JP6608827B2 - ヒト化抗タウ(pS422)抗体及び使用方法 - Google Patents
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Description
・アルツハイマー病(同疾患の神経原線維型(tangle-only form)を含む)
・ダウン症候群、成人症例
・グアムパーキンソニズム認知症複合(Guam parkinsonism dementia complex)
・ボクサー認知症(Dementia pugilistica)
・ピック病
・嗜銀顆粒性認知症
・前頭側頭型認知症
・大脳皮質基底核変性症
・淡蒼球−橋−黒質変性症
・進行性核上性麻痺
・神経原線維変化型ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー病。
i)配列番号03のアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異的に結合する、及び/又は
ii)1μg/mLで全長ヒトタウ(配列番号01)に結合しない、及び/又は
iii)第422位のセリンでリン酸化された全長ヒトタウ(配列番号02)に特異的に結合する、及び/又は
iv)第422位のセリンでリン酸化されたヒトタウ(配列番号02)の凝集体に特異的に結合する、及び/又は
v)配列番号01のアミノ酸配列を有し、アミノ酸突然変異S422Aを有するヒトタウに特異的に結合する。
a)重鎖可変ドメインに、配列番号08、18及び10のHVR、又は
b)重鎖可変ドメインに、配列番号08、09及び10のHVR
を含むことを特徴とする。
a)軽鎖可変ドメインに、配列番号13、14及び15のHVR、又は
b)軽鎖可変ドメインに、配列番号12、05及び15のHVR
を含む。
a)重鎖可変ドメインに配列番号08、18及び10のHVR、並びに軽鎖可変ドメインに配列番号13、14及び15のHVR、又は
b)重鎖可変ドメインに配列番号08、09及び10のHVR、並びに軽鎖可変ドメインに配列番号12、05及び15のHVR、又は
c)重鎖可変ドメインに配列番号08、09及び10のHVR、並びに軽鎖可変ドメインに配列番号13、14及び15のHVR
を含む。
a)配列番号20の重鎖可変ドメイン及び配列番号17の軽鎖可変ドメイン、又は
b)配列番号19の重鎖可変ドメイン及び配列番号16の軽鎖可変ドメイン、又は
c)配列番号19の重鎖可変ドメイン及び配列番号17の軽鎖可変ドメイン、又は
d)配列番号21の重鎖可変ドメイン及び配列番号17の軽鎖可変ドメイン
を含む。
i)配列番号03のアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異的に結合する、及び/又は
ii)1μg/mLで全長ヒトタウ(配列番号01)に結合しない、及び/又は
iii)第422位のセリンでリン酸化された全長ヒトタウ(配列番号02)に特異的に結合する、及び/又は
iv)第422位のセリンでリン酸化されたヒトタウ(配列番号02)の凝集体に特異的に結合する。
a)配列番号03のアミノ酸配列を有するヒトタウ(pS422)フラグメントに対して6ng/mL以下の、及び/又は
b)配列番号02のアミノ酸配列を有する全長ヒトタウ(pS422)に対して4.5ng/mL以下の、及び/又は
c)配列番号02のアミノ酸配列を有するヒトタウ(pS422)の凝集体に対して30ng/mL以下の、及び/又は
d)配列番号01のアミノ酸配列を有し、アミノ酸突然変異S422Aを有するヒトタウに対して125ng/mL以下の
EC50値を有する。
i)配列番号03のアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異的に結合する、及び/又は
ii)1μg/mLで全長ヒトタウ(配列番号01)に結合しない、及び/又は
iii)第422位のセリンでリン酸化された全長ヒトタウ(配列番号02)に特異的に結合する、及び/又は
iv)第422位のセリンでリン酸化されたヒトタウ(配列番号02)の凝集体に特異的に結合する、及び/又は
v)配列番号01のアミノ酸配列を有し、アミノ酸突然変異S422Aを有する全長ヒトタウに特異的に結合する、及び/又は
vi)配列番号03のアミノ酸配列を有するヒトタウ(pS422)フラグメントに対して6ng/mL以下のEC50値を有する、及び/又は
vii)配列番号02のアミノ酸配列を有する全長ヒトタウ(pS422)に対して4.5ng/mL以下のEC50値を有する、及び/又は
viii)配列番号02のアミノ酸配列を有するヒトタウ(pS422)の凝集体に対して30ng/mL以下のEC50値を有する、及び/又は
ix)配列番号01のアミノ酸配列を有し、アミノ酸突然変異S422Aを有するヒトタウに対して125ng/mL以下のEC50値を有する。
a)ヒトサブクラスIgG1の全長抗体、又は
b)ヒトサブクラスIgG4の全長抗体、又は
c)突然変異L234A、L235A及びP329Gを備えたヒトサブクラスIgG1の全長抗体、
d)突然変異S228P、L235E及びP329Gを備えたヒトサブクラスIgG4の全長抗体、
e)両重鎖に突然変異L234A、L235A及びP329G、並びに一方の重鎖に突然変異T366W及びS354C並びにそれぞれ他方の重鎖に突然変異T366S、L368A、Y407V及びY349Cを備えたヒトサブクラスIgG1の全長抗体、又は
f)両重鎖に突然変異S228P及びP329G、並びに一方の重鎖に突然変異T366W及びS354C並びにそれぞれ他方の重鎖に突然変異T366S、L368A、Y407V及びY349Cを備えたヒトサブクラスIgG4の全長抗体
である。
a)前記抗体は2つの抗体重鎖を含み、各々が重鎖可変ドメイン及び重鎖定常領域を含んでおり、
i)前記可変ドメインは、配列番号08、配列番号18及び配列番号10のHVRを含み、
ii)前記定常領域は、ヒトIgG1定常領域であって、そのC末端リジン残基は存在してもしなくてもよく、並びに
iii)前記定常領域は、アミノ酸変化L234A、L235A及びP329Gを含むものであり、
b)前記抗体は2つの抗体軽鎖を含み、各々が軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含んでおり、
i)前記可変ドメインは、配列番号13、配列番号14及び配列番号15のHVRを含み、
ii)前記定常領域は、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域であり、
並びに
c)前記抗体は、
i)配列番号03のアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異的に結合する、及び/又は
ii)1μg/mLで全長ヒトタウ(配列番号01)に結合しない、及び/又は
iii)第422位のセリンでリン酸化された全長ヒトタウ(配列番号02)に特異的に結合する、及び/又は
iv)第422位のセリンでリン酸化されたヒトタウ(配列番号02)の凝集体に特異的に結合する、及び/又は
v)配列番号01のアミノ酸配列を有し、アミノ酸突然変異S422Aを有する全長ヒトタウに特異的に結合する、及び/又は
vi)配列番号03のアミノ酸配列を有するヒトタウ(pS422)フラグメントに対して6ng/mL以下のEC50値を有する、及び/又は
vii)配列番号02のアミノ酸配列を有する全長ヒトタウ(pS422)に対して4.5ng/mL以下のEC50値を有する、及び/又は
viii)配列番号02のアミノ酸配列を有するヒトタウ(pS422)の凝集体に対して30ng/mL以下のEC50値を有する、及び/又は
ix)配列番号01のアミノ酸配列を有し、アミノ酸突然変異S422Aを有するヒトタウに対して125ng/mL以下のEC50値を有する
ことを特徴とする。
a)前記抗体は2つの抗体重鎖を含み、各々が重鎖可変ドメイン及び重鎖定常領域を含んでおり、
i)前記可変ドメインは、配列番号08、配列番号09及び配列番号10のHVRを含み、
ii)前記定常領域は、ヒトIgG1定常領域であって、そのC末端リジン残基は存在してもしなくてもよく、並びに
iii)前記定常領域は、アミノ酸変化L234A、L235A及びP329Gを含むものであり、
b)前記抗体は2つの抗体軽鎖を含み、各々が軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含んでおり、
i)前記可変ドメインは、配列番号12、配列番号05及び配列番号15のHVRを含み、
ii)前記定常領域は、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域であり、
並びに
c)前記抗体は、
i)配列番号03のアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異的に結合する、及び/又は
ii)1μg/mLで全長ヒトタウ(配列番号01)に結合しない、及び/又は
iii)第422位のセリンでリン酸化された全長ヒトタウ(配列番号02)に特異的に結合する、及び/又は
iv)第422位のセリンでリン酸化されたヒトタウ(配列番号02)の凝集体に特異的に結合する、及び/又は
v)配列番号01のアミノ酸配列を有し、アミノ酸突然変異S422Aを有する全長ヒトタウに特異的に結合する、及び/又は
vi)配列番号03のアミノ酸配列を有するヒトタウ(pS422)フラグメントに対して6ng/mL以下のEC50値を有する、及び/又は
vii)配列番号02のアミノ酸配列を有する全長ヒトタウ(pS422)に対して4.5ng/mL以下のEC50値を有する、及び/又は
viii)配列番号02のアミノ酸配列を有するヒトタウ(pS422)の凝集体に対して30ng/mL以下のEC50値を有する、及び/又は
ix)配列番号01のアミノ酸配列を有し、アミノ酸突然変異S422Aを有するヒトタウに対して125ng/mL以下のEC50値を有する
ことを特徴とする。
a)前記抗体は2つの抗体重鎖を含み、各々が重鎖可変ドメイン及び重鎖定常領域を含んでおり、
i)前記可変ドメインは、配列番号08、配列番号09及び配列番号10のHVRを含み、
ii)前記定常領域は、ヒトIgG1定常領域であって、そのC末端リジン残基は存在してもしなくてもよく、並びに
iii)前記定常領域は、アミノ酸変化L234A、L235A及びP329Gを含むものであり、
b)前記抗体は2つの抗体軽鎖を含み、各々が軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含んでおり、
i)前記可変ドメインは、配列番号13、配列番号14及び配列番号15のHVRを含み、
ii)前記定常領域は、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域であり、
並びに
c)前記抗体は、
i)配列番号03のアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異的に結合する、及び/又は
ii)1μg/mLで全長ヒトタウ(配列番号01)に結合しない、及び/又は
iii)第422位のセリンでリン酸化された全長ヒトタウ(配列番号02)に特異的に結合する、及び/又は
iv)第422位のセリンでリン酸化されたヒトタウ(配列番号02)の凝集体に特異的に結合する、及び/又は
v)配列番号01のアミノ酸配列を有し、アミノ酸突然変異S422Aを有する全長ヒトタウに特異的に結合する、及び/又は
vi)配列番号03のアミノ酸配列を有するヒトタウ(pS422)フラグメントに対して6ng/mL以下のEC50値を有する、及び/又は
vii)配列番号02のアミノ酸配列を有する全長ヒトタウ(pS422)に対して4.5ng/mL以下のEC50値を有する、及び/又は
viii)配列番号02のアミノ酸配列を有するヒトタウ(pS422)の凝集体に対して30ng/mL以下のEC50値を有する、及び/又は
ix)配列番号01のアミノ酸配列を有し、アミノ酸突然変異S422Aを有するヒトタウに対して125ng/mL以下のEC50値を有する
ことを特徴とする。
a)前記抗体は2つの抗体重鎖を含み、各々が重鎖可変ドメイン及び重鎖定常領域を含んでおり、
i)前記可変ドメインは、配列番号20のアミノ酸配列を有し、
ii)前記定常領域は、ヒトIgG1定常領域であって、そのC末端リジン残基は存在してもしなくてもよく、並びに
iii)前記定常領域は、アミノ酸変化L234A、L235A及びP329Gを含むものであり、
b)前記抗体は2つの抗体軽鎖を含み、各々が軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含んでおり、
i)前記可変ドメインは、配列番号17のアミノ酸配列を有し、
ii)前記定常領域は、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域であり、
並びに
c)前記抗体は、
i)配列番号03のアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異的に結合する、及び/又は
ii)1μg/mLで全長ヒトタウ(配列番号01)に結合しない、及び/又は
iii)第422位のセリンでリン酸化された全長ヒトタウ(配列番号02)に特異的に結合する、及び/又は
iv)第422位のセリンでリン酸化されたヒトタウ(配列番号02)の凝集体に特異的に結合する、及び/又は
v)配列番号01のアミノ酸配列を有し、アミノ酸突然変異S422Aを有する全長ヒトタウに特異的に結合する、及び/又は
vi)配列番号03のアミノ酸配列を有するヒトタウ(pS422)フラグメントに対して6ng/mL以下のEC50値を有する、及び/又は
vii)配列番号02のアミノ酸配列を有する全長ヒトタウ(pS422)に対して4.5ng/mL以下のEC50値を有する、及び/又は
viii)配列番号02のアミノ酸配列を有するヒトタウ(pS422)の凝集体に対して30ng/mL以下のEC50値を有する、及び/又は
ix)配列番号01のアミノ酸配列を有し、アミノ酸突然変異S422Aを有するヒトタウに対して125ng/mL以下のEC50値を有する
ことを特徴とする。
a)前記抗体は2つの抗体重鎖を含み、各々が重鎖可変ドメイン及び重鎖定常領域を含んでおり、
i)前記可変ドメインは、配列番号19のアミノ酸配列を有し、
ii)前記定常領域は、ヒトIgG1定常領域であって、そのC末端リジン残基は存在してもしなくてもよく、並びに
iii)前記定常領域は、アミノ酸変化L234A、L235A及びP329Gを含むものであり、
b)前記抗体は2つの抗体軽鎖を含み、各々が軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含んでおり、
i)前記可変ドメインは、配列番号16のアミノ酸配列を有し、
ii)前記定常領域は、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域であり、
並びに
c)前記抗体は、
i)配列番号03のアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異的に結合する、及び/又は
ii)1μg/mLで全長ヒトタウ(配列番号01)に結合しない、及び/又は
iii)第422位のセリンでリン酸化された全長ヒトタウ(配列番号02)に特異的に結合する、及び/又は
iv)第422位のセリンでリン酸化されたヒトタウ(配列番号02)の凝集体に特異的に結合する、及び/又は
v)配列番号01のアミノ酸配列を有し、アミノ酸突然変異S422Aを有する全長ヒトタウに特異的に結合する、及び/又は
vi)配列番号03のアミノ酸配列を有するヒトタウ(pS422)フラグメントに対して6ng/mL以下のEC50値を有する、及び/又は
vii)配列番号02のアミノ酸配列を有する全長ヒトタウ(pS422)に対して4.5ng/mL以下のEC50値を有する、及び/又は
viii)配列番号02のアミノ酸配列を有するヒトタウ(pS422)の凝集体に対して30ng/mL以下のEC50値を有する、及び/又は
ix)配列番号01のアミノ酸配列を有し、アミノ酸突然変異S422Aを有するヒトタウに対して125ng/mL以下のEC50値を有する
ことを特徴とする。
a)前記抗体は2つの抗体重鎖を含み、各々が重鎖可変ドメイン及び重鎖定常領域を含んでおり、
i)前記可変ドメインは、配列番号19のアミノ酸配列を有し、
ii)前記定常領域は、ヒトIgG1定常領域であって、そのC末端リジン残基は存在してもしなくてもよく、並びに
iii)前記定常領域は、アミノ酸変化L234A、L235A及びP329Gを含むものであり、
b)前記抗体は2つの抗体軽鎖を含み、各々が軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含んでおり、
i)前記可変ドメインは、配列番号17のアミノ酸配列を有し、
ii)前記定常領域は、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域であり、
並びに
c)前記抗体は、
i)配列番号03のアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異的に結合する、及び/又は
ii)1μg/mLで全長ヒトタウ(配列番号01)に結合しない、及び/又は
iii)第422位のセリンでリン酸化された全長ヒトタウ(配列番号02)に特異的に結合する、及び/又は
iv)第422位のセリンでリン酸化されたヒトタウ(配列番号02)の凝集体に特異的に結合する、及び/又は
v)配列番号01のアミノ酸配列を有し、アミノ酸突然変異S422Aを有する全長ヒトタウに特異的に結合する、及び/又は
vi)配列番号03のアミノ酸配列を有するヒトタウ(pS422)フラグメントに対して6ng/mL以下のEC50値を有する、及び/又は
vii)配列番号02のアミノ酸配列を有する全長ヒトタウ(pS422)に対して4.5ng/mL以下のEC50値を有する、及び/又は
viii)配列番号02のアミノ酸配列を有するヒトタウ(pS422)の凝集体に対して30ng/mL以下のEC50値を有する、及び/又は
ix)配列番号01のアミノ酸配列を有し、アミノ酸突然変異S422Aを有するヒトタウに対して125ng/mL以下のEC50値を有する
ことを特徴とする。
a)前記抗体は2つの抗体重鎖を含み、各々が重鎖可変ドメイン及び重鎖定常領域を含んでおり、
i)前記可変ドメインは、配列番号21のアミノ酸配列を有し、
ii)前記定常領域は、ヒトIgG1定常領域であって、そのC末端リジン残基は存在してもしなくてもよく、並びに
iii)前記定常領域は、アミノ酸変化L234A、L235A及びP329Gを含むものであり、
b)前記抗体は2つの抗体軽鎖を含み、各々が軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含んでおり、
i)前記可変ドメインは、配列番号17のアミノ酸配列を有し、
ii)前記定常領域は、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域であり、
並びに
c)前記抗体は、
i)配列番号03のアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異的に結合する、及び/又は
ii)1μg/mLで全長ヒトタウ(配列番号01)に結合しない、及び/又は
iii)第422位のセリンでリン酸化された全長ヒトタウ(配列番号02)に特異的に結合する、及び/又は
iv)第422位のセリンでリン酸化されたヒトタウ(配列番号02)の凝集体に特異的に結合する、及び/又は
v)配列番号01のアミノ酸配列を有し、アミノ酸突然変異S422Aを有する全長ヒトタウに特異的に結合する、及び/又は
vi)配列番号03のアミノ酸配列を有するヒトタウ(pS422)フラグメントに対して6ng/mL以下のEC50値を有する、及び/又は
vii)配列番号02のアミノ酸配列を有する全長ヒトタウ(pS422)に対して4.5ng/mL以下のEC50値を有する、及び/又は
viii)配列番号02のアミノ酸配列を有するヒトタウ(pS422)の凝集体に対して30ng/mL以下のEC50値を有する、及び/又は
ix)配列番号01のアミノ酸配列を有し、アミノ酸突然変異S422Aを有するヒトタウに対して125ng/mL以下のEC50値を有する
ことを特徴とする。
配列番号01:ヒトタウタンパク質アイソフォームF(441残基)
配列番号02:第422位のセリン残基でリン酸化されたヒトタウタンパク質アイソフォームF(441残基)
配列番号03:第7位(配列番号01の第422位に対応)にリン酸化セリンを有するヒトタウタンパク質のフラグメント(配列番号01の残基416〜430):Ser-Ile-Asp-Met-Val-Asp-Ser(PO3H2)-Pro-Gln-Leu-Ala-Thr-Leu-Ala-Asp
配列番号04:ウサギ抗体086 CDRL1 − QSSQSVRTNKLA
配列番号05:ウサギ抗体086 CDRL2 − SASTLDF
配列番号06:ウサギ抗体086 CDRL3 − LGYFDCSIADCVA
配列番号07:ウサギ抗体086 VL00
配列番号08:ウサギ抗体086 CDRH1 − SNAIN
配列番号09:ウサギ抗体086 CDRH2 − YIAVSGNTYYASWAKG
配列番号10:ウサギ抗体086 CDRH3 − SNI
配列番号11:ウサギ抗体086 VH00
配列番号12:ヒト化CDRL1変異1 − RSSQSVRTNKLA
配列番号13:ヒト化CDRL1変異2 − RSSQSVRTNRLA
配列番号14:ヒト化CDRL2変異1 − SASTLDY
配列番号15:ヒト化CDRL3変異1 − LGYFDSSADIVA
配列番号16:ヒト化VL変異1 − VL21
配列番号17:ヒト化VL変異2 − VL22
配列番号18:ヒト化CDRH2 − YIAVSGNTYYADSVKG
配列番号19:ヒト化VH変異1 − VH32
配列番号20:ヒト化VH変異2 − VH20
配列番号21:ヒト化VH変異3 − VH33
配列番号22:ヒト化CDRL2変異2 − SASTLQS
配列番号23:ヒト化CDRL2変異3 − SASTLES
配列番号24:ヒト化CDRL3変異2 − LGYFDSSIADSVA
配列番号25:ヒト化CDRL3変異3 − LGYFDSSIADRVA
配列番号26:ヒト化CDRL3変異4 − LGYFDPSIADPVA
配列番号27:ヒト化CDRL3変異5 − LGYFDSSIADIVA
配列番号28:ヒト化CDRL3変異6 − LGYFDPSADPIA
配列番号29:ヒト化CDRL3変異7 − LGYFDPSADPVA
配列番号30:ヒト化CDRL1変異3 − RASQGVRTNKLA
配列番号31:ヒト化CDRL1変異4 − RASQSVRTNKLA
配列番号32:ヒト化VL変異4 − VL01
配列番号33:ヒト化VL変異5 − VL09
配列番号34:ヒト化VL変異6 − VL12
配列番号35:ヒト化VL変異7 − VL15
配列番号36:ヒト化VL変異8 − VL16
配列番号37:ヒト化VL変異9 − VL17
配列番号38:ヒト化VL変異10 − VL19
配列番号39:ヒト化VL変異11 − VL28
配列番号40:ヒト化VL変異12 − VL33
配列番号41:ヒト化VL変異13 − VL35
配列番号42:ヒト化VL変異14 − VL39
配列番号43:ヒト化VL変異15 − VL40
配列番号44:ヒト化VL変異16 − VL41
配列番号45:ヒト化VL変異17 − VL42
配列番号46:ヒト化VH変異4 − VH01
配列番号47:ヒト化VH変異5 − VH02
配列番号48:ヒト化VH変異6 − VH03
配列番号49:ヒト化VH変異7 − VH04
配列番号50:ヒト化VH変異8 − VH14
配列番号51:ヒト化VH変異9 − VH15
配列番号52:ヒト化VH変異10 − VH18
配列番号53:ヒト化VH変異11 − VH19
配列番号54:ヒト化VH変異12 − VH22
配列番号55:ヒト化VH変異13 − VH23
配列番号56:ヒト化VH変異14 − VH24
配列番号57:ヒト化VH変異15 − VH31
I.定義
(a)アミノ酸残基26−32(L1)、50−52(L2)、91−96(L3)、26−32(H1)、53−55(H2)、及び96−101(H3)に存在する超可変ループ(Chothia, C. and Lesk, A.M., J. Mol. Biol. 196 (1987) 901-917);
(b)アミノ酸残基24−34(L1)、50−56(L2)、89−97(L3)、31−35b(H1)、50−65(H2)、及び95−102(H3)に存在するCDR(Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242);
(c)アミノ酸残基27c−36(L1)、46−55(L2)、89−96(L3)、30−35b(H1)、47−58(H2)、及び93−101(H3)に存在する抗原接触(MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996));並びに
(d)(a)、(b)、及び/又は(c)の組み合わせ(HVRアミノ酸残基46−56(L2)、47−56(L2)、48−56(L2)、49−56(L2)、26−35(H1)、26−35b(H1)、49−65(H2)、93−102(H3)、及び94−102(H3)を含む)。
割合X/Yの100倍
ここで、Xは、AとBとのそのプログラムのアラインメントにおける配列アラインメントプログラムALIGN-2により完全一致としてスコア化されたアミノ酸残基の数であり、YはBのアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Aの長さがアミノ酸配列Bの長さと等しくない場合、Bに対するAの%アミノ酸配列同一性は、Aに対するBの%アミノ酸配列同一性と等しくならないということは分かるであろう。別途具体的に述べない限り、本明細書で使用されるすべての%アミノ酸配列同一性値は、ALIGN-2コンピュータープログラムを使用して直上の段落に記載のとおりに得られる。
A.例示的なヒト化抗ヒトタウ(pS422)抗体
本明細書に報告されるヒト化抗体は、標準的なヒト化方法によっては得られなかった。親ウサギ抗体に匹敵する結合特性を備えたヒト化抗体を得るためには、アミノ酸配列に非標準的突然変異を導入する必要があった。これは、本明細書に報告される抗体が、ヒト血液脳関門を越えてヒト脳内で有効となることが意図されているのでとりわけ重要である。したがって、ヒト化抗体の選択のために一般的に適用される基準は、今回の場合に直接適用するには十分に厳密ではない。
i)(a)配列番号08のアミノ酸配列を含むHVR−H1;(b)配列番号18のアミノ酸配列を含むHVR−H2;及び(c)配列番号10のアミノ酸配列を含むHVR−H3;又は
ii)(a)配列番号08のアミノ酸配列を含むHVR−H1;(b)配列番号09のアミノ酸配列を含むHVR−H2;及び(c)配列番号10のアミノ酸配列を含むHVR−H3
から選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、又は全部で3つのVH HVR配列を含む(ヒト化)抗体を提供する。
i)(a)配列番号08のアミノ酸配列を含むHVR−H1;(b)配列番号18のアミノ酸配列を含むHVR−H2;及び(c)配列番号10のアミノ酸配列を含むHVR−H3;又は
ii)(a)配列番号08のアミノ酸配列を含むHVR−H1;(b)配列番号09のアミノ酸配列を含むHVR−H2;及び(c)配列番号10のアミノ酸配列を含むHVR−H3
を含む。
i)(a)配列番号13のアミノ酸配列を含むHVR−L1;(b)配列番号14のアミノ酸配列を含むHVR−L2;及び(c)配列番号15のアミノ酸配列を含むHVR−L3;又は
ii)(a)配列番号12のアミノ酸配列を含むHVR−L1;(b)配列番号05のアミノ酸配列を含むHVR−L2;及び(c)配列番号15のアミノ酸配列を含むHVR−L3
から選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、又は全部で3つのVL HVR配列を更に含む。
i)(a)配列番号13のアミノ酸配列を含むHVR−L1;(b)配列番号14のアミノ酸配列を含むHVR−L2;及び(c)配列番号15のアミノ酸配列を含むHVR−L3;又は
ii)(a)配列番号12のアミノ酸配列を含むHVR−L1;(b)配列番号05のアミノ酸配列を含むHVR−L2;及び(c)配列番号15のアミノ酸配列を含むHVR−L3
を含む。
i)(a)配列番号08のアミノ酸配列を含むHVR−H1;(b)配列番号18のアミノ酸配列を含むHVR−H2;(c)配列番号10のアミノ酸配列を含むHVR−H3;(d)配列番号13のアミノ酸配列を含むHVR−L1;(e)配列番号14のアミノ酸配列を含むHVR−L2;及び(f)配列番号15のアミノ酸配列を含むHVR−L3、又は
ii)(a)配列番号08のアミノ酸配列を含むHVR−H1;(b)配列番号09のアミノ酸配列を含むHVR−H2;(c)配列番号10のアミノ酸配列を含むHVR−H3;(d)配列番号12のアミノ酸配列を含むHVR−L1;(e)配列番号05のアミノ酸配列を含むHVR−L2;及び(f)配列番号15のアミノ酸配列を含むHVR−L3、又は
iii)(a)配列番号08のアミノ酸配列を含むHVR−H1;(b)配列番号09のアミノ酸配列を含むHVR−H2;(c)配列番号10のアミノ酸配列を含むHVR−H3;(d)配列番号13のアミノ酸配列を含むHVR−L1;(e)配列番号14のアミノ酸配列を含むHVR−L2;及び(f)配列番号15のアミノ酸配列を含むHVR−L3
を含む(ヒト化)抗体を提供する。
ある実施形態では、本明細書に提供される抗体は、≦100nM、≦50nM、又は1nMと100nMの間(例えば、10−7M以下、例えば10−7M〜10−9M)の解離定数(KD)を有する。
ある実施形態では、本明細書に提供される抗体は、抗体フラグメントである。抗体フラグメントは、Fab、Fab’、Fab’−SH、F(ab’)2、Fv、及びscFvフラグメント、及び下記その他のフラグメントを含むが、これらに限定されない。特定の抗体フラグメントのレビューについては、Hudson, P.J. et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134を参照されたい。scFvフラグメントのレビューについては、例えば、Plueckthun, A., In; The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg and Moore (eds.), Springer-Verlag, New York (1994), pp. 269-315を参照、また、WO 93/16185; US 5,571,894及びUS 5,587,458も参照されたい。サルベージレセプター結合エピトープ残基を含み、in vivo半減期が増加したFab及びF(ab')2フラグメントの議論については、US 5,869,046を参照されたい。
典型的には、非ヒト抗体は、親の非ヒト抗体の特異性及び親和性を保持しつつ、ヒトに対する免疫原性を低減するようにヒト化される。一般的にヒト化抗体は、HVR、例えば、CDR(又はその一部)が非ヒト抗体由来であり、またFR(又はその一部)がヒト抗体配列由来である、1以上の可変ドメインを含む。ヒト化抗体は場合により、ヒト定常領域の少なくとも一部又は全長も含むこととなろう。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体のいくつかのFR残基は、例えば抗体特異性又は親和性を回復又は改良するよう、非ヒト抗体(例えば、HVR残基の由来元である抗体)からの対応する残基で置換される。
ある実施形態では、本明細書に提供される抗体は多重特異性抗体、例えば二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも2つの異なる部位に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体である。ある実施形態では、結合特異性の1つは、ヒトタウ(pS422)に対し、そして他のものは任意の他の抗原に対する。ある実施形態では、二重特異性抗体は、ヒトタウ(pS422)の2つの異なるエピトープに結合し得る。二重特異性抗体は、全長抗体又は抗体フラグメントとして調製され得る。
ある実施形態では、本明細書に提供される抗体のアミノ酸配列変異が意図される。例えば、抗体の結合親和性及び/又は他の生物学的特性を改良することが望ましい場合がある。ある抗体のアミノ酸配列変異は、その抗体をコード化するヌクレオチド配列に適切な改変を導入することにより、又はペプチド合成により調製され得る。このような改変には、例えば、その抗体のアミノ酸配列からの欠失、及び/又はその抗体のアミノ酸配列への挿入及び/又はその抗体のアミノ酸配列内の残基の置換が含まれる。最終構築体が所望の特徴、例えば、抗原結合性を保持する限り、欠失、挿入、及び置換を任意に組み合わせて最終構築体に到達することができる。
ある実施形態では、1以上のアミノ酸置換を有する抗体変異が提供される。置換的突然変異誘発の対象となる部位には、HVR及びFRが含まれる。保存的置換を、「好ましい置換」という見出しの下に以下の表に示す。より実質的な変化は、以下の表で「例示的置換」という見出しの下に提供されており、アミノ酸側鎖クラスに関連して以下に更に説明するとおりである。アミノ酸置換を対象となる抗体に導入し、生成物を所望の活性について、例えば保持/改良された抗原結合、減少した免疫原性、又は改良されたADCC若しくはCDCについてスクリーニングし得る。
(1)疎水性:ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile;
(2)中性親水性:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln;
(3)酸性:Asp、Glu;
(4)塩基性:His、Lys、Arg;
(5)鎖配向に影響を及ぼす残基:Gly、Pro;
(6)芳香族:Trp、Tyr、Phe。
ある実施形態では、抗体がグリコシル化される程度を増加又は減少させるために、本明細書に提供される抗体は改変される。抗体へのグリコシル化部位の付加又は欠失は、1以上のグリコシル化部位が作出又は除去されるようにアミノ酸配列を改変することによって、好都合に達成され得る。
ある実施形態では、本明細書に提供される抗体のFc領域に1以上のアミノ酸改変を導入し、これによりFc領域変異を生成してもよい。Fc領域変異は、1以上のアミノ酸位置にアミノ酸改変(例えば、置換)を含むヒトFc領域配列(例えば、ヒトIgG1、IgG2、IgG3又はIgG4 Fc領域)を含み得る。
ある実施形態では、システイン操作抗体(cysteine engineered antibody)、例えば、抗体の1以上の残基がシステイン残基で置換されている「チオMAb」を作出することが望ましいかもしれない。特定の実施形態では、置換残基は抗体の接近可能部位に存在する。それらの残基をシステインで置換することによって抗体の接近可能部位に反応性のチオール基が位置することになり、本明細書において更に説明するように、それを用いて、抗体を他の部分、例えば薬物部分又はリンカー−薬物部分に接合することで、イムノコンジュゲートを作出することができる。ある実施形態では、次に挙げる残基の任意の1以上がシステインで置換され得る:軽鎖のV205(Kabatナンバリング)、重鎖のA118(EUナンバリング)、及び重鎖Fc領域のS400(EUナンバリング)。システイン操作抗体は、例えばUS 7,521,541に記載されているように生成され得る。
ある実施形態では、当技術分野において公知であり容易に入手することができる追加の非タンパク質部分を含有するように、本明細書に提供される抗体を更に改変し得る。抗体の誘導体化に好適な部分として水溶性ポリマーが挙げられるが、それらに限定されない。水溶性ポリマーの非限定的な例として、ポリエチレングリコール(PEG)、エチレングリコール/プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−1,3−ジオキソラン、ポリ−1,3,6−トリオキサン、エチレン/無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸(ホモポリマー又はランダムコポリマー)、及びデキストラン又はポリ(n−ビニルピロリドン)ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド/エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール(例えば、グリセロール)、ポリビニルアルコール、及びそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中でのその安定性ゆえに、製造時に有利であり得る。ポリマーは任意の分子量であってよく、分岐状であっても非分岐状であってもよい。抗体に付着されるポリマーの数は様々であってよく、複数のポリマーが付着される場合、それらは同じ分子又は異なる分子であることができる。一般に、誘導体化に使用されるポリマーの数及び/又はタイプは、改良しようとする抗体の特定の特性又は機能、抗体誘導体が所定の条件下で治療に使用されるかどうか等を含むがこれらに限定されない考慮事項に基づいて決定され得る。
抗体は、例えばUS 4,816,567に記載されているように、組換え法及び組換え組成物を使用して生成され得る。一つの実施形態では、本明細書に記載の抗ヒトタウ(pS422)抗体をコード化する単離された核酸が提供される。このような核酸は、抗体のVLを含むアミノ酸配列及び/又は抗体のVHを含むアミノ酸配列(例えば、抗体の軽鎖及び/又は重鎖)をコード化し得る。更なる実施形態では、このような核酸を含む1以上のベクター(例えば、発現ベクター)が提供される。さらなる実施形態では、このような核酸を含む宿主細胞が提供される。このような実施形態の一つでは、宿主細胞は、(1)抗体のVLを含むアミノ酸配列と抗体のVHを含むアミノ酸配列とをコード化する核酸を含むベクターを含むか、又は(2)抗体のVLを含むアミノ酸配列をコード化する核酸を含む第1ベクターと抗体のVHを含むアミノ酸配列をコード化する核酸を含む第2ベクターとを含む(例えば、前記ベクターで形質転換されている)。一つの実施形態では、宿主細胞は、真核生物、例えばチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞又はリンパ球系細胞(例えば、Y0、NS0、Sp20細胞)である。一つの実施形態では、抗ヒトタウ(pS422)抗体を作製する方法であって、上に提供される抗体をコード化する核酸を含む宿主細胞を抗体の発現に好適な条件下で培養すること、及び場合により、その宿主細胞(又は宿主細胞培養培地)から抗体を回収することを含む方法が提供される。
本明細書に提供される抗ヒトタウ(pS422)抗体は、当技術分野で公知の種々のアッセイにより、それらの物理的/化学的特性及び/又は生物活性について、同定し、スクリーニングし、又は特徴付けられ得る。
一つの態様では、本発明の抗体は、例えばELISA、アルファLISA、ウェスタンブロット、抗体又は逆相アレイ等の公知の方法によって、その抗原結合活性について試験される。
一つの態様では、生物活性を有するその抗ヒトタウ(pS422)抗体を同定するためのアッセイが提供される。生物活性として例えば、タウ(pS422)で誘発された細胞毒性からの保護/その低減/その阻害、及び/又はオリゴマーヒトタウ(pS422)の細胞間伝播からの保護/その低減/その阻害、及び/又はLUHMES細胞におけるタウ(pS422)で誘発されたカスパーゼ活性の低減を挙げることができる。in vivo及び/又はin vitroでこのような生物活性を有する抗体もまた提供される。
ある実施形態では、本明細書に提供される抗ヒトタウ(pS422)抗体はいずれも、生物試料におけるヒトタウ(pS422)の存在を検出するために有用である。本明細書で使用する場合、用語「検出する」は、定量的検出又は定性的検出を包含する。ある実施形態では、生物試料としては、細胞、又は脳組織等の組織が挙げられる。
本明細書に記載の抗ヒトタウ(pS422)抗体の医薬製剤は、所望の純度を有するこのような抗体を1以上の場合による薬学的に許容し得る担体(Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed.) (1980))と混合することにより、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態で調製される。薬学的に許容し得る担体は、使用される投薬量及び濃度においてレシピエントにとって一般に無毒性であり、これには、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸等の緩衝剤;アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤;保存剤(例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド;塩化ヘキサメトニウム;塩化ベンザルコニウム;塩化ベンゼトニウム;フェノール、ブチル又はベンジルアルコール;アルキルパラベン、例えばメチルパラベン又はプロピルパラベン;カテコール;レゾルシノール;シクロヘキサノール;3−ペンタノール;及びm−クレゾール);低分子量(約10残基未満)のポリペプチド;タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン;親水性ポリマー、例えばポリ(ビニルピロリドン);アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリジン;単糖、二糖、及び他の炭水化物、例えばグルコース、マンノース、又はデキストリン;キレート剤、例えばEDTA;糖、例えばスクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール;塩形成対イオン、例えばナトリウム;金属錯体(例えばZn−タンパク質錯体);及び/又は非イオン界面活性剤、例えばポリエチレングリコール(PEG)があるが、それらに限定されない。本明細書における、例示的な薬学的に許容し得る担体として更に、間質薬物分散剤、例えば可溶性の中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質(sHASEGP)、例えばヒト可溶性PH−20ヒアルロニダーゼ糖タンパク質、例えばrhuPH20(HYLENEX(登録商標)、Baxter International, Inc.)が挙げられる。rhuPH20を含む特定の例示的なsHASEGP及び使用方法は、US 2005/0260186及びUS 2006/0104968に記載されている。一つの態様では、sHASEGPは、1以上の追加のグリコサミノグリカナーゼ、例えばコンドロイチナーゼと併用される。
本明細書に提供される抗ヒトタウ(pS422)抗体はいずれも、治療方法で使用され得る。
本発明の別の態様では、上述の障害の処置、予防及び/又は診断に有用な材料を含む製造品が提供される。製造品は、容器、及び容器上の又は容器に付随するラベル又は添付文書を含む。適切な容器としては、例えばビン、バイアル、シリンジ、IV溶液バッグ等が挙げられる。容器は、ガラス又はプラスチック等の様々な材料から形成され得る。容器は、単独であるか、又はその状態を処置、予防及び/又は診断するのに有効な別の組成物と組み合わせた組成物を保持し、滅菌アクセスポートを有し得る(例えば、容器は静脈内溶液バッグであるか、皮下注射針で穿孔可能な栓を有するバイアルであってよい)。組成物中の少なくとも1つの活性薬剤は、本発明の抗体である。ラベル又は添付文書は、その組成物が選択された状態の処置に使用されることを示す。更に、製造品は、(a)本発明の抗体を含む組成物が入っている第1容器と、(b)更なる細胞毒性物質又は他の治療剤を含む組成物が入っている第2容器とを含み得る。本発明のこの実施形態の製造品は、特定の状態を処置するためにその組成物を使用できることを示す添付文書を更に含んでもよい。これに代えて、又はこれに加えて、製造品は、薬学的に許容し得る緩衝剤、例えば静菌性注射用水(BWFI)、リン酸緩衝食塩水、リンゲル液及びデキストロース溶液を含む第2(又は第3)の容器を更に含み得る。商業的観点及び使用者の観点から望ましい他の材料、例えば緩衝剤、希釈剤、フィルタ、針、及びシリンジを、更に含み得る。
1. ヒトタウ(pS422)に特異的に結合するヒト化抗体であって、当該抗体は、
i)配列番号03のアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異的に結合する、及び/又は
ii)1μg/mLで全長ヒトタウ(配列番号01)に結合しない、及び/又は
iii)第422位のセリンでリン酸化された全長ヒトタウ(配列番号02)に特異的に結合する、及び/又は
iv)第422位のセリンでリン酸化されたヒトタウ(配列番号02)の凝集体に特異的に結合する、及び/又は
v)配列番号01のアミノ酸配列を有し、アミノ酸突然変異S422Aを有するヒトタウに特異的に結合する抗体。
a)重鎖可変ドメインに配列番号08、18及び10のHVR、又は
b)重鎖可変ドメインに配列番号08、09及び10のHVR
を含む抗体。
a)軽鎖可変ドメインに、配列番号13、14及び15のHVR、又は
b)軽鎖可変ドメインに、配列番号12、05及び15のHVR
を更に含む抗体。
a)重鎖可変ドメインに配列番号08、18及び10のHVR、並びに軽鎖可変ドメインに配列番号13、14及び15のHVR、又は
b)重鎖可変ドメインに配列番号08、09及び10のHVR、並びに軽鎖可変ドメインに配列番号12、05及び15のHVR、又は
c)重鎖可変ドメインに配列番号08、09及び10のHVR、並びに軽鎖可変ドメインに配列番号13、14及び15のHVR
を含む抗体。
a)配列番号20の重鎖可変ドメイン及び配列番号17の軽鎖可変ドメイン、又は
b)配列番号19の重鎖可変ドメイン及び配列番号16の軽鎖可変ドメイン、又は
c)配列番号19の重鎖可変ドメイン及び配列番号17の軽鎖可変ドメイン、又は
d)配列番号21の重鎖可変ドメイン及び配列番号17の軽鎖可変ドメイン
を含む抗体。
i)配列番号03のアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異的に結合する、及び/又は
ii)1μg/mLで全長ヒトタウ(配列番号01)に結合しない、及び/又は
iii)第422位のセリンでリン酸化された全長ヒトタウ(配列番号02)に特異的に結合する、及び/又は
iv)第422位のセリンでリン酸化されたヒトタウ(配列番号02)の凝集体に特異的に結合する抗体。
a)配列番号03のアミノ酸配列を有するヒトタウ(pS422)フラグメントに対して6ng/mL以下の、及び/又は
b)配列番号02のアミノ酸配列を有する全長ヒトタウ(pS422)に対して4.5ng/mL以下の、及び/又は
c)配列番号02のアミノ酸配列を有するヒトタウ(pS422)の凝集体に対して30ng/mL以下の、及び/又は
d)配列番号01のアミノ酸配列を有し、アミノ酸突然変異S422Aを有するヒトタウに対して125ng/mL以下の
EC50値を有する抗体。
i)配列番号03のアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異的に結合する、及び/又は
ii)1μg/mLで全長ヒトタウ(配列番号01)に結合しない、及び/又は
iii)第422位のセリンでリン酸化された全長ヒトタウ(配列番号02)に特異的に結合する、及び/又は
iv)第422位のセリンでリン酸化されたヒトタウ(配列番号02)の凝集体に特異的に結合する、及び/又は
v)配列番号01のアミノ酸配列を有し、アミノ酸突然変異S422Aを有する全長ヒトタウに特異的に結合する、及び/又は
vi)配列番号03のアミノ酸配列を有するヒトタウ(pS422)フラグメントに対して6ng/mL以下のEC50値を有する、及び/又は
vii)配列番号02のアミノ酸配列を有する全長ヒトタウ(pS422)に対して4.5ng/mL以下のEC50値を有する、及び/又は
viii)配列番号02のアミノ酸配列を有するヒトタウ(pS422)の凝集体に対して30ng/mL以下のEC50値を有する、及び/又は
ix)配列番号01のアミノ酸配列を有し、アミノ酸突然変異S422Aを有するヒトタウに対して125ng/mL以下のEC50値を有する
抗体。
a)ヒトサブクラスIgG1の全長抗体、又は
b)ヒトサブクラスIgG4の全長抗体、又は
c)突然変異L234A、L235A及びP329Gを備えたヒトサブクラスIgG1の全長抗体、
d)突然変異S228P、L235E及びP329Gを備えたヒトサブクラスIgG4の全長抗体、
e)両重鎖に突然変異L234A、L235A及びP329G、並びに一方の重鎖に突然変異T366W及びS354C並びにそれぞれ他方の重鎖に突然変異T366S、L368A、Y407V及びY349Cを備えたヒトサブクラスIgG1の全長抗体、又は
f)両重鎖に突然変異S228P及びP329G、並びに一方の重鎖に突然変異T366W及びS354C並びにそれぞれ他方の重鎖に突然変異T366S、L368A、Y407V及びY349Cを備えたヒトサブクラスIgG4の全長抗体
である抗体。
a)前記抗体は2つの抗体重鎖を含み、各々が重鎖可変ドメイン及び重鎖定常領域を含んでおり、
i)前記可変ドメインは、配列番号08、配列番号18及び配列番号10のHVRを含み、
ii)前記定常領域は、ヒトIgG1定常領域であって、そのC末端リジン残基は存在してもしなくてもよく、並びに
iii)前記定常領域は、アミノ酸変化L234A、L235A及びP329Gを含むものであり、
b)前記抗体は2つの抗体軽鎖を含み、各々が軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含んでおり、
i)前記可変ドメインは、配列番号13、配列番号14及び配列番号15のHVRを含み、
ii)前記定常領域は、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域であり、
並びに
c)前記抗体は、
i)配列番号03のアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異的に結合する、及び/又は
ii)1μg/mLで全長ヒトタウ(配列番号01)に結合しない、及び/又は
iii)第422位のセリンでリン酸化された全長ヒトタウ(配列番号02)に特異的に結合する、及び/又は
iv)第422位のセリンでリン酸化されたヒトタウ(配列番号02)の凝集体に特異的に結合する、及び/又は
v)配列番号01のアミノ酸配列を有し、アミノ酸突然変異S422Aを有する全長ヒトタウに特異的に結合する、及び/又は
vi)配列番号03のアミノ酸配列を有するヒトタウ(pS422)フラグメントに対して6ng/mL以下のEC50値を有する、及び/又は
vii)配列番号02のアミノ酸配列を有する全長ヒトタウ(pS422)に対して4.5ng/mL以下のEC50値を有する、及び/又は
viii)配列番号02のアミノ酸配列を有するヒトタウ(pS422)の凝集体に対して30ng/mL以下のEC50値を有する、及び/又は
ix)配列番号01のアミノ酸配列を有し、アミノ酸突然変異S422Aを有するヒトタウに対して125ng/mL以下のEC50値を有する
抗体。
a)前記抗体は2つの抗体重鎖を含み、各々が重鎖可変ドメイン及び重鎖定常領域を含んでおり、
i)前記可変ドメインは、配列番号08、配列番号09及び配列番号10のHVRを含み、
ii)前記定常領域は、ヒトIgG1定常領域であって、そのC末端リジン残基は存在してもしなくてもよく、並びに
iii)前記定常領域は、アミノ酸変化L234A、L235A及びP329Gを含むものであり、
b)前記抗体は2つの抗体軽鎖を含み、各々が軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含んでおり、
i)前記可変ドメインは、配列番号12、配列番号05及び配列番号15のHVRを含み、
ii)前記定常領域は、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域であり、
並びに
c)前記抗体は、
i)配列番号03のアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異的に結合する、及び/又は
ii)1μg/mLで全長ヒトタウ(配列番号01)に結合しない、及び/又は
iii)第422位のセリンでリン酸化された全長ヒトタウ(配列番号02)に特異的に結合する、及び/又は
iv)第422位のセリンでリン酸化されたヒトタウ(配列番号02)の凝集体に特異的に結合する、及び/又は
v)配列番号01のアミノ酸配列を有し、アミノ酸突然変異S422Aを有する全長ヒトタウに特異的に結合する、及び/又は
vi)配列番号03のアミノ酸配列を有するヒトタウ(pS422)フラグメントに対して6ng/mL以下のEC50値を有する、及び/又は
vii)配列番号02のアミノ酸配列を有する全長ヒトタウ(pS422)に対して4.5ng/mL以下のEC50値を有する、及び/又は
viii)配列番号02のアミノ酸配列を有するヒトタウ(pS422)の凝集体に対して30ng/mL以下のEC50値を有する、及び/又は
ix)配列番号01のアミノ酸配列を有し、アミノ酸突然変異S422Aを有するヒトタウに対して125ng/mL以下のEC50値を有する
抗体。
a)前記抗体は2つの抗体重鎖を含み、各々が重鎖可変ドメイン及び重鎖定常領域を含んでおり、
i)前記可変ドメインは、配列番号08、配列番号09及び配列番号10のHVRを含み、
ii)前記定常領域は、ヒトIgG1定常領域であって、そのC末端リジン残基は存在してもしなくてもよく、並びに
iii)前記定常領域は、アミノ酸変化L234A、L235A及びP329Gを含むものであり、
b)前記抗体は2つの抗体軽鎖を含み、各々が軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含んでおり、
i)前記可変ドメインは、配列番号13、配列番号14及び配列番号15のHVRを含み、
ii)前記定常領域は、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域であり、
並びに
c)前記抗体は、
i)配列番号03のアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異的に結合する、及び/又は
ii)1μg/mLで全長ヒトタウ(配列番号01)に結合しない、及び/又は
iii)第422位のセリンでリン酸化された全長ヒトタウ(配列番号02)に特異的に結合する、及び/又は
iv)第422位のセリンでリン酸化されたヒトタウ(配列番号02)の凝集体に特異的に結合する、及び/又は
v)配列番号01のアミノ酸配列を有し、アミノ酸突然変異S422Aを有する全長ヒトタウに特異的に結合する、及び/又は
vi)配列番号03のアミノ酸配列を有するヒトタウ(pS422)フラグメントに対して6ng/mL以下のEC50値を有する、及び/又は
vii)配列番号02のアミノ酸配列を有する全長ヒトタウ(pS422)に対して4.5ng/mL以下のEC50値を有する、及び/又は
viii)配列番号02のアミノ酸配列を有するヒトタウ(pS422)の凝集体に対して30ng/mL以下のEC50値を有する、及び/又は
ix)配列番号01のアミノ酸配列を有し、アミノ酸突然変異S422Aを有するヒトタウに対して125ng/mL以下のEC50値を有する
抗体。
a)前記抗体は2つの抗体重鎖を含み、各々が重鎖可変ドメイン及び重鎖定常領域を含んでおり、
i)前記可変ドメインは、配列番号20のアミノ酸配列を有し、
ii)前記定常領域は、ヒトIgG1定常領域であって、そのC末端リジン残基は存在してもしなくてもよく、並びに
iii)前記定常領域は、アミノ酸変化L234A、L235A及びP329Gを含むものであり、
b)前記抗体は2つの抗体軽鎖を含み、各々が軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含んでおり、
i)前記可変ドメインは、配列番号17のアミノ酸配列を有し、
ii)前記定常領域は、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域であり、
並びに
c)前記抗体は、
i)配列番号03のアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異的に結合する、及び/又は
ii)1μg/mLで全長ヒトタウ(配列番号01)に結合しない、及び/又は
iii)第422位のセリンでリン酸化された全長ヒトタウ(配列番号02)に特異的に結合する、及び/又は
iv)第422位のセリンでリン酸化されたヒトタウ(配列番号02)の凝集体に特異的に結合する、及び/又は
v)配列番号01のアミノ酸配列を有し、アミノ酸突然変異S422Aを有する全長ヒトタウに特異的に結合する、及び/又は
vi)配列番号03のアミノ酸配列を有するヒトタウ(pS422)フラグメントに対して6ng/mL以下のEC50値を有する、及び/又は
vii)配列番号02のアミノ酸配列を有する全長ヒトタウ(pS422)に対して4.5ng/mL以下のEC50値を有する、及び/又は
viii)配列番号02のアミノ酸配列を有するヒトタウ(pS422)の凝集体に対して30ng/mL以下のEC50値を有する、及び/又は
ix)配列番号01のアミノ酸配列を有し、アミノ酸突然変異S422Aを有するヒトタウに対して125ng/mL以下のEC50値を有する
抗体。
a)前記抗体は2つの抗体重鎖を含み、各々が重鎖可変ドメイン及び重鎖定常領域を含んでおり、
i)前記可変ドメインは、配列番号19のアミノ酸配列を有し、
ii)前記定常領域は、ヒトIgG1定常領域であって、そのC末端リジン残基は存在してもしなくてもよく、並びに
iii)前記定常領域は、アミノ酸変化L234A、L235A及びP329Gを含むものであり、
b)前記抗体は2つの抗体軽鎖を含み、各々が軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含んでおり、
i)前記可変ドメインは、配列番号16のアミノ酸配列を有し、
ii)前記定常領域は、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域であり、
並びに
c)前記抗体は、
i)配列番号03のアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異的に結合する、及び/又は
ii)1μg/mLで全長ヒトタウ(配列番号01)に結合しない、及び/又は
iii)第422位のセリンでリン酸化された全長ヒトタウ(配列番号02)に特異的に結合する、及び/又は
iv)第422位のセリンでリン酸化されたヒトタウ(配列番号02)の凝集体に特異的に結合する、及び/又は
v)配列番号01のアミノ酸配列を有し、アミノ酸突然変異S422Aを有する全長ヒトタウに特異的に結合する、及び/又は
vi)配列番号03のアミノ酸配列を有するヒトタウ(pS422)フラグメントに対して6ng/mL以下のEC50値を有する、及び/又は
vii)配列番号02のアミノ酸配列を有する全長ヒトタウ(pS422)に対して4.5ng/mL以下のEC50値を有する、及び/又は
viii)配列番号02のアミノ酸配列を有するヒトタウ(pS422)の凝集体に対して30ng/mL以下のEC50値を有する、及び/又は
ix)配列番号01のアミノ酸配列を有し、アミノ酸突然変異S422Aを有するヒトタウに対して125ng/mL以下のEC50値を有する
抗体。
a)前記抗体は2つの抗体重鎖を含み、各々が重鎖可変ドメイン及び重鎖定常領域を含んでおり、
i)前記可変ドメインは、配列番号19のアミノ酸配列を有し、
ii)前記定常領域は、ヒトIgG1定常領域であって、そのC末端リジン残基は存在してもしなくてもよく、並びに
iii)前記定常領域は、アミノ酸変化L234A、L235A及びP329Gを含むものであり、
b)前記抗体は2つの抗体軽鎖を含み、各々が軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含んでおり、
i)前記可変ドメインは、配列番号17のアミノ酸配列を有し、
ii)前記定常領域は、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域であり、
並びに
c)前記抗体は、
i)配列番号03のアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異的に結合する、及び/又は
ii)1μg/mLで全長ヒトタウ(配列番号01)に結合しない、及び/又は
iii)第422位のセリンでリン酸化された全長ヒトタウ(配列番号02)に特異的に結合する、及び/又は
iv)第422位のセリンでリン酸化されたヒトタウ(配列番号02)の凝集体に特異的に結合する、及び/又は
v)配列番号01のアミノ酸配列を有し、アミノ酸突然変異S422Aを有する全長ヒトタウに特異的に結合する、及び/又は
vi)配列番号03のアミノ酸配列を有するヒトタウ(pS422)フラグメントに対して6ng/mL以下のEC50値を有する、及び/又は
vii)配列番号02のアミノ酸配列を有する全長ヒトタウ(pS422)に対して4.5ng/mL以下のEC50値を有する、及び/又は
viii)配列番号02のアミノ酸配列を有するヒトタウ(pS422)の凝集体に対して30ng/mL以下のEC50値を有する、及び/又は
ix)配列番号01のアミノ酸配列を有し、アミノ酸突然変異S422Aを有するヒトタウに対して125ng/mL以下のEC50値を有する
抗体。
a)前記抗体は2つの抗体重鎖を含み、各々が重鎖可変ドメイン及び重鎖定常領域を含んでおり、
i)前記可変ドメインは、配列番号21のアミノ酸配列を有し、
ii)前記定常領域は、ヒトIgG1定常領域であって、そのC末端リジン残基は存在してもしなくてもよく、並びに
iii)前記定常領域は、アミノ酸変化L234A、L235A及びP329Gを含むものであり、
b)前記抗体は2つの抗体軽鎖を含み、各々が軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含んでおり、
i)前記可変ドメインは、配列番号17のアミノ酸配列を有し、
ii)前記定常領域は、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域であり、
並びに
c)前記抗体は、
i)配列番号03のアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異的に結合する、及び/又は
ii)1μg/mLで全長ヒトタウ(配列番号01)に結合しない、及び/又は
iii)第422位のセリンでリン酸化された全長ヒトタウ(配列番号02)に特異的に結合する、及び/又は
iv)第422位のセリンでリン酸化されたヒトタウ(配列番号02)の凝集体に特異的に結合する、及び/又は
v)配列番号01のアミノ酸配列を有し、アミノ酸突然変異S422Aを有する全長ヒトタウに特異的に結合する、及び/又は
vi)配列番号03のアミノ酸配列を有するヒトタウ(pS422)フラグメントに対して6ng/mL以下のEC50値を有する、及び/又は
vii)配列番号02のアミノ酸配列を有する全長ヒトタウ(pS422)に対して4.5ng/mL以下のEC50値を有する、及び/又は
viii)配列番号02のアミノ酸配列を有するヒトタウ(pS422)の凝集体に対して30ng/mL以下のEC50値を有する、及び/又は
ix)配列番号01のアミノ酸配列を有し、アミノ酸突然変異S422Aを有するヒトタウに対して125ng/mL以下のEC50値を有する
抗体。
以下は本発明の方法及び組成物の実施例である。上に提供された一般的な説明をふまえて、他に種々の実施形態を行い得ることが理解される。
組換えDNA技術
標準的な方法を用いて、Sambrook, J. et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989に記載のようにDNAを操作した。分子生物学的試薬を、製造業者の使用説明書に従って使用した。
所望の遺伝子セグメントを、化学合成によりGeneart GmbH(Regensburg, Germany)で調製した。合成された遺伝子フラグメントを、増殖/増幅のためにE.coliプラスミドにクローニングした。サブクローニングされた遺伝子フラグメントのDNA配列を、DNA配列決定によって検証した。あるいは、短い合成DNAフラグメントを、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドをアニーリングすることにより、又はPCRを介して組立てた。それぞれのオリゴヌクレオチドを、metabion GmbH(Planegg-Martinsried, Germany)により調製した。
市販の化学物質、抗体及びキットは全て、別途に述べない限り製造業者のプロトコルに従い提供されるとおりに使用した。
ウサギ抗体の調製及び精製
Charles River Laboratories International, Inc.からのNZWウサギを、免疫化のために使用した。KLHにカップリングされたリン酸化ペプチドタウ(416−430)[pS422]をK3PO4緩衝液(puffer)pH7.0中に1mg/mlの濃度で溶解させ(solved)、安定なエマルションの生成まで完全フロイントアジュバント(CFA)と混合させた(1:1)。3羽のウサギに2mlのエマルションを皮内(i.d.)注射し、その後第2回目の筋肉内(i.m.)注射及び第3回目の皮下(s.c.)注射を、各々1mlづつ、1週間の間隔で行った。2週間後に1mlの第4回目の筋肉内注射を実施し、その後4週間の間隔で2回、更に1mlの皮下注射を行った。各動物の末梢全血試料10mlを、第3、4、5及び6回目の注射後4〜6日に採取して、FACSにおける単一細胞選別に用いた。各動物の追加の0.5ml血清を同じ時間に採取して、タウ(416−463)[pS422]特異性抗体応答の決定に用いた。
免疫化に対する抗体応答を、血清の段階希釈により、ELISAを用いて決定した。ELISAでは、ビオチン化タウ(416−430)[pS422]のウェル当たり30ngを、1×PBS中で4℃にて一晩、ストレプトアビジンが予め被覆された96ウェルマイクロタイタープレート(MC1347, Micro Coat Biotechnologie GmbH, Bernried, Germany)上でインキュベーションした。検出のため、セイヨウワサビペルオキシダーゼに結合させたヤギ抗ウサギIgG(The Jackson laboratory)を1:16000の希釈で用いた。Roche Diagnostics GmbHのBM Blue POD Substrate、沈降テトラメチルベンジジン(TMB)、使用準備済溶液を、可視化のために使用した。1N HClで反応を停止させて、450/690nmによりTecan Infiniteで測定した。
プレートの被覆
EDTA含有全血を1×PBSで2倍に希釈し、その後ウサギPBMCを単離するためにlympholyte mammal(Cedarlane Laboratories)で密度遠心分離を実施した。PBMCは、抗体で染色する前に2回洗浄された。
10%FCS(Hyclone, Logan, UT, USA)、2mM グルタミン、1%ペニシリン/ストレプトマイシン溶液(PAA, Pasching, Austria)、2mM ピルビン酸ナトリウ、10mM HEPES(PAN Biotech, Aidenbach, Germany)及び0.05mM β−メルカプトエタノール(Gibco, Paisley, Scotland)を追加したRPMI 1640(Pan Biotech, Aidenbach, Germany)。
滅菌6−ウェルプレート(細胞培養等級)を用いて、非特異的接着によりマクロファージ及び単球を枯渇させた。ウェルは、KLH(キーホールリンペットヘモシニアン)か、又はストレプトアビジン及び前記対照ペプチドかのいずれかで被覆された。最大4mlの培地及び免疫されたウサギからの最大6×106個の末梢血単核球で各ウェルを満たし、37℃で1時間、インキュベーターにて結合させた。上清中の細胞の50%をパニング工程のために用い、細胞の残りの50%を直接、免疫蛍光染色及び単一細胞選別に供した。
ストレプトアビジン及びビオチン化ペプチドタウ(416−430)[pS422] で被覆された6−ウェル組織培養プレートに、4ml培地当たり最大6×106個の細胞を播種し、37℃で1時間、インキュベーターにて結合させた。ウェルを注意深く1×PBSで1〜2回洗浄することにより、非接着性細胞を除去した。残存する粘質細胞は、インキュベーターにおいて37℃で10分、トリプシンによって剥離させて、その後培地で2回洗浄した。免疫蛍光染色まで、細胞を氷上で保持した。
単一細胞選別のために使用する抗ウサギIgG FITCは、AbD Serotec(STAR121F, Dusseldorf, Germany)より入手した。表面染色のため、枯渇及びパニング工程から得られた細胞を、PBS中の抗ウサギIgG FITC抗体と、冷却室内、暗所で4℃にて30分、回転させながらインキュベーションした。遠心分離の後、上清を吸引により除去した。PBMCは、2サイクルの遠心分離及び氷冷PBSでの洗浄に供した。最後にPBMCを氷冷PBSに再懸濁させて、直ちにFACS分析に供した。5μg/mlの濃度のヨウ化プロピジウム(BD Pharmingen, San Diego, CA, USA)を、FACS分析の前に添加し、死細胞と生細胞とを識別した。FACSは、FACSDiva ソフトウェアを備えたBecton Dickinson FACSAria(BD Biosciences, USA)を用いて実施し、単一のFITCラベル生細胞が、96−ウェルプレート内に沈殿した。
B細胞培養物は、Zubler, R.H. et al., J. Immunol. 134 (1985) 3662-3668に記載のものと類似の方法によって調製された。簡単に言うと、単一選別されたB細胞を96−ウェルプレートにおいて、Pansorbin細胞(1:20000)(Calbiochem (Merck), Darmstadt, Deutschland)、5%ウサギ胸腺細胞上清及びガンマ照射されたEL−4−B5マウス胸腺腫細胞(2×104/ウェル)を含む210μl/ウェルのEL−4 B5培地と共に37℃で7日間、5%CO2の雰囲気内でインキュベーターにて培養した。B細胞培養上清をスクリーニング用に除去し、細胞は直ちに可変領域遺伝子クローニング用に回収するか、又は100μl RLT緩衝液(Qiagen, Hilden, Germany)中で−80℃で凍結させた。
B細胞培養上清は、ビオチン化タウ(416−430)[pS422]への結合につき、ELISAによってスクリーニングされた。非リン酸化タウ(416−430)、KLH(キーホールリンペットヘモシニアン)及び関連性のないリン酸化ペプチドMCAK_Human(88−102)[95−pSer]を対照抗原として使用した。ELISAプレートの調製のため、ストレプトアビジンが予め被覆されたマイクロタイタープレートを50ng/mlのビオチン化タウ(415−430)[pS422]と共に室温で1時間インキュベーションした。KLH又は対照ペプチドの被覆は、1μg/mlで行った。B細胞上清を、1:5〜1:10に希釈し、抗原が被覆されたマイクロタイタープレートにおいて60分間インキュベーションした。念入りに洗浄した後、ヒツジ抗ウサギIgGジゴキシゲニン接合検出抗体(Chemicon AQ301D)を使用してウサギ抗体の結合を検出した。室温でTMBとインキュベーションした後、370nm〜492nmで吸光度を測定した。ビオチン化タウ(416−430)[pS422]でバックグラウンドを超えるシグナルを生じるが、KLH及びMCAK_Human(88−102)[95−pSer]では生じないB細胞クローンを更に検討し、可変領域遺伝子クローニングに供した。
全RNAを、NucleoSpin(登録商標)8/96 RNAキット(Macherey&Nagel;740709.4, 740698)を用い、製造業者のプロトコールに従って調製した。全工程を、epMotion 5075液体取扱いシステム(liquid handling system)(Eppendorf)で行った。RNAは、60μlのRNAse不含水で溶出させた。6μlのRNAを用いて、Superscript III First-Strand Synthesis SuperMix(Invitrogen 18080-400)及びオリゴdT−プライマーを使用し、製造業者の使用説明書に従って逆転写酵素反応によりcDNAを生成した。4μlのcDNAを用いて、重鎖用にプライマーrbHCfinal.up及びrbHCfinal.do、並びに軽鎖用にrbLCfinal.up及びrbLCfinal.do(以下の表を参照)を使用し、AccuPrime SuperMix(Invitrogen 12344-040)で50μlの最終体積にて免疫グロブリン重鎖及び軽鎖可変領域(VH及びVL)を増殖した。PCR条件は以下のとおりであった:94℃で5分間(高温開始);94℃で20秒、70℃で20秒、68℃で45秒の35サイクル、及び68℃で7分(最終的な伸長)。
ウサギモノクローナル抗体の組換え発現のために、VH又はVLをコード化するPCR生成物を、オーバーハングクローニング方法(Haun, R.S. et al., BioTechniques 13 (1992) 515-518;Li, M.Z., et al., Nature Methods 4 (2007) 251-256)により、発現ベクターへとcDNAとしてクローニングした。重複するプライマーを使用するPCRによって、VH挿入物のウサギのカッパ又はガンマ定常領域及びVLをコード化する線形化された発現プラスミドを増幅させた。一本鎖オーバーハングを生成するT4 DNAポリメラーゼと共に精製されたPCR生成物をインキュベーションした。dCTPを添加することにより反応を停止させた。次の工程で、プラスミド及び挿入物を合わせ、部位特異的組換えを誘導するRecAと共にインキュベーションした。組換えられたプラスミドをE.coliに形質転換した。翌日、増殖したコロニーを取り、プラスミド調製、制限解析及びDNA配列決定によって正確に組換えられたプラスミドについて試験した。抗体発現については、単離されたHC及びLCプラスミドを一過的にHEK293細胞へコトランスフェクトし、1週間後に上清を回収した。ウサギマウスキメラ抗体のクローニング及び発現については、PCRによってVH及びVL領域を増幅し、マウス定常カッパ又はマウス定常ガンマ1領域を含む発現ベクターへサブクローニングした。ウサギ/マウスキメラHC及びLCプラスミドを単離し、正確な挿入について制限解析及びDNA配列決定によって試験し、一過的にHEK293細胞へコトランスフェクトした。トランスフェクションの1週間後に上清を回収した。
組換え発現したウサギ抗体をMabSelectSuRe(商標)カラム(GE Healthcare)で細胞培養上清から精製した。試料をロードする前に、25mmol/L Tris−HCl、25mmol/L NaCl(pH7.4)でカラムを平衡化した。50mmol/L 酢酸塩(pH3.14)で抗体を溶出した。溶出された試料を直ちに脱塩カラム(Sephadex G25, GE Healthcare)にロードし、20mmol/L His−HCl、140mmol/L NaCl(pH6.0)に溶出した。精製抗体の保存にもこの緩衝液を使用した。一般的な保存温度は4℃であり、精製工程中は室温、分取後は−80℃であった。細胞培養上清から得られた組換え発現ウサギ/マウスキメラ抗体をMabSelectSuRe(商標)カラム(GE Healthcare)で精製した。試料をロードする前に、1×PBS(pH7.4)でカラムを平衡化した。100mmol/L クエン酸塩(pH3.0)で抗体を溶出した。溶出された試料を直ちに2mol/L Tris/HCl(pH9.0)で中和した。その後、サイズ排除カラム(Superdex 200, GE Healthcare)に抗体をロードし、20mmol/L His−HCl、140mmol/L NaCl(pH6.0)に溶出した。精製抗体の保存にも、この緩衝液を使用した。一般的な保存温度は4℃であり、精製工程中は室温、分取後は−80℃であった。
抗タウpS422モノクローナルウサギ抗体は、pS422でリン酸化されたタウに対して高度に選択的であり、タウpS422の原線維状凝集体に結合する
HEK293細胞においてウサギモノクローナル抗体を組換え発現させた。ELISAにより、ビオチン化タウ(416−430)[pS422]、非リン酸化タウ(416−430)、KLH(キーホールリンペットヘモシアニン)及び関係性のないリン酸化ペプチドMCAK_Human(88−102)[95−pSer]に対する結合について、細胞培養上清又は精製されたウサギ抗体を試験した。ELISAプレートの調製については、室温で1時間50ng/mLのビオチン化タウ(415−430)[pS422]と共に、ストレプトアビジンで予め被覆されたマイクロタイタープレートをインキュベーションした。KLH又は対照ペプチドによる被覆は、1μg/mLで行った。抗原でラベルされたマイクロタイタープレートにおいて、様々な濃度で60分間、ウサギ抗タウpS422抗体(Abcam AB51071)又は上清を含有しているウサギ抗体をインキュベーションした。念入りに洗浄した後、ヒツジ抗ウサギIgGジゴキシゲニン接合検出抗体(Chemicon AQ301D)を使用して、ウサギ抗体の結合を検出した。室温でTMBと共にインキュベーションした後、370nm〜492nmで吸光度を測定した。EC50値によって抗体結合を特徴付けた。ビオチン化タウ(416−430)[pS422]及び非リン酸化タウ(416−430)ペプチドに対する抗体結合を、そのEC50値によって特徴付けた。高濃度、即ち、1:5で希釈された細胞培養上清における一点測定によって、KLH又はMCAKリン酸化ペプチドの交差反応性を推定した。結果を以下の表に示す。タウリン酸化ペプチドに対する結合のEC50値は、タウペプチドに対する結合のEC50値の100分の1未満であることが見出され、これは、非リン酸化タウペプチドに比べてリン酸化タウフラグメントに対する選択性が少なくとも100倍であることを示唆する。KLH及びMCAK対照リン酸化ペプチドに対する結合は、全ての抗体でバックグラウンドレベルであり、これは、タウリン酸化ペプチドの最大値測定の約1<3%である。
BIAcore(商標)分析によって、原線維状タウpS422凝集体に対する結合につき、更に調査及び確認した。37℃でBIAcore 3000機器を使用して測定を行った。システム及び試料の緩衝液は、HBS−EP(10mM HEPES、150mM NaCl、3.4mM EDTA、0.005%ポリソルベート20(v/v))であった。BIAcore(商標)CM5センサーチップをプレコンディショニング手順に供した。連続して、フローセルFC1、FC2、FC3及びFC4上に30秒間、0.1%SDS、50mM NaOH、10mM HCl及び100mM H3PO4を注入した。アミンカップリング手順を、BIAcore 3000(商標)wizard v. 4.1を使用して、製造業者の使用説明書に従って行った。センサー表面をEDC/NHSで活性化した後、センサーのフローセルFC2、FC3及びFC4上に非リン酸化部位選択性抗タウ抗体mAb<TAU>M−4/53−IgGを固定化した。対照として、関連性のない抗原を認識するCK−MM(クレアチンキナーゼアイソタイプ)に対する抗体をFC1上に捕捉した。10mM NaAc(pH5.0)中30μg/mLになるようにmAb<TAU>M−4/53−IgG及びCK−MMに対する抗体を希釈し、10.000RUの抗体捕捉系を固定化するために、7分間の接触時間で10μL/分にて注入した。1Mエタノールアミンで飽和させることによって表面を不活化した。10μL/分にて2分間、溶液中の検体としてリン酸化線維状タウタンパク質(原液0.3mg/mLをHBS−EPで1:100に希釈)を用いて5サイクル、センサーをコンディショニングした。30μL/分にて3分間、10mMグリシン(pH2.5)で再生を行った。mAb 4/53からのpタウ線維の解離を観察することができなかったので、mAb 4/53に対する検体の結合はpタウ線維を解離させないと想定される。全ての更なる測定サイクルで、0.3mg/mLのpタウ線維をHBS−EP緩衝液で1:100に希釈し、不均一なサンドイッチ法において各抗体検体にpタウを呈示するために、1分間、10μL/分で注入した。抗体検体をHBS−EP緩衝液で100nMの濃度に希釈し、3分間20μL/分で系に注入した。3分間の解離後、100μL/分で1分間、10mM グリシン(pH2.5)を2回注入し、次いで、100μL/分で15秒間HBSで洗浄することによってセンサー表面を再生した。相互作用の会合及び解離相をモニターした。溶液中の抗体検体が二価であるので、アビディティに重み付けした(avidity-burdened)抗体―pタウカイネティックスを、速やかな親和性に基づく早期解離工程と、後半の錯体解離におけるアビディティは安定化しているが、律速であるカイネティック工程からなる二相解離モデルによって特徴付けた。検体注入が終了した10秒後(早期)及び50秒後(後期)、可能な場合kd及びt/2(diss)を定量した。二重参照手順を使用して、カイネティック測定値を評価した。先ず、FC1参照からのシグナルを減じて、緩衝液のバルク効果及び非特異的結合を補正した。次に、0nM 検体注入を減じて、それぞれの捕捉系から一次抗体の解離を補正した。BIAcore(商標)評価ソフトウェアv.4.1に従ってラングミュア1.1解離適合モデルを使用して、反応速度を評価した。式:ln(2)/60×kdに従って抗原/抗体複合体安定半減期(分)を計算した。
アルツハイマー病患者の脳切片における細胞内pタウに対する抗タウpS422モノクローナルウサギ抗体の結合
AD患者からのヒト脳組織の低温切片を用いる免疫蛍光染色実験によって、モノクローナルウサギ抗タウpS422抗体によるアルツハイマー病脳組織のpタウ病変の免疫組織化学的検出の特異性及び感受性について調べた。この手順は基本的に実施例X(マウス抗体)に記載されているのと同じ手順であった。ヤギ抗ウサギAlexa Fluor488(登録商標)接合二次抗体(Invitrogen/Molecular Probes A11034)によってウサギIgGを検出した。pタウ沈着物及び線維は、クローンMab005、Mab019、Mab020、Mab085、Mab086及びMab097について特異的且つ高感度に染色されていることが明らかである。大きな神経原線維濃縮体及び細長い糸屑状構造物のような、細胞内のpタウ沈着が顕著である。調査したクローン全てについて最小有効濃度は0.08〜0.016μg/mLであると測定され、これは、純粋なヒトpタウ沈着物に対して高感度で結合することを示唆する。
ウサギ抗ヒトタウ(pS422)抗体のヒト化
本明細書で使用する場合「可変ドメイン」(軽鎖(VL)の可変ドメイン、重鎖(VH)の可変ドメイン)は、抗体がタウ(pS422)抗原に結合する際に直接的に関係する、軽鎖ドメインと重鎖ドメインとの対の各々を意味する。可変軽鎖及び重鎖ドメインは同じ一般構造を有し、各ドメインは4つのフレームワーク(FR)領域を含み、それらの配列は広く保存されていて3つの「超可変領域」により連結されている。
組換え発現ベクターの生成
a)ヒトIgG1定常領域を用いた、免疫グロブリン重鎖の発現用ベクターの生成
ヒトIgG1定常領域(CH1、ヒンジ、CH2、CH3)と、ウサギ抗体Mab086由来のヒト化抗ヒトタウ(pS422)抗体VHドメインとを含む、ヒト化重鎖をコード化する融合遺伝子は、それぞれの抗ヒトタウ(pS422)−特異抗体VHドメインをコード化するDNAフラグメントを、ヒトIgG1定常領域をコード化する配列エレメントに融合することにより組立てられた。
− イントロンAを含むヒトサイトメガロウイルス(P−CMV)からの最初期エンハンサー及びプロモーター、
− ヒト重鎖免疫グロブリン5’−非翻訳領域(5’UTR)、
− マウスの免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
− 重鎖可変(VH)ドメインをコード化する核酸、
− ヒトIgG1定常領域をコード化する核酸、及び
− ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列(BGH pA)。
ヒトIg−カッパ定常領域(CL−カッパ)と、ウサギ抗体Mab086由来の抗ヒトタウ(pS422)抗体VL(カッパ)ドメインとを含む、ヒト化カッパ軽鎖をコード化する融合遺伝子は、それぞれの抗ヒトタウ(pS422)抗体VL(カッパ)ドメインをコード化するDNAフラグメントを、ヒトIg−カッパ定常領域をコード化する配列エレメントに融合することにより組立てられた。
− イントロンAを含むヒトサイトメガロウイルス(P−CMV)からの最初期エンハンサー及びプロモーター、
− ヒト重鎖免疫グロブリン5’−非翻訳領域(5’UTR)、
− マウスの免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
− 軽鎖可変(VL)ドメインをコード化する核酸、
− ヒトIg−カッパ定常領域をコード化する核酸、及び
− ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列(BGH pA)。
ヒトIg−ラムダ定常領域(CL−ラムダ)と、ウサギ抗体Mab086由来の抗ヒトタウ(pS422)抗体VL(ラムダ)ドメインとを含む、ヒト化ラムダ軽鎖をコード化する融合遺伝子は、それぞれの抗ヒトタウ(pS422)抗体VL(ラムダ)ドメインをコード化するDNAフラグメントを、ヒトIg−ラムダ定常領域をコード化する配列エレメントに融合することにより組立てられた。
− イントロンAを含むヒトサイトメガロウイルス(P−CMV)からの最初期エンハンサー及びプロモーター、
− ヒト重鎖免疫グロブリン5’−非翻訳領域(5’UTR)、
− マウスの免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
− 可変軽鎖(VL)ドメインをコード化する核酸、
− ヒトIg−ラムダ定常領域をコード化する核酸、及び
− ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列(BGH pA)。
ヒトIg−カッパ定常領域(CL−カッパ)と、ウサギ抗体Mab086由来の抗ヒトタウ(S422)抗体VL(カッパ)ドメインとを含む、ヒトIg−カッパ軽鎖をコード化する融合遺伝子は、それぞれの抗ヒトタウ(pS422)−抗体VL(カッパ)ドメインをコード化するDNAフラグメントを、ヒトIg−カッパ定常領域をコード化する配列エレメントに融合することにより組立てられた。構築体はゲノム編成となっており、すなわち、イントロンがシグナルペプチド内、及びVL(カッパ)ドメインとCL−カッパドメインとの間に存在していた。
− ヒトサイトメガロウイルス(P−CMV)からの最初期エンハンサー及びプロモーター
− ヒト重鎖免疫グロブリン5’−非翻訳領域(5’UTR)、
− マウスの免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
− 軽鎖可変(VL)ドメインをコード化する核酸、
− ヒトIgGカッパ定常領域、及び
− ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列(BGH pA)。
− ヒトサイトメガロウイルス(P−CMV)からの最初期エンハンサー及びプロモーター
− ヒト重鎖免疫グロブリン5’−非翻訳領域(5’UTR)、
− マウスの免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
− 軽鎖可変(VL)ドメインをコード化する核酸、
− ヒトIgGラムダ定常領域、及び
− ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列(BGH pA)。
抗ヒトタウ(pS422)抗体の組換え生成
F17培地(Invitrogen Corp.)中で培養された、一過的にトランスフェクトされたHEK293細胞(ヒト胎児腎臓細胞株293由来)において抗体を生成した。実施例5に記載のようなそれぞれのベクターのトランスフェクションには、「293-Free」トランスフェクション試薬(Novagen)を使用した。抗体は、個々の発現プラスミドから発現された。トランスフェクションを、製造業者の使用説明書に明記されるとおりに実施した。組換え抗体含有細胞培養上清は、トランスフェクションの3〜7日後に回収された。上清は、精製するまで低温(例えば、−80℃)で保存された。
組換え抗ヒトタウ(pS422)抗体の精製
抗体含有培養上清は、2種のクロマトグラフィー工程によって濾過及び精製された。
カイネティックスクリーニング
カイネティックスクリーニングは、Schraeml et al.(Schraeml, M. and M. Biehl, Methods Mol. Biol. 901 (2012) 171-181)に従い、BIAcore CM5センサーを備えたBIAcore 4000機器にて実施された。BIAcore 4000機器は、ソフトウェアバージョンV1.1の制御下にあった。BIAcore CM5シリーズSチップを機器に実装させ、製造業者の使用説明書に従って水力学的に扱い、プレコンディショニングした。機器緩衝液は、HBS−EP緩衝液(10mM HEPES(pH7.4)、150mM NaCl、1mM EDTA、0.05%(w/v)P20)であった。抗体捕獲システムを、センサー表面に準備した。NHS/EDC化学を使用し、10,000RUにて機器のフローセル1、2、3及び4内で、ヒトIgG−Fc特異性を有するポリクローナルヤギ抗ヒト抗体(Jackson Lab.)を、10mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH5)中30μg/mlでスポット1、2、4及び5に固定化した。各フローセルにおいて、抗体はスポット1及びスポット5で捕獲された。スポット2及びスポット4は、参照スポットとして使用された。センサーは、1M エタノールアミン溶液で不活化された。ヒト化抗体誘導体を、1mg/ml CMD(カルボキシメチルデキストラン)を追加した機器緩衝液中、44nMと70nMとの間の濃度で適用した。抗体は、30μl/分の流量で2分間注入された。表面呈示抗体の捕獲レベル(CL)を、rel.応答単位(RU)で測定した。溶液中の検体、リン酸化ヒトタウタンパク質、非リン酸化ヒトタウタンパク質及びリン酸化ヒトタウ突然変異体タンパク質T422Sは、300nMで3分間、30μl/分の流量で注入された。解離を、5分間モニタリングした。捕獲システムは、10mMグリシン緩衝液、pH1.7を30μL/分で1分間、全フローセルにわたって注入することにより再生された。2つの報告ポイント、すなわち、検体の注入終了の直前の記録シグナル(結合後期(binding late)(BL)と示す)と、解離時間の終了直前の記録シグナル(安定性後期(stability late)(SL))とを、カイネティックスクリーニング性能を特徴付けるために使用した。更に、解離速度定数kd(1/s)をラングミュアモデルに従って計算し、抗体/抗原複合体半減期を式:ln(2)/(60×kd)に従って分単位で計算した。モル比(MR)を、式:MR=(結合後期(RU))/(捕獲レベル(RU))×(MW(抗体)/(MW(抗原))に従って計算した。センサーが好適な量の抗体リガンド捕獲レベルで構成されている場合、各抗体は溶液中の少なくとも1つの検体に機能的に結合することができるはずであり、MR=1.0のモル比によって表される。それから、当該モル比は、検体結合の価数モードに対する指標でもある。最高価数は、2種の検体を結合する抗体に対してMR=2であることができ、1種が各Fab価数を有する。
ELISA
非被覆Maxisorbプレートに、非ビオチン化ペプチド/タンパク質/凝集体を、そしてストレプトアビジン被覆Maxisorbプレートに、PBS中ビオチン化ペプチド/タンパク質/凝集体を添加して一晩インキュベーションした。上清を破棄して、ウェルを90μlの洗浄緩衝液(1×PBS/0.1%Tween 20)で3回洗浄した。残存する反応性スポットを、ブロッキング緩衝液(1×PBS/2%BSA(ウシ血清アルブミンFraction V、脂肪酸不含、Roche, Cat. No.:10735078001)/0.05%Tween 20)で1時間インキュベーションすることによりブロックした。上清を破棄して、ウェルを90μlの洗浄緩衝液で3回洗浄した。試料及び対照抗体は、ELISA緩衝液(1×PBS/0.5%BSA(ウシ血清アルブミンFraction V、脂肪酸不含、Roche, Cat. No.:10735078001)/0.05%Tween 20)中500ng/mLの開始濃度で、12の希釈液(1:2)に調製された。インキュベーション時間は、振盪機上、室温にて60分間であった。上清を破棄して、ウェルを90μlの洗浄緩衝液で3回洗浄した。二次抗体の溶液を、ELISA緩衝液にて調製した。合計で25μlの抗体混合液を、アッセイプレートの全ウェル内に移し、このプレートをその後振盪機上、室温にて60分間インキュベーションした。上清を破棄して、ウェルを90μlの洗浄緩衝液で3回洗浄した。全てのウェルにABTS溶液25μlを添加した。吸光度を、405nm〜492nmで読み取った。
Claims (17)
- ヒトタウ(pS422)に特異的に結合するヒト化抗体であって、該抗体は、
a)重鎖可変ドメインに配列番号08、18及び10のHVR、並びに軽鎖可変ドメインに配列番号13、14及び15のHVR、又は
b)重鎖可変ドメインに配列番号08、09及び10のHVR、並びに軽鎖可変ドメインに配列番号12、05及び15のHVR、又は
c)重鎖可変ドメインに配列番号08、09及び10のHVR、並びに軽鎖可変ドメインに配列番号13、14及び15のHVR
を含む、ヒト化抗体。 - a)配列番号20の重鎖可変ドメイン及び配列番号17の軽鎖可変ドメイン、又は
b)配列番号19の重鎖可変ドメイン及び配列番号16の軽鎖可変ドメイン、又は
c)配列番号19の重鎖可変ドメイン及び配列番号17の軽鎖可変ドメイン、又は
d)配列番号21の重鎖可変ドメイン及び配列番号17の軽鎖可変ドメイン
を含む、請求項1に記載のヒト化抗体。 - 前記抗体が、エフェクター機能を示さない、請求項1〜2のいずれか一項記載のヒト化抗体。
- 前記抗体が、
i)配列番号03のアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異的に結合する、及び/又は
ii)1μg/mLで全長ヒトタウ(配列番号01)に結合しない、及び/又は
iii)第422位のセリンでリン酸化された全長ヒトタウ(配列番号02)に特異的に結合する、及び/又は
iv)第422位のセリンでリン酸化されたヒトタウ(配列番号02)の凝集体に特異的に結合する、
請求項1〜3のいずれか一項記載のヒト化抗体。 - 前記抗体が、
a)配列番号03のアミノ酸配列を有するヒトタウ(pS422)フラグメントに対して6ng/mL以下の、及び/又は
b)配列番号02のアミノ酸配列を有する全長ヒトタウ(pS422)に対して4.5ng/mL以下の、及び/又は
c)配列番号02のアミノ酸配列を有するヒトタウ(pS422)の凝集体に対して30ng/mL以下の、及び/又は
d)配列番号01のアミノ酸配列を有し、アミノ酸突然変異S422Aを有するヒトタウに対して125ng/mL以下の
EC50値を有する、請求項1〜4のいずれか一項記載のヒト化抗体。 - 前記抗体が、ヒトタウ(pS422)(配列番号02)に特異的に結合し、ヒトタウ(配列番号01)に結合しない、請求項1〜5のいずれか一項記載のヒト化抗体。
- 前記抗体が、
a)ヒトサブクラスIgG1の全長抗体、又は
b)ヒトサブクラスIgG4の全長抗体、又は
c)突然変異L234A、L235A及びP329Gを備えたヒトサブクラスIgG1の全長抗体、
d)突然変異S228P、L235E及びP329Gを備えたヒトサブクラスIgG4の全長抗体、
e)両重鎖に突然変異L234A、L235A及びP329G、並びに一方の重鎖に突然変異T366W及びS354C並びにそれぞれ他方の重鎖に突然変異T366S、L368A、Y407V及びY349Cを備えたヒトサブクラスIgG1の全長抗体、又は
f)両重鎖に突然変異S228P、L235E及びP329G、並びに一方の重鎖に突然変異T366W及びS354C並びにそれぞれ他方の重鎖に突然変異T366S、L368A、Y407V及びY349Cを備えたヒトサブクラスIgG4の全長抗体
である、請求項1〜6のいずれか一項記載のヒト化抗体。 - 請求項1〜7のいずれか一項記載のヒト化抗体と、薬学的に許容し得る担体とを含む医薬製剤。
- 抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体又は抗Aベータ抗体を更に含む、請求項8に記載の医薬製剤。
- 医薬の製造における、請求項1〜7のいずれか一項記載のヒト化抗体の使用。
- 前記医薬が、アルツハイマー病の処置用である、請求項10に記載の使用。
- 前記医薬が、前駆期アルツハイマー病の処置用である、請求項10〜11のいずれか一項記載の使用。
- 前記医薬が、軽度アルツハイマー病の処置用である、請求項10〜11のいずれか一項記載の使用。
- 前記医薬が、タウ(pS422)で誘発された神経変性の低減用である、請求項10〜13のいずれか一項記載の使用。
- 前記医薬が、認知及び機能の維持用である、請求項10〜14のいずれか一項記載の使用。
- 前記医薬が、認知的及び機能的減退の速度の緩徐化用である、請求項11〜15のいずれか一項記載の使用。
- タウ(pS422)で誘発された神経変性の低減のための、請求項1〜7のいずれか一項記載のヒト化抗ヒトタウ(pS422)抗体を含む請求項8又は9に記載の医薬製剤。
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