BR112013008765B1

BR112013008765B1 - Anticorpos monoclonais anti-tau humano isolados ou um fragmento de ligação à tau dos mesmos, métodos de preparação dos mesmos, polinucleotídeo ou polinucleotídeos, vetor ou vetores, composição, método in vitro de diagnóstico ou monitoramento da progressão de uma tauopatia neurodegenerativa em um indivíduo humano, método in vitro para diagnosticar uma tauopatia neurodegenerativa em um indivíduo humano, e kit útil para o diagnóstico de uma tauopatia neurodegenerativa

Info

Publication number: BR112013008765B1
Application number: BR112013008765-0A
Authority: BR
Inventors: Feng Chen; Jan Grimm; Jean-Lue Baeriswyl; Christopher Hock
Original assignee: University Of Zurich; Biogen International Neuroscience Gmbh
Priority date: 2010-10-11
Filing date: 2011-10-11
Publication date: 2022-07-12
Also published as: US20120087861A1; CN103339146A; US20190233506A1; HRP20181320T1; CN103339146B; AU2011315181B2; JP2014503178A; JP2016138102A; US20210238265A1; IL225670A0; CY1120951T1; EP2627672B1; TR201812636T4; EP2627672A1; BR112013008765A2; US20150252102A1; DK2627672T3; SI2627672T1; EA031698B1; SG189174A1

Abstract

ANTICORPOS ANTI-TAU HUMANOS. São fornecidos anticorpos humanos específicos de tau, bem como fragmentos, derivados e variantes dos mesmos, bem como métodos relacionados. Ensaios, kits e suportes sólidos relacionados com anticorpos específicos para tau são também divulgados. O anticorpo, a(s) cadeia(s) de imunoglobulina(s), bem como os fragmentos de ligação, derivados e variantes dos mesmos, podem ser usados em composições farmacêuticas e de diagnóstico para a imunoterapia e diagnóstico alvo de tau, respectivamente.

Description

Campo da Invenção

[001] A presente invenção geralmente refere-se a novas moléculas de ligação específicas de tau, em particular, anticorpos humanos bem como fragmentos, derivados e variantes das mesmas que reconhecem a proteína tau, incluindo tau fosforilada patologicamente e formas agregadas de tau. Além disso, a presente invenção refere-se a composições farmacêuticas e de diagnóstico compreendendo tais moléculas de ligação, anticorpos e miméticos das mesmas valiosos tanto como uma ferramenta de diagnóstico para a identificação de espécies de tau e tau tóxicas no plasma e CSF quanto também em estratégias de vacinação passiva para o tratamento de tauopatias neurodegenerativas como a doença de Alzheimer (AD), complexo de esclerose lateral amiotrófica/demência do parkinsonismo (ALS-PDC), demência de grãos argirofílicos (AGD), angiopatia amiloide tipo Britânica, angiopatia amiloide cerebral, degeneração córtico-basal (CBD), doença de Creutzfeldt-Jakob (CJD), demência pugilística, emaranhados neurofibrilares difusos com calcificação, síndrome de Down, demência frontotemporal, demência frontotemporal com parkinsonismo ligado ao cromossomo 17 (FTDP-17), degeneração lobar frontotemporal, doença de Gerstmann-Straussler-Scheinker, doença de Hallervorden-Spatz, miosite de corpos de inclusão, atrofia de múltiplos sistemas, distrofia miotônica, doença de Niemann-Pick tipo C (NP-C), doença do neurônio motor não Guamaniano com emaranhados neurofibrilares, doença de Pick (PiD), parkinsonismo pós encefalite, angiopatia amiloide cerebral de proteína do prion, gliose subcortical progressiva, paralisia supranuclear progressiva (PSP), panencefalite esclerosante subaguda, demência apenas por emaranhados, demência por multi-infarto e acidente vascular cerebral isquêmico.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] A acumulação, modificações e agregação de proteínas são aspectos patológicos de inúmeras doenças neurodegenerativas. Tau patologicamente modificada e agregada incluindo confôrmeros de tau hiperfosforilados são uma marca invariante de tauopatias e se correlacionam com a gravidade da doença.

[003] Tau é uma proteína associada ao microtúbulo expressa no sistema nervoso central com uma função primária para estabilizar os microtúbulos. Existem seis isoformas principais de tau expressas principalmente no cérebro humano adulto, que são derivados de um único gene por splicing alternativo. Em condições patológicas, a proteína tau se torna hiperfosforilada, o que resulta em uma perda de ligação da tubulina e desestabilização de microtúbulos seguido pela agregação e deposição de tau em emaranhados neurofibrilares patogênicos. Os distúrbios relacionados com a tau - coletivamente referidos como tauopatias neurodegenerativas - fazem parte de um grupo de distúrbios de desdobramento da proteína incluindo a doença de Alzheimer (AD), paralisia progressiva supranuclear, doença de Pick, degeneração corticabasal, FTDP-17 entre outros. Mais de 40 mutações no gene tau foram relatadas como estando associadas com demência frontotemporal hereditária demonstrando que as mutações no gene tau são suficientes para provocar neurodegeneração (Cairns et al., Am. J. Pathol. 171 (2007), 227-40). Estudos em camundongos transgênicos e cultura de células indicam que, em AD, a patologia de tau pode ser causada por uma cascata patológica em que Aβ se encontra a montante de tau (Gotz et al., Science 293 (2001), 1491-1495). Outra verificação, no entanto, aponta para um modelo de via dupla, onde ambas as cascatas funcionam independentemente umas das outras (van de Nes et al., Acta Neuropathol. 111 (2006), 126-138). Imunoterapias que têm como alvo o peptídeo beta-amiloide na AD têm produzido resultados animadores em modelos animais e se mostrado promissoras em ensaios clínicos. Dados da autópsia mais recentes de um pequeno número de indivíduos sugerem que a depuração de placas de beta- amiloide em doentes com AD progredida pode não ser suficiente para impedir a deterioração cognitiva, enfatizando a necessidade adicional de estratégias terapêuticas para a AD (Holmes et al., Lancet 372 (2008), 216-223; Boche et al., Acta Neuropathol. 120 (2010), 13-20). Na esteira do sucesso da terapia de imunização baseada em Abeta em modelos de animais transgênicos, o conceito de imunoterapia ativa foi expandido para a proteína tau. A vacinação ativa dos camundongos do tipo selvagem usando a proteína tau foi, no entanto, verificada como induzindo a formação de emaranhados neurofibrilares, dano axonal e infiltrados mononucleares no sistema nervoso central, acompanhado por déficits neurológicos (Rosenmann et al., Arch Neurol. 63 (2006), 1459-1467). Estudos subsequentes em linhagens de camundongos transgênicos usando vacinação ativa com peptídeos de tau fosforilada revelaram níveis cerebrais reduzidos de agregados de tau no cérebro e diminuíram a progressão da deficiência de comportamento (Sigurdsson, J. Alzheimers. Dis. 15 (2008), 157-168; Boimel et al., Exp. Neurol. 224 (2010), 472-485). Estas verificações destacam o benefício potencial, mas também os enormes riscos associados com abordagens de imunoterapia que têm como alvo tau. Novas estratégias terapêuticas com a terapia eficaz e segura abordando proteínas tau patológicas são urgentemente necessárias.

[004] A imunização passiva com anticorpos humanos derivados de sujeitos humanos saudáveis que são evolutivamente otimizados e maturados por afinidade pelo sistema imune humano proporcionaria uma nova via terapêutica promissora com uma elevada probabilidade de excelente eficácia e segurança.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[005] A presente invenção faz uso da resposta imunitária especifica de tau de sujeitos humanos saudáveis para o isolamento de anticorpos monoclonais humanos específicos de anti-tau natural. Em particular, as experiências realizadas de acordo com a presente invenção foram bem sucedidas no isolamento de anticorpos monoclonais específicos de tau a partir de um pool de sujeitos humanos saudáveis sem nenhum sinal de uma tauopatia neurodegenerativa.

[006] A presente invenção é assim dirigida a anticorpos humanos, fragmentos de ligação ao antígeno e moléculas de ligação a antígeno semelhantes que são capazes de reconhecer tau especificamente. Por "reconhece especificamente tau", "anticorpo específico para/de tau" e "anticorpo anti-tau" entende-se especificamente, em geral, e coletivamente, os anticorpos para a forma nativa de tau, ou isoformas de tau agregadas ou patologicamente modificadas. São fornecidos aqui anticorpos humanos seletivos para formas patologicamente fosforiladas e agregadas de comprimento completo.

[007] Em uma modalidade particular da presente invenção, o anticorpo humano ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo demonstra as características de ligação imunológicas de um anticorpo caracterizado pelas regiões variáveis de VH e/ou VL, conforme estabelecido na Fig. 1.

[008] O fragmento de ligação ao antígeno do anticorpo pode ser um fragmento Fv de cadeia única, um fragmento F(ab’), um fragmento F(ab), e um fragmento F(ab’)2, ou qualquer outro fragmento de ligação ao antígeno. Em uma modalidade específica, infra, o anticorpo ou fragmento do mesmo é um anticorpo do isotipo de IgG humana. Alternativamente, o anticorpo é um anticorpo quimérico de humano-murino ou murinizado, sendo este último particularmente útil para os métodos de diagnóstico e de estudos em animais.

[009] Além disso, a presente invenção diz respeito a composições que compreendem o anticorpo da presente invenção ou fragmentos ativos dos mesmos, ou agonistas e moléculas cognatas, ou alternativamente, os antagonistas dos mesmos e métodos de imunoterapia e de imunodiagnóstico usando tais composições na prevenção, diagnóstico ou tratamento de uma tauopatia, em que uma quantidade eficaz da composição é administrada a um paciente em necessidade do mesmo.

[010] Naturalmente, a presente invenção estende-se a células B e linfócitos B de memória de humanos imortalizados, respectivamente, que produzem o anticorpo tendo as características distintas e únicas, tal como definido abaixo.

[011] A presente invenção também diz respeito a polinucleotídeos que codificam pelo menos uma região variável de uma cadeia de imunoglobulina do anticorpo da presente invenção. Em uma modalidade, a referida região variável compreende pelo menos uma região determinante de complementaridade (CDR) de VH e/ou VL da região variável como estabelecido na Figura 1.

[012] Assim, a presente invenção também abrange vetores que compreendem os referidos polinucleotídeos e células hospedeiras transformadas com os mesmos, bem como o seu uso para a produção de um anticorpo e moléculas de ligação equivalentes que são específicas para a proteína tau. Os meios e métodos para a produção recombinante de anticorpos e mimetiza mesmos, bem como métodos de triagem de moléculas de ligação concorrentes, que podem ou não ser anticorpos, são conhecidos na técnica. No entanto, tal como aqui descrito, em particular no que diz respeito a aplicações terapêuticas em humanos, o anticorpo da presente invenção é um anticorpo humano, no sentido de que a aplicação do referido anticorpo é substancialmente livre de uma resposta imune dirigida contra tal anticorpo, de outro modo, observado anticorpos quiméricos e mesmo humanizados.

[013] Além disso, são aqui divulgados composições e métodos que podem ser usados para identificar tau em amostras. Os anticorpos anti-tau divulgados podem ser usados para rastrear o sangue humano, CSF, urina e para a presença de tau em amostras, por exemplo, pelo uso do ensaio adaptado à superfície ou baseado em ELISA. Os métodos e composições aqui divulgados podem ajudar nas tauopatias neurodegenerativas, tais como no diagnóstico da doença de Alzheimer e podem ser usados para monitorar a progressão da doença e a eficácia terapêutica.

[014] Por isso, é um objetivo particular da presente invenção proporcionar métodos para tratamento, diagnóstico ou prevenção de uma tauopatia neurodegenerativa tal como a doença de Alzheimer, complexo de esclerose lateral amiotrófica/demência do parkinsonismo, demência do grão argirofílico, angiopatia amiloide tipo Britânica, angiopatia amiloide cerebral, degeneração corticobasal, doença de Creutzfeldt-Jakob, demência pugilistica, emaranhados neurofibrilares difusos com calcificação, síndrome de Down, demência frontotemporal, demência frontotemporal com parkinsonismo ligado ao cromossomo 17, degeneração lobar frontotemporal, doença de Gerstmann-Straussler- Scheinker, doença de Hallervorden-Spatz, miosite de corpos de inclusão, atrofia de múltiplos sistemas, distrofia miotônica, doença de Niemann-Pick tipo C, doença do neurônio motor não guamaniana com emaranhados neurofibrilares, doença de Pick, parkinsonismo pós- encefalite, angiopatia amiloide cerebral da proteína do príon, gliose subcortical progressiva, paralisia supranuclear progressiva, panence- falite esclerosante subaguda, demência apenas de emaranhado, demência multi-infarto e acidente vascular cerebral isquêmico. Os métodos compreendem a administração de uma concentração eficaz de um anticorpo humano ou derivado de anticorpo para o sujeito onde o anticorpo tem como alvo tau

[015] Outras modalidades da presente invenção serão evidentes a partir da descrição e exemplos que se seguem.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[016] Fig.. 1: Sequências de aminoácidos e nucleotídeos da região variável, isto é, de cadeia pesada e cadeia leve lambda de anticorpos humanos NI-105-4E4 (A), NI-105-24B2 (B) e NI-105.4A3 (C). Regiões de estrutura (FR) e determinantes de complementaridade (CDRs) são indicadas com as CDRs sendo sublinhadas. Devido à estratégia de clonagem a sequência de aminoácidos no e N-terminal da cadeia pesada e da cadeia leve pode potencialmente conter alterações induzidas por iniciador na FR1 que, contudo, não afetam substancialmente a atividade biológica do anticorpo. De modo a proporcionar um anticorpo de consenso humano, as sequências de nucleotídeos e de aminoácidos do clone original foram alinhadas e sintonizadas de acordo com as sequências da região variável da linhagem germinativa humana pertinente no banco de dados, ver, por exemplo, Vbase (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/) no MRC Centre for Protein Engineering (Cambridge, UK). Os aminoácidos, os quais são considerados como potencialmente desviando-se da sequência de consenso da linhagem germinativa devido ao iniciador de PCR e, portanto, tendo sido substituídos na sequência de aminoácidos, estão indicados em negrito.

[017] Fig. 2: Placas de ELISA foram revestidas com tau recombinante humana (isoforma hTau40) a 1 μg/ml e incubadas com as concentrações indicadas de anticorpo NI-105.4E4. Anticorpo recombinante humano derivado NI-105.4E4 se liga à tau recombinante com uma afinidade elevada em EC50a2 nM.

[018] Fig.3: PHFTau e hTau40 recombinante foram resolvidas por gradiente SDS-PAGE seguido por análise de Western Blot. As membranas foram incubadas com anticorpos primários NI-105.4E4 (humano) ou anticorpo monoclonal Tau12 de camundongo, seguido por anticorpos secundários conjugados a HRP. O anticorpo de tau humana recombinante NI-105.4E4 liga-se a hTau40 recombinante, bem como para as isoformas da tau patologicamente modificadas (PHFTau) extraídas a partir de cérebro de AD em análise de Western blot.

[019] Fig. 4: Mapeamento do epítopo NI-105.4E4 que se liga a hTau40. Tecnologia PepSpot (JPT): Dois grupos de pontos de mancha de peptídeos adjacentes (peptídeo 83, 84 e 85; peptídeo 96 e 97) foram especificamente identificados por NI105.4E4 (A e A'), quando comparado com o anticorpo de detecção apenas (B). O anticorpo de detecção de IgG anti-humana de cabra conjugada a HRP individualmente produz um sinal forte no ponto de mancha único (peptídeo 50), mas não detecta os peptídeos 83, 84, 85, 96 e 97. Varrimento com alanina: (C) Pontos de mancha #35-50 e # 51-68 contêm os peptídeos originais (pontos de mancha # 35 e # 51) e suas variantes substituídas (# 36-50 e # 52-68) (D e E). Sequência de aminoácidos dos peptídeos originais e substituídos (# 35-50 e # 51-68). Varredura de alanina sugere que os resíduos V339, E342, D387, E391 e K395 contribuem para a ligação a NI-105.4E4.

[020] Fig. 5: Confirmação de que o anticorpo recombinante humano NI 105.4E4 se liga especificamente a um peptídeo tau correspondente aos aminoácidos 333-346 de hTau40.

[021] Fig. 6: NI-105.4E4 que se liga a emaranhados neutrofibrilares (NFT), neuritos distróficos e filamentos de neurópilo no cérebro de AD e camundongos que expressam TauP301L humanos. A coloração com NI105-4E4 identifica NFTs e filamentos de neurópilo no cérebro de AD (A), sem nenhuma ligação significativa a tau no cérebro do sujeito de controle saudável (B). Em TauP301L o NI-105.4E4 de camundongo transgênico (E-I) liga-se fortemente à tau patológica semelhante a NFT (E, F e H), filamentos de neurópilo (E e G) e neurites distróficas (E e H). Além disso, NI-105.4E4 também identifica agregados de tau no estágio de pré- emaranhado (I). NI-105.4E4 se liga a NFT, neurites distróficas e filamentos de neurópilo em camundongo transgênico expressando APP humana com mutação de Swedish e Arctic e TauP301L; a seta marca uma placa beta- amiloide, cercada por neurites distróficas reconhecidas por NI-105.4E4 (J). Anticorpo secundário individualmente não dá sinal, nem em AD humana (C) nem em controle saudável (D).

[022] Fig. 7: Placas de ELISA foram revestidas com tau humana recombinante (hTau40) a 3 μg/ml e incubadas com as concentrações indicadas de anticorpo NI-105.24B2. Anticorpo recombinante humano derivado NI-105.24B2 se liga a hTau40 com elevada afinidade em EC50 a 6 nM.

[023] Fig. 8: PHFTau e hTau40 recombinante foram resolvidas por gradiente SDS-PAGE seguido por análise de Western Blot. Os Blots foram incubados durante a noite com anticorpos primários NI-105.24B2 (humano), seguido por IgG anti-humana conjugada a HRP. O anticorpo de tau humana recombinante NI-105.24B2 se liga a hTau40 recombinante, bem como para as isoformas de tau patologicamente modificadas (PHFTau) extraídas a partir de AD de cérebro na análise de Western Blot.

[024] Fig. 9: Ensaio de imunorreatividade em placa amiloides de tecido (TAPIR) - O soro isolado de sujeitos idosos foi adicionado em seções histológicas de cérebros de AD. Como comparação uma coloração imuno-histológica com o anticorpo anti-fosfo-tau AT100 comercialmente disponível foi realizada. Emaranhados neurofibrilares são corados na coloração de controle com anticorpo anti-fosfo-tau AT100,quando submetidos a soro isolado, mostrando a presença de espécies de anticorpos reativos de emaranhados neurofibrilares nos soros testados.

[025] Fig.. 10: Anticorpo humano recombinante NI-105.4A3 especificamente se liga à tau humana por ELISA. Nenhuma ligação a BSA é observada.

[026] Fig. 11: Os epítopos NI-105.4E4 e NI-105.4A3 e epítopos de anticorpos monoclonais de tau de camundongos comercialmente disponíveis comumente usados são mostrados. Anticorpo humano NI- 105.4E4 têm como alvo um único epítopo que compreende dois polipeptídeos lineares, um dos quais estando localizado no domínio de ligação de microtúbulo (R4) de tau que é mascarado na fisiológica associada ao microtúbulo de tau. Tau-12 (Covance, Califórnia, EUA), HT7, AT8, AT180 (Thermo Scientific, EUA); PHF1 ((Lewis et al, Science 293 (2001), 1487-1491).

[027] Fig. 12: Placas de ELISA foram revestidas com tau recombinante humana (hTau40, 1ug/ml), PHFTau (1:100) e a preparação de controle (1:100), e incubadas com a concentração indicada de NI-105.4A3. 4A3 liga-se a rTau com EC50 a 1,4 nM, para PHFTau com EC50 a 1,2 nM.

[028] Fig. 13: Mapeamento do epítopo de ligação a NI-105.4A3 em hTau40. (A) Representação esquemática das quatro sobreposições dos domínios de hTau40 (domínio I (AA 1-158), domínio II (AA 136-258), domínio III (AA 235-373), e domínio IV (AA 355-441)) usados. (B) NI- 105.4A3 tau se liga apenas ao domínio I e ao polipeptídeo de hTau40 de comprimento completo. (C) Western blot confirmou a ligação específica de NI-105.4A3 ao domínio I de tau.

[029] Fig. 14: Mapeamento do epítopo NI-105.4A3 com tecnologia PepSpot (JPT) (A) e varrimento com alanina (B e C).

[030] Fig. 15: Ligação de ch4E4 e variantes para tau recombinante (ELISA).

[031] Fig. 16: Níveis de IgG Humana no plasma de camundongos após a administração intraperitoneal de 30 mg/kg de anticorpo de anti- tau humana 4E4 ou 4A3.

[032] Fig. 17: Níveis de IgG Humana em homogenato de cérebro de camundongos após a administração intraperitoneal de 30 mg/kg de anticorpo anti-tau humano 4E4 ou 4A3.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO I. Definições

[033] As tauopatias neurodegenerativas são um grupo diverso de distúrbios neurodegenerativos que compartilham uma lesão patológica comum que consiste em agregados intracelulares de filamentos anormais que são compostos principalmente por tau patologicamente hiperfosforilada em células de neurônios e/ou gliais. As características clínicas das tauopatias são heterogêneas e caracterizadas por demência e/ou síndromes motoras. A acumulação progressiva de inclusões de tau filamentosas pode causar a degeneração neuronal e glial em combinação com outros depósitos como, por exemplo, beta-amiloide na doença de Alzheimer ou como uma entidade patogênica única como ilustrado por mutações no gene de tau que estão associadas com formas familiares de demência frontotemporal e parkinsonismo ligado ao cromossomo 17 (FTDP-17). Devido à heterogeneidade das suas manifestações clínicas, uma lista potencialmente não exaustiva de doenças tauopáticas pode ser fornecida incluindo a doença de Alzheimer, complexo de esclerose/parkinsonismo-demência amiotrófica lateral, demência do grão argirofílico, angiopatia amiloide tipo Britânica, angiopatia amiloide cerebral, degeneração córtico-basal, doença de Creutzfeldt-Jakob, demência pugilistica, emaranhados neurofibrilares difusos com calcificação, síndrome de Down, demência frontotemporal, demência frontotemporal com parkinsonismo ligado ao cromossomo 17, degeneração lobar frontotemporal, doença de Gerstmann-Straussler-Scheinker, doença de Hallervorden-Spatz, miosite de corpos de inclusão, atrofia de múltiplos sistemas, distrofia miotônica, doença de Niemann-Pick tipo C, doença do neurônio motor não guamaniana com emaranhados neurofibrilares, doença de Pick, parkinsonismo pós-encefalite, angiopatia amiloide cerebral da proteína príon, gliose subcortical progressiva, paralisia supranuclear progressiva, panencefalite esclerosante subaguda, demência apenas de emaranhado, demência multi-infarto e acidente vascular cerebral isquêmico, para uma revisão ver, por exemplo, Lee et al., Annu. Rev. Neurosci. 24 (2001), 1121-1159 em que a Tabela 1 cataloga os membros únicos de tauopatias ou Sergeant et al., Bioch. Biophy. Acta 1739 (2005), 179-97, com uma lista na Figura 2 no mesmo.

[034] No presente relatório descritivo, o termo "tau", é usado indiferentemente para se referir especificamente à forma monomérica nativa de tau. O termo "tau" é também usado para identificar geralmente outros confôrmeros de tau, por exemplo, oligômeros e agregados de tau. O termo "tau" é também usado para se referir coletivamente a todos os tipos e formas de tau. Devido ao splicing alternativo seis isoformas de tau estão presentes no cérebro humano. As sequências de proteína para as isoformas são: Isoforma tau-Fetal de 352aa MAEPRQEFEVMEDHAGTYGLGDRKDQGGYTMHQDQEGDTDAGLKAEEAGIGD TPSLEDEAAGHVTQARMVSKSKDGTGSDDKKAKGADGKTKIATPRGAAPPGQK GQANATRIPAKTPPAPKTPPSSGEPPKSGDRSGYSSPGSPGTPGSRSRTPSLPTPPTR EPKKVAVVRTPPKSPSSAKSRLQTAPVPMPDLKNVK.SKIGSTENLKHQPGGGKV QIVYKPVDLSKVTSKCGSLGNIHHKPGGGQVEVKSEKLDFKDRVQSKIGSLDN1T HVPGGGNKK.1ETHKLTFRENAKAKTDHGAEIVYKSPVVSGDTSPRHLSNVSSTGS IDMVDSPQLATLADEVSASLAKQGL (SEQ ID NO:1) Isoforma Tau-B de 381aa MAEPRQEFEVMEDHAGTYGLGDRKDQGGYTMHQDQEGDTDAGLKESPLQTPT EDGSEEPGSETSDAKSTPTAEAEEAGIGDTPSLEDEAAGHVTQARMVSKSKDGTG SDDKKAKGADGKTKIATPRGAAPPGQKGQANATRIPAKTPPAPKTPPSSGEPPKS GDRSGYSSPGSPGTPGSRSRTPSLPTPPTREPKKVAVVRTPPKSPSSAKSRLQTAPV PMPDLKNVKSKIGSTENLKHQPGGGKVQIVYKPVDLSKVTSKCGSLGNIHHKPG GGQVEVKSEKLDFKDRVQSKIGSLDNITHVPGGGNKKIETHKLTFRENAKAKTD HGAEJVYKSPVVSGDTSPRHLSNVSSTGSIDMVDSPQLATLADEVSASLAKQGL (SEQ ID N0:2) Isoforma Tau-C de 410aa MAEPRQEFEVMEDHAGTYGLGDRKDQGGYTMHQDQEGDTDAGLKESPLQTPT EDGSEEPGSETSDAKSTPTAEDVTAPLVDEGAPGKQAAAQPHTEIPEGTTAEEAGI GDTPSLEDEAAGHVTQARMVSKSKDGTGSDDKKAKGADGKTKIATPRGAAPPG QKGQANATR1PAKTPPAPKTPPSSGEPPKSGDRSGYSSPGSPGTPGSRSRTPSLPTP PTREPKKVAVVRTPPKSPSSAKSRLQTAPVPMPDLKNVKSKIGSTENLKHQPGGG KVQIVYKPVDLSKVTSKCGSLGNIHHKPGGGQVEVKSEKLDFKDRVQSKIGSLD NITHVPGGGNKKIETHKLTFRENAKAKTDHGAEIVYKSPVVSGDTSPRHLSNVSS TGSIDMVDSPQLATLADEVSASLAKQGL (SEQ ID N0:3) Isoforma Tau-D de 383aa MAEPRQEFEVMEDHAGTYGLGDRKDQGGYTMHQDQEGDTDAGLKAEEAGIGD TPSLEDEAAGHVTQARMVSKSKDGTGSDDKKAKGADGKTKIATPRGAAPPGQK GQANATRIPAKTPPAPKTPPSSGEPPKSGDRSGYSSPGSPGTPGSRSRTPSLP TPPTR EPKKVAVVRTPPKSPSSAKSRLQTAPVPMPDLKNVKSKIGSTENLKHQPGGGKV QIINKKLDLSNVQSKCGSKDN1KHVPGGGSVQIVYKPVDLSKVTSKCGSLGNIHH KPGGGQVEVKSEKLDFKDR VQSKIGSLDN1THVPGGGNKKIETHKLTFRENAKA KTDHGAEIVYKSPWSGDTSPRHLSNVSSTGSIDMVDSPQLATLADEVSASLAKQ GL (SEQ ID NO:4) Isoforma Tau-E de 412aa MAEPRQEFEVMEDHAGTYGLGDRKDQGGYTMHQDQEGDTDAGLKESPLQTPT EDGSEEPGSETSDAKSTPTAEAEEAGIGDTPSLEDEAAGHVTQARMVSKSKDGTG SDDKKAKGADGKTK1ATPRGAAPPGQKGQANATR1PAKTPPAPKTPPSSGEPPKS GDRSGYSSPGSPGTPGSRSRTPSLPTPPTREPKKVAVVRTPPKSPSSAKSRLQTAPV PMPDLKNVKSK1GSTENLKHQPGGGKVQ1INKKLDLSNVQSKCGSKDNIKHVPG GGSVQIVYKPVDLSKVTSKCGSLGNIHHKPGGGQVEVKSEKLDFKDRVQSKIGSL DNITHVPGGGNKKIETHKLTFRENAKAKTDHGAEIVYKSPVVSGDTSPRHLSNVS STGSIDMVDSPQLATLADEVSASLAKQGL (SEQ ID NO:5) Isoforma Tau-F de 441aa MAEPRQEFEVMEDHAGTYGLGDRKDQGGYTMHQDQEGDTDAGLKESPLQTPT EDGSEEPGSETSDAKSTPTAEDVTAPLVDEGAPGKQAAAQPHTEIPEGTTAEEAGI GDTPSLEDEAAGHVTQARMVSKSKDGTGSDDKKAKGADGKTK1ATPRGAAPPG QKGQANATRIPAKTPPAPKTPPSSGEPPKSGDRSGYSSPGSPGTPGSRSRTPSLPTP PTREPKKVAVVRTPPK.SPSSAKSRLQTAPVPMPDLKNVKSKIGSTENLKHQPGGG KVQ1INKKLDLSNVQSKCGSKDN1KHVPGGGSVQIVYKPVDLSKVTSKCGSLGNI HHKPGGGQVEVKSEKLDFKDRVQSKIGSLDiNITHVPGGGNKKlETHKLTFRENA KAKTDHGAEIVYKSPWSGDTSPRHLSNVSSTGSIDMVDSPQLATLADEVSASLA KQGL (SEQ ID NO:6)

[035] A sequência de aminoácidos de tau do "tipo selvagem" é representada pela isoforma Tau-F de 441aa (SEQ ID NO: 6) adicional também referenciado como "hTau40", "TauF", "Tau-4" ou "tau de comprimento completo". A sequência de aminoácidos de tau pode ser recuperada a partir da literatura e bases de dados pertinentes; ver see Goedert et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 4051-4055, Goedert et al., EMBO J. 8(1989), 393-399, Goedert et al., EMBO J. 9 (1990), 42254230 e GenBank UniProtKB/swissprot: locus TAU_HUMAN, números de acessão P10636-2 (Fetal-tau) e P10636-4 a -8 (isoformas B a F).

[036] Outra característica surpreendente da proteína tau é a fosforilação, que ocorre em cerca de 30 de 79 sítios de fosforilação de serina (Ser) e treonina (Thr) potencial. Tau é altamente fosforilada durante o desenvolvimento do cérebro. O grau de fosforilação diminui na vida adulta. Alguns dos sítios de fosforilação estão localizados dentro dos domínios de ligação de tau dos microtúbulos, e demonstraram que um aumento da fosforilação da tau regula negativamente a ligação de microtúbulos. Por exemplo, Ser262 e Ser396, que se encontram dentro ou adjacente a motivos de ligação de microtúbulos, são hiperfosforiladas nas proteínas tau dos filamentos helicoidais emparelhados anormais (PHFs), um componente importante dos emaranhados neurofibrilares (NFTs) no cérebro de pacientes com AD. Os PHFs são agregados filamentosos de proteínas tau anormalmente hiperfosforiladas e podem ser marcados com anticorpos anti-tau específicos e anticorpos detectados por microscopia de luz. O mesmo vale para os chamados filamentos de tau lineares. PHF forma fitas torcidas consistindo em dois filamentos torcidos em torno de um outro com uma periodicidade de cerca de 80nm. Estas características patológicas são comumente referidas como "patologia de tau", "tauopatologia" ou "patologia relacionada com tau". Para uma descrição mais detalhada das características neuropatológicas de tauopatias veja Lee et al., Annu. Rev. Neurosci. 24 (2001), 1121-1159 e Gotz, Brain. Res. Rev. 35 (2001), 266-286, os conteúdos da divulgação do qual sendo aqui incorporados por referência. A proteína tau fisiológica estabiliza os microtúbulos em neurônios. A fosforilação patológica leva à localização e agregação de tau anormal, o que causa a desestabilização de microtúbulos e transporte celular prejudicado. A tau agregada é neurotóxica in vitro (Khlistunova et al., J. Biol. Chem. 281 (2006), 12051214). As espécies neurotóxicas exata permanecem incertas, no entanto, bem como o(s) mecanismo(s) pelo qual elas conduzem à morte neuronal. Os agregados de tau podem ser observados como o principal componente dos emaranhados neurofibrilares (NFT) em muitas tauopatias, tais como a doença de Alzheimer (AD), demência frontotemporal, paralisia supranuclear, doença de Pick, doença de grão argirofílico (AGD), degeneração córtico-basal, FTDP-17, doença de Parkinson, demência pugilistica (Revisto em Gendron e Petrucelli, Mol. Neurodegener. 4:13 (2009)). Além destas observações, surge a evidência de que a morte neuronal mediada por tau pode ocorrer mesmo na ausência de formação de emaranhados. As espécies fosfo-tau solúveis estão presentes em CSF (Aluise et al., Biochim. Biophys. Acta. 1782 (2008), 549-558). Os agregados de tau podem transmitir um estado desdobrado a partir do exterior para o interior de uma célula e se transferir entre as coculturas de células (Frost et al., J. Biol. Chem. 284 (2009), 12845-12852).

[037] Além do envolvimento em tauopatias neurodegenerativas, as alterações observadas na fosforilação da tau durante e após isquemia/reperfusão sugerem que tau desempenha um papel crucial no dano neuronal e fisiopatologia clínica de distúrbios neurovasculares, tais como acidente vascular cerebral isquêmico (Zheng et al., J. celular. Biochem. 109 (2010), 26-29).

[038] Os anticorpos anti-tau humanos aqui descritos se ligam a tau especificamente e aos epítopos destas, e várias conformações de tau e dos epítopos da mesma. Por exemplo, são aqui divulgados anticorpos que se ligam especificamente à tau, tau no seu comprimento completo, as isoformas da tau patologicamente modificadas e os agregados de tau. Tal como aqui usada, a referência a um anticorpo que "se liga especificamente", "se liga seletivamente" ou "se liga preferencialmente" à tau refere-se a um anticorpo que não se liga a outras proteínas não relacionadas. Em um exemplo, um anticorpo de tau aqui divulgado pode se ligar a tau ou um epítopo da mesma e não mostra nenhuma ligação acima de cerca de 1,5 vezes da base de outras proteínas. Um anticorpo que "se liga especificamente" ou "se liga seletivamente a" um confôrmero tau refere-se a um anticorpo que não se liga a todas as conformações de tau, isto é, não se liga pelo menos a um outro confôrmero de tau. Por exemplo, são aqui divulgados anticorpos que podem se ligar preferencialmente a formas agregadas de tau no tecido de AD. Uma vez que os anticorpos anti-tau humanos da presente invenção foram isolados a partir de um pool de sujeitos humanos saudáveis que exibem uma resposta imune específica de tau, os anticorpos de tau da presente invenção também podem ser chamados de "autoanticorpos humanos", a fim de realçar que estes anticorpos foram realmente expressos pelos sujeitos e não tinham sido isolados a partir de, por exemplo, uma humana de biblioteca de fago expressando uma imunoglobulina, o que até agora representava um método comum para tentar proporcionar anticorpos semelhantes a humanos.

[039] Deve-se notar que o termo "um" ou "uma" entidade referem- se a uma ou mais dessas entidades, por exemplo, "um anticorpo" é destinado a representar um ou mais anticorpos. Como tal, os termos "um" (ou "uma"), "um ou mais" e "pelo menos um" podem ser usados aqui alternadamente.

[040] Tal como usado aqui, o termo "polipeptídeo" é destinado a abranger um "polipeptídeo" singular, bem como "polipeptídeos" no plural, e refere-se a uma molécula composta de monômeros (aminoácidos) linearmente ligados por ligações de amida (também conhecidas como ligações peptídicas). O termo "polipeptídeo" refere-se a qualquer cadeia ou cadeias de dois ou mais aminoácidos, e não se refere a um comprimento específico do produto. Assim, peptídeos, dipeptídeos, tripeptídeos, oligopeptídeos, "proteína", "cadeia de aminoácidos", ou qualquer outro termo usado para se referir a uma cadeia ou cadeias de dois ou mais aminoácidos, estão incluídos dentro da definição de "polipeptídeo" e o termo "polipeptídeo" pode ser usado em vez de, ou indiferentemente com, qualquer um destes termos.

[041] O termo "polipeptídeo" destina-se também a se referir aos produtos das modificações pós-expressão do polipeptídeo, incluindo, sem limitação de glicosilação, acetilação, fosforilação, amidação, derivatização por grupos protetores/de bloqueio conhecidos, clivagem proteolítica, ou modificação por aminoácidos de ocorrência não natural. Um polipeptídeo pode ser derivado de uma fonte biológica natural ou produzido por tecnologia recombinante, mas não é necessariamente traduzido a partir de uma sequência de ácidos nucleicos designada. O mesmo pode ser gerado em qualquer forma, incluindo por síntese química.

[042] Um polipeptídeo da invenção pode ser de um tamanho de cerca de 3 ou mais, 5 ou mais, 10 ou mais, 20 ou mais, 25 ou mais, 50 ou mais, 75 ou mais, 100 ou mais, 200 ou mais, 500 ou mais, de 1.000 ou mais, ou 2000 ou mais aminoácidos. Os polipeptídeos podem ter uma estrutura tridimensional definida, embora não necessariamente, tenham tal estrutura. Polipeptídeos com uma estrutura tridimensional definida são referidos como dobrado, e os polipeptídeos que não possuem uma estrutura tridimensional definida, mas podem adotar um grande número de diferentes conformações, e são referidos como desdobrados. Como usado aqui, o termo glicoproteína refere-se a uma proteína acoplada a pelo menos uma fração de carboidrato que está fixa à proteína através de uma cadeia lateral contendo oxigênio ou contendo nitrogênio, de um resíduo de aminoácido, por exemplo, um resíduo de serina ou um resíduo de asparagina.

[043] Por um polipeptídeo "isolado" ou um fragmento, variante ou derivado do mesmo, quer-se dizer um polipeptídeo que não está no seu ambiente natural. Nenhum nível particular de purificação é necessário. Por exemplo, um polipeptídeo isolado pode ser removido do seu ambiente nativo ou natural. Os polipeptídeos produzidos de forma recombinante e proteínas expressas em células hospedeiras são considerados isolados para o propósito da invenção, tal como são os polipeptídeos nativos ou recombinantes que foram separados, fracionados, ou parcialmente ou substancialmente purificados por qualquer técnica adequada.

[044] Também incluídos como polipeptídeos da presente invenção estão os fragmentos, derivados, análogos ou variantes dos polipept- ídeos anteriores, e qualquer combinação dos mesmos. Os termos "fragmento", "variante", "derivado" e "análogo" quando se referem a anticorpos ou polipeptídeos de anticorpo da presente invenção incluem quaisquer polipeptídeos que retêm pelo menos algumas das propriedades de ligação ao antígeno da molécula de ligação nativa correspondente, anticorpo, ou um polipeptídeo. Fragmentos de polipeptídeos da presente invenção incluem fragmentos proteolíticos, bem como fragmentos de deleção, além dos fragmentos de anticorpos específicos discutidos aqui em outra parte. As variantes de anticorpos e polipeptídeos de anticorpo da presente invenção incluem fragmentos, como descrito acima, e também polipeptídeos com sequências de aminoácidos alteradas devido a substituições, deleções ou inserções de aminoácidos. As variantes podem ocorrer naturalmente ou ser de ocorrência não natural. As variantes de ocorrência não natural podem ser produzidas usando técnicas conhecidas na técnica de mutagênese. Polipeptídeos variantes podem compreender substituições, deleções ou adições de aminoácidos conservativas ou não conservativas. Derivados de moléculas de ligação específicas de tau, por exemplo, anticorpos e polipeptídeos de anticorpo da presente invenção, são polipeptídeos que tenham sido alterados de modo a exibir características adicionais que não são encontradas no polipeptídeo nativo. Exemplos incluem as proteínas de fusão. Polipeptídeos variantes podem também ser aqui referidos como "análogos de polipeptídeos". Como usado aqui, um "derivado" de uma molécula de ligação ou fragmento da mesma, um anticorpo, ou um polipeptídeo de anticorpo refere-se a um polipeptídeo em questão tendo um ou mais resíduos quimicamente derivados por reação de um grupo lateral funcional. Também estão incluídos como "derivados" aqueles peptídeos que contêm um ou mais derivados de ocorrência natural de aminoácidos dos vinte aminoácidos padrões. Por exemplo, a 4-hidroxiprolina pode ser substituída por prolina, 5- hidroxilisina pode ser substituída por lisina, 3-metil-histidina pode ser substituída por histidina; homoserina pode ser substituída por serina e a ornitina pode ser substituída por lisina.

[045] O termo "polinucleotídeo" destina-se a abranger um ácido nucleico singular, bem como ácidos nucleicos no plural, e refere-se a uma molécula ou construto de ácido nucleico isolado, por exemplo, o RNA mensageiro (mRNA) ou de DNA de plasmídeo (pDNA). Um polinucleotídeo pode compreender uma ligação de fosfodiéster convencional ou uma ligação não convencional (por exemplo, uma ligação de amida, tal como as encontradas em ácidos nucleicos peptídicos (PNA)). O termo "ácido nucleico" refere-se a qualquer um ou mais segmentos de ácido nucleico, por exemplo, fragmentos de DNA ou RNA, presentes em um polinucleotídeo. Por ácido nucleico "isolado" ou polinucleotídeo quer-se dizer uma molécula de ácido nucleico, DNA ou RNA, que tenha sido removida do seu ambiente nativo. Por exemplo, um polinucleotídeo recombinante que codifica um anticorpo contido em um vetor é considerado isolado para os fins da presente invenção. Outros exemplos de um polinucleotídeo isolado incluem polinucle- otídeos recombinantes mantidos em células hospedeiras heterólogas ou polinucleotídeos purificados (parcialmente ou substancialmente) em solução. As moléculas de RNA isoladas incluem transcritos de RNA in vivo ou in vitro de polinucleotídeos da presente invenção. Polinucleo- tídeos isolados ou ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção incluem ainda estas moléculas produzidas sinteticamente. Além disso, um polinucleotídeo ou ácido nucleico pode ser ou pode incluir um elemento regulador, tal como um promotor, sítio de ligação ao ribossoma, ou um terminador de transcrição.

[046] Tal como usado aqui, uma "região de codificação" é uma porção de ácido nucleico que consiste em códons de tradução em aminoácidos. Embora um "códon de terminação" (TAG, TGA ou TAA), não seja traduzido em um aminoácido, o mesmo pode ser considerado como parte de uma região de codificação, mas quaisquer sequências de flanqueamento, por exemplo, promotores, sítios de ligação ao ribossoma, terminadores da transcrição, íntrons, e semelhantes, não são parte de uma região de codificação. Duas ou mais regiões de codificação da presente invenção podem estar presentes em um construto polinucleotídico simples, por exemplo, em um único vetor ou em diferentes construtos polinucleotídicos, por exemplo, em vetores separados (diferentes). Além disso, qualquer vetor pode conter uma única região de codificação, ou pode compreender duas ou mais regiões de codificação, por exemplo, um vetor pode codificar separadamente uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina e uma região variável da cadeia leve de imunoglobulina. Além disso, um vetor, de polinucleotídeo ou ácido nucleico da presente invenção pode codificar regiões de codificação heterólogas, quer fundidas ou não fundidas, com um ácido nucleico que codifica uma molécula de ligação, um anticorpo, ou fragmento, variante ou derivado da mesma. As regiões de codificação heterólogas incluem, sem limitação, elementos ou motivos especializados, tais como um peptídeo sinal de secreção ou a um domínio heterólogo funcional.

[047] Em certas modalidades, o ácido nucleico ou polinucleotídeo é DNA. No caso do DNA, um polinucleotídeo compreendendo um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo normalmente pode incluir um promotor e/ou outros elementos de controle de tradução ou transcrição operacionalmente associados com uma ou mais regiões de codificação. Uma associação operável é quando uma região de codificação para um produto de gene, por exemplo, um polipeptídeo, está associada a uma ou maé SEQuências reguladoras de tal modo a colocar a expressão do produto do gene sob a influência ou controle da(s) sequência reguladora. Dois fragmentos de DNA (tais como uma região de codificação do polipeptídeo e um promotor associado com a mesma) estão "operacionalmente associados" ou "operacionalmente ligados", se a indução da função do promotor resulta na transcrição de mRNA que codifica o produto de gene desejado e a natureza da ligação entre os dois fragmentos de DNA não interfere com a capacidade das sequências reguladoras de expressão para dirigir a expressão do produto do gene, ou interferir com a capacidade do molde de DNA sendo transcrito. Assim, uma região promotora estaria operacionalmente associada com um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo se o promotor fosse capaz de efetuar a transcrição de tal ácido nucleico. O promotor pode ser um promotor específico de células, que dirige a transcrição substancial do DNA apenas nas células predeterminadas. Outros elementos de controle de transcrição, além de um promotor, por exemplo, potencializadores, operadores, repressores, e sinais de terminação da transcrição, podem ser operacionalmente associados com o polinucleotídeo para dirigir a transcrição específica de células. Promotores adequados e outras regiões de controle de transcrição são aqui descritos.

[048] Uma variedade de regiões de controle da transcrição é bem conhecida dos versados na técnica. Estas incluem, sem limitação, as regiões de controle de transcrição que funcionam em células de vertebrados, tais como, mas não limitadas a, o promotor e potencializador de segmentos de citomegalovírus (o promotor precoce imediato, em conjunto com o íntron-A), vírus símio 40 (o promotor precoce), e retrovírus (tais como vírus do sarcoma de Rous). Outras regiões de controle de transcrição incluem os derivados de genes de vertebrados, tais como a actina, a proteína de choque térmico, o hormônio de crescimento bovino e β-globina de coelho, assim como outras sequências capazes de controlar a expressão de genes em células eucarióticas. As regiões de controle de transcrição adicionais adequadas incluem promotores e potencializadores específicos de tecidos, assim como promotores indutíveis por linfocinas (por exemplo, promotores indutíveis por interferons ou interleucinas).

[049] Da mesma forma, uma variedade de elementos de controle de tradução é conhecida dos comuns versados na técnica. Estes incluem, mas não estão limitados a, sítios de ligação ao ribossoma, códons de iniciação e de terminação de tradução, e elementos derivados de picornavírus (particularmente um sítio de entrada do ribossoma interno, ou IRES, também referido como uma sequência CITE).

[050] Em outras modalidades, um polinucleotídeo da presente invenção é o RNA, por exemplo, sob a forma de RNA mensageiro (mRNA).

[051] As regiões de codificação de ácido nucleico e polinucleotídeo da presente invenção podem estar associadas com outras regiões de codificação que codificam os peptídeos sinais ou de secreção que dirigem a secreção de um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo da presente invenção. De acordo com a hipótese de sinal, as proteínas secretadas por células de mamíferos têm uma sequência líder secretora ou de peptídeo sinal que é clivada a partir da proteína madura, uma vez que a exportação da cadeia de proteína crescente através do retículo endoplasmático rugoso tiver sido iniciada. Os comuns versados na técnica estão cientes de que os polipeptídeos secretados por células de vertebrados têm, geralmente, um peptídeo sinal fundido com o N-terminal do polipeptídeo, que é clivado a partir do polipeptídeo completo ou de "comprimento completo" para produzir uma forma secretada ou "madura" do polipeptídeo. Em certas modalidades, o peptídeo sinal nativo, por exemplo, um peptídeo sinal de cadeia pesada ou de cadeia leve de imunoglobulina é usado, ou um derivado funcional dessa sequência que retém a capacidade para dirigir a secreção do polipeptídeo que está operacionalmente associada com ela. Alternativamente, um peptídeo sinal de mamífero heterólogo, ou um derivado funcional do mesmo, pode ser usado. Por exemplo, a sequência líder de tipo selvagem pode ser substituída com a sequência líder do ativador de plasminogênio de tecido humano (TPA) ou β- glucuronidase de camundongo.

[052] Salvo indicação em contrário, os termos "distúrbio" e "doença" são usados aqui indiferentemente.

[053] A "molécula de ligação", como usado no contexto da presente invenção refere-se principalmente aos anticorpos, e os fragmentos dos mesmos, mas também pode se referir a outras moléculas de não anticorpos que se ligam à proteína tau, incluindo, mas não se limitam a, hormônios, receptores, ligantes, complexo de histocompa- tibilidade maior (MHC), chaperonas, tais como proteínas de choque térmico (HSPs), bem como as moléculas de adesão célula-célula, tais como os membros da caderina, intergrina, lectina de tipo C e superfamílias de imunoglobulina (Ig). Assim, por uma questão de clareza, e sem limitar o escopo da presente invenção, a maior parte das modalidades que seguem é discutida no que diz respeito a anticorpos e moléculas tipo anticorpos que representam uma modalidade específica das moléculas de ligação para o desenvolvimento de agentes terapêuticos e de diagnóstico.

[054] Os termos "anticorpo" e "imunoglobulina" são usados aqui indiferentemente. Um anticorpo ou imunoglobulina é uma molécula de ligação à tau que compreende pelo menos o domínio variável de uma cadeia pesada, e normalmente compreende pelo menos os domínios variáveis de uma cadeia pesada e uma cadeia leve. Estruturas básicas de imunoglobulina em sistemas vertebrados são relativamente bem compreendidas; ver, por exemplo, Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a ed. 1988).

[055] Como será discutido em mais detalhes abaixo, o termo "imunoglobulina" compreende diversas amplas classes de polipeptídeos que podem ser distinguidas bioquimicamente. Os versados na técnica apreciarão que as cadeias pesadas são classificadas como gama, mu, alfa, delta, épsilon, (y, μ, α, δ, ε) com algumas subclasses entre elas (por exemplo, Y1-Y4). É a natureza desta cadeia que determina a "classe" do anticorpo como IgG, IgM, IgG IgA, ou IgE, respectivamente. As subclasses de imunoglobulina (isotipos), por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, etc., são bem caracterizadas e são conhecidas por conferir especialização funcional. Versões modificadas de cada uma destas classes e isotipos estão facilmente perceptíveis para o versado na técnica tendo em vista a presente divulgação e, em conformidade, estão dentro do escopo da presente invenção. Todas as classes de imunoglobulinas estão claramente dentro do escopo da presente invenção, a discussão que segue será geralmente dirigida para a classe IgG de moléculas de imunoglobulina. No que diz respeito à IgG, uma molécula de imunoglobulina padrão compreende duas cadeias leves idênticas de polipeptídeos de peso molecular de aproximadamente 23.000 Daltons, e duas cadeias pesadas idênticas de polipeptídeos de peso molecular de 53.000-70.000. As quatro cadeias são tipicamente unidas por ligações de dissulfeto em uma configuração "Y", em que as cadeias leve suportam as cadeias pesadas começando na boca de "Y" e continuando através da região variável.

[056] As cadeias leves são classificadas como capa ou lambda (K, À). Cada classe de cadeia pesada pode ser ligada com qualquer um cadeia leve capa ou lambda. Em geral, as cadeias leves e pesadas estão covalentemente ligadas umas às outras, e as porções da "cauda" das duas cadeias pesadas estão ligadas umas às outras por ligações covalentes de dissulfeto ou ligações não covalentes quando as imunoglobulinas são geradas quer por hibridomas, células B ou células hospedeiras geneticamente modificadas. Na cadeia pesada, as sequências de aminoácidos correm a partir de um N-terminal nas extremidades bifurcadas da configuração Y para o C-terminal na parte inferior de cada cadeia.

[057] Ambas as cadeias leves e pesadas estão divididas em regiões de homologia estrutural e funcional. Os termos "constante" e "variável" são usados funcionalmente. A este respeito, deve-se notar que os domínios variáveis de ambas as porções de cadeia leve (VL) e pesada (VH) determinam o reconhecimento e especificidade do antígeno. Por outro lado, os domínios constantes de cadeia leve (CL) e de cadeia pesada (CH1, CH2 ou CH3) conferem propriedades biológicas importantes tais como secreção, mobilidade transplacentária, ligação ao receptor Fc, ligação do complemento e semelhantes. Por convenção, a numeração dos domínios da região constante aumenta à medida que se torna mais distal do sítio de ligação ao antígeno ou amino-terminal do anticorpo. A porção N-terminal está uma região variável e na porção C-terminal está uma região constante, e os domínios CH3 e CL realmente compreendem o carbóxi-terminal da cadeia pesada e leve, respectivamente.

[058] Conforme indicado acima, a região variável permite que o anticorpo reconheça seletivamente e se ligue especificamente a epítopos em antígenos. Isto é, o domínio VL e VH do domínio, ou um subconjunto de regiões determinantes de complementaridade (CDRs), de um anticorpo se combinam para formar a região variável que define um período de três sítios de ligação ao antígeno dimensional. Esta estrutura quaternária anticorpo constitui o local de ligação ao antígeno presente na extremidade de cada braço do Y. Mais especificamente, o local de ligação ao antígeno é definido por três CDRs de cada um das cadeias VH e VL. Qualquer anticorpo ou fragmento de imunoglobulina que contém uma estrutura suficiente para ligar especificamente a tau é denotado aqui indiferentemente como um "fragmento de ligação" ou um "fragmento imunoespecífico".

[059] Nos anticorpos que ocorrem naturalmente, um anticorpo compreende seis regiões hipervariáveis, por vezes denominadas "regiões determinantes de complementaridade" ou "CDRs" presentes em cada domínio de ligação ao antígeno, que são sequências de aminoácidos não contíguas, curtas, que estão especificamente posicionadas para formar o domínio de ligação ao antígeno na medida em que o anticorpo assume a sua configuração tridimensional em um ambiente aquoso. As "CDR" são flanqueadas por quatro regiões de "estrutura" relativamente conservadas ou "FRs" que mostram menor variabilidade intermolecular. As regiões de estrutura amplamente adotam uma conformação β-folha e as CDR formam alças que se conectam, e em alguns casos formam parte da estrutura de β-folha. Assim, as regiões de estrutura atuam de modo a formar uma estrutura de suporte que fornece o posicionamento das CDRs na orientação correta por interações não covalentes intercadeias. O domínio de ligação ao antígeno formado pelas CDRs posicionadas define uma superfície complementar para o epítopo no antígeno imunorreativo. Esta superfície complementar promove a ligação não covalente do anticorpo ao seu epítopo cognato. Os aminoácidos que compreendem as CDRs e as regiões de estrutura, respectivamente, podem ser facilmente identificados para qualquer dada região variável da cadeia pesada ou leve de um comum versado na técnica, uma vez que elas tenham sido definidas com precisão, ver, "Sequences of Proteins of Immunological Interest," Kabat, E., et al., U.S. Department of Health e Human Services, (1983); e Chothia e Lesk, J. Mol. Biol., 196 (1987), 901-917, que são aqui incorporadas por referência na sua totalidade.

[060] No caso em que existem duas ou mais definições de um termo que é usado e/ou aceito na técnica, a definição do termo tal como usado aqui, pretende incluir todos esses significados, a menos que explicitamente indicado em contrário. Um exemplo específico é o uso do termo "região determinante de complementaridade" ("CDR") para descrever o antígeno não contíguo combinando sítios encontrados na região variável de ambos os polipeptídeos de cadeia pesada e leve. Esta região, em particular, foi descrita por Kabat et al., U.S. Dept. of Health e Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983) e por Chothia e Lesk, J. Mol. Biol., 196 (1987), 901-917, que são aqui incorporados por referência, onde as definições incluem a sobreposição ou subconjuntos de resíduos de aminoácidos, quando comparadas umas com as outras. No entanto, a aplicação de qualquer uma das definições para se referir a uma CDR de um anticorpo ou variantes das mesmas destina-se a estar dentro do escopo do termo tal como definido e usado aqui. Os resíduos de aminoácido apropriados que compreendem as CDR tal como definidas por cada uma das referências acima citadas são apresentados abaixo na Tabela 1 como uma comparação. Os números de resíduos exatos que abrangem uma CDR particular irão variar, dependendo da sequência e do tamanho da CDR. Os versados na técnica podem determinar rotineiramente quais os resíduos compreendem uma CDR ou região hipervariável particular do subtipo de IgG humana de anticorpos dada a sequência de aminoácidos da região variável do anticorpo. Tabela 1: Definições CDR 1

1Numeração de todas as definições de CDR na 1 rabela 1 está de acordo com as condições de numeração estabelecidas por Kabat et al. (ver abaixo).

[061] Kabat et al. definiram também um sistema de numeração para as sequências de domínio variável que é aplicável a qualquer anticorpo. Um comum versado na técnica pode atribuir inequivocamente este sistema de "numeração de Kabat" para qualquer sequência de domínio variável, sem dependência de quaisquer dados experimentais além da própria sequência. Como usado aqui, "numeração de Kabat" refere-se ao sistema de numeração estabelecido por Kabat et al., U.S. Dept. of Health e Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest" (1983). Salvo especificado em contrário, as referências à numeração das posições de resíduos de aminoácidos específicos em um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, variante, ou derivado do mesmo da presente invenção são de acordo com o sistema de numeração de Kabat, o qual, porém, é teórico e não pode aplicar-se igualmente a cada anticorpo da presente invenção. Por exemplo, dependendo da posição da primeirs CDR as CDRs seguintes podem ser deslocadas em qualquer direção.

[062] Os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno, fragmentos imunoespecíficos, variantes, ou derivados dos mesmos da presente invenção incluem, mas não estão limitados a, anticorpos policlonais, monoclonais, multiespecíficos, humanos, humanizados, primatizados, murinizados ou quiméricos, anticorpos de cadeia única, fragmentos de ligação aepítopo, por exemplo, Fab, Fab' e F(ab’)2, Fd, Fvs, Fvs de cadeia única (scFv), anticorpos de cadeia única, Fvs ligados por dissulfeto (sdFv), fragmentos compreendendo ou um domínio VL ou VH, fragmentos produzidos por uma biblioteca de expressão de Fab, e anticorpos anti-idiotípicos (anti-Id) (incluindo, por exemplo, anticorpos anti-Id para anticorpos aqui descritos). As moléculas de ScFv são conhecidas na técnica e são descritas, por exemplo, na patente US 5.892.019. As moléculas de imunoglobulina ou de anticorpo da presente invenção podem ser de qualquer tipo (por exemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), classe (por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) ou subclasse de molécula de imunoglobulina.

[063] Em uma modalidade, o anticorpo da presente invenção não é de IgM ou um derivado do mesmo com uma estrutura pentavalente. Em particular, em aplicações específicas da presente invenção, especialmente para usos terapêuticos, as IgMs são menos úteis do que as IgG e outros anticorpos bivalentes ou moléculas de ligação correspondentes, desde IgMs devido à sua estrutura pentavalente e a falta de maturação de afinidade mostram, com frequência, reatividades cruzadas inespecíficas e afinidade muito baixa.

[064] Em uma modalidade particular, o anticorpo da presente invenção não é um anticorpo policlonal, isto é, substancialmente consiste em uma espécie de anticorpos específicos, em vez de serem uma mistura obtida a partir de uma amostra de imunoglobulina de plasma.

[065] Os fragmentos de anticorpos, incluindo anticorpos de cadeia única, podem compreender a(s) região variável individualmente ou em combinação com a totalidade ou uma porção dos seguintes: região de dobradiça, domínios CH1, CH2, e CH3. Também incluídos na invenção estão os fragmentos de ligação à tau compreendendo também qualquer combinação da(s) região variável com uma região de dobradiça, domínios CH1, CH2, e CH3. Os anticorpos ou fragmentos imunoespecíficos dos mesmos da presente invenção podem ser de qualquer origem animal, incluindo as aves e os mamíferos. Em uma modalidade, os anticorpos são anticorpos de humanos, murino, burro, coelho, cabra, porquinhos da Índia, camelo, lhama, cavalo, ou galinha. Em outra modalidade, a região variável pode ser de origem condrictoide (por exemplo, a partir de tubarões).

[066] Em um aspecto, o anticorpo da presente invenção é um anticorpo monoclonal humano isolado a partir de um humano. Opcionalmente, a região de estrutura do anticorpo humano está alinhada e adoptada de acordo com as sequências da região variável de linhagem germinativa humana pertinentes do banco de dados, ver, por exemplo, Vbase (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/ ), no MRC Centre for Protein Engineering (Cambridge, UK). Por exemplo, os aminoácidos considerados como se desviando potencialmente da sequência de linhagem germinativa verdadeira poderiam ser devidos às sequências iniciadoras de PCR incorporadas durante o processo de clonagem. Em comparação com os anticorpos tipo humano gerados artificialmente, tais como fragmentos de anticorpo de cadeia única (scFv) a partir de uma biblioteca de anticorpos exibida em fago ou camundongos xenogênicos, o anticorpo monoclonal humano da presente invenção é caracterizado por (i) ser obtido usando a resposta imune humana, em vez de substitutos de animal, isto é, o anticorpo foi gerado em resposta à tau natural na sua conformação relevante no corpo humano, (ii) ter protegido o indivíduo ou pelo menos ser significativo para a presença de tau, e (iii) uma vez que o anticorpo é de origem humana, os riscos de reatividade cruzada contra autoantígenos é minimizado. Assim, de acordo com a presente invenção, os termos "anticorpo monoclonal humano", "autoanticorpo monoclonal humano", "anticorpo humano", e outros semelhantes são usados para indicar uma molécula de ligação à tau que é de origem humana, ou seja, que tenha sido isolada a partir de um célula humana, tal como uma célula B ou um hibridoma da mesma ou o cDNA do qual foi diretamente clonada a partir de RNAm de uma célula humana, por exemplo, uma célula B de memória humana. Um anticorpo humano ainda é "humano", mesmo que as substituições de aminoácidos são efetuadas no anticorpo, por exemplo, para melhorar as características de ligação.

[067] Os anticorpos derivados de bibliotecas de imunoglobulinas humanas ou de animais transgênicos para uma ou mais imunoglo- bulinas humanas e que não expressam imunoglobulinas endógenas, tal como descritos infra e, por exemplo, na patente US 5.939.598 por Kucherlapati et al., são denotados anticorpos tipo humano para distingui-los dos anticorpos verdadeiramente humanos da presente invenção.

[068] Por exemplo, o emparelhamento das cadeias pesada e leve de anticorpos tipo humano, tais como, anticorpos sintéticos e semissintéticos tipicamente isolados a partir de exibição em fagos não refletem necessariamente o emparelhamento original como ocorreu na célula B humana original. Consequentemente, os fragmentos Fab e scFv obtidos a partir de bibliotecas de expressão recombinantes como vulgarmente usados no estado da técnica podem ser considerados como sendo artificiais com todos os possíveis efeitos associados sobre a imunogenicidade e estabilidade.

[069] Em contraste, a presente invenção fornece anticorpos maturados por afinidade isolados selecionados a partir de sujeitos humanos, os quais são caracterizados pela sua utilidade terapêutica e a sua tolerância no homem.

[070] Tal como usado aqui, o termo "anticorpo murinizado" ou "imunoglobulina murinizada" refere-se a um anticorpo que compreende uma ou mais CDRs de um anticorpo humano da presente invenção, e uma região de estrutura humana, que contém substituições e/ou deleções e/ou inserções de aminoácidos que se baseiam na sequência de um anticorpo de camundongo. A imunoglobulina humana que fornece as CDRs é chamada o "original" ou "receptora", e o anticorpo de camundongo que fornecem as mudanças de estrutura é chamado o "doador". As regiões constantes não precisam estar presentes, mas se elas estão presentes, elas são geralmente substancialmente idênticas às regiões constantes do anticorpo de camundongo, isto é, pelo menos cerca de 85 a 90%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99 % ou mais idênticas. Assim, em algumas modalidades, uma imunoglobulina de cadeia pesada ou de cadeia leve humana ou murinizada de comprimento completo contém uma região constante de camundongo, CDRs humanas, e uma estrutura substancialmente humana, que tem uma série de substituições de aminoácidos de "murinização". Tipicamente, um "anticorpo murinizado" é um anticorpo que compreende uma cadeia leve variável murinizada e/ou uma cadeia pesada variável murinizada. Por exemplo, um anticorpo murinizado não englobaria um anticorpo quimérico típico, por exemplo, devido a toda região variável de um anticorpo quimérico ser de não camundongo. Um anticorpo modificado que tenha sido "murinizado" pelo processo de "murinização" liga-se ao mesmo antígeno que o anticorpo original que fornece as CDRs e é geralmente menos imunogênico em camundongos, em comparação com o anticorpo original.

[071] Tal como usado aqui, o termo "porção da cadeia pesada", inclui as sequências de aminoácidos derivadas a partir de uma cadeia pesada de imunoglobulina. Um polipeptídeo compreendendo uma porção da cadeia pesada compreende, pelo menos, um dos seguintes: um domínio CH1, um domínio de dobradiça (por exemplo, região de dobradiça superior, média, e/ou inferior), um domínio CH2, um domínio CH3, ou uma variante ou fragmento dos mesmos. Por exemplo, um polipeptídeo de ligação para uso na presente invenção pode compreender uma cadeia de polipeptídeo compreendendo um domínio CH1, uma cadeia de polipeptídeo que compreende um domínio CH1, pelo menos uma porção de um domínio de dobradiça, e um domínio CH2, uma cadeia de polipeptídeo que compreende um domínio CH1 e um domínio CH3, uma cadeia de polipeptídeo que compreende um domínio CH1, pelo menos uma porção de um domínio de dobradiça e um domínio CH3, ou uma cadeia de polipeptídeo que compreende um domínio CH1, pelo menos uma porção de um domínio de dobradiça, um domínio CH2, e um domínio CH3. Em outra modalidade, um polipeptídeo da presente invenção compreende uma cadeia de polipeptídeo que compreende um domínio CH3. Além disso, um polipeptídeo de ligação para uso na presente invenção pode não apresentar pelo menos uma porção de um domínio CH2 (por exemplo, a totalidade ou parte de um domínio CH2). Conforme estabelecido acima, será entendido por um comum versado na técnica que estes domínios (por exemplo, as porções de cadeia pesada) podem ser modificados de tal forma que eles variem na sequência de aminoácidos da molécula de imunoglobulina que ocorre naturalmente.

[072] Em certos anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno, variantes, ou derivados dos mesmos aqui descritos, as porções de cadeia pesada de uma cadeia de polipeptídeos de um multímero são idênticas às de uma segunda cadeia de polipeptídeos do multímero. Alternativamente, os monômeros contendo a porção da cadeia pesada da presente invenção não são idênticos. Por exemplo, cada monômero pode compreender um sítio de ligação alvo diferente, formando, por exemplo, um anticorpo biespecífico ou diacorpo.

[073] Em outra modalidade, os anticorpos, ou fragmentos de ligação ao antígeno, variantes, ou derivados dos mesmos aqui descritos são compostos de uma única cadeia de polipeptídeos tal como scFvs e devem ser expressos intracelularmente (intracorpos) para aplicações terapêuticas e de diagnóstico potenciais in vivo.

[074] As porções de cadeia pesada de um polipeptídeo de ligação para uso nos métodos de diagnóstico e de tratamento aqui descritos podem ser derivadas de moléculas de imunoglobulinas diferentes. Por exemplo, uma porção da cadeia pesada de um polipeptídeo pode compreender um domínio CH1 derivado de uma molécula de IgG1 e uma região de dobradiça de uma molécula derivada de IgG3. Em outro exemplo, uma porção da cadeia pesada pode compreender uma região de dobradiça derivada, em parte, de uma molécula de IgG1 e, em parte, de uma molécula de IgG3. Em outro exemplo, uma porção da cadeia pesada pode compreender uma dobradiça quimérica derivada, em parte, de uma molécula de IgG1 e, em parte, de uma molécula de IgG4.

[075] Tal como usado aqui, o termo "porção da cadeia leve", inclui as sequências de aminoácidos derivadas a partir de uma cadeia leve de imunoglobulina. Em uma modalidade, a porção da cadeia leve compreende pelo menos um de um domínio VL ou CL.

[076] Acredita-se que o tamanho mínimo de um epítopo de peptídeo ou polipeptídeo para um anticorpo é de cerca de quatro a cinco aminoácidos. Os epítopos de peptídeo ou polipeptídeo podem conter, pelo menos, sete, pelo menos, nove, ou entre, pelo menos, cerca de 15 a cerca de 30 aminoácidos. Uma vez que a CDR pode reconhecer um peptídeo antigênico ou um polipeptídeo na sua forma terciária, os aminoácidos que compreendem um epítopo não precisam ser contíguos e, em alguns casos, podem não precisam estar sobre a mesma cadeia de peptídeos. Na presente invenção, um epítopo de peptídeo ou polipeptídeo reconhecido pelos anticorpos da presente invenção contém uma sequência de pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10, em pelo menos 15, pelo menos 20, pelo menos 25, ou entre cerca de 5 a cerca de 30, cerca de 10 a cerca de 30 ou cerca de 15 a cerca de 30 aminoácidos contíguos ou não contíguos de tau.

[077] Por "se liga especificamente", ou "que reconhece especificamente", usado indiferentemente aqui, quer-se dizer geralmente que uma molécula de ligação, por exemplo, um anticorpo que se liga a um epítopo, através do seu domínio de ligação ao antígeno, e cuja ligação envolve alguma complementaridade entre o domínio de ligação ao antígeno e o epítopo. De acordo com esta definição, um anticorpo é dito que "se liga especificamente" a um epítopo, quando se liga ao epítopo, através do seu domínio de ligação ao antígeno mais facilmente do que seria se ligaria a um epítopo aleatório não relacionado. Um versado na técnica entende que um anticorpo pode se ligar especificamente a, ou reconhecer especificamente um polipeptídeo isolado compreendendo ou consistindo em resíduos de aminoácidos, correspondendo a uma porção de um epítopo linear não contíguo. O termo "especificidade" é usado aqui para qualificar a afinidade relativa pela qual um determinado anticorpo se liga a um determinado epítopo específico. Por exemplo, o anticorpo "A" pode ser considerado como tendo uma maior especificidade para um dado epítopo do que o anticorpo "B", ou anticorpo "A" pode se ligar ao epítopo "C", com uma especificidade mais elevada do que tem para o epítopo "D" relacionado.

[078] Quando presente, o termo "características de ligação imunológica", ou outras características de ligação de um anticorpo com um antígeno, em todas as suas formas gramaticais, refere-se à especificidade, afinidade, reatividade cruzada, e outras características de ligação de um anticorpo .

[079] Por "se liga preferencialmente a", quer-se dizer que a molécula de ligação, por exemplo, o anticorpo se liga especificamente a um epítopo mais rapidamente do que ele se ligaria a um epítopo, similar, homólogo, ou análogo relacionado. Assim, um anticorpo que "se liga preferencialmente" a um dado epítopo seria mais provável de se ligar ao epítopo do que um epítopo relacionado, apesar de um tal anticorpo poder reagir de forma cruzada com o epítopo relacionado.

[080] A título de exemplo não limitativo, uma molécula de ligação, por exemplo, um anticorpo, pode ser considerada como se ligando a um primeiro epítopo, preferencialmente se a mesma se liga ao dito primeiro epítopo com uma constante de dissociação (KD), que é menor do que a KD do anticorpo para o segundo epítopo. Em um outro exemplo não limitativo, um anticorpo pode ser considerado como se ligando a um primeiro antígeno, preferencialmente, se ele se liga ao primeiro epítopo com uma afinidade que é pelo menos uma ordem de grandeza menor do que a KD do anticorpo para o segundo epítopo. Em um outro exemplo não limitativo, um anticorpo pode ser considerado como se se ligando a um primeiro epítopo, preferencialmente, se ele se liga ao primeiro epítopo com uma afinidade que é pelo menos duas ordens de grandeza menor do que a KD do anticorpo para o segundo epítopo.

[081] Em outro exemplo não limitativo, uma molécula de ligação, por exemplo, um anticorpo, pode ser considerada como se ligando a um primeiro epítopo preferencialmente se a mesma se liga ao primeiro epítopo com uma taxa de dissociação (k(off)), que é menor do que k(off) do anticorpo para o segundo epítopo. Em um outro exemplo não limitativo, um anticorpo pode ser considerado como se ligando a um primeiro epítopo, preferencialmente, se ele se liga ao primeiro epítopo com uma afinidade que é pelo menos uma ordem de grandeza menor do que a k(off) do anticorpo para o segundo epítopo. Em um outro exemplo não limitativo, um anticorpo pode ser considerado como se ligando a um primeiro epítopo, preferencialmente, se ele se liga ao primeiro epítopo com uma afinidade que é pelo menos duas ordens de grandeza menor do que a k(off) do anticorpo para o segundo epítopo.

[082] Uma molécula de ligação, por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, variante ou derivado aqui divulgado pode ser dito como se ligando a uma proteína tau ou um fragmento ou variante da mesma, com uma taxa de dissociação (k(off)) menor ou igual a 5 x 10-2 s-1, 10-2 s-1, 5 x l0-3 s-1 ou l0-3 s-1. Em uma modalidade, um anticorpo da presente invenção pode ser dito como se ligando a tau ou um fragmento ou variante da mesma, com uma taxa de dissociação (k(off)) menor ou igual 5 x 10-4 s-1, 10-4 s-1, 5 x 10-5 s-1, ou 10-5 s-1 5 x 106 s-1, 10-6 s-1, 5 x 10-7 s-1 ou 10-7 s-1.

[083] Uma molécula de ligação, por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, variante ou derivado aqui divulgado pode ser dito como se ligando a tau ou um fragmento ou variante da mesma, com uma taxa de associação (k(on)), maior ou igual a 103 M-1 s-1, 5 x 103 M-1 s-1, 104 M-1 s-1 ou 5 x 104 M-1 s-1. Em uma modalidade, um anticorpo da presente invenção pode ser dito como se ligando à tau ou um fragmento ou variante da mesma, com uma taxa de associação (k(on)) maior ou igual a 105 M-1 s-1, 5 x 105, M-1 s-1, 106 M-1 s-1, 5 x 106 M-1 s-1 ou 107 M-1 s-1.

[084] Uma molécula de ligação, por exemplo, um anticorpo, é dita inibir competitivamente a ligação de um anticorpo de referência a um dado epítopo se a mesma se liga preferencialmente ao epítopo na extensão que a mesma bloqueia, até certo grau, a ligação do anticorpo de referência para o epítopo. A inibição competitiva pode ser determinada por qualquer método conhecido na técnica, por exemplo, ensaios de ELISA de competição. Um anticorpo pode ser dito inibir competitivamente a ligação do anticorpo de referência a um dado epítopo por pelo menos 90%, pelo menos 80%, pelo menos 70%, pelo menos 60%, ou pelo menos 50%. Um versado na técnica entende que a ligação de um anticorpo ao seu epítopo pode também ser competitivamente inibida por uma molécula de ligação que não é um anticorpo. Por exemplo, a ligação específica de um anticorpo aqui descrito à tau, por exemplo, hTau40, pode ser competitivamente inibida por microtúbulos.

[085] Tal como usado aqui, o termo "afinidade" refere-se a uma medida da força da ligação de um epítopo individual com a CDR de uma molécula de ligação, por exemplo, uma molécula de imunoglobulina, ver, por exemplo, Harlow et al, Antibodies. : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a ed. (1988) nas páginas 27-28. Como usado aqui, o termo "avidez" refere-se à estabilidade global do complexo de entre uma população de imunoglobulinas e um antígeno, ou seja, à resistência funcional da combinação de uma mistura de imunoglobulina com o antígeno, ver, por exemplo, Harlow, páginas 29 - 34. Avidez está relacionada com ambas a afinidade de moléculas de imunoglobulina individuais na população com epítopos específicos, e também com as valências das imunoglobulinas e do antígeno. Por exemplo, a interação entre um anticorpo monoclonal bivalente e um antígeno com uma estrutura de epítopo altamente repetida, tal como um polímero, seria uma de elevada avidez. A afinidade ou avidez de um anticorpo para um antígeno pode ser determinada experimentalmente usando qualquer método adequado, ver, por exemplo, Berzofsky et al., "Antibody-Antigen Interactions" In Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press New York, N Y (1984), Kuby, Janis Immunology, W. H. Freeman e Company New York, N Y (1992), e os métodos aqui descritos. As técnicas gerais para medir a afinidade de um anticorpo para um antígeno incluem ELISA, RIA, e ressonância de plásmons de superfície. A afinidade medida de uma interação de anticorpo-antígeno particular pode variar se for medida sob condições diferentes, por exemplo, concentração de sal, pH. Assim, as medições de afinidade e de outros parâmetros de ligação ao antígeno, por exemplo, KD, IC50, são preferencialmente feitas com soluções padronizadas de anticorpo e de antígeno, e um tampão normalizado.

[086] As moléculas de ligação, por exemplo, anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno, variantes ou derivados da invenção também podem ser descritas ou especificadas em termos da sua reatividade cruzada. Tal como usado aqui, o termo "reatividade cruzada" refere-se à capacidade de um anticorpo, específico para um antígeno, para reagir com um segundo antígeno, uma medida de parentesco entre duas substâncias antigênicas diferentes. Assim, um anticorpo é reativo de forma cruzada se o mesmo se liga a um epítopo diferente daquele que induziu a sua formação. O epítopo reativo de forma cruzada geralmente contém muitas das mesmas características estruturais complementares que as do epítopo indutor e, em alguns casos, pode na verdade se ajustar melhor do que o original.

[087] Por exemplo, certos anticorpos possuem certo grau de reatividade cruzada, em que eles se ligam a epítopos relacionados, mas não idênticos, por exemplo, epítopos com pelo menos 95%, pelo menos 90%, pelo menos 85%, pelo menos 80 %, pelo menos 75%, pelo menos 70%, pelo menos 65%, pelo menos 60%, pelo menos 55%, e pelo menos 50% de identidade (como calculado usando modos conhecidos na técnica e aqui descritos) a um epítopo de referência. Um anticorpo pode ser considerado como tendo pouca ou nenhuma reatividade cruzada, se ele não se liga a epítopos com menos de 95%, menos de 90%, menos de 85%, menos de 80%, menos de 75%, menos de 70%, menos de 65%, menos de 60%, menos de 55%, e menos de 50% de identidade (como calculado usando modos conhecidos na técnica e aqui descritos) a um epítopo de referência. Um anticorpo pode ser considerado como "muito específico" para um determinado epítopo, se ele não se liga a qualquer outro análogo, ortólogo, ou homólogo daquele epítopo.

[088] As moléculas de ligação, por exemplo, anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno, variantes ou derivados da invenção também podem ser descritas ou especificadas em termos da sua afinidade de ligação à tau. Em uma modalidade, as afinidades de ligação incluem as que têm uma constante de dissociação Kd ou menos de 5 x 10-2M, 10-2M, 5 x 10-3M, 10-3M, 5 x 10-4M, 10-4M, 5 x 10-5M, 105 M, 5 x 10-6 M, 10-6 M, 5 x 10-7 M, 10-7 M, 5 x 10-8 M, 10-8 M, 5 x 10-9 M, 10-9 M, 5 x 10-10 M, 10-10 M, 5 x 10-11 M, 10-11 M, 5 x 10-12 M, 10-12 M, 5 x 10-13M, 10-13M, 5 x 10-14M, 10-14M, 5 x 10-15 M, ou 10-15 M.

[089] Como indicado anteriormente, as estruturas da subunidade e três configurações dimensionais das regiões constantes das várias classes de imunoglobulinas são bem conhecidas. Tal como usado aqui, o termo "domínio VH" inclui o domínio variável do terminal amino de uma de cadeia pesada de imunoglobulina e o termo "domínio CH1" inclui o primeiro domínio da região constante (terminal mais amino) de uma cadeia pesada de imunoglobulina. O domínio CH1 é adjacente ao domínio VH e é amino terminal à região de dobradiça de uma molécula de cadeia pesada de imunoglobulina.

[090] Tal como usado aqui, o termo "domínio CH2" inclui a porção de uma molécula de cadeia pesada que se estende, por exemplo, a partir de cerca do resíduo 244 ao resíduo 360 de um anticorpo usando esquemas convencionais de numeração (resíduos 244 a 360, sistema de numeração de Kabat; e resíduos 231 a 340, Sistema de Numeração EU, ver Kabat EA et al. op. cit). O domínio CH2 é único na medida em que não está intimamente emparelhado com outro domínio. Em vez disso, duas cadeias de carboidratos ramificadas N-ligadas são interpostas entre os dois domínios CH2 de uma molécula de IgG nativa intacta. Também está bem documentado que o domínio CH3 se estende desde o domínio CH2 para o C-terminal da molécula de IgG, e compreende aproximadamente 108 resíduos.

[091] Tal como usado aqui, os termos "região de dobradiça" inclui a porção de uma molécula de cadeia pesada que se junta o domínio CH1 ao domínio CH2. Esta região da dobradiça compreende cerca de 25 resíduos e é flexível permitindo, assim, que as duas regiões de ligação ao antígeno N-terminais se movam de forma independente. As regiões de dobradiça podem ser subdivididas em três domínios distintos: domínios de dobradiça superior, intermediário e inferior; ver Roux et al., J. Immunol. 161 (1998), 4083.

[092] Como usado aqui, o termo "ligação de dissulfeto" inclui a ligação covalente formada entre dois átomos de enxofre. O aminoácido cisteína compreende um grupo tiol que pode formar uma ligação dissulfeto ou uma ponte com um segundo grupo tiol. Na maioria das moléculas de IgG que ocorrem naturalmente, as regiões de CH1 e CL estão ligadas por uma ligação de dissulfeto e as duas cadeias pesadas estão ligadas por duas pontes de dissulfeto nas posições correspondentes a 239 e 242, usando o sistema de numeração de Kabat (posição 226 ou 229, no sistema de numeração UE).

[093] Tal como usados aqui, os termos "ligado", "fundido" e "fusão" são usados indiferentemente. Estes termos referem-se à união de dois ou mais elementos ou componentes, por quaisquer meios, incluindo meios recombinantes ou conjugação de químicos. Uma "fusão na estrutura" refere-se à união de duas ou mais estruturas de leitura aberta de polinucleotídeos (ORFs) para formar uma ORF mais longa contínua, de uma maneira que mantém a estrutura de leitura de translação correta das ORFs originais. Assim, uma proteína de fusão recombinante é uma proteína única que contém dois ou mais segmentos que correspondem aos polipeptídeos codificados pelas ORFs originais (cujos segmentos não estão normalmente tão unidos por natureza). Embora a estrutura de leitura seja, assim, feita contínua ao longo dos segmentos fundidos, os segmentos podem ser fisicamente ou espacialmente separados, por exemplo, pela sequência do ligante na estrutura. Por exemplo, os polinucleotídeos que codificam as CDRs de uma região variável de imunoglobulina podem ser fundidos, na estrutura, mas ser separados por um polinucleotídeo que codifica pelo menos uma região de estrutura de imunoglobulina ou as regiões CDR adicionais, desde que as CDRs "fundidas" sejam cotraduzidas como parte de um polipeptídeo contínuo.

[094] O termo "expressão", tal como usado aqui se refere a um processo pelo qual um gene produz um produto bioquímico, por exemplo, um RNA ou um polipeptídeo. O processo inclui qualquer manifestação da presença funcional do gene dentro da célula, incluindo, sem limitação, o knockdown de gene, bem como ambas a expressão transitória e expressão estável. Isso inclui, sem limitação a transcrição do gene no RNA mensageiro (mRNA), RNA de transferência (tRNA), pequeno RNA hairpin (shRNA), pequeno RNA de transferência (siRNA) ou qualquer outro produto de RNA, e a tradução desse mRNA no(s) polipeptídeo(s). Se o produto final desejado é um bioquímico, a expressão inclui a criação do bioquímico e quaisquer precursores. A expressão de um gene produz um "produto do gene." Como usado aqui, um produto de gene pode ser um ácido nucleico, por exemplo, um RNA mensageiro produzido por transcrição de um gene, ou um polipeptídeo que é traduzido a partir de um transcrito. Produtos de genes aqui descritos incluem ainda ácidos nucleicos com modificações pós- transcricionais, por exemplo, de poliadenilação, ou polipeptídeos com modificações pós-translacionais, por exemplo, glicosilação, metilação, adição de lipídeos, associação com outras subunidades de proteína, clivagem proteolítica, e semelhantes.

[095] Tal como usado aqui, o termo "amostra" refere-se a qualquer material biológico obtido a partir de um sujeito ou paciente. Em um aspecto, uma amostra pode incluir sangue, fluido cerebroespinal ("CSF"), ou urina. Em outros aspectos, a amostra pode compreender sangue total, plasma, células B enriquecidas a partir de amostras de sangue, e as células cultivadas (por exemplo, as células B a partir de um sujeito). A amostra pode também incluir uma biopsia ou amostra de tecido, incluindo tecido neural. Em ainda outros aspectos, a amostra pode compreender células inteiras e/ou um lisado de células. As amostras de sangue podem ser recolhidas por meio de métodos conhecidos na técnica. Em um aspecto, o pélete pode ser ressuspenso em vórtice, a 4°C em 200 μl de tampão (Tris 20 mM, pH. 7,5, Nonidet a 0,5%, EDTA 1 mM, PMSF 1 mM, NaCl 0,1 M, Inibidor de Protease IX Sigma, e Inibidores de Fosfatase IX Sigma 1 e 2). A suspensão pode ser mantida em gelo durante 20 minutos com agitação em vórtice intermitente. Após a centrifugação a 15.000 x g durante 5 minutos a cerca de 4°C, as alíquotas de sobrenadante podem ser armazenadas a cerca de -70°C.

[096] Tal como usados aqui, os termos "tratar" ou "tratamento" referem-se tanto ao tratamento terapêutico quanto a medidas profiláticas ou preventivas, em que o objetivo é prevenir ou desacelerar (diminuir) uma mudança ou distúrbio fisiológico indesejado, tais como o desenvolvimento de parkinsonismo. Os resultados clínicos benéficos ou desejados incluem, mas não estão limitados a, alívio de sintomas, diminuição da extensão da doença, estado da doença estabilizado (isto é, não piora) atraso ou retardamento da progressão da doença, melhoria ou paliação do estado da doença, e remissão (quer parcial ou total), seja detectável ou indetectável. "Tratamento" também pode significar prolongar a sobrevivência, em comparação com a sobrevivência esperada se não receber o tratamento. Aqueles que necessitam de tratamento incluem aqueles já com a doença ou distúrbio bem como aqueles propensos a ter a condição ou distúrbio, ou aqueles em que a manifestação da doença ou distúrbio deve ser prevenido.

[097] Por "sujeito" ou "indivíduo" ou "animal" ou "paciente" ou "mamífero" quer-se dizer qualquer sujeito, particularmente, um sujeito mamífero, por exemplo, um paciente humano, para a qual o diagnóstico, prognóstico, prevenção, ou tratamento é desejado.

II. Anticorpos

[098] A presente invenção geralmente refere-se a anticorpos anti- tau humanos e antígenos e fragmentos de ligação dos mesmos. Em uma modalidade, um anticorpo da presente invenção demonstra as características imunológicas de ligação e/ou propriedades biológicas como descritos para os anticorpos ilustrados nos Exemplos. De acordo com a presente invenção os anticorpos monoclonais humanos específicos para a proteína tau foram clonados a partir de um pool de sujeitos humanos saudáveis.

[099] No decurso dos ensaios realizados de acordo com as tentativas iniciais da presente invenção as tentativas para clonar anticorpos específicos de tau falharam, mas quase sempre resultaram em clones falso-positivos. De modo a contornar este problema, os anticorpos em meio condicionado de culturas de células B de memória humana foram rastreados em paralelo para a ligação à proteína tau recombinante, PHFTau extraída de cérebro de AD, extratos cerebrais de controle saudáveis e albumina de soro bovino (BSA). Somente células B de culturas que foram positivas para PHFTau e/ou tau recombinante mas não para extrato do cérebro de controle ou BSA foram submetidas à clonagem de anticorpos.

[0100] As tentativas iniciais de isolamento para anticorpos específicos foram focalizadas em pools de seres humanos saudáveis, com atividade de ligação de plasma elevada para tau, sugestivo de elevados níveis de plasma de anticorpos de tau circulantes. Inesperadamente, estas tentativas não produziram células B de memória humana específicas de tau, e os anticorpos descritos na presente invenção foram isolados a partir de pools de sujeitos humanos saudáveis que não foram pré-selecionados por elevada reatividade de plasma de tau ou tinham baixa reatividade de plasma para tau.

[0101] Devido a esta medida, vários anticorpos poderiam ser isolados. Anticorpos selecionados foram adicionalmente analisados para a determinação da classe e subclasse de cadeia leve. As mensagens de anticorpos relevantes selecionados a partir de culturas de células B de memória são então transcritas por RT-PCR, clonadas e combinadas em vetores de expressão para a produção recombinante, ver os exemplos em anexo. A expressão recombinante dos anticorpos humanos em células CHO ou HEK293 e a caracterização subsequente das suas especificidades de ligação para a tau de comprimento completo (Fig. 2, Fig. 7 e Fig. 12), patologicamente modificaram as suas formas em Western Blot (Fig. 3 e Fig. 8) e a sua ligação distinta para tau agregada patologicamente confirmou que, pela primeira vez os anticorpos humanos foram clonados os quais são altamente específicos para tau e reconhecem as formas distintas patologicamente modificadas de proteína tau.

[0102] Assim, a presente invenção geralmente refere-se a um anticorpo anti-tau monoclonal isolado humano de ocorrência natural e fragmentos de ligação, derivados e suas variantes. Em uma modalidade da invenção, o anticorpo é capaz de se ligar especificamente à tau recombinante de comprimento completo e/ou à forma patologicamente agregada e/ou fosforilada (PHFTau) isolada a partir de cérebro de AD sob condições desnaturantes em Western Blot, ver Fig. 3 e Fig. 8.

[0103] Em uma modalidade, a presente invenção é dirigida a um anticorpo anti-tau, ou fragmento de ligação ao antígeno, variante ou derivados do mesmo, em que o anticorpo se liga especificamente ao mesmo epítopo de tau que um anticorpo de referência selecionado a partir do grupo consistindo em NI-105-4E4, NI-105-24B2 ou NI-105.4A3. Além disso, os resultados preliminares de ensaios diretos de ELISA realizados com o anticorpo exemplar NI-105-4E4 revelaram que NI-105- 4E4 reconhece especificamente a extremidade C-terminal de tau. Ensaios adicionais realizados indicam que o NI-105.4E4 reconhece um epítopo descontínuo que compreende duas sequências lineares: uma primeira sequência linear dentro do domínio de ligação do microtúbulo R4 e uma segunda sequência linear dentro da região entre os domínios R4 e C, conforme ilustrado na Figura 11. Em uma modalidade, um polipeptídeo linear constituído por um epítopo não contínuo, ou a um epítopo reconhecido por um anticorpo proporcionado pela presente invenção está localizado no domínio de ligação de microtúbulos a tau, que é mascarado na tau associada ao microtúbulo fisiológico. O mapeamento de epítopos identificou uma primeira sequência dentro do domínio de ligação de microtúbulos de tau humana, incluindo aa337- 343 VEVKSEK (SEQ ID NO: 7) como um único polipeptídeo linear constituído pelo epítopo reconhecido pelo anticorpo de NI-105.4E4 da presente invenção. Experimentos adicionais e uma comparação com um anticorpo de tau monoclonal de camundongo AT180 disponível comercialmente confirmou que NI-105-4E4 reconhece especificamente o epítopo único de SEQ ID NO: 7. Mais vantajosamente, o epítopo da SEQ ID NO: 7 reconhecido pelo anticorpo NI-105.4E4 da presente invenção é 100% conservado em todas as 6 isoformas de tau presentes no cérebro humano das sequências de aminoácidos representadas pelas SEQ ID NO: 1 a 6 e em outras espécies, tais como camundongos e ratos, assim proporcionando uma ferramenta de pesquisa adicional em modelos animais respectivos com os anticorpos da presente invenção. Experiências adicionais mostraram que os resíduos 3 e 6 do polipeptídeo de SEQ ID NO: 7, que corresponde aos resíduos V339 e E342 da SEQ ID NO: 6, contribuem para a ligação de NI-105.4E4. O mapeamento de epítopos identificou uma segunda sequência (SEQ ID NO: 41) dentro do domínio de ligação de microtúbulos de tau humana, incluindo aa387-397 da SEQ ID NO: 6 como um polipeptídeo único linear constituído pelo epítopo reconhecido pelo anticorpo NI-105.4E4 desta invenção. Os resíduos 1, 5 e 9 da SEQ ID NO: 41, que correspondem aos resíduos D387, E391 e K395 da SEQ ID NO: 6, contribuem para a ligação de NI-105.4E4.

[0104] Em uma modalidade, um anticorpo aqui descrito especificamente se liga à tau em um epítopo compreendendo os resíduos de aminoácidos de SEQ ID NO: 7. Em outra modalidade, um anticorpo aqui descrito especificamente se liga à tau em um epítopo compreendendo os resíduos de aminoácidos de SEQ ID: 41. Em uma modalidade específica, um anticorpo aqui descrito especificamente se liga à tau em um epítopo compreendendo os resíduos de aminoácidos das SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 41. Em uma outra modalidade, um anticorpo aqui descrito se liga especificamente à tau em um epítopo que compreende um ou mais resíduos de aminoácidos selecionados do grupo consistindo em resíduos V339, E342, D387, E391 e K395 de SEQ ID NO: 6. O epítopo pode compreender qualquer um, qualquer dois, qualquer três, qualquer quatro ou todos os cinco resíduos do grupo consistindo em resíduos V339, E342, D387, E391 e K395 de SEQ ID NO: 6. Em uma modalidade específica, a tau é hTau40.

[0105] Em uma modalidade, um anticorpo aqui descrito se liga à tau em um epítopo que compreende o domínio de ligação de microtúbulos de tau. Em uma modalidade específica, o anticorpo aqui descrito se liga à tau em um epítopo compreendendo os resíduos de aminoácidos da região de R4 de tau, como representado na Figura 11. Em uma modalidade, um anticorpo aqui descrito compete com os microtúbulos de ligação específica à tau. Em outra modalidade, um anticorpo descrito aqui tem afinidade de ligação reduzida para tau associada a microtúbulos em comparação com a afinidade de ligação de anticorpos para tau não associada a microtúbulos. Em uma outra modalidade, um anticorpo aqui descrito não se liga, ou substancialmente não se liga à tau associada com microtúbulos. Em modalidades específicas, a proteína tau pode ser a proteína tau nativa ou a proteína tau recombinante. Em uma modalidade específica, a tau é hTau40.

[0106] O mapeamento de epítopos identificou uma sequência (SEQ ID NO: 42) de tau humana, incluindo aa35-49 de SEQ ID NO: 6 como um único epítopo linear reconhecido pelo anticorpo NI-105.4A3 da presente invenção. Os resíduos de 6, 7 e 10 da SEQ ID NO: 42, correspondendo aos resíduos de D40, A41 e K44 de SEQ ID NO: 6, contribuem para a ligação de NI-105.4A3. Em uma modalidade, um anticorpo aqui descrito especificamente se liga à tau em um epítopo compreendendo os resíduos de aminoácidos de SEQ ID NO: 42. Em uma modalidade adicional, um anticorpo aqui descrito especificamente se liga à tau em um epítopo compreendendo um ou mais resíduos de aminoácidos selecionados do grupo consistindo em resíduos de D40, A41 e K44 de SEQ ID NO: 6. O epítopo pode compreender qualquer um, qualquer dois, ou todos os três resíduos a partir do grupo consistindo em resíduos de D40, A41 e K44 de SEQ ID NO: 6. Em uma modalidade específica, a tau é hTau40.

[0107] Além disso, sem pretender ficar restringido por observações experimentais iniciais, como demonstrado nos Exemplos e mostrado na Fig. 6, o anticorpo anti-tau monoclonal humano NI-105-4E4 da presente invenção é caracterizado por se ligar especificamente à tau patologicamente agregado e não reconhecendo substancialmente tau na forma fisiológica no tecido cerebral. Em uma modalidade, um anticorpo anti-tau humano da presente invenção pode se ligar especificamente à tau patologicamente agregada e não se ligar substancialmente à tau na forma fisiológica no tecido cerebral. Além disso, um anticorpo anti-tau humano da presente invenção pode ser adicionalmente caracterizado pela sua capacidade de reconhecer tau no estágio de pré-emaranhados, em emaranhados neurofibrilares (NFT), filamentos de neutrópilos e/ou neurites distróficas no cérebro. Assim, a presente invenção fornece um conjunto de anticorpos de tau humana com especificidade de ligação, que são, assim, particularmente úteis para fins de diagnóstico e terapêuticos.

[0108] Em uma modalidade, o anticorpo da presente invenção exibe as propriedades de ligação do anticorpo de NI-105-4E4 exemplar, tal como descrito nos Exemplos. Além disso, ou em alternativa, um anticorpo anti-tau da presente invenção, preferencialmente, reconhece tau patologicamente agregada em vez de formas fisiológicas, em especial, quando analisado de acordo com o Exemplo 4. Além disso, ou em alternativa, um anticorpo anti-tau da presente invenção liga-se a doença causando mutantes de tau humana, em particular, as descritas no Exemplo 4. Neste contexto, as especificidades de ligação podem estar na faixa como mostrado para os anticorpos NI-105.4E4, NI- 1054A3 e NI-105.24B2 exemplares nas Fig. 2, Fig. 12 e Fig. 7, respectivamente, ou seja, tendo uma meia concentração eficaz máxima (EC50) de cerca de 100 pM a 100 nM, ou uma EC50 de cerca de 100 pM a 10 nM para a tau do tipo selvagem.

[0109] Assim, um anticorpo anti-tau da presente invenção, liga-se preferencialmente a formas modificadas patológicas da tau no cérebro, por exemplo, agregados patológicos de tau, como exemplificado por coloração imuno-histoquímica descrita no Exemplo 4. Em outra modalidade de um anticorpo anti-tau da presente invenção, preferencialmente, liga-se tanto a tau recombinante quanto formas modificadas patologicamente de tau, tal como exemplificado no Exemplo 2 por Western Blot.

[0110] A presente invenção também é desenhado para um anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno, variante ou derivados dos mesmos, em que o anticorpo compreende um domínio de ligação ao antígeno idêntico ao de um anticorpo selecionado do grupo consistindo em NI-105-4E4, NI-105-24B2 e NI-105.4A3.

[0111] A presente invenção também exemplifica adicionalmente várias destas moléculas de ligação, por exemplo, anticorpos e fragmentos de ligação dos mesmos, que podem ser caracterizadas pelo fato de compreender na sua região variável, por exemplo, o domínio de ligação de pelo menos uma região determinante de complementaridade (CDR) de VH e/ou região variável de VL que compreende qualquer uma das sequências de aminoácidos representadas na Fig. 1. As sequências de nucleotídeos correspondentes que codificam as regiões variáveis acima identificadas são apresentadas na Tabela 2 abaixo. Um conjunto exemplar de CDRs das sequências de aminoácidos anteriores da região de VH e/ou VL, conforme ilustrado na Fig. 1. No entanto, como discutido a seguir o versado na técnica está bem ciente do fato de que, em adição ou em alternativa, podem ser usadas CDRs que diferem na sua sequência de aminoácidos daquelas apresentadas na Fig. 1, por um, dois, três ou mesmo mais ácidos aminados no caso de CDR2 e CDR3.

[0112] Em uma modalidade, um anticorpo da presente invenção compreende pelo menos uma CDR compreendendo, ou consistindo em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 23-25, 26-28, 29-31, 32-34, 35-37 e 38-40. Em uma modalidade, um anticorpo da presente invenção compreende uma, duas, três, quatro, cinco ou seis CDRs compreendendo, ou consistindo em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 23-25, 26-28, 29-31, 32-34, 35-37 e 38-40. O anticorpo pode compreender uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma CDR1 de VH de SEQ ID NO: 23, 29 ou 35; uma CDR2 de VH de SEQ ID NO: 24, 30 ou 36; ou uma CDR3 de VH de SEQ ID NO: 25, 31 ou 37. O anticorpo pode compreender uma região variável de cadeia leve compreendendo uma CDR1 de VL de SEQ ID NO: 26, 32 ou 38; uma CDR2 de VL de SEQ ID NO: 27, 33 ou 39; ou uma CDR3 de VL de SEQ ID NO: 28, 34 ou 40. O anticorpo pode compreender uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma CDR1 de VH de SEQ ID NO: 23, 29 ou 35; uma CDR2 de VH de SEQ ID NO: 24,30 ou 36; ou uma CDR3 de VH de SEQ ID NO: 25, 31 ou 37, e pode compreender ainda uma região variável de cadeia leve compreendendo uma CDR1 de VL de SEQ ID NO: 26, 32 ou 38; uma CDR2 de VL de SEQ ID NO: 27, 33 ou 39; ou uma CDR3 de VL de SEQ ID NO: 28, 34 ou 40.

[0113] Em uma modalidade, um anticorpo da presente invenção pode compreender uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma CDR1 de VH de SEQ ID NO: 23, 29 ou 35; uma CDR2 de VH de SEQ ID NO: 24, 30 ou 36; e uma CDR3 de VH de SEQ ID NO: 25, 31 ou 37. Em uma modalidade, um anticorpo da presente invenção pode compreender uma região variável de cadeia leve compreendendo uma CDR1 de VL de SEQ ID NO: 26, 32 ou 38; uma CDR2 de VL de SEQ ID NO: 27, 33 ou 39; e uma CDR3 de VL de SEQ ID NO: 28, 34 ou 40. The antibody pode compreender ainda uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma CDR1 de VH de SEQ ID NO: 23, 29 ou 35; uma CDR2 de VH de SEQ ID NO: 24, 30 ou 36; e uma CDR3 de VH de SEQ ID NO: 25, 31 ou 37, e pode compreender ainda uma região variável de cadeia leve compreendendo uma CDR1 de VL de SEQ ID NO: 26, 32 ou 38; uma CDR2 de VL de SEQ ID NO: 27, 33 ou 39; e uma CDR3 de VL de SEQ ID NO: 28, 34 ou 40.

[0114] Em uma modalidade, um anticorpo da presente invenção pode compreender uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma CDR1 de VH de SEQ ID NO: 23; uma CDR2 de VH de SEQ ID NO: 24; e uma CDR3 de VH de SEQ ID NO: 25. Em uma modalidade, um anticorpo da presente invenção pode compreender uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma CDR1 de VH de SEQ ID NO: 29; uma CDR2 de VH de SEQ ID NO: 30; e uma CDR3 de VH de SEQ ID NO: 31. Em uma modalidade, um anticorpo da presente invenção pode compreender uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma CDR1 de VH de SEQ ID NO: 35; uma CDR2 de VH de SEQ ID NO: 36; e uma CDR3 de VH de SEQ ID NO: 37.

[0115] Em uma modalidade, um anticorpo da presente invenção pode compreender uma região variável de cadeia leve compreendendo uma CDR1 de VL de SEQ ID NO: 26; uma CDR2 de VL de SEQ ID NO: 27; e uma CDR3 de VL de SEQ ID NO: 28. Em uma modalidade, um anticorpo da presente invenção pode compreender uma região variável de cadeia leve compreendendo uma CDR1 de VL de SEQ ID NO: 32; uma CDR2 de VL de SEQ ID NO: 33; e uma CDR3 de VL de SEQ ID NO: 34. Em uma modalidade, um anticorpo da presente invenção pode compreender uma região variável de cadeia leve compreendendo uma CDR1 de VL de SEQ ID NO: 38; uma CDR2 de VL de SEQ ID NO: 39; e uma CDR3 de VL de SEQ ID NO: 40.

[0116] Em uma modalidade, um anticorpo da presente invenção pode compreender uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma CDR1 de VH de SEQ ID NO: 23; uma CDR2 de VH de SEQ ID NO: 24; e uma CDR3 de VH de SEQ ID NO: 25, e pode compreender ainda uma região variável de cadeia leve compreendendo uma CDR1 de VL de SEQ ID NO: 26; uma CDR2 de VL de SEQ ID NO: 27; e uma CDR3 de VL de SEQ ID NO: 28.

[0117] Em uma modalidade, um anticorpo da presente invenção pode compreender uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma CDR1 de VH de SEQ ID NO: 29; uma CDR2 de VH de SEQ ID NO: 30; e uma CDR3 de VH de SEQ ID NO: 31 e pode compreender ainda uma região variável de cadeia leve compreendendo uma CDR1 de VL de SEQ ID NO: 32; uma CDR2 de VL de SEQ ID NO: 33; e uma CDR3 de VL de SEQ ID NO: 34.

[0118] Em uma modalidade, um anticorpo da presente invenção pode compreender uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma CDR1 de VH de SEQ ID NO: 35; uma CDR2 de VH de SEQ ID NO: 36; e uma CDR3 de VH de SEQ ID NO: 37 e pode compreender ainda uma região variável de cadeia leve compreendendo uma CDR1 de VL de SEQ ID NO: 38; uma CDR2 de VL de SEQ ID NO: 39; e uma CDR3 de VL de SEQ ID NO: 40.

[0119] Em uma modalidade, o anticorpo da presente invenção é qualquer um dos anticorpos que compreende uma sequência de aminoácidos de região VH e/ou VL, conforme ilustrado na Fig. 1. Em uma modalidade, o anticorpo da presente invenção é caracterizado pela preservação do emparelhamento cognato da cadeia pesada e leve como estava presente na célula B humana.

[0120] Em uma modalidade, um anticorpo da presente invenção compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo, ou consistindo em uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO: 9, 13, 17 e 93. Em uma modalidade, um anticorpo da presente invenção compreende uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo, ou consistindo em uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO: 11, 15 e 19. Em uma modalidade, um anticorpo da presente invenção compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo, ou consistindo em uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO: 9, 13, 17 e 93, e compreende ainda uma região variável da cadeia leve (VL) compreendendo, ou consistindo em uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO: 11, 15 e 19. Em uma modalidade específica, o anticorpo compreende um VH de SEQ ID NO: 9 e um VL de SEQ ID NO: 11, ou um VH de SEQ ID NO: 93 e um VL de SEQ ID NO: 11, um VH de SEQ ID NO: 13 e um VL de SEQ ID NO: 15, ou um VH de SEQ ID NO: 17 e um VL de SEQ ID NO: 19.

[0121] Em alternativa, o anticorpo da presente invenção é um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, derivado ou variantes do mesmo, que compete para a ligação à tau, tal como, por exemplo, hTau40, com pelo menos um dos anticorpos tendo a região de VH e/ou VL, conforme ilustrado na Fig. 1. Em uma modalidade, um anticorpo da presente invenção compete pela ligação específica à hTau40 com NI- 105-4E4, NI-105-24B2 ou NI-105.4A3. Esses anticorpos podem ser humanos, bem como, em particular para aplicações terapêuticas. Alternativamente, o anticorpo é um anticorpo de murino, murinizado e quimérico de murino-humano, que são particularmente úteis para os métodos de diagnóstico e estudos em animais.

[0122] Em uma modalidade o anticorpo da presente invenção é proporcionado por culturas de células B únicas ou oligoclonais que são cultivadas e o sobrenadante da cultura, que contém anticorpos produzidos pelas referidas células B é testado para a presença e afinidade de anticorpos anti-tau nas mesmas. O processo de triagem compreende as etapas de um ensaio de imunorreatividade da placa amiloide sensível ao tecido (TAPIR) tal como descrito no pedido internacional WO2004/095031, o conteúdo ae divulgação do qual sendo aqui incorporado por referência; triagem em seções do cérebro para ligação a PHFTau; triagem para ligação de um peptídeo derivado de tau da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 6 com grupos de fosfato nos aminoácidos Ser-202 e Thr-205; no aminoácido Thr-231, e/ou nos aminoácidos Ser-396 e Ser -404 da referida sequência, um triagem para a ligação de tau recombinante humana da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 6 e o isolamento do anticorpo para a qual a ligação é detectada ou a célula que produz o referido anticorpo.

[0123] Como mencionado acima, devido à sua geração em cima de uma resposta imune humana, o anticorpo monoclonal humano da presente invenção vai reconhecer epítopos que são de relevância patológica particular e que podem não ser acessíveis ou menos imunogênicos no caso de processos de imunização pela geração de, por exemplo, anticorpos monoclonais de camundongo e triagem in vitro de bibliotecas de apresentação de fagos, respectivamente. Por conseguinte, é prudente prever que o epítopo do anticorpo monoclonal anti-tau humana da presente invenção é único e nenhum outro anticorpo que é capaz de se ligar ao epítopo reconhecido pelo anticorpo monoclonal humano da presente invenção existe; ver também a Fig. 11 que mostra o epítopo único de anticorpos NI-105.4E4 e NI-105.4A3. Portanto, a presente invenção também se estende geralmente para anticorpos anti-tau e moléculas de ligação à tau, que competem com o anticorpo monoclonal humano da presente invenção para se ligar especificamente a tau. A presente invenção é dirigida, mais especificamente, a um anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno, variante ou derivado do mesmo, em que o anticorpo se liga especificamente ao mesmo epítopo de tau, como um anticorpo de referência selecionado a partir do grupo consistindo em NI-105.4E4, NI- 105.24B2 e NI-105.4A3.

[0124] A competição entre anticorpos é determinada através de um ensaio em que a imunoglobulina em teste inibe a ligação específica de um anticorpo de referência a um antígeno comum, como a tau. Numerosos tipos de ensaios de ligação competitivos são conhecidos, por exemplo: Radioimunoensaio de fase sólida direta ou indireta (RIA), imunoensaio enzimático de fase sólida direta ou indireta (EIA), ensaio de competição de sanduíche, ver Stahli et al., Methods in Enzymology 9 (1983), 242-253; EIA biotina-avidina direta em fase sólida; ver Kirkland et al., J. Immunol. 137 (1986), 3614-3619 e Cheung et al., Virology 176 (1990), 546-552; ensaio de marcação direto em fase sólida, em fase sólida, ensaio em sanduíche de marcação direta, ver Harlow e Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988); RIA de marcação direta em fase sólida usando marcação com I125, ver Morel et al, Molec. Immunol. 25 (1988), 7-15 e Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol. 32 (1990), 77-82. Tipicamente, tal ensaio envolve o uso de tau purificada ou agregados da mesma ligada a uma superfície sólida ou células portadoras de qualquer um destes, uma imunoglobulina de teste não marcado e uma imunoglobulina de referência marcada, isto é, o anticorpo monoclonal humano da presente invenção. A inibição competitiva é medida através da determinação da quantidade de marcador ligado à superfície sólida ou células na presença da imunoglobulina de teste. Geralmente a imunoglobulina de teste está presente em excesso. Em uma modalidade, o ensaio de ligação competitiva é realizado em condições como descrito para o ensaio ELISA nos Exemplos em anexo. Os anticorpos identificados por ensaio de competição (anticorpos concorrentes) incluem anticorpos que se ligam ao mesmo epítopo que o anticorpo de referência e anticorpos que se ligam a um epítopo adjacente suficientemente proximal ao epítopo ligado pelo anticorpo de referência para que ocorra impedimento espacial. Geralmente, quando um anticorpo de competição está presente em excesso, o mesmo irá inibir a ligação específica de um anticorpo de referência a um antígeno comum de pelo menos 50% ou 75%. Assim, a presente invenção é ainda desenhada para um anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno, variante, ou derivados do mesmo, em que o anticorpo inibe competitivamente um anticorpo de referência selecionado a partir do grupo consistindo em NI-105.4E4, NI-105.24B2 ou NI-105.4 A3 de ligação à tau.

[0125] Em uma outra modalidade, a presente invenção proporciona um polipeptídeo isolado compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo em uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina (VH), onde pelo menos uma das VH-CDRs da região variável de cadeia pesada ou pelo menos duas das VH-CDRs da região variável de cadeia pesada são pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idênticas a sequências de aminoácidos de VH-CDR1, VH-CDR2 ou VH-CDR3 de cadeia pesada de referência dos anticorpos divulgados aqui. Alternativamente, as regiões de VH-CDR1, VH-CDR2 e VH-CDR3 do VH são pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idênticas a sequências de aminoácidos de VH-CDR1, VH-CDR2 ou VH-CDR3 de cadeia pesada de referência dos anticorpos divulgados aqui. Assim, de acordo com esta modalidade uma região variável de cadeia pesada da invenção tem sequências de polipeptídeos de VH- CDR1, VH-CDR2 e VH-CDR3 relacionadas a grupos mostrados na Fig. 1. Embora a Fig. 1 mostre VH-CDRs definida pelo sistema de Kabat, outras definições de CDR, por exemplo, VH-CDRs definidas por sistema de Chothia, são também incluídas na presente invenção, e podem ser facilmente identificadas por uma pessoa versada na técnica usando os dados apresentados na Fig. 1. Em uma modalidade, a sequência de aminoácidos de CDR1 de VH de referência é SEQ ID NO: 23, 29, ou 35; a sequência de aminoácidos de CDR2 de VH de referência é SEQ ID NO: 24, 30 ou 36; e a sequência de aminoácidos de CDR3 de VH de referência é SEQ ID NO: 25, 31 ou 37.

[0126] Em uma outra modalidade, a presente invenção proporciona um polipeptídeo isolado compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo em uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina (VH) em que as regiões de VH-CDR1, VH-CDR2 e VH- CDR3 têm sequências de polipeptídeos que são idênticas aos grupos VH-CDR1, VH-CDR2 e VH-CDR3 mostrados na Fig. 1. Em uma modalidade, a sequência de aminoácidos de CDR1 de VH é SEQ ID NO: 23, 29, ou 35; a sequência de aminoácidos de CDR2 de VH é SEQ ID NO: 24, 30 ou 36; e a sequência de aminoácidos de CDR3 de VH é SEQ ID NO: 25, 31 ou 37.

[0127] Em uma outra modalidade, a presente invenção proporciona um polipeptídeo isolado compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo em uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina (VH) em que as regiões de VH-CDR1, VH-CDR2 e VH- CDR3 têm sequências de polipeptídeos que são idênticas aos grupos VH-CDR1, VH-CDR2 e VH-CDR3 mostrados na Fig. 1, exceto para uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou dez substituições de aminoácidos em qualquer uma VH-CDR. Em certas modalidades as substituições de aminoácidos são conservativas. Em uma modalidade, a sequência de aminoácidos de CDR1 de VH é SEQ ID NO: 23, 29, ou 35; a sequência de aminoácidos de CDR2 de VH é SEQ ID NO: 24, 30 ou 36; e a sequência de aminoácidos de CDR3 de VH é SEQ ID NO: 25, 31 ou 37.

[0128] Em uma outra modalidade, a presente invenção proporciona um polipeptídeo isolado compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo em uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina (VL), onde pelo menos uma das VL-CDRs da região variável de cadeia leve ou pelo menos duas das VL-CDRs da região variável de cadeia leve são pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idênticas a sequências de aminoácidos de VL-CDR1, VL-CDR2 ou VL-CDR3 de cadeia leve de referência de anticorpos divulgados aqui. Alternativamente, as regiões de VL-CDR1, VL-CDR2 e VL-CDR3 de VL são pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idênticas a sequências de aminoácidos de VL-CDR1, VL-CDR2 ou VL-CDR3 de cadeia leve de referência de anticorpos divulgados aqui. Assim, de acordo com esta modalidade uma região variável de cadeia leve da invenção tem sequências de polipeptídeos de VL-CDR1, VL- CDR2 e VL-CDR3 relacionadas com o polipeptídeo mostrado na Fig. 1. Embora a Fig. 1 mostre VL-CDRs definidas pelo sistema de Kabat, outras definições de CDR, por exemplo, VL-CDRs definidas no sistema de Chothia, são também incluídas na presente invenção. Em uma modalidade, a sequência de aminoácidos de VL CDR1 de referência é SEQ ID NO: 26, 32 ou 38; a sequência de aminoácidos de VL CDR2 de referência é SEQ ID NO: 27, 33 ou 39; e a sequência de aminoácidos de VL CDR3 de referência é SEQ ID NO: 28, 34 ou 40.

[0129] Em uma outra modalidade, a presente invenção proporciona um polipeptídeo isolado compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo em uma região variável de cadeia leve de imunoglo- bulina (VL) em que as regiões de VL-CDR1, VL-CDR2 e VL-CDR3 têm sequências de polipeptídeos que são idênticas aos grupos de VL-CDR1, VL-CDR2 e VL-CDR3 mostrados na Fig. 1. Em uma modalidade, a sequência de aminoácidos de VL CDR1 é SEQ ID NO: 26, 32 ou 38; a sequência de aminoácidos de VL CDR2 é SEQ ID NO: 27, 33 ou 39; e a sequência de aminoácidos de VL CDR3 é SEQ ID NO: 28, 34 ou 40.

[0130] Em uma outra modalidade, a presente invenção proporciona um polipeptídeo isolado compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo em uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina (VL) em que as regiões de VL-CDR1, VL-CDR2 e VL- CDR3 têm sequências de polipeptídeos que são idênticas aos grupos de VL-CDR1, VL-CDR2 e VL-CDR3 mostrados na Fig. 1, exceto para uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou dez substituições de aminoácidos em qualquer uma VL-CDR. Em certas modalidades as substituições de aminoácidos são conservativas. Em uma modalidade, a sequência de aminoácidos de VL CDR1 é SEQ ID NO: 26, 32 ou 38; a sequência de aminoácidos de VL CDR2 é SEQ ID NO: 27, 33 ou 39; e a sequência de aminoácidos de VL CDR3 é SEQ ID NO: 28, 34 ou 40.

[0131] Uma imunoglobulina ou seu cDNA de codificação pode ser ainda modificada. Assim, em uma outra modalidade, o método da presente invenção compreende qualquer uma das etapas de produção de um anticorpo quimérico, anticorpo murinizado, anticorpo de cadeia única, fragmento Fab-, anticorpos biespecíficos, anticorpos de fusão, ou anticorpo marcados ou um análogo de qualquer um destes. Métodos correspondentes são conhecidos do versado na técnica e estão descritos, por exemplo, em Harlow and Lane "Antibodies, A Laboratory Manual", CSH Press, Cold Spring Harbor (1988). Quando os derivados de tais anticorpos são obtidos por meio da técnica de apresentação de fagos, a ressonância de plásmons de superfície, como empregada no sistema BIAcore pode ser usada para aumentar a eficiência de anticorpos em fagos que se ligam ao mesmo epítopo que o de qualquer um dos anticorpos aqui descritos (Schier, Human Antibodies Hybridomas 7 (1996), 97-105; Malmborg, J. Immunol. Methods 183 (1995), 7-13). A produção de anticorpos quiméricos é descrita, por exemplo, no pedido internacional WO89/09622. Os métodos para a produção de anticorpos humanizados são descritos, por exemplo, pedido Eupopeu EP-A1 0 239 400 e Pedido Internacional WO90/07861. Outra fonte de anticorpos para serem usados de acordo com a presente invenção são os chamados anticorpos xenogênicos. O princípio geral para a produção de anticorpos xenogênicos, tais como anticorpos tipo humanos em camundongos é descrito, por exemplo, nos pedidos internacionais WO91/10741, WO94/02602, WO96/34096 e WO 96/33735. Como discutido acima, o anticorpo da presente invenção pode existir em uma variedade de formas além de anticorpos completos, incluindo, por exemplo, Fv, Fab e F(ab’)2, assim como em cadeias simples, ver por exemplo, pedido internacional WO88/09344.

[0132] Os anticorpos da presente invenção ou a sua(s) cadeia de imunoglobulina correspondente podem ser ainda modificados usando técnicas convencionais conhecidas na técnica, por exemplo, usando deleção(ões), inserção(ões), substituição(ões), adição(ões), e/ou recombinação(ões) de aminoácido e/ou qualquer outra modificação(ões) conhecidas na técnica, quer individualmente ou em combinação. Os métodos para introduzir tais modificações na sequência de DNA subjacente à sequência de aminoácidos de uma cadeia de imunoglobulina são bem conhecidos do versado na técnica, ver, por exemplo, Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y. e Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates ed Wiley Interscience, N.Y. (1994). As modificações do anticorpo da presente invenção incluem derivatizações químicas e/ou enzimáticas em um ou mais aminoácidos constituintes, incluindo as modificações da cadeia lateral, modificações da cadeia principal, e modificações N- e C-terminais, incluindo acetilação, hidroxilação, metilação, amidação, e fixação de frações de carboidratos ou lipídeos, cofatores, e semelhantes. Do mesmo modo, a presente invenção abrange a produção de proteínas quiméricas que compreendem o anticorpo descrito ou alguns fragmentos do mesmo, no terminal amino fundido à molécula heteróloga, tal como um ligante imunoestimulante no terminal carboxil, ver, por exemplo, pedido internacional WO00/30680 para detalhes da técnica correspondente.

[0133] Além disso, a presente invenção engloba os peptídeos incluindo aqueles que contêm uma molécula de ligação, tal como descrito acima, por exemplo, contendo a região CDR3 da região variável de qualquer um dos anticorpos mencionados, em especial CDR3 de cadeia pesada, uma vez que tem sido frequentemente observado que a CDR3 de cadeia pesada (HCDR3) é a região que tem um maior grau de variabilidade e uma participação predominante na interação antígeno- anticorpo. Tais peptídeos podem ser facilmente sintetizados ou produzidos por meios recombinantes para a produção de um agente de ligação útil de acordo com a invenção. Tais métodos são bem conhecidos dos comuns versados na técnica. Os peptídeos podem ser sintetizados, por exemplo, usando sintetizadores de peptídeos automatizados, que estão comercialmente disponíveis. Os peptídeos também podem ser produzidos por técnicas recombinantes através da incorporação do DNA expressando o peptídeo em um vetor de expressão e transformação de células com o vetor de expressão para produzir o peptídeo.

[0134] Assim, a presente invenção refere-se a qualquer molécula de ligação, por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação do mesmo, que é orientada para os anticorpos anti-tau humanos da presente invenção e mostra as propriedades mencionadas, ou seja, que reconhecem especificamente a tau. Tais anticorpos e moléculas de ligação podem ser testados quanto à sua especificidade de ligação e afinidade por meio de ELISA e Western Blot e de imuno-histoquímica como aqui descrito, ver, por exemplo, os Exemplos. Além disso, os resultados preliminares de experiências subsequentes efetuadas de acordo com a presente invenção revelaram que o anticorpo anti-tau humano da presente invenção, em particular, o anticorpo NI-105.4E4, liga-se principalmente à tau agregada patologicamente semelhante a emaranhados neurofibrilares (NFT), filamentos de neurópilos presentes em seções do cérebro humano de pacientes que sofriam de doença de Alzheimer (AD), em adição. Assim, em uma modalidade particular preferida da presente invenção, o anticorpo humano ou fragmento de ligação, derivado ou variante reconhece tau em seções de cérebro de AD humano. Além disso, a distinta capacidade do anticorpo NI-105.4E4 para ligar-se diferencialmente a patologias de tau pode também ser mostrada no camundongo transgênico que superexpressa tau humana P301L. Além dos NFT’s já mencionados e filamentos de neurópilo, o anticorpo liga-se a NI-105.4E4 em seções do cérebro de camundongo, além de neurites distróficas e identifica agregados de tau na fase de pré- emaranhados, ver Exemplo 4 e Fig. 6.

[0135] Como uma alternativa para a obtenção de imunoglobulinas diretamente a partir da cultura de células B imortalizadas, ou células B de memória, as células imortalizadas podem ser usadas como uma fonte de locais de cadeia pesada e de cadeia leve rearranjadas para a expressão subsequente e/ou manipulação genética. Genes de anticorpos rearranjados podem ser transcritos de forma inversa a partir de RNAm apropriado para produzir cDNA. Se desejado, a região constante da cadeia pesada pode ser trocada por aquela de um isotipo diferente ou completamente eliminado. As regiões variáveis podem ser ligadas para codificar as regiões Fv de cadeia única. Múltiplas regiões de Fv podem ser ligadas para conferir capacidade de ligação para mais do que um alvo ou combinações de cadeias pesada e leve quiméricas podem ser empregadas. Uma vez que o material genético é acessível, o projeto de análogos, como descrito acima que retêm suas capacidades (ambos) de se ligar ao alvo desejado é simples. Os métodos para a clonagem de regiões variáveis de anticorpos e geração de anticorpos recombinantes são conhecidos do versado na técnica e estão descritos, por exemplo, em Gilliland et al., Tissue Antigens 47 (1996), 1-20; Doenecke et al., Leukemia 11 (1997), 1787-1792.

[0136] Uma vez que o material genético apropriado é obtido e, se desejado, modificado para codificar um análogo, as sequências de codificação, incluindo aquelas que codificam, pelo menos, as regiões variáveis da cadeia pesada e leve, podem ser inseridas em sistemas de expressão contidos em vetores que podem ser transfectados em células hospedeiras recombinantes padrões. Uma variedade de tais células hospedeiras pode ser usada, para um processamento eficiente, no entanto, as células de mamíferos podem ser consideradas. As linhagens de células de mamífero típicas úteis para este fim incluem, mas não estão limitadas a, células CHO, células HEK 293, ou células NSO.

[0137] A produção do anticorpo ou análogo é então realizada através da cultura do hospedeiro recombinante modificado, em condições de cultura adequadas para o crescimento das células hospedeiras e a expressão das sequências de codificação. Os anticorpos são então recuperados por isolá-las a partir da cultura. Os sistemas de expressão são concebidos por incluir peptídeos sinais de modo a que os anticorpos resultantes são secretados para o meio, no entanto, a produção intracelular também é possível.

[0138] Em conformidade com o acima exposto, a presente invenção também diz respeito a um polinucleotídeo que codifica o anticorpo ou molécula de ligação equivalente da presente invenção. Em uma modalidade, o polinucleotídeo codifica pelo menos uma região variável de uma cadeia de imunoglobulina do anticorpo descrito acima. Tipicamente, a referida região variável codificada pelo polinucleotídeo compreende pelo menos uma região determinante de complementaridade (CDR) da região de VH e/ou VL da variável do referido anticorpo.

[0139] O versado na técnica compreenderá facilmente que o domínio variável do anticorpo tendo o domínio variável acima descrito pode ser usado para a construção de outros polipeptídeos ou anticorpos de especificidade e função biológica desejada. Assim, a presente invenção também engloba polipeptídeos e anticorpos que compreendem pelo menos uma CDR do domínio variável acima descrito e que, vantajosamente, têm substancialmente as mesmas propriedades de ligação ou propriedades semelhantes, como o anticorpo descrito nos exemplos em anexo. A pessoa versada na técnica sabe que a afinidade de ligação pode ser intensificada fazendo substituições de aminoácidos dentro das CDRs ou dentro de alças hipervariáveis (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196 (1987), 901-917), que se sobrepõem parcialmente com as CDR tal como definido por Kabat, ver, por exemplo, Riechmann, et al, Nature 332 (1988), 323-327. Assim, a presente invenção também se refere a anticorpos em que uma ou mais das CDRs mencionadas compreendem um ou mais, ou não mais do que duas substituições de aminoácidos. Em uma modalidade, o anticorpo da presente invenção compreende em uma ou em ambas das suas cadeias de imunoglobulina duas ou todas as três CDRs das regiões variáveis como definido na Fig. 1.

[0140] As moléculas de ligação, por exemplo, anticorpos, ou fragmentos de ligação ao antígeno, variantes, ou derivados dos mesmos da presente invenção, tal como é conhecido por aqueles versados na técnica, pode compreender uma região constante que medeia uma ou mais funções efetoras. Por exemplo, a ligação do componente C1 do complemento a uma região constante de anticorpo pode ativar o sistema do complemento. A ativação do complemento é importante para a opsonização e lise de células de organismos patogênicos. A ativação do complemento também estimula a resposta inflamatória e pode também estar envolvida na hipersensibilidade autoimune. Além disso, os anticorpos ligam-se a receptores em várias células através da região Fc, com um sítio de ligação do receptor Fc na região Fc do anticorpo que se liga a um receptor de Fc (FcR) em uma célula. Há uma série de receptores de Fc que são específicos para as diferentes classes de anticorpos, incluindo IgG (receptores gama), IgE (receptores epsilon), IgA (receptores-alfa) e IgM (receptores mu). A ligação do anticorpo a receptores de Fc nas superfícies das células desencadeia uma série de importantes e diversas respostas biológicas, incluindo imersão e destruição de partículas revestidas de anticorpo, depuração de complexos imunes, a lise de células alvo revestidas de anticorpo por células assassinas (chamado citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos ou ADCC), liberação de mediadores inflamatórios, transferência placentária e controle da produção de imunoglobulina.

[0141] Em consequência, certas modalidades da presente invenção incluem um anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno, variante, ou derivado do mesmo, em que pelo menos uma fração de um ou mais dos domínios da região constante foi deletada ou, de outro modo, alterada para proporcionar características bioquímicas desejadas, tais como as funções efetoras reduzidas, a capacidade para dimerizar de uma forma não covalente, capacidade aumentada para se localizar no sítio de agregação e deposição de tau, meia vida sérica reduzida, ou meia vida sérica aumentada, quando comparado com um todo, anticorpo inalterado de aproximadamente a mesma imunogenicidade. Por exemplo, determinados anticorpos para uso em métodos de diagnóstico e de tratamento aqui descritos são os anticorpos de domínio deletado que compreendem uma cadeia de polipeptídeo semelhante a uma cadeia pesada de imunoglobulina, mas que não têm pelo menos uma porção de um ou mais domínios de cadeia pesada. Por exemplo, em certos anticorpos, um domínio inteiro da região constante do anticorpo modificado será deletado, por exemplo, a totalidade ou parte do domínio CH2 será deletada. Em outras modalidades, certos anticorpos para uso em métodos de diagnóstico e de tratamento aqui descritos têm uma região constante, por exemplo, uma região constante de cadeia pesada de IgG, a qual é alterada para eliminar a glicosilação, referida aqui como em outra parte como anticorpos aglicosilados ou "agly". Tais anticorpos "agly" podem ser preparados enzimaticamente, bem como pela manipulação do(s) sítio(s) de glicosilação de consenso na região constante. Embora não estando limitado pela teoria, acredita- se que os anticorpos "agly" podem ter um perfil de segurança e estabilidade melhorado in vivo. Métodos de produção de anticorpos aglicosilados, tendo a função efetora desejada são encontrados, por exemplo, no pedido internacional WO2005/018572, o qual é incorporado por referência na sua totalidade.

[0142] Em certos anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno, variantes, ou derivados dos mesmos, descritos aqui, a porção Fc pode ser mutada para diminuir a função efetora, usando técnicas conhecidas na técnica. Por exemplo, a deleção ou inativação (através de mutações pontuais ou outros meios) de um domínio da região constante podem reduzir a ligação ao receptor Fc do anticorpo modificado circulante aumentando, assim, a localização de tau. Em outros casos, pode ser que as modificações da região constante de acordo com a presente invenção consistentes com a presente invenção moderam a ligação do complemento e, assim, reduzem a associação da meia vida sérica e não específica de uma citotoxina conjugada. No entanto, outras modificações da região constante podem ser usadas para modificar ligações de dissulfeto ou frações de oligossacarídeos que permitem a localização intensificada devido ao aumento da especificidade do antígeno ou flexibilidade do anticorpo. O perfil fisiológico resultante, biodisponibi- lidade e outros efeitos bioquímicos das modificações, tais como a localização de tau, biodistribuição e meia vida sérica, podem ser facilmente medidos e quantificados usando técnicas imunológicas bem conhecidas, sem experimentação indevida.

[0143] Em certos anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno, variantes, ou derivados dos mesmos descritos aqui, a porção Fc pode ser mutada ou trocada por sequências de proteínas alternativas para aumentar a absorção celular de anticorpos por meio de exemplo por intensificação da endocitose mediada pelo receptor de anticorpos através de receptores FCY, LRP, ou receptores Thy1 ou por 'Tecnologia SuperAntibody', que possibilita que os anticorpos sejam embaralhados em células vivas sem as danificar (Expert Opin. Biol. Ther. (2005), 237241). Por exemplo, a geração de proteínas de fusão da região de ligação do anticorpo e ligantes de proteínas cognatas de receptores de superfície celular ou anticorpos bi- ou multiespecíficos, com sequências específicas de ligação a tau, bem como um receptor da superfície da célula pode ser manipulada usando técnicas conhecidas na técnica.

[0144] Em certos anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno, variantes, ou derivados dos mesmos aqui descritos, a porção Fc pode ser mutada ou trocada por sequências de proteínas alternativas, ou o anticorpo pode ser quimicamente modificado para aumentar a sua penetração de barreira hematoencefálica.

[0145] Formas modificadas de fragmentos de anticorpos, ou de ligação ao antígeno, variantes, ou derivados dos mesmos da presente invenção podem ser feitas a partir do precursor inteiro ou anticorpos originais, usando técnicas conhecidas na técnica. Exemplos de técnicas são discutidos em mais detalhe aqui. Os anticorpos, fragmentos de ligação ao antígeno, variantes, ou derivados dos mesmos da presente invenção podem ser feitos ou fabricados usando técnicas que são conhecidas na técnica. Em certas modalidades, as moléculas de anticorpos ou fragmentos dos mesmos são "produzidas de forma recombinante", isto é, são produzidas usando tecnologia de DNA recombinante. Técnicas exemplares para produzir moléculas de anticorpos ou fragmentos dos mesmos são discutidas em mais detalhe neste documento.

[0146] Anticorpos, fragmentos de ligação ao antígeno, variantes, ou derivados dos mesmos da presente invenção também incluem os derivados que são modificados, por exemplo, por fixação covalente de qualquer tipo de molécula de anticorpo, tal que a ligação covalente não impede que o anticorpo se ligue especificamente ao seu epítopo cognato. Por exemplo, mas não a título de limitação, os derivados de anticorpos incluem os anticorpos que foram modificados, por exemplo, por glicosilação, acetilação peguilação, fosforilação, amidação, derivatização, por grupos protetores/de bloqueio conhecidos, clivagem proteolítica, ligação a um ligante celular ou outra proteína, etc.. Qualquer uma das numerosas modificações químicas pode ser realizada por técnicas conhecidas, incluindo, mas não se limitando a, clivagem química específica, acetilação, formilação, síntese metabólica de tunicamicina, etc.. Além disso, o derivado pode conter um ou mais aminoácidos não clássicos.

[0147] Em modalidades particulares, os anticorpos, ou fragmentos de ligação ao antígeno, variantes ou derivados dos mesmos da invenção não vão provocará uma resposta imune prejudicial no animal a ser tratado, por exemplo, em um humano. Em certas modalidades, as moléculas de ligação, por exemplo, anticorpos, ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos da presente invenção, são derivadas a partir de um paciente, por exemplo, um paciente humano e são, subsequentemente, usadas na mesma espécie a partir da qual elas são derivadas, por exemplo, humano, aliviando ou minimizando a ocorrência de respostas imunes prejudiciais.

[0148] A desimunização pode também ser usada para diminuir a imunogenicidade de um anticorpo. Tal como usado aqui, o termo "desimunização" inclui alteração de um anticorpo para modificar os epítopos de células T, ver, por exemplo, os pedidos internacionais WO98/52976 e WO00/34317. Por exemplo, as sequências de VH e VL do anticorpo de partida são analisadas e um "mapa" de epítopo de célula T humana a partir do cada região V mostrando a localização de epítopos, em relação às regiões determinantes de complementaridade (CDRs) e outros resíduos chaves dentro da sequência. Os epítopos de células T individuais, a partir do mapa de epítopo de célula T são analisados a fim de identificar substituições de aminoácidos alternativos, com um baixo risco de alterar a atividade do anticorpo final. Uma faixa de sequências de VH e VL alternativa foi projetada compreendendo combinações de substituições de aminoácidos e estas sequências são subsequentemente incorporadas em uma variedade de polipeptídeos de ligação, por exemplo, anticorpos específicos de tau ou fragmentos imunoespecíficos dos mesmos, para uso nos métodos de diagnóstico e de tratamento aqui descritos, que são então testados quanto à função. Normalmente, entre 12 e 24 anticorpos variantes são gerados e testados. Os genes de cadeia pesada e leve completos que compreendem as regiões C humana e V modificada são então clonados em vetores de expressão e os plasmídeos subsequentes são introduzidos em linhagens de células para a produção de anticorpo inteiro. Os anticorpos são então comparados em ensaios bioquímicos e biológicos apropriados, e a variante ótima é identificada.

[0149] Os anticorpos monoclonais podem ser preparados usando uma ampla variedade de técnicas conhecidas na técnica, incluindo o uso de hibridoma, recombinantes, e tecnologias de exibição de fagos, ou uma combinação destes. Por exemplo, os anticorpos monoclonais podem ser produzidos usando técnicas de hibridoma, incluindo as conhecidas na técnica e ensinadas, por exemplo, em Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a ed. (1988); Hammerling et al., em: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas Elsevier, N.Y., 563-681 (1981), referidas referências incorporadas por referência na sua totalidade. O termo "anticorpo monoclonal", como usado aqui não se limita a anticorpos produzidos através de tecnologia de hibridoma. A expressão "anticorpo monoclonal" refere-se a um anticorpo que é derivado a partir de um único clone, incluindo qualquer eucariótico, procariótico ou clone de fago, e não o método pelo qual é produzido. Assim, o termo "anticorpo monoclonal" não se limita a anticorpos produzidos através de tecnologia de hibridoma. Em certas modalidades, os anticorpos da presente invenção são derivados de células B humanas que foram imortalizadas através de transformação com o vírus Epstein-Barr, tal como descrito aqui.

[0150] No processo de hibridoma bem conhecido (Kohler et al., Nature 256 (1975), 495), os linfócitos relativamente de curta duração, ou mortais, a partir de um mamífero, por exemplo, as células B derivadas de um sujeito humano, como aqui descrito, são fundidas com uma linhagem de células de tumor não mortal (por exemplo,. uma linhagem de células de mieloma), assim, produzindo células híbridas ou "hibridomas" que são ambas imortais e capazes de produzir o anticorpo codificado geneticamente da célula B. Os híbridos resultantes são secretados em cepas genéticas individuais por diluição de seleção, e recrescimento com cada uma das cepas individuais compreendendo genes específicos para a formação de um único anticorpo. Elas produzem anticorpos, que são homogêneos contra um antígeno desejado e, em função do seu parentesco genético puro, são designados "monoclonais".

[0151] As células de hibridoma assim preparadas são semeadas e cultivadas em um meio de cultura apropriado que contém uma ou mais substâncias que inibem o crescimento ou sobrevivência das células de mieloma não fundidas originais. Os versados na técnica apreciarão que os reagentes, as linhagens de células e os meios para a formação, seleção e crescimento de hibridomas estão disponíveis comercialmente a partir de uma série de fontes, e protocolos padronizados estão bem estabelecidos. Geralmente, o meio de cultura no qual as células de hibridoma estão crescendo é ensaiado quanto à produção de anticorpos monoclonais contra o antígeno desejado. A especificidade de ligação dos anticorpos monoclonais produzidos por células de hibridoma é determinada por ensaios in vitro, tais como imunoprecipitação, radioimunoensaio (RIA) ou ensaio de imunoabsorção de ligação a enzima (ELISA) como descrito aqui. Depois que as células de hibridoma são identificadas produzindo anticorpos com a desejada especificidade, afinidade e/ou atividade, os clones podem ser subclonados por procedimentos de diluição limitante e crescidos por métodos padrões, ver, por exemplo, Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, pp 59-103 (1986). Será ainda apreciado que os anticorpos monoclonais secretados pelos subclones podem ser separados a partir de meio de cultura, fluido de ascites ou soro por procedimentos convencionais de purificação, tais como, por exemplo, proteína-A, cromatografia de cromatografia de hidroxilapatita, eletroforese em gel, diálise ou cromatografia de afinidade.

[0152] Em outra modalidade, os linfócitos podem ser selecionados por micromanipulação e os genes variáveis isolados. Por exemplo, as células mononucleares do sangue periférico podem ser isoladas a partir de um mamífero imunizado ou naturalmente imune, por exemplo, um ser humano, e cultivadas durante cerca de 7 dias in vitro. As culturas podem ser rastreadas para IgGs específicas que atendem os critérios de triagem. As células de poços positivos podem ser isoladas. As células B produtoras de Ig individuais podem ser isoladas por FACS ou pela identificação das mesmas um ensaio de placa hemolítica mediado pelo complemento. As células produtoras de Ig-B podem ser micromani- puladas em um tubo e os genes de VH e VL podem ser amplificados usando, por exemplo, RT-PCR. Os genes de VH e VL podem ser clonados em um vetor de expressão de anticorpos e transfectados em células (por exemplo, as células eucarióticas ou procarióticas) para expressão.

[0153] Em alternativa, as linhagens de células produtoras de anticorpos podem ser selecionadas e cultivadas usando técnicas bem conhecidas pelos versados na matéria. Tais técnicas são descritas em uma variedade de manuais de laboratório e publicações primárias. A este respeito, as técnicas adequadas para uso na presente invenção, tal como descrito abaixo são descritas em Current Protocols in Immunology, Coligan et al., Eds., Green Publishing Associates e Wiley- Interscience, John Wiley e Sons, New York (1991), que é aqui incorporado por referência na sua totalidade, incluindo os suplementos.

[0154] Os fragmentos de anticorpos que reconhecem epítopos específicos podem ser gerados por técnicas conhecidas. Por exemplo, os fragmentos Fab e F(ab’)2 podem ser produzidos de forma recom- binante ou por clivagem proteolítica de moléculas de imunoglobulina, usando enzimas tais como papaína (para produzir fragmentos Fab) ou pepsina (para produzir fragmentos F(ab’)2). Os fragmentos F(ab’)2 contêm a região variável, a região constante da cadeia leve e o domínio CH1 da cadeia pesada. Tais fragmentos são suficientes para uso, por exemplo, em procedimentos de imunodiagnóstico que envolvem o acoplamento das porções imunoespecíficas de imunoglobulinas para a detecção de reagentes, tais como radioisótopos.

[0155] Os anticorpos humanos, como aqui descritos, são particular mente desejáveis para uso terapêutico em pacientes humanos. Os anticorpos humanos da presente invenção são isolados, por exemplo, a partir de sujeitos humanos saudáveis que devido à sua idade podem ser suspeitos de estar em risco de desenvolver um distúrbio tauopático, por exemplo, doença de Alzheimer, ou um paciente com o distúrbio, mas com um curso da doença surpreendentemente estável. No entanto, apesar de ser prudente esperar que os idosos saudáveis e sujeitos livres de sintomas, respectivamente, vão desenvolver de anticorpos anti-tau protetores de forma mais regular do que os sujeitos mais jovens, estes últimos podem ser usados, bem como ser fonte para a obtenção de um anticorpo humano da presente invenção. Isto é particularmente verdadeiro para os pacientes mais jovens que estão predispostos a desenvolver uma forma familiar de uma doença tauopática mas permanecem livres de sintomas desde que seu sistema imune funciona de forma mais eficiente do que em adultos mais velhos.

[0156] Em uma modalidade, um anticorpo da presente invenção compreende pelo menos uma CDR de cadeia pesada ou leve de uma molécula de anticorpo. Em uma outra modalidade, um anticorpo da presente invenção compreende pelo menos duas CDRs de um ou mais moléculas de anticorpo. Em uma outra modalidade, um anticorpo da presente invenção compreende pelo menos três CDRs de uma ou mais moléculas de anticorpo. Em uma outra modalidade, um anticorpo da presente invenção compreende pelo menos quatro CDRs de uma ou mais moléculas de anticorpo. Em uma outra modalidade, um anticorpo da presente invenção compreende pelo menos cinco CDRs de uma ou mais moléculas de anticorpo. Em outra modalidade, um anticorpo da invenção compreende pelo menos seis CDR de uma ou mais moléculas de anticorpo. Exemplos de moléculas de anticorpo que compreendem pelo menos uma CDR que podem ser incluídas nos anticorpos em questão são descritas aqui.

[0157] Os anticorpos da presente invenção podem ser produzidos por qualquer método conhecido na técnica para a síntese de anticorpos, em particular, por síntese química ou por técnicas de expressão recombinante, conforme aqui descrito.

[0158] Em uma modalidade, um anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno, variante, ou derivado do mesmo da presente invenção compreende uma região constante sintética, em que um ou mais domínios são parcialmente ou totalmente deletados ("anticorpos de domínio excluídos"). Em certas modalidades compatíveis os anticorpos modificados compreenderão construtos de domínio deletados ou variantes em que o domínio CH2 inteiro foi removido (construtos (ΔCH2). Para outras modalidades, um peptídeo de conexão curto pode ser substituído para o domínio deletado para proporcionar flexibilidade e liberdade de movimento para a região variável. Os versados na técnica irão apreciar que tais construtos são particularmente preferidos devido às propriedades reguladoras do domínio CH2 sobre a taxa catabólica do anticorpo. Os construtos de domínio deletado podem ser derivados usando um vetor que codifica um domínio constante de IgG1 humana, ver, por exemplo, os pedidos internacionais WO02/060955 e WO02/096948A2. Este vetor foi projetado para deletar o domínio CH2 e proporcionar um vetor sintético que expressa uma região constante de IgG1 de domínio deletado.

[0159] Em certas modalidades, os anticorpos, ou fragmentos de ligação ao antígeno, variantes, ou derivados dos mesmos da presente invenção são minicorpos. Os minicorpos podem ser feitos usando métodos descritos na técnica, ver, por exemplo, Patente US 5.837.821 ou pedido internacional WO 94/09817.

[0160] Em uma modalidade, um anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno, variante, ou derivado do mesmo da presente invenção compreende uma cadeia pesada de imunoglobulina tendo deleção ou substituição de alguns ou mesmo um único aminoácido, desde que permita a associação entre subunidades monoméricas. Por exemplo, a mutação de um único aminoácido em áreas selecionadas do domínio CH2 pode ser suficiente para reduzir substancialmente a ligação de Fc e, assim, aumentar a localização de tau. De modo semelhante, pode ser desejável simplesmente deletar a parte de um ou mais domínios da região constante que controlam a função efetora (por exemplo, ligação do complemento) a ser modulada. Tais deleções parciais das regiões constantes podem melhorar as características selecionadas do anticorpo (meia vida sérica), enquanto deixando outras funções desejáveis associadas com o domínio da região constante em questão intacto. Além disso, como mencionado acima, as regiões constantes dos anticorpos divulgados podem ser sintéticas através da mutação ou substituição de um ou mais aminoácidos que melhoram o perfil do construto resultante. A este respeito, pode ser possível romper a atividade fornecida por um sítio de ligação conservado (por exemplo, ligação de Fc), enquanto mantendo substancialmente o perfil de configuração e imunogênico do anticorpo modificado. No entanto, outras modalidades compreendem a adição de um ou mais aminoácidos na região constante para intensificar as características desejáveis, tais como a função efetora ou fornecer mais citotoxina ou fixação de carboidratos. Em tais modalidades, pode ser desejável inserir ou reproduzir sequências específicas derivadas selecionadas dos domínios da região constante.

[0161] A presente invenção também proporciona anticorpos que compreendem, consistem essencialmente em, ou consistem em, variantes (incluindo derivados) de moléculas de anticorpo (por exemplo, as regiões de VH e/ou regiões de VL) aqui descritas, cujos anticorpos ou fragmentos dos mesmos se ligam imunoespecificamente à tau. Técnicas convencionais conhecidas dos versados na técnica podem ser usadas para introduzir mutações na sequência de nucleotídeos que codifica um anticorpo, incluindo, mas não se limitando a, mutagênese sítio-dirigida e mutagênese mediada por PCR, que resultam em substituições de aminoácidos. Em uma modalidade, as variantes (incluindo derivados) codificam menos de 50 substituições de aminoácidos, menos de 40 substituições de aminoácidos, menos de 30 substituições de aminoácidos, menos de 25 substituições de aminoácidos, menos de 20 substituições de aminoácidos, menos de 15 amino substituições de ácidos, menos de 10 substituições de aminoácidos, menos de 5 substituições de aminoácidos, menos de 4 substituições de aminoácidos, menos de 3 substituições de aminoácidos, ou menos do que 2 substituições de aminoácidos em relação à região de VH de referência, VH-CDR1, VH-CDR2, VH-CDR3, região de VL, VL-CDR1, VL-CDR2, ou VL-CDR3. Uma "substituição conservativa de aminoácidos" é aquela em que o resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácido com uma cadeia lateral com uma carga semelhante. As famílias de resíduos de aminoácidos tendo cadeias laterais com cargas semelhantes foram definidas na técnica. Estas famílias incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares não carregadas (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadeias laterais não polares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadeias laterais beta-ramificadas (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Alternativamente, as mutações podem ser introduzidas aleatoriamente ao longo de toda ou parte da sequência de codificação, tal como por mutagênese de saturação, e os mutantes resultantes podem ser rastreados para a atividade biológica para identificar mutantes que retêm a atividade (por exemplo, a capacidade de se ligar à tau).

[0162] Por exemplo, é possível introduzir mutações apenas em regiões de estrutura ou apenas em regiões CDR de uma molécula de anticorpo. As mutações introduzidas podem ser mutações missenso silenciosas ou neutras, por exemplo, não têm nenhum, ou têm pouco, efeito sobre a capacidade de um anticorpo para se ligar ao antígeno, apesar de algumas de tais mutações não alterarem a sequência de aminoácidos absolutamente. Estes tipos de mutações podem ser úteis para otimizar o uso de códons, ou melhorar a produção de um hibridoma de anticorpo. As regiões de codificação códon-otimizadas que codificam os anticorpos da presente invenção estão descritas em outras partes deste documento. Alternativamente, as mutações missenso não neutras podem alterar a capacidade do anticorpo para se ligar ao antígeno. A localização das mutações missenso mais silenciosas e neutras é provável que seja nas regiões de estrutura, enquanto que a localização da maioria das mutações missenso não neutras é suscetível de ser na CDR, embora isso não seja um requisito absoluto. Um versado na técnica seria capaz de projetar e testar as moléculas mutantes com as propriedades desejadas, tais como sem alteração da atividade de ligação ao antígeno ou alteração na atividade de ligação (por exemplo, melhorias da atividade de ligação ao antígeno ou alteração na especificidade do anticorpo). Seguindo a mutagênese, a proteína codificada pode ser expressa rotineiramente e a atividade funcional e/ou biológica da proteína codificada (por exemplo, a capacidade de se ligar imunoespecificamente a pelo menos um epítopo de tau) pode ser determinada usando técnicas aqui descritas, ou por técnicas de modificação rotineiras conhecidas na técnica.

[0163] Os agentes de ligação a tau, por exemplo, mas não limitados a, anticorpos de tau de ligação da presente invenção podem ser caracterizados usando quaisquer modelos in vivo ou in vitro de tauopatias neurodegenerativas. Um versado na técnica facilmente entende que um agente de ligação à tau (por exemplo, um anticorpo) da presente invenção pode ser caracterizado por um modelo de camundongo para tauopatias neurodegenerativas. Por exemplo, mas não limitado a, qualquer um dos seguintes três diferentes modelos animais para tauopatia, pode ser usado para caracterizar e validar os anticorpos de tau (e moléculas com as especificidades de ligação dos mesmos) da presente invenção. 1. Os camundongos TauP301L transgênicos (Linhagem 183): expressando Tau40 humana com mutação P301L sob o promotor Thy1.2 de murino (geração desses animais transgênicos é descrita em Gotz et al, J. Biol Chem 276 (2001), 529-534 e no pedido internacional WO 2003/017918, os conteúdos da descrição senso aqui incorporados por referência). 2. Camundongos JNPL3 que expressam a isoforma de tau humana 4R mais curta com mutação P301L sobre o promotor de PrP de murino (disponível a partir de Taconic, Hudson, NY, EUA). 3. Camundongos P301STau (Linhagem PS19) que expressam tau humana com mutação P301S sobre o promotor de PrP de murino (disponível a partir de Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine, EUA).

[0164] Um versado na técnica entende que um modelo experimental de tauopatias neurodegenerativas pode ser usado em uma configuração preventiva, ou pode ser usado em uma configuração terapêutica. Em uma configuração preventiva, o doseamento dos animais é iniciado antes do início das tauopatias neurodegenerativas ou sintomas destas. Em configurações preventivas, um agente de ligação à tau (por exemplo, anticorpo) da invenção é avaliado pela sua capacidade de prevenir, reduzir ou retardar o aparecimento de tauopatias neurodegenerativas ou sintomas das mesmas. Em uma configuração terapêutica, a dosagem de animais começam depois do início das tauopatias neurodegenerativas ou de um sintoma das mesmas. Em uma configuração terapêutica, um agente de ligação à tau (por exemplo, anticorpo) da invenção é avaliado pela sua capacidade para tratar, reduzir ou aliviar as tauopatias neurodegenerativas ou um sintoma das mesmas. Os sintomas das tauopatias neurodegenerativas incluem, mas não estão limitados a, acumulação de depósitos de tau patológica, emaranhados neurofibrilares (NFT), polipeptídeo de tau hiperfosforilado, frações de tau insolúveis nos neurônios, cérebro, medula espinal, fluido cerebroespinhal ou soro do objeto experimental. Um versado na técnica entende que um resultado preventivo ou terapêutico positivo, em qualquer modelo animal de tauopatias neurodegenerativas indica que o agente específico de ligação à tau (por exemplo, anticorpo) pode ser usado para fins preventivos ou terapêuticos em um sujeito que não o organismo do modelo experimental, por exemplo, pode ser usado para tratar tauopatias neurodege- nerativas em um sujeito humano com necessidade do mesmo.

[0165] Em uma modalidade, um agente de ligação à tau (por exemplo, um anticorpo) da invenção pode ser administrado a um modelo de camundongo de tauopatia e camundongos do tipo selvagem de controle correspondentes. O anticorpo administrado pode ser um anticorpo murinizado da presente invenção ou um de quimera humano- murino de um anticorpo da presente invenção. Ver, por exemplo, Exemplo 6 e 7. O agente de ligação à tau (por exemplo, um anticorpo) pode ser administrado por quaisquer meios conhecidos na técnica, por exemplo, por via intraperitoneal, intracraniana, intramuscular, intravenosa, subcutânea, oral, e aerossol. Animais experimentais podem ser administrados com uma, duas, três, quatro, cinco ou mais doses do agente de ligação à tau (por exemplo, um anticorpo) ou uma composição de controle, tal como PBS. Em uma modalidade, os animais experimentais serão administrados com uma ou duas doses de um agente de ligação à tau (por exemplo, um anticorpo). Ver, por exemplo, Exemplo 9. Em outra modalidade, os animais são doseados cronicamente com o agente de ligação à tau (por exemplo, um anticorpo) ao longo de várias semanas ou meses. Ver, por exemplo, o Exemplo 10. Um versado na técnica pode facilmente projetar um regime de dosagem que se encaixa na finalidade experimental, por exemplo, regime de dosagem para estudos agudos, regime dosagem para estudos crônicos, regime de dosagem para estudos de toxicidade, regime de dosagem para estudos preventivos ou terapêuticos. A presença do agente de ligação à tau (por exemplo, anticorpo) em um compartimento de tecido particular dos animais experimentais, por exemplo, mas não limitado a, soro, sangue, líquido cerebroespinhal, tecido cerebral, pode ser estabelecida usando métodos bem conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, o Exemplo 9 e 10. Em uma modalidade, um agente de ligação à tau (por exemplo, anticorpo) da presente invenção é capaz de penetrar a barreira hematoencefálica. Um versado na técnica entende que, ajustando a dose do agente de ligação à tau (por exemplo, anticorpo) e a frequência de dosagem, uma concentração do agente de ligação à tau desejada (por exemplo, anticorpo) pode ser mantida nos animais experimentais. Qualquer efeito de um agente de ligação à tau (por exemplo, anticorpos) da presente invenção, nos modelos de tauopatia pode ser avaliado por comparação do nível de características bioquímicas, ou distribuição de tau nos animais tratados e de controle. Em um exemplo, os emaranhados neurofibrilares (NFT) são examinados usando a técnica de impregnação de prata de Gallyas ou por imunocoloração com anticorpos monoclonais de camundongo AT100 e AT180, que reconhecem a tau fosforilada patologicamente em NFT. O número ou a frequência dos neurônios Gallyas-positivos e/ou os neurônios marcados AT100, AT180 no cérebro e na medula espinal em camundongos tratados com anticorpo e animais de controle podem ser determinados para avaliar o efeito do tratamento com o anticorpo. Em uma modalidade, um anticorpo da presente invenção é capaz de reduzir o nível, quantidade, ou concentração de emaranhados neurofibrilares no cérebro ou na medula espinhal de um modelo animal. O anticorpo pode reduzir o nível, quantidade, ou concentração de emaranhados neurofibrilares por pelo menos cerca de 5%, 10%, 20%, 30%, 50%, 70%, 90% ou mais. Em outra modalidade, um anticorpo da presente invenção é capaz de reduzir o número ou a frequência dos neurônios Gallyas-positivos no cérebro ou na medula espinhal de um modelo animal, por exemplo, por pelo menos cerca de 5%, 10%, 20%, 30%, 50%, 70%, 90% ou mais. Em uma outra modalidade, um anticorpo da presente invenção é capaz de reduzir o número ou a frequência dos neurônios positivos de anticorpos AT100 ou AT180 no cérebro ou na medula espinhal de um modelo animal, por exemplo, por pelo menos cerca de 5%, 10%, 20%, 30%, 50%, 70%, 90% ou mais. O efeito de um anticorpo da presente invenção pode também ser avaliado pelo exame da distribuição e as propriedades bioquímicas da tau após a administração de anticorpos. Em uma modalidade, um anticorpo da presente invenção é capaz de reduzir a quantidade ou a concentração de proteína tau no cérebro ou medula espinhal de um modelo animal, por exemplo, por pelo menos cerca de 5%, 10%, 20%, 30%, 50%, 70%, 90% ou mais. Em outra modalidade, um anticorpo da presente invenção é capaz de reduzir a quantidade ou a concentração de proteína tau insolúvel no cérebro ou medula espinhal de um modelo animal, por exemplo, por pelo menos cerca de 5%, 10%, 20%, 30 %, 50%, 70%, 90% ou mais. A fração insolúvel de tau pode ser preparada como descrito, por exemplo, no Exemplo 10, ou em Goedert M, Spillantini MG, NJ Cairns, RA Crowther. Neuron 8, 159 (1992). A quantidade de proteína tau em uma amostra biológica pode ser determinada por qualquer método conhecido por uma pessoa versada na técnica, por exemplo, tal como descrito no Exemplo 10. Em uma outra modalidade, um anticorpo da presente invenção pode reduzir a quantidade ou a concentração de proteína tau hiperfosforilada no cérebro ou na medula espinhal de um modelo animal, por exemplo, por pelo menos cerca de 5%, 10%, 20%, 30% , 50%, 70%, 90% ou mais. A tau hiperfosforilada pode ser detectada usando anticorpos específicos para as formas patologicamente hiperfosforiladas da proteína tau, como AT100 ou AT180. Um anticorpo da presente invenção também pode alterar, por exemplo, reduzir ou aumentar, a concentração de tau no sangue, soro ou fluido cerebroespinhal ou de um modelo animal, por exemplo, por pelo menos cerca de 5%, 10%, 20%, 30% , 50%, 70%, 90% ou mais. Em uma modalidade, a % de redução ou de aumento é relativa em comparação com o nível, número, frequência, quantidade ou concentração que existia antes do tratamento, ou com o nível, número, frequência, quantidade ou concentração que exista em um sujeito não tratado/tratado com controle.

[0166] Em uma modalidade, um anticorpo da presente invenção pode evitar ou retardar o aparecimento de pelo menos um sintoma de uma tauopatia neurodegenerativa em um sujeito. Em uma modalidade, um anticorpo da presente invenção pode reduzir ou eliminar pelo menos um sintoma de uma tauopatia neurodegenerativa em um sujeito. O sintoma pode ser a formação de depósitos de tau patológica, depósitos de tau hiperfosforilada, depósitos de tau insolúvel, fibras neurofibrilares, agregados de pré-emaranhado de tau fosforilada, emaranhados neurofi- brilares intraneuronais ou emaranhados neurofibrilares extraneuronais no cérebro ou na medula espinhal de um sujeito. Ver, por exemplo, Augustinack et al, Acta Neuropathol 103:26-35 (2002). O sintoma também pode ser a presença ou a concentração elevada ou a quantidade, de tau no soro, sangue, urina ou fluido cerebroespinhal, em que a quantidade elevada de concentração é comparada com um sujeito saudável. O sintoma pode ser um sintoma neurológico, por exemplo, aversão ao sabor condicionado alterada, condicionamento do medo contextual alterado, perda de memória, perda da função motora. Em uma modalidade, perda de memória é avaliada usando um ensaio labirinto em Y de duas vias (labirinto em Y). Em uma modalidade específica, o ensaio labirinto em Y de duas vias é realizado substancialmente como descrito no Exemplo 10. Em uma modalidade, o pelo menos um sintoma é reduzido em pelo menos cerca de 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 50%, 70%, ou 90%. Em uma outra modalidade, a razão da taxa de labirinto em Y de duas vias é significativamente maior em um sujeito tratado de anticorpo do que em um sujeito de controle. Em uma modalidade específica, a razão de labirinto em Y de duas vias é aumentada em pelo menos cerca de 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, ou 90%. Em uma outra modalidade, a razão do ensaio labirinto em Y de dias tarefas é de pelo menos cerca de duas vezes, três vezes, quatro vezes, cinco vezes, dez vezes, ou vinte vezes mais elevada. A presente invenção também fornece um método para prevenir ou retardar o aparecimento de pelo menos um sintoma de um tauopatia neurodegenerativa em um sujeito com essa necessidade, incluindo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo de tau aqui descrito. A presente invenção proporciona ainda um método para reduzir ou eliminar pelo menos um sintoma de uma tauopatia neurodegenerativa em um sujeito com essa necessidade, incluindo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo de tau aqui descrito. Em uma modalidade, o sujeito é um organismo experimental, tal como, mas não limitados a, camundongos transgênicos. Em uma modalidade, o sujeito é um humano.

III. Polinucleotídeos que Codificam Anticorpos

[0167] Um polinucleotídeo que codifica um anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno, variante, ou derivado do mesmo pode ser composto de qualquer um dentre polirribonucleotídeo ou polidesoxirri- bonucleotídeo, que pode ser RNA ou DNA não modificado ou RNA ou DNA modificado. Por exemplo, um polinucleotídeo que codifica um anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno, variante, ou derivado do mesmo pode ser composto por um DNA de cadeia simples e cadeia dupla, o DNA que é uma mistura de regiões de cadeia simples e cadeia dupla, RNA de cadeia simples e cadeia dupla, e o RNA que é uma mistura de regiões de cadeia simples e cadeia dupla, moléculas híbridas compreendendo DNA e RNA que podem ser de cadeia simples ou, mais normalmente, de cadeia dupla ou uma mistura de regiões de cadeia simples e cadeia dupla. Além disso, um polinucleotídeo que codifica um anticorpo, ou um fragmento de ligação ao antígeno, variante, ou derivado do mesmo pode ser composto de regiões de cadeia tripla compreendendo RNA ou DNA ou ambos RNA e DNA. Um fragmento de polinucleotídeo que codifica um anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno, variante, ou um derivado do mesmo pode também conter uma ou mais bases modificadas ou estruturas principais de DNA ou RNA modificadas para a estabilidade ou por outras razões. Bases "modificadas" incluem, por exemplo, bases tritiladas e bases não usuais, tal como inosina. Uma variedade de modificações pode ser feita para DNA e RNA, assim, o "polinucleotídeo" abrange formas quimicamente, enzimaticamente ou metabolicamente modificadas.

[0168] Um polinucleotídeo isolado que codifica uma variante não natural de um polipeptídeo derivado de uma imunoglobulina (por exemplo, uma porção de cadeia pesada ou porção de cadeia leve de imunoglobulina), pode ser criado através da introdução de uma ou mais substituições de nucleotídeos, adições ou deleções na sequência de nucleotídeos da imunoglobulina de tal forma que uma ou mais substituições de aminoácidos, adições ou deleções sejam introduzidas na proteína codificada. As mutações podem ser introduzidas por meio de técnicas padrões, tais como a mutagênese sítio-dirigida e mutagênese mediada por PCR. Em uma modalidade, substituições de aminoácidos conservativas são feitas em um ou mais resíduos de aminoácidos não essenciais.

[0169] Como é bem conhecido, o RNA pode ser isolado a partir de células B originais, células de hibridoma ou a partir de outras células transformadas por técnicas padrões, tais como a extração de isotiocianato de guanidina e precipitação seguida de centrifugação ou cromatografia. Quando desejável, o mRNA pode ser isolado a partir do RNA total por técnicas padrões tal como a cromatografia em celulose oligo dT. As técnicas adequadas estão familiarizadas na técnica. Em uma modalidade, os cDNAs codificando as cadeias leves e pesadas do anticorpo podem ser efetuados, simultaneamente ou separadamente, usando transcriptase reversa e polimerase de DNA de acordo com os métodos bem conhecidos. A PCR pode ser iniciada por iniciadores de consenso de região constante, ou por mais iniciadores específicos com base em sequências de aminoácidos e DNA de cadeia leve e de cadeia pesada publicado. Como discutido acima, a PCR também pode ser usada para isolar clones de DNA codificando as cadeias leve e pesada do anticorpo. Neste caso, as bibliotecas podem ser rastreadas por iniciadores de consenso ou sondas homólogas maiores, tais como sondas humanas de região constante.

[0170] O DNA, normalmente o DNA de plasmídeo, pode ser isolado a partir de células usando técnicas conhecidas na técnica, a restrição mapeada e sequenciada de acordo com as técnicas padrões bem conhecidas estabelecidas em detalhes, por exemplo, nas referências anteriores relacionadas a técnicas de DNA recombinante. Naturalmente, o DNA pode ser sintético de acordo com a presente invenção, em qualquer ponto durante o processo de isolamento ou análise posterior.

[0171] Em uma modalidade, a presente invenção proporciona um polinucleotídeo isolado compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo em um ácido nucleico que codifica uma região variável de cadeia pesada da imunoglobulina (VH), em que pelo menos uma das CDRs da região variável de cadeia pesada, ou pelo menos duas das VH-CDRs da região variável de cadeia pesada são pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, cerca de 97%, 98%, ou 99% idênticas às sequências de aminoácidos de VH-CDR1, VH-CDR2, ou VH-CDR3 de cadeia pesada de referência dos anticorpos divulgados neste documento. Alternativamente, as regiões VH-CDR1, VH-CDR2, ou VH- CDR3 de VH são, pelo menos, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, cerca de 97%, 98%, ou 99% idênticas às sequências de aminoácidos de VH- CDR1, VH-CDR2, ou VH-CDR3 de cadeia pesada de referência dos anticorpos divulgados neste documento. Desse modo, de acordo com esta modalidade, uma região variável de cadeia pesada da presente invenção tem sequências de polipeptídeos de VH-CDR1, VH-CDR2, ou VH-CDR3 relacionadas às sequências de polipeptídeos mostradas na figura 1. Em uma modalidade, a sequência de aminoácido da CDR1 de VH de referência é a SEQ ID NO: 23, 29, ou 35, a sequência de aminoácido da CDR2 de VH de referência é a SEQ ID NO: 24, 30 ou 36, e a sequência de aminoácido da CDR3 de VH de referência é a SEQ ID NO: 25, 31 ou 37.

[0172] Em uma modalidade, a presente invenção proporciona um polinucleotídeo isolado compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo em um ácido nucleico que codifica uma região variável de cadeia pesada da imunoglobulina (VH), em que as regiões VH-CDR1, VH-CDR2 e VH-CDR3 possuem sequências de polipeptídeo que são idênticas aos grupos de VH-CDR1, VH-CDR2 e VH-CDR3 mostrados na figura 1, com exceção de uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou dez substituições de aminoácidos em qualquer uma VH-CDR. Em determinadas modalidades as substituições de aminoácidos são conservativas. Em uma modalidade, a sequência de aminoácido da CDR1 de VH é a SEQ ID NO: 23, 29, ou 35, a sequência de aminoácido da CDR2 de VH é a SEQ ID NO: 24, 30 ou 36, e a sequência de aminoácido da CDR3 de VH é a SEQ ID NO: 25, 31 ou 37.

[0173] Em outra modalidade, a presente invenção proporciona um polinucleotídeo isolado compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo em um ácido nucleico que codifica uma região variável de cadeia leve da imunoglobina (VL), onde pelo menos uma das VL-CDRs da região variável de cadeia leve ou, pelo menos, duas das VL-CDRs da região variável de cadeia leve sejam pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, cerca de 97%, 98%, ou 99% idênticas às sequências de aminoácido de VL-CDR1, VL-CDR2, ou VL-CDR3 de cadeia leve de referência dos anticorpos divulgados neste documento. Alternativamente, as regiões VL-CDR1, VL-CDR2, ou VL-CDR3 são, pelo menos, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, cerca de 97%, 98%, ou 99% idênticas às sequências de aminoácido de VL-CDR1, VL-CDR2, ou VL-CDR3 de cadeia leve de referência dos anticorpos divulgados neste documento. Desse modo, de acordo com esta modalidade, uma região variável de cadeia leve da invenção tem as sequências de polipeptídeo de VL-CDR1, VL-CDR2, ou VL-CDR3 relacionadas às sequências de polipeptídeos mostradas na figura 1. Em uma modalidade, a sequência de aminoácido da CDR1 de VL de referência é a SEQ ID NO: 26, 32 ou 38, a sequência de aminoácido da CDR2 de VL de referência é a SEQ ID NO: 27, 33 ou 39, e a sequência de aminoácido da CDR3 de VL de referência é a SEQ ID NO: 28, 34 ou 40.

[0174] Em outra modalidade, a presente invenção proporciona um polinucleotídeo isolado compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo em um ácido nucleico que codifica uma região variável de cadeia leve da imunoglobina (VL) na qual as regiões VL- CDR1, VL-CDR2, ou VL-CDR3 têm sequências de polipeptídeo que são idênticas aos grupos de VL-CDR1, VL-CDR2, ou VL-CDR3 mostrados na figura 1, com exceção de uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou dez substituições de aminoácidos em qualquer uma VL-CDR. Em determinadas modalidades as substituições de aminoácidos são conservativas. Em uma modalidade, a sequência de aminoácido da CDR1 de VL é a SEQ ID NO: 26, 32 ou 38, a sequência de aminoácido da CDR2 de VL é a SEQ ID NO: 27, 33 ou 39, e a sequência de aminoácido da CDR3 de VL é a SEQ ID NO: 28, 34 ou 40.

[0175] Em outra modalidade, a presente invenção proporciona um polinucleotídeo isolado compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo em um ácido nucleico que codifica uma região variável de cadeia pesada da imunoglobina (VH), em que as regiões VH- CDR1, VH-CDR2, e VH-CDR3 têm sequências de polipeptídeo que são idênticas aos grupos de VH-CDR1, VH-CDR2 e VH-CDR3 mostrados na figura 1. Em uma modalidade, a sequência de aminoácido da CDR1 de VH é a SEQ ID NO: 23, 29, ou 35, a sequência de aminoácido da CDR2 de VH é a SEQ ID NO: 24, 30 ou 36, e a sequência de aminoácido da CDR3 de VH é a SEQ ID NO: 25, 31 ou 37.

[0176] Em outra modalidade, a presente invenção proporciona um polinucleotídeo isolado compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo em um ácido nucleico que codifica uma região variável de cadeia leve da imunoglobina (VL) na qual as regiões VL- CDR1, VL-CDR2, ou VL-CDR3 têm sequências de polipeptídeos que são idênticas aos grupos de VL-CDR1, VL-CDR2, ou VL-CDR3 mostrados na figura 1. Em uma modalidade, a sequência de aminoácido da CDR1 de VL é a SEQ ID NO: 26, 32 ou 38, a sequência de aminoácido da CDR2 de VL é a SEQ ID NO: 27, 33 ou 39, e a sequência de aminoácido da CDR3 de VL é a SEQ ID NO: 28, 34 ou 40.

[0177] Como é conhecido na técnica, a "identidade de sequência" entre dois polipeptídeos ou dois polinucleotídeos é determinada pela comparação da sequência de aminoácido ou de ácido nucleico de um polipeptídeo ou polinucleotídeo com a sequência de um segundo polipeptídeo ou polinucleotídeo. Quando discutido neste documento, se qualquer polipeptídeo específico for pelo menos cerca de 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% idêntico a outro polipeptídeo poderá ser determinado usando métodos e programas de computador/software conhecidos na técnica, tais como, mas não limitados a, programa BESTFIT (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711). O BESTFIT utiliza o algoritmo de homologia local de Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics 2 (1981), 482-489, para encontrar o melhor segmento de homologia entre duas sequências. Ao usar BESTFIT ou qualquer outro programa de alinhamento de sequência para determinar se uma sequência específica é, por exemplo, 95% idêntica a uma sequência de referência de acordo com a presente invenção, os parâmetros são ajustados, naturalmente, de tal modo que a percentagem de identidade seja calculada sobre o comprimento total da sequência de polipeptídeo de referência e que as falhas na homologia de até 5% do número total de aminoácidos na sequência de referência sejam permitidas.

[0178] Em uma modalidade da presente invenção, o polinucle- otídeo compreende, consiste essencialmente em, ou consiste em um ácido nucleico com uma sequência de polipeptídeo da região VH ou VL de um anticorpo anti-tau, como representado na Tabela 2. A este respeito, a pessoa versada na técnica imediatamente apreciará que os polinucleotídeos que codificam pelo menos o domínio variável de cadeia leve e/ou pesada pode codificar o domínio variável de ambas as cadeias de imunoglobulina ou apenas uma. A presente invenção proporciona adicionalmente um polinucleotídeo compreendendo, ou consistindo em uma sequência de nucleotídeos codificando a sequência de aminoácido de SEQ ID: 93. Tabela 2: Sequências de nucleotídeo da região VH e VL de anticorpos tau específicos.

[0179] Em uma modalidade, a presente invenção proporciona um polinucleotídeo isolado compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo em um ácido nucleico que codifica uma região variável de cadeia pesada da imunoglobina, pelo menos, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, cerca de 97%, 98%, ou 99% ou 95% idêntica à de cadeia pesada VH de referência. Em uma modalidade, a sequência de aminoácido da região variável da cadeia pesada de referência é a SEQ ID NO: 9, 13, 17 ou 93.

[0180] Em uma modalidade, a presente invenção proporciona um polinucleotídeo isolado compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo em um ácido nucleico que codifica uma região variável de cadeia leve da imunoglobina pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, cerca de 97%, 98%, ou 99% ou 95% idêntica à de cadeia leve VL de referência. Em uma modalidade, a sequência de aminoácido da região variável de cadeia leve de referência é a SEQ ID NO: 11, 15 ou 19.

[0181] A presente invenção também inclui fragmentos de polinucleotídeos da presente invenção, como descrito em outra parte. Adicionalmente polinucleotídeos que codificam os polinucleotídeos de fusão, fragmentos Fab, e outros derivados, como aqui descritos, também são contemplados pela presente invenção.

[0182] Os polinucleotídeos podem ser produzidos ou fabricados por qualquer método conhecido na técnica. Por exemplo, se a sequência de nucleotídeos do anticorpo for conhecida, um polinucleotídeo que codifica o anticorpo poderá ser montado a partir de oligonucleotídeos quimicamente sintetizados, por exemplo, como descrito em Kutmeier et al., BioTechniques 17 (1994), 242, que, resumidamente, envolve a síntese de porções contendo oligonucleotídeos sobrepostas da sequência codificando o anticorpo, hibridação e ligação daqueles oligonucleotídeos, e, em seguida, a amplificação dos oligonucleotídeos ligados por PCR.

[0183] Alternativamente, um polinucleotídeo que codifica um anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno, variante, ou um derivado do mesmo pode ser gerado a partir do ácido nucleico a partir de uma fonte adequada. Se um clone contendo um ácido nucleico que codifica um anticorpo específico, não estiver disponível, mas a sequência da molécula de anticorpo for conhecida, um ácido nucleico que codifica o anticorpo poderá ser quimicamente sintetizado ou obtido a partir de uma fonte adequada (por exemplo, uma biblioteca de cDNA de anticorpo, ou uma biblioteca de cDNA gerada a partir de, ou ácidos nucleicos, de preferência poliA + RNA, isolados a partir de, qualquer tecido ou células que expressam o anticorpo tau específico, tais como as células do hibridoma selecionadas para expressar um anticorpo) por amplificação por PCR usando iniciadores sintéticos hibridizáveis para as extremidades 3' e 5' da sequência ou por clonagem usando uma sonda de oligonucleotídeo específica para a sequência de gene específica para identificar, por exemplo, um clone de cDNA a partir de uma biblioteca de cDNA que codifica o anticorpo. Os ácidos nucleicos amplificados gerados por PCR podem ser então clonados em vetores de clonagem replicáveis usando qualquer método bem conhecido na técnica.

[0184] Uma vez que a sequência de nucleotídeos e a sequência de aminoácido correspondente do anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno, variante ou derivado da mesma é determinada, a sua sequência de nucleotídeos pode ser manipulada usando processos bem conhecidos na técnica para a manipulação de sequências de nucleotídeo, por exemplo, técnicas de DNA recombinante, mutagênese dirigida por local, PCR, etc. (vide, por exemplo, as técnicas descritas em Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990) and Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1998), os quais são ambos incorporados neste documento por referência em sua totalidade), para gerar anticorpos com uma sequência de aminoácido diferente, por exemplo, para criar as substituições, deleções e/ou inserções de aminoácidos.

IV. Expressão de Polipeptídeos de Anticorpo

[0185] Após a manipulação de material genético isolado para fornecer anticorpos, ou fragmentos de ligação ao antígeno, variantes, ou derivados dos mesmos da presente invenção, os polinucleotídeos que codificam os anticorpos são normalmente inseridos em um vetor de expressão para a introdução nas células hospedeiras que podem ser usadas para produzir a quantidade desejada de anticorpo. A expressão recombinante de um anticorpo, ou fragmento, derivado ou análogo do mesmo, por exemplo, uma cadeia leve ou pesada de um anticorpo que se liga a uma molécula alvo é aqui descrita. Uma vez que um polinucleotídeo que codifica uma molécula de anticorpo ou uma cadeia pesada ou leve de um anticorpo, ou porção do mesmo (de preferência contendo o domínio variável de cadeia leve ou pesada), da invenção tenha sido obtido, o vetor para a produção da molécula de anticorpo pode ser produzido por tecnologia de DNA recombinante usando técnicas bem conhecidas na técnica. Desse modo, os métodos para a preparação de uma proteína expressando um polinucleotídeo contendo uma sequência de nucleotídeos codificando o anticorpo são descritos no presente documento. Os métodos que são bem conhecidos pelos versados na técnica podem ser usados para construir vetores de expressão contendo sequências de codificação de anticorpo e sinais de controle apropriados transcricionais e translacionais. Estes métodos incluem, por exemplo, técnicas de DNA recombinante in vitro, técnicas sintéticas, e recombinação genética in vivo. A invenção, portanto, provê vetores replicáveis compreendendo uma sequência de nucleotídeos codificando uma molécula de anticorpo da invenção, ou uma cadeia leve ou pesada do mesmo, ou um domínio variável de cadeia leve ou pesada, ligada operativamente a um promotor. Tais vetores podem incluir a sequência de nucleotídeos codificando a região constante da molécula de anticorpo (vide, por exemplo, os pedidos internacionais WO 86/05807 e WO 89/01036; e Patente US 5.122.464), e o domínio variável do anticorpo pode ser clonado em tal vetor para a expressão da cadeia leve ou pesada inteira.

[0186] O termo "vetor" ou "vetor de expressão" é aqui usado para significar vetores usados de acordo com a presente invenção, como um veículo para introduzir em e expressar um gene desejado em uma célula hospedeira. Como é conhecido pelos versados na técnica, tais vetores podem ser facilmente selecionados a partir do grupo consistindo em plasmídeos, fagos, vírus e retrovírus. Em geral, os vetores compatíveis com a presente invenção compreenderão um marcador de seleção, os locais de restrição úteis para facilitar a clonagem do gene desejado e a capacidade de entrar e/ou replicar em células eucarióticas ou procari- óticas. Para os fins da presente invenção, diversos sistemas de vetor de expressão podem ser empregados. Por exemplo, uma classe de vetor utiliza elementos de DNA que são derivados de vírus de animal tais como vírus do papiloma bovino, vírus polioma, adenovírus, vírus vaccinia, baculovírus, retrovírus (RSV, MMTV ou MOMLV) ou vírus SV40. Outros envolvem o uso de sistemas policistrônicos com locais de ligação ao ribossoma internos. Além disso, as células que tenham integrado o DNA em seus cromossomos podem ser selecionadas através da introdução de um ou mais marcadores que permitem a seleção de células hospedeiras transfectadas. O marcador pode prover prototrofia a um hospedeiro auxotrófico, resistência a biocidas (por exemplo, antibióticos) ou resistência a metais pesados, tal como cobre. O gene marcador selecionável pode ser diretamente ligado às sequências de DNA a serem expressas, ou introduzido na mesma célula por cotransformação. Elementos adicionais também podem ser necessários para a síntese óptima de mRNA. Estes elementos podem incluir as sequências de sinal, sinais de splice, assim como promotores transcricionais, potenciadores e sinais de terminação.

[0187] Em modalidades específicas os genes de região variável clonados são inseridos em um vetor de expressão, juntamente com os genes de região constante de cadeia leve e cadeia pesada (por exemplo, genes de região constante de cadeia leve e cadeia pesada humana) como discutida acima. Em uma modalidade, isto é efetuado usando um vetor de expressão de propriedade de Biogen IDEC, Inc., referido como NEOSPLA, divulgado na Patente US 6.159.730. Este vetor contém o promotor/poten- ciador de citomegalovírus, o principal promotor de beta globina de camundongo, a origem de SV40 de replicação, a sequência de poliadenila- ção de crescimento hormonal bovino, a fosfotransferase de neomicina do éxon 1 e éxon 2, o gene de redutase de di-hidrofolato e a sequência líder. Este vetor foi encontrado resultar na expressão de nível muito elevado de anticorpos mediante a incorporação de genes das regiões variável e constante, transfecção em células CHO, seguida de seleção em um meio contendo G418 e amplificação de metotrexato. É claro que qualquer vetor de expressão que seja capaz de desencadear a expressão em células eucarióticas pode ser usado na presente invenção. Exemplos de vetores adequados incluem, mas não estão limitados a plasmídeos pcDNA3, pHCMV/Zeo, pCR3.1, pEF1/His, pIND/GS, pRc/HCMV2, pSV40/Zeo2, pTRACER-HCMV, pUB6/V5-His, pVAX1, e pZeoSV2 (disponível a partir de Invitrogen, San Diego, CA), e plasmídeo pCI (disponível a partir de Promega, Madison, WI). Em geral, o triagem de grandes números de células transformadas para as que expressam níveis adequadamente elevados se cadeias leve e pesada da imunoglobulina é a experimentação de rotina que pode ser realizada, por exemplo, por sistemas robóticos. Sistemas de vetores também são ensinados nas Patentes US 5.736.137 e 5.658.570, cada qual é incorporada por referência em sua totalidade neste documento. Este sistema provê elevados níveis de expressão, por exemplo, >30 pg/célula/dia. Outros sistemas de vetores exemplares são divulgados, por exemplo, na Patente US 6.413.777.

[0188] Em outras modalidades os anticorpos, ou fragmentos de ligação ao antígeno, variantes, ou derivados dos mesmos da presente invenção podem ser expressos usando construtos policistrônicos, tais como os divulgados na Publicação do Pedido de Patente US 20030157641 A1 e aqui incorporados em sua totalidade. Nestes sistemas de expressão, os múltiplos produtos de genes de interesse, tais como as cadeias leve e pesada de anticorpos, podem ser produzidos a partir de um construto policistrônico único. Estes sistemas vantajosamente usam um local de entrada de ribossomo interno (IRES) para fornecer níveis relativamente elevados de anticorpos. Sequências de IRES compatíveis são divulgadas na Patente US 6.193.980, que é também incorporada neste documento. Os versados na técnica apreciarão que tais sistemas de expressão podem ser usados para produzir de forma eficaz toda a gama de anticorpos divulgada no presente pedido.

[0189] De modo mais geral, uma vez que o vetor ou sequência de DNA codificando uma subunidade monomérica do anticorpo foi preparado, o vetor de expressão pode ser introduzido em uma célula hospedeira apropriada. A introdução do plasmídeo na célula hospedeira pode ser realizada por diversas técnicas bem conhecidas pelos versados na técnica. Estas incluem, mas não estão limitadas a, transfecção incluindo lipotransfecção usando, por exemplo, Fugene® ou lipofectamina, fusão de protoplasto, precipitação de fosfato de cálcio, fusão celular com DNA envolvido, microinjeção e infecção com vírus intacto. Normalmente, a introdução de plasmídeo no hospedeiro é através de um método padrão de coprecipitação de fosfato de cálcio. As células hospedeiras que abrigam a construção de expressão são cultivadas sob condições adequadas para a produção das cadeias leves e cadeias pesadas, e ensaiadas para a síntese de proteína de cadeia leve e/ou pesada. Técnicas de ensaio exemplares incluem ensaio imunossorvente ligado à enzima (ELISA), radioimunoensaio (RIA), ou análise do separador de célula ativado por fluorescência (FACS), imuno- histoquímica e semelhantes.

[0190] O vetor de expressão é transferido para uma célula hospedeira através de técnicas convencionais e as células transfec- tadas são então cultivadas através de técnicas convencionais para produzir um anticorpo a ser usado nos métodos descritos neste documento. Desse modo, a presente invenção inclui células hospedeiras contendo um polinucleotídeo que codifica um anticorpo da invenção, ou uma cadeia leve ou pesada do mesmo, ligada operativamente a um promotor heterólogo. Em modalidades específicas para a expressão de anticorpos de cadeia dupla, os vetores codificando ambas as cadeias leve e pesada podem ser coexpressos na célula hospedeira para a expressão da molécula de imunoglobulina inteira, tal como detalhado abaixo.

[0191] A célula hospedeira pode ser cotransfectada com dois vetores de expressão da presente invenção, o primeiro vetor codificando uma cadeia pesada derivada do polipeptídeo e o segundo vetor codificando uma cadeia leve derivada do polipeptídeo. Os dois vetores podem conter marcadores selecionáveis idênticos, que permitem a expressão igual de polipeptídeos de cadeias leve e pesada. Alternativamente, um único vetor pode ser usado que codifica ambos os polipeptídeos de cadeias leve e pesada. Em tais situações, a cadeia leve é vantajosamente colocada antes da cadeia pesada para evitar um excesso de cadeia pesada livre de tóxico; vide Proudfoot, Nature 322 (1986), 52; Kohler, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980), 2197. As sequências de codificação para as cadeias leve e pesada podem compreender cDNA ou DNA genômico.

[0192] Tal como aqui usado, "células hospedeiras" se referem a células que abrigam vetores construídos usando técnicas de DNA recombinante e codificando pelo menos um gene heterólogo. Em descrições de processos para o isolamento de anticorpos a partir de hospedeiros recombinantes, os termos "célula" e "cultura de célula" são usados indiferentemente para indicar a fonte de anticorpo a menos que seja claramente indicado de outra forma. Em outras palavras, a recuperação do polipeptídeo a partir das "células" pode significar a partir de células inteiras giradas para baixo, ou a partir da cultura de células contendo o meio e as células suspensas.

[0193] Uma variedade de sistemas de vetor de expressão de hospedeiro pode ser usada para expressar as moléculas de anticorpo para a utilização nos métodos aqui descritos. Tais sistemas de expressão de hospedeiro-expressão representam veículos através dos quais as sequências de codificação de interesse podem ser produzidas e subsequentemente purificadas, mas também representam células que podem, quando transformadas ou transfectadas com as sequências de codificação de nucleotídeo apropriadas, expressar uma molécula de anticorpo da presente invenção in situ. Estes incluem, mas não estão limitados a micro-organismos tais como bactérias (por exemplo, E. coli, B. subtilis) transformadas com DNA bacteriófago recombinante, DNA de plasmídeo ou vetores de expressão de DNA de cosmídeo contendo sequências de codificação de anticorpo, levedura (por exemplo, Saccharomyces, Pichia) transformada com vetores de expressão de levedura recombinante contendo sequências de codificação de anticorpo, sistemas de célula de inseto infectados com vetores de expressão de vírus recombinante (por exemplo, baculovírus) contendo as sequências de codificação de anticorpo, sistemas de célula vegetal infectados com vetores de expressão de vírus recombinante (por exemplo, vírus do mosaico da couve-flor, CaMV; vírus do mosaico do tabaco, TMV) ou transformados com vetores de expressão de plasmídeo recombinante (por exemplo, plasmídeo Ti) contendo sequências de codificação de anticorpo, ou sistemas de células de mamíferos (por exemplo, células COS, CHO, NSO, BLK, 293, 3T3) abrigando construtos de expressão recombinante contendo promotores derivados do genoma de células de mamíferos (por exemplo, promotor de metalotioneína) ou vírus de mamíferos (por exemplo, o promotor posterior de adenovírus, o promotor do vírus vaccinia 7.5K). Em uma modalidade, as células bacterianas, tal como a Escherichia coli, e preferencialmente, as células eucarióticas, especialmente para a expressão da molécula de anticorpo recombinante inteira, são usadas para a expressão de uma molécula de anticorpo recombinante. Por exemplo, células de mamífero, tais como células de ovário de hamster chinês (CHO), em conjunto com um vetor tal como o elemento promotor de gene precocemente intermediado principal do citomegalovírus humano é um sistema de expressão eficiente de anticorpos, vide, por exemplo, Foecking et al., Gene. 45 (1986), 101; Cockett et al., Bio/Technology 8 (1990), 2.

[0194] A linhagem de célula hospedeira usada para a expressão de proteínas é geralmente de origem mamífera, os versados na técnica são creditados com a capacidade de determinar as linhagens de células hospedeiras específicas, que são mais adequadas para o produto de gene desejado a ser expresso a partir disto. Linhagens de células hospedeiras exemplares incluem, mas não estão limitadas a, CHO (Ovário de Hamster Chinês), DG44 e DUXB11 (linhagens de ovário de Hamster Chinês, DHFR menos), HELA (carcinoma cervical humano), CVI (linhagem de rim de macaco), COS (um derivado de CVI com antígeno SV40 T), VERY, BHK (rim de hamster bebê), MDCK, WI38, R1610 (fibroblasto de hamster chinês) BALBC/3T3 (fibroblasto de camundongo), HAK (linhagem de rim de hamster), SP2/O (mieloma de camundongo), P3X63-Ag3.653 (mieloma de camundongo), BFA- 1c1BPT (células endoteliais de bovino), RAJI (linfócito humano) e 293 (rim humano). Em uma modalidade específica, as linhagens de células hospedeiras são células de CHO ou 293. As linhagens de células hospedeiras estão normalmente disponíveis a partir de serviços comerciais, da Coleção de Cultura de Tecido Americana ou da literatura publicada.

[0195] Além disso, uma cepa de células hospedeiras pode ser escolhida, que modula a expressão das sequências inseridas ou modifica e processa o produto de gene da forma específica desejada. Tais modificações (por exemplo, glicosilação) e processamento (por exemplo, clivagem) de produtos de proteína podem ser importantes para a função da proteína. Células hospedeiras diferentes têm mecanismos característicos e específicos para o processamento pós- traducional e modificação de proteínas e produtos de gene. Linhagens de células apropriadas ou sistemas hospedeiros podem ser escolhidos para assegurar a modificação correta e processamento da proteína estranha expressa. Para esta finalidade, as células hospedeiras eucarióticas que possuem a maquinaria celular para o processamento adequado do transcrito primário, glicosilação e fosforilação do produto de gene podem ser usadas.

[0196] Para produção de alto rendimento a longo prazo de proteínas recombinantes, a expressão estável é preferida. Por exemplo, linhagens de célula que expressam de forma estável a molécula de anticorpo podem ser engenheiradas. Em vez de usar vetores de expressão que contêm origens virais de replicação, as células hospedeiras podem ser transformadas com DNA controlado por elementos de controle de expressão apropriados (por exemplo, promotor, estimulador, sequências, terminadores de transcrição, locais de poliadenilação, etc.), e um marcador selecionável. Seguindo a introdução do DNA estranho, as células manipuladas podem ser deixadas crescer durante 1 a 2 dias em um meio enriquecido e depois são mudadas para um meio seletivo. O marcador selecionável no plasmídeo recombinante confere resistência à seleção e permite que as células integrem estavelmente o plasmídeo nos seus cromossomos e cresçam para formar focos que por sua vez podem ser clonados e expandidos em linhagens celulares. Este método pode ser vantajosamente usado para engenheirar linhagens de células que expressam de forma estável a molécula de anticorpo.

[0197] Um número de sistemas de seleção pode ser usado, incluindo, mas não se limitando a cinase de timidina do vírus de herpes simplex (Wigler et al., Cell 11 (1977), 223), fosforibosiltransferase de hipoxantina-guanina (Szybalska & Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 48 (1992), 202), e fosforibosiltransferase de adenina (Lowy et al., Cell 22 (1980), 817) os genes podem ser empregados em células tk, hgprt ou aprt, respectivamente. Além disso, a resistência antimetabólica pode ser usada como a base de seleção para os seguintes genes: dhfr, que confere resistência ao metotrexato (Wigler et al., Natl Acad. Sci. USA 77 (1980), 357; O'Hare et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 (1981), 1527); gpt, que confere resistência ao ácido micofenólico (Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 (1981), 2072); neo, que confere resistência ao aminoglicosídeo G-418 Goldspiel et al., Clinical Pharmacy 12 (1993), 488-505;. Wu and Wu, Biotherapy 3 (1991), 87-95; Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32 (1993), 573-596; Mulligan, Science 260 (1993), 926-932, e Morgan and Anderson, Ann. Rev. Biochem. 62 (1993), 191-217; TIB TECH 11 (1993), 155-215, e higro, que confere resistência à higromicina (Santerre et al., Gene 30 (1984), 147. Métodos vulgarmente conhecidos na técnica de tecnologia de DNA recombinante que podem ser usados são descritos em Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993),. Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990), e nos Capítulos 12 e 13, Dracopoli et al. (eds), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994); Colberre-Garapin et al., J. Mol. Biol. 150:1 (1981), que são incorporados neste documento por referência em sua totalidade.

[0198] Os níveis de expressão de uma molécula de anticorpo podem ser aumentados pela amplificação do vetor, para uma revisão, vide Bebbington and Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Academic Press, New York, Vol. 3. (1987). Quando um marcador no sistema de vetor expressando o anticorpo é amplificável, o aumento do nível de inibidor presente na cultura de célula hospedeira aumentará o número de cópias do gene marcador. Uma vez que a região amplificada está associada com o gene do anticorpo, a produção do anticorpo também aumentará; vide Crouse et al., Mol.. Cell. Biol. 3 (1983), 257.

[0199] Na produção in vitro permite ampliar a escala para fornecer grandes quantidades dos polipeptídeos desejados. Técnicas para o cultivo de células de mamíferos sob condições de cultura de tecido são conhecidas na técnica e incluem cultura em suspensão homogênea, por exemplo, em um reator tipo airlift ou em um reator de agitação contínua, ou cultura de célula imobilizada ou aprisionada, por exemplo, em fibras ocas, microcápsulas, em microesferas de agarose ou cartuchos de cerâmica. Se necessário e/ou desejado, as soluções de polipeptídeos podem ser purificadas pelos métodos de cromatografia habituais, por exemplo, filtração em gel, cromatografia de troca iônica, cromatografia sobre DEAE-celulose ou cromatografia por (imuno-)afinidade, por exemplo, depois de uma biossíntese preferencial de um polipeptídeo sintético de região de dobradiça ou antes ou depois da etapa de cromatografia HIC descrita neste documento.

[0200] Os anticorpos codificando os genes, ou fragmentos de ligação ao antígeno, variantes, ou derivados dos mesmos da presente invenção podem também ser expressos em células de não mamíferos tais como células de bactérias ou insetos ou leveduras ou vegetais. Bactérias que facilmente ocupam os ácidos nucleicos incluem elementos da Enterobacteriaceae, tais como cepas de Escherichia coli ou Salmonella; Bacillaceae, tais como Bacillus subtilis; Pneumococcus; Streptococcus e Haemophilus influenzae. Será adicionalmente apreciado que, quando expressos em bactérias, os polipeptídeos heterólogos normalmente tornam-se parte de corpos de inclusão. Os polipeptídeos heterólogos devem ser isolados, purificados e em seguida montados em moléculas funcionais. Em que as formas tetravalentes de anticorpos são desejadas, as subunidades, em seguida, se autoorganizarão em anticorpos tetravalentes, vide, por exemplo, Pedido Internacional WO02/096948.

[0201] Nos sistemas bacterianos, uma série de vetores de expressão pode ser vantajosamente selecionada dependendo da utilização pretendida para a molécula de anticorpo a ser expressa. Por exemplo, quando uma grande quantidade de tal proteína deve ser produzida, para a geração de composições farmacêuticas de uma molécula de anticorpo, vetores que direcionam a expressão de níveis elevados de produtos proteicos de fusão que sejam facilmente purificados podem ser desejáveis. Esses vetores incluem, mas não estão limitados, ao vetor de expressão E. coli pUR278 (Ruther et al., EMBO J. 2 (1983), 1791), em que a sequência de codificação de anticorpo pode ser ligada individualmente no vetor na estrutura com a região de codificação de lacZ de modo que uma proteína de fusão seja produzida, vetores pIN (Inouye & Inouye, Nucleic Acids Res. 13 (1985), 3101-3109; Van Heeke & Schuster, J. Biol Chem 24 (1989), 5503-5509), e outros similares. Vetores de pGEX podem também ser usados para expressar polipeptídeos estranhos como proteínas de fusão com S- transferase de glutationa (GST). Em geral, tais proteínas de fusão são solúveis e podem ser facilmente purificadas a partir de células lisadas pela adsorção e ligação a uma matriz de glutationa-agarose seguida por eluição na presença de glutationa livre. Os vetores de pGEX são designados a incluir trombina ou locais de clivagem de protease de fator Xa de modo que o produto de gene clonado alvo possa ser liberado a partir da porção GST.

[0202] Além disso, os micróbios procarióticos, eucarióticos podem também ser usados. Saccharomyces cerevisiae, ou levedura de panificação comum, é mais comumente usada entre os microorganismos eucarióticos, embora um determinado número de outras cepas esteja geralmente disponível, por exemplo, Pichia pastoris. Para a expressão em Saccharomyces, o plasmídeo de YRp7, por exemplo, (Stinchcomb et al., Nature 282 (1979), 39,. Kingsman et al., Gene 7 (1979), 141; Tschemper et al., Gene 10 (1980), 157) é comumente usado. Este plasmídeo já contém o gene de TRP1 que proporciona um marcador de seleção para uma cepa mutante de levedura sem a capacidade de crescer em triptofano, por exemplo, ATCC N° 44076 ou PEP4-1 (Jones, Genetics 85 (1977), 12). A presença da lesão trpl como uma característica do genoma da célula hospedeira de levedura provê então um ambiente eficaz para detectar a transformação através do crescimento na ausência de triptofano.

[0203] Em um sistema de inseto, o vírus de poliedrose nuclear Autographa californica (AcNPV) é normalmente usado como um vetor para expressar genes estranhos. O vírus cresce em células de Spodoptera frugiperda. A sequência de codificação de anticorpo pode ser clonada individualmente em regiões não essenciais (por exemplo, o gene da poliedrina) do vírus e colocada sob controle de um promotor de AcNPV (por exemplo o promotor da poliedrina).

[0204] Uma vez que uma molécula de anticorpo da presente invenção tem sido expressa de forma recombinante, os anticorpos inteiros, seus dímeros, cadeias leve e pesada individuais, ou outras formas de imunoglobulina da presente invenção, podem ser purificados de acordo com procedimentos padrão da técnica, incluindo, por exemplo, por cromatografia (por exemplo, troca de íons, afinidade, particularmente por afinidade para o antígeno específico, após a Proteína A, e cromatografia em coluna de tamanho), centrifugação, solubilidade diferencial, por exemplo, precipitação com sulfato de amônio, ou por qualquer outra técnica padrão para a purificação de proteínas, vide, por exemplo, Scopes, "Protein Purification", Springer Verlag, N.Y. (1982). Alternativamente, outro método para aumentar a afinidade dos anticorpos da presente invenção é divulgado na Publicação de Patente US 2002-0123057 A1.

V. Proteínas de Fusão e Conjugados

[0205] Em determinadas modalidades, o polipeptídeo de anticorpo compreende uma sequência de aminoácido ou uma ou mais porções que não estão normalmente associadas a um anticorpo. Modificações exemplares são descritas em mais detalhes a seguir. Por exemplo, um fragmento de anticorpo fv de cadeia única da invenção pode compreender uma sequência de ligante flexível, ou pode ser modificado para adicionar um grupo funcional (por exemplo, PEG, um fármaco, uma toxina, ou um marcador, tais como um fluorescente, radioativo, enzima, magnético nuclear, metal pesado e semelhantes).

[0206] Um polipeptídeo de anticorpo da presente invenção pode compreender, consistir essencialmente em, ou consistir em uma proteína de fusão. As proteínas de fusão são as moléculas quiméricas que compreendem, por exemplo, um domínio de ligação de tau da imunoglobulina com pelo menos um local de ligação alvo, e pelo menos uma porção heteróloga, ou seja, uma porção com a qual não está naturalmente ligado na natureza. As sequências de aminoácidos podem normalmente existir em proteínas separadas que são reunidas no polipeptídeo de fusão ou podem existir normalmente na mesma proteína, mas colocadas em um novo arranjo no polipeptídeo de fusão. As proteínas de fusão podem ser criadas, por exemplo, por síntese química, ou pela criação e tradução de um polinucleotídeo em que as regiões de peptídeo são codificadas na relação desejada.

[0207] O termo "heterólogo", quando aplicado a um polinucleotídeo ou um polipeptídeo, significa que o polinucleotídeo ou polipeptídeo é derivado de uma entidade distinta do resto da entidade para a qual está sendo comparada. Por exemplo, tal como usado neste documento, um "polipeptídeo heterólogo" a ser fundido com um anticorpo, ou um fragmento de ligação ao antígeno, variante ou análogo do mesmo é derivado de um polipeptídeo de não imunoglobulina da mesma espécie, ou uma imunoglobulina ou um polipeptídeo de não imunoglobulina de uma espécie diferente.

[0208] Como discutido em mais detalhes em outras partes deste documento, os anticorpos, ou fragmentos de ligação ao antígeno, variantes ou derivados dos mesmos da invenção podem adicionalmente ser recombinantemente fundidos para um polipeptídeo heterólogo em terminal N ou C ou quimicamente conjugados (incluindo conjugações covalentes e não covalentes) para polipeptídeos ou outras composições. Por exemplo, os anticorpos podem ser recombinantemente fundidos ou conjugados com moléculas úteis como marcadores em ensaios de detecção e moléculas efetoras, tais como polipeptídeos heterólogos, fármacos, radionucleotídeos, ou toxinas; vide, por exemplo, os Pedidos Internacionais WO92/08495; WO91/14438 WO89/12624; a Patente US 5.314.995 e Pedido de Patente Europeia EP 0 396 387.

[0209] Anticorpos, ou fragmentos de ligação ao antígeno, variantes, ou derivados dos mesmos da presente invenção podem ser compostos de aminoácidos ligados uns aos outros por ligações de peptídeo ou ligações de peptídeo modificadas, isto é, isósteros de peptídeo, e podem conter aminoácidos diferentes dos 20 aminoácidos codificados pelo gene. Os anticorpos podem ser modificados por processos naturais, tal como processamento pós-tradução, ou por técnicas de modificação química que são bem conhecidas na técnica. Tais modificações estão bem descritas em textos básicos e em monografias detalhadas, bem como em uma volumosa literatura de investigação. As modificações podem ocorrer em qualquer parte no anticorpo, incluindo a estrutura principal do peptídeo, as cadeias laterais de aminoácidos e os terminais amino ou carboxila, ou em porções, tais como carboidratos. Será apreciado que o mesmo tipo de modificação pode estar presente em graus iguais ou variáveis em diversos locais em um determinado anticorpo. Além disso, um anticorpo específico pode conter muitos tipos de modificações. Os anticorpos podem ser ramificados, por exemplo, como resultado de ubiquitinação, e podem ser cíclicos, com ou sem ramificação. Os anticorpos cíclicos, ramificados, e cíclicos ramificados podem resultar de processos naturais de pós-tradução ou podem ser produzidos por métodos de síntese. As modificações incluem acetilação, acilação, ribosilação por ADP, amidação, ligação covalente de flavina, ligação covalente de uma porção heme, ligação covalente de um nucleotídeo ou derivado de nucleotídeo, ligação covalente de um lípido ou derivado de lipídio, ligação covalente de fosfatidilinositol, ligação cruzada, ciclização, formação de ligação de dissulfeto, desmetilação, formação de ligações cruzadas covalentes, hidroxilação, formação de cisteína, formação de piroglutamato, formilação, gama-carboxilação, glicosilação, formação de âncora GPI, iodação, metilação, miristoilação, oxidação, peguilação, processamento proteolítico, fosforilação, prenilação, racemização, selenoilação, sulfatação, adição mediada por transferência de RNA de aminoácidos com as proteínas, tais como arginilação, e ubiquitinação, vide, por exemplo, Proteins - Structure And Molecular Properties, T.E. Creighton, W.H. Freeman and Company, New York 2nd Ed., (1993); Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B.C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, pgs. 1-12 (1983); Seifter et al., Meth.. Enzymol. 182 (1990), 626646; Rattan et al., Ann. NY Acad. Sci. 663 (1992), 48-62).

[0210] A presente invenção também provê proteínas de fusão compreendendo um anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno, variante, ou um derivado do mesmo, e um polipeptídeo heterólogo. Em uma modalidade, uma proteína de fusão da presente invenção compreende, consiste essencialmente em, ou consiste em, um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácido de qualquer uma ou mais das regiões VH de um anticorpo da invenção, ou a sequência de aminoácido de qualquer uma ou mais das regiões VL de um anticorpo da presente invenção ou fragmentos ou variantes dos mesmos, e uma sequência de polipeptídeo heterólogo. Em outra modalidade, uma proteína de fusão para uso nos métodos de diagnóstico e de tratamento aqui descritos compreende, consiste essencialmente em, ou consiste em um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácido de qualquer uma, duas, três das VH-CDRs de um anticorpo, ou fragmentos, variantes, ou seus derivados, ou a sequência de aminoácido de qualquer um, dois, três das CDRs VL de um anticorpo, ou seus fragmentos, variantes, ou derivados dos mesmos, e uma sequência de polipeptídeo heterólogo. Em uma modalidade, a proteína de fusão compreende um polipeptídeo possuindo a sequência de aminoácido de uma VH-CDR3 de um anticorpo da presente invenção, ou um fragmento, derivado, ou variante do mesmo, e uma sequência de polipeptídeo heterólogo, que a proteína de fusão se liga especificamente a tau. Em outra modalidade, uma proteína de fusão compreende um polipeptídeo possuindo a sequência de aminoácido de pelo menos uma região VH de um anticorpo da invenção e a sequência de aminoácido de pelo menos uma região VL de um anticorpo da presente invenção ou fragmentos, derivados ou variantes do mesmo, e uma sequência de polipeptídeo heterólogo. Em uma modalidade, as regiões VH e VL da proteína de fusão correspondem a uma única fonte de anticorpo (ou fragmento scFv ou Fab), que se liga especificamente a tau. Em ainda outra modalidade, a proteína de fusão para uso nos métodos de diagnóstico e de tratamento aqui descritos compreende um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácido de qualquer uma, duas, três ou mais das VH-CDRs de um anticorpo e a sequência de aminoácido de qualquer uma, duas, três ou mais das VL- CDRs de um anticorpo, ou fragmentos ou variantes dos mesmos, e uma sequência de polipeptídeo heterólogo. Em uma modalidade, duas, três, quatro, cinco, seis, ou mais das VH-CDR(s) ou VL-CDR(s) correspondem ao anticorpo de única fonte (ou fragmento scFv ou Fab) da presente invenção. As moléculas de ácido nucleico que codifica estas proteínas de fusão são também englobadas pela presente invenção.

[0211] Proteínas de fusão exemplares descritas na literatura incluem fusões do receptor de células T (Gascoigne et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987), 2936-2940; CD4 (Capon et al., Nature 337 (1989), 525-531; Traunecker et al., Nature 339 (1989), 68-70;. Zettmeissl et al., DNA Cell Biol. USA 9 (1990), 347-353; e Byrn et al., Nature 344 (1990), 667-670); L-selectina (receptor homing) (Watson et al., J. Cell Biol 110 (1990), 2221-2229; e Watson et al., Nature 349 (1991), 164-167); CD44 (Aruffo et al., Cell 61 (1990), 1303-1313); CD28 e B7 (Linsley et al., J. Exp. Med. 173 (1991), 721-730); CTLA-4 (Lisley et al., J. Exp. Med. 174 (1991), 561-569); CD22 (Stamenkovic et al., Cell 66 (1991), 1133-1144); receptor de TNF (Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991), 10535-10539; Lesslauer et al., Eur. J. Immunol 27 (1991), 2883-2886; e Peppel et al., J. Exp. Med. 174 (1991), 1483-1489 (1991), e um receptor de IgE a (Ridgway and Gorman, J. Cell. Biol. 115 (1991), Abstract N.° 1448).

[0212] Tal como discutido em outras partes deste documento, os anticorpos, ou fragmentos de ligação ao antígeno, variantes, ou derivados dos mesmos da presente invenção podem ser fundidos com polipeptídeos heterólogos, para aumentar a meia-vida in vivo em um dos polipeptídeos ou para uso em imunoensaios, usando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, em uma modalidade, o PEG pode ser conjugado com os anticorpos da presente invenção para aumentar a sua meia-vida in vivo, vide, por exemplo, Leong et al., Cytokine 16 (2001), 106-119; Adv. em Drug Deliv. Rev. 54 (2002), 531, ou Weir et al., Biochem. Soc. Transactions 30 (2002), 512.

[0213] Além disso, os anticorpos, fragmentos de ligação ao antígeno, variantes, ou derivados dos mesmos da presente invenção podem ser fundidos com sequências de marcador, tal como um peptídeo para facilitar a sua purificação ou detecção. Em modalidades específicas, o marcador de sequência de aminoácidos é um peptídeo de hexa-histidina (HIS), tal como o marcador fornecida em um vetor de pQE (QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, Calif., 91311), entre outros, muitos dos quais são comercialmente disponíveis. Como descrito em Gentz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989), 821-824, por exemplo, hexa-histidina provê purificação conveniente da proteína de fusão. Outras marcações de peptídeos úteis para a purificação incluem, mas não estão limitadas a, marcação "HA", o que corresponde a um epítopo derivado da proteína hemaglutinina da gripe (Wilson et al., Cell 37 (1984), 767) e o marcador "flag".

[0214] As proteínas de fusão podem ser preparadas usando métodos que são bem conhecidos na técnica, vide, por exemplo, as Patentes US 5.116.964 e 5.225.538. O local preciso em que a fusão é feita pode ser selecionado empiricamente para optimizar as características de secreção ou de ligação da proteína de fusão. O DNA codificando a proteína de fusão é então transfectado para uma célula hospedeira para a expressão.

[0215] Os anticorpos da presente invenção podem ser usados na forma não conjugada ou podem ser conjugados a pelo menos uma de uma variedade de moléculas, por exemplo, para melhorar as propriedades terapêuticas da molécula, para facilitar a detecção do alvo, ou para geração de imagens ou terapia do paciente. Anticorpos, ou fragmentos de ligação ao antígeno, variantes, ou derivados dos mesmos da presente invenção podem ser marcados ou conjugados, tanto antes quanto depois da purificação, quando a purificação é realizada. Em particular, os anticorpos, fragmentos de ligação ao antígeno, variantes, ou derivados dos mesmos da presente invenção podem ser conjugados com agentes terapêuticos, pró-fármacos, peptídeos, proteínas, enzimas, vírus, lipídios, modificadores da resposta biológica, agentes farmacêuticos, ou PEG.

[0216] Os conjugados que são imunotoxinas incluindo anticorpos convencionais têm sido amplamente descritos na técnica. As toxinas podem ser acopladas aos anticorpos por técnicas de acoplamento convencionais ou imunotoxinas contendo porções de proteína da toxina podem ser produzidas como proteínas de fusão. Os anticorpos da presente invenção podem ser usados de um modo correspondente para se obter tais imunotoxinas. Ilustrativos de tais imunotoxinas são aqueles descritos por Byers, Seminars Cell. Biol. 2 (1991), 59-70 e por Fanger, Immunol. Today 12 (1991), 51-54.

[0217] As pessoas versadas na técnica apreciarão que os conjugados podem também ser montados usando uma variedade de técnicas, dependendo do agente selecionado a ser conjugado. Por exemplo, conjugados com biotina são preparados, por exemplo, por reação de um polipeptídeo de ligação de tau com um éster ativado de biotina tal como o éster de N-hidroxisuccinimida de biotina. De modo similar, conjugados com um marcador fluorescente podem ser preparados na presença de um agente de acoplamento, por exemplo, aqueles aqui listados, ou por reação com um isotiocianato, ou isotiocianato de fluoresceína. Os conjugados dos anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno, variantes ou derivados dos mesmos da presente invenção são preparados de um modo análogo.

[0218] A presente invenção abrange adicionalmente os anticorpos, ou fragmentos de ligação ao antígeno, variantes, ou derivados dos mesmos do conjugado da presente invenção para um agente de diagnóstico ou terapêutico. Os anticorpos podem ser usados em diagnóstico, por exemplo, para demonstrar a presença de uma doença neurológica, para indicar o risco de contrair uma doença neurológica, para monitorar o desenvolvimento ou a progressão de uma doença neurológica, isto é, doença tauopática como parte de um procedimento de teste clínico para, por exemplo, determinar a eficácia de um determinado tratamento e/ou prevenção de regime. A detecção pode ser facilitada pelo acoplamento do anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno, variante ou derivado do mesmo para uma substância detectável. Exemplos de substâncias detectáveis incluem diversas enzimas, grupos prostéticos, materiais fluorescentes, materiais luminescentes, materiais bioluminescentes, materiais radioativos, metais emissores de pósitrons, usando diversas tomografias de emissão de pósitrons, e íons metálicos paramagnéticos não radioativos, vide, por exemplo, Patente US 4741900 para os íons metálicos que podem ser conjugados com anticorpos para uso como agentes de diagnóstico de acordo com a presente invenção. Exemplos de enzimas adequadas incluem peroxidase de raiz forte, fosfatase alcalina, β- galactosidase, ou acetilcolinesterase; exemplos de complexos de grupos prostéticos adequados incluem estreptavidina/biotina e avidina/biotina, exemplos de materiais fluorescentes adequados incluem umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, fluoresceína de diclorotriazinilamina, cloreto de dansila ou ficoeritrina, um exemplo de um material luminescente inclui luminol; exemplos de materiais bioluminescentes incluem luciferase, luciferina, e aequorina, e exemplos de materiais radioativos adequados incluem 125I, 131I, 111In ou 99Tc.

[0219] Um anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno, variante, ou um derivado do mesmo também pode ser marcado de forma detectável ligando-se a um composto quimioluminescente. A presença do anticorpo marcado quimioluminiscente é então determinada pela detecção da presença de luminescência que surge no decurso de uma reação química. Exemplos de compostos de marcação quimioluminescentes particularmente úteis são luminol, isoluminol, éster de acridínio teromático, imidazol, sal de acridínio e éster de oxalato.

[0220] Uma das formas na qual um anticorpo do mesmo, ou fragmento de ligação ao antígeno, variante ou derivado do mesmo pode ser marcado de forma detectável é ligando o mesmo a uma enzima e usando o produto ligado em um imunoensaio enzimático (EIA) (Voller, A., "The Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA)", Microbiological Associates Quarterly Publication, Walkersville, Md., Diagnostic Horizons 2 (1978), 1-7); Voller et al., J. Clin. Pathol. 31 (1978), 507-520; Butler, Meth. Enzymol. 73 (1981), 482-523; Maggio, E. (ed.), Enzyme Immunoassay, CRC Press, Boca Raton, Fla. (1980); Ishikawa, E. et al., (eds.), Enzyme Immunoassay, Kgaku Shoin, Tokyo (1981). A enzima que está ligada ao anticorpo reagirá com um substrato apropriado, de preferência um substrato cromogênico, de modo a produzir uma porção química que pode ser detectada, por exemplo, por meios espectrofoto- métricos, fluorimétricos ou visuais. As enzimas que podem ser usadas para marcar o anticorpo de forma detectável incluem, mas não estão limitadas a, desidrogenase de malato, nuclease de estafilococos, isomerase de delta-5-esteroide, desidrogenase de álcool de levedura, alfa-glicerofosfato, desidrogenase, isomerase de fosfato de triose, peroxidase de raiz forte, fosfatase alcalina, asparaginase, oxidase de glicose, beta-galactosidase, ribonuclease, urease, catalase, glicose-6- fosfato-desidrogenase, glicoamilase e acetilcolinesterase. Além disso, a detecção pode ser realizada por métodos colorimétricos que empregam um substrato cromogênico para a enzima. A detecção pode também ser obtida por comparação visual da extensão da reação enzimática de um substrato em comparação com padrões preparados de forma similar.

[0221] A detecção pode também ser obtida usando qualquer um de uma variedade de outros imunoensaios. Por exemplo, por marcação radioativa do anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno, variante, ou derivado do mesmo, é possível detectar o anticorpo através da utilização de um radioimunoensaio (RIA) (vide, por exemplo, Weintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, (March, 1986)), que é aqui incorporado por referência. O isótopo radioativo pode ser detectado por meios, incluindo, mas não limitados a, um contador gama, um contador de cintilação, ou autorradiografia.

[0222] Um anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno, variante, ou um derivado do mesmo pode também ser marcado de forma detectável usando metais emissores de fluorescência, tal como 152Eu, ou outros da série dos lantanídeos. Estes metais podem ser ligados ao anticorpo usando grupos quelantes de metais tal como o ácido dietilenotriaminopentacético (DTPA) ou ácido etilenodiaminotetra- acético (EDTA).

[0223] As técnicas para conjugar diversas porções a um anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno, variante, ou derivado do mesmo são bem conhecidas, vide, por exemplo, Arnon et al. "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", em Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. (1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), Marcel Dekker, Inc., pp. 623-53 (1987); Thorpe, "Antibody Carriers of of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective of The Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody in Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 Academic Press (1985), e Thorpe et al. "The preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev. 62 (1982), 119-158.

[0224] Tal como mencionado, em determinadas modalidades, uma unidade que aumenta a estabilidade ou a eficácia de uma molécula de ligação, por exemplo, um polipeptídeo de ligação, por exemplo, um anticorpo ou fragmento do mesmo, pode ser imunoconjugada. Por exemplo, em uma modalidade, o PEG pode ser conjugado com as moléculas de ligação da presente invenção para aumentar a sua meia- vida in vivo. Leong et al., Cytokine 16 (2001), 106; Adv. in Drug Deliv. Rev. 54 (2002), 531, ou Weir et al., Biochem. Soc. Transactions 30 (2002), 512.

VI. Composições e Métodos de Uso

[0225] A presente invenção refere-se a composições compreendendo a molécula de tau mencionada acima, por exemplo, anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo da presente invenção, ou um derivado ou variante do mesmo, ou o polinucleotídeo, vetor ou uma célula da invenção. A composição da presente invenção pode compreender adicionalmente um veículo farmaceuticamente aceitável. Além disso, a composição farmacêutica da presente invenção pode compreender agentes adicionais, tais como interleucinas ou interferons, dependendo da utilização pretendida da composição farmacêutica. Para uso no tratamento de uma doença tauopática, por exemplo, de mal de Alzheimer o agente adicional pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em moléculas orgânicas pequenas, anticorpos anti-tau, e combinações dos mesmos. Desse modo, em uma modalidade específica, a presente invenção se refere ao uso da molécula de tau, por exemplo, anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo da presente invenção, ou de uma molécula de ligação que tem substancialmente as mesmas especificidades de ligação de qualquer um dos mesmos, o polinucleotídeo, o vetor ou a célula da invenção para a preparação de uma composição farmacêutica ou de diagnóstico para o tratamento profilático e terapêutico de uma doença tauopática, monitorando a progressão de uma doença tauopática ou uma resposta a um tratamento de uma doença tauopática em um ou para a determinação do risco de um sujeito desenvolver uma doença tauopática.

[0226] Desse modo, uma modalidade da presente invenção refere- se a um método de tratamento de um distúrbio neurológico caracterizado por acumulação anormal e/ou deposição de tau no cérebro e no sistema nervoso central, respectivamente, cujo método compreende administrar a um sujeito em necessidade da mesma uma quantidade terapeuticamente eficaz de qualquer uma das moléculas de ligação de tau descritas acima, anticorpos, polinucleotídeos, vetores ou células da presente invenção. O "distúrbio neurológico" inclui mas não está limitado a doenças tauopáticas tais como o mal de Alzheimer, complexo de esclerose lateral amiotrófica/demência do parkinsonismo, demência por grão argirofílico, angiopatia de amiloide tipo Britânica, angiopatia de amiloide cerebral, degeneração córtico-basal, doença de Creutzfeldt-Jakob, demência pugilística, emaranhados neurofibrilares difusos com calcificação, síndrome de Down, demência frontotemporal, demência frontotemporal com parkinsonismo ligada ao cromossomo 17, degeneração lobar frontotemporal, doença de Gerstmann-Straussler- Scheinker, doença de Hallervorden-Spatz, miosite de corpo de inclusão, atrofia de múltiplos sistemas, distrofia miotônica, doença de Niemann- Pick tipo C, doença do neurônio motor não guamaniana com emaranhados neurofibrilares, doença de Pick, parkinsonismo pós- encefalite, angiopatia amiloide cerebral da proteína príon, gliose subcortical progressiva, paralisia supranuclear progressiva, panence- falite esclerosante subaguda, demência apenas de emaranhado, demência multi-infarto e acidente vascular cerebral isquêmico. Salvo indicação de outra forma, os termos neurodegenerativos, neurológicos ou neuropsiquiátricos são aqui usados neste documento de forma permutável.

[0227] Uma vantagem específica do método terapêutico da presente invenção reside no fato de que os anticorpos da presente invenção são derivados de células B ou células de memória B de seres humanos saudáveis, sem sinais de uma doença tauopática e, assim, são, com uma certa probabilidade, capaz de prevenir a doença tauopática clinicamente manifesta, ou de reduzir o risco da ocorrência da doença clinicamente evidente, ou atrasar o início ou a progressão da doença clinicamente evidente. Normalmente, os anticorpos da presente invenção também já têm passado pela maturação somática, ou seja, a optimização em relação à seletividade e eficácia na ligação de alta afinidade para a molécula de tau alvo por meio de variação somática de regiões variáveis do anticorpo.

[0228] O conhecimento de que tais células in vivo, por exemplo, em um ser humano, não foram ativadas por meio de outras proteínas relacionadas ou fisiológicas ou estruturas celulares, no sentido de uma reação alérgica ou autoimunológica também é de grande importância médica desde que isso signifique uma possibilidade consideravelmente aumentada de sucesso atravessando as fases de testes clínicos. Por assim dizer, a eficiência, a aceitabilidade e a tolerabilidade já foram demonstradas antes do desenvolvimento pré-clínico e clínico do anticorpo profilático ou terapêutico, em pelo menos um sujeito humano. Desse modo, pode-se esperar que os anticorpos anti-tau humanos da presente invenção, tanto a sua eficiência de estrutura específica alvo como agente terapêutico e sua probabilidade reduzida de efeitos secundários significativamente aumentem a probabilidade de sucesso clínico.

[0229] A presente invenção também provê um produto farmacêutico e de diagnóstico, respectivamente pacote ou kit compreendendo um ou mais recipientes cheios com um ou mais dos ingredientes acima descritos, por exemplo, anticorpo anti-tau, ou fragmento de ligação, derivado, ou variante do mesmo, polinucleotídeo, vetor, ou célula da presente invenção. Associado a tais recipientes pode estar um aviso na forma prescrita por uma agência governamental que regula a fabricação, uso ou venda de produtos farmacêuticos ou biológicos, em que o aviso reflete a aprovação pela agência de fabricação, uso ou venda para administração humana. Além disso, ou alternativamente, o kit compreende os reagentes e/ou instruções para a utilização em ensaios de diagnóstico apropriados. A composição, por exemplo, o kit da presente invenção é, evidentemente, particularmente apropriado para a avaliação do risco, diagnóstico, prevenção e tratamento de uma doença que está associada com a presença de tau e, em especial, aplicável ao tratamento de mal de Alzheimer (AD), esclerose lateral amiotrópica/complexo de demência de parkinsonismo (ALS-PDC), demência por grão argirofílico (AGD), angiopatia de amiloide tipo Britânica, angiopatia de amiloide cerebral, degeneração córtico-basal (CDB), doença de Creutzfeldt-Jakob (DCJ), demência pugilística, emaranhados neurofibrilares difusos com calcificação, síndrome de Down, demência frontotemporal, demência frontotemporal com parkinsonismo ligada ao cromossomo 17 (FTDP-17), degeneração lobar frontotemporal, doença de Gerstmann-Straussler-Scheinker, doença de Hallervorden-Spatz, miosite de corpo de inclusão, atrofia de múltiplos sistemas, distrofia miotônica, doença de Niemann-Pick tipo C (NP-C), doença do neurônio motor não guamaniana com emaranhados neurofibrilares, doença de Pick (PiD), parkinsonismo pós-encefalite, angiopatia amiloide cerebral da proteína príon, gliose subcortical progressiva, paralisia supranuclear progressiva (PSP), panencefalite esclerosante subaguda, demência apenas de emaranhado, demência multi-infarto e acidente vascular cerebral isquêmico.

[0230] As composições farmacêuticas da presente invenção podem ser formuladas de acordo com métodos bem conhecidos na técnica, vide, por exemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy (2000), by The University of Sciences in Philadelphia, ISBN 0-683306472. Exemplos de veículos farmacêuticos adequados são bem conhecidos na técnica e incluem soluções salinas tamponadas com fosfato, água, emulsões, tais como óleo/água, diversos tipos de emulsões de agentes umectantes, soluções estéreis, etc. As composições que compreendem tais veículos podem ser formuladas por métodos convencionais bem conhecidos. Estas composições farmacêuticas podem ser administradas ao sujeito em uma dose adequada. A administração das composições adequadas pode ser efetuada por diferentes vias, por exemplo, por via subcutânea, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intranasal, tópica ou intradérmica ou liberação da medula vertebral ou cerebral. As formulações de aerossol, tais como formulações de spray nasal incluem soluções aquosas purificadas ou outras do agente ativo com agentes conservantes e agentes isotônicos. Tais formulações são ajustadas a um pH e estado isotônico compatíveis com as membranas mucosas nasais. As formulações para administração por via retal ou vaginal podem ser apresentadas como um supositório com um veículo apropriado.

[0231] Além disso, embora que a presente invenção inclua o processo agora padrão (mas felizmente pouco frequente) de perfuração de um pequeno orifício no crânio para administrar um fármaco da presente invenção, em um aspecto, a molécula de ligação, em especial o anticorpo ou fármaco baseado em anticorpo da presente invenção pode atravessar a barreira hematoencefálica, o que permite a administração intravenosa ou oral.

[0232] O regime de dosagem será determinado pelo médico assistente e por fatores clínicos. Como é bem conhecido nas técnicas médicas, as dosagens para qualquer paciente dependem de muitos fatores, incluindo o tamanho do paciente, a área de superfície do corpo, idade, composto específico a ser administrado, sexo, tempo e via de administração, saúde geral, e outras medicamentos a serem administrados concomitantemente. Uma dose típica pode ser, por exemplo, no intervalo de 0,001 a 1000 μg (ou de ácido nucleico para expressão ou para inibição da expressão neste intervalo); contudo, doses abaixo ou acima deste intervalo exemplar são previstas, especialmente considerando os fatores acima mencionados. Geralmente, a dosagem pode variar, por exemplo, a partir de cerca de 0,0001 a 100 mg/kg, e mais usualmente de 0,01 a 5 mg/kg (por exemplo, 0,02 mg/kg, 0,25 mg/kg, 0,5 mg/kg, 0,75 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, etc.), do peso do corpo do hospedeiro. Por exemplo, as dosagens podem ser de 1 mg/kg de peso corporal ou 10 mg/kg de peso corporal ou dentro do intervalo de 1 a 10 mg/kg, ou, pelo menos, 1 mg/kg. Doses médias nos intervalos acima também se destinam a situar-se dentro do escopo da invenção. Tais doses diárias podem ser administradas a sujeitos, em dias alternados, semanalmente ou de acordo com qualquer outro programa determinado por análise empírica. Um tratamento exemplar implica na administração em múltiplas doses ao longo de um período prolongado, por exemplo, de pelo menos seis meses. Regimes de tratamento adicionais exemplares implicam na administração de uma vez a cada duas semanas ou uma vez por mês ou uma vez a cada 3 a 6 meses. Posologias exemplares incluem 1 a 10 mg/kg ou 15 mg/kg em dias consecutivos, 30 mg/kg em dias alternados ou 60 mg/kg por semana. Em alguns métodos, dois ou mais anticorpos monoclonais com diferentes especificidades de ligação são administrados simultaneamente, caso em que a dosagem de cada anticorpo administrado está dentro dos intervalos indicados. O progresso pode ser monitorado por avaliação periódica. As preparações para administração parenteral incluem soluções estéreis aquosas ou não aquosas, suspensões, e emulsões. Exemplos de solventes não aquosos são propilenoglicol, polietilenoglicol, óleos vegetais tais como azeite, e ésteres orgânicos injetáveis tal como oleato de etila. Os veículos aquosos incluem água, soluções, emulsões ou suspensões alcoólicas/aquosas, incluindo meios salinos e tamponados. Veículos parentéricos incluem solução de cloreto de sódio, dextrose de Ringer, cloreto de dextrose e sódio, Ringer com lactato, ou óleos fixos. Os veículos intravenosos incluem reabastecedores de fluidos e nutrientes, reabastecedores de eletrólitos (tais como aqueles baseados em dextrose de Ringer), e semelhantes. Os conservantes e outros aditivos podem também estar presentes, tais como, por exemplo, agentes antimicrobianos, antioxidantes, quelantes, e gases inertes e semelhantes. Além disso, a composição farmacêutica da presente invenção pode compreender agentes adicionais, tais como a dopamina, ou drogas psicofarmacológicas, dependendo da utilização pretendida da composição farmacêutica.

[0233] Além disso, em uma modalidade específica da presente invenção, a composição farmacêutica pode ser formulada como uma vacina, por exemplo, se a composição farmacêutica da presente invenção compreender um anticorpo anti-tau ou um fragmento de ligação, derivado ou variante, para a imunização passiva. Tal como mencionado na seção precedente, espécies de fósforo-tau têm sido relatadas extracelularmente no plasma e CSF (Aluise et al., Biochim. Biophys. Acta. 1782 (2008), 549-558), e estudos em linhagens de camundongos transgênicos usando vacinação ativa com peptídeos de tau fosforilada revelaram níveis cerebrais reduzidos de agregados de tau no cérebro e reduziram a progressão de deficiências do comportamento (Sigurdsson, J. Alzheimers Dis 15 (2008), 157-168; Boimel et al., Exp. Neurol 224 (2010), 472-485). Consequentemente é prudente esperar que a imunização passiva com anticorpos anti-tau humanos e moléculas de ligação de tau equivalentes da presente invenção ajudaria a quebrar diversos efeitos adversos dos conceitos de terapia de imunização ativa tal como já foi discutido na seção precedente. Portanto, os presentes anticorpos anti-tau e seus equivalentes da presente invenção serão particularmente úteis como uma vacina para a prevenção ou melhoria de doenças tais como a AD tauopática, ALS-PDC, AGD, CBD, CJD, FTD, FTDP-17, NP-C, PiD, PSP ou outras tauopatias como mencionado anteriormente.

[0234] Em uma modalidade, pode ser benéfico usar construtos recombinantes biespecíficos ou multiespecíficos do anticorpo da presente invenção. Para uma referência vide Fischer and Léger, Pathobiology 74 (2007), 3-14. Tal molécula biespecífica pode ser projetada para atingir tau com um braço de ligação e outra entidade patológica tal como Aβ ou alfa-sinucleína ou uma conformação patológica diferente de tau com um segundo braço de ligação. Alternativamente, o segundo braço de ligação pode ser concebido para atingir uma proteína presente na barreira hematoencefálica, com a finalidade de facilitar a penetração do anticorpo no cérebro.

[0235] Em uma modalidade, pode ser benéfico usar Fab recombinante (rFab) e fragmentos de cadeia simples (scFv) do anticorpo da presente invenção, que podem mais facilmente penetrar na membrana celular. Por exemplo, Robert et al., Protein Eng. Des. Sel. (2008) Oct 16; S1741-0134, publicado antes online, descreve o uso de Fab recombinante quimérico (rFab) e fragmentos de cadeia simples (scFv) do anticorpo monoclonal WO-2, que reconhecem um epítopo na região de terminal N de Ap. Os fragmentos de engenharia foram capazes de (i) prevenir fibrilização de amiloide, (ii) desagregar as fibrilas Aβ1-42 pré-formadas e (iii) inibir a neurotoxicidade Aβ1-42 do oligômero mediada in vitro de forma tão eficiente como a molécula de IgG total. As vantagens evidentes do uso de formatos de anticorpos manipulados pequenos de Fab e scFv que não possuem a função de efetor incluem passagem mais eficiente através da barreira hematoencefálica e minimizar o risco de desencadear reações inflamatórias secundárias. Além disso, além de anticorpos de domínio único e scFv reterem a especificidade de ligação de anticorpos de comprimento total, que pode ser expressa como um único gene e intracelularmente em células de mamíferos como intracorpos, com o potencial de alteração da dobragem, as interações, modificações ou localização subcelular de seus alvos; vide para revisão, por exemplo, Miller and Messer, Molecular Therapy 12 (2005), 394-401.

[0236] Em uma abordagem diferente Muller et al., Expert Opin. Biol. Ther. (2005), 237-241, descreve uma plataforma de tecnologia, a denominada 'SuperAntibody Technology', o que é dito permitir que os anticorpos sejam transportados em células vivas, sem prejudicá-los. Tais anticorpos que penetram nas células abrem novas janelas de diagnóstico e de terapêutica. O termo 'TransMabs' tem sido criado para esses anticorpos.

[0237] Em outra modalidade, a coadministração ou administração sequencial de outros anticorpos úteis para o tratamento de uma doença tauopática pode ser desejável. Em uma modalidade, o anticorpo adicional está compreendido na composição farmacêutica da presente invenção. Exemplos de anticorpos que podem ser usados no tratamento de um sujeito incluem, mas não estão limitados a, anticorpos alvo de beta-amiloide, alfa-sinucleína, TDP-43 e SOD-1.

[0238] Em uma modalidade adicional, a coadministração ou administração sequencial de outros agentes neuroprotetores úteis para o tratamento de uma doença tauopática pode ser desejável. Em uma modalidade, o agente adicional é composto na composição farmacêutica da presente invenção. Exemplos de agentes neuroprotetores que podem ser usados para tratar um sujeito incluem, mas não estão limitados a, um inibidor da acetilcolinesterase, um antagonista do receptor glutamatérgico, inibidores de quinase, inibidores de HDAC, agentes anti-inflamatórios, divalproex de sódio, ou qualquer combinação dos mesmos. Exemplos de outros agentes neuroprotetores que podem ser usados concomitantemente com a composição farmacêutica da presente invenção são descritos na técnica, vide, por exemplo, Pedido Internacional WO2007/011907. Em uma modalidade, o agente adicional é a dopamina ou um agonista do receptor de dopamina.

[0239] Uma dose ou quantidade terapeuticamente eficaz se refere a essa quantidade do ingrediente ativo suficiente para aliviar os sintomas ou a condição. A eficácia terapêutica e a toxicidade de tais compostos podem ser determinadas por procedimentos farmacêuticos padrão em culturas de células ou em animais experimentais, por exemplo, ED50 (a dose terapeuticamente eficaz em 50% da população) e LD50 (a dose letal para 50% da população). A razão da dose entre efeitos tóxicos e terapêuticos é o índice terapêutico, e este pode ser expresso como a razão, LD50/ED50. Em uma modalidade, o agente terapêutico na composição está presente em uma quantidade suficiente para restaurar ou preservar o comportamento normal e/ou propriedades cognitivas, no caso do mal de Alzheimer, ALS-PDC, AGD, CBD, CJD, FTD, FTDP-17, NP- C, PiD, PSP ou outras doenças tauopáticas como mencionado anteriormente.

[0240] A partir do exposto, é evidente que a presente invenção abrange o uso de uma molécula de ligação de tau que compreende pelo menos um CDR do anticorpo acima descrito, em particular para o diagnóstico e/ou tratamento de uma doença tauopática como mencionado acima, particularmente o mal de Alzheimer. Em uma modalidade, a referida molécula de ligação é um anticorpo da presente invenção ou uma cadeia de imunoglobulina do mesmo. Além disso, a presente invenção refere-se a anticorpos anti-idiotípicos de qualquer um dos anticorpos mencionados aqui anteriormente descritos. Estes são anticorpos ou outras moléculas de ligação que se ligam à sequência de peptídeo antigênico único localizada na região variável de um anticorpo, perto do local de ligação ao antígeno e são úteis, por exemplo, para a detecção de anticorpos anti-tau em uma amostra de um sujeito.

[0241] Em outra modalidade a presente invenção se refere a uma composição de diagnóstico que compreende qualquer uma das moléculas de ligação de tau acima descritas, anticorpos, fragmentos de ligação ao antígeno, polinucleotídeos, vetores ou células da invenção e, opcionalmente, meios adequados para a detecção, como reagentes convencionalmente usados em imunoensaio ou métodos de diagnóstico baseados em ácidos nucleicos. Os anticorpos da presente invenção são, por exemplo, adequados para uso em imunoensaios em que eles podem ser usados em fase líquida ou ligados a um veículo de fase sólida. Exemplos de imunoensaios que podem utilizar o anticorpo da presente invenção são imunoensaios competitivos e não competitivos, tanto em formato direto quanto indireto. Exemplos de tais imunoensaios são o radioimunoensaio (RIA), a sanduíche (ensaio imunométrico), citometria de fluxo e ensaio de Western blot. Os antígenos e anticorpos da presente invenção podem ser ligados a muitos veículos diferentes e usados para isolar células especificamente ligadas aos mesmos. Exemplos de veículos bem conhecidos incluem poliestireno, vidro, cloreto de polivinila, polipropileno, polietileno, policarbonato, dextrano, náilon, amiloses, celuloses naturais e modificadas, poliacrilamidas, agaroses e magnetita. A natureza do veículo pode ser solúvel ou insolúvel para os fins da presente invenção. Existem muitos marcadores diferentes e métodos de marcação conhecidos pelos versados na técnica. Exemplos dos tipos de marcadores que podem ser usados na presente invenção incluem enzimas, radioisótopos, metais coloidais, compostos fluorescentes, compostos quimioluminescentes, e compostos bioluminescentes; vide também as modalidades discutidas acima.

[0242] Por uma modalidade adicional, as moléculas de ligação de tau, de anticorpos específicos da presente invenção podem também ser usadas em um método para o diagnóstico de um distúrbio em um sujeito através da obtenção de uma amostra de fluido corporal do sujeito testado que pode ser um amostra de sangue, uma amostra de linfa ou qualquer outra amostra de fluido corporal e o contato da amostra de fluido corporal com um anticorpo da presente invenção, sob condições que permitam a formação de complexos anticorpo-antígeno. O nível de tais complexos é então determinado por métodos conhecidos na técnica, um nível significativamente mais elevado do que o formado em uma amostra de controle, indicando a doença no sujeito testado. De modo similar, o antígeno específico ligado pelos anticorpos da presente invenção pode também ser usado. Desse modo, a presente invenção refere-se a um imunoensaio in vitro que compreende a molécula de ligação, por exemplo, o anticorpo de ligação ao antígeno ou um fragmento do mesmo da presente invenção.

[0243] Neste contexto, a presente invenção também se refere a meios especificamente projetados para este fim. Por exemplo, uma matriz à base de anticorpo pode ser usada, por exemplo, que é carregada com anticorpos ou moléculas de ligação ao antígeno equivalentes da presente invenção, que reconhecem especificamente tau. A concepção de imunoensaios de microarranjo está resumida em Kusnezow et al., Mol. Cell Proteomics 5 (2006), 1681-1696. Por conseguinte, a presente invenção também se refere a microarranjos carregados com moléculas de ligação de tau identificados de acordo com a presente invenção.

[0244] Em uma modalidade, a presente invenção se refere a um método de diagnóstico de uma doença tauopática em um sujeito, o método compreendendo determinar a presença de tau e/ou tau patologicamente modificado e/ou agregado em uma amostra a partir do sujeito a ser diagnosticado com pelo menos um anticorpo da presente invenção, um fragmento de ligação de tau do mesmo ou uma molécula de ligação de tau possuindo substancialmente as mesmas especificidades de ligação de qualquer um dos mesmos, em que a presença de tau patologicamente modificada e/ou agregada é indicativa de uma tauopatia neurodegenerativa e um aumento do nível de tau patologicamente modificada e/ou agregada em comparação com o nível das formas de tau fisiológicas é indicativo de progressão de uma tauopatia neurodegenerativa no referido sujeito.

[0245] O sujeito a ser diagnosticado pode ser assintomático ou pré- clínico da doença. Em uma modalidade, o sujeito de controle tem uma doença tauopática, por exemplo, AD, ALS-PDC, AGD, CBD, CJD, FTD, FTDP-17, NP-C, PiD, PSP ou outras tauopatias como mencionado anteriormente, em que uma similaridade entre o nível de tau patológicamente modificada e/ou tau agregada e o padrão de referência indica que o sujeito a ser diagnosticado tem uma doença tauopática. Alternativamente, ou adicionalmente, como um segundo sujeito de controle não tem uma doença tauopática, em que a diferença entre o nível de tau patologicamente modificada e/ou tau agregada e o padrão de referência indica que o sujeito a ser diagnosticado tem uma doença tauopática. Em uma modalidade, o sujeito a ser diagnosticado e o sujeito de controle são pareados por idade. A amostra a ser analisada pode ser qualquer fluido corporal suspeito de conter tau patológicamente modificada e/ou agregada, por exemplo, uma amostra de sangue, CSF, ou urina.

[0246] O nível de tau patologicamente modificada e/ou tau agregada pode ser avaliado por qualquer método adequado conhecido na especialidade, compreendendo, por exemplo, análise de tau por uma ou mais técnicas escolhidas a partir de Western blot, imunoprecipitação, ensaio imunossorvente ligado à enzima (ELISA), radioimunoensaio (RIA), classificação de células ativadas fluorescentes (FACS), a eletroforese bidimensional em gel, espectrometria de massa (MS), dessorção de laser assistida pela matriz/tempo de ionização de vôo-MS (MALDI-TOF), tempo de ionização de dessorção de laser aumentada pela superfície de vôo (SELDI-TOF), cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), cromatografia líquida de proteína rápida (FPLC), cromatografia líquida multidimensional (LC), seguida por espectrometria de massa tandem (MS/MS), e densitometria a laser. Em uma modalidade, a referida imagem in vivo de tau compreende a tomografia por emissão de pósitrons (PET), tomografia por emissão de fóton único (SPECT), imagem óptica por infravermelho próximo (NIR) ou ressonância magnética (MRI).

[0247] Os métodos para o diagnóstico de uma doença tauopática tal como o mal de Alzheimer, a monitoração de uma progressão da doença tauopática e monitoração de um tratamento da doença tauopática usando anticorpos e os meios associados, que podem ser adaptados de acordo com a presente invenção são também descritos nos Pedidos Internacionais WO93/08302, WO94/13795, WO95/17429, WO96/04309, WO2002/062851 e WO2004/016655. De modo similar, os métodos de detecção baseados em anticorpos para a tau são descritos no Pedido Internacional WO2005/080986, o teor de divulgação de todos sendo incorporado neste documento por referência. Estes métodos podem ser aplicados como descrito, mas com um anticorpo específico de tau, fragmento de ligação, derivado ou variante da presente invenção.

[0248] Em um aspecto adicional, a presente invenção também se refere a peptídeos possuindo um epítopo de tau especificamente reconhecido por qualquer anticorpo da presente invenção. Em uma modalidade, o peptídeo compreende tal sequência de aminoácidos tal como indicado nas SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42 ou uma sequência modificada do mesmo em que um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete ou mais aminoácidos são substituídos, eliminados e/ou adicionados, em que o peptídeo é reconhecido por qualquer anticorpo da presente invenção, por exemplo, por anticorpo de NI-105.4E4 ou NI- 105.4E3.

[0249] Em uma modalidade da presente invenção, um tal peptídeo pode ser usado para diagnosticar uma tauopatia neurodegenerativa em um sujeito, compreendendo a etapa de determinação da presença de um anticorpo que se liga a um peptídeo, em uma amostra biológica do referido sujeito, e está sendo usado para o diagnóstico de uma tauopatia no referido sujeito através da medição dos níveis de anticorpos que reconhecem o peptídeo acima descrito da presente invenção e comparando as medições dos níveis que são encontrados em sujeitos saudáveis de idade e sexo comparáveis. Um nível elevado de anticorpos medidos específicos para o referido peptídeo da presente invenção seria indicativo para o diagnóstico de uma tauopatia no referido sujeito. O peptídeo da presente invenção pode ser formulado de uma matriz, e um kit de composição, respectivamente, como aqui descrito anteriormente.

[0250] Estas e outras modalidades são descritas e abrangidas na descrição e exemplos da presente invenção. A literatura adicional sobre qualquer um dos materiais, métodos, usos e compostos a serem usados de acordo com a presente invenção pode ser recuperada a partir de bibliotecas e bancos de dados públicos, usando, por exemplo, dispositivos eletrônicos. Por exemplo, o banco de dados público "Medline" pode ser usado, que é organizado pelo Centro Nacional de Informações sobre Biotecnologia e/ou a Biblioteca Nacional de Medicina, no Instituto Nacional de Saúde. Outros bancos de dados e endereços de web, tais como os do Instituto Europeu de Bioinformática (EBI), o qual faz parte do Laboratório Europeu de Biologia Molecular (EMBL) são conhecidos do versado na técnica e podem também ser obtidos usando os motores de busca da Internet. Uma visão geral da informação sobre patentes em biotecnologia e um levantamento de fontes relevantes de informação de patente úteis para pesquisa retrospectiva e para a consciência atual são fornecidos em Berks, TIBTECH 12 (1994), 352-364.

[0251] A divulgação acima descreve genericamente a presente invenção. A menos que indicado de outra forma, um termo como usado aqui é dado a definição, tal como previsto no Dicionário Oxford de Bioquímica e Biologia Molecular, Oxford University Press, 1997, revisado em 2000 e reimpresso em 2003, ISBN 0 19 850673 2. Diversos documentos são citados ao longo do texto deste Relatório Descritivo. Todas as referências bibliográficas podem ser encontradas no final do Relatório Descritivo imediatamente antes das reivindicações. Os conteúdos de todas as referências citadas (incluindo referências de literatura, Patentes emitidas, Pedidos de Patente publicados como citados ao longo deste pedido e as especificações do fabricante, instruções, etc.) são aqui expressamente incorporados por referência, no entanto, não há qualquer reconhecimento de que qualquer documento citado seja na verdade o estado da técnica como a presente invenção.

[0252] Uma compreensão mais completa pode ser obtida por referência aos seguintes exemplos específicos que são fornecidos aqui para fins de ilustração apenas e não se destinam a limitar o escopo da presente invenção.

Exemplos

[0253] Os exemplos a seguir ilustram melhor a invenção, mas não devem ser interpretados como limitando o escopo da invenção de qualquer forma. Os seguintes experimentos dos Exemplos 1 a 4 são ilustrados e descritos em relação aos anticorpos NI-105.4E4, NI-105.24.B2 e 105.4A3 quando clonados, ou seja, regiões variáveis por Ig de estrutura 1 (FR1) sem ser ajustadas para as sequências de linhagem germinal (GL) de cadeias leve e pesada variáveis humanas, vide Figura 1.

Materiais e Métodos

[0254] As descrições detalhadas de métodos convencionais, tais como os aqui usados podem ser encontradas na literatura citada, vide também "The Merck Manual of Diagnosis and Therapy" Seventeenth Ed. editado por Beers and Berkow (Merck & Co., Inc., 2003).

[0255] A prática da presente invenção empregará, a menos que indicado de outra forma, técnicas convencionais de biologia celular, cultura celular, biologia molecular, biologia transgênica, microbiologia, DNA recombinante e imunologia, que estão dentro da habilidade da técnica. Para posterior elaboração de técnicas gerais úteis na prática da presente invenção, o praticante pode se referir a livros de texto padrão e análises em biologia celular e cultura de tecidos, vide também as referências citadas nos exemplos. Métodos gerais de bioquímica celular e molecular podem ser encontrados em livros de texto padrão tais como Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3° Ed. (Sambrook et al., Harbor Laboratory Press 2001); Short Protocols in Molecular Biology, 4th Ed. (Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons 1999); DNA Cloning, Volumes I and II (Glover ed., 1985); Oligonucleotide Synthesis (Gait ed., 1984); Nucleic Acid Hybridization (Hames and Higgins eds. 1984); Transcription And Translation (Hames and Higgins eds. 1984); Culture Of Animal Cells (Freshney and Alan, Liss, Inc., 1987); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (Miller and Calos, eds.); Current Protocols in Molecular Biology and Short Protocols in Molecular Biology, 3rd Edition (Ausubel et al., eds.); and Recombinant DNA Methodology (Wu, ed., Academic Press). Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (Miller and Calos, eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155 (Wu et al., eds.); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV (Weir and Blackwell, eds., 1986). Protein Methods (Bollag et al., John Wiley & Sons 1996); Non- viral Vectors for Gene Therapy (Wagner et al. eds., Academic Press 1999); Viral Vectors (Kaplitt & Loewy eds., Academic Press 1995); Immunology Methods Manual (Lefkovits ed., Academic Press 1997); and Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures in Biotechnology (Doyle & Griffiths, John Wiley & Sons 1998). Reagents, cloning vectors and kits for genetic manipulation referred to in this disclosure are available from commercial vendors such as BioRad, Stratagene, Invitrogen, Sigma-Aldrich, and ClonTech. General techniques in cell culture and media collection are outlined in Large Scale Mammalian Cell Culture (Hu et al., Curr. Opin. Biotechnol. 8 (1997), 148); Serum-free Media (Kitano, Biotechnology 17 (1991), 73); Large Scale Mammalian Cell Culture (Curr. Opin. Biotechnol. 2 (1991), 375); e Suspension Culture of Mammalian Cells (Birch et al., Bioprocess Technol. 19 (1990), 251); Extracting information from cDNA arrays, Herzel et al., CHAOS 11 (2001), 98-107.

Métodos de identificação de células B de tau específica e clonagem dos respectivos anticorpos.

[0256] A menos que indicado de outra forma abaixo, a identificação de células B de tau específica e clonagem molecular de anticorpos anti- tau exibem especificidade de interesse, bem como a sua expressão recombinante e caracterização funcional foi ou pode ser geralmente realizada como descrito nos Exemplos e na seção de Métodos Complementares do Pedido Internacional PCT/EP2008/000053 publicado como WO2008/081008, o conteúdo da divulgação o qual é incorporado neste documento por referência em sua totalidade. Um novo método para identificação de células B de tau específica e clonagem molecular de anticorpos exibe especificidade de tau de interesse, bem como a sua expressão recombinante e a caracterização funcional são fornecidas neste Pedido. Como descrito acima, em uma modalidade da presente invenção as culturas de células B simples ou oligoclonais são cultivadas e o sobrenadante da cultura, que contém anticorpos produzidos pelas referidas células B é testado para a presença e a afinidade dos novos anticorpos anti-tau nas mesmas. O processo compreende as etapas de triagem de um tecido sensível ao ensaio de imunorreatividade da placa amiloide (TAPIR), tal como descrito no Exemplo 1 e mostrado na figura 9; o triagem em extratos cerebrais para a ligação a PHFTau como descrito no Exemplo 2, e mostrado nas figuras 3 e 8; o triagem para a ligação de um peptídeo derivado de tau da sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO: 6, com grupos de fosfato em aminoácidos Ser-202 e Ser-205; aminoácido em Thr-231, e/ou em aminoácidos Ser-396 e Ser-404, da referida sequência descrita de forma análoga no Exemplo 3, e mostrada na figura 5 dos peptídeos não-fosforilados devido aos experimentos de confirmação para o epítopo do anticorpo NI-105.4E4; um triagem para a ligação de tau total da sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO: 6 e o isolamento do anticorpo para o qual a ligação é detectada ou a célula que produz o referido anticorpo, tal como descrito no Pedido de Patente Internacional WO2008/081008 e como descrito no Exemplo 1 e mostrado nas Figuras 2, 5 e 7.

Purificação do antígeno

[0257] Tau40 humana recombinante foi adquirida a partir de rPeptide (Bogart, GA, USA). PHFTau foi extraída a partir do cérebro de AD.

[0258] O isolamento de filamentos helicoidais emparelhados que contêm filamentos de tau fosforilada (patologicamente PHFTau) foi realizado seguindo o método por Goedert et al. (Goedert et al., Neuron 8 (1992), 159-168) com modificações. Um grama de tecido cerebral AD foi cortado em pedaços de 5 milímetros, com todos os vasos sanguíneos visíveis removidos. O tecido foi lavado com 40 ml de solução de lavagem arrefecida em gelo (Tris a 100 mM, pH 7,4, EGTA a 6 mM, Na3VO4 a 1 mM e NaF a 1 mM) por três vezes seguida por homogeneização com 20 ml de tampão de lise (Tris a 10 mM, pH 7,4, NaCl a 0,8 M, EGTA a 1 mM, 1 x coquetel inibidor de protease, Na3VO4 a 1 mM, NaF a 1 mM, AEBSF a 1 mM, sacarose a 10%). O homogenato foi centrifugado a 4°C em 20'000xg durante 20 min. O sobrenadante foi recolhido, com a adição de sarcosinato de N-lauroíla (Sigma, Switzerland) a 1% (p/v). Depois de duas horas de incubação a 37°C com agitação, o sobrenadante foi então centrifugado a 4°C em 100'000xg durante uma hora. O pélete foi recolhido e ressuspenso em PBS. Depois de limpar possíveis imunoglobulinas contaminantes com esferas magnéticas de proteína A, a suspensão de PHFTau foi armazenada a - 80°C antes do uso. Um extrato de tecido cerebral saudável de controle humano foi preparado em conformidade.

Triagem de anticorpos de tau humanos ELISA:

[0259] Microplacas de meia área de 96 poços (Corning) foram revestidas com a proteína Tau recombinante (rPeptide, Bogart, USA) a uma concentração padrão de 1 μg/ml em tampão de revestimento de ELISA de carbonato (pH 9,6) durante a noite a 4°C. Para o triagem de PHFTau, Microplacas Imobilizadoras de 96 poços (Nunc, Denmark) foram revestidas com PHFTau extraída de cérebro de AD humano em diluições de 1:100 em tampão de revestimento de ELISA de carbonato (pH 9,6) durante a noite a 4°C. As placas foram lavadas em PBS-T a pH 7,6 e locais de ligação não-específicos foram bloqueados durante 2 horas à temperatura ambiente com PBS-T contendo 2% de BSA (Sigma, Buchs, Switzerland). O meio condicionado de células B foi transferido a partir de placas de cultura de células B de memória para placas de ELISA e incubado durante uma hora à temperatura ambiente. As placas de ELISA foram lavadas em PBS-T e, em seguida, incubadas com IgG anti-humana de jumento conjugado por peroxidase de raiz forte (HRP) (fragmento FCY específico) anticorpos policlonais (Jackson ImmunoResearch, Newmarket, UK). Após lavagem com PBS-T, a ligação de anticorpos humanos, foi determinada por medição da atividade de HRP em um ensaio colorimétrico padrão.

Triagem de microplaca MULTI-ARRAY®

[0260] Placas MULTI-SPOT de 10 locais de 96 poços padrão (Meso Scale Discovery, USA) foram revestidas com 30 ug/ml de rTau (rPeptide), extrato cerebral de PHFTau e extrato cerebral de controle saudável em PBS. Locais de ligação não específicos foram bloqueados durante 1 h à temperatura ambiente com PBS-T contendo 3% de BSA, seguido de incubação com meio condicionado de células B durante 1 hora à temperatura ambiente. As placas foram lavadas em PBS-T e, em seguida, incubadas com anticorpo policlonal anti-humano de conjugado SULFO-Tag (Meso Scale Discovery, USA). Após a lavagem com PBS- T, a ligação do anticorpo foi detectada através da medição por eletroquimioluminescência usando um Imageador SECTOR 6000 (Meso Scale Discovery, USA).

Clonagem molecular de anticorpos de tau

[0261] As amostras contendo células B de memória foram obtidas a partir de indivíduos humanos saudáveis. As células B vivas de culturas de células B de memória selecionadas são colhidas e o mRNA é preparado. As sequências de imunoglobulina de cadeias leve e pesada são então obtidas usando um método de PCR aninhado.

[0262] A combinação de iniciadores que representam todas as famílias de sequências do repertório da linhagem germinal humana de imunoglobulinas é usada para as amplificações de peptídeos líder, segmentos-V e segmentos-J. A amplificação da primeira volta é realizada usando iniciadores específicos de peptídeo líder na extremidade 5' e iniciadores específicos de região constante na extremidade 3' (Smith et al., Nat Protoc. 4 (2009), 372-384). Para cadeias leves de capa e cadeias pesadas, a segunda volta de amplificação é realizada usando os iniciadores específicos de segmento- V na extremidade 5' e os iniciadores específicos de segmento-J na extremidade 3'. Para as cadeias leves de lambda, a segunda volta de amplificação é realizada usando iniciadores específicos de segmento-V na extremidade 5' e um iniciador específico de região C na extremidade 3' (Marks et al., Mol. Biol. 222 (1991 ), 581-597, Haard et al., J. Biol. Chem. 26 (1999), 18218-18230).

[0263] A identificação do clone de anticorpo com a especificidade desejada é realizada por rertriagem em ELISA sobre a expressão recombinante de anticorpos completos. A expressão recombinante de anticorpos IgG1 humanos completa ou anticorpos IgG2a quiméricos é obtida após a inserção das sequências variáveis de cadeias leve e pesada "na estrutura de leitura correta" em vetores de expressão que complementam a sequência da região variável com uma sequência codificadora de um peptídeo líder na extremidade 5' e na extremidade 3' com uma sequência codificando o domínio constante apropriado. Para o efeito, os iniciadores continham locais de restrição projetados para facilitar a clonagem das sequências variáveis de cadeias leve e pesada em vetores de expressão de anticorpos. As imunoglobulinas de cadeias pesadas são expressas pela inserção do produto de RT-PCR de cadeia pesada da imunoglobulina na estrutura em um vetor de expressão de cadeia pesada tendo um peptídeo de sinal e os domínios constantes de imunoglobulina humana gama-1 ou imunoglobulina de camundongo gama 2a. As imunoglobulinas humanas de cadeia leve de capa são expressas pela inserção de produtos de RT-PCR de cadeia leve de capa na estrutura para um vetor de expressão de cadeia leve provendo um peptídeo de sinal e o domínio constante de imunoglobinas de cadeia leve de Lambda de imunoglobina de cadeia leve de capa humana é expresso pela inserção do produto de RT-PCR de cadeia leve de lambda na estrutura em um vetor de expressão de cadeia leve de lambda provendo um peptídeo de sinal e o domínio constante de imunoglobulina de cadeia leve de lambda de camundongo ou humana.

[0264] Anticorpos monoclonais recombinantes funcionais são obtidos após cotransfecção em células HEK293 ou CHO (ou qualquer outra linhagem de células receptora apropriada de origem humana ou de camundongo) de um vetor de expressão de cadeia pesada de Ig e um vetor de expressão de cadeia leve de Ig capa ou lambda. O anticorpo monoclonal humano recombinante é subsequentemente purificado a partir de meio condicionado usando uma purificação em coluna de proteína A padrão. O anticorpo monoclonal humano recombinante pode ser produzido em quantidades ilimitadas, usando células tanto transientemente quanto estavelmente transfectadas. A célula revestida produzindo anticorpo monoclonal humano recombinante pode ser estabelecida tanto através da utilização dos vetores de expressão de Ig diretamente quanto por reclonagem de regiões variáveis de Ig em vetores de expressão diferentes. Derivados, tais como F(ab), F(ab) 2 e scFv podem também ser gerados a partir destas regiões variáveis de Ig.

Anticorpos

[0265] O anticorpo de tau anti-humano monoclonal de camundongo Tau12 (Covance, California, U.S.A.) e anticorpo de tau monoclonal de camundongo AT180 (Thermo Scientific, U.S.A.) foi usado de acordo com o protocolo do fabricante. Anticorpos de tau recombinantes humanos NI-105.4E4, NI105.24B2 e NI-105.4A3 são anticorpos da presente invenção. Eles foram expressos em células CHO ou HEK293, purificados a partir de meio condicionado e foram diretamente usados em aplicações subsequentes, a menos que indicado de outra forma. Nos Exemplos 1 a 4 os anticorpos recombinantes purificados da presente invenção foram usados.

ELISA Direto

[0266] Microplacas de 96 poços (Costar, Corning, USA) foram revestidas com proteína Tau recombinante (htau40, rPeptide, Bogart, USA), diluídas a uma concentração de 1 μg/ml em tampão de revestimento de ELISA de carbonato (a 50 mM, pH 9,6) a 4°C durante a noite. Locais de ligação não específicos foram bloqueados durante 2 h à temperatura ambiente com PBS contendo 2% de BSA (Sigma, Buchs, Switzerland) e 0,5% de Tween 20. A ligação de anticorpos humanos da presente invenção (NI-105.4E4, NI-105.24B2 e NI- 105.4A3) foi determinada usando IgG Fcy anti-humano de cabra conjugado com HRP (Jackson immunoResearch, Newmarket, UK), seguida pela medição da atividade de HRP em um ensaio colorimétrico padrão. Os valores de EC50 foram estimados por uma regressão não linear usando software GraphPad Prism (San Diego, USA).

Coloração de proteína por Western Blotting

[0267] PHFTau e htau40 recombinante foram ressolvidos por SDS- PAGE de gradiente (NuPAGE 4-12%; Invitrogen, Basel, Switzerland), seguido de eletrotransferência em membranas de nitrocelulose. Após o bloqueio da ligação não específica com BSA a 2% à temperatura ambiente durante uma hora, as manchas foram incubadas durante a noite com anticorpos primários NI-105.4E4, NI-105.24B2 (humano) ou Tau12 (anticorpo monoclonal de camundongo, Covance, California, USA), seguido de um IgGFcY anti-humano de cabra de conjugado com HRP (para anticorpos primários humanos) ou um anticorpo secundário de IgG anti-camundongo de HRP.

[0268] As manchas foram desenvolvidas usando ECL e detecção ImageQuant 350 (GE Healthcare, Otelfingen, Switzerland).

Extração de PHFTau a partir de cérebro de AD

[0269] O isolamento de filamentos helicoidais emparelhados que contêm filamentos de tau fosforilada (patologicamente PHFTau) foi realizado seguindo o método por Goedert et al. (Goedert et al., Neuron 8 (1992), 159-168) com modificações. Um grama de tecido cerebral de AD foi cortado em pedaços de 5 milímetros, com todos os vasos sanguíneos visíveis removidos. O tecido foi lavado com 40 ml de solução de lavagem arrefecida em gelo (Tris a 100 mM, pH 7,4, EGTA a 6 mM, Na3VO4 a 1 mM e NaF a 1 mM) por três vezes seguida por homogeneização com 20 ml de tampão de lise (Tris a 10 mM, pH 7,4, NaCl a 0,8 M, EGTA a 1 mM, 1 x coquetel inibidor de protease, Na3VO4 a 1 mM, NaF a 1 mM, AEBSF a 1 mM, sacarose a 10%). O homogenato foi centrifugado a 4°C em 20'000xg durante 20 min. O sobrenadante foi recolhido, com a adição de sarcosinato de N-lauroíla (Sigma, Switzerland) a 1% (p/v). Depois de duas horas de incubação a 37°C com agitação, o sobrenadante foi então centrifugado a 4°C em 100'000xg durante uma hora. O pélete foi recolhido e ressuspenso em PBS. Depois de limpar possíveis imunoglobulinas contaminantes com esferas magnéticas de proteína A, a suspensão de PHFTau foi armazenada a - 80°C antes da utilização. Um extrato de tecido cerebral saudável de controle humano foi preparado em conformidade.

Síntese de peptídeos de Tau

[0270] Um peptídeo correspondente para os aminoácidos 333-346 de htau40 (333GGGQVEVKSEKLDF346), que inclui o epítopo de NI- 105.4E4 identificado por mapeamento Pepspot (aminoácidos 337-343) foi sintetizado por Schafer-N (Copenhagen, Denmark). Uma cisteína adicional foi adicionada à extremidade de terminal C para permitir a ligação covalente de Microplacas Imobilizadoras (Nunc, Denmark). Um segundo peptídeo que corresponde aos aminoácidos 226-239 de tau humana (226VAVVRpTPPKSPSSA239), o epítopo do anticorpo de tau monoclonal de camundongo comercialmente disponível AT180 (Thermo Scientific, USA), foi sintetizado em conformidade e usado como controle.

Camundongos transgênicos

[0271] Três modelos animais diferentes para tauopatias são usados para validar os anticorpos de tau (e moléculas com as especificidades de ligação dos mesmos) da presente invenção. 1. Os camundongos transgênicos TauP301L (linhagem183): expressando Tau40 humana com mutação P301L sob o promotor Thy1.2 murino (A geração desses animais transgênicos é descrita em Gotz et al., J. Biol. Chem. 276 (2001), 529-534 e no Pedido Internacional WO 2003/017918, o conteúdo da divulgação o qual é incorporado neste documento por referência). 2. Camundongos de JNPL3 que expressam a isoforma de tau humana de 4R mais curta com mutação P301L sob o promotor de PrP murino (disponível a partir de Taconic, Hudson, NY, U.S.A.). 3. Camundongos de P301STau (linhagem PS19) que expressam tau humana com mutação P301S sob o promotor de PrP murino (disponível a partir de Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine, U.S.A.).

[0272] Modelos de camundongo de tauopatias e camundongos tipo selvagens correspondentes são mantidos em condições de habitação padrão em um ciclo claro/escuro 12h:12h invertido, com livre acesso para água e comida. Os grupos de tratamento são equilibrados para idade e sexo.

Exemplo 1: Validação de alvo e especificidade de ligação de anticorpos de tau humanos

[0273] Para validar tau como um alvo reconhecido de anticorpos isolados, ensaios de ELISA diretos foram realizados como descrito acima. Para um anticorpo NI-105.4A3 humano recombinante exemplar microplacas de 96 poços (Costar, Corning, USA) foram revestidas com proteína tau humana recombinante (htau40, rPeptide, Bogart, USA), diluídas a uma concentração de 3 μg/ml, ou com BSA e, tampão de revestimento de ELISA de carbonato (pH 9,6) e a eficiência de ligação do anticorpo foi testada. O anticorpo NI-105.4A3 exemplar especificamente se liga a tau humana por ELISA. Não se observa ligação de BSA (Figura 10).

[0274] Para a determinação da concentração máxima média eficaz (EC50) dos anticorpos exemplares NI-105.4E4 e NI-105.24B2, experimentos diretos de ELISA adicionais com diferentes concentrações de anticorpo foram realizados. Microplacas de 96 poços (Costar, Corning, USA) foram revestidas com a proteína tau recombinante humana (htau40, rPeptide, Bogart, USA), diluídas a uma concentração de 1 μg/ml (para o ensaio com o anticorpo NI-105.4E4), ou de 3 μg/ml (para o ensaio com o anticorpo NI-105.24B2) em um tampão de revestimento de ELISA de carbonato e a eficiência de ligação do anticorpo foi testada. Os valores de EC50 foram estimados por uma regressão não linear usando o software GraphPad Prism. O anticorpo derivado humano recombinante NI-105.4E4 se liga a htau40 com alta afinidade na gama nanomolar baixa em EC50 de 2,4 nM (Figura 2). NI- 105.24B2 se liga a htau40 com alta afinidade na gama nanomolar baixa em EC50 a 6,6 nM (Figura 7).

[0275] A meia concentração máxima eficaz (EC50) do anticorpo exemplar NI-105.4A3 foi também determinada através de ensaios de ELISA diretos. As placas de ELISA foram revestidas com tau recombinante humana (htau40, 1μg/ml), PHFTau (1:100) e a preparação de controle (1:100), e incubadas com concentrações variáveis de anticorpos. NI-105.4A3 se liga a rTau com alta afinidade na gama nanomolar baixa em EC50 a 1,4 nM. NI-105.4A3 se liga a PHFTau com alta afinidade na gama nanomolar baixa de EC50 a 1,2 nM (Figura 12).

Exemplo 2: Análise de ligação de anticorpos humanos recombinantes a tau recombinante e tau patológica extraída de cérebro de AD

[0276] Para determinar a capacidade de ligação de NI-105.4E4 e NI-105.24B2 a espécie de tau patológica extraída de cérebro de AD. A análise por SDS-PAGE e Western Blot foi realizada como descrito em detalhes acima. As membranas foram incubadas durante a noite com anticorpos primários NI-105.4E4 (humano), NI-105.24B2 (humano) ou Tau12 (anticorpo monoclonal de camundongo, Covance, California, USA), seguido por um IgGFcY anti-humano de cabra de conjugado com HRP (para anticorpos humanos) ou de um conjugado com anticorpo secundário de IgG anti-camundongo de cabra de conjugado com HRP.

[0277] Os anticorpos recombinantes NI-105.4E4 (Figura 3) e NI- 105.24B2 (Figura 8) reconhecem htau40 recombinante bem como PHFTau patologicamente modificado extraído de cérebro de AD em Western blot. Tal como esperado, o anticorpo de controle Tau12 reconhece também ambas as espécies de tau (Figura 3).

[0278] Além disso, tal como discutido no Exemplo 1 acima, a concentração máxima média eficaz (EC50) do anticorpo exemplar NI- 105.4A3 foi determinada em experimentos de ELISA diretos usando PHFTau. NI-105.4A3 se liga a PHFTau com alta afinidade na gama nanomolar baixa de EC50 a 1,2 nM (Figura 12).

Exemplo 3: Mapeamento de epítopo de ligação de NI-105.4E4 e NI- 105.4A3 em htau40

[0279] Uma matriz de peptídeo de 118 sequências de peptídeos que abrangem a htau40 de comprimento total (aminoácidos 1-441), com uma sobreposição de 11 aminoácidos entre os dois peptídeos adjacentes foi manchada sobre uma membrana de nitrocelulose (JPT Peptide Technologies GmbH, Berlin, Germany). A imunomarcação de anticorpos, bem como a regeneração da membrana foram realizadas de acordo com as instruções do fabricante. Para excluir a ligação não específica do anticorpo de detecção, a membrana foi sondada pelo primeiro conjugado com IgG anti-humano de cabra de conjugado com HRP omitindo o anticorpo primário (Figura 4B). Após a regeneração, a membrana foi sondada com o anticorpo NI-105.4E4 recombinante a 100 nM. O anticorpo ligado foi detectado usando ECL e detecção ImageQuant 350 (GE Healthcare, Otelfingen, Switzerland).

[0280] Dois grupos de manchas de peptídeos adjacentes (peptídeo 83, 84 e 85; peptídeo 96 e 97) foram especificamente identificadas por NI105.4E4 (Figura 4A e A'), quando comparadas com o anticorpo de detecção apenas (Figura 4B). As sequências abrangidas por estes dois grupos de peptídeos correspondentes aos aminoácidos 329-351 e 387397 de htau40. Estes dados sugerem que o NI-105.4E4 reconhece um epítopo descontínuo que compreende duas sequências lineares: uma dentro do domínio de ligação de microtúbulos R4 e outra no domínio de terminal C.

[0281] A sequência dividida por peptídeos 83-85 compreende os resíduos de aminoácidos 337-343 de htau40. Os dados de Pepspot (JPT) sugerem que a NI-105.4E4 reconhece um epítopo em hTau que compreende os aminoácidos 337-343 da tau humana. Esta região está localizada dentro do domínio de ligação de microtúbulos de tau e é conservada entre todas as isoformas da tau neuronais humanas, bem como através de outras espécies, incluindo camundongos e ratos.

[0282] Uma vez que este domínio está ligado aos microtúbulos em tau associada a microtúbulo fisiológico, NI-105.4E4 é esperado atingir preferencialmente agrupamento relevante de tau que é separado a partir dos microtúbulos.

[0283] Para determinar os resíduos chave dentro dos peptídeos de ligação NI-105.4E4, varredura de alanina foi realizada para substituir cada um dos resíduos com alanina um de cada vez. Os resíduos de alanina na sequência original (A384 e A390) foram substituídos por prolina e glicina (Figura 4E). Manchas 35-50 e 51-68 (Figura 4C), são os peptídeos originais (ponto 35 e ponto 51) e as suas variantes substituídas por alanina, cujas sequências de aminoácidos são mostradas na Figura 4D e E. A varredura de alanina sugere que V339, E342, D387, E391 e K395 são necessárias para a ligação de NI- 105.4E4.

[0284] Um experimento adicional foi realizado por meio de testes da ligação de NI-105.4E4 a peptídeos tau. ELISA direto mostra que, NI- 105.4E4 reconhece especificamente um peptídeo que corresponde aos aminoácidos 333-346 de htau40, que contém os resíduos de aminoácidos 337-343 identificados por mapeamento Pepspot (Figura 5). Qualquer reatividade cruzada de NI-105.4E4 é observada para o peptídeo de controle que abrange o epítopo AT180. Vice-versa, AT180 reconhece seu epítopo cognato contendo peptídeo, mas não consegue se ligar ao peptídeo NI-105.4E4 específico. As espécies de anticorpos específicos secundários não se ligam a qualquer um dos peptídeos. Juntos, ELISA direto com peptídeos revestidos confirmam que NI- 105.4E4 reconhece especificamente um peptídeo contendo os resíduos de aminoácidos 337-343 da tau humana identificados por mapeamento Pepspot.

[0285] Para mapear grosseiramente o epítopo de ligação NI- 105.4A3 em hTau40, quatro polipeptídeos de domínio tau (domínio I, domínio II, domínio III e domínio IV) foram produzidos. Os fragmentos de DNA, sintetizados usando GeneArt® (Invitrogen), codificando cada domínio de Tau com 6xHis marcado na extremidade de terminal N foram clonados no vetor de expressão pRSET-A (Invitrogen), foram transfectados para E. coli BL21 (DE3) (New England Biolabs). As expressões de domínios de Tau marcados por His foram induzidas por IPTG a 0,5 mM durante seis horas antes de as bactérias terem sido lisadas com lisozima com sonicação. O lisado foi fervido durante cinco minutos antes de ser adicionalmente purificado com colunas de Ni-NTA Superflow (Qiagen). Os domínios de Tau marcados por His eluídos foram revestidos em placas de ELISA ou carregados em gel de poliacrilamida por Western Blot. Estes polipeptídeos de domínio de tau sequencialmente sobrepostos cobrem o comprimento total de htau40 (Figura 13A). Os domínios de tau purificados foram revestidos em placas de ELISA e a ligação de NI-105.4A3 foi testada. NI-105.4A3 se liga apenas ao domínio de tau I de comprimento total e a htau40, indicando que o epítopo está dentro da parte de terminal N de htau40 (aa1-136) (Figura 13B). Western blot confirmou a ligação específica de NI-105.4A3 ao domínio de tau I (Figura 13C).

[0286] O mapeamento de epítopos NI-105.4A3 com tecnologia PepSpot (JPT) identificou aminoácidos Q35-Q49 de Tau40 humana (Figuras 14A e C). Para determinar os resíduos chave dentro do epítopo para a ligação de NI-105.4A3, a varredura de alanina foi realizada para substituir cada um dos resíduos com alanina um de cada vez. O resíduo de alanina na sequência original (A41), foi substituído por glicina ou prolina (Figura 14B). Pontos numerados da esquerda para a direita, com 1 e 17 são o epítopo original (local 1) e as suas substituições de alanina, cujas sequências de aminoácidos são apresentadas na Figura 14C. A varredura de alanina mostrou que D40, A41 e K44 são resíduos chave para a ligação de NI-105.4A3.

Exemplo 4: Avaliação da ligação de NI-105.4E4 de formas fisiológicas, bem como agregados patológicos de tecidos cerebrais de AD de tau e em camundongos transgênicos de tau humana.

[0287] Emaranhados neurofibrilares (NFT), compostos por filamentos de tau hiperfosforilados são uma das características neuropatológicas de AD. Filamentos de tau hiperfosforilados são também os principais componentes de neurites distróficas e fios neuropil, ambos os quais são características neuropatológicas comuns em AD. A superexpressão da proteína tau humana contendo a mutação de tau familiar P301L em camundongos induz a formação de NFT em seis meses de idade (Gotz et al., 2001a).

[0288] Para avaliar a ligação de anticorpo de tau humana recombinante para as formas fisiológicas, bem como agregados patológicos de tau, colorações imuno-histológicas foram realizadas em tecidos cerebrais de AD e em camundongos transgênicos de TauP301L com o anticorpo NI-105.4E4 exemplar da presente invenção.

[0289] Os camundongos foram perfundidos com 20 ml de TrisCl a 100 mM/EGTA a 6 mM (pH 7,4) à temperatura ambiente, sob anestesia profunda. Os cérebros foram removidos e imersos em PFA a 4% em PBS (pH 7,4) a 4°C durante a noite para a fixação, seguido por inclusão em parafina. Para os tecidos humanos, os blocos de parafina de tecido cerebral de sujeitos de controle saudáveis e AD foram usados. A coloração de DAB foi realizada seguindo os protocolos padrão. Como controle positivo, o anticorpo monoclonal de camundongo Tau-12 (Covance, California, USA) foi usado. Os anticorpos de detecção de conjugados de HRP primários foram também incluídos.

[0290] O anticorpo humano recombinante NI-105.4E4 identifica diversos NFTs e fios neuropil no cérebro de AD (Figura 6A), os quais estão ausentes no cérebro saudáveis (Figura 6B). O anticorpo secundário sozinho não dá sinais em cérebro de AD (Figura 6C) e de controle (Figura 6D). No cérebro de camundongo transgênico de tau P301L, NI-105.4E4 se liga fortemente a NFT similar de proteína tau patológica (Figuras 6 E, F e H), fios neuropil (Figuras 6E e G) e neurites distróficas (Figuras 6E e H). Além disso, NI-105.4E4 também identifica agregados de tau na fase de pré-emaranhado (Figura 6I). No cérebro de camundongos transgênicos superexpressando tanto tau P301L humana e APP humana com mutações Swedish e Arctic, NI-105.4E4 se liga especificamente a neurites distróficas em torno de placas beta- amiloide (figura 6J).

Exemplo 5: Testes in vivo dos anticorpos da presente invenção

[0291] Como já foi descrito acima, os estudos em linhagens de camundongo transgênico usando vacinação ativa com peptídeos fosforilados da tau revelaram níveis cerebrais reduzidos de agregados de tau no cérebro e reduziram a progressão da deficiência de comportamento (Sigurdsson, J. Alzheimers Dis. 15 (2008), 157168; Boimel et al., Exp. Neurol. 224 (2010), 472-485). No entanto, a vacinação ativa pode não ser particularmente utilizável em seres humanos, pois uma parte significativa da população idosa deverá ser não responder à vacinação. Além disso, os efeitos colaterais potenciais associados a uma resposta imune direcionada a tau pode ser difícil de controlar. Moléculas de ligação de Tau da presente invenção podem ser razoavelmente esperadas obter reduções similares em níveis cerebrais de agregados de tau como descrito acima para os anticorpos de camundongo, devido às suas especificidades de ligação similares contra espécies de tau patológicas. No entanto, devido à optimização evolutivamente e maturação da afinidade de anticorpos humanos dentro do sistema imunitário da presente invenção prover uma valiosa ferramenta terapêutica devido a ser isolada a partir de indivíduos humanos saudáveis com alta probabilidade para o excelente perfil de segurança e falta de imunogenicidade. A confirmação de tais efeitos terapêuticos esperados pode ser fornecida por meio de métodos de ensaio, tal como descrito nos experimentos acima mencionados, com anticorpos de camundongo. Em particular, os anticorpos a serem rastreados podem ser aplicados em diversas vias possíveis para os animais, tais como a injeção de anticorpo intraperitoneal, injeção intracraniana, infusão cerebral e intraventricular e testados para efeitos de tratamento. Qualquer uma das possibilidades de aplicação acima mencionadas pode ser também usada após a injeção cerebral anterior de preparações de beta-amiloide no cérebro de camundongos transgênicos de tau para avaliar os efeitos do tratamento sobre a patologia de tau induzida por beta-amiloide.

[0292] A avaliação dos efeitos do tratamento pode ser realizada por métodos histoquímicos compreendendo a quantificação de contagens positivas Gallyas, células de coloração de tau humana total, carga cerebral de tau fosforilada e/ou determinação bioquímica de tau solúvel ou insolúvel do cérebro e níveis de tau solúvel e insolúvel de fósforo até a extração de cérebro sequencial. Em seguida, testes de comportamento dos camundongos tratados podem ser realizados, por exemplo, a aversão ao sabor condicionado ou o condicionamento do medo contextual para uma confirmação dos efeitos terapêuticos dos anticorpos da presente invenção (Pennanen, Genes Brain Behav. 5 (2006), 369-79, Pennanen Neurobiol Dis. 15 (2004), 500-9).

Exemplo 6: Quimerização de anticorpos 4E4 e 4A3 com domínios constantes de IgG2a de camundongo

[0293] De modo a gerar anticorpos com imunogenicidade reduzida para a utilização em estudos de tratamento crônico, as versões quiméricas de anticorpos 4E4 e 4A3 foram geradas usando tecnologia de DNA recombinante. Um isotipo de camundongo IgG2a/lambda foi selecionado para estes anticorpos quiméricos, de modo a gerar uma molécula que se liga com uma elevada afinidade a receptores de Fc- gama de camundongo, e foi, portanto, capaz de induzir uma resposta imune efetora. As sequências de aminoácidos de construtos de cadeias leve e pesada de 4E4 quimérico (ch4E4) e 4A3 quimérico (ch4A3) são mostradas abaixo. Tabela 3: As sequências de aminoácidos de 4E4 quimérico (ch4E4 e 4A3 quimérico (ch4A3).

Exemplo 7: Quimerização de anticorpos 4E4 e 4A3 com domínios constantes de IgG2a de camundongo

[0294] Um local de glicosilação N-ligado de consenso foi identificado na região CDR1 da cadeia pesada 4E4. Após a expressão em células de mamífero (CHO), o local previsto de N-glicosilação (Asn- 30) foi totalmente ocupado por glicanos, como demonstrado por espectrometria de massa. Com a finalidade de eliminar a N-glicosilação na região e reduzir a heterogeneidade do produto, Asn-30 de cadeia pesada de ch4E4 foi mudado para Gln (Tabela 4). Quando produzido e purificado a partir de células CHO, o anticorpo modificado ligado a tau recombinante com ~ 4 vezes maior afinidade de ligação aparente em relação ao anticorpo original e glicosilado (vide figura 15). Tabela 4: As sequências de aminoácidos de cadeia pesada madura ch4E4 (N30Q) (IgG2a de camundongo). O resíduo Gln substituído está em negrito, sublinhado.

Exemplo 8: Produção de 4E4 quimérico não glicosilado (ch4E4 (N30Q) mIgG1 Agly)

[0295] Uma variante não glicosilada quimérica de camundongo de 4E4 foi produzida (ch4E4 (N30Q) IgG1-Agly), com a finalidade de avaliar a relação entre a função efetora e atividade de anticorpo. Para a cadeia pesada, o domínio variável de 4E4 foi fundido para uma região constante de cadeia pesada de IgG1 de camundongo contendo uma mutação Asn para Gln para eliminar o local de glicosilação de Fc de consenso. A região variável de cadeia pesada continha também a alteração de N30Q, com a finalidade de eliminar o local de consenso de N-glicosilação em CDR1 (Exemplo 7). A cadeia leve foi a cadeia leve de lambda ch4E4 descrita acima.

Exemplo 9: Estudo de penetração cerebral aguda de 4E4 e 4A3 humanos

[0296] 4E4 e 4A3 humanas foram produzidas por transfecção transitória de células CHO e purificadas por purificação por afinidade. Os níveis de endotoxina foram controlados e estavam todos abaixo de 1 EU/mg. Camundongos TauP301L foram injetados intraperitone- almente com 30 mg/kg de 4E4 (n = 7), anticorpo 4A3 (n = 7) ou volume igual de PBS (n = 7) no dia 1 e no dia 4. No dia 5, os camundongos foram perfundidos sob anestesia com PBS contendo 1 unidade/ml de heparina. O sangue, cérebro, e medula espinhal foram coletados para análise. O hemisfério direito do cérebro foi congelado a -80°C, o hemisfério esquerdo do cérebro e a medula espinhal foram pós-fixados em formalina a 10% neutralizada a 4°C durante dois dias antes de serem incorporados no bloco de parafina e seccionados. O plasma foi armazenado a -80°C em alíquotas.

[0297] A extração de proteínas do cérebro: o hemisfério direito congelado foi pesado e homogeneizado em 5 volumes (5 ml/g de tecido úmido) de uma solução contendo NaCl a 50 mM, 0,2% de dietilamina, inibidores de protease (Roche Diagnostics GmbH) e inibidor de fosfatase (Roche Diagnostics GmbH). As amostras foram então transferidas para tubos de policarbonato e adicionados outros 5 volumes de solução de homogeneização, e mantidas em gelo durante 30 min. A fração solúvel foi então recolhida após centrifugação a 100.000 g, 4°C durante 30 min. Esta fração solúvel foi usada no ensaio de IgG humana. O sedimento foi ressuspenso em 3 volumes de PBS, com a protease e inibidores de fosfatase. Após a centrifugação a 16000 g, 4°C durante 30 minutos, os sobrenadantes e os péletes foram armazenados separadamente a -80°C para a extração de tau insolúvel. Os péletes adicionalmente extraídos com extração de sarcosila modificada (Goedert M, Spillantini MG, Cairns NJ, Crowther RA. Neuron 8, 159 (1992)).

[0298] Sanduíche ELISA específico de IgG humana: 2 μg/ml de IgG Fab anti-humana de cabra (Jackson) em tampão de revestimento de ELISA de carbonato a 50 mM (pH 9,6) foram usados como anticorpo de captura. Placas de microtitulação de 96 poços de área média foram revestidas com 30 μl/poço de anticorpo de captura, a 4°C durante a noite. A placa foi então lavada 4 vezes com PBS contendo 0,1% de Tween 20 antes da incubação com 50 μl/poço de PBS contendo 2% de BSA à temperatura ambiente durante uma hora. As frações solúveis de extratos de cérebro, amostras de plasma e padrões de anticorpo (4A3) foram diluídos em PBS contendo 2% de BSA e 0,1% de Tween 20. 30 μl das amostras diluídas foram adicionados a cada poço e incubados à temperatura ambiente durante uma hora. A placa foi então lavada com 200 μl/poço de PBS contendo 0,1% de Tween 20 por quatro vezes, antes incubada com Fcy anti-humano de jumento conjugado com HRP (Jackson, diluído em 1:10000 em PBS contendo 2% de BSA e 0,1% de Tween 20) à temperatura ambiente durante uma hora. A placa foi então lavada com 200 μl/poço de PBS contendo 0,1% de Tween 20 por quatro vezes antes da adição de 20 μl/poço de TMB (1:20 em 10 mM de solução de citrato de pH = 4,1). A reação foi então parada pela adição de 10 μl de H2SO4 para cada poço. A curva padrão de anticorpo foi obtida a partir de diluições em série de 4A3. As concentrações de anticorpos em amostras de cérebro e plasma foram calculadas de acordo com as normas. O nível de IgG cerebral humana foi então convertido para μg anticorpo/grama de tecido cerebral fresco (assumindo 1g/10 ml) tal como indicado na Figura 17.

[0299] Os níveis elevados de IgG humana foram detectados no plasma de todos os camundongos 4E4 e 4A3 tratados. Em contraste, nenhuma IgG humana foi detectada no plasma dos camundongos tratados com PBS (Figura 16). A quantidade significativa de IgG humana foi detectada em homogenados de cérebro de camundongos tratados 4E4 e 4A3 (Figura 17).

Exemplo 10: Estudo crônico com 4E4 e 4A3 quiméricos.

[0300] 4E4 e 4A3 quiméricos contendo os domínios variáveis do anticorpo de origem humana e as regiões constantes de IgG2a de camundongo podem ser produzidos por transfecção transitória de células CHO e purificados por purificação por afinidade. Os níveis de endotoxinas em cada lote de anticorpos serão controlados e mantidos abaixo de 1 EU/mg. Camundongos TauP301L de gênero equilibrado em idade de 7,5 a 8 meses serão injetados intraperitonealmente com 10 mg/kg, 3 mg/kg de uma solução de anticorpo, ou volume igual de PBS de controle. Cada grupo de tratamento terá 20 a 25 camundongos. O tratamento será realizado uma vez por semana durante 26 semanas. Alternativamente, o tratamento será efetuado duas vezes por semana durante 13 semanas. O peso corporal será monitorado de duas em duas semanas. Os camundongos serão perfundidos sob anestesia no final do período de tratamento. O sangue, cérebro, e medula espinhal serão coletados. As metades do cérebro e da espinal medula podem ser pós- fixadas em formalina a 10%, durante três dias antes de serem incorporadas no bloco de parafina. 4 a 6 μM de espessura cortados a partir destes blocos de tecido podem ser usados para estudos imuno- histoquímicos. A outra metade do cérebro será pesada e congelada a - 80°C para análise bioquímica.

[0301] Os efeitos do fármaco serão avaliados por comparação do nível de emaranhados neurofibrilares (NFT), e o nível de tau, com características de solubilidade diferentes em amostras de ensaio e de controle. NFT pode ser visualizada por impregnação de prata Gallyas (F Gallyas Acta Morphol. Acad. Sci. Hung 19.1 (1971)), ou por imunocolo- ração com anticorpo monoclonal de camundongos AT100 e AT180, que reconhecem tau patologicamente fosforilada em NFT. O número ou a frequência dos neurônios positivos de Gallyas e/ou AT100, AT180 marcados no cérebro e na medula espinal em camundongos tratados com anticorpo e animais de controle podem ser determinados para avaliar o efeito do tratamento com o anticorpo.

[0302] Tau solúvel e insolúvel podem ser extraídas, seguindo o protocolo de extração de proteína do cérebro aqui descrito. Alternativamente, tau solúvel e insolúvel podem ser extraídas com extração de sarcosila modificada (Goedert M, Spillantini MG, Cairns NJ, Crowther RA. Neuron 8, 159 (1992)). Resumidamente, o cérebro congelado é homogeneizado em 10 volumes (p/v) de tampão de sacarose a 10%, homogeneizado de consistindo em Tris • HCl a 10 mM (pH 7,4), NaCl a 0,8 M, EGTA a 1 mM, Na3VO4 a 1 mM, NaF a 1 mM, AEBSF a 1 mM, inibidores da protease (Roche Diagnostics GmbH) e inibidor de fosfatase (Roche Diagnostics GmbH). O homogenato é centrifugado durante 20 min a 20.000 g e o sobrenadante retido. O sedimento é homogeneizado em 10 volumes de tampão de homogeneização e centrifugado por uma segunda vez. Os sobrenadantes podem ser agrupados em conjunto, e sarcosinato de N-laurila (Sigma) é adicionado a 1% (p/v) de concentração final e incubado a 37°C com 300 rpm de rotação, durante 1,5 hora, seguido de centrifugação a 100.000 g durante 1 h. O sobrenadante é recolhido como fração solúvel de sarcosila e o pélete de 1 g de tecido cerebral é ressuspenso em 0,2 ml de Tris • HCl a 50 mM (pH 7,4) como fração de PHF.

[0303] Os níveis de tau solúvel e insolúvel serão medidos com kits de ELISA de Tau comercialmente disponíveis (Invitrogen). Além disso, os extratos de proteína do cérebro serão separados com 4 a 12% de Bis-Tris de SDS-PAGE seguidos de imunotransferência com anticorpos Tau12 (tau humano), AT8 (pS202/pT205), AT100 (pT212/pS214), AT180 (pT231) e E178 ( pS396). A análise semiquantitativa será realizada com a medição da densidade integrada de cada amostra de acordo com normas de quantidades conhecidas de tau.

[0304] Além disso, os testes de comportamento podem ser realizados como indicado no Exemplo 5, acima. Por exemplo, a melhoria da memória de trabalho, em camundongos tratados com anticorpo TauP301L pode ser testada usando um ensaio de duas tarefas de labirinto Y (por exemplo, Pennanen, Genes Brain Behav. 5 (2006), 369-79, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade). Os três braços do labirinto são de 22 centímetros de comprimento, 5 cm de largura e 15 cm de profundidade. Pistas abstrativas pretas e brancas são colocadas sobre uma cortina preta em torno do labirinto. As experiências são realizadas com um nível de luz ambiente, de 6 lux durante a fase escura. Cada experimento compreende uma sessão de treinamento e uma sessão de observação. Durante a sessão de treinamento, um camundongo é atribuído a dois dos três braços (o braço inicial e o segundo braço), que podem ser livremente explorados durante 4 min, sem acesso para o terceiro braço (o braço novo). O camundongo é em seguida removido do labirinto e mantido em uma gaiola de retenção por 1,5 a 5 min, enquanto que o labirinto é cuidadosamente limpo com etanol a 70% para remover quaisquer pistas olfativas. O camundongo é então colocado de volta no labirinto para observação com todos os três braços acessíveis por 4 min. A sequência de entradas, o número de entrada de cada braço e o tempo passado em cada braço é gravado. Uma vez que a razão entre o tempo gasto no novo terceiro braço sobre a média de tempo gasto nos outros dois braços (braço inicial e o segundo braço) é calculada e comparada entre os grupos de tratamento diferentes em modelo de camundongo e camundongos do tipo selvagem de controle correspondente. Roedores geralmente preferem investigar um novo braço do labirinto em vez de retornar para aquele que foi visitado anteriormente. Os efeitos dos anticorpos podem ser monitorados no que diz respeito a recuperação desta preferência por camundongos de modelo de tauopatia tratados, em comparação com o comportamento não- discriminativo de camundongos não tratados devido à sua perda de memória de trabalho relacionada com distúrbios. Portanto, uma estreita razão para 1 indica memória de trabalho prejudicada. A maior proporção indica melhor memória de trabalho. Memória de trabalho diminuída nos camundongos TauP301L é considerada como sendo devido à patologia de tau que resulta da superexpressão da proteína de tau humana. Portanto, uma razão significativamente mais elevada observada em camundongos TauP301L tratados pelo anticorpo anti-tau do que nos camundongos de controle TauP301L indicará que o anticorpo anti-tau tem efeito terapêutico sobre a patologia de tau.

[0305] A presente invenção não deve ser limitada no seu escopo pelas modalidades específicas descritas ase quais se destinam a ser ilustrações simples de aspectos individuais da invenção, e quaisquer composições ou métodos que são funcionalmente equivalentes estão dentro do escopo da presente invenção. Na verdade, diversas modificações da invenção além das aqui mostradas e descritas serão evidentes para os versados na técnica a partir da descrição acima mencionada e dos desenhos em anexo. Tais modificações se destinam a estar dentro do escopo das reivindicações em anexo.

Claims

1. Anticorpo monoclonal anti-tau humano isolado, ou fragmento de ligação à tau do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada compreendendo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 23, 24 e 25, respectivamente, e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve compreendendo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 26, 27 e 28, respectivamente; ou (b) uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada compreendendo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 35, 36, 37, respectivamente, e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve compreendendo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 38, 39 e 40, respectivamente, em que o anticorpo anti-tau ou o fragmento de ligação a tau do mesmo está: (c) marcado de forma detectável, em que o marcador detectável é selecionado do grupo que consiste em uma enzima, um radioisótopo, um fluoróforo e um metal pesado; (d) ligado a um fármaco; ou (e) conjugado com uma região constante de imunoglobulina não humana.

2. Anticorpo ou fragmento de ligação à tau do mesmo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) uma região variável da cadeia pesada e uma região variável da cadeia leve compreendendo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 e 11, respectivamente; (b) uma região variável da cadeia pesada e uma região variável da cadeia leve compreendendo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 93 e 11, respectivamente; ou (c) uma região variável da cadeia pesada e uma região variável da cadeia leve compreendendo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 e 19, respectivamente.

3. Anticorpo ou fragmento de ligação à tau do mesmo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que é um fragmento de ligação a tau selecionado do grupo que consiste em um fragmento Fv de cadeia única (scFv), um fragmento F(ab'), um fragmento F(ab), e um fragmento F(ab')2.

4. Polinucleotídeo ou polinucleotídeos, caracterizado(s) pelo fato de que codifica(m) o anticorpo anti-tau ou fragmento de ligação a tau do mesmo, compreendendo uma sequência de ácido nucleico ou sequências de ácido nucleico estabelecidas em SEQ ID NO:8 e SEQ ID NO:10.

5. Polinucleotídeo ou polinucleotídeos, caracterizado(s) pelo fato de que codifica(m) um anticorpo anti-tau ou fragmento de ligação a tau do mesmo compreendendo uma sequência de ácido nucleico ou sequências de ácido nucleico estabelecidas em SEQ ID NO: 16 e SEQ ID NO: 18.

6. Vetor ou vetores, caracterizado(s) pelo fato de que compreende(m) o polinucleotídeo, como definido na reivindicação 4 ou 5.

7. Método para preparar um anticorpo anti-tau ou fragmento de ligação a tau do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) cultivar uma célula hospedeira compreendendo os polinucleotídeos apresentados em SEQ ID NOs.: 8 e 10; e (b) isolar o referido anticorpo ou fragmento de ligação a tau do mesmo da cultura.

8. Método para a preparação de um anticorpo anti-tau ou fragmento de ligação à tau do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) cultivar uma célula compreendendo os polinucleotídeos estabelecidos nas SEQ ID NOs.: 16 e 18, e (b) isolar o referido anticorpo ou fragmento de ligação à tau do mesmo a partir da cultura.

9. Anticorpo anti-tau ou fragmento de ligação à tau do mesmo, caracterizado pelo fato de que é codificado pelo polinucleotídeo ou polinucleotídeos, como definido(s) na reivindicação 4 ou 5 ou obtenível pelo método como definido na reivindicação 7 ou 8.

10. Anticorpo ou fragmento de ligação à tau do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 ou 9, caracterizado pelo fato de que é: marcado de forma detectável, em que o marcador detectável é selecionado a partir do grupo que consiste em uma enzima, um radioisótopo, um fluoróforo, e um metal pesado.

11. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo ou fragmento de ligação à tau do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, 9 ou 10, o polinucleotídeo ou polinucleotídeos como definido(s) na reivindicação 4 ou 5, ou o vetor ou vetores como definido(s) na reivindicação 6, em que a composição é: 1. ) uma composição farmacêutica que compreende ainda um veículo farmaceuticamente aceitável, ou 11. ) uma composição de diagnóstico que compreende ainda um ou mais reagentes convencionalmente usados em métodos de diagnóstico baseados em ácidos nucleicos ou imunes.

12. Composição, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um agente neuroprotetor útil para o tratamento de uma tauopatia neurodegenerativa.

13. Método in vitro de diagnóstico ou monitoramento da progressão de um tauopatia neurodegenerativa em um indivíduo humano, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) avaliar o nível de tau modificada ou agregada patologicamente em uma amostra a partir de do indivíduo humano a ser diagnosticado com pelo menos um anticorpo, como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, 9 ou 10; e (b) comparar o nível de tau modificada ou agregada a um padrão de referência que indica o nível de tau patologicamente modificada ou agregada de um ou mais indivíduos humanos de controle, em que uma diferença ou semelhança entre o nível de tau modificada ou agregada patologicamente e o padrão de referência indica que o indivíduo tem uma tauopatia neurodegenerativa, em que o tauopatia neurodegenerativa é selecionada a partir do grupo que consiste em doença de Alzheimer, complexo de esclerose lateral amiotrófica/parkinsonismo-demência, demência de grãos argirofílicos, angiopatia amiloide tipo Britânica, angiopatia amiloide cerebral, degeneração córtico-basal, doença de Creutzfeldt-Jakob, demência pugilistica, emaranhados neurofibrilares difusos com calcificação, síndrome de Down, demência frontotemporal, demência frontotemporal com parkinsonismo ligado ao cromossomo 17, degeneração lobar frontotemporal, doença de Gerstmann-Straussler-Scheinker, doença de Hallervorden-Spatz, miosite de corpos de inclusão, atrofia de múltiplos sistemas, distrofia miotônica, doença de Niemann-Pick tipo C, doença do neurônio motor não guamaniana com emaranhados neurofibrilares, doença de Pick, parkinsonismo pós-encefalite, angiopatia amiloide cerebral da proteína príon, gliose subcortical progressiva, paralisia supranuclear progressiva, panencefalite esclerosante subaguda, demência apenas de emaranhado, demência multi-infarto e acidente vascular cerebral isquêmico.

14. Método in vitro para diagnosticar uma tauopatia neurodegenerativa em um indivíduo humano, caracterizado pelo fato de que compreende a detecção da presença de tau que se liga ao anticorpo, como definido na reivindicação 1 ou 2, em uma amostra biológica do referido indivíduo.

15. Kit útil para o diagnóstico de uma tauopatia neurodege- nerativa, caracterizado pelo fato de que compreende o anticorpo ou fragmento de ligação à tau do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, 9 ou 10, o polinucleotídeo ou polinucleotídeos como definido(s) na reivindicação 4 ou 5, ou o vetor ou vetores como definido(s) na reivindicação 6, com os reagentes ou as instruções de uso.