CN103339146B - 人抗tau抗体 - Google Patents

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Abstract

提供了人tau特异性抗体及其片段、衍生物和变体，及其相关方法。还公开了与tau特异性抗体相关的测定、试剂盒和固体支持物。所述抗体、免疫球蛋白链及其结合片段、衍生物和变体可分别用于tau靶向免疫治疗和诊断的药物和诊断组合物。

Description

人抗TAU抗体
发明领域
本发明一般涉及新型tau特异性结合分子，尤其是识别tau蛋白的人抗体及其片段、衍生物和变体，包括病理磷酸化的tau和tau的聚集形式。此外，本发明涉及包含此类结合分子、抗体及其模拟物的药物和诊断组合物，其用作识别血浆和CSF中的tau和毒性tau物质的诊断工具，以及在被动疫苗接种策略中用于治疗神经退行性tau蛋白病(tauopathy)，例如阿尔茨海默氏病(AD)、肌萎缩性侧索硬化/帕金森–痴呆综合征(ALS-PDC)、嗜银颗粒痴呆(AGD)、英式淀粉样血管病、脑淀粉样血管病、皮质基底退化(CBD)、克罗伊茨菲尔德-雅各布二氏病(Creutzfeldt-Jakob disease)(CJD)、拳击员痴呆、伴有钙质沉着的弥漫性神经原纤维缠结病、唐氏综合征、额颞痴呆、17号染色体相关的伴有帕金森症的额颞痴呆(FTDP-17)、额颞叶退化、杰茨曼-斯脱司勒-史茵克病(Gerstmann--Scheinkerdisease)、哈勒沃登-施帕茨病(Hallervorden-Spatz diseas)、包涵体肌炎、多系统萎缩、肌强直性营养不良、C型尼曼-皮克病(NP-C)、伴有神经原纤维缠结的非关岛运动神经元病、皮克氏病(PiD)、脑炎后帕金森症、朊病毒蛋白脑淀粉样血管病、进行性皮质下胶质增生、进行性核上性麻痹(PSP)、亚急性硬化全脑炎、缠结痴呆、多发性脑梗死性痴呆和缺血性中风均有重大价值。
发明背景
蛋白质积累、修饰和聚集是多种神经退行性疾病的病理学方面。包括超磷酸化tau构象异构体的病理修饰和聚集的tau是tau蛋白病的恒定标志，并且与疾病严重性相关联。
Tau是在中枢神经系统中表达的微管相关蛋白，其主要功能是稳定微管。有六种主要在成人大脑中表达的主要tau亚型，它们通过选择性剪接来源于单个基因。在病理条件下，tau蛋白变为超磷酸化，导致微管蛋白结合的丧失和微管的去稳定化，然后是tau在病原性神经原纤维缠结中的聚集和沉积。Tau相关的疾病-统称为神经退行性tau蛋白病-是蛋白质错误折叠疾病集合的一部分，所述疾病包括阿尔茨海默氏病(AD)、进行性核上性麻痹、皮克氏病、皮质基底退化、FTDP-17等。据报道，超过40种tau基因突变与遗传性额颞痴呆相关联，表明tau基因突变足以触发神经退行性变性(Cairns等,Am.J.Pathol.171(2007),227-40)。转基因小鼠和细胞培养研究表明在AD中，tau病变由病理级联反应引起，其中Aβ位于tau的上游(等,Science293(2001),1491–1495)。然而，其他发现指向双通路模型，其中两种级联反应彼此独立地发挥作用(van de Nes等,Acta Neuropathol.111(2006),126-138)。靶向AD中的β-淀粉样肽的免疫治疗在动物模型中已经产生令人鼓舞的结果，并且显示出在临床试验中的潜力。最近来自少量受试者的尸检数据暗示，患有进行性AD的患者中β-淀粉样蛋白斑的清除不足以阻止认知功能恶化，这强调了对附加AD治疗策略的需要(Holmes等,Lancet372(2008),216-223;Boche等,Acta Neuropathol.120(2010),13-20)。随着基于Aβ的免疫治疗在转基因动物模型中的成功，主动免疫治疗的概念扩展到了tau蛋白。然而，使用tau蛋白对野生型小鼠进行主动疫苗接种被发现会导致中枢神经系统中神经原纤维缠结的形成、轴突损伤和单核浸润，并且伴随着神经缺损(Rosenmann等,ArchNeurol.63(2006),1459-1467)。在使用磷酸化tau肽进行主动疫苗接种的转基因小鼠品系中的随后研究揭示，大脑中tau聚集体的水平降低，并且行为障碍的进展变慢(Sigurdsson,J.Alzheimers.Dis.15(2008),157-168;Boimel等,Exp.Neurol.224(2010),472-485)。这些发现突出了与靶向tau的主动免疫治疗方式相关联的潜在有益效果，以及巨大风险。迫切需要新型治疗策略，从而使用有效和安全的治疗处理病理性tau蛋白。
用来源于健康人受试者的人抗体进行被动免疫可以卓越疗效和安全性的高度可能性提供具有潜力的新型治疗途径，其中该抗体通过人免疫系统进行进化优化和亲和力成熟。
发明概要
本发明将健康人受试者的tau特异性免疫应答用于分离天然抗tau特异性人单克隆抗体。具体地讲，根据本发明进行的实验在从无神经退行性tau蛋白病症状的健康人受试者库分离单克隆tau特异性抗体中取得了成功。
因此，本发明涉及人抗体、抗原结合片段以及类似的抗原结合分子，其能够特异性识别tau。所谓“特异性识别tau”、“对tau具有特异性的抗体”和“抗tau抗体”具体、一般并且总体来讲是指tau的天然形式或聚集的或病理修饰的tau亚型的抗体。本文提供了对全长、病理磷酸化和聚集形式具有选择性的人抗体。
在本发明的特定实施方案中，人抗体或其抗原结合片段显示出了抗体的免疫结合特征，其特征在于可变区VH和/或VL，如图1中所示出。
抗体的抗原结合片段可以是单链Fv片段、F(ab')片段、F(ab)片段和F(ab')2片段或任何其他抗原结合片段。在下文的具体实施方案中，抗体或其片段为人IgG同种型抗体。作为另外一种选择，抗体为嵌合的人-鼠或鼠源化抗体，后者尤其可用于动物中的诊断方法和研究。
此外，本发明涉及包含本发明的抗体或其活性片段或激动剂和同源分子、或者其拮抗剂的组合物，并且涉及在tau蛋白病的预防、诊断或治疗中使用此类组合物的免疫治疗和免疫诊断方法，其中将有效量的该组合物施用至需要其的患者。
当然，本发明分别扩展到永生化的人B记忆淋巴细胞和B细胞，它们产生如下所定义具有显著和独特特征的抗体。
本发明还涉及编码至少本发明抗体的免疫球蛋白链的可变区的多核苷酸。在一个实施方案中，所述可变区包含可变区的VH和/或VL的至少一个互补决定区(CDR)，如图1中所示出。
因此，本发明还涵盖包含所述多核苷酸的载体和转化了该载体的宿主细胞，以及将它们用于制备tau特异性抗体和等同的结合分子的用途。重组制备抗体及其模拟物的方式和方法，以及筛选竞争性结合分子的方法是本领域已知的，所述竞争性结合分子可以是或可以不是抗体。然而，如本文所述，尤其是针对人的治疗应用，在所述抗体的应用基本上不含指向此类抗体或者观察到嵌合和甚至人源化抗体的免疫应答的意义上，本发明的抗体是人抗体。
此外，本文公开了可用于鉴定样本中的tau的组合物和方法。所公开的抗tau抗体可用于筛选人血液、CSF和尿液样本中tau的存在，例如通过使用基于ELISA或表面适应测定。本文所公开的方法和组合物可有助于神经退行性tau蛋白病，例如阿尔茨海默氏病的诊断，并且可用于监控疾病进展和治疗效能。
因此，本发明的特定目的是提供治疗、诊断或预防神经退行性tau蛋白病的方法，所述神经退行性tau蛋白病例如阿尔茨海默氏病、肌萎缩性侧索硬化/帕金森–痴呆综合征、嗜银颗粒痴呆、英式淀粉样血管病、脑淀粉样血管病、皮质基底退化、克罗伊茨菲尔德-雅各布二氏病、拳击员痴呆、伴有钙质沉着的弥漫性神经原纤维缠结病、唐氏综合征、额颞痴呆、17号染色体相关的伴有帕金森症的额颞痴呆、额颞叶退化、杰茨曼-斯脱司勒-史茵克病、哈勒沃登-施帕茨病、包涵体肌炎、多系统萎缩、肌强直性营养不良、C型尼曼-皮克病、伴有神经原纤维缠结的非关岛运动神经元病、皮克氏病、脑炎后帕金森症、朊病毒蛋白脑淀粉样血管病、进行性皮质下胶质增生、进行性核上性麻痹、亚急性硬化全脑炎、缠结痴呆、多发性脑梗死性痴呆和缺血性中风。该方法包括给受试者施用有效浓度的人抗体或抗体衍生物，其中该抗体靶向tau。
从以下发明详述和实施例，本发明的其他实施方案将显而易见。
附图简述
图1：人抗体NI-105-4E4(A)、NI-105-24B2(B)和NI-105.4A3(C)的可变区，即重链和λ轻链的氨基酸和核苷酸序列。标示了框架(FR)和互补决定区(CDR)，其中CDR以下划线标示。由于克隆策略，重链和轻链N-末端的氨基酸序列可能包含FR1中的引物诱导改变，然而其基本上不影响抗体的生物活性。为了提供共有人抗体，将原始克隆的核苷酸和氨基酸序列与数据库中相关的人种系可变区序列比对并且根据其调整；参见，例如由MRC Centrefor Protein Engineering(Cambridge,UK)主办的Vbase(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)。由于PCR引物而被视为可能偏离共有种系序列，因此在氨基酸序列中被置换的那些氨基酸以黑体标示。
图2：ELISA板涂覆有1μg/ml的重组人tau（亚型hTau40），并且与标示浓度的NI-105.4E4抗体孵育。重组人来源抗体NI-105.4E4以2nM EC50的高亲和力结合重组tau。
图3：PHFTau和重组hTau40通过梯度SDS-PAGE解析，然后进行蛋白质印迹分析。将印迹与一抗NI-105.4E4（人）或小鼠单克隆Tau12抗体孵育，然后与HRP偶联的二抗孵育。重组人tau抗体NI-105.4E4结合重组hTau40以及通过蛋白质印迹分析从AD大脑提取的病理修饰的tau亚型(PHFTau)。
图4：hTau40上NI-105.4E4结合表位的标绘。PepSpot(JPT)技术：当仅与检测抗体(B)进行比较时，两组相邻肽点（肽83、84和85；肽96和97）由NI105.4E4（A和A'）特异性识别。HRP偶联山羊抗人IgG检测抗体单独产生单点（肽50）上的强信号，但不检测肽83、84、85、96和97。丙氨酸扫描：(C)点#35-50和#51-68包含原始肽（点#35和#51）及其取代变体（#36-50和#52-68）（D和E）原始和取代肽（#35-50和#51-68）的氨基酸序列。丙氨酸扫描暗示残基V339、E342、D387、E391和K395有助于NI-105.4E4结合。
图5：证实人重组NI-105.4E4抗体特异性结合与hTau40的第333-346位氨基酸对应的tau肽。
图6：NI-105.4E4结合AD大脑和表达人TauP301L的小鼠中的神经原纤维缠结(NFT)、营养不良性神经突和神经纤维网线。NI105-4E4染色识别AD大脑中的NFT和神经纤维网线(A)，未显著结合健康对照受试者大脑中的tau(B)。在TauP301L转基因小鼠(E-I)中，NI-105.4E4牢固结合类似于NFT的病理tau（E、F和H）、神经纤维网线（E和G）以及营养不良性神经突（E和H）。此外，NI-105.4E4在预缠结阶段还识别tau聚集体(I)。NI-105.4E4结合表达含瑞典和北极突变的人APP和TauP301L的转基因小鼠中的NFT、营养不良性神经突和神经纤维网线；箭头标示了β-淀粉样蛋白斑，周围是通过NI-105.4E4识别的营养不良性神经突(J)。只有二抗不会得到人AD(C)和健康对照(D)二者中的信号。
图7：ELISA板涂覆有3μg/ml的重组人tau（hTau40），并且与标示浓度的NI-105.24B2抗体孵育。重组人来源抗体NI-105.24B2以6nM EC50的高亲和力结合hTau40。
图8：PHFTau和重组hTau40通过梯度SDS-PAGE解析，然后进行蛋白质印迹分析。将印迹与一抗NI-105.24B2（人），然后与HRP偶联抗人IgG孵育过夜。重组人tau抗体NI-105.24B2结合重组hTau40以及通过蛋白质印迹分析从AD大脑提取的病理修饰的tau亚型(PHFTau)。
图9：组织淀粉样蛋白斑免疫反应性(TAPIR)测定–将从老年受试者分离的血清加入组织AD大脑切片。作为比较，用可商购获得的AT100抗磷酸化tau抗体进行免疫组织染色。当受到分离的血清的处理时，在用AT100抗磷酸化tau抗体染色的对照中神经原纤维缠结被染色，显示神经原纤维缠结-反应性抗体物质存在于所测试的血清中。
图10：重组人抗体NI-105.4A3通过ELISA特异性结合人tau。未观察到结合BSA。
图11：示出了NI-105.4E4和NI-105.4A3表位和常用的可商购获得的小鼠单克隆tau抗体的表位。人抗体NI-105.4E4靶向包含两条直链多肽的独特表位，其中一条位于tau的微管结合域(R4)中，其掩蔽于生理微管相关tau中。Tau-12(Covance,California,U.S.A.)、HT7、AT8、AT180(Thermo Scientific,U.S.A.)；PHF1(Lewis等,Science293(2001),1487-1491)。
图12：ELISA板涂覆有重组人tau(hTau40,1μg/ml)、PHFTau(1:100)和对照制剂(1:100)，并且与标示浓度的NI-105.4A3孵育。4A3以1.4nM EC50结合rTau，以1.2nM EC50结合PHFTau。
图13：hTau40上NI-105.4A3结合表位的标绘。(A)所用的四个重叠hTau40域（域I(AA1-158)、域II(AA136-258)、域III(AA235-373)和域IV(AA355-441)）的示意图。(B)NI-105.4A3只结合tau域I和全长hTau40多肽。(C)蛋白质印迹证实NI-105.4A3特异性结合tau域I。
图14：用PepSpot(JPT)技术(A)和丙氨酸扫描（B和C）标绘的NI-105.4A3表位。
图15：ch4E4与重组tau的变体结合(ELISA)。
图16：在腹膜内施用30mg/kg4E4或4A3人抗tau抗体后，小鼠血浆中的人IgG水平。
图17：在腹膜内施用30mg/kg4E4或4A3人抗tau抗体后，小鼠大脑匀浆物中的人IgG水平。
发明详述
I.定义
神经退行性tau蛋白病是具有共同的病理性损伤的不同组神经退行性疾病，所述损伤由异常纤维的细胞内聚集体组成，所述异常纤维主要由神经元和/或胶质细胞中的病理超磷酸化tau组成。Tau蛋白病的临床特征为异质性，并且其特征在于痴呆和/或运动区综合征。丝状tau包涵体的进行性积累可导致神经元和胶质退化，以及其他沉积，如阿尔茨海默氏病中的β-淀粉样蛋白或作为单独的病原性实体，如家族型17号染色体相关的伴有帕金森症的额颞痴呆(FTDP-17)相关联的tau基因突变所示出。由于其临床表现的异质性，可提供tau蛋白病的可能不完全列表，其包括阿尔茨海默氏病、肌萎缩性侧索硬化/帕金森–痴呆综合征、嗜银颗粒痴呆、英式淀粉样血管病、脑淀粉样血管病、皮质基底退化、克罗伊茨菲尔德-雅各布二氏病、拳击员痴呆、伴有钙质沉着的弥漫性神经原纤维缠结病、唐氏综合征、额颞痴呆、17号染色体相关的伴有帕金森症的额颞痴呆、额颞叶退化、杰茨曼-斯脱司勒-史茵克病、哈勒沃登-施帕茨病、包涵体肌炎、多系统萎缩、肌强直性营养不良、C型尼曼-皮克病、伴有神经原纤维缠结的非关岛运动神经元病、皮克氏病、脑炎后帕金森症、朊病毒蛋白脑淀粉样血管病、进行性皮质下胶质增生、进行性核上性麻痹、亚急性硬化全脑炎、缠结痴呆、多发性脑梗死性痴呆和缺血性中风，参见综述如Lee等,Annu.Rev.Neurosci.24(2001),1121-1159（其中表1编写了tau蛋白病的独特成员）或Sergeant等,Bioch.Biophy.Acta1739(2005),179–97（其中列表在图2中）。
在本说明书中，术语“tau”可互换使用，具体地讲是指tau的天然单体形式。术语“tau”一般也用于识别tau的其他构象异构体，例如，tau的寡聚物或聚集体。术语“tau”也用于统称tau的所有类型和形式。由于选择性剪接，人的大脑中存在6种tau亚型。这些亚型的蛋白质序列为：
352个氨基酸的亚型胎儿-tau
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381个氨基酸的亚型Tau-B
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410个氨基酸的亚型Tau-C
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383个氨基酸的亚型Tau-D
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412个氨基酸的亚型Tau-E
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441个氨基酸的亚型Tau-F
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“野生型”tau氨基酸序列以441个氨基酸的亚型Tau-F(SEQ ID NO:6)表示，也称为“hTau40”、“TauF”、“Tau-4”或“全长tau”。Tau的氨基酸序列可从文献和相关的数据库检索；参见Goedert等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA85(1988),4051-4055、Goedert等,EMBO J.8(1989),393-399、Goedert等,EMBO J.9(1990),4225-4230和基因库UniProtKB/swissprot：基因座TAU_HUMAN，登录号P10636-2（胎儿-tau）和P10636-4至-8（亚型B至F）。
Tau蛋白的另一个显著特征是磷酸化，其发生在79个可能的丝氨酸(Ser)和苏氨酸(Thr)磷酸化位点中的约30个上。在大脑发育期间Tau是高度磷酸化的。磷酸化的程度在成年时下降。一些磷酸化位点位于tau的微管结合域内，并且显示tau磷酸化的增加会对微管的结合产生负调节。例如，Ser262和Ser396位于微管结合基序内或邻近，在异常成对螺旋纤维(PHF)的tau蛋白中是超磷酸化的，其中所述成对螺旋纤维是AD患者大脑中神经原纤维缠结(NFT)的主要组分。PHF是tau蛋白的丝状聚集体，它是异常超磷酸化的，并且可用特定的抗tau抗体染色，并且通过光学显微镜检测。其也适用于所谓的tau直纤维。PHF形成由两条纤维组成的缠绕带，该纤维相互缠绕，其中周期数为约80nm。这些病理特征通常称为“tau-蛋白病理症状”、“tau蛋白病理症状”或“tau相关病理症状”。关于tau蛋白病的神经病理特征的更详细的描述，参见Lee等,Annu.Rev.Neurosci.24(2001),1121-1159和Brain.Res.Rev.35(2001),266-286，它们的公开内容以引用方式并入本文。生理tau蛋白稳定神经元中的微管。病理磷酸化导致tau的异常定位和聚集，从而引起微管的去稳定化和细胞转运的破坏。聚集的tau在体外是具有神经毒性的(Khlistunova等,J.Biol.Chem.281(2006),1205-1214)。确切的神经毒性物质仍不清楚，然而，其借以导致神经元死亡的机制也不清楚。可观察到Tau的聚集体是多种tau蛋白病中神经原纤维缠结(NFT)的主要组分，例如阿尔茨海默氏病(AD)、额颞痴呆、核上性麻痹、皮克氏病、嗜银颗粒病(AGD)、皮质基底退化、FTDP-17、帕金森氏病、拳击员痴呆（综述参见Gendron和Petrucelli,Mol.Neurodegener.4:13(2009)）。除这些观察结果之外，还出现了即使缠结的形成不存在，tau介导的神经元死亡也可发生的证据。可溶性磷酸化tau物质存在于CSF中(Aluise等,Biochim.Biophys.Acta.1782(2008),549–558)。Tau聚集体可将错误折叠状态从细胞的外部转运至内部，并且在共培养的细胞之间转移(Frost等,J.Biol.Chem.284(2009),12845-12852)。
除参与神经退行性tau蛋白病之外，在缺血/再灌注期间和之后观察到的tau磷酸化的改变暗示tau在神经元损伤和神经血管疾病，例如缺血性中风的临床病理生理学中发挥重要作用(Zheng等,J.Cell.Biochem.109(2010),26-29)。
本文所公开的人抗tau抗体特异性结合tau及其表位，以及tau及其表位的各种构象。例如，本文公开了特异性结合tau、全长tau、病理修饰的tau亚型和tau聚集体的抗体。如本文所用，所提及的“特异性结合”、“选择性结合”或“优选地结合”tau的抗体是指不与其他不相关蛋白结合的抗体。在一个实例中，本文所公开的tau抗体可结合tau或其表位，并且对于其他蛋白质未显示出大于约1.5倍背景的结合。“特异性结合”或“选择性结合”tau构象异构体的抗体是指不结合tau的所有构象，即，不结合至少一种其他tau构象异构体的抗体。例如，本文公开了可优选地结合AD组织中tau的聚集形式的抗体。由于本发明的人抗tau抗体从表现出tau特异性免疫应答的健康人受试者库分离，本发明的tau抗体也可称为“人自体抗体”，以强调那些抗体实际上由受试者表达，并且未从例如表达噬菌体文库的人免疫球蛋白分离，迄今为止其代表了一种常见的试图提供类人抗体的方法。
应当注意，术语“一个”或“一种”实体是指该实体的一个或多个，例如，“抗体”应理解为代表一个或多个抗体。因此，术语“一个”（或“一种”）、“一个或多个”和“至少一个”在本文中可互换使用。
如本文所用，术语“多肽”旨在涵盖单个“多肽”以及复数个“多肽”，并且是指由通过酰胺键（也称为肽键）直链键合的单体（氨基酸）组成的分子。术语“多肽”是指两个或更多个氨基酸的任何一条或多条链，并且不是指特定长度的产物。因此，肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白质”、“氨基酸链”或用于指两个或更多个氨基酸的一条或多条链的任何其他术语包括在“多肽”的定义内，并且术语“多肽”可代替任何这些术语，或与它们互换使用。
术语“多肽”也旨在指多肽的表达后修饰的产物，包括但不限于糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/封端基团衍生化、蛋白水解裂解或通过非天然存在的氨基酸的修饰。多肽可衍生自天然生物来源或通过重组技术制备，但不一定从指定的核酸序列翻译。它可以任何方式，包括化学合成制备。
本发明的多肽可以具有约3个或更多个、5个或更多个、10个或更多个、20个或更多个、25个或更多个、50个或更多个、75个或更多个、100个或更多个、200个或更多个、500个或更多个、1,000个或更多个或2,000个或更多个氨基酸的大小。多肽可具有确定的三维结构，虽然它们不一定具有此类结构。具有确定三维结构的多肽称为折叠的，并且不具有确定三维结构，但可采取多种不同构象的多肽称为未折叠的。如本文所用，术语糖蛋白是指键合至至少一个糖类部分的蛋白质，所述糖类部分通过氨基酸残基，如丝氨酸残基或天冬酰胺残基的含氧或含氮侧链连接至蛋白质。
所谓“分离的”多肽或其片段、变体或衍生物是指未处于其天然环境中的多肽。不需要特定水平的纯化。例如，分离的多肽可从其天然或自然环境移除。出于本发明的目的，在宿主细胞中表达的重组制备的多肽和蛋白质被视为分离的，也是通过任何合适的技术分离、分级或部分或基本上纯化的天然或重组多肽。
前述多肽的片段、衍生物、类似物或变体及其任何组合也包括在本发明的多肽内。当意指本发明的抗体或抗体多肽时，术语“片段”、“变体”、“衍生物”和“类似物”包括保持相应的天然结合分子、抗体或多肽的至少一些抗原结合特性的任何多肽。除本文别处所讨论的特定抗体片段之外，本发明的多肽片段包括蛋白水解片段以及缺失片段。本发明的抗体和抗体多肽的变体包括如上所述的片段，以及由于氨基酸置换、缺失或插入而具有改变的氨基酸序列的多肽。变体可以是天然存在的或非天然存在的。非天然存在的变体可使用本领域已知的诱变技术制备。变体多肽可包含保守的或非保守的氨基酸置换、缺失或添加。Tau特异性结合分子的衍生物，如，本发明的抗体和抗体多肽，是经过改变以表现出天然多肽中不存在的附加特征的多肽。实例包括融合蛋白。变体多肽在本文中也可称为“多肽类似物”。如本文所用，结合分子或其片段、抗体或抗体多肽的“衍生物”是指具有一个或多个通过官能侧基的反应而化学衍生的残基的受试多肽。包含二十个标准氨基酸中的一个或多个天然存在的氨基酸衍生物的那些肽也包括在“衍生物”内。例如，4-羟脯氨酸可被脯氨酸置换；5-羟赖氨酸可被赖氨酸置换；3-甲基组氨酸可被组氨酸置换；高丝氨酸可被丝氨酸置换；以及鸟氨酸可被赖氨酸置换。
术语“多核苷酸”旨在涵盖单个核酸以及复数个核酸，并且是指分离的核酸分子或构建体，例如，信使RNA(mRNA)或质粒DNA(pDNA)。多核苷酸可包含常规的磷酸二酯键或非常规键（例如，存在于肽核酸(PNA)中的酰胺键）。术语“核酸”是指任何一个或多个核酸片段，例如，存在于多核苷酸中的DNA或RNA片段。所谓“分离的”核酸或多核苷酸意指从其天然环境中移除的核酸分子，DNA或RNA。例如，出于本发明的目的，包含于载体中的编码抗体的重组多核苷酸被视为分离的。分离的多核苷酸的另外实例包括保持于异源宿主细胞中的重组多核苷酸或溶液中纯化的（部分纯化的或基本上纯化的）多核苷酸。分离的RNA分子包括本发明多核苷酸的体内或体外RNA转录物。根据本发明的分离的多核苷酸或核酸还包括此类合成制备的分子。此外，多核苷酸或核酸可以是或可以包含调控元件例如启动子、核糖体结合位点或转录终止子。
如本文所用，“编码区”是由翻译为氨基酸的密码子组成的一部分核酸。虽然“终止密码子”（TAG、TGA或TAA）未翻译为氨基酸，但可视为编码区的部分，但是任何侧翼序列，例如启动子、核糖体结合位点、转录终止子、内含子等不是编码区的部分。本发明的两个或更多个编码区可存在于单个多核苷酸构建体中，例如，单个载体上，或单独的多核苷酸构建体中，例如，单独的（不同的）载体上。此外，任何载体可包含单个编码区，或可包含两个或更多个编码区，例如，单个载体可单独地编码免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区。此外，本发明的载体、多核苷酸或核酸可编码异源编码区，其与编码结合分子、抗体或其片段、变体或衍生物的核酸融合或不融合。异源编码区包括但不限于专门元件或基序，例如分泌信号肽或异源功能域。
在某些实施方案中，多核苷酸或核酸为DNA。在DNA的情况下，包含编码多肽的核酸的多核苷酸通常可包括启动子和/或可操作地结合一个或多个编码区的其他转录或翻译调控元件。可操作地结合是当基因产物，如多肽的编码区结合一个或多个调控序列时，以这种方式将基因产物的表达置于调控序列的影响或调控下。如果启动子功能的诱导使编码所需基因产物的mRNA转录，以及如果两个DNA片段之间的连接的性质不干扰表达调控序列引导基因产物表达的能力，或干扰DNA模板转录的能力，则两个DNA片段（例如与其结合的多肽编码区和启动子）“可操作地结合”或“可操作地连接”。因此，如果启动子能够影响该核酸的转录，则启动子区可操作地结合编码多肽的核酸。启动子可以是仅在预定细胞中引导DNA大量转录的细胞特异性启动子。除启动子之外，其他转录调控元件，例如增强子、操纵子、阻遏物和转录终止信号能够可操作地结合多核苷酸，以引导细胞特异性转录。本文公开了合适的启动子和其他转录调控区。
多种转录调控区是本领域技术人员已知的。这些包括但不限于在脊椎动物细胞中发挥作用的转录调控区，例如但不限于来自巨细胞病毒（立即早期启动子，与内含子-A连接）、猿猴病毒40（早期启动子）和逆转录病毒（例如劳氏肉瘤病毒）的启动子和增强子片段。其他转录调控区包括来源于脊椎动物基因，例如肌动蛋白、热激蛋白、牛生长激素和兔β-珠蛋白的那些转录调控区，以及能够控制真核细胞中基因表达的其他序列。附加的合适转录调控区包括组织特异性启动子和增强子，以及淋巴因子诱导的启动子（例如，干扰素或白介素诱导的启动子）。
类似地，多种翻译调控元件是本领域普通技术人员已知的。这些翻译调控元件包括但不限于核糖体结合位点、翻译起始和终止密码子以及来源于小RNA病毒(picomavirus)的元件（尤其是内部核糖体进入位点或IRES，也称为CITE序列）。
在其他实施方案中，本发明的多核苷酸为RNA，例如以信使RNA(mRNA)的形式。
本发明的多核苷酸和核酸编码区可结合编码分泌或信号肽的附加编码区，所述分泌或信号肽引导本发明多核苷酸编码的多肽的分泌。根据信号假说，哺乳动物细胞分泌的蛋白质具有信号肽或分泌前导序列，一旦增长的蛋白质链跨过糙面内质网的输出启动，该信号肽或分泌前导序列即从成熟蛋白质切除。本领域的普通技术人员认识到脊椎动物细胞分泌的多肽一般具有与多肽的N-末端融合的信号肽，该信号肽从完整的或“全长”多肽切除，以产生多肽的分泌或“成熟”形式。在某些实施方案中，使用天然信号肽，例如，免疫球蛋白重链或轻链信号肽，或保持引导可操作地与其结合的多肽分泌的能力的序列的功能衍生物。作为另外一种选择，可使用异源哺乳动物信号肽或其功能衍生物。例如，野生型前导序列可被人组织型纤溶酶原激活剂(TPA)或小鼠β-葡糖醛酸酶的前导序列置换。
除非另外指明，术语“病症”和“疾病”在本文中可互换使用。
本发明的语境中使用的“结合分子”主要指抗体及其片段，但也可指结合tau的其他非抗体分子，包括但不限于激素、受体、配体、主要组织相容性复合体(MHC)分子、伴侣分子例如热激蛋白(HSP)以及细胞-细胞粘附分子例如钙粘着蛋白、整联蛋白、C-型凝集素和免疫球蛋白(Ig)超家族成员。因此，仅为了清楚起见而非限制本发明的范围，大部分以下实施方案针对抗体和类抗体分子讨论，其代表用于治疗和诊断剂开发的结合分子的具体实施方案。
术语“抗体”和“免疫球蛋白”在本文中可互换使用。抗体或免疫球蛋白是tau结合分子，其包含至少重链的可变域，并且通常包含至少重链和轻链的可变域。脊椎动物系统中免疫球蛋白基本结构是相对充分理解的；参见例如，Harlow等,Antibodies:A LaboratoryManual,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,第2版1988)。
如下面更详细地讨论，术语“免疫球蛋白”包括可在生物化学上识别的多种广泛多肽类。本领域的技术人员将理解重链分为gamma、mu、alpha、delta或epsilon（γ、μ、α、δ、ε），以及其中的一些亚类（例如，γ1-γ4）。正是所述链的性质确定抗体的“类”，其分别为IgG、IgM、IgA、IgG或IgE。免疫球蛋白亚类（同种型）例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1等很好地进行了表征，并且已知可赋予功能专门性。技术人员可根据本公开容易地辨识每个这些类和同种型的改进型，并且因此其在本发明的范围内。所有免疫球蛋白类清晰地在本发明的范围内，以下讨论通常涉及IgG类免疫球蛋白分子。关于IgG，标准免疫球蛋白分子包括分子量为大约23,000道尔顿的两种相同轻链多肽和分子量为53,000至70,000的两种相同重链多肽。四条链通常通过二硫键以"Y"构型键合，其中轻链从"Y"的开口处开始支撑重链，并且继续通过可变区。
轻链分为kappa或lambda（κ、λ）。每个重链类可与κ或λ轻链键合。一般来讲，当免疫球蛋白通过杂交瘤、B细胞或遗传工程的宿主细胞制备时，轻链和重链彼此共价键合，并且两条重链的“尾”部通过共价二硫键或非共价键彼此键合。在重链中，氨基酸序列从Y构型分叉端的N-末端延伸至每条链底部的C-末端。
轻链和重链均分为结构和功能同源区。术语“恒定”和“可变”在功能上使用。在这点上，应当理解，轻链(VL)和重链(VH)部分的可变域均确定了抗原识别和特异性。相反，轻链(CL)和重链（CH1、CH2或CH3）的恒定域赋予重要生物学特性，例如分泌、经胎盘流动性、Fc受体结合、补体结合等。按照惯例，恒定区域的编号随着它们远离抗体的抗原结合位点或氨基末端而增加。N-末端部分为可变区，并且C-末端部分为恒定区；CH3和CL域实际上分别包含重链和轻链的羧基末端。
如上所述，可变区允许抗体选择性识别并且特异性结合抗原上的表位。也就是说，抗体的VL域和VH域或互补决定区(CDR)的子集组合形成限定三维抗原结合位点的可变区。该抗体四级结构形成存在于Y的每个臂末端的抗原结合位点。更具体地讲，抗原结合位点由每个VH和VL链上的三个CDR限定。包含足以特异性结合tau的结构的任何抗体或免疫球蛋白片段在本文中可互换地表示为“结合片段”或“免疫特异性片段”。
在天然存在的抗体中，抗体包含六个高可变区，有时称为存在于每个抗原结合域中的“互补决定区”或“CDR”，它们是短的、非邻接氨基酸序列，该序列随着抗体在水性环境中呈现其三维构型而特异性定位形成抗原结合域。“CDR”通过四个相对保守的“框架”区或“FR”侧接，它们显示出较少的分子间变异。框架区主要采取β-折叠构象，并且CDR形成环，所述环连接β-折叠结构，并且在一些情况下形成β-折叠结构的部分。因此，框架区起到形成支架的作用，所述支架使CDR通过链间、非共价相互作用以正确的取向定位。通过定位的CDR形成的抗原结合域限定了与免疫反应性抗原上的表位互补的表面。该互补表面促进了抗体与其同源表位的非共价结合。本领域普通技术人员可容易地辨识分别包含CDR和框架区的氨基酸的任何给定重链或轻链可变区，因为它们是精确定义的；参见，"Sequences ofProteins of Immunological Interest,"Kabat,E.,等,U.S.Department of Health andHuman Services,(1983)；和Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.,196(1987),901-917，这些文献全文以引用方式并入本文。
在其中本领域中使用和/或接受两种或更多种术语定义的情况下，如本文所用的术语定义旨在包括所有这些含义，除非明确指明与此相反。具体实例为使用术语“互补决定区”("CDR")描述可见于重链和轻链多肽二者的可变区中的非邻接抗原结合位点。该特定区域在Kabat等,U.S.Dept.of Health and Human Services,"Sequences of Proteins ofImmunological Interest"(1983)和Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.,196(1987),901-917中有所描述，这些文献以引用方式并入本文，其中当彼此比较时，定义包括氨基酸残基的重叠和子集。然而，应用任何一个定义来指抗体或其变体的CDR意指在如本文所定义和使用的术语的范围内。涵盖上文引用的参考文献中的每个所定义的CDR的适当氨基酸残基在下面表1中作为比较示出。涵盖特定CDR的确切残基数量取决于CDR的序列和大小而变化。本领域的技术人员可常规地确定包含特定的高可变区或抗体可变区氨基酸序列给出的人IgG亚类抗体的CDR的残基。
表1：CDR定义1
Kabat Chothia
VH CDR1 31-35 26-32
VH CDR2 50-65 52-58
VH CDR3 95-102 95-102
VL CDR1 24-34 26-32
VL CDR2 50-56 50-52
VL CDR3 89-97 91-96
1表1中所有CDR定义的编号均根据Kabat等示出的编号规定（参见下文）。
Kabat等还定义了适用于任何抗体的可变域序列的编号系统。本领域的普通技术人员可将该“Kabat编号”系统明确地分配给任何可变域序列，而无需依赖除序列本身之外的任何实验数据。如本文所用，“Kabat编号”是指Kabat等,U.S.Dept.of Health and HumanServices,"Sequence of Proteins of Immunological Interest"(1983)中所示出的编号系统。除非另外指明，对本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物中具体氨基酸残基位置的编号的参考根据Kabat编号系统进行，然而这是理论上的，不能等同地适用于本发明的每个抗体。例如，取决于第一CDR的位置，以下CDR可向任何一个方向转移。
本发明的抗体或其抗原结合片段、免疫特异性片段、变体或衍生物包括，但不限于多克隆、单克隆、多特异性、人、人源化、灵长动物源化、鼠源化或嵌合抗体、单链抗体、表位结合片段，例如，Fab、Fab'和F(ab')2、Fd、Fvs、单链Fvs(scFv)、单链抗体、二硫键Fvs(sdFv)、包含VL或VH域中的任何一者的片段、由Fab表达文库制备的片段以及抗独特型（抗-Id）抗体（包括例如，本文所公开的抗体的抗-Id抗体）。ScFv分子是本领域已知的，并且在例如美国专利5,892,019中有所描述。本发明的免疫球蛋白或抗体分子可为免疫球蛋白分子的任何类型（例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY）、类（例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2）或亚类。
在一个实施方案中，本发明的抗体不是具有五价结构的IgM或其衍生物。具体地讲，在本发明的具体应用中，尤其是治疗应用中，IgM比IgG和其他二价抗体或相应的结合分子用途更小，因为IgM由于其五价结构以及缺乏亲和力成熟，通常显示出非特异性交叉反应性和非常低的亲和力。
在特定的实施方案中，本发明的抗体不是多克隆抗体，即，其基本上由一种特定抗体物质组成，而不是作为从血浆免疫球蛋白样本获得的混合物。
包括单链抗体的抗体片段可包含单独的或与以下的整体或一部分组合的可变区：铰链区CH1、CH2和CH3域。本发明还包括tau结合片段，其也包含具有铰链区CH1、CH2和CH3域的可变区的任何组合。本发明的抗体或其免疫特异性片段可来自任何动物来源，包括禽类和哺乳动物。在一个实施方案中，抗体为人、鼠、驴、兔、山羊、豚鼠、骆驼、美洲驼、马或鸡抗体。在另一个实施方案中，可变区可以是软骨鱼来源的（例如，来自鲨鱼）。
在一个方面，本发明的抗体是从人分离的人单克隆抗体。任选地，人抗体的框架区根据数据库中相关的人种系可变区序列进行比对和采用；参见例如由MRC Centre forProtein Engineering(Cambridge,UK)主办的Vbase(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)。例如，被视为可能偏离真实种系序列的氨基酸可能由于在克隆过程中并入的结合PCR引物序列。与人工制备的类人抗体，例如来自噬菌体展示的抗体文库或异种小鼠的单链抗体片段(scFvs)相比，本发明的人单克隆抗体的特征在于(i)使用人免疫应答而不是动物替代物获得，即抗体响应人体中处于其相关构象的天然tau而产生，(ii)已保护个体或至少对于tau的存在是显著的，以及(iii)由于抗体是人来源的，对自体抗原的交叉反应性风险减至最小。因此，根据本发明，术语“人单克隆抗体”、“人单克隆自身抗体”、“人抗体”等用于表示人来源的tau结合分子，即从人细胞例如B细胞或其杂交瘤分离，或其cDNA从人细胞例如人记忆B细胞的mRNA直接克隆。人抗体仍然是“人”的，即使抗体中发生了例如改善结合特征的氨基酸置换。
来源于人免疫球蛋白文库或来自对于一种或多种人免疫球蛋白是转基因的，并且不表达内源免疫球蛋白的动物的抗体，如下文以及例如Kucherlapati等的美国专利号5,939,598所述是指类人抗体，以便将它们与本发明的真实人抗体区别。
例如，类人抗体，如通常从噬菌体展示分离的合成和半合成抗体的重链和轻链的配对不一定反映原始人B细胞中出现的原始配对。因此，从现有技术常用的重组表达文库获得的Fab和scFv片段可视为人工的，其具有对免疫原性和稳定性的所有可能相关影响。
与此相反，本发明提供来自所选人受试者的分离亲和力成熟抗体，其特征在于治疗效用和对人的耐受性。
如本文所用，术语“鼠源化抗体”或“鼠源化免疫球蛋白”是指包含一个或多个来自本发明的人抗体的CDR和包含基于小鼠抗体序列的氨基酸置换和/或缺失和/或插入的人框架区的抗体。提供CDR的人免疫球蛋白称为“亲本”或“受体”，并且提供框架改变的小鼠抗体称为“供体”。恒定区不一定存在，但如果存在，则通常基本上与小鼠抗体恒定区具有同一性，即至少约85至90%、约95%、约96%、约97%、约98%、约99%或更高的同一性。因此，在一些实施方案中，全长鼠源化人重链或轻链免疫球蛋白包含小鼠恒定区、人CDR以及具有多个“鼠源化”氨基酸置换的基本上人框架。通常，“鼠源化抗体”是包含鼠源化可变轻链和/或鼠源化可变重链的抗体。例如，鼠源化抗体不涵盖典型的嵌合抗体，例如，因为嵌合抗体的整个可变区为非小鼠的。通过“鼠源化”方法“鼠源化”的修饰抗体结合的抗原与提供CDR的亲本抗体所结合的相同，并且通常与亲本抗体相比在小鼠中的免疫原性更小。
如本文所用，术语“重链部分”包含来源于免疫球蛋白重链的氨基酸序列。包含重链部分的多肽包含CH1域、铰链（如上、中和/或下铰链区）域、CH2域、CH3域或其变体或片段中的至少一者。例如，用于本发明的结合多肽可包括含有CH1域的多肽链；含有CH1域、铰链域的至少一部分和CH2域的多肽链；含有CH1域和CH3域的多肽链；含有CH1域、铰链域的至少一部分和CH3域的多肽链或含有CH1域、铰链域的至少一部分、CH2域和CH3域的多肽链。在另一个实施方案中，本发明的多肽包括含有CH3域的多肽链。此外，适用于本发明的结合多肽可以缺乏CH2域（例如，CH2域的所有或部分）的至少一部分。如上面所示出，本领域的普通技术人员应当理解，可修饰这些域（例如，重链部分）以使得氨基酸序列不同于天然存在的免疫球蛋白分子。
在本文所公开的某些抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物中，多聚体一条多肽链的重链部分与多聚体第二条多肽链上的那些重链部分相同。作为另外一种选择，本发明含重链部分的单体是不相同的。例如，每个单体可包含不同的靶标结合位点，其形成例如双特异性抗体或双体抗体(diabody)。
在另一个实施方案中，本文所公开的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物由单条多肽链例如scFvs组成，并且在细胞内表达（胞内抗体），以用于可能的体内治疗和诊断应用。
适用于本文所公开的诊断和治疗方法的结合多肽的重链部分可来源于不同的免疫球蛋白分子。例如，多肽的重链部分可包含来源于IgG1分子的CH1域和来源于IgG3分子的铰链区。在另一个实例中，重链部分可包含部分来源于IgG1分子和部分来源于IgG3分子的铰链区。在另一个实例中，重链部分可包含部分来源于IgG1分子和部分来源于IgG4分子的嵌合铰链。
如本文所用，术语“轻链部分”包含来源于免疫球蛋白轻链的氨基酸序列。在一个实施方案中，轻链部分包含VL或CL域中的至少一者。
抗体的肽或多肽表位的最小大小被认为是约四至五个氨基酸。肽或多肽表位可包含至少七个、至少九个或介于至少约15个至约30个之间的氨基酸。由于CDR可识别处于其三级形式的抗原肽或多肽，包含表位的氨基酸不必是连续的，并且在一些情况下，可甚至不在同一条肽链上。在本发明中，本发明抗体识别的肽或多肽表位包含tau的至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、或介于约5个至约30个之间、介于约10个至约30个之间或介于约15个至约30个之间的连续或非连续氨基酸的序列。
所谓“特异性结合”或“特异性识别”在本文中可互换使用，通常意指结合分子，例如，抗体通过其抗原结合域结合表位，并且结合需要抗原结合域和表位之间的一些互补性。根据本定义，抗体被认为通过其抗原结合域结合表位时，比其结合随机、不相关的表位更容易“特异性结合”该表位。技术人员理解，抗体可特异性结合或特异性识别分离的多肽，所述多肽包含与非连续表位的直链部分对应的氨基酸残基，或由其组成。术语“特异性”在本文中用于确定某些抗体结合某些表位的相对亲和力。例如，对于给定的表位，抗体“A”被认为比抗体“B”具有更高的特异性，或据说抗体“A”可结合表位“C”，比结合相关的表位“D”具有更高的特异性。
当存在时，所有语法形式的术语“免疫结合特征”或抗体与抗原的其他结合特征是指抗体的特异性、亲和力、交叉反应性和其他结合特征。
所谓“优选地结合”意指结合分子，例如，抗体比结合相关、相似、同源或类似表位更容易地特异性结合表位。因此，“优选地结合”给定表位的抗体比结合相关表位更容易结合该表位，即使此类抗体可与相关表位交叉反应。
作为非限制性实例，如果结合分子例如抗体结合所述第一表位的解离常数(KD)小于抗体结合第二表位的KD，则其被视为优选地结合第一表位。在另一个非限制性实例中，如果抗体结合第一表位的亲和力小于抗体结合第二表位的KD至少一个数量级则其被视为优选地结合第一抗原。在另一个非限制性实例中，如果抗体结合第一表位的亲和力小于抗体结合第二表位的KD至少两个数量级则其被视为优选地结合第一表位。
在另一个非限制性实例中，如果结合分子例如抗体结合第一表位的解离速率(k(解离))小于抗体结合第二表位的k(解离)，则其被视为优选地结合第一表位。在另一个非限制性实例中，如果抗体结合第一表位的亲和力小于抗体结合第二表位的k(解离)至少一个数量级则其被视为优选地结合第一表位。在另一个非限制性实例中，如果抗体结合第一表位的亲和力小于抗体结合第二表位的k(解离)至少两个数量级则其被视为优选地结合第一表位。
本文所公开的结合分子，例如，抗体或抗原结合片段、变体或衍生物被认为结合tau或其片段或变体，其中解离速率(k(解离))小于或等于5×10-2秒-1、10-2秒-1、5×10-3秒-1或10-3秒-1。在一个实施方案中，本发明的抗体被认为结合tau或其片段或变体，其中解离速率(k(解离))小于或等于5×10-4秒-1、10-4秒-1、5×10-5秒-1或10-5秒-1、5×10-6秒-1、10-6秒-1、5×10-7秒-1或10-7秒-1。
本文所公开的结合分子，例如，抗体或抗原结合片段、变体或衍生物被认为结合tau或其片段或变体，其中结合速率(k(结合))大于或等于103M-1秒-1、5×103M-1秒-1、104M-1秒-1或5×104M-1秒-1。在一个实施方案中，本发明的抗体被认为结合tau或其片段或变体，其中结合速率(k(结合))大于或等于105M-1秒-1、5×105M-1秒-1、106M-1秒-1、5×106M-1秒-1或107M-1秒-1。
如果结合分子，例如，抗体优选地结合该表位达到阻断参考抗体与表位结合的程度，则其被认为竞争性抑制参考抗体与给定表位的结合。竞争性抑制可通过本领域已知的任何方法，例如，竞争ELISA测定来测定。抗体被认为竞争性抑制参考抗体与给定表位的结合至少90%、至少80%、至少70%、至少60%或至少50%。技术人员理解抗体与其表位的结合也可通过非抗体的结合分子竞争性抑制。例如，本文所述的抗体与tau，例如hTau40的特异性结合可通过微管进行竞争性抑制。
如本文所用，术语“亲和力”是指单个表位与结合分子，如免疫球蛋白分子的CDR结合强度的量度；参见例如，Harlow等,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory Press,第2版(1988)27-28页。如本文所用，术语“亲合力”是指免疫球蛋白群和抗原之间的复合物的总体稳定性，即免疫球蛋白混合物与抗原的功能结合强度；参见例如，Harlow,29-34页。亲合力与具有特定表位的单个免疫球蛋白分子群的亲和力，以及免疫球蛋白和抗原的效价有关。例如，二价单克隆抗体和具有高度重复表位结构，例如聚合物的抗原之间的相互作用将是高亲合力之一。抗体对抗原的亲和力或亲合力可使用任何合适的方法通过实验测定；参见例如，Berzofsky等,"Antibody-Antigen Interactions"于Fundamental Immunology,Paul,W.E.,Ed.,Raven Press New York,N Y(1984),Kuby,Janis Immunology,W.H.Freeman and Company New York,N Y(1992)以及本文所述的方法。测量抗体对抗原的亲和力的常规技术包括ELISA、RIA和表面等离子共振。如果测量在不同条件，如盐浓度、pH下进行，特定抗体-抗原相互作用的测量亲和力可变化。因此，亲和力和其他抗原结合参数，如KD、IC50的测量优选地用抗体和抗原的标准化溶液和标准化缓冲液进行。
本发明的结合分子，例如，抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物也可根据它们的交叉反应性来描述或指定。如本文所用，术语“交叉反应性”是指对一种抗原具有特异性的抗体与第二种抗原反应的能力；是两种不同抗原物质之间相关性的量度。因此，如果抗体结合表位而不是诱导其形成的抗原，则抗体是交叉反应的。交叉反应的表位通常包含多种与诱导表位相同的互补结构特征，并且在一些情况下，实际上比原始物更适合。
例如，某些抗体具有一定程度的交叉反应性，因为它们结合相关，但不相同的表位，例如，与参考表位具有至少95%、至少90%、至少85%、至少80%、至少75%、至少70%、至少65%、至少60%、至少55%和至少50%同一性的表位（如使用本领域已知和本文所述的方法计算）。如果抗体不结合与参考表位具有小于95%、小于90%、小于85%、小于80%、小于75%、小于70%、小于65%、小于60%、小于55%以及小于50%同一性（如使用本领域已知和本文所述的方法计算）的表位，则被认为具有很少的交叉反应性或无交叉反应性。如果抗体不结合该表位的任何其他类似物、直系同源物或同系物，则被认为对某些表位具有“高度特异性”。
本发明的结合分子，例如，抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物也可根据它们对tau的结合亲和力来描述或指定。在一个实施方案中，结合亲和力包括解离常数或Kd小于5×10-2M、10-2M、5×10-3M、10-3M、5×10-4M、10-4M、5×10-5M、10-5M、5×10-6M、10-6M、5×10-7M、10-7M、5×10-8M、10-8M、5×10-9M、10-9M、5×10-10M、10-10M、5×10-11M、10-11M、5×10-12M、10- 12M、5×10-13M、10-13M、5×10-14M、10-14M、5×10-15M或10-15M的那些。
如前所述，各种免疫球蛋白类的恒定区的亚基结构和三维构型是熟知的。如本文所用，术语“VH域”包括免疫球蛋白重链的氨基末端可变域，并且术语“CH1域”包括免疫球蛋白重链的第一（最氨基末端）恒定区域。CH1域邻近VH域，并且是免疫球蛋白重链分子铰链区的氨基末端。
如本文所用，术语“CH2域”包括如从使用常规编号方案的抗体约第244位残基延伸至第360位残基的重链分子的部分（第244至360位残基，Kabat编号系统；和第231至340位残基，EU编号系统；参见Kabat EA等，出处同上）。CH2域是独特的，因为它不与其他域密切配对。相反地，两条N-键合的支链糖链介于完整天然IgG分子的两个CH2域之间。还记载了CH3域从CH2域延伸至IgG分子的C-末端，并且包含大约108个残基。
如本文所用，术语“铰链区”包括将CH1域连接至CH2域的重链分子的部分。该铰链区包含大约25个残基，并且是柔性的，因此允许两个N-末端抗原结合区独立地移动。铰链区可再分为三个不同的域：上、中和下铰链域；参见Roux等,J.Immunol.161(1998),4083。
如本文所用，术语“二硫键”包括在两个硫原子之间形成的共价键。氨基酸半胱氨酸包含可与第二硫醇基形成二硫键或桥的硫醇基。在大多数天然存在的IgG分子中，CH1和CL区通过二硫键连接，并且两条重链通过在于使用Kabat编号系统的第239和242位（第226或229位，EU编号系统）对应位置处的两个二硫键连接。
如本文所用，术语“连接”、“融合的”或“融合”可互换使用。这些术语是指两个或多个元件或组分通过任何方式，包括化学缀合或重组方式连接在一起。“框内融合”是指两个或更多个多核苷酸开放阅读框(ORF)以保持原始ORF的正确翻译阅读框的方式连接形成连续的长ORF。因此，重组融合蛋白是包含与原始ORF编码的多肽对应的两个或更多个片段的单一蛋白质（其片段在自然界中通常不会这样连接）。虽然因此使阅读框在整个融合片段中是连续的，但该片段可以在物理上或空间上通过例如框内接头序列分隔。例如，编码免疫球蛋白可变区CDR的多核苷酸可以在框内融合，但通过编码至少一种免疫球蛋白框架区或附加CDR区的多核苷酸分隔，只要“融合的”CDR作为连续多肽的部分共翻译。
如本文所用，术语“表达”是指基因产生生物化学物质，例如RNA或多肽的过程。该过程包括细胞内基因功能存在的任何表现，包括但不限于基因敲低以及瞬时表达和稳定表达二者。其包括但不限于基因转录为信使RNA(mRNA)、转运RNA(tRNA)、小发夹RNA(shRNA)、小分子干扰RNA(siRNA)或任何其他RNA产物，以及此类mRNA翻译成多肽。如果最终所需产物是生物化学物质，则表达包括该生物化学物质和任何前体的产生。基因的表达产生“基因产物”。如本文所用，基因产物可以是核酸，例如，基因的转录产生的信使RNA或从转录物翻译的多肽。本文所述的基因产物还包括具有转录后修饰如聚腺苷酸化的核酸，或具有翻译后修饰如甲基化、糖基化、添加脂质、结合其他蛋白质亚基、蛋白水解裂解等的多肽。
如本文所用，术语“样本”是指从受试者或患者获得的任何生物材料。在一个方面，样本可包括血液、脑脊髓液("CSF")或尿液。在其他方面，样本可包括全血、血浆、从血液样本富集的B细胞和培养的细胞（例如，来自受试者的B细胞）。样本也可包括活检组织或组织样本，包括神经组织。在其他方面，样本可包括全细胞和/或细胞的裂解物。血液样本可通过本领域已知的方法收集。在一个方面，沉淀可通过在4℃的200μl缓冲液（20mM Tris、pH.7.5、0.5%Nonidet、1mM EDTA、1mM PMSF、0.1M NaCl、IX Sigma蛋白酶抑制剂和IX Sigma磷酸酶抑制剂1和2）中涡旋来重悬。悬浮液可保持在冰上20分钟并且间歇涡旋。在约4℃、15,000×g下离心5分钟后，小份上清液可存储在约-70℃下。
如本文所用，术语“治疗”或“处理”是指治疗处理和预防或预防性措施二者，其中目的是防止或减缓（减轻）不期望的生理变化或病症，例如帕金森症的发展。有益的或所需的临床结果包括但不限于可检测的或不可检测的症状的减轻、疾病程度的减少、疾病状态的稳定（即，不恶化）、疾病进行的推迟或减缓、疾病状态的改善或减轻和缓解（部分或全部）。“治疗”也可意指与未接受治疗时的预期存活期相比，延长存活期。需要治疗的那些疾病包括已具有症状或病症的那些疾病，以及倾向于具有症状或病症的那些疾病，或其中已预防症状或病症表现的那些疾病。
所谓“受试者”或“个体”或“动物”或“患者”或“哺乳动物”意指其中诊断、预后、预防或治疗是所期望的任何受试者，尤其是哺乳动物受试者，例如，人患者。
II.抗体
本发明一般涉及人抗tau抗体及其抗原结合片段。在一个实施方案中，本发明的抗体显示出如对实施例中说明的抗体所概述的免疫结合特征和/或生物特性。根据本发明，tau特异性人单克隆抗体从健康人受试者库克隆。
在根据本发明进行的实验过程中，初步尝试不能克隆tau特异性抗体，但几乎永远得到假阳性克隆。为了避免该问题，对人记忆B细胞培养物的条件培养基中的抗体进行平行筛选与重组tau蛋白、从AD大脑提取的PHFTau、健康对照大脑提取物和牛血清白蛋白(BSA)的结合。只有对重组tau和/或PHFTau而非对照大脑提取物或BSA呈阳性的B-细胞培养物才经受抗体克隆。
分离特异性抗体的初步尝试集中于对tau具有高血浆结合活性的健康人受试者库，暗示tau抗体血浆循环的水平提高。意外的是，这些尝试不能制备tau特异性人记忆B细胞，并且本发明所述的抗体从未预先选择高度tau血浆反应性或对tau具有低血浆反应性的健康人受试者库分离。
由于该措施，可分离多个抗体。进一步分析所选的抗体的类和轻链亚类测定。然后将来自记忆B细胞培养物的所选相关抗体信息通过RT-PCR转录，克隆并且组合至表达载体，用于重组制备；参见所附实施例。人抗体在HEK293或CHO细胞中的重组表达，以及随后用蛋白质印迹进行它们对全长tau（图2、图7和图12）、其病理修饰形式的结合特异性的表征（图3和图8）以及它们对病理聚集tau的特异性结合首次确定了克隆了对tau具有高度特异性的人抗体，并且特异性识别了tau蛋白的病理修饰形式。
因此，本发明一般涉及分离的天然存在人单克隆抗tau抗体及其结合片段、衍生物和变体。在本发明的一个实施方案中，抗体能够特异性结合全长重组tau和/或在蛋白质印迹的变性条件下从AD大脑分离的病理聚集和/或磷酸化形式(PHFTau)；参见图3和图8。
在一个实施方案中，本发明涉及抗tau抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物，其中抗体特异性结合与参考抗体相同的tau表位，该参考抗体选自NI-105-4E4、NI-105-24B2或NI-105.4A3。此外，用示例性抗体NI-105-4E4进行的直接ELISA测定的初步结果揭示NI-105-4E4特异性识别tau的C-末端。所进行附加测定暗示NI-105.4E4识别包含两条直链序列的不连续表位：在R4微管结合域内的第一直链序列和在R4和C域之间的区域内的第二直链序列，如图11中所描述。在一个实施方案中，非连续表位或本发明提供的抗体识别的表位包含的直链多肽位于tau的微管结合域内，其掩蔽于生理微管相关tau中。表位标绘鉴定包含aa337-343VEVKSEK(SEQ ID NO:7)的人tau的微管结合域内的第一序列，该序列作为本发明的抗体NI-105.4E4识别的表位包含的独特直链多肽。附加的实验以及与可商购获得的AT180小鼠单克隆tau抗体的比较确定了NI-105-4E4特异性识别SEQ ID NO:7的独特表位。最有利地，本发明的抗体NI-105.4E4识别的SEQ ID NO:7表位在人大脑中存在的所有6个tau亚型中是100%保守的，其氨基酸序列以SEQ ID NO:1至6表示，并且在其他物种例如小鼠和同样大鼠中，为本发明抗体提供了相应动物模型中的附加研究工具。其他实验示出对应于SEQ ID NO:6的残基V339和E342的SEQ ID NO:7多肽的残基3和6有助于NI-105.4E4的结合。表位标绘还鉴定包含SEQ ID NO:6的aa387-397的人tau的微管结合域内的第二序列(SEQ ID NO:41)，该序列作为本发明的抗体NI-105.4E4识别的表位包含的独特直链多肽。对应于SEQ ID NO:6的残基D387、E391和K395的SEQ ID NO:41的残基1、5和9有助于NI-105.4E4的结合。
在一个实施方案中，本文所述的抗体在包含SEQ ID NO:7的氨基酸残基的表位处特异性结合tau。在另一个实施方案中，本文所述的抗体在包含SEQ ID:41的氨基酸残基的表位处特异性结合tau。在具体的实施方案中，本文所述的抗体在包含SEQ ID NO:7和SEQID NO:41的氨基酸残基的表位处特异性结合tau。在另一个实施方案中，本文所述的抗体在包含一个或多个选自SEQ ID NO:6的残基V339、E342、D387、E391和K395的氨基酸残基的表位处特异性结合tau。表位可包含选自SEQ ID NO:6的残基V339、E342、D387、E391和K395中的任何一个、任何两个、任何三个、任何四个或所有五个残基。在具体的实施方案中，tau为hTau40。
在一个实施方案中，本文所述的抗体在包含tau的微管结合域的表位处结合tau。在具体的实施方案中，本文所述的抗体在包含来自tau的R4区的氨基酸残基的表位处结合tau，如图11中所描述。在一个实施方案中，本文所述的抗体与微管竞争特异性结合tau。在另一个实施方案中，与微管不相关tau的抗体结合亲和力相比，本文所述抗体对微管相关tau的结合亲和力减少。在另一个实施方案中，本文所述的抗体不结合、或基本上不结合微管相关的tau。在具体的实施方案中，tau蛋白可以是天然tau蛋白或重组tau蛋白。在具体的实施方案中，tau为hTau40。
表位标绘还鉴定包含SEQ ID NO:6的aa35-49的人tau的序列(SEQ ID NO:42)，该序列作为本发明的抗体NI-105.4A3识别的独特直链表位。对应于SEQ ID NO:6的残基D40、A41和K44的SEQ ID NO:42的残基6、7和10有助于NI-105.4A3的结合。在一个实施方案中，本文所述的抗体在包含SEQ ID NO:42的氨基酸残基的表位处特异性结合tau。在另一个实施方案中，本文所述的抗体在包含一个或多个选自SEQ ID NO:6的残基D40、A41和K44的氨基酸残基的表位处特异性结合tau。表位可包含选自SEQ ID NO:6的残基D40、A41和K44中的任何一个、任何两个或全部任何三个残基。在具体的实施方案中，tau为hTau40。
此外，不旨在受初步实验观察的束缚，如实施例中所展示和图6中所示出，本发明的人单克隆NI-105-4E4抗tau抗体的特征在于特异性结合病理聚集的tau，并且基本上不识别大脑组织中生理形式的tau。在一个实施方案中，本发明的人抗tau抗体可特异性结合病理聚集的tau，并且基本上不结合大脑组织中生理形式的tau。此外，本发明的人抗tau抗体还可通过其在预缠结阶段识别大脑中神经原纤维缠结(NFT)、神经纤维网线和/或营养不良性神经突中的tau的能力来表征。因此，本发明提供具有结合特异性的人tau抗体组，因此其尤其适用于诊断和治疗目的。
在一个实施方案中，本发明的抗体表现出示例性NI-105-4E4抗体的结合特性，如实施例中所描述。此外或作为另外一种选择，本发明的抗tau抗体优选地识别病理聚集的tau，而不是生理形式，尤其是根据实施例4分析时。此外或作为另外一种选择，本发明的抗tau抗体结合引起人tau突变的疾病，尤其是实施例4中描述的那些疾病。在该情况中，结合特异性可以处于分别在图2、图12和图7中的示例性NI-105.4E4、NI-1054A3和NI-105.24B2抗体示出的范围内，即对于野生型tau具有约100pM至100nM的半最大有效浓度(EC50)，或约100pM至10nM的EC50。
因此，本发明的抗tau抗体优选地结合大脑中tau的病理修饰形式，如tau的病理聚集体，如实施例4中描述的免疫组织化学染色所示例。在另一个实施方案中，本发明的抗tau抗体优选地结合重组tau和tau的病理修饰形式二者，如在实施例2中通过蛋白质印迹示例。
本发明还涉及抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物，其中抗体包含与选自NI-105-4E4、NI-105-24B2和NI-105.4A3的抗体的抗原结合域相同的抗原结合域。
本发明还示例出多种此类结合分子，例如抗体及其结合片段，其特征在于在其可变区中包含例如结合域VH和/或VL可变区的至少一个互补决定区(CDR)，其包含图1中描述的氨基酸序列中的任何一者。编码上述鉴定的可变区的相应核苷酸序列在下表2中示出。VH和/或VL区的上述氨基酸序列的CDR示例性组如图1中所描述。然而，如下所讨论，本领域技术人员熟知以下事实：除此之外或作为另外一种选择，可使用CDR，在CDR2和CDR3的情况下，其氨基酸序列与图1中示出的那些氨基酸序列的不同之处为一个、两个、三个或甚至更多个氨基酸。
在一个实施方案中，本发明的抗体包含至少一个CDR，其包含选自SEQ ID NO:23-25、26-28、29-31、32-34、35-37和38-40的氨基酸序列或由其组成。在一个实施方案中，本发明的抗体包含一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR，其包含选自SEQ ID NO:23-25、26-28、29-31、32-34、35-37和38-40的氨基酸序列或由其组成。抗体可包含含有SEQ ID NO:23、29或35的VH CDR1、SEQ ID NO:24、30或36的VH CDR2或SEQ ID NO:25、31或37的VH CDR3的重链可变区。抗体可包含含有SEQ ID NO:26、32或38的VL CDR1、SEQ ID NO:27、33或39的VLCDR2或SEQ ID NO:28、34或40的VL CDR3的轻链可变区。抗体可包含含有SEQ ID NO:23、29或35的VH CDR1、SEQ ID NO:24、30或36的VH CDR2或SEQ ID NO:25、31或37的VH CDR3的重链可变区，并且还可包含含有SEQ ID NO:26、32或38的VL CDR1、SEQ ID NO:27、33或39的VLCDR2或SEQ ID NO:28、34或40的VL CDR3的轻链可变区。
在一个实施方案中，本发明的抗体可包含含有SEQ ID NO:23、29或35的VH CDR1、SEQ ID NO:24、30或36的VH CDR2和SEQ ID NO:25、31或37的VH CDR3的重链可变区。在一个实施方案中，本发明的抗体可包含含有SEQ ID NO:26、32或38的VL CDR1、SEQ ID NO:27、33或39的VL CDR2和SEQ ID NO:28、34或40的VL CDR3的轻链可变区。抗体还可包含含有SEQID NO:23、29或35的VH CDR1、SEQ ID NO:24、30或36的VH CDR2和SEQ ID NO:25、31或37的VH CDR3的重链可变区，并且还可包含含有SEQ ID NO:26、32或38的VL CDR1、SEQ ID NO:27、33或39的VL CDR2和SEQ ID NO:28、34或40的VL CDR3的轻链可变区。
在一个实施方案中，本发明的抗体可包含含有SEQ ID NO:23的VH CDR1、SEQ IDNO:24的VH CDR2和SEQ ID NO:25的VH CDR3的重链可变区。在一个实施方案中，本发明的抗体可包含含有SEQ ID NO:29的VH CDR1、SEQ ID NO:30的VH CDR2和SEQ ID NO:31的VHCDR3的重链可变区。在一个实施方案中，本发明的抗体可包含含有SEQ ID NO:35的VHCDR1、SEQ ID NO:36的VH CDR2和SEQ ID NO:37的VH CDR3的重链可变区。
在一个实施方案中，本发明的抗体可包含含有SEQ ID NO:26的VL CDR1、SEQ IDNO:27的VL CDR2和SEQ ID NO:28的VL CDR3的轻链可变区。在一个实施方案中，本发明的抗体可包含含有SEQ ID NO:32的VL CDR1、SEQ ID NO:33的VL CDR2和SEQ ID NO:34的VLCDR3的轻链可变区。在一个实施方案中，本发明的抗体可包含含有SEQ ID NO:38的VLCDR1、SEQ ID NO:39的VL CDR2和SEQ ID NO:40的VL CDR3的轻链可变区。
在一个实施方案中，本发明的抗体可包含含有SEQ ID NO:23的VH CDR1、SEQ IDNO:24的VH CDR2和SEQ ID NO:25的VH CDR3的重链可变区，并且还可包含含有SEQ ID NO:26的VL CDR1、SEQ ID NO:27的VL CDR2和SEQ ID NO:28的VL CDR3的轻链可变区。
在一个实施方案中，本发明的抗体可包含含有SEQ ID NO:29的VH CDR1、SEQ IDNO:30的VH CDR2和SEQ ID NO:31的VH CDR3的重链可变区，并且还可包含含有SEQ ID NO:32的VL CDR1、SEQ ID NO:33的VL CDR2和SEQ ID NO:34的VL CDR3的轻链可变区。
在一个实施方案中，本发明的抗体可包含含有SEQ ID NO:35的VH CDR1、SEQ IDNO:36的VH CDR2和SEQ ID NO:37的VH CDR3的重链可变区，并且还可包含含有SEQ ID NO:38的VL CDR1、SEQ ID NO:39的VL CDR2和SEQ ID NO:40的VL CDR3的轻链可变区。
在一个实施方案中，本发明的抗体是包含图1中所描述的VH和/或VL区的氨基酸序列的抗体的任何一者。在一个实施方案中，本发明的抗体的特征在于重链和轻链的同源配对的维持如人B-细胞中所呈现。
在一个实施方案中，本发明的抗体包含重链可变区(VH)，其包含选自SEQ ID NO:9、13、17和93的氨基酸序列或由其组成。在一个实施方案中，本发明的抗体包含轻链可变区(VL)，其包含选自SEQ ID NO:11、15和19的氨基酸序列或由其组成。在一个实施方案中，本发明的抗体包含重链可变区(VH)，其包含选自SEQ ID NO:9、13、17和93的氨基酸序列或由其组成，并且还包含轻链可变区(VL)，其包含选自SEQ ID NO:11、15和19的氨基酸序列或由其组成。在具体实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:9的VH和SEQ ID NO:11的VL；或SEQ IDNO:93的VH和SEQ ID NO:11的VL；SEQ ID NO:13的VH和SEQ ID NO:15的VL；或SEQ ID NO:17的VH和SEQ ID NO:19的VL。
作为另外一种选择，本发明的抗体是抗体或其抗原结合片段、衍生物或变体，其与具有VH和/或VL区的抗体的至少一者竞争结合tau，例如hTau40，如图1中所描述。在一个实施方案中，本发明的抗体与NI-105-4E4、NI-105-24B2或NI-105.4A3竞争特异性结合hTau40。那些抗体也可以是人，尤其是用于治疗应用的抗体。作为另外一种选择，抗体为鼠、鼠源化和嵌合的鼠-人抗体，它们尤其可用于动物中的诊断方法和研究。
在一个实施方案中，本发明的抗体由培养的单或寡克隆B-细胞的培养物和培养物的上清液提供，其包含通过筛选其中抗tau抗体的存在和亲和力的所述B-细胞而产生的抗体。筛选方法包括如下步骤：敏感组织淀粉样蛋白斑免疫反应性(TAPIR)测定，例如国际申请WO2004/095031中所描述，该申请的公开内容以引用方式并入本文；在大脑切片上筛选与PHFTau的结合；筛选来源于tau的肽的结合，所述tau具有以SEQ ID NO:6表示的氨基酸序列，其中磷酸基在所述序列的氨基酸Ser-202和Thr-205上、在氨基酸Thr-231上和/或在氨基酸Ser-396和Ser-404上；筛选重组人tau的结合，所述tau具有以SEQ ID NO:6表示的氨基酸序列，并且分离检测到结合的抗体或产生所述抗体的细胞。
如上所述，由于其在人免疫应答时产生，本发明的人单克隆抗体将识别尤其是病理相关的表位，以及在分别用于产生例如小鼠单克隆抗体和体外筛选噬菌体展示文库的免疫过程的情况下，不可获取或免疫原性低的表位。因此，保证本发明的人抗tau抗体的表位是独特的，并且不存在能够结合本发明的人单克隆抗体识别的表位的其他抗体是明智的；还可参见图11，其示出了抗体NI-105.4E4和NI-105.4A3的独特表位。因此，本发明通常还扩展至与本发明的人单克隆抗体竞争特异性结合tau的抗tau抗体和tau结合分子。本发明更具体地讲涉及抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物，其中抗体特异性结合与参考抗体相同的tau表位，该参考抗体选自NI-105.4E4、NI-105.24B2和NI-105.4A3。
抗体之间的竞争通过其中免疫球蛋白在测试时抑制参考抗体与共同抗原例如tau的特异性结合的测定来测定。多种类型的竞争结合测试法是已知的，例如：固相直接或间接放射性免疫测定(RIA)、固相直接或间接酶免疫测定(EIA)、夹心竞争测定；参见Stahli等,Methods in Enzymology9(1983),242-253；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA；参见Kirkland等,J.Immunol.137(1986),3614-3619和Cheung等,Virology176(1990),546-552；固相直接标记测定、固相直接标记夹心测定；参见Harlow和Lane,Antibodies,ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Press(1988)；使用I125标记进行的固相直接标记RIA；参见Morel等，Molec.Immunol.25(1988),7-15和Moldenhauer等,Scand.J.Immunol.32(1990),77-82。通常，此类测定涉及使用纯化的tau或其聚集体结合带有其二者之一的固体表面或细胞、未标记测试免疫球蛋白和标记参考免疫球蛋白，即本发明的人单克隆抗体。竞争性抑制在测试免疫球蛋白的存在下通过测定结合固体表面或细胞的标记的量测量。通常测试免疫球蛋白过量存在。在一个实施方案中，竞争性结合测定在附属实施例中对ELISA测定所述的条件下进行。通过竞争测定（竞争抗体）鉴定的抗体包括结合与参考抗体相同表位的抗体和结合邻近表位的抗体，该邻近表位足够靠近参考抗体结合的表位，以产生空间位阻。通常，当竞争性抗体过量存在时，将抑制参考抗体与共同抗原的特异性结合至少50%或75%。因此，本发明还涉及抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物，其中抗体竞争性抑制选自NI-105.4E4,NI-105.24B2或NI-105.4A3的参考抗体结合tau。
在另一个实施方案中，本发明提供分离的多肽，其包含免疫球蛋白重链可变区(VH)、基本上由其组成或由其组成，其中重链可变区的至少一个VH-CDR或重链可变区的至少两个VH-CDR与来自本文所公开的抗体的参考重链VH-CDR1、VH-CDR2或VH-CDR3氨基酸序列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性。作为另外一种选择，VH的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3区与来自本文所公开的抗体的参考重链VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3氨基酸序列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性。因此，根据该实施方案，本发明的重链可变区的具有与图1中示出的组相关的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3多肽序列。虽然图1示出了Kabat系统定义的VH-CDR，但其他CDR定义例如，Chothia系统定义的VH-CDR也包括在本发明中，并且可由本领域普通技术人员使用图1中示出的数据容易地鉴定。在一个实施方案中，参考VH CDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO:23、29或35；参考VH CDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO:24、30或36；并且参考VH CDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO:25、31或37。
在另一个实施方案中，本发明提供分离的多肽，其包含免疫球蛋白重链可变区(VH)、基本上由其组成或由其组成，其中VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3区具有与图1中示出的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3组具有同一性的多肽序列。在一个实施方案中，VH CDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO:23、29或35；VH CDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO:24、30或36；并且VHCDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO:25、31或37。
在另一个实施方案中，本发明提供分离的多肽，其包含免疫球蛋白重链可变区(VH)、基本上由其组成或由其组成，其中VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3区具有与图1中示出的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3组具有同一性的多肽序列，不同的是在任何一个VH-CDR中具有一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个氨基酸置换。在某些实施方案中，氨基酸置换是保守的。在一个实施方案中，VH CDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO:23、29或35；VH CDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO:24、30或36；并且VH CDR3的氨基酸序列为SEQ IDNO:25、31或37。
在另一个实施方案中，本发明提供分离的多肽，其包含免疫球蛋白轻链可变区(VL)、基本上由其组成或由其组成，其中轻链可变区的至少一个VL-CDR或轻链可变区的至少两个VL-CDR与来自本文所公开的抗体的参考轻链VL-CDR1、VL-CDR2或VL-CDR3氨基酸序列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性。作为另外一种选择，VL的VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3区与来自本文所公开的抗体的参考轻链VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3氨基酸序列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性。因此，根据该实施方案，本发明轻链可变区具有与图1中示出的多肽相关的VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3多肽序列。虽然图1示出了Kabat系统定义的VL-CDR，但其他CDR定义如Chothia系统定义的VL-CDR也包括在本发明中。在一个实施方案中，参考VL CDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO:26、32或38；参考VLCDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO:27、33或39；并且参考VL CDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO:28、34或40。
在另一个实施方案中，本发明提供分离的多肽，其包含免疫球蛋白轻链可变区(VL)、基本上由其组成或由其组成，其中VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3区具有与图1中示出的VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3组具有同一性的多肽序列。在一个实施方案中，VL CDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO:26、32或38；VL CDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO:27、33或39；并且VLCDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO:28、34或40。
在另一个实施方案中，本发明提供分离的多肽，其包含免疫球蛋白轻链可变区(VL)、基本上由其组成或由其组成，其中VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3区具有与图1中示出的VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3组具有同一性的多肽序列，不同的是在任何一个VL-CDR中具有一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个氨基酸置换。在某些实施方案中，氨基酸置换是保守的。在一个实施方案中，VL CDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO:26、32或38；VL CDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO:27、33或39；并且VL CDR3的氨基酸序列为SEQ IDNO:28、34或40。
还可以修饰免疫球蛋白或其编码cDNA。因此，在本发明方法的另一个实施方案中，包括制备嵌合抗体、鼠源化抗体、单链抗体、Fab-片段、双特异性抗体、融合抗体、标记抗体或任何一种这些抗体的类似物的任何一个步骤。相应的方法是本领域技术人员已知的，并且在例如Harlow和Lane"Antibodies,A Laboratory Manual",CSH Press,Cold SpringHarbor(1988)中有所描述。当所述抗体的衍生物通过噬菌体展示技术获得时，用于BIAcore系统的表面等离子共振可用于增加噬菌体抗体的效率，该噬菌体抗体结合与本文所述抗体中的任何一者相同的表位（Schier,Human Antibodies Hybridomas7(1996),97-105；Malmborg,J.Immunol.Methods183(1995),7-13）。嵌合抗体的制备例如在国际申请WO89/09622中有所描述。人源化抗体的制备方法在例如欧洲申请EP-A10239400和国际申请WO90/07861中有所描述。其他来源的根据本发明利用的抗体即所谓的异种抗体。制备异种抗体例如小鼠中的类人抗体的一般原则在例如国际申请WO91/10741、WO94/02602、WO96/34096和WO96/33735中有所描述。如上所讨论，本发明的抗体可以除完整抗体之外的多种形式存在；包括例如Fv、Fab和F(ab)2以及单链；参见例如国际申请WO88/09344。
本发明的抗体或其相应的免疫球蛋白链还可使用本领域已知的常规技术修饰，例如通过单独或组合使用氨基酸缺失、插入、置换、添加和/或重组和/或本领域已知的任何其他修饰。在组成免疫球蛋白链的氨基酸序列的DNA序列中引入此类修饰的方法是本领域技术人员熟知的；参见例如,Sambrook,Molecular Cloning A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory(1989)N.Y.和Ausubel,Current Protocols in MolecularBiology,Green Publishing Associates and Wiley Interscience,N.Y.(1994)。本发明抗体的修饰包括在一个或多个组分氨基酸处的化学和/或酶学衍生，包括侧链修饰、主链修饰以及N-和C-末端修饰，其包括乙酰化、羟基化、甲基化、酰胺化和糖类或脂质部分、辅因子等的连接。同样，本发明涵盖嵌合蛋白质的制备，其包括所述抗体或其氨基末端处融合至异源分子，例如羧基末端的免疫刺激配体的一些片段；相应的技术详情参见例如国际申请WO00/30680。
此外，本发明涵盖肽，其包括含有如上所述的结合分子，例如含有任何一个所述抗体可变区的CDR3区，尤其是重链的CDR3的那些肽，因为经常观察到重链CDR3(HCDR3)是具有更大程度的变异性并且主要参与抗原-抗体相互作用的区。此类肽可通过重组方式容易地合成或制备，以制备根据本发明使用的结合剂。此类方法是本领域普通技术人员熟知的。肽可以例如使用可商购获得的自动化肽合成仪合成。肽也可通过重组技术制备，该技术将表达肽的DNA掺入表达载体，并且用表达载体转化细胞以制备肽。
因此，本发明涉及任何结合分子，例如，取向本发明的人抗tau抗体并且显示出所述特性即特异性识别tau的抗体或其结合片段。此类抗体和结合分子可通过本文所述的ELISA和蛋白质印迹和免疫组织化学方法测试其结合特异性和亲和力，参见例如实施例。此外，根据本发明进行的后续实验的初步结果揭示，本发明的人抗tau抗体，尤其是抗体NI-105.4E4主要结合类似于患有阿尔茨海默氏病(AD)的患者的人大脑切片上存在的神经原纤维缠结(NFT)、神经纤维网线的病理聚集的tau。因此，在本发明特别优选的实施方案中，人抗体或其结合片段、衍生物或变体识别人AD大脑切片上的tau。此外，抗体NI-105.4E4差异结合tau病理形式的独特能力也可在过表达人tauP301L的转基因小鼠中示出。除已经提及的NFT和神经纤维网线之外，抗体NI-105.4E4还结合小鼠大脑切片营养不良性神经突，并且在预缠结阶段识别tau聚集体；参见实施例4和图6。
作为直接从永生化B细胞或B记忆细胞的培养物获得免疫球蛋白的另外一种选择，永生化细胞可用作重排重链和轻链基因座的来源，用于后续表达和/或遗传操作。重排抗体基因可从适当的mRNA逆转录以制备cDNA。如果需要，重链恒定区可与不同同种型的恒定区交换或完全消除。可连接可变区以编码单链Fv区。可连接多个Fv区以赋予可利用的超过一个靶标或嵌合重链和轻链组合的结合能力。一旦遗传物质可用，则如上所述的类似物设计是简单的，其保持了结合所需靶标的能力。克隆抗体可变区和制备重组抗体的方法是本领域技术人员已知的，并且在例如Gilliland等,Tissue Antigens47(1996),1-20；Doenecke等,Leukemia11(1997),1787-1792中有所描述。
一旦获得适当的遗传物质，并且如果需要，进行修饰以编码类似物，则编码序列，包括最小编码重链和轻链可变区的那些序列可插入包含于载体的表达系统，该载体可转染标准重组宿主细胞。可使用多种此类宿主细胞；然而，出于有效处理目的，可考虑哺乳动物细胞。用于该目的的典型的哺乳动物细胞系包括但不限于CHO细胞、HEK293细胞或NSO细胞。
然后，抗体或类似物的制备通过在适于宿主细胞生长和编码序列表达的培养条件下培养修饰的重组宿主来进行。然后通过将其从培养物分离来回收抗体。表达系统设计为包含信号肽，以使所得的抗体分泌至培养基；然而，细胞内制备也是可能的。
根据如上所述，本发明还涉及编码本发明抗体或等同结合分子的多核苷酸。在一个实施方案中，多核苷酸编码至少上述抗体的免疫球蛋白链的可变区。通常，多核苷酸编码的所述可变区包含所述抗体的可变区的VH和/或VL的至少一个互补决定区(CDR)。
本领域技术人员将容易地认识到具有上述可变域的抗体的可变域可用于构建所需特异性和生物学功能的其他多肽或抗体。因此，本发明还涵盖包含上述可变域的至少一个CDR的多肽和抗体，并且其有利地具有与所附实施例描述的抗体基本上相同或类似的结合特性。本领域技术人员知道，结合亲和力可通过制备CDR内或高可变环内的氨基酸置换来增强（Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.196(1987),901-917），所述高可变环如Kabat所定义与CDR部分重叠；参见例如Riechmann等，Nature332(1988),323-327。因此，本发明还涉及其中一个或多个所述CDR包含一个或多个或不超过两个氨基酸置换的抗体。在一个实施方案中，本发明的抗体在一条或两条其免疫球蛋白链中包含可变区的两个或所有三个CDR，如图1中所示出。
本领域普通技术人员已知，本发明的结合分子，例如，抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物可包含恒定区，其介导一个或多个效应子功能。例如，与抗体恒定区互补的C1组分的结合可活化补体系统。补体的活化对于细胞病原体的调理和裂解是重要的。补体的活化还刺激了炎症反应，并且也可涉及自体免疫超敏反应。此外，抗体通过Fc区结合多种细胞上的受体，其中抗体Fc区上的Fc受体结合位点结合细胞上的Fc受体(FcR)。存在多种对不同类抗体具有特异性的Fc受体，包括IgG（γ受体）、IgE（ε受体）、IgA（α受体）和IgM（μ受体）。抗体与细胞表面上Fc受体的结合引发了多种重要和不同的生物应答，包括抗体涂覆颗粒的吞噬和破裂、免疫复合物的清除、抗体涂覆靶标细胞被杀伤细胞的裂解（称为抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用或ADCC）、炎症介质的释放、免疫球蛋白制备的胎盘转移和控制。
因此，本发明的某些实施方案包括抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物，其中一个或多个恒定区域的至少一部分已缺失，或改变，以提供所需的生物化学特征，例如效应子功能减少、非共价二聚化的能力、定位于tau聚集和沉积位点能力的提高、血清半衰期减少或与具有大约相同免疫原性的整个未改变抗体相比血清半衰期增加。例如，适用于本文所述诊断和治疗方法的某些抗体是域缺失抗体，其包含类似于免疫球蛋白重链的多肽链，但缺乏一个或多个重链域的至少一部分。例如，在某些抗体中，修饰抗体恒定区的一个完整域将缺失，例如所有或部分CH2域将缺失。在其他实施方案中，适用于本文所述诊断和治疗方法的某些抗体具有恒定区，例如，IgG重链恒定区，其改变以消除糖基化，在本文别处称为非糖基化或“非糖化”抗体。此类“非糖化”抗体可通过酶法以及恒定区中的共有糖基化位点的工程化制备。不受理论的限制，据信“非糖化”抗体可具有改善的体内安全性和稳定性特征。制备具有所需效应子功能的非糖基化抗体的方法可见于例如国际申请WO2005/018572中，该专利全文以引用方式并入。
在本文所述的某些抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物中，可使Fc部分突变以使用本领域已知的技术减少效应子功能。例如，恒定区域的缺失或失活（通过点突变或其他方式）可减少流通修饰抗体的Fc受体结合，从而增加tau的定位。在其他情况中，恒定区修饰与本发明中度互补结合一致，并因此减少血清半衰期和偶联细胞毒素的非特异性结合是可能的。但恒定区的其他修饰可用于修饰二硫键或寡聚糖部分，从而允许由于抗原特异性或抗体适应性增加而使定位增强。修饰的所得到的生理特征、生物利用率和其他生物化学效应，例如tau定位、生物分布和血清半衰期可使用熟知的免疫学技术容易地测量和定量，而无需过度的实验。
在本文所述的某些抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物中，可使Fc部分突变或交换为供选择的蛋白序列，以增加抗体的细胞摄取，例如通过Fcγ受体、LRP或Thy1受体或通过“超级抗体技术”增强受体介导的抗体的内吞作用，所述“超级抗体技术”据说能够使抗体穿梭至活细胞而不伤害它们（Expert Opin.Biol.Ther.(2005),237-241)。例如，抗体结合区的融合蛋白和细胞表面受体的同源蛋白配体或具有结合tau以及细胞表面受体的特定序列的双或多特异性抗体的制备，可使用本领域已知的技术工程化。
在本文所述的某些抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物中，Fc部分可突变或交换为供选择的蛋白序列，或抗体可通过化学改性，以增加其血脑屏障渗透。
本发明抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的修饰形式可从整个前体或亲本抗体使用本领域已知的技术制备。示例性技术在本文中更详细地讨论。本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物可使用本领域已知的技术制备或制造。在某些实施方案中，抗体分子或其片段通过“重组制备”，即，使用重组DNA技术制备。制备抗体分子或其片段的示例性技术在本文别处更详细地讨论。
本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物还包括修饰的衍生物，例如，通过将任何类型的分子共价键合至抗体，以使得共价键合不会阻止抗体特异性结合其同源表位。例如但不限于，抗体衍生物包括修饰的抗体，例如，通过糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、用已知的保护/封端基团衍生、蛋白水解裂解、键合至细胞配体或其他蛋白质等修饰。任何多种化学修饰可通过已知的技术进行，包括但不限于特异性化学裂解、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成等。此外，衍生物可包含一个或多个非经典氨基酸。
在特定的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物不会引发待治疗动物例如人中的有毒免疫应答。在某些实施方案中，结合分子例如本发明的抗体或其抗原结合片段来源于患者，例如，人患者，并且随后用于与其来源相同的物种，例如人，以减轻或最小化有毒免疫应答的发生。
去免疫化也可用于降低抗体的免疫原性。如本文所用，术语“去免疫化”包括改变抗体以修饰T细胞表位；参见例如，国际申请WO98/52976和WO00/34317。例如，分析来自起始抗体的VH和VL序列，并且来自每个V区的人T细胞表位“图”显示出表位相对于互补决定区(CDR)的定位和序列内的其他关键残基。分析来自T细胞表位图的单个T细胞表位，以鉴定供选择的氨基酸置换，该置换对最终抗体活性的改变具有低风险。一系列供选择的VH和VL序列设计为包含氨基酸置换的组合，并且这些序列随后被掺入一系列结合多肽，例如，适用于本文所公开的诊断和治疗方法的tau特异性抗体或其免疫特异性片段，然后测试该多肽的功能。通常，制备和测试介于12和24个变体抗体。然后，将包含修饰的V和人C区的完整的重链和轻链基因克隆至表达载体，并且将所得的质粒引入细胞系，用于制备整个抗体。然后通过以适当的生物化学和生物学测定比较抗体，并且鉴定最佳变体。
单克隆抗体可使用本领域已知的多种技术制备，包括使用杂交瘤、重组和噬菌体展示技术或它们的组合。例如，单克隆抗体可使用杂交瘤技术，包括本领域已知和教导的那些技术制备，例如Harlow等,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory Press,第2版(1988)、Hammerling等,于:Monoclonal Antibodies and T-CellHybridomas Elsevier,N.Y.,563-681(1981)，所述参考文献全文以引用方式并入。如本文所用，术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术制备的抗体。术语“单克隆抗体”是指来源于单个克隆，包括任何真核、原核或噬菌体克隆，而不是其制备方法的抗体。因此，术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术制备的抗体。在某些实施方案中，本发明的抗体来源于人B细胞，该细胞通过用艾伯斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barr virus)转染永生化，如本文所述。
在熟知的杂交瘤方法中(Kohler等,Nature256(1975),495)，来自哺乳动物的寿命相对短的或非永生化的淋巴细胞，例如来源于本文所述的人受试者的B细胞与永生化肿瘤细胞系（例如，骨髓瘤细胞系）融合，从而产生永生化并且能够产生B细胞的基因编码抗体的杂交细胞或“杂交瘤”。所得的杂交体通过使用每个单品系选择、稀释和再生长隔离为单个遗传品系，所述单品系包含用于单个抗体形成的特定基因。它们产生抗所需抗原的均匀抗体，并且该抗体相对于其纯遗传血缘关系称为“单克隆”。
将这样制备的杂交瘤细胞接种于包含一种或多种抑制未融合亲本骨髓瘤细胞的生长或存活的物质的合适培养基中，并且培养。本领域的技术人员将会知道，用于杂交瘤形成、选择和生长的试剂、细胞系和培养基可从多个来源商购获得，并且建立了标准化方案。一般来讲，对其中杂交瘤细胞生长的培养基测定抗所需抗原的单克隆抗体的产生。杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性通过体外测试法，例如本文所述的免疫沉淀、放射性免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA)测定。在杂交瘤细胞鉴定为产生所需特异性、亲和力和/或活性的抗体后，克隆可通过有限稀释程序进行亚克隆，并且通过标准方法生长；参见例如，Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,AcademicPress,59-103页(1986)。还将认识到，由亚克隆分泌的单克隆抗体可从培养基、腹水液或血清通过常规纯化程序例如蛋白-A、羟基磷灰石色谱法、凝胶电泳、透析或亲和色谱法分离。
在另一个实施方案中，淋巴细胞可通过显微操作选择和可进行变基因分离。例如，外周血单核细胞可从免疫的或天然免疫哺乳动物，例如人分离，并且在体外培养约7天。可筛选培养物的达到筛选标准的特异性IgG。可分离来自阳性孔的细胞。单个产生Ig的B细胞可通过FACS或通过补体介导的溶血空斑测定鉴定它们来分离。产生Ig的B细胞可在试管中显微操作，并且VH和VL基因可使用例如RT-PCR进行扩增。VH和VL基因可克隆至抗体表达载体，并且转染至细胞（例如，真核或原核细胞）用于表达。
作为另外一种选择，可使用技术人员熟知的技术选择和培养产生抗体的细胞系。此类技术在多种实验室手册和原始文献出版物中有所描述。在这方面，适用于本发明如下所述的技术在Current Protocols in Immunology,Coligan等，编著,Green PublishingAssociates and Wiley-Interscience,John Wiley和Sons,New York(1991)中有所描述，该文献全文包括增补内容以引用方式并入本文。
识别特定表位的抗体片段可通过已知技术制备。例如，Fab和F(ab')2片段可通过重组或使用酶例如木瓜蛋白酶（制备Fab片段）或胃蛋白酶（制备F(ab')2片段）对免疫球蛋白分子进行蛋白水解裂解来制备。F(ab')2片段包含可变区、轻链恒定区和重链的CH1域。此类片段足以用于，例如涉及免疫球蛋白的免疫特异性部分偶联至检测试剂如放射性同位素的免疫诊断程序。
例如本文所述的人抗体对于人患者的治疗应用是特别期望的。本发明的人抗体例如从由于其年龄而被怀疑处于tau蛋白病例如阿尔茨海默氏病发展风险的健康人受试者，或患有病症但通常具有稳定病程的患者分离。然而，虽然期望老年健康和无症状受试者分别比年轻受试者更经常地产生保护性抗tau抗体是明智的，但后者也可用作获得本发明人抗体的来源。对于倾向于发展家族型tau蛋白病，但由于其免疫系统功能比老年成体更高效而保持无症状的年轻患者尤其如此。
在一个实施方案中，本发明的抗体包含抗体分子的至少一个重链或轻链CDR。在另一个实施方案中，本发明的抗体包含来自一个或多个抗体分子的至少两个CDR。在另一个实施方案中，本发明的抗体包含来自一个或多个抗体分子的至少三个CDR。在另一个实施方案中，本发明的抗体包含来自一个或多个抗体分子的至少四个CDR。在另一个实施方案中，本发明的抗体包含来自一个或多个抗体分子的至少五个CDR。在另一个实施方案中，本发明的抗体包含来自一个或多个抗体分子的至少六个CDR。本文描述了包含至少一个CDR的示例性抗体分子，该CDR可包含在受试者抗体中。
本发明的抗体可通过本领域的任何已知的抗体合成方法，尤其是通过本文所述的化学合成或通过重组表达技术制备。
在一个实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物包含合成恒定区，其中一个或多个域部分或全部缺失（“域缺失抗体”）。在某些实施方案中，相容性修饰抗体将包括域缺失构建体或变体，其中整个CH2域已被移除（ΔCH2构建体）。对于其他实施方案，短连接肽可代替缺失域以为可变区提供适应性和自由移动性。本领域的技术人员将会知道，此类构建体由于CH2域对抗体分解代谢率的调节特性是尤其优选的。域缺失构建体可使用编码IgG1人恒定域的载体获得，参见例如，国际申请WO02/060955和WO02/096948A2。该载体经工程改造以缺失CH2域，并且提供表达域缺失IgG1恒定区的合成载体。
在某些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物是小体(minibody)。小体可使用本领域所述的方法制备，参见例如，美国专利5,837,821或国际申请WO94/09817。
在一个实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物包含具有几个或甚至单个氨基酸的缺失或置换的免疫球蛋白重链，只要其允许单体亚基之间的结合。例如，CH2域的所选区中单个氨基酸的突变足以基本上减少Fc结合，并且从而增加tau定位。类似地，仅仅缺失控制待调节效应子功能（如补体结合）的一个或多个恒定区域的该部分可为所期望的。恒定区的此类部分缺失可改善抗体的所选特征（血清半衰期），而保留与受试者恒定区域完整性相关的其他所需功能。此外，如上所提及，本公开抗体的恒定区可通过增强所得构建体特征的一个或多个氨基酸的突变或置换合成。在这方面，破坏保守结合位点（如Fc结合）提供的活性，而基本上保持修饰抗体的构型和免疫原特征可为可能的。但其他实施方案包括将一个或多个氨基酸添加至恒定区，以增强所需特征，例如效应子功能或提供更多的细胞毒素或糖类结合。在此类实施方案中，插入或重复来源于所选恒定区域的特定序列可为所期望的。
本发明还提供包含本文所述抗体分子（例如，VH区和/或VL区）的变体（包括衍生物）、基本上由其组成或由其组成的抗体，其中抗体或其片段免疫特异性地结合tau。本领域技术人员已知的标准技术可用于在编码抗体的核苷酸序列中引入突变，包括但不限于导致氨基酸置换的定点诱变和PCR介导的诱变。在一个实施方案中，变体（包括衍生物）相对于参考VH区、VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL区、VL-CDR1、VL-CDR2或VL-CDR3编码小于50个氨基酸置换、小于40个氨基酸置换、小于30个氨基酸置换、小于25个氨基酸置换、小于20个氨基酸置换、小于15个氨基酸置换、小于10个氨基酸置换、小于5个氨基酸置换、小于4个氨基酸置换、小于3个氨基酸置换或小于2个氨基酸置换。“保守氨基酸置换”是其中氨基酸残基被具有带类似电荷的侧链的氨基酸残基代替的置换。具有带类似电荷的侧链的氨基酸残基家族是本领域所定义的。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸（例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸）、具有酸性侧链的氨基酸（例如，天冬氨酸、谷氨酸）、具有不带电极性侧链的氨基酸（例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸）、具有非极性侧链的氨基酸（例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸）、具有β-支链侧链的氨基酸（例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸）和具有芳族侧链的氨基酸（例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸）。作为另外一种选择，突变可沿着编码序列的所有或部分，例如通过饱和诱变随机引入，并且可筛选所得突变体的生物活性，以鉴定保持活性（例如，结合tau的能力）的突变体。
例如，仅在抗体分子的框架区中或仅在CDR区中引入突变是可能的。引入的突变可以是沉默或中性错义突变，例如，对抗体结合抗原的能力无影响或有很少的影响，实际上无论如何一些此类突变不会改变氨基酸序列。这些类型的突变可用于优化密码子使用，或改善杂交瘤的抗体产量。本发明的密码子优化编码区编码抗体在本文别处有所公开。作为另外一种选择，非中性错义突变可改变抗体的结合抗原能力。大多数沉默和中性错义突变的定位很可能在框架区中，而大多数非中性错义突变的定位很可能在CDR中，虽然这不是绝对的要求。本领域技术人员将能够利用所需的特性，例如抗原结合活性不改变或结合活性改变（例如，抗原结合活性提高或抗体特异性改变）来设计和测试突变体分子。在诱变后，编码蛋白可常规表达，并且编码蛋白的功能和/或生物活性（例如，免疫特异性结合tau的至少一个表位的能力）可使用本文所述的技术或通过本领域已知的常规修饰技术测定。
Tau结合剂，例如但不限于本发明的tau结合抗体可使用任何体内或体外神经退行性tau蛋白病的模型表征。技术人员很容易理解，本发明的tau结合剂（例如，抗体）可在神经退行性tau蛋白病小鼠模型中表征，例如但不限于以下三种不同的tau蛋白病动物模型中的任何一种可用于表征和验证本发明的tau抗体（及其具有结合特异性的分子）。
1.转基因TauP301L小鼠（品系183）：在鼠Thy1.2启动子调控下表达具有P301L突变的人Tau40（这些转基因动物的制备在等,J.Biol.Chem.276(2001),529-534和国际申请WO2003/017918中有所描述，其公开内容以引用方式并入本文）
2.JNPL3小鼠：在鼠PrP启动子的调控下表达具有P301L突变的最短4R人tau亚型（得自Taconic,Hudson,NY,U.S.A.）。
3.P301STau（品系PS19）小鼠：在鼠PrP启动子的调控下表达具有P301S突变的人tau（得自Jackson Laboratory,Bar Harbor,Maine,U.S.A.）。
技术人员理解，神经退行性tau蛋白病的实验模型可用于预防环境或可用于治疗环境。在预防环境中，动物的给药在神经退行性tau蛋白病或其症状的发作前开始。在预防环境中，评估本发明的tau结合剂（例如，抗体）预防、减少或延迟神经退行性tau蛋白病或其症状的发作的能力。在治疗环境中，动物的给药在神经退行性tau蛋白病或其症状的发作后开始。在治疗环境中，评估本发明的tau结合剂（例如，抗体）治疗、减少或减轻神经退行性tau蛋白病或其症状的能力。神经退行性tau蛋白病的症状包括但不限于实验对象的神经元、大脑、脊髓、脑脊髓液或血清中病理tau沉积物、神经原纤维缠结(NFT)、超磷酸化tau多肽、不溶性tau部分的积累。技术人员理解，神经退行性tau蛋白病的任何动物模型中的阳性预防或治疗结果表明，特定的tau结合剂（例如，抗体）可在除实验模式生物之外的受试者中用于预防或治疗目的，例如，可在需要其的人受试者中用于治疗神经退行性tau蛋白病。
在一个实施方案中，本发明的tau结合剂（例如，抗体）可施用至tau蛋白病小鼠模型和相应的对照野生型小鼠。所施用的抗体可以是本发明的鼠源化抗体或本发明抗体的人-鼠嵌合体。参见，例如实施例6和7。Tau结合剂（例如，抗体）可通过本领域已知的任何方法施用，例如通过腹膜内、颅内、肌内、静脉内、皮下、口服和气雾剂施用。实验动物可给予一剂、两剂、三剂、四剂、五剂或更多剂tau结合剂（例如，抗体）或对照组合物例如PBS。在一个实施方案中，实验动物将施用一剂或两剂tau结合剂（例如，抗体）。参见，例如实施例9。在另一个实施方案中，动物长期施用tau结合剂（例如，抗体）达数周或数月。参见，例如实施例10。技术人员可容易地设计适合实验目的的给药方案，例如，用于急性研究的给药方案、用于慢性研究的给药方案、用于毒性研究的给药方案、用于预防或治疗研究的给药方案。Tau结合剂（例如，抗体）在实验动物的特定组织隔室，例如但不限于血清、血液、脑脊髓液、大脑组织中的存在可使用本领域熟知的方法确定。参见，例如实施例9和10。在一个实施方案中，本发明的tau结合剂（例如，抗体）能够透过血脑屏障。技术人员理解，通过调整tau结合剂（例如，抗体）剂量和给药频率，可保持实验动物中的所需tau结合剂（例如，抗体）浓度。本发明tau结合剂（例如，抗体）在tau蛋白病模型中的任何效果可通过比较tau在治疗和对照动物中的水平、生物化学特征或分布来评估。在一个实例中，神经原纤维缠结(NFT)使用Gallyas的银浸渗技术或通过用识别NFT中病理磷酸化tau的单克隆小鼠抗体AT100和AT180免疫染色来检查。可测定抗体治疗小鼠和对照动物的大脑和脊髓中Gallyas阳性神经元和/或AT100、AT180标记神经元的数量或频率，以评估抗体治疗的效果。在一个实施方案中，本发明的抗体能够降低动物模型的大脑或脊髓中神经原纤维缠结的水平、量或浓度。抗体可将神经原纤维缠结的水平、量或浓度降低至少约5%、10%、20%、30%、50%、70%、90%或更多。在另一个实施方案中，本发明的抗体能够降低动物模型的大脑或脊髓中Gallyas阳性神经元的数量或频率，例如降低至少约5%、10%、20%、30%、50%、70%、90%或更多。在其他实施方案中，本发明的抗体能够降低动物模型的大脑或脊髓中AT100或AT180抗体阳性神经元的数量或频率，例如降低至少约5%、10%、20%、30%、50%、70%、90%或更多。本发明抗体的效果也可通过检查抗体施用后tau的分布和生物化学特性来评估。在一个实施方案中，本发明的抗体能够降低动物模型的大脑或脊髓中tau蛋白的量或浓度，例如降低至少约5%、10%、20%、30%、50%、70%、90%或更多。在另一个实施方案中，本发明的抗体能够降低动物模型的大脑或脊髓中不溶性tau蛋白的量或浓度，例如降低至少约5%、10%、20%、30%、50%、70%、90%或更多。不溶性tau部分可根据例如实施例10或Goedert M,Spillantini MG,Cairns NJ,CrowtherRA.Neuron8,159(1992)中所述制备。生物样本中tau蛋白的量可通过技术人员已知的任何方法，例如实施例10中所述的方法测定。在其他实施方案中，本发明的抗体可降低动物模型的大脑或脊髓中超磷酸化tau蛋白的量或浓度，例如减低至少约5%、10%、20%、30%、50%、70%、90%或更多。超磷酸化tau可使用病理超磷酸化形式tau的特异性抗体，例如AT100或AT180来检测。本发明的抗体也可改变，例如减少或增加血液、血清或脑脊髓液或动物模型中的tau浓度，例如改变至少约5%、10%、20%、30%、50%、70%、90%或更多。在一个实施方案中，%减少或增加相对于治疗前存在的水平、数量、频率、量或浓度，或相对于未治疗/对照治疗受试者中存在的水平、数量、频率、量或浓度而比较。
在一个实施方案中，本发明的抗体可预防或延迟受试者中神经退行性tau蛋白病的至少一种症状的发作。在一个实施方案中，本发明的抗体可减少或消除受试者中神经退行性tau蛋白病的至少一种症状。症状可以是受试者大脑或脊髓中病理tau沉积物、超磷酸化tau沉积物、不溶性tau沉积物、神经原纤维、神经原纤维、预缠结磷tau聚集体、神经内神经原纤维缠结或神经外神经原纤维缠结的形成。参见，例如Augustinack等，ActaNeuropathol103:26-35(2002)。症状也可以是血清、血液、尿液或脑脊髓液中tau的存在或升高浓度或量，其中升高浓度量与健康受试者比较。症状可以是神经症状，例如条件性味觉厌恶改变、情境恐惧制约改变、记忆障碍、运动功能丧失。在一个实施方案中，记忆障碍使用两试Y-迷宫任务评估。在具体的实施方案中，两试Y-迷宫任务基本上如实施例10中所述进行。在一个实施方案中，至少一种症状减少至少约5%、10%、15%、20%、30%、50%、70%或90%。在另一个实施方案中，抗体治疗的受试者中两试Y-迷宫任务比率显著高于对照受试者。在具体的实施方案中，两试Y迷宫任务比率增加至少约5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%。在另一个实施方案中，两试Y迷宫任务比率为高至少约两倍、三倍、四倍、五倍、十倍或二十倍。本发明还提供预防或延迟需要其的受试者中神经退行性tau蛋白病的至少一种症状的发作的方法，其包括施用治疗有效量的本文所述tau抗体。本发明还提供减少或消除需要其的受试者中神经退行性tau蛋白病的至少一种症状的方法，其包括施用治疗有效量的本文所述tau抗体。在一个实施方案中，受试者是实验生物，例如但不限于转基因小鼠。在一个实施方案中，受试者是人。
III.编码抗体的多核苷酸
编码抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的多核苷酸可由任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸组成，所述多核苷酸可以是未修饰的RNA或DNA或修饰的RNA或DNA。例如，编码抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的多核苷酸可由单链和双链DNA、单链和双链区混合物的DNA、单链和双链RNA以及单链和双链区混合物的RNA、包含可为单链或更通常双链或单链和双链区混合物的DNA和RNA的杂交分子组成。此外，编码抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的多核苷酸可由包含RNA或DNA或RNA和DNA二者的三链区组成。编码抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的多核苷酸也可包含一个或多个修饰碱基或出于稳定性或其他原因而修饰的DNA或RNA主链。“修饰”碱基包括，例如三苯甲基碱基和稀有碱基，例如肌苷。可对DNA和RNA进行多种修饰；因此，“多核苷酸”涵盖化学、酶学或代谢修饰形式。
编码来源于免疫球蛋白的多肽（例如，免疫球蛋白重链部分或轻链部分）的非天然变体的分离多核苷酸可通过将一个或多个核苷酸置换、添加或缺失引入免疫球蛋白的核苷酸序列，以使得一个或多个氨基酸置换、添加或缺失引入编码的蛋白质来产生。突变可通过标准技术，例如定点诱变和PCR介导的诱变引入。在一个实施方案中，保守氨基酸置换在一个或多个非必需氨基酸残基处产生。
如所熟知，RNA可从原始B细胞、杂交瘤细胞或从其他转化细胞通过标准技术，例如异硫氰酸胍提取和沉淀，然后通过离心或色谱法分离。如有需要，mRNA可从总RNA通过标准技术，例如在寡聚dT纤维素上通过色谱法分离。合适的技术在本领域是熟悉的。在一个实施方案中，编码抗体轻链和重链的cDNA可同时或分别使用逆转录酶和DNA聚合酶根据熟知的方法制备。基于公布的重链和轻链DNA和氨基酸序列，PCR可由共有恒定区引物或由更多特异性引物启动。如上所讨论，PCR也可用于分离编码抗体轻链和重链的DNA克隆。在这种情况下，文库可通过共有引物或较大的同源探针，例如人恒定区探针筛选。
DNA，通常为质粒DNA可使用本领域已知的技术从细胞分离，根据例如在前述涉及重组DNA技术的参考文献中详细示出的标准熟知技术限制标绘和测序。当然，DNA可根据本发明在分离过程或随后分析期间的任何点合成。
在一个实施方案中，本发明提供分离的多核苷酸，其包含编码免疫球蛋白重链可变区(VH)的核酸、基本上由其组成或由其组成，其中重链可变区的至少一个CDR或重链可变区的至少两个VH-CDR与来自本文所公开的抗体的参考重链VH-CDR1、VH-CDR2或VH-CDR3氨基酸序列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、约97%、98%或99%同一性。作为另外一种选择，VH的VH-CDR1、VH-CDR2或VH-CDR3区与来自本文所公开的抗体的参考重链VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3氨基酸序列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、约97%、98%或99%同一性。因此，根据该实施方案，本发明重链可变区的具有与图1中示出的多肽序列相关的VH-CDR1、VH-CDR2或VH-CDR3多肽序列。在一个实施方案中，参考VH CDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO:23、29或35；参考VH CDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO:24、30或36；并且参考VH CDR3的氨基酸序列为SEQID NO:25、31或37。
在一个实施方案中，本发明提供分离的多核苷酸，其包含编码免疫球蛋白重链可变区(VH)的核酸、基本上由其组成或由其组成，其中VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3区具有与图1中示出的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3组具有同一性的多肽序列，不同的是在任何一个VH-CDR中具有一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个氨基酸置换。在某些实施方案中，氨基酸置换是保守的。在一个实施方案中，VH CDR1的氨基酸序列为SEQ IDNO:23、29或35；VH CDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO:24、30或36；并且VH CDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO:25、31或37。
在另一个实施方案中，本发明提供分离的多核苷酸，其包含编码免疫球蛋白轻链可变区(VL)的核酸、基本上由其组成或由其组成，其中轻链可变区的至少一个VL-CDR或轻链可变区的至少两个VL-CDR与来自本文所公开的抗体的参考轻链VL-CDR1、VL-CDR2或VL-CDR3氨基酸序列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、约97%、98%或99%同一性。作为另外一种选择，VL的VL-CDR1、VL-CDR2或VL-CDR3区与来自本文所公开的抗体的参考轻链VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3氨基酸序列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、约97%、98%或99%同一性。因此，根据该实施方案，本发明的轻链可变区具有与图1中示出的多肽序列相关的VL-CDR1、VL-CDR2或VL-CDR3多肽序列。在一个实施方案中，参考VL CDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO:26、32或38；参考VL CDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO:27、33或39；并且参考VL CDR3的氨基酸序列为SEQID NO:28、34或40。
在另一个实施方案中，本发明提供分离的多核苷酸，其包含编码免疫球蛋白轻链可变区(VL)的核酸、基本上由其组成或由其组成，其中VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3区具有与图1中示出的VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3组具有同一性的多肽序列，不同的是在任何一个VL-CDR中具有一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个氨基酸置换。在某些实施方案中，氨基酸置换是保守的。在一个实施方案中，VL CDR1的氨基酸序列为SEQ IDNO:26、32或38；VL CDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO:27、33或39；并且VL CDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO:28、34或40。
在另一个实施方案中，本发明提供分离的多核苷酸，其包含编码免疫球蛋白重链可变区(VH)的核酸、基本上由其组成或由其组成，其中VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3区具有与图1中示出的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3组具有同一性的多肽序列。在一个实施方案中，VHCDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO:23、29或35；VH CDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO:24、30或36；并且VH CDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO:25、31或37。
在另一个实施方案中，本发明提供分离的多核苷酸，其包含编码免疫球蛋白轻链可变区(VL)的核酸、基本上由其组成或由其组成，其中VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3区具有与图1中示出的VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3组具有同一性的多肽序列。在一个实施方案中，VLCDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO:26、32或38；VL CDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO:27、33或39；并且VL CDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO:28、34或40。
如本领域已知，两种多肽或两种多核苷酸之间的“序列同一性”通过将一种多肽或多核苷酸的氨基酸或核酸序列与第二种多肽或多核苷酸的序列比较来确定。在本文中讨论时，无论任何具体的多肽是否与另一种多肽具有至少约40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%同一性，均可使用本领域已知的方法和计算机程序/软件确定，例如但不限于BESTFIT程序(Wisconsin Sequence Analysis Package,Version8for Unix,Genetics Computer Group,University Research Park,575Science Drive,Madison,WI53711)。BESTFIT使用Smith和Waterman,Advances in Applied Mathematics2(1981),482-489的局部同源性算法寻找两个序列之间的最佳同源性片段。当使用BESTFIT或任何其他序列比对程序确定具体序列是否与根据本发明的参考序列具有例如95%同一性时，参数毫无疑问地设置为使得同一性的百分比在参考多肽序列的全长计算，并且允许参考序列中空隙同源性为氨基酸的总数的至多5%。
在本发明的一个实施方案中，多核苷酸包含具有如表2中所述的抗tau抗体的VH或VL区的多核苷酸序列的核酸，基本上由其组成或由其组成。在这方面，本领域技术人员将容易地认识到编码轻链和/或重链的至少可变域的多核苷酸可编码两条免疫球蛋白链或仅一条链的可变域。本发明还提供多核苷酸，其包含编码SEQ ID:93的氨基酸序列的核苷酸序列或由其组成。
表2：Tau特异性抗体的VH和VL区的核苷酸序列。
在一个实施方案中，本发明提供分离的多核苷酸，其包含编码免疫球蛋白重链可变区的核酸、基本上由其组成或由其组成，该重链可变区与参考重链VH具有至少80%、85%、90%、95%、96%、约97%、98%或99%或95%同一性。在一个实施方案中，参考重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:9、13、17或93。
在一个实施方案中，本发明提供分离的多核苷酸，其包含编码免疫球蛋白轻链可变区的核酸、基本上由其组成或由其组成，该轻链可变区与参考轻链VL具有至少80%、85%、90%、95%、96%、约97%、98%或99%或95%同一性。在一个实施方案中，参考轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:11、15或19。
本发明还包括本发明别处所述的多核苷酸片段。本发明还设想了编码如本文所述的融合多核苷酸、Fab片段和其他衍生物的另外多核苷酸。
多核苷酸可通过本领域已知的任何方法制备或产生。例如，如果抗体的核苷酸序列是已知的，则编码抗体的多核苷酸可从化学合成的寡聚核苷酸组装，例如，如Kutmeier等,BioTechniques17(1994),242中所描述，简而言之，该文献涉及包含编码抗体的序列部分的重叠寡聚核苷酸的合成、那些寡聚核苷酸的退火和连接以及然后通过PCR扩增连接的寡聚核苷酸。
作为另外一种选择，编码抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的多核苷酸可从合适来源的核酸制备。如果包含编码特定抗体的核酸的克隆不可用，但抗体分子的序列是已知的，则编码抗体的核酸可通过化学方法合成，或从合适的来源获得（例如，抗体cDNA文库或从任何组织或表达tau特异性抗体的细胞，例如选择用于表达抗体的杂交瘤细胞制备的cDNA文库，或从其中分离的核酸，优选地polyA+RNA），所述获得通过使用可与序列的3'和5'末端杂交的合成引物进行PCR扩增或使用特定基因序列特异性寡聚核苷酸探针进行克隆，以鉴定例如来自编码抗体的cDNA文库的cDNA克隆来进行。然后，通过PCR制备的扩增核酸可使用本领域熟知的任何方法克隆至可复制的克隆载体。
一旦确定核苷酸序列以及抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的对应氨基酸序列，则其核苷酸序列可使用本领域熟知的核苷酸序列操作方法，如重组DNA技术、定点诱变、PCR等操作（参见例如，Sambrook等,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,第2版,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.(1990)和Ausubel等,编著,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,NY(1998)中所述的技术，它们二者全文以引用方式并入），以产生具有不同氨基酸序列的抗体，例如产生氨基酸置换、缺失和/或插入。
IV.抗体多肽的表达
在操作分离的遗传物质以提供本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物之后，编码抗体的多核苷酸通常插入表达载体，以用于引入可用于制备所需量抗体的宿主细胞。本文描述了抗体或其片段、衍生物或类似物，例如结合靶标分子的抗体的重链或轻链的重组表达。一旦获得编码本发明的抗体分子或抗体的重链或轻链或其部分（优选地包含重链或轻链可变域）的多核苷酸，制备抗体分子的载体即可使用本领域熟知的技术通过重组DNA技术制备。因此，本文描述了通过表达包含编码核苷酸序列的抗体的多核苷酸来制备蛋白质的方法。本领域的技术人员熟知的方法可用于构建包含抗体编码序列和适当转录和翻译调控信号的表达载体。这些方法包括，例如体外重组DNA技术、合成技术和体内基因重组。因此，本发明提供包含编码本发明抗体分子或其重链或轻链或重链或轻链可变域的核苷酸序列的可复制载体，其可操作地连接至启动子。此类载体可包括编码抗体分子恒定区的核苷酸序列（参见例如，国际申请WO86/05807和WO89/01036以及美国专利号5,122,464），并且抗体的可变域可克隆至此类载体，用于表达整个重链或轻链。
术语“载体”或“表达载体”在本文中用于指根据本发明使用的载体，其用作将所需基因引入宿主细胞并且在其中表达的媒介物。如本领域的技术人员已知，此类载体可容易地选自质粒、噬菌体、病毒和逆转录病毒。一般来讲，与本发明相容的载体将包含选择标记、有利于所需基因克隆的适当限制性位点，以及进入真核或原核细胞和/或在其中复制的能力。出于本发明的目的，可利用多种表达载体系统。例如，一类载体利用来源于动物病毒例如牛乳头瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒、牛痘病毒、杆状病毒、逆转录病毒（RSV、MMTV或MOMLV）或SV40病毒的DNA元件。其他涉及具有内部核糖体结合位点的多顺反子系统的使用。此外，其DNA整合进它们的染色体的细胞可通过引入一个或多个标记来选择，该标记允许选择转染的宿主细胞。标记可为原养型提供营养缺陷型宿主、生物杀灭抗性（例如，抗生素）或重金属例如铜抗性。可选择标记基因可直接连接至要表达的DNA序列，或通过共转化引入相同的细胞。附加元件对于mRNA的优化合成也可以是必须的。这些元件可包括信号序列、剪接信号以及转录启动子、增强子和终止信号。
在特定的实施方案中，克隆的可变区基因沿着重链和轻链恒定区基因（例如，人重链和轻链恒定区基因）插入表达载体，如上面所讨论。在一个实施方案中，这使用BiogenIDEC,Inc.的专利表达载体实现，该载体称为NEOSPLA，在美国专利号6,159,730中有所公开。该载体包含巨细胞病毒启动子/增强子、小鼠β珠蛋白主要启动子、SV40复制起点、牛生长激素多腺苷酸序列、新霉素磷酸转移酶外显子1和外显子2、二氢叶酸还原酶基因和前导序列。已经发现该载体在掺入可变和恒定区基因，转染CHO细胞，然后在包含G418的培养基中选择以及氨甲喋呤扩增时，会产生非常高的抗体表达水平。当然，能够在真核细胞中诱发表达的任何表达载体均可用于本发明。合适载体的实例包括但不限于质粒pcDNA3、pHCMV/Zeo、pCR3.1、pEF1/His、pIND/GS、pRc/HCMV2、pSV40/Zeo2、pTRACER-HCMV、pUB6/V5-His、pVAX1和pZeoSV2（得自Invitrogen,San Diego,CA）和质粒pCI（得自Promega,Madison,WI）。一般来讲，如果免疫球蛋白重链和轻链是可通过例如机器人系统进行的常规实验，则筛选大量转化细胞中适当高水平表达的细胞。载体系统也在美国专利号5,736,137和5,658,570中教导，每个专利全文以引用方式并入本文。该系统提供了高表达水平，例如，>30pg/细胞/天。其他示例性载体系统在例如美国专利号6,413,777中有所公开。
在其他实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物可使用多顺反子构建体，例如美国专利申请公布号2003-0157641A1中公开的那些构建体来表达，该专利全文并入本文中。在这些表达系统中，多个所关注的基因产物，例如抗体的重链和轻链可从单个多顺反子构建体制备。这些系统有利地使用内部核糖体进入位点(IRES)以提供相对较高的抗体水平。相容性IRES序列在美国专利号6,193,980中有所公开，该专利也并入本文中。本领域的技术人员将会知道，此类表达系统可用于有效地制备全范围的本申请公开的抗体。
更一般地讲，一旦制备编码抗体的单体亚基的载体或DNA序列，表达载体即可引入适当的宿主细胞。将质粒引入宿主细胞可通过本领域的技术人员熟知的各种技术实现。这些技术包括但不限于转染包括使用例如或脂质体的脂转染、原生质体融合、磷酸钙沉淀、用包膜DNA进行的细胞融合、显微注射以及用完整病毒感染。通常，质粒引入宿主通过标准磷酸钙共沉淀法进行。携带表达构建体的宿主细胞在适于制备轻链和重链的条件下生长，并且测定重链和/或轻链蛋白合成。示例性测定技术包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射性免疫测定(RIA)或荧光活化细胞分选仪分析(FACS)、免疫组织化学等等。
表达载体通过常规技术转移至宿主细胞，并且然后通过常规技术培养转染的细胞，以制备适用于本文所述方法的抗体。因此，本发明包括含有编码本发明抗体或其重链或轻链的多核苷酸的宿主细胞，所述多核苷酸可操作地连接至异源启动子。在双链抗体表达的特定实施方案中，编码重链和轻链二者的载体可在宿主细胞中共表达，以用于表达整个免疫球蛋白分子，如下面所详述。
宿主细胞可用本发明的两个表达载体，编码重链来源多肽的第一载体和编码轻链来源多肽的第二载体共转染。两个载体可包含相同的可选择标记，它能够使重链和轻链多肽等量表达。作为另外一种选择，可使用编码重链和轻链多肽二者的单个载体。在这种情况下，轻链有利地设置于重链之前，以避免无毒性重链的过量；参见Proudfoot,Nature322(1986),52;Kohler,Proc.Natl.Acad.Sci.USA77(1980),2197。重链和轻链的编码序列可包括cDNA或基因组DNA。
如本文所用，“宿主细胞”是指携带使用重组DNA技术构建，并且编码至少一个异源基因的载体的细胞。在从重组宿主分离抗体的过程的描述中，术语“细胞”和“细胞培养物”可互换使用，是指抗体的来源，除非另外清晰地指明。换句话讲，从“细胞”回收多肽可以指从降速全细胞，或从包含培养基和悬浮细胞二者的细胞培养物回收。
多种宿主表达载体系统可用于表达适用于本文所述方法的抗体分子。此类宿主表达系统代表媒介物，所关注的编码序列可通过其制备，随后纯化，但也代表细胞，当转化或转染适当的核苷酸编码序列时，可原位表达本发明的抗体分子。这些宿主包括但不限于微生物例如转化包含抗体编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体的细菌（例如，大肠杆菌(E.coli)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)）；转化包含抗体编码序列的重组酵母表达载体的酵母（例如，酵母属(Saccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)）；感染包含抗体编码序列的重组病毒表达载体的昆虫细胞系统（例如，杆状病毒）；感染重组病毒表达载体（例如，花椰菜花叶病毒(CaMV)、烟草花叶病毒(TMV)）或转化包含抗体编码序列的重组质粒表达载体（例如，Ti质粒）的植物细胞系统；或携带包含来源于哺乳动物细胞基因组（例如，金属硫蛋白启动子）或来源于哺乳动物病毒（例如，腺病毒晚期启动子、牛痘病毒7.5K启动子）的启动子的重组表达构建体的哺乳动物细胞系统（例如，COS、CHO、NSO、BLK、293、3T3细胞）。在一个实施方案中，细菌细胞例如大肠杆菌，更优选地真核细胞，尤其是用于整个重组抗体分子表达的细胞，可用于重组抗体分子的表达。例如，哺乳动物细胞例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，与载体例如来自人巨细胞病毒的主要中早期基因启动子元件共同作为抗体的有效表达系统；参见例如，Foecking等,Gene45(1986),101；Cockett等,Bio/Technology8(1990),2。
用于蛋白质表达的宿主细胞系通常是哺乳动物来源的；本领域的技术人员被认为具有确定最适于所需基因产物在其中表达的特定宿主细胞系的能力。示例性的宿主细胞系包括但不限于CHO（中国仓鼠卵巢）、DG44和DUXB11（中国仓鼠卵巢细胞系、DHFR缺陷型）、HELA（人宫颈癌）、CVI（猴肾细胞系）、COS（具有SV40T抗原的CVI的衍生物）、VERY、BHK（幼仑鼠肾）、MDCK、WI38、R1610（中国仓鼠成纤维细胞）、BALBC/3T3（小鼠成纤维细胞）、HAK（仓鼠肾细胞系）、SP2/O（小鼠骨髓瘤）、P3x63-Ag3.653（小鼠骨髓瘤）、BFA-1c1BPT（牛内皮细胞）、RAJI（人淋巴细胞）和293（人肾）。在具体的实施方案中，宿主细胞系为CHO或293细胞。宿主细胞系通常得自商业服务美国组织培养物保藏中心(American Tissue CultureCollection)，或来自已出版的文献。
此外，可选择调节插入序列的表达，或以所需的特定方式修饰和加工基因产物的宿主细胞株。此类蛋白质产物的修饰（例如，糖基化）和加工（例如，裂解）对于蛋白质的功能可为重要的。不同的宿主细胞具有蛋白质和基因产物的翻译后加工和修饰的特有和特定机制。可选择适当的细胞系或宿主系统，以确保所表达的外源蛋白的正确修饰和加工。为此，可使用具有用于初级转录物适当加工、糖基化以及基因产物的磷酸化的细胞机器的真核宿主细胞。
对于重组蛋白的长期、高产量制备，稳定表达是优选的。例如，可工程化改造稳定表达抗体分子的细胞系。除使用包含病毒复制起点的表达载体之外，宿主细胞可用由适当表达调控元件（例如，启动子、增强子、序列、转录终止子、多腺苷酸化位点等）调控的DNA和选择性标记转化。在引入外源DNA后，工程化改造的细胞可允许在富集培养基中生长1至2天，然后转换到选择培养基。重组质粒中的选择性标记赋予选择抗性，并且允许细胞将质粒稳定地整合到其染色体，并且生长形成细胞灶(foci)，继而可克隆该细胞灶并且扩大为细胞系。该方法可有利地用于工程化改造稳定表达抗体分子的细胞系。
可使用多种选择系统，包括但不限于单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler等,Cell11(1977),223)、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Szybalska&Szybalski,Proc.Natl.Acad.Sci.USA48(1992),202)和腺嘌呤磷酸核糖转移酶(Lowy等,Cell22(1980),817)基因可分别用于tk-细胞、hgprt-细胞或aprt-细胞。同样，抗代谢物抗性可用作选择如下基因的基础：dhfr，其赋予氨甲喋呤抗性(Wigler等,Natl.Acad.Sci.USA77(1980),357;O'Hare等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA78(1981),1527)；gpt，其赋予霉酚酸抗性(Mulligan&Berg,Proc.Natl.Acad.Sci.USA78(1981),2072)；neo，其赋予氨基糖苷G-418抗性(Goldspiel等,Clinical Pharmacy12(1993),488-505;Wu和Wu,Biotherapy3(1991),87-95;Tolstoshev,Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32(1993),573-596;Mulligan,Science260(1993),926-932；和Morgan和Anderson,Ann.Rev.Biochem.62(1993),191-217;TIB TECH11(1993),155-215)；和hygro，其赋予潮霉素抗性(Santerre等,Gene30(1984),147)。可用的重组DNA技术的本领域熟知方法在Ausubel等(编著),Current Protocols in MolecularBiology,John Wiley&Sons,NY(1993);Kriegler,Gene Transfer and Expression,ALaboratory Manual,Stockton Press,NY(1990);和在12和13章,Dracopoli等(编著),Current Protocols in Human Genetics,John Wiley&Sons,NY(1994);Colberre-Garapin等,J.Mol.Biol.150:1(1981)中有所描述，这些文献全文以引用方式并入本文。
抗体分子的表达水平可通过载体扩增提高，综述参见Bebbington和Hentschel,The use of vectors based on gene amplification for the expression of clonedgenes in mammalian cells in DNA cloning,Academic Press,New York,Vol.3.(1987)。当表达抗体的载体系统中的标记可扩增时，宿主细胞培养物中存在的抑制剂水平的提高将增加标记基因的拷贝数。由于扩增区与抗体基因相关，抗体的产量也将增加；参见Crouse等,Mol.Cell.Biol.3(1983),257。
体外制备允许放大以产生大量所需多肽。组织培养条件下的哺乳动物细胞培养技术是本领域已知的，并且包括均匀悬浮培养，如在气升式反应器或连续搅拌反应器中，或固定化或截留细胞培养，例如在中空纤维、微囊剂中、琼脂糖微珠或陶瓷滤芯上。如果必要和/或需要，多肽溶液可通过常规色谱法，例如凝胶过滤、离子交换色谱法、DEAE-纤维素色谱法或（免疫）亲和色谱法纯化，如在合成铰链区多肽的优先生物合成之后，或在本文所述的HIC色谱法步骤之前或之后。
编码本发明抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的基因也可在非哺乳动物细胞，例如细菌或昆虫或酵母或植物细胞中表达。容易吸收核酸的细菌包括肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，例如大肠杆菌或沙门氏菌属(Salmonella)菌株；芽孢杆菌科(Bacillaceae)，例如枯草芽孢杆菌(Bacilus subtilis)；肺炎球菌(Pneumococcus)；链球菌属(Streptococcus)和流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)的成员。还将认识到，当在细菌中表达时，异源多肽通常成为包涵体的部分。异源多肽必须分离、纯化然后组装成功能分子。当抗体的四价形式为所期望时，亚基将自组装为四价抗体；参见例如，国际申请WO02/096948。
在细菌系统中，可有利地选择多个表达载体，取决于待表达的抗体分子的所需用途。例如，当产生大量此类蛋白，用于制备抗体分子的药物组合物时，引导易于纯化的融合蛋白产物高水平表达的载体可为所期望的。此类载体包括但不限于大肠杆菌表达载体pUR278(Ruther等,EMBO J.2(1983),1791)，其中抗体编码序列可单独连接至载体的与lacZ编码区框内，以制备融合蛋白；pIN载体(Inouye&Inouye,Nucleic Acids Res.13(1985),3101-3109;Van Heeke&Schuster,J.Biol.Chem.24(1989),5503-5509)等。pGEX载体也可用于表达作为与谷胱甘肽S-转移酶(GST)的融合蛋白的外源多肽。一般来讲，此类融合蛋白是可溶解的，并且可通过如下方式容易地纯化：从裂解细胞吸附和结合到谷胱甘肽-琼脂糖珠的基质，然后在不存在谷胱甘肽的情况下洗脱。pGEX载体设计为包含凝血酶或因子Xa凝血酶裂解位点，使得所克隆的靶标基因产物可从GST部分释放。
除原核生物之外，也可使用真核微生物。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或常见的面包酵母是最常用的真核微生物，虽然多种其他菌株也是常用的，例如，巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)。对于在酵母属中的表达，例如质粒YRp7(Stinchcomb等,Nature282(1979),39;Kingsman等,Gene7(1979),141;Tschemper等,Gene10(1980),157)是常用的。该质粒已包含TRP1基因，其提供缺乏在色氨酸中生长能力的酵母突变株的选择性标记，例如ATCC No.44076或PEP4-1(Jones,Genetics85(1977),12)。然后，trpl损害的存在作为酵母宿主细胞基因组的特征提供了通过在缺乏色氨酸中生长来检测转化的有效环境。
在昆虫系统中，苜蓿环纹夜蛾(Autographa californica)核型多角体病毒(AcNPV)通常用作表达外源基因的载体。该病毒在草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞中生长。抗体编码序列可单独克隆至病毒的非必需区（例如多角体蛋白基因），并且置于AcNPV启动子（例如多角体蛋白启动子）的调控下。
一旦本发明的抗体分子重组表达，本发明的整个抗体、它们的二聚体、单个轻链和重链或其他免疫球蛋白形式可根据本领域的标准步骤纯化，包括例如通过色谱法（例如，离子交换、亲和尤其是蛋白A后特定抗原的亲和以及分级柱层析）、离心、差别性溶解如硫酸铵沉淀，或通过任何其他蛋白质纯化的标准技术进行；参见例如，Scopes,"ProteinPurification",Springer Verlag,N.Y.(1982)。作为另外一种选择，另一种提高本发明抗体亲和力的方法在美国专利公布2002-0123057A1中有所公开。
V.融合蛋白和偶联物
在某些实施方案中，抗体多肽包含氨基酸序列或通常与抗体不相关的一个或多个部分。示例性的修饰在下文中更详细地描述。例如，本发明的单链fv抗体片段可包含柔性接头序列，或可修饰以添加功能部分（例如，PEG、药物、毒素或标记例如荧光标记、放射性标记、酶标记、核磁标记、重金属标记等）。
本发明的抗体多肽可包含融合蛋白、基本上由其组成或由其组成。融合蛋白是包含例如具有至少一个靶标结合位点和至少一个异源部分（即，本质上未天然与其连接的部分）的免疫球蛋白tau结合域的嵌合分子。氨基酸序列通常可存在于结合在融合多肽中的分离蛋白质中，或它们通常可存在于相同的蛋白质中，但在融合多肽中以新型排列布置。可通过例如化学合成，或通过产生和翻译其中肽区域以所需关系编码的多核苷酸来产生融合蛋白。
适用于多核苷酸或多肽的术语“异源”意指多核苷酸或多肽来源于实体，该实体的其余部分与其比较为不同。例如，如本文所用，与抗体或其抗原结合片段、变体或类似物融合的“异源多肽”来源于相同物种的非免疫球蛋白多肽，或不同物种的免疫球蛋白或非免疫球蛋白多肽。
如本文别处更详细地讨论，本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物还可重组融合至异源多肽的N-或C-末端，或化学偶联（包括共价和非共价偶联）至多肽或其他组合物。例如，抗体可重组融合或偶联至在检测测定中用作标记的分子，和效应分子，例如异源多肽、药物、放射性核素或毒素；参见例如，国际申请WO92/08495、WO91/14438、WO89/12624、美国专利号5,314,995和欧洲专利申请EP0396387。
本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物可由通过肽键或修饰肽键彼此键合的氨基酸，即，肽同电子排列体组成，并且可包含除20个基因编码的氨基酸之外的氨基酸。抗体可通过天然过程，例如翻译后加工，或通过本领域熟知的化学改性技术修饰。此类修饰在基础课本中，并且在详细的专题论文以及大量研究文献中详细地描述。修饰可发生在抗体的任何部分，包括肽主链、氨基酸侧链和氨基或羧基末端，或例如糖类的部分上。应当理解，相同类型的修饰可以相同或不同的程度存在于给定抗体中的多个位点。同样，给定的抗体可包含多种类型的修饰。抗体可以是支链的，例如，作为泛素化的结果，并且它们可以是含有或不含支链的环状。环状的、支链的以及支链环状的抗体可得自翻译后天然过程，或可通过合成方法制备。修饰包括乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、核黄素的共价键合、血红素部分的共价键合、核苷酸或核苷酸衍生物的共价键合、脂质或脂质衍生物的共价键合、磷脂酰肌醇的共价键合、交联、环化、二硫键形成、脱甲基化、共价交联的形成、半胱氨酸的形成、焦谷氨酸的形成、甲酰化、γ-羧化、糖基化、GPI锚定形成、羟化、碘化、甲基化、豆蔻酰化、氧化、聚乙二醇化、蛋白酶解加工、磷酸化、异戊烯化、外消旋化、硒醇化(selenoylation)、硫酸盐化、转运RNA介导的氨基酸添加至蛋白质例如精氨酰化和泛素化；参见例如，Proteins-Structure And Molecular Properties,T.E.Creighton,W.H.Freeman and Company,New York第2版,(1993);Posttranslational CovalentModification Of Proteins,B.C.Johnson,Ed.,Academic Press,New York,1-12页(1983)；Seifter等,Meth.Enzymol.182(1990),626-646;Rattan等,Ann.NY Acad.Sci.663(1992),48-62)。
本发明还提供包含抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物以及异源多肽的融合蛋白。在一个实施方案中，本发明的融合蛋白包含具有任何一个或多个本发明抗体VH区的氨基酸序列，或任何一个或多个本发明抗体VL区的氨基酸序列的多肽或其片段或变体以及异源多肽序列，基本上由其组成或由其组成。在另一个实施方案中，适用于本文所公开的诊断和治疗方法的融合蛋白包含具有抗体的任何一个、两个、三个VH-CDR的氨基酸序列或片段、变体或其衍生物，或抗体的任何一个、两个、三个VL-CDR的氨基酸序列或其片段、变体或衍生物以及异源多肽序列的多肽，基本上由其组成或由其组成。在一个实施方案中，融合蛋白包含具有本发明抗体的VH-CDR3的氨基酸序列或其片段、衍生物或变体以及异源多肽序列的多肽，该融合蛋白特异性结合tau。在另一个实施方案中，融合蛋白包含具有本发明抗体的至少一个VH区的氨基酸序列和本发明抗体至少一个VL区的氨基酸序列或其片段、衍生物或变体以及异源多肽序列的多肽。在一个实施方案中，融合蛋白的VH和VL区对应于特异性结合tau的单源抗体（或scFv或Fab片段）。在又一个实施方案中，适用于本文所公开的诊断和治疗方法的融合蛋白包含具有抗体的任何一个、两个、三个或更多个VH CDR的氨基酸序列和抗体的任何一个、两个、三个或更多个VL CDR的氨基酸序列或其片段或变体以及异源多肽序列的多肽。在一个实施方案中，两个、三个、四个、五个、六个或更多个VH-CDR或VL-CDR对应于本发明的单源抗体（或scFv或Fab片段）。本发明还涵盖编码这些融合蛋白的核酸分子。
文献中报道的示例性融合蛋白包括T细胞受体(Gascoigne等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA84(1987),2936-2940)、CD4（Capon等,Nature337(1989),525-531；Traunecker等,Nature339(1989),68-70；Zettmeissl等,DNA Cell Biol.USA9(1990),347-353；和Byrn等,Nature344(1990),667-670）、L-选择素（归巢受体）（Watson等,J.Cell.Biol.110(1990),2221-2229；和Watson等,Nature349(1991),164-167）、CD44(Aruffo等,Cell61(1990),1303-1313)、CD28和B7(Linsley等,J.Exp.Med.173(1991),721-730)、CTLA-4(Lisley等,J.Exp.Med.174(1991),561-569)、CD22(Stamenkovic等,Cell66(1991),1133-1144)、TNF受体（Ashkenazi等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA88(1991),10535-10539；Lesslauer等,Eur.J.Immunol.27(1991),2883-2886；和Peppel等,J.Exp.Med.174(1991),1483-1489(1991)）以及IgE受体a(Ridgway和Gorman,J.Cell.Biol.115(1991),Abstract No.1448)的融合。
如本文别处所讨论，本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物可融合至异源多肽，以增加多肽的体内半衰期，或用于使用本领域已知方法进行的免疫测定。例如，在一个实施方案中，PEG可偶联至本发明的抗体，以增加其体内半衰期；参见例如，Leong等,Cytokine16(2001),106-119;Adv.in Drug Deliv.Rev.54(2002),531；或Weir等,Biochem.Soc.Transactions30(2002),512。
此外，本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物可融合至标记序列例如肽，以促进其纯化或检测。在特定的实施方案中，标记氨基酸序列是六组氨酸肽(HIS)，例如pQE载体(QIAGEN,Inc.,9259Eton Avenue,Chatsworth,Calif.,91311)中提供的标记等，很多标记是可商购获得的。如Gentz等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA86(1989),821-824中所述，例如，六组氨酸提供了融合蛋白的简便纯化。用于纯化的其他肽标记包括但不限于"HA"标记，其对应于来源于流感血凝素蛋白的表位(Wilson等,Cell37(1984),767)，以及“旗帜”标记。
融合蛋白可使用本领域熟知的方法制备；参见例如美国专利号5,116,964和5,225,538。融合发生的精确位点可根据经验选择，以优化融合蛋白的分泌或结合特征。然后，将编码融合蛋白的DNA转染至宿主细胞中用于表达。
本发明的抗体可以非偶联形式使用，或可以偶联至多个分子中的至少一个，例如，以改善分子的治疗特性，促进靶标检测或患者的成像或治疗。当进行纯化时，可在纯化之前或之后标记或偶联本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物。具体地讲，本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物可偶联至治疗剂、前药、肽、蛋白质、酶、病毒、脂质、生物学应答调节剂、药剂或PEG。
作为包括常规抗体的免疫毒素的偶联剂已在本领域中广泛描述。毒素可通过常规偶联技术偶联至抗体，或包含蛋白毒素部分的免疫毒素可制备为融合蛋白。本发明的抗体可以相应的方式使用，以获得此类免疫毒素。此类免疫毒素的例证如Byers,SeminarsCell.Biol.2(1991),59-70和Fanger,Immunol.Today12(1991),51-54所描述。
本领域的技术人员将会知道，偶联物也可使用多种技术组装，取决于所选的待偶联的试剂。例如，含生物素的偶联物例如通过使tau结合多肽与生物素的活化酯如生物素N-羟基琥珀酰亚胺酯反应制备。类似地，含荧光标记的偶联物可在偶联剂的存在下，例如本文所列的那些偶联剂，或通过与异硫氰酸酯或荧光素-异硫氰酸酯的反应制备。本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的偶联物以类似的方式制备。
本发明还涵盖与诊断或治疗剂偶联的本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物。抗体可用于诊断，以便例如展示神经疾病的存在，表明患上神经疾病的风险，监测神经疾病，即tau蛋白病的发展或进行，作为临床测试程序部分，如测定给定治疗和/或预防方案的功效。检测可通过将抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物偶联至可检测物质来促进。可检测物质的实例包括各种酶、辅基、荧光物质、发光物质、生物发光物质、放射性物质、使用各种正电子发射断层显像术的正电子发射金属和非放射性顺磁性金属离子；金属离子参见例如，美国专利号4,741,900，该离子可偶联至抗体，以用于根据本发明的诊断。合适的酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳醣苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适辅基络合物的实例包括链霉抗生素蛋白/生物素和抗生物素蛋白/生物素；合适荧光物质的实例包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、若丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红素；发光材料的实例包括鲁米诺；生物发光材料的实例包括荧光素酶、荧光素和水母素；并且合适的放射线物质的实例包括125I、131I、111In或99Tc。
抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物也可通过将其偶联至化学发光化合物来可检测地标记。然后，化学发光标记抗体的存在通过检测化学反应过程期间产生的发光的存在来确定。尤其有用的化学发光标记化合物的实例为鲁米诺、异氨基苯二酰肼、山马蒂吖啶酯(theromatic acridinium ester)、咪唑、吖啶盐和草酸酯。
其中抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物可检测地标记的一种方式为将其连接至酶，以及在酶免疫测定(EIA)中使用连接产物(Voller,A.,"The Enzyme LinkedImmunosorbent Assay(ELISA)"Microbiological Associates Quarterly Publication,Walkersville,Md.,Diagnostic Horizons2(1978),1-7;Voller等,J.Clin.Pathol.31(1978),507-520;Butler,Meth.Enzymol.73(1981),482-523;Maggio,E.(编著),EnzymeImmunoassay,CRC Press,Boca Raton,Fla.,(1980);Ishikawa,E.等,(编著),EnzymeImmunoassay,Kgaku Shoin,Tokyo(1981))。结合至抗体的酶将与适当的底物，优选地生色底物反应，以便制备例如通过分光光度法、荧光或通过可视方式可检测的化学部分。可用于可检测地标记抗体的酶包括但不限于苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、δ-5-类固醇异构酶、酵母醇脱氢酶、α-甘油磷酸脱氢酶、丙糖磷酸异构酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、尿素酶、过氧化氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶。此外，检测可通过比色法实现，其利用了酶的生色底物。检测也可通过底物的酶反应程度与类似制备的标准品的可视比较实现。
检测也可使用任何多种其他免疫测定实现。例如，通过放射性标记抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物，可能可通过使用放射性免疫测定(RIA)检测抗体（参见例如，Weintraub,B.,Principles of Radioimmunoassays,Seventh Training Course onRadioligand Assay Techniques,The Endocrine Society,(March,1986)，该文献以引用方式并入）。放射性同位素可通过包括但不限于γ射线计数器、闪烁计数器或放射自显影的方法检测。
抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物也可使用荧光发射金属，例如152Eu或其他镧系元素可检测地标记。这些金属可使用例如二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)的金属螯合基团连接至抗体。
将各种部分偶联至抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的技术是熟知的，参见例如，Arnon等,"Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In CancerTherapy",于Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy,Reisfeld等(编著),243-56页(Alan R.Liss,Inc.(1985)；Hellstrom等,"Antibodies For Drug Delivery",于Controlled Drug Delivery(第2版),Robinson等(编著),Marcel Dekker,Inc.,623-53页(1987)；Thorpe,"Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy:AReview",于Monoclonal Antibodies'84:Biological And Clinical Applications,Pinchera等(编著),475-506页(1985)；"Analysis,Results,And Future Prospective OfThe Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy",于MonoclonalAntibodies For Cancer Detection And Therapy,Baldwin等(编著),AcademicPress303-16页(1985)和Thorpe等,"The Preparation And Cytotoxic Properties OfAntibody-Toxin Conjugates",Immunol.Rev.62(1982),119-158。
如上所述，在某些实施方案中，可偶联增强结合分子的稳定性或功效的部分，例如，结合多肽如抗体或其免疫特异性片段。例如，在一个实施方案中，PEG可偶联至本发明的结合分子，以增加它们的体内半衰期。Leong等,Cytokine16(2001),106;Adv.于DrugDeliv.Rev.54(2002),531；或Weir等,Biochem.Soc.Transactions30(2002),512。
VI.组合物和使用方法
本发明涉及包含前述tau结合分子，如本发明的抗体或其抗原结合片段或衍生物或其变体或本发明的多核苷酸、载体或细胞的组合物。本发明的组合物还可包含可药用载体。此外，本发明的药物组合物还可包含例如白介素或干扰素的药剂，取决于药物组合物的预期用途。对于tau蛋白病，如阿尔茨海默氏病的治疗用途，附加药剂可选自有机小分子、抗tau抗体以及它们的组合。因此，在特定实施方案中，本发明涉及tau结合分子，例如本发明的抗体或其抗原结合片段或具有其任何一者基本上相同的结合特异性的结合分子、本发明多核苷酸、载体或细胞用于制备预防和治疗处理tau蛋白病的药物或诊断组合物、监测受试者中tau蛋白病的进行或tau蛋白病治疗的响应或确定受试者患上tau蛋白病的风险的用途。
因此，在一个实施方案中，本发明涉及治疗神经疾病的方法，所述神经疾病特征在于tau分别在大脑和中枢神经系统中异常积累和/或沉积，该方法包括给需要其的受试者施用治疗有效量的本发明的前述tau结合分子、抗体、多核苷酸、载体或细胞中的任何一者。术语“神经疾病”包括但不限于tau蛋白病，例如阿尔茨海默氏病、肌萎缩性侧索硬化/帕金森–痴呆综合征、嗜银颗粒痴呆、英式淀粉样血管病、脑淀粉样血管病、皮质基底退化、克罗伊茨菲尔德-雅各布二氏病、拳击员痴呆、伴有钙质沉着的弥漫性神经原纤维缠结病、唐氏综合征、额颞痴呆、17号染色体相关的伴有帕金森症的额颞痴呆、额颞叶退化、杰茨曼-斯脱司勒-史茵克病、哈勒沃登-施帕茨病、包涵体肌炎、多系统萎缩、肌强直性营养不良、C型尼曼-皮克病、伴有神经原纤维缠结的非关岛运动神经元病、皮克氏病、脑炎后帕金森症、朊病毒蛋白脑淀粉样血管病、进行性皮质下胶质增生、进行性核上性麻痹、亚急性硬化全脑炎、缠结痴呆、多发性脑梗死性痴呆和缺血性中风。除非另外指明，术语神经退行性、神经病或神经精神病在本文中可互换使用。
本发明治疗方法的特定优点基于如下事实：本发明的抗体来源于无tau蛋白病症状的健康人受试者的B细胞或B记忆细胞，并且因此在一定可能性上能够预防临床上明显的tau蛋白病，或降低临床上明显的疾病发生的风险，或延迟临床上明显的疾病的发作或进行。通常，本发明的抗体也已经成功经历了体细胞成熟，即针对通过抗体可变区的体细胞变异方式高亲和力结合靶标tau分子的选择性和有效性的优化。
从自免疫或过敏性反应的意义上说，此类体内细胞，如人体中的细胞未通过相关的或其他生理蛋白或细胞结构的方式活化的认识也具有重大医学重要性，因为这意味着成功经历临床测试阶段的可能性显著增加。可以说，在至少一个人受试者中，在预防或治疗抗体的临床前和临床开发之前已显示出效率、可接受性和耐药性。因此，可以预期本发明的人抗tau抗体，作为治疗剂的靶标结构特异性效率及其副作用可能性的降低，均显著增加了其临床成功可能性。
本发明还分别提供了药物和诊断包装或试剂盒，其包括一个或多个填充有一种或多种上述成分的容器，所述成分例如本发明的抗tau抗体、其结合片段、衍生物或变体、多核苷酸、载体或细胞。政府部门规定的管理制造、使用或销售药物或生物制品形式的通知书可与此类容器相关联，该通知书反映了制造、使用或销售机构部门对于人施用的批准。此外或作为另外一种选择，该试剂盒包含用于适当诊断测定的试剂和/或使用说明。当然，本发明的组合物，如试剂盒尤其适用于tau的存在伴随的病症的风险评估、诊断、预防和治疗，并且具体地讲适用于阿尔茨海默氏病(AD)、肌萎缩性侧索硬化/帕金森–痴呆综合征(ALS-PDC)、嗜银颗粒痴呆(AGD)、英式淀粉样血管病、脑淀粉样血管病、皮质基底退化(CBD)、克罗伊茨菲尔德-雅各布二氏病(CJD)、拳击员痴呆、伴有钙质沉着的弥漫性神经原纤维缠结病、唐氏综合征、额颞痴呆、17号染色体相关的伴有帕金森症的额颞痴呆(FTDP-17)、额颞叶退化、杰茨曼-斯脱司勒-史茵克病、哈勒沃登-施帕茨病、包涵体肌炎、多系统萎缩、萎缩性肌强直、C型尼曼-皮克病(NP-C)、伴有神经原纤维缠结的非关岛运动神经元病、皮克氏病(PiD)、脑炎后帕金森症、朊病毒蛋白脑淀粉样血管病、进行性皮质下胶质增生、进行性核上性麻痹(PSP)、亚急性硬化全脑炎、缠结痴呆、多发性脑梗死性痴呆和缺血性中风的治疗。
本发明的药物组合物可根据本领域熟知的方法配制；参见例如Remington:TheScience and Practice of Pharmacy(2000)by the University of Sciences inPhiladelphia,ISBN0-683-306472。合适的药物载体的实例是本领域熟知的，并且包括磷酸盐缓冲盐溶液、水、乳液例如油/水乳液、各种类型润湿剂、无菌溶液等。包含此类载体的组合物可通过熟知的常规方法配制。这些药物组合物可以合适的剂量施用给受试者。合适组合物的施用可通过不同的方式实现，例如，通过静脉内、腹膜内、皮下、肌内、鼻内给药、局部施用或真皮内施或脊髓或大脑递送。气雾剂制剂例如鼻喷剂制剂包括含防腐剂和等渗剂的活性剂的纯净水溶液或其他溶液。将此类制剂调节至与鼻粘膜相容的pH和等渗状态。直肠或阴道施用的制剂可以含合适载体的栓剂提供。
此外，鉴于本发明包括在颅骨上钻出小孔，以施用本发明的药物的现在标准（虽然幸而不常见）的程序，在一个方面，本发明的结合分子，尤其是抗体或基于抗体的药物可跨过血脑屏障，从而允许静脉内施用或口服施用。
给药方案将由主治医师和临床因素确定。如医学领域所熟知，任何一个患者的剂量取决于多种因素，包括患者的体型、身体表面积、年龄、待施用的特定化合物、性别、施用时间和途径、一般健康以及同时施用的其他药物。通常的剂量可在，例如0.001至1000μg的范围内（或用于在该范围内表达或抑制表达的核酸）；然而，还设想了低于或高于该示例性范围的剂量，尤其考虑了前述因素。一般来讲，剂量可在例如约0.0001至100mg/kg、并且更通常地0.01至5mg/kg（例如，0.02mg/kg、0.25mg/kg、0.5mg/kg、0.75mg/kg、1mg/kg、2mg/kg等）宿主体重的范围内。例如，剂量可为1mg/kg体重或10mg/kg体重或在1至10mg/kg的范围内或至少1mg/kg。上述范围中的剂量中值也旨在处于本发明的范围内。受试者可每日、隔日、每周施用该剂量，或根据由经验分析确定的任何其他计划表。示例性的治疗需要在长期，例如至少六个月内施用多个剂量。附加的示例性治疗方案需要每两周施用一次或每月一次或每3至6个月一次。示例性的剂量计划表包括连续日1至10mg/kg或15mg/kg、隔日30mg/kg或每周60mg/kg。在一些方法中，具有不同结合特异性的两种或更多种单克隆抗体同时施用，在这种情况下每种施用的抗体的剂量处于所标示的范围内。进展可通过周期性评估监测。用于肠胃外施用的制剂包括无菌水溶液或非水溶液、悬浮液和乳液。非水溶剂的实例为丙二醇、聚乙二醇、植物油例如橄榄油和可注射有机酯例如油酸乙酯。水性载体包括水、醇/水溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。肠胃外媒介物包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸林格氏溶液或固定油。静脉内媒介物包括流体和营养补充剂、电解质补充剂（例如基于林格氏葡萄糖的那些）等。也可以存在防腐剂和其他添加剂，例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。此外，本发明的药物组合物还可包含例如多巴胺或精神药理学药物的药剂，取决于药物组合物的预期用途。
此外，在本发明的特定实施方案中，例如如果本发明的药物组合物包含用于被动免疫的抗tau抗体或其结合片段、衍生物或变体，药物组合物可配制为疫苗。如发明背景部分中所提及，磷酸化tau物质已报道处于细胞外的血浆和CSF中(Aluise等，Biochim.Biophys.Acta.1782(2008),549–558)，并且在使用磷酸化tau肽进行主动疫苗接种的转基因小鼠品系中的研究揭示，大脑中tau聚集体的水平降低，并且行为障碍的进展变慢(Sigurdsson,J.Alzheimers Dis.15(2008),157-168;Boimel等,Exp Neurol.224(2010),472-485)。因此，期望用本发明的人抗tau抗体和等同的tau结合分子被动免疫将帮助避免如已在发明背景部分中讨论的主动免疫治疗概念的多种副作用是明智的。因此，本发明现有的抗tau抗体及其等同物将尤其可用作预防或改善tau蛋白病，例如AD、ALS-PDC、AGD、CBD、CJD、FTD、FTDP-17、NP-C、PiD、PSP或前述其他tau蛋白病的疫苗。
在一个实施方案中，使用本发明抗体的重组双特异性或多特异性构建体可为有利的。参考文献参见Fischer和Léger,Pathobiology74(2007),3-14。此类双特异性分子可设计为靶向具有一个结合臂和另一个病理实体，例如Aβ或α-突触核蛋白的tau或具有第二结合臂的不同病理构象的tau。作为另外一种选择，第二结合臂可设计为靶向存在于血脑屏障处的蛋白质，以促进抗体渗入大脑。
在一个实施方案中，使用本发明抗体的重组Fab(rFab)和单链片段(scFvs)可为有利的，它们更容易渗入细胞膜。例如，Robert等，Protein Eng.Des.Sel.(2008)10月16日;S1741-0134（在线提前发表）描述了单克隆抗体WO-2的嵌合重组Fab(rFab)和单链片段(scFvs)的使用，其识别Aβ的N-末端区的表位。经工程化改造的片段能够(i)防止淀粉样原纤维化，(ii)解聚预成型Aβ1-42原纤维以及(iii)抑制Aβ1-42寡聚物介导的体外神经毒性，其效率与整个IgG分子相同。使用缺乏效应子功能的小Fab和scFv工程化抗体形式的感知优势包括更有效地跨过血脑屏障，并且使引发炎性副反应的风险最小化。此外，除scFv和单域抗体保持全长抗体的结合特异性之外，它们也可以单基因表达，并且在哺乳动物细胞内以胞内抗体表达，具有用于改变其靶标的折叠、相互作用、修饰或亚细胞定位的潜力；综述参见例如，Miller和Messer,Molecular Therapy12(2005),394–401。
在不同的方法中，Muller等,Expert Opin.Biol.Ther.(2005),237-241描述了所谓的“超级抗体技术”平台，其据说能够使抗体穿梭至活细胞而不伤害它们。此类细胞穿透抗体打开了新的诊断和治疗窗口。术语“TransMabs”即为这些抗体而创造的。
在另外的实施方案中，用于治疗tau蛋白病的其他抗体的共施用或连续施用可为期望的。在一个实施方案中，附加抗体包含在本发明的药物组合物中。可用于治疗受试者的抗体的实例包括但不限于靶向β-淀粉样、α-突触核蛋白、TDP-43和SOD-1的抗体。
在另外的实施方案中，用于治疗tau蛋白病的其他神经保护剂的共施用或连续施用可为期望的。在一个实施方案中，附加药剂包含在本发明的药物组合物中。可用于治疗受试者的神经保护剂的实例包括但不限于乙酰胆碱酯酶抑制剂、谷氨酸能受体拮抗剂、激酶抑制剂、HDAC抑制剂、抗炎剂、双丙戊酸钠或它们的任何组合。可伴随着本发明药物组合物使用的其他神经保护剂的实例在本领域中有所描述；参见例如，国际专利申请WO2007/011907。在一个实施方案中，附加药剂为多巴胺或多巴胺受体激动剂。
治疗有效剂量或量是指足以改善症状或病症的活性成分的量。此类化合物的治疗功效和毒性可通过细胞培养或实验动物中的标准制药程序测定，例如，ED50（群体50%的治疗有效剂量）和LD50（群体50%的致死剂量）。治疗和毒性效应之间的剂量比是治疗指数，并且可以比率LD50/ED50表示。在一个实施方案中，在AD、ALS-PDC、AGD、CBD、CJD、FTD、FTDP-17、NP-C、PiD、PSP或上述其他tau蛋白病的情况下，组合物中的治疗剂以足以恢复或保持正常行为和/或认知特性的量存在。
从前面可以看出，本发明明显涵盖包含上述抗体的至少一个CDR的tau结合分子的任何用途，具体地讲用于诊断和/或治疗上述tau蛋白病，尤其是阿尔茨海默氏病。在一个实施方案中，所述结合分子为本发明的抗体或其免疫球蛋白链。此外，本发明涉及上文所述抗体中任何一者的抗独特型抗体。这些抗体是结合位于抗原结合位点附近抗体的可变区上的独特抗原肽序列的抗体或其他结合分子，并且用于例如受试者样本中抗tau抗体的检测。
在另一个实施方案中，本发明涉及包含本发明上述tau结合分子、抗体、抗原结合片段、多核苷酸、载体或细胞中的任何一者的诊断组合物，以及任选地合适的检测方法，例如常用于免疫或基于核酸的诊断方法的试剂。本发明的抗体，例如适用于免疫测定，其中它们可用于液相，或结合至固相载体。可利用本发明抗体的免疫测定的实例为直接或间接形式的竞争性和非竞争性免疫测定。此类免疫测定的实例为放射性免疫测定(RIA)、夹心（免疫测定）、流式细胞术和蛋白质印迹测定。本发明的抗原和抗体可结合至多种不同的载体，并且用于分离与其特异性结合的细胞。熟知的载体的实例包括玻璃、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚碳酸酯、葡聚糖、尼龙、直链淀粉、天然和改性纤维素、聚丙烯酰胺、琼脂糖和磁铁矿。出于本发明的目的，载体的性质可以是可溶性的或不溶性的。有多种不同的本领域普通技术人员已知的标记和标记方法。可用于本发明的标记类型的实例包括酶、放射性同位素、胶态金属、荧光化合物、化学发光化合物和生物发光化合物；也可参见上文讨论的实施方案。
通过另外的实施方案，tau结合分子，具体地讲本发明的抗体也可用于个体中病症的诊断方法，所述方法通过如下步骤进行：获得来自测试个体的体液样本，该样本可以是血液样本、淋巴样本或任何其他体液样本；并且在能够形成抗体-抗原复合物的条件下使体液样本接触本发明的抗体。然后，通过本领域已知的方法测定此类复合物的水平，该水平显著高于对照样本中形成的水平，表明测试个体中存在疾病。以同样的方式，也可使用由本发明抗体结合的特异性抗原。因此，本发明涉及包括结合分子，如本发明的抗体或其抗原结合片段的体外免疫测定。
就此而论，本发明还涉及为该目的而特别设计的方法。例如，可使用基于抗体的阵列，该阵列例如加载了特异性识别tau的本发明抗体或等同抗原结合分子。微阵列免疫测定的设计汇总在Kusnezow等,Mol.Cell Proteomics5(2006),1681-1696中。因此，本发明还涉及加载了根据本发明鉴定的tau结合分子的微阵列。
在一个实施方案中，本发明涉及诊断受试者中的tau蛋白病的方法，该方法包括确定来自受试者的样本中tau和/或病理修饰的和/或聚集的tau的存在，该受试者用本发明的至少一种抗体、其tau结合片段或与其任何一者具有基本上相同的结合特异性的tau结合分子诊断，其中病理修饰的和/或聚集的tau的存在表明神经退行性tau蛋白病，并且与生理tau形式的水平相比，病理修饰的和/或聚集的tau的水平的增加表明所述受试者中神经退行性tau蛋白病进展。
待诊断受试者的疾病可以是无症状的或临床前的。在一个实施方案中，对照受试者患有tau蛋白病，例如AD、ALS-PDC、AGD、CBD、CJD、FTD、FTDP-17、NP-C、PiD、PSP或前述其他tau蛋白病，其中病理修饰的和/或聚集的tau的水平和参考标准品之间的相似性表明待诊断的受试者患有tau蛋白病。作为另外一种选择，或除此之外，作为第二对照，对照受试者不患有tau蛋白病，其中tau和/或病理修饰的和/或聚集的tau的水平和参考标准品之间的差异表明待诊断的受试者患有tau蛋白病。在一个实施方案中，待诊断的受试者和对照受试者的年龄匹配。待分析的样本可以是任何被怀疑包含病理修饰的和/或聚集的tau的体液，例如血液、CSF或尿液样本。
Tau和/或病理修饰的和/或聚集的tau的水平可通过本领域已知的任何合适方法评估，该方法包括例如通过一种或多种选自以下的技术分析tau：蛋白质印迹、免疫沉淀、酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射性免疫测定(RIA)、荧光活化细胞分选仪分析(FACS)、双向凝胶电泳、质谱分析(MS)、基质辅助激光解吸/电离-飞行时间-MS(MALDI-TOF)、表面增强激光解吸电离-飞行时间(SELDI-TOF)、高效液相色谱(HPLC)、快速蛋白液相色谱(FPLC)、多维液相色谱(LC)然后串联质谱(MS/MS)和激光密度分析。在一个实施方案中，所述tau的体内成像包括正电子发射断层显像术(PET)、单光子发射断层显像术(SPECT)、近红外(NIR)光学成像或磁共振成像(MRI)。
可根据本发明修改的使用抗体诊断tau蛋白病例如阿尔茨海默氏病、监测tau蛋白病进展和监测tau蛋白病治疗的方法和相关方法在国际申请WO93/08302、WO94/13795、WO95/17429、WO96/04309、WO2002/062851和WO2004/016655中也有所描述。类似地，基于抗体的tau检测方法在国际申请WO2005/080986中有所描述，该专利申请的所有公开内容以引用方式并入本文。那些方法可根据所描述，但与本发明的tau特异性抗体、结合片段、衍生物或变体一起应用。
在另外的方面，本发明还涉及具有由本发明任何抗体特异性识别的tau表位的肽。在一个实施方案中，此类肽包含SEQ ID NO:7、SEQID NO:41、SEQ ID NO:42标示的氨基酸序列或其修饰序列，其中一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或更多个氨基酸被置换、缺失和/或添加，其中所述肽由本发明的任何抗体，例如由抗体NI-105.4E4或NI-105.4E3识别。
在本发明的一个实施方案中，此类肽可用于诊断受试者的神经退行性tau蛋白病，所述诊断包括如下步骤：确定结合所述受试者的生物样本中的肽的抗体的存在，用于通过测量识别本发明上述肽的抗体水平来诊断所述受试者中的tau蛋白病，以及比较测量值与存在于可比年龄和性别的健康受试者中的水平。对本发明所述肽具有特异性的测量抗体的升高水平将表明诊断所述受试者中tau蛋白病。本发明的肽可分别配制于阵列、试剂盒和组合物中，如上文所述。
本发明说明书和实施例中公开和涵盖了这些和其他实施方案。关于根据本发明采用的材料、方法、用途和化合物中的任何一者的其他文献可从公用图书馆和数据库，使用例如电子设备检索。例如，可利用公用数据库"Medline"，该数据库由位于美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)的国家生物技术信息中心(National Center forBiotechnology Information)和/或国家医学图书馆(National Library of Medicine)主办。其他数据库和网址是本领域技术人员已知的，也可使用互联网搜索引擎获得，例如作为欧洲分子生物学实验室(European Molecular Biology Laboratory)(EMBL)一部分的欧洲生物信息研究所(European Bioinformatics Institute)(EBI)。生物技术的专利信息的概述以及用于回溯检索和最新情报通报的专利信息的相关资源概况在Berks,TIBTECH12(1994),352-364中给出。
上述公开内容整体上描述了本发明。除非另外指明，本文所用的术语以OxfordDictionary of Biochemistry and Molecular Biology,Oxford University Press,1997,2000年修订并且2003年再版，ISBN0198506732中提供的定义给出。本说明书的正文中引用了多个文档。全部文献引文可见于说明书的末尾，紧接着权利要求之前。所有引用的参考文献的内容（包括本申请通篇引用的参考文献、公布专利、公开专利申请以及制造商说明书、说明等）据此明确地以引用方式并入；然而，并非认为任何引用的文档均实际上是关于本发明的现有技术。
可参考以下具体实施例获得更完整的理解，本文提供的实施例仅出于例证目的，并且不旨在限制本发明的范围。
实施例
以下实施例进一步说明了本发明，但不应解释为以任何方式限制本发明的范围。实施例1至4中的如下实验针对所克隆的抗体NI-105.4E4、NI-105.24.B2和105.4A3，即未调整为人可变重链和轻链的种系(GL)序列的框架1(FR1)Ig-可变区进行举例说明和描述；参见图1。
材料和方法
常规方法的详述，例如本文采用的那些可见于引用的文献中；另参见"The MerckManual of Diagnosis and Therapy"Seventeenth Ed.由Beers和Berkow编著(Merck&Co.,Inc.2003)。
除非另外指明，本发明的实施将采用细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术，这些技术在本领域的技术内。关于用于本发明实施的一般技术的其他详细说明，专业人员可参考细胞生物学和组织培养的标准教科书和综述；也可参见实施例中引用的参考文献。分子和细胞生物化学的一般方法可见于标准教科书，例如Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第3版(Sambrook等,HarborLaboratory Press2001)；Short Protocols in Molecular Biology,第4版(Ausubel等编著,John Wiley&Sons1999)；DNA Cloning,卷I和II(Glover编著,1985);OligonucleotideSynthesis(Gait编著,1984)；Nucleic Acid Hybridization(Hames和Higgins编著1984)；Transcription And Translation(Hames和Higgins编著1984)；Culture Of Animal Cells(Freshney和Alan,Liss,Inc.,1987)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(Miller和Calos,编著)；Current Protocols in Molecular Biology and ShortProtocols in Molecular Biology,第3版(Ausubel等,编著)；以及Recombinant DNAMethodology(Wu,编著,Academic Press)。Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(Miller和Calos,编著,1987,Cold Spring Harbor Laboratory)；Methods InEnzymology,卷154和155(Wu等,编著)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press,1986)；Perbal,A Practical Guide To Molecular Cloning(1984)；论文Methods InEnzymology(Academic Press,Inc.,N.Y.)；Immunochemical Methods In Cell AndMolecular Biology(Mayer和Walker,编著,Academic Press,London,1987)；Handbook OfExperimental Immunology,卷I-IV(Weir和Blackwell,编著,1986)。Protein Methods(Bollag等,John Wiley&Sons1996)；Non-viral Vectors for Gene Therapy(Wagner等编著,Academic Press1999)；Viral Vectors(Kaplitt&Loewy编著,Academic Press1995)；Immunology Methods Manual(Lefkovits编著,Academic Press1997)；和Cell and TissueCulture:Laboratory Procedures in Biotechnology(Doyle&Griffiths,John Wiley&Sons1998)。公开内容涉及的用于遗传操作的试剂、克隆载体和试剂盒可得自商业化载体，例如BioRad、Stratagene、Invitrogen、Sigma-Aldrich和ClonTech。细胞培养和培养基收集的一般技术在Large Scale Mammalian Cell Culture(Hu等,Curr.Opin.Biotechnol.8(1997),148)；Serum-free Media(Kitano,Biotechnology17(1991),73)；Large ScaleMammalian Cell Culture(Curr.Opin.Biotechnol.2(1991),375)；和Suspension Cultureof Mammalian Cells(Birch等,Bioprocess Technol.19(1990),251)；Extractinginformation from cDNA arrays,Herzel等,CHAOS11(2001),98-107中有所概述。
Tau特异性B细胞的鉴定方法和相应抗体的克隆方法
除非在下面另外指明，tau特异性B细胞的鉴定和显示出所关注特异性的抗tau抗体的分子克隆，及其重组表达和功能表征已经或通常可以如国际申请PCT/EP2008/000053（以WO2008/081008公布）的实施例和补充方法部分所述进行，该专利申请的公开内容全文以引用方式并入本文。本专利申请中提供了tau特异性B细胞的鉴定和显示出所关注特异性的tau抗体的分子克隆，及其重组表达和功能表征的新方法。如上所述，在本发明的一个实施方案中，培养单或寡克隆B细胞的培养物，并且对包含通过所述B细胞产生的抗体培养物的上清液筛选其中新型抗tau抗体的存在和亲和力。筛选方法包括如下步骤：如实施例1中描述和图9中示出的敏感组织淀粉样蛋白斑免疫反应性(TAPIR)测定；如实施例2中描述和图3和8中示出的筛选大脑提取物的结合PHFTau；筛选来源于以SEQ ID NO:6表示的氨基酸序列的tau的肽与所述序列的氨基酸Ser-202和Ser-205上、氨基酸Thr-231上和/或氨基酸Ser-396和Ser-404上磷酸基团的结合，所述序列如实施例3中类似描述和图5中示出，由于抗体NI-105.4E4的表位确认实验而具有非磷酸化的肽；筛选以SEQ ID NO:6表示的氨基酸序列的全长tau的结合以及分离检测到与其结合的抗体或产生所述抗体的细胞，如国际专利WO2008/081008中所描述，以及如实施例1中所描述和图2、5和7中所示出。
抗原的纯化
重组人Tau40购自rPeptide(Bogart,GA,USA)。PHFTau从AD大脑提取。
含病理磷酸化tau纤维(PHFTau)的成对螺旋纤维的分离在Goedert等(Goedert等,Neuron8(1992),159-168)的改进方法后进行。将一克AD大脑组织切成5mm切片，移除所有可见血管。组织用40ml冰冷的洗涤溶液（100mM Tris pH7.4、6mM EGTA、1mM Na3VO4和1mM NaF）洗涤三次，然后用20ml裂解缓冲液（10mM Tris pH7.4、0.8M NaCl、1mM EGTA、1×蛋白酶抑制剂混合物、1mM Na3VO4、1mM NaF、1mM AEBSF、10%蔗糖）进行匀浆。将匀浆在4℃20’000×g下离心20分钟。上清液通过加入N-月桂酰肌氨酸酯(Sigma,Switzerland)至1%(w/v)来收集。在37℃下振荡孵育两小时后，然后将上清液在4℃100’000×g下离心一小时。收集沉淀并且重悬于PBS中。在用蛋白A磁珠清除可能的污染免疫球蛋白后，将PHFTau悬浮液保存在-80℃下直到使用。相应地制备来自健康对照人大脑组织的对照提取物。
人tau抗体的筛选
ELISA：
用碳酸盐ELISA涂覆缓冲液(pH9.6)中的重组tau蛋白(rPeptide,Bogart,USA)以1μg/ml的标准浓度涂覆96孔半区微孔板(Corning)，在4℃下过夜。对于PHFTau筛选，用从人AD大脑提取的在碳酸盐ELISA涂覆缓冲液(pH9.6)中以1:100稀释的PHFTau涂覆96孔Immobilizer微孔板(Nunc,Denmark)，在4℃下过夜。将板在PBS-T(pH7.6)中洗涤，并且非特异性结合位点在室温下用包含2%BSA的PBS-T(Sigma,Buchs,Switzerland)封闭2小时。将B细胞条件培养基从记忆B细胞培养板转移至ELISA板，并且在室温下孵育一小时。将ELISA板在PBS-T中洗涤，并且然后与辣根过氧化物酶(HRP)偶联的驴抗人IgG（Fcγ片段特异性）多克隆抗体(Jackson immunoResearch,Newmarket,UK)孵育。在用PBS-T洗涤后，人抗体的结合在标准比色测定中通过HRP活性的测量确定。
微孔板筛选
用30μg/ml PBS中的rTau(rPeptide)、PHFTau大脑提取物和健康对照大脑提取物涂覆标准96孔10点MULTI-SPOT板(Meso Scale Discovery,USA)。非特异性结合位点在室温下用包含3%BSA的PBS-T封闭1小时，然后与B细胞条件培养基在室温下孵育1小时。将板在PBS-T中洗涤，并且然后与SULFO标记偶联的抗人多克隆抗体(Meso Scale Discovery,USA)孵育。在用PBS-T洗涤后，抗体的结合使用SECTOR Imager6000(Meso Scale Discovery,USA)通过电化学发光测量检测。
Tau抗体的分子克隆
包含记忆B细胞的样本得自健康人受试者。收获所选记忆B细胞培养物的活B细胞，并且制备mRNA。然后，免疫球蛋白重链和轻链序列使用巢式PCR方法获得。
将代表人免疫球蛋白种系全体成员的所有序列家族的引物组合用于前导肽、V-片段和J-片段的扩增。第一轮扩增使用5’末端的前导肽特异性引物和3’末端的恒定区特异性引物进行(Smith等,Nat Protoc.4(2009),372-384)。对于重链和κ轻链，第二轮扩增使用5’末端的V-片段特异性引物和3’末端的J-片段特异性引物进行。对于λ轻链，第二轮扩增使用5’末端的V-片段特异性引物和3’末端的C-区特异性引物进行（Marks等,Mol.Biol.222(1991),581-597；de Haard等,J.Biol.Chem.26(1999),18218-18230）。
具有所需特异性的抗体克隆的鉴定在重组表达完整抗体后通过ELISA重新筛选进行。完整人IgG1抗体或嵌合IgG2a抗体的重组表达在可变重链和轻链序列“在正确的阅读框中”插入表达载体后实现，使得可变区序列在5’末端与编码前导肽的序列互补，并且在3’末端与编码适当恒定域的序列互补。为此，引物包含设计为有利于可变重链和轻链序列克隆至抗体表达载体的限制性位点。重链免疫球蛋白通过将免疫球蛋白重链RT-PCR产物在框内插入携带信号肽和人免疫球蛋白γ1或小鼠免疫球蛋白γ2a的恒定域的重链表达载体来表达。κ轻链免疫球蛋白通过将κ轻链RT-PCR产物在框内插入提供信号肽和人κ轻链免疫球蛋白的恒定域的轻链表达载体来表达。λ轻链免疫球蛋白通过将λ轻链RT-PCR产物在框内插入提供信号肽和人或小鼠λ轻链免疫球蛋白的恒定域的λ轻链表达载体来表达。
功能重组单克隆抗体在共转染至含有Ig-重链表达载体和κ或λIg-轻链表达载体的HEK293或CHO细胞（或人或小鼠来源的任何其他适当受体细胞系）后获得。随后，重组人单克隆抗体使用标准蛋白A柱纯化法从条件培养基纯化。重组人单克隆抗体可使用瞬时或稳定转染的细胞以无限量制备。产生重组人单克隆抗体的细胞系可通过直接使用Ig-表达载体或通过将Ig-可变区重新克隆至不同的表达载体来建立。衍生物例如F(ab)、F(ab)2和scFv也可从这些Ig-可变区制备。
抗体
小鼠单克隆抗人tau抗体Tau12(Covance,California,U.S.A.)和小鼠单克隆tau抗体AT180(Thermo Scientific,U.S.A.)根据制造商方案使用。重组人tau抗体NI-105.4E4、NI105.24B2和NI-105.4A3是本发明的抗体。它们在HEK293或CHO细胞中表达，从条件培养基纯化，并且直接用于随后的应用，除非另外指明。在实施例1至4中，使用本发明的纯化重组抗体。
直接ELISA
用在碳酸盐ELISA涂覆缓冲液(50mM,pH9.6)中稀释至1μg/ml的浓度的重组tau蛋白(hTau40,rPeptide,Bogart,USA)涂覆96孔微孔板(Costar,Corning,USA)，在4℃下过夜。非特异性结合位点在室温下用包含2%BSA的PBS(Sigma,Buchs,Switzerland)和0.5%Tween20封闭2小时。本发明的人抗体（NI-105.4E4、NI-105.24B2和NI-105.4A3）的结合使用HRP偶联的山羊抗人IgG Fcγ(Jackson immunoResearch,Newmarket,UK)，然后在标准比色测定中通过HRP活性的测量确定。EC50值使用GraphPad Prism软件(San Diego,USA)通过非线性回归估算。
蛋白质印迹蛋白染色
PHFTau和重组hTau40通过梯度SDS-PAGE(NuPAGE4-12%;Invitrogen,Basel,Switzerland)，然后在硝化纤维膜上进行电印迹来解析。在室温下用2%BSA封闭非特异性结合一小时后，将印迹与一抗NI-105.4E4、NI-105.24B2（人）或Tau12（小鼠单克隆抗体，Covance,California,U.S.A.），然后与HRP偶联的山羊抗人IgGFcγ（抗人一抗）或HRP偶联的山羊抗小鼠IgG二抗孵育过夜。
印迹使用ECL和ImageQuant350检测(GE Healthcare,Otelfingen,Switzerland)显色。
从AD大脑提取PHFTau
含病理磷酸化tau纤维(PHFTau)的成对螺旋纤维的分离在Goedert等(Goedert等,Neuron8(1992),159-168)的改进方法后进行。将一克AD大脑组织切成5mm切片，移除所有可见血管。组织用40ml冰冷的洗涤溶液（100mM Tris pH7.4、6mM EGTA、1mM Na3VO4和1mM NaF）洗涤三次，然后用20ml裂解缓冲液（10mM Tris pH7.4、0.8M NaCl、1mM EGTA、1×蛋白酶抑制剂混合物、1mM Na3VO4、1mM NaF、1mM AEBSF、10%蔗糖）进行匀浆。将匀浆物在4℃20’000×g下离心20分钟。上清液通过加入N-月桂酰肌氨酸酯(Sigma,Switzerland)至1%(w/v)来收集。在37℃下振荡孵育两小时后，然后将上清液在4℃100’000×g下离心一小时。收集沉淀并且重悬于PBS中。在用蛋白A磁珠清除可能的污染免疫球蛋白后，将PHFTau悬浮液保存在-80℃下直到使用。相应地制备来自健康对照人大脑组织的对照提取物。
Tau肽合成
对应于hTau40的第333至346位氨基酸的肽(333GGGQVEVKSEKLDF346)包含Pepspot标绘鉴定的NI-105.4E4表位（第337至343位氨基酸），通过Schafer-N(Copenhagen,Denmark)合成。将附加的半胱氨酸添加至C-末端，以允许共价键合至Immobilizer微孔板(Nunc,Denmark)。对应于人tau第226至239位氨基酸的第二肽(226VAVVRpTPPKSPSSA239)，可商购获得的小鼠单克隆tau抗体AT180(Thermo Scientific,USA)的同源表位相应地合成，并且用作对照。
转基因小鼠
将三种不同的tau蛋白病动物模型用于验证本发明的tau抗体（及其具有结合特异性的分子）。
1.转基因TauP301L小鼠（品系183）：在鼠Thy1.2启动子调控下表达具有P301L突变的人Tau40（这些转基因动物的制备在等,J.Biol.Chem.276(2001),529-534和国际申请WO2003/017918中有所描述，其公开内容以引用方式并入本文）。
2.JNPL3小鼠：在鼠PrP启动子的调控下表达具有P301L突变的最短4R人tau亚型（得自Taconic,Hudson,NY,U.S.A）。
3.P301STau（品系PS19）小鼠：在鼠PrP启动子的调控下表达具有P301S突变的人tau（得自Jackson Laboratory,Bar Harbor,Maine,U.S.A）。
将tau蛋白病小鼠模型和相应的野生型小鼠保持在标准饲养条件下，12h:12h颠倒光/暗周期，自由获取食物和水。平衡治疗组的年龄和性别。
实施例1：人tau抗体的靶标和结合特异性验证
为了验证tau是分离抗体的识别靶标，如上所述进行直接ELISA测定。对于示例性重组人NI-105.4A3抗体，用稀释至3μg/ml浓度的重组人tau(hTau40,rPeptide,Bogart,USA)或用碳酸盐ELISA涂覆缓冲液(pH9.6)中的BSA涂覆96孔微孔板(Costar,Corning,USA)，并且测试抗体的结合效率。ELISA显示，示例性NI-105.4A3抗体特异性结合人tau。未观察到结合至BSA（图10）。
为了确定示例性抗体NI-105.4E4和NI-105.24B2的半最大有效浓度(EC50)，进行不同抗体浓度的附加直接ELISA实验。用在碳酸盐ELISA涂覆缓冲液中稀释至1μg/ml浓度（对于使用NI-105.4E4抗体的测定）或3μg/ml（对于使用NI-105.24B2抗体的测定）的重组人tau(hTau40,rPeptide,Bogart,USA)涂覆96孔微孔板(Costar,Corning,USA)，并且测试抗体的结合效率。EC50值使用GraphPad Prism软件通过非线性回归估算。重组人来源抗体NI-105.4E4结合hTau40，其具有在2.4nM EC50的低纳摩尔范围内具有高亲和力（图2）。NI-105.24B2结合hTau40，其具有在6.6nM EC50的低纳摩尔范围内的高亲和力（图7）。
示例性抗体NI-105.4A3的半最大有效浓度(EC50)也使用直接ELISA实验确定。用重组人tau(hTau40,1μg/ml)、PHFTau(1:100)和对照制剂(1:100)涂覆ELISA板，并且以不同的抗体浓度孵育。NI-105.4A3结合rTau，其具有在1.4nM EC50的低纳摩尔范围内的高亲和力。NI-105.4A3结合PHFTau，其具有在1.2nM EC50的低纳摩尔范围内的高亲和力（图12）。
实施例2：重组人抗体与重组tau和从AD大脑提取的病理tau的结合分析
为了确定NI-105.4E4和NI-105.24B2与从AD大脑提取的病理tau物质的结合能力。如上面所详细描述进行SDS-PAGE和蛋白质印迹分析。将印迹与一抗NI-105.4E4（人）、NI-105.24B2（人）或Tau12（小鼠单克隆抗体，Covance,California,U.S.A.），然后与HRP偶联的山羊抗人IgGFcγ（抗人抗体）或HRP偶联的山羊抗小鼠IgG二抗孵育过夜。
在蛋白质印迹上，重组抗体NI-105.4E4（图3）和NI-105.24B2（图8）识别重组hTau40以及从AD大脑提取的病理修饰的PHFTau。如所期望，对照抗体Tau12也识别两种tau物质（图3）。
此外，如上面实施例1中所讨论，示例性抗体NI-105.4A3的半最大有效浓度(EC50)在直接ELISA实验中使用PHFTau确定。NI-105.4A3结合PHFTau，其具有在1.2nM EC50的低纳摩尔范围内的高亲和力（图12）。
实施例3：hTau40上NI-105.4E4和NI-105.4A3结合表位的标绘
将覆盖全长hTau40（第1至441位氨基酸）、在两个邻近肽之间具有11个氨基酸重叠的118个肽序列的肽阵列点在硝化纤维膜(JPT Peptide Technologies GmbH,Berlin,Germany)上。抗体的免疫标记以及膜再生根据制造商的说明进行。为了排除检测抗体的非特异性结合，膜首先用HRP偶联的山羊抗人IgG探测，省略了一抗（图4B）。再生后，膜用100nM重组NI-105.4E4抗体探测。结合的抗体使用ECL和ImageQuant350检测仪(GE Healthcare,Otelfingen,Switzerland)检测。
当仅与检测抗体（图4B）进行比较时，两组相邻肽点（肽83、84和85；肽96和97）通过NI105.4E4（图4A和A'）特异性识别。被这两组肽覆盖的序列对应于hTau40第329至351位和第387至397位氨基酸。这些数据暗示，NI-105.4E4识别包含两个直链序列的不连续表位：一个在R4微管结合域内，并且另一个在C末端域内。
肽83至85共享的序列包含hTau40的第337至343位氨基酸残基。Pepspot(JPT)数据暗示，NI-105.4E4识别包含人tau的第337至343位氨基酸的hTau中的表位。该区域位于tau的微管结合域内，并且在所有神经元人tau亚型，以及包括小鼠和大鼠的其他物种中是保守的。
随着该域以生理微管相关tau结合微管，NI-105.4E4预期优选地靶向从微管分离的tau的病理相关库。
为了确定NI-105.4E4结合肽内的关键残基，进行丙氨酸扫描，使每个残基被丙氨酸每次一个地置换。原始序列中的丙氨酸残基（A384和A390）被置换为脯氨酸和甘氨酸（图4E）。点35至50和51至68（图4C）为原始肽（点35和点51）及其丙氨酸置换变体，它们的氨基酸序列在图4D和E中示出。丙氨酸扫描暗示V339、E342、D387、E391和K395对于NI-105.4E4结合是必须的。
附加实验已通过测试NI-105.4E4与tau肽的结合进行。直接ELISA显示，NI-105.4E4特异性识别对应于hTau40的第333至346位氨基酸的肽，其包含由Pepspot标绘鉴定的第337至343位氨基酸残基（图5）。未观察到NI-105.4E4对覆盖AT180表位的对照肽的交叉反应性。反之亦然，AT180识别其包含肽的同源表位，但不能结合NI-105.4E4特异性肽。物种特异性二抗不结合任何肽。同时，涂覆肽的直接ELISA确认，NI-105.4E4特异性识别包含由Pepspot标绘鉴定的人tau的第337至343位氨基酸残基的肽。
为了大致标绘hTau40上的NI-105.4A3结合表位，制备四种tau域多肽（Tau域I、域II、域III和域IV）。将使用(Invitrogen)合成的，编码每个具有N-末端6xHis标签的Tau域的DNA片段克隆至pRSET-A表达载体(Invitrogen)，转染至大肠杆菌BL21(DE3)(New England Biolabs)。His标记的Tau域的表达通过0.5mM IPTG诱导六小时，然后用溶菌酶和超声处理裂解细菌。在用Ni-NTA Superflow柱(Qiagen)进一步纯化前煮沸裂解物五分钟。将洗脱的His标记的Tau域涂覆在ELISA板上，或加载于聚丙烯酰胺凝胶上用于蛋白质印迹。这些基本上重叠的tau域多肽覆盖全长hTau40（图13A）。将纯化的tau域涂覆在ELISA板上，并且测试NI-105.4A3的结合。NI-105.4A3仅结合tau域I和全长hTau40，表明表位在hTau40的N-末端部分(aa1-136)内（图13B）。蛋白质印迹确认了NI-105.4A3与tau域I的特异性结合（图13C）。
用PepSpot(JPT)技术进行的NI-105.4A3表位标绘鉴定了人Tau40的氨基酸Q35至Q49（图14A和C）。为了确定NI-105.4A3结合表位内的关键残基，进行丙氨酸扫描以使每个残基被丙氨酸每次一个地置换。原始序列(A41)中的丙氨酸残基被甘氨酸或脯氨酸置换（图14B）。从左至右编号为1和17的点是原始表位（点1）及其丙氨酸置换，其氨基酸序列在图14C中示出。丙氨酸扫描示出，D40、A41和K44为NI-105.4A3结合的关键残基。
实施例4：AD大脑组织和人tau转基因小鼠中NI-105.4E4与tau的生理形式以及病理聚集体结合的评估
由超磷酸化tau纤维组成的神经原纤维缠结(NFT)是AD的神经病理学标志。超磷酸化tau纤维也是营养不良性神经突和神经纤维网线的主要组分，它们二者是AD中的普遍神经病理特征。包含小鼠中家族P301L tau突变的人tau的过表达诱导了六个月龄时的NFT形成(Gotz等.,2001a)。
为了评估重组人tau抗体与tau的生理形式以及病理聚集体的结合，在AD大脑组织和TauP301L转基因小鼠中用本发明的示例性NI-105.4E4抗体进行免疫组织染色。
在室温深麻醉下给小鼠灌注20ml100mM TrisCl/6mM EGTA(pH7.4)。取出大脑，并且浸入PBS中的4%PFA(pH7.4)中，在4℃下固定过夜，然后包埋于石蜡中。对于人组织，使用来自AD和健康对照受试者大脑组织的石蜡块。DAB染色根据标准方案进行。作为阳性对照，使用小鼠单克隆抗体Tau-12(Covance,California,U.S.A.)。还包括不含一抗的HRP偶联的检测抗体。
重组人抗体NI-105.4E4识别AD大脑中的多种NFT和神经纤维网线（图6A），它们不存在于健康对照大脑中（图6B）。单独二抗不会给出AD（图6C）和对照大脑（图6D）二者中的信号。在P301Ltau转基因小鼠大脑中，NI-105.4E4强烈结合类似于NFT的病理tau（图6E、F和H）、神经纤维网线（图6E和G）以及营养不良性神经突（图6E和H）。此外，NI-105.4E4在预缠结阶段还识别tau聚集体（图6I）。在过表达人P301L tau和含瑞典和北极突变的人APP二者的转基因小鼠的大脑中，NI-105.4E4特异性结合β-淀粉样蛋白斑周围的营养不良性神经突（图6J）。
实施例5：本发明抗体的体内测定
如上面已描述，在使用磷酸化tau肽进行主动疫苗接种的转基因小鼠品系中的研究揭示，大脑中tau聚集体的水平降低，并且行为障碍的进展变慢(Sigurdsson,J.Alzheimers Dis.15(2008),157-168;Boimel等,Exp.Neurol.224(2010),472-485)。然而，主动疫苗接种不是特用于人的，因为预期大部分老年群体是疫苗接种的非应答者。此外，于tau诱导的免疫应答相关的潜在副作用难以控制。由于其对病理tau物质的类似结合特异性，合理预期本发明的tau结合分子可实现tau聚集体的大脑水平类似下降，如上面针对小鼠抗体所述。然而，由于人免疫系统内的进化优化和亲和力成熟，本发明的抗体提供了有价值的治疗工具，因为它们从具有优异安全特征和缺乏免疫原性的高度可能性的健康人受试者分离。这些预期治疗效果的确认可由上述使用小鼠抗体的实验中所述的测试方法提供。具体地讲，待筛选的抗体可通过多种可能途径施用至动物，例如腹膜内抗体注射、颅内注射、心室内大脑灌注，并且测试治疗效果。上述施用可能性中的任何一者也可在β-淀粉样制剂前脑注射至tau转基因小鼠的大脑后，用于评估对β淀粉样诱导的tau蛋白病的治疗效果。
治疗效果的评估可通过组织化学方法进行，其包括Gallyas阳性细胞计数的定量、总人tau染色、磷酸化tau的大脑载荷量和/或大脑可溶性和不溶性tau的生物化学测定，以及连续大脑提取时的磷酸化tau水平。此外，可进行治疗小鼠的行为测试，例如，条件性味觉厌恶或情境恐惧制约，以确定本发明抗体的治疗效果(Pennanen,Genes Brain Behav.5(2006),369-79,Pennanen Neurobiol Dis.15(2004),500-9)。
实施例6：具有小鼠IgG2a恒定域的抗体4E4和4A3的嵌合
为了制备用于慢性治疗研究的降低免疫原性的抗体，抗体4E4和4A3的小鼠嵌合型使用重组DNA技术制备。选择小鼠IgG2a/λ同种型用于这些嵌合抗体，以制备以高亲和力结合至小鼠Fc-γ受体的分子，并且因此该同种型能够诱导免疫效应子响应。嵌合4E4(ch4E4)和嵌合4A3(ch4A3)重链和轻链构建体的氨基酸序列如下所示出。
表3：嵌合4E4(ch4E4)和嵌合4A3(ch4A3)的氨基酸序列
实施例7：具有小鼠IgG2a恒定域的抗体4E4和4A3的嵌合
共有N-键合糖基化位点在4E4重链的CDR1区中鉴定。在哺乳动物(CHO)细胞表达后，预测的N-糖基化位点(Asn-30)被聚糖完全占据，如质谱分析所示出。为了消除该区域中的N-糖基化，并且减少产物异质性，将ch4E4重链的Asn-30改为Gln（表4）。当从CHO细胞制备和纯化时，修饰的抗体结合重组tau，其表观结合亲和力相对于原始、糖基化抗体高约4倍（参见图15）。
表4：成熟ch4E4(N30Q)重链（小鼠IgG2a）的氨基酸序列。置换的Gln残基以粗体、下划线表示。
实施例8：非糖基化嵌合4E4（ch4E4(N30Q)mIgG1非糖化）的制备
制备4E4的小鼠嵌合非糖基化变体（ch4E4(N30Q)IgG1-非糖化），以评估抗体效应子功能和活性之间的关系。对于重链，将4E4的可变域融合至包含Asn至Gln突变的小鼠IgG1重链恒定区，以消除共有Fc糖基化位点。重链可变区还包含N30Q改变，以消除CDR1中的共有N-糖基化位点（实施例7）。轻链为上述ch4E4λ轻链。
实施例9：人4E4和4A3的急性大脑渗透研究
人4E4和4A3通过瞬时转染CHO细胞来制备，并且通过亲和纯化法来纯化。控制内毒素水平，并且所有均低于1EU/mg。在第1天和第4天用30mg/kg4E4(n=7)、4A3(n=7)抗体或等量PBS(n=7)腹腔内注射TauP301L小鼠。在第5天，在麻醉下用包含1单位/ml肝素的PBS灌注小鼠。收集血液、大脑和脊髓用于分析。将大脑右半球冷冻在-80℃，将大脑左半球和脊髓后固定于10%中和福尔马林中，在4℃下放置两天，然后包埋于石蜡块中，并且切片。将血浆以小份保存在-80℃下。
大脑蛋白质提取：对冷冻的右半球称重，并在5体积（5mL/g润湿组织）包含50mMNaCl、0.2%二乙胺、蛋白酶抑制剂(Roche Diagnostics GmbH)和磷酸酶抑制剂(RocheDiagnostics GmbH)的溶液中进行匀浆。然后，将样本转移至聚碳酸酯管，再加入5体积匀浆溶液，并保持在冰上30分钟。然后，在100,000g、4℃下离心30分钟后收集可溶性级份。将该可溶性级份用于人IgG测定。将沉淀重悬于3体积含蛋白酶和磷酸酶抑制剂的PBS中。在16,000g、4℃下离心30分钟后，将上清液和沉淀分别保存在-80℃下，以进一步用于不溶性tau提取。沉淀用改性十二烷基肌氨酸钠提取法(Goedert M,Spillantini MG,Cairns NJ,Crowther RA.Neuron8,159(1992))进一步提取。
人IgG特异性夹心ELISA：将50mM碳酸盐ELISA涂覆缓冲液(pH9.6)中的2μg/ml的山羊抗人IgG Fab(Jackson)用作捕获抗体。以30μl/孔用捕获抗体涂覆半区96孔微滴定板，在4℃下过夜。然后用包含0.1%Tween20的PBS洗涤板4次，然后与50μl/孔包含2%BSA的PBS在室温下孵育一小时。将大脑提取物、血浆样本和抗体标准品(4A3)的可溶性级份稀释于包含2%BSA和0.1%Tween20的PBS中。将30μl稀释样本加入每个孔中，并且在室温下孵育一小时。然后用200μl/孔包含0.1%Tween20的PBS洗涤板四次，然后与HRP偶联的驴抗人Fcγ（Jackson，以1:10,000稀释于包含2%BSA和0.1%Tween20的PBS中）在室温下孵育一小时。然后用200μl/孔包含0.1%Tween20的PBS洗涤板四次，然后加入20μl/孔TMB（1:20于10mM柠檬酸盐溶液(pH=4.1)中）。然后通过向每孔加入10μl1M H2SO4来终止反应。从4A3的系列稀释获得抗体标准曲线。根据标准计算血浆和大脑样本中的抗体浓度。然后，将大脑的人IgG水平转换为μg抗体/克新鲜大脑组织（假设为1g/10ml），如图17中所示出。
所有4E4和4A3处理小鼠的血浆中检测到高水平人IgG。与此相反，PBS处理小鼠的血浆中未检测到人IgG（图16）。4E4和4A3处理小鼠的大脑匀浆物中检测到显著量的人IgG（图17）。
实施例10：用嵌合4E4和4A3进行慢性研究
包含原始人抗体可变域和小鼠IgG2a恒定区的嵌合4E4和4A3可通过瞬时转染CHO细胞来制备，并且通过亲和纯化法来纯化。控制每批抗体的内毒素水平，并且保持低于1Eu/mg。对7.5至8月龄的性别平衡TauP301L小鼠腹腔内注射10mg/kg、3mg/kg抗体溶液或等量的PBS对照。每个处理组将具有20至25只小鼠。处理每周进行一次持续26周。作为另外一种选择，处理每周进行两次持续13周。每两周监测体重。处理期结束时，在麻醉下灌注小鼠。收集大脑、脊髓和血液。可将一半脑和脊髓后固定于10%福尔马林中三天，然后包埋于石蜡块中。从这些组织块切下的厚切片可用于免疫组织化学研究。将另一半脑称重，并且速冻于-80℃下，以用于生物化学分析。
药效将通过比较处理和对照样本中神经原纤维缠结(NFT)的水平和具有不同溶解度特征的tau的水平来评估。NFT可通过Gallyas银浸渗(F Gallyas ActaMorphol.Acad.Sci.Hung19.1(1971))或通过用单克隆小鼠抗体AT100和AT180的免疫染色进行可视化，所述抗体识别NFT中病理磷酸化的tau。可测定抗体治疗小鼠和对照动物的大脑和脊髓中Gallyas阳性神经元和/或AT100、AT180标记的神经元的数量或频率，以评估抗体治疗的效果。
可溶性和不溶性tau可根据本文所述的大脑蛋白质提取物方案提取。作为另外一种选择，可溶性和不溶性tau可用改性十二烷基肌氨酸钠提取法(Goedert M,SpillantiniMG,Cairns NJ,Crowther RA.Neuron8,159(1992))提取。简而言之，将冷冻的大脑在由10mMTris·HCl(pH7.4)、0.8M NaCl、1mM EGTA、1mM Na3VO4、1mM NaF、1mM AEBSF、蛋白酶抑制剂(Roche Diagnostics GmbH)和磷酸酶抑制剂(Roche Diagnostics GmbH)组成的10体积（重量/体积）10%蔗糖匀浆缓冲液中进行匀浆。匀浆物在20,000g下离心20分钟，并且保留上清液。将沉淀在10体积的匀浆缓冲液中进行匀浆，并且再次离心。上清液可合并在一起，并且加入N-月桂酰肌氨酸(Sigma)达到1%（重量/体积）终浓度，并且在37℃和300rpm旋转下孵育1.5小时，然后在100,000g下离心1小时。上清液以十二烷基肌氨酸钠可溶性级份收集，并且将1g大脑组织的沉淀重悬于0.2ml50mM Tris·HCl(pH7.4)中，作为PHF级份。
可溶性和不溶性tau的水平用可商购获得的Tau ELISA试剂盒(Invitrogen)测量。此外，大脑蛋白质提取物用4至12%Bis-Tris SDS-PAGE分离，然后用Tau12（人tau）、AT8(pS202/pT205)、AT100(pT212/pS214)、AT180(pT231)和E178(pS396)抗体进行免疫印迹。半定量分析通过测量每个样本对已知数量tau标准品的积分密度进行。
此外，行为测试可如上述实施例5中所示进行。例如，抗体处理TauP301L小鼠中工作记忆的改善可使用两试Y迷宫任务来测试（例如，Pennanen,Genes Brain Behav.5(2006),369-79，该文献全文以引用方式并入本文）。迷宫的三臂(arm)为22cm长、5cm宽和15cm深。将黑白抽象线索(abstractive clue)置于迷宫周围的黑幕上。在黑暗期期间，实验在6勒克斯的环境光水平下进行。每个实验包括培训期和观察期。在培训期期间，小鼠被分配至三臂中的两个（起始臂和第二臂），它们可在4分钟内自由探索，不能进入第三臂（新臂）。然后将小鼠从迷宫中移除，并保留在固定笼中1.5至5分钟，同时迷宫用70%乙醇完全清洗，以除去任何嗅觉线索。然后，将小鼠再次放回迷宫中，以观察所有三个可进入的臂4分钟。记录进入的顺序、进入每个臂的编号以及在每个臂中耗费的时间。由此计算在第三新臂中耗费的时间与在其他两个臂（起始臂和第二臂）中耗费时间的平均值的比率，并且比较tau蛋白病小鼠模型和相应的对照野生型小鼠中的不同处理组。啮齿动物通常优选地用于研究迷宫的新臂，而不是返回之前到达的臂。抗体的效果可针对该偏好的恢复来监测，由于其病症相关工作记忆障碍，该监测通过处理的tau蛋白病模型小鼠与未处理小鼠的无差别行为的比较进行。因此，接近1的比率表明工作记忆被破坏。高比率表明工作记忆较好。TauP301L小鼠中工作记忆的破坏被认为是由于人tau的过表达导致的tau蛋白病引起的。因此，与对照TauP301L小鼠相比，抗tau抗体处理的TauP301L小鼠中观察到的显著较高的比率表明，抗tau抗体对tau蛋白病具有治疗效果。
本发明不应被限制在所述具体实施方案的范围内，该实施方案旨在作为本发明单个方面的单个例证，并且功能上等同的任何组合物或方法均在本发明的范围内。实际上，除本文示出和描述的那些修改之外，本发明的各种修改从前述描述和附图中对本领域的技术人员将变得显而易见。此类修改旨在处于所附权利要求的范围内。

Claims (21)

1.一种分离的结合人tau的人单克隆抗体或其tau结合片段，其中所述抗体或其片段包含SEQ ID NO:9和11所示的氨基酸序列，
其中所述的tau结合片段包含单链Fv片段(scFv)、F(ab')片段、F(ab)片段和F(ab')2片段。
2.权利要求1所述的分离的结合人tau的人单克隆抗体或其tau结合片段，其是包含SEQID NO:9和11所示的氨基酸序列的抗体。
3.一种分离的结合人tau的人单克隆抗体或其tau结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，其中
(a)重链可变区含有氨基酸序列如SEQ ID NO:23、24和25所示的互补决定区，以及
(b)轻链可变区含有氨基酸序列如SEQ ID NO:26、27和28所示的互补决定区，
其中所述的tau结合片段包含单链Fv片段(scFv)、F(ab')片段、F(ab)片段和F(ab')2片段。
4.权利要求3所述的分离的结合人tau的人单克隆抗体或其tau结合片段，其是抗体，其中
(a)重链可变区含有氨基酸序列如SEQ ID NO:23、24和25所示的互补决定区，以及
(b)轻链可变区含有氨基酸序列如SEQ ID NO:26、27和28所示的互补决定区。
5.权利要求3所述的分离的结合人tau的人单克隆抗体或其tau结合片段，其中所述重链可变区不包含处于Kabat编号位置30的天冬酰胺。
6.权利要求3所述的分离的结合人tau的人单克隆抗体或其tau结合片段，其中所述重链可变区包含处于Kabat编号位置30的谷氨酰胺。
7.权利要求6所述的分离的结合人tau的人单克隆抗体或其tau结合片段，其包含SEQID NO:93和SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。
8.一种编码根据权利要求1-7任一项所述的抗体或tau结合片段的分离的多核苷酸。
9.一种包含根据权利要求8所述的多核苷酸的分离的载体。
10.一种包含根据权利要求8所述的多核苷酸的分离的宿主细胞。
11.一种制备抗tau抗体或其tau结合片段的方法，所述方法包括
(a)培养根据权利要求10所述的细胞；以及
(b)从所述培养物分离所述抗体或其tau结合片段。
12.一种由权利要求8所述的多核苷酸编码的抗tau抗体或其tau结合片段。
13.由权利要求11所述的方法获得的分离的抗tau抗体或其tau结合片段。
14.根据权利要求1至7中任一项所述的人单克隆抗体或tau结合片段，其
(a)被可检测地标记，其中所述可检测标记选自酶、放射性同位素、荧光团和重金属；或
(b)连接至药物。
15.一种包含根据权利要求1至7中任一项所述的人单克隆抗体或tau结合片段的组合物，其中所述组合物为
(i)还包含可药用载体的药物组合物；或
(ii)还包含常用于免疫或基于核酸的诊断方法的一种或多种试剂的诊断组合物。
16.根据权利要求15所述的组合物，还包含用于治疗神经退行性tau蛋白病的附加药剂。
17.根据权利要求1至7中任一项所述的人单克隆抗体或tau结合片段在制备药物或监测试剂中的下列用途：
(i)预防或治疗处理受试者的神经退行性tau蛋白病，或
(ii)监测受试者的神经退行性tau蛋白病的进展，或对受试者的神经退行性tau蛋白病的治疗的响应
其中所述神经退行性tau蛋白病选自阿尔茨海默氏病、肌萎缩性侧索硬化/帕金森–痴呆综合征、嗜银颗粒痴呆、英式淀粉样血管病、脑淀粉样血管病、皮质基底退化、克罗伊茨菲尔德-雅各布二氏病、拳击员痴呆、伴有钙质沉着的弥漫性神经原纤维缠结病、唐氏综合征、额颞痴呆、17号染色体相关的伴有帕金森症的额颞痴呆、额颞叶退化、杰茨曼-斯脱司勒-史茵克病、哈勒沃登-施帕茨病、包涵体肌炎、多系统萎缩、肌强直性营养不良、C型尼曼-皮克病、伴有神经原纤维缠结的非关岛运动神经元病、皮克氏病、脑炎后帕金森症、朊病毒蛋白脑淀粉样血管病、进行性皮质下胶质增生、进行性核上性麻痹、亚急性硬化全脑炎、缠结痴呆、多发性脑梗死性痴呆和缺血性中风。
18.根据权利要求1至7中任一项所述的人单克隆抗体或tau结合片段在制备用于诊断或监测受试者的神经退行性tau蛋白病的进展的诊断或监测试剂中的用途，所述诊断或监测包括下列步骤：
(a)评估来自所述受试者的样本中病理修饰的或聚集的tau的水平，所述受试者用所述抗体诊断；以及
(b)将修饰的或聚集的tau的水平与参考标准品比较，所述参考标准品表明了一个或多个对照受试者中所述病理修饰的或聚集的tau的水平，
其中病理修饰的或聚集的tau和所述参考标准品的水平之间的差异性或相似性表明，所述受试者患有神经退行性tau蛋白病，其中所述神经退行性tau蛋白病选自阿尔茨海默氏病、肌萎缩性侧索硬化/帕金森–痴呆综合征、嗜银颗粒痴呆、英式淀粉样血管病、脑淀粉样血管病、皮质基底退化、克罗伊茨菲尔德-雅各布二氏病、拳击员痴呆、伴有钙质沉着的弥漫性神经原纤维缠结病、唐氏综合征、额颞痴呆、17号染色体相关的伴有帕金森症的额颞痴呆、额颞叶退化、杰茨曼-斯脱司勒-史茵克病、哈勒沃登-施帕茨病、包涵体肌炎、多系统萎缩、肌强直性营养不良、C型尼曼-皮克病、伴有神经原纤维缠结的非关岛运动神经元病、皮克氏病、脑炎后帕金森症、朊病毒蛋白脑淀粉样血管病、进行性皮质下胶质增生、进行性核上性麻痹、亚急性硬化全脑炎、缠结痴呆、多发性脑梗死性痴呆和缺血性中风。
19.根据权利要求1至7中任一项所述的人单克隆抗体或其tau结合片段在制备用于体内检测或使治疗或诊断剂靶向人或动物体内的tau的检测或靶向试剂中的用途，其中所述体内检测包括正电子发射断层显像术(PET)、单光子发射断层显像术(SPECT)、近红外(NIR)光学成像或磁共振成像(MRI)。
20.一种具有由权利要求1至7中任一项所述的人单克隆抗体特异性识别的tau的表位的肽，其中所述肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:7、41或它们的组合。
21.一种用于神经退行性tau蛋白病的诊断的试剂盒，所述试剂盒包含根据权利要求1至7中任一项所述的抗体或tau结合片段以及试剂或使用说明。
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