ES2883212T3 - Moléculas de unión específica a TDP-43 - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo anti-proteína de unión a ADN de TAR de 43 kDa (TDP-43), o un fragmento de unión a TDP-43 del mismo, que comprende un dominio variable de cadena pesada (VH) y un dominio variable de cadena ligera (VL), en donde: (i) el VH comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 130 y el VL comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 134; o (ii) el VH comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 259 y el VL comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 263.

Description

DESCRIPCIÓN

Moléculas de unión específica a TDP-43

Campo de la invención

La invención se refiere en general a nuevas moléculas de unión específica a TDP-43 (proteína de unión a ADN TAR de 43 kDa), tales como anticuerpos, incluyendo fragmentos, derivados y variantes de estos, que reconocen específicamente TDP-43. Además, la invención se refiere a composiciones farmacéuticas y de diagnóstico que comprenden dichos anticuerpos y otras moléculas de unión específica a TDP-43 y su uso para detectar e identificar TDP-43 en plasma, líquido cefalorraquídeo, cerebro y otras muestras, así como en aplicaciones terapéuticas incluyendo por ejemplo, estrategias de vacunación pasiva para tratar trastornos relacionados con agregados u otras aberraciones en la expresión de TDP-43, tales como, degeneración del lóbulo frontotemporal y/o esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson y otras proteinopatías de TDP-43.

Antecedentes de la invención

La degeneración del lóbulo frontotemporal (FTLD) es la segunda causa más común de demencia que afecta a individuos de menos de 65 años de edad; véase, por ejemplo, McKhann et al., Arch. Neurol. 58 (2001), 1803; Forman et al., Ann. Neurol. 59 (2006), 952 a 62. En un nivel patológico celular, las lesiones características en la mayoría de los cerebros con FTLD son inclusiones de proteínas ubiquitinadas anómalas. La composición bioquímica de las inclusiones ubiquitinadas en la forma patológica más común de FTLD, concretamente FTLD-U, siguió siendo desconocida hasta 2006, cuando la proteína de unión a ADN-TAR 43 (TDP-43) se identificó como la principal proteína de enfermedad en la mayoría de los casos de FTLD-U esporádica y familiar. Posteriormente, también se descubrió que las inclusiones compactas ubiquitinadas, características de esclerosis lateral amiotrófica (ALS) estaban compuestas de TDP-43, proporcionando de este modo pruebas de que ambas afecciones están ligadas mecánicamente y son parte del espectro de enfermedades que pueden clasificarse como proteinopatías de TDP-43, véase, por ejemplo, Neumann et al., Science 314 (2006), 130 a 133.

Además de FTLD y ALS, también se sabe que TDP-43 se acumula en las células nerviosas y células gliales del complejo de demencia de Parkinson-ALS de Guam, degeneración corticobasal, Demencia con cuerpos de Lewy, enfermedad de Huntington, enfermedad de cuerpos de Lewy, enfermedad de neuronas motoras, demencia frontotemporal, degeneración del lóbulo frontotemporal con inclusiones positivas para ubiquitina, esclerosis del hipocampo, miopatía de cuerpos de inclusión, miositis de cuerpos de inclusión, enfermedad de Parkinson, demencia de enfermedad de Parkinson, complejo de demencia de Parkinson en península de Kii y enfermedad de Piek y similares; véase, por ejemplo, Lagier-Tourenne et al., Hum. Mol. Gen. 19 (2010), R46-64. Estas enfermedades se denominan colectivamente proteinopatías de TDP-43. Se observa acumulación anómala de TDP-43 en el sitio de lesiones de cada enfermedad que parece implicar participación en la causa de degeneración nerviosa en estas enfermedades. Se ha propuesto que la localización citoplasmática aumentada de TDP-43 en cerebros y médulas espinales de pacientes denominada “preinclusiones” es un evento temprano en las proteinopatías de TDP-43, con la implicación de un posible papel patógeno en estas enfermedades; véase, por ejemplo Giordana et al., Brain Pathol.

20 (2010), 351 a 60. Coherentemente, se ha indicado que se ha encontrado localización de TDP-43 citoplasmática aumentada en estadios presintomáticos en ratones que sobreexpresan TDP-43 de tipo silvestre; véase, por ejemplo, Wils et al., Proc. Nati Acad. Sel USA 107 (2010), 3858 a 63 así como en un modelo de rata agudo con expresión de TDP-43 de tipo silvestre mediada por adenovirus; véase, por ejemplo, Tatom et al., Mol. Ther. 17 (2009), 607 a 613. Se usan principalmente anticuerpos murinos monoclonales disponibles en el mercado en los estudios sobre TDP-43 y para realizar diagnóstico patológico de proteinopatías de TDP-43. Un anticuerpo monoclonal murino anti TDP-43, que reconoce la forma fosforilada de TDP-43 se divulga en la Solicitud de Patente Europea N.° 2 189526 A1. Se divulgan anticuerpos anti TDP-43 adicionales en Zhang et al., Proc Nati Acad Sci U S A, 106(18): 7607 a 12 (2009) y la Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos N.° 20100136573. Xu et al., J. Neurosci. 30 (2010), 10851 a 10859 enseña un anticuerpo monoclonal de ratón y un policlonal de conejo que se unen a TDP-43. Shiina et al., Cell. Mol. Neurobiol 30 (2010), 641 a 652 enseña un anticuerpo policlonal de conejo que se une a TDP-43.

El éxito en la generación de anticuerpos monoclonales se basa, entre otras cosas, en la fusión eficaz y selectiva de linfocitos B estimulados por antígenos con una línea celular de mieloma murino seguida de la selección de híbridos productores de anticuerpos estables como se ha descrito originalmente en Kóhler y Milstein, Nature 256 (1975), 495 a 497. Sin embargo, la utilidad terapéutica de anticuerpos de base murina en seres humanos está obstaculizada por la respuesta de anticuerpo humano anti ratón (HAMA) como consecuencia de su origen no humano. Se han puesto a disposición enfoques para preparar anticuerpos monoclonales humanos o de tipo humano mediante ingeniería genética. Sin embargo, estos métodos típicamente padecen el inconveniente de que no son adecuados para producir anticuerpos que presenten muchas de las características de anticuerpos que se producen de forma endógena por el sistema inmunitario humano durante el transcurso de una respuesta inmunitaria humana fisiológica. Además, estos anticuerpos modificados por ingeniería genética pueden mostrar reactividad cruzada no deseada con otras proteínas y/o la proteína diana en el contexto de la conformación nativa biológicamente relevante y la función fisiológica normal del antígeno diana. Los efectos secundarios resultantes tras la administración sistémica de los anticuerpos exógenos pueden variar, por ejemplo, de enfermedad autoinmunitaria no deseada a reacciones anafilácticas. Estos efectos secundarios se han indicado en los llamados “anticuerpos humanizados”, que originalmente surgen de organismos no humanos, tales como ratones, así como los llamados “anticuerpos completamente humanos”, in vitro o en ratones xenogénicos modificados por ingeniería genética para expresar un repertorio de anticuerpos humanos. Por otro lado, la inmunización activa con antígenos patológicamente relevantes conlleva el riesgo considerable de que los pacientes desarrollen respuestas inmunitarias incontrolables contra estos antígenos y reactividad cruzada con antígenos endógenos que puede conducir en consecuencia a respuestas autoinmunitarias peligrosas.

Además, el desarrollo de ensayos para detectar y controlar los niveles de TDP-43 normal y patológica en plasma, líquido cefalorraquídeo y otras muestras como biomarcadores de FTLD y ALS proporcionará la capacidad para diagnosticar y distinguir proteinopatías de TDP-43 de otros trastornos neurodegenerativos clínicamente similares, tales como tauopatías o proteinopatías relacionadas. Además, el desarrollo de ligandos de obtención de imágenes que permitan la detección y/o cuantificación de neuropatología de TDP-43 en pacientes vivos proporcionará una herramienta potente no solamente para el diagnóstico, sino también para el control de la respuesta de los pacientes que tengan una proteinopatía de TDP-43 neurodegenerativa a terapias modificadoras de enfermedad cuando estén disponibles.

Por lo tanto, existe la necesidad de superar las limitaciones anteriormente descritas y proporcionar anticuerpos terapéuticos y de diagnóstico y otras moléculas de unión que reconozcan específicamente conformaciones biológicamente relevantes de TDP-43.

Compendio de la invención

La presente invención se refiere a las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones. En particular, la invención se refiere a anticuerpos para TDP-43 (proteína de unión a ADN TAR de 43 kDa), incluyendo fragmentos, derivados y variantes de anticuerpos que son capaces de reconocer específicamente TDP-43. Por “reconocer específicamente TDP-43”, “anticuerpo específico de/para TDP-43” y “anticuerpo anti TDP-43” se entiende específicamente, en general, et alectivamente, anticuerpos para TDP-43, o TDP-43 plegada erróneamente, oligomérica, agregada o modificada postraduccionalmente. Como se divulga en el presente documento, los anticuerpos (incluyendo fragmentos de anticuerpo de unión a antígeno y derivados) reconocen específicamente TDP-43 de longitud completa, truncada o agregada humana. Además, los anticuerpos reconocen ^t DP-43 humana de longitud completa que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 94 o un péptido que consiste en los restos 390 a 414 de la secuencia C terminal de SEQ ID NO: 94 fosforilado en los restos 409 y 410.

Según la invención, el anticuerpo para TDP-43 (incluyendo fragmentos de unión de antígeno o derivados de estos) comprende las regiones variables V^h y V^l de la secuencia de aminoácidos expuesta en (SEQ ID NO: 130) y (SEQ ID NO: 134) o (SEQ ID NO: 259) y (SEQ ID NO: 263), respectivamente.

La invención también se refiere a composiciones que comprenden un anticuerpo de la invención (incluyendo fragmentos del anticuerpo de unión a TDP-43) y al uso del anticuerpo de la invención en la prevención y tratamiento de una proteinopatía de TDP-43 así como a métodos de inmunodiagnóstico usando dichas composiciones en el diagnóstico de una proteinopatía de TDP-43, en el que se administra una cantidad eficaz de la composición a un paciente que lo necesite.

También están abarcados por la invención polinucleótidos que codifican los anticuerpos anti TDP-43 (incluyendo fragmentos de anticuerpo de unión a TDP-43). Como se divulga en el presente documento, el polinucleótido puede codificar al menos una región variable de una cadena de inmunoglobulina de un anticuerpo.

También están abarcados por la invención vectores que contienen polinucleótidos que codifican moléculas de unión a TDP-43, es decir, anticuerpos de la invención y células hospedadoras transformadas con estos vectores y/o polinucleótidos, así como su uso para la producción de un anticuerpo que es específico para TDP-43. Se conocen en la técnica medios y métodos para la producción recombinante de anticuerpos así como métodos para explorar con respecto a anticuerpos que compiten con estos anticuerpos por la unión con TDP-43. Como se describe en este documento, en algunas realizaciones, por ejemplo las relacionadas con aplicaciones terapéuticas en seres humanos, el anticuerpo de unión específica a TDP-43 de la invención es un anticuerpo humano en el sentido de que la aplicación de dicho anticuerpo sustancialmente no tiene una respuesta HAMA observada de otro modo para anticuerpos quiméricos e incluso humanizados.

En una realización, los anticuerpos anti TDP-43 de la invención pueden usarse para explorar sangre humana, CSF, y orina con respecto a la presencia de TDP-43 en las muestras, por ejemplo, usando ensayo basado en ELISA o adaptado a superficie. Los métodos y composiciones divulgados en este documento tienen aplicaciones en el diagnóstico de proteinopatías de TDP-43 tales como esclerosis lateral amiotrófica (ALS) o degeneración del lóbulo frontotemporal (FTLD). Los métodos y composiciones de la invención también tienen aplicaciones en el diagnóstico de enfermedad presintomática y en el control de la progresión de enfermedad y la eficacia terapéutica. De acuerdo con algunas realizaciones, un anticuerpo específico para TDP-43 (por ejemplo, un anticuerpo de longitud completa o un fragmento de unión a TDP-43 o derivado de un anticuerpo) se pone en contacto con una muestra (por ejemplo, sangre, líquido cefalorraquídeo o tejido cerebral) para detectar, diagnosticar o controlar la degeneración del lóbulo frontotemporal (FTLD) o esclerosis lateral amiotrófica (ALS). En otra realización, se pone en contacto un anticuerpo específico para TDP-43 con una muestra para detectar, diagnosticar o controlar una enfermedad seleccionada de enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson y enfermedad de cuerpos de Lewy. En otra realización, se pone en contacto un anticuerpo específico para TDP-43 con una muestra para detectar, diagnosticar o controlar una enfermedad seleccionada de: enfermedad de granos argirófilos, complejo de demencia de ALS-Parkinson de Guam, degeneración corticobasal, Demencia con cuerpos de Lewy, enfermedad de Huntington, enfermedad de neuronas motoras, degeneración del lóbulo frontotemporal (FTLD), demencia frontotemporal, degeneración del lóbulo frontotemporal con inclusiones positivas para ubiquitina, esclerosis del hipocampo, miopatía de cuerpos de inclusión, miositis de cuerpos de inclusión, demencia de enfermedad de Parkinson, complejo de demencia de Parkinson en península de Kii, enfermedad de Pick y enfermedad o demencia de Machado-Joseph.

En realizaciones adicionales, la invención proporciona el anticuerpo para su uso en métodos para tratar o prevenir una proteinopatía neurológica de TDP-43. De acuerdo con una realización, los métodos de la invención comprenden administrar una concentración eficaz de un anticuerpo específico para TDP-43 (por ejemplo, un anticuerpo de longitud completa o un fragmento de unión a TDP-43 o derivado de un anticuerpo) a un sujeto. En una realización adicional, la invención proporciona un método para tratar o prevenir proteinopatías neurológicas de TDP-43. De acuerdo con algunas realizaciones, se administra un anticuerpo específico para TDP-43 para tratar o prevenir la degeneración del lóbulo frontotemporal (FTLD) o esclerosis lateral amiotrófica (ALS). En otra realización, se administra un anticuerpo específico para TDP-43 para tratar o prevenir una enfermedad neurodegenerativa seleccionada de enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson y enfermedad de cuerpos de Lewy. En otra realización, se administra un anticuerpo específico para TDP-43 para tratar o prevenir una enfermedad seleccionada de enfermedad de granos argirófilos, complejo de demencia de ALS-Parkinson de Guam, degeneración corticobasal, Demencia con cuerpos de Lewy, enfermedad de Huntington, enfermedad de neuronas motoras, degeneración del lóbulo frontotemporal (FTLD), demencia frontotemporal, degeneración del lóbulo frontotemporal con inclusiones positivas para ubiquitina, esclerosis del hipocampo, miopatía de cuerpos de inclusión, miositis de cuerpos de inclusión, demencia de enfermedad de Parkinson, complejo de demencia de Parkinson en península de Kii, enfermedad de Pick, y enfermedad o demencia de Machado-Joseph.

Son evidentes realizaciones adicionales de la invención a partir de la descripción y ejemplos siguientes. El alcance de la invención se define solo por las reivindicaciones adjuntas.

Breve descripción de los dibujos

Figuras 1A a 1K: secuencias de aminoácidos de la región variable, es decir cadena pesada y cadena ligera kappa/lambda de anticuerpos humanos NI-205.3F10 (Fig. 1A), NI-205.51C1 (Fig. 1B), NI-205.21G2 (Fig. 1C), NI-205.8A2 (Fig. ID), NI-205.15F12 (Fig. IE), NI-205.113C4 (Fig. IF), NI-205.25F3 (Fig. 1G), NI-205.87E7 (Fig. 1H), NI-205.21G1 (Fig. II), NI-205.68G5 (Fig. 1^j ), y NI-205.20A1 (Fig. 1K). Se indican las regiones marco conservadas (FR), regiones determinantes de complementariedad (CDR; subrayadas), región de unión de cadena pesada (JH) y región de unión de cadena ligera (JK) o (JL). Las posiciones de aminoácidos modificadas para compensar artefactos de clonación inducidos por cebador de PCR potenciales y que se han modificado para coincidir con las secuencias de región variable de línea germinal humana correspondientes se proporcionan en negrita.

Figuras 2A a 2J: unión de anticuerpos de TDP-43 humanos con fragmentos marcados con His amino terminales de TDP-43 consistentes en los restos de aminoácidos 2 a 106 (dominio I (SEQ ID NO: 117)), 99 a 204 (dominio II (SEQ ID NO: 118)), 183 a 273 (dominio III (SEQ ID NO: 119)), 258 a 414 (dominio IV (SEQ ID NO: 120)), o 2 a 414 (longitud completa (SEQ ID NO: 121)).

Figuras 3A a 3R: secuencias de aminoácidos de la región variable, es decir cadena pesada (VH) y cadena ligera kappa (VK)/lambda (VL) de anticuerpos humanos NI205.41D1 (Fig. 3A), NI205.29E11 (Fig. 3B), NI205.9E12 (Fig. 3C), NI205.98H6 (Fig. 3D), NI205.10D3 (Fig. 3E), NI205.44B2 (Fig. 3F), NI205.38H2 (Fig. 3G), NI205.36D5 (Fig. 3H), NI205.58E11 (Fig. 3I), NI205.14H5 (Fig. 3J), NI205.31D2 (Fig. 3K), NI205.8F8 (Fig. 3L), NI205.31C11 (Fig. 3M), NI205.8C10 (Fig. 3N), NI205.10H7 (Fig. 3O), NI205.1A9 (Fig. 3P), NI205.14W3 (Fig. 3Q) y NI205.19G5 (Fig. 3R). Las regiones determinantes de complementariedad (CDR) están subrayadas.

Figuras 4A a 4H: determinación de la concentración eficaz semimáxima (CE⁵⁰) de anticuerpos de TDP-43 derivados de seres humanos por ELISA directo para (A a D) TDP-43 de longitud completa recombinante (•), extracto de Escherichia coli (▲) y BSA (■), o (E a H) un péptido sintético que abarca los restos 390 a 414 del dominio C terminal de TDP-43 con modificación de fosforilación en los restos 409/410 (•) y BSA (■).

Figuras 5A a 5M: especificidad de unión de los anticuerpos derivados de seres humanos con dominios de TDP-43 que comprenden los aminoácidos 2 a 106 (dominio I), 99 a 204 (dominio II), 183 a 273 (dominio III), 258 a 414 (dominio IV) y 2 a 414 (longitud completa) de TDP-43 como se determina por ELISA directo.

Figuras 6A a 6Q: unión de anticuerpos derivados de seres humanos con dominios de TDP-43 que comprenden los aminoácidos 2 a 414 (longitud completa), 2 a 106 (dominio I), 99 a 204 (dominio II), 183 a 273 (dominio III), y 258 a 414 (dominio IV) de TDP-43 como se determina por Análisis de Transferencia de Western.

Figuras 7A a 7C: (A) unión del anticuerpo NI-205.41D1 con TDP-43 de longitud completa y fragmentos de TDP-43 que comprenden los restos de aminoácidos 258 a 414, 258 a 384, 258 a 375, 258 a 362, 258 a 353, 258 a 319, 317 a 414 y 340 a 414. (B) unión del anticuerpo NI-205.41D1 y 12892-1-AP con TDP-43 de longitud completa, fragmento de TDP-43 que comprende los restos de aminoácidos 258 a 414 y con un fragmento polipeptídico de TDP-43 mutante que comprende los restos de aminoácidos 258 a 414 y la sustitución A a G en el resto 321, la sustitución M a G en el resto 322 y la sustitución M a G en el resto 323 (TDP-43 258 a 414 AMM321GGG). (C) unión del anticuerpo NI-205.41D1 con fragmentos de TDP-43 que comprenden los restos de aminoácidos 316 a 353, 316 a 343, y 316 a 333.

Figuras 8A a 8C: purificación de formas monoméricas de TDP-43 usando condiciones caotrópicas suaves. A) gel de SDS-PAGE teñido con Coomassie de formas de TDP-43 purificadas en presencia o ausencia del caótropo KSCN. Carriles 1 a 4, respectivamente: patrones de Peso Molecular, 6xHis-TDP-43 (1 a 414), 6xHis-SUMO-TDP-43 (1 a 414), 6His-SUMO-TDP-43 (220 a 414), todos purificados en presencia de Ks CN 1,5 M, y carriles 5 y 6: 6xHis-SUMO-TDP-43 (101 a 265) purificado en presencia de KCl (carril 5) o KSCN (carril 6). B) Disposición de dominio de proteínas purificadas que ilustra la localización de dominios de unión a ARN (RRM1 y RRM2) así como marcadores (6His y SUMO). C) Distribuciones del coeficiente de sedimentación de ultracentrifugación analítica para TDP-43 de longitud completa marcado con 6His y 6His-SUMO purificado. Los coeficientes de sedimentación y pesos moleculares calculados se muestran por encima de los picos.

Figura 9: A) Unión de TDP-43 de longitud completa con ARN específico ((UG)6) o de control ((UU)6) en tampón que contiene HEPES 40 mM, KCl 0,5 M, arginina 0,4 M, pH 7,4. B), C) y D) unión de ARN por TDP-43 (101 a 265) en presencia de un tampón fisiológico que contiene HEPES 20 mM, glutamato potásico 80 mM, acetato magnésico 4 mM, glicerol 5 %, pH 7,5, DTT 2 mM, para determinar B) Kd, y la estequiometría purificada en C) condiciones no caotrópicas o D) condiciones caotrópicas suaves.

Figura 10: curvas de valoración para la unión del anticuerpo NI-205.41D1, NI-205.21G1, NI-205.51C1, NI-205.21G2 y NI-205.3F10 humano con A) TDP-43 de longitud completa plegado y B) fragmento de TDP-43 que comprende los restos 220 a 414 en un ensayo de ELISA de captura.

Figura 11: tinción inmunohistoquímica de tejido del hipocampo de FTLD-U humano con anticuerpos (A a C) 2E2-D3, (D a F) anticuerpo de control p403/p404, (G a I) anticuerpo de control p409/p410, (J) NI-205.10D3, (K) NI-205.8C10, (L) NI-205.15F12, (M) NI-205.8A2, (N) NI-205.3F10, (O) NI-205.21G2, (P) NI-205.8F8, (Q) NI-205.31C11, (R) NI-205.36D5, (S) NI-205.31D2, (T) NI-205.10H7, (U) NI-205.14H5, (V) NI-205.68G5, (W) NI-205.14W3, (X) NI-205.21G1, y (Y) NI-205.41D1. (Z) tinción inmunohistoquímica de tejido del hipocampo de control con NI-205.41D1.

Descripción detallada de la invención

La invención se refiere a las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones.

I. Definiciones

Como se usa en este documento, la frase “enfermedades neurodegenerativas” se refiere a la presencia de acumulación de proteína, localización celular o plegamiento proteico anómalo en el cerebro, médula espinal u otro tejido neural y están provocadas por la muerte o deterioro funcional de neuronas. En algunos casos de enfermedades neurodegenerativas, las anomalías definidas genéticamente contribuyen al desarrollo de la enfermedad. Las enfermedades neurodegenerativas incluyen por ejemplo, enfermedad degenerativa cerebral (por ejemplo, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, parálisis supranuclear progresiva y enfermedad de Huntington) y enfermedades degenerativas de la médula espinal/enfermedades degenerativas de neuronas motoras, por ejemplo, esclerosis lateral amiotrófica y atrofia muscular espinal; véase, por ejemplo, Forman et al. Nat. Med. 10 (2004), 1055 a 63.

“Proteinopatía de TDP-43” se refiere a enfermedades del sistema nervioso, en particular a enfermedades neurodegenerativas y se conoce como un grupo heterólogo de trastornos ligados por la proteína de unión a ADN TAR (sensible a Transactivación) de 43 kDa. Las proteínas de TDP-43 se caracterizan por el hecho de que TDP-43 es una proteína de enfermedad que liga mecánicamente la degeneración del lóbulo frontotemporal con inclusiones positivas para ubiquitina (FTLD-U) con y sin enfermedad de neuronas motoras con la esclerosis lateral amiotrófica (ALS), enfermedad de granos argirófilos, enfermedad de Alzheimer, esclerosis lateral amiotrófica (ALS), complejo de demencia de Parkinson-ALS de Guam, degeneración corticobasal, Demencia con cuerpos de Lewy, enfermedad de Huntington, enfermedad de cuerpos de Lewy, enfermedad de neuronas motoras, degeneración del lóbulo frontotemporal (FTLD), demencia frontotemporal, degeneración del lóbulo frontotemporal con inclusiones positivas para ubiquitina, esclerosis del hipocampo, miopatía de cuerpos de inclusión, miositis de cuerpos de inclusión, enfermedad de Parkinson, demencia de enfermedad de Parkinson, complejo de demencia de Parkinson en península de Kii, enfermedad de Pick, enfermedad de Machado-Joseph y similares; véase por ejemplo, Lagier-Tourenne et al., Hum. Mol. Gen. 19 (2010), R46-64.

En condiciones fisiológicas normales, TDP-43 se localiza predominantemente en el núcleo. Sin embargo, se observa una pérdida sustancial de TDP-43 nuclear en neuronas que portan inclusiones de TDP-43 citoplasmáticas aberrantes. TDP-43 muestra una identificación bioquímica específica de enfermedad; TDP-43 alterada patológicamente. Las proteinopatías de TDP-43 son distintas de la mayoría de otros trastornos neurodegenerativos en los que el plegamiento erróneo de la proteína conduce a amiloidosis cerebral, ya que TDP-43 patológica forma inclusiones neuronales y gliales que carecen de las características de depósitos amiloides cerebrales; véase por ejemplo, Neumann et al., Arch Neurol. 64 (2007), 1388 a 1394.

Como se usa en este documento, la expresión “TDP-43 patológica” se refiere a inclusiones extracelulares, citoplasmáticas, neuríticas y nucleares, también se denomina “cuerpo de inclusión de TDP-43” en el que la proteína forma grupos de tipo fibrilla. Específicamente, se ha descubierto que la TDP-43 patológica está hiperfosforilada, ubiquitinada y truncada en el extremo N terminal, generando de este modo especies anómalas de TDP-43 que migran con una masa molecular superior a aproximadamente 45 kDa, así como una mancha de proteínas de alta masa molecular y fragmentos C terminales de aproximadamente 25 kDa; véase, por ejemplo, Neumann et al., Science 314 (2006), 130 a 133 y Arai et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 351 (2006), 602 a 611. Adicionalmente, se ha descubierto que TDP-43 muestra múltiples sitios de fosforilación en regiones carboxilo terminal de TDP-43 depositado y se ha sugerido que la fosforilación conduce a oligomerización y formación de fibrillas aumentadas de TDP-43; véase, por ejemplo, Hasegawa et al., Annals of Neurology 64 (2008), 60 a 70.

La formación de cuerpos de inclusión de TDP-43 se ve acompañada de cambio en la distribución subcelular de TDP-43 con falta completa de tinción de TDP-43 nuclear difusa normal en células que portan inclusiones. La presencia y alcance de esta identificación patológica en materia gris y blanca cortical afectada, así como la médula espinal, se corresponde aproximadamente con la densidad de las inclusiones positivas para TDP-43; véase, por ejemplo, Neumann et al., J. Neuropath. Exp, Neurol. 66 (2007), 177 a 183. La composición de las inclusiones ubiquitinadas (UBI) en FTLD-U se caracteriza por una abundancia relativa baja, distribución desigual de UBI entre diferentes casos de FTLD-U, y su naturaleza no amiloidogénica. Por lo tanto, TDP-43 es un marcador específico y sensible para detectar las lesiones inmunorreactivas a ubiquitina características en FTLD-U, incluyendo inclusiones citoplasmáticas neuronales (NCI), neuritas distróficas e inclusiones intranucleares neuronales (NII).

Como se usa en este documento, las expresiones “TARDBP”, “proteína de unión a ADN sensible a transactivación de 43 kDa”, “proteína de unión a ADN sensible a transactivo de 43 kDa”, “proteína de unión a ADN-TAR de 43 kDa” y “TDP-43” se usan de forma intercambiable para hacer referencia a la forma nativa de TDP-43. El término “TDP-43” también se usa para hacer referencia colectivamente a todos los tipos y formas de TDP-43. “TDP-43” también se usa para identificar generalmente otros confórmeros de TDP-43, incluyendo por ejemplo, formas fosforiladas de TDP-43 y agregados asociados con ubiquitina o agregados de TDP-43.

La secuencia de aminoácidos de TDP-43 humana se conoce en la técnica; véase, por ejemplo, Strausberg et al., proteína TARDBP (Homo sapiens) GenBank Pubmed: AAH71657 versión GI:47939520. De acuerdo con una realización, la secuencia de aminoácidos de TDP-43 humana nativa es:

MSEYIRVTEDENDEPIEIPSEDDGTVLLSTVTAQFPGACGLRYRNPVSQCM

RGVRLVEGILHAPDAGWGNLVYVVNYPKDNKRKMDETDASSAVKVKR

AVQKTSDLIVLGLPWKTTEQDLKEYFSTFGEVLMVQVKKDLKTGHSKGF

GFVRFTEYETQVKVMSQRIIMIDGRWCDCKLPNSKQSQDEPLRSRKVFVG

RCTEDMTEDELREFFSQYGDVMDVFIPKPFRAFAFVTFADDQIAQSLCGE

DLIIKGISVIIISNAEPKIINSNRQLERSGRFGGNPGGFGNQGGFGNSRGGG

AGLGNNQGSNMGGGMNFGAFSINPAMMAAAQAALQSSWGMMGMLAS

QQNQSGPSGNNQNQGNMQREPNQAFGSGNNSYSGSNSGAAIGWGSASN

AGSGSGFNGGFGSSMDSKSSGWGM (SEQ IDNO:94)

Como se usa en este documento, se entiende que el término “anticuerpo” o “anticuerpos” se refiere a anticuerpos completos, intactos, y Fab, Fab', F(ab)2 y otros fragmentos de anticuerpo. Los anticuerpos completos, intactos incluyen, a título enunciativo, anticuerpos monoclonales tales como anticuerpos monoclonales murinos, anticuerpos policlonales, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanos y anticuerpos humanizados. Pueden producirse diversas formas de anticuerpos usando técnicas de ADN recombinante convencionales (Winter y Milstein, Nature 349 (1991), 293 a 99. Por ejemplo, pueden construirse anticuerpos “quiméricos”, en los que el dominio de unión a antígeno de un anticuerpo animal está unido a un dominio constante humano (un anticuerpo derivado inicialmente de un mamífero no humano en el que se ha usado tecnología de ADN recombinante para reemplazar todas o parte de las regiones bisagra y constante de la cadena pesada y/o la región constante de la cadena ligera, con regiones correspondientes de una cadena ligera o cadena pesada de inmunoglobulina humana) (véase, por ejemplo, Patente de Estados Unidos N° 4.816.567: Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 81 (1984), 6851 a 6855). Los anticuerpos quiméricos reducen las respuestas inmunogénicas inducidas por anticuerpos animales cuando se usan en tratamientos clínicos humanos.

Además, pueden sintetizarse anticuerpos “humanizados” recombinantes. Los anticuerpos humanizados son anticuerpos inicialmente derivados de un mamífero no humano en los que se ha usado tecnología de ADN recombinante para sustituir algunos o todos los aminoácidos no requeridos para la unión a antígeno con aminoácidos de regiones correspondientes de una cadena ligera o pesada de inmunoglobulina humana. Es decir, son quimeras que comprenden principalmente secuencias de inmunoglobulina humana en las que se han insertado las regiones responsables de la unión a antígeno específica (véase, por ejemplo, Publicación de Solicitud de Patente Internacional N.° WO 94/04679). Los animales se inmunizan con el antígeno deseado, los anticuerpos correspondientes se aíslan y las partes de las secuencias de región variable responsables de la unión a antígeno específica se retiran. Las regiones de unión a antígeno derivadas de animales se clonan después en la posición apropiada de los genes de anticuerpo humano en los que se han suprimido las regiones de unión a antígeno. Los anticuerpos humanizados minimizan el uso de secuencias heterólogas (entre especies) en anticuerpos para su uso en terapias humanas, y es menos probable que induzcan respuestas inmunitarias no deseadas. Pueden producirse de forma similar anticuerpos primatizados.

Realizaciones adicionales de la invención se refieren a anticuerpos humanos así como al uso de estos anticuerpos humanos. En una realización, los anticuerpos humanos derivan de linfocitos B humanos y otras células inmunitarias y generalmente se denominan en este documento “anticuerpos completamente humanos”. Por lo tanto, la descripción abarca el linfocito de memoria B humano inmortalizado y linfocito B, respectivamente, que produce el anticuerpo que tiene las características distintas y únicas que se definen posteriormente. Como alternativa, los anticuerpos humanos pueden producirse en animales no humanos, tales como animales transgénicos que albergan uno o más transgenes de inmunoglobulina humana. Dichos animales pueden usarse como una fuente de esplenocitos para producir hibridomas, como se describe en la Patente de Estados Unidos N.° 5.569.825.

Los fragmentos de unión a antígeno de los anticuerpos de la invención pueden ser un fragmento Fv monocatenario, un fragmento F(ab'), un fragmento F(ab), y un fragmento F(ab')². En realizaciones adicionales, el fragmento de unión a antígeno es un fragmento de unión a TDP-43 que reconoce TDP-43 por uno o más dominios variables de anticuerpo, o fragmentos o variantes de estos, tales como una o más CDR o un derivado de una o más CDS. En una realización específica, posteriormente, el anticuerpo o fragmento de este es un anticuerpo de isotipo IgG humano. Como alternativa, el anticuerpo es un anticuerpo quimérico humano-murino o murinizado, siendo este último particularmente útil para métodos de diagnóstico y estudios en animales.

También pueden usarse fragmentos de anticuerpo, anticuerpos univalentes y anticuerpos de un único dominio en los métodos y composiciones de la invención. Los anticuerpos univalentes comprenden un dímero de cadena pesada/cadena ligera unido con la región Fc (o tallo) de una segunda cadena pesada. La “región Fab” se refiere a las partes de las cadenas que son aproximadamente equivalentes, o análogas, de las secuencias que comprenden las partes de la rama Y de la cadena pesada y de la cadena ligera en su totalidad, y que se ha mostrado colectivamente (en agregados) que muestran actividad de anticuerpos. Una proteína Fab incluye agregados de una cadena pesada y una ligera (habitualmente conocida como Fab'), así como tetrámeros que corresponden a los dos segmentos de ramas del anticuerpo Y (conocido habitualmente como F(ab)2), si cualquiera de los anteriores están agregados de forma covalente o no covalente, siempre que la agregación sea capaz de reaccionar específicamente con un antígeno o familia de antígenos particular.

Los anticuerpos de TDP-43 de la invención se unen específicamente con TDP-43, epítopos de TDP-43 y con diversas conformaciones de TDP-43 y epítopos de estos. Por ejemplo, se divulgan en este documento anticuerpos que se unen específicamente con t DP-43 nativa, TDP-43 de longitud completa y truncada y TDP-43 patológica. Como se usa en este documento, la referencia a un anticuerpo que “se une específicamente”, “se une selectivamente” o “se une preferentemente” o aún más generalmente “se une a TDP-43” o “de unión a TDP-43”, se refiere a un anticuerpo que se une con TDP-43 preferentemente sobre otras proteínas distintas. Como se usa en este documento, un anticuerpo que “se une específicamente” o “se une selectivamente” con un confórmero de TDP-43 no se une con al menos otro confórmero de TDP-43. Por ejemplo, se divulgan en este documento anticuerpos que se unen selectivamente con TDP-43 de longitud completa así como los que se unen selectivamente con TDP-43 citoplasmática sobre TDP-43 nuclear.

Debe observarse que el término “una” entidad se refiere a una o más de esa entidad; por ejemplo, se entiende que “un anticuerpo” representa uno o más anticuerpos. Como tales, las expresiones “un”, “uno o más” y “al menos uno” pueden usarse de forma intercambiable en este documento.

Como se usa en este documento, el término “polipéptido” se usa de forma intercambiable con el término “polipéptido” y abarca un polipéptido/proteína singular así como polipéptidos/proteínas plurales y se refiere a cualquier cadena o cadenas de dos o más aminoácidos y no se refiere a una longitud específica del producto. Por lo tanto, péptidos, dipéptidos, tripéptidos, oligopéptidos, “proteína”, “cadena de aminoácidos” o cualquier otro término usado para hacer referencia a una cadena o cadenas de dos o más aminoácidos, se incluyen dentro de la definición de “polipéptido” y el término “polipéptido” se usa en lugar de, o de forma intercambiable con cualquiera de estos términos.

Como se usa en este documento, los términos “polipéptido” y “proteína” también se refieren a productos de modificaciones postexpresión del polipéptido, incluyendo a título enunciativo glucosilación, acetilación, fosforilación, amidación, derivatización por grupos de protección/bloqueo conocidos, escisión proteolítica o modificación por aminoácidos de origen no natural u otros restos químicos. Un polipéptido puede derivar de una fuente biológica natural o producirse por tecnología recombinante, pero no se traduce necesariamente de una secuencia de ácido nucleico particular. Los polipéptidos de la invención pueden generarse de cualquier manera, incluyendo por síntesis química.

Un polipéptido de la invención puede ser de un tamaño de aproximadamente 3 o más, 5 o más, 10 o más, 20 o más, 25 o más, 50 o más, 75 o más, 100 o más, 200 o más, 500 o más, 1.000 o más, o 2.000 o más aminoácidos. Los polipéptidos pueden tener una estructura tridimensional definida, aunque no necesariamente tienen dicha estructura. Los polipéptidos con una estructura tridimensional definida pueden denominarse en este documento plegados, y los polipéptidos que no poseen una estructura tridimensional definida, sino que en su lugar adoptan un gran número de conformaciones diferentes, pueden denominarse en este documento desplegados. Como se usa en este documento, el término glucoproteína se refiere a un polipéptido acoplado a al menos un resto de carbohidrato que está unido con la proteína mediante una cadena lateral que contiene oxígeno o una que contiene nitrógeno de un resto de aminoácido, por ejemplo, un resto de serina o un resto de asparagina.

Como se usa en este documento, un polipéptido “aislado” o un fragmento, variante o derivado de este, se refiere a un polipéptido que no está en su medio natural. No se requiere nivel de purificación particular. Por ejemplo, un polipéptido aislado puede estar retirado de su ambiente nativo o natural. Los polipéptidos y proteínas producidos de forma recombinante expresados en células hospedadoras pueden considerarse aislados para los fines de la invención, así como polipéptidos nativos o recombinantes que se han separado, fraccionado o purificado parcial o sustancialmente por cualquier técnica adecuada.

También se incluyen como polipéptidos de acuerdo con la presente divulgación fragmentos, derivados, análogos o variantes de los polipéptidos anteriores, y cualquier combinación de estos. Los términos “fragmento”, “variante”, “derivado” y “análogo” cuando se hace referencia a anticuerpos o polipéptidos de unión a TDP-43 incluyen cualquier polipéptido que conserve al menos alguna de las propiedades de unión a antígeno del anticuerpo de referencia correspondiente o molécula de unión a TDP-43. Los fragmentos de polipéptidos de unión a TDP-43 tales como fragmentos de anticuerpo de unión a antígeno incluyen fragmentos proteolíticos, así como fragmentos de deleción, además de fragmentos de anticuerpo adicionales analizados en este documento. Variantes de molécula de unión a TDP-43, tales como anticuerpos (incluyendo fragmentos de anticuerpo de unión a antígeno) y también polipéptidos con secuencias de aminoácidos alteradas debido a sustituciones de aminoácidos, deleciones o inserciones. Las variantes pueden aparecer de forma natural o pueden ser de origen no natural. Pueden producirse variantes de origen no natural usando técnicas de mutagénesis conocidas en este campo. Los polipéptidos variantes pueden comprender sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos conservativas o no conservativas. Los derivados de moléculas de unión específica a TDP-43, por ejemplo, anticuerpos y otras moléculas de unión específica a TDP-43, son polipéptidos que se han alterado de modo que muestran características alteradas o adicionales no halladas en un polipéptido de referencia. Los ejemplos de derivados de moléculas de unión específica a TDP-43 incluyen proteínas de fusión. Los polipéptidos variantes también pueden denominarse en este documento “análogos polipeptídicos”. Como se usa en este documento, un “derivado” de una molécula de unión específica a TDP-43 o fragmento de esta, se refiere a un polipéptido objeto que tiene uno o más restos derivatizados químicamente por reacción de un grupo lateral funcional. También se incluyen como “derivados” los péptidos que contienen uno o más derivados de aminoácidos de origen natural de los veinte aminoácidos convencionales. Por ejemplo, 4-hidroxiprolina puede sustituir a prolina; 5-hidroxilisina puede sustituir a lisina; 3-metilhistidina puede sustituir a histidina; homoserina puede sustituir a serina; u ornitina puede sustituir a lisina.

Como se usa en este documento, la expresión “polinucleótido” o “ácido nucleico” abarca un ácido nucleico singular así como ácidos nucleicos plurales, e incluye una molécula o construcción de ácido nucleico aislado, por ejemplo, ARN mensajero (ARNm) o ADN plasmídico (ADNp). Un polinucleótido puede comprender un enlace fosfodiéster convencional o un enlace no convencional (por ejemplo, un enlace amida, tal como se encuentra en ácidos péptido nucleicos (PNA)).

La expresión “ácido polinucleotídico” también puede referirse a uno cualquiera o más segmentos de ácido nucleico, por ejemplo, fragmentos de ADN o ARN, presentes en un polinucleótido. Por ácido nucleico o polinucleótido “aislado” se entiende una molécula de ácido nucleico, ADN o ARN que se ha retirado de su ambiente nativo. Por ejemplo, un polinucleótido recombinante que codifica un dominio variable de cadena pesada o ligera de anticuerpo contenido en un vector se considera aislado para los fines de la invención. Los ejemplos adicionales de un polinucleótido aislado incluyen polinucleótidos recombinantes mantenidos en células hospedadoras heterólogas o polinucleótidos purificados (parcial o sustancialmente) en solución. Las moléculas de ARN aisladas pueden incluir transcritos de ARN in vivo o in vitro de polinucleótidos de la invención. Los polinucleótidos o ácidos nucleicos aislados de acuerdo con la invención incluyen además dichas moléculas producidas de forma sintética. Además, el polinucleótido o un ácido nucleico puede ser o puede incluir un elemento regulador tal como un promotor, sitio de unión a ribosoma, o un terminador de la transcripción asociado operativamente con una secuencia que codifica un polipéptido de unión específica a TDP-43 de la invención.

Como se usa en este documento, un “región codificante” es una parte de ácido nucleico que consiste en codones traducidos en aminoácidos. Aunque un “codón de parada” (TAG, TGA o TAA) no se traduce a un aminoácido, se puede considerar que es parte de una región codificante, pero cualquier secuencia flanqueante, por ejemplo, promotores, sitios de unión a ribosomas, terminadores de la transcripción, intrones y similares, no son parte de una región codificante. Dos o más regiones codificantes de la invención pueden estar presentes en una única construcción polinucleotídica, por ejemplo, en un único vector, o en construcciones polinucleotídicas separadas, por ejemplo, en vectores separados (diferentes). Además, cualquier vector puede contener una única región codificante, o puede comprender dos o más regiones codificantes, por ejemplo, un único vector puede codificar por separado una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina y una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina. Además, un vector que incluye un ácido nucleico de la invención puede opcionalmente codificar una o más regiones codificantes heterólogas, bien fusionadas o bien no fusionadas con un ácido nucleico que codifica un polipéptido de unión a TDP-43, incluyendo por ejemplo, un anticuerpo o un fragmento, variante o derivado de este. Las regiones codificantes heterólogas incluyen a título enunciativo elementos o motivos especializados, tales como un péptido de señal secretora o un dominio funcional heterólogo.

En ciertas realizaciones, el polinucleótido o ácido nucleico de la invención es ADN. Un polinucleótido que comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido opcionalmente incluye un promotor y/u otro elemento de control de la transcripción o traducción asociado operativamente con una o más regiones codificantes. Una asociación operativa está presente cuando una región codificante para un producto génico, por ejemplo, un polipéptido, se asocia con una o más secuencias reguladoras de tal modo que sitúe la expresión del producto génico bajo la influencia o el control de la secuencia o las secuencias reguladoras. Dos fragmentos de ADN (tales como una región codificante de polipéptidos y un promotor asociado a esta) están “asociados operativamente” o “unidos operativamente” si la inducción de la función promotora da como resultado la transcripción de ARNm que codifica el producto génico deseado y si el enlace entre los dos fragmentos de ADN no interfiere con la capacidad de las secuencias reguladoras de la expresión para dirigir la expresión del producto génico o evitar la capacidad del molde de ADN para transcribirse. Por lo tanto, una región promotora puede estar asociada operativamente con un ácido nucleico que codifica un polipéptido si el promotor es capaz de efectuar la transcripción de ese ácido nucleico. El promotor puede ser un promotor específico de célula que dirige la transcripción sustancial del ADN solamente en células predeterminadas. El promotor también puede ser constitutivo o regulable. Otros elementos de control de la transcripción que están opcionalmente unidos operativamente con los ácidos nucleicos de la invención incluyen por ejemplo potenciadores, operadores, represores, y señales de terminación de la transcripción, pueden estar asociados operativamente con el polinucleótido para dirigir la transcripción específica de células. Se divulgan en este documento o se conocen de otro modo en la técnica ejemplos de promotores adecuados y otras regiones de control de la transcripción.

Se conocen en la técnica una diversidad de regiones de control de la transcripción que pueden usarse para controlar la expresión de los polinucleótidos de la invención. Estas incluyen, a título enunciativo, regiones de control de la transcripción que actúan en células de vertebrados, incluyendo a título enunciativo, segmentos promotores y potenciadores de citomegalovirus (el promotor temprano inmediato, junto con el intrón A), virus de simio 40 (el promotor temprano) y retrovirus (tales como virus del sarcoma de Rous). Otras regiones de control de la transcripción incluyen a título enunciativo, las derivadas de genes de vertebrados tales como actina, proteína de choque térmico, hormona del crecimiento bovino y p globina de conejo, así como otras secuencias capaces de controlar la expresión génica en células eucariotas. Las regiones de control de la transcripción adecuadas adicionales incluyen promotores específicos de tejido y potenciadores así como promotores inducibles por linfocinas (por ejemplo, promotores inducibles por interferones o interleucinas).

De forma similar, se conocen por los expertos habituales en la materia una diversidad de elementos de control de la traducción adecuados. Estos incluyen, a título enunciativo, sitios de unión a ribosomas, codones de inicio y terminación de la traducción y elementos derivados de picornavirus (particularmente un sitio de entrada de ribosoma interno, o IRES, también denominado secuencia CITE).

En otras realizaciones, un polinucleótido o ácido nucleico puede ser ARN, por ejemplo, en forma de ARN mensajero (ARNm).

Pueden asociarse secuencias codificantes de polinucleótidos y ácido nucleico con secuencias codificantes heterólogas adicionales que codifican por ejemplo péptidos secretores o señales, que dirigen la secreción de un polipéptido codificado por un polinucleótido de la invención. De acuerdo con la hipótesis de la señal, las proteínas secretadas por células de mamífero tienen un péptido señal o secuencia líder secretora que se escinde de la proteína madura una vez que se ha iniciado la exportación de la cadena proteica creciente a través del retículo endoplásmico rugoso. Los expertos habituales en la materia son conscientes de que los polipéptidos secretados por células de vertebrados generalmente tienen un péptido señal fusionado con el extremo N terminal del polipéptido, que se escinde del polipéptido de “longitud completa” para producir una forma secretada o “madura” del polipéptido. También es posible que se use el péptido señal nativo, por ejemplo, un péptido señal de cadena pesada o cadena ligera de inmunoglobulina, o un derivado funcional de la secuencia que conserva la capacidad para dirigir la secreción de un polipéptido con el que está unida operativamente. Como alternativa, puede usarse un péptido señal de mamífero heterólogo, o un derivado funcional de este. Por ejemplo, la secuencia del péptido señal nativo puede sustituirse con la secuencia del péptido señal del activador de plasminógeno tisular humano (TPA), p-glucuronidasa de ratón, o una secuencia señal derivada de una proteína secretada de una célula hospedadora preferida.

A no ser que se indique de otro modo, los términos “trastorno” y “enfermedad” se usan de forma intercambiable en este documento.

Una “molécula de unión” como se usa en este documento se refiere a anticuerpos (incluyendo fragmentos de anticuerpo de unión a TDP-43 o derivados).

Los términos “anticuerpo” e “inmunoglobulina” se usan de forma intercambiable en este documento. Un anticuerpo o inmunoglobulina es una molécula de unión a TDP-43 que comprende al menos el dominio variable de una cadena pesada y normalmente comprende al menos los dominios variables de una cadena pesada y una cadena ligera. Se entienden bien las estructuras de inmunoglobulina básicas en sistemas de vertebrados; véase, por ejemplo, Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a ed. 1988). Como se analizará en más detalle posteriormente, el término “inmunoglobulina” comprende diversas clases generales de polipéptidos que pueden distinguirse bioquímicamente. Como se entiende en general en la técnica, las cadenas pesadas se clasifican como gamma, mu, alfa, delta o épsilon, (y, |i, a, 8, e) con algunas subclases entre ellas (por ejemplo, y1-y4). Es la naturaleza de esta cadena la que determina la “clase” del anticuerpo como IgG, IgM, IgA, IgG o IgE, respectivamente. Las subclases de inmunoglobulina (isotipos), por ejemplo, IgG1, IgG2, lgG3, IgG4, IgA1, etc. están bien caracterizadas y se sabe que confieren especialización funcional que puede incorporarse o modificarse en los anticuerpos de la invención para modificar propiedades funcionales u otras de estos anticuerpos. Las versiones modificadas de clases e isotipos de anticuerpos de la invención son fácilmente discernibles para un experto en la materia a la vista del informe y están dentro del alcance de la invención. Adicionalmente aunque todas las clases de inmunoglobulina están abarcadas por el alcance de la invención, para fines de brevedad y ejemplaridad, el siguiente análisis se dirige en general a la clase IgG de moléculas de inmunoglobulina. Con respecto a IgG, una molécula de inmunoglobulina convencional comprende dos polipéptidos de cadena ligera idénticos de peso molecular de aproximadamente 23.000 Dalton, y dos polipéptidos de cadena pesada idénticos de peso molecular de 53.000 a 70.000 Dalton. Las cuatro cadenas típicamente se unen por enlaces disulfuro en una configuración en “Y” en la que las cadenas ligeras flanquean las cadenas pesadas comenzando en la boca de la “Y” y continuando hasta la región variable.

Los polipéptidos de cadena ligera se clasifican como kappa o lambda ( ^k , X). Cada clase de polipéptido de cadena pesada puede unirse con una cadena ligera kappa o lambda. En general, los polipéptidos de cadena ligera y pesada se unen covalentemente entre sí, y las partes de “cola” de los dos polipéptidos de cadena pesada se unen entre sí por enlaces disulfuro covalentes o enlaces no covalentes cuando las inmunoglobulinas se generan por hibridomas, linfocitos B o células hospedadoras modificadas por ingeniería genética. En el polipéptido de cadena pesada, las secuencias de aminoácidos van del extremo N terminal en los extremos en horquilla de la configuración en Y al extremo C terminal en la parte inferior de cada polipéptido de cadena pesada.

Los polipéptidos de cadena tanto ligera como pesada contienen regiones de homología estructural y funcional. Los términos “constante” y “variable” se usan funcionalmente. A este respecto, se apreciará que los dominios variables de regiones de cadena tanto ligera (V^l) como pesada (V^h) determinan el reconocimiento y la especificidad de antígenos. Por el contrario, los dominios constantes de la cadena ligera (CL) y la cadena pesada (CH1, CH2 o CH3) confieren propiedades biológicas importantes tales como secreción, movilidad transplacentaria, unión con el receptor de Fc, unión de complemento, y similares. Por convención la numeración de los dominios de región constante aumenta a medida que se hacen más distantes del sitio de unión a antígeno o el extremo amino terminal del anticuerpo. La parte N terminal de los polipéptidos de cadena pesada y ligera es una región variable y en la parte C terminal hay una región constante; los dominios CH3 y CL comprenden de hecho el extremo carboxilo terminal de la cadena pesada y ligera, respectivamente.

Como se ha indicado anteriormente, la región variable permite al anticuerpo reconocer selectivamente y unirse específicamente a epítopos en antígenos. Es decir, el dominio V^l y dominio V^h, o subconjunto de las regiones determinantes de complementariedad (CDR), de un anticuerpo se combinan para formar la región variable que define un sitio de unión a antígeno tridimensional. Esta estructura de anticuerpo cuaternario forma el sitio de unión a antígeno presente en el extremo de cada rama de la estructura en Y del anticuerpo. El sitio de unión a antígeno de un anticuerpo completo se define por tres CDR en cada una de las cadenas V^h y V^l. Cualquier anticuerpo (incluyendo fragmentos de anticuerpo, derivados y variantes) que contenga suficiente estructura relacionada con inmunoglobulina para permitir que se una específicamente con TDP-43 se denomina de forma intercambiable en este documento “fragmento de unión” o “fragmento inmunoespecífico”, y puede denominarse generalmente anticuerpo que reconoce específicamente TDP-43.

En anticuerpos de origen natural, un anticuerpo comprende seis regiones hipervariables que se denominan con frecuencia “regiones determinantes de complementariedad” o “CDR” presentes en cada dominio de unión a antígeno. Las CDR son secuencias cortas, no contiguas de aminoácidos que forman el dominio de unión a antígeno ya que el anticuerpo asume su configuración tridimensional en un ambiente acuoso. Las “CDR” están flanqueadas por cuatro regiones “marco” relativamente conservadas o “FR” que muestran menos variabilidad de secuencia intermolecular que las CDR. Las regiones marco conservadas adoptan en gran medida una conformación en lámina P y las CDR forman bucles que conectan, y en algunos casos forman parte de, la estructura de lámina p. Por lo tanto, las regiones marco conservadas actúan para formar un armazón que posibilita el posicionamiento de las CDR en orientación correcta por interacciones intercatenarias, no covalentes. El dominio de unión a antígeno formado por las CDR de cadena pesada y ligera situadas colectivamente define una superficie complementaria del epítopo en el antígeno inmunorreactivo. Esta superficie complementaria promueve la unión no covalente del anticuerpo con su epítopo afín. Los aminoácidos que comprenden las CDR y las regiones marco conservadas, respectivamente, pueden identificarse y definirse fácilmente para cualquier región variable de cadena pesada o ligera dada usando métodos conocidos en la técnica; véase, “Sequences of Proteins of Immunological Interest” Kabat, E., et al., Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos, (1983); y Chothia y Lesk, J. Mol Biol, 196 (1987), 901 a 917.

En el caso de que haya dos o más definiciones de un término que se usen y/o acepten dentro de la técnica, la definición del término como se usa en este documento pretende incluir todos estos significados a no ser que se indique de forma explícita lo contrario. Un ejemplo específico es el uso de la expresión “región determinante de complementariedad” (“CDR”) para describir los sitios de combinación con antígeno no contiguos hallados dentro de la región variable de polipéptidos de cadena tanto pesada como ligera. Esta región particular se ha descrito por Kabat et al., U.S. Dept. of Health, and Human Services, “Sequences of Proteins of Immunological Interest” (1983) y por Chothia y Lesk, J. Mol. Biol, 196 (1987), 901 a 917, donde las definiciones incluyen restos de aminoácidos solapantes o en subconjuntos cuando se comparan entre sí. No obstante, se pretende que la aplicación de una de las definiciones para hacer referencia a una CDR de un anticuerpo o variantes de este esté dentro del alcance del término CDR como se usa en este documento. Los restos de aminoácidos apropiados que abarcan las CDR como se definen en cada una de las referencias anteriormente citadas se exponen en la Figura 1. El número de restos exacto que abarca una CDR particular variará dependiendo de la secuencia y el tamaño de la CDR. Un experto en la materia que cuenta con la secuencia de región variable de un anticuerpo puede determinar rutinariamente qué restos comprenden una región hipervariable particular o CDR de un anticuerpo IgG humano.

Tabla 1: Definiciones de CDR1

Kabat et al., también definieron un sistema de numeración para secuencias de dominio variable que es aplicable a cualquier anticuerpo. Un experto en la materia puede asignar de modo inequívoco este sistema de “numeración de Kabat” a cualquier secuencia de dominio variable, sin basarse en ningún dato experimental más allá de la secuencia en sí misma. Como se usa en este documento, la “numeración de Kabat” se refiere al sistema de numeración expuesto en Kabat et al., U.S. Dept, of Health and Human. Services, “Sequence of Proteins of Immunological Interest” (1983). A no ser que se especifique de otro modo, las referencias a la numeración de posiciones de restos de aminoácidos específicas en un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado como se divulga en el presente documento son de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat, que, sin embargo, es teórico y puede no aplicarse igualmente a todos los anticuerpos de la invención. Por ejemplo, dependiendo de la posición de la primera CDR (es decir, CDR1), las siguientes CDR podrían desplazarse en cualquier dirección.

Un anticuerpo de la invención es un anticuerpo monoclonal. En realizaciones adicionales, las composiciones de la invención contienen anticuerpos monoclonales. El anticuerpo es humano (por ejemplo, un anticuerpo enteramente humano y/o completamente humano), humanizado, primatizado, murinizado o un anticuerpo quimérico. En realizaciones adicionales, un anticuerpo de la invención es un anticuerpo monocatenario, fragmento de unión a epítopo, por ejemplo, Fab, Fab' y F(ab')², Fd, Fv, Fv monocatenario (scFv), anticuerpo monocatenario, Fv unido a disulfuro (sdFv), un fragmento que comprende un dominio V^l o V^h, un fragmento producido por una biblioteca de expresión de Fab o un anticuerpo antiidiotípico (anti Id) (incluyendo, por ejemplo, anticuerpos anti Id para anticuerpos que contienen una secuencia de dominio variable proporcionada en la Figura 1, y otros anticuerpos divulgados en este documento). Se conocen en la técnica moléculas de scFv y se describen, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos N.° 5.892.019. Los anticuerpos de la invención pueden ser de cualquier tipo (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), clase (por ejemplo, IgG1, IgG2 IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) o subclase de molécula de inmunoglobulina.

En algunas realizaciones, los anticuerpos de la invención pueden ser IgG1. En otras realizaciones, los anticuerpos de la invención pueden ser IgG3. En una realización adicional, el anticuerpo de la invención no es IgM o un derivado de este que contiene una estructura pentavalente. Más particularmente, en ciertas aplicaciones de la invención, especialmente las que se refieren al uso terapéutico, los IgM son menos deseables que IgG y otros anticuerpos bivalentes o moléculas de unión correspondientes dado que los IgM con frecuencia muestran reactividades cruzadas no específicas y afinidad muy baja como consecuencia de su estructura pentavalente y falta de maduración de afinidad.

En una realización particular, el anticuerpo de la invención no es un anticuerpo policlonal, es decir, consiste sustancialmente en una especie de anticuerpo particular en lugar de ser una mezcla obtenida de una muestra de inmunoglobulina de plasma.

Un anticuerpo de la invención es un anticuerpo monoclonal “completamente humano” que reconoce específicamente TDP-43 humana y que se aísla de un ser humano. En comparación con otros anticuerpos monoclonales humanos, tales como los derivados de fragmentos de anticuerpo monocatenarios (scFv) identificados usando una biblioteca de presentación de fagos o ratones xenogénicos, los anticuerpos monoclonales completamente humanos de la invención se caracterizan por (i) obtenerse usando la respuesta inmunitaria humana en lugar de sustitutos animales, es decir el anticuerpo se ha generado en respuesta a ^t DP-43 endógeno nativo en su conformación relevante en el cuerpo humano, (ii) haber protegido al individuo o ser al menos significativo con respecto a la presencia de TDP-43 y (iii) tener un riesgo reducido de autorreactividad frente a autoantígenos debido al hecho de que el anticuerpo es de origen humano.

Por lo tanto, aunque las expresiones “anticuerpo completamente humano” o “autoanticuerpo monoclonal humano” abarcan las expresiones “anticuerpo humano”, “anticuerpo monoclonal humano” y similares, estas expresiones se usan en este documento para indicar una molécula de unión a TDP-43 que es de origen humano, es decir que ha derivado de una célula productora de anticuerpos humanos tal como un linfocito B o hibridoma de este o una célula que contiene ácidos nucleicos tales como ADNc que es el ADNc del que se ha clonado directamente de o deriva de una célula productora de anticuerpos humanos tal como un linfocito B de memoria humano. Un anticuerpo se considera “completamente humano” para los fines de este informe cuando el anticuerpo contiene una o más sustituciones de aminoácidos u otras alteraciones de un anticuerpo completamente humano, por ejemplo, para mejorar las características de unión. Opcionalmente, las regiones marco conservadas del anticuerpo completamente humano u otros anticuerpos de la invención son o se han modificado para conformar una secuencia de región variable de línea germinal humana o para conformar una parte de una secuencia de región variable de línea germinal humana, tal como una secuencia disponible, por ejemplo, en Vbase (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/) hospedada en el Centro de Ingeniería Proteica MRC (Cambridge, Reino Unido). Dichas modificaciones pueden ser útiles, entre otros, para reducir o eliminar las desviaciones de secuencia de línea germinal resultantes de los artefactos de clonación, tales como los que pueden resultar de cebadores de PCR.

Los anticuerpos derivados de bibliotecas de inmunoglobulina humana o de animales transgénicos para una o más humanas se denominan generalmente en este documento anticuerpos humanos, o “anticuerpos de tipo humano”. Dichas inmunoglobulinas no corresponden a inmunoglobulinas humanas endógenas, como se describe posteriormente. Véase, por ejemplo, Patente de Estados Unidos N.° 5.939.598. Por ejemplo, el emparejamiento de cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos de tipo humano tales como anticuerpos sintéticos y semisintéticos típicamente aislados de presentación de fagos no reflejan necesariamente el emparejamiento original como sucedió en el linfocito B humano original. En consecuencia, puede considerarse que los fragmentos Fab y scFv obtenidos de bibliotecas de expresión recombinante son artificiales y pueden presentar efectos de inmunogenicidad y estabilidad como resultado de su composición artificial. Por el contrario, los anticuerpos completamente humanos de la invención son anticuerpos aislados, madurados por afinidad de sujetos humanos seleccionados y los anticuerpos se han caracterizado por su tolerancia en el hombre.

Como se usa en este documento, la expresión “anticuerpo murinizado” o “inmunoglobulina murinizada” se refiere a un anticuerpo que comprende una o más CDR de un anticuerpo humano u otro anticuerpo de la invención; y por ejemplo una región marco conservada humana que contiene sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácidos que se basan en una secuencia de anticuerpo de ratón. En este caso, la inmunoglobulina humana u otra que proporciona las CDR se denomina la “parental” o “aceptora” y el anticuerpo de ratón que proporciona los cambios de marco conservado se denomina el “donante”. No es necesario que estén presentes regiones constantes, pero si lo están, son habitualmente sustancialmente idénticas a las regiones constantes del anticuerpo de ratón, es decir al menos aproximadamente 85 a 90 %, o al menos aproximadamente 95 %, aproximadamente 97 %, aproximadamente 98 %, o aproximadamente 99 % o más idénticas a la secuencia correspondiente de la región constante de ratón. Por lo tanto, en algunas realizaciones, una inmunoglobulina de cadena pesada o ligera humana murinizada completa contiene una región constante de ratón, una o más CDR humanas, y un marco conservado sustancialmente humano que tiene varias sustituciones de aminoácidos “murinizantes”. Típicamente, un “anticuerpo murinizado” es un anticuerpo que comprende una cadena ligera variable murinizada y/o una cadena pesada variable murinizada. Por ejemplo, un anticuerpo murinizado no abarcaría un anticuerpo quimérico típico, por ejemplo, porque la región variable completa de un anticuerpo quimérico no es de ratón. Un anticuerpo modificado que se ha “murinizado” por el proceso de “murinización” se une con el mismo antígeno que el anticuerpo parental que proporciona las CDR y es habitualmente menos inmunogénico en ratones, en comparación con el anticuerpo parental.

Como se usa en este documento, la expresión “parte de cadena pesada” incluye secuencias de aminoácidos derivadas de una cadena pesada de inmunoglobulina. Un polipéptido que comprende una parte de cadena pesada comprende al menos uno de: un dominio CH1, un dominio bisagra (por ejemplo, región bisagra superior, media y/o inferior), un dominio CH2, un dominio CH3 o una variante o fragmento de estos. Por ejemplo, un polipéptido de unión de la invención puede comprender un polipéptido que contiene una región o regiones variables o partes de una región variable (por ejemplo, una o más CDR, tales como la CDR3 V^h), sola o en combinación con una cadena polipeptídica que comprende un dominio CH1, al menos una parte de un dominio bisagra y un dominio CH2; una cadena polipeptídica que comprende un dominio CH1 y un dominio CH3; una cadena polipeptídica que comprende un dominio CH1, al menos una parte de un dominio bisagra, y un dominio CH3, o una cadena polipeptídica que comprende un dominio CH1, al menos una parte de un dominio bisagra, un dominio CH2 y un dominio CH3. En otra realización, un polipéptido de la invención comprende una región o regiones variables o partes de una región variable (por ejemplo, una o más CDR, tales como CDR3 de V^h) y una cadena polipeptídica que comprende un dominio CH3. En una realización adicional, un polipéptido de la invención carece de al menos una parte de un dominio CH2 (por ejemplo, todo o parte de un dominio CH2). Como se expone en este documento, y como se apreciaría por un experto habitual en la materia, los dominios polipeptídicos de cadena pesada anteriores (por ejemplo, las partes de cadena pesada) pueden modificarse de tal modo que varíen en su secuencia de aminoácidos de la molécula de inmunoglobulina de origen natural. Como se divulga en el presente documento, las partes de cadena pesada de una cadena polipeptídica de un anticuerpo (incluyendo fragmentos de unión a antígeno, variantes o derivados de estos) son idénticas a las de una segunda cadena polipeptídica del anticuerpo. Como alternativa, las partes de cadena pesada de una cadena polipeptídica de un anticuerpo (incluyendo fragmentos de unión a antígeno, variantes o derivados de estos) son diferentes de la de una segunda cadena polipeptídica del anticuerpo. Por lo tanto, cada componente monomérico de un anticuerpo divulgado en el presente documento puede comprender un sitio de unión a diana diferente, formando, por ejemplo, un anticuerpo biespecífico o diacuerpo.

Los fragmentos de anticuerpo divulgados en el presente documento, incluyendo anticuerpos monocatenarios, pueden comprender una región o regiones variables o partes de regiones variables (por ejemplo, una o más CDR, tales como CDR3 VH o CDR3 VL) solas o en combinación con la totalidad o una parte de lo siguiente: región bisagra, dominios CH1, CH2, y CH3. La presente divulgación abarca también fragmentos de unión a TDP-43 que comprenden cualquier combinación de región o regiones variables con una región bisagra, dominios CH1, CH2 y CH3. Los anticuerpos (incluyendo fragmentos inmunoespecíficos de estos) divulgados en el presente documento pueden derivar de cualquier origen animal incluyendo aves y mamíferos. Como se divulga en el presente documento, los anticuerpos pueden ser anticuerpos humanos, murinos, de burro, de conejo, de cabra, de cobaya, de camello, de llama, de caballo o de pollo o la región variable puede ser de origen condrictio (por ejemplo, de tiburones).

En otra realización, los anticuerpos divulgados en este documento están compuestos de una única cadena polipeptídica tal como scFv y pueden expresarse de forma intracelular (intracuerpos) para aplicaciones terapéuticas y de diagnóstico in vivo potenciales.

Las partes de cadena pesada o partes de cadena ligera de un polipéptido de unión para su uso en los métodos de diagnóstico y tratamiento divulgados en este documento pueden derivar de diferentes moléculas de inmunoglobulina. Por ejemplo, una parte de cadena pesada de un polipéptido puede comprender un dominio CH1 derivado de una molécula de IgG1 y una región bisagra derivada de una molécula de IgG3. En otro ejemplo, una parte de cadena pesada puede comprender una región bisagra derivada, en parte, de una molécula de IgG1 y, en parte, de una molécula de IgG3. En otro ejemplo, una parte de cadena pesada puede comprender una bisagra quimérica derivada, en parte, de una molécula de IgG1 y, en parte, de una molécula de IgG4.

Como se usa en este documento, la expresión “parte de cadena ligera” incluye secuencias de aminoácidos derivadas de una cadena ligera de inmunoglobulina. En una realización, la parte de cadena ligera comprende al menos un dominio V^l o CL. Como se usa en este documento, la expresión “parte de cadena ligera” incluye secuencias de aminoácidos derivadas de una cadena ligera de inmunoglobulina. Un polipéptido que comprende una parte de cadena ligera comprende al menos una región o regiones variables de cadena ligera o partes de una región variable (por ejemplo, una o más CDR, tal como la CDR3 V^l). En algunas realizaciones, la parte de cadena ligera incluye un dominio CH1. En otra realización, la parte de cadena ligera comprende al menos uno de un dominio V^l o CL. También se divulgan en el presente documento polipéptidos que comprenden fragmentos, variantes y derivados de estas partes de cadena ligera.

Se cree que el tamaño mínimo de un epítopo peptídico o polipeptídico para un anticuerpo es de aproximadamente cuatro a cinco aminoácidos. Los epítopos peptídicos o polipeptídicos pueden contener al menos siete, al menos nueve o entre al menos aproximadamente 15 y aproximadamente 30 aminoácidos. Dado que una CDR puede reconocer un péptido o polipéptido antigénico en su forma terciaria, no es necesario que los aminoácidos que comprenden un epítopo sean contiguos, y en algunos casos pueden incluso no estar en la misma cadena peptídica. Un epítopo peptídico o polipeptídico reconocido por un anticuerpo de la invención puede contener una secuencia de al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 15, al menos 20, al menos 25 aminoácidos contiguos o no contiguos de TDP-43. Un epítopo peptídico o polipeptídico reconocido por un anticuerpo de la invención puede contener entre aproximadamente 5 y aproximadamente 30, aproximadamente 10 y aproximadamente 30, o 15 y aproximadamente 30 aminoácidos contiguos o no contiguos de TDP-43.

Las expresiones “que se une específicamente” y “que reconoce específicamente” se usan de forma intercambiable en este documento y se refieren en general a una molécula de unión (por ejemplo, un polipéptido tal como un anticuerpo) que se une con un epítopo o antígeno más fácilmente de lo que se uniría con un epítopo o antígeno no relacionado, aleatorio. Como se entiende en la técnica, un anticuerpo puede unirse específicamente con, o reconocer específicamente un polipéptido aislado que comprende, o consiste en, restos de aminoácidos correspondientes a una parte lineal de un epítopo no contiguo. El término “especificidad” se usa en este documento para calificar la afinidad relativa por la que cierto anticuerpo se une con cierto epítopo o antígeno. Por ejemplo, puede considerarse que el anticuerpo “A” tiene una especificidad mayor para un epítopo dado que el anticuerpo “B”, o puede decirse que el anticuerpo “A” se une con el epítopo “C” con una especificidad mayor que la que tiene para el epítopo relacionado “D”. Por ejemplo, puede considerarse que el anticuerpo “A” tiene una especificidad mayor para un epítopo dado que el anticuerpo “B”, o puede decirse que el anticuerpo “A” se une con el epítopo “C” con una especificidad mayor que la que tiene para el epítopo relacionado “D”. De forma similar, puede considerarse que un anticuerpo “A” tiene una especificidad mayor para un antígeno dado que el anticuerpo “B”, o puede decirse que el anticuerpo “A” se une con el antígeno “C” con una especificidad mayor que la que tiene para el antígeno relacionado

“D”.

Cuando está presente, la expresión “características de unión inmunológicas”, u otras características de unión de un anticuerpo con un antígeno, en todas sus formas gramaticales, se refiere a la especificidad, afinidad, reactividad cruzada u otras características de unión de un anticuerpo.

Por “que se une preferentemente”, se entiende que la molécula de unión, por ejemplo, el anticuerpo se une específicamente con un epítopo o antígeno más fácilmente de lo que se uniría con un epítopo o antígeno relacionado, similar, homólogo o análogo. Por lo tanto, un anticuerpo que “se une preferentemente” con un epítopo o antígeno dado se uniría más probablemente con ese epítopo o antígeno que con un epítopo o antígeno relacionado, incluso aunque dicho anticuerpo pueda reaccionar de forma cruzada con el epítopo o antígeno relacionado.

Como ejemplo no limitante, puede considerarse que una molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo se une con un primer epítopo o antígeno preferentemente si se une con dicho primer epítopo o antígeno con una constante de disociación (K^d) que es menor que la K^d del anticuerpo para el segundo epítopo o antígeno. En otro ejemplo no limitante, puede considerarse que un anticuerpo se une con un primer antígeno preferentemente si se une con el primer epítopo o antígeno con una afinidad que es al menos un orden de magnitud menor que la K^d del anticuerpo para el segundo epítopo o antígeno. En otro ejemplo no limitante, puede considerarse que un anticuerpo se une con un primer epítopo o antígeno preferentemente si se une con el primer epítopo o antígeno con una afinidad que es al menos dos órdenes de magnitud inferior a la K^d del anticuerpo para el segundo epítopo o antígeno.

En otro ejemplo no limitante, puede considerarse que una molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo, se une con un primer epítopo o antígeno preferentemente si se une con el primer epítopo o antígeno con una velocidad de disociación (k(off)) que es menor que la k(off) del anticuerpo para el segundo epítopo o antígeno. En otro ejemplo no limitante, puede considerarse que un anticuerpo se une con un primer epítopo o antígeno preferentemente si se une con el primer epítopo con una afinidad que es al menos un orden de magnitud inferior a la k(off) del anticuerpo para el segundo epítopo o antígeno. En otro ejemplo no limitante, puede considerarse que un anticuerpo se une con un primer epítopo o antígeno preferentemente si se une con el primer epítopo o antígeno con una afinidad que es al menos dos órdenes de magnitud inferior a la k(off) del anticuerpo para el segundo epítopo o antígeno.

Como se divulga en el presente documento, una molécula de unión a TDP-43 (por ejemplo, un anticuerpo, incluyendo un fragmento de unión a antígeno o variante de un anticuerpo o derivado de estos) se une con TDP-43 o un fragmento o variante de este con una velocidad de disociación (k(off)) inferior a o igual a 5 x 10‘2 s-1, 10‘2 s-1, 5 x

10'3 s_1 o 10'3 s-1. Como alternativa, como se divulga en el presente documento, una molécula de unión a TDP-43 se une con TDP-43 o un fragmento o variante de este, con una velocidad de disociación (k(off)) inferior a o igual a 5 x

10-4 s-1, 10-4 s-1, 5 x 10-5 s-1, o 10-5 s-1, 5 x 10'6 s-1, 10'6 s-1, 5 x 10'7 s'1 o 10'7 s-1.

Como alternativa, como se divulga en el presente documento, una molécula de unión a TDP-43 (por ejemplo, un anticuerpo, incluyendo un fragmento de unión a antígeno o variante de un anticuerpo o derivado de estos) se une con TDP-43 o un fragmento o variante de este, con una velocidad de asociación (k(on)) superior a o igual a 103 M_1 s-1, 5 x 103 M_1 s-1, 104 M_1 s_1 o 5 x 104 M-1 s-1. Como alternativa, como se divulga en el presente documento, una molécula de unión a TDP-43 de la invención se puede unir con TDP-43 o un fragmento o variante de este con una velocidad de asociación (k(on)) superior a o igual a 105 M_1 s-1, 5 x 105 M_1 s-1, 106 M_1 s-1.

La presente divulgación también abarca una molécula de unión a TDP-43 que compite con una o más de las moléculas de unión a TDP-43 de la invención por la unión con TDP-43. Para los fines de esta invención, se dice que una molécula de unión a TDP-43 (por ejemplo, un anticuerpo) inhibe de forma competitiva la unión de una molécula

de unión a TDP-43 de referencia (por ejemplo, anticuerpo) con un epítopo o antígeno dado si se une preferentemente con ese epítopo o antígeno hasta el punto de que bloquea, en algún grado, la unión del anticuerpo de referencia con el epítopo o antígeno. La inhibición competitiva puede determinarse por cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo, ensayos de ELISA de competición. La presente divulgación también abarca una molécula de unión a TDP-43 (por ejemplo, un anticuerpo) que inhibe competitivamente la unión de una molécula de unión a TDP-43 de referencia (por ejemplo, un anticuerpo) con un epítopo o antígeno dado en al menos 90 %, al menos 80 %, al menos 70 %, al menos 60 % o al menos 50 %.

Como se usa en este documento, el término “afinidad” se refiere a una medida de la fuerza de la unión de un epítopo o antígeno individual con una molécula de unión a TDP-43 (por ejemplo, un anticuerpo, incluyendo fragmentos, variantes y derivados de este). Véase, por ejemplo, Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a ed. (1988) en las páginas 27 a 28. Como se usa en este documento, el término “avidez” se refiere a la estabilidad global del complejo entre una población de inmunoglobulinas y un antígeno, es decir, la fuerza de combinación funcional de una mezcla de inmunoglobulina con el antígeno; véase, por ejemplo, Harlow en las páginas 29 a 34. La avidez se relaciona tanto con la afinidad de las moléculas de inmunoglobulina individuales en la población con epítopos o antígenos específicos, como también con las valencias de las inmunoglobulinas y el antígeno. Por ejemplo, la interacción entre un anticuerpo monoclonal bivalente y un antígeno con una estructura de epítopo altamente repetitiva, tal como un polímero, sería de alta avidez. La afinidad o avidez de un anticuerpo por un antígeno puede determinarse experimentalmente usando cualquier método adecuado; véase, por ejemplo, Berzofsky et al., “Antibody-Antigen Interactions” en Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press Nueva York, N Y (1984), Kuby, Janis Immunology, W. H. Freeman and Company Nueva York, N Y (1992), y métodos descritos en este documento. Las técnicas generales para medir la afinidad de un anticuerpo por un antígeno incluyen ELISA, RIA, y resonancia de plasmón superficial. La afinidad medida de una interacción de anticuerpoantígeno particular puede variar si se mide en condiciones diferentes, por ejemplo, concentración salina, pH. Por lo tanto, las mediciones de afinidad y otros parámetros de unión a antígeno, por ejemplo, Kd, CI⁵⁰, se realizan preferentemente con soluciones normalizadas de anticuerpo y antígeno, y un tampón normalizado.

También se pueden describir anticuerpos de unión a TDP-43 o fragmentos de unión a antígeno de la invención o se especifican con respecto a su reactividad cruzada. Como se usa en este documento, la expresión “reactividad cruzada” se refiere a la capacidad de una molécula de unión a TDP-43 (por ejemplo, un anticuerpo) específica para un antígeno, para reaccionar con un segundo antígeno distinto; una medida que con frecuencia refleja el grado de relación entre dos sustancias antigénicas diferentes.

Por ejemplo, ciertos anticuerpos tienen algún grado de reactividad cruzada, porque se unen con epítopos o antígenos relacionados, pero no idénticos, por ejemplo, epítopos con al menos 95 %, al menos 90 %, al menos 85 %, al menos 80 %, al menos 75 %, al menos 70 %, al menos 65 %, al menos 60 %, al menos 55 %, y al menos 50 % de identidad (como se calcula usando métodos descritos en este documento o conocidos de otro modo en la técnica) con un epítopo o antígeno de referencia. Puede considerarse que un anticuerpo es “altamente específico” para cierto epítopo, si no se une con ningún otro análogo, ortólogo u homólogo de ese epítopo o antígeno. La presente divulgación también abarca moléculas de unión a TDP-43 (por ejemplo, anticuerpos incluyendo fragmentos de unión a antígeno de anticuerpos, y variantes o derivados de estos) que no se unen con epítopos con menos de 95 %, menos de 90 %, menos de 85 %, menos de 80 %, menos de 75 %, menos de 70 %, menos de 65 %, menos de 60 %, menos de 55 % y menos de 50 % identidad (como se calcula usando métodos descritos en este documento o conocidos de otro modo en la técnica) con un epítopo o antígeno de referencia en condiciones fisiológicas.

También se pueden describir moléculas de unión a TDP-43 tales como anticuerpos (incluyendo fragmentos de unión a antígeno de un anticuerpo y variantes o derivados de estos) como se desvela en el presente documento con respecto a su afinidad de unión con TDP-43. Por ejemplo, las moléculas de unión a TDP-43 (por ejemplo, anticuerpos incluyendo fragmentos de unión a antígeno, variantes o derivados de estos) pueden tener afinidades de unión con una constante de disociación o Kd inferior a 5 x 10'2 M, 10'2 M, 5 x 10'3 M, l0 '3 M, 5 x 10'4 M, 10'4 M, 5 x 10-5 M, 10-5 M, 5 x 10-6 M, 10-6 M, 5 x 10'7 M, 10'7 M, 5 x 10'8 M, 10'8 M, 5 x 10'9 M, 10'9 M, 5 x 10'1° M, 10'1° M, 5 x 10-11 M, 10-11 M, 5 x 10-12 M, 10-12 M, 5 x 10'13 M, 10'13 M, 5 x 10'14 M, 10'14 M, 5 x 10'15 M o 10'15 M.

Las estructuras subunitarias y la configuración tridimensional de las regiones constantes de las diversas clases de inmunoglobulina se conocen bien. Como se usa en este documento, la expresión “dominio V^h” incluye el dominio variable amino terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina y la expresión “dominio CH1” incluye el primer (más amino terminal) dominio de región constante de una cadena pesada de inmunoglobulina. El dominio CH1 es adyacente al dominio V^h y está en sentido amino terminal de la región bisagra de una molécula de cadena pesada de inmunoglobulina.

Como se usa en este documento la expresión “dominio CH2” incluye la parte de una molécula de cadena pesada que se extiende, por ejemplo, desde aproximadamente el resto 244 al resto 360 de un anticuerpo usando esquemas de numeración convencionales (restos 244 a 360, sistema de numeración de Kabat; y restos 231 a 340, sistema de numeración EU; véase Kabat EA et al., referencia ya citada). El dominio CH2 es único porque no se empareja estrechamente con otro dominio. En su lugar, se interponen dos cadenas de carbohidratos ramificados ligados a N entre los dos dominios CH2 de una molécula IgG nativa intacta. También se ha documentado bien que el dominio CH3 se extiende desde el dominio CH2 al extremo C terminal de la molécula de IgG y comprende aproximadamente 108 restos.

Como se usa en este documento, la expresión “región bisagra” incluye la parte de una molécula de cadena pesada que une el dominio CH1 con el dominio CH2. Esta región bisagra comprende aproximadamente 25 restos y es flexible, permitiendo de este modo que las dos regiones de unión a antígeno N terminal se muevan independientemente. Las regiones bisagras pueden subdividirse en tres dominios distintos: dominios bisagra superior, medio e inferior; véase Roux et al., J. Immunol. 161 (1998), 4083.

Como se usa en este documento la expresión “enlace disulfuro” incluye el enlace covalente formado entre dos átomos de azufre. El aminoácido cisteína comprende un grupo tiol que puede formar un enlace o puente disulfuro con un segundo grupo tiol. En la mayoría de las moléculas de IgG de origen natural, las regiones CH1 y CL están unidas por un enlace disulfuro y las dos cadenas pesadas están unidas por dos enlaces disulfuro en posiciones correspondientes a 239 y 242 usando el sistema de numeración de Kabat (posición 226 o 229, el sistema de numeración EU).

Como se usan en este documento, los términos “unido”, “fusionado” o “fusión” se usan de forma intercambiable. Estos términos se refieren a la unión entre sí de dos o más elementos o componentes, por cualquier medio incluyendo conjugación química o medios recombinantes. Una “fusión en fase” se refiere a la unión de dos o más fases abiertas de lectura polinucleotídicas (ORF) para formar una ORF continua más larga, de una manera que mantenga la fase de lectura de traducción correcta de las ORF originales. Por lo tanto, una proteína de fusión recombinante es una única proteína que contiene dos o más segmentos que corresponden a polipéptidos codificados por las ORF originales (cuyos segmentos no están normalmente unidos de este modo en la naturaleza). Aunque la fase de lectura se hace de este modo continua a lo largo de los segmentos fusionados, los segmentos pueden separarse física o espacialmente mediante, por ejemplo, una secuencia enlazadora en fase. Por ejemplo, los polinucleótidos que codifican las CDR de una región variable de inmunoglobulina pueden fusionarse, en fase, pero separarse por un polinucleótido que codifica al menos una región marco conservada de inmunoglobulina o regiones CDR adicionales, siempre que las CDR “fusionadas” se traduzcan conjuntamente como parte de un polipéptido continuo.

El término “expresión” como se usa en este documento se refiere a un proceso por el que un gen produce un producto bioquímico, por ejemplo, un ARN o polipéptido. El proceso incluye cualquier manifestación de la presencia funcional del gen dentro de la célula incluyendo, a título enunciativo, anulación génica así como tanto expresión estable como expresión transitoria. Incluye a título enunciativo la transcripción del gen en ARN mensajero (ARNm), ARN de transferencia (ARNt), ARN en horquilla pequeño (ARNhp), ARN de interferencia pequeño (ARNip) o cualquier otro producto de ARN, y la traducción de dicho ARNm en polipéptido o polipéptidos. Si el producto deseado final es un producto bioquímico, la expresión incluye la creación de ese producto bioquímico y cualquier precursor. La expresión de un gen produce un “producto génico”. Como se usa en este documento, un producto génico puede ser un ácido nucleico, por ejemplo, un ARN mensajero producido por la transcripción de un gen, o un polipéptido que se traduce a partir de un transcrito. Los productos génicos descritos en este documento incluyen además ácidos nucleicos con modificaciones postranscripcionales, por ejemplo, poliadenilación, o polipéptidos con modificaciones postraduccionales, por ejemplo, metilación, glucosilación, adición de lípidos, asociación con otras subunidades proteicas, escisión proteolítica y similares.

Como se usa en este documento, el término “muestra” se refiere a cualquier material biológico obtenido de un sujeto o paciente. En una realización, una muestra comprende sangre, líquido cefalorraquídeo (“CSF”) u orina. En otra realización una muestra comprende sangre completa, plasma, linfocitos B enriquecidos a partir de muestras sanguíneas, o células cultivadas (por ejemplo, linfocitos B de un sujeto). En otra realización una muestra de la invención contiene una biopsia o muestra tisular incluyendo tejido neural. En una realización adicional, una muestra de la invención comprende células completas o un lisado de las células. Las muestras de la invención, incluyendo muestras de sangre y muestras de CSF pueden recogerse usando métodos conocidos en la técnica.

Como se usa en este documento, los términos “tratar” o “tratamiento” se refieren al tratamiento terapéutico y medidas profilácticas o preventivas, en las que el objetivo es prevenir o ralentizar (reducir) un cambio fisiológico indeseado o trastorno, tal como el desarrollo de demencia. Los resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyen, a título enunciativo, alivio de los síntomas, reducción del alcance de la enfermedad, estado estabilizado (es decir, sin empeoramiento) de la enfermedad, retardo o ralentización de la progresión de enfermedad, alivio o paliación de la patología y remisión (bien parcial o bien total), bien detectable o bien indetectable. El “tratamiento” también puede significar prolongar la supervivencia en comparación con la supervivencia esperada si no se recibe tratamiento. Las personas que necesitan tratamiento incluyen las que ya tienen la afección o trastorno así como las propensas a tener la afección o trastorno o en las que la manifestación de la afección o trastorno debe prevenirse.

Por “sujeto”, “individuo”, “animal”, “paciente” o “mamífero” se entiende cualquier sujeto, particularmente un sujeto mamífero, por ejemplo, un paciente humano, para el que se desee el diagnóstico, pronóstico, prevención o terapia.

II. Anticuerpos

La invención abarca anticuerpos, como están caracterizados en las reivindicaciones, que se unen selectivamente a TDP-43. Como se usa en este documento, el término anticuerpo o anticuerpos abarcan anticuerpos completos, así como fragmentos de anticuerpo de unión a TDP-43.

De acuerdo con algunas realizaciones, el anticuerpo de la invención es un anticuerpo completamente humano. La invención también abarca fragmentos de unión a antígeno de un anticuerpo completamente humano. Como se divulga en los ejemplos, los anticuerpos completamente humanos divulgados en este documento derivaron de un grupo de muestras de sujetos sanos. Los anticuerpos de interés potencial se analizaron con respecto a determinación de clase y subclase de cadena ligera, se transcribió el mensaje de los cultivos de linfocitos B de memoria seleccionados por RT-PCR, se clonaron y se combinaron en vectores de expresión para producción recombinante; véase los Ejemplos adjuntos. Los anticuerpos completamente humanos se expresaron después de forma recombinante en células HEK293 y se caracterizaron posteriormente basándose en sus especificidades de unión hacia TDP-43 de longitud completa, TDP-43 truncada y una forma modificada de TDP-43 (Figuras 2, 4 a 7, 10 y 11). Esta caracterización confirmó que por primera vez se han clonado anticuerpos humanos que son altamente específicos para TDP-43 y reconocen diferentes epítopos dentro de la proteína TDP-43.

La invención se refiere en general a un anticuerpo que reconoce específicamente TDP-43. En una realización adicional, la invención se refiere a un anticuerpo humano que reconoce específicamente TDP-43. En una realización adicional más, la invención se refiere a un anticuerpo humano total que reconoce específicamente TDP-43. En realizaciones adicionales, la invención abarca un fragmento de unión a TDP-43 de un anticuerpo humano intacto de unión a TDP-43 (incluyendo completamente humano) de la invención. En otra realización, los anticuerpos de la invención reconocen específicamente TDP-43 patológica humana en una transferencia de Western. En una realización adicional, los anticuerpos de la invención se unen selectivamente a TDP-43 patológica en una transferencia de Western. En otra realización, los anticuerpos de la invención reconocen específicamente TDP-43 patológica humana en un ELISA. En una realización adicional, los anticuerpos de la invención se unen selectivamente a TDP-43 patológica en un ELISA. En otra realización, los anticuerpos de la invención reconocen específicamente TDP-43 patológica humana en una inmunohistoquímica. En una realización adicional, los anticuerpos de la invención se unen selectivamente a TDP-43 patológica en una inmunohistoquímica. En otra realización, los anticuerpos de la invención reconocen específicamente TDP-43 patológica humana en una inmunohistoquímica del hipocampo. En una realización adicional, los anticuerpos de la invención se unen selectivamente a TDP-43 patológica en una inmunohistoquímica del hipocampo. En una realización adicional, los anticuerpos de la invención se unen selectivamente con uno o más de t DP-43 nuclear, TDP-43 citoplasmática, TDP-43 axónica o TDP-43 neurítica en una inmunohistoquímica del hipocampo con FTLD-U humano. En otra realización, los anticuerpos de la invención se unen selectivamente con uno o más de TDP-43 citoplasmática y TDP-43 neurítica en células granulares del hipocampo en una inmunohistoquímica del hipocampo con FTLD-U humano. Los anticuerpos de la invención reconocen específicamente TDP-43 humana patológica.

La invención abarca un anticuerpo (incluyendo un fragmento de unión a antígeno) que tiene el dominio variable de cadena pesada y ligera de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en: NI-205.41D1 y NI-205.14W3.

Como se ilustra en los ejemplos, la invención abarca anticuerpos que se unen con el dominio IV de TDP-43 (restos de aminoácidos 258 a 414 de SEQ ID NO: 94). Como se divulga en el presente documento, el anticuerpo anti-TDP-43 no reconoce una forma truncada de TDP-43. Como alternativa, la presente divulgación abarca un anticuerpo anti-TDP-43 que reconoce un fragmento N-terminah^-259 de TDP-43. Un anticuerpo anti-TDP-43 puede unirse específicamente al dominio IV de TDP-43 (restos de aminoácidos 258 a 414 de SEQ ID NO: 94), pero no se une específicamente al dominio IV de TDP-43 que comprende las sustituciones A321G, M322G y M323G.

La divulgación abarca anticuerpos anti TDP-43 humanos que tienen diferentes especificidades de TDP-43, que son por lo tanto particularmente útiles para fines de diagnóstico y terapéuticos. La invención también se refiere al anticuerpo NI-205.41D1 y NI-205.14W3 que comprende una cualquiera de las secuencias de aminoácidos representadas en las figuras 3A y 3Q. Las secuencias de CDR de los anticuerpos de la invención se enumeran en la tabla 2. Las secuencias de nucleótidos correspondientes que codifican estas regiones variables se exponen en la Tabla 3.

Tabla 2. SEQ ID NO: de la región V^h, CDR1 V^h, CDR2 V^h, CDR2 V^h, región V^l, CDR2 V^l, CDR2 V^l y CDR3 V^l de anticuer os es ecíficos de TDP-43.

continuación

De acuerdo con la invención el anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos de la región V^h y V^l como se representa en las figuras 3A y 3Q.

De acuerdo con la invención el anticuerpo comprende un VH de SEQ ID NO: 130 y un VL de SEQ ID NO: 134 o un VH de SEQ ID NO: 259 y un VL de SEQ ID NO: 263.

Como se analiza en este documento, el epítopo de TDP-43 de un anticuerpo completamente humano es particularmente relevante para aplicaciones de diagnóstico y terapéuticas debido al hecho de que el anticuerpo se generó inicialmente como resultado de una respuesta inmunitaria humana. Por lo tanto, los anticuerpos monoclonales humanos completamente 2humanos de la invención reconocen epítopos que tienen particular relevancia fisiológica y que podrían no estar accesibles o ser menos inmunogénicos usando inmunización convencional y otros procesos de exploración de anticuerpos para la generación de, por ejemplo, anticuerpos monoclonales de ratón y anticuerpos derivados de exploración in vitro de bibliotecas de presentación de fagos.

La divulgación también abarca un anticuerpo (incluyendo un fragmento de unión a anticuerpo, variante o derivados de estos) que se une específicamente a un polipéptido de TDP-43 SINPAMMAAAQAALQ^s S^w GMMGMLASQ (SEQ ID NO: 323) pero que no se une específicamente a SINPGGGAAAQAALQSSWGMMGMLASQ (SEQ ID NO: 314).

La competición entre anticuerpos se determina mediante un ensayo en el que la inmunoglobulina en ensayo inhibe la unión específica de un anticuerpo de referencia frente a un antígeno común, tales como TDP-43. En la técnica se conocen numerosos tipos de ensayos de unión competitiva y se pueden aplicar de forma rutinaria o modificar para analizar la capacidad de dos compuestos para competir por la unión a un antígeno, tal como radioinmunoensayo (RIA) de fase sólida directo o indirecto, inmunoensayo enzimático (EIA) de fase sólida directo o indirecto, ensayo de competición de tipo sándwich; véase Stahli et al., Methods in Enzymology 9 (1983), 242-253; EIA de biotina-avidina directa de fase sólida; véase Kirkland et al., J. Immunol. 137 (1986), 3614-3619, y Cheung et al., Virology 176 (1990), 546-552; ensayo de marcaje directo de fase sólida, ensayo de tipo sándwich de marcaje directo de fase sólida; véase Harlow y Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988); RIA de marcaje directo de fase sólida usando el marcador 125I; véase Morel et al., Molec. Immunol. 25 (1988), 7-15 y Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol. 32 (1990), 77-82. Normalmente, dicho ensayo implica el uso de TDP-43 purificado o agregados del mismo unidos a una superficie sólida o células portadores de estos, una inmunoglobulina para ensayo sin marcar y una inmunoglobulina de referencia marcada, por ejemplo un anticuerpo monoclonal humano de la invención. La inhibición competitiva se mide determinando la cantidad de marcaje unido a la superficie sólida o a las células en presencia de la inmunoglobulina de ensayo. Normalmente, la inmunoglobulina de ensayo está presente en exceso. En una realización, el ensayo de unión competitiva se realiza en las condiciones descritas para el ensayo ELISA en los ejemplos adjuntos. Los anticuerpos identificados por ensayo de competición (anticuerpos en competición) incluyen anticuerpos que se unen al mismo epítopo que el anticuerpo de referencia y anticuerpos que se unen a un epítopo adyacente suficientemente próximo al epítopo unido por el anticuerpo de referencia para que se produzca impedimento estérico. Normalmente, cuando hay un exceso de un anticuerpo de competición, inhibirá la unión específica de un anticuerpo de referencia a un antígeno común en al menos un 50% o un 75%.

Una inmunoglobulina o el ácido nucleico que la codifica (p. ej., un ADNc) puede modificarse además. Por tanto, en una realización adicional, el procedimiento de la invención comprende una cualquiera de la(s) etapa(s) de producción de un anticuerpo quimérico, anticuerpo murinizado, anticuerpo monocatenario, fragmento Fab, anticuerpo biespecífico, anticuerpo de fusión, anticuerpo marcado o un análogo de cualquiera de estos. En la técnica se conocen procedimientos correspondientes y se describen en, por ejemplo, Harlow y Lane “Antibodies, A Laboratory Manual”, CSH Press, Cold Spring Harbor (1988). Cuando se obtienen derivados de dichos anticuerpos mediante, por ejemplo, se puede usar la técnica de expresión en fagos, resonancia de plasmón superficial como se usa en el sistema BIAcore, para aumentar la eficiencia de los anticuerpos de fagos que se unen al mismo epítopo que el de uno cualquiera de los anticuerpos descritos en este documento (Schier, Human Antibodies Hybridomas 7 (1996), 97-105; Malmborg, J. Immunol. Methods 183 (1995), 7-13). La producción de anticuerpos quiméricos se describe en, por ejemplo, la publicación de solicitud internacional n.° WO89/09622. Procedimientos para la producción de anticuerpos humanizados se describen en, por ejemplo, la solicitud europea EP-A 10239400 y la solicitud internacional WO90/07861. Una fuente adicional de anticuerpos a usar de acuerdo con la invención es la de los denominados anticuerpos xenogénicos. El principio general para la producción de anticuerpos xenogénicos tales como anticuerpos de tipo humano en ratones se describe en, por ejemplo, las publicaciones de solicitud internacional n.° WO91/10741, WO94/02602, WO96/34096 y WO 96/33735. Como se ha tratado anteriormente, el anticuerpo de la invención puede existir en diversas formas además de anticuerpos completos, incluyendo, por ejemplo, Fv, Fab y F(ab)², así como en cadenas sencillas; véase, por ejemplo, la publicación de la solicitud internacional n.° WO88/09344.

Los anticuerpos de la invención o sus correspondientes cadenas de inmunoglobulina se pueden modificar además usando técnicas convencionales conocidas en la materia, por ejemplo, usando deleción(es), inserción(es), sustitución(es), adición(es) y/o recombinación(es) de aminoácidos, y/u otra(s) modificación(es) conocidas en la técnica, solas o en combinación. El experto en la técnica conoce bien los procedimientos de introducción de dichas modificaciones en la secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de una cadena de inmunoglobulina, véase, por ejemplo, Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y. y Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates y Wiley interscience, N.Y. (1994). Las modificaciones del anticuerpo de la invención incluyen derivaciones químicas y/o enzimáticas en uno o más aminoácidos constituyentes, incluyendo modificaciones en una sola cadena, modificaciones en la estructura y modificaciones en los extremos N y C, incluyendo acetilación, hidroxilación, metilación, amidación y la unión de hidratos de carbono o restos lipídicos, cofactores y similares. Asimismo, la invención abarca la producción de proteínas quiméricas (es decir, proteínas de fusión), que comprenden los polipéptidos de unión a TDP-43 de la invención, tales como anticuerpos, en el extremo amino fusionado con una molécula heteróloga, tal como un ligando inmunoestimulador en el extremo carboxilo; véase, por ejemplo, la publicación de solicitud internacional n.° WO00/30680 para los correspondientes detalles técnicos.

Además, la divulgación moléculas de unión a TDP-43, es decir, anticuerpos (p. ej., un fragmento de unión a TDP-43 de un anticuerpo) que muestran una o más propiedades del anticuerpo anti TDP-43 descritas en este documento. Por ejemplo, dichos anticuerpos se pueden analizar para determinar su especificidad y afinidad de unión mediante, por ejemplo, ELISA o transferencia de tipo Western, e inmunohistoquímica como se describe en este documento; véase, por ejemplo, los Ejemplos. Como se divulga en el ejemplo 2, la semiconcentración máxima eficaz (CE⁵⁰) de NI-205.41D1 y Nl-205.14W3, se determinó para el TDP-43 humano mediante ELISA directo para unir el TDP-43 humano con una afinidad elevada a una CE⁵⁰ (0,18-17,2 nM) sub-med, nanomolar.

Como alternativa a la obtención de inmunoglobulinas directamente del cultivo de linfocitos B inmortalizados o linfocitos B de memoria, las células inmortalizadas se pueden usar como fuente de loci reorganizados de cadenas pesadas y cadenas ligeras para su posterior expresión y/o manipulación genética. Los genes de anticuerpos reorganizados se pueden someter a transcripción inversa a partir de ARNm adecuados para producir ADNc. Si se desea, la región constante de la cadena pesada se puede intercambiar por la de un isotipo diferente o eliminar completamente. Las regiones variables se pueden unir para codificar regiones Fv de cadena sencilla. Múltiples regiones Fv se pueden unir para conferir capacidad de unión a más de una diana o se pueden usar combinaciones de cadenas pesadas y ligeras quiméricas. Una vez que está disponible el material genético, el diseño de análogos que conservan la capacidad de unirse a una diana deseada es directo. Los procedimientos para clonar las regiones variables del antcuerpo y la generación de los anticuerpos recombinantes se conocen en la técnica y se describen en, por ejemplo, Gilliland et al., Tissue Antigens 47 (1996), 1-20; Doenecke et al.., Leukemia 11 (1997), 1787-1792.

Una vez que se obtiene el material genérico adecuado y, si se desea, se ha modificado para codificar un análogo, las secuencias de codificación, incluidas las que codifican, como mínimo, las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras, se pueden insertar en sistemas de expresión contenidos en vectores que se pueden transfectar en células huésped recombinantes estándar. Se pueden usar diversas de estas células huésped; no obstante, para un procesamiento eficiente se pueden considerar las células de mamífero. Entre las líneas celulares de mamífero útiles para este fin se incluyen, a título enunciativo, células CHO, células HEK 293 o células NSO.

La producción del anticuerpo o análogo se lleva a cabo después cultivando el huésped recombinante modificado en condiciones de cultivo adecuadas para el crecimiento de las células huésped y la expresión de las secuencias de codificación. Después, los anticuerpos se recuperan mediante su aislamiento del cultivo. Los sistemas de expresión están diseñados para incluir péptidos señal para que los anticuerpos resultantes se secreten en el medio; no obstante, también es posible la producción intracelular.

De acuerdo con lo anterior, la invención también se refiere a un polinucléotido que codifica el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la invención. En una realización, el polinucleótido codifica al menos ambas regiones variables del anticuerpo descrito anteriormente. Normalmente, dicha región variable codificada por el polinucleótido comprende las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de las V^h y/o V^l de la región variable de dicho anticuerpo.

El experto en la técnica apreciará fácilmente que el domino variable del anticuerpo que tiene el dominio variable descrito anteriormente se puede usar para la construcción de otros polipéptidos o anticuerpos de especificidad y de función biológica deseadas. Como generalmente se entiende en la técnica, la afinidad de unión se puede potenciar realizando sustituciones de aminoácidos dentro de las CDR o dentro de los bucles hipervariables (Chothia y Lesk, J. MoL Biol. 196 (1987), 901-917) que parcialmente solapan con las CDR como define Kabat; véase, por ejemplo, Riechmann, et al., Nature 332 (1988), 323-327. El anticuerpo de la invención comprende en ambas de sus cadenas de inmunoglobulina las tres CDR de las regiones variables, como se expone en las Figuras 3A y 3Q.

Las moléculas de unión, es decir anticuerpos (incluyendo fragmentos de unión a antígeno, variantes o derivados de los mismos) de la invención, pueden comprender una región constante que participa en una o más funciones efectoras. Por ejemplo, la unión del componente C1 del complemento a una región constante del anticuerpo puede activar el sistema del complemento. La activación del complemento es importante en la opsonización y la lisis de patógenos celulares. La activación del complemento también estimula la respuesta inflamatoria y también puede estar implicada en la hipersensibilidad autoinmunitaria. Además, los anticuerpos se unen a los receptores sobre varias células mediante la región Fc, con un sitio de unión al receptor de Fc en la región Fc del anticuerpo que se une a un receptor de Fc (FcR) sobre una célula. Existe una serie de receptores de Fc que son específicos de diferentes clases de anticuerpos, incluyendo IgG (receptores gamma), IgE (receptores épsilon), IgA (receptores alfa) e IgM (receptores mu). La unión de los anticuerpos a los receptores de Fc sobre las superficies celulares desencadena una serie de importantes y diversas respuestas biológicas incluyendo engullido y destrucción de las partículas recubiertas de anticuerpos, eliminación de complejos inmunitarios, lisis de células diana recubiertas por anticuerpos por las células asesinas (denominada citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos o ADCC), liberación de mediadores inflamatorios, transferencia placentaria y control de la producción de inmunoglobulinas.

De acuerdo con lo anterior, determinadas realizaciones de la invención pueden incluir un anticuerpo (incluyendo un fragmento de anticuerpo de unión a antígeno), en el que al menos una fracción de uno o más de los dominios de la región constante se ha sustituido, delecionado o alterado de otro modo para proporcionar características bioquímicas deseadas tales como funciones efectoras reducidas, capacidad para dimerizar no covalentemente, incremento de la capacidad para localizar en el sitio de agregación y depósito de TDP-43, reducción de la semivida en suero o incremento de la semivida en suero cuando se compara con un anticuerpo entero sin alterar de aproximadamente la misma inmunogenicidad. Por ejemplo, determinados anticuerpos para uso en los procedimientos diagnósticos y terapéuticos descritos en este documento son anticuerpos con un dominio delecionado que comprenden una cadena polipeptídica similar a una cadena pesada de inmunoglobulina, pero que carecen de al menos una porción de uno o más dominios de la cadena pesada. Por ejemplo, puede eliminarse un dominio completo de la región constante del anticuerpo modificado, tal como, todo o parte del dominio CH2. Como alternativa, los anticuerpos divulgados en el presente documento útiles, por ejemplo, en procedimientos diagnósticos o terapéuticos, tienen una región constante, por ejemplo, una región constante de la cadena pesada de IgG, que está alterada para eliminar la glucosilación, denominado en otros lugares de este documento anticuerpos aglucosilados o “aglu”. Dichos anticuerpos “aglu” se pueden preparar enzimáticamente o mediante otras técnicas conocidas en la materia, incluyendo, por ejemplo, ingeniería del o los sitios de glucosilación consenso en la región constante. Aunque sin desear quedar anclado por teoría alguna, se cree que los anticuerpos “aglu” pueden tener un perfil mejorado de seguridad y estabilidad in vivo. Procedimientos para producir anticuerpos aglucosilados que tengan la función efectora deseada se encuentran en, por ejemplo, la publicación de solicitud de patente internacional n.° WO2005/018572.

En determinados anticuerpos, incluyendo fragmentos de anticuerpo de unión a antígeno y variantes descritas en este documento, la porción Fc se puede mutar para disminuir la fundón efectora usando técnicas conocidas en la materia. Por ejemplo, la deleción o inactivación (mediante mutaciones puntuales u otros medios) de un dominio de la región constante pueden reducir la unión al receptor de FC del anticuerpo modificado circulante, de modo que se incrementa la localización de TDP-43. En otros casos, puede ser que las modificaciones de la región constante consistentes con esta invención moderan la unión del complemento y, por tanto, reducen la semida en suero y la asociación inespecífica de una citotoxina conjugada. Otras modificaciones más de la región constante se pueden usar para modificar los enlaces disulfuro o los restos oligosacáridos que permiten potenciar la localización debido a un incremento de la especificidad por el antígeno o de la flexibilidad del anticuerpo. El perfil fisiológico resultante, la biodisponibilidad y otros efectos bioquímicos de las modificaciones, tales como la localización de TDP-43, la biodistribución y la semivida en suero, se pueden medir de forma rutinaria usando técnicas conocidas en la materia.

En determinados anticuerpos, la porción Fc pueden mutarse o intercambiarse por secuencias proteicas alternativas para aumentar la captación celular de los anticuerpos a modo de ejemplo, potenciar la endocitosis mediada por receptor de los anticuerpos a través de los receptores Fcy, LRP o receptores Thy1 o mediante “Tecnología de Superanticuerpos”, que se dice que permite transportar los anticuerpos en el interior de las células vivas sin dañarlas (Mullet, S., et al., Expert Opin. Biol. Ther. (2005), 237 - 241). Por ejemplo, la generación de proteínas de fusión de la región de unión al anticuerpo y los ligandos proteicos afines de los receptores de la superficie celular o anticuerpos biespecíficos o multiespecíficos con secuencias específicas de unión a TDP-43, así como un receptor de superficie celular se pueden modificar mediante ingeniería usando técnicas conocidas en la materia.

En determinadas realizaciones, incluyendo fragmentos de anticuerpo de unión a antígeno y variantes descritos en este documento, la porción Fc se puede mutar o intercambiar por secuencias proteicas alternativas o el anticuerpo se puede modificar químicamente para aumentar su penetración en la barrera hematoencefálica.

Los fragmentos de unión a antígeno de los anticuerpos de la invención se pueden fabricar a partir de anticuerpos enteros precursores o parentales usando técnicas conocidas en la materia. Ejemplos de técnicas se tratan con más detalle en este documento. Los anticuerpos de la invención, incluyendo fragmentos de anticuerpo de unión a antígeno y variantes descritos en este documento, se pueden fabricar o preparar de forma rutinaria usando técnicas conocidas en la materia. Los anticuerpos (incluyendo fragmento de unión a antígeno de estos) de la invención se pueden “producir de forma recombinante”, es decir se pueden producir usando tecnología de ADN recombinante. Técnicas de ejemplo para fabricar anticuerpos se tratan con más detalle en otro lugar en este documento.

Los anticuerpos (incluyendo los fragmentos de unión a antígeno de los anticuerpos también incluyen modificaciones, por ejemplo mediante la unión covalente de cualquier tipo de molécula al anticuerpo de modo que la unión covalente no impida la unión específica del anticuerpo a su epítopo afín. Por ejemplo, las modificaciones pueden incluir, por ejemplo, glucosilación, acetilación, pegilación, fosforilación, amidación, derivación mediante grupos protectores/de bloqueo conocidos, escisión proteolítica, unión a un ligando celular u otra proteína etc. Cualquiera de las numerosas modificaciones químicas se puede llevar a cabo mediante técnicas conocidas, incluidas, entre otras, escisión química específica, acetilación, formilación, síntesis metabólica de tunicamicina etc. Además, el derivado puede contener uno o más aminoácidos no clásicos.

En realizaciones concretas, las moléculas de unión a TDP-43 de la invención, es decir anticuerpos (incluyendo fragmentos de unión a antígeno de los mismos) no provocan una respuesta inmunitaria perjudicial en el animal que se va a tratar, por ejemplo en un ser humano. En determinadas realizaciones, las moléculas de unión, es decir los anticuerpos (incluyendo los fragmentos de unión a antígeno de los anticuerpos) de la invención derivan de un paciente, por ejemplo un paciente humano y, posteriormente, se usa en la misma especie de la cual derivan, por ejemplo un ser humano, de modo que alivia o minimiza la aparición de respuestas inmunitarias perjudiciales.

La desinmunización también se puede usar para disminuir la inmunogenicidad de un anticuerpo. Como se usa en este documento, el término “desinmunización” incluye la alteración de un anticuerpo para modificar los epítopos de linfocitos T; véase, por ejemplo, las publicaciones de solicitud internacional N.° WO98/52976 y WO00/34317. Por ejemplo, las secuencias V^h y V^l del anticuerpo de partida se analizan y se crea un “mapa” de epítopo de linfocito T humano de cada región V que muestra la localización de epítopos en relación con las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) y otros residuos clave dentro de la secuencia. Los epítopos de linfocitos T individuales del mapa del epítopo de linfocitos T se analizan con el fin de identificar sustituciones de aminoácidos alternativas con un riesgo bajo de alterar la actividad del anticuerpo final. Se diseña una serie de secuencias de V^h y V^h alternativas que comprenden combinaciones de sustituciones de aminoácidos y estas secuencias se incorporan después en una serie de polipéptidos de unión, por ejemplo, anticuerpos específicos de TDP-43, incluyendo fragmentos inmunoespecíficos de los mismos, para uso en los procedimientos diagnósticos y terapéuticos divulgados en este documento, que después se analizan para determinar la función. Normalmente se generan y analizan entre 12 y 24 anticuerpos variantes. Después, se clonan los genes completos de las cadenas pesadas y ligeras que comprenden las regiones V modificadas y C humanas en vectores de expresión y los posteriores plásmidos se introducen en las líneas celulares para la producción del anticuerpo entero. Después, los anticuerpos se comparan en ensayos bioquímicos y biológicos adecuados y se identifica la variante óptima.

Los anticuerpos monoclonales se pueden preparar usando una amplia variedad de técnicas conocidas en la materia, incluido el uso de tecnologías de expresión en fagos, hibridoma y recombinante, o una combinación de las mismas. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales se pueden producir usando técnicas de hibridoma, incluidas las conocidas y enseñadas en la técnica, por ejemplo en Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a ed. (1988); Hammerling, et al.., en: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas Elsevier, N. Y., 563-681 (1981). La expresión “anticuerpo monoclonal” como se usa en la presente memoria, no está limitada a los anticuerpos producidos mediante la tecnología de hibridoma. La expresión “anticuerpo monoclonal” se refiere a un anticuerpo que deriva de un único clon aislado, incluido un clon eucariota, procariota o de fago, y no el procedimiento por el cual se produce. Por tanto, la expresión “anticuerpo monoclonal” no está limitada a los anticuerpos producidos mediante la tecnología de hibridoma. En determinadas realizaciones, los anticuerpos de la invención derivan de linfocitos B humanos que se han inmortalizado mediante transformación con el virus de Epstein-Barr, como se describe en este documento. Por claridad, la expresión "anticuerpo monoclonal" como se usa en este documento, no abarca un anticuerpo endógeno que se puede aislar del plasma de un organismo huésped.

En el proceso de hibridoma bien conocido (Kohler et al., Nature 256 (1975), 495), los linfocitos mortales, o de vida relativamente corta, de un mamífero, por ejemplo linfocitos B derivados de un sujeto humano como se describe en este documento, se condensan con una línea celular tumoral inmortal (p. ej., una línea celular de mieloma), de modo que se producen células híbridos o “hibridomas” que son inmortales y capaces de producir el anticuerpo codificado genéticamente del linfocito B. Los híbridos resultantes se segregan en cepas genéticas sencillas mediante selección, dilución y recrecimiento, comprendiendo cada cepa individual genes específicos para la formación de un anticuerpo sencillo. Los hibridomas seleccionados producen anticuerpos que son homogéneos contra un antígeno deseado y, en referencia a su linaje genético puro, se denominan “monoclonales”.

Las células de hibridoma preparadas de este modo se siembran y cultivan en un medio de cultivo adecuado que contiene una o más sustancias que inhiben el crecimiento o la supervivencia de las células de mieloma parentales sin condensar. Los reactivos, líneas celulares y procedimientos para formar, seleccionar y cultivar hibridomas se conocen en la técnica. Generalmente, el medio de cultivo en el que crecen las células de hibridoma se analiza para determinar la producción de anticuerpos monoclonales contra el antígeno deseado. La especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales producidos por las células de hibridoma se determina mediante ensayos in vitro tales como inmunoprecipitación, radioinmunoensayo (RIA) o ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), como se describe en este documento. Después de identificar las células de hibridoma que producen anticuerpos de la especificidad, afinidad y/o actividad deseadas, los clones se subclonan mediante procedimientos de dilución límite y se cultivan mediante procedimientos estándar; véase, por ejemplo, Coding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, Academic Press, pág. 59-103 (1986). También se apreciará que los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones de hibridoma se pueden separar del medio de cultivo, fluido ascítico o suero mediante procedimientos de purificación convencionales, tales como, por ejemplo, proteína A, cromatografía en hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis o cromatografía de afinidad.

Los linfocitos se pueden seleccionar mediante micromanipulación y se aíslan los genes variables. Por ejemplo, las células mononucleares de sangre periférica se pueden aislar de un mamífero inmunizado o inmune de forma natural, por ejemplo, un ser humano, y cultivar durante aproximadamente 7 días in Vitro. Después, los cultivos de PBMC se someten a detección selectiva de IgG específicas que cumplen los criterios de selección y se aíslan las células de los pocillos positivos. Los linfocitos B productores de Ig individuales se pueden aislar mediante FACS o identificándolos en un ensayo en placa hemolítica mediada por el complemento. Los linfocitos B productores de Ig se pueden micromanipular en un tubo y los genes de V^h y V^l se pueden amplificar usando, por ejemplo, PCR-RT. Los genes de V^h y V^l se pueden clonar en un vector de expresión de anticuerpos y transfectar en las células (p. ej., células eucariotas o procariotas) para su expresión.

Como alternativa, las líneas celulares productoras de anticuerpos se pueden seleccionar y cultivar usando o modificando de forma rutinaria las técnicas conocidas en la materia. Dichas técnicas se describen en varios manuales de laboratorio y publicaciones primarias. A este respecto, las técnicas adecuadas, las técnicas adecuadas para usar en la invención como se describe más adelante se describen en Current Protocols in Immunology, Coligan et al., Eds., Green Publishing Associates and Wiley- Interscience, John Wiley and Sons, Nueva York (1991).

Los fragmentos de anticuerpo que reconocen antígenos y/o epítopos se pueden generar usando técnicas conocidas en la materia. Por ejemplo, se pueden producir fragmentos Fab y F(ab')2 de forma recombinante o mediante escisión proteolítica de moléculas de inmunoglobulina, usando enzimas tales como papaína (para producir fragmentos Fab) o pepsina (para producir fragmentos F(ab')2). Los fragmentos F(ab')2 contienen la región variable, la región constante de la cadena ligera y el dominio CH1 de la cadena pesada. Dichos fragmentos son suficientes para usar, por ejemplo, en procedimientos inmunodiagnósticos que implican acoplamiento de las porciones inmunoespecíficas de inmunoglobulinas para detectar reactivos tales como radioisótopos.

Los anticuerpos completamente humanos, tales como los descritos en este documento, son particularmente deseables para tratamiento terapéutico de pacientes humanos. Los anticuerpos humanos de la invención se aíslan de, por ejemplo, sujetos sanos ancianos que, debido a su edad, se puede sospechar que están en riesgo de desarrollar un trastorno, por ejemplo esclerosis lateral amiotrófica y/o degeneración lobular frontotemporal o un paciente con el trastorno pero con una evolución de la enfermedad inusualmente estable. No obstante, aunque es prudente esperar que los sujetos ancianos sanos y sin síntomas, respectivamente, habrán desarrollado anticuerpos protectores anti-TDP-43 con más regularidad que los sujetos sanos, estos últimos se pueden usar también como fuente para obtener un anticuerpo humano de la invención. Esto es particularmente cierto para los pacientes más jóvenes que están predispuestos a desarrollar una forma familiar de unas proteinopatías de TDP-43 pero permanecen sin síntomas, ya que su sistema inmunitario y la respuesta inmunitaria funcionan más eficientemente que en adultos mayores.

Los anticuerpos de la invención se pueden producir por cualquier procedimiento conocido en la técnica para la síntesis de anticuerpos, incluyendo, en particular, síntesis química o técnicas de expresión recombinante, como se describe en este documento.

Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo puede comprender una región constante sintética en la que uno o más dominios se eliminan parcial o completamente (“anticuerpos con deleción de dominio”). Determinados anticuerpos pueden comprender construcciones de dominio delecionado o variantes en las que la totalidad del dominio CH2 se ha eliminado (construcciones ACH2). Como alternativa, un corto péptido de conexión puede sustituir al dominio delecionado para proporcionar flexibilidad y libertad de movimientos para la región variable. Los expertos en la técnica apreciarán que dichas construcciones pueden ser deseables debido a las propiedades reguladoras del dominio ^c H2 sobre la tasa catabólica del anticuerpo. Las construcciones con dominio delecionado se pueden derivar usando un vector que codifica un dominio constante humano de IgGi; véase, por ejemplo, las solicitudes internacionales WO02/060955 y WO02/096948A2. Este vector se modifica mediante ingeniería para eliminar el dominio CH2 y proporcionar un vector sintético que expresa una región constante de IgGi con deleción de dominio.

Los anticuerpos (incluyendo fragmentos de unión a antígeno de los mismos) también pueden ser minicuerpos. Los minicuerpos se pueden realizar usando procedimientos conocidos en la técnica; véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. N.° 5.837.821 o la publicación de solicitud internacional n.° WO 94/09817.

Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo puede comprender una cadena pesada de inmunoglobulina que tiene deleción o sustitución de unos pocos o incluso de un único aminoácido, siempre que permita la asociación entre las subunidades monoméricas. Por ejemplo, la mutación de un único aminoácido en áreas seleccionadas del dominio CH2 puede ser suficiente para reducir sustancialmente la unión a Fc y, de este modo, incrementar la localización de TDP-43. De un modo similar, puede ser deseable simplemente delecionar la parte de uno o más dominios de la región constante que controla la modulación de la función efectora (p. ej., la unión al complemento). Dichas deleciones parciales de las regiones constantes pueden mejorar características seleccionadas del anticuerpo (semivida en suero) dejando otras funciones deseadas asociadas al dominio intacto de la región constante del sujeto. Además, como se ha indicado anteriormente, las regiones constantes de los anticuerpos divulgados pueden sintetizarse mediante la mutación o sustitución de uno o más aminoácidos que potencia el perfil de la construcción resultante. A este respecto, puede ser posible alterar la actividad proporcionada mediante un sitio de unión conservado (p. ej., unión a Fc) al tiempo que mantienen sustancialmente la configuración y el perfil inmunogénico del anticuerpo modificado. La adición de uno o más aminoácidos a la región constante se puede usar para potenciar las características deseables tales como la función efectora o proporcionar más citotoxina o unión del carbohidrato. También puede ser deseable insertar o replicar secuencias específicas derivadas de dominios de región constante seleccionados.

Se pueden usar técnicas estándar conocidas por los expertos en la materia para introducir mutaciones en la secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo, incluyendo, a título enunciativo, mutagénesis dirigida a sitio y mutagénesis mediada por PCR, que tienen como resultado sustituciones de aminoácidos. Una “sustitución conservadora de aminoácido” es una en la que el residuo de aminoácido está sustituido por otro residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral con una carga similar. En la técnica se han definido familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales con cargas similares. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (p. ej., lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (p. ej., ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares sin carga (p. ej., glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (p. ej., alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales ramificadas beta (p. ej., treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (p. ej., tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Como alternativa, se pueden introducir mutaciones aleatorias a lo largo de toda o parte de la secuencia codificadora, tal como mediante mutagénesis por saturación, y los mutantes resultantes se pueden someter a detección selectiva según la actividad biológica para identificar mutantes que conserven actividad (p. ej., la capacidad para unirse a TDP-43).

Por ejemplo, es posible introducir mutaciones únicamente en las regiones estructurales o únicamente en las regiones CDR de un anticuerpo. Las mutaciones introducidas pueden ser silenciosas o mutaciones neutras de sentido erróneo, por ejemplo que tienen ninguno, o poco efecto, sobre la capacidad del anticuerpo para unirse al antígeno, de hecho algunas de estas mutaciones no alteran la secuencia de aminoácidos de ningún modo. Estos tipos de mutaciones pueden ser útiles para optimizar el uso de codones o mejorar la producción de anticuerpos de un hibridoma. Como alternativa, las mutaciones no neutras de sentido erróneo pueden alterar la capacidad de un anticuerpo para unirse a un antígeno. Es probable que la localización de la mayoría de las mutaciones silenciosas o neutras de sentido erróneo sea en las regiones estructurales, mientras que es probable que la localización de la mayoría de las mutaciones no neutras de sentido erróneo sea en las CDR, aunque esto no es un requisito absoluto. Un experto en la técnica puede diseñar y analizar moléculas alteradas para determinar las propiedades deseadas, incluyendo, por ejemplo, mejoras en la actividad de unión a antígeno o cambios en la especificidad del anticuerpo. Tras la mutagénesis, las proteínas que muestran las propiedades deseadas pueden expresarse de forma rutinaria y/o la actividad biológica de la proteína codificada (p. ej., la capacidad para unirse inmunoespecíficamente a al menos un epítopo de TDP-43) se puede determinar usando o modificando de forma rutinaria las técnicas conocidas en la materia.

Los anticuerpos anti-TDP-43 de esta invención se pueden caracterizar usando cualquier modelo in vivo o in vitro de proteinopatías de TDP-43. Un experto en la técnica entiende fácilmente que un anticuerpo anti-TDP-43 de la invención se puede caracterizar en un modelo de ratón para proteinopatías de TDP-43, por ejemplo, a título enunciativo, uno cualquiera de los modelos animales para proteinopatías de TDP-43 descritas en el ejemplo 5. Wegorzewska et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (2009), 18809-14; Gurney et al., Science 264 (1994), 1772-75; Shan et al., Neuropharmacol. Letters 458 (2009), 70-74; Wils et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106 (2010), 3858-63; Duchen y Strich, J. Neurol. Neurosurg, Psychiatry 31 (1968), 535-42; Dennis y Citron, Neuroscience 185 (2009), 745-50; Swamp et al., Brain 134 (2011), 2610-2626; Igaz et al., J Clin invest. 121(2): 726-38 (2011); Caccamo et al. Am J Pathol. 180(1): 293-302 (2012), Cannon et al., Acta Neuropathol. 123(6): 807-23 (2012), Custer et al., Hum Mol Genet. 19(9): 1741-55 (2010): y Tatom et al., Mol Ther. 17 (2009), 607-613.

Un experto en la técnica entiende que un modelo experimental de proteinopatía de TDP-43 se puede usar en un contexto preventivo o se puede usar en un contexto terapéutico. En un contexto preventivo, la dosificación de los animales comienza antes del inicio de la proteinopatía de TDP-43 o síntomas de la misma. En contextos preventivos, un anticuerpo anti-TDP-43 de la invención se evalúa para determinar su capacidad para prevenir, reducir o retrasar el inicio de la proteinopatía de TDP-43 o síntomas de la misma. En un contexto terapéutico, la dosificación de los animales comienza después del inicio de la proteinopatía de TDP-43 o síntomas de la misma. En un contexto terapéutico, un anticuerpo anti-TDP-43 de la invención se evalúa para determinar su capacidad para tratar, reducir o aliviar la proteinopatía de TDP-43 o un síntoma de la misma. Los síntomas de las proteinopatías de TDP-43 incluyen, a título enunciativo, acumulación de depósitos de TDP-43 patológicos, distribución de TDP-43 patológica, TDP-43 fosforilado o fracciones de TDP-43 insolubles en las neuronas, cerebro, médula espinal, líquido cefalorraquídeo o suero del objeto experimental. Un experto en la técnica entiende que un resultado preventivo o terapéutico positivo en cualquier modelo animal de proteinopatías de TDP-43 indica que el anticuerpo anti-TDP-43 concreto se puede usar para fines preventivos o terapéuticos en un sujeto distinto al organismo del modelo experimental, por ejemplo, se puede usar para tratar las proteinopatías de TDP-43 en un sujeto humano que lo necesite.

En una realización, un anticuerpo anti-TDP-43 de la invención se puede administrar a un modelo de ratón de proteinopatía de TDP-43 y los correspondientes ratones salvajes control. El anticuerpo administrado puede ser un anticuerpo murinizado de esta invención o una quimera humana-murina de un anticuerpo de esta invención. El anticuerpo anti-TDP-43 se puede administrar por cualquier medio conocido en la materia, por ejemplo, mediante administración intraperitoneal, intracraneal, intramuscular, intravenosa, subcutánea, oral y en aerosol. Se puede administrar a los animales experimentales una, dos, tres, cuatro, cinco o más dosis del anticuerpo anti-TDP-43 o una composición control, tal como PBS. En una realización, se administrará a los animales experimentales una o dos dosis de un anticuerpo anti-TDP-43. En otra realización, los animales reciben dosis crónicamente del anticuerpo anti-TDP-43 durante varias semanas o meses. Un experto en la técnica puede diseñar fácilmente un régimen de dosificación que encaje en el propósito experimental, por ejemplo un régimen de dosificación para estudios agudos, régimen de dosificación para estudios crónicos, régimen de dosificación para estudios de toxicidad, régimen de dosificación para estudios preventivos o terapéuticos. La presencia del anticuerpo anti-TDP-43 en un compartimento tisular concreto de los animales experimentales, por ejemplo, a título enunciativo, suero, sangre, líquido cefalorraquídeo, tejido cerebral, se puede establecer usando procedimientos bien conocidos en la materia. En una realización, un anticuerpo anti-TDP-43 de la invención puede atravesar la barrera hematoencefálica. En otra realización, un anticuerpo anti-TDP-43 de la invención puede entrar en las neuronas. Un experto en la técnica entiende que ajustando la dosis del anticuerpo anti-TDP-43 y la frecuencia de dosificación, una concentración deseada del anticuerpo anti-TDP-43 se puede mantener en los animales experimentales. Cualquier efecto de un anticuerpo anti-TDP-43 de esta invención en los modelos de proteinopatía de TDP-43 se puede evaluar comparando el nivel, las características bioquímicas o la distribución de TDP-43 en los animales tratados y control. En una realización, un anticuerpo de esta invención puede reducir el nivel, la cantidad o la concentración de las inclusiones de TDP-43 en el cerebro o la médula espinal en un modelo animal. El anticuerpo puede reducir el nivel, la cantidad o la concentración de las inclusiones de TDP-43 en al menos aproximadamente un 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 50 %, 70 %, 90 % o más. En otra realización, un anticuerpo de esta invención puede reducir el número o la frecuencia de neuronas positivas a inclusiones de TDP-43 en el cerebro o la médula espinal en un modelo animal, por ejemplo, en al menos aproximadamente un 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 50 %, 70 %, 90 % o más. El efecto de un anticuerpo de esta invención también se puede evaluar examinando la distribución y las propiedades bioquímicas de TDP-43 tras la administración del anticuerpo. En una realización, un anticuerpo de esta invención puede reducir la cantidad o la concentración de la proteína TDP-43 citoplasmática en el cerebro o la médula espinal de un modelo animal, por ejemplo, en al menos aproximadamente un 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 50 %, 70 %, 90 % o más. En otra realización, un anticuerpo de esta invención puede reducir la cantidad o la concentración de la proteína TDP-43 neurítica en el cerebro o la médula espinal de un modelo animal, por ejemplo, en al menos aproximadamente un 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 50 %, 70 %, 90% o más. En una realización adicional, un anticuerpo de esta invención puede reducir la cantidad o la concentración de la proteína TDP-43 fosoforilada en el cerebro o la médula espinal en un modelo animal, por ejemplo, en al menos aproximadamente un 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 50 %, 70 %, 90 % o más. La TDP-43 fosforilada se puede detectar usando anticuerpos específicos de formas fosforiladas patológicamente de TDP-43, tales como p403/p404 y p409/p410. Hasegawa et al., Ann Neurol, 64(1): 60-70 (2008). Un anticuerpo de esta invención puede alterar, por ejemplo, reducir o aumentar la concentración de TDP-43 en sangre, suero o líquido cefalorraquídeo de un modelo animal en, por ejemplo, al menos aproximadamente 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 50 %, 70 %, 90 % o más. En una realización, el % de reducción o incremento es relativo en comparación con el nivel, el número, la frecuencia, la cantidad o la concentración que existía antes del tratamiento o con el nivel, el número, la frecuencia, la cantidad o la concentración que existía en un sujeto sin tratar/control tratado.

En una realización, un anticuerpo de esta invención puede prevenir o retrasar el inicio de al menos un síntoma de una proteinopatía de TDP-43 en un sujeto. En una realización, un anticuerpo de esta invención puede reducir o eliminar al menos un síntoma de una proteinopatía de TDP-43 en un sujeto. El síntoma puede ser la formación de depósitos patológicos de TDP-43, depósitos de TDP-43 fosforilada o depósitos de TDP-43 insolubles. El síntoma también puede ser la presencia, o la concentración o cantidad elevada, de TDP-43 en suero, sangre, orina o líquido cefalorraquídeo, en el que la concentración o cantidad elevada se compara con la de un sujeto sano. El síntoma puede ser un síntoma neurológico, por ejemplo, aversión al gusto condicionado alterado, acondicionamiento al miedo contextual alterado, deterioro de la memoria, pérdida de función motora. En una realización, el deterioro de la memoria se evalúa usando una tarea del laberinto Y de dos pruebas. En una realización, el al menos un síntoma se reduce en al menos aproximadamente un 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 30 %, 50 %, 70 % o 90 %. En otra realización, la proporción de la tarea del laberinto Y de dos pruebas es significativamente superior en un sujeto tratado con anticuerpos que en un sujeto control. En una realización específica, la proporción de la tarea del laberinto Y de dos pruebas aumenta en al menos aproximadamente un 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o 90 %. En otra realización, la proporción de la tarea del laberinto Y de dos pruebas es de al menos aproximadamente dos veces, tres veces, cuatro veces, cinco veces, diez veces o veinte veces mayor. Esta invención también proporciona un procedimiento de prevenir o retrasar el inicio de al menos un síntoma de una proteinopatía de TDP-43 en un sujeto que lo necesite, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo anti-TDP-43 descrito en este documento. La presente invención también proporciona un procedimiento de reducir o eliminar el inicio de al menos un síntoma de una proteinopatía de TDP-43 en un sujeto que lo necesite, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo anti-TDP-43 descrito en este documento. En una realización, el sujeto es un organismo experimental tal como, a título enunciativo, un ratón transgénico. En una realización, el sujeto es un ser humano.

III. Polinucleótidos que codifican anticuerpos

Un polinucleótido que codifica un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo puede estar compuesto por cualquier polirribonucleótido o polidesoxirribonucléotido, que puede ser ARN o ADN sin modificar o ARN o ADN modificado. Por ejemplo, un polinucleótido que codifica un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo puede estar compuesto por ADN mono y bicatenario, ADN que es una mezcla de regiones mono y bicatenarias, ARN mono y bicatenario y ARN que es una mezcla de regiones mono y bicatenarias, moléculas híbridas que comprenden ADN y ARN que puede ser monocatenario o, más típicamente, bicatenario, o una mezcla de regiones mono y bicatenarias. Además, un polinucleótido que codifica un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo puede estar compuesto por regiones de triple hebra que comprenden ARN o ADN o tanto ARN como ADN. Un polinucleótido que codifica un anticuerpo (incluyendo un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo, o una variante o derivado del mismo) también puede contener una o más bases modificadas o estructuras de ADN o ARN modificadas por estabilidad o por otras razones. Bases “modificadas” incluyen, por ejemplo, bases tritiladas y bases inusuales tales como inosina. Se pueden realizar diversas modificaciones al ADN y al ARN; por tanto, “polinucleótido” abarca formas modificadas química, enzimática o metabólicamente.

Un polinucleótido aislado que codifica una variante no natural de un polipéptido derivado de una inmunoglobulina (p. ej., una porción de la cadena pesada de inmunoglobulina o porción de la cadena ligera) se puede crear introduciendo una o más sustituciones, adiciones o deleciones de nucleótidos en la secuencia de nucleótidos que codifican la inmunoglobulina, de un modo tal que se introducen en la proteína codificada una o más sustituciones, adiciones o deleciones de aminoácidos. Las mutaciones se pueden introducir a través de técnicas estándar, tales como mutagénesis dirigida a un sitio y mutagénesis mediada por PCR. En una realización, las sustituciones conservadoras de aminoácidos se realizan en una o más posiciones de residuos de aminoácidos que no son esenciales.

El ARN se puede aislar de los linfocitos B originales, de células de hibridoma o de otras células transformadas mediante técnicas estándar, tales como extracción con isotiocianato de guanidinio y precipitación seguida de centrifugación o cromatografía. Cuando sea deseable se puede aislar el ARNm del ARN total usando técnicas estándar tales como cromatografía en oligo dT celulosa. Las técnicas adecuadas son familiares en la materia. En una realización, los ADNc que codifican las cadenas ligera y pesada del anticuerpo se pueden fabricar, simultánea o por separado, usando transcriptasa inversa y ADN polimerasa de acuerdo con procedimientos conocidos. La PCR se puede iniciar mediante cebadores de la región constante consenso o mediante cebadores más específicos basados en las secuencias de aminoácido y de ADN de las cadenas pesadas y ligeras publicadas. Como se ha tratado anteriormente, la PCR también se puede usar para aislar clones de ADN que codifican las cadenas ligeras y pesadas del anticuerpo. En este caso, las bibliotecas se pueden someter a detección selectiva con cebadores consenso o sondas homólogas más grandes, tales como sondas de la región constante humana.

El ADN, típicamente ADN plasmídico, se puede aislar de las células usando técnicas conocidas en la materia, se puede mapear con enzimas de restricción y secuenciar de acuerdo con técnicas conocidas estándar establecidas con detalle en, por ejemplo, las referencias anteriores en relación con técnicas de ADN recombinante. Por supuesto, el ADN puede ser sintético de acuerdo con la invención en cualquier momento durante el proceso de aislamiento o el posterior análisis.

De acuerdo con la invención, el polinucleótido comprende, consiste esencialmente en o consiste en un ácido nucleico que tiene una secuencia de polinucleótidos de la región V^h o V^l de un anticuerpo de unión a TDP-43 como se indica en la Tabla 3. A este respecto, un experto en la materia apreciará fácilmente que los polinucleótidos que codifican al menos el dominio variable de la cadena ligera y/o pesada puede codificar el dominio variable de ambas cadenas de inmunoglobulina o de solo uno.

T l : n i D n l i l r i n V V ni r ífi TDP-4

Además, los polinucleótidos que codifican los polinucleótidos de fusión, los fragmentos de Fab y otros derivados, como se describen en este documento, también están abarcados por la descripción.

Los polinucleótidos se pueden producir o fabricar mediante cualquier procedimiento adecuado conocido en la técnica. Por ejemplo, si se conoce la secuencia de nucleótidos del anticuerpo, un polinucleótido que codifica el anticuerpo se puede ensamblar a partir de oligonucleótidos sintetizados químicamente, por ejemplo, como se ha descrito en Kutmeier et al., BioTechniques 17 (1994), 242, que, brevemente, implica la síntesis de oligonucleótidos solapantes que contienen porciones de la secuencia que codifica el anticuerpo, la hibridación y la unión de dichos oligonucleótidos y, después, la amplificación de los oligonucleótidos ligados mediante PCR.

Como alternativa, un polinucleótido que codifica un anticuerpo (incluyendo un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo o una variante o derivado del mismo) se puede generar a partir de ácido nucleico de una fuente adecuada. Si no se dispone de un clon que contenga un ácido nucleico que codifica un anticuerpo concreto, pero se conoce la secuencia de la molécula del anticuerpo, un ácido nucleico que codifica el anticuerpo puede sintetizarse químicamente u obtenerse a partir de una fuente adecuada (p. ej., una biblioteca de ADNc de anticuerpos o una biblioteca de ADNc generada a partir de, o un ácido nucleico, preferentemente ARN poliA+, aislado de, cualquier tejido o célula que exprese el anticuerpo específico de TDP-43, tales como células de hibridoma seleccionadas para expresar un anticuerpo) mediante amplificación por PCR usando cebadores sintéticos que pueden hibridar con los extremos 3' y 5' de la secuencia o mediante clonación usando una sonda oligonucleotídica específica de la secuencia génica concreta para identificar, por ejemplo, un clon de ADNc de una biblioteca de ADNc que codifica el anticuerpo. A continuación, los ácidos nucleicos amplificados generados mediante PCR se pueden clonar en vectores de clonación replicables usando cualquier procedimiento bien conocido en la técnica.

Una vez que se ha determinado la secuencia de nucleótidos y la correspondiente secuencia de aminoácidos del anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo, su secuencia de nucleótidos se puede manipular usando procedimientos conocidos en la técnica para la manipulación de secuencias de nucleótidos, por ejemplo técnicas de ADN recombinante, mutagénesis dirigida a sitio, PCR, etc. (véase, por ejemplo, las técnicas descritas en Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990); y Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1998) ), para generar anticuerpos que tienen una secuencia de aminoácidos diferente, por ejemplo para crear sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácidos.

IV. Expresión de polipéptidos de anticuerpos

Tras la manipulación del material genético aislado para proporcionar un anticuerpo (incluyendo un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo, o variante o derivado del mismo) de la invención, el polinucleótido que codifica el anticuerpo típicamente se inserta en un vector de expresión para la introducción en células huésped que se pueden usar para producir la cantidad deseada de anticuerpo. La expresión recombinante de un anticuerpo, o fragmento, derivado o análogo del mismo, por ejemplo, una cadena pesada o ligera de un anticuerpo que se une a una molécula diana se describe en este documento. Una vez que se ha obtenido un polinucleótido que codifica un anticuerpo o una cadena pesada y ligera de un anticuerpo, o una porción del mismo que contiene el dominio variable de la cadena pesada y ligera, de la invención, el vector para la producción de un anticuerpo se puede producir mediante tecnología de ADN recombinante usando técnicas bien conocidas en la técnica. Por tanto, en este documento se describen procedimientos para preparar una proteína mediante la expresión de un polinucleótido que contiene una secuencia nucleotídica que codifica un anticuerpo. Se pueden usar procedimientos bien conocidos por los expertos en la técnica para construir vectores de expresión que contengan secuencias que codifican anticuerpos y las señales adecuadas de control de la transcripción y la traducción. Estos procedimientos incluyen, por ejemplo, técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas sintéticas y recombinación genética in vivo. Por tanto, la invención proporciona vectores replicables que comprenden una secuencia nucleotídica que codifica un anticuerpo de la invención o una cadena pesada o ligera del mismo, o un dominio variable de cadena pesada y ligera, operablemente unida a un promotor. Dichos vectores pueden incluir la secuencia de nucleótidos que codifica la región constante del anticuerpo (véase, por ejemplo, la publicación de solicitud internacional n.° WO 86/05807 y la patente de EE.UU. n.° 5.122.464) y el dominio variable del anticuerpo pueden clonarse en dicho vector para la expresión de la cadena pesada y la cadena ligera completas.

El término “vector” o “vector de expresión” se usa en este documento para indicar los vectores usados de acuerdo con la invención como vehículo para introducir y expresar un gen deseado en una célula huésped. Como se sabe en la técnica, dichos vectores se pueden seleccionar fácilmente del grupo que consiste en plásmidos, fagos, virus y retrovirus. En general, los vectores compatibles con esta invención comprenderán un marcador de selección, sitios de restricción adecuados para facilitar la clonación del gen deseado y la capacidad para entrar y/o replicarse en células eucariotas o procariotas. Numerosos sistemas de vectores de expresión se pueden usar para los fines de esta invención. Por ejemplo, una clase de vector usa elementos de ADN que derivan de virus animales, tales como el virus del papiloma bovino, el virus del polioma, adenovirus, virus vacunal, baculovirus, retrovirus (RSV, MMTV o MOMLV) o virus SV40. Otros implican el uso de sistemas policistrónicos con sitios internos de unión al ribosoma. Además, las células que tienen integrado el ADN en sus cromosomas se pueden seleccionar introduciendo uno o más marcadores que permitan la selección de las células huésped transfectadas. El marcador puede proporcionar prototrofia a un huésped auxotrófico, resistencia a biocidas (p. ej., antibióticos) o resistencia a metales pesados como el cobre. El gen marcador seleccionable puede estar directamente unido a las secuencias de ADN que se van a expresar o introducir en la misma célula mediante cotransformación. También pueden ser necesarios elementos adicionales para la síntesis óptima de ARNm. Estos elementos pueden incluir secuencias señal, señales de corte y empalme, así como promotores de la transcripción, potenciadores y señales de terminación.

En realizaciones concretas, los genes de la región variable clonados se insertan en un vector de expresión junto con las secuencias de codificación de la región constante de las cadenas pesada y ligera (p. ej., genes de la región constante de las cadenas pesadas o ligeras humanas) como se ha tratado anteriormente. En una realización, esto se efectúa usando un vector de expresión patentado de Biogen IDEC, Inc., denominado NEOSPLA, divulgado en la patente de EE.UU. N.° 6.159.730. Este vector contiene el promotor/potenciador del citomegalovirus, el promotor principal de la beta globina de ratón, el origen de replicación de SV40, la secuencia de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina, el exón 1 y el exón 2 de la neomicina fosfotransferasa, el gen de la dihidrofolato reductasa y la secuencia líder. Se ha encontrado que este vector tiene como resultado un nivel de expresión de anticuerpos muy alto tras la incorporación de genes de las regiones variables y constantes, transfección en células CHO, seguido de la selección en G418 que contiene medio y amplificación con metotrexato. Por supuesto, cualquier vector de expresión que sea capaz de provocar la expresión en células eucariotas se puede usar en la invención. Ejemplos de vectores adecuados incluyen, a título enunciativo, los plásmidos pcDNA3, pHCMV/Zeo, pCR3,1, pEFl/His, pIND/GS, pRc/HCMV2, pSV40/Zeo2, pTRACER-HCMV, pUB6/V5-His, pVAXl y pZeoSV2 (disponibles en Invitrogen, San Diego, CA), y el plásmido pCI (disponible en Promega, Madison, WI). En general, la detección selectiva de grandes números de células transformadas para encontrar las que expresan niveles altos adecuados de cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina es experimentación de rutina que puede llevarse a cabo mediante, por ejemplo, sistemas robóticos. Los sistemas de vectores también se describen en las patentes de EE.UU. N.° 5.736.137 y 5.658.570. Este sistema proporciona niveles de expresión elevados, por ejemplo, > 30 pg/célula/día. Otros sistemas vectores de ejemplo se divulgan en la patente de ^e E.UU. N.° 6.413.777.

En otras realizaciones, los anticuerpos (p. ej., fragmentos de unión a antígeno de anticuerpos y variantes o derivados de los mismos) de la invención se pueden expresar usando construcciones policistrónicas tales como las divulgadas en la publicación de solicitud de patente de EE.UU. N.° 2003-0157641 A1. En estos sistemas de expresión se pueden producir múltiples productos génicos de interés, tales como las cadenas ligeras y pesadas de los anticuerpos, a partir de una única construcción policistrónica. Estos sistemas usan de forma ventajosa un sitio de entrada al ribosoma interno (IRES), para proporcionar niveles relativamente altos de anticuerpos. Las secuencias de IRES compatibles se divulgan en la patente de EE.UU. N.° 6.193.980. Los expertos en la técnica apreciarán que dichos sistemas de expresión se pueden usar para producir con eficacia el rango completo de anticuerpos divulgados en la solicitud.

Más generalmente, una vez que se ha preparado el vector o la secuencia de ADN que codifica una subunidad monomérica del anticuerpo, el vector de expresión se puede introducir en una célula huésped adecuada. La introducción del plásmido en la célula huésped se puede conseguir mediante varias técnicas conocidas en la materia. Estas incluyen, a título enunciativo, transfección, incluyendo lipotransfección usando, por ejemplo, Fugene o lipofectamina, fusión de protoplastos, precipitación en fosfato cálcico, fusión celular con ^a Dⁿ encapsulado, microinyección e infección con virus intacto. Típicamente, la introducción del plásmido en el huésped se produce mediante procedimientos estándar conocidos en la técnica, tales como el procedimiento de coprecipitación en fosfato cálcico. Las células huésped que alojan la construcción de expresión se cultivan en condiciones adecuadas para la producción de las cadenas ligeras y las cadenas pesadas, y se analizan para determinar la síntesis proteica de cadenas pesadas y/o ligeras. Ejemplos no limitantes de técnicas de ensayo incluyen el ensayo de inmunosorción ligado a enzimas (ELISA), radioinmunoensayo (RIA) o análisis clasificador de células activado por fluorescencia (FACS) e inmunohistoquímmica.

El vector de expresión se transfiere a una célula huésped mediante técnicas convencionales y, después, las células transfetadas se cultivan mediante técnicas convencionales para producir un anticuerpo para usar en los procedimientos descritos en este documento. Por tanto, la invención incluye células huésped que contienen un polinucleótido que codifica un anticuerpo de la invención o una cadena pesada y ligera del mismo, unido operativamente a un promotor heterólogo, En realizaciones particulares para la expresión de anticuerpos de doble cadena, los vectores que codifican las cadenas pesada y ligera se pueden co-expresar en la célula huésped para la expresión de toda la molécula de inmunoglobulina, como se detalla más adelante.

La célula huésped se puede co-transfectar con dos vectores de expresión de la invención, en el que el primer vector codifica un polipéptido derivado de la cadena pesada y el segundo vector codifica un polipéptido derivado de la cadena ligera. Los dos vectores pueden contener marcadores seleccionables idénticos que permiten una expresión igual de los polipéptidos de la cadena pesada y de la cadena ligera. Como alternativa, se puede usar un solo vector que codifique ambos polipéptidos, de la cadena pesada y de la cadena ligera. En estas situaciones, la cadena ligera se introduce de forma ventajosa antes que la cadena pesada para evitar un exceso de cadena pesada libre tóxico; véase Proudfoot, Nature 322 (1986),52; Kohler, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980), 2197. Las secuencias de codificación de las cadenas pesadas y ligeras pueden comprender ADNc o ADN genómico.

Como se usa en este documento, “células huésped” hace referencia a células que alojan vectores construidos usando técnicas de ADN recombinante y que codifican al menos un gen heterólogo. En descripciones de procesos de aislamiento de anticuerpos a partir de huéspedes recombinantes, las expresiones “célula” y “cultivo celular” se usan de forma intercambiable para indicar la fuente de un anticuerpo a menos que claramente se especifique lo contrario. En otras palabras, la recuperación del polipéptido de las “células” puede significar de células enteras centrifugadas o del cultivo celular que contiene tanto el medio como las células suspendidas.

Para expresar anticuerpos para uso en procedimientos descritos en este documento se pueden usar varios sistemas de vector de expresión-huésped. Dichos sistemas de expresión-huésped representan vehículos mediante los cuales se pueden producir las secuencias de codificación de interés y posteriormente purificarlas, pero también representan células que pueden, cuando se transforman o transfectan con las secuencias de codificación de nucleótidos adecuadas, expresar un anticuerpo de la invención in situ. Estas incluyen, a título enunciativo, microorganismos tales como bacterias (p. ej., E. coli, B. subtilis) transformadas con vectores de expresión de ADN de bacteriófago recombinante, ADN plasmídico o ADN de cósmido que contienen secuencias de codificación de anticuerpos; levaduras (p. ej., Saccharomyces, Pichia) transformadas con vectores de expresión en levaduras recombinantes que contienen secuencias de codificación de anticuerpos; sistemas de células de insectos infectadas con vectores de expresión en virus recombinantes (p. ej., baculovirus) que contienen secuencias de codificación de anticuerpos; sistemas de células vegetales infectadas con vectores de expresión en virus recombinantes (p. ej., el virus del mosaico de la coliflor, CaMV; el virus del mosaico del tabaco, TMV) o transformadas con vectores de expresión en plásmidos recombinantes (p. ej., plásmido Ti) que contienen secuencias de codificación de anticuerpos; o sistemas de células de mamífero (p. ej., células COS, CHO, NSO, BLK, 293, 3T3) que alojan construcciones de expresión recombinantes que contienen promotores derivados del genoma de las células de mamífero (p. ej., promotor de la metalotioneína) o de virus de mamífero (p. ej., el promotor tardío del adenovirus; el promotor 7,5^k del virus vacunal). En una realización, se usan células bacterianas, tales como Escherichia coli, y células eucariotas, especialmente para la expresión de anticuerpos recombinante enteros, para la expresión de un anticuerpo recombinante. Por ejemplo, las células de mamífero, tales como células de ovario de hámster chino (CHO), junto con un vector, como el elemento promotor del gen temprano intermedio mayor del citomegalovirus humano es un sistema de expresión eficaz para anticuerpos-, véase, por ejemplo, Foecking et al., Gene 45 (1986, 101; Cockett et al., Bio/Technology 8 (1990), 2.

Las líneas de células huésped usadas para la expresión proteica de las moléculas de unión a TDP-43 de la invención incluyen, por ejemplo, células de origen mamífero; los expertos en la técnica tienen la capacidad de determinar líneas de células huésped concretas que son más adecuadas para la expresión del producto génico deseado. Ejemplos de líneas de células huésped incluyen, a título enunciativo, células CHO (de ovario de hámster chino), DG44 y DUXB11 (líneas de ovario de hámster chino, DHFR minus), HELA (carcinoma del cuello uterino humano), CVI (línea renal de mono), COS (un derivado de la CVI con el antígeno T de SV40), VERY, BHK (riñón de hámster neonato), MDCK, WI38, R1610 (fibroblastos de hámster chino) BALBC/3T3 (fibroblastos de ratón), HAK (línea renal de hámster), SP2/O (mieloma de ratón), P3x63-Ag3,653 (mieloma de ratón), BFA-1c1BPT (células endoteliales bovinas), RAJI (linfocitos humanos) y 293 (riñón humano). En una realización específica, las líneas de células huésped son células CHO o 293. Las líneas de células huésped están disponibles fácilmente y disponibles típicamente en servicios comerciales, incluyendo, por ejemplo, la Colección Americana de Cultivos Tisulares, o en la literatura publicada.

Además, se puede escoger una cepa de célula huésped que module la expresión de las secuencias insertadas o que modifique y procese el producto génico del modo específico deseado. Dichas modificaciones (p. ej., glucosilación) y procesamiento (p. ej., escisión) de los productos proteicos pueden ser importantes para la función de las proteínas. Diferentes células huésped tienen mecanismos característicos y específicos para el procesamiento y la modificación postraduccionales de proteínas y productos génicos. Se pueden escoger líneas celulares o sistemas de huéspedes adecuados de modo que se asegure una correcta modificación y procesamiento de la proteína extraña expresada. Con este fin se pueden usar células huésped eucariotas que posean la maquinaria celular para el procesamiento adecuado del transcrito primario, glucosilación y fosforilación del producto génico.

Para la producción a largo plazo y con un rendimiento alto de proteínas recombinantes se prefiere la expresión estable. Por ejemplo, las líneas celulares que expresan de forma estable el anticuerpo se pueden modificar mediante ingeniería. En lugar de usar vectores de expresión que contienen orígenes de replicación virales, las células huésped se pueden transformar con ADN controlado mediante elementos de control de la expresión adecuados (p. ej., promotor, potenciador, secuencias, terminadores de la transcripción, sitios de poliadenilación etc.) y un marcador seleccionable. Tras la introducción del ADN extraño, las células modificadas por ingeniería se pueden dejar crecer durante 1-2 días en un medio enriquecido y, después, se pasan a un medio selectivo. El marcador seleccionable en el plásmido recombinante confiere resistencia a la selección y permite que las células integren de forma estable el plásmido en sus cromosomas y crezcan para formar focos que, a su vez, se pueden clonar y expandir en las líneas celulares. Este procedimiento puede usarse de forma ventajosa para modificar mediante ingeniería las líneas celulares que expresan de forma estable el anticuerpo.

Se pueden usar numerosos sistemas de selección de acuerdo con esta invención, incluidos, entre otros, se pueden usar los genes de timidina quinasa del virus del herpes simple (Wigler et al., Cell 11 (1997), 223), hipoxantina guanina fosforribosiltransferasa (Szybalski y Szybalski, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48 (1992), 202) y adenina fosforribosiltransferasa (Lowy et al., Cell 22 (1980), 817) en las células tk-, gs-, hgprt- o aprt-, respectivamente. Asimismo, se puede usar resistencia antimetabolitos como la base de la selección para los genes siguientes: dhfr, que confiere resistencia al metotrexato (Wigler et al., Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980), 357; O'Hare et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, (1981), 1527; gpt, que confiere resistencia al ácido micofenólico (Mulligan y Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 (1981), 2072); neo, que confiere resistencia al aminoglucósido G-418 Goldspiel et al., Clinical Pharmacy 12 (1993), 488-505; Wu y Wu, Biotherapy 3 (1991), 87-95; Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32 (1993), 573-596; Mulligan, Science 260 (1993), 926-932; y Morgan y Anderson, Ann. Rev. Biochem. 62 (1993), 191­ 217: T iB TECH 11 (1993), 155-215; e hygro, que confiere resistencia a la higromicina (Santerre et al., Gene 30 (1984), 147. Procedimientos conocidos en la técnica de tecnología de ADN recombinante que se pueden usar se describen en Ausubel et al., (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990); y en los capítulos 12 y 13, Dracopoli. et al., (eds), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994); Colberre-Garapin et al., J. Mol. Biol. 150: 1 (1981).

Los niveles de expresión de un anticuerpo se pueden aumentar usando técnicas conocidas en la materia, incluyendo, por ejemplo, amplificación en vector, véase, por ejemplo, Bebbington y Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Academic Press, Nueva York, Vol. 3. (1987). Cuando un marcador en el sistema de vector que expresa un anticuerpo es amplificable, el incremento del nivel del inhibidor presente en el cultivo de la célula huésped aumentará el número de copias del gen marcador. Dado que la región amplificada está asociada con el gen del anticuerpo, la producción del anticuerpo también aumentará, véase Crouse et al., Mol. Cell. Biol. 3 (1983), 257.

La producción in vitro permite aumentar para dar cantidades grandes de los polipéptidos deseados. Las técnicas para cultivo de células de mamífero en condiciones de cultivo tisular se conocen en la materia e incluyen cultivo en suspensión homogénea, por ejemplo en un reactor aéreo o en un reactor con agitación continua, o cultivo celular inmovilizado o atrapado, por ejemplo en fibras huecas, microcápsulas microesferas de agarosa o cartuchos de cerámica. En caso necesario y/o si se desea, las soluciones de polipéptidos se pueden purificar mediante procedimientos de cromatografía habituales, por ejemplo filtración en gel, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía sobre DEAE-celulosa o cromatografía de inmunoafinidad, por ejemplo después de la biosíntesis preferencial de un polipéptido de la región bisagra sintético o antes o después de la etapa de cromatografía HIC descrita en este documento.

Los genes que codifican anticuerpos (incluyendo, por ejemplo, fragmentos de unión a antígeno de anticuerpos y variantes o derivados de los mismos) de la invención también se pueden expresar en células que no sean de mamífero, tales como bacterias o células de insectos o levaduras o vegetales. Las bacterias que captan fácilmente ácidos nucleicos incluyen miembros de las familias Enterobacteriaceae, tales como cepas de Escherichia coli o Salmonella, Bacillaceae, tales como Bacillus subtilis; Pneumococcus; Streptococcus, y Haemophilus influenzae. También se apreciará que, cuando se expresan en bacterias, los polipéptidos heterólogos típicamente forman parte de cuerpos de inclusión. Los polipéptidos heterólogos deben aislarse, purificarse y, después, ensamblarse en moléculas funcionales. Cuando se desean formas tetravalentes, las subunidades se autoensamblarán después en anticuerpos tetravalentes; véase, por ejemplo, la publicación de solicitud internacional n.° WO02/096948

En los sistemas bacterianos, de forma ventajosa se pueden seleccionar numerosos vectores de expresión en función del uso previsto para el anticuerpo que se exprese. Por ejemplo, cuando se ha de producir una gran cantidad de dicha proteína, para la generación de composiciones farmacéuticas de un anticuerpo, pueden ser deseables vectores que dirijan la expresión de niveles elevados de productos proteicos de fusión que se purifiquen fácilmente. Dichos vectores incluyen, a título enunciativo, el vector de expresión de E. coli pUR278 (Ruther et al., EMBO J. 2 (1983), 1791), en el que la secuencia codificadora del anticuerpo puede estar unida individualmente en el vector dentro del marco de la región de codificación lacZ, de modo que se produce una proteína de fusión; vectores pIN (Inouye e Inouye, Nucleic Acids Res. 13 (1985), 3101-3109; Van Heeke y Schuster, J. Biol. Chem. 24 (1989), 5503­ 5509); y similares. También se pueden usar vectores pGEX para expresar polipéptidos extraños como proteínas de fusión con glutatión-S-transferasa (GST). En general, dichas proteínas de fusión son solubles y pueden purificarse fácilmente de las células lisadas mediante adsorción y la unión a una matriz de esferas de glutatión-agarosa, seguido de elución en presencia de glutatión libre. Los vectores pGEX se han diseñado para que incluyan trombina o sitios de escisión por la proteasa del factor Xa de modo que el producto del gen diana clonado se pueda liberar de la fracción GST.

Además de procariotas, también se pueden usar microbios eucariotas. Saccharomyces cerevisiae, o la levadura del pan común, es la más usadas entre los microorganismos eucariotas, aunque habitualmente se dispone de otras varias cepas, por ejemplo Pichia pastoris. Para la expresión en Saccharomyces, habitualmente se usa el plásmido YRp7, por ejemplo, (Stincheomb et al., Nature 282 (1979), 39; Kingsraan et al., Gene 7 (1979), 141; Tschemper et al., Gene 10 (1980), 157). Este plásmido ya contiene el gen TRP1 que proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levaduras que carece de la capacidad para crecer en triptófano, por ejemplo, ATCC N.° 44076 o PEP4-1 (Jones, Genetics, 85 (1977), 12). La presencia de daños en trp1 como característica del genoma de la célula huésped de levadura proporciona un ambiente eficaz para detectar transformación mediante crecimiento en ausencia de triptófano.

En un sistema de insectos, como vector para expresar genes extraños típicamente se usa el virus de la poliedrosis nuclear Autographa californica (AcNPV). El virus crece en células de Spodoptera frugiperda. La secuencia de codificación del anticuerpo se puede clonar individualmente en regiones no esenciales (p. ej., el gen de la poliedrina) del virus y se coloca bajo el control de un promotor de AcNPV (por ejemplo el promotor de la poliedrina).

Una vez que se ha expresado de forma recombinante un anticuerpo de la invención, los anticuerpos enteros, sus dímeros, las cadenas ligeras y pesadas individuales u otras formas de inmunoglobulina de la invención se pueden purificar de acuerdo con procedimientos estándar de la técnica, incluyendo, por ejemplo, cromatografía (p. ej., cromatografía en columna de intercambio iónico, de afinidad, particularmente de afinidad por el antígeno específico después de la proteína A, y de exclusión por tamaño), centrifugación, solubilidad diferencial, por ejemplo precipitación en sulfato amónico, o mediante cualquier otra técnica estándar para la purificación de proteínas; véase, por ejemplo, Scopes, "Protein Purification", Springer Verlag, N.Y. (1982). Como alternativa, otro procedimiento para aumentar la afinidad de los anticuerpos de la invención se divulga en la publicación de patente de EE.UU. N.° 2002-0123057A1.

V. Proteínas de fusión y conjugados

Un polipéptido del anticuerpo determinado comprende una secuencia de aminoácidos o uno o más restos que normalmente no están asociados con un anticuerpo. Ejemplos de modificaciones se describen con más detalle más adelante. Por ejemplo, un fragmento de anticuerpo Fv de una cadena puede comprender una secuencia ligadora flexible o se pueden modificar para añadir un resto funcional (p. ej., PEG, un fármaco, una toxina o un marcador tal como fluorescente, radioactivo, enzima, magnética nuclear, metal pesado y similares).

Un polipéptido de anticuerpo como se describe en el presente documento puede comprender, consistir esencialmente en o consistir en una proteína de fusión. Las proteínas de fusión son moléculas quiméricas que comprenden, por ejemplo, un dominio de unión a TDP-43 de inmunoglobulina con al menos un sitio de unión a diana y al menos una porción heteróloga, es decir, una porción con la que no está ligado de forma natural en la naturaleza. Las secuencias de aminoácidos normalmente pueden existir en proteínas distintas que se juntan en el polipéptido de fusión o normalmente pueden existir en la misma proteína pero estar en una organización nueva en el polipéptido de fusión. Las proteínas de fusión se pueden crear mediante, por ejemplo, síntesis química, o creando y traduciendo un polinucleótido en el que las regiones peptídicas están codificadas en la relación deseada.

El término “heterólogo”, como se aplica a un polinucleótido o un polipéptido, significa que el polinucleótido o un polipéptido deriva de una entidad distinta de la del resto de entidades con las que se compara. Por ejemplo, como se usa en este documento, un "polipéptido heterólogo" que se va a fusionar con un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno, variante o análogo del mismo deriva de un polipéptido no inmunoglobulínico de la misma especie o un polipéptido inmunoglobulínico y no inmunoglobulínico de una especie diferente.

Como se trata con más detalle en otro lugar de este documento, los anticuerpos (p. ej., fragmentos de unión a antígeno de anticuerpos y variantes o derivados de los mismos) o fragmentos de unión a antígeno, variantes o derivados de los mismos de la invención pueden además condensarse de forma recombinante con un polipéptido heterólogo en el extremo N o el extremo C o conjugarse químicamente (incluidas conjugaciones covalentes y no covalentes) con polipéptidos u otras composiciones. Por ejemplo, los anticuerpos pueden condensarse de forma recombinante o conjugarse con moléculas útiles como marcadores en ensayos de detección y moléculas efectoras tales como polipéptidos heterólogos, fármacos radionúclidos o toxinas; véase, por ejemplo, las publicaciones de solicitud internacional n.° WO92/08495; WO91/14438; WO89/12624; la patente de EE.UU. N.° 5.314.995; y la solicitud de patente europea n.° EP 0396387.

Los anticuerpos (p. ej., fragmentos de unión a antígeno de anticuerpos y variantes o derivados de los mismos) de la invención pueden estar compuestos por aminoácidos unidos entre sí por enlaces peptídicos o enlaces peptídicos modificados, es decir isoésteres peptídicos, y pueden contener aminoácidos distintos a los 20 aminoácidos codificados por el gen. Los anticuerpos pueden modificarse mediante procedimientos naturales, tales como procesamiento postraduccional, o mediante técnicas de modificación química que son bien conocidas en la técnica. Dichas modificaciones están bien descritas en textos básicos y en monografías más detalladas, así como en una literatura de investigación voluminosa. Se pueden producir modificaciones en cualquier lugar del anticuerpo, incluyendo la estructura peptídica, las cadenas laterales de aminoácidos y los extremos amino o carboxilo, o sobre restos tales como hidratos de carbono. Se apreciará que el mismo tipo de modificación puede estar presente en los mismos grados o grados variables en varios sitios en un anticuerpo dado. Asimismo, un anticuerpo dado puede contener muchos tipos de modificaciones. Los anticuerpos pueden estar ramificados como resultado de, por ejemplo, ubiquitinación y pueden ser cíclicos, con o sin ramificación. Los anticuerpos cíclicos, ramificados y cíclicos ramificados pueden ser el resultado de procesos naturales postraduccionales o pueden fabricarse mediante procedimientos sintéticos. Las modificaciones incluyen acetilación, acilación, ADP-ribosilación, amidación, unión covalente de flavina, unión covalente de un resto hemo, unión covalente de un nucleótido o derivado nucleotídico, unión covalente de un lípido o derivado lipídico, unión covalente de fosfotidilinositol, reticulación, ciclación, formación de puentes disulfuro, desmetilación, formación de reticulaciones covalentes, formación de cisteína, formación de piroglutamato, formilación, carboxilación gamma, glucosilación, formación de anclajes GPI, hidroxilación, yodinación, mutilación, miristilación, oxidación, pegilaciión, procesamiento proteolítico, fosforilación, prenilación, racemización, selenoilación, sulfatación, adición mediada por ARN de transferencia de aminoácidos a proteínas, tal como arginilación y ubiquitinación; véase, por ejemplo, Proteins - structure and molecular properties, T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, Nueva York 2a Ed., (1993); Post-translational covalent modification of proteins, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, Nueva York, pág. 1-12 (1983); Seifter et al., Meth Enzymol. 182 (1990), 626-646: Rattan et al., Ann. NY Acad. Sci. 663(1992), 48-62).

La presente divulgación también abarca proteínas de fusión que comprenden un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo, y un polipéptido heterólogo. Una proteína de fusión puede comprender, consistir esencialmente en o consistir en un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de una cualquiera o más de las regiones V^h de un anticuerpo de la invención o la secuencia de aminoácidos de una cualquiera o más de las regiones V^l de un anticuerpo de la invención o fragmentos o variantes de las mismas, y una secuencia polipeptídica heteróloga. Como alternativa, una proteína de fusión para uso en los procedimientos diagnósticos y de tratamiento divulgados en este documento puede comprender, consistir esencialmente en o consistir en un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de uno, dos, tres cualquiera de las CDR de la V^h de un anticuerpo, o fragmentos, variantes o derivados de los mismos, o la secuencia de aminoácidos de uno, dos, tres cualquiera de las CDR de V^l de un anticuerpo, o fragmentos, variantes o derivados del mismo, y una secuencia polipeptídica heteróloga. Una proteína de fusión puede comprender también un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de una CDR3 de V^h de un anticuerpo de la invención, o fragmento, derivado o variante del mismo, y una secuencia polipeptídica heteróloga, proteína de fusión que se une específicamente a TDP-43. Como alternativa, una proteína de fusión puede comprender un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de al menos una región V^h de un anticuerpo de la invención y la secuencia de aminoácidos de al menos una región V^l de un anticuerpo de la invención o fragmentos, derivados o variantes de los mismos, y una secuencia polipeptídica heteróloga. O las regiones V^h y V^l de la proteína de fusión puede corresponder a un único anticuerpo fuente (o fragmento scFv o Fab) que se une específicamente a TDP-43. Una proteína de fusión para uso en los procedimientos diagnósticos y de tratamiento divulgados en este documento comprende un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de una, dos, tres o más cualesquiera de las CDR de V^h de un anticuerpo y la secuencia de aminoácidos de una, dos, tres o más cualesquiera de las CDR de V^l de un anticuerpo o fragmentos o variantes de los mismos, y una secuencia polipeptídica heteróloga. Las moléculas de ácido nucleico que codifican estas proteínas de fusión también están abarcadas por la divulgación.

Ejemplos de proteínas de fusión comunicados en la literatura incluyen fusiones del receptor de los linfocitos T (Gascoigne et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987), 2936-2940; CD42221 -2229; y Watson et al., Nature 349 (1991 ), 164-167); CD44 (Aruffo et al., Cell 61 (1990), 1303-1313); CD28 y B7 (Linsley et al., J. Exp. Med. 173 (1991), 721- 730); CTLA-4 (Lisley et al., J. Exp. Med. 174 (1991), 561-569); CD22 (Stamenkovic et al., Cell 66 (1991), 1133-1144); receptor del TNF (Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991), 10535-10539; Lesslauer et al., Eur. J. Immunol. 27 (1991), 2883-2886; y Peppel et al., J. Exp. Med. 174 (1991), 1483-1489 (1991); y el receptor de IgE a (Ridgway y Gorman, J. Cell. Biol. 115 (1991), N.° de resumen 1448).

Como se ha tratado en otro lugar en este documento, los anticuerpos (p. ej., anticuerpos intactos y fragmentos de unión a antígeno de anticuerpos y variantes o derivados de los mismos) de la invención se pueden fusionar a polipéptidos heterólogos para aumentar la semivida in vivo de los polipéptidos o para usar en inmunoensayos mediante procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, en una realización se puede conjugar PEG con los anticuerpos de la invención para aumentar su semivida in vivo; véase, por ejemplo, Leong et al., Cytokine 16 (2001), 106-119; Adv. in Drug Deliv. Rev. 54 (2002), 531; o Weir et al., Biochem. Soc. Transactions 30 (2002), 512.

Además, los anticuerpos (p. ej., los anticuerpos intactos y fragmentos de unión a antígeno de anticuerpos de los mismos) de la invención se pueden fusionar a secuencias marcadoras, tales como un péptido, para facilitar su purificación o detección. En realizaciones particulares, la secuencia de aminoácidos marcadora es un péptido de hexahistidina (HIS), tal como la marca proporcionada en un vector pQe (QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91311), entre otros, muchos de los cuales están disponibles compercialmente. Como se describe en Gentz et al., Proc. Natl. Acad, Sci. USA 86 (1989), 821-824, por ejemplo, la hexahistidina proporciona una purificación cómoda de la proteína de fusión. Otros marcadores peptídicos útiles para la purificación incluyen, a título enunciativo, el marcador de hemaglutinina “HA", que corresponde a un epítopo derivado de la proteína hemaglutinina de la gripe (Wilson et al., Cell 37 (1984), 767) y el marcador "flag".

Las proteínas de fusión se pueden preparar usando procedimientos bien conocidos en la técnica; véanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU. n.° 5.116.964 y 5.225.538. El sitio preciso en el que se realiza la fusión se puede seleccionar empíricamente para optimizar las características de secreción o de unión de la proteína de fusión. El ADN que codifica la proteína de fusión se transfecta después a una célula huésped para su expresión.

Los anticuerpos de la invención se pueden usar en forma no conjugada o se pueden conjugar con al menos una de diversas moléculas, por ejemplo para mejorar las propiedades terapéuticas de la molécula, para facilitar la detección de la diana o para obtención de imágenes o terapia del paciente. Los anticuerpos (p. ej., anticuerpos intactos y fragmentos de unión a antígeno de anticuerpos y variantes o derivados de los mismos) de la invención se pueden marcar o conjugar antes o después de la purificación, cuando se realiza la purificación. En particular, los anticuerpos de la invención se pueden conjugar con agentes terapéuticos, profármacos, péptidos, proteínas, enzimas, virus, lípidos, modificadores de la respuesta biológica, agentes farmacéuticos o PEG.

Los conjugados que son inmunotoxinas, incluyendo anticuerpos convencionales, se han descrito ampliamente en la técnica. Las toxinas se pueden acoplar a los anticuerpos mediante técnicas de acoplamiento convencionales o las inmunotoxinas que contienen porciones de la toxina proteica se pueden producir como proteínas de fusión. Los anticuerpos de la invención se pueden usar de un modo correspondiente para obtener dichas inmunotoxinas. Son ilustrativas de dichas inmunotoxinas las descritas por Byers, Seminars Cell. Biol. 2 (1991), 59-70 y por Fanger, Immunol. Today 12 (1991), 51-54.

Los expertos en la técnica apreciarán que los conjugados también se pueden ensamblar usando diversas técnicas dependiendo del agente seleccionado que se va a conjugar. Por ejemplo, los conjugados con biotina se preparan, por ejemplo, mediante reacción de un polipéptido de unión a TDP-43 con un éster activado de biotina, tal como el éster N-hidroxisuccinimida de biotina. De un modo similar, se pueden preparar conjugados con un marcador fluorescente en presencia de un agente de acoplamiento, por ejemplo los indicados en este documento, o mediante reacción con un isotiocianato o fluoresceína-isotiocianato. Los conjugados de la invención se preparan de un modo análogo.

La invención también abarca anticuerpos (p. ej., anticuerpos intactos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos) de la invención conjugados con un agente diagnóstico o terapéutico. Los anticuerpos pueden usarse en diagnóstico para, por ejemplo, demostrar la presencia de una enfermedad neurológica, para indicar el riesgo de contraer una enfermedad neurológica, para monitorizar el desarrollo o progresión de una enfermedad neurológica, es decir proteinopatía de TDP-43, como parte de un procedimiento de análisis clínico para, por ejemplo, determinar la eficacia de un régimen de tratamiento y/o prevención dado. La detección se puede facilitar mediante acoplamiento del anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo, a una sustancia detectable. Ejemplos de sustancias detectables incluyen varias enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes, materiales radioactivos, metales emisores de positrones que usan varias tomografías de emisión de positrones e iones metálicos paramagnéticos no radioactivos: véanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU. N.° 4.741.900 para iones metálicos que pueden conjugarse con anticuerpos para uso como diagnóstico de acuerdo con la invención. Ejemplos de enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, p-galactosidasa o acetilcolinesterasa; ejemplos de complejos de grupo prostético adecuados incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina; ejemplos de materiales fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de material luminiscente incluye luminol; ejemplos de materiales bioluminiscentes incluyen luciferasa, luciferina y ecuorina, y ejemplos de materiales radioactivos adecuados incluyen 125I, 131I, 111In o 99Tc.

Un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo, también se pueden marcar de forma detectable mediante su acoplamiento a un compuesto quimioluminiscente. La presencia del anticuerpo marcado con quimioluminiscencia se determina después detectando la presencia de luminiscencia que se produce durante el trascurso de una reacción química. Ejemplos de compuestos para marcaje quimioluminiscente particularmente útiles son luminol, isoluminol, éster de acridinio aromático, imidazol, sal de acridinio y éster de oxalato.

Una de las formas en las que un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo se puede marcar de forma detectable es uniéndolo a una enzima y usando el producto ligado en un inmunoensayo enzimático (EIA) (Voller, A,, “The Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA)" Microbiological Associates Quarterly Publication, Walkersville, Md., Diagnostic Horizons 2 (1978), 1-7); Voller et al., J. Clin. Pathol. 31 (1978), 507-520; Butler, Meth. Enzymol. 73 (1981), 482-523; Maggio, E. (ed.), Enzyme Immunoassay, CRC Press, Boca Raton, Fla., (1980); Ishikawa, E. et al., (eds,), Enzyme Immunoassay, Kgaku Shoin, Tokio (1981). La enzima, que se une al anticuerpo, reaccionará con un sustrato adecuado, preferentemente un sustrato cromogénico, de un modo tal que produzca un resto químico que se pueda detectar por medios, por ejemplo, espectrofotométricos, fluorométricos o visuales. Las enzimas que se pueden usar para marcar de forma detectable el anticuerpo incluyen, a título enunciativo, malato deshidrogenasa, nucleasa de estafilococos, delta-5-esteroide isomerasa, alcohol deshidrogenasa de levadura, alfa-glicerofosfato deshidrogenasa, triosa fosfato isomerasa, peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, asparaginasa, glucosa oxidasa, beta-galactosidasa, ribonucleasa, ureasa, catalasa, glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, glucoamilasa y acetilcolinesterasa. Además, la detección se puede realizar por procedimientos colorimétricos que usan un sustrato cromogénico para la enzima. La detección también se puede realizar mediante comparación visual de la extensión de la reacción enzimática de un sustrato en comparación con patrones preparados de forma similar.

La detección también se puede realizar usando cualquiera de varios otros inmunoensayos. Por ejemplo, mediante marcaje radioactivo del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo, es posible detectar el anticuerpo mediante el uso de un radioinmunoensayo (RIA) (véase, por ejemplo, Weintraub, B., Principies of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society (marzo de 1986)). El isótopo radioactivo se puede detectar por medios, incluidos, a título enunciativo, un contador gamma, un contador de centelleo o mediante autorradiografía.

Un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo también se pueden marcar de forma detectable usando metales de emisión de fluorescencia, tales como 152Eu, u otros del grupo de los lantánidos. Estos metales se pueden unir al anticuerpo usando dichos grupos quelantes de metales como ácido dietilentriaminopentacético (DTPA) o ácido etilendiaminotetraacético (EDTA).

Se conocen técnicas para conjugar varios restos a un anticuerpo, fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo; véase, por ejemplo, Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy," en Monoclonal Antibodies And Cáncer Therapy, Reisfeld et al (eds) pág. 243-56 (Alan R. Liss, Inc.

1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", en Controlled Drug Delivery (2a Ed.), Robinson et al. (eds), Marcel Dekker, Inc., pág. 623-53 (1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents in Cancer Therapy: A Review," en Monoclonal Antibodies ’84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al., (eds.), pág. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy," en Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. eds.), Academic Press pág.

303-16 (1985), y Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev, 62 (1982), 119-158.

Como se ha mencionado, se puede conjugar un resto que potencia la estabilidad o eficacia de una molécula de unión, por ejemplo, un polipéptido de unión, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento inmunoespecífico del mismo. Por ejemplo, PEG se puede conjugar con las moléculas de unión de la invención para aumentar su semivida in vivo. Leong et al., Cytokine 16 (2001), 106; Adv. in Drug Deliv. Rev. 54 (2002), 531; o Weir et al., Biochem. Soc. Transactions 30 (2002), 512.

VI. Composiciones y procedimientos de uso

La invención se refiere a composiciones que comprenden el anticuerpo de unión a TDP-43 mencionado anteriormente o fragmento de unión a antígeno del mismo, o el polinucleótido, vector o célula de la invención. La composición de la invención puede además comprender un vehículo farmacéuticamente aceptable. Además, la composición farmacéutica de la invención puede comprender otros agentes tales como interleucinas o interferones en función del uso previsto de la composición farmacéutica. Por ejemplo, para usar en el tratamiento de la proteinopatía de TP-43, el agente adicional se puede seleccionar del grupo que consiste en moléculas orgánicas pequeñas, anticuerpos anti-TDP-43 y combinaciones de los mismos. Por tanto, en una realización particular, la invención se refiere al uso de la molécula de unión a TDP-43, por ejemplo, anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención el polinucleótido, el vector o la célula de la invención para la preparación de una composición farmacéutica o diagnóstica para el tratamiento profiláctico y terapéutico de una proteinopatía de TDP-43, monitorizar la progresión de una proteinopatía de TDP-43 o una respuesta al tratamiento de una proteinopatía de TDP-43 en un sujeto o para determinar el riesgo de un sujeto de desarrollar una proteinopatía de TDP-43.

Por tanto, en una realización la invención se refiere al anticuerpo, el vector, la célula o la composición de la invención para su uso en un procedimiento de tratamiento de un trastorno neurológico caracterizado por una acumulación y/o depósito anormales de TDP-43 en el cerebro y el sistema nervioso central, respectivamente, procedimiento que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad terapéuticamente eficaz de una cualquiera de las moléculas de unión a TDP-43, anticuerpos, polinucleótidos, vectores o células de esta invención descritos anteriormente. La expresión “proteinopatía de t DP-43” incluye, a título enunciativo, proteinopatías de TDP-43 tales como enfermedad por granos argirofílicos, enfermedad de Alzheimer, esclerosis lateral amiotrófica (ALS), complejo ALS-Parkinsonismo de Guam, degeneración corticobasal, Demencia con cuerpos de Lewy, enfermedad de Huntington, enfermedad de cuerpos de Lewy, enfermedad de las neuronas motoras, degeneración lobular frontotemporal (FTLD), demencia frontotemporal, degeneración lobular frontotemporal con inclusiones positivas para ubiquitina, esclerosis del hipocampo, miopatía con cuerpos de inclusión, miositis con cuerpos de inclusión, enfermedad de Parkinson, demencia por enfermedad de Parkinson, complejo Parkinson-demencia en la península de Kii y enfermedad de Pick, así como otros trastornos del movimiento, enfermedades neurodegenerativas y enfermedades del sistema nervioso central (SNC) en general. A menos que se indique lo contrario, los términos neurodegenerativo, neurológico o neuropsiquiátrico se usan de forma intercambiable en este documento.

Una ventaja concreta del abordaje terapéutico de la invención reside en el hecho de que los anticuerpos de la invención derivan de linfocitos B o de linfocitos B de memoria de sujetos humanos sanos sin signo de ALS y/o FTLD y, por tanto, son, con una cierta probabilidad, capaz de prevenir proteinopatías de TDP-43 clínicamente manifiestas, o de disminuir el riesgo de aparición de la enfermedad clínicamente manifiesta o de retrasar el inicio de la enfermedad clínicamente manifiesta. Típicamente, los anticuerpos de la invención también han sufrido con éxito una maduración somática, es decir la optimización con respecto a la selectividad diana y eficacia en la unión de alta afinidad por la molécula de TDP-43 diana por medio de variación somática de las regiones variables del anticuerpo. El conocimiento de que dichas células in vivo, por ejemplo en un ser humano, no se han activado por medios de proteínas fisiológicas relacionadas o de otro tipo o estructuras celulares en el sentido de una reacción autoinmunológica o alérgica también es de gran importancia, dado que esto significa una probabilidad considerablemente mayor de pasar por éxito por las fases de ensayo clínico. Por consiguiente, la eficiencia, la aceptabilidad y la tolerabilidad ya se han demostrado antes del desarrollo preclínico y clínico del anticuerpo profiláctico o terapéutico en al menos un sujeto humano. Por tanto, cabe esperar que los anticuerpos anti-TDP-43 humanos de la invención, tanto su eficiencia específica por la estructura diana como agente terapéutico como su menor probabilidad de producir efectos secundarios aumentan significativamente su probabilidad clínica de éxito.

La composición de la invención también se puede proporcionar en un paquete o kit farmacéutico y diagnóstico, respectivamente, que comprenden uno o más contenedores cargados con uno o más de los ingredientes descritos anteriormente, por ejemplo anticuerpo anti-TDP-43, fragmento de unión, derivado o variante del mismo, polinucleótido, vector o célula de la invención. Asociados con dicho(s) envase(s) puede adjuntarse una nota en la forma prescrita por una agencia gubernamental que regula la fabricación, uso o venta de productos farmacéuticos o productos biológicos, en la que se refleja la aprobación de la agencia de la fabricación, uso o venta para administración en seres humanos. Además o como alternativa, el kit comprende reactivos y/o instrucciones para usar en ensayos diagnósticos adecuados. La composición, por ejemplo un kit es, por supuesto, particularmente adecuado para la evaluación del riesgo, diagnóstico, prevención y tratamiento de un trastorno que se acompaña de la presencia de TDP-43 y, en particular, aplicable al tratamiento de enfermedades neurodegenerativas, proteinopatías de TDP-43, enfermedad por granos argirofílicos, enfermedad de Alzheimer, Esclerosis lateral amiotrófica (ALS), complejo de demencia por ALS-parkinsonismo de Guam, degeneración corticobasal, demencia con cuerpos de Lewy, enfermedad de Huntington, enfermedad de cuerpos de Lewy, enfermedad de las neuronas motoras, degeneración lobular frontotemporal (FTLD), demencia frontotemporal, degeneración lobular frontotemporal con inclusiones positivas para ubiquitina, esclerosis del hipocampo, miopatía con cuerpos de inclusión, miositis con cuerpos de inclusión, enfermedad de Parkinson, demencia por enfermedad de Parkinson, complejo Parkinsondemencia en la península de Kii y enfermedad de Pick.

La composición de la invención puede estar en una solución acuosa estéril. Uno o más de los componentes de la composición pueden estar liofilizados. La composición de la invención puede ser sin suero. En una realización adicional, uno o más anticuerpos contenidos en una composición de la invención se producen de forma recombinante. La población de los anticuerpos en la composición puede constituir al menos un 10% de la población de inmunoglobulina en la composición.

Las composiciones farmacéuticas de la invención se pueden formular de acuerdo con procedimientos conocidos en la técnica; véase, por ejemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy (2000) by the University of Sciences In Philadelphia, ISBN 0-683-306472. Ejemplos de vehículos farmacéuticamente aceptables son bien conocidos en la técnica e incluyen soluciones salinas tamponadas con fosfato, agua, emulsiones, tales como emulsiones de aceite/agua, varios tipos de agentes humectantes, soluciones estériles etc. Las composiciones que comprenden dichos vehículos se pueden formular por procedimientos convencionales. Estas composiciones farmacéuticas se pueden administrar al sujeto como una dosis adecuada. La administración de las composiciones adecuadas se puede efectuar por diferentes modos, por ejemplo, mediante administración intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, intramuscular, tópica o intradérmica. Las formulaciones en aerosol, tales como formulaciones de pulverización nasal, incluyen soluciones acuosas purificadas o de otro tipo del agente activo con agentes conservantes y agentes isotónicos. Dichas formulaciones se ajustan a un pH y estado isotónico compatibles con las membranas mucosas nasales. Las formulaciones para administración rectal o vaginal se pueden presentar como supositorios con un vehículo adecuado.

Más particularmente, las composiciones farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles (cuando sean hidrosolubles) y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. En estos casos, la composición debe ser estéril y debe ser fluida en la medida que pueda cargarse en jeringuillas fácilmente. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y, preferentemente, se conservará frente a la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos. El vehículo puede ser un disolvente o medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido, y similares) y mezclas adecuadas de los mismos. Se puede mantener la fluidez apropiada, por ejemplo, por el uso de un recubrimiento tal como lecitina, por el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y por el uso de tensioactivos.

Además, mientras que la invención incluye el ahora procedimiento estándar (aunque afortunadamente infrecuente) de perforar un pequeño orificio en el cráneo para administrar un fármaco de la invención, en un aspecto, la molécula de unión, especialmente un anticuerpo o fármaco basado en el anticuerpo de la invención, puede atravesar la barrera hematoencefálica, que permite la administración intravenosa u oral.

El régimen de dosificación será determinado por el médico encargado de la atención y mediante factores clínicos. Como es bien conocido en las técnicas médicas, las dosis para un paciente cualquiera dependen de muchos factores, incluidos el tamaño del paciente, el área de superficie corporal, la edad, el compuesto concreto que se va a administrar, el sexo, la hora y la vía de administración, el estado de salud general y otros fármacos que se estén administrando de forma concurrente. Una dosis típica puede estar, por ejemplo, en el intervalo de 0,001 a 1.000 |ig (o de ácido nucleico para expresión o para la inhibición de la expresión en este rango); no obstante, se conciben dosis inferiores o superiores a este intervalo de ejemplo, considerando especialmente los factores anteriores.

Generalmente, la dosis puede variar de, por ejemplo, aproximadamente 0,0001 a 100 mg/kg, y más habitualmente de 0,01 a 5 mg/kg (p. ej., 0,02 mg/kg, 0,25 mg/kg, 0,5 mg/kg, 0,75 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, etc.), del peso corporal del huésped. Por ejemplo, las dosis pueden ser de 1 mg/kg de peso corporal o de 10 mg/kg de peso corporal o dentro del rango de 1 a 10 mg/kg, o al menos de 1 mg/kg. También se pretende que las dosis intermedias en los rangos anteriores entren dentro del alcance de la invención. Se puede administrar a los sujetos estas dosis diarias, en días alternos, semanalmente o de acuerdo con cualquier otro programa determinado mediante análisis empírico. Un tratamiento de ejemplo abarca la administración en múltiples dosificaciones durante un periodo prolongado, por ejemplo, de al menos seis meses. Ejemplos de regímenes de tratamiento adicionales abarcan la administración una vez cada dos semanas o una vez al mes o una vez cada de 3 a 6 meses. Ejemplos de pautas posológicas incluyen de 1 a 10 mg/kg o 15 mg/kg en días consecutivos, 30 mg/kg en días alternos o 60 mg/kg semanales. En algunos procedimientos, se administran de forma simultánea dos o más anticuerpos monoclonales con diferentes afinidades de unión, en cuyo caso la dosificación de cada anticuerpo administrado entra dentro de los intervalos indicados. El progreso se puede monitorizar mediante evaluación periódica.

Para la administración parenteral, las preparaciones incluyen soluciones, suspensiones y emulsiones acuosas o no acuosas estériles. Son ejemplos de disolventes no acuosos propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales tales como aceite de oliva y ésteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo. Vehículos acuosos incluyen agua, soluciones alcohólicas/acuosas, emulsiones o suspensiones, todas incluyendo medios salinos y tamponados. Vehículos parenterales incluyen solución de cloruro sódico, dextrosa de Ringer, cloruro sódico y dextrosa, Ringer lactato o aceites fijos. Vehículos intravenosos incluyen reponedores de fluido y de nutrientes, reponedores de electrolitos (tales como los basados en dextrosa de Ringer) y similares. También pueden estar presentes conservantes y otros aditivos, tales como, por ejemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes y gases inertes y similares. Además, la composición farmacéutica de la invención puede comprender otros agentes tales como dopamina o fármacos psicofarmacológicos, en función del uso previsto de la composición farmacéutica.

Además, la composición farmacéutica se puede formular como una vacuna, por ejemplo si la composición farmacéutica comprende un anticuerpo anti-TDP-43 o fragmento de unión del mismo para inmunización pasiva. Es prudente esperar que los anticuerpos anti-TDP43 humanos o fragmentos de unión de los mismos de la invención son particularmente útiles como vacuna para la prevención o mejora de proteinopatías de TDP-43 tales como esclerosis lateral amiotrófica (ALS), enfermedad por granos argirofílicos, enfermedad de Alzheimer, complejo de demencia por Parkinsonismo-ALS de Guam, degeneración corticobasal, demencia con cuerpos de Lewy, enfermedad de Huntington, enfermedad de cuerpos de Lewy, enfermedad de las neuronas motoras, degeneración lobular frontotemporal (FTLD), demencia frontotemporal, degeneración lobular frontotemporal con inclusiones positivas para ubiquitina, esclerosis del hipocampo, miopatía con cuerpos de inclusión, miositis con cuerpos de inclusión, enfermedad de Parkinson, demencia por enfermedad de Parkinson, complejo Parkinson-demencia en la península de Kii, enfermedad de Pick, enfermedad de Machado-Joseph y similares.

En una realización, puede ser beneficioso usar Fab recombinante (rFab) y fragmentos monocatenarios (scFv) del anticuerpo de la invención, que podrían atravesar más fácilmente la membrana celular. Por ejemplo, Robert et al., Protein Eng. Des. Sel. (2008) Oct 16; S1741-0134, publicado online con antelación, describen el uso de Fab recombinante (rFab) quimérico y fragmentos monocatenarios (scFv) del anticuerpo monoclonal WO-2 que reconoce un epítopo en una región N-terminal de Ap. Los fragmentos modificados por ingeniería pudieron (i) prevenir la fibrilación amiloide, (ii) disgregar las fibrillas Ap1-42 preformadas y (iii) inhibir la neurotoxicidad mediada por el oligómero Ap1-42 in vitro de un modo tan eficiente como la molécula de IgG entera. Las ventajas percibidas del uso de pequeños formatos de anticuerpos modificados por ingeniería Fab y scFv que carecen de la función efectora incluyen un paso más eficiente a través de la barrera hematoencefálica y minimizar el riesgo de desencadenar reacciones secundarias inflamatorias. Además, aparte de que los fragmentos scFv y los anticuerpos de un solo dominio retienen la especificidad de unión de los anticuerpos de longitud completa, se pueden expresar como genes únicos e intracelularmente en células de mamífero como intracuerpos, con el potencial de alteración del plegamiento, interacciones, modificaciones o localización subcelular de sus dianas; véase, para una revisión, por ejemplo, Miller y Messer, Molecular Therapy 12 (2005), 394-401.

En un abordaje diferente, Muller et al., Expert Opin. Biol. Ther. (2005), 237-241, describen una plataforma de tecnología, la denominada “Tecnología del Superanticuerpo”, que se dice que permite transportar los anticuerpos al interior de las células vivas sin dañarlos. Dichos anticuerpos que penetran en las células abren nuevas ventanas diagnósticas y terapéuticas. Para estos anticuerpos se ha acuñado el término “T ransMabs”.

Puede ser deseable la coadministración o administración secuencial de otros agentes neuroprotectores útiles para tratar una proteinopatía de TDP-43. El agente adicional puede estar comprendido en la composición farmacéutica de la invención. Ejemplos de agentes neuroprotectores que se pueden usar para tratar a un sujeto incluyen, entre otros, un inhibidor de la acetilcolinesterasa, un antagonista del receptor glutaminérgico, inhibidores de las quinasas, inhibidores de HDAC, agentes antiinflamatorios, divalproex sódico o cualquier combinación de los mismos. Se describen en la técnica ejemplos de otros agentes neuroprotectores que se pueden usar junto con la composición farmacéutica de la invención; véase, por ejemplo, la publicación de solicitud internacional n.° WO2007/01 1907. En una realización, el agente adicional es dopamina o un agonista del receptor de dopamina.

Una dosis o cantidad terapéuticamente eficaz se refiere a la cantidad del principio activo suficiente para mejorar los síntomas o la afección. La eficacia terapéutica y la toxicidad de dichos compuestos se pueden determinar mediante procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares o animales experimentales, por ejemplo, la DE50 (la dosis terapéuticamente eficaz en el 50 % de la población) y la DL50 (la dosis letal para el 50 % de la población). La proporción de la dosis entre efectos terapéuticos y tóxicos es el índice terapéutico y se puede expresar como la proporción entre la DL50 y la DE50. En una realización, el agente terapéutico en la composición está presente en una cantidad suficiente para restaurar y conservar el comportamiento y/o las propiedades cognitivas normales en el caso de la ALS y/o la FTLD u otras proteinopatías de TDP-43.

En otra realización, la invención se refiere a una composición diagnóstica que comprende una cualquiera de las moléculas de unión a TDP-43 descritas anteriormente, es decir anticuerpos, fragmentos de unión a antígeno, polinucleótidos, vectores o células de la invención y opcionalmente medios adecuados para detección, tales como reactivos usados convencionalmente en procedimientos diagnósticos basados en ácido nucleico o inmunología. Los anticuerpos de la invención son, por ejemplo, adecuados para usar en inmunoensayos en los que se pueden usar en fase líquida o unidos a un vehículo en fase sólida. Ejemplos de inmunoensayos que pueden usar el anticuerpo de la invención son inmunoensayos competitivos y no competitivos en formato directo o indirecto. Ejemplos de estos inmunoensayos son radioinmunoensayo (RIA), ensayo de tipo sándwich (ensayo inmunométrico), citometría de flujo y ensayo de transferencia de tipo western. Los antígenos y anticuerpos de la invención pueden estar unidos a muchos vehículos diferentes y usarse para aislar las células unidas específicamente. Ejemplos de vehículos conocidos incluyen vidrio, poliestireno, cloruro de polivinillo, polipropileno, polietileno, policarbonato, dextrano, nylon, amilosas, celulosas naturales y modificadas, poliacrilamidas, agarosas y magnetita. La naturaleza del vehículo puede ser soluble o insoluble para los fines de la invención. Existen muchos marcadores y procedimientos de marcaje diferentes conocidos para los expertos en la técnica. Ejemplos de los tipos de marcadores que se pueden usar en la invención incluyen enzimas, radioisótopos, metales coloidales, compuestos fluorescentes, compuestos quimioluminiscentes y compuestos bioluminiscentes; véase también las realizaciones tratadas anteriormente en este documento.

Mediante una realización adicional, las moléculas de unión a TDP-43, en particular los anticuerpos de la invención, también se pueden usar en un procedimiento para el diagnóstico de un trastorno en un individuo obteniendo una muestra de fluido corporal del individuo analizado que puede ser una muestra de sangre, una muestra de linfa y cualquier otra muestra de fluido corporal y poniendo en contacto la muestra de fluido corporal con un anticuerpo de esta invención en condiciones que permitan la formación de complejos antígeno-anticuerpo. El nivel de estos complejos se determina después mediante procedimientos conocidos en la técnica, un nivel significativamente mayor que el formado en una muestra control es indicativo de enfermedad en el individuo analizado. Del mismo modo, también se puede usar el antígeno específico unido por los anticuerpos de la invención. Por tanto, la invención se refiere a un inmunoensayo in vitro que comprende la molécula de unión, es decir el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención.

Por ejemplo, se puede usar una matriz basada en anticuerpos que, por ejemplo, se carga con anticuerpos de la invención, que reconocen específicamente TDP-43. El diseño de inmunoensayos en micromatrices se resume en Kusnezow et al., Mol. Cell Proteomics 5 (2006), 1681-1696.

En una realización, la invención se refiere a un procedimiento de diagnóstico de una proteinopatía de TDP-43 en un sujeto como se caracteriza en las reivindicaciones, comprendiendo el procedimiento:

(a) evaluar el nivel de TDP-43 en una muestra del sujeto a diagnosticar con un anticuerpo de la invención, un fragmento de unión a TDP-43 del mismo; y

(b) comparar el nivel de la TDP-43 con un patrón de referencia que indique el nivel de la TDP-43 en uno o más sujetos control,

en el que una diferencia o similitud entre el nivel de TDP-43 y el patrón estándar indica que el sujeto sufre una proteinopatía de TDP-43.

El sujeto que se va a diagnosticar puede estar asintomático o preclínico para la enfermedad. En una realización, el sujeto control tiene una proteinopatía de TDP-43, por ejemplo ALS o FTLD, en la que una similitud entre el nivel de ^t DP-43 y el patrón de referencia indica que el sujeto a diagnosticar sufre una proteinopatía de TDP-43. Como alternativa, o además, como segundo control, el sujeto de control no tiene una proteinopatía de TDP-43, en la que una diferencia entre el nivel de TDP-43 y el patrón de referencia indica que el sujeto a diagnosticar sufre una proteinopatía de TDP-43. I, el sujeto a diagnosticar y el o los sujetos control tienen la misma edad. La muestra que se va a analizar puede ser cualquier fluido corporal que se sospeche que contiene TDP-43, por ejemplo una muestra de sangre, LCR u orina.

El nivel de TDP-43 se puede evaluar por cualquier procedimiento adecuado conocido en la técnica que comprende, por ejemplo, analizar la TDP-43 mediante una o más técnicas elegidas de transferencia de tipo western, inmunoprecipitación, ensayo de inmunosorción ligado a enzimas (ELISA), radioinmunoensayo (RIA), clasificación de células activada por fluorescencia (FACS), electroforesis en gel bidimensional, espectroscopia de masas (MS), MS por desorción/ionización láser asistida por matriz-tiempo de vuelo (MALDI-TOF), desorción/ionización láser potenciada por superficie-tiempo de vuelo (SELDI-TOF), cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC), cromatografía de líquidos rápida de proteínas (FPLC), cromatografía de líquidos multidimensional (LC) seguida de espectrometría de masas en tándem (MS/MS) y densitometría láser. En una realización, dicha obtención de imágenes in vivo de TDP-43 comprende tomografía de emisión de positrones (PET), tomografía de emisión de fotón único (SPECT), obtención de imágenes ópticas en infrarrojo cercano (NIR) u obtención de imágenes por resonancia magnética (MRI).

Los procedimientos de diagnóstico de una enfermedad neurodegenerativa, tal como AD, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, demencia con cuerpos de Lewy o FTLD para monitorizar la progresión de una proteinopatía de TDP-43 y monitorizar un tratamiento de una proteinopatía de TDP-43 usando anticuerpos y medios relacionados que se pueden adaptar de acuerdo con la invención también se describen en las publicaciones de solicitud internacional N.° WO2010/111587 y WO2007/011907. Dichos procedimientos se pueden aplicar como se ha descrito pero con un anticuerpo específico de TDP-43, fragmento de unión, derivado o variante de la invención. Más literatura concerniente a uno cualquiera de los materiales, procedimientos, usos y compuestos que se van a usar de acuerdo con la invención se puede recuperar de bibliotecas públicas y bases de datos usando, por ejemplo, dispositivos electrónicos. Por ejemplo, se puede usar la base de datos pública "Medline", que está alojada en el National Center for Biotechnology Information y/o la National Library of Medicine en los National Institutes of Health. Otras bases de datos y direcciones web, como los del European Bioinformatics Institute (EBI), que forma parte del European Molecular Biology Laboratory (EMBL), son conocidas para los expertos en la técnica y también se pueden obtener usando motores de búsqueda en internet. Una revisión de la información sobre patentes en biotecnología y una investigación de fuentes relevantes de información sobre patentes útil para búsquedas retrospectivas y para los conocimientos actuales se proporcionan en Berks, TIBTECH 12 (1994), 352-364.

A menos que se indique lo contrario, se proporciona la definición de un término como se usa en este documento según el Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology, Oxford University Press, 1997, revisado en 2000 y reimpreso en 2003, ISBN 0198506732.

Un entendimiento más completo se puede obtener por referencia a los siguientes ejemplos específicos de los anticuerpos NI-205.41D1 y NI-20514W3 de la invención y anticuerpos adicionales como anticuerpos de referencia.

Ejemplos

Materiales y procedimientos

Descripciones detalladas de procedimientos convencionales, tales como los usados en este documento, se pueden encontrar en la bibliografía citada. A menos que se indique lo contrario más adelante, la identificación de linfocitos B específicos de TDP-43 y la clonación molecular de anticuerpos frente a TDP-43 que muestren especificidad de interés, así como su expresión recombinante y caracterización funcional se han realizado o se pueden realizar como se describe en los ejemplos y en la sección Procedimientos complementarios de la solicitud internacional PCT/EP2008/000053 publicada como WO2008/081008.

Exploración de anticuerpo frente a TDP-43 humano

ELISA

Se revistieron microplacas con semiárea de 96 pocillos (Corning) con:

(a) TDP-43 humano recombinante de longitud completa marcado con His (Biogen Idec, EE.UU.); o

(b) un péptido sintético que consiste en los residuos 390-414 del dominio en C-terminal de TDP-43 con modificación por fosforilación en los residuos 409 y 410 (Shafer-N, DK) a una concentración de 5 jg/ml y 3,3 |jg/ml, respectivamente, en tampón de recubrimiento de carbonato para ELISA (pH 9,6) durante la noche a 4 °C. Las placas se lavaron en PBS-Tween (pH 7,6) y los sitios no específicos se bloquearon durante 1 hora a temperatura ambiente con PBS-T que contenía 2% de BSA (Sigma, Buchs, Suiza). El medio acondicionado para linfocitos B se transfirió desde las placas de cultivo de linfocitos B de memoria a placas de ELISA y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas de ELISA se lavaron en PBS-T y después se incubaron con anticuerpos policlonales anti-inmunoglobulinas humanas conjugadas con peroxidasa de rábano picante (HRP) (Jackson Immuno Research, EE.UU.). Después de lavar con PBS-T, la unión de los anticuerpos humanos se determinó mediante la medición de la actividad de la HRP en un ensayo colorimétrico estándar.

MSD

Las placas de 10 puntos de 96 pocillos MULTI-SPOT (Meso Scale Discovery, EE.UU.) se revistieron con una mezcla de fragmentos proteicos de TDP-43 correspondientes a los aminoácidos 1-259, 260 a 277 y 350-366 (Abeampic, Reino Unido), respectivamente. Se usaron 10 |ig/ml de cada péptido y se formularon en PBS. Los sitios de unión no específica se bloquearon durante 1 hora a temperatura ambiente con PBS-T que contiene 3% de BSA, seguido de incubación con medio acondicionado para linfocitos B durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron en PBS-T y después se incubaron con anticuerpo policlonal anti-humano conjugado con SULFO-Tag (Mesoscale Discovery, EE.UU.). Después de lavar con PBS-T, el anticuerpo unido se detectó mediante medición con electroquimioluminiscencia usando un SECTOR Imager 6000 (Meso Scale Discovery, EE.UU.).

Clonación molecular de anticuerpos frente a TDP-43 humanos

Las muestras que contenían los linfocitos B de memoria se obtuvieron de sujetos humanos sanos. Los linfocitos B vivos de los cultivos de linfocitos B de memoria seleccionados se recogieron, el ARNm se aisló y el ADNc se preparó mediante transcriptasa inversa (Clontech, EE.UU.). Las secuencias de las cadenas pesadas y ligeras de la inmunoglobulina se obtuvieron después usando un enfoque de PCR anidada.

Una combinación de cebadores que representan todas las familias de secuencias del repertorio de la línea germinal de inmunoglobulinas humanas se usa para las amplificaciones de los péptidos líder, segmentos V y segmentos J. La primera ronda de amplificación se realiza usando cebadores específicos de los péptidos líder en el extremo 5' y cebadores específicos de la región constante en el extremo 3' (Smith et al., Nat Protoc. 4 (2009), 372-384). Para las cadenas pesadas y las cadenas ligeras kappa, la segunda ronda de amplificación se realiza usando cebadores específicos del segmento V en el extremo 5' y cebadores específicos del segmento J en el extremo 3'. Para las cadenas ligeras lambda, la segunda ronda de amplificación se realiza usando cebadores específicos del segmento V en el extremo 5' y un cebador específico de la región C en el extremo 3' (Marks et al., Mol. Biol. 222 (1991), 581-597: de Haard et al., J. Biol. Chem. 26 (1999), 18218-18230).

La identificación del clon del anticuerpo con la especificidad deseada se realiza mediante una nueva detección selectiva en ELISA con la expresión recombinante de anticuerpos completos. La expresión recombinante de anticuerpos IgG1 humanos completos o anticuerpos IgG2a quiméricos se consigue tras la inserción de las secuencias de las regiones variables de las cadenas pesada y ligera “en el marco de lectura correcto” en los vectores de expresión que complementan la secuencia de la región variable con una secuencia que codifica un péptido líder en el extremo 5' y con una secuencia que codifica el o los dominios constantes adecuados en el extremo 3'. Con este fin, los cebadores contenían sitios de restricción diseñados para facilitar la clonación de las secuencias variables de las cadenas pesada y ligera en vectores de expresión de anticuerpos. Las inmunoglobulinas de cadena pesada se expresan insertando el producto de la RT-PCR de la cadena pesada de la inmunoglobulina en el marco dentro de un vector de expresión de la cadena pesada portador de un péptido señal y los dominios constantes de la inmunoglobulina gamma 1 humana o la inmunoglobulina gamma 2a de ratón. Las inmunoglobulinas de cadena ligera kappa se expresan insertando el producto de la RT-PCR de la cadena ligera kappa en el marco dentro de un vector de expresión de la cadena ligera que proporcione un péptido señal y el dominio constante de la inmunoglobulina de cadena ligera kappa humana. Las inmunoglobulinas de cadena ligera lambda se expresan insertando el producto de la RT-PCR de la cadena ligera lambda en el marco dentro de un vector de expresión de la cadena ligera lambda que proporcione un péptido señal y el dominio constante de la inmunoglobulina de cadena ligera lambda humana o de ratón.

Los anticuerpos monoclonales recombinantes funcionales se obtienen tras la co-transfección en células HEK293 o CHO (o cualquier otra línea celular receptora adecuada de origen humano o de ratón) de un vector de expresión de Ig-cadena pesada y un vector de expresión de Ig-cadena ligera kappa o lambda. El anticuerpo monoclonal humano recombinante se purifica después del medio acondicionado usando una purificación en columna de proteína A estándar. El anticuerpo monoclonal humano recombinante se puede producir en cantidades ilimitadas usando células transfectadas de forma transitoria o estable. Las líneas celulares productoras de anticuerpo monoclonal humano recombinante se pueden establecer usando los vectores de expresión de Tg directamente o mediante reclonación de las regiones variables de Ig en diferentes vectores de expresión. Los derivados, tales como F(ab), F(ab)2 y scFv, también se pueden generar a partir de estas regiones variables de Ig.

Purificación y caracterización de TDP-43 marcado con His

Un vector de expresión para la TDP-43 marcada con 6XHis (pCGB026) se generó clonando la secuencia de TDP-43 en el vector de expresión pRSET A (Invitrogen). Células BL21 Star (DE3)pLysS de E. coli (Invitrogen) se transformaron con pCGB026. Tras el crecimiento a 37 °C hasta aproximadamente 1 DO en un matraz de agitación de 1 l que contiene caldo LB, se añadió IPTG hasta 0,5 mM y las células se cultivaron durante la noche a 18°C. Las células se sedimentaron mediante centrifugación a baja velocidad, se decantó el sobrenadante y los sedimentos celulares se congelaron para almacenar a -20°C.

Los sedimentos celulares se equilibraron hasta la temperatura amiente y se resuspendieron en 50 ml de Tris-HCl 50 mM a pH 7,5, imidazol 20 mM, NaCl 150 mM, que contiene inhibidores de la proteasa (IP) (concentración final de IP: PMSF 1 mM, pepstatina A 5 pM, benzamida 1 mM, bestatina 10 pM, E64 10 pM, leupeptina 20 pM, aprotinina 1,5 |jM). Tras la homogeneización durante 5 minutos para romper las partículas grandes las células se rompieron a presión alta usando un microfluidificador (Microfluidics, Inc.). El lisado celular se centrifugó durante 30 minutos a 10.000 rpm a 4°C. El sedimento, que contenía TDP-43 marcada con his insoluble, se resuspendió en 5 ml de solución B-PER (Thermo Scientific) que contenía MgCb 2 mM, comprimidos de EDTA completo sin PI (Roche), 100 |jg/ml de lisozima, 5 U/ml de DNasa (Thermo Scientific) y se incubó durante 15 min a temperatura ambiente. Se añadió una solución adicional de comprimidos de B-PER/MgCh 2 mM/PI hasta un volumen final de 50 ml y la mezcla se centrifugó durante 10 minutos a 10.000 rpm. El sedimento aislado se lavó dos veces en 20 ml de Tris-HCl pH 7,5, imidazol 20 mM, NaCl 150 mM, tampón de Pl, seguido de centrifugación durante 10 min. a 10.000 rpm. El sedimento aislado se resuspendió después en urea 8 M, fosfato sódico 20 mM, a pH 7,8, con Pl, se mezcló durante 5 minutos mediante homogeneización y se centrifugó a 10.000 rpm durante 10 minutos.

El sobrenadante se aisló, se filtró a través de un filtro de 0,45 jm, se combinó con 4 ml de resina Ni-NTA (Invitrogen) equilibrada en urea 8 M, fosfato sódico 20 mM a pH 7,8, NaCl 0,5M con Pl, y se incubó en agitación durante la noche a 4 °C. Se recolectó el flujo continuo y la resina se lavó con 10 volúmenes de columna de urea 8 M, fosfato sódico 20 mM a pH 5,3, NaCl 0,5 M. La TDP-43 marcada con His se eluyó en fracciones de 0,5 volúmenes de columna con urea 8 M, fosfato sódico 20 mM a pH 4, cloruro sódico 0,5 M. Las fracciones pico se combinaron y se determinó la concentración proteica usando espectrometría UV. El rendimiento total purificado fue ~ 8 mg/l de cultivo.

El análisis SDS-PAGE de la proteína purificada mostró una banda principal en ~ 47 kDa (datos no proporcionados) consistente con la masa molecular predicha de 46,5 kDa. La espectrometría de masas intacta sobre la proteína purificada indicó un pico principal a 46538 Da, consistente con la masa predicha de 46529,9 Da. La capacidad de los anticuerpos disponibles comercialmente conocidos contra TDP-43 para unirse a la proteína purificada se determinó mediante ELISA. El anticuerpo monoclonal de ratón 2E2-D3, que reconoce los aminoácidos 205-222 (Zhang, H.-X., et al., 2008, Neuroscience Lett., 434, 170-74), y los anticuerpos policlonales de conejo A260 y G400, que reconocen secuencias alrededor de los aminoácidos Ala-260 y Gly-400, respectivamente, se unieron todos a la TDP-43 marcada con His purificada (datos no proporcionados)

Expresión recombinante de dominios de TDP-43 humanos

Las secuencias que codifican el dominio de TDP-43 humano se amplificaron mediante PCR de la secuencia de ADNc de longitud completa (Q13 148, TARBP_HUMAN) y se clonaron en el vector de expresión pRSET-A (Invitrogen, EE.UU.). Los cuatro vectores de expresión (dominio I His-huTDP-43, dominio I1His-huTDP-43, dominio III His-huTDP-43 y dominio IV His-huTDP-43) codifican los cuatro dominios de TDP-43: el dominio en N-terminal (residuos de aminoácidos 2-106 de la SEQ ID NO: 94), el dominio 1 de unión a ARN (residuos de aminoácidos 99­ 204 de la SEQ ID NO: 94), el dominio 2 de unión a ARN (residuos de aminoácidos 183-273 de la SEQ ID NO: 94) y el dominio rico en glicina (residuos de aminoácidos 258-414 de la SEQ ID NO: 94), respectivamente. Las construcciones de ADN que comprenden el ADNc que codifican los dominios de TDP-43 bajo el control del promotor de T7 se usaron para transformar una cepa de Escherichia coli adecuada, tal como BL21 (DE3) (New England Biolabs, EE.UU.) y la expresión de 15 ml de cultivo celular se indujo mediante la adición de p-D-tiogalactopiranósido isopropilo (IPTG) 0,5 mM. Las células se recogieron después de 4 horas de inducción a 37 °C y después se resuspendieron en 1 ml de KCl 100 mM, HEPES 50 mM, eGtA 2 mM, MgCb 1 mM, ditiotreitol 1 mM, PMSF 0,1 mM, 10 % de glicerol y 0,1 mg/ml de lisozima, a pH 7,5, seguido de sonicación. Las fracciones solubles e insolubles se recogieron tras la centrifugación a 9.000 rpm a 4 °C durante 45 minutos. De forma similar, se recogieron 9.000 g de sobrenadante de Escherichia coli simulada. Cuando se requirió (dominio IV de TDP-43), la fracción insoluble se solubilizó en 1 ml de urea 8 M, Tris 20 mM, KCl 200 mM y p-mercaptoetanol 1 mM. Las fracciones solubles e insolubles se cargaron en columnas de supeflujo Ni-NTA (Qiagen, EE.UU.) y los dominios His-TDP-43 se purificaron de acuerdo con el protocolo del fabricante. El grado de pureza de las proteínas recombinantes se estimó mediante SDS-PAGE y tinción de Coomassie. La concentración de las proteínas purificadas se determinó mediante medición de la absorbancia a 280 nM.

ELISA directo

Microplacas de 96 pocillos (Corning) se revistieron con TDP-43 humano de longitud completa, dominio I de TDP-43 (residuos de aminoácidos 2-106 de la SEQ ID NO: 94), dominio II de TDP-43 (residuos de aminoácidos 99-204 de la SEQ ID NO: 94), dominio III de TDP-43 (residuos de aminoácidos 183-273 de la SEQ ID NO: 94), dominio IV de TDP-43 (residuos de aminoácidos 258-414 de la SEQ ID NO: 94) o con un péptido sintético que cubre los residuos 390 a 414 del dominio en C-terminal de TDP-43 (véase la SEQ ID NO: 94) con modificación de fosforilación en los residuos 409/410 (Schafer-N, DK) diluidos a una concentración de 6,6 jg/ml o 3,3 jg/ml, respectivamente, en tampón de recubrimiento de carbonato para ELISA (pH 9,6) durante la noche a 4 °C. Los sitios de unión no específica se bloquearon durante 1 hora a temperatura ambiente con PBST que contenía 2 % de BSA (Sigma, Buchs, Suiza). Los anticuerpos se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. La unión se determinó usando un anticuerpo específico de IgGy anti-humano de burro conjugado con HRP (Jackson ImmunoResearch, EE.UU.) o un anticuerpo secundario específico de (H+L) IgG anti-ratón de cabra conjugado con HRP (Jackson ImmunoResearch, EE.UU.), seguido de medición de la actividad de la HRP en un ensayo colorimétrico estándar.

Análisis de transferencia de tipo Western

La TDP-43 recombinante de longitud completa, el dominio I de TDP-43 (residuos de aminoácidos 2-106 de la SEQ ID NO: 94), dominio II de TDP-43 (residuos de aminoácidos 99-204 de la SEQ ID NO: 94), el dominio III de TDP-43 (residuos de aminoácidos 183-273 de la SEQ ID NO: 94), el dominio IV de TDP-43 (residuos de aminoácidos 258­ 414 de la SEQ ID NO: 94), 300 ng de cada uno, se resolvieron mediante SDS-PAg E (NuPAGE 12 % Bis-Tris Gel; Invitrogen, Basilea, Suiza), seguido de electrotransferencia sobre membranas de nitrocelulosa. Los sitios de unión no específica se bloquearon durante 1 hora a temperatura ambiente con PBST que contenía 2% de BSA (Sigma, Buchs, Suiza). Las transferencias se incubaron durante la noche con anticuerpos primarios (10 nM), seguido de anticuerpo secundario específico de IgGy anti-humano de burro conjugado con HRP (Jackson ImmunoResearch, EE.UU.) o anticuerpo secundario específico de (H+L) IgG anti-ratón de cabra conjugado con HRP (Jackson ImmunoResearch, E^e .UU.). Las transferencias se desarrollaron usando detección ^eC^l y ImageQuant 350 (GE Healthcare, Otelfingen, Suiza).

Tarea del laberinto Y de dos pruebas

La mejora de la memoria de trabajo en el modelo de ratón con proteinopatía de TDP-43 tratado con anticuerpos se puede analizar usando una tarea del laberinto Y de dos pruebas (p. ej., Penanen, Genes Brain Behav. 5 (2006), 369­ 79). Las tres ramas del laberinto tienen una longitud de 22 cm, una anchura de 5 cm y una profundidad de 15 cm. Se colocan pistas abstractas blancas y negras en una cortina negra rodeando al laberinto. Los experimentos se realizan con un nivel de luz ambiental de 6 lux durante la fase de oscuridad. Cada experimento comprende una sesión de entrenamiento y una sesión de observación. Durante la sesión de entrenamiento se asigna a un ratón a dos de las tres ramas (la rama de inicio y la segunda rama), que se puede explorar con libertad durante 4 minutos sin acceso a la tercera rama (la rama nueva). Después, se saca al ratón del laberinto y se mantiene en una jaula de retención durante 1,5 - 5 min, mientras se limpia el laberinto completamente con 70% de etanol para eliminar cualquier pista para el olfato. Después, se introduce de nuevo al ratón en el laberinto para observación con las tres ramas accesibles durante 4 minutos. Se registra la secuencia de entradas, el número de entradas en cada rama y el tiempo que ha pasado en cada rama. A partir de esto se calcula la proporción de tiempo pasado en la nueva rama tercera durante la media de tiempo pasado en las otras dos ramas (rama de inicio y segunda rama) y se compara entre los diferentes grupos de tratamiento en el modelo de ratón de tauopatía y el correspondiente control con ratones salvajes. Típicamente, los roedores prefieren investigar una nueva rama del laberinto en lugar de volver a una que ya han visitado previamente. Los efectos de los anticuerpos se pueden monitorizar con respecto a la conservación de esta preferencia por los ratones del modelo de proteionopatía de TDP-43 tratados en comparación con el comportamiento no discriminatorio de los ratones sin tratar debido a su alteración de la memoria de trabajo relacionada con el trastorno. Por tanto, una proporción cercana a 1 indica alteración de la memoria de trabajo. Una proporción mayor indica mejor memoria de trabajo. La memoria de trabajo alterada en un modelo de proteinopatía de TDP-43 se considera debida a una patología de TDP-43 resultante de la sobreexpresión de TDP-43 humana. Por tanto, una proporción significativamente mayor observada en ratones tratados con el anticuerpo anti-TDP-43 con respecto a los ratones control indicará que el anticuerpo anti-TDP-43 tiene un efecto terapéutico sobre la patología de TDP-43.

Ensayo de poste

Los ratones se analizan al principio de la fase de oscuridad cuando están más activos. El poste está hecho de una barra de madera con una longitud de 50 cm y una anchura de 1 cm cubierto con un paño para facilitar la escalada. La base del poste se coloca en la jaula del ratón. El ratón se coloca encima del poste y el tiempo que tarda en orientarse hacia abajo y el tiempo que tarda en bajar a la jaula se registran en 5 ensayos con intervalos entre los ensayos de 30 minutos. Se analiza el ensayo que arrojó mejor rendimiento.

Ensayo del laberinto elevado

Los ratones se analizan al principio de la fase de oscuridad cuando están más activos. El ensayo se realiza en luz tenue (40 lux). El laberinto en cruz elevado consta de dos ramas abiertas y dos ramas cerradas (longitud de la rama: 30 cm; anchura: 5 cm). Las ramas abiertas tienen un pequeño borde de 1 cm y las ramas cerradas están limitadas por una pared de 15 cm. Al principio de la tarea, se coloca a los ratones en el centro de un laberinto en cruz elevado frente a una rama abierta. Se graba a los ratones mientras exploran el laberinto durante 5 minutos. El tiempo que pasan en las ramas abiertas y cerradas y la distancia que recorren se mide y se analiza.

Ejemplo 1: Análisis de unión al anticuerpo frente a TDP-43 humano mediante ELISA y transferencia de tipo Western ELISA directos

Se revistieron microplacas de 96 pocillos (Corning) con polipéptidos que comprenden los residuos de aminoácidos de TDP-432-106 de la SEQ ID NO: 94 (dominio I de TDP-43), residuos 99-204 de la SEQ ID NO: 94 (dominio II de TDP-43), residuos 183-273 de la SEQ ID NO: 94 (dominio III de TDP-43), residuos 258-414 de la SEQ ID NO: 94 (dominio IV de TDP-43), residuos 2-414 de la ^s E^q ID NO: 94 (TDP-43 de longitud completa) y un polipéptido sintético que contiene los residuos 390-414 con modificación de fosforilación en los residuos 409/410 de la SEQ ID NO: 94. Los polipéptidos revistieron las placas de ELISA a una concentración de revestimiento igual de 6,6 pg/ml (TDP-43 recombinante y fragmentos de TDP-43) o 3,3 pg/ml (péptidos sintéticos). La unión de los anticuerpos derivados de humanos se determinó mediante ELISA directo.

Los anticuerpos NI-205.51C1 (Fig. 2A) y NI-205.3F10 (Fig. 2C) se unieron específicamente al dominio III de TDP-43 (residuos de aminoácidos 183-273 de la SEQ ID NO: 94). Los anticuerpos NI-205.8A2 (Fig. 2D), NI-205.15F12 (Fig. 2^e ), NI-205.25F3 (Fig. 2G) y NI- 205.21G1 (Fig. 2I) se unieron específicamente al dominio IV de TDP-43 (residuos de aminoácidos 258-414 de la SEQ ID NO: 94). El anticuerpo NI-205.87E7 (Fig. 2H) se unió específicamente al dominio I de TDP-43 (residuos de aminoácidos 2-106 de la s Eq ID NO: 94). Los anticuerpos NI-205.21G2 (Fig. 2B) y NI-205.113C4 (Fig. 2F) se unieron específicamente al dominio II de TDP-43 (residuos de aminoácidos 99-204 de la SEQ ID NO: 94). Todos los anticuerpos específicos de TDP-43 derivados de ser humano reconocían específicamente la TDP-43 de longitud completa. Para controlar la eficiencia del revestimiento de los diferentes dominios de TDP-43 se usaron los anticuerpos disponibles comercialmente que se unen a TDP-43 de longitud completa y un dominio de TDP-43 específico: Ab50930 (Abcam, Reino Unido), dominio 1 de TDP-43 ; anticuerpo monoclonal TARDBP (M01), clon 2E2-D3 (Abnova, Taiwán), dominio III de ^t D^p-43 y Ab82695 (Abcam, EE.UU.), dominio IV de TDP-43. Los anticuerpos de control se unieron a la TDP-43 de longitud completa y a su dominio de TDP-43 específico.

Unión a distintos dominios de TDP-43 mediante transferencia de tipo Western

La TDP-43 recombinante de longitud completa, el dominio I de TDP-43 (residuos de aminoácidos 2-106 de la SEQ ID NO: 94), dominio II de TDP-43 (residuos de aminoácidos 99-204 de la SEQ ID NO: 94), el dominio III de TDP-43 (residuos de aminoácidos 183-273 de la SEQ ID NO: 94) y el dominio IV de TDP-43 (residuos de aminoácidos 258­ 414 de la SEQ ID NO: 94) se resolvieron mediante SDS-PAGE. El anticuerpo específico de TDP-43 disponible comercialmente TARDBP (M01), clon 2E2-D3 (Abnova, Taiwán) se usó como control positivo para la detección de TDP-43, mientras que un anticuerpo específico de Fcy de IgG anti-humano se usó como control negativo. La unión de los anticuerpos derivados de humanos a dominios de TDP-43 específicos se determinó mediante análisis de transferencia de tipo Western.

La transferencia de tipo Western indicó que los anticuerpos: (a) los anticuerpos NI-205.51C1 y NI-205.3F10 se unieron específicamente al dominio III de TDP-43 (residuos de aminoácidos 183-273 de la SEQ ID NO: 94); (b) los anticuerpos NI-205.8A2 y NI-205.21G1 se unieron específicamente al dominio IV de TDP-43 (residuos de aminoácidos 258-414 de la SEQ ID NO: 94); (c) NI-205.21G2 reconoció específicamente el dominio II de TDP-43 (residuos de aminoácidos 99-204 de la SEQ ID NO: 94); (d) NI-205.51C1, NI-205.3F10, NI-205.8A2, NI-205.21G1, NI-205.21G2 reconoció la TDP-43 humana de longitud completa además de un dominio de TDP-43; y (e) los anticuerpos derivados de ser humano NI-205.25F3, NI-205.15F12 y NI-205.87E7 reconocieron la TDP-43 de longitud completa pero no parecían unirse a un dominio específico de TDP-43 (datos no proporcionados). Además, los anticuerpos NI-205.68G5 y NI-205.20A1, que preferentemente o exclusivamente se unían al péptido en C-terminal fosfo-TDP-43 (véase el ejemplo 2) no parecían reconocer la TDP-43 recombinante de longitud completa ni ninguno de sus fragmentos (datos no proporcionados).

Ejemplo 2: Determinación de la CE ⁵⁰ para los anticuerpos de unión a TDP-43

Determinación de la concentración semimáxima eficaz (CE ⁵⁰ )

Para determinar la concentración semimáxima (CE50) eficaz de los anticuerpos específicos de TDP-43 derivados de ser humano por la TDP-43 humana y para evaluar la especificidad por la diana, se revistieron microplacas de 96 pocillos (Corning) con TDP-43 de longitud completa recombinante (Biogen Idec, EE.UU.), extracto de Escherichia coli y BSA (Sigma, Buchs, Suiza), diluido a una concentración de 5 pg/ml en tampón de revestimiento de carbonato para ELISA (pH 9,6) durante la noche a 4 °C. Como alternativa, microplacas de semiárea de 96 pocillos (Corning) se revistieron con un péptido sintético que cubre los residuos de 390 a 414 del dominio en C-terminal de TDP-43 con modificación por fosforilación en los residuos 409/410 (Schafer-N, DK) y BSA (Sigma, Buchs, Suiza), diluido a una concentración de 3,3 pg/ml en tampón de revestimiento de carbonato para ELISA (pH 9,6) durante la noche a 4 °C. Los sitios de unión no específica se bloquearon durante 1 hora a temperatura ambiente con PBS que contenía 2 % de BSA (Sigma, Buchs, Suiza). Los anticuerpos específicos de TDP-43 humana se diluyeron a las concentraciones indicadas y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. La unión se determinó usando un anticuerpo secundario específico de IgGy anti-humano de burro conjugado con HRP (Jackson ImmunoResearch, EE.UU.) seguido de la medición de la actividad de la HRP en un ensayo colorimétrico estándar. Los valores de la CE50 se estimaron mediante una regresión no lineal usando el software GraphPad Prism (San Diego, EE.UU.).

Como se divulga en la Tabla 4, los anticuerpos NI-205.51C1 y NI-205.21G2 se unen a la TDP-43 humana con afinidad alta a CE50 subnanomolar de 180 pM y 240 pM, respectivamente. No se observó unión al péptido TDP-43-fosfo en C-terminal para estos anticuerpos. Los anticuerpos NI-205.3F10, NI-205.8A2, NI-205.15F12, Ni-205.113C4, NI-205.25F3 y NI-205.87E7 se unieron a la TDP-43 humana pero no al péptido TDP-43-fosfo en C-terminal. Los valores de CE50 de estos anticuerpos para las proteínas TDP-43 humanas variaron de 1 a 18 nM. NI-205.21G1 se unió a la TDP-43 de longitud completa a una CE50 de 4,1 nM y reconoció el péptido TDP-43-fosfo en C-terminal con una afinidad menor a una CE50 de 49,5 nM. Los anticuerpos NI-205.68G5 y NI-205.20A1 mostraron una unión preferencial o exclusiva al péptido TDP-43-fosfo en C-terminal con una CE50 de 16,9 y 15,8 nM, respectivamente, lo que sugiere que la fosforilación de la serina en la posición 409 y/o la serina en la posición 410 de TDP-43 es necesaria para la unión por NI-205.68G5 y NI-205.20A1.

Tabla 4: Afinidad del anticuerpo por TDP-43 y por TDP-43 fosforilada

Tabla 4: CE50 de unión de los anticuerpos de unión a TDP-43 derivada de ser humano a TDP-43 recombinante y al é tido TDP-43-fosfo.

Ejemplo 3: Mapeo del epítopo con péptidos sintéticos (PepSpotting)

Se usaron escáneres de péptidos solapantes para mapear los epítopos dentro de la proteína TDP-43 humana que son reconocidos por los anticuerpos específicos de TDP-43 derivada de ser humano, Se usaron membranas Pepscan (PepSpots, JPT Peptide Technologies, Berlín, Alemania) con 101 péptidos lineales de 15 unidades de 11 secuencias de aminoácidos solapantes que representan en conjunto toda la secuencia de la TDP-43 humana (Q13148, TARDBP_HUMAN). Los péptidos se pasaron a membranas de nitrocelulosa que se activaron después durante 5 minutos en metanol y después se lavaron a temperatura ambiente en TBS durante 10 minutos. Los sitios de unión no específica se bloquearon durante 2 horas a temperatura ambiente con Roti®-Block (Carl Roth GmbH Co. KG, Karlsruhe, Alemania). Los anticuerpos específicos de TDP-43 derivados de ser humano (1 |ig/ml) se incubaron durante 3 horas a temperatura ambiente en Roti®-Block. La unión del anticuerpo primario se determinó usando anticuerpo secundario específico de IgGy anti-humano de burro conjugado con HRP (Jackson ImmunoResearch, EE.UU.). Las transferencias se desarrollaron usando detección ECL e ImageQuant 350 (GE Healthcare, Otelfingen, Suiza).

En la Tabla 4 se resumen los epítopos de unión identificados para los diferentes anticuerpos específicos de TDP-43 derivados de ser humano identificados usando PepSpot.

-

Ejemplo 4: Unión de anticuerpos frente a TDP-43 recombinante humana a formas patológicas de TDP-43 en médula espinal y tejido cerebral humano

Para la validación de la capacidad de unión del anticuerpo frente a TDP-43 se usaron secciones de médula espinal y de cerebro de pacientes humanos de ALS o pacientes con FTLD. La unión del anticuerpo a una TDP-43 patológica se evaluó mediante tinción inmunohistoquímica. La unión de los anticuerpos anti-TDP-43 recombinantes humanos se caracterizó en tejido de casos de FTLD-TDP-43 (10 casos de pacientes, 7 casos de controles). La inmunohistoquímica se realizó en secciones incluidas en parafina de 5 um de espesor y se incluyó el uso de recuperación de epítopos basada en EDTA antes de realizar los procedimientos con inmunoperoxidasa por otro lado estándar con kits de Elite ABC (Vector Laboratories) con dAb (Pierce). Se usaron los anticuerpos primarios siguientes: anticuerpo monoclonal de ratón 2E2-D3 producido contra TDP-43 humana (Abnova) como control positivo; anticuerpos anti-TDP-43 humanos recombinantes descritos en este documento/anteriormente NI205.3F10, NI205.51C1, NI205.21G2, NI205.8A2, NI205.15F12, NI205.25F3, NI205.87E7, NI205.21G1, NI205.68G5, NI205.20A1. La secciones se contratiñeron con hematoxilina para revelar los núcleos celulares.

Los anticuerpos NI205.8A2, NI205.3F10, NI205.21G2, y NI205.21G1 se unieron preferentemente a la TDP-43 citoplásmica (es decir, las formas patológicas de TDP-43) sobre la TDP-43 nuclear. Por el contrario, se observó que el anticuerpo control positivo disponible comercialmente 2E2 (Abnova, Taiwán) se unía a la TDP-43 tanto citoplásmica como nuclear. Es interesante el hecho de que la unión del anticuerpo NI205.21G1 demostró unión muy específica que parece ser comparable a la unión observada para los anticuerpos control que reconocen la TDP-43 fosforilada (Figura 11E y H).

Ejemplo 5: Validación in vivo de anticuerpo para TDP-43

Los experimentos para la validación preclínica de los anticuerpos para TDP-43 se realizan en modelos de ratón de proteinopatía de TDP-43. Anticuerpos para TDP-43 humana se administran por inyección periférica o infusión intraventricular-cerebro mediante minibombas osmóticas. Los efectos del tratamiento se monitorizan por análisis de sangre y muestras de CSF, y análisis de peso corporal, impresión clínica general y signos de deterioro motor o cognitivo como se observa mediante, por ejemplo, pruebas conductuales que incluyen campo abierto, laberinto en Y, laberinto en cruz elevada, reconocimiento de objetos novedosos, fuerza de agarre, resistencia de la fuerza de agarre de las patas, prueba de la barra, marcha difícil en barra, rodillo giratorio, o de otro modo conocidas en la técnica. Tras completarse los estudios de tratamiento, se miden los cambios en los niveles de TDP-43 en sangre recogida y CSF y se evalúan tejidos del cerebro y la médula espinal por técnicas inmunohistoquímicas y bioquímicas cuantitativas para contenido en cerebro y médula espinal de TDP-43 fisiológica y patológica y neuropatología general.

Los modelos preclínicos útiles para validar los anticuerpos y otras moléculas de unión a TDP-43 de la invención incluyen el sistema de modelo de ratón TDP-43-A315T como se describe por Wegorzewska et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (2009), 18809-14. El ratón A315T es un modelo transgénico de proteinopatía de TDP-43, en el que el fenotipo de los ratones muestra características de tanto ALS como degeneración lobular frontotemporal con agregados de ubiquitina (FTLD-U).

Otros modelos adecuados incluyen el sistema de modelo de ratón B6.Cg-Tg (SOD1*G93A)1Gur/J como se describe por Gurney et al., Science 264 (1994), 1772-75. Esta línea de ratón expresa la forma mutante de G93A de la superóxido dismutasa 1 humana y desarrolla signos de enfermedad de las neuronas motoras seguido de progresión a muerte en el plazo de 6 a 8 meses. Estos ratones muestran una redistribución característica de TDP-43 al citoplasma de neuronas motoras y la aparición de inclusiones inmunorreactivas de TDP-43 y son, por tanto, un modelo adecuado para estudiar intervenciones farmacológicas que eligen TDP-43 como diana; véase, por ejemplo, Shan et al., Neuropharmacol, Letters 458 (2009), 70-74.

Otros experimentos para validar los anticuerpos para TDP-43 se realizan en el sistema de modelo de ratón TDP43WT como se describe por Wils et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106 (2010), 3858-63. Esta línea de ratón expresa TDP-43 humana natural y desarrolla degeneración de neuronas motoras corticales y espinales y desarrollo de tetraplejia espástica alusiva a ALS. Una degeneración dependiente de la dosis de neuronas corticales y subcorticales no motoras característica de FTLD también se observa en esta línea de ratón. Las neuronas en las regiones de la médula espinal y cerebro afectadas muestran acumulación de agregados nucleares y citoplásmicos de TDP-43 que están tanto ubiquitinados como fosforilados como se observa en pacientes con ALS/FTLD.

Otros experimentos para validar los anticuerpos para TDP-43 se realizan en un modelo independiente de enfermedad de las neuronas motoras, el modelo de ratón Wobbler (B6.B-Vps54wr/J, disponible de Jackson Laboratories) como se describe por Duchen y Strich, J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry 31 (1968), 535-42. Se informó que este modelo de ratón mostraba amplias inclusiones de ubiquitina intracelulares y distribución citoplásmica anormal de TDP-43 alusivas a ALS esporádica, véase, por ejemplo, Dennis y Citron, Neuroscience 185 (2009), 745­ 50.

Otros experimentos para validar los anticuerpos para TDP-43 se realizan en ratones transgénicos TDP-43_G348C recientemente caracterizados que expresan en exceso TDP-43_G348C genómico humano bajo el control del promotor endógeno. Swarup et al., Brain 134 (2011), 2610-2626.

Otros experimentos para validar los anticuerpos para TDP-43 se realizan en sistemas de modelo, que incluyen líneas celulares transgénicas y animales transgénicos, que expresan o expresan en exceso TDP-43, mutantes de TDP-43, tales como truncaciones del extremo C de TDP-43, mutaciones de TDP-43 observadas en una población de pacientes, o mutantes que efectúan localización celular, por ejemplo, localización nuclear de TDP-43. Los sistemas de modelo de TDP-43, por ejemplo, líneas celulares y modelos animales, para validar los anticuerpos para TDP-43 incluyen además sistemas con regulación por incremento demostrada de TDP-43 o acumulación resultante de los cambios en la expresión de un gen diferente, por ejemplo, el ratón Wobbler y modelos con regulación por disminución de progranulina. En una realización, los experimentos para validar los anticuerpos para TDP-43 se realizan en ratones que expresan TDP-43 humana con una señal de localización nuclear defectuosa en el prosencéfalo (Igaz et al., J Clin Invest, 121 (2): 726-38 (2011)); ratones transgénicos que expresan selectivamente el fragmento del extremo C de 25 kDa de Td P-43 en neuronas (Caccamo et al., Am J Pathol. 180(1):293-302 (^{20 12} )), ratones transgénicos que expresan condicionalmente TDP-43 humana natural (hTDP-43) en el prosencéfalo (Cannon et al., Acta Neuropathol. 123(6):807-23 (2012)), y ratones transgénicos con expresión ubicua de versiones naturales y causantes de enfermedad de VCP/p97 humano (Custer et al., Hum Mol Genet. 19(9): 1741-55 (2010)). En otra realización, los experimentos para validar los anticuerpos para TDP-43 se realizan en ratones transfectados con un vector AAV que codifica TDP-43 natural, TDP-43 de señal de localización nuclear defectuosa o un fragmento del extremo C truncado de TDP-43 que comprende los residuos 220 a 414 de SEQ ID NO: 94. Tatom et al., Mol. Ther. 17 (2009), 607-613.

Estudio de eficacia crónica: Para evaluar los efectos farmacológicos de los anticuerpos anti-TDP-43 humana divulgados en este documento, ratones transgénicos TDP-43_G348C (Swarup et al., Brain 134 (2011), 2610-2626) se tratan semanalmente con 10 mg/kg de inyección i.p. de un anticuerpo anti-TDP-43 humana o control de vehículo durante un periodo de 16 a 24 semanas. Después de 12 semanas de tratamiento, se recogen muestras de sangre por sangrado de la vena de la cola. Los niveles de anticuerpos anti-TDP-43 en suero se determinan por ELISA. Después de 12 semanas y 22 semanas de tratamiento, el comportamiento neurológico y cognitivo/motor se evalúa usando la prueba de campo abierto, prueba del laberinto en Y, prueba del laberinto en cruz elevada, prueba de reconocimiento de objetos novedosos, prueba de fuerza de agarre, prueba de resistencia de la fuerza de agarre de las patas (PAGE), prueba de la barra, prueba de marcha difícil en barra o prueba del rodillo giratorio. Se comparan los resultados de las pruebas del comportamiento neurológico y cognitivo/motor para animales tratados con anticuerpo y de control. El comportamiento mejorado de los animales tratados con anticuerpo indica eficacia terapéutica del anticuerpo anti-TDP-43.

Estudio de eficacia aguda: Ratones transgénicos TDP-43_G348C (Swarup et al., Brain 134 (2011), 2610-2626) se tratan con 1 a 4 inyecciones i.p. de hasta 50 mg/kg de anticuerpo anti-TDP-43 o control de vehículo en el plazo de un periodo de una semana. Al final del periodo de tratamiento, las muestras de sangre se recogen por sagrado de la vena de la cola. Los niveles de anticuerpo anti-TDP-43 en suero se determinan por ELISA. Al final del periodo de tratamiento de ¹ semana se evalúa el comportamiento neurológico y cognitivo/motor usando la prueba de campo abierto, prueba del laberinto en Y, prueba del laberinto en cruz elevado, prueba de reconocimiento de objetos novedosos, prueba de fuerza de agarre, prueba de resistencia de la fuerza de agarre de las patas (PAGE), prueba del poste, prueba de marcha difícil en barra o prueba del rodillo giratorio. Se comparan los resultados de las pruebas del comportamiento neurológico y cognitivo/motor para animales tratados con anticuerpo y de control. El comportamiento mejorado de los animales tratados con anticuerpo indica eficacia terapéutica del anticuerpo anti-TDP-43.

Ejemplo 6: Determinación de la afinidad de unión (CE ⁵⁰ ) para anticuerpos para TDP-43 humana por ELISA directo.

La concentración semimáxima eficaz (CE50) de los anticuerpos específicos para TDP-43 derivada de ser humano para TDP-43 humana y su especificidad por diana objetivo se determinó sustancialmente como se describe en el Ejemplo 2 anteriormente. Brevemente, microplacas de 96 pocillos (Corning) se recubrieron con TDP-43 de longitud completa recombinante (Biogen Idec, EE.UU.), extracto de Escherichia coli y BSA (Sigma, Buchs, Suiza), diluido a una concentración de 5 |ig/ml en tampón de recubrimiento de ELISA de carbonato (pH 9,6) durante la noche a 4 °C. Alternativamente, microplacas de la mitad de área de 96 pocillos (Corning) se recubrieron con un péptido sintético que cubría los residuos 390 a 414 del dominio del extremo C de TDP-43 con modificación de la fosforilación en los residuos 409/410 (Schafer-N, DK) y BSA (Sigma. Buchs, Suiza), diluido a una concentración de 3,3 |ig/ml en tampón de recubrimiento de ELISA de carbonato (pH 9,6) durante la noche a 4 °C. Los sitios de unión no específica se bloquearon durante 1 h, a temperatura ambiente, con PBS que contenía 2 % de BSA (Sigma, Buchs, Suiza). Los anticuerpos específicos para TDP-43 humana se diluyeron a las concentraciones indicadas y se incubaron 1 h a temperatura ambiente. La unión se determinó usando un anticuerpo secundario de burro específico dirigido contra IgGy humana conjugado con HRP (Jackson ImmunoResearch, EE.UU.), seguido de medición de la actividad de HRP en un ensayo colorimétrico convencional. Los valores de CE50 se estimaron por una regresión no lineal usando el software GraphPad Prism (San Diego, EE.UU.). Las curvas de valoración a modo de ejemplo obtenidas con los anticuerpos 41D1,21G1 31D2 y ⁸ F⁸ se muestran en las Figuras 4.

Como se ha divulgado en la Tabla ⁶ , los anticuerpos NI-205.41D1 (Fig. 4A y E), NI-205.51C1 y NI-205.21G2 se unieron a TDP-43 humana con alta afinidad a CE50 subnanomolar de 60 pM, ¹⁸⁰ pM y 240 pM, respectivamente. No se observó unión al péptido del extremo C de fosfo-TDP-43. Los anticuerpos NI-205.1A9, NI-205.3F10, NI-205.14W3, NI-205.98H6, NI-205.44B2, NI-205.9E12A, NI-205.8A2, NI-205.15F12, NI-205.10D3, NI-205.38H2, NI-205.29E11, NI-205.9E12D, NI-205.31C11, NI-205.113C4, NI-205.25.25F3, NI-205.10H7, NI-205.8C10 y NI-205.87E7 se unieron a TDP-43 humana, pero no al péptido del extremo C de fosfo-TDP-43 con CE50 nanomolar. Para estos anticuerpos, los valores de CE50 oscilaron de 1 a 18 nM (véase la Tabla 6). El anticuerpo NI-205.21G1 (Fig. 4B y F) se unió a TDP-43 de longitud completa a CE504,1 nM y reconoció péptido del extremo C de fosfo-TDP-43 con menor afinidad a CE5049,5 nM. Los anticuerpos NI-205.31D2 (Fig. 4C y G), NI-205.14H5, NI-205.36D5, NI-205.19G5 y NI-205.68G5 mostraron unión preferencial al péptido del extremo C de fosfo-TDP-43 con valores de CE50 que oscilaron de 0,7 a 17 nM (véase la Tabla 6). A diferencia, los anticuerpos NI-205.8F8, NI-205.8F8 (Fig. 4D y H) y NI-205.20A1 se unieron exclusivamente al péptido del extremo C de fosfo-TDP-43 humana con alta afinidad a CE50 nanomolar de 5 nM, 7 nM y 16 nM, respectivamente (véase la Tabla 6) de acuerdo con la idea de que la fosforilación de serina 409 y/o serina 410 se requirió para la unión.

Tabla 6: Unión de CE50 de anticuerpos para TDP-43 derivados de ser humano a TDP-43 humana recombinante y é tido del extremo C de fosfo-TDP-43.

Ejemplo 7: Análisis de unión de anticuerpo para TDP-43 humana por ELISA y transferencia de tipo Western

ELISA directos

Se realizaron ensayos de ELISA directos sustancialmente como se describe en el Ejemplo 1. Brevemente, los fragmentos de TDP-43 (SEQ ID NO: 94) que comprenden los aminoácidos 2 a 106 (dominio I), 99 a 204 (dominio II), 183 a 273 (dominio III), 258 a 414 (dominio IV) y Td P-43 de longitud completa (2 a 414) se recubrieron sobre placas de ELISA a concentración de recubrimiento igual de 6,6 |ig/ml. La unión de los anticuerpos derivados de ser humano se determinó por ELISA directo. Se muestran ejemplos de los resultados obtenidos en la Figura 5. Los anticuerpos NI-205.41 D1 (Fig. 5A), NI-205.14W3 (Fig. 5C), NI-205.44B2 (Fig. 5E), NI-205.10D3 (Fig. 5G) y NI-205.10H7 (Fig. 5L) se unieron específicamente al dominio IV de TDP-43 (aa 258 a 414). Los anticuerpos NI- NI-205.98H6 (Fig. 5D) se unieron específicamente al dominio III de TDP-43 (aa 183 a 273). Los anticuerpos NI-205.1A9 (Fig. 5B), NI-205.38H2 (Fig. 5H) y NI-205.31C11 (Fig. 5K) reconocieron específicamente el dominio II de TDP-43 (aa 99 a 204), mientras que los anticuerpos NI-205.9E12A (Fig. 5F), NI-205.29E11 (Fig. 5I), NI-205.9E12D (Fig. 5J) y NI-205.8C10 (Fig. 5M) se unieron al dominio I de TDP-43 (aa 2 a 106). Todos los anticuerpos específicos para TDP-43 derivados de ser humano también reconocieron TDP-43 humana de longitud completa. Para controlar la eficiencia del recubrimiento de los diferentes dominios de TDP-43 recombinante se usaron anticuerpos comercialmente disponibles que se unen a TDP-43 de longitud completa y un dominio de TDP-43 específico (Fig. 5W): i) Ab50930 (Abcam, RU), dominio I de TDP-43; ii) anticuerpo monoclonal para TARDBP (M01), clon 2E2-D3 (Abnova 23435, Abnova, Taiwán), dominio III de TDP-43 y iii) Ab82695 (Abcam, RU), dominio IV de TDP-43. Los anticuerpos de control se unieron a TDP-43 de longitud completa y su dominio de TDP-43 específico.

Unión a distintos dominios de TDP-43 por transferencia de tipo Western

TDP-43 de longitud completa recombinante, dominio I de TDP-43 (residuos de aminoácidos 2 a 106 de SEQ ID NO: 94), dominio II de TDP-43 dominio (residuos de aminoácidos 99 a 204 de SEQ ID NO: 94), dominio III de TDP-43 (residuos de aminoácidos 183 a 273 de SEQ ID NO: 94) y dominio IV de TDP-43 (residuos de aminoácidos 258 a 414 de SEQ ID NO: 94) se resolvieron por SDS-PAGE. La unión a dominios de TDP-43 específicos de los anticuerpos derivados de ser humano se determinó por análisis de transferencia de tipo Western.

Se muestran ejemplos de los resultados obtenidos en la Figura 6. Los anticuerpos NI-205.41D1 (Fig. 6A), NI-205.14W3 (Fig. 6F), NI-205.8A2 (Fig. 6H), NI-205.15F12 (Fig. 6I), NI-205.10D3 (Fig. 6J), NI-205.10H7 (Fig. 6L) y NI-205.21G1 (Fig. 6M) se unieron específicamente al dominio IV de TDP-43 (aa 258 a 414). Los anticuerpos NI-205.51C1 (Fig. 6B), NI-205.3F10 (Fig. 6E) y NI-205.98H6 se unieron específicamente al dominio III de TDP-43 (aa 183 a 273) mientras que los anticuerpos NI-205.21G2 (Fig. 6C), NI-205.1A9 (Fig. 6D) y NI-205.31C11 (Fig. 6K) reconocieron específicamente el dominio II de TDP-43 (99 a 204 aa). Estos trece anticuerpos específicos para TDP-43 derivados de ser humano también reconocieron TDP-43 de longitud completa humana. Solo el anticuerpo NI-205.10D3 (Fig. 6J) reconoció un señal no específica adicional, lo más probablemente un contaminante de proteína derivado de E. coli. NI-205.68G5 (Fig. 6N) y NI-205.20A1 (Fig. 6O), dos anticuerpos que muestran unión preferencial o exclusiva al péptido del extremo C de fosfo-TDP-43, no reconocieron TDP-43 de longitud completa recombinante o cualquiera de sus fragmentos. El anticuerpo específico para TDP-43 comercialmente disponible 2E2-D3 (Abnova 23435, Abnova, Taiwán) (Fig. 6P) se usó como control positivo para la detección de TDP-43 humana mientras que el anticuerpo específico para Fcy dirigido contra IgG humana (Fig. 6Q) se usó como control negativo.

Los anticuerpos derivados de ser humano NI-205.44B2, NI-205.9E12A, NI-205.38H2, NI-205.29E11, NI-205.9E12D, NI-205.113C4, NI-205.25F3, NI-205.8C10 y NI-205.87E7 reconocieron TDP-43 de longitud completa, pero no identificaron un fragmento de TDP-43 específica (datos no mostrados).

Ejemplo 8: Mapeo de epítopes con péptidos sintéticos (PepSpotting)

Los epítopes reconocidos por los anticuerpos específicos para TDP-43 derivados de ser humano dentro de la proteína TDP-43 humana se mapearon usando membranas pepscan (PepSpots, JPT Peptide Technologies, Berlín, Alemania) con 101 péptidos 15-méricos lineales con solapamiento de 11 aa entre péptidos individuales que cubrían la secuencia de proteínas TDP-43 humana entera. El mapeo con pepscan se realizó sustancialmente como se describe en el Ejemplo 3. Brevemente, los péptidos se aplicaron en puntos sobre membranas de nitrocelulosa que luego se activaron durante 5 min en metanol y posteriormente se lavaron a temperatura ambiente en TBS durante 10 min. La Tabla 7 resume los epítopes de unión para los diferentes anticuerpos específicos para TDP-43 derivados de ser humano identificados usando PepSpot.

Tabla 7: Epítopes de unión dentro de la secuencia de proteína TDP-43 humana para los diferentes anticuerpos ífi r TDP-4 riv r h m n i nifi n P . NA - n li l .

continuación

Determinación del epítope de unión de NI-205.41D1 por ensayos de ELISA.

TDP-43 de longitud completa (2 a 414) y fragmentos del extremo C de TDP-43 que comprenden los aminoácidos 258 a 414 (dominio IV), 258 a 384, 258 a 375, 258 a 362, 258 a 353, 258 a 319, 317 a 414 y 340 a 414 se recubrieron sobre placas de ELISA a concentración de recubrimiento igual de 10 |ig/ml. La unión del anticuerpo NI-205.41D1 a fragmentos de TDP-43 específica se determinó por ELISA directo. Se proporcionan ejemplos de los datos obtenidos en la Figura 7A. NI-205.41D1 se unió a todos los fragmentos recombinantes, excepto a los fragmentos 258 a 319 y 340 a 414, que indica que el epítope de unión de NI-205.41D1 estaba en la región 317 a 353 del extremo C de TDP-43. El anticuerpo NI-205.41D1 se unió a TDP-43 de longitud completa.

TDP-43 de longitud completa (2 a 414), dominio IV de TDP-43 natural que comprende los residuos 258 a 414 de SEQ ID NO: 94 (258 a 414 de TDP-43) y un dominio IV de TDP-43 mutante (258 a 414 de TDP-43 AMM321GGG) que llevan la sustitución A a G en el residuo 321, la sustitución M a G en el residuo 322 y la sustitución M a G en el residuo 323 se recubrieron sobre placas de ELISA a concentración de recubrimiento igual de 10 |ig/ml. La unión del anticuerpo NI-205.41D1 a variantes del dominio IV de TDP-43 específica se determinó por ELISA directo (Figura 7B). NI-205.41D1 se unió específicamente a TDP-43 de longitud completa y al dominio IV de TDP-43 natural, pero no al dominio IV de TDP-43 mutante, que indica que uno o más de los residuos mutados fue esencial para la unión de NI-205.41D1 a TDP-43 humana. Para controlar la eficiencia de recubrimiento de las diferentes especies de TDP-43 recombinante se usó el anticuerpo 12892-1-AP comercialmente disponible que se une a TDP-43 de longitud completa.

Péptidos biotinilados sintéticos que comprenden los residuos 316 a 353 (316 a 353 de TDP-43), 316 a 343 (316 a 343 de TDP-43) y 316 a 333 (316 a 333 de TDP-43) de SEQ ID NO: 94 se recubrieron sobre placas recubiertas con estreptavidina a concentración de recubrimiento igual de 10 |ig/ml. La unión del anticuerpo NI-205.41D1 a péptidos del extremo C de TDP-43 específica se determinó por ELISA directo (Figura 7C). NI-205.41D1 se unió específicamente a los péptidos 316 a 353 de TDP-43 y 316 a 343 de TDP-43, pero no al péptido 316 a 333 de TDP-43. Este resultado está de acuerdo con la idea de que los residuos 334 a 343 de SEQ ID NO: 94 en la región del extremo C de TDP-43 participan en la unión del anticuerpo NI-205.41D1 a TDP-43 humana. Los resultados de estos inventores están de acuerdo con un entendimiento de que el epítope de unión del anticuerpo NI-205.41 es discontinuo entre los residuos 317 a 343 de SEQ ID NO: 94 y está formado por dos regiones de unión independientes: la primera que comprende los residuos 321 a 323 de SEQ ID NO: 94 y la segunda que comprende los residuos 334 a 343 de SEQ ID NO: 94.

Ejemplo 9: Los anticuerpos específicos para TDP-43 derivados de ser humano interaccionan con TDP-43 nativa

La proteína TDP-43 de longitud completa pura tiene una tendencia natural a agregarse. Por tanto, solo cantidades muy pequeñas de TDP-43 de longitud completa soluble se recuperaron bajo condiciones de purificación convencionales. Estos inventores desarrollaron así una estrategia de expresión y purificación recombinante para aislar grandes cantidades de TDP-43 humana marcada de longitud completa marcada con 6xHis-SUMO funcional de Escherichia coli usando KSCN y arginina, agentes caotrópicos suaves conocidos por preservar la estructura de proteínas nativas a la vez que previenen la agregación de proteínas.

Plásmidos: Polinucleótidos que codifican TDP-43 de longitud completa humana (1 a 414 de SEQ ID NO: 94) y sus residuos de truncación 101 a 265 y los residuos 220 a 414 de SEQ ID NO: 94 se amplificaron usando procedimientos convencionales y se subclonaron en un vector pET19-b modificado (Novagen) produciendo marcas de 6xHis y SUMO en el extremo N de la proteína codificada por los polinucleótidos amplificados. Una representación esquemática de los polipéptidos recombinantes marcados con 6xHis/SUMO se muestra en la Figura 8B.

Expresión y purificación de proteínas: Plásmidos de expresión de TDP-43 marcados con 6xHis/SUMO se transformaron en Escherichia coli BL21(DE3) Star (Invitrogen). Los cultivos bacterianos se cultivaron a una DO600 de 1,0 a 37 °C y se indujeron con IPTG 1 mM durante 16 h a 18 °C. Después de la sedimentación, las células se lisaron por microfluidización en tampón de purificación con inhibidores de proteasa (HEPES 40 mM (pH 7,5), KSCN 1,5 M y tris(2-carboxietil)fosfina 1 mM (TCEP), PMSF 1 mM, pepstatina 5 |iM, benzamina 1 mM, bestatina 10 |iM, E-64 10 |iM, leupeptina 20 |iM, aprotinina 1,5 |iM). Para generar apropiadamente TDP-43 de longitud completa plegada, TDP-43 (101 a 265) y TDP-43 (220 a 414), las proteínas de fusión marcadas con 6xHis-SUMO correspondientes se purificaron sobre resina de agarosa Ni-NTA (Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante, usando tampón de purificación para la unión y el lavado. Las proteínas unidas se eluyeron de la resina de Ni-NTA con el mismo tampón que contenía imidazol 250 mM y se purificaron además sobre una columna de exclusión por tamaño S200 preparativa (GE Healthcare) siguiendo las instrucciones del fabricante usando tampón de purificación. Las fracciones que contenían proteínas TDP-43 monoméricas se reunieron, y se re-formularon en un tampón que contenía HEPES 40 mM (pH 7,5), arginina 400 mM, TCEP 1 mM por diálisis. 6xHis-SUMO-TDP43 (101 a 265) se purificó además usando la misma estrategia de purificación, pero alterando las composiciones del tampón sustituyendo KSCN 1,5 M con KCl 0,5 M. Para preparar 6xHis-TDP-43 sin plegar, las células se lisaron por microfluidización en un tampón Tris-imidazol (Tris 50 mM (pH 7,5), imidazol 20 mM, NaCl 150 mM) con inhibidores de proteasa. El sedimento insoluble se lavó secuencialmente con los siguientes tampones que contenían inhibidores de proteasa: tampón B-PER (Pierce) que contenía MgCh 2 mM, seguido de tampón Tris-imidazol. Los sedimentos lavados se solubilizaron a continuación en urea 8 M, fosfato de sodio 20 mM (pH 7,8). Entonces, el material soluble en urea se purificó sobre resina de agarosa Ni-NTA siguiendo las instrucciones del fabricante, usando condiciones de lavado y elución desnaturalizantes. La determinación de los coeficientes de sedimentación y difusión (Figura 8C), además de la separación de SDS-PAGE (Figura 8A), se llevaron a cabo mediante procedimientos convencionales (Laue, T. et al. (1992) en Analytical Ultracentrifugation in Biochemistry and Polymer Science (Harding, S. E., ed) Royal Society of Chemistry, Cambridge, RU).

ELISA de captura: Placas de 96 pocillos (Thermo Fisher Scientific) se recubrieron con anticuerpo monoclonal de ratón anti-6xHis (Clontech) diluido a una concentración de 1 |ig/ml en tampón PBS (NaCl 137 mM, Na2HPO48,05 mM, KH2PO41,5 mM, KCl 2,7 mM, pH 7,4) a 4 °C durante la noche. Los sitios de unión no específicos se bloquearon durante 1 h a TA con PBS que contenía 1 % de BSA (Sigma) y 0,05 % de Tween-20 (Fisher Scientific). Las proteínas 6xHis-SUMO-TDP43 a una concentración de 1,7 |iM se dejaron unir a placas recubiertas de anticuerpo durante 1 h a TA en tampón PBS que contenía 1 % de BsA, arginina 300 mM y 0,1 % de PEG 5000, pH 7,5. Las placas se incubaron durante 1 h a TA con anticuerpos humanos de esta invención, se valoraron en una serie triple de dilución, seguido de Fcy dirigido contra IgG humana conjugado con HRP (Jackson ImmunoResearch) en PBST que contenía 1 % de BSA. La actividad de HRP se midió en un ensayo colorimétrico convencional. Los valores de CE50 se calcularon usando un ajuste de la curva logística de cuatro parámetros en el software Softmax pro (Molecular Devices).

Ensayo de unión a ARN: Las afinidades de unión en equilibrio de construcciones de TDP-43 por ARN se determinaron usando polarización por fluorescencia. Sustratos de ARN marcados con el fluoróforo 5'TYETM, ARN específico (TYETM-UGUGUGUGUGUG) (SEQ ID NO: 312) y control de ARN (TYETM-UUUUUUUUUUUU) (SEQ ID NO: 313) (Integrated DNA Technologies), se incubaron a una concentración de 5 nM durante 30 min a 25 °C con TDP-43 (concentraciones finales 0 a 20 |iM) en tampón de incubación como se indica. La polarización por fluorescencia se midió con el lector de placas-fluorímetro Envision (PerkinElmer) a cada concentración de TDP-43 en un formato de placa de 96 pocillos con una excitación a 645 nm y emisión a 665. Las Kd se calcularon usando la ecuación cuadrática para la estrecha unión (ecuación de Morrison) usando Sigmaplot (Systat Software Inc.). Para determinar la estequiometría de la unión de ARN/TDP-43, se usó el mismo equipo experimental de polarización por fluorescencia con la adición de 95 nM de ARN sin marcar de la misma secuencia para una concentración de ARN total de 100 nM (>7x superior a los valores de Kd previamente determinados). Las estequiometrias se calcularon midiendo la ordenada en el origen de dos líneas rectas, un ajuste usando puntos de datos del estado parcialmente unido y el otro usando puntos de datos del estado completamente unido.

La TDP-43 de longitud completa recombinante fue monomérica mediante análisis de sedimentación (Figura 8C) en tampón que contenía arginina 400 mM. Se mantuvo un mínimo de arginina 300 mM en ensayos analíticos cuando se deseó TDP-43 nativa monomérica, debido a que la agregación se observó a menores concentraciones de arginina. De acuerdo con que la arginina no afecta adversamente a la actividad de TDP-43, la TDP-43 de longitud completa recombinante de estos inventores se une a un ARN de secuencia específica previamente establecida (UGUGUGUGUGUG (SEQ ID NO: 312)) con afinidad al menos 30 veces superior que una secuencia no específica genérica (UUUUUUUUUUUU (SEQ ID NO: 313)) (Figura 9).

Estos inventores también purificaron un fragmento de TDP-43 marcado con 6xHis/SUMO que comprendía los residuos de aminoácidos 101 a 265 de SEQ ID NO: 94 de los que se eliminó el dominio del extremo C (aminoácidos 265 a 414) que se sabía que mediaba en la agregación. El fragmento de TDP-43 truncado en 101 a 265 marcado con 6xHis/SUMO, purificado con o sin caótropos, mantuvo una afinidad de unión por la secuencia de ARN específica muy similar a la K^d previamente informada (~ 14 nM) a pesar de los procedimientos analíticos muy diferentes usados (Figura 9). Véase Kou Nucleic Acids Res. 2009, 37:1799-808. La estequiometría de la unión de ARN/TDP-43 también fue la misma independientemente de la estrategia de purificación, que indica que no hubo diferencia significativa en la población de proteínas desnaturalizadas entre las dos preparaciones (Figura 9). Juntos, estos datos indicaron que la TDP-43 de longitud completa pura recombinante purificada estaba en su estado de plegamiento nativo.

Estos inventores midieron la afinidad de unión de los anticuerpos específicos para TDP-43 derivados de ser humano proporcionados en este documento por TDP-43 marcada con 6xHis/SUMO apropiadamente plegada usando un ELISA de captura en el que TDP-43 nativa se inmovilizó sin adsorción directa sobre la superficie de la placa de ELISA. Esto se logró inmovilizando un anticuerpo anti-6xHis que luego capturó TDP-43 nativa. La unión a la marca anti-6xHis por TDP-43 de longitud completa humana marcada con 6xHis/SUMO plegada se logró a concentración de arginina 300 mM, asegurando un estado monomérico de TDP-43. Después de esta etapa de inmovilización, la unión por anticuerpos humanos se probó en tampones regulares sin interferencia de agregación de TDP-43. Un ejemplo de las curvas de valoración generadas se muestra en la Figura 10. La Tabla 8 resume las afinidades (CE50 [nM]) por TDP-43 marcada con 6xHis/SUMO de longitud completa plegada, o por una construcción de truncación marcada con 6xHis/SUMO que contiene la región propensa a la agregación del extremo C de TDP-43 (residuos 220 a 414 de SEQ ID NO: 94) por este procedimiento de ELISA de captura.

Tabla 8: Unión de CE50 [nM] de anticuerpos para TDP-43 derivados de ser humano a TDP-43 de longitud completa marcada con 6xHis/SUMO recombinante apropiadamente plegada y TDP-43 truncada marcada con 6xHis/SUMO ue com rende los residuos 220 a 414.

Ejemplo 10: Evaluación de anticuerpo para TDP-43 derivado de ser humano que se une a TDP-43 en tejidos hipocámpicos de pacientes con FTLD-U y de control.

Tejidos de FTLD-U cortical, hipocámpica y de médula espinal y de control humanos se obtuvieron de IDIBAPS Biobank (Banc de Teixits Neurologics, Barcelona). La inmunohistoquímica se realizó en secciones incorporadas en parafina de 5 |im de espesor usando recuperación de epítopes basada en EDTA antes de realizar los procedimientos inmunohistoquímicos de otro modo convencionales con kits Elite ABC (Vector Laboratories) con DAB (Thermo Scientific). La inmunohistoquímica se realizó usando los anticuerpos para TDP-43 humana de la invención a concentración 50 nM. Las tinciones de control se hicieron usando anticuerpo monoclonal de ratón 2E2 contra TDP-43 humana (Abnova), anticuerpo policlonal de conejo p409/p410 producido contra p409/p410 de TDP-43 (CosmoBio) y anticuerpo policlonal de conejo p409/p410 producido contra p409/p410 de TDP-43 (CosmoBio).

La capacidad de los anticuerpos anti-TDP-43 derivados de ser humano descritos en este documento para reconocer formas nativas y patológicas de TDP-43 se caracterizó por experimentos de inmunohistoquímica en tejidos hipocámpicos de pacientes con FTLD-U humana (10) y de control (7). TDP-43 es una proteína predominantemente nuclear que se transporta a y del citoplasma. Bajo afecciones patológicas se acumula en el núcleo y particularmente en el citoplasma, y la patología se caracteriza/clasifica normalmente basándose en la localización celular; NCI -inclusión citoplásmica neuronal, NII - inclusión intranuclear neuronal, y patología neurítica distrófica (revisado en Mackenzie et al., Lancet Neurology, 9: 995-1007 (2010)). En tejidos de pacientes con FTLD-U y ALS también se encuentra que la proteína está fosforilada. Las características de unión de TDP-43 humana de los anticuerpos divulgados en este documento se compararon con las de anticuerpos comercialmente disponibles comúnmente usados para diagnosticar pacientes cadavéricos. El anticuerpo de control 2E2-D3 (epítope mapeado con aa 205 a 222; Zhang et al., Neurosci. Lett., 434: 170-174 (2008)) reconoció la acumulación de TDP-43 nuclear y citoplásmica en neuronas piramidales hipocámpicas (Figura 11A) y células granulosas (Figura 11B), además de TDP-43 en neuritas distróficas (Figura 11C). En tejidos de pacientes de control, 2E2-D3 reconoció predominantemente TDP-43 nuclear. El anticuerpo específico de fosforilación, p403/p404 (producido contra CNGGFGS(p)S(p)MDSK (SEQ ID NO: 324); Hasegawa et al., Ann Neurol, 64(l):60-70 (2008)) reconoció (Figura 11D) TDP-43 citoplásmica en células piramidales, (Figura 11E) acumulación nuclear y citoplásmica en células granulosas, además de (Figura 11F) TDP-43 en neuritas distróficas. Un segundo anticuerpo específico de fosforilación, p409/p410 (producido contra CMDSKS(p)S(p)GWGM (SEQ ID NO: 325); Hasegawa et al., Ann Neurol, 64(1):60-70 (2008)) se unió a TDP-43 que se acumula en el núcleo y citoplasma de (Figura 11G) células piramidales y (Figura 11H) células granulosas, además de (Figura 11I) TDP-43 en neuritas distróficas.

Los anticuerpos anti-TDP-43 derivados de ser humano descritos en este documento mostraron diversos patrones de tinción, que incluyen unión a formas nucleares, citoplásmicas y neuríticas de TDP-43. Varios de los anticuerpos anti-TDP-43 derivados de ser humano descritos en este documento se unieron específicamente a formas de enfermedad de TDP-43, en comparación con la tinción en tejidos de pacientes de control de individuos sanos (Figura 11 y Tabla 9). Por ejemplo, los anticuerpos NI-205.68G5, NI-205.14W3, NI-205.21G1 y NI-205.41D1 se unieron selectivamente a formas patológicas, es decir, a TDP-43 neurítica, y TDP-43 nuclear y citoplásmica en células granulosas hipocámpicas. Los anticuerpos NI-205.14W3, NI-205.21G1 y NI-205.41D1 se unieron específicamente a formas patológicas de TDP-43 en tejidos de pacientes con FTLD-U sin unión a tejidos de pacientes de control (véase la tinción de NI-205.41D1 en tejidos de pacientes con FTLD-U (Figura 11Y) y tejido de pacientes de control (Figura 11Z)).

El anticuerpo (Fig. 11J) NI-205.10D3 se unió predominantemente a TDP-43 nuclear, mientras que (Fig. 11K) NI-205.8C10 se unió a TDP-43 en citoplasma y axones. A diferencia de los anticuerpos anti-TDP-43 de control analizados, un subconjunto de los anticuerpos anti-TDP-43 humanos informados en este documento se unió predominantemente a TDP-43 citoplásmica, en vez de a TDP-43 nuclear. Los anticuerpos que se unieron predominantemente a TDP-43 citoplásmica incluyen (Fig. 11L) NI-205.15F12, (Fig. 11M) NI-205.8A2, (Fig. 11N) NI-205.3F10, (Fig. 11O) NI-205.21G2, (Fig. 11P) NI-205.8F8, (Fig. 11Q) NI-205.31C11 (Fig. 11R) NI-205.36D5, (Fig. 11S) NI-205.31 D2, (Fig. 11T) NI-205.10H7 y (Fig. 11U) NI-205.14H5. Los anticuerpos (Fig. 11V) NI-205.68G5, (Fig. 11W) NI-205.14W3, (Fig. 11X) NI-205.21G1 y (Fig. 11Y) NI-205.41D1 se unieron a TDP-43 neurítica y TDP-43 que se acumula en el núcleo y citoplasma en células granulosas hipocámpicas.

Tabla 9: Evaluación de anticuerpo para TDP-43 derivado de ser humano que se une a TDP-43 en tejidos hipocámpicos de pacientes con FTLD-U y de control. Las muestras de pacientes y de control también se tiñeron con anticuer os ant -TDP-43 de control 2E2-D3 403/ 404 409/ 410. ND - no determinado

continuación

La selección de anticuerpos anti-TDP-43 humana usando TDP-43 recombinante desnaturalizada y el péptido 390 a 414 de TDP-43 fosforilado en los residuos S409 y S410 produjo la generación de anticuerpos que cubren la mayoría de los epítopes naturales y relacionados con enfermedad de TDP-43 humana. Los anticuerpos anti-TDP-43 humana divulgados en este documento identifican epítopes nuevos e interesantes de TDP-43, y proporcionan novedosa información conformacional específica para el proceso de enfermedad de proteinopatías de TDP-43. Por ejemplo, NI-205.14W3, NI- 205.21G1 y NI-205.41D1 se unieron a TDP-43 con alta afinidad y fueron específicos para formas patológicas de TDP-43 sobre tejidos de FTLD-U en comparación con pacientes de control. Aunque estos tres anticuerpos tuvieron patrón de tinción específica para TDP-43 patológica similar en inmunohistoquímica, reconocieron distintos epítopes en la región del extremo C propensa a la agregación de TDP-43: NI-41D1 se unió a un epítope discontinuo en la porción del extremo C de TDP-43 y NI-21G1 se unió a una región propensa a la fosforilación de TDP-43. Además, los anticuerpos NI-205.14H5 y NI-205.31D2 tuvieron alta afinidad por TDP-43 fosforilada en uno o ambos de los residuos S409 y S410, y específicamente tiñeron TDP-43 citoplásmica en inmunohistoquímica. Además, NI-205.21G2 y NI-205.51C1 también demostraron alta afinidad por TDP-43, y se unieron a epítopes del extremo N con respecto al sitio de escisión de caspasa predicho, uniéndose NI-205.51 C1 al motivo 2 de reconocimiento de ARN (RRM2). NI-205.10D3 tiñó específicamente TDP-43 nuclear en tanto tejidos de pacientes con FTLD-U como de control, lo que sugiere que se unió a formas endógenas/nativas de TDP-43.

Ejemplo 11: Estudio de penetración cerebral aguda

Se inyectaron intraperitonealmente en ratones transgénicos TDP-43_G348C (Swamp et al., Brain 134 (2011), 2610­ 2626) 30 mg/kg de anticuerpo humano anti-TDP-43 o volumen igual de PBS en el día 1 y el día 4. En el día 5, los ratones se perfunden bajo anestesia con PBS que contiene 1 unidad/ml de heparina. La sangre, cerebro y médula espinal se recogen para análisis. El hemisferio derecho del cerebro se congela a -80 °C, el hemisferio izquierdo del cerebro y la médula espinal se fijan posteriormente en 10 % de formalina neutralizada a 4 °C durante dos días antes de incorporarse en bloque de parafina y seccionarse. El plasma se almacena a -80 °C en alícuotas.

Extracción de proteína del cerebro: Las fracciones de proteína del cerebro se extraen usando procedimientos experimentales convencionales, por ejemplo, el hemisferio derecho congelado se pesa y se homogeneiza en 5 volúmenes (5 ml/g de tejido húmedo) de una disolución que contiene NaCl 50 mM, 0,2 % de dietilamina, inhibidores de proteasa (Roche Diagnostics GmbH) e inhibidor de fosfatasa (Roche Diagnostics GmbH). Entonces, las muestras se transfieren a tubos de policarbonato y se añaden otros 5 volúmenes de disolución de homogenización, y se mantienen sobre hielo durante 30 min. Entonces, la fracción soluble se recoge después de la centrifugación a 100.000 g, 4 °C durante 30 min. Esta fracción soluble se usa en ensayo de IgG humana. El sedimento se resuspende en 3 volúmenes de PBS con inhibidor de proteasa y fosfatasa. Después de la centrifugación a 16.000 g, 4 °C durante 30 min, los sobrenadantes y sedimentos se almacenan por separado a -80 °C para la posterior extracción de TDP-43 insoluble.

El anticuerpo humano y TDP-43 se detectan y cuantifican en los extractos de proteína del cerebro usando procedimientos experimentales convencionales. Por ejemplo, ELISA tipo sándwich específico de IgG humana: como anticuerpo de captura se usan 2 |ig/ml de Fab de cabra dirigido contra IgG humana (Jackson) en tampón de recubrimiento de ELISA de carbonato 50 mM (pH 9,6). Placas de microtitulación de 96 pocillos de la mitad de área se recubren con 30 |il/pocillo con anticuerpo de captura a 4 °C durante la noche. Entonces, la placa se lava 4 veces con PBS que contiene 0,1 % de Tween 20 antes de incubar con 50 |il/pocillo de PBS que contiene 2 % de BSA a temperatura ambiente durante una hora. Las fracciones solubles de extractos de cerebro, muestras de plasma y patrón de anticuerpo humano se diluyen en PBS que contiene 2 % de BSA y 0,1 % de Tween 20. 30 |il de las muestras diluidas se añaden a cada pocillo y se incuban a temperatura ambiente durante una hora. Entonces, la placa se lava con 200 |il/pocillo de PBS que contiene 0,1 % de Tween 20 durante cuatro veces antes de incubar con Fcy de burro anti-humano conjugado con HRP (Jackson, diluido a 1:10.000 en PBS que contiene 2 % de BSA y 0,1 % de Tween 20) a temperatura ambiente durante una hora. Entonces, la placa se lava con 200 |il/pocillo de PBS que contiene 0,1 % de Tween 20 durante cuatro veces antes de añadir 20 |il/pocillo de TMB (1:20 en disolución de citrato 10 mM a pH=4,1). La reacción se detiene entonces añadiendo 10 |il de H2SO41 M a cada pocillo. La curva patrón del anticuerpo se obtiene a partir de diluciones sucesivas de anticuerpo de control. Las concentraciones de anticuerpo en muestras de plasma y cerebro se calculan según los patrones. El nivel de IgG humana en cerebro se convierte entonces en |ig de anticuerpo/gramo de tejido de cerebro fresco.

La penetración neuronal del anticuerpo anti-TDP-43 humana administrado se detecta por tinción inmunohistológica de secciones de tejido de cerebro obtenidas de animales tratados con anticuerpo humano anti-TDP-43 y de control. Por ejemplo, secciones de tejido de libre flotación se lavan en Tris-Triton a pH 7,4 (Tris 50 mM, NaCl 150 mM, 0,05 % de Triton X-100), se incuban en 1 % de H2O2-PBS durante 30 min y se incuban con una disolución de bloqueo que contiene 2 % de suero de cabra y caballo normal en Tris-Triton y con 0,2 % de Triton X-100 adicional durante 1 h a temperatura ambiente. Las secciones se incuban entonces con IgG anti-humana de burro biotinilado (H+L) (Jackson ImmunoResearch Labs, 709-065-149) a 1:200 en disolución de bloqueo durante 16 h a 4 °C con agitación a 100 rpm para detectar IgG humana neuronal. El anticuerpo biotinilado unido a tejido se visualiza por reacción cromogénica de peroxidasa usando el kit Vectastain Elite ABC (Vector Laboratories, PK6100, 1:100). La reacción enzimática se detiene con PBS helado y las secciones se lavan en PBS 3 veces. Entonces, las secciones se montan sobre portaobjetos de vidrio y se secan al aire durante la noche antes de contrateñirse con disolución de hemalum (Carl Roth GmbH Co. t 865,1). Después de las etapas de deshidratación, los portaobjetos se cubren con cubreobjetos antes de explorarse con el sistema de microscopio virtual Olympus dotSlide 2.1. La tinción de IgG anti­ humana neuronal observada en los animales tratados con anticuerpo, pero no en los animales de control, indica que el anticuerpo humano anti-TDP-43 entra en las neuronas.

Ejemplo 12: Estudio crónico con anticuerpos anti-TDP-43.

Se inyectaron intraperitonealmente en ratones transgénicos TDP-43_G348C (Swamp et al. Brain 134 (2011), 2610­ 2626) 10 mg/kg, 3 mg/kg de disolución de anticuerpo, o volumen igual de control de PBS. Cada grupo de tratamiento tiene 20 a 25 ratones. El tratamiento se lleva a cabo una vez a la semana durante 26 semanas. Alternativamente, el tratamiento se lleva a cabo dos veces a la semana durante 13 semanas. El peso corporal se monitoriza cada dos semanas. Los ratones se perfunden bajo anestesia al final del periodo de tratamiento. Se recoge cerebro, médula espinal y sangre. La mitad del cerebro y la médula espinal se fijan posteriormente en 10 % de formalina durante tres días antes de incorporarse en bloque de parafina. Secciones de 4 a 6 |im de espesor cortadas de estos bloques de tejido se usan para estudios de inmunohistoquímica. La otra mitad del cerebro se pesa y se ultracongela a 80 °C para análisis bioquímicos.

Los efectos del fármaco se evalúan comparando el nivel y distribución de TDP-43, que incluye el nivel y distribución de formas patológicas de TDP-43 en animales tratados con anticuerpo y de control usando inmunohistoquímica. Las muestras de tejido obtenidas de animales tratados con anticuerpo y de control se tiñen con un anticuerpo anti-TDP-43, por ejemplo, un anticuerpo anti-TDP-43 específico para formas patológicas de TDP-43, usando procedimientos histológicos convencionales. En una realización, el anticuerpo usado en el análisis histoquímico es el mismo que el anticuerpo administrado a los animales. En otra realización, el anticuerpo usado en el análisis histoquímico es diferente del anticuerpo administrado a los animales. La eficacia terapéutica de los anticuerpos humanos anti-TDP-43 divulgada en este documento se indica por una reducción en el nivel, o ausencia de formas patológicas, de TDP-43 en animales tratados con anticuerpo con respecto a animales de control.

Los efectos de los fármacos también se evalúan comparando el nivel de TDP-43, que incluye el nivel de formas patológicas de TDP-43 en animales tratados con anticuerpo y de control, usando ELISA o transferencia de tipo Western. La eficacia terapéutica de los anticuerpos humanos anti-TDP-43 divulgada en este documento se indica por una reducción en el nivel, o ausencia de formas patológicas, de TDP-43 en animales tratados con anticuerpo con respecto a animales de control.

Claims (17)

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo anti-proteína de unión a ADN de TAR de 43 kDa (TDP-43), o un fragmento de unión a TDP-43 del mismo, que comprende un dominio variable de cadena pesada (VH) y un dominio variable de cadena ligera (VL), en donde:

(i) el VH comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 130 y el VL comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 134; o

(ii) el VH comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 259 y el VL comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 263.

2. El anticuerpo anti-TDP-43 o fragmento de unión a TDP-43 de la reivindicación 1, que es un anticuerpo humano o un anticuerpo quimérico.

3. El anticuerpo anti-TDP-43 o fragmento de unión a TDP-43 de la reivindicación 1, que es un fragmento de unión a TDP-43 seleccionado del grupo que consiste en un fragmento Fv monocatenario (scFv), un fragmento F(ab'), un fragmento F(ab) y un fragmento F(ab')2.

4. Un polinucleótido o polinucleótidos aislados que comprenden una secuencia de nucleótidos o secuencias de nucleótidos que codifican el anticuerpo anti-TDP-43 o fragmento de unión a TDP-43 de la reivindicación 1.

5. El polinucleótido aislado o polinucleótidos de la reivindicación 4, en donde:

(i) la secuencia de nucleótidos que codifica el VH comprende la secuencia de ácido nucleico expuesta en la SEQ ID NO: 275 y la secuencia de nucleótidos que codifica el VL comprende la secuencia de ácido nucleico expuesta en la SEQ ID NO: 276; o

(ii) la secuencia de nucleótidos que codifica el VH comprende la secuencia de ácido nucleico expuesta en la SEQ ID NO: 308 y la secuencia de nucleótidos que codifica el VL comprende la secuencia de ácido nucleico expuesta en la SEQ ID NO: 309.

6. Un vector o vectores que comprenden el polinucleótido o los polinucleótidos de la reivindicación 4 o la reivindicación 5.

7. Una célula huésped aislada que comprende el polinucleótido o los polinucleótidos la reivindicación 4 o la reivindicación 5, o el vector o los vectores de la reivindicación 6.

8. Un método para preparar un anticuerpo anti-TDP-43 o fragmento de unión a TDP-43 del mismo, comprendiendo el método:

(a) cultivar la célula huésped de la reivindicación 7; y

(b) aislar el anticuerpo anti-TDP-43 o fragmento de unión a TDP-43 del mismo del cultivo.

9. Un anticuerpo anti-TDP-43 aislado o fragmento de unión a TDP-43 del mismo obtenido mediante el método de la reivindicación 8.

10. El anticuerpo anti-TDP-43 o fragmento de unión a TDP-43 del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o 9, que está marcado con un marcador detectable seleccionado del grupo que consiste en una enzima, un radioisótopo, un fluoróforo y un metal pesado.

11. El anticuerpo anti-TDP-43 o fragmento de unión a TDP-43 del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o 9, que está unido a un fármaco.

12. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo anti-TDP-43 o fragmento de unión a TDP-43 del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o 9 a 11, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

13. Una composición de diagnóstico que comprende el anticuerpo anti-TDP-43 o fragmento de unión a TDP-43 del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o 9 a 11, y un reactivo de inmunodiagnóstico o diagnóstico basado en ácido nucleico.

14. El anticuerpo anti-TDP-43 o fragmento de unión a TDP-43 del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o 9 a 11, o la composición farmacéutica de la reivindicación 12, para su uso en el tratamiento profiláctico o terapéutico de una proteinopatía de TDP-43 en un sujeto humano, en donde la proteinopatía de TDP-43 se selecciona del grupo que consiste en enfermedad de granos argirófilos, enfermedad de Alzheimer, esclerosis lateral amiotrófica (ALS), complejo de ALS-parkinsonismo-demencia de Guam, degeneración corticobasal, demencia con cuerpos de Lewy, enfermedad de Huntington, enfermedad de cuerpos de Lewy, enfermedad de las neuronas motoras, degeneración lobular frontotemporal (FTLD), demencia frontotemporal, degeneración lobular frontotemporal con inclusiones positivas para ubiquitina, esclerosis hipocámpica, miopatía de cuerpos de inclusión, miositis de cuerpos de inclusión, enfermedad de Parkinson, demencia por enfermedad de Parkinson, complejo de Parkinsondemencia en la península de Kii y enfermedad de Pick.

15. Un método para diagnosticar una proteinopatía de TDP-43 en un sujeto humano, comprendiendo el método: (a) evaluar el nivel de TDP-43 en una muestra del sujeto, opcionalmente en donde la muestra es una muestra de sangre, orina o líquido cefalorraquídeo, con el anticuerpo anti-TDP-43 o fragmento de unión a TDP-43 del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o 9 a 11; y

(b) comparar el nivel de TDP-43 en la muestra con un patrón de referencia que indica el nivel de TDP-43 en un sujeto de control,

en donde el patrón de referencia es de un sujeto que tiene una proteinopatía de TDP-43, y en donde una similitud entre el nivel de TDP-43 en la muestra y el patrón de referencia indica que el sujeto tiene una proteinopatía de TDP-43, y/o

en donde el patrón de referencia es de un sujeto que no tiene una proteinopatía de TDP-43, y en donde una diferencia entre el nivel de TDP-43 en la muestra y el patrón de referencia indica que el sujeto tiene una proteinopatía de TDP-43, y

en donde la proteinopatía de TDP-43 se selecciona del grupo que consiste en enfermedad de granos argirófilos, enfermedad de Alzheimer, esclerosis lateral amiotrófica (ALS), complejo de ALS-parkinsonismo-demencia de Guam, degeneración corticobasal, demencia con cuerpos de Lewy, enfermedad de Huntington, enfermedad de cuerpos de Lewy, enfermedad de las neuronas motoras, degeneración lobular frontotemporal (FTLD), demencia frontotemporal, degeneración lobular frontotemporal con inclusiones positivas para ubiquitina, esclerosis hipocámpica, miopatía de cuerpos de inclusión, miositis de cuerpos de inclusión, enfermedad de Parkinson, demencia por enfermedad de Parkinson, complejo de Parkinson-demencia en la península de Kii y enfermedad de Pick.

16. El anticuerpo anti-TDP-43 o fragmento de unión a TDP-43 del mismo de la reivindicación 10 para su uso en la detección in vivo de TDP-43 en un sujeto humano.

17. El anticuerpo anti-TDP-43 o fragmento de unión a TDP-43 del mismo para su uso de la reivindicación 16, en donde la detección in vivo comprende detectar el marcador detectable en el sujeto humano mediante tomografía de emisión de positrones (PET), tomografía de emisión de un único fotón (SPECT), obtención de imágenes ópticas de infrarrojo cercano (NIR) o resonancia magnética nuclear (MRI).