MX2013003879A

MX2013003879A - Anticuerpos anti-tau humanos,.

Info

Publication number: MX2013003879A
Application number: MX2013003879A
Authority: MX
Inventors: Roger Nitsch; Christoph Hock; Jan Grimm; Feng Chen; Jean-Luc Baeriswyl
Original assignee: Univ Zuerich
Priority date: 2010-10-11
Filing date: 2011-10-11
Publication date: 2014-07-09
Also published as: IL225670B; TR201812636T4; EP2627672B1; PT2627672T; US8940272B2; IL225670A0; EA031698B1; PL2627672T3; US9605059B2; HRP20181320T1; SI2627672T1; EP2627672A1; JP2016138102A; NZ609984A; DK2627672T3; US20150252102A1; MX345092B; LT2627672T; BR112013008765B1; ZA201303175B

Abstract

Se proporcionan anticuerpos específicos de tau humana así como fragmentos, derivados y variantes de estos así como también métodos relacionados con estos. También se describen ensayos, kits y soportes sólidos relacionados a los anticuerpos específicos para tau. El anticuerpo, cadena(s) de inmunoglobulina, así como también fragmentos de unión, derivados y variantes de estos se pueden usar en composiciones farmacéuticas y de diagnóstico para el diagnóstico e inmunoterapia dirigidos a tau, respectivamente.

Description

ANTICUERPOS ANTI-TAU HUMANOS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere generalmente a moléculas de unión específicas de tau novedosas, particularmente anticuerpos humanos así como fragmentos, derivados y variantes de estos que reconocen la proteína tau, que incluye tau fosforilada patológicamente y formas agregadas de tau. Además, la presente invención se refiere a composiciones farmacéuticas y diagnósticas que comprenden tales moléculas de unión, anticuerpos e imitaciones de estas valiosas tanto como herramienta de diagnóstico para identificar especies de tau y tau tóxica en plasma y CSF [líquido cerebroespinal] y también en estrategias de vacunación pasivas para tratar taupatías neurodegenerativas tales como enfermedad de Alzheimer (AD, por sus siglas en inglés) , esclerosis lateral amiotrófica/complejo parkinsonismo-demencia (ALS-PDC, por sus siglas en inglés) , demencia con granos argirófilos (AGD, por sus siglas en inglés) , angiopatía amiloide de tipo inglés, angiopatía amiloide cerebral, degeneración corticobasal (CBD, por sus siglas en inglés) , enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (CJD) , demencia pugilística, ovillos neurofibrilares difusos con calcificaciones, síndrome de Down, demencia frontotemporal , demencia frontotemporal con parkinsonismo vinculado al Ref. 240358 cromosoma 17 (FTDP-17, por sus siglas en inglés), degeneración lobar frontotemporal , enfermedad de Gerstmann-Stráussler-Scheinker, enfermedad de Hallervorden-Spatz , miositis por cuerpos de inclusión, atrofia multisistémica , distrofia miotónica, enfermedad de Niemann-Pick tipo C (NP-C) , enfermedad de la motoneurona no de Guam con ovillos neurofibrilares , enfermedad de Pick (PiD, por sus siglas en inglés) , parkinsonismo postencefalítico, angiopatía amiloide cerebral causada por priones, gliosis subcortical progresiva, parálisis supranuclear progresiva (PSP) , panencefalitis esclerosante subaguda, demencia de solo ovillo, demencia multiinfarto y apoplejía isquémica.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La acumulación, modificaciones y agregación de proteínas son aspectos patológicos de numerosas enfermedades neurodegenerativas. Las tau agregadas y modificadas patológicamente, que incluyen confórmeros tau hiperfosforilados , son una característica distintiva de taupatías y se correlacionan con la gravedad de las enfermedades.

Tau es una proteína asociada a microtúbulos expresada en el sistema nervioso central con la función principal de estabilizar los microtúbulos. Existen seis isoformas principales de tau expresadas principalmente en el cerebro humano adulto, que derivan de un único gen mediante empalme alternativo. En condiciones patológicas, la proteína tau se hiperfosforila, provocando una pérdida de unión a la tubulina y desestabilización de microtúbulos seguido por la agregación y deposición de tau en ovillos neurofibrilares patogénicos. Los trastornos relacionados con tau - denominados en forma colectiva taupatías neurodegenerativas - son parte de un grupo de trastornos por el mal plegamiento de proteínas que incluyen la enfermedad de Alzheimer (AD) , parálisis supranuclear progresiva, enfermedad de Pick, degeneración corticobasal , FTDP-17, entre otros. Se ha reportado que más de 40 mutaciones en el gen tau están asociadas con demencia frontotemporal hereditaria demostrando que las mutaciones del gen tau son suficientes para activar la neurodegeneración (Cairns et ál . , Am. J. Pathol . 171 (2007), 227-40). Los estudios en ratones transgénicos y cultivos celulares indican que en AD, la patología de tau puede ser causada por una cascada patológica donde ?ß se ubica arriba de tau (Gótz et ál., Science 293 (2001), 1491-1495). Otro descubrimiento sin embargo apunta a un modelo de doble ruta donde ambas cascadas funcionan independientemente de cada una (van de Nes et ál . , Acta Neuropathol . 111 (2006), 126-138). Las inmunoterapias que se dirigen al péptido beta-amiloide en AD produjeron resultados alentadores en modelos animales y muestran resultados alentadores en ensayos clínicos. Datos más recientes de autopsias de una pequeña cantidad de sujetos sugieren que la depuración de placas beta-amiloide en pacientes con AD avanzado puede no ser suficiente para detener el deterioro cognitivo, enfatizando la necesidad de estrategias terapéuticas adicionales para la AD (Holmes et ál., Lancet 372 (2008), 216-223; Boche et ál . , Acta Neuropathol . 120 (2010), 13-20). Tras el éxito de la terapia de inmunización basada en Abeta en modelos animales transgénicos , el concepto de la inmunoterapia activa se expandió a la proteína tau. Sin embargo, se encontró que la vacunación activa de ratones de tipo natural usando la proteína tau induce la formación de ovillos neurofibrilares , daño axonal e infiltrados mononucleares en el sistema nervioso central, acompañado por déficits neurológicos (Rosenmann et ál . , Arch Neurol . 63 (2006), 1459-1467). Estudios posteriores en líneas de ratones transgénicos usando vacunación activa con péptidos tau fosforilados revelaron una reducción en los niveles cerebrales de agregados tau en el cerebro y una evolución más lenta del deterioro de la conducta (Sigurdsson, J. Alzheimers. Dis. 15 (2008) , 157-168; Boimel et ál . , Ex . Neurol. 224 (2010), 472-485). Estos resultados destacan el potencial beneficio pero también los enormes riesgos asociados con los enfoques de inmunoterapia activa dirigidos a tau. Se necesitan urgentemente estrategias terapéuticas novedosas que aborden las proteínas tau patológicas con una terapia eficaz y segura.

La inmunización pasiva con anticuerpos humanos derivados de sujetos humanos sanos optimizados evolutivamente y madurados por afinidad por el sistema inmunitario humano proporcionaría una nueva vía terapéutica prometedora con una alta probabilidad de excelente eficacia y seguridad.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención usa la respuesta inmunitaria específica de tau de sujetos humanos sanos para el aislamiento de anticuerpos monoclonales humanos específicos anti-tau natural. En particular, los experimentos llevados a cabo de acuerdo con la presente invención fueron exitosos en el aislamiento de anticuerpos monoclonales específicos de tau de un grupo de sujetos humanos sanos sin señales de taupatía neurodegenerativa .

La presente invención por lo tanto se refiere a anticuerpos humanos, fragmentos de unión al antígeno y moléculas de unión al antígeno similares que son capaces de reconocer específicamente la tau. Por "reconocer específicamente la tau", "anticuerpo específico de/para tau" y "anticuerpo anti-tau" se entiende específica, general y colectivamente, anticuerpos contra la forma natural de tau o isoformas de tau agregadas o patológicamente modificadas. En la presente se proporcionan anticuerpos humanos selectivos para las formas de longitud completa, agregadas y patológicamente fosforiladas .

En una modalidad particular de la presente invención, el anticuerpo humano o fragmento de unión al antígeno de este demuestra las características de unión inmunológicas de un anticuerpo caracterizado por las regiones variables VH y/o VL tal como se establece en la Fig. 1.

El fragmento de unión al antígeno del anticuerpo puede ser un fragmento Fv de cadena simple, un fragmento F(ab'), un fragmento F(ab) y un fragmento F(ab' )2# o cualquier otro fragmento de unión al antígeno. En una modalidad específica, más adelante, el anticuerpo o fragmento de este es un anticuerpo de isotipo IgG humano. De manera alternativa, el anticuerpo es un anticuerpo quimérico humano-murino o murinizado, siendo el último particularmente útil para métodos de diagnóstico y estudios en animales.

Además, la presente invención se refiere a composiciones que comprenden el anticuerpo de la presente invención o fragmentos activos de este, o agonistas y moléculas cognadas o, alternativamente, antagonistas de este y a métodos inmunoterapéuticos e inmunodiagnósticos que usan tales composiciones en la prevención, diagnóstico o tratamiento de una taupatía, donde una cantidad eficaz de la composición se administra a un paciente que la necesita.

Naturalmente, la presente invención se extiende a la célula B y linfocito B de memoria humano inmortalizado, respectivamente, que produce el anticuerpo que tiene las características distintas y únicas tal como se define a continuación.

La presente invención también se refiere a polinucleótidos que codifican al menos una región variable de una cadena de inmunoglob lina del anticuerpo de la invención. En una modalidad, la región variable comprende al menos una región determinante de complementariedad (CDR, por sus siglas en inglés) de la VH y/o VL de la región variable tal como se establece en la Figura 1.

Por consiguiente, la presente invención también abarca vectores que comprenden els polinucleótidos y células hospedadoras transformadas con eso así como su uso para la producción de un anticuerpo y moléculas de unión equivalentes que son específicas para la tau. Los medios y métodos para la producción recombinante de anticuerpos e imitaciones de estos así como métodos para analizar moléculas de unión : rivales , que pueden ser anticuerpos o no, se conocen en la técnica. Sin embargo, tal como se describe en la presente, en particular con respecto a las aplicaciones terapéuticas en humanos, el anticuerpo de la presente invención es un anticuerpo humano en el sentido de que la aplicación de el anticuerpo está sustancialmente libre de una respuesta inmune dirigida a el anticuerpo observado de otra forma para anticuerpos quiméricos e incluso humanizados.

Además, en la presente se describen composiciones y métodos que pueden usarse para identificar tau en muestras. Los anticuerpos anti-tau descritos pueden usarse para analizar sangre, CSF y orina humana por la presencia de tau en muestras, por ejemplo, usando un ensayo basado en ELISA o adaptado a la superficie. Los métodos y composiciones descritos en la presente pueden ayudar en taupatías neurodegenerativas tales como el diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer y pueden usarse para monitorear la evolución de la enfermedad y la eficacia terapéutica.

Por lo tanto, es un objeto particular de la presente invención proporcionar métodos para tratar, diagnosticar o prevenir una taupatía neurodegenerativa tal como enfermedad de Alzheimer, esclerosis lateral amiotróf ica/complejo parkinsonismo-demencia, demencia con granos argirófilos, angiopatía amiloide de tipo inglés, angiopatía amiloide cerebral, degeneración corticobasal , enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, demencia pugilística, ovillos neurofibrilares difusos con calcificaciones, síndrome de Down, demencia frontotemporal , demencia frontotemporal con parkinsonismo vinculado al cromosoma 17, degeneración lobar frontotemporal , enfermedad de Gerstmann-Stráussler-Scheinker , enfermedad de Hallervorden-Spatz , miositis por cuerpos de inclusión, atrofia multisistémica, distrofia miotónica, enfermedad de Niemann-Pick tipo C, enfermedad de la motoneurona no de Guam con ovillos neurofibrilares , enfermedad de Pick, parkinsonismo postencefalítico, angiopatía amiloide cerebral causada por priones, gliosis subcortical progresiva, parálisis supranuclear progresiva, panencefalitis esclerosante subaguda, demencia de solo ovillo, demencia multiinfarto y apoplejía isquémica. Los métodos comprenden administrar una concentración eficaz de un anticuerpo humano o derivado de anticuerpo al sujeto donde el anticuerpo se dirige a la tau.

Otras modalidades de la presente invención serán obvias a partir de la descripción y los Ejemplos que siguen.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figuras la-lC: Las secuencias de aminoácidos y nucleótidos de la región variable, es decir, cadena pesada y cadena ligera lambda de anticuerpos humanos NI-105-4E4 (fig. A), NI-105-24B2 (fig. IB) y NI-105.4A3 (fig. 1C) . Las regiones determinantes de complementariedad (CDR) y flanqueantes (FR) se indican con las CDR subrayadas . Debido a la estrategia de clonación la secuencia de aminoácidos en el N-terminal de la cadena pesada y la cadena ligera puede contener potencialmente alteraciones inducidas por cebadores en FR1 que, sin embargo, no afectan sustancialmente la actividad biológica del anticuerpo. Para poder proporcionar un anticuerpo humano de consenso, las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos del clon original se alinearon y ajustaron de acuerdo con las secuencias de región variable de línea germinal humana pertinentes en la base de datos; véase, por ejemplo, Vbase (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/) patrocinada por el MRC Centre for Protein Engineering (Cambridge, Reino Unido) . Esos aminoácidos, que se considera que se desvían potencialmente de la secuencia de línea germinal de consenso debido al cebador de PCR y por lo tanto podrían haberse remplazado en la secuencia de aminoácidos, se indican en negrita.

Figura 2: Las placas ELISA se recubrieron con tau humano recombinante (isoforma hTau40) a 1 µg/ml y se incubaron con las concentraciones indicadas de anticuerpo NI-105.4E4. El anticuerpo recombinante derivado de humano NI-105.4E4 se une a la tau recombinante con alta afinidad a EC50 2 nM.

Figura 3: PHFTau y hTau40 recombinante se resolvieron por gradiente SDS-PAGE seguido por análisis de transferencia Western. Las manchas se incubaron con anticuerpos primarios NI-105.4E4 (humanos) o anticuerpo Taul2 monoclonal de ratón, seguido por anticuerpos secundarios conjugados por HRP . El anticuerpo tau humano recombinante NI-105.4E4 se une a hTau40 recombinante así como también isoformas de tau patológicamente modificadas (PHFTau) extraídas de un cerebro con AD mediante análisis de transferencia Western.

Figuras 4A-4F: Mapeo del epítopo de unión NI-105.4E4 en hTau40. Tecnología PepSpot (JPT) : Dos grupos de manchas de péptidos adyacentes (péptido 83, 84 y 85; péptido 96 y 97) se identificaron específicamente por NI105.4E4 (4A Y 4B y A'), al compararse únicamente con el anticuerpo de detección (fig. 4C) . El anticuerpo de detección IgG de cabra anti -humano conjugado con HRP solo produce una fuerte señal en una única mancha (péptido 50) pero no detecta los péptidos 83, 84, 85, 96 y 97. Barrido de alanina: (FIG. 4D) Manchas #35-50 y #51-68 contienen los péptidos originales (manchas #35 y #51) y sus variantes sustituidas (#36-50 y #52-68) (figs. 4D, 4E y 4F) Secuencia de aminoácidos de los péptidos originales y sustituidos (#35-50 y #51-68) . El barrido de alanina sugiere que los residuos V339, E342, D387, E391 y K395 contribuyen con la unión de NI-105.4E4.

Figura 5: Confirmación de que el anticuerpo NI-105.4E4 recombinante humano se une específicamente a un péptido de tau que correspondiente a los aminoácidos 333-346 de hTau40.

Figuras 6A-6J: NI-105.4E4 se une a ovillos neurofibrilares (NFT) , neuritas distróficas e hilos del neuropilo en ratones que expresan TauP301L humano y con cerebro con AD. La tinción de NI105-4E4 identifica NFT e hilos del neuropilo en un cerebro con AD (fig. 6A) , sin unión significativa a tau en el cerebro de un sujeto de control sano (fig. 6B) . En TauP301L un ratón transgénico (figs. 6E-61) NI-105.4E4 se une fuertemente a la tau patológica similar a NFT (figs. 6E, 6F y 6H) , hilos del neuropilo (figs. 6E y 6G) y neuritas distróficas (figs. 6E y 6H) . Además, NI-105.4E4 también identifica agregados de tau en la etapa pre-ovillo (fig. 61). NI-105.4E4 se une a NFT, neuritas distróficas e hilos del neurópilo en ratones transgenicos que expresan APP humana con la mutación sueca y ártica y TauP301L; la flecha indica una placa beta-amiloide , rodeada por neuritas distróficas reconocidas por NI-105.4E4 (fig. 6J) . El anticuerpo secundario solo no brinda señales a ambas AD humana (fig. 6C) y control sano (fig. 6D) .

Figura 7: Las placas ELISA se recubrieron con tau humano recombinante (hTau40) a 3 ug/ml y se incubaron con las concentraciones indicadas de anticuerpo NI-105.24B2. El anticuerpo recombinante derivado de humano NI-105.24B2 se une a hTau40 con alta afinidad a EC50 6 nM.

Figura 8: PHFTau y hTau40 recombinante se resolvieron por gradiente SDS-PAGE seguido por análisis de transferencia Western. Las manchas se incubaron durante la noche con anticuerpos primarios NI-105.24B2 (humanos), seguido por IgG anti -humano conjugado con H P. El anticuerpo tau humano recombinante NI-105.24B2 se une a hTau40 recombinante así como también isoformas de tau patológicamente modificadas (PHFTau) extraídas de un cerebro con AD mediante análisis de transferencia Western.

Figura 9: El ensayo de Inmunorreactividad sobre el amiloide de placas tisulares (TAPIR) - suero aislado de ancianos se agregó a secciones del cerebro con AD histológica. En comparación, se llevó a cabo una tinción inmunohistológica con el anticuerpo AT100 anti-fosfo- au comercialmente disponible. Los ovillos neurofibrilares se tiñeron en la tinción de control con anticuerpo AT100 anti-fosfo- tau al someterse a sueros aislados, demostrando la presencia de especies de anticuerpo reactivo-ovillos neurofibrilares en los sueros analizados.

Figura 10: Anticuerpo NI-105.4A3 humano recombinante se une específicamente a tau humana mediante ELISA. No se observa ninguna unión a BSA.

Figura 11: Se muestran los epítopos NI-105.4E4 y NI-105.4A3 y epítopos de anticuerpos de tau monoclonales de ratón de uso común y comercialmente disponibles. El anticuerpo NI-105.4E4 humano se dirige a un único epítopo que comprende dos polipéptidos lineales, uno de los cuales se ubica en el dominio de unión a microtúbulos (R4) de tau que se enmascara en tau fisiológica asociada a microtúbulos.' Tau-12 (Covance, California, EUA) , HT7 , AT8, AT180 (Thermo Scientific, EUA) ; PHF1 (Lewis et ál . , Science 293 (2001) , 1487-1491) .

Figura 12 : Las placas ELISA se recubrieron con tau humano recombinante (hTau40, lug/ml) , PHFTau (1:100) y preparación de control (1:100), y se incubaron con la concentración indicada de NI-105.4A3. 4A3 se une a rTau con EC50 1.4 nM, a PHFTau con EC50 1.2 nM .

Figuras 13A-13C: Mapeo del epítopo de unión NI-105.4A3 en hTau40. (fig. 13A) Representación esquemática de los cuatro dominios hTau40 en superposición (dominio I (AA 1-158), dominio II (AA 136-258), dominio III (AA 235-373) y dominio IV (AA 355-441)) usados, (fig. 13B) NI-105.4A3 se une únicamente al dominio I de tau y al polipéptido hTau40 de longitud completa. (fig. 13C) El Western blot confirma la unión específica de NI-105.4A3 al dominio I de tau.

Figuras 14A-14C: Mapeo del epítopo NI-105.4A3 con tecnología PepSpot (JPT) (fig. 14A) y barrido de alanina (figs. 14B y 14C) .

Fig. 15: Unión de ch4E4 y variantes a tau recombinante (ELISA) .

Fig. 16: Niveles de IgG humano en el plasma de ratones tras la administración intraperitoneal de 30 mg/kg de anticuerpo anti-tau humano 4E4 o 4A3.

Fig. 17: Niveles de IgG humano en homogenato de cerebro de ratón tras la administración intraperitoneal de 30 mg/kg de anticuerpo anti-tau humano 4E4 o 4A3.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN I. Definiciones Las taupatías neurodegenerativas son un grupo diverso de trastornos neurodegenerativos que comparten una lesión patológica común que consiste en agregados intracelulares de filamentos anormales que se componen principalmente de tau patológicamente hiperfosforilado en neuronas y/o células gliales. Los rasgos clínicos de las taupatías son heterogéneos y se caracterizan por demencia y/o síndromes motores. La acumulación progresiva de inclusiones de tau filamentosas pueden causar degeneración neuronal y glial en combinación con otros depósitos como, por ej . , beta-amiloide en enfermedad de Alzheimer o como una única entidad patogénica tal como lo ilustran las mutaciones del gen tau que están asociadas con formas familiares de demencia frontotemporal y parkinsonismo vinculado al cromosoma 17 (FTDP-17) . Por lo tanto, es un objeto particular de la presente invención proporcionar métodos para tratar, diagnosticar o prevenir una taupatía neurodegenerativa tal como enfermedad de Alzheimer, esclerosis lateral amiotrófica/complej o parkinsonismo-demencia, demencia1 con granos argirófilos, angiopatía amiloide de tipo; inglés, angiopatía amiloide cerebral, degeneración corticobasal , enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, demencia pugilística, ovillos neurofibrilares difusos con calcificaciones, síndrome de Down, demencia frontotemporal , demencia frontotemporal con parkinsonismo vinculado al cromosoma 17, degeneración lobar frontotemporal , enfermedad de Gerstmann-Stráussler-Scheinker, enfermedad de Hallervorden-Spatz , miositis por cuerpos de inclusión, atrofia multisistémica , distrofia miotónica, enfermedad de Niemann-Pick tipo C, enfermedad de la motoneurona no de Guam con ovillos neurofibrilares , enfermedad de Pick, parkinsonismo postencefalítico, angiopatía amiloide cerebral causada por priones, gliosis subcortical progresiva, parálisis supranuclear progresiva, panencefalitis esclerosante subaguda, demencia de solo ovillo, demencia multiinfarto y apoplejía isquémica; véase para una revisión, por ej . , Lee et ál . , Annu. Rev. Neurosci. 24 (2001) , 1121-1159 en cuya Tabla 1 cataloga los únicos miembros de taupatías o Sergeant et ál . , Bioch. Biophy. Acta 1739 (2005), 179-97, con una lista en la Figura 2 en esta.

En esta descripción, el término "tau" se usa de manera intercambiable para referirse específicamente a la forma natural de monómero de tau. El término "tau" se usa también para identificar generalmente otros confórmeros de tau, por ejemplo, oligómeros o agregados de tau. El término "tau" también se usa para referirse de forma colectiva a todos los tipos y formas de tau. Debido al empalme 6 alternativo, las isoformas de tau están presentes en el cerebro humano. Las secuencias de proteínas para estas isoformas son: Isoforma Fetal-tau de 352aa MAEPRQEFEVMEDHAGTYGLGDRKDQGGYTMHQDQEGDTDAGLKAEEAGIGDTPS LEDEAAGHVTQARMVSKSKDGTGSDDKKAKGADGKTKIATPRGAAPPGQKGQANATRIPAK TPPAPKTPPSSGEPPKSGDRSGYSSPGSPGTPGSRSRTPSLPTPPTREPK VAWRTPPKS PSSAKSRLQTAPVPMPDLKWKSKIGSTENLMQPGGGKVQIVYKP-VDLSKVTSKCGSLGN IHHKPGGGQVEVKSEKLDFKDRVQSKIGSLDNITHVPGGGNKKIETHKLTFRENAKAKTDH GAEIVYKSPWSGDTSPRHLSNVSSTGSIDMVDSPQLATLADEVSASLAKQGL (SEQ ID NO: 1) Isoforma Tau-B de 381aa MAEPRQEFEVMEDHAGTYGLGDRKDQGGYTMHQDQEGDTDAGLKES LQTPTEDG SEEPGSETSDAKSTPTAEAEEAGIGDTPSLEDEAAGHVTQARMVSKSKDGTGSDDKKAKGA DGKTKIATPRGAAPPGQKGQA ATRIPAKTPPAPKTPPSSGEPPKSGDRSGYSSPGSPGTP GSRSRTPSLPTPPTREPKKVAWRTPPKSPSSAKSRLQTAPVPMPDLK VKSKIGSTENLK HQPGGGKVQIVYKPVDLSKVTSKCGSLGNIHHKPGGGQVEVKSEKLDFKDRVQSKIGSLDN ITHVPGGGNKKIETHKLTFRENAKAKTDHGAEIVYKSPWSGDTSPRHLSNVSSTGSIDMV DSPQLATLADEVSASLAKQGL (SEQ ID NO : 2 ) Isoforraa Tau-C de 410aa MAEPRQEFEVMEDHAGTYGLGDRKDQGGYTMHQDQEGDTDAGLKESPLQTPTEDG SEEPGSETSDAKSTPTAEDVTAPLVDEGAPGKQAAAQPHTEIPEGTTAEEAGIGDTPSLED EAAGHVTQARMVSKSKDGTGSDDKKAKGADGKTKIATPRGAAPPGQKGQA ATRIPAKTPP APKTPPSSGEPPKSGDRSGYSSPGSPGTPGSRSRTPSLPTPPTREPKKVAWRTPPKSPSS AKSRLQTAPVPMPDLK VKSKIGSTENLKHQPGGGKVQIVYKPVDLSKVTSKCGSLGNIHH KPGGGQVEVKSEKLDFKDRVQSKIGSLDNITHVPGGGNKKIETH LTFRENAKAKTDHGAE IVYKSPWSGDTSPRHLS VSSTGSIDMVDSPQLATLADEVSASLAKQGL (SEQ ID NO : 3 ) Isoforma Tau-D de 383aa MAEPRQEFEV EDHAGTYGLGDRKDQGGYTMHQDQEGDTDAGLKAEEAGIGDTPS LEDEAAGHVTQARMVSKSKDGTGSDDKKAKGADGKTKIATPRGAAPPGQKGQA ATRIPAK TPPAPKTPPSSGEPPKSGDRSGYSSPGSPGTPGSRSRTPSLPTPPTREPKKVAWRTPPKS PSSAKSRLQTAPVPMPDLKNVKSKIGSTENLKHQPGGGKVQIINKKLDLSNVQSKCGSKDN I HVPGGGSVQIVYKPVDLSKVTSKCGSLGNIHHKPGGGQVEVKSEKLDFKDRVQSKIGSL DNITHVPGGGNKKIETHKLTFRENAKAKTDHGAEIVYKSPWSGDTSPRHLSNVSSTGSID MVDSPQLATLADEVSASLAKQGL (SEQ ID NO : 4 ) Isoforma Tau-E de 412aa MAEPRQEFEVMEDHAGTYGLGDRKDQGGYTMHQDQEGDTDAGLKESPLQTPTEDG SEEPGSETSDAKSTPTAEAEEAGIGDTPSLEDEAAGHVTQAR VSKSKDGTGSDDKKAKGA DGKTKIATPRGAAPPGQKGQANATRIPAKTPPAPKTPPSSGEPPKSGDRSGYSSPGSPGTP GSRSRTPSLPTPPTREPKKVAWRTPPKSPSSAKSRLQTAPVPMPDLK VKSKIGSTENLK HQPGGGKVQIINKKLDLS VQSKCGSKDNIKHVPGGGSVQIVYKPVDLSKVTSKCGSLGNI HHKPGGGQVEVKSEKLDFKDRVQSKIGSLDNITHVPGGGNKKIETHKLTFRENAKAKTDHG AEIVYKSPWSGDTSPRHLSNVSSTGSIDMVDSPQLATLADEVSASLAKQGL (SEQ ID NO : 5 ) Isoforma Tau-F de 441aa MAEPRQEFEVMEDHAGTYGLGDRKDQGGYTMHQDQEGDTDAGLKESPLQ PTEDG SEEPGSETSDAKSTPTAEDVTAPLVDEGAPGKQAAAQPHTEIPEGTTAEEAGIGDTPSLED EAAGHVTQARMVSKSKDGTGSDDKKAKGADGKTKIAT RGAAPPGQKGQANATRIPAKTPP APKTPPSSGEPPKSGDRSGYSSPGSPGTPGSRSRTPSLPTPPTREPKKVAWRTPPKSPSS AKSRLQTAPVPMPDLK VKSKIGSTENLKHQPGGGKVQIINKKLDLSNVQSKCGSKDNIKH VPGGGSVQIVYKPVDLSKVTSKCGSLGNIHHKPGGGQVEVKSEKLDFKDRVQSKIGSLDNI THVPGGGNKKIETHKLTFRENAKAKTDHGAEIVYKSPWSGDTSPRHLSNVSSTGSIDMVD SPQLATLADEVSASLAKQGL (SEQ ID NO:6) La secuencia de aminoácidos de "tipo natural" se representa por la isoforma Tau-F de 441aa (SEQ ID NO: 6) también denominado l,hTau40"í "TauF" , "Tau-4" o "tau de longitud completa" . La secuencia de aminoácidos de tau puede recuperarse de la bibliografía y bases de datos pertinentes; véase Goedert et ál . , Proc . Nati. Acad. Sci. USA 85 (1988), 4051-4055, Goedert et ál . , EMBO J. 8(1989), 393-399, Goedert et ál., EMBO J. 9 (1990), 4225-4230 y GenBank UniProtKB/swissprot : locus TAU_HUMAN, números de acceso P10636-2 (Fetal-tau) y P10636-4 a -8 (Isoformas B a F) .

Otro rasgo sorprendente de la proteína tau es la fosforilación, que ocurre a alrededor de 30 de 79 potenciales sitios de fosforilación de serina (Ser) y treonina (Thr) . La tau es altamente fosforilada durante el desarrollo cerebral. El grado de fosforilación disminuye en la adultez. Algunos de los sitios de fosforilación se ubican dentro de los dominios de unión a microtúbulos de tau, y se demostró que un aumento de la fosforilación de tau regula negativamente la unión de los microtúbulos. Por ejemplo, Ser262 and Ser396, que están ubicadas o adyacentes a motivos de unión a microtúbulos, se hiperfosforilan en las proteínas tau de los filamentos helicoidales apareados anormales (PHF, por sus siglas en inglés) , un componente principal de los ovillos neurofibrilares (NFT, por sus siglas en inglés) en el cerebro de pacientes con AD. Los PHF son agregados filamentosos de proteínas tau que están anormalmente hiperfosforilados y pueden teñirse con anticuerpos anti-tau específicos y detectarse por microscopía óptica. Esto es válido para los llamados filamentos de tau rectos. Los PHF forman cintas que consisten en dos filamentos enrollados entre sí con una periodicidad de alrededor de 80nm. Estos rasgos patológicos se denominan comúnmente "tau-patología" , "tauopatología" o "patología relacionada con tau" . Para una descripción más detallada de rasgos neuropatológicos de taupatías sírvase referirse a Lee et ál . , Annu. Rev. Neurosci . 24 (2001), 1121-1159 y Gótz, Brain. Res. Rev. 35 (2001), 266-286, cuyos contenidos de la descripción se incorporan a la presente mediante esta referencia. La proteína tau fisiológica estabiliza los microtúbulos en las neuronas. La fosforilación patológica provoca localización y agregación anormal de tau, que causa una desestabilización de los microtúbulos y deterioro del transporte celular. La tau agregada es neurotóxica in vitro (Khlistunova et ál., J. Biol. Chem. 281 (2006) , 1205-1214) . Las especies neurotóxicas exactas permanecen poco claras, sin embargo, al igual que el o los mecanismos mediante los cuales provocan la muerte' celular. Los agregados de tau pueden observarse como el componente principal de ovillos neurofibrilares (NFT, por sus siglas en inglés) en varias taupatías, tales como enfermedad de Alzheimer (AD) , demencias frontotemporales , parálisis supranuclear, enfermedad de Pick, enfermedad con granos argirófilos (AGD) , degeneración corticobasal , FTDP-17, enfermedad de Parkinson, demencia pugilística (Revisado en Gendron y Petrucelli, Mol. Neurodegene . 4:13 (2009)). Aparte de estas observaciones, surgen pruebas de que la muerte neuronal mediada por tau puede ocurrir incluso en ausencia de formación de ovillos. Las especies fosfo-tau solubles están presentes en CSF (Aluise et al., Biochim. Biophys . Acta. 1782 (2008) , 549-558) . Los agregados de tau pueden transmitir un estado mal plegado desde fuera hacia dentro de una célula y transferir entre células co-cultivadas (Frost et ál . , J. Biol. Chem. 284 (2009), 12845-12852).

Además de la relación con las taupatías neurodegenerativas, las alteraciones observadas en la fosforilación de tau durante y luego de la isquemia/reperfusión sugieren que tau tiene una función crucial en el daño neuronal y patofisiología clínica de trastornos neurovasculares tales como apoplejía isquémica (Zheng et ál . , J. Cell. Biochem. 109 (2010), 26-29).

Los anticuerpos humanos anti-tau descritos en la presente se unen específicamente a la tau y epítopos de esta y a varias conformaciones de tau y epítopos de esta. Por ejemplo, en la presente se describen anticuerpos que se unen específicamente a la tau, tau en su longitud completa, isoformas de tau patológicamente modificadas y agregados de tau. Tal como se usa en la presente, las referencias a un anticuerpo que "se une específicamente", "se une selectivamente" o "se une preferentemente" a tau se refieren a un anticuerpo que no se une a otras proteínas no relacionadas. En un ejemplo, un anticuerpo tau descrito en la presente puede unirse a tau o un epítopo de esta y no mostrar ningún antecedente de unión por encima de alrededor de 1.5 veces para otras proteínas. Un anticuerpo que "se une específicamente" o "se une selectivamente" a un conformador de tau se refiere a un anticuerpo que no se une a todas las conformaciones de tau, es decir, no se une a al menos otro conformador de tau. Por ejemplo, en la presente se describen anticuerpos que pueden unirse preferentemente a formas agregadas de tau en tejido con AD. Debido a que los anticuerpos humanos anti-tau de la presente invención se aislaron de un conjunto de sujetos humanos sanos que exhibían una respuesta inmunitaria específica de tau, los anticuerpos tau de la presente invención también pueden llamarse "autoanticuerpos humanos" para enfatizar que aquellos anticuerpos eran realmente expresados por los sujetos y no se han aislado de, por ejemplo, una biblioteca de fagos que expresa inmunoglobuli a humana, lo que hasta i ahora representaba un método común para intentar proporcionar anticuerpos similares a humanos.

Cabe destacar que el término "un" o "una" entidad se refiere a uno o más de esa entidad; por ejemplo, se debe entender que "un anticuerpo" representa uno o más anticuerpos. Como tal, los términos "un" (o "una"), "uno o más" y "al menos uno" se pueden usar de manera intercambiable en la presente.

Tal como se usa en la presente, el término "polipéptido" pretende abarcar un único "polipéptido" así como varios "polipéptidos" y se refiere a una molécula compuesta de monómeros (aminoácidos) unidos de forma lineal por enlaces de amida (también conocidos como enlaces peptídicos) . El término "polipéptido" se refiere a cualquier cadena o cadenas de dos o más aminoácidos, y no se refiere a una longitud específica del producto. Por lo tanto, los péptidos, dipéptidos, tripéptidos, oligopéptidos , "proteína", "cadena de aminoácidos" o cualquier otro término usado para referirse a una cadena o cadenas de dos o más aminoácidos se incluyen dentro de la definición de "polipéptido" y el término "polipéptido" se puede usar en vez de, o de forma intercambiable con, cualquiera de estos términos.

El término "polipéptido" también pretende hacer referencia a los productos de modificaciones post-expresión del polipéptido, que incluyen, de modo no taxativo, glicosilación, acetilación, fosforilación, amidación, derivatización por grupos protectores/de bloqueo conocidos, escisión proteolítica o modificación por aminoácidos de origen no natural. Un polipéptido puede derivar de una fuente biológica natural o ser producido mediante tecnología de recombinación, pero no es necesariamente traducido a partir de una secuencia de ácido nucleico designada. Puede generarse de cualquier forma, incluso mediante síntesis química.

Un polipéptido de la invención puede tener un tamaño de alrededor de 3 o más, 5 o más, 10 o más, 20 o más, 25 o más, 50 o más, 75 o más, 100 o más, 200 o más, 500 o más, 1,000 o más o 2,000 o más aminoácidos. Los polipéptidos pueden tener una estructura tridimensional definida, aunque no tengan necesariamente la estructura. Los polipéptidos con una estructura tridimensional definida se denominan plegados, y los polipéptidos que no poseen una estructura tridimensional definida sino que adoptan una gran cantidad de diferentes conformaciones, se denominan no plegados. Tal como se usa en la presente, el término glicoproteína se refiere a una proteína acoplada a al menos un resto carbohidrato que está unido a la proteína mediante una cadena lateral que contiene oxígeno o nitrógeno de un residuo de aminoácidos, por ej . , un residuo de serina o un residuo de asparagina.

Por polipéptido "aislado" o fragmento, variante o derivado de este se pretende un polipéptido que no está en su medio natural. No se requiere ningún nivel de purificación particular. Por ejemplo, un polipéptido aislado puede quitarse de su ambiente original o natural. Los polipéptidos y proteínas producidos de forma recombinante expresados en células hospedadoras se consideran aislados a efectos de la invención, al igual que los polipéptidos naturales o recombinantes que han sido separados, fraccionados ó parcial o sustancialmente purificados por cualquier técnica adecuada.

También se incluyen como polipéptidos de la presente invención fragmentos, derivados, análogos o variantes de los polipéptidos anteriores, y cualquier combinación de estos. Los términos "fragmento", "variante", "derivado" y "análogo" cuando se refieren a anticuerpos o polipéptidos de anticuerpos de la presente invención incluyen cualquier polipéptido que retiene al menos algunas de las propiedades de unión al antígeno de la molécula de unión, anticuerpo o polipéptido naturales correspondientes. Los fragmentos de polipéptidos de la presente invención incluyen fragmentos proteolíticos, así como también fragmentos de eliminación, además de fragmentos de anticuerpo específicos descritos en otro punto de la presente. Las variantes de anticuerpos y polipéptidos de anticuerpo de la presente invención incluyen fragmentos tal como se describe anteriormente y también polipéptidos con secuencias de aminoácidos alteradas ' debido a sustituciones, eliminaciones o inserciones de aminoácidos. Las variantes pueden ser de origen natural o no natural . Las variantes de origen no natural pueden producirse usando técnicas de mutagénesis conocidas en loa técnica. Las variantes de polipéptidos pueden comprender sustituciones, eliminaciones o adiciones conservativas o no conservativas de aminoácidos. Los derivados de moléculas de unión específicas de tau, por ej . , anticuerpos y polipéptidos de anticuerpo de la presente invención, son polipéptidos que fueron alterados de modo de exhibir rasgos adicionales que no se encuentran en el polipéptido natural. Los ejemplos incluyen proteínas de fusión. Las variantes de polipéptidos también pueden denominarse en la presente "análogos de polipéptidos" . Tal como se usa en la presente un "derivado" de una molécula de unión o fragmento de esta, un anticuerpo o un polipéptido de anticuerpo se refiere a un polipéptido en cuestión que tiene uno o más residuos químicamente derivados por reacción de un grupo lateral funcional. Los "derivados" también incluyen esos péptidos que contienen uno o más derivados de aminoácidos de origen natural de los veinte aminoácidos estándar. Por ejemplo, prolina se puede sustituir por 4-hidroxiprolina, lisina se puede sustituir por 5-hidroxilisina, histidina se puede sustituir por 3-metilhistidina, serina se puede sustituir por homoserina y lisina se puede sustituir por ornitina.

El término "polinucleótido" pretende abarcar un único ácido nucleico así como varios ácidos nucleicos y se refiere a una molécula o construcción de ácido nucleico aisladas, por ej . , ARN mensajero (ARNm) o ADN plásmido (ADNp) . Un polinucleótido puede comprender un enlace de fosfodiéster convencional o un enlace no convencional (por ej . , un enlace de amida, tal como el encontrado en ácidos nucleicos peptídicos (PNA, por sus siglas en inglés) ) . El término "ácido nucleico" se refiere a uno o más segmentos de ácido nucleico, por ej . , fragmentos de ADN o ARN, presentes en un polinucleótido . Ácido nucleico o polinucleótido "aislado" es una molécula de ácido nucleico, ADN o ARN, que se quitó de su ambiente natural. Por ejemplo, un polinucleótido recombinante que codifica un anticuerpo contenido en un vector se considera aislado a los efectos de la presente invención. Ejemplos adicionales de un polinucleótido aislado incluyen polinucleótidos recombinantes mantenidos en células hospedadoras heterólogas o polinucleótidos purificados (parcial o sustancialmente) en solución. Las moléculas de ARN aisladas incluyen transcripciones de ARN in vivo o in vitro de polinucleótidos de la presente invención. Los polinucleótidos o ácidos nucleicos aislados conforme a la presente invención también incluyen tales moléculas producidas sintéticamente. Adicionalmente , un polinucleótido o un ácido nucleico puede ser o puede incluir un elemento de regulación tal como un promotor, sitio de unión a ribosomas o un terminador de la transcripción.

Tal como se usa en la presente, una "región de codificación" es una porción del ácido nucleico que consiste en codones traducidos en aminoácidos. Pese a que un "codón de terminación" (TAG, TGA o TAA) no se traduce en un aminoácido, puede considerarse parte de una región de codificación, pero cualesquiera secuencias flanqueantes, por ejemplo promotores, sitios de unión a ribosoma, terminadores de transcripción, intrones y similares, no son parte de una región de codificación. Dos o más regiones de codificación de la presente invención pueden estar presentes en una construcción de un solo polinucleótido, por ej . , en un vector simple, o en construcciones de polinucleótido separadas, por ej . , en vectores separados (diferentes). Además, cualquier vector puede contener una única región de codificación, o puede comprender dos o más regiones de codificación, por ej . , un vector simple puede codificar separadamente una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina y una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina. Además, un vector, un polinucleótido o un ácido nucleico de la invención puede codificar regiones de codificación heterólogas, ya se fusionadas o no fusionadas a un ácido nucleico que codifica una molécula de unión, un anticuerpo, un f agmento, variante o derivado de este. Las regiones de codificación heterólogas incluyen de modo no taxativo elementos o motivos especializados, tales como un péptido de señal secretora o un dominio funcional heterólogo.

En determinadas modalidades, el polinucleótido o ácido nucleico es ADN. En el caso de ADN, un polinucleótido que comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido normalmente puede incluir un promotor y/o otros elementos de control de transcripción o traducción asociados operativamente con una o más regiones de codificación. Una asociación operable es cuando una región de codificación para un producto del gen, por ej . , un polipéptido, está asociada con una o más secuencias reguladoras de modo de colocar la expresión del producto del gen bajo la influencia o control de la o las secuencias reguladoras. Dos fragmentos de ADN (tal como una región de codificación de polipéptido y un promotor asociado con esta) están "asociados de forma operativa" o "unidos de forma operativa" si la inducción de la función promotora provoca la transcripción del ARNm que codifica el producto del gen deseado y si la naturaleza de la unión entre los dos fragmentos de ADN no interfiere con la capacidad de las secuencias reguladoras de expresión para dirigir la expresión del producto del gen o interfiere con la capacidad de la plantilla de ADN de transcribirse. Por lo tanto, una región promotora estaría asociada de forma operativa con un ácido nucleico que codifica un polipéptido si el promotor fuera capaz de efectuar la transcripción de ese ácido nucleico. El promotor puede ser un promotor específico de células que dirige la transcripción sustancial del ADN únicamente en células predeterminadas. Otros elementos de control de la transcripción además del promotor, por ejemplo potenciadores , operadores, represores y señales de terminación de la transcripción, pueden estar asociados de forma operativa con el polinucleótido para dirigir la transcripción específica de células. En la presente se describen promotores adecuados y otras regiones de control de la transcripción.

Una variedad de regiones de control de la transcripción es conocida por los expertos en la técnica. Estas incluyen, de modo no taxativo, regiones de control de transcripción que funcionan en células vertebradas, tales como, de modo no taxativo, segmentos promotores y potenciadores de citomegalovirus (el promotor temprano inmediato, junto con el intrón-A) , virus simio 40 (el promotor temprano) y retrovirus (tales como virus Rous sarcoma) . Otras regiones de control de transcripción incluyen aquellas derivadas de genes vertebrados tales como actina, proteína de choque térmico, hormona de crecimiento bovino y beta-globina de conejo, así como otras secuencias capaces de controlar la expresión génica en células eucariotas . Otras regiones de control de transcripción adecuadas incluyen promotores y potenciadores específicos de tejido así como promotores inducibles por linfocina (por ej . , promotores inducibles por interferones o interleucinas ) .

De manera similar, una variedad de elementos de control de traducción son conocidos por los expertos en la técnica. Estos incluyen, de modo no taxativo, sitios de unión a ribosoma, codones de iniciación y terminación de traducción y elementos que provienen de picornavirus (particularmente un sitio de entrada a ribosoma interno, o IRES, también llamado secuencia CITE) .

En otras modalidades, un polinucleótido de la presente invención es ARN, por ejemplo, en forma de ARN mensajero (ARNm) .

Las regiones de codificación de polinucleótidos y ácidos nucleicos de la presente invención pueden estar asociadas con regiones de codificación adicionales que codifican péptidos secretores o de señal, que dirigen la secreción de un polipéptido codificado por un polinucleótido de la presente invención. De acuerdo con la hipótesis de las señales, las proteínas secretadas por células de mamífero tienen un péptido de señal o secuencia líder secretora que se escinde de la proteína madura una vez que se inició la exportación de la cadena de proteínas de crecimiento a lo largo del retículo endoplasmático rugoso. Los expertos en la técnica son conscientes de que los polipéptidos secretados por células vertebradas generalmente tienen un péptido de señal fusionado al N-terminal del polipéptido, que se escinde del polipéptido completo o "de longitud completa" para producir un forma secretada o "madura" del polipéptido. En algunas modalidades, se usa el péptido de señal natural, por ej . , un péptido de señal de cadena pesada o de cadena ligera de inmunoglobulina, o un derivado funcional de esa secuencia que retiene la capacidad de dirigir la secreción del polipéptido que se asocia operativamente con el mismo. De manera alternativa, se puede usar un péptido de señal heteróloga de mamífero o un derivado funcional de este. Por ejemplo, la secuencia líder de tipo natural puede estar sustituida por la secuencia líder de activador de plasminógeno de tejido humano (TPA, por sus siglas en inglés) o ß-glucuronidasa de ratón.

A menos que se especifique lo contrario, los términos "trastorno" y "enfermedad" se usan de manera intercambiable en la presente .

Una "molécula de unión" tal como se usa en el contexto de la presente invención se refiere principalmente a anticuerpos y fragmentos de estos, pero también pueden hacer referencia a otras moléculas que no son de anticuerpo que se unen a tau que incluyen, de modo no taxativo, hormonas, receptores, ligandos, moléculas de complejo de histocompatibilidad principal (MHC, por sus siglas en inglés) , chaperonas tales como proteínas de choqué térmico (HSP, por sus siglas en inglés) así como moléculas de adhesión célula-célula tales como membranas de la caderina, integrina, lectina tipo C y superfamilias de inmunoglobulina (Ig) . Por lo tanto, para más claridad y sin limitar el alcance de la presente invención, la mayoría de las siguientes modalidades se describen con respecto a anticuerpos y moléculas tipo anticuerpo que representan una modalidad específica de moléculas de unión para el desarrollo de agentes terapéuticos y de diagnóstico.

Los términos "anticuerpo" e " inmunoglobulina" se utilizan de manera intercambiable en la presente. Un anticuerpo o inmunoglobulina es una molécula de unión a tau que comprende al menos el dominio variable de una cadena pesada y normalmente comprende al menos los dominios variables de una cadena pesada y una cadena ligera. Las estructuras de inmunoglobulina básicas en sistemas vertebrados se comprenden relativamente bien; véase, por ej . , Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a ed. 1988) .

Como se discutirá en más detalle a continuación, el término "inmunoglobulina" comprende varias clases amplias de polipéptidos que se pueden distinguir bioquímicamente. Los expertos en la técnica reconocerán que las cadenas pesadas se clasifican como gamma, mu, alfa, delta o epsilon, (?, µ, a, d, e) con algunas subclases entre ellos (por ej . , ?1-?4) . La naturaleza de esta cadena determina la "clase" del anticuerpo como IgG, IgM, IgA IgG o IgE, respectivamente. Las subclases de inmunoglobulina (isotipos) por ej . , IgGl , IgG2 , IgG3 , IgG4 , IgAl, etc. están bien caracterizadas y se sabe que otorgan especialización funcional. Las versiones modificadas de cada una de estas clases e isotipos son fácilmente distinguibles para el experto en la técnica en vista de la presente descripción y, por consiguiente, se encuentran dentro del alcance de la presente invención. Todas las clases de inmunoglobulina se encuentran claramente dentro del alcance de la presente invención. La siguiente descripción se dirigirá en general a la clase IgG de moléculas de inmunoglobulina. Con respecto a IgG, una molécula estándar de inmunoglobulina comprende dos polipéptidos idénticos de cadena ligera de peso molecular de aproximadamente 23,000 daltons y dos polipéptidos idénticos de cadena pesada de peso molecular 53,000-70,000. Las cuatro cadenas están típicamente unidas por enlaces de disulfuro en una configuración "Y" donde las cadenas ligeras agrupan las cadenas pesadas comenzando en la boca de la "Y" y continuando a través de la región variable.

Las cadenas ligeras se clasifican como kappa o lambda (?, ?) . Cada clase de cadena pesada puede estar unida con una cadena ligera kappa o lambda. En general, las cadenas ligera y pesada están unidas covalentemente entre sí y las porciones de "cola" de las dos cadenas pesadas están unidas ; entre sí por enlaces covalentes de disulfuro o enlaces no covalentes donde las inmunoglobulinas se generan por hibridomas, células B o células hospedadoras modificadas genéticamente. En la cadena pesada, las secuencias de aminoácidos van desde el N-terminal en los extremos bifurcados de la configuración Y hacia el terminal -C al final de cada cadena.

Tanto la cadena ligera como la pesada se dividen en regiones de homología estructural y funcional . Los términos "constante" y "variable" se utilizan funcionalmente . En este aspecto, se reconocerá que los dominios variables de las porciones de cadenas ligeras (VL, por sus siglas en inglés) y pesadas (VH, por sus siglas en inglés) determinan el reconocimiento y la especificidad del antígeno. Por el contrario, los dominios constantes de la cadena ligera (CL) y la cadena pesada (CH1, CH2 o CH3) brindan propiedades biológicas importantes, tales como secreción, movilidad transplacentaria, unión al receptor de Fe, unión al complemento y similares. Como convención, la numeración de los dominios de región constante aumenta a medida que se alejan más del sitio de unión al antígeno o del extremo amino del anticuerpo. La porción del N-terminal es una región variable y la porción del terminal-C es una región constante; los dominios CH3 y CL en realidad comprenden el terminal-Carboxi de la cadena pesada y ligera, respectivamente.

Como se indicó anteriormente, la región variable permite al anticuerpo reconocer selectivamente y . unir específicamente epítopos en antígenos. Es decir, el domino VL y el dominio VH, o subconjunto de las regiones determinantes de complementariedad (CDR) de un anticuerpo se combinan para formar la región variable que define un sitio de unión al antígeno tridimensional. Esta estructura de anticuerpo cuaternaria forma el sitio de unión al antígeno presente al final de cada brazo de la Y. Más específicamente, el sitio de unión al antígeno se define por tres CDR en cada una de las cadenas VH y VL. Cualquier fragmento de inmunoglobulina o anticuerpo que contiene suficiente estructura como para unirse específicamente a tau se denomina en la presente de manera intercambiable "fragmento de anticuerpo" o "fragmento inmunoespecífico" .

En anticuerpos de origen natural, un anticuerpo comprende seis regiones hipervariables , muchas veces denominadas "regiones determinantes de complementariedad" o "CDR" presentes en cada dominio de unión al antígeno, que son secuencias cortas, no contiguas de aminoácidos que se colocan específicamente para formar el dominio de unión al antígeno a medida que el anticuerpo asume su configuración tridimensional en un ambiente acuoso. Las "CDR" están flanqueadas por cuatro regiones "flanqueantes" o "FR" relativamente conservadas que muestran menos variabilidad intermolecular. Las regiones flanqueantes adoptan en gran medida conformación ß-lámina y las CDR forman bucles que se conectan y, en algunos casos, forman parte de la estructura ß- lámina. De este modo, las regiones flanqueantes actúan para formar una estructura que proporciona el posicionamiento de las CDR en una orientación correcta mediante interacciones no covalentes de intercadena. El dominio de unión al antígeno formado por las CDR posicionadas define una superficie complementaria al epítopo en el antígeno inmunorreactivo . Esta superficie complementaria promueve la unión no covalente del anticuerpo a su epítopo cognado. Los aminoácidos que comprenden las CDR y las regiones flanqueantes, respectivamente, se pueden identificar fácilmente por un experto en la técnica para cualquier región variable de cadena pesada o ligera dada, debido a que se han definido con precisión (véase, "Sequences of Proteins of Immunological Interest," Kabat, E., et ál . , U.S. Department of Health and Human Services, (1983) y Chothia and Lesk, J. Mol. Biol . , 196 (1987), 901-917, que se incorporan a la presente mediante esta referencia en sus totalidades.

En el caso en que se utilicen y/o acepten en la técnica dos o más definiciones de un término, la definición del término como se utiliza en la presente pretende incluir todos els significados a menos que se establezca explícitamente lo contrario. Un ejemplo específico es el uso del término "región determinante de complementariedad" ("CDR") para describir los sitios que combinan antígenos no contiguos encontrados dentro de la región variable de tanto los polipéptidos de cadenas pesadas como ligeras. Esta región particular es descrita en Kabat et ál., Departamento de Salud y Servicios Sociales de los Estados Unidos, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983) y en Chothia and Lesk, J. Mol. Biol., 196 (1987), 901-917, que se incorporan en la presente mediante esta referencia, donde las definiciones incluyen superposición o subconj untos de residuos de aminoácidos al compararlos entre sí. Sin embargo, la aplicación de la definición para referirse a una CDR de un anticuerpo o las variantes de esta pretende estar dentro del alcance del término, tal como se definió y utilizó en la presente. Los residuos de aminoácidos adecuados que abarcan las CDR, como se definieron en cada una de las referencias citadas anteriormente, se establecen a continuación en la Tabla 1 como una comparación. Las cantidades exactas de residuos que abarcan una CDR en particular variarán dependiendo de la secuencia y el tamaño de la CDR. Los expertos en la técnica pueden determinar de manera rutinaria cuáles residuos comprenden una región hipervariable o CDR particular del subtipo de anticuerpo IgG humano debido a la secuencia de aminoácidos de la región variable del anticuerpo.

Tabla 1: Definiciones1 de CDR ¦"¦La numeración de las definiciones de todas las CDR de la Tabla 1 está de acuerdo con las convenciones de numeración establecidas en Kabat et ál . (véase a continuación).

Kabat et ál . definieron también un sistema de numeración para secuencias de dominio variable que se aplica a cualquier anticuerpo. Un experto en la técnica puede asignar sin ambigüedad este sistema de "numeración de Kabat" a cualquier secuencia de dominio variable, sin depender de ninguna información experimental más allá de la secuencia en sí misma. Como se utiliza en la presente, la "numeración de Kabat" se refiere al sistema de numeración establecido por Kabat et ál . , U.S. Dept . of Health and Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest" (1983). A menos que se especifique lo contrario, las referencias a la numeración de posiciones de residuos de aminoácidos específicas en un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno, variante o derivado de este de la presente invención están de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat, que sin embargo es teórico y puede no aplicar de la misma forma cada anticuerpo de la presente invención. Por ejemplo, según la posición de la primera CDR, las siguientes CDR pueden cambiar de dirección.

Los anticuerpos o fragmentos de unión al ntígeno, fragmentos inmunoespecíficos , variantes o derivados de estos de la invención incluyen, de modo no taxativo, anticuerpos policlonales , monoclonales , multiespecíficos , humanos, humanizados, primatizados , murinizados o quiméricos, anticuerpos de cadena simple, fragmentos de unión al epítopo, por ej . , Fab, Fab 1 y F(ab')2i Fd, Fv, Fvs de cadena simple (scFv) , anticuerpos de cadena simple, Fvs enlazados a disulfuro (sdFv) , fragmentos que comprenden un dominio VL o VH/ fragmentos producidos mediante una biblioteca de expresión de Fab y anticuerpos anti-idiotípicos (anti-Id) (que incluyen, por ej . anticuerpos anti-Id a anticuerpos descritos en la presente) . Las moléculas scFv se conocen en la técnica y se describen, por ej . , en la patente estadounidense N° 5,892,019. Las moléculas de anticuerpo o inmunoglobulina de la invención pueden ser de cualquier tipo (por ej . , IgG, igE, IgM, igD, IgA, e IgY) , clase (por ej . , IgGl, IgG2, IgG3 , IgG4 , IgAl e IgA2) o subclase de molécula de inmunoglobulina.

En una modalidad, el anticuerpo de la ; presente invención no es IgM o un derivado de este con una estructura pentavalente. En particular, en aplicaciones específicas de la presente invención, especialmente uso terapéutico, las IgM son menos útiles que las IgG y otros anticuerpos bivalentes o molécula de unión correspondientes ya que las IgM debido a su estructura pentavalente y falta de maduración de la afinidad, muestran frecuentemente reactividades cruzadas no específicas y muy baja afinidad.

En una modalidad particular, el anticuerpo de la presente invención no es un anticuerpo policlonal, es decir, consiste sustancialmente en una especie de anticuerpo particular en vez de ser una mezcla obtenida de una muestra de i munoglobulina en plasma.

Los fragmentos de anticuerpo, incluyendo anticuerpos de cadena simple, pueden comprender la o las regiones variables solas o en combinación con la totalidad o una porción de lo siguiente: región bisagra, dominios CH1, CH2 y CH3. También se incluyen en la invención los fragmentos de unión a tau que también comprenden cualquier combinación de una o más regiones variables con una región bisagra, dominios CH1 , CH2 y CH3. Los anticuerpos o fragmentos inmunoespecíficos de estos de la presente invención pueden ser de cualquier origen animal incluyendo aves y mamíferos. En una modalidad, los anticuerpos son anticuerpos de humano, murino, burro, conejo, cabra, cobayos, camello, llama, caballo o pollo. En otra modalidad, la región variable puede tener un origen condrictio (por ej . , de tiburones) .

En un aspecto, el anticuerpo de la presente invención es un anticuerpo monoclonal humano aislado de un humano. Opcionalmente, la región flanqueante del anticuerpo humano se alinea y adopta de acuerdo con las secuencias de región variable de línea germinal humana pertinentes de la base de datos; véase, por ejemplo, Vbase (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/) patrocinada por el C Centre for Protein Engineering (Cambridge, Reino Unido) . Por ejemplo, los aminoácidos que se considera se desvían potencialmente de la verdadera secuencia de línea germinal podrían deberse a las secuencias de cebadores de PCR incorporadas durante el proceso de clonación. En comparación con anticuerpos similares a humanos generados artificialmente tales como fragmentos de anticuerpo de cadena simple (scFv) de una biblioteca de anticuerpos de expresión en fagos o ratones xenogeneicos , el anticuerpo monoclonal humano de la presente invención se caracteriza por (i) obtenerse usando la respuesta inmunitaria humana en vez de la de sustitutos de animal, es decir, el anticuerpo se genera en respuesta a tau natural en su conformación relevante en el cuerpo humano, (ii) haber protegido al individuo o es al menos significativo por la presencia de tau, y (iii) debido a que el anticuerpo es de origen humano, los riesgos de reactividad cruzada en comparación con autoantígenos se minimizan. Por lo tanto, de acuerdo con la presente invención los términos "anticuerpo monoclonal humano", "autoanticuerpo monoclonal humano", "anticuerpo humano" y similares se usan para denotar una molécula de unión a tau que es de origen humano, es decir, que se aisló de una célula humana tal como una célula B o hibridoma de esta o el ADNc de donde se clonó directamente de ARNm de una célula humana, por ejemplo una célula B de memoria humana. Un anticuerpo humano es aun "humano" incluso si las sustituciones de aminoácidos se llevan a cabo en el anticuerpo, por ej . , para mejorar las características de unión .

Los anticuerpos que derivan de bibliotecas de inmunoglobulina humana o de animales transgénicos para una o más inmunoglobulinas humanas o que no expresan inmunoglobulinas endógenas, tal como se describe más adelante y, por ejemplo en la patente estadounidense N° 5,939,598 por Kucherlapati et ál . , denotan anticuerpos similares a humanos para distinguirlos de los anticuerpos verdaderamente humanos de la presente invención.

Por ejemplo, la equiparación de las cadenas ligera y pesada de anticuerpos similares a humanos tales como anticuerpos sintéticos y semisintéticos típicamente aislados de expresión en fagos no reflejan necesariamente la equiparación original como ocurrió en la célula B humana original. Por consiguiente, los fragmentos Fab y scFv obtenidos de bibliotecas de expresión recombinante tal como se usa normalmente en la técnica previa pueden considerarse artificial con todos los posibles efectos asociados en inmunogenicidad y estabilidad.

Por el contrario, la presente invención proporciona anticuerpos aislados y madurados por afinidad de sujetos humanos seleccionados, que se caracterizan por su utilidad terapéutica y su tolerancia en el hombre.

Tal como se usa en la presente, el término "anticuerpo murinizado" o " inmunoglobulina murinizada" se refiere a un anticuerpo que comprende una o más CDR de un anticuerpo humano de la presente invención; y una región flanqueante humana que contiene sustituciones y/o eliminaciones y/o inserciones de aminoácidos que están basadas en una secuencia de anticuerpo de ratón. La inmunoglobulina humana que proporciona las CDR se denomina "original" o "aceptora" y el anticuerpo de ratón que proporciona los cambios flanqueantes se denomina "donante" . Las regiones constantes no necesitan estar presentes, pero si lo están, en general son sustancialmente idénticas a regiones constantes de anticuerpo de ratón, es decir, al menos alrededor de 85-90%, alrededor de 95%, alrededor de 96%, alrededor de 97%, alrededor de 98%, alrededor de 99% o más idénticas. Por lo tanto, en algunas modalidades, una inmunoglobulina de cadena pesada o ligera humana murinizada de longitud completa contiene una región constante de ratón, CDR humanas y una región flanqueante humana que tiene la cantidad de sustituciones de aminoácidos "murinizantes" . Típicamente, un "anticuerpo murinizado" es un anticuerpo que comprende una cadena ligera variable murinizada y/o una cadena pesada variable murinizada. Por ejemplo, un anticuerpo murinizado no abarcaría un anticuerpo quimérico típico, por ej . , debido a que la región variable entera de un anticuerpo quimérico no es de ratón. Un anticuerpo modificado que se "murinizó" mediante el proceso de "murinización" se une al mismo antígeno como el anticuerpo original que proporciona las CDR y es generalmente menos inmunogénico en ratones, en comparación con el anticuerpo original .

Tal como se usa en la presente, el término "porción de cadena pesada" incluye secuencias de aminoácidos derivadas de una cadena pesada de inmunoglobulina . Un polipéptido que comprende una porción de cadena pesada comprende al menos uno de: dominio CH1, un dominio bisagra (por ej . , región bisagra superior, media y/o inferior), un dominio CH2 , un dominio CH3 o una variante o fragmento de estos. Por ejemplo, un polipéptido de unión para usar en la invención puede comprender una cadena de polipéptidos que comprende un dominio CH1 ; una cadena de polipéptidos que comprende un dominio CH1 , al menos una porción de un dominio bisagra y un dominio CH2 ; una cadena de polipéptido que comprende un dominio CH1 y un dominio CH3 ; una cadena de polipéptidos que comprende un dominio CH1, al menos una porción de un dominio bisagra y un dominio CH3 o una cadena de polipéptidos que comprende un dominio CH1, al menos una porción de un dominio bisagra, un dominio CH2 y un dominio CH3. En otra modalidad, un polipéptido de la invención comprende una cadena de polipéptidos que comprende un dominio CH3. Adémás, un polipéptido de unión para usar en la invención puede carecer de al menos una porción de un dominio CH2 (por ej . , todo o parte de un dominio CH2) . Tal como se estableció anteriormente, un experto en la técnica comprenderá que estos dominios (por ej . , las porciones de cadena pesada) se pueden modificar de modo que varíen en la secuencia de aminoácidos con respecto a la molécula de inmunoglobulina de origen natural .

En determinadas modalidades, los fragmentos de unión al antígeno, variantes o derivados de estos descritos en la presente, las porciones de cadena pesada de una cadena de polipéptidos de un multímero son idénticas a las de una segunda cadena de polipéptidos del multímero. De manera alternativa, los monómeros que contienen porciones de cadena pesada de la invención no son idénticos. Por ejemplo, cada monómero puede comprender un sitio de unión diana diferente, por lo que forma, por ejemplo, un anticuerpo o diacuerpo biespecífico .

En otra modalidad, los anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno, variantes o derivados de estos descritos en la presente están compuestos por una cadena de polipéptidos simple tal como scFv y deben expresarse de modo intracelular ( intracuerpos) para potenciales aplicaciones de diagnóstico o terapéuticas in vivo.

Las porciones de cadena pesada de un polipéptido de unión para usar en los métodos de tratamiento y diagnóstico descritos en la presente pueden derivar de diferentes moléculas de inmunoglobulina . Por ejemplo, una porción de cadena pesada de un polipéptido puede comprender un dominio CH1 derivado de una molécula IgGl y una región bisagra derivada de una molécula IgG3. En otro ejemplo, una porción de cadena pesada puede comprender una región bisagra derivada, en parte, de una molécula IgGl y, en parte, de una molécula IgG3. En otro ejemplo, una porción de cadena pesada puede comprender una región bisagra quimérica derivada, en parte, de una molécula IgGl y, en parte, de una molécula IgG4.

Tal como se usa en la presente, el término "porción de cadena ligera" incluye secuencias de aminoácidos derivadas de una cadena ligera de inmunoglobulina . En una modalidad, la porción de cadena ligera comprende al menos uno de un dominio CL o VL.

Se considera que el tamaño mínimo de un epítopo de péptido o polipéptido para un anticuerpo debe ser de alrededor de cuatro a cinco aminoácidos. Los epítopos de péptido o polipéptido pueden contener al menos siete, al menos nueve o entre al menos alrededor de 15 y alrededor de 30 aminoácidos. Debido a que una CDR puede reconocer un péptido o polipéptido antigénico en su forma terciaria, los aminoácidos que comprenden un epítopo no necesitan ser contiguos, y en algunos casos, pueden incluso no estar en la misma cadena de péptidos. En la presente invención, un epítopo de péptido o polipéptido reconocido por anticuerpos de la presente invención contiene una secuencia de al menos 4 , al menos 5 , al menos 6 , al menos 7 , al menos 8 , al menos 9, al menos 10, al menos 15, al menos 20, al menos 25 o entre alrededor de 5 y alrededor de 30, alrededor de 10 a alrededor de 30 o alrededor de 15 a alrededor de 30 aminoácidos contiguos o no contiguos de tau.

Por "unir específicamente" o "reconocer específicamente", usados de manera intercambiable en la presente, se entiende generalmente que una molécula de unión, por ej . , un anticuerpo, se une a un epítopo mediante su dominio de unión al antígeno, y que la unión implica algo de complementariedad entre el dominio de unión al antígeno y el epítopo. De acuerdo con esta definición, se dice que un anticuerpo se "une específicamente" a un epítopo cuando se une -a ese epítopo, mediante su dominio de unión al antígeno más fácilmente de lo que se uniría a un epítopo aleatorio, no relacionado. Un experto en la técnica entiende que un anticuerpo puede unirse específicamente a o reconocer específicamente un polipéptido aislado que comprende o consiste en residuos de aminoácidos correspondientes a una porción lineal de un epítopo no contiguo. El término "especificidad" se usa en la presente para calificar la afinidad relativa mediante la cual determinado anticuerpo se une a . determinado epítopo. Se puede considerar, por ejemplo, que el anticuerpo "A" tiene una mayor especificidad para un epítopo dado que el anticuerpo "B" o se puede decir que el anticuerpo "A" se une al epítopo "C" con una mayor especificidad que la que tiene por el epítopo "D" relacionado .

Siempre que esté presente, el término "características de unión inmunológicas" u otras características de unión de un anticuerpo con un antígeno, en todas sus formas gramaticales, se refiere a la especificidad, afinidad, reactividad cruzada y otras características de unión de un anticuerpo .

"Unir preferentemente" significa que la molécula de unión, por ej . , un anticuerpo, se une específicamente a un epítopo más fácilmente de lo que se uniría a un epítopo relacionado, similar, homólogo o análogo. Por lo tanto, un anticuerpo que "se une preferentemente" a un epítopo dado tendría más probabilidades de unirse a el epítopo que a un epítopo relacionado, a pesar de que el anticuerpo pueda tener una reacción cruzada con el epítopo relacionado.

A modo de ejemplo no taxativo, se puede considerar que una molécula de unión, por ej . , un anticuerpo se une a un primer epítopo preferentemente si une el primer epítopo con una constante de disociación (KD) que es menor que la KD del anticuerpo para el segundo epítopo. En otro ejemplo no taxativo, se puede considerar que un anticuerpo se une a un primer antígeno preferentemente si une el primer epítopo con una afinidad que es al menos un orden de magnitud menor que la KD del anticuerpo para el segundo epítopo. En otro ejemplo no taxativo, se puede considerar que un anticuerpo se une a un primer epítopo preferentemente si une el primer epítopo con una afinidad que es al menos dos órdenes de magnitud menor que la KD del anticuerpo para el segundo epítopo.

En otro ejemplo no taxativo, se puede considerar que una molécula de unión, por ej . , un anticuerpo se une a un primer epítopo preferentemente si une al primer epítopo con una tasa de disociación (k(off)) que es menor que la k(off) del anticuerpo para el segundo epítopo. En otro ejemplo no taxativo, se puede considerar que un anticuerpo se une a un primer epítopo preferentemente si une el primer epítopo con una afinidad que es al menos un orden de magnitud menor que la k(off) del anticuerpo para el segundo epítopo. En otro ejemplo no taxativo, se puede considerar que un anticuerpo se une a un primer epítopo preferentemente si une él primer epítopo con una afinidad que es al menos dos órdenes de magnitud menor que la k(off) del anticuerpo para el segundo epítopo.

Se dice que una molécula de unión, por ej . , un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno, variante o derivado de este se une a un tau o un fragmento o variante de esta con una tasa de disociación (k(off)) menor o igual a 5 x 10"2 seg"1, 10"2 seg"1, 5 x 10"3 seg"1 o 10"3 seg"1. En una modalidad, se dice que un anticuerpo de la invención se une a tau o un fragmento o variante de esta con una tasa de disociación (k(off)) menor o igual a 5 X 10"4 seg"1, 10~4 seg"1, 5 x 10"5 seg"1 o 10"5 seg"1, 5 x 10"6 seg"1, 10"6 seg"1, 5 x 10"7 seg"1 o 10"7 seg"1.

Puede decirse que una molécula de unión, por ej . , un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno, variante o derivado descrito en la presente se une a tau o a un fragmento o variante de esta con una tasa de asociación (k(on)) mayor o igual a 103 M"1 seg"1, 5 x 103 M"1 seg"1, 104 M"1 seg"1 o 5 x 104 "1 seg"1. En una modalidad, puede decirse que un anticuerpo de la invención se une a tau o a un fragmento o variante de esta con una tasa de asociación (k(on)) mayor o igual a 105 M"1 seg"1, 5 x 105 M"1 seg"1, 106 M"1 seg"1 o 5 x 106 M"1 seg"1 o 107 M"1 seg"1.

Se dice que una molécula de unión, por ej . , un anticuerpo inhibe de forma competitiva la unión de un anticuerpo de referencia a un epítopo dado si se une preferentemente a el epítopo al punto que bloquea, en cierto grado, la unión del anticuerpo de referencia con el epítopo. La inhibición competitiva puede determinarse mediante cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo, ensayos de competición ELISA. Puede decirse que un anticuerpo inhibe de forma competitiva la unión del anticuerpo de referencia con un epítopo dado en al menos 90%, al menos 80%, al menos 70%, al menos 60% o al menos 50%. Un experto entiende que la unión de un anticuerpo a su epítopo puede también inhibirse de forma competitiva mediante una molécula de unión que no sea un anticuerpo. Por ejemplo, la unión específica de un anticuerpo descrito en la presente a tau, por ej . , hTau40, puede inhibirse de forma competitiva mediante microtúbulos .

Tal como se usa en la presente, el término "afinidad" se refiere a una medida de la fuerza de la unión a un epítopo individual con la CDR de una molécula de unión, por ej . , una molécula de inmunoglobulina; véase, por ej . , Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2da ed. (1988) en páginas 27-28. Tal como se usa en la presente, el término "avidez" se refiere a la estabilidad general del complejo entre una población de inmunoglobulinas y un antígeno, es decir, la fuerza de combinación funcional de una mezcla de inmunoglobulina con el antígeno; véase, por ej . , Harlow en páginas 29-34. La avidez se relaciona tanto a la afinidad de las moléculas de inmunoglobulina individuales en la población con epítopos específicos, y también las valencias de las inmunoglobulinas y el antígeno. Por ejemplo, la interacción entre un anticuerpo monoclonal bivalente y un antígeno con una estructura de epítopo de alta repetición, tal como un polímero, sería una de alta avidez. La afinidad o avidez de un anticuerpo para un antígeno puede determinarse de forma experimental usando cualquier método adecuado; véase, por ejemplo, Berzofsky et ál . , "Antibody-Antigen Interactions " In Fundamental Immunology, Paul, . E., Ed., Raven Press Nueva York, N Y (1984) , Kuby, Janis Immunology, W. H. Freeman and Company Nueva York, N Y (1992) , y métodos descritos en la presente. Las técnicas generales para calcular la afinidad de un anticuerpo para un antígeno incluyen ELISA, RIA y resonancia de plasmones superficiales. La afinidad calculada de una interacción de anticuerpo-antígeno particular puede variar si se calcula en diferentes condiciones, por ej . , concentración de sal, pH. Por ende, los cálculos de afinidad y otros parámetros de unión al antígeno, por ej . , KD, IC50, se realizan preferentemente con soluciones estandarizadas de anticuerpo y antígeno y un amortiguador estandarizado.

Las moléculas de unión, por ej . , anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno, variantes o derivados de estos de la invención pueden también describirse o especificarse en términos de su reactividad cruzada. Tal como se usa en la presente, el término "reactividad cruzada" se refiere a la capacidad de un anticuerpo, específico para un antígeno, de reaccionar con un segundo antígeno; un cálculo de la relación entre dos sustancias antigénicas diferentes. Por lo tanto, un anticuerpo tiene reactividad cruzada si se i une a un epítopo distinto del que indujo su formación. El epítopo con reactividad cruzada generalmente contiene muchos de los rasgos estructurales de complementariedad como el epítopo inductor, y en algunos casos, puede , realmente ajustarse mejor que el original.

Por ejemplo, determinados anticuerpos tiene algún grado de reactividad cruzada, ya que se unen a epítopos relacionados pero no idénticos, por ej . , epítopos con al menos 95%, al menos 90%, al menos 85%, al menos 80%, al menos 75%, al menos 70%, al menos 65%, al menos 60%, al menos 55% y al menos 50% de identidad (según los cálculos usando métodos conocidos en la técnica y descritos en la presente) para un epítopo de referencia. Puede decirse que un anticuerpo tiene poca o ninguna reactividad cruzada si no se une a epítopos con menos de 95%, menos de 90%, menos de 85%, menos de 80%, menos de 75%, menos de 70%, menos de 65%, menos de 60%, menos de 55% y menos de 50% de identidad (según los cálculos usando métodos conocidos en la técnica y descritos en la presente) para un epítopo de referencia. Un anticuerpo puede considerarse "altamente específico" para determinado epítopo si no se une a ningún otro análogo, ortólogo u homólogo de ese epítopo.

Las moléculas de unión, por ej . , anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno, variantes o derivados de estos de la invención pueden también describirse o especificarse en términos de su afinidad de unión a tau. En una modalidad, las afinidades de unión incluyen aquellas con una constante de disociación o Kd menor a 5 x 10"2 M, 10"2 M, 5 x 10~3 M, 10"3 M, 5 X 10~4 M, 1CT4 M, 5 x 10"5 M, 10"5 M, 5 X 10"6 M, 10"6 M, 5 x 10"7 M, 10"7 M, 5 x 10~8 M, 10"8 M, 5 x 10"9 M, 10~9 M, 5 x 10"10 M, 10"10 M, 5 x 10"11 M, 10"11 M, 5 X 10"12 M, 10"12 , 5 x 10"13 M, 10-13 , 5 x 10"14 M, 10"14 M, 5 x 10"15 M o 10"15 M.

Tal como se indica previamente, se conocen¦ bien las estructuras de subunidades y la configuración tridimensional de las regiones constantes de las diversas clases de inmunoglobulina . Tal como se usa en la presente, el término "dominio VH" incluye el dominio variable de extremo amino terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina y el término "dominio CH1" incluye el primer (extremo más amino) dominio de región constante de una cadena pesada de inmunoglobulina. El dominio CH1 es adyacente al dominio VH y es extremo amino a la región bisagra de una molécula de cadena pesada de inmunoglobulina .

Tal como se usa en la presente, el término "dominio CH2 " incluye la porción de una molécula de cadena pesada que se extiende, por ej . , de alrededor del residuo 244 al residuo 360 de un anticuerpo usando esquemas de numeración convencionales (residuos 244 a 360, sistema de numeración Kabat; y residuos 231-340, sistema de numeración de la EU; véase Kabat EA et ál . op. cit) . El dominio CH2 es único en el sentido que no está íntimamente emparejado con otro dominio. En cambio, dos cadenas de carbohidratos ramificados enlazadas por N se interponen entre los dos dominios CH2 de una molécula de IgG natural intacta. También está bien documentado que el dominio CH3 se extiende del dominio CH2 al terminal-C de la molécula IgG y comprende aproximadamente 108 residuos .

Tal como se usa en la presente, el término "región bisagra" incluye la porción de una molécula de cadena pesada que une el dominio CH1 al dominio CH2. Esta región bisagra comprende aproximadamente 25 residuos y es flexible, permitiendo de este modo que las dos regiones de unión al antígeno del N-terminal terminal se muevan independientemente. Las regiones bisagra pueden subdividirse en tres dominios distintos: dominios bisagra superior, medio e inferior; véase Roux et ál . , J. Immunol . 161 (1998), 4083.

Tal como se usa en la presente, el término "enlace disulfuro" incluye el enlace covalente formado entre dos átomos de azufre. El aminoácido cisteína comprende un grupo tiol que puede formar un enlace o puente disulfuro con un segundo grupo tiol. En la mayoría de las moléculas IgG de origen natural, las regiones CH1 y CL se unen por un enlace de disulfuro y las dos cadenas pesadas se unen por dos enlaces de disulfuro en las posiciones correspondientes a 239 y 242 utilizando el sistema de numeración de Kabat (posición 226 o 229, sistema de numeración de la EU) .

Tal como se usa en la presente, los términos "enlazado", "fusionado" o "fusión" se usan de manera intercambiable. Estos términos se refieren a la unión de dos elementos o componentes adicionales, por cualquier medio incluyendo conjugación química o medios recombinantes . Una "fusión dentro de la estructura" se refiere a la unión de dos o más marcos de lectura abierta de polinucleótido (ORF) para formar un ORF más largo continuo, de manera de mantener el marco de lectura traduccional correcto de los ORF originales. De este modo, una proteína de fusión recombinante es una proteína simple que contiene dos o más segmentos que corresponden a polipéptidos codificados por los ORF originales (cuyos segmentos no se enlazan normalmente en la naturaleza) . Aunque el marco de lectura se hace de este modo continuo a través de los segmentos fusionados, los segmentos se pueden separar física o espacialmente , por ejemplo, mediante una secuencia de enlace dentro del marco. Por ejemplo, los polinucleótidos que codifican las CDR de una región variable de inmunoglobulina pueden fusionarse, dentro del marco, pero estar separados por un polinucleótido que codifica al menos una región variable de inmunoglobulina o regiones CDR adicionales, siempre que las CDR "fusionadas" se cotraduzcan como parte de un polipéptido continuo.

El término "expresión", como se utiliza en la presente, se refiere a un proceso por el cual un gen produce un bioquímico, por ejemplo, un ARN o polipéptido. El proceso incluye cualquier manifestación de la presencia funcional del gen dentro de la célula que incluye, de modo no taxativo, inactivación génica así como también expresión transitoria y expresión estable. Incluye, de modo no taxativo, la transcripción del gen a un ARN mensajero (ARNm) , ARN de transferencia (ARNt) , ARN horquillado corto (ARNhc) , ARN interferente pequeño (ARNip) o cualquier otro producto de ARN y la traducción de el ARNm en polipéptido/s . Si el producto final deseado es un bioquímico, la expresión incluye la creación de ese bioquímico y de cualquier precursor. La expresión de un gen produce un "producto del gen" . Tal como se usa en la presente, un producto del gen puede ser un ácido nucleico, por ej . , un ARN mensajera producido por la transcripción de un gen o un polipéptido que se traduce de una transcripción. Los productos producto del gen descritos en la presente incluyen, además, ácidos nucleicos con modificaciones posteriores a la transcripción, por ejemplo, poliadenilación, o polipéptidos con modificaciones posteriores a la traducción, por ejemplo, metilación, glucosilación, adición de lípidos, asociación con otras subunidades de proteína, escisión proteolítica y similares.

Tal como se usa en la presente el término "muestra" se refiere a cualquier material biológico obtenido de un sujeto o paciente. En un aspecto, una muestra puede comprender sangre, fluido cerebroespinal ("CSF") u orina. ??· otros aspectos, una muestra puede comprender sangre completa, plasma, células B enriquecidas de muestras de sangre y células cultivadas (por ej . células B de un sujeto) . Una muestra puede también incluir una biopsia o muestra tisular que incluye tejido neural . En aun otros aspectos, una muestra puede comprender células completas y/o un lisado de las células. Las muestras de sangre se pueden recoger mediante métodos bien conocidos en la técnica. En un aspecto, el sedimento puede resuspenderse al agitarse en un vórtex a 4°C en 200 µ? de amortiguador (Tris 20 mM, pH. 7.5, Nonidet al 0.5%, EDTA 1 mM, PMSF 1 mM, NaCl 0.1M, Inhibidor de proteasa sigma IX e Inhibidores de fosfatasa sigma IX 1 y 2) . La suspensión puede mantenerse en hielo durante 20 minutos con agitación en un vórtex intermitente. Tras girar a 15,000 x g durante 5 minutos a alrededor de 4°C, las alícuotas de sobrenadante pueden almacenarse a alrededor de -70°C.

Tal como se usa en la presente, los términos "tratar" o "tratamiento" se refieren tanto a tratamiento terapéutico como a medidas preventivas y profilácticas, en las que el objetivo es prevenir o enlentecer (reducir) un cambio fisiológico o trastorno no deseado, tal como el desarrollo del Parkinsonismo. Los resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyen, de modo no taxativo, alivio de síntomas, reducción del alcance de enfermedad, estabilización del estado de la enfermedad (es decir, que no empeora) , demora o enlentecimiento del avance de la enfermedad, mejora o mitigación del estado de enfermedad y remisión (ya sea parcial o total), ya sea detectable o no detectable. "Tratamiento" también puede significar prolongar la supervivencia según se compara con la supervivencia esperada en caso de no recibir tratamiento. Las personas que necesitan tratamiento incluyen aquellas que ya padecen la afección o el trastorno, así como aquellas propensas a padecer la afección o el trastorno o aquellas en las que se quiere evitar la manifestación de la afección o trastorno.

"Sujeto", "individuo", "animal", "paciente" o "mamífero" quiere decir todo sujeto, en particular un sujeto mamífero, por ej . , un paciente humano, para el cual; se. desea el diagnóstico, el pronóstico o la terapia.

II. Anticuerpos La presente invención generalmente se refiere a anticuerpos anti-tau humanos y fragmentos de unión al antígeno de estos. En una modalidad, un anticuerpo de la presente invención demuestra las características de unión inmunológica y/o propiedades biológicas tal como se resume para los anticuerpos ilustrados en los Ejemplos. De acuerdo con la presente invención los anticuerpos mon clonales humanos específicos para tau se clonaron de un conjunto de sujetos humanos sanos.

En el transcurso de los experimentos realizados de acuerdo con la presente invención los intentos iniciales no lograron clonar anticuerpos específicos de tau pero casi siempre resultaron en clones falso-positivos. Para evitar este problema, los anticuerpos en medio condicionado de cultivos de células B de memoria humanas se analizaron en paralelo para unirse a la proteína tau recombinante , PHFTau extraído de un cerebro con AD, extractos de cerebro de control sano y albúmina de suero bovino (BSA, por sus siglas en inglés) . Solo los cultivos de células B que resultaron positivos a la PHFTau y/o tau recombinante pero no se sometió ningún extracto de cerebro de control o BSA a la clonación de anticuerpos .

Los intentos iniciales de aislar en anticuerpos específicos se enfocaron en grupos de sujetos humanos sanos con elevada actividad de unión en plasma a tau, lo que sugiere niveles elevados de plasma de anticuerpos tau circulantes. Inesperadamente, estos intentos no lograron producir células B de memoria humana específicas para tau y los anticuerpos descritos en la presente invención se aislaron de grupos de sujetos humanos sanos que no se preseleccionaron para alta reactividad en plasma de tau o tuvieron baja reactividad en plasma a tau.

Debido a este cálculo, pudieron aislarse diversos anticuerpos. Los anticuerpos seleccionados se analizaron adicionalmente para determinar la clase y subclase de cadena ligera. Los mensajes de anticuerpos relevantes seleccionados de cultivos de células B de memoria se transcriben luego mediante RT-PCR, clonan y combinan en vectores de expresión para producción recombinante ; véanse los Ejemplos adjuntos. La expresión recombinante de los anticuerpos humanos en células HEK293 o CHO y la posterior caracterización de sus especificidades de unión hacia tau de longitud completa (Fig. 2, Fig. 7 y Fig. 12), formas modificadas patológicamente de estos en transferencia Western (Fig. 3 y Fig. 8) y su unión distintiva a tau agregada patológicamente confirmó que se clonaron por primera vez los anticuerpos humanos que son altamente específicos para tau y reconocen diferentes las formas modificadas patológicamente de la proteína tau.

Por lo tanto, la presente invención se refiere generalmente a un anticuerpo anti-tau monoclonal humano aislado de origen natural y fragmentos de unión, derivados y variantes de estos. En una modalidad de la invención, el anticuerpo es capaz de unirse específicamente a tau recombinante de longitud completa y/o la forma agregada patológicamente y/o fosforilada (PHFTau) aislada del cerebro con AD en condiciones de desnaturalización en transferencia western véanse las Fig. 3 y Fig. 8.

En una modalidad, la presente invención se refiere a un anticuerpo anti-tau, o un fragmento de unión al antígeno, variantes o derivados de este, donde el anticuerpo se une específicamente al mismo epítopo de tau como un anticuérpo de referencia que se selecciona del grupo que consiste en NI-105-4E4, NI-105-24B2 o NI-105.4A3. Además, los resultados preliminares de ensayos ELISA directos realizados con los ejemplos de anticuerpo NI-105-4E4 revelaron que NI-105-4E4 reconoce específicamente el terminal -C terminal de tau. Los ensayos adicionales realizados sugirieron que NI-105.4E4 reconoce un epítopo discontinuo que comprende dos secuencias lineales: una primera secuencia lineal dentro del dominio de unión a microtúbulos R4 y una segunda secuencia lineal dentro de la región entre los dominios R4 y C tal como se describen en la Figura 11. En una modalidad, un polipéptido lineal comprendido por un epítopo no continuo o un epítopo reconocido por un anticuerpo proporcionado por esta invención se ubica en el dominio de unión a microtúbulos de tau, que se enmascara en tau fisiológica asociada a microtúbulos. El mapeo de epítopos identificó una primera secuencia dentro del dominio de unión a microtúbulos de tau humana que incluye aa337-343 VEVKSEK (SEQ ID NO: 7) como un único polipéptido lineal comprendido por el epítopo reconocido por el anticuerpo NI-105.4E4 de esta invención. Los experimentos adicionales y la comparación con un anticuerpo tau mónoclonal de ratón AT180 comercialmente disponible confirmó que NI-105-4E4 reconoce específicamente el único epítopo de la SEQ ID NO: 7. De forma más ventajosa, el epítopo de la SEQ ID NO : 7 reconocido por el anticuerpo NI-105.4E4 de esta invención está 100% conservado en todas las 6 isoformas de tau presentes en el cerebro humano de las secuencias de aminoácidos representadas por la SEQ ID NO : 1 a 6 y en otras especies, tales como ratón y rata así como también proporciona una herramienta de búsqueda adicional en modelos animales respectivos con los anticuerpos de la presente invención. Experimentación adicional mostró que los residuos 3 y 6 del polipéptido de la SEQ ID NO: 7, que corresponden a los residuos V339 y E342 de la SEQ ID NO: 6, contribuyen a la unión de NI-105.4E4. El mapeo de epítopos identificó además una segunda secuencia (SEQ ID NO: 1) dentro del dominio de unión a microtúbulos de tau humana que incluye aa387-397 de la SEQ ID NO: 6 como un único polipéptido lineal comprendido por el epítopo reconocido por el anticuerpo NI-105.4E4 de esta invención. Los residuos 1, 5 y 9 de la SEQ ID NO: 41, que corresponden a los residuos D387, E391 y K395 de la SEQ ID NO: 6, contribuyen a la unión de NI-105.4E4.

En una modalidad, un anticuerpo descrito en la presente se une específicamente a tau en un epítopo que comprende los residuos de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7. En otra modalidad, un anticuerpo descrito en la presente sé une específicamente a tau en un epítopo que comprende los residuos de aminoácidos de la SEQ ID: 41. En una modalidad específica, un anticuerpo descrito en la presente se une específicamente a tau en un epítopo que comprende los residuos de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 41. En una modalidad adicional, un anticuerpo descrito en la presente se une específicamente a tau en un epítopo que comprende uno o más residuos de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste en los residuos V339, E342, D387, E391 y K395 de la SEQ ID NO : 6. El epítopo puede comprender cualquiera de uno, cualesquiera dos, cualesquiera tres, cualesquiera cuatro o todos los cinco residuos del grupo que consiste en los residuos V339, E342, D387, E391 y K395 de la SEQ ID NO : 6. En una modalidad específica, tau es hTau40.

En una modalidad, un anticuerpo descrito en la presente se une a tau en un epítopo que comprende el dominio de unión a microtúbulos de tau. En una modalidad específica, un anticuerpo descrito en la presente se une a tau en un epítopo que comprende los residuos de aminoácidos de la región R4 de tau tal como se describe en la Figura 11. En una modalidad, un anticuerpo descrito en la presente compite con microtúbulos por la unión específica a tau. En otra modalidad, un anticuerpo descrito en la presente tiene afinidad de unión a tau asociada a microtúbulos reducida en comparación con la afinidad de unión a anticuerpos a tau no asociado con microtúbulos . En una modalidad adicional, un anticuerpo descrito en la presente no se une o no se une sustancialmente a tau asociada a microtúbulos. En modalidades específicas, la proteína tau puede ser una proteína de tau natural o proteína tau recombinante . En una modalidad específica, tau es hTau40.

El mapeo de epítopos identificó además una secuencia (SEQ ID NO: 42) de tau humana que incluye aa35-49 de la SEQ ID NO: 6 como un único epítopo reconocido por el anticuerpo NI-105.4A3 de esta invención. Los residuos 6, 7 y 10 de la SEQ ID NO: 42, que corresponden a los residuos D40, A41 y K44 de la SEQ ID NO: 6, contribuyen a la unión de NI-105.4A3. En una modalidad, un anticuerpo descrito en la presente se une específicamente a tau en un epítopo que comprende los residuos de aminoácidos de la SEQ ID NO: 42. En una modalidad adicional, un anticuerpo descrito en la presente se une específicamente a tau en un epítopo que comprende uno o más residuos de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste en los residuos D40, A41 y K44 de la SEQ ID NO: 6. El epítopo puede comprender cualquiera de uno, cualesquiera dos o todos los tres residuos del grupo que consiste en los residuos D40, A41 y K44 de la SEQ ID NO: 6. En una modalidad específica, tau es hTau40.

Además, sin pretender limitarse por observaciones experimentales iniciales tal como lo demuestran los Ejemplos y se muestra en la Fig. 6, el anticuerpo anti-tau NI-105-4E4 monoclonal humano de la presente invención se caracteriza por unirse específicamente a la tau agregada patológicamente y por no reconocer sustancialmente a tau en la forma fisiológica en el te ido cerebral. En una modalidad, un anticuerpo anti-tau humano de la presente invención puede unirse específicamente a tau agregada patológicamente y no unirse sustancialmente a tau en la forma fisiológica en el tejido cerebral. Además, un anticuerpo anti-tau humano de la presente invención puede caracterizarse además por su capacidad de reconocer tau en la etapa pre-ovillo, en ovillos neurofibrilares (NFT) , hilos del neurópilo y/o neuritas distróficas en el cerebro. Por lo tanto, la presente invención proporciona un conjunto de anticuerpos tau humanos con especificidades de unión, que son por ende particularmente útiles a efectos de diagnóstico y terapéuticos .

En una modalidad, el anticuerpo de la presente invención exhibe las propiedades de unión del ejemplo de anticuerpo NI-105-4E4 tal como se describe en los Ejemplos. Además, o de manera alternativa, un anticuerpo anti-tau de la presente invención reconoce preferentemente tau agregada patológicamente en vez de formas fisiológicas, en particular al analizarse de acuerdo con el Ejemplo 4. Además, o de manera alternativa, un anticuerpo anti-tau de la presente invención se une a mutantes causantes de enfermedades de tau humana, en particular las descritas en el Ejemplo 4. En este contexto, las especificidades de unión pueden estar en el intervalo tal como se muestra para los ejemplos de anticuerpos NI-105.4E4, NI-1054A3 y NI-105.24B2 de la Fig. 2, Fig. 12 y Fig. 7, respectivamente, es decir, que tienen concentraciones eficaces de media máxima (EC50) de alrededor de 100 pM a 100 nM, o una EC50 de alrededor de 100 pM a ???? para tau de tipo natural. ' Por lo tanto, un anticuerpo anti-tau de la presente invención se une preferentemente a formas patológicas modificadas de tau en el cerebro, por ej . , agregados patológicos de tau ejemplificadas por tinción inmunohistoquímica descritas en el Ejemplo 4. En otra modalidad un anticuerpo anti-tau de la presente invención se une preferentemente a tau recombinante y formas modificadas patológicamente de tau ejemplificadas en el Ejemplo '2 por transferencia western.

La presente invención se dirige también a un anticuerpo, o un fragmento de unión al antígeno, variante o derivados de este, donde el anticuerpo comprende un dominio de unión al antígeno idéntico al del anticuerpo que se selecciona del grupo que consiste en NI-105-4E4, NI-105-24B2 y NI-105.4A3.

La presente invención ejemplifica además varias de las moléculas de unión, por ej . , anticuerpos y fragmentos de unión de este, que pueden caracterizarse por comprender en su región variable, por ej . , dominio de unión al menos una región determinante de complementariedad (CDR) de la región variable VH y/o VL que comprende cualquiera de las secuencias de aminoácidos descritas en la Fig. 1. Las secuencias de nucleótidos correspondientes que codifican las regiones variables descritas anteriormente se establecen en la Tabla 2 a continuación. Un ejemplo de conjunto de CDR de las secuencias de aminoácidos anteriores de la región VH y/o VL se describe en la Fig. 1. Sin embargo, tal como se describe a continuación, el experto en la técnica es consciente del hecho de que pueden usarse CDR además o de manera alternativa, que difieren en su secuencia de aminoácidos de las establecidas en la Fig. 1 por uno, dos, tres o incluso más aminoácidos en el caso de CDR2 y CDR3.

En una modalidad, un anticuerpo de la ' presente invención comprende al menos una CDR que comprende, o consiste en una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 23-25, 26-28, 29-31, 32-34, 35-37 y 38-40. En una modalidad, un anticuerpo de la presente invención comprende una, dos, tres, cuatro, cinco o seis CDR que comprenden, o consisten en una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 23-25, 26-28, 29-31, 32-34, 35-37 y 38-40. El anticuerpo puede comprender una región variable de cadena pesada que comprende una CDRl de VH de la SEQ ID NO: 23, 29 o 35; una CDR2 de VH de la SEQ ID NO: 24, 30 o 36; o una CDR3 de VH de la SEQ ID NO: 25, 31 o 37. El anticuerpo puede comprender una región variable de cadena ligera que comprende una CDRl de VL de la SEQ ID NO: 26, 32 o 38; una CDR2 de VL de la SEQ ID NO: 27, 33 o 39; o una CDR3 de VL de la SEQ ID NO: 28, 34 o 40. El anticuerpo puede comprender una región variable de cadena pesada que comprende una CDRl de VH de la SEQ ID NO: 23, 29 o 35; una CDR2 de VH de la SEQ ID NO: 24, 30 o 36; o una CDR3 de VH de la SEQ ID NO: 25, 31 o 37, y puede comprender adicionalmente una región variable de cadena ligera que comprende una CDRl de VL de la SEQ ID NO: 26, 32 o 38; una CDR2 de VL de la SEQ ID NO: 27, 33 o 39; o una CDR3 de VL de la SEQ ID NO: 28, 34 o 40.

En una modalidad, un anticuerpo de la presente invención puede comprender una región variable de cadena pesada que comprende una CDRl de VH de la SEQ ID NO: 23, 29 o 35; una CDR2 de VH de la SEQ ID NO: 24, 30 o 36; y una CDR3 de VH de la SEQ ID NO: 25, 31 o 37. En una modalidad, un anticuerpo de la presente invención puede comprender una región variable de cadena ligera que comprende una CDRl de VL de la SEQ ID NO: 26, 32 o 38; una CDR2 de VL de la SEQ ID NO: 27, 33 o 39; y una CDR3 de VL de la SEQ ID NO: 28, 34 o 40. El anticuerpo puede comprender adicionalmente una región variable de cadena pesada que comprende una CDRl de VH de la SEQ ID NO: 23, 29 o 35; una CDR2 de VH de la SEQ ID NO: 24, 30 o 36; y una CDR3 de VH de la SEQ ID NO: 25, 31 o 37, y puede comprender adicionalmente una región variable de cadena ligera que comprende una CDRl de VL de la SEQ ID NO: 26, 32 o 38; una CDR2 de VL de la SEQ ID NO: 27, 33 o 39; y una CDR3 de VL de la SEQ ID NO: 28, 34 o 40.

En una modalidad, un anticuerpo de la presente invención puede comprender una región variable de cadena pesada que comprende una CDRl de VH de la SEQ ID NO: 23; una CDR2 de VH de la SEQ ID NO: 24; una CDR3 de VH de la SEQ ID NO: 25. En una modalidad, un anticuerpo de la presente invención puede comprender una región variable de cadena pesada que comprende una CDRl de VH de la SEQ ID NO : 29; una CDR2 de VH de la SEQ ID NO: 30; una CDR3 de VH de la SEQ ID NO: 31. En una modalidad, un anticuerpo de la presente invención puede comprender una región variable de cadena pesada que comprende una CDRl de VH de la SEQ ID NO: 35; una CDR2 de VH de la SEQ ID NO: 36; una CDR3 de VH de la SEQ ID NO: 37.

En una modalidad, un anticuerpo de la presente invención puede comprender una región variable de cadena ligera que comprende una CDRl de VL de la SEQ ID NO: 26; una CDR2 de VL de la SEQ ID NO: 27; una CDR3 de VL de la SEQ ID NO: 28. En una modalidad, un anticuerpo de la .presente invención puede comprender una región variable de cadena ligera que comprende una CDRl de VL de la SEQ ID NO: 32; una CDR2 de VL de la SEQ ID NO: 33; una CDR3 de VL de la SEQ ID NO: 34. En una modalidad, un anticuerpo de la presente invención puede comprender una región variable de cadena ligera que comprende una CDRl de VL de la SEQ ID NO: 38; una CDR2 de VL de la SEQ ID NO: 39; una CDR3 de VL de la SEQ ID NO: 40.

En una modalidad, un anticuerpo de la presente invención puede comprender una región variable de cadena pesada que comprende una CDRl de VH de la SEQ ID NO: 23; una CDR2 de VH de la SEQ ID NO: 24; una CDR3 de VH de la SEQ ID NO: 25, y puede comprender adicionalmente una región variable de cadena ligera que comprende una CDRl de VL de la SEQ ID NO: 26; una CDR2 de VL de la SEQ ID NO: 27; una CDR3 de VL de la SEQ ID NO: 28.

En una modalidad, un anticuerpo de la presente invención puede comprender una región variable de cadena pesada que comprende una CDRl de VH de la SEQ ID NO: 29; una CDR2 de VH de la SEQ ID NO : 30; una CDR3 de VH de la SEQ ID NO: 31 y puede comprender adicionalmente una región variable de cadena ligera que comprende una CDRl de VL de la SEQ ID NO: 32; una CDR2 de VL de la SEQ ID NO: 33; una CDR3 de VL de la SEQ ID NO: 34.

En una modalidad, un anticuerpo de la presente invención puede comprender una región variable de cadena pesada que comprende una CDR1 de VH de la SEQ ID NO: 35; una CDR2 de VH de la SEQ ID NO: 36; una CDR3 de VH de la SEQ ID NO: 37 y puede comprender adicionalmente una región variable de cadena ligera que comprende una CDR1 de VL de la SEQ ID NO: 38; una CDR2 de VL de la SEQ ID NO : 39; una CDR3 de VL de la SEQ ID NO: 40.

En una modalidad, el anticuerpo de la presente invención es cualquiera de los anticuerpos que comprenden una secuencia de aminoácidos de la región VH y/o VL tal como se representa en la Fig 1. En una modalidad, el anticuerpo de la presente invención está caracterizado por la conservación del apareamiento cognado de la cadena pesada y ligera como se encontraba presente en la célula B humana.

En una modalidad, un anticuerpo de la presente invención comprende una región variable de cadena pesada (VH) que comprende, o consiste en una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 9, 13, 17 y 93. En una modalidad, un anticuerpo de la presente invención comprende una región variable de cadena ligera (VL) que comprende, o consiste en una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 11, 15 y 19. En una modalidad, un anticuerpo de la presente invención comprende una región variable de cadena pesada (VH) que comprende, o consiste en una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste en la SEQ ID NO : 9, 13, 17 and 93, y comprende adicionalmente una región variable de cadena ligera (VL) que comprende, o consiste en una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 11, 15 y 19. En una modalidad específica, el anticuerpo comprende una VH de la SEQ ID NO : 9 y una VL de la SEQ ID NO: 11; o una VH de la SEQ ID NO: 93 y una VL de la SEQ ID NO: 11; una VH de la SEQ ID NO: 13 y una VL de la SEQ ID NO: 15; o una VH de la SEQ ID NO: 17 y una VL de la SEQ ID NO: 19.

De manera alternativa, el anticuerpo de la presente invención es un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno, derivado o variante de este, que compite por la unión a tau, tal como, por ejemplo, hTau40, con al menos uno de los anticuerpos que tiene la región VH y/o VL tal como se representa en la Fig. 1. En una modalidad, un anticuerpo de la presente invención compite por la unión específica a hTau40 con NI-105-4E4, NI-105-24B2 o NI-105.4A3. Estos anticuerpos pueden ser humanos también, en particular para aplicaciones terapéuticas. De manera alternativa, el anticuerpo es murino, el anticuerpo humano murino quimérico y murinizado, que son particularmente útiles para métodos de diagnóstico y estudios en animales.

En una modalidad, el anticuerpo de la presente invención se proporciona mediante cultivos de células B simples u oligoclonales cultivadas y se analiza el sobrenadante del cultivo, que contiene anticuerpos producidos por las células B, para determinar la presencia y afinidad de los anticuerpos anti-tau en ellas. El proceso de análisis comprende los pasos de un ensayo de Inmunoreactividad sobre el Amiloide de Placas Tisulares (TAPIR) tal como se describe en la solicitud internacional WO2004/095031 , cuyo contenido se describe en la presente mediante esta referencia; análisis sobre sectores del cerebro para unión al PHFTau; análisis para determinar la unión de un péptido derivado de tal de la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO : 6 con grupos de fosfato en los aminoácidos Ser-202 y Thr-205; en el aminoácido Thr-231; y/o aminoácidos Ser-396 y Ser-404 de la secuencia; un análisis para determinar la unión del tal humano recombinante de la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 6 y aislamiento del anticuerpo para el cual se detecta la unión o la célula que produce el anticuerpo .

Tal como se mencionó anteriormente, debido a su generación tras una respuesta inmunitaria humana, el anticuerpo monoclonal humano de la presente invención reconocerá epítopos que son de importancia patológica particular y que pueden no ser accesibles o menos inmunogénicos en el caso de procesos de inmunización para la generación de, por ejemplo, anticuerpos monoclonales de ratón y exploración in vitro de bibliotecas de expresión en fago, respectivamente. Por consiguiente, es prudente estipular que el epítopo del anticuerpo anti-tau humano de la presente invención es único y no existe ningún otro anticuerpo que sea capaz de unirse al epítopo reconocido por el anticuerpo monoclonal humano de la presente invención; véase también la Fig. 11 que muestra el único epítopo de los anticuerpos NI-105.4E4 y NI-105.4A3. Por lo tanto, la presente invención también se extiende en general a anticuerpos anti-tau y moléculas de unión a tau que compiten con el anticuerpo monoclonal humano de la presente invención por la unión específica de unión a tau. La presente invención está dirigida más específicamente a un anticuerpo, o un fragmento de unión al antígeno, variante o derivados de este, donde el anticuerpo se une específicamente al mismo epítopo de tau como un anticuerpo de referencia que se selecciona del grupo que consiste en NI-105.4E4, NI-105.24B2 y NI-105.4A3.

La competencia entre anticuerpos se determina por un ensayo donde la inmunoglobulina que se está analizando inhibe la unión específica de un anticuerpo de referencia a un antígeno común, tal como tau. Se conocen varios tipos de ensayos de unión competitivos, por ejemplo: radioinmunoensayo directo o indirecto de fase sólida (RIA, por sus siglas en inglés) , inmunoensayo enzimático directo o indirecto de fase sólida (EIA, por sus siglas en inglés) , ensayo de competición sándwich (véase Stahli et ál . , Methods in Enzymology 9 (1983), 242-253; EIA de biotina-avidina directo de fase sólida (véase Kirkland et ál . , J. Immunol . 137 (1986),, 3614-3619 y Cheung et ál . , Virology 176 (1990), 546-552; ensayo etiquetado de fase sólida, ensayo intercalado etiquetado directo de fase sólida; véase Harlo and Lañe, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988); RIA etiquetado directo de fase sólida usando etiqueta I125; véase Morel et ál, Molec. Immunol. 25 (1988), 7-15 y Moldenhaüer et ál., Scand. J. Immunol. 32 (1990), 77-82. Típicamente, tal ensayo implica el uso de tau purificado o agregados de este unido a una superficie sólida o células que tienen cualquiera de estos, una inmunoglobulina de prueba no etiquetada y una inmunoglobulina de referencia etiquetada, esto es, el anticuerpo monoclonal humano de la presente invención. La inhibición competitiva se mide mediante la determinación de la cantidad de etiqueta unida a la superficie sólida o las células en presencia de la inmunoglobulina de prueba. Generalmente la inmunoglobulina de prueba está presente en exceso. En una modalidad, el ensayo de unión competitiva se realiza en condiciones tal como se describe para el ensayo ELISA en los Ejemplos adjuntos. Los anticuerpos identificados por el ensayo de competencia (anticuerpos competitivos) incluyen anticuerpos que se unen al mismo epítopo que el anticuerpo de referencia y anticuerpos que se unen a un epítopo adyacente lo suficientemente cercano al epítopo unido por el anticuerpo de referencia para que ocurra el impedimento estérico. Generalmente, cuando un anticuerpo está presente en exceso, inhibirá la unión específica de un anticuerpo de referencia a un antígeno común en al menos 50% o 75%. Por lo tanto, la presente invención se dirige adicionalmente a un anticuerpo, o un fragmento de unión al antígeno, variante o derivados de este, donde el anticuerpo inhibe de forma competitiva un anticuerpo de referencia que se selecciona del grupo que consiste en NI-105.4E4, NI-105.24B2 o NI-105.4A3 de la unión a tau.

En otra modalidad, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina (VH) , donde al menos una de las VH-CDR de la región variable de cadena pesada o al menos dos de las VH-CDR de la región variable de cadena pesada son al menos 80%; 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idénticas a las secuencias de aminoácido VH-CDR1, VH-CDR2 o VH-CDR3 de cadena pesada de referencia de los anticuerpos descritos en la presente. De manera alternativa, las regiones VH-CDR1, VH-CDR2 y VH-CDR3 de la VH son al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idénticas a las secuencias de aminoácido VH-CDR1, VH-CDR2 y VH-CDR3 de cadena pesada de referencia de los anticuerpos descritos en la presente. Por lo tanto, conforme a esta modalidad una región variable de cadena pesada de la invención tiene secuencias de. polipéptidos VH-CDR1, VH-CDR2 y VH-CDR3 relacionadas a los grupos que muestran en la Fig. 1.

Mientras la Fig. 1 muestra VH-CDR definidos por el sistema Kabat, otras definiciones de COR, por ej . , VH-CDR definidos por el sistema Chothia, también se incluyen en la presente invención, y se pueden identificar fácilmente por un experto en la técnica usando los datos presentados en la Fig. 1. En una modalidad, la secuencia de aminoácidos de la CDR1 de VH de referencia es la SEQ ID NO: 23, 29 o 35; la secuencia de aminoácidos de la CDR2 de VH de referencia es la SEQ ID NO: 24, 30 o 36; y la secuencia de aminoácidos de la CDR3 de VH de referencia es la SEQ ID NO: 25, 31 o 37.

En otra modalidad, la presente invención proporciona un polipéptido aislado que comprende, consiste esencialmente en o consiste en una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina (VH) donde las regiones VH-CDR1, VH-CDR2 y VH-CDR3 tienen secuencias de polipéptidos que son idénticas a los grupos VH-CDR1, VH-CDR2 y VH-CDR3 mostrados en la Fig.l. En una modalidad, la secuencia de aminoácidos de la CDR1 de VH es la SEQ ID NO: 23, 29 o 35; la secuencia de aminoácidos de la CDR2 de VH es la SEQ ID NO: 24, 30 o 36; y la secuencia de aminoácidos de la CDR3 de VH es la SEQ ID NO: 25, 31 o 37.

En otra modalidad, la presente invención proporciona un polipéptido aislado que comprende, consiste esencialmente en o consiste en una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina (VH) donde las regiones VH-CDR1, VH-CDR2 y VH-CDR3 tienen secuencias de polipéptidos que son idénticas a los grupos VH-CDR1, VH-CDR2 y VH-CDR3 mostrados en la Fig.l, salvo por uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez sustituciones de aminoácidos en cualquiera de las VH-CDR. En determinadas modalidades, las sustituciones de aminoácidos son conservadoras. En una modalidad, la secuencia de aminoácidos de la CDR1 de VH es la SEQ ID NO: 23, 29 o 35; la secuencia de aminoácidos de la CDR2 de VH es la SEQ ID NO: 24, 30 o 36; y la secuencia de aminoácidos de la CDR3 de VH es la SEQ ID NO: 25, 31 o 37.

En otra modalidad, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina (VL) , donde al menos una de las VL-CDR de la región variable de cadena ligera o al menos dos de las VL-CDR de la región variable de cadena ligera son al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idénticas a las secuencias de aminoácido VL-CDR1, VL-CDR2 o VL-CDR3 de cadena ligera de referencia de los anticuerpos descritos en la presente. De manera alternativa, las regiones VL-CDR1, VL-CDR2 y VL-CDR3 de la VL son al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idénticas a las secuencias de aminoácido VL -CDR1, VL-CDR2 y VL-CDR3 de cadena ligera de referencia de los anticuerpos descritos en la presente. Por lo tanto, conforme a esta modalidad una región variable de cadena ligera de la invención tiene secuencias de polipéptidos VL-CDR1, VL-CDR2 y VL-CDR3 relacionadas a los polipéptidos mostrados en la Fig. 1. Mientras la Fig. 1 muestra VL-CDR definidas por el sistema Kabat, otras definiciones de CDR, por ej . , VL-CDR definidas por el sistema Chothia, también se incluyen en la presente invención. En una modalidad, la secuencia de aminoácidos de la CDR1 de VL de referencia es la SEQ ID NO: 26, 32 o 38; la secuencia de aminoácidos de la CDR2 de VL de referencia es la SEQ ID NO: 27, 33 o 39; y la secuencia de aminoácidos de la CDR3 de VL de referencia es la SEQ ID NO: 28, 34 o 40.

En otra modalidad, la presente invención proporciona un polipéptido aislado que comprende, consiste esencialmente en o consiste en una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina (VL) donde las regiones VL-CDR1, VL-CDR2 y VL-CDR3 tienen secuencias de polipéptidos que son idénticas a los grupos VL-CDR1, VL-CDR2 y VL-CDR3 mostrados en la Fig.l. En una modalidad, la secuencia de aminoácidos de la CDR1 de VL es la SEQ ID NO: 26, 32 o 38; la secuencia de aminoácidos de la CDR2 de VL es la SEQ ID NO: 27, 33 o 39; y la secuencia de aminoácidos de la CDR3 de VL es la SEQ ID NO: 28, 34 o 40.

En otra modalidad, la presente invención proporciona un polipéptido aislado que comprende, consiste esencialmente en o consiste en una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina (VL) donde las regiones VL-CDR1, VL-CDR2 y VL-CDR3 tienen secuencias de polipéptidos que son idénticas a los grupos VL-CDR1, VL-CDR2 y VL-CDR3 mostrados en la Fig.l, salvo por uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez sustituciones de aminoácidos en cualquiera de las VL-CDR. En algunas modalidades, las sustituciones de aminoácidos son conservadoras. En una modalidad, la secuencia de aminoácidos de la CDR1 de VL es la SEQ ID NO: 26, 32, o 38; la secuencia de aminoácidos de la CDR2 de VL es la SEQ ID NO: 27, 33 o 39; y la secuencia de aminoácidos de la CDR3 de VL es la SEQ ID NO: 28, 34 o 40.

Una inmunoglobulina o su ADNc codificante se puede modificar adicionalmente . Por lo tanto, en una modalidad adicional, el método de la presente invención comprende cualquiera del o los pasos de producir un anticuerpo quimérico, anticuerpo murinizado, anticuerpo de cadena simple, fragmento Fab, anticuerpo biespecífico, anticuerpo de fusión, anticuerpo etiquetado o un análogo de cualquiera de estos. Los métodos correspondientes son conocidos por expertos en la técnica y se describen, por ej . , en Harlow and Lañe "Antibodies, A Laboratory Manual", CSH Press, Cold Spring Harbor (1988) . Cuando los derivados de els anticuerpos se obtienen mediante la técnica de expresión por fagos, se puede usar la resonancia de plasmones superficiales, tal como se emplea en el sistema BIAcore, para aumentar la eficacia de los anticuerpos de fago que se unen al mismo epítopo que el de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente (Schier, Human Antibodies Hybridomas 7 (1996), 97-105; Malmborg, J. Immunol . Methods 183 (1995), 7-13). La producción de anticuerpos quiméricos se describe, por ejemplo, en la solicitud internacional WO89/09622. Los métodos para la producción de anticuerpos humanizados se describen en, por e . , la solicitud europea EP-A1 0 239, 400 y la solicitud internacional WO90/07861. Una fuente adicional de anticuerpos a ser utilizada de acuerdo con la presente invención son los anticuerpos denominados xenogénicos. El principio general para la producción de anticuerpos xenogénicos tales como anticuerpos de tipo humano en ratones, se describe en, por ej . , las solicitudes internacionales WO91/10741, WO94/02602, WO96/34096 y WO 96/33735. Tal como se describe anteriormente, el anticuerpo de la invención puede existir en una variedad de formas además de anticuerpos completos; que incluyen, por ejemplo, Fv, Fab y F(ab)2, así como en cadenas simples; véase por ej . , la solicitud internacional WO88/09344.

Los anticuerpos de la presente invención o su(s) cadena (s) de inmunoglobulina correspondiente se pueden modificar adicionalmente usando técnicas convencionales conocidas en la técnica, por ejemplo, usando una o más eliminaciones, inserciones, sustituciones, adicionales y/o recombinaciones de aminoácidos, y/o cualesquiera otras modificaciones conocidas en la técnica ya sea solas o en combinación. Los métodos para introducir las modificaciones en la secuencia de ADN subyacente a la secuencia de aminoácidos de una cadena de inmunoglobulina son conocidos para un experto en la técnica; véase, por ej . , Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y. y Ausubel, Current Protocole in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience , N.Y. (1994). Las modificaciones del anticuerpo de la invención incluyen derivatizaciones químicas y/o enzimáticas en uno o más aminoácidos constitutivos, que incluyen modificaciones de cadena lateral, modificaciones en la espina dorsal, y modificaciones en el terminal-C y N que incluyen acetilación, hidroxilación, metilación, amidación, y la unión de restos carbohidrato o lípido, cofactores, y similares. Asimismo, la presente invención comprende la producción de proteínas quiméricas que comprenden el anticuerpo descrito o algún fragmento de este en el extremo amino fusionado a la molécula heteróloga tal como un ligando inmuniestimulador en el terminal-Carboxilo; véase, por ej . , la solicitud internacional WOOO/30680 para detalles técnicos correspondientes .

De manera adicional, la presente invención comprende péptidos que incluyen aquellos que contienen una molécula de unión tal como se describe anteriormente, por ejemplo que contiene la región CDR3 de la región variable de cualquiera de los anticuerpos mencionados, en particular la CDR3 de la cadena pesada dado que se ha observado con frecuencia que la CDR3 de cadena pesada (HCDR3) es la región que tiene un mayor grado de variabilidad y una participación predominante en la interacción antígeno-anticuerpo . Els péptidos pueden sintetizarse o producirse fácilmente mediante medios recombinantes para producir un agente de unión útil de acuerdo con la invención. Els métodos son bien conocidos por los expertos en la técnica. Los péptidos se pueden sintetizar, por ejemplo, usando sintetizadores de péptido automatizados que se encuentran comercialmente disponibles. Los péptidos también se pueden producir mediante técnicas recombinantes incorporando el ADN que expresa el péptido en un vector de expresión y transformando las células con el vector de expresión para producir el péptido.

Por lo tanto, la presente invención se refiere a cualquier molécula de unión, por ej . , un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de este que está orientado hacia los anticuerpos anti-tau humanos de la presente invención y exhiben las propiedades mencionadas, esto es, que reconocen específicamente tau. Els anticuerpos y moléculas de unión se pueden someter a prueba para determinar su especificidad y afinidad de unión mediante ELISA y transferencia Western e inmunohistoquímica, tal como se describe en la presente, véase, por ej . , los Ejemplos. Además, los resultados preliminares de experimentos posteriores realizados de acuerdo con la presente invención revelaron que el anticuerpo anti-tau humano de la presente invención, en particular, el anticuerpo NI-105.4E4 se une principalmente a ovillos neurofibrilares (NFT) similares a tau agregados patológicamente, hilos de neurópilo presentes en sectores del cerebro humano de pacientes que padecieron además enfermedad de Alzheimer (AD) . Por lo tanto, en una modalidad preferida particular de la presente invención, el anticuerpo humano o fragmento de unión, derivado o variante de este, reconoce tau en sectores del cerebro humano con AD. Además, la capacidad diferente del anticuerpo NI-105.4E4 de unirse diferencialmente a patologías tau también se pueden mostrar en ratones transgénicos que sobreexpresan P301L tau humano. Además de los ya mencionados NFT e hilos de neurópilo, el anticuerpo NI-105.4E4 se une en sectores del cerebro de ratón también a neuritas distróficas e identifica agregados de tau en una etapa previa a los ovillos; véase Ejemplo 4 y Fig. 6.

Como una alternativa para obtener inmunoglobulinas directamente del cultivo de células B inmortalizadas o células de memoria B, las células inmortalizadas se pueden usar como una fuente de loci de cadena pesada y cadena ligera reorganizadas para la expresión posterior y/o manipulación genética. Los genes de anticuerpo reorganizados se pueden transcribir de manea inversa a partir de ARNm apropiados para producir ADNc . Si se desea, la región constante de cadena pesada se puede intercambiar por aquella de un isotipo diferente o se puede eliminar en su totalidad. Las regiones variables se pueden enlazar para codificar regiones Fv de cadena simple. Se pueden enlazar múltiples regiones Fv para conferir capacidad de unión a más de una diana o se pueden emplear combinaciones de cadena pesada y ligera quiméricas. Una vez que se encuentra disponible el material genético, el diseño de análogos tal como se describe anteriormente que retiene su capacidad para unir la diana deseada es sencillo. Los métodos para la clonación de regiones variables de anticuerpo y para la creación de anticuerpos recombinantes , son conocidos para un experto en la técnica y se describen, por ejemplo, en Gilliland et al., Tissue Antigens 47 (1996), 1-20; Doenecke et ál . , Leukemia 11 (1997), 1787-1792.

Una vez que se obtiene el material genético apropiado, y si se desea, se modifica para codificar un análogo, las secuencias de codificación, incluidas aquellas que codifican, en un mínimo, las regiones variables de cadena pesada y ligera, se pueden insertar en sistemas de expresión contenidos en vectores que se pueden transfectar en células hospedadoras recombinantes estándar. Se puede usar una variedad de las células hospedadoras; sin embargo, para un procesamiento eficiente, se pueden considerar también células de mamífero. Las líneas celulares de mamífero típicas para este fin, incluyen, de modo no taxativo, células CHO, células HEK 293 o células NSO .

La producción del anticuerpo o análogo luego se asume mediante el cultivo del hospedador recombinante modificado en condiciones de cultivo apropiadas para el crecimiento de las células hospedadoras y la expresión de las secuencias de codificación. Luego se recuperan los anticuerpos mediante su aislamiento del cultivo. Los sistemas de expresión se diseñan para incluir péptidos de señal de forma tal que los anticuerpos resultantes se segregan en el medio; sin embargo, también es posible la producción intracelular .

De acuerdo con lo anterior, la presente invención también se refiere a un polinucleótido que codifica el anticuerpo o la molécula de unión equivalente de la presente invención. En una modalidad, el polinucleótido codifica al menos una región variable de una cadena de inmunoglobulina del anticuerpo descrito anteriormente. Típicamente, la región variable codificada por el polinucleó ido comprende al menos una región determinante de complementariedad (CDR) de la VH y/o VL de la región variable de el anticuerpo.

El experto en la técnica apreciará fácilmente que el dominio variable del anticuerpo que tiene el dominio variable antes mencionado se puede usar para la construcción de otros polipéptidos o anticuerpos de especificidad y función biológica deseadas. Por lo tanto, la presente invención también comprende polipéptidos y anticuerpos que contienen al menos una CDR del dominio variable antes mencionado y que tiene de forma ventajosa sustancialmente las mismas propiedades de unión o similares a las del anticuerpo descrito en los ejemplos adjuntos. El experto en la técnica sabe que la afinidad de unión se puede potenciar haciendo sustituciones de aminoácidos dentro de las CDR o dentro de los bucles hipervariables (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol . 196 (1987) , 901-917) que se superponen parcialmente con las CDR tal como lo define Kabat; véase, por ej . , Riechmann, efc ál, Nature 332 (1988), 323-327. Por lo tanto, la presente invención también se refiere a anticuerpos donde una o más de las CDR mencionadas comprenden una o más, o no más de dos sustituciones de aminoácidos. En una modalidad, el anticuerpo de la invención comprende en una o las dos de sus cadenas de inmunoglobulina, dos o todas las tres CDR de las ' regiones variables tal como se establece en la Fig. 1.

Las moléculas de unión, por ej . , los anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno, variantes o derivados de los mismos de la invención, como las conocen los expertos en la técnica, pueden comprender una región constante que media una o más funciones efectoras. Por ejemplo, la unión del componente Cl de complemento a una región constante del anticuerpo puede activar el sistema de complemento. La activación del complemento es importante en la opsoriización y lisis de patógenos celulares. La activación del complemento estimula también la respuesta inflamatoria y puede estar implicada también en la hipersensibilidad autoinmune . Además, los anticuerpos se unen a receptores en diversas células mediante la región Fe, con un sitio de unión al receptor Fe en la región Fe del anticuerpo que se une al receptor Fe (FcR) en una célula. Existen varios receptores Fe que son específicos para diferentes clases de anticuerpos, incluyendo IgG (receptores gamma) , IgE (receptores epsilon) , IgA (receptores alfa) e IgM (receptores mu) . La unión del anticuerpo a los receptores Fe sobre las superficies celulares desencadena una cantidad de respuestas biológicas importantes y diversas que incluyen la inmersión y destrucción de partículas recubiertas por anticuerpos, depuración de complejos inmunes, lisis de células diana recubiertas por anticuerpos mediante linfocitos citolíticos (denominada citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos o ADCC) , liberación de mediadores inflamatorios, transferencia de placenta y control de producción de inmunoglobulina .

Por consiguiente, determinadas modalidades de la presente invención incluyen un anticuerpo, o fragmento de unión al antígeno, variante o derivado de este, donde al menos una fracción de uno o más dominios de regiones constantes de modo de proporcionar características bioquímicas deseadas, tales como funciones efectoras reducidas, la capacidad de dimerizar de forma no covalente, la capacidad aumentada de ubicar en el sitio de agregación y deposición de tau, semivida sérica reducida o semivida sérica aumentada en comparación con un anticuerpo sin alteración completo de aproximadamente la misma inmunogenicidad . Por ejemplo, determinados anticuerpos para su uso en los procedimientos de diagnóstico y tratamiento descritos en la presente son anticuerpos eliminados de dominio que comprenden una cadena de polipéptidos similar a una cadena pesada de inmunoglobulina, pero que le falta al menos una porción de uno o más dominios de cadena pesada. Por ejemplo, en determinados anticuerpos, se eliminará un dominio completo de la región constante del anticuerpo modificado, por ejemplo, se eliminará todo o parte del dominio CH2. En otras modalidades, determinados anticuerpos para su uso en métodos de diagnóstico y tratamiento descritos en la presente tienen una región constante, por ej . , una región constante de cadena pesada de IgG, que se altera para eliminar la glicosilación, denominados en la presente como anticuerpos aglicosilados o "agly" . Tales anticuerpos "agly" se pueden preparar enzimáticamente así como mediante el diseño de uno o más sitios de glicosilación de consenso en la región constante.

Sin limitarse a la teoría, se cree que los anticuerpos "agly" pueden tener una seguridad mejorada y un perfil de estabilidad in vivo. Los métodos para producir anticuerpos aglicosilados , que tienen una función efectora deseada, se encuentran por ejemplo en la solicitud internacional WO2005/018572 , que se incorpora en su totalidad mediante esta referencia .

En determinados anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno, variantes o derivados de los mismos descritos en la presente, la porción Fe se puede mutar para reducir la función efectora usando técnicas conocidas en la técnica. Por ejemplo, la eliminación o inactivación (a través de mutaciones puntuales u otros medios) de un dominio de región constante puede reducir la unión del receptor Fe del anticuerpo modificado circulante y, de esta manera, reducir la localización y/o penetración en aumento de la localización de tau. En otros casos se puede dar que las modificaciones de región constante consistente con la unión complementaria moderada de la presente invención y por lo tanto reducen la semivida sérica y la asociación no específica de una citotoxina conjugada. Aun otras modificaciones de la región constante se pueden usar para modificar enlaces de disulfuro o restos oligosacárido que permiten la localización potenciada debido a la especificidad del antígeno o flexibilidad de anticuerpo aumentadas. El perfil fisiológico, la biodisponibilidad y otros efectos bioquímicos resultantes de las modificaciones, tales como localización, biodistribución y semivida sérica de tau, pueden medirse y cuantificarse fácilmente utilizando técnicas inmunológicas bien conocidas sin experimentación indebida.

En determinados anticuerpos, o fragmentos de unión al antígeno, variantes o derivados de estos descritos en la presente, la porción Fe se puede mutar o intercambiar por secuencias de proteína alternativas para aumentar la absorción celular de anticuerpos a modo de ejemplo potenciando la endocitosis mediada por el receptor de anticuerpos mediante receptores Fcy, LRP o receptores Thyl o mediante 'Tecnología de SuperAnticuerpos ' , que se dice permite que los anticuerpos se trasladen a células vivientes sin dañarlas (Expert Opin. Biol . Ther. (2005), 237-241). Por ejemplo, la creación de las proteínas de fusión de la región de unión al anticuerpo y los ligandos de proteínas' cognados de los receptores de superficie celular o anticuerpos bi o multiespecífieos con una unión de secuencias específicas que se unen a tau asi como un receptor de superficie celular se puede diseñar usando" técnicas conocidas en la técnica.

En determinados anticuerpos, o fragmentos de unión al antígeno, variantes o derivados de los mismos descritos en la presente, la porción Fe se puede mutar o intercambiar las secuencias de proteína alternativas o el anticuerpo se puede modificar químicamente para aumentar su penetración de la barrera hematoencef lica .

Las formas modificadas de anticuerpos, o fragmentos de unión al antígeno, variantes o derivados de los mismos dé la invención, se pueden realizar a partir de anticuerpos precursores u originales completos usando técnicas conocidas en la técnica. Los ejemplos de técnicas se discuten en más detalle en la presente. Los anticuerpos o fragmentos de, unión al antígeno, variantes o derivados de los mismos de la invención, se pueden realizar o fabricar usando técnicas conocidas en la técnica. En determinadas modalidades, las moléculas de anticuerpo o fragmentos de las mismas se "producen de forma recombinante", esto es, se producen usando tecnología de ADN recombinante. Los ejemplos de técnicas para realizar moléculas de anticuerpo o fragmentos de este se discuten en más detalle en otra parte de la presente '.

Los anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno, variantes o derivados de los mismos de la invención también incluyen derivados que se modifican, por ej . , mediante la unión covalente de cualquier tipo de molécula al anticuerpo de forma tal que la unión covalente no evita que el anticuerpo se una específicamente a su epítopo cognado. Por ejemplo, a modo no taxativo, los anticuerpos y polipéptidos antagonistas de DR6 se pueden modificar, por ejemplo, mediante glicosilación, acetilación, pegilación, fosfiláción, fosforilación, amidación, derivatización mediante grupos de bloqueo/protección conocidos, escisión proteolítica , enlace a un ligando . celular u otra> proteína, etc. Se pueden llevar a cabo cualquiera de una cantidad de modificaciones químicas mediante técnicas conocidas que incluyen, a modo no taxativo, escisión química específica, acetilación, formilación, síntesis metabólica de tunicamicina , etc. Adicionalmente , el derivado puede contener uno o más aminoácidos no clásicos.

En modalidades particulares, lbs anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno, variantes o derivados de los mismos de la invención no provocan una respuesta inmunitaria perjudicial en el animal a ser tratado, por ej . , en un humano. En determinadas modalidades, las moléculas de unión, por ej . , anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno, variantes o derivados de los mismos de la invención derivan de un paciente, por ej . , un paciente humano, y' se1 usan posteriormente en las mismas especies de las que se1 derivan, por ej . , humanos, aliviando o minimizando la aparición de respuestas inmunitarias perjudiciales.

La desinmunización se puede utilizar también para disminuir la inmunogenicidad de un anticuerpo. Tal como se usa en la presente, el término "desinmunización" incluye la alteración de un anticuerpo para modificar los epítopos de células T; véase, por ej . , las solicitudes internacionales 098/52976 y WO00/34317) . Por ejemplo, se analizan las secuencias VH y VL del anticuerpo de partida y un "mapa" del epítopo de células T humanas de cada región V que muestra la ubicación de los epítopos con relación a las regiones determinantes de complementariedad (CDR) y otros residuos clave dentro de la secuencia. Se analizaron los epítopos de células T individuales del mapa del epítopo de células T para identificar las sustituciones de aminoácidos alternativas con un bajo riesgo de alterar la actividad del anticuerpo final. Se designaron un intervalo de secuencias VH y VL alternativas, que comprende combinaciones de sustituciones de aminoácidos y posteriormente estas secuencias se incorporaron en un intervalo de polipéptidos de unión, por ej . , anticuerpos específicos de tau o fragmentos inmunoespecíficos de los mismos para su uso en los procedimientos del diagnóstico y tratamiento descritos en la presente, que luego se prueban para su función. Típicamente, se generan y prueban entre 12 y 24 anticuerpos diversos. Luego se clonan genes completos de cadena pesada y ligera que comprenden regiones modificadas V y humanas C, en vectores de expresión y los plásmidos subsiguientes se introducen en líneas celulares para producir anticuerpos totales. Luego se comparan los anticuerpos en ensayos bioquímicos y biológicos apropiados y se identifica la variante óptima.

Los anticuerpos monoclonales se pueden preparar utilizando una amplia variedad de técnicas conocidas en la práctica incluyendo el uso de tecnologías de hibridoma, recombinantes y de visualización de fagos o una combinación de los mismos. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales se pueden producir utilizando técnicas de hibridoma incluyendo aquellas conocidas en la práctica y descritas, por ejemplo, en Harlow et ál . , Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a ed. (1988) ; Hammerling et ál . , en: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas Elsevier, N.Y., 563-681 (1981), las referencias se incorporan en su totalidad mediante referencia. Como se utiliza en la presente, el término "anticuerpo monoclonal" no se limita a los anticuerpos producidos a través de tecnología de hibridoma. El término "anticuerpo monoclonal" se refiere a un anticuerpo que deriva de un único clon, incluyendo todo clon eucariótico, procariótico o de fagos y no el método por el cual se produce. Por lo tanto, el término "anticuerpo monoclonal" no se limita a los anticuerpos producidos a través de la tecnología de hibridoma. En determinadas modalidades, los anticuerpos de la presente invención derivan de células B humanas que fueron inmortalizadas mediante transformación con virus Epstein-Barr , tal como se describe en la presente.

En este proceso bien conocido (Kohler et ál . , Nature 256(1915) , 495), los linfocitos de vida relativamente corta o mortales de un mamífero, por ej . , células B derivadas de un sujeto humano tal como se describe en la presente, se fusionan con una línea celular de tumor inmortal (por ej . , una línea celular de mieloma) , produciendo de este modo células híbridas o "hibridomas" que son ambas inmortales y capaces de producir el anticuerpo codificado genéticamente de la célula B. Los híbridos resultantes se segregan en> cepas genéticas simples por selección, dilución y neoformación con cada cepa individual que comprende genes específicos para la formación de un anticuerpo simple. Estos producen anticuerpos que son homogéneos contra el antígeno deseado y, con referencia a su parentesco genético puro, se denominan "monoclonales " .

Las células de hibridoma preparadas de esta manera se siembran y cultivan en un medio de cultivo adecuado que contiene una o más sustancias que inhiben el crecimiento o la supervivencia de las células de mieloma parental no fusionadas. Los expertos en la técnica apreciarán: que los reactivos, las líneas celulares y el medio para la formación, selección y el crecimiento de hibridomas están disponibles comercialmente a partir de una cantidad de fuentes y se establecen protocolos estándar. En general, el medio de cultivo en el que están creciendo las células de hibridoma se ensaya para determinar la producción de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno deseado. La especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales producidos por células de hibridoma se determina por ensayos in vitro, tales como inmunoprecipitación, radioinmunóensayo (RIA) o ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA, por sus siglas en inglés) tal como se describe en la presente. Luego de que se identifican las células de hibridoma que producen anticuerpos de la especificidad, afinidad y/o actividad deseadas,' los clones se pueden subclonar por procedimientos de limitación de dilución y se pueden cultivar por métodos estándares; véase, por ej . , Goding, Monoclonal antibodies .- Principies and Practice, Academic Press, pp 59-103 (1986). Adicionalmente se apreciará que los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones se pueden separar del medio de cultivo, fluido de ascitis o suero mediante procesos de purificación convencionales tales como, por ejemplo, proteína A, cromatografía de hidroxiapatita, electroforesis en gel, diálisis o cromatografía de afinidad.

En otra modalidad, los linfocitos se pueden seleccionar por micromanipulación y los genes variables se aislan. Por ejemplo, las células mononucleares de sangre periférica se pueden aislar a partir de un mamífero inmunizado o naturalmente inmune, por ej . , un humano, y cultivar durante aproximadamente 7 días in vitro. Se pueden detectar en cultivos IgG específicos que cumplan con los criterios de detección. Las . células de pocilios positivos se pueden aislar. Las células B que producen Ig individual se pueden aislar por FACS o identificándolas en un ensayo de placa hemolítica mediada por com lemento. Los linfocitos B que producen Ig se pueden micromanipular en un tubo y los genes VH y VL se pueden amplificar utilizando, por ej . , RT-PCR. Los genes de VH y VL pueden clonarse en un vector de expresión de anticuerpos y transíectarse en células (por ej . , células eucariotas o procariotas) para su expresión.

De manera alternativa, las líneas celulares que producen anticuerpos pueden seleccionarse y cultivarse utilizando técnicas bien conocidas por el experto en la práctica. Las técnicas se describen en una variedad de manuales de laboratorio y publicaciones primarias. En lo que a esto respecta, tal como se describe a continuación, las técnicas adecuadas para su uso en la invención se describen en Current Protocols in Immunology, Coligan et ál . , Eds . , Green Publishing Associates y Wiley- Interscience , John Wiley y Sons, Nueva York (1991), que se incorporan a la presente mediante esta referencia en su totalidad, incluyendo los complementos .

Los fragmentos de anticuerpo que reconocen los epítopos específicos se pueden generar mediante técnicas conocidas. Por ejemplo, los fragmentos Fab y F(ab')2 se pueden producir de forma recombinante o mediante escisión proteolítica de moléculas de inmunoglobulina, utilizando enzimas, tales como papaína (para producir fragmentos Fab) o pepsina (para producir fragmentos F(ab')2). Los fragmentos F(ab')2 contienen la región variable, la región constante de cadena ligera y el dominio CH1 de la cadena pesada. Els fragmentos sin suficientes para su uso, por ejemplo, en procedimientos de inmunodiagnóstico que implican acoplar las porciones inmunoespecíficas de inmunoglobulinas para detectar reactivos tales como radioisótopos.

Los anticuerpos humanos, tal como se describen en la presente, se desean particularmente para uso terapéutico en pacientes humanos. Los anticuerpos humanos de la presente invención se aislan, por ej . , de sujetos humanos sanos quienes dada su edad, se sospecha que corren el riesgo de desarrollar una taupatía, por ej . , enfermedad de Alzheimer, o un paciente con el trastorno pero con un transcurso de la enfermedad inusualmente estable. Sin embargo, aunque es prudente esperar que los sujetos de edad, sanos y que no padecen síntomas, respectivamente, habrán desarrollado anticuerpos anti-tau protectores más regularmente que los sujetos más jóvenes, estos últimos se pueden usar como fuente para obtener un anticuerpo humano de la presente invención. Esto es particularmente verdadero para los pacientes jóvenes que están predispuestos a desarrollar una forma familiar de una taupatía pero permaneces sin padecer síntomas dado que su sistema inmunitario funciona más eficientemente que en los adultos mayores.

En una modalidad, un anticuerpo de la invención comprende al menos una CDR de cadena pesada o ligera de una molécula de anticuerpo. En otra modalidad, un anticuerpo de la invención comprende al menos dos CDR de una o más moléculas de anticuerpo. En otra modalidad, un anticuerpo de la invención comprende al menos tres CDR de una o más moléculas de anticuerpo. En otra modalidad, un anticuerpo de la invención comprende al menos cuatro CDR de una o más moléculas de anticuerpo. En otra modalidad, un anticuerpo de la invención comprende al menos cinco CDR de una o más moléculas de anticuerpo. En otra modalidad, un anticuerpo de la invención comprende al menos seis CDR de una o más moléculas de anticuerpo. Los ejemplos de moléculas de anticuerpo que comprenden al menos una CDR que se pueden incluir en estos anticuerpos se describen en la presente.

Los anticuerpos de la presente invención se pueden producir mediante cualquier método conocido en la técnica para la síntesis de anticuerpos, en particular, mediante síntesis química o mediante técnicas de expresión recombinante tal como se describió en la presente.

En una modalidad, un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno, variante o derivado de este de la invención comprende una región constante sintética donde uno o más dominios se eliminan parcial o completamente ("anticuerpos eliminados del dominio"). En determinadas modalidades compatibles de anticuerpos modificados comprenderán constructos eliminados de dominio o variantes donde se eliminó todo el dominio de CH2 (Aconstructos de CH2). Para otras modalidades, un péptido conector corto se puede sustituir por el dominio eliminado para proporcionar flexibilidad y libertad de movimiento para la región variable. Los expertos en la técnica reconocerán que las construcciones se prefieren particularmente debido a las propiedades reguladoras del dominio CH2 en el líndice catabólico del anticuerpo. Los constructos eliminados del dominio pueden derivarse usando un vector que codifica un dominio constante humano de IgGi, véase, por ej . , las solicitudes internacionales WO02/060955 y WO02/096948A2 ) . Este vector está diseñado para tener el dominio CH2 eliminado y para proporcionar un vector sintético que exprese un dominio eliminado de la región constante de lgG1.

En algunas modalidades, los anticuerpos, fragmentos de unión al antígeno, variantes o derivados de los mismos de la presente invención son minicuerpos. Se pueden realizar minicuerpos usando métodos descritos en la técnica, véase, por ej . , la patente estadounidense 5,837,821 o la solicitud internacional WO 94/09817.

En una modalidad, un anticuerpo o fragmento de , unión al antígeno, variante o derivado de este de la invención comprende una cadena pesada de inmunoglobulina que tiene eliminación o sustitución de pocos o incluso un solo aminoácido simple siempre y cuando permita la asociación entre las subunidades monoméricas. Por ejemplo, la mutación de un solo aminoácido en áreas seleccionadas del dominio CH2 puede ser suficiente como para reducir de manera sustancial la unión de Fe y de esa manera reducir la localización de tau. De modo similar, puede ser deseable eliminar simplemente esa parte de uno o más dominios de región constante que controla la función efectora (por ej . , unión de complemento) que se va a modular. Las supresiones parciales de las regiones constantes pueden mejorar las características seleccionadas del anticuerpo (semivida sérica) mientras se dejan intactas otras funciones deseables asociadas con el dominio de la región constante de la invención. Asimismo, tal como se mencionó anteriormente, las regiones constantes de los anticuerpos descritos pueden ser sintéticas a través de la mutación o sustitución de uno o más aminoácidos, que mejora el perfil de la construcción resultante. Eri este sentido, puede ser posible la interrupción de la actividad proporcionada por un sitio de unión conservado (por ej . , la unión de Fe) mientras se mantienen de manera sustancial la configuración y el perfil inmunogénicos del anticuerpo modificado. Aun otras modalidades comprenden la adición de uno o más aminoácidos a la región constante para mejorar las características deseables, tal como la función efectora o la proporción de la unión de más citotoxinas o carbohidratos. En las modalidades, puede ser deseable la inserción o replicación de secuencias específicas derivadas de los dominios de regiones constantes seleccionados.

La presente invención también proporciona anticuerpos que comprenden, consisten esencialmente en o consisten en variantes (incluyendo derivados) de moléculas de anticuerpos (por ej . , las regiones VH y/o regiones VL) descritas en la presente, cuyos anticuerpos o fragmentos de los mismos se unen a tau. Las técnicas estándar conocidas por los expertos en la práctica pueden utilizarse para introducir mutaciones en la secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo, incluyendo, de modo no taxativo, mutagénesis dirigida al sitio y mutagénesis mediada por PCR que resultan en sustituciones de aminoácidos. En una modalidad, las variantes (incluyendo derivados) codifican menos de 50 sustituciones de aminoácidos, menos de 40 sustituciones de aminoácidos, menos de 30 sustituciones de aminoácidos, menos de 25 sustituciones de aminoácidos, menos de 20 sustituciones de aminoácidos, menos de 15 sustituciones de aminoácidos, menos de 10 sustituciones de aminoácidos, menos de 5 sustituciones de aminoácidos, menos de 4 sustituciones de aminoácidos, menos de 3 sustituciones de aminoácidos o menos de 2 sustituciones de aminoácidos con relación a la región VH, VH-CDR1, VH-CDR2 , VH-CDR3, región VL, VL-CDR1, VL-CDR2 o VL-CDR3 de referencia. Una "sustitución de aminoácidos conservativa" es una en la cual el residuo de aminoácidos se remplaza con un residuo de aminoácidos que tiene una cadena lateral con una carga similar. En la técnica se definen las familias de residuos de aminoácidos. que tienen cadenas laterales con cargas similares. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ej . , lisina, arginina, histidina) , cadenas laterales ácidas (por ej . , ácido aspártico, ácido glutámico) , cadenas laterales polares no cargadas (por ej . , glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína) , cadenas laterales no polares (por ej . , alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano) , cadenas laterales beta-ramificadas (por ej . , treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ej . , tirosina, fenilalanina , triptófano, histidina) . De manera alternativa, las mutaciones se pueden introducir aleatoriamente a lo largo de toda o parte de la secuencia de codificación, tal como por mutagénesis de saturación y los mutantes resultantes se pueden explorar para determinar actividad biológica para identificar mutantes que retienen actividad (por ej . , la capacidad de unirse a tau) .

Por ejemplo, es posible introducir mutaciones solamente en regiones flanqueantes o solo en regiones CDR de una molécula de anticuerpo. Las mutaciones introducidas pueden ser mutaciones de aminoácido imperceptibles o neutrales, por ej . , no tiene efecto o tienen un efecto pequeño sobre la capacidad de un anticuerpo de unirse a un antígeno, de hecho algunas de estas mutaciones no modifican la secuencia de aminoácidos de forma alguna. Estos tipos de mutaciones pueden ser útiles para optimizar el uso de codones o mejorar la producción de anticuerpos por parte de un hibridoma. Las regiones codificantes optimizadas por codones que codifican anticuerpos de la presente invención se describen en otras partes de la presente. De manera alternativa, las mutaciones imperceptibles no neutras pueden modificar la capacidad del anticuerpo de unirse al antígeno. Es probable que la ubicación de la mayoría de las mutaciones de aminoácido imperceptibles y neutras sea en las regiones flanqueantes, mientras que la ubicación de la mayoría de las mutaciones de aminoácido no neutras es probable que sea en COR, pese a que no es un requisito absoluto. Un experto en la técnica será capaz de diseñar y probar moléculas mutantes con propiedades deseadas tal como actividad de unión al antígeno no alterada o alteración en actividad de unión (por ej . , mejoras en la actividad de unión al antígeno o cambio en la especificidad del anticuerpo) . Después de la mutagénesis, la proteína codificada puede expresarse de forma rutinaria y la actividad funcional y/o biológica de la proteína codificada (por ej . , capacidad de unirse inmunoespecíficamente a al menos un epítopo de tau) se puede determinar usando técnicas descritas en la presente o por técnicas de modificación rutinaria conocidas en la técnica.

Los agentes de unión a tau, por ejemplo, de modo no taxativo, anticuerpos de unión a tau de la presente invención se pueden caracterizar usando cualesquiera modelos in vivo o in vitro de taupatías neurodegenerativas. Un experto en la técnica entiende fácilmente que un agente de unión á tau (por ej . , un anticuerpo) de la invención puede estar caracterizado en un modelo de ratón para taupatías neurodegenerativas. Por ejemplo, de modo no taxativo, cualquiera de los siguientes tres modelos animales diferentes para taupatías se pueden usar para caracterizar y validar los anticuerpos tau (y las moléculas con las especificidades de unión de los mismbs) de la presente invención. 1. Ratón TauP301L transgénico (línea 183):· expresa Tau40 humano con mutación P301L bajo el promotor Thyl .2 murino (la creación de estos animales transgénicos se describe en Gótz et ál., J. Biol. Chem. 276 (2001), 529-534 y en la solicitud internacional WO2003/017918 , cuyo contenido se incorpora a la presente mediante esta referencia) . 2. Los ratones J PL3 que expresan la isoforma de tau humana 4R más corta con mutación P301L bajo el promotor PrP murino (disponible en Taconic, Hudson, NY, EUA) . 3. Los ratones P301STau (línea PS19) que expresan tau humano con mutación P301S bajo el promotor PrP humano (disponible en Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine, EUA) .

Un experto en la técnica entiende que un modelo experimental de taupatías neurodegenerativas se puede usar en un escenario preventivo o se puede usar en un escenario terapéutico. En un escenario preventivo, la dosificación de animales empieza antes del comienzo de las taupatías neurodegenerativas o de los síntomas de las mismas. En escenarios preventivos, se evalúa en un agente de unión a tau (por ej . , anticuerpo) la capacidad de prevenir, reducir o retrasar el comienzo de taupatías neurodegenerativas o los síntomas de las mismas. En un escenario terapéutico, la dosificación de animales empieza después del comienzo de las taupatías neurodegenerativas o de un síntoma de las mismas. En un escenario terapéutico, se evalúa en un agente de unión a tau (por ej . , anticuerpo) la capacidad de tratar, reducir o aliviar las taupatías neurodegenerativas o un síntoma de las mismas. Los síntomas de las taupatías neurodegenerativas incluyen, de modo no taxativo, acumulación de depósitos de tau patológico, ovillos neurofibrilares (NFT) , polipeptido tau hiperfosforilado, fracciones tau insolubles en las neuronas, cerebro, médula espinal, fluido cerebroespinal o suero del objeto experimental. Un experto en la técnica entiende que un resultado terapéutico o preventivo positivo en cualquier modelo animal de taupatías neurodegenerativas indica que el agente de unión a tau particular (por ej . , anticuerpo) se puede usar con fines preventivos o terapéuticos en un sujeto distinto de un organismo de 1 modelo experimental, por ejemplo, se puede usar para tratar taupatías neurodegenerativas en un sujeto humano que lo necesita.

En una modalidad, un agente de unión a tau (por ej . , un anticuerpo) de la invención se puede administrar a un modelo de ratón con taupatía y ratón de tipo natural de control correspondiente. El anticuerpo administrado puede ser un anticuerpo murinizado de la presente invención o una quimera murina humana de un anticuerpo de la presente invención. Véase, por ejemplo, Ejemplos 6 y 7. El agente de unión a tau (por ej . , un anticuerpo) se puede administrar mediante cualquier medio conocido en la técnica, por ejemplo, mediante administración intraperitoneal , intracraneal, intramuscular, intravenosa, subcutánea, oral y en aerosol. A los animales experimentales se les puede administrar una, dos, tres, cuatro, cinco o más dosis de agente de unión a tau (por ej . , un anticuerpo) o una composición de control, tal como PBS . En una modalidad, a los animales experimentales se les puede administrar uno o dos dosis de agente de unión a tau (por ej . , un anticuerpo). Véase, por ejemplo, Ejemplo 9. En otra modalidad, a los animales se los dosifica crónicamente con el agente de unión a tau (por ej . , un anticuerpo) durante varias semanas o meses. Véase, por ejemplo, Ejemplo 10. Un experto puede diseñar rápidamente un régimen de dosificación que se ajuste al fin experimental, por ejemplo, régimen de dosificación para estudios agudos, régimen de dosificación para estudios crónicos, régimen de dosificación para estudios de toxicidad, régimen de dosificación para estudios preventivos o terapéuticos. La presencia del agente de unión a tau (por ej . , anticuerpo) en un componente tisular particular de los animales experimentales, por ejemplo, de modo no taxativo, suero, sangre, fluido cerebroespinal, tejido cerebral, se puede establecer usando métodos conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Ejemplos 9 y 10. En una modalidad, un agente de unión a tau (por ej . , anticuerpo) de la invención es capaz de penetrar la barrera hematoencefálica . Un experto entiende que por medio del ajuste de la dosis del agente de unión a tau (por ej . , anticuerpo) y la frecuencia de dosificación, se puede mantener una concentración deseada de agente de unión a tau (por ej . , anticuerpo) en animales experimentales. Cualquier efecto de un agente de unión a tau (por ej . , anticuerpo) de la presente invención en los modelos de taupatía se pueden evaluar comparando el nivel, las características bioquímicas o la distribución de tau en los animales tratados y de control. En un ejemplo, los ovillos neurofibrilares (NFT) se examinan usando la técnica de impregnación de plata de Gallyas o mediante inmunotinción con anticuerpo de ratón monoclonal AT100 y AT180, que reconoce tau fosforilado patológicamente en NFT. La cantidad o frecuencia de neuronas Gallyas positivas y/o neuronas etiquetadas AT100, AT180 en el cerebro y en la médula espinal en ratones tratados con el anticuerpo y animales de control, se puede determinar para evaluar el efecto del tratamiento con anticuerpos. En una modalidad, el anticuerpo de la presente invención es capaz de reducir el nivel, la cantidad o concentración de ovillos neurofibrilares en el cerebro o en la médula espinal en un modelo animal. El anticuerpo puede reducir el nivel, la cantidad o concentración de ovillos neurofibrilares en al menos alrededor de 5%, 10%, 20%, 30%, 50%, 70%, 90% o más. En otra modalidad, un anticuerpo de la presente invención es capaz de reducir la cantidad o frecuencia de neuronas Gallyas positivas en el cerebro o en la médula espinal en un modelo animal, por ejemplo, en al menos alrededor de 5%, 10%, 20%, 30%, 50%, 70%, 90% o más. En una modalidad adicional, un anticuerpo de la presente invención es capaz de reducir la cantidad o frecuencia de neuronas positivas del anticuerpo AT100 o AT180 en el cerebro o en la médula espinal en un modelo animal, por ejemplo, en al menos alrededor de 5%, 10%, 20%, 30%, 50%, 70%, 90% o más. El efecto de un anticuerpo de la presente invención también se puede evaluar examinando la distribución y las propiedades bioquímicas de tau que siguen a la administración del anticuerpo. En una modalidad, un anticuerpo de la presente invención es capaz de reducir la cantidad o concentración de la proteína tau en el cerebro o en la médula espinal en un modelo animal, por ejemplo, en al menos alrededor de 5%, 10%, 20%, 30%, 50%, 70%, 90% o más. En otra modalidad, un anticuerpo de la presente invención es capaz de reducir la cantidad o concentración de la proteína tau insoluble en el cerebro o en la médula espinal en un modelo animal, por ejemplo, en al menos alrededor de 5%, 10%, 20%, 30%, 50%, 70%, 90% o más. La fracción de tau insoluble se puede preparar tal como se describe, por ejemplo, en el. Ejemplo 10 o en Goedert M, Spillantini MG, Cairns NJ, Crowther RA. Neuron 8, 159 (1992) . La cantidad de proteína tau en una muestra biológica se puede determinar mediante cualquier método conocido por un experto, por ejemplo, tal como se describe en el Ejemplo 10. En una modalidad adicional, un anticuerpo de la presente invención puede reducir la cantidad o concentración de la proteína tau hiperfosforilada en el cerebro o en la médula espinal en un modelo animal, por ejemplo, en al menos alrededor de 5%> 10%, 20%, 30%, 50%, 70%, 90% o más. La tau hiperfosforilada se puede detectar usando anticuerpos específicos para formas patológicamente hiperfosforiladas de tau, tales como AT100 o AT180. Un anticuerpo de la presente invención puede también alterar, por ejemplo, reducir o aumentar la concen raci'ón de tau en la sangre, suero o fluido cerebroespinal o un modelo animal, por ejemplo, en al menos alrededor de 5%, 10%, 20%, 30%, 50%, 70%, 90% o más. En una modalidad, el porcentaje de reducción o aumento es relativo en comparación con el nivel, la cantidad frecuencia, cantidad o concentración que existía antes del tratamiento, o con el nivel, la cantidad, frecuencia, cantidad o concentración que existe en un sujeto tratado como control/no tratado.

En una modalidad, un anticuerpo de la presente invención puede prevenir o retrasar el comienzo de al menos un síntoma de una taupatía neurodegenerativa en un sujeto. En una modalidad, un anticuerpo de la presente invención puede reducir o eliminar al menos un síntoma de una taupatía neurodegenerativa en un sujeto. El síntoma puede ser la formación de depósitos de tau patológica, depósitos de tau hiperfosforilada, depósitos de tau insoluble,: fibras neurofobrilada, fibras neurofobrilada, agregados de tau de fósforo pre-ovillos, ovillos neurofibrilares intraneurónales o extraneuronales en el cerebro o en la médula espinal de un sujeto. Véase, por ej . , Augustinack et ál, Acta Neuropathol 103:26-35 (2002). El síntoma puede ser también la presencia, o concentración o cantidad elevada de tau en el suero, sangre, orina o fluido cerebroespinal, donde la cantidad o concentración elevada se compara con un sujeto sano. El síntoma puede ser un síntoma neurológico, por ejemplo, aversión alterada condicionada al sabor, condicionamiento alterado contextual del miedo, deterioro de la memoria, pérdida de función motora. En una modalidad, el deterioro de la memoria se evalúa usando una tarea de laberinto en Y en dos ensayos. En una modalidad específica, la tarea de laberinto en Y en dos ensayos se realiza sustancialmente tal como se describe en el Ejemplo 10. En una modalidad, el al menos un síntoma se reduce en al menos alrededor de 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 50%, 70%, o 90%. En otra modalidad, la relación de la tarea de laberinto en Y en dos ensayos es considerablemente mayor en un sujeto tratado con el anticuerpo que en un sujeto de control. En una modalidad específica, la relación de la tarea de laberinto en Y ;en dos ensayos se aumenta en al menos alrededor de 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, o 90%. En otra modalidad, la relación de la tarea de laberinto en Y en dos ensayos es al menos alrededor de dos veces, tres veces, cuatro veces, cinco veces, diez veces o veinte veces mayor. La presente invención también proporciona un método para prevenir o retrasar el comienzo de al menos un síntoma de una taupatía neurodegenerativa en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo tau descrito en la presente. La presente invención proporciona adicionalmente un método para reducir o eliminar al menos un síntoma de una taupatía neurodegenerativa en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un antic.uerpo tau descrito en la presente. En una modalidad, el sujeto es un organismo experimental, tal como, de modo no taxativo, ratón transgénico. En una modalidad, el sujeto es un humano.

III. Polinucleótidos que codifican anticuerpos Un polinucleótido que codifica un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno, variante o derivado de este puede constar de cualquier polirribonucleótido o polidesoxirribonucleótido que puede ser ARN o ADN no modificado o ARN o ADN modificado. Por ejemplo, un polinucleótido que codifica un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno, variante o derivado de este puede constar de un ADN de cadena simple o doble, ADN que es una mezcla de regiones de cadena simple o doble, ARN de cadena simple y doble y ARN que es una mezcla de regiones de cadena simple y doble, moléculas híbridas que comprenden ADN y ARN que puede ser de cadena simple o, más típicamente, de cadena doble o una mezcla de regiones de cadena simple o doble. Además, un polinucleótido que codifica un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno, variante o derivado de este puede constar de regiones de cadena triple que comprenden ARN o ADN o ARN y ADN. Un polinucleótido que codifica un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno, variante o derivado de este también puede contener una o más bases modificadas o estructuras principales de ADN o ARN modificadas en lo que respecta a estabilidad y por otras razones. Las bases "modificadas" incluyen, por ejemplo, bases tritiladas y bases inusuales tales como inosina. Se puede hacer una variedad de modificaciones a ADN y ARN; por lo tanto, "polinucleótido" abarca formas modificadas química, enzimática o metabólicamente .

Un polinucleótido aislado que codifica una variante no natural de un polipéptido que proviene de una inmunoglóbulina (por ej . , una porción de cadena pesada o una porción de cadena ligera de inmunoglóbulina) se puede crear por la introducción de una o más sustituciones, adiciones o eliminaciones de nucleótido en la secuencia de nucleótidos de la inmunoglóbulina de forma tal que una o más sustituciones, adiciones o eliminaciones de aminoácidos se introducen < en la proteína codificada. Las mutaciones se pueden introducir mediante técnicas estándar, tales como la mutagénesis dirigida al sitio y mutagénesis mediada por PCR: En una modalidad, las sustituciones de aminoácido conservativas se realizan en uno o más residuos de aminoácidos no esenciales.

Como es bien sabido, el ARN se puede aislar de los linfocitos B originales, células de hibridoma o de otras células transíectadas por técnicas estándar, tales como extracción de isotiocianato de guanidina y precipitación seguida por centrifugación o cromatografía. En los casos en que se desea, el ARNm se puede aislar del ARN total por técnicas estándar tales como cromatografía en celulosa oligo dT. Las técnicas adecuadas son conocidas en la técnica. En una modalidad, los ADNc que codifican las cadenas ligera y pesada del anticuerpo se pueden hacer ya sea simultáneamente o por separado usando transcriptasa inversa y polimerasa de ADN de acuerdo con métodos bien conocidos . La PCR se puede iniciar por cebadores de región constante unánimes . o por cebadores más específicos basados en las secuencias publicadas de ADN de cadena pesada y ligera y de aminoácidos. Tal como se describe anteriormente, la PCR también se puede usar para aislar clones de ADN que codifican las cadenas ligera y pesada de anticuerpos. En este caso se pueden explorar las bibliotecas por cebadores de consenso o .sondas homologas más grandes tales como sondas de región constante humana .

El ADN, típicamente ADN plásmido, se puede aislar de las células usando técnicas conocidas en la técnica, se mapearon por restricción y se secuenciaron de acuerdo con técnicas estándar, bien conocidas, establecidas en detalle, por ej . , en las referencias anteriores con relación a las técnicas de ADN recombinante . Desde luego, el ADN puede ser sintético conforme a la presente invención en cualquier momento durante el proceso de aislamiento o el posterior análisis .

En una modalidad, la presente invención proporciona un polipéptido aislado que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en un ácido nucleico que codifica una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina (VH) , donde al menos una de las CDR de la región variable de cadena pesada o al menos dos de las VH-CDR de la región variable de cadena pesada son al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, alrededor de 97%, 98% o 99% idénticas a las secuencias de aminoácido VH~ CDR1, VH-CDR2 o VH-CDR3 de cadena pesada de referencia de los anticuerpos descritos en la presente. De manera alternativa, las regiones VH-CDR1, VH-CDR2 o VH-CDR3 de la VH son al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, alrededor de 97%, 98% o 99% idénticas a las secuencias de aminoácido VH -CDRl, VH-CDR2 y VH-CDR3 de cadena pesada de referencia de los anticuerpos descritos en la presente. Por lo tanto, conforme a esta modalidad una región variable de cadena pesada de la invención tiene secuencias de polipéptidos VH-CDR1, VH-CDR2 y VH-CDR3 relacionadas a las secuencias de polipéptidos mostradas en la Fig. 1. En una modalidad, la secuencia de aminoácidos de la CDRl de VH de referencia es la SEQ ID NO: 23, 29 o 35; la secuencia de aminoácidos de la CDR2 de VH de referencia es la SEQ ID NO: 24, 30 o 36; y la secuencia de aminoácidos de la CDR3 de VH de referencia es la SEQ ID NO: 25, 31 o 37.

En una modalidad, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado que comprende, consiste esencialmente en o consiste en un ácido nucleico que codifica una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina (VH) donde las regiones VH-CDR1, VH-CDR2 y VH-CDR3 tienen secuencias de polipéptidos que son idénticas a los grupos VH-CDR1, VH-CDR2 y VH-CDR3 mostrados en la Fig.l, salvo por uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez sustituciones de aminoácidos en cualquiera de las VH-CDR. En determinadas modalidades, las sustituciones de aminoácidos son conservadoras. En una modalidad, la secuencia de aminoácidos de la CDR1 de VH es la SEQ ID NO: 23, 29 o 35; la secuencia de aminoácidos de la CDR2 de VH es la SEQ ID NO: 24, 30 o 36; y la secuencia de aminoácidos de la CDR3 de VH es la SEQ ID NO: 25, 31 o 37.

En otra modalidad, la presente invención proporciona un polipéptido aislado que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en un ácido nucleico que codifica una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina (VL) , donde al menos una de las VL-CDR de la región variable de cadena ligera o al menos dos de las VL-CDR de la región variable de cadena ligera son al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, alrededor de 97%, 98% o 99% idénticas a las secuencias de aminoácido VL-CDR1, VL-CDR2 o VL-CDR3 de cadena ligera de referencia de los anticuerpos descritos en la presente. Dé manera alternativa, las regiones VL-CDR1, VL-CDR2 o VL-CDR3 de la VL son al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, alrededor de 97%, 98% o 99% idénticas a las secuencias de aminoácido VL -CDR1, VL-CDR2 y VL-CDR3 de cadena ligera de referencia de los anticuerpos descritos en la presente. Por lo tanto, conforme a esta modalidad una región variable de cadena ligera de la invención tiene secuencias de polipéptidos VL-CDR1, VL-CDR2 y VL-CDR3 relacionadas a las secuencias de polipéptidos mostrados en la Fig. 1. En una modalidad, la secuencia de aminoácidos de la CDR1 de VL de referencia es la SEQ ID NO: 26, 32 o 38; la secuencia de aminoácidos de la CDR2 de VL de referencia es la SEQ ID NO: 27, 33 o 39; y la secuencia de aminoácidos de la CDR3 de VL de referencia es la SEQ ID NO: 28, 34 o 40.

En otra modalidad, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado que comprende, consiste esencialmente en o consiste en un ácido nucleico que codifica una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina (VL) donde las regiones VL-CDR1, VL-CDR2 y VL-CDR3 tienen secuencias de polipéptidos que son idénticas a los grupos VL-CDR1, VL-CDR2 y VL-CDR3 mostrados en la Fig.l, salvo por uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez sustituciones de aminoácidos en cualquiera de las VL-CDR. En determinadas modalidades, las sustituciones de aminoácidos son conservadoras. En una modalidad, la secuencia de aminoácidos de la CDR1 de VL es la SEQ ID NO: 26, 32 o 38; la secuencia de aminoácidos de la CDR2 de VL es la SEQ ID NO: 27, 33 o 39; y la secuencia de aminoácidos de la CDR3 de VL es la SEQ ID NO: 28, 34 o 40.

En otra modalidad, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado que comprende, consiste esenciálmente en o consiste en un ácido nucleico que codifica una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina (VH) donde las regiones VH-CDR1, VH-CDR2 y VH-CDR3 tienen secuencias de polipéptidos que son idénticas a los grupos VH-CDR1, VH-CDR2 y VH-CDR3 mostrados en la Fig.l. En una modalidad, la secuencia de aminoácidos de la CDR1 de VH es la SEQ ID NO: 23, 29 o 35; la secuencia de aminoácidos de la CDR2 de VH es la SEQ ID NO: 24, 30 o 36; y la secuencia de aminoácidos de la CDR3 > de VH es la SEQ ID NO: 25, 31 o 37.

En otra modalidad, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado que comprende, consiste esencialmente en o consiste en n ácido nucleico que codifica una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina (VL) donde las regiones VL-CDR1, VL-CDR2 y VL-CDR3 tienen secuencias de polipéptidos que son idénticas a los grupos VL-CDR1, VL-CDR2 y VL-CDR3 mostrados en la Fig.l. En una modalidad, la secuencia de aminoácidos de la CDR1 de VL es la SEQ ID NO: 26, 32 o 38; la secuencia de aminoácidos de la CDR2 de VL es la SEQ ID NO: 27, 33 o 39; y la secuencia de aminoácidos de la CDR3 de VL es la SEQ ID NO : 28 , 34 o 40.

Como es sabido en la técnica, "identidad de secuencia" entre dos polipéptidos o dos polinucleótidos se determina por la comparación de la secuencia de aminoácido o ácido nucleico de un polipéptido o polinucleótido con la secuencia de un segundo polipéptido o polinucleótido. Cuando se discute en la presente, si un polipéptido particular es al menos alrededor de 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% o 95% idéntico a otro polipéptido se puede determinar usando métodos y programas de computadora/software conocidos 1 en la técnica tal como, de modo no taxativo, el programa BESTFIT ( isconsin Sequence Analysis Package, Versión 8 para1 Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711) . BESTFIT usa el algoritmo de homología local de Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics 2 (1981) , 482-489, para encontrar el mejor segmento de homología entre las dos secuencias. Cuando se usa BESTFIT o cualquier otro programa de alineación de secuencia para determinar si una secuencia particular es, por ejemplo, 95% idéntica a una secuencia de referencia de acuerdo con la presente invención, los parámetros se fijan, claro está, de forma tal que el porcentaje de identidad se calcula sobre la longitud completa de la secuencia de polipéptido de referencia y se permiten las brechas en la homología de hasta 5% del número total de aminoácidos en la secuencia de referencia.

En una modalidad de la presente invención, el polinucleótido comprende, consiste esencialmente en o consiste en un ácido nucleico que tiene una secuencia de polinucleótido de región VH o VL de un anticuerpo anti-tau como se representa en la Tabla 2. En este sentido, el experto en la técnica comprenderá fácilmente que los polinucléótidos que codifican al menos el dominio variable de la cadena ligera y/o pesada pueden codificar el dominio variable de ambas cadenas de inmunoglobulina o solo de una. La presente invención también proporciona un polinucleótido que comprende o consiste en una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID: 93.

Tabla 2 : Las secuencias de nucleótidos de la región VH y VL de anticuerpos específicos de tau.

Anticue Las secuencias de nucleótidos de las cadenas ligera rpo (VL) variable y pesada variable (VH) NI- gaggtgcagctggtggagtctgggggaggcttggtccagcctgggggatccct 105 4E4 gaaactctcctgtgcagcctctgggttcaatttcaacatctctgctatacact -VH SEQ gggtccgccaggcttccgggaaagggctggagtgggttggccgaataagaagt ID NO: aaatctcacaattacgcgactttatatgctgcgtccctgaaaggccggttcac 8 cctctccagagatgattcaaggaacacggcgtatctgcaaatgagcagcctgc aaaccgaggatatggccgtctattactgtactgttctgagtgcgaattacgac acctttgactactggggccagggaaccctggtcaccgtctcctcg NI- tcctatgagctgactcagccaccctcggtgtcagtgtccccaggacagacggc 105 4E4 caggatctcctgctttggagatacattgccaaagcaatatactta tggtatc -vL SEQ agcagaagcctggccaggcccctgtgttagtgatttataaagacactgagagg ID NO: ccctcagggatccccgagcgattctctggctccagctcagggacaacagtcac 10 cttgaccatcagtggagtccaggcagaagacgaggctgacta tactgtctat En una modalidad, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en un ácido nucleico que codifica una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, alrededor de 97%, 98%, o 99% o 95% idéntica a la VH de cadena pesada de referencia. En una modalidad, la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada de referencia es la SEQ ID NO : 9, 13, 17 o 93.

En una modalidad, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en un ácido nucleico que codifica una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, alrededor de 97%, 98%, o 99% o 95% idéntica a la VL de cadena ligera de referencia. En una modalidad, la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera de referencia es la SEQ ID NO: 11, 15 o 19.

La presente invención también incluye fragmentos de los polinucleótidos de la invención, tal como se describe en otra parte. Además, los polinucleótidos que codifican los polinucleótidos de fusión, fragmentos Fab y otros derivados, tal como se describe en la presente también están contemplados por la invención.

Los polinucleótidos se pueden producir o fabricar por cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, si la secuencia de nucleótidos del anticuerpo es conocida, un polinucleótido que codifica el anticuerpo se debe armar a partir de oligonucleó idos químicamente sintetizados, por ej . , como se describe en Kutmeier et ál . , BioTechniques 17 (1994), 242, que brevemente implica la síntesis de oligonucleótidos solapantes que contienen porciones de la secuencia que codifica el anticuerpo, fusión y ligación de esos oligonucleótidos y luego amplificación de los oligonucleótidos ligados por PCR.

De manera alternativa, un polinucleótido que codifica un anticuerpo, o fragmento de unión al antígeno o derivado de este se puede generar de ácido nucleico a partir de una fuente adecuada. Si un clon que contiene un ácido nucleico que codifica un anticuerpo particular no está disponible, pero la secuencia de la molécula del anticuerpo es conocida, un ácido nucleico que codifica el anticuerpo puede sintetizarse químicamente u obtenerse de una fuente adecuada (por ej . , una biblioteca de ADN complementario de anticuerpo o una biblioteca de ADN complementario generada a partir de ácido nucleico, preferentemente poliA+ ARN, aislada de cualquier tejido o célula que expresa el anticuerpo específico de tau, tal como células de hibridoma seleccionadas para expresar un anticuerpo) por amplificación por PCR usando cebadores sintéticos hibridizables á los extremos 31 y 5 ' de la secuencia o por medio de la clonación usando una sonda de oligonucleótido específica para la secuencia de gen particular para identificar, por ej . , un clon de ADNc a partir de una biblioteca de ADNc que codifica el anticuerpo. Los ácidos nucleicos amplificados , generados por PCR luego se pueden clonar en vectores de clonación reproducidos usando cualquier método bien conocido en la técnica.

Una vez que se determina la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácido correspondiente del anticuerpo o fragmento de unión al antígeno, variante o derivado de este, su secuencia de nucleótidos se puede manipular usando métodos bien conocidos en la técnica para la manipulación de las secuencias de nucleótido, por ej . , técnicas de ADN recombinante , mutagénesis dirigida al sitio, PCR, etc. (véase, por ejemplo, las técnicas descritas en Sambrpok et ál . , Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. ; (1990) y Ausubel et ál . , eds . , Current Protocole in Molecular Biology, John iley & Sons, NY (1998) , que se incorporan a la presente mediante esta referencia en sus totalidades) , para generar anticuerpos que tienen diferentes secuencias de aminoácidos, por ejemplo para crear sustituciones, eliminaciones y/o inserciones de aminoácido.

IV. Expresión de Polipeptidos de Anticuerpo Luego de la manipulación del material genético aislado para proporcionar anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno, variantes o derivados de este de la invención, los polinucleótidos que codifican anticuerpos se insertan típicamente en un vector de expresión para la introducción en células hospedadoras que se pueden usar para producir la cantidad deseada de anticuerpo. La expresión recombinante de un anticuerpo o fragmento, derivado o análogo de este, por ej . , una cadena pesada o ligera de un anticuerpo que se une a una molécula diana se describe en la presente. Una vez que se ha obtenido un polinucleótido que codifica una molécula de anticuerpo o una cadena pesada o ligera de un anticuerpo o porción de este (que preferentemente contiene el dominio variable de cadena pesada o ligera) de la invención, el vector para la producción de la molécula de anticuerpo se puede producir por tecnología de ADN recombinante usando técnicas bien conocidas en la técnica. Por lo tanto, los métodos para preparar una proteína por la expresión ,de un polinucleótido que contiene un anticuerpo que codifica una secuencia de nucleótidos se describen en la presente. Los métodos que son bien conocidos para los expertos en la técnica se pueden usar para construir vectores de expresión que contienen secuencias de codificación de anticuerpos y señales de control transcripcional y traduccional adecuadas. Estos métodos incluyen, por ejemplo, técnicas de, ADN recombinante in vifcro, técnicas sintéticas y recombinación genética in vivo. La invención, por lo tanto, proporciona vectores replicables que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica una molécula de anticuerpo de la invención o una cadena pesada o ligera de este, o un dominio variable de cadena pesada o ligera, unidos operativamente a un promotor. Tales vectores pueden incluir la secuencia de nucleótidos que codifica la región constante de la molécula de anticuerpo (véase, por ej . , solicitudes internacionales WO 86/05807 y WO 89/01036 y patente estadounidense n° 5,122,464) y el dominio variable del anticuerpo se puede clonar en uno de estos vectores para la expresión de toda la cadena pesada o ligera.

El término "vector" o "vector de expresión" se usa en la presente para hacer referencia a vectores usados de acuerdo con la presente invención como un vehículo para introducir y expresar un gen deseado en una célula hospedadora. Como ya saben los expertos en la técnica,' tales vectores se pueden seleccionar fácilmente a partir del grupo que consiste en plásmidos, fagos, virus y retroyirus . En general, los vectores compatibles con la presente invención comprenderán un marcador de selección, sitios de restricción adecuados para facilitar la clonación del gen deseado y la capacidad de ingresar en células eucariotas o procariotas y/o replicarlas. A los efectos de esta invención se pueden emplear numerosos sistemas de vector de expresión. Por ejemplo, una clase de vector utiliza elementos de ADN que provienen de virus animales tales como virus de papiloma bovino, virus de polioma, adenovirus, virus vaccinia, baculovirs, retrovirus, (RSV, MMTV o MO LV) o virus SV40. Otros implican el uso de sistemas policistrónicos con sitios de unión a ribosomas internos. Además, las células que tienen el ADN integrado en sus cromosomas se pueden seleccionar introduciendo uno o más marcadores que permiten la selección de células hospedadoras transfectadas . El marcador puede proporcionar prototrofía a un hospedador auxotrófico, resistencia a biocidas (por ej . , antibióticos) o resistencia a metales pesados, tales como el cobre. El gen marcador seleccionable puede estar unido directamente a las secuencias de ADN para expresarse o introducirse en la misma célula por co-transformación . Los elementos adicionales también se pueden necesitar para la síntesis óptima de ARNm. Estos elementos pueden incluir secuencias de señal, secuencias de empalme, así como promotores transcripcionales , potenciadores y señales de terminación.

En modalidades particulares, los genes de región variable clonados se insertan en un vector de expresión junto con los genes de región constante de cadena pesada y ligera (por ej . , genes de región constante de cadena pesada y ligera humanos) tal como se describe anteriormente. En una modalidad, esto se realiza usando un vector de expresión patentado de Biogen IDEC, Inc., conocido como NEOSPLA, descrito en la patente estadounidense n° 6,159,730. Este vector contiene el promotor/potenciador de citomegalovirus , el promotor principal de beta globina de ratón, el origen SV40 de replicación, la secuencia de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina, exon 1 y exon 2 de fosfotransferasa de neomicina, el gen dihidrofolato reductasa y la secuencia líder. Se ha encontrado que este vector da como resultado un nivel muy alto de expresión de anticuerpos tras la incorporación de genes de región variable y constante, la transfección de células CHO, seguido por selección en G418 que contiene medio y amplificación de metotrexato. Desde luego, en la presente invención se puede usar cualquier vector de expresión que sea capaz de elicitar expresión en células eucariotas . Los ejemplos de vectores adecuados incluyen, de modo no taxativo, plásmido pcDNA3 , pHCMV/Zeo, pCR3.1, pEFl/His, pIND/GS, pRc/HCMV2, pSV40/Zeo2, pTRACER-HCMV, pUB6/V5-His, pVAXl y pZeoSV2 (disponibles de Invitrogen, San Diego, CA) y plásmido pCI (disponible de Promega, Madison, WI) . En general, la exploración de altos números de células transformadas para aquellas que expresan niveles adecuadamente superiores si las cadenas pesada y liviana de inmunoglobulina es experimentación de rutina que se puede llevar a cabo, por ejemplo, por sistemas robóticos. Los sistemas de vector también se enseñan en las patente estadounidense n° 5,736,137 y 5,658,570, cada una de las cuales se incorporan mediante esta referencia en su totalidad en la presente. El sistema proporciona altos niveles de expresión, por ej . , > 30 pg/célula/día . Otros ejemplos de sistemas de vector se describen, por ej . , en la patente estadounidense n° 6,413,777.

En otras modalidades, los anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno, variantes o derivados de los mismos, de la invención se pueden expresar usando construcciones policistrónicas tales como las descritas en la solicitud de publicación de patente estadounidense n° 2003-0157641 Al y se incorpora en la presente en su totalidad. En estos si'stemas de expresión, los productos de múltiples genes tales como cadenas pesada y ligera de anticuerpos se pueden producir a partir de una construcción policistriónica simple. : Estos sistemas ventajosamente usan un sitio interno de entrada al ribosoma (IRES, por sus siglas en inglés) para proporcionar niveles relativamente altos de anticuerpos. Las secuencias IRES compatibles se describen en la patente estadounidense n° 6,193,980 que también se incorpora a la presente. Los expertos en la técnica comprenderán que tales sistemas de expresión se pueden usar para producir efectivamente el intervalo completo de anticuerpos descritos en la presente solicitud.

Más generalmente, una vez que se ha preparado el vector o secuencia de ADN que codifica una subunidad monomérica del anticuerpo, el vector de expresión se puede introducir en una célula hospedadora apropiada. La introducción del plásmido en la célula hospedadora se puede lograr por varias técnicas bien conocidas para los expertos en la técnica. ' Estas incluyen, de modo no taxativo, transfección incluyendo lipotransfección usando, por ejemplo, Fugene® o lipofectamina, fusión protoplástica, precipitación de fosfato de calcio, fusión celular con ADN cubierto, microinyección e infección con virus intacto. Típicamente, la introducción del plásmido en el hospedador es por medio de método estándar de co-precipitación de fosfato de calcio. Las células hospedadoras que alojan la construcción de expresión se cultivan en condiciones adecuadas para la producción de cadenas ligeras y cadenas pesadas y se ensayan para síntesis de proteína de cadena pesada y/o ligera. Los ejemplos de técnicas de ensayo incluyen ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) , radioinmunoensayo (RIA) , de análisis de distribuidor celular activado por fluorescencia (FACS) , inmunohistoquímica y similares.

El vector de expresión se transfiere a una célula hospedadora por técnicas convencionales y las células transíectadas luego se cultivan por técnicas convencionales para producir un anticuerpo para uso en los métodos descritos en la presente. Por lo tanto, la invención incluye células hospedadoras que contienen un polinucleótido que codifica un anticuerpo de la invención, o una cadena pesada o ligera de esta, unida operativamente a un promotor heterólogo. En modalidades particulares para la expresión de anticuerpos de cadena doble, los vectores que codifican tanto la cadena pesada como la ligera se pueden co-expresar en la célula hospedadora para la expresión de molécula de inmunoglobulina entera, como se detalla a continuación.

La célula hospedadora puede co-transfectarse con dos vectores de expresión de la invención, el primer vector codifica un polipéptido que proviene de una cadena pesada y el segundo vector que codifica un polipéptido que proviene de una cadena ligera. Los dos vectores pueden contener marcadores seleccionables idénticos que permiten una expresión igual de polipéptidos de cadena pesada y ligera. De manera alternativa, se puede usar un único vector que codifica tanto los polipéptidos de cadena pesada como los de ligera. En tales situaciones, la cadena ligera se ubica ventajosamente antes de la cadena pesada para evitar un exceso de cadena pesada libre tóxica, véase, Proudfoot, Nature 322 (1986), 52; Kohler, Proc . Nati. Acad. Sci . EUA 77 (1980), 2197. Las secuencias de codificación para las cadenas pesada y ligera pueden comprender ADNc o ADN genómico.

Tal como se usa en la presente, "célula hospedadora" se refiere a una célula que alberga vectores construidos usando técnicas de ADN recombinante y codificando al menos un gen heterólogo. En las descripciones de procesos para el aislamiento de anticuerpos a partir de hospedadores recombinantes , los términos "célula" y "cultivo celular" se usan de manera intercambiable para indicar la fuente de anticuerpo a menos que se especifique claramente lo contrario. En otras palabras, la recuperación de polipéptidos desde las "células" puede significar desde células enteras centrifugadas o desde el cultivo celular que contiene tanto el medio como las células suspendidas.

Se puede utilizar una variedad de sistemas de vector de expresión de hospedador para expresar moléculas de anticuerpo para uso en los métodos descritos en la presente. Tales sistemas de expresión de hospedador representan vehículos por los cuales las secuencias de codificación de interés se pueden producir y posteriormente purificar pero también representan células que pueden, cuando se las transforma o transfecta con las secuencias de codificación de nucleótido adecuadas, expresar una molécula de anticuerpo de la invención in si u. Estos incluyen de modo no taxativo microorganismos tales como bacterias (por ej . , E. coli, B. subtilis) transformadas con vectores de expresión de ADN bacteriófago recombinante, ADN plásmido o ADN cósmido que contiene secuencias de codificación de anticuerpos; levadura (por ej . , Saccharomyces, Pichia) transformadas con vectores de expresión de levadura recombinantes que contienen secuencias de codificación de anticuerpos, sistemas celulares de insectos infectados con vectores de expresión de, virus recombinantes (por ej . , baculovir) que contienen secuencias de codificación de anticuerpos; sistemas de células vegetales infectados con vectores de expresión de virus recombinante (por ej . , virus de mosaico de coliflor, CaMV; virus de mosaico de tabaco, TMV) o transformados con vectores de expresión de plásmido recombinante (por e . , plásmido Ti) que contiene secuencias de codificación de anticuerpo o sistemas celulares de mamíferos (por ej . , células COS, CHO, NSO, BLK, 293, 3T3) que albergan construcciones de expresión recombinante que contiene promotores derivados del genóma de células de mamífero (por ej . , promotor de metalotioneina) o de virus de mamífero (por ej . , el promotor tardío del adenovirus, el promotor 7.5K del virus vaccinia) . En una modalidad, las células bacterianas tales como Escherichia coli y más preferentemente, células eucariotas, especialmente para la expresión de molécula de anticuerpo recombinante entera se usan para la expresión de una molécula de anticuerpo recombinante. Por ejemplo, las células de mamífero tales como células de ovario de hámster chino (CHO, por sus siglas en inglés) junto con un vector tal como el elemento promotor temprano de gen intermedio del citomegalovirus humano es un sistema de expresión eficaz para los anticuerpos, véase, por ej . , Foecking et ál . , Gene 45 (1986), 101; Cockett et ál . , Bio/Technology 8 (1990), 2.

La línea celular hospedadora usada para la expresión de proteína es generalmente de origen mamífero, los expertos en la técnica tienen la capacidad de determinar líneas celulares hospedadoras particulares que son más aptas para el producto del gen deseado a ser expresado en la presente. Los ejemplos de líneas celulares hospedadoras incluyen de modo no taxativo, CHO (ovario de hámster chino) , DG44 y DUXB11 (líneas de ovario de hámster chino, DHFR menos) , HELA (carcinoma cervical humano) , CVI (línea de riñon de mono) , COS (un derivado de CVI con antígeno SV40 T) , VERY, BKH (riñon de hámster bebé) , DCK, WI38, R1610 (fibroblasto de hámster chino) , BALBC/3T3 (fibroblasto de ratón) , HAK (línea de riñon de hámster), SP2/0 (mieloma de ratón), P3x63 -Ag3.653 (mieloma de ratón) , BFA-lclBPT (células endoteliales bovinas) , RAJI (linfocito humano) y 293 (riñon humano) . En una modalidad específica, las líneas celulares hospedadoras son CHO o 293. Las líneas celulares hospedadoras normalmente se encuentran disponibles en servicios comerciales, American Tissue Culture Collection o en la bibliografía publicada.

Además, se puede elegir una cepa de célula hospedadora que modula la expresión de las secuencias insertadas o modifica y procesa el producto del gen en la forma específica deseada. Tales modificaciones (por ej . , glicosiláción) y procesamiento (por ej . , escisión) de productos de proteína pueden ser importantes para la función de la proteína. Las células hospedadoras diferentes tienen características y mecanismos específicos para el proceso y modificación post-traduccional de proteínas y productos genéticos. Las líneas celulares o sistemas hospedadoras apropiadas se pueden elegir para asegurar la modificación correcta y procesamiento de la proteína extraña. Con este fin, se pueden usar las células hospedadoras eucariotas que poseen la maquinaria celular para el procesamiento adecuado de la transcripción primaria, glicosilación y fosforilación del producto del gen.

Para la producción a largo término, de alto rendimiento de proteínas recombinante se prefiere la expresión estable. Por ejemplo, se pueden diseñar las líneas celulares que expresan establemente la molécula de anticuerpo. En vez de usar los vectores de expresión que contienen orígenes virales de replicación, las células hospedadoras se pueden transformar con ADN controlado por elementos de control de expresión adecuada (por ej . , promotor, potenciador, secuencias, terminadores de transcripción, sitios de poliadenilación, etc.) y un marcador seleccionable . Luego de la introducción del ADN extraño, las células modificadas se pueden dejar crecer durante 1-2 días en un medio enriquecido y luego se cambian a un medio selectivo. El marcador seleccionable en el plásmido recombinante otorga resistencia a la selección y permite que las células integren establemente al plásmido en sus cromosomas y crezcan para formar focos que a su vez se pueden clonar y expandir en líneas celulares. Este método puede usarse ventajosamente para diseñar líneas celulares que expresan establemente la molécula de anticuerpo.

Un número de sistemas de selección se pueden usar, incluyendo, de modo no taxativo, la timidina quinasa del virus del herpes simple (Wigler et ál . , Cell 11 (1977), 223), fosforribosiltransfera de hipoxantina-guanina (Szybalska & Szybalski, Proc Nati. Acad. Sci. EUA, 48 (1992), 202) y fosforribosiltransferasa de adenina (Lowy et ál . , Céll 22 (1980), 817) se pueden emplear en células tk-, hgprt- o aprt-respectivamente . Además, la resistencia anti-metabolito se puede usar como la base de selección de los siguientes genes: dhfr que otorga resistencia al metotrexato (Wigler et ál . , Nati. Acad. Sci. EUA 77 (1980), 357; 01 Haré et ál . , Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, 78 (1981), 1527); gpt, que otorga resistencia al ácido micofenólico ( ulligan & Berg, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, 78 (1981), 2072); neo, que otorga resistencia a aminoglicósido G-418 Goldspiel et ál . , Clinical Pharmacy 12 (1993), 488-505; Wu and Wu, Biotherapy 3 (1991), 87-95; Tolstoshev, Ann . Rev. Pharmacol . Toxicol . 32 (1993), 573-596; Mulligan, Science 260 (1993), 926-932 y Morgan and Anderson, Ann. Rev. Biochem. 62 (1993), 191-217; TIB TECH 11 (1993) , 155-215 e higro, que otorga resistencia a la higromicina (Santerre et al., Gene 30 (1984), 147. Los métodos comúnmente conocidos en la técnica de la tecnología de ADN recombinante que se pueden usar se describen en Ausubel et ál . (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993) ; Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990) y en los Capítulos 12 y 13, Dracopoli et ál . (eds), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994); Colberre-Garapin et ál . , J. Mol. Biol . 150:1 (1981), que se incorporan a la presente mediante esta referencia en su totalidad.

Los niveles de expresión de una molécula de anticuerpo se puede aumentar por amplificación de vectores, por una revisión, véase Bebbington and Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression óf cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Academic Press, Nueva York, Vol . 3. (1987) . Cuando un marcador en el anticuerpo que expresa sistema de vector es amplificable , el aumento en el nivel del inhibidor presente en el cultivo de una célula hospedadora aumentará el número de copias del gen marcador. Debido a que la región amplificada está asociada con el gen del anticuerpo, la producción del anticuerpo también aumentará; véase Crouse et al., Mol. Cell . Biol. 3 (1983) , 257) .

La producción in vi tro permite que el aumento dé grandes cantidades proporcione los polipéptidos deseados. En la técnica se conocen técnicas de cultivo de células de mamíferos en condiciones de cultivo de tejidos e incluyen el cultivo de suspensiones homogéneas, por ej . , en un reactor aerotransportado o en un reactor de agitación continuo o el cultivo celular inmovilizado o atrapado, por ej . , en fibras huecas, microcápsulas , en microperlas de agarosa o cartuchos de cerámica. Si se necesita y/o desea, las soluciones de los polipéptidos se pueden purificar mediante los métodos de cromatografía habituales, por ejemplo filtración de gel, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía sobre celulosa DEAE o cromatografía por ( inmuno) afinidad, por ej . , antes de la biosíntesis preferencial de un polipéptido de región bisagra sintética o antes o después del paso de la cromatografía HIC descritos en la presente.

Los genes que codifican anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno, variantes o derivados de los mismos de la invención también se pueden expresar en células no de mamíferos tales como células de bacterias, insectos, levaduras o vegetales. Las bacterias que absorben fácilmente los ácidos nucleicos incluyen miembros de enterobacteriaceae , tal como cepas de Escherichia coli o Salmonella; Bacillaceae, tales como Bacillus subtilis; Pneumococcus; Streptócoccus y Haemophilus influenzas. También se comprenderá que, cuando se expresan en bacterias, los polipéptidos heterólogos típicamente se vuelven parte de los cuerpos de inclusión. Los polipéptidos heterólogos se deben aislar, purificar y luego ensamblar en moléculas funcionales. En los casos en que se deseen formas tetravalentes de anticuerpos, las subunidades se auto-ensamblarán en anticuerpos tetravalentes, véase, por ej . , solicitud internacional O02/096948.

En los sistemas bacterianos, un número de vectores de expresión se pueden seleccionar ventajosamente dependiendo del uso pretendido de la molécula de anticuerpo que se está expresando. Por ejemplo, cuando se debe producir una gran cantidad de la proteína, para la generación de composiciones farmacéuticas de una molécula de anticuerpo, se pueden desear vectores que dirigen la expresión de altos niveles de productos de proteína de fusión que son fácilmente purificados. Tales vectores incluyen de modo no taxativo el vector de expresión de E. coli pUR278 (Ruther et ál . , EMBO J. 2 (1983) , 1791) en el cual la secuencia de codificación del anticuerpo se puede ligar individualmente en el vector en marco con la región codificante lacZ de forma tal que se produce una proteína de fusión; vectores pIN (Inouye & Inouye, Nucleic Acids Res. 13 (1985), 3101-3109; Van Heeke & Schuster, J. Biol . Chem. 24 (1989), 5503-5509) y similares. Los vectores pGEX también se pueden usar para expresar polipéptidos extraños como proteínas de fusión con S- transferasa de glutationa (GST, por sus siglas en inglés) . En general, tales proteínas de fusión son solubles y se pueden purificar fácilmente a partir de células Usadas por absorción y unión a una matriz de perlas de glutationa-agarosa seguido por elución en presencia de la glutationa libre. Los vectores pGEX se diseñan para incluir trombina o sitios de escisión de proteasa de factor Xa de forma tal que el producto del gen diana clonada se pueda liberar del resto GST.

Además de los procariotas, también se pueden usar microbios eucariotas. Saccharomyces cerevisiae, o levadura de panadero común es la más comúnmente usada entre microorganismos eucariotas pese a que un número de otras cepas están comúnmente disponibles, por ej . , Pichia pastoris. Para la expresión en Saccharomyces, comúnmente se usa el YRp7 plásmido, por ejemplo, (Stinchcomb et ál . , Nature 282 (!l979) , 39; Kingsman et ál . , Gene 7 (1979), 141; Tschemper et ál . , Gene 10 (1980) , 157) . El plásmido ya contiene el gen TRPl que proporciona un marcador de selección para una cepa mutahte de levadura que no tiene la capacidad de crecimiento en triptófano, por ejemplo, ATCC No. 44076 o PEP4-1 (Jones, Genetics 85 (1977) , 12) . La presencia de la lesión trpl como una característica del genoma de célula hospedadora de levadura proporciona un entorno eficaz para detectar la transformación por crecimiento en la ausencia de triptófano.

En un sistema de insecto, el virus polihedrosis nuclear Autographa californica (AcNPV) se usa típicamente como un vector para expresar genes extraños. El virus crece en células Spodoptera frugiperda . La secuencia de codificación de anticuerpo se puede clonar de forma individual en regiones no esenciales (por ejemplo, el gen de poliedrina) del virus y colocar bajo el control de un promotor de AcNPV (por ejemplo, el promotor de poliedrina) .

Una vez que una molécula de anticuerpo de la invención fue expresada recombinantemente , todos los anticuerpos, sus dímeros, las cadenas pesada y ligera individuales, u otras formas de inmunoglobulina de la presente invención, se pueden purificar de acuerdo con procedimientos estándar de la técnica, por ejemplo, por cromatografía (por ej . , intercambio iónico, afinidad, particularmente por afinidad a un antígeno específico luego de la Proteína A, y cromatografía en columna por tamaño) , centrifugación, solubilidad diferencial, por ej . , precipitación de sulfato de amonio, o por cualquier otra técnica estándar para la purificación de proteínas, véase, por ej . , Scopes, "Protein Purification" , Springer Verlag, N.Y. (1982) . De manera alternativa, se describe otro método para aumentar la afinidad de anticuerpos de la invención en la publicación de patente estadounidense 2002-0123057 Al.

V. Proteínas de fusión y conjugados En algunas modalidades, el polipéptido de anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos o una o más porciones normalmente no asociadas con un anticuerpo. Los ejemplos de modificaciones se describen en más detalle a continuación. Por ejemplo, un fragmento de anticuerpo fv de cadena simple de la invención puede comprender una secuencia enlazadora flexible, o se puede modificar para agregar una porción funcional (por ej . , PEG, un fármaco, una toxina o una etiqueta tal como una fluorescente, radioactiva, enzima, magnética nuclear, metal pesado y similares) .

Un polipéptido de anticuerpo de la invención puede comprender, consistir esencialmente en o consistir en una proteína de fusión. Las proteínas de fusión son moléculas quiméricas que comprenden, por ejemplo, un dominio de unión a tau de inmunoglobulina con al menos un sitio de unión diana, y al menos una porción heteróloga, es decir, una porción con la cual no está naturalmente enlazado en la naturaleza. Las secuencias de aminoácido pueden existir normalmente en proteínas separadas que se juntan en el polipéptido de fusión o pueden existir normalmente en la misma proteína pero están situadas en un nuevo arreglo en el polipéptido de fusión. Las proteínas de fusión se pueden crear, por ejemplo, mediante síntesis química, o mediante la creación y traducción de un polinucleótido en el que se codifican las regiones del péptido en la relación deseada.

El término "heterólogo" tal como se aplica a un polinucleótido o a un polipéptido, significa que el polinucleótido o polipéptido proviene de una entidad distinta de aquella del resto de la entidad a la que se compara. Por ejemplo, tal como se usa en la presente, un polipéptido heterólogo" a ser fusionado a un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno, variante o análogo de este proviene de un polipéptido no de inmunoglobulina de la misma especie, o un polipéptido de inmunoglobulina o no de inmunoglobulina de una especie diferente.

Tal como se discute en más detalle en la presente, los anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno, variantes o derivados de los mismos de la invención pueden adicionalmente fusionarse recombinantemente a un polipéptido heterólogo en el N-terminal o C o conjugarse químicamente (incluyendo conjugaciones covalentes o no covalentes) a polipéptidos u otras composiciones. Por ejemplo, los anticuerpos se pueden fusionar recombinantemente o conjugarse a moléculas útiles como etiquetas en ensayos de detección y moléculas efectoras tales como polipéptidos heterólogos, fármacos, radionúclidos o toxinas; véase, por ej . , solicitudes internacionales WO92/08495; W091/14438; W089/12624; patente estadounidense N° 5,314,995; y solicitud de patente europea EP 0 396 387.

Los anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno, variantes o derivados de estos de la invención pueden estar compuestos por aminoácidos unidos entre sí por enlaces peptídicos o enlaces peptídicos modificados, es decir, isoésteres péptidicos, y pueden contener aminoácidos distintos de aminoácido codificados con el gen 20/20 ¡genes. Los anticuerpos se pueden modificar mediante procesos naturales, tales como procesamiento postraduccional o mediante técnicas de modificación química que son conocidas en la técnica. Tales modificaciones están bien descritas en textos básicos y en monografías más detalladas, así como también en bibliografía de investigación extensa. Las modificaciones pueden ocurrir en cualquier lugar del anticuerpo, incluyendo la estructura principal del péptido, las cadenas laterales de aminoácidos y los extremos amino o carboxilo, o en porciones tales como carbohidratos. Se comprenderá que el mismo tipo de modificación puede estar presente en igual grado o distintos grados en diversos sitios de un anticuerpo dado. También, un anticuerpo dado puede contener varios tipos de modificaciones. Los anticuerpos se pueden ramificar, por ejemplo, como un resultado de ubiquitinación, y luego pueden ser cíclicos, con o sin ramificación. Los anticuerpos cíclicos, ramificados y cíclicos ramificados pueden resultar de procesos naturales de postraducción o se pueden realizar por métodos sintéticos. Las modificaciones pueden incluir acetilación, acilación, ADP-ribosilación, amidación, enlace covalente de' flavina, enlace covalente de una porción hemo, enlace covalente de un nucleótido o derivado de nucleótido, enlace covalente de un lípido o derivado de lípido, enlace covalente de fosfotidilinositol , reticulación, ciclización, formación de enlace de disulfuro, desmetilación, formación de reticulaciones covalentes, formación de cisteína, formación de piroglutamato, formilación, gamma-carboxilación, glicosilación, formación de ancla de GPI, hidroxilación, yodinación, metilación, miristoilación, oxidación, pegilación, procesamiento proteolítico, fosforilación, prenilación, racemización, selenoilación, sulfatación, adición mediada por ARN transferente de aminoácidos a proteínas tal como arginilación y ubiquitinación véase, por ej . , Proteins - Structure And Molecular Properties, ; T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, Nueva York 2a Ed. , (1993); Posttranslational Covalent Modification Of Proteins, B. C. Johnson, Ed. , Academic Press, Nueva York, pgs . 1-12 (1983); Seifter et ál . , Meth. Enzymol . 182 (1990), 626-646; Rattan et ál., Ann. NY Acad. Sci. 663 (1992), 48-62).

La presente invención también proporciona proteínas de fusión que comprenden un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno, variante o derivado de este, y un polipéptido heterólogo. En una modalidad, una proteína de fusión de la invención comprende, consiste esencialmente en o consiste en un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de una o más de las regiones VH de un anticuerpo de la invención o la secuencia de aminoácidos de una o más de las regiones VL de un anticuerpo de la invención o fragmentos o variantes de los mismos, y una secuencia de polipéptidos heterólogos . En otra modalidad, una proteína de fusión para uso en métodos de diagnóstico y tratamiento comprende, consiste esencialmente en o consiste en un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de una, dos, tres de las VH-CDR de un anticuerpo o fragmentos, variantes o derivados de este, o la secuencia de aminoácidos de una, dos, tres de las VL-Ct>R : de un anticuerpo o fragmentos, variantes o derivados de los mismos, y una secuencia de polipéptidos heterólogos. En una modalidad, la proteína de fusión comprende un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácido de un VH-CDR3 de un anticuerpo de la presente invención, o un fragmento, dérivado o variante de este, y una secuencia de polipéptidos heterólogos, cuya proteína de fusión se une específicamente a tau. En otra modalidad, una proteína de fusión comprende un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de al menos una región VH de un anticuerpo de la invención o la secuencia de aminoácidos de al menos una región VL de un anticuerpo de la invención o fragmentos, derivados o variantes de los mismos, y una secuencia de polipéptidos heterólogos. En una modalidad, las regiones VH y VL de las regiones de proteína de fusión corresponden a un anticuerpo de única fuente (o fragmento scFv o Fab) que se une específicamente a tau. En aun otra modalidad, una proteína de fusión para uso en métodos de diagnóstico y tratamiento descritos en la presente comprende un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de una, dos, tres o más de las VH-CDR de un anticuerpo y la secuencia de aminoácidos de una, dos, tres o más de las VL-CDR de un anticuerpo o fragmentos o variantes de los mismos, y una secuencia de polipéptidos heterólogos . En una modalidad, dos, tres, cuatro, cinco, seis o más de la(s) VH-CDR o VL-CDR corresponden a una anticuerpo de fuente simple/única (o fragmento scFv o Fab) de la invención. Las moléculas de ácido nucleico que codifican estas proteínas de fusión también se encuentran comprendidas por la invención.

Ejemplos de proteínas de fusión reportadas en la bibliografía incluyen fusiones de receptores de células T (Gascoigne efc ál . , Proc . Nati. Acad. Sci . USA 84 (1987), 2936-2940; CD4 (Capón et ál . , Nature 337 (1989), 525-531; Traunecker et ál . , Nature 339 (1989), 68-70; Zettmeissl et ál., DNA Cell Biol. USA 9 (1990), 347-353; and Byrn et ál . , Nature 344 (1990) , 667-670) ; L-selectina (receptor de alojamiento) (Watson et ál . , J. Cell. Biol. 110 (1990), 2221-2229; and Watson et ál . , Nature 349 (1991), 164-167); CD44 (Aruffo et ál . , Cell 61 (1990), 1303-1313); CD28 y B7 (Linsley et ál . , J. Ex . Med. 173 (1991) , 721-730) ; CTLA-4 (Lisley et ál . , J. Exp. Med. 174 (1991), 561-569); CD22 (Stamenkovic et ál . , Cell 66 (1991), 1133-1144); receptor TNF (Ashkenazi et ál . , Proc . Nati. Acad. Sci . USA 88 (1991), 10535-10539; Lesslauer et ál . , Eur. J. Immunol . 27 (1991), 2883-2886; and Peppel et ál . , J. Exp . Med. 174 (1991), 1483-1489 (1991); y receptor IgE a (Ridgway and Gorman, J. Cell. Biol. 115 (1991), Abstract No. 1448).

Tal como se discute en la presente, los anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno, variantes o derivados de los mismos de la invención se pueden fusionar a polipéptidos heterólogos para aumentar la semivida in vivo de los polipéptidos para usar en inmunoensayos usando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, en una modalidad, PEG se puede conjugar a los anticuerpos de la invención para aumentar su semivida in vivo; véase, por ej . , Leong et ál . , Cytokine 16 (2001), 106-119; Adv. in Drug Deliv. Rev. 54 (2002), 531; o eir et ál . , Biochem. Soc . Transactions 30 (2002) , 512. ' Además, los anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno, variantes o derivados de los mismos de la invención se pueden fusionar a secuencias de marcadoras, talés como un péptido para facilitar su purificación o detección. En modalidades particulares, la secuencia de aminoácidos marcadora es un péptido de hexa-histidina (HIS) , tal como la etiqueta proporcionada en un vector pQE (QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, Calif., 91311), entre otras, muchas de las cuales están comercialmente disponibles. Tal como se describe en Gentz et ál . , Proc . Nati. Acad. Sci. USA 86 (1989), 821-824, por ejemplo, la hexa-histidina proporciona una purificación conveniente de la proteína de fusión. Otras etiquetas de péptidos útiles para la purificación incluyen, de modo no taxativo, la etiqueta "HA", que corresponde a un epítopo derivado de la proteína influenza hemaglutinina ( ilson et ál . , Cell 37 (1984), 767) y la etiqueta "bandera".

Las proteínas de fusión se pueden preparar usando métodos que son conocidos en la técnica; véase por ejemplo patente estadounidense n° 5,116,964 y 5,225,538. El sitio preciso en el que se realiza la fusión puede seleccionarse empíricamente para optimizar las características de unión o secreción de la proteína de fusión. El ADN que codifica la proteína de fusión se transfecta luego a una célula hospedadora para expresión.

Los anticuerpos de la presente invención pueden usarse en forma no conjugada o se pueden conjugar para al menos una variedad de moléculas, por ej . , para mejorar las propiedades terapéuticas de la molécula, para facilitar la detección diana o para imagenología o tratamiento del paciente. Los anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno, variantes o derivados de los mismos de la invención se pueden etiquetar o conjugar antes o después de la purificación, cuando se lleva a cabo la purificación. En particular, los anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno, variantes o derivados de los mismos de la invención se pueden conjugar con agentes terapéuticos, profármacos, péptidos, proteínas, enzimas, virus, lípidos, modificadores de la respuesta biológica, agentes farmacéuticos o PEG.

Los conjugados que son inmunotoxinas incluyendo anticuerpos convencionales han sido muy descritos en la técnica. Las toxinas se pueden acoplar a los anticiuerpos mediante técnicas de acoplamiento convencionales o las porciones de toxina de proteínas que contienen inmunotoxinas se pueden producir como proteínas de fusión. Los anticuerpos de la presente invención también se pueden usar de , manera correspondiente para obtener las inmunotoxinas. Es ilustrativo de las inmunotoxinas lo descrito en Byers, Seminars Cell . Biol . 2 (1991), 59-70 y por Fanger, Immunol . Today 12 (1991), 51-54.

Los expertos en la técnica apreciarán que los conjugados también se pueden ensamblar usando; diversas técnicas dependiendo del agente seleccionado a ser conjugado. Por ejemplo, los conjugados con buitina se preparan por ej . al hacer reaccionar un polipéptido de unión a tau con un éster de biotina activado tal como el éster de biotina N-hidroxisuccinimida . De manera similar, los conjugados con un marcador fluorescente se puede preparar en presencia; de un agente de acoplamiento, por ej . , los enumerados en la presente, o mediante la reacción con un isotiocianato, o isotiocianato de fluoresceína . Los conjugados de los anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno, variantes o derivados de los mismos de la invención se preparan de ; manera análoga .

La presente invención comprende ' adicionálmente anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno, variantes o derivados de los mismos de la invención conjugados con un agente terapéutico o diagnóstico. Los anticuerpos se pueden usar como diagnóstico para, por ejemplo, demostrar la presencia de una enfermedad neurológica, para indicar el riesgo de contraer una enfermedad neurológica, para monitorear el desarrollo o evolución de una enfermedad neurológica, esto es, una taupatía, como parte de un procedimiento de prueba clínica para, por ej . , determinar la eficacia de un régimen de prevención y/o tratamiento dado. La detección se puede facilitar mediante el acoplamiento del anticuerpo o fragmento de unión al antígeno, variante o derivado de este a una sustancia detectable. Los ejemplos de sustancias detectables incluyen varias enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes , materiales radioactivos, metales emisores de positrones usando varias tomografías de emisión de positrones e iones de metales paramagnéticos no radioactivos; véase, por ej . , patente estadounidense n° 4,741,900 para iones de metales que se pueden conjugar para anticuerpos para uso como diagnósticos de acuerdo con la presente invención. Los ejemplos de enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa o acetilcolinesterasa; ejemplos de complejos de grupos prostéticos adecuados incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina ; ejemplos de materiales fluorescentes adecuados incluyen umbelliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína , cloruro de dansilo o ficoeritrina ; un ejemplo de un material luminescente incluye luminol; ejemplos de materiales bioluminescentes incluyen luciferasa, luciferina y aequorina; y ejemplos de materiales radioactivos adecuados incluyen 125I, 131I, 111In o 99Tc.

Un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno, variante o derivado de este también se puede etiquetar de manera detectable acoplándolo a un compuesto quimioluminiscente . La presencia del anticuerpo etiquetado quimioluminiscente se determina luego mediante la detección de la presencia de luminiscencia que surge durante el transcurso de una reacción química. Los ejemplos de compuestos con etiqueta quimioluminiscente particularmente útiles son luminol, isoluminol, éster de acridinio teromático, imidazol, sal de acridinio y éster de oxalato.

Una de las maneras en las que un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno, variante o derivado de este se puede etiquetar de manera detectable es mediante el enlace de este a una enzima y el uso del producto enlazado en un inmunoensayo de enzima (EIA, por sus siglas en inglés) (Voller, A. , "The Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) " Microbiological Associates Quarterly Publication, alkersville, Md. , Diagnostic Horizons 2 (1978) , 1-7) ; Voller et ál., J. Clin. Pathol . 31 (1978), 507-520; Butler, Meth. Enzymol. 73 (1981), 482-523; Maggio, E. (ed.), Enzyme Immunoassay, CRC Press, Boca Ratón, Fia., (1980); Ishikawa, E. et ál . , (eds.), Enzyme Immunoassay, Kgaku Shoin, Tokio (1981) . La enzima, que se une al anticuerpo reaccionará con un sustrato adecuado, preferentemente un sustrato cromogénico, de manera tal que produzca una porción química que se puede detectar, por ejemplo, por medios espectrofotométricos , fluorimétricos o visuales. Las enzimas que se pueden usar para etiquetar de manera detectable el anticuerpo incluyen, pe de modo no taxativo, malato deshidrogenasa , nucleasa estafilocóccica, delta- 5 -esteroide isomerasa, levadura alcohol deshidrogenasa, alfa-glicerofosfato, deshidrogenasa, triosa fosfato isomerasa, peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, asparaginasa, glucosa oxidasa, beta-galactosidasa, ribonucleasa, ureasa, catalasa, glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, glucoamilasa y acetilcolihesterasa .

Adicionalmente , la detección se puede lograr por métodos coloriraétricos que emplean un sustrato cromogénico para la enzima. La detección también se puede lograr; mediante comparación visual del grado de reacción enzimática de un sustrato en comparación con estándares preparados de manera similar.

La detección también se puede lograr usando cualquiera de una variedad de imnunoensayos . Por ejemplo, etiquetando de manera radioactiva el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno, variante o derivado de este, es posible detectar el anticuerpo mediante el uso de un radioinmunoensayo (RIA) (véase, por ejemplo, eintraub, B., Principies of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radiúligand Assay Techniques, The Endocrine Society, (Marzo, 1986)), que se incorpora a la presente mediante esta referencia) . El isótopo radioactivo se puede detectar por medios que incluyen, de modo no taxativo, un contador gamma, un contador de centelleo o autoradiografía .

Un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno, variante o derivado de este también se puede etiquetar de manera detectable usando metales emisores de fluorescencia tales como 15Eu u otros de la serie lantánida. Estos metales se pueden unir al anticuerpo usando tales grupos quelantes de metales como ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA) o ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) .

Las técnicas para conjugar varias porciones a un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno, variante o derivado de este son conocidos, véase, por ej . , Arnon et ál . , "Monoclonal Antibodies For Iramunotargeting Of Drugs In Cáncer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cáncer Therapy, Reisfeld et ál . (eds.), p . 243-56 (Alan R. Lissi, Inc. (1985); Hellstrom efe ál . , "Antibodies For Drug Delivery" , in Controlled Drug Delivery (2a Ed.), Robinson et ál . (eds.), Marcel Dekker, Inc., pp. 623-53 (1987); Thorpe, "Aritibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cáncer Therapy: A Review" , in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et ál. (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cáncer Therapy" , in Monoclonal Antibodies For Cáncer Detection And Therapy, Bald in et ál . (eds.), Academic Press pp. 303-16 (1985), y Thorpe et ál . , "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol . Rev. 62 (1982), 119-158.

Tal como se menciona, en algunas modalidades, se puede conjugar una porción que mejora la estabilidad o eficacia de una molécula de unión, por ej . , un polipéptido de unión, por ej . , un anticuerpo o fragmento inmunoespecífico de este. Por ejemplo, en una modalidad, PEG se puede conjugar con las moléculas de unión de la invención para aumentar su semivida in vivo. Leong et ál . , Cytokine 16 (2001), 106; Adv. in Drug Deliv. Rev. 54 (2002), 531; or Weir et ál . , Biochem. Soc . Transactions 30 (2002), 512.

VI. Composiciones y métodos de uso i La presente invención se refiere a composiciones que comprenden la molécula de unión de tau, por ej . , un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de este de la presente invención o derivado o variante de este del polinucleótido, vector o célula de la invención. La composición de la presente invención puede comprender adicionalmente un portador farmacéuticamente aceptable. Además, la composición farmacéutica de la presente invención puede comprender adicionalmente agentes tales como interleucinas o interferonas según el uso pretendido de la composición farmacéutica. Para su uso en el tratamiento de una taupatía, por ej . , de la enfermedad de Alzheimer el agente adicional se puede seleccionar del grupo que consiste en moléculas orgánicas pequeñas, anticuerpos anti-tau y combinaciones de los mismos. Por consiguiente, en una modalidad particular la presente invención se refiere al uso de una molécula de unión a tau, por ej . , anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de la presente invención o de una molécula de unión que tiene sustancialmente las mismas especificidades de unión de cualquiera de los mismos, el polinucleótido, el vector o la célula de la presente invención para la preparación de una composición farmacéutica o diagnóstica para el tratamiento profiláctico y terapéutico de una taupatía, monitoreo de la evolución de una taupatía o una respuesta a un tratamiento de una taupatía en un sujeto o para determinar el riesgo de un sujeto a desarrollar una taupatía.

Por consiguiente, en una modalidad de la presente invención se refiere a un método para tratar un trastorno neurológico caracterizado por la acumulación anormal y/o deposición de tau en el cerebro y sistema nervioso central, respectivamente, que comprende administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad terapéuticamente eficaz de cualquiera de las moléculas de unión a tau, anticuerpos, polinucleót idos , vectores o células de la presente invención. El término "trastorno neurológico" incluye, de modo no taxativo, taupatías tales como enfermedad de Alzheimer, esclerosis lateral amiotrófica/complejo parkinsonismo-demencia, demencia con granos argirófilos, angiopatía amiloide de tipo inglés, angiopatía amiloide cerebral, degeneración corticobasal , enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, demencia pugilística, ovillos neurofibrilares difusos con calcificaciones, síndrome de Down, demencia frontotemporal , demencia frontotemporal con parkinsonismo vinculado al cromosoma 17, degeneración lobar frontotemporal , enfermedad de Gerstmann-Straussler-Scheinker, enfermedad de Hallervorden-Spatz , miositis por cuerpos de inclusión, atrofia atrofia multisistéraica, distrofia miotónica, enfermedad de Niemann-Pick tipo C, enfermedad de la motoneurona no de Guam con ovillos neurofibrilares , enfermedad de Pick, parkinsonismo postencefalítico, angiopatía amiloide cerebral causada por priones, gliosis subcortical progresiva, parálisis supranuclear progresiva, panencefalitis esclerosante subaguda, demencia de solo ovillo, demencia multiinfarto y apoplejía isquémica. A menos que se especifique lo contrario, los términos neuredegenerativo, neurológico o neurosiquiátrico se usan de manera intercambiable en la presente.

Una ventaja particular del enfoque terapéutico, de la presente invención reside en que los anticuerpos de la presente invención provienen de células B o células B de memoria de sujetos humanos sanos sin signos de una taupatía y por consiguiente son, con cierta probabilidad, capaces de prevenir una enfermedad sinucleinopática clínicamente manifiesta o de disminuir el riesgo de la aparición de la taupatía manifiesta o de retardar el inicio o evolución de la enfermedad clínicamente manifiesta. Típicamente, los anticuerpos de la presente invención también han pasado por maduración somática de forma exitosa, es decir, la optimización con respecto a la selectividad y efectividad en la unión de alta afinidad a la molécula de tau diana mediante variación somática de las regiones variables del anticuerpo.

El hecho de saber que tales células in vivo, por ej . en un humano, no se han activado mediante proteínas fisiológicas o estructuras celulares diferentes o relacionadas en el sentido de una reacción alérgica o autonimunológica es también de gran importancia médica ya que implica una posibilidad considerablemente aumentada de vivir satisfactoriamente a través de las fases de prueba clínica. Por así decirlo, ya se han demostrado la eficiencia, aceptabilidad y tolerabilidad antes del desarrollo preclínico y clínico del anticuerpo profiláctico o terapéutico' en al menos un sujeto humano. Por consiguiente, se puede pretender/suponer que los anticuerpos anti tau humanos de la presente invención, tanto su eficiencia con estructura específica diana como agente terapéutico y su probabilidad disminuida de efectos secundarios aumentan significativamente su probabilidad clínica de éxito.

La presente invención también proporciona un paquete o kit farmacéutico y diagnóstico, respectivamente; que comprende uno o más contenedores llenos con uno o más de los ingredientes descritos anteriormente, por ej . , un anticuerpo anti tau, fragmento de unión, derivado o variante de este, polinucleótido, vector o célula de la presente invención. Puede haber un aviso junto a el (s) contenedor (es) de la forma prescrita por un organismo gubernamental que regula la fabricación, uso o venta de productos farmacéuticos o biológicos, que refleje la aprobación por parte del organismo de la fabricación, uso o venta para administración en humanos. De manera adicional o alternativa el kit comprende reactivos y/o instrucciones para uso en ensayos de diagnóstico adecuados. La composición, por ej . , kit de la presente invención es por supuesto particularmente adecuado para la evaluación del riesgo, diagnóstico, prevención y tratamiento de un trastorno que está acompañado por la presencia de tau, y en particular es aplicable al trabamiento de enfermedad de Alzheimer (AD) , esclerosis lateral amiotrófica/complejo parkinsonismo-demencia (ALS-PDC) , demencia con granos argirófilos (AGD) , angiopatía amiloide de tipo inglés, angiopatía amiloide cerebral, degeneración corticobasal (CBD) , enfermedad de Creutzfeldt-Jakob ? (CJD) , demencia pugilística, ovillos neurofibrilares difusos con calcificaciones, síndrome de Down, demencia frontotemporal , demencia frontotemporal con parkinsonismo vinculado al cromosoma 17 (FTDP-17) , degeneración lobar frontotemporal , enfermedad de Gerstmann-Stráussler-Scheinker, enfermedad de Hallervoirden-Spatz , miositis por cuerpos de inclusión, atrofia multisistémica , distrofia miotónica, enfermedad de Niemann-Pick tipo C (NP-C) , enfermedad de la motoneurona no de Guam con ovillos neurofibrilares , enfermedad de Pick (PiD) , parkinsonismo postencefalítico, angiopatía amiloide cerebral causada por priones, gliosis subcortical progresiva, parálisis supranuclear progresiva (PSP) , panencefalitis esclerosante subaguda, demencia de solo ovillo, demencia multiinfarto y apoplejía isquémica.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden formular de acuerdo con métodos conocidos en la técnica; véase por ejemplo Remington: The Science and Practice of Pharmacy (2000) by the University of Sciences in Philadelphia , ISBN 0-683-306472. Los ejemplos de porjtadores farmacéuticos adecuados son conocidos en la técnica e incluyen soluciones salinas tamponadas con fosfato, agua, emulsiones, tales como emulsiones de aceite/agua, varios tipos de agentes humectantes, soluciones estériles, etc. Las composiciones que comprenden els portadores se pueden formular mediante métodos convencionales conocidos. Estas composiciones farmacéuticas se pueden administrar al sujeto en una dosis adecuada. La administración de las composiciones adecuadas se pueden efectuar de diferentes maneras, por ej . , por administración intravenosa, intraperitoneal , subcutánea, intramuscular, intranasal, tópica o intradérmica o administración espinal o cerebral . Las formulaciones en aerosol tales como formulaciones nasales en spray incluyen soluciones acuosas purificadas u otras del agente activo con agentes conservantes y agentes isotónicos. Tales formulaciones se ajustan a un pH y estado isotónico compatible con las membranas mucosas nasales: Las formulaciones para administración rectal o vaginal se pueden presentar como un supositorio con un portador adecuado.

Además, considerando que la presente invención incluye el procedimiento estándar actual (aunque afortunadamente no frecuente) de perforar un pequeño agujero en el cráneo para administrar un fármaco de la presente invención, en un aspecto, la molécula de unión, especialmente anticuerpo o fármaco basado en el anticuerpo de la presente invención puede atravesar la barrera sangre-cerebro, que permite la administración intravenosa u oral.

El régimen de dosificación lo determinará el médico encargado y los factores clínicos. Tal como se conoce en la técnica médica, las dosificaciones para cualquier paciente dependen de muchos factores, incluyendo la talla del paciente, el área de superficie del cuerpo, edad, compuesto particular a administrar, sexo, momento y vía de administración, salud general y otros fármacos administrados simultáneamente. Una dosis típica puede estar, por ejemplo, en el intervalo de 0.001 a 1000 µg (o de ácido nucleico para expresión o para inhibición de la expresión en este intervalo) ; sin embargo, se prevén dosis por debajo o por encima de este ejemplo de intervalo, considerando especialmente los factores mencionados anteriormente. Generalmente, la dosificación puede variar, por ej . , de alrededor de 0.0001 a 100 mg/kg, y más comúnmente 0.01 a 5 mg/kg (por ej . , 0.02 mg/kg, 0.25 mg/kg, 0.5 mg/kg, 0.75 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, etc.), del peso corporal del hospedador. Por ejemplo, las dosificaciones pueden ser de 1 mg/kg de peso corporal o 10 mg/kg de peso corporal o¡ dentro del intervalo de 1-Í0 mg/kg, o al menos 1 mg/kg. Se pretende que las dosis dentro de los intervalos antes mencionados también estén dentro del intervalo de la invención. Tales dosis se pueden administrar a los sujetos diariamente, en días alternados, semanalmente o de acuerdo con cualquier otro cronograma/calendario determinado por análisis empírico. Un ejemplo de tratamiento implica una administración en dosificaciones múltiples durante un período prolongado, por ejemplo, de al menos seis meses. Los ejemplos de regímenes de tratamiento adicionales implican una administración de una vez cada dos semanas o una vez por mes o una vez cada 3 a 6 meses. Los ejemplos de cronograraas de dosificación incluyen entre 1 y 10 mg/kg o 15 mg/kg en días consecutivos, 30 mg/kg en días alternados o 60 mg/kg por semana. En algunos métodos, dos o más anticuerpos monoclonales con diferentes especificidades de unión se administran de manera simultánea, en cuyo caso la dosificación de cada anticuerpo administrado se encuentra dentro de los intervalos indicados. La evolución se puede monitorear por evaluación periódica. Las preparaciones para la administración parenteral incluyen soluciones, suspensiones y emulsiones estériles acuosas o no acuosas. Ejemplos de solventes no acuosos son propilenglicol , polietilenglicol , aceites vegetales tales como aceite de oliva y ésteres orgánicos inyectables tales como oléato de etilo. Los portadores acuosos incluyen agua, soluciones, emulsiones o suspensiones alcohólicas/acuosas, incluyendo medios salinos y tamponados . Los vehículos parenterales incluyen solución de cloruro de sodio, dextrosa de Ringer, cloruro de sodio y dextrosa, Ringer lactado o aceites fijos. Los vehículos intravenosos incluyen regeneradores de fluidos y nutrientes, regeneradores de electrolitos (tales como aquellos basados en la dextrosa de Ringer), y similares. Los conservantes y otros aditivos también pueden estar presentes como, por ejemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes y gases inertes y similares. Además, la composición farmacéutica de la presente invención puede comprender adicionalmente agentes tales como dopamina o fármacos psicofarmacológicos según el uso pretendido de la composición farmacéutica.

Además, en una modalidad particular de la presente invención la composición farmacéutica se puede formular como una vacuna, por ejemplo, si la composición farmacéutica de la invención comprende un anticuerpo anti-tau o fragmento de unión, derivado o variante de este para inmunización pasiva. Tal como se menciona en la sección se antecedentes, las especies fósforo-tau han sido reportadas de forma extracelular en plasma y CSF (Aluise et al., Biochim. Biophys. Acta. 1782 (2008), 549-558) y estudios posteriores en líneas de ratones transgénicos usando vacunación activa con péptidos tau fosforilados revelaron una reducción en los niveles cerebrales de agregados tau en el cerebro y una evolución más lenta del deterioro de la conducta (Sigurdsson, J. Alzheimers Dis. 15 (2008), 157-168; Boimel et ál . , Exp Neurol . 224 (2010), 472-485). Por consiguiente, es prudente esperar que la inmunización pasiva con anticuerpos anti-tau humanos y las moléculas de unión a tau equivalentes de la presente invención ayudarían a evitar diversos efectos de los conceptos de terapia de inmunización activa tal como se describe anteriormente en la sección antecedentes. Por lo tanto, los anticuerpos anti-tau de la presente y sus equivalentes de la presente invención serán particularmente útiles como una vacuna para la prevención o mejora de taupatías tales como AD, ALS-PDC, AGD, CBD, CJD, FTD, FTDP-17, NP-C, PiD, PSP u otras taupatías tal como se describe anteriormente .

En una modalidad, puede ser beneficioso usar construcciones mutiespecífieos o biespecífieos recombinantes del anticuerpo de la presente invención. Para una referencia véase Fischer and Léger, Pathobiology 74 (2007), 3-14. La molécula biespecífica se puede diseñar para dirigirse a tau con un brazo de unión y otra entidad patológica tal como ?ß o alfa-sinucleína o una' conformación patológica diferente de tau con un segundo brazo de unión. De manera alternativa, el segundo brazo de unión se puede diseñar para dirigirse a una proteína presente en la barrera hematoencefálic para facilitarle al anticuerpo la penetración en el cerebro.

En una modalidad, puede ser beneficioso usar Fab recombinante (rFab) y fragmentos de cadena simple (scFv) del anticuerpo de la presente invención, que podría penetrar más fácilmente una membrana celular. Por ejemplo, Robert et ál . , Protein Eng. Des. Sel. (2008) 16 de octubre; S1741-0134, publicado antes online, describe el uso de Fab recombinante quimérico (rFab) y fragmentos de cadena simple (scFv) del anticuerpo monoclonal O-2 que reconoce un epítopo en la región del N-terminal de ?ß . Los fragmentos diseñados ; podían (i) impedir la fibrilización de tipo amiloide, (ii) desagregar/desglosar fibrilos de ?ß1-42 preformados y (iii) inhibir la neurotoxicidad mediada por el oligómero ?ß1-42 in vitro de manera tan eficiente como la molécula IgG entera. Las ventajas percibidas de usar formatos de anticuerpos Fab y ' scFv pequeños diseñados que carecen de la función efectora incluyen más pasaje eficiente a través de la barrera sangre- cerebro y minimizar el riesgo de reacciones secundarias inflamatorias disparadoras. Además, aparte de que los anticuerpos de dominio simple y scFv retienen la especificidad de unión de los anticuerpos de longitud completa, pueden expresarse como genes simples e intracelularmente en células de mamíferos como intracuerpos , con la capacidad de alteración del plegamiento, interacciones, modificaciones o localización subcelular de sus dianas; véase para análisis, por ej . , Miller and Messer, Molecular Therapy 12 (2005), 394-401.

En un enfoque diferente Muller eü al., Expert Opin. Biol . Ther. (2005), 237-241, describe una plataforma de tecnología, conocida como 1 SuperAntibody Technology', que según se dice permite que los anticuerpos se trasladen a células vivientes sin dañarse. Tales anticuerpos que penetran células abren nuevas ventanas terapéuticas y de diagnóstico. El término ' TransMabs 1 ha sido acuñado para estos anticuerpos .

En una modalidad adicional, puede desearse la coadministración o administración secuencial de otros anticuerpos útiles para tratar una taupatía. En una modalidad, el anticuerpo adicional está comprendido ; en la composición farmacéutica de la presente invención. Los ejemplos de anticuerpos que se pueden usar para tratar un sujeto incluyen, de modo no taxativo, anticuerpos que se dirigen a beta-amiloide , alfa-sinucleína, TDP-43 y SOD-1.

En una modalidad adicional, puede desearse la coadministración o administración secuencial de otros agentes neuroprotectores útiles para tratar una taupatía. En una modalidad, el agente adicional está comprendido en la composición farmacéutica de la presente invención. Ejemplos de agentes neuroprotectores que se pueden usar para tratar un sujeto incluyen, de modo no taxativo, un inhibidor de acetilcolinesterasa, un antagonista del receptor glutamatérgico, inhibidores de cinasa, inhibidores dé HDAC, agentes antiinflamatorios, sodio de divalproex o cualquier combinación de los mismos. Ejemplos de agentes neuroprotectores que se pueden usar concomitantemente con la composición farmacéutica de la presente invención se describen en la técnica, véase, por ej . , solicitud internacional WO2007/011907. En una modalidad, el agente adicional es dopamina o un agonista del receptor de dopamina.

Una dosis o cantidad terapéuticamente eficaz se refiere a una cantidad del ingrediente activo suficiente para mejorar los síntomas o condición/afección . La eficacia y: toxicidad terapéutica de tales compuestos se pueden determinar por procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares o animales experimentales, por ej . , ED50 (la dosis terapéuticamente eficaz en 50% de la población) y LD50 (la dosis letal para el 50% de la población) . La relación de dosis entre los efectos terapéuticos y tóxicos es ; el índice terapéutico, y se puede expresar como la relación, LD5o/ED50. En una modalidad, el agente terapéutico en la composición está presente en una cantidad suficiente para restaurar o preservar el comportamiento normal y/o propiedades cognitivas en caso de AD, ALS-PDC, AGD, CBD, CJD, FTD, FTDP-17, NP-C, PiD, PSP u otras taupatías tal como se menciona anteriormente.

De lo anterior, es evidente que la presente invención comprende cualquier uso de una molécula de unión a tau que comprende al menos una CDR del anticuerpo antes descrito, en particular para diagnosticar y/o tratar una taupatia tal como se menciona anteriormente, particularmente enfermedad de Alzheimer. En una modalidad, la molécula de unión es un anticuerpo de la presente invención o una cadena de inmunoglobulina de este. Además, la presente invención se refiere a anticuerpos anti-idiotípicos de cualquiera de los anticuerpos mencionados descritos en la presente. Estos son anticuerpos u otras moléculas de unión que se unen a la única secuencia de péptido antigénico ubicada en una región variable del anticuerpo próxima al sitio de unión al antígeno y son útiles, por ej . , para detectar anticuerpos anti-tau en la muestra de un sujeto.

En otra modalidad la presente invención se refiere a una composición de diagnóstico que comprende cualquiera de las moléculas de unión de tau, anticuerpos, fragmentos de unión al antígeno, polinucleótidos , vectores o células de la invención descritos anteriormente y medios opcionalmente adecuados para detectar tales reactivos 'usados convencionalmente en métodos de diagnóstico basados en inmuno o ácido nucleico. Los anticuerpos de la invención son, por ejemplo, adecuados para usar en inmunoensayos en los que se pueden utilizar en fase líquida o unidos a un portador de fase sólida. Los ejemplos de inmunoensayos que se pueden utilizar el anticuerpo de la invención son inmunoensayos competitivos y no competitivos ya sea en formato directo o indirecto. Los ejemplos de els inmunoensayos son el radioinmunoensayo (RIA) , el (ensayo inmunométrico) intercalado, citometría de flujo y el ensayo de transferencia Western. Los antígenos y anticuerpos de la invención se pueden unir a diferentes portadores y usar para aislar células específicamente unidas a los mismos. Los ejemplos de portadores conocidos incluyen vidrio, poliestireno, cloruro de polivinilo, polipropileno, polietileno, policarbonato, dextrano, nilón, amilosas, celulosas naturales y modificadas, poliacrilamidas , agarosas y magnetita. La naturaleza del portador puede ser soluble o insoluble para los fines de la invención. Hay muchas etiquetas y métodos diferentes para etiquetar conocidos para los expertos en la técnica. Los ejemplos de los tipos de etiquetas que se pueden usar en la presente invención incluye enzimas, radioisótopos, metales coloidales, compuestos fluorescentes, compuestos quimioluminiscentes y; véase también las modalidades discutidas en la presente.

Mediante una modalidad adicional, las moléculas de unión a tau, en particular anticuerpos de la presente invención se pueden usar en un método para el diagnóstico de un trastorno en un individuo mediante la obtención de una muestra de fluido corporal del individuo sometido a prueba que puede ser una muestra de sangre, una muestra linfática o cualquier otra muestra de fluido corporal y el contacto de la muestra de fluido corporal con un anticuerpo de la presente invención en condiciones que permitan la formación de complejos anticuerpo-antígeno . El nivel de els complejos se determina luego por métodos conocidos en la técnica, un nivel significativamente mayor a aquel formado en una muestra de control que indica la enfermedad en el individuo sometido a prueba. De la misma manera, también se puede usar el antígeno específico unido por los anticuerpos de la invención. Por consiguiente, la presente invención se refiere a un inmunoensayo in vitro que comprende la molécula de unión, por ej . , anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de este de la invención.

En este contexto, la presente invención también se refiere a medios específicamente designados para este fin. Por ejemplo, se puede usar una matriz basada en anticuerpos, que esté por ejemplo cargada con anticuerpos o moléculas de unión al antígeno equivalentes de la presente invención que reconocen específicamente tau. El diseño de inmunoensayos de micromatrices se resumen en Kusnezow et ál . , Mol. Cell Proteomics 5 (2006), 1681-1696. Por consiguiente, la presente invención también se refiere a micromatrices cargadas con moléculas de unión a tau identificadas de acuerdo con la presente invención.

En una modalidad, la presente invención se refiere a un método para diagnosticar una taupatía en un sujeto, el' método comprende determinar la presencia de tau y/o tau agregada y/o modificada patológicamente en una muestra del sujeto a ser diagnosticado con al menos un anticuerpo de la presente invención, un fragmento de unión a tau de este o una molécula de unión a tau que tiene sustancialmente las mismas especificidades de unión de cualquiera de los mismos, donde la presencia de tau agregada y/o modificada patológicamente indica una taupatía neurodegenerativa y un aumento en el nivel de tau agregada y/o modificada patológicamente en comparación con el nivel de formas de tau fisiológica, indica la evolución de una taupatía neurodegenerativa en el sujeto.

El sujeto a ser diagnosticado puede ser asintomático o preclínico para la enfermedad. En una modalidad, el sujeto de control tiene una taupatía, por ejemplo, AD, ALS-PDC, AGD, CBD, CJD, FTD, FTDP-17, NP-C, PiD, PSP u otras taupatías tal como se menciona anteriormente, donde una similitud entre el nivel de tau agregada y/o modificada patológicamente y el estándar de referencia indica que el sujeto a ser diagnosticado tiene una taupatía. De manera alternativa o además como un segundo control, el sujeto de control no tiene una taupatía, donde una diferencia entre el nivel de tau y/o de tau modificada y/o agregada patológicamente y el estándar de referencia indica que el sujeto a ser diagnosticadó tiene una taupatía. En una modalidad, el sujeto a ser diagnosticado y el/los sujeto (s) de control tiene (n) la misma edad. La muestra a analizar puede ser cualquier fluido corporal' que se sospeche que contiene tau modificada y/o agregada patológicamente, por ejemplo, una muestra de sangre, CSF u orina .

El nivel de tau y/o de tau patológicamente modificada y/o agregada se puede evaluar mediante cualquier método adecuado conocido en la técnica que comprenda, por ej . analizar tau por una o más técnicas escogidas de el Western blot, inmunoprecipitación, ensayo inmunoabsorbente1 ligado a enzimas (ELISA) , radioinmunoensayo (RIA) , selección de células activadas por fluorescencia (FACS, por sus siglas en inglés) , electroforesis en gel bidimensional, espectroscopia de masas (MS, por sus siglas en inglés), desorción/ionización láser asistida por matriz- tiempo de vuelo (MALDI-TOF, por sus siglas en inglés) , tiempo de vuelo de ionización-desorción por láser en superficie (SELDI-TOF, por sus siglas en inglés) , cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) , cromatografía líquida de proteína rápida (FPLC, por sus siglas en inglés) , cromatografía líquida multidimehsional (LC, por sus siglas en inglés) seguido por espectrometría de masas en tándem (MS/MS, por sus siglas en inglés) y densitometría láser. En una modalidad, la imagenología in vivo de tau comprende tomografía por emisión de positrones (PET, por sus siglas en inglés) , tomografía de emisión de fotones simples (SPECT, por sus siglas en inglés) , imagenología óptica casi infrarrojo (NIR, por sus siglas en inglés) o imagenología por resonancia magnética (MRI, por sus siglas en inglés) .

Los métodos para diagnosticar una taupatía tal como enfermedad de Alzheimer, monitorear la evolución de una taupatía y monitorear el tratamiento de una taupatía usando anticuerpos y medios relacionados que se pueden adaptar de acuerdo con la presente invención también se describen en la solicitud internacional WO93/08302, 094/13795, W095/17429, WO96/04309, WO2002/062851 y WO2004/016655. De manera similar, los métodos de detección basados en anticuerpos para tau se describen en las solicitudes internacionales WO2008/080986 , cuyo contenido de descripción se incorpora en la presente mediante esta referencia. Estos métodos se pueden aplicar tal como se describen pero con un anticuerpo específico de tau, fragmento de unión, derivado o variante de la presente invención .

En un aspecto adicional la presente invención también se refiere a péptidos que tienen un epítopo de tau reconocido específicamente por cualquier anticuerpo de la presente invención. En una modalidad, el péptido comprende una secuencia de aminoácidos tal como se indica en la SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42 o una secuencia modificada de esta donde uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete o más aminoácidos se sustituyen, eliminan y/o agregan, donde el péptido se reconoce por medio de un anticuerpo de la presente invención, por ejemplo por el anticuerpo NI-105.4E4 o NI-105.4E3.

En una modalidad de la presente invención, el péptido se puede usar para diagnosticar una taupatía neurodegenerativa en un sujeto, que comprende el paso de determinar la presencia de un anticuerpo que se uñé a un péptido en una muestra biológica de el sujeto, y para el diagnóstico de una taupatía en el sujeto mediante la medición de los niveles de anticuerpos que reconocen el péptido descrito anteriormente de la presente invención y comparar las mediciones con los niveles que se encuentran en sujetos sanos de edad y género comparables. Un nivel elevado de anticuerpos medidos específicos para el péptido de la presente invención indicaría el diagnóstico de una taupatía en el sujeto. El péptido de la presente invención se puede formular en una matriz, un kit y una composición, respectivamente, tal como se describe anteriormente en la presente .

Estas y otras modalidades se describen y se encuentran comprendidas en la descripción y en los ejemplos de la presente invención. Se puede recobrar más bibliografía relacionada con cualquiera de los materiales, métodos, usos y compuestos a emplearse de acuerdo con la presente invención de bibliotecas públicas y bases de datos, usando por ejemplo dispositivos electrónicos. Por ejemplo se puede utilizar la base de datos pública "Medline", que está almacenada en el National Center por Biotechnology Information y/o la National Library of Medicine at the National Institutes of Health. Bases de datos y direcciones web adicionales, tales como aquellas del European Bioinformatics Institute (EBI) , que forma parte del European Molecular Biology Laboratory; (EMBL) son conocidos por los expertos en la técnica y también se pueden obtener usando motores de búsqueda en Internet . En Berks, TIBTECH 12 (1994) , 352-364 se brinda una visión en conjunto de información de patente en biotecnología y un estudio de fuentes importantes de información de patente útil para la búsqueda retrospectiva y para conciencia actual.

La descripción anterior generalmente describe la presente invención. A menos que se especifique lo contrario, un término tal como se usa en la presente brinda la definición tal como la brinda el Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology, Oxford University , Press , 1997, revisado en 2000 y reimpreso en 2003, ISBN 0 19 850673 2. Se citan varios documentos a lo largo del texto de esta descripción. Se pueden encontrar citas bibliográficas completas al final de la descripción inmediatamente antes de las reivindicaciones. El contenido de todas las referencias citadas (incluyendo las referencias de la bibliografía, patentes otorgadas, solicitudes de patente publicadas tal como se citan a lo largo de esta solicitud y memorias descriptivas de los fabricantes, instrucciones, etc.) se expresan en la presente incorporadas mediante esta referencia; sin embargo no se admite que ningún documento citado sea de hecho técnica previa de la presente invención.

Se puede lograr una mejor comprensión mediante la referencia a los ejemplos específicos a continuación que se proporcionan en la presente con fines ilustrativos; solamente y no pretenden limitar el alcance de la invención.

EJEMPLOS Los ejemplos que siguen ilustran adicionalmente la invención, pero no se debería considerar que limitan el alcance de la invención de forma alguna. Los siguientes experimentos en los Ejemplos 1 a 4 se ilustran y describen con respecto a los anticuerpos NI-105.4E4, NI-105-24.B2 y 105.4A3 tal como se clonan, es decir, las regiones variables de Ig flanqueantes 1 (FR1) sin ajustarse a las secuencias de línea germinal (GL) de cadenas variables pesada y ligera humana; véase Figura 1.

Material y métodos Se pueden encontrar descripciones detalladas de métodos convencionales, tales como los empleados en la presente, en la bibliografía citada; véase también "The Merck Manual of Diagnosis and Therapy" Seventeenth Ed. editado por Beers and Berkow (Merck & Co., Inc. 2003).

La puesta en práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de biología celular, cultivo celular, biología molecular, biología transgénica, microbiología, ADN recombinante e inmunología, que se encuentran dentro del conocimiento en la técnica. Para una elaboración adicional de las técnicas generales útiles en la práctica de esta invención, los expertos se pueden dirigir a libros de texto estándar y reseñas sobre cultivos tisulares y biología celular; véase también las referencias citadas en los ejemplos. Los métodos generales sobre bioquímica molecular y celular se pueden encontrar en los libros de texto estándar tales como Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a Ed. (Sambrook efc ál . , Harbor Laboratory Press 2001); Short Protocols in Molecular Biology, 4a Ed. (Ausubel et ál . eds . , John iley & Sons 1999) ; DNA Cloning, Volumes I and II (Glover ed. , 1985); Oligonucleotide Synthesis (Gait ed. , 1984); Nucleic Acid Hybridization (Hames and Higgins eds . 1984); Transcription And Translation (Hames and Higgins eds. 1984) ; Culture Of Animal Cells (Freshney and Alan, Liss, Inc., 1987); Gene Transfer Vectors for Mammalian: Cells (Miller and Calos, eds.); Current Protocols in Molecular Biology and Short Protocols in Molecular Biology, 3rd Edition (Ausubel et ál . , eds.); y ecorabinant DNA Methodology (Wu, ed. , Academic Press) . Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (Miller and Calos, eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory) ; Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155 (Wu et ál . , eds.); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984) ; el tratado, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volúmenes I-IV (Weir and Blackwell, eds., 1986). Protein Methods (Bollag et ál . , John Wiley & Sons 1996); Non-viral Vectors for Gene Therapy ( agner et ál . eds., Academic Press 1999); Viral Vectors ( aplitt & Loewy eds., Academic Press 1995); Immunology Methods Manual (Lefkovits ed., Academic Press 1997); y Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures in Biotechnology (Doyle & Griffiths, John Wiley & Sons 1998) . Los reactivos, vectores de clonación y kits para la manipulación genética referidas en esta descripción, se encuentran disponibles con vendedores comerciales tales como BioRad, Stratagene, Invitrogen, Sigma-Aldrich y ClonTech. Las técnicas generales en el cultivo celular y recolección de medios se resumen en Large Scale Mammalian Cell Culture (Hu et ál . , Curr. Opin. Biotechnol . 8 (1997) , 148) ; Serum-free Media (Kitano, Biotechnology 17 (1991) , 73) ; Large Scale Mammalian Cell Culture (Curr. Opin. Biotechnol. 2 (1991), 375); y Suspensión Culture of Mammalian Cells (Birch et ál . , Bioprocess Technol . 19 (1990), 251); Extracting information from cDNA arrays, Herzel et ál . , CHAOS 11 (2001) , 98-107.

Métodos de identificación de células B específicas de tau y clonación de los anticuerpos correspondientes A menos que se indique lo contrario, la identificación de células B específicas de tau y clonación molecular de anticuerpos anti-tau que muestran especificidad de interés así como su expresión recombinante y caracterización funcional se ha desempeñado o se puede desempañar por lo general como se describe en la sección de Ejemplos y Métodos Complementarios de la solicitud internacional PCT/EP2008/000053 publicada como O2008/081008 , cuyo contenido se incorpora a la presente mediante esta referencia en su totalidad. Se proporciona en esta solicitud un nuevo método para la identificación de células B específicas de tau y clonación molecular de anticuerpos tau que muestran especificidad de interés así como su expresión recombinante y caracterización funcional. Tal como se describe anteriormente, en una modalidad de la presente invención, se cultivan los cultivos de células B simples u oligoclonales y se analiza el sobrenadante del cultivo, que contiene anticuerpos producidos por las células B, para determinar la presencia y afinidad de los anticuerpos anti-tau en ellas. El proceso de análisis comprende los pasos de un ensayo Inmunoreactividad sobre el amiloide de placas 1 tisulares (TAPIR) tal como se describe en el Ejemplo 1 y como se muestra en la Fig. 9; análisis sobre extractos del cerebro para unirse a PHFTau tal como se describe en el Ejemplo 2 y como se muestra en las Figuras 3 y 8 ; análisis de la unión de un péptido derivado de tau de la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO : 6 con grupos fosfato en aminoácidos Ser-202 y Ser-205 en el aminoácido Thr-231; y/o en los aminoácidos Ser-396 y Ser-404 de la secuencia tal como se describe de forma análoga en el Ejemplo 3 y como se muestra en la Fig. 5 con péptidos no fosforilados debido a experimentos de confirmación de epítopos para el anticuerpo NI-105.4E4; un análisis para unir tau de longitud completa de la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 6 y aislar el anticuerpo para el cual se detecta la unión o la célula que produce el anticuerpo tal como se describe en la patente internacional WO2008/081008 y tal como se describe en el Ejemplo 1 y como se muestra en las Figuras 2, 5 y 7.' Purificación del antígeno Tau40 humana recombinante se adquirió en rPeptide (Bogart, GA, EUA) .

PHFTau se extrajo de un cerebro con AD.

El aislamiento de los filamentos helicoidales apareados que contiene filamentos de tau fosforilada patológicamente (PHFTau) se llevó a cabo siguiendo el método de Goedert et ál . (Goedert et ál . , Neuron 8 (1992), 159-168) con modificaciones. Un gramo de tejido de cerebro con AD se cortó en partes de 5mm y se retiraron todos los vasos sanguíneos visibles. El tejido se lavó con 40 mi de solución de lavado helada (lOOmM de Tris pH 7.4, 6 mM de EGTA, 1 ni de Na3V04 y 1 mM de NaF) tres veces seguido de la homogeneizacion con 20 mi de amortiguador de lisis (lOmM de Tris pH 7.4, 0.8M de NaCl , lmM de EGTA, 1 x cóctel inhibidor de proteasa, 1 mM de Na3V04, lmM de NaF, lmM de AEBSF, 10% de sacarosa) . El homogenato se centrifugó a 4°C a 20'000xg durante 20 min. El sobrenadante se recogió con la adición de sarcosinato de N-láuroilo (Sigma, Suiza) hasta 1% (p/v) . Luego de dos horas de incubación a 37°C con agitación, el sobrenadante luego se centrifugó a 4°C a 100'000xg durante una hora. El sedimento se recogió y resuspendió en PBS . Luego de despejar posibles inmunoglobulinas contaminantes con cuentas magnéticas de proteína A, la suspensión de PHFTau se almacenó a -80 °C antes de usarse. Por consiguiente, se preparó un extracto de control de tejido de cerebro humano sano de control.

Análisis de anticuerpo tau humano ELISA: Se recubrieron las microplacas de media área de 96 pocilios (Corning) con proteína Tau recombinante (rPeptide, Bogart, USA) a una concentración estándar de 1 µ?/ml en amortiguador de recubrimiento ELISA con carbonato (pH 9.6) durante la noche a 4°C. Para el análisis de PHF au, se recubrieron Immobilizer Microplates (Nunc, Denmark) se 96 pocilios con PHFTau extraído de cerebro humano con AD a 1:100 diluciones en amortiguador de recubrimiento ELISA con carbonato (pH9.6) durante la noche a 4°C. Las placas se lavaron en PBS-T pH 7.6 y se bloquearon sitios de unión no específica durante 2 horas a RT con PBS-T que contiene 2% de BSA (Sigma, Buchs, Suiza). El medio condicionado de células B se transfirió desde placas de cultivo de células B de memoria a placas de ELISA y se incubaron durante 1 hora a RT. Las placas ELISA se lavaron con PBS-T y luego se incubaron con anticuerpo policlonales IgG (específicos del fragmento Fcy) an i -humano de burro conjugados con peroxidasa de rábano picante (HRP, por sus siglas en inglés) (Jackson immunoResearch, Newmarket, Reino Unido). Luego de lavar con PBS-T, la unión de anticuerpos humanos se determinó por medición de la actividad de HRP en un ensayo colorimétrico estándar.

Análisis de microplacas MULTI -ARRAY Se recubrieron placas MULTI-SPOT estándar de 96 pocilios (Meso Scale Discovery, EUA) con 30 ug/ml de rTau (rPeptide) , extracto de cerebro PHFTau y extracto de cerebro de control en PBS . Los sitios de unión no específicos se bloquearon durante 1 hr a RT con PBS-T que contiene 3% de BSA seguido de la incubación con un medio condicionado con células B durante 1 hr a R . Las placas se lavaron en PBS-T y luego se incubaron con anticuerpo anti-humano conjugado con SULFO-Tag (Meso Scale Discovery, EUA) . Luego de lavar con PBS-T, la unión de anticuerpo se detectó mediante medición por electroquimioluminiscencia usando un SECTOR Imagér 6000 (Meso Scale Discovery, EUA) .

Clonación molecular de anticuerpo tau Las células que contienen células B de memoria se obtuvieron de sujetos humanos sanos. Los' linfocitos B vivientes de los cultivos de célula B de memoria seleccionados se cultivan y se prepara AR m. Las secuencias de cadena ligera y pesada de inmunoglobulina luego se obtienen usando un enfoque PCR anidado.

Sé usa una combinación de cebadores que representan todas las familias de secuencias del repertorio de línea germinal de inmunoglobulina para las ampli icaciones de péptidos segmentos V y segmentos J líderes. La primera ronda de amplificación se realiza usando cebadores específicos de péptidos líderes en el extremo 5' y cebadores específicos de la región constante en el extremo 3' (Smith et ál . , Nat Protoc. 4 (2009), 372-384). Para las cadenas pesadas y las cadenas ligeras kappa, la segunda ronda de amplificación se realiza usando cebadores específicos del segmento V en el extremo 5' y cebadores específicos del segmento J en el extremo 3'. Para las cadenas ligeras lambda, la segunda ronda de amplificación se realiza usando cebadores específicos del segmento V en el extremo 5' y un cebador específico de la región C en el extremo 3' (Marks et ál . , Mol. Biol . 222 (1991), 581-597; de Haard et ál . , J. Biol. Chem. 26 (1999), 18218-18230) .

La identificación del clon de anticuerpo con la especificidad deseada se lleva a cabo por medio de la nueva exploración en ELISA tras la expresión recombinantes de anticuerpos completos. La expresión recombinantes de anticuerpos IgGl humanos o anticuerpos IgG2a quiméricos se logra tras la inserción de las secuencias de cadena pesada y ligera variables "en el marco de lectura adecuado" en vectores de expresión que complementan la secuencia de región variable con una secuencia que codifica un péptido líder en el extremo 5' y el extremo 3' con una secuencia que codifica el o los dominios constantes apropiados. A esos efectos, los cebadores contenidos en sitios de restricción diseñados para facilitar la clonación de secuencias de cadena pesada y ligera variable en vectores de expresión de anticuerpos. Las inmunoglobulinas de cadena pesada se expresan insertando el producto RT-PCR de cadena pesada de inmunoglobulina en marco en un vector de expresión de cadena pesada que porta un péptido de señal y los dominios constantes de inmunoglobulina gama 1 humana o inmunoglobulina gama 2a de ratón. Las inmunoglobulinas de cadena ligera kappa se expresan mediante la inserción en el producto RT-PCR de cadena ligera kappa en la estructura dentro del vector de expresión de cadena ligera proporcionando un péptido de señal y el dominio constante de la inmunoglobulina de cadena ligera kappa humana, las inmunoglobulinas de cadena ligera lambda se expresan mediante la inserción del producto RT-PCR de cadena ligera lambda en la estructura dentro del vector de expresión de cadena ligera lambda proporcionando un péptido señal y el dominio constante de inmunoglobulina de cadena ligera lambda de ratón o humano.

Los anticuerpos monoclonales recombinantes funcionales se obtienen tras la cotransfección en células HEK293 o CHO (o cualquier otra línea celular receptora apropiada de origen humano o de ratón) de un vector de expresión de cadena pesada Ig y un vector de expresión de cadena ligera Ig lambda o kappa. El anticuerpo monoclonal humano recombinante se purifica posteriormente a partir del medio acondicionado usando purificación de columna de proteína A estándar. El anticuerpo monoclonal humano recombinante se puede producir en cantidades ilimitadas usando células transfectadas de forma transitoria o estable. Se pueden establecer líneas celulares que producen anticuerpos monoclonales humanos recombinantes ya sea usando vectores de expresión Ig directamente o por medio de la reclonación de regiones variables de Ig en diferentes vectores de expresión. Los derivados tales como F(ab), F(ab)2 y scFv también se pueden generar a partir de estas regiones variables de Ig.

Anticuerpos El anticuerpo tau anti -humano monoclonal Taul2 (Covance, California, EUA) y el anticuerpo tau monoclonal de ratón AT180 (Thermo Scientific, EUA) se usaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los anticuerpos tau humanos recombinantes NI-105.4E4, NI-105.24B2 y NI-105.4A3 son anticuerpos de esta invención. Se expresaron en células HEK293 o CHO, se purificaron a partir del medio condicionado y se usaron directamente en aplicaciones posteriores a menos que se indique otra cosa. En los Ejemplos 1 a 4 se usaron los anticuerpos recombinantes purificados de la presente invención.

ELISA directo Se recubrieron microplacas de 96 pocilios (Costar, Corning, EUA) con proteína Tau recombinante (hTau40, rPeptide, Bogart , EUA) diluida hasta una concentración de 1 g/ml en amortiguador de recubrimiento de ELISA con carbonato (50mM, pH 9.6) a 4°C durante la noche. Se bloquearon los sitios de unión no específica durante 2 hr a RT con PBS que contiene 2% de BSA (Sigma, Buchs , Suiza) y 0.5% de Tween20. La unión de anticuerpos humanos de la presente invención (NI-105.4E4, NI-105.24B2 and NI-105.4A3) se determinó usando Fcy de IgG anti -humano de cabra conjugado con HRP (Jackson immunoResearch, Newmarket, Reino Unido), seguido de la medición de actividad de HRP en un ensayo colorimétrico estándar. Los valores de EC50 se evaluaron mediante una regresión no lineal usando GraphPad Prism software (San Diego, EUA) .

Tinción de proteínas por transferencia Western Se resolvieron PHFTau y hTau40 recombinante mediante SDS-PAGE gradiente (NuPAGE 4-12%; Invitrogen, Basilea, Suiza) seguido de electrotransferencia en membranas de nitrocelulosa . Luego de bloquear la unión no específica con 2% de BSA a temperatura ambiente durante una hora, las bandas se incubaron durante la noche con anticuerpos primarios NI-105.4E4, NI-105.24B2 (humano) o Taul2 (anticuerpo monoclonal de ratón, Covance, California, EUA) , seguido de IgGFcy antihumano de cabra conjugado con HRP (para anticuerpos primarios humanos) o un anticuerpo secundario de IgG ant i -ratón de cabra conjugado con HRP.

Las bandas se desarrollaron usando detección ECL e ImageQuant 350 (GE Healthcare, Otelfingen, Suiza) .

Extracción de PHFTau de un cerebro con AD El aislamiento de los filamentos helicoidales apareados que contiene filamentos de tau fosforilada patológicamente (PHFTau) se llevó a cabo siguiendo el método de Goedert et ál. (Goedert et ál . , Neuron 8 (1992), 159-168) con modificaciones. Un gramo de tejido de cerebro con AD se cortó en partes de 5mm y se retiraron todos los vasos sanguíneos visibles. El tejido se lavó con 40 mi de solución de' lavado helada (lOOmM de Tris pH 7.4, 6 mM de EGTA, 1 mM de, Na^ y 1 mM de NaF) tres veces seguido de la homogeneización con 20 mi de amortiguador de lisis (lOmM de Tris pH 7.4, 0.8M de NaCl , lmM de EGTA, 1 x cóctel inhibidor de proteasa, 1 mM de Na3V04, lmM de NaF, lmM de AEBSF, 10% de sacarosa) . El homogenato se centrifugó a 4°C a 20'000xg durante 20 min. El sobrenadante se recogió con la adición de sarcosinato de N-lauroilo (Sigma, Suiza) hasta 1% (p/v) . Luego de dos horas de incubación a 37 °C con agitación, el sobrenadante luego se centrifugó a 4°C a 100'000xg durante una hora. El sedimento se recogió y resuspendió en PBS . Luego de despejar posibles inmunoglobulinas contaminantes con cuentas magnéticas de proteína A, la suspensión de PHFTau se almacenó a -80°C antes de usarse. Por consiguiente, se preparó un extracto de control de tejido de cerebro humano sano de control.

Síntesis de péptidos Tau Un péptido que corresponde a los aminoácidos 333-346 de hTau40 ( 333GGGQVEVKSEKLDF346) que incluye el epítopo de NI-105. E4 identificado mediante mapeo Pepspot (aminoácidos 337-343) se sintetizó por Schafer-N (Copenague, Dinamarca) . Se agregó una cisteína adicional al terminal-C para permitir la unión covalente a Immobilizer Microplates (Nunc, Dinamarca) . Un segundo péptido que corresponde a los aminoácidos 226-239 de tau humano (226VAWRpTPPKSPSSA239) , por consiguiente el epltopo cognado de anticuerpo tau monoclonal se ratón comercialmente disponible AT180 (Thermo Scientific, EUA) se sintetizó y se usó como control .

Ratones transgénicos Se usan tres modelos animales diferentes para taupatías para validar los anticuerpos tau (y modelos con las especificidades de unión de los mismos) de la presente invención. 1. Ratones TauP301L transgénico (línea 183) : expresa Tau40 humano con mutación P301L bajo el promotor Thyl .2 murino (la creación de estos animales transgénicos se describe en Gótz et ál . , J. Biol . Chem. 276 (2001), 529-534 y en la solicitud internacional WO2003/017918 , cuyo contenido se incorpora a la presente mediante esta referencia) . 2. Los ratones JNPL3 que expresan la isoforma de tau humana 4R más corta con mutación P301L bajo el promotor PrP murino (disponible en Taconic, Hudson, NY, EUA) . 3. Los ratones P301STau (línea PS19) que expresan tau humano con mutación P301S bajo el promotor PrP humano (disponible en Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine, EUA) .

Los modelos de ratón de taupatías y los ratones correspondientes de tipo silvestre se mantienen en condiciones de vivienda estándar en un ciclo de luz/oscuridad de 12h:12h inverso con acceso libre a agua y comida. Los grupos de tratamiento se equilibran según la edad y el sexo.

Ejemplo 1: Validación de especificidad diana y de unión de anticuerpos tau humanos Para validar tau como una diana reconocida de anticuerpos aislados se realizaron ensayos ELISA directos tal como se describe anteriormente. Para el ejemplo de anticuerpo NI-105.4A3 humano recombinante se recubrieron las microplacas de 96 pocilios (Costar, Corning, EUA) se recubrieron con tau humana recombinante (hTau40, rPeptide, Bogart, EUA) diluida hasta una concentración de 3 ug/ml o con BSA :en el amortiguador de recubrimiento por ELISA con carbonato (pH 9.6) y se sometió a prueba la eficacia de unión del anticuerpo. El ejemplo de anticuerpo NI-105.4A3 se une específicamente a tau humana mediante ELISA. No se observa ninguna unión a BSA (Fig. 10) .

Para una determinación de la mitad máxima de concentración eficaz (EC50) de los ejemplos de anticuerpos NI-105.4E4 y NI-105.24B2, se realizaron experimentos ELISA directos adicionales con concentraciones de anticuerpo variantes. Se recubrieron microplacas de 96 pocilios (Costar, Corning, EUA) con tau humana recombinante (hTau40, rPeptide, Bogart, USA) diluida hasta una concentración de 1 ug/ml (para el ensayo con el anticuerpo NI-105.4E4), o de 3 µg/ml (para el ensayo con el anticuerpo NI-105.24B2) en amortiguador de recubrimiento de ELISA con carbonato y se sometió a prueba la eficacia de unión del anticuerpo. Los valores de EC50 se evaluaron mediante una regresión no lineal usando GraphPad Prism software. El anticuerpo derivado de humano recombinante NI-105.4E4 se une a hTau40 con afinidad elevada en el intervalo nanomolar bajo a 2.4 nM EC50 (Figura 2). NI-105.24B2 se une a hTau40 con afinidad elevada en el intervalo nanomolar bajo a 6.6 nM EC50 (Figura 7) .

La concentración eficaz de media máxima (EC50) del ejemplo de anticuerpo NI-105.4A3 también se determinó usando experimentos ELISA directos. Las placas ELISA se recubrieron con tau humano recombinante (hTau40, lug/ml) , PHFTau (1:100) y preparación de control (1:100), y se incubaron con concentraciones variadas de anticuerpo. NI-105.4A3 se une a rTau con afinidad elevada en el intervalo nanomolar bajo a 1.4 nM EC50. NI-105.4A3 se une a PHFTau con afinidad elevada en el intervalo nanomolar bajo a 1.2 nM EC50 (Figura 12) .

Ejemplo 2: Análisis de unión de anticuerpos humanos recombinantes a tau recombinante y tau patológica extraído de cerebro con AD Para determinar la capacidad de unión de NI-105.4E4 y NI-105.24B2 a especies de tau patológica extraídas de .cerebro con AD. Los análisis de SDS-PAGE y transferencia Western se realizaron tal como se describe anteriormente. Las bandas se incubaron durante la noche con anticuerpos primarios NI-105. E4 (humano), NI-105.24B2 (humano) o Taul2 (anticuerpo monoclonal de ratón, Covance, California, EUA) , seguido de IgGFcY anti-humano de cabra conjugado con H P (para anticuerpos humanos) o un anticuerpo secundario de IgG antiratón de cabra conjugado con HRP.

Los anticuerpos recombinantes NI-105.4E4 (Figura 3) y NI-105.24B2 (Figura 8) reconocen hTau40 recombinante así como PHFTau modificada patológicamente extraída de cerebro con AD en el Western blot . Como era esperado, el anticuerpo de control Taul2 también reconoce ambas especies de tau (Figura 3) .

De manera adicional, tal como se describe en el Ejemplo 1 anterior, la concentración eficaz de media máxima (EC50) del ejemplo de anticuerpo NI-105.4A3 se determinó en experimentos ELISA directos usando PHFTau. NI-105.4A3 se une a PHFTau con afinidad elevada en el intervalo nanomolar bajo a 1.2 nM EC50 (Figura 12) .

Ejemplo 3: apeo del epítopo de unión de NI-105.4E4 y NI-105.4A3 en hTau40 Una matriz de péptidos de 118 secuencias de péptidos que cubre el hTau40 de longitud completa (aminoácidos 1-441) con una superposición de 11 aminoácidos entre dos péptidos adyacentes se salpicó en una membrana de nitrocelulosa (JPT Peptide Technologies GmbH, Berlín, Alemania) . La inmunomarcación de anticuerpos así como la regeneración de membranas se llevó a cabo de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para descartar la unión no específica del anticuerpo de detección, la membrana se sondó primero por IgG anti-humana de cabra conjugada con HRP omitiendo el anticuerpo primario (Figura 4D) . Luego de la regeneración la membrana se sondó con el anticuerpo NI-105.4E4 recombinante 100 nM. El anticuerpo se detectó usando detección ECL e ImageQuant 350 (GE Healthcare, Otelfingen, Suiza) .

Dos grupos de manchas de péptidos adyacentes (péptido 83, 84 y 85; péptido 96 y 97) se identificaron específicamente por NI105.4E4 (Figura 4A y 4B) , al compararse únicamente con el anticuerpo de detección (Figura 4D) . Las secuencias cubiertas por estos dos grupos de péptidos corresponden a los aminoácidos 329-351 y 387-397 de hTau40. Estos datos sugieren que NI-105.4E4 reconoce un epítopo discontinuo que comprende dos secuencias lineales: uno dentro del dominio de unión microtúbulos R4 y otro en el dominio del terminal-C .

La secuencia compartida por los péptidos 83-85 comprende los residuos de aminoácidos 337-343 de hTau40. Los datos de Pepspot (JPT) sugieren que NI-105.4E4 reconoce un epítopo en hTau que comprende aminoácidos 337-343 de tau humana. Esta región está ubicada dentro del dominio de unión a microtúbulos de tau y se conserva entre todas las isoformas de tau humanas neuronales así como a través de otras especies que incluyen ratón y rata.

Como este dominio está unido a microtúbulos en tau asociada a microtúbulos fisiológicos, se espera que NI-105.4E4 se dirija preferentemente al grupo patológicamente relevante de tau que se separa de los microtúbulos.

Para determinar los residuos clave dentro de los péptidos de unión a NI-105.4E4, el barrido de alanina se realizó para sustituir cada residuo con alanina uno por vez. Los residuos de alanina en la secuencia original (A384 y A390) se sustituyeron con prolina y glicina (Figura 4F) . Las manchas 35-50 y 51-68 (Figura 4D) son los péptidos originales (mancha 35 y mancha 51) y sus variantes sustituidas por alanina, cuyas secuencias de aminoácidos se muestran en la Figura 4D y 4F. El escaneo de alanina sugiere que V339, E342, D387, E391 y K395 son necesarios para la unión de NI-105.4E4.

Se llevó a cabo un experimento adicional mediante la prueba de la unión de NI-105.4E4 a los péptidos tau. ELISA directa muestra que NI-105.4E4 reconoce específicamente un péptido que corresponde a los aminoácidos 333-346 de hTau40, que contiene los residuos de aminoácidos 337-343 identificados por mapeo Pepspot (Figura 5) . No se observó reactividad cruzada de NI-105.4E4 para el péptido de control que cubre el epítopo AT180. Al revés, AT180 reconoce su epítopo cognado que contiene péptido pero falla en la unión al péptido específico NI-105.4E4. Los anticuerpos específicos de especies no se unen a ninguno de los péptidos. Juntos, ELISA directo y los péptidos recubiertos confirman que NI-105.4E4 reconoce específicamente un péptido que contiene los residuos de aminoácidos 337-343 de tau humana mediante mapeo Pepspot .

Para mapear ampliamente el epítopo de unión NI-105.4A3 en hTau40, se produjeron cuatro polipéptidos del dominio tau (dominio Tau I, dominio II, dominio III y dominio IV) . Los fragmentos de ADN, sintetizados usando GeneArt® ( Invitrogen) , que codifican cada dominio Tau con 6xHis etiquetada en el extremo, se clonaron en el vector de expresión pRSET-A (Invitrogen) , y se transfectaron en E. Coli BL21 (DE3) (New England Biolabs) . Las expresiones de los dominios Tau etiquetado con His se indujeron por 0.5mM IPTG durante seis horas antes de que las bacterias se lisaran con lisozima con sonicación. El lisado se hirvió durante cinco minutos antes de purificarse adicionalmente con Ni-NTA Superflow Columns (Qiagen) . Los dominios Tau etiquetados con His se recubrieron en placas de ELISA o se cargaron en gel de poliacrilamida para transferencia Western. Estos polipéptidos de dominio tau superpuestos cubren la longitud completa de hTau40 (Figura 13A) . Los dominios tau purificados se recubrieron en una placa de ELISA y se sometió a prueba la unión de NI-105.4A3. NI-105.4A3 se une solamente al dominio tau I y hTau40 de longitud completa, indicando que el ep topo se encuentra dentro de la parte del N-terminal del hTau40 (aal-136) (Figura 13B) . El Western blot confirma la unión específica de NI-105.4A3 al dominio I de tau (Figura 13C) .

El mapeo del epitopo NI-105.4A3 con tecnología PepSpot (JPT) identificó los aminoácidos Q35-Q49 de la Tau40, humana (Figura 14A y 14C) . Para determinar los residuos clave, dentro del epitopo para la unión de NI-105.4A3, el barrido de alanina se realizó para sustituir cada residuo con alanina uno por vez. El residuo de alanina en la secuencia original (A41) se sustituyó por glicina o prolina (Figura ' 14B) . Las manchas enumeradas de izquierda a derecha con 1 y ' 17 son el epitopo original (mancha 1) y sus sustituciones de alanina, cuyas secuencias de aminoácidos se muestran en la Figura 14C. El escaneo de alanina mostró que D40, A41 y K44 son residuo clave para la unión de NI-105.4A3.

Ejemplo 4: Evaluación de la unión de NI-105.4E4 a las formas fisiológicas así como los agregados patológicos de tejidos de cerebro con AD con tau y en ratones transgénicos con tau humana Lo ovillos neurofibrilares (NFT) compuestos por filamentos tau hiperfosforilados son una característica neuropatológica de AD. Los filamentos de tau hiperfosforilada también son los componentes más importantes de los neuritas distróficas e hilos del neurópilo, estos dos son rasgos neuropatológicos comunes en AD. La sobreexpresión de tau humana que contiene la mutación de tau P301L familiar en ratones induce la formación de NFT a los seis meses de edad (Gotz et ál. , 2001a) .

Para evaluar la unión del anticuerpo tau recombinante a las formas fisiológicas así como agregados patológicos de tau, las tinciones inmunohistológicas se realizaron en te idos de cerebro con AD y en ratones transgénicos con TauP301L con el ejemplo de anticuerpo NI-105.4E4 de esta invención.

Se perfundieron los ratones con 20 mi de 100 mM TrisCl/6 mM EGTA (pH 7.4) a temperatura ambiente bajo anestesia profunda. Se tomaron los cerebros y se sumergieron en 4% de PFA en PBS (pH 7.4) a 4°C durante la noche para fijación seguido de la inclusión en parafina. Para el tejido humano, la parafina bloquea los tejidos cerebrales de AD y se usaron sujetos de control sanos. La tinción DAB se llevó a cabo siguiendo protocolos estándar. Se usó como control positivo el anticuerpo monoclonal de ratón Tau-12 (Covance, California, EUA) . También se incluyeron anticuerpos de detección conjugados con HRP sin anticuerpos primarios.

El anticuerpo humano recombinante NI-105.4E4 identifica diversos NFT e hilos del neurópilo en un cerebro con AD (Figura 6A) , que están ausentes en el cerebro de contrpl sano (Figura 6B) . El anticuerpo secundario por sí solo no da señales tanto en el cerebro con AD (Figura 6C) como en el cerebro de control (Figura 6D) . En el cerebro de ratón transgénico con tau P301L, NI-105.4E4 se une fuertemente a la tau patológica similar a NFT (Figuras 6, 6E, 6F y 6H) , hilos del neurópilo (Figuras 6E y 6G) y neuritas distróficas (Figuras 6E y 6H) . Además, NI-105.4E4 también identifica agregados de tau en la etapa pre-ovillo (Figura 61) . En el cerebro de ratones transgénicos que sobreexpresan tanto tau humana P301L y tau humana APP con mutaciones suecas y árticas, NI-105.4E4 se une específicamente a neuritas distróficas alrededor de placas beta-amiloide (Figura 6J) .

Ejemplo 5: Pruebas in vivo de los anticuerpos de la presente invención Tal como se describe anteriormente, estudios posteriores en líneas de ratones transgénicos usando vacunación activa con péptidos tau fosforilados revelaron una reducción en los niveles cerebrales de agregados de tau en el cerebro y una evolución más lenta del deterioro de la conducta (Sigurdsson, J. Alzheimers Dis. 15 (2008), 157-168; Boimel et ál . , Exp. Neurol . 224 (2010), 472-485).. Sin embargo, la vacunación activa puede no ser capaz de usarse particularmente en humanos dado que se espera que una fracción considerable de la población de edad no respondan a la vacunación. Además, los efectos secundarios potenciales asociados a la respuesta inmunitaria dirigida a tau puede ser difícil de controlar. Se puede esperar razonablemente que las moléculas de unión a tau de la presente invención alcancen reducciones similares en niveles cerebrales de agregados de tau tal como se describe anteriormente para anticuerpos de ratón, dadas sus especificidades de unión similares contra especies de tau patológica. Sin embargo, dado que la optimización evolutiva y la maduración de afinidad dentro de los anticuerpos del sistema inmunitario humano de la presente invención proporciona una herramienta terapéutica valiosa ya que se aislan de sujetos humanos sanos con altas probabilidades de perfiles de seguridad excelentes y falta de inmunogenicidad . La confirmación de estos efectos terapéuticos esperados se puede proporcionar mediante métodos de prueba tal como se describe en los experimentos mencionados anteriormente con los anticuerpos de ratón. En particular, los anticuerpos a ser analizados se pueden aplicar en diversas rutas posibles a los animales tales como inyección de anticuerpo de forma intraperitoneal, inyección intracraneal, infusión intraventricular al cerebro y se pueden someter a prueba para detectar efectos del tratamiento. Cualquiera de las posibilidades de aplicación mencionadas anteriormente también se pueden usar antes de la inyección en el cerebro de preparaciones beta-amiloide en el cerebro de ratones transgénicos con tau para evaluar los efectos del tratamiento en patologías tau inducidas por beta-amiloide .

La evaluación de los efectos del tratamiento se puede realizar mediante métodos histoquímicos que comprenden la cuantificación de conteos de célula Gallyas positivas, tinción total de tau humana, carga en el cerebro de tau fosforilada y/o determinación bioquímica de tau soluble e insoluble en el cerebro y niveles de fósforo-tau tras la extracción en serie del cerebro. Además, las pruebas del comportamiento de los ratones tratado se pueden realizar, por ej . , por aversión condicionada al sabor, o condicionamiento contextual del miedo de los anticuerpos de la presente invención (Pennanen, Genes Brain Behav. 5 (2006) , 369-79, Pennanen Neurobiol Dis. 15 (2004), 500-9.) Ejemplo 6: Quimerización de anticuerpos 4E4 y 4A3 con dominios constantes de IgG2a de ratón.

Para generar anticuerpos con inmunogenicidad reducida para su uso en estudios del tratamiento crónico, se generaron las versiones quiméricas de ratón de los anticuerpos 4E4 y 4A3 usando tecnología de ADN recombinante . Se seleccionó un isotipo lgG2a/latnbda de ratón para estos anticuerpos quiméricos, para poder generar una molécula que se una con afinidad elevada con receptores Fe -gamma de ratón y por lo tanto fue capaz de inducir una respuesta efectora inmunitaria. Las secuencias de aminoácidos de las construcciones de cadena ligera y pesada de 4E4 (ch4E4) y 4A3 quimérica (ch4A3) se muestran a continuación.

Tabla 3 : Las secuencias de aminoácidos de la 4E4 quimérica (ch4E4) y 4A3 quimérica (ch4A3) .

Ejemplo 7: Quimerización de anticuerpos 4E4 y 4A3 con dominios constantes IgG2a de ratón.

Se identificó un sitio de glicosilación unidos á N de consenso en la región CDR1 de la cadena pesada de 4E4. Tras la expresión de células de mamífero (CHO) , el sitio de glicosilación N (Asn-30) previsto estuvo ocupado totalmente por glican, tal como se demuestra la espectrómetro de1 masas. Para eliminar la glicosilación N en esta región y reducir la heterogeneidad del producto, se cambió el Asn-30 de la cadena pesada de ch4E4 por Gln (Tabla 4) . Cuando se produce y purifica a partir de células CHO, el anticuerpo modificado unido a tau recombinante con afinidad de unión aparten ~4-veces mayor con respecto al anticuerpo glicosilado original (véase Figura 15) .

Tabla 4: Secuencias de aminoácidos de una cadena pesada de ch4E4 (N30Q) maduro (IgG2a de ratón) . El residuo de Gln sustituido está en negrita y subrayado.

Ejemplo 8: Producción de 4E4 quimérica aglicosilada (ch4E4(N30Q) mlgGl Agly) .

Una variante aglicosilada quimérica de ratón de 4E4 se produjo (ch4E4(N30Q) IgGl-Agly) para evaluar la relación entre la actividad y la función efectora del anticuerpo. Para la cadena pesada, el dominio variable de 4E4 se fusionó a una región constante de cadena pesada de IgGl de ratón que contiene una mutación de Asn a Gln para eliminar el sitio de glicosilación de Fe de consenso. La región variable de; cadena pesada también contenía el cambio de N30Q para eliminar el sitio de glicosilación N de consenso en CDR1 (Ejemplo 7) . La cadena ligera fue la cadena ligera de lambda ch4E4 descrita anteriormente .

Ejemplo 9: Estudio de penetración aguda en el cerebro de 4E4 y 4E3 humano Se produjeron 4E4 y 4A3 humano mediante transfección transitoria de células CHO y se modificaron mediante purificación por afinidad. Los niveles de endotoxina se controlaron y todos se ubicaron por debajo de 1 EU/mg: A los ratones TauP301L se les inyectó de forma intraperitorieal 30 mg/kg de anticuerpo 4E4 (n=7) , 4A3 (n=7) o igual volumen de PBS (n=7) en el día 1 y día 4. El día 5 se perfundieron los ratones con anestesia con PBS que contiene 1 Unidad/ml de heparina. Se recolectaron sangre, cerebro y médula espinal para análisis. El hemisferio derecho del cerebro se congeló a -80°C, el hemisferio izquierdo del derecho y la médula espinal se fijaron luego en 10% de formalina neutralizada a 4°C durante dos días antes de incluirse en un bloque de parafina y seccionarse. El plasma se almacenó a -80 °C en alícuotas.

Extracción de proteína del cerebro: el hemisferio derecho congelado se pesó y homogeneizó en 5 volúmenes (5 mL/g de te ido húmedo) de una solución que contiene 50 mM NaCl, 0.2% de dietilamina, inhibidores de proteasa (Roche Diagnostics GmbH) e inhibidor de fosfatasa (Roche Diagnostics GmbH) . Las muestras luego se transfirieron a tubos de policarbonato y se agregaron otros 5 volúmenes de solución de homogeneización, y se mantuvieron en hielo durante 30 min. La fracción soluble se recogió luego de la centrifugación a 100,000 g, 4°C durante 30 min. Esta fracción soluble se usó en el ensayo de IgG humana. El sedimento se resuspendió en 3 volúmenes de PBS con inhibidor de proteasa y fosfatasa. Luego de la centrifugación a 16,000 g, 4°C durante 30 min, los sobrenadantes y sedimentos se almacenaron por separado a -80°C para la extracción de tau insoluble adicional. Los sedimentos se extrajeron adicionalmente con extracción de sarcosilo modificado (Goedert M, Spillantini MG, Cairns NJ, Crowther RA. Neuron 8, 159 (1992)).

ELISA intercalado específico de IgG humano: Se usaron 2 µg/ml de Fab de IgG anti-humano de cabra (Jackson) en 50 mM de amortiguador de recubrimiento ELISA con carbonato (pH 9.6) como anticuerpo de captura. Las placas de microtitülación de 96 pocilios de área media con 30 µ?/pocillo con anticuerpo de captura a 4°C durante la noche. La placa luego se lavó 4 veces con PBS que contiene 0.1% de Tween 20 antes de incubar con 50 µ?/pocillo de PBS que contiene 2% de BSA a temperatura ambiente durante una hora. Las fracciones de extractos de cerebro, las muestras de plasma y anticuerpo estándar (4A3) se diluyeron en PBS que contiene 2% de BSA y 0.1% de Tween 20. Se agregaron 30 µ? de las muestras diluidas en cada pocilio y se incubaron a temperatura ambiente durante una hora. La placa luego se lavó con 200 µ?/pocillo de PBS que contiene 0.1% de Tween 20 durante cuatro veces antes de incubarse con Fcy anti -humano de burro conjugado con HRP (Jackson, diluido a 1:10,000 en PBS que contiene 2% de BSA y 0.1% de Tween 20) a temperatura ambiente durante una hora. Luego se lavó la placa con 200 µ?/pocillo de PBS que contiene 0.1% de Tween 20 durante cuatro veces antes de agregar 20 µ?/pocillo de TMB (1:20 en 10 mM de solución de citrato pH=4.1). La reacción luego se detuvo agregando 10 µ? H2S04 1M a cada pocilio. La curva estándar de anticuerpo se obtuvo a partir de diluciones en serie de 4A3. Las concentraciones de anticuerpo en muestras de plasma y cerebro se calcularon de acuerdo con los estándares. El nivel de IgG humana en el cerebro luego se convirtió en g de tejido cerebral fresco de anticuerpo/gramo (asumiendo 1 g/10 mi) tal como se indica en la Figura 17.

Los niveles elevados de IgG humana se detectaron en el plasma de todos los ratones tratados con 4E4 y 4A3. En contraste, no se detectó IgG humana en el plasma de los ratones tratados con PBS (Figura 16) . La cantidad considerable de IgG humana se detectó en homogenatos de cerebro de ratones tratados con 4E4 y 4A3 (Figura 17) .

Ejemplo 10: Estudio crónico con 4E4 y 4A3 quimérico. 4E4 y 4A3 quiméricos que contienen los dominios variables del anticuerpo humano original y las regiones constantes de IgG2a de ratón se pueden producir por transfección transitoria de células CHO y purificar por purificación por afinidad. Los niveles de endotoxina en cada lote de anticuerpos se controlará y mantendrá por debajo de 1 Eu/mg. A los ratones TauP301L equilibrados por sexo de 7.5-8 meses de edad se les inyectará de forma intraperitoneal 10 mg/kg, 3 mg/kg de solución de anticuerpo, o el mismo volumen de PBS de control. Cada grupo de tratamiento tendrá 20-25 ratones. El tratamiento se realizará una vez a la semana durante 26 semanas. De manera alternativa, el tratamiento se realizará dos veces a la semana durante 13 semanas. El peso corporal se monitorea cada dos semanas . Los ratones se perfundirán con anestesia al final del período de tratamiento. Se recogerán cerebro, médula espinal y sangre. Se puede post-fijar medio cerebro y médula espinal en 10% de formalina durante tres días antes de incrustarse en un bloque de parafina. Se pueden usar secciones de 4-6 µt? de espesor tomadas de estos bloques de tejido para estudios de inmunohistoquímica . La otra mitad del cerebro se pesará y congelará profundamente a -80°C para análisis bioquímicos.

Los efectos de los fármacos se evaluarán comparando el nivel de ovillos neurof ibrilares (NFT) y el nivel de tau con características de solubilidad diferentes en muestras tratadas y de control. Se podrá visualizar NFT mediante impregnación de plata de Gallyas (F Gallyas Acta Morphol . Acad. Sci. Hung 19.1 (1971) ) , o mediante inmunotinción con anticuerpo de ratón monoclonal AT100 y AT180, que reconocen tau fosforilada patológicamente en NFT. La cantidad o frecuencia de neuronas Gallyas positivas y/o neuronas etiquetadas AT100, AT180 en el cerebro y en la médula espinal en ratones tratados con el anticuerpo y animales de control, se puede determinar para evaluar el efecto del tratamiento con anticuerpos.

Se puede extraer tau soluble e insoluble siguiendo el protocolo de extracción de proteína del cerebro descrito en la presente. De forma alternativa, se puede extraer tau soluble e insoluble con extracción de sarcosilo modificado (Goedert M, Spillantini MG, Cairns NJ, Crowther RA. Neuron 8, 159 (1992)) . En resumen, se homogeniza el cerebro congelado en 10 volúmenes (peso/vol) de 10 % de amortiguador de homogenato de sacarosa que consiste en 10 mM de Tris«HCl (pH 7.4), NaCl 0.8 M, 1 mM de EGTA, lmM de Na3V04 , 1 mM de NaF, lmM de AEBSF, inhibidores de proteasa (Roche Diagnostics GmbH) e inhibidor de fosfatasa (Roche Diagnostics GmbH) . El homogenato se giró durante 20 min a 20,000 g, y se retuvo el sobrenadante. El sedimento se homogeneizó en 10 volúmenes de amortiguador de homogeneización y se centrifugó una segunda vez. Los sobrenadantes se juntaron, y se agregó N-lauril-sarcosinato (Sigma) a 1% (peso/vol) de concentración final, y se incubaron a 37°C con 300 rpm de rotación durante 1.5 horas, seguido de centrifugación a 100,000 g durante 1 h. Se recogió el sobrenadante como fracción soluble de sarcosilo y el sedimento de 1 g de tejido cerebral se volvió a suspender en 0.2 mi 50 mM de Tris»HCl (pH 7.4) como fracción de PHF.

Los niveles de tau soluble e insoluble se medirán con kits ELIA de tau comercialmente disponibles ( Invitrogen) . Además, los extractos de proteína de cerebro se separarán con 4-12% de Bis-Tris SDS-PAGE seguido de inmunotihción con anticuerpos Taul2 (tau humana) , AT8 (pS202/pT205) , AT100 (pT212/pS214) , AT180 (pT231) y E178 (pS396) . Se realizará un análisis semicuantitativo midiendo la densidad integrada de cada muestra en comparación con estándares de cantidades conocidas de tau.

De manera adicional, se pueden realizar pruebas de comportamiento tal como se indica en el Ejemplo 5 anterior. Por ejemplo, la mejora en la memoria de funcionamiento en ratones tratados con anticuerpo TauP301L se puede someter a prueba usando una tarea de laberinto en Y en dos ensayos (por ej . , Pennanen, Genes Brain Behav. 5 (2006) , 369-79 el cual se incorpora en su totalidad a la presente mediante esta referencia) . Los tres brazos del laberinto tienen 22 cm de largo, 5 cm de ancho y 15 cm de profundidad. Se colocan señales abstractivas blancas y negras en una cortina negra alrededor del laberinto. Se conducen experimentos con un nivel de luz ambiente de 6 lux durante la fase oscura. Cada experimento comprende una sesión de entrenamiento y una sesión de observación. Durante la sesión de entrenamiento, se asigna un ratón a dos de los tres brazos (el brazo de partida y el segundo brazo) , que sé pueden explorar libremente durante 4 min, sin acceso al tercer brazo (el brazo nuevo) . Luego se retira el ratón del laberinto y se mantiene en una jaula durante 1.5-5 min, mientras se limpia a fondo el laberinto con 70% de etanol para retirar cualquier señal olfativa. Luego se coloca nuevamente el ratón en el laberinto durante la observación con todos los tres brazos accesibles durante 4 min. Se registra la secuencia de entradas, la cantidad de entrada a cada brazo y el tiempo utilizado en cada brazo. A partir de esto, se calcula la relación del tiempo utilizado en el tercer brazo nuevo durante el promedio del tiempo utilizado en los otros dos brazos (brazo de partida y segundo brazo) y se compara en diferentes grupos de tratamiento en modelos de ratón con taupatía y los correspondientes ratones de tipo natural de controlador. Los roedores prefieren típicamente investigar un nuevo brazo del laberinto antes que volver a uno que ya visitaron. Los efectos de los anticuerpos se pueden monitorear con respecto a que los ratones del modelo de taupatía tratados recuperen esta preferencia en comparación con el comportamiento no discriminatorio de los ratones no tratados debido a su alteración de memoria de funcionamiento relacionada a un trastorno. Por lo tanto, una proporción cercana a 1 indica una memoria de funcionamiento alterado. Una proporción mayor indica una memoria de mejor funcionamiento. Se considera que la memoria de funcionamiento alterada en ratones TauP301L se debe a patología de tau que resulta de la sobreexpresión de tau humana. Por lo tanto, una relación considerablemente mayor observada en ratones TauP301L tratados con anticuerpo anti-tau a los ratones TauP301L de control indicará que el anticuerpo anti-tau tiene efecto terapéutico en las patologías tau.

La presente invención no se debe limitar en su alcance por modalidades específicas descritas, cuya intención es solamente ilustrar aspectos individuales de la invención. Asimismo, toda composición o método f ncionalmente equivalente se encuentra dentro del alcance de la presente invención. De hecho, diversas modificaciones de la invención además de las que se muestran y describen en la presente serán evidentes para los expertos en la técnica a partir de la descripción que antecede y las figuras adjuntas. Se pretende que tales modificaciones se encuentren dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención. ;

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Un anticuerpo caracterizado porque es anti-tau monoclonal humano o un fragmento de unión a tau de este.

2. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque (i) es capaz de unirse a tau humana recombinante ; (ii) es capaz de unirse a tau modificada patológicamente; (iii) se une a tau agregada patológicamente en la etapa pre-ovillo, en ovillos neurofibrilares (NFT) , hilos del neurópilo y/o neuritas distróficas en el cerebro (iv) no se une sustancialmente a formas fisiológicas de tau en el cerebro; (v) se une específicamente a una de las isoformas de tau B a F o tau fetal representado por la SEQ ID NO: 1 a 6; (vi) se une específicamente al terminal-C de tau; (vii) se une específicamente al N-terminal de tau; (viii) se une específicamente a un epítopo de tau ubicado en el dominio de unión a microtúbulos que se enmascara en tau asociada a microtúbulos fisiológica; (ix) se une específicamente a tau agregada patológicaménte en la etapa pre-ovillo, en ovillos neurofibrilares (NFT) , hilos del neurópilo y/o neuritas distróficas en el cerebro; (x) se une específicamente a un epítopo de tau que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7; (xi) se une específicamente a un epítopo de tau que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 41; (xii) se une específicamente a un epítopo de tau que comprende las secuencias de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7 y 1 ; o (xiii) se une específicamente a un epítopo de tau que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 42.

3. El anticuerpo o fragmento de unión a tau de este de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque comprende (a) una CDRl de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 23, 29 y 35, una CDR2 de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO:24, 30 y 36, y una CDR3 de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que se seleccionan del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 25, 31 y 37; (b) una CDRl de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 26, 32 y 38, una CDR2 de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 27, 33 y 39, y una CDR3 de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que se seleccionan del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 28, 34 y 40; (c) una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 9, 13, 17 y 93 ; o (d) una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 11, 15 y 19.

4. El anticuerpo o fragmento de unión a tau de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque es un anticuerpo quimérico murino-humano o murinizado.

5. Un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de este que compite con un anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado por la unión específica a tau.

6. El anticuerpo o fragmento de unión a tau de este de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque se selecciona del grupo que consiste en un fragmento Fv de cadena simple (scFv) , un fragmento F(ab'), un fragmento F(ab) y un fragmento F(ab')2.

7. Un polinucleótido caracterizado porque codifica el anticuerpo o fragmento de unión a tau de este de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

8. Un vector caracterizado porque comprende el polinucleótido de conformidad con la reivindicación 7.

9. Una célula hospedadora caracterizada porque comprende el polinucleótido de conformidad con la reivindicación 7 o el vector de conformidad con la reivindicación 8.

10. Un método para preparar un anticuerpo anti-tau o fragmento de unión a tau de este, caracterizado porque comprende (a) cultivar la célula de conformidad con la reivindicación 9; y (b) aislar el anticuerpo o fragmento de unión a tau de este del cultivo.

11. Un anticuerpo anti-tau o fragmento de unión a tau de este codificado por el polinucleótido de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque se puede obtener por el método de conformidad con la reivindicación 10.

12. El anticuerpo o f agmento de unión a tau de este de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 u 11, caracterizado porque está (a) etiquetado de forma detectable, donde la etiqueta detectable se selecciona del grupo que consiste en una enzima, un radioisótopo, un fluoróforo y un metal pesado; o (b) que está unido a un fármaco.

13. Una composición caracterizada porque comprende el anticuerpo o fragmento de unión a tau de este de cualquiera de conformidad con las reivindicaciones 1 a 6, 11 o 12, el polinucleótido de conformidad con la reivindicación 7, el vector de conformidad con la reivindicación 8 o la célula hospedadora de conformidad con la reivindicación 9, donde la composición es (i) una composición farmacéutica que comprende además un portador farmacéuticamente aceptable; o (ii) una composición de diagnóstico que comprende además uno o más reactivos que se usan convencionalmente en métodos de diagnóstico basados en inmuno o ácido nucleico.

14. La composición de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque comprende además un agente adicional útil para el tratamiento de una taupatía neurodegenerativa.

15. El anticuerpo anti-tau o fragmento de unión a tau de este de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, 11 o 12, el polinucleótido de conformidad con la reivindicación 7, el vector de conformidad con la reivindicación 8 o la célula hospedadora de conformidad con la reivindicación 9 para usarse en (i) el tratamiento profiláctico o terapéutico de una taupatía neurodegenerativa en un sujeto, o (ii) el monitoreo de la evolución de una taupatía neurodegenerativa en un sujeto, o la respuesta a un tratamiento de una taupatía neurodegenerativa en un sujeto donde la taupatía neurodegenerativa se selecciona del grupo que consiste en enfermedad de Alzheimer, esclerosis lateral amiotrófica/complejo parkinsonismo-demencia, demencia con granos argirófilos, angiopatía amiloide de tipo inglés, angiopatía amiloide cerebral, degeneración corticobasal , enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, demencia pugilística, ovillos neurofibrilares difusos con calcificaciones, síndrome de Down, demencia frontotemporal , demencia frontotemporal con parkinsonismo vinculado al cromosoma 17, degeneración lobar f ontotemporal , enfermedad de Gerstmann-Stráussler-Scheinker, enfermedad de Hallervorden-Spatz , miositis por cuerpos de inclusión, atrofia multisistémica, distrofia miotónica, enfermedad de Niemann-Pick tipo C, enfermedad de la motoneurona no de Guam con ovillos neurofibrilares , enfermedad de Pick, parkinsonismo postencefalítico, angiopatía amiloide cerebral causada por priones, gliosis subcortical progresiva, parálisis supranuclear progresiva, panencefalitis esclerosante subaguda, demencia de solo ovillo, demencia multiinfarto y apoplejía isquémica.

16. Un método de diagnóstico o monitoreo de la evolución de una taupatía neurodegenerativa en un sujeto, caracterizado porque comprende (a) evaluar el nivel de tau agregada o modificada patológicamente en una muestra de un sujeto a diagnosticar con al menos un anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, 11 o 12; y (b) comparar el nivel de tau agregada o modificada a un estándar de referencia que indica el nivel de tau agregada o modificada patológicamente en uno o más sujetos de control, donde la diferencia o similitud entre el nivel de tau agregada o modificada patológicamente y el estándar de referencia indican que el sujeto tiene una taupatía neurodegenerativa, donde la taupatía neurodegenerativa se selecciona del grupo que consiste en enfermedad de Alzheimer, esclerosis lateral amiotrófica/complej o parkinsonismo-demencia, demencia con granos argirófilos, angiopatía amiloide de tipo inglés, angiopatía amiloide cerebral, degeneración corticobasal , enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, demencia pugilística, ovillos neurofibrilares difusos con calcificaciones, síndrome de Down, demencia f ontotemporal , demencia frontotemporal con parkinsonismo vinculado al cromosoma 17, degeneración lobar frontotemporal , enfermedad de Gerstmann-Str ussler-Scheinker, enfermedad de Hallervorden-Spatz , miositis por cuerpos de inclusión, atrofia multisistémica, distrofia miotónica, enfermedad de Niemann-Pick tipo C, enfermedad de la motoneurona no de Guam con ovillos neurofibrilares , enfermedad de Pick, parkinsonismo postencefalítico, angiopatía amiloide cerebral causada por priones, gliosis subcortical progresiva, parálisis supranuclear progresiva, panencefalitis esclerosante subaguda, demencia de solo ovillo, demencia multiinfarto y apoplejía isquémica.

17. El anticuerpo o f agmento de unión a tau de este de conformidad con cualquiera de conformidad con las reivindicaciones 1 a 6, 11 o 12 para usarse en la detección in vivo de o direccionamiento de un agente terapéutico o de diagnóstico a tau en el cuerpo animal o humano, donde la detección in vivo comprende tomografía de emisión de positrones (PET) , tomografía por emisión de fotones simples (SPECT) , imagenología óptica casi infrarroja (NIR) o imagenología por resonancia magnética (MRI) .

18. Un péptido que tiene un epítopo de tau específicamente reconocido por el anticuerpo de cualquiera de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, 11 o 12, caracterizado porque el péptido comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 9, 41, 42 y combinaciones de estas.

19. Un método para diagnosticar una taupatía neurodegenerativa en un sujeto, caracterizado porque comprende detectar la presencia de un anticuerpo que se une al péptido de conformidad con la reivindicación 18 en una muestra biológica del sujeto.

20. Un kit útil para el diagnóstico de una taupatía neurodegenerativa, caracterizado porque comprende el anticuerpo o fragmento de unión a tau de este de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, 11 o 12, el polinucleótido de conformidad con la reivindicación 7, el vector de conformidad con la reivindicación 8 o la célula hospedadora de conformidad con la reivindicación 9 o el péptido de conformidad con la reivindicación 18, con reactivos o instrucciones de uso.