일본 특허공고 제 60-163824호).

WO88/00837는 EGF와 세포독성 화학물질 또는 그와 결합된 폴리머와의 결합을 개시하였으나, 세포독성 화학물질 또는 그와 결합된 폴리머 자체가 정상 세포에 대해 독성을 나타내고, 심지어는 화학물질에 대한 항체가 형성되어, 종래 항암제의 독성을 크게 개선하였다고 볼 수 없었다.

EP 제 467,536호는 TGF-α에 슈도모나스 엑소톡신 A의 변형된 형태를 유전공학적으로 융합하여, 방광암(bladder cancer)을 표적으로 하는 융합단백질을 개시하였으나, 미생물 유래의 독소가 가지는 항원성을 극복하지 못하였다.

일본 특허공고 제 63-41418호는 화학물질을 연결체(linker)로 이용하여 EGF와 녹농균독소를 결합시킨 융합체를 개시하였지만, 정상 세포에 대한 세포독성의 문제를 여전히 해결하지 못하였다.

EP 제 11111호는 분자량이 작은 성장인자에 화학물질을 화학적으로 결합시킨 암세포 지향성의 항암제를 개시하고 있는데, 이는 화학물질이 단백질의 베타-아미노기나 카르복실기에 비특이적으로 결합하여 제조된 것이기 때문에, 화학반응이 일어나는 동안의 오염, 단백질의 변성 및 융합체의 불균질성으로 인한 문제점이 제기되었다.

상술한 바와 같이, 암세포 표면의 종양표지인자에 대한 단일클론항체와 세포독성물질(cytotoxic agent) 또는 미생물 유래 독소가 결합된 독소단백질(참조: USP 4,664,911; USP 4,545,985) 및 종양 유래 성장인자와 미생물 유래 독소가 결합된 독소단백질(참조: Jill et al., J. Biol. Chem., 266:21118 (1991); Daniel et al., Cell. 22:563-570 (1980); Chaudhary et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA,84: 4538-4542 (1987))에 대한 연구가 진행되었지만, 독소단백질 자체의 독성, 화학적결합(conjugation) 과정에서의 화학물질 오염, 화학적결합복합체(conjugate)에 대해 형성되는 항체로 인한 면역독성의 유발과 항체의 비특이적 결합 및 융합체의 큰 분자량으로 인한 암세포까지의 운반 곤란성 때문에 만족할만한 성과를 거두지 못하였다(참조: Chung et al., Mol. Cells, 6:125-132(1996)).

이에, 본 발명자들은 전기의 문제점을 해결한 항암 미사일 요법제용 융합단백질을 개발하고자, 인체 유래의 단백질인 hEGF와 안지오게닌을 암세포를 추적하는 추적단백질과 암세포를 괴사시키는 세포독소로 이용하여 융합단백질을 제조한 결과, ① 상기 hEGF와 안지오게닌이 결합된 융합단백질이 모두 인체 유래 단백질이기 때문에 항체 형성을 유발하지 않을 뿐만 아니라, 간에서의 대사 등과 같은 체내 수송시에 손실이 없으며; ② 융합단백질이 hEGF에 의해 암세포에만 선택적으로 작용하기 때문에 정상세포에는 영향을 미치지 않으면서 암세포의 성장만 저해하고; ③ 독소 단백질인 안지오게닌은 hEGF에 의해 암세포 내로 들어간 후에야 그 기능을 발휘하기 때문에, 기존의 항암제와는 달리 독성을 나타내지 않으며; ④ 융합단백질의 분자량이 약 20kD으로 통상적인 항암 미사일 요법제의 50kD에 비해 매우 작기 때문에, 약물이 암세포까지 높은 효율로 선택적으로 수송되며; ⑤ hEGF와 안지오게닌을 화학적 반응이 아닌 유전공학적 방법 즉, 대장균내에서 융합단백질 형태로 발현시키기 때문에, 화학적 융합시 발생할 수 있는 미량 화학물질의 오염 및 구성 단백질의 변성에 대한 문제점을 해결하는 등 기존의 항암제가 갖는 단점을 극복함을 확인하고, 이를 특허출원한 바 있다(참조: 대한민국 특허 제 236,977호 및 대한민국 특허공개 제 2000-14094호; 국제특허공개 제 WO99/23112).

전기 hEGF-안지오게닌 융합단백질은 대장균 발현시스템에서 높은 발현량을 보이지만, 봉입체 형태로 생산할 경우 융합단백질의 특성상 재접힘(refolding) 효율이 낮고, 분비형으로 생산할 경우 생물학적으로 활성을 갖는 융합단백질의 분비 효율이 매우 낮았으며, 효과적인 번역 후 수식(post-translational modification)이 일어나지 않고, 또한, 대장균 발현 시스템에서 치료용 단백질을 생산하는 경우, 대장균의 세포벽에서 유래하는 발열성 물질인 파이로젠(pyrogen) 등이 혼입되어 부작용이 유발될 수 있었다(참조: Murphy, et al., Protein Expression & Purification, 4, 349-357, 1993).

따라서, 상기 hEGF와 안지오게닌의 융합단백질을 대장균보다 분비 효율이 우수한 고등생물에서 효율적으로 생산할 수 있는 방법을 개발하여야 할 필요성이 대두되었다.

이에, 본 발명자들은 hEGF와 안지오게닌의 융합단백질을 대장균보다 분비 효율이 우수한 고등생물에서 생산할 수 있는 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 융합단백질 유전자를 포함하는 재조합 베큘로바이러스 도너 플라스미드를 작제하고, 그를 대장균에 형질전환시켜 수득한 재조합 베크미드로부터 베큘로바이러스를 제조하여, 전기 베큘로바이러스를 곤충세포에 감염시킨 다음, 전기 곤충세포를 배양하면, 발현되는 융합단백질은 세포외로 대량 분비되며, 세포 배양액으로부터 융합단백질을 효율적으로 정제할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

결국, 본 발명의 첫 번째 목적은 hEGF, 안지오게닌 및 전기 두 단백질을 연결하는 연결체를 포함하는 융합단백질을 암호화하는 유전자, 폴리히드린 프로모터 및 그에 인접한 gp67 분비서열을 포함하는 재조합 베큘로바이러스 도너 플라스미드를 제공하는 것이다.

본 발명의 두 번째 목적은 전기 재조합 베큘로바이러스 도너 플라스미드로 형질전환된 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명의 세 번째 목적은 전기 재조합 베큘로바이러스 도너 플라스미드와 베크미드간의 부위-특이적인 재조합에 의해 작제된 재조합 베크미드를 제공하는 것이다.

본 발명의 네 번째 목적은 전기 재조합 베크미드를 곤충세포에 형질감염시켜 수득한 재조합 베큘로바이러스를 제공하는 것이다.

본 발명의 다섯 번째 목적은 전기 재조합 베큘로바이러스를 곤충세포에 감염시키고, 그를 배양하여, 분비형으로 발현된 융합단백질을 수득하고, 정제하는 공정을 포함하는 융합단백질을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 여섯 번째 목적은 전기 방법에 의하여 제조된 융합단백질을 제공하는 것이다.

도 1은 본 발명의 융합단백질 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드 pAG-EA16을 작제하는 과정을 나타내는 그림이다.

도 2는 본 발명의 융합단백질 유전자를 포함하는 재조합 베큘로바이러스 도너 플라스미드 pFB-GEA16을 작제하는 과정을 나타내는 그림이다.

도 3은 본 발명의 각기 링커길이가 다른 융합단백질 유전자를 포함하는 재조합 베큘로바이러스 도너 플라스미드 pFB-GEA9 및 pFB-GEA10을 작제하는 과정을 나타내는 그림이다.

도 4는 본 발명의 융합단백질 DWP40810 유도체(analog)의 유전자를 포함하는 재조합 베큘로바이러스 도너 플라스미드를 작제하는 과정을 나타내는 그림이다.

도 5a, 5b, 5c 및 5d는 본 발명의 융합단백질 DWP40810 유도체의 유전자를 포함하는 재조합 베큘로바이러스 도너 플라스미드의 유전자 지도이다.

도 6은 본 발명의 융합단백질 DWP40810 및 그의 유도체의 생체내 항암효과를나타내는 그래프이다.

본 발명자들은 hEGF와 안지오게닌의 융합단백질을 보다 효율적으로 생산하기 위하여, 베큘로바이러스를 이용한 곤충 발현시스템에 주목하게 되었다. 베큘로바이러스(baculovirus)는 곤충에만 한정적으로 감염을 일으키는 바이러스로서, 약 80-200 Kbp 크기의 이중가닥 DNA가 막대형의 뉴클레오캡시드 외피에 둘러싸여 있으며, 일찍부터 생물학적 살충제를 연구하기 위하여 많이 이용되어 왔다. 베큘로바이러스를 이용한 곤충 발현시스템은 대장균의 발현시스템과 유사한 정도로 단백질을 대량생산할 수 있고, 대장균이나 효모와는 달리 당화(glycosylation) 등의 번역후 수식을 효과적으로 이룰 수 있으므로, 생물학적으로 활성이 있는 단백질을 생산할 수 있다는 점에서 산업적으로 매우 유용하기 때문에, 최근들어 더욱 각광을 받고 있다. 베큘로바이러스 속은 바이러스의 형태에 따라 다시 세 개의 아그룹으로 분류된다. 아그룹 A 바이러스인 핵다각체형 바이러스(nuclear polyhedrosis virus, NPV)는 하나의 외피가 한 개의 뉴클레오캡시드를 포함하거나(single nuclear polyhedrosis virus, SNPV) 또는 여러 개의 뉴클레오캡시드를 포함하는 (multiple nuclear polyhedrosis virus, MNPV) 형태를 가지며, 뉴클레오캡시드는 폴리히드라라는 폴리히드린 단백질의 복합체에 봉입되어 있다. 아그룹 B 바이러스인 그래눌로시스 바이러스(granulosis virus, GV)는 그래눌린(granulin) 단백질의 복합체를 가진다. 아그룹 C 바이러스는 단 하나의 뉴클레오캡시드로 구성되고 단백질 봉입체를 갖지 않는다(Non-occluded baculovirus, NOBV). 전기 아그룹 바이러스 중, 아그룹 A 바이러스에 속하는, 알팔파 루퍼(alfalfa looper)로 불리는 나방모충인 오토그라파 캘리포니카(Autographa californica)에서 분리한 AcMNPV 바이러스 또는 봄비스모리(Bombix mori)에서 분리한 BmNPV 바이러스가 유용한 단백질을 대량으로 생산하기 위한 발현벡터 또는 발현시스템으로 현재 많이 이용되고 있다. 이에, 본 발명자들은 베큘로바이러스를 이용한 발현시스템을 선택하여, 융합단백질을 생산하기로 하였다.

본 발명에서 벡터로 사용되는 모든 베큘로바이러스 도너 플라스미드 및 베크미드는 베큘로바이러스 유래의 폴리히드린 프로모터와 그에 인접한 gp67 분비서열을 포함한다. 아그룹 A 베큘로바이러스의 폴리히드린 단백질은 발현되는 총단백질의 약 25% 이상을 차지하므로, 폴리히드린 프로모터는 목적하는 단백질의 대량생산에 매우 유용하다. 따라서, 본 발명의 베큘로바이러스 도너 플라스미드 및 베크미드는 본 발명의 융합단백질 뿐만 아니라, 기타 다른 단백질의 발현에도 이용될 수 있고, 하기의 실시예에 의하여 제한되지 않으며, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 벡터의 기본적인 구성요소를 포함하는 모든 벡터를 포함한다.

이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다.

본 발명의 융합단백질은 인간 상피세포성장인자, 인간 안지오게닌 및 전기 두 단백질을 연결하는 연결체를 포함한다. 이 때, hEGF와 안지오게닌의 결합은 hEGF의 카르복시 말단에 안지오게닌의 아미노 말단이 위치하도록 결합하는 것이 바람직하며, 각각 하나씩 결합하는 것이 바람직하지만, 이에 제한되지 않고, 하나 이상으로 연결하는 것도 가능하다. 예를 들면, hEGF와 안지오게닌의 융합비는 2:1내지 2:4(수량)도 가능하다. hEGF와 안지오게닌은 연결체 없이 직접 연결하거나, 각 구성단백질이 그의 활성을 유지하기에 적절한 아미노산 종류와 갯수로 이루어진 펩타이드 연결체로 연결할 수 있다. 연결체는 1 내지 15개의 아미노산이 바람직하며, 예를 들면, 펩타이드 EAF, GGGGS 또는 (GGGGS)₂가 바람직하다.

본 발명의 곤충세포를 이용하여 인간 상피세포성장인자와 인간 안지오게닌의 융합단백질 및 그의 유도체를 생산하는 방법은 융합단백질의 유전자를 포함하는 재조합 베큘로바이러스 도너 플라스미드를 작제하는 공정; 전기 재조합 베큘로바이러스 도너 플라스미드를 대장균에 형질전환시켜 융합단백질 유전자를 포함하는 재조합 베크미드를 작제하는 공정; 전기 재조합 베크미드를 곤충세포에 형질감염시켜 재조합 베큘로바이러스를 제조하는 공정; 및, 전기 재조합 베큘로바이러스를 곤충세포에 감염시키고, 그를 배양하여, 분비형으로 발현된 융합단백질을 수득하고, 정제하는 공정을 포함한다.

제 1공정: 융합단백질의 유전자를 포함하는 재조합 베큘로바이러스 도너 플라스미드의 작제

인간 상피세포성장인자, 인간 안지오게닌 및 전기 두 단백질을 연결하는 연결체를 포함하는 융합단백질을 암호화하는 유전자, 폴리히드린 프로모터 및 그에 인접한 gp67 분비서열을 포함하는 재조합 베큘로바이러스 도너 플라스미드를작제하였다: 베큘로바이러스 도너 플라스미드 작제의 전단계로서, 대한민국 특허공개 제 2000-14094호에 개시된 발현벡터 pTT408-3으로부터 중합효소 연쇄반응(PCR)을 통해 수득한 PCR 산물을 클로닝하여, 중간체 플라스미드 pAG-EA16을 작제하였고(참조: 도 1), 전기 pAG-EA16을 이용하여 재조합 베큘로바이러스 도너 플라스미드 pFB-GEA16를 작제하였다(참조: 도 2). 그런 다음, 전기 pFB-GEA16 및 대한민국 특허 제 236977호에 개시된 발현벡터를 이용하여 각기 다른 연결체를 가진 융합단백질 유전자를 포함하는 재조합 베큘로바이러스 도너 플라스미드 pFB-GEA9 및 pFB-GEA10을 작제하였다(참조: 도 3). 또한, 전기 pFB-GEA10을 주형으로 하는 PCR에 의해 융합단백질 유전자의 특정 부위에 돌연변이를 도입하여, 융합단백질 유도체의 유전자를 포함하는 pFB-GEA17, pFB-GEA18, pFB-GEA19, pFB-GEA20, pFB-GEA21, pFB-GEA22, pFB-GEA23 또는 pFB-GEA24를 작제하였다(참조: 도 4). 그런 다음, 전기 작제한 재조합 베큘로바이러스 도너 플라스미드를 대장균에 형질전환시킨 미생물을 수득하였고, 전기 미생물 중 하나인Escherichia coliTOP10/pFB-GEA24를 대전광역시 유성구 어은동 52번지 한국생명공학연구원 유전자원센터에 소재하는 국제기탁기관인 유전자은행에 기탁번호 KCTC 10041BP로, 2001년 8월 14일자로 기탁하였다.

제 2공정: 융합단백질 유전자를 포함하는 재조합 베크미드의 작제

전기에서 작제한 재조합 베큘로바이러스 도너 플라스미드를 대장균에 형질전환시켜 융합단백질 유전자를 포함하는 재조합 베크미드를 작제하였다: 전기 베큘로바이러스 도너 플라스미드를 "Bac-to-Bac Baculovirus Expression Systems"의 매뉴얼에 따라, 카나마이신 저항성 마커(kanamycin resistance marker), 낮은 복제수를 갖는 미니-에프 복제장치(low-copy number of mini-F replicon) 및 부위-특이적인 전이에 필요한 세균의 트랜스포존 Tn7(bacterial mini-attTn7) 등을 포함하는 베큘로바이러스 셔틀벡터(이하, '베크미드')를 포함하는 대장균 DH10BAC^TM(참조: Luckow, et al., J. Virol., 67, 4566-4579, 1993)에 형질전환시켜, 전기 재조합 베큘로바이러스 도너 플라스미드와 베크미드간의 부위-특이적 재조합에 의해 작제된 재조합 베크미드를 포함하는 미생물을 수득하였다. 전기 미생물로부터 분리한 재조합 베크미드는 Bac-GEA16, Bac-GEA9, Bac-GEA10, Bac-GEA17, Bac-GEA18, Bac-GEA19, Bac-GEA20, Bac-GEA21, Bac-GEA22, Bac-GEA23 또는 Bac-GEA24이다.

제 3공정: 재조합 베큘로바이러스의 제조

전기에서 분리한 재조합 베크미드를 곤충세포에 형질감염시켜 융합단백질 유전자를 포함하는 재조합 베큘로바이러스를 제조하였다: 이 때, 곤충세포는 스포돕프테라 푸르기페다(Spodoptera frugiperda) 또는 하이파이브(High Five^TM;BT1-TN-5B1-4) 세포주가 될 수 있지만, Sf9을 사용하는 것이 바람직하다. 전기 재조합 베크미드를 곤충세포 Sf9에 형질감염시키고, 그를 배양하여, 배양 상등액으로부터재조합 베큘로바이러스를 수득하였다. 수득한 재조합 베큘로바이러스는 BV-GEA16, BV-GEA9, BV-GEA10, BV-GEA17, BV-GEA18, BV-GEA19, BV-GEA20, BV-GEA21, BV-GEA22, BV-GEA23 또는 BV-GEA24이며, 그 중 하나인 BV-GEA24(recombinant baculovirus)를 국제기탁기관인 유전자은행에 기탁번호 KCTC 10042BP로, 2001년 8월 14일자로 기탁하였다.

제 4공정: 융합단백질의 수득 및 정제

전기 재조합 베큘로바이러스를 곤충세포에 감염시키고, 그를 배양하여 분비형으로 발현된 융합단백질을 수득한 후, 여러가지 크로마토그래피 방법으로 정제하였다: 이때, 곤충세포는 스포돕프테라 푸르기페다 또는 하이파이브 세포주가 될 수 있지만, 하이파이브 세포주를 이용하는 것이 바람직한데, 이것은 하이파이브 세포주에서 융합단백질이 약 2배 이상 많이 발현되기 때문이다. 융합단백질의 대량 발현에 있어서, 감염되는 곤충세포의 밀도는 전체면적의 20-25%가 바람직하고, 바이러스의 양은 5 MOI가 바람직하며, 융합단백질은 배양 후 48시간 내지 72시간이 경과하였을 때, 최대의 발현량을 나타내고, 시간이 보다 경과되면, 융합단백질의 양이 조금씩 감소되며, 경우에 따라 융합단백질의 분해산물이 생성되기도 하므로, 배양 시간은 72시간을 넘지 않는 것이 바람직하다. 정제된 융합단백질을 웨스턴 블랏팅, BCA 분석법 및 효소면역 측정방법(ELISA)으로 확인하고, 정량한 결과, 배양액 리터당 최소 10mg 이상, 평균 20mg 이상의 융합단백질이 수득됨을 확인하였다.수득된 융합단백질은 DWP40816, DWP4089, DWP40810, DWP40817(서열번호 22), DWP40818(서열번호 23), DWP40819(서열번호 24), DWP40820(서열번호 25), DWP40821(서열번호 26), DWP40822(서열번호 27), DWP40823(서열번호 28) 또는 DWP40824(서열번호 29)이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 이들 실시예에 의하여 본 발명의 범위가 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 융합단백질 유전자를 포함하는 플라스미드 pFB-GEA16의 작제

실시예 1-1: 융합단백질 유전자를 포함하는 플라스미드 pAG-EA16의 작제

곤충세포에서 hEGF와 안지오게닌의 융합단백질을 생산하기 위한 도너 플라스미드 작제의 전단계로서, 대한민국 특허공개 제 2000-14094호에 개시된 발현벡터 pTT408-3으로부터 중합효소 연쇄반응(PCR)을 이용하여, gp67 분비서열 유전자 및 글루탐산-알라닌-페닐알라닌의 연결체로 연결된 hEGF와 안지오게닌의 융합단백질 유전자를 포함하는 중간체 플라스미드 pAG-EA16을 작제하였다(참조: 도 1): PCR은 pTT408-3을 주형으로 하고,BamHI 제한효소 부위를 포함하는 다음과 같은 서열번호1 및 서열번호 2를 프라이머로 하여 수행하였다.

5'-AAAGGATCCA ATAGTGACTC CGAATGTCCG CTG -3' (서열번호 1)

5'-AAAGGATCCT TATCACGGGC GACGGAAAAT TGA-3' (서열번호 2)

PCR 혼합액은 pTT408-3 100ng(㎕), 프라이머 각 100pmole, dNTPs 혼합액 8mM(각 2mM), Mg²⁺가 포함된 반응용액, Pfu 중합효소 1단위를 넣고 물을 가하여 최종 부피 100㎕로 조정하고 잘 혼합하였다. DNA 증폭은 온도 순환기(Peltier Thermalcycler PTC-200, MJ Research, Inc., USA)에서 95℃에서 2분, 58℃에서 30초, 72℃에서 1분, 95℃에서 30초의 순으로 25회 반복하고, 최종 단계에서는 72℃에서 5분간 반응하여 실시하였다. 증폭된 PCR 산물(약 560bp)을 1% 아가로즈 겔 전기영동하여 분리, 정제한 후,BamHI 제한효소로 절단하여 재분리, 정제하였다. 전기BamHI 제한효소로 절단된 PCR 산물(약 550bp) 및BamHI 제한효소로 절단하고 37℃에서 1시간동안 세균의 알칼리성 포스파타아제(bacterial alkaline phosphatase, BAP)로 처리하여 분리, 정제한 베큘로바이러스 벡터 pAcGP67B(BD PharMingen, USA)의 9,765bp DNA 절편을 잘 혼합한 후, T4 DNA 리가아제 0.5㎕를 첨가하여 16℃에서 18시간 동안 반응시켜 이들을 접합하였다. 그런 다음, 대장균 TOP10(Invitrogen Corp., USA) 균주에 형질전환시켜 형질전환된 미생물을 수득하였다. 전기 미생물에서 분리한 융합단백질 유전자를 포함하는 베큘로바이러스 벡터를 'pAG-EA16'으로 명명하고, 제한효소BamHI,NsiI,Bpu1102I,AflII,AflIII, 및BstEII를 이용하여 단일 및 이중 절단한 다음, 1% 아가로스 겔 전기영동을 수행하여 융합단백질 유전자가바르게 삽입되었음을 확인하였다. 최종적으로, 생거(Sanger)의 다이데옥시 뉴클레오티드 서열 결정방법을 수행하여 융합단백질 유전자의 염기서열을 확인하였다.

실시예 1-2: 융합단백질 유전자를 포함하는 재조합 도너 플라스미드 pFB-GEA16의 작제

전기 실시예 1-1에서 작제된 베큘로바이러스 벡터 pAG-EA16으로부터 PCR을 이용하여 gp67 분비서열 유전자 및 글루탐산-알라닌-페닐알라닌의 연결체로 연결된 hEGF와 안지오게닌 융합단백질 유전자를 포함하는 도너 플라스미드 pFB-GEA16를 작제하였다(참조: 도 2): PCR은 pAG-EA16을 주형으로 하고,EcoRI 제한효소 부위를 포함하는 다음과 같은 서열번호 3 및 서열번호 4를 프라이머로 이용한 것을 제외하고는, 전기 실시예 1-1과 동일한 PCR 혼합액 조성 및 DNA 증폭 조건에서 실시되었다.

5'-AAAGAATTCA TGCTACTAGT AAATCAGTCA CAC-3' (서열번호 3)

5'-AAAGAATTCT TATCACGGGC GACGGAAAAT TGA-3' (서열번호 4)

증폭된 PCR 산물(약 690bp)을 EcoR I 제한효소로 절단하여 재분리, 정제한 산물(약 680bp) 및EcoRI 제한효소로 절단하고 37℃에서 1시간동안 세균의 알칼리성 포스파타아제로 처리하여 분리, 정제한 베큘로바이러스 도너 플라스미드 pF_ASTB_AC1(Gibco-BRL, USA)의 4,775bp DNA 절편을 잘 혼합한 다음, T4 DNA 리가아제를 첨가하여 이들을 접합하였다. 그런 다음, 대장균 TOP10 균주에 형질전환시켜 형질전환된 미생물을 수득하였다. 전기 미생물에서 분리한 융합단백질 유전자를 포함하는 재조합 도너 플라스미드를 'pFB-GEA16'으로 명명하고, 제한효소BamHI,NsiI,Bpu1102I,AflII,AflIII, 및BstEII를 이용하여 단일 및 이중 절단한 후, 1% 아가로스 겔 전기영동과 생거의 다이데옥시 뉴클레오티드 서열 결정방법을 수행하여 gp67 분비서열 및 융합단백질 유전자의 올바른 삽입과 염기서열을 확인하였다. 전기 작제된 pFB-GEA16 및 그로부터 발현되는 단백질의 구성을 표 1에 상세히 나타내었다.

실시예 2: 융합단백질 유전자를 포함하는 재조합 베큘로바이러스 도너 플라스미드 pFB-GEA9 및 pFB-GEA10의 작제

전기 작제된 재조합 도너 플라스미드 pFB-GEA16을 이용하여 연결체가 각기 다른 hEGF와 안지오게닌의 융합단백질을 제조하기 위하여, 대한민국 특허 제 236977호에 개시된 발현벡터로부터 PCR방법을 이용하여 각기 다른 연결체를 가진 hEGF와 안지오게닌 융합유전자를 포함하는 재조합 도너 플라스미드 pFB-GEA9 및 pFB-GEA10을 작제하였다(참조: 도 3): PCR은 pTE4089 및 pTE40810을 각각 주형으로 하고, 서열번호 1 및 서열번호 2를 프라이머로 하여 수행하였다. PCR 혼합액은 주형 플라스미드 100ng(㎕), 프라이머 각 30pmole, dNTPs 혼합액 8mM(각 2mM), Mg²⁺가 포함된 반응용액 및 Pfu 중합효소 1단위에 물을 가하여 최종 부피 100㎕로 잘 혼합하고, 전기 실시예 1-1과 같은 조건으로 DNA를 증폭하였다. 증폭된 PCR 산물을AflII 및BstEII 제한효소로 절단하여 재분리, 정제한 산물 및 재조합 도너 플라스미드 pFB-GEA16 5.2kb DNA 절편을 잘 혼합한 다음, T4 DNA 리가아제를 첨가하여 이들을 접합하고, 대장균 TOP10 균주에 형질전환시켜 형질전환된 미생물을 수득하였다. 전기 미생물에서 분리한 융합단백질 유전자를 포함하는 재조합 도너 플라스미드를 각각 'pFB-GEA9' 및 'pFB-GEA10'으로 명명하고, 제한효소BamHI,NsiI,Bpu1102I,AflII,AflIII, 및BstEII를 이용하여 단일 및 이중 절단한 후, 전기와 같은 방법으로 gp67 분비서열 및 융합단백질 유전자의 올바른 삽입과 염기서열을 확인하였다. 하기의 표 1은 전기 실시예 1-2에서 작제된 pFB-GEA16, 전기 작제된 pFB-GEA9와 pFB-GEA10 및 그로부터 발현되는 단백질의 구성을 상세히 보여준다.

표 1: 본 발명에서 곤충세포에서의 발현을 위하여 작제된 hEGF와 안지오게닌의 융합단백질 유전자를 포함하는 도너 플라스미드

벡터	발현된 융합단백질	연결체 서열*	유전자 기원**
pFB-GEA16	hEGF-L1-ANG (DWP40816)	EAF(서열번호 19)	pTT408-3
pFB-GEA9	hEGF-L2-ANG (DWP4089)	GGGGS(서열번호 20)	pTE4089
pFB-GEA10	hEGF-L3-ANG (DWP40810)	(GGGGS)₂(서열번호 21)	pTE40810
* : 연결체 DNA 염기서열이 암호화하는 아미노산을 단일문자로 표기** : 대한민국 특허 제 236977호 및 대한민국 특허공개 제 2000-14094호 참조

실시예 3: 재조합 도너 플라스미드를 이용한 융합단백질 유전자를 포함한 재조합 베크미드의 작제

"Bac-to-Bac Baculovirus Expression Systems"(Gibco-BRL, USA)의 매뉴얼에 따라, 전기 실시예 1-2 및 2에서 작제한 재조합 베큘로바이러스 도너 플라스미드를 대장균에 형질전환하여 폴리히드린 프로모터, gp67 분비서열, 및 융합단백질 유전자를 포함하는 재조합 베큘로바이러스 DNA인 베크미드(Bacmid)를 작제하였다: 도너 플라스미드 pFB-GEA16, pFB-GEA9, 및 pFB-GEA10 각각 1ng을 베크미드 bMON14272를 갖고 있는 대장균 DH10BAC^TM컴피턴트 세포(competent cell; Gibco-BRL, USA) 100ul에 넣고 가볍게 혼합한 후, 30분간 얼음에 방치하였다. 그런 다음, 42℃ 수조에서 45초간, 얼음에서 2분간 방치하고, SOC 배지 900ul를 첨가하여 37℃에서 4시간동안 진탕배양하였다. SOC 배지에서 배양된 세균을 10, 100, 및 1000 배로 연속적으로 희석하고, 각각의 희석액 100ul를 50ug/ml 카나마이신(kanamycin), 7ug/ml 젠타마이신(gentamicin), 10ug/ml 테트라사이클린(tetracycline), 100ug/ml 블루오 갈(Bluo-gal), 및 40ug/ml IPTG를 함유하는 LB 아가로스 플레이트에 도말하여 37℃에서 24시간 배양하였다. 24시간 후, 플레이트에 나타난 흰색의 콜로니 중 약 10개를 새로운 동종의 플레이트에서 37℃로 하룻밤동안 획선배양(streak culture)하여 표현형을 확인하였다. 표현형이 확인된 단일 콜로니를 50ug/ml 카나마이신, 7ug/ml 젠타마이신, 및 10ug/ml 테트라사이클린을 포함하는 LB배지에서 37℃로 하룻밤동안 배양한 다음, QIAGEN Plasmid Mini Kit(Qiagen, USA)를 이용하여 베크미드 DNA를 분리, 정제하였고, 서열번호 1 및 2의 프라이머를 이용한 PCR을 통하여재조합 베크미드임을 확인하였다. PCR 혼합액은 재조합 베크미드 주형 DNA 100ng(㎕), 프라이머 각 30pmole, dNTPs 혼합액 8mM(각 2mM), Mg2+가 포함된 반응용액, Pfu 중합효소 1단위를 넣고 물을 가하여 최종 부피 50㎕로 조정하고 잘 혼합하였다. DNA 증폭은 온도 순환기에서 93℃에서 3분, 94℃에서 45초, 55℃에서 45초, 72℃에서 5분, 93℃에서 45초의 순으로 30회 반복하고, 최종 단계에서는 72℃에서 10분간 반응하여 실시하였다. PCR 산물을 1% 아가로스겔에서 전기영동하여 융합단백질 유전자가 삽입되었음을 확인하고, 확인된 재조합 베크미드를 각각 'Bac-GEA16', 'Bac-GEA9' 및 'Bac-GEA10'으로 명명하였다.

실시예 4: 융합단백질 유전자를 포함하는 재조합 베큘로바이러스의 제조

곤충세포 Sf9 세포주를 재조합 베크미드로 형질감염시켜 융합단백질 유전자를 포함하는 재조합 베큘로바이러스를 제조하였다: Sf9 세포주를 35mm 디쉬에 9X10⁵세포로 접종하고, 젠타마이신 50ug/ml을 포함한 배지 Sf-900II SFM(Gibco-BRL, USA) 2ml을 첨가하여 27℃에서 최소 1시간 이상 배양함으로써 세포를 디쉬에 부착시켰다. 부착된 세포를 항생제없는 Sf-900II SFM 2ml로 세척하여 남은 용액을 완전히 제거하였다. 지질-DNA 복합체는 전기 정제된 재조합 베크미드 5ul와 항생제없는 Sf-900II SFM 100ul를 혼합한 용액 A, 및 CELLFECTIN Reagent(Gibco-BRL, USA) 6ul와 항생제없는 Sf-900II SFM 100ul를 혼합한 용액 B를 잘 혼합한 후, 실온에서 15-45분간 방치시켜 제조하였다. 제조된 지질-DNA 복합체 용액과 항생제없는 Sf-900II SFM 800ul의 혼합액 1ml을 세포가 부착되어 있는 디쉬에 가하고, 27℃에서 배양하였다. 5시간 후, 전기 혼합액을 완전히 제거하고, 젠타마이신을 함유한 Sf-900II SFM 2ml을 가하여 27℃에서 3일동안 배양하였다. 배양기간 동안, 재조합 베크미드를 포함하는 재조합 베큘로바이러스는 곤충세포 내에서 생성되어, 배양액으로 분비된다. 재조합 베큘로바이러스가 생성되면, 감염된 곤충세포는 세포 및 세포핵의 크기가 정상세포보다 커지고, 핵내에서 바이러스 봉입체가 보이지 않는(occlusion negative, occ) 플라크(plaque)를 현미경상에서 관찰할 수 있다. 배양한지 3일 후, 배양액 약 2ml을 회수하여 재조합 베큘로바이러스 DNA를 분리한 다음, PCR을 수행하여 재조합 베큘로바이러스 DNA에 융합단백질 유전자가 삽입되었음을 확인하였다.

전기 재조합 바이러스 DNA는 다음의 방법으로 분리하였다: 배양액 500ul를 5000 rpm으로 5분간 원심분리하여 수득한 그의 상등액에 동량의 20% 폴리에틸렌글리콜 8000/1M NaCl 용액을 가하여 완전히 혼합한 다음, 30분간 실온에 방치하고, 상온에서 14000rpm으로 10분간 원심분리하여 수득한 침전물을 100ul 이차 증류수에 용해시켜 완전히 균질화시켰다. 여기에 프로테아제 K 10ug을 넣어 50℃에서 1시간 동안 반응시키고, 동량의 페놀:클로로포름:이소아밀알콜 (25:24:1, v/v/v) 용액을 가하여 잘 혼합한 다음, 5분간 10000rpm으로 원심분리하여 수득한 상등액에 약 1/10 부피의 3M 소디움아세테이트 용액과 2배 부피의 100% 에탄올을 가하여 -20℃에서 5분간 방치하였다. 5분 후, 용액을 14000rpm에서 15분간 원심분리하고, 70%에탄올로 1회 세척한 다음, 침전물을 10ul의 이차 증류수에 용해시키고, 그 중 2ul를 실시예 3과 동일한 PCR 조건에서 반응시켜 융합단백질 유전자의 존재를 확인하였다. 융합단백질 유전자를 포함하는 것으로 확인된 재조합 베큘로바이러스를 각각 'BV-GEA16', 'BV-GEA9'및 'BV-GEA10'으로 명명하고, 하기의 융합단백질 발현에 이용하였다.

실시예 5: 고농도의 재조합 바이러스 원액의 제조 및 융합단백질 발현

곤충세포에서 융합단백질을 발현시키기 위한 고농도의 재조합 베큘로바이러스 원액(HTS; High Titer Stock)을 다음과 같은 방법으로 제조하였다: 10% 소혈청을 함유하는 Sf-900II SFM 배지 50mL을 포함하는 250-mL 삼각플라스크에 Sf9 세포를 4X10⁵세포/mL로 접종하여 3일간 27℃, 110rpm에서 배양한 다음, Sf9 세포를 회수하여 새로운 동일 배지 50mL에 약 1.5X10⁶세포/mL로 접종하고, 24시간 동안 배양하였다(약 2X10⁶세포/mL). 여기에 35mm 디쉬에서 얻은 재조합 베큘로바이러스 원액 1mL을 가하여 세포를 감염시키고, 5-6일간 27℃에서 배양하여 일차 증폭된 재조합 베큘로바이러스 원액을 제조하였다. 배지 500mL을 포함하는 2-L Impeller 배양기(Nalgen, USA)에서 일차 증폭된 재조합 바이러스를 증폭시켜 전기와 같은 방법으로 이차 재조합 바이러스 원액을 제조하였다. 바이러스 원액의 타이터(titer)를결정하는 공지의 플라크 검정법을 수행하여, 원액 1mL 당 1X10⁸PFU(plaque forming unit) 이상의 원액이 제조되었음을 확인하였다.

전기 제조된 이차 증폭 바이러스를 곤충세포주 Sf9과 트리코플루시아 니(Trichoplusia ni, TN5)에서 유래된 하이파이브에 각각 감염시키고 융합단백질을 발현시킨 결과, Sf9 세포주에서는 배지 1리터당 평균 약 10mg, 하이파이브 세포주에서는 약 20mg의 융합단백질이 분비됨을 확인하였다: 500mL-삼각플라스크의 배지에 곤충세포를 2X10⁶세포/mL로 접종하고, 재조합 바이러스를 최종적으로 5 MOI가 되도록 첨가한 다음, 최종 부피 125mL이 되도록 조절하여 27℃, 110rpm에서 3일간 진탕 배양한 후, 배양액을 5000rpm에서 15분간 원심분리하여 상등액을 회수하였다. Sf9 세포의 경우, 10% 소혈청을 함유하는 Sf-900II SFM 배지를, 하이파이브 세포의 경우, 최종 20mM 글루타민을 함유하는 ExpressFive SFM(Gibco-BRL, USA) 배지를 이용하였다. 회수한 상등액 10ul를 취해 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(Novex, USA) 및 웨스턴 블랏팅(Bio-Rad, USA)을 수행하여 융합단백질의 발현을 확인하고, 안지오게닌 항원 코팅 ELISA 방법으로 융합단백질의 발현량을 측정하였다. 발현량은 배양액 리터당 최소 10mg 이상, 평균 20mg 이상이었다.

실시예 6: 항암력 증대를 위한 pFB-GEA10의 유도체 작제와 발현

전기 제조된 HTS를 이용하여 곤충세포에서 발현된 연결체가 각기 다른 융합단백질을 정제하여 이들 융합단백질의 항암력을 비교하고, 항암력이 가장 우수한 융합단백질을 선별하여 항암력을 증대시키기 위한 융합단백질의 유도체를 제조하였다: 구체적으로, pFB-GEA10 또는 대한민국 특허 제 236,977호에 개시된 발현벡터 pTE40810을 주형으로 하는 PCR에 의해 융합단백질 유전자의 특정 부위에 돌연변이를 도입하여 유도체 유전자를 포함하는 pFB-GEA10 유도체를 작제하였다(참조: 도 4). pFB-GEA10 또는 pTE40810을 주형으로 하고 표 2에 개시된 한 쌍의 프라이머를 이용하는 PCR을 수행하여, 절반 길이(half-length)의 PCR 절편 산물을 수득하였다. PCR 혼합액은 전기 실시예 2와 동일하게 제조하여, 온도 순환기에서 94℃에서 2분, 55℃에서 1분, 72℃에서 1분, 94℃에서 1분의 순으로 25회 반복하고, 최종 단계에서 72℃에서 10분간 반응하여 DNA를 증폭하였다. 그런 다음, 수득한 절반 길이의 PCR 절편 산물 한쌍을 주형으로 하고 표 2에 개시된 프라이머 한 쌍을 이용하여, 전기와 동일한 PCR 혼합액 조성과 DNA 증폭 조건에서 PCR을 수행하여, 완전 길이(full-length)의 PCR 산물을 수득하였다. 수득된 PCR 산물을 표 2에 개시된 제한효소로 절단하여 재분리, 정제한 산물 및 재조합 도너 플라스미드 pFB-GEA10 DNA 절편을 잘 혼합한 다음, T4 DNA 리가아제를 첨가하여 이들을 접합하였다. 그런 다음, 대장균 TOP10 균주에 형질전환시켜 형질전환된 미생물을 수득하였다. 전기 미생물에서 분리한 융합단백질 유전자를 포함하는 재조합 도너 플라스미드를 'pFB-GEA17 ~ 24'로 명명하고, 표 2에 개시된 제한효소 및BamHI,NsiI,Bpu1102I,AflII,AflIII, 또는BstEII를 이용하여 단일 및 이중 절단한 후, 아가로스 겔 전기영동을 수행하여 융합유전자가 바르게 삽입되었음을 확인하였다. 최종적으로,생거의 다이데옥시 뉴클레오티드 서열 결정방법을 수행하여 돌연변이 도입 부위 및 융합단백질 유전자의 염기서열을 확인하였다. 도 5a, 5b, 5c 및 5d는 본 발명의 융합단백질 DWP40810 유도체의 유전자를 포함하는 재조합 베큘로바이러스 도너 플라스미드의 유전자 지도로, 5a는 hEGF 수용체 결합능 향상을 위한 유도체, 5b는 RNase 활성 증대를 위한 유도체, 5c는 RNase 활성 증대를 위하여 RNase A(59-73)로 치환한 유도체, 및 5d는 안지오게닌의 C-말단에 펩타이드 'KDEL'을 부착한 유도체를 나타낸다.

본 발명의 재조합 도너 플라스미드 중 pFB-GEA24를 대장균 TOP10 균주에 형질전환시킨 미생물인Escherichia coliTOP10/pFB-GEA24를 대전광역시 유성구 어은동 52번지 한국생명공학연구원 유전자원센터에 소재하는 국제기탁기관인 유전자은행에 기탁번호 KCTC 10041BP로 2001년 8월 14일자로 기탁하였다.

표 2: 본 발명에서 제조된 hEGF와 안지오게닌의 융합단백질, DWP40810의 유도체

벡터(단백질)	돌연변이도입부위	절반 길이의 PCR 용프라이머쌍	완전 길이의 PCR 용프라이머쌍	Cloning부위	비고
pFB-GEA17(DWP40817,서열번호 22)	EGF 유전자내 G12Q	-	서열번호 5/서열번호 9	BlpI/BstEII	pTE40810에 cloning (BlpI/PstI) 후subcloning
pFB-GEA18(DWP40818,서열번호 23)	EGF 유전자내 V19E	-	서열번호 8/서열번호 6	BlpI/BstEII	pTE40810에 cloning (NsiI/KpnI) 후subcloning
pFB-GEA19(DWP40819,서열번호 24)	EGF 유전자내 V34D	-	서열번호 7/서열번호 9	BlpI/BstEII	pTE40810에 cloning (AflIII/PstI) 후subcloning
pFB-GEA20(DWP40820, 서열번호 25)	ANG 유전자내 R5A	서열번호 1/서열번호 10서열번호 11/서열번호 9	서열번호 1/서열번호 9	AflII/BstEII	-
pFB-GEA21(DWP40821, 서열번호 26)	ANG 유전자내 Q117G	서열번호 1/서열번호 12서열번호 13/서열번호 9	서열번호 1/서열번호 9	AflII/PstI	-
pFB-GEA22(DWP40822, 서열번호 27)	ANG 유전자내 T80A	서열번호 1/서열번호 14서열번호 15/서열번호 9	서열번호 1/서열번호 9	AflII/PstI	-
pFB-GEA23(DWP40823, 서열번호 28)	ANG(58-70)을RNase(59-73)으로 치환	서열번호 1/서열번호 16서열번호 17/서열번호 9	서열번호 1/서열번호 9	BlpI/BstEII	pTE40810에 cloning (AflII/PstI) 후subcloning
pFB-GEA24(DWP40824, 서열번호 29)	ANG 유전자 C-말단에 KDEL 첨가	-	서열번호 1/서열번호 18	AflII/PstI	-

전기 작제된 재조합 도너 플라스미드를 이용하여 전기 실시예 3 및 4에 언급한 것과 동일한 방법으로 재조합 배크미드 및 재조합 베큘로바이러스를 제조하고, 재조합 베큘로바이러스 중 BV-GEA24(recombinant baculovirus)를 국제기탁기관인 유전자은행에 기탁번호 KCTC 10042BP로 2001년 8월 14일자로 기탁하였으며, 그를 이용하여 전기 실시예 5와 동일한 방법으로 곤충세포에서 DWP40810 유도체를 생산하였다.

실시예 7: 곤충세포에서 발현된 융합단백질의 정제

실시예 7-1: 곤충세포 배양액의 회수

재조합 베큘로바이러스를 감염시킨 후 72 시간이 되었을 때, 곤충세포 배양액을 5,000Xg에서 20분간 원심분리하여 상등액을 회수하고, 1M 나트륨 인산완충액(pH 7.0)을 1/10 부피로 첨가하여 상등액의 pH를 약 7.0으로 조정하였다.

실시예 7-2: CM-세파로스 컬럼 크로마토그라피

전기 상등액에서 융합단백질을 정제하기 위하여 CM-세파로스(CM-Speharose, Pharmacia Biotech, Sweden)를 이용하였다. 전기 상등액을 100mM 염화나트륨/10mM 인산완충액(pH 7.0)으로 평형화된 컬럼에 적용하고, 컬럼부피 4배의 100mM 염화나트륨/10mM 인산완충액(pH 7.0)으로 세척하여 불순물을 제거한 다음, 염화나트륨 구배(0.1M →1.0M)로 융합단백질을 용출하였다.

실시예 7-3: 헤파린-세파로스 컬럼 크로마토그라피

전기 용출액을 10mM 나트륨 인산완충액(pH 7.0)으로 2배 희석하여 염화나트륨 최종농도를 약 100mM 수준으로 조정한 다음, 100mM 염화나트륨/10mM 나트륨 인산완충액으로 평형화된 헤파린 세파로즈(Heparin-Sepharose, Pharmacia Biotech, Sweden)에 적용하고, 컬럼부피 6배의 100mM 염화나트륨/10mM 나트륨 인산완충액으로 세척한 후, 염화나트륨 구배(0.1M →2.0M)로 용출하였다.

실시예 7-4: 프랩 액상 크로마토그라피(Prep-LC)

전기 활성 용출액을 마이크로 본다팩 C18(uBondapak C18, Waters, USA)이 장착된 RCM 25X10(Waters, USA)에 적용하고, 아세토니트릴을 이용한 표 3의 구배 조건으로 용출하였다. 각 정제 단계별 활성 용출분액을 SDS-폴리아크릴아미드 젤로 분석하여, 목적하는 활성 용출분액을 모은 다음, 10% 글리세롤 및 0.2M 염화나트륨/인산완충액(PBS, Gibco-BRL, USA)을 이용하여 투석하고, 활성을 측정하였다. 최종 시료는 BCA 분석법(Pierce, USA) 및 hEGF와 안지오게닌 각각에 대한 정량용 효소결합면역측정키트(ELISA, Quantikine R & D System, USA)를 이용하여 정량하였다.

표 3: Prep-LC의 구배 조건

시간	이동상 A	이동상 B
05152035607085100110120125	8080707060555040008080	20203030404550601001002020
- 이동상 A : 0.1% 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid, TFA)- 이동상 B : 0.09% TFA/75% 아세토니트릴

실시예 8: 발현된 융합단백질의 수용체 결합 활성

세포표면에 과량 발현된 EGF 수용체를 갖는 A431 세포(ATCC CRL-1555)에 일정 농도의¹²⁵I-표지 EGF와 시료 또는 대조군(EGF)을 함께 첨가하여, 경쟁적으로 수용체에 결합되는 정도를 측정하였다: A431 세포를 4x10⁴세포/mL 농도로 24공(well) 플레이트에 분주하고 컨플루언트(confluent)하게 배양한 후, 10% 포름알데히드로 고정하고,¹²⁵I-표지 EGF와 시료를 각 공당 20ul씩을 첨가하여 EGF를 경쟁적으로 수용체에 결합시킨 후, 결합하지 않은 EGF를 세척하고, 세포를 탈리시켜 세포에 결합한 방사능량을 감마-카운터(gamma-counter)로 측정하였다. 결합정도를 나타내는 cpm 값을 % 결합능으로 환산하여 대조군의 농도와 % 결합능으로 표시되는 표준곡선을 구하고, 표준곡선에 시료의 % 결합능 값을 대입하여 시료의 수용체 결합활성을 결정한 다음, EGF 자체의 결합활성과 비교하였다. 하기의 표 4는 융합단백질의 수용체 결합 활성을 보여주는 결과이다. 표 4에서 보듯이, 본 발명에서 제조된 융합단백질의 hEGF 수용체 결합능은 90% 이상으로 EGF의 결합능과 큰 차이가 없었다.

표 4: 융합단백질의 수용체 결합 활성 비교

시료	수용체 결합활성(%)
EGF	100
DWP40816	92.5
DWP4089	96.4
DWP40810	98.0
DWP40817	98.9
DWP40820	97.6
DWP40821	97.3
DWP40823	98.0
DWP40824	98.5

실시예 9: 융합단백질의 RNase 활성

120mM HEPES(pH 6.8), 120mM NaCl, 0.004% BSA를 함유하는 반응 완충용액 및 동일 부피의 1.2% 효모 t-RNA의 혼합액 50uL에 2uM 시료 50uL을 혼합하여 37℃에서 2시간 반응시킨 후, 동일 부피의 6% 과염소산으로 반응을 중단하고, 10분간 원심분리하여 수득한 상등액에 대해 260nm에서 흡광도를 측정하였다. 그로부터 표준곡선을 작성하여 시료의 RNase 활성을 결정하고, 안지오게닌 활성과 비교하였다. 하기의 표 5는 융합단백질의 RNase 활성을 보여주는 결과이다. 표 5에서 보듯이, 본 발명에서 제조된 융합단백질은 결합링커의 길이가 길수록 안지오게닌의 RNase 활성이 증가되었고, 항암력 증대를 위해 돌연변이하여 제조한 융합단백질에서도 의도한 대로 RNase 활성이 증가됨을 알 수 있었다.

표 5: 융합단백질의 RNase 활성

시료	상대적 RNase 활성
안지오게닌	1.0
DWP40816	1.8
DWP4089	2.8
DWP40810	5.6
DWP40817	8.9
DWP40820	1.4
DWP40821	88.9
DWP40823	1839
DWP40824	4.4

실시예 10: 융합단백질의 암세포에 대한 단백질 합성 저해 활성

RNase 활성에 의한 융합단백질의 단백질 합성 저해능력을 평가하기 위하여, 암 세포주인 A431을 10% FBS를 함유하는 DMEM에서 배양하고, 각공당 1x10⁴세포 농도로 96공 플레이트에서 1일 추가 배양한 후, 메티오닌이 없는 무혈청배지 RPMI 1640 100uL로 교체하여 배양하고, 대조군(안지오게닌)과 시료를 각 10uL씩 첨가하여 16-20시간 배양하였다. 그런 다음, 삼중수소로 표지된 메티오닌([³H]-methionine)을 각 공당 1uCi씩 첨가하여 90-120분간 배양하고, 세포 단백질의 방사능 함량을 측정하여 융합단백질의 단백질 합성 저해활성을 비교하였다. 하기의 표 6은 암세포주 A431에 대한 융합단백질의 단백질 합성 저해 활성을 보여주는 결과이다. 표 6에서 보듯이, 본 발명에서 제조된 융합단백질은 암세포내의 세포 단백질 합성을 효과적으로 저해시켰다.

표 6: 암세포주 A431에 대한 융합단백질의 단백질 합성 저해 활성 비교

시료	IC ₅₀ (nM)
안지오게닌	> 1,000
DWP40816	300
DWP4089	100
DWP40810	33.0
DWP40817	53.0
DWP40820	20.0
DWP40821	25.0
DWP40823	20.0
DWP40824	6.5

실시예 11: 융합단백질의 암세포에 대한 세포독성(실험실적 조건)

실험실적 조건(in vitro)에서의 융합단백질의 활성을 평가하기 위하여, 암 세포주인 A431을 10% FBS를 함유하는 DMEM에서 배양하고, 각공당 1x10⁴세포 농도로 96공 플레이트에서 1일 추가 배양한 후, 음성 대조군(안지오게닌), 시료, 및 양성 대조군인 5-플루오로우라실(5-fluorouracil)을 포함하는 무혈청배지로 교체하여 2일간 배양하고, MTT(3-(3,4-dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide)로 세포생존률을 측정하여 세포에 대한 IC₅₀을 계산하였다. 하기의 표 7은 암세포주 A431에 대한 융합단백질의 세포독성을 IC₅₀으로 비교하여 나타낸 결과이다. 표 7에서 보듯이, 본 발명에서 제조된 융합단백질은 암세포를 효과적으로 치사시켰다.

표 7: 암세포주 A431에 대한 융합단백질의 세포독성 비교

시료	IC ₅₀ (nM)
안지오게닌	>1,000
DWP40816	200
DWP4089	137
DWP40810	45.5
DWP40817	100
DWP40820	35.0
DWP40821	55
DWP40823	35.6
DWP40824	10.1
5-플루오로우라실	49.5

실시예 12: 정상세포에 대한 융합단백질의 독성

실험실적 조건(in vitro)에서의 세포독성을 평가하기 위하여, hEGF 수용체를 발현하지 않는 정상 난소세포주인 CHO K-1(ATCC CCL-61) 및 정상 간세포주인 Chang liver(ATCC CCL-13)를 10% FBS를 함유하는 F-12 및 DMEM 배지에서 배양하고, 각공당 1x10⁴세포 농도로 96공 플레이트에서 1일 추가 배양한 후, 대조군(시료를 포함하지 않은 완충액)과 시료를 포함하는 무혈청배지로 교체하여 2일간 배양하고, MTT로 세포생존률을 측정하였다. 하기의 표 8은 융합단백질의 세포독성을 보여주는 결과이다. 표 8에서 보듯이, 본 발명에서 제조된 융합단백질은 hEGF 수용체를 발현하지 않는 정상 세포주 및 간세포주에 대해 매우 안정적이었다.

표 8: 융합단백질의 세포독성

정상 세포주	세포생존율(%)	IC ₅₀ (nM)
CHO-K1	> 98.0	>1,000
Chang liver	> 95.0	>1,000

실시예 13: 융합단백질의 생체내 항암효과

생체내(in vivo)에서의 융합단백질의 항암효과를 평가하기 위하여, 면역결핍 생쥐(체중 16∼20g의 nude mouse)의 복부피하에 A431 상피암세포를 3x10⁷(0.2mL)으로 이식하여 종양을 형성시키고, 종양의 크기가 약 30 mm³(W*L*D/2)으로 성장하면 한 군을 7마리로 하여 약물투여를 시작하였다. 약물의 처리기간은 21일 동안 하루 간격으로 총 11일 투여하고, 투여량을 0.2mL(100ug)/20g 몸무게로 하여 복강투여하였으며, 약물의 음성 대조군으로는 0.2M NaCl 및 10% 글리세롤/PBS 용액, 양성 대조군으로는 독소루비신(2mg/kg)을 이용하였다. 종양의 억제여부는 3회/1W 정도로 종양 무게와 부피를 측정하여 확인하고, 최종일(22일째)에 동물을 치사시켜 종양을 분리한 후, 종양의 무게와 부피를 측정하였다. 도 6은 본 발명의 융합단백질 DWP40810 및 그의 유도체의 생체내 항암효과를 나타내는 그래프이고, 하기의 표 9는 융합단백질 및 그의 유도체의 생체내 항암효과를 나타내는 결과이다. 도 6과 표 9에서 보듯이, 본 발명의 융합단백질을 투여받은 동물군은 안지오게닌만을 투여받은 동물군보다 종양괴의 성장이 현저히 억제되어, 양성 대조군인 독소루비신과 유사하거나 우수한 억제효과를 보였고, 실험 기간동안 별다른 부작용 증례나 사망예가 관찰되지 않았으며, 종양괴의 성장억제작용이 육안으로도 관찰되었다. 무게 측정 및 종양사진 촬영후 모든 군의 종양은 액체질소에 고정시켰다.

표 9: 융합단백질의 생체내 항암효과

시료	종양괴의 평균부피 (mean of tumor size, mm ³ )	22일 후 종양괴의 평균무게 (mean of tumor weight g)
시료	투여일(A)	22일 후 종양괴의 평균무게 (mean of tumor weight g)	투여 22일후(B)	B/A
음성대조군	27.6 ±4.8	593.5 ±73.0	21.5	4.8 ±0.4
독소루비신	31.1 ±7.9	428.5 ±77.5	13.9	3.6 ±0.4
안지오게닌	29.3 ±5.4	615.2 ±70.9	21.0	4.8 ±0.7
DWP40816	30.6 ±4.8	409.6 ±77.1	13.3	3.7 ±0.6
DWP4089	29.9 ±4.8	371.4 ±83.2	12.4	3.3 ±0.3
DWP40810	31.4 ±5.6	327.3 ±95.4	10.4	2.5 ±0.7
DWP40817	28.6 ±4.8	298.5 ±83.7	10.4	2.4 ±0.4
DWP40818	31.2 ±4.8	335.1 ±91.8	10.7	2.7 ±0.6
DWP40819	29.6 ±4.8	311.2 ±87.1	10.5	2.4 ±0.3
DWP40820	29.1 ±6.0	166.6 ±85.6	5.7	1.9 ±0.4
DWP40821	28.6 ±5.8	263.7 ±69.8	9.2	2.2 ±0.6
DWP40822	28.9 ±4.8	257.6 ±89.5	8.9	2.2 ±0.4
DWP40823	28.9 ±6.1	206.2 ±77.3	7.1	2.0 ±0.5
DWP40824	31.0 ±5.6	114.7 ±64.0	3.7	1.5 ±0.5

실시예 14: 급성독성 검사

본 발명의 융합단백질의 낮은 독성을 확인하기 위하여, 다음과 같은 방법으로 급성독성 검사를 실시하였다: 전기 실시예에서 가장 우수한 항암효과를 나타낸 융합단백질 DWP40824를 수컷의 생쥐(ICR mouse,체중 20∼25g, 한 군 당 5마리)에 0.1 내지 100mg/kg을 복강내 투여하고, 일반적인 증상을 관찰하며 죽은 쥐의 수를 측정하였을 때, 100mg/kg 투여군에서만 7일째에 1 마리가 사망하였다. 따라서, 본발명의 융합단백질의 LD₅₀은 100mg/kg 이상으로, 매우 낮은 독성을 가진다는 것을 확인하였다.

이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 hEGF와 안지오게닌이 융합된 융합단백질 유전자를 포함하는 재조합 베큘로바이러스 도너 플라스미드, 전기 재조합 베큘로바이러스 도너 플라스미드로 형질전환된 미생물, 전기 재조합 베큘로바이러스 도너 플라스미드로부터 작제된 재조합 베크미드, 전기 재조합 베크미드를 포함하는 재조합 베큘로바이러스 및 전기 재조합 베큘로바이러스를 곤충세포에 감염시키고, 그를 배양하여 융합단백질 및 그의 유도체를 생산하는 방법을 제공한다. 본 발명에 의하면, 융합단백질 유전자를 포함하는 재조합 베큘로바이러스 도너 플라스미드를 작제하고, 그를 대장균에 형질전환시켜 수득한 재조합 베크미드로부터 베큘로바이러스를 제조하여, 전기 베큘로바이러스를 곤충세포에 감염시킨 다음, 전기 곤충세포를 배양하면, 발현되는 융합단백질은 세포외로 대량 분비되며, 세포 배양액으로부터 융합단백질을 효율적으로 정제할 수 있다.

Claims

인간 상피세포성장인자(human epidermal growth factor), 인간 안지오게닌 (human angiogenin) 및 전기 두 단백질을 연결하는 연결체(linker)를 포함하는 융합단백질을 암호화하는 유전자, 폴리히드린 프로모터 및 그에 인접한 gp67 분비서열을 포함하는 재조합 베큘로바이러스 도너 플라스미드.
제 1항에 있어서,

재조합 베큘로바이러스 도너 플라스미드는 pFB-GEA16, pFB-GEA9, pFB-GEA10, pFB-GEA17, pFB-GEA18, pFB-GEA19, pFB-GEA20, pFB-GEA21, pFB-GEA22, pFB-GEA23 및 pFB-GEA24로 구성된 그룹으로부터 선택되는 1종인 것을 특징으로 하는

재조합 베큘로바이러스 도너 플라스미드.
제 1항의 재조합 베큘로바이러스 도너 플라스미드로 형질전환된 미생물.
제 3항에 있어서,

미생물은 재조합 베큘로바이러스 도너 플라스미드 pFB-GEA24를 대장균 TOP10에 형질전환시켜 수득한Escherichia coliTOP10/pFB-GEA24 (KCTC 10041BP)인 것을 특징으로 하는

미생물.
제 1항의 재조합 베큘로바이러스 도너 플라스미드와 베크미드간의 부위-특이적인 재조합에 의해 작제된 재조합 베크미드.
제 5항에 있어서,

재조합 베크미드는 Bac-GEA16, Bac-GEA9, Bac-GEA10, Bac-GEA17, Bac-GEA18, Bac-GEA19, Bac-GEA20, Bac-GEA21, Bac-GEA22, Bac-GEA23 및 Bac-GEA24로 구성된 그룹으로부터 선택되는 1종인 것을 특징으로 하는

재조합 베크미드.
제 5항의 재조합 베크미드를 곤충세포에 형질감염시켜 수득한 재조합 베큘로바이러스.
제 7항에 있어서,

재조합 베큘로바이러스는 BV-GEA16, BV-GEA9, BV-GEA10, BV-GEA17, BV-GEA18, BV-GEA19, BV-GEA20, BV-GEA21, BV-GEA22, BV-GEA23 및 BV-GEA24로 구성된 그룹으로부터 선택되는 1종인 것을 특징으로 하는

재조합 베큘로바이러스.
제 7항에 있어서,

곤충세포는 스포돕프테라 푸르기페다(Spodoptera frugiperda) 또는 하이파이브(High Five) 세포주인 것을 특징으로 하는

재조합 베큘로바이러스.
제 7항에 있어서,

재조합 베큘로바이러스는 재조합 베크미드 Bac-GEA24를 곤충세포 Sf9에 형질감염시켜 수득한 재조합 베큘로바이러스 BV-GEA24(recombinant baculovirus)(KCTC 10042BP)인 것을 특징으로 하는

재조합 베큘로바이러스.
다음의 각 공정을 포함하는 곤충세포를 이용하여 인간 상피세포성장인자와 인간 안지오게닌의 융합단백질 및 그의 유도체를 생산하는 방법:

(i) 융합단백질의 유전자를 포함하는 재조합 베큘로바이러스 도너 플 라스미드를 작제하는 공정;

(ii) 전기 재조합 베큘로바이러스 도너 플라스미드를 대장균에 형질전 환시켜 융합단백질 유전자를 포함하는 재조합 베크미드를 작제하 는 공정;

(iii) 전기 재조합 베크미드를 곤충세포에 형질감염시켜 재조합 베큘로바이러스를 제조하는 공정; 및,

(iv) 전기 재조합 베큘로바이러스를 곤충세포에 감염시키고, 그를 배양하여, 분비형으로 발현된 융합단백질을 수득하고, 정제하는 공정.
제 11항에 있어서,

곤충세포는 스포돕프테라 푸르기페다 또는 하이파이브 세포주 인것을 특징으로 하는

곤충세포를 이용하여 인간 상피세포성장인자와 인간 안지오게닌의 융합단백질 및 그의 유도체를 생산하는 방법.
다음의 각 공정을 포함하는 곤충세포를 이용하여 인간 상피세포성장인자와 인간 안지오게닌의 융합단백질 유도체 DWP40824를 생산하는 방법:

(i) 융합단백질의 유전자를 포함하는 재조합 베큘로바이러스 도너 플라스미드 pFB-GEA24(KCTC 10041BP)를 작제하는 공정;

(ii) 전기 재조합 베큘로바이러스 도너 플라스미드 pFB-GEA24를 대장균 DH10BAC^TM에 형질전환시켜 융합단백질 유전자를 포함하는 재조합 베크미드 Bac-GEA24를 작제하는 공정;

(iii) 전기 재조합 베크미드 Bac-GEA24를 곤충세포 Sf9주에 형질감염시켜 재조합 베큘로바이러스 BV-GEA24(recombinant baculovir us)(KCTC 10042BP)를 제조하는 공정; 및,

(iv) 전기 재조합 베큘로바이러스 BV-GEA24(recombinant baculo virus)를 곤충세포에 감염시키고, 그를 배양하여, 분비형으로 발현된 융합단백질 DWP40824(서열번호 29)를 수득하고, 정제하는 공정.
서열번호 22의 아미노산 서열로 나타내어지는 융합단백질.
서열번호 23의 아미노산 서열로 나타내어지는 융합단백질.
서열번호 24의 아미노산 서열로 나타내어지는 융합단백질.
서열번호 25의 아미노산 서열로 나타내어지는 융합단백질.
서열번호 26의 아미노산 서열로 나타내어지는 융합단백질.
서열번호 27의 아미노산 서열로 나타내어지는 융합단백질.
서열번호 28의 아미노산 서열로 나타내어지는 융합단백질.
서열번호 29의 아미노산 서열로 나타내어지는 융합단백질.