TW202019398A - 用於治療或預防構形疾病之方法及藥物篩選方法 - Google Patents

Abstract

本文所描述的是用於治療及預防如TDP-43蛋白質病變、SMA、類澱粉陽性癌症、正常及過早老化(premature aging)的構形疾病之醫藥組合物及方法。同時亦揭露藉由測量聚集傾向蛋白的普里昂樣摺疊或P53聚集體的表現量以篩選用於治療構形疾病之治療候選物的體外篩選方法。

Description

用於治療或預防構形疾病之方法及藥物篩選方法

相關申請的交互參照

本申請案主張2018年6月28日提交之美國專利申請號No. 62/691,142之效益，其全部內容透過引用併入本文。

本發明關於藉由穩定生物學多價形式、減少蛋白質降解或摺疊錯誤的聚集體、或增加普里昂樣LC蛋白(prion-like LC proteins)的普里昂樣構形異構物(prion-like conformer)用以治療及預防如蛋白質病變(proteinopathies)、神經退化性疾病(neurodegenerative diseases)、類澱粉陽性癌症(amyloid positive cancer)、正常老化及過早老化(premature aging)、非類澱粉生成及類澱粉生成疾病(amyloidogenic diseases)的構形疾病(conformational diseases)的醫藥組合物及方法。

構形異常造成非常廣泛的人類疾病，特別是神經退化性疾病(neurodegenerative diseases)。

年齡相關的失智症及如邊緣系統為主年齡相關TDP-43腦病變(limbic-predominant age-related TDP-43 encephalopathy，LATE)、阿茲海默症(Alzheimer’s disease)、肌萎縮性側索硬化(amyotrophic lateral sclerosis)、具有泛素陽性包涵體之額顳葉退化症(frontotemporal lobar degeneration with ubiquitin-positive inclusions，FTLD-U)、脊髓性肌肉萎縮症(spinal muscular atrophy，SMA)及腦損傷之神經退化性疾病為全世界造成主要大眾健康問題的慢性疾病。神經退化疾病重度地影響患者以及其親友。

摺疊錯誤之蛋白聚集體為神經退化性疾病的主要原因，且在患有失智症的患者中經常發現多發性神經退化性蛋白質病變的併發。目前尚未有針對恢復混合神經病理學之摺疊錯誤的疾病蛋白的生物活性之治療。

一種固有無序蛋白質(Intrinsically disordered protein)的亞型帶有低複雜度(LC)區(low-complexity regions)，相似於那些造成酵母普里昂形成的區，最近由我們及其他研究小組所鑑定。基於對酵母普里昂之蛋白質序列相似度的電腦演算法已預測了超過250種的人類蛋白帶有區別性普里昂樣鏈段，其中包含各種與神經退化性疾病相關之RNA結合蛋白，即TDP-43 (SEQ ID No. 1)、Htt (SEQ ID No. 2)、PFN1 (SEQ ID No. 3)、FUS (SEQ ID No. 4)及TIA1 (SEQ ID No. 5)。這些域(domain)通常富含不帶電胺基酸(Q、N、Y、S及G)、具有可撓性結構且可形成交聯-β聚合物(cross-β polymers)。普里昂樣域(prion-like domain)已被提出在如經由暫時性同質-及異質交聯-β聚合作用(普里昂樣交互作用)組織無膜顆粒(membrane-less granules)、選擇性剪接(splicing)及異染色質(heterochromatin)形成等的正常生物學中扮演著各種角色。

PLD的結構可塑性允許了構形轉化及易變，可逆地聚集入液樣(liquid-like)相分離的間隔(compartments)中，即環境刺激後無膜胞器經由普里昂樣交聯β聚合作用形成。普里昂樣蛋白的自聚合(self-polymerize)及與其他成分進行多重交互作用的能力表示其作為分子骨架(molecular scaffold)的功能。

泛素化(ubiquitinated)、磷酸化的TDP-43之羧基端(C-terminus)形成的毒性包涵體(inclusions)，最早在患有FTLD-U及ALS的患者的大腦中發現。使用特異性針對非正常磷酸化抗原決定位(phosphor-epitopes)的抗體在90%的海馬迴硬化(hippocampal sclerosis，HS)病例及大約30%的阿茲海默症病例中亦偵測到TDP-43的病理現象。最新研究顯示一般TDP-43蛋白病變侵襲80歲以上的患者。

在患有ALS及FTLD的患者中之神經元(neurons)及神經膠質(glia)的細胞質(cytoplasm)中發現病理學上切割的(cleaved)、泛素化的、過磷酸化的TDP-43羧基端片段的沉積。

大約50種ALS的致病性突變(causative mutation)在羧基端被發現，進一步支持此蛋白的直接致病性角色。

TDP-43為結合至DNA及RNA兩者並調節多方面生物程序(biological processes)之廣泛性表現(ubiquitously expressed)的核酸蛋白，生物程序包含聚合酶II依賴性轉錄、premRNA剪接、microRNA生成及蛋白質轉譯。TDP-43的各種功能涉及神經突生長(neurite outgrowth)、軸突運動(axonal transport)、細胞週期及細胞凋亡(apoptosis)。

多數TDP-43蛋白出現在細胞核(nucleus)中，並在細胞核及細胞液(cytosol)中穿梭以流通RNA。相似於普里昂樣RNA結合蛋白的結構及功能，TDP-43具有兩個RNA結合域及其羧基端的普里昂樣低複雜度域(LC域)，普里昂樣低複雜度域(LC域)可經由自分子內(self-intra)交互作用或自分子間交互作用(self-intermolecular interactions)組裝成交聯β聚合物的。

對於TDP-43核狀體(nuclear bodies)的形成、CFTR的選擇性剪接及TDP-43的蛋白穩定性而言，PLD的自締合(self-associations)是必要的。功能異常的自相互作用(self-interaction)導致TDP-43的降解及錯誤摺疊，且為TDP-43蛋白質病變的潛在病因。

目前，因為已在小鼠模式中已顯示能有效減少摺疊錯誤的蛋白聚集體之毒性以緩解病理學上的衰退(pathological decline)，所以多數涉及摺疊錯誤之疾病蛋白的臨床試驗研究的目標在於經由蛋白質降解系統的活化、免疫治療或疾病蛋白合成的抑制來移除類澱粉沉積的負擔。然而，因為在果蠅、魚及齧齒動物中，TDP-43細胞功能的失效導致細胞週期中的異常，並造成神經退化(neurodegeneration)，除了移除摺疊錯誤的蛋白聚集體之外，在TDP-43病理現象的病例中，拯救TDP-43之生理機能(physiological functions)為治療效果的關鍵性指標。值得注意的是，在患有TDP-43之患者的病理現象中觀察到，缺陷的TDP-43中斷pre-mRNA選擇性剪接並誘導轉位子(transposable element)的錯誤調節。

脊髓性肌肉萎縮症(SMA)為全世界每年出生的每1000個嬰兒就有1個受到影響的染色體隱性神經肌肉失常。SMN蛋白中的缺陷導致脊隨之前角(anterior horn)中運動神經元的逐漸喪失以及之後全系統(system-wide)的骨骼肌萎縮。已鑑別出負責SMA的基因--運動神經元存活基因1(survival motor neuron 1，SMN1 )(SEQ ID No. 7)。

在所有患有SMA的患者中通常表現幾乎完全相同複製的基因SMN2 。雖然產生了少量鑑別為SMN1 的全長蛋白，但在所有個體中之SMN2 中的外顯子7帶有C至T(C-to-T)移轉的外顯子剪接靜默子(silencer)跳過外顯子7。SMN2 複製數量的增加調節了SMA的嚴重度，但未完全補足SMN1 的損失。

蛋白質產物SMN△7呈現為不穩定且迅速降解，且其生物功能仍未分明。雖然20年前SMN1 鑑別為負責SMA的突變基因，外顯子7缺失改變細胞功能及SMA相關突變觸發及病的分子機制仍成謎。

包含p53(SEQ ID No. 8)及RB1(SEQ ID No. 9)的抑瘤基因(tumor suppressor genes)通常作用以抑制細胞增生並維持基因組完整性(genomic integrity)。抑瘤基因的突變會導致癌症。他們保護細胞免於步上通往癌症的路徑。

已有實驗顯示P53聚集體形成類澱粉寡聚物及相似於那些在可與硫代黃素T(thioflavin T)的結合而具有β摺板登記類澱粉結構的阿茲海默症、帕金森氏症及普里昂病中鑑別出的原纖維(fibrils)。

一般在惡性腫瘤中觀察到摺疊錯誤的P53聚集體，特別是在帶有p53突變之經化療處理的腫瘤或高度轉移性癌症中。p53相關癌症突變中有30至40%影響蛋白質的結構，導致對聚集反應傾向的增加。近期已知P53聚集體陽性的癌症類型包含乳癌、大腸癌、皮膚癌、卵巢癌及攝護腺癌。

p53蛋白為在多數人類腫瘤中經常由於突變、缺失或摺疊錯誤而失活的同源四聚物(homotetrameric)腫瘤抑制物。p53蛋白在調節如DNA修復、細胞週期控制、細胞凋亡及衰老(senescence)的數種細胞過程中扮演關鍵的角色。

在摺疊錯誤的P53聚集體及癌症侵入與化學抗性之間具有強烈的臨床相關性。

儘管在過去50年以來構形疾病的診斷及治療具有進展，醫療社群仍面對治療許多種類之構形疾病的挑戰。因此，仍有需要更多對構形疾病有效的治療。本發明目的在此需求與其他需求。

在一個實施例中，本發明提供一種醫藥組合物。有利地，該醫藥組合物藉由協同作用減少摺疊錯誤的TDP-43聚集體及/或TDP-43與SMN降解的片段。

在另一實施例中，提供一種用於在個體中預防或治療構形疾病的方法，這種方法包含對有需要之個體施予有效劑量的治療劑，以增加聚集傾向蛋白(aggregation-prone protein)的普里昂樣摺疊的量，或減少普里昂樣LC蛋白的降解片段或摺疊錯誤之聚集體，其中減少了構形疾病的病徵或症狀。

本發明亦提供一種用於鑑別用以治療構形疾病之治療候選物的體外方法，這種方法包含a)在將治療候選物接觸一個或多個測試細胞之前，測定P53聚集體在一個或多個測試細胞中的表現量；以及b)在以一個或多個測試細胞接觸治療候選物之後，測定步驟(a)中的P53聚集體的表現量的步驟，其中，相對於以一個或多個測試細胞接觸治療候選物之前P53聚集體的表現量，以一個或多個測試細胞接觸治療候選物之後P53聚集體的表現量的下降表示治療候選物有效於治療構形疾病。

本發明進一步提供一種用於鑑別用以治療構形疾病之治療候選物的體外方法，這種方法包含a)在將治療候選物接觸一個或多個測試細胞之前，測定選自一個或多個測試細胞中特異於構形疾病之聚合物的表現量；以及b) 在以一個或多個測試細胞接觸治療候選物之後，測定步驟(a)中的聚合物的表現量的步驟，其中聚合物選自主要由TDP-43、Htt、Lamin B1、FUS、TIA-1、Tau(SEQ ID No. 6)、SMN、p53、Rb(Rb1)、PFN1及SMN所組成之群組，且相對於以一個或多個測試細胞接觸治療候選物之前聚合物的表現量，以一個或多個測試細胞接觸治療候選物之後聚合物表現量的增加作為篩選候選物的指標。在本專利中所使用的用語「發明(invention)」、「該發明(the invention)」、「此發明(this invention)」以及「本發明(the present invention)」意於廣泛指的是所有本專利及下列的申請專利範圍的申請標的。包含這些用語的敘述應理解為不限制本文所描述的申請標的或不限制下列申請專利範圍的含義或範疇。藉由本專利涵蓋的本發明之實施例係藉由下列申請專利範圍定義，而非此發明內容。此發明內容為本發明各種態樣的高度概述，並引導進一步描述於下列實施方式的段落中的部分概念。此發明內容不意於定義所請申請標的的關鍵或必要特徵，亦非意於用在隔離所請申請標的的範疇的定義。申請標的應藉由參考說明書全文、任何或所有圖式及各申請專利範圍合適的部分而理解。

當閱讀下面的附圖和實施方式時，本發明將變得更加顯而易見。

本文描述了醫藥組合物及用於治療構形疾病的方法。包含熱休克蛋白調節物及類黃酮之組合的組合物或包含熱休克蛋白調節物、類黃酮及多酚類化合物之組合的組合物。多酚類化合物可選自由洋芫荽黃(Apigenin)、兒茶素(Catechin)、表兒茶素(Epicatechin)、堪非黃酮醇(Kaempferol)、2,2¢-二羥基二苯甲酮(2,2¢-Dihydroxybenzophenon)、2,3,4,2¢,4¢-五羥基二苯酮(2,3,4,2¢,4¢-Pentahydroxyben-zophenone)、棉黃酮(Gossypetin)、檞黃酮(Quercetin)、桑色素(Morin)及楊梅黃酮(Myricetin)所組成之群組。當施予細胞、組織或個體時，這些各種組合物的每一個協同地減少TDP-43摺疊錯誤的聚集及/或TDP-43降解的片段。

本文亦描述了藉由施予治療劑用以穩定TDP-43及SMN蛋白之生物形式及/或恢復TDP-43及SMN蛋白之生物活性的方法。

此外，本文描述了藉由在細胞、組織或個體中施予有效劑量的治療劑以減少TDP-43及SMN摺疊錯誤聚集體或增加活性TDP-43構形異構物，用以在細胞、組織或個體中降低TDP-43及SMN摺疊錯誤的聚集或恢復TDP-43及SMN的生物學形式的方法。在一個實施例中，治療劑為類黃酮。在另一實施例中，治療劑為熱休克蛋白調節物。在另一實施例中，治療劑為多酚類化合物。在又另一實施例中，治療劑為本文所描述的醫藥組合物。

亦描述的是藉由對細胞、組織或個體施予有效劑量的類黃酮以改變TDP-43聚合物的量，用以改變在細胞、組織或個體中TDP-43聚合物的量的方法。

當以上及本揭露全文所使用下列的用語，除非另有說明，否則應被理解具有下列涵義。

除非上下文另有清楚的表明，否則本文所用的單數形式「一(a)」、「一(an)」及「該(the)」也包含複數形式。

除非另有說明，當本文所使用的用語「大約 (about)」涉及如含量、持續時間(temporal duration)及其類似值等可測量的值，意指涵蓋特定值± 10%的變異，例如這些變異適合為治療劑之劑量。除非另有說明，當本文所使用的用語「大約 (about)」涉及一個範圍，意指涵蓋從特定值到具有不同範圍± 10%的變異，例如這些變異適合為治療劑之劑量。

當本文使用「有效劑量(effective amount)」包含試劑足以減少TDP-43降解片段或TDP-43摺疊錯誤聚集體或p53摺疊錯誤聚集體或構形疾病的病徵或症狀的劑量。

當本文使用用語「治療(treating)」、「治療(treated)」或「治療(treatment)」包含預防的(preventative)(例如，預防性(prophylactic))、舒緩的(palliative)以及治療的(curative)用途或結果。

用語「減少(reducing)」或「減少(reduce)」包含簡慢或停止TDP-43、SMN或p53錯誤摺疊聚集體或TDP-43或SMA降解片段的行程，或拆開已經形成的TDP-43、SMN或p53錯誤摺疊聚集體。

用語「前驅藥(prodrug)」為可藉由代謝轉化(metabolic transformation)而被轉換為藥理活性劑(pharmacologically active agent)的無藥理活性化合物。

醫藥組合物之酸性治療劑的用語「藥學上可接受的鹽(Pharmaceutically acceptable salt)」為與鹼形成的鹽，亦即如鹼金屬(alkali)及如鈉(sodium)、鋰(lithium)、鉀(potassium)、鈣(calcium)、鎂(magnesium)的鹼土金屬鹽的鹼加成鹽(base addition salts)，以及如銨(ammonium)、三甲基-銨(trimethyl-ammonium)、二乙基銨(diethylammonium)以及三-(羥甲基)-甲基-銨鹽(tris-(hydroxymethyl)-methyl-ammonium salts)的4銨鹽(4 ammonium salts)。相似地，如礦酸(mineral acids)、有機羧酸(organic carboxylic)與有機磺酸(organic sulfonic acids)的酸加成鹽(acid addition salts)，例如氫氯酸(hydrochloric acid)、甲磺酸(methanesulfonic acid)、馬來酸(maleic acid)亦可能以如吡啶基(pyridyl)作為結構之一部分的構成提供給鹼治療劑。

用語「構形疾病(conformational disease)」廣泛所指的是包括但不限於正常老化、過早老化、降解性構形疾病、構形疾病(包含類澱粉聚集體構形疾病及非類澱粉聚集體構形疾病)的情況。降解性構形疾病包括但不限於SMA、兒童癌症(childhood cancer)、視網膜母細胞瘤(retinoblastoma)(RB)、膀胱癌(bladder cancer)、乳癌(breast cancer)、骨性肉瘤(osteogenic sarcoma)及Rb1缺陷癌症。類澱粉聚集體構形疾病包括但不限於阿茲海默症(Alzheimer’s disease)、帕金森氏症(Parkinson's disease)、具有p53聚集體的癌症、唐氏症(Down syndrome)或青光眼(glaucoma)。非類澱粉聚集體構形疾病包括但不限於TDP-43 蛋白質病變 (如FTLD-U或ALS)、海馬迴硬化(hippocampal sclerosis)或混合的蛋白質病變。

當本文使用用語「TDP-43蛋白病變(TDP-43 proteinopathy)」廣泛所指的是與TDP-43蛋白之結構及/或功能在一個或多個方面中的改變相關的情況。TDP-43蛋白病變可以TDP-43蛋白之結構及/或功能從發生在族群中的正常或基線量在一個或多個方面中偏差來表徵。這些偏差可外顯其本身作為如具有包含TDP-43降解片段及TDP-43錯誤摺疊聚集體之非正常構形的TDP-43分子的量或包含可溶及不可溶構形異構物之TDP-43的各種多聚體型式(multimeric form)的量等在結構上異常的TDP-43蛋白。偏差亦可外顯其本身作為TDP-43之各種分子形式在細胞及組織分布中的異常、包含正常功能的缺陷、獲得毒性或毒性功能的TDP-43之功能的偏差，或關於TDP-43之蛋白及細胞路徑之調節的偏差。使用用語「蛋白病變(proteinopathy)」以提及TDP-43或一般而言可與用語「蛋白病變」、「錯誤摺疊病症(misfolding disorder)」或「錯誤摺疊疾病(misfolding disease)」互換使用。目前考慮到的TDP-43蛋白質病變之情況的實例為肌萎縮性側索硬化(ALS)、具有泛素化包涵體之額顳葉退化症(frontotemporal lobar dementia with ubiquitin，FTDL-U)、輕度認知功能障礙(milder cognition impairments，MCI)、阿茲海默症(AD)及神經退化的混合病理現象。應理解的是TDP-43蛋白質病變不限於上述情況。

使用用語「普里昂樣LC蛋白(prion-like LC proteins)」以提及TDP-43或一般而言可與用語「具有交聯-β延續域的蛋白(protein with cross-β perpetuating domain)」、「低複雜度蛋白(low complexity protein)」、「普里昂樣蛋白(prion-like protein)」或「相分離蛋白(phase separated protein)」互換使用。

當本文使用用語「普里昂樣摺疊(prion-like folding)」廣泛所指的是一種新穎類型的β-褶板富含域，其能夠藉由催化其本身或其他蛋白質的轉變進行結構複製並依序形成生理聚合物(physiological polymers)。各種所述的普里昂樣域為低複雜度(LC)、交聯-β增殖、交聯-β延續、聚集傾向(aggregation-prone)、普里昂基因(prionogenic)或液相分離域、瞬時形成交聯-β聚合凝聚的相以執行包含無膜式(membrane-less)次細胞器官、前驅傳訊RNA(pre-mRNA)的剪接、RNA聚合酶II依賴性轉錄及異染色質鬆開(heterochromatin relaxation)之關鍵的生物活性。此外，能捕獲包含TDP-43、FUS、hnRNPA1、TIA1、PFN1、核片層蛋白 B1、SMN、Rb及p53的普里昂樣LC蛋白的群組的b-isox，可作為LC域之交聯-β普里昂樣聚合物的特異性化學探針。

使用用語「聚合物(polymer)」以提及多價蛋白或域(domain)。聚合物可藉由使用西方墨點轉漬法分析分子量、使用電子顯微鏡分析型態學(morphology)、使用免疫螢光染色分析液滴形成(如無膜式次細胞器官)、使用b-isox作為探針分析化學沉澱。

使用用語「交聯-β聚合物(cross-β polymer)」以提及多價普里昂樣LC蛋白，可與用語「普里昂樣聚合物(prion-like polymer)」互換使用，並藉由b-isox辨識。

使用用語「次級聚集傾向蛋白(secondary aggregation-prone protein)」以提及補償缺陷的聚集傾向蛋白之角色的聚集傾向蛋白。次級聚集傾向蛋白可藉由質體表現，或藉由蛋白質或脂質基底的奈米顆粒或智慧型中孔洞二氧化矽奈米粒子(Smart Mesoporous Silica Nanoparticles)輸送(參見H. J. Liu et al “Smart Mesoporous Silica Nanoparticles for Protein Delivery”Nanomaterials 2019, 9(4), 511.)。

用語「情況(condition)」用於廣泛指的是意為發生在身體或生物體中的過程的醫學或臨床情況，且以某些病徵及症狀為特徵。用語情況可用於廣泛指的是意為影響身體或生物體的非正常疾病或情況的疾病或病理現象。用語「情況」亦可用於表示正常生物學的階段或程序。

當本文使用用語「治療介入(therapeutic intervention)」廣泛指的是期望以獲得治癒結果、改善病徵或恢復健康所採取的動作。

具有不同三維結構(three-dimensional structure)、意即在二級、三級或四級結構中的一種或多種中具有差異的TDP-43蛋白的形式可稱為TDP-43構形物、TDP-43構形異構物、TDP-43構形變異體、TDP-43蛋白變異體、TDP-43摺疊變異體及其他相關的用語。應理解的是TDP-43可具有相同或不同的初級結構或胺基酸序列。TDP-43構形異構物包含TDP-43單體、寡聚物或聚合物，包含可溶及不可溶的單體、寡聚物或聚合物。TDP-43構形異構物包含但不限於在體內發現的TDP-43之形式、包含與TDP-43蛋白質病變相關的形式、在體外發現的形式以及人造的形式。TDP-43蛋白質病變可以在神經細胞及組織中的某些TDP-43構形異構物的含量表徵或與之相關。

在此文件中使用的用語「含量(amount)」以表示某者的量或分布。在一些實施例中，本發明可利用任何前述的資訊落入用語「含量」之意義，以比較一種或多種蛋白質以及這些蛋白的分類及次分類。在蛋白的量上這些資訊可稱為「圖案(pattern)」。

本文使用的用語「個體(subject)」通常指的是具有構形疾病或懷疑具有構形疾病的人類或動物。應理解的是個體可為如研究個體之無已知或疑似具有構形疾病的個體也包含在用語「個體」的範疇中。

用語「熱休克蛋白(heat shock protein)」或「熱休克蛋白(heat shock proteins)」分別縮寫為「HSP」及「HSPs」指的是涉及「熱休克反應(Heat shock response)」的蛋白，熱休克反應是對增加的溫度或其他壓力因子的細胞反應，其包含編碼熱休克蛋白的基因的轉錄向上調控作為細胞的內部保護及修復機制的一部分。對於壓力情況涉及各種細胞反應的HSPs也稱為壓力蛋白，壓力情況包含但不限於冷及缺氧(oxygen deprivation)。HSPs在正常情況下的細胞中也存且作用著。一些HSPs為協助蛋白的取得並維持正確結構的分子伴護蛋白(molecular chaperones)。例如，HSP伴護蛋白可協助蛋白摺疊並避免蛋白分子的聚集。其他HSP可在細胞中將蛋白從一個隔間(compartment)穿梭到另一個隔間，並將摺疊錯誤的蛋白標記給用以降解的蛋白酶。例如，熱休克反應已於Richteret al ., “The Heat Shock Response: Life on the Verge of Death,”Molecular Cell 40:253 (2010) 討論。

在細胞、組織或生物體中調節熱休克蛋白活性或熱休克蛋白路徑的試劑稱為「熱休克蛋白調節物(heat shock protein modulators)」。熱休克蛋白調節物可藉由各種機制活化或抑制HSP的功能或HSP路徑。下降或抑制熱休克蛋白的活性或路徑的HSP調節物稱為HSP抑制物。HSP調節物的一個實例為抗生素格爾德黴素(geldanamycin)之衍生物的17-N-丙烯胺-17-去甲氧基格爾德黴素(17-N-allylamino-17-demethoxygeldanamycin)(17-AAG)。17-AAG結合並抑制HSP90(熱休克蛋白90)的活性，HSP90為結合至已知為「受質蛋白質(client protein)」之訊號蛋白的伴護蛋白。17-AAG能夠中斷HSP-90-受質蛋白複合物。活化或增加熱休克蛋白之活性或路徑的HSP調節物稱為HSP活化物。活化物的熱休克蛋白調節物的一個實例為阿瑞洛莫(arimoclomol)，其已知用於誘導一種或多種如HSP70及HSP90的分子伴護蛋白HSPs的表現。

用語「類黃酮(flavonoid)」包含黃酮(flavone)，其包含始分離自黃芩(Scutellaria baicalensis )之根部的貝加因。貝加因為CYP2C9的抑制物，CYP2C9為在身體中代謝藥物之細胞色素P450系統的酵素。類黃酮包含貝加因及其衍生物。

重塑TDP-43聚集體及穩定TDP-43蛋白之生物學形式的方法

神經退化疾病指的是如含有傾向至聚集蛋白之TDP-43蛋白變性的疾病。TDP-43之富含Q/N的域能夠功能上以酵母普里昂域Sup35N取代，並對包含pre-mRNA剪接、次細胞定位、CTFR的外顯子跳躍、核顆粒組裝及細胞摺疊穩定性的細胞功能具有新穎的固有特性(intrinsic property)(Wanget al ., “The self-interaction of native TDP-43 C terminus inhibits its degradation and contributes to early proteinopathies.”  Nature Communication . 3:766 (2012) 2012)。TDP-43之羧基端富含Q/N的域亦已知為「普里昂樣域或PLD(prion-like domain or PLD)」。然而，與多數已知的普里昂相反，體外TDP-43的功能或錯誤摺疊聚集體不與類澱粉特異性染劑剛果紅(Congo red)反應，表示TDP-43 PLD可能不會是prionogenic域(Wanget al .,Nature Communication . 2012)。PLD分配在天然TDP-43羧基端穩定化的細胞摺疊中，多數TDP-43蛋白互連以在細胞核中形成TDP-43功能性聚集體，且功能性TDP-43聚合物增加(參見第2、6及7圖)。

在活體中，構形疾病蛋白的摺疊階段與老化及神經退化疾病的致病性相關。這些致病蛋白含有具高結構可塑性及結構多型性(polymorphisms)的無序域(intrinsic disordered domain)，並允許在摺疊階段與如細胞結合(cellular binding)、轉役後修飾及ROS的各種生物及病理因子交換。此類型蛋白之摺疊階段上的病理影響導致了錯誤摺疊聚集體及無法維持恆定(homeostasis)並造成神經退化。

在正常情況下，普里昂樣本質接合自組裝TDP-43蛋白以在3D核空間中聚集在纖維顆粒網質中，其中TDP-43蛋白質執行選擇性剪接功能並成為mRNA加工中心(processing hubs)。在前驅(prodromal)或臨床疾病階段，病理風險因子誘導TDP-43蛋白的功能性摺疊以轉變成錯誤摺疊階段，接著泛蛋白化(ubiquitination)、磷酸化並聚集在細胞液中。在VCP/p97相關的TDP-43蛋白質病變的病例中，已顯示在TDP-43蛋白質病變的光譜中由VCP/p97及VCP/p97 R155H免疫沉澱的少數TDP-43。本文中我們的研究進一步顯示VCP / p97 R155H突變或VCP / p97 ATP酵素活性的缺陷干擾高階TDP-43聚合物的細胞定位及核組裝，接著中斷TDP-43的外顯子跳躍能力。此外，亦發現了偶發地或遺傳的FTLD/ALS-相關TDP-43突變(即TDP-43 R361S)加速了致病性。此外，我們發現了體內治療後24小時不致病路徑化合物貝加因及EGCG拆開TDP-43的不溶性非類澱粉病理聚集體成為可溶性片段，並有效與17-AGG在減少錯誤摺疊聚集體上產生協同作用。明顯地，貝加因不僅拆開TDP-43纖維，也功能上校正疾病TDP-43蛋白成為具有TDP-43介導的CTFR之外顯子跳躍活性TDP-43聚合物。申請人相信重定向(redirecting)治病蛋白的摺疊階段至活化階段能夠同時解決許多包含衍生自獲得及損失疾病蛋白本身之功能的病徵、普里昂樣蔓延及脫靶效應(off-target effects的摺疊錯誤的蛋白病理現象。用於緩解具有伴發混合的蛋白質病變之患者的嚴重及複雜病理現象，單一小化合物療法治療神經病變的多重錯誤摺疊疾病蛋白將比組合療法更安全。

本文提供藉由施予治療劑穩定TDP-43蛋白之細胞摺疊的方法。在一個實施例中，治療劑為穩定TDP-43蛋白之細胞摺疊的類黃酮(參見第1、2及3圖為貝加因的各種實施例)，由此貝加因在體外重整TDP-43纖維為聚合物，且在細胞核中有更多TDP-43功能性構形異構物。此外，異噁唑(isoxazole)捕獲普里昂樣蛋白的群組(包含TDP-43)，顯示異噁唑可能在TDP-43蛋白質病變的治療介入中潛在地作為貝加因的作用。

減少不溶性TDP-43降解片段及錯誤摺疊TDP-43聚集體的方法

不受特定理論限制，據信藉由病理切割、ALS鍵結突變或其他未知的細胞因子在TDP-43 羧基端中PLD的缺失細胞的破壞或TDP-43羧基端之普里昂樣摺疊及TDP-43蛋白降解並形成TDP-43降解片段及/或TDP-43錯誤摺疊聚集體。TDP-43錯誤摺疊聚集體可導致嚴重的神經元損失(neuron loss)及TDP-43蛋白變性的發作(onset)。

TDP-43降解片段為可溶的，大約22至大約27 kDa (Neumann et al, “Ubiquitinated TDP-43 in Frontotemporal Lobar Degeneration and Amyotrophic Lateral Sclerosis. Science 314, 130 (2006))。如第2圖所示，在細胞質(cytoplasm)中TDP-43降解片段可導致TDP-43錯誤摺疊聚集體的形成。

在本文提供之方法的各種實施例中，治療劑為熱休克蛋白調節物、多酚類化合物、類黃酮或如本文所述參照所提供的醫藥組合物的組合物，以減少在細胞、組織及個體中不溶性TDP-43降解片段或TDP-43錯誤摺疊聚集體的量。在細胞、組織及個體中不溶性TDP-43降解片段或TDP-43錯誤摺疊聚集體的量的下降可在個體中的TDP-43蛋白病變上具有有益的效果，如但不限於下降TDP-43蛋白病變的風險或發病率、衰減或抑制TDP-43蛋白病變的進程、神經退化的抑制、運動及/或神經功能的改善、降低TDP-43蛋白病變的病徵及症狀、減緩TDP-43蛋白病變的進程及增加具有TDP-43蛋白病變的之個體的壽命。

本文所描述的方法有效減少不溶性TDP-43降解片段及/或TDP-43錯誤摺疊聚集體的可偵測量，如TDP-43降解片段及/或TDP-43錯誤摺疊聚集體的量的減少、TDP-43降解片段及/或TDP-43錯誤摺疊聚集體的降解或去組裝、如TDP-43錯誤摺疊聚集體的去組裝、TDP-43降解片段至與健康細胞相關之功能性TDP-43蛋白的轉移或改變TDP-43降解片段及/或TDP-43錯誤摺疊聚集體在細胞或組織中的分布(distribution)或分配(partitioning)。

為執行本文提供的方法，將選自熱休克蛋白調節物、多酚類化合物、類黃酮或本文描述的醫藥組合物的治療劑以有效減少細胞、組織或個體中TDP-43降解片段及/或TDP-43錯誤摺疊聚集體的量施予細胞、組織或個體。本文提供的方法涵蓋包含治療或衰減TDP-43蛋白質病變的方法之治療方法及用途，及包含預防或降低在個體中TDP-43蛋白質病變之量的機率的預防方法。本文提供的方法亦涵蓋包含降低在細胞、組織或個體中TDP-43錯誤摺疊片段之TDP-43降解片段的體外及體內方法的研究方法及用途。熱休克蛋白調節物、多酚類化合物、類黃酮或本文描述的醫藥組合物用於製造降低細胞、組織或個體中不溶性TDP-43降解片段或TDP-43錯誤摺疊聚集體之藥物的用途亦藉由本文所描述方法的實施例涵蓋。

本文提供的方法減少TDP-43錯誤摺疊聚集體的變異。在一個實施例中，TDP-43錯誤摺疊聚集體為模仿TDP-43病理片段的來自TDP-43 羧基端之降解片段融合的錯誤摺疊聚集體。在另一實施例中，TDP-43錯誤摺疊聚集體為來自全長TDP-43的錯誤摺疊聚集體。

TDP-43降解片段及TDP-43錯誤摺疊聚集體位於受影響細胞的細胞質，且為不與類澱粉特異性剛果紅反應的「非類澱粉結構」。

可被施予以減少TDP-43降解片段或TDP-43錯誤摺疊聚集體的HSP調節物之非限制性的實例為17-AGG、其藥學上可接受的鹽、其衍生物、其前藥或其結構類似物。在一個實施例中， 17-AGG的有效劑量為大約150 nM至大約400 nM。

可被施予以減少TDP-43降解片段或TDP-43錯誤摺疊聚集體的多酚類化合物之非限制性的實例為EGCG、其藥學上可接受的鹽、其衍生物、其前藥或其結構類似物。

可被施予以減少TDP-43降解片段或TDP-43錯誤摺疊聚集體的類黃酮之非限制性的實例為貝加因、其藥學上可接受的鹽、其衍生物、其前藥或其結構類似物。

用於根據本文所提供之方法的施予，熱休克蛋白調節物、多酚類化合物或類黃酮單獨施予或單獨或組合的併入合適的醫藥組合物中施予，該醫藥組合物如本文所描述的醫藥組合物。

增加功能性TDP-43聚合物的方法

申請人發現的是VCP/p97的ATPase活性涉及了TDP-43的細胞定位及TDP-43聚合物的組裝(第4圖)。申請人亦發現HSPB1表現影響組裝TDP-43聚合物與TDP-43介導之外顯子跳耀的鍵聯，其對新種類提供了貝加因依賴性的證據；即展現TDP-43介導之外顯子跳耀的核TDP-43聚合物(第5圖)。因此，申請人發現的是VCP/p97及HSPB1的ATPase活性為對於影響TDP-43構形異構物轉換及增加TDP-43聚合物並因此校正蛋白質病變之有效的藥物標靶。

以表徵具有VCP/97突變R155H的FTLD/ALS中的TDP-43蛋白質病變。VCP/97突變R155H改變了VCP/97的功能，再分配(redistributes) TDP-43至細胞液病導致TDP-43之不溶性聚集體的形成。在救援CFTR之TDP-43介導的外顯子跳躍及增加TDP-43聚合物的狀態之間的功能性校正亦在貝加因處理的VCP/p97 R155H細胞中觀察到(第3e圖)。

已在TDP-43蛋白質病變的光譜中顯示藉由VCP/p97免疫沉澱少數的TDP-43，意味著在具有偶發性或遺傳的tdp-43蛋白質病變的患者中VCP/p97與TDP-43之間的交互作用的干擾為致病性的關鍵步驟。VCP/p97與TDP-43的顯著缺陷的交互作用導致TDP-43聚合物可藉由貝加因校正的組裝失敗。

本文提供為了在細胞、組織或個體中改變一種或多種功能性TDP-43聚合物的量使用VCP/p97之HSPB1或ATPase的調節物或如貝加因的類黃酮及其衍生物及結構類似物的方法。HSPB1(亦已知為HSP27)調節物的實例包含針對HSP27的siRNA。在一例示性實施例中，針對HSP27的siRNA至少90、95或100%與SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：18相同。

在個體中改變一種或多種TDP-43構形異構物的量可在個體中的TDP-43蛋白病變上具有有益效果，如但不限於TDP-43蛋白病變之發生率的風險下降、神經退化的抑制、運動及/或神經功能的改善、降低TDP-43蛋白病變的病徵及症狀、減緩TDP-43蛋白病變的進程及增加具有TDP-43蛋白病變的之個體的壽命。

為執行本文提供之方法的實施例，將如HSPB1RNAi或VCP/p97質體的蛋白質表現調節物或如貝加因的類黃酮及其衍生物及結構類似物以有效劑量施予細胞、組織或個體，以改變細胞、組織或個體中的一種或多種TDP-43構形異構物。本文提供的方法涵蓋包含治療或衰減TDP-43蛋白質病變的方法之治療方法及用途，及包含預防或降低在個體中TDP-43蛋白質病變之量的機率的預防方法。方法亦涵蓋包含降低在細胞、組織或個體中改變一種或多種功能性TDP-43構形異構物的量的體外及體內方法的研究方法及用途。HSP調節物用於製造用於在細胞、組織或個體中改變一種或多種功能性TDP-43構形異構物的量之藥物的用途亦藉由本文所描述方法的實施例涵蓋。

本文提供的方法包含改變各種TDP-43構形異構物的量。TDP-43構形異構物的一個實例為可溶性TDP-43聚合物，如具有分子量為200 kDa或更多的TDP-43聚合物(「可溶性TDP-43構形異構物」)。

根據本文提供的方法在細胞、組織或個體中改變一種或多種TDP-43構形異構物的量涵蓋如在細胞液中200 kDa或更多的TDP-43構形異構物的減少的TDP-43構形異構物之可偵測量的減少，不可溶TDP-43構形異構物之降解或去組裝的TDP-43構形異構物之降解或去組裝，如從與TDP-蛋白病變相關的TDP-43構形異構物轉換至與健康細胞相關的功能性多聚體(multimer)的TDP-43從一種構形至另一種構形異構物的轉換，或構形異構物在細胞或組織中的分布或分配的改變。

可施予以改變一種或多種TDP-43構形異構物的量之類黃酮的一些實例為貝加因及其衍生物及結構類似物。

用於根據本文提供的方法施予，類黃酮可單獨或合併成本文所描述合適的醫藥組合物施予。

TDP-43及核片層蛋白A功能性交互作用為用於治療TDP-43蛋白質病變及過早老化之成藥路徑(druggable pathways)的方法

申請人發現了TDP-43形成由與球狀結構相關之分支的、多結狀長絲(filaments)組成的纖維顆粒網質，相似於已知的纖維腺體核糖核蛋白(fibrogranular ribonucleoprotein)且其與核中間絲(intermediate filament)核片層蛋白A/C連接(參見第6圖及第7圖) 。

缺陷的核片層蛋白、突變、早衰症造成過早老化症、哈欽森-吉利福德早衰症候群(Hutchinson-Gilford progeria syndrome，HGPS)。申請人觀察到早衰症突變干擾TDP-43聚合物的組裝，造成TDP-43介導的選擇性剪接失敗的結果。TDP-43功能異常似乎導致了在患有HGPS的患者的選擇性剪接中廣泛的改變。明顯地，藉由老化相關蛋白TDP-43之細胞溶質聚集的誘導顯露了關於在TDP-43蛋白質病變中與老化有關的線索。

藉由增加聚集傾向域之普里昂樣摺疊的量用於治療SMA的方法

脊髓性肌肉萎縮症 (SMA)造成運動神經元的缺失及漸進的肌無力(muscle weakness)。在95%患有SMA的患者中，運存活動神經元1(SMN1 ­)基因的對偶基因兩者被刪除，或基因具有誤義突變(missense mutation)。

值得注意的是SMA具有固有的普里昂樣傾向，其驅動SMA的同質及異質交聯-β低聚合反應(oligomerization)以調控Gems formation、SMN蛋白穩定性及運動神經元的軸突生長(axonal outgrowth)。致病的誤義突變及在蛋白質中外顯子7的刪除(SMN△7)導致錯誤摺疊狀態並廢除功能性普里昂樣交互作用。這些蛋白質產物呈現不穩定且快速降解的。

藉由貝加因強制重組SMN△7之普里昂樣構形異構物可減少降解片段、增加蛋白質穩定性、與其他即PFN1的普里昂樣蛋白的普里昂樣交互作用、表現SMN△7之運動神經元培養的軸突生長及細胞存活率及並改善SMA小鼠運動功能(參見第10圖)。

在SMA小鼠中SMN△7之功能性缺陷的恢復亦藉由過表現TDP-43的普里昂樣域達成(參見第11圖)。這些發現顯現SMN的固有分子特性，其準確地連結致SMA並藉由簡單地恢復普里昂樣活性對患有致SMA突變的患者提供治療。

降低錯誤摺疊的P53聚集體的方法

錯誤摺疊的P53聚集體通常在惡性腫瘤中觀察到，特別是在化療處理的腫瘤或帶有p53突變的高轉移性癌症中觀察到。百分之三十至四十的p53相關的癌症突變影響蛋白質的結構，導致聚其傾向的增加。目前已知的P53聚集體陽性癌症的種類包含乳癌、大腸癌、皮膚癌、卵巢癌及攝護腺癌。已有實驗顯示P53聚集體形成類澱粉寡聚物及相似於那些在由於與硫代黃素T的結合而具有β摺板登記類澱粉結構的阿茲海默症、帕金森氏症及普里昂病中鑑別出的原纖維。

用於p53蛋白質病變之藥物篩選系統的方法

毒性類澱粉如何誘導腫瘤形成(tumorigenesis)仍不清楚。體內實驗調查此假說係受阻於分析p53類澱粉在腫瘤形成的影響之簡單系統的缺乏，因為誘導p53聚集作用同時抑制p53腫瘤抑制活性本身可導致致癌作用(carcinogenesis)。此外，人工添加p53纖維至細胞培養物以誘導細胞P53聚集體的形成造成細胞死亡，與P53聚集體陽性腫瘤顯示強化生長的臨床觀察相矛盾。而且，未鑑別出下游致癌的影響物或路徑。本文中，我們顯示出自發的野生型p53(Wt p53)聚集作用發生在293T細胞中，以允許我們研究錯誤摺疊的P53聚集體，其中p53類澱粉與臨床報告表現相似。我們分離並單一選殖(single clonally)擴增四的品系：三種p53類澱粉品系-p53[L](長纖維)、p53[S](短纖維)及p53[P](點狀聚集體(punctate aggregates))及品系p53-NVA(無可見P53聚集體)。各個p53類澱粉品係表型從親株(parent strains)傳輸至子細胞。據此優勢，我們調查幾種P53聚集體重要的態樣，特別是其普里昂特性、致腫瘤性及其下游影響物。值得注意的是，從293T細胞分離之獨特的四種p53品系顯示了此大眾的細胞株實際上為細胞類型的異質池(heterogeneous pool)。

申請人亦發現三種p53品系的聚集體不止分享了一些如成核(nucleation)及平行傳播(horizontal transmission)的普里昂特徵，也如其它普里昂或普里昂樣蛋白影響了細胞功能。然而，僅有p53[P]品系能夠感染其他細胞。

各個表型具有其本身固有的特徵。一系列的生化、免疫螢光及基因剖析(gene profiling)對三種品系顯示區別的病理生理學(pathophysiologies)，如在p53[P]品系中ROS的戲劇性增加及H3K27me3的缺失。癌幹細胞指標CD133的表現在p53[S]及p53[P]品系中顯著增加。進一步地，僅有展現點狀聚集體表型的p53[P]品系能夠感染細胞，表示非細胞自主影響(autonomous influence)。

用於P53聚集體誘導之蛋白、抗類澱粉劑、減少HSPB1表現或增加p53表現作為p53蛋白質病變的可藥性標靶之方法

與p53-NVA品系比較，p53聚集作用的品系顯示了細胞生長的加速、上皮間質轉化(epithelial to mesenchymal transition，EMT)活性、癌幹性的增加。經鑑別的一般下游影響物包含涉及賀爾蒙相關濃度及EGFR路徑的蛋白，以及包含p53類澱粉的一般病理標靶H3K27me3、H3K27Ac及DNMT1之表觀遺傳調節物(epigenetic regulators)的群組。

申請人發現與p53聚集作用相關的較低HSPB1表現在p53品系及HSPB1-減弱細胞中觀察到。

申請人亦探索到在所有品係中抗類澱粉劑及p53質體過表現24小時有效地消除p53聚集作用，並減少細胞存活率及癌幹性，為治療錯誤摺疊P53聚集體陽性腫瘤提供潛在的對策。

藉由阻斷錯誤摺疊蛋白的感染性用於治療類澱粉陽性癌症及/或癌幹細胞的方法

隨著加入p53類澱粉萃取物致非含有類澱粉的細胞中，申請人觀察到p53點狀物可表現為傳染性實體(infectious entity)。

P53聚集體能夠感染其他細胞或組織，顯示了普里昂樣傳輸可能發生在癌症進程中。因此我們提出兩個使用疫苗或胜肽潛在用於預防及/或治療聚集作用陽性腫瘤的治療對策。用於抗類澱粉免疫療法對策的抗原設計成能夠阻斷成核及/或摺疊錯誤蛋白聚集體之傳輸的「一種化學修飾的及/或突變的」蛋白片段、胜肽衍生物及其變異體。由於這些抗原的生態能夠阻斷成核作用，他們能進一步應用於治療中做為治療類澱粉疾病的治療胜肽。目前針對聚集體相關的神經退化的疫苗的方法為可導致普里昂的接踵並造成蛋白質病變的重組病理構形抗原。確實地，目前已顯示了對於人類病理Aβ及α-突觸核蛋白(synuclein)如同普里昂般增值的證據(Jaunmuktane Z et al., 2015; Prusiner SB et al., 2015)。

如同p53點狀物可表現為感染性實體，且在癌症患者中發現p53自體抗體(autoantibodies)。我們提出p53之錯誤摺疊聚集體的傳輸可在患者中誘導免疫反應以產生針對p53摺疊錯誤的蛋白的特異性自體抗體。相似的機制可能發生在如神經退化疾病或子癎前症(preeclampsia)的其它類澱粉疾病中。因此，偵測患者的蛋白質變性蛋白的自體抗體及/或錯誤摺疊聚集體可用評估健康人的早期蛋白質變性及相關疾病的患者。在血漿中的疾病聚集體或CSF可藉由包含類黃酮、多酚類及如如人類抗體、免疫球蛋白鏈、片段、衍生物及其變異體的多肽的聚集體結合分子偵測，其可結合至p53、TDP-43、類澱粉、寡聚物、tau、Beta類澱粉、IAPP、PrP^SC 、亨汀頓蛋白(Huntingtin)、抑鈣素(Calcitonin)、心房利尿鈉因子(Atrial natriuretic factor)、脂蛋白元A1(Apolipoprotein A1)、血清類澱粉A、邁迪因(Medin)、泌乳素(Prolactin)、轉甲狀腺素蛋白(Transthyretin)、溶菌酶(Lysozyme)、β2微球蛋白(Beta-2 microglobulin)、凝溶膠蛋白(Gelsolin)、角膜上皮蛋白(Keratoepithelin)、胱抑素(Cystatin)、免疫球蛋白輕鏈AL(Immunoglobulin light chain AL)、S-IBM、碳酸酐酶II(carbonic anhydrase II)、視網膜母細胞瘤蛋白(Retinoblastoma protein，pRb)、 Fus及α-突觸核蛋白(alpha-synuclein)。

藉由次級聚集傾向蛋白之負調節(Down-regulation)用於治療類澱粉陽性癌症及/或癌幹細胞的方法

申請人發現在p53類澱粉陽性內含物中TDP-43及p53之間的相互作用(第13圖)。本文中，TDP-43是p53類澱粉中的另一種普里昂樣蛋白，因此我們將TDP-43稱為次級聚集傾向蛋白。P53為初級聚集蛋白(primary aggregation proteins)。

申請人亦發現在以TDP-43siRNAs轉染的細胞中p53類澱粉纖維的顯著減少(第13f圖及第13g圖)。

藉由干擾類澱粉治療TDP-43蛋白質病變的方法

申請人發現p53類澱粉品系可調節其它聚集傾向蛋白的表徵及細胞功能；對於TDP-43，此包含隨後將影像其跳躍CFTR外顯子9之特性的TDP-43聚集傾向的改變(第13a圖至第13e圖)。

醫藥組合物

本文提供用於穩定TDP-43蛋白的細胞摺疊及減少TDP-43降解片段及TDP-43錯誤摺疊聚集體的醫藥組合物。本文提供的醫藥組合物有效於減少TDP-43錯誤摺疊聚集體，較佳為藉由組合物有益的協同作用。

在一個實施例中，醫藥組合物包含如17-AGG、其衍生物、其醫藥上可接受的鹽或其前藥的熱休克蛋白調節物與如EGCG、其衍生物、其藥學上可接受的鹽或其前藥的多酚類化合物的組合。選擇性地，醫藥組合物進一步包含如貝加因、其衍生物、其醫藥上可接受的鹽或其前藥的類黃酮。

在另一實施例中，醫藥組合物包含如17-AGG、其衍生物、其醫藥上可接受的鹽或其前藥的熱休克蛋白調節物與如貝加因、其衍生物、其醫藥上可接受的鹽或其前藥的類黃酮的組合。選擇性地，醫藥組合物進一步包含如EGCG、其衍生物、其藥學上可接受的鹽或其前藥的多酚類化合物。

在另一實施例中，醫藥組合物包含如EGCG、其衍生物、其藥學上可接受的鹽或其前藥的多酚類化合物與如貝加因、其衍生物、其醫藥上可接受的鹽或其前藥的類黃酮的組合。選擇性地，醫藥組合物進一步包含如17-AGG、其衍生物、其醫藥上可接受的鹽或其前藥的熱休克蛋白調節物。

根據本文提供的一些實施例的方法施用的藥物組合物可輕易地與藥學上可接受的載體一起配製，製備或與之一起施用。這些製劑可以藉由各種技術製備。這些技術包含帶入醫藥組合物之相關的活性化合物(如類黃酮、熱休克蛋白調節物或多酚類化合物)及合適的載體。在一個實施例中，醫藥組合物藉由將醫藥組合物之活性相關的化合物與液體載體、與固體載體或兩者均勻且緊密地帶入而製備。液體載體包含但不限於水性配方、非水性配方或兩者。固體載體包含但不限於生物載體、化學載體或兩者。

醫藥組合物以水性懸浮液、油性乳液、油包水乳液(water in oil emulsion)及水包油包水乳液(water-in-oil-in-water emulsion)，且在載體中包含但不限於乳霜(creams)、凝膠(gels)、脂質體(liposomes)(中性的、陰離子的或陽離子的)、液態奈米球(lipid nanospheres)或液態微球體(microspheres)、中性的、陰離子的或陽離子的聚合奈米粒子(polymeric nanoparticles)或微粒子(microparticles)、位置-特異性乳劑(site-specific emulsions)、常駐乳劑(long-residence emulsions)、黏性-乳劑(sticky-emulsions)、微-乳劑(micro-emulsions)、奈米-乳劑(nano-emulsions)、微球體(microspheres)、奈米球(nanospheres)、奈米顆粒(nanoparticles)與小型泵(minipumps)中，並與允許該醫藥組成物的持續釋放(sustained release)之各種不同的天然或合成的聚合物施予，聚合物包含陰離子的、中性的或陽離子的多醣(polysaccharides)以及陰離子的、中性的或陽離子的聚合物或共聚物，小型泵或聚合物可被植入需要組成物遞送處的附近。進一步地，本文所提供之醫藥組合物的活性成分與該等載劑中的任一者或任何的組合是有用的。這些載劑包括，但不限於，抗-氧化劑、緩衝液以及靜菌劑(bacteriostatic agents)，且可選擇性地包括懸浮劑(suspending agents)以及增稠劑(thickening agents)。

為了於非-水性載劑中投藥，本文提供之醫藥組合物的活性成分可以如但不限於二酸甘油酯(diglyceride)、三酸甘油酯(triglyceride)、磷脂質(phospholipid)、脂質、油及其混合物的礦物油(mineral oil)或以中性油(neutral oil)乳化，其中油含有多不飽和與飽和的脂肪酸之一適當混合。實例包含但不限於，大豆油(soybean oil)、芥花油(canola oil)、棕櫚油(palm oil)、橄欖油(olive oil)以及myglyol，其中脂肪酸碳的數目是介於12與22之間，且其中該等脂肪酸可為飽和或不飽和的。選擇性地，帶電的脂質或磷脂質是被懸浮於該中性油中。一適當的磷脂質為但不限於，標靶於巨噬細胞(macrophages)上的受體之磷脂醯絲胺酸(phosphatidylserine)。此處所提供的醫藥組合物可選擇性地使用習知的技術而被配方於水性介質中或被配方為乳劑。

本文提供的醫藥組合物可選擇性地包含本文描述的活性劑，且選擇性地其它治療劑及/或預防成分。載體及其他治療成分必須在與該組成物的其他成分相容並且不會有害於它的接受者(recipient)之效用上是可接受的。

醫藥組合物以減少TDP-43降解片段及/或TDP-43錯誤摺疊聚集體或在包含人類的動物中誘導治療反應的有效劑量施予。所施予的醫藥組合物的劑量將取決於被治療的情況、特定的配方以及其他如接受者的體重與病況以及投藥的途徑的臨床因子。在一個實施例中，每劑量之施予的醫藥組合物的量對應於大約0.00001 mg/kg至大約100 mg/kg的活性成分。在另一實施例中，每劑量之施予的醫藥組合物的量對應於大約0.0001 mg/kg至大約50 mg/kg活性成分。在進一步的實施例中，每劑量之施予的醫藥組合物的量對應於大約0.001 mg/kg至大約10 mg/kg的活性成分。在另一實施例中，每劑量之施予的醫藥組合物的量對應於大約0.01 mg/kg至大約5 mg/kg的活性成分。在進一步的實施例中，每劑量之施予的醫藥組合物的量對應於大約0.1 mg/kg至大約1 mg/kg的活性成分。

本文提供之 醫藥組合物的有用的劑量藉由比較其體外活性及動物模式中的體內活性偵測。在小鼠及其他動物中外推至人類的方法為所屬技術領域中已知；例如，參見美國專利號4,938,949，期藉由引用併入本文中。

根據本文提供的方法，醫藥組合物藉由各種途徑傳遞，包含但不限於注射(例如，皮下的(subcutaneous)、肌肉內的(intramuscular)、靜脈內的(intravenous)、動脈內的(intra-arterial)、腹膜內的(intraperitoneal))；連續靜脈內注入(continuous intravenous infusion)；皮膚地(cutaneously)、真皮地(dermally)、穿皮地(transdermally)；口服地(orally)(例如，錠劑(tablet)、丸劑(pill)、液態藥物(liquid medicine)、可食性薄膜帶(edible film strip))；植入式滲透泵(implanted osmotic pumps)；栓劑(suppository)或氣溶膠噴霧(aerosol spray)。施予的途徑包含但不限於局部的(topical)、皮內(intradermal)、蜘蛛膜下腔(intrathecal)、疾病部位內(intralesional)、腫瘤內(intratumoral)、膀胱內(intrabladder)、陰道內(intravaginal)、 眼球內(intra-ocular)、直腸內(intrarectal)、肺內(intrapulmonary)、椎管內(intraspinal)、真皮(dermal)、皮下(subdermal)、關節內(intra-articular)、放置在身體的腔內(placement within cavities of the body)、鼻腔吸入(nasal inhalation)、肺吸入(pulmonary inhalation)、插入皮膚的印模(impression into skin)以及電穿孔(electroporation)。

取決於施予的途徑，在可接受的載體中本文所提供之醫藥組合物的量每劑量為0.001 ml大約至大約100 ml。在一個實施例中，在可接受的載體中本文所提供之醫藥組合物的量每劑量為0.01 ml大約至大約50 ml。在另一實施例中，在可接受的載體中本文所提供之醫藥組合物的量每劑量為0.01 ml大約至大約30 ml。在預定的時程上，或者歷時適合於要被治療的疾病、接受者的病況以及投藥的途徑之一段時間，醫藥組合物可以單一劑量治療或以多重劑量治療而被投藥。所欲的劑量可便利地被呈現於單一劑量中或被呈現為於適當的間隔下而被投藥之經分割的劑量，例如，每天二、三、四或多個次-劑量(sub-doses)。次-劑量本身可進一步被分割，例如，被分割為許多不連續之零散間隔的投藥。

用於構形疾病之體外藥物篩選方法

貝加因在體外和體內將現有的TDP-43聚集體整建成可溶性聚合物的狀態(第1圖及第3圖)。TDP-43的可溶性聚合物實現例如CFTR的外顯子跳躍的生物學功能(第3圖及第5圖)。

貝加因在與老化相關之疾病的多重細胞模式中恢復錯誤摺疊TDP-43蛋白的生物活性(第3圖及第7圖)。

TDP-43之黃芩誘導的(Baicalein-induced)聚合物執行TDP-43核功能。此顯示了普里昂樣LC蛋白的聚核作用可被用來篩選用於構形疾病的治療候選物，以恢復構形疾病之普里昂樣疾病蛋白錯誤摺疊的生物活性。

本發明之實施例藉由下列實例說明，其不應以任何方式解釋為對其範圍強加限制。相反地，應被清楚理解的是在不脫離本發明的精神下，所屬技術領域具有通常知識者在閱讀本文說明書之後，可採取各種其他實施例、修改及其相效物。除非另有說明，在描述下列實例的研究中，將遵循習知程序。一些程序將在以下描述以用於說明目的。

用於實例中的材料與方法之描述

以下描述了用於實例中的材料及方法。

細胞培養及藥物治療：239T細胞用於全文實驗研究中。239T細胞在補充以10%胎牛血清(fetal bovine serum)、1%盤尼西林/鏈黴素(penicillin/streptomycin)及1%L-麩胺酸酯(L-glutamate)的杜氏改良依格爾培養基(Dulbecco's modified Eagle medium，DMEM)/F12中生長。大鼠海馬迴神經元(hippocampal neurons)的初代培養係如前(Wanget al , TDP-43, the signature protein of FTLD-U, is a neuronal activity-responsive factor.J. Neurochem. 105, 797–806 (2008))所述從胚胎期第17天的大鼠胚胎製備。所有對大鼠的操作程序根據實驗動物管理及使用委員會(Institutional Animal Care and Utilization Committee, Academia Sinica)批准的指南進行。海馬迴細胞以低密度(每平方公分10000個細胞)放置在塗布有多聚離胺酸(poly-L-lysine)的蓋玻片(coverslides)上，並在神經基底培養基(Neurobasal medium)/B27 (Invitrogen)中培養。使用根據製造商指導且如前Wanget al .(Wanget al .,ProcNatlAcadSci USA . 99, 13583-13588 (2002). All of the plasmid constructs were described in Wanget al .,Nature Communication, 2012)所述的磷酸鈣規程轉染293T細胞。293T細胞(1 x 10⁵ )接踵於六孔盤中的每一孔中並在37°C下以5% CO₂ 隔夜培養。為了測定不致病穩定劑對減少病理樣聚集體的影響，細胞以貝加因及EGCG以指定的濃度(25或50 μM)處理12、24或48小時。為了測定貝加因、EGCG及180 nM之17-AGG在減少病理樣聚集體上的協同作用，在以GFP-TDP-43-IIP質體轉染後以組合配方處理細胞24小時。

試劑及抗體：貝加因及EGCG取得自Sigma。17-AFF購自Sigma並溶解於二甲亞碸(dimethyl sulfoxide，DMSO)。針對HSPB1的一級抗體購自Cell Signaling Technology (Beverly, MA)。針對核片層蛋白A/C的初期抗體購自Millipore Inc。針對U1 snRNP C的一級抗體購自Sigma。針對DNMT1、eIF4A1、p-EGFR及HIF1-α的一級抗體購自Cell Signaling.com。針對CD133的一級抗體購自abcam.com。

藉由極限稀釋(limiting dilution)分離單一p53品系：在以補充以10%胎牛血清、1%盤尼西林/鏈黴素及1%L-麩胺酸酯補充的杜氏改良依格爾培養基中稀釋293T細胞至1 cells/100 µl的最終濃度。96孔盤的每個孔以100 µl的細胞懸浮液接踵並培養2周。僅有良好含有的單一選殖會進一步的擴展。

TDP-43及p53的溶解度分析：轉染或無轉染TDP-43-FL或TDP-43-Q303P的細胞以RIPA緩衝液(50 mM Tris、150 mM NaCl、1 mM EDTA、1% NP-40, pH 7.4)裂解，溶解產物進一步藉由在4°C 16,000 g離心5分鐘區分(fractionated)。然後將不溶性沉澱物(pellets)溶解於8 M 尿素/ 50 mM Tris (pH 8.0)中。蛋白質使用多株TDP-43抗體或單株p53抗體藉由西方墨點轉漬法鑑別。

TDP-43纖維型成的體外分析：三微莫耳全長TDP-43重組蛋白(GenWay)與3 μM貝加因在組裝緩衝液中培養。反應在室溫下以攪拌執行30分鐘、60分鐘及90分鐘。所得到的樣品以4%醋酸氧鈾(uranyl acetate)染色1分鐘。以FEI Tecnai G2 Spirit TWIN穿透式電子顯微鏡(transmission electron microscope)進行EM分析。

感染分析。p53 [L]、p53 [S]或p53 [P]細胞以PBS潤洗並再懸浮於1ml H₂ O中。離心之後上清液及再懸浮的沉澱物加至平盤培養(plated)的p53-NVA受體細胞。二十四小時的暴露之後，以PBS潤洗細胞並固定用以使用p53特異性抗體免疫染色(1C12; Cell Signaling #2524)抗體。

siRNAs及轉染：針對HSPB1 (HSP27)及TDP-43的siRNA分別購自Santa Cruz (SC-29350) and Dharmacon。用於過表現及減弱實驗，各別的質體(3 µg)或siRNAs (25 or 60 pmol)使用Lipofectamine 2000 (Invitrogen)根據製造商的指南短暫地(transiently)轉染至293T細胞中。

質體：從人類cDNA藉由使用引子組HSPB1及R280S的PCR個別的放大HSPB1及p53R280S。所得到的片段進一步選殖成pEGFP-N3(Clontech, Mountain View, CA, USA)。使用GFP-P53R280S作為模板藉由定點突變作用(site-directed mutagenesis)產生GFP-p53。定點突變作用遵循標準規程使用PfuUltra II HS Fusion DNA Polymerase (Agilent)及引子組S280R執行。

免疫組織化學：螢光染色如前(Wanget al ., 2012)所述的進行。細胞以或無質體或siRNAs轉染並生長24至42小時。細胞以在PBS中的3.7%三聚甲醛(paraformaldehyde)在室溫下固定15分鐘，及然後以0.1% Triton X-100通透化(permeabilized)。固定的細胞以一級抗體在室溫下培養2小時，接著以Cy2-或Cy3-標定的二級抗體培養。使用Vectashield DAPI H-1200 (Vector)安裝蓋玻片。使用LSM710 META雷射掃描共軛焦顯微鏡(laser-scanning confocal microscope)(Zeiss)收集細胞螢光影像。

選擇性剪接分析：TDP-43介導的CFTR外顯子9跳躍分析如前所述的進行。簡言之，細胞以TDP-43質體、hCF-(TG)₁₃ (T)₅ 袖珍基因(minigenes)及包含VCP/p97 wt、VCP/p97 QQ、HSPB1、核片層蛋白 A 或早衰症或HSPB1 siRNA之指定的質體共轉染。經轉染之細胞的總RNA藉由TRIzol試劑(Invitrogen)分離，以及RT-PCR根據製造商的規程藉由使用特異性引子的Superscript III (Invitrogen)以放大CFTR的外顯子8-10進行。在1.3%的瓊脂糖凝膠(agarose gels)上驗證了cDNA的相對量。

統計分析。統計學顯著性(statistical significance)藉由變數分析(t-test)計算。若P 值>0.05則認為群組之間的差異為顯著。

小鼠：SMA的小鼠模式藉由刪除Smn 基因的外顯子7並敲入(knock-in)人類SMN2 基因而製造(Smn-/-SMN2+/- )。我們能夠經由重複回交(back-crossing)得到更同質的基因背景產生存在更嚴重疾病症狀學的變異體。此嚴重SMA模式有兩個SMN2 轉基因(Smn-/-SMN2+/- )的複製。SMA的小鼠模式經由將異質體剔除小鼠(Smn+/-SMN2-/- )與帶有兩個SMN2 轉基因的複製(Smn-/-SMN2+/+ )的同型體剔除小鼠雜交而產生。SMA小鼠自出生承受每日貝加因(在酒精中40 mg/kg/d)或僅有酒精(控制組)的腹膜內注射，及然後承受運動功能測試及存活分析。進行迴轉測試(turnover test)、管測試(tube test)及負趨地性測試(negative geotaxis test)的三種行為測試以計算前述具有SMA(Smn-/-SMN2+/- )及異質體同胎仔(littermates)(Smn+/-SMN2+/- )的小鼠的運動功能。在迴轉測試中，紀錄小鼠從俯臥姿勢至自行翻正並將四隻腳放在地面上所需的時間(截止時間為60秒)。管測試用於根據後肢及尾部的位置測定後肢的力量；分數範圍從0(最差)至4(最佳)。在負趨地性測試中，小鼠以頭朝下放置在45°斜面上。反應(轉向及攀爬)以0(最差)至4(最佳)計分。

B-isox沉澱：獲取293T細胞並以RIPA緩衝液裂解。蛋白質濃度調整至1至10 mg/mL，並將生物素化異噁唑(biotinylated isoxazole)加入細胞溶解產物至最終濃度為100至200 µM。然後混合物在4°C下培養60分鐘，在4°C下以15000 rpm離心15分鐘，並倒棄上清液。整個反應體積以SDS-PAGE及西方墨點轉漬法分析。

實例

實例1：貝加因、非類澱粉路徑化合物、體外整建天然未摺疊單體及錯誤摺疊TDP-43成為TDP-43聚合物

以sup35的類澱粉普里昂域功能性取代TDP-43之非類澱粉普里昂樣域顯示潛在以非類澱粉穩定劑用於治療TDP-43蛋白質病變的通用結構。為檢察我們的假說，我們選擇幾種已知非類澱粉路徑化合物並驗證其在去組裝TDP-43錯誤摺疊聚集體的效果。我們將經純化的TDP-43重組蛋白與或不與這些不致病路徑化合物(等莫耳濃度)在組裝緩衝液終於室溫下攪拌培養0、30、60及90分鐘。不致病路徑化合物的效果由負染色電子顯微鏡檢查。在這些化合物不存在下，TDP-43纖維的長度漸漸地增加3至10 μm (第1a圖)。在貝加因的存在下，TDP-43先為、寡聚物或天然未摺疊的單體有效的重塑為TDP-43蛋白以時間依賴性的方式沿著絲狀以重組球狀結構(約30nm長)之有序的TDP-43纖維(第1b)。箭頭指出TDP-43聚合物之代表性的高放大倍率影像。貝加因誘導的TDP-43聚合物為0.15-0.9 μm長，而短於TDP-43纖維。分析在不同時間點之TDP-43纖維及TDP-43聚合物的長度(第1c圖)。值得注意的是，不像如原纖維(protofibers)的管狀結構，這些貝加因誘導的tdp-43聚合物具有高度分枝結構，且該分支隨反應時間的增加漸漸地增加至形成有序的巨大複合物(第1d圖)。第1b圖的下圖面中以箭號指出了其中一個分支點。第1e圖示出了兩個聚合TDP-43聚合物之選定的圖案。這些結果使出貝加因直接結合並拆開TDP-43纖維，且然後將聚集階段轉形成TDP-43聚合物。

實例2：貝加因、EGCG及17-AAG體內去組裝病理TDP-43包涵體

接著，我們在體內驗證貝加因在TDP-43錯誤摺疊聚集體之去組裝上的效果。GFP-TDP-43病理樣(GFP-TDP-43-IIPLD)包涵體表現的293T細胞以或不以50 μM貝加因處理12小時，接著以顯微鏡分析及西方墨點轉漬法確效。如第2a圖中所示，抑制了TDP-43-IIPLD蛋白質(proteinaceous)核顆粒的組裝(箭頭指出了TDP-43-IIPLD聚集體)。統計分析顯示了藉由貝加因之TDP-43-IIPLD聚集體的劑量依賴性的減少(第2b圖)。此外，西方墨點轉漬法顯示了在貝加因處理的細胞中不可溶性TDP-43-IIPLD蛋白的減少(第2c圖)。以高劑量貝加因(30-400 μM)處理的細胞在可溶性部分中具有顯著的代償性(compensatory)增加，顯示了貝加因拆開了病理TDP-43聚集體而不是促進降解(第2c圖)。相似地，EGCG等其他不致病路徑穩定物也顯示減少的TDP-43蛋白質核顆粒及增加的可溶性TDP-43-IIPLD蛋白(第2d、2e及2f圖)。我們發現了在細胞疾病模式中，兩個不致病路徑化合物，貝加因及EGCG去組裝了TDP-43的病理樣聚集體並重新指引他們城為可溶性的部分(第2a-f圖)。

為進一步調查以低劑量的潛在療法及與有效的抗聚集作用化合物之合併療法，我們驗證了包含貝加因、EGCG及17-AGG的非TDP-43聚集體化合物隨著治療7或24小時的協同作用(第2g、2h及2i圖)。我們發現了貝加因、EGCG或17-AGG在治療後7及24小時對減少TDP-43-IIPLD錯誤摺疊聚集體展現協同作用(第2h及2i)。

實例3：貝加因在FTLD-U及ALSVCP97之遺傳突變細胞膜式中拯救了TDP-43功能異常

然後我們測試貝加因是否可以功能性地拯救疾病TDP-43蛋白。在以VCP/97突變R155H的FTLD/ALS中已表徵了TDP-43蛋白質病變。VCP/97突變R155H改變了VCP/97的功能，再分配TDP-43至細胞液並導致TDP-43不可溶聚集體的形成。因為功能性TDP-43蛋白能夠促進CTFR外顯子9跳躍，因此我們使用體內剪接分析驗證再貝加因存在下細胞TDP-43蛋白的摺疊階段(第3a圖)。顯而易見地，在以TDP-43及VCP/p97 R155H突變共轉染的細胞中，TDP-43促進CFTR外顯子9跳躍失效；然而，此失效在貝加因存在下校正(第3a圖)。僅以貝加因處理的細胞以劑量依賴性的方式顯示出強化的促進TDP-43介導CFTR外顯子9跳躍的能力。沒有共過表現的TDP-43蛋白，貝加因在CTFR的外顯子跳躍上沒有效果(第3c圖)，見了貝加因在促進CFTR外顯子9跳躍上的效果經由TDP-43蛋白發生。這些結果證實了在VCP/97突變誘導的疾病模式中，貝加因功能性校正TDP-43疾病蛋白。因為如第1圖所示貝加因體外整建了TDP-43纖維及天然未摺疊的TDP-43單體成為聚合物，我們進一步藉由分析以貝加因處理細胞之TDP-43蛋白的品系以調查貝加因的藥理作用(pharmacological action)。確實，我們發現在貝加因處理的細胞中，TDP-43聚合物顯著地減少了不可溶的尿素部分而在核部分中代償地增加(第3d圖，藉由箭頭顯示)。在拯救的TDP-43介導的CFTR外顯子跳耀及TDP-43聚合物增加的表象之間的功能性相關也在貝加因處理的VCP/p97 R155H細胞中觀察到(第3e圖)。這些結果證實TDP-43促進CFTR外顯子跳耀的能力與可溶性TDP-43聚合物有關。不幸地，EGCG增加了130 kD TDP-43的量而不是不足以在mRNA加工中中校正TDP-43功能異常的高階TDP-43聚合物。此結果隱含了在貝加因及EGCG之藥理作用的差異。

實例4：VCP/p97的ATP酶活性涉及TDP-43聚合物的組裝及TDP-43介導的外顯子跳躍

我們進一步調查VCP/p97的ATP酶活性是否涉及TDP-43的細胞定位及TDP-43聚合物的組裝。我們分析了在以野生型VCP/p97或ATP酶缺陷的VCP/p97變異體-VCP/p97-QQ轉染的293T細胞中的TDP-43蛋白質定位及TDP-43聚合物(第4a圖及第4b圖)。我們發現在細胞中TDP-43形成的細胞溶質聚集體表現VCP/p97-QQ(第4a圖，箭頭)。TDP-43聚合物在以VCP/p97-wt轉染的細胞中展現劑量依賴性方式的逐漸增加(第4b圖，箭頭)；相反地，在VCP/p97-QQ-表現細胞中觀察到TDP-43聚合物的逐漸減少(第4c圖，箭頭)。體內剪接分析進一步顯示VCP/p97-QQ抑制了TDP-43介導的CFTR外顯子9跳躍(第4d圖)。接著我們測試貝加因是否也能夠救援VCP/97-QQ-誘導TDP-43對於CFTR外顯子9跳躍的失能並發現貝加因在VCP/97-QQ-表現細胞中增加了CFTR外顯子9跳躍(第4e圖)。與Gitchoet al. 的研究一致，交聯IP檢查顯示VCP/p97物理性地與TDP-43相互作用(第4f圖)。觀察到與VCP/p97-wt比較，TDP-43與VCP/p97-QQ較低的共免疫沉澱效率顯示了VCP/p97ATP酶活性在TDP-43及VCP/p97的交互作用中作用以調節高階TDP-43聚合物的形成。值得注意的是，已在TDP-43蛋白質病變的光譜中顯示了藉由VCP/p97較少的免疫沉澱，此意味著VCP/p97及TDP-43之間交互作用的干擾為患有偶發性或遺傳的TDP-43蛋白質病變的患者中致病性的關鍵步驟。VCP/p97及TDP-43之交互作用顯著的缺陷可由貝加因校正之TDP-43聚合物的組裝導正。

因此，為了檢查貝加因是否能夠功能性地校正疾病相關的TDP-43突變，我們使用FTLD/ALS連結的偶發性突變TDP-43 R361S及VCP/p97-QQ的共表現設計了TDP-43的細胞疾病模式。設計了VCP/p97及TDP-43 R361S關連的減少與TDP-43經由VCP/p97-QQ 過表現的外顯子跳耀能力退化已刺激病理情況。我們發現貝加因拯救了藉由TDP-43的FTLD/ALS-連結的偶發性突變R361S造成的功能異常，且脯胺酸取代作用突變部分損失普里昂樣組裝的GFP-TDP-43-Q303P在細胞中表現VCP/p97-QQ (第4g圖、第4h圖)。這些結果意味著貝加因不只拯救了錯誤摺疊的wtTDP-43也拯救了遺傳的TDP-43突變。

實例5：HSPB1的缺失增加了活化CTFR外顯子9跳躍的核TDP-43聚合物

我們進一步調查調節TDP-43聚合物組裝的其他細胞因子。一種TDP-43功能性聚合物的潛在調節物HSPB1在細胞液中在氧化壓力及與TDP-43物理性交互作用下影響高階TDP-43寡聚物的組裝。在293T細胞中藉由轉染HSPB1 siRNA之HSPB1的缺陷在細胞核中增加核TDP-43聚合物(第5a圖)。確認了高效率的HSPB1減弱(第5a圖)。進一步地，體內剪接分析在HSPB1減弱的細胞中CFTR外顯子9跳躍對應的增加(第5b圖)。相反地，HSPB1的過表現在細胞液中增加TDP-43聚合物並減少CFTR外顯子9跳躍(第5c圖及第5d圖)。HSPB1表現影響組裝TDP-43聚合物與TDP-43介導之外顯子跳耀的鍵聯，其對新種類提供了貝加因依賴性的證據；即展現執行TDP-43介導之外顯子跳耀的核TDP-43聚合物。

實例6：TDP-43核複合物的超微結構(ultrastructure)

為表徵TDP-43核複合物的細胞構形，特別是聚合物結構，我們發展了涉及在免疫沉澱前固定細胞接著以負染色用於電子顯微鏡的修飾方法。用於含有細胞TDP-43複合物純化的實驗程序在第6a圖中說明。為保留其結構完整性，在獲得之前細胞部分地以3.7%三聚甲醛固定10分鐘。然後分量細胞並經由標定這些蛋白的抗體免疫沉澱從細胞核萃取中分離TDP-43-、TIAR-及CBP相關的細胞複合物。以西方墨點轉漬法確認TDP-43蛋白複合物的成功純化(第6b圖)。TIAR及CBP用作為對特異性分離的控制(第6b圖)。電子顯微鏡免疫沉澱顯示含有核複合物的tdp-43形成直徑在6致43 nm之範圍中的短纖維及寡聚物(第6c圖)。箭頭指出TDP-43複合物在第6d-6f及6h-6j中代表性的高倍率放大影像。TDP聚合物展現短的、管狀的、非平行的組織(第6d、6e及6f圖)。主要含有TDP-43聚合物的長度為150-350 nm。提供於第6f途中代表性的影像顯示分離的聚合物可能歷經聚合作用的兩個分支。含有TDP-43聚合物相似於形成鬆散F-肌動蛋白樣組裝的體外貝加因誘導TDP-43聚合物，但它們的形態包括不規則形狀和異質性。值得注意的是，也在細胞核中觀察到TDP-43的線性免疫金標記(第6g圖)。明顯地，我們觀察到與TDP-43抗體沉澱，由與球狀結構相關之分支的、多結狀長絲組成的纖維顆粒網質，相似於已知的纖維腺體核糖核蛋白(第6k圖及第6l圖)。使用TAIR及CBP抗體沉澱沒有相似的結構(未顯示數據)。為謹慎地驗證TDP-43蛋白是否在細胞核中構成纖維顆粒網質，我們以長抗體培養期間(4°C, 16-18 h)，並使用具有120 nm解析度的螢光顯微鏡術(fluorescence microscopy)進行免疫螢光實驗。如地6k圖所示，免疫螢光分析一致地顯示TDP-43的絲狀網質，其中TDP-43沿著延長的絲狀纖維分布並密集的聚集(第6m圖)。此外，GFP-mTDP-43-FL蛋白相似於內生性TDP-43展現與球狀結構相關之分支的、多結狀長絲，但mTDP-43-PLD△不形成球狀結構且長絲減少(第6n圖)。此結果表示TDP-43的普里昂樣域需要螯合TDP-43成為節狀的長絲。可能是由於內生性TDP-43經由RNA結合域的隔離利，展現了在長絲中稀少的GFP-mTDP-43-PLD△蛋白。本文中，我們鑑別了細胞TDP-43蛋白包含低聚複合物、鬆散絲狀聚合物及纖維顆粒網質的基本建構塊(basic building block)。

實例7：藉由校正普里昂樣蛋白的迷走相(aberrant phase)拯救過早老化

為進一步表徵TDP-43蛋白是否存在於由如核片層蛋白A/C之蛋白組成的核基質中，我們雙重染色TDP-43(綠色)與核片層蛋白A/C(紅色)(第7圖)。TDP-43纖維顆粒網質部分地連接至核片層蛋白A/C(第7a圖，箭號指出共定位區域)。當缺陷的核片層蛋白A可造成早衰症及過早老化疾病HGPS，早衰症蛋白的過表現被認為是老化的細胞模式且允許我們探討TDP-73及老化或核片層蛋白A病理現象的機制連結。因此我們過表現早衰症蛋白並檢查TDP-43定位、TDP-43PLD介導的外顯子9跳躍之效率及TDP-43聚合物。在早衰症表現細胞中，我們發現TDP-43蛋白展現擴散及細胞質錯誤定位的圖案，且無法促進CFTR外顯子9跳躍(分別為第7b圖及7c圖)。明顯地，在一些細胞中我們觀察到TDP-43的TDP-43蛋白質病變的病理特徵的細胞溶質聚集體(第7b圖，箭頭)。西方墨點轉漬法進一步顯示在早衰症表現細胞中TDP-43聚合物組裝的失效(第7d圖)。我們進一步測試TDP-43 PLD的藥理伴護小分子(Pharmacological chaperone)-貝加因是否能夠拯救早衰症誘導的TDP-43功能異常。如第4E圖中所示，貝加因顯著的誘導在表現早衰症蛋白的細胞中核TDP-43的滯留(retention)，且統計分析示於第7f圖。體內剪接分析顯示貝加因以劑量依賴的方式拯救由早衰症造成的TDP-43功能異常(第7g圖)。隨著貝加因從10µm至50 µm的濃度，藉由貝加因之外顯子跳耀的滯留率從1.31至1.91(比率表示在第7g圖的底部)。

這些結果表示早衰症突變中斷TDP-43 PLD介導的選擇性剪接，可能是由於TDP-43聚合物組裝的失效及TDP-43功能異常導致在患有HGPS的患者中選擇性剪接廣泛的改變。這些TDP-43功能異常可藉由貝加因功能性地校正。有趣的是，我們發現貝加因不僅恢復TDP-43的活性，也校正在HGPS中核形狀的缺陷(第7j圖；箭頭示出恢復的核)。此結果與先前錯誤摺疊的TDP-43蛋白破壞了核膜的報導一致。

我們進一步分析核片層蛋白A及TDP-43的倒數關係(reciprocal relation)。我們觀察到在表現核片層蛋白A的細胞中TDP-43品種的顯著改變(第7i圖)。在表現核片層蛋白A的細胞中觀察到54 kD-及70 kD-的TDP-43品種消失，但不溶性之90 kD-TDP-43蛋白(箭頭)的組裝(第7i圖)。然而，雖然免疫螢光顯示TDP-43與核片層蛋白A/C在尖端(punta)部分地共定位，我們無法藉由共免疫沉澱鑑別TDP-43與核片層蛋白A/C之間的物理相互作用(第7a圖)。或許當核片層蛋白B作用為普里昂樣蛋白以結合至其b-isox時TDP-43經由核片層蛋白B(SEQ ID No. 10)與核片層蛋白A交互作用。總之，貝加因在拯救核片層蛋白中的藥理活性顯示了對於在疾病老化中TDP-43蛋白的普里昂樣摺疊的關鍵角色。

實例8：SMN的固有普里昂樣傾向

已經顯示SMN在稱為Gems的次核體中濃縮，並且經由與普里昂樣蛋白TIA1的交互作用併入細胞溶質壓力顆粒(SG)中。Lorson et al.進一步鑑別在SMN1 的外顯子6中的模組自-寡合區域(self-oligomerization region)，且疾病嚴重度與勝任寡核的SMN蛋白並損失Gems之細胞內濃度成反比。這些良好表徵的分子行為及SMN的特性可藉由目前我們團隊及其它發現之固有的普里昂樣傾向說明。因此，我們假設SMN蛋白在外顯子6中具有普里昂樣域。SMN之普里昂樣摺疊的中斷導致普里昂樣自聚合作用的流失，並造成SMA病理現象之後續發展的結果。

目前鑑別的特異性化學探針-生物素化異噁唑，特異性地辨識交聯-β普里昂樣聚合物並依序與具有低複雜度的蛋白、普里昂樣域或如TDP-43及Fus的項分離域沉澱。我們原始地將100 μM b-isox與mes23.5的細胞溶解產物及293T細胞在4°C下培養以化學沉澱整個普里昂樣蛋白，及然後藉由西方墨點轉漬法分析SMA結合的效率以評估普里昂樣或相變SMN的潛力(第8a及b圖)。西方墨點轉漬法顯示藉由b-isox沉澱了SMN及類泛素化(sumoylated)的SMN兩者(第8a及b圖)。次細胞分群分析進一步顯示內生性類泛素化SMN蛋白在不溶性尿素部份中偵測到主要的SMN構形，且這些蛋白隨著b-isox治療後消失(第8c圖)。H3K4me3用作為不溶性裝載的控制(第8c圖)。確實，不溶性SMN以報導經由SUMO-樣交互作用部分(SIM樣)對於Cajal體的組裝重要。因此，類泛素化為觸發核SMN經由交聯-β 聚合作用形成分離相的細胞調控機制之一。已經顯示SMN對Gems和CBs的功能異常標靶為患者中SMA的特徵。

出乎意料地，我們發現藉由b-isox辨識之SMN的主要構形位於細胞液中(第8b圖)。因為可見的SMN顆粒在正常情況下未在細胞液中觀察到，我們推導在細胞液中SMN聚合物可參與與其他普里昂樣蛋白的異聚體相互作用以實現生物學功能。因此，我們藉由以b-isox沉澱測試已知SMN交互作用物的相變潛力，並發現在細胞液中已知的SMN交互作用物PFN1與b-isox沉澱(第8b圖)。PFN1中的突變造成患有家族性萎縮性側索硬化(ALS)的患者中TDP-43的共聚集，支持了PFN1為普里昂樣蛋白的假說。在先前研究中，PFN1已顯示為經由直接與SMN中位於自寡核區域之脯胺酸拉伸的交互作用調節細胞骨架動力學(cytoskeletal dynamics)。因此，我們假設這些交互作用藉由普里昂樣本質介導。進一步地，我們將全長SMN或SMN之外顯子刪除構造的部分與b-isox培養，且然後進行西方墨點轉漬法分析以鑑別在SMN中的b-isox結合位。SMN變異體的地圖集結果示於第8d圖中。藉由外顯子1-3、4-7及6-7編碼的區域良好地與b-isox沉澱，但脯胺酸富含域及Gemin2無法與b-isox沉澱(第8d圖)。由外顯子2b及6編碼的域一直以來被報導為自交互作用。雖然由外顯子2及6兩者編碼的域展現經由交聯-β聚合作用進行相轉移的潛力，僅有含有藉由外顯子6編碼域的片段形成可見的顆粒(第8f圖，箭頭)。即使那些變異體形成可見的顆粒，基於溶解度檢驗的結果，含有外顯子6-7的變異體沒有偵測到不溶性部分。因此，不溶性與顆粒形成不成比例。SMN的N-端及C-端可採取交聯-β聚合物構形，但SMN的兩個域具有不同的生化特性及行為。

實例9：藉由致病突變及外顯子7刪除增加交聯-β結構及SMN之摺疊錯誤的蛋白聚集體

我們測試SMN的普里昂摺疊的缺陷是否與SMA嚴重性相關。我們使用b-isox直接檢查患者衍生的誤義SMN突變Y272C及G279V2的細胞構形。第一型SMA突變Y272C及G279V為在已示出中斷了自寡合作用之YG盒中的點突變。估計佔診斷為SMA的患者50%至70%第一型SMA為最嚴重且常見的類型。相較於野生形SMN，b-isox強烈地沉澱Y272C及G279V SMN蛋白。在b-isox之結合親合力(binding affinity)的改變中反應了這兩種突變體的細胞形已經改變。有趣的是，類似於TDP-43羧基末端的病理錯誤摺疊聚集體，大量的Y272C及G279V SMN蛋白集合在不溶性尿素部分中，(第9a圖)。我們進一步分析兩種致病突變的位置已偵測這兩種突變是否形成病理樣包涵體。確實，在培養表現Y272C及G279V SMN蛋白的運動神經元中，可見蛋白聚集體增加(第9b圖)。因此，Y272C及G279V突變改變了原始功能性構形並導致SMN錯誤摺疊。突變Y272C或G279V SMN蛋白之摺疊錯誤的蛋白聚集體並未在患有SMA的患者中報導。我們推導Y272C及G279V SMN蛋白的過表現導致了過載蛋白降解系統之摺疊錯誤的蛋白。此無效率的蛋白質清除導致蛋白聚集體並允許我們在分子程度的突變下偵測固有特性及行為。

進一步而言，SMN△7蛋白的過表現導致細胞質及核聚集體的形成，此暗示我們測試SMN△7的構形是否與全長SMN不同。確實，相似與兩個上述的SMN突變，與SMN比較下以b-isox的SMN△7蛋白沉澱作用增加(第9c圖)。基於這些結果，胺基酸272及279及外顯子7對於蛋白質採用勝任普里昂樣構形為重要的。SMN採用勝任普里昂樣摺疊的失敗因而代表經常藉由溶酶體和自噬體的細胞清除而降解之摺疊錯誤的蛋白，最終導致構形疾病的發展。此現象解釋了SMN△7為何是不穩定的蛋白。已報導SMN△7蛋白的快速降解且被認為是補償SMN功能並導致SMA患者細胞死亡的主要限制因素。

實例10：藉由貝加因拯救SMN△7-表現神經元及SMA小鼠

我們調查貝加因是否能作為再摺疊錯誤摺疊蛋白SMN△7成為如第8圖所示功能性普里昂樣域的藥學伴護蛋白(第10a圖)。同樣地，貝加因已劑量依賴性方式在293T細胞中使SMN△7聚集體的形成下降並使SMN△7細胞的存活率增加大約2倍(第10b及10c圖)。有趣的是，貝加因增加了SMN△7細胞的軸突樣結構(第10d圖)。相反地，在以b-isox治療後SMN△7細胞變得圓且分離。此外，共免疫沉澱分析顯示在貝加因存在下，PFN1與SMN△7的交互作用顯著增加(第10e圖)。PFN1為在細胞液中已知的SMN交互作用物。我們進一步檢查貝加因是否減弱SMN△7蛋白的降解。確實，貝加因顯著地減少SMN△7降解作用(第10f圖，箭號)。此外，在先前研究中以SMN△7轉染的神經元延長了明顯較短的軸突。我們發現貝加因從表現SMN△7的NSC34細胞增加了軸突的長度大約2倍(第10g圖)。統計分析示於第10h圖。基於這些結果，恢復錯誤摺疊TDP-43之普里昂樣生物活性的貝加因也在SMN△7中恢復普里昂樣功能性缺陷。

SMA的小鼠模式從出生起受到貝加因的腹膜內注射(13.6 mg/kg/d)，且然後我們使用運動功能測試及存活分析評估動物體外發現是否重現(recapitulate)在體內動物模式中(第10i圖)。然而，貝加因治療後，包含翻正時間、管試驗分數及傾斜分數的SMA小鼠的功能表現(functional performance)在出生後第6天(p>0.05)改善，且結果相似於以或不以貝加因處理的異質體同胎仔。在出生後第8天，貝加因處理之SMA小鼠的功能表現在管測試(p=0.009)中優於控制組的SMA小鼠，但不在迴轉測試 (p=0.065)或負趨地性測試 (p=0.58)(第10i圖)。我們的研究提供藉由調變SMN△7羧基端的摺疊及SMA相關突變以確保蛋白質執行全長SMN的細胞功能來恢復功能性SMN蛋白的方法。

實例11：藉由過表現TDP-43的普里昂樣域拯救SMN△7-表現神經元

我們藉由在表現SMN△7蛋白的NSC34運動神經元細胞中過表現TDP-43普里昂樣域(TDP-43-PLD)增加功能性普里昂樣域的量以確認功能性普里昂樣構形異構物之量的減少造成SMN△7-表現神經元中的軸突退化。期望TDP-43-PLD採用通常結構上相似於β摺板以經由異聚合作用補償SMN的普里昂樣功能。我們的實驗顯示與GFP-及GFP-NPLD-表現的控制組比較，表現SMN△7及GFP-TDP-43 PLD兩者的細胞中軸突長度增加(第11圖，箭頭)。統計分析示於第11b圖。同樣地，在運動神經元中SMN過表現也顯示了在突變TDP-43的模式中減緩ALS的發病及病理特徵。因此，普里昂樣構形異構物的量對於運動神經元存活是重要的，且其他功能上無關的普里昂樣蛋白可補償缺陷蛋白的功能。

實例12：基於普里昂樣構形異構物的治療策略

基於在運動神經元中普里昂樣構形異構物的獨特角色，我們提出SMA的治療模式「基於普里昂樣構形異構物的治療策略」，其中部分錯誤摺疊的SMA致病突變及SMN△7轉變成普里昂樣摺疊蛋白(第12圖)。貝加因啟動SMN突變及SMN△7以重獲普里昂樣或型，隨後增加SMN-PFN1交互作用、減少蛋白降解、促進軸突樣生長及運動神經元的存活及在SMA小鼠中改善運動功能。藉由藥學伴護蛋白重組裝SMN突變及SMN△7的普里昂樣構形異構物稱為普里昂樣異形構形異構物。

實例13：同時細胞中LC序列域之異源性交聯-β模板

為了測試普里昂樣蛋白的可溶性交聯-β構形異構物是否能夠自我複製(self-replication)，我們在誘導特定的普里昂樣蛋白過表達之後藉由生物素化異噁唑(b-isox)沉澱，系統性地檢驗普里昂樣蛋白脂細胞交聯-β構形異構物的量(第13圖)。b-isox為目前鑑別的特異性化學探針，特異性地與LC域的交聯-β普里昂樣聚合物共沉澱。我們將100 µM b-isox與Htt-97Q-過表現的293T細胞之溶解產物在4°C化學沉澱交聯-β聚合物，且然後藉由西方墨點轉漬法分析樸里昂樣蛋白的結合效率(第13a-c圖)。第1A圖中示出收穫前轉染細胞中的Htt-97Q。雖然Htt-97Q蛋白形成了可見的聚集體，多數Htt-97Q蛋白分子式可溶性的(第13b圖)。顯而易見地，與對照組比較，我們發現在Htt97Q-過表達細胞中b-isox增加TDP-43及PFN1普里昂樣蛋白的沉澱量，但沒有改變SMN及核片層蛋白B1普里昂樣蛋白的沉澱效率(第13c圖)。進一步地，基於模板交聯-β構形的能力，我們定義這種LC域的類型為交聯-β成核域。

如同包含TDP-43及Fus的多種LC蛋白含有RNA結合域，我們測試RNA在交聯-β摺疊及TDP-43之模板的效果。TDP-43殘基147及149以顯示對核酸結合是重要的。我們先前的工作已進一步顯示RNA結合缺陷突變TDP-43-F147/149L在細胞核中集合成可溶性可見顆粒，這只出了RNA結合的損失經由TDP-43之普里昂樣域的結構轉換誘導相分離。為了體內檢查細胞結構及RNA結合缺陷突變TDP-43-F147/149L的能力，我們將TDP-43的RNA結合缺陷突變蛋白與b-isox培養，接著進行西方墨點轉漬法(第13d圖)。不期望地，雖然形成了可見的顆粒，相似於TDP-43的普里昂樣域刪除突變，RNA結合缺陷突變的損失其形成交聯-β構形異構物及PFN1及Lam B之模板摺疊的能力(第13d圖)。這些結果意涵了RNAs促進在TDP-43中交聯-β構形的採用且隨之在生理情況下拯救了普里昂樣蛋白的次群組用以轉換成交聯-β構形異構物(第13d圖)。此外，我們推斷了不似於壓力顆粒，RNA為結合的TDP-43之可見顆粒經由相異構形及交聯-β依賴性的機制組裝成分離相。

次之，我們建構了類泛素化(SUMOylation)噘線的TDP-43突變K136R並檢查其體內交聯-β模板的能力。我們的實驗顯示與hTDP-43比較，hTDPK136R突變強烈的結合至b-isox並顯著地增加內生性TDP-43的交聯-β構形異構物及普里昂樣蛋白Lam B及PFN1(第13e圖)。與第13c及d的結果一致，我們發現LC域的b-isox結合之能力與交聯-β的模板能力成比例。使用抗-Flag或Lam B抗體的免疫沉澱分析進一步顯示hTDPK136R增加與Lam B的相關性(第13f圖)。因此，我們發現hTDPK136R較佳定位於Lam B所在的核膜。與~24% hTDP-43 FL的核膜定位比較，~70% hTDPK136R定位於核膜(第13g圖)。如類泛素化的轉異後修飾的動力學可為核建構(nuclear architecture)的結構調節物以經由樸里昂樣蛋白摺疊的轉換引導基因表達。

為了調查交聯-β之異源交互作用的從頭機制(de novo mechanism)，我們將TDP-43及Lam B重組蛋白以或不以b-isox體外培養2小時。我們發現TDP-43及Lam B體外組裝成在b-isox存在下中斷的短圓柱長絲狀(第13h圖)。此發現顯示了TDP-43及Lam B的交聯-β交互作用。因此，我們將TDP-43及Lam B重組蛋白分別培養1小時，且然後混合兩種重組蛋白接著培養1小時。我們發現了TDP-43及Lam B形成寡聚物樣結構且無法組裝成短圓柱長絲狀(第13h圖)。此發現顯示了單分子構造的LC域為普里昂樣蛋白之異型交聯-β交互作用的先決條件，且可解釋交聯-β構形異構物的形成並非與次細胞隔室中的普里昂樣蛋白的量成比例(第13i圖)。在細胞中，藉由b-isoz結合分析，LC蛋白之交聯-β構形異構物的百分比為大約10~70%，例如，在Mes23.5多巴胺(dopaminergic)神經元中TDP-43 21.2%的交聯-β構形異構物(第13j圖)。我們假設在細胞內部，多數本質上無序的LC域經由結構摺疊或限制交聯-β成核反應的的與其他蛋白結合受到保護。我們建議了單分子構造的LC域釋放或新合成的同時，在細胞中發生可溶性交聯-β的異源性增殖。

實例14：在ALS的病理階段下交聯-β同步化的損失及致病蛋白的交互作用

次之，我們將293T細胞過表現的野生型PFN1或患者衍生的突變PFN1G118V的溶解產物與b-isox培養，接著以西方墨點轉漬法分析。與PFN1G118V比較，與內源性PFN1和Lam B的沉澱增加有關的PFN1-FL強烈地結合b-isox；然而，沒有觀察到TDP-43蛋白沉澱的變化(第14a圖)。這些結果顯示了普里昂樣蛋白之交聯-β構形異構物的增加增加了異源或同源型普里昂樣蛋白之交聯-β構形異構物的選定子集合。值得注意的是G118V疾病突變損害了PFN1摺疊及傳播交聯-β結構的能力。

有鑑於普里昂樣域的自身交互作用，我們藉由免疫沉澱進一步驗證PFN1-FL及PFN1-G118V異源交互作用的參與者(partners)。我們的實驗顯示當PFN1-FL過表現時TDP-43 與PFN1或Lam B的關聯增加，但在控制組或FN1-G118V突變中沒有改變(第14b圖)。觀察到PFN1及Lam B的可溶性交聯-β構形異構物及其與TDP-43的普里昂樣交互作用的正相關。全然地，LC域的交聯-β構形異構物可在細胞中複製以起始蛋白之間的從頭關聯網狀結構，且此機制並沒有發生在PFN1相關ALS的病理狀態中。此結果意涵了交聯-β聚合作用缺陷與ALS之病因學的潛在關係。

此外，使用b-isox沉澱分析以偵測體內TDP-43的交聯-β構形，我們發現在過表現ALS-相關的VCP突變VCP R155H之細胞中b-isox與TDP-43的交聯-β結合親和力增加，被認為是ALS的體外疾病模式(第14c圖)。然而，b-isox與與層蛋白 b及PFN1的交聯-β結合親和力下降顯示了增加的TDP-43之交聯-β無法增殖。我們注意到TDP-43的核建構受到擾動(perturbed)且在ALS相關突變的細胞液中觀察到核TDP-43之錯誤定位的出現(第14d及e圖)。我們推斷VCP R155H將內生性TDP-43的一部分轉化為具有交聯-β結構的致病構形構異構物；因此，減少TDP-43的生理交聯-β。TDP-43減少的生理交聯-β導致其他如核片層蛋白b及PFN1的普里昂樣蛋白之交聯-β交互作用的下降，接著在ALS相關突變中TDP-43-PLD結構殘基骨架的分解。

分餾分析(fractionation analysis)進一步顯示VCP R155H蛋白較VCP野生型蛋白更穩定，且VCP R155H蛋白在核染色質未結合的部分，即核質部分中顯著地增加(第14f圖，箭頭指出在核染色質未結合的部分的VCP蛋白)。有鑑於VCP以顯示作為分離酶(segregase)，我們假設在致病性下ALS相關之VCP突變增加核質(nucleoplasmic)VCP蛋白的穩定性，其可導致TDP-43從核結構框架中解離及核TDP-43蛋白的順序上的錯誤定位。雖然增加VCP活性轉換核TDP-43之構形的方式未完全明瞭，我們的結果提供了重要的見解，顯示了經由撤銷生理交聯-β網狀結構在分子層面上ALS病因學的新關鍵。

實例15：細胞交聯-β-自身延續之提出的模式

目前已知的生物程序之調節機制包含基因的控制及蛋白質表現、蛋白質修飾及藉由頻率、速度或範圍來調節非編碼RNA。本文中，我們發現了調節的一個層面，其中富含-β摺板域的一種新穎形式能夠藉由催化其自身或其他蛋白質的轉化結構複製並隨後形成生物聚合物。經由新的普里昂樣網狀結構重建或空間重組(spatial reorganization)，這些天然的自身模板組裝生物聚合物超越了功能和結構複雜性，以重設細胞恆定及細胞恆定性及細胞適應性。我們稱此生物學反應為「交聯-β自身延續」。交聯-β自身延續的一個提出的模式說明在第15圖中。我們將此生物學程序分成三個階段：誘導、同步化及功能開關。在誘導階段，可藉由普里昂樣蛋白、RNA或後位修飾(postmodification)在蛋白質層次上誘導感染性構形。這些富含β-褶板的構形異構物在同步化階段結合至同源性或異源性普里昂樣分子並催化其轉化，以及接著在功能開關階段聚合組裝、重建新的普里昂樣交互作用網狀物。在具有遺傳的蛋白質病變的ALS患者中，病理突變損失具有正常細胞功能的損失之模板交聯-β聚合物的能力並得到不可逆的病理富含β-褶板聚集體。此新穎的調節類型可藉由不改變DNA或RNA的組織蛋白質的現存位置而顯著重塑細胞生物化學。

實例16：p53產生類澱粉品系的平行傳播

藉由以p53抗體進行免疫螢光，我們在293T細胞的細胞液中的P53聚集體當中觀察到包含長纖維(5–10 µm)、短纖維(1.6–3.2 µm)、及點狀聚集體(0.5–1 µm的直徑)之顯著的異質性程度 (第16a圖，箭號)。分析了p53纖維及P53聚集體的長度(第16b圖)。與藉由中斷蛋白質降解路徑聚集的澱粉類沉積物一致，MG132蛋白酶抑制物顯著地增加P53聚集體並將p53纖維的三種類型轉化成不規則的包涵體(第16c圖)。為了測定這些異質的p53類澱粉圖案是否為遺傳的或隨機轉化，我們繼代培養(subcultured)並從細胞之異質體的池分離單一群落(colonies)。實驗流程示於第16d圖。單一同源細胞(clonal)擴增之後，在單一細胞衍生選殖中僅觀察到一種p53類澱粉圖案，之後穩定地表現該特定的表型。我們取得四種示於第16a圖中的表型，包涵長及短纖維、點狀及擴散的核染色，且這些表型穩地定的延伸(第16e圖)。我們稱這些分離之品系的p53表型如下：p53[L](長纖維)、p53[S](短纖維)、p53[P](點狀(puntca))及p53-NVA(無可見P53聚集體)。具有P53聚集體的細胞顯示較佳的附連及間質樣形態(mesenchymal-like morphologies)(第16f圖；對應於下方肌動蛋白染色)。

實例17：p53產生類澱粉品系的遺傳至腫瘤性及癌幹性

我們的選殖性擴大系統提供精確研究體內品系特異性p53澱粉樣蛋白構形之致腫瘤性之優異的細胞模式。我們藉由檢查細胞週期流動及計算倍增時間(doubling time)分析四種p53類澱粉品系的細胞生長(第17a及17b圖)。流式細胞儀分析顯示在S(合成)相細胞增加的百分比在p53[L]、[S]及[P]細胞中分別為4.1%、10.7%及3.9%(第17a圖)。與加速細胞生長一致，我們發現有包含p53[L]及[P]之細胞溶質P53聚集體的細胞具有在接踵後48-72小時之較快速的倍增時間。P53[L]顯示了24小時之延遲的停滯期(lag phase)，接著斜率突然急遽的增加(第17b圖)。與在神經退化脈絡中觀察到的毒性類澱粉相反，p53類澱粉似乎促進細胞生長。此外，為得到壓力反應(stress response)，以精三胺(spermidine)及H₂ O₂ 考驗四種細胞品系(第17c及17d圖)。細胞存活率在所有壓力條件下減弱。然而，p53 [P]選殖對精三胺誘導的細胞存活率有一定的抵抗力，對氧化壓力有較高的耐受性(第17c及17d圖)。這些結果顯示了這些品系特異性的p53類澱粉構形具有獨特而持久的生物化學和生理作用。為了進一步鑑定涉及P53聚集體的獲得功能(gain of function)之腫瘤形成(tumorigenesis)的關鍵病理生理學路徑，我們藉由西方墨點轉漬法進行一系列的篩選，並比較在四種品系中癌症相關蛋白的表現。通常地，p53[S]及[P]顯示相似的表現圖譜(expression profiles)(第17e圖)。最明顯地，癌幹性生物標記CD133的表現在P53聚集體選殖中的三種中計算(第17e圖)。表觀遺傳調節物(epigenetic regulators)的一個群組在P53聚集體存在下改變了他們的表現。與表觀遺傳緘黙化(epigenetic silencing)相關的H3K27me3在P53聚集體品系中顯著的減少，但另一個緘默調節物DNMT1在P53聚集體品系中增加(第17e圖)。包含p-EGFR及HIF-1α之上皮-間質細胞轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)相關的基因亦在與他們型態轉換相關的P53聚集體品系中增加。這些結果顯露了對於p53類澱粉在癌症細胞蓋性之誘導中，以及對於p53類澱粉在甲基化組蛋白H3的向下調控之角色可導致基因表現中之整體變化的第一直接證據。與第16圖中所示的平行傳播性一起，三種內生性P53聚集體能夠轉變為包含活化的EMT、增加的癌幹性及顯著改變表觀遺傳調節物的惡性癌細胞，且品系特異性的p53類澱粉可經由基於蛋白質的機制傳播致癌基因的遺傳。

實例18：p53類澱粉品系的感染性

為得到自然發生的p53類澱粉是否可感染細胞及促進普里昂樣活性，將分離自個別的品系特異性p53選值得細胞萃取物加入p53-NVA受體細胞中(第18圖)。我們使用造成細胞腫脹的低張緩衝液產生萃取物並藉由離心分離可溶及不可溶的部分。當以p53抗體使用免疫染色測定時，不論使用可溶或不可溶部分，從p53 [P]選殖產生的萃取物在p53-NVA細胞中誘導了P53聚集體。值得注意的是，在受體細胞中發現了p53聚集體的三個種類，顯示了在萃取程序期間p53[P]的遺傳性損失(第18a圖，箭頭)。雖然p53[S]之細胞周圍標誌了一些點狀螢光訊號，在加入由p53[L]或p53[S]品系產生的萃取物後，未觀察到p53纖維的顯著誘導(第18a圖)。內生性p53[L]及p53[S]萃取物誘導p53-NVA細胞中纖維形成的失敗與體外p53纖維之誘導的展示結果不一致。我們推測p53[L]及p53[S]的聚集尺寸可能對進入受體細胞而言太大。誘導效率的統計分析示於第18b圖。雖然p53[P]可表現為傳染性實體，將p53類澱粉萃取物加入非類澱粉細胞中之後，我們沒有觀察到受體細胞中三種p53品系觀察到的普里昂遺傳圖案。

實例19：在p53 類澱粉內容物中TDP-43及p53之間的相互作用

普里昂或聚集傾向蛋白可誘導次級蛋白錯誤摺疊。因此，我們測試p53聚集作用是否影響在患有FTLD-U及ALS的患者之ubi-陽性包涵體的聚集體中發現的一種普里昂樣蛋白TDP-43。我們藉由螢光顯微鏡檢查在四種品系中的TDP-43定位(第19a圖)。我們發現特別在p53[S]中，TDP-43蛋白螯合(sequestered)入TDP-43細胞質點，顯示了p53[S]類澱粉調節的TDP-43聚集傾向(第19a圖，箭頭)。為了謹慎的調查p53類澱粉在功能及錯誤摺疊病理樣TDP-43蛋白上的影響，我們在p53 [S]或p53-NVA選殖中過表現GFP-TDP-43-FL蛋白或病理樣GFP-TDP-43IIP片段，且然後檢查GFP-TDP-43蛋白的定位(第19b圖及19c圖)。與p53-NVA選殖比較，在p53[S]選殖中TDP-43-FL進入細胞質點的螯合增加了6倍，顯示了特定摺疊的類澱粉能夠加強功能性TDP-43集合作用(第19b圖)。相反地，與p53-NVA選殖比較，在p53[S]選殖中TDP-43 (GFP-TDP-43IIP)之病理樣包涵體的形成下降了6倍。我們推導或許p53及TDP-43可完成射擊錯誤摺疊聚集作用之形成的細胞因子(第19c圖)。

進一步地，使用原態膠體分析(native gel analysis)，萃取自p53-NVA選殖的TDP-43蛋白具有較高於那些萃取自P53聚集體選殖的分子量(第19d圖)。使用富含Q的蛋白Sp1作為控制組。為了測試p53類澱粉是否影響TDP-43介導的生物學程序，我們在藉由TDP-43之普里昂樣活性調節的CFTR外顯子9跳躍上進行體內選擇性剪切分析。與p53-NVA選殖比較，p53[S]選殖中觀察到更有效的CFTR外顯子9跳躍(第19e圖)。

此外，在以TDP-43 siRNAs轉染的細胞中發現p53 類澱粉纖維明顯減少(第19f圖)。對於三種P53聚集體表型的統計分析示於第19g圖中。這些結果表示p53及TDP-43之間聚集傾向的相互作用。

在以TDP-43變異體轉染的細胞中發現p53纖維的明顯減少(第19h圖)。P53聚集體的統計分析示於第19h圖中。這些結果表示操縱如TDP-43的次級聚集傾向蛋白能夠調節p53的聚集傾向。

實例20：藉由HSPB1偵測p53聚集作用的形成

西方墨點轉漬法及免疫染色分析顯示在p53[L]、[S]及[P]選殖中，HSPB1表現的伴發性損失，但不在p53-NVA選殖中(第20a圖)。與HSPB1在四種品系中的蛋白質表現圖譜一致，我們發現在在p53[L]、[S]及[P]選殖中HSPB1 mRNA表現分別下降至正常量的35%、25.5%及47.9%(第20b圖)。

有趣的是，在微陣列晶片上存在的25個熱休克蛋白中，僅有HSPB1及HSPB8在P53聚集體品系中顯示下降的mRNA表現；其他包含HSP70及HSP90的熱休克蛋白在mRNA表現中並沒有顯示改變(第20b圖，數據未顯示)。因此，我們測試在p53-NVA選殖中下降的HSPB1是否能夠使用HSPB1的siRNA減弱誘導p53類澱粉纖維。確實，HSPB1的減弱誘導了p53纖維及斑點，且具有P53聚集體的p53-NVA細胞之統計分析示於第14c圖中。進一步以西方墨點轉漬法確認在HSPB1 siRNA-減弱細胞中不溶性p53蛋白脂含量的增加。

此外，我們發現施以H₂ O₂ 減少HSPB1表現及誘導P53聚集體形成。值得注意的是，在p53[L]、[S]及[P]選殖中HSPB1的過表現並沒有明顯地減少p53類澱粉(第20e圖)。因此，功能性p53的維持需要HSPB1，但不能助於重摺疊錯誤摺疊的p53蛋白。

實例21：藉由過表現p53蛋白及Aβ 類澱粉去組裝劑有效消除P53聚集體

為了在活體細胞中p53類澱粉的行為，我們測試過表現p53本身是否能夠螯合入P53聚集體中(第21圖)。出乎意料的是，我們發現外生性的GFP-p53WT沒有螯合入品系特異性的纖維也沒有顯示出點狀染色(第21a圖)。野生型p53過表現有效地移除高達60%的p53 [L]、[S]及[P]聚集體。我們也發現了p53突變體R280S (GFP-p53R280S)能夠幾乎完全地清除P53聚集體(第21b圖)。計算p53類澱粉的清除效率並總結於第21b圖中。

值得注意的是，過表現的p53WT及R280S蛋白兩者不僅減少了CD133的表現，其與P53聚集體同時升高並誘導細胞死亡(第21c圖)。

此外，我們以Aβ類澱粉去組裝劑貝加因處理293T細胞，之後以抗-p53抗體免疫螢光染色。我們發現貝加因也減少了p53錯誤摺疊聚集體並抑制p53的自發性聚集作用(第21d及21e圖)。這些結果顯示了Aβ類澱粉去組裝劑潛在地能夠用於癌症治療。

實例22：Rb的普里昂樣域的鑑別

我們將100 μM b-isox與293T細胞的細胞溶解產物在4°C下培養以化學成店所有普里昂樣蛋白，及然後藉由西方墨點轉漬法分析Rb結合的效率以得到Rb的普里昂樣或相轉移的潛力(第22圖)。西方墨點轉漬法顯示藉由b-isox之Rb的沉澱(第22a圖)。溶解度分析進一步顯示Rb的小口袋(aa.263-788)是普里昂樣域(第22b圖)。Rb(aa. 10-56)的N端穩定普里昂樣構型(第22c圖)。Rb之N端的刪除導致蛋白質降解(第22d圖)。

無

本發明之說明性的實施例在下文中參照下列圖式詳細描述： 第1圖為說明貝加因(baicalein)體外將TDP-43纖維整建為TDP-43聚合物的組合影像，圖面(a)及(b)含有經純化的全長TDP-43重組蛋白(等同3 μM單體)在貝加因的缺乏(a)或存在(3 μM)下培養；b)組合的緩衝液在室溫下(RT)攪拌30分鐘、60分鐘及90分鐘，接著以電子顯微鏡確認。在b中的箭頭所指的是在下方圖面中之TDP-43聚合物的代表性高倍率影像。分支點的其中之一藉由箭號表示。在a中的量尺(bar)：1 μm；在b中的量尺：0.5 μm。圖面(c)含有TDP-43纖維及TDP-43聚合物之長度的統計分析。所有數據以具有標準差(SD)(n=6)的平均值表示。圖面(d)含有說明瞭貝加因-誘導之TDP-43聚合物分支點分析的柱狀圖。所有數據以具有標準差(n=10)的平均值表示。圖面(e)為所選兩個聚合TDP-43之負染色結構的電子顯微圖。比例尺：100 nm。 第2圖為說明減少病理樣TDP-43包涵體且增加溶解度的非類澱粉路徑(off- amyloid pathway)化合物的組合影像。圖面(a)含有具有以50 μM貝加因或無貝加因處理之TDP-43-IIPLD的293T細胞。已顯示個別處理的兩個影像。箭頭指出了TDP-43-IIPLD聚集體。量尺：10 μm。圖面(b)含有顯示在TDP-43-IIPLD聚集體上貝加因之有效性的統計分析。所有數據以具有標準差(n=3)的平均值表示。使用t檢定(t-test)，*P > 0.05。圖面(c)為顯示分別以低劑量或高劑量貝加因以48或9小時治療後，貝加因對強化TDP-43-IIPLD溶解度之有效性的西方墨點轉漬法的照片。圖面(d)說明瞭具有以50 μM EGCG處理之TDP-43-IIPLD的293T細胞。已顯示個別處理的兩個影像。量尺：10 μm。圖面(e)含有EGCG以劑量依賴(dose-dependent)方式拆開形成之TDP-43摺疊錯誤聚集體的影像。所有數據以具有標準差(n=3)的平均值表示。使用t檢定，*P > 0.05。圖面(f)為顯示以EGCG(0、5、10、15、20及30 μM)24小時治療後TDP-43-IIPLD在尿素部分(fractions)中之西方墨點轉漬法的照片。圖面(g)顯示包含貝加因及EGCG的醫藥組合物在TDP-43摺疊錯誤聚集體還原上的協同作用。圖面(h)及(i)分別顯示於7小時及24小時包含貝加因及17-AAG的醫藥組合物及包含EGCG及17-AAG的醫藥組合物在TDP-43摺疊錯誤聚集體還原上的協同作用。所有數據以具有SD的平均值表示。 第3圖為說明貝加因恢復的TDP-43介導的CFTR外顯子9在ALS之基於細胞遺傳的VCP/p97突變的模式中跳躍的組合影像。圖面(a)含有在VCP/p97突變R155H存在下TDP-43含有或無貝加因之體內(in-vivo )剪接分析。指出了包含(+)及排除(-)外顯子9的條帶(band)。*：異常剪接產物。圖面(b)含有在細胞中以貝加因處理或無貝加因處理之TDP-43介導的CFTR外顯子9跳躍之體外剪接分析。圖面(c)說明貝加因在無TDP-43過表現下對CFTR外顯子9跳躍的影響之體內剪接分析。圖面(d)為顯示了TDP-43蛋白含有貝加因或無加因的表現之西方墨點轉漬法的照片。293T細胞分離成核(nuclear)、細胞溶質(cytosolic)及尿素(urea)部分之後以0、25或50 μM貝加因處理。箭頭指出了TDP-43聚合物。圖面(e)為顯示了在VCP/p97 R155H-表現細胞中TDP-43蛋白含有貝加因或無貝加因之西方墨點轉漬法的照片。箭頭指出了TDP-43聚合物。 第4圖為說明在TDP-43聚合作用及TDP-43介導CFTR外顯子9跳躍中VCP/p97 ATP酶(ATPase)活性分析的組合影像。圖面(a)含有說明在以VCP/p97-WT或VCP/p97-QQ轉染的細胞中TDP-43之位置的顯微照片。量尺：10 μm。圖面(b)為顯示在以0.1、0.2、0.5、1.5或2.0 μg VCP/p97-wt轉染的細胞中TDP-43聚合物(箭頭)的量之西方墨點轉漬法的照片。圖面(c)含有在以0.1、0.2、0.5、1.5或2.0 μg VCP/p97-QQ轉染的細胞中TDP-43聚合物(箭頭)的免疫轉漬分析(immunoblot analysis)。圖面(d)含有在VCP/p97變異體存在下TDP-43的體內剪接分析。指出了包含(+)及不包含(-)外顯子9的條帶。 *：異常剪接產物。圖面(e)含有在VCP/p97-QQ-表現細胞有貝加因或無貝加因中TDP-43的體內剪接分析。圖面(f)說明藉由cross-IP在體內TDP-43及VCP/p97之間的交互作用。收穫自His-VCP/p97變異體表現293T細胞的蛋白質溶解產物(protein lysate)用於與抗-His抗體免疫沉澱(immunoprecipitation)並藉由與抗-TDP抗體免疫轉漬進一步檢查。圖面(g)含有在TDP-43之R361S突變及VCP/p97變異體存在下TDP-43的體內剪接分析。圖面(h)含有在VCP/p97-QQ-表現細胞中有貝加因或無貝加因TDP-43之R361S突變的體內剪接分析。 第5圖為說明藉由HSPB1(HSP27)之TDP-43 聚合作用及TDP-43介導CFTR外顯子9跳躍的組合影像。圖面(a)說明以0、100或200 pmol HSPB1 (HSP27)的siRNA轉染之細胞中TDP-43的量之免疫轉漬分析。箭頭指出了TDP-43 聚合物。圖面(b)說明藉由體內剪接分析在HSPB1 siRNA的存在下TDP-43的選擇性剪切分析。指出了包含(+)及不包含(-)外顯子9的條帶。*：異常剪接產物。圖面(c)含有在以5或10μg GFP-HSPB1的質體轉染的細胞中，TDP-43 聚合物的量的免疫轉漬分析。箭頭指出了TDP-43 聚合物。圖面(d)含有在表現GFP-HSPB1的細胞中TDP-43的體內選擇性剪接分析。 第6圖為說明核TDP-43複合物及聚合物的鑑別之組合影像。圖面(a)含有說明施用於細胞的富含麩醯胺酸/天冬醯胺酸(glutamine/asparagine-rich)蛋白複合物之單離法的免疫沉澱法-EM(immunoprecipitation-EM)的示意圖。圖面(b)說明有或無前固定(pre-fixation)之TDP-43、CBP及TIAR的免疫沉澱效率。這三種蛋白遵循在a中所描述使用抗-TDP-43或TIAR、CBP抗體之經修改的流程從239T細胞的融解產物純化。經由以抗-TDP-43或TIAR、CBP抗體進行免疫轉漬進一步檢查免疫沉澱。圖面(c)含有使用抗TDP-43抗體負染色的免疫沉澱的顯微照片。量尺： 20 nm。箭頭指出了在d-f及h-j中經分離的TDP-43複合物的代表性高倍放大圖。圖面(d)、(e)及(f)含有說明預固定處理後分離自細胞溶解產物的TDP-43聚合物之負染色結構的三個選定的電子顯微圖。螺旋聚合物結構分離自細胞的TDP-43。在f中選定的影像說明TDP-43聚合物的兩個分支。比例尺： 20 nm。圖面(g)含有說明在293T細胞的核中TDP-43蛋白之直形(straight)免疫金標記(immunogold labeling)的顯微照片。比例尺： 100 nm。圖面(h)、(i)及(j)含有說明來自不同顯微圖之單球形結構的顯微照片。比例尺： 20 nm。圖面 (k)含有無預固定分離的TDP-43纖維顆粒網質之負染色結構的電子顯微圖。比例尺： 100 nm。圖面(l)含有有預固定分離的TDP-43纖維顆粒網質之負染色結構的電子顯微圖。比例尺： 100 nm。圖面(m)含有內生性(endogenous)TDP-43的免疫螢光染色(immunofluorescence staining)。比例尺： 5 µm。圖面(n) 藉由TDP-43-FL-及TDP-43-PLD△-表現圖案的分析說明需要TDP-43的普里昂樣傾向以形成TDP-43之纖維顆粒網質的多節狀結構。箭頭指出了纖維狀結構(fibrillar structure)。比例尺：10 µm。 第7圖為說明在哈欽森-吉利福德早衰症候群(Hutchinson-Gilford progeria syndrome)中TDP-43功能異常的影像組合。圖面(a)免疫染色(immunostaining)TDP-43及核片層蛋白(lamin)A/C。綠色：TDP-43；紅色：核片層蛋白A/C，比例尺：5 µm。箭頭指出了TDP-43及核片層蛋白A的共定位(colocalization)。圖面(b)在合片層蛋白A-及早衰症(progeria)表現細胞中GFP-TDP-43-FL蛋白的定位。箭頭指出了TDP-43的細胞溶質聚集體。比例尺：10 µm。圖面(c)在核片層蛋白A或早衰症存在下藉由體內剪接分析檢查TDP-43選擇性剪接能力。指出了包含(+)及不包含(-)外顯子9的條帶。*：異常剪接產物。圖面(d)用於在早衰症表現細胞中TDP-43之確效的西方墨點轉漬法。圖面(e)在表達早衰症的細胞中有或無貝加因之TDP-43的定位。量尺：10 μm。圖面(f)顯示貝加因拯救TDP-43核定位的統計分析。所有數據以具有標準差(n=3)的平均值表示。使用t檢定(t-test)，*P > 0.05。圖面(e)藉由體內剪接分析在表現早衰症的細胞中貝加因存在下對TDP-43選擇性剪接能力的檢查。指出了包含(+)及不包含(-)外顯子9的條帶。*：異常剪接產物。圖面(h)使用抗-核片層蛋白A/C抗體在有或無貝加因的早衰症表現細胞中核狀的免疫染色。在b中的箭頭指出畸形核(misshapen nuclei)及在c中的箭頭顯示拯救的核(rescued nuclei)。量尺：10 μm。圖面(i)用於在核片層蛋白A表現細胞中TDP-43蛋白之確效的西方墨點轉漬法。 第8圖為說明治療疾病TDP-43蛋白中小化合物之模式的示意圖。對於在正常生理學情況下TDP-43介導的外顯子跳躍建議的時空(spatiotemporal)組織。TDP-43蛋白在核纖維顆粒網質重新組成(reassembled)執行剪接功能的聚合物。在藉由如ROS或遺傳的突變之風險因子造成的前驅(prodromal)疾病階段或臨床疾病階段，隨著病理包涵體的聚集，降解的TDP-43羧基端易位(translocated)進入細胞液中。以貝加因藥學上的介入拆開病理包涵體並藉由在細胞核中增加活性TDP-43聚合物的數量拯救TDP-43的核功能。此外，在減少TDP-43摺疊錯誤之聚集體上能夠以EGCG或17-AAG單獨或與貝加因以協同方式有效地作用。 第9圖為說明SMN的普里昂樣傾向之鑑別的影像組合。圖面(a) b-isox從mes23.5細胞沉澱SMN蛋白。圖面(b)在293T細胞不同的次細胞分群(subcellular fraction)中SMN及PFN1之普里昂樣構形異構物的量之分析。圖面(c)顯示從以b-isox處理或不以b-isox處理的細胞溶解產物分餾的蛋白質的結果。圖面(d)SMN突變的示意圖。圖面(e)SMN的普里昂樣域的鑑別。圖面(f)SMN變異體的次細胞定位(subcellular localization)。比例尺，10 μm。圖面(g)最上方的圖面，誤義(missense)SMN突變體Y272C及G279V的b-isox化學結合分析。中間及底部的圖面，Y272C及G279V突變體的溶解度。圖面(h)Y272C及G279V突變體的細胞表現圖案及定位。圖面(i)SMN△7的b-isox化學結合分析。 第10圖為說明藉由貝加因使SMN△7功能性轉化為全長SMN的影像組合。圖面(a)全長SMN、SMN△7及SMA誤義突變體的建議結構特性的示意圖。圖面(b)貝加因使SMN△7聚集體的數量下降。所有數據以具有標準差(n=3)的平均值表示。使用t檢定，*P > 0.05。圖面(c)以50 µM貝加因處理的SMN△7表現細胞的細胞存活率(cell viability)分析。所有數據以具有標準差(n=3)的平均值表示。使用t檢定，*P > 0.05。圖面(d)貝加因使具有軸突樣(neurite-like)結構的SMN△7的數量增加。有數據以具有標準差(n=3)的平均值表示。使用t檢定，*P > 0.05。圖面(e)在貝加因存在下檢查SMN△7與PFN1的物理交互作用。圖面(f)貝加因弱化(attenuates)SMN△7蛋白的降解。圖面(g)貝加因對經培養的NSC34運動神經元之軸突(axon)長度的影響。貝加因(50 µM)處理或模擬處理(mock-treated)的NSC34以βII-微管蛋白抗體(βII-tubulin antibody)(紫色)染色。SMN△7-轉染的細胞藉由紅色mCherry訊號顯示。比例尺，50 μm。圖面(h)SMN△7轉染的細胞之軸突長度的定量。利用雙尾學生t檢定(two-tailed Student’st -tests)執行統計比較。所有數據以具有標準差(n=3)的平均值表示。*** p>0.001。圖面(i)在SMA小鼠中貝加因在運動功能上的治療效果。SMA小鼠及異質體的同窩小鼠(heterozygous littermates)從出生起每日腹膜內注射(intraperitoneal)貝加因，然後進行運動功能分析。顯示了未處理(SMA，n=27；異質體，n=23)及貝加因處理的(SMA/TX，n=18；異質體/TX，n=27)SMA及異質體小鼠的翻正時間(Righting time)(左圖面)、管測試分數(tube score)(中間圖面)及傾斜分數(tilting score)(右圖面)。貝加因治療後SMA小鼠的運動功能顯著地改善，特別是在出生後6天，以及在出生後8天部分地改善(具有LSD事後比較(LSD post hoc)分析的單因子變異數分析(One-way ANOVA))。* p>0.05、** p>0.01、*** p>0.001。 第11圖為說明生長自SMN△7表現運動神經元軸突上普里昂樣域的量之影響的影像組合。圖面(a)將共轉染的NSC34細胞(以箭號指示)以βII-微管蛋白抗體(紫色)染色。比例尺，50 μm。圖面(b)共轉染的細胞之軸突長度的定量。利用雙尾學生t檢定執行統計比較。所有數據以具有標準差(n=3)的平均值表示。*** p>0.001。 第12圖為說明藉由校正摺疊錯誤的SMN蛋白用於治療SMA之普里昂樣基於構形異構物的治療策略之模擬的影像組合。我們的研究鑑別用於SMA的小分子結構校正子，貝加因，其藉由藥學伴護蛋白誘導的(pharmacological chaperone-induced)「普里昂樣同等構形異構物(prion-like iso-conformers)」解決普里昂樣構形異構物不足量的問題。 第13圖為說明異源性(heterologous)LC域的體內結構模板的影像組合。圖面(a)GFP-Htt97Q的細胞影像。比例尺：10 µm。圖面(b)GFP-Htt97Q蛋白的溶解度分析。圖面(c)藉由GFP-Htt-97Q之交聯β構形異構物的模板摺疊及增殖(propagation)。圖面(d)TDP-43-FL、TDP-43-PLD△及TDP-43-F147/149L之交聯β構形異構物的量之分析。在表現TDP-43-FL、TDP-43-PLD△及TDP-43-F147/149L (RD)蛋白的細胞中，交聯β聚合物的b-isox結合分析。圖面(e)在表現hTDP-43 FL及hTDPK136R蛋白的細胞中，交聯β聚合物的b-isox結合分析。圖面(f)TDP搭檔於經hTDP-43 FL-及hTDPK136R轉染的細胞之細胞溶解產物中交互作用的免疫沉澱分析。圖面(g)hTDP-43 FL及hTDPK136R的核膜定位之統計分析。所有數據以具有SD(n=5)的平均值表示。使用t檢定，*P > 0.05。圖面(h)在室溫下組裝緩衝液中缺少(左)或存在b-isox (100 μM；中間)下培養經純化的全長TDP-43及Lam B重組蛋白(等同3 μM單體)，接著以電子顯微鏡確效。分開地培養TDP-43及Lam B重組蛋白1小時且然後混合1小時(右邊)。量尺：1 μm。圖面(i)內生性交聯-β構形異構物在293T細胞的不同次細胞分群中量的分析。圖面(j)藉由西方墨點轉漬法計算在Mes23.5細胞中TDP-43之內生性交聯-β 構形異構物的百分比。 第14圖為說明在ALS的細胞模式中交聯-β構形異構物及模板的分析之影像組合。圖面(a)在表現PFN1-FL及PFN1G118V蛋白的細胞中普里昂樣蛋白的b-isox結合分析。圖面(b)PFN1-FL-及PFN1G118V-轉染細胞之TDP細胞萃取物的免疫沉澱分析。圖面(c)在VCP-及VCP R155H-轉染細胞中TDP-43的b-isox結合分析。圖面(d)在VCP-及VCP R155H-轉染細胞中TDP-43的免疫染色。比例尺：5 µm。圖面(e)在VCP-及VCP A234E-轉染細胞中TDP-43表現的次細胞分群分析。箭頭指出了90-kD TDP-43二聚體(dimers)。圖面(f)VCP及VCP R155H表現的次細胞分群分析。箭頭指出了染色質未結合(chromatin-unbound)VCP蛋白的分群。 第15圖為說明交聯-β延續(cross-β perpetuation)之模式的影像組合。用語「交聯-β延續(cross-β perpetuation)」為一種新穎類型的β-褶板富含域(β-sheet-rich domain)，其能夠藉由催化其本身或其他蛋白質的轉變進行結構複製並組合成生物聚合物，接著重建普里昂樣網質以重設(reshape)細胞恆定(cellular homeostasis)。交聯-β延續可藉由變形LC蛋白、RNAs及轉譯後修飾的增加引發。此新穎類型的調節藉由辨識蛋白質的存在集合顯著地重設細胞恆定。 第16圖為說明摺疊錯誤的P53聚集體之表現型特徵的組合影像。圖面(a)及(b)含有說明含有p53抗體(1C12)之293T細胞之免疫染色的顯微照片。箭號指出聚集的p53蛋白的三種類型。量尺：10 μm。P53聚集體之尺寸的統計分析示於b中。所有數據以具有SD(n=3)的平均值表示。圖面(c)說明MG132在p53聚集體上之影響的發現。量尺：10 μm。圖面(d)含有說明p53品系之分離的流程圖。圖面(e)含有四種p53品系：p53 [L]、p53 [S]、p53 [P]及p53-NVA之選定的影像。量尺：10 μm。圖面(f)含有具有肌動蛋白(actin)抗體之四種p53品系的免疫染色顯微圖。量尺：10 μm。圖面(g)含有有絲分裂(mitosis)期間P53聚集體分布的分析。細胞以p53抗體及DAPI雙重染色。量尺：10 μm。圖面(h)說明對於在四種p53品系中細胞內ROS含量之偵測的發現。所有數據以具有SD(n=3)的平均值表示。使用t檢定，*P > 0.05。 第17圖為說明p53品系致腫瘤性(oncogenicity)研究的實驗發現。圖面(a)含有藉由流動式細胞測量術驗證之p53品系細胞週期分布分析的圖表。圖面(b)含有說明對於各個p53品系之細胞週期倍增時間(doubling time)的長條圖。所有數據以具有SD(n=3)的平均值表示。圖面(c)含有使用MTT分析以精胺酸處理的四種p53品系的細胞可活性分析(cell viability analysis)。所有數據以具有SD(n=3)的平均值表示。圖面(d)含有使用MTT分析以H₂ O₂ 處理的四種p53品系的細胞可活性分析。所有數據以具有SD(n=3)的平均值表示。圖面(e)具有與癌幹性(cancer stemness)及表觀遺傳調控(epigenetic regulation)相關之特定抗體的四種p53品系之表現圖譜的西方墨點轉漬法分析。 第18圖說明p53品系的感染性。圖面(a)含有說明藉由以來自p53 [L]、[S]及[P]細胞的溶解產物培養，在p53-NVA細胞中可見的p53聚集體誘導的顯微照片。箭頭指出了誘導的p53-NVA聚集體。量尺：20 μm。圖面(b)含有P53聚集體誘導效率的統計分析。所有數據以具有SD(n=3)的平均值表示。 第19圖為說明對於在p53與TDP-43之間的聚集傾向之交互相互作用之實驗發現的組合。圖面(a)說明在四種p53品系中TDP-43的位置。藉由箭頭指示TDP-43細胞質點(cytoplasmic foci)。量尺：10 μm。圖面(b)為說明細胞溶質GFP-TDP-43FL聚集在p53[S]及p53-NVA品系中之統計分析的柱狀圖。所有數據以具有SD(n=3)的平均值表示。圖面(c)為說明GFP-TDP-43IIPLD聚集在p53[S]及p53-NVA品系中之統計分析的柱狀圖。所有數據以具有SD(n=3)的平均值表示。使用t檢定，*P > 0.05。圖面(d)說明藉由非變性聚丙烯醯胺凝膠電泳(native PAGE)顯示在四種p53品系中TDP-43物種的西方墨點轉漬法分析。圖面(e)說明在p53[S]及p53-NVA品系中TDP-43之選擇性剪接能力的體內選擇性剪接分析。指出了包含(+)及排除(-)外顯子9的條帶。*：異常剪接產物。圖面(f)含有說明在TDP-43減弱(knockdown)細胞中p53聚集的柱狀圖。量尺：10 μm。圖面(g)含有說明在TDP-43減弱細胞中p53聚集之統計分析的柱狀圖。所有數據以具有SD(n=3)的平均值表示。使用t檢定，*P > 0.05。圖面(h)含有說明藉由過度表現GFP-標定TDP變異體清除P53聚集體的柱狀圖。僅有FL及PLD有效率地清除P53聚集體。P53聚集體藉由使用p53 1c12抗體的免疫染色偵測(n=5)。 第20圖為說明HSPB1在p53類澱粉組合上之影響的影像組合。圖面(a)顯示HSPB1蛋白在四種p53品系中之西方墨點轉漬法數據的定量分析。圖面(b)顯示在四種p53品系中HSPB1、HSPB8及HSP90的mRNA表現量。圖面(c)含有藉由在p53-NVA品系中減弱HSPB1之P53誘導效率的統計分析。所有數據以具有SD(n=3)的平均值表示。使用t檢定，*P > 0.05。圖面(d)含有在HSPB1減弱細胞中p53溶解度的西方墨點轉漬法分析。箭頭指出了不溶的蛋白。圖面(e)含有在過表現HSPB1的四種p53品系中P53聚集體的柱狀圖。所有數據以具有SD(n=3)的平均值表示。 第21圖含有在表現Wt p53或p53R280S突變的細胞中摺疊錯誤P53聚集體的分析。圖面(a)顯示在過表現GFP-p53或GFP-p53R280S蛋白的細胞中的P53聚集體。以GFP-p53WT或GFP-p53R280S質體轉染293T細胞且然後以p53抗體染色。量尺：10 μm。圖面(b)含有在GFP-p53WT及GFP-p53R280S轉染物中內生性P53聚集體之清除效率的柱狀圖。所有數據以具有SD(n=3)的平均值表示。使用t檢定，*P > 0.05。圖面(c)顯示在表現GFP-p53或GFP-p53R280S蛋白的細胞中CD133及H3K27me3之表現的西方墨點轉漬法分析。圖面(d)顯示在具有或不具有25 μM貝加因處理的細胞中p53類澱粉聚集的分析。顯示了在具有或不具有25 μM貝加因處理的細胞中p53類澱粉之選定的影像及統計分析。所有數據以具有SD(n=4)的平均值表示。量尺：10 μm。圖面(e)說明藉由貝加因抑制P53聚集體之自發形成。所有數據以具有SD(n=3)的平均值表示。使用t檢定，*P > 0.05。量尺：10 μm。 第22圖為說明Rb(Rb1)之普里昂樣傾向之識別的影像組合。圖面(a)在293T細胞的不同次細胞部分中Rb的普里昂樣構形異構物之量的分析。圖面(b)Rb突變體及Rb的普里昂樣域之識別的示意圖。圖面(c-d)Rb變異體脂蛋白溶解度的分析。

Claims (21)

1. 一種在個體中預防或治療構形疾病的方法，其包含： 對有需要之該個體施予有效劑量的一治療劑，以增加聚集傾向蛋白(aggregation-prone protein)的普里昂樣摺疊的量，或減少普里昂樣LC蛋白的降解片段或摺疊錯誤之聚集體，其中減少了該構形疾病的病徵或症狀。
2. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該治療劑為類黃酮，且被治療的該構形疾病為TDP-43蛋白質病變、海馬迴硬化(HS)、具有泛素陽性包涵體之額顳葉退化症(FTLD-U)、肌萎縮性側索硬化(ALS)、混合的神經病理學(mixed neuropathology)、唐氏症、青光眼或脊髓性肌肉萎縮症(SMA)。
3. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該治療劑為類黃酮(flavonoid)，且被預防的構形疾病為阿茲海默症或老化。
4. 如申請專利範圍第2項或第3項所述之方法，其中該類黃酮為貝加因(baicalein)或其衍生物。
5. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該治療劑為針對HSP27的siRNA。
6. 如申請專利範圍第5項所述之方法，其中該針對HSP27的siRNA與SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18至少90至100%相同。
7. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該治療劑為次級聚集傾向蛋白。
8. 如申請專利範圍第7項所述之方法，其中該次級聚集傾向蛋白為TDP-43。
9. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該治療劑為表現普里昂樣LC域的質體。
10. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該治療劑為熱休克蛋白調節劑。
11. 如申請專利範圍第10項所述之方法，其中該熱休克蛋白調節劑為17-N-丙烯胺-17-去甲氧基格爾德黴素(17-N-allylamino-17-demethoxygeldanamycin)(17-AAG)或阿瑞洛莫(arimoclomol)。
12. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該治療劑為熱休克蛋白調節劑與類黃酮的組合。
13. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該降解片段為大約20至大約20 kDa的TDP-43聚集體。
14. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該聚集傾向蛋白的普里昂樣摺疊為交聯-β聚合物(cross-β polymer)。
15. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該構形疾病為類澱粉陽性癌症(amyloid-positive cancer)、老化、降解構形疾病(degradative conformational diseases)、類澱粉聚集構形疾病(amyloid aggregation conformational diseases)及非類澱粉聚集構形疾病(non-amyloid aggregation conformational diseases)。
16. 一種醫藥組合物，其包含： (a)熱休克蛋白調節劑；以及 (b)類黃酮(flavanoid)。
17. 如申請專利範圍第16項所述之醫藥組合物，其中該熱休克蛋白調節劑為17-N-丙烯胺-17-去甲氧基格爾德黴素(17-AAG)或阿瑞洛莫。
18. 如申請專利範圍第17項所述之醫藥組合物，其中該類黃酮為貝加因或其衍生物。
19. 一種用於鑑別用以治療聚集構形疾病之治療候選物的體外方法，其包含： a)在將治療候選物接觸一個或多個測試細胞之前，測定P53聚集體在該一個或多個測試細胞中的表現量；以及 b)在以一個或多個測試細胞接觸該治療候選物之後，測定步驟(a)中的P53聚集體的表現量， 其中，相對於以一個或多個測試細胞接觸治療候選物之前P53聚集體的表現量，以一個或多個測試細胞接觸治療候選物之後P53聚集體的表現量的下降表示該治療候選物有效於治療構形疾病。
20. 如申請專利範圍第19項所述之方法，其中該P53聚集體的大小為大約0.1至大約100 um。
21. 一種用於鑑別用以治療構形疾病之治療候選物的體外方法，其包含： a)在將治療候選物接觸一個或多個測試細胞之前，測定選自一個或多個測試細胞中特異於構形疾病之聚合物的表現量；以及 b) 在以一個或多個測試細胞接觸該治療候選物之後，測定步驟(a)中的聚合物的表現量， 其中，該聚合物選自主要由TDP-43、Htt、Lamin B1、FUS、TIA-1、Tau、SMN、p53、Rb、PFN1及SMN所組成之群組，且相對於以一個或多個測試細胞接觸治療候選物之前聚合物的表現量，以一個或多個測試細胞接觸治療候選物之後聚合物表現量的增加作為篩選候選物的指標。

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