EA032003B1 - Анти-tdp-43 антитело - Google Patents

Анти-tdp-43 антитело Download PDF

Info

Publication number
EA032003B1
EA032003B1 EA201490825A EA201490825A EA032003B1 EA 032003 B1 EA032003 B1 EA 032003B1 EA 201490825 A EA201490825 A EA 201490825A EA 201490825 A EA201490825 A EA 201490825A EA 032003 B1 EA032003 B1 EA 032003B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
seq
tdp
antibody
antibodies
amino acid
Prior art date
Application number
EA201490825A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201490825A1 (ru
EA201490825A8 (ru
Inventor
Нитш Рожер
Кристоф Хок
Мария Грация Баренко Монтрасио
Фабио Монтрасио
Ян Гримм
Жан-Люк Берисвиль
Пол Вейнреб
Янаки Кумарасвами
Омар Куинтеро-Монзон
Original Assignee
Байоджен Айдек Интернэшнл Нейросайенз Гмбх
Юниверсити Оф Цюрих
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Байоджен Айдек Интернэшнл Нейросайенз Гмбх, Юниверсити Оф Цюрих filed Critical Байоджен Айдек Интернэшнл Нейросайенз Гмбх
Publication of EA201490825A1 publication Critical patent/EA201490825A1/ru
Publication of EA201490825A8 publication Critical patent/EA201490825A8/ru
Publication of EA032003B1 publication Critical patent/EA032003B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/06—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations
    • A61K49/08—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations characterised by the carrier
    • A61K49/10—Organic compounds
    • A61K49/14—Peptides, e.g. proteins
    • A61K49/16—Antibodies; Immunoglobulins; Fragments thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/10—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody
    • A61K51/1018—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/02—Drugs for disorders of the nervous system for peripheral neuropathies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/2814—Dementia; Cognitive disorders

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Radiology & Medical Imaging (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Psychology (AREA)

Abstract

Изобретение относится к области иммунотерапии TDP-43 протеинопатий. Предложены анти-TDP-43 (TAR-ДНК-связывающий белок 43 кДа) антитела или их TDP-43-связывающие фрагменты, характеризующиеся участки CDR, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 131, 132 и 133, SEQ ID NO: 135, 136 и 137 или SEQ ID NO: 260, 261 и 262, 264, 265 и 266 соответственно. Также описаны выделенные полинуклеотиды, кодирующие указанные антитела, вектор, содержащий такой полинуклеотид, клетка-хозяин, содержащая полинуклеотид или вектор, способ получения указанного анти-TDP-43 антитела или его TDP-43-связывающего фрагмента, фармацевтические и диагностические композиции, содержащие анти-TDP-43 антитело или его фрагмент, и варианты их терапевтического и диагностического применения.

Description

Настоящее изобретение в целом относится к новым TDP-43-(TAR ДНК-связывающего белка 43 кДа)-антителам, включая их фрагменты, специфически связывающим TDP-43. Кроме того, изобретение относится к фармацевтическим и диагностическим составам/композициям, содержащим такие антитела, и к их применению для обнаружения и идентификации TDP-43 в плазме, спинномозговой жидкости, мозге и других образцах, а также к терапевтическим применениям, которые включают, например, пассивную стратегию вакцинации для лечения расстройств, связанных с агрегатами или другими аберрациями в TDP-43 экспрессии, таких как лобно-височная дегенерация и/или боковой амиотрофический склероз, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона и другие TDP-43 протеинопатии.
Уровень техники
Лобно-височная (лобная) дегенерация (ЛВД) является второй наиболее частой причиной деменции, затрагивающей лиц моложе 65 лет; см., например, McKhann et al., Arch. Neurol. 58 (2001), 1803; Forman et al., Ann. Neurol. 59 (2006), 952-62. Ha клеточном патологическом уровне характерными поражениями в большинстве мозгов с ЛВД ненормальными являются убиквитинированные белковые включения. Биохимический состав убиквитинированных включений в наиболее распространенных патологических формах ЛВД, а именно ЛВД-U, оставался неизвестным до 2006 года, когда TAR-ДНК-связывающий белок 43 (TDP-43) был определен в качестве основного белка болезни в большинстве спорадических и семейных случаев ЛВД-U. Впоследствии было обнаружено, что убиквитинированные компактные включения, характерные для бокового амиотрофического склероза (БАС), состоят из TDP-43, тем самым обеспечивая доказательства того, что оба условия механически связаны и часть спектра заболеваний, которые можно классифицировать как TDP-43 протеинопатии, см., например, Neumann et al., Science 314 (2006), 130-133.
Известно, что кроме ЛВД и БАС, TDP-43 также накапливаются в нервных клетках и глиальных клетках при комплексе деменция-БАС-паркинсонизм Гуам, кортикобазальной дегенерации, деменции с тельцами Леви, болезни Хантингтона, болезни телец Леви, болезни двигательных нейронов, лобновисочной деменции, лобно-височной дегенерации с убиквитин-положительными включениями, склерозе гиппокампа, миопатии тельцами включений, миозита тельцами включений, болезни Паркинсона, деменции болезни Паркинсона, деменции-Паркинсона в комплексе с полуострова Кии и болезнью Пика и т.п.; см., например, Lagier-Tourenne et al., Hum. Mol. Gen. 19 (2010), R46-64, который включен в настоящем документе в качестве ссылки в полном объеме. Эти заболевания все вместе именуются TDP-43 протеинопатиями. Аномальное накопление TDP-43 наблюдается в местах поражения каждой болезни, которая, как представляется, подразумевает причастность дегенерации нерва в этих заболеваний. Увеличение цитоплазматической локализация TDP-43 в мозге и спинном мозге пациентов называют предварительными включениями было предложено считать первым признаком в TDP-43 протеинопатии, подразумевая возможную патогенную роль в болезнях; см., например, Giordana et al., Brain Pathol. 20 (2010), 351-60. Последовательно, увеличение цитоплазматической локализации TDP-43 на предсимптоматических этапах, как сообщается, можно найти в мышах дикого типа сверхэкспрессирующих TDP-43; см., например, Wils et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 107 (2010), 3858-63, a также в ранних крысиных моделях дикого типа с аденовирус-опосредованной экспрессией TDP-43; см., например, Tatom et al., Mol. Ther. 17 (2009), 607613. Коммерчески доступные моноклональные мышиные антитела в основном используются в исследованиях по TDP-43 и постановке патологического диагноза при TDP-43 протеинопатии. Моноклональное мышиное анти-TDP-43 антитело, которое распознает фосфорилированную форму TDP-43, представлено в Европейской патентной заявке № 2189526 А1. Дополнительно анти-TDP-43 антитела раскрыты в Zhang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 106(18):7607-12 (2009) и заявке на патент США № 20100136573.
Успех в создании моноклонального антитела зависит, кроме всего прочего, от эффективного и селективного соединения антиген-стимулированных В клеток с мышиной миеломной клеточной линией с последующим отбором стабильных гибридов по производству антител, как первоначально описано Kohler и Milstein, Nature 256 (1975), 495-497. Тем не менее, терапевтическое применение антител на основе мышей у человека затрудняется ответом человеческого антимышиного антитела (НАМА), как следствие их нечеловеческого происхождения. Подходы для создания человеческого или человекоподобного моноклонального антитела стали доступными с помощью генной инженерии. Однако эти способы обычно имеют недостаток, так что они не пригодны для получения антитела, отображающего многие характеристики антитела, которые производятся эндогенно иммунной системой человека в ходе физиологического человеческого иммунного ответа. Кроме того, эти генетически модифицированные антитела могут показать нежелательные перекрестные реакции с другими белками и/или белками-мишенями в контексте биологически соответствующей нативной конформации и нормальной физиологической функции целевого антигена. Полученные побочные эффекты в результате системного введения экзогенного антитела охватывают диапазон, например, от нежелательного аутоиммунного заболевания до анафилактических реакций. Эти побочные эффекты были отнесены к так называемым гуманизированным антителам, которые первоначально получены из нечеловеческих организмов, таких как мыши, а также к так называемым полностью человеческим антителам in vitro или из ксеногенных мышей, полученных с помощью генной инженерии, чтобы передать набор характеристик человеческого антитела. С другой стороны, активная иммунизация патологически важными антигенами несет значительный риск для пациентов в виде
- 1 032003 развивающихся неконтролируемых иммунных реакций против этих антигенов и перекрестной реакции с эндогенными антигенами, которые могут привести к опасным аутоиммунным реакциям.
Кроме того, развитие анализов для выявления и мониторинга уровня нормальной и патологической TDP-43 в плазме, цереброспинальной жидкости и других образцах, как биомаркера ЛВД и БАС, обеспечит способность диагностировать и отличать TDP-43 протеинопатии от других клинически подобных нейродегенеративных расстройств, таких как таупатии или схожие протеинопатии. Кроме того, развитие визуализации лигандов, которые позволяют обнаружить и/или подвергнуть количественному анализу TDP-43 невропатологии в живых пациентах, обеспечит мощный инструмент не только для диагностики, но и для контроля реакции пациентов, имеющих нейродегенеративную TDP-43 протеинопатию к иммуномодулирующим терапиям, когда они станут доступны.
Таким образом, существует потребность преодолеть вышеописанные недостатки и обеспечить терапевтические и диагностические антитела и другие связывающие молекулы, которые специфически распознают соответствующие биологические конформации TDP-43.
Краткое описание изобретения
Настоящее изобретение в целом относится к новым TDP-43 (TAR ДНК-связывающего белка 43 кДа)-специфически связывающим антителам, в том числе фрагментам, которые специфически распознают TDP-43. Под специфически распознает TDP-43, антитело специфическое к TDP-43 и анти-TDP43 антитело подразумевают конкретно, в общем, или все вместе, антитела к TDP-43, или неправильно свернутые или олигомерные или агрегированные или посттрансляционные изменение TDP-43. Согласно одному из вариантов реализации антитела данного изобретения (включая антиген связывающие фрагменты и производные антитела) специфически распознают полную длину, усеченные или агрегированные человеческие TDP-43. В дополнительном варианте реализации антитела распознают полную длину человеческого TDP-43, имеющего последовательность SEQ ID NO: 94 или пептид, состоящий из остатков 390-414 С-концевой последовательности SEQ ID NO: 94, фосфорилированной по остаткам 409 и 410.
В одном варианте реализации TDP-43-специфически связывающей молекулой является антитело (в том числе антигенсвязывающие фрагменты или их производные), имеющее характеристику иммунологического связывания, описанного в настоящем документе антитела, например антитела, имеющего аминокислотную последовательность вариабельных участков VH и/или VL, изложенные в (SEQ ID NO: 130) и (SEQ ID NO: 134), (SEQ ID NO: 259) и (SEQ ID NO: 263) соответственно.
Настоящее изобретение также относится к композициям, содержащим антитело по данному изобретению (в том числе TDP-43-связывающие фрагменты), и к иммунотерапевтическим и иммунодиагностическим методам с использованием таких композиций в профилактике, диагностике или лечении TDP-43 протеинопатии, отличающееся тем, что эффективное количество композиции вводят пациенту, нуждающемуся в этом.
Полинуклеотиды, кодирующие TDP-43-связывающие антитела (в том числе TDP-43-связывающие фрагменты или варианты антител), также охватываются данным изобретением. В некоторых вариантах реализации полинуклеотид кодирует, по меньшей мере, вариабельный участок цепи иммуноглобулина в антителе согласно данному изобретению. В дополнительном варианте реализации полинуклеотид кодирует по меньшей мере один гипервариабельный участок (CDR) из VH и/или VL вариабельного участка, как показано на фиг. 1 и 3. В дополнительном варианте реализации полинуклеотид кодирует по меньшей мере один гипервариабельный участок (CDR) из VH и/или VL вариабельного участка, кодируемой полинуклеотидной последовательности, как указано в табл. 3. Полинуклеотиды, кодирующие производные или аналоги указанных кодированных TDP-43-связывающих пептидов и полипептидов, кодируемых этими полинуклеотидами, также охватываются настоящим изобретением.
Векторы, содержащие полинуклеотиды, кодирующие TDP-43-связывающие антитела и их фрагменты по данному изобретению и трансформированные этими векторами и/или полинуклеотидами клеткихозяева, также охватываются настоящим изобретением, также как и их применение для производства антител и их фрагментов которые являются специфическими для TDP-43. Средства и методы для рекомбинантного получения антител и других связывающих полипептидов имитирующих их, а также методов скрининга для молекул, например, антител, которые конкурируют с этими антителами или другими связывающими белками для связывания с TDP-43, как известно в данной области. Как описано в настоящем документе, в некоторых вариантах реализации, например, касающихся терапевтического применения у человека, TDP-43-специфически связывающее антитело по данному изобретению представляет собой человеческое антитело в том смысле, что применение указанного антитела является полностью свободным от ответа НАМА, что наблюдается в случае применения химерных и даже гуманизированных антител.
В одном из вариантов реализации настоящее изобретение охватывает антитела, которые специфически связывают TDP-43 и применение этих антител для обнаружения присутствия (детектирования) TDP-43 в образце. Соответственно, TDP-43-связывающие антитела по данному изобретению, могут быть использованы для скрининга крови и мочи человека с CSF на наличие TDP-43 в образцах, например, с помощью анализа на основе ELISA или приспособленной поверхности. Способы и композиции данного изобретения имеют применения в диагностике таких TDP-43 протеинопатий, как боковой амиотрофиче- 2 032003 ский склероз (БАС) или лобно-височная дегенерация (ЛВД). Способы и композиции по данному изобретению также находят применение в диагностике предсимптоматических болезней и в мониторинге прогресса болезни и терапевтической эффективности. Согласно некоторым вариантам реализации, антитела, специфические для TDP-43 (например, антитело полномерное или TDP-43-связывающий фрагмент или производное антитела) контактируют с образцом (например, крови, спинномозговой жидкости или ткани головного мозга) для выявления, диагностики или мониторинга лобно-височной дегенерации (ЛВД) или бокового амиотрофического склероза (БАС). В другом варианте реализации специфичное антитело для TDP-43 контактирует с образцом для выявления, диагностики или мониторинга заболевания, выбранного из болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона и болезни телец Леви. В другом варианте реализации специфичное антитело для TDP-43 контактирует с образцом для выявления, диагностики или мониторинга заболевания, выбранного из болезни аргирофильных волокон, комплекса деменция-БАС-паркинсонизм Гуам, кортикобазальной дегенерации, деменции с тельцами Леви, болезни Хантингтона, болезни двигательных нейронов, лобно-височной дегенерации (ЛВД), лобно-височной деменции, лобно-височной дегенерации с убиквитин-положительными включениями, склероз гиппокампа, миопатию тельцами включений, миозит тельцами включений, деменции болезни Паркинсона, комплекса деменции и болезни Паркинсона с полуострова Кии, болезни Пика, и болезни Мачадо-Джозефа или деменции.
В дополнительных вариантах реализации изобретение относится к способам лечения или профилактики TDP-43 неврологической протеинопатий. Согласно одному из вариантов реализации, способы по данному изобретению включают введение антитела, специфического для TDP-43 (например, антитело полномерное или TDP-43-связывающего фрагмента или производной антитела), в эффективной концентрации субъекту. В дополнительном варианте реализации изобретение относится к способу лечения или профилактики TDP-43 неврологической протеинопатии. Согласно некоторым вариантам реализации, специфичное антитело для TDP-43 вводят для лечения или профилактики лобно-височной дегенерации (ЛВД) или бокового амиотрофического склероза (БАС). В другом варианте реализации специфичное антитело для TDP-43 вводят для лечения или профилактики нейродегенеративного заболевания, выбранного из болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона и болезни телец Леви. В другом варианте реализации специфичное антитело для TDP-43 вводят для лечения или профилактики заболевания, выбранного из болезни аргирофильных волокон, комплекса деменция-БАС-паркинсонизм Гуам, кортикобазальной дегенерации, деменции с тельцами Леви, болезни Хантингтона, болезни двигательных нейронов, лобновисочной дегенерации (ЛВД), лобно-височной деменции, лобно-височной дегенерации с убиквитинположительными включениями, склероз гиппокампа, миопатию тельцами включений, миозит тельцами включений, деменции болезни Паркинсона, комплекса деменции и болезни Паркинсона с полуострова Кии, болезни Пика и болезни Мачадо-Джозефа или деменции.
Другие варианты реализации изобретения будут очевидны из описания и примеров, которые рассмотрены далее.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1A-1K. Аминокислотные последовательности вариабельного участка, т.е. тяжелая цепь и каппа/лямбда легкая цепь человеческого антитела NI-205.3F10 (фиг. 1А), N1-205.510 (фиг. 1B), NI205.21G2 (фиг. 1С), М-205.8А2 (фиг. 1D), NI-205.15F12 (фиг. 1E), NI-205.113O (фиг. 1F), NI-205.25F3 (фиг. 1G), NI-205.87B7 (фиг. 1H), NI-205.21G1 (фиг. 1I), NI-205.68G5 (фиг. 1J) и NI-205.20A1 (фиг. 1K). Указаны каркасный участок (FR), определяющий комплементарность (CDR; подчеркнуто), участок соединения тяжелой цепи (JH) и участок соединения легкой цепи (JK) или (JL). Положения аминокислот, модифицированных для учета потенциальных индуцированных артефактов клонирования PCRпраймеров и которые были изменены, чтобы подходить соответствующей последовательности вариабельного участка человеческой зародышевой линии, выделены жирным шрифтом.
Фиг. 2A-2J. Связывание человеческого TDP-43 антитела с терминальными амино-фрагментами TDP-43 His-tagged состоящими из аминокислотных остатков 2-106 (домен I (SEQ ID NO: 117)), 99-204 (домен II (SEQ ID NO: 118)), 183-273 (домен III (SEQ ID NO: 119)), 258-414 (домен IV (SEQ ID NO: 120)), или 2-414 (полная длина (SEQ ID NO: 121)).
Фиг. 3A-3R. Аминокислотные последовательности вариабельного участка, т.е. тяжелая цепь (VH) и каппа (У|<)/лямбда (VL) легкая цепь человеческого антитела NI205.41D1 (фиг. 3A), NI205.29E11 (фиг. 3B), NI205.9B12 (фиг. 3C), NI205.98H6 (фиг. 3D), NI205.10D3 (фиг. 3E), NI205.44B2 (фиг. 3F), NI205.38H2 (фиг. 3G), NI205.36D5 (фиг. 3H), NI205.58E11 (фиг. 3I), NI205.14H5 (фиг. 3J), NI205.31D2 (фиг. 3K), NI205.8F8 (фиг. 3L), NI205.31C11 (фиг. 3M), NI205.800 (фиг. 3N), NI205.10H7 (фиг. 3O), N[205.09 (фиг. 3P), NI205.14W3 (фиг. 3Q), и NI205.19G5 (фиг. 3R). Определяющие комплементарность участки (CDR-ы) подчеркнуты.
Фиг. 4А-4Н. Определение половины максимальной эффективной концентрации (ВС50) TDP-43 антитела человеческого происхождения путем прямого ELISA к (А-D) рекомбинантной полной длине TDP43 (*)> экстракт Escherichia coli , и BSA (“)’ или (В-Н) остатки, покрытые синтетическим пептидом от 390 до 414 С-концевого домена TDP-43 с фосфорилированной модификацией остатков 409/410 (*) и BSA ()Фиг. 5А-5М. Связывание специфического антитела человеческого происхождения с доменами TDP- 3 032003
43, содержащими аминокислоты 2-106 (домен I), 99-204 (домен II), 183-273 (домен III), 258-414 (домен
IV) и 2-414 (полномерный) TDP-43, как определено путем прямого ELISA.
Фиг. 6A-6Q. Связывание специфического антитела человеческого происхождения с доменами TDP43, содержащими аминокислоты 2-414 (полномерный), 2-106 (домен I), 99-204 (домен II), 183-273 (домен
III) и 258-414 (домен IV) TDP-43, как определено путем Вестерн-блоттинг анализа.
Фиг. 7А-7С. (А) NI-205.41D1 антитело связывается с полной длиной TDP-43 и фрагментами TDP43, содержащими аминокислотные остатки 258-414, 258-384, 258-375, 258-362, 258-353, 258-319, 317-414 и 340-414. (В) NI-205.41D1 и 12892-1-АР антитела связываются с полной длиной TDP-43, фрагментами TDP-43, содержащими аминокислотные остатки 258-414, и с мутантным TDP-43 фрагментом полипептида, содержащими аминокислотные остатки 258-414 и заменой А на G в остатке 321, заменой М на G в остатке 322, и заменой М на G в остатке 323 (TDP-43 258-414 AMM321GGG). (С) NI-205.41D1 антитело связывается с фрагментами TDP-43, содержащими аминокислотные остатки 316-353, 316-343 и 316-333.
Фиг. 8А-8С. Очистка мономерных форм TDP-43 с использованием мягких хаотропных условий. А) Окрашивание Кумасси SDS-PAGE гелем очищенных форм TDP-43 в присутствии или в отсутствии хаотропа KSCN. Ряд с 1 по 4 соответственно: стандарт молекулярного веса, 6xHis-TDP-43 (1-414), 6xHisSUMO-TDP-43 (1-414), 6His-SUMO-TDP-43 (220-414), все очищенные в присутствии 1.5М KSCN, и ряды 5 и 6: 6xHis-SUMO-TDP-43 (101-265) очищенные в присутствии KCl (ряд 5) или KSCN (ряд 6). В) Расположение очищенных белков в домене иллюстрирует расположение РНК связывающих доменов (RRM1 и RRM2), а также метки (6His и SUMO). С) Коэффициент распределения полученный аналитическим ультрацентрифугированием для очищенных 6His-SUMO и 6His отмеченных полномерных TDP-43. Коэффициенты седиментации и рассчитанные молекулярные массы указаны над пиками.
Фиг. 9. А) Полномерный TDP-43 связывается со специфической ((UG)6) или контрольной ((UU)6) РНК в буфере, содержащем 40 мМ HEPES, 0.5 М KCl, 0.4 М аргинин, рН 7.4. В), С) и D) РНК связанная с TDP-43 (101-265) в физиологическом буфере, содержащем 20мМ HEPES, 80мМ глютамата калия, 4мМ ацетата магния, 5% глицерола, рН 7.5, 2мМ DTT, для определения В) Kd, и стоихиометрии очищенных в С) нехаотропных условиях или D) мягких хаотропных услових.
Фиг. 10. Кривые титрования для человеческих NI-205.41D1, NI-205.21G1, NI-205.51W, NI-205.21G2 и NI-205.3F10 антител, связанных с А) полномерной укладкой TDP-43, и В) фрагментом TDP-43, содержащем остатки 220-414 в отслеживания ELISA анализом.
Фиг. 11. Иммуногистохимическое окрашивание человеческой ЛВД-U ткани гиппокампа с антителами (А-С) 2E2-D3, (D-F) контрольное антитело р403/р404, (G-I) контрольное антитело р409/р410, (J) NI205.10D3, (K) NI-205.8W0, (L) NI-205.15F12, (M) NI-205.8A2, (N) NI-205.3F10, (O) NI-205.21G2, (P) NI205.8F8, (Q)NI-205.31d1, (R) NI-205.36D5, (S) NI-205.31D2, (T) NI-205.10H7, (U) NI-205.14H5, (V) NI205.68G5, (W) NI-205.14W3, (X) NI-205.21G1, и (Y) NI-205.41D1, (Z) Иммуногистохимическое окрашивание контрольной ткани гиппокампа с NI-205.41D1.
Подробное описание изобретения
I. Определения.
Используемая в настоящем документе фраза нейродегенеративное заболевание относится к наличию ненормального накопления белка, клеточной локализации, или укладки белков в мозге, спинном мозге или других нервных тканях, и которые вызывают смерть или функциональные нарушения нейронов. В некоторых случаях нейродегенеративных заболеваний, генетически определенные аномалии способствуют развитию болезни. Нейродегенеративные заболевания включают, например, церебральные дегенеративные заболевания (например, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, прогрессирующий супрануклеарный паралич, болезнь Гентингтона) и вертебральные дегенеративные заболевания/заболевания дегенерации двигательных нейронов, например, боковой амиотрофический склероз и спинальная мышечная атрофия; см., например, Forman et al. Nat. Med. 10 (2004), 1055-63.
TDP-43 протеинопатия относится к заболеваниям нервной системы, в частности, нейродегенеративным заболеваниям и известна как гетерологичная группа заболеваний, связанных с TAR(Трансактивация реагирования)-ДНК-связывающего белка массой 43 кДа. TDP-43 протеинопатия характеризуются тем, что TDP-43 представляет собой белок заболевания, который механически соединяет лобно-височную дегенерацию с убиквитин-положительными включениями (ЛВД-U) с и без заболевания двигательных нейронов с боковым амиотрофическим склерозом (БАС) болезни аригирофильных волокон, болезнью Альцгеймера, боковым амиотрофическим склерозом (БАС), комплексом деменция-БАСпаркинсонизм Гуам, кортикобазальной дегенерацией, деменцией с тельцами Леви, болезнью Хантингтона, болезнью телец Леви, заболеванием двигательных нейронов, лобно-височной дегенерацией (ЛВД), лобно-височной деменцией, лобно-височной дегенерацией с убиквитин-положительными включениями, склерозом гиппокампа, миопатию тельцами включений, миозит тельцами включений, болезнью Паркинсона, деменцией болезни Паркинсона, комплексом деменции и болезни Паркинсона с полуострова Кии, болезнью Пика, болезнью Мачадо-Джозефа и т.п.; см., например, Lagier-Tourenne et al., Hum. Mol. Gen. 19 (2010), R46-64, который находится в настоящем документе в качестве ссылки во всей полноте. В нормальных физиологических условиях, TDP-43 преимущественно локализуется в ядре. Тем не менее, существенная потеря ядра TDP-43 наблюдается в нейронах, несущих аномальные цитоплазматические
- 4 032003
TDP-43 включений. TDP-43 обладает болезнеспецифическими биохимическими признаками; патологически измененный TDP-43. TDP-43 протеинопатия отличается от большинства других нейродегенеративных заболеваний, в которых неправильное сворачивание белка приводит к амилоидозу мозга, так как патологические TDP-43 формируют нейроны и глиальные включения с недостающими признаками амилоидных отложений мозга; см., например, Neumann et al., Arch Neurol. 64 (2007), 1388-1394, включенный в настоящий документ в качестве ссылки во всей своей полноте.
Как используется в настоящем документе, термин патологический TDP-43 относится к внеклеточным, цитоплазматическим, нейритным, и ядерным включениям, также упоминается в настоящем документе как TDP-43 включения телец в качестве белковы фибриллоподобных форм как сгустков. В частности было обнаружено, что патологический TDP-43 гиперфосфорилированный, убиквитинированный, и N-терминально усеченный, тем самым генерируя аномальные виды TDP-43, которые мигрируют с более высокой молекулярной массой примерно 45 кДа, а также в мазке высокомолекулярные белки и Сконцевые фрагменты массой приблизительно 25 кДа; см., например, Neumann et al., Science 314 (2006), 130-133 и Arai et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 351 (2006), 602-611, каждый из которых включен в настоящий документ в качестве ссылки во всей полноте. Кроме того, было установлено, что TDP-43 обладает несколькими сайтами фосфорилирования в карбоксил-концевых участках осажденных TDP-43, и предполагается, что фосфорилирование приводит к увеличению олигомеризации и фибрилизации TDP43; см., например, Hasegawa et al., Annals из Neurology 64 (2008), 60-70.
Формирование TDP-43 внеклеточных включений сопровождается изменением субклеточного распределения TDP-43 с полным отсутствием нормального диффузного ядра TDP-43, которое окрашивается как клетка тельцами включений. Наличие и степень этих патологических признаков в пораженных кортикальном сером и белом веществах, а также спинном мозге, примерно соответствуют плотности TDP43-позитивных включений; см., например, Neumann et al., J. Neuropath. Exp. Neurol. 66 (2007), 177-183. Состав убиквитинированных включений (UBIS) при ЛВД-U характеризуется относительно низкой численностью, неравномерным распределением UBIs среди различных случаев ЛВД-U, и их неамилоидогенной природы. Таким образом, TDP-43 является специфическим и чувствительным маркером для выявления характерных убиквитин-иммунореактивных поражений при ЛВД-U, в том числе нервных цитоплазматических включений (NCIS), дистрофических нейритов, и нейронных внутриядерных включений (NIIS).
Как используется в настоящем документе, термины TARDBP, Ответственный за трансактивацию-ДНК-связывающий белок 43кДа, Чувствительный к трансактивации ДНК-связывающий белок массой 43кДа, TAR-ДНК-связывающий белок массой 43кДа и TDP-43 используются как взаимозаменяемые для обозначения нативной формы TDP-43. Термин TDP-43 также используется для обозначения совокупности всех типов и форм TDP-43. TDP-43 также используется для правильного определения других конформаций TDP-43, в том числе, например, фосфорилированных форм TDP-43 и убиквитиново-связанных агрегатов или агрегатов TDP-43.
Аминокислотная последовательность человеческого TDP-43 известна в данной области техники; см., например, Strausberg et al., TARDBP белок (Homo sapiens) GenBank Pubmed: AAH71657 версия GI:47939520 включена в настоящий документ в качестве ссылки во всей своей полноте. Согласно одному варианту реализации, аминокислотной последовательностью нативного человеческого TDP-43 является: MSEYIRVTEDENDEPIEIPSEDDGTVLLSTVTAQFPGACGLRYRNPVSQCM RGVRLVEGILHAPDAGWGNLVYVVNYPKDNKRKMDETDASSAVKVKR AVQKTSDLIVLGLPWKTTEQDLKEYFSTFGEVLMVQVKKDLKTGHSKGF GFVRFTEYETQVKVMSQRHMIDGRWCDCKLPNSKQSQDEPLRSRKVFVG RCTEDMTEDELREFFSQYGDVMDVFIPKPFRAFAFVTFADDQIAQSLCGE DLIIKGISVHISNAEPKHNSNRQLERSGRFGGNPGGFGNQGGFGNSRGGG AGLGNNQGSNMGGGMNFGAFSINPAMMAAAQAALQSSWGMMGMLAS QQNQSGPSGNNQNQGNMQREPNQAFGSGNNSYSGSNSGAAIGWGSASN AGSGSGFNGGFGSSMDSKSSGWGM (SEQ ID №94)
Как используется в настоящем документе, термин антитело или антитела означает полное, нативное антител, и Fab, Fab', F(ab)2, и другие фрагменты антитела. Полные, нативные антитела включают, моноклональные антитела, такие как мышиное моноклональное антитело, поликлональные антитела, химерные антитела, человеческие антитела, и гуманизированные антитела, но не ограничиваются ими. Различные формы антител могут быть получены с использованием техники стандартных рекомбинантных ДНК (Winter and Milstein, Nature 349 (1991), 293-99. Например, могут быть сконструированы химерные антитела, в которых антигенсвязывающий домен из животного антитела присоединен к человеческому константному домену (антитело получено нативным из нечеловеческого млекопитающего, в котором была использована технология рекомбинантной ДНК, чтобы заменить весь или часть шарнирного участка и константного участка тяжелой цепи и/или константного участка легкой цепи с соответствующими участками легкой или тяжелой цепи человеческого иммуноглобулина) (см., например, патент США № 4816567; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 81 (1984), 6851-6855. Химерное антитело уменьшает иммуногенный ответ вызванный животным антителом при использовании в клиническом лечении
- 5 032003 человека.
Кроме того, может быть синтезировано рекомбинантное гуманизированное антитело. Гуманизированные антитела являются антителами первоначально полученными из нечеловеческого млекопитающего, с использованием технологии рекомбинантной ДНК, чтобы заменить некоторые или все аминокислоты не требующиеся для связывания с антигеном на аминокислоты из соответствующих участков легкой или тяжелой цепи иммуноглобулина человека. То есть они являются химерными, содержащими в основном последовательности иммуноглобулина человека, в которые были вставлены участки, отвечающие за специфическое связывания с антигеном (см., например, международная заявка на патент № WO 94/04679). Животных иммунизируют желаемым антигеном, соответствующие антитела изолируются и удаляются части вариабельных участков последовательностей, ответственных за конкретное связывание с антигеном. Антигенсвязывающий участок животного происхождения клонируют в соответствующее положение генов антитела человека, в котором участки связывания антигена были удалены. Гуманизированные антитела сводят к минимуму использование гетерологичных (межвидовых) последовательностей в антителах для терапии человека, и, чтобы понизить вероятность вызывания нежелательных иммунных реакций. Приматизированные антитела могут быть получены аналогичным образом.
К дополнительным вариантам реализации данного изобретения относятся человеческой антитела, а также использование этих человеческих антител. В одном варианте реализации, человеческие антитела получают из В-клеток человека или других иммунных клеток и, как правило, называют в настоящем документе как полностью человеческие антитела. Таким образом, изобретение охватывает иммортализованные человеческие В-лимфоциты памяти и В-клетки, соответственно, которые производят антитела, имеющие отчетливые и уникальные характеристики, как определено ниже. В другом варианте, человеческие антитела могут быть получены из нечеловеческих животных, таких как трансгенные животные, несущих один или несколько трансгенов иммуноглобулина человека. Такие животные могут быть использованы в качестве источника спленоцитов для получения гибридом, как описано в патенте США № 5569825.
Антигенсвязывающим фрагментом антитела данного изобретения может быть одноцепочечный Fv фрагмент, F(ab') фрагмент, F(ab) фрагмент и F(ab')2 фрагмент. В дополнительных вариантах реализации, антигенсвязывающим фрагментом является TDP-43-связывающий фрагмент, который распознает TDP-43 одним или несколькими вариабельными доменами антитела или фрагментами или их вариантами, такими как, один или более CDR-ов, или его производное) одного или больше CDS. В конкретном варианте реализации, ниже, антитело или его фрагмент является изотипом человеческого антитела IgG. В другом случае, антитело является химерным человеческо-мышиным или муринизированным антителом, отличающийся тем, что последнее особенно полезно для диагностических методов и исследования на животных.
Фрагменты антитела, одновалентные антитела и однодоменные антитела также можно использовать в способах и составах по данному изобретению. Одновалентные антитела содержат тяжелую цепь/легкую цепь димерно связанную с Fc (или стволовым) участком второй тяжелой цепи. Fab участок относится к тем участкам цепи, которые приблизительно эквивалентны или аналогичны последовательностям, которые содержат части Y-разветвления тяжелой цепи и легкой цепи в полном объеме, и для которых в совокупности (в агрегатах) были показано, что они обладают активностью антител. Fab белок включает агрегаты одной тяжелой и одной легкой цепей (известного как Fab'), а также тетрамеры, которые соответствуют сегментам двух ветвей антитела Y, (известного как F(ab)2); любой из вышеперечисленного является ковалентно или нековалентно агрегированным, при условии, что агрегат способен специфически взаимодействовать с определенным антигеном или семейством антигена.
TDP-43 антитела данного изобретения специфически связываются с TDP-43, эпитопами TDP-43, и с различными конформациями TDP-43 и его эпитопами. Например, раскрытыми в настоящем документе являются антитела, которые специфически связываются нативный TDP-43, полномерный и усеченный TDP-43, и патологический TDP-43. В настоящем документе используется ссылка на антитело, которое специфически связывается, селективно связывает или преимущественно связывается или даже в более общем связывает TDP-43 или TDP-43 связывающее, относится к антителу, которое связывается преимущественно с TDP-43 по сравнению с другими различными белками. Используемый в настоящем документе термин антитело, которое специфически связывается или избирательно связывается с конформерами TDP-43 не связывается по меньшей мере с одним другим TDP-43 конформером. Например, раскрытыми в настоящем документе являются антитела, которые избирательно связываются с полномерным TDP-43, а также те, которые избирательно связываются с цитоплазматическим TDP-43 по сравнению с ядерным TDP-43. Следует отметить, что упоминание единичного антитела относится к одному или нескольким схожим антителам; например, под антителом, подразумевается, что представляются одно или несколько антител. Таким образом, термины антитело, одно или более антител, и по меньшей мере одно антитело могут быть взаимозаменяемыми в настоящем документе.
Как используется в настоящем документе, термин полипептид используется взаимозаменяемо с термином полипептиды и включает в себя особый полипептид/белок, а также множественные полипептиды/белки и относится к любой цепи или цепи двух или более аминокислот, и не относится к кон
- 6 032003 кретной длине продукта. Таким образом, пептиды, дипептиды, трипептиды, олигопептиды, белок, цепь аминокислот, или любой другой термин используется для обозначения цепи или цепи двух или более аминокислот, включенных в определение полипептид и термин полипептид используется вместо или наравне с любым из этих терминов. Используемые в настоящем документе термины полипептид и белок также относятся к продуктам постэкспрессионной модификации полипептида, включая без ограничения гликозилирование, ацетилирование, фосфорилирование, амидирование, производных от известных защищенных/блокированных групп, протеолитического расщепления, или модификации, не встречающейся в природе аминокислоты или других химических групп. Полипептид может быть получен из естественного биологического источника или производится с помощью рекомбинантных технологий, но не обязательно быть транслируемым с определенной последовательностью нуклеиновой кислоты. Полипептиды данного изобретения могут быть сгенерированы в любой форме, в том числе путем химического синтеза.
Полипептид данного изобретения может иметь размер около 3 или более, 5 или более, 10 или более, 20 или более, 25 или более, 50 или более, 75 или более, 100 или более, 200 или более, 500 или более, 1000 или более, или 2000 или более аминокислот. Полипептиды могут иметь определенную трехмерную структуру, хотя они не обязательно имеют такую структуру. Полипептиды с определенной трехмерной структурой могут быть отнесены, в настоящем документе, как к сложенными, так и к полипептидам, которые не обладают определенной трехмерной структурой, а скорее могут принимать большое количество различных конформаций, и могут упоминаться в настоящем документе как развернутые. Используемый в настоящем документе термин гликопротеин относится к полипептиду, соединенному по меньшей мере с одним углеводным фрагментом, который присоединен к белку через кислородсодержащий или азотсодержащий участок боковой цепи, например, остатка серина или остатка аспарагина. Используемый в настоящем документе, выделенный полипептид или его фрагмент, вариант, или его производное, относится к полипептиду, который находится не в своей естественной среде. Не требуется применение определенного уровня очистки. Например, выделенный полипептид может быть удален из своей нативной или естественной среды. Рекомбинантно полученные полипептиды и белки, экспрессируемые в клеткаххозяевах можно рассматривать изолировано для целей настоящего изобретения, так же как и нативные или рекомбинантные полипептиды, которые были разделены на фракции, или частично или предметно очищены любым подходящим способом.
Кроме того, как полипептиды данное изобретение включает фрагменты, производные, аналоги или варианты указанных выше полипептидов, и их любые комбинации. Термины фрагмент, вариант, производное и аналог, когда речь идет об антителе или TDP-43-связывающем полипептиде данного изобретения, включают любые полипептиды, которые сохраняют, по меньшей мере, некоторые из антигенсвязывающих свойств соответствующих известным антителам или TDP-43-связывающим молекулам. Фрагменты TDP-43-связывающих полипептидов, таких как антигенсвязывающие фрагменты антитела, включают протеолитические фрагменты, а также делеционные фрагменты, как дополнение к дополнительным фрагментам антитела, обсуждаемых в настоящем документе. Варианты TDP-43-связывающей молекулы, такие как антитела (включая антигенсвязывающие фрагменты антитела) и также полипептидов с измененными аминокислотными последовательностями из-за аминокислотных замен, делеций или вставок. Варианты могут образовываться естественным путем или быть неестественными. Неестественные варианты могут быть получены с использованием известных в данной области методов мутагенеза. Вариантные полипептиды могут содержать консервативные или неконсервативные аминокислотные замены, делеций или дополнения. Производные TDP-43-специфически связывающих молекул, например, антитела и другие TDP-43-специфически связывающие молекулы, являются полипептидами, которые были изменены, так что имеют измененные или дополнительные функции, которых нет у эталонного полипептида. Примеры производных TDP-43-специфически связывающих молекул включают слитые белки. Варианты полипептидов в настоящем документе также могут быть отнесены к полипептидным аналогам. Используемое в настоящем документе, производное от TDP-43-специфически связывающей молекулы или ее фрагмента, относится к полипептиду, имеющему один или более остаток, химически дериватизированный реакцией функциональных боковых групп. Также в качестве производных выступают те пептиды, которые содержат одно или более естественных производных аминокислот из двадцати стандартных аминокислот. Например, согласно некоторым вариантам реализации 4-гидроксипролин может быть заменен на пролин; 5-гидроксилизин может быть заменен на лизин; 3-метилгистидин может быть заменен на гистидин; гомосерин может быть заменен на серин; или орнитин может быть заменен на лизин.
Используемый в настоящем документе термин полинуклеотид или нуклеиновая кислота включает в себя особую нуклеиновую кислоту, а также множественное число нуклеиновых кислот, и включает в себя выделенную или собранную молекулу нуклеиновой кислоты, например, матричной РНК (мРНК) или плазмиды ДНК (пДНК). Полинуклеотид может содержать обычную фосфодиэфирную связь или нетрадиционную связь (например, амидную связь, которую можно найти в пептидных нуклеиновых кислотах (ПНК)).
Термин полинуклеотидная кислота может также относиться к любому одному или более сегмен
- 7 032003 там нуклеиновых кислот, например фрагментам ДНК или РНК, присутствующим в полинуклеотиде. Под выделенной нуклеиновой кислоты или полинуклеотидом подразумевают молекулу нуклеиновой кислоты, ДНК или РНК, которая была удалена из ее нативного окружения. Например, рекомбинантный полинуклеотид, кодирующий антитело или тяжелый вариабельный участок легкой цепи, содержащийся в векторе, считается изолированным для целей настоящего изобретения. Другие примеры выделенного полинуклеотида включают рекомбинантные полинуклеотиды, поддерживаемые в гетерологических клетках-хозяевах или очищенные (частично или предметно) полинуклеотиды в растворе. Выделенные молекулы РНК, по данному изобретению, включают in vivo или in vitro РНК-транскрипты полинуклеотидов. Выделенные полинуклеотиды или нуклеиновые кислоты согласно данному изобретению дополнительно включают молекулы, полученные синтетическим путем. Кроме того, полинуклеотид или нуклеиновая кислота может быть или может включать в себя регуляторный элемент, такой как промотор, сайт связывания с рибосомой, или терминатор транскрипции, функционально связанный с последовательностью, кодирующей TDP-43-специфически связывающий полипептид согласно данному изобретению.
Используемая в настоящем документе кодирующая область представляет собой часть нуклеиновую кислоту, которая состоит из кодонов, транслированных в аминокислоты. Хотя стоп-кодон (TAG, TGA, или ТАА) не транслирован в аминокислоту, он может рассматриваться как часть кодирующей области, но любые фланкирующие последовательности, например, промоторы, сайты связывания рибосом, терминаторы транскрипции, интроны, и тому подобное, не являются частью кодирующей области. Две или более кодирующие области данного изобретения могут присутствовать в одной полинуклеотидной конструкции, например, на одном векторе, или в отдельных полинуклеотидных конструкциях, например, на отдельных (различных) векторах. Кроме того, любой вектор может содержать одну кодирующую область, или может содержать две или более кодирующие области, например, один вектор может кодировать отдельно вариабельный участок тяжелой цепи иммуноглобулина и вариабельный участок легкой цепи иммуноглобулина. Кроме того, вектор, включающий нуклеиновую кислоту данного изобретения, может дополнительно кодировать один или несколько гетерологичных кодирующих областей, сконденсированных или несконденсированных с нуклеиновой кислотой, кодирующей TDP-43-связывающий полипептид, в том числе, например, антитело или фрагмент, его вариант или производное. Гетерологичные кодирующие области включают без ограничения специализированные элементы или мотивы, такие как секреторный сигнальный пептид или гетерологичный функциональный домен.
В некоторых вариантах реализации данного изобретения, полинуклеотидом или нуклеиновой кислотой является ДНК. Полинуклеотид, включающий нуклеиновую кислоту, которая кодирует полипептид, необязательно включает промотор и/или другие элементы, управляющие транскрипцией или трансляцией, функционально связанные с одной или более кодирующей областью. Действующее объединение присутствует, когда область, кодирующая генный продукт, например, полипептид, связанна с одной или более регуляторной последовательностью таким образом, чтобы держать экспрессию генного продукта под воздействием или под контролем регуляторной последовательности(ей). Два фрагмента ДНК (например, области, кодирующей полипептид и связанный с ним промотор) являются функционально ассоциированными или функционально связанный, если индукция функции промотора результирует в транскрипцию мРНК, кодирующей желаемый продукт гена и если связь между двумя ДНК фрагментами не мешает экспрессии регуляторных последовательностей, чтобы направить экспрессию генного продукта или предотвратить транскрипцию ДНК-матрицы. Таким образом, область промотора может быть функционально связана с нуклеиновой кислотой, кодирующей полипептид, если промотор способен осуществлять транскрипцию этой нуклеиновой кислоты. Промотор может быть клеткоспецифичным промотором, который направляет предметную транскрипцию ДНК только в определенных клетках. Промотор может также быть конститутивным или индуцибельным. Другие элементы управления транскрипцией, которые необязательно функционально связанные с нуклеиновыми кислотами данного изобретения включают, например, гены-усилители, операторы, репрессоры и сигналы терминации транскрипции, могут быть функционально связаны с полинуклеотидом для направления клеткоспецифичной транскрипции. Примеры подходящих промоторов и других участков контроля транскрипции, раскрыты в настоящем документе или, так или иначе, известны в данной области.
Различные участки управления транскрипцией, которые могут быть использованы для контроля экспрессии полинуклеотидов в данном изобретении, известны в данной области. Они включают, без ограничения, участки контроля транскрипции, которые функционируют в клетках позвоночных, в том числе промоутеры и энхансеры из цитомегаловирусов (предранний промотор, в сочетании с интроном-А), вируса обезьян 40 (ранний промотор), и ретровирусов (например, вируса саркомы Рауса), но не ограничиваясь ими. Другие участки контроля транскрипции включают те, которые получены из генов позвоночных, таких как актин, белок теплового шока, бычий гормона роста и бета-глобин кролика, но не ограничиваясь ими, а также другие последовательности, способные контролировать экспрессию генов в эукариотических клетках. Дополнительно подходящие участки контроля транскрипции включают тканеспецифические промоторы и усилители, а также лимфокин-индуцируемые промоторы (например, промоторы, индуцируемые интерфероны или интерлейкины).
- 8 032003
Кроме того, специалистам в данной области известно множество подходящих элементов управления трансляцией. Они включают сайты связывания рибосом, кодоны инициации трансляции и терминации, и элементы, полученные из пикоРНКвирусов (в частности, сайт встраивания рибосомы интеРНК1 или IRES, также называемые как CITE последовательности), но не ограничиваются ими. В других вариантах реализации, полинуклеотид или нуклеиновой кислотой данного изобретения является РНК, например, в виде матричной РНК (мРНК). Полинуклеотид и нуклеиновая кислота, кодирующие последовательности данного изобретения могут быть связаны с дополнительными гетерологичными кодирующими последовательностями, которые кодируют, например, секреторные или сигнальные пептиды, которые направляют секрецию полипептида, кодируемого полинуклеотидом согласно данному изобретению. Согласно сигнальной гипотезе, белки, выделяемые клетками млекопитающих, имеют сигнальный пептид или секреторную лидерную последовательность, которые отщепляются от зрелого белка, как только был начат экспорт растущей цепи белка через шероховатый эндоплазматический ретикулюм. Специалистам в данной области техники известно, что полипептиды, секретируемые клетками позвоночных, это, как правило, сигнальные пептиды, слитые с N-концом полипептида, который отщепляются от полномерных полипептидов с получением секретируемого или зрелого полипептида. В некоторых вариантах реализации, используется нативный сигнальный пептид, например, тяжелая цепь иммуноглобулина или легкая цепь сигнального пептида, или его функциональное производное из этой последовательности, которое сохраняет способность направлять секрецию полипептида, с которым он функционально связан. Дополнительно могут быть использован гетерологичный сигнальный пептид млекопитающих или его функциональное производное. Например, нативная последовательность сигнального пептида может быть заменена последовательностью сигнального пептида человеческого тканевого плазминогенного активатора (ТРА), мышиной бета-глюкуронидазой, или сигнальной последовательностью, полученной предпочтительно из секретируемого белка клетки-хозяина.
Если не указано иное, термины расстройство и болезнь используются в настоящем документе как синонимы.
Связывающая молекула используемая в настоящем документе, относится, прежде всего, к антителам (в том числе TDP-43-связывающим антителам, фрагментам или производным), но может также относиться к другим белкам и полипептидам, которые специфически распознают TDP-43, в том числе гормоны, рецепторы, лиганды, молекулы главного комплекса гистосовместимости (МНС), такие как шаперонные белки теплового шока (HSP), и молекулы адгезии клетка-клетка, таких как члены кадгерина, интегрина, лектинов С-типа и надсемейств иммуноглобулинов (Ig), но не ограничиваясь ими. Фрагменты, варианты и производные этих полипептидов, которые специфически распознают TDP-43, также охватываются настоящим изобретением. Для ясности и без ограничения объема данного изобретения большинство следующих вариантов реализации обсуждаются в отношении антител (включая фрагменты и производные антител), которые представляют собой один вариант реализации молекул и композиций данного изобретения, которые специфично распознают TDP-43.
Термины антитело и иммуноглобулин используются в настоящем документе как синонимы. Антитело или иммуноглобулин является TDP-43-связывающей молекулой, которая содержит, по меньшей мере, вариабельный домен тяжелой цепи, и обычно содержит, по меньшей мере, вариабельные домены тяжелой цепи и легкой цепи. Основные иммуноглобулиновые структуры в системах позвоночных хорошо известны; см., например, Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual., (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988). Как будет обсуждаться более подробно ниже, термин иммуноглобулин включает в себя различные широкие классы полипептидов, которые можно выделить биохимически. Как известно в данной области, тяжелые цепи классифицируют как гамма-, мю-, альфа-, дельта- или ипсилон, γ, μ, α, δ, ε) с некоторых их подклассами (например, γ1-γ4). Это природа этой цепи, которая определяет класс антитела как IgG, IgM, IgA, IgG, или IgE соответственно. Подклассы иммуноглобулинов (изотипы), например, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и т.д. хорошо охарактеризованы и, как известно, придают функциональную специализацию, которая может быть включена или изменена в антителе данного изобретения для изменения функциональных или других свойств этих антител. Модифицированные версии классов и изотипов антител данного изобретения легко различимы специалистами в данной области техники в свете настоящего раскрытия и находятся в пределах объема настоящего изобретения. Кроме того, пока все классы иммуноглобулинов включены в объем данного изобретения, для краткости и в иллюстративных целях, последующее обсуждение, как правило, направлено на класс молекул иммуноглобулина IgG. Что касается IgG, стандартная молекула иммуноглобулина состоит из двух идентичных легких цепей полипептидов с молекулярной массой около 23000 Дальтон (Да), и двух одинаковых тяжелых цепей полипептидов с молекулярной массой 53000-70000 Да. Четыре цепи, как правило, соединяются дисульфидными связями в Y конфигурацию, отличающуюся тем, что легкие цепи начинают разветвляться с конца тяжелых цепей Y и до вариабельного участка.
Легкие цепи полипептидов классифицируются как каппа или лямбда (к, λ). Каждый класс полипептидов тяжелых цепей может быть связан с каппа или лямбда легкой цепью. В общем, полипептиды легкой и тяжелой цепей ковалентно связаны друг с другом, и части хвостов полипептидов двух тяжелых
- 9 032003 цепей связаны друг с другом ковалентной дисульфидной связью или нековалентной связью, когда иммуноглобулины генерируются либо гибридомами, В-клетками или генетически модифицированными клетками-хозяевами. В полипептиде тяжелой цепи аминокислотные последовательности идут с N-конца на раздвоенных концах Y конфигурации до С-конца в нижней части полипептидов каждой тяжелой цепи. Полипептиды легкой и тяжелой цепей содержат области структурной и функциональной гомологии. Термины константный и переменный использоваться функционально. В этой связи следует отметить, что вариабельные домены участков легкой (VL) и тяжелой (VH) цепей определяют распознавание и специфичность антигена. С другой стороны, константные домены легкой цепи (CL) и тяжелой цепь (CHb CH2 или CH3) проявляют важные биологические свойства, такие как секреция, трансплацентарная мобильность, Fc рецепторное связывание, связывание комплемента, и тому подобное. По соглашению нумерация доменов константной области увеличивается с их отдалением от сайта антигенсвязывания или амино-конца антитела. На N-терминальных частях полипептидов тяжелых и легких цепей находятся вариабельные участки, а на С-концевых частях находятся постоянные области; CH3 и CL домены составляют карбокси-конец тяжелой и легкой цепи соответственно.
Как указано выше, вариабельный участок позволяет антителу избирательно распознавать и специфически связываться эпитопом с антигенами. То есть VL домен VH и домен или подмножество определяющих комплементарность участков (CDR-ов) антитела образуют вариабельный участок, который определяет трехмерный антигенсвязывающий сайт. Эта четвертинная структура антитела образует антигенсвязывающий сайт на конце каждой части вилки Y структуры антитела. Антигенсвязывающий участок полного антитела определяется тремя CDR-ами на каждой из VH и VL цепей. Любое антитело (в том числе фрагменты антитела, производные и варианты) содержит достаточное количество иммуноглобулина, связанного со структурой таким образом, чтобы позволить ему специфически связываются с TDP43, упоминается в настоящем документе взаимозаменяемо с связывающим фрагментом или иммуноспецифическим фрагментом, и в целом может обозначать антитело, которое специфически распознает TDP-43. В естественных антителах антитело состоит из шести гипервариабельных участков, которые часто называют гипервариабельными участками или CDR-ами, присутствующими в каждом антигенсвязывающем домене. CDR-ы представлены короткими, неконтактирующими последовательностями аминокислот, образующими антигенсвязывающий домен, когда антитело принимает трехмерную конфигурацию в водной среде. CDR-ы фланкированы четырьмя относительно консервативными рамочными участками или FR-ами, которые показывают меньшую изменчивость межмолекулярных последовательностей, чем CDR-ы. Каркасные области в значительной степени принимают β-складчатую конформацию и CDR-ы образуют петли, соединяющие, и в некоторых случаях являющиеся частью, βскладчастой структуры. Таким образом, каркасные области формируют каркас, который обеспечивает размещение CDR с правильной ориентацией с межцепными, нековалентными взаимодействиями. Антигенсвязывающий домен образован совместно расположенными тяжелой и легкой цепями CDR, и определяет поверхность, комплементарную эпитопу на иммунореактивном антигене. Эта дополнительная поверхность способствует нековалентному связыванию антитела родственным эпитопом. Аминокислоты, содержащие CDR-ы и каркасные участки, соответственно могут быть легко идентифицированы и определены для любого заданного вариабельного участка тяжелой или легкой цепей с использованием методов, известных в данной области; см., Sequences из Proteins из Immunological Interest, Kabat, E., et al., U.S. Department of Health and Human Services, (1983); и Chothia and Lesk, J. Mol. Biol., 196 (1987), 901-917, которые включены в настоящий документ в качестве ссылки во всей их полноте.
В случае если существуют два или более определений термина, который используется и/или принятый в данной области, определение термина, которое используется в настоящем документе предназначено для включения всех таких значений, если явно не указано иное. Конкретным примером является использование термина гипервариабельный участок (CDR) для описания неконтактирующего антигена, сочетающего сайты, найденные в полипептидах вариабельного участка как тяжелой, так и легкой цепей. Данный конкретный участок был описан Kabat et al., U.S. Department of Health and Human Services, Sequences из Proteins из Immunological Interest (1983) и by Chothia и Lesk, J. Mol. Biol., 196 (1987), 901-917, которые включены в настоящий документ в качестве ссылки во всей их полноте, где определения включают в себя перекрытия или подмножества аминокислотных остатков, сравниваемых друг с другом. Тем не менее, применение определения для обозначения CDR из антитела, или его вариантов, предназначен для использования в настоящем документе в рамках термина CDR. Соответствующие аминокислотные остатки, которые охватывают CDR, как определено в каждой из цитированных выше ссылок приведены на фиг. 1. Точные остатки с номерами, которые охватывают конкретный CDR будут варьироваться в зависимости от размера и последовательностей в CDR. Специалисту в данной области техники при условии известно, что вариабельные участки последовательностей антитела могут обычно определяться, как остатки, содержащие конкретные гипервариабельные области или CDR IgG человеческого антитела.
- 10 032003
Таблица 1
Определения1 CDR
Кэбота Чотия
VHCDR1 31-35 26-32
VHCDR2 50-65 52-58
VHCDR3 95-102 95-102
VLCDR1 24-34 26-32
VLCDR2 50-56 50-52
VLCDR3 89-97 91-96
1 Нумерация всех определений CDR приведена в табл. 2 в соответствии с правилами, установленными номенклатурой Кэбота и др. (см. ниже).
Кэбот и др., также определяют систему нумерации последовательностей переменных доменов, которая применима к любому антителу. Специалист в данной области может однозначно назвать эту систему номенклатурой Кэбота для любой вариабельной последовательности домена, без опоры на любые экспериментальные данные за пределами самой последовательности. Используемая в настоящем документе номенклатура Кэбота относится к системе нумерации, установленной Кэботом и др., U.S. Department of Health and Human Services, Sequence of Proteins of Immunological Interest (1983). Если не указано иное, ссылки на нумерации конкретных позиций аминокислотных остатков в антителах или антигенсвязывающих фрагментах, вариантах или его производных данного изобретения соответствуют нумерационной системе Кэбота, которая, однако, теоретическая и может не в равной степени относится к каждому антителу данного изобретения. Например, в зависимости от положения первого CDR (т.е. CDR1), следующие CDR-ы могут быть смещены в любом направлении.
В некоторых вариантах реализации антитело данного изобретения является моноклональным антителом. В дополнительных вариантах реализации антитело данного изобретения не является поликлональным антителом. По некоторым вариантам реализации антитело данного изобретения является двухвалентным или мультиспецифическим антителом. В других вариантах реализации антитело данного изобретения является поликлональным антителом. В дальнейших вариантах реализации композиции данного изобретения содержат моноклональные антитела. В дополнительных вариантах реализации композиции данного изобретения не содержат поликлональные антитела.
В дополнительных вариантах реализации антитело является человеческим (например, полностью человеческим и/или полным человеческим антителом), гуманизированнм, приматизированным, муринизированным или химерным антителом. В дальнейших вариантах реализации антитело данного изобретения является одноцепочечным антителом, эпитопсвязывающим фрагментом, например, Fab, Fab' и F(ab')2, Fd, Fv одноцепочечном Fv (ScFv), одноцепочечным антителом, дисульфидно связанным с Fv (sdFv), фрагментом, содержащим либо VL или VH домен, фрагментом, созданным Fab экспрессионной библиотекой, или антиидиотипическим (анти-Id) антителом (в том числе, например, анти-Id антителом к антителу, содержащему вариабельную последовательность домена, которая предоставлена на фиг. 1, и другими антителами, раскрытыми в настоящем документе). Молекулы ScFv известны в данной области и описаны, например, в патенте США № 5892019. Антитела данного изобретения могут быть любого типа (например, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA и IgY), класса (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2) или подкласса иммуноглобулина молекулы.
В некоторых вариантах реализации антителами данного изобретения являются IgG1. В других вариантах реализации антителами данного изобретения являются IgG3. В дополнительных вариантах реализации антителами данного изобретения являются не IgM или его производное, которое содержит пятивалентную структуру. Более конкретно, в некоторых применениях настоящего изобретения, особенно тех, которые относятся к терапевтическому применению, IgMH-ы менее желательны, чем IgG и другие двухвалентные антитела или соответствующие связывающие молекулы, IgM часто показывают неспецифические перекрестные реакции и очень низкую аффинность, как следствие их пятивалентной структуры и отсутствие созревания аффинности.
В конкретном варианте реализации антитело данного изобретения не является поликлональным антителом, т.е. по существу состоит из одного конкретного вида антитела, а не из смеси, полученной из образца иммуноглобулина из плазмы. Согласно одному варианту реализации антителом данного изобретения является полностью человеческое моноклональное антитело, которое специфически распознает человеческий TDP-43 и которое выделено из человека. По сравнению с другими человеческими моноклональными антителами, например, полученными из одноцепочечных фрагментов антитела (scFvs) определенных с использованием библиотеки фагового дисплея или ксеногенных мышей, полностью человеческое моноклональное антитело данного изобретения характеризуется (i) полученным с помощью человеческого иммунного ответа, а не из суррогатных животных, т.е. антитело было выработано в ответ на нативные эндогенные TDP-43 в соответствующей конформации в организме человека, (ii) защищенным индивидуальным или, по меньшей мере, значительным присутствующим TDP-43, и (iii) имеющим
- 11 032003 пониженные риски самостоятельной реактивности против самостоятельных антигенов из-за факта человеческого происхождение антитела.
Таким образом, в то время как термины полностью человеческое антитело или человеческое моноклональное авто-антитело охватывают термины человеческое антитело, человеческое моноклональное антитело, и тому подобное, эти термины используются в настоящем документе для обозначения TDP-43-связывающих молекул, которые имеют человеческое происхождение, т.е. которые были получены из человеческой антитело-продуцирующей клетки, такой как В клетки или гибридомы или клетки, содержащей нуклеиновые кислоты, такие как кДНК, которая является кДНК, которая была непосредственно клонирована или получена из человеческого антитела, производимого клетками, такими как, в человеческие В-клетки памяти. Антитело считается полностью человеческим для целей этого раскрытия, когда антитело содержит одну или несколько аминокислотных замен или другие изменения человеческого антитела, например, для улучшения характеристик связывания. Дополнительно, каркасные области полностью человеческого антитела или другого антитела данного изобретения изменены или были изменены, чтобы соответствовать последовательностям зародышевой линии человеческого вариабельного участка или в соответствии с частью последовательности зародышевой линии человеческого вариабельного участка, например, последовательности, доступной, например, в Vbase (http://vbase.mrccpe.cam.ac.uk/) организованной MRC Центром белковой инженерии (Кембридж, Великобритания). Такие модификации могут быть полезны, в частности, для снижения или устранения отклонений последовательностей зародышевой линии в результате клонирования артефактов, таких, как те, которые могут возникнуть из PCR-праймеров. Антитела получены из библиотек иммуноглобулинов человека или из животных, трансгенных для одного или нескольких человек, как правило, называют в настоящем документе как человеческие антитела, или человекоподобные антитела. Такие иммуноглобулины не соответствуют эндогенным иммуноглобулинам человека, как описано ниже. См., например, патент США № 5939598. Например, соединение тяжелых и легких цепей, человекоподобных антител, таких как синтетические и полусинтетические антитела, обычно изолированные из фагов не обязательно отражают первоначальное соединение, как это происходило в оригинальной человеческой В-клетке. Соответственно, Fab и scFvфрагменты, полученные из рекомбинантных экспрессионных библиотек, можно рассматривать как искусственные и которые могут отображать иммуногенность и стабильные эффекты в результате их искусственной композиции. С другой стороны, полностью человеческими антителами данного изобретения являются изолированные, антитела с созревшей аффинностью из выбранных субъектов и антитела, которым характерна толерантность в человеке.
Используемый в настоящем документе термин муринизированное антитело или муринизированный иммуноглобулин относится к антителу, включающему один или несколько CDR, из человеческого антитела или другого антитела согласно изобретению; и, например, участок каркаса человека, который содержит аминокислотные замены и/или делеции и/или вставки, которые основаны на последовательности антитела мыши. В этом случае, человеческий или другой иммуноглобулин, содержащий CDR, называется родитель или акцептор и мышиное антитело, которое обеспечивает изменения рамки, называется донор. Константные области не должны присутствовать, но если они есть, они, как правило, по существу, идентичны константным областям мышиного антитела, т.е. по меньшей мере примерно на 8590%, или по меньшей мере примерно на 95%, примерно на 97%, примерно на 98% или примерно на 99% или более идентичны соответствующей последовательности константного участка мыши. Таким образом, в некоторых вариантах реализации, полная муринизированная человеческая тяжелая или легкая цепь иммуноглобулина содержит мышиную постоянную область, одно или несколько человеческих CDR, и, по существу, человеческий каркас, который имеет ряд мишиных аминокислотных замен. Как правило, муринизированное антитело является антителом, содержащим муринизированную вариабельную легкую цепь и/или муринизированную вариабельную тяжелую цепь. Например, муринизированное антитело не будет охватывать типичное химерное антитело, например, потому что весь вариабельный участок химерного антитела не является мышиным. Модифицированные антитело, которое было муринизированно в процессе муринизации связывается с тем же антигеном, что и родительское антитело, которое содержит CDR, и, как правило, является менее иммуногенным у мышей, по сравнению с родительским антителом.
Используемый в настоящем документе термин часть тяжелой цепи включает аминокислотные последовательности, полученные из тяжелой цепи иммуноглобулина. Полипептид, содержащий часть тяжелой цепи содержит по меньшей мере одно из следующего: домен CH1, шарнирный (например, верхнюю, среднюю, и/или нижнюю шарнирный участок) домен, домен CH2, домен CH3, или его вариант или фрагмент. Например, связывающий полипептид данного изобретения может содержать полипептид, содержащий вариабельный участок(и) или части вариабельного участка (например, один или несколько CDR, таких, как VH CDR3), отдельно или в комбинации с полипептидной цепью, содержащей домен СН1, по меньшей мере часть шарнирного участка, и домен СН2; полипептидную цепь, содержащую домен СН1 и домен CH3; полипептидную цепь, содержащую домен СН1, по меньшей мере часть шарнирного участка, и домен CH3, или полипептидную цепь, содержащую домен СН1, по меньшей мере часть шарнирного участка, домена СН2, и домен CH3. В другом варианте реализации полипептид данного изо- 12 032003 бретения содержит вариабельный участок(и) или части вариабельного участка (например, один или более CDR, таких как VH CDR3) и полипептидную цепь, содержащую домен CH3. В дополнительном варианте реализации полипептид данного изобретения обходится, по меньшей мере, частью домена СН2 (например, всеми или частью домена СН2). Как указано в настоящем документе, и как это будет понятно специалисту в данной области, указанные выше тяжелые цепи полипептидных доменов (например, части тяжелых цепей) могут быть изменены таким образом, что они отличаются по аминокислотной последовательности от встречающихся в природе иммуноглобулиновых молекул. Соответственно, изобретение охватывает полипептиды, содержащие фрагменты, варианты и производные части тяжелой цепи.
В некоторых вариантах реализации часть тяжелой цепи одной полипептидной цепи антитела (в том числе антигенсвязывающего фрагмента, варианта или их производного) идентичны тем, которые находятся на второй полипептидной цепи антитела. В альтернативном варианте реализации часть тяжелой цепи одной полипептидной цепи антитела (в том числе антигенсвязывающего фрагмента, варианта или их производного) отличаются от того, что на второй полипептидной цепи антитела. Таким образом, каждый мономерный компонент антитела данного изобретения может содержать другой мишеньсвязывающий сайт, образуя, например, биспецифическое антитело или диантитело.
Фрагменты антитела изобретения, в том числе одноцепочечного антитела, могут содержать вариабельный участок(и) или части вариабельного участка (например, один или несколько CDR, таких как VH CDR3 или VL CDR3) отдельно или в сочетании с полностью или часть следующего: шарнирный участок, CH1, CH2, и CH3 доменами. Также включенными в объем изобретения являются TDP-43-связывающие фрагменты, которые содержат любую комбинацию из вариабельной участка(ов) с шарнирным участком, CH1, CH2 и CH3 доменами. Антитела (в том числе их иммуноспецифические фрагменты) данного изобретения могут быть получены из животного любого происхождения, включая птиц и млекопитающих. В одном варианте реализации антитела являются человеческими, мышиными, ослиными, кроличьими, козьими, морской свинки, верблюжьими, ламы, лошадиными или куриными антителами. В другом варианте реализации вариабельный участок может быть кондриктоидного происхождения (например, от акул). В другом варианте реализации антитела, раскрытые в настоящем документе, состоят из одной полипептидной цепи, такой как scFvs, и должны экспрессироваться внутриклеточно (интрательно) для потенциальных in vivo терапевтических и диагностических применений.
Части тяжелой цепи или части легкой цепи связывающего полипептида для использования в диагностических методах и методах лечения раскрытых в настоящем документе и могут быть получены из различных молекул иммуноглобулинов. Например, часть тяжелой цепи полипептида может включать домен CH1, полученный из молекулы IgG1 и шарнирного участка, полученную из молекулы IgG3. В другом примере часть тяжелой цепи может содержать шарнирный участок, полученную, в частности, из молекул IgG1 и, в частности, от молекулы IgG3. В другом примере часть тяжелой цепи может содержать химерный шарнир, полученный, в частности, из молекул IgG1 и, в частности, из молекулы IgG4. Как используется в настоящем документе, термин часть легкой цепи включает аминокислотные последовательности, полученные из легкой цепи иммуноглобулина. В одном варианте реализации часть легкой цепи содержит по меньшей мере один VL или домен CL. Как используется в настоящем документе, термин часть легкой цепи включает аминокислотные последовательности, полученные из легкой цепи иммуноглобулина. Полипептид, содержащий участок легкой цепи, включает, по меньшей мере, вариабельный участок(и) легкой цепи или части вариабельного участка (например, один или более CDR, таких как VL CDR3). В некоторых вариантах реализации часть легкой цепи включает в себя домен CH1. В другом варианте реализации часть легкой цепи содержит по меньшей мере один из доменов VL или CL. Полипептиды, содержащие фрагменты, варианты и производные этих частей легких цепей, также охватываются настоящим изобретением.
Минимальный размер пептида или эпитопа полипептида для антитела, как полагают, составляет около четырех-пяти аминокислот. Пептид или эпитопы эпитоп полипептида могут содержать по меньшей мере семь, по меньшей мере девять или по меньшей мере между примерно 15 и примерно 30 аминокислотами. Поскольку CDR может распознать антигенный пептид или полипептид в третичной форме, аминокислоты, содержащие эпитоп, не обязательно должны быть смежными, и в некоторых случаях даже не на одной пептидной цепи. Согласно одному варианту реализации пептид или эпитоп полипептида, распознаваемый антителом данного изобретения, содержит последовательность по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 15, по меньшей мере 20, по меньшей мере 25 смежных или несмежных аминокислот TDP-43. В дополнительном варианте реализации пептид или эпитоп полипептида, распознаваемый антителом данного изобретения содержит от примерно 5 до примерно 30, от примерно 10 до примерно 30, или от 15 до приблизительно 30 смежных или несмежных аминокислот TDP-43. Термины специфически связываться и специфически распознавать используются как синонимы в настоящем документе и в целом относятся к связывающей молекуле (например, полипептида, такого как антитело), что связывается с эпитопом или антигеном легче, чем это было бы при связывании рендомно, с неродственным эпитопом или антигеном. Как известно в данной области, антитело может специфически связываться с, или специфически распознавать изолированный полипептид, содержащий или состоящий
- 13 032003 из, аминокислотных остатков, соответствующих линейной части в не смежном эпитопе. Термин специфичность используется в настоящем документе, чтобы претендовать на относительную близость, по которой определенное антитело связывается с определенным эпитопом или антигеном. Например, антитело А можно считать, имеет более высокую специфичность в отношении данного эпитопа, чем антитело В, или антитело А, можно сказать, связывается с эпитопом С с более высокой специфичностью, чем это имеет в течение соответствующего эпитопа D. Например, антитело А можно считать, имеют более высокую специфичность в отношении данного эпитопа, чем антитело В, или антитело А, можно сказать, связываются с эпитопом С с более высокой специфичностью, чем с соответствующим эпитопом D. Кроме того, антитело А, можно считать, имеет более высокую специфичность для данного антигена, чем антитело В, или антитело А, можно сказать, связывается с антигеном С с более высокой специфичностью, чем это имеет место для соответствующего антигена D.
Где присутствует термин иммунологические характеристики связывания или другие характеристики связывания антитела с антигеном, во всех его грамматических формах, относится к специфичности, аффинности, перекрестной реактивности или других обязательных характеристиках антитела. Под предпочтительным связыванием, подразумевают, что связывание молекулы, например, антитело, специфически связывается с эпитопом или антигеном более легко, чем это было бы при связывании с родственным, подобным, гомологичным или аналогичным эпитопом или антигеном. Таким образом, антитело, которое преимущественно связывается с данным эпитопом или антигеном более вероятно связывается с этими эпитопом или антигеном, чем с родственным эпитопом или антигеном, хотя такое антитело может перекрестно реагировать с соответствующим эпитопом или антигеном.
В качестве не ограничивающего примера, связывающая молекула, например, антитело, может связаться с первым эпитопом или антигеном преимущественно, если оно связывает упомянутый первый эпитоп или антиген с константой диссоциации (KD), что составляет менее KD антитела для второго эпитопа или антигена. В другом, не ограничивающем примере, можно считать, что антитело связывается с первым антигеном преимущественно, если оно связывает первый эпитоп или антиген со сродством, по меньшей мере, на порядок меньше, чем KD антитела, касающегося второго эпитопа или антигена. В другом, не ограничивающем примере, можно считать, что антитело связывается с первым эпитопом или антигеном преимущественно, если оно связывает первый эпитоп или антиген со сродством по меньшей мере на два порядка меньше, чем KD антитела второго эпитопа или антигена.
В другом не ограничивающем примере, связывающую молекулу, например, антитело, можно рассматривать при связывании первого эпитопа или антигена предпочтительно, если оно связывает первый эпитоп или антиген со скоростью диссоциации (к(дис)), что меньше чем у антитела к(дис) для второго эпитопа или антигена. В другом, не ограничивающем примере, можно считать, что антитело связывается с первым эпитопом или антигеном преимущественно, если оно связывает первый эпитоп с аффинностью, которая, по меньшей мере, на порядок меньше, чем у антитела к(дис) для второго эпитопа или антигена. В другом, не ограничивающем примере, можно считать, что антитело связывается с первым эпитопом или антигеном преимущественно, если оно связывает первый эпитоп или антиген со сродством по меньшей мере на два порядка меньше, чем у антитела к(дис) для второго эпитопа или антигена.
Согласно одному варианту реализации в TDP-43-связывающая молекула (например, антитело, включая антигенсвязывающий фрагмент или вариант антитела или его производное) связывает TDP-43 или его фрагмент или вариант, со скоростью диссоциации (к(дис)) менее или равной 5х10-2, 10-2, 5х10-3 или 10-3 с-1. В другом варианте реализации TDP-43-связывающая молекула связывается с TDP-43 или его фрагментом или вариантом, со скоростью диссоциации (к(дис)) меньше или равной 5х10-4, 10-4, 5х10-5 или 10-5, 10-6, 10-6, 5х10-7 или 10-7 с-1.
Согласно другому варианту реализации TDP-43-связывающая молекула (например, в антитело, включая антигенсвязывающий фрагмент или вариант антитела или его производное) связывает TDP-43 или его фрагмент или вариант, со скоростью диссоциации (к(дис)) больше или равной 103, 5х103, 104 или 5х104 М-1-с-1. В дополнительном варианте реализации TDP-43-связывающая молекула данного изобретения связывает TDP-43 или его фрагмент или вариант со скоростью диссоциации (к(дис)) больше или равной 105, 5х105, 106, или 5х106, или 107 М-1-с-1.
Настоящее изобретение также охватывает TDP-43-связывающую молекулу, которая конкурирует с одной или более TDP-43-связывающими молекулами данного изобретения за связывания с TDP-43. Для целей настоящего изобретения, TDP-43-связывающая молекула (например, антитело), как говорят, конкурентно ингибирует связывание эталонной TDP-43-связывающей молекулы (например, антитела) с данным эпитопом или антигеном, если он преимущественно связывается с эпитопом или антигеном в той степени, что он блокирует, в некоторой степени, связывание эталонного антитела с эпитопом или антигеном. Конкурентное ингибирование может быть определено любым способом, известным в данной области, например, исследованием конкуренции с помощью ELISA. В соответствии с одним вариантом реализации TDP-43-связывающая молекула (например, антитело) конкурентно ингибирует связывание эталонной TDP-43-связывающей молекулы (например, антитела) с данным эпитопом или антигеном по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 60% или
- 14 032003 по меньшей мере на 50%.
Используемый в настоящем документе термин сродство относится к мере прочности связывания индивидуального эпитопа или антигена с TDP-43-связывающей молекулой (например, антителом, в том числе фрагментом, вариантом и их производным). См., например, Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. (1988) at pages 27-28. Используемый в настоящем документе термин авидность относится к общей стабильности комплекса между популяцией иммуноглобулинов и антигенов, т.е. функциональное объединение прочности смеси иммуноглобулина с антигеном; см., например, Harlow at pages 29-34. Авидность связана как со сродством отдельных молекул иммуноглобулина в популяции с конкретным эпитопам или антигенами, и также с валентностью иммуноглобулинов и на антигенов. Например, взаимодействие между двухвалентным моноклональным антителом и антигеном с сильно повторяющейся структурой эпитопа, например полимера, будет одним из высоко авидных. Близость или авидность антитела к антигену может быть определена экспериментально, используя любой подходящий метод; см., например, Berzrosky et al., Antigen-Antibody Interactions In Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press New York, N Y (1984), Kuby, Janis Immunology, W. H. Freeman и Company New York, N Y (1992), и методы, описанные в настоящем документе. Общие методы измерения аффинности антитела к антигену включают ELISA, RIA, и поверхностный плазмонный резонанс. Измеренное сродство взаимодействия конкретного антитела с антигеном может изменяться, если измерять в различных условиях, например, концентрации соли, рН. Таким образом, измерения сродства и других антигенсвязывающих параметров, например, KD, IC50, предпочтительно выполнять со стандартизированными растворами антитела и антигена, и в стандартизированном буфере.
TDP-43-связывающие молекулы (например, антитела, включая антигенсвязывающие фрагменты антитела и варианты или их производные) данного изобретения также определены или описаны с точки зрения их перекрестной реактивности. Используемый в настоящем документе термин перекрестная реактивность относится к способности TDP-43-связывающей молекулы (например, антитела), характерной для одного антигена, реагировать со вторым отдельным антигеном; мера часто отражает степень сродства между двумя различными антигенными веществами.
Например, некоторые антитела имеют некоторую степень перекрестной реактивности, в том, что они связывают похожие, но не идентичные эпитопы или антигены, например, эпитопы по меньшей мере с 95%, по меньшей мере с 90%, по меньшей мере с 85%, по меньшей мере с 80%, по меньшей мере с 75%, по меньшей мере с 70%, по меньшей мере с 65%, по меньшей мере с 60%, по меньшей мере с 55% и по меньшей мере с 50% идентичностью (по расчету с использованием методов, описанных в настоящем документе или иначе известных в этой области техники ) с опорным эпитопом или антигеном. Антитело можно считать высокоспецифичным в пределах определенного эпитопа, если оно не связывает любой другой аналог, ортолог, или гомолог вышеуказанного эпитопа или антигена. Согласно одному варианту реализации TDP-43-связывающие молекулы (например, антитела, включая антигенсвязывающие фрагменты антитела, и варианты или их производные) не связывают эпитопы менее чем с 95%, менее чем с 90%, менее чем с 85%, менее чем с 80%, менее чем с 75%, менее чем с 70%, менее чем с 65%, менее чем с 60%, менее чем с 55% и менее с 50% идентичностью (по расчету с использованием методов, описанных в настоящем документе или иным образом известных в данной области) с опорным эпитопом или антигеном в физиологических условиях.
TDP-43-связывающие молекулы, такие как антитела (включая антигенсвязывающие фрагменты антитела и варианты или их производные, данного изобретения могут также быть описаны с точки зрения их аффинности связывания с TDP-43. Согласно одному варианту реализации аффинность связывания TDP-43-связывающих молекул (например, антител, включая антигенсвязывающие фрагменты антитела и варианты или их производные) включает вышеупомянутые с константой диссоциации или Kd менее 5x10-2 10-2 5x10-3 10-3 5x10-4 10-4 5x10-5 10-5 5x10-6 10-6 5x10-7 10-7 5x10-8 10-8 5x 10-9 10-9 5x10-10
W-10 г. ,ι л-11 ι λ-11 £κ^ιλ-12 i λ·1^ ^/1 λ·1^ 1 λ·1^ ^/1 λ·1^ 1 a-14 £..i/\-15 ~ ι a-15 ά к , 5x10 , 10 , 5x10 , 10 , 5x10 , 10 , 5x10 , 10 , 5x10 или 10 ^М.
Структуры субъединиц и трехмерных конфигураций из константных участков иммуноглобулинов различных классов хорошо известны. Используемый в настоящем документе термин VH домен включает аминоконцевой вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина и термин CH1 домен включает первый (наиболее аминоконцевой) константный участок домена тяжелой цепи иммуноглобулина. Домен CH1 находится рядом с VH доменом и представляет собой аминоконцевой шарнирный участок тяжелой цепи иммуноглобулина молекулы. Используемый в настоящем документе термин CH2 домена включает в себя часть тяжелой цепи молекулы, которая охватывает, например, от примерно 244 остатка до 360 остатка антитела с использованием обычных схем нумерации (остатки с 244 до 360, систему нумерации Кэбота; и остатки 231-340, система нумерации ЕС, см. Kabat ЕА и др., там же). Домен CH2 уникален тем, что он не тесно сочетается с другим доменом. Напротив, две N-связанные разветвленные углеводные цепи расположены между двумя доменами CH2 интактной нативной IgG молекулы. Также хорошо документировано, что домен CH3 располагается от домена CH2 к С-концу молекулы IgG и включает приблизительно 108 остатков.
Как используется в настоящем документе, термин шарнирный участок включает в себя часть тя
- 15 032003 желой цепной молекулы, которая соединяет CHI-домен с доменом CH2. Эта петлевой участок включает в себя около 25 остатков и является гибким, что позволяет двум N-концевым антигенсвязывающии учасктам самостоятельно передвигаться. Шарнирные участки можно разделить на три области: верхняя, средняя, и нижняя петли доменов; см. Roux et al., J. Immunol. 161 (1998), 4083. Как используется в настоящем документе термин дисульфидная связь включает в себя ковалентную связь, образуемую между двумя атомами серы. Аминокислота цистеин содержит тиольную группу, которая может образовывать дисульфидную связь или мостик со второй тиольной группой. В большинстве естественных молекул IgG, CH1 и CL регионы связаны дисульфидной связью и две тяжелые цепи связаны двумя дисульфидными связями в местах, соответствующих 239 и 242 с использованием системы нумерации Кэбота (позиция 226 или 229 система нумерации ЕС).
Используемые в настоящем документе термины связанный, слияние или слитый используются взаимозаменяемо. Эти термины относятся к соединенным вместе более двух элементов или компонентов, любыми средствами, включая химическую конъюгацию или рекомбинантные способы. Слияние внутри рамки считывания относится к соединению двух или более полинуклеотидных открытых рамок считывания (ORF) с образованием непрерывной длительный ORF, таким образом, поддерживается правильное трансляционное считывание рамки исходных ORF. Таким образом, рекомбинантный слитый белок это один белок, содержащий два или более сегментов, которые соответствуют полипептидам, кодируемым исходным ORF (сегменты которых обычно не так соединены в природе). Несмотря на то, что рамка считывания таким образом непрерывно проходит все слитые сегменты, сегменты могут быть физически или пространственно разделены, например, линкерной последовательностью рамки считывания. Например, полинуклеотиды, кодирующие CDR, из вариабельного участка иммуноглобулина могут быть слиты в рамке, но быть разделены полинуклеотидом, кодирующим по меньшей мере один иммуноглобулиновый каркасный участок или дополнительные CDR участки, при условии, что слитый CDR является одним из транслируемых как часть непрерывного полипептида.
Термин экспрессия, используемый в настоящем документе относится к процессу, с помощью которого ген производит биохимические, например, РНК или полипептид. Процесс включает в себя любое проявление функционального присутствия гена в клетке, включая, без ограничения, нокдаун гена, а также временную экспрессию и стабильную экспрессию. Он включает в себя, помимо прочего, транскрипцию гена в матричной РНК (мРНК), передачу РНК (тРНК), небольшую шпильку РНК (шРНК), малые интерферирующие РНК (миРНК) или любой другой продукт РНК, и трансляцию таких мРНК в полипептид(ы). Если конечный целевой продукт представляет собой биохимический продукт, выражение включает в себя создание этого биохимического продукта и любых предшественников. Экспрессия гена производит генный продукт. Как используется в настоящем документе, продукт гена может быть либо нуклеиновой кислотой, например, информационную РНК получают путем транскрипции гена, или полипептида, который транслирован с транскрипта. Генные продукты, описанные в настоящем документе, далее включают нуклеиновые кислоты с после транскрипционной модификаций, например, полиаденилированием, или полипептиды с посттрансляционными модификациями, например, метилированием, гликозилированием, добавлением липидов, совместно с другими белковыми субъединицами, протеолитическим расщеплением и тому подобное. Как используется в настоящем документе, термин образец относится к любому биологическому материалу, полученному от субъекта или пациента. В одном варианте реализации образец состоит из крови, спинномозговой жидкости (CSF), или мочи. В другом варианте реализации образец содержит цельную кровь, плазму, образцы обогащенной В-клетками крови, или культивируемых клеток (например, В-клетки субъекта). В другом варианте реализации образец данного изобретения содержит биопсию или образец ткани, в том числе нервной ткани. В дополнительном варианте реализации образец данного изобретения содержит целые клетки или лизат клеток. Образцы по настоящему изобретению, в том числе образцы крови и образцы CSF могут быть собраны с использованием способов, известными в данной области. Как используется в настоящем документе, термины лечить или лечение относятся к терапевтическому лечению и профилактическим или превентивным мерам, отличающиеся тем, что объект призван предотвратить или замедлить (уменьшить) нежелательные физиологические изменения или нарушения, например развитие слабоумия. Выгодные или желаемые клинические результаты включают, облегчение симптомов, уменьшение степени болезни, стабилизацию (т.е. не ухудшение) состояния болезни, задержку или замедление прогрессирования заболевания, улучшение или временное облегчение болезненного состояния, и ремиссию (частичную или полную), но не ограничиваются ими, независимо от обнаружения или не обнаружения. Лечение может также означать, продевание выживания по сравнению с ожидаемым выживанием, в случае неполучения лечения. Те, кто нуждается в лечении, включая тех, кто уже в состоянии или расстройстве, а также лиц, склонных к состоянию или расстройству, или тех, у которых проявление состояния или расстройства должно быть предотвращено.
Под субъектом, или индивидуумом, или животным, или пациентом, или млекопитающим имеется в виду любой субъект, в частности млекопитающий субъект, например больной человек, для которых требуется диагноз, прогноз, профилактика или терапию.
- 16 032003
II. Антитела.
Антитела, которые селективно связывают TDP-43, охватываются настоящим изобретением. Используемый в настоящем документе термин антитело или антитела охватывает полные антитела, а также TDP-43-связывающие фрагменты антитела и варианты и производные этих полных антител или фрагменты антитела, которые связывают TDP-43. В одном варианте реализации антитело данного изобретения демонстрирует по меньшей мере одну, две, три, четыре, пять или более структурные характеристики (например, последовательность), иммунологические характеристики связывания (например, IC50, или связывания с эпитопом), и/или биологические свойства антител, описанные в примерах и в других местах в данном описании.
По некоторым вариантам реализации антитело данного изобретения является совершенно человеческим антителом. Изобретение также включает фрагменты, варианты и производные из полностью человеческого антитела. Как раскрыто в примерах, полностью человеческие антитела раскрытые в настоящем документе, были получены из пула образцов от здоровых людей. Антитела потенциального интереса были проанализированы для определения класса и подкласса легкой цепи, выбранных из культур Вклеток памяти и были расшифрованы методом RT-PCR, клонированы и соединены с векторами экспрессии рекомбинантного производства; см. прилагаемые примеры. Полностью человеческие антитела были затем рекомбинантно экспрессированы в клетках HEK293 и, впоследствии, характеризуются на основе их специфичности связывания по отношению к полномерным TDP-43, усеченным TDP-43 и модифицированным формам TDP-43 (фиг. 2, 4-7, 10 и 11). Эта характеристика подтверждает, что в первый раз были клонированы человеческие антитела, которые являются высокоспецифичными для TDP-43 и распознают различные эпитопы в белке TDP-43.
Таким образом, согласно одному варианту реализации изобретение в целом относится к антителу, которое специфически распознает TDP-43. В еще одном варианте реализации изобретение направлено на человеческое антитело, которое специфически распознает TDP-43. В еще одном дополнительном варианте реализации изобретение направлено на создание общего человеческого антитела, которое специфически распознает TDP-43. В дополнительных вариантах реализации изобретение охватывает TDP-43связывающий фрагмент, вариант или производное TDP-43-связывающего интактного человеческого (в том числе полностью человеческого) антитела по изобретению. В другом варианте реализации антитела данного изобретения специфично распознают полномерный, усеченный или патологический человеческий TDP-43 в Вестерн-блоттинге. В дополнительном варианте реализации антитела данного изобретения селективно связывают полномерный или патологический TDP-43 в Вестерн-блоттинге. В другом варианте реализации антитела данного изобретения специфически распознают полномерный, усеченный или патологический человеческий TDP-43 в ELISA. В дополнительном варианте реализации антитела данного изобретения селективно связывают полномерный или патологический TDP-43 в ELISA. В другом варианте реализации антитела данного изобретения специфично распознают любую комбинацию полномерного, усеченного, или патологического человеческого TDP-43 в иммуногистохимии. В дополнительном варианте реализации антитела данного изобретения селективно связывают полномерный или патологический TDP-43 в иммуногистохимии. В другом варианте реализации антитела данного изобретения специфично распознают любую комбинацию полномерного, усеченного, или патологического человеческого TDP-43 в иммуногистохимии гиппокампа. В дополнительном варианте реализации антитела данного изобретения селективно связывают полномерный или патологический TDP-43 в иммуногистохимии гиппокампа. В дополнительном варианте реализации антитела данного изобретения селективно связываются с одним или несколькими ядерными TDP-43, цитоплазматическими TDP-43, аксонамси TDP-43, или невритическими TDP- 43 в иммуногистохимии человеческого ЛВД-U гиппокампа. В другом варианте реализации антитела данного изобретения селективно связываются с одним или несколькими из цитоплазматическими TDP-43 и нейритными TDP-43 в гранулярных клетках гиппокампа в иммуногистохимии человеческого ЛВД-U гиппокампа. Согласно одному варианте реализации антитела данного изобретения специфично распознают патологический человеческий-TDP-43.
В другом варианте реализации изобретение охватывает антитело (в том числе в антигенсвязывающий фрагмент, вариант или их производные), которое специфически связывается с тем же эпитопом TDP-43, что и эталонное антитело, имеющее тяжелую и легкую цепь вариабельного домена антитела, выбранного из группы, состоящей из NI-205.3F10, NI-205.51O, NI-205.21G2, М-205.8А2, NI-205.15F12, NI-205.113O, NI-205.25F3, М-205.87Е7, NI-205.21G1, NI-205.68G5, №-205.20А1, NI205.41D1, NI205.29E11, М205.9Е12, NI205.98E6, NI205.10D3, NI205.44B2, NI205.38E2, NI205.36D5, NI205.58E11, NI205.1445, NI205.31D2, NI205.8F8, NI205.31C11, NI205.800, NI205.10E7, М205.1А9, NI205.14W3 и NI205.19G5. В дополнительном варианте реализации изобретение охватывает антитело (в том числе в антигенсвязывающий фрагмент, вариант или их производные), которое специфически связывается с тем же эпитопом TDP-43, что и эталонное антитело, имеющее тяжелую и легкую цепь вариабельного домена антитела, выбранного из группы, состоящей из NI-205.3F10, N[-205.510. NI-205.21G2, М-205.8А2, NI205.15F12, NI-205.113O, NI-205.25F3, №-205.87Е7, NI-205.21G1, NI-205.68G5, NI-205.20A1, NI205.41D1, NI205.29E11, NI205.9E12, NI205.98E6, NI205.10D3, NI205.44B2, NI205.38E2, NI205.36D5, NI205.58E11, NI205.14E5, NI205.31D2, NI205.8F8, NI205.31O1, NI205.800, NI205.10E7, NI205.O9,
- 17 032003
NI205.14W3 и NI205.19G5.
В другом варианте реализации изобретение охватывает антитело (в том числе в антигенсвязывающий фрагмент, вариант или их производные), которое специфически связывается с TDP-43 полипептидной последовательностью, выбранной из:
QYGDVMDVFIP (SEQ Ш № 123), AAIGWGSASNA (SEQ Ш № 124),
DMTEDELREFF (SEQ ID № 125), EDENDEP (SEQ ID № 126), VQVKKDL (SEQ ID № 127), KEYFSTF (SEQ ID № 128), IIKGISV (SEQ ID №315), NQSGPSG (SEQ ID №316), FNGGFGS (SEQ ID №317), FGNSRGGGAGL (SEQ ID №318), SNAGSGSGFNG (SEQ ID №319), QLERSGRFGGN (SEQ ID №320), EIPSEDD (SEQ ID №321), FNGGFGSSMDS (SEQ ID №322) и SINPAMMAAAQAALQSSWGMMGMLASQ (SEQ ID №323)
В другом варианте реализации изобретение охватывает антитело (в том числе в антигенсвязывающий фрагмент, вариант или их производные), которое специфически связывается с TDP-43 полипептидом FGNSRGGGAGL (SEQ ID №318) и SNAGSGSGFNG (SEQ ID №319)
В другом варианте реализации изобретение охватывает антитело (в том числе в антигенсвязывающий фрагмент, вариант или их производные), которое специфически связывается с TDP-43 полипептидом SINPAMMAAAQAALQSSWGMMGMLASQ (SEQ ID №323), но не связывается специфически с SINPGGGAAAQAALQSSWGMMGMLASQ (SEQ ID №314).
В другом варианте реализации изобретение охватывает антитело (в том числе в антигенсвязывающий фрагмент, вариант или их производные), которое конкурентно ингибирует связывание TDP-43 с эталонным антителом, имеющим вариабельный домен тяжелой и легкой цепей антитела, выбранной из группы, состоящей из NI-205.3F10, NI-205.51C1, NI-205.21G2, ΝΙ-205.8Ά2, NI-205.15F12, NI-205.113C4, NI-205.25F3, NI-205.87E7, NI-205.21G1, NI-205.68G5, NI-205.20A1, NI205.41D1, NI205.29E11, NI205.9E12, NI205.98H6, NI205.10D3, NI205.44B2, NI205.38H2, NI205.36D5, NI205.58E11, NI205.14H5, NI205.31D2, NI205.8F8, NI205.31C11, NI205.8C10, NI205.10H7, NI205.1A9, NI205.14W3 и NI205.19G5. В дополнительном варианте реализации изобретение охватывает антитело (в том числе в антигенсвязывающий фрагмент, вариант или их производные), которое конкурентно ингибирует связывание TDP-43 с эталонным антителом, имеющим вариабельный домен тяжелой и легкой цепей антитела, выбранной из группы, состоящей из NI-205.3F10, NI-205.51C1, NI-205.21G2, NI-205.8A2, NI-205.15F12, NI-205.113C4, NI-205.25F3, NI-205.87E7, NI-205.21G1, NI-205.68G5, NI-205.20A1, NI205.41D1, NI205.29E11, NI205.9E12, NI205.98H6, NI205.10D3, NI205.44B2, NI205.38H2, NI205.36D5, NI205.58E11, NI205.14H5, NI205.31D2, NI205.8F8, NI205.31C11, NI205.8C10, NI205.10H7, NI205.1A9, NI205.14W3 и NI205.19G5.
Как показано в примерах, изобретение охватывает антитела, которые связываются с различными частями и эпитопами TDP-43. По некоторым вариантам реализации антитело данного изобретения связывает линейный эпитоп TDP-43. По другим вариантам реализации антитело данного изобретения связывает конформационный эпитоп TDP-43. В дополнительном варианте реализации антитело данного изобретения селективно связывает домен TDP-43, выбранный из группы, состоящей из: TDP-43 домена I (аминокислотные остатки 2-106 из SEQ ID NO: 94) остатков домена II TDP-43 (аминокислотные 99-204 из SEQ ID NO: 94), TDP-43 домена III (остатки домена TDP-43 аминокислотных 183-273 из SEQ ID NO: 94), и TDP-43 домена IV (аминокислотные остатки 258-414 из SEQ ID NO: 94). В другом варианте реализации анти-TDP-43 антитело не распознает усеченную форму TDP-43. В дополнительном варианте реализации изобретение относится к анти-TDP-43 антителу, которое распознает №терминальный1-259 фрагмент TDP-43. В дополнительном варианте реализации анти-TDP-43 антитело селективно связывает патологический TDP-43. В дополнительном варианте реализации анти-TDP-43 антитело специфически связывает TDP-43 домен IV (аминокислотные остатки 258-414 из SEQ ID NO: 94), но специфически не связывает TDP-43 домен IV, включающий A321G, M322G, и M323G замены.
Изобретение охватывает человеческие анти-TDP-43 антитела, имеющие различные TPD-43 особенности, которые, таким образом, особенно полезны для диагностических и терапевтических целей. Изобретение также обращается к антителу, содержащему антигенсвязывающий домен, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из присутствующего в эталонном антителе, выбранного из группы, состоящей из NI-205.3F10, NI-205.51C1, NI-205.21G2, NI-205.8A2, NI-205.15F12, NI-205.113C4, NI-205.25F3, NI-205.87E7, NI-205.21G1, NI-205.68G5, NI-205.20A1, NI205.41D1, NI205.29E11, NI205.9E12, NI205.98H6, NI205.10D3, NI205.44B2, NI205.38H2, NI205.36D5, NI205.58E11, NI205.14H5, NI205.31D2, NI205.8F8, NI205.31C11, NI205.8C10, NI205.10H7, NI205.1A9, NI205.14W3 и NI205.19G5.
Примеры и фигуры раскрывают TDP-43-связывающие молекулы, которые характеризуются тем, что содержат в своем связывающем домене по меньшей мере один гипервариабельный участок (CDR) из VH и/или VL вариабельного участка, включающего любые из аминокислотные последовательности, изображенные на фиг. 1A-1K и 3A-3R и перечисленные в табл. 2. ^ответствующие нуклеотидные последовательности, кодирующие эти вариабельные участки, изложены в табл. 3. Примерный набор CDR, указанных выше аминокислотных последовательностей в VH и/или VL участков изображен в фиг. 1A-1K и
- 18 032003
3A-3R. Однако, как будет понятно специалисту в данной области техники, можно использовать дополнительные или альтернативные CDR, которые специфически связываются TDP-43, но которые отличаются по их аминокислотной последовательности от изложенных на фиг. 1А-1К и 3A-3R на одну, две, три или даже больше аминокислот в случае CDR2 и CDR3.
Таблица 2 Номера SEQ ID NO: участков VH, VH CDR1, VH CDR2, VH CDR2, участков VL, VL CDR2, VL CDR2 и VL CDR3 TDP-43-специфичных антител
Антитело Vh/Vl CDR1 CDR2 CDR3
N1-20 5.3F10 Vh SEQ ID №1 SEQ ID №3 SEQ ID №4 SEQ ID №5
Vl SEQ ID №6 SEQ ID №7 SEQ ID №8 SEQ ID №9
N1-205.51C1 Vh SEQ ID №10 SEQ ID №11 SEQ ID №12 SEQ ID №13
Vl SEQ ID №14 SEQ ID №15 SEQ ID №16 SEQ ID №17
N1-205.21G2 Vh SEQ ID №18 SEQ ID №19 SEQ ID №20 SEQ ID №21
Vl SEQ ID №22 SEQ ID №23 SEQ ID №24 SEQ ID №25
N1-205.8A2 Vh SEQ ID №26 SEQ ID №28 SEQ ID №29 SEQ ID №30
Vl SEQ ID №31 SEQ ID №32 SEQ ID №33 SEQ ID №34
N1-205.15F12 Vh SEQ ID №:35 SEQ ID №37 SEQ ID №38 SEQ ID №39
Vl SEQ ID №40 SEQ ID №42 SEQ ID №43 SEQ ID №44
N1-205.113C4 Vh SEQ ID №45 SEQ ID №46 SEQ ID №47 SEQ ID №48
Vl SEQ ID №49 SEQ ID №50 SEQ ID №51 SEQ ID №52
NI-205.25F3 Vh SEQ ID №53 SEQ ID №54 SEQ ID №55 SEQ ID №56
Vl SEQ ID №57 SEQ ID №58 SEQ ID №59 SEQ ID №60
N1-205.87E7 Vh SEQ ID №61 SEQ ID №62 SEQ ID №63 SEQ ID №64
Vl его m Xik/cc 01--4/ J_LZ СТТ/Л ТТЛ МкЛЛ 0124/ 11-/ СТБГЛ ТТЛ МЧД-7 0124/ IL·* t cm утл ΆιΛ/ίο jny 11 j
N1-205.21G1 Vh SEQ ID №69 SEQ ID №70 SEQ ID №71 SEQ ID №72
Vl SEQ ID №73 SEQ ID №74 SEQ ID №75 SEQ ID №76
N1-205.68G5 Vh SEQ ID №77 SEQ ID №79 SEQ ID №80 SEQ ID №81
Vl SEQ ID №82 SEQ ID №84 SEQ ID №85 SEQ ID №86
NI-205.20A1 Vh SEQ ID №87 SEQ ID №88 SEQ ID №89 SEQ ID №90
Vl SEQ ID №122 SEQ ID №91 SEQ ID №92 SEQ ID №93
N1205.41D1 Vh SEQ ID №130 SEQ ID №131 SEQ ID №132 SEQ ID №133
Vl SEQ ID №134 SEQ ID №135 SEQ ID №136 SEQ ID №137
NI205.29E11 Vh SEQ ID №138 SEQ ID №139 SEQ ID №140 SEQ ID №141
Vl SEQ ID №142 SEQ ID №143 SEQ ID №144 SEQ ID №145
NI205.9E12 Vh SEQ ID №146 SEQ ID №147 SEQ ID №148 SEQ ID №149
Vl SEQ ID №150 SEQ ID №326 SEQ ID №327 SEQ ID №328
Vl SEQ ID №151 SEQ ID №152 SEQ ID №153 SEQ ID №154
NI205.98H6 Vh SEQ ID №155 SEQ ID №156 SEQ ID №157 SEQ ID №158
Vl SEQ ID №159 SEQ ID №160 SEQ ID №161 SEQ ID №162
N1205.10D3 Vh SEQ ID №163 SEQ ID №164 SEQ ID №165 SEQ ГО №166
- 19 032003
Vl SEQ ID №167 SEQ ID №168 SEQ ID №169 SEQ ID №170
NI205.44B22 Vh SEQ ID №171 SEQ ID №172 SEQ ID №173 SEQ ID №174
Vl SEQ ID №175 SEQ ID №176 SEQ ID №177 SEQ ID №178
N1205.38Н2 Vh SEQ ID №179 SEQ ID №180 SEQ ID №181 SEQ ID №182
Vl SEQ ID №183 SEQ ID №184 SEQ ID №185 SEQ ID №186
N1205.36D5 Vh SEQ ID №187 SEQ ID №188 SEQ ID №189 SEQ ID №190
Vl SEQ ID №191 SEQ ID №192 SEQ ID №193 SEQ ID №194
NI205.58E11 Vh SEQ ID №195 SEQ ID №196 SEQ ID №197 SEQ ID №198
Vl SEQ ID №199 SEQ ID №200 SEQ ID №201 SEQ ID №202
N1205.14Н5 Vh SEQ ID №203 SEQ ID №204 SEQ ID №205 SEQ ID №206
Vl SEQ ID №207 SEQ ID №208 SEQ ID №209 SEQ ID №210
N1205 31D2 Vh SEQ ID №211 SEQ ID №212 SEQ ID №213 SEQ ID №214
Vl SEQ ID №215 SEQ ID №216 SEQ ID №217 SEQ ID №218
N1205.8F8 Vh SEQ ID №219 SEQ ID №220 SEQ ID №221 SEQ ID №222
Vl SEQ ID №223 SEQ ID №224 SEQ ID №225 SEQ ID №226
NI205.31C11 Vh SEQ ID №227 SEQ ID №228 SEQ ID №229 SEQ ID №230
Vl SEQ ID №231 SEQ ID №232 SEQ ID №233 SEQ ID №234
NI205.8C10 Vh SEQ ID №235 SEQ ID №236 SEQ ID №237 SEQ ID №238
Vl SEQ ID №239 SEQ ID №240 SEQ ID №241 SEQ ID №242
N1205 10Н7 Vh SEQ ID №243 SEQ ID №244 SEQ ID №245 SEQ ID №246
Vl SEQ ID №247 SEQ ID №248 SEQ ID №249 SEQ ID №250
N1205.1А9 Vh SEQ ID №251 SEQ ID №252 SEQ ID №253 SEQ ID №254
Vl SEQ ID №255 SEQ ID №256 SEQ ID №257 SEQ ID №258
N1205.14W3 Vh SEQ ГО №259 SEQ ID №260 SEQ ID №261 SEQ ID №262
Vl SEQ ID №263 SEQ ID №264 SEQ ID №265 SEQ ID №266
N1205.19G5 Vh SEQ ID №267 SEQ ID №268 SEQ ID №269 SEQ ID №270
Vl SEQ ID №271 SEQ ID №272 SEQ ID №273 SEQ ID №274
В одном варианте реализации антитело данного изобретения содержит по меньшей мере один CDR, включающий или состоящий из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3-5, 7-9, 11-13, 15-17, 19-21, 23-25, 28-30, 32-34, 37-39, 42-44, 46-48, 50-52, 54-56, 58-60, 62-64, 66-68, 70-72, 74-76, 79-81, 84-86, 88-93, 131-133, 135-137, 139-141, 143-145, 147-149, 152-154, 156158, 160-162, 164-166, 168-170, 172-174, 176-178, 180-182, 184-186, 188-190, 192-194, 196-198, 200-202, 204-206, 208-210, 212-214, 216-218, 220-222, 224-226, 228-230, 232-234, 236-238, 240-242, 244-246, 248250, 252-254, 256-258, 260-262, 264-266, 268-270, 272-274 и 326-328.
В одном варианте реализации антитело данного изобретения содержит один, два, три, четыре, пять или шесть CDR, включающих или состоящих из аминокислотных последовательностей, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3-5, 7-9, 11-13, 15-17, 19-21, 23-25, 28-30, 32-34, 37-39, 42-44, 46-48, 50-52, 54-56, 58-60, 62-64, 66-68, 70-72, 74-76, 79-81, 84-86, 88-93, 131-133, 135-137, 139-141, 143-145, 147-149, 152-154, 156-158, 160-162, 164-166, 168-170, 172-174, 176-178, 180-182, 184-186, 188-190, 192194, 196-198, 200-202, 204-206, 208-210, 212-214, 216-218, 220-222, 224-226, 228-230, 232-234, 236-238, 240-242, 244-246, 248-250, 252-254, 256-258, 260-262, 264-266, 268-270, 272-274 и 326-328.
В одном варианте реализации антитело данного изобретения содержит один, два, три, четыре, пять или шесть CDR, включающих или состоящих из аминокислотных последовательностей, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3-5 и 7-9, 11-13 и 15-17, 19-21 и 23-25, 28-30 и 32-34, 37-39 и 42-44, 46-48 и 50-52, 54-56 и 58-60, 62-64 и 66-68, 70-72 и 74-76, 79-81 и 84-86, 88-93, 131-133 и 135-137, 139141 и 143-145, 147-149 и 152-154, 156-158 и 160-162, 164-166 и 168-170, 172-174 и 176-178, 180-182 и 184-186, 188-190 и 192-194, 196-198 и 200-202, 204-206 и 208-210, 212-214 и 216-218, 220-222 и 224-226, 228-230 и 232-234, 236-238 и 240-242, 244-246 и 248-250, 252-254 и 256-258, 260-262 и 264-266, 268-270 и 272-274 и 147-149 и 326-328. В одном варианте реализации антитело данного изобретения содержит один, два или три VH CDR, включающих или состоящих из аминокислотных последовательностей, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3-5, 11-13, 19-21, 28-30, 37-39, 46-48, 54-56, 62-64, 70-72, 79-81, 88-90, 131-133, 139-141, 147-149, 156-158, 164-166, 172-174, 180-182, 188-190, 196-198, 204-206, 212-214, 220-222, 228-230, 236-238, 244-246, 252-254, 260-262 и 268-270.
В одном варианте реализации антитело данного изобретения содержит один, два или три VL CDR, включающих или состоящих из аминокислотных последовательностей, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 7-9, 15-17, 23-25, 32-34, 42-44, 50-52, 58-60, 66-68, 74-76, 84-86, 91-93, 135-137, 143-145,
- 20 032003
152-154, 160-162, 168-170, 176- 178, 184-186, 192-194, 200-202, 208-210, 216-218, 224-226, 232-234, 240242, 248-250, 256-258, 264-266, 272-274 и 326-328.
Согласно одному варианту реализации антитело данного изобретения содержит тяжелую цепь вариабельного участка, которая содержит VH CDR1 из SEQ ID NO: 3, 11, 19, 28, 37, 46, 54, 62, 70, 79, 88, 131, 139, 147, 156, 164, 172, 180, 188, 196, 204, 212, 220, 228, 236, 244, 252, 260 или 268; VH CDR2 из SEQ ID NO: 4, 12, 20, 29, 38, 47, 55, 63, 71, 80, 89, 132, 140, 148, 157, 165, 173, 181, 189, 197, 205, 213, 221, 229, 237, 245, 253, 261 или 269; или VH CDR3 из SEQ ID NO: 5, 13, 21, 30, 39, 48, 56, 64, 72, 81, 90, 133, 141, 149, 158, 166, 174, 182, 190, 198, 206, 214, 222, 230, 238, 246, 254, 262 или 270.
Согласно одному варианту реализации антитело содержит легкую цепь вариабельного участка, которая содержит VL CDR1 из SEQ ID NO: 7, 15, 23, 32, 42, 50, 58, 66, 74, 84, 91, 135, 143, 152, 160, 168, 176, 184, 192, 200, 208, 216, 224, 232, 240, 248, 256, 264, 272 или 326; VL CDR2 из SEQ ID NO: 8, 16, 24, 33, 43, 51, 59, 67, 75, 85, 92, 136, 144, 153, 161, 169, 177, 185, 193, 201, 209, 217, 225, 233, 241, 249, 257, 265, 273 или 327; или VL CDR3 из SEQ ID NO: 9, 17, 25, 34, 44, 52, 60, 68, 76, 86, 93, 137, 145, 154, 162, 170, 178, 186, 194, 202, 210, 218, 226, 234, 242, 250, 258, 266, 274 или 328.
В другом варианте реализации антитело содержит тяжелую цепь вариабельного участка, которая содержит VH CDR1 из SEQ ID NO: 3, 11, 19, 28, 37, 46, 54, 62, 70, 79, 88, 131, 139, 147, 156, 164, 172, 180, 188, 196, 204, 212, 220, 228, 236, 244, 252, 260 или 268; VH CDR2 из SEQ ID NO: 4, 12, 20, 29, 38, 47, 55, 63, 71, 80, 89, 132, 140, 148, 157, 165, 173, 181, 189, 197, 205, 213, 221, 229, 237, 245, 253, 261 или 269; или VH CDR3 из SEQ ID NO: 5, 13, 21, 30, 39, 48, 56, 64, 72, 81, 90, 133, 141, 149, 158, 166, 174, 182, 190, 198, 206, 214, 222, 230, 238, 246, 254, 262 или 270, и дополнительно содержит легкую цепь вариабельного участка, которая содержит VL CDR1 из SEQ ID NO: 7, 15, 23, 32, 42, 50, 58, 66, 74, 84, 91, 135, 143, 152, 160, 168, 176, 184, 192, 200, 208, 216, 224, 232, 240, 248, 256, 264, 272 или 326; VL CDR2 из SEQ ID NO: 8, 16, 24, 33, 43, 51, 59, 67, 75, 85, 92, 136, 144, 153, 161, 169, 177, 185, 193, 201, 209, 217, 225, 233, 241, 249, 257, 265, 273 или 327; или VL CDR3 из SEQ ID NO: 9, 17, 25, 34, 44, 52, 60, 68, 76, 86, 93, 137, 145, 154, 162, 170, 178, 186, 194, 202, 210, 218, 226, 234, 242, 250, 258, 266, 274 или 328.
Согласно одному варианту реализации антитело данного изобретения содержит тяжелую цепь вариабельного участка, которая содержит VH CDR1 из SEQ ID NO: 3, 11, 19, 28, 37, 46, 54, 62, 70, 79, 88, 131, 139, 147, 156, 164, 172, 180, 188, 196, 204, 212, 220, 228, 236, 244, 252, 260 или 268; VH CDR2 из SEQ ID NO: 4, 12, 20, 29, 38, 47, 55, 63, 71, 80, 89, 132, 140, 148, 157, 165, 173, 181, 189, 197, 205, 213, 221, 229, 237, 245, 253, 261 или 269; и VH CDR3 из SEQ ID NO: 5, 13, 21, 30, 39, 48, 56, 64, 72, 81, 90, 133, 141, 149, 158, 166, 174, 182, 190, 198, 206, 214, 222, 230, 238, 246, 254, 262 или 270.
Согласно одному варианту реализации антитело содержит легкую цепь вариабельного участка, которая содержит VL CDR1 из SEQ ID NO: 7, 15, 23, 32, 42, 50, 58, 66, 74, 84, 91, 135, 143, 152, 160, 168, 176, 184, 192, 200, 208, 216, 224, 232, 240, 248, 256, 264, 272 или 326; VL CDR2 из SEQ ID NO: 8, 16, 24, 33, 43, 51, 59, 67, 75, 85, 92, 136, 144, 153, 161, 169, 177, 185, 193, 201, 209, 217, 225, 233, 241, 249, 257, 265, 273 или 327; и VL CDR3 из SEQ ID NO: 9, 17, 25, 34, 44, 52, 60, 68, 76, 86, 93, 137, 145, 154, 162, 170, 178, 186, 194, 202, 210, 218, 226, 234, 242, 250, 258, 266, 274 или 328.
В другом варианте реализации антитело содержит тяжелую цепь вариабельного участка, которая содержит VH CDR1 из SEQ ID NO: 3, 11, 19, 28, 37, 46, 54, 62, 70, 79, 88, 131, 139, 147, 156, 164, 172, 180, 188, 196, 204, 212, 220, 228, 236, 244, 252, 260 или 268; VH CDR2 из SEQ ID NO: 4, 12, 20, 29, 38, 47, 55, 63, 71, 80, 89, 132, 140, 148, 157, 165, 173, 181, 189, 197, 205, 213, 221, 229, 237, 245, 253, 261 или 269; и VH CDR3 из SEQ ID NO: 5, 13, 21, 30, 39, 48, 56, 64, 72, 81, 90, 133, 141, 149, 158, 166, 174, 182, 190, 198, 206, 214, 222, 230, 238, 246, 254, 262 или 270, и дополнительно содержит легкую цепь вариабельного участка, которая содержит VL CDR1 из SEQ ID NO: 7, 15, 23, 32, 42, 50, 58, 66, 74, 84, 91, 135, 143, 152, 160, 168, 176, 184, 192, 200, 208, 216, 224, 232, 240, 248, 256, 264, 272 или 326; VL CDR2 из SEQ ID NO: 8, 16, 24, 33, 43, 51, 59, 67, 75, 85, 92, 136, 144, 153, 161, 169, 177, 185, 193, 201, 209, 217, 225, 233, 241, 249, 257, 265, 273или 327; и VL CDR3 из SEQ ID NO: 9, 17, 25, 34, 44, 52, 60, 68, 76, 86, 93, 137, 145, 154, 162, 170, 178, 186, 194, 202, 210, 218, 226, 234, 242, 250, 258, 266, 274 или 328.
В одном варианте реализации антитело данного изобретения может содержать тяжелую цепь вариабельного участка, которая содержит VH CDR1 из SEQ ID NO: 3, VH CDR2 из SEQ ID NO: 4 и VH CDR3 из SEQ ID NO: 5, и может дополнительно содержать легкую цепь вариабельного участка, которая содержит VL CDR1 из SEQ ID NO: 7, VL CDR2 из SEQ ID NO: 8 и VL CDR3 из SEQ ID NO: 9.
В одном варианте реализации антитело данного изобретения может содержать тяжелую цепь вариабельного участка, которая содержит VH CDR1 из SEQ ID NO: 11, VH CDR2 из SEQ ID NO: 12 и VH CDR3 из SEQ ID NO: 13, и может дополнительно содержать легкую цепь вариабельного участка, которая содержит VL CDR1 из SEQ ID NO: 15, VL CDR2 из SEQ ID NO: 16 и VL CDR3 из SEQ ID NO: 17.
В одном варианте реализации антитело данного изобретения может содержать тяжелую цепь вариабельного участка, которая содержит VH CDR1 из SEQ ID NO: 19, VH CDR2 из SEQ ID NO: 20 и VH CDR3 из SEQ ID NO: 21, и может дополнительно содержать легкую цепь вариабельного участка, которая содержит VL CDR1 из SEQ ID NO: 23, VL CDR2 из SEQ ID NO: 24 и VL CDR3 из SEQ ID NO: 25.
В одном варианте реализации антитело данного изобретения может содержать тяжелую цепь вариабельного участка, которая содержит VH CDR1 из SEQ ID NO: 28, VH CDR2 из SEQ ID NO: 29 и VH
- 21 032003
CDR3 из SEQ ID NO: 30, и может дополнительно содержать легкую цепь вариабельного участка, которая содержит VL CDR1 из SEQ ID NO: 32, VL CDR2 из SEQ ID NO: 33 и VL CDR3 из SEQ ID NO: 34.
В одном варианте реализации антитело данного изобретения может содержать тяжелую цепь вариабельного участка, которая содержит VH CDR1 из SEQ ID NO: 37, VH CDR2 из SEQ ID NO: 38, VH CDR3 из SEQ ID NO: 39, и может дополнительно содержать легкую цепь вариабельного участка, которая содержит VL CDR1 из SEQ ID NO: 42, VL CDR2 из SEQ ID NO: 43 и VL CDR3 из SEQ ID NO: 44.
В одном варианте реализации антитело данного изобретения может содержать тяжелую цепь вариабельного участка, которая содержит VH CDR1 из SEQ ID NO: 46, VH CDR2 из SEQ ID NO: 47, и V HCDR3 из SEQ ID NO: 48, и может дополнительно содержать легкую цепь вариабельного участка, которая содержит VL CDR1 из SEQ ID NO: 50, VL CDR2 из SEQ ID NO: 51 и VL CDR3 из SEQ ID NO: 52.
В одном варианте реализации антитело данного изобретения может содержать тяжелую цепь вариабельного участка, которая содержит VH CDR1 из SEQ ID NO: 54, VH CDR2 из SEQ ID NO: 55 и VH CDR3 из SEQ ID NO: 56, и может дополнительно содержать легкую цепь вариабельного участка, которая содержит VL CDR1 из SEQ ID NO: 58, VL CDR2 из SEQ ID NO: 59 и VL CDR3 из SEQ ID NO: 60.
В одном варианте реализации антитело данного изобретения может содержать тяжелую цепь вариабельного участка, которая содержит VH CDR1 из SEQ ID NO: 62, VH CDR2 из SEQ ID NO: 63 и VH CDR3 из SEQ ID NO: 64, и может дополнительно содержать легкую цепь вариабельного участка, которая содержит VL CDR1 из SEQ ID NO: 66, VL CDR2 из SEQ ID NO: 67 и VL CDR3 из SEQ ID NO: 68.
В одном варианте реализации антитело данного изобретения может содержать тяжелую цепь вариабельного участка, которая содержит VH CDR1 из SEQ ID NO: 70, VH CDR2 из SEQ ID NO: 71 и VH CDR3 из SEQ ID NO: 72, и может дополнительно содержать легкую цепь вариабельного участка, которая содержит VL CDR1 из SEQ ID NO: 74, VL CDR2 из SEQ ID NO: 75 и VL CDR3 из SEQ ID NO: 76.
В одном варианте реализации антитело данного изобретения может содержать тяжелую цепь вариабельного участка, которая содержит VH CDR1 из SEQ ID NO: 79, VH CDR2 из SEQ ID NO: 80 и VH CDR3 из SEQ ID NO: 81, и может дополнительно содержать легкую цепь вариабельного участка, которая содержит VL CDR1 из SEQ ID NO: 84, VL CDR2 из SEQ ID NO: 85 и VL CDR3 из SEQ ID NO: 86.
В одном варианте реализации антитело данного изобретения может содержать тяжелую цепь вариабельного участка, которая содержит VH CDR1 из SEQ ID NO: 88, VH CDR2 из SEQ ID NO: 89 и VH CDR3 из SEQ ID NO: 90, и может дополнительно содержать легкую цепь вариабельного участка, которая содержит VL CDR1 из SEQ ID NO: 91, VL CDR2 из SEQ ID NO: 92 и VL CDR3 из SEQ ID NO: 93.
В одном варианте реализации антитело данного изобретения может содержать тяжелую цепь вариабельного участка, которая содержит VH CDR1 из SEQ ID NO: 131, VH CDR2 из SEQ ID NO: 132 и VH CDR3 из SEQ ID NO: 133, и может дополнительно содержать легкую цепь вариабельного участка, которая содержит VL CDR1 из SEQ ID NO: 135, VL CDR2 из SEQ ID NO: 136 и VL CDR3 из SEQ ID NO: 137.
В одном варианте реализации антитело данного изобретения может содержать тяжелую цепь вариабельного участка, которая содержит VH CDR1 из SEQ ID NO: 147, VH CDR2 из SEQ ID NO: 148 и VH CDR3 из SEQ ID NO: 149, и может дополнительно содержать легкую цепь вариабельного участка, которая содержит VL CDR1 из SEQ ID NO: 152, VL CDR2 из SEQ ID NO: 153 и VL CDR3 из SEQ ID NO: 154.
В одном варианте реализации антитело данного изобретения может содержать тяжелую цепь вариабельного участка, которая содержит VH CDR1 из SEQ ID NO: 147, VH CDR2 из SEQ ID NO: 148 и VH CDR3 из SEQ ID NO: 149, и может дополнительно содержать легкую цепь вариабельного участка, которая содержит VL CDR1 из SEQ ID NO: 326, a VL CDR2 из SEQ ID NO: 327 и VL CDR3 из SEQ ID NO: 328.
В одном варианте реализации антитело данного изобретения может содержать тяжелую цепь вариабельного участка, которая содержит VH CDR1 из SEQ ID NO: 156, VH CDR2 из SEQ ID NO: 157 и VH CDR3 из SEQ ID NO: 158, и может дополнительно содержать легкую цепь вариабельного участка, которая содержит VL CDR1 из SEQ ID NO: 160, VL CDR2 из SEQ ID NO: 161 и VL CDR3 из SEQ ID NO: 162.
В одном варианте реализации антитело данного изобретения может содержать тяжелую цепь вариабельного участка, которая содержит VH CDR1 из SEQ ID NO: 164, VH CDR2 из SEQ ID NO: 165 и VH CDR3 из SEQ ID NO: 166, и может дополнительно содержать легкую цепь вариабельного участка, которая содержит VL CDR1 из SEQ ID NO: 168, VL CDR2 из SEQ ID NO: 169 и VL CDR3 из SEQ ID NO: 170.
В одном варианте реализации антитело данного изобретения может содержать тяжелую цепь вариабельного участка, которая содержит VH CDR1 из SEQ ID NO: 172, VH CDR2 из SEQ ID NO: 173 и VH CDR3 из SEQ ID NO: 174, и может дополнительно содержать легкую цепь вариабельного участка, которая содержит VL CDR1 из SEQ ID NO: 176, VL CDR2 из SEQ ID NO: 177 и VL CDR3 из SEQ ID NO: 178.
В одном варианте реализации антитело данного изобретения может содержать тяжелую цепь вариабельного участка, которая содержит VH CDR1 из SEQ ID NO: 180, VH CDR2 из SEQ ID NO: 181 и VH CDR3 из SEQ ID NO: 182, и может дополнительно содержать легкую цепь вариабельного участка, которая содержит VL CDR1 из SEQ ID NO: 184, VL CDR2 из SEQ ID NO: 185 и VL CDR3 из SEQ ID NO: 186.
В одном варианте реализации антитело данного изобретения может содержать тяжелую цепь вариабельного участка, которая содержит VH CDR1 из SEQ ID NO: 188, VH CDR2 из SEQ ID NO: 189 и VH CDR3 из SEQ ID NO: 190, и может дополнительно содержать легкую цепь вариабельного участка, которая содержит VL CDR1 из SEQ ID NO: 192, VL CDR2 из SEQ ID NO: 193 и VL CDR3 из SEQ ID NO: 194.
- 22 032003
В одном варианте реализации антитело данного изобретения может содержать тяжелую цепь вариабельного участка, которая содержит VH CDR1 из SEQ ID NO: 196, VH CDR2 из SEQ ID NO: 197 и VH
CDR3 из SEQ ID NO: 198, и может дополнительно содержать легкую цепь вариабельного участка, которая содержит VL CDR1 из SEQ ID NO: 200, VL CDR2 из SEQ ID NO: 201 и VL CDR3 из SEQ ID NO: 202.
В одном варианте реализации антитело данного изобретения может содержать тяжелую цепь вариабельного участка, которая содержит VH CDR1 из SEQ ID NO: 204, VH CDR2 из SEQ ID NO: 205 и VH CDR3 из SEQ ID NO: 206, и может дополнительно содержать легкую цепь вариабельного участка, которая содержит VL CDR1 из SEQ ID NO: 208, VL CDR2 из SEQ ID NO: 209 и VL CDR3 из SEQ ID NO: 210.
В одном варианте реализации антитело данного изобретения может содержать тяжелую цепь вариабельного участка, которая содержит VH CDR1 из SEQ ID NO: 212, VH CDR2 из SEQ ID NO: 213 и VH CDR3 из SEQ ID NO: 214, и может дополнительно содержать легкую цепь вариабельного участка, которая содержит VL CDR1 из SEQ ID NO: 216, VL CDR2 из SEQ ID NO: 217 и VL CDR3 из SEQ ID NO: 218.
В одном варианте реализации антитело данного изобретения может содержать тяжелую цепь вариабельного участка, которая содержит VH CDR1 из SEQ ID NO: 220, VH CDR2 из SEQ ID NO: 221 и VH CDR3 из SEQ ID NO: 222, и может дополнительно содержать легкую цепь вариабельного участка, которая содержит VL CDR1 из SEQ ID NO: 224, VL CDR2 из SEQ ID NO: 225 и VL CDR3 из SEQ ID NO: 226.
В одном варианте реализации антитело данного изобретения может содержать тяжелую цепь вариабельного участка, которая содержит VH CDR1 из SEQ ID NO: 228, VH CDR2 из SEQ ID NO: 229 и VH CDR3 из SEQ ID NO: 230, и может дополнительно содержать легкую цепь вариабельного участка, которая содержит VL CDR1 из SEQ ID NO: 232, VL CDR2 из SEQ ID NO: 233 и VL CDR3 из SEQ ID NO: 234.
В одном варианте реализации антитело данного изобретения может содержать тяжелую цепь вариабельного участка, которая содержит VH CDR1 из SEQ ID NO: 236, VH CDR2 из SEQ ID NO: 237 и VH CDR3 из SEQ ID NO: 238, и может дополнительно содержать легкую цепь вариабельного участка, которая содержит VL CDR1 из SEQ ID NO: 240, VL CDR2 из SEQ ID NO: 241 и VL CDR3 из SEQ ID NO: 242.
В одном варианте реализации антитело данного изобретения может содержать тяжелую цепь вариабельного участка, которая содержит VH CDR1 из SEQ ID NO: 244, VH CDR2 из SEQ ID NO: 245 и VH CDR3 из SEQ ID NO: 246, и может дополнительно содержать легкую цепь вариабельного участка, которая содержит VL CDR1 из SEQ ID NO: 248, VL CDR2 из SEQ ID NO: 249 и VL CDR3 из SEQ ID NO: 250.
В одном варианте реализации антитело данного изобретения может содержать тяжелую цепь вариабельного участка, которая содержит VH CDR1 из SEQ ID NO: 252, VH CDR2 из SEQ ID NO: 253 и VH CDR3 из SEQ ID NO: 254, и может дополнительно содержать легкую цепь вариабельного участка, которая содержит VL CDR1 из SEQ ID NO: 256, VL CDR2 из SEQ ID NO: 257 и VL CDR3 из SEQ ID NO: 258.
В одном варианте реализации антитело данного изобретения может содержать тяжелую цепь вариабельного участка, которая содержит VH CDR1 из SEQ ID NO: 260, VH CDR2 из SEQ ID NO: 261 и VH CDR3 из SEQ ID NO: 262, и может дополнительно содержать легкую цепь вариабельного участка, которая содержит VL CDR1 из SEQ ID NO: 264, VL CDR2 из SEQ ID NO: 265 и VL CDR3 из SEQ ID NO: 266. В одном варианте реализации антитело данного изобретения может содержать тяжелую цепь вариабельного участка, которая содержит VH CDR1 из SEQ ID NO: 268, VH CDR2 из SEQ ID NO: 269 и VH CDR3 из SEQ ID NO: 270, и может дополнительно содержать легкую цепь вариабельного участка, которая содержит VL CDR1 из SEQ ID NO: 272, VL CDR2 из SEQ ID NO: 273 и VL CDR3 из SEQ ID NO: 274. В одном варианте реализации антителом данного изобретения является антитело, содержащее последовательность аминокислот из VH и/или VL участка, как показано на фиг. 1A-1K и 3A-3R.
В другом варианте реализации антитело данного изобретения характеризуется сохранением родственного спаривания тяжелой и легкой цепи, которые присутствует в человеческой В-клетке.
В одном варианте реализации антитело данного изобретения содержит вариабельный участок тяжелой цепи (VH), включающий или состоящий из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, 10, 18, 26, 35, 45, 53, 61, 69, 77, 87, 130, 138, 146, 155, 163, 171, 179, 187, 195, 203, 211, 219, 227, 235, 243, 251, 259 и 267. В одном варианте реализации антитело данного изобретения содержит вариабельный участок легкой цепи (VL), включающий или состоящий из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 6, 14, 22, 31, 40, 49, 57, 65,73, 82, 122, 134, 142, 150, 151, 159, 167, 175, 183, 191, 199, 207, 215, 223, 231, 239, 247, 255, 263 и 271. В одном варианте реализации антитело данного изобретения содержит вариабельный участок тяжелой цепи (VH), включающий или состоящий из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, 10, 18, 26, 35, 45, 53, 61, 69, 77, 87, 130, 138, 146, 155, 163, 171, 179, 187, 195, 203, 211, 219, 227, 235, 243, 251, 259 и 267, и дополнительно содержит вариабельный участок легкой цепи (VL), включающий или состоящий из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 6, 14, 22, 31, 40, 49, 57, 65,73, 82, 122, 134, 142, 150, 151, 159, 167, 175, 183, 191, 199, 207, 215, 223, 231, 239, 247, 255, 263 и 271. В узком варианте реализации антитело содержит VH из SEQ ID NO: 1 и VL из SEQ ID NO: 6; или VH из SEQ ID NO: 10 и VL из SEQ ID NO: 14; или VH из SEQ ID NO: 18 и VL из SEQ ID NO: 22; или VH из SEQ ID NO: 26 и VL из SEQ ID NO: 31; или VH из SEQ ID NO: 35 и VL из SEQ ID NO: 40, или VH из SEQ ID NO: 45 и VL из SEQ ID NO: 49; или VH из SEQ ID NO: 53 и VL из SEQ ID NO: 57; или VH из SEQ ID NO: 61 и VL из SEQ ID NO: 65; или VH из SEQ ID NO: 69 и
- 23 032003
VL из SEQ ID NO: 73; или VH из SEQ ID NO: 77 и VL из SEQ ID NO: 82, или VH из SEQ ID NO: 87 и VL из
SEQ ID NO: 122, или VH из SEQ ID NO: 130 и VL из SEQ ID NO: 134, или VH из SEQ ID NO: 138 и VL из
SEQ ID NO: 142, или VH из SEQ ID NO: 146 и VL из SEQ ID NO: 150, или VH из SEQ ID NO: 146 и VL из
SEQ ID NO: 151, или VH из SEQ ID NO: 155 и VL из SEQ ID NO: 159, или VH из SEQ ID NO: 163 и VL из
SEQ ID NO: 167, или VH из SEQ ID NO: 171 и VL из SEQ ID NO: 175, или VH из SEQ ID NO: 179 и VL из
SEQ ID NO: 183, или VH из SEQ ID NO: 187 и VL из SEQ ID NO: 191, или VH из SEQ ID NO: 195 и VL из
SEQ ID NO: 199, или VH из SEQ ID NO: 203 и VL из SEQ ID NO: 207, или VH из SEQ ID NO: 211 и VL из
SEQ ID NO: 215, или VH из SEQ ID NO: 219 и VL из SEQ ID NO: 223, или VH из SEQ ID NO: 227 и VL из
SEQ ID NO: 231, или VH из SEQ ID NO: 235 и VL из SEQ ID NO: 239, или VH из SEQ ID NO: 243 и VL из
SEQ ID NO: 247, или VH из SEQ ID NO: 251 и VL из SEQ ID NO: 255, или VH из SEQ ID NO: 259 и VL из
SEQ ID NO: 263, или VH из SEQ ID NO: 267 и VL из SEQ ID NO: 271.
Альтернативно, TDP-связывающая молекула данного изобретения является полипептидом, таким как антитело (включая антигенсвязывающий фрагмент из антитела или его производное или его вариант), которое конкурирует за связывание с TDP-43 по меньшей мере с одним антителом, имеющим VH и/или VL участок, как показано на фиг. 1А-1К и 3A-3R. Эти антитела могут быть человеческими, в частности, для терапевтического применения. Альтернативно, антитело представляет собой мышиное, муринизированное или химерное мышиное-человеческое антитело, которое особенно полезно для диагностических методов и исследований эффективности и безопасности на животных.
Как обсуждалось в настоящем документе, эпитоп TDP-43 полностью человеческого антитела имеет особое значение для диагностики и терапевтического применения в связи с тем, что антитело было первоначально поколение в результате иммунного ответа человека. Следовательно, человеческие полностью человеческие моноклональные антитела данного изобретения распознают эпитопы, которые соответствуют конкретным физиологическим значениям и которые не могут быть доступны или менее иммуногены с использованием обычной иммунизации и другие процессы скрининга антител для поколения из, например, мышиных моноклональных антител и антител, происходящих от in vitro скрининга из библиотек фагов. Таким образом, изобретение также относится, в общем, к анти-TDP-43 антителам и другим TDP-43-связывающим молекулам, которые конкурируют с человеческим моноклональным антителом данного изобретения за специфическое связывание с TDP-43. Согласно одному варианту реализации антитело или другая TDP-43 связывающая молекула, конкурирует с антителом, содержащим вариабельные домены, описанные в фиг. 1А-1К и 3A-3R для связывания с TDP-43. В другом варианте реализации антитело или другая TDP-43-связывающая молекула конкурирует с эталонным антителом, выбранным из группы, состоящей из NI-205.3F10, NI-205.51W, NI-205.21G2, №-205.8А2, NI-205.15F12, №-205.113С4, NI-205.25F3, NI-205.87E7, NI-205.21G1, NI-205.68G5, NI-205.20A1, NI205.41D1, NI205.29E11, NI205.9E12, NI205.98H6, NI205.10D3, NI205.44B2, NI205.38H2, NI205.36D5, NI205.58E11, NI205.14H5, NI205.31D2, NI205.8F8, NI205.31C11, NI205.8W0, NI205.10H7, М205.1А9, NI205.14W3 и NI205.19G5, за связывание с TDP-43.
Изобретение также охватывает анти-TDP-43 антитела и другие TDP-43-связывающие молекулы, которые связываются с тем же эпитопом TDP-43, что и человеческие моноклональные антитела изобретения. Согласно одному варианту реализации антитело (в том числе TDP-43-связывающие фрагменты антитела и варианты или их производные) или другие TDP-43-связывающие молекулы связываются с тем же эпитопом TDP-43, что и антитела, содержащие вариабельные домены, раскрытые на фиг. 1А-1К и 3A3R. В другом варианте реализации антитело (в том числе TDP-43-связывающий фрагмент антитела и вариант или его производное) или другая TDP-43-связывающая молекула связывается с тем же эпитопом TDP-43, что и эталонное антитело, выбранное из группы, состоящей из NI-205.3F10, NI-205.51G.4. NI205.21G2, №-205.8А2, NI-205.15F12, ИТ-205.113С4, NI-205.25F3, NI-205.87E7, NI-205.21G1, NI-205.68G5, NI-205.20A1, NI205.41D1, NI205.29E11, NI205.9E12, NI205.98H6, NI205.10D3, NI205.44B2, NI205.38H2, NI205.36D5, NI205.58E11, NI205.14H5, NI205.31D2, NI205.8F8, NI205.31C11, NI205.800, NI205.10H7, №205.1А9, NI205.14W3 и NI205.19G5.
В другом варианте реализации изобретение охватывает антитело (в том числе антигенсвязывающий фрагмент, вариант или его производное), которое специфически связывается с TDP-43 полипептидной последовательностью, выбранной из:
QYGDVMDVFIP (SEQ ID № 123); AAIGWGSASNA (SEQ ID № 124);
DMTEDELREFF (SEQ ID № 125), EDENDEP (SEQ ID № 126), VQVKKDL (SEQ ID № 127), KEYFSTF (SEQ ID № 128), IIKGISV (SEQ ID №315), NQSGPSG (SEQ ID №316), FNGGFGS (SEQ ID №317), FGNSRGGGAGL (SEQ ID №318), SNAGSGSGFNG (SEQ ID №319), QLERSGRFGGN (SEQ ID №320), EIPSEDD (SEQ ID №321), FNGGFGSSMDS (SEQ ID №322) и SINPAMMAAAQAALQSSWGMMGMLASQ (SEQ ID №323)
В другом варианте реализации изобретение охватывает антитело (в том числе антигенсвязывающий фрагмент, вариант или его производное), которое специфически связывается с TDP-43 полипептидами FGNSRGGGAGL (SEQ ID №318) и SNAGSGSGFNG (SEQ ID №319).
- 24 032003
В другом варианте реализации изобретение охватывает антитело (в том числе антигенсвязывающий фрагмент, вариант или его производное), которое специфически связывается с TDP-43 полипептидом
SINPAMMAAAQAALQSSWGMMGMLASQ (SEQ ID №323), но не связывается специфически с
SINPGGGAAAQAALQSSWGMMGMLASQ (SEQ Ш №314).
Конкуренция между антителами определяется с помощью анализа, в котором испытуемый иммуноглобулин ингибирует специфическое связывание схожего антитела с общим антигеном, например, TDP-43. В данной области известны многочисленные типы анализа конкурентного связывания и обычно могут быть применены или изменены, чтобы проверить способность из двух соединений конкурировать за связывание с антигеном, такие как, твердофазный прямой или непрямой радиоиммуноанализ (RIA), твердофазный прямой или непрямой иммуноферментный анализ (EIA), анализ конкуренции по типу сэндвича; см. Stahli et al., Methods in Enzymology 9 (1983), 242-253; твердофазный прямой биотинавидиновый EIA; см., Kirkland et al., J. Immunol. 137 (1986), 3614-3619, и Cheung et al., Virology 176 (1990), 546-552; твердофазный прямой меченый анализ, твердофазный прямой меченый анализ по типу сэндвича; см., Harlow and Lane, Antibodies, A Laboratory Manual., Cold Spring Harbor Press (1988); твердофазный прямой меченый RIA с использованием I125 метки; см. Morel et al., Molec. Immunol. 25 (1988), 715 и Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol. 32 (1990), 77-82. Как правило, такой анализ включает использование очищенных TDP-43 или их агрегатов связанных с твердой поверхностью или клетками, несущими их, немеченый тестируемый иммуноглобулин и меченый эталонный иммуноглобулин, например, человеческое моноклональное антитело из изобретения. Конкурентное ингибирование измеряется путем определения количества меток, связанных с твердой поверхностью или клетками в присутствии тестового иммуноглобулина. Обычно тестовый иммуноглобулин присутствует в избытке. В одном варианте реализации анализ конкурентного связывания выполняется в условиях, как описано для анализа ELISA в прилагаемых примерах. Антитела, которые были определены конкурентным анализом (конкурирующие антитела), включают антитела, связывающиеся с тем же эпитопом, что и эталонное антитело и антитела, связывающиеся со смежным эпитопом достаточно проксимальны эпитопу, связанного эталонным антителом, чтобы произошли стерические затруднения. Обычно, когда конкурирующие антитело присутствует в избытке, оно будет ингибировать специфическое связывание эталонного антитела с общим антигеном по меньшей мере на 50% или на 75%. Таким образом, изобретение дополнительно обращается к антителу (например, антигенсвязывающему фрагменту антитело), где антитело конкурентно ингибирует связывание TDP-43 с эталонным антителом, выбранным из группы, состоящей из NI-205.3F10, NI205.51С1, NI-205.21G2, NI-205.8A2, NI-205.15F12, NI-205.113C4, NI-205.25F3, NI-205.87E7, NI-205.21G1, NI-205.68G5, NI-205.20A1, NI205.41D1, NI205.29E11, NI205.9E12, NI205.98H6, NI205.10D3, NI205.44B2, NI205.38H2, NI205.36D5, NI205.58E11, NI205.14H5, NI205.31D2, NI205.8F8, NI205.31C11, NI205.8C10, NI205.10H7, NI205.1А9, NI205.14W3 и NI205.19G5.
В изобретении также предложены антитела, которые включают, состоят в основном из или состоят из, вариантов (включая производные) молекул антитела (например, участки VH и/или VL) описанных в настоящем документе, которые антитела иммуноспецифически связываются с TDP-43 полипептидом или его фрагментом или его вариантом. Стандартные методики, известные в данной области, могут быть использованы для введения мутации в нуклеотидную последовательность, кодирующую молекулу из настоящего изобретения, в том числе, например, сайт направленный мутагенез и PCR-опосредствованный мутагенез, которые приводят к аминокислотным заменам. Предпочтительно, чтобы варианты (в том числе производные) кодирующие менее 50 аминокислотных замен, менее чем 40 аминокислотных замен, менее 30 аминокислотных замен, менее чем 25 аминокислотных замен, менее 20 аминокислотных замен, менее чем 15 аминокислотных замен, менее 10 аминокислотных замен, менее 5 аминокислотных замен, менее 4 аминокислотных замен, менее чем 3 аминокислотные замены, или менее 2 аминокислотных замен относительно эталонного VH участка, VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3, VL участка, VLCDR1, VLCDR2, или VlCDR3 . Согласно одному варианту реализации в изобретении предложен изолированный полипептид, содержащий, состоящий в основном из или состоящий из вариабельного участка тяжелой цепи иммуноглобулина (VH), где по меньшей мере один из VH-CDR вариабельного участка тяжелой цепи или по меньшей мере два VH-CDR вариабельного участка тяжелой цепи по меньшей мере на 80, на 85, на 90, на 95, на 96, на 97, на 98 или на 99% идентичны эталонной тяжелой цепи VH-CDR1, VH-CDR2 или VH-CDR3 аминокислотных последовательностей антитела, раскрытых в настоящем документе. Альтернативно, что VH-CDR1, VH-CDR2 и VH-CDR3 участки VH по меньшей мере на 80, на 85, на 90, на 95, на 96, на 97, на 98 или на 99% идентичны эталонной тяжелой цепи VH-CDR1, VH-CDR2 или VH-CDR3 аминокислотных последовательностей антитела, раскрытых в настоящем документе. Таким образом, согласно этому варианту реализации вариабельный участок тяжелой цепи данного изобретения имеет VH-CDR1, VH-CDR2 и VH-CDR3-полипептидные последовательности, связанные с группами, показанными на фиг. 1A-1K и 3A3R. Хотя фиг. 1A-1K и 3A-3R показывает VH-CDR, определенных системой Кэбота, других определений CDR, например, VH-CDR, определяется системой Чотиа, также включены в изобретение, и могут быть легко идентифицированы специалистом в данной области с использованием данных, представленных на фиг. 1A-1K и 3A-3R. В одном варианте реализации аминокислотная последовательность эталонного VH CDR1 является SEQ ID NO: 3, 11, 19, 28, 37, 46, 54, 62, 70, 79, 88, 131, 139, 147, 156, 164, 172, 180, 188,
- 25 032003
196, 204, 212, 220, 228, 236, 244, 252, 260 или 268; аминокислотная последовательность эталонного VH CDR2 является SEQ ID NO: 4, 12, 20, 29, 38, 47, 55, 63, 71, 80, 89, 132, 140, 148, 157, 165, 173, 181, 189,
197, 205, 213, 221, 229, 237, 245, 253, 261 или 269; и аминокислотная последовательность эталонного VH CDR3 является SEQ ID NO: 5, 13, 21, 30, 39, 48, 56, 64, 72, 81, 90, 133, 141, 149, 158, 166, 174, 182, 190,
198, 206, 214, 222, 230, 238, 246, 254, 262 или 270.
В другом варианте реализации в изобретении предложен изолированный полипептид, содержащий, состоящий в основном из или состоящий из вариабельного участка тяжелой цепи иммуноглобулина (VH) в котором VH-CDR1, VH-CDR2 и VH-CDR3 участки имеют полипептидные последовательности, которые идентичны VH-CDR1, VH-CDR2 и VH-CDR3 группам, показанным на фиг. 1А-1К и 3A-3R. В одном варианте реализации аминокислотная последовательность VH-CDR1 является SEQ ID NO: 3, 11, 19, 28, 37, 46, 54, 62, 70, 79, 88, 131, 139, 147, 156, 164, 172, 180, 188, 196, 204, 212, 220, 228, 236, 244, 252, 260 или 268; аминокислотная последовательность эталонного VH-CDR2 CDR1 является SEQ ID NO: 4, 12, 20, 29, 38,
47, 55, 63, 71, 80, 89, 132, 140, 148, 157, 165, 173, 181, 189, 197, 205, 213, 221, 229, 237, 245, 253, 261 или 269; и аминокислотная последовательность эталонного VH-CDR3 является SEQ ID NO: 5, 13, 21, 30, 39,
48, 56, 64, 72, 81, 90, 133, 141, 149, 158, 166, 174, 182, 190, 198, 206, 214, 222, 230, 238, 246, 254, 262 или 270.
В другом варианте реализации в изобретении предложен изолированный полипептид, содержащий, состоящий в основном из или состоящий из вариабельного участка тяжелой цепи иммуноглобулина (VH) в котором VH-CDR1, VH-CDR2 и VH-CDR3 участки имеют полипептидные последовательности, которые идентичны VH-CDR1, VH-CDR2 и VH-CDR3 группам, показанным на фиг. 1А-1К и 3A-3R, за исключением одной, двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти или десяти аминокислотных замен в любом VH-CDR. В определенном варианте реализации аминокислотные замены консервативны. В одном варианте реализации аминокислотная последовательность VH-CDR1 является SEQ ID NO: 3, 11, 19, 28,
37, 46, 54, 62, 70, 79, 88, 131, 139, 147, 156, 164, 172, 180, 188, 196, 204, 212, 220, 228, 236, 244, 252, 260 или 268; аминокислотная последовательность эталонного VH-CDR2 является SEQ ID NO: 4, 12, 20, 29,
38, 47, 55, 63, 71, 80, 89, 132, 140, 148, 157, 165, 173, 181, 189, 197, 205, 213, 221, 229, 237, 245, 253, 261 или 269; и аминокислотная последовательность эталонного VH-CDR3 является SEQ ID NO: 5, 13, 21, 30,
39, 48, 56, 64, 72, 81, 90, 133, 141, 149, 158, 166, 174, 182, 190, 198, 206, 214, 222, 230, 238, 246, 254, 262 или 270.
В другом варианте реализации в изобретении предложен изолированный полипептид, содержащий, состоящий в основном из или состоящий из вариабельного участка легкой цепи иммуноглобулина (VL), где по меньшей мере один из VL-CDRs вариабельного участка легкой цепи или по меньшей мере два VLCDRs вариабельного участка легкой цепи по меньшей мере на 80, на 85, на 90, на 95, на 96, на 97, на 98 или на 99% идентичны эталонной легкой цепи VL-CDR1, VL-CDR2 или VL-CDR3 аминокислотных последовательностей антитела, раскрытых в настоящем документе. Альтернативно, что VL-CDR1, VL-CDR2 и Vl-CDR3 участки VL по меньшей мере на 80, на 85, на 90, на 95, на 96, на 97, на 98 или на 99% идентичны эталонной легкой цепи VL-CDR1, VL-CDR2 и VL-CDR3 аминокислотных последовательностей антитела, раскрытых в настоящем документе. Таким образом, согласно этому варианту реализации вариабельный участок легкой цепи данного изобретения имеет VL-CDR1, VL-CDR2 и VL-CDR3 полипептидные последовательности, связанные с группами, показанными на фиг. 1А-1К и 3A-3R. Хотя фиг. 1А1K и 3A-3R показывают VL-CDR, определяется системой Кэбота, других определений CDR, например, Vl-CDR, определяется системой Чотиа, также включены в изобретение, и могут быть легко идентифицированы специалистом в данной области с использованием данных, представленных на фиг. 1А-1К и 3A3R. В одном варианте реализации аминокислотная последовательность эталонного VL-CDR1 является SEQ ID NO: 7, 15, 23, 32, 42, 50, 58, 66, 74, 84, 91, 135, 143, 152, 160, 168, 176, 184, 192, 200, 208, 216, 224,
232, 240, 248, 256, 264, 272 или 326; аминокислотная последовательность эталонного VL-CDR2 является SEQ ID NO: 8, 16, 24, 33, 43, 51, 59, 67, 75, 85, 92, 136, 144, 153, 161, 169, 177, 185, 193, 201, 209, 217, 225,
233, 241, 249, 257, 265, 273 или 327; и аминокислотная последовательность эталонного VL-CDR3 является SEQ ID NO: 9, 17, 25, 34, 44, 52, 60, 68, 76, 86, 93, 137, 145, 154, 162, 170, 178, 186, 194, 202, 210, 218, 226, 234, 242, 250, 258, 266, 274 или 328.
В другом варианте реализации в изобретении предложен изолированный полипептид, содержащий, состоящий в основном из или состоящий из вариабельного участка легкой цепи иммуноглобулина (VL) в котором Vl-CDR1, Vl-CDR2 и VL-CDR3 участки имеют полипептидные последовательности, которые идентичны Vl-CDR1, Vl-CDR2 и VL-CDR3 группам, показанным на фиг. 1А-1К и 3A-3R. В одном варианте реализации аминокислотная последовательность VL-CDR1 является SEQ ID NO: 7, 15, 23, 32, 42, 50, 58, 66, 74, 84, 91, 135, 143, 152, 160, 168, 176, 184, 192, 200, 208, 216, 224, 232, 240, 248, 256, 264, 272 или 326; аминокислотная последовательность VL-CDR2 является SEQ ID NO: 8, 16, 24, 33, 43, 51, 59, 67, 75, 85, 92, 136, 144, 153, 161, 169, 177, 185, 193, 201, 209, 217, 225, 233, 241, 249, 257, 265, 273 или 327; и аминокислотная последовательность VL-CDR3 является SEQ ID NO: 9, 17, 25, 34, 44, 52, 60, 68, 76, 86, 93, 137, 145, 154, 162, 170, 178, 186, 194, 202, 210, 218, 226, 234, 242, 250, 258, 266, 274 или 328.
В другом варианте реализации в изобретении предложен изолированный полипептид, содержащий, состоящий в основном из или состоящий из вариабельного участка легкой цепи иммуноглобулина (VH) в
- 26 032003 котором Vh-CDR1, Vh-CDR2 и Vh-CDR3 участки имеют полипептидные последовательности, которые идентичны Vh-CDR1, Vh-CDR2 и Vh-CDR3 группам, показанным на фиг. 1А-1К и 3A-3R, за исключением одной, двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти или десяти аминокислотных замен в любом Vl-CDR. В определенном варианте реализации аминокислотные замены консервативны. В одном варианте реализации аминокислотная последовательность Vl-CDR1 является SEQ ID NO: 7, 15, 23, 32, 42, 50, 58, 66, 74, 84, 91, 135, 143, 152, 160, 168, 176, 184, 192, 200, 208, 216, 224, 232, 240, 248, 256, 264, 272 или 326; аминокислотная последовательность Vl-CDR2 является SEQ ID NO: 8, 16, 24, ЗЗ, 43, 51, 59, 67, 75, 85, 92, 136, 144, 153, 161, 169, 177, 185, 193, 201, 209, 217, 225, 233, 241, 249, 257, 265, 273 или 327; и аминокислотная последовательность Vl-CDR3 является SEQ ID NO: 9, 17, 25, 34, 44, 52, 60, 68, 76, 86, 93, 137, 145, 154, 162, 170, 178, 186, 194, 202, 210, 218, 226, 234, 242, 250, 258, 266, 274 или 328.
Согласно одному варианту реализации в изобретении предложен изолированный полипептид, содержащий, состоящий в основном из или состоящий из вариабельного участка тяжелой цепи иммуноглобулина (Vh), по меньшей мере на 80, на 85, на 90, на 95, на 96, на 97, на 98 или на 99% идентичны эталонному вариабельному участку тяжелой цепи (Vh) аминокислотной последовательности из антитела, раскрытого в настоящем документе. Таким образом, согласно этому варианту реализации вариабельный участок тяжелой цепи данного изобретения имеет полипептидную последовательность, схожую с вариабельным участком тяжелой цепи, показанную на фиг. 1 А-IK и 3A-3R. В одном варианте реализации аминокислотная последовательность эталонного вариабельного участка тяжелой цепи (Vh) является SEQ ID NO: 1, 10, 18, 26, 35, 45, 53, 61, 69, 77, 87, 130, 138, 146, 155, 163, 171, 179, 187, 195, 203, 211, 219, 227, 235, 243, 251, 259 или 267.
В другом варианте реализации в изобретении предложен изолированный полипептид, содержащий, состоящий в основном из или состоящий из вариабельного участка тяжелой цепи иммуноглобулина (Vh), который идентичен эталонному вариабельному участку тяжелой цепи, показанному на фиг. 1 А-IK и ЗА3R. В одном варианте реализации аминокислотная последовательность эталонного вариабельного участка тяжелой цепи является SEQ ID NO: 1, 10, 18, 26, 35, 45, 53, 61, 69, 77, 87, 130, 138, 146, 155, 163, 171, 179, 187, 195, 203, 211, 219, 227, 235, 243, 251, 259 и 267.
В другом варианте реализации в изобретении предложен изолированный полипептид, содержащий, состоящий в основном из или состоящий из вариабельного участка тяжелой цепи иммуноглобулина (Vh), который имеет полипептидную последовательность, которая идентична эталонной последовательности вариабельного участка тяжелой цепи (Vh), показанной на фиг. 1 А-IK и 3A-3R, за исключением одной, двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти или десяти аминокислотных замен. В определенном варианте реализации аминокислотные замены консервативны. В одном варианте реализации аминокислотная последовательность эталонной последовательности вариабельного участка тяжелой цепи является SEQ ID NO: 1, 10, 18, 26, 35, 45, 53, 61, 69, 77, 87, 130, 138, 146, 155, 163, 171, 179, 187, 195, 203, 211, 219, 227, 235, 243, 251, 259 или 267. Согласно одному варианту реализации в изобретении предложен изолированный полипептид, содержащий, состоящий в основном из или состоящий из вариабельного участка легкой цепи иммуноглобулина (Vl), по меньшей мере на 80, на 85, на 90, на 95, на 96, на 97, на 98 или на 99% идентичны эталонному вариабельному участку легкой цепи (Vl) аминокислотной последовательности из антитела, раскрытого в настоящем документе. Таким образом, согласно этому варианту реализации вариабельный участок легкой цепи данного изобретения имеет полипептидную последовательность, схожую с вариабельным участком легкой цепи, показанную на фиг. 1 А-IK и 3A-3R. В одном варианте реализации аминокислотная последовательность эталонного вариабельного участка легкой цепи (Vl) является SEQ ID NO: 6, 14, 22, 31, 40, 49, 57, 65,73, 82, 122, 134, 142, 150, 151, 159, 167, 175, 183, 191, 199, 207, 215, 223, 231, 239, 247, 255, 263 и 271.
В другом варианте реализации в изобретении предложен изолированный полипептид, содержащий, состоящий в основном из или состоящий из вариабельного участка легкой цепи иммуноглобулина (Vl), который идентичен эталонному вариабельному участку легкой цепи, показанному на фиг. 1 А-IK и 3A3R. В одном варианте реализации аминокислотная последовательность эталонного вариабельного участка легкой цепи является SEQ ID NO: 6, 14, 22, 31, 40, 49, 57, 65,73, 82, 122, 134, 142, 150, 151, 159, 167, 175, 183, 191, 199, 207, 215, 223, 231, 239, 247, 255, 263 и 271.
В другом варианте реализации в изобретении предложен изолированный полипептид, содержащий, состоящий в основном из или состоящий из вариабельного участка легкой цепи иммуноглобулина (Vl) который имеет полипептидную последовательность, которая идентична эталонной последовательности вариабельного участка легкой цепи (Vl), показанной на фиг. 1 А-IK и 3A-3R, за исключением одной, двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти или десяти аминокислотных замен. В определенном варианте реализации аминокислотные замены консервативны. В одном варианте реализации аминокислотная последовательность эталонной последовательности вариабельного участка легкой цепи является SEQ ID NO: 6, 14, 22, 31, 40, 49, 57, 65,73, 82, 122, 134, 142, 150, 151, 159, 167, 175, 183, 191, 199, 207, 215, 223, 231, 239, 247, 255, 263 и 271. Иммуноглобулин или кодирующая его нуклеиновая кислота (например, кДНК) могут быть дополнительно изменены. Таким образом, в дополнительном варианте реализации способ данного изобретения включает любую из стадии (стадий) получения химерного антитела, муринизированного антитела, одноцепочечного антитела, Fab-фрагмента, биспецифического анти
- 27 032003 тела, слитого антитела, меченого антитела или его аналога любого из них. Соответствующие способы известны в области техники и описаны, например, в Harlow и Lane Antibodies, A Laboratory Manual, CSH Press, Cold Spring Harbor (1988). Когда получают производные указанных антител, например, методом фагового дисплея, поверхностного плазмонного резонанса, как используется в системе BIAcore могут быть использованы для повышения эффективности фаговых антител, которые связываются с тем же эпитопом, что и любое описанное антитело в настоящем документе (Schier, Human Antibodies Hybridomas 7 (1996), 97-105; Malmborg, J. Immunol. Methods 183 (1995), 7-13). Производство химерных антител описано, например, в международной заявке № WO 89/09622. Способы производства гуманизированного антитела описаны, например, в европейской заявке ЕР-А1 0239400 и международной заявке № WO 90/07861. Еще одним источником антител, которые будут использоваться в соответствии с настоящим изобретением, является так называемые ксеногенные антитела. Общий принцип для производства ксеногенных антител, таких как человекоподобные антитела мышей, описан, например, в международных заявках № WO 91/10741, WO 94/02602, WO 96/34096 и WO 96/33735. Как уже говорилось выше, антитело данного изобретения может существовать в различных формах кроме полного антитела; в том числе, например, в форме Fv, Fab и F(ab)2, а также в форме одиночных цепей; см., например, международной заявке № WO 88/09344.
Антитела данного изобретения или соответствующие им цепи иммуноглобулина(ов) могут быть дополнительно модифицированы с использованием обычных методик, известных в данной области, например, с помощью удаления(ий) аминокислоты, вставки(ок), замен(ы), сложения(ий), и/или рекомбинации(ий) и/или любой другой модификации(ий), известных в данной области по отдельности или в комбинации. Способы введения таких изменений в последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей аминокислотную последовательность цепи иммуноглобулина, хорошо известны специалисту в данной области; см., например, Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual., Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y. и Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates и Wiley Interscience, N.Y. (1994). Модификации антитела данного изобретения включают химическую и/или ферментную дериватизацию на одном или более составных аминокислотах, в том числе модификацию боковой цепи, модификацию скелета, и N- и С-концевые модификации, включая ацетилирование, гидроксилирование, метилирование, амидирование, и присоединение фрагментов углеводов или липидов, кофакторов и т.п. Кроме того, изобретение охватывает производство химерных белков (например, слитых белков), которые включают связывающие полипептиды TDP-43 данного изобретения, такие как антитела, в аминоконце слитые с гетерологичной молекулой, такие как иммуностимулирующие лиганды на карбоксильном конца; см., например, международная заявка № WO 00/30680 для соответствующих технических деталей.
Кроме того, изобретение охватывает пептиды и полипептиды, которые специфически связываются с TDP-43. Например, содержащие область CDR3 вариабельного участка любого одного из упомянутых антител, в частности CDR3 тяжелой цепи, так как было часто замечено, что CDR3 тяжелой цепи (HCDR3) является участком, имеющим большую степень вариабельности и преобладающим в участии во взаимодействии антиген-антитело. Такие пептиды и полипептиды могут быть легко синтезированы или получены рекомбинантными способами, чтобы получить TDP-43-связывающую молекулу изобретения. Такие способы известны в данной области техники. Пептиды могут быть синтезированы, например, с использованием автоматических синтезаторов пептидов, которые являются коммерчески доступными. Пептиды могут быть также получены с помощью рекомбинантных методов путем включения экспрессии ДНК пептида в вектор экспрессии и трансформацией клеток вектором экспрессии с получением пептида. Таким образом, изобретение относится к TDP-43-связывающим молекулам, таким как, антитела (например, TDP-43-связывающие фрагменты антитела), которые должны показывать одно или несколько свойств связывания молекулы с TDP-43, описанных в настоящем документе. Например, такие антитела и связывающие молекулы могут быть проверены на их специфичность связывания и сродства, например, ELISA или Вестерн-блот и иммуногистохимией, как описано в настоящем документе; см., примеры. Как описано в примере 2, половина максимально эффективной концентрация (EC50) из NI-205.3F10, NI205.51С1, NI-205.21G2, NI-205.8A2, NI-205.15F12, НТ-205.113С4, NI-205.25F3, NI-205.87E7, NI-205.21G1, NI-205.68G5, NI-205.20A1, NI205.41D1, NI205.29E11, NI205.9E12, NI205.98H6, NI205.10D3, NI205.44B2, NI205.38H2, NI205.36D5, NI205.58E11, XI205.14115. NI205.31D2, NI205.8F8, М205.31С11, NI205.8C10, NI205.10H7, NI205.1A9, NI205.14W3 и NI205.19G5, определялась для человеческого TDP-43 путем прямого ELISA связывания человеческого TDP-43 с высоким сродством в полусредней наномолярной EC50 (0.18-17.2 нМ).
В качестве альтернативного получения иммуноглобулинов непосредственно из культуры иммортализованных В-клеток или В-клеток памяти, иммортализованные клетки могут быть использованы в качестве источника перестроенных локусов тяжелой цепи и легкой цепи для последующей экспрессии и/или генетических манипуляций. Перестроенные гены антитела могут быть обратной транскрибированы из соответствующих мРНК для производства кДНК. При желании, константный участок тяжелой цепи можно обменять на другой изотип или вообще исключить. Вариабельные участки могут быть связаны для кодирования одноцепочечных Fv участков. Несколько участков Fv могут быть связаны, чтобы при
- 28 032003 дать способность связываться с более чем одной целью или могут быть использованы химерные комбинациями тяжелой и легкой цепи. После того как генетический материал доступен, конструкция аналогов, которые сохраняют способность связывать желаемый целевой, являются эффективными. Методы клонирования вариабельного участка антитела и поколения рекомбинантных антител известны в данной области и описаны, например, в Gilliland et al., Tissue Antigens 47 (1996), 1-20; Doenecke et al., Leukemia 11 (1997), 1787-1792. После того как соответствующий генетический материал получают и, при желании, модифицируют для кодирования аналога, кодирующие последовательности, в том числе те, которые кодируют, как минимум, вариабельный участок тяжелой и легкой цепи, могут быть вставлены в систему экспрессии, содержащуюся на векторах, которые могут быть трансфицированы в стандартные рекомбинантные клетки-хозяева. Множество таких клеток-хозяев могут быть использованы; для эффективной обработки, тем не менее, могут быть рассмотрены клетки млекопитающих. Линии клеток млекопитающих, пригодные для этой цели, включают, клетки CHO, клетки HEK 293, или NSO клеток, но не ограничиваются ими.
Производство антитела или аналога проводится путем культивирования модифицированных рекомбинантных хозяев в условиях культивирования, подходящих для роста клеток-хозяев и экспрессии кодирующих последовательностей. Антитела затем извлекают путем выделения их из культуры. Системы экспрессии предназначены для включения сигнальных пептидов, так что полученные антитела секретируются в среду; Однако внутриклеточное производство также возможно.
В соответствии с вышеизложенным, настоящее изобретение также относится к полинуклеотиду, кодирующему антитело или эквивалентную связывающую молекулу изобретения. В одном варианте реализации полинуклеотид кодирует, по меньшей мере, вариабельный участок цепи иммуноглобулина антитела, описанного выше. Обычно указанный вариабельный участок кодируется полинуклеотидом, который содержит по меньшей мере один гипервариабельный участок (CDR) VH и/или VL вариабельного участка антитела.
Специалисту в данной области будет понятно, что вариабельный домен антитела, имеющего вышеописанный вариабельный домен, может быть использован для строительства других полипептидов или антител с желаемой специфичностью и биологической функцией. Таким образом, изобретение также охватывает полипептиды и антитела, содержащего по меньшей мере один CDR из вышеописанных вариабельных доменов, который предпочтительно имеет по существу такие же или аналогичные связывающие свойства, как антитело, описанное в прилагаемых примерах. Как правило, известные в области техники, аффинность связывания может быть повышена путем замены аминокислот в пределах CDR, или в гипервариабельных петлях (Chothia и Lesk, J. Mol. Biol. 196 (1987), 901-917), которые частично перекрываются с CDR, как определено Кэботом; см., например, Riechmann, et al., Nature 332 (1988), 323327. Таким образом, к изобретению также относятся антитела, отличающиеся тем, что один или более из указанных CDR, содержит один или несколько, или не более двух аминокислотных замен. В одном варианте реализации антитело данного изобретения содержит в одной или обоих его цепях иммуноглобулина два или все три CDR вариабельного участка, изложенные на фиг. 1A-1K и 3A-3R.
Связывающие молекулы, такие как антитела (включая антигенсвязывающий фрагменты, варианты или их производные) настоящего изобретения, могут содержать константный участок, который опосредует одну или несколько эффекторных функций. Например, связывание компонента С1 комплемента с константным участком антитела может активировать систему комплемента. Активация комплемента важна в опсонизации и лизисе клеток патогенов. Активация комплемента также стимулирует воспалительный ответ и также может быть вовлечена в аутоиммунную гиперчувствительность. Кроме того, антитела связываются с рецепторами на различных клетках через Fc-участок, с Fc-рецепторным сайтом связывания на антителе Fc участок связывается с рецептором Fc (FcR) на клетке. Есть целый ряд Fcрецепторов, которые являются специфическими для различных классов антител, в том числе IgG (гаммарецепторов), IgE (эпсилон-рецепторов), IgA (альфа-рецепторов) и IgM (мю-рецепторы). Связывание антител с Fc рецепторами на поверхности клеток вызывает ряд важных и разнообразных биологических реакций, в том числе, поглощение и уничтожения антитело-покрытых частиц, клиренс иммунных комплексов, лизис антитело-покрытых клеток-мишеней киллерами (называемых антитело-зависимой клеточной цитотоксичностью или ADCC), высвобождение медиаторов воспаления, плацентарный перенос и контроль продукции иммуноглобулинов. Соответственно, определенный вариант реализации данного изобретения включает антитело (включая антигенсвязывающий фрагмент антитела, вариант или его производное), в котором по меньшей мере часть одного или более участка константного домена заменены, удалены или иным образом изменены так, чтобы обеспечить желаемые биохимические характеристики, такие как снижение эффекторных функций, способность нековалентной димеризации, повышение способности к локализации на месте TDP-43 агрегации и осаждения, уменьшение времени полужизни в сыворотке, или увеличение периода полураспада в сыворотке крови, по сравнению с целым, неизмененным антителом примерно такой же иммуногенности. Например, некоторые антитела для применения в диагностических и лечебных методах, описанные в настоящем документе, являются антителами с удаленными доменами, которые содержат полипептидную цепь, подобную тяжелой цепи иммуноглобулина, но у которых отсутствует, по меньшей мере, часть одной или более тяжелых цепей домена. Например, в оп
- 29 032003 ределенном варианте реализации в антителе данного изобретения отсутствует целый домен из постоянного участка модифицированного антитела, такого как, весь или часть СН2-домена. В других вариантах реализации антитела данного изобретения полезны, например, в диагностических или терапевтических методах, имеют константный участок, например, константный участок тяжелой цепи IgG, который изменен для устранения гликозилирования, как говорится в другом месте в настоящем документе агликозилированого или агли антитела. Такое агли антител может быть получено ферментативно или другими способами, известными в данной области, включая, например, путь конструирования сайта гликозилирования общего типичного элемента структуры в константном участке. Не будучи связанными какой-либо теорией, полагают, что агли антитело может иметь улучшенную безопасность стабильности in vivo. Способы производства агликозилированного антитела, имеющего желательную эффекторную функцию, найдены, например, в международной заявке № WO 2005/018572, который включен в настоящий документ в качестве ссылки во всей своей полноте.
В некоторых антителах, в том числе антигенсвязывающих фрагментах антитела и вариантах, описанных в настоящем документе, часть Fc может быть заменена для уменьшения эффекторной функции с использованием методик, известных в данной области. Например, удаление или инактивация (через точечные мутации или другими средствами) константного участка домена может уменьшить связывания Fc рецептора циркулирующего модифицированного антитела, тем самым повышая TDP-43 локализацию. В других случаях модификация константного участка, которая соответствует настоящему изобретению, умеренный комплемент связывается и тем самым уменьшает время полужизни в сыворотке и неспецифическую ассоциация сопряженную с цитотоксином. Тем не менее, другие модификации константного участка могут быть использованы для изменения дисульфидных мостиков или олигосахаридных фрагментов, которые позволяют увеличить локализацию за счет увеличения специфичной гибкости антигена или антитела. Полученный физиологический профиль, биодоступность и другие биохимические эффекты модификаций, такие как TDP-43 локализация и биораспределение времени полужизни в сыворотке, могут быть обычно измерены с помощью методов, известных в данной области техники.
В некоторых вариантах реализации часть Fc антитела данного изобретения мутирована или обменяна на альтернативные белковые последовательности увеличением клеточного поглощения антитела, например, путем повышения рецептор-опосредованного эндоцитоза антитела через Fcy рецепторы, LRP, или Thy1 рецепторы или через технологию суперантитела, которая, как говорят, делает антитела способными курсировать в живые клетки, не вредя им (Muller, S., et al., Expert Opin. Biol. Ther. (2005), 237241). Например, поколение слитых белков участка связывания антитела и родственных лигандов белка рецепторов клеточной поверхности или биспецифических или нескольких конкретных антител со специфическими последовательностями, связывающимися с TDP-43, а также с рецептором клеточной поверхности, могут быть сконструированы с помощью методов, известных в данной области.
В некоторых антителах, в том числе антигенсвязывающих фрагментах антител и вариантов, описанных в настоящем документе, Fc часть может быть мутировавшей или обмененой на альтернативные белковые последовательности или антитела могут быть химически модифицированы, чтобы увеличить их проникновение через гематоэнцефалический барьер.
Модифицированные формы антитела (например, антигенсвязывающие фрагменты антитела и варианты или их производные) данного изобретения могут быть изготовлены из целого предшественника или родительского антитела с использованием методик, известных в данной области. Примерные методы обсуждаются более подробно в настоящем документе. Антитела изобретение, в том числе антигенсвязывающие фрагменты антитела и варианты, описанные в настоящем документе, могут регулярно быть сделаны или изготовлены с использованием способов, известных в данной области. В некоторых вариантах реализации антитела (включая фрагменты антитела и его производные) являются рекомбинантно полученными, т.е. производятся с использованием технологии рекомбинантной ДНК. Примерные способы получения антитела обсуждаются более подробно в другом месте в настоящем документе.
Антитела (включая антигенсвязывающие фрагменты антитела и варианты, и их производные) данного изобретения также включают производные, которые изменяются, например, путем ковалентного соединения любого типа молекулы к антителу таким образом, что ковалентное соединение не мешает антителу специфически связываться с родственным эпитопом. Например, но не для ограничения, производные антитела включают антитела, которые были изменены, например, путем гликозилирования, ацетилирования, пегилирования, фосфорилирования, амидирования, дериватизации известных защищающих/блокирующих групп, протеолитического расщепления, привязки к клеточному лиганду или другому белку и т.д. Любой из многочисленных химических модификаций может быть осуществлен известными способами, в том числе специфическим химическим расщеплением, ацетилированием, формилированием, метаболическим синтезом из туникамицина и т.д., но не ограничиваясь ими. Кроме того, производное может содержать одну или более неклассических аминокислот.
В частном варианте реализации TDP-43-связывающими молекулами изобретения, являются полипептиды, такие как антитела (включая антигенсвязывающие фрагменты, варианты или их производные), не вызывающие вредного иммунного ответа у животного, подлежащего лечению, например, у человека. В некоторых вариантах реализации связывающие молекулы, например, антитела (включая антигенсвя
- 30 032003 зывающий фрагменты антител) данного изобретения могут быть выделены от больного, например, больного человека, и в дальнейшем использоваться в тех же видах, от которых они получены, например, человеке, таким образом, облегчая или минимизируя возникновение вредных иммунных реакций. Деиммунизация также может быть использована для уменьшения иммуногенности антитела. Используемый в настоящем документе термин деиммунизация включает изменение антитела, для изменения Тклеточных эпитопов; см., например, международные заявки № WO 98/52976 и WO 00/34317. Например, и VL последовательности исходного антитела анализируются и эпитоп Т клеток человека картируется для каждого V участка с указанием местоположения эпитопов в отношении определения комплементарности участков (CDR) и других ключевых остатков в последовательности. Индивидуальные эпитопы Т-клеток на карте Т-клеточных эпитопов анализируются с целью выявления альтернативных аминокислотных замен с низким риском изменяющейся активности окончательного антитела. Диапазон альтернативных VH и VL последовательностей предназначен включать комбинации аминокислотных замен и эти последовательности впоследствии включают в ряд связывающих полипептидов, например, TDP-43специфических антител, в том числе их иммуноспецифических фрагментов, для использования в методах диагностически и лечения, раскрытых в настоящем документе, которые затем проверяются на функционирование. Как правило, между 12 и 24 вариантами антитела образуются и испытываются. Полные гены тяжелой и легкой цепи, содержащие модифицированные V и человеческие С участки затем клонируются в векторы экспрессии и последующие плазмиды вносятся в клеточные линии для производства полного антитела. Антитела затем сравниваются в соответствующих биохимических и биологических анализах, и оптимальный вариант идентифицируется.
Моноклональные антитела могут быть получены с использованием методов широкого спектра, известных в данной области техники, включая использование гибридом, рекомбинантной и технологии фагов, или их комбинаций. Например, моноклональные антитела могут быть получены с использованием гибридомных методов, в том числе известных в данной области и описанных, например, в Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. (1988); Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas Elsevier, N.Y., 563-681 (1981), каждая из ссылок включена в настоящей документ в качестве ссылки во всей их полноте. Термин моноклональное антитело, используемый в настоящем документе, не ограничивается антителом, полученным с помощью гибридомной технологии. Термин моноклональное антитело относится к антителу, который является производным от одного изолированного клона, в том числе любого эукариотического, прокариотического или клона фага, и не включает метод, с помощью которого он производится. Таким образом, термин моноклональное антитело не ограничивается антителами, полученными с помощью гибридомной технологии. В некоторых вариантах реализации антитела данного изобретения получены из В-клеток человека, которые были иммортализованы через трансформацию вирусом Эпштейна-Барра, как описано в настоящем документе. Для ясности, термин моноклональное антитело, используемый в настоящем документе, не включает эндогенные антитела, который могут быть выделены из плазмы организма-хозяина.
В хорошо известном методе гибридом (Kohler et al., Nature 256 (1975), 495) сравнительно короткоживущие или смертные лимфоциты млекопитающих, например, В-клетки, полученные из человеческого субъекта, как описано в настоящем документе, сливают с иммортализованной линией опухолевых клеток (например, линией клеток миеломы), таким образом, производя гибридные клетки или гибридомы, которые иммортализованы и способны к производству генетически закодированного антитела В-клеткок. Полученные гибриды разделены на отдельные генетические штаммы путем отбора, разбавления и повторного роста каждого отдельного штамма, содержащего специфические гены для образования единичного антитела. Выбранные гибридомы производят антитела, которые являются гомогенными против желаемого антигена и, со ссылкой на их чистое генетическое происхождение, называются моноклональными. Таким образом, подготовленные клетки гибридомы высевают и выращивают в подходящей культуральной среде, которая содержит одно или несколько веществ, которые ингибируют рост или выживание неслитых исходных клеток миеломы. Реагенты, клеточные линии и способы формования, селекция и выращивание гибридом, известны в данной области техники. Как правило, культуральную среду, в которой растут клетки гибридомы, анализируют на продуцирование моноклональных антител против желаемого антигена. Специфичность связывания моноклонального антитела, продуцируемого клетками гибридомы, определяется с помощью анализов в пробирке, таких как иммунопреципитация, радиоиммунный анализ (RIA) или твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), как описано в настоящем документе. После идентификации гибридомных клеток, которые продуцируют антитела требуемой специфичностьи, сродства и/или активности, клоны могут быть субклонированы путем ограничения процедуры разбавления и выращенные стандартными методами; см., например, Goding, Monoclonal Antibodies: Principles u Practice, Academic Press, p. 59-103 (1986). Кроме того, следует понимать, что моноклональные антитела, секретируемые гибридомными субклонами, могут быть отделены от культуральной среды, асцитной жидкости или сыворотки обычными способами очистки, такими как, например, хроматография протеина-А, гидроксилапатита, гель-электрофорез, диализ или аффинная хроматография. В другом варианте реализации лимфоциты выбирают микроманипуляцией и изолируют переменные гены. Например, мононуклеарные клетки периферической крови могут быть выделены из иммунизированного или естест
- 31 032003 венным иммунной реакции млекопитающего, например, человека, и культивированы в течение 7 дней в пробирке Культуры РВМС затем подвергают скринингу на предмет конкретных IgG, которые отвечают критериям отбора и клетки из положительных лунок изолируют. Отдельные Ig-продуцирующие Вклетки могут быть выделены путем FACS или путем определения их комплемент-опосредованной гемолитической бляшке. Ig-продуцирующие В-клетки могут быть микроотобраны в трубку и VH и VL гены могут быть амплифицированны с помощью, например, RT-PCR. В VH и VL гены могут быть клонированы в векторы экспрессии антитела и трансфицированы в клетки (например, эукариотические или прокариотические клетки) для экспрессии. Альтернативно, антитело-продуцирующие клеточные линии могут быть выбраны и культивированы с использованием или обычных модифицированных методик, известных в данной области. Такие методы описаны в различных лабораторных руководствах и первичных публикациях. В этом отношении методы, пригодные для использования в настоящем изобретении, как описано ниже, описаны в Current Protocols in Immunology, Coligan et al., Eds., Green Publishing Associates и Wiley-Interscience, John Wiley and Sons, New York (1991) включенном в настоящий документ в качестве ссылки в полном объеме, включая пищевые добавки. Фрагменты антитела, которые распознают специфические антигены и/или эпитопы могут быть получены с использованием способов, известных в данной области техники. Например, Fab и F(ab')2 фрагменты могут быть получены рекомбинантно или путем протеолитического расщепления молекул иммуноглобулина, с использованием ферментов, таких как папаин (для получения фрагментов Fab) или пепсин (для получения F(ab')2 фрагментов). F(ab')2 фрагменты содержат вариабельный участок, константный участок легкой цепи и CHT-домен тяжелой цепи. Такие фрагменты являются достаточными для использования, например, в иммунодиагностических процедурах, связанных с соединением иммуноспецифических порции иммуноглобулинов с обнаруживающими реагентами, таким, как радиоизотопы.
Полностью человеческие антитела, описанные в настоящем документе, являются особенно желательными для терапевтического лечения пациентов. Человеческие антитела данного изобретения изолированы, например, от пожилых здоровых людей, которые в силу их возраста могут быть отнесены к группе риска развивающихся расстройств, например, бокового амиотрофического склероза и/или лобновисочной дегенерации, или к пациентам с расстройством, но с необычно стабильным течением заболевания. Однако, хотя этого разумно ожидать, пожилые здоровые субъекты без симптомов, соответственно, более регулярно будут вырабатывать защитные анти-TDP-43 антитела, чем молодые субъекты, последние могут также использоваться в качестве источника для получения человеческого антитела из изобретения. Это особенно верно для молодых пациентов, которые предрасположены к развитию семейной формы TDP-43 протеинопатии, но остаются без симптомов, так как их иммунная система и функции иммунных реакции более эффективны, чем у пожилых людей.
Антитела данного изобретения могут быть получены любым способом, известным в данной области, для синтеза антитела, в том числе, в частности, методов химического синтеза или рекомбинантной экспрессии, как описано в настоящем документе.
В одном варианте реализации антитело или антигенсвязывающий фрагмент, вариант, или его производное, данного изобретения, содержит синтетический константный участок, отличающийся тем, что один или несколько доменов частично или полностью удалены (домен-удаленные антитела). В определенном варианте реализации совместимые изменения антитела будут включать доменные удаления конструкций или вариантов, отличающихся тем, что весь домен CH2 был удален (ACH2 конструкции). Для других вариантов реализации короткий соединяющий пептид может быть заменен на удаленную область, чтобы обеспечить гибкость и свободы движения для вариабельного участка. Обладающим обычной квалификацией в данной области техники будет понятно, что такие конструкции могут быть желательны изза свойств CH2-домена регулирующих скорость катаболизма антитела. Домен-удаленные конструкции могут быть получены с использованием вектора, кодирующего человеческий константный домен IgG1; см., например, международная заявка WO 02/060955 и WO 02/096948 А2. Этот вектор сконструирован, чтобы удалить домен CH2 и обеспечить экспрессию синтетического вектора удаленного константного участка домена IgG1.
В некоторых вариантах реализации антитела (включая антигенсвязывающие фрагменты, варианты или их производные) данного изобретения являются мини-антителами. Мини-антитела могут быть сделаны с использованием методов, известных в данной области; см., например, патент США № 5837821 или международную заявку № WO 94/09817.
В одном варианте реализации антитело (например, антигенсвязывающий фрагмент, вариант, или производное антитела) данного изобретения содержит тяжелую цепь иммуноглобулина, имеющую удаление или замену из нескольких или даже одной аминокислоты до тех пор, пока разрешено связывание между мономерными субъединицами. Например, мутации одной аминокислоты в отдельных областях домена CH2 может быть достаточно, чтобы существенно уменьшить Fc связывания и тем самым повысить TDP-43 локализацию. Аналогичным образом, желательно, простое удаление этой части одного или более константных участков доменов, которые контролируют эффекторную функцию (например, комплемент связывание), для модулирования. Такие частичные делеции константных участков могут улучшить выбранные характеристики антитела (время полужизни в сыворотке), оставляя другие желательные
- 32 032003 функции, связанные с нетронутыми константными участками домена субъекта. Кроме того, как упоминалось выше, константный участок раскрытого антитела может быть синтетическим путем мутации или замещения одной или более аминокислот, которые усиливают привлекательность профиля полученной конструкции. В этом отношении может быть возможным прервать обеспечение активности консервативного сайта связывания (например, связывание Fc) при существенном сохранении конфигурации и иммунного профиля модифицированного антитела. Тем не менее, другие варианты реализации включают добавление одной или нескольких аминокислот в константный участок для повышения желаемых характеристик, таких как эффекторная функция или для большего присоединения цитотоксинов или углеводов. В таком варианте реализации желательно вставить или копировать определенные последовательности, полученные из выбранного константного участка домена.
В изобретении также предложены антитела, которые включают, состоят в основном из или состоят из, вариантов (включая производные) антитела (к примеру, VH участков и/или VL участков) описанных в настоящем документе, антитела (включая фрагменты антитела), которые иммуноспецифически связываются с TDP-43. Стандартные методы, известные специалисту в данной области, могут быть использованы для введения мутации в нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело, в том числе сайт направленный мутагенез и PCR-опосредованный мутагенез, но не ограничиваясь ими, которые приводят к аминокислотным заменам. В одном варианте реализации варианты (в том числе производные) кодируют менее 50 аминокислотных замен, менее 40 аминокислотных замен, менее 30 аминокислотных замен, менее 25 аминокислотных замен, менее 20 аминокислотных замен, менее 15 аминокислотных замен, менее 10 аминокислотных замен, менее 5 аминокислотных замен, менее 4 аминокислотных замен, менее 3 аминокислотных замен, или менее 2 аминокислотных замен по отношению к эталонному VH участку, VHCDR1, VH-CDR2, VH-CDR3, VL участку, VL-CDR1, VL-CDR2 или VL-CDR3. Консервативная аминокислотная замена является той, в которой аминокислотный остаток заменен на аминокислотный остаток, имеющий боковую цепь с аналогичным зарядом. Семейства аминокислотных остатков, имеющих боковые цепи с аналогичными зарядами были определены в данной области. Эти семейства включают аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислыми боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан), бета-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Альтернативно, мутации могут быть введены рандомно вдоль всей или части кодирующей последовательности, например, путем насыщающего мутагенеза, и полученные мутанты могут быть подвергнуты скринингу на предмет биологической активности для идентификации мутантов, которые сохраняют активность (например, способность связываться TDP-43).
Например, можно ввести мутации только в рамочные участки или только в CDR участки антитела. Введенные мутации могут пустыми или нейтральными миссенс мутациями, например, не иметь, или иметь слабый эффект на способность антитела к связыванию антигена, действительно, некоторые такие мутации не изменяют последовательность аминокислот как бы там ни было. Эти типы мутации могут быть полезны для оптимизации кодонов, или улучшения производства антител гибридомами. Альтернативно, не нейтральные миссенс мутации могут изменять способность антитела к связыванию антигена. Расположение самых пустых и нейтральных миссенс мутаций, вероятно, будет в каркасных участках, в то время как расположение большинства не нейтральных миссенс мутаций, вероятно, будет в CDR, хотя это не является обязательным требованием. Человек с квалификацией в данной области способен проектировать и тестировать измененные молекулы для получения желаемых свойств, включая, например, улучшения в антигенсвязывающей активности или изменения специфичности антитела. После мутагенеза, белки, отображающие желаемые свойства, обычно могут экспрессироваться и функциональная и/или биологическая активность кодированного белка (например, способность иммуноспецифически связывается по меньшей мере с одним эпитопом TDP-43) может быть определена с использованием методов или обычно модифицированных методов, известных в области техники. Анти-TDP-43 антитело настоящего изобретения может быть охарактеризовано с помощью любой из in vivo или in vitro моделей TDP-43 протеинопатии. Специалист в данной области легко поймет, что анти-TDP-43 антитело данного изобретения может быть охарактеризовано в мышиной модели TDP-43 протеинопатии, например, в любой модели на животных для TDP-43 протеинопатии, но не ограничиваясь им, описанной в примере 5. Wegorzewska et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (2009), 18809-14; Gurney et al., Science 264 (1994), 1772-75; Shan et al., Neuropharmacol. Letters 458 (2009), 70-74; Wils et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106 (2010), 3858-63; Duchen and Strich, J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry 31 (1968), 535-42; Dennis and Citron, Neuroscience 185 (2009), 745-50; Swarup et al., Brain 134 (2011), 2610-2626; Igaz et al., J Clin Invest. 121(2):726-38 (2011); Сассато et al., Am J Pathol. 180(l):293-302 (2012), Cannon et al., Acta Neuropathol. 123(6):807-23 (2012), Custer et al., Hum Mol Genet. 19(9): 1741-55 (2010); и Tatom et al., Mol. Ther. 17 (2009), 607-613. Специалисту в данной области понятно, что экспериментальная модель TDP-43 протеинопатии может быть использована в качестве превентивной меры или может быть использована в терапевтических целях. В ка
- 33 032003 честве превентивной меры, дозирование животных начинается до наступления TDP-43 протеинопатии или ее симптомов. В профилактических мерах, анти-TDP-43 антитело данного изобретения оценивается по его способности предотвращать, снижать или отстрачивать возникновение TDP-43 протеинопатии или ее симптомов. В терапевтических целях, дозирование животных начинают после появления TDP-43 протеинопатии или ее симптомов. В терапевтических целях, анти-TDP-43 антитело данного изобретения оценивают по его способности лечить, уменьшать или облегчать TDP-43 протеинопатию или ее симптомы. Симптомы TDP-43 протеинопатии включают накопление патологических TDP-43 накоплений, патологических TDP-43 распределений, фосфорилированных TDP-43, или нерастворимых TDP-43 фракций, но не ограничиваются ими, в нейронах, мозге, спинном мозге, спинномозговой жидкости или сыворотке экспериментальной объекта. Специалист в данной области поймет, что положительный профилактический или терапевтический результат на любой животной модели TDP-43 протеинопатии указывает на то, что конкретное анти-TDP-43 антитело можно использовать в профилактических или терапевтических целях у субъекта, кроме экспериментального модельного организма, например, он может быть использован для лечения TDP-43 протеинопатии у человека, нуждающегося в этом.
В одном варианте реализации анти-TDP-43 антитело данного изобретения можно вводить в модельных мышей с TDP-43 протеинопатией и в соответствующих контрольных мышей дикого типа. Вводимым антителом может быть муринизированное антитело настоящего изобретения или химерное человеческо-мышиное антитело настоящего изобретения. Анти-TDP-43 антитело можно вводить любым способом, известным в данной области, например, путем внутрибрюшинного, внутричерепного, внутримышечного, внутривенного, подкожного, перорального, и аэрозольного введения. Экспериментальным животным могут быть даны одна, две, три, четыре, пять или более доз анти-TDP-43 антитела или контрольной композиции, такой как PBS. В одном варианте реализации экспериментальным животным будут вводиться одна или две дозы анти-TDP-43 антитела. В другом варианте реализации животные постоянно дозируются анти-TDP-43 антителом в течение нескольких недель или месяцев. Специалист в данной области может легко разработать режим дозирования, который соответствует экспериментальной цели, например, режим дозирования для острых исследований, режим дозирования при хронических исследованиях, режим дозирования для исследований токсичности, режим дозирования для профилактических или терапевтических исследований. Наличие анти-TDP-43 антитела в конкретной тканевой области экспериментальных животных, например, сыворотки крови, спинномозговой жидкости, ткани головного мозга, но не ограничиваясь ими, может быть установлено с помощью хорошо известных методов области техники. В одном варианте реализации анти-TDP-43 антитело данного изобретения способно проникать через гематоэнцефалический барьер. В другом варианте реализации анти-TDP-43 антитело данного изобретения способно вводиться в нейроны. Специалист в данной области поймет, что, регулируя дозу и частоту дозирования анти-TDP-43 антитела, желательная концентрация анти-TDP-43 антитела может поддерживаться в экспериментальных животных. Любой эффект анти-TDP-43 антитела настоящего изобретения в модели TDP-43 протеинопатии можно оценить путем сравнения уровня, биохимических характеристик или распределения TDP-43 в обработанных и контрольных животных. В одном варианте реализации антитело из настоящего изобретения способно снижать уровень, количество или концентрацию TDP-43 включений в головном или спинном мозге в животной модели. Антитело может снизить уровень, количество или концентрацию TDP-43 включений по меньшей мере примерно на 5, на 10, на 20, на 30, на 50, на 70, на 90% или более. В другом варианте реализации антитело настоящего изобретения способно сокращать количество или частоту TDP-43-позитивных включений нейронов в головном мозге или спинном мозге в животной модели, например, по меньшей мере примерно на 5, на 10, на 20, на 30%, на 50, на 70, на 90% или более. Эффект антитела настоящего изобретения также может быть оценен путем изучения распределения и биохимических свойств TDP-43, следующее за введением антитела. В одном варианте реализации антитело настоящего изобретения способно снижать количество или концентрацию цитоплазматического TDP-43 белка в головном мозге или спинном мозге животной модели, например, по меньшей мере примерно на 5, на 10, на 20, на 30, на 50, на 70, на 90% или более. В другом варианте реализации антитело настоящего изобретения способно снижать количество или концентрацию невритического TDP-43 белка в головном мозге или спинном мозге животной модели, например, по меньшей мере примерно на 5, на 10, на 20, на 30, на 50, на 70, на 90% или более. В дополнительном варианте реализации антитело настоящего изобретения может уменьшать количество или концентрацию фосфорилированного TDP-43 белка в головном мозге или спинном мозге животной модели, например, по меньшей мере примерно на 5, на 10, на 20, на 30, на 50, на 70, на 90% или более. Фосфорилированные TDP-43 могут быть обнаружены с помощью антител, характерных для патологических фосфорилированных форм TDP-43, например, р403/р404 и р409/р410. Hasegawa et al., Ann Neurol, 64(1):60-70 (2008). Антитело настоящего изобретения может также изменять, например, уменьшать или увеличивать концентрацию TDP-43 в крови, сыворотке или спинномозговой жидкости животной модели, например, по меньшей мере примерно на 5, на 10, на 20, на 30, на 50, на 70, на 90% или более. В одном варианте реализации^ снижение или увеличение сравнивается с уровнем, числом, частотой, количеством или концентрацией, котораые существовали до начала лечения, или до уровня, числа, частоты, количества или концентрации, которые существуют в необработанном/контрольном субъекте лечения. В одном варианте
- 34 032003 реализации антитело настоящего изобретения может предотвратить или отсрочить наступление по меньшей мере одного симптома TDP-43 протеинопатии у субъекта. В одном варианте реализации антитело настоящего изобретения может уменьшить или устранить по меньшей мере один симптом TDP-43 протеинопатии у субъекта. Симптом может быть сформирован из патологических TDP-43 месторождений, фосфорилированных TDP-43 месторождений, или нерастворимых TDP-43 месторождений. Симптом может быть также присутствие или повышенная концентрация или количество TDP-43 в сыворотке крови, крови, моче или спинномозговой жидкости, отличающееся тем, что величина концентрации по сравнению со здорового субъекта повышена. Симптомами могут быть неврологические симптомы, например, изменение условно рефлекторно выработанного отвращения к пище, изменение контекстуального условно-рефлекторного замирания, ухудшение памяти, потеря моторную функции. В одном варианте реализации ухудшение памяти оценивается с помощью двух испытательных задач с Y-лабиринтом. В одном варианте реализации по меньшей мере один симптом уменьшается по меньшей мере примерно на 5, на 10, на 15, на 20, на 30, на 50, на 70 или на 90%. В другом варианте реализации соотношение двух испытательных задач с Y-лабиринтом значительно выше у обработанного антителом субъекта, чем у контрольного субъекта. В конкретном варианте реализации соотношение двух испытательных задач с Yлабиринтом увеличивается по меньшей мере приблизительно на 5, на 10, на 20, на 30, на 40, на 50, на 60, на 70, на 80 или на 90%. В другом варианте реализации соотношение двух испытательных задач с Yлабиринтом по меньшей мере приблизительно в два раза, три раза, четыре раза, в пять раз, в десять раз или в двадцать раз выше. Настоящее изобретение также относится к способу предупреждения или задержки начала по меньшей мере одного симптома TDP-43 протеинопатии у субъекта, нуждающегося в этом, включающему введение терапевтически эффективного количества анти-TDP-43 антитела, описанного в настоящем документе. Настоящее изобретение также относится к способу сокращения или устранения по меньшей мере одного симптома TDP-43 протеинопатии у субъекта, нуждающегося в этом, включающему введение терапевтически эффективного количества анти-TDP-43 антитела, описанного в настоящем документе. В одном варианте реализации субъект представляет собой экспериментальный организм, такой как, трансгенная мышь, но не ограничиваясь этим. В одном варианте реализации субъектом является человек.
III. Полинуклеотиды, кодирующие антитела.
Полинуклеотид, кодирующий антитело или антигенсвязывающий фрагмент, вариант или его производное может состоять из любого полирибонуклеотида или полидезоксирибонуклеотида, который может быть немодифицированной РНК или ДНК или измененной РНК или ДНК. Например, полинуклеотид, кодирующий антитело или антигенсвязывающий фрагмент, вариант или его производное может состоять из одно- и двухцепочечной ДНК, ДНК, представляющей собой смесь одно-и двухцепочечной участков, одно- и двухцепочечной РНК, и РНК, которая является смесью одно- и двухцепочечной участков, гибридных молекул, содержащих ДНК и РНК, которые могут быть одноцепочечными или, что чаще, двухцепочечными или смесью одно- и двухцепочечной участков. Кроме того, полинуклеотид, кодирующий антитело или антигенсвязывающий фрагмент, вариант или его производное может состоять из трехцепочечных участков, содержащих РНК или ДНК или обе РНК и ДНК. Полинуклеотид, кодирующий антитело (в том числе антигенсвязывающий фрагмент антитела, или его варианта или производного), может также содержать одно или несколько модифицированных оснований ДНК или РНК или модифицированные остовы для стабильности или по другим причинам. Модифицированные основания включают, например, тритилированные основания и необычные основания, такие как инозин. Различные модификации могут быть сделаны в ДНК и РНК; Таким образом, полинуклеотид включает в себя химически, ферментативно или метаболически модифицированные формы. Выделенный полинуклеотид, кодирующий неприродный вариант полипептида, полученного из иммуноглобулина (например, части тяжелой цепи иммуноглобулина или части легкой цепи) могут быть созданы путем введения одной или нескольких нуклеотидных замен, добавлений или делеций в нуклеотидную последовательность кодирующую иммуноглобулин, так что замены одной или более аминокислот, добавления или делеции вводят в кодируемый белок. Мутации могут быть введены стандартными методами, такими как сайт-направленный мутагенез и PCR-опосредованный мутагенез. В одном варианте реализации консервативные аминокислотные замены сделаны в одном или более положениях аминокислотных остатков, которые не являются существенными.
РНК может быть выделена из исходных В-клеток, гибридомных клеток или других трансформированных клеток по стандартным методикам, таким как экстракция гуанидинизотиоцианатом и осаждением с последующим центрифугированием или хроматографией. По необходимости, мРНК могут быть выделены из общей РНК с использованием стандартных методик, таких как хроматография на олиго дТ целлюлозе. Подходящие методы известны в данной области техники. В одном варианте реализации кДНК, которые кодируют легкие и тяжелые цепи антитела могут быть сделаны либо одновременно, либо отдельно, с использованием обратной транскриптазы и ДНК-полимеразы в соответствии с известными способами. PCR может быть начато на основе соответствующего константного участка праймеров или более специфических праймеров, основанных на размещенных последовательностях тяжелой и легкой цепи ДНК и аминокислот. Как обсуждалось выше, PCR может также использоваться, чтобы изолировать
- 35 032003 клоны ДНК, кодирующие легкие и тяжелые цепи антитела. В этом случае библиотеки могут быть подвергнуты скринингу на основе соответствующих праймеров или больших гомологичных зондов, таких как человеческие константные участки зондов. ДНК, обычно плазмидная ДНК, может быть выделена из клеток с использованием методик, известных в данной области, картирования рестрикции и секвенирования в соответствии со стандартными, известными методиками, изложенными подробно, например, в приведенных выше ссылках, связанных с рекомбинантной ДНК. Конечно, ДНК может быть синтетической, согласно изобретению, в любой точке процесса выделения или последующего анализа.
В одном варианте реализации в изобретении предложен изолированный полипептид, содержащий, состоящий в основном из или состоящий из вариабельного участка тяжелой цепи иммуноглобулина (Vh), где, по меньшей мере один из CDRs вариабельного участка легкой цепи или по меньшей мере два VhCDRs вариабельного участка тяжелой цепи, по меньшей мере на 80, на 85, на 90, на 95, на 96, на 97, на 98 или на 99% идентичны эталонной легкой цепи Vh-CDR1, Vh-CDR2, или Vh-CDR3 аминокислотных последовательностей антитела, раскрытых в настоящем документе. Альтернативно, что Vh-CDR1, VhCDR2, или Vh-CDR3 участки Vh по меньшей мере на 80, на 85, на 90, на 95, на 96, на 97, на 98 или на 99% идентичны эталонной тяжелой цепи Vh-CDR1, Vh-CDR2, и Vh-CDR3 аминокислотных последовательностей антитела, раскрытых в настоящем документе. Таким образом, согласно этому варианту реализации тяжелая цепь вариабельного участка данного изобретения имеет Vh-CDR1, Vh-CDR2, или VhCDR3 полипептидные последовательности, связанные с группами, показанными на фиг. 1А-IK и 3A-3R. В одном варианте реализации аминокислотная последовательность эталонного Vh-CDR1 является SEQ ID NO: 3, 11, 19, 28, 37, 46, 54, 62, 70, 79, 88, 131, 139, 147, 156, 164, 172, 180, 188, 196, 204, 212, 220, 228,
236, 244, 252, 260 или 268; аминокислотная последовательность эталонного Vh-CDR2 является SEQ ID NO: 4, 12, 20, 29, 38, 47, 55, 63, 71, 80, 89, 132, 140, 148, 157, 165, 173, 181, 189, 197, 205, 213, 221, 229,
237, 245, 253, 261 или 269; и аминокислотная последовательность эталонного Vh-CDR3 является SEQ ID NO: 5, 13, 21, 30, 39, 48, 56, 64, 72, 81, 90, 133, 141, 149, 158, 166, 174, 182, 190, 198, 206, 214, 222, 230,
238, 246, 254, 262 или 270. В одном варианте реализации в изобретении предложен изолированный полипептид, содержащий, состоящий в основном из или состоящий из вариабельного участка тяжелой цепи иммуноглобулина (Vh), в котором Vh-CDR1, Vh-CDR2 и Vh-CDR3 участки имеют полипептидные последовательности из Vh-CDR1, Vh-CDR2 и Vh-CDR3 групп, показанных на фиг. 1 А-IK и 3A-3R, за исключением одной, двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти или десяти аминокислотных замен в любом Vh-CDR. В определенном варианте реализации аминокислотные замены консервативны. В одном варианте реализации аминокислотная последовательность Vh-CDR1 является SEQ ID NO: 3, 11, 19, 28, 37, 46, 54, 62, 70, 79, 88, 131, 139, 147, 156, 164, 172, 180, 188, 196, 204, 212, 220, 228, 236, 244, 252, 260,или 268; аминокислотная последовательность Vh-CDR2 является SEQ ID NO: 4, 12, 20, 29, 38, 47, 55, 63, 71, 80, 89, 132, 140, 148, 157, 165, 173, 181, 189, 197, 205, 213, 221, 229, 237, 245, 253, 261 или 269; и аминокислотная последовательность Vh-CDR3 является SEQ ID NO: 5, 13, 21, 30, 39, 48, 56, 64, 72, 81, 90, 133, 141, 149, 158, 166, 174, 182, 190, 198, 206, 214, 222, 230, 238, 246, 254, 262 или 270. В другом варианте реализации в изобретении предложен изолированный полипептид, содержащий, состоящий в основном из или состоящий из вариабельного участка легкой цепи иммуноглобулина (Vl), где по меньшей мере один из VL-CDRs вариабельного участка легкой цепи или, по меньшей мере два VL-CDRs вариабельного участка легкой цепи по меньшей мере на 80, на 85, на 90, на 95, на 96, на 97, на 98 или на 99% идентичны эталонной легкой цепи Vl-CDR1, Vl-CDR2 или Vl-CDR3 аминокислотных последовательностей антитела, раскрытых в настоящем документе. Альтернативно, что Vl-CDR1, Vl-CDR2, или VlCDR3 участки Vl по меньшей мере на 80, на 85, на 90, на 95, на 96, на 97, на 98 или на 99% идентичны эталонной легкой цепи Vl-CDR1, Vl-CDR2, и Vl-CDR3 аминокислотных последовательностей антитела, раскрытых в настоящем документе. Таким образом, согласно этому варианту реализации вариабельный участок легкой цепи данного изобретения имеет Vl-CDR1, Vl-CDR2 или Vl-CDR3 полипептидные последовательности, связанные с группами, показанными на фиг. 1 А-IK и 3A-3R. В одном варианте реализации аминокислотная последовательность эталонного Vl-CDR1 является SEQ ID NO: 7, 15, 23, 32, 42,
50, 58, 66, 74, 84, 91, 135, 143, 152, 160, 168, 176, 184, 192, 200, 208, 216, 224, 232, 240, 248, 256, 264, 272 или 326; аминокислотная последовательность эталонного Vl-CDR2 является SEQ ID NO: 8, 16, 24, 33, 43,
51, 59, 67, 75, 85, 92, 136, 144, 153, 161, 169, 177, 185, 193, 201, 209, 217, 225, 233, 241, 249, 257, 265, 273 или 327; и аминокислотная последовательность эталонного Vl-CDR3 является SEQ ID NO: 9, 17, 25, 34, 44, 52, 60, 68, 76, 86, 93, 137, 145, 154, 162, 170, 178, 186, 194, 202, 210, 218, 226, 234, 242, 250, 258, 266, 274 или 328.
В другом варианте реализации в изобретении предложен изолированный полипептид, содержащий, состоящий в основном из или состоящий из вариабельного участка легкой цепи иммуноглобулина (Vl) в котором Vl-CDR1, Vl-CDR2 и Vl-CDR3 участки имеют полипептидные последовательности из VlCDR1, Vl-CDR2 и Vl-CDR3 групп, показанные на фиг. 1 А-IK и 3A-3R, за исключением одной, двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти или десяти аминокислотных замен в любом Vl-CDR. В определенном варианте реализации аминокислотные замены консервативны. В одном варианте реализации аминокислотная последовательность Vl-CDR1 является SEQ ID NO: 7, 15, 23, 32, 42, 50, 58, 66, 74, 84, 91, 135, 143, 152, 160, 168, 176, 184, 192, 200, 208, 216, 224, 232, 240, 248, 256, 264, 272 или 326; ами- 36 032003 нокислотная последовательность VL-CDR2 является SEQ ID NO: 8, 16, 24, 33, 43, 51, 59, 67, 75, 85, 92,
136, 144, 153, 161, 169, 177, 185, 193, 201, 209, 217, 225, 233, 241, 249, 257, 265, 273 или 327; и аминокислотная последовательность VL-CDR3 является SEQ ID NO: 9, 17, 25, 34, 44, 52, 60, 68, 76, 86, 93, 137, 145,
154, 162, 170, 178, 186, 194, 202, 210, 218, 226, 234, 242, 250, 258, 266, 274 или 328.
Как известно в данной области техники, идентичность последовательностей между двумя полипептидами или двумя полинуклеотидами определяется путем сравнения аминокислот или последовательностей нуклеиновой кислоты одного полипептида или полинуклеотида с последовательностью второго полипептида или полинуклеотида. Когда обсуждаются в настоящем документе, является ли какойлибо конкретный полипептид по меньшей мере приблизительно на 40, на 45, на 50, на 55, на 60, на 65, на 70, на 75, на 80, на 85, на 90 или на 95% идентичен с другим полипептидом, это может быть определено с использованием методов и компьютерных программ/обеспечения известного в данной области, таких как программы BESTFIT (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 для Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711), но не ограничиваясь этим. BESTFIT использует локальный алгоритм гомологии Smith и Waterman, Advances in Applied Mathematics 2 (1981), 482-489, чтобы найти лучший сегмент гомологии между двумя последовательностями. При использовании BESTFIT или любой другой программы выравнивания последовательностей, чтобы определить, является ли конкретная последовательность, например, на 95% идентична эталонной последовательности согласно изобретению, параметры установлены, конечно, такие, что процент идентичности рассчитывается более полной длины последовательности опорного полипептид и допускаются пробелы в гомологии вплоть до 5% общего числа аминокислот в эталонной последовательности.
В одном варианте реализации изобретения, полинуклеотид включает, по существу состоит из, или состоит из нуклеиновой кислоты, имеющей полинуклеотидную последовательность VH или VL участка TDP-43-связывающего антитела, как указано в табл. 3. В этом соблюдении человеку с квалификацией в данной области техники должно быть понятно, что полинуклеотиды, кодирующие, по меньшей мере, вариабельный домен легкой и/или тяжелой цепи, могут кодировать вариабельный домен обеих цепей иммуноглобулина или только один.
- 37 032003
Таблица 3
Нуклеотидная последовательность У,, и V, участков TDP-43-специфического антитела
Антитело Нуклеотидная последовательность вариабельной тяжелой (Vh) и вариабельной легкой (Vl) цепей
N1-205.3F10 Vh SEQ ID №95
Vl SEQ ID №96
NI-205 51C1 Vh SEQ ID №97
Vl SEQ ID №98
NI-205.21G2 Vh SEQ ID №99
Vl SEQ ID №100
NI-205.8A2 Vh SEQ ID №101
Vl SEQ ID №102
N1-205.15F12 Vh SEQ ID №103
Vl SEQ ID №104
N1-205 113С4 Vh SEQ ID №105
Vl SEQ ID №106
NI-205.25F3 Vh SEQ ID №107
Vl SEQ ID №108
N1-205.87Е7 Vh SEQ ID №109
Vl SEQ ID №110
NI-205.21G1 Vh SEQ ID №111
Vl SEQ ID №112
NI-205.68G5 Vh SEQ ID №113
Vl SEQ ID №114
NI-205.20A1 Vh SEQ ID №115
Vl SEQ ID №116
NI205.41D1 Vh SEQ. ID. №275
Vl SEQ. ID №276
NI205.29E11 Vh SEQ. ID. №277
Vl SEQ ID. №278
NI205.9E12 Vh SEQ. ID. №279
Vl SEQ. ID. №280
Vl SEQ. ID №281
N1205.98Н6 Vh SEQ. ID. №282
- 38 032003
Vl SEQ. ID №283
N1205.10D3 Vh SEQ ID. №284
Vl SEQ ID. №285
NI205.44B22 Vh SEQ. ID №286
Vl SEQ. ID №287
N1205.38Н2 Vh SEQ ID. №288
Vl SEQ ID. №289
N1205.36D5 Vh SEQ ID №290
Vl SEQ. ID №291
N1205 58Е11 Vh SEQ. ID №292
Vl SEQ ID. №293
N1205 14Н5 Vh SEQ ID №294
Vl SEQ ID. №295
N1205.31D2 Vh SEQ. ID. №296
Vl SEQ ID. №297
NI205.8F8 Vh SEQ. ID №298
Vl SEQ. ID №299
N1205.31С11 Vh SEQ. ID. №300
Vl SEQ ID. №301
NI205.8C10 Vh SEQ ID. №302
Vl SEQ. ID №303
N1205.10Н7 Vh SEQ. ID №304
Vl SEQ ID. №305
N1205.1А9 Vh SEQ ID. №306
Vl SEQ. ID. №307
N1205.14W3 Vh SEQ. ID. №308
Vl SEQ ID. №309
N1205.19G5 Vh SEQ. ID №310
Vl SEQ. ID. №310
В одном варианте реализации изобретении предложен изолированный полипептид, содержащий, состоящий в основном из или состоящий из нуклеиновой кислоты, кодирующей вариабельный участок тяжелой цепи иммуноглобулина по меньшей мере на 80, на 85, на 90, на 95, на 96, на 98 или на 99 или 95% идентичный эталонной тяжелой цепи VH. В одном варианте реализации аминокислотная последовательность эталонной тяжелой цепи вариабельного участка является SEQ ID NO: 1, 10, 18, 26, 35, 45, 53, 61, 69, 77, 87, 130, 138, 146, 155, 163, 171, 179, 187, 195, 203, 211, 219, 227, 235, 243, 251, 259 или 267. В одном варианте реализации изобретении предложен изолированный полипептид, содержащий, состоящий в основном из или состоящий из нуклеиновой кислоты, кодирующей вариабельный участок легкой цепи иммуноглобулина по меньшей мере на 80, на 85, на 90, на 95, на 96, на 98 или на 99 или 95% идентичный эталонной легкой цепи VL. В одном варианте реализации аминокислотная последовательность эталонной легкой цепи вариабельного участка является SEQ ID NO: 6, 14, 22, 31, 40, 49, 57, 65,73, 82, 122, 134, 142, 150, 151, 159, 167, 175, 183, 191, 199, 207, 215, 223, 231, 239, 247, 255, 263 или 271. Изобретение также включает фрагменты полинуклеотида изобретения. Предпочтительно полинуклеотиды кодируют полипептид, который связывается TDP-43. Кроме того, полинуклеотиды, которые кодируют слитые полинуклеотиды, Fab-фрагменты, и другие производные, как описано в настоящем документе, также рассматриваются в данном изобретении.
Полинуклеотиды могут быть получены или изготовлены любым подходящим способом, известным в данной области техники. Например, если нуклеотидная последовательность антитела известна, полинуклеотид, кодирующий антитело может быть собран из химически синтезированных олигонуклеотидов, например, как описано в Kutmeier et al., BioTechniques 17 (1994), 242, которые кратко, включают синтез перекрывающихся олигонуклеотидов, содержащих части последовательностей, кодирующух антитела, отжиг и лигирование этих олигонуклеотидов, и затем амплификацию лигированных олигонуклеотидов с помощью PCR.
Альтернативно, полинуклеотид, кодирующий антитело (в том числе в антигенсвязывающий фрагмент антитела, или вариант или его производное) может быть получен из нуклеиновой кислоты соответствующего источника. Если клон, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую конкретное антитело не доступен, но последовательность антитела известна, нуклеиновая кислота, кодирующая антитело, может быть химически синтезирована или получена из соответствующего источника (например, антитела библиотеки кДНК, или полученна из библиотеки кДНК, или нуклеиновой кислоты, предпочтительно
- 39 032003 полиА+РНК, выделенной из любой ткани или клетки, экспрессирующей TDP-43-специфическое антитело, например, гибридомных клеток, выбранных, чтобы експрессировать антитела) путем PCRамплификации с использованием синтетических праймеров, которые гибридизуются с 3'- и 5'-концами последовательности или путем клонирования с использованием зонда, специфичного олигонуклеотида для конкретной последовательности гена, чтобы определить, например, кДНК клона из библиотеки кДНК, которая кодирует антитело. Амплифицированные нуклеиновые кислоты, полученные с помощью PCR, могут быть клонированы в векторах клонирования, воспроизводимых с помощью любого способа, известного в данной области техники. После того как нуклеотидная последовательность и соответствующая аминокислотная последовательности антитела, или антигенсвязывающего фрагмента, варианта или его производного определятся, его нуклеотидной последовательностью можно манипулировать с помощью методов, известных в данной области для манипуляций нуклеотидными последовательностями, например, рекомбинантной ДНК, сайт-направленным мутагенезом, PCR и т.п. (см., например, методы, описанные в Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual., 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990) и Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1998), содержаниеся в настоящем документе в качестве ссылки во всей их полноте), для генерации антитела, имеющего отличающиеся аминокислотный последовательности, например, чтобы создать аминокислотные замены, делеции, и/или вставки.
IV. Экспрессия полипептидов антитела.
Последующие манипуляции с изолированным генетическим материалом обеспечивают антитело (в том числе антигенсвязывающий фрагмента антитела, или вариант или его производного) настоящего изобретения полинуклеотид, кодирующий антитело, как правило, вставляется в экспрессирующий вектор для введения в клетку-хозяина, которая может быть использована для получения желаемого количества антител. Рекомбинантная экспрессия антитела или фрагмента, производного или его аналога, например, тяжелой или легкой цепи антитела, которое связывается с молекулой-мишенью, описывается в настоящем документе. После того как полинуклеотид, кодирующий антитело или тяжелую или легкую цепи антитела или его части (предпочтительно содержащий вариабельный домен тяжелой или легкой цепи), данного изобретения были получены, вектор для производства антител может быть получен путем технологии рекомбинантной ДНК с использованием способов, известных в данной области техники. Таким образом, способы получения белка, посредством экспрессии полинуклеотида, содержащего антителокодирующие нуклеотидные последовательности, описаны в настоящем документе. Методы, которые известны человеку с квалификацией в данной области, могут быть использованы для построения векторов экспрессии, содержащих антителокодирующие последовательности и соответствующие контрольные сигналы транскрипции и трансляции. Эти методы включают, например, in vitro рекомбинантную ДНК, синтетические методы, и in vivo генетическую рекомбинацию. Изобретение, таким образом, обеспечивает воспроизведение векторов, содержащих нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело изобретения или тяжелую или легкую его цепи, или тяжелую или легкую цепи вариабельного домена, функционально связанного с промотором. Такие векторы могут включать нуклеотидную последовательность, кодирующую константный участок антитела (см., например, международную заявку № WO 86/05807 и патент США № 5122464) и вариабельный домен антитела может быть клонирован в такой вектор для экспрессии всей тяжелой или легкой цепи.
Термин вектор или экспрессирующий вектор используется в настоящем документе для обозначения векторов, используемых в соответствии с изобретением в качестве средства для введения и экспрессии желаемого гена в клетку-хозяина. Как известно в данной области техники, такие векторы могут быть легко выбраны из группы, состоящей из плазмид, фагов, вирусов и ретровирусов. В общем, векторы, совместимые с настоящим изобретением, будут включать селективный маркер, соответствующий сайту рестрикции для облегчения клонирования желаемого гена и возможности ввода и/или репликации в эукариотических или прокариотических клетках. Многочисленные системы векторов экспрессии могут быть использованы для целей из настоящего изобретения. Например, один класс векторов использует элементы ДНК, которые получены из вирусов животных, таких как вирус бычьей папилломы, вирус полиомы, аденовирус, вирус коровьей оспы, бакуловирус, ретровирусы (RSV, MMTV или MOMLV) или вирус SV40. Другие предполагают использование полицистронных систем с внутренними сайтами связывания рибосом. Кроме того, клетки, с интегрированной ДНК в свои хромосомы, могут быть выбраны путем введения одного или нескольких маркеров, которые позволяют выбрать трансфицированных клеток-хозяев. Маркер может обеспечить прототрофию ауксотрофному хозяина, биоцидную резистентность (например, к антибиотикам) или резистентность к тяжелым металлам, таким как медь. Селективный маркерный ген может быть напрямую связан с последовательностями ДНК, которые будут экспрессированы, или введены в ту же клетку котрансформацией. Дополнительные элементы могут быть также необходимы для оптимального синтеза мРНК. Эти элементы могут включать сигнальные последовательности, сигналы сплайсинга, а также транскрипционные промоторы, энхансеры и сигналы терминации.
В частном варианте реализации клонированные вариабельные участки генов вставляются в вектор экспрессии вместе с кодирующими последовательностями тяжелой и легкой цепей константного участка (генов, например, человеческой тяжелой или легкой цепей константного участка), как было описано вы
- 40 032003 ше. В одном варианте реализации это осуществляется с помощью собственного вектора экспрессии, из Biogen IDEC, Inc., называемый NEOSPLA, раскрытый в патенте США № 6159730. Этот вектор содержит промотор/энхансер цитомегаловируса, основной промотор бета-глобина мыши, ориджин репликации SV40, последовательность полиаденилирования бычьего гормона роста, неомицинфосфотрансферазы экзон 1 и экзон 2, ген дигидрофолатредуктазы и лидерной последовательности. Этот вектор был найден, чтобы привести экспрессию антитела на очень высоком уровне после включения генов из вариабельного и константного участков, трансфекции в клетках CHO, после отбора G418, содержащих среднюю и метотрексатаниновую амплификацию. Конечно, любой вектор экспрессии, который способен вызывать экспрессию в эукариотических клетках может быть использован в изобретении. Примеры подходящих векторов включают плазмиды pcDNA3, pHCMV/Zeo, pCR3.1, pEF1/His, pIND/GS, pRc/HCMV2, pSV40/Zeo2, pTRACER-HCMV, pUB6/V5-His, pVAX1, и pZeoSV2 (доступные в Инвитроген, Сан диего, КА), и плазмиду pCI (доступную в Промега, Мэдисон, ВИ), но не ограничиваются ими. В общем, скрининг большого количества трансформированных клеток для выявления тех, которые экспрессируют высокий уровень соответствующим образом, если тяжелые и легкие цепи иммуноглобулина являются рутинным экспериментированием, которое может быть осуществлено, например роботизированными системами. Векторные системы также изложены в патентах США № 5736137 и 5658570, каждый из которых включен в настоящий документ в качестве ссылки во всей полноте. Эта система предусматривает высокий уровень экспрессии, например >30 пг/клетку/день. Другие примеры векторных систем раскрыты, например, в патенте США №6413777.
В другом варианте реализации антитела (например, антигенсвязывающие фрагменты антитела и его варианты или производные) данного изобретения могут быть выражены с использованием полицистронной конструкции, такой как те, которые описаны в заявке на патент США № 2003-0157641 А1 и включены в настоящий документ в качестве ссылки во всей полноте. В этих системах экспрессии, несколько интересных генных продуктов, таких как тяжелые и легкие цепи антитела, могут быть получены из одной полицистронной конструкции. Эти системы успешно используют внутренние сайты встраивания рибосомы (IRES), чтобы обеспечить относительно высокие уровни антител. Совместимые последовательности IRES раскрыты в патенте США № 6193980, который также включен в настоящий документ. Специалистам в данной области техники будет понятно, что такие экспрессионные системы могут быть использованы, чтобы эффективно производить полный спектр антител, раскрытых в заявке на изобретение.
В целом, как только вектор или последовательность ДНК, кодирующая субъединицу мономерного антитела, были подготовлены, вектор экспрессии может быть введен в соответствующую клеткухозяина. Введение плазмиды в клетку-хозяина может быть осуществлено различными методами, известными специалистам в данной области. Они включают трансфекцию, в том числе липотрансфекцию с использованием, например, FuGENE или липофектамина, слияние протопластов, преципитацию фосфата кальция, слияние клеток с огибающей ДНК, микроинъекции, и инфекции с интактным вирусом, но не ограничиваются ими. Как правило, плазмиды вводят в организм хозяина стандартными способами, известными в данной области, такими как, метод со-преципитации с фосфатом кальция. Клетки-хозяева, несущие конструкции экспрессии, выращивают в условиях, подходящих для производства легких цепей и тяжелых цепей, и они были проанализированы на синтез тяжелой и/или легкой цепи белка. Неограничивающие иллюстративные методы анализа включают твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), радиоиммуноанализ (RIA) или флуоресцентно-активированный анализ клеточного сортера (FACS), и иммуногистохимию.
Вектор экспрессии переносят в клетку-хозяина с помощью обычных методик и трансфицированные клетки, затем культивируют обычными методами с получением антител для использования в способах, описанных в настоящем документе. Таким образом, изобретение включает клетки-хозяева, содержащие полинуклеотид, кодирующий антитело изобретения или его тяжелую или легкую цепи, функционально связанные с гетерологичным промотором. В частном варианте реализации для экспрессии двухцепочечных антител векторы, кодирующие обе, тяжелую и легкую, цепи, могут быть коэкспрессированы в клетку-хозяина для экспрессии всей молекулы иммуноглобулина, как описано ниже.
Клетка-хозяин может ко-трансфицирована двумя векторами экспрессии настоящего изобретения, первым вектором, кодирующим полученный полипептид тяжелой цепи и вторым вектором, кодирующим полученный полипептид легкой цепи. Два вектора могут содержать идентичные селективные маркеры, которые позволяют в равной мере экспрессировать полипептиды тяжелой и легкой цепей. Альтернативно, может быть использован один вектор, который кодирует полипептиды тяжелой и легкой цепей. В таких ситуациях, легкая цепь предпочтительно помещена перед тяжелой цепью, чтобы избежать избытка токсичной свободной тяжелой цепи; см. Proudfoot, Nature 322 (1986), 52; Kohler, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980), 2197. Кодирующие последовательности тяжелой и легкой цепей могут содержать кДНК или геномную ДНК.
Используемый в настоящем документе термин клетки-хозяева относится к клеткам, которые укрывают сконструированные векторы с помощью рекомбинантных ДНК и кодируют по меньшей мере один гетерологичный ген. В описаниях процессов изоляции антитела от рекомбинантных хозяев, терми- 41 032003 ны клетка и клеточная культура используются как синонимы для обозначения источника оптимального антитела, если не указано иное. Другими словами, извлечение полипептида из клеток может означать либо центрифугирование целых клеток, либо культуры клеток, содержащей среду и суспендированные клетки.
Разнообразные хост-экспрессируемые векторные системы могут быть использованы для экспрессии антител для использования в способах, описанных в настоящем документе. Такие хост-экспрессируемые системы представляют собой носителей, с помощью которых интересующие кодирующие последовательности могут быть получены и затем очищены, и представляют собой клетки, которые могут, при трансформации или трансфекции с соответствующим нуклеотидными кодирующими последовательностями, экспрессировать антитела данного изобретения in situ. Они включают, микроорганизмы, такие как бактерии (например, Е. coli, В. subtilis), трансформированные рекомбинантной ДНК бактериофага, плазмидной ДНК или космидными ДНК-векторвми экспрессии, содержащими последовательности, кодирующие антитела; дрожжами (например, Saccharomyces, Pichia), трансформированными векторами рекомбинантной экспрессии дрожжей, содержащими кодирующие последовательности антитела; системами клеток насекомых, инфицированных рекомбинантным вирусными векторами экспрессии (например, бакуловируса), содержащими кодирующие последовательности антитела; растительными клеточными системами, инфицированными рекомбинантными вирусными векторами экспрессии (например, вирусом мозаики цветной капусты, CaMV; вирусом табачной мозаики, ВТМ) или трансформированных рекомбинантных плазмидных векторов экспрессии (например, Ti плазмид), содержащих антитело-кодирующие последовательности; или системы клеток млекопитающих (например, COS, CHO, NSO, BLK, 293, 3T3) укрывающих рекомбинантные конструкции экспрессии, содержащие промоторы, полученные из генома клеток млекопитающих (например, промотор металлотионеина) или из вирусов млекопитающих (например, поздний промотор аденовируса; промотор вируса коровьей оспы 7.5K), но не ограничиваются ими. В одном варианте реализации бактериальные клетки, такие как кишечная палочка, и эукариотические клетки, особенно для экспрессии всего рекомбинантного антитела, используются для экспресси рекомбинантного антитела. Например, клетки млекопитающих, как яичника китайского хомячка (CHO), в сочетании с таким вектором, в качестве элемента основного промежуточного раннего генного промотора цитомегаловируса человека являются эффективным система экспрессии антител; см., например, Foecking et al., Gene 45 (1986), 101; Cockett et al., Bio/Technology 8 (1990), 2.
Клеточные линии хозяев, используемые для экспрессии белка TDP-43-связывающими молекулами данного изобретения, включают, например клетки млекопитающих; специалисты в данной области техники имеют способность определять конкретные клеточные линии хозяев, которые лучше всего подходят для желаемого продукта гена, который будет закреплен в них. Примерные линии клеток-хозяев включают, CHO (клетки яичника китайского хомячка), DG44 и DUXB11 (линии яичника китайского хомячка, DHFR минус), HELA (рак шейки матки человека), CVI (линия почек обезьяны), COS (производное CVI с SV40 Т-антигеном), VERY, ВНК (почки детеныша хомячка), MDCK, WI38, R1610 (фибробласты китайского хомячка) BALBC/3T3 (фибробласты мышей), HAK (линия почек хомяка), SP2/O (миелома мыши), P3x63-Ag3.653 (миелома мыши), БФА-IcIBPT (эндотелиальные клетки крупного рогатого скота), RAJI (человеческие лимфоциты и 293 (почки человека), но не ограничиваются ими. В конкретном варианте реализации клеточными линиями хозяев является CHO или клетки 293. Линий клеток-хозяев являются легко доступными и обычно доступны из коммерческих служб, включая, например, американскую коллекцию культур тканей, или из опубликованной литературы.
Кроме того, штаммы клеток-хозяев могут быть выбраны из тех, что модулируюь экспрессию инсерционных последовательностей или модифицируют и обрабатывают генный продукт конкретной желаемой формы. Такие модификации (например, гликозилирование) обработки (например, расщепление) белковых продуктов могут быть важны для функции белка. Различные клетки-хозяева имеют характерные и специфические механизмы для пост-трансляционной обработки и модификации белков и генных продуктов. Соответствующие клеточные линии или системы хозяев могут быть выбраны, чтобы обеспечить правильную модификацию и обработку чужеродного экспрессированого белка. С этой целью могут быть использованы эукариотические клетки-хозяева, которые обладают клеточным механизмами для надлежащей обработки первичного транскрипта, гликозилирования, и фосфорилирование генного продукта.
В долгосрочной перспективе, для производства с высоким выходом рекомбинантных белков, предпочтительна стабильная экспрессия. Например, могут быть спроектированы клеточные линии, которые стабильно экспрессируют антитела. Вместо того, чтобы использовать векторы экспрессии, которые содержат вирусные сайты инициации репликации, клетки-хозяева могут быть трансформированы ДНК под контролем соответствующих контрольных элементов экспрессии (например, промоторов, энхансеров, последовательностей, терминаторов транскрипции, сайтов полиаденилирования и т.д.), и селективных маркеров. После введения чужеродной ДНК, сконструированные клетки могут расти в течение 1-2 дней в обогащенной среде, и затем переключаться на селективную среду. Селектируемый маркер в рекомбинантной плазмиде придает устойчивость к селекции и позволяет клеткам стабильно интегрировать плазмиду в свои хромосомы и расти с образованием очагов, которые, в свою очередь, могут быть клонирова- 42 032003 ны и введены в клеточные линии. Этот способ может быть преимущественно использован для проектирования клеточные линии, которая стабильно экспрессирует антитела.
Число селекционных систем может быть использовано в соответствии с настоящим изобретением, в том числе, но не ограничиваясь ими, гены тимидинкиназы вируса простого герпеса (Wigler et al., Cell 11 (1977), 223), гипоксантин-гуанин фосфорибозилтрансферазы (Szybalska & Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48 (1992), 202), и аденинфосфорибозилтрансферазы (Lowy et al., Cell 22 (1980), 817) могут быть использованы в tk-, hgprt- или aprt-клетках соответственно. Кроме того, антиметаболитная резистентность может быть использована в качестве основы для выбора следующих генов: dhfr, который придает резистентность к метотрексату (Wigler et al., Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980), 357; O'Hare et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 (1981), 1527); гпт, который придает резистентность к микофеноловой кислоте (Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 (1981), 2072); нео, который придает резистентность к аминогликозиду G-418 Goldspiel et al., Clinical Pharmacy 12 (1993), 488-505; Wu and Wu, Biotherapy 3 (1991), 87-95; Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32 (1993), 573-596; Mulligan, Science 260 (1993), 926-932; и Morgan и Anderson, Ann. Rev. Biochem. 62 (1993), 191-217; TIB TECH 11 (1993), 155-215; и хигро, который придает резистентность к гигромицину (Santerre et al., Gene 30 (1984), 147. Методы, известные в данной области технологии рекомбинантной ДНК, которую можно использовать, описаны в Ausubel et al., (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual., Stockton Press, NY (1990); и in Chapters 12 и 13, Dracopoli et al., (eds), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994); Colberre-Garapin et al., J. Mol. Biol. 150:1 (1981), каждый из которых включен в настоящий документ в качестве ссылки во всей их полноте.
Уровни экспрессии антитела могут быть увеличены с помощью методов, известных в данной области, например, с помощью вектора амплификации, см., например, Bebington и Hentschel, The use из vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Academic Press, New York, Vol. 3. (1987). Когда маркер в векторной системе экспрессии антитела является амплифицируемым, увеличение уровня ингибитора в культуре клеток-хозяев увеличивает число копии маркерного гена. Поскольку амплифицированный участок связан с геном антитела, производство антитела также увеличивается; см. Crouse et al., Mol. Cell. Biol. 3 (1983), 257.
In vitro производство позволяет расширить производство, чтобы дать большие объемы нужных полипептидов. Методы культивирования клеток млекопитающих под тканевыми культуральными условиями, которые известны в данной области, и включают гомогенную суспензию культуры, например, в эрлифтном реакторе или в реакторе непрерывного перемешивания, или иммобилизованной захваченной или клеточной культуры, например, в полых волоконах, микрокапсулах, на агарозных микрогранулах или керамических картриджах. При желании необходимые и/или растворы полипептиды могут быть очищены обычными методами хроматографии, фильтрации, например, гель, ионообменной хроматографии, хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе или (иммуно-аффинной хроматографии), например, после преимущественного биосинтеза синтетического шарнирного участка полипептида или до или после HIC хроматографии, описанной в настоящем документе. Гены, кодирующие антитела (в том числе, например, антигенсвязывающие фрагменты антитела и их варианты или производные) данного изобретения могут также быть экспрессированы в клетках немлекопитающих, таких как бактерии или насекомые или дрожжи или растительных клетках. Бактерии, которые легко поглощают нуклеиновые кислоты, включают члены энтеробактерий, таких как штаммы Escherichia cjli или Salmonella; Bacillaceae, таких как Bacillus subtilis; Pneumococcus; Streptococcus, и Haemophilus influenzae. Кроме того, следует понимать, что, когда они экспрессируются в бактериях, гетерологичные полипептиды обычно становятся частью телец включения. Гетерологичные полипептиды должны быть изолированы, очищенные и затем собраны в функциональные молекулы. Где желательны четырехвалентные формы антитела, субъединицы будут самостоятельно собираться в четырехвалентные антитела; см., например, международная заявка № WO 02/096948.
В бактериальных системах, ряд векторов экспрессии могут быть преимущественно выбраны в зависимости от предназначения использования экспрессии антитела. Например, когда должно быть произведено большое количество такого белка, для генерации фармацевтических композиций антитела, векторы, которые направляют экспрессию высоких уровней слитого белка из продуктов, которые легко могут быть очищены. Такие векторы включают экспрессирующий вектор pUR278 E. coli (Ruther et al., EMBO J. 2 (1983), 1791), в котором антитело-кодирующая последовательность может быть лигирована отдельно в вектор в рамке с lacZ кодирующим участком, так что производится слитый белок; pIN векторы (Inouye & Inouye, Nucleic Acids Res. 13 (1985), 3101-3109; Van Heeke & Schuster, J. Biol. Chem. 24 (1989), 55035509); и т.п. pGEX векторы также могут быть использованы для экспрессии чужеродных полипептидов в виде слитых белков с глутатион-с-трансферазой (GST). В общем, такие слитые белки растворимы и могут быть легко очищены из лизированных клеток путем адсорбции и связывания с матрицей из глутатион-агарозных шариков с последующим элюированием в присутствии свободного глутатиона. Векторы pGEX предназначены для включения тромбина или фактора Ха протеазы сайта расщепления так, что клонированный целевой продукт гена может быть освобожден от GST фрагмента. Кроме прокариотических, также могут быть использованы эукариотические микроорганизмы. Saccharomyces cerevisiae, или
- 43 032003 обычные пекарские дрожжи, являются наиболее часто используемыми среди эукариотических микроорганизмов, хотя ряд других штаммов является общедоступными, например, Pichia pastoris. Для экспрессии в Saccharomyces, обычно используется плазмида YRp7, например, (Stinchcomb et al., Nature 282 (1979), 39; Kingsman et al., Gene 7 (1979), 141; Tschemper et al., Gene 10 (1980), 157). Эта плазмида уже содержит ген TRP1, который обеспечивает селективный маркер для мутантного дрожжевого штамма, как отсутствие способности расти на триптофане, например АТСС №44076 или РЕР4-1 (Jones, Genetics 85 (1977), 12). Наличие в TRPL повреждения как характеристики генома дрожжевой клетки-хозяина затем предоставляет эффективную среду для обнаружения трансформации по отсутствию роста на триптофане.
В системе насекомого, Autographa californica вирус ядерного полиэдроза (AcNPV) обычно используется в качестве вектора для экспрессии чужеродных генов. Вирус растет в клетках Spodoptera frugiperd. Последовательность, кодирующая антитело, может быть клонирована в отдельные несущественные участки (например, ген полиэдрина) вируса и помещенна под контроль AcNPV промотора (например, промотера полигедрина).
После того как антитело данного изобретения было рекомбинантно экспрессировано, все антитела, их димеры, отдельные легкие и тяжелые цепи или другие формы иммуноглобулинов изобретения могут быть очищены в соответствии со стандартными процедурами из данной области, например, с помощью хроматографии (например, ионообменной, аффинной, в частности с аффинностью к специфичному антигену после белка А, и эксклюзионной колоночной хроматографией), центрифугированием, дифференциальной растворимостью, например, осаждение сульфатом аммония, или любыми другими стандартными техниками для очистки белков; см., например, Scopes, Protein Purification, Springer Verlag, N.Y. (1982). Альтернативно, другой способ увеличения сродства антитела данного изобретения описан в патенте США № 2002-0123057 А1.
V. Слитые белки и коньюгаты.
В некоторых варианте реализации полипептид антитела содержит последовательность аминокислот, или один или несколько фрагментов, обычно не связанных с антителом. Примеры модификаций описаны более подробно ниже. Например, одноцепочечный FV фрагмент антитела данного изобретения может содержать гибкую линкерную последовательность, или может быть модифицирован добавлением функциональной группы (например, ПЭГ, лекарственного средства, токсина или меченого, например, флуоресцентной, радиоактивной, ферментной, ядерной магнитной меткой, тяжелым металлом и т.п.).
Полипептид антитела данного изобретения может включать, состоять по существу из или состоять из слитого белка. Слитые белки представляют собой химерные молекулы, которые содержат, например, TDP-43-связывающий домен иммуноглобулина по меньшей мере одного целевого сайта связывания и по меньшей мере одну гетерологичную часть, т.е. часть, с которой он не связан, естественно, в природе. Аминокислотные последовательности могут нормально существовать в отдельных белках, которые приняли участие в слитом полипептиде или они могут нормально существовать в том же белке, но размещаться в новой аранжировке слитого полипептида. Слитые белки могут быть созданы, например, путем химического синтеза, либо путем создания и трансляции полинуклеотидов, в которых пептидные участки кодируются в нужном отношении.
Термин гетерологичный в применении к полинуклеотиду или полипептиду, означает, что полинуклеотид или полипептид получен из отдельного из остального множества, с которы он сравнивается. Например, как используется в настоящем документе, гетерологичный полипептид, который будет слит с антителом или антигенсвязывающим фрагментом, вариантом, или его аналогом, происходит от неиммуноглобулинового полипептида того же вида, или иммуноглобулина или неиммуноглобулинового полипептида различных видов.
Как описано более подробно в другом месте в настоящем документе, антитела (например, антигенсвязывающие фрагменты антитела и варианты или его производные) или антигенсвязывающие фрагменты, варианты или его производные данного изобретения могут быть дополнительно рекомбинантно слиты с гетерологичным полипептидом по N- или С-концу или химически конъюгированы (в том числе ковалентным и нековалентным сопряжением) с полипептидами или другими составами. Например, антитела могут быть рекомбинантно слиты или сочтены с молекулами, используемыми в качестве меток в анализах обнаружения и эффекторными молекулами, такими как гетерологичные полипептиды, лекарства, радионуклиды, или токсины; см., например, публикации международных заявок № WO 92/08495; WO 91/14438; WO 89/12624; патент США № 5314995; и европейский патент № ЕР 0396387. Антитела (например, антигенсвязывающих фрагмент антитела и варианты или его производные) данного изобретения могут состоять из аминокислот, соединенных друг с другом пептидными связями или измененными пептидными связями, например, пептидные изостеры, и могут содержать аминокислоты, отличающиеся от 20 геннокодируемых аминокислот. Антитела могут быть модифицированы путем естественных процессов, таких как посттрансляционная обработка, или с помощью химических методов модификации, которые известны в данной области техники. Такие модификации хорошо описаны в основных документах и в более подробных монографиях, а также в обширной научной литературе. Модификации могут произойти в любом месте антитела, включая пептидный остов, аминокислотные боковые цепи и амино- или карбоксиконцы или на фрагменты, такие как углеводы. Следует понимать, что модификация того же ти
- 44 032003 па может присутствовать в той же или разной степени на нескольких участках в данном антителе. Кроме того, данное антитело может содержать много типов модификаций. Антитела могут быть разветвленными, например, в результате убиквитинирования, и они могут быть циклическими, с или без ветвления. Циклические, разветвленные, циклические и разветвленные антитела могут возникнуть в результате естественных процессов. Посттрансляционные могут быть получены методами синтеза. Модификации включают ацетилирование, ацилирование, АДФ-рибозилирование, амидирование, ковалентное присоединение флавина, ковалентное присоединение части гема, ковалентное присоединение нуклеотида или производных нуклеотидов, ковалентное присоединение липида или липидной производной, ковалентное присоединение фосфотидилиноситола, перекрестное сшивание, циклизация, образование дисульфидной связи, деметилирование, образование ковалентной поперечной связи, формирование цистеина, образование пироглутамата, формилирование, гамма-карбоксилирование, гликозилирование, формирование GPI якоря, гидроксилирование, йодирование, метилирование, миристоилирование, окисление, пегилирование, протеолитический процессинг, фосфорилирование, пренилирование, рацемизацию, селеноилирование, сульфатирование, передачу РНК-опосредованного добавления аминокислот в белках, таких как аргинилирование и убиквитинирование; см., например, Proteins - Structure and Molecular Properties, Т. Е. Creighton, W. H. Freeman и Company, New York 2nd Ed. (1993); Posttranslational Covalent Modification Из Proteins, В. С Johnson, Ed., Academic Press, New York, p. 1-12 (1983); Seifter et al., Meth. Enzymol. 182(1990), 626-646; Rattan et al., Ann. NY Acad. Sci. 663 (1992), 48-62).
Настоящее изобретение также относится к слитым белкам, содержащим антитело или антигенсвязывающий фрагмент, вариант или его производное, и гетерологичный полипептид. В одном варианте реализации слитый белок данного изобретения содержит, состоит в основном из, или состоит из полипептида, имеющего аминокислотную из любого одного или нескольких участков VH антитела данного изобретения или последовательность аминокислот из любого одного или более участков VL антитела данного изобретения или фрагменты или его варианты, и гетерологичную полипептидную последовательность. В другом варианте реализации в настоящем документе раскрыт слитый белок для использования в диагностических методах лечения содержащий, состоящий по существу из или состоящий из полипептида, имеющего последовательность аминокислот из любого одного, двух, трех VH-CDR антитела, или фрагмента, варианта или его производного или последовательности аминокислот из любого одного, двух, трех VL-CDR антитела или фрагмента, варианта или его производного, и гетерологичную полипептидную последовательность. В одном варианте реализации слитый белок содержит полипептид, имеющий аминокислотную последовательность VH-CDR3 антитела из изобретения или фрагмента, производного или его варианта, и гетерологичную полипептидную последовательность, которая слита с белоком, специфически связанным с TDP-43. В другом варианте реализации слитый белок содержит полипептид, содержащий аминокислотную последовательность по меньшей мере одного участка VH антитела данного изобретения, аминокислотную последовательность по меньшей мере одного участка VL антитела данного изобретения или фрагменты, производные или его варианты, и гетерологичную полипептидную последовательность. В одном варианте реализации VH и VL участки слитого белка соответствуют одному антителу (или ScFv или Fab фрагменту), которое специфически связывается с TDP-43. В еще одном варианте реализации слитый белок для использования в диагностических методах и лечении раскрытый в настоящем документе, содержит полипептид, имеющий последовательность аминокислот любого одного, двух, трех или больше VH-CDR антитела и последовательность аминокислот любого одного, двух, трех или больше VL-CDR антитела или фрагмента или его варианта, и гетерологичную полипептидную последовательность. В одном варианте реализации один, два, три, четыре, пять, шесть или более VHCDR(ob) или V^CDR^b) соответствуют одному антителу (или ScFv или Fab-фрагменту) из настоящего изобретения. Молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие эти слитые белки, также охватываются настоящим изобретением. Образцовый слитые белки в литературе включают слияния Т-клеточного рецептора (Gascoigne et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987), 2936-2940; CD4 (Capon et al., Nature 337 (1989), 525-531; Traunecker et al., Nature 339 (1989), 68-70; Zettmeissl et al., DNA Cell. Biol. USA 9 (1990), 347-353; и Byrn et al., Nature 344 (1990), 667-670); L-селектина (рецептор самонаведения) (Watson et al., J. Cell. Biol. 110 (1990), 2221-2229; и Watson et al., Nature 349 (1991), 164-167); CD44 (Aruffo et al., Cell 61 (1990), 1303-1313); CD28 и B7 (Linsley et al., J. Exp. Med. 173 (1991),721-730); CTLA-4 (Lisley et al., J. Exp. Med. 174 (1991), 561-569); CD22 (Stamenkovic et al., Cell 66 (1991), 1133-1144); TNF рецептора (Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991), 10535-10539; Lesslauer et al., Eur. J. Immunol. 27 (1991), 2883-2886; и Peppel et al., J. Exp. Med. 174 (1991), 1483-1489 (1991); и IgE рецептора (Ridgway и Gorman, J. Cell. Biol. 115 (1991), Реферат № 1448). Как уже говорилось в другом месте в настоящем документе, антитела (например, интактные антитела, и антигенсвязывающие фрагменты антитела и варианты или их производные) данного изобретения могут быть слиты с гетерологичными полипептидами для увеличения в естественных условиях времени полужизни полипептидов или для использования в иммунологических анализах с использованием способов, известных в данной области. Например, в одном варианте реализации PEG могут быть конъюгированы с антителом данного изобретения для увеличения их времени полужизни в естественных условиях; см., например, Leong et al., Cytokine 16 (2001), 106-119; Adv. in Drug Deliv. Rev. 54 (2002), 531; или Weir et al., Biochem. Soc. Transactions 30 (2002), 512. Кроме того, антитела (на
- 45 032003 пример, интактные антитела и антигенсвязывающие фрагменты антитела и варианты или их производные) данного изобретения могут быть слиты с маркерными последовательностями, такими как пептиды, чтобы облегчить их очистку или обнаружение. В частном варианте реализации маркерная последовательность аминокислоты представляет собой гекса-гистидин пептид (HIS), такие как метки, представленные в PQE векторе (QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, Calif., 91311), в частности, многие из которых имеются в продаже. Как описано в Gentz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989), 821-824, например, гекса-гистидин обеспечивает удобную очистку слитого белка. Другие полезные пептидные метки для очистки включают, но не ограничиваясь этим, НА метку, которая соответствует эпитопу, полученную из белка гемагглютинина вируса гриппа (Wilson et al., Cell 37 (1984), 767) и метку флаг. Слитые белки могут быть получены с использованием способов, которые хорошо известны в данной области; см., например, патенты США № 5116964 и 5225538. Точный сайт, на котором производится сплав может быть выбран эмпирически для оптимизизации секреции или связывающих характеристик слитого белка. ДНК, кодирующая слитый белок, затем трансфицируется в клетку-хозяина для экспрессии.
Антитела данного изобретения могут использоваться в несопряженной форме или могут быть сопряженными по меньшей мере с одной из множества молекул, например, для улучшения терапевтических свойств молекул, чтобы облегчить обнаружение цели, или для изображения или терапии пациента. Антитела (например, интактные антитела, и антигенсвязывающие фрагменты антитела и варианты или их производные) данного изобретения могут быть помечены или конъюгированы либо до, либо после очистки, либо в время очистки. В частности, антитела данного изобретения могут быть конъюгированы с терапевтическими агентами, пролекарствами, пептидами, белками, ферментами, вирусами, липидами, модификаторами биологического ответа, фармацевтическими агентами, или PEG.
Конъюгаты, которые являются иммунотоксинами, включая обычные антитела, были широко описаны в данной области. Токсины могут быть соединены с антителами с помощью обычных методик сочетания или иммунотоксин-содержащие белковые части токсина могут быть получены в виде слитых белков. Антитела данного изобретения могут быть использованы соответствующим образом, чтобы получить такие иммунотоксины. Показательными иммунотоксинами являются те, которые описаны Byers, Seminars Cell. Biol. 2 (1991), 59-70 и Fanger, Immunol. Today 12 (1991), 51-54.
Специалистам в данной области техники будет понятно, что конъюгаты также могут быть собраны, используя разнообразные методики в зависимости от выбранного конъюгированного агента. Например, конъюгаты с биотином готовятся, например, реакцией TDP-43-связывающего полипептида с активированным сложным эфиром биотина, такого как биотин N-гидроксисукцинимид эфир. Аналогично, конъюгаты с флуоресцентным маркером могут быть получены в присутствии из связующего агента, например, тех, которые перечислены в настоящем документе, или реакцией с изотиоцианат флуоресцеином, или изотиоцианатом. Конъюгаты данного изобретения подготовлены аналогичным образом.
Кроме того, изобретение включает в себя антитела (например, интактные антитела, и антигенсвязывающие фрагменты антител и их варианты или производные) данного изобретения конъюгированные с диагностическим или терапевтическим агентом. Антитела могут быть использованы диагностически, например, демонстрируя наличие неврологического заболевания, для оценки риска получение неврологического заболевания, для мониторинга развития или прогрессирования неврологического заболевания, т.е. TDP-43 протеинопатии как части процедуры клинического тестирования, например, определения эффективности данного лечения и/или режима профилактики. Обнаружение может быть облегчено путем связывания антитела или антигенсвязывающего фрагмента, варианта или его производного с детектируемым веществом. Примеры обнаруживаемых веществ включают различные ферменты, простетические группы, флуоресцентные материалы, люминесцентные материалы, биолюминесцентных материалы, радиоактивные материалы, позитроннизлучающие металлы с использованием различных позитронноэмиссионных томографии, и ионы нерадиоактивного парамагнитного металла; см., например, патент США № 4741900 на ионов металлов, которые могут быть конъюгированы с антителом для применения в диагностике согласно изобретению. Примеры подходящих ферментов включают пероксидазу хрена, щелочную фосфатазу, β-галактозидазу или ацетилхолинэстеразу; примеры подходящих простетических групп включают стрептавидин/биотин и авидин/биотин; примеры подходящих флуоресцентных материалов включают умбеллиферон, флуоресцеин, флуоресцеинизотиоцианатом, родамин, дихлоротриазиниламин флуоресцеина, дансилхлорид или фикоэритрин; пример излюминесцентного материала включает люминол; примеры биолюминесцентных материалов включают люциферазу, люциферином и экворин; и примеры подходит радиоактивных материалов включают 125I, 131I, 111In или 99Tc.
Антитело или антигенсвязывающий фрагмент, вариант или его производное могут быть также помечены обнаруживаемой меткой путем связывания их с хемилюминесцентным соединением. Наличие хемилюминесцентной метки антитела затем определяется путем обнаружения наличия люминесценции, которая возникает в ходе химической реакции. Примерами особенно полезных хемилюминесцентных маркировочных соединений являются люминол, изолюминол, тероматический эфир акридиния, имидазол, соль акридиния и сложный эфир щавелевой кислоты.
Один из способов, в которых антитело или антигенсвязывающий фрагмент, вариант, или его производное можно детектируемо помечено, является связывание с ферментом и использование связанного
- 46 032003 продукта в иммуноферментном анализе (EIA) (Voller, A., The Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) Microbilogical Associates Quarterly Publication, Walkersville, Md., Diagnostic Horizons 2 (1978), 1-7); Voller et al., J. Clin. Pathol. 31 (1978), 507-520; Butler, Meth. Enzymol. 73 (1981), 482-523; Maggio, E. (ed.), Enzyme Immunoassay, CRC Press, Boca Raton, Fla., (1980); Ishikawa, E. et al., (eds.), Enzyme Immunoassay, Kgaku Shoin, Tokyo (1981). Фермент, который связан с антителом, реагирует с соответствующим субстратом, предпочтительно хромогенным субстратом, таким образом, чтобы производить химический радикал, который может быть обнаружен, например, спектрофотометрическим или флуориметрическим визуальными средствами. Ферменты, которые могут быть использованы для детектируемо меченого антитело, включают, малатдегидрогеназу, стафилококковой нуклеазу, дельта-5-стероид-изомеразу, дрожжевую алкогольдегидрогеназу, альфа-глицерофосфат, дегидрогеназу, триозофосфатизомеразу, пероксидазу хрена, щелочная фосфатазу, аспарагиназу, глюкозооксидазу, бета-галактозидазу, рибонуклеазу, уреазу, каталазу, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу, глюкоамилазу и ацетилхолинэстеразу, но не ограничиваются ими. Кроме того, обнаружение может быть достигнуто путем колориметрических методов, которые используют хромогенный субстрат для фермента. Обнаружение также может быть достигнуто путем визуального сравнения по мере ферментативной реакции субстрата по сравнению с аналогичными подготовленными стандартами.
Обнаружение может также быть выполнено с помощью любого из множества других иммунологических анализов. Например, радиоактивно меченное антитело или антигенсвязывающий фрагмент, вариант или его производное можно обнаружить за счет использования радиоиммуноанализа (RIA) (см., например, Weintraub, В., Principles из Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligu Assay Techniques, The Endocrine Society, (March, 1986)), который включен в настоящий документ в качестве ссылки в полном объеме).
Радиоактивный изотоп может быть обнаружен с помощью гамма-счетчика, сцинтилляционного счетчика или авторадиографии, но не ограничиваясь этим. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент, вариант, или его производное можно также пометить обнаруживаемой меткой с помощью металлов, излучающих флуоресценцию, таких как 152Eu, или других из ряда лантанидов. Эти металлы могут быть присоединены к антителу с использованием таких металлических хелатирующих групп, как диэтиленетриаминэпентацетовая кислота (DTPA) или этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA). Известны методы сопряжения различных фрагментов с антителом или антигенсвязывающим фрагментом, вариантом, или его производным; см., например, Arnon et al., Monoclonal Антитела For Immunotargeting of Drugs In Cancer Therapy, in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Reisfeld et al., (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. (1985); Hellstrom et al., Antibodies For Drug Delivery, in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al., (eds.), Marcel Dekker, Inc., pp. 623-53 (1987); Thorpe, Antibody Carriers of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review, in Monoclonal Antibodies'84: Biological И Clinical Applications, Pinchera et al., (eds.), pp. 475-506 (1985); Analysis, Results, and Future Prospective of The Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy, in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection and Therapy, Baldwin et al. (eds.), Academic Press, p. 303-16 (1985), и Thorpe et al., The Preparation and Cytotoxic Properties of Antibody-Toxin Conjugates, Immunol. Rev. 62 (1982), 119-158. Как уже упоминалось, в некоторых варианте реализации фрагмент, который повышает стабильность или эффективность связывающей молекулы, например, связывающего полипептида, например, антитела или его иммуноспецифического фрагмента может быть конъюгирован. Например, в одном варианте реализации PEG может быть конъюгирован со связывающей молекулой данного изобретения для увеличения их времени полужизни in vivo. Leong et al., Cytokine 16 (2001), 106; Adv. in Drug Deliv. Rev. 54 (2002), 531; или Weir et al., Biochem. Soc. Transactions 30 (2002), 512.
VI. Композиции и методы использования.
Настоящее изобретение относится к составам, содержащим вышеупомянутую TDP-43связывающую молекулу, например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, вариант, или полинуклеотид, вектор или клетку из изобретения. Состав данного изобретения может дополнительно включать фармацевтически приемлемый носитель. Кроме того, фармацевтический состав данного изобретения может содержать дополнительные агенты, такие как интерлейкины или интерфероны, в зависимости от предполагаемого использования фармацевтической композиции. Например, для применения в лечении TDP-43 протеинопатии дополнительный агент может быть выбран из группы, состоящей из небольших органических молекул, auTu-TDP-43 антител и их комбинаций. Таким образом, в каждом конкретном варианте реализации изобретение относится к применению TDP-43-связывающей молекулы, например, антитела или его антигенсвязывающего фрагмента данного изобретения или связывающей молекулы, имеющей по существу те же обязательные особенности какого-либо одного полинуклеотида, вектора или клетки данного изобретения для подготовки фармацевтической или диагностической композиции для профилактического и терапевтического лечения TDP-43 протеинопатии, мониторинга прогрессирования TDP-43 протеинопатии или ответа на лечение TDP-43 протеинопатии у субъекта, или для определения риска возникновения TDP-43 протеинопатии у субъекта.
Таким образом, в одном варианте реализации изобретение относится к способу лечения неврологического расстройства, характеризующегося аномальным накоплением и/или осаждением TDP-43 в мозге
- 47 032003 и центральной нервной системе, и, соответственно, включающему введение субъекту, который в этом нуждается, терапевтически эффективного количества любого одного из вышеописанных TDP-43 связывающих молекул, антител, полинуклеотидов, векторов или клеток из настоящего изобретения. Термин TDP-43 протеинопатия включает такую TDP-43 протеинопатию, как болезнь аргирофильных волокон, болезнь Альцгеймера, боковой амиотрофический склероз (БАС), комплекс деменция-БАСпаркинсонизм Гуам, кортикобазальная дегенерация, деменция с тельцами Леви, болезнь Хантингтона, болезнь телец Леви, болезнь двигательных нейронов, лобно-височная дегенерация (ЛВД), лобновисочная деменция, лобно-височная дегенерация с убиквитин-положительными включениями, склероз гиппокампа, миопатия тельцами включений, миозит тельцами включений, болезнь Паркинсона, деменция болезни Паркинсона, комплекс деменции и болезни Паркинсона с полуострова Кии и болезнью Пика, а также другие двигательные расстройства, нейродегенеративные заболевания и болезни центральной нервной системы (CNS) в целом, но не ограничиваются ими. Если не указано иное, нейродегенеративные, неврологические или психоневрологические термины являются взаимозаменяемыми в настоящем документе.
Особое преимущество терапевтического подхода данного изобретения заключается в том, что антитела данного изобретения получены из В-клеток или В-клеток памяти от здоровых людей без признаков БАС и/или ЛВД и, таким образом, с некоторой вероятностью, способны предотвращать клинические проявления TDP-43 протеинопатии или уменьшать риск возникновения клинических проявлений болезни, или влиять на более позднее начало клинических проявлений заболевания. Как правило, антитела данного изобретения также уже успешно пережили соматическое созревание, т.е. оптимизацию в отношении целевой селективности и эффективности в высоком сродстве связывания с целевой TDP-43 молекулой с помощью соматической вариации вариабельного участка антитела.
Знание того, что такие клетки in vivo, например, у человека, не были активированы посредством схожих или других физиологических белов или клеточных структур в том смысле аутоиммунологическая или аллергическая реакция также имеет большое медицинское значение, так как это означает, что значительно повышается вероятность успешно пережить этапы клинических испытаний. К слову, эффективность, приемлемость и переносимость уже были продемонстрированы перед доклинической и клинической разработками профилактического или терапевтического антитела по меньшей мере на одном человеческом субъекте. Таким образом, можно ожидать, что человеческое анти-1ЛР-43 антитело изобретения, как и его целевая структурно-специфическая эффективность как терапевтического средства и снижение вероятности его побочных эффектов значительно увеличит вероятность его клинического успеха. Настоящее изобретение также относится к фармацевтической и диагностикой, соответственно, упаковке или набору, включающему один или несколько контейнеров, заполненных одним или более описанными выше ингредиентами, например, анти-1ЛР-43 антителами, связывающими фрагментами, производными или их вариантами, полинуклеотидами, векторами или клетками изобретения. К такому контейнеру(ам) может быть уведомление в форме, предписанной правительственным агентством, регулирующим производство, применение или продажу фармацевтических или биологических продуктов, отличающийся тем, что уведомление отражает одобрение агентства на производство, использование или продажу для введения человеку. Кроме того, или альтернативно набор включает реагенты и/или инструкцию для использования в соответствующих диагностических анализах. Состав, например, комплекта данного изобретения, конечно, особенно подходит для оценки риска, диагностики, профилактики и лечения расстройств, которые сопровождаются наличием TDP-43, и в частности, применяются для лечения нейродегенеративных заболеваний, TDP-43 протеинопатий, болезни аргирофильных волокон, болезни Альцгеймера, бокового амиотрофического склероза (БАС), комплекса деменция-БАС-паркинсонизм Гуам, кортикобазальной дегенерации, деменции с тельцами Леви, болезни Хантингтона, болезни телец Леви, болезни двигательных нейронов, лобно-височной дегенерации (ЛВД), лобно-височной деменции, лобно-височной дегенерации с убиквитин-положительными включениями, склероза гиппокампа, миопатии тельцами включений, миозита тельцами включений, болезни Паркинсона, деменции болезни Паркинсона, комплекса деменции и болезни Паркинсона с полуострова Кии и болезни Пика.
В конкретном варианте реализации состав изобретения находится в стерильном водном растворе. В другом варианте реализации один или более из компонентов состава данного изобретения были лиофилизированы. В дополнительном варианте реализации в составе данного изобретения нет сыворотки. В еще одном варианте реализации одно или более антитело, содержащееся в композиции данного изобретения, получено рекомбинантным методом. В другом варианте реализации популяция антител данного изобретения составляет не менее 10% популяции иммуноглобулина в композиции.
Фармацевтические композиции данного изобретения могут быть получены в соответствии со способами, известными в данной области; см., например, Remington: The Science и Practice из Pharmacy (2000) by the University из Sciences in Philadelphia, ISBN 0-683-306472. Примеры подходящих фармацевтических носителей известны в данной области и включают раствор фосфатно-солевой буфера, воду, эмульсии, такие как эмульсия масло/вода, различные типы смачивающих агентов, стерильные растворы и т.д. Композиции, содержащие такие носители, могут быть приготовлены известными обычными способами. Эти фармацевтические композиции можно вводить субъекту в подходящей дозе. Введение подхо
- 48 032003 дящей композиции может быть осуществлено различными способами, например, путем внутривенного, внутрибрюшинного, подкожного, внутримышечного, местного или внутрикожного введения. Аэрозольные препараты, такие как носовые распылительные композиции, включают очищенные водные или другие растворы активного агента с консервирующими агентами и изотоническими агентами. Такие композиции доводят рН до изотонического состояния, совместимого со слизистыми оболочек носа. Композиции для ректального или вагинального введения могут быть представлены в виде суппозиториев с приемлемыми носителями. Более конкретно, фармацевтические составы, подходящие для применения в виде инъекций, включают стерильные водные растворы (растворимые в воде) или дисперсии и стерильные порошки для приготовленные для немедленного приёма стерильных инъекционных растворов или дисперсий. В таких случаях состав должен быть стерильным и должен быть жидким до такой степени, что легко вводиться с помощью шприца. Он должен быть стабильным в условиях изготовления и хранения, предпочтительно быть защищенным от загрязняющего действия микроорганизмов, таких как бактерии и грибки. Носитель может быть растворителем или дисперсионной средой, содержащим, например, воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль, и жидкий полиэтиленгликоль и т.п.), и подходящие их смеси. Надлежащую текучесть можно поддерживать, например, путем использования покрытия, такого как лецитин, путем поддержания требуемого размера частиц в случае дисперсии и использованием поверхностно-активных веществ.
Кроме того, в то время как данное изобретение включает настоящие стандартные (хотя, к счастью, редкие) процедуры просверливания небольшого отверстия в черепе для введения препарата из изобретения, в одном аспекте, связывающей молекулы, особенно антитела или антитело на основе препарата данного изобретения может пересечь гематоэнцефалический барьер, что позволяет применять его для внутривенного или перорального введения. Режим дозирования будет определяться лечащим врачом и клиническими факторами. Как известно, в области медицины, дозы для любого пациента зависят от многих факторов, включая размер пациента, площадь поверхности тела, возраст, конкретное соединения, подлежащее введению, пол, время и путь введения, общее состояние здоровья, и другие лекарства, вводимые одновременно. Типичная доза может быть, например, в диапазоне от 0,001 до 1000 мкг (или нуклеиновой кислоты для экспрессии или ингибирования экспрессии в этом диапазоне); однако предусмотрены дозы ниже или выше этого примерного диапазона, особенно учитывая вышеуказанные факторы. Как правило, доза может быть в диапазоне, например, от примерно 0,0001 до 100 мг/кг и более, обычно от 0,01 до 5 мг/кг (например, 0,02, 0,25, 0,5, 0,75, 1, 2 мг/кг и т.д.), веса тела хозяина. Например, дозировки могут быть 1 мг/кг массы тела или 10 мг/кг массы тела или в пределах диапазона из 1-10 мг/кг, или по меньшей мере 1 мг/кг. Дозы промежуточного продукта в вышеуказанных диапазонах также предназначены для того, чтобы быть в пределах изобретения. Субъекту могут быть введены такие дозы ежедневно, по некоторым дням, еженедельно или согласно любому другому графику, определенному эмпирическим анализом. Примерное лечение включает введение в нескольких дозировках в течение длительного периода времени, например, не менее шести месяцев. Примерное лечения влечет за собой введение один раз в каждые две недели или раз в месяц или раз в 3-6 месяцев. Примеры расписания доз включают 1-10 мг/кг или 15 мг/кг по последовательным дням, 30 мг/кг по некоторым дням или 60 мг/кг в неделю. В некоторых методах, два или более моноклональных антитела с различной специфичностью связывания вводят одновременно, в этом случае доза каждого вводимого антитела находится в пределах указанного диапазона. Прогресс можно контролировать с помощью периодической оценки. Препараты для парентерального введения включают стерильные водные или неводные растворы, суспензии и эмульсии. Примерами неводных растворителей являются пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительные масла, такие как оливковое масло, и инъецируемые органические сложные эфиры, такие как этилолеат. Водные носители включают воду, спиртовые/водные растворы, эмульсии или суспензии, включая солевые и буферные среды. Парентеральные носители включают раствор хлорида натрия, декстрозу Рингера, декстрозу и хлорид натрия, раствор Рингера с лактатом или жирные масла. Внутривенные носители включают жидкость и питательные наполнители, электролитные наполнители (например, на основе декстрозы Рингера), и т.п. Консерванты и другие добавки могут также присутствовать, например, антимикробные, антиоксиданты, хелатирующие агенты, и инертные газы и т.п. Кроме того, фармацевтический состав данного изобретения может содержать дополнительные агенты, такие как допамин или психофармакологические препараты, в зависимости от предполагаемого использования фармацевтической композиции.
Кроме того, в частном варианте реализации данного изобретения, фармацевтический состав может быть приготовлен в виде вакцины, например, если фармацевтический состав данного изобретения включает анти-ТОР-43 антитело или связывающий фрагмент, производное или его вариант для пассивной иммунизации. Ожидаемо, что человеческое анти-ТПР-43 антитело и эквивалентная TDP-43-связывающая молекула данного изобретения особенно полезны в качестве вакцины для профилактики или облегчения TDP-43 протеинопатии, такой, как болезнь аргирофильных волокон, болезнь Альцгеймера, боковой амиотрофический склероз (БАС), комплекса деменция-БАС-паркинсонизм Гуам, кортикобазальная дегенерация, деменция с тельцами Леви, болезнь Хантингтона, болезнь телец Леви, болезнь двигательных нейронов, лобно-височная дегенерация (ЛВД), лобно-височная деменция, лобно-височная дегенерация с убиквитин-положительными включениями, склероз гиппокампа, миопатия тельцами включений, миозит
- 49 032003 тельцами включений, болезнь Паркинсона, деменция болезни Паркинсона, комплекс деменции и болезни Паркинсона с полуострова Кии и болезнью Пика, болезнь Мачадо-Джозефа и т.п. В одном варианте реализации можно выгодно использовать рекомбинантные Fab (rFab) и отдельные фрагменты цепи (scFvs) антитела согласно изобретению, которые могут более легко проникать в клеточную мембрану. Например, Robert et al., Protein Eng. Des. Sel. (2008) Oct 16; S1741-0134, опубликованные в сети выше, описывают использование химерных рекомбинантных Fab (rFab) и отдельных фрагментов цепи (scFvs) моноклонального антитела WO-2, которые распознаются эпитопом в N-концевой области А. Инженерные фрагменты смогли (i) предотвратить амилоидную фибрилизацию, (ii) предварительную дезагрегацию A [’>1-42 фибрилл и (iii) ингибировать A [’>1-42 олигомеропосредованную нейротоксичность in vitro так же эффективно, как целая молекула IgG. Предполагаемые преимущества использования небольших Fab и ScFv сконструированных форматов антител, которым не хватает эффекторной функции, включающих более эффективное прохождение через гематоэнцефалический барьер и минимизирующих риск запуска воспалительных побочных реакций. Кроме того, что ScFv и однодоменные антитела сохраняют специфичность связывания, полномерных антител, они могут быть экспрессированы как одиночные гены и внутриклеточно в клетках млекопитающих, как интратела, с потенциалом для изменения складывания, взаимодействия, модификации, или внутриклеточной локализации своих целей; см. для обзора, например, Miller and Messer, Molecular Therapy 12 (2005), 394-401. В другом подходе Muller et al., Expert Opin. Biol. Ther. (2005), 237-241, описывают технологическую платформу, так называемый Технология СуперАнтитела, которая, как говорят, дает возможность антителам, которые будут курсировать в живые клетки, не вредить им. Такие клеткопроникающие антитела открывают новые диагностические и терапевтические окна. Термин ТрансМабс был придуман для этих антитела.
В еще одном варианте реализации совместное введение или последовательное введение других нейропротекторов полезных для лечения TDP-43 протеинопатии может быть желательным. В одном варианте реализации дополнительный агент включен в состав фармацевтической композиции изобретения. Примеры нейропротекторов, которые могут быть использованы для лечения субъекта, включают, ингибиторы ацетилхолинэстеразы, антагониста рецептора глутамата, ингибиторы киназы, ингибиторы HDAC, антивоспалительные агенты, дивалпроекс натрия или любую их комбинацию, но не ограничиваются ими. Примеры других нейропротекторов, которые можно использовать одновременно с фармацевтической композицией данного изобретения, описаны в данной области; см., например, международную заявку № WO 2007011907. В одном варианте реализации дополнительный агент является допамин или антагонист рецептора допамина.
Терапевтически эффективная доза или количество относится к количеству активного ингредиента, достаточному для улучшения симптомов или состояния. Терапевтическая эффективность и токсичность таких соединений может быть определена стандартными фармацевтическими процедурами в культурах клеток или экспериментальных животных, например, ED50 (терапевтически эффективной дозы в 50% популяции) и LD50 (дозы, летальной для 50% популяции). Соотношение дозы между терапевтическим и токсическим эффектами является терапевтическим индексом, и он может быть выражен в виде отношения LD50/ED50. В одном варианте реализации терапевтический агент в составе присутствует в количестве, достаточном для восстановления или сохранения нормального поведения и/или когнитивных свойств в случае БАС и/или ЛВД или другой TDP-43 протеинопатии.
Из вышеизложенного очевидно, что данное изобретение охватывает любое использование TDP-43 связывающей молекулы, содержащей по меньшей мере один CDR из описанного выше антитела, в частности для диагностики и/или лечения TDP-43 протеинопатии, как упоминалось выше, в частности бокового амиотрофического склероза и/или лобно-височной дегенерации. В одном варианте реализации упомянутая связывающая молекула является антителом данного изобретения или цепью его иммуноглобулина. Кроме того, изобретение относится к анти-антиидиотипическим антителам любого указанного антитела описанного в настоящем документе ранее. Анти-антиидиотипические антитела являются антителами или другими связывающими молекулами, которые связываются с уникальной антигенной пептидной последовательностью, расположенной на вариабельном участке антитела возле антигенсвязывающего сайта полезны, например, для обнаружения анти-TDP-43 антитела в образце субъекта.
В другом варианте реализации настоящее изобретение относится к диагностической композиции, содержащей любую одну из вышеописанных TDP-43-связывающих молекул, антител, антигенсвязывающих фрагментов, полинуклеотидов, векторов или клеток данного изобретения и необязательно подходящие средства для обнаружения, такие как реагенты, обычно используется в диагностических методах, основанных на иммуно- или нуклеиновой кислоте. Антитела данного изобретения, например, подходят для использования в иммунологических анализах, в которых они могут быть использованы в жидкой фазе или связанными с твердофазным носителем. Примеры иммунотестов, в которых могут использоваться антитела данного изобретения являются конкурентными и неконкурентными иммунотестами в прямой или косвенной форме. Примерами таких иммунотестов являются радиоиммуноанализ (RIA), сэндвич (иммунометрический анализ), проточная цитометрия и Вестерн-блоттинг анализ. Антигены и антитела данного изобретения могут быть связаны со множеством различных носителей, используемых для выделения клеток, специфического связывания с ними. Примеры известных носителей включают стекло,
- 50 032003 полистирол, поливинилхлорид, полипропилен, полиэтилен, поликарбонат, декстран, нейлон, амилозу, природные и модифицированные целлюлозы, полиакриламиды, агарозы и магнетит. По характеру носитель может быть растворимым или нерастворимым для целей изобретения. Есть много различных меток и методик маркировки известных специалисту в данной области. Примеры типов этикеток, которые можно использовать в изобретении, включают ферменты, радиоизотопы, коллоидные металлы, флуоресцентные соединения, хемилюминесцентные соединения и биолюминесцентного соединения; см. также варианты реализации, обсуждаемые в настоящем документе выше. В еще одном варианте реализации TDP-43-связывающие молекулы, в частности антитела, данного изобретения также могут быть использованы в способе диагностики расстройства у индивидуума путем получения пробы жидкости организма от тестируемого индивидуума, которая может быть образцом крови, образцом лимфы или любой другой пробой жидкости организма и контактированием образца жидкости организма с антителом из настоящего изобретения в условиях, позволяющих образовать комплекс антитело-антиген. Уровень таких комплексов затем определяют способами, известными в данной области, на значительно более высоком уровне, чем образуется в контрольном образце, указывающем на заболевание у тестируемого индивидуума. Таким же образом, специфическое связывание антигена антителом данного изобретения также может быть использовано. Таким образом, настоящее изобретение относится к иммуноанализу in vitro, содержащему связывающую молекулу, например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент изобретения. В данном контексте, настоящее изобретение также относится к средствам, специально предназначенным для этой цели. Например, может быть использован массив на основе антитела, который, например, загружен антителом или эквивалентной антигенсвязывающей молекулой данного изобретения, которые специфически распознают TDP-43. Дизайн иммунологических микрочипов резюмируется в Kusnezow et al., Mol. Cell Proteomics 5 (2006), 1681-1696. Соответственно, настоящее изобретение также относится к микрочипам, нагруженным TDP-43-связывающими молекулами, идентифицированными в соответствии с изобретением.
В одном варианте реализации изобретение относится к способу диагностики TDP-43 протеинопатии у субъекта, включающему:
(a) оценку уровня TDP-43 в образце субъекта, подлежащего диагностике антителом изобретения, его TDP-43-связывающим фрагментом или TDP-43-связывающей молекулой, имеющими, по существу, те же обязательные особенности какой-либо одного из них; и (b) сравнение уровня TDP-43 с эталонным стандартом, который указывает на уровень TDP-43 в одном или более контрольных субъектах, Отличающимся тем, что разница или сходство между уровнем TDP-43 и эталонным стандартом указывает, что субъект страдает от TDP-43 протеинопатии.
У субъекта может быть диагностировано бессимптомное или доклиническое заболевание. В одном варианте реализации контрольный субъект имеет TDP-43 протеинопатию, например БАС или ЛВД, отличающуюся тем, что сходство между уровнем TDP-43 и эталонным стандартом указывает, что субъекту будет поставлен диагноз TDP-43 протеинопатия. Альтернативно, или дополнено в качестве второго контрольного субъекта выступает не имеющий TDP-43 протеинопатию, отличающуюся тем, что разница между уровнем TDP-43 и эталонным стандартом указывает, что субъекту будет поставлен диагноз TDP43 протеинопатия. Я, субъект, которому будет поставлен диагноз и контрольный субъект(ы) выбираются соответствующего возраста. Образцом для анализа может быть любая жидкость организма, предположительно содержащая TDP-43, например, крови, CSF или образца мочи.
Уровень TDP-43 может быть оценен любым подходящим способом, известным в данной области, содержащим, например, анализ TDP-43 одним или несколькими методами, выбранными из Вестернблоттинга, иммунопреципитации, иммуноферментного анализа (ELISA), радиоиммуноанализа (RIA), флуоресцентной активированной сортировки клеток (FACS), двумерного гель-электрофореза, массспектроскопии (MS), время-пролётная ионизация лазерной десорбцией с использованием матрицы (MALDI-TOF), поверхностно-повышенной ионизация лазерной десорбцией с использованием матрицы (SELDI-TOF), высокоэффективная жидкостная хроматография (FIPLC), жидкостной экспрессхроматографии белков (FPLC), многомерной жидкостной хроматографии (LC) с последующей тандемная масс-спектрометрией (MS/MS) и лазерной денситометрии. В одном варианте реализации упомянутое in vivo изображение TDP-43 содержит позитронно-эмиссионную томографию (PET), одно-эмиссионную фотонную томографию (SPECT), оптическое изображение в ближней инфракрасной области (NIR) или магнитно-резонансную томографию (MRI).
Методы диагностики нейродегенеративных заболеваний, таких как AD, болезнь Паркинсона, БАС, болезнь Хантингтона, деменция с тельцами Леви или ЛВД для мониторинга прогрессирования TDP-43 протеинопатии, и мониторинга лечения TDP-43 протеинопатии с использованием антител и связанных с ними средств, которые могут быть адаптированы в соответствии с изобретением, также описаны в публикации международной заявки WO 2010111587 и WO 2007011907, что включен в настоящий документ в качестве ссылки во всей полноте. Эти методы могут быть применены, как описано, но с TDP-43 специфическим антителом, связывающим фрагментом, производным или вариантом изобретения.
Эти и другие варианты реализации раскрываются и охватываются примерами описания изобретения. Дополнительная литература о любых материалах, методах, использованных соединениях, которые
- 51 032003 будут использованы в соответствии с изобретением, могут быть получены из общественных библиотек и баз данных, с использованием, например электронных устройств. Например, могут быть использованы общественные базы данных Medline, которые приняты Национальным центром биотехнологической информации и/или Национальная библиотека медицины при Национальном институте здравоохранения. Дальнейшие базы данных и веб-адреса, такие как Европейского института биоинформатики (EBI), который является частью Европейской лаборатории молекулярной биологии (EMBL), как известно специалисту в данной области техники, также могут быть получены с помощью интернет поисковых систем. Обзор патентной информации в области биотехнологии и исследование соответствующих источников патентной информации полезно для ретроспективного поиска и для текущей осведомленности, приведены в Berks, TIBTECH 12 (1994), 352-364.
Приведенное выше описание в общих чертах описывает изобретение. Если не указано иное, термин, используемый в настоящем документе, дает определение, как это предусмотрено Оксфордским словарем биохимии и молекулярной биологии, издательство Оксфордского университета, 1997 г., пересмотренное в 2000 и переизданное в 2003, ISBN 0198506732. Несколько документов приводятся в течение текст из этой спецификации. Полные библиографические цитаты можно найти в конце описания непосредственно перед формулой изобретения. Содержимое всех цитируемых ссылок (включая литературные ссылки, выданные патенты, опубликованные патентные заявки, цитируемые во всех производственных спецификациях и приложениях, инструкций и т.д.) включены в настоящем документе в качестве ссылки во всей их полноте; однако нет признания того, что любой документ, приведенный в предшествующем уровне техники в отношении настоящего изобретения.
Более полное понимание может быть получено по ссылке на следующие конкретные примеры, которые приведены в настоящем документе только для иллюстрации и не предназначены для ограничения объема изобретения.
Примеры
Материалы и методы.
Подробное описание традиционных методов, используемых в настоящем документе, можно найти в цитируемой литературе. Если не указано иное ниже, идентификация TDP-43-специфических В-клеток и молекулярного клонирования TDP-43 антитела отображают интересующую специфичность, а также их рекомбинантная экспрессия и функциональные характеристики были или могут быть выполнены, как описано в примерах и Дополнительных методах раздела международной заявки РСТ/ЕР2008000053 опубликованной как WO 2008081008, каждый из которых включен в настоящий документ в качестве ссылки в полном объеме.
Скрининг человеческого TDP-43 антитела.
ELISA.
Микропланшет с 96 лунками половинного объёма (Corning) покрывали либо:
(a) рекомбинантным полномерным His-поражающим человеческим TDP-43 (Biogen Idec, США); либо (b) синтетическим пептидом, состоящим из остатков 390-414 С-концевого домена TDP-43 с фосфорилированой модификацией в остатках 409 и 410 (Shafer-N, DK) в концентрации 5 мкг/мл и 3,3 мкг/мл, соответственно, в карбонатном покрывающем буфере ELISA (рН 9,6) в течение ночи при 4°С.
Планшеты промывали в PBS-Твин (рН 7,6) и неспецифические сайты связывания блокировали в течение 1 ч при комнатной температуре с PBS-T, содержащем 2% BSA (Sigma, Buchs, Швейцария). Кондиционированная В-клетками среда была перенесена из культуральных планшет В-клеток памяти в ELISA планшеты и инкубировалась в течение 1 ч при комнатной температуре. ELISA планшеты отмывали PBST и затем инкубировали с пероксидазой хрена (HRP), конъюгирующей с античеловеческими иммуноглобулиновыми поликлональными антителами (Jackson ImmunoResearch, USA). После отмывания PBS-T, связывание человеческого антитела определяли с помощью измерения HRP активности стандартным колориметрическим анализом.
MSD.
Стандартный планшет на 96 лунок, 10 лунок, многолуночный (Meso Scale Discovery, USA) покрывали смесью TDP-43 фрагментов белка, соответствующего аминокислотам 1-259, с 260 до 277 и 350-366 (Abcam plc, UK) соответственно. 10 мкг/мл каждого пептида использовали и формировали в PBS. Неспецифические сайты связывания блокировали в течение 1 ч при комнатной температуре с PBS-Т, содержащем 3% BSA с последующей инкубацией в кондиционированной В-клетками среде в течение 1 ч при комнатной температуре. Планшеты отмывали PBS-T и затем инкубировали с SULFO-Tag конъюгированным античеловеческим поликлональным антителом (Mesoscale Discovery, USA). После промывки PBS-T, связанное антитело детектировали с использованием измерения электрохемилюминесценции SECTOR Imager 6000 (Meso Scale Discovery, USA.
Молекулярное клонирование человеческого TDP-43 антитела.
Образцы, содержащие В-клетки памяти, были получены от здоровых субъектов. Живые В-клетки из отобранных культур В-клеток памяти собирали, выделяли мРНК и получали кДНК путем обратной транскрипции (Clontech, США). Последовательности тяжелых и легких цепей иммуноглобулина затем были
- 52 032003 получены с использованием гнездовой PCR.
Сочетание праймеров, представляющих все семейство последовательностей зародышевого набора человеческого иммуноглобулина, которые используются для амплификации лидерных пептидов, Vсегментов и J-сегментов. Первый раунд амплификации осуществляется с помощью лидирующего пептид-специфического праймера на 5'-концевом и константном участок-специфический праймер на 3'конце (Smith et al., Nat Protoc. 4 (2009), 372-384). Для тяжелых цепей и каппа легких цепей, второй раунд амплификации выполняется с помощью V-сегмент-специфического праймера на 5'-конце и J-сегментспецифического праймера на 3'-конце. Для лямбда легких цепей, второй раунд амплификации проводили с использованием V-сегмент-специфического праймера на 5'-конце и С-участок-специфического праймера на 3'-конце (Marks et al., Mol. Biol. 222 (1991), 581-597; de Haard et al., J. Biol. Chem. 26 (1999), 1821818230).
Определение клона антитела с желаемой специфичностью осуществляется повторным скринингом на ELISA через рекомбинантную экспрессию полного антитела. Рекомбинантная экспрессия полного человеческого IgG1 антитела или химерного антитела IgG2a достигается при введении вариабельных последовательностей тяжелых и легких цепей в правильную рамку считывания в векторы экспрессии, которые комплементарны вариабельной последовательности участка с кодирующим лидерным пептидом на 5'-конце и последовательности, кодирующей соответствующий домен(ы) константного участка на 3'конце. С этой целью праймеры, содержащие сайты рестрикции, предназначенные для облегчения клонирования вариабельных последовательностей тяжелой и легкой цепи в антителе векторов экспрессии. Тяжелые цепи иммуноглобулинов выражены посредством вставки в тяжелую цепь иммуноглобулина RTPCR продукта в рамку тяжелой цепи вектора экспрессии, несущего сигнальный пептид, и в константный домен человеческого иммуноглобулина гамма 1 или мышиного иммуноглобулина гамма 2а. Легкая цепь каппа иммуноглобулина выражена посредством вставки RT-PCR-продукта каппа легкой цепи в рамку вектора экспрессии легкой цепи, обеспечивающего сигнальный пептид и в константный домена человеческой легкой цепи каппа иммуноглобулина. Легкая цепь лямбда иммуноглобулина выражена посредством вставки RT-PCR-продукта каппа легкой цепи в рамку вектора экспрессии легкой цепи лямбда обеспечивая сигнальный пептид и в константный домен лямбда легкой цепи иммуноглобулина человека или мыши. Функциональные рекомбинантные моноклональные антитела получают при котрансфекции HEK 293 или CHO (или любой другой подходящей линии клеток-реципиентов человеческого или мышиного происхождения) вектора экспрессии Ig-тяжелой-цепи и каппа или лямбда вектора экспрессии Ig-легкойцепи. Рекомбинантное человеческое моноклональное антитело затем очищали от кондиционированной среды с использованием стандартной очистки на колонке белка А. Рекомбинантные моноклональные антитела человека могут быть произведены в неограниченном количестве с использованием трансцентных или стабильно трансфицированных клеток. Клеточные линии, продуцирующие рекомбинантные человеческие моноклональные антитела, могут быть установлены непосредственно с помощью векторов Ig-экспрессии или путем повторного клонирования Ig-вариабельного участка различных векторов экспрессии. Производные, такие как F(ab), F(ab)2 и ScFv также могут быть получены из этих Igвариабельных участков.
Очистка и характеристика His-меченого TDP-43.
Вектор экспрессии для 6xHis-меченого TDP-43 (pCGB026) был создан путем клонирования TDP-43 последовательности в pRSET вектор экспрессии (Invitrogen). BL21 звездообразная структура (DE3) pLysS клеток E.coli (Invitrogen) трансформировали pCGB026. После роста при 37°С до приблизительно 1 OD в 1 л встряхиваемой колбы, содержащей LB бульон, был добавлен IPTG до 0,5 мМ и клетки выращивали в течение ночи при 18°С. Клетки осаждали низкоскоростным центрифугированием, супернатант декантировали и клеточные осадки были заморожены для хранения при -20°С.
Клеточные осадки были доведены до комнатной температуры и снова суспендированны в 50 мл 50 мМ Трис- HCl, рН 7,5, 20 мМ имидазола, 150 мМ NaCl, содержащего ингибиторы протеазы (PI) (конечная концентрация PI: 1 мМ PMSF, 5 мкМ пепстатина, 1 мМ бензамида, 10 мкМ бестатина, 10 мкМ Е64, 20 мкМ лейпептина, 1,5 мкМ апротинина). После гомогенизации в течение 5 мин, чтобы разбить большие частицы, клетки разрушают под высоким давлением с использованием Микрофлюидизатор (Microfluidics, Inc.). Клеточный лизат центрифугировали в течение 30 мин при 10000 об/мин при 4°С. Осадок, содержащий нерастворимый His-меченый TDP-43, ресуспендировали в 5 мл раствора В-PER (Thermo Scientific), содержащем 2 мМ MgCl2, полные свободные от EDTA PI таблетки (Roche), 100 мк/гмл лизоцима, 5 ед./мл ДНКазы (Thermo Scientific) и инкубировали в течение 15 мин при комнатной температуре. Раствор дополнительной B-PER/2 мМ MgCl2/PI таблетки добавляли до конечного объема 50 мл и смесь центрифугировали в течение 10 мин при 10000 об/мин. Выделенный осадок дважды промывали в 20 мл 50 мМ трис-HCl, рН 7,5, 20 мМ имидазоле, 150 мМ NaCl, PI буфере с последующим центрифугированием в течение 10 мин при 10000 об/мин. Выделенный осадок затем ресуспендировали в 8 М мочевине, 20 мМ фосфате натрия, рН 7,8, содержащего PI, перемешивали в течение 5 мин путем гомогенизации и центрифугировали при 10000 об/мин в течение 10 мин.
Супернатант выделяли, фильтровали через фильтр 0,45 мкм, в сочетании с 4 мл Ni-NTA смолы (Invitrogen), насыщенной 8 М мочевины, 20 мМ натрий фосфата, рН 7,8, 0,5 М NaCl, с PI, и инкубировали с
- 53 032003 перемешиванием в течение ночи при 4°С. Элюат собирали и смолу промывали 10 объемами колонки 8 М мочевины, 20 мМ фосфата натрия, рН 5,3, 0,5 М NaCl. His-меченый TDP-43 элюировали в 0,5 объеме колонки фракции с 8 М мочевины, 20 мМ фосфата натрия, рН 4, 0,5 М хлорида натрия. Пиковые фракции объединяли, и концентрацию белка определяли с помощью УФ-спектрометрии. Общий очищенный выход составлял ~ 8 мг/л культуры.
SDS-PAGE анализ очищенного белка содержал основную полосу около 47 кДа (данные не приводятся), в соответствии с предполагаемой молекулярной массой 46,5 кДа. Интактная масс-спектрометрия очищенного белка показала основной пик при 46538 Да, в соответствии с предсказанной массой 46529,9 Да. Способность известных коммерчески доступных антител против TDP-43 связывать очищенный белок определяли с помощью ELISA. Мышиные моноклональные антитела 2E2-D3, распознающие аминокислоты 205-222 (Zhang, H.-X. et al., 2008, Neuroscience Lett., 434, 170-74), и кроличьи поликлональные антитела А260 и G400, распознающие последовательности вокруг аминокислоты Ala-260 и Gly-400, соответственно, все связывали очищенный His-меченный TDP-43 (данные не приводятся).
Рекомбинантная экспрессия человеческих TDP-43 доменов.
Последовательности, кодирующие человеческий домен TDP-43, амплифицировали с помощью PCR из полномерной последовательности кДНК (Q13148, TARDBP_HUMAN) и клонировали в вектор экспрессии pRSET-A (Invitrogen, США). Четыре вектора экспрессии (His-huTDP-43 домен I, His-huTDP-43 домен II, His-huTDP-43 домен III и His-huTDP-43 домен IV) являются кодирующими для четырех TDP-43 доменов: N-концевого домена (аминокислотные остатки 2-106 из SEQ ID NO: 94), РНК связывающий домен 1 (аминокислотные остатки 99-204 из SEQ ID NO: 94), РНК связывающий домен 2 (аминокислотные остатки 183-273 из SEQ ID NO: 94) и глицин-богатый домен (аминокислотные остатки 258-414 из SEQ ID NO: 94) соответственно. ДНК-конструкции, содержащие кДНК, кодирующие TDP-43 домены под контролем промотора Т7, были использованы для трансформации соответствующего штамма Escherichia coli, например, BL21 (DE3) (New England Biolabs, USA) и экспрессию 15 мл культуры клеток индуцировали добавлением 0,5 мМ изопропил З-В-тиогалактопиранозида (IPTG). Клетки собирают после 4 ч индукции при 37°С и затем ресуспендируют в 1 мл 100 мМ KCl, 50 мМ HEPES, 2 мМ EGTA, 1 мМ MgCl2, 1 мМ дитиотреитола, 0,1 мМ PMSF, 10% глицерина и 0,1 мг/мл лизоцима, рН 7,5, с последующим удаление при помощи ультразвука. Растворимые и нерастворимые фракции собирают после центрифугирования при 9000 об/мин при 4°С в течение 45 мин. Точно так же, был собран 9000G супернатант пробного штамма Escherichia coli. При необходимости (TDP-43 домена IV), нерастворимую фракцию растворяли в 1 мл 8 М мочевины, 20 мМ Трис, 200 мМ KCl и 1 мМ β-меркаптоэтанола. Растворимые и растворенные фракции наносили на Суперпроточную Колонку Ni-NTA (Qiagen, США) и His-TDP-43 домены были очищены в соответствии с протоколом производителя. Степень чистоты рекомбинантных белков оценивалась окрашиванием SDS-PAGE Кумаси. Концентрацию очищенных белков определяли измерением абсорбции при 280 нМ.
Направленный ELISA.
96-луночные микропланшеты (Corning) покрывали полномерным человеческим TDP-43, доменом I TDP-43 (аминокислотные остатки 2-106 из SEQ ID NO: 94), доменом II TDP-43 (аминокислотные остатки 99-204 из SEQ ID NO: 94), остатками домена III TDP-43 (аминокислота 183-273 из SEQ ID NO: 94), домена IV TDP-43 (аминокислотные остатки 258-414 из SEQ ID NO: 94) или синтетического пептида, охватывающего остатки с 390 до 414 С-концевого домена TDP-43 (см., SEQ ID NO: 94) с модификацией фосфорилирования в остатках 409/410 (Schafer-N, DK) разбавленных до концентрации 6,6 мкг/мл или 3,3 мкг/мл, соответственно, в карбонатном покрывающем буфере ELISA (рН 9,6) в течение ночи при 4°С. Неспецифическое связывание сайтов блокировали в течение 1 ч при комнатной температуре с PBST, содержащем 2% BSA (Sigma, Buchs, Switzerland). Антитела инкубировали 1 час при комнатной температуре. Связывание определяли с использованием ослиного античеловеческого IgGY-специфического антитела, конъюгированного с HRP (Jackson ImmunoResearch, США) или козьего антимышиного IgG (H+L)специфического вторичного антитела, конъюгированного с HRP (Jackson ImmunoResearch, США), с последующим измерением HRP активности в стандартном колориметрическом анализе.
Вестерн-блоттинг.
Рекомбинантный полномерный TDP-43, домен TDP-43 I (аминокислотные остатки 2-106 из SEQ ID NO: 94), домен II TDP-43 (аминокислотные остатки 99-204 из SEQ ID NO: 94), домен III TDP-43 (аминокислотные остатки 183-273 из SEQ ID NO: 94), TDP-43 домен IV (аминокислотные остатки 258-414 из SEQ ID NO: 94), 300 нг каждого, были перерастворенны в SDS-PAGE (NuPAGE 12% Bis-Tris Gel; Invitrogen, Basel, Switzerland) после электроблоттинга на нитроцеллюлозной мембране. Неспецифические сайты связывания блокировали в течение 1 ч при комнатной температуре с PBST, содержащем 2% BSA (Sigma, Buchs, Switzerland). Пятна инкубировали в течение ночи с первичными антителами (10 нМ), после конъюгации ослиных античеловеческих IgGY-специфических вторичных антител с HRP (Jackson ImmunoResearch, USA) или конъюгации козьих антимышиных IgG(H+L)-специфических вторичных антител с HRP (Jackson ImmunoResearch, USA). Пятна были разработаны с использованием ECL и детекцией ImageQuant 350 (GE Healthcare, Otelfingen, Switzerland).
- 54 032003
Две испытательные задачи с Y-лабиринтом.
Улучшение рабочей памяти у обработанных антителами TDP-43 модельных мышах с протеинопатией может быть проверена с использованием двух пробных задач с Y-лабиринтом (например, Pennanen, Genes Brain Behav. 5 (2006), 369-79, который включен в настоящем документе в качестве ссылки в полном объеме). Три ветви лабиринта составляют 22см в длину, 5 см в ширину и 15 см в глубину. Черные и белые абстрактные ключи размещаются на черном занавесе, окружающем лабиринт. Эксперименты проводятся с уровнем освещенности 6 люксов в течение темной фазы. Каждый эксперимент состоит из тренировки и наблюдательной сессии. Во время тренировки, мыши находятся в двух из трех коридорах (начальный коридор и второй коридор), которые они могут свободно исследоваться на протяжении 4 мин, не имея доступа к третьей группе (новый коридор). Затем мыши удаляются из лабиринта и хранятся в режиме ожидания в клетке в течение 1,5-5 мин, в то время как лабиринт тщательно очищается 70% этанолом, чтобы удалить любые обонятельные подсказки. Затем мышь помещают обратно в лабиринт для наблюдения со всеми тремя коридорами доступными в течение 4 мин. Последовательность пребывания, число пребываний в каждом коридоре и время, проведенное в каждое коридоре, записывается. Соотношение времени, потраченного в третьем коридоре и среднего времени, проведенного в двух других коридорах (начальный коридор и второй коридор) рассчитывается и сравнивается между различными группами лечения мышиных моделей таутопатии и соответствующими контрольными мышами дикого типа. Грызуны обычно предпочитают исследовать новый коридор лабиринта, а не возвращаться к тому, который ранее посетили. Эффекты антитела можно наблюдать в отношении восстановления этого предпочтения обработанными мышами модели TDP-43 протеинопатии по сравнению с недискриминационным поведением необработанных мышей из-за их расстройства, связанного с нарушениями работы памяти. Таким образом, отношение близкое к 1 указывает на нарушение рабочей памяти. Более высокий коэффициент указывает лучшую рабочую память. Нарушение работы памяти у мышей модели TDP-43 протеинопатии объясняют TDP-43 патологией, в результате избыточной экспрессии человеческого TDP-43. Поэтому, значительно более высокое соотношение наблюдается в обработанных анти-TDP-43 антителами мышах по сравнению с контрольными мышами и указывает, что анти-TDP-43 антитела имеют терапевтический эффект на TDP-43 патологии.
Опорный тест.
Мыши тестируются в темной фазе, когда они наиболее активны. Опора сделана из деревянной палки длиной 50 см и 1 см шириной, покрытой тканью, чтобы облегчить восхождение. Основание опоры помещают в клетку мышей. Мышей помещают на верхней части опоры полюса и время, чтобы сориентироваться вниз и временя, чтобы спуститься в клетку записывается в более 5 испытаниях с 30 мин интервалами. Лучшие ходовые испытания анализируются.
Приподнятый крестообразный лабиринт тест.
Испытания проводятся в тусклом свете (40 люкс). Приподнятый крестообразный лабиринт состоит из двух открытых и двух закрытых сооружений (длина коридора: 30 см, ширина: 5 см). Открытые коридоры имеют небольшой 1 см край и закрытые коридоры граничат с 15 см стеной. В начале этой задачи, мышей помещают в центре приподнятого крестообразного лабиринта мордой к открытому коридору. Мыши записываются на видео, исследуя лабиринт в течение 5 мин. Время, проведенное в открытом и закрытом коридорах, и пройденное расстояние измеряются и анализируются.
Пример 1. Анализ ELISA и Вестерн-блоттинг человеческого TDP-43-связывающее антитела.
Прямые ELISA.
96-луночные микропланшеты (Corning) покрывали полипептидами, содержащими TDP-43 аминокислотные остатки 2-106 из SEQ ID NO: 94 (доменом I TDP-43 ), остатки 99-204 из SEQ ID NO: 94 (домен II TDP-43), остатки 183-273 из SEQ ID NO: 94 (домен III TDP-43), остатки 258-414 из SEQ ID NO: 94 (TDP-43 домена IV), остатки 2-414 из SEQ ID NO: 94 (полноразмерный TDP-43) и синтетический полипептид, содержащий остатки 390-414 с модификацией фосфорилирования в остатках 409/410 из SEQ ID NO: 94. Полипептиды наносили на ELISA-планшеты в концентрации равной покрытию 6,6 мкг/мл (рекомбинантные TDP-43 и TDP-43 фрагменты) или 3,3 мкг/мл (синтетические пептиды). Связывание человеческих антител определяли по ELISA.
Антитела NI-205.51C1 (фиг. 2А) и NI-205.3F10 (фиг. 2С) специфически связаны с доменом III TDP43 (аминокислотные остатки 183-273 из SEQ ID NO: 94). Антитела М-205.8А2 (фиг. 2D), NI-205.15F12 (фиг. 2Е), NI-205.25F3 (фиг. 2G) NI-205.21G1 (фиг. 21) специфически связаны с доменом IV TDP-43 (аминокислотные остатки 258-414 из SEQ ID NO: 94). Антитело NI-205.87E7 (фиг. 2Н) специфически связано с доменом I TDP-43 (аминокислотные остатки 2-106 из SEQ ID NO: 94). Антитела NI-205.21G2 (фиг. 2В) и N[-205.1136’4 (фиг. 2F) специфически связаны с доменом II TDP- 43 (остатки 99-204 аминокислот из SEQ ID NO: 94). Все человеческие полученные TDP-43 специфические антитела, специфически узнавали полноразмерный TDP-43. Для контроля эффективности были использованы покрытия различных TDP-43 доменов, коммерчески доступные антитела связывающие полномерные TDP-43 и специфические домены TDP-43: Ab50930 (Abcam, UK), TDP-43 домен I; TARDBP моноклональное антитело (М01), клон 2E2-D3 (Abnova, Taiwan), TDP-43 домен III, и Ab82695 (Abcam, US), TDP-43 домен IV. Контроль связывания антитела с полномерным TDP-43 и его специфическими TDP-43 доменами.
- 55 032003
Связывание с различными TDP-43 доменами по Вестерн-блоттингу.
Рекомбинантный полномерные TDP-43, домен I TDP-43 (аминокислотные остатки 2-106 из SEQ ID NO: 94), домен II TDP-43 (аминокислотные остатки 99-204 из SEQ ID NO: 94), домен III TDP-43 (аминокислотные остатки 183-273 из SEQ ID NO: 94), и TDP-43 домен IV (аминокислотные остатки 258-414 из SEQ ID NO: 94) были предоставлены SDS-PAGE. Коммерчески доступный TDP-43 специфическое антитело TARDBP (M01), клон 2E2-D3 (Abnova, Taiwan) использовали в качестве положительного контроля для обнаружения человеческого TDP-43 в то время как античеловеческое IgG Fcy-специфическое антитело использовали в качестве отрицательного контроля. Связывание человеческого антитела со специфичными TDP-43 доменами определяли методом Вестерн-блоттинга.
Вестерн-блоттинг показал, что антитела: (а) NI-205.51O и NI-205.3F10 специфично связаны с доменом III TDP-43 (аминокислотные остатки 183-273 из SEQ ID NO: 94); (b) NI-205.8A2 и NI-205.21G1 специфично связаны с доменом IV TDP-43 (аминокислотные остатки 258-414 из SEQ ID NO: 94); (с) NI205.21G2 специфически узнавали домен II TDP-43 (аминокислотные остатки 99-204 из SEQ ID NO: 94); (d) NI-205.51C1, NI-205.3F10, NI-205.8A2, NI-205.21G1, NI-205.21G2, узнавали полномерные человеческие TDP-43 в дополнение к домену TDP- 43; и (е) человеческие антитела NI-205.25F3, NI-205.15F12 и NI-205.87E7 узнавали полномерные TDP-43 но, казалось, не связывали конкретный TDP-43 домен (данные не приводятся). Кроме того, антитела NI-205.68G5 и NI-205.20X1, которые преимущественно или исключительно связывали фосфо-TDP-43 С-концевой пептид (см. пример 2), казалось, не распознавали рекомбинантный полномерный TDP-43 или любой из его фрагментов (данные не приводятся).
Пример 2. Определение EC50 для человеческого TDP-43 связывающего антитела.
Определение концентрации полумаксимального эффекта (EC50).
Для определения полумаксимальной эффективной концентрации (ЕС50) TDP-43-специфического антитела человеческого происхождения для человеческого TDP-43 и для оценки целевой специфичности, 96-луночные микропланшеты (Corning) были покрыты рекомбинантным полномерным TDP-43 (Biogen Idec, USA), экстрактом Escherichia coli и BSA (Sigma, Buchs, Switzerland), разведенными до концентрации 5 мкг/мл в карбонатном покрывающем буфере ELISA (рН 9,6 ) в течение ночи при 4°С. Альтернативно, микропланшет с половинным объёмом лунок (Corning) покрывали синтетическим пептидом, охватывающим остатки с 390 по 414 С-концевого домена TDP-43 с модификацией фосфорилирования в остатках 409/410 (Schafer-N, DK) и BSA (Sigma, Buchs, Switzerland), разводенными до концентрации 3,3 мкг/мл в карбонатном покрывающем буфере ELISA (рН 9,6) в течение ночи при 4°С. Неспецифические сайты связывания блокировали в течение 1 ч при комнатной температуре с PBS, содержащим 2% BSA (Sigma, Buchs, Switzerland). Человеческие TDP-43-специфические антитела разводили в указанных концентрациях и инкубировали 1 час при комнатной температуре. Связывание определяли с использованием ослиных античеловеческих IgGY-специфичных вторичных антител коньюгированых с HRP (Jackson ImmunoResearch, USA), после измерения HRP активности стандартным колориметрическим анализом. Значения EC50 оценивались с помощью нелинейной регрессии с использованием программного обеспечения GraphPad Prism (San Diego, USA).
Как указано в табл. 4, антитела NI-205.51O и NI-205.21G2 связываются с человеческим TDP-43 с высоким сродством субнаномолярных EC50 180 пкМ и 240 пкМ соответственно. Отсутствие связывания наблюдалось для фосфо-TDP^ С-концевого пептида этих антитела. Антитела NI-205.3F10, М-205.8А2, NI-205.15F12, НТ-205.113С4, NI-205.25F3, и М-205.87Е7 связывали человеческий TDP-43, но не фосфоTDP-43 С-концевой пептид. Значения EC50 этих антител для человеческого TDP-43 белка колебались в диапазоне от 1 до 18 нМ. Связывание NI-205.21G1 с полномерным TDP-43 при 4.1нМ EC50 и распознавание фосфорно-TDP-43 С-концевого пептида с более низкой аффинностью при 49,5 нМ EC50. Антитела NI-205.68G5 и М-205.20А1 показали преимущественное или исключительное связывание с фосфорноTDP-43 С-концевым пептидом при 16,9 и 15,8 нМ ЕС50, соответственно, предположили, что фосфорилирование серина в положении 409 и/или серина в положении 410 TDP-43 требуется для связывания NI205.68G5 и НТ-205.20А1.
- 56 032003
Таблица 4
Аффинность антитела к TDP-43 и фосфорилиронному TDP-43
Антитело полное TDP-43 ECjo (нМ)] Фосфо-ТОР-43 Пептид ЕС50 (нМ)
N1-205.51С1 0.18 не применяется
N1-205.21G2 0.24 не применяется
NI-205.3F10 1.4 -2.8 не применяется
N1-205 8А2 7.2 не применяется
N1-205 15F12 7.2 не применяется
N1-205.11ЗС4 13.2 не применяется
NI-205.25F3 13 3 не применяется
NI-205.87E7 17.2 не применяется
N1-205.21G1 4.1 49.5
N1-205.68G5 >100 16.9
N1-205.20А1 не применяется 15.8
Табл. 4: EC50 связывания человеческого TDP-43-связывающего антитела с рекомбинантным TDP-43 и фосфор-TDP^ пептидом.
Пример 3. Картирование эпитопа синтетическим пептидом (Пепспоттинг).
Сканы перекрывающихся пептидов были использованы для сопоставления эпитопов человеческого TDP-43 белка, которые распознаются TDP-43 специфическим антителом человеческого происхождения. Пепскановые мембраны (PepSpots, JPT Peptide Technologies, Berlin, Germany) с 101 линейным 15-мерным пептидом из 11 аминокислотных перекрывающихся последовательностей, которые в совокупности представляют всю последовательность человеческого TDP-43 (Q13148, TARDBP_HUMAN). Пептиды были помещены на нитроцеллюлозные мембраны, которые затем были активированы в течение 5 мин в метаноле и затем промыты при комнатной температуре в TBS в течение 10 мин. Неспецифические сайты связывания блокировали в течение 2 ч при комнатной температуре Roti®-Block (Carl Roth GmbH Co. KG, Karlsruhe, Germany). Специфические антитела TDP-43 человеческого происхождения (1 мкг/мл) инкубировали в течение 3 ч при комнатной температуре в Roti ®-Block. Связывание первичного антитела определяли с помощью HRP сопряженной ослиного античеловеческого IgGY-специфического вторичного антитела (Jackson ImmunoResearch, USA). Пятна были разработаны с использованием ECL и ImageQuant 350 детекции (GE Healthcare, Otelfingen, Switzerland).
В табл. 4 приведены выявленные связывающие эпитопы для различных TDP-43-специфических антител человеческого происхождения, идентифицированные с помощью Pep Spot.
Таблица 5 Выявленные связыв^щие эпитопы с человеческими TDP-43 последовательностями белков
Антитело Связывающий епитоп
N1-205.3F10 213-Q YGD VMDVFIP-223 (SEQ ID № 123)
N1-205.8А2 381-AAIGWGSASNA-391 (SEQ ID № 124)
N1-205.51С1 201-DMTEDELREFF-211 (SEQ ID № 125)
N1-205.87Е7 9-EDENDEP-15 (SEQ ID № 126)
N1-205.113С4 133-VQVKKDL-139 (SEQ ГО№ 127)
NI-205.21G2 121-KEYFSTF-127 (SEQ ID № 128)
Пример 4. Связывание человеческого рекомбинантного TDP-43 антитела с патологическими формами TDP-43 в человеческом спинном мозге и мозговой ткани.
Для валидации TDP-43 антителосвязывающей способности были получены срезы спинного мозга и головного мозга от человеческих пациентов с БАС или пациентов с ЛВД. Антитело связывающее патологический TDP-43 оценивали по иммуногистохимическому окрашиванию. Связывание человеческого рекомбинантного TDP-43 антитела характеризовали человеческие ЛВД-TDP-43 ткани пациента (10 случаев пациент, 7 контрольных случаев). Иммуногистохимию проводили на парафине толщиной 5 мкм, которая включала в себя использование EDTA-основаного эпитопа согласно найденному уровню техники, стандартными иммунопероксидазными процедурами с Elite ABC комплектами (Vector Laboratories) с DAB (Pierce). В следующем первичном антителе были использованы: мышиное моноклональное антитело 2E2-D3, полученное против человеческого TDP-43 (Abnova) в качестве положительного контроля; рекомбинантное человеческое TDP-43 антитело описано здесь/выше NI205.3F10, N1205.510, NI205.21G2, NI205.8A2, NI205.15F12, NI205.25F3, NI205.87E7, NI205.21G1, NI205.68G5, NI205.20A1.
- 57 032003
Срезы контрастировали гематоксилином для выявления клеточных ядер.
Антитела NI205.8A2, NI205.3F10, NI205.21G2, и NI205.21G1 преимущественно связываются с цитоплазматическими TDP-43 (то есть, патологическими формами TDP-43) чем с ядерной TDP-43. В противоположность этому, для коммерчески доступного контрольного антитела, 2Е2 (Abnova, Taiwan) наблюдалось связывание ядерного и цитоплазмотического TDP-43. Интересно, что связывание антитела NI205.21G1 продемонстрировало очень специфическое связывания, что, кажется, сопоставимо со связыванием, наблюдаемым для контрольного антитела, которое распознает фосфорилированный TDP-43 (фигуры 11E и Н).
Пример 5. In vivo валидация TDP-43 антитела.
Эксперименты для доклинической валидации TDP-43 антител производят на мышиных моделях TDP-43 протеинопатия. Человеческие TDP-43 антитела введят периферической инъекцией или внутрижелудочковой инфузией в мозг через осмотические мини-насосы. Эффекты лечения контролируются анализов крови и CSF, и анализом массы тела, общей клинической оценки и признаков двигательных или когнитивных нарушений, как видно по примеру, хотя поведенческие тесты, включая открытое поле, Yлабиринт, приподнятый крестообразный лабиринт, распознавание новых объектов, силу захвата, выносливость сцепления лап, полюсный тест, исследования луча ходьбы, метод оценки способности удерживаться на вращающемся барабане или иначе известных в данной области.
После завершения исследований лечения, изменения TDP-43 уровней в собранной крови и CSF измеряются и ткани мозга и спинного мозга оцениваются количественно иммуногистохимическими и биохимическими методами для содержания мозга и спинного мозга физиологических и патологических TDP-43 и общей невропатологии.
Доклинические модели полезны для валидации антител и других TDP-43 связывающих молекул данного изобретения, включая TDP-43-A315T модельную мышиную систему, как описано Wegorzewska et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (2009), 18809-14. A315T мыши являются трансгенной моделью TDP-43 протеинопатии, отличающейся тем, что фенотип мышей проявляет особенности обоих БАС и лобно-височной дегенерации с убиквитиновыми включениями (ЛВД-U).
Дальнейшие подходящие модели включают B6.Cg-Tg (SOD1*G93A) 1Gur/J модельные мышиные системы, как описано Gurney et al., Science 264 (1994), 1772-75. Эта линия мышей экспрессирует G93A мутантную форму человеческой супероксиддисмутазы 1 и развивает признаки болезни двигательных нейронов с последующим прогрессированием к смерти в течение от 6 до 8 месяцев. Эти мыши показывают характерное перераспределение TDP-43 в цитоплазме двигательных нейронов и возникновение TDP-43 иммунореактивных включений и поэтому являются подходящей моделью для изучения фармакологических интервенций, направленных на TDP-43; см., например, Shan et al., Neuropharmacol. Letters 458 (2009), 70-74.
Дальнейшие эксперименты для подтверждения TDP-43 антитела производятся в независимой модели заболевания двигательных нейронов, мышиной модели Воблера (B6.B-Vps54wr/J, можно получить в Лаборатории Джексона), как описано Duchen and Strich, J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry 31 (1968), 535-42. Эта линия мышей экспрессирует человеческие TDP-43 дикого типа и развивает дегенерацию корковых и спинальных двигательных нейронов и развитие спастической квадриплегии напоминающей БАС. Зависимо от дозы, дегенерация немоторных корковых и подкорковых нейронов, характерная ЛВД, наблюдается также в этой мышиной линии. Нейроны в пострадавших участках спинного мозга и мозга показывают накопление TDP-43 ядерных и цитоплазматических агрегатов, в обоих случаях убиквитинированных и фосфорилированых, как это наблюдается у больных БАС/ЛВД.
Дальнейшие эксперименты для валидации TDP-43 антитела производятся в независимой модель заболевания двигательных нейронов, мышиной модели Воблера (B6.B-Vps54wr/J, можно получить в Jackson Laboratories) как описано Duchen и Strich, J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry 31 (1968), 535-42. Эта мышиная модель, сообщалось, отображает обширные внутриклеточные убиквитиновые включения и ненормальное цитоплазматическое распределение TDP-43, чем напоминает спорадический БАС, см., например, Dennis и Citron, Neuroscience 185 (2009), 745-50.
Дальнейшие эксперименты для валидации TDP-43 антитела, производимые в последнее время, характеризуются TDP-43G348C трансгенными мышами с избыточной экспрессией человеческого генома TDP-43G348C под контролем эндогенного промотора. Swarup et al., Brain 134 (2011), 2610-2626. Дальнейшие эксперименты для валидации TDP-43 антитела выполняются в модельных системах, в том числе трансгенных клеточных линиях и трансгенных животных, экспрессирующих или сверхэкспрессирующих TDP-43, TDP-43 мутантах, таких как С-концевые усеченные TDP-43, TDP-43 мутации, замеченные в популяции пациентов, или мутанты, которые влияют на клеточную локализацию, например, ядерную локализацию TDP-43. TDP-43 модельные системы, например, клеточные линии и животные модели, для валидации TDP-43 антитела дополнительно включают системы с продемонстрированной TDP-43 повышающей или накапливающей в результате изменения экспрессии другого гена, например, мышиной модели Воблера с понижающей регуляцией програнулина. В одном варианте реализации эксперименты для валидации TDP-43 антитела проводят на мышах, экспрессирующих человеческий TDP-43 с неисправным сигналом ядерной локализации в переднем мозге (Igaz et al., J Clin Invest. 121(2):726-38 (2011)); транс
- 58 032003 генных мышах, которые избирательно экспрессируют С-концевой фрагмент 25 кДа TDP-43 в нейронах (Caccamo et al., Am J Pathol. 180(1):293-302 (2012)), трансгенных мышах, которые условно экспрессируют человеческий TDP-43 дикого типа (HTDP-43) в переднем мозге (Cannon et al., Acta Neuropathol. 123(6):807-23 (2012)), и трансгенных мышах с повсеместной экспрессией версий дикого типа и болезнетворных версий человеческого VCP/p97 (Custer et al., Hum Mol Genet. 19(9):1741-55 (2010)). В другом варианте реализации эксперименты по валидации TDP-43 антител выполняются на мышах, трансфицированных AAV вектором, кодирующим TDP-43 дикого типа, TDP- 43 с дефектом сигнала ядерной локализации, или усеченного С-концевого фрагмента TDP-43, включающего остатки 220-414 из SEQ ID NO: 94. Tatom et al., Mol. Ther. 17 (2009), 607-613. Изучение хронической эффективности: Для оценки фармакологического эффекта человеческого анти-TDP-43 антитела, раскрытого в настоящем документе, TDP43_G348C трансгенных мышей (Сварупа и др.., Brain 134 (2011), 2610-2626), еженедельно вводят 10 мг/кг внутрибрюшинно инъекции человеческого анти-TDP-43 антитела или транспортного средства контроля на период из 16-24 недель. После 12 недель лечения, образцы крови собирают из кровотечения хвостовой вены. В сыворотке крови анти-TDP-43 антитело определяют посредством ELISA. После 12 недель и 22 недель лечения, неврологическое и когнитивное/моторное поведение оценивается с помощью теста открытого поля, теста Y-лабиринт, теста приподнятого крестообразного лабиринта, теста распознавания новых объектов, силы захвата, выносливости сцепления лап, полюсного теста, исследования луча ходьбы, метода оценки способности удерживаться на вращающемся барабане. Результаты испытаний неврологического и когнитивного/моторного поведения поведение для антител обработанных и контрольных животных сравниваются. Улучшенная производительность антитело обработанными животными указывает на терапевтическую эффективность анти-TDP-43 антитела.
Изучение кратковременной эффективности: TDP-43G348C трансгенных мышей (Swarup et al., Brain 134 (2011), 2610-2626) обрабатывают 1-4 внутрибрюшинными инъекциями до 50мг/кг анти-TDP-43 антитела или контролем растворителем в течение одной недели. В конце периода лечения, образцы крови собирали кровотечением из хвостовой вены. В сыворотке крови анти-TDP-43 антитело определяются посредством ELISA. В конце 1-недельного периода лечения, неврологическое и когнитивное/двигательное поведение оценивают с помощью теста открытого поля, теста Y-лабиринт, теста приподнятого крестообразного лабиринта, теста распознавания новых объектов, силы захвата, выносливости сцепления лап, полюсного теста, исследования луча ходьбы, метода оценки способности удерживаться на вращающемся барабане. Результаты испытаний неврологического и когнитивного/моторного поведения поведение для антител обработанных и контрольных животных сравниваются. Улучшенная производительность антитело обработанными животными указывает на терапевтическую эффективность антиTDP-43 антитела.
Пример 6. Определение аффинности связывания (EC50) человеческого TDP-43 антитела прямым ELISA.
Половина максимально эффективной концентрации (EC50) Половина максимально эффективной концентрации (ЕС50) TDP-43-специфических антител человеческого происхождения для человеческого TDP-43 и их воздействие на специфическую мишень определялось в основном, как описано в пример 2 выше. Вкратце, 96-луночные микропланшеты (Corning) покрывали рекомбинантными полномерными TDP-43 (Biogen Idec, USA), экстрактом Escherichia coli и BSA (Sigma, Buchs, Switzerland), разведенными до концентрации 5 мкг/мл в карбонатном покрывающем буфере ELISA (рН 9,6) в течение ночи при 4°С. Альтернативно, микропланшет с половинным объёмом лунок (Corning) покрывали синтетическим пептидом, охватывающим остатки с 390 по 414 из С-концевого домена TDP-43 с модификацией фосфорилирования в остатках 409/410 (Schafer-N, DK) и BSA (Sigma, Buchs, Switzerland), разведенными до концентрации 3,3 мкг/мл в карбонатном покрывающем буфере ELISA (рН 9,6 ) в течение ночи при 4°С. Неспецифические сайты связывания блокировали в течение 1 ч при комнатной температуре с PBS, содержащим 2% BSA (Sigma, Buchs, Switzerland). Человеческие TDP-43-специфические антитела разводили в указанных концентрациях и инкубировали 1 час при комнатной температуре. Связывание определяли с использованием ослиных античеловеческих IgGy- специфичных вторичных антител коньюгированых с HRP (Jackson ImmunoResearch, USA), после измерения HRP активности стандартным колориметрическим анализом. Значения ЕС50 оценивались с помощью нелинейной регрессии с использованием программного обеспечения GraphPad Prism (San Diego, USA). Примерные кривые титрования, полученные с 41D1, 21G1, 31D2 и 8F8 антителами приведены на фигурах.
Как раскрыто в табл. 6, антитела NI-205.41D1 (фиг. 4А и Е), NI-205.51W и NI.205-21G2 связывают человеческий TDP-43 с высокой аффинностью в субнаномолярных EC50 60 пкМ, 180 пкМ и 240 пкМ соответственно. Связывания не было обнаружено для фосфо-TDP-43 С-терминального пептида. Антитела М-205.1А9, NI-205.3F10, NI-205.14W3, М-205.98Н6, NI-205.44B2, NI-205.9E12A, М-205.8А2, NI205.15F12, NI-205.10D3, NI-205.38H2, NI-205.29E11, NI-205.9E12D, NI-205.31W1, №-205.113С4, NI205.25.25F3, №-205.10Н7, NI-205.800, и М-205.87Е7 связывают человеческий TDP-43, но не фосфоTDP-43 С-терминальный пептид с наномолярной EC50. Для этих антител значение EC50 варьирует от 1 до 18 нМ (см. табл. 6). Антитело NI-205.21G1 (фиг. 4В и F) связывает полномерные TDP-43 при 4.1 нМ ЕС50 и распознает фосфо-TDP-43 С-теминальный пептид с низкой аффинностью при 49.5 нМ EC50. Антитела
- 59 032003
NI-205.31D2 (фиг. 4С и G), NI-205.14H5, NI-205.36D5, NI-205.19G5 и NI-205.68G5 показывают преимущественное связывание с фосфо-ТЪРМЗ С-терминальным пептидом со значением EC50, которое варьирует от 0.7 до 17 нМ (см. табл. 6). Для сравнения, антитела NI-205.8F8, NI-205.8F8 (фиг. 4D и Н) и NI205.20A1 связывают исключительно человеческий фосфо-TDP-43 С-терминальный пептид с высокой аффинностью к наномолярной EC50 из 5 нМ, 7 нМ и 16 нМ, соответственно (см. табл. 6) согласуется с идеей, что фосфорилирование серина 409 и/или серина 410 требуется для связывания.
Таблица 6
EC50 связывания TDP-43 антитела человеческого происхождения с рекомбинантным человеческим TDP43 и фосфо TDP-43 С-концевым пептидом
Антитело полные TDP-43 ЗС;о [нМ] фосфо-ТОР-43 пептид
N1-205.41D1 0.06 не связывает
N1-205.51С1 0.18 не связывает
NI-205.21G2 0.24 не связывает
N1-205.1А9 1.0 не связывает
N1-205.3F10 1.4 не связывает
N1-205.14W3 15 не связывает
N1-205.98Н6 2.6 не связывает
N1-205.44В2 2.8 не связывает
NI-205.9E12A 3.7 не связывает
N1-205.8А2 7.2 не связывает
N1-205.15F12 7.2 не связывает
N1-205.10D3 7.3 не связывает
N1-205.38Н2 8.2 не связывает
N1-205.29Е11 10.4 не связывает
N1-205.9Е12D 11.2 не связывает
N1-205,31С11 11 0 не связывает
N1-205.113С4 13.2 не связывает
N1-205.25F3 13.3 не связывает
N1-205.10Н7 15.3 не связывает
NI-205.8C10 15 6 не связывает
NI-205.87E7 17.2 не связывает
N1-205.21G1 4.1 49.5
N1-205.31D2 >41.0 069
N1-205.14Н5 > 100 0.90
N1-205.36D5 >72.0 4.3
N1-205.19G5 >200 13 6
N1-205.68G5 > 100 16.9
NI-205.8F8 не связывает 5.1
N1-205.5 8Е11 не связывает 6.9
N1-205.20А1 не связывает 15 8
Пример 7. Человеческое TDP-43 антитело связывающий анализ ELISA и Вестерн-блоттинг.
Прямые ELISA.
Прямые ELISA анализы проводили по существу, как описано в пример 1. Вкратце, фрагменты TDP43 (SEQ ID NO: 94), содержащие аминокислоты 2-106 (домен I), 99-204 (домен II), 183-273 (домен III), 258-414 (домен IV) и полномерные TDP-43 (2-414) наносили на ELISA-планшеты в концентрации, равной покрывающей концентрации 6,6 мкг/мл. Связывание антитела человеческого происхождения определяли по ELISA. Примеры полученных результатов показаны на фиг. 5. Антитела NI-205.41D1 (фиг. 5А), NI-205.14W3 (фиг. 5С), NI-205.44B2 (фиг. 5Е), NI-205.10D3 (фиг. 5G), и №-205.10Н7 (фиг. 5L) спецефически связывают TDP-43 домен IV (аа 258-414). Антитело NI- М-205.98Н6 (фиг. 5D) спецефически связывают TDP-43 домен III (аа 183-273). Антитела NI-205.1 А9 (фиг. 5В), М-205.38Н2 (фиг. 5Н) и NI205.31С11 (фиг. 5K) спецефически распознают TDP-43 домен II (аа 99-204) ВТО время, как антитела NI205.9Е12А (фиг. 5F), NI-205.29E11 (фиг. 51), NI-205.9E12D (фиг. 5J) и NI-205.8W0 (фиг. 5М) связывают TDP-43 домен I (аа 2-106). Все TDP-43 специфические антитела человеческого происхождения также распознают полномерные человеческие TDP-43. Для контроля эффективность покрытия различных рекомбинантных TDP-43 доменов, коммерчески доступные антитела связывают полномерные TDP-43 и конкретные домены TDP-43 были использованы (фиг. 5W): i) Ab50930 (Abcam, UK), TDP-43 домен I; ii) TARDBP моноклональное антитело (М01), клон 2E2-D3 (Abnova 23435, Abnova, Taiwan), TDP-43 домен III и iii) Ab82695 (Abcam, UK), TDP-43 домен IV. Контрольные антитела связывают полномерные TDP43 и их специфические TDP-43 домены.
Связывание различных TDP-43 доменов по Вестерн-блоттингу.
Рекомбинантные полномерные TDP-43, TDP-43 домен I (аминокислотные остатки 2-106 из SEQ ID NO: 94), TDP-43 домен II (аминокислотные остатки 99-204 из SEQ ID NO: 94), TDP-43 домен III (аминокислотные остатки 183-273 из SEQ ID NO: 94), и TDP-43 домен IV (аминокислотные остатки 258-414 из SEQ ID NO: 94) были предоставлены SDS-PAGE. Привязка к конкретным TDP-43 доменам антитела че
- 60 032003 ловеческого происхождения определяли с помощью анализа вестерн-блоттинга. Примеры полученных результатов приведены на фиг. 6. Антитела NI-205.41D1 (фиг. 6А), NI-205.14W3 (фиг. 6F), ΝΙ-205.8Ά2 (фиг. 6Н), NI-205.15F12 (фиг. 6I), NI-205.10D3 (фиг. 6J), NI-205.10H7 (фиг. 6L) и NI-205.21G1 (фиг. 6М) специфически связывают TDP-43 домен IV (аа 258-414). Антитела NI-205.51C1 (фиг. 6В), NI-205.3F10 (фиг. 6Е) и NI-205.98H6 специфически связывают TDP-43 домен III (аа 183-273), в то время, как антитела NI-205.21G2 (фиг. 6С), NI-205.1A9 (фиг. 6D) и NI-205.31C11 (фиг. 6K) специфически распознают TDP-43 домен II (99-204 аа). Эти тринадцать TDP-43 специфических антитела человеческого происхождения также распознают полномерный человеческий TDP-43. Только антитело NI-205.10D3 (фиг. 6J) аспознает дополнительный неспецифический сигнал, наиболее вероятно E.coli-производимиго белка контаминации. NI-205.68G5 (фиг. 6N) и NI-205.20A1 (фиг. 6O), два антитела, показывающие преимущественное или эксклюзивное связывание с фосфо-TDP-43 С-концевым пептидом, не распознает рекомбинантный полномерный TDP-43 или любой его фрагмент. Коммерчески доступное TDP-43 специфическое антитело 2E2-D3 (Abnova 23435, Abnova, Taiwan) (фиг. 6Р) использовали в качестве положительного контроля для обнаружения человеческого TDP-43, в то время как античеловеческое IgG Fcy-специфическое антитело (фиг. 6Q) использовали как негативный контроль.
Антитела человеческого происхождения NI-205.44B2, NI-205.9E12A, NI-205.38H2, NI-205.29E11, NI-205.9E12D, NI-205.113C4, NI-205.25F3, NI-205.8C10 и NI-205.87E7 распознают полномерные TDP-43, но не идентифицируют специфический TDP-43 фрагмент (данные не приводятся).
Пример 8. Картирование эпитопа синтетическими пептидами (Пепспоттинг).
Эпитопы, распознанные TDP-43 специфичным антителом человеческого происхождения в человеческим TDP-43 белком были нанесены на карту с помощью Пепскан мембраны (PepSpots, JPT пептида Technologies, Берлин, Германия) со 101 линейными 15-мерными пептидами с 11 аа перекрытиями между отдельными пептидами, охватывающими всю TDP-43 последовательность белка человека. Пепскан картирование проводили по существу, как описано в примере 3. Вкратце, пептиды были помещены на нитроцеллюлозные мембраны, которые затем были активированы в течение 5 мин в метаноле и затем промыты при комнатной температуре в TBS в течение 10 мин. Табл. 7 подитоживает обязательные эпитопы для различных TDP-43-специфических антител человеческого происхождения, идентифицированых с помощью Pep Spot.
Таблица 7 Связывание эпитопа с человеческой TDP-43 белковой последовательностью для разных TDP-43специфических антител человеческого происхождения. идентифицированых с помощью PepSpot
Антитело Связывающий эпитоп Эффект фосфорилирования Ser409 и/или Ser410 остатков
NI-205.41D1 317- SINPAMMAAAQAAL QSSWGMMGMLASQ- 343 (SEQ ID №323) ΝΑ
N1-205.51С1 201-DMTEDELREFF-211 (SEQ ID №125) ΝΑ
N1-205.21G2 121-KEYFSTF-127 (SEQ ID №128) ΝΑ
N1-205.3F10 213-QYGDVMDVF IP-223 (SEQ ID №123) ΝΑ
NI-205.98H6 249-IIKGISV-255 (SEQ ID №315) ΝΑ
- 61 032003
N1-205.44В2 345-NQSGPSG-351 (SEQ ID №316) NA
NI-205.8А2 381-AAIGWGSASNA- 391(SEQ ID №124) NA
N1-205.15F12 397-FNGGFGS-403 (SEQ ГО №317) NA
289-FGNSRGGGAGL-299 NA
N1-205.10D3 (SEQ ГО №318) 389-SNAGSGSGFNG-399
(SEQ ID №319)
NI-205 113С4 133-VQVKKDL-139 (SEQ ID №127) NA
N1-205.10Н7 269-QLERSGRFGGN-279 (SEQ ID №320) NA
NI-205.8C10 17-EIPSEDD-23 (SEQ ID №321) NA
NI-205 87Е7 9-EDENDEP-15 (SEQ ID №126) NA
Фосфоролирование
N1-205.21G1 390-414 Ser409/Ser410 частично
— ингибирует связывание Связывание с пептидом,
1D2 ipOCipupiuinpu&annbiivi ιιϋ
Ser409 и Ser410
Связывание с пептидом, фосфорилированным по
NI-205.14Н5 390-414 Ser409 и/или Ser410; слабое связывание также наблюдается независимо от
— фосфорилирования Связывание с пептидом, фосфорилированным по
NI-205.36D5 390-414 Ser409; одновременное Ser410 фосфорилирование
отменят связывание
Связывание с пептидом, фосфорилированным по
NI-205.19G5 390-414 Ser409; одновременное Ser410 фосфорилирование
отменят связывание
Связывание с пептидом,
NI-205.68G5 390-414 фосфорилированным по
Ser409 и/или Ser410
NI-205.8F8 390-414 Не определено
NI-205.58Е11 390-414 Не определено
Связывание с пептидом,
NI-205.20A1 390-414 фосфорилированным по
Ser409 и Ser410
NA - не применяется.
Определение NI-205.41D1 связывания с эпитопом посредством ELISA анализов.
Полномерные TDP-43 (2-414) и TDP-43 С-концевые фрагменты, содержащие аминокислоты 258414 (домен IV), 258-384, 258-375, 258-362, 258-353, 258-319, 317-414 и 340-414 наносили на ELISA планшеты в концентрации покрытия равной 10 мкг/мл. Связывание NI-205.41D1 антитела с конкретным TDP43 фрагментом определяли по ELISA. Примеры полученных данных представлены на фиг. 7А. NI205.41D1 связывается со всеми рекомбинантными фрагментами, за исключением фрагментов 258-319 и 340-414, указывая, что NI-205.41D1 эпитоп был на С-концевых TDP-43 участках 317-353. NI-205.41D1 антитело связывается с полномерным TDP-43.
Полномерные TDP-43 (2-414), TDP-43 домен IV дикого типа включает остатки 258-414 из SEQ ID NO: 94 (TDP-43258-414) и мутантный TDP-43 домен IV (TDP-43 258-414 AMM321GGG) несет замену А на G в положении остатка 321, замену М на G в положении остатка 322 и замену М на G в остатке 323, наносили на ELISA планшеты в концентрации покрытия равной 10 мкг/мл. Связывание NI-205.41D1 антитело с конкретным вариантом TDP-43 домена IV было определено путем прямого ELISA (фигура 7В). NI-205.41D1 специфически связывается с полномерным TDP-43 и TDP-43 доменом IV дикого типа, но не мутантным TDP-43 доменом IV, указывая, что один или более мутировавших остатков имеют важное значение для NI-205.41D1 связывания с человеческим TDP-43. Для контроля эффективности покрытия различных рекомбинантных TDP-43 видов, коммерчески доступное антитело 12892-1-АР связывающее полномерное TDP-43 было использовано.
Синтетические биотинилированные пептиды, содержащие остатки 316-353 (TDP-43 316-353), 316343 (TDP-43 316-343) и 316-333 (TDP-43 316-333) из SEQ ID NO: 94, были нанесены на покрытые стреп
- 62 032003 тавидином пластины в концентрации покрытия равной 10 мкг/мл. Связывание NI-205.41D1 антитела с конкретным TDP-43 С-концевым пептидом определяли по ELISA (фигура 1С). NI-205.41D1 специфически связывается с пептидами TDP-43 316-353 и TDP-43 316-343 но не с пептидом TDP-43 316-333. Этот результат согласуется с идеей, что остатки 334-343 из SEQ ID NO: 94 на TDP-43 С-концевом участке участвуют в связывании NI-205.41D1 антитела с человеческим TDP-43. Наши результаты согласуются с понимаем того, что эпитоп антитела NI-205,41 разрывается между остатками 317-343 из SEQ ID NO: 94 и состоит из двух независимых участков: первый включает остатки 321-323 из SEQ ID NO: 94 и второй содержит остатки 334-343 из SEQ ID NO: 94.
Пример 9. TDP-43 специфические антитела человеческого происхождения взаимодействуют с нативным TDP-43.
Чистый полномерный TDP-43 белок имеет естественную склонность к агрегации. Таким образом, только очень маленькие количества растворимых, полномерных TDP-43 были обнаружены при стандартных условиях очистки. Таким образом, авторы разработали рекомбинантную экспрессию и стратегию очистки для отделения больших количеств функционального 6xHis-SUMO-меченого полномерного человеческого TDP-43 от Escherichia coli с использованием KSCN и аргинина, мягких хаотропных агентов, известных сохранением нативной структуры белка, предотвращая агрегацию белка.
Плазмиды. Полинуклеотиды, кодирующие человеческие полномерные TDP-43 (1-414 из SEQ ID NO: 94) и его усеченные остатки 101-265 и остатки 220-414 из SEQ ID NO: 94 были амплифицированны с помощью стандартных процедур и субклонированы в модифицированный pET19-b (Novagen) вектор в результате 6xHis и SUMO меток на N-конце белка, кодируемого амплифицированными полинуклеотидами. Схематическое изображение 6xHis/SUMO меченных рекомбинантных полипептидов показан на фиг. 8В.
Экспрессия белка и очистка. 6xHis/SUMO меченные TDP-43 экспрессионные плазмиды были преобразованы в BL21 (DE3) звездообразные структуры Escherichia coli (Invitrogen). Бактериальные культуры выращивали до OD600 при 1,0 при 37°С и индуцированные 1 мМ IPTG в течение 16 ч при 18°С. После грануляции, клетки лизировали посредством микрофлюидизации в буфере очистки с ингибиторами протеазы (40 мМ HEPES (рН 7,5), 1,5 М KSCN, и 1 мМ трис-(2-карбоксиэтил)фосфин (ТСЕР), 1 мМ PMSF, 5 мкМ пепстатина, 1 мМ бензамина, 10 мкМ бестатина, 10 мкМ Е- 64, 20 мкМ лейпептина, 1,5 мкМ апротинин). Для генерации правильно уложенного полномерного TDP-43, TDP-43 (101-265) и TDP43 (220-414), соответствующие 6xHis-SUMO меченные слитые белки очищали на Ni-NTA-агарозной смоле (Qiagen) в соответствии с инструкциями изготовителя, используя буфер очистки для связывания и промывки. Связанные белки элюировали с Ni-NTA смолы в том же буфере, содержащем 250 мМ имидазола и дополнительно очищали на препаративной колонке S200 (GE Healthcare) в соответствии с инструкциями изготовителя с использованием буфера очистки. Фракции, содержащие мономерные TDP-43 белки были объединены, и повторно сформированы в буфере, содержащем 40 мМ HEPES (рН 7,5), 400 мм аргинина, 1 мМ ТСЕР диализома. 6xHis-SUMO-TDP43 (101-265) был дополнительно очищают, используя ту же стратегию очистки, но изменения буферные композиции путем замены 1,5 М KSCN на 0,5 М KCl. Чтобы подготовить развернутые 6xHis-TDP-43, клетки лизировали посредством микрофлюидизации в Трис-имидазольном буфера (50 мМ Трис (рН 7,5 ), 20 мМ имидазоле, 150 мМ NaCl) с ингибиторами протеазы. Нерастворимый осадок промывают последовательно следующими буферами, содержащими ингибиторы протеазы: B-PER буфером(Pierce), содержащем 2 мМ MgCl2, а затем трисимидазольным буфером. Промытые гранулы растворяли в 8 М мочевине, 20 мМ фосфата натрия (рН 7,8). Растворенный в мочевине материал затем очищают на Ni-NTA агарозной смоле следуя инструкциям производителя, используя условия денатурирующего отмывания и элюции. Определение коэффициентов седиментации и диффузии (фигура 8С), а также SDS-PAGE сепарацию (фигура 8 А) проводили стандартными методами. (Laue, T. et al. (1992) in Analytical Ultracentrifugation in Biochemistry и Polymer Science (Harding, S. E., ed) Royal Society из Chemistry, Cambridge, UK).
ELISA с захватом. 96-луночные планшеты (Thermo Fisher Scientific) покрывали анти 6xHis мышиными моноклональными антителами (Clontech), разбавленными до концентрации 1 мкг/мл в PBS-буфере (137 мМ NaCl, 8.05мМ Na2HPO4, 1,5 мМ KH2PO4, 2,7 мм KCl, рН 7,4) при 4°С в течение ночи. Неспецифические участки связывания блокировали в течение 1 ч при комнатной температуре с PBS, содержащим 1% BSA (Sigma) и 0,05% Твин-20 (Fisher Scientific). 6xHis-SUMO-TDP-43 белкам в концентрации 1,7 мкМ давали связаться с пластинами покрытыми антителами в течение 1 ч при комнатной температуре в PBS-буфере, содержащем 1% BSA, 300 мМ аргинина и 0,1% PEG 5000, рН 7,5. Планшеты инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре с человеческими антителами настоящего изобретения, титровали в трехкратной серии разведений, после HRP конъюгации античеловеческого IgG Fc γ (Jackson ImmunoResearch) в PBST содержащем 1% BSA. HRP активность измеряли стандартным колориметрическим анализом. Значения EC50 были рассчитаны с использованием четырехпараметрической логистической кривой на програмном обеспечении Softmax pro (Molecular Devices).
РНК связывающий анализ. Равновесная аффинность связывания TDP-43 конструкции с РНК определяли с помощью флуоресцентной поляризации. 5'TYETM флуорофором помеченые субстраты РНК, специфические РНК (TYETM-UGUGUGUGUGUG) (SEQ ID NO: 312) и контрольные РНК (TYETM
- 63 032003
UUUUUUUUUUUU) (SEQ ID NO: 313) (Integrated DNA Technologies), инкубировали при концентрации из 5 нМ 30 мин при 25°С с TDP-43 (конечные концентрации от 0 до 20 мкМ) в инкубационном буфере, как указано. Поляризацию флуоресценции измеряли с флуорометром для прочтения планшетов Envision (PerkinElmer) при каждой концентрации TDP-43 в формате 96-луночной пластины с возбуждением при 645 нм и эмиссией при 665. Kd были рассчитаны с использованием квадратного уравнение для сильной связи (уравнение Моррисон), используя SigmaPlot (Systat Software Inc.) Для определения стехиометрии связывания PHK/TDP-43, то же экспериментальная установка поляризационной флуоресценции использовалась с добавлением 95 нм немеченного РНК той же последовательности на общую концентрации 100 нМ РНК (>7х выше, чем ранее определенное Kd значение). Стехиометрия были рассчитана путем измерения пересечения двух прямых, одна подходит через точки данных в частично связанном состоянии, и другая, используя точки данных полностью связанного состояния.
Рекомбинантный полномерный TDP-43 был мономерным по седиментационному анализу (фиг. 8С) в буфере, содержащем 400 мМ аргинина. Минимум 300 мМ аргинина поддерживалось в аналитическом анализе, когда надеялись на получение мономерного нативного TDP-43, так как агрегация наблюдалась при более низких концентрациях аргинина. В соответствии с тем, что аргинин не отрицательно сказывается на активности TDP-43, наш рекомбинантный полномерный TDP-43 связывает РНК с ранее установленными специфическими последовательностями (UGUGUGUGUGUG (SEQ ID NO: 312)), по меньшей мере в 30 раз большим сродством, чем универсальные неспецифические последовательности (UUUUUUUUUUUU (SEQ ID NO: 313)) (фигура 9).
Также очищают 6xHis/SUMO меченные фрагменты остатков TDP-43, включающие аминокислотные остатки 101-265 из SEQ ID NO: 94, из которых С-концевой домен (аминокислоты с 265 по 414), известный опосредованной агрегацией, был удален. 6xHis/SUMO меченные 101-265 усеченные TDP-43 фрагменты, очищенные с или без хаотропов, поддерживают аффинность связывания с определенной последовательностью РНК очень похожи на ранее описанные KD (~ 14 нМ) несмотря на используемые самые различные аналитические методы (фиг. 9). См. Kou Nucleic Acids Res. 2009, 37:1799-808. Стехиометрия PHK/TDP-43 связывания была также одинакова, независимо от стратегии очистки, показывала, что не было никакого существенного различия в денатурированной популяции белка между двумя препаратами (фиг. 9). Вместе эти данные показали, что очищенный рекомбинантный чистый полномерный TDP-43 использовался в его нативном собранном состоянии.
Авторы изобретения измерили аффинность связывания TDP-43 специфичного антитела человеческого происхождения, предоставленную в настоящем документе с правильно сложенным 6xHis/SUMO меченным TDP-43 с использованием ELISA с захватом, в котором нативные TDP-43 были иммобилизованны без прямой адсорбции на поверхности ELISA пластины. Это было достигнуто путем иммобилизации анти-6xHis антитела, которые затем захватывали нативные TDP-43. Связывание с анти 6xHis меткой сложенным 6xHis/SUMO меченным полномерным человеческим TDP-43 было достигнуто при концентрации аргинина 300 мМ, обеспечивая мономерное состояние TDP-43. После этого шага иммобилизации, связывание человеческого антитела было испытано в регулярных буферах без вмешательства TDP-43 агрегации. Пример полученнных кривых титрования показан на фиг. 10. Табл. 8 обобщает аффинность (ЕС50 [нм]) сложеных полномерных 6xHis/SUMO меченных TDP-43 или 6xHis/SUMO меченных усеченных конструкций, содержащих С-концевой, склонный к агрегации участок TDP-43 (остатки 220-414 из SEQ ID NO: 94) методом ELISA с захватом.
- 64 032003
Таблица 8
ЕС50 [нМ] связывания TDP-43 антитела человеческого происхождения с правильно уложенным рекомбинантным 6xHis/SUMO меченным полномерным TDP-43 и 6xHis/SUMO меченным усеченным TDP-43, содержащим остатки 220-414
Антитело полное TDP-43 TDP-43 остатки 220-414
NI-205.41D1 0.07 0.10
NI-205.51C1 11 Нет связывания
N1-205.21G2 3.6 Нет связывания
N1-205.1A9 >98 Нет связывания
N1-205.3F10 >90 Нет связывания
N1-205.14W3 7.4 1.6
N1-205 98H6 46 20
N1-205.44B2 >125 33.5
N1-205.9E12A Нет связывания -
N1-205.8A2 34 4.6
N1-205.15F12 16.3 9.7
N1-205.10D3 >90 20 5
N1-205.38H2 >120 Нет связывания
N1-205.29E11 >100 >97
NI-205.9E12D Нет связывания Нет связывания
N1-205,31C11 21 1 Нет связывания
N1-205 113C4 Нет связывания Нет связывания
NI-205.25F3 >120 >100
N1-205.10H7 30.9 6.45
NI-205.8C10 Нет связывания -
NI-205.87E7 Нет связывания Нет связывания
NI-205.21G1 4.4 0.33
N1-205.31D2 41.0 194
N1-205.14H5 > 100 -
N1-205.36D5 >72.0 >60
N1-205.19G5 Нет связывания
N1-205.68G5 Нет связывания
N1-205.8F8 >94
N1-205 58E11 Нет связывания
N1-205 20Al Нет связывания
Пример 10. Оценка связывания TDP-43 антитела человеческого происхождения с TDP-43 в случае ЛВД-U и контроле в ткани гиппокампа.
Человеческие кортикальные ткати, ткани гиппокампа, и ткани спинного мозга ЛВД-U и контроля были получении из IDIBAPS Биобанка (Banc de Teixits Neurologics, Барселона). Иммуногистохимию проводили на парафиновых вложенных отрезках толщиной 5 мкМ с использованием EDTA-основанной демаскировке антигене до проведения других стандартных иммуногистохимических процедур с Elite ABC комплектом (Vector Laboratories) с DAB (Thermo Scientific). Иммуногистохимию проводили с использованием человеческого TDP-43 антитела данного изобретения в концентрации 50 нМ. Контрольное окрашивание выполняли с помощью мышиных моноклональных антител 2Е2 против человеческого TDP-43 (Abnova), кроличьих поликлональных антител р409/р410 выработанных против TDP-43 p409/p410 (CosmoBio), и кроличьих поликлональных антител р409/р410 выработанных против TDP-43 Р409/Р410 (CosmoBio).
Емкость анти-TDP-43 антитела человеческого происхождения, описания в настоящем документе, для распознавания нативны и патологически форм TDP-43, характеризовалась иммуногистохимическими экспериментами в случае человеческого ЛВД-U (10) и контрольной (7) ткани гиппокампа. TDP-43 является преимущественно ядерным белком, который курсирует в и из цитоплазмы. В патологическом состоянии, он накапливается в ядрах и особенно в цитоплазме, и патология обычно характеризуется/классифицируются на основе клеточной локализации; NCI - нейронные цитоплазматические включения, NII - нейронные внутриядерные включения, и дистрофическая нейритная патология (обзор Mackenzie et al., Lancet Neurology, 9: 995-1007 (2010)). В ЛВД-U и БАС тканях пациента, также обнаружен фосфорилированный белок. Характеристики связывания человеческого TDP-43 антителом, раскрытые в настоящем документе, сравнмвали с коммерчески доступными антителами широко использования для диагностики посмертных случаев. Контрольное антитело 2E2-D3 (Эпитоп картирован на аа205-222; Zhang et al., Neurosci. Lett., 434:170-174 (2008)) распознает ядерные и цитоплазматические TDP-43 накопления в пирамидальных нейронах гиппокампа (фиг. 11A) и гепариноцитах (фиг. 11В), а также TDP-43 в дистрофических нейритах (фиг. 11С). На тканях контроля, 2E2-D3 распознает преимущественно ядерный TDP43. Фосфорилирования конкретного антитела, р403/р404 (выработанного против CNGGFGS(p)S(p)MDSK (SEQ ID NO: 324); Hasegawa et al., Ann Neurol, 64(l):60-70 (2008)) распознает (фиг. 11D) цитоплазматический TDP-43 в пирамидальных клетках, (фиг. 11Е) ядерный и цитоплазматические накопление в гепариноцитах, а также (фиг. 11F) TDP-43 в дистрофических нейритах. Второе фосфорилированое специфическое антитело, р409/р410 (выработанное против CMDSKS(p)S(p)GwGm (SeQ ID NO: 325 ); Hasegawa et
- 65 032003 al., Ann Neurol, 64(1):60-70 (2008)) связывает с TDP-43, накапливаемом в ядре и цитоплазме (фиг. 11G) пирамидальных клеток и (фиг. 11H) гепариноцитах, а также (фиг. 11I) TDP-43 в дистрофических нейритах. Ahth-TDP-43 антитела человеческого происхождения, описаные в настоящем документе, отображают различные шаблоны окрашивания, в том числе связывание с ядерной, цитоплазматическй, и нейритной формами TDP-43. Несколько анти-TDP-43 антител человеческого происхождения, описаные в настоящем документе, специфически связываются с формами заболеваний TDP-43, по сравнению с окрашиными контрольными тканями здоровых людей (фиг. 11 и табл. 9). Наример, антитела NI-205.68G5, NI205.14W3, NI-205.21G1, и NI-205.41D1, селективно связывают патологические формы, то есть, невритический TDP-43, и ядерный и цитоплазматическый TDP-43 в гепариноцитах гиппокампа. Антитела NI205.14W3, NI-205.21G1, и NI-205.41D1 специфически связывают патологические формы TDP-43 в ЛВДU тканях пациента без связывания в контрольных тканях (сравнение для NI-205.41D1 окрашенного в ЛВД-U ткани пациента (фиг. 11Y) и контрольной ткани (фиг. 11Z)).
Антитело (фиг. 11J) NI-205.10D3 связывает преимущественно ядерный TDP-43, в то время как (фиг. 11K) NI-205.8G10 связывает TDP-43 в цитоплазме и аксоноах. В отличие от анализируемого контрольного анти-TDP-43 антитела, подмножество человеческих анти-TDP-43 антител, описанных в настоящем документе, связывают преимущественно цитоплазматический TDP-43, а не ядерный TDP-43. Антитела которые связывают преимущественно цитоплазматический TDP-43 включают (фиг. 11L) NI-205.15F12, (фиг. 11M) NI-205.8A2, (фиг. 11N) NI-205.3F10, (фиг. 11O) NI-205.21G2, (фиг. 11P) NI-205.8F8, (фиг. 11Q) NI-205.31G11, (фиг. 11R) NI-205.36D5, (фиг. 11S) NI-205.31D2, (фиг. 11Т) NI-205.10H7, и (фиг. 11U) №-205.14Н5. Антитела (фиг. 11V) NI-205.68G5, (фиг. 11W) NI-205.14W3, (фиг. 11X) NI-205.21G1, и (фиг. 11Y) NI-205.41D1 связывают нейритный TDP-43 и накапливающийся TDP-43 в ядрах и цитоплазме в гепариноцитах гиппокампа.
Таблица 9 Оценка связывания TDP-43 антитела человеческого происхождения с TDP-43 в случае ЛВД-U и контрольной ткани гиппокампа. Примеры и контрольные образцы также окрашивали с 2E2-D3, р403/р404, контрольными р409/р410 анти-ТРР-43 антителами
Антитело Окрашивание антител с помощью иммуногистохимии
ЛВД-U Изучаемая ткань Контрольная ткань
NI-205.41D1 цитоплазматическое и ядерное в гранулярных клетках + нейритных нет связывания
N1-205 51С1 нет связывания но
NI-205.21G2 цитоплазматическое но.
N1-205.1А9 нет связывания но.
N1-205.3F10 цитоплазматическое цитоплазматическое
N1-205.14W3 цитоплазматическое и ядерное в гранулярных клетках + нейритных нет связывания, цитоплазматическое в нейронах (в некоторых случаях)
N1-205.98Н6 нет связывания но.
N1-205 44В2 нет связывания но
N1-205.9Е12А нет связывания но
N1-205.8А2 цитоплазматическое цитоплазматическое
N1-205.15F12 цитоплазматическое в гранулярных клетках но.
N1-205.10D3 ядерное ядерное
NI-205.38H2 нет связывания но
N1-205 29Е11 нет связывания но.
N1-205.9E12D нет связывания но.
N1-205.31С11 цитоплазматическое цитоплазматическое
N1-205.113С4 нет связывания но.
NI-205.25F3 нет связывания но.
N1-205.10Н7 цитоплазматическое цитоплазматическое
N1-205.8С10 цитоплазматическое + аксонное (один случай) нет связывания
N1-205.87Е7 нет связывания но.
NI-205.21G1 цитоплазматическое и ядерное в гранулярных клетках + нейритных нет связывания
N1-205.31D2 цитоплазматическое цитоплазматическое
N1-205 14Н5 цитоплазматическое цитоплазматическое
NI-205.36D5 цитоплазматическое цитоплазматическое
N1-205.19G5 нет связывания но.
NI-205.68G5 цитоплазматическое + нейритное (один случай) но.
N1-205.8F8 цитоплазматическое цитоплазматическое
- 66 032003
N1-205.58Е11 нет связывания но
NI-205.20A1 нет связывания но
2E2-D3 ядерное, цитоплазматическое и нейритное ядерное (цитоплазматическое в некоторых контролях)
р403/р404 ядерное, цитоплазматическое и нейритное нет связывания
р409/р410 ядерное, цитоплазматическое и нейритное нет связывания
Н.О. - не определено.
Усиливающий экран для человеческого анти-ТПР-43 антитела, используя денатурированный рекомбинантный TDP-43 и TDP-43 390-414 пептид фосфорилированный на остатках S409 и S410, приводит к поколению антител, которые охватывают большинство естественных и связанных с болезнью эпитопов человеческого TDP-43. Человеческие анти-TDP-43 антитела раскрыты в настоящем документе, выявляют новые и интересующие эпитопы TDP-43, и предложено новую конформационную информацию, относящуюся к болезненному процессу TDP-43 протеинопатий. Например, the NI-205.14W3, NI-205.21G1, и NI205.41D1 связывают TDP-43 с высокой аффинностью и были специфичными для патологических форм TDP-43 ЛВД-U тканей по сравнению с контрольными случаями. В то время, как эти три антитела имели подобные патологические TDP-43 специфические паттерны окрашивания в иммуногистохимии, они распознавали различные эпитопы в склонные к агрегации С-концевой области TDP-43: NI-41D1, они распознавали различные эпитопы в склонных к агрегации С-концевых участках TDP-43 и NI-21G1 связывает склонный к фосфорилированию участок TDP-43. Кроме того, NI-205.14H5 и NI-205.31D2 антитела имели высокую аффинность к TDP-43 фосфорилированому по одному или обоим остаткам S409 и S410, и специфический окрашенный цитоплазматический TDP-43 в иммуногистохимии. Кроме того, NI-205.21G2 и NI-205.51C1 также показали высокое сродство к TDP-43, и связывали эпитопы N-концевых к предсказанному сайту расщепления каспаз, с NI-205.51W связывающим РНК-распознающий мотив 2 (RRM2). NI-205.10D3 специфично окрашенный ядерным TDP-43 в случае ЛВД-U ткани и контроля, предполагаем, что это связано с эндогенными/нативными формами TDP-43.
Пример 11. Исследование мозга с острым проникновением.
TDP-43_G348C трансгенным мышам (Swarup et al., Brain 134 (2011), 2610-2626) внутрибрюшинно вводили 30 мг/кг человеческого анти-TDP-43 антитела или равный объем PBS в 1-й день и 4-й день. На 5-й день, мышей перфузировали под наркозом PBS, содержащем 1 Единицу/мл гепарина. Кровь, мозг и спинной мозг собрали для анализа. Правое полушарие мозга замораживали при температуре -80°С, левое полушарие мозга и спинной мозг фиксировали в 10% нейтрализованном формалине при 4°С в течение двух дней прежде, чем помещали в парафиновые блоки и секции. Плазму хранили при -80°С в аликвотах. Экстракция белка мозга: фракции белка мозга экстрагировали с использованием стандартных экспериментальных методик, например, замороженное правое полушарие взвешивали и гомогенизировали в 5 объемах (5 мл/г мокрой ткани) раствора, содержащего 50 мМ NaCl, 0,2% диэтиламина, ингибиторы протеазы (Roche Diagnostics GmbH) и ингибиторы фосфатазы (Roche Diagnostics GmbH). Образцы, которые затем помещали в поликарбонатные трубы и добавляли еще 5 объемов гомогенизационного раствора, и держали на льду в течение 30 мин. Растворимые фракции затем собирают после центрифугирования при 100000 г, при 4°С в течение 30 мин. Эта растворимая фракция используется в анализе человеческого IgG. Осадок повторно суспендируют в 3 объемах PBS с ингибитором протеазы и фосфатазы. После центрифугирования при 16000 г, при 4°С в течение 30 мин, надосадочную жидкость и гранулы хранят отдельно при -80°С для дальнейшей экстракции нерастворимого TDP-43.
Человеческое антитело и TDP-43 обнаружены и произведен количественный анализ белковых экстрактов мозга с помощью стандартных экспериментальных методов. Например, человеческий IgG специфический сэндвич ELISA: 2 мкг/мл козьего античеловеческого IgG Fab (Jackson) в 50 мМ карбонатном покрывающем буфере ELISA (рН 9.6), используется в качестве захвата антитела. Микропланшет с половинным объёмом 96 лунок покрывали 30 мкл/лунке с захватом антитела при 4°С в течение ночи. Затем планшет промывали 4 раза PBS, содержащим 0,1% Твин 20 перед инкубацией с 50 мкл/лунке PBS, содержащим 2% BSA при комнатной температуре в течение 1 ч. Растворимые фракции экстрактов мозга, образцы плазмы и человеческого антитела стандартно разводят в PBS, содержащем 2% BSA и 0,1% Tween 20. 30 мкл разбавленных образцов добавляют в каждую лунку и инкубируют при комнатной температуре в течение 1 ч. Затем планшет промывают 200 мкл/лунку PBS, содержащим 0,1% Твин 20 четыре раза перед инкубирование с HRP-конъюгированными ослиными античеловеческими Fcy (Jackson, diluted at 1:10,000 in PBS containing 2% BSA и 0.1% Твин 20) при комнатной температуре в течение 1 ч. Затем планшет промывали 200 мкл/лунку PBS, содержащим 0,1% Твин 20 четыре раза перед добавлением 20 мкл/лунку ТМВ (1:20 в 10 мМ раствора цитрата рН 4,1). Реакцию затем останавливают добавлением 10 мкл 1 М H2SO4 в каждую лунку. Стандартная кривая антитела получается из серийных разведений контрольного антитела. Концентрации антитела в образцах плазмы и мозга рассчитывали в соответствии со
- 67 032003 стандартами. Уровень человеческого IgG мозга затем превращают в мкг антитела/гр свежей ткани мозга.
Нейронные проникновения введенного человеческого анти-ТПР-43 антитела обнаруживается иммуногистологическим окрашиванием срезов тканей головного мозга, полученных из человеческой антиTDP-43 антитела, обработанного и контрольного животного. Например, секции свободно-плавающих тканей промывают в Tris-Triton рН 7,4 (50 мМ Трис, 150 мМ NaCl, 0,05% Triton X-100), инкубируют в 1% Н2О2 PBS в течение 30 мин, и инкубируют с блокирующим раствором, содержащим 2% нормальную козью- и лошадиную сыворотку в Tris-Triton и с дополнительным 0,2% Triton Х-100 в течение 1 ч при комнатной температуре. Срезы затем инкубируют с биотинилированным ослинным античеловеческий IgG (H+L) (Jackson ImmunoResearch Labs, 709-065-149) в соотношении 1:200 в блокирующем растворе в течение 16 ч при 4°С при перемешивании 100 об/мин для обнаружения нейронных человеческих IgG. Тканьсвязанное биотинилированное антитело визуализируется пероксидазной хромогенной реакцией с использованием набора Vectastain Elite ABC (Vector Laboratories, PK6100, 1:100). Ферментативную реакцию останавливают ледяной PBS и секции промывают в PBS 3 раза. Секции затем монтируют на стеклах и сушат на воздухе в течение ночи, прежде чем контрастировать раствором Майера (Carl Roth GmbH+Co. T865.1). После шагов обезвоживания, секции покрывают покровными стеклами до сканирования системы виртуальной микроскопии Olympus dotSlide 2.1. Окрашивание нейронных античеловеческих IgG наблюдалось в животных, которым вводили антитела, но не у контрольных животных, что указывает на то, что человеческое анти-TDP-43 антитело поступает в нейроны.
Пример 12. Chronic study with анти-TDP-43 антитела.
TDP-43 G348C трансгенным мышам (Swarup et al., Brain 134 (2011), 2610-2626) внутрибрюшинно вводили 10 мг/кг, 3 мг/кг раствора антитела или равный объем контроля PBS. Каждая группа лечения имела 20-25 мышей. Лечение проводили раз в неделю в течение 26 недель. Альтернативно, лечение проводили два раза в неделю в течение 13 недель. Вес тела контролировали каждые две недели. Мышей перфузировали под наркозом в конце периода лечения. Мозг, спинной мозг и кровь собирали. Половину мозга и спинного мозга фиксировали в 10% формалине в течение трех дней, прежде чем заливали в блоки парафина. Срезы толщиной 4-6 мкм, вырезанные из этих блоков ткани, использовали для иммуногистохимических исследований. Другую половину мозга, взвешивали и глубоко замораживают при -80°С для биохимических анализов.
Эффекты лекарств оценивают путем сравнения распределения и уровня TDP-43, в том числе, распределения и уровня патологических форм TDP-43 при лечение антителами и у контрольных животных с помощью иммуногистохимии. Образцы тканей, полученные леченых антителами и контрольных животных окрашивают с анти-TDP-43 антителами, например, анти-TDP-43 антителами, характерными для патологических форм TDP-43, используя стандартные гистологические методы. В одном варианте реализации антитело, используемое в гистохимическом анализе, является таким же, как антитело, вводимое животным. В другом варианте реализации антитело, используемое в гистохимическом анализе, отличается от антитела, вводимого животным. Терапевтическая эффективность человеческого анти-TDP-43 антитела, раскрытого в настоящем документе, будет показана снижением уровня или отсутствием патологических форм TDP-43 леченых антителами животных по сравнению с контрольными животными.
Эффекты лекарств также оценивают путем сравнения уровня TDP-43, в том числе уровня патологических форм TDP-43 в леченых антителами и контрольных животных с использованием ELISA или Вестерн-блоттинг. Терапевтическая эффективность человеческого анти-TDP-43 антитела, раскрытого в настоящем документе, будет показана снижением уровня или отсутствием патологических форм TDP-43 в леченых антителами животных по сравнению с контрольными животными.
Настоящее изобретение не должно быть ограничено в объеме конкретными описанными вариантами реализации, которые предназначены для единичных иллюстраций отдельных аспектов изобретения, и любых композиций или способов, которые функционально эквивалентны находящимся в пределах объема настоящего изобретения. Действительно, различные модификации данного изобретения, в дополнение к показанным и описанным в настоящем документе, будут очевидны для специалистов в данной области техники из приведенного выше описания и прилагаемых иллюстраций. Такие модификации подпадают под объем притязаний прилагаемой формулы изобретения.
- 68 032003
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ <110> Биоген IDEC Международной Неврологии GmbH
Университет Цюриха
Нитч, Роджер
Хок, Кристоф
Баренко Монтрасио,
Мария Грация
Монтрасио, Фабио
Гримм, Ян
Березвиль, Жан-Люк
<120> АНТИ-TDP-43 АНТИТЕЛО
<130> 2159.362PC01
<140> Присваивается
<141> Настоящим
<150> 60/553,113
<151> 2011-10-28
<160> 328
<170> Патент в версии 3.5
<210> 1
<211> 124
<212> ПРТ
<213> Homo sapiens
<400> 1
Glu 1 Val Gln Leu Leu 5 Glu Ser Gly Gly Asp 10 Leu Val Gln Pro Gly 15 Gly
Ser Leu Arg Leu 20 Ser Cys Ala Ala Ser 25 Gly Phe Thr Phe Ser 30 Ser Gln
Ala Met Ser 35 Trp Val Arg Gln Ala 40 Pro Gly Lys Gly Leu 45 Glu Trp Val
Ser Ala 50 Leu Ser Arg Thr Gly 55 Asp Tyr Thr Trp Tyr 60 Ala Asp Ser Val
Arg 65 Gly Arg Phe Thr Val 70 Ser Arg Asp Asp Ser 75 Lys Asn Ile Phe Tyr 80
Leu Glu Met Asn Ser 85 Leu Arg Ala Glu Asp 90 Thr Ala Val Tyr Tyr 95 Cys
Ala Lys Asn Tyr 100 Tyr Ser Ser Phe Gly 105 Tyr Asn Trp Ala Ala 110 Phe His
Ile
Trp
Gly
115
Gln
Gly
Thr
Met
Val
120
Thr
Val
Ser
Ser
- 69 032003 <210>2 <211>124 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>2
Glu Val 1 Gln Leu Val 5 Glu Ser Gly Gly Asp 10 Leu Val Gln Pro Gly 15 Gly
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Gln
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Leu Ser Arg Thr Gly Asp Tyr Thr Trp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Arg Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ile Phe Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asn Tyr Tyr Ser Ser Phe Gly Tyr Asn Trp Ala Ala Phe His
100 105 110
Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 3
<211> 5
<212> ПРТ
<213> Homo sapiens
<400> 3
Ser Gln Ala Met Ser
1 5
<210> 4
<211> 17
<212> ПРТ
<213> Homo sapiens
<400> 4
Ala Leu Ser Arg Thr Gly Asp Tyr Thr Trp Tyr Ala Asp Ser Val Arg
1 5 10 15
- 70 032003
Gly <210>5 <211>15 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>5
Asn Tyr Tyr Ser Ser Phe Gly Tyr Asn Trp Ala Ala Phe His
510
Ile <210>6 <211>109 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>6
Glu 1 Ile Val Leu Thr 5 Gln Ser Pro Gly Thr Leu 10 Ser Leu Ser Pro 15 Gly
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Asn Asn
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Arg Arg Ala Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Arg Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Met Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Gly Gly Ser Pro
85 90 95
Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 7
<211> 12
<212> ПРТ
<213> Homo sapiens
<400> 7
Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Asn Asn Tyr Leu Ala
1 5 10
<210>8 <211>7
- 71 032003
<212> ПРТ
<213> Homo sapiens
<400> 8
Gly Ala Ser Arg Arg Ala Thr
1 5
<210> 9
<211> 10
<212> ПРТ
<213> Homo sapiens
<400> 9
Gln Gln Tyr Gly Gly Ser Pro Pro Tyr Thr
510 <210>10 <211>114 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>10
Glu 1 Val Gln Leu Val 5 Glu Ser Gly Gly Gly Leu 10 Val Gln Pro Gly 15 Gly
Ser Leu Arg Ile 20 Ser Cys Thr Thr Ser 25 Gly Phe Ile Phe Ser 30 Asp Tyr
Trp Met His 35 Trp Val Arg Gln Ala 40 Pro Gly Lys Gly Leu 45 Thr Trp Val
Ser Arg 50 Ile Asn Leu Asp Gly 55 Ser Asp Thr Ile Tyr 60 Ala Asp Ser Val
Lys 65 Gly Arg Phe Thr Ile 70 Ser Arg Asp Asn Asp 75 Lys Asn Thr Leu Tyr 80
Leu Gln Met Asn Ser 85 Leu Arg Val Glu Asp 90 Thr Ala Ile Tyr Tyr 95 Cys
Ala Arg Ser Arg 100 Lys Ser Val Trp Gly 105 Gln Gly Thr Met Val 110 Thr Val
Ser Ser <210>11 <211>5 <212> ПРТ <213> Homo sapiens
- 72 032003 <400>11
Asp Tyr Trp Met His <210>12 <211>17 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>12
Arg Ile Asn Leu Asp Gly Ser Asp Thr
Tyr Ala Asp Ser Val Lys
Gly <210>13 <211>5 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>13
Ser Arg Lys Ser Val <210>14 <211>110 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>14
Gln 1 Ser Ala Leu Thr 5 Gln Pro Ala Ser
Ser Ile Thr Ile 20 Ser Cys Thr Gly Ser 25
Asp Tyr Val 35 Ser Trp Ser Gln Gln 40 Leu
Val Ile 50 Phe Asp Val Asp Val 55 Arg Pro
Ser 65 Gly Ser Lys Ser Gly 70 Asn Thr Ala
Gln Ala Glu Asp Glu 85 Ala Asp Tyr Tyr
Ser Gly Ser Pro Gly Gln
Thr Asp Val Gly Ala Tyr
Gly Lys Ala Pro Lys Phe
Gly Ile Ser Asp Arg Phe
Leu Thr Ile Ser Gly Leu
80
Ser Ser Tyr Thr Lys Ser
- 73 032003
Gly Thr Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr
100105
Val Thr Val Val
110 <210>15 <211>14 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>15
Thr Gly Ser Asn Thr Asp Val Gly Ala
Asp Tyr Val Ser <210>16 <211>7 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>16
Asp Val Asp Val Arg Pro Ser <210>17 <211>10 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>17
Ser Ser Tyr Thr Lys Ser Gly Thr Leu <210>18 <211>119 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>18
Gln Val 1 Gln Leu Val 5 Gln Ser Gly Ala
Ser Val Lys Val 20 Ser Cys Lys Thr Ser 25
Thr Leu His 35 Trp Val Arg Gln Ala 40 Pro
Gly Trp 50 Ile Asn Ala Ala Phe 55 Ile Asn
Gln 65 Gly Arg Ile Thr Leu 70 Thr Arg Asp
Val Lys Lys Pro Gly Ala
Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
His Arg Pro Glu Trp Met
Lys Tyr Ser Gln Lys Phe
Ser Ala Asn Ile Ala Tyr
80
- 74 032003
Leu Glu Leu Arg Ser Leu Thr Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 95 Cys
85 90
Ala Arg Arg Ala Ser Gly Ser Asn Gly Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 <210>19 <211>5 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>19
Ser Tyr Thr Leu His <210>20 <211>17 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>20
Trp Ile Asn Ala Ala Phe Ile Asn Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe Gln
5 1015
Gly <210>21 <211>10 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>21
Arg Ala Ser Gly Ser Asn Gly Leu Asp Val
510 <210>22 <211>107 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>22
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
5 1015
Asp Arg Ile Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Arg Asp Ile Thr Asn Tyr
- 75 032003
Leu Asn Trp 35 Tyr Gln Gln Lys Pro 40 Gly Lys Ala Pro Lys 45 Leu Leu Ile
Tyr Asp 50 Ala Ser Tyr Leu Glu 55 Thr Gly Val Pro Ser 60 Thr Phe Ser Gly
Ser 65 Gly Ser Gly Thr His 70 Phe Thr Leu Thr Ile 75 Ser Ser Leu Gln Pro 80
Asp Asp Phe Ala Thr 85 Tyr Tyr Cys Gln Gln 90 Tyr Asp Ser Val Pro 95 Leu
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 23
<211> 11
<212> ПРТ
<213> Homo sapiens
<400> 23
Gln Ala Ser Arg Asp Ile Thr Asn Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 24
<211> 7
<212> ПРТ
<213> Homo sapiens
<400> 24
Asp Ala Ser Tyr Leu Glu Thr
1 5
<210> 25
<211> 9
<212> ПРТ
<213> Homo sapiens
<400> 25
Gln Gln Tyr Asp Ser Val Pro Leu Thr
1 5
<210>
<211>
<212>
<213>
121
ПРТ
Homo sapiens <400> 26
- 76 032003
Gln Val 1 Gln Leu Val 5 Glu Ser Gly Gly Gly Val 10 Val Gln Pro Gly 15 Lys
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Asp His
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Leu Asp Gly Ser Ser Arg Phe Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Thr Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Arg Val Ala Ser Glu Gly Thr Ala Phe Asp Val Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 27
<211> 121
<212> ПРТ
<213> Homo sapiens
<400> 27
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Lys
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Asp His
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Leu Asp Gly Ser Ser Arg Phe Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Thr Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
- 77 032003
Ala Arg Asp Arg Val Ala Ser Glu Gly 105 Thr Ala Phe Asp Val 110 Trp Gly
100
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 28
<211> 5
<212> ПРТ
<213> Homo sapiens
<400> 28
Asp His Gly Met His
1 5
<210> 29
<211> 17
<212> ПРТ
<213> Homo sapiens
<400> 29
Val Ile Trp Leu Asp Gly Ser Ser Arg Phe Tyr Ala Asp Ser Val Glu
1 5 10 15
Gly
<210>30 <211>12 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>30
Asp Arg Val Ala Ser Glu Gly Thr Ala Phe Asp Val
510 <210>31 <211>105 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>31
Glu 1 Ile Val Leu Thr 5 Gln Ser Pro Ala Thr 10 Leu Ser Leu Ser Pro 15 Gly
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Trp Ala Ser Gln Asn Val Asn His Tyr
20 25 30
Leu Val Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Leu
35 40 45
- 78 032003
Tyr Asp Thr Ser Val Arg Ala Ala Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ile Gly
Ser Gly Ser Gly Thr His Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Arg Ser Asp Trp Thr Phe
Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100105 <210>32 <211>11 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>32
Trp Ala Ser Gln Asn Val Asn His Tyr Leu Val
510 <210>33 <211>7 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>33
Asp Thr Ser Val Arg Ala Ala <210>34 <211>7 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>34
Gln His Arg Ser Asp Trp Thr <210>35 <211>119 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>35
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Thr Ala Val Lys Lys Pro Gly Ala
5 1015
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Ser Phe Asn Gly Tyr
- 79 032003
Tyr Met His 35 Trp Val Arg Gln Ala 40 Pro Gly Gln Gly Leu 45 Glu Trp Met
Gly Val Ile Asn Pro Asn Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Ile Thr Met Ser Ala Asp Thr Pro Ala Arg Ser Val Ser
65 70 75 80
Met Glu Leu Gly Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Pro Val Asn Ile Glu Val Leu Asp Leu Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 36
<211> 119
<212> ПРТ
<213> Homo sapiens
<400> 36
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Thr Ala Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Ser Phe Asn Gly Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Val Ile Asn Pro Asn Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Ile Thr Met Ser Ala Asp Thr Pro Ala Arg Ser Val Ser
65 70 75 80
Met Glu Leu Gly Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Pro Val Asn Ile Glu Val Leu Asp Leu Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
- 80 032003
<210> 37
<211> 5
<212> ПРТ
<213> Homo sapi ens
<400> 37
Gly Tyr Tyr Met His
1 5
<210> 38
<211> 17
<212> ПРТ
<213> Homo sapiens
<400> 38
Val Ile Asn Pro Asn Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Lys
5 1015
Gly <210>39 <211>10 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>39
Leu Pro Val Asn Ile Glu Val Leu Asp Leu
510 <210>40 <211>113 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>40
Asp 1 Ile Val Met Thr 5 Gln Ser Pro Asp Ser 10 Leu Ala Val Ser Leu 15 Gly
Glu Arg Ala Thr 20 Ile Asn Cys Arg Ser 25 Ser Gln Thr Val Leu 30 Phe Ser
Ser Asn Asp 35 Lys Asn Tyr Leu Ala 40 Trp Tyr Gln Gln Lys 45 Pro Gly Gln
Pro Pro 50 Lys Leu Leu Ile Tyr 55 Trp Ala Ser Val Arg 60 Ala Ser Gly Val
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Thr
- 81 032003
Ile Asn Gly
Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val
Tyr Tyr Cys Gln Gln
Ser Ser Thr
Ala Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys <210>41 <211>113 <212> ПРТ <213> Homo <400>41
Glu Ile Val sapiens
Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
10 15
Glu Arg Ala
Thr Ile Asn Cys Arg Ser Ser Gln Thr Val Leu Phe Ser
25 30
Ser Asn Asp
Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 40 45
Pro Pro Lys
Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Val Arg Ala Ser Gly Val
60
Pro Asp Arg
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Thr
75 80
Ile Asn Gly
Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
90 95
Ser Ser Thr
Ala Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys <210>42 <211>17 <212> ПРТ <213> Homo <400>42
Arg Ser Ser sapiens
Gln Thr Val Leu Phe Ser Ser Asn Asp Lys Asn Tyr Leu
10 15
- 82 032003
Ala
<210> 43
<211> 7
<212> ПРТ
<213> Homo sapi ens
<400> 43
Trp Ala Ser Val Arg Ala Ser
1 5
<210> 44
<211> 9
<212> ПРТ
<213> Homo sapiens
<400> 44
Gln Gln Ser Ser Thr Ala Pro Leu Thr <210>45 <211>134 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>45
Gln Val 1 Gln Leu Val 5 Gln Ser Gly Ala Glu Val 10 Lys Lys Pro Gly 15 Ala
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Arg Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Ala Ser Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Val Ile Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Arg Pro Ser Gly Tyr Ser Gly Tyr Gly Pro Ser Glu Ser
100 105 110
- 83 032003
Tyr Gly Asn Pro Thr Asp Asp Ala Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr
115
120
125
Thr Val Thr Val Ser Ser
130 <210>46 <211>5 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>46
Asn Tyr Tyr Met His <210>47 <211>17 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>47
Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Arg Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
5 1015
Gly <210>48 <211>25 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>48
Gln Arg Pro Ser Gly Tyr Ser Gly Tyr Gly Pro Ser Glu Ser Tyr Gly
5 1015
Asn Pro Thr Asp Asp Ala Phe Asp Val <210>49 <211>109 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>49
Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln
5 1015
Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Arg Gly Val
- 84 032003
His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr
Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
Asn Ser Gly Asp Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Val Gly
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Asn Ser Ser Asp His
Leu Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100105 <210>50 <211>11 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>50
Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Arg Gly Val His
510 <210>51 <211>7 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>51
Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser <210>52 <211>12 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>52
Gln Val Trp Asp Asn Ser Ser Asp His Leu Val Val
510 <210>53 <211>130 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>53
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
5 1015
- 85 032003
Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
Ser Leu Arg Leu 20 Ser Cys Ala Ala Ser 25
Val Met Tyr 35 Trp Val Arg Gln Ala 40 Pro
Ala Phe 50 Ile Ser Tyr Asp Gly 55 Ser Asn
Lys 65 Gly Arg Phe Thr Ile 70 Ser Arg Asp
Leu Gln Met Asp Ser 85 Leu Arg Ala Glu
Ala Arg Asp Thr 100 Tyr Gln Tyr Asp Ser 105
Tyr Tyr Tyr 115 Gly Met Asp Val Trp 120 Gly
Ser Ser
130 <210>54 <211>5 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>54
Asn Tyr Val Met Tyr <210>55 <211>17 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>55
Phe Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys
Lys Gly Leu Glu Trp Val
Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
Ser Met Asn Thr Leu Tyr
80
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
Thr Tyr Tyr Pro Tyr Phe
110
Gly Thr Thr Val Thr Val
125
Tyr Pro Asp Ser Val Lys
Gly <210> 56 <211> 21 <212> ПРТ
- 86 032003
Tyr Pro Tyr Phe Tyr Tyr
<213> Homo sapi ens
<400> 56
Asp Thr Tyr Gln Tyr Asp Ser Ser Thr
1 5
Tyr Gly Met Asp Val
20
<210> 57
<211> 111
<212> ПРТ
<213> Homo sapi ens
<400> 57
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser
1 5
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Ile Gly Thr
20 25
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His
35 40
Met Ile Tyr Glu Val Ser Asn Arg Pro
50 55
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala
65 70
Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr
85
Ser Thr Ser Val Thr Phe Gly Gly Gly
100 105
<210> 58
<211> 14
<212> ПРТ
<213> Homo sapi ens
<400> 58
Ile Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly
1 5
<210> 59
<211> 7
<212> ПРТ
<213> Homo sapi ens
Ser Gly Ser Pro Gly Gln
Ser Asp Val Gly Gly Tyr
Gly Lys Ala Pro Lys Leu
Gly Val Ser Ser Arg Phe
Leu Thr Ile Ser Gly Leu
80
Ser Ser Phe Ala Ser Ser
Lys Leu Thr Val Leu
110
Asn Tyr Val Ser
- 87 032003 <400> 59
Glu Val 1 Ser Asn Arg Pro Ser 5
<210> 60
<211> 11
<212> ПРТ
<213> Homo sapi ens
<400> 60
Ser Ser Phe Ala Ser Ser Ser Thr Ser Val Thr
510 <210>61 <211>129 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>61
Glu Val 1 Gln Leu Leu 5 Glu Ser Gly Gly Gly Leu 10 Val Gln Pro Gly 15 Gly
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Gly Gly Asp Arg Thr Tyr Ser Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Gln Gly Gly Gly Gly Glu Met Thr Ala Val Thr Met Asp Gly Thr
100 105 110
Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
115 120 125
Ser <210> 62 <211> 5 <212> ПРТ
- 88 032003
<213> Homo sapi ens
<400> 62
Ser Tyr Ala Met Ser
1 5
<210> 63
<211> 17
<212> ПРТ
<213> Homo sapi ens
<400> 63
Ala Ile Ser Gly Gly Gly Asp Arg Thr Tyr Ser Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 64
<211> 20
<212> ПРТ
<213> Homo sapiens
<400> 64
Gly Gly Gly Gly Glu Met Thr Ala Val Thr Met Asp Gly Thr Tyr Tyr
1 5 10 15
Gly Met Asp Val <210>65 <211>110 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>65
Gln 1 Ser Ala Leu Thr 5 Gln Pro Arg Ser Val 10 Ser Gly Ser Pro Gly 15 Gln
Ser Ile Thr Ile 20 Ser Cys Thr Gly Thr 25 Ser Ser Asn Val Gly 30 Thr Tyr
Lys Phe Val 35 Ser Trp Tyr Gln Gln 40 His Pro Gly Lys Ala 45 Pro Lys Leu
Met Ile 50 Tyr Asp Val Thr Lys 55 Arg Pro Ser Gly Val 60 Pro Asp Arg Phe
Ser 65 Gly Ser Lys Ser Gly 70 Asn Thr Ala Ser Leu 75 Thr Ile Ser Gly Leu 80
- 89 032003
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Cys Ser Tyr Ala Gly Ser
Tyr Thr Tyr Val Phe Gly Ser Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100 105110 <210>66 <211>14 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>66
Thr Gly Thr Ser Ser Asn Val Gly Thr Tyr Lys Phe Val Ser
510 <210>67 <211>7 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>67
Asp Val Thr Lys Arg Pro Ser <210>68 <211>10 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>68
Cys Ser Tyr Ala Gly Ser Tyr Thr Tyr Val
510 <210>69 <211>119 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>69
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Met
5 1015
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser His
Gly Met His Trp Val Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Ala Ser Asn Lys Ser Tyr Ala Asp Ser Val
- 90 032003
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Lys Thr Leu Tyr
Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
Ala Asn Ala Phe Ser Ser Ser Ala Ser Gly Gly Tyr Trp Gly Gln Gly
100
105
110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 <210>70 <211>5 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>70
Ser His Gly Met His <210>71 <211>17 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>71
Val Ile Ser Tyr Asp Ala Ser Asn Lys Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys
5 1015
Gly <210>72 <211>10 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>72
Ala Phe Ser Ser Ser Ala Ser Gly Gly Tyr
510 <210>73 <211>113 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>73
- 91 032003
Asp 1 Val Val Met Thr 5 Gln Ser Pro Leu Ser 10 Leu Pro Val Thr Leu 15
Gln Pro Ala Ser 20 Ile Ser Cys Arg Ser 25 Ser Gln Ser Leu Val 30 His
Asp Gly Val 35 Thr Tyr Leu Asn Trp 40 Phe Gln Gln Arg Pro 45 Gly Gln
Pro Arg 50 Arg Leu Ile Tyr Lys 55 Val Ser Asn Arg Asp 60 Ser Gly Val
Asp 65 Arg Phe Ser Gly Ser 70 Gly Ser Gly Thr Asp 75 Phe Thr Leu Glu
Ser Arg Val Glu Ala 85 Glu Asp Val Gly Ile 90 Tyr Tyr Cys Met Gln 95
Thr His Trp Pro Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu
100 105 110
Gly
Ser
Ser
Pro
Ile
Gly
Ile
Lys <210>74 <211>16 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>74
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asp Gly Val Thr Tyr Leu 1 5 1015
Asn
<210> 75
<211> 7
<212> ПРТ
<213> Homo sapiens
<400> 75
Lys Val Ser Asn Arg Asp Ser
1 5
<210>76 <211>10 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>76
Met Gln Gly
Thr His
Trp
Pro
Pro
Trp
Thr
- 92 032003 <210>
<211>
126 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400> 77
Gln Val 1 Gln Leu Val 5 Glu Ser Gly Gly Gly 10 Val Val Gln Pro Gly 15 Arg
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ile Ile Tyr Tyr Asp Ser Ser Gln Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Ala Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Leu Pro Phe His Tyr His Arg Ser Ala Ser Phe Ala Pro
100 105 110
Ser Asp Thr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 78
<211> 126
<212> ПРТ
<213> Homo sapiens
<400> 78
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ile Ile Tyr Tyr Asp Ser Ser Gln Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
- 93 032003
Lys 65 Gly Arg Phe Thr Ile 70 Ser Arg Asp Asn Ser 75 Lys Asn Ala Leu Tyr 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Leu Pro Phe His Tyr His Arg Ser Ala Ser Phe Ala Pro
100 105 110
Ser Asp Thr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210>79 <211>5 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>79
Ser Tyr Gly Met His <210>80 <211>17 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>80
Ile Ile Tyr Tyr Asp Ser Ser Gln Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
5 1015
Gly <210>81 <211>17 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>81
Asp Leu Pro Phe His Tyr His Arg Ser Ala Ser Phe Ala Pro Ser Asp
5 1015
Thr <210>82 <211>108 <212> ПРТ <213> Homo sapiens
- 94 032003 <400> 82
Glu 1 Ile Val Leu Thr 5 Gln Ser Pro Gly Thr 10 Leu Ser Leu Ser Pro 15 Gly
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ala Val Thr Asn Asn
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Val Tyr Ala Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Tyr
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Ala Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Thr Ser Pro
85 90 95
Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 83
<211> 108
<212> ПРТ
<213> Homo sapiens
<400> 83
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ala Val Thr Asn Asn
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Val Tyr Ala Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Tyr
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Ala Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Thr Ser Pro
85 90 95
Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105
- 95 032003 <210>84 <211>12 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>84
Arg Ala Ser Gln Ala Val Thr Asn Asn Tyr Leu Ala
510 <210>85 <211>7 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>85
Ala Ala Ser Ser Arg Ala Thr <210>86 <211>9 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>86
Gln Gln Tyr Gly Thr Ser Pro Ile Thr <210>87 <211>113 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>87
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
5 1015
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
Arg Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
Ser Tyr Ile Ser Thr Ser Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
- 96 032003
Ala Arg Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
100 105110
Ser <210>88 <211>5 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>88
Ser Tyr Arg Met Asn <210>89 <211>17 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>89
Tyr Ile Ser Thr Ser Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
5 1015
Gly <210>90 <211>4 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>90
Ala Phe Asp Tyr <210>91 <211>12 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>91
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala
510 <210>92 <211>7 <212> ПРТ <213> Homo sapiens
- 97 032003 <400> 92
Gly Ala 1 Ser Ser Arg Ala Thr 5
<210> 93
<211> 9
<212> ПРТ
<213> Homo sapi ens
<400> 93
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Phe Thr <210>94 <211>414 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>94
Met 1 Ser Glu Tyr Ile 5 Arg Val Thr Glu Asp 10 Glu Asn Asp Glu Pro 15 Ile
Glu Ile Pro Ser Glu Asp Asp Gly Thr Val Leu Leu Ser Thr Val Thr
20 25 30
Ala Gln Phe Pro Gly Ala Cys Gly Leu Arg Tyr Arg Asn Pro Val Ser
35 40 45
Gln Cys Met Arg Gly Val Arg Leu Val Glu Gly Ile Leu His Ala Pro
50 55 60
Asp Ala Gly Trp Gly Asn Leu Val Tyr Val Val Asn Tyr Pro Lys Asp
65 70 75 80
Asn Lys Arg Lys Met Asp Glu Thr Asp Ala Ser Ser Ala Val Lys Val
85 90 95
Lys Arg Ala Val Gln Lys Thr Ser Asp Leu Ile Val Leu Gly Leu Pro
100 105 110
Trp Lys Thr Thr Glu Gln Asp Leu Lys Glu Tyr Phe Ser Thr Phe Gly
115 120 125
Glu Val Leu Met Val Gln Val Lys Lys Asp Leu Lys Thr Gly His Ser
130 135 140
Lys Gly Phe Gly Phe Val Arg Phe Thr Glu Tyr Glu Thr Gln Val Lys
145 150 155 160
- 98 032003
Val
Leu
Val
Glu
Pro
225
Gln
Ile
Ser
Phe
Ser
305
Ala
Met
Asn
Ser
Trp
385
Phe
Met Ser Gln Arg His 165 Met Ile Asp Gly 170 Arg Trp Cys Asp Cys 175 Lys
Pro Asn Ser Lys Gln Ser Gln Asp Glu Pro Leu Arg Ser Arg Lys
180 185 190
Phe Val Gly Arg Cys Thr Glu Asp Met Thr Glu Asp Glu Leu Arg
195 200 205
Phe Phe Ser Gln Tyr Gly Asp Val Met Asp Val Phe Ile Pro Lys
210 215 220
Phe Arg Ala Phe Ala Phe Val Thr Phe Ala Asp Asp Gln Ile Ala
230 235 240
Ser Leu Cys Gly Glu Asp Leu Ile Ile Lys Gly Ile Ser Val His
245 250 255
Ser Asn Ala Glu Pro Lys His Asn Ser Asn Arg Gln Leu Glu Arg
260 265 270
Gly Arg Phe Gly Gly Asn Pro Gly Gly Phe Gly Asn Gln Gly Gly
275 280 285
Gly Asn Ser Arg Gly Gly Gly Ala Gly Leu Gly Asn Asn Gln Gly
290 295 300
Asn Met Gly Gly Gly Met Asn Phe Gly Ala Phe Ser Ile Asn Pro
310 315 320
Met Met Ala Ala Ala Gln Ala Ala Leu Gln Ser Ser Trp Gly Met
325 330 335
Gly Met Leu Ala Ser Gln Gln Asn Gln Ser Gly Pro Ser Gly Asn
340 345 350
Gln Asn Gln Gly Asn Met Gln Arg Glu Pro Asn Gln Ala Phe Gly
355 360 365
Gly Asn Asn Ser Tyr Ser Gly Ser Asn Ser Gly Ala Ala Ile Gly
370 375 380
Gly Ser Ala Ser Asn Ala Gly Ser Gly Ser Gly Phe Asn Gly Gly
390 395 400
Gly Ser Ser Met Asp Ser Lys Ser Ser Gly Trp Gly Met
- 99 032003
405
410 <210>95 <211>372 <212> ДНК <213> Homo sapiens <400> 95
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggagac ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agccaggcca tgagttgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcggcc cttagtcgca ctggtgatta cacatggtac 180
gcagactccg tgaggggccg gttcaccgtc tccagagacg attccaaaaa catcttttat 240
ctggaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attattgtgc gaaaaactac 300
tatagtagtt ttggttataa ttgggctgct tttcatatct ggggccaagg gacaatggtc 360
accgtctcct cg 372
<210>96 <211>327 <212> ДНК <213> Homo sapiens <400> 96
gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca ggatgttaac aacaactact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatccc gcagggccac tggcgtccca 180
gacaggttca gtggccgtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcaa cagactggag 240
cctgaagatt ttgcaatgta tttctgtcag cagtatggtg gctcacctcc gtacactttt 300
ggccagggga ccaagctgga gatcaaa 327
<210>97 <211>342 <212> ДНК <213> Homo sapiens <400> 97
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttagttcagc ctggggggtc cctgagaatc 60
tcctgcacaa cgtcaggatt cattttcagc gactattgga tgcactgggt ccgccaagct 120
ccagggaagg ggctcacttg ggtctcacgt attaatcttg atgggagtga caccatctat 180
gcggactccg tgaagggccg attcaccatt tccagagaca acgacaagaa cacactatat 240
ttacaaatga acagtctgag agtcgaggac acggctattt attactgtgc aaggtcaaga 300
aagagtgtct ggggccaagg gacaatggtc accgtctctt cg 342
<210> 98
- 100 032003 <211>330 <212> ДНК <213> Homo sapiens <400> 98
cagtctgccc tgactcagcc tgcctccgtg tctgggtctc ctggacagtc gatcaccatc 60
tcctgcactg gaagcaacac tgacgttggt gcttatgact atgtctcctg gtcccaacaa 120
ctcccgggca aagcccccaa atttgtgatt tttgatgtcg atgttcggcc ctcagggatt 180
tctgatcgct tctctggctc caagtctggc aacacggcct ccctgaccat ctctgggctc 240
caggctgagg acgaggctga ttattattgc agttcatata caaagagcgg cactctggtt 300
ttcggtggag ggaccaaggt gaccgtcgta 330
<210>99 <211>357 <212> ДНК <213> Homo sapiens <400> 99
caggtgcagc tggtgcaatc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60
tcctgcaaga cctctggata ctccttcact agttatactt tacattgggt gcgccaggcc 120
cccggacaca ggcctgagtg gatgggatgg atcaacgctg ccttcattaa cacaaaatat 180
tcacagaagt tccagggcag aatcaccctt accagggaca cgtccgcgaa catagcctac 240
ctggagttga gaagcctgac aactgaggac acggctgtgt attactgtgc gagacgggct 300
tcagggagta acggtttgga cgtctggggc caagggacca cggtcaccgt ctcctcg 357
<210>100 <211>321 <212> ДНК <213> Homo sapiens <400> 100
gacatccaga tgacccagtc gccatcctcc ctgtctgcat ctgtgggaga cagaatcacc 60
atcacttgcc aggcgagtcg tgacattacc aactatttaa attggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaaactcct gatctacgat gcatcctatt tggaaacagg ggtcccatca 180
acgttcagtg gaagtggatc tggcacacat tttactttaa ccatcagcag cctccagcct 240
gacgattttg caacatatta ctgtcaacag tatgattctg tccccctcac tttcggcgga 300
gggaccaagg tggaaatcaa a 321
<210>
<211>
<212>
<213>
101
363
ДНК
Homo sapiens <400>
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaagtc cctgagactc
101
- 101 032003 tcctgtgcag cgtctgggtt caccttcaga gatcatggca tgcactgggt ccgccaggct 120 ccaggcaaag ggctggagtg ggtggcagta atatggcttg atggaagtag tcgcttctat 180 gcagactccg tagaaggccg gttcaccatc tccagagaca actccaagaa tacactatat 240 ctacaactga cgagcctgag agccgaggac acggctattt attactgtgc gagagaccgt 300 gtggcatcag aagggactgc ttttgatgtc tggggccaag ggacaatggt caccgtctct 360 tcg 363 <210>102 <211>315 <212> ДНК <213> Homo sapiens <400> 102
gaaattgtgc tgactcagtc tccagccacc ctgtccttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgct gggccagtca gaatgttaat cattacttag tctggtatca acagagacct 120
ggccaggctc ccaggctcct cctctatgat acatccgtta gggccgctgg catcccagcc 180
aggttcattg gctctgggtc tgggacacac ttcactctca ccatcagcag cctggagcct 240
gaagattctg cagtttatta ctgtcagcac cgtagcgact ggacgttcgg ccaagggacc 300
aaggtggaga tcaaa 315
<210>103 <211>357 <212> ДНК <213> Homo sapiens <400> 103
caggtgcagc tggtgcaatc tggtactgcg gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60
tcctgtaagg catctggatt cagtttcaac ggctattata tgcattgggt gcgacaggcc 120
cctggacagg ggcttgagtg gatgggagtc attaacccta atggtggcag tacaaactac 180
gcacaaaaat tcaagggtag aatcaccatg agcgcggaca cgcccgcgag gtcagtctcc 240
atggagttgg gcagtctgag atctgacgac acggccatgt attactgtgc gagacttccc 300
gtgaatatag aagtccttga cctctggggc cagggcaccc tggtcaccgt ctcctcg 357
<210>104 <211>339 <212> ДНК <213> Homo sapiens <400> 104
gatattgtga tgacccagag tccagactcc ctggctgtgt ctctgggcga gagggccacc 60
atcaactgca ggtcgagcca gactgttttg ttcagctcca acgataagaa ttacttagca 120
tggtatcagc agaaaccagg acagcctcct aaattgctca tttactgggc atctgtccgg 180
- 102 032003
gcatccgggg tccctgaccg attcagtggc agcgggtctg ggacagattt cagtctcacc 240
atcaacggcc tgcaggctga agatgtggca gtttactatt gtcagcaatc ttctactgct 300
ccgctcacct tcggcggagg gaccaaggtg gaaatcaaa 339
<210>105 <211>402 <212> ДНК <213> Homo sapiens <400> 105
caggtgcagc tggtgcaatc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60
tcctgcaagg catctggata caccttcacc aactactata tgcactgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggaata atcaatccta gtggtgggag gacaagctac 180
gcacagaagt tccagggcag agcctccatg accagggaca cgtccaccag cacagtctac 240
atggaggtga tcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc tagacaacgc 300
ccgtcgggat atagtggcta cgggccctca gagtcatacg gtaacccgac agatgatgct 360
tttgatgtct ggggccaagg gaccacggtc accgtctcct cg 402
<210>106 <211>327 <212> ДНК <213> Homo sapiens <400> 106
tcctatgtgc tgactcagcc accctcggtg tcagtggccc caggacagac ggccaggatt 60
acgtgtgggg gaaacaacat tggaagtagg ggtgtacact ggtaccagca gaggccaggc 120
caggcccctg tgttggtcgt ctatgatgat agcgaccggc cctcagggat ccctgagcga 180
ttctctggct ccaactctgg ggacacggcc accctgacca tcagcagggt cgaagtcggg 240
gatgaggccg actattactg tcaggtgtgg gataatagta gtgatcatct tgtggttttc 300
ggcggaggga ccaagctgac cgtccta 327
<210>107 <211>390 <212> ДНК <213> Homo sapiens <400> 107
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt aattatgtta tgtattgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggctttt atatcatatg atggaagcaa taaatactac 180
ccagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccatgaa cacgctgtat 240
ctgcaaatgg acagcctgag agctgaggac acggctgtct attactgtgc gagagacacg 300
- 103 032003 tatcaatatg atagtagcac ttattacccg tacttctact actacggtat ggacgtctgg 360 ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctcg390 <210>108 <211>333 <212> ДНК <213> Homo sapiens <400> 108
cagtctgccc tgactcagcc tgcctccgtg tctgggtctc ctggacagtc gatcaccatc 60
tcctgtattg gaaccagcag tgacgttggt ggttataact atgtctcctg gtaccagcag 120
cacccaggca aagcccccaa actcatgatt tatgaggtca gtaatcggcc ctcaggggtt 180
tctagtcgct tctcaggctc caagtctggc aacacggcct ccctgaccat ctctgggctc 240
cagtctgagg acgaggctga ttattactgc agctcatttg caagcagcag cacttctgtg 300
acgttcggcg gagggaccaa gctgaccgtc cta 333
<210>109 <211>387 <212> ДНК <213> Homo sapiens <400> 109
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttagt agttatgcca tgagttgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagcggtg gaggtgatag aacttactcc 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa caccctgtat 240
ctgcaaataa acagcctgag agttgaggac acggccgtat attactgtgc gcaagggggg 300
gggggggaaa tgaccgcagt aactatggac gggacctact acggtatgga cgtctggggc 360
caagggacca cggtcaccgt ctcctcg 387
<210>110 <211>330 <212> ДНК <213> Homo sapiens <400> 110
cagtctgccc tgactcagcc tcgctcagtg tccgggtctc ctggacagtc aatcaccatc 60
tcctgcactg gaaccagcag taatgttggt acttataagt ttgtctcctg gtaccaacaa 120
caccccggca aagcccccaa actcatgatt tatgatgtca ctaagcggcc ctcaggggtc 180
cctgatcgct tctctggctc caagtctggc aacacggcct ccctgaccat ctctggactc 240
caggctgaag atgaggctga ttattactgc tgctcatatg caggcagtta cacttatgtc 300
ttcggaagtg ggaccaaggt caccgtccta 330
- 104 032003 <210>111 <211>357 <212> ДНК <213> Homo sapiens <400> 111
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggatgtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cagcttcagt agtcatggca tgcactgggt ccgccagact 120
ccaggcaagg ggctggagtg gttggcagta atttcatatg atgcaagtaa caaaagttat 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa gacgctgtat 240
ttgcaaatgg acagcctgag agttgaagac acggctctgt attactgtgc gaatgcgttc 300
agcagttcgg catctggggg ctactggggc cagggcaccc tggtcaccgt ctcctcg 357
<210>112 <211>339 <212> ДНК <213> Homo sapiens <400> 112
gatgttgtga tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccttggaca gccggcctcc 60
atctcctgca ggtccagtca aagcctcgtt cacagtgatg gagtcaccta cttgaattgg 120
tttcaacaga ggccaggcca atctccaagg cgcctaattt ataaggtttc taatcgggac 180
tctggggtcc cagacagatt cagcggcagt gggtcaggca ctgatttcac actggaaatc 240
agcagggtgg aggctgagga tgttgggatt tattactgca tgcaaggtac acactggcct 300
ccctggacgt tcggccaagg gaccaaggtg gaaatcaaa 339
<210>113 <211>378 <212> ДНК <213> Homo sapiens <400> 113
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagt agctatggca tgcactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcgatt atatactatg attcaagtca gagatactat 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cgcgctgtat 240
ctgcaaatga atagcctgag ggccgaggac accgctctgt attactgtgc gagagatctt 300
ccgtttcact atcatagaag tgcctctttc gcaccttcgg acacctgggg ccagggaacc 360
ctggtcaccg tctcctcg 378
<210>114 <211>324
- 105 032003 <212> ДНК <213> Homo sapiens <400> 114
gaaattgtgc tgactcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccggggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca ggctgttacc aacaactact tagcctggta ccagcaaaaa 120
cctggccagg ctcccagact cctcgtctat gctgcatcca gcagggccac tggcatccca 180
gacagattct atggcagtgg gtctggggcg gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag caatatggta cctcaccgat caccttcggc 300
caagggacac gactggagat taaa 324
<210>115 <211>339 <212> ДНК <213> Homo sapiens <400> 115
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt agctatagga tgaactgggt ccgtcaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtttcatac attagtacta gtagtagtac catatactac 180
gcagactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa ctcactgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagcattc 300
gactactggg gccagggaac cctggtcacc gtctcctcg 339
<210>116 <211>324 <212> ДНК <213> Homo sapiens <400> 116
gaaattgtgc tgactcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcat cagactggag 240
cctgaagact ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcaccgtt cacttttggc 300
caggggacca aggtggagat caaa 324
<210> 117
<211> 122
<212> ПРТ
<213> Artificial
<220>
<223> His-huTDP43 domain I
- 106 032003 <400> 117
Met Arg 1 Gly Ser His 5 His His His His His 10 Gly Leu Val Pro Arg 15 Gly
Ser Ser Glu Tyr Ile Arg Val Thr Glu Asp Glu Asn Asp Glu Pro Ile
20 25 30
Glu Ile Pro Ser Glu Asp Asp Gly Thr Val Leu Leu Ser Thr Val Thr
35 40 45
Ala Gln Phe Pro Gly Ala Cys Gly Leu Arg Tyr Arg Asn Pro Val Ser
50 55 60
Gln Cys Met Arg Gly Val Arg Leu Val Glu Gly Ile Leu His Ala Pro
65 70 75 80
Asp Ala Gly Trp Gly Asn Leu Val Tyr Val Val Asn Tyr Pro Lys Asp
85 90 95
Asn Lys Arg Lys Met Asp Glu Thr Asp Ala Ser Ser Ala Val Lys Val
100 105 110
Lys Arg Ala Val Gln Lys Thr Ser Asp Leu
115 120 <210> 118 <211> 123 <212> ПРТ <213> Artificial <220>
<223> His-huTDP43 domain II
<400> 118
Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Leu Val Pro Arg Gly
1 5 10 15
Ser Ala Val Gln Lys Thr Ser Asp Leu Ile Val Leu Gly Leu Pro Trp
20 25 30
Lys Thr Thr Glu Gln Asp Leu Lys Glu Tyr Phe Ser Thr Phe Gly Glu
35 40 45
Val Leu Met Val Gln Val Lys Lys Asp Leu Lys Thr Gly His Ser Lys
50 55 60
Gly Phe Gly Phe Val Arg Phe Thr Glu Tyr Glu Thr Gln Val Lys Val
65 70 75 80
- 107 032003
Met Ser Gln Arg His 85 Met Ile Asp Gly Arg 90 Trp Cys Asp Cys Lys 95 Leu
Pro Asn Ser Lys Gln Ser Gln Asp Glu Pro Leu Arg Ser Arg Lys Val
100 105 110
Phe Val Gly Arg Cys Thr Glu Asp Met Thr Glu
115 120 <210> 119 <211> 108 <212> ПРТ <213> Artificial <220>
<223> His-huTDP43 domain III <400> 119
Met 1 Arg Gly Ser His 5 His His His His His 10 Gly Leu Val Pro Arg 15 Gly
Ser Ser Gln Asp Glu Pro Leu Arg Ser Arg Lys Val Phe Val Gly Arg
20 25 30
Cys Thr Glu Asp Met Thr Glu Asp Glu Leu Arg Glu Phe Phe Ser Gln
35 40 45
Tyr Gly Asp Val Met Asp Val Phe Ile Pro Lys Pro Phe Arg Ala Phe
50 55 60
Ala Phe Val Thr Phe Ala Asp Asp Gln Ile Ala Gln Ser Leu Cys Gly
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ile Ile Lys Gly Ile Ser Val His Ile Ser Asn Ala Glu
85 90 95
Pro Lys His Asn Ser Asn Arg Gln Leu Glu Arg Ser
100 105
<210> 120
<211> 174
<212> ПРТ
<213> Artificial
<220>
<223> His-huTDP43 domain IV
<400> 120
Met Arg Gly Ser His His His His His
5
His Gly Leu Val Pro Arg Gly
15
- 108 032003
Ser Ser Asn Ala 20 Glu Pro Lys His Asn 25 Ser Asn Arg Gln Leu 30 Glu Arg
Ser Gly Arg Phe Gly Gly Asn Pro Gly Gly Phe Gly Asn Gln Gly Gly
35 40 45
Phe Gly Asn Ser Arg Gly Gly Gly Ala Gly Leu Gly Asn Asn Gln Gly
50 55 60
Ser Asn Met Gly Gly Gly Met Asn Phe Gly Ala Phe Ser Ile Asn Pro
65 70 75 80
Ala Met Met Ala Ala Ala Gln Ala Ala Leu Gln Ser Ser Trp Gly Met
85 90 95
Met Gly Met Leu Ala Ser Gln Gln Asn Gln Ser Gly Pro Ser Gly Asn
100 105 110
Asn Gln Asn Gln Gly Asn Met Gln Arg Glu Pro Asn Gln Ala Phe Gly
115 120 125
Ser Gly Asn Asn Ser Tyr Ser Gly Ser Asn Ser Gly Ala Ala Ile Gly
130 135 140
Trp Gly Ser Ala Ser Asn Ala Gly Ser Gly Ser Gly Phe Asn Gly Gly
145 150 155 160
Phe Gly Ser Ser Met Asp Ser Lys Ser Ser Gly Trp Gly Met
165 170 <210> 121 <211> 430 <212> ПРТ <213> Artificial <220>
<223> His-huTDP43 full- length
<400> 121
Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Leu Val Pro Arg Gly
1 5 10 15
Ser Ser Glu Tyr Ile Arg Val Thr Glu Asp Glu Asn Asp Glu Pro Ile
20 25 30
Glu Ile Pro Ser Glu Asp Asp Gly Thr Val Leu Leu Ser Thr Val Thr
40 45
- 109 032003
Ala Gln Phe 50 Pro Gly Ala Cys 55 Gly Leu Arg Tyr Arg Asn 60 Pro Val
Gln Cys Met Arg Gly Val Arg Leu Val Glu Gly Ile Leu His Ala
65 70 75
Asp Ala Gly Trp Gly Asn Leu Val Tyr Val Val Asn Tyr Pro Lys
85 90 95
Asn Lys Arg Lys Met Asp Glu Thr Asp Ala Ser Ser Ala Val Lys
100 105 110
Lys Arg Ala Val Gln Lys Thr Ser Asp Leu Ile Val Leu Gly Leu
115 120 125
Trp Lys Thr Thr Glu Gln Asp Leu Lys Glu Tyr Phe Ser Thr Phe
130 135 140
Glu Val Leu Met Val Gln Val Lys Lys Asp Leu Lys Thr Gly His
145 150 155
Lys Gly Phe Gly Phe Val Arg Phe Thr Glu Tyr Glu Thr Gln Val
165 170 175
Val Met Ser Gln Arg His Met Ile Asp Gly Arg Trp Cys Asp Cys
180 185 190
Leu Pro Asn Ser Lys Gln Ser Gln Asp Glu Pro Leu Arg Ser Arg
195 200 205
Val Phe Val Gly Arg Cys Thr Glu Asp Met Thr Glu Asp Glu Leu
210 215 220
Glu Phe Phe Ser Gln Tyr Gly Asp Val Met Asp Val Phe Ile Pro
225 230 235
Pro Phe Arg Ala Phe 245 Ala Phe Val Thr Phe 250 Ala Asp Asp Gln Ile 255
Gln Ser Leu Cys Gly Glu Asp Leu Ile Ile Lys Gly Ile Ser Val
260 265 270
Ile Ser Asn Ala Glu Pro Lys His Asn Ser Asn Arg Gln Leu Glu
275 280 285
Ser Gly Arg Phe Gly Gly Asn Pro Gly Gly Phe Gly Asn Gln Gly
290 295 300
Ser
Pro
Asp
Val
Pro
Gly
Ser
160
Lys
Lys
Lys
Arg
Lys
240
Ala
His
Arg
Gly
- 110 032003
Phe 305 Gly Asn Ser Arg Gly 310 Gly Gly Ala Gly Leu 315 Gly Asn Asn Gln
Ser Asn Met Gly Gly Gly Met Asn Phe Gly Ala Phe Ser Ile Asn
325 330 335
Ala Met Met Ala Ala Ala Gln Ala Ala Leu Gln Ser Ser Trp Gly
340 345 350
Met Gly Met Leu Ala Ser Gln Gln Asn Gln Ser Gly Pro Ser Gly
355 360 365
Asn Gln Asn Gln Gly Asn Met Gln Arg Glu Pro Asn Gln Ala Phe
370 375 380
Ser Gly Asn Asn Ser Tyr Ser Gly Ser Asn Ser Gly Ala Ala Ile
385 390 395
Trp Gly Ser Ala Ser Asn Ala Gly Ser Gly Ser Gly Phe Asn Gly
405 410 415
Phe Gly Ser Ser Met Asp Ser Lys Ser Ser Gly Trp Gly Met
420 425 430
<210> 122
<211> 108
<212> ПРТ
<213> ] Homo sapiens
<400> 122
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ile Arg Leu
65 70 75
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser
85 90 95
Gly
320
Pro
Met
Asn
Gly
Gly
400
Gly
Gly
Ser
Leu
Ser
Glu
Pro
- 111 032003
Phe Thr Phe Gly Gln 100 Gly Thr Lys Val 105 Glu Ile Lys
<210> 123
<211> 11
<212> ПРТ
<213> Homo sapiens
<400> 123
Gln Tyr Gly Asp Val Met Asp Val Phe Ile Pro
1 5 10
<210> 124
<211> 11
<212> ПРТ
<213> Homo sapiens
<400> 124
Ala Ala . Ile Gly Trp Gly Ser Ala Ser Asn Ala
1 5 10
<210> 125
<211> 11
<212> ПРТ
<213> Homo sapiens
<400> 125
Asp Met Thr Glu Asp Glu Leu Arg Glu Phe Phe
1 5 10
<210> 126
<211> 7
<212> ПРТ
<213> Homo sapiens
<400> 126
Glu Asp Glu Asn Asp Glu Pro
1 5
<210> 127
<211> 7
<212> ПРТ
<213> Homo sapiens
<400> 127
Val Gln Val Lys Lys Asp Leu
1 5
<210> 128 <211> 7
- 112 032003 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>128
Lys Glu Tyr Phe Ser Thr Phe <210>129 <211>130 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>129
Glu 1 Val Gln Leu Val 5 Glu Ser Gly Gly Gly Val 10 Val Gln Pro Gly 15 Arg
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Val Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Phe Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Met Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Thr Tyr Gln Tyr Asp Ser Ser Thr Tyr Tyr Pro Tyr Phe
100 105 110
Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val
115 120 125
Ser Ser
130 <210>130 <211>113 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>130
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
5 1015
- 113 032003
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 25 Gly Phe Thr Phe Ser Thr 30 Tyr
20
Tyr Met Ser 35 Trp Val Arg Gln Ala 40 Pro Gly Lys Gly Leu 45 Glu Trp Val
Ala Asn 50 Ile Lys Gln Asp Gly 55 Ser Glu Lys Tyr Tyr 60 Val Asp Ser Val
Lys 65 Gly Arg Phe Thr Ile 70 Ser Arg Asp Asn Ala 75 Arg Asn Ser Leu Tyr 80
Leu Gln Met His Ser 85 Leu Arg Ala Glu Asp 90 Thr Ala Val Tyr Tyr 95 Cys
Ala Ser Pro Pro Gly Trp
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100
105
Thr Val
110
Ser
Ser <210>131 <211>10 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>131
Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr Tyr Met Ser 1 510 <210>132 <211>17 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>132
Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys
5 1015
Gly
<210> 133
<211> 4
<212> ПРТ
<213> Homo sapiens
<400> 133
Pro Pro Gly Trp
- 114 032003 <210>134 <211>112 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>134
Asp 1 Ile Val Met Thr 5 Gln Thr Pro Leu Ser 10 Leu Ser Val Thr Pro 15 Gly
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Pro
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Glu Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ser
85 90 95
Ile Gln Leu Pro Val Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 135
<211> 16
<212> ПРТ
<213> Homo sapi ens
<400> 135
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Tyr
1 5 10 15
<210>136 <211>7 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>136
Glu Val Ser Asn Arg Phe Ser <210>137 <211>9 <212> ПРТ <213> Homo sapiens
- 115 032003 <400>137
Met Gln Ser Ile Gln Leu Pro Val Thr <210>138 <211>119 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>138
Gln 1 Val Gln Leu Val 5 Gln Ser Gly Ala Glu 10 Val Lys Lys Pro Gly 15 Ala
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Phe Ile His Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Lys Pro Lys Ser Gly Gly Thr Asp Tyr Ala Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Arg Asp Thr Ser Ile Thr Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Asn Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Lys Tyr Ser Val Pro Asp Ser Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 <210>139 <211>10 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>139
Gly Tyr Ile Phe Thr Asp Tyr Phe Ile His 1 510 <210>140 <211>17 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>140
- 116 032003
Trp Ile Lys
Pro Lys
Ser
Gly
Gly
Thr
Asp
Tyr
Ala
Glu
Lys
Phe
Gln
Gly <210>141 <211>10 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>141
Leu Lys Tyr Ser Val Pro Asp Ser Asp Tyr 1 510 <210>142 <211>112 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>142
Asp 1 Val Val Met Thr 5 Gln Ser Pro Leu Ser 10 Leu Pro Val Thr Leu 15 Gly
Gln Ser Ala Ser 20 Ile Ser Cys Arg Ser 25 Ser Gln Gly Leu Val 30 His Ser
Asp Gly Asn 35 Thr Tyr Leu Asn Trp 40 Phe His Gln Arg Pro 45 Gly Gln Ser
Pro Arg 50 Arg Leu Ile Tyr Lys 55 Val Phe Asn Arg Asp 60 Ser Gly Val Ser
Asp 65 Arg Phe Ser Gly Ser 70 Gly Ser Gly Ser Asp 75 Phe Thr Leu Met Ile 80
Ser Arg Val Glu Ala 85 Glu Asp Val Gly Ile 90 Tyr Tyr Cys Met Gln 95 Gly
Thr Leu Trp Pro 100 Leu Thr Phe Gly Gln 105 Gly Thr Lys Val Glu 110 Ile Lys
<210>143 <211>16 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>143
Arg Ser Ser Gln Gly Leu Val His Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asn
- 117 032003
5 1015 <210>144 <211>7 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>144
Lys Val Phe Asn Arg Asp Ser <210>145 <211>9 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>145
Met Gln Gly Thr Leu Trp Pro Leu Thr <210>146 <211>126 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>146
Glu Val 1 Gln Leu Val 5 Glu Ser Gly Gly Gly Leu 10 Val Lys Pro Gly 15 Gly
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Asn Phe Ser Asn Val
20 25 30
Trp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Lys Ser Lys Asn Asp Gly Gly Thr Thr Glu Tyr Ala Ala
50 55 60
Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Ala Gly Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Thr Asp Pro Tyr His Tyr Phe Asp Met Gly Gly Pro Gly
100 105 110
Phe Gly Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
- 118 032003 <210>
<211>
147 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400> 147
Gly Phe 1 Asn Phe Ser Asn Val Trp Ile Ser
5 10
<210> 148
<211> 19
<212> ПРТ
<213> Homo sapiens
<400> 148
Arg Ile Lys Ser Lys Asn Asp Gly Gly Thr Thr Glu Tyr Ala Ala Pro
5 1015
Val Lys Gly <210>149 <211>15 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>149
Asp Pro Tyr His Tyr Phe Asp Met Gly Gly Pro Gly Phe Gly Pro
5 1015 <210>150 <211>113 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>150
Asp 1 Ile Val Met Thr Gln 5 Ser Pro Asp Ser 10 Leu Ala Val Ser Leu 15 Gly
Glu Arg Ala Thr 20 Ile Asn Cys Lys Ser 25 Gly Gln Ser Val Leu 30 Tyr Arg
Ser Asn Asn 35 Arg Asn Tyr Ile Ala 40 Trp Tyr Gln Gln Lys 45 Pro Gly Gln
Pro Pro 50 Lys Leu Leu Ile Tyr 55 Trp Ala Ser Thr Arg 60 Glu Ser Gly Val
Pro 65 Asp Arg Phe Ser Gly 70 Ser Gly Ser Gly Thr 75 Asp Phe Thr Leu Thr 80
- 119 032003
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp
Val Ala Val
Tyr Tyr Cys Gln Gln
Tyr Tyr Ser
Asn Arg
100
Trp
Thr
Phe
Gly
105
Gln
Gly
Thr
Lys
Val
110
Glu
Ile
Lys <210> 151 <211> 113 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400> 151
Asp 1 Ile Val Met Thr 5 Gln Ser Pro Asp Ser 10 Leu Ala Val Ser Leu 15 Gly
Glu Arg Ala Thr 20 Ile Asn Cys Lys Ser 25 Ser Gln Ser Val Ser 30 Tyr Ser
Ser Asn Asn 35 Lys Asn Phe Leu Ser 40 Trp Tyr Gln Gln Lys 45 Pro Gly Gln
Pro Pro 50 Lys Leu Leu Ile Tyr 55 Trp Ala Ser Thr Arg 60 Glu Ser Gly Val
Pro 65 Asp Arg Phe Ser Gly 70 Ser Gly Ser Gly Thr 75 Asp Phe Thr Leu Thr 80
Ile Ser Ser Leu Gln 85 Ala Glu Asp Val Ala 90 Val Tyr Tyr Cys Gln 95 Gln
Tyr
Ser
Ser
Leu
100
Pro
Ile
Ser
Phe
Gly
105
Gln
Gly
Thr
Arg
Leu
110
Glu
Ile
Lys <210>152 <211>17 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>152
Lys Ser Ser Gln Ser Val Ser Tyr Ser
Ser Asn Asn Lys Asn Phe Leu
15
- 120 032003
Ser
<210> 153
<211> 7
<212> ПРТ
<213> Homo sapiens
<400> 153
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
1 5
<210> 154
<211> 9
<212> ПРТ
<213> Homo sapiens
<400> 154
Gln Gln Tyr Ser Ser Leu Pro Ile Ser <210>155 <211>123 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>155
Glu 1 Val Gln Leu Leu Glu 5 Ser Gly Gly Ala 10 Leu Val Gln Pro Gly 15 Gly
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Phe Ser Arg His
20 25 30
Ala Phe Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ile Ser Ser Gly Ser Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Ala Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Glu Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Glu Val Leu Glu Trp Ser Leu Leu Ser Arg Tyr Met Asp Val
100 105 110
Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
- 121 032003
115
120 <210>156 <211>10 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400> 156
Gly Leu 1 Thr Phe Ser Arg His Ala Phe Ser
5 10
<210> 157
<211> 17
<212> ПРТ
<213> Homo sapiens
<400> 157
Ile Ser Ser Gly Ser Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Ala Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210>158 <211>14 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>158
Glu Val Leu Glu Trp Ser Leu Leu Ser Arg Tyr Met Asp Val
510 <210>159 <211>110 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>159
Gln 1 Ser Val Leu Thr Gln 5 Pro Pro Ser Ala 10 Ser Gly Thr Pro Gly 15 Gln
Arg Val Thr Ile 20 Ser Cys Ser Gly Ser 25 Ser Ser Asn Ile Gly 30 Gly Asn
Thr Val Asn 35 Trp Tyr His Gln Leu 40 Pro Gly Thr Ala Pro 45 Lys Leu Leu
Val Tyr 50 Ser Thr Asn Gln Arg 55 Pro Ser Gly Val Pro 60 Asp Arg Phe Ser
- 122 032003
Gly 65 Ser Lys Ser Gly Thr 70 Ser Ala Ser Leu Ala 75 Ile Ser Gly Leu Gln 80
Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Trp Asp Asp Ser Leu
85 90 95
Asn Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210>160 <211>13 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>160
Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Gly Asn Thr Val Asn
510 <210>161 <211>7 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>161
Ser Thr Asn Gln Arg Pro Ser <210>162 <211>11 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>162
Ala Thr Trp Asp Asp Ser Leu Asn Gly Trp Val
510 <210>163 <211>112 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>163
Gln 1 Val Gln Leu Gln 5 Glu Ser Gly Pro Gly 10 Leu Val Lys Pro Ser 15 Glu
Thr Leu Ser Leu 20 Thr Cys Thr Val Ser 25 Gly Gly Ser Ile Thr 30 Asp Tyr
Tyr Trp Ser 35 Trp Ile Arg Gln Pro 40 Pro Gly Lys Gly Leu 45 Glu Trp Ile
- 123 032003
Gly Tyr 50 Ile His Asp Ser Gly Thr 55 Thr Arg Tyr Asn 60 Pro Ser Leu Thr
Ser Arg Leu Ser Met Ser Leu Asp Thr Ser Thr Asn Gln Val Ser Leu
65 70 75 80
Arg Leu Thr Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys Val Pro Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
100 105 110
<210>164 <211>10 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>164
Gly Gly Ser Ile Thr Asp Tyr Tyr Trp Ser 1 510 <210>165 <211>16 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>165
Tyr Ile His Asp Ser Gly Thr Thr Arg Tyr Asn Pro Ser Leu Thr Ser
5 1015 <210>166 <211>4 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>166
Val Pro Asp Tyr <210>167 <211>113 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>167
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
5 1015
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Asn
2530
- 124 032003
Gln Gln Lys Pro Gly Gln
Ser Asp Asn 35 Lys Asn Tyr Leu Ala 40 Trp
Pro Pro Lys Val Leu Ile Tyr Trp Ala
50 55
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser
65 70
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val
85
Tyr Tyr Ser Val Pro Phe Thr Phe Gly
100 105
Lys
<210> 168
<211> 17
<212> ПРТ
<213> Homo sapi ens
<400> 168
Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Asn
1 5
Ala
Thr Arg Glu Phe Gly Val
Thr Asp Phe Thr Leu Thr
80
Val Tyr Tyr Cys His Gln
Gly Thr Lys Val Glu Ile
110
Asp Asn Lys Asn Tyr Leu
<210> 169
<211> 7
<212> ПРТ
<213> Homo sapiens
<400> 169
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Phe
1 5
<210> 170
<211> 9
<212> ПРТ
<213> Homo sapiens
<400> 170
His Gln Tyr Tyr Ser Val Pro Phe Thr
1 5
- 125 032003 <210>171 <211>116 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>171
Gln 1 Val Gln Leu Gln Glu 5 Ser Gly Pro Gly 10 Val Val Lys Pro Ser 15 Gln
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Val Gly Ser Gly
20 25 30
Asp Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg His His Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Tyr Ile Ser Phe Phe Gly Ser Ser Asn Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Gly Arg Val Ser Met Ser Val Asp Thr Ser Asn Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Asn Leu Lys Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Phe
85 90 95
Cys Ala Thr Gly Asn Ala Tyr Ser Phe Trp Gly Gln Gly Thr Met Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 172
<211> 12
<212> ПРТ
<213> Homo sapi ens
<400> 172
Gly Val Ser Val Gly Ser Gly Asp Tyr Tyr Trp Ser
1 5 10
<210> 173
<211> 16
<212> ПРТ
<213> Homo sapi ens
<400> 173
Tyr Ile Ser Phe Phe Gly Ser Ser Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Gly
1 5 10 15
<210>174 <211>6
- 126 032003 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>174
Gly Asn Ala Tyr Ser Phe <210>175 <211>108 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>175
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Ile Gly Thr His
20 25 30
Asn Leu Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Ile Ile Tyr Glu Ile Phe Glu Arg Pro Ser Gly Ile Ser Ser Arg Phe
50 55 60
Thr Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys Cys Ala Tyr Ser Val Thr
85 90 95
Val Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 176
<211> 14
<212> ПРТ
<213> Homo sapi ens
<400> 176
Thr Gly Thr Ser Ser Asp Ile Gly Thr His Asn Leu Val Ser
5 10 <210>177 <211>7 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>177
Glu Ile Phe Glu Arg Pro Ser
- 127 032003 <210>178 <211>8 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>178
Cys Ala Tyr Ser Val Thr Val Ile <210>179 <211>112 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>179
Glu 1 Val Gln Leu Val 5 Glu Ser Gly Gly Asp 10 Leu Val Gln Pro Gly 15 Gly
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Leu Gly Asp Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Val Pro Gly Lys Gly Leu Val Trp Val
35 40 45
Ser Arg Ile Ser Ser Asp Gly Ala Ser Val Ser Tyr Ala Asp Phe Val
50 55 60
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Gly Asn Ala Arg Asn Thr Leu Phe
65 70 75 80
Leu Glu Leu Asn Ser Leu Arg Leu Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Met Gly Val Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
100 105 110
<210> 180
<211> 10
<212> ПРТ
<213> Homo sapiens
<400> 180
Gly Phe Asn Leu Gly Asp Tyr Trp Met His
1 5 10
<210>181 <211>17 <212> ПРТ
- 128 032003 <213> Homo sapiens <400> 181
Arg Ile Ser Ser Asp Gly Ala Ser Val Ser Tyr Ala Asp Phe Val Glu
1 5 10 15
Gly
<210>182 <211>3 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>182
Gly Val Val <210>183 <211>108 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>183
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val 10 Ser Val Ser Pro Gly 15 Gln
1 5
Thr Ala Thr Ile Ser Cys Ser Gly Asp Ala Leu Pro Lys Arg Tyr Ala
20 25 30
Tyr Trp Tyr Lys Gln Lys Ser Gly Gln Val Pro Val Leu Ile Ile Tyr
35 40 45
Glu Asp Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Ser Ser Gly Thr Met Ala Thr Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Val Asp
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Tyr Ser Ser Asp Asn Ser Asp Thr Tyr
85 90 95
Ser Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 <210>184 <211>11 <212> ПРТ <213> Homo sapiens
- 129 032003 <400>184
Ser Gly Asp Ala Leu Pro Lys Arg Tyr Ala Tyr
510 <210>185 <211>7 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>185
Glu Asp Asn Lys Arg Pro Ser <210>186 <211>11 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>186
Tyr Ser Ser Asp Asn Ser Asp Thr Tyr Ser Val
510 <210>187 <211>126 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>187
Gln 1 Val Gln Leu Val 5 Glu Ser Gly Gly Gly Val 10 Val Gln Pro Gly 15 Arg
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Leu Ile Tyr Tyr Asp Ala Thr Gln Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Ala Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ala Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Leu Pro Tyr His Tyr His Arg Ser Ala Ser Phe Ala Pro
100 105 110
- 130 032003
Ala Asp Thr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120125 <210>188 <211>10 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>188
Arg Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met His
510 <210>189 <211>17 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>189
Leu Ile Tyr Tyr Asp Ala Thr Gln Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
5 1015
Gly <210>190 <211>17 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>190
Asp Leu Pro Tyr His Tyr His Arg Ser Ala Ser Phe Ala Pro Ala Asp
5 1015
Thr <210>191 <211>108 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>191
Glu 1 Ile Val Leu Thr 5 Gln Ser Pro Gly Thr 10 Leu Ser Leu Ser Pro 15 Gly
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Thr Ile Ser Asn Asn
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
- 131 032003
Val Tyr Ala Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Tyr
Gly Ser Gly Ser Gly Ala Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
Pro Glu Asp Phe Val Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100105 <210>192 <211>12 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>192
Arg Ala Ser Gln Thr Ile Ser Asn Asn Tyr Leu Ala
510 <210>193 <211>7 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>193
Ala Ala Ser Ser Arg Ala Thr <210>194 <211>9 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>194
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Ile Thr <210>195 <211>120 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>195
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
5 1015
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
- 132 032003
Ser Met Ser Trp Val 35 Arg Gln Ala 40 Pro Gly Lys Gly Leu 45 Glu Trp Val
Ala Thr Val Gly Tyr Gly Gly Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Glu Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Ala Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys Ala Asn Tyr Gly Gly Asn Arg Phe Gly Leu Asp Val Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210>196 <211>10 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>196
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ser Met Ser 1 510 <210>197 <211>16 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>197
Thr Val Gly Tyr Gly Gly Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
5 1015
<210> 198
<211> 12
<212> ПРТ
<213> Homo sapiens
<400> 198
Ala Asn Tyr Gly Gly Asn Arg Phe Gly Leu Asp Val
1 5 10
<210> 199
<211> 111
<212> ПРТ
<213> Homo sapiens
- 133 032003 <400> 199
Gln 1 Ser Ala Leu Thr 5 Gln Pro Pro Ser Ala 10 Ser Gly Ser Pro Gly 15 Gln
Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
20 25 30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln His Gln Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Met Ile Tyr Glu Val Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Val Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Ala Gly Ser
85 90 95
Asn Asn Leu Gly Val Phe Gly Thr Gly Thr Glu Val Thr Val Leu
100 105 110
<210>200 <211>14 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>200
Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser
510 <210>201 <211>7 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>201
Glu Val Ser Lys Arg Pro Ser <210>202 <211>11 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>202
Ser Ser Tyr Ala Gly Ser Asn Asn Leu Gly Val
510
- 134 032003 <210>203 <211>120 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>203
Glu Val 1 Gln Leu Leu 5 Glu Ser Gly Gly Gly Leu 10 Val Gln Pro Gly 15 Gly
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Pro Ala Arg Gly Asp Lys Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ile Ser Lys Ser Ala Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Ala His His Leu Tyr Asn Lys Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210>204 <211>10 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>204
Gly Phe Thr Phe Arg Asn Tyr Ala Met Ala 1 510 <210>205 <211>17 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>205
Ala Ile Pro Ala Arg Gly Asp Lys Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Arg
5 1015
Gly
- 135 032003 <210>206 <211>11 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>206
Ala His His Leu Tyr Asn Lys Asn Phe Asp Tyr
510 <210>207 <211>104 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>207
Glu 1 Ile Val Leu Thr 5 Gln Ser Pro Gly Thr 10 Leu Ser Leu Ser Pro 15 Gly
Glu Thr Val Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Arg Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Tyr Gly Thr Phe Gly
85 90 95
Gln Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys
100
<210> 208
<211> 12
<212> ПРТ
<213> Homo sapiens
<400> 208
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Asn Leu Ala
1 5 10
<210>209 <211>7 <212> ПРТ
- 136 032003 <213> Homo sapiens <400>209
Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr <210>210 <211>5 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>210
Gln His Tyr Gly Thr <210>211 <211>123 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>211
Glu Val 1 Gln Leu Leu 5 Glu Ser Gly Gly Gly Ser 10 Val Gln Pro Gly 15 Gly
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Val Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Arg Arg Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Arg Trp Leu Thr Gly Arg Thr Gly Gly Val Phe Asp Ile
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210>212 <211>10 <212> ПРТ <213> Homo sapiens
- 137 032003 <400> 212
Gly Phe Thr
Phe Ser
Thr
Tyr
Val
Met
Ser <210>
<211>
<212>
<213>
213
ПРТ
Homo sapiens <400>
213
Ala Ile Ser
Arg Arg
Gly
Gly
Ser
Thr
Tyr
Tyr
Ala
Asp
Ser
Val
Lys
Gly <210>214 <211>14 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>214
Asp Arg Trp Leu Thr Gly Arg Thr Gly Gly Val Phe Asp Ile
510 <210>215 <211>107 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>215
Asp 1 Ile Gln Met Thr 5 Gln Ser Pro Ser Ser 10 Leu Ser Ala Ser Val 15 Gly
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu 55 Thr Gly Val Pro Ser 60 Arg Phe Ser Gly
50
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Asn Leu Pro Leu
85 90 95
- 138 032003
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val 100 Glu Ile Lys 105
<210> 216
<211> 11
<212> ПРТ
<213> Homo sapiens
<400> 216
Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn
510 <210>217 <211>7 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>217
Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr <210>218 <211>9 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>218
Gln Gln Tyr Asp Asn Leu Pro Leu Thr <210>219 <211>120 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>219
Glu 1 Val Gln Leu Leu 5 Glu Ser Gly Gly Gly Leu 10 Val Gln Pro Gly 15 Gly
Ser Leu Arg Leu 20 Ser Cys Ala Ala Ser 25 Gly Tyr Thr Phe Ser 30 Tyr Tyr
Ala Met Ser 35 Trp Val Arg Gln Ala 40 Pro Gly Lys Gly Leu 45 Glu Trp Val
Ser Thr 50 Ile Gly Asp Ser Gly 55 Ser Thr Thr His Tyr 60 Ala Asp Ser Val
Lys 65 Gly Arg Phe Thr Ile 70 Ser Arg Asp Asn Ser 75 Lys Ser Thr Leu Tyr 80
- 139 032003
Leu
Gln
Met
Asn
Ser
Leu
Arg
Ala
Glu
Asp
Thr
Ala
Val
Tyr
Tyr
Cys
Ala
Lys
Gly
Leu
100
Gly
Pro
Val
Ala
Ala
105
Ile
Gly
Asp
Tyr
Trp
110
Gly
Gln
Gly
Thr
Leu
115
Val
Thr
Val
Ser
Ser
120 <210>220 <211>10 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>220
Gly Tyr Thr Phe Ser Tyr Tyr Ala Met Ser 1 510 <210>221 <211>17 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>221
Thr Ile Gly Asp Ser Gly Ser Thr Thr His Tyr Ala Asp Ser Val Lys
5 1015
Gly <210>222 <211>11 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>222
Gly Leu Gly Pro Val Ala Ala Ile Gly Asp Tyr
510 <210>223 <211>110 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>223
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
5 1015
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn
2530
- 140 032003
Asn Val Tyr 35 Trp Tyr Gln Gln Leu 40 Pro Gly Thr Ala Pro 45 Lys Leu
Val Tyr Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Val
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Ser Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu
65 70 75
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser
85 90 95
Arg Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100 105 110
Leu
Ser
Arg
Leu <210>224 <211>13 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>224
Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Asn Val Tyr
510 <210>225 <211>7 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>225
Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser <210>226 <211>11 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>226
Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Arg Gly Tyr Val
510 <210>227 <211>115 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>227
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly
Arg
- 141 032003
Phe Thr Phe Asp Asn Tyr
1 5
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser
20 25
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro
35 40
Ala Val Ile Ser Tyr Gly Gly Asp His
50 55
Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp
65 70
Leu Gln Met His Ser Leu Arg Pro Asp
85
Ala Thr Gly Val Thr Pro Asp Phe Trp
100 105
Val Ser Ser
115
<210> 228
<211> 5
<212> ПРТ
<213> Homo sapi ens
<400> 228
Asn Tyr Gly Met His
1 5
<210> 229
<211> 17
<212> ПРТ
<213> Homo sapi ens
<400> 229
Val Ile Ser Tyr Gly Gly Asp His Gln
1 5
Asp
Lys Gly Leu Glu Trp Leu
Phe Tyr Gly Asp Ser Val
Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
80
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
Gln Gly Thr Leu Val Thr
110
Tyr Gly Asp Ser Val Lys
<210> 230
<211> 6
<212> ПРТ
<213> Homo sapiens
<400> 230
- 142 032003
Gly Val Thr Pro Asp Phe <210>231 <211>113 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>231
Asp 1 Val Val Met Thr 5 Gln Ser Pro Leu Ser 10 Leu Pro Val Thr Leu 15 Gly
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Lys Val Ser His Arg Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Gly
85 90 95
Thr His Trp Pro Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 232
<211> 16
<212> ПРТ
<213> Homo sapi ens
<400> 232
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asn
1 5 10 15
<210>233 <211>7 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>233
Lys Val Ser His Arg Asp Ser
- 143 032003 <210>234 <211>10 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>234
Leu Gln Gly Thr His Trp Pro Pro Phe Thr 1 510 <210>235 <211>121 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>235
Glu 1 Val Gln Leu Val 5 Glu Ser Gly Gly Gly Leu 10 Val Asn Pro Gly 15 Gly
Ser Leu Arg Leu 20 Ser Cys Thr Ala Ser 25 Gly Phe Ser Phe Ser 30 Thr Tyr
Ser Met Asn 35 Trp Val Arg Gln Ala 40 Pro Gly Lys Gly Leu 45 Glu Trp Val
Ser Leu 50 Ile Thr Ser Ser Gly 55 Ser Tyr Ile Tyr Tyr 60 Ala Asp Ser Val
Lys 65 Gly Arg Phe Thr Ile 70 Ser Arg Asp Asp Ala 75 Lys Asn Ser Leu Tyr 80
Leu Gln Met Asn Ser 85 Leu Arg Ala Glu Asp 90 Thr Ala Val Tyr Tyr 95 Cys
Ala Asn Met Leu 100 Ala Ala Ala Gly Ser 105 His Tyr Phe His Tyr 110 Trp Gly
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115120 <210>236 <211>5 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>236
Thr Tyr Ser Met Asn
- 144 032003 <210>
<211>
237 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>237
Leu Ile Thr Ser Ser Gly Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
5 1015
Gly <210>238 <211>12 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>238
Met Leu Ala Ala Ala Gly Ser His Tyr Phe His Tyr
510 <210>239 <211>112 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>239
Asp 1 Ile Val Met Thr 5 Gln Thr Pro Leu Ser 10 Ser Pro Val Thr Leu 15 Gly
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Ser Trp Leu Gln Gln Arg Pro Gly Gln Pro
35 40 45
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Ile Ser Glu Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Val
85 90 95
Thr Gln Phe Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210>240
- 145 032003 <211>16 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>240
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Ser
5 1015 <210>241 <211>7 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>241
Lys Ile Ser Glu Arg Phe Ser <210>242 <211>9 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>242
Met Gln Val Thr Gln Phe Pro Ile Thr <210>243 <211>114 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>243
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Met His 35 Trp Val Arg Gln Ala 40 Pro Gly Lys Gly Leu 45 Glu Trp Val
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Lys Tyr Tyr Gly Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Pro Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu
Gln
Met
Asn
Ser
Leu
Arg
Val
Glu
Asp
Thr
Ala
Ile
Tyr
Tyr
Cys
- 146 032003
Val Pro Asp
Ala Phe
100
Asp
Met
Trp
Gly
105
Gln
Gly
Thr
Met
Val
110
Thr
Val
Ser Ser <210> 244 <211> 5 <212> ПРТ
<213> Homo sapiens
<400> 244
Asn Tyr Ala Met His
1 5
<210> 245
<211> 17
<212> ПРТ
<213> Homo sapiens
<400> 245
Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Lys Tyr Tyr Gly Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210>246 <211>5 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>246
Asp Ala Phe Asp Met <210>247 <211>112 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>247
Asp 1 Ile Val Met Thr 5 Gln Thr Pro Leu Ser 10 Ser Pro Val Thr Leu 15 Gly
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Thr
20 25 30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Ser Trp Leu His Gln Arg Pro Gly Gln Pro
35 40 45
- 147 032003
Pro Arg 50 Pro Leu Ile Tyr Lys 55 Met Ser Lys Arg Phe 60 Ser Gly Val Pro
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Glu Thr Glu Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Leu
85 90 95
Thr Gln Phe Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210>248 <211>16 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>248
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Thr Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Ser
5 1015 <210>249 <211>7 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>249
Lys Met Ser Lys Arg Phe Ser <210>250 <211>9 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>250
Leu Gln Leu Thr Gln Phe Pro Ile Thr <210>251 <211>123 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>251
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
5 1015
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
2530
- 148 032003
Ala
Met
Asn
Trp
Val
Arg
Gln
Ala
Pro
Gly
Gln
Gly
Leu
Glu
Trp
Met
Gly
Trp
Ile
Asn
Thr
Asn
Thr
Gly
Asn
Pro
Thr
Tyr
Ala
Gln
Gly
Phe
Thr
Gly
Arg
Phe
Val
Phe
Ser
Leu
Asp
Thr
Ser
Val
Ser
Thr
Ala
Tyr
Leu
Gln
Ile
Ser
Ser
Leu
Lys
Ala
Glu
Asp
Thr
Ala
Val
Tyr
Tyr
Cys
Ala
Arg
Asp
Arg
100
Ile
Asp
Gly
Ser
Ser
105
Trp
Ser
Ser
Trp
Phe
110
Asp
Pro
Trp
Gly
Gln
115
Gly
Thr
Leu
Val
Thr
120
Val
Ser
Ser <210>
<211>
<212>
<213>
252
ПРТ
Homo sapiens <400>
252
Tyr Ala Met
Asn <210>
<211>
<212>
<213>
253
ПРТ
Homo sapiens <400>
253
Trp Ile Asn
Thr Asn
Thr
Gly
Asn
Pro
Thr
Tyr
Ala
Gln
Gly
Phe
Thr
Gly <210>
<211>
<212>
<213>
254
ПРТ
Homo sapiens <400>
254
Asp Arg Ile
Asp Gly
Ser
Ser
Trp
Ser
Ser
Trp
Phe
Asp
Pro
- 149 032003 <210>255 <211>111 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>255
Gln 1 Ser Val Leu Thr Gln 5 Pro Pro Ser Val 10 Ser Gly Ala Pro Gly 15 Gln
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly
20 25 30
Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Phe Asp Ser Ser
85 90 95
Leu Ser Ser Ser Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 256
<211> 14
<212> ПРТ
<213> Homo
<400> 256
Thr Gly Ser
1
<210> 257
<211> 7
<212> ПРТ
<213> Homo
<400> 257
Gly Asn Ser
1
<210> 258
<211> 11
<212> ПРТ
<213> Homo
<400> 258
sapiens sapiens sapiens
Ser Ser
Asn Arg
Asn
Pro
Ile
Ser
Gly
Ala
Gly
Tyr
Asp
Val
His
- 150 032003
Gln Ser Phe Asp Ser Ser Leu Ser Ser Ser Val
510 <210>259 <211>120 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>259
Gln 1 Val Gln Leu Val 5 Gln Ser Gly Ser Glu Leu 10 Lys Lys Pro Gly 15 Ala
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Pro Val Asn Asn Tyr
20 25 30
Ala Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Phe Ile Asn Thr Asn Thr Gly Ile Pro Thr Tyr Ala Gln Gly Phe
50 55 60
Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Ser Gly Leu Lys Ala Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Val Gly Ile Val Gly Val Ile Val Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210>260 <211>5 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>260
Asn Tyr Ala Ile Asn <210>261 <211>17 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>261
Phe Ile Asn Thr Asn Thr Gly Ile
Pro Thr Tyr Ala Gln Gly Phe Thr
- 151 032003
Gly <210>262 <211>11 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>262
Val Gly Ile Val Gly Val Ile Val Phe Asp Tyr
510 <210>263 <211>122 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>263
Asp 1 Val Val Met Thr 5 Gln Ser Pro Asp Ser 10 Leu Ala Val Ser Leu 15 Gly
Glu Arg Ala Thr 20 Ile Asn Cys Lys Ser 25 Ser Gln Ser Val Leu 30 Ser Ser
Ser Lys Asn 35 Lys Asn His Leu Ala 40 Trp Tyr Gln Gln Lys 45 Pro Gly Gln
Pro Pro 50 Lys Leu Leu Ile Tyr 55 Trp Ala Ser Thr Arg 60 Glu Ser Gly Tyr
Trp 65 Ala Ser Thr Arg Glu 70 Ser Gly Val Pro Asp 75 Arg Phe Ser Gly Ser 80
Gly Ser Gly Thr Asp 85 Phe Thr Leu Thr Ile 90 Ser Ser Leu Gln Ala 95 Glu
Asp Val Ala Val 100 Tyr Tyr Cys Gln Gln 105 Tyr Tyr Ser Pro Ser 110 Val Thr
Phe Gly Gly 115 Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 120
<210> 264
<211> 17
<212> ПРТ
<213> Homo sapiens
<400> 264
- 152 032003
Lys Ser Ser
Gln Ser
Val
Leu
Ser
Ser
Ser
Lys
Asn
Lys
Asn
His
Leu
Ala <210>265 <211>7 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>265
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser <210>266 <211>9 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>266
Gln Gln Tyr Tyr Ser Pro Ser Val Thr <210>267 <211>126 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>267
Gln 1 Val Gln Leu Val 5 Glu Ser Gly Gly Gly 10 Val Val Gln Pro Gly 15 Arg
Ser Leu Arg Leu 20 Ser Cys Ala Ala Ser 25 Gly Phe Thr Phe Ser 30 Ser Tyr
Gly Met His 35 Trp Val Arg Gln Ala 40 Pro Gly Lys Gly Leu 45 Glu Trp Val
Ala Ile 50 Ile Tyr Tyr Asp Ser 55 Ser Gln Arg Tyr Tyr 60 Ala Asp Ser Val
Lys 65 Gly Arg Phe Thr Ile 70 Ser Arg Asp Asn Ser 75 Lys Asn Ala Leu Tyr 80
Leu Gln Met Asn Ser 85 Leu Arg Ala Glu Asp 90 Thr Ala Leu Tyr Tyr 95 Cys
Ala Arg Asp Leu Pro Phe His Tyr His Arg Ser Ala Ser Phe Ala Pro
- 153 032003
100
105
110
Thr
Val
Ser
125
Ser Asp Thr
115
Trp Gly
Gln
Gly
Thr
120
Leu
Val
Ser <210>
<211>
<212>
<213>
268
ПРТ
Homo sapiens <400>
268
Ser Tyr Gly
Met His <210>
<211>
<212>
<213>
269
ПРТ
Homo sapiens <400>
269
Ile Ile Tyr
Tyr Asp
Ser
Ser
Gln
Arg
Tyr
Tyr
Ala
Asp
Ser
Val
Lys
Gly <210>
<211>
<212>
<213>
270
ПРТ
Homo sapiens <400>
270
Asp Leu Pro
Phe His
Tyr
His
Arg
Ser
Ala
Ser
Phe
Ala
Pro
Ser
Asp
Thr <210>271 <211>108 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>271
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
5 1015
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ala Val Thr Asn Asn
2530
- 154 032003
Tyr Leu Ala Trp Tyr
Gln Gln Lys Pro Gly
Gln Ala Pro Arg Leu Leu
Val Tyr Ala Ala Ser
Ser Arg Ala Thr Gly
Ile Pro Asp Arg Phe Tyr
Gly Ser Gly Ser Gly
Ala Asp Phe Thr Leu
Thr Ile Ser Arg Leu Glu
80
Pro Glu Asp Phe Ala
Val Tyr Tyr Cys Gln
Gln Tyr Gly Thr Ser Pro
Ile Thr Phe Gly Gln
100
Gly Thr Arg Leu Glu
105
Ile Lys <210>
<211>
<212>
<213>
272
ПРТ
Homo sapiens <400>
272
Arg Ala Ser
Gln Ala
Val
Thr
Asn
Asn
Tyr
Leu
Ala <210>
<211>
<212>
<213>
273
ПРТ
Homo sapiens <400>
273
Ala Ala Ser
Ser Arg
Ala
Thr <210>
<211>
<212>
<213>
274
ПРТ
Homo sapiens <400>
274
Gln Gln Tyr
Gly Thr
Ser
Pro
Ile
Thr <210>
<211>
<212>
<213>
275
339
ДНК
Homo sapiens <400>
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc
275 ctggggggtc cctgagactc tcctgtgcag cctctggatt cacctttagt acctattata tgagctgggt ccgccaggct
120
- 155 032003
ccaggaaagg ggctggagtg ggtggccaac ataaagcaag atggaagtga gaaatactat 180
gtggactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaggaa ctcactgtat 240
ctgcagatgc acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagtccccct 300
gggtggtggg gccagggcac cctggtcacc gtctcctcg 339
<210>276 <211>336 <212> ДНК <213> Homo sapiens <400> 276
gatattgtga tgacccagac tccactctct ctgtccgtca cccctggaca gccggcctcc 60
atctcctgta agtctagtca gagcctcctg catagtgatg gaaagaccta tttgtattgg 120
tacctgcaga agccaggcca gcctccacag ctcctgatct atgaagtttc caaccggttc 180
tctggagtgc cagataggtt cagtggcagc gggtcaggga cagatttcac actgaaaatc 240
agccgggtgg aggctgagga tgttggggtt tattactgca tgcaaagtat acagcttccc 300
gtgactttcg gcggagggac caaggtggag atcaaa 336
<210>277 <211>357 <212> ДНК <213> Homo sapiens <400> 277
caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttccggata catcttcacc gactatttta tacactggat aagacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatggggtgg atcaagccta aaagtggtgg cacagactat 180
gcagagaaat ttcagggcag ggtcaccctg actagggaca cgtccatcac cacagtttat 240
atggaattga gcaggctgaa ttctgacgac acggccgtgt attactgtgc gagacttaag 300
tactcagtgc ctgattcaga ttattggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctcg 357
<210>278 <211>336 <212> ДНК <213> Homo sapiens <400> 278
gatattgtga tgacccagac tccactctct ctgtccgtca cccctggaca gccggcctcc 60
atctcctgta agtctagtca gagcctcctg catagtgatg gaaagaccta tttgtattgg 120
tacctgcaga agccaggcca gcctccacag ctcctgatct atgaagtttc caaccggttc 180
tctggagtgc cagataggtt cagtggcagc gggtcaggga cagatttcac actgaaaatc 240
agccgggtgg aggctgagga tgttggggtt tattactgca tgcaaagtat acagcttccc 300
- 156 032003 gtgactttcg gcggagggac caaggtggag atcaaa
336 <210>279 <211>378 <212> ДНК <213> Homo sapiens <400> 279
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtaaagc ctggggggtc ccttagactc 60
tcctgtgcaa cctctggatt caatttcagt aacgtctgga taagctgggt ccgccaggct 120
ccaggaaagg ggctggagtg ggttggccgt attaaaagca aaaatgatgg tgggacaaca 180
gaatatgctg cacccgtgaa aggcagattc accatctcaa gagatgattc aaaaaatacg 240
gtgtatctcc aaatgaacag cctgaaaacc gaagacgcag gcgtttacta ctgtaccaca 300
gacccgtatc attactttga tatggggggg cctgggttcg gcccctgggg ccagggcacc 360
ctggtcaccg tctcctcg 378
<210>280 <211>339 <212> ДНК <213> Homo sapiens <400> 280
gatattgtga tgactcaatc accagactcc ctggctgtgt ctctgggcga gagggccacc 60
atcaactgca agtccggcca gagtgtttta tacaggtcca ataataggaa ctatatagct 120
tggtatcagc agaaaccagg acagcctcct aagttgctca tttactgggc atctacccgg 180
gaatccgggg tccctgaccg attcagtggc agcgggtctg ggacagattt cactctcacc 240
atcagcagcc tgcaggctga agatgtggca gtttattact gtcaacaata ttatagtaat 300
cgttggacgt tcggccaagg gaccaaggtg gagatcaaa 339
<210>281 <211>339 <212> ДНК <213> Homo sapiens <400> 281
gatattgtga tgactcaatc accagactcc ctggctgtgt ctctgggcga gagggccacc 60
atcaactgca agtccagcca gagtgtttcg tacagctcca acaataagaa cttcttatct 120
tggtaccagc agaaaccagg acagcctcct aagctgctca tttactgggc atctacccgg 180
gaatccgggg tccctgaccg attcagtggc agcgggtctg ggacagattt cactctcacc 240
atcagcagcc tgcaggctga agatgtggca gtttattact gtcagcaata ttctagtctc 300
ccgatctcct tcggccaagg gacacgactg gagattaaa 339
<210>282
- 157 032003 <211>369 <212> ДНК <213> Homo sapiens <400> 282
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggagcc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggact cacttttagc aggcatgcct ttagttgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtcgcaatt agtagtggta gtgggggtaa cacatactac 180
gcagcctccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagacg aatcaaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagtctgag agtcgaggac acggccctgt attactgtgc gaaagaggtc 300
ttggagtggt cattattgag tcgatacatg gacgtctggg gcaaagggac cacggtcacc 360
gtctcctcg 369 <210>283 <211>330 <212> ДНК <213> Homo sapiens <400> 283
cagtctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60
tcttgttctg gaagcagctc caacatcgga ggtaatactg tgaactggta ccaccagctc 120
ccaggaacgg cccccaaact cctcgtctat agtactaatc agcggccctc aggggtccct 180
gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccag 240
gctgaggatg aggctgatta ttactgtgca acatgggatg acagcctgaa tggttgggtg 300
ttcggcggag ggaccaagct gaccgtcctg 330
<210>284 <211>336 <212> ДНК <213> Homo sapiens <400> 284
caggtgcagc tgcaggagtc gggcccaggg ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60
acctgcactg tctctggtgg ctccatcact gattactact ggagttggat ccggcagccc 120
ccagggaagg gactggagtg gattggctat atccatgaca gtgggaccac caggtacaac 180
ccctccctca cgagtcgact cagcatgtca ttagacacgt ccacgaacca ggtctccctg 240
aggttgacct ctgtgaccgc tgcggacacg gccgtgtatt actgtgcgaa agttcctgac 300
tactggggcc agggcaccct ggtcaccgtc tcctcg 336
<210>285 <211>339 <212> ДНК <213> Homo sapiens
- 158 032003 <400> 285 gatattgtga tgactcaatc accagactcc ctggctgtgt ctctgggcga gagggccacc atcaactgca agtccagtca gagtgttttg tacaactccg acaataagaa ctacttagct
120 tggttgcagc agaagccagg acagcctcct aaggtcctca tttactgggc atctacccgg
180 gaattcgggg tccctgaccg attcagtggc agcgggtctg ggacagattt cactctcacc
240 atcagcagcc tgcaggctga agatgtggca gtttattact gtcatcaata ttatagtgtt
300 cccttcactt tcggcggagg gaccaaggtg gagatcaaa
339 <210>286 <211>348 <212> ДНК <213> Homo sapiens <400> 286
caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga gtggtgaagc cttcacagac cctgtccctc 60
acctgcactg tctctggtgt ctccgtcggt agtggtgatt actactggag ttggatccgc 120
caccacccag ggaagggcct ggagtggatt ggatacatct ctttttttgg gagttccaat 180
tacaacccgt ccctcaaggg tcgagtttcc atgtcagtag acacgtctaa caaccagttc 240
tccctgaatt tgaagtctgt gactgccgcg gacacggccg tctatttctg tgccacggga 300
aatgcctatt ctttctgggg ccaggggaca atggtcaccg tctcttcg 348
<210>287 <211>324 <212> ДНК <213> Homo sapiens <400> 287
cagtctgccc tgactcagcc tgcctccgtg tcggggtctc ctggacagtc gatcaccatc 60
tcctgcactg gaaccagcag tgatattggg acccataacc ttgtctcctg gtaccaacaa 120
caccccggca aagcccccaa actcatcatt tatgagatct ttgagcggcc ttcagggatt 180
tcttctcgct tcactggctc caagtctggc aacacggcct ccctgacaat ctctgggctc 240
caggctgagg acgaggctga ttatttctgc tgcgcatatt cagttactgt tatattcggc 300
ggagggacca aattgaccgt cctt 324
<210>
<211>
<212>
<213>
288
336
ДНК
Homo sapiens <400>
288
gaggtgcagc tggtggagtc cgggggagac ctagttcagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtacag cctctggatt caacttaggt gactactgga tgcactgggt ccgccaagtt 120
ccagggaagg ggctggtgtg ggtctcacgt attagtagtg atggagcttc tgtaagttac 180
- 159 032003 gcggacttcg tggagggccg attcaccatc tccagaggca acgccaggaa tacacttttt
240 ctggaactga acagtctgag actcgacgac acggctgtgt attattgtgc catgggggtg
300 gtctggggcc agggcaccct ggtcaccgtc tcctcg
336 <210>289 <211>324 <212> ДНК <213> Homo sapiens <400> 289
tcctatgagc tgactcagcc accctcggtg tcagtgtccc caggacaaac ggccacgatc 60
tcctgctctg gagatgcatt gccaaaaaga tatgcttatt ggtataagca gaagtcaggc 120
caggtccctg ttctgatcat ctatgaggac aacaaacgac cctccgggat ccctgcgaga 180
ttctctggct ccagctccgg gacaatggcc acattgacta tcactggggc ccaggtggac 240
gatgaagctg actactactg ttactcatca gacaatagtg atacttacag tgtgttcggc 300
ggagggacca agctgaccgt ccta 324
<210>290 <211>378 <212> ДНК <213> Homo sapiens <400> 290
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cgtccagatt caccttcagt agctatggca tgcactgggt ccgccaggcg 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcactt atatactatg atgcgactca aaaatattat 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cgcgctgtat 240
ctgcaaatga ctagcctgag ggccgacgac accgctgtct attactgtgc gagagatctt 300
ccgtatcact atcatagaag tgcctctttc gcacctgcgg acacctgggg ccagggaacc 360
ctggtcaccg tctcctcg 378
<210>291 <211>324 <212> ДНК <213> Homo sapiens <400> 291
gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gaccattagc aacaactact tagcctggta ccagcaaaaa 120
cctggccagg ctcccagact cctcgtctat gctgcatcca gcagggccac aggcatccca 180
gacagatttt atggcagtgg gtctggggcg gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgtagtcta ttactgtcag caatacggta gctcaccgat caccttcggc 300
- 160 032003 caagggacac gactggagat taaa
324 <210>292 <211>360 <212> ДНК <213> Homo sapiens <400> 292
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ctggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctattcca tgagctgggt ccgccaggct 120
cctgggaagg ggctggagtg ggtcgcaact gttggttatg gtggtactat ctactacgcc 180
gactccgtga agggccggtt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctgtatctg 240
gaaatgaaca gcctgagagc cgaggccacg gccgtatatt actgtgcgaa agcgaactac 300
ggtggtaacc gcttcggttt ggacgtctgg ggccagggga ccacggtcac cgtctcctcg 360
<210>293 <211>333 <212> ДНК <213> Homo sapiens <400> 293
cagtctgccc tgactcagcc tccctccgcg tccgggtctc ctggacagtc agtcaccatc 60
tcctgcactg gaaccagcag tgacgttggt ggttataact atgtctcctg gtaccaacac 120
cagccaggca aagcccccaa actcatgatt tatgaggtca gtaagcggcc ctcaggggtc 180
cctgatcgct tctctggctc caagtctggc aacacggcct ccctgaccgt ctctgggctc 240
caggctgagg atgaggctga ttactattgc agctcatatg caggcagtaa caatttggga 300
gtcttcggaa ctgggaccga ggtcaccgtc cta 333
<210>294 <211>360 <212> ДНК <213> Homo sapiens <400> 294
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttaga aactatgcca tggcctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagcc attcctgcta ggggtgataa gacatactac 180
gcagactccg tgaggggccg gttcaccatc tccagagaca tttccaagag cgcactgtat 240
ttgcaaatga acagcctgag agtcgaggac acggccgtat actactgtgc gaaagcccac 300
cacctgtaca acaaaaactt tgactactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcctcg 360
<210>295 <211>312
- 161 032003 <212> ДНК <213> Homo sapiens <400> 295
gaaattgtgc tgactcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga gacagtcacc 60
ctctcctgta gggccagtca gagtgttagc agcagcaact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggccgtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cactatggca cttttggcca ggggaccaaa 300
gtggatatca aa 312
<210>296 <211>369 <212> ДНК <213> Homo sapiens <400> 296
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc tcggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctccggatt cacctttagc acctatgtca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtcgtc gtggtggtag cacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacactgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagatcgt 300
tggctaactg gaaggacggg gggtgttttt gatatctggg gccaagggac aatggtcacc 360
369 gtctcttcg <210>297 <211>321 <212> ДНК <213> Homo sapiens <400> 297
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc aggcgagtca ggacattagc aactatttaa attggtatca gcagaagcca 120
gggaaagccc ctaagctcct gatctacgat gcatccaatt tggaaacagg ggtcccatca 180
aggttcagtg gaagtggatc tgggacagat tttactttca ccatcagtag cctgcagcct 240
gaagatactg caacatatta ctgtcaacag tatgataatc tcccgctcac tttcggcgga 300
gggaccaagg tggaaatcaa a 321
<210> <211> <212> <213> 298 360 ДНК Homo sapiens
<400> 298
- 162 032003
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggata cacctttagc tactatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcaacc attggtgata gtggttctac cacacactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagag cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaagggactt 300
ggaccagtgg ctgctattgg tgactactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcctcg 360
<210>299 <211>330 <212> ДНК <213> Homo sapiens <400> 299
cagtctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60
tcttgttctg gaagcagctc caacatcgga agtaataatg tatactggta ccagcagctc 120
ccaggaacgg cccccaaact cctcgtctat aggaataatc agcggccctc aggggtccct 180
gaccgagtct ctggctccaa gtctggctcc tcagcctccc tggccatcag tgggctccgg 240
tccgaggatg aggctgatta ttactgtgca gcatgggatg acagcctgcg tggttatgtc 300
ttcggaactg ggaccaaggt caccgtccta 330
<210>300 <211>345 <212> ДНК <213> Homo sapiens <400> 300
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtgtag cctctggatt caccttcgat aactatggca tgcactgggt acgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg gctggcagtt atatcatatg gtggagatca tcaattctat 180
ggagactccg tgaaggaccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacagcgtat 240
ctgcaaatgc acagcctgag acctgacgac acggctgtct actactgtgc gacgggggtg 300
acccctgatt tttggggcca gggcaccctg gtcaccgtct cctcg 345
<210>
<211>
<212>
<213>
301
339
ДНК
Homo sapiens <400>
301
gatgttgtga tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccttggaca gccggcctcc 60
atctcctgca ggtctagtca aagcctcgta cacagtgatg ggaataccta cttgaattgg 120
tttcagcaga ggccaggcca atctccaagg cgcctaattt ataaggtttc tcaccgggac 180
- 163 032003 tctggggtcc cagatagatt cagcggcagt gggtcaggca ctgatttcac actgaaaatc
240 agcagggtgg aggctgagga tgttggggtt tattactgcc tgcaaggaac acactggcct
300 ccgttcactt ttggccaggg gaccaagctg gagatcaaa
339 <210>302 <211>363 <212> ДНК <213> Homo sapiens <400> 302
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ctggtcaacc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtacag cctctggatt cagcttcagt acctatagca tgaactgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcattg attactagta gtggtagtta catatactac 180
gcagactcag tgaagggccg attcaccatc tccagagacg acgccaagaa ctcactctat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gaatatgttg 300
gcagcagctg gtagtcacta ctttcactac tggggccagg gaaccctggt caccgtctcc 360
tcg 363
<210>303 <211>336 <212> ДНК <213> Homo sapiens <400> 303
gatattgtga tgacccagac tccactctcc tcacctgtca cccttggaca gccggcctct 60
atctcctgca ggtccagtca aagcctcgta cacagtgatg gaaacaccta cttgagttgg 120
cttcagcaga ggccaggcca gcctccaaga ctcctaattt ataagatttc tgaacggttc 180
tctggggtcc cagacagatt cagtggcagt ggggcaggga cagatttcac actgaaaatc 240
agcagggtgg aagctgagga tgtcggggtt tattactgca tgcaagttac acaatttcct 300
atcaccttcg gccaagggac acgactggag attaaa 336
<210>304 <211>342 <212> ДНК <213> Homo sapiens <400> 304
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagt aattatgcca tgcactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atttggtatg atggaagtaa aaaatattat 180
ggcgactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca atcccaagaa cacgttgtat 240
ctacagatga acagtctgag agtcgaagac acggctatat attactgtgt ccccgacgct 300
- 164 032003 tttgatatgt ggggccaagg gacaatggtc accgtctctt cg
342 <210>305 <211>337 <212> ДНК <213> Homo sapiens <400> 305
ggatattgtg atgacccaga ctcctctctc ctcacctgtc acccttgggc agccggcctc 60
catctcctgc aggtctagtc aaagcctcgt acacactgat ggaaagacct acttgagttg 120
gcttcatcag aggccaggcc agcctccaag acccctaatt tataagatgt ctaagcggtt 180
ctctggggtc ccagacagat tcagtggcag tggggcagag acagagttca cactgaaaat 240
cagcagggtg gaagctgagg atgtcggaat ttattactgc ttgcaactta cacaatttcc 300
gatcaccttc ggccaaggga cacgactgga gattaaa 337
<210>306 <211>369 <212> ДНК <213> Homo sapiens <400> 306
caggtgcagc tggtgcagtc tgggtctgag ttgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60
tcctgcaagg cttctggata caccttcact agctatgcta tgaattgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcaacacca acactgggaa cccaacgtat 180
gcccagggct tcacaggacg gtttgtcttc tccttggaca cctctgtcag cacggcatat 240
ctgcagatca gcagcctaaa ggctgaggac actgccgtgt attactgtgc gagagatcgg 300
attgatggca gcagctggtc gtcctggttc gacccctggg gccagggaac cctggtcacc 360
369 gtctcctcg <210>307 <211>334 <212> ДНК <213> Homo sapiens <400> 307
ccagtctgtg ctgacgcagc cgccctcagt gtctggggcc ccagggcaga gggtcaccat 60
ctcctgcact gggagcagct ccaacatcgg ggcaggttat gatgtacact ggtaccagca 120
acttccagga acagccccca aactcctcat ctatggtaac agcaatcggc cctcaggggt 180
ccctgaccga ttctctggct ccaagtctgg cacctcagcc tccctggcca tcactgggct 240
ccaggctgag gatgaggctg attattactg ccagtccttt gacagtagcc tgagtagttc 300
ggtattcggc ggagggacca agctgaccgt ccta 334
<210> 308
- 165 032003 <211>361 <212> ДНК <213> Homo sapiens <400>308 ccaggtgcag ctggtgcaat ctgggtctga gttgaagaag cctggggcct cagtgaaggt60 ttcctgcaag gcttctggat accccgtcaa caactatgcc attaattggg tgcgacaggc120 ccctggacaa gggcttgagt ggatgggctt catcaacacc aacactggga tccccacgta180 tgcccagggc ttcacaggac ggtttgtctt ctccttagac acctctgtca acacggcata240 tctgcagatc agtggcctaa aggctgacga cactgccgtg tattactgtg cgagagtcgg300 tatagtggga gttattgttt ttgactactg gggccaggga accctggtca ccgtctcctc360 g361 <210>309 <211>366 <212> ДНК <213> Homo sapiens <400>309 gatgttgtga tgactcagtc tccagactcc ctggctgtgt ctctgggcga gagggccacc 60 atcaactgca agtccagcca gagtgtttta tccagctcca agaataagaa ccacttagcc 120 tggtaccagc agaaaccagg acagcctcct aagctgctca tctactgggc atctacccgg 180 gaatccggct actgggcatc tacccgggaa tccggggtcc ctgaccgatt cagtggcagc 240 gggtctggga cagattttac tctcaccatc agcagcctgc aggctgaaga tgtggcagtt 300 tattactgtc agcaatatta tagtccttcg gtcactttcg gcggagggac caaggtggaa 360 atcaaa 366 <210> 310 <211> 378 <212> ДНК <213> Homo sapiens <400> 310
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagt agctatggca tgcactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcgatt atatactatg attcaagtca gagatactat 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cgcgctgtat 240
ctgcaaatga atagcctgag ggccgaggac accgctctgt attactgtgc gagagatctt 300
ccgtttcact atcatagaag tgcctctttc gcaccttcgg acacctgggg ccagggaacc 360
ctggtcaccg tctcctcg 378
<210> 311
- 166 032003 <211>
<212>
<213>
324
ДНК
Homo sapiens
<400> 311
gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccggggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca ggctgttacc aacaactact tagcctggta ccagcaaaaa 120
cctggccagg ctcccagact cctcgtctat gctgcatcca gcagggccac tggcatccca 180
gacagattct atggcagtgg gtctggggcg gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag caatatggta cctcaccgat caccttcggc 300
caagggacac gactggagat taaa 324
<210> 312
<211> 12
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 312
ugugugugug ug
<210> 313
<211> 12
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 313
uuuuuuuuuu uu <210>314 <211>27 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>314
Ser Ile Asn Pro Gly Gly Gly Ala Ala Ala Gln Ala Ala Leu Gln Ser
5 1015
Ser Trp Gly Met Met Gly Met Leu Ala Ser Gln
25 <210>315 <211>7 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>315
Ile Ile Lys Gly Ile Ser Val
- 167 032003 <210> 316 <211> 7 <212> ПРТ
<213> <400> Asn Gln 1 Homo 316 Ser sapiens Gly
Gly Pro 5 Ser
<210> 317
<211> 7
<212> ПРТ
<213> Homo sapiens
<400> 317
Phe Asn Gly Gly Phe Gly Ser
1 5
<210> 318
<211> 11
<212> ПРТ
<213> Homo sapiens
<400> 318
Phe Gly Asn Ser Arg Gly Gly Gly Ala Gly Leu
1 5 10
<210> 319
<211> 11
<212> ПРТ
<213> Homo sapiens
<400> 319
Ser Asn Ala Gly Ser Gly Ser Gly Phe Asn Gly
1 5 10
<210> 320
<211> 11
<212> ПРТ
<213> Homo sapiens
<400> 320
Gln Leu Glu Arg Ser Gly Arg Phe Gly Gly Asn
1 5 10
<210> 321
<211> 7
<212> ПРТ
<213> Homo sapiens
<400> 321
Glu Ile Pro Ser Glu Asp Asp
- 168 032003 <210> 322 <211> 11 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400> 322
Phe Asn Gly Gly Phe Gly Ser Ser Met Asp 10 Ser
1 5
<210> 323
<211> 27
<212> ПРТ
<213> Homo sapiens
<400> 323
Ser Ile Asn Pro Ala Met Met Ala Ala Ala Gln Ala Ala Leu Gln Ser
1 5 10 15
Ser Trp Gly Met Met Gly Met Leu Ala Ser Gln
20 25
<210> 324
<211> 12
<212> ПРТ
<213> Homo sapiens
<220> <221> MOD_RES
<222> (7)..(8)
<223> ФОСФОРИЛЯЦИЯ
<400> 324
Cys Asn Gly Gly Phe Gly Ser Ser Met Asp Ser Lys
1 5 10
<210> 325
<211> 11
<212> ПРТ
<213> Homo sapiens
<220> <221> MOD_RES
<222> (6)..(7)
<223> ФОСФОРИЛЯЦИЯ
<400> 325
Cys Met Asp Ser Lys Ser Ser Gly Trp Gly Met
1 5 10
- 169 032003 <210>326 <211>17 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400>326
Lys Ser Gly Gln Ser Val
Leu Tyr Arg Ser Asn Asn Arg Asn Tyr Ile
15
Ala
<210> 327
<211> 7
<212> ПРТ
<213> Homo sapiens
<400> 327
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
1 5
<210> 328
<211> 9
<212> ПРТ
<213> Homo sapiens
<400> 328
Gln Gln Tyr Tyr Ser Asn Arg Trp Thr
1 5
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Claims (22)

1. Ahtu-TDP-43 (TAR-ДНК-связывающий белок 43кДа) антитело или его TDP-43-связывающий фрагмент, содержащий вариабельный домен тяжелой цепи (VH) и вариабельный домен легкой цепи (VL), причем указанный VH содержит гипервариабельные участки (CDR) Vh-CDR1, Vh-CDR2 и Vh-CDR3 и указанный VL содержит гипервариабельные участки Vl-CDR1, Vl-CDR2 и Vl-CDR3, где Vh-CDR1, VhCDR2 и Vh-CDR3 состоят из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 131, 132 и 133 соответственно, и Vl-CDR1, Vl-CDR2 и Vl-CDR3 состоят из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 135, 136 и 137 соответственно.
2. Ahtu-TDP-43 антитело или TDP-43-связывающий фрагмент по п.1, где VH состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 130, и VL состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 134.
3. Ahtu-TDP-43 (TAR-ДНК-связывающий белок 43кДа) антитело или его TDP-43-связывающий фрагмент, содержащий вариабельный домен тяжелой цепи (VH) и вариабельный домен легкой цепи (VL), причем указанный VH содержит гипервариабельные участки (CDR) Vh-CDR1, Vh-CDR2 и Vh-CDR3 и указанный VL содержит гипервариабельные участки Vl-CDR1, Vl-CDR2 и Vl-CDR3, где Vh-CDR1, VhCDR2 и Vh-CDR3 состоят из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 260, 261 и 262 соответственно, и Vl-CDR1, Vl-CDR2 и Vl-CDR3 состоят из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 264, 265 и 266 соответственно.
4. Ahtu-TDP-43 антитело или TDP-43-связывающий фрагмент по п.2, где VH состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 259, и VL состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 263.
5. Ahtu-TDP-43 антитело или TDP-43-связывающий фрагмент по любому из пп.1-4, отличающееся тем, что является человеческим антителом или химерным антителом.
- 170 032003
6. TDP-43-связывающий фрагмент по любому из пп.1-5, отличающийся тем, что TDP-43связывающий фрагмент выбран из группы, состоящей из одноцепочечного фрагмента Fv (scFv), фрагмента F(ab'), фрагмента F(ab) и фрагмента F(ab')2.
7. Выделенный полинуклеотид, который содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую анти-TDP-43 антитело или TDP-43-связывающий фрагмент по любому из пп.1-6.
8. Выделенный полинуклеотид по п.7, где нуклеотидная последовательность, кодирующая VH, состоит из последовательности нуклеиновой кислоты, представленной в SEQ ID NO: 275, и нуклеотидная последовательность, кодирующая VL, состоит из последовательности нуклеиновой кислоты, представленной в SEQ ID NO: 276.
9. Выделенный полинуклеотид по п.7, где нуклеотидная последовательность, кодирующая VH, состоит из последовательности нуклеиновой кислоты, представленной в SEQ ID NO: 308, и нуклеотидная последовательность, кодирующая VL, состоит из последовательности нуклеиновой кислоты, представленной в SEQ ID NO: 309.
10. Вектор, который содержит полинуклеотид по любому из пп.7-9.
11. Выделенная клетка-хозяин, которая содержит полинуклеотид по любому из пп.7-9, или вектор по п.10.
12. Способ получения анти-TDP-43 антитела или его TDP-43-связывающего фрагмента, включающий:
(a) культивирование клетки-хозяина по п.11 и (b) выделение указанного анти-TDP-43 антитела или его TDP-43-связывающего фрагмента из культуры.
13. Выделенное анти-TDP-43 антитело или его TDP-43-связывающий фрагмент, полученное способом по п.12.
14. Анти-TDP-43 антитело или его TDP-43-связывающий фрагмент по любому из пп.1-6 или 13, отличающееся тем, что помечено детектируемой меткой, выбранной из группы, состоящей из фермента, радиоизотопа, флюорофора и тяжелого металла.
15. Анти-TDP-43 антитело или его TDP-43-связывающий фрагмент по любому из пп.1-6 или 13, отличающееся тем, что присоединено к лекарственному средству.
16. Фармацевтическая композиция для профилактического или терапевтического лечения TDP-43 протеинопатии, содержащая анти-TDP-43 антитело или его TDP-43-связывающий фрагмент по любому из пп.1-6 или 13-15 и фармацевтически приемлемый носитель.
17. Диагностическая композиция, содержащая анти-TDP-43 антитело или его TDP-43-связывающий фрагмент по любому из пп.1-6 или 13-15, и диагностический реагент.
18. Применение анти-TDP-43 антитела или его TDP-43-связывающего фрагмента по любому из пп.1-6 или 13-15 в профилактике или терапевтическом лечении TDP-43 протеинопатии у субъекта, представляющего собой человека, причем TDP-43 протеинопатия выбрана из группы, состоящей из болезни аргирофильных волокон, болезни Альцгеймера, бокового амиотрофического склероза (БАС), комплекса деменция-БАС-паркинсонизм Гуам, кортикобазальной дегенерации, деменции с тельцами Леви, болезни Хантингтона, болезни телец Леви, болезни двигательных нейронов, лобно-височной дегенерации (ЛВД), лобно-височной деменции, лобно-височной дегенерации с убиквитин-положительными включениями, склероза гиппокампа, миопатии с тельцами включения, миозита с тельцами включения и болезни Паркинсона.
19. Применение фармацевтической композиции по п.16 в профилактическом или терапевтическом лечении TDP-43 протеинопатии у субъекта, представляющего собой человека, причем TDP-43 протеинопатия выбрана из группы, состоящей из болезни аргирофильных волокон, болезни Альцгеймера, комплекса деменция-БАС-паркинсонизм Гуам, кортикобазальной дегенерации, деменции с тельцами Леви, болезни Хантингтона, болезни телец Леви, болезни двигательных нейронов, лобно-височной дегенерации (ЛВД), лобно-височной деменции, лобно-височной дегенерации с убиквитин-положительными включениями, склероза гиппокампа, миопатии с тельцами включения, миозита с тельцами включения и болезни Паркинсона.
20. Способ диагностики TDP-43 протеинопатии у субъекта, представляющего собой человека, включающий:
(a) оценку уровня TDP-43 в образце субъекта с анти-TDP-43 антителом или его TDP-43связывающим фрагментом по любому из пп.1-6 или 13-15 и (b) сравнение уровня TDP-43 со справочным стандартом, который показывает уровень TDP-43 у контрольного субъекта, где разница или сходство между уровнем TDP-43 в образце и справочным стандартом показывает, что субъект страдает от TDP-43 протеинопатии, причем TDP-43 протеинопатия выбрана из группы, состоящей из болезни аргирофильных волокон, болезни Альцгеймера, комплекса деменция-БАСпаркинсонизм Гуам, кортикобазальной дегенерации, деменции с тельцами Леви, болезни Хантингтона, болезни телец Леви, болезни двигательных нейронов, лобно-височной дегенерации (ЛВД), лобновисочной деменции, лобно-височной дегенерации с убиквитин-положительными включениями, склероза
- 171 032003 гиппокампа, миопатии с тельцами включения, миозита с тельцами включения и болезни Паркинсона лобно-височной дегенерации (ЛВД).
21. Применение анти-ТПР-43 антитела или его TDP-43-связывающего фрагмента по п.14 для in vivo детекции TDP-43 у субъекта, представляющего собой человека.
22. Применение по п.21, отличающееся тем, что указанная in vivo детекция включает обнаружение детектируемой метки у субъекта, представляющего собой человека, с помощью позитронноэмиссионной томографии (PET), однофотонной эмиссионной томографии (SPECT), оптического изображения около инфракрасной области (NIR) или магнитно-резонансной томографии (MRI).
EA201490825A 2011-10-28 2012-10-26 Анти-tdp-43 антитело EA032003B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161553113P 2011-10-28 2011-10-28
PCT/IB2012/002905 WO2013061163A2 (en) 2011-10-28 2012-10-26 Tdp-43 specific binding molecules

Publications (3)

Publication Number Publication Date
EA201490825A1 EA201490825A1 (ru) 2015-01-30
EA201490825A8 EA201490825A8 (ru) 2016-09-30
EA032003B1 true EA032003B1 (ru) 2019-03-29

Family

ID=47720540

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201490825A EA032003B1 (ru) 2011-10-28 2012-10-26 Анти-tdp-43 антитело

Country Status (18)

Country Link
US (3) US9587014B2 (ru)
EP (2) EP2771359B1 (ru)
JP (3) JP6240611B2 (ru)
KR (2) KR102032080B1 (ru)
CN (1) CN104159918B (ru)
AU (1) AU2012327211C9 (ru)
BR (1) BR112014010161B1 (ru)
CA (2) CA2853412C (ru)
CL (1) CL2014001074A1 (ru)
EA (1) EA032003B1 (ru)
ES (1) ES2883212T3 (ru)
HK (1) HK1201846A1 (ru)
IL (2) IL232219B (ru)
MX (2) MX357678B (ru)
MY (1) MY167795A (ru)
SG (1) SG11201401735WA (ru)
WO (1) WO2013061163A2 (ru)
ZA (1) ZA201403680B (ru)

Families Citing this family (38)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL199534A (en) 2007-01-05 2013-01-31 Univ Zuerich An isolated human antibody capable of detecting a neoepitope in a disease-related protein, a polynucleotide encoding an antibody, a vector containing the polynucleotide, a host cell containing the polynucleotide or vector, a preparation containing the antibody and related methods and uses.
CN104159918B (zh) * 2011-10-28 2019-09-13 生物国际神经系统科学公司 Tdp-43特异性结合分子
JP6192818B2 (ja) * 2013-06-11 2017-09-06 パウル・シェラー・インスティトゥート 単一アミノ酸分割での変異可能なリガンド−ｇｐｃｒ結合を決定するための方法、および変異リガンドとｇｐｃｒとの対
WO2015117088A2 (en) 2014-01-31 2015-08-06 Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University Antibody based reagents that specifically recognize neurodegenerative disease related forms of the protein tdp-43
CN104497121A (zh) * 2014-08-29 2015-04-08 苏州顺升桥生物科技有限公司 淀粉样蛋白tdp-43及其用途
TWI592423B (zh) * 2014-10-03 2017-07-21 中央研究院 可辨識致病性ｔｄｐ－４３之抗體及其用途
WO2016053610A1 (en) * 2014-10-03 2016-04-07 Academia Sinica Antibodies against pathological forms of tdp-43 and uses thereof
JP2018503596A (ja) 2014-10-03 2018-02-08 アカデミア シニカＡｃａｄｅｍｉａ Ｓｉｎｉｃａ Ｔｄｐ−４３の病理学的形態に対する抗体及びその使用
MA41115A (fr) 2014-12-02 2017-10-10 Biogen Int Neuroscience Gmbh Procédé de traitement de la maladie d'alzheimer
WO2017111166A1 (ja) * 2015-12-25 2017-06-29 国立大学法人東京農工大学 Ｔｄｐ－４３細胞内存在量関連疾患治療剤
WO2017157961A1 (en) 2016-03-14 2017-09-21 Biogen International Neuroscience Gmbh Antibody-dependent cell-mediated phagocytosis assay for reliably measuring uptake of aggregated proteins
MA45715A (fr) 2016-07-25 2019-05-29 Biogen Ma Inc Anticorps anti-hspa5 (grp78) et leurs utilisations
MA47163A (fr) 2016-12-16 2019-11-06 Biogen Ma Inc Facteur 11 de différenciation de croissance activé protéolytiquement stabilisé
BR112019019108A2 (pt) * 2017-03-14 2020-04-22 Five Prime Therapeutics, Inc. anticorpos, ácido nucleico, composições, célula, métodos para preparar de um anticorpo, para tratar um sujeito com câncer, para tratar uma doença infecciosa, para tratar uma inflamação, para identificar um ab, para melhorar a eficácia antitumoral de um ab, para melhorar a farmacocinética de um anticorpo, para seleção de um anticorpo, para melhorar a eficácia de anticorpos, para isolar anticorpos e para detectar vista em uma amostra
US11214613B2 (en) 2017-05-30 2022-01-04 The University Of British Columbia Epitopes in the RNA recognition motif 1 (RRM1) of TDP-43 and misfolding-selective antibodies thereto
SG11202001281WA (en) 2017-08-22 2020-03-30 Biogen Ma Inc Pharmaceutical compositions containing anti-beta amyloid antibodies
WO2019113711A1 (en) 2017-12-14 2019-06-20 University Of Ottawa Exosome packaging and targeted autophagy
US11246857B2 (en) * 2017-12-14 2022-02-15 The Johns Hopkins University Anti-fungal inhibitors
CN111886247A (zh) * 2018-01-05 2020-11-03 Ac免疫有限公司 错折叠tdp-43结合分子
US20210024621A1 (en) * 2018-03-16 2021-01-28 National University Corporation Shiga University Of Medical Science Antibody fragment degrading and removing abnormal tdp-43
TW202019398A (zh) * 2018-06-28 2020-06-01 張翔毓 用於治療或預防構形疾病之方法及藥物篩選方法
MA54070A (fr) 2018-10-29 2021-09-08 Biogen Ma Inc Variants fc5 humanisés et stabilisés pour l'amélioration du transport à travers la barrière hémato-encéphalique
JP2022512388A (ja) * 2018-12-14 2022-02-03 ザ・ユニバーシティ・オブ・ブリティッシュ・コロンビア ミスフォールドｔｄｐ－４３に対する抗体およびその使用方法
EP3972692A1 (en) * 2019-05-23 2022-03-30 AC Immune SA Anti-tdp-43 binding molecules and uses thereof
US20220347258A1 (en) * 2019-08-12 2022-11-03 Macquarie University Compositions and methods for treatment
GB202004863D0 (en) * 2020-04-02 2020-05-20 Univ Oxford Innovation Ltd Method
WO2021222168A2 (en) 2020-04-28 2021-11-04 Sola Biosciences Llc Compositions and methods for the treatment of tdp-43 proteinopathies
AU2021265165A1 (en) * 2020-04-29 2022-12-08 Promis Neurosciences Inc. Single chain antibodies and intrabodies to misfolded TDP-43 and methods of use
CN116615452A (zh) 2020-08-14 2023-08-18 Ac免疫有限公司 人源化抗tdp-43结合分子及其用途
JP2023551542A (ja) 2020-11-30 2023-12-08 エニグマ バイオインテリジェンス，インコーポレイテッド アルツハイマー病の非侵襲的評価
CN112920264B (zh) * 2021-02-08 2022-07-05 武汉大学 Tdp-43蛋白的o-糖基化突变体及其应用
JP6961278B1 (ja) * 2021-03-10 2021-11-05 国立研究開発法人量子科学技術研究開発機構 生体試料中のｔｄｐ−４３を測定する方法及び装置
CA3221254A1 (en) * 2021-05-27 2022-12-01 Mayo Foundation For Medical Education And Research Methods and materials for treating proteinopathies
US20230107901A1 (en) * 2021-10-01 2023-04-06 University Of Utah Research Foundation Pathologic tdp-43 as a biomarker for the diagnosis of tdp-43 proteinopathy
CA3239708A1 (en) 2021-12-03 2023-06-08 Aubin MICHALON Novel potency assay for antibody-based drugs and useful means therefor
AR128540A1 (es) 2022-02-16 2024-05-22 Ac Immune Sa Moléculas de unión anti-tdp-43 humanizadas y usos de las mismas
WO2023194565A1 (en) * 2022-04-08 2023-10-12 Ac Immune Sa Anti-tdp-43 binding molecules
WO2023205579A1 (en) * 2022-04-18 2023-10-26 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for disrupting pathological aggregates

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5688511A (en) * 1991-11-05 1997-11-18 Board Of Regents, The University Of Texas System Cellular protein TDP-43 and regulation of HIV-1 gene expression
WO2008081008A1 (en) * 2007-01-05 2008-07-10 University Of Zurich Method of providing disease-specific binding molecules and targets
WO2009099941A2 (en) * 2008-02-01 2009-08-13 Washington University In St. Louis Sequences associated with tdp-43 proteinopathies and methods of using the same
CN101634656A (zh) * 2009-08-21 2010-01-27 武汉三鹰生物技术有限公司 人tdp-43的单抗包被酶标板的制法及elisa检测试剂盒

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2253633A1 (en) * 1997-12-03 1999-06-03 Boehringer Mannheim Corporation Complex specific antibodies, method of preparation and uses thereof
US8354236B2 (en) * 2006-09-29 2013-01-15 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Detection of neurodegenerative disease
WO2008151055A1 (en) 2007-06-01 2008-12-11 Mayo Foundation For Medical Education And Research Diagnosing neurodegenerative diseases
JP5439176B2 (ja) 2007-07-06 2014-03-12 公益財団法人東京都医学総合研究所 Ｔｄｐ−４３凝集物に特異的に結合する抗体
US8940276B2 (en) 2008-12-19 2015-01-27 Biogen Idec International Neuroscience Gmbh Human anti-alpha-synuclein antibodies
CN104159918B (zh) 2011-10-28 2019-09-13 生物国际神经系统科学公司 Tdp-43特异性结合分子

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5688511A (en) * 1991-11-05 1997-11-18 Board Of Regents, The University Of Texas System Cellular protein TDP-43 and regulation of HIV-1 gene expression
WO2008081008A1 (en) * 2007-01-05 2008-07-10 University Of Zurich Method of providing disease-specific binding molecules and targets
WO2009099941A2 (en) * 2008-02-01 2009-08-13 Washington University In St. Louis Sequences associated with tdp-43 proteinopathies and methods of using the same
CN101634656A (zh) * 2009-08-21 2010-01-27 武汉三鹰生物技术有限公司 人tdp-43的单抗包被酶标板的制法及elisa检测试剂盒

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Biogen Idec and Neurimmune Announce Agreement on Three Neurodegenerative Disease Programs", 20 December 2010 (2010-12-20), XP055064808, Retrieved from the Internet: URL:http://www.businesswire.com/news/home/20101220006526/en/Biogen-Idec-Neurimmune-Announce-Agreement-Neurodegenerative-Disease [retrieved on 2013-05-31], the whole document *
"TARDBP (41-7.1): sc-100871", 26 March 2009 (2009-03-26), XP055064934, Retrieved from the Internet: URL:http://datasheets.scbt.com/sc-100871.pdf [retrieved on 2013-06-03], the whole document *
JOHNSON B.S. ET AL.,: "a yeast TDP-43 proteinopathy model: exploring the molecular determinants of TDP-43 aggregation and cellular toxicity", PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF THE UNITED STATES OF AMERICA, NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES, US, vol. 105, no. 17, 29 April 2008 (2008-04-29), US, pages 6439 - 6444, XP002534604, ISSN: 0027-8424, DOI: 10.1073/PNAS.0802082105 *
YUKI SHIINA ; KUNIMASA ARIMA ; HIROKO TABUNOKI ; JUN-ICHI SATOH: "TDP-43 Dimerizes in Human Cells in Culture", CELLULAR AND MOLECULAR NEUROBIOLOGY, KLUWER ACADEMIC PUBLISHERS-PLENUM PUBLISHERS, NE, vol. 30, no. 4, 31 December 2009 (2009-12-31), Ne, pages 641 - 652, XP019815449, ISSN: 1573-6830 *

Also Published As

Publication number Publication date
JP6417451B2 (ja) 2018-11-07
KR20180132977A (ko) 2018-12-12
AU2012327211B2 (en) 2016-03-10
US10259866B2 (en) 2019-04-16
CN104159918A (zh) 2014-11-19
KR101961508B1 (ko) 2019-03-25
EA201490825A1 (ru) 2015-01-30
SG11201401735WA (en) 2014-05-29
WO2013061163A3 (en) 2014-03-06
BR112014010161B1 (pt) 2022-02-08
JP2015505665A (ja) 2015-02-26
IL270223B (en) 2021-05-31
EP3964524A1 (en) 2022-03-09
HK1201846A1 (en) 2015-09-11
US9587014B2 (en) 2017-03-07
CA2853412C (en) 2021-05-04
AU2012327211C9 (en) 2016-11-17
JP6652609B2 (ja) 2020-02-26
JP6240611B2 (ja) 2017-11-29
MX2018008680A (es) 2023-04-18
CA2853412A1 (en) 2013-05-02
ES2883212T3 (es) 2021-12-07
AU2012327211C1 (en) 2016-09-15
CA3112082A1 (en) 2013-05-02
WO2013061163A2 (en) 2013-05-02
ZA201403680B (en) 2020-05-27
US20170152308A1 (en) 2017-06-01
US11091540B2 (en) 2021-08-17
NZ624871A (en) 2016-06-24
IL232219A0 (en) 2014-06-30
KR102032080B1 (ko) 2019-10-15
EA201490825A8 (ru) 2016-09-30
IL232219B (en) 2019-11-28
MX2014005048A (es) 2014-11-10
MY167795A (en) 2018-09-26
EP2771359B1 (en) 2021-05-19
CN104159918B (zh) 2019-09-13
US20140255304A1 (en) 2014-09-11
BR112014010161A2 (pt) 2018-09-25
AU2012327211A1 (en) 2013-05-23
EP2771359A2 (en) 2014-09-03
JP2017205118A (ja) 2017-11-24
US20200017577A1 (en) 2020-01-16
JP2019022500A (ja) 2019-02-14
MX357678B (es) 2018-07-19
CL2014001074A1 (es) 2015-01-09
KR20140100480A (ko) 2014-08-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11091540B2 (en) TDP-43 specific binding molecules
US20220144928A1 (en) Antibody-based therapy of transthyretin (ttr) amyloidosis and human-derived antibodies therefor
US11352441B2 (en) Human anti-SOD1 antibodies
AU2013361107B2 (en) Human anti-tau antibodies
AU2012327211B9 (en) TDP-43 specific binding molecules
KR102594327B1 (ko) 인간-유래의 항-디펩티드 반복체(dpr) 항체
EA031698B1 (ru) Человеческие анти-тау антитела
KR20180138201A (ko) Ilt7 결합 분자 및 이의 사용 방법