EA031698B1 - Человеческие анти-тау антитела - Google Patents

Человеческие анти-тау антитела Download PDF

Info

Publication number
EA031698B1
EA031698B1 EA201390453A EA201390453A EA031698B1 EA 031698 B1 EA031698 B1 EA 031698B1 EA 201390453 A EA201390453 A EA 201390453A EA 201390453 A EA201390453 A EA 201390453A EA 031698 B1 EA031698 B1 EA 031698B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
tau
antibody
seq
amino acid
antibodies
Prior art date
Application number
EA201390453A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201390453A1 (ru
Inventor
Фэн Чэнь
Ян Гримм
Жан-Луи Баерисвиль
Рогер Нитш
Кристоф Хок
Original Assignee
Байоджен Интернэшнл Нейросайенз Гмбх
Юниверсити Оф Цюрих
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Байоджен Интернэшнл Нейросайенз Гмбх, Юниверсити Оф Цюрих filed Critical Байоджен Интернэшнл Нейросайенз Гмбх
Publication of EA201390453A1 publication Critical patent/EA201390453A1/ru
Publication of EA031698B1 publication Critical patent/EA031698B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4711—Alzheimer's disease; Amyloid plaque core protein
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/56—Staging of a disease; Further complications associated with the disease

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)

Abstract

Изобретение относится к области терапевтических и диагностических антител. Предложены новые человеческие тау-специфические антитела, а также их тау-связывающие фрагменты, кодирующие их полинуклеотиды, векторы и клетки-хозяева для продуцирования таких антител, способы получения антител, диагностические и фармацевтические композиции для применения при нейродегенеративной таупатии, применение антител или их фрагментов для профилактического или терапевтического лечения или диагностики нейродегенеративной таупатии у субъекта-человека, способ контроля прогрессирования нейродегенеративной таупатии у субъекта-человека, применение тау-специфических антител, а также их тау-связывающих фрагментов для нацеливания терапевтического или диагностического агента на тау. Дополнительно предложен набор для диагностики нейродегенеративной таупатии.

Description

Изобретение относится к области терапевтических и диагностических антител. Предложены новые человеческие тау-специфические антитела, а также их тау-связывающие фрагменты, кодирующие их полинуклеотиды, векторы и клетки-хозяева для продуцирования таких антител, способы получения антител, диагностические и фармацевтические композиции для применения при нейродегенеративной таупатии, применение антител или их фрагментов для профилактического или терапевтического лечения или диагностики нейродегенеративной таупатии у субъекта-человека, способ контроля прогрессирования нейродегенеративной таупатии у субъекта-человека, применение тау-специфических антител, а также их таусвязывающих фрагментов для нацеливания терапевтического или диагностического агента на тау. Дополнительно предложен набор для диагностики нейродегенеративной таупатии.
Область техники
Настоящее изобретение в общем относится к новым тау-специфическим связывающим молекулам, особенно человеческим антителам, а также их фрагментам, производным и вариантам, которые распознают тау-белок, включая патологически фосфорилированные тау и агрегированные формы тау. Кроме того, настоящее изобретение относится к фармацевтическим и диагностическим композициям, содержащим такие связывающие молекулы, антитела и их миметики, пригодные для использования как в качестве диагностического инструмента для идентификации тау и токсичных тау-частиц в плазме и ЦСЖ (цереброспинальная жидкость), так и в стратегиях пассивной вакцинации при лечении нейродегенеративных таупатий, таких как болезнь Альцгеймера (AD), комплекс боковой амиотрофический склероз/паркинсонизм-деменция (ALS-PDC), деменция с аргирофильными гранулами (AGD), амилоидная ангиопатия британского типа, церебральная амилоидная ангиопатия, кортикобазальная дегенерация (CBD), болезнь Крейцфельда-Якоба (БКЯ), боксерская деменция, диффузные нейрофибриллярные клубочки с кальцификацией, синдром Дауна, фронтотемпоральная деменция, фронтотемпоральная деменция с паркинсонизмом, ассоциированная с хромосомой 17 (FTDP-17), фронтотемпоральная лобарная дегенерация, болезнь Герстманна-Штреусслера-Шейнкера, болезнь Галлервордена-Шпатца, миозит с тельцами включений, множественная системная атрофия, миотоническая дистрофия, болезнь Ниманна-Пика типа С (NP-C), негуамовская болезнь двигательных нейронов с нейрофибриллярными клубками, болезнь Пика (PiD), постэнцефалический паркинсонизм, прион-протеинцеребральная амилоидная ангиопатия, прогрессивный субкортикальный глиоз, прогрессивный надъядерный паралич (ПНП), подострый склерозирующий панэнцефалит, деменция, проявляющаяся только в образовании клубков (tangle only dementia), мультиинфарктная деменция и ишемический инсульт.
Уровень техники
Накопление, модификации и агрегация белка являются патологическими аспектами многих нейродегенеративных болезней. Патологически модифицированные и агрегированные тау, включая гиперфосфорилированные тау-конформеры, являются постоянными признаками таупатий и коррелируют с тяжестью болезни.
Тау представляет собой белок, ассоциированный с микротрубочками, который экспрессируется в центральной нервной системе с первичной функцией стабилизации микротрубочек. Существуют шесть основных изоформ тау, экспрессирующихся преимущественно в мозгу взрослого человека, которые образуются из одного гена путем альтернативного сплайсинга. В патологических условиях тау-белок становится гиперфосфорилированным, что приводит к потере связывания тубулина и дестабилизации микротрубочек с последующей агрегацией и отложению тау в патогенных нейрофибриллярных клубках. Расстройства, связанные с тау - которые коллективно называются нейродегенеративными таупатиями являются частью группы расстройств нарушения укладки белков, включающей, в числе прочего, болезнь Альцгеймера (AD), прогрессивный надъядерный паралич, болезнь Пика, кортикобазальную дегенерацию, FTDP-17. Сообщалось, что более 40 мутаций гена ассоциировано с наследственной фронтотемпоральной деменцией, демонстрируя, что мутации гена тау достаточны для инициирования нейродегенерации (Cairns et al., Am. J. Pathol. 171 (2007), 227-40). Исследования на трансгенных мышах и клеточных культурах показывают, что при AD патология тау может быть вызвана патологическим каскадом, в котором АР находится выше по ходу процесса от тау (Gotz et al., Science 293 (2001), 1491-1495). Другие результаты, однако, указывают на модель двойного пути, в которой оба каскада функционируют независимо друг от друга (van de Nes et al., Acta Neuropathol. 111 (2006), 126-138). Иммунотерапии, нацеленные на бета-амилоидный пептид при AD, дали обнадеживающие результаты на животных моделях и продемонстрировали перспективу в клинических испытаниях. Более поздние данные аутопсий небольшого числа субъектов позволяют предположить, что клиренс бета-амилоидных бляшек у пациентов с прогрессирующей AD может быть недостаточным для того, чтобы остановить ухудшение познавательной способности, подчеркивая необходимость в дополнительных терапевтических стратегиях для AD (Holmes et al., Lancet 372 (2008), 216-223; Boche et al., Acta Neuropathol. 120 (2010), 13-20). Вслед за успехом иммунизационной терапии на основе Абета (бета-амилоидных пептидов) на трансгенных животных моделях концепция активной иммунотерапии была распространена на тау-белок. Однако было обнаружено, что активная вакцинация мышей дикого типа с использованием тау-белка индуцирует образование нейрофибриллярных клубков, аксональное повреждение и мононуклеарные инфильтраты в центральной нервной системе, сопровождаемые неврологическими дефицитами (Rosenmann et al., Arch Neurol. 63 (2006), 14591467). Последующие исследования на линиях трансгенных мышей с использованием активной вакцинации фосфорилированными тау-пептидами показали пониженные уровни тау-агрегатов в мозге и замедленное прогрессирование поведенческих расстройств (Sigurdsson, J. Alzheimers. Dis. 15 (2008), 157-168; Boimel et al., Exp. Neural. 224 (2010), 472-485). Эти результаты подчеркивают потенциальный полезный эффект, но также и огромные риски, ассоциированные с активными иммунотерапевтическими подходами, нацеленными на тау. Срочно требуются новые терапевтические стратегии, направленные на патологические тау-белки, с эффективной и безопасной терапией.
Пассивная иммунизация человеческими антителами, полученными от здоровых людей, которые были эволюционно оптимизированы и подвергнуты аффинному созреванию под воздействием человече
- 1 031698 ской иммунной системы, позволит получить перспективные новые терапевтические средства с высокой вероятностью прекрасной эффективности и безопасности.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение использует тау-специфический иммунный ответ здоровых людей для выделения природных анти-тау специфических человеческих моноклональных антител. В частности, эксперименты, проведенные в соответствии с настоящим изобретением, позволили успешно выделить моноклональные тау-специфические антитела из пула здоровых людей без признаков нейродегенеративной таупатии.
Настоящее изобретение, таким образом, касается моноклональных антител, антигенсвязывающих фрагментов, способных специфически распознавать тау. Под специфически распознающий тау, антитело, специфическое по отношению к тау, и анти-тау антитело подразумеваются, конкретно, в общем, и коллективно антитела к нативной форме тау или агрегированным или патологически модифицированным изоформам тау. В конкретном варианте исполнения настоящего изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент демонстрирует характеристики иммунологического связывания антитела, характеризующиеся вариабельными областями VH и/или VL, как изображено на фиг. 1.
Антигенсвязывающий фрагмент антитела может быть одноцепочечным Fv фрагментом, F(ab') фрагментом, F(ab) фрагментом, F(ab')2 фрагментом или любым другим антигенсвязывающим фрагментом. В конкретном варианте исполнения, ниже, антитело или его фрагмент представляет собой человеческое антитело изотипа IgG. Кроме того, настоящее изобретение относится к композиции, содержащей антитело по настоящему изобретению или его активные фрагменты, и к иммунотерапевтическим и иммунодиагностическим способам с использованием таких композиций для предотвращения, диагностики или лечения таупатии, при которых эффективное количество композиции вводится нуждающемуся в этом пациенту.
Естественно, настоящее изобретение охватывает иммортализованные человеческие В-лимфоциты памяти и В-клетки соответственно, которые продуцируют антитело, обладающее определенными и уникальными характеристиками, описанными ниже.
Настоящее изобретение также относится к полинуклеотидам, кодирующим, по меньшей мере, вариабельную область иммуноглобулиновой цепи антитела по изобретению. Соответственно настоящее изобретение также охватывает векторы, включающие указанные полинуклеотиды и трансформированные с их помощью клетки-хозяева, а также их использование для продуцирования антитела, специфического по отношению к тау. Средства и способы рекомбинантного продуцирования антител известны специалистам в данной области техники. Однако, как описано тут, в частности, в отношении терапевтических применений на людях, антитело по настоящему изобретению представляет собой человеческое антитело в том смысле, что использование указанного антитела, по существу, не вызывает иммунного ответа, направленного против такого антитела, который в других случаях наблюдается для химерных и даже гуманизированных антител.
Кроме того, в данном документе раскрыты композиции и способы, которые могут быть использованы для идентификации тау в образцах. Раскрытые анти-тау антитела могут быть использованы для скрининга человеческой крови, ЦСЖ и мочи на присутствие тау в образцах, например, путем использования анализа на основе ELISA (иммуноферментный твердофазный анализ) или адаптированного к поверхности способа анализа. Способы и композиции, раскрытые в данном документе, могут быть полезны при нейродегенеративных таупатиях, например, для диагностики болезни Альцгеймера, и могут быть использованы для контроля течения болезни и терапевтической эффективности.
Таким образом, конкретной целью настоящего изобретения является обеспечение способов лечения, диагностирования или предотвращения нейродегенеративной таупатии, такой как болезнь Альцгеймера, комплекс боковой амиотрофический склероз/паркинсонизм-деменция, деменция с аргирофильными гранулами, амилоидная ангиопатия британского типа, церебральная амилоидная ангиопатия, кортикобазальная дегенерация, болезнь Крейцфельда-Якоба, боксерская деменция, диффузные нейрофибриллярные клубочки с кальцификацией, синдром Дауна, фронтотемпоральная деменция, фронтотемпоральная деменция с паркинсонизмом, ассоциированная с хромосомой 17, фронтотемпоральная лобарная дегенерация, болезнь Герстманна-Штреусслера-Шейнкера, болезнь Галлервордена-Шпатца, миозит с тельцами включений, множественная системная атрофия, миотоническая дистрофия, болезнь Ниманна-Пика типа С, негуамовская болезнь двигательных нейронов с нейрофибриллярными клубками, болезнь Пика, постэнцефалический паркинсонизм, прион-протеинцеребральная амилоидная ангиопатия, прогрессивный субкортикальный глиоз, прогрессивный надъядерный паралич, подострый склерозирующий панэнцефалит, деменция, проявляющаяся только в образовании клубков, мультиинфарктная деменция и ишемический инсульт. Способы включают введение субъекту эффективной концентрации человеческого антитела или производного антитела, где антитело нацелено на тау.
Дополнительные варианты исполнения настоящего изобретения будут понятны из приведенных далее описания и примеров.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1. Аминокислотная и нуклеотидная последовательности вариабельной области, т.е. тяжелая
- 2 031698 цепь и лямбда-легкая цепь человеческих антител NI-105.4E4 (A), NI-105.24B2 (В) и NI-105.4A3 (С). Обозначены каркас (FR) и участки, определяющие комплементарность (CDRs), причем CDRs подчеркнуты. Вследствие стратегии клонирования аминокислотная последовательность на N-конце тяжелой цепи и легкой цепи могут потенциально содержать индуцированные праймером изменения в FR1, которые, однако, существенно не влияют на биологическую активность антитела. Для получения консенсусного человеческого антитела нуклеотидную и аминокислотную последовательности исходного клона выравнивали с и корректировали по соответствующей последовательности вариабельной области человеческой зародышевой линии в базе данных (см., например, Vbase (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/), размещенной Центром белковой инженерии Совета по медицинским исследованиям (MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, UK). Аминокислоты, которые считаются потенциально отклоняющимися от консенсусной последовательности зародышевой линии из-за ПЦР-праймера и были поэтому заменены в аминокислотной последовательности, выделены жирным шрифтом.
Фиг. 2. Планшеты для ELISA покрывали рекомбинантным человеческим тау (изоформа hTau40) в количестве 1 мкг/мл и инкубируют с указанными концентрациями антитела NI-105.4E4. Полученное от человека рекомбинантное антитело NI-105.4E4 связывается с рекомбинантным тау с высокой аффинностью при ЕС50, равном 2 нМ.
Фиг. 3. PHFTau (спаренные спиральные волокна-тау) и рекомбинантный hTau40 разделяли способом градиентного SDS-PAGE с последующим вестерн-блот анализом. Блоты инкубируют с первичными антителами NI-105.4E4 (человеческими) или мышиным моноклональным антителом Tau12, а затем со вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена (ПХ). Рекомбинантное человеческое тау-антитело NI-105.4E4 связывается с рекомбинантным hTau40, а также с патологически модифицированными изоформами тау (PHFTau), экстрагированными из пораженного болезнью Альцгеймера (AD) мозга в вестерн-блот анализе.
Фиг. 4. Картирование №-105.4Е4-связывающего эпитопа hTau40. Технология PepSpot (JPT): две группы близко расположенных пептидных спотов (пептиды 83, 84 и 85; пептиды 96 и 97) были специфически идентифицированы №-105.4Е4 (А и А') при сравнении с одним лишь детектирующим антителом (В). Отдельно взятое ПХ-конъюгированное козье детектирующее антитело против человеческого IgG дает сильный сигнал на единичном споте (пептид 50), но не детектирует пептиды 83, 84, 85, 96 и 97. Аланиновое сканирование: (C) Споты № 35-50 и № 51-68 содержат исходные пептиды (споты № 35 и № 51) и их замещенные варианты (№ 36-50 и № 52-68) (D и E) Аминокислотная последовательность исходных и замещенных пептидов (№ 35-50 и № 51-68). Аланиновое сканирование позволяет предположить, что остатки V339, Е342, D387, Е391 и K395 участвуют в связывании NI-105.4E4.
Фиг. 5. Подтверждение того, что человеческое рекомбинантное антитело М-105.4Е4 специфически связывается с тау-пептидом, соответствующим аминокислотам 333-346 hTau40.
Фиг. 6. NI-105.4E4 связывается с нейрофибриллярными клубками (NFT), дистрофическими нейритами и нейропильными нитями в пораженном болезнью Альцгеймера (AD) мозгу, и у мышей, экспрессирующих человеческий TauP301L. Окрашивание NI105-4E4 идентифицирует NFT и нейропильные нити в пораженном болезнью Альцгеймера (AD) мозгу (A), без существенного связывания с тау в мозгу здорового контрольного субъекта (B). У трансгенной TauP301L мыши (E-I) М-105.4Е4 сильно связывается с напоминающими патологический тау NFT (E, F и H), нейропильными нитями (E и G) и дистрофическими нейритами (E и H). Кроме того, NI-105.4E4 также идентифицирует агрегаты тау на стадии, предшествующей образованию клубков (I). NI-105.4E4 связывается с NFT, дистрофическими нейритами и нейропильными нитями у трансгенных мышей, экспрессирующих человеческий АРР с мутацией Swedish и Arctic и TauP301L; стрелка указывает бета-амилоидную бляшку, окруженную дистрофическими нейритами, распознаваемыми NI-105.4E4 (J). Одно лишь вторичное антитело не дает сигнала как при человеческой AD (C), так и для здорового контроля (D).
Фиг. 7. Планшеты для ELISA покрывают рекомбинантным человеческим тау (hTau40) в количестве 3 мкг/мл и инкубируют с указанными концентрациями антитела NI-105.24B2. Полученное от человека рекомбинантное антитело М-105.24В2 связывается с hTau40 с высокой аффинностью при EC50, равном 6 нМ.
Фиг. 8. PHFTau и рекомбинантный hTau40 разделяют способом градиентного SDS-PAGE с последующим вестерн-блот анализом. Блоты инкубируют в течение ночи с первичными антителами NI105.24B2 (человеческими), а затем с ПХ-конъюгированным анти-человеческим IgG. Рекомбинантное антитело NI-105.24B2 к человеческому тау связывается с рекомбинантным hTau40, а также с патологически модифицированными изоформами тау (PHFTau), экстрагированными из пораженного болезнью Альцгеймера (AD) мозга в вестерн-блот анализе.
Фиг. 9. Определение амилоидных бляшек способом анализа иммунореактивности тканей (TAPIR). Сыворотку, полученную у людей пожилого возраста, прибавляют к гистологическим срезам пораженного болезнью Альцгеймера (AD) мозга. В качестве сравнения проводят иммуногистологическое окрашивание коммерчески доступным АТ100 анти-фосфо-тау антителом. Нейрофибриллярные клубки окрашиваются при контрольном окрашивании АТ100 анти-фосфо-тау антителом при воздействии выделенной сыворотки, что указывает на присутствие реакционноспособных по отношению к нейрофибриллярным
- 3 031698 клубкам антител в испытываемой сыворотке.
Фиг. 10. Рекомбинантное человеческое антитело NI-105.4A3 специфически связывается с человеческим тау при определении способом ELISA. Связывание с БСА (BSA, бычий сывороточный альбумин) не наблюдается.
Фиг. 11. Показаны эпитопы NI-105.4E4 и NI-105.4A3 и эпитопы обычно используемых коммерчески доступных мышиных моноклональных тау-антител. Человеческое антитело NI-105.4E4 нацелено на уникальный эпитоп, включающий два линейных полипептида, один из которых расположен в связывающем микротрубочки домене (R4) тау, который находится в скрытом состоянии в физиологическом ассоциированном с микротрубочками тау. Tau-12 (Covance, California, U.S.A.), HT7, АТ8, АТ180 (Thermo Scientific, U.S.A.); PHF1 (Lewis et al., Science 293 (2001), 1487-1491).
Фиг. 12. Планшеты для ELISA покрывают рекомбинантным человеческим тау (hTau40, 1 мкг/мл), PHFTau (1:100) и контрольным препаратом (1:100), и инкубируют с указанной концентрацией NI105.4A3. 4A3 связывается с rTau с EC50, равным 1,4 нМ, и с PHFTau - с ЕС50, равным 1,2 нМ.
Фиг. 13. Картирование связывающего эпитопа NI-105.4A3 на hTau40. (A) Схематическое изображение четырех используемых перекрывающихся доменов hTau40 (домен I (АА 1-158), домен II (АА 136258), домен III (AA 235-373) и домен IV (АА 355-441)). (B) NI-105.4A3 связывает только домен I тау и полноразмерный полипептид hTau40. (C) Вестерн-блоттинг подтверждает специфическое связывание NI105.4A3 с доменом I тау.
Фиг. 14. Картирование эпитопа NI-105.4A3 с помощью технологии PepSpot (JPT) (A) и способом аланинового сканирования (B и C).
Фиг. 15. Связывание ch4E4 и вариантов с рекомбинантным тау (ELISA).
Фиг. 16. Уровни человеческого IgG в плазме мышей после интраперитонеального введения 30 мг/кг человеческого анти-тау антитела 4Е4 или 4A3.
Фиг. 17. Уровни человеческого IgG в гомогенате мозга мышей после интраперитонеального введения 30 мг/кг человеческого анти-тау антитела 4Е4 или 4A3.
Детальное описание изобретения
I. Определения.
Нейродегенеративные таупатии представляют собой неоднородную группу нейродегенеративных расстройств, общим признаком которых является патологическое поражение, состоящее из внутриклеточных агрегатов аномальных волокон, состоящих преимущественно из патологически гиперфосфорилированного тау в нейронах и/или глиальных клетках. Клинические признаки таупатий являются неоднородными и характеризуются деменцией и/или двигательными синдромами. Прогрессирующее накопление филаментозных включений тау может вызывать нейронную и глиальную дегенерацию в сочетании с другими отложениями, такими как, например, бета-амилоид при болезни Альцгеймера, или как единственный патогенный признак, на что указывают мутации гена тау, связанные с семейными формами фронтотемпоральной деменции и паркинсонизмом, ассоциированным с хромосомой 17 (FTDP-17). Вследствие разнообразия их клинических проявлений может быть составлен потенциально неисчерпывающий перечень таупатических заболеваний, включающий болезнь Альцгеймера, комплекс боковой амиотрофический склероз/паркинсонизм-деменция, деменция с аргирофильными гранулами, амилоидная ангиопатия британского типа, церебральная амилоидная ангиопатия, кортикобазальная дегенерация, болезнь Крейцфельда-Якоба, боксерская деменция, диффузные нейрофибриллярные клубочки с кальцификацией, синдром Дауна, фронтотемпоральная деменция, фронтотемпоральная деменция с паркинсонизмом, ассоциированная с хромосомой 17, фронтотемпоральная лобарная дегенерация, болезнь Герстманна-Штреусслера-Шейнкера, болезнь Галлервордена-Шпатца, миозит с тельцами включений, множественная системная атрофия, миотоническая дистрофия, болезнь Ниманна-Пика типа С, негуамовская болезнь двигательных нейронов с нейрофибриллярными клубками, болезнь Пика, постэнцефалический паркинсонизм, прион-протеинцеребральная амилоидная ангиопатия, прогрессивный субкортикальный глиоз, прогрессивный надъядерный паралич, подострый склерозирующий панэнцефалит, деменция, проявляющаяся только в образовании клубков, мультиинфарктная деменция и ишемический инсульт; см. обзор, например, Lee et al., Annu. Rev. Neurosci. 24 (2001), 1121-1159, в котором в табл. 1 обобщены уникальные представители таупатий, или Sergeant et al., Bioch. Biophy. Acta 1739 (2005), 179-97, где перечень приведен на фиг. 2.
В данном описании термин тау используется взаимозаменяемо для конкретного обозначения нативной мономерной формы тау. Термин тау также используется для обозначения в общем других конформеров тау, например олигомеров или агрегатов тау. Термин тау также используется для обозначения коллективно всех типов и форм тау. Вследствие альтернативного сплайсинга в мозгу людей присутствует 6 изоформ тау. Белковыми последовательностями этих изоформ являются:
Изоформа фетального тау (Fetal-tau), состоящая из 352аа (аминокислот)
- 4 031698
MAEPRQEFEVMEDHAGTYGLGDRKDQGGYTMHQDQEGDTDAGLKAEEAGIGDTPSL
EDEAAGHVTQARMVSKSKDGTGSDDKKAKGADGKTKIATPRGAAPPGQKGQANATRI PAKTPPAPKTPPSSGEPPKSGDRSGYSSPGSPGTPGSRSRTPSLPTPPTREPKKVAV VRTPPKSPSSAKSRLQTAPVPMPDLKNVKSKIGSTENLKHQPGGGKVQIVYKPVDLSK VTSKCGSLGNIHHKPGGGQVEVKSEKLDFKDRVQSKIGSLDNITHVPGGGNKKIETHK LTFRENAKAKTDHGAEIVYKSPWSGDTSPRHLSNVSSTGSIDMVDSPQLATLADEVS ASLAKQGL (SEQ ID N0:1)
Изоформа тау-В, состоящая из 381аа
MAEPRQEFEVMEDHAGTYGLGDRKDQGGYTMHQDQEGDTDAGLKESPLQTPTEDG SEEPGSETSDAKSTPTAEAEEAGIGDTPSLEDEAAGHVTQARMVSKSKDGTGSDDKK AKGADGKTKIATPRGAAPPGQKGQANATRIPAKTPPAPKTPPSSGEPPKSGDRSGYS SPGSPGTPGSRSRTPSLPTPPTREPKKVAWRTPPKSPSSAKSRLQTAPVPMPDLKN VKSKIGSTENLKHQPGGGKVQIVYKPVDLSKVTSKCGSLGNIHHKPGGGQVEVKSEKL DFKDRVQSKIGSLDNITHVPGGGNKKIETHKLTFRENAKAKTDHGAEIVYKSPWSGDT SPRHLSNVSSTGSIDMVDSPQLATLADEVSASLAKQGL (SEQ ID N0:2)
Изоформа тау-С, состоящая из 410аа
MAEPRQEFEVMEDHAGTYGLGDRKDQGGYTMHQDQEGDTDAGLKESPLQTPTEDG
SEEPGSETSDAKSTPTAEDVTAPLVDEGAPGKQAAAQPHTEIPEGTTAEEAGIGDTPS
LEDEAAGHVTQARMVSKSKDGTGSDDKKAKGADGKTKIATPRGAAPPGQKGQANAT RIPAKTPPAPKTPPSSGEPPKSGDRSGYSSPGSPGTPGSRSRTPSLPTPPTREPKKVA WRTPPKSPSSAKSRLQTAPVPMPDLKNVKSKIGSTENLKHQPGGGKVQIVYKPVDLS KVTSKCGSLGNIHHKPGGGQVEVKSEKLDFKDRVQSKIGSLDNITHVPGGGNKKIETH
KLTFRENAKAKTDHGAEIVYKSPWSGDTSPRHLSNVSSTGSIDMVDSPQLATLADEV
SASLAKQGL (SEQ ID N0:3)
Изоформа тау-D, состоящая из 383 аа
MAEPRQEFEVMEDHAGTYGLGDRKDQGGYTMHQDQEGDTDAGLKAEEAGIGDTPSL
EDEAAGHVTQARMVSKSKDGTGSDDKKAKGADGKTKIATPRGAAPPGQKGQANATRI
PAKTPPAPKTPPSSGEPPKSGDRSGYSSPGSPGTPGSRSRTPSLPTPPTREPKKVAV
VRTPPKSPSSAKSRLQTAPVPMPDLKNVKSKIGSTENLKHQPGGGKVQIINKKLDLSNV
QSKCGSKDNIKHVPGGGSVQIVYKPVDLSKVTSKCGSLGNIHHKPGGGQVEVKSEKL
DFKDRVQSKIGSLDNITHVPGGGNKKIETHKLTFRENAKAKTDHGAEIVYKSPWSGDT
SPRHLSNVSSTGSIDMVDSPQLATLADEVSASLAKQGL (SEQ ID N0:4)
Изоформа тау-Е, состоящая из 412аа
MAEPRQEFEVMEDHAGTYGLGDRKDQGGYTMHQDQEGDTDAGLKESPLQTPTEDG
SEEPGSETSDAKSTPTAEAEEAGIGDTPSLEDEAAGHVTQARMVSKSKDGTGSDDKK
AKGADGKTKIATPRGAAPPGQKGQANATRIPAKTPPAPKTPPSSGEPPKSGDRSGYS
SPGSPGTPGSRSRTPSLPTPPTREPKKVAWRTPPKSPSSAKSRLQTAPVPMPDLKN
VKSKIGSTENLKHQPGGGKVQIINKKLDLSNVQSKCGSKDNIKHVPGGGSVQIVYKPVD
LSKVTSKCGSLGNIHHKPGGGQVEVKSEKLDFKDRVQSKIGSLDNITHVPGGGNKKIET
HKLTFRENAKAKTDHGAEIVYKSPWSGDTSPRHLSNVSSTGSIDMVDSPQLATLADE
VSASLAKQGL (SEQ ID N0:5)
Изоформа тау-F, состоящая из 441аа
MAEPRQEFEVMEDHAGTYGLGDRKDQGGYTMHQDQEGDTDAGLKESPLQTPTEDG
SEEPGSETSDAKSTPTAEDVTAPLVDEGAPGKQAAAQPHTEIPEGTTAEEAGIGDTPS
LED Е AAG Н VTQ ARMVS KSKDGTGSDD KKAKG AD G KTKI ATP RGAAP Р G Q KG Q AN АТ
RIPAKTPPAPKTPPSSGEPPKSGDRSGYSSPGSPGTPGSRSRTPSLPTPPTREPKKVA
WRTPPKSPSSAKSRLQTAPVPMPDLKNVKSKIGSTENLKHQPGGGKVQIINKKLDLSN
VQSKCGSKDNIKHVPGGGSVQIVYKPVDLSKVTSKGGSLGNIHHKPGGGQVEVKSEKL
DFKDRVQSKIGSLDNITHVPGGGNKKIETHKLTFRENAKAKTDHGAEIVYKSPWSGDT
SPRHLSNVSSTGSIDMVDSPQLATLADEVSASLAKQGL (SEQ ID N0:6)
Аминокислотная последовательность тау дикого типа представлена изоформой тау-F, состоящей из 441аа (SEQ ID N0:6), которая также дополнительно обозначается hTau40, TauF, тау-4 или полноразмерный тау. Аминокислотная последовательность тау может быть найдена в литературе и соответствующих базах данных (см. Goedert et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 4051-4055, Goedert et al., EMBO J. 8 (1989), 393-399, Goedert et al., EMBO J. 9 (1990), 4225-4230 и GenBank UniProtKB/swissprot: locus TAU_HUMAN, номера доступа Р10636-2 (фетальный тау) и Р 10636-4^-8 (Изоформы В-F).
Другой отличительной особенностью тау-белка является фосфорилирование, которое происходит по примерно 30 из 79 потенциальных сайтов фосфорилирования серина (Ser) и треонина (Thr). Тау сильно фосфорилируется во время развития мозга. Степень фосфорилирования уменьшается во взрослом состоянии. Некоторые сайты фосфорилирования расположены в доменах тау, связывающих микротрубочки, и было показано, что увеличение фосфорилирования тау оказывает негативное регулирующее воздействие на связывание микротрубочек. Например, Ser262 и Ser396, которые находятся внутри или рядом с мотивами связывания микротрубочек, являются гиперфосфорилированными в тау-белках аномально спаренных спиральных волокон (PHF), основного компонента нейрофибриллярных клубков (NFT) в мозгу пациентов с болезнью Альцгеймера. PHF представляют собой филаментозные агрегаты таубелков, которые являются аномально гиперфосфорилированными и могут быть окрашены специфическими анти-тау антителами и детектированы способом световой микроскопии. То же самое наблюдается для так называемых прямых тау-волокон. PHF образуют переплетенные ленты, состоящие из двух воло
- 5 031698 кон, закрученных вокруг друг друга периодичностью примерно 80 нм. Такие патологические признаки обычно называются тау-патология, таупатология или тау-ассоциированная патология. Более подробное описание нейропатологических признаков таупатий приведены в Lee et al., Annu. Rev. Neurosci. 24 (2001), 1121-1159 и Gotz, Brain. Res. Rev. 35 (2001), 266-286, раскрытое содержание которых включено сюда в качестве ссылок. Физиологический тау-белок стабилизирует микротрубочки в нейронах. Патологическое фосфорилирование приводит к аномальной локализации тау и агрегации, что вызывает дестабилизацию микротрубочек и нарушение клеточного транспорта. Агрегированный тау является нейротоксичным in vitro (Khlistunova et al., J. Biol. Chem. 281 (2006), 1205-1214). Однако точная природа нейротоксичных частиц остается неизвестной, так же как и механизм(ы), по которым они приводят к гибели нейронов. Агрегаты тау могут наблюдаться как основной компонент нейрофибриллярных клубков (NFT) при многих таупатиях, таких как болезнь Альцгеймера (AD), фронтотемпоральные деменции, супрануклеарный паралич, болезнь Пика, болезнь аргирофильных гранул (AGD), кортикобазальная дегенерация, FTDP-17, болезнь Паркинсона, боксерская деменция (обзор Gendron and Petrucelli, Mol. Neurodegener. 4:13 (2009)). Помимо этих наблюдений были получены данные, свидетельствующие, что таумедиируемая гибель нейронов может происходить даже в отсутствие образования клубков. Растворимые соединения фосфо-тау присутствуют в ЦСЖ (Aluise et al., Biochim. Biophys. Acta. 1782 (2008), 549-558). Агрегаты тау могут переносить неправильную укладку снаружи вовнутрь клетки и переносить ее между совместно культивируемыми клетками (Frost et al., J. Biol. Chem. 284 (2009), 12845-12852).
В дополнение к участию в нейродегенеративных таупатиях наблюдаемые изменения фосфорилирования тау во время и после ишемии/реперфузии позволяет предположить, что тау играет ключевую роль в повреждениях нейронов и клинической патофизиологии нейроваскулярных расстройств, таких как ишемический инсульт (Zheng et al., J. Cell. Biochem. 109 (2010), 26-29).
Человеческие анти-тау антитела, раскрытые в данном документе, специфически связываются с тау и его эпитопами и с различными конформациями тау и его эпитопов. Например, в данном документе раскрыты антитела, которые специфически связывают тау, полноразмерный тау, патологически модифицированные изоформы тау и агрегаты тау. В используемом тут значении указание на антитело, которое специфически связывает, селективно связывает или предпочтительно связывает тау, относится к антителу, которое не связывает другие неродственные белки. В одном примере антитело тау, раскрытое в данном документе, может связывать тау или его эпитоп и не демонстрирует связывания с другими белками, превышающего более чем в примерно 1,5 раза фоновый уровень. Антитело, которое специфически связывает или селективно связывает конформер тау, относится к антителу, которое не связывает все конформации тау, т.е. не связывает по меньшей мере один другой конформер тау. Например, в данном документе раскрыты антитела, которые могут предпочтительно связываться с агрегированными формами тау в пораженных болезнью Альцгеймера тканях. Поскольку человеческие анти-тау антитела по настоящему изобретению были выделены из пула здоровых людей, проявляющих тау-специфический иммунный ответ, тау-антитела по настоящему изобретению могут быть также названы человеческими аутоантителами для того, чтобы подчеркнуть, что такие антитела были действительно экспрессированы людьми и не были выделены, например, из фаговой библиотеки, экспрессирующей человеческий иммуноглобулин, что до настоящего времени является одним из обычных способов, используемых при попытках получения человекоподобных антител.
Следует отметить, что термины, указывающие на объекты в единственном числе (с артиклями а или an в английском тексте) относятся к одному или нескольким таким объектам; например, антитело следует понимать как представляющий одно или несколько антител. По существу, термины в единственном числе (с артиклями а (или an)), один или несколько и по меньшей мере один могут использоваться тут взаимозаменяемо.
В используемом тут значении термин полипептид должен охватывать полипептид в единственном числе, а также полипептиды во множественном числе, и относится к молекуле, состоящей из мономеров (аминокислот), линейно соединенных амидными связями (также известными как пептидные связи). Термин полипептид относится к любой цепи или цепям, состоящим из двух или более аминокислот, и не указывает на конкретную длину продукта. Таким образом, пептиды, дипептиды, трипептиды, олигопептиды, белок, аминокислотная цепь или любой другой термин, используемый для обозначения цепи или цепей, состоящих из двух или более аминокислот, включены в определение полипептида, и термин полипептид может быть использован вместо или взаимозаменяемо с любыми из этих терминов.
Термин полипептид также должен относиться к продуктам постэкспрессионных модификаций полипептида, включая, без ограничений, гликозилирование, ацетилирование, фосфорилирование, амидирование, дериватизацию известными защитными/блокирующими группами, протеолитическое расщепление или модификацию неприродными аминокислотами. Полипептид может быть получен из природного биологического источника или изготовлен с помощью рекомбинантной технологии и не обязательно транслируется из указанной последовательности нуклеиновой кислоты. Он может быть генерирован любым способом, включая химический синтез.
Полипептид по изобретению может иметь размер примерно 3 или более, 5 или более, 10 или более,
- 6 031698 или более, 25 или более, 50 или более, 75 или более, 100 или более, 200 или более, 500 или более, 1000 или более или 2000 или более аминокислот. Полипептиды могут иметь определенную трехмерную структуру, хотя они не обязательно имеют такую структуру. Полипептиды с определенной трехмерной структурой называются уложенными, а полипептиды, которые не обладают определенной трехмерной структурой, но могут принимать большое число разных конформаций, называются неуложенными. В используемом тут значении термин гликопротеин относится к белку, связанному по меньшей мере с одним углеводным фрагментом, который присоединен к белку через кислородсодержащую или азотсодержащую боковую цепь остатка аминокислоты, например остатка серин или остатка аспарагин.
Под изолированным полипептидом или его фрагментом, вариантом или производным подразумевается полипептид, который не находится в своем природном окружении. Никакой конкретный уровень очистки не требуется. Например, изолированный полипептид может быть извлечен из его нативного или природного окружения. Рекомбинантно получаемые полипептиды и белки, экспрессирующиеся в клетках-хозяевах, считаются изолированными в целях изобретения, так же как и нативные или рекомбинантные полипептиды, которые были выделены, фракционированы или частично или в существенной степени очищены любым пригодным способом.
Настоящее изобретение также включает в качестве полипептидов фрагменты, производные, аналоги или варианты вышеописанных полипептидов и любую их комбинацию. Термины фрагмент, вариант, производное и аналог при описании антител или полипептидов антител по настоящему изобретению включают любые полипептиды, которые сохраняют, по меньшей мере, некоторые антигенсвязывающие свойства соответствующей нативной связывающей молекулы, антитела или полипептида. Фрагменты полипептидов по настоящему изобретению включают протеолитические фрагменты, а также делеционные фрагменты, в дополнение к конкретным фрагментам антитела, описанным в других местах данного документа. Варианты антител и полипептиды антитела по настоящему изобретению включают фрагменты, описанные выше, а также полипептиды с измененными аминокислотными последовательностями в результате аминокислотных замещения, делеций или инсерций. Варианты могут быть природными или не встречающимися в природных условиях. Неприродные варианты могут быть получены с использованием известных специалистам методик мутагенеза. Варианты полипептидов могут включать консервативные или неконсервативные аминокислотные замещения, делеции или вставки. Производные специфических по отношению к тау-связывающих молекул, например антитела и полипептиды антител по настоящему изобретению, представляют собой полипептиды, которые были изменены таким образом, чтобы они обладали дополнительными признаками, отсутствующими у нативного полипептида. Примеры включают слитые белки. Варианты полипептида могут также называться тут аналоги полипептида. В используемом тут значении производное связывающей молекулы или ее фрагмента, антитела или полипептида антитела относится к полипептиду по настоящему изобретению, имеющему один или несколько остатков, химически дериватизованных путем проведения реакции с функциональной боковой группой. Также включены в качестве производных пептиды, которые содержат одно или несколько природных производных 20 стандартных аминокислот. Например, 4-гидроксипролин может замещать пролин; 5-гидроксилизин может замещать лизин; 3-метилгистидин может замещать гистидин; гомосерин может замещать серин; и орнитин может замещать лизин.
Термин полинуклеотид должен охватывать отдельно взятую нуклеиновую кислоту, а также нуклеиновые кислоты во множественном числе, и относится к изолированной молекуле или конструкту нуклеиновой кислоты, например матричная РНК (мРНК) или плазмидная ДНК (пДНК). Полинуклеотид может содержать обычную фосфодиэфирную связь или необычную связь (например, амидную связь, такую как в пептидных нуклеиновых кислотах (ПНК)). Термин нуклеиновая кислота относится к любому одному или нескольким сегментам нуклеиновой кислоты, например фрагментам ДНК или РНК, присутствующим в полинуклеотиде. Под изолированной нуклеиновой кислотой или полинуклеотидом подразумевается молекула нуклеиновой кислоты, ДНК или РНК, которая была извлечена из ее нативного окружения. Например, рекомбинантный полинуклеотид, кодирующий антитело, входящий в состав вектора, считается изолированным в целях настоящего изобретения. Дополнительные примеры изолированного полинуклеотида включают рекомбинантные полинуклеотиды, содержащиеся в гетерологичных клеткаххозяевах, или очищенные (частично или в значительной степени) полинуклеотиды в растворе. Изолированные молекулы РНК включают in vivo или in vitro РНК-транскрипты полинуклеотидов по настоящему изобретению. Изолированные полинуклеотиды или нуклеиновые кислоты в соответствии с настоящим изобретением дополнительно включают такие молекулы, полученные способами синтеза. Кроме того, полинуклеотид или нуклеиновая кислота могут представлять собой или могут включать регуляторный элемент, такой как промотор, сайт связывания рибосомы, или терминатор транскрипции.
В используемом тут значении кодирующая область представляет собой часть нуклеиновой кислоты, которая состоит из кодонов, транслируемых в аминокислоты. Хотя терминирующий кодон (TAG, TGA или ТАА) не транслируется в аминокислоту, он может считаться частью кодирующей области, но любые фланкирующие последовательности, например промоторы, сайты связывания рибосом, терминаторы транскрипции, интроны и т.п., не являются частью кодирующей области. Две или более кодирующих областей по настоящему изобретению могут присутствовать в одном полинуклеотидном конструкте,
- 7 031698 например в одном векторе, или в разных полинуклеотидных конструктах, например в отдельных (разных) векторах. Кроме того, любой вектор может содержать одну кодирующую область или может включать две или более кодирующих области, например один вектор может отдельно кодировать вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина и вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина. Кроме того, вектор, полинуклеотид или нуклеиновая кислота по изобретению может кодировать гетерологичные кодирующие области, слитые или неслитые с нуклеиновой кислотой, кодирующей связывающую молекулу, антитело или его фрагмент, вариант или производное. Гетерологичные кодирующие области включают, без ограничений, специализированные элементы или мотивы, такие как секреторный сигнальный пептид или гетерологичный функциональный домен.
В определенных вариантах исполнения полинуклеотид или нуклеиновая кислота представляет собой ДНК. В случае ДНК полинуклеотид, содержащий нуклеиновую кислоту, которая кодирует полипептид, нормально может включать промотор и/или другие контрольные элементы транскрипции или трансляции, функционально связанные с одной или несколькими кодирующими областями. Считается, что существует функциональная связь, если кодирующая область генного продукта, например полипептид, ассоциирована с одной или несколькими регуляторными последовательностями таким образом, чтобы экспрессия генного продукта находилась под влиянием или контролем регуляторной последовательности (последовательностей). Два фрагмента ДНК (такие как полипептидная кодирующая область и ассоциированный с ней промотор) являются функционально связанными или функционально сцепленными, если индуцирование функции промотора приводит к транскрипции мРНК, кодирующей желательный генный продукт, и если природа связи между двумя фрагментами ДНК не препятствует способности регуляторных последовательностей экспрессии направлять экспрессию генного продукта или препятствует способности ДНК-матрицы к транскрипции. Таким образом, промоторная область будет функционально связана с нуклеиновой кислотой, кодирующей полипептид, если промотор способен вызвать транскрипцию данной нуклеиновой кислоты. Промотор может быть клеточно-специфическим промотором, который направляет значительную транскрипцию ДНК только в предварительно определенных клетках. Другие контрольные элементы транскрипции, кроме промотора, например энхансеры, операторы, репрессоры и сигналы терминации транскрипции, могут быть функционально связанные с полинуклеотидом для управления клеточно-специфической транскрипцией. Пригодные промоторы и другие контрольные области транскрипции раскрыты в данном документе.
Квалифицированным специалистам в данной области техники известны различные контрольные области транскрипции. Они включают, без ограничений, контрольные области транскрипции, функционирующие в клетках позвоночных, таких как, без ограничений, промоторные и энхансерные сегменты цитомегаловирусов (немедленный ранний промотор, в сочетании с интроном-А), вакуолизирующего обезьянего вируса ОВ-40 (ранний промотор) и ретровирусов (таких как вирус саркомы Рауса). Другие контрольные области транскрипции включают области, выделенные из генов позвоночных, такие как актин, белок теплового шока, гормон роста крупного рогатого скота и β-глобин кролика, а также другие последовательности, способные контролировать генную экспрессию в эукариотических клетках. Дополнительные пригодные контрольные области транскрипции включают ткань-специфические промоторы и энхансеры, а также лимфокин-индуцируемые промоторы (например, промоторы, индуцируемые интерферонами или интерлейкинами).
Аналогично, рядовым специалистам в данной области техники известны различные контрольные элементы трансляции. Они включают, без ограничения, сайты связывания рибосом, кодоны инициации и терминации трансляции, и элементы, выделенные из пикорнавирусов (особенно участок внутренней посадки рибосомы или IRES, также называемый последовательностью CITE).
В других вариантах исполнения полинуклеотид по настоящему изобретению представляет собой РНК, например, в форме матричной РНК (мРНК).
Кодирующие области полинуклеотида и нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению могут быть ассоциированы с дополнительными кодирующими областями, которые кодируют секреторные или сигнальные пептиды, управляющие секрецией полипептида, кодируемого полинуклеотидом по настоящему изобретению. В соответствии с сигнальной гипотезой белки, секретируемые клетки млекопитающих, имеют сигнальный пептид или секреторную лидерную последовательность, которая отщепляется от зрелого белка после инициирования экспорта растущей белковой цепи через шероховатый эндоплазматический ретикулум. Рядовые специалисты в данной области техники знают, что полипептиды, секретируемые клетками позвоночных, в общем имеют сигнальный пептид, слитый с N-концом полипептида, который отщепляется от цельного или полноразмерного полипептида для получения секретированной или зрелой формы полипептида. В определенных вариантах исполнения используется нативный сигнальный пептид, например сигнальный пептид тяжелой цепи или легкой цепи иммуноглобулина, или функциональное производное такой последовательности, сохраняющее способность направлять секрецию полипептида, функционально связанного с ним. Альтернативно, может быть использовано гетерологичный сигнальный пептид млекопитающего или его функциональное производное. Например, лидерная последовательность дикого типа может быть замещена на лидерную последовательность человече
- 8 031698 ского тканевого активатора плазминогена (ТАП) или мышиной β-глюкуронидазы.
Если не указано иное, термины расстройство и болезнь используются в данном документе взаимозаменяемо.
Связывающая молекула, как этот термин используется в контексте настоящего изобретения, относится главным образом к антителам и их фрагментам, но могут также относиться к другим не являющимся антителами молекулам, которые связываются с тау, включая, без ограничений, гормоны, рецепторы, лиганды, молекулы главного комплекса гистосовместимости (ГКГС), шапероны, такие как белки теплового шока (HSPs), а также молекулы межклеточной адгезии, такие как члены суперсемейств кадгерина, интегрина, лектина С-типа и иммуноглобулина (Ig). Таким образом, только для ясности и без ограничения объема настоящего изобретения большая часть описываемых далее вариантов исполнения обсуждается по отношению к антителам и антителоподобным молекулам, которые представляют собой конкретные варианты исполнения связывающих молекул для разработки терапевтических и диагностических агентов.
Термины антитело и иммуноглобулин используются в данном документе взаимозаменяемо. Антитело или иммуноглобулин представляет собой тау-связывающую молекулу, которая включает, по меньшей мере, вариабельный домен тяжелой цепи, и нормально содержит, по меньшей мере, вариабельные домены тяжелой цепи и легкой цепи. Базовые структуры иммуноглобулина в системах позвоночных изучены относительно хорошо (см., например, Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988)).
Как будет более детально обсуждаться ниже, термин иммуноглобулин включает различные широкие классы полипептидов, которые может быть распознаны биохимически. Квалифицированным специалистам в данной области техники известно, что тяжелые цепи классифицируются как гамма, мю, альфа, дельта или эпсилон (γ, μ, α, δ, ε), включающие некоторые подклассы (например, γ1-γ4). Именно характер этой цепи определяет класс антитела как IgG, IgM, IgA IgG или IgE соответственно. Подклассы (изотипы) иммуноглобулина, например IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и т.д., хорошо охарактеризованы и, как известно, обеспечивают функциональную специализацию. Модифицированные версии каждого из этих классов и изотипов легко различимы для квалифицированного специалиста, принимая во внимание данное описание, и соответственно входят в объем настоящего изобретения. Все классы иммуноглобулинов безусловно входят в объем настоящего изобретения, но приведенное далее обсуждение в общем будет направлено на молекулы иммуноглобулина класса IgG. Что касается IgG, стандартная молекула иммуноглобулина содержит два идентичных полипептида легкой цепи с молекулярным весом приблизительно 23000 Да и два идентичных полипептида тяжелой цепи с молекулярным весом 53000-70000. Четыре цепи типично соединены дисульфидными связями в Y''-конфигурации, где легкие цепи охватывают тяжелые цепи, начиная от развилки Y и на протяжении вариабельной области.
Легкие цепи классифицируются на каппа или лямбда (к, λ). Каждый класс тяжелой цепи может быть связан с каппа- или лямбда-легкой цепью. В общем, легкие и тяжелые цепи ковалентно связаны друг с другом, и хвостовые участки двух тяжелых цепей связаны друг с другом ковалентными дисульфидными связями или нековалентными связями, когда иммуноглобулины генерируются гибридомами, В-клетками или генетически модифицированными клетками-хозяевами. В тяжелой цепи аминокислотные последовательности проходят от N-конца на разветвленных концах Y-конфигурации до С-конца в нижней части каждой цепи.
Как легкие, так и тяжелые цепи разделены на области структурной и функциональной гомологии. Термины константный и вариабельный используются функционально. В этом отношении следует понимать, что вариабельные домены участков как легкой (VL), так и тяжелой (VH) цепи определяют распознавание и специфичность антигена. Наоборот, константные домены легкой цепи (CL) и тяжелой цепи (СН1, СН2 или CH3) обеспечивают важные биологические свойства, такие как секреция, трансплацентарная подвижность, связывание рецептора Fc, связывание комплемента и т.п. Условно принято, что нумерация доменов константной области возрастает с увеличением их отдаленности от антигенсвязывающего сайта или аминоконца антитела. N-концевой участок представляет собой вариабельную область, а С-концевой участок - константную область; домены CH3 и CL фактически включают карбоксиконцы тяжелой и легкой цепей соответственно.
Как указано выше, вариабельная область позволяет антителу селективно распознавать и специфически связывать эпитопы антигенов. Это означает, что домен VL и домен VH или подмножество участков, определяющих комплементарность (CDRs) антитела, объединяются с образованием вариабельной области, которая формирует трехмерный антигенсвязывающий сайт. Такая четвертичная структура антитела образует антигенсвязывающий сайт, расположенный на конце каждой ветви Y. Более конкретно, антигенсвязывающий сайт образуется тремя CDRs каждой из цепей VH и VL. Любое антитело или фрагмент иммуноглобулина, содержащие достаточную структуру для специфического связывания с тау, называется тут взаимозаменяемо связывающим фрагментом или иммуноспецифическим фрагментом.
В природных антителах антитело содержит шесть гипервариабельных областей, иногда называемых участками, определяющими комплементарность или CDRs, присутствующих в каждом антигенсвя
- 9 031698 зывающем домене, которые представляют собой короткие несмежные последовательности аминокислот, которые специфически расположены таким образом, что они образуют антигенсвязывающий домен, когда антитело принимает свою трехмерную конфигурацию в водной среде. ’’CDRs” фланкируются четырьмя относительно консервативными каркасными участками или FRs, которые демонстрируют меньшую межмолекулярную изменчивость. Каркасные участки преимущественно принимают конформацию β-листа, a CDRs образуют петли, которые соединяют и в некоторых случаях образуют часть структуры β-листа. Таким образом, каркасные участки образуют каркас, обеспечивающий размещение CDRs в правильной ориентации за счет межцепочечных нековалентных взаимодействий. Антигенсвязывающий домен, образованный размещенными в определенном положении CDRs, образует поверхность, комплементарную к эпитопу иммунореактивного антигена. Такая комплементарная поверхность способствует нековалентному связыванию антитела с соответствующим ему эпитопом. Аминокислоты, составляющие CDRs и каркасные участки соответственно, могут быть легко идентифицированы для любой данной вариабельной области тяжелой или легкой цепи рядовым специалистом в данной области техники, поскольку они были точно определены (см. Sequences of Proteins of Immunological Interest, Kabat E., et al., U.S. Department of Health and Human Services, (1983); и Chothia and Lesk, J. Mol. Biol., 196 (1987), 901-917), которые целиком включены сюда в качестве ссылок.
В тех случаях, когда существует два или более определений термина, используемых и/или принятых специалистами, подразумевается, что определение термина в используемом тут значении включает все такие значения, если явным образом не будет указано иное. Конкретным примером является использование термина участок, определяющий комплементарность (CDR) для описания несмежного антигена, объединяющего сайты, расположенные в вариабельных областях как тяжелой, так и легкой цепей полипептидов. Такой конкретный участок был описан Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, Sequences of Proteins of Immunological Interest (1983) и Chothia and Lesk, J. Mol. Biol., 196 (1987), 901-917, которые включены сюда в качестве ссылок, где определения включают перекрывающиеся или подмножества аминокислотных остатков при сравнении друг с другом. Тем не менее, подразумевается, что применение любого определения по отношению к CDR антитела или его вариантов входит в объем термина, определенного и используемого тут. Пригодные аминокислотные остатки, которые охватывают CDRs, как они определены в каждой из указанных выше ссылок, приведены ниже в табл. 1 в виде сравнения. Точные номера остатков, охватывающие конкретный CDR, будут меняться в зависимости от последовательности и размера CDR. Квалифицированные специалисты могут в рабочем порядке определить, какие остатки составляют конкретную гипервариабельную область или CDR человеческого антитела субтипа IgG для данной аминокислотной последовательности вариабельной области антитела.
Таблица 1
Определения CDR1
Kabat Chothia
VH CDR1 31-35 26-32
VH CDR2 50-65 52-58
VH CDR3 95-102 95-102
VL CDR1 24-34 26-32
VL CDR2 50-56 50-52
VL CDR3 89-97 91-96
1 - нумерация всех определений CDR в табл. 1 соответствует правилам нумерации, установленным Kabat et al. (см. ниже).
Kabat et al. также определил систему нумерации для последовательностей вариабельного домена, применимую для любого антитела. Рядовой специалист в данной области техники может однозначно применить эту систему нумерации по Кабат к любой последовательности вариабельного домена, без использования каких-либо экспериментальных данных, кроме самой последовательности. В используемом тут значении нумерация по Кабат относится к системе нумерации, установленной Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, Sequences of Proteins of Immunological Interest (1983). За исключением случаев, когда указано иное, указания нумерации положения конкретного остатка аминокислоты в антителе или его антигенсвязывающем фрагменте, варианте или производном по настоящему изобретению приводятся в соответствии с системой нумерации Кабат, которая, однако, является теоретической и может не быть в равной степени применимой для всех антител по настоящему изобретению. Например, в зависимости от положения первого CDR последующие CDRs могут быть смещены в любую сторону.
Антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, иммуноспецифические фрагменты, варианты или производные по изобретению включают, без ограничения, поликлональные, моноклональные, мультиспецифические, человеческие, гуманизированные, приматизированные, приближенные к мышиным или химерные антитела, одноцепочечные антитела, эпитопсвязывающие фрагменты, например Fab, Fab' и F(ab')2, Fd, Fvs, одноцепочечные Fvs (scFv), одноцепочечные антитела, соединенные дисульфидными связями Fvs (sdFv), фрагменты, включающие VL или VH домен, фрагменты, полученные с помощью библиотеки экспрессии Fab, и антиидиотипические (анти-Id) антитела (включая, например, анти-Id антитела к антителам, раскрытым в данном документе). Молекулы ScFv известны специалистам в данной области
- 10 031698 техники и описаны, например, в патенте США № 5892019. Молекулы иммуноглобулина или антитела по могут принадлежать к любому типу (например, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, и IgY), классу (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2) или подклассу молекул иммуноглобулина.
В одном варианте исполнения антитело по настоящему изобретению не является IgM или его производным с пятивалентной структурой. В частности, в конкретных применениях настоящего изобретения, особенно в терапевтическом применении, IgM являются менее пригодными, чем IgG и другие бивалентные антитела или соответствующие связывающие молекулы, поскольку IgM вследствие их пятивалентной структуры и отсутствия созревания аффинности часто демонстрируют неспецифические перекрестные реактивности и очень низкую аффинность.
В конкретном варианте исполнения антитело по настоящему изобретению не является поликлональным антителом, т.е. оно, по существу, состоит из одного конкретного вида антител, а не является смесью, полученной из образца иммуноглобулина плазмы.
Фрагменты антитела, включая одноцепочечные антитела, могут содержать вариабельную область (области), одну или в комбинации со всеми или частью следующего перечня: шарнирная область, домены СН1, СН2 и CH3. Изобретение также включает тау-связывающие фрагменты, которые также включают любую комбинацию вариабельной области (областей) с шарнирной областью, доменами СН1, СН2 и CH3. Антитела или их иммуноспецифические фрагменты по настоящему изобретению могут быть получены от любого животного, включая птиц и млекопитающих. В одном варианте исполнения антитела являются человеческими, мышиными, ослиными, кроличьими, козьими, морских свинок, верблюжьими, ламы, лошадиными или куриными антителами. В другом варианте исполнения вариабельная область может быть получена от хрящевых рыб (condricthoid) (например, от акул).
В одном аспекте антитело по настоящему изобретению представляет собой человеческое моноклональное антитело, полученное от человека. Необязательно, каркасную область человеческого антитела выравнивают и принимают в соответствии с последовательностями вариабельной области соответствующей человеческой зародышевой линии в базе данных (см., например, Vbase (http://vbase.mrccpe.cam.ac.uk/), размещенную MRC Centre for Protein Engineering (Cambridge, UK)). Например, аминокислоты, которые считаются потенциально отклоняющимися от истинной последовательности зародышевой линии, могут быть вызваны последовательностями ПЦР-праймера, включенного в процессе клонирования. По сравнению с искусственно генерируемыми человекоподобными антителами, такими как одноцепочечные фрагменты антитела (scFvs) из фагового дисплея библиотеки антител или ксеногенных мышей, человеческое моноклональное антитело по настоящему изобретению отличается тем, что (i) его получают с использованием человеческого иммунного ответа, а не животных суррогатов, т. е. антитело генерируется в ответ на природный тау в его релевантной конформации в человеческом организме, (ii) защищает индивидуума или по меньшей мере вырабатывается в значительном количестве в присутствии тау, и (iii) поскольку антитело имеет человеческое происхождение, риски перекрестной реактивности против аутоантигенов минимизируются. Таким образом, в соответствии с настоящим изобретением термины человеческое моноклональное антитело, человеческое моноклональное аутоантитело, человеческое антитело и т. п. используются для обозначения тау-связывающей молекулы, имеющей человеческое происхождение, т. е. выделенной из человеческой клетки, такой как В-клетка или ее гибридома, или кДНК которой была клонирована непосредственно из мРНК человеческой клетки, например человеческой В-клетки памяти. Человеческое антитело остается человеческим, даже если в антителе будут проведены аминокислотные замещения, например, для улучшения характеристик связывания.
Антитела, выделенные из библиотек человеческих иммуноглобулинов или из животных, трансгенных по одному или нескольким человеческим иммуноглобулинам, и не экспрессирующие эндогенных иммуноглобулинов, как описано ниже и, например, в патенте США № 5939598, на имя Kucherlapati et al., называются человекоподобными антителами для того, чтобы отличить их истинно человеческих антител по настоящему изобретению.
Например, спаривание тяжелых и легких цепей человекоподобных антител, таких как синтетические и полусинтетические антитела, типично выделенные из фагового дисплея, не обязательно отображает оригинальное спаривание, происходящее в исходной человеческой В-клетке. Соответственно фрагменты Fab и scFv, полученные из библиотек рекомбинантной экспрессии, широко используемые в известном уровне техники, могут рассматриваться как искусственные со всеми возможными ассоциированными эффектами на иммуногенность и стабильность.
В отличие от них настоящее изобретение предусматривает изолированные антитела со зрелой аффинностью от выбранных людей, которые отличаются их терапевтической полезностью и их переносимостью у людей.
В используемом тут значении термины приближенное к мышиному антитело или приближенный к мышиному иммуноглобулин относятся к антителу, включающему один или несколько CDRs из человеческого антитела по настоящему изобретению; и человеческую каркасную область, которая содержит аминокислотные замещения, и/или делеции, и/или инсерции, основанные на последовательности мышиного антитела. Человеческий иммуноглобулин, обеспечивающий CDRs, называют родительским или акцептором, и мышиное антитело, обеспечивающее изменения в каркасе, называют донором. Кон
- 11 031698 стантные области не обязательно должны присутствовать, но если они есть, то они обычно, по существу, идентичны константным областям мышиного антитела, т.е. имеют по меньшей мере примерно 85-90%, примерно 95%, примерно 96%, примерно 97%, примерно 98%, примерно 99% или более идентичности. Таким образом, в некоторых вариантах исполнения тяжелая или легкая цепь полноразмерного приближенного к мышиному человеческого иммуноглобулина содержит мышиную константную область, человеческие CDR, и, по существу, человеческий каркас, содержащий ряд муринизирующих (murinizing, приближающих к мышиным) аминокислотным замещениям. Типично, приближенное к мышиному антитело представляет собой антитело, содержащее приближенную к мышиной вариабельную легкую цепь и/или приближенную к мышиной вариабельную тяжелую цепь. Например, приближенное к мышиному антитело не будет охватывать типичное химерное антитело, например, потому что вся вариабельная область химерного антитело не является мышиной. Модифицированное антитело, которое было приближено к мышиному с помощью процесса муринизации, связывается с тем же антигеном, что и родительское антитело, которое обеспечивает CDR, и обычно является менее иммуногенным у мышей по сравнению с родительским антителом.
В используемом тут значении термин участок тяжелой цепи включает аминокислотные последовательности, выделенные из тяжелой цепи иммуноглобулина. Полипептид, содержащий участок тяжелой цепи, не содержит по меньшей мере один из: домена СН1, шарнирного (например, верхней, средней, и/или нижней шарнирной области) домена, домена СН2, домена CH3, или их варианта, или фрагмента. Например, связывающий полипептид для использования по изобретению может содержать полипептидную цепь, включающую домен СН1; полипептидную цепь, включающую домен СН1, по меньшей мере часть шарнирного домена, и домен СН2; полипептидную цепь, включающую домен СН1 и домен CH3; полипептидную цепь, включающую домен СН1, по меньшей мере часть шарнирного домена, и домен CH3 или полипептидную цепь, включающую домен СН1, по меньшей мере часть шарнирного домена, домен СН2 и домен CH3. В другом варианте исполнения полипептид по изобретению содержит полипептидную цепь, включающую домен CH3. Дополнительно связывающий полипептид для использования по изобретению может не содержать по меньшей мере часть домена СН2 (например, весь или часть домена СН2). Как было указано выше, рядовому специалисту в данной области техники будет понятно, что такие домены (например, части тяжелой цепи) могут быть модифицированы таким образом, чтобы они отличались по своей аминокислотной последовательности от природной молекулы иммуноглобулина.
В определенных антителах или антигенсвязывающих фрагментах, их вариантах или производных, раскрытых в данном документе, части тяжелой цепи одной полипептидной цепи мультимера идентичны соответствующим частям второй полипептидной цепи мультимера. Альтернативно, мономеры по изобретению, содержащие участок тяжелой цепи, не являются идентичными.
Например, каждый мономер может содержать разные сайты связывания мишени, образующие, например, биспецифическое антитело или диатело.
В другом варианте исполнения антитела или антигенсвязывающие фрагменты, их варианты или производные, раскрытые в данном документе, состоят из одной полипептидной цепи, такой как scFvs, и должны экспрессироваться внутриклеточно (интратела) для того, чтобы обладать потенциалом in vivo терапевтического и диагностического применения.
Части тяжелой цепи связывающего полипептида для использования в способах диагностики и лечения, раскрытых в данном документе, могут быть выделены из разных молекул иммуноглобулина. Например, участок тяжелой цепи полипептида может включать домен СН1, выделенный из молекулы IgG1, и шарнирную область, выделенную из молекулы IgG3. В другом примере участок тяжелой цепи может включать шарнирную область, выделенную, частично, из молекулы IgG1 и, частично, из молекулы IgG3. В другом примере участок тяжелой цепи может включать химерный шарнир, выделенный частично из молекулы IgG1 и частично из молекулы IgG4.
В используемом тут значении термин участок легкой цепи включает аминокислотные последовательности, выделенные из легкой цепи иммуноглобулина. В одном варианте исполнения участок легкой цепи не содержит меньшей мере один из VL или домена CL.
Считается, что минимальный размер пептидного или полипептидного эпитопа антитело составляет примерно четыре-пять аминокислот. Пептидные или полипептидные эпитопы могут содержать по меньшей мере семь, по меньшей мере девять или от по меньшей мере примерно 15 до примерно 30 аминокислот. Поскольку CDR может распознавать антигенный пептид или полипептид в его третичной форме, аминокислоты, составляющие эпитоп, не должны обязательно быть смежными, и в некоторых случаях могут даже не находиться в одной и той же пептидной цепи. В настоящем изобретении пептидный или полипептидный эпитоп, распознаваемый антителами по настоящему изобретению, содержит последовательность по меньшей мере из 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 15, по меньшей мере 20, по меньшей мере 25, или от примерно 5 до примерно 30, от примерно 10 до примерно 30 или от примерно 15 до примерно 30 смежных или несмежных аминокислот тау.
Под специфическим связыванием или специфическим распознаванием, которые в данном доку
- 12 031698 менте используются взаимозаменяемо, в общем понимают, что связывающая молекула, например антитело, связывается с эпитопом через свой антигенсвязывающий домен, и что связывание сопряжено с некоторой комплементарностью между антигенсвязывающим доменом и эпитопом. В соответствии с этим определением говорят, что антитело специфически связывается с эпитопом, когда оно связывается с таким эпитопом через свой антигенсвязывающий домен легче, чем оно связывалось бы со случайным неродственным эпитопом. Квалифицированному специалисту понятно, что антитело может специфически связываться с или специфически распознавать изолированный полипептид, содержащий или состоящий из аминокислотных остатков, соответствующих линейной части несмежного эпитопа. Термин специфичность используется тут для оценки относительной аффинности, с которой определенное антитело связывается с определенным эпитопом. Например, может считаться, что антитело А имеет более высокую специфичность к данному эпитопу, чем антитело В, или можно утверждать, что антитело А связывается с эпитопом С с более высокой специфичностью, чем с родственным эпитопом D.
В случае его использования термин характеристики иммунологического связывания или другие характеристики связывания антитела с антигеном во всех его грамматических формах относится к специфичности, аффинности, перекрестной реактивность и другим характеристикам связывания антитела.
Под предпочтительно связывающим подразумевается, что связывающая молекула, например антитело, специфически связывается с эпитопом легче, чем она связывалась бы с родственным, подобным, гомологичным или аналогичным эпитопом. Таким образом, антитело, которое предпочтительно связывается с данным эпитопом, будет с большей вероятностью связываться с этим эпитопом, чем с родственным эпитопом, даже если такое антитело может перекрестно реагировать с родственным эпитопом.
В качестве неограничивающего примера связывающая молекула, например антитело, может считаться предпочтительно связывающей первый эпитоп, если она связывает указанный первый эпитоп с константой диссоциации (KD), меньшей, чем KD этого антитела со вторым эпитопом. В другом неограничивающем примере антитело может считаться предпочтительно связывающим первый антиген, если оно связывает первый эпитоп с аффинностью, по меньшей мере на один порядок величины меньшей, чем KD антитела для второго эпитопа. В другом неограничивающем примере антитело может считаться предпочтительно связывающим первый эпитоп, если оно связывает первый эпитоп с аффинностью, по меньшей мере на два порядка величины меньшей, чем KD антитела для второго эпитопа.
В другом неограничивающем примере связывающая молекула, например антитело, может считаться предпочтительно связывающим первый эпитоп, если оно связывает первый эпитоп со скоростью диссоциации k(off), меньшей, чем k(off) антитела для второго эпитопа. В другом неограничивающем примере антитело может считаться предпочтительно связывающим первый эпитоп, если оно связывает первый эпитоп с аффинностью, по меньшей мере на один порядок величины меньшей, чем k(off) антитела для второго эпитопа. В другом неограничивающем примере антитело может считаться предпочтительно связывающим первый эпитоп, если оно связывает первый эпитоп с аффинностью, по меньшей мере на два порядка величины меньшей, чем k(off) антитела для второго эпитопа.
Может быть указано, что связывающая молекула, например антитело или антигенсвязывающий фрагмент, вариант или производное, раскрытая в данном документе, связывает тау или его фрагмент или вариант со скоростью диссоциации (k(off)), меньшей или равной 5х10- с- , 10- с- , 5х10- с- или 10- с- . В одном варианте исполнения может быть указано, что антитело по изобретению связывает тау или его фрагмент или вариант со скоростью диссоциации (k(off)), меньшей или равной 5х10-4 с-1, 10-4 с-1, 5х10-5 с-1 или 10-5 с-1 5х10-6 с-1, 10-6 с-1, 5х10-7 с-1 или 10-7 с-1.
Может быть указано, что связывающая молекула, например антитело или антигенсвязывающий фрагмент, вариант или производное, раскрытая в данном документе, связывает тау или его фрагмент или вариант со скоростью связывания (k(on)), большей или равной 103 М-1 с-1, 5х103М-1 с-1, 104 М-1 с-1 или 5х104 М-1 с-1. В одном варианте исполнения может быть указано, что антитело по изобретению связывает тау или его фрагмент или вариант со скоростью связывания (k(on)), большей или равной 105 М-1 с-1, 5х105, М-1 с-1, 106 М-1 с-1, 5х106 М-1 с-1 или 107 М-1 с-1.
Говорят, что связывающая молекула, например антитело, конкурентно ингибирует связывание референсного антитела с данным эпитопом, если она предпочтительно связывается с этим эпитопом в такой степени, чтобы оно блокировало в некоторой степени связывание референсного антитела с эпитопом. Конкурентное ингибирование может быть определено любым способом, известным специалистам, например анализами способом конкурентного ELISA. Может быть сказано, что антитело конкурентно ингибирует связывание референсного антитела с данным эпитопом по меньшей мере на 90%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 60% или по меньшей мере 50%. Квалифицированному специалисту понятно, что связывание антитела с его эпитопом могут также конкурентно ингибироваться связывающей молекулой, не являющейся антителом. Например, специфическое связывание описанного тут антитела с тау, например hTau40, может конкурентно ингибироваться микротрубочками.
В используемом тут значении термин аффинность относится к мере силы связывания индивидуального эпитопа с CDR связывающей молекулы, например молекулы иммуноглобулина (см., например, Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. (1988), с. 27 и
- 13 031698
28). В используемом тут значении термин авидность относится к общей стабильности комплекса между популяцией иммуноглобулинов и антигеном, то есть функциональной прочности связывания смеси иммуноглобулинов с антигеном (см., например, Harlow, с. 29-34). Авидность связана как с аффинностью индивидуальных молекул иммуноглобулина в популяции со специфическими эпитопами, так и с валентностями иммуноглобулинов и антигена. Например, взаимодействие между бивалентным моноклональным антителом и антигеном с высокоповторяющейся структурой эпитопа, такой как полимер, будет обладать высокой авидностью. Аффинность или авидность антитела к антигену может быть определена экспериментально с использованием любого пригодного способа (см., например, Berzofsky et al., Antibody-Antigen Interactions в: Fundamental Immunology, Paul, W.E., Ed., Raven Press, New York, NY (1984), Kuby, Janis Immunology, W.H. Freeman and Company, New York, NY (1992)) и описанных тут способов. Общие методики измерения аффинности антитела к антигену включают ELISA, RIA и поверхностный плазмонный резонанс. Измеренная аффинность конкретного взаимодействия антитело-антиген может меняться при измерении в разных условиях, например концентрация соли, рН. Таким образом, измерения аффинности и других параметров связывания антигена, например KD, IC50, предпочтительно выполняются со стандартными растворами антитела и антигена и стандартным буфером.
Связывающие молекулы, например антитела или антигенсвязывающие фрагменты, их варианты или производные по изобретению могут быть также описаны или определены на основании их перекрестной реактивности. В используемом тут значении термин перекрестная реактивность относится к способности антитела, специфичного к одному антигену, реагировать со вторым антигеном; является мерой сродства двух разных антигенных веществ. Таким образом, антитело является перекрестно реактивным, если оно связывается с эпитопом, отличным от того, который индуцировал его образование. Перекрестно-реактивный эпитоп в общем содержит многие такие же комплементарные структурные элементы, что и индуцирующий эпитоп, и в некоторых случаях может быть в действительности более подходящим, чем оригинал.
Например, определенные антитела обладают некоторой степенью перекрестной реактивности, то есть они связывают родственные, но не идентичные эпитопы, например эпитопы по меньшей мере с 95%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 55% и по меньшей мере 50% идентичности (рассчитанной с использованием способов, известных специалистам и описанных тут), с референсным эпитопом. Может быть сказано, что антитело имеет незначительную или не имеет перекрестной реактивности, если оно не связывает эпитопы с менее чем 95%, менее чем 90%, менее чем 85%, менее чем 80%, менее чем 75%, менее чем 70%, менее чем 65%, менее чем 60%, менее чем 55% и менее чем 50% идентичности (рассчитанной с использованием способов, известных специалистам и описанных тут) с референсным эпитопом. Антитело может считаться высокоспецифическим к определенному эпитопу, если оно не связывает любой другой аналог, ортолог или гомолог данного эпитопа.
Связывающие молекулы, например антитела или антигенсвязывающие фрагменты, их варианты или производные по изобретению также могут быть описаны или определены на основании их аффинности связывания с тау. В одном варианте исполнения аффинности связывания включают имеющие константу диссоциации или KD менее чем 5х10-2 М, 10-2 М, 5х10-3 М, 10-3М, 5х10-4 М, 10-4 М, 5х10-5 М, 10-5 М, 5х10-6 М, 10-6 М, 5х10-7 М, 10-7 М, 5х10-8 М, 10-8 М, 5х10-9 М, 10-9М, 5х10-10 М, 10-10 М, 5х10-11 М, 10-11 М, 5х10-12 М, 10-12 М, 5х10-13 М, 10-13 М, 5х10-14 М, 10-14 М, 5х10-15 М или 10-15 М.
Как было указано ранее, структуры субъединиц и трехмерная конфигурация константных областей различных классов иммуноглобулинов хорошо известны. В используемом тут значении термин домен VH включает аминоконцевой вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина, а термин домен СН1 включает первый (ближайший к аминоконцу) домен константной области тяжелой цепи иммуноглобулина. Домен СН1 прилегает к домену VH и является аминоконцевым для шарнирной области тяжелой цепи молекулы иммуноглобулина.
В используемом тут значении термин домен СН2 включает участок тяжелой цепи молекулы, имеющий протяженность, например, примерно от остатка 244 до остатка 360 антитела при использовании обычных схем нумерации (остатки 244-360, система нумерации Кабат; и остатки 231-340, система нумерации EU; см. Kabat EA et al. op. cit). Домен СН2 уникален, потому что он не является тесно спаренным с другим доменом. Скорее две N-связанные разветвленные углеводные цепи вставлены между двумя доменами СН2 интактной нативной молекулы IgG. Также хорошо документировано, что домен CH3 имеет протяженность от домена СН2 до С-конца молекулы IgG и содержит приблизительно 108 остат ков.
В используемом тут значении термин шарнирная область включает участок тяжелой цепи молекулы, который соединяет домен СН1 с доменом СН2. Эта шарнирная область содержит приблизительно 25 остатков и является гибкой, позволяя двум N-концевым антигенсвязывающим областям двигаться независимо. Шарнирные области могут быть разделены на три отдельных домена: верхний, средний и нижний шарнирный домены (см. Roux et al., J. Immunol. 161 (1998), 4083).
В используемом тут значении термин дисульфидная связь включает ковалентную связь, обра
- 14 031698 зующуюся между двумя атомами серы. Аминокислота цистеин содержит тиольную группу, которая может образовывать дисульфидную связь или мостик со второй тиольной группой. В большинстве природных молекул IgG области СН1 и CL соединены дисульфидной связью, и две тяжелые цепи соединены двумя дисульфидными связями в положениях, соответствующих остаткам 239 и 242 по системе нумерации Кабат (положения 226 или 229, система нумерации EU).
В используемом тут значении термины соединенные, слитые или слияние используются взаимозаменяемо. Эти термины относятся к соединению вместе двух или более элементов или компонентов любыми средствами, включая химическую конъюгацию или рекомбинантные способы. Слияние внутри рамки относится к соединению двух или более открытых рамок считывания (ORF) полинуклеотида с образованием непрерывной более длинной ORF таким образом, чтобы при этом сохранялась правильная трансляционная рамка считывания исходных ORF. Таким образом, рекомбинантный слитый белок представляет собой единый белок, содержащий два или более сегментов, которые соответствуют полипептидам, кодируемым исходными ORF (причем такие сегменты нормально не соединены таким образом в природных условиях). Хотя рамка считывания таким образом становится непрерывной благодаря слиянию сегментов, сегменты могут быть физически или пространственно разделены, например, находящейся внутри рамки линкерной последовательностью. Например, полинуклеотиды, кодирующие CDR вариабельной области иммуноглобулина могут быть слитыми внутри рамки, но быть разделенными полинуклеотидом, кодирующим по меньшей мере одну каркасную область иммуноглобулина или дополнительные области CDR, при условии, что слитые CDR совместно транслируются как часть непрерывного полипептида.
Термин экспрессия в используемом тут значении относится к процессу, в результате которого ген продуцирует биохимический материал, например РНК или полипептид. Процесс включает любые проявления функционального присутствия гена в клетке, включая, без ограничений, нокдаун гена, а также как транзиентную экспрессию, так и стабильную экспрессию. Он включает, без ограничений, транскрипцию гена в матричную РНК (мРНК), транспортную РНК (тРНК), малую шпилечную РНК (shPHK), малую интерферирующую РНК (siPHK) или любой другой РНК-продукт и трансляцию такой мРНК в полипептид(ы). Если желательный конечный продукт является биохимическим материалом, экспрессия включает создание такого биохимического материала и любых прекурсоров. Экспрессия гена дает генный продукт. В используемом тут значении генный продукт может быть нуклеиновой кислотой, например матричной РНК, получаемой в результате транскрипции гена или полипептида, который транслируется из транскрипта. Генные продукты, описанные тут, дополнительно включают нуклеиновые кислоты с посттранскрипционными модификациями, например, полиаденилированием, или полипептиды с посттрансляционными модификациями, например, метилированием, гликозилированием, добавлением липидов, ассоциацией с другими белковыми субъединицами, протеолитическим расщеплением и т. п.
В используемом тут значении термин образец относится к любому биологическому материалу, полученному от субъекта или пациента. В одном аспекте образец может включать кровь, цереброспинальную жидкость (ЦСЖ) или мочу. В других аспектах образец может включать цельную кровь, плазму, В-клетки, выделенные из образцов крови, и культивируемые клетки (например, В-клетки субъекта). Образец может также включать биопсию или образец ткани, включая нервную ткань. В других аспектах образец может включать цельные клетки и/или лизат клеток. Образцы крови могут быть получены способами, известными специалистам. В одном аспекте осадок может быть ресуспендирован с помощью вихревой мешалки при 4°C в 200 мкл буфера (20 мМ Tris, pH 7,5, 0,5% Nonidet, 1 мМ EDTA, 1 мМ PMSF, 0,1M NaCl, ингибитор протеазы IX Sigma и ингибиторы фосфатазы 1 и 2 IX Sigma). Суспензия может выдерживаться на льду в течение 20 мин с периодическим перемешиванием вихревой мешалкой. После центрифугирования при 15000xg в течение 5 мин при примерно 4°C аликвоты супернатанта могут храниться при примерно -70°C.
В используемом тут значении термины лечить или лечение относятся как к терапевтическому лечению, так и к профилактическим или предупредительным мерам, целью которых является предотвращение или замедление (ослабление) нежелательного физиологического изменения или расстройства, такого как развитие паркинсонизма. Благотворные или желательные клинические результаты включают, без ограничения, ослабление симптомов, уменьшение распространения болезни, стабилизацию (т.е. отсутствие ухудшения) состояния болезни, задержку или замедление развития болезни, уменьшение интенсивности или облегчение болезненного состояния и ремиссию (частичную или полную), которые могут быть детектируемыми или недетектируемыми. Лечение может также означать увеличение времени выживания по сравнению с ожидаемым выживанием без получения лечения. Особы, нуждающиеся в лечении, включают тех, у кого уже наблюдается состояние или расстройство, а также склонных к состоянию или расстройству, или тех, у кого необходимо предотвратить проявления состояния или расстройства.
Под субъектом, или индивидуумом, или животным, или пациентом, или млекопитающим подразумевается любой субъект, особенно млекопитающее-субъект, например пациент, для которого желательны диагноз, прогноз, предотвращение или терапия.
II. Антитела.
- 15 031698
Настоящее изобретение в общем относится к человеческим анти-тау антителам и их антигенсвязывающим фрагментам. В одном варианте исполнения антитело по настоящему изобретению демонстрирует характеристики иммунологического связывания и/или биологические свойства, описные для антител в примерах. В соответствии с настоящим изобретением, человеческие моноклональные антитела, специфические по отношению к тау, были клонированы из пула здоровых людей.
В ходе экспериментов, проведенных в соответствии с настоящим изобретением, первые попытки клонировать специфические по отношению к тау антитела были неудачными, но почти всегда приводили к получению ложно-позитивных клонов. Для того, чтобы обойти эту проблему, антитела в кондиционированных средах культур человеческих В-клеток памяти подвергали параллельному скринингу на связывание с рекомбинантным тау-белком PHFTau, экстрагированным из пораженного болезнью Альцгеймера мозга, экстрактов здорового контрольного мозга и бычьим сывороточным альбумином (БСА). Для клонирования антител использовали только культуры В-клеток, которые были позитивными к рекомбинантному тау и/или PHFTau, но не к контрольному экстракту мозга или БСА.
Первые попытки выделения специфических антител были сфокусированы на пулах здоровых людей с высокой активностью связывания тау в плазме, что позволяет предположить повышенные уровни циркулирующих антител тау в плазме. Неожиданно, эти попытки не позволили получить тау-специфические человеческие В-клетки памяти, и антитела, описанные в данном изобретении, были выделены из пулов здоровых людей, которые не подвергались предварительному отбору по высокой реактивности плазмы к тау или имели низкую реактивность плазмы к тау.
Благодаря этой мере смогли изолировать несколько антител. Выбранные антитела были подвергнуты дополнительному анализу с целью определения класса и подкласс легкой цепи. Выбранные релевантные элементы генетического кода антител из культуры В-клеток памяти затем подвергали транскрипции способом ОТ-ПЦР, клонировали и комбинировали в экспрессионные векторы для рекомбинантного продуцирования (см. приложенные примеры). Рекомбинантная экспрессия человеческих антител в клетках HEK293 или СНО и последующая характеризация их специфичности связывания с полноразмерным тау (фиг. 2, 7 и 12), их патологических модифицированных форм вестерн-блоттингом (фиг. 3 и 8) и их дифференциальное связывание с патологически агрегированным тау подтвердили, что впервые были клонированы человеческие антитела, высокоспецифические по отношению к тау и специфически распознающие патологически модифицированные формы тау-белка.
Таким образом, настоящее изобретение в общем относится к изолированному природному человеческому моноклональному анти-тау антителу и их связывающим фрагментам, производным и вариантам. В одном варианте исполнения изобретения антитело способно специфически связывать полноразмерный рекомбинантный тау и/или патологически агрегированную и/или фосфорилированную форму (PHFTau), выделенную из пораженного болезнью Альцгеймера (AD) мозга в денатурирующих условиях на вестернблоте (см. фиг. 3 и 8).
В одном варианте исполнения настоящее изобретение направлено на анти-тау антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, вариант или производные, где антитело специфически связывается с тем же эпитопом тау, что и референсное антитело, выбранное из группы, состоящей из NI-105.4E4, NI105.24B2 или NI-105.4A3. Кроме того, предварительные результаты прямых анализов ELISA, проведенных с типовым антителом NI-105.4E4, показали, что NI-105.4E4 специфически распознает С-конец тау. Проведенные дополнительные анализы позволяют предположить, что NI-105.4E4 распознает прерывистый эпитоп, включающий две линейные последовательности: первую линейную последовательность в домене R4 связывания микротрубочек и вторую линейную последовательность в области между доменами R4 и С, как изображено на фиг. 11. В одном варианте исполнения линейный полипептид, составляющий прерывистый эпитоп, или эпитоп, распознаваемый антителом, предлагаемый данным изобретением, расположен в домене связывания микротрубочек тау, который является скрытым в физиологическом ассоциированном с микротрубочками тау. Картирование эпитопа идентифицировало первую последовательность в домене связывания микротрубочек человеческого тау, включающую аа337-343 VEVKSEK (SEQ ID NO:7) как уникальный линейный полипептид, составляющий эпитоп, распознаваемый антителом NI-105.4E4 по настоящему изобретению. Дополнительные эксперименты и сравнение с коммерчески доступным мышиным моноклональным антителом тау АТ 180 подтвердили, что NI-105.4E4 специфически распознает уникальный эпитоп SEQ ID NO:7. Наиболее предпочтительно эпитоп SEQ ID NO:7, распознаваемый антителом NI-105.4E4 по настоящему изобретению, является на 100% консервативным во всех 6 изоформах тау, присутствующих в человеческом мозге, имеющих аминокислотные последовательности, представленные SEQ ID NO:1-6, и у других видов, таких как мыши и крысы, а также обеспечивает дополнительный исследовательский инструмент в соответствующих животных моделях с антителами по настоящему изобретению. Дополнительные эксперименты показали, что остатки 3 и 6 полипептида SEQ ID NO:7, соответствующие остаткам V339 и Е342 SEQ ID NO:6, участвуют в связывании NI105.4E4. Картирование эпитопа дополнительно идентифицировало вторую последовательность (SEQ ID NO:41) в домене связывания микротрубочек человеческого тау, включающую аа387-397 SEQ ID NO:6 как уникальный линейный полипептид, входящий в состав эпитопа, распознаваемого антителом NI105.4E4 по настоящему изобретению. Остатки 1, 5 и 9 SEQ ID NO:41, соответствующие остаткам D387,
- 16 031698
Е391 и K395 SEQ ID NO:6, участвуют в связывании NI-105.4E4.
В одном варианте исполнения описанное тут антитело специфически связывается с тау по эпитопу, включающему аминокислотные остатки SEQ ID NO:7. В другом варианте исполнения описанное тут антитело специфически связывается с тау по эпитопу, включающему аминокислотные остатки SEQ ID:41. В конкретном варианте исполнения описанное тут антитело специфически связывается с тау по эпитопу, включающему аминокислотные остатки SEQ ID N0:7 и SEQ ID N0:41. В дополнительных вариантах исполнения описанное тут антитело специфически связывается с тау по эпитопу, включающему один или несколько аминокислотных остатков, выбранных из группы, состоящей из остатков V339, Е342, D387, Е391 и K395 SEQ ID NO:6. Эпитоп может включать любой один, любые два, любые три, любые четыре или все пять остатков из группы, состоящей из остатков V339, Е342, D387, Е391 и K395 SEQ ID NO:6. В конкретном варианте исполнения тау представляет собой hTau40.
В одном варианте исполнения описанное тут антитело связывается с тау по эпитопу, включающему домен связывания микротрубочек тау. В конкретном варианте исполнения описанное тут антитело связывается с тау по эпитопу, включающему аминокислотные остатки из области R4 тау, как изображено на фиг. 11. В одном варианте исполнения описанное тут антитело конкурирует с микротрубочками за специфическое связывание с тау. В другом варианте исполнения описанное тут антитело имеет пониженную аффинность связывания с ассоциированным с микротрубочками тау по сравнению с аффинностью связывания антител с тау, не ассоциированным с микротрубочками. В дополнительных вариантах исполнения описанное тут антитело не связывает или, по существу, не связывает тау, ассоциированный с микротрубочками. В конкретных вариантах исполнения тау-белок может быть нативным тау-белком или рекомбинантным тау-белком. В конкретном варианте исполнения тау представляет собой hTau40.
Картирование эпитопа дополнительно идентифицировало последовательность (SEQ ID NO:42) человеческого тау, включающую аа35-49 SEQ ID NO:6 как уникальный линейный эпитоп, распознаваемый антителом NI-105.4A3 по настоящему изобретению. Остатки 6, 7 и 10 SEQ ID NO:42, соответствующие остаткам D40, А41 и K44 SEQ ID NO:6, участвуют в связывании NI-105.4A3. В одном варианте исполнения, описанное тут антитело специфически связывается с тау по эпитопу, включающему аминокислотные остатки SEQ ID NO:42. В дополнительных вариантах исполнения описанное тут антитело специфически связывается с тау по эпитопу, включающему один или несколько аминокислотных остатков, выбранных из группы, состоящей из остатков D40, А41 и K44 SEQ ID NO:6. Эпитоп может включать любой один, любые два или все три остатка из группы, состоящей из остатков D40, А41 и K44 SEQ ID NO:6. В конкретном варианте исполнения, тау представляет собой hTau40.
Далее, без намерения ограничиваться исходными экспериментальными наблюдениями, как продемонстрировано в примерах и показано на фиг. 6, человеческое моноклональное NI-105.4E4 анти-тау антитело по настоящему изобретению характеризуется специфическим связыванием патологически агрегированного тау и отсутствием существенного распознавания тау в физиологической форме в ткани мозга. В одном варианте исполнения человеческое анти-тау антитело по настоящему изобретению может специфически связывать патологически агрегированный тау и, по существу, не связывать тау в физиологической форме в ткани мозга. Кроме того, человеческое анти-тау антитело по настоящему изобретению может быть дополнительно охарактеризовано его способностью к распознаванию тау на стадии до образования клубков, в нейрофибриллярных клубках (NFT), нейропильных нитях и/или дистрофических нейритах в мозгу. Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает набор человеческих антител тау со специфичностями связывания, особенно пригодными для диагностических и терапевтических целей.
В одном варианте исполнения антитело по настоящему изобретению проявляет связывающие свойства по отношению к типовому антителу NI-105.4E4, как описано в примерах. Кроме того или альтернативно, анти-тау антитело по настоящему изобретению предпочтительно распознает патологически агрегированный тау, а не физиологические формы, в частности, при проведении анализа в соответствии с примером 4. Кроме того или альтернативно, анти-тау антитело по настоящему изобретению связывается с вызывающими болезнь мутантами человеческого тау, в частности, описанными в примере 4. В этом контексте специфичности связывания могут находиться в интервале значений, как показано для типовых антител NI-105.4E4, NI-105.4A3 и NI-105.24B2 на фиг. 2, 7 и 12 соответственно, т.е. иметь полумаксимальные эффективные концентрации (ЕС50) от примерно 100 пМ до 100 нМ или ЕС50 от примерно 100 пМ до 10 нМ для тау дикого типа.
Таким образом, анти-тау антитело по настоящему изобретению связывается предпочтительно с патологически модифицированными формами тау в мозгу, например патологическими агрегатами тау, как демонстрирует иммуногистохимическое окрашивание, описанное в примере 4. В другом варианте исполнения анти-тау антитело по настоящему изобретению предпочтительно связывается как с рекомбинантным тау, так и с патологически модифицированными формами тау, как продемонстрировано в примере 2 способом вестерн-блоттинга.
Настоящее изобретение также касается антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, варианта или производных, где антитело включает антигенсвязывающий домен, идентичный домену антитела, выбранного из группы, состоящей из NI-105.4E4, NI-105.24B2 и NI-105.4A3.
Настоящее изобретение далее приводит примеры нескольких таких связывающих молекул, напри
- 17 031698 мер антител и их связывающих фрагментов, которые могут быть охарактеризованы тем, что содержат в своей вариабельной области, например связывающем домене, по меньшей мере один определяющий комплементарность участок (CDR) вариабельной области VH и/или VL, включающий любую одну из аминокислотных последовательностей, изображенных на фиг. 1. Соответствующие нуклеотидные последовательности, кодирующие вышеуказанные вариабельные области, приведены в табл. 2 ниже. Типичный набор CDR вышеупомянутых аминокислотных последовательностей области VH и/или VL изображен на фиг. 1. Однако, как будет описано ниже, квалифицированному специалисту в данной области техники хорошо известно, что дополнительно или альтернативно могут быть использованы CDR, которые отличаются по своим аминокислотным последовательностям от изображенных на фиг. 1 на одну, две, три или даже больше аминокислот в случае CDR2 и CDR3.
В одном варианте исполнения антитело по настоящему изобретению содержит меньшей мере один CDR, включающий или состоящий из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID N0:23-25, 26-28, 29-31, 32-34, 35-37 и 38-40. В одном варианте исполнения антитело по настоящему изобретению содержит один, два, три, четыре, пять или шесть CDR, включающих или состоящих из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:2325, 26-28, 29-31, 32-34, 35-37 и 38-40. Антитело может включать вариабельную область тяжелой цепи, содержащую VH CDR1 SEQ ID NO:23, 29 или 35; VH CDR2 SEQ ID NO:24, 30 или 36; или VH CDR3 SEQ ID NO :25, 31 или 37. Антитело может включать вариабельную область легкой цепи, содержащую VL CDR1 SEQ ID NO:26, 32 или 38; VL CDR2 SEQ ID NO:27, 33 или 39 или VL CDR3 SEQ ID NO:28, 34 или 40. Антитело может включать вариабельную область тяжелой цепи, содержащую VH CDR1 SEQ ID NO:23, 29 или 35; VH CDR2 SEQ ID NO:24,30 или 36 или VH CDR3 SEQ ID NO:25, 31 или 37, и может дополнительно включать вариабельную область легкой цепи, содержащую VL CDR1 SEQ ID NO:26, 32 или 38; VL CDR2 SEQ ID NO:27, 33 или 39 или VL CDR3 SEQ ID NO:28, 34 или 40.
В одном варианте исполнения антитело по настоящему изобретению может включать вариабельную область тяжелой цепи, содержащую VH CDR1 SEQ ID nO:23, 29 или 35; VH CDR2 SEQ ID NO:24, 30 или 36 и VH CDR3 SEQ ID NO:25, 31 или 37. В одном варианте исполнения антитело по настоящему изобретению может включать вариабельную область легкой цепи, содержащую VL CDR1 SEQ ID NO:26, 32 или 38; VL CDR2 SEQ ID NO:27, 33 или 39 и VL CDR3 SEQ ID NO:28, 34 или 40. Антитело может дополнительно включать вариабельную область тяжелой цепи, содержащую VH CDR1 SEQ ID NO:23, 29 или 35; VH CDR2 SEQ ID NO:24, 30 или 36 и VH CDR3 SEQ ID NO:25, 31 или 37, и может дополнительно включать вариабельную область легкой цепи, содержащую VL CDR1 SEQ ID NO:26, 32 или 38; VL CDR2 SEQ ID NO:27, 33 или 39 и VL CDR3 SEQ ID NO:28, 34 или 40.
В одном варианте исполнения антитело по настоящему изобретению может включать вариабельную область тяжелой цепи, содержащую VH CDR1 SEQ ID NO:23; VH CDR2 SEQ ID NO:24 и VH CDR3 SEQ ID NO:25. В одном варианте исполнения антитело по настоящему изобретению может включать вариабельную область тяжелой цепи, содержащую VH CDR1 SEQ ID nO:29; Vh CDR2 SEQ ID NO:30 и VH CDR3 SEQ ID NO:31. В одном варианте исполнения антитело по настоящему изобретению может включать вариабельную область тяжелой цепи, содержащую VH CDR1 SEQ ID NO:35; VH CDR2 SEQ ID NO:36 и VH CDR3 SEQ ID NO:37.
В одном варианте исполнения антитело по настоящему изобретению может включать вариабельную область легкой цепи, содержащую VL CDR1 SEQ ID NO:26; VL CDR2 SEQ ID NO:27 и VL CDR3 SEQ ID NO:28. В одном варианте исполнения антитело по настоящему изобретению может включать вариабельную область легкой цепи, содержащую VL CDR1 SEQ ID NO:32; VL CDR2 SEQ ID NO:33 и VL CDR3 SEQ ID NO:34. В одном варианте исполнения антитело по настоящему изобретению может включать вариабельную область легкой цепи, содержащую VL CDR1 SEQ ID NO:38; VL CDR2 SEQ ID NO:39 и VL CDR3 SEQ ID NO:40.
В одном варианте исполнения антитело по настоящему изобретению может включать вариабельную область тяжелой цепи, содержащую VH CDR1 SEQ ID NO:23; VH CDR2 SEQ ID NO:24 и VH CDR3 SEQ ID NO:25, и может дополнительно включать вариабельную область легкой цепи, содержащую VL CDR1 SEQ ID NO:26; VL CDR2 SEQ ID NO:27 и VL CDR3 SEQ ID NO:28.
В одном варианте исполнения антитело по настоящему изобретению может включать вариабельную область тяжелой цепи, содержащую VH CDR1 SEQ ID NO:29; VH CDR2 SEQ ID NO:30 и VH CDR3 SEQ ID NO:31, и может дополнительно включать вариабельную область легкой цепи, содержащую VL CDR1 SEQ ID NO:32; VL CDR2 SEQ ID NO:33 и VL CDR3 SEQ ID NO:34.
В одном варианте исполнения антитело по настоящему изобретению может включать вариабельную область тяжелой цепи, содержащую VH CDR1 SEQ ID NO:35; VH CDR2 SEQ ID NO:36 и VH CDR3 SEQ ID NO:37, и может дополнительно включать вариабельную область легкой цепи, содержащую VL CDR1 SEQ ID NO:38; VL CDR2 SEQ ID NO:39 и VL CDR3 SEQ ID NO:40.
В одном варианте исполнения антитело по настоящему изобретению представляет собой любое антитело, содержащее аминокислотную последовательность области VH и/или VL, изображенную на фиг. 1. В одном варианте исполнения антитело по настоящему изобретению характеризуется сохранением когнатного спаривания тяжелой и легкой цепей, присутствующего в человеческих В-клетках.
- 18 031698
В одном варианте исполнения антитело по настоящему изобретению содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), включающую или состоящую из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:9, 13, 17 и 93. В одном варианте исполнения антитело по настоящему изобретению содержит вариабельную область легкой цепи (VL), включающую или состоящую из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID N0:11, 15 и 19. В одном варианте исполнения антитело по настоящему изобретению содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), включающую или состоящую из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:9, 13, 17 и 93, и дополнительно содержит вариабельную область легкой цепи (VL), включающую или состоящую из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:11, 15 и 19. В конкретном варианте исполнения антитело содержит VH SEQ ID NO:9 и VL SEQ ID NO:11 или VH SEQ ID NO:93 и VL SEQ ID NO:11; VH SEQ ID NO:13 и VL SEQ ID NO:15 или VH SEQ ID NO:17 и VL SEQ ID NO:19.
Альтернативно, антитело по настоящему изобретению представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, производное или вариант, который конкурирует за связывание с тау, такие как, например, hTau40, причем по меньшей мере одно антитело имеет область VH и/или VL, изображенную на фиг. 1. В одном варианте исполнения антитело по настоящему изобретению конкурирует за специфическое связывание с hTau40 с NI-105.4E4, NI-105.24B2 или NI-105.4A3.
Такие антитела могут также быть человеческими, в частности, для терапевтического применения. Альтернативно, антитело является мышиным, приближенным к мышиному, и химерным мышиночеловеческим антителом, которое особенно пригодно для диагностических способов и исследований на животных.
В одном варианте исполнения антитело по настоящему изобретению вырабатывается культурами отдельных или олигоклональных В-клеток, которые культивируют и супернатант культуры, содержащий антитела, продуцируемые указанными В-клетками, подвергают скринингу на присутствие и аффинность анти-тау антител в нем. Процесс скрининга включает стадии анализа иммунореактивности чувствительных тканей для определения амилоидных бляшек (TAPIR), такого как описанный в международной заявке WO 2004/095031, описание которого включено сюда в качестве ссылки; проведение скрининга на срезах мозга на связывание с PHFTau; скрининг на связывание выделенного из тау пептида с аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO:6, с фосфатными группами на аминокислотах Ser202 и Thr-205; на аминокислоте Thr-231 и/или на аминокислотах Ser-396 и Ser-404 указанной последовательности; скрининг на связывание рекомбинантного человеческого тау с аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO:6, и выделение антитела, для которого было определено связывание, или клетки, продуцирующей указанное антитело.
Как было указано выше, благодаря тому, что человеческое моноклональное антитело по настоящему изобретению образуется в результате человеческого иммунного ответа, оно будет распознавать эпитопы, имеющие особую патологическую релевантность, которые могут быть недоступными или менее иммуногенными в случае способов иммунизации, направленных на получение, например, мышиных моноклональных антител, и in vitro скрининг библиотек фагового дисплея соответственно. Поэтому будет разумным указать, что эпитоп человеческого анти-тау антитела по настоящему изобретению является уникальным, и что никакое другое антитело не способно связывать эпитоп, распознаваемый человеческим моноклональным антителом по настоящему изобретению; см. также фиг. 11, изображающую уникальный эпитоп антител М-105.4Е4 и NI-105.4A3. Таким образом, настоящее изобретение также охватывает в общем анти-тау антитела и тау-связывающие молекулы, которые конкурируют с человеческим моноклональным антителом по настоящему изобретению за специфическое связывание с тау. Настоящее изобретение, более конкретно, касается антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, варианта или производных, где антитело специфически связывается с тем же эпитопом тау, что и референсное антитело, выбранное из группы, состоящей из NI-105.4E4, М-105.24В2 и NI-105.4A3.
Конкуренция между антителами определяется с помощью анализа, в котором тестируемый иммуноглобулин ингибирует специфическое связывание референсного антитела с обычным антигеном, таким как тау. Известны многочисленные типы анализов конкурентного связывания, например твердофазный прямой или непрямой радиоиммуноанализ (RIA), твердофазный прямой или непрямой ферментноиммунный анализ (EIA), конкурентный сэндвич-анализ (см. Stahli et al., Methods in Enzymology 9 (1983), 242-253); твердофазный прямой биотин-авидин EIA (см. Kirkland et al., J. Immunol. 137 (1986), 3614-3619 и Cheung et al., Virology 176 (1990), 546-552); твердофазный прямой меченый анализ, твердофазный прямой меченый сэндвич-анализ (см. Harlow and Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988)); твердофазный прямой меченый RIA с использованием I125 метки (см. Morel et al., Molec. Immunol. 25 (1988), 7-15 и Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol. 32 (1990), 77-82). Типично, такой анализ предусматривает использование очищенного тау или его агрегатов, связанных с твердой поверхностью, или клеток, несущих любые из указанных частиц, немеченого тестируемого иммуноглобулина и меченого референсного иммуноглобулина, т. е. человеческого моноклонального антитела по настоящему изобретению. Конкурентное ингибирование измеряют путем определения количества метки, связанной с твердой поверхностью или клетками, в присутствии тестируемого иммуноглобулина. Обычно тестируе
- 19 031698 мый иммуноглобулин присутствует в избытке. В одном варианте исполнения анализ конкурентного связывания проводят в условиях, описанных для анализа способом ELISA в приложенных примерах. Антитела, идентифицированные с помощью конкурентного анализа (скрининг антител), включают антитела, связывающиеся с тем же эпитопом, что и референсное антитело, и антитела, связывающиеся со смежным эпитопом, достаточно близко расположенный к эпитопу, связанному референсным антителом для возникновения стерических препятствий. Обычно, когда конкурирующее антитело присутствует в избытке, оно будет ингибировать специфическое связывание референсного антитела с общим антигеном по меньшей мере на 50 или 75%. Таким образом, настоящее изобретение дополнительно касается антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, варианта или производных, где антитело конкурентно ингибирует связывание с тау референсного антитела, выбранного из группы, состоящей из NI-105.4E4, М-105.24В2 или NI-105.4A3.
В другом варианте исполнения настоящее изобретение предусматривает изолированный полипептид, содержащий состоящий, по существу, из или состоящий из вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина (VH), где по меньшей мере один из VH-CDR вариабельной области тяжелой цепи или по меньшей мере два из VH-CDR вариабельной области тяжелой цепи являются по меньшей мере на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичными референсным аминокислотным последовательностям тяжелой цепи VH-CDR1, VH-CDR2 или VH-CDR3 антитела, раскрытого в данном документе. Альтернативно, области VH-CDR1, VH-CDR2 и VH-CDR3 VH являются по меньшей мере на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичными референсным аминокислотным последовательностям тяжелой цепи VH-CDR1, VH-CDR2 и VH-CDR3 антитела, раскрытого в данном документе. Таким образом, в соответствии с этим вариантом исполнения вариабельная область тяжелой цепи по изобретению имеет полипептидные последовательности VH-CDR1, VH-CDR2 и VH-CDR3, родственные с группами, изображенными на фиг. 1. Хотя фиг. 1 изображает VH-CDR, определенные по системе Кабат, другие определения CDR, например VH-CDR, определенные по системе Chothia, также включены в объем настоящего изобретения и могут быть легко идентифицированы рядовым специалистом в данной области техники с использованием данных, представленных на фиг. 1. В одном варианте исполнения аминокислотная последовательность референсной VH CDR1 представляет собой SEQ ID NO:23, 29 или 35; аминокислотная последовательность референсной VH CDR2 представляет собой SEQ ID NO:24, 30 или 36; и аминокислотная последовательность референсной VH CDR3 представляет собой SEQ ID NO:25, 31 или 37.
В другом варианте исполнения настоящее изобретение предусматривает изолированный полипептид, содержащий состоящий, по существу, из или состоящий из вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина (VH), в котором области VH-CDR1, VH-CDR2 и VH-CDR3 имеют полипептидные последовательности, идентичные группам VH-CDR1, VH-CDR2 и VH-CDR3, изображенным на фиг. 1. В одном варианте исполнения аминокислотная последовательность VH CDR1 представляет собой SEQ ID NO:23, 29 или 35; аминокислотная последовательность VH CDR2 представляет собой SEQ ID NO:24, 30 или 36; и аминокислотная последовательность VH CDR3 представляет собой SEQ ID NO:25, 31 или 37.
В другом варианте исполнения настоящее изобретение предусматривает изолированный полипептид, содержащий состоящий, по существу, из или состоящий из вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина (VH), в котором области VH-CDR1, VH-CDR2 и VH-CDR3 имеют полипептидные последовательности, идентичные группам VH-CDR1, VH-CDR2 и VH-CDR3, изображенным на фиг. 1, за исключением одного, двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти или десяти аминокислотных замещений в любом одном из VH-CDR. В определенных вариантах исполнения аминокислотные замещения являются консервативными. В одном варианте исполнения аминокислотная последовательность VH CDR1 представляет собой SEQ ID NO:23, 29 или 35; аминокислотная последовательность VH CDR2 представляет собой SEQ ID NO:24, 30 или 36; и аминокислотная последовательность VH CDR3 представляет собой SEQ ID NO:25, 31 или 37.
В другом варианте исполнения настоящее изобретение предусматривает изолированный полипептид, содержащий состоящий по существу из или состоящий из вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина (VL), где по меньшей мере один из VL-CDR вариабельной области легкой цепи или по меньшей мере два из VL-CDR вариабельной области легкой цепи являются по меньшей мере на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичными аминокислотным последовательностям референсной легкой цепи Vl-CDR1, Vl-CDR2 или VL-CDR3 антитела, раскрытого в данном документе. Альтернативно, области VL-CDR1, VL-CDR2 и VL-CDR3 VL являются по меньшей мере на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичными аминокислотным последовательностям референсной легкой цепи VL-CDR1, VL-CDR2 и VLCDR3 антитела, раскрытого в данном документе. Таким образом, в соответствии с этим вариантом исполнения вариабельная область легкой цепи по изобретению имеет полипептидные последовательности Vl-CDR1, Vl-CDR2 и Vl-CDR3, родственные полипептидам, изображенным на фиг. 1. Хотя фиг. 1 изображает VL-CDR, определенные по системе Кабат, другие определения CDR, например VL-CDR, определенные по системе Chothia, также включены в объем настоящего изобретения. В одном варианте исполнения аминокислотная последовательность референсного VL CDR1 представляет собой SEQ ID NO:26, 32 или 38; аминокислотная последовательность референсного VL CDR2 представляет собой SEQ ID NO:27, 33 или 39; и аминокислотная последовательность референсного VL CDR3 представляет собой SEQ ID
- 20 031698
NO:28, 34 или 40.
В другом варианте исполнения настоящее изобретение предусматривает изолированный полипептид, содержащий состоящий, по существу, из или состоящий из вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина (VL), в котором области VL-CDR1, VL-CDR2 и VL-CDR3 имеют полипептидные последовательности, идентичные группам VL-CDR1, VL-CDR2 и VL-CDR3, изображенным на фиг. 1. В одном варианте исполнения аминокислотная последовательность VL CDR1 представляет собой SEQ ID NO:26, 32 или 38; аминокислотная последовательность VL CDR2 представляет собой SEQ ID NO:27, 33 или 39; и аминокислотная последовательность VL CDR3 представляет собой SEQ ID NO:28, 34 или 40.
В другом варианте исполнения настоящее изобретение предусматривает изолированный полипептид, содержащий состоящий, по существу, из или состоящий из вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина (VL), в котором области VL-CDR1, VL-CDR2 и VL-CDR3 имеют полипептидные последовательности, идентичные группам VL-CDR1, VL-CDR2 и VL-CDR3, изображенным на фиг. 1, за исключением одного, двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти или десяти аминокислотных замещений в любом одном из VL-CDR. В определенных вариантах исполнения аминокислотные замещения являются консервативными. В одном варианте исполнения аминокислотная последовательность VL CDR1 представляет собой SEQ ID NO:26, 32 или 38; аминокислотная последовательность VL CDR2 представляет собой SEQ ID NO:27, 33 или 39; и аминокислотная последовательность VL CDR3 представляет собой SEQ ID NO:28, 34 или 40.
Иммуноглобулин или кодирующая его кДНК может быть дополнительно модифицирован. Таким образом, в дополнительных вариантах исполнения способ по настоящему изобретению включает любую стадию (стадии) получения химерного антитела, приближенного к мышиному антитела, одноцепочечного антитела, Fab-фрагмента, биспецифического антитела, слитого антитела, меченого антитела или аналога любого из вышеперечисленного. Соответствующие способы известны квалифицированному специалисту в данной области техники и описаны, например, Harlow and Lane Antibodies, A Laboratory Manual, CSH Press, Cold Spring Harbor (1988). В тех случаях, когда производные указанных антител получают по способу фагового дисплея, поверхностный плазмонный резонанс, такой как используемый в системе BIAcore, может быть использован для увеличения эффективности фаговых антител, которые связываются с тем же эпитопом, что и любое из антител, описанных тут (Schier, Human Antibodies Hybridomas 7 (1996), 97-105; Malmborg, J. Immunol. Methods 183 (1995), 7-13). Получение химерных антител описано, например, в международной заявке WO 89/09622. Способы продуцирования гуманизированных антител описаны, например, в европейской заявке ЕР-А1 0239400 и международной заявке WO 90/07861. Дополнительным источником антител для использования в соответствии с настоящим изобретением являются так называемые ксеногенные антитела. Общий принцип продуцирования ксеногенных антител, таких как человекоподобные антитела у мышей, описан, например, в международных заявках WO 91/10741, WO 94/02602, WO 96/34096 и WO 96/33735. Как было описано выше, антитело по изобретению может существовать в различных формах, помимо полных антител; включая, например, Fv, Fab и F(ab)2, а также одноцепочечных (см., например, международную заявку WO 88/09344).
Антитела по настоящему изобретению или их соответствующая иммуноглобулиновая цепь (цепи) могут быть дополнительно модифицированы с использованием обычных методик, известных специалистам, например путем использования аминокислотной делеции (делеций), инсерции (инсерций), замещения (замещений), вставки (вставок) и/или рекомбинации (рекомбинаций) и/или любой другой модификации (модификаций), известных специалистам, по отдельности или в комбинации. Способы внесения таких модификаций в ДНК-последовательность, лежащую в основе аминокислотной последовательности иммуноглобулиновой цепи, хорошо известны квалифицированному специалисту в данной области техники (см., например, Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y. и Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1994)). Модификации антитела по изобретению включают химические и/или ферментативные дериватизации одной или нескольких входящих в его состав аминокислот, включая модификации боковой цепи, модификации основной цепи и N- и С-концевые модификации, включая ацетилирование, гидроксилирование, метилирование, амидирование, и присоединение углеводных или липидных фрагментов, кофакторов и т. п. Аналогично, настоящее изобретение охватывает продуцирование химерных белков, которые включают описанное антитело или некоторый его фрагмент, слитые на аминоконце с гетерологичной молекулой, такой как иммуностимулирующий лиганд с карбоксильного конца (см., например, соответствующие технические детали в международной заявке WO 00/30680).
Дополнительно, настоящее изобретение охватывает пептиды, включая содержащие связывающую молекулу, как описано выше, например, содержащие область CDR3 вариабельной области любого из упомянутых антител, в частности CDR3 тяжелой цепи, поскольку часто наблюдалось, что тяжелая цепь CDR3 (HCDR3) является областью, имеющей большую степень изменчивости и преимущественно участвующую во взаимодействии антиген-антитело. Такие пептиды могут быть легко синтезированы или продуцированы рекомбинантными способами для получения связывающего агента, пригодного для использования в соответствии с изобретением. Такие способы хорошо известны рядовым специалистам в данной области техники. Пептиды могут быть синтезированы, например, с использованием автоматиче
- 21 031698 ских пептидных синтезаторов, являющихся коммерчески доступными. Пептиды могут также быть получены рекомбинантными способами путем включения ДНК, экспрессирующей пептид, в вектор экспрессии и трансформирования клеток с помощью вектора экспрессии для получения пептида.
Таким образом, настоящее изобретение относится к любой связывающей молекуле, например антителу или его связывающему фрагменту, направленному на человеческие анти-тау антитела по настоящему изобретению и проявляющему вышеупомянутые свойства, т. е. специфически распознающему тау. Такие антитела и связывающие молекулы могут быть подвергнуты тестированию на их специфичность связывания и аффинность способами ELISA и вестерн-блоттинга и иммуногистохимии, как описано тут (см., например, примеры). Кроме того, предварительные результаты дальнейших экспериментов, проведенных в соответствии с настоящим изобретением, показали, что человеческое анти-тау антитело по настоящему изобретению, в частности антитело NI-105.4E4, связывается главным образом с патологически агрегированным тау, напоминающим нейрофибриллярные клубки (NFT), нейропильные нити, присутствующие на срезах человеческого мозга пациентов, дополнительно страдающих болезнью Альцгеймера (AD). Таким образом, в конкретном предпочтительном варианте исполнения настоящего изобретения человеческое антитело или его связывающий фрагмент, производное или вариант распознает тау на срезах человеческого мозга, пораженного болезнью Альцгеймера (AD). Кроме того, особая способность антитела NI-105.4E4 дифференцированно связываться с тау-патологиями может также быть продемонстрирована на трансгенных мышах, сверхэкспрессирующих человеческий тау P301L. В дополнение к уже упомянутым NFT и нейропильным нитям антитело NI-105.4E4 связывает на срезах мышиного мозга также дистрофические нейриты и идентифицирует агрегаты тау на стадии, предшествующей образованию клубков (см. пример 4 и фиг. 6).
В качестве альтернативы получению иммуноглобулинов непосредственно из культуры иммортализованных В-клеток или В-клеток памяти иммортализованные клетки могут быть использованы в качестве источника перестроенных локусов тяжелой цепи и легкой цепи для последующей экспрессии и/или генетических манипуляций. Перестроенные гены антител могут быть подвергнуты обратной транскрипции с соответствующих мРНК для получения кДНК. При необходимости константная область тяжелой цепи может быть замещена на область от другого изотипа или удалена вообще. Вариабельные области могут быть присоединены для кодирования одноцепочечных Fv-областей. Могут быть присоединены многочисленные Fv-области для придания связывающей способности к нескольким мишеням или могут быть использованы химерные комбинации тяжелой и легкой цепей. После получения генетического материала конструирование аналогов, описанных выше, сохраняющих обе способности к связыванию желательной мишени, является несложным. Способы клонирования вариабельных областей антитела и генерирования рекомбинантного антитела известны квалифицированному специалисту в данной области техники и описаны, например, Gilliland et al., Tissue Antigens 47 (1996), 1-20; Doenecke et al., Leukemia 11 (1997), 1787-1792.
После получения соответствующего генетического материала и при необходимости его модифицирования для кодирования аналога кодирующие последовательности, включая те, которые кодируют как минимум вариабельные области тяжелой и легкой цепей, могут быть вставлены в системы экспрессии, содержащиеся в векторах, которые могут быть трансфицированы в стандартные рекомбинантные клеткихозяева. Могут быть использованы различные такие клетки-хозяева; для эффективного процессинга, однако, можно предусмотреть использование клеток млекопитающих. Типичные линии клеток млекопитающих, пригодные для этой цели, включают, без ограничения, клетки СНО, клетки HEK293 или клетки NSO.
Затем осуществляют продуцирование антитела или аналога путем культивирвания модифицированного рекомбинантного хозяина в условиях культуры, пригодных для роста клеток-хозяев и экспрессии кодирующих последовательностей. Антитела затем собирают путем их выделения из культуры. Системы экспрессии конструируют с включением сигнальных пептидов, так чтобы образующиеся антитела секретировались в среду; однако возможно также внутриклеточное продуцирование.
В соответствии с приведенным выше описанием настоящее изобретение также относится к полинуклеотиду, кодирующему антитело или эквивалентную связывающую молекулу по настоящему изобретению. В одном варианте исполнения полинуклеотид кодирует по меньшей мере вариабельную область иммуноглобулиновой цепи антитела, описанного выше. Типично, указанная вариабельная область кодируемого полинуклеотида содержит по меньшей мере один участок, определяющий комплементарность (CDR) VH и/или VL вариабельной области указанного антитела.
Квалифицированный специалист в данной области техники легко поймет, что вариабельный домен антитела, имеющего вышеописанный вариабельный домен, может быть использован для конструирования других полипептидов или антител с желательной специфичностью и биологическими функциями. Таким образом, настоящее изобретение также охватывает полипептиды и антитела, содержащие по меньшей мере один CDR вышеописанного вариабельного домена, который преимущественно обладает, по существу, такими же или подобными связывающими свойствами, что и антитело, описанное в приложенных примерах. Квалифицированный специалист в данной области техники знает, что аффинность связывания может быть повышена путем проведения аминокислотных замещений в CDR или в гиперва
- 22 031698 риабельных петлях (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196 (1987), 901-917), частично перекрывающихся с CDR при определении по Кабат (см., например, Riechmann, et al., Nature 332 (1988), 323-327). Таким образом, настоящее изобретение также относится к антителам, у которых один или несколько вышеупомянутых CDR содержат одно или несколько или не более двух аминокислотных замещений. В одном варианте исполнения антитело по изобретению содержит в одной или обоих своих иммуноглобулиновых цепях два или все три CDR вариабельных областей, приведенных на фиг. 1.
Связывающие молекулы, например антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные по изобретению, как известно рядовым специалистам в данной области техники, могут содержать константную область, которая медиирует одну или несколько эффекторных функций. Например, связывание компонента С1 комплемента с константной областью антитела может активировать систему комплемента. Активация комплемента важна для опсонизации и лизиса клеточных патогенов. Активация комплемента также стимулирует воспалительную реакцию и может также участвовать в аутоиммунной гиперчувствительности. Дополнительно, антитела связываются с рецепторами различных клеток через Fc-область, причем связывающий сайт Fc-рецептора Fc-области антитела связывается с Fcрецептором (FcR) клетки. Существует ряд Fc-рецепторов, специфических по отношению к разным классам антитела, включая IgG (гамма-рецепторы), IgE (эпсилон-рецепторы), IgA (альфа-рецепторы) и IgM (мю-рецепторы). Связывание антитела с Fc-рецепторами поверхности клетки инициирует ряд важных и разнообразных биологических реакций, включая поглощение и разрушение покрытых антителами частиц, клиренс иммунных комплексов, лизис покрытых антителами клеток-мишеней клетками-убийцами (называемый антителозависимой клеточно-медиируемой цитотоксичностью или ADCC), высвобождение воспалительных медиаторов, переход через плаценту и контроль продуцирования иммуноглобулина.
Соответственно определенные варианты исполнения настоящего изобретения включают антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, вариант или производное, в котором по меньшей мере часть одного или нескольких доменов константной области были удалены или иначе изменены для обеспечения желательных биохимических характеристик, таких как пониженные эффекторные функции, способность к нековалентной димеризации, повышенная способность локализоваться на участках агрегации и отложения тау, уменьшенный период полувыведения из сыворотки или увеличенный период полувыведения из сыворотки по сравнению с цельным, неизмененным антителом приблизительно такой же иммуногенности. Например, определенные антитела для использования в способах диагностики и лечения, описанных тут, представляют собой антитела с удаленным доменом, содержащие полипептидную цепь, схожую с тяжелой цепью иммуноглобулина, но с отсутствующей по меньшей мере частью одного или нескольких доменов тяжелой цепи. Например, в определенных антителах будет удален целиком один домен константной области модифицированного антитела, например будет удален весь или часть домена СН2. В других вариантах исполнения определенные антитела для использования в способах диагностики и лечения, описанных тут, имеют константную область, например константную область тяжелой цепи IgG, которая была изменена для устранения гликозилирования, и могут быть названы в данном документе агликозилированными или agly''-антителами. Такие agly''-антитела могут быть получены ферментативно, а также генно-инженерными способами получения консенсусного сайта (сайтов) гликозилирования в константной области. Без ограничений теорией считается, что agly''-антитела могут обладать улучшенным профилем безопасности и стабильности in vivo. Способы получения агликозилированных антител, имеющих желательные эффекторные функции, приведены, например, в международной заявке WO 2005/018572, которая целиком включена сюда в качестве ссылки.
В определенных антителах или их антигенсвязывающих фрагментах, вариантах или производных, описанных тут, участок Fc может быть мутирован для снижения эффекторной функции с использованием способов, известных специалистам. Например, делеция или инактивация (с помощью точечных мутаций или других способов) домена константной области может ослабить связывание Fc-рецептора циркулирующего модифицированного антитела, тем самым увеличивая локализацию тау. В других случаях, возможно, модификации константной области в соответствии с настоящим изобретением ослабляют связывание комплемента и, таким образом, уменьшают период полувыведения из сыворотки и неспецифическую ассоциацию конъюгированного цитотоксина. Еще другие модификации константной области могут быть использованы для модификации дисульфидных связей или олигосахаридных фрагментов, что позволяет усиливать локализацию вследствие повышенной антигенной специфичности или гибкости антитела. Полученный физиологический профиль, биодоступность и другие биохимические эффекты модификации, такие как локализация тау, биораспределение и период полувыведения из сыворотки, могут быть легко измерены и количественно определены с использованием хорошо известных иммунологических методик без чрезмерных экспериментов.
В определенных антителах или их антигенсвязывающих фрагментах, вариантах или производных, описанных тут, участок Fc может быть мутирован или заменен на альтернативные белковые последовательности для увеличения клеточного поглощения антител, например путем усиления рецептормедиируемого эндоцитоза антител через FcY-рецепторы, LRP или Thy1-рецепторы или с помощью технологии суперантитела, которая, как указывается, позволяет антителам проникать в живые клетки без их повреждения (Expert Opin. Biol. Ther. (2005), 237-241). Например, получение слитых белков связы
- 23 031698 вающей области антитела и когнатных белковых лигандов рецепторов клеточной поверхности или биили мультиспецифических антител со специфическими последовательностями, связывающимися с тау, а также с рецептором клеточной поверхности, может быть осуществлено генно-инженерными способами с использованием методик, известных специалистам.
В определенных антителах или их антигенсвязывающих фрагментах, вариантах или производных, описанных тут, участок Fc может быть мутирован или заменен на альтернативные белковые последовательности, или антитело может быть химически модифицировано для увеличения его проницаемости через гематоэнцефалический барьер.
Модифицированные формы антител или их антигенсвязывающих фрагментов, вариантов или производных по изобретению могут быть получены из цельного прекурсора или родительского антитела с использованием методик, известных специалистам. Типичные примеры методики более детально описаны в данном документе. Антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные по изобретению могут быть получены или произведены с использованием методик, известных специалистам в данной области техники. В определенных вариантах исполнения молекулы антитела или их фрагменты являются рекомбинантно продуцируемыми, т.е. продуцируются с использованием технологии рекомбинантной ДНК. Типичные примеры методик получения молекул антитела или их фрагментов более детально описаны в других разделах данного документа.
Антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные по изобретению также включают производные, модифицированные, например, путем ковалентного присоединения к антителу молекулы любого типа таким образом, чтобы ковалентное присоединение не препятствовало специфическому связыванию антитела с его когнатным эпитопом. Например, но не в качестве ограничения, производные антитела включают антитела, которые были модифицированны, например, путем гликозилирования, ацетилирования, пегилирования, фосфорилирования, амидирования, дериватизации известными защитными/блокирующими группами, протеолитического расщепления, образования связей с клеточным лигандом или другим белком и т.д. Любые из многочисленных химических модификаций могут быть выполнены известными способами, включая, без ограничений, специфическое химическое расщепление, ацетилирование, формилирование, метаболический синтез туникамицина и т. д. Дополнительно, производное может содержать одну или несколько неклассических аминокислот.
В конкретных вариантах исполнения антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные по изобретению не будут вызывать вредного иммунного ответа у животного, получающего лечение, например у человека. В определенных вариантах исполнения связывающие молекулы, например антитела или их антигенсвязывающие фрагменты по изобретению, получены от пациента, например человека, и впоследствии используются для того же вида, от которого они получены, например человека, что уменьшает или минимизирует возникновение вредных иммунных ответов.
Деиммунизация также может быть использована для снижения иммуногенности антитела. В используемом тут значении термин деиммунизация включает изменение антитела с целью модификации эпитопов Т-клетки (см., например, международные заявки WO 98/52976 и WO 00/34317). Например, анализируют последовательности VH и VL исходного антитела, и карта эпитопов каждой V-области человеческой Т-клетки показывает положение эпитопов относительно участков, определяющих комплементарность (CDR), и других ключевых остатков последовательности. Анализируют индивидуальные эпитопы Т-клетки на карте эпитопов Т-клетки для идентификации альтернативных аминокислотных замещений с низким риском изменения активности конечного антитела. Конструируют ряд альтернативных последовательностей VH и VL, содержащих комбинации аминокислотных замещений, и эти последовательности затем включают в ряд связывающих полипептидов, например тау-специфические антитела или их иммуноспецифически фрагменты, для использования в способах диагностики и лечения, раскрытых в данном документе, которые затем тестируют на проявление ими требуемой функции. Типично, генерируют и испытывают от 12 и 24 вариантов антитела. Полные гены тяжелой и легкой цепей, содержащие модифицированные V- и человеческие С-области затем клонируют в экспрессионные векторы, и полученные после этого плазмиды вводят в клеточные линии для продуцирования цельного антитела. Антитела затем сравнивают с помощью соответствующих биохимических и биологических анализов, и определяют оптимальный вариант.
Моноклональные антитела могут быть получены с использованием широкого спектра методик, известных специалистам, включая использование гибридомы, рекомбинантных технологий и технологий фагового дисплея или их комбинации. Например, моноклональные антитела могут быть получены с использованием методик гибридомы, включая известные специалистам и описанные, например, у Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. (1988); Hammerling et al., в: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas Elsevier, N.Y., 563-681 (1981), причем указанные источники целиком включены в качестве ссылок. Термин моноклональное антитело в используемом тут значении не ограничен антителами, полученными по гибридомной технологии. Термин моноклональное антитело относится к антителу, которое получают из отдельного клона, включая любой эукариотический, прокариотический или фаговый клон, а не к способу, которым его получают. Таким образом, термин моноклональное антитело не ограничен антителами, полученными по гибридомной технологии. В
- 24 031698 определенных вариантах исполнения антитела по настоящему изобретению получают из человеческих В-клеток, которые были иммортализованы путем трансформации с помощью вирус Эпштейна-Барр, как описано тут.
В хорошо известном гибридомном способе (Kohler et al., Nature 256 (1975), 495) относительно короткоживущие, или смертные, лимфоциты млекопитающего, например В-клетки человека, как описано тут, сливают с линией бессмертных опухолевых клеток (например, клеточной линией миеломы), получая таким образом гибридные клетки или гибридомы, которые являются бессмертными и при этом способны продуцировать генетически кодированное антитело В-клетки.
Полученные гибриды разделяют на отдельные генетические штаммы путем селекции, разбавления и повторного выращивания, причем каждый индивидуальный штамм содержит специфические гены для образования одного антитела. Они продуцируют антитела, гомогенные против желательного антигена, и для указания на их чистое генетическое происхождение называются моноклональными.
Полученные таким образом гибридомные клетки высеивают и выращивают в пригодной культуральной среде, содержащей одно или несколько веществ, ингибирующих рост или выживание неслитых родительских миеломных клеток. Квалифицированным специалистам в данной области техники известно, что реагенты, клеточные линии и среды для получения, селекции и выращивания гибридом являются коммерчески доступными из ряда источников и отработаны стандартные протоколы. В общем, культуральную среду, в которой выращивают гибридомные клетки, анализируют на продуцирование моноклональных антител против требуемого антигена. Специфичность связывания моноклональных антител, продуцируемых гибридомными клетками, определяют с помощью in vitro анализов, таких как иммунопреципитация, радиоиммуноанализ (RIA) или твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), как описано тут. После идентификации гибридомных клеток, продуцирующих антитела с желательной специфичностью, аффинностью и/или активностью, клоны могут быть субклонированы с помощью процедур ограниченного разбавления и выращены стандартными способами (см., например, Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, pp 59-103 (1986)). Дополнительно следует понимать, что моноклональные антитела, секретируемые субклонами, могут быть выделены из культуральной среды, асцитической жидкости или сыворотки обычными процедурами очистки, такими как, например, использование белка А, хроматография на гидроксилапатите, гель-электрофорез, диализ или аффинная хроматография.
В другом варианте исполнения лимфоциты могут быть выбраны с помощью микроманипуляций и вариабельные гены изолированы. Например, мононуклеарные клетки периферической крови могут быть получены от иммунизированного или природно иммунного млекопитающего, например человека, и культивируются в течение примерно 7 дней in vitro. Культуры могут быть подвергнуты скринингу на специфические IgG, удовлетворяющие критериям скрининга. Клетки из положительных лунок могут быть изолированы. Индивидуальные Ig-продуцирующие В-клетки могут быть выделены способом FACS или путем их идентификации с помощью комплемент-медиируемого анализа гемолитических бляшек. Ig-продуцирующие В-клетки могут быть перенесены микроманипулированием в пробирку, и гены VH и VL могут быть амплифицированы с помощью, например, ОТ-ПЦР. Гены VH и VL могут быть клонированы в вектор экспрессии антитела и трансфицированы в клетки (например, эукариотические или прокариотические клетки) для экспрессии.
Альтернативно, антителопродуцирующие клеточные линии могут быть выбраны и культивироваться с использованием методик, хорошо известных квалифицированному специалисту. Такие методики описаны в различных лабораторных руководствах и первичных публикациях. В этом отношении методики, пригодные для использования по изобретению, как описано ниже, описаны в Current Protocols in Immunology, Coligan et al., Eds., Green Publishing Associates and Wiley-Interscience, John Wiley and Sons, New York (1991), которая целиком включена сюда в качестве ссылки, включая приложения.
Фрагменты антитела, распознающие специфические эпитопы, могут быть получены известными способами. Например, фрагменты Fab и F(ab')2 могут быть получены рекомбинантными способами или протеолитическим расщеплением молекул иммуноглобулина с использованием ферментов, таких как папаин (для получения фрагментов Fab) или пепсин (для получения фрагментов F(ab')2). Фрагменты F(ab')2 содержат вариабельную область, легкую цепь константной области и домен СН1 тяжелой цепи. Такие фрагменты являются достаточными для использования, например, в иммунодиагностических процедурах, использующих связывание иммуноспецифических участков иммуноглобулинов с детектирующими реагентами, такими как радиоизотопы.
Человеческие антитела, такие как описанные тут, являются особенно желательными для терапевтического применения на людях. Человеческие антитела по настоящему изобретению выделяют, например, у здоровых людей, у которых на основании их возраста можно заподозрить риск развития таупатического расстройства, например болезни Альцгеймера, или у пациента с расстройством, но с необычно стабильным течением болезни. Однако, хотя есть основания ожидать, что у пожилых здоровых и бессимптомных субъектов соответственно чаще будут развиваться защитные анти-тау антитела, чем у более молодых субъектов, последние также могут быть использованы в качестве источника для получения человеческого антитела по настоящему изобретению. Это особенно касается более молодых пациентов,
- 25 031698 предрасположенных к развитию семейной формы таупатической болезни, но остающихся бессимптомными, поскольку их иммунная система функционирует более эффективно, чем у людей старшего возраста.
В одном варианте исполнения антитело по изобретению содержит по меньшей мере один CDR тяжелой или легкой цепи молекулы антитела. В другом варианте исполнения антитело по изобретению содержит по меньшей мере два CDR из одной или нескольких молекул антитела. В другом варианте исполнения антитело по изобретению содержит по меньшей мере три CDR из одной или нескольких молекул антитела. В другом варианте исполнения антитело по изобретению содержит меньшей по мере четыре CDR из одной или нескольких молекул антитела. В другом варианте исполнения антитело по изобретению содержит по меньшей мере пять CDR из одной или нескольких молекул антитела. В другом варианте исполнения антитело по изобретению содержит по меньшей мере шесть CDR из одной или нескольких молекул антитела. Типичные примеры молекул антитела, содержащих по меньшей мере один CDR, который может входить в состав антитела субъекта, описаны в данном документе.
Антитела по настоящему изобретению могут быть получены любым известным специалистам способом синтеза антител, в частности химическим синтезом или способами рекомбинантной экспрессии, как описано тут.
В одном варианте исполнения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, вариант или производное по изобретению содержит синтетическую константную область, в которой один или несколько доменов частично или целиком удалены (антитела с удаленным доменом). В определенных вариантах исполнения совместимые модифицированные антитела будут содержать конструкты с удаленным доменом или варианты с целиком удаленным доменом СН2 (ЛСН2 конструкты). В других вариантах исполнения короткий соединительный пептид может быть вставлен вместо удаленного домена для обеспечения гибкости и свободы движения вариабельной области. Квалифицированным специалистам в данной области техники известно, что такие конструкты являются особенно предпочтительными вследствие того, что домен СН2 обладает регуляторным воздействием на скорость катаболизма антитела. Конструкты с удаленным доменом могут быть получены с использованием вектора, кодирующего человеческий константный домен IgGi (см., например, международные заявки WO 02/060955 и WO 02/096948 A2). В этом векторе генно-инженерными способами удаляют домен СН2 и получают синтетический вектор, экспрессирующий константную область IgG1 с удаленным доменом.
В определенных вариантах исполнения антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные по настоящему изобретению представляют собой мини-тела. Мини-тела могут быть получены с использованием способов, описанных в литературе (см., например, патент США 5837821 или международную заявку WO 94/09817).
В одном варианте исполнения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, вариант или производное по изобретению содержит тяжелую цепь иммуноглобулина, имеющую делецию или замещение нескольких или даже одной аминокислоты, при условии, что при этом обеспечивается возможность ассоциации мономерных субъединиц. Например, мутация одной аминокислоты в выбранных областях домена СН2 может быть достаточной для того, чтобы существенно уменьшить связывание Fc и тем самым повысить локализацию тау. Аналогично, может быть желательным просто удалить часть одного или нескольких доменов константной области, контролирующую эффекторную функцию (например, связывание комплемента), которую требуется откорректировать. Такие частичные делеции константных областей могут улучшить выбранные характеристики антитела (период полувыведения из сыворотки), оставляя в то же время другие желательные функции, ассоциированные с данным доменом константной области неизменными. Кроме того, как упоминалось выше, константные области раскрытых антител могут быть синтезированы путем мутации или замещения одной или нескольких аминокислот, улучшающих характеристики полученного конструкта. В этом отношении может существовать возможность нарушения активности, обеспечиваемой консервативным связывающим сайтом (например, связывание Fc), при сохранении в существенной степени конфигурации и иммуногенного профиля модифицированного антитела. Другие варианты исполнения включают вставку одной или нескольких аминокислот в константную область для усиления желательных характеристик, таких как эффекторная функция или для обеспечения более сильного присоединения цитотоксина или углевода. В таких вариантах исполнения может быть желательной вставка или репликация специфических последовательностей, выделенных из выбранных доменов константной области.
Настоящее изобретение также предусматривает антитела, которые содержат, состоят, по существу, из или состоят из вариантов (включая производные) молекул антител (например, области VH и/или области VL), описанных тут, где антитела или их фрагменты иммуноспецифически связываются с тау. Стандартные методики, известные квалифицированным специалистам в данной области техники, могут быть использованы для введения мутаций в нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело, включая, без ограничений, сайт-направленный мутагенез и ПЦР-медиируемый мутагенез, приводящие к аминокислотным замещениям. В одном варианте исполнения варианты (включая производные) кодируют менее чем 50 аминокислотных замещений, менее чем 40 аминокислотных замещений, менее чем 30 аминокислотных замещений, менее чем 25 аминокислотных замещений, менее чем 20 аминокислотных
- 26 031698 замещений, менее чем 15 аминокислотных замещений, менее чем 10 аминокислотных замещений, менее чем 5 аминокислотных замещений, менее чем 4 аминокислотных замещения, менее чем 3 аминокислотных замещения или менее чем 2 аминокислотных замещения по сравнению с референсной областью VH, VH-CDR1, VH-CDR2, VH-CDR3, областью VL, VL-CDR1, VL-CDR2 или VL-CDR3. Консервативным аминокислотным замещением является такое, в котором остаток аминокислоты замещают на остаток аминокислоты, имеющей боковую цепь со схожим зарядом. Семейства аминокислотных остатков, имеющих боковые цепи со схожими зарядами, были определены в литературе. Такие семейства включают аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислотные боковые цепи (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженные полярные боковые цепи (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин), неполярные боковые цепи (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан), бетаразветвленные боковые цепи (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматические боковые цепи (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Альтернативно, мутации могут быть введены случайным образом по всей длине или части кодирующей последовательности, например путем насыщающего мутагенеза, и полученные мутанты могут быть подвергнуты скринингу на биологическую активность для идентификации мутантов, сохраняющих активность (например, способность к связыванию тау).
Например, можно вводить мутации только в каркасные участки или только в CDR-области молекулы антитела. Введенные мутации могут быть молчащими или нейтральными бессмысленными мутациями, например не оказывают или оказывают незначительное влияние на способность антитела связывать антиген, более того, некоторые такие мутации вообще не изменяют аминокислотную последовательность. Такие типы мутаций могут быть полезны для оптимизации использования кодонов или улучшения продуцирования антитела гибридомой. Кодоноптимизированные кодирующие области, кодирующие антитела по настоящему изобретению, раскрыты в других разделах описания. Альтернативно, ненейтральные бессмысленные мутации могут изменять способность антитела связывать антиген. Большинство молчащих и нейтральных бессмысленных мутаций будет вероятно находиться в каркасных участках, тогда как большинство ненейтральных бессмысленных мутаций будет вероятно находиться в CDR, хотя это требование не является абсолютным. Квалифицированный специалист в данной области техники будет способен сконструировать и протестировать мутантные молекулы с желательными свойствами, такими как отсутствие изменений антигенсвязывающей активности или изменение активности связывания (например, улучшение антигенсвязывающей активности или изменение специфичности антитела). После мутагенеза кодированный белок может быть в обычном порядке экспрессирован, и функциональная и/или биологическая активность кодированного белка (например, способность иммуноспецифически связывать по меньшей мере один эпитоп тау) может быть определена с использованием методик, описанных тут, или путем изменения в обычном порядке методик, известных специалистам.
Связывающие тау агенты, например, без ограничений, тау-связывающие антитела по настоящему изобретению, могут быть охарактеризованы с использованием любых in vivo или in vitro моделей нейродегенеративных таупатий. Квалифицированному специалисту будет легко понятно, что таусвязывающий агент (например, антитело) по изобретению может быть охарактеризован на мышиной модели нейродегенеративной таупатии. Например, без ограничений, любая из трех следующих разных животных моделей таупатии может быть использована для того, чтобы охарактеризовать и провести валидацию тау-антител (и молекул со специфичным их связыванием) по настоящему изобретению.
1. Трансгенные мыши TauP301L (линия 183): экспрессируют человеческий Tau40 с мутацией P301L под мышиным Thy1.2 промотором (получение этих трансгенных животных описано у Gotz et al., J. Biol. Chem. 276 (2001), 529-534 и в международной заявке WO 2003/017918, описание которых включено сюда в качестве ссылок).
2. Мыши JNPL3, экспрессирующие самую короткую 4R-изоформу человеческого тау с мутацией Р301Ь под мышиным PrP промотором (поставляются фирмой Taconic, Hudson, NY, U.S.A).
3. Мыши P301STau (линия PS19), экспрессирующие человеческий тау с мутацией P301S под мышиным PrP промотором (поставляются фирмой Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine, U.S.A).
Квалифицированному специалисту понятно, что экспериментальная модель нейродегенеративных таупатий может быть использована в профилактическом контексте или же она может быть использована в терапевтическом контексте. В профилактическом контексте введение доз животным начинается до начала проявления нейродегенеративных таупатий или их симптомов. В профилактическом контексте таусвязывающий агент (например, антитело) по изобретению оценивают по его способности предотвращать, ослаблять или задерживать начало проявления нейродегенеративных таупатий или их симптомов. В терапевтическом контексте введение доз животным начинается после начала проявления нейродегенеративных таупатий или их симптома. В терапевтическом контексте тау-связывающий агент (например, антитело) по изобретению оценивают по его способности лечить, ослаблять или облегчать нейродегенеративные таупатии или их симптом. Симптомы нейродегенеративных таупатий включают, без ограничения, накопление патологических отложений тау, нейрофибриллярные клубки (NFT), гиперфосфорилированный тау-полипептид, нерастворимые фракции тау в нейронах, мозгу, спинном мозгу, цереброспи
- 27 031698 нальной жидкости или сыворотке экспериментального объекта. Квалифицированному специалисту понятно, что позитивный профилактический или терапевтический исход в любой животной модели нейродегенеративных таупатий указывает, что конкретный тау-связывающий агент (например, антитело) может быть использован в профилактических или терапевтических целях у субъекта, отличного от организма экспериментальной модели, например он может быть использован для лечения нейродегенеративных таупатий у человека, нуждающегося в этом.
В одном варианте исполнения тау-связывающий агент (например, антитело) по изобретению может быть введен мышиной модели таупатии и соответствующей контрольной мыши дикого типа. Введенное антитело может быть приближенным к мышиному антителом по настоящему изобретению или человеческо-мышиными химерными антителами по настоящему изобретению (см., например, примеры 6 и 7). Тау-связывающий агент (например, антитело) может быть введен любыми способами, известными специалистам, например путем интраперитонеального, внутричерепного, внутримышечного, внутривенного, подкожного, перорального и аэрозольного введения. Экспериментальным животным может быть дана одна, две, три, четыре, пять или больше доз тау-связывающего агента (например, антитела) или контрольной композиции, такой как PBS (фосфатно-солевой буфер). В одном варианте исполнения экспериментальным животным будет введена одна или две дозы тау-связывающего агента (например, антитела) (см., например, пример 9). В другом варианте исполнения животные хронически получают дозы таусвязывающего агента (например, антитела) на протяжении нескольких недель или месяцев (см., например, пример 10). Квалифицированный специалист может легко разработать режим введения, соответствующий цели эксперимента, например режим введения для острых исследований, режим введения для хронических исследований, режим введения для исследований токсичности, режим введения для профилактических или терапевтических исследований. Присутствие тау-связывающего агента (например, антитела) в конкретном компартменте ткани экспериментальных животных, например, без ограничений, сыворотке, крови, цереброспинальной жидкости, ткани мозга, может быть установлено с использованием хорошо известных специалистам способов (см., например, примеры 9 и 10). В одном варианте исполнения тау-связывающий агент (например, антитело) по изобретению способен проникать через гематоэнцефалический барьер. Квалифицированному специалисту понятно, что путем корректирования дозы таусвязывающего агента (например, антитела) и частоты введения доз можно поддерживать желательную концентрацию тау-связывающего агента (например, антитела) у экспериментальных животных. Любой эффект тау-связывающего агента (например, антитела) по настоящему изобретению в моделях таупатии может быть оценен путем сравнения уровня содержания, биохимических характеристик или распределения тау у получающих лечение и контрольных животных. В одном примере анализируют нейрофибриллярные клубки (NFT) с использованием методики импрегнирования серебром по Gallyas или путем иммуноокрашивания моноклональным мышиным антителом АТ100 и АТ180, которое распознает патологически фосфорилированный тау в NFT. Число или частота встречаемости Gallyas-позитивных нейронов и/или меченых АТ100, АТ180 нейронов в мозгу и спинном мозгу мышей, получавших антитело, и контрольных животных могут быть определены для оценки эффекта лечения антителом. В одном варианте исполнения антитело по настоящему изобретению способно снижать уровень, количество или концентрацию нейрофибриллярных клубков в мозгу или спинном мозгу животной модели. Антитело может снижать уровень, количество или концентрацию нейрофибриллярных клубков по меньшей мере на примерно 5, 10, 20, 30, 50, 70, 90% или более. В другом варианте исполнения антитело по настоящему изобретению способно уменьшать число или частоту Gallyas-позитивных нейронов в мозгу или спинном мозгу животной модели, например, по меньшей мере на примерно 5, 10, 20, 30, 50, 70, 90% или более. В дополнительных вариантах исполнения антитело по настоящему изобретению способно уменьшать число или частоту антитело АТ100- или АТ180-позитивных нейронов в мозгу или спинном мозгу животной модели, например, по меньшей мере на примерно 5, 10, 20, 30, 50, 70, 90% или более. Эффект антител по настоящему изобретению можно также оценить путем анализа распределения и биохимических свойств тау после введения антитела. В одном варианте исполнения антитело по настоящему изобретению способно уменьшать количество или концентрацию тау-белка в мозгу или спинном мозгу животной модели, например, по меньшей мере на примерно 5, 10, 20, 30, 50, 70, 90% или более. В другом варианте исполнения антитело по настоящему изобретению способно уменьшать количество или концентрацию нерастворимого тау-белка в мозгу или спинном мозгу животной модели, например, по меньшей мере на примерно 5, 10, 20, 30, 50, 70, 90% или более. Нерастворимая фракция тау может быть приготовлена, как описано, например, в примере 10 или в Goedert M., Spillantini M.G., Cairns N.J., Crowther R.A. Neuron 8, 159 (1992). Количество тау-белка в биологическом образце может быть определено любым способом, известным квалифицированному специалисту, например, как описано в примере 10. В дополнительных вариантах исполнения антитело по настоящему изобретению может снижать количество или концентрацию гиперфосфорилированного тау-белка в мозгу или спинном мозгу животной модели, например, по меньшей мере на примерно 5, 10, 20, 30, 50, 70, 90% или более. Гиперфосфорилированный тау может быть детектирован с использованием антител, специфических по отношению к патологически гиперфосфорилированным формам тау, таким как АТ100 или АТ180. Антитело по настоящему изобретению может также изменять, например уменьшать или увеличивать концентрацию тау в крови, сыворотке или
- 28 031698 цереброспинальной жидкости или животной модели, например, по меньшей мере на примерно 5, 10, 20, 30, 50, 70, 90% или более. В одном варианте исполнения % уменьшения или увеличения является относительным и определяется по сравнению с уровнем, числом, частотой, количеством или концентрацией, существовавшими до лечения, или с уровнем, числом, частотой, количеством или концентрацией, существующими у не получающего лечения/контрольного получающего лечения субъекта.
В одном варианте исполнения антитело по настоящему изобретению может предотвращать или задерживать начало проявления по меньшей мере одного симптома нейродегенеративной таупатии у субъекта. В одном варианте исполнения антитело по настоящему изобретению может уменьшать или устранять по меньшей мере один симптом нейродегенеративной таупатии у субъекта. Симптомом может быть образование патологических отложений тау, гиперфосфорилированных отложений тау, нерастворимых отложений тау, нейрофибриллярных волокон, нейрофибриллярных волокон, агрегатов фосфор-тау до образования клубков, внутринейронных нейрофибриллярных клубков или экстранейронные нейрофибриллярные клубки в мозгу или спинном мозгу субъекта (см., например, Augustinack et al., Acta Neuropathol 103:26-35 (2002)). Симптомом могут быть также присутствие или повышенная концентрация, или количество тау в сыворотке, крови, моче или цереброспинальной жидкости, где повышенная величина концентрации определяется по сравнению со здоровым субъектом. Симптомом может быть неврологический симптом, например изменение условно-рефлекторно выработанного отвращения к пище, изменение условного рефлекса замирания, нарушение памяти, потеря моторной функции. В одном варианте исполнения нарушение памяти оценивают с помощью задачи с Т-образным лабиринтом с двумя попытками (two-trial Y-лабиринт task). В конкретном варианте исполнения задачу с Т-образным лабиринтом с двумя попытками выполняют, по существу, как описано в примере 10. В одном варианте исполнения по меньшей мере один симптом снижается по меньшей мере на примерно 5, 10, 15, 20, 30, 50, 70 или 90%. В другом варианте исполнения величина соотношения для задачи с Т-образным лабиринтом с двумя попытками будет значительно выше у субъекта, получавшего лечение антителами, чем у контрольного субъекта. В конкретном варианте исполнения величина соотношения для задачи с Т-образным лабиринтом с двумя попытками возрастает по меньшей мере на примерно 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 или 90%. В другом варианте исполнения величина соотношения для задачи с Т-образным лабиринтом с двумя попытками будет по меньшей мере в примерно два раза, три раза, четыре раза, пять раз, десять раз или двадцать раз больше. Настоящее изобретение также предусматривает способ предотвращения или задержки начала проявления по меньшей мере одного симптома нейродегенеративной таупатии у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение терапевтически эффективного количества тау-антитела, описанного тут. Настоящее изобретение дополнительно предусматривает способ уменьшения или устранения по меньшей мере одного симптома нейродегенеративной таупатии у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение терапевтически эффективного количества тау-антитела, описанного тут. В одном варианте исполнения субъект представляет собой экспериментальный организм, такой как, без ограничений, трансгенная мышь. В одном варианте исполнения субъект является человеком.
III. Полинуклеотиды, кодирующие антитела.
Полинуклеотид, кодирующий антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, вариант или производное может состоять из любого полирибонуклеотида или полидезоксирибонуклеотида, который может быть немодифицированными РНК или ДНК или модифицированными РНК или ДНК. Например, полинуклеотид, кодирующий антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, вариант или производное может состоять из одно- и двухцепочечной ДНК, ДНК, представляющей собой смесь одно- и двухцепочечных областей, одно- и двухцепочечной РНК, и РНК, представляющей собой смесь одно- и двухцепочечных областей, гибридных молекул, включающих ДНК и РНК, которые могут быть одноцепочечными или, более типично, двухцепочечными, или смесью одно- и двухцепочечных областей. Кроме того, полинуклеотид, кодирующий антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, вариант или производное может состоять из трехцепочечных областей, включающих РНК или ДНК или как РНК, так и ДНК. Полинуклеотид, кодирующий антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, вариант или производное могут также содержать одно или несколько модифицированных оснований или иметь основные цепи ДНК или РНК, модифицированные для придания стабильности или по другим причинам. Модифицированные основания включают, например, тритилированные основания и необычные основания, такие как инозин. Различные модификации могут быть выполнены в ДНК и РНК; таким образом, полинуклеотид охватывает химически, ферментативно или метаболически модифицированные формы.
Изолированный полинуклеотид, кодирующий неприродный вариант полипептида, выделенного из иммуноглобулина (например, участок тяжелой цепи или участок легкой цепи иммуноглобулина), может быть создан путем введения одного или нескольких нуклеотидных замещений, вставок или делеций в нуклеотидную последовательность иммуноглобулина таким образом, чтобы одна или несколько аминокислотных замещений, вставок или делеций были введены в кодируемый белок. Мутации могут быть введены стандартными методами, такими как сайт-направленный мутагенез и ПЦР-медиируемый мутагенез. В одном варианте исполнения консервативные аминокислотные замещения выполняются по одному или нескольким остаткам заменимых аминокислот.
Как хорошо известно, РНК может быть выделена из исходных В-клеток, гибридомных клеток или
- 29 031698 из других трансформированных клеток стандартными методами, такими как экстракция с гуанидинийизотиоцианатом и осаждение с последующим центрифугированием или хроматографией. В тех случаях, когда это желательно, мРНК может быть выделена из общей РНК стандартными методами, такими как хроматография на олиго dT целлюлозе. Пригодные методики известны специалистам. В одном варианте исполнения кДНК, кодирующие легкие и тяжелые цепи антитела, могут быть получены, одновременно или раздельно, с использованием обратной транскриптазы и ДНК полимеразы в соответствии с хорошо известными способами. ПЦР может быть инициирована консенсусными праймерами константной области или более специфическими праймерами, основанными на опубликованных ДНК и аминокислотных последовательностей тяжелой и легкой цепей. Как было описано выше, ПЦР также может быть использована для выделения клонов ДНК, кодирующих легкую и тяжелую цепи антитела. В этом случае библиотеки могут быть подвергнуты скринингу с использованием консенсусных праймеров или более крупных гомологичных зондов, таких как зонды человеческой константной области.
ДНК, типично плазмидная ДНК, может быть выделена из клеток с использованием известных специалистам методик, подвергнута рестрикционному картированию и секвенирована в соответствии со стандартными, хорошо известными методиками, детально описанными, например, в ранее упомянутых ссылках, относящихся к методикам рекомбинантной ДНК. Конечно, ДНК может быть синтезированной в соответствии с настоящим изобретением в любой точке процесса выделения или последующего анализа.
В одном варианте исполнения настоящее изобретение предусматривает изолированный полинуклеотид, содержащий состоящий, по существу, из или состоящий из нуклеиновой кислоты, кодирующей вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина (VH), где по меньшей мере один из CDR вариабельной области тяжелой цепи или по меньшей мере два из VH-CDR вариабельной области тяжелой цепи являются по меньшей мере на 80, 85, 90, 95, 96, примерно 97, 98 или 99% идентичными референсным аминокислотным последовательностям тяжелой цепи VH-CDR1, VH-CDR2 или VH-CDR3 антитела, раскрытого в данном документе. Альтернативно, VH-CDR1, VH-CDR2 или VH-CDR3 области VH являются по меньшей мере на 80, 85, 90, 95, 96, на примерно 97, 98 или 99% идентичными референсным аминокислотным последовательностям тяжелой цепи VH-CDR1, VH-CDR2, и VH-CDR3 антитела, раскрытого в данном документе. Таким образом, в соответствии с этим вариантом исполнения вариабельная область тяжелой цепи по изобретению имеет полипептидные последовательности VH-CDR1, VH-CDR2 или VHCDR3, родственные полипептидным последовательностям, представленным на фиг. 1. В одном варианте исполнения аминокислотная последовательность референсной VH CDR1 представляет собой SEQ ID NO:23, 29 или 35; аминокислотная последовательность референсной VH CDR2 представляет собой SEQ ID NO:24, 30 или 36; и аминокислотная последовательность референсной VH CDR3 представляет собой SEQ ID NO:25, 31 или 37.
В одном варианте исполнения настоящее изобретение предусматривает изолированный полинуклеотид, содержащий состоящий, по существу, из или состоящий из нуклеиновой кислоты, кодирующей вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина (VH), в которой VH-CDR1, VH-CDR2 и VH-CDR3 области имеют полипептидные последовательности, идентичные VH-CDR1, VH-CDR2 и VH-CDR3 группам, изображенным на фиг. 1, за исключением одного, двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти или десяти аминокислотных замещений в любом одном из VH-CDR. В определенных вариантах исполнения аминокислотные замещения являются консервативными. В одном варианте исполнения аминокислотная последовательность VH CDR1 представляет собой SEQ ID NO:23, 29 или 35; аминокислотная последовательность VH CDR2 представляет собой SEQ ID NO:24, 30 или 36; и аминокислотная последовательность VH CDR3 представляет собой SEQ ID NO:25, 31 или 37.
В другом варианте исполнения настоящее изобретение предусматривает изолированный полинуклеотид, содержащий состоящий, по существу, из или состоящий из нуклеиновой кислоты, кодирующей вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина (VL), где по меньшей мере один VL-CDR вариабельной области легкой цепи или по меньшей мере два из VL-CDR вариабельной области легкой цепи являются по меньшей мере на 80, 85, 90, 95, 96, примерно на 97, 98 или 99% идентичными референсным аминокислотным последовательностям легкой цепи VL-CDR1, VL-CDR2 или VL-CDR3 антитела, раскрытого в данном документе. Альтернативно, VL-CDR1, VL-CDR2 или VL-CDR3 области VL являются по меньшей мере на 80, 85, 90, 95, 96, примерно на 97, 98 или 99% идентичными референсным аминокислотным последовательностям легкой цепи VL-CDR1, VL-CDR2, и VL-CDR3 антитела, раскрытого в данном документе. Таким образом, в соответствии с этим вариантом исполнения вариабельная область легкой цепи по изобретению имеет полипептидные последовательности VL-CDR1, VL-CDR2 или VL-CDR3, родственные полипептидным последовательностям, представленным на фиг. 1. В одном варианте исполнения аминокислотная последовательность референсного VL CDR1 представляет собой SEQ ID NO: 26, 32 или 38; аминокислотная последовательность референсного VL CDR2 представляет собой SEQ ID NO: 27, 33 или 39; и аминокислотная последовательность референсного VL CDR3 представляет собой SEQ ID NO: 28, 34 или 40.
В другом варианте исполнения настоящее изобретение предусматривает изолированный полинуклеотид, содержащий состоящий, по существу, из или состоящий из нуклеиновой кислоты, кодирующей вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина (VL), в которой VL-CDR1, VL-CDR2 и VL-CDR3
- 30 031698 области имеют полипептидные последовательности, идентичные VL-CDR1, VL-CDR2 и VL-CDR3 группам, изображенным на фиг. 1, за исключением одного, двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти или десяти аминокислотных замещений в любом одном из VL-CDR. В определенных вариантах исполнения аминокислотные замещения являются консервативными. В одном варианте исполнения аминокислотная последовательность VL CDR1 представляет собой SEQ ID NO:26, 32 или 38; аминокислотная последовательность VL CDR2 представляет собой SEQ ID NO:27, 33 или 39; и аминокислотная последовательность VL CDR3 представляет собой SEQ ID NO:28, 34 или 40.
В другом варианте исполнения настоящее изобретение предусматривает изолированный полинуклеотид, содержащий состоящий, по существу, из или состоящий из нуклеиновой кислоты, кодирующей вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина (VH), в которой VH-CDR1, VH-CDR2, и VH-CDR3 области имеют полипептидные последовательности, идентичные VH-CDR1, VH-CDR2, и VH-CDR3 группам, изображенным на фиг. 1. В одном варианте исполнения аминокислотная последовательность VH CDR1 представляет собой SEQ ID NO:23, 29 или 35; аминокислотная последовательность VH CDR2 представляет собой SEQ ID NO:24, 30 или 36; и аминокислотная последовательность VH CDR3 представляет собой SEQ ID NO:25, 31 или 37.
В другом варианте исполнения настоящее изобретение предусматривает изолированный полинуклеотид, содержащий состоящий, по существу, из или состоящий из нуклеиновой кислоты, кодирующей вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина (VL), в которой VL-CDR1, VL-CDR2, и VL-CDR3 области имеют полипептидные последовательности, идентичные VL-CDR1, VL-CDR2, и VL-CDR3 группам, изображенным на фиг. 1. В одном варианте исполнения аминокислотная последовательность VL CDR1 представляет собой SEQ ID NO:26, 32 или 38; аминокислотная последовательность VL CDR2 представляет собой SEQ ID NO:27, 33 или 39; и аминокислотная последовательность VL CDR3 представляет собой SEQ ID NO:28, 34 или 40.
Как известно специалистам, идентичность последовательностей между двумя полипептидами или двумя полинуклеотидами определяют путем сравнения аминокислотной или нуклеиново-кислотной последовательности одного полипептида или полинуклеотида с последовательностью второго полипептида или полинуклеотида. При обсуждении в данном документе, является ли какой-либо конкретный полипептид по меньшей мере на примерно 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 или 95% идентичным другому полипептиду, это может быть определено с использованием способов и компьютерных программ/программного обеспечения, известного специалистам в данной области техники, таких как, без ограничений, программа BESTFIT (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711). BESTFIT использует алгоритм локальной гомологии Смита-Уотермана (Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics 2 (1981), 482-489) для нахождения наилучшего сегмента гомологии между двумя последовательностями. При использовании BESTFIT или любой другой программы выравнивания последовательностей для определения того, является ли конкретная последовательность, например, на 95% идентичной референсной последовательности в соответствии с настоящим изобретением, параметры задаются, конечно, таким образом, чтобы процент идентичности рассчитывался по всей длине референсной полипептидной последовательности и чтобы допускались пробелы в гомологии, составляющие до 5% от общего числа аминокислот в референсной последовательности.
В одном варианте исполнения настоящего изобретения полинуклеотид содержит, состоит по существу, из или состоит из нуклеиновой кислоты, имеющей полинуклеотидную последовательность области VH или VL анти-тау антитела, приведенную в табл. 2. В этом отношении квалифицированному специалисту в данной области техники будет понятно, что полинуклеотиды, кодирующие, по меньшей мере, вариабельный домен легкой и/или тяжелой цепи, могут кодировать вариабельный домен обоих иммуноглобулиновых цепей или только одной из них. Настоящее изобретение дополнительно предусматривает полинуклеотид, содержащий или состоящий из нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность SEQ ID:93.
- 31 031698
Таблица 2
Нуклеотидные последовательности области VH и VL тау-специфических антител
Антитело Нуклеотидные последовательности вариабельной тяжелой (VH) и вариабельной легкой (VL) цепей
NI-105.4E4 -Vh SEQ ID NO: 8 GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTG GGGGATCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGGTTCAATTTCA ACATCTCTGCTATACACTGGGTCCGCCAGGCTTCCGGGAAAGGG CTGGAGTGGGTTGGCCGAATAAGAAGTAAATCTCACAATTACGCG ACTTTATATGCTGCGTCCCTGAAAGGCCGGTTCACCCTCTCCAGA GATGATTCAAGGAACACGGCGTATCTGCAAATGAGCAGCCTGCA AACCGAGGATATGGCCGTCTATTACTGTACTGTTCTGAGTGCGAA TTACGACACCTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCG TCTCCTCG
NI-105.4E4 -Vl SEQ ID NO: 10 TCCTATGAGCTGACTCAGCCACCCTCGGTGTCAGTGTCCCCAGG ACAGACGGCCAGGATCTCCTGCTTTGGAGATACATTGCCAAAGC AATATACTTATTGGTATCAGCAGAAGCCTGGCCAGGCCCCTGTGT TAGTGATTTATAAAGACACTGAGAGGCCCTCAGGGATCCCCGAG CGATTCTCTGGCTCCAGCTCAGGGACAACAGTCACCTTGACCATC AGTGGAGTCCAGGCAGAAGACGAGGCTGACTATTACTGTCTATC AGCTGACAACAGTGCTACTTGGGTGTTCGGCGGAGGGACCAAGG TGACCGTCCTA
NI-105.24B2-Vh SEQ ID NO: 12 CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTG GGGCCTCGGTGAAGGTTTCCTGTAAGGCATCTGGATACACCTTC GTCAATTACATTATACACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGG GCTTGAGTGGATGGGAATCATCAATCCTAATGGCGGAAACACAA GTTATGCAGAGAAATTCCAGGCCCGAGTCACCTTGACCAGCGAC ACGTCTACGAGTACGGTGTACATGGACCTGAGCAGCCTGACATC TGAGGACACGGCCGTCTATTACTGTGCCGTCCTTTCCCCTTCGAA TCCCTGGGGCCAGGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCG
NI-105.24B2-Vl SEQ ID NO: 14 TCCTATGAGCTGACTCAGCCACCCTCGGTGTCAGTGTCCCCAGG ACAGACGGCCGGGATCACCTGCTCTGGAGATGCTTTGCCAAAGC AATTTGTTTATTGGTACCAGAAGAAGCCAGGCCAGGCCCCTGTGT TATTGATATATAAAGACACTGAGAGGCCCTCACGAATCCCTGAGC GCTTCTCTGGCTCCACCTCAGGGACAACAGTCGCGTTGACCATC AATGGGGTCCAGGCAGAGGACGAGGCTGACTATTACTGTCAATC AGCCGACCGCAGTGGTGCTCTTTGGGTGTTCGGCGGAGGGACC AAGCTGACCGTCCTA
NI-105.4A3 -Vh SEQ ID N0:16 CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGCGGTCCAGCCTG GGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTC AGTGACTATGCCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGG GCTGCAGTGGGTGGCAGTTATATCGTATGAGGGAACTTATAAATA CTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACA ATTCCAAGAACACGCTGAACTTGCAGATGAGCAGCCTGAGAGTT GAAGACACGGCTGTGTATTTCTGTGTGAAAGCTCGAGCCTTTGCC TCCGGACAGCGAAGCACCTCCACCGTACCTGACTACTGGGGCCA GGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCG
NI-105.4A3 -Vl SEQ ID NO: 18 TCCTATGAGCTGACTCAGCCACCCTCGGTGTCAGTGTCCCCAGG ACAAACGGCCAGGATCACCTGCTCTGGAGATGCATTGCCAAAAA AATATGCTTATTGGTACCAGCAGAAGTCAGGCCAGGCCCCTGTGT TGGTCATCTATGAGGACAACAAACGACCCTCCGGGATCCCTGAG AGATTCTCTGGCTCCAGCTCAGGGACAGTGGCCACCTTGACTAT CAGTGGGGCCCAGGTGGACGATGAAGCTGACTACTACTGCTACT CGACAGACATCAGTGGTGACCTTCGGGTGTTCGGCGGAGGGAC CAAGCTGACCGTCCTC
В одном варианте исполнения настоящее изобретение предусматривает изолированный полинуклеотид, содержащий состоящий, по существу, из или состоящий из нуклеиновой кислоты, кодирующей вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, по меньшей мере на 80, 85, 90, 95, 96, примерно на 97, 98, или 99, или 95% идентичный референсной тяжелой цепи VH. В одном варианте исполнения аминокислотная последовательность референсной вариабельной области тяжелой цепи представляет собой SEQ ID NO:9, 13, 17 или 93.
В одном варианте исполнения настоящее изобретение предусматривает изолированный полинуклеотид, содержащий состоящий, по существу, из или состоящий из нуклеиновой кислоты, кодирующей вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина по меньшей мере на 80, 85, 90, 95, 96, примерно на
- 32 031698
97, 98, или 99, или 95%, идентичной референсной легкой цепи VL. В одном варианте исполнения аминокислотная последовательность референсной вариабельной области легкой цепи представляет собой SEQ ID NO:11, 15 или 19.
Настоящее изобретение также включает фрагменты полинуклеотидов по изобретению, как описано в других разделах заявки. Изобретение также дополнительно предусматривает полинуклеотиды, кодирующие слитые полинуклеотиды, Fab фрагменты, и другие производные, как описано тут.
Полинуклеотиды могут быть получены или произведены любым способом, известным специалистам. Например, если нуклеотидная последовательность антитела известна, то полинуклеотид, кодирующий антитело, может быть собран из химически синтезированных олигонуклеотидов, например, как описано у Kutmeier et al., BioTechniques 17 (1994), 242, которая, вкратце, предусматривает синтез перекрывающихся олигонуклеотидов, содержащих участки последовательности, кодирующей антитело, отжиг и лигирование этих олигонуклеотидов, и затем амплификацию лигированных олигонуклеотидов методом ПЦР.
Альтернативно, полинуклеотид, кодирующий антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, вариант или производное, может быть получен из нуклеиновой кислоты из пригодного источника. Если клона, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую конкретное антитело, не существует, но последовательность молекулы антитела известна, то нуклеиновая кислота, кодирующая антитело, может быть химически синтезирована или получена из пригодного источника (например, библиотека кДНК антитела или библиотека кДНК, генерированная из, или нуклеиновая кислота, предпочтительно поли-А+ РНК, изолированная из любой ткани или клеток, экспрессирующих тау-специфическое антитело, таких как гибридомные клетки, выбранные для экспрессии антитела) методом ПЦР амплификации с использованием синтетических праймеров, пригодных для гибридизации с 3'- и 5'-концами последовательности, или путем клонирования с использованием олигонуклеотидного зонда, специфического по отношению к конкретной генной последовательности, для идентификации, например, клона кДНК из библиотеки кДНК, кодирующей антитело. Амплифицированные нуклеиновые кислоты, полученные методом ПЦР, могут затем быть клонированы в пригодные для репликации клонирующие вектора с использованием любого способа, хорошо известного специалистам.
После того как нуклеотидная последовательность и соответствующая аминокислотная последовательность антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, варианта или производного будут определены, с его нуклеотидной последовательностью могут быть проведены манипуляции с использованием способов, хорошо известных специалистам, для воздействия на нуклеотидные последовательности, например, методами рекомбинантной ДНК, сайт-направленного мутагенеза, ПЦР и т.д. (см., например, методики, описанные в Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990) и Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1998), которые обе целиком включены сюда в качестве ссылок), для получения антител, имеющих разные аминокислотные последовательности, например, для создания аминокислотных замещений, делеций и/или инсерций.
IV. Экспрессия полипептидов антитела.
После манипуляций с выделенным генетическим материалом для обеспечения антител или их антигенсвязывающих фрагментов, вариантов или производных по изобретению полинуклеотиды, кодирующие антитела, типично вставляют в вектор экспрессии для введения в клетки-хозяева, которые могут быть использованы для получения желательного количества антитела. Рекомбинантная экспрессия антитела или его фрагмента, производного или аналога, например тяжелой или легкой цепи антитела, которые связываются с молекулой-мишенью, описана в данном документе. После того как будет получен полинуклеотид, кодирующий молекулу антитела или тяжелую или легкую цепь антитела или их участок (предпочтительно, содержащий вариабельный домен тяжелой или легкой цепи), в соответствии с изобретением, вектор для продуцирования молекулы антитела может быть приготовлен по технологии рекомбинантной ДНК с использованием методик, хорошо известных специалистам. Таким образом, способы получения белка путем экспрессии полинуклеотида, содержащего нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело, описаны в данном документе. Способы, хорошо известные квалифицированным специалистам в данной области техники, могут быть использованы для конструирования экспрессионных векторов, содержащих кодирующие последовательности антитела и пригодные транскрипционные и трансляционные контрольные сигналы. Такие способы включают, например, in vitro методики рекомбинантной ДНК, методы синтеза и in vivo генетическую рекомбинацию. Изобретение, таким образом, предусматривает пригодные для репликации векторы, содержащие нуклеотидную последовательность, кодирующую молекулу антитела по изобретению или ее тяжелую, или легкую цепь, или вариабельный домен тяжелой или легкой цепи, функционально связанный с промотором. Такие векторы могут включать нуклеотидную последовательность, кодирующую константную область молекулы антитела (см., например, международные заявки WO 86/05807 и WO 89/01036 и патент США № 5122464), и вариабельный домен антитела может быть клонирован в такой вектор для экспрессии целиком тяжелой или легкой цепи.
Термин вектор или экспрессионный вектор используется тут для обозначения векторов, исполь
- 33 031698 зуемых в соответствии с настоящим изобретением в качестве носителя для введения и экспрессии желательного гена в клетке-хозяине. Как известно квалифицированным специалистам в данной области техники, такие векторы могут быть легко выбраны из группы, состоящей из плазмид, фагов, вирусов и ретровирусов. В общем, векторы, совместимые с настоящим изобретением, будут содержать селектируемый маркер, пригодные сайты рестрикции для обеспечения возможности клонирования желательного гена и способности проникать в и/или реплицироваться в эукариотических или прокариотических клетках. В целях настоящего изобретения могут быть использованы многочисленные системы векторов экспрессии. Например, один из классов векторов использует элементы ДНК, выделенные из вирусов животных, таких как вирус папилломы крупного рогатого скота, вирус полиомы, аденовирус, вирус коровьей оспы, бакуловирус, ретровирусы (RSV (вирус саркомы Рауса), MMTV (вирус опухоли молочной железы мышей) или MOMLV (вирус мышиной лейкемии Молони)) или вирус SV40. Другие предусматривают использование полицистронных систем с внутренними сайтами связывания рибосом. Дополнительно, клетки, имеющие ДНК, интегрированную в их хромосомы, могут быть выбраны путем введения одного или нескольких маркеров, которые обеспечивают возможность селекции трансфицированных клетокхозяев. Маркер может обеспечивать прототрофию ауксотрофного хозяина, резистентность к биоцидам (например, антибиотикам) или резистентность к тяжелым металлам, таким как медь. Ген селектируемого маркера может быть или непосредственно связан с ДНК-последовательностями для экспрессии, или введен в ту же самую клетку путем котрансформации. Для оптимального синтеза мРНК могут быть также необходимы дополнительные элементы. Такие элементы могут включать сигнальные последовательности, сигналы сплайсинга, а также промоторы транскрипции, энхансеры и сигналы терминации.
В конкретных вариантах исполнения клонированные гены вариабельной области вставляют в вектор экспрессии вместе с генами константной области тяжелой и легкой цепей (например, человеческими генами константной области тяжелой и легкой цепей), как было описано выше. В одном варианте исполнения это делается с использованием фирменного вектора экспрессии Biogen IDEC, Inc., который называется NEOSPLA, раскрытого в патенте США № 6159730. Такой вектор содержит промотор/энхансер цитомегаловируса, мажорный промотор мышиного бета-глобина, точку начала репликации SV40, последовательность полиаденилирования гормона роста крупного рогатого скота, неомицинфосфотрансферазу экзон 1 и экзон 2, ген дигидрофолатредуктазы и лидерную последовательность. Было обнаружено, что этот вектор обеспечивает очень высокой уровень экспрессии антител при включении генов вариабельной и константной областей, трансфекции в клетки СНО с последующей селекцией в среде, содержащей G418, и амплификацией с метотрексатом. Конечно, любой вектор экспрессии, способный вызывать экспрессию в эукариотических клетках, может быть использован в настоящем изобретении. Примеры пригодных векторов включают, без ограничения, плазмиды pcDNA3, pHCMV/Zeo, pCR3,1, pEF1/His, pIND/GS, pRc/HCMV2, pSV40/Zeo2, pTRACER-HCMV, pUB6/V5-His, pVAX1 и pZeoSV2 (поставляются фирмой Invitrogen, San Diego, CA), и плазмиду pCI (поставляется фирмой Promega, Madison, WI). В общем, скрининг больших количеств трансформированных клеток для выявления тех из них, которые экспрессируют пригодно высокие уровни тяжелых и легких цепей иммуноглобулина, является обычной экспериментальной процедурой, которая может быть выполнена, например, роботизированными системами. Системы векторов также описаны в патентах США №№ 5736137 и 5658570, каждый из которых целиком включен сюда в качестве ссылки. Эта система обеспечивает высокие уровни экспрессии, например >30 пг/клетку/сутки. Другие типичные примеры систем векторов раскрыты, например, в патенте США № 6413777.
В других вариантах исполнения антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные по изобретению могут быть экспрессированы с использованием полицистронных конструктов, таких как раскрытые в публикации патентной заявки США № 2003-0157641 А1, целиком включенной в данный документ. В таких системах экспрессии множество представляющих интерес генных продуктов, таких как тяжелые и легкие цепи антител, может быть получено из одного полицистронного конструкта. Такие системы преимущественно используют участок внутренней посадки рибосомы (IRES) для обеспечения относительно высоких уровней антител. Совместимые последовательности IRES раскрыты в патенте США № 6193980, который также включен в данный документ. Квалифицированным специалистам в данной области техники известно, что такие системы экспрессии могут быть использованы для эффективного получения полного спектра антител, раскрытых в данной заявке.
В общем случае после приготовления вектора или ДНК-последовательности, кодирующей мономерную субъединицу антитела, вектор экспрессии может быть введен в пригодную клетку-хозяина. Введение плазмиды в клетку-хозяина может быть осуществлено различными методами, хорошо известными квалифицированным специалистам в данной области техники. Такие методы включают, без ограничения, трансфекцию, включая липотрансфекцию с использованием, например, Fugene® или липофектамина, слияние протопластов, осаждение фосфатом кальция, слияние клеток с ДНК, заключенной в оболочку, микроинъекции, и инфицирование интактным вирусом. Типично, введение плазмиды в хозяина осуществляется с помощью стандартного способа соосаждения с фосфатом кальция. Клетки-хозяева, содержащие экспрессионный конструкт, выращивают в условиях, пригодных для продуцирования легких цепей и тяжелых цепей, и анализируются на синтез тяжелой и/или легкой цепей белка. Типичные примеры ме
- 34 031698 тодики анализа включают твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), радиоиммуноанализ (RIA) или анализ с помощью клеточного сортировщика с активацией флуоресценции (FACS), иммуногистохимию и т. п.
Вектор экспрессии переносят в клетку-хозяина обычными методами, и трансфицированные клетки затем культивируют обычными способами получения антитела для использования в описанных тут способах. Таким образом, изобретение включает клетки-хозяева, содержащие полинуклеотид, кодирующий антитело по изобретению или его тяжелую, или легкую цепь, функционально связанный с гетерологичным промотором. В конкретных вариантах исполнения для экспрессии двухцепочечных антител вектора, кодирующие как тяжелые, так и легкие цепи, могут коэкспрессироваться в клетке-хозяине для экспрессии полной молекулы иммуноглобулина, как детальнее описано ниже.
Клетка-хозяин может быть котрансфицирована двумя экспрессионными векторами по изобретению, где первый вектор кодирует полипептид, выделенный из тяжелой цепи, и второй вектор кодирует полипептид, выделенный из легкой цепи. Два вектора могут содержать идентичные селектируемые маркеры, которые обеспечивают возможность равной экспрессии тяжелой и легкой цепей полипептидов. Альтернативно, может быть использован один вектор, который кодирует как тяжелую, так и легкую цепь полипептидов. В таких ситуациях легкая цепь преимущественно расположена перед тяжелой цепью во избежание образования избытка токсичной свободной тяжелой цепи 9 (см. Proudfoot, Nature 322 (1986), 52; Kohler, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980), 2197). Кодирующие последовательности тяжелых и легких цепей могут включать кДНК или геномную ДНК.
В используемом тут значении клетки-хозяева относятся к клеткам, которые содержат векторы, сконструированные с использованием методов рекомбинантной ДНК и кодирующие по меньшей мере один гетерологичный ген. В описаниях способов выделения антител из рекомбинантных хозяев термины клетка и клеточная культура используются взаимозаменяемо для обозначения источника антитела, за исключением тех случаев, когда четко указано иное. Другими словами, выделение полипептида из клеток может обозначать использование или осажденных центрифугированием цельных клеток, или клеточной культуры, содержащей как среду, так и суспендированные клетки.
Различные системы экспрессии хозяин-вектор могут быть использованы для экспрессии молекул антитела для использования в описанных тут способах. Такие системы экспрессии в хозяине включают носители, с помощью которых представляющие интерес кодирующие последовательности могут быть получены и затем очищены, но также включают клетки, которые могут, будучи трансформированными или трансфицированными пригодными нуклеотидными кодирующими последовательностями, экспрессировать in situ молекулу антитела по изобретению. Они включают, без ограничения, микроорганизмы, такие как бактерии (например, Е. coli, В. subtilis), трансформированные векторами экспрессии ДНК рекомбинантного бактериофага, плазмидной ДНК или космидной ДНК, содержащими кодирующие последовательности антитела; дрожжи (например, Saccharomyces, Pichia) трансформированные экспрессионными векторами рекомбинантных дрожжей, содержащих кодирующие последовательности антитела; системы клеток насекомых, инфицированных экспрессионными векторами рекомбинантного вируса (например, бакуловируса), содержащего кодирующие последовательности антитела; системы растительных клеток, инфицированных экспрессионными векторами рекомбинантного вируса (например, вирус мозаики цветной капусты, CaMV; вирус мозаики табака, TMV) или трансформированные экспрессионными векторами рекомбинантных плазмид (например, Ti-плазмиды), содержащими кодирующие последовательности антитела; или системы клеток млекопитающих (например, клетки COS, CHO, NSO, BLK, 293, 3T3), содержащих рекомбинантные экспрессионные конструкты, содержащие промоторы, выделенные из генома клеток млекопитающих (например, промотор металлотионеина) или из вирусов млекопитающих (например, аденовирусный поздний промотор; промотор вируса коровьей оспы 7.5K). В одном варианте исполнения бактериальные клетки, такие как Escherichia coli и более предпочтительно эукариотические клетки, особенно для экспрессии цельной рекомбинантной молекулы антитела, используются для экспрессии рекомбинантной молекулы антитела. Например, клетки млекопитающих, такие как клетки яичника китайского хомячка (СНО) в сочетании с вектором, таким как промоторный элемент мажорного промежуточного гена человеческого цитомегаловируса, являются эффективной системой экспрессии антител (см., например, Foecking et al., Gene 45 (1986), 101; Cockett et al., Bio/Technology 8 (1990), 2).
Линия клетки-хозяина, используемой для экспрессии белка, часто имеет происхождение от млекопитающих; квалифицированные специалисты считаются способными определить конкретные линии клетки-хозяина, наиболее подходящие для экспрессии в них желательного генного продукта. Типичные примеры линий клетки-хозяина включают, без ограничения, СНО (яичника китайского хомячка), DG44 и DUXB11 (линии яичника китайского хомячка, DHFR (дигидрофолатредуктаза)-минус), HELA (человеческий рак шейки матки), CVI (линия почки обезьян), COS (производное CVI с Т-антигеном SV40), VERY, BHK (почка детенышей хомяка), MDCK, WI38, R1610 (фибробласт китайского хомячка) BALBC/3T3 (фибробласт мыши), HAK (линия почки хомяка), SP2/O (мышиная миелома), P3х63-Ag3,653 (мышиная миелома), BFA-1c1BPT (бычьи эндотелиальные клетки), RAJI (человеческие лимфоциты) и 293 (человеческая почка). В конкретном варианте исполнения линии клетки-хозяина представляют собой клетки СНО или 293. Линии клетки-хозяина типично являются доступными от коммерческих организаций, из
- 35 031698
Американской коллекции тканевых культур (American Tussue Culture Collection) или из опубликованной литературы.
Кроме того, может быть выбран штамм клетки-хозяина, который модулирует экспрессию вставленных последовательностей или модифицирует и процессирует генный продукт желательным конкретным образом. Такие модификации (например, гликозилирование) и процессинг (например, расщепление) белковых продуктов могут быть важны для функции белка. Разные клетки-хозяева имеют характерные и специфические механизмы посттрансляционного процессинга и модификации белков и генных продуктов. Могут быть выбраны пригодные клеточные линии или системы хозяев для обеспечения точной модификации и процессинга экспрессирующегося чужеродного белка. Для этого могут быть использованы эукариотические клетки-хозяева, обладающие клеточными механизмами для надлежащего процессинга первичного транскрипта, гликозилирования и фосфорилирования генного продукта.
Для долгосрочного продуцирования рекомбинантных белков с высоким выходом предпочтительна стабильная экспрессия. Например, могут быть созданы генно-инженерными методами клеточные линии, которые стабильно экспрессируют молекулу антитела. Вместо использования экспрессионных векторов, содержащих вирусные точки начала репликации, клетки-хозяева могут быть трансформированы с помощью ДНК, находящейся под управлением пригодных контрольных элементов экспрессии (например, промотора, энхансера, последовательностей, терминаторов транскрипции, сайтов полиаденилирования и т.д.), и селектируемого маркера. После введения чужеродной ДНК генно-модифицированные клетки могут быть оставлены для роста на 1-2 дня в обогащенных средах и затем перенесены на селективные среды. Селектируемый маркер в рекомбинантной плазмиде придает резистентность, необходимую для селекции, и позволяет клеткам стабильно интегрировать плазмиду в их хромосомы и расти с образованием очагов, которые, в свою очередь, могут быть клонированы и растянуты в клеточные линии. Этот способ может быть преимущественно использован в генно-инженерных методах получения клеточных линий, которые стабильно экспрессируют молекулу антитела.
Может быть использован ряд систем селекции, включая, без ограничений, гены тимидинкиназы вируса простого герпеса (Wigler et al., Cell 11 (1977), 223), гипоксантин-гуанин фосфорибозилтрансферазы (Szybalska & Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48 (1992), 202) и аденинфосфорибозилтрансферазы (Lowy et al., Cell 22 (1980), 817), которые могут быть использованы в tk-, hgprt- или aprt-клетках соответственно. Кроме того, антиметаболитная резистентность может быть использована в качестве основы для селекции следующих генов: dhfr, который придает резистентность к метотрексату (Wigler et al., Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980), 357; O'Hare et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 (1981), 1527); gpt, который придает резистентность к микофенольной кислоте (Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 (1981), 2072); neo, который придает резистентность к аминогликозиду G-418 Goldspiel et al., Clinical Pharmacy 12 (1993), 488-505; Wu and Wu, Biotherapy 3 (1991), 87-95; Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32 (1993), 573-596; Mulligan, Science 260 (1993), 926-932; и Morgan and Anderson, Ann. Rev. Biochem. 62 (1993), 191-217; TIB TECH 11 (1993), 155-215; и hygro, который придает резистентность к гигромицину (Santerre et al., Gene 30 (1984), 147. Могут быть использованы общеизвестные специалистам способы технологии рекомбинантной ДНК, описанные Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990); и в Главах 12 и 13, Dracopoli et al. (eds), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994); Colberre-Garapin et al., J. Mol. Biol. 150:1 (1981), которые целиком включены сюда в качестве ссылок.
Уровни экспрессии молекул антитела могут быть повышены путем амплификации вектора (см. обзор Bebbington and Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Academic Press, New York, vol. 3. (1987)). В тех случаях, когда маркер в векторной системе экспрессии антитела является амплифицирующимся, повышение уровня ингибитора, присутствующего в культуре клетки-хозяина, будет увеличивать число копий маркерного гена. Поскольку амплифицированная область ассоциирована с геном антитела, продуцирование антитела также будет возрастать (см. Crouse et al., Mol. Cell. Biol. 3 (1983), 257).
In vitro продуцирование обеспечивает возможность масштабирования для получения больших количеств желательных полипептидов. Методики культивации клеток млекопитающих в условиях тканевой культуры известны специалистам в данной области техники и включают культуру в гомогенной суспензии, например в реакторе с эрлифтным перемешиванием или в реакторе с непрерывным перемешиванием, или иммобилизованные или арестованные клеточные культуры, например в пустотелых волокнах, микрокапсулах, на агарозных микробусинах или керамических картриджах. При необходимости и/или желании растворы полипептидов могут быть очищены обычными хроматографическими методами, например гель-фильтрацией, ионообменной хроматографией, хроматографией на DEAE-целлюлозе или (иммуно)аффинной хроматографией, например, после предпочтительного биосинтеза синтетической шарнирной области полипептида или перед, или после стадии гидрофобной (HIC) хроматографии, описанной тут.
Гены, кодирующие антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные по изобретению, могут также экспрессироваться в клетках, не принадлежащих млекопитающим, таких
- 36 031698 как бактерии, или клетки насекомых, или дрожжи, или растительные клетки. Бактерии, легко поглощающие нуклеиновые кислоты, включают члены семейств энтеробактерий (Enterobacteriaceae), такие как штаммы Escherichia coli или Salmonella; бацилл (Bacillaceae), такие как Bacillus subtilis; Pneumococcus; Streptococcus и Haemophilus influenzae. Кроме того, следует понимать, что при экспрессии в бактериях гетерологичные полипептиды типично становятся частью телец включения. Гетерологичные полипептиды должны быть изолированы, очищены и затем собраны в функциональные молекулы. В тех случаях, когда желательны тетравалентные формы антител, субъединицы будут затем осуществлять самосборку в тетравалентные антитела (см., например, международную заявку WO 02/096948).
В бактериальных системах может быть выбран ряд предпочтительных экспрессионных векторов в зависимости от предполагаемого использования экспрессируемой молекулы антитела. Например, в тех случаях, когда должно быть получено большое количество такого белка для приготовления фармацевтических композиций молекулы антитела, могут быть желательны векторы, обеспечивающие экспрессии высоких уровней слитых белковых продуктов, которые могут быть легко очищены. Такие векторы включают, без ограничений, вектор экспрессии pUR278 E. coli (Ruther et al., EMBO J. 2 (1983), 1791), в которой кодирующая последовательность антитела может быть индивидуально лигирована в вектор в рамке с кодирующей областью lacZ таким образом, чтобы продуцировался слитый белок; векторы pIN (Inouye & Inouye, Nucleic Acids Res. 13 (1985), 3101-3109; Van Heeke & Schuster, J. Biol. Chem. 24 (1989), 5503-5509) и т.п. Векторы pGEX могут быть также использованы для экспрессии чужеродных полипептидов в виде слитых белков с глутатион^-трансферазой (GST). В общем, такие слитые белки являются растворимыми и могут быть легко очищены из лизированных клеток путем адсорбции и связывания с матрицей глутатион-агарозных бусин с последующим элюированием в присутствии свободного глутатиона. Векторы pGEX сконструированы таким образом, чтобы они включали сайты расщепления тромбином или протеазой фактора Ха для высвобождения клонированного целевого генного продукта от GST-фрагмента.
В дополнение к прокариотам могут быть также использованы эукариотические микроорганизмы. Saccharomyces cerevisiae или обычные пекарские дрожжи являются наиболее распространенными эукариотическими микроорганизмами, хотя ряд других штаммов является широко доступным, например Pichia pastoris. Для экспрессии в Saccharomyces обычно используется плазмида YRp7, например Stinchcomb et al., Nature 282 (1979), 39; Kingsman et al., Gene 7 (1979), 141; Tschemper et al., Gene 10 (1980), 157. Эта плазмида уже содержит ген TRP1, который обеспечивает селектируемый маркер для мутантного штамма дрожжей, не обладающего способностью к росту в триптофане, например АТСС No. 44076 или РЕР4-1 (Jones, Genetics 85 (1977), 12). Присутствие поражения trpl, характерное для генома дрожжевой клетки-хозяина, при этом обеспечивает эффективные условия для детектирования трансформации по росту в отсутствие триптофана.
В системах насекомых вирус ядерного полиэдроза Autographa californica (AcNPV) типично используется в качестве вектора для экспрессии чужеродных генов. Вирус растет в клетках Spodoptera frugiperda. Кодирующая последовательность антитела может быть клонирована индивидуально в несущественные области (например, ген полиэдрина) вируса и помещена под контроль промотора AcNPV (например, промотора полиэдрина).
После того как молекула антитела по изобретению будет подвергнута рекомбинантной экспрессии, цельные антитела, их димеры, индивидуальные легкие и тяжелые цепи или другие формы иммуноглобулина по настоящему изобретению могут быть очищены в соответствии со стандартными процедурами, известными специалистам, включая, например, хроматографию (например, ионообменную, аффинную, особенно по аффинности к специфическому антигену после белка А, и эксклюзионную хроматографию на колонке), центрифугирование, дифференциальную растворимость, например осаждение сульфатом аммония, или любым другим стандартным методом очистки белков (см., например, Scopes, Protein Purification, Springer Verlag, N.Y. (1982)). Альтернативно, другой способ повышения аффинности антител по изобретению раскрыт в публикации патента США № 2002-0123057 А1.
V. Слитые белки и конъюгаты.
В определенных вариантах исполнения полипептид антитела содержит аминокислотную последовательность или один или несколько фрагментов, которые в нормальных условиях не ассоциированы с антителом. Типичные примеры модификаций описаны более детально ниже. Например, одноцепочечный fv-фрагмент антитела по изобретению может включать гибкую линкерную последовательность или может быть модифицирован путем введения функционального фрагмента (например, ПЭГ, лекарственного препарата, токсина или метки, такой как флуоресцентной, радиоактивной, ферментной, ядерномагнитной, тяжелого металла и т.п.).
Полипептид антитела по изобретению может содержать, состоять, по существу, из или состоять из слитого белка. Слитые белки представляют собой химерные молекулы, которые включают, например, тау-связывающий домен иммуноглобулина по меньшей мере с одним сайтом связывания мишени и по меньшей мере один гетерологичный участок, т. е. участок, с которым он обычно не связан в природных условиях. Аминокислотные последовательности могут нормально существовать в разных белках, которые объединяются в слитом полипептиде, или они могут нормально существовать в одном и том же белке, но быть перегруппированы в слитом полипептиде. Слитые белки могут быть получены, например,
- 37 031698 путем химического синтеза или путем создания и трансляции полинуклеотида, в котором пептидные области закодированы в желательном соотношении.
Термин гетерологичный по отношению к полинуклеотиду или полипептиду означает, что полинуклеотид или полипептид был получен из объекта, отличного от остальной части объекта, с которым он сравнивается. Например, в используемом тут значении гетерологичный полипептид для слияния с антителом или его антигенсвязывающим фрагментом получают из неиммуноглобулинового полипептида того же вида или иммуноглобулинового или неиммуноглобулинового полипептида другого вида.
Как более детально описано в других разделах данного описания, антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные по изобретению могут быть дополнительно рекомбинантно слиты с гетерологичным полипептидом на N- или С-конце или химически конъюгированы (включая ковалентные и нековалентные конъюгации) с полипептидами или другими композициями. Например, антитела могут быть рекомбинантно слиты или конъюгированы с молекулами, пригодными для использования в качестве меток для анализов детектирования, и эффекторными молекулами, такими как гетерологичные полипептиды, лекарственные вещества, радионуклиды или токсины (см., например, международные заявки WO 92/08495; WO 91/14438; WO 89/12624; патент США № 5314995 и европейскую патентную заявку ЕР 0396387).
Антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные по изобретению могут состоять из аминокислот соединенных друг с другом пептидными связями или модифицированными пептидными связями, т. е. пептидными изостерами, и могут содержать аминокислоты, отличные от кодируемых 20 генами аминокислот. Антитела могут быть модифицированы в результате природных процессов, таких как посттрансляционный процессинг или методами химической модификации, которые хорошо известны специалистам. Такие модификации хорошо описаны в основнополагающих текстах и в более детальных монографиях, а также объемной исследовательской литературе. Модификации могут находиться в любом месте антитела, включая пептидную основную цепь, аминокислотные боковые цепи и амино- или карбоксильные концы или на фрагментах, таких как углеводы. Следует понимать, что один и тот же тип модификации может присутствовать в одной и той же или в разных степенях в нескольких участках данного антитела. Также данное антитело может содержать много типов модификаций. Антитела могут быть разветвленными, например, в результате убиквитинирования, и они могут быть циклическими с разветвлениями или без них. Циклические, разветвленные и разветвленные циклические антитела могут быть получены в результате природных посттрансляционных процессов или могут быть получены методами синтеза. Модификации включают ацетилирование, ацилирование, АДФрибозилирование, амидирование, ковалентное присоединение флавина, ковалентное присоединение фрагмента гема, ковалентное присоединение нуклеотида или нуклеотидного производного, ковалентное присоединение липида или липидного производного, ковалентное присоединение фосфатидилинозита, перекрестное сшивание, циклизацию, образование дисульфидной связи, деметилирование, образование ковалентных поперечных связей, образование цистеина, образование пироглутамата, формилирование, гамма-карбоксилирование, гликозилирование, образование гликозил-фосфатидилинозитной связи (GPI anchor), гидроксилирование, йодирование, метилирование, миристоилирование, окисление, пегилирование, протеолитический процессинг, фосфорилирование, пренилирование, рацемизацию, селеноилирование, сульфирование, медиируем транспортной РНК присоединение аминокислот к белкам, такое как аргинилирование, и убиквитинирование (см., например, Proteins - Structure and Molecular Properties, Т.Е. Creighton, W.H. Freeman and Company, New York 2nd Ed., (1993); Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B.C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, pgs. 1-12 (1983); Seifter et al., Meth. Enzymol. 182 (1990), 626-646; Rattan et al., Ann. NY Acad. Sci. 663 (1992), 48-62).
Настоящее изобретение также предусматривает слитые белки, содержащие антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, вариант или производное, и гетерологичный полипептид. В одном варианте исполнения слитый белок по изобретению содержит, состоит, по существу, из или состоит из полипептида, имеющего аминокислотную последовательность любой одной или нескольких VH областей антитела по изобретению или аминокислотную последовательность любой одной или нескольких VL областей антитела по изобретению, или ее фрагменты, или варианты и последовательность гетерологичного полипептида. В другом варианте исполнения слитый белок для использования в способах диагностики и лечения, раскрытый в данном документе, содержит, состоит, по существу, из или состоит из полипептида, имеющего аминокислотную последовательность любого из одного, двух, трех VH-CDR антитела или их фрагментов, вариантов или производных, или аминокислотную последовательность любого из одного, двух, трех VL-CDR антитела или их фрагментов, вариантов или производных и последовательность гетерологичного полипептида. В одном варианте исполнения слитый белок содержит полипептид, имеющий аминокислотную последовательность VH-CDR3 антитела по настоящему изобретению или ее фрагмент, производное или вариант и последовательность гетерологичного полипептида, причем слитый белок специфически связывается с тау. В другом варианте исполнения слитый белок содержит полипептид, имеющий аминокислотную последовательность по меньшей мере одной области VH антитела по изобретению и аминокислотную последовательность по меньшей мере одной области VL антитела по изобретению или их фрагменты, производные или варианты и последовательность гетерологичного полипептида.
- 38 031698
В одном варианте исполнения VH и VL области слитого белка соответствуют единому источнику антитела (или фрагменту scFv или Fab), которое специфически связывает тау. В еще одном варианте исполнения слитый белок для использования в способах диагностики и лечения, раскрытый в данном документе, содержит полипептид, имеющий аминокислотную последовательность любого из одного, двух, трех или более VH CDR антитела и аминокислотную последовательность любого из одного, двух, трех или более VL CDR антитела или их фрагменты или варианты и последовательность гетерологичного полипептида. В одном варианте исполнения два, три, четыре, пять, шесть или более VH-CDR или VL-CDR соответствуют одному источнику антитела (или фрагменту scFv или Fab) по изобретению. Молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие такие слитые белки, также входят в объем изобретения.
Типичные примеры слитых белков, описанные в литературе, включают слияния рецептора Т-клетки (Gascoigne et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987), 2936-2940; CD4 (Capon et al., Nature 337 (1989), 525531; Traunecker et al., Nature 339 (1989), 68-70; Zettmeissl et al., DNA Cell Biol. USA 9 (1990), 347-353; и Byrn et al., Nature 344 (1990), 667-670); L-селектина (хоминг-рецептор) (Watson et al., J. Cell. Biol. 110 (1990), 2221-2229; и Watson et al., Nature 349 (1991), 164-167); CD44 (Aruffo et al., Cell 61 (1990), 13031313); CD28 и B7 (Linsley et al., J. Exp. Med. 173 (1991), 721-730); CTLA-4 (Lisley et al., J. Exp. Med. 174 (1991), 561-569); CD22 (Stamenkovic et al., Cell 66 (1991), 1133-1144); рецептор TNF (фактор некроза опухоли) (Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991), 10535-10539; Lesslauer et al., Eur. J. Immunol. 27 (1991), 2883-2886; и Peppel et al., J. Exp. Med. 174 (1991), 1483-1489 (1991) и рецептор a IgE (Ridgway и Gorman, J. Cell. Biol. 115 (1991), Abstract № 1448).
Как описано в других разделах данного документа, антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные по изобретению могут быть слиты с гетерологичными полипептидами для увеличения in vivo периода полувыведения полипептидов или для использования в иммуноанализах с использованием способов, известных специалистам. Например, в одном варианте исполнения ПЭГ может быть конъюгирован с антителами по изобретению для увеличения их периода полувыведения in vivo (см., например, Leong et al., Cytokine 16 (2001), 106-119; Adv. in Drug Deliv. Rev. 54 (2002), 531 или Weir et al., Biochem. Soc. Transactions 30 (2002), 512).
Кроме того, антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные по изобретению могут быть слиты с маркерными последовательностями, такими как пептид, для облегчения их очистки или детектирования. В конкретных вариантах исполнения маркерная аминокислотная последовательность представляет собой гексагистидиновый пептид (HIS), такой как метка, предусмотренная, в том числе, в векторе pQE (QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, Calif., 91311) и многих других коммерчески доступных продуктах. Как описано Gentz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989), 821824, например, гексагистидин обеспечивает удобство очистки слитого белка. Другие пептидные метки, пригодные для очистки, включают, без ограничения, метку НА, которая соответствует эпитопу, выделенному из белка гемагглютинина гриппа (Wilson et al., Cell 37 (1984), 767), и метку flag.
Слитые белки могут быть получены с использованием способов, хорошо известных специалистам (см., например, патенты США №№ 5116964 и 5225538). Точное положение места слияния может быть выбрано эмпирически для оптимизации секреции или характеристик связывания слитого белка. ДНК, кодирующую слитый белок, затем трансфицируют в клетку-хозяина для экспрессии.
Антитела по настоящему изобретению могут быть использованы в неконъюгированной форме или могут быть конъюгированы по меньшей мере с одной из различных молекул, например, для улучшения терапевтических свойств молекулы, для улучшения детектирования мишени или для визуализации или терапии пациента. Антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные по изобретению могут быть мечеными или конъюгированными до или после очистки, если очистка проводится. В частности, антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные по изобретению могут быть конъюгированы с терапевтическими агентами, пролекарствами, пептидами, белками, ферментами, вирусами, липидами, модификаторами биологического ответа, фармацевтическими агентами или ПЭГ.
Конъюгаты, представляющие собой иммунотоксины, включающие обычные антитела, были широко описаны в литературе. Токсины могут быть связаны с антителами обычными методами спаривания или иммунотоксины, содержащие фрагменты белковых токсинов, могут быть получены в виде слитых белков. Антитела по настоящему изобретению могут быть использованы соответствующим образом для получения таких иммунотоксинов. Иллюстративные примеры таких иммунотоксинов описаны Byers, Seminars Cell. Biol. 2 (1991), 59-70 и Fanger, Immunol. Today 12 (1991), 51-54.
Квалифицированным специалистам в данной области техники известно, что конъюгаты могут быть также собраны с использованием различных методик в зависимости от выбранного для конъюгации агента. Например, конъюгаты с биотином получают, например, путем проведения реакции таусвязывающего полипептида с активированным сложным эфиром биотина, таким как Nгидроксисукцинимидный сложный эфир биотина. Аналогично, конъюгаты с флуоресцентным маркером могут быть получены в присутствии связующего агента, например, перечисленные тут, или путем проведения реакции с изотиоцианатом или флуоресцеин-изотиоцианатом. Конъюгаты антител или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные по изобретению получают аналогично.
- 39 031698
Настоящее изобретение дополнительно охватывает антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные по изобретению, конъюгированные с диагностическим или терапевтическим агентом. Антитела могут быть использованы диагностически, например, для того, чтобы продемонстрировать наличие неврологической болезни, для указания риска возникновения неврологической болезни, для контроля развития или прогрессирования неврологической болезни, т. е. таупатической болезни, в качестве части процедуры клинических испытаний, например для определения эффективности данной схемы лечения и/или профилактики. Детектированию может способствовать связывание антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, варианта или производного с детектируемым веществом. Примеры детектируемых веществ включают различные ферменты, простетические группы, флуоресцентные материалы, люминесцентные материалы, биолюминесцентные материалы, радиоактивные материалы, позитрон-излучающие металлы с использованием различных позитрон-эмиссионных томографий, и нерадиоактивные парамагнитные металлические ионы (см., например, патент США № 4741900), где указаны ионы металлов, которые могут быть конъюгированы с антителами для использования в качестве диагностических средств в соответствии с настоящим изобретением. Примеры пригодных ферментов включают пероксидазу хрена, щелочную фосфатазу, β-галактозидазу или ацетилхолинэстеразу; примеры пригодных комплексов простетических групп включают стрептавидин/биотин и авидин/биотин; примеры пригодных флуоресцентных материалов включают умбеллиферон, флуоресцеин, флуоресцеинизотиоцианат, родамин, дихлортриазиниламинфлуоресцеин, дансил хлорид или фикоэритрин; пример люминесцентного материала включает люминол; примеры биолюминесцентных материалов включают люциферазу, люциферин и экворин; и примеры пригодных радиоактивных материалов включают 125I, 131I, 1UIn или 99Tc.
Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, вариант или производное также могут быть детектируемо мечены путем его связывания с хемолюминесцентным соединением. Присутствие хемолюминесцентно-меченого антитела затем определяют путем детектирования присутствия люминесценции, возникающей в ходе химической реакции. Примерами особенно пригодных соединений хемолюминесцентных меток являются люминол, изолюминол, ароматический (theromatic) сложный эфир акридиния, имидазол, соль акридиния и оксалатный сложный эфир.
Один из способов, которыми антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, вариант или производное могут быть детектируемо помечены, заключается в его связывании с ферментом и использовании связанного продукт в иммунно-ферментном анализе (EIA) (Voller A. The Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) Microbiological Associates Quarterly Publication, Walkersville, Md., Diagnostic Horizons 2 (1978), 1-7); Voller et al., J. Clin. Pathol. 31 (1978), 507-520; Butler, Meth. Enzymol. 73 (1981), 482-523; Maggio, E. (ed.), Enzyme Immunoassay, CRC Press, Boca Raton, Fla., (1980); Ishikawa, E. et al., (eds.), Enzyme Immunoassay, Kgaku Shoin, Tokyo (1981). Фермент, который связывается с антителом, будет реагировать с пригодным субстратом, предпочтительно хромогенным субстратом, таким образом, чтобы получить химический фрагмент, который может быть детектирован, например, спектрофотометрическими, флюориметрическими или оптическими средствами. Ферменты, которые могут быть использованы для детектируемого мечения антитела, включают, без ограничения, малатдегидрогеназу, стафилококковую нуклеазу, дельта-5-стероидизомеразу, алкогольдегидрогеназу дрожжей, альфа-глицерофосфат, дегидрогеназу, триозофосфатизомеразу, пероксидазу хрена, щелочную фосфатазу, аспарагиназу, глюкозооксидазу, бета-галактозидазу, рибонуклеазу, уреазу, каталазу, глюкоза-6-фосфатдегидрогеназу, глюкоамилазу и ацетилхолинэстеразу. Дополнительно детектирование может осуществляться колориметрическими способами, которые используют хромогенный субстрат для фермента. Детектирование может быть также проведено путем визуального сравнения степени ферментативной реакции субстрата по сравнению с аналогично приготовленными стандартами.
Детектирования могут также производиться с использованием различных других иммуноанализов. Например, путем радиоактивного мечения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, варианта или производного можно детектировать антитело с помощью радиоиммуноанализа (RIA) (см., например, Weintraub В., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, (March, 1986)), которая включена сюда в качестве ссылки). Радиоактивный изотоп может быть детектирован различными средствами, включая, без ограничений, гамма-счетчик, сцинтилляционный счетчик или авторадиографию.
Антитело или его антигенсвязывающи фрагмент, вариант или производное может также быть детектируемо меченым с использованием излучающих флуоресценцию металлов, таких как 152Eu или другие лантаниды. Такие металлы может быть присоединены к антитело с помощью таких металлхелатирующих групп, как диэтилентриаминпентауксусная кислота (DTPA) или этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA).
Методики конъюгации различных фрагментов с антителом или его антигенсвязывающего фрагмента, варианта или производного хорошо известны (см., например, Arnon et al., Monoclonal Antibodies For Immunotergeting Of Drugs In Cancer Therapy, in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. (1985); Hellstrom et al., Antibodies For Drug Delivery, in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), Marcel Dekker, Inc., pp. 623-53 (1987); Thorpe, Antibody Car
- 40 031698 riers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review, in Monoclonal Antibodies '84: Biological and Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); Analysis, Results, and Future Prospective Of Therapeutical Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy, in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection and Therapy, Baldwin et al. (eds.), Academic Press pp. 303-16 (1985) и Thorpe et al., The Preparation and Cytotoxic Properties of Antibody-Toxin Conjugates, Immunol. Rev. 62 (1982), 119-158).
Как упоминалось, в определенных вариантах исполнения может быть конъюгирован фрагмент, который усиливает стабильность или эффективность связывающей молекулы, например связывающий полипептид, например антитело или его иммуноспецифический фрагмент. Например, в одном варианте исполнения ПЭГ может быть конъюгирован со связывающими молекулами по изобретению для увеличения их периода полувыведения in vivo (Leong et al., Cytokine 16 (2001), 106; Adv. in Drug Deliv. Rev. 54 (2002), 531 или Weir et al., Biochem. Soc. Transactions 30 (2002), 512).
VI. Композиции и способы применения.
Настоящее изобретение относится к композициям, содержащим вышеупомянутую таусвязывающую молекулу, например антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению, или его производное, или вариант, или полинуклеотид, вектор или клетку по изобретению. Композиция по настоящему изобретению может дополнительно включать фармацевтически приемлемый носитель. Кроме того, фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может включать дополнительные агенты, такие как интерлейкины или интерфероны, в зависимости от предполагаемого использования фармацевтической композиции. Для использования в лечении таупатической болезни, например болезни Альцгеймера, дополнительный агент может быть выбран из группы, состоящей из малых органических молекул, анти-тау антитела и их комбинаций. Таким образом, в конкретном варианте исполнения настоящее изобретение относится к использованию тау-связывающей молекулы, например антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по настоящему изобретению, или связывающей молекулы, обладающей, по существу, такой же специфичностью связывания любого из них, полинуклеотида, вектора или клетки по настоящему изобретению для изготовления фармацевтической или диагностической композиции для профилактического и терапевтического лечения таупатической болезни, контроля прогрессирования таупатической болезни или реакции на лечение таупатической болезни у субъекта или для определения риска развития таупатической болезни у субъекта.
Таким образом, в одном варианте исполнения настоящее изобретение относится к способу лечения неврологического расстройства, характеризующегося аномального накопления и/или отложения тау в мозгу и центральной нервной системе соответственно, который включает введение нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества любой из вышеописанных тау-связывающих молекул, антител, полинуклеотидов, векторов или клеток по настоящему изобретению. Термин неврологическое расстройство включает, без ограничений, таупатические болезни, такие как болезнь Альцгеймера, комплекс боковой амиотрофический склероз/паркинсонизм-деменция, деменция с аргирофильными гранулами, амилоидная ангиопатия британского типа, церебральная амилоидная ангиопатия, кортикобазальная дегенерация, болезнь Крейцфельда-Якоба, боксерская деменция, диффузные нейрофибриллярные клубочки с кальцификацией, синдром Дауна, фронтотемпоральная деменция, фронтотемпоральная деменция с паркинсонизмом, ассоциированная с хромосомой 17, фронтотемпоральная лобарная дегенерация, болезнь Герстманна-Штреусслера-Шейнкера, болезнь Галлервордена-Шпатца, миозит с тельцами включений, множественная системная атрофия, миотоническая дистрофия, болезнь НиманнаПика типа С, негуамовская болезнь двигательных нейронов с нейрофибриллярными клубками, болезнь Пика, постэнцефалический паркинсонизм, прион-протеинцеребральная амилоидная ангиопатия, прогрессивный субкортикальный глиоз, прогрессивный надъядерный паралич, подострый склерозирующий панэнцефалит, деменция, проявляющаяся только в образовании клубков, мультиинфарктная деменция и ишемический инсульт. Если не указано иное, термины нейродегенеративный, неврологический или психоневрологический используются в данном документе взаимозаменяемо.
Особое преимущество терапевтического подхода по настоящему изобретению заключается в том, что антитела по настоящему изобретению получают из В-клеток или В-клеток памяти здоровых людей без признаков таупатической болезни и, таким образом, с определенной вероятностью, являются способными предотвращать клинически проявляющейся таупатической болезни или уменьшать риск возникновения клинически проявляющейся болезни или задержки начала проявления или прогрессирования клинически проявляющейся болезни. Типично, антитела по настоящему изобретению также были уже успешно подвергнуты соматическому созреванию, т. е. оптимизации в отношении селективности и эффективности высокоаффинного связывания с тау-молекулой-мишенью путем соматических вариаций вариабельных областей антитела.
Знание того, что такие клетки in vivo, например, у человека, не были активированы с помощью родственных или других физиологических белков или клеточных структур в том смысле, что автоиммунологическая или аллергическая реакция также имеет большую медицинскую важность, поскольку это означает значительно возрастающие шансы успешно выживания на протяжении фаз клинических испытаний. Можно сказать, что эффективность, приемлемость и переносимость были уже продемонстрированы до преклинической и клинической разработки профилактического или терапевтического антитела у по
- 41 031698 меньшей мере одного человеческого субъекта. Таким образом, можно ожидать, что человеческие антитау антитела по настоящему изобретению благодаря как их специфической структуре мишени эффективности в качестве терапевтических агентов, так и уменьшенной для них вероятности побочных эффектов значительно повышают их клиническую вероятность успеха.
Настоящее изобретение также предусматривает фармацевтический и диагностический соответственно комплект или набор, включающий один или несколько контейнеров, заполненных одним или несколькими из вышеописанных ингредиентов, например анти-тау антителом, его связывающим фрагментом, производным или вариантом, полинуклеотидом, вектором или клеткой по настоящему изобретению. С таким контейнером (контейнерами) может быть связано уведомление, имеющее форму, предписанную правительственным агентством, регулирующим производство, использование или продажу фармацевтических средств или биологических продуктов, в котором отражено данное агентство, разрешение на производство, применение или продажу для введения людям. В дополнение или альтернативно набор содержит реагенты и/или инструкции по использованию в соответствующих диагностических анализах. Композиция, например набор по настоящему изобретению, конечно, является особенно пригодной для оценки риска, диагностики, профилактики и лечения расстройства, которое сопровождается присутствием тау и, в частности, применимо для лечения болезни Альцгеймера (AD), комплекса боковой амиотрофический склероз/паркинсонизм-деменция (ALS-PDC), деменции с аргирофильными гранулами (AGD), амилоидной ангиопатии британского типа, церебральной амилоидной ангиопатии, кортикобазальной дегенерации (CBD), болезни Крейцфельда-Якоба (БКЯ), боксерской деменции, диффузных нейрофибриллярных клубочков с кальцификацией, синдрома Дауна, фронтотемпоральной деменции, фронтотемпоральной деменции с паркинсонизмом, ассоциированной с хромосомой 17 (FTDP-17), фронтотемпоральной лобарной дегенерации, болезни Герстманна-Штреусслера-Шейнкера, болезни ГаллерворденаШпатца, миозита с тельцами включений, множественной системной атрофии, миотонической дистрофии, болезни Ниманна-Пика типа С (NP-C), негуамовской болезни двигательных нейронов с нейрофибриллярными клубками, болезни Пика (PiD), постэнцефалического паркинсонизма, прионпротеинцеребральной амилоидной ангиопатии, прогрессивного субкортикального глиоза, прогрессивного надъядерного паралича (ПНП), подострого склерозирующего панэнцефалита, деменции, проявляющейся только в образовании клубков, мультиинфарктной деменции и ишемического инсульта.
Фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут быть составлены в соответствии со способами, хорошо известными специалистам (см. например, Remington: The Science and Practice of Pharmacy (2000), University of Sciences in Philadelphia, ISBN 0-683-306472). Примеры пригодных фармацевтических носителей хорошо известны специалистам и включают фосфатно-солевые буферные растворы, воду, эмульсии, такие как эмульсии масло/вода, различные типы смачивающих агентов, стерильные растворы и т.д. Композиции, содержащие такие носители, могут быть составлены хорошо известными обычными способами. Такие фармацевтические композиции могут быть введены субъекту в пригодной дозе. Введение пригодных композиций может быть осуществлено разными путями, например путем внутривенного, интраперитонеального, подкожного, внутримышечного, интраназального, местного или интрадермального введения или доставкой в спинной или головной мозг. Аэрозольные композиции, такие как композиции назального спрея, включают очищенные водные или другие растворы активного агента с консервантами и изотоническими агентами. Такие композиции доводят до рН и изотонического состояния, совместимых со слизистыми оболочками носа. Композиции для ректального или вагинального введения могут быть выполнены в виде суппозитория с пригодным носителем.
Кроме того, несмотря на то, что настоящее изобретение включает существующую в настоящее время стандартную (хотя, к счастью, нечасто применяющуюся) процедуру просверливания маленького отверстия в черепе для введения лекарственного средства по настоящему изобретению, в одном аспекте связывающая молекула, особенно антитело или лекарственное средство на основе антитела по настоящему изобретению, может проникать через гематоэнцефалический барьер, что обеспечивает возможность внутривенного или перорального введения.
Схема дозирования будет определяться лечащим врачом и клиническими факторами. Как хорошо известно в медицине, дозировки для любого конкретного пациента зависят от многих факторов, включая размеры пациента, площадь поверхности тела, возраст, конкретное соединение, которое должно быть введено, пол, время и путь введения, общее состояние здоровья и другие параллельно вводимые лекарственные препараты. Типичная доза может иметь значение, например, в интервале от 0,001 до 1000 мкг (или нуклеиновой кислоты для экспрессии или для ингибирования экспрессии в этом интервале значений); однако предусматриваются дозы ниже или выше такого примерного диапазона значений, особенно с учетом вышеупомянутых факторов. В общем, доза может составлять, например, от примерно 0,0001 до 100 мг/кг, более обычно от 0,01 до 5 мг/кг (например, 0,02, 0,25, 0,5, 0,75, 1, 2 мг/кг и т.д.) веса тела хозяина. Например, доза может составлять 1 или 10 мг/кг веса тела, или иметь значение в интервале 1-10 мг/кг, или составлять по меньшей мере 1 мг/кг. Дозы, имеющие промежуточные значения в вышеуказанных диапазонах, также считаются входящими в объем изобретения. Такие дозы могут вводиться субъектам ежедневно, через день, еженедельно или в соответствии с любым другим графиком, определенным с помощью эмпирического анализа. Типичный пример лечения предусматривает введение множества доз
- 42 031698 на протяжении длительного периода времени, например по меньшей мере шести месяцев. Дополнительные типичные примеры схем лечения предусматривают введение один раз каждые две недели, или раз в месяц, или один раз каждые 3-6 месяцев. Типичные примеры схем применения включают 1-10 или 15 мг/кг в последовательные дни, 30 мг/кг через день или 60 мг/кг еженедельно. В некоторых способах два или больше моноклональных антител с разными специфичностями связывания вводятся одновременно, причем доза каждого вводимого антитела находится в указанных интервалах значений. Прогресс может контролироваться с помощью периодической оценки. Препараты для парентерального введения включают стерильные водные или неводные растворы, суспензии и эмульсии. Примерами неводных растворителей являются пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительные масла, такие как оливковое масло, и пригодные для инъекций органические сложные эфиры, такие как этилолеат. Водные носители включают воду, спиртовые/водные растворы, эмульсии или суспензии, включая солевые и забуференные среды. Парентеральные носители включают раствор хлорид натрия, декстрозы Рингера, декстрозы и хлорид натрия, раствор Рингера с лактозой или нелетучие масла. Внутривенные носители включают жидкие и питательные пополняющие растворы, пополняющие растворы электролитов (такие как на основе декстрозы Рингера) и т.п. Также могут присутствовать консерванты и другие добавки, такие как, например, антимикробные средства, антиоксиданты, хелатирующие агенты и инертные газы и т.п. Кроме того, фармацевтическая композиция по изобретению может включать дополнительные агенты, такие как допамин или психофармакологические лекарственные средства, в зависимости от предполагаемого использования фармацевтической композиции.
Кроме того, в конкретном варианте исполнения настоящего изобретения фармацевтическая композиция может быть составлена в виде вакцины, например, если фармацевтическая композиция по изобретению содержит анти-тау антитело или его связывающий фрагмент, производное или вариант, для пассивной иммунизации. Как упоминалось в разделе известного уровня техники, внеклеточные частицы фосфор-тау были описаны в плазме и ЦСЖ (Aluise et al., Biochim. Biophys. Acta. 1782 (2008), 549-558), и исследования трансгенных мышиных линий с использованием активной вакцинации фосфорилированными тау-пептидами продемонстрировали пониженные уровни агрегатов тау в мозгу и замедленное прогрессирование нарушений поведения (Sigurdsson, J. Alzheimers Dis. 15 (2008), 157-168; Boimel et al., Exp Neurol. 224 (2010), 472-485). Соответственно будет обоснованным ожидать, что пассивная иммунизация человеческими анти-тау антителами и эквивалентными тау-связывающими молекулами по настоящему изобретению поможет избежать нескольких нежелательных эффектов концепции терапии активной иммунизации, как уже обсуждалось в разделе известного уровня техники. Поэтому анти-тау антитела и их эквиваленты по настоящему изобретению будут особенно полезны для использования в качестве вакцины для профилактики или облегчения таупатических болезней, таких как AD, ALS-PDC, AGD, CBD, БКЯ, FTD, FTDP-17, NP-C, PiD, ПНП или другие таупатии, упомянутые ранее.
В одном варианте исполнения может быть полезным использование рекомбинантных биспецифических или мультиспецифических конструктов антител по настоящему изобретению (см. Fischer and Leger, Pathobiology 74 (2007), 3-14). Такая биспецифическая молекула может быть сконструирована нацеленной на тау одной связывающей ветвью и на другой патологической объект, такой как АР или альфасинуклеин или разные патологические конформации тау, второй связывающей ветвью. Альтернативно, вторая связывающая ветвь может быть сконструирована нацеленной на белок, присутствующий на гематоэнцефалическом барьере для облегчения проникновения антитела в головной мозг.
В одном варианте исполнения может быть полезным использовать рекомбинантные Fab (rFab) и одноцепочечные фрагменты (scFvs) антитела по настоящему изобретению, которые могут легче проникать через клеточную мембрану. Например, Robert et al., Protein Eng. Des. Sel. (2008) Oct 16; S1741-0134, в заблаговременной онлайн-публикации описывают использование химерных рекомбинантных Fab (rFab) и одноцепочечных фрагментов (scFvs) моноклонального антитела WO-2, которое распознает эпитоп в N-концевой области Ар. Полученные методами генной инженерии фрагменты были способны (i) предотвращать амилоидную фибриллизацию, (ii) дезагрегировать ранее сформировавшиеся Ap1-42 фибриллы и (iii) ингибировать AP1-42 олигомер-медиируемую нейротоксичность in vitro так же эффективно, как и цельная молекула IgG. Ощутимые преимущества использования полученных методами генной инженерии малых Fab и scFv форматов антитела, не обладающих эффекторной функцией, включают более эффективное прохождение через гематоэнцефалический барьер и минимизацию риска инициирования воспалительных побочных реакций. Кроме того, помимо того, что scFv и однодоменные антитела сохраняют специфичность связывания полноразмерных антител, они могут экспрессироваться как отдельные гены и внутриклеточно в клетках млекопитающих как интратела с потенциалом изменения укладки, взаимодействий, модификаций или субклеточной локализации их мишеней (см. обзор, например, Miller and Messer, Molecular Therapy 12 (2005), 394-401).
В отличном от описанного подходе Muller et al., Expert Opin. Biol. Ther. (2005), 237-241 описывают технологическую платформу, так называемую Технологию суперантитела, которая, как утверждается, позволяет антителам проникать в живые клетки, не повреждая их. Такие проникающие в клетку антитела открывают новые диагностические и терапевтические возможности. Для таких антител был предложен
- 43 031698 термин TransMabs.
В дополнительных вариантах исполнения может быть желательно совместное введение или последовательное введение других антител, пригодных для лечения таупатической болезни. В одном варианте исполнения дополнительное антитело содержится в фармацевтической композиции по настоящему изобретению. Примеры антител, которые могут быть использованы для лечения субъекта, включают, без ограничений, антитела, нацеленные на бета-амилоид, альфа-синуклеин, TDP-43 и SOD-1.
В дополнительных вариантах исполнения может быть желательным совместное введение или последовательное введение других нейрозащитных агентов, пригодных для лечения таупатической болезни. В одном варианте исполнения дополнительный агент содержится в фармацевтической композиции по настоящему изобретению. Примеры нейрозащитных агентов, которые могут быть использованы для лечения субъекта, включают, без ограничения, ингибитор ацетилхолинэстеразы, антагонист глутаматергического рецептора, ингибиторы киназы, ингибиторы HDAC, противовоспалительные агенты, дивалпроекс натрия или любую их комбинацию. Примеры других нейрозащитных агентов, которые могут быть использованы совместно с фармацевтической композицией по настоящему изобретению, описаны в литературе (см., например, международную заявку WO 2007/011907). В одном варианте исполнения дополнительный агент представляет собой допамин или агонист допаминового рецептора.
Терапевтически эффективная доза или количество относится к такому количеству активного ингредиента, которое достаточно для облегчения симптомов или состояния. Терапевтическая эффективность и токсичность таких соединений могут быть определены стандартными фармацевтическими процедурами на клеточных культурах или экспериментальных животных, например ED50 (доза, терапевтически эффективная у 50% популяции) и LD50 (доза, летальная для 50% популяции). Дозовое соотношение между терапевтическими и токсичными эффектами представляет собой терапевтический индекс и может быть выражено в виде соотношения LD50/ED50. В одном варианте исполнения терапевтический агент в композиции присутствует в количестве, достаточном для восстановления или сохранения нормального поведения и/или когнитивных способностей в случае AD, ALS-PDC, AGD, CBD, БКЯ, FTD, FTDP-17, NP-C, PiD, ПНП или других таупатических болезней, упомянутых выше.
Из предшествующего описания понятно, что настоящее изобретение охватывает любое использование тау-связывающей молекулы, содержащей по меньшей мере один CDR вышеописанного антитела, в частности для диагностики и/или лечения таупатической болезни, как было указано выше, особенно болезни Альцгеймера. В одном варианте исполнения указанная связывающая молекула представляет собой антитело по настоящему изобретению или его иммуноглобулиновую цепь. Кроме того, настоящее изобретение относится к антиидиотипическим антителам любого из вышеупомянутых ранее описанных антител. Они представляют собой антитела или другие связывающие молекулы, которые связываются с уникальной антигенной пептидной последовательностью, расположенной в вариабельной области антитела поблизости от антигенсвязывающего сайта и пригодны, например, для детектирования анти-тау антител в образце субъекта.
В другом варианте исполнения настоящее изобретение относится к диагностической композиции, содержащей любую одну из вышеописанных тау-связывающих молекул, антител, антигенсвязывающих фрагментов, полинуклеотидов, векторов или клеток по изобретению и необязательно пригодных для детектирования средств, таких как реагенты, обычно используемые в иммунных диагностических способах или способах на основе нуклеиновых кислот. Антитела по изобретению, например, пригодны для использования в иммуноанализах, в которых они могут быть использованы в жидкой фазе или связаны с твердофазным носителем. Примерами иммуноанализов, в которых может использоваться антитело по изобретению, являются конкурентные и неконкурентные иммуноанализы в прямом или непрямом форматах. Примерами таких иммуноанализов являются радиоиммуноанализ (RIA), сэндвич-методы (количественный иммунный анализ), поточная цитометрия и анализ методом вестерн-блоттинга. Антигены и антитела по изобретению могут быть связаны с различными носителями и использованы для выделения клеток, специфически связывающихся с ними. Примеры хорошо известных носителей включают стекло, полистирол, поливинилхлорид, полипропилен, полиэтилен, поликарбонат, декстран, найлон, амилозы, природные и модифицированные целлюлозы, полиакриламиды, агарозы и магнетит. По своей природе носитель для использования в целях изобретения может быть растворимым или нерастворимым. Существует много разных меток и способов мечения, известных рядовым специалистам в данной области техники. Примеры типов меток, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, включают ферменты, радиоизотопы, коллоидные металлы, флуоресцентные соединения, хемолюминесцентные соединения и биолюминесцентные соединения (см. также варианты исполнения, описанные выше).
В качестве дополнительного варианта исполнения тау-связывающие молекулы, в частности антитела по настоящему изобретению, могут быть также использованы в способе диагностики расстройства у индивидуума путем получения образца биологической жидкости от исследуемого индивидуума, который может быть образцом крови, образцом лимфы или любым другим образцом биологической жидкости, и введения в контакт образца биологической жидкости с антителом по настоящему изобретению в условиях, обеспечивающих возможность образования комплексов антитела-антиген. Уровень таких комплексов затем определяют способами, известными специалистам, причем уровень, значительно превышающий
- 44 031698 полученный в контрольном образце, указывает на болезнь исследуемого индивидуума. Аналогично также может быть использован специфический антиген, связывающийся антителами по изобретению. Таким образом, настоящее изобретение относится к in vitro иммуноанализу, включающему связывающую молекулу, например антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению.
В этом контексте настоящее изобретение также относится к средствам, сконструированным специально для этой цели. Например, может быть использована матрица на основе антитела, которую, например, загружают антителами или эквивалентными антигенсвязывающими молекулами по настоящему изобретению, специфически распознающими тау. Конструирование микроматричных иммуноанализов подытожено Kusnezow et al., Mol. Cell Proteomics 5 (2006), 1681-1696. Соответственно настоящее изобретение также относится к микроматрицам, нагруженным тау-связывающими молекулами, идентифицированными в соответствии с настоящим изобретением.
В одном варианте исполнения настоящее изобретение относится к способу диагностики таупатической болезни у субъекта, включающему определение присутствия тау и/или патологически модифицированного и/или агрегированного тау во взятом у субъекта образце для диагностики по меньшей мере одного антитела по настоящему изобретению, его тау-связывающего фрагмента или тау-связывающей молекулы, имеющей, по существу, такую же специфичность связывания любого из них, где присутствие патологически модифицированного и/или агрегированного тау указывает на нейродегенеративную таупатию и увеличение уровня патологически модифицированного и/или агрегированного тау по сравнению с уровнем физиологических форм тау указывает на прогрессирование нейродегенеративной таупатии у указанного субъекта.
Субъект, которому проводится диагностика, может быть бессимптомным или находиться на преклинической стадии болезни. В одном варианте исполнения контрольный субъект имеет таупатическую болезнь, например AD, ALS-PDC, AGD, CBD, БКЯ, FTD, FTDP-17, NP-C, PiD, ПНП или другие таупатии, упомянутые ранее, где сходство между уровнями патологически модифицированного и/или агрегированного тау и эталонным стандартом указывает, что субъект, которому проводится диагностика, имеет таупатическую болезнь. Альтернативно или дополнительно в качестве второго контроля контрольный субъект не имеет таупатической болезни, причем различие между уровнями тау и/или патологически модифицированного и/или агрегированного тау и эталонного стандарта указывает, что субъект, которому проводится диагностика, имеет таупатическую болезнь. В одном варианте исполнения субъект, которому проводится диагностика, и контрольный субъект (субъекты) находятся в одной возрастной группе. Образец для анализа может быть любой биологической жидкостью, которая подозревается на содержание патологически модифицированного и/или агрегированного тау, например образцом крови, ЦСЖ или мочи.
Уровень тау и/или патологически модифицированного и/или агрегированного тау можно оценивать любым пригодным способом, известным специалистам, включающим, например, анализ тау по одной или нескольким методикам, выбранным из вестерн-блоттинга, иммунопреципитации, твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), радиоиммуноанализа (RIA), сортировки клеток с возбуждением флуоресценции (FACS), двумерного гель-электрофореза, масс-спектроскопии (МС), часпролетной матричноактивированной лазерной десорбции/ионизации-МС (MALDI-TOF), часпролетной поверхностноусиленной лазерной десорбции/ионизации (SELDI-TOF), высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), жидкостной экспресс-хроматографии белков (FPLC), многомерной жидкостной хроматографии (LC) с последующей тандемной масс-спектрометрией (MS/MS) и лазерной денситометрией. В одном варианте исполнения указанная in vivo визуализация тау включает позитронно-эмиссионную томографию (PET), однофотонную эмиссионную томографию (SPECT), оптическую визуализацию в ближней ИК-области (NIR) или магнитно-резонансную визуализацию (MRI).
Способы диагностики таупатической болезни, такой как болезнь Альцгеймера, контроля прогрессирования таупатической болезни и контроля лечения таупатической болезни с использованием антитела и родственных средств, которые могут быть адаптированы к настоящему изобретению, также описаны в международных заявках WO 93/08302, WO 94/13795, WO 95/17429, WO 96/04309, WO 2002/062851 и WO 2004/016655. Аналогично, способы детектирования тау на основе антитела описаны в международной заявке WO 2005/080986, содержание которой включено в данный документ в качестве ссылки. Такие способы могут использоваться, как описано, но с тау-специфическим антителом, связывающим фрагментом, производным или вариантом по настоящему изобретению.
В следующем аспекте настоящее изобретение также относится к пептидам, имеющим эпитоп тау, специфически распознаваемый любым антителом по настоящему изобретению. В одном варианте исполнения такой пептид содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:42, или модифицированную последовательность, в которой одна, две, три, четыре, пять, шесть, семь или более аминокислот замещены, удалены и/или вставлены, где пептид распознается любым антителом по настоящему изобретению, например антителом NI-105.4E4 или NI-105.4E3.
В одном варианте исполнения настоящего изобретения такой пептид может быть использован для диагностики нейродегенеративной таупатии у субъекта, включающей стадию определения присутствия антитела, которое связывается с пептидом в биологическом образце указанного субъекта, и используется
- 45 031698 для диагностики таупатии у указанного субъекта путем измерения уровней антител, которые распознают описанный выше пептид по настоящему изобретению, и сравнения с результатами измерений уровней у здоровых субъектов сравнимого возраста и пола. Повышенный уровень измеренных антител, специфических к указанному пептиду по настоящему изобретению, будет индикативным для диагностики таупатии у указанного субъекта. Пептид по настоящему изобретению может быть использован в виде матрицы, набора и композиции соответственно, как описано выше.
Такие и другие варианты исполнения раскрыты и охватываются описанием и примерами настоящего изобретения. Дополнительная литература, касающаяся любых материалов, методов, применений и соединений для использования в соответствии с настоящим изобретением, может быть получена из публичных библиотек и баз данных с использованием, например, электронных устройств. Например, может быть использована публичная база данных Medline, размещенная в Национальном центре биотехнологической информации (National Center for Biotechnology Information) и/или Национальной медицинской библиотеке (National Library of Medicine) Национальных институтов здравоохранения (National Institutes of Health). Дополнительные базы данных и веб-адреса, такие как Европейский институт биоинформатики (European Bioinformatics Institute, EBI), являющийся частью Европейской лаборатории молекулярной биологии (European Molecular Biology Laboratory, EMBL), известны квалифицированному специалисту в данной области техники и могут быть также получены с использованием поисковых интернет-систем. Обзор патентной информации в области биотехнологии и обзор соответствующих источников патентной информации, пригодный для ретроспективного поиска и для текущего оповещения, приведен в Berks, TIBTECH 12 (1994), 352-364.
Приведенное выше раскрытие в общем описывает настоящее изобретение. За исключением случаев, когда указано иное, используемые тут термины имеют определения, приведенные в Oxford Dictionary of Bio химия and Molecular Biology, Oxford University Press, 1997, в редакции 2000 г., переиздание 2003 г., ISBN 0198506732. В тексте данного описания упоминаются несколько документов. Полная библиографическая информация приведена в конце описания непосредственно перед формулой изобретения. Содержание всех упоминаемых ссылок (включая литературные ссылки, выданные патенты, опубликованные патентные заявки, упоминаемые в данной заявке, описаниях и инструкциях производителей и т.д.) настоящим явным образом включены сюда в качестве ссылок; однако это не является допущением того, что любой упомянутый документ в действительности является известным уровнем техники по отношению к настоящему изобретению.
Более полное понимание может быть достигнуто со ссылкой на следующие конкретные примеры, приведенные тут только в целях иллюстрации и не предназначенные для какого-либо ограничения объема изобретения.
Примеры
Приведенные далее примеры иллюстрируют изобретение, но не должны истолковываться как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения. Описанные далее эксперименты в примерах 1-4 проиллюстрированы и описаны для антител NI-105.4E4, N1-105.24.62 и NI-105.4A3 в полученном после клонирования состоянии, т.е. каркасные 1 (FR1) Ig-вариабельные области без корректировки по последовательностям зародышевой линия (GL) человеческих вариабельных тяжелых и легких цепей (см. фиг. 1).
Материалы и способы.
Детальные описания обычных способов, таких как используемые тут, можно найти в цитируемой литературе (см. также The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, Seventeenth Ed., edited by Beers and Berkow (Merck & Co., Inc. 2003)).
В практике настоящего изобретения используются, за исключением случаев, когда указано иное, обычные методики клеточной биологии, клеточных культур, молекулярной биологии, трансгенной биологии, микробиологии, рекомбинантных ДНК и иммунологии, которые все входят в известный уровень техники. Более подробное описание общих методик, пригодных для использования в практике настоящего изобретения, врач-практик может обратиться к стандартным руководствам и обзорам по биологии клетки и тканевым культурам (см. также ссылки, указанные в примерах). Общие способы молекулярной и клеточной биохимии можно найти в таких стандартных руководствах, как Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed. (Sambrook et al., Harbor Laboratory Press 2001); Short Protocols in Molecular Biology, 4th Ed. (Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons 1999); DNA Cloning, Volumes I and II (Glover ed., 1985); Oligonucleotide Synthesis (Gait ed., 1984); Nucleic Acid Hybridization (Hames and Higgins eds. 1984); Transcription and Translation (Hames and Higgins eds. 1984); Culture of Animal Cells (Freshney and Alan, Liss, Inc., 1987); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (Miller and Calos, eds.); Current Protocols in Molecular Biology and Short Protocols in Molecular Biology, 3rd Edition (Ausubel et al., eds.); и Recombinant DNA Methodology (Wu, ed., Academic Press). Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (Miller and Calos, eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Methods In Enzymology, Vols. 154 и 155 (Wu et al., eds.); Immobolized Cells and Enzymes (IRL Press, 1986); Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Immunochemical Methods In Cell and Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV (Weir and Blackwell, eds., 1986). Protein Methods (Bollag et al., John Wiley & Sons 1996);
- 46 031698
Non-Viral Vectors for Gene Therapy (Wagner et al. eds., Academic Press 1999); Viral Vectors (Kaplitt & Loewy eds., Academic Press 1995); Immunology Methods Manual (Lefkovits ed., Academic Press 1997); и Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures in Biotechnology (Doyle & Griffiths, John Wiley & Sons 1998). Реагенты, клонирующие векторы и наборы для генетических манипуляций, упоминаемые в данном описании, поставляются коммерческими поставщиками, такими как BioRad, Stratagene, Invitrogen, SigmaAldrich и ClonTech. Общие методики клеточных культур и коллекций сред описаны в Large Scale Mammalian Cell Culture (Hu et al., Curr. Opin. Biotechnol. 8 (1997), 148); Serum-Free Media (Kitano, Biotechnology 17 (1991), 73); Large Scale Mammalian Cell Culture (Curr. Opin. Biotechnol. 2 (1991), 375); и Suspension Culture of Mammalian Cell (Birch et al., Bioprocess Technol. 19 (1990), 251); Extracting information fron cDNA arrays, Herzel et al., CHAOS 11 (2001), 98-107.
Способы идентификации тау-специфических В-клеток и клонирование соответствующих антител.
За исключением случаев, когда ниже будет указано иное, идентификация тау-специфических Вклеток и молекулярное клонирование анти-тау антител, проявляющих представляющую интерес специфичность, а также их рекомбинантная экспрессия и функциональная характеризация были или могут быть в общем осуществлены, как описано в примерах и в разделе Дополнительные способы международной заявки РСТ/ЕР 2008/000053, опубликованной как WO 2008/081008, описание которой целиком включено сюда в качестве ссылки. Новый способ идентификации тау-специфических В-клеток и молекулярного клонирования тау-антител, проявляющих представляющую интерес специфичность, а также их рекомбинантной экспрессии и функциональной характеризации, приведен в данной заявке. Как описано выше в одном варианте исполнения настоящего изобретения, культуры отдельных или олигоклональных В-клеток культивируют и супернатант культуры, содержащий антитела, продуцируемые указанными В-клетками, подвергают скринингу на присутствие в нем и аффинность новых анти-тау антител. Процесс скрининга включает стадии анализа иммунореактивности чувствительных тканей для определения амилоидных бляшек (TAPIR), описанного в примере 1 и изображенного на фиг. 9; скрининг экстрактов мозга на связывание с PHFTau, как описано в примере 2 и изображено на фиг. 3 и 8; скрининг на связывание пептида, выделенного из тау с аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO:6, с фосфатными группами на аминокислотах Ser-202 и Ser-205; на аминокислоте Thr-231 и/или на аминокислотах Ser-396 и Ser-404 указанной последовательности, аналогично описанному в примере 3 и изображенному на фиг. 5, с нефосфорилированными пептидами по результатам экспериментов по подтверждению эпитопа для антитела NI-105.4E4; скрининг на связывание полноразмерного тау с аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO:6, и выделение антитела, для которого детектируется связывание, или клетки, продуцирующей указанное антитело, как описано в международном патенте WO 2008/081008, как описано в примере 1 и изображено на фиг. 2, 5 и 7.
Очистка антигена.
Рекомбинантный человечески Tau40 был приобретен у фирмы rPeptide (Bogart, GA, USA). PHFTau был экстрагирован из мозга, пораженного болезнью Альцгеймера.
Выделение спаренных спиральных филаментов, содержащих патологически фосфорилированные филаменты тау (PHFTau), проводили в соответствии со способом Goedert et al. (Goedert et al., Neuron 8 (1992), 159-168) с модификациями. Один грамм ткани пораженного болезнью Альцгеймера (AD) мозга разрезают на кусочки размером 5 мм, и удаляют все видимые кровеносные сосуды. Ткань промывают 40 мл охлажденного льдом раствора для промывания (100 мМ Tris pH 7,4, 6 мМ EGTA, 1 мМ Na3VO4 и 1 мМ NaF) три раза с последующей гомогенизацией с 20 мл буфера для лизиса (10 мМ Tris pH 7,4, 0,8М NaCl, 1 мМ EGTA, 1хкоктейль ингибитора протеазы, 1 мМ Na3VO4, 1 мМ NaF, 1 мМ AEBSF, 10% сахарозы). Гомогенат центрифугируют при 4°C при 20000xg в течение 20 мин. Супернатант собирают с добавлением N-лауроилсаркозината (Sigma, Switzerland) до 1% (мас./об.). После двух часов инкубирования при 37°C со встряхиванием супернатант центрифугируют при 4°C при 100000xg в течение одного часа. Осадок собирают и ресуспендируют в PBS. После очистки от возможных загрязняющих иммуноглобулинов с помощью магнитных бусин с белком А суспензию PHFTau хранят при -80°C до использования. Контрольный экстракт здоровой ткани контрольного человеческого мозга готовят соответственно.
Скрининг человеческого антитела тау.
ELISA.
96-луночные микропланшеты с половинным размером лунок (Corning) покрывают рекомбинантным тау-белком (rPeptide, Bogart, USA) при стандартной концентрации 1 мкг/мл в карбонатном буфере для покрытий ELISA (рН 9,6) в течение ночи при 4°C. Для скрининга PHFTau 96-луночные микропланшеты Immobilizer (Nunc, Denmark) покрывают PHFTau, экстрагированным из человеческого мозга, пораженного болезнью Альцгеймера (AD), с 1:100 разбавлением в карбонатном буфере для покрытий ELISA (pH9,6) в течение ночи при 4°C. Планшеты промывают PBS-T рН 7,6, и неспецифические связывающие сайты блокируют на 2 ч при комнатной температуре (RT) с помощью PBS-T, содержащего 2% БСА (Sigma, Buchs, Switzerland). Кондиционированную для В-клеток среду переносят с культуральных планшет В-клеток памяти на планшеты для ELISA и инкубируют в течение одного часа при комнатной температуре. Планшеты для ELISA промывают в PBS-T и затем инкубируют с пероксидазой хрена (HRP)
- 47 031698 конъюгированными ослиными античеловеческий IgG (специфическими к фрагменту Fcy) поликлональными антителами (Jackson immunoResearch, Newmarket, UK). После промывания PBS-T связывание человеческих антител определяют путем измерения активности HRP в стандартном колориметрическом анализе.
Скрининг на микропланшетах MULTI-ARRAY®.
Стандартные 96-луночные планшеты 10-Spot MULTI-SPOT (Meso Scale Discovery, USA) покрывают 30 мкг/мл rTau (rPeptide), экстрактом PHFTau из мозга и экстрактом здорового контрольного мозга в PBS. Неспецифические связывающие сайты блокируют на 1 ч при комнатной температуре с помощью PBS-T, содержащего 3% БСА, с последующим инкубированием в кондиционированной для В-клеток среде в течение 1 ч при комнатной температуре. Планшеты промывают PBS-T и затем инкубируют с SULFO-Tag-конъюгированным анти-человеческим поликлональным антителом (Meso Scale Discovery, USA). После промывания PBS-T связанные антитела детектируют путем измерения электрохемолюминесценции с использованием прибора SECTOR Imager 6000 (Meso Scale Discovery, USA).
Молекулярное клонирование тау-антител.
Образцы, содержащие В-клетки памяти, получают от здоровых людей. Собирают живые В-клетки выбранных культур В-клеток памяти и получают мРНК. Затем получают последовательности тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина с использованием подхода гнездовой ПЦР.
Комбинацию праймеров, представляющих все семейства последовательностей репертуара человеческого иммуноглобулина зародышевой линии, используют для амплификации лидерных пептидов, Vсегментов и J-сегментов. Первый раунд амплификация проводят с использованием лидерных пептидспецифических праймеров на 5'-конце и константных область-специфических праймеров на 3'-конце (Smith et al., Nat Protoc. 4 (2009), 372-384). Для тяжелых цепей и каппа-легкой цепи проводят второй раунд амплификации с использованием V-сегмент-специфических праймеров на 5'-конце и J-сегментспецифических праймеры на 3'-конце. Для лямбда-легкой цепи второй раунд амплификации проводят с использованием V-сегмент-специфических праймеров на 5'-конце и С-область-специфического праймера на 3'-конце (Marks et al., Mol. Biol. 222 (1991), 581-597; de Haard et al., J. Biol. Chem. 26 (1999), 1821818230).
Идентификацию клона антитела с желательной специфичностью проводят путем повторного скрининга на ELISA после рекомбинантной экспрессии полных антител. Рекомбинантная экспрессия полных человеческих IgG1 антител или химерных IgG2a антител достигается путем инсерции вариабельных последовательностей тяжелой и легкой цепей в правильной рамке считывания в экспрессионные векторы, которые дополняют последовательность вариабельной области последовательностью, кодирующей лидерный пептид на 5'-конце, и на 3'-конце - последовательностью, кодирующей пригодный константный домен (домены). Для этого конструируют праймеры, содержащие сайт рестрикции, рассчитанный на обеспечение клонирования вариабельных последовательностей тяжелой и легкой цепей в экспрессионные векторы антитела. Тяжелые цепи иммуноглобулинов экспрессируют путем вставки ОТ-ПЦР продукта тяжелой цепи иммуноглобулина в рамке в вектор экспрессии тяжелой цепи, несущий сигнальный пептид и константные домены человеческого иммуноглобулина гамма 1 или мышиного иммуноглобулина гамма 2а. Каппа-легкие цепи иммуноглобулинов экспрессируют путем вставки ОТ-ПЦР-продукта каппалегкой цепи в рамке в вектор экспрессии легкой цепи, содержащий сигнальный пептид и константный домен человеческой каппа-легкой цепи иммуноглобулин. Лямбда-легкие цепи иммуноглобулинов экспрессируют путем вставки ОТ-ПЦР-продукта лямбда-легкой цепи в рамке в вектор экспрессии лямбдалегкой цепи, содержащий сигнальный пептид и константный домен человеческой или мышиной лямбдалегкой цепи иммуноглобулина.
Функциональные рекомбинантные моноклональные антитела получают в результате котрансфекции в клетки HEK293 или СНО (или любую другую пригодную линию клеток-реципиентов человеческого или мышиного происхождения) вектора экспрессии тяжелой цепи Ig и вектора экспрессии каппа- или лямбда-легкой цепи Ig. Рекомбинантное человеческое моноклональное антитело затем очищают от кондиционированной среды путем стандартной очистки на колонке с белком А. Рекомбинантное человеческое моноклональное антитело можно продуцировать в неограниченных количествах с использованием ранзиентно или стабильно трансфицированных клеток. Клеточные линии, продуцирующие рекомбинантное человеческое моноклональное антитело, могут быть получены или путем прямого использования Ig-экспрессионных векторов, или путем повторного клонирования вариабельных областей Ig в разные экспрессионные векторы. Из таких вариабельных областей Ig также могут быть получены производные, такие как F(ab), F(ab)2 и scFv.
Антитела.
Мышиное моноклональное антитело против человеческого тау Tau12 (Covance, California, U.S.A.) и мышиное моноклональное тау-антитело АТ180 (Thermo Scientific, U.S.A.) используют в соответствии с протоколом производителя. Рекомбинантные человеческие тау-антитела NI-105.4E4, N1-105,24132 и NI105.4A3 являются антителами по настоящему изобретению. Их экспрессируют в клетках HEK293 или СНО, очищают от кондиционированной среды и непосредственно используют в последующих экспери
- 48 031698 ментах за исключением случаев, когда указано иное. В примерах 1-4 используют очищенные рекомбинантные антитела по настоящему изобретению.
Прямой ELISA.
96-луночные микропланшеты (Costar, Corning, USA) покрывают рекомбинантным тау-белком (hTau40, rPeptide, Bogart, USA), разведенным до концентрации 1 мкг/мл в карбонатном буфере для покрытий ELISA (50 мМ, рН 9,6) при 4°C в течение ночи. Неспецифические связывающие сайты блокируют в течение 2 ч при комнатной температуре помощью PBS, содержащего 2% БСА (Sigma, Buchs, Switzerland) и 0,5% Tween 20. Связывание человеческих антител по настоящему изобретению (NI-105.4E4, NI-105.24B2 и NI-105.4A3) определяют с использованием HRP-конъюгированных козьих античеловеческий IgG Fcy (Jackson immunoResearch, Newmarket, UK), с последующим измерением активности HRP в стандартном колориметрическом анализе. Значения EC50 рассчитывают методом нелинейной регрессии с использованием прикладной программы GraphPad Prism (San Diego, USA).
Окрашивание белка методом вестерн-блоттинга.
PHFTau и рекомбинантный hTau40 разделяют методом градиентного SDS-PAGE (NuPAGE 4-12%; Invitrogen, Basel, Switzerland) с последующим электроблоттингом на нитроцеллюлозных мембранах. После блокирования неспецифического связывания с помощью 2% БСА при комнатной температуре в течение одного часа, блоты инкубируют в течение ночи с первичными антителами NI-105.4E4, NI-105.24B2 (человеческие) или Tau12 (мышиное моноклональное антитело, Covance, California, U.S.A.), а затем ПХконъюгированным козьим античеловеческим IgGFcy (для человеческих первичных антител) или ПХконъюгированного козьего анти-мышиный IgG вторичного антитела.
Блоты проявляют с использованием ECL (усиленная хемолюминесценция) и детектирования ImageQuant 350 (GE Healthcare, Otelfingen, Switzerland).
Экстракция PHFTau из пораженного болезнью Альцгеймера мозга.
Выделение спаренных спиральных филаментов, содержащих патологически фосфорилированные филаменты тау (PHFTau) проводят в соответствии со способом Goedert et al. (Goedert et al., Neuron 8 (1992), 159-168) с модификациями. Один грамм ткани пораженного болезнью Альцгеймера (AD) мозга разрезают на кусочки размером 5 мм и удаляют все видимые кровеносные сосуды. Ткань промывают 40 мл охлажденного льдом раствора для промывания (100 мМ Tris рН 7,4, 6 мМ EGTA, 1 мМ Na3VO4 и 1 мМ NaF) три раза с последующей гомогенизацией с 20 мл буфера для лизиса (10 мМ Tris рН 7,4, 0,8М NaCl, 1 мМ EGTA, 1х коктейль ингибитора протеазы, 1 мМ Na3VO4, 1 мМ NaF, 1 мМ AEBSF, 10% сахарозы). Гомогенат центрифугируют при 4°C при 20000xg в течение 20 мин. Супернатант собирают с добавлением N-лауроилсаркозината (Sigma, Switzerland) до 1% (мас./об.). После двух часов инкубирования при 37°C со встряхиванием, супернатант центрифугируют при 4°C при 100000xg в течение одного часа. Осадок собирают и ресуспендируют в PBS. После очистки от возможных загрязняющих иммуноглобулинв с помощью магнитных бусин с белком А, суспензию PHFTau хранят при -80°C до использования. Контрольный экстракт ткани здорового контрольного человеческого мозга готовят соответственно.
Синтез тау-пептидов.
Пептид, соответствующий аминокислотам 333-346 hTau40 (333GGGQVEVKSEKLDF346), содержащий эпитоп NI-105.4E4, идентифицированный путем картирования Pepspot (аминокислоты 337-343), был синтезирован фирмой Schafer-N (Copenhagen, Denmark). Дополнительный цистеин был добавлен на Сконце для обеспечения возможности ковалентного связывания с микропланшетами Immobilizer (Nunc, Denmark). Второй пептид, соответствующий аминокислотам 226-239 человеческого тау (226VAWRPTPPKSPSSA239), когнатному эпитопу коммерчески доступного мышиного моноклонального антитела тау АТ180 (Thermo Scientific, USA), был синтезирован соответственно и использовался в качестве контроля.
Трансгенные мыши.
Три разные животные модели таупатий используют для валидации тау антител (и молекул, обладающих специфичностью связывания с ними) по настоящему изобретению.
1. Трансгенные мыши TauP301L (линия 183): экспрессируют человеческий Tau40 с мутацией P301L под контролем мышиного Thy1.2 промотора (получение этих трансгенных животных описано Gotz et al., J. Biol. Chem. 276 (2001), 529-534 и в международной заявке WO 2003/017918, описания которых включены сюда в качестве ссылок)
2. Мыши JNPL3, экспрессирующие самую короткую изоформу 4R человеческого тау с мутацией P301L под контролем мышиного PrP промотора (поставляются фирмой Taconic, Hudson, NY, U.S.A).
3. Мыши P301STau (линия PS19), экспрессирующие человеческий тау с мутацией P301S под контролем мышиного PrP промотора (поставляются фирмой Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine, U.S.A).
Мышиные модели таупатий и соответствующих мышей дикого типа содержат в стандартных условиях с обращенным 12 ч:12 ч циклом свет/тьма со свободным доступом к пище и воде. Группы исследуемого препарата сбалансированы по возрасту и полу.
Пример 1. Валидация мишени и специфичности связывания человеческого тау-антитела.
Для валидации тау как распознаваемой мишени выделенного антитела были проведены прямые
- 49 031698
ELISA-анализы, как описано выше. Для типичного рекомбинантного человеческого антитела NI-105.4A3 96-луночные микропланшеты (Costar, Corning, USA) покрывают рекомбинантным человеческим тау (hTau40, rPeptide, Bogart, USA) разведенным до концентрации 3 мкг/мл, или БСА в карбонатном буфере для покрытий ELISA (рН 9,6) и проводят анализы эффективности связывания антитела. Типичное NI105.4A3 антитело специфически связывается с человеческим тау по результатам ELISA. Связывание с БСА не наблюдается (фиг. 10).
Для определения полумаксимальной эффективной концентрации (EC50) типичных антител NI105.4E4 и NI-105.24B2 были проведены дополнительные эксперименты методом прямого ELISA с различными концентрациями антитела. 96-Луночные микропланшеты (Costar, Corning, USA) покрывают рекомбинантным человеческим тау (hTau40, rPeptide, Bogart, USA), разведенным до концентрации 1 мкг/мл (для анализа антитела NI-105.4E4) или 3 мкг/мл (для анализа антитела №-105.24В2) в карбонатном буфере для покрытий ELISA и проводят испытания эффективности связывания антитела. Значения EC50 рассчитывают методом нелинейной регрессии с использованием прикладной программы GraphPad Prism. Рекомбинантное антитело NI-105.4E4 человеческого происхождения связывается с hTau40 с высокой аффинностью в нижнем наномолярном диапазоне концентраций с EC50, равным 2,4 нМ (фиг. 2). NI105.24B2 связывается с hTau40 с высокой аффинностью в нижнем наномолярном диапазоне концентраций с EC50, равным 6,6 нМ (фиг. 7).
Также определяют полумаксимальную эффективную концентрацию (EC50) типичного антитела NI105.4A3 с использованием экспериментов методом прямого ELISA. Планшеты для ELISA покрывают рекомбинантным человеческим тау (hTau40, 1 мкг/мл), PHFTau (1:100) и контрольным препаратом (1:100), и инкубируют с различными концентрациями антитела. NI-105.4A3 связывается с rTau с высокой аффинностью в нижнем наномолярном диапазоне концентраций с EC50, равным 1,4 нМ. NI-105.4A3 связывается с PHFTau с высокой аффинностью в нижнем наномолярном диапазоне концентраций с EC50, равным 1,2 нМ (фиг. 12).
Пример 2. Анализ связывания рекомбинантных человеческих антител с рекомбинантным тау и патологическим тау, экстрагированным из пораженного болезнью Альцгеймера (AD) мозга.
Для определения связывающей способности NI-105.4E4 и NI-105.24B2 с патологическими таучастицами, экстрагированными из пораженного болезнью Альцгеймера мозга, проводят анализ методами SDS-PAGE и вестерн-блоттинга, как детально описано выше. Блоты инкубируют в течение ночи с первичными антителами NI-105.4E4 (человеческое), NI-105.24B2 (человеческое) или Tau12 (мышине моноклональное антитело, Covance, California, U.S.A.), а затем с ПХ-конъюгированным козьим античеловеческим IgGFcy (для человеческих антител) или ПХ-конъюгированным козьим анти-мышиный IgG вторичным антителом.
Рекомбинантные антитела NI-105.4E4 (фиг. 3) и NI-105.24B2 (фиг. 8) распознают рекомбинантный hTau40, а также патологически модифицированный PHFTau, экстрагированный из пораженного болезнью Альцгеймера (AD) мозга на вестерн-блотах. Как и ожидалось, контрольное антитело Tau12 также распознает обе тау-частицы (фиг. 3).
Дополнительно, как было описано в примере 1 выше, определяют полумаксимальную эффективную концентрацию (EC50) типичного антитела NI-105.4A3 в прямых ELISA-экспериментах с использованием PHFTau. NI-105.4A3 связывается с PHFTau с высокой аффинностью в нижнем наномолярном диапазоне концентраций с EC50, равным 1,2 нМ (фиг. 12).
Пример 3. Картирование связывающего эпитопа NI-105.4E4 и NI-105.4A3 в hTau40.
Пептидную матрицу из 118 пептидных последовательностей, охватывающих полноразмерный hTau40 (аминокислоты 1-441) с перекрыванием 11 аминокислот между двумя соседними пептидами наносят оттиском на нитроцеллюлозную мембрану (JPT Peptide Technologies GmbH, Berlin, Germany). Иммуномечение антител, а также регенерацию мембраны осуществляют в соответствии с инструкциями производителя. Для исключения возможности неспецифического связывания детектирующего антитела, мембрану сначала зондируют ПХ-конъюгированным козьим анти-человеческим IgG, не взаимодействующим с первичным антителом (фиг. 4B). После регенерации мембрану зондируют 100 нМ рекомбинантным антителом NI-105.4E4. Связанное антитело детектируют с использованием ECL и детектирования ImageQuant 350 (GE Healthcare, Otelfingen, Switzerland).
Две группы смежных пептидных спотов (пептиды 83, 84 и 85; пептиды 96 и 97) были специфически идентифицированы с помощью NI105.4E4 (фиг. 4A и A'), при сравнении только с детектирующим антителом (фиг. 4C). Последовательности, охватываемые этими двумя группами пептидов, соответствуют аминокислотам 329-351 и 387-397 hTau40. Эти данные позволяют предположить, что NI-105.4E4 распознает прерывистый эпитоп, включающий две линейные последовательности: одну в домене связывания микротрубочек R4 и вторую в С-концевом домене.
Последовательность, содержащая пептиды 83-85, включает аминокислотные остатки 337-343 hTau40. Данные Pepspot (JPT) позволяют предположить, что NI-105.4E4 распознает эпитоп hTau, содержащий аминокислоты 337-343 человеческого тау. Эта область расположена в домене связывания микротрубочек тау и является консервативной для всех изоформ нейронных человеческих тау, а также для других видов, включая мышей и крыс.
- 50 031698
Поскольку этот домен связан с микротрубочками в физиологическом ассоциированном с микротрубочками тау, NI-105.4E4, как ожидается, будет предпочтительно нацелен на патологически релевантный пул тау, то есть отделенный от микротрубочек.
Для определения ключевых остатков связывающих пептидов NI-105.4E4, было проведено аланиновое сканирование с замещением по одному каждого остатка аланина. Аланиновые остатки в исходной последовательности (А384 и А390) были замещены на пролин и глицин (фиг. 4E). Споты 35-50 и 51-68 (фиг. 4C) представляют собой исходные пептиды (спот 35 и спот 51) и их аланин-замещенные варианты, аминокислотные последовательности которых изображены на фиг. 4D и E. Аланиновое сканирование позволяет предположить, что V339, Е342, D387, Е391 и K395 являются необходимыми для связывания NI-105.4E4.
Был проведен дополнительный эксперимент путем анализа связывания №-105.4Е4 с тау-пептидами. Прямой ELISA показал, что NI-105.4E4 специфически распознает пептид, соответствующий аминокислотам 333-346 hTau40, который содержит аминокислотные остатки 337-343, идентифицированные путем картирования Pepspot (фиг. 5). Не наблюдается перекрестной реактивности №-105.4Е4 по отношению к контрольному пептиду, охватывающему эпитоп АТ180. Наоборот, АТ180 распознает свой когнатный эпитоп, содержащий пептид, но не способен связываться с пептидом, специфическим к NI-105.4E4. Видоспецифические вторичные антитела не связываются ни с одним из пептидов. Вместе, прямой ELISA с покрытиями из пептидов подтверждает, что NI-105.4E4 специфически распознает пептид, содержащий аминокислотные остатки 337-343 человеческого тау, идентифицированные путем картирования Pepspot.
Для грубого картирования связывающего эпитопа NI-105.4A3 hTau40 были получены четыре полипептида доменов тау (домены I, II, III и IV тау). Фрагменты ДНК, синтезированные с помощью GeneArt® (Invitrogen), которые кодируют каждый тау-домен c 6хHis меткой на N-конце, были клонированы в вектор экспрессии pRSET-A (Invitrogen) и трансфицированы в Е. coli BL21 (DE3) (New England Biolabs). Экспрессию His-меченых тау-доменов индуцируют 0,5 мМ IPTG в течение 6 ч, после чего бактерии лизируют лизозимом с озвучиванием. Лизат кипятят в течение 5 мин, а затем дополнительно очищают с помощью колонок Ni-NTA Superflow (Qiagen). Элюированными His-меченными тау-доменами покрывают планшеты для ELISA или загружают на полиакриламидный гель для вестерн-блотинга. Такие последовательно перекрывающиеся полипептиды тау-доменов охватывают всю длину hTau40 (фиг. 13A). Очищенными тау-доменами покрывают планшет ELISA, и проводят анализ связывания NI-105.4A3. NI105.4A3 связывается только с тау-доменом I и полноразмерным hTau40, указывая, что эпитоп находится в N-концевой части hTau40 (aa1-136) (фиг. 13B). Вестерн-блоттинг подтверждает специфическое связывание NI-105.4A3 с тау-доменом I (фиг. 13C).
Картирование эпитопа NI-105.4A3 с помощью технологии PepSpot (JPT) идентифицировало аминокислоты Q35-Q49 человеческого Tau40 (фиг. 14A и C). Для определения ключевых остатков эпитопа для связывания NI-105.4A3, было проведено аланиновое сканирование с замещением по одному каждого остатка аланина. Аланиновый остаток исходной последовательности (А41) был замещен на глицин или пролин (фиг. 14B). Споты, пронумерованные слева направо 1 и 17, являются исходным эпитопом (спот 1) и его аланиновые замещения, аминокислотные последовательности которых изображены на фиг. 14C. Аланиновое сканирование показало, что D40, А41 и K44 являются ключевыми остатками для связывания NI-105.4A3.
Пример 4. Оценка связывания NI-105.4E4 с физиологическими формами, а также патологическими агрегатами тау тканей пораженного болезнью Альцгеймера (AD) мозга и у трансгенных мышей с человеческим тау.
Нейрофибриллярные клубки (NFT), состоящие из гиперфосфорилированных филаментов тау, являются нейропатологическими признаками болезни Альцгеймера (AD). Гиперфосфорилированные тауфиламенты также являются важными компонентами дистрофических нейритов и нейропильных нитей, которые оба являются обычными нейропатологическими признаками AD. Сверхэкспрессия человеческого тау, содержащего семейную тау мутацию P301L, у мышей индуцирует образование NFT в возрасте шести месяцев (Gotz et al., 2001a).
Для оценки связывания рекомбинантного человеческого тау-антитела с физиологическими формами, а также патологическими агрегатами тау, было проведено иммуногистологическое окрашивание тканей пораженного болезнью Альцгеймера (AD) мозга и трансгенных мышей TauP301L с типичным антителом М-105.4Е4 по настоящему изобретению.
Мышам вводили перфузией 20 мл 100 мМ TrisCl/6 мМ EGTA (рН 7,4) при комнатной температуре под глубокой анестезией. Извлекали мозг и погружали в 4% PFA в PBS (рН 7,4) при 4°C в течение ночи для фиксации с последующей заливкой парафином. Для человеческих тканей были использованы парафиновые блоки тканей мозга, пораженного болезнью Альцгеймера (AD), и здоровых контрольных субъектов. Окрашивание DAB проводят в соответствии со стандартными протоколами. В качестве позитивного контроля было использовано мышиное моноклональное антитело тау-12 (Covance, California, U.S.A.). Были также включены ПХ-конъюгированные детектирующие антитела без первичных антител.
Рекомбинантное человеческое антитело NI-105.4E4 идентифицирует многочисленные NFT и ней
- 51 031698 ропильные нити в пораженном болезнью Альцгеймера (AD) мозгу (фиг. 6A), которые отсутствуют в здоровом контрольном мозгу (фиг. 6B). Одно лишь вторичное антитело не дает сигналов как в пораженном AD (фиг. 6C), так и в контрольном мозгу (фиг. 6D). В мозгу Р301Е-тау трансгенных мышей NI-105.4E4 сильно связывается с патологическим тау, напоминающим NFT (фиг. 6, E, F и H), нейропильными нитями (фиг. 6, E и G) и дистрофическими нейритами (фиг. 6, E и H). Кроме того, NI-105.4E4 также идентифицирует агрегаты тау на стадии, предшествующей образованию клубков (фиг. 6I). В мозгу трансгенных мышей, сверхэкспрессирующих как человеческий ₽30^-тау, так и человеческий АРР с мутациями Swedish и Arctic, NI-105.4E4 специфически связывается с дистрофическими нейритами, окружающими бетаамилоидные бляшки (фиг. 6J).
Пример 5. In vivo испытания антител по настоящему изобретению.
Как было уже описано выше, исследования на линиях трансгенных мышей с использованием активной вакцинации фосфорилированными тау-пептидами выявили пониженные уровни агрегатов тау в мозгу и замедленное прогрессирование нарушений поведения (Sigurdsson, J. Alzheimers Dis. 15 (2008), 157-168; Boimel et al., Exp. Neurol. 224 (2010), 472-485). Однако, активная вакцинация не может быть в значительной степени полезной для людей, потому что, как ожидается, существенная часть людей старшего возраста будет невосприимчива к вакцинации. Кроме того, потенциальные побочные эффекты, ассоциированные с направленным на тау иммунным ответом, могут с трудом поддаваться контролю. Есть основания ожидать, что тау-связывающие молекулы по настоящему изобретению могут достигать аналогичного снижения уровней агрегатов тау в мозгу, как описано выше для мышиных антител, вследствие их сходной специфичности связывания с патологическими тау-частицами. Однако из-за эволюционной оптимизации и созревания аффинности в иммунной системе человека антитела по настоящему изобретению обеспечивают ценный терапевтический инструмент вследствие того, что они были получены от здоровых людей с высокой вероятностью превосходных характеристик безопасности и отсутствия иммуногенности. Подтверждение таких ожидаемых терапевтических эффектов может быть получено с помощью способов испытаний, описанных в вышеупомянутых экспериментах с мышиными антителами. В частности, антитела, подвергаемые скринингу, могут быть введены животным различными возможными путями, такими как интраперитонеальная инъекция антитела, внутричерепная инъекция, интравентрикулярная инфузия в мозг, и проанализированы на эффекты лечения. Любая из вышеупомянутых возможностей применения может быть также использована перед инъекцией бета-амилоидных препаратов в мозг таутрансгенных мышей для оценки эффектов лечения индуцированной амилоидами тау-патологии.
Оценка эффектов лечения может быть проведена гистохимическими способами, включающими определение числа Gallyas-позитивных клеток, общее окрашивание человеческого тау, нагрузка на мозг фосфорилированного тау и/или биохимическое определение растворимого и нерастворимого тау мозга и уровни фосфора-тау при последовательной экстракции мозга. Затем могут быть проведен анализ поведения подвергнутых лечению мышей, например, условно-рефлекторно выработанного отвращения к пище или условного рефлекса замирания, для подтверждения терапевтических эффектов антител по настоящему изобретению (Pennanen, Genes Brain Behav. 5 (2006), 369-79, Pennanen Neurobiol Dis. 15 (2004), 5009).
Пример 6. Химеризация антител 4Е4 и 4A3 константными доменами мышиного IgG2a.
Для получения антител с пониженной иммуногенностью для использования в исследованиях хронического лечения, были получены версии мышиных химер антител 4Е4 и 4A3 с использованием технологии рекомбинантной ДНК. Для таких химерных антител был выбран изотип мышиный IgG2a/лямбда с целью получения молекулы, которая бы связывалась с высокой аффинностью с мышиными Fc-гамма рецепторами и, таким образом, была бы способна индуцировать иммунный эффекторный ответ. Аминокислотные последовательности тяжелой и легкой цепей конструктов химерного 4Е4 (ch4E4) и химерного 4A3 (ch4A3) приведены ниже.
Таблица 3
Аминокислотные последовательности химерного 4Е4 (ch4E4 и химерного 4A3 (ch4A3)
Зрелый ch4E4, тяжелая цепь (мышиный lgG2a) SEQ ID NO: 20 EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFNFNISAIHWVRQASGKGLE VWGRIRSKSHNYATLYAASLKGRFTLSRDDSRNTAYLQMSSLQTED MAVYYCTVLSANYDTFDYWGQGTLVTVSSAKTTAPSVYPLAPVCGD TTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTL SSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCK CPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVWDVSEDDPDVQIS WFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRWSALPIQHQDWMSGKEFKC KVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCM VTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEK KNWVERNSYSCSWHEGLHNHHTTKSFSRTPGK
- 52 031698
Зрелый ch4E4, легкая цепь (мышиный лямбда) SEQ ID NO: 21 SYELTQPPSVSVSPGQTARISCFGDTLPKQYTYWYQQKPGQAPVLV IYKDTERPSGIPERFSGSSSGTTVTLTISGVQAEDEADYYCLSADNSA TWVFGGGTKVTVLGQPKSSPSVTLFPPSSEELETNKATLVCTITDFY PG WTVDWKVDGTPVTQGM ETTQPS KQSN N KYMASSYLTLTARAW ERHSSYSCQVTHEGHTVEKSLSRADCS
Пример 7. Химеризация антител 4Е4 и 4A3 константными доменами мышиного IgG2a.
Консенсусный N-связанный сайт гликозилирования был идентифицирован в области CDR1 тяжелой цепи 4Е4. При экспрессии клеток млекопитающих (СНО), предсказанный сайт N-гликозилирования (Asn-30) был полностью занят гликаном, как было продемонстрировано масс-спектрометрией. Для того, чтобы устранить N-гликозилирование в данной области и уменьшить гетерогенность продукта, Asn-30 тяжелой цепи ch4E4 был заменен на Gln (табл. 4). После продуцирования и очистки из клеток СНО, модифицированное антитело связывалось с рекомбинантным тау с ~4-кратно повышенной кажущейся аффинностью связывания по сравнению с исходным гликозилированным антителом (см. фиг. 15).
Таблица 4
Аминокислотные последовательности зрелой ch4E4(N30Q) тяжелой цепи (мышиный IgG2a). Замещенный остаток Gln выделен жирным шрифтом и подчеркнут.
Зрелый ch4E4(N30Q), тяжелая цепь (мышиный lgG2a) SEQ ID NO: 22 EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFNFQISAIHWVRQASGKGLE VWGRIRSKSHNYATLYAASLKGRFTLSRDDSRNTAYLQMSSLQTED MAVYYCTVLSANYDTFDYWGQGTLVTVSSAKTTAPSVYPLAPVCGD TTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTL SSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCK CPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVWDVSEDDPDVQIS WFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRWSALPIQHQDWMSGKEFKC KVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCM VTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEK KNWVERNSYSCSWHEGLHNHHTTKSFSRTPGK
Пример 8. Продуцирование агликозилированного химерного 4Е4 (ch4E4(N30Q) mlgG1 Agly).
Был получен мышиный химерный агликозилированный вариант 4Е4 (ch4E4(N30Q) IgG1-Agly) для оценки соотношения между эффекторной функцией антитела и активностью. Для тяжелой цепи, вариабельный домен 4Е4 сливают с мышиной константной областью тяжелой цепи IgG1, содержащей мутацию Asn на Gln для удаления консенсусного сайта гликозилирования Fc. Вариабельная область тяжелой цепи также содержит замену N30Q для удаления консенсусного сайта N-гликозилирования в CDR1 (пример 7). Легкая цепь представляет собой ch4E4 лямбда-легкую цепь, описанную выше.
Пример 9. Острые исследования проникновения в мозг человеческих 4Е4 и 4A3.
Человеческие 4Е4 и 4A3 были получены путем транзиентной трансфекции клеток СНО и очищены методом аффинной очистки. Уровни эндотоксина контролировались и все имели значение ниже 1 ЭЕ (эндотоксиновых единиц)/мг. Мышам TauP301L делают интраперитонеальные инъекции 30 мг/кг 4Е4 (n=7), 4A3 (n=7) антитела или равный объем PBS (n=7) в день 1 и день 4. В день 5, мышам делают под анестезией перфузию PBS, содержащего 1 единицу/мл гепарина. Кровь, мозг и спинной мозг отбирают для анализов. Правое полушарие мозга замораживают при -80°C, левое полушарие мозга и спинной мозг подвергают постфиксации в 10% нейтрализованном формалине при 4°C в течение двух дней перед заливкой в парафиновый блок и приготовление срезов. Плазму хранят при -80°C в аликвотах.
Экстракция белка из мозга: замороженное правое полушарие взвешивают и гомогенизуют в 5 объемах (5 мл/г влажной ткани) раствора, содержащего 50 мМ NaCl, 0,2% диэтиламина, ингибиторы протеаз (Roche Diagnostics GmbH) и ингибитор фосфатазы (Roche Diagnostics GmbH). Образцы затем переносят в поликарбонатные пробирки и прибавляют еще 5 объемов раствора для гомогенизации и выдерживают на льду течение 30 мин. Растворимую фракцию затем собирают после центрифугирования при 100000xg, 4°C в течение 30 мин. Эту растворимую фракцию используют для анализа IgG на людях. Осадок ресуспендируют в 3 объемах PBS с ингибитором протеазы и фосфатазы. После центрифугирования при 16000xg, 4°C в течение 30 мин., супернатанты и осадки хранят раздельно при -80°C для последующей экстракции нерастворимого тау. Осадки дополнительно экстрагируют модифицированным методом экстракции саркозилом (Goedert M, Spillantini MG, Cairns NJ, Crowther RA. Neuron 8, 159 (1992)).
Человеческий IgG-специфический сэндвич-ELISA: 2 мкг/мл козьего античеловеческого IgG Fab (Jackson) в 50 мМ карбонатного буфера для покрытий ELISA (рН 9,6) используют в качестве иммобилизованного антитела. 96-Луночные микротитровальные планшеты с половинной рабочей площадью лунок покрывают 30 мкл/лунку иммобилизованным антителом при 4°C в течение ночи. Планшет затем промывают 4 раза PBS, содержащим 0,1% Tween 20, перед инкубацией с 50 мкл/лунку PBS, содержащего 2% БСА при комнатной температуре в течение одного часа. Растворимые фракции экстрактов мозга, образцы плазмы и стандартное антитело (4A3) разбавляют в PBS, содержащем 2% БСА и 0,1% Tween 20. Прибавляют 30 мкл разбавленных образцов в каждую лунку и инкубируют при комнатной температуре в течение одного часа. Планшет затем промывают 200 мкл/лунку PBS, содержащего 0,1% Tween 20, четыре раза перед инкубацией с ПХ-конъюгированным ослиным анти-человеческим Fcy (Jackson, разбавлен
- 53 031698
1:10000 в PBS, содержащем 2% БСА и 0,1% Tween 20) при комнатной температуре в течение одного часа. Планшет затем промывают 200 мкл/лунку PBS, содержащего 0,1% Tween 20, четыре раза перед прибавлением 20 мкл/лунку ТМВ (1:20 в 10 мМ цитратном растворе, рН=4,1). Реакцию затем останавливают добавлением 10 мкл 1М H2SO4 в каждую лунку. Строят калибровочную кривую для антитела по серийным разбавлениям 4A3. Концентрации антитела в образцах плазмы и мозга рассчитывают в соответствии со стандартами. Уровень человеческого IgG в мозгу затем переводят в мкг антитела/грамм свежей ткани мозга (принимая 1 г/10 мл), как указано на фиг. 17.
Высокие уровни человеческого IgG были детектированы в плазме всех мышей, получавших 4Е4 и 4A3. В отличие от них, человеческий IgG не был обнаружен в плазме мышей, получавших PBS (фиг. 16). Значительные количества человеческого IgG были детектированы в гомогенатах мозга мышей, получавших 4Е4 и 4A3 (фиг. 17).
Пример 10. Хронические исследования с химерными 4Е4 и 4A3.
Химерные 4Е4 и 4A3, содержащие вариабельные домены исходного человеческого антитела и константные области мышиного IgG2a, могут быть получены транзиентной трансфекцией клеток СНО и очищены аффинной очисткой.
Уровни эндотоксина в каждой партии антител должны контролироваться и поддерживаться ниже 1 ЭЕ/мг. Сбалансированным по полу группам мышей TauP301L в возрасте 7,5-8 месяцев делают интраперитонеально инъекции раствора 10 мг/кг, 3 мг/кг антитела или равный объем PBS-контроля. Каждая группа исследуемого препарата включает 20-25 мышей. Введение препарата осуществляют раз в неделю в течение 26 недель. Альтернативно, введение осуществляют два раза в неделю в течение 13 недель. Вес тела контролируют через каждые две недели. Мышам делают перфузию под анестезией в конце периода испытаний. Собирают мозг, спинной мозг и кровь. Половина мозга и спинного мозга может быть подвергнута постфиксации в 10% формалине в течение трех дней перед заливкой в парафиновый блок. Срезы толщиной 4-6 мкм, изготовленные из этих блоков ткани, могут быть использованы для иммуногистохимических исследований. Вторую половину мозга взвешивают и подвергают глубокой заморозке при 80°C для биохимических анализов.
Эффекты лекарственных препаратов оценивают путем сравнения уровня нейрофибриллярных клубков (NFT) и уровня тау с разными характеристиками растворимости в обработанных и контрольных образцах. NFT могут быть визуализированы методом импрегнирования серебром по Gallyas (F. Gallyas, Acta Morphol. Acad. Sci. Hung 19.1 (1971)) или путем иммуноокрашивания моноклональным мышиным антителом АТ100 и АТ180, которое распознает патологически фосфорилированный тау в NFT. Число или частота Gallyas-позитивных нейронов и/или АТ100, АТ180-меченых нейронов в мозгу и спинном мозг у получавших антитело мышей и контрольных животных могут быть определены для оценки эффекта лечения антителом.
Растворимый и нерастворимый тау может быть экстрагирован в соответствии с описанным тут протоколом экстракции белка мозга. Альтернативно, растворимый и нерастворимый тау может быть экстрагирован модифицированным методом экстракции саркозилом (Goedert M, Spillantini MG, Cairns NJ, Crowther RA, Neuron 8, 159 (1992)). Вкратце, замороженный мозг гомогенизуют в 10 объемах (мас./об.) содержащего 10% сахарозы буфера для гомогената, состоящего из 10 мМ Tris-HCl (pH 7,4), 0,8 М NaCl, 1 мМ EGTA, 1 мМ Na3VO4, 1 мМ NaF, 1 мМ AEBSF, ингибиторов протеаз (Roche Diagnostics GmbH) и ингибитора фосфатазы (Roche Diagnostics GmbH). Гомогенат центрифугируют в течение 20 мин при 20000xg и супернатант собирают. Осадок гомогенизируют в 10 объемах буфера гомогенизации и центрифугируют второй раз. Супернатанты могут быть объединены, и N-лаурилсаркозинат (Sigma) прибавляют до конечной концентрации 1% (мас./об.) и инкубируют при 37°C при вращении со скоростью 300 об/мин в течение 1,5 ч, с последующим центрифугированием при 100000xg в течение 1 ч. Супернатант собирают как растворимую в саркозиле фракцию и осадок 1 г ткани мозга ресуспендируют в 0,2 мл 50 мМ Tris-HCl (pH 7,4) как фракцию PHF.
Уровни растворимого и нерастворимого тау измеряют с помощью коммерчески доступных наборов ELISA для определения тау (Invitrogen). Кроме того, экстракты белка мозга разделяют методом SDSPAGE с 4-12% Bis-Tris, с последующим иммуноблоттингом с антителами Tau12 (человеческий тау), АТ8 (pS202/pT205), АТ100 (pT212/pS214), AT180 (рТ231) и Е178 (pS396). Проводят полуколичественный анализ с измерением интегральной плотности каждого образца по сравнению со стандартами с известными количествами тау.
Дополнительно могут быть проведены поведенческие тесты, как указано в примере 5 выше. Например, улучшение рабочей памяти у получавших антитело мышей TauP301L может быть протестировано с использованием задачи с Т-образным лабиринтом с двумя попытками (например, Pennanen, Genes Brain Behav. 5 (2006), 369-79, которая целиком включена сюда в качестве ссылки). Три ветви лабиринта имеют длину 22 см, ширину 5 см и глубину 15 см. Черные и белые абстрагированные ориентиры размещены на черной занавеси, окружающей лабиринт. Эксперименты проводят при уровне освещенности рассеянным светом, равном 6 люкс в темной фазе. Каждый эксперимент включает тренировочную сессию и сессию наблюдения. Во время тренировочной сессии мышь допускают в две из трех ветвей (начальная ветвь и
- 54 031698 вторая ветвь), которые она может свободно исследовать течение 4 мин, без доступа в третью ветвь (новая ветвь). Мышь затем удаляют из лабиринта и помещают в клетку для содержания на 1,5-5 мин, пока лабиринт тщательно протирают 70%-ным этанолом для удаления каких-либо обонятельных ориентиров. После этого мышь снова помещают в лабиринт для наблюдения с доступом во все три ветви в течение 4 мин. Регистрируют последовательность заходов, число заходов в каждую ветвь и время, проведенное в каждой ветви. По этим данным рассчитывают соотношение времени, проведенного в новой третьей ветви, по сравнению со средним временем, проведенным в двух других ветвях (начальная ветвь и вторая ветвь) и сравнивают для разных групп исследуемого препарата мышиной модели таупатии и соответствующих контрольных мышей дикого типа. Грызуны типично предпочитают исследовать новую ветвь лабиринта, а не возвращаться в ту, где они перед этим были. Можно контролировать влияние антител на восстановление такого предпочтения получавшими лечение мышами модели таупатии по сравнению с недискриминирующим поведением не получавших лечения мышей, вызванным их ассоциированным с расстройством нарушением рабочей памяти. Таким образом, величина отношения, близкая к 1, указывает на нарушение рабочей памяти. Повышенное значение соотношения указывает на лучшую рабочую память. Считается, что нарушение рабочей памяти у мышей TauP301L вызвано тау-патологией, причиненной сверхэкспрессией человеческого тау. Поэтому значительно более высокое значение соотношения, наблюдаемое у мышей TauP301L, получавших анти-тау антитело по сравнению с контрольными мышами TauP301L, будет указывать на то, что анти-тау антитело обладает терапевтическим эффектом на таупатологию.
Объем настоящего изобретения не должен быть ограничен описанными конкретными вариантами исполнения, которые должны рассматриваться как отдельные иллюстрации индивидуальных аспектов изобретения, и любыми композициями или способами, являющимися функционально эквивалентными в рамках настоящего изобретения. В действительности, различные модификации изобретения в дополнение к представленным и описанным тут, будут очевидными для квалифицированных специалистов в данной области техники из предшествующего описание и сопровождающих чертежей. Такие модификации должны рассматриваться как входящие в объем приложенной формулы изобретения.
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ <110> Чэнь, Фэн
Гримм, Ян
Баерисвиль, Жан-Луи
Нитш, Рогер Хок, Кристоф Байоджен Айдек Интернэшнл Нейросайенз ГМБХ Юниверсити оф Цюрих <120> ЧЕЛОВЕЧЕСКИЕ АНТИ-ТАУ АНТИТЕЛА <130> 2159.341PC02 <140> Должно быть определено <141> приложено <150> EP 10 013 494.9 <151> 2010-10-11 <150> 61/391,751 <151> 2010-10-11 <160> 93 <170> Патентная версия 3.5 <210> 1 <211> 352 <212> БЕЛОК <213> Homo sapiens <220>
<221> ПЕПТИД
- 55 031698 <222> (1)..(352) <223> Изоформа фетального тау <300>
<301> Goedert M., Wischik C., Crowther R., Walker J., Klug A.
<302> Cloning and sequencing of the cDNA encoding a core protein of the paired helical filament of Alzheimer disease: identification as the microtubule-associated protein tau.
<303> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
<304> 85 <306> 4051-4055 <307> 1988-06-01 <300>
<308> P10636-2 <309> 2010-10-05 <313> (1)..(352) <400> 1
Met Ala 1 Glu Pro Arg 5 Gln Glu Phe Glu Val 10 Met Glu Asp His Ala 15 Gly
Thr Tyr Gly Leu Gly Asp Arg Lys Asp Gln Gly Gly Tyr Thr Met His
20 25 30
Gln Asp Gln Glu Gly Asp Thr Asp Ala Gly Leu Lys Ala Glu Glu Ala
35 40 45
Gly Ile Gly Asp Thr Pro Ser Leu Glu Asp Glu Ala Ala Gly His Val
50 55 60
Thr Gln Ala Arg Met Val Ser Lys Ser Lys Asp Gly Thr Gly Ser Asp
65 70 75 80
Asp Lys Lys Ala Lys Gly Ala Asp Gly Lys Thr Lys Ile Ala Thr Pro
85 90 95
Arg Gly Ala Ala Pro Pro Gly Gln Lys Gly Gln Ala Asn Ala Thr Arg
100 105 110
Ile Pro Ala Lys Thr Pro Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ser Ser Gly
115 120 125
Glu Pro Pro Lys Ser Gly Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser
130 135 140
Pro Gly Thr Pro Gly Ser Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro
145 150 155 160
Pro Thr Arg Glu Pro Lys Lys Val Ala Val Val Arg Thr Pro Pro Lys
165 170 175
- 56 031698
Ser Pro Ser Ser 180 Ala Lys Ser Arg Leu 185 Gln Thr Ala Pro Val 190 Pro Met
Pro Asp Leu Lys Asn Val Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu
195 200 205
Lys His Gln Pro Gly Gly Gly Lys Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val
210 215 220
Asp Leu Ser Lys Val Thr Ser Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His
225 230 235 240
His Lys Pro Gly Gly Gly Gln Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp
245 250 255
Phe Lys Asp Arg Val Gln Ser Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr
260 265 270
His Val Pro Gly Gly Gly Asn Lys Lys Ile Glu Thr His Lys Leu Thr
275 280 285
Phe Arg Glu Asn Ala Lys Ala Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val
290 295 300
Tyr Lys Ser Pro Val Val Ser Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu Ser
305 310 315 320
Asn Val Ser Ser Thr Gly Ser Ile Asp Met Val Asp Ser Pro Gln Leu
325 330 335
Ala Thr Leu Ala Asp Glu Val Ser Ala Ser Leu Ala Lys Gln Gly Leu
340 345 350
<210> 2 <211> 381 <212> БЕЛОК <213> Homo sapiens <220>
<221> ПЕПТИД <222> (1)..(381) <223> Изоформа тау-B <300>
<301> Goedert M., Spillantini M.G., Jakes R., Rutherford D., Crowther R.A.
<302> Multiple isoforms of human microtubule-associated protein tau: sequences and localization in neurofibrillary tangles of Alzheimer's disease.
<303> Нейрон
- 57 031698 <304> 3 <306> 519-526 <307> 1989-10-01 <300>
<308> P10636-4 <309> 2010-10-05 <313> (1)..(381) <400> 2
Met 1 Ala Glu Pro Arg 5 Gln Glu Phe Glu Val 10 Met Glu Asp His Ala 15 Gly
Thr Tyr Gly Leu Gly Asp Arg Lys Asp Gln Gly Gly Tyr Thr Met His
20 25 30
Gln Asp Gln Glu Gly Asp Thr Asp Ala Gly Leu Lys Glu Ser Pro Leu
35 40 45
Gln Thr Pro Thr Glu Asp Gly Ser Glu Glu Pro Gly Ser Glu Thr Ser
50 55 60
Asp Ala Lys Ser Thr Pro Thr Ala Glu Ala Glu Glu Ala Gly Ile Gly
65 70 75 80
Asp Thr Pro Ser Leu Glu Asp Glu Ala Ala Gly His Val Thr Gln Ala
85 90 95
Arg Met Val Ser Lys Ser Lys Asp Gly Thr Gly Ser Asp Asp Lys Lys
100 105 110
Ala Lys Gly Ala Asp Gly Lys Thr Lys Ile Ala Thr Pro Arg Gly Ala
115 120 125
Ala Pro Pro Gly Gln Lys Gly Gln Ala Asn Ala Thr Arg Ile Pro Ala
130 135 140
Lys Thr Pro Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ser Ser Gly Glu Pro Pro
145 150 155 160
Lys Ser Gly Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser Pro Gly Thr
165 170 175
Pro Gly Ser Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr Arg
180 185 190
Glu Pro Lys Lys Val Ala Val Val Arg Thr Pro Pro Lys Ser Pro Ser
195 200 205
- 58 031698
Ser Ala 210 Lys Ser Arg Leu Gln 215 Thr Ala Pro Val Pro 220 Met Pro Asp Leu
Lys Asn Val Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu Lys His Gln
225 230 235 240
Pro Gly Gly Gly Lys Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp Leu Ser
245 250 255
Lys Val Thr Ser Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His His Lys Pro
260 265 270
Gly Gly Gly Gln Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe Lys Asp
275 280 285
Arg Val Gln Ser Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr His Val Pro
290 295 300
Gly Gly Gly Asn Lys Lys Ile Glu Thr His Lys Leu Thr Phe Arg Glu
305 310 315 320
Asn Ala Lys Ala Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser
325 330 335
Pro Val Val Ser Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu Ser Asn Val Ser
340 345 350
Ser Thr Gly Ser Ile Asp Met Val Asp Ser Pro Gln Leu Ala Thr Leu
355 360 365
Ala Asp Glu Val Ser Ala Ser Leu Ala Lys Gln Gly Leu
370 375 380
<210> 3 <211> 410 <212> БЕЛОК <213> Homo sapiens <220>
<221> ПЕПТИД <222> (1)..(410) <223> Изоформа тау-C <300>
<301> Goedert M., Spillantini M.G., Jakes R., Rutherford D., Crowther R.A.
<302> Multiple isoforms of human microtubule-associated protein tau: sequences and localization in neurofibrillary tangles of Alzheimer's disease.
<303> Нейрон <304> 3
- 59 031698 <306> 519-526 <307> 1989-10-01 <300>
<308> P10636-5 <309> 2010-10-05 <313> (1)..(410) <400> 3
Met Ala Glu 1 Pro Arg 5 Gln Glu Phe Glu Val 10 Met Glu Asp His Ala 15 Gly
Thr Tyr Gly Leu Gly Asp Arg Lys Asp Gln Gly Gly Tyr Thr Met His
20 25 30
Gln Asp Gln Glu Gly Asp Thr Asp Ala Gly Leu Lys Glu Ser Pro Leu
35 40 45
Gln Thr Pro Thr Glu Asp Gly Ser Glu Glu Pro Gly Ser Glu Thr Ser
50 55 60
Asp Ala Lys Ser Thr Pro Thr Ala Glu Asp Val Thr Ala Pro Leu Val
65 70 75 80
Asp Glu Gly Ala Pro Gly Lys Gln Ala Ala Ala Gln Pro His Thr Glu
85 90 95
Ile Pro Glu Gly Thr Thr Ala Glu Glu Ala Gly Ile Gly Asp Thr Pro
100 105 110
Ser Leu Glu Asp Glu Ala Ala Gly His Val Thr Gln Ala Arg Met Val
115 120 125
Ser Lys Ser Lys Asp Gly Thr Gly Ser Asp Asp Lys Lys Ala Lys Gly
130 135 140
Ala Asp Gly Lys Thr Lys Ile Ala Thr Pro Arg Gly Ala Ala Pro Pro
145 150 155 160
Gly Gln Lys Gly Gln Ala Asn Ala Thr Arg Ile Pro Ala Lys Thr Pro
165 170 175
Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ser Ser Gly Glu Pro Pro Lys Ser Gly
180 185 190
Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser
195 200 205
Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr Arg Glu Pro Lys
- 60 031698
210
215
220
Lys 225 Val Ala Val Val Arg 230 Thr Pro Pro Lys Ser 235 Pro Ser Ser Ala Lys 240
Ser Arg Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro Met Pro Asp Leu Lys Asn Val
245 250 255
Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu Lys His Gln Pro Gly Gly
260 265 270
Gly Lys Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp Leu Ser Lys Val Thr
275 280 285
Ser Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His His Lys Pro Gly Gly Gly
290 295 300
Gln Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe Lys Asp Arg Val Gln
305 310 315 320
Ser Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr His Val Pro Gly Gly Gly
325 330 335
Asn Lys Lys Ile Glu Thr His Lys Leu Thr Phe Arg Glu Asn Ala Lys
340 345 350
Ala Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser Pro Val Val
355 360 365
Ser Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu Ser Asn Val Ser Ser Thr Gly
370 375 380
Ser Ile Asp Met Val Asp Ser Pro Gln Leu Ala Thr Leu Ala Asp Glu
385 390 395 400
Val Ser Ala Ser Leu Ala Lys Gln Gly Leu
405 410
<210> <211> <212> <213> 4 383 БЕЛОК Homo sapiens
<220> <221> <222> <223> ПЕПТИД (1)..(383) Изоформа тау-D
<300>
- 61 031698 <301> Goedert M., Spillantini M.G., Potier M.-C., Ulrich J., Crowther R.A.
<302> Cloning and sequencing of the cDNA encoding an isoform of microtubule-associated protein tau containing four tandem repeats: differential expression of tau protein mRNAs in human brain.
<303> EMBO J.
<304> 8 <306> 393-399 <307> 1989-02-01 <300>
<308> P10636-6 <309> 2010-10-05 <313> (1)..(383) <400> 4
Met Ala 1 Glu Pro Arg Gln 5 Glu Phe Glu Val 10 Met Glu Asp His Ala 15 Gly
Thr Tyr Gly Leu Gly Asp Arg Lys Asp Gln Gly Gly Tyr Thr Met His
20 25 30
Gln Asp Gln Glu Gly Asp Thr Asp Ala Gly Leu Lys Ala Glu Glu Ala
35 40 45
Gly Ile Gly Asp Thr Pro Ser Leu Glu Asp Glu Ala Ala Gly His Val
50 55 60
Thr Gln Ala Arg Met Val Ser Lys Ser Lys Asp Gly Thr Gly Ser Asp
65 70 75 80
Asp Lys Lys Ala Lys Gly Ala Asp Gly Lys Thr Lys Ile Ala Thr Pro
85 90 95
Arg Gly Ala Ala Pro Pro Gly Gln Lys Gly Gln Ala Asn Ala Thr Arg
100 105 110
Ile Pro Ala Lys Thr Pro Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ser Ser Gly
115 120 125
Glu Pro Pro Lys Ser Gly Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser
130 135 140
Pro Gly Thr Pro Gly Ser Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro
145 150 155 160
Pro Thr Arg Glu Pro Lys Lys Val Ala Val Val Arg Thr Pro Pro Lys
165 170 175
Ser Pro Ser Ser Ala Lys Ser Arg Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro Met
- 62 031698
180 185 190
Pro Asp Leu Lys Asn Val Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu
195 200 205
Lys His Gln Pro Gly Gly Gly Lys Val Gln Ile Ile Asn Lys Lys Leu
210 215 220
Asp Leu Ser Asn Val Gln Ser Lys Cys Gly Ser Lys Asp Asn Ile Lys
225 230 235 240
His Val Pro Gly Gly Gly Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp
245 250 255
Leu Ser Lys Val Thr Ser Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His His
260 265 270
Lys Pro Gly Gly Gly Gln Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe
275 280 285
Lys Asp Arg Val Gln Ser Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr His
290 295 300
Val Pro Gly Gly Gly Asn Lys Lys Ile Glu Thr His Lys Leu Thr Phe
305 310 315 320
Arg Glu Asn Ala Lys Ala Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr
325 330 335
Lys Ser Pro Val Val Ser Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu Ser Asn
340 345 350
Val Ser Ser Thr Gly Ser Ile Asp Met Val Asp Ser Pro Gln Leu Ala
355 360 365
Thr Leu Ala Asp Glu Val Ser Ala Ser Leu Ala Lys Gln Gly Leu
370 375 380
<210> <211> <212> <213> 5 412 БЕЛОК Homo sapiens
<220> <221> <222> <223> ПЕПТИД (1)..(412) Изоформа тау-E
<300>
- 63 031698 <301> Goedert M., Spillantini M.G., Jakes R., Rutherford D., Crowther R.A.
<302> Multiple isoforms of human microtubule-associated protein tau: sequences and localization in neurofibrillary tangles of Alzheimer's disease.
<303> Нейрон <304> 3 <306> 519-526 <307> 1989-10-01 <300>
<308> P10636-7 <309> 2010-10-05 <313> (1)..(412) <400> 5
Met 1 Ala Glu Pro Arg Gln Glu 5 Phe Glu Val 10 Met Glu Asp His Ala 15 Gly
Thr Tyr Gly Leu Gly Asp Arg Lys Asp Gln Gly Gly Tyr Thr Met His
20 25 30
Gln Asp Gln Glu Gly Asp Thr Asp Ala Gly Leu Lys Glu Ser Pro Leu
35 40 45
Gln Thr Pro Thr Glu Asp Gly Ser Glu Glu Pro Gly Ser Glu Thr Ser
50 55 60
Asp Ala Lys Ser Thr Pro Thr Ala Glu Ala Glu Glu Ala Gly Ile Gly
65 70 75 80
Asp Thr Pro Ser Leu Glu Asp Glu Ala Ala Gly His Val Thr Gln Ala
85 90 95
Arg Met Val Ser Lys Ser Lys Asp Gly Thr Gly Ser Asp Asp Lys Lys
100 105 110
Ala Lys Gly Ala Asp Gly Lys Thr Lys Ile Ala Thr Pro Arg Gly Ala
115 120 125
Ala Pro Pro Gly Gln Lys Gly Gln Ala Asn Ala Thr Arg Ile Pro Ala
130 135 140
Lys Thr Pro Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ser Ser Gly Glu Pro Pro
145 150 155 160
Lys Ser Gly Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser Pro Gly Thr
165 170 175
Pro Gly Ser Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr Arg
180 185 190
- 64 031698
Glu Pro Lys 195 Lys Val Ala Val Val 200 Arg Thr Pro Pro Lys 205 Ser Pro Ser
Ser Ala Lys Ser Arg Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro Met Pro Asp Leu
210 215 220
Lys Asn Val Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu Lys His Gln
225 230 235 240
Pro Gly Gly Gly Lys Val Gln Ile Ile Asn Lys Lys Leu Asp Leu Ser
245 250 255
Asn Val Gln Ser Lys Cys Gly Ser Lys Asp Asn Ile Lys His Val Pro
260 265 270
Gly Gly Gly Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp Leu Ser Lys
275 280 285
Val Thr Ser Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His His Lys Pro Gly
290 295 300
Gly Gly Gln Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe Lys Asp Arg
305 310 315 320
Val Gln Ser Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr His Val Pro Gly
325 330 335
Gly Gly Asn Lys Lys Ile Glu Thr His Lys Leu Thr Phe Arg Glu Asn
340 345 350
Ala Lys Ala Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser Pro
355 360 365
Val Val Ser Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu Ser Asn Val Ser Ser
370 375 380
Thr Gly Ser Ile Asp Met Val Asp Ser Pro Gln Leu Ala Thr Leu Ala
385 390 395 400
Asp Glu Val Ser Ala Ser Leu Ala Lys Gln Gly Leu
405 410
<210> 6
<211> 441
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
- 65 031698 <220>
<221> ПЕПТИД <222> (1)..(441) <223> Изоформа тау-F <300>
<301> Goedert M., Spillantini M.G., Jakes R., Rutherford D., Crowther
R.A.
<302> Multiple isoforms of human microtubule-associated protein tau: sequences and localization in neurofibrillary tangles of Alzheimer's disease.
<303> Нейрон <304> 3 <306> 519-526 <307> 1989-10-01 <300>
<308> P10636-8 <309> 2010-10-05 <313> (1)..(441) <400> 6
Met 1 Ala Glu Pro Arg 5 Gln Glu Phe Glu Val 10 Met Glu Asp His Ala 15 Gly
Thr Tyr Gly Leu Gly Asp Arg Lys Asp Gln Gly Gly Tyr Thr Met His
20 25 30
Gln Asp Gln Glu Gly Asp Thr Asp Ala Gly Leu Lys Glu Ser Pro Leu
35 40 45
Gln Thr Pro Thr Glu Asp Gly Ser Glu Glu Pro Gly Ser Glu Thr Ser
50 55 60
Asp Ala Lys Ser Thr Pro Thr Ala Glu Asp Val Thr Ala Pro Leu Val
65 70 75 80
Asp Glu Gly Ala Pro Gly Lys Gln Ala Ala Ala Gln Pro His Thr Glu
85 90 95
Ile Pro Glu Gly Thr Thr Ala Glu Glu Ala Gly Ile Gly Asp Thr Pro
100 105 110
Ser Leu Glu Asp Glu Ala Ala Gly His Val Thr Gln Ala Arg Met Val
115 120 125
Ser Lys Ser Lys Asp Gly Thr Gly Ser Asp Asp Lys Lys Ala Lys Gly
130 135 140
Ala Asp Gly Lys Thr Lys Ile Ala Thr Pro Arg Gly Ala Ala Pro Pro
145 150 155 160
- 66 031698
Gly Gln Lys Gly Gln 165 Ala Asn Ala Thr Arg 170 Ile Pro Ala Lys Thr 175 Pro
Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ser Ser Gly Glu Pro Pro Lys Ser Gly
180 185 190
Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser
195 200 205
Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr Arg Glu Pro Lys
210 215 220
Lys Val Ala Val Val Arg Thr Pro Pro Lys Ser Pro Ser Ser Ala Lys
225 230 235 240
Ser Arg Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro Met Pro Asp Leu Lys Asn Val
245 250 255
Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu Lys His Gln Pro Gly Gly
260 265 270
Gly Lys Val Gln Ile Ile Asn Lys Lys Leu Asp Leu Ser Asn Val Gln
275 280 285
Ser Lys Cys Gly Ser Lys Asp Asn Ile Lys His Val Pro Gly Gly Gly
290 295 300
Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp Leu Ser Lys Val Thr Ser
305 310 315 320
Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His His Lys Pro Gly Gly Gly Gln
325 330 335
Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe Lys Asp Arg Val Gln Ser
340 345 350
Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr His Val Pro Gly Gly Gly Asn
355 360 365
Lys Lys Ile Glu Thr His Lys Leu Thr Phe Arg Glu Asn Ala Lys Ala
370 375 380
Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser Pro Val Val Ser
385 390 395 400
Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu Ser Asn Val Ser Ser Thr Gly Ser
405 410 415
- 67 031698
Ile Asp Met Val Asp Ser Pro Gln
420
Leu Ala Thr Leu Ala Asp Glu Val
425 430
Ser Ala Ser Leu Ala Lys Gln Gly Leu
435 440
<210> 7
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> искусственная последовательность
<220> <223> Эпитоп, распозначаемый антителом NI-105.4E4
<220>
<221> ПЕПТИД <222> (1)..(7) <223> Эпитоп NI-105.4E4 <400> 7
Val Glu Val Lys Ser Glu Lys
5
<210> 8
<211> 363
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS <222> (1)..(363) <223> NI-105.4E4-VH, вариабельная последовательность тяжелой цепи (VH) <220>
<221> ^область
<222> <223> (91)..(105) гипервариабельный участок (CDR) VH-CDR1
<220>
<221> У_область
<222> (148)..(204)
<223> гипервариабельный участок (CDR) VH-CDR2
<220>
<221> ^область <222> (301)..(330) <223> гипервариабельный участок (CDR) VH-CDR3
<400> 8
gag Glu 1 gtg Val cag Gln ctg Leu gtg Val 5 gag Glu tct Ser ggg Gly gga Gly ggc Gly 10 ttg Leu gtc Val cag Gln cct Pro ggg Gly 15 gga Gly 48
tcc ctg aaa ctc tcc tgt gca gcc tct ggg ttc aat ttc aac atc tct 96
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Phe Asn Ile Ser
- 68 031698
gct Ala ata Ile cac His 35 tgg Trp gtc Val cgc Arg cag Gln gct Ala 40 tcc Ser ggg Gly aaa Lys ggg Gly ctg Leu 45 gag Glu tgg Trp gtt Val 144
ggc cga ata aga agt aaa tct cac aat tac gcg act tta tat gct gcg 192
Gly Arg Ile Arg Ser Lys Ser His Asn Tyr Ala Thr Leu Tyr Ala Ala
50 55 60
tcc ctg aaa ggc cgg ttc acc ctc tcc aga gat gat tca agg aac acg 240
Ser Leu Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Arg Asp Asp Ser Arg Asn Thr
65 70 75 80
gcg tat ctg caa atg agc agc ctg caa acc gag gat atg gcc gtc tat 288
Ala Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Gln Thr Glu Asp Met Ala Val Tyr
85 90 95
tac tgt act gtt ctg agt gcg aat tac gac acc ttt gac tac tgg ggc 336
Tyr Cys Thr Val Leu Ser Ala Asn Tyr Asp Thr Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
cag gga acc ctg gtc acc gtc tcc tcg 363
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 9 <211> 121 <212> БЕЛОК <213> Homo sapiens <400> 9
Glu 1 Val Gln Leu Val 5 Glu Ser Gly Gly Gly Leu 10 Val Gln Pro Gly 15 Gly
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Phe Asn Ile Ser
20 25 30
Ala Ile His Trp Val Arg Gln Ala Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Arg Ser Lys Ser His Asn Tyr Ala Thr Leu Tyr Ala Ala
50 55 60
Ser Leu Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Arg Asp Asp Ser Arg Asn Thr
65 70 75 80
Ala Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Gln Thr Glu Asp Met Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Val Leu Ser Ala Asn Tyr Asp Thr Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
- 69 031698
115
120 <210> 10 <211> 321 <212> ДНК <213> Homo sapiens <220>
<221> CDS <222> (1)..(321) <223> NI-105.4E4-VL, вариабельная последовательность легкой цепи (VL) wherein amino acid sequence Ser-Tyr-Glu at positions 1-3 may also be Leu-Pro-Val <220>
<221> <222> <223> Область (67)..(99) гипервариабельный участок (CDR) VL-CDR1
<220>
<221> Область
<222> (145)..(165)
<223> гипервариабельный участок (CDR) VL-CDR2
<220>
<221> У_область <222> (262)..(291) <223> гипервариабельный участок (CDR) VL-CDR3
<400> 10
tcc Ser 1 tat Tyr gag Glu ctg Leu act Thr 5 cag Gln cca Pro ccc Pro tcg Ser gtg Val 10 tca Ser gtg Val tcc Ser cca Pro gga Gly 15 cag Gln 48
acg gcc agg atc tcc tgc ttt gga gat aca ttg cca aag caa tat act 96
Thr Ala Arg Ile Ser Cys Phe Gly Asp Thr Leu Pro Lys Gln Tyr Thr
20 25 30
tat tgg tat cag cag aag cct ggc cag gcc cct gtg tta gtg att tat 144
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
aaa gac act gag agg ccc tca ggg atc ccc gag cga ttc tct ggc tcc 192
Lys Asp Thr Glu Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
agc tca ggg aca aca gtc acc ttg acc atc agt gga gtc cag gca gaa 240
Ser Ser Gly Thr Thr Val Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Ala Glu
65 70 75 80
gac gag gct gac tat tac tgt cta tca gct gac aac agt gct act tgg 288
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Ser Ala Asp Asn Ser Ala Thr Trp
85 90 95
gtg ttc ggc gga ggg acc aag gtg acc gtc cta 321
Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100 105
<210> 11
- 70 031698 <211>107 <212> БЕЛОК <213> Homo sapiens <400>11
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val 10 Ser Val Ser Pro Gly 15 Gln
1 5
Thr Ala Arg Ile Ser Cys Phe Gly Asp Thr Leu Pro Lys Gln Tyr Thr
20 25 30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Lys Asp Thr Glu Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Ser Ser Gly Thr Thr Val Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Ala Glu
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Ser Ala Asp Asn Ser Ala Thr Trp
85 90 95
Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100 105 <210> 12 <211>345 <212> ДНК <213> Homo sapiens <220>
<221> CDS <222> (1)..(345) <223> NI-105.24B2-VH, вариабельная последовательность тяжелой цепи (VH), где Gln в положении 1 последовательности может также быть Glu <220>
<221> У_область <222> (91)..(105)
<223> гипервариабельный участок (CDR) VH-CDR1
<220>
<221> ^область
<222> (148)..(198)
<223> гипервариабельный участок (CDR) VH-CDR2
<220>
<221> ^область
<222> (295)..(312)
<223> гипервариабельный участок (CDR) VH-CDR3
<400> 12
cag gtg cag ctg gtg cag tct ggg gct gag gtg aag aag cct ggg gcc 48
- 71 031698
Gln 1 Val Gln Leu Val 5 Gln Ser Gly Ala Glu 10 Val Lys Lys Pro Gly 15 Ala
tcg gtg aag gtt tcc tgt aag gca tct gga tac acc ttc gtc aat tac 96
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Val Asn Tyr
20 25 30
att ata cac tgg gtg cga cag gcc cct gga caa ggg ctt gag tgg atg 144
Ile Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
gga atc atc aat cct aat ggc gga aac aca agt tat gca gag aaa ttc 192
Gly Ile Ile Asn Pro Asn Gly Gly Asn Thr Ser Tyr Ala Glu Lys Phe
50 55 60
cag gcc cga gtc acc ttg acc agc gac acg tct acg agt acg gtg tac 240
Gln Ala Arg Val Thr Leu Thr Ser Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
atg gac ctg agc agc ctg aca tct gag gac acg gcc gtc tat tac tgt 288
Met Asp Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
gcc gtc ctt tcc cct tcg aat ccc tgg ggc cag ggg acc acg gtc acc 336
Ala Val Leu Ser Pro Ser Asn Pro Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr
100 105 110
gtc tcc tcg 345
Val Ser Ser
115
<210> 13
<211> 115
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 13
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Val Asn Tyr
20 25 30
Ile Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asn Pro Asn Gly Gly Asn Thr Ser Tyr Ala Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Ala Arg Val Thr Leu Thr Ser Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Asp Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
- 72 031698
Ala Val Leu Ser Pro Ser Asn Pro Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115 <210> 14
<211> 324
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS <222> (1)..(324) <223> NI-105.24B2-VL, вариабельная последовательность легкой цепи (VL), где Glu в положении 3 последовательности может также быть Val <220>
<221> ^область <222> (67)..(99)
<223> гипервариабельный участок (CDR) VL-CDR1
<220>
<221> ^область
<222> (145)..(165)
<223> гипервариабельный участок (CDR) VL-CDR2
<220>
<221> ^область
<222> (262)..(294)
<223> гипервариабельный участок (CDR) VL-CDR3
<400> 14
tcc Ser 1 tat Tyr gag Glu ctg Leu act Thr 5 cag Gln cca Pro ccc Pro tcg Ser gtg Val 10 tca Ser gtg Val tcc Ser cca Pro gga Gly 15 cag Gln 48
acg gcc ggg atc acc tgc tct gga gat gct ttg cca aag caa ttt gtt 96
Thr Ala Gly Ile Thr Cys Ser Gly Asp Ala Leu Pro Lys Gln Phe Val
20 25 30
tat tgg tac cag aag aag cca ggc cag gcc cct gtg tta ttg ata tat 144
Tyr Trp Tyr Gln Lys Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
aaa gac act gag agg ccc tca cga atc cct gag cgc ttc tct ggc tcc 192
Lys Asp Thr Glu Arg Pro Ser Arg Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
acc tca ggg aca aca gtc gcg ttg acc atc aat ggg gtc cag gca gag 240
Thr Ser Gly Thr Thr Val Ala Leu Thr Ile Asn Gly Val Gln Ala Glu
65 70 75 80
gac gag gct gac tat tac tgt caa tca gcc gac cgc agt ggt gct ctt 288
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Ala Asp Arg Ser Gly Ala Leu
85 90 95
tgg gtg ttc ggc gga ggg acc aag ctg acc gtc cta 324
Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
- 73 031698 <210>15 <211> 108 <212> БЕЛОК <213> Homo sapiens <400>15
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val 10 Ser Val Ser Pro Gly 15 Gln
1 5
Thr Ala Gly Ile Thr Cys Ser Gly Asp Ala Leu Pro Lys Gln Phe Val
20 25 30
Tyr Trp Tyr Gln Lys Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Lys Asp Thr Glu Arg Pro Ser Arg Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Thr Ser Gly Thr Thr Val Ala Leu Thr Ile Asn Gly Val Gln Ala Glu
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Ala Asp Arg Ser Gly Ala Leu
85 90 95
Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 16 <211>378 <212> ДНК <213> Homo sapiens <220>
<221> CDS <222> (1)..(378) <223> NI-105.4A3-VH, вариабельная последовательность тяжелой цепи (VH), где Gln в положении 1 последовательности может также быть Glu и Ser в положении 7 последовательности может также быть Thr <220>
<221> У_область <222> (91)..(105) <223> гипервариабельный участок (CDR) VH-CDR1 <220>
<221> У_область <222> (148)..(198) <223> гипервариабельный участок (CDR) VH-CDR2 <220>
<221> У_область <222> (295)..(345)
- 74 031698 <223> гипервариабельный участок (CDR) VH-CDR3 <400> 16
cag Gln 1 gtg Val cag Gln ctg Leu gtg Val 5 gag Glu tct Ser ggg Gly gga Gly ggc Gly 10 gcg Ala gtc Val cag Gln cct Pro ggg Gly 15 ggg Gly 48
tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gcc tct gga ttc acc ttc agt gac tat 96
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
gcc atg cac tgg gtc cgc cag gct cca ggc aag ggg ctg cag tgg gtg 144
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Gln Trp Val
35 40 45
gca gtt ata tcg tat gag gga act tat aaa tac tat gca gac tcc gtg 192
Ala Val Ile Ser Tyr Glu Gly Thr Tyr Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
aag ggc cga ttc acc atc tcc aga gac aat tcc aag aac acg ctg aac 240
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Asn
65 70 75 80
ttg cag atg agc agc ctg aga gtt gaa gac acg gct gtg tat ttc tgt 288
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
gtg aaa gct cga gcc ttt gcc tcc gga cag cga agc acc tcc acc gta 336
Val Lys Ala Arg Ala Phe Ala Ser Gly Gln Arg Ser Thr Ser Thr Val
100 105 110
cct gac tac tgg ggc cag gga acc ctg gtc acc gtc tcc tcg 378
Pro Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 17
<211> 126
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 17
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ala Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Gln Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Glu Gly Thr Tyr Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Asn
65 70 75 80
- 75 031698
Leu Gln Met Ser Ser 85 Leu Arg Val Glu Asp 90 Thr Ala Val Tyr Phe 95 Cys
Val Lys Ala Arg Ala Phe Ala Ser Gly Gln Arg Ser Thr Ser Thr Val
100 105 110
Pro Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 18
<211> 324
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS <222> (1)..(324) <223> NI-105.4A3-VL, вариабельная последовательность легкой цепи (VL) <220>
<221> ^область <222> (67)..(99)
<223> гипервариабельный участок (CDR) VL-CDR1
<220>
<221> ^область
<222> (145)..(165)
<223> гипервариабельный участок (CDR) VL-CDR2
<220>
<221> ^область
<222> (262)..(294)
<223> гипервариабельный участок (CDR) VL-CDR3
<400> 18
tcc Ser 1 tat Tyr gag Glu ctg Leu act Thr 5 cag Gln cca Pro ccc Pro tcg Ser gtg Val 10 tca Ser gtg Val tcc Ser cca Pro gga Gly 15 caa Gln 48
acg gcc agg atc acc tgc tct gga gat gca ttg cca aaa aaa tat gct 96
Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Ala Leu Pro Lys Lys Tyr Ala
20 25 30
tat tgg tac cag cag aag tca ggc cag gcc cct gtg ttg gtc atc tat 144
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
gag gac aac aaa cga ccc tcc ggg atc cct gag aga ttc tct ggc tcc 192
Glu Asp Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
agc tca ggg aca gtg gcc acc ttg act atc agt ggg gcc cag gtg gac 240
Ser Ser Gly Thr Val Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Ala Gln Val Asp
65 70 75 80
gat gaa gct gac tac tac tgc tac tcg aca gac atc agt ggt gac ctt 288
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Tyr Ser Thr Asp Ile Ser Gly Asp Leu
85 90 95
- 76 031698
cgg gtg ttc ggc gga ggg acc aag ctg acc gtc ctc 324
Arg Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210>19 <211> 108 <212> БЕЛОК <213> Homo sapiens <400>19
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val 10 Ser Val Ser Pro Gly 15 Gln
1 5
Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Ala Leu Pro Lys Lys Tyr Ala
20 25 30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Glu Asp Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Ser Ser Gly Thr Val Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Ala Gln Val Asp
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Tyr Ser Thr Asp Ile Ser Gly Asp Leu
85 90 95
Arg Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 20 <211>451 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> зрелая тяжелая цепь ch4E4 (мышиный IgG2a) Аминокислотные последовательности тяжелой и легкой цепей конструктов химерного 4E4 (ch4E4) <400> 20
Glu 1 Val Gln Leu Val 5 Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val 10 Gln Pro Gly 15 Gly
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Phe Asn Ile Ser
20 25 30
Ala Ile His Trp Val Arg Gln Ala Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
- 77 031698
Gly Arg 50 Ile Arg Ser Lys Ser 55 His Asn Tyr Ala Thr 60 Leu Tyr Ala Ala
Ser Leu Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Arg Asp Asp Ser Arg Asn Thr
65 70 75 80
Ala Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Gln Thr Glu Asp Met Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Val Leu Ser Ala Asn Tyr Asp Thr Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser
115 120 125
Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val
130 135 140
Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu
145 150 155 160
Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Thr
180 185 190
Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro
195 200 205
Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr
210 215 220
Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met
245 250 255
Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu
260 265 270
Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val
275 280 285
His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu
290 295 300
- 78 031698
Arg 305 Val Val Ser Ala Leu 310 Pro Ile Gln His Gln 315 Asp Trp Met Ser Gly 320
Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr
355 360 365
Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu
370 375 380
Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val
405 410 415
Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val
420 425 430
His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr
435 440 445
Pro Gly Lys
450 <210> 21 <211> 213 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> зрелая легкая цепь ch4E4 (мышиный лямбда) <400> 21
Ser 1 Tyr Glu Leu Thr 5 Gln Pro Pro Ser Val 10 Ser Val Ser Pro Gly 15 Gln
Thr Ala Arg Ile Ser Cys Phe Gly Asp Thr Leu Pro Lys Gln Tyr Thr
20 25 30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
- 79 031698
Lys Asp 50 Thr Glu Arg Pro Ser Gly 55 Ile Pro Glu Arg 60 Phe Ser Gly Ser
Ser Ser Gly Thr Thr Val Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Ala Glu
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Ser Ala Asp Asn Ser Ala Thr Trp
85 90 95
Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys Ser
100 105 110
Ser Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Glu Thr
115 120 125
Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Thr Ile Thr Asp Phe Tyr Pro Gly Val
130 135 140
Val Thr Val Asp Trp Lys Val Asp Gly Thr Pro Val Thr Gln Gly Met
145 150 155 160
Glu Thr Thr Gln Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Met Ala Ser
165 170 175
Ser Tyr Leu Thr Leu Thr Ala Arg Ala Trp Glu Arg His Ser Ser Tyr
180 185 190
Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly His Thr Val Glu Lys Ser Leu Ser
195 200 205
Arg Ala Asp Cys Ser
210 <210> 22 <211> 451 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> зрелая тяжелая цепь ch4E4(N30Q) (мышиный IgG2a) <400>22
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
5 1015
Ser Leu Lys
Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Phe Gln Ile Ser
2530
- 80 031698
Ala Ile His 35 Trp Val Arg Gln Ala 40 Ser Gly Lys Gly Leu 45 Glu Trp Val
Gly Arg Ile Arg Ser Lys Ser His Asn Tyr Ala Thr Leu Tyr Ala Ala
50 55 60
Ser Leu Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Arg Asp Asp Ser Arg Asn Thr
65 70 75 80
Ala Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Gln Thr Glu Asp Met Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Val Leu Ser Ala Asn Tyr Asp Thr Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser
115 120 125
Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val
130 135 140
Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu
145 150 155 160
Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Thr
180 185 190
Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro
195 200 205
Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr
210 215 220
Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met
245 250 255
Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu
260 265 270
Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val
275 280 285
- 81 031698
His Thr 290 Ala Gln Thr Gln Thr 295 His Arg Glu Asp Tyr 300 Asn Ser Thr Leu
Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly
305 310 315 320
Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr
355 360 365
Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu
370 375 380
Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val
405 410 415
Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val
420 425 430
His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr
435 440 445
Pro Gly Lys
450 <210> 23 <211> 5 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> NI-105.4E4-VH (вариабельная последовательность тяжелой цепи VH)
CDR1 <400>23
Ile Ser Ala Ile His <210>24 <211>19 <212> БЕЛОК
- 82 031698 <213> Искусственная последовательность <220>
<223> NI-105.4E4-VH (вариабельная последовательность тяжелой цепи VH)
CDR2 <400>24
Arg Ile Arg Ser Lys Ser His Asn Tyr Ala Thr Leu Tyr Ala Ala Ser
5 1015
Leu Lys Gly <210>25 <211> 10 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> NI-105.4E4-VH (вариабельная последовательность тяжелой цепи VH)
CDR3 <400> 25
Leu Ser Ala Asn Tyr Asp Thr Phe Asp Tyr
5 10 <210> 26 <211> 11 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> NI-105.4E4-VL CDR1 (вариабельная последовательность легкой цепи VL
<400> 26
Phe Gly Asp Thr Leu Pro Lys Gln Tyr Thr Tyr
1 5 10
<210> 27
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220> <223> NI-105.4E4-VL (вариабельная последовательность легкой цепи VL
CDR2 <400> 27
Lys Asp Thr Glu Arg Pro Ser
5 <210> 28 <211> 10
- 83 031698
<212> <213> БЕЛОК Искусственная последовательность
<220> <223> NI-105.4E4-VL (вариабельная последовательность легкой цепи VL CDR3
<400> 28
Leu Ser Ala Asp Asn Ser Ala Thr Trp Val
510
<210> 29
<211> 5
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220> <223> NI-105.24B2-VH CDR1 (вариабельная последовательность тяжелой цепи VH)
<400> 29
Asn Tyr Ile Ile His
<210> 30
<211> 17
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220> <223> NI-105.24B2-VH (вариабельная последовательность тяжелой цепи VH)
CDR2 <400>30
Ile Ile Asn Pro Asn Gly Gly Asn Thr
Ser Tyr Ala Glu Lys
Phe Gln
Ala
<210> 31
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220> <223> NI-105.24B2-VH (вариабельная последовательность тяжелой цепи VH)
CDR3 <400>31
Leu Ser Pro Ser Asn Pro <210>32
- 84 031698 последовательность легкой цепи
VL)
<211> 11
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220> <223> NI-105.24B2-V: CDR1
<400> 32
Ser Gly Asp Ala Leu
1 5
<210> 33
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220> <223> NI-105.24B2-V CDR2
<400> 33
Lys Asp Thr Glu Arg
1 5
<210> 34
<211> 11
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220> <223> NI-105.24B2-V CDR3
<400> 34
Gln Ser Ala Asp Arg
1 5
<210> 35
<211> 5
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220> <223> NI-105.4A3-VH CDR1
<400> 35
Asp Tyr Ala Met His
1 5
<210> 36
<211> 17
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
Pro Ser (вариабельная
Ser Gly Ala Leu последовательность (вариабельная
Pro Lys Gln Phe
Val Tyr последовательность (вариабельная последовательность последовательность последовательность
Trp Val последовательность легкой легкой (вариабельная последовательность тяжелой последовательность цепи цепи цепи
VL)
VL)
VH)
- 85 031698 <220>
<223> NI-105.4A3-VH (вариабельная последовательность тяжелой цепи VH)
CDR2 <400>36
Val Ile Ser Tyr Glu Gly Thr Tyr Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
5 1015
Gly <210>37 <211>17 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> NI-105.4A3-VH (вариабельная последовательность тяжелой цепи VH)
CDR3 <400>37
Ala Arg Ala Phe Ala Ser Gly Gln Arg Ser Thr Ser Thr Val Pro Asp
5 1015
Tyr
<210> <211> <212> <213> 38 11 БЕЛОК Искусственная последовательность
<220> <223> NI-105.4A3-VL (вариабельная последовательность легкой цепи VL CDR1
<400> 38
Ser Gly Asp Ala Leu Pro Lys Lys Tyr Ala Tyr
510
<210> <211> <212> <213> 39 7 БЕЛОК Искусственная последовательность
<220> <223> NI-105.4A3-VL (вариабельная последовательность легкой цепи VL CDR2
<400> 39
Glu Asp Asn Lys Arg Pro Ser
- 86 031698
<210> 40
<211> 11
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220> <223> NI-105.4A3-VL CDR3 (вариабельная последовательность легкой цепи VL
<400> 40
Tyr Ser Thr Asp Ile Ser Gly Asp Leu Arg Val
5 10 <210> 41 <211> 11 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> ПЕПТИД <400>41
Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser Pro
510 <210>42 <211>15 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> ПЕПТИД <400>42
Gln Glu Gly Asp Thr Asp Ala Gly Leu Lys Glu Ser Pro Leu Gln 1 5 1015 <210>43 <211>15 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Аланиновый мутагенез эпитопа 4E4 <400> 43
Gly Gln Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe Lys Asp Arg 1 5 10 15
<210> <211> <212> <213> 44 15 БЕЛОК Искусственная последовательность
- 87 031698 <220>
<223> Аланиновый мутагенез эпитопа 4E4 <400> 44
Ala Gln Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe Lys Asp Arg
1 5 10 15
<210> 45
<211> 15
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аланиновый мутагенез эпитопа 4E4
<400> 45
Gly Ala Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe Lys Asp Arg
1 5 10 15
<210> 46
<211> 15
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аланиновый мутагенез эпитопа 4E4
<400> 46
Gly Gln Ala Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe Lys Asp Arg
1 5 10 15
<210> 47
<211> 15
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аланиновый мутагенез эпитопа 4E4
<400> 47
Gly Gln Val Ala Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe Lys Asp Arg
1 5 10 15
<210> 48
<211> 15
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аланиновый мутагенез эпитопа 4E4
<400> 48
Gly Gln Val Glu Ala Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe Lys Asp Arg
1 5 10 15
- 88 031698 <210> 49 <211> 15 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Аланиновый мутагенез эпитопа 4E4 <400> 49
Gly Gln Val Glu Val Ala Ser Glu Lys Leu Asp Phe Lys Asp Arg
1 5 10 15
<210> 50
<211> 15
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220> <223> Аланиновый мутагенез эпитопа 4E4
<400> 50
Gly Gln Val Glu Val Lys Ala Glu Lys Leu Asp Phe Lys Asp Arg
1 5 10 15
<210> 51
<211> 15
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220> <223> Аланиновый мутагенез эпитопа 4E4
<400> 51
Gly Gln Val Glu Val Lys Ser Ala Lys Leu Asp Phe Lys Asp Arg
1 5 10 15
<210> 52
<211> 15
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220> <223> Аланиновый мутагенез эпитопа 4E4
<400> 52
Gly Gln Val Glu Val Lys Ser Glu Ala Leu Asp Phe Lys Asp Arg
1 5 10 15
<210> <211> <212> <213> 53 15 БЕЛОК Искусственная последовательность
- 89 031698 <220>
<223> Аланиновый мутагенез эпитопа 4E4 <400> 53
Gly Gln Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Ala Asp Phe Lys Asp Arg
1 5 10 15
<210> 54
<211> 15
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220> <223> Аланиновый мутагенез эпитопа 4E4
<400> 54
Gly Gln Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Ala Phe Lys Asp Arg
1 5 10 15
<210> 55
<211> 15
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220> <223> Аланиновый мутагенез эпитопа 4E4
<400> 55
Gly Gln Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Ala Lys Asp Arg
1 5 10 15
<210> 56
<211> 15
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220> <223> Аланиновый мутагенез эпитопа 4E4
<400> 56
Gly Gln Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe Ala Asp Arg
1 5 10 15
<210> 57
<211> 15
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220> <223> Аланиновый мутагенез эпитопа 4E4
<400> 57
Gly Gln Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe Lys Ala Arg
1 5 10 15
- 90 031698 <210> 58 <211> 15 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Аланиновый мутагенез эпитопа 4E4 <400> 58
Gly Gln Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe Lys Asp Ala
1 5 10 15
<210> 59
<211> 15
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аланиновый мутагенез эпитопа 4E4
<400> 59
Lys Ala Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser Pro
1 5 10 15
<210> 60
<211> 15
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аланиновый мутагенез эпитопа 4E4
<400> 60
Ala Ala Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser Pro
1 5 10 15
<210> 61
<211> 15
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аланиновый мутагенез эпитопа 4E4
<400> 61
Lys Gly Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser Pro
1 5 10 15
<210> <211> <212> <213> 62 15 БЕЛОК Искусственная последовательность
- 91 031698 <220>
<223> Аланиновый мутагенез эпитопа 4E4 <400> 62
Lys Pro Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile 10 Val Tyr Lys Ser Pro 15
1 5
<210> 63
<211> 15
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220> <223> Аланиновый мутагенез эпитопа 4E4
<400> 63
Lys Ala Ala Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser Pro
1 5 10 15
<210> 64
<211> 15
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220> <223> Аланиновый мутагенез эпитопа 4E4
<400> 64
Lys Ala Lys Ala Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser Pro
1 5 10 15
<210> 65
<211> 15
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220> <223> Аланиновый мутагенез эпитопа 4E4
<400> 65
Lys Ala Lys Thr Ala His Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser Pro
1 5 10 15
<210> 66
<211> 15
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220> <223> Аланиновый мутагенез эпитопа 4E4
<400> 66
Lys Ala Lys Thr Asp Ala Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser Pro
1 5 10 15
- 92 031698 <210> 67 <211> 15 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Аланиновый мутагенез эпитопа 4E4 <400> 67
Lys Ala Lys Thr Asp His Ala Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser Pro
1 5 10 15
<210> 68
<211> 15
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220> <223> Аланиновый мутагенез эпитопа 4E4
<400> 68
Lys Ala Lys Thr Asp His Gly Gly Glu Ile Val Tyr Lys Ser Pro
1 5 10 15
<210> 69
<211> 15
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220> <223> Аланиновый мутагенез эпитопа 4E4
<400> 69
Lys Ala Lys Thr Asp His Gly Pro Glu Ile Val Tyr Lys Ser Pro
1 5 10 15
<210> 70
<211> 15
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220> <223> Аланиновый мутагенез эпитопа 4E4
<400> 70
Lys Ala Lys Thr Asp His Gly Ala Ala Ile Val Tyr Lys Ser Pro
1 5 10 15
<210> <211> <212> <213> 71 15 БЕЛОК Искусственная последовательность
- 93 031698 <220>
<223> Аланиновый мутагенез эпитопа 4E4 <400> 71
Lys Ala Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ala 10 Val Tyr Lys Ser Pro 15
1 5
<210> 72
<211> 15
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220> <223> Аланиновый мутагенез эпитопа 4E4
<400> 72
Lys Ala Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Ala Tyr Lys Ser Pro
1 5 10 15
<210> 73
<211> 15
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220> <223> Аланиновый мутагенез эпитопа 4E4
<400> 73
Lys Ala Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Ala Lys Ser Pro
1 5 10 15
<210> 74
<211> 15
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220> <223> Аланиновый мутагенез эпитопа 4E4
<400> 74
Lys Ala Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr Ala Ser Pro
1 5 10 15
<210> 75
<211> 15
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220> <223> Аланиновый мутагенез эпитопа 4E4
<400> 75
Lys Ala Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ala Pro
1 5 10 15
- 94 031698 <210> 76 <211> 15 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Аланиновый мутагенез эпитопа 4E4 <400> 76
Lys Ala Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser Ala
1 5 10 15
<210> 77
<211> 15
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аланиновый мутагенез
<400> 77
Ala Glu Gly Asp Thr Asp Ala Gly Leu Lys Glu Ser Pro Leu Gln
1 5 10 15
<210> 78
<211> 15
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аланиновый мутагенез
<400> 78
Gln Ala Gly Asp Thr Asp Ala Gly Leu Lys Glu Ser Pro Leu Gln
1 5 10 15
<210> 79
<211> 15
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аланиновый мутагенез
<400> 79
Gln Glu Ala Asp Thr Asp Ala Gly Leu Lys Glu Ser Pro Leu Gln
1 5 10 15
<210> <211> <212> <213> 80 15 БЕЛОК Искусственная последовательность
- 95 031698 <220>
<223> Аланиновый мутагенез <400> 80
Gln Glu Gly Ala Thr Asp Ala Gly Leu Lys 10 Glu Ser Pro Leu Gln 15
1 5
<210> 81
<211> 15
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220> <223> Аланиновый мутагенез
<400> 81
Gln Glu Gly Asp Ala Asp Ala Gly Leu Lys Glu Ser Pro Leu Gln
1 5 10 15
<210> 82
<211> 15
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220> <223> Аланиновый мутагенез
<400> 82
Gln Glu Gly Asp Thr Ala Ala Gly Leu Lys Glu Ser Pro Leu Gln
1 5 10 15
<210> 83
<211> 15
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220> <223> Аланиновый мутагенез
<400> 83
Gln Glu Gly Asp Thr Asp Gly Gly Leu Lys Glu Ser Pro Leu Gln
1 5 10 15
<210> 84
<211> 15
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220> <223> Аланиновый мутагенез
<400> 84
Gln Glu Gly Asp Thr Asp Pro Gly Leu Lys Glu Ser Pro Leu Gln
1 5 10 15
- 96 031698 <210> 85 <211> 15 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Аланиновый мутагенез <400> 85
Gln Glu Gly Asp Thr Asp Ala Ala Leu Lys Glu Ser Pro Leu Gln
1 5 10 15
<210> 86
<211> 15
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220> <223> Аланиновый мутагенез
<400> 86
Gln Glu Gly Asp Thr Asp Ala Gly Ala Lys Glu Ser Pro Leu Gln
1 5 10 15
<210> 87
<211> 15
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220> <223> Аланиновый мутагенез
<400> 87
Gln Glu Gly Asp Thr Asp Ala Gly Leu Ala Glu Ser Pro Leu Gln
1 5 10 15
<210> 88
<211> 15
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220> <223> Аланиновый мутагенез
<400> 88
Gln Glu Gly Asp Thr Asp Ala Gly Leu Lys Ala Ser Pro Leu Gln
1 5 10 15
<210> <211> <212> <213> 89 15 БЕЛОК Искусственная последовательность
- 97 031698 <220>
<223> Аланиновый мутагенез <400> 89
Gln Glu Gly Asp Thr Asp Ala Gly Leu Lys Glu Ala Pro Leu Gln
1 5 10 15
<210> 90
<211> 15
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220> <223> Аланиновый мутагенез
<400> 90
Gln Glu Gly Asp Thr Asp Ala Gly Leu Lys Glu Ser Ala Leu Gln
1 5 10 15
<210> 91
<211> 15
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220> <223> Аланиновый мутагенез
<400> 91
Gln Glu Gly Asp Thr Asp Ala Gly Leu Lys Glu Ser Pro Ala Gln
1 5 10 15
<210> 92
<211> 15
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220> <223> Аланиновый мутагенез
<400> 92
Gln Glu Gly Asp Thr Asp Ala Gly Leu Lys Glu Ser Pro Leu Ala
1 5 10 15
<210> 93
<211> 121
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220> <223> VH антитело
<400> 93
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
- 98 031698
Ser Leu Lys Leu 20 Ser Cys Ala Ala Ser 25 Gly Phe Asn Phe Gln 30 Ile Ser
Ala Ile His Trp Val Arg Gln Ala Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Arg Ser Lys Ser His Asn Tyr Ala Thr Leu Tyr Ala Ala
50 55 60
Ser Leu Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Arg Asp Asp Ser Arg Asn Thr
65 70 75 80
Ala Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Gln Thr Glu Asp Met Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Val Leu Ser Ala Asn Tyr Asp Thr Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120

Claims (29)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Изолированное моноклональное анти-тау антитело человека или его тау-связывающий фрагмент, содержащее вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (VL), причем (а) VH содержит CDR1 тяжелой цепи, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:23, CDR2 тяжелой цепи, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:24, и CDR3 тяжелой цепи, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:25; и (б) VL содержит CDR1 легкой цепи, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:26, CDR2 легкой цепи, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:27, и CDR3 легкой цепи, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:28.
  2. 2. Анти-тау антитело или его тау-связывающий фрагмент по п.1, в котором VH не содержит аспарагин в положении 30 согласно нумерации по Кабат.
  3. 3. Анти-тау антитело или его тау-связывающий фрагмент по п.1, в котором VH содержит глутамин в положении 30 согласно нумерации по Кабат.
  4. 4. Изолированное моноклональное анти-тау антитело человека или его тау-связывающий фрагмент, содержащее вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (VL), причем (а) VH содержит CDR1 тяжелой цепи, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:29, CDR2 тяжелой цепи, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:30, и CDR3 тяжелой цепи, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:31; и (б) VL содержит CDR1 легкой цепи, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:32, CDR2 легкой цепи, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:33, и CDR3 легкой цепи, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:34.
  5. 5. Изолированное моноклональное анти-тау антитело человека или его тау-связывающий фрагмент, содержащее вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (VL), причем (а) VH содержит CDR1 тяжелой цепи, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:35, CDR2 тяжелой цепи, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:36, и CDR3 тяжелой цепи, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:37; и (б) VL содержит CDR1 легкой цепи, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:38, CDR2 легкой цепи, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:39, и CDR3 легкой цепи, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:40.
  6. 6. Антитело или его тау-связывающий фрагмент по п.1, в котором VH состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:9, и в котором VL состоит из аминокислотной последовательности SEQ
    - 99 031698
    ID NO:11.
  7. 7. Антитело или его тау-связывающий фрагмент по п.1, в котором VH состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:93, и в котором VL состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:11.
  8. 8. Антитело или его тау-связывающий фрагмент по п.4, в котором VH состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:13, и в котором VL состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:15.
  9. 9. Антитело или его тау-связывающий фрагмент по п.5, в котором VH состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:17 и в котором VL состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:19.
  10. 10. Анти-тау антитело или его тау-связывающий фрагмент по любому из пп.1 и 4-9, причем указанное антитело или фрагмент является полностью человеческим.
  11. 11. Антитело или его тау-связывающий фрагмент по любому из пп.1-10, которое выбирают из группы, состоящей из одноцепочечного фрагмента Fv(scFv), фрагмента F(ab'), фрагмента F(ab) и фрагмента F(ab')2.
  12. 12. Полинуклеотид, кодирующий антитело или его тау-связывающий фрагмент по любому из пп.111.
  13. 13. Вектор, содержащий полинуклеотид по п.12 для продуцирования антитела по любому из пп.1-11 или его тау-связывающего фрагмента.
  14. 14. Выделенная клетка-хозяин, содержащая полинуклеотид по п.12 или вектор по п.13 для продуцирования антитела по любому из пп.1-11 или его тау-связывающего фрагмента.
  15. 15. Способ получения анти-тау антитела или его тау-связывающего фрагмента по любому из пп.111, включающий:
    (а) культивирование клетки по п.14 и (б) выделение указанного антитела или его тау-связывающего фрагмента из культуры.
  16. 16. Анти-тау антитело или его тау-связывающий фрагмент, полученный способом по п.15.
  17. 17. Антитело или его тау-связывающий фрагмент по любому из пп.1-11, причем указанное антитело или фрагмент является детектируемо меченым, где детектируемую метку выбирают из группы, состоящей из фермента, радиоизотопа, флуорофора и тяжелого металла.
  18. 18. Антитело или его тау-связывающий фрагмент по любому из пп.1-11, причем указанное антитело или фрагмент присоединено к лекарственному средству.
  19. 19. Диагностическая композиция для мониторинга прогрессирования нейродегенеративной таупатии, содержащая антитело или его тау-связывающий фрагмент по любому из пп.1-11, полинуклеотид по п.12, вектор по п.13 или изолированную клетку-хозяин по п.14 и один или несколько реагентов, обычно используемых в иммунологических способах или в диагностических способах с использованием нуклеиновых кислот.
  20. 20. Фармацевтическая композиция для профилактического или терапевтического лечения нейродегенеративного заболевания, содержащая антитело или его тау-связывающий фрагмент по любому из пп.1-11, полинуклеотид по п.12, вектор или векторы по п.13 или изолированную клетку-хозяин по п.14 и фармацевтически приемлемый носитель.
  21. 21. Применение анти-тау антитела или его тау-связывающего фрагмента по любому из пп.1-11 для профилактического или терапевтического лечения нейродегенеративной таупатии у субъекта-человека.
  22. 22. Применение по п.21, отличающееся тем, что нейродегенеративная таупатия представляет собой болезнь Альцгеймера.
  23. 23. Применение анти-тау антитела или его тау-связывающего фрагмента по любому из пп.1-11 для контроля прогрессирования нейродегенеративной таупатии у субъекта-человека, где нейродегенеративная таупатия выбрана из группы, состоящей из болезни Альцгеймера, комплекса боковой амиотрофический склероз/паркинсонизм-деменция, деменции с аргирофильными гранулами, амилоидной ангиопатии британского типа, церебральной амилоидной ангиопатии, кортикобазальной дегенерации, болезни Крейцфельда-Якоба, боксерской деменции, диффузных нейрофибриллярных клубочков с кальцификацией, синдрома Дауна, фронтотемпоральной деменции, фронтотемпоральной деменции с паркинсонизмом, ассоциированной с хромосомой 17, фронтотемпоральной лобарной дегенерации, болезни ГерстманнаШтреусслера-Шейнкера, болезни Галлервордена-Шпатца, миозита с тельцами включений, множественной системной атрофии, миотонической дистрофии, болезни Ниманна-Пика типа С, негуамовской болезни двигательных нейронов с нейрофибриллярными клубками, болезни Пика, постэнцефалического паркинсонизма, прион-протеинцеребральной амилоидной ангиопатии, прогрессивного субкортикального глиоза, прогрессивного надъядерного паралича, подострого склерозирующего панэнцефалита, деменции, проявляющейся только в образовании клубков, мультиинфарктной деменции и ишемического инсульта.
  24. 24. Применение анти-тау антитела или его тау-связывающего фрагмента по любому из пп.1-11 для контроля ответа на лечение нейродегенеративной таупатии у субъекта-человека, где нейродегенеративная таупатия выбрана из группы, состоящей из болезни Альцгеймера, комплекса боковой амиотрофический склероз/паркинсонизм-деменция, деменции с аргирофильными гранулами, амилоидной ангиопатии
    - 100 031698 британского типа, церебральной амилоидной ангиопатии, кортикобазальной дегенерации, болезни Крейцфельда-Якоба, боксерской деменции, диффузных нейрофибриллярных клубочков с кальцификацией, синдрома Дауна, фронтотемпоральной деменции, фронтотемпоральной деменции с паркинсонизмом, ассоциированной с хромосомой 17, фронтотемпоральной лобарной дегенерации, болезни ГерстманнаШтреусслера-Шейнкера, болезни Галлервордена-Шпатца, миозита с тельцами включений, множественной системной атрофии, миотонической дистрофии, болезни Ниманна-Пика типа С, негуамовской болезни двигательных нейронов с нейрофибриллярными клубками, болезни Пика, постэнцефалического паркинсонизма, прион-протеинцеребральной амилоидной ангиопатии, прогрессивного субкортикального глиоза, прогрессивного надъядерного паралича, подострого склерозирующего панэнцефалита, деменции, проявляющейся только в образовании клубков, мультиинфарктной деменции и ишемического инсульта.
  25. 25. Способ диагностики прогрессирования нейродегенеративной таупатии у субъекта-человека, включающий:
    (а) оценку уровня патологически модифицированного или агрегированного тау в образце от субъекта-человека, нуждающегося в диагностике, с помощью по меньшей мере одного антитела по любому из пп.1-11; и (б) сравнение уровня модифицированного или агрегированного тау с эталоном, указывающим уровень патологически модифицированного или агрегированного тау у одного или нескольких контрольных субъектов-людей, при этом различие или сходство уровней между патологически модифицированным или агрегированным тау и эталоном указывает, что субъект-человек болен нейродегенеративной таупатией, где нейродегенеративная таупатия выбрана из группы, состоящей из болезни Альцгеймера, комплекса боковой амиотрофический склероз/паркинсонизм-деменция, деменции с аргирофильными гранулами, амилоидной ангиопатии британского типа, церебральной амилоидной ангиопатии, кортикобазальной дегенерации, болезни Крейцфельда-Якоба, боксерской деменции, диффузных нейрофибриллярных клубочков с кальцификацией, синдрома Дауна, фронтотемпоральной деменции, фронтотемпоральной деменции с паркинсонизмом, ассоциированной с хромосомой 17, фронтотемпоральной лобарной дегенерации, болезни Герстманна-Штреусслера-Шейнкера, болезни Галлервордена-Шпатца, миозита с тельцами включений, множественной системной атрофии, миотонической дистрофии, болезни Ниманна-Пика типа С, негуамовской болезни двигательных нейронов с нейрофибриллярными клубками, болезни Пика, постэнцефалического паркинсонизма, прион-протеинцеребральной амилоидной ангиопатии, прогрессивного субкортикального глиоза, прогрессивного надъядерного паралича, подострого склерозирующего панэнцефалита, деменции, проявляющейся только в образовании клубков, мультиинфарктной деменции и ишемического инсульта.
  26. 26. Способ контроля прогрессирования нейродегенеративной таупатии у субъекта-человека, включающий:
    (а) оценку уровня патологически модифицированного или агрегированного тау в образце от субъекта-человека, нуждающегося в диагностике, с помощью по меньшей мере одного антитела по любому из пп.1-11; и (б) сравнение уровня модифицированного или агрегированного тау с эталоном, указывающим уровень патологически модифицированного или агрегированного тау у одного или нескольких контрольных субъектов-людей, при этом различие или сходство уровней между патологически модифицированным или агрегированным тау и эталоном указывает, что субъект-человек болен нейродегенеративной таупатией, где нейродегенеративная таупатия выбрана из группы, состоящей из болезни Альцгеймера, комплекса боковой амиотрофический склероз/паркинсонизм-деменция, деменции с аргирофильными гранулами, амилоидной ангиопатии британского типа, церебральной амилоидной ангиопатии, кортикобазальной дегенерации, болезни Крейцфельда-Якоба, боксерской деменции, диффузных нейрофибриллярных клубочков с кальцификацией, синдрома Дауна, фронтотемпоральной деменции, фронтотемпоральной деменции с паркинсонизмом, ассоциированной с хромосомой 17, фронтотемпоральной лобарной дегенерации, болезни Герстманна-Штреусслера-Шейнкера, болезни Галлервордена-Шпатца, миозита с тельцами включений, множественной системной атрофии, миотонической дистрофии, болезни Ниманна-Пика типа С, негуамовской болезни двигательных нейронов с нейрофибриллярными клубками, болезни Пика, постэнцефалического паркинсонизма, прион-протеинцеребральной амилоидной ангиопатии, прогрессивного субкортикального глиоза, прогрессивного надъядерного паралича, подострого склерозирующего панэнцефалита, деменции, проявляющейся только в образовании клубков, мультиинфарктной деменции и ишемического инсульта.
  27. 27. Применение антитела или его тау-связывающего фрагмента по любому из пп.1-11 для in vivo детектирования тау в организме человека или животного, где указанное in vivo детектирование включает позитронную эмиссионную томографию (PET), однофотонную эмиссионную томографию (SPECT), оптическую визуализацию в ближней инфракрасной области (NIR) или магнитно-резонансную визуализацию (MRI).
  28. 28. Применение антитела или его тау-связывающего фрагмента по любому из пп.1-11 для нацели
    - 101 031698 вания терапевтического или диагностического агента на тау в организме человека или животного.
  29. 29. Набор для использования в диагностике нейродегенеративной таупатии, содержащий антитело или его тау-связывающий фрагмент по любому из пп.1-11, полинуклеотид по п.12, вектор по п.13 или изолированную клетку-хозяин по п.14 с реагентами и инструкциями по использованию.
    A NI-105.4E4-VH (вариабельная последовательность тяжелой цепи VH; SEQID NO: 9)
    FR1---------------------------CDR1-FR2-----------CDR2--------SVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFNFNISAIHWVRQASGKGLEWVGRIRSKSHNYATLY
    ------FR3-----------------------------CDR3------FR4-------AASLKGRFTLSRDDSRNTAYLQMSSLQTEDMAVYYCTVLSANYpTFDYWGQGTLVTVSS
    N1-105.4E4-VL (вариабельная последовательность легкой цепи VL; SEQ. ID NO: 11)
    FR1-------------------CDR1-------FR2------------CDR2---FR3---SYELTQPPSVSVSPGQTARI3CFGDTLPKQYTYWYQQKPGQAPVLVIYKDTERPSGIPERFS
    LPV
    -------------------------CDR3------FR4------GSSSGTTVTLTISGVQAEDEADYYCLSADNSATWVFGGGTKVTVL
    В NI-105.24B2-VH (вариабельная последовательность тяжелой цепи VH; SEQ ID NO: 13)
    FR1---------------------------CDR1-FR2-----------CDR2--------QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFVNYIlHVTvRQAPGQGLEWMGIINPNGGNTSYAE E
    ----FR3-----------------------------CDR3--FR4-------KFQARVTLTSDTSTSTVYMDLSSLTSEDTAVYYCAVLSPSMPWGQGTTVTVSS
    NI-105.24B2-VL (вариабельная последовательность легкой цепи VL; SEQ ID NO: 15)
    FR1-------------------CDR1-------FR2------------CDR2---FR3---SYELTQPPSVSVSPGQTAGITCSGpALPKQFVYWYQKKPGQAPVLLlYKDTERPSRIPERFS
    V
    -------------------------CDR3-------FR4------GSTSGTTVALTINGVQAEDEADYYCQSADRSGALWVFGGGTKLTVL
    C NI-105.4A3-VH (вариабельная последовательность тяжелой цепи VH; SEQ ID NO: 17)
    FR1---------------------------CDR1-FR2-----------CDR2--------QVQLVESGGGAVQPGGS LRLS CAAS GFTFSDYAMHWRQAPGKGLQWVAVISYEGTYKYYAD
    E T
    ----FR3-----------------------------CDR3-------------FR4-----SVKGRFTISRDNSKNTLNLQMSSLRVEDTAVYFCVKARAFASGQRSTSTyPpYWGQGTLVTV
    SS
    NI-105.4A3-VL (вариабельная последовательность легкой цепи VL; SEQ ID NO: 19)
    FR1-------------------CDR1-------FR2------------CDR2---FR3---SYELTQPPSVSVSPGQTARITCSGDALPKKYAYWYQQKSGQAPVLVIYEDNKRPSGIPERFS
    -------------------------CDR3-------FR4------GS S SGTVATLTISGAQVDDEADYYCYSTDISGDLRVFGGGTKLTVL
EA201390453A 2010-10-11 2011-10-11 Человеческие анти-тау антитела EA031698B1 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US39175110P 2010-10-11 2010-10-11
EP10013494 2010-10-11
PCT/IB2011/002786 WO2012049570A1 (en) 2010-10-11 2011-10-11 Human anti-tau antibodies

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201390453A1 EA201390453A1 (ru) 2013-08-30
EA031698B1 true EA031698B1 (ru) 2019-02-28

Family

ID=43602869

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201390453A EA031698B1 (ru) 2010-10-11 2011-10-11 Человеческие анти-тау антитела

Country Status (23)

Country Link
US (6) US20130295021A1 (ru)
EP (1) EP2627672B1 (ru)
JP (2) JP2014503178A (ru)
CN (1) CN103339146B (ru)
AU (1) AU2011315181B2 (ru)
BR (1) BR112013008765B8 (ru)
CA (1) CA2813493C (ru)
CY (1) CY1120951T1 (ru)
DK (1) DK2627672T3 (ru)
EA (1) EA031698B1 (ru)
ES (1) ES2686550T3 (ru)
HR (1) HRP20181320T8 (ru)
IL (1) IL225670B (ru)
LT (1) LT2627672T (ru)
MX (1) MX345092B (ru)
NZ (1) NZ609984A (ru)
PL (1) PL2627672T3 (ru)
PT (1) PT2627672T (ru)
SG (1) SG189174A1 (ru)
SI (1) SI2627672T1 (ru)
TR (1) TR201812636T4 (ru)
WO (1) WO2012049570A1 (ru)
ZA (1) ZA201303175B (ru)

Families Citing this family (83)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL199534A (en) 2007-01-05 2013-01-31 Univ Zuerich An isolated human antibody capable of detecting a neoepitope in a disease-related protein, a polynucleotide encoding an antibody, a vector containing the polynucleotide, a host cell containing the polynucleotide or vector, a preparation containing the antibody and related methods and uses.
EA031698B1 (ru) 2010-10-11 2019-02-28 Байоджен Интернэшнл Нейросайенз Гмбх Человеческие анти-тау антитела
CA2826286C (en) 2011-01-31 2021-09-21 Intellect Neurosciences Inc. Treatment of tauopathies
AU2012359039B2 (en) * 2011-12-20 2017-08-24 Janssen Biotech, Inc. Anti-PHF-tau antibodies and their uses
RU2668159C2 (ru) 2012-07-03 2018-09-26 Вашингтон Юниверсити Антитела против тау
WO2014016737A1 (en) * 2012-07-24 2014-01-30 Pfizer Inc. Novel chicken monoclonal antibodies against human phosphorylated tau and uses thereof
BR112015003326A2 (pt) 2012-08-16 2017-07-04 Ipierian Inc métodos de tratamento de uma tauopatia
US20140056901A1 (en) * 2012-08-21 2014-02-27 The Institute For Molecular Medicine Anti-tau antibodies and compositions for and methods of making and using in treatment, diagnosis and monitoring of tauopathies
US9598484B2 (en) * 2012-12-21 2017-03-21 Biogen Ma Inc. Human anti-tau antibodies
US8980270B2 (en) 2013-01-18 2015-03-17 Ipierian, Inc. Methods of treating a tauopathy
JP6674888B2 (ja) 2013-03-13 2020-04-01 プロセナ バイオサイエンシーズ リミテッド タウ免疫療法
JP6568514B2 (ja) * 2013-03-15 2019-08-28 エーシー イミューン エス．エー． 抗タウ抗体及び使用方法
EA039554B1 (ru) * 2013-06-10 2022-02-09 АйПИЕРИАН, ИНК. Способ снижения уровней a40 и/или a42 в нервной клетке и/или во внеклеточной жидкости
GB201312226D0 (en) * 2013-07-08 2013-08-21 Adx Neurosciences Improved antibodies
BR112016010454A2 (pt) * 2013-11-27 2017-12-05 Ipierian Inc métodos para tratar uma taupatia
CN105899533B (zh) 2013-12-20 2019-10-11 豪夫迈·罗氏有限公司 人源化的抗-Tau(pS422)抗体和使用方法
US10400018B2 (en) 2014-02-14 2019-09-03 Ipierian, Inc. Tau peptides, anti-tau antibodies, and methods of use thereof
AR100978A1 (es) 2014-06-26 2016-11-16 Hoffmann La Roche LANZADERAS CEREBRALES DE ANTICUERPO HUMANIZADO ANTI-Tau(pS422) Y USOS DE LAS MISMAS
ZA201608812B (en) * 2014-06-26 2019-08-28 Janssen Vaccines & Prevention Bv Antibodies and antigen-binding fragments that specifically bind to microtubule-associated protein tau
US10400034B2 (en) 2014-06-26 2019-09-03 Janssen Vaccines & Prevention, B.V. Antibodies and antigen-binding fragments that specifically bind to microtubule-associated protein tau
TWI664190B (zh) * 2014-06-27 2019-07-01 美商Ｃ２Ｎ醫療診斷有限責任公司 人類化抗－ｔａｕ抗體
EP3200832B1 (en) * 2014-09-30 2020-07-29 Washington University Tau kinetic measurements
US10098973B2 (en) 2014-10-10 2018-10-16 National Research Council Of Canada Anti-tau antibody and uses thereof
WO2016079597A1 (en) * 2014-11-19 2016-05-26 Axon Neuroscience Se Humanized tau antibodies in alzheimer's disease
MA41115A (fr) 2014-12-02 2017-10-10 Biogen Int Neuroscience Gmbh Procédé de traitement de la maladie d'alzheimer
US10202444B2 (en) 2015-02-24 2019-02-12 Rpeptide, Llc Anti-tau antibodies
JO3576B1 (ar) * 2015-02-26 2020-07-05 Lilly Co Eli أجسام مضادة لـ tau واستخداماتها
WO2016164530A1 (en) * 2015-04-07 2016-10-13 University Of Maryland, College Park Compositions and methods for high throughput protein sequencing
JP6793134B2 (ja) 2015-06-05 2020-12-02 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ｔａｕ抗体及び使用方法
WO2016207245A1 (en) 2015-06-24 2016-12-29 F. Hoffmann-La Roche Ag Humanized anti-tau(ps422) antibodies and methods of use
MX2017015908A (es) 2015-07-06 2018-03-15 Ucb Biopharma Sprl Anticuerpos de union a tau.
GB201512203D0 (en) 2015-07-13 2015-08-19 Lundbeck & Co As H Agents,uses and methods
JO3711B1 (ar) 2015-07-13 2021-01-31 H Lundbeck As أجسام مضادة محددة لبروتين تاو وطرق استعمالها
CN105388302A (zh) * 2015-12-22 2016-03-09 中国医学科学院输血研究所 一种人免疫球蛋白制品中Tau蛋白抗体含量的检测方法
US11340225B2 (en) 2016-03-14 2022-05-24 Biogen International Neuroscience Gmbh Antibody-dependent cell-mediated phagocytosis assay for reliably measuring uptake of aggregated proteins
KR102533675B1 (ko) 2016-05-02 2023-05-22 프로테나 바이오사이언시즈 리미티드 타우 인식 항체
FI3452507T3 (fi) 2016-05-02 2022-12-15 Tau-immuunihoito
EA201892417A1 (ru) 2016-05-02 2019-05-31 Протена Биосайенсис Лимитед Антитела, распознающие тау
US20200308259A1 (en) 2016-06-07 2020-10-01 Biogen International Neuroscience Gmbh Methods for treating alzheimer's disease
GEP20217222B (en) 2016-07-12 2021-02-10 Lundbeck A/S H Antibodies specific for hyperphosphorylated tau and methods of use thereof
JP2018035137A (ja) 2016-07-13 2018-03-08 マブイミューン ダイアグノスティックス エイジーＭａｂｉｍｍｕｎｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ａｇ 新規な抗線維芽細胞活性化タンパク質（ｆａｐ）結合薬剤およびその使用
WO2018017370A1 (en) * 2016-07-20 2018-01-25 Anahit Ghochikyan Humanized anti-tau antibodies and compositions for and methods of making and using in treatment, diagnosis and monitoring of tauopathies
MA45715A (fr) 2016-07-25 2019-05-29 Biogen Ma Inc Anticorps anti-hspa5 (grp78) et leurs utilisations
US10988529B2 (en) 2016-08-09 2021-04-27 Eli Lilly And Company Combination therapy
EP3509622A4 (en) 2016-09-08 2020-06-17 Regenerative Research Foundation BI-FUNCTIONAL ANTI-TAU POLYPEPTIDES AND THEIR USE
JP2020511937A (ja) 2016-12-07 2020-04-23 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ｔａｕ抗体及び使用方法
AR110321A1 (es) 2016-12-07 2019-03-20 Genentech Inc Anticuerpos antitau y métodos de uso
WO2018112362A1 (en) 2016-12-16 2018-06-21 Biogen Ma Inc. Stabilized proteolytically activated growth differentiation factor 11
WO2018152359A1 (en) 2017-02-17 2018-08-23 Denali Therapeutics Inc. Anti-tau antibodies and methods of use thereof
JP2018139530A (ja) 2017-02-27 2018-09-13 帝人ファーマ株式会社 認知症治療又は予防のためのヒト化抗体及びその製造方法、並びにそれを用いた認知症治療剤又は予防剤
JOP20180021A1 (ar) * 2017-03-16 2019-01-30 Janssen Biotech Inc الأجسام المضادة لتكتلات خيوط بروتين تاو (tau) الحلزونية المزدوجة واستخداماتها
JP2020515543A (ja) 2017-03-28 2020-05-28 ジェネンテック， インコーポレイテッド 神経変性疾患の治療方法
CA3056517A1 (en) * 2017-03-28 2018-10-04 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Binding molecules that specifically bind to tau
JP2020515846A (ja) * 2017-03-28 2020-05-28 ヤンセン ファッシンズ アンド プリベンション ベーフェーＪａｎｓｓｅｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ＆ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ Ｂ．Ｖ． タウタンパク質凝集を調節する化合物の検出のための方法
CN110881274A (zh) 2017-05-02 2020-03-13 普罗塞纳生物科学有限公司 识别tau的抗体
CA3064550A1 (en) * 2017-06-16 2018-12-20 Bristol-Myers Squibb Company Compositions and methods for treating tauopathies
SG11202001281WA (en) 2017-08-22 2020-03-30 Biogen Ma Inc Pharmaceutical compositions containing anti-beta amyloid antibodies
EP3691639B1 (en) 2017-10-02 2023-11-15 Merck Sharp & Dohme LLC Chromane monobactam compounds for the treatment of bacterial infections
JP6851549B2 (ja) * 2017-10-16 2021-03-31 エーザイ・アール・アンド・ディー・マネジメント株式会社 抗タウ抗体及びその使用
KR20200094177A (ko) * 2017-12-04 2020-08-06 얀센 백신스 앤드 프리벤션 비.브이. 타우에 특이적으로 결합하는 결합 분자
EP3724232A4 (en) 2017-12-14 2021-12-15 The University of Ottawa EXOSOME PACKAGING AND TARGETED AUTOPHAGY
WO2019161384A1 (en) * 2018-02-19 2019-08-22 New York University Tau single domain antibodies
NL2020520B1 (en) * 2018-03-02 2019-09-12 Labo Bio Medical Invest B V Multispecific binding molecules for the prevention, treatment and diagnosis of neurodegenerative disorders
TW201946654A (zh) * 2018-03-05 2019-12-16 比利時商健生藥品公司 抗ＰＨＦ－Ｔａｕ抗體及其用途
CA3090356A1 (en) * 2018-03-11 2019-09-19 Koorosh Shahpasand Conformation-independent antibodies against neurotoxic tau proteins
WO2020028141A1 (en) 2018-07-31 2020-02-06 Eli Lilly And Company Combination therapy
JP2022509372A (ja) 2018-10-29 2022-01-20 バイオジェン・エムエイ・インコーポレイテッド 血液脳関門輸送の促進のためのヒト化され安定化されたｆｃ５バリアント
PE20211777A1 (es) * 2018-11-08 2021-09-08 Prothena Biosciences Ltd Anticuerpos que reconocen tau
BR112021016947A2 (pt) 2019-03-03 2021-11-03 Prothena Biosciences Ltd Anticorpos que reconhecem tau
CN113874078A (zh) 2019-04-05 2021-12-31 Tauc3生物制品有限公司 抗tauc3抗体及其应用
CA3148740A1 (en) 2019-08-06 2021-02-11 Aprinoia Therapeutics Limited Antibodies that bind to pathological tau species and uses thereof
CN114502781A (zh) * 2019-09-20 2022-05-13 纳维再生科技股份有限公司 个人化癌症免疫治疗
US20230265175A1 (en) 2020-06-25 2023-08-24 Merck Sharp & Dohme Llc High affinity antibodies targeting tau phosphorylated at serine 413
US20240101654A1 (en) * 2020-12-29 2024-03-28 Neurimmune Ag Human anti-tau antibodies
IL310382A (en) 2021-08-27 2024-03-01 Genentech Inc Methods for treating tau pathologies
WO2023041805A1 (en) 2021-09-20 2023-03-23 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for improving the efficacy of hdac inhibitor therapy and predicting the response to treatment with hdac inhibitor
CA3239708A1 (en) 2021-12-03 2023-06-08 Aubin MICHALON Novel potency assay for antibody-based drugs and useful means therefor
WO2023178049A1 (en) 2022-03-14 2023-09-21 Genentech, Inc. Predicting neurodegenerative diseases based on speech analyses
WO2023250326A1 (en) 2022-06-21 2023-12-28 Genentech, Inc. Detecting longitudinal progression of alzheimer's disease (ad) based on speech analyses
TW202405020A (zh) 2022-07-29 2024-02-01 美商阿列克特有限責任公司 轉鐵蛋白受體抗原結合域及其用途
WO2024026471A1 (en) 2022-07-29 2024-02-01 Alector Llc Cd98hc antigen-binding domains and uses therefor
CN116948025B (zh) * 2023-09-14 2024-04-02 北京凯祥弘康生物科技有限公司 一种抗Tau蛋白的抗体
CN117106081B (zh) * 2023-09-28 2024-05-07 北京凯祥弘康生物科技有限公司 一种抗nfl蛋白的捕获抗体

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1993008302A1 (en) * 1991-10-25 1993-04-29 Itt Automotive Europe Gmbh Monoclonal antibodies directed against the microtubule-associated protein tau
WO1998022120A1 (en) * 1996-11-19 1998-05-28 The Wistar Institute Of Anatomy & Biology Diagnostic and therapeutic reagents for alzheimer's disease
WO2003014960A2 (en) * 2001-08-03 2003-02-20 Medical Research Council Method of identifying a consensus sequence for intracellular antibodies
US20060122122A1 (en) * 2004-12-06 2006-06-08 Toagosei Co., Ltd. Antimicrobial peptides and use thereof
WO2007068105A1 (en) * 2005-12-12 2007-06-21 Robarts Research Institute Method of diagnosing amyotrophic lateral sclerosis
US20080050383A1 (en) * 2006-03-29 2008-02-28 New York University Immunotherapy for clearing pathological tau conformers
WO2010144711A2 (en) * 2009-06-10 2010-12-16 New York University Immunological targeting of pathological tau proteins

Family Cites Families (55)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4741900A (en) 1982-11-16 1988-05-03 Cytogen Corporation Antibody-metal ion complexes
JP2532858B2 (ja) 1985-04-01 1996-09-11 セルテツク リミテツド 形質転換したミエロ―マ細胞系
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
DE3856559T2 (de) 1987-05-21 2004-04-29 Micromet Ag Multifunktionelle Proteine mit vorbestimmter Zielsetzung
US5892019A (en) 1987-07-15 1999-04-06 The United States Of America, As Represented By The Department Of Health And Human Services Production of a single-gene-encoded immunoglobulin
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
EP0362371A4 (en) 1988-04-15 1990-10-24 Protein Design Labs, Inc. Il-2 receptor-specific chimeric antibodies
DE68921982D1 (de) 1988-06-14 1995-05-04 Cetus Oncology Corp Kupplungsmittel und sterisch gehinderte, mit disulfid gebundene konjugate daraus.
IL162181A (en) 1988-12-28 2006-04-10 Pdl Biopharma Inc A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same
US5116964A (en) 1989-02-23 1992-05-26 Genentech, Inc. Hybrid immunoglobulins
US5225538A (en) 1989-02-23 1993-07-06 Genentech, Inc. Lymphocyte homing receptor/immunoglobulin fusion proteins
IE63847B1 (en) 1989-05-05 1995-06-14 Res Dev Foundation A novel antibody delivery system for biological response modifiers
AU633698B2 (en) 1990-01-12 1993-02-04 Amgen Fremont Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US5314995A (en) 1990-01-22 1994-05-24 Oncogen Therapeutic interleukin-2-antibody based fusion proteins
JP3319594B2 (ja) 1990-03-20 2002-09-03 ザ・トラスティーズ・オブ・コランビア・ユニバーシティー・イン・ザ・シティー・オブ・ニューヨーク 定常領域の代わりに受容体結合性リガンドを有するキメラ抗体
ATE218889T1 (de) 1990-11-09 2002-06-15 Stephen D Gillies Cytokine immunokonjugate
IE922437A1 (en) 1991-07-25 1993-01-27 Idec Pharma Corp Recombinant antibodies for human therapy
EP0746609A4 (en) * 1991-12-17 1997-12-17 Genpharm Int NON-HUMAN TRANSGENIC ANIMALS CAPABLE OF PRODUCING HETEROLOGOUS ANTIBODIES
NZ255101A (en) 1992-07-24 1997-08-22 Cell Genesys Inc A yeast artificial chromosome (yac) vector containing an hprt minigene expressible in murine stem cells and genetically modified rodent therefor
DE69232604T2 (de) 1992-11-04 2002-11-07 City Of Hope Duarte Antikörperkonstrukte
DK0669986T3 (da) 1992-11-13 2003-07-28 Idec Pharma Corp Fuldstændigt inaktiverede kozac-sekvenser til ekspression i pattedyr
US5736137A (en) 1992-11-13 1998-04-07 Idec Pharmaceuticals Corporation Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human B lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of B cell lymphoma
EP0673418B1 (en) 1992-12-14 1998-05-06 N.V. Innogenetics S.A. Monoclonal antibodies directed against the microtubule-associated protein tau, hybridomas secreting these antibodies, antigen recognition by these monoclonal antibodies and their applications
ATE335007T1 (de) 1993-12-21 2006-08-15 Innogenetics Nv Monoklonale antikörper gegen phf-tau, hybridomen die diese ausscheiden, antigenerkennung durch diesen antikörper und deren verwendungen
WO1996004309A1 (en) 1994-07-29 1996-02-15 Innogenetics N.V. Monoclonal antibodies specific for an epitope of a particular subclass or form of phosphorylated tau, hybridomas secreting them, antigen recognition of these antibodies and their applications
EP1978033A3 (en) 1995-04-27 2008-12-24 Amgen Fremont Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
CA2219486A1 (en) 1995-04-28 1996-10-31 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
GB9524973D0 (en) 1995-12-06 1996-02-07 Lynxvale Ltd Viral vectors
JP4128227B2 (ja) 1997-03-14 2008-07-30 バイオジェン・アイデック・インコーポレイテッド 哺乳類細胞内の特定部位に相同組換えによって遺伝子を組み込む方法とそれを実施するためのベクター
ES2258817T3 (es) 1997-05-21 2006-09-01 Biovation Limited Metodo para la produccion de proteinas no inmunogenas.
WO2000030680A1 (en) 1998-11-23 2000-06-02 Idec Pharmaceuticals Corporation Tumor antigen-specific antibody-gp39 chimeric protein constructs
US20040110938A1 (en) 2000-02-24 2004-06-10 Parekh Rajesh Bhikhu Proteins, genes and their use for diagnosis and treatment of schizophrenia
JP4368196B2 (ja) 2000-11-17 2009-11-18 ユニバーシティー オブ ロチェスター 真核細胞において免疫グロブリン分子を製造および同定するインビトロにおける方法
WO2002096948A2 (en) 2001-01-29 2002-12-05 Idec Pharmaceuticals Corporation Engineered tetravalent antibodies and methods of use
BR0206985A (pt) 2001-01-29 2005-04-19 Idec Pharma Corp Anticorpos modificados e métodos de uso
AT500379B8 (de) 2001-02-02 2009-08-15 Axon Neuroscience Tau-proteine
WO2003017918A2 (en) 2001-08-24 2003-03-06 Universität Zürich A method of inducing the formation of neurofibrillary tangles in transgenic animals
US20030157641A1 (en) 2001-11-16 2003-08-21 Idec Pharmaceuticals Corporation Polycistronic expression of antibodies
AU2003257850A1 (en) 2002-08-14 2004-03-03 Mitsubishi Kagaku Iatron, Inc. ANTIBODY SPECIFIC TO CENTRAL Tau-PROTEIN
WO2004095031A1 (en) 2003-04-24 2004-11-04 Universität Zürich Method of monitoring immunotherapy
NZ545776A (en) 2003-08-22 2009-05-31 Biogen Idec Inc Improved antibodies having altered effector function and methods for making the same
WO2005080986A1 (en) 2004-02-18 2005-09-01 University Of Iowa Research Foundation Antibodies to phosphorylated tau, methods of making and methods of use
US7083854B1 (en) 2005-05-10 2006-08-01 Cornell Research Foundation, Inc. Fibers from polymer nanoclay nanocomposites by electrospinning
WO2007011907A2 (en) 2005-07-19 2007-01-25 University Of Rochester Alpha-synuclein antibodies and methods related thereto
SI2436696T1 (sl) 2007-01-05 2017-10-30 University Of Zurich Anti-beta-amiloidno protitelo in načini njegove uporabe
CA2737267A1 (en) * 2008-09-16 2010-04-08 Simon Fraser University Selective glycosidase inhibitors and uses thereof
US8609097B2 (en) 2009-06-10 2013-12-17 Hoffmann-La Roche Inc. Use of an anti-Tau pS422 antibody for the treatment of brain diseases
WO2011053565A2 (en) 2009-10-29 2011-05-05 Biomedical Sciences Research Centre "Alexander Fleming" Compositions and methods for detecting a tauopathy
MY164376A (en) 2010-10-07 2017-12-15 Univ Leuven Kath Phosphospecific antibodies recognizing tau
EA031698B1 (ru) 2010-10-11 2019-02-28 Байоджен Интернэшнл Нейросайенз Гмбх Человеческие анти-тау антитела
CA2826286C (en) 2011-01-31 2021-09-21 Intellect Neurosciences Inc. Treatment of tauopathies
WO2012149365A2 (en) 2011-04-27 2012-11-01 Northwestern University Antibodies selective for pathological tau dimers and prefibrillar pathological tau oligomers and their uses in treatment, diagnosis and monitoring of tauopathies
US20120323214A1 (en) 2012-05-16 2012-12-20 Totada R Shantha Alzheimer's disease treatment with multiple therapeutic agents delivered to the olfactory region through a special delivery catheter and iontophoresis
US9598484B2 (en) 2012-12-21 2017-03-21 Biogen Ma Inc. Human anti-tau antibodies

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1993008302A1 (en) * 1991-10-25 1993-04-29 Itt Automotive Europe Gmbh Monoclonal antibodies directed against the microtubule-associated protein tau
WO1998022120A1 (en) * 1996-11-19 1998-05-28 The Wistar Institute Of Anatomy & Biology Diagnostic and therapeutic reagents for alzheimer's disease
WO2003014960A2 (en) * 2001-08-03 2003-02-20 Medical Research Council Method of identifying a consensus sequence for intracellular antibodies
US20060122122A1 (en) * 2004-12-06 2006-06-08 Toagosei Co., Ltd. Antimicrobial peptides and use thereof
WO2007068105A1 (en) * 2005-12-12 2007-06-21 Robarts Research Institute Method of diagnosing amyotrophic lateral sclerosis
US20080050383A1 (en) * 2006-03-29 2008-02-28 New York University Immunotherapy for clearing pathological tau conformers
WO2010144711A2 (en) * 2009-06-10 2010-12-16 New York University Immunological targeting of pathological tau proteins

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Anonymous: "Four new research studies describe experimental immunotherapies for Alzheimer's", Alzheimer's Association International Conference on Alzheimer's Disease 13 July 2010 (2010-07-13), page 3PP, XP002625813, Retrieved from the Internet: URL:http://www.alz.org/icad/2010_release_four_071310_1230pm.asp [retrieved on 2011-02-28] page 2, section "Tau antibodies reduce tangles in Alzheimer-model mice" *
ASUNI AYODEJI A, ET AL: "Immunotherapy targeting pathological tau conformers in a tangle mouse model reduces brain pathology with associated functional improvements", THE JOURNAL OF NEUROSCIENCE, SOCIETY FOR NEUROSCIENCE, US, vol. 27, no. 34, 1 August 2007 (2007-08-01), US, pages 9115 - 9129, XP002589887, ISSN: 0270-6474, DOI: 10.1523/JNEUROSCI.2361-07.2007 *
HOFFMANN R , LEE V M-Y, LEIGHT S, VARGA I, OTVOS L: "Unique Alzheimer's disease paired helical filament specific epitopes involve double phosphorylation at specific sites.", BIOCHEMISTRY, AMERICAN CHEMICAL SOCIETY, vol. 36, no. 26, 1 July 1997 (1997-07-01), pages 8114 - 8124, XP002625812, ISSN: 0006-2960, DOI: 10.1021/bi970380+ *
JEAN C. AUGUSTINACK, ANJA SCHNEIDER, EVA-MARIA MANDELKOW AND BRADLEY T. HYMAN: "Specific tau phosphorylation sites correlate with severity of neuronal cytopathology in Alzheimer's disease.", ACTA NEUROPATHOLOGICA., SPRINGER VERLAG, BERLIN, DE, vol. 103, no. 1, 1 January 2002 (2002-01-01), BERLIN, DE, pages 26 - 35, XP002625811, ISSN: 0001-6322, DOI: 10.1007/S004010100423 *
TALAN J: "Advances Reported In Targeting Pathology in Alzheimer Disease", NEUROLOGY TODAY, LIPPINCOTT WILLIAMS & WILKINS, US, vol. 10, no. 16, 19 August 2010 (2010-08-19), US, pages 17 - 19, XP002625814, ISSN: 1533-7006, DOI: 10.1097/01.NT.0000388162.41833.4c *

Also Published As

Publication number Publication date
CN103339146A (zh) 2013-10-02
CA2813493C (en) 2019-07-09
US20210238265A1 (en) 2021-08-05
AU2011315181A1 (en) 2013-05-09
WO2012049570A1 (en) 2012-04-19
JP2014503178A (ja) 2014-02-13
CN103339146B (zh) 2017-09-01
CA2813493A1 (en) 2012-04-19
EP2627672A1 (en) 2013-08-21
BR112013008765B1 (pt) 2022-07-12
HRP20181320T1 (hr) 2018-10-19
EP2627672B1 (en) 2018-08-01
US8940272B2 (en) 2015-01-27
US9605059B2 (en) 2017-03-28
US20190233506A1 (en) 2019-08-01
BR112013008765B8 (pt) 2023-05-02
US20120087861A1 (en) 2012-04-12
ZA201303175B (en) 2021-05-26
EA201390453A1 (ru) 2013-08-30
CY1120951T1 (el) 2019-12-11
US20130295021A1 (en) 2013-11-07
TR201812636T4 (tr) 2018-09-21
BR112013008765A2 (pt) 2020-09-15
DK2627672T3 (en) 2018-08-27
LT2627672T (lt) 2018-12-10
IL225670A0 (en) 2013-06-27
MX345092B (es) 2017-01-17
MX2013003879A (es) 2014-07-09
HRP20181320T8 (hr) 2018-12-14
JP2016138102A (ja) 2016-08-04
AU2011315181B2 (en) 2016-07-28
JP6300842B2 (ja) 2018-03-28
SG189174A1 (en) 2013-05-31
US20180002409A1 (en) 2018-01-04
SI2627672T1 (sl) 2018-10-30
NZ609984A (en) 2015-05-29
ES2686550T3 (es) 2018-10-18
PL2627672T3 (pl) 2018-11-30
IL225670B (en) 2018-04-30
US20150252102A1 (en) 2015-09-10
PT2627672T (pt) 2018-11-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20210238265A1 (en) Human Anti-Tau Antibodies
US20200262895A1 (en) Human anti-tau antibodies
EP2370466B1 (en) Human anti-alpha-synuclein autoantibodies
DK2723379T3 (en) ANTI-ALPHA SYNUCLEIN BINDING MOLECULES
US20140255304A1 (en) Tdp-43 specific binding molecules
NZ709976B2 (en) Human anti-tau antibodies
BR122022003923B1 (pt) Anticorpos anti-tau isolados e fragmentos de ligação a tau dos mesmos, seus usos e método de preparação, bem como polinucleotídeos, vetores de expressão, composições, e métodos in vitro de monitoramento da progressão de uma tautopatia neurodegenerativa e de uso do nível de taupatologicamente modificado ou agregado como um indicador de tautopatia neurodegenerativa