ES2352668T3

ES2352668T3 - Anticuerpo específico para una proteína tau del sistema nervioso central.

Info

Publication number: ES2352668T3
Application number: ES03788111T
Authority: ES
Inventors: Koichi C/O MITSUBISHI KAGAGU INST. OF LIFE CIE ISHIGURO; Hideto C/O Mitsubishi Chemical Medience Corp. OHNO; Masaki Imagawa
Original assignee: LSI Medience Corp
Current assignee: LSI Medience Corp
Priority date: 2002-08-14
Filing date: 2003-08-14
Publication date: 2011-02-22
Anticipated expiration: 2023-08-14
Also published as: EP1535930A4; US20050181460A1; AU2003257850A8; WO2004016655A1; AU2003257850A1; JP4393382B2; JPWO2004016655A1; US7442516B2; DE60334460D1; EP1535930B1; EP1535930A1

Abstract

Un anticuerpo específico para una proteína tau del sistema nervioso central (SNC), donde el anticuerpo reconoce específicamente una proteína tau del SNC pero no una proteína tau periférica y donde el anticuerpo reconoce específicamente una secuencia de aminoácidos de una parte de conexión entre la secuencia de aminoácidos codificada por el Exón 4 de un gen que codifica una proteína tau y la secuencia de aminoácidos codificada por el Exón 5 del mismo como un epítopo.

Description

CAMPO TÉCNICO

La presente invención se refiere a un anticuerpo que reconoce específicamente la proteína tau del sistema nervioso central (proteína tau del SNC) pero no la proteína tau de tejidos periféricos (proteína tau periférica). Adicionalmente, la presente invención se refiere a un método de detección de tauopatía en el que se analiza la presencia de la proteína tau del SNC en una muestra, particularmente a un método de detección de la enfermedad de Alzheimer y también a un kit de reactivos.

TÉCNICA ANTECEDENTE

La enfermedad de Alzheimer es una demencia progresiva que se produce en la etapa presenil (entre los 45 y 65 años). Produce cambios mórbidos tales como degeneración neuronal y atrofia del córtex cerebral debido a la disminución del número de neuronas. Patológicamente, se observan varias placas seniles y degeneración neurofibrilar en el cerebro. La denominada demencia senil causada por envejecimiento espontáneo en la senectud a una edad de 65 años o más no difiere sustancialmente de la enfermedad de Alzheimer desde el punto de vista patológico y se considera una demencia senil de tipo Alzheimer. Esta enfermedad se ha percibido como un problema social porque el número de pacientes que padecen la enfermedad de Alzheimer aumenta a medida que aumenta la población senil. Aunque existen diversas hipótesis acerca de las causas de esta enfermedad, aún no se han esclarecido y se desea un rápido avance en la aclaración de la enfermedad.

Se sabe que el principal componente de las placas seniles que es uno de los cambios patológicos causados por la enfermedad de Alzheimer es la proteína  amiloide (Annu. Rev, Neurosci., 12, 463-490 (1989)). La degeneración neurofibrilar, que es otro cambio patológico, muestra acumulación del filamento pareado helicoidal (que puede denominarse en lo sucesivo en este documento PHF) en las neuronas y la proteína tau fosforilada se identifica como uno de sus constituyentes

(J. Biochem. 99, 1807-1810 (1986); Proc. Natl. Sci. USA, 83, 4913-4917 (1986)).

Aunque la proteína tau está compuesta de un grupo de isoformas de proteínas que normalmente forman varias bandas con un peso molecular de 48 a 65 kD como resultado de la electroforesis en gel de poliacrilamida/SDS y promueve la formación de microtúbulos, se ha demostrado que la proteína tau incorporada en el PHF del cerebro con enfermedad de Alzheimer se encuentra anormalmente fosforilada en comparación con la del cerebro normal usando un anticuerpo policlonal contra PHF (anti-p-tau; J. Biochem., 99, 1807-1810 (1986)) y un anticuerpo monoclonal contra la proteína tau (anticuerpo de tau-1; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 4913-4917 (1986)). Además, se han identificado los sitios de fosforilación de la proteína tau fosforilada incorporada en el PHF (documento JP 6239893 A); y actualmente se están clarificando las funciones de la proteína tau implicadas en la enfermedad de Alzheimer.

Para las proteínas tau, se encuentra actualmente disponible en el mercado un kit para la medición de la concentración de una proteína tau en el líquido cefalorraquídeo (nombre comercial en Japón “Finoscolor hTAU” y nombre comercial en los Estados Unidos y Europa “INNOTEST hTAU Ag”, fabricado por Innogenetics) y se utiliza clínicamente. Por otro lado, se ha desarrollado un método de detección de la enfermedad de Alzheimer basado en el sitio de fosforilación de una proteína tau fosforilada en PHF (Neurosci. Lett., 270, 91-94 (1999); Ann. Neurol., 50, 150156 (2001)). Estos dos métodos están diseñados para usar como muestra líquido cefalorraquídeo. La extracción de las muestras presenta problemas debido a su gran invasividad en los pacientes. Por lo tanto, para reducir la invasividad en los pacientes y realizar un análisis conveniente, ha existido una fuerte demanda de métodos específicos y sensibles de detección de la enfermedad de Alzheimer con los que pueda analizarse una proteína tau del SNC incluso usando una diversidad de muestras no limitadas al líquido cefalorraquídeo y que incluyen la sangre.

Sin embargo, se ha puesto de manifiesto que se han descubierto varias formas diferentes para la proteína tau, y un tejido nervioso central tal como el cerebro y un tejido periférico tal como el músculo son diferentes en las isoformas de la proteína tau que existen predominantemente en cada tejido (J. Neurochem., 67, 1235-1244 (1996). Por ejemplo, la isoforma de una proteína tau que existe predominantemente en un tejido periférico (que también se denomina en lo sucesivo en este documento “proteína tau periférica”) tiene un gran peso molecular en comparación con la isoforma de una proteína tau que existe predominantemente en un tejido nervioso central (que también se denomina en lo sucesivo en este documento “proteína tau del SNC”). Se ha sugerido que, en una muestra de sangre

o similar, esta proteína tau periférica que tiene un gran peso molecular está incluida en una gran cantidad.

Los inventores de la presente invención han propuesto previamente un método para la detección de la enfermedad de Alzheimer usando sangre como muestra (documento JP 2002-040023 A). Sin embargo, este método es un método en el que no se distinguen isoformas en la proteína tau y se detecta la cantidad total de la misma. Por consiguiente, el método no permite analizar específicamente un cambio en la proteína tau del SNC que se produce en el cerebro de un paciente con enfermedad de Alzheimer. Por ejemplo, cuando se analiza una muestra de sangre o similar usando dicho método, la detección de una proteína tau del SNC se ve afectada por la fuerte reacción de una proteína tau periférica que tiene un gran peso molecular que está contenida en una gran cantidad en la muestra de sangre. Como resultado, no se obtiene suficiente sensibilidad.

Mercken M et al. (Acta Neuropathologica, Springer Verlag, Berlin, DE, vol. 84, nº 3, 1992, páginas 265-272) se dirigen a anticuerpos monoclonales con especificidad selectiva para la proteína Tau de la enfermedad de Alzheimer dirigidos contra epítopos sensibles a fosfatasa. Tranchant C. (M/S Medecine Sciences, Societe des Periodiques Flammarion, París, FR, vol. 13, nº 8/9, Agosto de 1997, páginas 989-997) se dirigen a proteínas Tau y enfermedades neurodegenerativas. El documento WO 96/04309 se dirige a anticuerpos monoclonales específicos para un epítopo de una subclase particular o forma de hibridomas de tau fosforilada que los secretan, al reconocimiento de antígeno de estos anticuerpos y a sus aplicaciones.

Resumiendo, ha sido difícil analizar una proteína tau procedente de un tejido del sistema nervioso central cuyo contenido es bajo en una muestra de sangre o similar que tiene concentraciones extremadamente elevadas de proteínas en bruto y una gran interferencia debida a impurezas (Dement, Geriat. Cong. Disord., 10, 442-445 (1999); Neurosci. Lett., 275, 159-162 (1999), y no se ha realizado el establecimiento de métodos específicos y sensibles para detectar la enfermedad de Alzheimer.

Adicionalmente, el deterioro cognitivo leve (que puede abreviarse en lo sucesivo en este documento como “MCI”), que muestra un síntoma subjetivo de pérdida de memoria o similar, ha recibido recientemente atención como pródromo de la enfermedad de Alzheimer. Se ha dicho que pacientes diagnosticados que tienen MCI, el 10-15% en un año y el 50% en varios años, desarrollan la enfermedad de Alzheimer, y cada vez hay más aceptación de que los pacientes con enfermedad de Alzheimer temprana se incluyen en los pacientes con MCI. Sin embargo, la evaluación existente para el MCI satisface un criterio tal como los criterios de Petersen, R. C. et al., (Arch. Neurol., 56, 303-308 (1999)) que se centran en tomar historias o en exámenes de función inteligente. Por lo tanto, no se han establecido diagnósticos objetivos y claros. Adicionalmente, con estos métodos convencionales, no es posible detectar pacientes con enfermedad de Alzheimer temprana entre un grupo de pacientes diagnosticados que tienen MIC. Por consiguiente, se ha pedido encarecidamente, el establecimiento de métodos para detectar claramente la enfermedad de Alzheimer para pacientes que incluyen dichos pacientes.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención se ha realizado para proporcionar un método muy específico, sensible y conveniente para detectar la enfermedad de Alzheimer.

Los inventores de la presente invención se han dedicado a extensos estudios para conseguir el objetivo anterior y han descubierto que la detección de la enfermedad de Alzheimer puede realizarse específicamente y de manera conveniente mediante análisis usando un anticuerpo que reconoce específicamente una proteína tau del SNC pero no una proteína tau periférica. Más particularmente, los inventores de la presente invención han descubierto que una proteína tau del SNC puede analizarse de un modo fiable empleando un anticuerpo que puede obtenerse usando un antígeno de un polipéptido que contiene una secuencia de aminoácidos de la parte de conexión entre la secuencia de aminoácidos que codifica el Exón 4 de un gen que codifica una proteína tau y la secuencia de aminoácidos codificada por el Exón 5, como un epítopo específico para la isoforma de la proteína tau que existe predominantemente en un tejido nervioso central, y que la concentración de la proteína tau del SNC analizada de esta manera cambiaba significativamente en una muestra obtenida a partir de un paciente con enfermedad de Alzheimer. La presente invención se ha conseguido basándose en estos hallazgos.

Concretamente, de acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proporciona:

(1): un anticuerpo específico contra una proteína tau del SNC, donde el anticuerpo reconoce específicamente una proteína tau del SNC pero no una proteína tau periférica;

(2): el anticuerpo de acuerdo con (1), donde la proteína tau del SNC es una proteína que está aumentada específicamente en un fluido corporal de un paciente con la enfermedad de Alzheimer;

(3): el anticuerpo de acuerdo con (1) o (2), donde el anticuerpo se obtiene usando un polipéptido que contiene una secuencia de aminoácidos específica contra la proteína tau del SNC como un antígeno;

(4): el anticuerpo de acuerdo con (3), donde la secuencia de aminoácidos específica para la proteína tau del SNC comprende una secuencia que contiene una secuencia de aminoácidos de una parte de conexión entre la secuencia de aminoácidos que codifica el Exón 4 de un gen que codifica una proteína tau y la secuencia de aminoácidos que codifica el Exón 5 de la misma;

(5): el anticuerpo de acuerdo con (4), donde la secuencia de la parte de conexión es una secuencia de aminoácidos representada por los números de aminoácidos 121-128 de una secuencia de aminoácidos descrita en la SEC ID Nº: 1 de la lista de secuencias; y

(6): un método para producir un anticuerpo específico para una proteína tau del SNC, que comprende: inmunizar a un animal con un polipéptido que contiene una secuencia de aminoácidos específica para una proteína tau del SNC como un antígeno; analizar la reactividad de un anticuerpo resultante con la proteína tau del SNC y una proteína tau periférica; y seleccionar un anticuerpo que tenga reactividad específica para la proteína tau del SNC.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona:

(7): un método para detectar tauopatía, que comprende analizar la presencia de una proteína tau del SNC en una muestra obtenida a partir de un individuo que se sospecha que tiene tauopatía usando el anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de (1) a (5);

(8): el método de acuerdo con (7), en el que la tauopatía es la enfermedad de Alzheimer;

(9): el método de acuerdo con (7) u (8), en el que la muestra se ha tratado por desnaturalización en presencia de un agente de solubilización de proteínas para eliminar proteína concomitantes;

(10): el método de acuerdo con (9), en el que la muestra se ha tratado adicionalmente por condensación;

(11): el método de acuerdo con una cualquiera de (7) a (10), en el que la muestra es sangre; y

(12): el método de acuerdo con una cualquiera de (7) a (11), en el que el análisis de la presencia de la proteína tau del SNC se realiza mediante ensayo inmunoabsorbente unido a enzimas.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona:

(13): un kit de reactivos para la detección de la enfermedad de Alzheimer, que comprende al menos el anticuerpo como se define en una cualquiera de (1) a (5).

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La Figura 1 es un diagrama fotográfico que muestra el resultado del análisis de transferencia puntual realizado para analizar la especificidad del anticuerpo de la presente invención. Cada uno de los cuatro anticuerpos que se han producido se hace reaccionar con ocho polipéptidos antigénicos sometidos a transferencia puntual sobre una membrana de PVDF y se detecta por una reacción de desarrollo de color.

La Figura 2 muestra un diagrama fotográfico de un análisis de transferencia de Western de la especificidad del anticuerpo de la presente invención contra una proteína tau del SNC. En esta figura, “anti-Exón 4-5” es un anticuerpo anti-Exón 4-5 (118-131) (purificación 121-128), “anti-Exón 4A” es un anticuerpo anti-Exón 4A y “HT7” es un anticuerpo monoclonal anti-proteína tau HT7. “M” de una muestra representa un extracto de un tejido muscular humano, “B” representa un extracto de un tejido cerebral de un paciente con enfermedad de Alzheimer y “C” representa un control positivo. “tau grande" (Exón 4A+) y “tau" (Exón 4A-)” representan la posición de la banda de una proteína tau periférica y la posición de la banda de un proteína tau del SNC, respectivamente.

MEJOR MODO PARA REALIZAR LA INVENCIÓN

En lo sucesivo en este documento, la presente invención se describirá adicionalmente con detalle.

1. Proteínas tau del SNC y periféricas

Un método de detección de tauopatía, especialmente un método para detectar la enfermedad de Alzheimer, de la presente invención, se caracteriza usando un anticuerpo que reconoce específicamente una proteína tau del SNC pero no una proteína tau periférica (que en lo sucesivo en este documento también se denomina “anticuerpo específico para una proteína tau del SNC”) para analizar la presencia de la proteína tau del SNC en una muestra obtenida a partir de un individuo que se sospecha que padece la enfermedad de Alzheimer.

Como se usa en la presente memoria, una “proteína tau del SNC” significa la isoforma de una proteína tau que existe predominantemente en un tejido nervioso central tal como el cerebro e incluye principalmente seis isoformas para seres humanos (Neuron, 3, 519-526 (1989)). Esas isoformas de la proteína tau del SNC tienen la característica en común de carecer de una secuencia de inserción entre el aminoácido Nº 124 (Gln) y el Nº 125 (Ala) en la secuencia de aminoácidos descrita en la SEC ID Nº: 1 de la lista de secuencias. En este caso, “entre el aminoácido Nº 124 y Nº 125” se refiere a una secuencia de la parte de conexión (GlnAla; que también se denomina en lo sucesivo en este documento, una “parte de conexión del Exón 4-5”) entre la secuencia de aminoácidos codificada por el Exón 4 de un gen que codifica una proteína tau (números de aminoácidos 103-124 de la SEC ID Nº: 1) y la secuencia de aminoácidos codificada por el Exón 5 de la misma (números de aminoácidos 125-143 de la SEC ID Nº: 1). La secuencia de una proteína tau del SNC mostrada en este documento (SEC ID Nº: 1) es la secuencia más larga de la isoforma de una proteína tau en un tejido nervioso central humano que se describe en Neuron, 3, 519-526 (1989), y la numeración de aminoácidos usada en este documento es la de la secuencia anterior.

“Proteína tau periférica” significa la isoforma de una proteína tau que existe predominantemente en un tejido periférico tal como el músculo y más particularmente significa, por ejemplo, la isoforma que tiene una secuencia de inserción entre el aminoácido nº 124 y nº 125 en la secuencia de aminoácidos descrita en la SEC ID Nº: 1 de la lista de secuencias. Para un ser humano, los ejemplos de la secuencia de inserción anterior en la proteína tau periférica incluyen una secuencia de aminoácidos codificada por el Exón 4A de un gen que codifica una proteína tau (SEC ID Nº: 2; Biochem., 31, 10626-10633 (1992)).

En este caso, cada una de las proteínas tau del SNC y tau periférica puede estar fosforilada o no y también incluye un fragmento de la misma.

En un tejido nervioso central tal como el cerebro de un paciente con enfermedad de Alzheimer, la proteína tau del SNC anterior está muy fosforilada y pierde su función original. Después, esta proteína se libera con o sin fragmentación y entra en el líquido cefalorraquídeo. Algunas veces, la proteína tau del SNC fluye al interior de un fluido corporal tal como sangre o linfa, porque existe una transporte entre el líquido cefalorraquídeo y fluidos corporales tales como sangre o linfa (Nyumon Visual Science “Mechanism of Brain” por Yasumasa Arai, Nippon Jitsugyo Publishing Co., Ltd.). Especialmente en la sangre, la proteína tau periférica está contenida en una gran cantidad de manera que si se usa sangre como muestra, es necesario analizar únicamente la proteína tau del SNC diferenciada de la proteína tau periférica. Como se ha descrito anteriormente, la proteína tau del SNC y la proteína tau periférica se diferencian una de otra basándose en la presencia o ausencia de la secuencia de inserción entre el aminoácido nº 124 y nº 125 de la secuencia descrita en la SEC ID Nº: 1 de la lista de secuencias. Preferiblemente, se diferencian usando, por ejemplo, un anticuerpo contra la secuencia de aminoácidos de la parte de conexión del Exón 4-5 como un epítopo.

La desviación de la proteína tau desde un tejido nervioso central a un fluido corporal en un paciente con la enfermedad de Alzheimer como se ha descrito anteriormente puede producirse mediante mecanismos similares a los encontrados en pacientes con otras enfermedades que tienen la proteína tau del SNC anterior que está muy fosforilada en un tejido nervioso central. Los ejemplos de dichas enfermedades incluyen un grupo de enfermedades clasificadas como tauopatía que presenta neurodegeneración causada por la acumulación de proteínas tau en un tejido nervioso central. Los ejemplos de tauopatía distintos de la enfermedad de Alzheimer incluyen síndrome de Down, síndrome de Parkinson, enfermedad de Pick, parálisis supranuclear progresiva (PSP), y degeneración corticobasal (CBD).

2. Anticuerpo específico para la proteína tau del SNC

En la presente invención, puede usarse cualquier anticuerpo siempre que reconozca específicamente una proteína tau del SNC pero no una proteína tau periférica, y los ejemplos del mismo incluyen un anticuerpo obtenido usando, como un antígeno, un polipéptido compuesto de una secuencia de aminoácidos específica contra una proteína tau del SNC (que también se denomina en lo sucesivo en este documento “polipéptido antigénico”). Es decir, el polipéptido antigénico puede tener cualquier secuencia siempre que un anticuerpo obtenido por inmunización de un animal con el polipéptido compuesto por la secuencia de aminoácidos específica para una proteína tau del SNC pueda diferenciar una proteína tau del SNC de una proteína tau periférica y pueda reconocer específicamente una proteína tau del SNC. En la presente invención, una “secuencia de aminoácidos específica para una proteína tau del SNC” se refiere a una secuencia de aminoácidos que está presente en la secuencia de aminoácidos de una proteína tau del SNC pero no en la de una proteína tau periférica.

Los ejemplos de la secuencia de aminoácidos específica para una proteína tau del SNC incluyen una secuencia de aminoácidos de la parte de conexión (parte de conexión del Exón 4-5) entre una secuencia de aminoácidos codificada por el Exón 4 de un gen que codifica una proteína tau y una secuencia de aminoácidos codificada por el Exón 5 de la misma (por ejemplo, el aminoácido Nº 124 (Gln) y Nº 125 (Ala) de la SEC ID Nº: 1). El polipéptido usado preferiblemente como un polipéptido antigénico es, por ejemplo, un polipéptido de 5 o más restos aminoacídicos, más preferiblemente 8 o más restos, o aún más preferiblemente 10

o más restos que incluyen la secuencia de aminoácidos de dicha parte de conexión (aminoácidos del aminoácido Nº 124 (Gln) y Nº 125 (Ala)). El límite superior de la longitud del polipéptido antigénico no está particularmente restringido siempre que pueda generar un anticuerpo específico contra una proteína tau del SNC. Generalmente, el límite superior es 20 restos o menos, preferiblemente 15 o menos. Una secuencia preferida del polipéptido antigénico usado en la presente invención contiene al menos la secuencia de aminoácidos (GlnAla) de la parte de conexión del Exón 4-5 y restos aminoacídicos añadidos a ambos extremos de GlnAla que no están particularmente limitados pero preferiblemente son restos aminoacídicos de la propia proteína tau humana mostrada en la SEC ID Nº: 1. Aunque la posición de la secuencia de aminoácidos de la parte de conexión del Exón 4-5 no está particularmente limitada, se prefiere que la secuencia se sitúe en la parte central del polipéptido. Es decir, el polipéptido antigénico es preferiblemente un polipéptido que contiene de 1 a 8 restos aminoacídicos, preferiblemente aproximadamente de 3 a 6 restos de la secuencia de la proteína tau humana, en ambos de los extremos de la secuencia de aminoácidos (GlnAla) de la parte de conexión.

Los ejemplos específicos de una secuencia preferida de la misma incluyen un polipéptido que contiene una secuencia representada por los números de aminoácidos 121-128 de la secuencia descrita en la SEC ID Nº: 1 de la lista de secuencias. Los ejemplos específicos de una secuencia más preferible incluyen un polipéptido que tiene una secuencia representada por los números de aminoácidos 118-131 de la SEC ID Nº: 1 (SEC ID Nº: 3; que también se denomina en lo sucesivo en este documento “polipéptido 118-131”), un polipéptido que tiene una secuencia representada por los números de aminoácidos 121-128 de la SEC ID Nº: 1 (SEC ID Nº: 4; que también se denomina en lo sucesivo en este documento “polipéptido 121-128”) y un polipéptido que tiene una secuencia representada por los números de aminoácidos 121-129 de la SEC ID Nº: 1 (SEC ID Nº: 5; que también se denomina en lo sucesivo en este documento “polipéptido 121-129”).

El anticuerpo de la presente invención puede ser un anticuerpo monoclonal

o un anticuerpo policlonal, y preferiblemente se usa un anticuerpo policlonal. Un método para preparar un anticuerpo puede emplear un método habitual conocido en esta técnica. Si, por ejemplo, se produce un anticuerpo policlonal, el polipéptido antigénico anterior se une a una proteína transportadora tal como BSA (albúmina de suero bovino), globulina de tiroides porcina o KLH (hemocianina de lapa californiana) usando un agente de condensación apropiado tal como maleimida o carbodiimida para producir un antígeno para la inmunización (inmunógeno). La unión del polipéptido antigénico a la proteína transportadora puede realizarse mediante un método habitual conocido en esta técnica. Por ejemplo, la KLH usada como una proteína transportadora se maleimida para unirse al polipéptido antigénico. En este método, la KLH se maleimida por reacción con, preferiblemente, un agente de condensación bifuncional tal como Sulfo-SMCC (ciclohexano-1carboxilato de sulfosuccimidil 4-(N-maleimidometilo)), seguido de la reacción con el polipéptido antigénico en el que se añade cisteína en un extremo deseado para la unión del extremo amino o el extremo carboxilo del péptido. Como resultado, la KLH maldeimidada puede unirse fácilmente con el polipéptido antigénico mediante tiol y, por lo tanto, se prepara un antígeno para la inmunización. De manera alternativa, si se usa carbodiimida, la KLH y el polipéptido pueden unirse entre sí formando un enlace peptídico con condensación por deshidratación entre KLH y el polipéptido antigénico.

Una solución que contiene el inmunógeno preparado como se ha descrito anteriormente se mezcla con un adyuvante, si es necesario, y un animal usado generalmente para la producción de un anticuerpo (por ejemplo, ratón, rata, conejo, cobaya, oveja o cabra) se inmuniza por vía subcutánea o intraperitoneal con la mezcla de manera repetida cada 2 ó 3 semanas. Se extrae sangre del animal inmunizado y se separa el suero de la misma para obtener antisuero. En la presente invención, aunque el antisuero obtenido puede usarse sin purificación, también puede purificarse para su uso por el método descrito a continuación. Los métodos de purificación de un anticuerpo incluyen: un método en el que el suero se trata térmicamente para inactivar el complemento, seguido de desplazamiento salino usando sulfato amónico; un método de purificación de una fracción de inmunoglobulina mediante, por ejemplo, cromatografía de intercambio iónico; y un método de purificación de un anticuerpo mediante cromatografía de afinidad en columna usando una columna en la que se inmoviliza un determinado polipéptido. De éstos, es preferible el método que usa la cromatografía de afinidad en columna. En este caso, como polipéptido para la purificación que se inmoviliza en una columna (que también se denomina en lo sucesivo en este documento “polipéptido para la purificación”), puede seleccionarse un polipéptido que tenga la misma secuencia o la secuencia de una parte del mismo dependiendo de la secuencia de aminoácidos del polipéptido antigénico usado para la inmunización.

Los ejemplos de una combinación del polipéptido antigénico con el polipéptido para la purificación incluyen combinaciones de un polipéptido 118-131 con un polipéptido 121-128, de un polipéptido 118-131 con un polipéptido 118-131, de un polipéptido 121-128 con un polipéptido 121-129, y de un polipéptido 121-129 con un polipéptido 121-128. De éstos, se prefiere la combinación del polipéptido 118-131 con el polipéptido 121-128. Más particularmente, usando un polipéptido antigénico sintetizado químicamente, se prepara un inmunógeno mediante el método descrito anteriormente para inmunizar a un animal tal como un conejo. El antisuero obtenido a partir del animal de acuerdo con el método anterior puede purificarse por una columna por afinidad en la que se inmoviliza un polipéptido para la purificación. Tomando el caso en el que se usa una combinación del polipéptido 118-131 como el polipéptido antigénico con el polipéptido 121-128 como el polipéptido para la purificación como la combinación más preferible para preparar un anticuerpo por purificación por afinidad, se describirá con más detalle el método para preparar el anticuerpo de la presente invención.

En primer lugar, se hace reaccionar hemocianina de lapa californiana (KLH) con Sulfo-SMCC (ciclohexano-1-carboxilato de sulfosuccimidil 4-(Nmaleimidometilo)) y se realiza una diálisis en un tampón apropiado o similar para preparar KLH maleimidada. El polipéptido 118-131 al cual se añade cisteína en su extremo amino se prepara mediante síntesis química y se hace reaccionar con la KLH maleimidada, seguido por diálisis contra una solución salina fisiológica o similar para obtener un inmunógeno. Se inmuniza repetidamente un conejo o similar con este inmunógeno para obtener antisuero, que posteriormente se carga y se absorbe sobre una columna de afinidad en la que se inmoviliza el polipéptido 121

128. La fracción absorbida puede eluirse en un tampón de elución apropiado o similar para obtener el anticuerpo de la presente invención que se ha purificado por afinidad.

De manera alternativa, si se produce un anticuerpo monoclonal, se recoge una célula productora de anticuerpo del bazo de un animal inmunizado mediante el mismo método que se ha descrito anteriormente y se fusiona con una célula cultivada tal como una célula de mieloma mediante un método convencional para generar un hibridoma (Koehler y Milstein, Nature, 256, 495-497 (1975)). A partir de un medio de cultivo del hibridoma o similar, puede seleccionarse un anticuerpo monoclonal que reconoce un epítopo de interés.

Cualquiera de los anticuerpos obtenidos como se ha descrito anteriormente es un anticuerpo que reconoce la secuencia de aminoácidos de la parte de conexión del Exón 4-5 anterior y se une específicamente a una proteína tau procedente de un tejido nervioso central pero no a una proteína tau procedente de un tejido periférico independientemente de la presencia o ausencia de fosforilación. Esto puede confirmarse usando extractos procedentes de un tejido nervioso central tal como el cerebro y procedentes de un tejido periférico tal como el músculo para comparar la reactividad del anticuerpo, o analizando la reactividad del anticuerpo con una secuencia de inserción insertada en la parte de conexión del Exón 4-5 anterior, por ejemplo, un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos (SEC ID Nº: 2) codificado por el Exón 4A del gen que codifica una proteína tau, o mediante otros métodos.

3. Preparación de muestra para realizar la detección de la enfermedad de Alzheimer.

En la presente invención, una muestra de interés para el análisis incluye fluido corporal tal como sangre, líquido cefalorraquídeo u orina que puede obtenerse de un individuo que se sospecha que tiene enfermedad de Alzheimer, y especialmente se prefiere la sangre. Por ejemplo, en el caso de la sangre, se extrae sangre de la vena basílica del codo o similar de un individuo que se sospecha que tiene enfermedad de Alzheimer con un tubo de extracción de sangre o similar, y se separa el plasma o suero de la misma mediante un método preferido tal como centrifugación, y de este modo se obtiene la muestra. En caso de usar líquido cefalorraquídeo como muestra, el líquido se extrae de un individuo que se sospecha que padece enfermedad de Alzheimer, por ejemplo, mediante punción lumbar con anestesia y se obtiene una muestra, preferiblemente, sometiendo al fluido a centrifugación.

Para las enfermedades anteriores distintas de la enfermedad de Alzheimer en las que se puede producir una desviación de una proteína tau del SNC procedente de un tejido nervioso central a un fluido corporal, puede obtenerse una muestra para uso a partir de un individuo que se sospecha que tiene cualquiera una de las enfermedades de una manera similar. Por ejemplo, puede utilizarse fluido corporal, tal como sangre, líquido cefalorraquídeo u orina de un individuo que se sospecha que tiene síndrome de Down, síndrome de Parkinson, enfermedad de Pick, parálisis supranuclear progresiva (PSP), degeneración corticobasal (CBD) o similar.

Preferiblemente, la muestra obtenida se complementa con un inhibidor enzimático en el momento o después de la extracción de la muestra para evitar el cambio de la proteína tau (fragmentación, desfosforilación, etc.) o la coagulación de la sangre en la muestra. Los ejemplos de inhibidores enzimáticos que pueden utilizarse incluyen: inhibidores de fosfatasa tales como EDTA, EGTA, ácido okadaico, ácido pirofosfórico, fosfato, fluoruro sódico, ácido -glicerofosfórico y ciclosporina A; e inhibidores de proteasa tales como aprotinina, antipaína, pepstatina, leupeptina, EDTA, EGTA, PMSF (fluoruro de fenilmetanosulfonilo) y TLCK (tosil lisina clorometil cetona).

Como inhibidor de fosfatasa se prefiere cualquiera de EDTA y EGTA.

Además, la concentración del inhibidor de fosfatasa añadido a la muestra no se limita particularmente siempre que la concentración tenga un efecto inhibidor sobre la actividad de la fosfatasa presente en la muestra. La combinación de concentraciones óptimas de inhibidores de fosfatasa usados puede determinarse, dependiendo de los tipos de los inhibidores de fosfatasa. Por ejemplo, EDTA y EGTA se usan normalmente en el intervalo de 1 a 1.000 mM, preferiblemente en el intervalo de 1 a 100 mM. Como inhibidor de proteasa se prefiere aprotinina. De manera similar, la concentración del inhibidor de proteasa añadido a la muestra no se limita particularmente siempre que la concentración tenga un efecto inhibidor sobre la actividad de la proteasa presente en la muestra. Por ejemplo, la aprotinina se usa normalmente en el intervalo de 0,1 M a 1.000 mM, preferiblemente se usa en el intervalo de 1 M a 100 mM.

De éstas, como la muestra más preferible a usar en la presente invención, se emplea plasma que puede obtenerse extrayendo sangre usando un tubo de extracción de sangre o similar complementado con EDTA y aprotinina y centrifugando la sangre. Como alternativa, si se usa como muestra líquido cefalorraquídeo, el líquido cefalorraquídeo extraído usando un tubo de muestra o similar complementado con EDTA y aprotinina puede someterse al análisis de una proteína tau del SNC, sin tratarse. Se prefiere almacenar las muestras, por ejemplo, a 4ºC o a una temperatura inferior después de la extracción hasta que se sometan al análisis de la proteína tau del SNC, y es más preferible que se congelen y almacenen a -20ºC o a una temperatura menor.

Adicionalmente, si se desea, dicha muestra se trata por desnaturalización en presencia de un agente de solubilización de proteínas para eliminar las proteínas concomitantes (lo cual también se denominan en lo sucesivo en este documento “desproteinización”). También es preferible usar esta muestra tratada como una muestra. Especialmente, si se usa sangre como muestra, se prefiere realizar la desproteinización por una razón tal como el impedimento de la reacción antígenoanticuerpo debido a una concentración elevada de proteínas concomitantes. En caso de usar una pequeña cantidad de una muestra de sangre, pueden omitirse los procedimientos para la desproteinización porque el impedimento por proteínas concomitantes es pequeño. Sin embargo, si existe un problema asociado con el impedimento por la gran cantidad de proteínas concomitantes en una muestra de sangre a usar, preferiblemente se realizan procedimientos para la desproteinización. Además, opcionalmente, una muestra que se condensa adicionalmente también puede usarse como muestra en el método de la presente invención.

El agente de solubilización de proteínas que puede usarse en el tratamiento anterior no está limitado particularmente, siempre que tenga un efecto de solubilización de una proteína que apenas es hidrosoluble. Sus ejemplos específicos incluyen guanidina o una sal de la misma, un agente que contiene un grupo sulfhidrilo (que también se denomina en lo sucesivo en este documento “agente que contiene el grupo SH”), urea y un tensioactivo. Cada una de estas sustancias puede usarse sola o pueden usarse dos o más de ellas en combinación. De éstas, preferiblemente se usa una combinación de la sal de guanidina y el agente que contiene el grupo SH. Los ejemplos de la sal de guanidina incluyen una diversidad de sales de guanidina con ácidos tales como isotiocianato, hidrocloruro y perclorato. De éstos, se prefiere el isotiocianato de guanidina y el perclorato de guanidina. Los ejemplos del agente que contiene el grupo SH incluyen mercaptoetanol, ditiotreitol y N-acetilcisteína, y se prefiere especialmente el mercaptoetanol. Los ejemplos de una combinación preferida de la sal de guanidina y el agente que contiene el grupo SH como agente de solubilización de proteínas a añadir en una muestra de sangre incluyen una combinación de perclorato de guanidina y -mercaptoetanol y una combinación de isotiocianato de guanidina y mercaptoetanol.

Los ejemplos del tensioactivo incluyen Tween 20 (fabricado por ICI Americas Inc.), Tritón X-100 (fabricado por Rohm y Haas) y Nonidet P40 (fabricado por Shell International Petroleum Company Ltd).

La concentración de un agente de solubilización de proteínas usado en la presente invención es normalmente de 0,01 M, preferiblemente de 0,1 M, en el límite inferior, y de 10 M, preferiblemente de 6 M, en el límite superior. El intervalo de concentraciones se selecciona entre combinaciones de dicho límite inferior y dicho límite superior y un intervalo adecuado es normalmente de 0,01 a 10 M, preferiblemente de aproximadamente 0,1 a 6 M. Estos intervalos de concentración se proporcionan como una orientación y, más particularmente, las concentraciones óptimas se determinan preferiblemente dependiendo de los tipos de agentes de solubilización de proteínas y la combinación de los mismos. Por ejemplo, la concentración de sal de guanidina está en el intervalo de habitualmente 1 mM a 6 M, preferiblemente de 0,5 a 1 M. La concentración del agente que contiene el grupo SH está normalmente en el intervalo de 1 mM a 1 M, preferiblemente en el intervalo de 50 a 500 mM. La concentración de tensioactivo se encuentra normalmente en intervalo del 0,001 al 0,5% (v/v), preferiblemente en el intervalo del 0,01 al 0,2% (v/v). De manera similar, la concentración de urea está normalmente en el intervalo de 2 a 10 M, preferiblemente en el intervalo de 5 a 7 M. Debe indicarse que los intervalos numéricos de concentraciones y similares usados en este documento pueden ser los intervalos de las combinaciones respectivas de un límite inferior y un límite superior ilustrados de manera similar como anteriormente salvo que se especifique otra cosa.

El agente de solubilización de proteínas anterior se añade a una muestra de sangre y la muestra se diluye dos veces o más, preferiblemente de 2 a 10 veces, seguido por la mezcla con agitación para permitir que las proteínas de la muestra se solubilicen. Para diluir una muestra, se usa una solución tal como TBS (NaCl 150 mM, Tris-HCl 20 mM (pH 7,5)).

A continuación, las proteínas concomitantes disueltas como se ha descrito anteriormente en una solución de muestra se desnaturalizan y se eliminan de la solución de la muestra. Los ejemplos de un método para el tratamiento de desnaturalización de proteínas concomitantes incluyen: un método de tratamiento de proteínas concomitantes con un agente de desnaturalización de proteínas tal como ácido tricloroacético, ácido trifluoroacético, sulfato amónico, urea o un disolvente orgánico; un método que utiliza una interfaz; y un método por medio de calentamiento, que puede usarse solo o en combinación. Cada condición de tratamiento puede ser una condición en la que las proteínas concomitantes contenidas en una solución de muestra se desnaturalizan pero no se desnaturaliza la proteína tau presente en la misma. De estos métodos, el que se usa preferiblemente en la presente invención es el método por medio de calentamiento y, más preferiblemente, ebullición, es decir, un método en el que se realiza el calentamiento hirviendo a 100ºC. Además, es más preferido que la ebullición se realice en presencia de NaCl a una concentración de 0,2 M o más. El tiempo de ebullición (calentamiento) es normalmente de 1 a 15 minutos, preferiblemente de 3 a 10 minutos. Como método de ebullición, se prefiere un baño caliente.

Las proteínas concomitantes tratadas mediante solubilización y desnaturalización pueden separarse por un método de separación sólido-líquido habitual conocido en esta técnica, por ejemplo, un método de separación por membrana o un método de centrifugación, y de esta manera puede realizarse la desproteinización. Preferiblemente, la separación se realiza por centrifugación. En caso de tratamiento de desnaturalización por ebullición y calentamiento, seguido de centrifugación, la proteína tau no experimenta desnaturalización mediante calentamiento y se recoge dentro del sobrenadante después de la centrifugación.

La muestra obtenida anteriormente puede condensarse adicionalmente si es necesario de acuerdo con un método conocido en esta técnica para aumentar la sensibilidad de la detección de la proteína tau. Los ejemplos de un método de condensación incluyen un método que implica la disminución de las concentraciones de sal mediante ultrafiltración, diálisis, filtración en gel o similares, seguido por condensación específica por inmunoprecipitación usando perlas magnéticas o similares en las que se inmoviliza un anticuerpo proteína anti-tau. Como alternativa, la muestra puede condensarse mediante un método de extracción en fase sólida. En particular, la muestra se añade, por ejemplo, a una fase sólida general para extracción en la que se inmoviliza un hidrocarburo con un bajo peso molecular sobre un gel de sílice o similar, la proteína tau se retiene en la fase sólida y después se retiran las impurezas tales como una sal mediante lavado. Posteriormente, se vierte un disolvente orgánico o un disolvente mixto de agua con un disolvente orgánico para hacer fluir la proteína tau, que después puede recogerse y condensarse eliminado el disolvente. Como alternativa, puede realizarse un proceso de retirada de inmunoglobulina-G por cromatografía en columna o similar. Preferiblemente se usa una columna de Proteína G-Sepharose o similar para la cromatografía en columna.

4. Método para detectar proteína tau del SNC.

La presente invención también se refiere a un método para detectar tauopatías en el que se analiza la presencia de una proteína tau del SNC en una muestra obtenida a partir de un individuo que se sospecha que tiene tauopatía usando el anticuerpo de la presente invención. La tauopatía es una enfermedad que tiene neurodegeneración debida a la acumulación de proteínas tau en el tejido nervioso central, y sus ejemplos incluyen enfermedad de Alzheimer, síndrome de Down, síndrome de Parkinson, enfermedad de Pick, parálisis supranuclear progresiva (PSP) y degeneración corticobasal (CBD). Más preferiblemente, el método de detección de la presente invención se usa para detectar la enfermedad de Alzheimer.

En lo sucesivo se describirá el método de la presente invención tomando la detección de la enfermedad de Alzheimer como ejemplo. Particularmente, para una solución de muestra obtenida de un individuo que se sospecha que padece enfermedad de Alzheimer y aplicada, si se desea, a tratamientos tales como la solubilización de proteínas y la desnaturalización de proteínas concomitantes, desproteinización y condensación, se analiza la presencia de una proteína tau del SNC usando el anticuerpo específico contra una proteína tau del SNC de la presente invención. El método de análisis de la presencia de una proteína tau del SNC no se limita particularmente siempre que se realice usando el anticuerpo específico contra una proteína tau del SNC de la presente invención. Este análisis puede realizarse de acuerdo con un método con el que puede compararse la reactividad del anticuerpo específico contra una proteína tau del SNC en la muestra, es decir, la reacción inmune entre la proteína contenida en la muestra y el anticuerpo, con una reacción inmune entre un control positivo y el anticuerpo. Comparando el resultado del uso del control positivo que tiene una concentración conocida con el resultado del uso de la muestra, puede determinarse la cantidad de la proteína tau del SNC en la muestra.

El análisis mediante la reacción inmune entre el anticuerpo de la presente invención y la proteína en la muestra obtenida a partir de un individuo que se sospecha que padece enfermedad de Alzheimer puede realizarse mediante un método habitual conocido en esta técnica, que se describe en manuales de laboratorio tales como Biochemical Experimental Method 11 “Enzyme Immunoassay” (por Tijssen P., Tokyo Kagaku Dojin) y “Antibodies: A LABORATORY MANUAL” (Ed Harlow et al., Cold Spring Harbor Laboratory (1988)). En particular, los ejemplos del método incluyen: inmunotransferencias: métodos de tipo sándwich tales como el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA); y métodos competitivos.

Si se analiza una proteína tau del SNC mediante el método de tipo sándwich

o un método similar, el anticuerpo usado en combinación con el anticuerpo específico contra una proteína tau del SNC de la presente invención es un anticuerpo que reconoce un epítopo diferente de uno que reconoce el anticuerpo de la presente invención y, preferiblemente, un anticuerpo que reconoce una proteína tau independientemente del tipo de isoforma (que también se denomina en lo sucesivo en este documento “anticuerpo de proteína anti-tau no específico”). Los ejemplos específicos del anticuerpo anti-proteína tau no específico incluyen anticuerpos monoclonales anti-proteína tau HT7 (que se une a los aminoácidos número 159-163 de una proteína tau) y BT2 (que se une a los aminoácidos número 193-198 de una proteína tau) disponibles en el mercado procedentes de Innogenetics.

Preferiblemente, el anticuerpo anti-proteína tau no específico es un anticuerpo que reconoce una proteína tau independientemente de la presencia de fosforilación. Cuando este anticuerpo se usa en combinación con un anticuerpo que reconoce una proteína tau fosforilada en el sitio de fosforilación específico para la enfermedad de Alzheimer, puede detectarse adicionalmente un cambio específico para la enfermedad de Alzheimer. Los ejemplos de dicho anticuerpo incluyen: un anticuerpo anti-proteína tau fosforilada descrito en la Publicación Internacional Nº WO97/34145; y un anticuerpo anti-proteína tau preparado de acuerdo con la descripción de la publicación, tal como anti-PSI99, anti-PS202, anti-PT205, antiPT231, anti-PS235, anti-PS262, anti-PS396, anti-PS404, anti-PS413, anti-PS422 o anti-tau 154-168.

Si se aprovecha la ventaja de que el anticuerpo de la presente invención reconoce específicamente una proteína tau del SNC pero no una proteína tau periférica para analizar la presencia de una proteína tau del SNC mediante inmunotransferencia o similar, pueden realizarse análisis más fiables por comparación con, por ejemplo, el resultado obtenido usando un anticuerpo que reconoce específicamente una proteína tau periférica (que también se denomina en lo sucesivo en este documento “anticuerpo específico contra una proteína tau periférica”). Los ejemplos del anticuerpo específico contra una proteína tau periférica incluyen un anticuerpo obtenido usando, como antígeno, un polipéptido que tiene toda o una parte de una secuencia de aminoácidos (SEC ID Nº: 2) codificada por el Exón 4A de un gen que codifica una proteína tau. Los ejemplos específicos del anticuerpo incluyen un anticuerpo obtenido usando un inmunógeno en el que KLH está unida a un polipéptido en el que se ha introducido cisteína en el extremo amino de la secuencia de aminoácidos descrita en la SEC ID Nº: 6 de la lista de secuencias (que también se denomina en lo sucesivo en este documento, “anticuerpo anti-Exón 4A”). Un método de producción del anticuerpo puede utilizar un método habitual conocido en esta técnica como método descrito anteriormente para producir el anticuerpo específico contra una proteína tau del SNC. El anticuerpo anti-Exón 4A producido de esta manera se une específicamente a una proteína tau periférica que tiene, como secuencia de inserción, una secuencia de aminoácidos codificada por el Exón 4A, independientemente de la presencia o ausencia de fosforilación.

En el presente documento se describirá el método mediante la ejemplificación del análisis de la presencia de una proteína tau del SNC en una muestra mediante ELISA.

En primer lugar, como anticuerpo para la inmovilización, se inmoviliza el anticuerpo específico para una proteína tau del SNC de la presente invención o un anticuerpo anti-proteína tau no específico en una placa ELISA de 96 pocillos y se añade una muestra obtenida por el método como se describe en el apartado anterior 3 para unir la proteína tau en la muestra a la fase sólida. A continuación, como anticuerpo para detectar la proteína tau unida, se añade un anticuerpo distinto del anticuerpo inmovilizado, que es el anticuerpo anti-proteína tau no específico o el anticuerpo específico para una proteína tau del SNC de la presente invención, y se incuba la placa. Aunque la combinación de anticuerpos usados en este documento incluye los descritos anteriormente, normalmente se prefiere inmovilizar un anticuerpo que tiene mayor especificidad contra la sustancia a medir, es decir, se inmoviliza el anticuerpo específico para una proteína tau del SNC en este caso y se usa para la detección un anticuerpo que tiene menor especificidad y amplia reactividad, es decir, el anticuerpo anti-proteína tau no específico. Sin embargo, considerando el grado de afinidad de cada anticuerpo empleado, y similar, pueden usarse a la inversa.

Después de la incubación, la placa se lava en una solución de lavado y se hace reaccionar con otro anticuerpo que reconoce el anticuerpo para la detección y se marca con una sustancia marcadora, por ejemplo, un anticuerpo anti-IgG de conejo marcado con una enzima. De manera alternativa, el anticuerpo para la detección al que se ha incorporado previamente biotina o similar se hace reaccionar con estreptavidina marcada enzimáticamente. Después del lavado en una solución de lavado, la actividad de la sustancia de marcado unida a la fase sólida puede medirse y compararse con el resultado obtenido usando un control positivo que tiene una concentración conocida para medir la cantidad de proteína tau del SNC presente en la muestra.

A continuación se describirá en lo sucesivo en este documento otro ejemplo del método de análisis, mediante la ejemplificación de un método de detección de la presencia de una proteína tau del SNC en una muestra mediante inmunotransferencia.

A la muestra obtenida mediante el método descrito en el apartado 3 anterior, se le añade una solución de tratamiento apropiada, por ejemplo, una solución de tampón de muestra de Laemmli (Tris-HCl 0,125 mM (pH 6,8), SDS al 4%, glicerol al 20%, 20 g/ml de BPB y -mercaptoetanol 0,7 M) y toda la solución se trata térmicamente. Esta solución se somete a electroforesis con un gel de poliacrilamida del 7 al 15% mediante el método de Laemmli (Nature, 227, 680-685 (1970)) y se transfiere a una membrana usada generalmente para la transferencia de proteínas, tal como una membrana de PVDF (difluoruro de polivinilideno) con un equipo de transferencia de proteínas habitual, tal como un sistema de transferencia semiseca.

La membrana resultante se bloquea en una solución de proteína tal como leche desnatada y después se hace reaccionar con el anticuerpo específico contra una proteína tau del SNC. Después del lavado para eliminar el anticuerpo que no ha reaccionado, la membrana se hace reaccionar con un anticuerpo secundario al que previamente se ha incorporado una sustancia marcadora. Si la sustancia marcadora es, por ejemplo, una sustancia tal como una enzima que no emite una señal por sí misma, se lava la membrana después de la reacción y se elimina el anticuerpo secundario que no ha reaccionado, seguido por la reacción con una sustancia, tal como un sustrato que reacciona específicamente con la sustancia marcadora, y se detecta la señal emitida procedente de la reacción. La detección resultante puede compararse con el resultado obtenido usando un control positivo que tiene una concentración conocida para determinar la abundancia de la proteína tau en la muestra. Los ejemplos de una enzima usada como una sustancia marcadora incluyen fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano picante (que también se denomina en lo sucesivo en este documento “HRP”). Adicionalmente, los ejemplos de un método para detectar una señal incluyen un método de quimioluminiscencia y un método de desarrollo de color. De éstos, preferiblemente se usa el método de quimioluminiscencia.

Si la sustancia marcadora es, por ejemplo, una sustancia tal como una sustancia fluorescente o una sustancia radiactiva que emite una señal por sí misma, se lava la membrana después de la reacción y se retira el anticuerpo secundario que no ha reaccionado, seguido por la detección de una señal emitida por la sustancia marcadora. El resultado de la detección puede compararse con el resultado obtenido usando un control positivo que tiene una concentración conocida para determinar la abundancia de la proteína tau en la muestra.

Adicionalmente, en dicha detección, para eliminar el efecto causado por los anticuerpos procedentes de la muestra o similar, puede utilizarse la reacción de una sustancia que tiene una capacidad de unión específica en lugar de una reacción antígeno-anticuerpo. Por ejemplo, se usa una combinación de biotina y estreptavidina o una combinación de digoxigenina y un anticuerpo anti-digoxigenina como sustancia que tiene una capacidad de unión específica, y entre ellas, se prefiere especialmente la combinación de biotina y estreptavidina.

Un control positivo usado en el método de detección de la presente invención puede ser cualquier sustancia que se una específicamente al anticuerpo específico contra una proteína tau del SNC de la presente invención, y sus ejemplos incluyen una proteína tau que carece de secuencia de inserción entre el aminoácido número 124 y número 125 de la secuencia descrita en la SEC ID Nº: 1 de la lista de secuencias. Como alternativa, el control positivo puede ser un fragmento que comprende una secuencia de aminoácidos de la parte de conexión (parte de conexión del Exón 4-5) entre la secuencia de aminoácidos codificada por el Exón 4 de un gen que codifica una proteína tau y la secuencia de aminoácidos codificada por el Exón 5 del mismo, o similar. Sus ejemplos específicos incluyen: una proteína tau purificada a partir de tejido nervioso central de un ser humano, conejo o similar; una proteína tau preparada por recombinación génica y un fragmento de la misma; y un polipéptido sintetizado.

Un método para purificar una proteína tau a partir de un tejido puede ser un método habitual conocido en esta técnica. Por ejemplo, una proteína tau puede purificarse a partir de tejido cerebral de acuerdo con un método tal como el que se describe en Journal of Neuroscience Research, 25, 412-419 (1990). De manera similar, una proteína tau modificada por ingeniería genética se prepara de acuerdo con un método conocido en esta técnica. Sin embargo, también puede usarse cualquiera de los que tienen la longitud completa de una secuencia de aminoácidos descrita en la SEC ID Nº: 1 y los que tienen una parte de la misma siempre que se una específicamente al anticuerpo de la presente invención. Preferiblemente, se usa como secuencia de aminoácidos de una parte de la misma, por ejemplo, un fragmento que contiene una parte de conexión del Exón 4-5 tal como un fragmento que tiene 1-249 restos del extremo amino de una proteína tau (aminoácidos número 1-249 de la SEC ID Nº: 1) o un fragmento sin una secuencia de inserción correspondiente a los aminoácidos número 45-102 del fragmento anterior (SEC ID Nº: 7; que también se denomina en lo sucesivo en este documento “fragmento de lado N de tau más corto”). Además, también puede usarse una proteína convencional proporcionada en un kit disponible en el mercado (Finoscolor hTAU o INNOTEST hTAU Ag; fabricado por Innogenetics).

Se prefiere que una proteína tau o un péptido usado como un control positivo, por ejemplo, se conserve como un polvo liofilizado o disuelto en un tampón apropiado para la crioconservación en pequeñas cantidades. Por ejemplo, 1 mg de polvo puede disolverse en 100 l de TBST (tampón Tris HCl 20 mM (pH 7,5) que contiene NaCl 150 mM y Tween 20 al 0,05%) y congelarse y almacenarse en una pequeña cantidad de 10 a 20 l.

Como se ha mencionado anteriormente, para un individuo que se sospecha que tiene la enfermedad de Alzheimer, se mide la cantidad de una proteína tau del SNC en una muestra obtenida del individuo y se compara con la cantidad de la proteína en una muestra obtenida de un sujeto normal. Al individuo que tiene una cantidad significativamente grande de una proteína tau del SNC se le puede diagnosticar enfermedad de Alzheimer. Si no hay diferencias entre la cantidad de la proteína tau del SNC medida en la muestra obtenida del sujeto normal y la cantidad de la proteína en la muestra obtenida del sujeto que tiene enfermedad de Alzheimer, se puede diagnosticar que este individuo no tiene enfermedad de Alzheimer. Preferiblemente, dicha comparación se realiza usando muestras homogéneas obtenidas de cada uno de los individuos a comparar.

En la comparación de la cantidad de una proteína tau del SNC en una muestra obtenida de un individuo que se sospecha que tiene la enfermedad de Alzheimer con la cantidad de la proteína en una muestra obtenida de un sujeto normal, el valor medio que se ha obtenido previamente realizando la medición con varias muestras puede usarse como la cantidad de la proteína en la muestra obtenida del sujeto normal. Se desea que dicho valor medio sea un valor que tenga en cuenta las edades de los individuos de los que se obtienen las muestras. En este caso, “significativamente grande” significa que la cantidad de la proteína tau del SNC contenida en la muestra obtenida del individuo que se sospecha que tiene enfermedad de Alzheimer es, por ejemplo, dos o más veces mayor que la cantidad de la proteína tau en una muestra obtenida de un sujeto normal, y entonces al individuo se le diagnostica enfermedad de Alzheimer. Como alternativa, puede determinarse la desviación típica por análisis estadístico para averiguar si es una diferencia significativa o no.

Además, por ejemplo, si se ha obtenido el valor medio respectivo de las cantidades de las proteínas tau del SNC contenidas en una muestra obtenida de un individuo que se sospecha que tiene enfermedad de Alzheimer y en una muestra obtenida de un sujeto normal, puede ajustarse un valor umbral para la evaluación. Cuando la muestra medida contiene la proteína tau del SNC que tiene una cantidad por encima de este valor, al individuo se le puede diagnosticar enfermedad de Alzheimer. Se desea ajustar dicho valor umbral considerando la edad del individuo del cual se obtiene la muestra. Además, si la cantidad de proteínas tau del SNC en muestras obtenidas de sujetos normales de la cohorte está en o por debajo de un límite de detección, al individuo se le puede diagnosticar enfermedad de Alzheimer cuando se detecta proteína tau del SNC en una muestra obtenida del individuo que se sospecha que tiene la enfermedad de Alzheimer.

De manera similar, para una diversidad de enfermedades distintas a la enfermedad de Alzheimer como se ha descrito anteriormente, el diagnóstico puede realizarse basándose en la cantidad detectada de una proteína tau del SNC.

5. Kit de reactivos

Un kit de reactivos de la presente invención incluye al menos un anticuerpo específico para una proteína tau del SNC y se proporciona con componentes de acuerdo con un kit utilizado para una reacción inmune normal. El kit de reactivos incluye además, como componentes opcionales, una solución de lavado, un anticuerpo marcado para la detección, una solución de pretratamiento que contiene un agente de solubilización de proteínas, un control positivo, un diluyente, un agente desnaturalizante de proteínas y un aparato o un reactivo para la condensación.

Más particularmente, en el caso de un kit aplicado a un ELISA, el kit incluye al menos el anticuerpo específico contra una proteína tau del SNC de la presente invención y, adicionalmente, un anticuerpo anti-proteína tau inmovilizado y un anticuerpo anti-IgG marcado, e incluye, como componente opcional, una solución de pretratamiento que contiene un agente de solubilización de proteínas. Como alternativa, en el caso de un kit aplicado a un método competitivo, el kit incluye una proteína tau marcada y un anticuerpo específico contra una proteína tau del SNC e incluye, como un componente opcional, una solución de pretratamiento que contiene un agente de solubilización de proteínas. En el caso de un kit aplicado a un método de tipo sándwich usando látex, el kit incluye al menos látex magnético sobre el que se inmoviliza un anticuerpo específico contra una proteína tau del SNC

o un anticuerpo anti-proteína tau y un anticuerpo marcado para la detección, e incluye, como componente opcional, un agente de solubilización de proteínas. En el caso de un kit aplicado a un método competitivo que usa látex, el kit incluye al menos látex magnético en el que se inmoviliza un anticuerpo específico para una proteína tau del SNC y una proteína tau marcada e incluye, como componente opcional, una solución de pretratamiento que contiene un agente de solubilización de proteínas.

El uso de estos kits de reactivos permite que el método de detección de la enfermedad de Alzheimer de la presente invención se realice de una manera más rápida y conveniente.

EJEMPLOS

En lo sucesivo en este documento, la presente invención se describirá presentando ejemplos, pero la presente invención no se limita a esos ejemplos.

En los ejemplos descritos a continuación, “TBS” es tampón Tris-HCl 20 mM (pH 7,5) que contiene NaCl 150 mM y “TBST” es TBS que contiene Tween 20 al 0,5%.

Para un anticuerpo específico contra una proteína tau del SNC preparado en los ejemplos descritos a continuación, un anticuerpo generado usando un polipéptido 118-131 como antígeno y purificado por afinidad con un polipéptido 121128 se indica por un “anticuerpo anti-Exón 4-5 (118-131) (purificación 121-128)”, un anticuerpo generado usando un polipéptido 118-131 como antígeno y purificado por afinidad con un polipéptido 118-131 se indica por un “anticuerpo anti-Exón 4-5 (118131) (purificación 118-132)”, un anticuerpo generado usando un polipéptido 121128 y purificado por afinidad con un polipéptido 121-129 como antígeno se indica por un “anticuerpo anti-Exón 4-5 (121-128) (purificación 121-129)” y un anticuerpo inmunizado usando un polipéptido 121-129 como antígeno y purificado por afinidad con un polipéptido 121-128 se indica por un “anticuerpo anti-Exón 4-5 (121-129) (purificación 121-128)”, a menos que se especifique otra cosa. Además, se adquiere un anticuerpo monoclonal anti-proteína tau HT7 (que se une a los aminoácidos número 159-163 de una proteína tau) en Innogenetics.

EJEMPLO 1: Preparación y evaluación de un anticuerpo

Se preparó un anticuerpo específico contra una proteína tau del SNC de acuerdo con la descripción de la Publicación Internacional Nº WO97/34145 de la siguiente manera. Se usaron tres polipéptidos 118-131 (SEC ID Nº: 3), 121-128 (SEC ID Nº: 4) y 121-129 (SEC ID Nº: 5) como polipéptidos antigénicos. El antisuero resultante se purificó respectivamente usando una columna de afinidad sobre la que se inmovilizó un polipéptido purificado particular para cada uno de los antisueros, y se confirmó la especificidad de cada uno de los anticuerpos mediante análisis por transferencia puntual.

(1) Anticuerpo anti-Exón 4-5 (118-131)

Se sintetizó químicamente un polipéptido 118-131 (SEC ID Nº: 3) al cual se añadió cisteína en su extremo amino como un polipéptido antigénico y se unió a hemocianina de lapa californiana (KLH), seguido por la inmunización repetida de un conejo con el polipéptido para obtener antisuero. Específicamente, se disolvieron 35 mg de KLH (un producto liofilizado; fabricado por Pierce) en 7 ml de agua pura y se proporcionó como tampón (tampón fosfato 83 mM, NaCl 0,9 M (pH 7,2)). Posteriormente, se disolvieron 43,75 mg de Sulfo-SMCC (ciclohexano-1-carboxilato de sulfosuccimidil 4-(N-maleimidometilo); fabricado por Pierce) en 0,4 ml de DMSO (dimetilsulfóxido) y la solución se añadió al tampón. La mezcla se hizo reaccionar a temperatura ambiente (25ºC) durante 1 hora y se dializó durante una noche a 4ºC en un tampón fosfato 83 mM que contenía EDTA 100 mM y NaCl 0,9 M. Se retiró el reactivo degradado y que no reaccionó y, de esta manera, se preparó KLH maleimidada. A continuación, al material dializado (KLH maleimidada), se le añadieron 16,2 mg del polipéptido antigénico (polipéptido al cual se añadió cisteína en el extremo amino del polipéptido 118-132) y todo el conjunto se hizo reaccionar a temperatura ambiente (25ºC) durante 1 hora. Después de una diálisis de una noche frente a una solución salina fisiológica a 4ºC, esta solución dializada se ajustó a 17,5 ml con una solución salina fisiológica para usar como antígeno para la inmunización (inmunógeno).

Se inmunizó repetidamente un conejo con el inmunógeno resultante. Se extrajo antisuero y después se cargó y se absorbió en columnas en las que se inmovilizaron dos polipéptidos para la purificación (un polipéptido 121-128 y un polipéptido 118-131 a los que se añadió cisteína en su extremo amino), respectivamente, y las fracciones absorbidas se eluyeron con un tampón de elución suave disponible en Pierce para obtener anticuerpos purificados por afinidad específicos contra una proteína tau del SNC (anticuerpo anti-Exón 4-5 (118-131) (purificación 121-128) y un anticuerpo anti-Exón 4-5 (118-131) (purificación 118131)). La confirmación de la especificidad de los anticuerpos obtenidos se realizó usando un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA) y análisis de transferencia puntual como se ha descrito anteriormente para examinar la unión de cada polipéptido antigénico y un control positivo.

En el ELISA, en una placa de 96 pocillos en la que se inmovilizó un anticuerpo monoclonal anti-proteína tau HT7 (fabricado por Innogenetics), se añadió el fragmento del lado N de tau más corto recombinante (SEC ID Nº: 7) preparado de acuerdo con un método descrito en Brain Res., 737, 119-132 (1996) y se incubó, seguido de lavado. A continuación se añadieron dos anticuerpos obtenidos como se ha descrito anteriormente y se incubaron, seguido de lavado. Después, se añadió un anticuerpo (de cabra) anti-IgG de conejo marcado con HRP como anticuerpo secundario y se lavó la placa. Como resultado de la medición de la actividad HRP de la fase sólida, la actividad enzimática (actividad HRP) aumentó en respuesta a la concentración del fragmento del lado N más corto recombinante, lo que confirmó que los dos anticuerpos obtenidos anteriormente se unen al fragmento del lado N más corto recombinante.

(2): Anticuerpo anti-Exón 4-5 (121-128)

Se sintetizó químicamente un polipéptido 121-128 (SEC ID Nº: 4) y se usó para la preparación de un anticuerpo. En primer lugar, se disolvieron 39 mg de globulina tiroidea porcina (un producto liofilizado; fabricado por Sigma) en 4 ml de agua pura y la solución se complementó con un 1,4 mg del polipéptido 121-128 sintetizado y el pH se ajustó a 6,5 añadiendo una cantidad apropiada de hidróxido sódico 0,1 normal. A esta solución se añadieron adicionalmente 76,7 mg de hidrocloruro de carbodiimida soluble en agua y el conjunto se hizo reaccionar durante una noche a 4ºC. Después de una diálisis de una noche a 4ºC frente a una solución salina fisiológica, la solución dializada se ajustó a 19,5 ml con una solución salina fisiológica para obtener un antígeno para la inmunización (inmunógeno). Se inmunizó repetidamente un conejo con este inmunógeno para obtener antisuero. Después, el antisuero se cargó y se absorbió sobre una columna sobre la que se inmovilizó un polipéptido, donde se había añadido cisteína en el extremo amino del polipéptido 121-129 (SEC ID Nº: 5). La fracción absorbente se eluyó con un tampón de elución suave disponible en Pierce para obtener un anticuerpo purificado por afinidad (anticuerpo anti-Exón 4-5 (121-128) (purificación 121-129)). La especificidad del anticuerpo obtenido se confirmó por análisis de transferencia puntual descrito a continuación.

(3): Anticuerpo anti-Exón 4-5 (121-129)

Se sintetizó químicamente un polipéptido en el que se añadió cisteína en el extremo amino del polipéptido 121-129 (SEC ID Nº: 5) y se añadieron 6,5 mg de este polipéptido a una solución preparada disolviendo 20 mg de KLH activada con maleimida (un producto liofilizado; fabricado por Pierce) en 4 ml de agua pura (tampón fosfato 83 mM, NaCl 0,9 M, EDTA 0,1 M (pH 7,2)). La solución se hizo reaccionar a temperatura ambiente (25ºC) durante 1 hora y después se hizo reaccionar durante una noche a 4ºC, seguido por diálisis durante una noche a 4ºC contra una solución salina fisiológica. La solución dializada se ajustó a 10 ml con una solución salina fisiológica para preparar un antígeno para la inmunización (inmunógeno). El antisuero obtenido inmunizando repetidamente a un conejo con este inmunógeno se cargó y se absorbió sobre una columna en la que se inmovilizó el polipéptido 121-128 (SEC ID Nº: 4), y la fracción absorbida se eluyó con un tampón de elución suave disponible en Pierce, y de esta manera se obtuvo un anticuerpo purificado por afinidad (anticuerpo anti-Exón 4-5 (121-129) (purificación 121-128)). La especificidad del anticuerpo obtenido se confirmó por análisis de transferencia puntual descrito a continuación.

(4) Evaluación del anticuerpo mediante análisis de transferencia puntual Se prepararon los cuatro anticuerpos de los apartados (1) – (3) anteriores para la especificidad mediante análisis de transferencia puntual.

En primer lugar, se realizó una transferencia puntual sobre una membrana de PVDF de una solución en DMSO (10 pmol/0,5 l) del fragmento del lado N de tau recombinante más corto y una diversidad de polipéptidos como antígenos. Los antígenos empleados son ocho antígenos: el fragmento del lado N de tau más corto recombinante; un polipéptido 24-36 sintetizado químicamente (SEC ID Nº: 8); un polipéptido 118-131 (SEC ID Nº: 3) al cual se añadió cisteína en su extremo N; un polipéptido 121-128 (SEC ID Nº: 4); un polipéptido 121-129 (SEC ID Nº: 5) al cual se añadió cisteína en su extremo amino; un polipéptido que tenía una secuencia de la parte de una secuencia de aminoácidos codificada por el Exón 4A de una proteína tau (SEC ID Nº: 6); un polipéptido 134-144 (SEC ID Nº: 9) al cual se añadió tirosina en su extremo amino y un polipéptido 154-156 (secuencia de aminoácidos Pro-Arg-Gly) al cual se añadió cisteína en su extremo amino.

Después de secar la membrana al aire, se bloqueó durante 1 hora con 10 ml de TBS que contenía leche desnatada al 5%, seguido por el lavado cinco veces en 20 ml de TBST. A la membrana resultante se le añadieron los anticuerpos preparados en los apartados (1) – (3) anteriores, que se disolvieron en 5 ml de TBST que contenía leche desnatada al 5% y se ajustaron a 500 mg/ml y el conjunto se hizo reaccionar durante una noche a 4ºC en una caja húmeda. Se utilizaron cuatro anticuerpos: el anticuerpo anti-Exón 4-5 (118-131) (purificación 121-128); el anticuerpo anti-Exón 4-5 (118-131) (purificación 118-131); el anticuerpo anti-Exón 4-5 (121-128) (purificación 121-129) y el anticuerpo anti-Exón 4-5 (121-129) (purificación 121-128).

Después de la reacción, la membrana se lavó cinco veces en 20 ml de TBST y se hizo reaccionar en una solución que contenía 0,25 ml de una solución de anticuerpo anti-IgG de ratón marcado con fosfatasa alcalina (Simple Stain MAX-AP; fabricado por Nichirei) en 10 ml de TBST que contenía leche desnatada al 5% a temperatura ambiente durante 1 hora en una caja húmeda. La membrana se lavó cinco veces en 20 ml de TBST para retirar el anticuerpo marcado que no había reaccionado. Después, la membrana se lavó dos veces en 20 ml de TBS y después se puso en una caja húmeda y se sumergió en 10 ml de un tampón (Tris-HCl 100 mM (pH 9,5), NaCl 100 mM, MgCl2 5 mM) que contenía un sustrato con fosfatasa alcalina. A esta mezcla de reacción se le añadieron 66 l de una solución NBT como sustrato (solución de 50 mg/ml de nitroazul de tetrazolio/dimetilformamida al 70%; fabricada por Promega) y se mezcló. Después, se añadieron 33 l de una solución de BCIP (solución de 50 mg/ml de 5-bromo-4-cloro-3-indolilfosfato/dimetilformamida al 70%; fabricada por Promega) y se mezcló. Después de la reacción a temperatura ambiente durante 30 minutos, la membrana se lavó tres veces en 20 ml de TBST para eliminar el sustrato que no había reaccionado. Como resultado, se observó la especificidad de cada uno de los anticuerpos como se muestra en la Figura 1.

En este caso, como es obvio por la Figura 1, el anticuerpo anti-Exón 4-5 (118-131) (purificación 121-128) reaccionó más fuertemente con la proteína tau recombinante. El anticuerpo anti-Exón 4-5 (121-128) (purificación de anticuerpo 121-129) que se esperaba que tuviera mayor especificidad por la parte de conexión del Exón 4-5 tenía baja reactividad con la proteína tau recombinante. Por otro lado, el anticuerpo anti-Exón 4-5 (121-129) (purificación 121-128) mostró mayor reactividad con la proteína tau recombinante que con el polipéptido antigénico y, por lo tanto, probablemente era un anticuerpo potente. En los estudios descritos a continuación, se decidió usar el anticuerpo anti-Exón 4-5 (118-131) (purificación 121-128) que reaccionó mucho más con la proteína tau recombinante.

EJEMPLO 2. Detección de la proteína tau del SNC en líquido cefalorraquídeo humano por ELISA

Usando el anticuerpo anti-Exón 4-5 (118-131) (purificación 121-128) seleccionado en el Ejemplo 1 anterior, se realizó un análisis con el líquido cefalorraquídeo como muestra por un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA). Además, usando un kit de medición de la proteína tau (Finoscolor hTAU o INNOTEST hTAUAg) disponible en el mercado en Innogenetics, la medición se realizó y se comparó con el método con el anticuerpo de la presente invención.

(1): Preparación de líquido cefalorraquídeo humano (CSF)

Se recogió líquido cefalorraquídeo como una muestra de un individuo que se sospechaba que padecía enfermedad de Alzheimer (AD) y un individuo que tenía una enfermedad neurológica distinta a demencia (Control; CTL) por punción lumbar bajo anestesia después de dar el consentimiento informado. El líquido después se centrifugó para obtener un sobrenadante para su uso.

(2): Inmovilización del anticuerpo anti-proteína tau humana

A una placa ELISA de 96 pocillos se le añadió tampón carbonato sódico 0,1 M (pH 9,0) que contenía un anticuerpo monoclonal anti-proteína tau humana HT7 a 0,1 ml/pocillo y se incubó a 4ºC durante 3 horas en una caja húmeda para inmovilizar el anticuerpo. Después, la solución se retiró, la placa se lavó en tampón carbonato sódico 0,1 M y se bloqueó a 4ºC durante 2 horas añadiendo 0,2 ml de una solución de PBS (fosfato sódico 10 mM, NaCl 150 mM (pH 7,4)) que contenía BSA al 1%, leche desnatada al 1% y gelatina al 0,5%. La placa se usó inmediatamente después de lavar en una solución de lavado (Tris-HCl 20 mM (pH 7,4), Tween 20 al 0,05%). Cuando no se usó inmediatamente, la placa se lavó adicionalmente en agua pura, se secó al vacío y se almacenó a 4ºC dentro de una bolsa laminada.

(3): Medición de la proteína tau del SNC en líquido cefalorraquídeo mediante ELISA usando anticuerpo de la presente invención

De acuerdo con un método descrito en la Publicación Internacional Nº WO97/34145, se midió proteína tau del SNC de la siguiente manera y se comparó con la concentración de una proteína tau medida usando un kit de medición de proteína tau disponible en el mercado (nombre comercial en Japón “Finoscolor hTAU” y nombre comercial en los Estados Unidos y Europa “INNOTEST hTAU Ag”, fabricado por Innogenetics).

Se midió un fragmento del lado N de tau más corto modificado por ingeniería genética (SEC ID Nº: 7) obtenido introduciendo en E. coli una parte que carecía de la secuencia de inserción representada por los aminoácidos número 45-102 en un gen que codifica los aminoácidos número 1-249 de una proteína tau, usando un kit de medición de proteína tau disponible en el mercado (nombre comercial en Japón “Finoscolor hTAU” y nombre comercial en los Estados Unidos y Europa “INNOTEST hTAU Ag”, fabricado por Innogenetics) para determinar un valor. El fragmento del lado N de tau más corto usado como control positivo se diluyó a concentraciones que variaban en un tampón de ensayo (BSA al 0,1%, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, Tris-HCl 20 mM (pH 7,4), NaCl 0,15 M, Tween 20 al 0,05%) y cada una de las soluciones que contenía cada concentración se añadió a 50 l/pocillo a la placa ELISA preparada en el apartado (2) anterior. De manera similar, cada uno de los líquidos cefalorraquídeos obtenidos en el apartado (1) anterior se añadió a 50 l/pocillo a la placa ELISA. Posteriormente, a cada pocillo que contenía el control positivo que tenía el fragmento de concentración conocida o cualquiera de los líquidos cefalorraquídeos humanos, se añadieron 50 l del anticuerpo anti-Exón 4-5 (118-131) (purificación 121-128) preparado en el Ejemplo 1 anterior a la concentración de 100 ng/ml (un tampón de ensayo que contenía suero de cabra normal al 1% y suero de ratón normal al 1%), y después la placa se selló con un sellante de placas y se incubó durante una noche a 4ºC con agitación.

Después, la placa se lavó en una solución de lavado (Tris-HCl 20 mM (pH 7,4), NaCl 0,15 M, Tween 20 al 0,05%), se diluyó una solución de anticuerpo anti-IgG de conejo marcado con peroxidasa (Simple Stain MAX-PO; fabricado por Nichirei) en un tampón de ensayo que contenía suero de cabra normal al 1%, leche desnatada al 5% y suero de ratón normal al 1% y se añadieron a 100 l/pocillo a la placa. La placa se selló herméticamente con un sellante de placa y se incubó adicionalmente a 4ºC durante 1 hora con agitación. Después del lavado en la solución de lavado anterior de nuevo, se añadió una solución de sustrato a 0,1 ml/pocillo a la placa y se hizo reaccionar con HRP inmovilizada en la fase sólida a temperatura ambiente durante 30 a 40 minutos para desarrollar el color. La solución de sustrato se preparó disolviendo 2,64 mg de TMB (3,3’,5,5’-tetrametil bencidina) en 0,1 ml de DMSO, añadiendo la solución de DMSO a 10 ml de un tampón de ácido cítrico 0,1 M (pH 4,4) y posteriormente complementando con 3,3 l de una solución de peróxido de hidrógeno al 30%. Para finalizar la reacción, se añadieron 0,1 ml de ácido sulfúrico 1 normal y se determinó la concentración de la proteína tau del SNC midiendo la absorbancia a 450 nm con un lector de placas.

(4) Medición de la proteína tau en el líquido cefalorraquídeo usando un kit disponible en el mercado.

Después se realizó la medición usando un kit de medición de proteína tau disponible en el mercado (nombre comercial en Japón “Finoscolor hTAU” y nombre comercial en los Estados Unidos y Europa “INNOTEST hTAU Ag”, fabricado por Innogenetics). De acuerdo con todos los procedimientos en las instrucciones

5 proporcionadas en el kit, se usaron 25 l de cada una de las muestras usadas en el apartado (3) anterior para medir la concentración de la proteína tau.

(5) Análisis de medición Se analizaron los resultados de los apartados anteriores (3) y (4) y se

muestran en la Tabla 1. 10

Tabla 1

Concentraciones (fmol/ml; pM) de proteínas tau del SNC (a) y proteínas tau (b) en líquidos cefalorraquídeos (CSF) de un paciente con enfermedad de Alzheimer (AD) y un sujeto sin demencia (CTL)

Paciente Nº: proteína tau del SNC (a) proteína tau (b) a/b

AD1: 32,74 5,1 6,42

AD2: 48,94 10,0 4,89

AD3: 74,64 11,4 6,55

AD4: 52,07 11,1 4,69

CTL1: 10,41 N.D. (< 0,5) -

CTL2: 13,67 N.D. (< 0,5) -

Como resulta evidente a partir de la Tabla 1, el anticuerpo anti-Exón 4-5 (118-131) (purificación 121-128) fue capaz de distinguir entre la muestra obtenida a 15 partir de un individuo que se sospechaba que padecía enfermedad de Alzheimer (AD) y la muestra obtenida a partir de un individuo con una enfermedad neurológica distinta de demencia (Control; CTL). Aunque el resultado de la medición correspondía con el obtenido usando el kit disponible en el mercado, se observó que su sensibilidad de detección de una proteína tau del SNC era mucho mayor

20 que la del kit. Por lo tanto, se ha demostrado que el anticuerpo de la presente invención es muy útil para la detección de la enfermedad de Alzheimer.

EJEMPLO 3. Detección de proteína tau del SNC en cerebro humano y tejido muscular mediante ELISA

(1) Preparación de la muestra

Para la muestra de un tejido cerebral, se extrajo proteína tau y se purificó a partir de un tejido cerebral obtenido durante la autopsia de un paciente con enfermedad de Alzheimer (proporcionado por el Doctor Hiroyuki Shimada en el Tokyo Metropolitan Geriatric Medical Center (Centro Médico Geriátrico Metropolitano de Tokio) en 1990) de acuerdo con un método descrito en la Publicación Internacional Nº WO97/341345 (un método de acuerdo con un método descrito en H. Ksiezak-Reding et al., Journal of Neuroscience Research, 25, 412419, 420-430 (1990)). Como muestra de un tejido muscular se usó un extracto de tejido muscular humano disponible en el mercado (Nº Cat. 7804-1, procedente de CLONTECH Laboratories, Inc.).

Esas muestras se usaron para realizar la medición mediante el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA) de la misma manera que en el Ejemplo

(2): anterior.

(2): Inmovilización del anticuerpo anti-proteína tau humana

Se inmovilizó un anticuerpo monoclonal anti-proteína tau humana HT7 en una placa ELISA de 96 pocillos de la misma manera que en el Ejemplo 2 (2).

(3): Medición de proteína tau del SNC en tejido cerebral y muscular mediante ELISA usando anticuerpo de la presente invención

Como en el Ejemplo 2 (3), se midió una proteína tau del SNC de la siguiente manera y se comparó con el resultado medido usando un kit de medición de proteína tau fabricado por Innogenetics.

El fragmento del lado N de tau más corto obtenido por ingeniería genética (SEC ID Nº: 7) cuyo valor se había determinado en el Ejemplo anterior 2 (3) se usó como un control positivo. El fragmento de lado N de tau más corto con la concentración determinada se diluyó a concentraciones que variaban en un tampón de ensayo (BSA al 0,1%, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, Tris-HCl 20 mM (pH 7,4), NaCl 0,15 M, Tween 20 al 0,05%) para preparar series de dilución, cada una de las cuales después se añadió a 50 l/pocillo a la placa ELISA preparada en el apartado

(2): anterior. Los extractos de tejido muscular y cerebral preparados en el apartado

(1): anterior se diluyeron respectivamente en un tampón de ensayo para preparar series de dilución, cada una de las cuales posteriormente se añadió a 50 l/pocillo al pocillo de la placa ELISA de la misma manera.

A cada pocillo que contenía, como muestra, el control positivo que tenía una concentración conocida del fragmento o el extracto tisular, se añadieron 50 l del anticuerpo anti-Exón 4-5 (118-131) (purificación 121-128) (100 mg/ml; en un tampón de ensayo que contenía suero de cabra normal al 1% y suero de ratón normal al 1%) y la placa se selló con un sellante de placas y se incubó durante una noche a 4ºC con agitación. Después de la reacción, la placa se lavó en una solución de lavado (Tris-HCl 20 mM (pH 7,4), NaCl 0,15 M, Tween 20 al 0,05%) y se añadió un anticuerpo anti-IgG de conejo marcado con peroxidasa (Simple Stain MAX-PO; fabricado por Nichirei) que se diluyó en el tampón de ensayo anterior a 100 l/pocillo a la placa. La placa se selló con un sellante de placas y se incubó a 4ºC durante 1 hora con agitación.

Después de lavar en una solución de lavado, se añadió una solución de sustrato a 0,1 ml/pocillo a la placa y se hizo reaccionar con HRP inmovilizada en la fase sólida a temperatura ambiente durante 30 a 40 minutos para desarrollar color. La solución de sustrato se preparó disolviendo 64 mg de TMB (3,3’,5,5’-tetrametil bencidina) en 0,1 ml de DMSO (dimetil sulfóxido), añadiendo la solución de DMSO a 10 ml de un tampón de ácido cítrico 0,1 M (pH 4,4), y posteriormente complementando con 3,3 l de solución de peróxido de hidrógeno al 30%. Para finalizar la reacción, se añadieron 0,1 ml de ácido sulfúrico 1 normal y se determinó la concentración de la proteína tau del SNC midiendo la absorbancia a 450 nm con un lector de placas.

(4): Medición de la proteína tau en tejidos cerebrales y musculares usando un kit disponible en el mercado

Para las muestras preparadas en el apartado (1) anterior, se midió la concentración de la proteína tau usando un kit de medición de proteína tau disponible en el mercado (nombre comercial en Japón “Finoscolor hTAU” y nombre comercial en los Estados Unidos y Europa “INNOTEST hTAU Ag”, fabricado por Innogenetics). De acuerdo con las instrucciones proporcionadas con el kit, la medición se realizó usando 25 l de cada una de las muestras.

(5): Análisis de la medición

Se analizaron los resultados de los apartados (3) y (4) anteriores y se muestran en la Tabla 2.

Tabla 2

Concentraciones (pmol/ml; nM) de proteínas tau del SNC (a) y proteínas tau (b) en extracto de cerebro procedente de un paciente con enfermedad de Alzheimer (AD) y extracto muscular procedente de un sujeto normal (CTL)

proteína tau del SNC (a): proteína tau (b) a/b

Extracto de cerebro AD: 412 35 11,8

Extracto muscular CTL: 1,8 1,0 1,8

Cerebro/músculo: 229 35 -

Como resulta evidente a partir de la Tabla 2, el método de medición usando

5 el anticuerpo anti-Exón 4-5 (118-131) (purificación 121-128) de la presente invención tenía tanta reactividad con la proteína tau como el del kit disponible en el mercado, aunque el método presentó una reacción extremadamente fuerte con la proteína tau del SNC. La reactividad con la proteína tau del SNC fue 10 o más veces mayor que la del kit comercial. Como resultado, se ha demostrado que el

10 anticuerpo de la presente invención no reacciona con una proteína tau periférica contenida en un tejido periférico tal como el músculo o la sangre y puede detectar una proteína tau del SNC específicamente y con sensibilidad sin impedimento de la proteína tau periférica.

15 EJEMPLO 4. Detección de proteína tau del SNC en tejidos cerebral y muscular humanos por inmunotransferencia

(1) Preparación de un anticuerpo Se adquirió un anticuerpo monoclonal anti-proteína tau HT7 en Innogenetics 20 para su uso. Se usó el anticuerpo anti-Exón 4-5 (118-131) (purificación 121-128) preparado en el Ejemplo 1 anterior.

Para un anticuerpo que reconoce específicamente una proteína tau periférica (un anticuerpo específico para una proteína tau periférica), un anticuerpo obtenido por inmunización con un antígeno, se preparó un polipéptido que tenía una

25 parte de una secuencia de aminoácidos codificada por el Exón 4A de un gen que codificaba una proteína tau de la siguiente manera de acuerdo con la descripción de la Publicación Internacional Nº WO97/34145.

Se sintetizó químicamente un polipéptido que tenía una secuencia en la que se introdujo cisteína en el extremo amino de la secuencia de la parte de la secuencia de aminoácidos (SEC ID Nº: 6) codificada por el Exón 4A de un gen que codificaba una proteína tau como polipéptido antigénico, y se unió a hemocianina de lapa californiana (KLH) para preparar un inmunógeno. En primer lugar, se disolvieron 1,5 mg de KLH maleimidada (un producto liofilizado; fabricado por Pierce) en 0,15 ml de agua pura (tampón fosfato 50 mM, NaCl 0,15 M, EDTA 100 mM (pH 7,2)) y se añadieron 3,0 mg del polipéptido anterior a la solución, y se hizo reaccionar a temperatura ambiente (25ºC) durante 2 horas. Se dializó esta solución durante una noche a 4ºC frente a una solución salina fisiológica y después se ajustó a 1,0 ml con una solución salina fisiológica para preparar un antígeno para la inmunización (inmunógeno). Se obtuvo antisuero a partir de un conejo inmunizado repetidamente con el inmunógeno resultante y el antisuero se cargó y se absorbió sobre una columna en la que se inmovilizó el polipéptido anterior, y la fracción absorbida se eluyó con un tampón de elución suave disponible en Pierce y, de esta manera, se obtuvo un anticuerpo purificado por afinidad (que también se denomina en este documento en lo sucesivo “anticuerpo anti-Exón 4A”).

Para la especificidad de este anticuerpo anti-Exón 4A, se analizó la reactividad con una diversidad de polipéptidos sintetizados por transferencia puntual de la misma manera que en la evaluación del anticuerpo anti-Exón 4-5 realizada en el Ejemplo 1(4) anterior y se confirmó que el anticuerpo anti-Exón 4A reaccionaba específicamente con el polipéptido antigénico anterior.

(2): Preparación de la muestra

Como muestras se usaron el extracto de tejido cerebral procedente de un paciente con enfermedad de Alzheimer y el mismo extracto de tejido muscular humano disponible en el mercado que se usó en el Ejemplo 3(1) anterior. Como control positivo se usó una proteína tau modificada genéticamente (SEC ID Nº: 1) proporcionada por el Doctor Goedert (MRC Laboratory of Molecular Biology, Reino Unido).

(3): Análisis por inmunotransferencia

Cada uno de los extractos tisulares y el control positivo preparado en el apartado (2) anterior se aplicaron a un gel de poliacrilamida al 9%, se sometieron a electroforesis por el método de Laemmli (Nature, 227, 680-685 (1970)) y se transfirieron a una membrana de PVDF con un aparato de transferencia semiseca. Tres de dichas membranas de PVDF se prepararon y se analizaron con inmunotransferencia usando el anticuerpo anti-Exón 4-5 (118-131) (purificación 121-128), el anticuerpo anti-Exón 4A (conejo) y el anticuerpo monoclonal antiproteína tau HT7 de la siguiente manera.

Las membranas de PVDF obtenidas se bloquearon durante 1 hora usando 20 ml de TBS que contenía leche desnatada al 5% como solución de bloqueo. Después de esto, esta solución de bloqueo se complementó con el anticuerpo anti-Exón 4-5 (118-131) (purificación 121-128) a la concentración de 540 ng/ml, con el anticuerpo anti-Exón 4A a la concentración de 1.300 ng/ml o con el anticuerpo monoclonal anti-proteína tau HT7 a la concentración de 2.000 ng/ml, respectivamente. Se añadieron 15 ml de cada uno de ellos a una membrana, seguido de la reacción durante una noche a 4ºC en una caja húmeda. Después de la reacción, las membranas se lavaron tres veces en 20 ml de TBST durante 10 minutos para retirar los anticuerpos que no habían reaccionado.

Como anticuerpo secundario marcado con fosfatasa alcalina, se añadieron 0,75 ml de una solución de anticuerpo anti-IgG de conejo (Simple Stain MAX-AP fabricado por Nichirei) para el anticuerpo anti-Exón 4-5 (118-131) (purificación 121128) y el anticuerpo anti-Exón 4A, y 3 l de una solución de anticuerpo anti-IgG de ratón (fabricado por Promega) para el anticuerpo monoclonal anti-proteína tau HT7 a 15 ml de TBS que contenía leche desnatada al 5% y se hizo reaccionar a temperatura ambiente durante 1 hora en una caja húmeda. Después de la reacción, las membranas se lavaron tres veces en 20 ml de TBST durante 10 minutos para retirar los anticuerpos secundarios que no habían reaccionado.

Las membranas se pusieron en una caja húmeda de nuevo y se sumergieron en 15 ml de un tampón para un sustrato de fosfatasa alcalina (Tris-HCl 100 mM (pH 9,5), NaCl 100 mM, MgCl2 5 mM). Como sustrato, se añadieron adicionalmente 100 l de solución de NBT (50 mg/ml de solución de nitroazul de tetrazolio/dimetilformamida al 70%; fabricada por Promega) y solución BCIP (50 mg/ml de solución de 5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato/dimetilformamida al 70%; fabricada por Promega), seguido de mezcla. Después de la reacción a temperatura ambiente durante 30 minutos, las membranas se lavaron tres veces en 20 ml de TBST durante 10 minutos para retirar el sustrato que no había reaccionado.

El resultado se muestra en la Figura 2. En la Figura 2, el carril M muestra la imagen de la electroforesis del extracto de tejido muscular humano, el carril B muestra la del extracto de tejido cerebral de un paciente con AD y el carril C muestra la de la proteína tau modificada genéticamente (proteína tau del SNC) como control positivo.

El resultado de la inmunotransferencia ha revelado que existe una proteína tau periférica con un peso molecular de 110 kD que tiene, como secuencia de inserción, una secuencia de aminoácidos codificada por el Exón 4A (en la figura, que se indica por “tau grande (Exón 4A+)”) y fragmentos de la misma en el extracto de tejido muscular humano, y que se detectaron por el anticuerpo anti-Exón 4A y el anticuerpo monoclonal anti-proteína tau HT7, aunque casi estaban ausentes en el extracto de tejido cerebral. Por otro lado, se ha confirmado que el anticuerpo anti-Exón 4-5 (118-131) (purificación 121-128) no reacciona con el extracto muscular humano de ninguna manera y reacciona específicamente sólo con proteínas tau del SNC con un peso molecular de 48 a 65 kD (en la figura, que se indica mediante “tau (Exón 4A-)”) y un material polimerizado y fragmentos de los mismos, contenidos en el extracto de tejido cerebral humano y el control positivo.

Como resulta evidente a partir de estos resultados, el anticuerpo de la presente invención puede diferenciar claramente las proteínas tau del SNC procedentes de un tejido nervioso central tal como el cerebro de una proteína tau periférica procedente de un tejido periférico tal como el músculo. Por lo tanto, se sugirió que incluso usando una muestra procedente de un tejido periférico tal como la sangre o el músculo con la que convencionalmente no se ha podido obtener alta sensibilidad debido al impedimento de la proteína tau periférica con un peso molecular grande, las proteínas tau del SNC pueden detectarse de manera específica y sensible.

EJEMPLO 5. Detección de proteína tau del SNC en sangre humana por ELISA

En el Ejemplo 4 anterior se ha indicado que el anticuerpo de la presente invención puede diferenciar claramente una proteína tau del SNC procedente de un tejido nervioso central tal como el cerebro de una proteína tau periférica procedente de un tejido periférico tal como el músculo. Por lo tanto, el anticuerpo se usó para detectar una proteína tau del SNC en sangre humana que contenía una gran cantidad de proteínas tau periféricas.

(1): Preparación de la muestra

Se extrajo sangre de un individuo que se sospechaba que padecía enfermedad de Alzheimer (AD) y de un individuo voluntario sano (Control) a través de la vena basílica del codo después de que los individuos dieran su consentimiento informado y se almacenó a -40ºC después de la separación del plasma. La sangre obtenida procedente del individuo que se sospechaba que padecía enfermedad de Alzheimer se adquirió en Scripps Laboratories, Japón, Inc.

(2): Inmovilización de anticuerpo anti-proteína tau humana

A una placa ELISA de 96 pocillos (para la medición de fluorescencia/luminiscencia) se le añadió tampón carbonato sódico 0,1 M (pH 9,0) que contenía un anticuerpo monoclonal anti-proteína tau humana HT7 a 0,1 ml/pocillo y se incubó a 4ºC durante 3 horas en una caja húmeda para inmovilizar el anticuerpo. Después de retirar la solución, la placa se lavó en un tampón carbonato sódico 0,1 M y se bloqueó a 4ºC durante 2 horas añadiendo 0,2 ml de una solución de PBS (fosfato sódico 10 mM, NaCl 150 mM (pH 7,4)) que contenía BSA al 1% y leche desnatada al 1%. La placa se usó inmediatamente después de lavar en una solución de lavado (Tris-HCl 20 mM (pH 7,4), Tween 20 al 0,05%). Cuando no se usó inmediatamente, la placa se lavó adicionalmente en agua pura, se secó al vacío y se almacenó a 4ºC dentro de una bolsa laminada.

(3): Medición de la proteína tau del SNC en sangre por ELISA usando anticuerpo de la presente invención

De acuerdo con un método descrito en la Publicación Internacional WO97/34145, se midió proteína tau del SNC en sangre humana de la siguiente manera.

En primer lugar, a la placa ELISA preparada en el apartado (2) anterior, se añadió un anticuerpo anti-Exón 4-5 (118-131) (purificación 121-128) (100 ng/ml; en un tampón de ensayo (BSA al 0,1%, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, Tris-HCl 20 mM (pH 7,4), NaCl 0,15 M, Tween 20 al 0,05%) que contenía leche desnatada al 5%, suero de cabra normal al 1% y suero de ratón normal al 1%) a 75 l/pocillo. En los pocillos respectivos se añadió la muestra de sangre preparada en el apartado (1) anterior a 25 l/pocillo. De manera alternativa, el fragmento del lado N de tau más corto obtenido por ingeniería genética (SEC ID Nº: 7) como control positivo que se midió en el Ejemplo 2 (3) anterior con el kit de medición de proteína tau disponible en el mercado (nombre comercial en Japón “Finoscolor hTAU” y nombre comercial en los Estados Unidos y Europa “INNOTEST hTAU Ag”, fabricado por Innogenetics) se diluyó a concentraciones que variaban en un tapón de ensayo para preparar series de dilución y se añadió a 25 l/pocillo a diferentes pocillos. La placa se selló con un sellante de placas y se incubó durante una noche a 4ºC con agitación.

Después de la reacción, la placa se lavó en una solución de lavado (Tris-HCl 20 mM (pH 7,4), NaCl 0,15 M, Tween 20 al 0,05%) y a la placa se añadieron 100 l/pocillo de un anticuerpo anti-IgG de conejo marcado con fosfatasa alcalina (Simple Stain MAX-AP; fabricado por Nichirei) que se diluyó en el tampón de ensayo anterior (BSA al 0,1%, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, Tris-HCl 20 mM (pH 7,4), NaCl 0,15 M, Tween 20 al 0,05%) que contenía leche desnatada al 5%, suero de cabra normal al 1% y suero de ratón normal al 1%. La placa se selló de nuevo con un sellante de placas y se incubó a 4ºC durante 1 hora con agitación.

Después de lavar en una solución de lavado, se añadió una solución de sustrato luminiscente “CDP-star” (2-cloro-5-(4-metoxiespiro(1,2-dioxetano-3,2’-(5’cloro)-triciclo[3.3.1.13,7]decan)-4-il)-1-fenil fosfato) disponible en Applied Biosystems a 0,1 ml/pocillo a la placa y se hizo reaccionar con fosfatasa alcalina inmovilizada en la fase sólida a temperatura ambiente durante 40 a 50 minutos para emitir luz. La intensidad de emisión se midió con un lector de placas luminiscentes (LUMINUS CT9000: fabricado por DIA-IATRON) para determinar la concentración de la proteína tau del SNC.

(4) Análisis de la medición

Se analizó el resultado obtenido del apartado (3) anterior y se muestra en la Tabla 3.

Tabla 3

Concentraciones (fmol/ml; pM) de proteínas tau del SNC en sangre de un paciente con enfermedad de Alzheimer (AD) y un sujeto normal (CTL)

Muestra Nº: concentración de proteína tau del SNC

AD1: 1,30

AD2: 1,91

AD3: 5,88

AD4: 1,43

CTL1: 0,41

CTL2: 1,05

CTL3: 0,81

CTL4: 0,48

Como es obvio a partir de la Tabla 3, se ha demostrado que, si se usa el

5 anticuerpo específico para una proteína tau del SNC de la presente invención, puede analizarse la presencia de una proteína tau del SNC incluso usando sangre humana con la que había sido difícil la detección de la proteína tau del SNC debido a la gran abundancia de proteínas tau periféricas, y puede realizarse la detección de la enfermedad de Alzheimer.

10 EJEMPLO 6. Detección de la proteína tau del SNC en sangre humana por ELISA En el Ejemplo 5 anterior se ha demostrado que el anticuerpo de la presente invención es útil para analizar la presencia de una proteína tau del SNC incluso en

15 sangre humana y, por lo tanto, puede realizarse la detección de la enfermedad de Alzheimer. Por lo tanto, el anticuerpo se usó adicionalmente para análisis usando sangre como muestra para un grupo de pacientes a los que se les había diagnosticado enfermedad de Alzheimer o MCI mediante un método convencional. De los pacientes con diagnóstico de MCI mediante el método convencional,

20 se decía que del 10 al 15% en un año y aproximadamente el 50% en varios años desarrollaron enfermedad de Alzheimer, y existe un reconocimiento creciente de que en los pacientes MCI están incluidos pacientes con enfermedad de Alzheimer en sus primeras fases. Evaluando a dicho grupo de pacientes con el presente método, se examinó la posibilidad de detectar enfermedad de Alzheimer en sus primeras fases que casi no se había diagnosticado mediante el método convencional.

(1) Preparación de la muestra

Se extrajo sangre de un individuo que se sospechaba que tenía enfermedad de Alzheimer (AD), un individuo que se sospechaba que tenía MCI y un individuo voluntario sano (Control) después del consentimiento informado. Se extrajo sangre a través de la vena basílica del codo y se almacenó a -40ºC después de la separación del plasma.

El diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer se realizó basándose en el “Diagnostic and Statiscal Manual of Mental Disorders" (Manual Diagnóstico y Estadístico de Trastornos Mentales), 4ª edición, texto revisado (DSM-IV-TR)” (publicado por la Asociación Americana de Psiquiatría, 2000) y el diagnóstico de MCI se realizó basándose en los criterios de Petersen, R. C. et al. (Arch. Neurol., 56, 303-308 (1999)).

(2): Inmovilización del anticuerpo anti-proteína tau humana

A una placa ELISA de 96 pocillos (para la medición de fluorescencia/luminiscencia) se añadió tampón carbonato sódico 0,1 M (pH 9,0) que contenía un anticuerpo monoclonal anti-proteína tau humana HT7 a 0,1 ml/pocillo y se incubó a 4ºC durante 3 horas en una caja húmeda para inmovilizar el anticuerpo. Después de retirar la solución, la placa se lavó en tampón carbonato sódico 0,1 M y se bloqueó a 4ºC durante 2 horas añadiendo 0,2 ml de una solución de PBS (fosfato sódico 10 mM, NaCl 150 mM (pH 7,4)) que contenía BSA al 1% y leche desnatada al 1%. La placa se usó inmediatamente después del lavado en una solución de lavado (Tris-HCl 20 mM (pH 7,4), Tween 20 al 0,05%). Cuando no se usó inmediatamente, la placa se lavó adicionalmente en agua pura, se secó al vacío y se almacenó a 4ºC dentro de una bolsa laminada.

(3): Medición de la proteína tau del SNC en sangre mediante ELISA usando anticuerpo de la presente invención

De acuerdo con un método descrito en la Publicación Internacional Nº WO97/34145, se midió proteína tau del SNC en sangre humana de la siguiente manera.

En primer lugar, a la placa ELISA preparada en el apartado (2) anterior se le añadió un anticuerpo anti-Exón 4-5 (118-131) (purificación 121-128) (50 ng/ml; en un tampón de ensayo (BSA al 0,1%, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, Tris-HCl 20 mM (pH 7,4), NaCl 0,15 M, Tween 20 al 0,05%) que contenía suero de cabra normal al 1% y suero de ratón normal al 1%) a 80 l/pocillo. A los pocillos respectivos se añadió la muestra de sangre preparada en el apartado (1) anterior a 20 l/pocillo. De manera alternativa, el fragmento del lado N de tau más corto obtenido por ingeniería genética (SEC ID Nº: 7) como control positivo que se midió en el Ejemplo 2 (3) anterior con el kit de medición de proteína tau disponible en el mercado (nombre comercial en Japón “Finoscolor hTAU” y nombre comercial en los Estados Unidos y Europa “INNOTEST hTAU Ag”, fabricado por Innogenetics) se diluyó a concentraciones variables en un tampón de ensayo para preparar series de dilución y se añadieron a 20 l/pocillo a diferentes pocillos. La placa se selló con un sellante de placas y se incubó durante una noche a 4ºC con agitación.

Después de la reacción, la placa se lavó en una solución de lavado (Tris-HCl 20 mM (pH 7,4), NaCl 0,15 M, Tween 20 al 0,05%) y a la placa se le añadieron 100 l/pocillo de un anticuerpo anti-IgG de conejo marcado con fosfatasa alcalina (Simple Stain MAX-AP; fabricado por Nichirei) que se diluyó en el tampón anterior (BSA al 0,1%, Tris-HCl 20 mM (pH 7,4), NaCl 0,15 M, Tween 20 al 0,05%) que contenía leche desnatada al 5%, suero de cabra normal al 1% y suero de ratón normal al 1%. La placa se selló de nuevo con un sellante de placas y se incubó a 4ºC durante 1 hora con agitación.

Después de lavar en una solución de lavado, se añadió una solución de sustrato luminiscente “CDP-star” (2-cloro-5-(4-metoxiespiro(1,2-dioxetano-3,2’-(5’cloro)-triciclo[3.3.1.13,7]decan)-4-il)-1-fenil fosfato disódico) disponible en Applied Biosystems a 0,1 ml/pocillo a la placa y se hizo reaccionar con fosfatasa alcalina inmovilizada sobre la fase sólida a 30ºC durante 30 a 50 minutos para emitir luz. La intensidad de emisión se midió con un lector de placas luminiscentes (LUMINUS CT9000: fabricado por DIA-IATRON) y, de esta manera, se determinó la concentración de la proteína tau del SNC.

(4) Análisis de medición

Se analizó el resultado obtenido del apartado (3) anterior y se muestra en la Tabla 4.

Tabla 4

Concentraciones (fmol/ml; pM) de proteínas tau del SNC en sangre de pacientes con enfermedad de Alzheimer (AD), deterioro cognitivo leve (MCI) y sujeto normal (CTL)

Muestra Nº: concentración de proteína tau del SNC Muestra Nº concentración de proteína tau SNC

AD1: 0 MCI8 0,37

AD2: 0,39 MCI9 0,16

AD3: 33,94 MCI10 6,7

AD4: 3,11 MCI11 8,57

AD5: 0,17 MCI12 4,66

AD6: 3,17 MCI13 9,12

AD7: 7,8 MCI14 3,19

AD8: 0,18 MCI15 3,2

AD9: 0 MCI16 12,02

AD10: 0,58 CTL1 0,5

AD11: 0,29 CTL2 0,26

AD12: 0,08 CTL3 0

MCI1: 6,82 CTL4 0,12

MCI2: 25,84 CTL5 0,29

MCI3: 4,06 CTL6 0,33

MCI4: 0 CTL7 0

MCI5: 0 CTL8 0,14

MCI6: 0,36 CTL9 0,51

MCI7: 4,58 CTL10 0,91

Como resulta evidente a partir de la Tabla 4, se ha demostrado que si se

usa el anticuerpo específico contra una proteína tau del SNC de la presente

5 invención, la presencia de proteína tau del SNC también puede analizarse usando

sangre humana como muestra para un grupo de pacientes a los que se les ha

diagnosticado MCI mediante un método convencional. Además, se ha confirmado

que podría usarse una pequeña cantidad de muestra para realizar el análisis sin

pretratamiento y que el uso del método quimioluminiscente podría conseguir una 10 sensibilidad mucho mayor. Es decir, se confirmó que el anticuerpo y el método de

detección de la presente invención tenían alta sensibilidad.

APLICABILIDAD INDUSTRIAL

El uso del anticuerpo de la presente invención permite el análisis específico de una proteína tau del SNC incluso usando una muestra procedente de un tejido periférico tal como sangre. Por consiguiente, puede realizarse una detección más conveniente y sensible de la enfermedad de Alzheimer sin la extracción de líquido cefalorraquídeo o similar que causa una gran invasión a los pacientes, y por lo tanto, el anticuerpo de la presente invención puede usarse como un medio para ayudar en la decisión de los ciclos terapéuticos, la valoración de los efectos terapéuticos, la decisión sobre los patrones de cuidados en ancianos, y similares.

LISTA DE SECUENCIAS

<110> Mitsubishi Chemical Corporation

<120> Anticuerpos anti-tau específicos del SNC y el uso de los mismos

<130> A30680P1636 5 <150> JP 2002-236472

<151> 14-08-2002

<160> 9

<170> Patentln Ver. 2.1

<210>: 1 10 <211> 441

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

<210> 2

<211> 250

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

<210> 3

<211> 14

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 3

<210> 4

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 4

<210>: 5 10 <211> 9

imagen1

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 5

imagen1

imagen2

<210> 6

<211> 15

<212> PRT

<213> Homo sapiens 20 <400> 6

imagen1

<210> 7

<211> 191

<212> PRT 25 <213> Homo sapiens

<400> 7

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<210> 8

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 8

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<210> 9

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 9

imagen1

Claims

1.: Un anticuerpo específico para una proteína tau del sistema nervioso central (SNC), donde el anticuerpo reconoce específicamente una proteína tau del SNC pero no una proteína tau periférica y donde el anticuerpo reconoce específicamente una secuencia de aminoácidos de una parte de conexión entre la secuencia de aminoácidos codificada por el Exón 4 de un gen que codifica una proteína tau y la secuencia de aminoácidos codificada por el Exón 5 del mismo como un epítopo.

2.: El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicha parte de conexión es una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos número 121-128 de una secuencia de aminoácidos descrita en la SEC ID Nº: 1 de la lista de secuencias.

3.: Un método para producir un anticuerpo específico para una proteína tau del SNC, que comprende: inmunizar a un animal con un polipéptido que contiene una secuencia de aminoácidos específica para una proteína tau del SNC como antígeno;

analizar la reactividad del anticuerpo resultante con una proteína tau del SNC y una proteína tau periférica; y seleccionar un anticuerpo que tenga reactividad específica para la proteína tau del SNC y que tenga reactividad específica para una secuencia de aminoácidos de una parte de conexión entre la secuencia de aminoácidos codificada por el Exón 4 de un gen que codifica una proteína tau y la secuencia de aminoácidos codificada por el Exón 5 del mismo como epítopo, donde la secuencia de aminoácidos específica para la proteína tau del SNC comprende una secuencia que contiene una secuencia de aminoácidos de una parte de conexión entre la secuencia de aminoácidos codificada por el Exón 4 de un gen que codifica una proteína tau y la secuencia de aminoácidos codificada por el Exón 5 del mismo.

4.: El método de acuerdo con la reivindicación 3, en el que dicha parte de conexión es una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos número 121-128 de una secuencia de aminoácidos descrita en la SEC ID Nº: 1 de la lista de secuencias.

5.: Un método para detectar tauopatías, que comprende analizar la presencia de una proteína tau del SNC en una muestra obtenida de un individuo que se sospecha que tiene tauopatía, usando el anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2.

6.: El método de acuerdo con la reivindicación 5, en el que la tauopatía es la enfermedad de Alzheimer.

7.: El método de acuerdo con la reivindicación 5 ó 6, en el que la muestra se ha tratado por desnaturalización en presencia de un agente de solubilización de proteínas para retirar las proteínas concomitantes.

8.: El método de acuerdo con la reivindicación 7, en el que la muestra se ha tratado adicionalmente por condensación.

9.: El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, en el que la muestra es sangre.

10.: El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9, en el que el análisis de la presencia de la proteína tau del SNC se realiza mediante ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima.

11.: Un kit de reactivos para la detección de la enfermedad de Alzheimer, que comprende al menos el anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2.