CN113929779A

CN113929779A - 人源化的抗-Tau(pS422)抗体和使用方法

Info

Publication number: CN113929779A
Application number: CN202111222102.4A
Authority: CN
Inventors: T·埃姆里希; F·格吕宁格尔; A·胡根马特尔; E·默斯纳; S·登格尔; G·乔治斯; U·格普费特; A·约赫纳; H·克腾伯格; J·莫莱肯; O·穆恩迪格尔; J·尼韦纳; T·施洛特豪尔; M·莫尔霍伊; K·布雷迪
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2015-06-24
Filing date: 2016-06-22
Publication date: 2022-01-14
Also published as: CN107810196B; EP3313877A1; AR105089A1; US11572404B2; WO2016207245A1; CN107810196A; US20180079804A1; ES2809728T3; US20230265177A1; JP2018520133A; US9862763B2; JP6965328B2; US10822402B2; JP6619460B2; PL3313877T3; JP7257482B2; US20210139571A1; TW201708254A; JP2022023149A; JP2020037580A

Abstract

本发明提供了人源化的抗‑Tau(pS422)抗体和使用方法。

Description

人源化的抗-Tau(pS422)抗体和使用方法

本申请为2016年6月22日提交的、发明名称为“人源化的抗-Tau(pS422)抗体和使用方法”的PCT申请PCT/EP2016/064465的分案申请，所述PCT申请进入中国国家阶段的日期为2017年12月22日，申请号为201680036961.5。

发明领域

本发明涉及特异结合SEQ ID NO：03的磷酸化的Tau片段的人源化的抗-Tau(pS422)抗体，及其用于治疗脑疾病的用途。

背景

人Tau(微管相关蛋白Tau(神经原纤维缠结蛋白，配对螺旋丝-Tau(Pairedhelicalfilament-Tau)，PHF-Tau))是主要在轴突中发现的神经元的微管相关蛋白，其功能是促进微管蛋白聚合并稳定微管。在人脑中发现八种同种型(同种型A、B、C、D、E、F、G、胎儿-Tau)，最长的同种型包含441个氨基酸(同种型F，Uniprot P10636-8)。Tau及其性质也被Reynolds,C.H.等人，J.Neurochem.69(1997)191-198描述。

处于超磷酸化形式的Tau是配对螺旋丝(PHF)的主要成分，配对螺旋丝(PHF)是阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)脑中神经原纤维损伤的结构单元。Tau可在其丝氨酸或苏氨酸残基被数种不同的激酶(包括GSK3β、cdk5、MARK和MAP激酶家族的成员)磷酸化。

Tau病(tauopathies)以Tau的异常超磷酸化为特征，并且根据Iqbal,K.等人(Biochim.Biophysica Acta 1739(2005)198-210)，Tau病是：

·阿尔茨海默病(Alzheimer disease)，包括该病的仅有缠结的形式(tangle-only form)

·唐氏综合征，成人病例(Down syndrome,adult cases)

·关岛型帕金森综合征痴呆复合征(Guam Parkinsonism dementia complex)

·拳击员痴呆(Dementia pugilistica)

·皮克病(Pick disease)

·具有嗜银颗粒的痴呆(Dementia with argyrophilic grains)

·额颞叶痴呆(Fronto-temporal dementia)

·皮质基底节变性(Cortico-basal degeneration)

·苍白球脑桥黑质变性(Pallido-ponto-nigral degeneration)

·进行性核上性麻痹(Progressive supranuclear palsy)

·具有缠结的格-施-沙病(Gerstmann-

-Scheinker diseasewithtangles)。

迄今为止，在阿尔茨海默病的脑中已经发现近40个丝氨酸(S)/苏氨酸(T)磷酸化位点(Hanger,D.P.等人，J.Biol.Chem.282(2007)23645-23654)。在阿尔茨海默病中Tau病理学的发展与其磷酸化状态有关。然而，40个磷酸化位点的大部分不与疾病病理学相关，因为它们也在从健康的、胎儿脑组织提取的Tau中发现。仅有一些磷酸化位点是疾病状态特有的，推测其负责异常的、聚集和特征性的不溶性，它们定义了阿尔茨海默脑PHFs中的Tau(Morishima-Kawashima,M.等人，J.Biol.Chem.270(1995)823-829)。根据Pei,J.J.等人，(J.Alzheimer’s Disease 14(2008)385-392)，现有文献对于这些位点中的哪些是AD脑特异性的提供了有限且不清楚的信息。Pei使用一系列Tau的磷酸特异性抗体并测量它们在来自22个AD患者和10个对照的内侧颞叶皮质的匀浆中的水平。

Bussiere,T.等人(Acta Neuropathol.97(1999)221-230)描述了Tau蛋白上磷酸化的丝氨酸422(pS422)是在数种具有神经原纤维变性的疾病中发现的病理性表位。Augustinack,J.C.等人(Acta Neuropathol 103(2002)26-35)描述了pS422与阿尔茨海默病中神经元病理学的严重性相关。Guillozet-Bongaarts,A.J.Neurochem 97(2006)1005-1014描述了Tau在丝氨酸422的磷酸化是PHFs成熟过程的一部分。也发现Tau pS422与阿尔茨海默病的各种转基因小鼠模型中的病理学发展相关。因此，Deters,N.等人在Biochem.Biophys.Res.Commun.379(2009)400-405中提到双重转基因Dom5/pR5小鼠显示7倍数目增加的含有特异性磷酸化病理性S422表位的海马神经元。Goetz,J.等人(Science293(2001)1491-1495)报道注射Aβ42原纤维的Tau P301L转基因小鼠脑中出现在S422处磷酸化的Tau。

EP 2 009 104涉及来自阿尔茨海默病PHFs的Tau蛋白磷酸化状态中存在的Tau蛋白的表位，以及所述表位用于产生特异性检测阿尔茨海默Tau蛋白的抗体中的应用。WO2002/062851和US 7,446,180涉及对异常截短形式的Tau蛋白具有特异性的抗体以及与阿尔茨海默病和相关Tau病有关的诊断和治疗方面。

WO 1998/22120涉及治疗患有阿尔茨海默病的患者的方法，包括向该患者施用针对氨基酸约207至约222，氨基酸约224至约240和氨基酸约390至约408的磷酸化Tau片段的抗体的步骤。使用磷酸化Tau片段379-408[P-Ser396，404]来疫苗接种Tau转基因小鼠的动物研究在Asuni,A.A.等人，J.Neuroscience 27(2007)9115-9129中提及。US2008/0050383涉及通过施用Tau蛋白片段治疗和预防受试者中阿尔茨海默病或其它Tau病的方法。

Hasegawa,M.，等人(FEBS Lett.384(1996)25-30)报道了对微管相关蛋白tau中磷酸丝氨酸422特异的单克隆抗体(AP422)。

在WO 2001/55725中，报道了用于体内诊断tau蛋白病变(tauopathy)和/或用于体内相对于非tau蛋白病变差异诊断tau蛋白病变的方法的特异识别tau的抗体和特异识别磷酸-tau(181)的抗体。

在WO 2002/027017中，报道了从具有磷酸化的丝氨酸的多肽免疫原制备的抗体。WO2002/062851涉及对Tau蛋白的异常截短形式具有特异性的抗体以及与阿尔茨海默病和相关Tau蛋白病变相关的诊断和治疗方面。

在WO 2004/016655中，报道了对中枢神经系统(CNS)Tau蛋白特异的抗体，其中所述抗体特异识别CNS Tau蛋白，但不识别外周Tau蛋白，并且其中所述抗体特异识别作为表位的由编码Tau蛋白的基因的外显子4编码的氨基酸序列和由其外显子5编码的氨基酸序列之间的连接部分的氨基酸序列。

针对Tau pS422的单克隆抗体在例如EP 1 876 185中描述。针对Tau pS422的多克隆抗体是可商购的(例如ProSci Inc.和Biosource International)。

在WO 2006/055178中，报道了抑制tau蛋白在Ser202/Thr205处的磷酸化的方法，所述方法包括将含有tau蛋白的样品与结合淀粉样蛋白β-衍生的扩散性配体的抗体或抗原结合片段相接触，由此抑制tau蛋白在Ser202/Thr205处的磷酸化。

在WO 2007/019273中报道了特异结合在tyr394和/或tyr310处磷酸化的tau的抗体制剂。在Asuni,A.A.等人，J.Neuroscience 27(2007)9115-9129中提及其中磷酸化的Tau片段379-408[P-Ser396，404]用于免疫接种Tau转基因小鼠的动物研究。

EP 2 009 104涉及来自阿尔茨海默病PHFs的Tau蛋白中以磷酸化状态出现的Tau蛋白的表位，并涉及所述表位用于产生特异检测阿尔茨海默病Tau蛋白的抗体的用途。

US 2008/0050383涉及通过施用Tau蛋白片段治疗和预防受试者中阿尔茨海默病或其他Tau蛋白病变的方法。

在WO 2010/037135中，报道了分离的、合成的或重组多肽或肽，其包含含有或由针对血脑屏障(BBB)受体的配体或等效物组成的第一结构域和含有或由减缓蛋白聚集体的聚集速率、抑制蛋白聚集体的形成，或逆转、消化或溶解蛋白聚集体的酶或组合物组成的第二结构域。在WO2010/115843中报道了能够体外和/或体内识别和结合tau蛋白的抗体，特别是单克隆抗体或其功能部分。

在WO 2011/026031中，报道了特异结合tau寡聚物并且不结合可溶tau或tau纤丝的单克隆抗体或其片段，其用于治疗蛋白病变例如阿尔茨海默病、进行性核上性麻痹和皮质基底节变性。在WO 2011/053565中报道了特异结合在Ser(238)和Thr(245)中的一个或多个处磷酸化的人tau蛋白的分离的抗体。

在WO 2012/045882中，报道了特异结合哺乳动物Tau蛋白上的磷酸化表位的抗体，其用于治疗神经变性病症如Tau蛋白病变，和用于治疗或缓解认知缺陷。在WO 2012/049570中报道了人单克隆抗-tau抗体或其tau结合片段。在WO 2012/106363中报道了用于预防或治疗受试者中阿尔茨海默病或其他tau蛋白病变的方法，其包括向需要对于阿尔茨海默病或其他tau蛋白病变的治疗的人施用抗体，所述抗体对tau蛋白的异常形式具有特异性，所述抗体对正常tau蛋白不显示结合和/或反应性，并且在有效预防或治疗阿尔茨海默病或其他tau蛋白病变的条件下和以有效预防或治疗阿尔茨海默病或其他tau蛋白病变的量施用。

在WO 2012/149365中，报道了对聚集的tau显示反应性并且对非聚集的Tau基本上不显示反应性的抗体，其中所述聚集的tau包含直接或通过接头在一个或多个半胱氨酸处彼此交联的至少两个tau蛋白。

在WO 2010/142423中报道了用于治疗Tau蛋白病变例如阿尔茨海默病的组合物，其包含结合Tau的抗体、在特异结合特定的磷酸化的Tau的特定位置处磷酸化的丝氨酸修饰的化合物及其片段以及载体。

在EP 1 876 185A中，报道了识别磷酸化的多肽的抗体。在WO 2013/151762中，报道了人源化的tau抗体。在WO 2014/016737中，报道了针对人磷酸化的tau的新的鸡单克隆抗体及其用途。在WO 2014/016737中报道了针对人磷酸化的tau的新的鸡蛋克隆抗体及其用途。在WO 2012/149365中报道了对病理性的tau二聚体和前丝状病理性tau寡聚物具有选择性的抗体和它们在治疗、诊断和监控Tau蛋白病变中的用途。

在WO2015/091656中报道了人源化抗τ(pS422)抗体和使用方法。在WO2015/101586中报道了双特异性抗半抗原/抗血脑屏障受体抗体、其复合物及其作为血脑屏障穿梭物的用途。

发明概述

本发明提供抗人Tau(pS422)抗体，尤其是人源化的抗人Tau(pS422)抗体，及其使用方法。

如本文报道的人源化的抗体不可通过标准人源化方法获得。其需要在氨基酸序列中引入非标准突变，以获得具有与包含具有SEQ ID NO：07和SEQ ID NO：11的氨基酸序列的可变结构域的亲本兔抗体相当的结合特性和药物动力学性质的人源化的抗体。这是特别重要的，因为如本文报道的抗体意在跨过人血脑屏障并且在人脑内起作用。因此，在当前情形中，为了直接应用，通常应用的对于人源化的抗体的选择标准不足够严格。

如本文报道的一个方面是特异结合人Tau(pS422)的(人源化的)抗体，其中所述抗体

i)特异结合具有SEQ ID NO：03的氨基酸序列的多肽，和/或

ii)不以1μg/mL结合全长人Tau(SEQ ID NO:01)，和/或

iii)特异结合在位置422处的丝氨酸处磷酸化的全长人Tau(SEQ ID NO：02)，和/或

iv)特异结合在位置422处的丝氨酸处磷酸化的人Tau(SEQ ID NO：02)的聚集体，和/或

v)特异结合具有SEQ ID NO：01的氨基酸序列并且具有氨基酸突变S422A的人Tau。

如本文报道的抗体显示关于在位置422处的丝氨酸处磷酸化的人Tau，关于未磷酸化的野生型人Tau和Tau突变体S422A的选择性。所述未磷酸化的野生型人Tau和所述Tau突变体S422A分别根本不被结合或以较低的亲和力被结合。

本文报道的一个方面是(人源化的)抗人Tau(pS422)单克隆抗体，其是通过将Mab086的HVR嫁接到人构架区和恒定区上产生的抗体Mab086的人源化变体，其中选择的人可变区构架残基任选被如下取代：

当氨基酸(1)直接非共价结合抗原，(2)与HVR区域相邻，(3)或者与HVR区相互作用，或(4)参与VL-VH界面时，选择的人可变区构架残基被来自兔Mab 086抗体的等同构架氨基酸取代；或者

在该位置人免疫球蛋白异常的人构架氨基酸被来自兔供体抗体的等同位置的氨基酸或来自更典型的人免疫球蛋白的等同位置的氨基酸取代。

如本文报道的一个方面是特异结合包含SEQ ID NO：02的氨基酸序列的人Tau(pS422)的(人源化的)抗体，其中所述抗体具有针对Tau(pS422)诱导的细胞毒性的抑制活性，并且其中所述抗体结合人Tau(pS422)蛋白的片段，并且其中所述片段包含SEQ ID NO：02的氨基酸残基416-430，并且其中所述抗体包含人恒定区，其中所述抗体选自以下(1)至(2)中的任一个；

(1)

(a)抗体，其包含具有SEQ ID NO：08的氨基酸序列作为HVR-H1，SEQ ID NO：09的氨基酸序列作为HVR-H2和SEQ ID NO：10的氨基酸序列作为HVR-H3的重链，以及具有SEQ IDNO：70的氨基酸序列作为HVR-L1，SEQ ID NO：72的氨基酸序列作为HVR-L2和SEQ ID NO：15的氨基酸序列作为HVR-L3的轻链；

或

(b)抗体，其包含具有SEQ ID NO：08的氨基酸序列作为HVR-H1，SEQ ID NO：09的氨基酸序列作为HVR-H2和SEQ ID NO：10的氨基酸序列作为HVR-H3的重链，以及具有SEQ IDNO：12的氨基酸序列作为HVR-L1，SEQ ID NO：14的氨基酸序列作为HVR-L2和SEQ ID NO：74的氨基酸序列作为HVR-L3的轻链；

或

(c)抗体，其包含具有SEQ ID NO：08的氨基酸序列作为HVR-H1，SEQ ID NO：09的氨基酸序列作为HVR-H2和SEQ ID NO：10的氨基酸序列作为HVR-H3的重链，以及具有SEQ IDNO：71的氨基酸序列作为HVR-L1，SEQ ID NO：73的氨基酸序列作为HVR-L2和SEQ ID NO：15的氨基酸序列作为HVR-L3的轻链；

或

(d)抗体，其包含具有SEQ ID NO：08的氨基酸序列作为HVR-H1，SEQ ID NO：77的氨基酸序列作为HVR-H2和SEQ ID NO：10的氨基酸序列作为HVR-H3的重链，具有SEQ ID NO：12的氨基酸序列作为HVR-L1，SEQ ID NO：14的氨基酸序列作为HVR-L2和SEQ ID NO：75的氨基酸序列作为HVR-L3的轻链；

(2)具有(1)的抗体中一个或多个保守氨基酸取代的抗体，其具有与(1)的抗体等效的活性。

a)在重链可变结构域中包含SEQ ID NO：08、18和10的HVR，或

b)在重链可变结构域中包含SEQ ID NO：08、09和10的HVR，或

c)在重链可变结构域中包含SEQ ID NO：08、77和10的HVR。

在一个优选的实施方案中，本文报道的人源化抗体在轻链可变结构域中的位置32具有赖氨酸(K)氨基酸残基(根据Kabat编号)。

在一个实施方案中，人源化抗体

a)在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO：71、73和15的HVR，或

b)在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO：70、72和15的HVR，或

c)在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO：12、14和79的HVR，或

d)在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO：71、81和15的HVR。

在一个实施方案中，本文报道的人源化抗体

a)在重链可变结构域中包含SEQ ID NO：08、18和10的HVR，并且在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO：13、14和15的HVR，或

b)在重链可变结构域中包含SEQ ID NO：08、09和10的HVR，并且在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO：12、05和15的HVR，或

c)在重链可变结构域中包含SEQ ID NO：08、09和10的HVR，并且在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO：13、14和15的HVR，或

d)在重链可变结构域中包含SEQ ID NO：08、09和10的HVR，并且在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO：71、73和15的HVR，或

e)在重链可变结构域中包含SEQ ID NO：08、09和10的HVR，并且在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO：70、72和15的HVR，或

f)在重链可变结构域中包含SEQ ID NO：08、77和10的HVR，并且在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO：12、14和79的HVR，或

g)在重链可变结构域中包含SEQ ID NO：08、09和10的HVR，并且在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO：12、14和79的HVR，或

h)在重链可变结构域中包含SEQ ID NO：08、77和10的HVR，并且在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO：71、81和15的HVR。

一个优选的方面是特异性结合人Tau(pS422)的人源化抗体，其中所述抗体包含来自VH35H5和VL31A1的HVR。

在一个实施方案中，特异性结合人Tau(pS422)的这种人源化抗体在重链可变结构域中包含SEQ ID NO：08、09和10的HVR，并且在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO：70、72和15的HVR。SEQ ID NO：70对应于HVR-L1的序列并且在根据Kabat的位置32处具有氨基酸残基赖氨酸。

在一个实施方案中，这种特异性结合人Tau(pS422)的人源化抗体包含具有SEQ IDNO：65的氨基酸序列的重链可变结构域和具有SEQ ID NO：66的氨基酸序列的轻链可变结构域。

一个优选的方面是特异性结合人Tau(pS422)的人源化抗体，其中所述抗体包含来自VH35H5和VL49G1的HVR。

在一个优选的实施方案中，特异性结合人Tau(pS422)的这种人源化抗体在重链可变结构域中包含SEQ ID NO：08、09和10的HVR，并且在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO：71、73和15的HVR。SEQ ID NO：71对应于HVR-L1的序列并且在根据Kabat的位置32处具有氨基酸残基赖氨酸。

在一个实施方案中，这种特异性结合人Tau(pS422)的人源化抗体包含具有SEQ IDNO：65的氨基酸序列的重链可变结构域和具有SEQ ID NO：67的氨基酸序列的轻链可变结构域。

一个优选的方面是特异性结合人Tau(pS422)的人源化抗体，其中所述抗体包含来自VH35H5和VL35F2的HVR。

在一个实施方案中，特异性结合人Tau(pS422)的这种人源化抗体在重链可变结构域中包含SEQ ID NO：08、09和10的HVR，并且在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO：12、14和74的HVR。SEQ ID NO：12对应于HVR-L1的序列并且在根据Kabat的位置32处具有氨基酸残基赖氨酸。

在一个实施方案中，这种特异性结合人Tau(pS422)的人源化抗体包含具有SEQ IDNO：65的氨基酸序列的重链可变结构域和具有SEQ ID NO：68的氨基酸序列的轻链可变结构域。

一个优选的方面是特异性结合人Tau(pS422)的人源化抗体，其中所述抗体包含来自VH76A6和VL35G4的HVR。

在一个实施方案中，特异性结合人Tau(pS422)的这种人源化抗体在重链可变结构域中包含SEQ ID NO：08、77和10的HVR，并且在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO：12、14和75的HVR。SEQ ID NO：12对应于HVR-L1的序列并且在根据Kabat的位置32处具有氨基酸残基赖氨酸。

在一个实施方案中，这种特异性结合人Tau(pS422)的人源化抗体包含具有SEQ IDNO：76的氨基酸序列的重链可变结构域和具有SEQ ID NO：69的氨基酸序列的轻链可变结构域。

在一个实施方案中，本文报道的人源化抗体包含

a)SEQ ID NO：20的重链可变结构域和SEQ ID NO：17的轻链可变结构域，或

b)SEQ ID NO：19的重链可变结构域和SEQ ID NO：16的轻链可变结构域，或

c)SEQ ID NO：19的重链可变结构域和SEQ ID NO：17的轻链可变结构域，或

d)SEQ ID NO：21的重链可变结构域和SEQ ID NO：17的轻链可变结构域，或

e)SEQ ID NO：65的重链可变结构域和SEQ ID NO：67的轻链可变结构域，或

f)SEQ ID NO：65的重链可变结构域和SEQ ID NO：66的轻链可变结构域，或

g)SEQ ID NO：76的重链可变结构域和SEQ ID NO：78的轻链可变结构域，或

h)SEQ ID NO：19的重链可变结构域和SEQ ID NO：78的轻链可变结构域，或

i)SEQ ID NO：76的重链可变结构域和SEQ ID NO：80的轻链可变结构域。

在一个优选的实施方案中，人源化抗体包含SEQ ID NO：65的重链可变结构域和SEQ ID NO：66或67或68的轻链可变结构域。

在一个优选的实施方案中，人源化抗体包含SEQ ID NO：76的重链可变结构域和SEQ ID NO：69的轻链可变结构域。

在一个实施方案中，人源化抗体包含SEQ ID NO：76或19的重链可变结构域和SEQID NO：78的轻链可变结构域。

在一个实施方案中，抗体用于治疗阿尔茨海默病。

在一个实施方案中，抗体是效应子功能沉默的。在一个实施方案中，抗体不具有效应子功能。在一个实施方案中，抗体是人IgG1亚类的并且在两条重链中都具有突变L234A、L235A和P329G(根据Kabat的EU索引编号)。

在一个实施方案中，抗体

i)特异结合具有SEQ ID NO：03的氨基酸序列的多肽，和/或

ii)不以1μg/mL结合全长人Tau(SEQ ID NO:01)，和/或

iv)特异结合在位置422处的丝氨酸处磷酸化的人Tau(SEQ ID NO：02)的聚集体。

在一个实施方案中，抗体对以下具有如下EC₅₀值

a)对于具有SEQ ID NO：03的氨基酸序列的人Tau(pS422)片段，6ng/mL或更小，和/或

b)对于具有SEQ ID NO：02的氨基酸序列的全长人Tau(pS422)，4.5ng/mL或更小，和/或

c)对于具有SEQ ID NO：02的氨基酸序列的人Tau(pS422)的聚集体，30ng/mL或更小，和/或

d)对于具有SEQ ID NO：01的氨基酸序列并且具有氨基酸突变S422A的人Tau，125ng/mL或更小。

在一个实施方案中，抗体特异结合人Tau(pS422)(SEQ ID NO：02)并且不结合人Tau(SEQ ID NO：01)。

在一个实施方案中，抗体是单克隆抗体。

在一个实施方案中，抗体是抗体片段，其结合人Tau(pS422)并且：

i)特异结合具有SEQ ID NO：03的氨基酸序列的多肽，和/或

ii)不以1μg/mL结合全长人Tau(SEQ ID NO:01)，和/或

v)特异结合具有SEQ ID NO：01的氨基酸序列并且具有氨基酸突变S422A的全长人Tau，和/或

vi)对于具有SEQ ID NO：03的氨基酸序列的人Tau(pS422)片段具有6ng/mL或更小的EC50值，和/或

vii)对于具有SEQ ID NO：02的氨基酸序列的全长人Tau(pS422)具有4.5ng/mL或更小的EC50值，和/或

viii)对于具有SEQ ID NO：02的氨基酸序列的人Tau(pS422)的聚集体具有30ng/mL或更小的EC50值，和/或

ix)对于具有SEQ ID NO：01的氨基酸序列并且具有氨基酸突变S422A的人Tau具有125ng/mL或更小的EC50值。

在一个实施方案中，抗体是

a)人IgG1亚类的全长抗体，或

b)人IgG4亚类的全长抗体，或

c)具有突变L234A、L235A和P329G的人IgG1亚类的全长抗体，

d)具有突变S228P、L235E和P329G的人IgG4亚类全长抗体，

e)在两条重链中都具有突变L234A、L235A和P329G和在一条重链中具有突变T366W和S354C并且在相应的另一重链中具有突变T366S、L368A、Y407V和Y349C的人IgG1亚类的全长抗体，或

f)在两条重链中都具有突变S228P和P329G和在一条重链中具有突变T366W和S354C并且在相应的另一重链中具有突变T366S、L368A、Y407V和Y349C的人IgG4亚类的全长抗体。

如本文报道的一个方面是(人源化的)抗人Tau(pS422)抗体，其特征在于

a)抗体包含两条抗体重链，每条包含重链可变结构域和重链恒定区，其中

i)可变结构域包含SEQ ID NO：08、SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：10的HVR，

ii)恒定区是人IgG1恒定区，其中C-末端赖氨酸残基或甘氨酸-赖氨酸二肽可以存在或不存在，并且

iii)恒定区包含氨基酸改变L234A、L235A和P329G，

b)抗体包含两条抗体轻链，每条包含轻链可变结构域和轻链恒定结构域，其中

i)可变结构域包含SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15的HVR，

ii)恒定区是人κ轻链恒定区或人λ轻链恒定区，

并且

c)抗体

i)特异结合具有SEQ ID NO：03的氨基酸序列的多肽，和/或

ii)不以1μg/mL结合全长人Tau(SEQ ID NO:01)，和/或

i)可变结构域包含SEQ ID NO：08、SEQ ID NO：09和SEQ ID NO：10的HVR，

iii)恒定区包含氨基酸改变L234A、L235A和P329G，

i)可变结构域包含SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：05和SEQ ID NO：15的HVR，

ii)恒定区是人κ轻链恒定区或人λ轻链恒定区，

并且

c)抗体

i)特异结合具有SEQ ID NO：03的氨基酸序列的多肽，和/或

ii)不以1μg/mL结合全长人Tau(SEQ ID NO:01)，和/或

iii)恒定区包含氨基酸改变L234A、L235A和P329G，

ii)恒定区是人κ轻链恒定区或人λ轻链恒定区，

并且

c)抗体

i)特异结合具有SEQ ID NO：03的氨基酸序列的多肽，和/或

ii)不以1μg/mL结合全长人Tau(SEQ ID NO:01)，和/或

如本文报道的一个优选的方面是(人源化的)抗人Tau(pS422)抗体，其特征在于

iii)恒定区包含氨基酸改变L234A、L235A和P329G，

i)可变结构域包含SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：73和SEQ ID NO：15的HVR，

ii)恒定区是人κ轻链恒定区或人λ轻链恒定区，

并且

c)抗体

i)特异结合具有SEQ ID NO：03的氨基酸序列的多肽，和/或

ii)不以1μg/mL结合全长人Tau(SEQ ID NO:01)，和/或

iii)恒定区包含氨基酸改变L234A、L235A和P329G，

i)可变结构域包含SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：72和SEQ ID NO：15的HVR，

ii)恒定区是人κ轻链恒定区或人λ轻链恒定区，

并且

c)抗体

i)特异结合具有SEQ ID NO：03的氨基酸序列的多肽，和/或

ii)不以1μg/mL结合全长人Tau(SEQ ID NO:01)，和/或

iii)恒定区包含氨基酸改变L234A、L235A和P329G，

i)可变结构域包含SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：79的HVR，

ii)恒定区是人κ轻链恒定区或人λ轻链恒定区，

并且

c)抗体

i)特异结合具有SEQ ID NO：03的氨基酸序列的多肽，和/或

ii)不以1μg/mL结合全长人Tau(SEQ ID NO:01)，和/或

iii)恒定区包含氨基酸改变L234A、L235A和P329G，

i)可变结构域包含SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：74的HVR，

ii)恒定区是人κ轻链恒定区或人λ轻链恒定区，

并且

c)抗体

i)特异结合具有SEQ ID NO：03的氨基酸序列的多肽，和/或

ii)不以1μg/mL结合全长人Tau(SEQ ID NO:01)，和/或

本文报道的一个优选方面是(人源化)抗人Tau(pS422)抗体，其特征在于：

i)可变结构域包含SEQ ID NO：08、SEQ ID NO：77和SEQ ID NO：10的HVR，

iii)恒定区包含氨基酸改变L234A、L235A和P329G，

i)可变结构域包含SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：75的HVR，

ii)恒定区是人κ轻链恒定区或人λ轻链恒定区，

并且

c)抗体

i)特异结合具有SEQ ID NO：03的氨基酸序列的多肽，和/或

ii)不以1μg/mL结合全长人Tau(SEQ ID NO:01)，和/或

本文报道的一个方面是(人源化)抗人Tau(pS422)抗体，其特征在于：

a)抗体包含两条抗体重链，每条重链包含重链可变结构域和重链恒定区，其中

i)可变结构域具有SEQ ID NO：20的氨基酸序列，

ii)恒定区是人IgG1恒定区，其中C-末端赖氨酸残基或甘氨酸-赖氨酸二肽可以存在或不存在，以及

iii)恒定区包含氨基酸改变L234A、L235A和P329G，

b)抗体包含两条抗体轻链，每条轻链包含轻链可变结构域和轻链恒定结构域，其中

i)可变结构域具有SEQ ID NO：17的氨基酸序列，

ii)恒定区是人κ轻链恒定区或人λ轻链恒定区，

和

c)抗体

i)特异结合具有SEQ ID NO：03的氨基酸序列的多肽，和/或

ii)不以1μg/mL结合全长人Tau(SEQ ID NO:01)，和/或

i)可变结构域具有SEQ ID NO：19的氨基酸序列，

iii)恒定区包含氨基酸改变L234A、L235A和P329G，

i)可变结构域具有SEQ ID NO：16的氨基酸序列，

ii)恒定区是人κ轻链恒定区或人λ轻链恒定区，

和

c)抗体

i)特异结合具有SEQ ID NO：03的氨基酸序列的多肽，和/或

ii)不以1μg/mL结合全长人Tau(SEQ ID NO:01)，和/或

i)可变结构域具有SEQ ID NO：19的氨基酸序列，

iii)恒定区包含氨基酸改变L234A、L235A和P329G，

i)可变结构域具有SEQ ID NO：17的氨基酸序列，

ii)恒定区是人κ轻链恒定区或人λ轻链恒定区，

和

c)抗体

i)特异结合具有SEQ ID NO：03的氨基酸序列的多肽，和/或

ii)不以1μg/mL结合全长人Tau(SEQ ID NO:01)，和/或

i)可变结构域具有SEQ ID NO：21的氨基酸序列，

iii)恒定区包含氨基酸改变L234A、L235A和P329G，

i)可变结构域具有SEQ ID NO：17的氨基酸序列，

ii)恒定区是人κ轻链恒定区或人λ轻链恒定区，

和

c)抗体

i)特异结合具有SEQ ID NO：03的氨基酸序列的多肽，和/或

ii)不以1μg/mL结合全长人Tau(SEQ ID NO:01)，和/或

本文报道的一个优选的方面是(人源化)抗人Tau(pS422)抗体，其特征在于：

i)可变结构域具有SEQ ID NO：65的氨基酸序列，

iii)恒定区包含氨基酸改变L234A、L235A和P329G，

i)可变结构域具有SEQ ID NO：67的氨基酸序列，

ii)恒定区是人κ轻链恒定区或人λ轻链恒定区，

和

c)抗体

i)特异结合具有SEQ ID NO：03的氨基酸序列的多肽，和/或

ii)不以1μg/mL结合全长人Tau(SEQ ID NO:01)，和/或

i)可变结构域具有SEQ ID NO：65的氨基酸序列，

iii)恒定区包含氨基酸改变L234A、L235A和P329G，

i)可变结构域具有SEQ ID NO：66的氨基酸序列，

ii)恒定区是人κ轻链恒定区或人λ轻链恒定区，

和

c)抗体

i)特异结合具有SEQ ID NO：03的氨基酸序列的多肽，和/或

ii)不以1μg/mL结合全长人Tau(SEQ ID NO:01)，和/或

i)可变结构域具有SEQ ID NO：65的氨基酸序列，

iii)恒定区包含氨基酸改变L234A、L235A和P329G，

i)可变结构域具有SEQ ID NO：68的氨基酸序列，

ii)恒定区是人κ轻链恒定区或人λ轻链恒定区，

和

c)抗体

i)特异结合具有SEQ ID NO：03的氨基酸序列的多肽，和/或

ii)不以1μg/mL结合全长人Tau(SEQ ID NO:01)，和/或

i)可变结构域具有SEQ ID NO：19的氨基酸序列，

iii)恒定区包含氨基酸改变L234A、L235A和P329G，

i)可变结构域具有SEQ ID NO：78的氨基酸序列，

ii)恒定区是人κ轻链恒定区或人λ轻链恒定区，

和

c)抗体

i)特异结合具有SEQ ID NO：03的氨基酸序列的多肽，和/或

ii)不以1μg/mL结合全长人Tau(SEQ ID NO:01)，和/或

i)可变结构域具有SEQ ID NO：76的氨基酸序列，

iii)恒定区包含氨基酸改变L234A、L235A和P329G，

i)可变结构域具有SEQ ID NO：69的氨基酸序列，

ii)恒定区是人κ轻链恒定区或人λ轻链恒定区，

和

c)抗体

i)特异结合具有SEQ ID NO：03的氨基酸序列的多肽，和/或

ii)不以1μg/mL结合全长人Tau(SEQ ID NO:01)，和/或

在所有方面的一个优选实施方案中，抗-人Tau(pS422)抗体的特征在于抗体在轻链可变结构域的位置32处具有赖氨酸(K)氨基酸残基(根据Kabat编号)。

在所有方面的一个优选实施方案中，所述抗人Tau(pS422)抗体特征在于所述抗体在重链可变结构域中位置4、24和78处具有缬氨酸残基。

在所有方面的一个优选实施方案中，所述抗人Tau(pS422)抗体特征在于所述抗体在重链可变结构域中位置71处具有精氨酸残基。

如本文报道的一个方面是编码如本文报道的(人源化的)抗体的分离的核酸。该核酸包含编码抗体重链的核酸和编码抗体轻链的一种核酸。该核酸包含至少一个表达盒。优选地，所述核酸包含两个表达盒。

如本文报道的一个方面是宿主细胞，其包含如本文报道的核酸。

如本文报道的一个方面是产生(人源化的)抗体的方法，其包括培养如本文报道的宿主细胞从而产生抗体的步骤。

在一个实施方案中，所述方法还包括从细胞或培养基回收抗体的步骤。

如本文报道的一个方面是药物制剂，其包含如本文报道的(人源化的)抗体和药用载体。

在一个实施方案中，所述药物制剂还包含另外的治疗剂。

在一个实施方案中，所述另外的治疗剂是抗-淀粉样蛋白治疗剂。在一个实施方案中，所述抗-淀粉样蛋白治疗剂是抗人α-突触核蛋白抗体或抗-Abeta抗体。

如本文报道的一个方面是如本文报道的(人源化的)抗体，其用作药物。

如本文报道的一个方面是如本文报道的(人源化的)抗体，其用于阿尔茨海默病的治疗。

如本文报道的一个方面是如本文报道的(人源化的)抗体，其用于前驱(prodromal)阿尔茨海默病的治疗。

如本文报道的一个方面是如本文报道的(人源化的)抗体，其用于轻度阿尔茨海默病的治疗。

如本文报道的一个方面是如本文报道的(人源化的)抗体，其用于减轻Tau(pS422)-引起的神经变性。

如本文报道的一个方面是如本文报道的(人源化的)抗体，其用于维持认知和功能。

如本文报道的一个方面是如本文报道的(人源化的)抗体，其用于减缓认知和功能下降的速率。

如本文报道的一个方面是如本文报道的(人源化的)抗体，其用于减缓神经原纤维缠结积累速率。

在前述方面的一个实施方案中，所述用途是通过清除Tau(pS422)而减轻神经原纤维缠结负荷。

在前述方面的一个实施方案中，所述用途是通过防止神经原纤维缠结建立。

在前述方面的一个实施方案中，所述用途是通过移除/清除神经原纤维缠结。

在一个实施方案中，所述防止和/或移除通过促进Tau聚集体的细胞内清除。

在前述方面的一个实施方案中，所述用途是通过抑制神经原纤维缠结扩散。在一个实施方案中，所述抑制是通过防止病理性Tau形式/种子的神经元间转移。

本发明的其他方面是治疗方法，其包括施用如本文报道的(人源化的)抗体，用于治疗阿尔茨海默病，用于治疗前驱阿尔茨海默病，用于治疗轻度阿尔茨海默病，用于减轻Tau(pS422)-引起的神经变性，用于维持认知和功能，用于减缓认知和功能下降速率，和/或用于减缓神经原纤维缠结积累的速率。

如本文报道的一个方面是如本文报道的(人源化的)抗体在制备药物中的用途。

在一个实施方案中，所述药物用于治疗阿尔茨海默病。

在一个实施方案中，所述药物用于治疗前驱阿尔茨海默病。

在一个实施方案中，所述药物用于治疗轻度阿尔茨海默病。

在一个实施方案中，所述药物用于减轻Tau(pS422)引起的神经变性。

在一个实施方案中，所述药物用于维持认知和功能。

在一个实施方案中，所述药物用于减缓认知和功能下降速率。

如本文报道的一个方面是治疗患有阿尔茨海默病的个体的方法，所述方法包括向个体施用有效量的如本文报道的(人源化的)抗人Tau(pS422)抗体。

如本文报道的一个方面是减轻个体中Tau(pS422)引起的神经变性的方法，其包括向个体施用有效量的如本文报道的(人源化的)抗人Tau(pS422)抗体以减轻Tau(pS422)引起的神经变性。

如本文报道的一个方面是维持个体中认知和功能的方法，其包括向个体施用有效量的如本文报道的(人源化的)抗人Tau(pS422)抗体以维持认知和功能。

如本文报道的一个方面是减缓个体中认知和功能下降速率的方法，其包括向个体施用有效量的如本文报道的(人源化的)抗人Tau(pS422)抗体以减缓认知和功能下降速率。

如本文报道的一个方面是如本文报道的(人源化的)抗人Tau(pS422)抗体在减轻Tau(pS422)引起的神经变性方面的用途。

如本文报道的一个方面是如本文报道的(人源化的)抗人Tau(pS422)抗体在维持认知和功能中的用途。

如本文报道的一个方面是如本文报道的(人源化的)抗人Tau(pS422)抗体在减缓认知和功能下降速率中的用途。

如本文报道的抗体可用于治疗阿尔茨海默病。

利用如本文报道的(人源化的)抗体可以影响阿尔茨海默病和神经病理学的进展的抑制/减轻。

如本文报道的(人源化的)抗体可以用于保护动物免于发展为阿尔茨海默病或甚至用于终止动物的阿尔茨海默病的进展。在一个实施方案中，动物是人。

在一个实施方案中，如本文报道的(人源化的)抗体i)结合Tau(pS422)转基因小鼠和阿尔茨海默病患者的脑切片上的Tau(pS422)；和/或标记Tau(pS422)转基因细胞中的Tau(pS422)。

如本文报道的(人源化的)抗体可以用于治疗阿尔茨海默病。

如本文报道的一个方面是特异结合人Tau(pS422)中SEQ ID NO：03的氨基酸序列的(人源化的)抗体。

如本文报道的(人源化的)抗体特异结合/识别人Tau(pS422)的早期和晚期疾病相关形式。

如本文报道的一个方面是如本文报道的(人源化的)抗体用于预防人Tau(pS422)-相关阿尔茨海默病扩散的用途。

如本文报道的一个方面是如本文报道的(人源化的)抗体用于减少溶酶体膜分解的用途。

如本文报道的一个方面是如本文报道的(人源化的)抗体用于针对人Tau(pS422)诱导的去稳定和/或分解作用使溶酶体膜稳定的用途。

如本文报道的一个方面是如本文报道的(人源化的)抗体用于防止阿尔茨海默病进展的用途。

如本文报道的(人源化的)抗体通过抗体介导的对人Tau(pS422)接种和细胞间扩散的抑制而行使功能。

如本文报道的(人源化的)抗体通过结合人Tau(pS422)来保护溶酶体免于纤维损伤。

附图简述

图1：食蟹猴药物动力学研究结果；实心菱形：VH35H5/VL31A1；空心方形：VH35H5/VL35F2；实心方形：VH76A6/VL35G4；实心三角形：VH32/VL22；实心圆形：VH00/VL00；X轴：给药后的时间[h]；y轴：血清浓度，剂量-norm。[(μg/mL)/(mg/kg)]。

图2：缩放到图1的0-200小时的时间范围。

图3：人源化的VH和VL的不同组合与(A)磷酸化的tau肽，(B)磷酸化的全长人tau，(C)非磷酸化的tau肽，(D)非磷酸化的全长人tau的生化结合；(1)＝VH00/VL00，(2)＝VH32/VL21，(3)＝VH20/VL22，(4)＝VH32/VL22，(5)＝VH33/VL22；包被浓度：磷酸化的tau肽：50ng/ml，所有其他靶标：1μg/ml；(如果磷酸化的tau肽以1μg/ml包被，则获得相当的结果(数据未显示))。

图4：人源化的VH和VL的不同组合与(A)＝全长人tau S422A突变体，(B)＝聚集的人Tau(pS422)的生化结合；(1)＝VH00/VL00，(2)＝VH32/VL21，(3)＝VH20/VL22，(4)＝VH32/VL22，(5)＝VH33/VL22；包被浓度：磷酸化的tau肽：50ng/ml，所有其他靶标：1μg/ml；(如果磷酸化的tau肽以1μg/ml包被，则获得相当的结果(数据未显示))。

图5：显示选择的人源化的VH/VL组合的选择性的Western印迹；(1)＝VH00/VL00，(2)＝VH32/VL21，(3)＝VH20/VL22，(4)＝VH32/VL22，(5)＝VH33/VL22。

图6：对阿尔茨海默病患者的脑提取物中的超磷酸化的tau的结合；(1)＝VH00/VL00，(2)＝VH32/VL21，(3)＝VH32/VL22。

图7：小鼠脑提取物中Tau(pS442)水平的定量；最大-最小值，中位数和平均值(+)；用Student t检验计算显著性，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

A：x轴：Tau(pS422)[ng/mg脑]；y轴：1：基线，2：载体，3：抗Tau(pS422)抗体(VH35H5/VL31A1)@1.7mg/kg，4：抗Tau(pS422)抗体(VH35H5/VL31A1)@5mg/kg，5：抗-Tau(pS422)抗体(VH35H5/VL31A1)@15mg/kg。

B：x轴：Tau(pS422)[ng/mg脑]；y轴：1：基线，2：载体，3：抗Tau(pS422)抗体(VH35H5/VL49G1)@1.7mg/kg，4：抗Tau(pS422)抗体(VH35H5/VL49G1)@5mg/kg，5：抗Tau(pS422)抗体(VH35H5/VL49G1)@15mg/kg。

图8：小鼠脑提取物中总Tau的定量；最大-最小值，中位数和平均值(+)。

A：x轴：总Tau[ng/mg脑]；y轴：1：基线，2：载体，3：抗Tau(pS422)抗体(VH35H5/VL49G1)@1.7mg/kg，4：抗Tau(pS422)抗体(VH35H5/VL49G1)@5mg/kg，5：抗Tau(pS422)抗体(VH35H5/VL49G1)@15mg/kg。

B：x轴：总Tau[ng/mg脑]；y轴：1：基线，2：载体，3：抗Tau(pS422)抗体(VH35H5/VL31A1)@1.7mg/kg，4：抗Tau(pS422)抗体(VH35H5/VL31A1)@5mg/kg，5：抗-Tau(pS422)抗体(VH35H5/VL31A1)@15mg/kg。

图9：抗Tau(pS422)抗体(VH35H5/VL31A1)处理的TauPS2APP小鼠中Tau(pS422)病理的定量IHC分析；最大-最小值，中位数和平均值(+)，使用Student's t检验计算显著性，**p<0.01，***p<0.001。

A：皮质；x轴：Tau(pS422)面积占有率[％]；y轴：1：基线，2：载体，3：抗Tau(pS422)抗体(VH35H5/VL31A1)@1.7mg/kg，4：抗Tau(pS422)抗体(VH35H5/VL31A1)@5mg/kg，5：抗-Tau(pS422)抗体(VH35H5/VL31A1)@15mg/kg。

B：海马；x轴：面积占有率[％]；y轴：1：基线，2：载体，3：抗Tau(pS422)抗体(VH35H5/VL31A1)@1.7mg/kg，4：抗Tau(pS422)抗体(VH35H5/VL31A1)@5mg/kg，5：抗-Tau(pS422)抗体(VH35H5/VL31A1)@15mg/kg。

序列简述

SEQ ID NO：01人Tau蛋白同种型F(441残基)

SEQ ID NO：02在位置422的丝氨酸残基处磷酸化的人Tau蛋白同种型F(441残基)

SEQ ID NO：03在位置7(对应于SEQ ID NO：01的位置422)处具有磷酸化的丝氨酸的人Tau蛋白的片段(SEQ ID NO：01的残基416至430)：Ser-Ile-Asp-Met-Val-Asp-Ser(PO₃H₂)-Pro-Gln-Leu-Ala-Thr-Leu-Ala-Asp

SEQ ID NO:04兔抗体086CDRL1-QSSQSVRTNKLA

SEQ ID NO:05兔抗体086CDRL2-SASTLDF

SEQ ID NO:06兔抗体086CDRL3-LGYFDCSIADCVA

SEQ ID NO:07兔抗体086VL00

SEQ ID NO:08兔抗体086CDRH1-SNAIN

SEQ ID NO:09兔抗体086CDRH2-YIAVSGNTYYASWAKG

SEQ ID NO:10兔抗体086CDRH3-SNI

SEQ ID NO:11兔抗体086VH00

SEQ ID NO:12人源化CDRL1变体1–RSSQSVRTNKLA

SEQ ID NO:13人源化CDRL1变体2–RSSQSVRTNRLA

SEQ ID NO:14人源化CDRL2变体1–SASTLDY

SEQ ID NO:15人源化CDRL3变体1–LGYFDSSADIVA

SEQ ID NO:16人源化VL变体1–VL21

SEQ ID NO:17人源化VL变体2–VL22

SEQ ID NO:18人源化CDRH2–YIAVSGNTYYADSVKG

SEQ ID NO:19人源化VH变体1–VH32

SEQ ID NO:20人源化VH变体2–VH20

SEQ ID NO:21人源化VH变体3–VH33

SEQ ID NO:22人源化CDRL2变体2–SASTLQS

SEQ ID NO:23人源化CDRL2变体3–SASTLES

SEQ ID NO:24人源化CDRL3变体2–LGYFDSSIADSVA

SEQ ID NO:25人源化CDRL3变体3–LGYFDSSIADRVA

SEQ ID NO:26人源化CDRL3变体4–LGYFDPSIADPVA

SEQ ID NO:27人源化CDRL3变体5–LGYFDSSIADIVA

SEQ ID NO:28人源化CDRL3变体6–LGYFDPSADPIA

SEQ ID NO:29人源化CDRL3变体7–LGYFDPSADPVA

SEQ ID NO:30人源化CDRL1变体3–RASQGVRTNKLA

SEQ ID NO:31人源化CDRL1变体4–RASQSVRTNKLA

SEQ ID NO:32人源化VL变体4–VL01

SEQ ID NO:33人源化VL变体5–VL09

SEQ ID NO:34人源化VL变体6–VL12

SEQ ID NO:35人源化VL变体7–VL15

SEQ ID NO:36人源化VL变体8–VL16

SEQ ID NO:37人源化VL变体9–VL17

SEQ ID NO:38人源化VL变体10–VL19

SEQ ID NO:39人源化VL变体11–VL28

SEQ ID NO:40人源化VL变体12–VL33

SEQ ID NO:41人源化VL变体13–VL35

SEQ ID NO:42人源化VL变体14–VL39

SEQ ID NO:43人源化VL变体15–VL40

SEQ ID NO:44人源化VL变体16–VL41

SEQ ID NO:45人源化VL变体17–VL42

SEQ ID NO:46人源化VH变体4–VH01

SEQ ID NO:47人源化VH变体5–VH02

SEQ ID NO:48人源化VH变体6–VH03

SEQ ID NO:49人源化VH变体7–VH04

SEQ ID NO:50人源化VH变体8–VH14

SEQ ID NO:51人源化VH变体9–VH15

SEQ ID NO:52人源化VH变体10–VH18

SEQ ID NO:53人源化VH变体11–VH19

SEQ ID NO:54人源化VH变体12–VH22

SEQ ID NO:55人源化VH变体13–VH23

SEQ ID NO:56人源化VH变体14–VH24

SEQ ID NO:57人源化VH变体15–VH31

SEQ ID NO:65人源化VH变体16–VH35H5

SEQ ID NO:66人源化VL变体18–VL31A1

SEQ ID NO:67人源化VL变体19–VL49G1

SEQ ID NO:68人源化VL变体20–VL35F2

SEQ ID NO:69人源化VL变体21–VL53A2

SEQ ID NO:70人源化CDRL1变体5

SEQ ID NO:71人源化CDRL1变体6

SEQ ID NO:72人源化CDRL2变体4

SEQ ID NO:73人源化CDRL2变体5

SEQ ID NO:74人源化CDRL3变体8

SEQ ID NO:75人源化CDRL3变体9

SEQ ID NO:76人源化VH变体17–VH76A6

SEQ ID NO:77人源化CDRH1变体1

SEQ ID NO:78人源化VL变体22–VL35G4

SEQ ID NO:79人源化CDRL3变体10

SEQ ID NO:80人源化VL变体23–VL145B12

SEQ ID NO:81人源化CDRL2变体6

SEQ ID NO:82抗转铁蛋白受体抗体重链1

SEQ ID NO:83抗转铁蛋白受体抗体重链2

SEQ ID NO:84抗转铁蛋白受体抗体重链3

SEQ ID NO:85抗转铁蛋白受体抗体轻链

SEQ ID NO:86人源化VL变体24–VL4G1

SEQ ID NO:87人源化CDRL3变体11

序列对应表

发明的详述

本发明涉及结合肽或蛋白质或其功能部分，特别涉及抗体，特别是单克隆抗体或其功能部分，特别是结合肽或抗体，所述结合肽或抗体识别并特异性结合在哺乳动物，特别是在人Tau蛋白或其片段上的磷酸-表位，特别是病理蛋白tau构象异构体，但在一个实施方案中，不结合相应的非磷酸化表位和/或非相关表位，其中所述结合肽或抗体结合哺乳动物特别是如SEQ ID NO：02所示的人Tau蛋白上的表位，所述表位由Tau氨基酸残基416-430组成，其在422位包含磷酸化Ser(pS422)。

I.定义

出于本文目的，“接纳体人构架”是这样的构架，它包含源自人免疫球蛋白构架的轻链可变结构域(VL)构架或重链可变结构域(VH)构架或如下文定义的人共有序列构架的氨基酸序列。“衍生自”人免疫球蛋白构架或人共有构架的接纳体人构架可以包含其相同的氨基酸序列，或它可以含有氨基酸序列变化。在一些实施方案中，氨基酸变化的数目是10或更小、9或更小、8或更小、7或更小、6或更小、5或更小、4或更小、3或更小、或2或更小。在一些实施方案中，VL接纳体人构架在序列上与VL人免疫球蛋白构架序列或人共有构架序列相同。

“亲和力”指分子(例如，抗体)的单一结合位点及其结合配偶物(例如，抗原)之间非共价相互作用的强度总和。除非另外指出，否则如本文所用，“结合亲和力”指反映结合对子的成员(例如，抗体和抗原)之间1:1相互作用的固有结合亲和力。通常可以由解离常数(K_d)代表分子X对其配偶物Y的亲和力。亲和力可以由本领域已知的常见方法测量，包括本文所述的那些方法。在下文中描述用于测量结合亲和力的具体示意性和示例性实施方案。

“亲和力成熟的”抗体指在一个或多个高变区(HVR)中具有一个或多个改变的抗体，其中与不拥有这些改变的亲本抗体相比，这类改变导致抗体对抗原的亲和力改善。

术语“抗人Tau(pS422)抗体”和“特异性结合人Tau(pS422)的抗体”是指能够以足够的亲和力结合人Tau(pS422)的抗体，从而所述抗体可在靶向人Tau(pS422)中用作诊断和/或治疗剂。在一个实施方案中，如例如，通过放射免疫测定(RIA)测量的，抗人Tau(pS422)抗体对不相关、非-人Tau(pS422)蛋白的结合程度小于抗体对人Tau(pS422)的结合的约10％。

术语“抗体”在本文中以最广意义使用并且涵盖多种抗体结构物，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们显示出所需的抗原结合活性即可。

“抗体片段”指不同于完整抗体的分子，所述分子包括完整抗体的一部分，该部分结合完整抗体所结合的抗原。抗体片段的例子包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab’-SH、F(ab')₂；双体抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；和从抗体片段形成的多特异性抗体。

与参照抗体“结合相同的表位的抗体”是指在竞争测定中以50％或以上阻断参照抗体与其抗原的结合的抗体，并且反过来，参照抗体在竞争测定中以50％或以上阻断抗体对其抗原的结合。在一个实施方案中，与参照抗体结合相同的表位的抗体以50％或以上阻断参照抗体与其抗原的结合。在一个实施方案中，与参照抗体结合相同的表位的抗体以80％或以上阻断参照抗体与其抗原的结合。在一个实施方案中，与参照抗体结合相同的表位的抗体以90％或以上阻断参照抗体与其抗原的结合。在一个实施方案中，与参照抗体结合相同的表位的抗体以95％或以上阻断参照抗体与其抗原的结合。在一个优选的实施方案中，与参照抗体结合相同的表位的抗体与抗原上与参照抗体相同的残基具有结合相互作用。

术语“嵌合”抗体指一种抗体，其中重链和/或轻链的一部分衍生自特定来源或物种，而重链和/或轻链的剩余部分衍生自不同来源或物种。

抗体的“类”指由其重链拥有的恒定结构域或恒定区的类型。存在五个主要类别的抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些类别中的几种可以进一步划分成亚类(同种型)，例如，IgG₁、IgG₂、IgG₃、IgG₄、IgA₁和IgA₂。对应于不同类别免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称作α、δ、ε、γ和μ。

“效应子功能”指随抗体类别变动的归因于抗体Fc区的那些生物学活性。抗体效应子功能的例子包括：C1q结合和补体依赖的细胞毒性(CDC)；Fc受体结合作用；抗体依赖的细胞介导细胞毒性(ADCC)；吞噬；下调细胞表面受体(例如，B细胞受体)；和B细胞活化。

活性剂(例如，药物制剂)的“有效量”指有效实现所需治疗性或预防性结果的量、以实现前述结果的剂量和时间段。

术语“Fc区”在本文中用来定义免疫球蛋白重链的含有至少一部分恒定区的C端区域。该术语包括天然序列Fc区和变异Fc区。在一个实施方案中，人IgG重链Fc区从Cys226或从Pro230延伸至重链的羧基端。然而，Fc区的C端赖氨酸(Lys447)可以存在或可以不存在。除非本文中另外说明，否则Fc区或恒定区中的氨基酸残基的编号根据如Kabat,E.A.等人,Sequences of Proteins of Immunological Interes,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991),NIH Publication 91-3242中所述的EU编号体系，也称作EU索引。

“构架”或“FR”指除高变区(HVR)残基之外的可变结构域残基。可变结构域的FR通常由以下4个FR结构域组成：FR1、FR2、FR3和FR4。因此，HVR序列和FR序列通常按以下顺序出现在VH(或VL)中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。

术语“全长抗体”、“完整抗体”和“完全抗体”在本文中可互换地用来指一种抗体，所述抗体具有基本上与天然抗体结构相似的结构或具有含有如本文定义的Fc区的重链。术语“全长抗体”表示由通过二硫键连接的两条抗体轻链多肽和两条抗体重链多肽组成的多聚体多肽，其中在所述两条抗体重链多肽中，C-末端赖氨酸残基(K)可以存在或不存在。术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用并且指已经向其中引入外源核酸的细胞，包括这类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化的细胞”，这包括原代转化的细胞和从其衍生的子代，而无论传代次数是多少。后代可以在核酸含量方面不与亲本细胞完全相同，反而可以含有突变。本文中包括突变子代，所述突变子代具有与最初转化的细胞相同的用于筛选或选择的功能或生物学活性。

“人共有构架”是这样的构架，它代表在人免疫球蛋白VL或VH构架序列的选项中最常出现的氨基酸残基。通常，人免疫球蛋白VL或VH构架序列的选项来自可变结构域序列的亚组。通常，序列亚组是如Kabat,E.A.等人,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,第5版,Bethesda MD(1991),NIH Publication 91-3242，第1-3卷中描述的亚组。在一个实施方案中，对于VL，该亚组是如上文Kabat等人中描述的亚组κI。在一个实施方案中，对于VH，该亚组是如上文Kabat等人中描述的亚组III。

“人源化”抗体指包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体将基本上包含至少1个、并且一般2个可变结构域的全部，其中全部或基本上全部的HVR(例如，CDR)与非人抗体的那些HVR对应并且全部或基本上全部的FR区与人抗体的那些FR对应。人源化抗体任选地可以包含从人抗体衍生的抗体恒定区的至少一部分。抗体的“人源化形式”，例如非人抗体，指已经历过人源化的抗体。

如本文所用，术语“高变区”或“HVR”指抗体可变结域的下述每个区域，所述区域在序列上高变(“互补决定区”或“CDR”)和/或形成结构上确定的环(“高变环”)，和/或含有抗原接触残基(“抗原触点”)。通常，抗体包含六个HVR；VH中三个(H1、H2、H3)和VL中三个(L1、L2、L3)。

本文中的HVR包括

(a)出现在第26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)氨基酸残基处的高变环(Chothia,C.和Lesk,A.M.,J.Mol.Biol.196(1987)901-917)；

(b)出现在第24-34(L1)、50-56(L2)、89-97(L3)、31-35b(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)氨基酸残基处的CDR(Kabat,E.A.等人,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991),NIH Publication 91-3242)；

(c)出现在第27c-36(L1)、46-55(L2)、89-96(L3)、30-35b(H1)、47-58(H2)和93-101(H3)氨基酸残基处的抗原触点(MacCallum等人,J.Mol.Biol.262:732-745(1996))；和

(d)(a)、(b)和/或(c)的组合，包括HVR氨基酸残基46-56(L2)、47-56(L2)、48-56(L2)、49-56(L2)、26-35(H1)、26-35b(H1)、49-65(H2)、93-102(H3)和94-102(H3)。

除非另外说明，否则HVR残基和可变结构域中的其他残基(例如，FR残基)在本文中根据上文Kabat等人编号。

“免疫缀合物”是与一个或多个异源分子缀合的抗体。

“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯化动物(例如，奶牛、绵羊、猫、犬和马)、灵长类(例如，人和非人灵长类如猴)、兔和啮齿类(例如，小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，个体或受试者是人。

“分离的”抗体是已经与其自然环境的组分分离的一种抗体。在一些实施方案中，将抗体纯化至大于95％或99％纯度，如通过例如电泳(例如，SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳法)或色谱(例如，离子交换或反相HPLC)所确定。关于评估抗体纯度的方法的综述，参见，例如，Flatman,S.等人,J.Chromatogr.B 848(2007)79-87。

“分离的”核酸指已经与其自然环境的组分分离的核酸分子。分离的核酸包括含于细胞内的核酸分子，所述细胞通常含有该核酸分子，但是该核酸分子存在于染色体外或与其天然染色体位置不同的染色体位置处。

“编码抗人TAU(pS422)抗体的分离核酸”指编码抗体重链和轻链(或其片段)的一个或多个核酸分子，包括在单一载体或分别的载体中的这类核酸分子和在宿主细胞中一个或多个位置处存在的这类核酸分子。

如本文中所用的术语“单克隆抗体”指从基本上均质的抗体群体获得的抗体，即，构成该群体的各个抗体是相同的和/或结合相同的表位，除了可能的变体抗体之外(例如，含有天然存在突变或在产生单克隆抗体制备物期间出现)，这类变体通常以微小的量存在。与一般包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物相反，单克隆抗体制备物的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。因此，修饰语“单克隆的”表明该抗体的特征为从基本上均质的抗体群体获得，并且不得解释为要求通过任何特定方法产生该抗体。例如，可以通过多种技术产生待根据本发明使用的单克隆抗体，所述技术包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法和利用含有全部或部分的人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，本文中描述了用于产生单克隆抗体的这类方法和其他示例性方法。

“天然抗体”指具有不定结构的天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗体是由二硫键结合的两条相同轻链和两条相同重链组成的约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白。从N端至C端，每条重链具有一个可变区(VH)，也称作可变重结构域或重链可变结构域，随后是三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)。类似地，从N端至C端，每条轻链具有一个可变区(VL)，也称作可变轻结构域或轻链可变结构域，随后一个恒定轻链(CL)结构域。抗体的轻链可以基于其恒定域的氨基酸序列而划分成称作κ(κ)和λ(λ)的两种类型之一。

术语“包装插页”用来指治疗产品的商业包装中习惯性包括的说明书，所述说明书含有关于适应症、用法、剂量、施用、联合疗法、禁忌症和/或关于使用此类治疗产品的注意事项的信息。

相对于参照多肽序列，将“氨基酸序列同一性百分数(％)”定义为比对序列并根据需要引入空位以实现最大序列同源性百分数并且不考虑任何保守性置换作为序列同一性的部分之后，候选序列中与参照多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分数。为了确定氨基酸序列同一性百分数的比对可以按本领域能力范围内的多种方式实现，例如，使用可公开获得的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适宜参数，包括为实现正在比较的全长序列范围内最大比对所需要的任何算法。然而，出于本文目的，使用序列比较计算机程序ALIGN-2产生氨基酸序列同一性％值。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech,Inc.授权，并且源代码已经随用户文档提交至华盛顿特区20559的美国版权局，在那里它以美国版权登记号TXU510087登记。从Genentech,Inc.,South San Francisco,加利福尼亚州可公开获得ALIGN-2程序或可以从源代码汇编。应当将ALIGN-2程序汇编在UNIX操作系统(包括数字式UNIX V4.0D)上使用。全部序列比较参数由ALIGN-2程序设定并且不变动。

在使用ALIGN-2比较氨基酸序列的情况下，如下计算给定氨基酸序列A与给定氨基酸序列B、同给定氨基酸序列B或针对给定氨基酸序列B的氨基酸序列同一性％(这可以备选地描述为与给定氨基酸序列B、同给定氨基酸序列B或针对给定氨基酸序列B具有或包含某个氨基酸序列同一性％的给定氨基酸序列A)：

100乘以分数X/Y

其中X是由序列比对程序ALIGN-2在该程序的A和B比对结果中评定为相同匹配的氨基酸残基的数目，并且其中Y是B中氨基酸残基的总数。将可以理解在氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度时，A相对于B的氨基酸序列同一性％将不等于B相对于A的氨基酸序列同一性％。除非另外特别声明，否则本文所用的全部氨基酸序列同一性值％如紧接前段中所述那样使用ALIGN-2计算机程序获得。

术语“药物制剂”指一种制备物，所述制备物处于这类形式从而允许其中所含的有效成分的生物学活性有效，并且不含有对于将会施用该制剂的受试者不可接受地有毒的额外组分。

“可药用载体”指药物制剂中除有效成分之外的对受试者无毒的成分。可药用载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。

如本文使用的术语“人Tau(pS422)”，是指天然的人Tau(pS422)(UniProtP37840)。术语包括“全长”，未加工的人Tau(pS422)以及由在细胞中加工得到的人Tau(pS422)的任何形式。术语还包括天然存在的人Tau(pS422)的变体，例如，突变体、剪接变体或等位基因变体。人Tau(pS422)的氨基酸序列显示在SEQ ID NO：02中。

如本文所用，名词“治疗”(和其语法变型如动词“治疗”或分词“治疗”)指意欲改变正在接受治疗的个体的天然过程的临床介入，并且可以用于预防或在临床病理学过程期间实施。想要的治疗效果包括但不限于防止疾病出现或复发、减轻症状、减小疾病的任何直接或间接病理学后果、防止转移、降低疾病进展速率、改善或缓和疾病状态，以及缓解或改善预后。在一些实施方案中，本发明的抗体用来延缓疾病发展或用来减慢疾病的进展。

术语“可变区”或“可变结构域”指抗体重链或轻链的参与抗体结合至抗原的结构域。天然抗体重链和轻链的可变结构域(分别是VH和VL)通常具有相似的结构，每种结构域包含四个保守的构架区(FR)和三个高变区(HVR)。(参见，例如，Kindt,T.J.等人,KubyImmunology，第6版，W.H.Freeman and Co.，N.Y.(2007)第91页)。单个VH结构域或VL结构域可能足以赋予抗原结合特异性。另外，结合特定抗原的抗体可以利用来自结合该抗原的抗体的VH或VL结构域进行分离以分别筛选互补性VL结构域或VH结构域的文库。参见，例如，Portolano,S.等人,J.Immunol.150(1993)880-887；Clackson,T.等人,Nature 352(1991)624-628)。

如本文所用，术语“载体”指能够增殖与其连接的另一种核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制型核酸结构的载体以及并入已经将该载体引入宿主细胞中的基因组内的载体。某些载体能够指导与它们有效连接的核酸表达。此类载体在本文中称作“表达载体”。

II.组合物和方法

A.示例性人源化的抗人Tau(pS422)抗体

如本文报道的人源化的抗体不可通过标准人源化方法获得。需要在氨基酸序列中引入非标准突变以获得具有与亲本兔抗体相当的结合特性和药物动力学性质的人源化的抗体。这特别重要，因为如本文报道的抗体意在跨越人血脑屏障并在人脑内有效。因此，用于选择人源化抗体的通常应用的标准的严格程度不足以直接用于本案。

已经发现，为了获得合适的和可开发的人源化的抗体，在CDRL3(轻链CDR3)中形成二硫键的两个半胱氨酸必需分别被丝氨酸和异亮氨酸替代。除了保证相同CDRL3的正确取向之外，存在于兔CDRL3中间的异亮氨酸残基被缺失，得到比亲本兔CDRL3少一个氨基酸残基的人源化的CDRL3。

还发现为了保持体内药物动力学性质，轻链中位置32处的氨基酸残基应该是赖氨酸(根据Kabat编号)。轻链HVR-L3中二硫键的去除不影响体内的动力学行为。

还进一步发现，在重链位置4、24和78处(根据Kabat编号)维持三个缬氨酸氨基酸残基是有利的。不受该理论限制，猜想这些残基是保证重链可变区的抗原结合环的正确呈递所需的。此外，在重链可变结构域位置71处(根据Kabat编号)精氨酸残基的存在是有利的。

HVR-L3包含两个天冬氨酸残基，这可能是脱酰胺热点，特别是在长期储存期间。在轻链可变结构域变体VL35G4中，这两个天冬氨酸残基中的一个已被改变。

如本文使用的所有编号基于Kabat可变结构域编号方案。

在下表中，显示分别与人源化的重链可变结构域VH14和VH20组合的兔轻链可变结构域的不同人源化的变体的特性。结合伙伴是人Tau(pS422)。

参考值VH00与VL00(兔抗体)：

25℃：kd＝2.6E-04；t/2＝44min。

37℃：ka＝3.7E+04，kd＝5.25E-03，KD＝1.4E-08，t/2＝22min。

在下表中，显示分别与人源化的轻链可变结构域VL17和VL19组合的兔轻链可变结构域的不同人源化的变体的特性。

参考值VH00与VL00(兔抗体)：

25℃：kd＝2.6E-04；t/2＝44min。

37℃：ka＝3.7E+04，kd＝5.25E-03，KD＝1.4E-08，t/2＝22min。

在下表中显示不同VH/VL组合的动力学常数(根据实施例8确定)。

人源化的VH和VL的不同组合的生物化学结合显示在图3和4中。

在下表中显示不同VH/VL组合的结合特异性(EC50值，以[ng/ml]计)。

从图5中显示的Western印迹可以看出选择的人源化的VH/VL组合对人tau突变体S422A的灵敏度。所有人源化的变体选择性地结合在S422磷酸化的人tau。对亲本兔抗体的非S422磷酸化表位存在低水平的交叉反应性，但在这一点，显示的人源化的变体具有比亲本兔抗体弱的交叉反应性。

在图6中，显示对于亲本兔抗体和对于选择的人源化的抗人Tau(pS422)抗体，对阿尔茨海默病患者的脑提取物中PHF-tau的结合。

基于上述，选择VH32/VL22的组合作为人源化抗体。

用亲本VH/VL组合和人源化VH/VL组合(对于人IgG的正常清除率为0.18-0.36ml/hr/kg)，发现食蟹猴的以下平均清除率。

n.d.＝未测定

可以看出，VH32/VL22组合具有增加的清除率，其是剂量依赖性的。

在下表中显示了产生的另外的VH/VL组合的动力学常数，以解决与Tau(pS422)片段的VH32/VL22的增加的剂量依赖性清除率(根据实施例10测定)。

在下表中显示了与全长Tau(pS422)和Tau(pS422)片段的作为Fab片段的VH/VL组合的动力学常数(根据实施例11和实施例12测定)。

在下表中显示了通过ELISA测定的不同VH/VL组合的结合特异性(对于磷酸化对非磷酸化Tau的选择性)。

用不同的VH/VL组合发现食蟹猴的下列平均清除率(人IgG的正常清除率为0.18-0.36ml/hr/kg；n.d.＝未测定)。

用不同的VH/VL组合发现小鼠的下列平均清除率(人IgG的正常清除率为0.18-0.36ml/hr/kg)。

在本文报道的所有方面的一个实施方案中，人源化抗人Tau(pS422)抗体在静脉内施用后具有小于0.6ml/hr/kg的平均清除率，其剂量高达25mg/kg。在一个实施方案中，在高达25mg/kg的剂量下，平均清除率为0.3ml/hr/kg或更低。

在一个优选的方面，本发明提供(人源化的)抗人Tau(pS422)抗体，其包含至少一个、或两个、或三个、或四个、或五个、或六个选自以下的HVR：(a)包含SEQ ID NO：08的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：09的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：71的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：73的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列的HVR-L3。

在一个优选的方面，本发明提供(人源化的)抗人Tau(pS422)抗体，其包含至少一个、或两个、或三个、或四个、或五个、或六个选自以下的HVR：(a)包含SEQ ID NO：08的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：09的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：70的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：72的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列的HVR-L3。

在一个优选的方面，本发明提供(人源化的)抗人Tau(pS422)抗体，其包含至少一个、或两个、或三个、或四个、或五个、或六个选自以下的HVR：(a)包含SEQ ID NO：08的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：09的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO：74的氨基酸序列的HVR-L3。

在一个优选的方面，本发明提供(人源化的)抗人Tau(pS422)的抗体，其包含至少一个、或两个、或三个、或四个、或五个、或六个选自以下的HVR：(a)包含SEQ ID NO：08的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：77的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ IDNO：14的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO：75的氨基酸序列的HVR-L3。

在一个方面，本发明提供(人源化的)抗人Tau(pS422)抗体，其包含至少一个、或两个、或三个、或四个、或五个、或六个选自以下的HVR：(a)包含SEQ ID NO：08的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：77的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO：79的氨基酸序列的HVR-L3。

在一个方面，本发明提供(人源化的)抗体，其包含至少一个、至少两个、或所有三个选自以下的VH HVR序列：(a)包含SEQ ID NO：08的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ IDNO：09的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的HVR-H3。

在一个方面，抗体包含(a)包含SEQ ID NO：08的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQID NO：09的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的HVR-H3。

在另一个实施方案中，抗体还包含至少一个、至少两个、或所有三个选自以下的VLHVR序列：

i)(a)包含SEQ ID NO：71的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：73的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列的HVR-L3；或

ii)(a)包含SEQ ID NO：70的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：72的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列的HVR-L3；或

iii)(a)包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQ ID NO：79的氨基酸序列的HVR-L3。

在又一个实施方案中，抗体包含

在一个方面，本发明提供了(人源化)的抗体，其包含

i)(a)包含SEQ ID NO：08的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：09的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：71的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：73的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列的HVR-L3，或

ii)(a)包含SEQ ID NO：08的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：09的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：70的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：72的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ IDNO：15的氨基酸序列的HVR-L3，或者

iii)(a)包含SEQ ID NO：08的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：09的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ IDNO：79的氨基酸序列的HVR-L3。

在另一实施方案中，相对于参照序列，VH或VL含有置换(例如保守置换)、插入、或缺失，但包含该序列的抗人Tau(pS422)抗体保留结合人Tau(pS422)的能力。

在本发明的进一步方面，根据上述实施方案中任一个的抗人Tau(pS422)抗体是单克隆抗体，包括嵌合、人源化或人抗体。在一个实施方案中，抗人Tau(pS422)抗体是抗体片段，例如，Fv、Fab、Fab’、scFv、双抗体、或F(ab’)2片段。在另一实施方案中，所述抗体是全长抗体，例如，完整IgG1或IgG 4抗体或如本文定义的其他抗体类型或同种型。

如本文报道的(人源化的)抗体降低转基因TauPS2APP小鼠的脑中的Tau(pS422)水平。

在进一步的方面，根据任何上述实施方案中的(人源化的)抗人Tau(pS422)抗体可以单独或组合并入如以下部分1-7中描述的任何特征：

1.抗体亲和力

在某些实施方案中，本文提供的抗体具有≤100nM，≤50nM，或1nM至100nM之间(例如10^-7M或更少，例如从10^-7M至10^-9M)的解离常数(KD)。

在一个实施方案中，Kd通过放射标记的抗原结合测定(RIA)测量。在一个实施方案中，RIA以感兴趣的抗体的Fab版本及其抗原进行。例如，Fab对于抗原的溶液结合亲和力通过在未标记的抗原滴定系列的存在下利用最小浓度的(¹²⁵I)-标记的抗原平衡Fab，然后用抗-Fab抗体-包被的板捕获结合的抗原来测量(参见，例如，Chen,Y.等人，J.Mol.Biol.293(1999)865-881)。为了建立测定条件，将

多孔板(ThermoScientific)用5μg/ml的捕获抗-Fab抗体(Cappel Labs)在50mM碳酸钠(pH 9.6)中包被过夜，并且随后用PBS中的2％(w/v)牛血清白蛋白在室温(大约23℃)封闭二至五小时。在非吸附板(Nunc#269620)中，将100pM或26pM[¹²⁵I]-抗原与感兴趣的Fab的系列稀释物混合(例如，与在Presta,L.G.等人，Cancer Res.57(1997)4593-4599中对抗-VEGF抗体，Fab-12的评价一致)。然后将感兴趣的Fab孵育过夜；然而，孵育可以继续更长时期(例如，约65小时)以保证达到平衡。之后，将混合物转移至捕获平板用于在室温孵育(例如，一小时)。然后移除溶液并将平板用PBS中的0.1％聚山梨醇酯

洗涤八次。当平板干燥时，加入150μl/孔的闪烁液(scintillant)(MICROSCINT-20^TM；Packard)，并且将平板在TOPCOUNT^TM计数器(Packard)上计数十分钟。选择各个Fab的给出小于或等于最大结合的20％的浓度用于竞争结合测定。

根据另一个实施方案，Kd使用

表面等离子共振测量。例如，使用

或

(BIAcore，Inc.，Piscataway，NJ)的测定在25℃利用以～10响应单位(RU)固定的抗原CM5芯片进行。在一个实施方案中，根据供应商的使用说明将羧甲基化的葡聚糖生物传感器芯片(CM5，BIAcore，Inc.)用N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化。将抗原用10mM乙酸钠，pH4.8，稀释至5μg/ml(～0.2μM)，然后以5μl/分钟的流速注射获得大约10响应单位(RU)的偶联的蛋白。注射抗原后，注入1M乙醇胺以封闭未反应的基团。为了动力学测量，将两倍系列稀释的Fab(0.78nM至500nM)在具有0.05％聚山梨醇酯

表面活性剂的PBS(PBST)中以大约25μl/min的流速在25℃注射。使用简单的一对一Langmuir结合模型([

评价软件版本3.2)，通过同时拟合结合和解离传感曲线计算结合速率(kon)和解离速率(koff)。平衡解离常数(Kd)计算为比率koff/kon(参见，例如，Chen,Y.等人，J.Mol.Biol.293(1999)865-881)。如果通过上述表面等离子共振测定的结合速率(on-rate)超过10⁶M^-1s^-1，则结合速率可以通过使用荧光猝灭技术测定，该技术在分光计，如停流装备的分光光度计(Aviv Instruments)或具有搅拌容器的8000-系列SLM-AMINCO^TM分光光度计(ThermoSpectronic)中测量的增加的抗原浓度的存在下，测量PBS，pH 7.2中的20nM抗-抗原抗体(Fab形式)在25℃的荧光发射强度的增加或减少(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)。

2.抗体片段

在某些实施方案中，本文提供的抗体是抗体片段。抗体片段包括但不限于Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)₂、Fv和scFv片段和下文描述的其他片段。关于某些抗体片段的综述，见Hudson,P.J.等人,Nat.Med.9(2003)129-134。关于scFv片段的综述，参见例如Plueckthun,A.,引自The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,第113卷,Rosenburg和Moore(编著),(Springer-Verlag,New York(1994),第269-315页；还参见WO 93/16185；US 5,571,894和US5,587,458。关于包含救援受体(salvage receptor)结合表位残基和具有增加的体内半寿期的Fab和F(ab')₂片段的讨论，见US 5,869,046。

双体抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段，其可以是双价或双特异性的。参见例如EP 0 404 097；WO 1993/01161；Hudson,P.J.等人,Nat.Med.9(2003)129-134；和Holliger,P.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(1993)6444-6448。三体抗体和四体抗体还在Hudson,P.J.等人,Nat.Med.9(2003)129-134)中描述。

单结构域抗体是包含抗体的全部或一部分重链可变结构域或全部或一部分轻链可变结构域的抗体片段。在某些实施方案中，单结构域抗体是人单结构域抗体(Domantis,Inc.,Waltham,MA；参见例如US 6,248,516)。

可以通过多种技术产生抗体片段，所述多种技术包括但不限于蛋白酶解消化完整抗体以及由重组宿主细胞产生(例如，大肠杆菌或噬菌体)，如本文所述。

3.人源化抗体

一般地，将非人抗体人源化以降低对人的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。通常，人源化抗体包含一个或多个可变结构域，其HVR(例如，CDR)(或其部分)衍生自非人抗体并且FR(或其部分)衍生自人抗体序列。人源化抗体任选地也将包含人恒定区的至少一部分或全长。在一些实施方案中，将人源化抗体中的一些FR残基置换为来自非人抗体(例如，从其衍生HVR残基的抗体)的相应残基，例如，以恢复或改善抗体特异性或亲和力。

人源化抗体和制造它们的方法例如在Almagro,J.C.和Fransson,J.,Front.Biosci.13(2008)1619-1633中综述，并且例如在Riechmann,I.等人,Nature 332(1988)323-329；Queen,C.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(1989)10029-10033；US 5,821,337、US 7,527,791、US 6,982,321和US 7,087,409；Kashmiri,S.V.等人,Methods 36(2005)25-34(描述特异性决定区(SDR)移植)；Padlan,E.A.,Mol.Immunol.28(1991)489-498(描述“表面重塑”)；Dall'Acqua,W.F.等人,Methods 36(2005)43-60(描述“FR改组”)；和Osbourn,J.等人,Methods 36(2005)61-68；以及Klimka,A.等人,Br.J.Cancer 83(2000)252-260(描述针对FR改组的“导向选择”方案)中进一步描述。

可以用于人源化的人构架区包括但不限于：使用“最佳配合”方法选择的构架区(例如，参见Sims,M.J.等人,J.Immunol.151(1993)2296-2308)；从特定亚组的人抗体的轻链可变区或重链可变区的共有序列衍生的构架区(例如，参见Carter,P.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89(1992)4285-4289；和Presta,L.G.等人,J.Immunol.151(1993)2623-2632)；人成熟(体细胞突变)构架区或人种系构架区(例如，参见Almagro,J.C.和Fransson,J.,Front.Biosci.13(2008)1619-1633)；和从筛选FR文库衍生的构架区(例如，参见Baca,M.等人,J.Biol.Chem.272(1997)10678-10684和Rosok,M.J.等人,J.Biol.Chem.271(1996)22611-22618)。

4.多特异性抗体

在某些实施方案中，本文提供的抗体是多特异性抗体，例如双特异性抗体。多特异性抗体是对至少两个不同位点具有结合特异性的单克隆抗体。在某些实施方案中，这些结合特异性之一针对人Tau(pS422)，并且其它特异性针对任何其他抗原。在某些实施方案中，双特异性抗体可以结合人Tau(pS422)的2个不同表位。双特异性抗体可以作为全长抗体或抗体片段制备。

用于制备多特异性抗体的技术包括但不限于重组共表达具有不同特异性的两个免疫球蛋白重链-轻链对(参见Milstein,C.和Cuello,A.C.,Nature 305(1983)537-540,WO93/08829和Traunecker,A.等人,EMBO J.10(1991)3655-3659)和“结入扣”工程化(例如，参见US5,731,168)。也可以通过以下方式制备多特异性抗体：工程化静电转向效应用于产生抗体Fc-异二聚体分子(WO 2009/089004)；交联两个或更多个抗体或片段(例如，参见US 4,676,980和Brennan,M.等人,Science 229(1985)81-83)；使用亮氨酸拉链以产生双特异性抗体(参见例如Kostelny,S.A.等人,J.Immunol.148(1992)1547-1553)；使用“双体抗体(diabody)”技术以制备双特异性抗体片段(参见例如Holliger,P.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(1993)6444-6448)；和使用单链Fv(sFv)二聚体(例如，参见Gruber,M.等人,J.Immunol.152(1994)5368-5374)；以及制备三特异性抗体，如在例如Tutt,A.等人,J.Immunol.147(1991)60-69)中所述那样。

本文中还包括具有三个或更多个功能性抗原结合位点的工程化抗体，包括“八抗体(Octopus antibody)”(参见例如US 2006/0025576)。

本文的抗体或片段还包括“双重功能FAb(Dual Acting Fab)”或“DAF”，其包含与人Tau(pS422)以及另一种不同抗原结合的抗原结合位点(例如参见，US 2008/0069820)。

本文中的抗体或片段也包括在WO 2009/080251、WO 2009/080252、WO 2009/080253、WO 2009/080254、WO 2010/112193、WO 2010/115589、WO 2010/136172、WO 2010/145792和WO 2010/145793中描述的多特异性抗体。

5.抗体变体

在某些实施方案中，构思了本文提供的抗体的氨基酸序列变体。例如，可能想要改善该抗体的结合亲和力和/或其他生物学特性。可以通过向编码抗体的核苷酸序列引入适宜修饰或通过肽合成制备该抗体的氨基酸序列变体。此类修饰包括例如，从抗体的氨基酸序列内部缺失残基和/或将残基插入所述氨基酸序列中和/或置换所述氨基酸序列中的残基。可以产生缺失、插入和置换的任意组合以获得最终构建体，只要所述最终构建体拥有想要的特征，例如抗原结合作用。

a)置换变体、插入变体和缺失变体

在某些实施方案中，提供具有一个或多个氨基酸置换的抗体变体。用于置换诱变的目的位点包括HVR和FR。下表中在“优选置换”的标题下显示保守性置换。在下表中在“示例性置换”的标题下提供了更实质的变化，并且参考氨基酸侧链类别在下面进一步描述。可以将氨基酸置换引入目的抗体中并且对产物筛选所需的活性，例如，保留/改善的抗原结合作用、降低的免疫原性或改善的ADCC或CDC。

表

可以根据常见的侧链特性分组氨基酸：

(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；

(2)中性亲水：Cys、Ser、Thr、Asn；Gln；

(3)酸性：Asp、Glu；

(4)碱性：His、Lys、Arg；

(5)影响链方向的残基：Gly、Pro；

(6)芳族：Trp、Tyr、Phe。

非保守性置换将使这些类别之一的成员交换为另一个类别的成员。

一个置换变体类型涉及置换亲本抗体(例如，人源化抗体)的一个或多个高变区残基。通常，经选择用于进一步研究的所得变体将相对于亲本抗体在某些生物学特性方面(例如，增加的亲和力、降低的免疫原性)具有修饰(例如，改善)和/或将具有亲本抗体的基本上保留的某些生物学特性。示例性置换变体是亲和力成熟抗体，所述抗体可以例如使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术如本文所述的那些技术便利地产生。简而言之，将一个或多个HVR残基突变并且将变体抗体在噬菌体上展示并筛选特定生物学活性(例如结合亲和力)。

可以在HVR中做出改变(例如，置换)，例如以改善抗体亲和力。可以在HVR“热点”(即，在体细胞成熟过程期间以高频率经历突变的密码子所编码的残基(参见例如Chowdhury,P.S.,Methods Mol.Biol.207(2008)179-196)和/或接触抗原的残基中做出这类改变，同时对所产生的变体VH或VL测试结合亲和力。已经例如在Hoogenboom,H.R.等人,引自Methods in Molecular Biology 178(2002)1-37中描述了通过构建次级文库并从中重新选择实现亲和力成熟。在亲和力成熟的一些实施方案中，通过多种方法(例如，易错PCR、链改组或寡核苷酸定向诱变)中的任一种方法，将多样性引入所选择用于成熟的可变基因中。随后产生次级文库。随后筛选该文库以鉴定具有所需亲和力的任何抗体变体。另一种引入多样性的方法涉及HVR导向的方案，其中将几个HVR残基(例如，一次4-6个残基)随机分组。可以特别地鉴定参与抗原结合的HVR残基，例如，使用丙氨酸扫描法诱变或建模。特别地经常靶向CDR-H3和CDR-L3。

在某些实施方案中，可以在一个或多个HVR中发生置换、插入或缺失，只要这类改变基本上不降低抗体结合抗原的能力。例如，可以在HVR中做出基本上不降低结合亲和力的保守性改变(例如，如本文中提供的保守性置换)。这类改变可以例如是在HVR中的抗原接触残基外部。在上文提供的变体VH和VL序列的某些实施方案中，每个HVR或者不予改变或含有不多于一个、两个或三个氨基酸置换。

一种用于鉴定可以被靶向用于诱变的抗体残基或区域的有用方法称作“丙氨酸扫描法诱变法”，如Cunningham,B.C.和Wells,J.A.,Science 244(1989)1081-1085所述。在这种方法中，鉴定一个残基或靶残基组(例如，带电荷残基如arg、asp、his、lys和glu)并且用中性或带负电荷的氨基酸(例如，丙氨酸或聚丙氨酸)替换以确定该抗体与抗原的相互作用是否受影响。可以在对于初始置换显示功能敏感性的氨基酸位置处引入其他置换。备选地或额外地，测定抗原-抗体复合物的晶体结构以鉴定抗体和抗原之间的接触点。可以将这类接触残基和邻近残基作为置换候选物打靶或消除。可以筛选变体以确定它们是否含有所需的特性。

氨基酸序列插入包括长度从1个残基至含有成百个或更多个残基的多肽间变动的氨基端和/或羧基端融合，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的例子包括具有N末端甲硫氨酰基残基的抗体。抗体分子的其他插入性变体包括抗体的N末端或C末端与酶(例如针对ADEPT的酶)或增加该抗体血清半寿期的多肽融合。

b)糖基化变体

在某些实施方案中，改变本文提供的抗体以增加或减少抗体发生糖基化的程度。可以通过改变氨基酸序列从而创造或移除一个或多个糖基化位点，便利地实现对抗体添加或删除糖基化位点。

在抗体包含Fc区的情况下，可以改变与之连接的糖。哺乳动物细胞产生的天然抗体一般包含分枝的双天线状低聚糖，所述低聚糖通常借助N联连接至Fc区的CH2结构域的Asn297(例如，见Wright,A.和Morrison,S.L.,TIBTECH 15(1997)26-32)。低聚糖可以包括多种糖，例如，甘露糖、N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸，以及与双天线状低聚糖结构的“茎部”中GlcNAc连接的岩藻糖。在一些实施方案中，可以修饰本发明抗体中的低聚糖以产生某些特性改善的抗体变体。

c)Fc区变体

在某些实施方案中，可以将一个或多个氨基酸修饰引入本文提供的抗体的Fc区中，由此产生Fc区变体。该Fc区变体可以包含人Fc区序列(例如，人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc区)，所述人Fc区序列在一个或多个氨基酸位置处包含氨基酸修饰(例如，置换)。

在某些实施方案中，本发明构思了拥有一些但非全部效应子功能的抗体变体，这使所述抗体变体成为下述应用的有利候选物，其中抗体的体内半寿期重要，而某些效应子功能(如补体和ADCC)是不必要或有害的。可以实施体外和/或体内细胞毒性测定法以证实CDC和/或ADCC活性降低/消耗。例如，可以实施Fc受体(FcR)结合测定法以确保抗体缺少FcγR结合作用(因此可能缺少ADCC活性)，但是保留FcRn结合能力。介导ADCC的主要细胞-NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。Ravetch,J.V.和Kinet,J.P.,Annu.Rev.Immunol.9(1991)457-492的第464页上的表3中总结了造血细胞上的FcR表达。评估目的分子的ADCC活性的体外测定法的非限制性例子在US 5,500,362(参见例如Hellstrom,I.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83(1986)7059-7063；和Hellstrom,I.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82(1985)1499-1502)；US 5,821,337(参见Bruggemann,M.等人,J.Exp.Med.166(1987)1351-1361))中描述。备选地，可以使用非放射性分析方法(参见例如用于流式细胞术的ACTI^TM非放射性细胞毒性测定法(CellTechnology,Inc.MountainView,CA；和CytoTox

非放射性细胞毒性测定法(Promega,Madison,WI))。用于此类测定法的有用效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。备选或额外地，可以在体内，例如，在动物模型中，如在Clynes,R.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95(1998)652-656公开中的那种动物模型中评估目的分子的ADCC活性。也可以实施C1q结合测定法以证实抗体不能结合C1q并因此缺少CDC活性。参见例如WO 2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体激活，可以进行CDC测定法(参见例如Gazzano-Santoro,H.等人,J.Immunol.Methods 202(1996)163-171；Cragg,M.S.等人,Blood 101(2003)1045-1052；以及Cragg,M.S.和M.J.Glennie,Blood 103(2004)2738-2743)。也可以使用本领域已知的方法确定FcRn结合作用和体内清除率/半寿期(参见例如Petkova,S.B.等人,Int.Immunol.18(2006:1759-1769)。

效应子功能减少的抗体包括置换一个或多个Fc区残基238、265、269、270、297、327和329(US 6,737,056)的那些。这类Fc区突变体包括在氨基酸位置265、269、270、297和327的两个或更多个位置处具有置换的Fc区突变体，包括残基265和297置换成丙氨酸的所谓“DANA”Fc区突变体(US 7,332,581)。

描述了具有FcR结合作用改善或削弱的某些抗体变体。(参见例如US6,737,056；WO2004/056312，和Shields,R.L.等人,J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604)

在一些实施方案中，在Fc区内做出改变，所述改变导致变更(即削弱)的C1q结合作用和/或补体依赖的细胞毒性(CDC)，例如，如US 6,194,551、WO 99/51642和Idusogie,E.E.等人,J.Immunol.164(2000)4178-4184中所述。

在US 2005/0014934中描述了半寿期增加和新生儿Fc受体(FcRn)结合作用改善的抗体，所述新生儿Fc受体负责转移母源IgG至胎儿(Guyer,R.L.等人,J.Immunol.117(1976)587-593和Kim,J.K.等人,J.Immunol.24(1994)2429-2434)。这些抗体包含其中具有一个或多个置换的Fc区，其中所述置换改善Fc区与FcRn的结合。这类Fc区变体包括在一个或多个Fc区残基：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434处具有置换(例如，Fc区残基434置换)的那些(US 7,371,826)。

关于Fc区变体的其他例子，还参见Duncan,A.R.和Winter,G.,Nature 322(1988)738-740；US 5,648,260；US 5,624,821和WO 94/29351。

d)半胱氨酸工程化抗体变体

在某些实施方案中，可能想要产生半胱氨酸工程化的抗体，例如，“硫代MAb”，其中所述抗体的一个或多个残基用半胱氨酸残基置换。在具体的实施方案中，置换的残基出现在抗体的可及位点处。通过用半胱氨酸置换这些残基，因而将反应性巯基安置在抗体的可及位点处并且可以用来使抗体缀合至其他部分，如药物部分或接头-药物部分以产生免疫缀合物，如本文中进一步所述。在某些实施方案中，可以用半胱氨酸置换以下残基的任何一个或多个：轻链的V205(Kabat编号)；重链的A118(EU编号)；和重链Fc区的S400(EU编号)。可以例如如US 7,521,541中所述那样产生半胱氨酸工程化的抗体。

e)抗体衍生物

在某些实施方案中，可以进一步修饰本文提供的抗体以含有本领域已知并轻易可获得的额外的非蛋白质部分。适于抗体衍生化的部分包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性例子包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚1,3-二氧戊环、聚1,3,6-三

烷、亚乙基/马来酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)和葡聚糖或聚(N-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如，丙三醇)、聚乙烯醇和它们的混合物。聚乙二醇丙醛可以具有制造方面的优点，原因在于其在水中的稳定性。这种聚合物可以具有任何分子量，并可以是分枝或不分枝的。与抗体连接的聚合物的数目可以变动，并且如果连接多于一个聚合物，它们可以是相同或不同的分子。通常，用于衍生化的聚合物的数目和/或类型可以基于以下考虑事项确定，包括但不限于待改善的抗体特定特性或功能、抗体衍生物是否将用于定义情况下的疗法中等等。

在另一个实施方案中，提供了抗体和非蛋白质部分的缀合物，其中所述非蛋白质部分可以通过暴露于辐射而选择性加热。在一个实施方案中，非蛋白质部分是碳纳米管(Kam,N.W.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102(2005)11600-11605)。辐射可以具有任何波长，并包括但不限于这样的波长，所述波长不伤害普通细胞，但是使非蛋白质部分加热至杀伤临近于抗体-非蛋白质部分的细胞的温度。

B.重组方法和组合物

可以使用重组方法和组合物产生抗体，例如如US 4,816,567中所述。在一个实施方案中，提供了编码本文所述的抗人Tau(pS422)抗体的分离核酸。这种核酸可以编码包含抗体VL的氨基酸序列和/或包含抗体VH的氨基酸序列(例如，抗体的轻链和/或重链)。在又一个实施方案中，提供一种或多种包含这种核酸的载体(例如，表达载体)。在又一个实施方案中，提供包含这种核酸的宿主细胞。在这样一个实施方案中，宿主细胞包含(例如，已经用以下转化)：(1)包含核酸的载体，所述核酸编码包含抗体的VL的氨基酸序列和包含抗体的VH的氨基酸序列，或(2)包含核酸的第一载体，所述核酸编码包含抗体的VL的氨基酸序列，和包含核酸的第二载体，所述核酸编码包含抗体的VH的氨基酸序列。在一个实施方案中，宿主细胞是真核的，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴样细胞(例如，Y0、NS0、Sp20细胞)。在一个实施方案中，提供一种制备抗人Tau(pS422)抗体的方法，其中所述方法包括在适于表达抗体的条件下培养如上文提供的宿主细胞，所述宿主细胞包含编码抗体的核酸，和任选地从宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收抗体。

为了重组产生抗人Tau(pS422)抗体，将编码抗体的核酸(例如，如上文所述)分离并插入一种或多种载体中用于宿主细胞中进一步克隆和/或表达。可以使用常规方法(例如，通过使用能够与编码抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)，轻易地分离这种核酸并将其测序。

克隆或表达编码抗体的载体的合适宿主细胞包括本文所述的原核或真核细胞。例如，可以在细菌中产生抗体，尤其当不需要糖基化和Fc效应子功能时。对于细菌中表达抗体片段和多肽，例如，参见US 5,648,237、U S5,789,199和US 5,840,523。(还参见Charlton,K.A.,引自Methods in Molecular Biology,第248卷,Lo,B.K.C.(编著),Humana Press,Totowa,NJ(2003),第245-254页，其描述了在大肠杆菌中表达抗体片段)。在表达后，可以将抗体从细菌细胞糊状物分离于可溶性级分中并且可以进一步纯化抗体。

除原核生物之外，真核微生物如丝状真菌或酵母是编码抗体的载体的合适克隆宿主或表达宿主，包括其糖基化途径已经“人源化”的真菌和酵母菌株，导致产生具有部分或完全人糖基化模式的抗体。参见Gerngross,T.U.,Nat.Biotech.22(2004)1409-1414；和Li,H.等人,Nat.Biotech.24(2006)210-215。

表达糖基化抗体的合适宿主细胞还源自多细胞生物(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的例子包括植物细胞和昆虫细胞。已经鉴定可以与昆虫细胞联合使用的许多杆状病毒毒株，特别是用于转染草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞。

也可以利用植物细胞培养物作为宿主。例如，见US 5,959,177、US 6,040,498、US6,420,548,US 7,125,978和US 6,417,429(描述了在转基因植物中产生抗体的PLANTIBODIES^TM技术)。

也可以使用脊椎动物细胞作为宿主。例如，适应于悬浮培育的哺乳动物细胞系可以是有用的。可用哺乳动物宿主细胞系的其他例子是由SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾系(如在例如Graham,F.L.等人，J.Gen Virol.36(1977)59-74中所述的293或293细胞)；幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠支持细胞(如在例如Mather,J.P.,Biol.Reprod.23(1980)243-252中所述的TM4细胞)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK；布法罗大鼠肝细胞(BRL 3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(HepG2)；小鼠乳腺瘤(MMT 060562)；如在例如Mather,J.P.等人,Annals N.Y.Acad.Sci.383(1982)44-68中所述的TRI细胞；MRC 5细胞；和FS4细胞。其他可用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR^-CHO细胞(Urlaub,G.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA77(1980)4216-4220)；和骨髓瘤细胞系如Y0、NS0和Sp2/0。关于适于产生抗体的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，例如，见Yazaki,P.和Wu,A.M.,Methods in Molecular Biology,第248卷,Lo,B.K.C.(编著),Humana Press,Totowa,NJ(2004),第255-268页。

C.测定法

可以通过本领域已知的多种测定法，鉴定、筛选或表征本文提供的抗人Tau(pS422)抗体的物理/化学特性和/或生物学活性。

1.结合测定和其他测定

在一个方面，例如，通过已知方法如ELISA、αLISA、Western印迹、抗体或反相阵列等对本发明的抗体测试其抗原结合活性等。

在示例性ELISA或αLISA测定中，溶液(例如细胞上清、细胞或组织裂解物、体液等)中的Tau(pS422)被特异结合Tau(pS422)上的第一表位或某种构象的Tau(pS422)的捕获抗体结合，并且检测抗体与特异结合Tau(pS422)的第二表位或构象的检测实体偶联。结果读取基于检测实体(化学发光、荧光、能量转移引起的发光等)。在一些情况中，同一抗体可以在同一测定中用作捕获和检测抗体以检测Tau(pS422)的聚集形式(参见例如Tokuda,T.等人，Neurology 75(2010)1766-1772)。

在抗体阵列的情况中，将抗体点在玻璃或硝酸纤维素芯片上。将载玻片封闭并用含有Tau(pS422)的溶液孵育，洗涤以去除未结合的抗体并且用荧光标记的相应二抗检测结合的抗体。通过荧光载玻片扫描器测量荧光信号。类似地，对于反相阵列，将重组Tau(pS422)、细胞上清、细胞或组织裂解物、体液等点在玻璃或硝酸纤维素芯片上。将载玻片封闭并且将个体阵列用针对Tau(pS422)上的特定表位的抗体孵育。洗去未结合的抗体并且利用荧光标记的对应二抗检测结合的抗体。通过荧光载玻片扫描器测量荧光信号(Dernick,G.等人，J.Lipid Res.52(2011)2323-2331)。

在Western印迹的实例中，将源自例如细胞上清、细胞或组织裂解物、体液等的聚集的重组Tau(pS422)或Tau(pS422)在SDS PAGE或天然凝胶条件中通过分子量分离并且印迹到硝酸纤维素或PVDF膜上。封闭后，将膜与对Tau(pS422)的氨基酸序列或构象特异的抗体孵育。然后将膜洗涤以去除未结合的抗体。用与检测实体偶联的相应二抗检测结合的抗体，用于化学发光或荧光或其方式的检测。对Tau(pS422)的氨基酸序列特异的抗体将结合各种聚集形式和因此各种分子量的Tau(pS422)，只要表位不被聚集所遮盖。另一方面，构象特异的抗体将仅检测Tau(pS422)的某些聚集形式，仅在特定分子量处显示条带(参见例如Towbin,H.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76(1979)4350-4353；Burnette,W.N.,Anal.Biochem.112(1981)195-203)。

在另一方面，竞争测定可以用于鉴定与如本文报道的(人源化的)抗体竞争结合人Tau(pS422)的抗体。在某些实施方案中，这样的竞争性抗体结合被如本文报道的(人源化的)抗体结合的相同表位(例如，线性或构象表位)。在Morris,G.E.(编)，Epitipe MappingProtocols，在：Methods in Molecular Biology，第66卷，Humana Press，Totowa，NJ(1996)中提供用于将抗体结合表位制图的详细的示例性方法。

在示例性竞争测定中，将固定的人Tau(pS422)在包含结合人Tau(pS422)的第一标记的抗体和测试其与第一抗体竞争结合人Tau(pS422)的能力的第二未标记的抗体的溶液中孵育。作为对照，将固定的人Tau(pS422)在包含第一标记的抗体但不包含第二未标记的抗体的溶液中孵育。在允许第一抗体结合人Tau(pS422)的条件下孵育后，移除过量未结合的抗体，并且测量与固定的人Tau(pS422)关联的标记的量。如果与固定的人Tau(pS422)关联的标记的量在测试样品中相对于对照样品显著减少，则表明第二抗体与第一抗体竞争结合人Tau(pS422)(参见例如，Harlow,E.和Lane,D.,Antibodies：A Laboratory Manual，第14章，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY(1988))。

2.活性测定

在一个方面，提供用于鉴定具有生物活性的抗人Tau(pS422)抗体的测定。生物活性可以包括，例如，保护免受/减少/抑制Tau(pS422)引起的细胞毒性，和/或保护免受/减少/抑制寡聚的人Tau(pS422)的细胞至细胞的传输，和/或减少LUHMES细胞中Tau(pS422)-引起的胱天蛋白酶活性。还提供在体内和/或体外具有该生物活性的抗体。

在某些实施方案中，对本发明的抗体测试所述生物活性。

保护性生物活性可以通过加入含有分泌的Tau(pS422)的条件培养基来评价，所述分泌的Tau(pS422)引起接受者神经元细胞的细胞死亡。该毒性可以通过加入如本文所述的保护性抗体来逆转。之前已经确立了分泌的Tau(pS422)的毒性(Emmanouilidou,E.等人，J.Neurosci.,30(2010)6838-6851)。

D.用于诊断和检测的方法和组合物

在某些实施方案中，本文提供的任一种抗人Tau(pS422)抗体可用于检测人Tau(pS422)在生物样品中的存在。如本文所用，术语“检测”涵盖定量性或定性检测。在某些实施方案中，生物样品包含细胞或组织，如脑组织。

在一个实施方案中，提供在诊断或检测方法中使用的抗人Tau(pS422)抗体。在又一个方面，提供一种检测人Tau(pS422)在生物样品中存在的方法。在某些实施方案中，该方法包括：使生物样品与如本文所述的抗人Tau(pS422)抗体在允许抗人Tau(pS422)抗体与人Tau(pS422)结合的条件下接触，并且检测抗人Tau(pS422)抗体和人Tau(pS422)之间是否形成复合物。这种方法可以是体外或体内方法。在一个实施方案中，抗人Tau(pS422)抗体用来选择适于用抗人Tau(pS422)抗体治疗的受试者，例如其中人Tau(pS422)是选择患者的生物标志物。

可以使用本发明的抗体诊断的示例性病症包括具有脑铁积累类型1的神经变性(neurodegeneration with brain iron accumulation type 1，NBIA1)、单纯性自主神经衰竭(pure autonomic failure)、唐氏综合征(Down’s syndrome)、关岛复合体(complexof Guam)、和多种路易小体病症(Lewy body disorder)如弥漫性路易小体病(DLBD)，阿尔茨海默病的路易小体变体(LBVAD)，某些形式的高歇氏病(Gaucher’s disease)，和帕金森病痴呆(PDD)。

在某些实施方案中，提供了标记的抗人Tau(pS422)抗体。标记物包括但不限于，直接检出的标记物或部分(如荧光、发色、电子致密、化学发光和放射性标记物)，以及间接检出(例如借助酶促反应或分子相互作用)的部分，如酶或配体。示例性标记物包括但不限于放射性同位素³²P、¹⁴C、¹²⁵I、³H和¹³¹I、荧光团如稀土元素螯合物或荧光素及其衍生物、罗丹明及其衍生物、丹磺酰、伞形酮、萤光素酶例如萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶(US 4,737,456)、萤光素、2,3-二氢二氮杂萘二酮、辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、杂环氧化酶如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶，其与利用过氧化氢来氧化染料前体的酶如HRP、乳过氧化物酶或微过氧化物酶偶联、生物素/抗生物素蛋白、自旋标记物、噬菌体标记物、稳定的自由基等。

E.药物制剂

通过以下方式制备冻干制剂或水溶液形式的如本文所述的抗人Tau(pS422)抗体的药物制剂：将具有所需纯度的这种抗体与一种或多种任选的可药用载体混合(Remington's Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.(编著)(1980))。可药用载体总体上在所用的剂量和浓度对接受者无毒，并且包括但不限于：缓冲剂如磷酸盐、柠檬酸和其他有机酸；抗氧化剂(包括抗坏血酸和甲硫氨酸)；防腐剂(如十八烷基苄基二甲基氯化铵；六甲氯铵；苯扎氯铵、苯扎溴铵；苯酚、丁醇或苄醇；烷基尼泊金酯如尼泊金甲酯或丙酯；儿茶酚；雷琐辛；环己醇；3-戊醇和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物如聚(乙烯吡咯烷酮)；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他糖包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂如EDTA；糖如蔗糖、甘露糖、海藻糖或山梨糖；形成盐的反离子如钠；金属复合物(例如，Zn-蛋白质复合物)和/或非离子表面活性剂如聚乙二醇(PEG)。本文中的示例性可药用载体还包括间质药物分散剂如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如，人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，如rhuPH20(

Baxter International,Inc.)。在US2005/0260186和US 2006/0104968中描述了某些示例性sHASEGP和使用方法，包括rhuPH20。在一个方面，sHASEGP与一种或多种额外的糖胺聚糖酶如软骨素酶组合。

在US 6,267,958中描述了示例性冻干抗体制剂。水质抗体制剂包括在US 6,171,586和WO 2006/044908中描述的那些制剂，后一类制剂包含组氨酸-乙酸盐缓冲剂。

本文中的制剂也可以根据正在治疗的特定适应症的需要而含有多于一种有效成分，优选地是具有并未相互不利影响的互补活性的那些有效成分。这类有效成分以有效用于预期目的的量适当地存在。

有效成分可以包埋于例如分别通过凝聚技术或界面聚合聚合制备的微胶囊(例如，羟甲基纤维素微胶囊或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)、胶态药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球体、微乳液、纳米粒子和纳米胶囊)或大乳浊液(macroemulsion)中。此类技术在Remington's Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.(编著)(1980)中公开。

可以制备持续释放制品。持续释放制品的合适例子包括含有抗体的固态疏水性聚合物的半通透性基质，所述基质处于成型制品(例如，薄膜或微胶囊)形式。

待用于体内施用的制剂通常是无菌的。可以例如通过借助无菌滤膜过滤轻易地实现无菌性。

例如，在被治疗的适应症是阿尔茨海默病或前驱阿尔茨海默病的情况下，药物制剂还可以含有一种或多种另外的活性成分，例如多奈哌齐、美金刚、利凡斯的明、加兰他敏、雷司替明(rivastigmine)、甲磺酸双氢麦角毒碱(ergoloid mesylates)、抗Abeta抗菌剂和抗α-突触核蛋白抗体。

F.治疗方法和组合物

本文提供的任何抗人Tau(pS422)抗体可以用于治疗方法中。

在一个方面，提供作为药物使用的抗人Tau(pS422)抗体。在其他方面，提供用于治疗阿尔茨海默病的抗人Tau(pS422)抗体。在某些实施方案中，提供用于治疗方法中的抗人Tau(pS422)抗体。在某些实施方案中，本发明提供用于治疗患有阿尔茨海默病的个体的方法中的抗人Tau(pS422)抗体，所述方法包括向该个体施用有效量抗人Tau(pS422)抗体。在一个这种实施方案中，该方法还包括向该个体施用有效量的至少一种额外治疗剂，例如，如下文描述的治疗剂。在其他实施方案中，本发明提供抗人Tau(pS422)抗体，其用于抑制人神经元和胶质细胞中Tau(pS422)引起的细胞毒性，或抑制神经元和胶质细胞之间寡聚人Tau(pS422)的细胞-至-细胞传输，或减少Tau(pS422)-引起的胱天蛋白酶活性。在某些实施方案中，本发明提供抗人Tau(pS422)抗体，其用于在个体中抑制人神经元和胶质细胞中Tau(pS422)引起的细胞毒性，或抑制神经元和胶质细胞之间寡聚人Tau(pS422)的细胞-至-细胞传输，或减少Tau(pS422)-引起的胱天蛋白酶活性的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的抗人Tau(pS422)抗体以抑制人神经元和胶质细胞中Tau(pS422)引起的细胞毒性，或抑制神经元和胶质细胞之间寡聚人Tau(pS422)的细胞-至-细胞传输，或减少Tau(pS422)-引起的胱天蛋白酶活性。根据上述实施方案中任一项的“个体”优选为人。

在又一个方面，本发明提供抗人Tau(pS422)抗体在制造或配制药物中的用途。在一个实施方案中，该药物用于治疗阿尔茨海默病。在又一个实施方案中，该药物用于治疗阿尔茨海默病的方法中，所述方法包括向患有阿尔茨海默病的个体施用有效量的药物。在一个这种实施方案中，该方法还包括向该个体施用有效量的至少一种额外治疗剂，例如，如下文描述的。在又一个实施方案中，所述药物用于抑制人神经元和胶质细胞中Tau(pS422)引起的细胞毒性，或用于抑制神经元和胶质细胞之间寡聚人Tau(pS422)的细胞-至-细胞传输，或用于减少Tau(pS422)-引起的胱天蛋白酶活性。在进一步的实施方案中，所述药物用于在个体中抑制人神经元和胶质细胞中Tau(pS422)引起的细胞毒性，或抑制神经元和胶质细胞之间寡聚人Tau(pS422)的细胞-至-细胞传输，或减少Tau(pS422)-引起的胱天蛋白酶活性的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的所述药物以抑制人神经元和胶质细胞中Tau(pS422)引起的细胞毒性，或抑制神经元和胶质细胞之间寡聚人Tau(pS422)的细胞-至-细胞传输，或减少Tau(pS422)-引起的胱天蛋白酶活性。根据上述实施方案中任一项的“个体”优选为人。

在其它的方面，本发明提供用于治疗阿尔茨海默病的方法。在一个实施方案中，所述方法包括向患有所述阿尔茨海默病的个体施用有效量的抗人Tau(pS422)抗体。在一个这样的实施方案中，所述方法进一步包括向所述个体施用有效量的至少一种如下文所述的另外的治疗剂。根据上述实施方案中任一个的“个体”可以为人。

在其它的方面，本发明提供在个体中抑制人神经元和胶质细胞中Tau(pS422)引起的细胞毒性，或抑制神经元和胶质细胞之间寡聚人Tau(pS422)的细胞-至-细胞传输，或减少Tau(pS422)-引起的胱天蛋白酶的方法。在一个实施方案中，所述方法包括向所述个体施用有效量的抗人Tau(pS422)抗体以抑制人神经元和胶质细胞中Tau(pS422)引起的细胞毒性，或抑制神经元和胶质细胞之间寡聚人Tau(pS422)的细胞-至-细胞传输，或减少Tau(pS422)-引起的胱天蛋白酶活性。在一个实施方案中，“个体”是人。

在又一个方面，本发明提供了包含本文提供的任何抗人Tau(pS422)抗体的药物制剂，例如，用于前述任一个治疗方法中。在一个实施方案中，药物制剂包含本文中提供的任何抗人Tau(pS422)抗体和可药用载体。在另一个实施方案中，药物制剂包含本文提供的任何抗人Tau(pS422)抗体和至少一种额外治疗剂(例如，如下文描述)。

本发明的抗体可以在疗法中单独或与其他药物组合使用。例如，本发明的抗体可以与至少一种额外治疗剂共施用。

上文所示的这类联合疗法涵盖联合施用(其中在相同或独立的制剂中包含两种或更多种治疗剂)，和独立施用，在这种情况下，本发明抗体的施用可以在施用额外的一种治疗剂或多种治疗剂之前、同时和/或之后进行。在一个实施方案中，抗人Tau(pS422)抗体的施用和额外治疗剂的施用彼此相隔约一个月内，或约一周、两周或三周内，或约一、二、三、四、五或六日内进行。

本发明的抗体(和任何额外的治疗剂)可以通过任何合适的手段施用，所述的合适手段包括肠胃外、肺内和鼻内以及(如果需要局部治疗)病灶内施用。肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。给药可以通过任何合适的途径进行，例如通过注射，如静脉内或皮下注射，这部分地取决于施用是否为短暂或长期。本文中构思了各种给药方案，包括但不限于单次或在各种时间点多次施用、推注施用(bolus administration)和脉冲输注。

本发明的抗体将以符合良好医学实践的方式配制、定剂量和施用。在这种情况下考虑的因素包括正在治疗的具体病症、正在治疗的具体哺乳动物、个体患者的临床状况、病症原因、送递药物的部位、施用方法、施用计划和医疗执业者已知的其他因素。该抗体不是必需与目前用来预防或治疗所讨论病症的一种或多种活性剂一起配制，但是任选地与它们一起配制。这类其他药物的有效量取决于该制剂中存在的抗体的量、疾病类型或疗法和上文讨论的其他因素。这些药物通常以与本文所述相同的剂量并且采用与本文所述相同的施用途径使用，或以约1％至99％的本文所述剂量使用，或以经验地/临床上确定适宜的任何剂量和任何途径使用。

对于预防或治疗疾病，本发明抗体的适宜剂量(当单独或与一种或多种其他额外治疗剂组合使用时)将取决于待治疗疾病的类型、抗体的类型、疾病的严重性和过程，抗体是否出于预防或治疗目的施用、先前疗法、患者的临床史和对抗体的反应以及主治医师的决定。将抗体适当地按一次或经过一系列治疗施用至患者。取决于疾病的类型和严重性，约1μg/kg至15mg/kg(例如0.5mg/kg-10mg/kg)抗体可以是施用至患者的起始候选剂量，无论例如是否通过一次或多次独立施用或通过连续输注来施用。取决于上文提到的因素，一个常见的每日剂量可能是从约1μg/kg至100mg/kg或更多。对于在几日或更长时间范围内重复施用，取决于疾病，治疗通常将持续直至对疾病症状的所需抑制作用出现。抗体的一个示例性剂量将处于约0.05mg/kg至约10mg/kg范围内。因此，可以向患者施用一剂或多剂的约0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg(或其任意组合)。这类剂量可以间歇地施用，例如，每周或每3周施用(例如，从而患者接受约2剂至约20剂或例如约6剂抗体)。可以施用较高的初始施用剂量，随后是一个或多个较低剂量。然而，可以使用其他剂量方案。通过常规技术和测定法容易地监测这种疗法的进程。

例如，在被治疗的适应症是阿尔茨海默病或前驱阿尔茨海默病的情况下，所述另外的治疗剂可以选自多奈哌齐、美金刚、利凡斯的明、加兰他敏、雷司替明(rivastigmine)、甲磺酸双氢麦角毒碱(ergoloid mesylates)、抗Abeta抗菌剂和抗α-突触核蛋白抗体。

可以理解，前述任一种制剂或治疗方法可以使用本发明的免疫缀合物替代抗人Tau(pS422)抗体或除抗人Tau(pS422)抗体之外还使用本发明的免疫缀合物来实施。

III.制造品

在本发明的另一个方面，提供一种制造品，所述制造品含有上文描述的可用于治疗、预防和/或诊断病症的物质。该制造品包括容器和或在该容器上或与之相关的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶、小药瓶、注射器、静脉内输液袋等。容器可以从多种材料如玻璃或塑料形成。该容器容纳了本身或与另一种组合物组合时有效治疗、预防和/或诊断病症的组合物并且可以具有无菌接入口(例如该容器可以是静脉内输液袋或是具有皮下注射针头可穿透的瓶塞的小药瓶)。组合物中的至少一种活性物质是本发明的抗体。标签或包装插页说明该组合物用于治疗选择的疾病。另外，制造品可以包含(a)其中含有组合物的第一容器，其中所述组合物包含本发明的抗体；和(b)其中含有组合物的第二容器，其中所述组合物包含其他细胞毒性剂或治疗剂。在本发明的这个实施方案中，制造品还可以包含指示组合物可以用来治疗特定疾病的包装插页。备选地或额外地，该制造品可以还包含第二(或第三)容器，其包含可药用缓冲剂，如抑菌注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格溶液和葡萄糖溶液。它可以还包括从商业和用户观点看受欢迎的其他材料，包括其他缓冲剂、稀释剂、滤器、针头和注射器。

可以理解，替代抗人Tau(pS422)抗体或除抗人Tau(pS422)抗体之外，前述任一者制造品可以包含本发明的免疫缀合物。

IV.具体实施方案

1.特异结合人Tau(pS422)的人源化的抗体，其中所述抗体

a)在重链可变结构域中包含SEQ ID NO：08、09和10的HVR，或

b)在重链可变结构域中包含SEQ ID NO：08、77和10的HVR。

2.根据第1项所述的人源化的抗体，其还

a)在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO：71、73和15的HVR，或

b)在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO：70、72和15的HVR，或

c)在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO：12、14和79的HVR，或

d)在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO：71、81和15的HVR，或

e)在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO：12、14和74的HVR，或

f)在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO：12、14和75的HVR。

3.根据第1至2项中任一项所述的人源化的抗体，其

a)在重链可变结构域中包含SEQ ID NO：08、09和10的HVR以及在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO：71、73和15的HVR，或

b)在重链可变结构域中包含SEQ ID NO：08、09和10的HVR以及在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO：70、72和15的HVR，或

c)在重链可变结构域中包含SEQ ID NO：08、77和10的HVR以及在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO：12、14和79的HVR，或

d)在重链可变结构域中包含SEQ ID NO：08、09和10的HVR以及在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO：12、14和79的HVR，或

e)在重链可变结构域中包含SEQ ID NO：08、77和10的HVR以及在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO：71、81和15的HVR，或

f)在重链可变结构域中包含SEQ ID NO：08、09和10的HVR以及在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO：12、14和74的HVR，或

g)在重链可变结构域中包含SEQ ID NO：08、77和10的HVR以及在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO：12、14和75的HVR.

4.根据项1至3中任一项所述的人源化抗体，包含

a)SEQ ID NO：19的重链可变结构域和SEQ ID NO：67的轻链可变结构域，或

b)SEQ ID NO：65的重链可变结构域和SEQ ID NO：66的轻链可变结构域，或

c)SEQ ID NO：76的重链可变结构域和SEQ ID NO：78的轻链可变结构域，或

d)SEQ ID NO：19的重链可变结构域和SEQ ID NO：78的轻链可变结构域，或

e)SEQ ID NO：76的重链可变结构域和SEQ ID NO：80的轻链可变结构域，或

f)SEQ ID NO：65的重链可变结构域和SEQ ID NO：67的轻链可变结构域，或

g)SEQ ID NO：65的重链可变结构域和SEQ ID NO：68的轻链可变结构域，或

h)SEQ ID NO：76的重链可变结构域和SEQ ID NO：69的轻链可变结构域。

5.人源化双特异抗体，包含

i)第一结合位点，选自

f)SEQ ID NO：19的重链可变结构域和SEQ ID NO：66的轻链可变结构域，或

h)SEQ ID NO：65的重链可变结构域和SEQ ID NO：78的轻链可变结构域，或

i)SEQ ID NO：65的重链可变结构域和SEQ ID NO：66的轻链可变结构域，或

j)SEQ ID NO：65的重链可变结构域和SEQ ID NO：68的轻链可变结构域，或

k)SEQ ID NO：76的重链可变结构域和SEQ ID NO：69的轻链可变结构域，或

l)SEQ ID NO：76的重链可变结构域和SEQ ID NO：80的轻链可变结构域，

和

ii)第二结合位点，选自

a)SEQ ID NO：82的重链可变结构域和SEQ ID NO：85的轻链可变结构域，或

b)SEQ ID NO：83的重链可变结构域和SEQ ID NO：85的轻链可变结构域，或

c)SEQ ID NO：84的重链可变结构域和SEQ ID NO：85的轻链可变结构域。

6.根据第1至5项中任一项所述的人源化的抗体，其中所述抗体用于治疗阿尔茨海默病。

7.根据第1至6项中任一项所述的人源化的抗体，其中所述抗体是效应子功能沉默的。

8.根据第1至7项中任一项所述的人源化的抗体，其中所述抗体不具有效应子功能。

9.根据第1至8项中任一项所述的人源化的抗体，其中所述抗体

i)特异结合具有SEQ ID NO：03的氨基酸序列的多肽，和/或

ii)不以1μg/mL结合全长人Tau(SEQ ID NO:01)，和/或

10.根据第2至9项中任一项所述的人源化的抗体，其中所述抗体对于以下具有以下EC50值

a)对于具有SEQ ID NO：03的氨基酸序列的人Tau(pS422)片段为6ng/mL或更小，和/或

b)对于具有SEQ ID NO：02的氨基酸序列的全长人Tau(pS422)为4.5ng/mL或更小，和/或

c)对于具有SEQ ID NO：02的氨基酸序列的人Tau(pS422)的聚集体为30ng/mL或更小，和/或

d)对于具有SEQ ID NO：01的氨基酸序列并且具有氨基酸突变S422A的人Tau为125ng/mL或更小。

11.根据第1至10项中任一项所述的人源化的抗体，其中所述抗体特异结合人Tau(pS422)(SEQ ID NO：02)并且不结合人Tau(SEQ ID NO：01)。

12.根据第1至11项中任一项所述的人源化的抗体，其中所述抗体在重链可变结构域的位置4、24和78处具有缬氨酸残基。

13.根据第1至12项中任一项所述的人源化的抗体，其中所述抗体在重链可变结构域的位置71处具有精氨酸残基。

14.根据第1至13项中任一项所述的人源化的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体。

15.根据第1至14项中任一项所述的人源化的抗体，其中所述抗体是结合人Tau(pS422)的抗体片段并且

i)特异结合具有SEQ ID NO：03的氨基酸序列的多肽，和/或

ii)不以1μg/mL结合全长人Tau(SEQ ID NO:01)，和/或

16.根据第1至14项中任一项所述的人源化的抗体，其中所述抗体是

a)人IgG1亚类的全长抗体，或

b)人IgG4亚类的全长抗体，或

c)具有突变L234A、L235A和P329G的人IgG1亚类的全长抗体，

d)具有突变S228P、L235E和P329G的人IgG4亚类的全长抗体，

e)在两条重链中具有突变L234A、L235A和P329G和在一条重链中具有突变T366W和S354C并且在相应的另一重链中具有突变T366S、L368A、Y407V和Y349C的人IgG1亚类的全长抗体，或

f)在两条重链中具有突变S228P和P329G和在一条重链中具有突变T366W和S354C并且在相应的另一重链中具有突变T366S、L368A、Y407V和Y349C的人IgG4亚类的全长抗体。

17.人源化的抗人Tau(pS422)抗体，其中

a)所述抗体包含两条抗体重链，其各自包含重链可变结构域和重链恒定区，其中

i)所述可变结构域包含SEQ ID NO：08、SEQ ID NO：09和SEQ ID NO：10的HVR，

ii)所述恒定区是人IgG1恒定区，其中C-末端赖氨酸残基可以存在或不存在，并且

iii)所述恒定区包含氨基酸改变L234A、L235A和P329G，

b)所述抗体包含两条抗体轻链，其各自包含轻链可变结构域和轻链恒定结构域，其中

i)所述可变结构域包含SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：73和SEQ ID NO：15的HVR，

ii)所述恒定区是人κ轻链恒定区或人λ轻链恒定区，

和

c)所述抗体

i)特异结合具有SEQ ID NO：03的氨基酸序列的多肽，和/或

ii)不以1μg/mL结合全长人Tau(SEQ ID NO:01)，和/或

18.人源化的抗人Tau(pS422)抗体，其中

iii)所述恒定区包含氨基酸改变L234A、L235A和P329G，

i)所述可变结构域包含SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：72和SEQ ID NO：15的HVR，

ii)所述恒定区是人κ轻链恒定区或人λ轻链恒定区，

和

c)所述抗体

i)特异结合具有SEQ ID NO：03的氨基酸序列的多肽，和/或

ii)不以1μg/mL结合全长人Tau(SEQ ID NO:01)，和/或

19.人源化的抗人Tau(pS422)抗体，其中

iii)所述恒定区包含氨基酸改变L234A、L235A和P329G，

i)所述可变结构域包含SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：74的HVR，

ii)所述恒定区是人κ轻链恒定区或人λ轻链恒定区，

和

c)所述抗体

i)特异结合具有SEQ ID NO：03的氨基酸序列的多肽，和/或

ii)不以1μg/mL结合全长人Tau(SEQ ID NO:01)，和/或

20.人源化的抗人Tau(pS422)抗体，其中

i)所述可变结构域包含SEQ ID NO：08、SEQ ID NO：77和SEQ ID NO：10的HVR，

iii)所述恒定区包含氨基酸改变L234A、L235A和P329G，

i)所述可变结构域包含SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：75的HVR，

ii)所述恒定区是人κ轻链恒定区或人λ轻链恒定区，

和

c)所述抗体

i)特异结合具有SEQ ID NO：03的氨基酸序列的多肽，和/或

ii)不以1μg/mL结合全长人Tau(SEQ ID NO:01)，和/或

21.人源化的抗人Tau(pS422)抗体，其中

i)所述可变结构域包含SEQ ID NO：65的氨基酸序列，

iii)所述恒定区包含氨基酸改变L234A、L235A和P329G，

i)所述可变结构域具有SEQ ID NO：67的氨基酸序列，

ii)所述恒定区是人κ轻链恒定区或人λ轻链恒定区，

和

c)所述抗体

i)特异结合具有SEQ ID NO：03的氨基酸序列的多肽，和/或

ii)不以1μg/mL结合全长人Tau(SEQ ID NO:01)，和/或

22.人源化的抗人Tau(pS422)抗体，其中

i)所述可变结构域具有SEQ ID NO：65的氨基酸序列，

iii)所述恒定区包含氨基酸改变L234A、L235A和P329G，

i)所述可变结构域具有SEQ ID NO：66的氨基酸序列，

ii)所述恒定区是人κ轻链恒定区或人λ轻链恒定区，

和

c)所述抗体

i)特异结合具有SEQ ID NO：03的氨基酸序列的多肽，和/或

ii)不以1μg/mL结合全长人Tau(SEQ ID NO:01)，和/或

23.人源化的抗人Tau(pS422)抗体，其中

i)所述可变结构域具有SEQ ID NO：65的氨基酸序列，

iii)所述恒定区包含氨基酸改变L234A、L235A和P329G，

i)所述可变结构域具有SEQ ID NO：68的氨基酸序列，

ii)所述恒定区是人κ轻链恒定区或人λ轻链恒定区，

和

c)所述抗体

i)特异结合具有SEQ ID NO：03的氨基酸序列的多肽，和/或

ii)不以1μg/mL结合全长人Tau(SEQ ID NO:01)，和/或

24.人源化的抗人Tau(pS422)抗体，其中

i)所述可变结构域具有SEQ ID NO：76的氨基酸序列，

iii)所述恒定区包含氨基酸改变L234A、L235A和P329G，

i)所述可变结构域具有SEQ ID NO：69的氨基酸序列，

ii)所述恒定区是人κ轻链恒定区或人λ轻链恒定区，

和

c)所述抗体

i)特异结合具有SEQ ID NO：03的氨基酸序列的多肽，和/或

ii)不以1μg/mL结合全长人Tau(SEQ ID NO:01)，和/或

25.根据第1-24中任一项所述的人源化抗体，其中所述抗体在轻链可变结构域位置32处具有赖氨酸(K)氨基酸残基(根据Kabat编号)。

26.分离的核酸，其编码根据第1至25项中任一项所述的人源化的抗体。

27.宿主细胞，其包含根据第26项所述的核酸。

28.产生根据第1至25项中任一项所述的人源化的抗体的方法，其包括培养如本文报道的宿主细胞从而产生人源化的抗体的步骤。

29.根据第28项所述的方法，其还包含从细胞或培养基回收人源化的抗体的步骤。

30.药物制剂，其包含根据第1至25项中任一项所述的人源化的抗体和药用载体。

31.根据第30项所述的药物制剂，其还包含另外的治疗剂。

32.根据第31项所述的药物制剂，其中所述另外的治疗剂是抗-淀粉样蛋白治疗剂。

33.根据第32项所述的药物制剂，其中所述抗-淀粉样蛋白治疗剂是抗人α-突触核蛋白抗体或抗-Abeta抗体。

34.根据第1至25项中任一项所述的人源化的抗体，其用作药物。

35.根据第1至25项中任一项所述的人源化的抗体，其用于治疗阿尔茨海默病。

36.根据第1至25项中任一项所述的人源化的抗体，其用于治疗前驱阿尔茨海默病。

37.根据第1至25项中任一项所述的人源化的抗体，其用于治疗轻度阿尔茨海默病。

38.根据第1至25项中任一项所述的人源化的抗体，其用于减轻Tau(pS422)-引起的神经变性。

39.根据第1至25项中任一项所述的人源化的抗体，其用于维持认知和功能。

40.根据第1至25项中任一项所述的人源化的抗体，其用于减缓认知和功能下降的速率。

41.根据第1至25项中任一项所述的人源化的抗体用于制备药物的用途。

42.根据第34和41项中任一项所述的用途，其中所述药物用于治疗阿尔茨海默病。

43.根据第32和41至42项中任一项所述的用途，其中所述药物用于治疗前驱阿尔茨海默病。

44.根据第34和41至43项中任一项所述的用途，其中所述药物用于治疗轻度阿尔茨海默病。

45.根据第34和41至44项中任一项所述的用途，其中所述药物用于减轻Tau(pS422)引起的神经变性。

46.根据第34和41至45项中任一项所述的用途，其中所述药物用于维持认知和功能。

47.根据第34和41至46项中任一项所述的用途，其中所述药物用于减缓认知和功能下降的速率。

48.治疗患有阿尔茨海默病的个体的方法，其包括向个体施用有效量的根据1至25项任一项所述的人源化的抗人Tau(pS422)抗体。

49.在个体中减轻Tau(pS422)引起的神经变性的方法，其包括向个体施用有效量的根据第1至25项中任一项所述的人源化的抗人Tau(pS422)抗体以减轻Tau(pS422)引起的神经变性。

50.维持个体中认知和功能的方法，其包括向个体施用有效量的根据第1至25项中任一项所述的人源化的抗人Tau(pS422)抗体以维持认知和功能。

51.减缓个体中认知和功能下降速率的方法，其包括向个体施用有效量的根据第1至25项中任一项所述的人源化的抗人Tau(pS422)抗体以减缓认知和功能下降速率。

52.根据第1至25项中任一项所述的人源化的抗人Tau(pS422)抗体在减轻Tau(pS422)引起的神经变性方面的用途。

53.根据第1至25项中任一项所述的人源化的抗人Tau(pS422)抗体在维持认知和功能中的用途。

54.根据第1至25项中任一项所述的人源化的抗人Tau(pS422)抗体在减缓认知和功能下降速率中的用途。

55.根据第1至25项中任一项所述的人源化的抗体，其中所述抗体i)结合Tau(pS422)转基因小鼠和阿尔茨海默病患者的脑切片上的Tau(pS422)；和/或标记Tau(pS422)转基因细胞中的Tau(pS422)。

56.根据第1至25项中任一项所述的人源化的抗体，其中所述抗体特异结合/识别早期和晚期疾病相关的人Tau(pS422)形式。

57.根据第1至25项中任一项所述的人源化的抗体用于预防人Tau(pS422)-相关阿尔茨海默病扩散的用途。

58.根据第1至25项中任一项所述的人源化的抗体用于减少溶酶体膜分解(disintegration)的用途。

59.根据第1至25项中任一项所述的人源化的抗体针对人Tau(pS422)引起的去稳定和/或分解作用的用于稳定溶酶体膜的用途。

60.根据第1至25项中任一项所述的人源化的抗体用于防止阿尔茨海默病进展的用途。

本发明还涉及以下实施方案：

1.一种特异性结合人Tau(pS422)的人源化抗体，其中所述抗体包含：

在重链可变结构域中，SEQ ID NO：08、09和10的HVR，和

在轻链可变域中，

SEQ ID NO：71、73和15的HVR，或

SEQ ID NO：70、72和15的HVR，或

SEQ ID NO：12、14和74的HVR。

2.根据实施方案1所述的人源化抗体，包含：

a)SEQ ID NO：65的重链可变结构域和SEQ ID NO：67的轻链可变结构域，或

c)SEQ ID NO：65的重链可变结构域和SEQ ID NO：68的轻链可变结构域。

3.根据实施方案1至2中任一项所述的人源化抗体，其中所述抗体是效应子功能沉默的。

4.根据实施方案1至3中任一项所述的人源化抗体，其中所述抗体

i)特异性结合具有SEQ ID NO：03的氨基酸序列的多肽，和/或

ii)不以1μg/mL结合全长人Tau(SEQ ID NO：01)，和/或

iii)特异性结合位置422处的丝氨酸处磷酸化的全长人Tau(SEQ ID NO：02)，和/或

iv)特异性结合位置422处的丝氨酸处磷酸化的人Tau聚集体(SEQ ID NO：02)。

5.根据实施方案1至4中任一项所述的人源化抗体，其中所述抗体具有以下EC50值

a)对于具有SEQ ID NO：03的氨基酸序列的人Tau(pS422)片段具有6ng/mL或更小，和/或

b)对于具有SEQ ID NO：02的氨基酸序列的全长人Tau(pS422)具有4.5ng/mL或更小，和/或

c)对于具有SEQ ID NO：02的氨基酸序列的人Tau(pS422)的聚集体具有30ng/mL或更小，和/或

d)对于具有SEQ ID NO：01的氨基酸序列并且具有氨基酸突变S422A的人Tau具有125ng/mL或更小。

6.根据实施方案1至5中任一项所述的人源化抗体，其中所述抗体与人Tau(pS422)(SEQ ID NO：02)特异性结合并且不与人Tau(SEQ ID NO：01)结合。

7.根据实施方案1至6中任一项所述的人源化抗体，其中所述抗体是

a)人亚类IgG1的全长抗体，或

b)人亚类IgG4的全长抗体，或

c)具有突变L234A、L235A和P329G的人亚类IgG1的全长抗体，

d)具有突变S228P、L235E和P329G的人亚类IgG4的全长抗体，

e)具有在两条重链中的突变L234A、L235A和P329G和一条重链中的突变T366W和S354C和在相应的另一重链中的突变T366S、L368A、Y407V和Y349C的人亚类IgG1全长抗体，或

f)具有在两条重链中的突变S228P、L235E和P329G和在一条重链中的突变T366W和S354C和在相应的另一条重链中的突变T366S、L368A、Y407V和Y349C的人亚类IgG4全长抗体。

8.一种双特异性抗体，包含

i)第一结合位点，选自

a)SEQ ID NO：65的重链可变结构域和SEQ ID NO：66的轻链可变结构域，或

b)SEQ ID NO：65的重链可变结构域和SEQ ID NO：67的轻链可变结构域，或

c)SEQ ID NO：65的重链可变结构域和SEQ ID NO：68的轻链可变结构域，

和

ii)第二结合位点，选自

9.一种药物制剂，包含根据实施方案1至8中任一项所述的抗体和任选的药学上可接受的载体。

10.根据实施方案1至8中任一项所述的抗体，其用作药物。

11.根据实施方案1至8中任一项所述的抗体，其用于治疗阿尔茨海默病。

12.根据实施方案1至8中任一项所述的抗体，其用于治疗前驱阿尔茨海默病。

13.根据实施方案1至8中任一项所述的抗体在制备药物中的用途。

14.根据实施方案1至8中任一项所述的抗人Tau(pS422)抗体在减少Tau(pS422)诱导的神经变性中的用途。

15.一种治疗方法，包括给予根据实施方案1至8中任一项所述的抗体用于治疗阿尔茨海默病，用于治疗前驱阿尔茨海默病，用于治疗轻度阿尔茨海默病，用于减少Tau(pS422)-诱导的神经变性，用于维持认知和功能，用于减缓认知和功能下降的速率，和/或用于减缓神经原纤维缠结积累的速率。

V.实例

以下是本发明的方法和组合物的实施例。要理解，考虑到上文提供的一般描述，可以实践多种其他实施方案。

材料和方法

重组DNA技术

如在Sambrook,J.等人，Molecular cloning：A laboratory manual；Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，1989中描述的，使用标准方法操作DNA。根据制造商的使用说明使用分子生物试剂。

基因和寡核苷酸合成

通过在Geneart GmbH(Regensburg，Germany)化学合成制备所需的基因片段。将合成的基因片段克隆入大肠杆菌质粒中用于繁殖/扩增。亚克隆的基因片段的DNA序列通过DNA测序验证。备选地，通过将化学合成的寡核苷酸退火或经由PCR组装短的合成的DNA片段。通过metabion GmbH(Planegg-Martinsried，Germany)制备各个寡核苷酸。

试剂

如果没有另外陈述，根据制造商的方案如所提供的使用所有商业化学品、抗体或试剂盒。

实施例1

制备和纯化兔抗体

免疫

将来自Charles River Laboratories International,Inc.的新西兰白(NZW)兔用于免疫。偶联在钥孔血蓝蛋白(KLH)上的磷酸肽Tau(416-430)[pS422]以浓度为1mg/ml溶解于K3PO4缓冲液pH 7.0并且与完全弗氏佐剂(CFA)(1：1)混合直至产生稳定乳剂。三只兔接收真皮内(i.d.)注射2ml的乳剂，随之为第二次肌内(i.m.)和第三次皮下(s.c.)注射，每次用1ml以一周的间隔注射。两周后进行第四次i.m.注射1ml，接着以四周的间隔进行两次进一步的s.c.注射1ml。在第三、四、五、六次注射后4-6天收集每只动物的10ml外周全血样品，并用于FACS中的单细胞分选。在相同时间收集每只动物的另外0.5ml血清并且用于确定Tau(416-463)[pS422]特异性抗体应答。

抗体应答

对免疫的抗体应答使用ELISA通过连续稀释的血清来确定，其中30ng/孔的生物素化的Tau(416-430)[pS422]在1x PBS中在4℃于链霉亲和素预包被的96孔微量滴定板(MC1347,Micro Coat Biotechnologie GmbH,Bernried,Germany)上孵育过夜。对于检测，连接至辣根过氧化物酶(The Jackson laboratory)的山羊抗兔IgG以1：16000稀释使用。来自罗氏诊断(Roche Diagnostics GmbH)的随时可用的BM Blue POD底物(沉淀四甲基联苯胺(TMB))用于显示。通过1N HCl终止反应并且在Tecan Infinite中通过450/690nm测量。

B-细胞克隆

板的包被

无菌链霉亲和素包被的6孔板(细胞培养级)与3种生物素化的对照肽(未磷酸化的Tau(416-430)、MCAK_人(88-102)[95-pSer]和MAP2_人(1802-1816)[pSer-1802])的混合物或与生物素化的磷酸肽Tau(416-430)[pS422](每种以PBS中0.5-1μg/ml的浓度)一起在室温孵育1小时。使用前以无菌PBS洗涤板三次。细胞培养6孔板用碳酸盐缓冲液(0.1M碳酸氢钠，34mM碳酸氢二钠(Disodiumhydrogencarbonate)，pH 9.55)中2μg/ml KLH(匙孔血蓝蛋白)在4℃包被过夜。使用前在无菌PBS中洗涤板三次。

分离兔外周血单核细胞(PBMC)

在淋巴细胞分离哺乳动物(lympholyte mammal)(Cedarlane Laboratories)上的密度离心(进行其以分离兔PBMC)之前，含EDTA的全血用1xPBS稀释两倍。用抗体染色之前洗涤PBMCs两次。

EL-4B5培养基

RPMI 1640(Pan Biotech,Aidenbach,Germany)，补充有10％FCS(Hyclone,Logan,UT,USA)，2mM谷氨酰胺，1％青霉素/链霉素溶液(PAA,Pasching,Austria)，2mM丙酮酸钠，10mM HEPES(PAN Biotech,Aidenbach,Germany)和0.05mMβ-巯基乙醇(Gibco,Paisley,Scotland)。

巨噬细胞/单核细胞的清除

无菌6孔板(细胞培养级)用于通过非特异性粘附清除巨噬细胞和单核细胞。孔用KLH(匙孔血蓝蛋白)或用链霉亲和素和对照肽包被。每个孔填充最大4ml培养基和至多6x10⁶个来自免疫的兔的外周血单核细胞，并且允许在恒温箱中37℃结合1小时。上清液中50％的细胞用于淘选步骤；剩余的50％的细胞直接进行免疫荧光染色和单细胞分选。

在肽上淘选B细胞

用链霉亲和素和生物素化的肽Tau(416-430)[pS422]包被的6孔组织培养板接种至多6x10⁶个细胞/4ml培养基，并且允许在恒温箱中在37℃结合1小时。未粘附的细胞通过用1xPBS小心地洗涤孔1-2次去除。剩余的粘着细胞通过胰蛋白酶在恒温箱中在37℃10分钟进行脱附，然后在培养基中洗涤两次。细胞保持在冰上直至进行免疫荧光染色。

免疫荧光染色和单细胞分选

用于单细胞分选的抗兔IgG FITC来自AbD Serotec(STAR121F,Düsseldorf,Germany)。对于表面染色，来自清除和淘选步骤的细胞与PBS中抗兔IgG FITC抗体在冷室内于暗中在4℃滚动孵育30分钟。离心后，上清液通过抽吸去除。PBMCs用冰冷PBS进行2个循环的离心和洗涤。最后，PBMCs在冰冷PBS中重悬浮并且立即进行FACS分析。在FACS分析前添加5μg/ml浓度的碘化丙啶(BD Pharmingen,San Diego,CA,USA)以便分辨死亡细胞和活细胞。FACS使用带有FACSDiva软件的Becton Dickinson FACSAria(BD Biosciences,USA)进行，单个、FITC-标记的活细胞沉积于96孔板中。

B-细胞培养

B细胞培养通过类似于Zubler,R.H.等人，J.Immunol.134(1985)3662-3668所述的方法制备。简言之，单个分选的B细胞在96孔板中培养，用210μl/孔EL-4B5培养基和Pansorbin细胞(1：20000)(Calbiochem(Merck),Darmstadt,Germany)，5％兔胸腺细胞上清液和γ-照射的EL-4-B5鼠胸腺瘤细胞(2×10⁴个/孔)于恒温箱中在5％CO₂的气氛中37℃培养7天。为了筛选，去除B细胞培养上清液，立即收获细胞用于可变区基因克隆或在100μlRLT缓冲液(Qiagen,Hilden,Germany)中冰冻于-80℃。

B-细胞克隆筛选

通过ELISA筛选B细胞培养上清液对生物素化的Tau(416-430)[pS422]的结合。非磷酸化的Tau(416-430)，KLH(匙孔血蓝蛋白)和不相关的磷酸肽MCAK_人(88-102)[95-pSer]用作对照抗原。对于ELISA板的制备，链霉亲和素预包被的微量滴定板与50ng/ml的生物素化的Tau(415-430)[pS422]在室温孵育1小时。KLH或对照肽的包被于1μg/mL进行。B细胞上清液以1：5至1：10稀释并且与抗原包被的微量滴定板孵育60分钟。强烈洗涤后，兔抗体的结合用绵羊抗兔IgG地高辛缀合的检测抗体(Chemicon AQ301D)检测。与TMB在室温孵育后，测量在370nm-492nm的吸光度。与生物素化的Tau(416-430)[pS422]但是不与KLH和MCAK_人(88-102)[95-pSer]产生高于背景的信号的B细胞克隆被进一步考虑，并且进行可变区基因克隆。

V-结构域的PCR扩增和测序

总RNA使用

8/96RNA试剂盒(Macherey&Nagel；740709.4,740698)根据制造商的方案制备。所有步骤在epMotion 5075液体处理系统(Eppendorf)上进行。RNA用60μl无RNAse水洗脱。6μl的RNA用于通过逆转录酶反应使用Superscript III第一链合成超混合物(Superscript III First-Strand Synthesis SuperMix，Invitrogen 18080-400)和寡聚dT引物根据制造商的说明产生cDNA。4μl的cDNA用于扩增免疫球蛋白重链和轻链可变区(VH和VL)，使用AccuPrime Super Mix(Invitrogen12344-040)，终体积50μl，使用引物rbHCfinal.up和rbHCfinal.do用于重链和使用引物rbLCfinal.up和rbLCfinal.do用于轻链(参见下表)。PCR条件如下：热启动于94℃ 5min；94℃，20s，70℃，20s，68℃，45s，35个循环；最终延伸在68℃进行7min。

表：

50μl PCR溶液中的8μl加载于48E-Gel 2％(Invitrogen G8008-02)上。阳性PCR反应物使用

Extract II试剂盒(Macherey&Nagel；740609250)根据制造商的方案清洁并且洗脱在50μl洗脱缓冲液中。12μl的纯化的PCR产物在两个方向上使用rbHCfinal.up和rbHCfinal.do用于重链和rbLCfinal.up和rbLCfinal.do用于轻链(参见上表)进行直接测序。

兔单克隆抗体和兔/小鼠嵌合抗体的重组表达

为了重组表达兔单克隆抗体，编码VH或VL的PCR产物作为cDNA通过悬突(overhang)克隆方法(Haun,R.S.等人，Bio Techniques 13(1992)515-518；Li,M.Z.等人，Nature Methods 4(2007)251-256)克隆至表达载体中。编码兔κ或γ恒定区的线性化表达质粒和VL或VH插入物通过PCR使用重叠引物扩增。纯化的PCR产物与产生单链悬突的T4DNA聚合酶孵育。反应通过添加dCTP终止。下一步，质粒和插入物组合并且与诱导位点特异性重组的RecA孵育。重组质粒转化入大肠杆菌中。次日，挑选生长的克隆并且通过质粒制备、限制性分析和DNA测序测试正确重组的质粒。对于抗体表达，分离的HC和LC质粒瞬时共转染至HEK293细胞中，1周后收获上清液。为了克隆和表达兔小鼠嵌合抗体，VH和VL区通过PCR扩增并且亚克隆至含有小鼠恒定κ区或小鼠恒定γ1区的表达载体中。兔/小鼠嵌合HC和LC质粒被分离，通过限制性分析和DNA测序检测正确的插入，并且瞬时共转染至HEK293细胞中。转染后一周收集上清液。

抗体纯化

在MabSelectSuRe^TM柱(GE Healthcare)上从细胞培养上清液中纯化重组表达的兔抗体。样品装载前，柱用25mmol/L Tris-HCl，25mmol/L NaCl，pH 7.4平衡。抗体洗脱用50mmol/L乙酸盐pH 3.14完成。洗脱的样品立即装载于脱盐柱(Sephadex G25,GEHealthcare)并且在20mmol/L His-HCl，140mmol/L NaCl pH 6.0中洗脱。这种缓冲液也用于储存纯化的抗体。在纯化过程中一般存储温度是4℃，室温，在分装后为-80℃。来自细胞培养上清液的重组表达的兔/小鼠嵌合抗体在MabSelectSuRe^TM柱(GE Healthcare)上纯化。样品装载前，柱用1x PBS,pH 7.4平衡。抗体洗脱用100mmol/L柠檬酸盐pH 3.0完成。洗脱的样品立即用2mol/L Tris/HCl pH9.0中和。然后，抗体装载于尺寸排阻柱(Superdex 200,GEHealthcare)上并且在20mmol/L His-HCl，140mmol/L NaCl pH 6.0中洗脱。这种缓冲液也用于储存纯化的抗体。在纯化过程中一般存储温度是4℃，室温，在分装后为-80℃。

实施例2

抗-Tau pS422单克隆兔抗体对在pS422磷酸化的Tau是高度选择性的并且结合TaupS422的原纤维聚集体

ELISA

兔单克隆抗体在HEK 293细胞中重组表达。通过ELISA测试细胞培养上清液或纯化的兔抗体对生物素化的Tau(416-430)[pS422]，非磷酸化的Tau(416-430)，KLH和不相关的磷酸肽MCAK_人(88-102)[95-pSer]的结合。为了制备ELISA板，链霉亲和素预包被的微量滴定板与50ng/ml的生物素化的Tau(415-430)[pS422]在室温孵育1小时。用KLH或对照肽的包被于1μg/mL进行。不同浓度的兔抗Tau pS422抗体(Abcam AB51071)或含有兔抗体的上清液在抗原标记的微量滴定板中孵育60分钟。强烈洗涤后，兔抗体的结合用绵羊抗兔IgG地高辛缀合的检测抗体(Chemicon AQ301D)检测。与TMB在室温孵育后，测量在370nm-492nm的吸光度。抗体结合通过其EC50值表征。结合生物素化的Tau(416-430)[pS422]和非磷酸化的Tau(416-430)肽的抗体通过其EC50值表征。与KLH或MCAK磷酸肽的交叉反应性在高浓度(即细胞培养上清液的1：5稀释)下通过单点测量来估计。结果显示于下表中。发现结合Tau磷酸肽的EC50值比结合Tau肽的EC50值低超过100倍，表明与非磷酸化的Tau肽相比较，对磷酸化的Tau片段至少100倍的选择性。对于所有抗体，与KLH和MCAK对照磷酸肽的结合在背景水平，其是用Tau磷酸肽测量的最大值的约1<3％。

表：

也测试了对可溶性和聚集的全长Tau pS422的特异性。Tau pS422的原纤维聚集体(300μg/ml)在室温(RT)过夜包被于基于聚苯乙烯的Maxisorb微量滴定板(Nunc)。以类似的方式，可溶性全长Tau和Tau pS422包被于Maxisorb微量滴定板。添加兔抗Tau pS422抗体对照(Abcam AB51071)或纯化的兔抗体并且以至多1000ng/ml的浓度孵育60分钟。强烈洗涤后，对兔抗体的结合用绵羊抗兔IgG地高辛缀合的检测抗体(Chemicon AQ301D)检测。与TMB在室温孵育后，测量在370nm-492nm的吸光度。抗体结合通过其EC50值表征。结果显示于下表中。

表：

兔单克隆抗体以低于1ng/ml的EC50值结合Tau-pS422蛋白。检测的原纤维的TaupS422的EC50值范围为0.4ng/ml至14ng/ml。结合非磷酸化的全长Tau蛋白的信号与背景水平不可区分。因此，估计相比于Tau，每种抗体以至少100倍的选择性结合Tau pS422和原纤维的Tau pS422。

BIAcore^TM

通过BIAcore^TM分析进一步研究和确认对原纤维的Tau pS422聚集体的结合。测量使用BIAcore 3000仪器在37℃实施。系统和样品缓冲液是HBS-EP(10mM HEPES，50mM NaCl，3.4mM EDTA，0.005％聚山梨酯20(v/v))。BIAcore^TM CM5传感器芯片进行预处理程序。对于流路池FC1、FC2、FC3和FC4相继注射0.1％SDS，50mM NaOH，10mM HCl和100mM H₃PO₄达30秒。使用BIAcore 3000^TM wizard v.4.1根据制造商说明书进行胺偶联程序。在EDC/NHS活化传感器表面后，非-磷酸选择性的抗-Tau抗体mAb<TAU>M-4/53-IgG固定在传感器流路池FC2、FC3和FC4上。作为对照，针对CK-MM(肌酸激酶同种型)的抗体，其识别不相关抗原，被捕获于FC1流路池。mAb<TAU>M-4/53-IgG和针对CK-MM的抗体以30μg/ml稀释在10mM NaAc pH 5.0中，并且以10μl/min注射7min接触时间以固定10.000RU的抗体捕获系统。表面通过1M乙醇胺去活化。传感器通过5个循环的用磷酸化的丝状Tau蛋白(原液0.3mg/ml，在HBS-EP中1：100稀释)作为溶液中的分析物以10μl/min进行2min来适应。再生用10mM甘氨酸pH 2.5以30μl/min进行3min。推定结合mAb 4/53的分析物不解离pTau丝，因为没有观察到pTau丝从mAb4/53的解离。对于所有进一步的测量循环，0.3mg/ml pTau丝在HBS-EP缓冲液中稀释1：100并且以10μl/min注射1min，以便以异质夹心方式(heterogeneous sandwich-mode)将pTau呈递给相应抗体分析物。抗体分析物在HBS-EP缓冲液中稀释至100nM浓度并且以20μl/min注射3min至系统中。3min解离后，通过以100μl/min 2次注射10mM甘氨酸pH 2.5 1min随之以100μl/min HBS洗涤15秒使传感器表面再生。监测相互作用的结合和解离相。由于溶液中的抗体分析物是二价的，所以抗体亲抗原性负荷的(avidity-burdened)抗体-pTau动力学通过二相性解离模型表征，其由下述组成：快速的基于亲和力(affinity-based)的早期解离步骤，随之是后面的复合物解离中的抗体亲抗原性稳定的(avidity-stabilized)但是限速的动力学步骤。分析物注射结束后10秒(早期)和50秒(晚期)，如果可能，定量kd和t/2(diss)。动力学测量使用双重参照程序评价。首先来自FC1参照的信号被扣除以纠正缓冲液体积效应和非特异性结合。次之0nM分析物注射被扣除以纠正来自各自捕获系统的一级抗体的解离。动力学速率使用Langmuir 1.1解离拟合模型、根据BIAcore^TM评价软件v.4.1进行评价。抗原/抗体复合物稳定性半衰期(min)根据公式ln(2)/60*kd计算。

结果总结于下表中。

表：

实施例3

抗-Tau pS422单克隆兔抗体对阿尔茨海默病患者脑切片中细胞内pTau的结合

通过免疫荧光染色实验，使用来自AD患者的人脑组织的低温切片来研究通过单克隆兔抗-Tau pS422抗体特异性和灵敏性免疫组织化学检测阿尔茨海默病脑组织中的pTau病理学。兔IgGs通过山羊抗兔Alexa

缀合的二抗(Invitrogen/MolecularProbes A11034)检测。对于克隆Mab 005、Mab 019、Mab 020、Mab 085、Mab 086和Mab 097，pTau沉积和丝的特异性和灵敏性染色是明显的。细胞内pTau沉积，如大的神经原纤维缠结和延长的嗜中性粒细胞丝线是显著的。对于所有研究的克隆，确定了范围在0.08和0.016μg/ml之间的最小有效浓度，其表明对真正的人pTau沉积的高敏感性的结合。

实施例4

兔抗人Tau(pS422)抗体的人源化

如本文使用的“可变结构域”(轻链(VL)的可变结构域，重链(VH)的可变结构域)表示直接参与抗体与Tau(pS422)抗原的结合的轻链和重链结构域对的每一个。可变轻链和重链结构域具有相同的一般结构并且每个结构域包含由三个“高变区”连接的序列广泛保守的四个构架(FR)区。

计算机模拟(in silico)分析兔抗体Mab 086的VH和VL结构域的结构，并且与人VH和VL结构域的结构数据库(IMGT)比较。选择一组结构最类似的V结构域用于将兔抗体的CDR嫁接到选择的人VH和VL结构域上。此外，考虑一级序列的相似性，通过将兔抗体的VH和VL结构域的一级序列与人V结构域组库(repertoire)比对来缩小对人V结构域的选择。在一些人源化变体中在人构架区内引入向兔亲本残基的回复突变。类似地，在适于可能增加对抗原的亲和力的情况下，在一些变体中引入CDR的突变，以维持CDR三级结构，并且移除不希望的特征如半胱氨酸残基或可以在抗体纯化后经历修饰的残基。

将含有人源化的变体中的每一个的重链和轻链载体以矩阵的方式共转染入微量滴定培养板中的HEK293悬浮细胞中，获得表达所有可能轻链/重链组合的全尺寸IgG的细胞培养物。在37℃ 5天的培养后，收获上清并以微量滴定规模通过蛋白A亲和层析纯化。

实施例5

重组表达载体的产生

a)用于表达使用人IgG1恒定区的免疫球蛋白重链的载体的产生

编码包含人IgG1恒定区(CH1、铰链、CH2、CH3)和源自兔抗体Mab086的人源化的抗人Tau(pS422)抗体VH结构域的融合基因的人源化的重链，通过将编码各个抗人Tau(pS422)-特异性抗体VH结构域的DNA片段与编码人IgG1恒定区的序列元件融合来组装。

所述人IgG1恒定区具有以下氨基酸序列：

表达载体还包含来自载体pUC18的复制起点(其允许该质粒在大肠杆菌中复制)和在大肠杆菌中赋予氨苄青霉素抗性的β-内酰胺酶基因。

抗体重链的转录单位在5’至3’方向上包含以下功能元件：

-来自人巨细胞病毒(P-CMV)的立即早期增强子和启动子，其包括内含子A，

-人重链免疫球蛋白5’-非翻译区(5’UTR)，

-鼠免疫球蛋白重链信号序列，

-编码重链可变(VH)结构域的核酸，

-编码人IgG1恒定区的核酸，和

-牛生长激素多聚腺苷酸化序列(BGH pA)。

b)表达使用人Ig-κ恒定区的免疫球蛋白轻链的载体的产生

编码包含人Ig-κ恒定区(CL-κ)和源自兔抗体Mab 086的抗人Tau(pS422)抗体VL(κ)结构域的融合基因的人源化的κ轻链通过将编码各个抗人Tau(pS422)抗体VL(κ)结构域的DNA片段与编码人Ig-κ恒定区的序列元件融合来组装。

所述人Ig-κ恒定区具有以下氨基酸序列：

所述表达载体还包含来自载体pUC18的复制起点(其允许该质粒在大肠杆菌中复制)和在大肠杆菌中赋予氨苄青霉素抗性的β-内酰胺酶基因。

抗体κ轻链的转录单位在5’至3’方向上包含以下功能元件：

-人重链免疫球蛋白5’-非翻译区(5’UTR)，

-鼠免疫球蛋白重链信号序列，

-编码轻链可变(VL)结构域的核酸，

-编码人Ig-κ恒定区的核酸，和

-牛生长激素多聚腺苷酸化序列(BGH pA)。

c)用于表达使用人Ig-λ恒定区的免疫球蛋白轻链的载体的产生

编码包含人Ig-λ恒定区(CL-λ)和源自兔抗体Mab 086的抗人Tau(pS422)抗体VL(λ)结构域的融合基因的人源化的λ轻链通过将编码各个抗人Tau(pS422)抗体VL(λ)结构域的DNA片段与编码人Ig-λ恒定区的序列元件融合来组装。

所述人Ig-λ恒定区具有以下氨基酸序列：

抗体λ轻链的转录单位在5’至3’方向上包含以下功能元件：

-人重链免疫球蛋白5’-非翻译区(5’UTR)，

-鼠免疫球蛋白重链信号序列，

-编码可变轻链(VL)结构域的核酸，

-编码人Ig-λ恒定区的核酸，和

-牛生长激素多聚腺苷酸化序列(BGH pA)。

d)用于使用人Ig-κ恒定区的免疫球蛋白κ轻链的表达的载体的产生

编码包含人Ig-κ恒定区(CL-κ)和源自兔抗体Mab 086的抗人Tau(S422)抗体VL(κ)结构域的融合基因的人Ig-κ轻链，通过将编码各个抗人Tau(pS422)-抗体VL(κ)结构域的DNA片段与编码人Ig-κ恒定区的序列元件融合来组装。该构建体在基因组结构中，即内含子存在于信号肽中以及在VL(κ)和CL-κ结构域之间。

抗体κ轻链的转录单位在5’至3’方向上包含以下功能元件：

-来自人巨细胞病毒(P-CMV)的立即早期增强子和启动子

-人重链免疫球蛋白5’-非翻译区(5’UTR)，

-鼠免疫球蛋白重链信号序列，

-编码轻链可变(VL)结构域的核酸，

-人IgGκ恒定区，和

-牛生长激素多聚腺苷酸化序列(BGH pA)。

e)用于表达使用人Ig-λ恒定区的免疫球蛋白λ轻链的载体的产生

编码包含人Ig-λ恒定区(CL-λ)和源自兔抗体Mab 086的抗人Tau(S422)抗体VL(λ)结构域的融合基因的人Ig-λ轻链，通过将编码各个抗人Tau(pS422)-抗体VL(λ)结构域的DNA片段与编码人Ig-λ恒定区的序列元件融合来组装。该构建体在基因组结构中，即内含子存在于信号肽中以及在VL(λ)和CL-λ结构域之间。

抗体λ轻链的转录单位在5’至3’方向上包含以下功能元件：

-来自人巨细胞病毒(P-CMV)的立即早期增强子和启动子，

-人重链免疫球蛋白5’-非翻译区(5’UTR)，

-鼠免疫球蛋白重链信号序列，

-编码轻链可变(VL)结构域的核酸，

-人IgGλ恒定区，和

-牛生长激素多聚腺苷酸化序列(BGH pA)。

实施例6

抗人Tau(pS422)抗体的重组生产

在F17培养基(Invitrogen Corp.)中培养的瞬时转染的HEK293细胞(人胚肾细胞系293-衍生的)中生产抗体。对于如在实施例5中描述的各个载体的转染，使用"无293(293-Free)"转染试剂(Novagen)。从个体表达质粒表达抗体。如在制造商的使用说明中指明的进行转染。转染后三至七天，收获含有重组抗体的细胞培养上清。在降低的温度(例如-80℃)储存上清，直到纯化。

关于在例如HEK293细胞中重组表达人免疫球蛋白的一般信息在：Meissner,P.等人，Biotechnol.Bioeng.75(2001)197-203中给出。

实施例7

重组抗人Tau(pS422)抗体的纯化

过滤含有抗体的培养上清并通过两个层析步骤纯化。

使用用PBS(1mM KH₂PO₄，10mM Na₂HPO₄，137mM NaCl，2.7mM KCl)，pH 7.4平衡的HiTrap MabSelectSuRe(GE Healthcare)，通过亲和层析捕获抗体。通过用平衡缓冲液洗涤移除未结合的蛋白，并且用25mM柠檬酸盐缓冲液，pH 3.1回收抗体，其在洗脱后立即用1MTris-碱，pH 9.0调节至pH 6.0。

使用Superdex 200^TM(GE Healthcare)上的尺寸排阻层析作为第二纯化步骤。在20mM组氨酸缓冲液，0.14M NaCl，pH 6.0中进行尺寸排阻层析。将含有抗体的溶液用装有Biomax-SK膜的Ultrafree-CL离心过滤设备(Millipore，Billerica，MA，USA)浓缩并在-80℃储存。

实施例8

动力学筛选

根据Schraeml等人(Schraeml，M.和M.Biehl，Methods Mol.Biol.901(2012)171-181)在装有BIAcore CM5传感器的BIAcore 4000仪器上进行动力学筛选。BIAcore 4000仪器在软件版本V1.1的控制下。根据制造商的说明将BIAcore CM5系列S芯片安装入所述仪器并且液体动力学处理和预处理。仪器缓冲液为HBS-EP缓冲液(10mM HEPES(pH 7.4)，150mMNaCl，1mM EDTA，0.05％(w/v)P20)。在传感器表面准备抗体捕获系统。使用NHS/EDC化学将具有人IgG-Fc特异性的多克隆山羊抗人抗体(Jackson Lab.)以在10mM乙酸钠缓冲液(pH5)中的30μg/ml，以10,000RU固定于仪器的流路池1、2、3和4中的点1、2、4和5。在各个流路池中，在点1和点5上捕获抗体。点2和点4用作参照点。将传感器用1M乙醇胺溶液去活化。将人源化的抗体衍生物以在补充以1mg/ml CMD(羧甲基右旋糖苷)的仪器缓冲液中44nM至70nM的浓度施用。将抗体以30μl/min的流速注射2min。表面存在的抗体的捕获水平(CL)以相对响应单位(RU)测量。将溶液中的分析物、磷酸化的人tau蛋白、非磷酸化的人tau蛋白和磷酸化的人tau突变体蛋白T422S以300nM，以30μl/min的流速注射3min。监测解离5min。捕获系统通过以30μL/min向所有流路池注射10mM甘氨酸缓冲液pH 1.7达1min来再生。两个报告点(在分析物注射结束之前不久记录的信号(表示为结合晚期(BL))和解离时间结束之前不久(稳定晚期(SL))记录的信号)用于表征动力学筛选性能。此外，根据Langmuir模型计算解离速率常数kd(1/s)并且根据公式ln(2)/(60*kd)以分钟计，计算抗体/抗原复合体半衰期。根据公式MR＝(结合晚期(RU))/(捕获水平(RU))*(MW(抗体)/(MW(抗原))计算摩尔比(MR)。在传感器配置以合适量的抗体配体捕获水平的情形中，各个抗体应该能够至少功能性结合溶液中的一种分析物，其由MR＝1.0的摩尔比来表示。然后，摩尔比还是分析物结合的化合价模式的指征。对于结合两个分析物的抗体，最大化合价可以是MR＝2，每个Fab化合价为一。

在另一个实施方案中，在25℃和37℃，使用相同实验设置，但使用在0nM(缓冲液)、1.2nM、3.7nM、11.1nM、33.3nM、100nM和300nM的溶液中的多种浓度系列的各个分析物，确定动力学速率。从浓度依赖性结合行为，使用BIAcore评价软件，根据制造商的使用说明和具有RMAX整体(global)的Langmuir 1.1模型，计算动力学数据。

实施例9

ELISA

向未包被的Maxisorb板中加入PBS中的非生物素化的肽/蛋白/聚集体，并且向链霉亲和素包被的Maxisorb板中加入PBS中的生物素化的肽/蛋白/聚集体，并孵育过夜。弃上清并且将孔用90μl洗涤缓冲液(1x PBS/0.1％Tween 20)洗涤三次。通过孵育1h，剩余的反应性点用封闭缓冲液(1xPBS/2％BSA(牛血清白蛋白级分V，无脂肪酸，Roche，Cat.No.：10735078001)/0.05％Tween 20)封闭。弃上清并且将孔用90μl洗涤缓冲液洗涤三次。以在ELISA缓冲液(1xPBS/0.5％BSA(牛血清白蛋白级分V，无脂肪酸，Roche，Cat.No.：10735078001)/0.05％Tween 20)中的12个稀释(1：2)制备样品和对照抗体，起始浓度为500ng/mL。在室温在摇床上孵育时间为60分钟。弃上清并且将孔用90μl洗涤缓冲液洗涤三次。在ELISA缓冲液中制备二抗溶液。将总共25μl抗体混合物转移到测定板的所有孔中并且之后将板在室温在摇床上孵育60分钟。弃上清并且将孔用90μl洗涤缓冲液洗涤三次。向所有孔中加入25μl的ABTS溶液。在405nm-492nm读取吸光度。

实施例10

结合抗pTau抗体的pTau肽的动力学测量(捕获测定)

通过使用BIACORE T200仪(GE Healthcare)的表面等离子体共振来研究pTau片段与抗pTau抗体的结合。在pH5.0下，通过使用由GE Healthcare提供的胺偶联试剂盒，将捕获系统(10μg/ml山羊抗人Fc抗体；Jackson Immuno Research；订购代码：JIR 109-005-098)的大约10,000个共振单位(RU)偶联在CM5芯片(GE Healthcare BR-1005-30)上。作为运行缓冲液，使用HBS-N pH 7.4(10mM HEPES，150mM NaCl，pH 7.4，GE Healthcare)。为了测量样品，运行和稀释缓冲液是pH 7.4的PBS-T(包含0.05％Tween 20的10mM磷酸盐缓冲盐水)。样品块设定为12℃。流路池设定为25℃并用流动缓冲液灌注两次。

通过以10μl/min的流速注射10μg/ml溶液300秒来捕获抗pTau抗体。通过以30μl/min的流速注射在溶液中的各种浓度(以1：3的稀释度从300nM开始)的pTau片段180秒来测量结合。监测解离阶段长达300秒，并通过从样品溶液切换到运行缓冲液来触发。表面再生用0.85％磷酸溶液洗涤60秒，之后用5mM氢氧化钠溶液以10μl/min的流速洗涤60秒。通过减去从山羊抗人Fc抗体表面获得的应答来校正体积折射率差异。空白注射也被减去(＝双重参考)。为了计算KD和其他动力学参数，使用Langmuir1：1模型。

实施例11

结合pTau片段的抗pTau抗体Fab片段的动力学测量(直接测定)

通过使用BIACORE T200仪(GE Healthcare)的表面等离子体共振来研究抗pTau抗体Fab片段样品与pTau片段的结合。将大约20个共振单位(RU)的生物素化的pTau片段(0.2μg/ml；pTau(416-430)[Bi-XUUU-416；pSer-422]偶联在S系列SA芯片(GE Healthcare BR-1005-31)上。用于固定的运行和稀释缓冲液是HBS-N pH 7.4(10mM HEPES，150mM NaCl，pH7.4，GE Healthcare)。对于以下动力学表征，运行和稀释缓冲液是pH7.4的PBS-T(10mM磷酸盐缓冲盐水，包括0.05％Tween 20)。样品块设定为12℃。流路池设定为25℃并用流动缓冲液灌注两次。

通过以30μl/min的流速注射在溶液中不同浓度(以1：3稀释度从100nM开始)的抗pTau抗体Fab片段样品180秒来测量结合。监测解离阶段长达600秒，并通过从样品溶液切换到运行缓冲液来触发。通过用一次注射10mM甘氨酸溶液pH 1.7洗涤60秒来再生表面，流速为10μl/min。通过减去从空白表面获得的应答来校正体折射率差异。空白注射也被减去(＝双重参考)。为了计算KD和其他动力学参数，使用Langmuir 1：1模型。

实施例12

结合全长pTau的抗pTau抗体Fab片段的动力学测量(直接测定)

通过使用BIACORE T200仪(GE Healthcare)的表面等离子体共振来研究抗pTau抗体Fab片段样品与全长pTau蛋白的结合。将大约200个共振单位(RU)的生物素化的pTau蛋白(2μg/ml)偶联在S系列SA芯片(GE Healthcare BR-1005-31)上。用于固定的运行和稀释缓冲液是HBS-N pH7.4(10mM HEPES，150mM NaCl，pH 7.4，GE Healthcare)。对于以下动力学表征，运行和稀释缓冲液是pH 7.4的PBS-T(10mM磷酸盐缓冲盐水，包括0.05％Tween 20)。样品块设定为12℃。流路池设定为25℃并用运行缓冲液灌注两次。

通过以30μl/min流速注射在溶液中的不同浓度(以1：3的稀释度从300nM开始)的抗pTau抗体Fab片段样品180秒来测量结合。监测解离阶段长达600秒。并通过从样品溶液切换到运行缓冲液来触发。通过用一次注射10mM甘氨酸溶液pH 1.7洗涤60秒来再生表面，流速为10μl/min。通过减去从空白表面获得的响应来校正体折射率差异。空白注射也被减去(＝双重参考)。为了计算KD和其他动力学参数，使用Langmuir 1：1模型。

实施例13

抗-Tau(pS422)抗体(VH35H5/VL31A1)和抗-Tau(pS422)抗体(VH35H5/VL49G1)对人tau蛋白过表达小鼠中的tau病理的影响

用抗体1(VH35H5/VL31A1)、抗体2(VH35H5/VL49G1)或载体处理过表达最长的人类tau同种型的TauPS2APP转基因小鼠(Grüninger等人，Neurobiol.Dis.37(2010)294)16周。就在治疗之前，通过施用单剂量的抗CD4抗体(0.5mg/小鼠)免疫抑制所有小鼠。小鼠随后每周接受i.p.注射相应的抗体或载体，从9个月龄开始。对于两种抗体中的每一种，测试了三种单独的剂量，即1.7mg/kg、5mg/kg和15mg/kg。最后一次注射后4-6天将小鼠处死，经心脏灌注，并取出脑进行分析。在实验开始时处死未处理的一组小鼠(9月龄)并用作基线比较物。

将每个脑部在矢状面上切片，并将各个半球在干冰上快速冷冻。将左半球通过免疫测定法用于对Tau、Tau(pS422)和Tau聚集体的生物化学定量。右脑半球用于含有Tau(pS422)的神经原纤维tau蛋白的定量免疫组织化学分析。

方法

脑匀浆的制备

将来自每只小鼠的一个脑半球称重并加入到10体积的冰冷的提取缓冲液(25mMTris-HCl，800mM NaCl，10％蔗糖，1mM EGTA，pH7.5，补充有1％蛋白酶抑制剂混合物(Calbiochem#539134)和1％磷酸酶抑制剂混合物(Sigma#P0044))。然后将组织在2ml玻璃Dounce匀浆器中匀浆。在4℃，将匀浆在20.000xg下离心20min。弃去沉淀的物质，将匀浆分装并在-20℃储存直至进一步使用。

在脑匀浆中的Tau和Tau(pS422)的AlphaLISA定量

链霉亲和素包被的供体和未偶联的受体珠购自Perkin Elmer。受体珠与抗-Tau抗体或抗-Tau(pS422)抗体偶联。

使用生物素-N-羟基琥珀酰胺(Thermo Fischer)将抗Tau抗体5A6(DSHB)在伯胺基团上生物素化。

使用生物素化的5A6抗体，链霉抗生物素蛋白供体珠和抗Tau抗体受体珠在1xHiBlock测定缓冲液(Perkin Elmer)中进行Tau测量。

使用生物素化的5A6抗体，链霉亲和素供体珠和抗Tau(pS422)抗体受体珠，在测定缓冲液B(25mM Hepes，pH7.4，0.5％Triton X-100，0.1％TopBlock(LuBioscience)，1mg/mlDextran500，1/10Blocking试剂(Roche))中进行Tau(pS422)测量。

通过将5μl标准品或样品与10μl生物素化的5A6抗体和10μl抗体偶联的受体珠混合，然后在RT振荡孵育1小时，制备用于在1/2AreaPlate-96(Perkin Elmer)中测定的样品。然后向混合物中补充25μl链霉抗生物素蛋白供体珠，并在室温下在黑暗中振荡再孵育30分钟。然后在Envision微量滴定板读数器(Perkin Elmer)中使用激光发射在680nm和615nm发射滤器下测量板。使用重组人Tau(最长同种型)和ERK-磷酸化Tau产生标准曲线。

pTau病理学的定量免疫组织化学分析

在低温恒温器上制备矢状面低温切片(厚度10μm)，并将每只动物的四个切片用缀合有山羊抗小鼠/AlexaFluor555的Tau抗体(S422)以10μg/ml的浓度进行免疫荧光染色。

使用Metafer 4载玻片扫描系统(MetaSystems GmbH,Altlussheim,Germany)完成整个脑切片的图像采集。借助计算机辅助图像分析，通过无偏的形态计测学方法测定的海马和新皮质区域和pTau阳性免疫荧光信号区域内测量了Tau(pS422)免疫阳性面积。使用Definiens图像分析软件(Definiens AG,Munich,Germany)完成pTau阳性面积的定量。

结果

用抗体1或抗体2处理TauPS2APP小鼠导致脑匀浆中的Tau(pS422)积累的剂量依赖性降低(图7)。使用抗体1(VH35H5/VL31AS1)，在15mg/kg下的降低是统计学显著的。对于抗体2(VH35H5/VL49G1)，在所有剂量组中都积累了显著减少的Tau(pS422)。在两种抗体的所有剂量组的Tau总体水平都没有变化(图8)。在抗体1小鼠的大脑上进行定量免疫组织化学分析以检测含有Tau(pS422)的神经原纤维聚集体(图9)。虽然在任何剂量组中都没有统计学上显著的tau病理学减轻，但随着剂量的增加，观察到病理学减少的趋势。这在大脑的皮质区域更明显。

虽然本文已经描述了本发明的说明性实施例，但是应当理解的是，本发明不限于所描述的那些，并且本领域技术人员可以进行各种其他改变或修改而不脱离本发明的范围或精神。

序列表

<110> 豪夫迈·罗氏有限公司(F. Hoffmann-La Roche AG)

<120> 人源化的抗-Tau(pS422)抗体和使用方法

<130> P32939

<150> EP15173511.5

<151> 2015-06-24

<160> 87

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 441

<212> PRT

<213> 人

<400> 1

Met Ala Glu Pro Arg Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly

1 5 10 15

Thr Tyr Gly Leu Gly Asp Arg Lys Asp Gln Gly Gly Tyr Thr Met His

20 25 30

Gln Asp Gln Glu Gly Asp Thr Asp Ala Gly Leu Lys Glu Ser Pro Leu

35 40 45

Gln Thr Pro Thr Glu Asp Gly Ser Glu Glu Pro Gly Ser Glu Thr Ser

50 55 60

Asp Ala Lys Ser Thr Pro Thr Ala Glu Asp Val Thr Ala Pro Leu Val

65 70 75 80

Asp Glu Gly Ala Pro Gly Lys Gln Ala Ala Ala Gln Pro His Thr Glu

85 90 95

Ile Pro Glu Gly Thr Thr Ala Glu Glu Ala Gly Ile Gly Asp Thr Pro

100 105 110

Ser Leu Glu Asp Glu Ala Ala Gly His Val Thr Gln Ala Arg Met Val

115 120 125

Ser Lys Ser Lys Asp Gly Thr Gly Ser Asp Asp Lys Lys Ala Lys Gly

130 135 140

Ala Asp Gly Lys Thr Lys Ile Ala Thr Pro Arg Gly Ala Ala Pro Pro

145 150 155 160

Gly Gln Lys Gly Gln Ala Asn Ala Thr Arg Ile Pro Ala Lys Thr Pro

165 170 175

Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ser Ser Gly Glu Pro Pro Lys Ser Gly

180 185 190

Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser

195 200 205

Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr Arg Glu Pro Lys

210 215 220

Lys Val Ala Val Val Arg Thr Pro Pro Lys Ser Pro Ser Ser Ala Lys

225 230 235 240

Ser Arg Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro Met Pro Asp Leu Lys Asn Val

245 250 255

Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu Lys His Gln Pro Gly Gly

260 265 270

Gly Lys Val Gln Ile Ile Asn Lys Lys Leu Asp Leu Ser Asn Val Gln

275 280 285

Ser Lys Cys Gly Ser Lys Asp Asn Ile Lys His Val Pro Gly Gly Gly

290 295 300

Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp Leu Ser Lys Val Thr Ser

305 310 315 320

Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His His Lys Pro Gly Gly Gly Gln

325 330 335

Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe Lys Asp Arg Val Gln Ser

340 345 350

Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr His Val Pro Gly Gly Gly Asn

355 360 365

Lys Lys Ile Glu Thr His Lys Leu Thr Phe Arg Glu Asn Ala Lys Ala

370 375 380

Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser Pro Val Val Ser

385 390 395 400

Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu Ser Asn Val Ser Ser Thr Gly Ser

405 410 415

Ile Asp Met Val Asp Ser Pro Gln Leu Ala Thr Leu Ala Asp Glu Val

420 425 430

Ser Ala Ser Leu Ala Lys Gln Gly Leu

435 440

<210> 2

<211> 441

<212> PRT

<213> 人

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (422)..(422)

<223> X=磷酸丝氨酸

<400> 2

Met Ala Glu Pro Arg Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly

1 5 10 15

Thr Tyr Gly Leu Gly Asp Arg Lys Asp Gln Gly Gly Tyr Thr Met His

20 25 30

Gln Asp Gln Glu Gly Asp Thr Asp Ala Gly Leu Lys Glu Ser Pro Leu

35 40 45

Gln Thr Pro Thr Glu Asp Gly Ser Glu Glu Pro Gly Ser Glu Thr Ser

50 55 60

Asp Ala Lys Ser Thr Pro Thr Ala Glu Asp Val Thr Ala Pro Leu Val

65 70 75 80

Asp Glu Gly Ala Pro Gly Lys Gln Ala Ala Ala Gln Pro His Thr Glu

85 90 95

Ile Pro Glu Gly Thr Thr Ala Glu Glu Ala Gly Ile Gly Asp Thr Pro

100 105 110

Ser Leu Glu Asp Glu Ala Ala Gly His Val Thr Gln Ala Arg Met Val

115 120 125

Ser Lys Ser Lys Asp Gly Thr Gly Ser Asp Asp Lys Lys Ala Lys Gly

130 135 140

Ala Asp Gly Lys Thr Lys Ile Ala Thr Pro Arg Gly Ala Ala Pro Pro

145 150 155 160

Gly Gln Lys Gly Gln Ala Asn Ala Thr Arg Ile Pro Ala Lys Thr Pro

165 170 175

Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ser Ser Gly Glu Pro Pro Lys Ser Gly

180 185 190

Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser

195 200 205

Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr Arg Glu Pro Lys

210 215 220

Lys Val Ala Val Val Arg Thr Pro Pro Lys Ser Pro Ser Ser Ala Lys

225 230 235 240

Ser Arg Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro Met Pro Asp Leu Lys Asn Val

245 250 255

Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu Lys His Gln Pro Gly Gly

260 265 270

Gly Lys Val Gln Ile Ile Asn Lys Lys Leu Asp Leu Ser Asn Val Gln

275 280 285

Ser Lys Cys Gly Ser Lys Asp Asn Ile Lys His Val Pro Gly Gly Gly

290 295 300

Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp Leu Ser Lys Val Thr Ser

305 310 315 320

Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His His Lys Pro Gly Gly Gly Gln

325 330 335

Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe Lys Asp Arg Val Gln Ser

340 345 350

Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr His Val Pro Gly Gly Gly Asn

355 360 365

Lys Lys Ile Glu Thr His Lys Leu Thr Phe Arg Glu Asn Ala Lys Ala

370 375 380

Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser Pro Val Val Ser

385 390 395 400

Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu Ser Asn Val Ser Ser Thr Gly Ser

405 410 415

Ile Asp Met Val Asp Xaa Pro Gln Leu Ala Thr Leu Ala Asp Glu Val

420 425 430

Ser Ala Ser Leu Ala Lys Gln Gly Leu

435 440

<210> 3

<211> 15

<212> PRT

<213> 人

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (7)..(7)

<223> X=磷酸丝氨酸

<400> 3

Ser Ile Asp Met Val Asp Xaa Pro Gln Leu Ala Thr Leu Ala Asp

1 5 10 15

<210> 4

<211> 12

<212> PRT

<213> 穴兔

<400> 4

Gln Ser Ser Gln Ser Val Arg Thr Asn Lys Leu Ala

1 5 10

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 穴兔

<400> 5

Ser Ala Ser Thr Leu Asp Phe

1 5

<210> 6

<211> 13

<212> PRT

<213> 穴兔

<400> 6

Leu Gly Tyr Phe Asp Cys Ser Ile Ala Asp Cys Val Ala

1 5 10

<210> 7

<211> 112

<212> PRT

<213> 穴兔

<400> 7

Ala Gln Val Leu Thr Gln Thr Thr Ser Pro Val Ser Ala Ala Val Gly

1 5 10 15

Ser Thr Val Thr Ile Ser Cys Gln Ser Ser Gln Ser Val Arg Thr Asn

20 25 30

Lys Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Arg Leu

35 40 45

Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Asp Phe Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser

50 55 60

Ala Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Val Gln

65 70 75 80

Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Tyr Phe Asp Cys Ser

85 90 95

Ile Ala Asp Cys Val Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys

100 105 110

<210> 8

<211> 5

<212> PRT

<213> 穴兔

<400> 8

Ser Asn Ala Ile Asn

1 5

<210> 9

<211> 16

<212> PRT

<213> 穴兔

<400> 9

Tyr Ile Ala Val Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly

1 5 10 15

<210> 10

<211> 3

<212> PRT

<213> 穴兔(Oryctolagus cuniculus)

<400> 10

Ser Asn Ile

1

<210> 11

<211> 108

<212> PRT

<213> 穴兔

<400> 11

Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro

1 5 10 15

Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Asn Ala

20 25 30

Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly

35 40 45

Tyr Ile Ala Val Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly

50 55 60

Arg Phe Thr Ile Ser Lys Ala Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Met Thr

65 70 75 80

Ser Pro Thr Ala Glu Asp Thr Gly Thr Tyr Phe Cys Gly Lys Ser Asn

85 90 95

Ile Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Leu

100 105

<210> 12

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化序列

<400> 12

Arg Ser Ser Gln Ser Val Arg Thr Asn Lys Leu Ala

1 5 10

<210> 13

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化序列

<400> 13

Arg Ser Ser Gln Ser Val Arg Thr Asn Arg Leu Ala

1 5 10

<210> 14

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化序列

<400> 14

Ser Ala Ser Thr Leu Asp Tyr

1 5

<210> 15

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化序列

<400> 15

Leu Gly Tyr Phe Asp Ser Ser Ala Asp Ile Val Ala

1 5 10

<210> 16

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化序列

<400> 16

Ala Gln Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Val Arg Thr Asn

20 25 30

Lys Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Arg Leu

35 40 45

Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Asp Phe Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Tyr Phe Asp Ser Ser

85 90 95

Ala Asp Ile Val Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 17

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化序列

<400> 17

Ala Gln Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Val Arg Thr Asn

20 25 30

Arg Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Arg Leu

35 40 45

Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Asp Tyr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Tyr Phe Asp Ser Ser

85 90 95

Ala Asp Ile Val Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 18

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化序列

<400> 18

Tyr Ile Ala Val Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly

1 5 10 15

<210> 19

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化序列

<400> 19

Glu Val Gln Val Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Asn

20 25 30

Ala Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Tyr Ile Ala Val Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Gly

85 90 95

Lys Ser Asn Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

100 105 110

<210> 20

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化序列

<400> 20

Ala Gln Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Val Arg Thr Asn

20 25 30

Lys Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Arg Leu

35 40 45

Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Asp Phe Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Tyr Phe Asp Ser Ser

85 90 95

Ile Ala Asp Ile Val Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 21

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化序列

<400> 21

Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Val Arg Thr Asn

20 25 30

Arg Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Arg Leu

35 40 45

Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Asp Phe Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Tyr Phe Asp Ser Ser

85 90 95

Ile Ala Asp Ile Val Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 22

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化序列

<400> 22

Ser Ala Ser Thr Leu Gln Ser

1 5

<210> 23

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化序列

<400> 23

Ser Ala Ser Thr Leu Glu Ser

1 5

<210> 24

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化序列

<400> 24

Leu Gly Tyr Phe Asp Ser Ser Ile Ala Asp Ser Val Ala

1 5 10

<210> 25

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化序列

<400> 25

Leu Gly Tyr Phe Asp Ser Ser Ile Ala Asp Arg Val Ala

1 5 10

<210> 26

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化序列

<400> 26

Leu Gly Tyr Phe Asp Pro Ser Ile Ala Asp Pro Val Ala

1 5 10

<210> 27

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化序列

<400> 27

Leu Gly Tyr Phe Asp Ser Ser Ile Ala Asp Ile Val Ala

1 5 10

<210> 28

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化序列

<400> 28

Leu Gly Tyr Phe Asp Pro Ser Ala Asp Pro Ile Ala

1 5 10

<210> 29

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化序列

<400> 29

Leu Gly Tyr Phe Asp Pro Ser Ala Asp Pro Val Ala

1 5 10

<210> 30

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化序列

<400> 30

Arg Ala Ser Gln Gly Val Arg Thr Asn Lys Leu Ala

1 5 10

<210> 31

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化序列

<400> 31

Arg Ala Ser Gln Ser Val Arg Thr Asn Lys Leu Ala

1 5 10

<210> 32

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化序列

<400> 32

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Thr Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser Gln Ser Val Arg Thr Asn

20 25 30

Lys Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu

35 40 45

Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Asp Phe Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln

65 70 75 80

Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Tyr Phe Asp Cys Ser

85 90 95

Ile Ala Asp Cys Val Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 33

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化序列

<400> 33

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Arg Thr Asn

20 25 30

Lys Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu

35 40 45

Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln

65 70 75 80

Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Tyr Phe Asp Cys Ser

85 90 95

Ile Ala Asp Cys Val Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 34

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化序列

<400> 34

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Val Arg Thr Asn

20 25 30

Lys Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Arg Leu

35 40 45

Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Tyr Phe Asp Cys Ser

85 90 95

Ile Ala Asp Cys Val Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 35

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化序列

<400> 35

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Val Arg Thr Asn

20 25 30

Lys Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Arg Leu

35 40 45

Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Tyr Phe Asp Ser Ser

85 90 95

Ile Ala Asp Ser Val Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 36

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化序列

<400> 36

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Val Arg Thr Asn

20 25 30

Lys Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Arg Leu

35 40 45

Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Tyr Phe Asp Ser Ser

85 90 95

Ile Ala Asp Arg Val Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 37

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化序列

<400> 37

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Val Arg Thr Asn

20 25 30

Lys Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Arg Leu

35 40 45

Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Asp Phe Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Tyr Phe Asp Cys Ser

85 90 95

Ile Ala Asp Cys Val Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 38

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化序列

<400> 38

Ala Gln Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Val Arg Thr Asn

20 25 30

Lys Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Arg Leu

35 40 45

Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Asp Phe Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Tyr Phe Asp Cys Ser

85 90 95

Ile Ala Asp Cys Val Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 39

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化序列

<400> 39

Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Val Arg Thr Asn

20 25 30

Arg Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu

35 40 45

Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Asp Phe Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln

65 70 75 80

Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Tyr Phe Asp Pro Ser

85 90 95

Ala Asp Pro Val Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 40

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化序列

<400> 40

Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Val Arg Thr Asn

20 25 30

Arg Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Arg Leu

35 40 45

Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Asp Phe Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Tyr Phe Asp Ser Ser

85 90 95

Ile Ala Asp Ile Val Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 41

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化序列

<400> 41

Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Val Arg Thr Asn

20 25 30

Arg Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Arg Leu

35 40 45

Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Asp Phe Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Tyr Phe Asp Ser Ser

85 90 95

Ile Ala Asp Ile Val Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 42

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化序列

<400> 42

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Val Arg Thr Asn

20 25 30

Arg Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Arg Leu

35 40 45

Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Asp Phe Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Tyr Phe Asp Pro Ser

85 90 95

Ile Ala Asp Pro Val Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 43

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化序列

<400> 43

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Val Arg Thr Asn

20 25 30

Arg Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Arg Leu

35 40 45

Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Asp Phe Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Tyr Phe Asp Pro Ser

85 90 95

Ala Asp Pro Val Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 44

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化序列

<400> 44

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Val Arg Thr Asn

20 25 30

Arg Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Arg Leu

35 40 45

Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Asp Phe Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Tyr Phe Asp Pro Ser

85 90 95

Ala Asp Pro Ile Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 45

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化序列

<400> 45

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Val Arg Thr Asn

20 25 30

Arg Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu

35 40 45

Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Asp Phe Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Tyr Phe Asp Pro Ser

85 90 95

Ala Asp Pro Ile Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 46

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化序列

<400> 46

Gln Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser

1 5 10 15

Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Asn Ala

20 25 30

Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly

35 40 45

Tyr Ile Ala Val Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly

50 55 60

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln

65 70 75 80

Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Gly Lys

85 90 95

Ser Asn Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

100 105 110

<210> 47

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化序列

<400> 47

Gln Ser Val Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser

1 5 10 15

Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Asn Ala

20 25 30

Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly

35 40 45

Tyr Ile Ala Val Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly

50 55 60

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln

65 70 75 80

Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Gly Lys

85 90 95

Ser Asn Ile Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

100 105 110

<210> 48

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化序列

<400> 48

Gln Ser Val Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser

1 5 10 15

Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Asn Ala

20 25 30

Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly

35 40 45

Tyr Ile Ala Val Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly

50 55 60

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln

65 70 75 80

Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Gly Lys

85 90 95

Ser Asn Ile Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

100 105 110

<210> 49

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化序列

<400> 49

Gln Ser Val Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser

1 5 10 15

Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Asn Ala

20 25 30

Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly

35 40 45

Tyr Ile Ala Val Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly

50 55 60

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ser Thr Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn

65 70 75 80

Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Gly Lys Ser Asn

85 90 95

Ile Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

100 105

<210> 50

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化序列

<400> 50

Gln Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser

1 5 10 15

Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Asn Ala

20 25 30

Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly

35 40 45

Tyr Ile Ala Val Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly

50 55 60

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln

65 70 75 80

Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Gly Lys

85 90 95

Ser Asn Ile Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

100 105 110

<210> 51

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化序列

<400> 51

Gln Ser Val Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser

1 5 10 15

Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Asn Ala

20 25 30

Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly

35 40 45

Tyr Ile Ala Val Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly

50 55 60

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln

65 70 75 80

Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Gly Lys

85 90 95

Ser Asn Ile Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

100 105 110

<210> 52

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化序列

<400> 52

Gln Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser

1 5 10 15

Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Asn Ala

20 25 30

Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly

35 40 45

Tyr Ile Ala Val Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly

50 55 60

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln

65 70 75 80

Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Gly Lys

85 90 95

Ser Asn Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

100 105 110

<210> 53

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化序列

<400> 53

Gln Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser

1 5 10 15

Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Asn Ala

20 25 30

Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly

35 40 45

Tyr Ile Ala Val Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly

50 55 60

Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln

65 70 75 80

Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Gly Lys

85 90 95

Ser Asn Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

100 105 110

<210> 54

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化序列

<400> 54

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Asn

20 25 30

Ala Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Tyr Ile Ala Val Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Gly

85 90 95

Lys Ser Asn Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

100 105 110

<210> 55

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化序列

<400> 55

Glu Val Gln Val Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Asn

20 25 30

Ala Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Tyr Ile Ala Val Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Gly

85 90 95

Lys Ser Asn Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

100 105 110

<210> 56

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化序列

<400> 56

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Asn

20 25 30

Ala Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Tyr Ile Ala Val Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Gly

85 90 95

Lys Ser Asn Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

100 105 110

<210> 57

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化序列

<400> 57

Glu Val Gln Val Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Asn

20 25 30

Ala Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Tyr Ile Ala Val Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Gly

85 90 95

Lys Ser Asn Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

100 105 110

<210> 58

<211> 330

<212> PRT

<213> 人

<400> 58

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 59

<211> 107

<212> PRT

<213> 人

<400> 59

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 60

<211> 106

<212> PRT

<213> 人

<400> 60

Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser

1 5 10 15

Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp

20 25 30

Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro

35 40 45

Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn

50 55 60

Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys

65 70 75 80

Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val

85 90 95

Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

100 105

<210> 61

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> rbHCfinal.up

<400> 61

aagcttgcca ccatggagac tgggctgcgc tggcttc 37

<210> 62

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> rbHCfinal.do

<400> 62

ccattggtga gggtgcccga g 21

<210> 63

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> rbLCfinal.up

<400> 63

aagcttgcca ccatggacay gagggccccc actc 34

<210> 64

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> rbLCfinal.do

<400> 64

cagagtrctg ctgaggttgt aggtac 26

<210> 65

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化序列

<400> 65

Glu Val Gln Val Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ile Ser Leu Ser Ser Asn

20 25 30

Ala Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Tyr Ile Ala Val Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Gly

85 90 95

Lys Ser Asn Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

100 105 110

<210> 66

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化序列

<400> 66

Ala Gln Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Val Arg Asn Asn

20 25 30

Lys Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Arg Leu

35 40 45

Ile Tyr Ser Ala Ser Asp Leu Asp Tyr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Tyr Phe Asp Ser Ser

85 90 95

Ala Asp Ile Val Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 67

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化序列

<400> 67

Ala Gln Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Val Arg Ser Asn

20 25 30

Lys Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Arg Leu

35 40 45

Ile Tyr Ser Ala Ser Asn Leu Asp Tyr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Tyr Phe Asp Ser Ser

85 90 95

Ala Asp Ile Val Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 68

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化序列

<400> 68

Ala Gln Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Val Arg Thr Asn

20 25 30

Lys Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Arg Leu

35 40 45

Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Asp Phe Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Tyr Phe Asp Ser Pro

85 90 95

Leu Asp Ile Val Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 69

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化序列

<400> 69

Ala Gln Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Val Arg Thr Asn

20 25 30

Lys Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Arg Leu

35 40 45

Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Asp Phe Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gly Tyr Phe Asp Pro His

85 90 95

Gln Asp Val Val Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 70

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HVR-L1

<400> 70

Arg Ser Ser Gln Ser Val Arg Asn Asn Lys Leu Ala

1 5 10

<210> 71

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HVR-L1

<400> 71

Arg Ser Ser Gln Ser Val Arg Ser Asn Lys Leu Ala

1 5 10

<210> 72

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HVR-L2

<400> 72

Ser Ala Ser Asp Leu Asp Tyr

1 5

<210> 73

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HVR-L2

<400> 73

Ser Ala Ser Asn Leu Asp Tyr

1 5

<210> 74

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HVR-L3

<400> 74

Leu Gly Tyr Phe Asp Ser Pro Leu Asp Ile Val Ala

1 5 10

<210> 75

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HVR-L3

<400> 75

Ala Gly Tyr Phe Asp Pro His Gln Asp Val Val Ala

1 5 10

<210> 76

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链可变结构域

<400> 76

Glu Val Gln Val Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Asn Ser

20 25 30

Ala Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Tyr Ile Ala Val Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Gly

85 90 95

Lys Ser Asn Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

100 105 110

<210> 77

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HVR-H1

<400> 77

Asn Ser Ala Ile Asn

1 5

<210> 78

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VL35G4

<400> 78

Ala Gln Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Val Arg Thr Asn

20 25 30

Lys Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Arg Leu

35 40 45

Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Asp Phe Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gly Tyr Phe Glu Ala Pro

85 90 95

Ala Asp Ile Val Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 79

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HVR-L3

<400> 79

Ala Gly Tyr Phe Glu Ala Pro Ala Asp Ile Val Ala

1 5 10

<210> 80

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VL145B12

<400> 80

Ala Gln Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Val Arg Ser Asn

20 25 30

Lys Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Arg Leu

35 40 45

Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Asp Phe Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Tyr Phe Asp Ser Ser

85 90 95

Ala Asp Ile Val Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 81

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HVR-L2

<400> 81

Ala Ala Ser Asn Leu Asp Phe

1 5

<210> 82

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 299-009 VH人源化变体_DANG

<400> 82

Gln Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser

1 5 10 15

Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala

20 25 30

Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly

35 40 45

Tyr Ile Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly

50 55 60

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln

65 70 75 80

Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys

85 90 95

Arg Tyr Gly Thr Ser Tyr Pro Asp Tyr Gly Asp Ala Asn Gly Phe Asp

100 105 110

Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 83

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 299-009 VH人源化变体_DASG

<400> 83

Gln Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser

1 5 10 15

Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala

20 25 30

Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly

35 40 45

Tyr Ile Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly

50 55 60

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln

65 70 75 80

Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys

85 90 95

Arg Tyr Gly Thr Ser Tyr Pro Asp Tyr Gly Asp Ala Ser Gly Phe Asp

100 105 110

Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 84

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 299-009 VH人源化变体_DAQG

<400> 84

Gln Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser

1 5 10 15

Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala

20 25 30

Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly

35 40 45

Tyr Ile Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly

50 55 60

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln

65 70 75 80

Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys

85 90 95

Arg Tyr Gly Thr Ser Tyr Pro Asp Tyr Gly Asp Ala Gln Gly Phe Asp

100 105 110

Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 85

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 299-009 VL人源化变体_NYA

<400> 85

Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Arg Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Tyr Ala Ser Ser Asn

85 90 95

Val Asp Asn Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 86

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VL4G1

<400> 86

Ala Gln Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Val Arg Thr Asn

20 25 30

Lys Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Arg Leu

35 40 45

Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Asp Phe Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Tyr Phe Asp Ser Pro

85 90 95

Ala Asp Ile Val Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 87

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VL4G1-HVR-L3

<400> 87

Leu Gly Tyr Phe Asp Ser Pro Ala Asp Ile Val Ala

1 5 10

Claims

1.人源化双特异抗体，包含

i)第一结合位点，其具有

c)SEQ ID NO：21的重链可变结构域和SEQ ID NO：17的轻链可变结构域，或

d)SEQ ID NO：65的重链可变结构域和SEQ ID NO：67的轻链可变结构域，或

e)SEQ ID NO：65的重链可变结构域和SEQ ID NO：66的轻链可变结构域，或

f)SEQ ID NO：76的重链可变结构域和SEQ ID NO：78的轻链可变结构域，或

g)SEQ ID NO：19的重链可变结构域和SEQ ID NO：78的轻链可变结构域，或

h)SEQ ID NO：76的重链可变结构域和SEQ ID NO：80的轻链可变结构域；

和

ii)第二结合位点，选自

2.根据权利要求1所述的人源化的抗体，其中所述抗体是效应子功能沉默的。

3.根据权利要求1所述的人源化的抗体，其中所述抗体

i)特异结合具有SEQ ID NO：03的氨基酸序列的多肽，和/或

ii)不以1μg/mL结合具有SEQ ID NO:01的氨基酸序列的人Tau，和/或

iii)特异结合具有SEQ ID NO:02的氨基酸序列的在位置422处的丝氨酸处磷酸化的人Tau，和/或

iv)特异结合具有SEQ ID NO:02的氨基酸序列的在位置422处的丝氨酸处磷酸化的人Tau的聚集体。

4.根据权利要求1所述的人源化的抗体，其中所述抗体对于以下具有以下EC50值

a)对于具有SEQ ID NO：03的氨基酸序列的多肽为6ng/mL或更小，和/或

b)对于具有SEQ ID NO：02的氨基酸序列的在位置422处的丝氨酸处磷酸化的人Tau为4.5ng/mL或更小，和/或

c)对于具有SEQ ID NO：02的氨基酸序列的在位置422处的丝氨酸处磷酸化的人Tau的聚集体为30ng/mL或更小，和/或

5.根据权利要求1中所述的人源化的抗体，其中所述抗体特异结合具有SEQ ID NO:02的氨基酸序列的在位置422处的丝氨酸处磷酸化的人Tau并且不结合具有SEQ ID NO:01的氨基酸序列的人Tau。

6.根据权利要求3中所述的人源化的抗体，其中所述抗体特异结合具有SEQ ID NO:02的氨基酸序列的在位置422处的丝氨酸处磷酸化的人Tau并且不结合具有SEQ ID NO:01的氨基酸序列的人Tau。

7.根据权利要求4中所述的人源化的抗体，其中所述抗体特异结合具有SEQ ID NO:02的氨基酸序列的在位置422处的丝氨酸处磷酸化的人Tau并且不结合具有SEQ ID NO:01的氨基酸序列的人Tau。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的人源化的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体。

9.根据权利要求3所述的人源化的抗体，其中所述抗体是结合在位置422处的丝氨酸处磷酸化的人Tau的抗体片段并且

i)特异结合具有SEQ ID NO：03的氨基酸序列的多肽，和/或

ii)不以1μg/mL结合具有SEQ ID NO:01的氨基酸序列的人Tau，和/或

iv)特异结合具有SEQ ID NO:02的氨基酸序列的在位置422处的丝氨酸处磷酸化的人Tau的聚集体，和/或

vi)对于具有SEQ ID NO：03的氨基酸序列的在位置422处的丝氨酸处磷酸化的人Tau片段具有6ng/mL或更小的EC50值，和/或

vii)对于具有SEQ ID NO：02的氨基酸序列的在位置422处的丝氨酸处磷酸化的全长人Tau具有4.5ng/mL或更小的EC50值，和/或

viii)对于具有SEQ ID NO：02的氨基酸序列的在位置422处的丝氨酸处磷酸化的人Tau的聚集体具有30ng/mL或更小的EC50值，和/或

10.根据权利要求1所述的人源化的抗体，其中所述抗体是

a)人IgG1亚类的全长抗体，或

b)人IgG4亚类的全长抗体，或

c)具有突变L234A、L235A和P329G的人IgG1亚类的全长抗体，

d)具有突变S228P、L235E和P329G的人IgG4亚类的全长抗体，

11.根据权利要求8所述的人源化的抗体，其中所述抗体是

a)人IgG1亚类的全长抗体，或

b)人IgG4亚类的全长抗体，或

c)具有突变L234A、L235A和P329G的人IgG1亚类的全长抗体，

d)具有突变S228P、L235E和P329G的人IgG4亚类的全长抗体，

12.分离的核酸，其编码根据权利要求1至11中任一项所述的人源化的抗体。

13.宿主细胞，其包含根据权利要求12所述的核酸。

14.产生根据权利要求1至11中任一项所述的人源化的抗体的方法，其包括培养如权利要求13的宿主细胞从而产生人源化的抗体的步骤。

15.根据权利要求14所述的方法，其还包含从细胞或培养基回收人源化的抗体的步骤。

16.药物制剂，其包含根据权利要求1至11中任一项所述的人源化的抗体和药用载体。

17.根据权利要求16所述的药物制剂，其还包含另外的治疗剂。

18.根据权利要求17所述的药物制剂，其中所述另外的治疗剂是抗-淀粉样蛋白治疗剂。

19.根据权利要求18所述的药物制剂，其中所述抗-淀粉样蛋白治疗剂是抗人α-突触核蛋白抗体或抗-Abeta抗体。

20.根据权利要求1至11中任一项所述的人源化的抗体用于制备药物的用途，其中所述药物用于治疗阿尔茨海默病。

21.根据权利要求1至11中任一项所述的人源化的抗体用于制备药物的用途，其中所述药物用于治疗前驱阿尔茨海默病。

22.根据权利要求1至11中任一项所述的人源化的抗体用于制备药物的用途，其中所述药物用于治疗轻度阿尔茨海默病。

23.根据权利要求1至11中任一项所述的人源化的抗体用于制备药物的用途，其中所述药物用于减轻在位置422处的丝氨酸处磷酸化的人Tau引起的神经变性。

24.根据权利要求20-23中任一项所述的用途，其中所述药物用于维持认知和功能。

25.根据权利要求20-23中任一项所述的用途，其中所述药物用于减缓认知和功能下降的速率。

26.根据权利要求24所述的用途，其中所述药物用于减缓认知和功能下降的速率。