EA032675B1 - Способ и композиции для лечения болезни альцгеймера и других таупатий - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к способам и композициям для лечения, предотвращения и диагностирования болезни Альцгеймера и других таупатий у пациента путем введения иммуногенного тау-пептида или антитела, распознающего иммуногенный тау-эпитоп, в условиях, эффективных для лечения, предупреждения или диагностирования болезни Альцгеймера или других таупатий. Также описаны способы ускорения выведения скоплений из мозга пациента и замедления прогрессирования связанного с тау-патологией поведенческого фенотипа пациента.

Description

По заявке испрашивается приоритет предварительной заявки на патент (США), серийный номер 61/185895 от 10.06.2009, которая включена в настоящее описание полностью посредством ссылки.

Предмет данной заявки был разработан при поддержке правительства Соединенных Штатов Национальным Институтом Здоровья, грант № AG032611. Правительство Соединенных Штатов имеет определенные права.

Область техники

Изобретение направлено на иммунологические способы и составы для профилактики, лечения и диагностики болезни Альцгеймера и родственных таупатий, а также снижения накопления у пациента нейрофибриллярных сплетений тау и/или их патологических тау-предшественников.

Уровень техники

В качестве неотложной помощи при болезни Альцгеймера (AD), для выведения бета-амилоида (АР) применяется иммунотерапия. Другая важная цель при AD и лобно-височной деменции - это нейрофибриллярные сплетения и/или их тау-протеиновые конформеры, присутствие которых прямо коррелирует со степенью деменции (Terry R., Neuropathological Changes in Alzheimer Disease, Prog. Brain Res. 101:383-390 (1994); Goedert M., Tau Protein and Neurodegeneration, Semin. Cell Dev. Biol. 15:45-49 (2004)). Целью иммунотерапии при тау-паталогии является устранение антителами тау-скоплений, которые могут отрицательно сказываться на жизнеспособности нейронов. Другие компоненты иммунной системы также могут играть роль в этом выведении. Тау-протеин - это растворимый белок, который способствует сборке тубулина, стабильности микротрубочек и целостности цитоскелета. Хотя, судя по изучению синдрома Дауна, тау-патология чаще всего следует за агрегацией АР, анализ мозга больных AD и мышиных моделей показывает, что эти патологии вероятно синергичны (Sigurdsson et al., Local and Distant Histopathological Effects of Unilateral Amyloid-beta 25-35 Injections into the Amygdala of Young F344 Rats, Neurobiol. Aging. 17:893-901 (1996); Sigurdsson et al., Bilateral Injections of Amyloid-β 25-35 into the Amygdala of Young Fischer Rats: Behavioral, Neurochemical, and Time Dependent Histopathological Effects, Neurobiol. Aging. 18:591-608 (1997); Lewis et al., Enhanced Neurofibrillary Degeneration in Transgenic Mice Expressing Mutant Tau and APP, Science 293 (5534): 1487-91 (2001); Gotz et al., Formation of Neurofibrillary Tangles in P301L Tau Transgenic Mice Induced by A-beta 42 Fibrils, Science 293:1491-1495 (2001); Delacourte et al., Nonoverlapping but Synergetic Tau and APP Pathologies in Sporadic Alzheimer's Disease, Neurology. 59:398-407 (2002); Oddo et al., Abeta Immunotherapy Leads to Clearance of Early, But Not Late, Hyperphosphorylated Tau Aggregates via the Proteasome, Neuron 43:321-332 (2004); Ribe et al., Accelerated Amyloid Deposition, Neurofibrillary Degeneration and Neuronal Loss in Double Mutant APP/Tau Transgenic Mice, Neurobiol. Dis. (2005)). Таким образом, воздействуя на обе патологии, можно существенно поднять эффективность лечения. До сих пор при AD тау-мутаций не наблюдалось, тогда как при лобновисочной деменции мутации по тау-белку в 17-й хромосоме (FTDP-17) являются причинным фактором заболевания, который в дальнейшем лежит в основе тау-белкового терапевтического подхода (Poorkaj et al., Tau is a Candidate Gene for Chromosome 17 Frontotemporal Dementia, Ann. Neurol. 43:815-825 (1998); Spillantini et al., Frontotemporal Dementia and Parkinsonism Linked to Chromosome 17: A New Group of Tauopathies, Brain Pathol. 8:387-402 (1998)). Трансгенные мыши, экспрессирующие эти мутации, смоделировали многие аспекты болезни и являются ценными инструментами для изучения патогенеза нейродегенерации, связанной с тау-патологией, и для определения потенциальных способов лечения. Одна из них, мышиная модель P301L (Lewis et al., Neurofibrillary Tangles, Amyotrophy and Progressive Motor Disturbance in Mice Expressing Mutant (P301L) Tau Protein, Nat. Genet. 25:402-405 (2000)), демонстрирует многие черты лобно-височной деменции, хотя распространение тау-скоплений по ЦНС приводит в первую очередь к сенсомоторным аномалиям, что затрудняет анализ. У гомозиготных линий этой мышиной модели ЦНС-патология имеет раннее проявление и сопутствующие функциональные нарушения, что делает их идеальными для первичного определения пригодности иммунотерапии, нацеленной на патологические тау-конформеры.

Другие терапевтические подходы, связанные с тау-белками, включают: (1) препараты, которые ингибируют киназы или активируют фосфатазы, нарушающие фазы тау-фосфорилирования (Iqbal et al., Inhibition of Neurofibrillary Degeneration: A Promising Approach to Alzheimer's Disease and Other Tauopathies, Curr. Drug Targets. 5: 495-502 (2004); Noble et al., Inhibition of Glycogen Synthase Kinase-3 by Lithium Correlates with Reduced Tauopathy and Degeneration In Vivo, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 102:69906995 (2005)); (2) препараты, стабилизирующие микротрубочки (Michaelis et al., {beta}-Amyloid-Induced Neurodegeneration and Protection by Structurally Diverse Microtubule-Stabilizing Agents, J. Pharmacol. Exp. Ther. 312:659-668 (2005); 312:659-668 (2005); Zhang et al., Microtubule-Binding Drugs Offset Tau Sequestration by Stabilizing Microtubules and Reversing Fast Axonal Transport Deficits in a Tauopathy Model, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 102:227-231 (2005)); (3) вещества, препятствующие агрегации тау-белков (Pickhardt et al., Anthraquinones Inhibit Tau Aggregation and Dissolve Alzheimer's Paired Helical Filaments In Vitro and in Cells, J. Biol. Chem. 280:3628-3635 (2005)); и (4) препараты, способствующие выведению тау-белков, опосредованному белками теплового шока (Dickey et al., Development of a High Throughput Drug Screening Assay for the Detection of Changes in Tau Levels - Proof of Concept with HSP90 Inhibitors, Curr. Alz

- 1 032675 heimer Res. 2:231-238 (2005)). Хотя все эти подходы стоит развивать дальше, большое значение имеют специфичность и токсичность мишени, что подчеркивает важность параллельного развития других видов тау-ориентированных способов лечения, таких как иммунотерапия.

Изобретение направлено на восполнение этих и других пробелов в данной области.

Сущность изобретения

Первый аспект данного изобретения нацелен на способ предотвращения или лечения болезни Альцгеймера или другой таупатии. Этот способ предполагает введение пациенту одного или более иммуногенных тау-пептидов, имеющих аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2-75, или одного или более антител, распознающих иммуногенный тау-эпитоп, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2-75 и 101103, при условиях, эффективных для лечения или профилактики болезни Альцгеймера или другой таупатии у пациента.

Другой аспект данного изобретения направлен на способ активации выведения скоплений таубелков из мозга пациента. Этот способ предполагает введение пациенту одного или более иммуногенных тау-пептидов, имеющих аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2-75, или одно или более антител, распознающих иммуногенный тау-эпитоп, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2-75 и 101-103 при условиях, эффективных для активации выведения скоплений тау-белков из мозга пациента.

Третий аспект данного изобретения направлен на способ замедления развития у пациента обусловленного тау-патолотией поведенческого фенотипа. Этот способ предполагает введение пациенту одного или более иммуногенных тау-пептидов, имеющих аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2-75, или одно или более антител, распознающих иммуногенный тауэпитоп, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2-75 и 101-103 при условиях, эффективных для замедления развития у пациента обусловленного таупатолотией поведенческого фенотипа.

Четвертый аспект данного изобретения направлен на отдельный тау-пептид, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 2-75 и 101-103. Иммуногенный тау-пептид эффективен в профилактике и лечении болезни Альцгеймера или другой таупатии, способствуя выведению скоплений из мозга пациента и замедляя развитие у пациента обусловленного тау-патологией поведенческого фенотипа.

Нейрофибриллярные сплетения и их патологические тау-протеиновые конформеры являются важными мишенями при профилактике и лечении болезни Альцгеймера и других тау-обусловленных нейродегенеративных заболеваний. Тем не менее, стратегия нацеливания и выведения нейрофибриллярных сплетений и/или патологических тау-конформеров, имеющая высокую специфичность и минимально токсичная, отсутствует. Иммуногенные тау-пептиды и антитела, описанные здесь, созданы, чтобы восполнить этот недостаток. Поскольку иммуногенные тау-пептиды настоящего изобретения имитируют узкоспецифичные фосфо-эпитопы патологических тау-белков, а тау-антитела распознают их же, проблема высокой специфичности и безопасности решена. Этот сценарий относится также и к описанным здесь антителам, разработанным против свободных N- и С-концов патологических тау-фрагментов. Таким образом, используя описанные здесь иммунологические подходы, можно создать мощный иммунный ответ на патологический тау-протеин с минимальным риском возникновения побочной иммунной реакции на нормальный тау-протеин.

Краткое описание графического материала

Фиг. 1А-1В отображают иммунный ответ мышиной модели JNPL3 P301L со сплетениями на иммуногенные тау-пептиды настоящего изобретения. Двух-трехмесячные мыши получили первые две иммунизации с разницей в две недели и в дальнейшем - ежемесячно. Кровь для определения антител бралась у мышей перед первой иммунизацией, периодически затем, через неделю после вакцинации, и во время умерщвления с целью взятия проб тканей в возрасте 8-9 месяцев. Ответ антител IgG и IgM, показанный на фиг. 1А и 1В, был измерен спустя неделю после 6-й иммунизации (Т3) и снова - в возрасте 8-9 месяцев, в момент умерщвления (Tf=Tfinal). Фиг. 1А демонстрирует сильный иммунный ответ IgG и IgM у мышей JNPL3 P301L, иммунизированных Tau210-216[P-Thr₂₁₂-Ser₂₁₄] (SEQ ID NO: 2), соединенным при помощи связующего агента GPSL с антигенной детерминантой тетанотоксинового Т-хэлпера (ТТ947967). Фиг. 1В показывает сильный ответ антител на эпитоп тетанотоксина, что оценивается по связыванию IgG и IgM с неродственным тау-эпитопом Tau260-264 [P-Ser₂₆₂], объединенным с ТТ947-967 при посредстве GPSL. Пептид был нанесен на планшеты ELISA по 0,5 мкг на лунку, и плазма растворялась в соотношении 1:200;

фиг. 2А-2С демонстрируют, что мыши JNPL3 P301L со сплетениями, иммунизированные Tau260264[P-Ser262] (SEQ ID NO: 3) (также относится к пептиду Т299), соединенным с антигенной детерминантой тетанотоксинового Т-хэлпера при помощи связующего агента GPSL, генерируют мощную реакцию IgG на иммуноген. Фиг. 2А показывает ответ антител IgG, следующий за иммунизацией мышей пептидом Tau260-264[P-Ser₂₆₂]. Как и ранее, мыши получали первые две иммунизации с интервалом в две недели и затем ежемесячно от 2-3 до 8-9 месяцев. Фиг. 2В показывает развитие значительной части иммун

- 2 032675 ного ответа на тетанотоксиновый эпитоп, что подтверждается связыванием IgG неродственного тауэпитопа Tau210-216 [P-Thr₂i2-Ser₂i4], объединенным с ТТ947-967 при посредстве GPSL. Фиг. 2С показывает развитие значительной части иммунного ответа на тау-эпитоп, что подтверждается связыванием IgG большего тау-эпитопа Tau240-270[P-Ser₂₆₂], содержащего участок Tau260-264[P-Ser₂₆₂]. Пептид был нанесен на планшеты ELISA по 0,5 мкг на лунку, и плазма растворялась в соотношении 1:200. ΊΌ-Tfinai: проба крови перед вакцинацией (Т0), спустя неделю после третьей (Т1), шестой (Т2), седьмой (Т3) иммунизации и при получении тканей (Tf);

фиг. 3 показывает мощный ответ антител (IgG) у мышиных моделей JNPL3 P301L со сплетениями, иммунизированных Tau229-237[P-Thr₂₃₁-Ser₂3₅] (SEQ ID NO: 4), соединенным с антигенной детерминантой тетанотоксинового Т-хэлпера (ТТ947-967]. Мыши иммунизировались, начиная с возраста 2-3 месяца, с интервалом в две недели, затем через месяц, проба крови (Т1) бралась спустя неделю после третьей иммунизации. Пептид был нанесен на планшеты ELISA по 0,5 мкг на лунку, и плазма растворялась в соотношении 1:200;

фиг. 4 показывает мощный ответ антител (IgG) у мышиных моделей JNPL3 P301L со сплетениями, иммунизированных псевдофосфорилированным иммуногеном, Tau379-408 [Asp₃₉₆,₄₀₄] (SEQ ID NO: 57) с квасцами в качестве адъюванта. Важно то, что эти антитела в той же мере распознают фосфо-эпитоп Tau379-408[P-Ser₃₉₆,₄₀₄]. Мыши иммунизировались, начиная с возраста 2-3 месяца, первые два раза с интервалом в две недели, и затем - ежемесячно. Кровь бралась (Tf=Tfinai) вместе с пробой тканей в возрасте 8-9 месяцев. Пептид был нанесен на планшеты ELISA по 0,5 мкг на лунку, и плазма растворялась в соотношении 1:200;

фиг. 5А-5В показывают уменьшение патологического тау у мышиной модели со сплетениями, подвергающейся иммунотерапии, наблюдаемое в стволовой части мозга (фиг. 5А) и зубчатой извилине (рис 5В). Гомозиготные мыши JNPL3 тау-Р30Ш были иммунизированы Т299 (Tau260-264 [P-Ser₂₆₂] (SEQ ID NO: 3)), соединенным при помощи связующего агента GPSL с антигенной детерминантой тетанотоксинового Т-хэлпера (ТТ947-967). И в стволовой части, и в зубчатой извилине патологические тау были определены с помощью иммунного окрашивания антител PHF1. PHF1 -моноклональное антитело, распознающее тау-белок, фосфорилированный по серину 404 и 396 на С-конце (Greenberg et ai., Hydrofluoric Acid-Treated Tau PHF Proteins Display the Same Biochemical Properties as Normal Tau, J. Bioi. Chem. 267:564-569 (1992), включено сюда во всей полноте посредством ссылки). Существенное уменьшение окрашивания патологического тау наблюдалось и в стволовой части, и в зубчатой извилине животных, активно иммунизированных пептидом Т299, в сравнении с контрольными особями, получавшими лишь адъювант;

фиг. 6 показывает уменьшение до 56% тау-скоплений в грушевидной коре мышей htau/PS1, иммунизированных фосфорилированным Tau379-408 [P-Ser₃₉₆,₄₀₄] (SEQ ID NO: 82). Наблюдалось существенное различие между иммунизированной и контрольной группами (однофакторный дисперсионный анализ, р<0,01). Ретроспективный анализ также продемонстрировал различие иммунизированных и контрольных мышей htau/PS1 (р<0,01). ** р<0,01;

фиг. 7А-7В показывают, что тау-иммунотерапия предотвращает функциональные нарушения у мышиной модели со сплетениями. Гомозиготные мыши JNPL3 P301L были иммунизированы фосфорилированным иммуногенным пептидом Таи 299 (Tau260-264|P-Ser₂₆₂] (SEQ ID NO: 3)), соединенным при помощи связующего агента GPSL с антигенной детерминантой тетанотоксинового Т-хэлпера (ТТ947967) . Контрольные животные получали только адъювант. Введение Tau260-264[P-Ser₂₆₂]-пептидной вакцины препятствовало функциональным расстройствам, что оценивалось по пороговому моменту в возрасте 8 месяцев при количестве зафиксированных неверных движений у иммунизированных животных меньшем, чем у контрольных (фиг. 7А). Аналогично, введение Tau260-264[P-Ser₂₆₂]-пептидной вакцины предотвращало функциональные расстройства, определенные с помощью теста вращающегося стержня, как в возрасте 5-6 месяцев, так и в возрасте 8-9 (фиг. 7В);

фиг. 8А-8В показывают, что иммунизация мышей htau/PS1 фосфорилированным Tau379-408 [PSer₃₉₆,₄₀₄] (SEQ ID NO: 82) нормализует результаты прохождения радиального лабиринта (фиг. 8 А) и теста распознавания объекта (фиг. 8В). Существенная разница наблюдалась между иммунизированной и контрольной группой при прохождении радиального лабиринта (двухфакторный дисперсионный анализ, повторные показатели, р<0,0001), как показано на фиг. 8А. Ретроспективный тест Ньюмена-Кеульса обнаружил у иммунизированных мышей htau/PS1 лучшие результаты (т.е. меньше ошибок), чем у контрольной группы за все дни (р<0,01-0,001). Существенное различие между группами также наблюдалось при прохождении теста распознавания объекта (однофакторный дисперсионный анализ, р=0,005) (фиг. 8В). Ретроспективный тест Ньюмена-Кеульса обнаружил, что кратковременная память иммунизированных мышей htau/PS1 лучше, чем у контрольной группы (р<0,01). Было установлено, что мыши с нормальной познавательной способностью тратят порядка 70% времени на новый объект в сравнении с уже известным. ** р<0,01;

фиг. 9А-9С показывают, что иммунизация мышей htau/PS1 фосфорилированным Tau379-408 [PSer₃₉₆,₄₀₄] (SEQ ID NO: 82) нормализует результаты прохождения симметричного лабиринта закрытого поля. Существенные различия наблюдались между иммунизированными и контрольными группами с

- 3 032675 учетом ошибок, допущенных в каждом из лабиринтов 9А-9С (однофакторный дисперсионный анализ, лабиринт А: р<0,001, лабиринт В: р<0,0001, лабиринт С: р<0,01). Ретроспективный анализ выявил, группа htau/PS1, подвергнутая лечению, показала лучшие результаты, чем идентичные контрольные мыши (htau/PS1 контроль) (лабиринт А: р<0,01, лабиринт В, С: р<0,001). Ретроспективный анализ также выявил существенные различия между некоторыми другими группами в зависимости от лабиринта, но эти различия в меньшей степени относятся к делу и, таким образом, не разбираются здесь подробно. Сложность лабиринтов возрастала от первого до третьего, что демонстрирует количество ошибок (обратите внимание, что показатель по оси Y варьирует). ** р<0,01, *** р<0,001;

фиг. 10A-10F - это графическое отображение уровней растворимых и нерастворимых тау-белков (общих и паталогических тау), обнаруживаемых с помощью вестерн-блоттинга у иммунизированных фосорилированным Tau379-408 [P-Ser₃₉₆,4₀₄] (SEQ ID NO: 82) мышей htau/PS1 и соответствующих контрольных особей. Тау-иммунотерапия уменьшает содержание патологических тау-белков по отношению к общему уровню тау на 35-43% (фиг. 10С и 10D). Иммунотерапия не оказывала влияния на общий уровень тау, что определялось с помощью антитела В19 (фиг. 10А и 10В), важного для надежности данного подхода. В сравнении с контролем htau/PS1 содержание PHF1-растворимых тау-белков значительно снизилось (р<0,001), а соотношение растворимых тау-белков (₽№1/общие тау) уменьшилось на 35% (р<0,05) (фиг. 10Е). Также наблюдалась четкая тенденция к снижению содержания PHF1-нерастворимых тау-белков (р=0,06), а соотношение нерастворимых тау-белков (ГЮТ/общие тау) уменьшилось на 43% (р=0,08) (фиг. 10F). ** p<0,05, *** p<0,001;

фиг. 11А-11С демонстрируют, что пассивная иммунотерапия, нацеленная на эпитопы 396 и 404 фосфорилированного тау-белка, предотвращает функциональное ухудшение и уменьшает тау-патологию у мышей со сплетениями P301L. Фиг. 11А - это график, показывающий существенную разницу в количестве неверных движений, совершенных в пороговый момент контрольными особями, которым вводили IgG, и PHF1-иммунизированными мышами P301L, где контрольные животные, пересекая пороговый момент, совершали больше неверных движений (объединенные исследования, р=0,03). Фиг. 11В - это график, показывающий процент иммуноокрашивания в зубчатой извилине иммунизированных и контрольных мышей P301L. В зубчатой извилине PHF1-иммунизированных мышей P301L выявилось на 58% меньшее тау-патологическое PHF1-окрашивание, чем у контрольных особей (р=0,02). Как видно из фиг. 11С, количество антител PHF-1 (мкг/мкл) в плазме за две недели уменьшилось в 4 раза. В контрольных образцах не наблюдалось заметного содержания антител, тогда как у иммунизированных животных их уровень со временем снизился. Средние значения для иммунизированных мышей таковы. Т0: до первой иммунизации, Т1: 24 ч после 12-й инъекции, Т2: 7 дней после 13-й и последней инъекции, Т3: 14 дней после последней инъекции. На планшеты ELISA был нанесен Tau379-408 [P-Ser₃₉₆,₄₀₄];

фиг. 12А-12В - это графики, показывающие обратную корреляцию между уровнем антител PHF1 в плазме и тау-патологией. Наблюдалась значительная корреляция в стволовой части мозга (фиг. 12А; р<0,01) и четкая тенденция к корреляции в двигательной зоне коры (фиг. 12В; р=0,06);

фиг. 13А-13В - это графики, отображающие синтез моноклональных антител в ответ на иммуногенный тау-пептид, включающий аминокислоты 386-408 (SEQ ID NO: 13), содержащий эпитопы, фосфорилированные по серину в положении 396 и 404. Как показано на фиг. 13 А, с помощью серии титрований плазмы был зафиксирован очень интенсивный синтез антител против белка-носителя иммуногена Tau386-408 [P-Ser₃₉₆,₄₀₄] (red). Антитела плазмы преимущественно распознавали фосфо^ег404-эпитоп (blue) и не-фосфорилированный эпитоп (white). Фосфо-Ser396-эпитоп (green) распознавался в меньшей степени. Было обнаружено много резко-положительных клонов (>50). Из них 8 фосфо-специфичных клонов было отобрано для первого субклонирования (фиг. 13В). Все оказалось стабильно, и три клона были отобраны для второго субклонирования (все IgG1). Из клонов, не проявлявших специфического распознавания фосфорилированного эпитопа, шесть были отобраны для первого субклонирования. Все оказалось стабильно, и три клона были отобраны для второго субклонирования (IgG1, IgG2a и IgM);

фиг. 14А-14В - это графики, показывающие связывание эпитопа стабильными фосфоспецифичными (фиг. 14А) и фосфо-неспецифичными (рис. 14В) клонами антител Tau-386-408 [P-Ser₃₉₆, ₄₀₄] после третьего субклонирования в ELISA. Из фосфо-специфичных моноклональных антител, отобранных для дальнейшего субклонирования, у четырех из шести сохранилась специфичность к фосфоSer^-эпитопу (см. клоны 1F12C2, 1F12G6, 4Е6Е3 и 4E6G7 на фиг. 14А). Два клона менее фосфоспецифичны (8B2D1) или неспецифичны (8B2D4) (фиг. 14А) Из фосфо-неспецифичных моноклональных антител, в частности, 6В2Е9 и 6B2G12 сохранили неспецифичность после дальнейшего субклонирования (фиг. 14В). Приведенные данные были получены при растворении супернатанта культуры в пропорции 1:810;

фиг. 15А-15В - результаты вестерн-блоттинга, показывающие реактивность четырех клонов Tau386-408 P-Ser₃₉₆,₄₀₄] фосфо-специфичных (фиг. 15 А) и фосфо-неспецифичных (фиг. 15В) моноклональных антител в гомогенатах мозга, взятого у мышей JNPL3 P301L и у мышей дикого типа (Wt). Из четырех фосфо-специфичных клонов 4E6G7 демонстрирует наибольшую реактивность, что согласуется с результатами тестов ELISA на фиг. 14А. В отличие от антитела PHF-1, которое также распознает тау-РSer₃₉₆, ₄₀₄-эпитоп, все клоны лучше реагируют с гомогенатом мозга мышей JNPL3 P301L, чем мышей ди

- 4 032675 кого типа. Не-фосфо-специфичные клоны реагировали, как и ожидалось, быстрее, поскольку большинство тау-белков не фосфорилированы;

фиг. 16А-16В иллюстрируют синтез моноклональных антител в ответ на иммуногенный тау-пептид, включающий аминокислоты 260-271 (SEQ ID NO: 12) и содержащий эпитоп, фосфорилированный по серину в положении 262. Как показано на фиг. 16 А, высокий титр антител был вызван иммуногеном Tau260-271[P-Ser₂₆₂] (purple), но антитела плазмы также распознавали не фосфорилированный пептид Tau260-271 (No-P; white). Восемь стабильных фосфо-специфичных клонов было выбрано для дальнейших исследований (фиг. 16В);

фиг. 17 - это результат вестерн-блоттинга, показывающий реактивность трех клонов Tau260-271[PSer^-фосфо-специфичных моноклональных антител. Клон антитела 2С11 распознает более высокомолекулярную зону, чем другие фосфо-специфичные клоны, и в этом нет различий между тканями дикого типа и P301L. 5F7D10 и 5F7E9 представляют другие клоны. Tau-5 распознает все тау-белки, связывая эпитоп в районе аминокислот в положении 216-227. СР27 распознает человеческие, но не мышиные таубелки;

фиг. 18А-18Е - это иммуногистохимические микрофотографии, показывающие обнаружение таупаталогии с использованием клона антитела 5F7D10 в срезах мозга мыши P301L со сплетениями. Моноклональное антитело 5F7D10 демонстрирует интенсивное гистологическое окрашивание в срезе мозга P301L (фиг. 18А) по сравнению с диким типом (фиг. 18В). Антитело PHF1 также влияло на таупаталогию у мыши со сплетениями (фиг. 18С), однако характер был другой, нежели в случае с антителом 5F7D10, что неудивительно, поскольку они распознают различные тау-эпитопы. Фиг. 18D - это увеличенное изображение участка на фиг. 18А, ограниченного рамкой, на котором видны нейроны со скоплениями тау-белка. Фиг. 18Е - сильно увеличенное изображение похожей на сплетение паталогии, обнаруженной с помощью 5F7D10 у другой мыши JNPL3 P301L.

Подробное описание изобретения

Первый аспект данного изобретения нацелен на способ предотвращения или лечения болезни Альцгеймера или другой таупатии. Этот способ предполагает введение пациенту одного или более иммуногенных тау-пептидов, имеющих аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 2-75, или одного или более антител, распознающих иммуногенный тау-эпитоп, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 2-75 и 101-103, при условиях, эффективных для лечения или профилактики болезни Альцгеймера или другой таупатии у пациента.

Использованный в данном случае термин таупатия включает любое нейродегенеративное заболевание, влекущее за собой образование в мозге патологического скопления тау-протеина микротрубочек. Соответственно, в дополнение к семейной и спорадической болезни Альцгеймера, другие таупатии, поддающиеся лечению способами настоящего изобретения, включают в том числе: лобно-височную деменцию, паркинсонизм, связанный с 17-й хромосомой (FTDP-17), болезнь Стила-Ричардсона-Ольшевского, кортико-базальную дегенерацию, атрофию Пика, прогрессивный субкортикальный глиоз, сенильную деменцию, диффузные нейрофибриллярные сплетения с кальцинозом, деменцию аргирофильных волокон, комплекс амиотрофического бокового склероза, паркинсонизма и деменции, деменцию боксеров, синдром Дауна, болезнь Герстманна-Штреусслера-Шейнкера, болезнь Халлервордена-Шпатца, миозит с включенными тельцами, болезнь Крейцфельда-Якоба, множественную системную атрофию, липоидный гистиоцитоз типа С, прионовую церебральную амилоидную ангиопатию, подострый склерозирующий панэнцефалит, миотоническую дистрофию, болезнь двигательного нейрона с нейрофибриллярными сплетениями, постэнцефалитический паркинсонизм и хроническую травматическую энцефалопатию.

Другой аспект данного изобретения направлен на способ активации очистки мозга пациента от скоплений тау-белков. Этот способ предполагает введение пациенту одного или более иммуногенных таупептидов, имеющих аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающую SEQ ID NO: 2-75, или одного или более антител, распознающих иммуногенный тау-эпитоп, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 2-75 и 101-103 при условиях, эффективных для активации очистки мозга пациента от скоплений тау-белков.

Очистка от тау-скоплений включает очистку от нейрофибриллярных сплетений и/или их патологических тау-предшественников. Нейрофибриллярные сплетения часто связаны с нейродегенеративными заболеваниями, такими как семейная и спорадическая болезнь Альцгеймера, амиотрофический боковой склероз, деменция аргирофильных волокон, деменция боксеров, хроническая травматическая энцефалопатия, диффузные нейрофибриллярные сплетения с кальцинозом, синдром Дауна, болезнь ГерстманнаШтреусслера-Шейнкера, болезнь Халлервордена-Шпатца, наследственная лобно-височная деменция, паркинсонизм, связанный с 17-й хромосомой (FTDP-17), миозит с включенными тельцами, болезнь Крейцфельда-Якоба, множественная системная атрофия, липоидный гистиоцитоз типа С, атрофия Пика, прионовая церебральная амилоидная ангиопатия, спорадическая кортико-базальная дегенерация, болезнь Стила-Ричардсона-Ольшевского, подострый склерозирующий панэнцефалит, миотоническая дистрофия, болезнь двигательного нейрона с нейрофибриллярными сплетениями, сенильная деменция и прогрессивный субкортикальный глиоз.

- 5 032675

Следующий аспект данного изобретения направлен на способ замедления развития у пациента обусловленного тау-патолотией поведенческого фенотипа. Этот способ предполагает введение пациенту одного или более иммуногенных тау-пептидов, имеющих аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 2-75, или одного или более антител, распознающих иммуногенный тау-эпитоп, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 2-75 и 101-103 при условиях, эффективных для замедления развития у пациента обусловленного тау-патолотией поведенческого фенотипа.

Термин тау-патология здесь относится к поведенческому фенотипу, включающему, в том числе, когнитивные нарушения, раннее изменение личности и расторможенность, апатию, абулию, мутизм, апраксию, персеверацию, стереотипные движения и поведение, вербигерацию, дезорганизацию, неспособность планировать и организовывать последовательное выполнение задач, эгоизм и нечуткость, антисоциальные черты, недостаток сочувствия, запинающуюся, аграмматичную речь с частыми парафазическими ошибками, но сравнительно сохраненную апперцепцию, нарушенную апперцепцию и трудности с нахождением слов, медленно прогрессирующее расстройство походки, ретропульсии, замерзание, частые падения, невосприимчивую к ловодопу аксиальную ригидность, надъядерный паралич взора, прямоугольно-импульсные сокращения мыщц, замедленные вертикальные саккады, псевдобульбарный паралич, апраксию конечностей, дистонию, кортикальную потерю чувствительности и тремор.

В соответствии с способами настоящего изобретения, с одним из вариантов, пациенту при необходимости вводится иммуногенный тау-пептид или их комбинация. Фрагменты соответствующего иммуногенного пептида в тау-протеине содержат один или более антигенных эпитопов, имитирующих патологическую форму тау-протеина. Образцы иммуногенных тау-эпитопов фосфорилированы по одной или более аминокислотам, тем же, что фосфорилированы в патологической форме тау-белка, но не являются таковыми в естественной или непатологической форме тау-белка.

В наиболее предпочтительном осуществлении данного изобретения введение иммуногенного таупептида индуцирует у пациента активный иммунный ответ на иммуногенный тау-пептид и на патологическую форму тау-белка, таким образом способствуя очищению от связанных с ней тау-скоплений, замедляя развитие связанного с патологией поведения и устраняя таупатическую первопричину. В соответствии с этим аспектом изобретения иммунный ответ подразумевает развитие действенного гуморального (антителозависимого) и/или клеточного (опосредованного антигенспецифичными Т-клетками или продуктами их секреции) ответа, направленного на иммуногенный тау-пептид.

Наличие гуморального иммунного ответа можно обнаружить и наблюдать при исследовании биологического материала пациента (например кровь, плазма, сыворотка, моча, слюна, кал, спинномозговая жидкость или лимфа) на предмет антител, направленных на иммуногенный тау-пептид. Способы выявления антител в биологическом материале хорошо известны, например ELISA, дот-блоттинг, электрофорез в ПААГ или способ иммуноферментных пятен. Наличие клеточно-зависимого иммунного ответа может быть установлено анализом пролиферации (CD4⁺-T-клеток) или ЦТЛ (цитотоксических Тлимфоцитов) с помощью хорошо известных способов.

Выделенные иммуногенные тау-пептиды настоящего изобретения включают аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 2-30, показанные ниже, в табл. 1. Фосфорилированные аминокислотные остатки каждой цепочки выделены жирным и помечены сносками. Названия пептидов в табл. 1 соответствуют порядку расположениия в них аминокислот в самой длинной изоформе человеческого таупротеина, включающей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, как показано ниже.

- 6 032675

Met 1

Ala

Glu

Pro

Arg 5

Gin

Glu

Phe

Glu Vai 10

Met

Glu

Asp

His

Ala 15

Gly

Thr

Tyr

Gly

Leu

Gly

Asp

Arg

Lys

Asp

Gin

Gly

Gly

Tyr

Thr

Met

Hrs

20

25

30

Gin

Asp

Gin

Glu

Gly

Asp

Thr

Asp

Ala

Gly

Leu

Lys

Glu

Ser

Pro

Leu

35

40

45

Gin

Thr

Pro

Thr

Glu

Asp

Gly

Ser

Glu

Glu

Pro

Gly

Ser

Glu

Thr

Ser

50

55

60

Asp

Ala

Lys

Ser

Thr

Pro

Thr

Ala

Glu

Asp

Vai

Thr

Ala

Pro

Leu

Vai

65

70

75

90

Asp

Glu

Gly

Ala

Pro

Gly

Lys

Gin

Ala

Ala

Ala

Gin

Pro

His

Thr

Glu

85

90

95

Ile

Pro

Glu

Gly

Thr

Thr

Ala

Glu

Glu

Ala

Gly

Ile

Gly

Asp

Thr

Pro

100

105

110

Ser

Leu

Glu

Asp

Glu

Ala

Ala

Gly

His

Vai

Thr

Gin

Ala

Arg

Met

Vai

115

120

125

Ser

Lys

Ser

Lys

Asp

Gly

Thr

Gly

Ser

Asp

Asp

Lys

Lys

Ala

Lys

Gly

130

135

140

Ala

Asp

Gly

Lys

Thr

Lys

Ile

Ala

Thr

Pro

Arg

Gly

Ala

Ala

Pro

Pro

145

150

155

160

Gly

Gin

Lys

Gly

Gin

Ala

Asn

Ala

Thr

Arg

lie

Pro

Ala

Lys

Thr

Pro

155

170

175

Pro

Ala

Pro

Lys 180

Thr

Pro

Pro

Ser

Ser 185

Gly

Glu

Pro

Pro

Lys 190

Ser

Gly

Asp

Arg

Ser

Gly

Tyr

Ser

Ser

Pro

Gly

Ser

Pro

Gly

Thr

Pro

Gly

Ser

195

200

205

Arg

Ser

Arg

Thr

Pro

Ser

Leu

Pro

Thr

Pro

Pro

Thr

Arg

Glu

Pro

Lys

210

215

220

Lys

Vai

Ala

Vai

Vai

Arg

Thr

Pro

Pro

Lys

Ser

Pro

Ser

Ser

Ala

Lys

225

230

235

240

Ser

Arg

Leu

Gin

Thr

Ala

Pro

Vai

Pro

Met

Pro

Asp

Leu

Lys

Asn

Vai

245

250

255

Lys

Ser

Lys

lie

Gly

Ser

Thr

Glu

Asn

Leu

Lys

His

Gin

Pro

Gly

Gly

260

265

270

Gly

Lys

Vai

Gin

He

He

A.sn

Lys

Lys

Leu

Asp

Leu

Ser

Asn

Vai

Gin

275

280

285

Ser

Lys

Cys

Gly

Ser

Lys

Asp

Asn

lie

Lys

His

Vai

Pro

Gly

Gly

Gly

290

295

300

Ser

Vai

Gin

lie

Vai

Tyr

Lys

Pro

Vai

Asp

Leu

Ser

Lys

Vai

Thr

Ser

305

310

315

320

Lys

Cys

Gly

Ser

Leu

Gly

Asn

He

His

His

Lys

Pro

Gly

Gly

Gly

Gin

325

330

335

Vai

Glu

Vai

Lys

Ser

Glu

Lys

Leu

Asp

Phe

Lys

Asp

Arg

Vai

Gin

Ser

340

345

350

Lys

lie

Gly

Ser

Leu

Asp

Asn

lie

Thr

His

Vai

Pro

Gly

Gly

Gly

Asn

355

360

365

Lys

Lys

He

Glu

Thr

His

Lys

Leu

Thr

Phe

Arg

Glu

Asn

Ala

Lys

Ala

370

375

380

Lys

Thr

Asp

His

Gly

Ala

Glu

lie

Vai

Tyr

Lys

Ser

Pro

Vai

Vai

Ser

385

390

395

400

Gly

Asp

Thr

Ser

Pro

Arg

His

Leu

Ser

Asn

Vai

Ser

Ser

Thr

Gly

Ser

405

410

415

Ils

Asp

Met

Vai

Asp

Ser

Pro

Gin

Leu

Ala

Thr

Leu

Ala

Asp

Glu

Vai

420

425

430

Ser

Ala

Ser

Leu

Ala

Lys

Gin

Gly

Leu

435

440

- 8 032675

Таблица 1. Иммуногенные Тау пептиды

SEQ ID N0:	наименование	последовательность
SEQ ID NO: 2	Tau210-216 [P-Thr.j, - Ser214]	SRT*PS*LP
SEQ ID NO; 3	Tau260-264 [P-Ser262 ]	IGS*TE
SEQ ID NO: 4	Tau229-237 [P-Thr231- Ser2J5]	VRT*PPKS*PS
SEQ ID NO: 5	Tau394-406 [P- Ser 404 1	YK$*PVVSGDTS*PR
SEQ ID NO: 6	Taul92-221 (P-Thr^ Serini	GDRSGYSSPGSPGTPGSRSRT*PS*LPTPPTR
SEQ ID NO: 7	Taul92-221 [P-Seri9% 202, 214, ТЬГ2Г15, jij]	GDRSGYSS*PGS*PGT*PGSRSRT*PS*LPTPPTR
SEQ ID NO: 8	Taul92-221 [P-Ser 155,214 Thr212 , 21-|	GDRSGYSS*PGSPGTPGSRSRT*PS*LPT*PPTR
SEQ ID NO: 9	Taul92-221 [₽- Ser2lj2Thr203 ]	GDRSGYSSPGS*PGT*PGSRSRTPSLPTPPTR
SEQ ID NO: 10	Tau200-229 [P-Thr212- Ser2i4 ]	PGSPGTPGSRSRT*PS*LPTPPTREPKKVAW
SEQ ID NO: 11	Tau322-358 [P-Ser 324,35½)	CGS*LGNIHHKPGGGQVEVKSEKLDFKDRVQSKIGS*LD
SEQ ID NO: 12	Tau260-271 [P-Ser262]	IGS*TENLKHQPG
SEQ ID NO: 13	Tau386-408 [P-Ser^6, вегцпц]	TDHGAEIVYKS*PVVSGDTS*PRHL
SEQ ID NO: 14	Tau48-7I [P-Thr5n,6i]	LQT*PTEDGSEEPGSETSDAKST*PT
SEQ ID NO: 15	Taulll-115 [P-Ser113|	TPS*LE
SEQ ID NO: 16	Taul51-155[P-Thr^s]	IAT*PR
SEQ ID NO: 17	Taul73-177 [P-Thri?5]	AKT*PP
SEQ ID NO: 18	Tau203-219[P- ТЪГ20?, 212,217_Ser2o«/ 2in, „14	PGT*PGS*RS*RT*PS*LPT*PP
SEQ ID NO: 19	Tau233-237 [P-Thr23 = ]	PKS*PS

- 9 032675

SEQ ID NO: 20	Tau256-264 [P—Sei?25A,2ij]	VKS*KIGS*TE
SEQ ID NO: 21	Tau2S7-291 [P-Ser2ss]	VQS*KC
SEQ ID NO: 22	Tau354-358 [P-Ser350 ]	IGS*LD
SEQ ID NO: 23	Tau398-416[P- 5400,409,412,413 “ Thr 40 4, 41 4 ]	WS*GDT*SPRHLS*NVS*S*T*GS
SEQ ID NO: 24	Tau420-437[P- Ser 422, 433, 43.5 — Thr427]	VDS*PQLAT*LADEVS*AS*LA
SEQ ID NO: 25	Tau200-204 [P-Ser;o;]	PGS*P
SEQ ID NO: 26	Tau203-207 [P-Thr205]	PGT*PG
SEQ ID NO: 2 7	Taul97-207 [P-Ser153j2Q2- -Thr205]	YSS*PGS*PGT*PG
SEQ ID N0:28	Tau206-216 [P-Thr;12:- Ser214]	PGSRSRT*PS*LP
SEQ ID N0:29	Tau229-239 [P-Thr;.51- Ser235]	VRT*PPKS*PSSA
SEQ ID N0:30	Taul79-188 [P-Thr^i- 5er 1Θ4, 1	PKT*PPS*S*GEP

Могут быть использованы также варианты и аналоги вышеприведенных иммуногенных пептидов, индуцирующих и/или перекрестно реагирующих с антителами к нужным тау-протеиновым эпитопам. Аналоги, включающие аллельные, видовые и модельные варианты, обычно отличаются от пептидов естественного происхождения на одно, два или несколько положений, часто в силу консервативного замещения. Аналоги обнаруживают как минимум 80 или 90% идентичности последовательностей с естественными пептидами. Некоторые аналоги включают также неприродные аминокислоты или модификации N- и С-концах в одном, двух или нескольких положениях.

В одном из вариантов настоящего изобретения альтернативные тау-пептиды - псевдофосфорилированные. Синтез псевдофосфориллированных пептидов происходит в результате замещения одного или более остатков фосфориллированного серина, треонина тау-пептидов остатками кислых аминокислот, в частности глутаминовой и аспарагиновой (Huang et al., Constitutive Activation of Mek1 by Mutation of Serine Phosphorylation Sites, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (19): 8960-3 (1994), включено сюда целиком посредством ссылки). Образцы выделенных иммуногенных псевдофосфорилированных таупептидов настоящего изобретения показаны ниже, в табл. 2. Положение, в котором происходит замещение аминокислотного остатка, во всех последовательностях табл. 2 обозначено X, где X - замена на глутамат или аспартат.

- 10 032675

Таблица 2. Иммуногенные псевдофосфорилированные пептиды

SEQ	ID NO:	наименование	последовательность
SEQ	ID	NO:	Tau210-216	[T212X,	SRXPXLP
31			Ξ214Χ]
SEQ	ID	NO:	Tau260-264 [S262X]	IGXTE
32
SEQ	ID	NO:	Taa229-237	[T231X,	VRXPPKXPS
33			S235XI
SEQ	ID	NO:	Tau394-406	[S396X,	YKXPVVSGDTXPR
34			S202X]
SEQ	ID	NO:	Taul92-221		GDRSGYSSPGSPGTPGSRSRXPXLPTPPTR
35			[T212X,S214X
SEQ	ID	NO:	Taul92-221	[S199X,	GDRSGYSXPGXPGXPGSRSRXPXLPTPPTR
36			S202X,	S214X,
			T205X, T212X
SEQ	ID	NO:	Taul92-221	[S199X,	GDRSGYSXPGSPGTPGSRSRXPXLPXPPTR
37			S214X,	T212X,
			T217X]
SEQ	ID	NO:	Taul92-221	[S202X,	GDRSGYSSPGXPGXPGSRSRTPSLPTPPTR
38			T205X]
SEQ	ID	NO:	Tau200-229		PGSPGTPGSRSRXPXLPTPPTREPKKVAW
39			[T212X,S214X
SEQ	ID	NO:	Tau322-358[S324X,	CGXLGNIHHKPGGGQVEVKSEKLDFKDRVQSKIGXLD
40			S356XI
SEQ	ID	NO:	Tau260-271[S262X]	IGXTENLKHQPG
41
SEQ	ID	NO:	Tau386-408	[S396X,	TDHGAEIVYKXPVVSGDTXPRHL
42			S404X]

- 11 032675

SEQ 43	ID	NO:	Tau48-71 [T50X, T69X]	LQXPTEDGSEEPGSETSDAKSXPT
SEQ 44	ID	NO:	Taulll-115 (S113X)	TPXLE
SEQ 45	ID	NO:	Taul51-155[T153X]	IAXPR
SEQ 46	ID	NO:	Taul73—177[T175X]	AKXPP
SEQ 47	ID	NO:	Tau203-219[T205X, T212X, T217X, S208X, S210X, S214X]	PGXPGXRXRXPXLPXPP
SEQ 43	ID	NO:	Tau233-237[T235X]	PKXPS
SEQ 49	ID	NO:	Tau256-264[S258X, S262X]	VKXKIGXTE
SEQ 50	ID	NO:	Tau287-291[S289X]	VQXKC
SEQ 51	ID	NO:	Tau354-358[S356X]	IGXLD
SEQ 52	ID	NO:	Tau39S-416[S400X, S409X, S412X, S413X, T403X, S414X]	VVXGDXS PRHLXNVXXXGS
SEQ 53	ID	NO:	Tau420-437[S422X, S433X, S435X, T427X]	VDXPQ L AXL ADE VXAXL A
SEQ 54	ID	NO;	Tau200-204[S202X]	PGXP
SEQ 55	ID	NO:	Tau203-207[T205X]	PGXPG
SEQ 56	ID	NO:	Tau 133-162 [T149X, T153X]	DGTGSDDKKAKGADGKXKIAXTPRGAAPPGQ
SEQ 57	ID	NO:	Tau 379-408 [S396X, S404X]	RENAKAKTDHGAEIVYKXPWSGDTXPRHL
SEQ 53	ID	NO:	Tau 192-221 [S199X, S202X, S214X, T205X, T212X]	GDRSGYSXPGXPGXPGSRSRXPXLPTPPTR
SEQ 59	ID	NO:	Tau221-250 [T231X, S235X)	REPKKVAWRXPPKXPSSAKSRLQTAPVPM

- 12 032675

SEQ	ID	NO:	Taul84-213[S184X,	XSGEPPKXGDRSQXXXPGXPGXPGXRXRX
60			S191X, S198X, S202X, S208X, T212X]	Y197X, S199X, T205X, S210X,
SEQ 61	ID	NO:	Taul-30 Y29X]	[Y18X,	MAEPRQEFEVMEDHAGTXGLGDRKDQGGXT
SEQ 62	ID	NO:	Tau30-60 S46X, T50X Ξ56Χ]	[T39X, , T52X,	TMHQDQEGDXDAGLKEXPLQXPXEDGXEEPG
SEQ 63	ID	NO:	Tau60-90 T69Xj T71X]	[S68X,	GSE TSDAKXXPXAEDVTAPLVDEGAPGKQAA
SEQ 64	ID	NO:	Tau90-120 T101X, T113X]	[T95X, T102X,	AAQPHXEIPEGXXAEEAGIGDTPXLEDEAAG
SEQ 65	ID	NO:	Taul20-150 [T123X, S131X, T149X]	GHVXQARMVSKXKDGTGSDDKKAKGADGKXK
SEQ 66	ID	NO:	Taul50-180	[T175X]	КIATPRGAAPPGQKGQANATRIPAKXPPAPK
SEQ 67	ID	NO:	Taul80-210 [T181X, S184X, S185X,Y197X, S198X, S199X, S202X, T205X, S208XI	KXPPXXGEPPKSGDRSGXXXPGXPGXPGXRS
SEQ 68	ID	NO:	Tau210-240 S214X, T231X,S235X S238XI	[T212X, T217X, , S237X,	SRXPXLPXPPTREPKKVAVVRXPPKXPXXAK
SEQ 69	ID	NO:	Tau240-270	[S262X]	KSRLQTAPVPMPDLKNVKSKIGXTENLKHQP
SEQ 70	ID	NO:	Tau270-300	[S293]	PGGGKVQIINKKLDLSNVQSKCGXKDNIKHV
SEQ 71	ID	NO:	Tau300-330 S324X]	[Y310,	VPGGGSVQIVXKPVDLSKVTSKCGXLGNIHH
SEQ 72	ID	NO:	Tau330-360	[S356X)	HKPGGGQVEVKSEKLDFKDRVQSKIGXLDNI
SEQ 73	ID	NO:	Tau360-390 [T361X, T373X, T386X]	IXHVPGGGNKKIEXHKLTFRENAKAKXDHGA

SEQ 74	ID	NO:	Tau390-420 S396X, T403X, S409X, S413X)	[Ύ394Χ, S400X, Г404Х, S412X,	AEIVXKXPVVXGDXXPRHLXNVXXTGSIDMV
SEQ 75	ID	NO:	Tau411-441 [S412X, S413X, S422X]	VXXTGSIDMVDXPQLATLADEVSASLAKQGL

Все тау-пептиды данного изобретения, а именно SEQ ID NO: 2-75 и 87-88 (табл. 3 ниже) преимуществено ацетилированы на N-конце и амидированы на С-конце для более полного соответствия тем же аминокислотам, встроенным в полноценный тау-протеин. Для повышения стабильности эти тау-пептиды также могут содержать один или более D-аминокислотных остатков. D-аминокислоты могут располагаться в том же порядке, что и в L-форме пептида, или в обратном, в целях сохранения общей топологии исходной последовательности. (Ben-Yedidia et al., A Retro-Inverso Peptide Analogue of Influenza Virus Hemagglutinin B-cell Epitope 91-108 Induces a Strong Mucosal and Systemic Immune Response and Confers Protection in Mice after Intranasal Immunization, Mol. Immunol. 39:323 (2002); Guichard et al., Antigenic

- 13 032675

Mimicry of Natural L-peptides with Retro-Inverso-Peptidomimetics, PNAS 91:9765-9769 (1994); Benkirane et al., Antigenicity and Immunogenicity of Modified Synthetic Peptides Containing D-Amino Acid Residues, J. Bio. Chem. 268(35) : 26279-26285 (1993), включено сюда целиком посредством ссылки).

Все указанные пептидные последовательности могут соединяться с молекулой-носителем иммуногена, что повышает ее антигенный потенциал. Соответствующие носители включают (но не ограничиваются ими) Т-хэлперные эпитопы, такие как столбнячный анатоксин (например, эпитопы Р2 и Р30), поверхностный антиген гепатита В, холерный токсин В, дифтерийный анатоксин, F-протеин вируса кори, главный внешний мембранный антиген Chlamydia trachomatis, циркумспорозоит Т Plasmodium falciparum, CS-антиген P.Falciparum, триозофосфатизомераза Schistosoma mansoni, TraT Bordetella pertussis, Clostridium tetani, Pertusaria trachythallina, Escherichia coli и гемагглютинин вируса гриппа (НА) (см., Патент США № 6,906,169 Wang; публикацию заявки на патент 20030068325 Wang, и WO/2002/096350 Wang, включено сюда целиком посредством ссылки). В предпочтительном варианте изобретения Тхэлперным эпитопом является столбнячный токсин 947-967 (Р30), содержащий аминокислотную последовательность FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE (SEQ ID NO: 76). В другом варианте Т-хэлперным эпитопом является столбнячный токсин 830-843 (Р2), содержащий аминокислотную последовательность QYIKANSKFIGIT (SEQ ID NO: 77).

Иммуногенные тау-пептиды данного изобретения могут соединяться с молекулой-носителем при помощи короткой связующей аминокислотной цепочки. В предпочтительном варианте изобретения для соединения иммуногенного тау-пептида с молекулой-носителем используется связующая цепочка GPSL (SEQ ID NO: 78). Другие соответствующие последовательности включают глицин-насыщенные (например, G3-5) или серин-насыщенные (например, GSG, GSGS (SEQ ID NO: 79), GSGSG (SEQ ID NO: 80), GS_nG) цепочки или гибкие связующие агенты иммуноглобулина (патент США № 5516637 Huang et al., включен сюда целиком посредством ссылки).

Иммуногенные тау-пептиды данного изобретения могут соединяться с молекулой-носителем и другим способом, с использованием химического сшивания. Техника связывания пептидного иммуногена с молекулой-носителем включает формирование дисульфидных связей с помощью №сукцинимидил-3-(2пиридил-тио)пропионата (SPDP) и сукцинимидил-4-(№малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилата (SMCC) (дефицит в пептиде сульфгидрильной группы восполняется добавлением остатка цистеина). Эти реагенты образуют дисульфидную связь с цистеиновым остатком пептида и амидную связь с эпсилонаминогруппой лизина или свободной аминогруппой другой аминокислоты. Ряд таких дисульфид/амидобразующих агентов описывается в источнике Jansen et al., Immunotoxins: Hybrid Molecules Combining High Specificity and Potent Cytotoxicity, Immun. Rev. 62:185-216 (1982), который включен сюда целиком посредством ссылки. Прочие бифункциональные линкеры формируют чаще тиоэфирные, чем дисульфидные связи. Многие из этих тиоэфир-образующих агентов коммерчески доступны и включают химически активные сложные эфиры б-малеимидо-капроновой, 2-бромуксусной, 2-йодуксусной и 4-(Nмалеимидометил)циклогексан-1-карбоновой кислот. Карбоксильные группы активируются, соединяясь с сукцинимидом или натриевой солью 1-гидрокси-2-нитро-4-сульфоновой кислоты.

Иммунногенные тау-пептиды настоящего изобретения могут быть получены путем твердофазного пептидного синтеза или рекомбинантной экспрессирующей системы. Автоматические пептидные синтезаторы доступны в продаже у множества поставщиков, например Applied Biosystems (Foster City, Ca.). Рекомбинантными экспрессирующими системами могут служить бактерии, например B.coli, дрожжи, клетки насекомых или млекопитающих. Методика рекомбинантной экспрессии описана в источнике Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (C.S.H.P. Press, NY 2d ed., 1989), включенном сюда целиком посредством ссылки.

Иммуногенные тау-пептиды данного изобретения могут вводиться пациенту как поодиночке, так и в комбинации, по мере необходимости. В одном из вариантов иммуногенный тау-пептид вводится в комбинации с еще одним или более из показанных ниже, в табл. 3 (публикация заявки на патент США 20080050383 Sigurdsson, включен сюда целиком посредством ссылки). Названия пептидов в табл. 3 соответствуют порядку расположению в них аминокислот в самой длинной изоформе тау-протеина, включающей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1.

Фосфорилированные аминокислотные остатки каждой цепочки выделены жирным и помечены сносками.

Таблица 3. Последовательности иммуногенных тау-пептидов комбинированного назначения

SEQ NO:	ID	наименование	последовательость
SEQ N0:81	ID	Таи 133-162	DGTGSDDKKAKGADGKTKIATPRGAAPPGQ

- 14 032675

SEQ N0:82	ID	Tao 379-408 [P-Ser3ji( из ]	RENAKAKTDHGAETVYKS*PWSGDTS*₽RHL
SEQ NO: S3	ID	Tau 192-221 [P — SSI 202,214, — Th-r20D,212 )		GDRSGYSS*PGS*PGT*PGSRSRT*PS*LPTPPTR
SEQ N0:84	ID	Tau221-250 [P-Thr231,-Ser;35|		REPKKVAWRT*PPKS * P S SAKSRLQTAP VPM
SEQ N0:85	ID	Taul84-213		SSGEPPKSGDRSQYSSPGSPGTPGSRSRT
SEQ N0:86	TD	Taul-30 [P-Tyrls,		MAEPRQEFEVMEDHAGTY*GLGDRKDQGGY*T
SEQ N0:87	ID	Tau30-60		TMEQDQEGDTDAGLKESPLQTPTEDGSEEPG
SEQ N0:83	ID	Tau60-90		GS ET S DAKSTP TAEDVTAP LVDEGAPGKQAA
SEQ N0:89	ID	Tau90-120		AAQPHTEIPEGTTAEEAGIGDTPSLEDEAAG
SEQ N0:90	ID	Taul20-150		GHVTQARMVSKSKDGTGSDDKKAKGADGKTK
SEQ N0:91	ID	Taul50-180 Thr175]	[P-	KIATPRGAAPPGQKGQANATRIPART* PPAPK
SEQ N0:92	TD	Taul80-210 ΤΐΊΐ'ΐϊ^ϋίΟ “ Ser 134, 18 5, 198, 199, 202, -Tyr197]	[P- 20*/	KT*PPS*S*GEPPKSGDRSGY*S*S*PGS*PGT*PGS*RS
SEQ N0:93	ID	Tau21C-240 Thr212,217,231» “ Ser 21 4,235,25 7, 23*1	[P-	SRT*PS*LPT*PPTREPKKVAWRT*PPKS*PS*S*AK
SEQ N0:94	ID	Tau240-270 Ser 202!	[₽-	KS RLQTAPVPMPDLKNVKSKIG S* TENLKHQP
SEQ N0:95	ID	Tau270-300 Ser2i3]	[₽-	PGGGKVQIINKKL DLSNVQSKCGS * KDNIKHV
SEQ N0:96	ID	Tau300-330 Tyr3]n, Ser5;4]	[P-	VPGGGSVQIVY*KPVDLSKVTSKCGS*LGNIHH
SEQ N0:97	ID	Tau330-360 Ser35o]	[P-	HKPGGGQVEVKSEKLDFKDRVQSKIGS*LDNI
SEQ N0:93	ID	Tau360-390		ITHVPGGGNKKIE THKL TFRENAKAKT DHGA
SEQ N0:99	ID	Tau39C-420 ТУГ394, Ser390, 400,404 , 412. 413/ Thr4Q3 )	[₽- , 409	AEIVY*KS*PWS*GDT*S*PRHLS*NVS*S*TGSIDMV

Для достижения желаемого иммунного ответа вводить пациенту иммуногенные тау-пептиды можно в сопровождении соответствующего адъюванта. Он может вводиться до, после или одновременно с иммуногенным тау-пептидом. Предпочтительные адъюванты усиливают естественный ответ на иммуноген, не вызывая его конформационных изменений, негативно влияющих на качественную сторону ответа.

Предпочтительным классом адъювантов являются соли алюминия (квасцы), к примеру гидроксид, фосфат и сульфат алюминия. Такие адъюванты можно применять в присутствии других специфических иммуностимулирующих агентов (или без них), например 3-О-дезацилированного монофосфорил-липида A (MPL) или 3-DMP, полимерных и мономерных аминокислот, таких как полиглутамин или полилизин. Эти адъюванты можно применять в присутствии других специфических иммуностимулирующих агентов (или без них), таких как мурамилпептиды (Ы-ацетилмурамилЖ-треонилЮ-изоглутамин (thr-MDP), N- 15 032675 ацетилнормурамил-Ь-аланил-О-изоглутамин (nor-MDP), N-ацетилмурамил-Ь-аланил-О-изоглутаминилЬ-аланин-2-(1'-2'дииальмитоил-8п-глицеро-3-гидроксифосфорилокси)этиламин (МТР-РЕ), Nацетилглюксаминил-№ацетилмурамил-Е-А1-О-18од1и-Е-А1а-дипальмитоксипропиламид (DTP-DPP) theramide™) или другие компоненты бактериальной клеточной стенки. Водно-масляные эмульсии включают MF59 (см. WO 90/14837 Van Nest et al., приведено здесь целиком посредством ссылки), содержащий 5% сквалена, 0,5% твина 80, 0,5% спана 85 (в ряде случаев - разные количества МТР-РЕ), приведенные в форму субмикронных частиц при помощи микрофлюидайзера; фактор активации стволовой клетки (SAF), содержащий 10% сквалена, 0,4% твина 80, 5% плюроник-блокированного полимера L121 и thrMDP, либо доведенные способом микрофлюидики до состояния субмикронной эмульсии, либо перемешанные на вортексе для образования эмульсии с большим размером частиц; и адъювантная система Ribi™ (RAS) (Ribi ImmunoChem, Hamilton, Mont.), содержащая 2% сквалена, 0,2% твина 80 и один или более компонентов бактериальной клеточной стенки, выбранных из группы, состоящей из монофосфорил-липида A (MPL), димиколата трегалозы (TDM) и скелета клеточной стенки (CWS), предпочтительно MPL+CWS (Detox™). Прочие адъюванты включают полный (CFA) и неполный (IFA) адъюванты Фрейнда, и цитокины, такие как интерлейкины (IL-1, IL-2 и IL-12), макрофагальный колониестимулирующий фактор (M-CSF) и фактор некроза опухоли (TNF).

Выбор адъюванта зависит от стабильности содержащего его иммуногенного образования, способа введения, режима дозирования, эффективности адъюванта для видов, подвергаемых вакцинации, и, в случае человека, фармацевтически приемлемым является адъювант, одобренный или имеющий основания быть одобренным соответствующими регулирующими органами для введения человеку. К примеру, квасцы, MPL или неполный адъювант Фрейнда (Chang et al., Advanced Drug Delivery Reviews 32:173-186 (1998), приведено здесь целиком посредством ссылки), по отдельности или (в ряде случаев) любые их сочетания, подходят для введения человеку.

Другой аспект данного изобретения связан с лекарственным препаратом, содержащим один или более иммуногенных тау-пептидов, описанных выше, и фармацевтический носитель (описан ниже). Смесь может содержать препарат одного, а в ином случае большего числа иммуногенных тау-пептидов. В предпочтительном варианте рассматриваемое лекарственное средство содержит один или более соответствующих адъювантов, как описано выше.

В другом случае пациенту по мере необходимости вводится антитело, распознающее один или более иммуногенных тау-эпитопов данного изобретения. Соответствующие антитела включают все иммуноглобулины, специфически связывающие иммуногенные тау-эпитопы, имеющие в составе любую из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 2-75 и 101-103. В предпочтительном варианте рассматриваемое антитело узнает и связывает эпитоп, специфичный для патологической формы тау-белка, и почти или совсем не реагирует с нормальным тау или другими белками.

Как здесь было описано, синтезированы моноклональные антитела, распознающие иммуногенные тау-эпитопы, включающие SEQ ID NO: 13 (Tau 386-408 [P-Ser₃9₆,₄₀₄]) и SEQ ID NO: 12 (Tau 260-271[PSer₂₆₂]). Эти антитела, являясь фосфо-специфичными и, таким образом, специфичными для патологических форм тау-белков, почти или совсем не реагируют с нормальным тау-протеином.

Кроме антител, узнающих фосфорилированные патологические эпитопы тау-протеина, настоящее изобретение также направлено на антитела, преимущественно узнающие патологические тау-фрагменты, содействующие накоплению токсинов в нейронах и/или инициирующие образование тау-скоплений. Например, каспазное расщепление тау, преимущественно по аспартату 421 (D421), создает укороченную молекулу, колокализирующую со скоплениями и коррелирующую с развитием болезни Альцгеймера и животных моделей таупатии (см. Calignon et al., Caspase Activation Precedes and Leads to Tangles, Nature 464:1201-1205 (2010), приведено здесь целиком посредством ссылки). Антитело, нацеленное на свободный D421-конец расщепленного тау-протеина, специфично и способствует удалению паталогического, но не естественного тау-белка. Таким образом, настоящее изобретение направлено на антитело, предпочтительно моноклональное, реагирующее с D421 на свободном С-конце расщепленного патологического тау-протеина, который отсутствует в его нормальной форме. В одном из вариантов изобретения синтез антитела производится описанными здесь способами с использованием иммуногенного тау-пептида, содержащего аминокислотную последовательность HLSNVSSTGSIDMVD (SEQ ID NO: 101).

Укорачивание тау-белка по глутамату 391 (Е391) также связано с формированием нейрофибриллярных сплетений в мозгу пациентов с болезнью Альцгеймера (Basurto-Islas et al., Accumulation of Aspartic Acid⁴²¹- and Glutamic Acid³⁹¹ - Cleaved Tau in Neurofibrillary Tangles Correlates with Progression in Alzheimer Disease, J. Neuropathol. Exp. Neurol. 67:470-483 (2008), приведено здесь целиком посредством ссылки). Таким образом, настоящее изобретение направлено также на антитело, предпочтительно моноклональное, реагирующее с Е391 на свободном С-конце расщепленного патологического тау-протеина, который отсутствует в его нормальной форме. В одном из вариантов изобретения синтез антитела производится описанными здесь способами с использованием иммуногенного тау-пептида, содержащего аминокислотную последовательность RENAKAKTDHGAE (SEQ ID NO: 102).

Кальпаин-1 также является посредником в расщеплении тау-белка, продуцируя токсичный тау

- 16 032675 фрагмент 17 кДа, способствующий Άβ-индуцированной нейротоксичности (Park et al., The Generation of a 17kDa Neurotoxic Fragment: An Alternative Mechanism by which Tau Mediates (3-Amyloid-Induced Neurodegeneration J. Neurosci. 25 (22):5365-75 (2005), приведено здесь целиком посредством ссылки). Таким образом, воплощение данного изобретения направлено также на антитело, предпочтительно моноклональное, спецефически распознающее свободный N- и/или С-конец токсичного тау-фрагмента, но не нормального тау-протеина, и содержащего аминокислотные остатки тау 45-230 (SEQ ID NO: 1), показанные ниже как SEQ ID NO: 103.

Glu 1

Ser Pro

Leu

Gin 5

Thr

Pro

Thr

Glu

Asp 10

Gly

Ser

Glu

Glu

Pro 15

Gly

Ser

Glu

Thr

Ser

Asp

Ala

Lys

Ser

Thr

Pro

Thr

Ala

G1U

Asp

Vai

Thr

20

25

30

Ala

Fro

Leu

Val

Asp

Glu

Gly

Ala

Pro

Gly

Lys

Gin

Ala

Ala

Ala

Girt

35

40

45

Pro

His

Thr

Glu

He

Pro

Glu

Gly

Thr

Thr

Ala

Glu

Glu

Ala

Gly

lie

50

55

60

Gly

Asp

Thr

Pro

Ser

Leu

Glu

Asp

Glu

Ala

Ala

Gly

His

Val

Thr

Girt

65_

70

75

80

Ala

Arg

Met

Vai

Ser

Lys

Ser

Lys

Asp

Gly

Thr

Gly

Ser

Asp

Asp

Lys

85

50

55

Lys

Ala

Lys

Gly

Ala

Asp

Gly

Lys

Thr

Lys

lie

Ala

Thr

Pro

Arg

Gly

100

105

110

Ala

Ala

Pro

Pro

Gly

Gin

Lys

Gly

Gin

Ala

Asn

Ala

Thr

Arg

lie

Pro

115

120

125

Ala

Lys

Thr

Pro

Pro

Ala

Pro

Lys

Thr

Pro

Pro

Ser

Ser

Gly

Glu

Pro

130

135

140

Pro

Lys

Ser

Gly

Asp

Arg

Ser

Gly

Tyr

Ser

Ser

Pro

Gly

Ser

Pro

Gly

145

150

155

160

Thr

Pro

Gly

Ser

Arg

Ser

Arg

Thr

Pro

Ser

Leu

Pro

Thr

Pro

Pro

Thr

165

170

175

Arg Glu Pro Lys Lys Val Ala Val Val Arg

180 185

Использованный здесь термин антитело включает как интактные иммуноглобулины, полученные из естественных и рекомбинантных источников, так и иммунореактивные участки (т.е. участки связывания антигена) интактных иммуноглобулинов. Антитела данного изобретения могут существовать в виде целого ряда форм, включающего, к примеру, поликлональные и моноклональные антитела, внутриклеточные антитела (интраантитела), фрагменты антител (Fv, Fab и F(ab)₂), а также одноцепочечные (scFv), гибридные и гуманизированные антитела (Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); Houston et al., Protein Engineering of Antibody Binding Sites: Recovery of Specific Activity in an Anti-Digoxin Single-Chain Fv Analogue Produced in Escherichia coll, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85:58 79-5883 (1988); Bird et al., Single-Chain Antigen-Binding Proteins, Science 242:423-426 (1988)).

Способы создания моноклональных антител могут быть реализованы с использованием описанных здесь или других широко известных технических приемов (Monoclonal Antibodies - Production, Engineering and Clinical Applications (Mary A. Ritter and Heather M. Ladyman eds., 1995), приведено здесь целиком посредством ссылки). В целом процесс заключается в получении иммунных клеток (лимфоцитов) из селезенки млекопитающего, предварительно иммунизированного нужным антигеном (а именно, иммуногенным тау-пептидом) либо In vivo, либо In vitro. Образцы тау-пептидов описаны выше. При синтезе моноклональных антител с использованием тау-пептидов SEQ ID NO: 2-75 или SEQ ID NO: 101-103, к Nили С-концу каждой цепочки может присоединяться остаток цистеина для облегчения связывания белканосителя, что увеличивает продукцию антител в результате иммунизации. Соответствующие белкиносители включают в том числе гемоцианин моллюсков сем. Фиссуреловые, голубой иммуногенный белок-носитель (полученный из Concholepas concholepas), альбумин бычьей сыворотки (BSA), овальбумин и катионированный BSA.

Лимфоциты, секретирующие антитела, сливаются с клетками миеломы или измененными клетками, способными к неограниченной репликации в клеточной культуре, образуя в итоге бессмертную иммуноглобулин-секретирующую линию клеток. Ассоциация с клетками миеломы млекопитающих или другими сливающимися клетками, способными к неограниченной репликации в клеточной культуре, достигается стандартными и широко известными методиками, к примеру с использованием полиэтиленгликоля (PEG) или других факторов слияния (Milstein and Kohler, Derivation of Specific Antibody-Producing Tissue Culture and Tumor Lines by Cell Fusion, Eur. J. Immunol. 6:511 (1976), приведено здесь целиком

- 17 032675 посредством ссылки). Бессмертная линия клеток, предпочтительно мышиных, но также извлекаемых из других видов млекопитающих, отбирается по признакам недостатка ферментов к определенным питательным веществам, быстрого роста и хорошей способности к слиянию. Культивируются слитые клетки (гибридомы), и полученные колонии тестируются на образование желаемых моноклональных антител. Для получения большого количества антител, колонии, их образующие, клонируются и выращиваются in vivo или in vitro.

Моноклональные антитела могут быть получены другим способом, с использованием способов рекомбинантных ДНК, как описано в патенте США № 4816567 Cabilly et al., приведенном здесь целиком посредством ссылки. Полинуклеотиды, кодирующие моноклональные антитела отделяются от материнских В-клеток, например, с помощью олигонуклеотидной затравки, использующей RT-PCR, которая специфически амплифицирует гены, кодирующие тяжелые и легкие цепи антител. Изолированные полинуклеотиды, кодирующие тяжелые и легкие цепи, затем клонируются в соответствующие векторы экспрессии, которые при трансфекции в клетку-хозяина, в иных обстоятельствах не образующую иммуноглобулин (B.coli, клетки COS обезьян, клетки яичника китайского хомячка (СНО) или клетки миеломы), начинает синтез моноклональных антител. Рекомбинантные моноклональные антитела желаемых видов или их фрагменты могут быть также выделены из библиотек фагового дисплея (McCafferty et al., Phage Antibodies: Filamentous Phage Displaying Antibody Variable Domains, Nature 348:552-554 (1990); Clackson et al., Making Antibody Fragments using Phage Display Libraries, Nature 352:624-628 (1991); and Marks et al., By-Passing Immunization. Human Antibodies from V-Gene Libraries Displayed on Phage, J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991), приведено здесь целиком посредством ссылки).

Полинуклеотид(ы), кодирующий(е) моноклональное антитело, может быть подвергнут дальнейшей модификации для синтеза других антител, с помощью способа рекомбинантных ДНК. К примеру, Сдомены легкой и тяжелой цепей мышиного моноклонального антитела могут замещать аналогичные участки у человека, образуя гибридное антитело. В другом случае С-домены легкой и тяжелой цепей мышиного моноклонального антитела могут замещать неиммуноглобулиновый полипептид, образуя слитое антитело. В других вариантах для получения требуемого фрагмента моноклонального антитела константная область укорачивается или удаляется. Кроме того, направленный мутагенез или мутагенез высокой плотности вариабельного участка может использоваться для оптимизации специфичности и аффинности моноклонального антитела.

К моноклональным антителам настоящего изобретения относятся и гуманизированные антитела. Гуманизированные антитела в своих вариабельных участках содержат минимальные последовательности нечеловеческих (например, мышиных) антител. Такие антитела терапевтически применяются для уменьшения антигенности мышиных антител и ответа на них при введении в организм человека.

Антитело может быть гуманизировано замещением гипервариабельного участка (CDR) человеческого антитела аналогом из животного антитела (например, мыши, крысы, кролика, хомяка и т.д.), имеющего желаемую специфичность, аффинность и функциональность (Jones et al., Replacing the Complementarity-Determining Regions in a Human Antibody With Those From a Mouse, Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Reshaping Human Antibodies for Therapy, Nature 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Reshaping Human Antibodies: Grafting an Antilysozyme Activity, Science 239:1534-1536 (1988), включено сюда целиком посредством ссылки). Гуманизированное антитело с целью уточнения и оптимизации его специфичности, аффинности и/или функциональности может быть подвергнуто дальнейшей модификации путем замены дополнительных остатков или в каркасном участке Fv или/и среди уже замещенных остатков из антитела животного.

Человеческие антитела могут быть получены с помощью известных методик. Иммортализованные человеческие В-лимфоциты, иммунизированные in vitro или выделенные из иммунизированной особи, синтезируют антитело против конкретного антигена (см. например, Reisfeld et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy 77 (Alan R. Liss ed., 1985) и патент США № 5750373 Garrard, включено сюда целиком посредством ссылки). Другим способом является выбор антител из библиотеки фагов, в том случае если она содержит человеческие антитела (Vaughan et al., Human Antibodies with Sub-Nanomolar Affinities Isolated from a Large Non-immunized Phage Display Library, Nature Biotechnology, 14:309-314 (1996); Sheets et al., Efficient Construction of a Large Nonimmune Phage Antibody Library: The Production of HighAffinity Human Single-Chain Antibodies to Protein Antigens, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95:6157-6162 (1998); Hoogenboom et al., By-passing Immunization. Human Antibodies From Synthetic Repertoires of Germline VH Gene Segments Rearranged In Vitro, J. Mol. Biol. 227:381-8 (1992); Marks et al., Bypassing Immunization. Human Antibodies from V-Gene Libraries Displayed on Phage, J. Mol. Biol. 222:581-97 (1991), приведено здесь целиком посредством ссылки). Человеческие антитела при отсутствии эндогенного синтеза иммуноглобулинов могут также быть синтезированы у трансгенных мышей, имеющих иммуноглобулиновые локусы, в результате иммунизации способные продуцировать полный спектр человеческих антигенов. Этот подход описан в патенте США № 5545,807 Surani et al.; 5545806 Lonberg et al.; 5569825 Lonberg et al.; 5625126 Lonberg et al.; 5633425 Lonberg et al.; и 5661016 Lonberg et al., приведенном здесь целиком посредством ссылки.

Способы индуцирования синтеза поликлональных антител также хорошо известны. Обычно эти ан

- 18 032675 титела образуются в ответ на подкожное введение пептида, содержащего соответствующий эпитоп (а именно: любой тау-пептид из группы, включающей SEQ ID NO: 2-75 или SEQ ID NO: 101-103), новозеландскому белому кролику, у которого брали кровь для получения неиммунной сыворотки. Антигены могут вводиться в комбинации с адъювантом. Пробы крови у кроликов брались ориентировочно каждые две недели после первой инъекции и затем, периодически давая дополнительные дозы того же антигена, три раза каждые шесть недель. Поликлональные антитела обнаруживаются в сыворотке с помощью аффинной хроматографии с использованием соответствующего антигена для связывания антитела. Эта и другие методики стимуляции поликлональных антител описаны в руководстве Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988), включенном сюда целиком посредством ссылки.

В дополнение к нормальным антителам данное изобретение охватывает и связующие фрагменты таких антител. Они включают одновалентные Fab-фрагменты, Fv-фрагменты (например, одноцепочечное антитело, scFv), одиночные вариабельные домены VH и VL, двухвалентные фрагменты F(ab')2, Bis-scFv, диатела, триатела, миниантитела и т.д. Эти фрагменты могут быть получены традиционными способами, например ограниченным протеолизом, как показано в источнике James Goding, Monoclonal Antibodies : Principles and Practice 98-118 (Academic Press, 1983) and Ed Harlow and David Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, 1988), включенном сюда целиком посредством ссылки, или другими известными способами.

Также подходящими для использования в данном изобретении являются фрагменты антител, призванные связывать внутриклеточные белки, т.е. интраантитела. Интраантитела, нацеленные на иммуногенный тау-эпитоп, содержащий одну из последовательностей SEQ ID NO: 2-75 или SEQ ID NO: 101-103, может предотвращать патологическую агрегацию тау-белка, его аккумуляцию в нейронах и глиальных клетках и/или способствовать очищению от его скоплений. Применение способа интраантител для лечения неврологических нарушений, включая таупатии, рассмотрено в источнике Miller et al., Intrabody Applications in Neurological Disorders: Progress and Future Prospects, Mol. Therapy 12:394-401 (2005), включенном сюда целиком посредством ссылки.

Интраантитела обычно получают путем отделения одиночного вариабельного домена из вариабельных участков антитела, состоящего из двух вариабельных доменов (т.е. гетеродимер домена тяжелой цепи и домена легкой цепи). Одноцепочечные Fv-фрагменты, Fab-фрагменты, слитые белки ScFv-Ck, одноцепочечные диатела, Уц-Сц 1-фрагменты, и даже цельная молекула IgG подходят для создания системы синтеза интраантител (Kontermann R.E., Intrabodies as Therapeutic Agents, Methods 34:163-70 (2004), включено сюда целиком посредством ссылки).

Интраантитела, обладающие специфичностью к эпитопу патологического тау-протеина, могут быть получены из фагового дисплея, дисплея дрожжевой поверхности или рибосомного дисплея. Способы производства библиотек интраантител и отдельных нужных интраантител далее описаны в публикации заявки на патент США № 20030104402 Zauderer и публикации заявки на патент США № 20050276800 Rabbitts, включенном сюда целиком посредством ссылки. Способы повышения стабильности и аффинного связывания интраантител описаны в WO 2008070363 Zhenping and Contreras-Martinez et al., Intracellular Ribosome Display via SecM Translation Arrest as a Selection for Antibodies with Enhanced Cytosolic Stability, J. Mol. Biol. 372(2):513-24 (2007), включенном сюда целиком посредством ссылки.

В дальнейшем, возможно, будет желательно модифицировать антитело с целью увеличения времени его полужизни в сыворотке, особенно в случае с фрагментами антител. Это может быть достигнуто, к примеру, включением эпитопа, связывающего рецептор реутилизации, во фрагмент антитела с помощью мутации его соответствующего участка или включением эпитопа в пептидный конец, который затем спаивается с фрагментом антитела или в конце, или в середине (например, синтезом ДНК или пептида).

Имитаторы антител также подходят для использования в соответствии с настоящим изобретением. Известно некоторое количество имитаторов антител, включая в том числе известные как монотела, получаемые из десятого (^|0Гп3)-домена человеческого фибронектина типа III (Koide et al., The Fibronectin Type III Domain as a Scaffold for Novel Binding Proteins, J. Mol. Biol. 284:1141-1151 (1998); Koide et al., Probing Protein Conformational Changes in Living Cells by Using Designer Binding Proteins: Application to the Estrogen Receptor, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99:1253-1258 (2002), каждый источник включен сюда целиком посредством ссылки), и аффитела, получаемые из стабильного домена Z одноцепочечного рецептора стафилакоккового протеина A (Nord et al., Binding Proteins Selected from Combinatorial Libraries of an alpha-helical Bacterial Receptor Domain, Nature Biotechnol 15(8):772-777 (1997), включено сюда целиком посредством ссылки).

Далее настоящее изобретение посвящено лекарственным препаратам, содержащим одно или более антител, распознающих иммуногенные тау-пептиды, как было описано выше. Эта смесь может содержать препарат одних и тех же антител, узнающих одинаковый эпитоп. В другом случае это может быть препарат одного или нескольких антител, узнающих один или несколько различных тау-эпитопов. Лекарственное средство данного изобретения содержит фармацевтически приемлемый носитель или другие фармацевтически приемлемые компоненты, как описано ниже.

Лекарственные средства данного изобретения, содержащие иммуногенные тау-пептиды или анти

- 19 032675 тела, их узнающие, помимо активного лечебного агента включают ряд прочих фармацевтически приемлемых компонентов (см. Remington's Pharmaceutical Science (15th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1980), включено сюда целиком посредством ссылки). Предпочтительная форма препарата зависит от назначенного режима приема и области терапевтического применения. Препараты могут включать фармацевтически приемлемые, нетоксичные переносчики и растворители, определяемые как носители, широко используемые при составлении композиций для введения животным или человеку. Растворитель подбирается так, чтобы не повредить биологической активности состава. Примерами таких растворителей могут служить дистиллированная вода, забуференный фосфатом физиологический раствор, раствор Рингера-Локка, раствор глюкозы и раствор Ханка. Кроме того, лекарственный препарат или форма могут также включать другие носители, адъюванты или нетоксичные, нетерапевтические, неиммуногенные стабилизаторы и пр.

Лекарственные препараты могут также включать большие, долго метаболизирующие макромолекулы, такие как белки, полисахариды, подобные хитозану, полимолочные кислоты, полигликолиевые кислоты и кополимеры (например, функционализированная латексом сахароза, агароза, целлюлоза и пр.), полимерные аминокислоты, аминокислотные кополимеры и липидные агрегаты (например, вкрапления масла или липосомы). Эти носители могут дополнительно функционировать в качестве иммуностимулирующих агентов (т.е. адъювантов).

Лекарственный препарат также может включать соответствующее средство доставки. Такие средства включают вирусы, бактерии, биодеградируемые микросферы, микро- и наночастицы, липосомы, минипеллеты коллагена и кохлеаты.

В одном из вариантов данного изобретения средством доставки служит вирус или бактерия, а иммуногенный тау-пептид передается ими, как частями иммуногенной композиции. Согласно такой реализации изобретения молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая иммуногенный пептид, встроена в геном вирусной или бактериальной эписомы. В некоторых случаях нуклеиновая кислота встроена таким образом, что иммуногенный пептид экспрессирует как отдельный протеин или слитый с другим поверхностным белком вируса или трансмембранным белком бактерии так, что пептид оказывается снаружи. Вирусы или бактерии, используемые в таких способах, должны быть непатологические или ослабленные. Подходящие вирусы включают аденовирус, вирус простого герпеса, вирус венесуэльского энцефалита лошадей и другие альфа-вирусы, вирус везикулярного стоматита и другие рабдовирусы, вакциния и оспа птиц. Подходящие бактерии представлены родами Salmonella и Shigella. Слияние иммуногенного пептида с поверхностным антигеном (HbsAg) вируса гепатита В (HBV) дает особенно хороший эффект.

При иной реализации данного изобретения лекарственный препарат в качестве средства доставки содержит липосомы. Липосомы - это пузырьки, состоящие из одной или более концентрически расположенных липидных двухслойных структур, заключающих водную среду в оболочку. Иммуногенный таупептид или антитело, возникшее в ответ на него в настоящем изобретении, подразделяются на поверхностно-связанные, инкапсулированные и ассоциированные с мембраной липосомного носителя. Известны различные типы липосом, способных к доставке тау-пептидной вакцины (см. Hayashi et al., A Novel Vaccine Delivery System Using Immunopotentiating Fusogenic Liposomes, Biochem Biophys Res Commun 261(3):824-28 (1999) и U.S. Patent Publication No. 20070082043 Michaeli et al., включено сюда целиком посредством ссылки). Другие способы подготовки липосом для использования в настоящем изобретении включают рассмотренные в источниках Bangham et al., Diffusion of Univalent Ions Across the Lamellae of Swollen Phospholipids, J. Mol. Biol. 13:238-52 (1965); патент США № 5653996 Hsu; патент США № 5643599 Lee et al.; патент США № 5885613 Holland et al.; патент США № 5631237 Dzau & Kaneda и патент США № 5059421 Loughrey et al., включены сюда целиком посредством ссылки).

В другом случае молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая иммуногенный тау-пептид или тауантитело данного изобретения, вводится при посредстве генотерапевтической системы доставки. Соответствующие генотерапевтические векторы включают, в том числе, аденовирусные, аденоассоциированные вирусные, ретровирусные, лентивирусные и векторы вируса герпеса.

Система доставки аденовирусного вектора может быть легко подготовлена и использована, как описано в источниках: Berkner, Development of Adenovirus Vectors for the Expression of Heterologous Genes, Biotechniques 6:616-627 (1988), Rosenfeld et al., Adenovirus-Mediated Transfer of a Recombinant Alpha 1-Antitrypsin Gene to the Lung Epithelium In Vivo, Science 252:431-434 (1991), WO 93/07283 Curiel et al., WO 93/06223 Perricaudet et al., WO 93/07282 Curiel et al., включены сюда целиком посредством ссылки). Для транспорта в клетки нуклеиновой кислоты, кодирующей тау-антитело, может быть построена аденоассоциированная вирусная система доставки, как описано в источниках: Shi et al., Therapeutic Expression of an Anti-Death Receptor-5 Single-Chain Fixed Variable Region Prevents Tumor Growth in Mice, Cancer Res. 66:11946-53 (2006); Fukuchi et al., Anti-AP Single-Chain Antibody Delivery via AdenoAssociated Virus for Treatment of Alzheimer's Disease, Neurobiol. Dis. 23:502-511 (2006); Chatterjee et al., Dual-Target Inhibition of HIV-1 In Vitro by Means of an Adeno-Associated Virus Antisense Vector, Science 258:1485-1488 (1992); Ponnazhagan et al., Suppression of Human Alpha-Globin Gene Expression Mediated by the Recombinant Adeno-Associated Virus 2-Based Antisense Vectors, J. Exp. Med. 179:733-738 (1994); Zhou et al., Adeno-associated Virus 2-Mediated Transduction and Erythroid Cell-Specific Expression of a Human

- 20 032675

Beta-Globin Gene, Gene Ther. 3:223-229 (1996), включены сюда целиком посредством ссылки). Использование этих средств in vivo описано в источниках: Flotte et al., Stable in Vivo Expression of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator With an Adeno-Associated Virus Vector, Proc. Nat'l. Acad. Sci. 90:10613-10617 (1993), Kaplitt et al., Long-Term Gene Expression and Phenotypic Correction Using Adeno-Associated Virus Vectors in the Mammalian Brain, Nature Genet. 8:148-153 (1994), включены сюда целиком посредством ссылки). Другие типы аденовирусных векторов описаны в патенте США № 6057155 Wickham et al.; патенте США № 6033908 Bout et al.; патенте США № 6001557 Wilson et al.; патенте США № 5994132 Chamberlain et al.; патенте США № 5981225 Kochanek et al.; патенте США № 5885808 Spooner et al.; патенте США № 5871727 Curiel, включенных сюда целиком посредством ссылки.

Ретровирусные векторы, модифицированные для создания инвазионной системы трансформации, могут также быть использованы для переноса молекул нуклеиновой кислоты, кодирующей желаемый пептид или антитело, в клетку-мишень. Один тип такого ретровирусного вектора рассмотрен в патенте США № 5849586 Kriegler et al., включен сюда целиком посредством ссылки.

Генотерапевтические векторы, транспортирующие молекулу нуклеиновой, кодирующую иммуногенный тау-пептид или тау-антитело, вводятся пациенту с помощью, например, внутривенной инъекции, местного применения (патент США № 5328470 Nabel et al., включен сюда целиком посредством ссылки) или стереотаксической инъекции (см. Chen et al., Gene Therapy for Brain Tumors: Regression of Experimental Gliomas by Adenovirus Mediated Gene Transfer In Vivo, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 91:3054-3057 (1994), включено сюда целиком посредством ссылки). Фармацевтический препарат генотерапевтического вектора может включать вектор в приемлемом растворителе или содержать матрицу медленного высвобождения со встроенным в нее аппаратом трансгеноза.

При реализации способов настоящего изобретения перед введением иммуногенных пептидов или антител желательно выбрать пациента с наличием или опасностью возникновения болезни Альцгеймера или другой таупатии, пациента со скоплениями тау-белка в мозге или демонстрирующего поведенческий фенотип, связанный со сплетениями. Пациенты, подлежащие лечению, включают как находящихся в группе риска, но не выказывающих симптомов, так и больных с заметной симптоматикой. В случае болезни Альцгеймера практически каждый рискует пострадать от нее. Вследствие этого данные способы могут применяться для профилактики населения без необходимости оценки риска заболевания. Эти способы особенно полезны для людей, у которых уже определен генетический риск болезни Альцгеймера. Сюда входят те, кто имеет родственников с этой болезнью, и те, чей риск зафиксирован анализом генетических и биохимических маркеров. Генетические маркеры болезни Альцгеймера включают мутации в гене белка-предшественника амилоида, в частности в позиции 717 и в позициях 670 и 671, называемые мутацией Харди и шведской мутацией соответственно. Прочие факторы риска включают мутации гена пресенилина, PS1 и PS2, и гена аполипопротеина АроЕ4; наследственность по AD и гиперхолестеролемия или атеросклероз. Больных, страдающих от болезни Альцгеймера, можно отличить от страдающих типичным слабоумием по присутствию описанных выше факторов риска. Кроме того, доступен ряд тестов для идентификации AD. Они включают измерение содержания колониестимулирующего тау-белка и А(>42. Высокий уровень тау и пониженный - А(>42 служат признаком наличия AD. Людей, страдающих от болезни Альцгеймера, можно диагностировать по критериям Ассоциации болезни Альцгеймера и родственных заболеваний.

В случае бессимптомных пациентов лечение может начинаться в любом возрасте (например, 10, 20, 30 лет). Обычно, однако, нет необходимости начинать лечение раньше достижения пациентом возраста в 40, 50, 60 или 70 лет. Стандартное лечение включает многократные инъекции в течение промежутка времени. Ход лечения можно наблюдать с помощью количественного анализа антител или ответа активированных Т- и В-клеток на лечебный фактор в течение продолжительного периода. Если ответ уменьшился, требуется дополнительная дозировка. В случае потенциального синдрома Дауна лечение можно начинать во внутриутробный период введением лечебного агента матери или вскоре после рождения.

В профилактических целях лекарственные средства, содержащие иммуногенные тау-пептиды, вводятся пациенту, склонному к болезни Альцгеймера или с риском заболевания ею или другими таупатиями, в количестве, достаточном для устранения или уменьшения риска, снижения тяжести или замедления начальной стадии заболевания, включая биохимические, гистологические и/или поведенческие симптомы, его осложнений и промежуточных патологических фенотипов, возникающих по мере развития болезни. В терапевтических целях препараты, содержащие тау-антитела, вводятся пациенту с подозрением на или уже страдающему таким заболеванием, в количестве, достаточном для лечения или хотя бы частичного угнетения симптомов болезни (биохимических, гистологических и/или поведенческих), включая осложнения и промежуточные патологические фенотипы, возникающие по мере развития болезни. В некоторых способах введение агента снижает умеренные когнитивные нарушения у пациентов с еще не развитой типичной патологией Альцгеймера. Количество, нужное для осуществления терапевтического или профилактического лечения, называется терапевтически или профилактически эффективной дозой. И при профилактическом, и при терапевтическом режиме агенты, как правило, вводятся в нескольких дозировках, пока не будет достигнут удовлетворительный иммунный ответ. Обычно иммунный ответ контролируется и, если он начинает ослабевать, даются повторные дозы.

- 21 032675

Эффективные дозы препаратов настоящего изобретения для лечения описанных выше состояний варьируют в зависимости от множества различных факторов, в том числе от способа введения, сайтамишени, физиологического состояния пациента, введения других препаратов и от того, является ли лечение профилактическим или терапевтическим. Лечебные дозировки необходимо титровать для оптимизации эффективности и безопасности. Количество иммуногена зависит от того, вводится ли также адъювант, с более высокими требуемыми дозировками в его отсутствие. Количество вводимого иммуногена иногда варьирует в пределах 1-500 мкг и, чаще, 5-500 мкг на одноразовую инъекцию человеку. В некоторых случаях необходима большая доза, в 1-2 мг на инъекцию. Обычно для одной инъекции человеку используются количества в районе 10, 20, 50 или 100 мкг. Масса иммуногена также зависит от соотношения масс иммуногенного эпитопа в иммуногене к массе иммуногена в целом. Как правило, 10^-3-10^-5 мкмоль иммуногенного эпитопа используются на каждый мкг иммуногена. Расписание инъекций может существенно меняться, от одного раза в день до раза в год или раза в десять лет. В любой день использования иммуногена дозировка превышает 1 мкг на пациента и обычно выше 10 мкг на пациента при одновременном введении адъюванта, и более чем 10 мкг на пациента и обычно выше 100 мкг на пациента в отсутствие адъюванта. Типичная схема приема состоит из иммунизации, за которой следуют вторичные инъекции антигена через интервалы в 6 недель. Другой режим приема состоит из иммунизации, за которой следуют бустер-инъекции 1, 2 и 12 месяцев спустя. Еще одна схема предполагает инъекцию каждые два месяца в течение всей жизни. В другом случае бустер-инъекции могут производиться нерегулярно, по результатам мониторинга иммунного ответа.

Для пассивной иммунизации с помощью антител дозировка составляет от 0,0001 до 100 мг/кг, а чаще всего от 0,01 до 5 мг/кг веса тела. Например, она может быть 1 мг/кг массы тела или 10 мг/кг массы тела или в пределах 1-10 мг/кг. Пример режима лечения предполагает введение препарата один раз каждые две недели, или раз в месяц, или раз в 3-6 месяцев. В некоторых способах два или более моноклональных антитела с различной специфичностью связывания вводятся одновременно, и в этом случае дозировка каждого антитела снижается в указанном диапазоне. Антитела обычно назначают несколько раз. Интервалы между отдельными приемами могут быть недельными, месячными или годичными. В некоторых способах устанавливается дозировка для достижения концентрации антител в плазме крови 1-1000 мкг/мл, а в ряде случаев - 25-300 мкг/мл. В ином случае антитела могут быть введены в виде состава с замедленным высвобождением, причем требуется менее частое назначение. Дозировка и частота изменяются в зависимости от времени полужизни антител у пациента. В целом, человеческие антитела показывают самое длительное время полужизни, ряд продолжают гуманизированные антитела, химерные антитела и нечеловеческие антитела. Дозировка и частота приема может изменяться в зависимости от того, профилактическое лечение или терапевтическое. В профилактических целях вводят относительно низкие дозы со сравнительно редкими интервалами в течение длительного периода времени. Некоторые пациенты продолжают лечение в течение всей жизни. В терапевтических целях для остановки или прекращения прогресса заболевания иногда требуется относительно высокая дозировка в относительно короткие промежутки времени и, желательно, до тех пор, пока пациент не демонстрирует частичное или полное улучшение симптоматики. После этого пациент может быть переведен на профилактический режим.

Дозы нуклеиновых кислот, кодирующих иммуногены, колеблются от приблизительно 10 нг до приблизительно 1 г, от приблизительно 100 нг до приблизительно 100 мг, от приблизительно 1 мкг до приблизительно 10 мг или от приблизительно 30 до приблизительно 300 мкг ДНК на одного пациента. Дозы для инфекционных вирусных векторов варьируют от 10-100 или более вирионов на дозу.

Агенты стимуляции иммунного ответа для профилактики и/или терапевтического лечения можно вводить парентеральным, местным, внутривенным, пероральным, подкожным, внутриартериальным, внутричерепным, внутрибрюшинным, интраназальным или внутримышечным способами. Наиболее типичным является подкожный путь введения иммуногенного агента, хотя другие способы могут быть столь же эффективны. Еще один обычный путь внутримышечная инъекция. Этот тип инъекции чаще всего осуществляется в мышцы предплечья или ноги. В некоторых случаях может быть желательно введение терапевтического агента настоящего изобретения непосредственно в конкретную ткань, где накапливаются отложения, например внутричерепная инъекция. Для введения антител предпочтительны внутримышечные инъекции или внутривенные вливания. В некоторых способах отдельные терапевтические антитела вводят непосредственно в черепную коробку. В некоторых способах антитела вводятся в виде состава с замедленным высвобождением или системы, такой как Medipad™ (Elan Pharm, Technologies, Dublin, Ireland).

Другой аспект настоящего изобретения направлен на комбинированную терапию, при которой иммуногенный тау-пептид или антитела, распознающие его эпитоп, вводят в сочетании с агентами, эффективными для профилактики или лечения состояний или заболеваний, связанных с или наступивших в результате отложений амилоидогенных белков или пептидов. Откладывающиеся амилоидогенные белки/пептиды включают в том числе предшественник бета-протеина, прионы и прионные белки, асинуклеин, тау, предшественники белков ABRI и ADan, островковый амилоидный полипептид, аполипо

- 22 032675 протеины AI и AII, лизоцим, цистатин С, гельсолин, предсердный натрийуретический фактор, кальцитонин, кератоэпителин, лактоферрин, легкие цепи иммуноглобулинов, транстиретин, амилоидоз А, β2микроглобулин, тяжелые цепи иммуноглобулинов, цепи альфа-фибриногена, пролактин, кератин и медин. Таким образом, терапевтическая комбинация настоящего изобретения должна включать иммуногенный тау-пептид или антитело, узнающее его эпитоп, и агент или агенты, поражающие один или более из вышеупомянутых амилоидогенных белков или пептидов.

В случае амилоидогенных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера и синдром Дауна, иммуномодуляция с целью устранения бета-амилоидных (АЗ) отложений, является новый терапией. Иммунотерапии, ориентированные на АЗ, последовательно привели к когнитивным улучшениям. Похоже на то, что тау- и АЗ-патологии - синергичны. Таким образом, комбинированная терапия, ориентированная одновременно на устранение как тау-белков, так и АЗ и АЗ-зависимых патологий, может быть более эффективна, чем ориентированная на них по отдельности.

В случае болезни Паркинсона и родственных нейродегенеративных заболеваний иммунномодуляция с целью очистки от агрегированных форм α-синуклеина - также новый вид терапии. Комбинированная терапия, которая нацелена на очищение и от тау, и от α-синуклеина одновременно, может быть более эффективной, чем ориентированная на каждый белок по отдельности.

В случае прионной болезни и родственных нейродегенеративных заболеваний иммунномодуляция для устранения формы прионных белков PrP^Sc, связанной с болезнью, также является новой терапией. Таким образом, комбинированная терапия, которая нацелена на очищение и от тау, и от патологического протеина PrP^Sc одновременно, может быть более эффективной, чем ориентированная на каждый белок по отдельности.

Люди с диабетом 2-го типа могут быть более склонны к развитию болезни Альцгеймера. Таким образом, комбинированная терапия, включающая агент, ориентированный на амилин, и агент предупреждения возникновения и развития болезни Альцгеймера (предотвращая отложение тау-белка), оказывала бы усиленный терапевтический эффект на пациента.

Следующий аспект данного изобретения нацелен на способ диагностики болезни Альцгеймера или другой таупатии. Этот способ заключается в выявлении у пациента наличия патологического тауконформера, с использованием диагностических реагентов, где таким реагентом является антитело или его активный связующий фрагмент. Как описано выше, антитело обладает антигенной специфичностью к отдельному тау-пептиду, содержащему аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 2-75 или SEQ ID NO: 101-103. Диагностика болезни Альцгеймера или других таупатии основана на обнаружении у пациента патологических тау-конформеров.

Обнаружение наличия патологического тау-конформера у пациента с помощью диагностического реагента антител настоящего изобретения может достигаться путем получения биологического материала пациента (например, крови, мочи, спинномозговой жидкости), осуществления контакта биологической пробы с диагностическим реагентом антител и выявления связывания им патологического тауконформера в биологическом материале пациента. Способы осуществления обнаружения патологического тау-протеина в биологическом образце с помощью диагностического антитела настоящего изобретения хорошо известны и включают, в том числе, ELISA, иммуногистохимический способ, вестернблоттинг.

Кроме того, определения наличия у пациента патологического тау-протеинового конформера, с помощью диагностического реагента антител настоящего изобретения, можно достичь, используя способы получения изображений in vivo. Они включают в себя введение пациенту диагностического антитела с антигенной специфичностью к патологическому тау-пептиду или эпитопу (а именно, SEQ ID NO: 2-75 и 101-103) и обнаружение связывания патологического тау-протеинового конформера диагностическим реагентом антител in vivo. Как описано выше, предпочтительными являются антитела, связывающие патологический тау-протеин, не реагируя на не-тау-белки и непатологические формы тау.

Диагностические антитела или похожие реагенты можно вводить путем внутривенной инъекции в тело пациента или непосредственно в мозг, путем внутричерепной инъекции. Дозировка антител должна находиться в том же диапазоне, что и для лечебных способов. Как правило, антитела помечены, хотя в некоторых способах первичное антитело, со сродством к патологическому тау-протеину, является непомеченным, и с ним связывается вторичный агент маркировки. Выбор метки зависит от средств обнаружения. Например, флуоресцентная метка подходит для оптической детекции. Использование парамагнитных меток подходит для томографического обнаружения без хирургического вмешательства. Радиоактивные метки могут также быть обнаружены с помощью ПЭТ или ОФЭКТ (PET, SPECT соотв.).

Диагностика проводится путем сравнения количества, размера и/или интенсивности меченых патологических тау-конформеров, тау-скоплений и/или нейрофибриллярных сплетений у пациента или в его материале, с соответствующими исходными значениями. По этим значениям можно составить представление о среднем уровне в популяции лиц, не пораженных заболеванием. Исходные значения также могут представлять предыдущие уровни, зафиксированные у того же пациента.

Диагностические способы, описанные выше, могут также быть использованы для мониторинга от

- 23 032675 вета пациента на терапию. В данном варианте определение наличия патологических тау-белков у пациента производится до начала лечения. Уровень патологических тау-белков у пациента в этой временной точке используется в качестве исходного значения. В разные моменты в течение курса лечения определение уровня патологических тау-протеиновых конформеров, тау-скоплений, и/или нейрофибриллярных сплетений повторяется, и после этого измеренные значения сравниваются с исходными. Снижение значений относительно исходных сигнализирует о положительном ответе на лечение. Значения могут также временно возрастать в биологических жидкостях, пока происходит очищение мозга от патологических тау-белков.

Настоящее изобретение также направлено на комплект для выполнения описанных выше способов диагностики и мониторинга. Как правило, такие наборы содержат диагностические реагенты, предпочтительно антитело данного изобретения, которое обладает антигенной специфичностью к патологическому тау-пептиду (а именно, SEQ ID NO: 2-75 и 101-103). В набор также может входить маркер. Диагностическое антитело само по себе может содержать маркер (например, флуоресцентные молекулы, биотин и др.), обнаруживаемый непосредственно или с помощью дополнительных реакций (например, реакции со стрептавидином). В другом случае может быть использован вторичный реагент, содержащий маркер и обладающий специфичностью связывания к первичному антителу. В диагностическом наборе, подходящем для измерения уровня патологического тау-протеина в биологическом образце, антитела могут быть укомплектованы предварительно связанными с твердой фазой, например в лунки планшета для микротитрования.

Диагностические наборы данного изобретения также включает инструментарий, полезный для обнаружения у пациента синтеза антител, следующего за введением иммуногенного тау-пептида. Как правило, такие комплекты включают реагент, содержащий антигенный эпитоп к антителам, синтезируемым пациентом. В набор также входит маркер. В предпочтительном варианте маркер, как правило, представлен мечеными антиидиотипическими антителами. Реагент набора может поставляться предварительно связанным с твердой фазой, например в лунках планшета для микротитрования.

Нижеследующие примеры иллюстрируют различные композиционные решения в лечебном способе. Примеры призваны проиллюстрировать, но никоим образом не исчерпывают объем изобретения.

Примеры

Пример 1. Пептиды.

Пептидные иммуногены были синтезированы на технической базе Кек (Йельский университет) твердофазным способом на п-метил-бензгидриламиновой смоле с использованием синтезатора Biosearch SAM 2 (Biosearch, Inc., San Rafael, CA). Пептиды выделили из смолы при помощи HF, а затем экстрагировали эфиром и уксусной кислотой с последующей лиофилизацией. Затем пептиды очистили ВЭЖХ с использованием обращенно-фазовой стабилизирующей среды (Delta-Bondapak) на колонке 0,78 х 30 см с линейным градиентом ацетонитрила 0-66% в 0,1% ТФК.

Пример 2. Животные, используемые в исследованиях.

Исследования выполнили на трансгенных (Tg) мышиных моделях JNPL3 P301L, проявляющих нейрофибриллярные сплетения в нескольких областях мозга и спинного мозга (Taconic, Germantown, NY) (Lewis et al., Neurofibrillary Tangles, Amyotrophy and Progressive Motor Disturbance in Mice Expressing Mutant (P301L) Tau Protein, Nat. Genet. 25:402-405 (2000), включен сюда целиком посредством ссылки). Хотя эта модель не является идеальной для AD, она превосходно подходит для изучения последствий развития сплетений и для скрининговой терапии, которая может предотвратить образование этих агрегатов. Другим преимуществом этих животных является относительно раннее проявление у них патологии. В гомозиготной линии поведенческие аномалии, связанные с тау-патологией, могут наблюдаться по меньшей мере в 3 месяца, однако животные остаются относительно здоровыми, по меньшей мере, до возраста 8 месяцев. Другими словами, в 8 месяцев животные передвигаются, питаются и могут достаточно хорошо выполнять поведенческие задачи для контроля эффекта лечения.

Помимо модели JNPL3 P301L, исследования выполнялись также на мышиной модели htau/PS1 (M146L) (Boutajangout et al., Presenilin 1 Mutation Promotes Tau Phosphorylation and Aggregation in a Novel Alzheimer's Disease Mouse Model, Alzheimer's and Dementia 4:T185 (2008), включено сюда целиком посредством ссылки). Мыши htau экспрессируют немутированный тау-протеин человека на нулевом тауфоне мышей и больше похожи на тау-патологию Альцгеймера в возрасте проявления болезни и распространения в мозге (Andorfer et al., Hyperphosphorylation and Aggregation of Tau in Mice Expressing Normal Human Tau Isoforms, J. Neurochem. 86: 582-90 (2003), включено сюда целиком посредством ссылки). Показано, что модель PS1 с мутацией (M146L) в белке пресенилина 1 имеет увеличенные уровни АР и ускоряет отложение АР при скрещивании с мышами Tg2576 (Duff et al., Increased Amyloid-beta 42(43) in Brains of Mice Expressing Mutant Presenilin 1, Nature 383:710-713 (1996) and Holcomb et al., Accelerated Alzheimer-Type Phenotype in Transgenic Mice Carrying Both Mutant Amyloid Precursor Protein and Presenilin 1 Transgenes, Nature Med. 4:97-100 (1998), включены сюда целиком посредством ссылки).

Мышей htau, экспрессирующих все шесть изоформ тау человека, скрестили с мышами PS1 (M146L) и выдерживали в окружении тау нокаутных мышей (htau/PS1/mtau-/-). Мутация PS1 ускоряет гиперфос

- 24 032675 форилирование тау в этой модели, что приводит к более агрессивной тау-патологии с более ранним проявлением болезни, по сравнению с моделью htau (Boutajangout et al., Presenilin 1 Mutation Promotes Tau Phosphorylation and Aggregation in a Novel Alzheimer's Disease Mouse Model, Alzheimer's and Dementia 4:T185 (2008), включено сюда целиком посредством ссылки).

Пример 3. Введение вакцины.

Перед введением фос-тау пептиды смешали с адъювантом Адъю-фос (Brenntag Biosector, Дания) в концентрации 1 мг/мл, и перемешивали раствор в течение ночи при 4°С для адсорбции пептида на частицы фосфата алюминия.

Мышам JNPL3 P301L ввели подкожную инъекцию 100 мкл, а затем, спустя 2 недели - вторую инъекцию, а затем раз в месяц (если не указано иное). Вакцинацию начали в возрасте 2-3 месяцев и продолжали до достижения животными возраста 8-9 месяцев, когда животных подвергли перфузии и собрали их органы для анализа. Мыши прошли серию сенсомоторных тестов в 5-6 месяцев и снова в возрасте 8-9 месяцев перед умерщвлением. Мышам контрольной группы вводили только адъювант.

Мышей htau/PS1/mtau-/- (n=12) иммунизировали фосфорилированным тау-иммуногеном Tau379408[P-Ser396,404]. Три неиммунизированные контрольные группы включали только тех, кому вводили только адъювант. Основная контрольная группы состояла из одинаковых неиммунизированных мышей (контрольная группа htau/PS1; n=16). Другие контрольные группы были мышами htau/PS1, экспрессирующими тау мышей (htau/PS1/mtau; n=8), a также однопоментными мышами htau в окружении тау нокаутных мышей (контрольная группа htau; n=10).

Мышам htau/PS1/mtau-/- (возрастом 3-4 месяца) интраперитонеально (i.p.) вводили 100 мкг фосфорилированного тау производного в квасцовом адъюванте, первые три инъекции осуществляли каждые 2 недели. Последующее введение осуществляли с месячными интервалами. Контрольным группам вводили только адъювант. В 7-8 месяцев мыши прошли экстенсивное поведенческое тестирование для определения эффективности лечения, а затем их умертвили в возрасте 8-9 месяцев для анализа. Был выполнен тест локомоторной активности, испытание способом поперечной балки и оценка способности удерживаться на вращающемся барабане для установления зависимости измеренного когнитивного дефицита в тестах на познавание и запоминание от сенсомоторных патологий. Когнитивное тестирование выполнили с использованием радиального лабиринта, симметричного лабиринта в закрытом поле и теста на распознавание предметов (Sigurdsson et al., An Attenuated Immune Response is Sufficient to Enhance Cognition in an Alzheimer's Disease Mouse Model Immunized with Amyloid-beta Derivatives, J. Neurosci. 24:6277-6282 (2004), Asuni et al., Vaccination of Alzheimer's Model Mice with Abeta Derivative in Alum Adjuvant Reduces Abeta Burden Without Micro hemorrhages. Eur. J. Neurosci. 24:2530-42 (2006), and Asuni et al., Immunotherapy Targeting Pathological Tau Conformers in a Tangle Mouse Model Reduces Brain Pathology with Associated Functional Improvements, J. Neurosci. 27:9115-9129 (2007), включены сюда целиком посредством ссылки).

Пример 4. Тау-иммунотерапия создает здоровую реакцию антител.

У мышей взяли кровь перед началом исследования (Т0), через неделю после третьей инъекции, затем периодически, и при умерщвлении (Tf). Реакцию антител на вакцину определяли по разбавлению плазмой (1:200, если не указано иное), используя анализ ELISA, как описано ранее (Sigurdsson et al., Immunization with a Non-Toxic/Non-Fibrillar Amyloid-β Homologous Peptide Reduces Alzheimer's Disease Associated Pathology in Transgenic Mice, Am. J. Pathol. 159:439-447 (2001), Sigurdsson et al., An Attenuated Immune Response is Sufficient to Enhance Cognition in an Alzheimer's Disease Mouse Model Immunized with Amyloid-beta Derivatives, J. Neurosci. 24:6277-6282 (2004), включены сюда целиком посредством ссылки), где иммуноген нанесен на микротитровые лунки Immulon™ (Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA). Для определения использовали анти-мышиный IgG (Pierce, Rockford, IL) или анти-мышиный IgM (Sigma, St. Louis, МО), связанный с пероксидазей хрена обыкновенного при разбавлении 1:3000. В качестве подложки использовали тетраметилбензидин (Pierce).

На фиг. 1А представлен здоровая иммунная реакция IgG и IgM в мышах со сплетениями JNPL3 P301L, иммунизированных Tau210-216 [P-Thr₂i₂-Ser₂i₄] (SEQ ID NO: 2), связанного с эпитопом Т-клеток помощника тетанотоксина (ТТ947-967) через линкер GPSL. Мышам в возрасте 2-3 месяцев вводили первые две иммунизации с интервалом в две недели, а затем раз в месяц. Для оценки реакции антитела у мышей взяли кровь перед первой иммунизацией, затем периодически через неделю после введения вакцины, и при умерщвлении мышей для сбора тканей в возрасте 8-9 месяцев. На фиг. 1А представлен ответ антител IgG и IgM через одну неделю после шестой иммунизации (Т3) и еще раз в возрасте 8-9 месяцев, что являлось временем умерщвления (Tf=Tfinal). На фиг. 1В представлена сильная реакция антитела, созданная против собственно эпитопа тетанотоксина, оцененная по связыванию IgG и IgM с неродственным тау-эпитопом Tau260-264[P-Ser₂₆₂] , связанным линкером GPSL с ТТ947-967.

Мыши со сплетениями JNPL3 P301L, иммунизированные Tau260-264 [P-Ser₂₆₂] (SEQ ID NO: 3), связанным с эпитопом Т-клеток токсин-помощника тетануса (ТТ947-967) через линкер GPSL, формировали здоровую реакцию IgG против иммуногена, как показано на фиг. 2А. Как указано выше, мышам вводили первые две иммунизации с интервалом в две недели, а затем ежемесячно с возраста 2-3 месяца до возрас

- 25 032675 та 8-9 месяцев. Значительная доля этой реакции антител сформирована против эпитопа тетанотоксина, что оценено по связыванию IgG с неродственным тау-эпитопом Tau210-216 [P-Thr₂i₂-Ser₂₁₄], связанным линкером GPSL с ТТ947-967 (фиг. 2В). Однако, как показано на фиг. 2С, значительная часть реакции антитела сформирована также против тау-эпитопа, что оценено по связыванию IgG с более крупным тауэпитопом Tau240-270 [P-Ser262], содержащим регион Tau260-264 [P-Ser262]. T0-Tfinal: отбор крови перед вакцинацией (Т0), спустя неделю после третьей -(Т1), шестой -(Т2), седьмой (Т3) иммунизации и при сборе тканей (Tf).

Здоровая реакция антител (IgG) сформирована в модели мышей сплетения JNPL3 P301L, иммунизированных Tau229-237[P-Thr₂₃₁-Ser₂3₅] (SEQ ID NO: 4), связанного с эпитопом Т-клеток помощника тетанотоксина (ТТ947-967) (фиг. 3). Мышей иммунизировали в возрасте 2-3 месяца, через две недели и через месяц, кровь брали (Т1) через неделю после третьей иммунизации.

Здоровая реакция антител (IgG) сформирована также в модели мышей сплетения JNPL3 P301L, иммунизированных псевдофосфорилированным иммуногеном Tau379-408 [Asp₃₉₆, ₄₀₄] (SEQ ID NO: 57) в квасцовом адъюванте. Важно, что эти антитела распознают фосфо-эпитоп, Tau379-408 [P-Ser₃₉₆,₄₀₄], в равной степени. Мышей иммунизировали с возраста 2-3 месяца, каждые две недели для первых двух иммунизации, а затем раз в месяц. Кровь брали (Tf=Tfinal) во время сбора тканей в возрасте 7-8 месяцев.

Пример 5. Тау-иммунотерапия снижает тау-агрегацию в мозге.

Для гистологического анализа тау-патологии мышей анестезировали пентопарбиталом натрия (120 мг/кг, i.p.), трансартериально умертвили при помощи PBS и обработали мозги, как описано выше (Sigurdsson et al., Immunization with a Non-Toxic/Non-Fibrillar Amyloid-β Homologous Peptide Reduces Alzheimer's Disease Associated Pathology in Transgenic Mice, Am. J. Pathol. 159:439-447 (2001); Sigurdsson et al., An Attenuated Immune Response is Sufficient to Enhance Cognition in an Alzheimer's Disease Mouse Model Immunized with Amyloid-beta Derivatives, J. Neurosci. 24:6277-6282 (2004); and Sigurdsson E., Histological Staining of Amyloid-beta in Mouse Brains, Methods Mol. Biol. 299:299-308 (2005), включены сюда целиком посредством ссылки). Вкратце, правое полушарие погрузили на ночь в перйодат-лизинпараформальдегид (PLP), а левое полушарие мгновенно заморозили для анализа тау-протеина. После фиксации мозг перенесли в фосфатный буферный раствор, содержащий 20% глицерина и 2% диметилсульфоксида (ДМСО) и хранили при 4°С до разделения. Отрезали серийные коронарные сегменты мозга (40 мкм) и каждый десятый сегмент окрасили моноклональным антителом PHF1, которое распознает фосфорилированные серины 396 и 404, расположенные в микротубулярно-связывающем повторе Сконцевого тау-протеина PHF (Otvos et al., Monoclonal Antibody PHF-1 Recognizes Tau Protein Phosphorylated at Serine Residues 396 and 404, J. Neurosci. Res. 39:669-673 (1994), включено сюда целиком посредством ссылки).

Окрашивание тау-антитела выполнили, как описано в публикациях Sigurdsson et al., Immunization with a Non-Toxic/Non-Fibrillar Amyloid-β Homologous Peptide Reduces Alzheimer's Disease Associated Pathology in Transgenic Mice, Am. J. Pathol. 159:439-447 (2001), Sigurdsson et al., An Attenuated Immune Response is Sufficient to Enhance Cognition in an Alzheimer's Disease Mouse Model Immunized with Amyloidbeta Derivatives, J. Neurosci. 24:6277-6282 (2004), включенных сюда целиком посредством ссылки. Вкратце, сегменты инкубировали в первичном антителе PHF1 при разбавлении от 1:100 до 1:1000. Использовали мышей из набора иммуноопределения мышей (Vector Laboratories, Burlingame, Калифорния), в котором использовали анти-мышиные вторичные антитела IgG при разбавлении 1:2000.

Анализ сегментов ткани количественно выполнили при помощи графической аналитической системы Bioquant. В программном обеспечении используется оттенок, насыщенность и интенсивность сегментов, находящихся в поле изображения. По точно установленным объектам были установлены пороги на стандартных наборах слайдов, и эти пороги сегментации оставались постоянными в течение сеанса анализа. После установления пороговых параметров поле изображения оцифровали при помощи механизма захвата кадра. Программное обеспечение Bioquant корректирует неоднородность фонового освещения (коррекция пустого поля) и рассчитывает параметр измерения для целого поля. Для количественного графического анализа иммуногистохимии сначала выбрали гранулированный слой зубчатой извилины, содержащий интранейрональные тау-агрегаты (пред-сплетения и сплетения). Это наблюдение совпадает с первоначальной характеристикой этой модели (Lewis et al., Neurofibrillary Tangles, Amyotrophy and Progressive Motor Disturbance in Mice Expressing Mutant (P301L) Tau Protein, Nat. Genet. 25:402-405 (2000), включено сюда целиком посредством ссылки). Все процедуры были выполнены специалистом, не обращающим внимания на экспериментальные условия исследования. Перед началом обработки тканей образцы были пронумерованы в случайном порядке, а код раскрыли только после завершения анализа. Взяли образец каждого десятого сегмента мозга мыши и измерили процент области в поле измерения при 200-кратном увеличении, которую занимает продукт реакции с верхушкой зубчатой извилины на левой границе поля. Для каждого животного проанализировали четыре-пять сегментов.

Иммунизация гомозиготных мышей JNPL3 тау P301L при помощи Tau260-264 [P-Ser₂₆₂] (SEQ ID NO: 3), связанного с ТТ947-967 (T299), снизила уровни паталогического тау как в стволе мозга (фиг. 5А), так и в зубчатой извилине (фиг. 5В), по сравнению с контрольными мышами, которым вводили только

- 26 032675 адъювант. Точно так же, иммунизация мышей htau/PS1 фосфорилированным иммуногенным пептидом Tau379-408 [P-Ser₃₉₆,₄₀₄] снизила количество тау агрегатов в грушевидной коре на 56% (фиг. 6, сравнение иммунизированных htau/PS1 с контрольными htau/PS1). Между иммунизированной и контрольной группами наблюдали значительное различие (односторонний дисперсионный анализ, р<0,01). Ретроспективный анализ также показал, что иммунизированные мыши htau/PS1 отличаются от контрольных мышей htau/PS1 (p<0,01). ** р<0,01.

Пример 6. Тау иммунотерапия предотвращает снижение познавательной способности.

Для определения факта предотвращения или реверсирования сенсомоторных возрастных аномалий у P301L, при помощи тау иммунотерапии, или ее влияния на любое ухудшение движения мышей htau/PS1, мышам вводили иммуногенный Tau 260-264 [P-Ser₂₆₂] (SEQ ID NO: 3) или Tau 379-408 [PSer396,404] (SEQ ID NO: 82) и проводили оценку с использованием различных сенсомоторных и когнитивных тестов, описанных ниже.

Испытание способом вращающегося барабана. Животных поместили на барабан (диаметром 3,6 см) для оценки различия в двигательной координации и баланса путем измерения координации и баланса передних и задних конечностей (ускорительная модель Rotarod 7650; Ugo Basile, Biological Research Apparatus, Varese, Italy). Эту процедуру разработали для оценки двигательного поведения без практического опровержения. Животных приучили к устройству проведением обучающих занятий по две попытки, достаточные для достижения базового уровня исполнения. Затем мышей проверяли еще три раза при увеличивающейся скорости. При обучении скорость вращения барабана установили на 1,0 об/мин, которая постепенно увеличивалась каждые 30 с, и протирали стержень 30% раствором этанола после каждого сеанса. Подушку из мягкой пены поместили рядом с устройством для предотвращения возможных повреждений при падении. Каждое животное испытали три раза (данные объединили для последующих анализов), с интервалом 15 мин, предприняли меры для замедления падения или переворота (при помощи цепляния) из верхней части вращающегося барабана.

Поперечная балка. Это задание тестирует баланс и общую двигательную координацию и функциональную интеграцию. Мышей оценили при помощи измерений их способности проходить по постепенно сужающейся деревянной балке для достижения заданной коробки (Torres et al., Behavioural, Histochemical and Biochemical Consequences of Selective Immunolesions in Discrete Regions of the Basal Forebrain Cholinergic System, Neuroscience 63:95-122 (1994), включено сюда целиком посредством ссылки). Мышей поместили на перекладину шириной 1,1 см и длиной 50,8 см, подвешенную на высоте 30 см от обитой поверхности на двух одинаковых стойках. С каждого края перекладины присоединили по затененной целевой коробке. Для обучения мышей помещали на перекладину в перпендикулярном направлении, а затем контролировали максимум в течение 60 с. Записывали количество соскальзывания лап каждой мыши перед ее падением или достижением целевой коробки для каждой из четырех успешных попыток. Ошибки определялись как соскальзывание лап и записывались по номерам.

Радиальный лабиринт. Лабиринтом служит 8-ходовой приподнятый радиальный лабиринт, сделанный из плексигласа. В каждом ходе длиной 35 см и шириной 7 см имеется чашка воды диаметром 1 см, установленная в конце каждого хода. Боковые стенки высотой 15 см заходят на 12 см в каждый ход для предотвращения перемещения животных между ходами. Центральная зона имеет форму восьмиугольного ядра диаметром 14 см. Доступ в ходы управляется прозрачными гильотинными дверцами из плексигласа с удаленным управлением роликовой системой. Лабиринт приподнят на 75 см над уровнем пола и установлен в помещении с несколькими отличительными предметами с постоянным местоположением, служащими в качестве внешних меток лабиринта. Перед тестированием мыши адаптировались в течение 5 дней. В течение этого периода мыши принимали 0,1% раствор сахарина в воде в течение 1 ч в день, а затем через 16 ч приспосабливались получать сахарный раствор из чашки, помещенной в конце каждого хода. Первые два дня адаптации были проведены в Y-лабиринте, который мыши могли использовать свободно. Последующие три дня адаптации были проведены в радиально-ходовом лабиринте, в котором дверцы периодически поднимались и опускались для приучения животных к звуку, связанному с этим действием. В течение 9 дней испытательного периода поддерживали тот же график лишения воды. В этом графике мыши сохранили хорошее здоровье. Каждое тестовое испытание начинали, помещая мышь в центральную зону и поднимая все дверцы. Когда мышь входила в ход, все дверцы опускали. После того как мышь потребила всю сахариновую воду, дверцу в этот ход поднимали, позволяя мыши вернуться в центральную зону. Через 5 с начинали следующее испытание, снова одновременно поднимая все дверцы. Эту процедуру продолжали до тех пор, пока животное не войдет во все 8 ходов или до истечения 10 мин. Ежедневные сеансы приема продолжали в течение 9 дней. Записывали количество ошибок (входы в уже посещенные ходы) и время до завершения каждого сеанса.

Распознавание предмета. Испытание самопроизвольного распознавания предмета, в котором использовался дефицит измерений в краткосрочной памяти, проводили в квадратной коробке открытого поля (квадрат 48 см со стенками высотой 18 см, сделанный из черного плексигласа), поднятой на 50 см от пола. Интенсивность освещения установили на 30 лк. За день до испытаний мышей индивидуально обучили в ходе сеансов, когда им позволяли изучать пустую коробку в течение 15 мин. Во время тренировочного сеанса в диагональные углы помещали два новых предмета в открытом поле и позволяли

- 27 032675 животным изучать коробку 15 мин. В любом из данных испытаний предметы в паре были высотой 10 см и состояли из одного и того же материала, так что их можно было легко распознать по обонятельным сигналам. Время, потраченное на изучение каждого предмета, записали при помощи системы слежения (San Diego Instruments, San Diego, CA), а в конце каждой фазы обучения мышь вынули из коробки на время задержки запоминания (RD=3 ч). Нормальные мыши запоминают конкретный предмет после задержки до 1 ч и проводят большую часть времени, изучая новый предмет во время испытания на запоминание. Во время тестирования на запоминание животных поместили обратно в ту же коробку, в которой один из предыдущих знакомых с обучения предметов был заменен вторым новым предметом, и позволили им свободно изучать предмет в течение 6 мин. Для каждого испытания для данного животного использовали различные пары предметов и порядок представления пар предметов, а распознанный образец и новые предметы для каждой пары были уравновешены в пределах групп и между ними. Время, потраченное на изучение нового и знакомого предметов, было записано для 6 мин.

Симметричный лабиринт замкнутого поля. Это устройство представляет собой прямоугольное поле площадью 30 кв. см со стенками высотой 9 см, разделенное на 36 квадратов по 9,5 кв. см и накрытое прозрачной крышкой из плексигласа. Концевые коробки, каждая размером 11 х 16 х 9 см, размещены в диагональных углах поля. Симметричный лабиринт является модификацией тестов Геба-Вильямса и Рабиновича-Росвольда, описанных ранее (Asuni et al., Vaccination of Alzheimer's Model Mice with Abeta Derivative in Alum Adjuvant Reduces Abeta Burden without Microhemorrhages, Eur. J. Neurosci. 24:2530-2542 (2006), включено сюда целиком посредством ссылки). Вкратце, основным отличием является то, что каждая концевая камера действует как исходная коробка и как целевая коробка, и мышь в испытаниях попеременно бежит в противоположных направлениях, исключая, таким образом, ее переноску между испытаниями. Барьеры симметрично размещены в поле, так что мышь встречается с одинаковыми поворотами, двигаясь в обоих направлениях в рамках данной задачи. Перед тестированием мыши прошли адаптацию к графику ограниченной подачи воды (ежедневный доступ к воде на 2 ч). Мыши прошли два сеанса такой адаптации перед началом тестирования. В первом сеансе всем мышам давали воду, подслащенную сахарином, в целевой коробке в течение 10 мин. Во втором сеансе их поместили в стартовую камеру, дали возможность изучить поле и войти в целевую коробку, где они получали вознаграждение в виде воды (0,05 мл). Когда мыши уверенно бежали от исходной камеры к целевой коробке, им задали три практических сеанса одинаковых задач, где один или два барьера были помещены в различные положения на поле, так чтобы воспрепятствовать прямому доступу к целевой коробке. Формальное тестирование состояло из постановки трех задач, сортированных по сложности на основании имеющихся данных (Asuni et al., Vaccination of Alzheimer's Model Mice with Abeta Derivative in Alum Adjuvant Reduces Abeta Burden without Microhemorrhages, Eur. J. Neurosci. 24:2530-2542 (2006), включено сюда целиком посредством ссылки) и опубликованных норм для мышей. Ставили по одной задаче в день и мышам давали по пять попыток на каждую задачу со временем между попытками 2 мин. Выполнение вручную отмечалось одним и тем же наблюдателем на основе ошибок (т.е. входы и повторные входы в обозначенные зоны ошибок) и времени выполнения каждой попытки.

Задачей этих экспериментов была оценка влияния вакцинации на выбранное сенсомоторное (т.е. поперечная перекладина и вращающийся барабан) и когнитивное поведение (т.е. радиальный лабиринт, тест на распознавание предметов и испытание в симметричном лабиринте замкнутого поля. Гомозиготные мыши P301L имеют патологию сплетения в возрасте 3 месяцев, и этих животных испытывали в возрасте 5 и 8 месяцев. Животных htau/PS1 тестировали в возрасте 7-8 месяцев.

Иммунизация гомозиготных мышей JNPL3 тау P301L фосфорилированным иммуногенным таупептидом Tau260-264[P-Ser₂₆₂], связанным с эпитопом Т-клеток токсин-помощника тетануса (ТТ947967), препятствовала функциональному ухудшению, связанному с развитием нейрофибриллярных сплетений, что оценено при помощи теста с поперечной перекладины в возрасте 8 месяцев (фиг. 7А) и теста с вращающимся барабаном в возрасте 5-6 месяцев и возрасте 8-9 месяцев (фиг. 7В). Контрольная группа мышей JNPL3 тау P301L получала только адъювант.

Иммунизация мышей htau/PS1 фосфорилированным Tau379-408[P-Ser396,404] препятствовала ухудшению познавательной способности во всех трех использованных тестах: 1) радиальный лабиринт (RAM; повторяющиеся измерения двустороннего дисперсионного анализа, р<0,0001, фиг. 8А), 2) тест на распознавание предмета (ORT; односторонний дисперсионный анализ, р=0,005, фиг. 8В) и 3) симметричный лабиринт замкнутого поля (CFSM; односторонний дисперсионный анализ, лабиринт А: р<0,001, лабиринт В: р<0,0001, лабиринт С: р<0,01, фиг. 9А-9С). Тесты RAM и CFSM иммунизированные мыши htau/PS1 выполнили лучше, чем мыши htau/PS1 контрольной группы в течение всех дней (RAM; p<0,010,001) и во всех лабиринтах с увеличивающейся сложностью, как показано количеством ошибок (следует заметить, что масштаб оси Y различен; CFSM лабиринт А: р<0,01, лабиринты В, С: р<0,001). В ORT ретроспективный анализ показал, что иммунизированные мыши htau/PS1 имеют лучшую кратковременную память, чем такие же мыши контрольной группы (р<0,01). Хорошо известно, что когнитивно нормальные мыши затрачивают около 70% времени на новый предмет, по сравнению со старым предметом (Asuni et al., Immunotherapy Targeting Pathological Tau Conformers in a Tangle Mouse Model Reduces Brain Pathology with Associated Functional Improvements, J. Neurosci. 27:9115-9129 (2007), включено сюда це

- 28 032675 ликом посредством ссылки). Иммунизированные мыши htau/PS1 незначительно отличаются от таких же неиммунизированных мышей контрольной группы по любому из сенсомоторных заданий (вращающийся барабан, поперечная перекладина, локомоторная активность). Эти открытия показывают, что когнитивные улучшения, наблюдаемые после иммунизации, не могут быть объяснены сенсомоторными эффектами, которые дополнительно усиливают эти результаты.

Пример 7. Тау-иммунотерапия снижает уровень патологического тау.

Мозговую ткань гомогенизировали в буфере, содержащем 0,1 мМ 2-(№морфолино) этансульфоновой кислоты, 0,5 мМ MgSO₄, 1 мМ ЭГТА, 2 мМ дитиотреитола, рН 6,8, 0,75 мМ NaCl, 2 мМ фенилметил сульфонилфторида, полную смесь игнибитора мини-протеазы (1 таблетка в 10 мл воды; Roche) и ингибиторы фосфатазы (20 мМ NaF и 0,5 мМ ортованадата натрия). Затем гомогенат центрифугировали (20000 об/мин) в течение 30 мин при 4°С для отделения растворимой цитозольной фракции (супернатант 1) и нерастворимой фракции (гранулы 1). Гранулы повторно суспендировали в таком же объеме буфера без ингибиторов протеазы и фосфатазы, но содержащем 1% (об./об.) Тритон Х-100 и 0,25% (вес./об.) дезоксихолата натрия, и ультрацентрифугировали при скорости 50000 об/мин в течение 30 мин для получения детергент-экстрагированного супернатанта 2, который анализировали как нерастворимую фракцию. Супернатанты 1 и 2 нагревали при 100°С в течение 5 мин и такое же количество белка обработали электрофорезом на 12% (вес./об.) полиакриламидном геле. Блоты закрепили в 5% нежирном молоке с 0,1% Твин-20 в ТБС и инкубировали с различными антителами в течение ночи, а затем промыли и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч с пероксидаза-конъюгированным, анти-мышиным или анти-кроличьим IgG. Затем связанные антитела определили при помощи ECL (Pierce). Денситометрический анализ иммуноблотов выполнили при помощи программы NIH Image J, а уровни патологического тау нормализировали относительно количества общего тау-протеина по сравнению с уровнем актина, поскольку в некоторых исследованиях отмечено, что изменения патофизиологических состояний и взаимодействий с компонентами внеклеточной матрицы могут изменять синтез белка актина, делая актин непригодным в качестве внутреннего стандарта.

Для вестерн-блотинга общее количество тау измерили при помощи поликлонального антитела В19, тогда как патологический тау определяли по моноклональному антителу PHF1 (фиг. 10A-10F). Уровни общего растворимого и нерастворимого тау незначительно различаются между группами (фиг. 10А-10В), тогда как уровни растворимого тау, окрашенного PHF1, значительно увеличились (41%, р<0,001) у иммунизированных мышей по сравнению с такими же мышами контрольной группы (фиг. 10С). Наблюдалась тенденция к снижению (22%) нерастворимого PHF1 реактивного тау (фиг. 10D). Дополнительный анализ показал очень сильную тенденцию к снижению за счет иммунотерапии отношения PHF1/B19 на 35 и 43% в растворимой и нерастворимой фракции соответственно (фиг. 10Е и 10F). Эти открытия показывают, что патологический тау был предпочтительно просветлен.

Важно, что когнитивные улучшения, наблюдавшиеся у мышей htau/PS1, подвергавшихся иммунотерапии, хорошо коррелировали со снижением тау-агрегатов, окрашенных PHF1, что оценено иммуногистохимией. Существенная корреляция наблюдалась во всех трех тестах памяти (RAM (анализировали последний день тестирования): r=0,36, p=0,01; CFSM: лабиринт А, r=0,33, р=0,02; лабиринт С, r=0,40, p=0,01; ORT: r=-0,31, р=0,03). Что касается фракций вестерн-блоттинга, значительная корреляция наблюдалась как в растворимой, так и в нерастворимой фракции, и их доли относительно общего тау в радиальном лабиринте (растворимый PHF1: r=0,41, р<0,01; растворимый PHF1/общий растворимый тау: r=0,34, р<0,05; нерастворимый PHF1: r=0,52, р<0,001; нерастворимый PHF1/общий нерастворимый тау: r=0,33, р<0,05), но не в двух других когнитивных тестах.

Пример 8. Пассивная иммунотерапия, направленная на эпитоп Р-396, 404 предотвращает функциональное ухудшение и сокращает тау-скопления в мозге.

Для определения осуществимости пассивной иммунотерапии гомозиготным мышам P301L внутрибрюшинно (i.p.) ввели инъекцию PHF1, моноклонального тау-антитела (предоставленного доктором Peter Davies), распознающего NFT и предсплетений в модели на мышах P301L (JNPL3) и в AD (Lewis et al., Neurofibrillary Tangles, Amyotrophy and Progressive Motor Disturbance in Mice Expressing Mutant (P301L) Tau Protein, Nat. Genet. 25:402-40522 (2000), включено сюда целиком посредством ссылки). Это моноклональное антитело распознает тау, фосфорилированный на сериновых аминокислотах 404 и 396 на Сокончании тау (Greenberg et al., Hydrofluoric Acid-Treated Tau PHF Proteins Display the Same Biochemical Properties as Normal Tau, J. Biol. Chem. 267:564-569 (1992), включено сюда целиком посредством ссылки). Поэтому оно является моноклональным аналогом прототипа одного из подходов активной иммунизации (Asuni et al., Immunotherapy Targeting Pathological Tau Conformers in a Tangle Mouse Model Reduces Brain Pathology with Associated Functional Improvements, J. Neurosci. 27:9115-9129 (2007), включено сюда целиком посредством ссылки), Tau379-408[P-Ser396,404], содержащего эпитоп антитела PHF1.

Дозировка PHF1 составила 250 мкг/125 мкл, растворенного в PBS. Контрольной группе ввели i.p. инъекцию такой же дозы мышиного IgG в PBS. Первую инъекцию ввели в возрасте от 9 до 12 недель. Затем животным еженедельно вводили в целом 13 инъекций, а затем провели поведенческое тестирование в возрасте 5-6 месяцев с последующим анализом ткани в 6-7 месяцев.

- 29 032675

Пассивная иммунизация антителом PHF1 предотвратила тау-патологию, связанную с ухудшением движения в модели на мышах P301L. Как показано на фиг. 11 А, существует значительная разница между контрольной группой, которой вводили IgG, и животными, иммунизированными PHF1, при испытаниях на поперечной перекладине, где контрольные животные имели больше соскальзываний лап при прохождении по перекладине, чем иммунизированные животные (объединенные попытки, р=0,03). Точно так же мыши P301L, иммунизированные PHF1, имели на 58% меньше PHF1-окрашенной тау-патологии в зубчатой извилине, по сравнению с контрольными (р=0,02) (фиг. 11В). Наблюдалась обратная корреляция между уровнями плазмы антител PHF1 и тау-патологий в стволе мозга (фиг. 12А; р<0,01), и сильная тенденция к корреляции в двигательной области коры головного мозга (фиг. 12В; р=0,06).

Количество антител PHF-1 (мкг/мкл) в плазме иммунизированных животных уменьшилось в четыре раза за две недели (фиг. 11 С). У контрольных животных не наблюдалось обнаруживаемых антител. Представлены средние значения иммунизированных мышей.

Пример 9. Образование моноклональных тау-антител.

Десять мышей balb/c иммунизировали при помощи Tau386-408[P-Ser₃₉₆,₄₀₄] (SEQ ID NO: 13), связанным с KLH через остаток цистеина, присоединенного к N-концу. Образовался концентрированный титр антитела против тау-части иммуногена, что обнаружено по серийным разбавлениям плазмы (фиг. 13А). Отобрали двух мышей для слияния клеток, и провели первоначальный скрининг с пептидом иммуногена без KLH. Второй скрининг выполнили с тем же пептидом, а также с Tau386-408[P-Ser₃₉₆], Tau386408 [P-Ser₄₀₄] и не-фосфопептидом Tau386-408 (фиг. 13В). На основании этого скрининга отобрали клоны для первого и второго субклонирования. Важно, что были установлены многочисленные сильно позитивные клоны (>50), и были определены стабильные клоны, специфически распознающие фосфоэпитоп в пределах этого региона или связанный с не-фосфорилированным центром в пределах этого региона, позволяя, таким образом, проводить сравнение эффективности и безопасности связывания антител с фосфо- или не-фосфо тау-эпитопами в пределах одного и того же региона молекулы.

На фосфо-специфических моноклональных антителах, выбранных для дальнейшего субклонирования, четыре из шести сохраняли свою специфичность для эпитопа фосфо-Ser^ epitope (см. клоны 1F12C2, 1F12G6, 4B6B3 и 4E6G7 на фиг. 14А). Два клона являются менее фосфо-специфичными (8B2D1) или не-специфичными (8B2D4) (фиг. 14А). У не-фосфоспецифичных моноклональных антител, в частности 6В2В9 и 6B2G12, сохранялась их не-специфичность после дальнейшего субклонирования (фиг. 14В).

Активность четырех клонов P-Ser₃₉₆, 404 тау фосфо-специфичных (фиг. 15А) и нефосфоспецифичных (фиг. 15В) моноклональных антител тау протестировали по отношению к гомогенатам мозга мышей JNPL3 P301L и немутантных мышей (Wt). Из четырех фосфо-специфичных клонов 4E6G7 продемонстрировал наиболее сильную активность (фиг. 15А), что согласуется с результатами иммуноферментного твердофазного анализа на фиг. 14А. В противоположность антителу PHF-1, которое также распознает эпитоп тау P-Ser₃₉₆, ₄₀₄, все клоны лучше реагируют с гомогенатом мозга JNPL3 P301L, чем с гомогенатом Wt. Не-фосфоспецифичные клоны реагировали быстрее, как и ожидалось, поскольку большинство тау является не-фосфорилированными.

Другую группу из десяти мышей balb/c иммунизировали при помощи Tau260-271 [P-Ser₂₆₂] (SEQ ID NO: 12), связанным с KLH через остаток цистеина, присоединенного к С-концу. Хотя образовался концентрированный титр против иммуногена Tau260-271[P-Ser262], антитела плазмы распознали также нефосфопептид Tau260-271 (фиг. 16А). Из второго субклонирования отобрали восемь стабильных фосфоспецифичных клонов для дальнейших анализов (фиг. 16В) и для производства антитела выбрали клон 2С11, поскольку он является изотипом IgG2a. IgG3 имеет самое короткое время полужизни, и поэтому не является идеальным для исследований пассивной иммунизации.

Провели оценку активности трех фосфо-специфичных клонов моноклонального антитела P-Ser262 против JNPL3 P301L и немутантных мышей (Wt) (фиг. 17). Клон антитела 2С11 распознает более высокие диапазоны молекулярного веса, чем другие фосфо-специфические клоны, и не различает немутантную ткань и ткань P301L. 5F7D10 и 5F7E9 являются представителями других клонов. Тау-5 распознает общий тау и связывается с эпитопом возле аминокислот 216-227 тау. СР27 распознает тау человека, но не распознает тау мышей.

Клон антитела 5F7D10 легко обнаруживает тау-патологию в отделах мозга сплетения мышей P301L, как показано на фигурах 18А-18В. Моноклональное антитело 5F7D10 демонстрирует сильное гистологическое окрашивание в отделе мозга P301L (фиг. 18А) по сравнению с немутантным типом (фиг. 18В). Антитело PHF1 определило тау-патологию в том же сплетении мышей (фиг. 18С), хотя его структура отличалась от антитела 5F7D10, что не является удивительным, поскольку они распознают различные тау-эпитопы. Фиг. 18D является увеличенным изображением выделенного на фиг. 18А региона, отображая нейроны с агрегированным тау. Фиг. 18В является более увеличенным изображением петлеобразной патологии, обнаруженной при помощи 5F7D10 у различных мышей JNPL3 P301L.

Несмотря на то что были отображены и подробно описаны предпочтительные варианты, специалисту в соответствующей области очевидно, что могут быть сделаны различные модификации, дополнения, замены и т.п. без отклонения от идеи изобретения, и поэтому подразумевается, что они входят в рамки изобретения, как определено в формуле, представленной далее.

- 30 032675

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ <110> Sigurdsson, Einar M.

<120> СПОСОБ И КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ БОЛЕЗНИ АЛЬЦГЕЙМЕРА И ДРУГИХ ТАУПАТИЙ <130> 57953-1801 <150> 61/185,895 <151> 2009-06-10 <160>103 <170> патентная версия 3.5 <210> 1 <211>441 <212> белок <213> Homo Sapiens <400>1

Met Ala Glu 1

Pro

Arg Gln Glu 5

Phe Glu

Val 10

Met

Glu

Asp

His

Ala 15

Gly

Thr

Tyr

Gly

Leu

Gly

Asp

Arg

Lys

Asp

Gln

Gly

Gly

Tyr

Thr

Met

His

20

25

30

Gln

Asp

Gln

Glu

Gly

Asp

Thr

Asp

Ala

Gly

Leu

Lys

Glu

Ser

Pro

Leu

35

40

45

Gln

Thr

Pro

Thr

Glu

Asp

Gly

Ser

Glu

Glu

Pro

Gly

Ser

Glu

Thr

Ser

50

55

60

Asp

Ala

Lys

Ser

Thr

Pro

Thr

Ala

Glu

Asp

Val

Thr

Ala

Pro

Leu

Val

65

70

75

80

Asp

Glu

Gly

Ala

Pro

Gly

Lys

Gln

Ala

Ala

Ala

Gln

Pro

His

Thr

Glu

85

90

95

Ile

Pro

Glu

Gly

Thr

Thr

Ala

Glu

Glu

Ala

Gly

Ile

Gly

Asp

Thr

Pro

100

105

110

Ser

Leu

Glu

Asp

Glu

Ala

Ala

Gly

His

Val

Thr

Gln

Ala

Arg

Met

Val

115

120

125

Ser

Lys

Ser

Lys

Asp

Gly

Thr

Gly

Ser

Asp

Asp

Lys

Lys

Ala

Lys

Gly

130

135

140

Ala

Asp

Gly

Lys

Thr

Lys

Ile

Ala

Thr

Pro

Arg

Gly

Ala

Ala

Pro

Pro

145

150

155

160

Gly

Gln

Lys

Gly

Gln

Ala

Asn

Ala

Thr

Arg

Ile

Pro

Ala

Lys

Thr

Pro

- 31 032675

165

170

175

Pro

Ala

Pro

Lys 180

Thr

Pro

Pro

Ser

Ser 185

Gly

Glu

Pro

Pro

Lys 190

Ser

Gly

Asp

Arg

Ser

Gly

Tyr

Ser

Ser

Pro

Gly

Ser

Pro

Gly

Thr

Pro

Gly

Ser

195

200

205

Arg

Ser

Arg

Thr

Pro

Ser

Leu

Pro

Thr

Pro

Pro

Thr

Arg

Glu

Pro

Lys

210

215

220

Lys

Val

Ala

Val

Val

Arg

Thr

Pro

Pro

Lys

Ser

Pro

Ser

Ser

Ala

Lys

225

230

235

240

Ser

Arg

Leu

Gln

Thr

Ala

Pro

Val

Pro

Met

Pro

Asp

Leu

Lys

Asn

Val

245

250

255

Lys

Ser

Lys

Ile

Gly

Ser

Thr

Glu

Asn

Leu

Lys

His

Gln

Pro

Gly

Gly

260

265

270

Gly

Lys

Val

Gln

Ile

Ile

Asn

Lys

Lys

Leu

Asp

Leu

Ser

Asn

Val

Gln

275

280

285

Ser

Lys

Cys

Gly

Ser

Lys

Asp

Asn

Ile

Lys

His

Val

Pro

Gly

Gly

Gly

290

295

300

Ser

Val

Gln

Ile

Val

Tyr

Lys

Pro

Val

Asp

Leu

Ser

Lys

Val

Thr

Ser

305

310

315

320

Lys

Cys

Gly

Ser

Leu

Gly

Asn

Ile

His

His

Lys

Pro

Gly

Gly

Gly

Gln

325

330

335

Val

Glu

Val

Lys

Ser

Glu

Lys

Leu

Asp

Phe

Lys

Asp

Arg

Val

Gln

Ser

340

345

350

Lys

Ile

Gly

Ser

Leu

Asp

Asn

Ile

Thr

His

Val

Pro

Gly

Gly

Gly

Asn

355

360

365

Lys

Lys

Ile

Glu

Thr

His

Lys

Leu

Thr

Phe

Arg

Glu

Asn

Ala

Lys

Ala

370

375

380

Lys

Thr

Asp

His

Gly

Ala

Glu

Ile

Val

Tyr

Lys

Ser

Pro

Val

Val

Ser

385

390

395

400

Gly

Asp

Thr

Ser

Pro

Arg

His

Leu

Ser

Asn

Val

Ser

Ser

Thr

Gly

Ser

405

410

415

- 32 032675

Ile Asp Met

Val Asp Ser

420

Pro Gln

Leu Ala Thr Leu Ala Asp Glu Val

425 430

Ser Ala Ser Leu Ala Lys Gln Gly Leu
435	440

<210>	2
<211>	7
<212>	белок
<213>	синтетический
<220>
<223>	тау пептид

<220>
<221>	MOD_RES
<222>	(3)..(3)
<223>	фосфорилирование
<220>
<221>	MOD_RES
<222>	(5)..(5)
<223>	фосфорилирование
<400>	2
Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro
1	5

<210>	3
<211>	5
<212>	белок
<213>	синтетический
<220>
<223>	тау пептид

<220>
<221>	MOD_RES
<222>	(3)..(3)
<223>	фосфорилирование
<400>	3

Ile Gly Ser Thr Glu

5

<210>	4
<211>	9
<212>	белок
<213>	синтетический
<220>
<223>	тау пептид

<220>

- 33 032675 <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> фосфорилирование <220>

<221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> фосфорилирование

<400>	4
Val Arg Thr Pro Pro Lys	Ser	Pro
1	5
<210>	5
<211>	13
<212>	белок
<213>	синтетический
<220>
<223>	тау пептид
<220>
<221>	MOD_RES
<222>	(3)..(3)
<223>	фосфорилирование
<220>
<221>	MOD_RES
<222>	(11)..(11)
<223>	фосфорилирование
<400>	5
Tyr Lys Ser Pro Val Val	Ser	Gly
1	5
<210>	6
<211>	30
<212>	белок
<213>	синтетический
<220>
<223>	тау пептид
<220>
<221>	MOD_RES
<222>	(21)..(21)
<223>	фосфорилирование
<220>
<221>	MOD_RES
<222>	(23)..(23)
<223>	фосфорилирование
<400>	6
Gly Asp Arg Ser Gly Tyr	Ser	Ser
1	5

Ser

Asp Thr Ser Pro Arg

Pro Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly

15

- 34 032675

Ser Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu

Pro Thr Pro

Pro Thr Arg <210> 7 <211> 30 <212> белок <213> синтетический <220>

<223> тау пептид <220>

<221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> фосфорилирование <220>

<221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> фосфорилирование <220>

<221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> фосфорилирование <220>

<221> MOD_RES <222> (21)..(21) <223> фосфорилирование <220>

<221> MOD_RES <222> (23)..(23) <223> фосфорилирование <400> 7

Gly Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser

5 10

Pro Gly Thr Pro Gly

Ser Arg Ser Arg Thr Pro

Ser Leu Pro Thr Pro

Pro Thr Arg

<210>	8
<211>	30
<212>	белок
<213>	синтетический
<220>
<223>	тау пептид
<220>
<221>	MOD_RES
<222>	(8)..(8)
<223>	фосфорилирование

- 35 032675 <220>

<221> MOD_RES <222> (21)..(21) <223> фосфорилирование <220>

<221> MOD_RES <222> (23)..(23) <223> фосфорилирование <220>

<221> MOD_RES <222> (26)..(26) <223> фосфорилирование <400> 8

Gly Asp Arg	Ser Gly Tyr Ser	Ser Pro Gly Ser	Pro Gly Thr Pro Gly
1	5	10	15

Ser Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr Arg
20	25	30

<210>	9
<211>	30
<212>	белок
<213>	синтетический
<220>
<223>	тау пептид

<220>
<221>	MOD_RES
<222>	(11)..(11)
<223>	фосфорилирование
<220>
<221>	MOD_RES
<222>	(14)..(14)
<223>	фосфорилирование
<400>	9
Gly Asp Arg Ser Gly Tyr Ser	Ser Pro Gly Ser	Pro Gly Thr Pro Gly
1	5	10	15

Ser Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr Arg
20	25	30

<210> <211> <212> <213>

10 30 белок синтетический

<220>

<223> тау пептид

- 36 032675 <220>

<221> MOD_RES <222> (13)..(13) <223> фосфорилирование <220>

<221> MOD_RES <222> (15)..(15) <223> фосфорилирование <400> 10

Pro Gly Ser	Pro Gly Thr Pro Gly Ser Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu
1	5	10	15

Pro Thr Pro Pro Thr Arg Glu Pro Lys	Lys Val Ala Val Val
20	25	30

<210> 11 <211> 37 <212> белок <213> синтетический <220>

<223> тау пептид <220>

<221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> фосфорилирование <220>

<221> MOD_RES <222> (35)..(35) <223> фосфорилирование <400> 11

Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His	His Lys Pro Gly Gly Gly Gln Val
1	5	10	15

Glu Val Lys Ser Glu Lys	Leu Asp Phe Lys Asp Arg Val Gln Ser Lys
20	25	30

Ile Gly Ser Leu Asp

<210> <211> <212> <213>

12 12 белок синтетический

<220>

<223> тау пептид

- 37 032675 <220>

<221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> фосфорилирование <400> 12

Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu Lys His Gln Pro Gly
1	5	10

<210>	13
<211>	23
<212>	белок
<213>	синтетический
<220>
<223>	тау пептид
<220>
<221>	MOD_RES
<222>	(11)..(11)
<223>	фосфорилирование
<220>
<221>	MOD_RES
<222>	(19)..(19)
<223>	фосфорилирование
<400>	13
Thr Asp His Gly Ala Glu	Ile Val	Tyr Lys	Ser Pro Val Val Ser Gly
1	5		10	15
Asp Thr Ser Pro Arg His	Leu
	20

<210>	14
<211>	24
<212>	белок
<213>	синтетический
<220>
<223>	тау пептид

<220>

<221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> фосфорилирование <220>

<221> MOD_RES <222> (22)..(22) <223> фосфорилирование <400> 14

Leu Gln Thr Pro Thr	Glu Asp Gly Ser Glu Glu Pro Gly Ser Glu Thr
1	5	10	15

- 38 032675

Ser Asp Ala Lys Ser Thr Pro Thr <210> 15 <211> 5 <212> белок <213> синтетический <220>

<223> тау пептид <220>

<221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> фосфорилирование <400>15

Thr Pro Ser Leu Glu <210> 16 <211>5 <212> белок <213> синтетический <220>

<223> тау пептид <220>

<221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> фосфорилирование <400>16

Ile Ala Thr Pro Arg <210>17 <211>5 <212> белок <213> синтетический <220>

<223> тау пептид <220>

<221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> фосфорилирование <400> 17

Ala Lys Thr Pro Pro

- 39 032675 <210> 18 <211> 17 <212> белок <213> синтетический <220>

<223> тау пептид <220>

<221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> фосфорилирование <220>

<221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> фосфорилирование <220>

<221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> фосфорилирование <220>

<221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> фосфорилирование <220>

<221> MOD_RES <222> (12)..(12) <223> фосфорилирование <220>

<221> MOD_RES <222> (15)..(15) <223> фосфорилирование <400> 18

Pro Gly Thr Pro Gly Ser Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro

5 10 15

Pro

<210>	19
<211>	5
<212>	белок
<213>	синтетический
<220>
<223>	тау пептид
<220>
<221>	MOD_RES

- 40 032675

<222> <223>	(3)..(3) фосфорилирование
<400>	19

Pro Lys Ser Pro Ser

5

<210> <211> <212> <213>

20 9 белок синтетический

<220> <223>

тау пептид

<220> <221> <222> <223>

MOD_RES (3)..(3) фосфорилирование

<220> <221> <222> <223>	MOD_RES (7)..(7) фосфорилирование
<400>	20

Val Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu

5

<210> <211> <212> <213>

21 5 белок синтетический

<220> <223>

тау пептид

<220> <221> <222> <223>	MOD_RES (3)..(3) фосфорилирование
<400>	21

Val Gln Ser Lys Cys

1	5
<210> <211> <212> <213>	22 5 белок синтетический

<220> <223>

тау пептид

- 41 032675 <220>

<221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> фосфорилирование <400>22

Ile Gly Ser Leu Asp <210>23 <211>19 <212> белок <213> синтетический <220>

<223> тау пептид <220>

<221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> фосфорилирование <220>

<221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> фосфорилирование <220>

<221> MOD_RES <222> (12)..(12) <223> фосфорилирование <220>

<221> MOD_RES <222> (15)..(17) <223> фосфорилирование <400> 23

Val Val Ser Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu Ser Asn Val Ser Ser

5 10 15

Thr Gly Ser

<210> <211> <212> <213>

24 18 белок синтетический

<223> тау пептид <220>

<221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> фосфорилирование <220>

- 42 032675 <220>

<221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> фосфорилирование <220>

<221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> фосфорилирование <220>

<221> MOD_RES <222> (16)..(16) <223> фосфорилирование <400> 24

Val Asp Ser Pro Gln Leu Ala Thr Leu Ala Asp Glu Val Ser Ala Ser

5 10 15

Leu Ala

<210>	25
<211>	4
<212>	белок
<213>	синтетический
<220>
<223>	тау пептид

<220>

<221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> фосфорилирование <400> 25

Pro Gly Ser Pro

<210>	26
<211>	5
<212>	белок
<213>	синтетический
<220>
<223>	тау пептид

<220>

<221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> фосфорилирование <400> 26

Pro Gly Thr Pro Gly

- 43 032675

1	5
<210> <211> <212> <213>	27 11 белок синтетический

<220> <223>

тау пептид

<220> <221> <222> <223>

MOD_RES (3)..(3) фосфорилирование

<220> <221> <222> <223>

MOD_RES (6)..(6) фосфорилирование

<220> <221> <222> <223>	MOD_RES (9)..(9) фосфорилирование
<400>	27

Tyr Ser Ser Pro Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly

1	5 10
<210> <211> <212> <213>	28 11 белок синтетический

<220> <223>

тау пептид

<220> <221> <222> <223>

MOD_RES (7)..(7) фосфорилирование

<220> <221> <222> <223>	MOD_RES (9)..(9) фосфорилирование
<400>	28

Pro Gly Ser Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro

1	5 10
<210> <211> <212> <213>	29 11 белок синтетический

- 44 032675 <220>

<223> тау пептид <220>

<221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> фосфорилирование <220>

<221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> фосфорилирование <400>29

Val Arg Thr Pro Pro Lys Ser Pro Ser Ser Ala

510 <210>30 <211> 10 <212> белок <213> синтетический <220>

<223> тау пептид <220>

<221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> фосфорилирование <220>

<221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> фосфорилирование <220>

<221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> фосфорилирование <400>30

Pro Lys Thr Pro Pro Ser Ser Gly Glu Pro

510 <210>31 <211>7 <212> белок <213> синтетический <220>

<223> псевдофосфорилированный тау пептид <220>

<221> разное <222> (3)..(3) <223> Хаа это глютаминовая кислота или остаток аспарагиновой кислоты

- 45 032675 <220>

<221> <222> <223>	разное (5)..(5) Хаа это глютаминовая кислота или остаток аспарагиновой кислоты
<400>	31

Ser Arg Xaa Pro

Xaa Leu Pro

<210>	32
<211>	5
<212>	белок
<213>	синтетический

<220>

<223> псевдофосфорилированный тау пептид

<220>
<221>	разное
<222>	(3)..(3)
<223>	Хаа это	глютаминовая кислота или остаток аспарагиновой кислоты
<400>	32
Ile Gly Xaa Thr	Glu
1		5

<210>	33
<211>	9
<212>	белок
<213>	синтетический

<220>

<223> псевдофосфорилированный тау пептид <220>

<221> разное

<222> <223>	(3). Хаа	. .(3) это	глютаминовая кислота или остаток аспарагиновой кислоты
<220>
<221>	разное
<222>	(7).	.(7)
<223>	Хаа	это	глютаминовая кислота или остаток аспарагиновой кислоты
<400>	33

Val Arg Xaa Pro Pro Lys Xaa Pro Ser

5

<210> <211> <212> <213>

34 13 белок синтетический

<220>

- 46 032675 <223> псевдофосфорилированный тау пептид <220>

<221> разное <222> (3)..(3)

<223>	Хаа это глютаминовая	кислота	или	остаток	аспарагиновой кислоты
<220>
<221>	разное
<222>	(11)..(11)
<223>	Хаа это глютаминовая	кислота	или	остаток	аспарагиновой кислоты
<400>	34
Tyr Lys	Xaa Pro Val Val Ser	Gly Asp	Thr	Xaa Pro	Arg
1	5		10

<210> 35 <211> 30 <212> белок <213> синтетический <220>

<223> псевдофосфорилированный тау пептид <220>

<221>

<222>

<223>

разное (21)..(21)

Хаа это глютаминовая кислота или остаток аспарагиновой кислоты <220>

<221>

<222>

<223>

разное (23)..(23)

Хаа это глютаминовая кислота или остаток аспарагиновой кислоты <400>

Gly

Asp

Arg

Ser

Gly

Tyr

Ser

Ser

Pro

Gly

Ser

Pro

Gly

Thr

Pro Gly

Ser

Arg

Ser

Arg

Xaa

Pro

Xaa

Leu

Pro

Thr

Pro

Pro

Thr

Arg <210> 36 <211> 30 <212> белок <213> синтетический <220>

<223> псевдофосфорилированный тау пептид <220>

<221> разное <222> (8)..(8) <223> Хаа это глютаминовая кислота или остаток аспарагиновой кислоты <220>

- 47 032675 <221> разное <222> (11)..(11)

<223>	Хаа это глютаминовая	кислота	или	остаток	аспарагиновой	кислоты
<220>
<221>	разное
<222>	(14)..(14)
<223>	Хаа это глютаминовая	кислота	или	остаток	аспарагиновой	кислоты
<220>
<221>	разное
<222>	(21)..(21)
<223>	Хаа это глютаминовая	кислота	или	остаток	аспарагиновой	кислоты
<220>
<221>	разное
<222>	(23)..(23)
<223>	Хаа это глютаминовая	кислота	или	остаток	аспарагиновой	кислоты
<400>	36
Gly Asp Arg Ser Gly Tyr Ser	Xaa Pro	Gly	Xaa Pro	Gly Xaa Pro Gly
1	5		10		15

Ser Arg Ser Arg

Xaa Pro Xaa Leu Pro

Thr Pro Pro

Thr Arg <210> 37 <211> 30 <212> белок <213> синтетический <220>

<223> псевдофосфорилированный тау пептид <220>

<221> разное <222> (8)..(8)

<223>	Хаа это глютаминовая	кислота	или	остаток	аспарагиновой	кислоты
<220>
<221>	разное
<222>	(21)..(21)
<223>	Хаа это глютаминовая	кислота	или	остаток	аспарагиновой	кислоты
<220>
<221>	разное
<222>	(23)..(23)
<223>	Хаа это глютаминовая	кислота	или	остаток	аспарагиновой	кислоты
<220>
<221>	разное
<222>	(26)..(26)
<223>	Хаа это глютаминовая	кислота	или	остаток	аспарагиновой	кислоты
<400>	37
Gly Asp Arg Ser Gly Tyr Ser	Xaa Pro	Gly	Ser Pro	Gly Thr Pro Gly
1	5		10		15

- 48 032675

Ser Arg Ser Arg Xaa Pro Xaa Leu Pro Xaa Pro Pro

2025

Thr Arg <210>38 <211>30 <212> белок <213> синтетический <220>

<223> псевдофосфорилированный тау пептид <220>

<221> разное <222> (11)..(11)

<223>	Хаа это глютаминовая	кислота	или	остаток	аспарагиновой	кислоты
<220>
<221>	разное
<222>	(14)..(14)
<223>	Хаа это глютаминовая	кислота	или	остаток	аспарагиновой	кислоты
<400>	38
Gly Asp	Arg Ser Gly Tyr Ser	Ser Pro	Gly	Xaa Pro	Gly Xaa Pro Gly
1	5		10		15

Ser Arg Ser Arg Thr Pro Ser

Leu Pro

Thr Pro Pro

Thr Arg <210> 39 <211> 30 <212> белок <213> синтетический <220>

<223> псевдофосфорилированный тау пептид <220>

<221> разное <222> (13)..(13)

<223>	Хаа это	глютаминовая	кислота	или	остаток	аспарагиновой	кислоты
<220>
<221>	разное
<222>	(15)..(15)
<223>	Хаа это	глютаминовая	кислота	или	остаток	аспарагиновой	кислоты
<400>	39
Pro Gly Ser Pro	Gly	Thr	Pro	Gly	Ser	Arg	Ser	Arg	Xaa Pro Xaa Leu
1		5					10			15
Pro Thr	Pro Pro	Thr	Arg	Glu	Pro	Lys	Lys	Val	Ala	Val Val
	20					25				30

- 49 032675 <210> 40 <211> 37 <212> белок <213> синтетический <220>

<223> псевдофосфорилированный тау пептид <220>

<221> разное <222> (3)..(3)

<223>	Хаа	это	глютаминовая	кислота	или	остаток	аспарагиновой кислоты
<220>
<221>	разное
<222>	(35)	..(35)
<223>	Хаа	это	глютаминовая	кислота	или	остаток	аспарагиновой кислоты
<400>	40
Cys Gly	Xaa	Leu	Gly Asn Ile	His His	Lys	Pro Gly	Gly Gly Gln Val
1			5		10		15
Glu Val	Lys	Ser	Glu Lys Leu	Asp Phe	Lys	Asp Arg	Val Gln Ser Lys
		20		25			30

Ile Gly Xaa Leu Asp <210> 41 <211> 12 <212> белок <213> синтетический <220>

<223> псевдофосфорилированный тау пептид <220>

<221> разное <222> (3)..(3) <223> Хаа это глютаминовая кислота или остаток аспарагиновой кислоты <400> 41

Ile Gly Xaa Thr Glu Asn Leu Lys His Gln Pro Gly

5 10

<210> <211> <212> <213>

42 23 белок синтетический

<223> псевдофосфорилированный тау пептид <220>

<220>

- 50 032675 <221> разное <222> (11)..(11)

<223>	Хаа это глютаминовая	кислота	или	остаток	аспарагиновой	кислоты
<220>
<221>	разное
<222>	(19)..(19)
<223>	Хаа это глютаминовая	кислота	или	остаток	аспарагиновой	кислоты
<400>	42
Thr Asp	His Gly Ala Glu Ile	Val Tyr	Lys	Xaa Pro	Val Val Ser Gly
1	5		10		15

Asp Thr Xaa

Pro Arg His Leu <210> 43 <211> 24 <212> белок <213> синтетический <220>

<223> псевдофосфорилированный тау пептид <220>

<221> разное <222> (3)..(3)

<223>	Хаа это глютаминовая	кислота	или	остаток	аспарагиновой	кислоты
<220>
<221>	разное
<222>	(22)..(22)
<223>	Хаа это глютаминовая	кислота	или	остаток	аспарагиновой	кислоты
<400>	43
Leu Gln Xaa Pro Thr Glu Asp	Gly Ser	Glu	Glu Pro	Gly Ser Glu Thr
1	5		10		15

Ser Asp Ala Lys Ser Xaa Pro Thr

<210>	44
<211>	5
<212>	белок
<213>	синтетический

<220>

<223> псевдофосфорилированный тау пептид

<220> <221> <222> <223>	разное (3)..(3) Хаа это глютаминовая кислота или остаток аспарагиновой кислоты
<400>	44

- 51 032675

Thr Pro Xaa Leu Glu

5

<210>	45
<211>	5
<212>	белок
<213>	синтетический

<220>

<223> псевдофосфорилированный тау пептид <220>

<221> разное <222> (3)..(3) <223> Хаа это глютаминовая кислота или остаток аспарагиновой кислоты <400> 45

Ile Ala Xaa Pro Arg

5

<210>	46
<211>	5
<212>	белок
<213>	синтетический
<220>
<223>	псевдофосфорилированный тау пептид

<220>
<221>	разное
<222>	(3)..(3)
<223>	Хаа это	глютаминовая кислота или остаток аспарагиновой кислоты
<400>	46
Ala Lys	Xaa Pro	Pro
1		5

<210>	47
<211>	17
<212>	белок
<213>	синтетический
<220>
<223>	псевдофосфорилированный тау пептид

<220> <221> <222> <223>	разное
(3). Хаа	. .(3) это	глютаминовая кислота или остаток аспарагиновой кислоты
<220>
<221>	разное
<222>	(6).	.(6)
<223>	Хаа	это	глютаминовая кислота или остаток аспарагиновой кислоты

- 52 032675 <220>

<221> разное <222> (8)..(8)

<223>	Хаа это глютаминовая	кислота	или	остаток	аспарагиновой	кислоты
<220>
<221>	разное
<222>	(10)..(10)
<223>	Хаа это глютаминовая	кислота	или	остаток	аспарагиновой	кислоты
<220>
<221>	разное
<222>	(12)..(12)
<223>	Хаа это глютаминовая	кислота	или	остаток	аспарагиновой	кислоты
<220>
<221>	разное
<222>	(15)..(15)
<223>	Хаа это глютаминовая	кислота	или	остаток	аспарагиновой	кислоты
<400>	47
Pro Gly Xaa Pro Gly Xaa Arg	Xaa Arg	Xaa	Pro Xaa	Leu Pro Xaa Pro
1	5		10		15

Pro

<210>	48
<211>	5
<212>	белок
<213>	синтетический

<220>

<223> псевдофосфорилированный тау пептид

<220> <221> <222> <223>	разное (3)..(3) Хаа это глютаминовая кислота или остаток аспарагиновой кислоты
<400>	48

Pro Lys Xaa Pro Ser

5

<210>	49
<211>	9
<212>	белок
<213>	синтетический
<220>
<223>	псевдофосфорилированный тау пептид

<220>
<221>	разное
<222>	(3).	.(3

- 53 032675

<223>	Хаа это	глютаминовая	кислота или	остаток аспарагиновой кислоты
<220>
<221>	разное
<222>	(7)..(7)
<223>	Хаа это	глютаминовая	кислота или	остаток аспарагиновой кислоты
<400>	49
Val Lys	Xaa Lys	Ile Gly Xaa	Thr Glu
1		5

<210>	50
<211>	5
<212>	белок
<213>	синтетический
<220>
<223>	псевдофосфорилированный тау пептид

<220>
<221>	разное
<222>	(3)..(3)
<223>	Хаа это	глютаминовая кислота или остаток аспарагиновой кислоты
<400>	50
Val Gln Xaa Lys	Cys
1		5

<210> 51 <211> 5 <212> белок <213> синтетический <220>

<223> псевдофосфорилированный тау пептид <220>

<221> разное <222> (3)..(3) <223> Хаа это глютаминовая кислота или остаток аспарагиновой кислоты <400> 51

Ile Gly Xaa Leu Asp

5

<210> <211> <212> <213>

52 19 белок синтетический

<223> псевдофосфорилированный тау пептид <220>

<220>

- 54 032675 <221> разное <222> (3)..(3)

<223>	Хаа это глютаминовая	кислота	или	остаток	аспарагиновой	кислоты
<220>
<221>	разное
<222>	(6)..(6)
<223>	Хаа это глютаминовая	кислота	или	остаток	аспарагиновой	кислоты
<220>
<221>	разное
<222>	(12)..(12)
<223>	Хаа это глютаминовая	кислота	или	остаток	аспарагиновой	кислоты
<220>
<221>	разное
<222>	(15)..(17)
<223>	Хаа это глютаминовая	кислота	или	остаток	аспарагиновой	кислоты
<400>	52
Val Val	Xaa Gly Asp Xaa Ser	Pro Arg	His	Leu Xaa	Asn Val Xaa Xaa
1	5		10		15

Xaa Gly Ser <210> 53 <211> 18 <212> белок <213> синтетический <220>

<223> псевдофосфорилированный тау пептид <220>

<221> разное <222> (3)..(3)

<223>	Хаа это глютаминовая	кислота	или	остаток	аспарагиновой	кислоты
<220>
<221>	разное
<222>	(8)..(8)
<223>	Хаа это глютаминовая	кислота	или	остаток	аспарагиновой	кислоты
<220>
<221>	разное
<222>	(14)..(14)
<223>	Хаа это глютаминовая	кислота	или	остаток	аспарагиновой	кислоты
<220>
<221>	разное
<222>	(16)..(16)
<223>	Хаа это глютаминовая	кислота	или	остаток	аспарагиновой	кислоты
<400>	53
Val Asp Xaa Pro Gln Leu Ala	Xaa Leu	Ala	Asp Glu	Val Xaa Ala Xaa
1	5		10		15

- 55 032675

Leu Ala

<210>	54
<211>	4
<212>	белок
<213>	синтетический

<220>

<223> псевдофосфорилированный тау пептид <220>

<221> разное <222> (3)..(3) <223> Хаа это глютаминовая кислота или остаток аспарагиновой кислоты <400> 54

Pro Gly Xaa Pro

<210>	55
<211>	5
<212>	белок
<213>	синтетический
<220>
<223>	псевдофосфорилированный тау пептид

<220>
<221>	разное
<222>	(3)..(3)
<223>	Хаа это	глютаминовая кислота или остаток аспарагиновой кислоты
<400>	55
Pro Gly Xaa Pro	Gly
1		5

<210>	56
<211>	31
<212>	белок
<213>	синтетический
<220>
<223>	псевдофосфорилированный тау пептид

<220>

<221> разное <222> (17)..(17) <223> Хаа это глютаминовая кислота или остаток аспарагиновой кислоты <220>

<221>

<222>

<223>

разное (21)..(21)

Хаа это глютаминовая кислота или остаток аспарагиновой кислоты

- 56 032675 <400>56

Asp Gly Thr Gly Ser Asp Asp Lys Lys Ala Lys Gly Ala Asp Gly Lys

5 1015

Xaa Lys Ile Ala

Xaa Thr Pro Arg Gly Ala Ala Pro

Pro Gly Gln

<210> <211> <212> <213>

57 30 белок синтетический

<220>

<223> псевдофосфорилированный тау пептид <220>

<221> разное <222> (18)..(18)

<223>	Хаа	это	глютаминовая	кислота	или	остаток	аспарагиновой	кислоты
<220>
<221>	разное
<222>	(26)	..(26)
<223>	Хаа	это	глютаминовая	кислота	или	остаток	аспарагиновой	кислоты
<400>	57
Arg Glu	. Asn	Ala	Lys	Ala	Lys	Thr	Asp	His	Gly Ala	Glu Ile Val Tyr
1			5					10		15
Lys Xaa	Pro	Val	Val	Ser	Gly	Asp	Thr	Xaa	Pro Arg	His Leu
		20					25			30

<210>58 <211>30 <212> белок <213> синтетический <220>

<223> псевдофосфорилированный тау пептид <220>

<221> разное <222> (8)..(8)

<223>	Хаа это	глютаминовая	кислота	или	остаток	аспарагиновой	кислоты
<220>
<221>	разное
<222>	(11)..(11)
<223>	Хаа это	глютаминовая	кислота	или	остаток	аспарагиновой	кислоты
<220>
<221>	разное
<222>	(14)..(14)
<223>	Хаа это	глютаминовая	кислота	или	остаток	аспарагиновой	кислоты

- 57 032675

<220> <221> <222> <223>	разное	кислота	или	остаток	аспарагиновой	кислоты
(21) Хаа	..(21) это глютаминовая
<220>
<221>	разное
<222>	(23)	..(23)
<223>	Хаа	это глютаминовая	кислота	или	остаток	аспарагиновой	кислоты
<400>	58
Gly Asp	Arg	Ser Gly Tyr Ser	Xaa Pro	Gly	Xaa Pro	Gly Xaa Pro Gly
1		5		10		15
Ser Arg	Ser	Arg Xaa Pro Xaa	Leu Pro	Thr	Pro Pro	Thr Arg
		20	25			30

<210> <211> <212> <213>

59 30 белок синтетический

<220>

<223> псевдофосфорилированный тау пептид <220>

<221> разное <222> (11)..(11)

<223>	Хаа это	глютаминовая	кислота	или	остаток	аспарагиновой	кислоты
<220>
<221>	разное
<222>	(15)..(15)
<223>	Хаа это	глютаминовая	кислота	или	остаток	аспарагиновой	кислоты
<400>	59
Arg Glu	Pro Lys	Lys	Val	Ala	Val	Val	Arg	Xaa	Pro	Pro Lys Xaa Pro
1		5					10			15
Ser Ser	Ala Lys	Ser	Arg	Leu	Gln	Thr	Ala	Pro	Val	Pro Met
	20					25				30

<210> <211> <212> <213>

60 29 белок синтетический

<220>

<223> псевдофосфорилированный тау пептид <220>

<221> разное <222> (1)..(1) <223> Хаа это глютаминовая кислота или остаток аспарагиновой кислоты

- 58 032675 <220>

<221> разное <222> (8)..(8)

<223>	Хаа это глютаминовая	кислота	или	остаток	аспарагиновой	кислоты
<220>
<221>	разное
<222>	(14)..(16)
<223>	Хаа это глютаминовая	кислота	или	остаток	аспарагиновой	кислоты
<220>
<221>	разное
<222>	(19)..(19)
<223>	Хаа это глютаминовая	кислота	или	остаток	аспарагиновой	кислоты
<220>
<221>	разное
<222>	(22)..(22)
<223>	Хаа это глютаминовая	кислота	или	остаток	аспарагиновой	кислоты
<220>
<221>	разное
<222>	(25)..(25)
<223>	Хаа это глютаминовая	кислота	или	остаток	аспарагиновой	кислоты
<220>
<221>	разное
<222>	(27)..(27)
<223>	Хаа это глютаминовая	кислота	или	остаток	аспарагиновой	кислоты
<220>
<221>	разное
<222>	(29)..(29)
<223>	Хаа это глютаминовая	кислота	или	остаток	аспарагиновой	кислоты
<400>	60
Xaa Ser Gly Glu Pro Pro Lys	Xaa Gly	Asp	Arg Ser	Gln Xaa Xaa Xaa
1	5		10		15

Pro Gly Xaa

Pro

Gly Xaa Pro

Gly Xaa Arg

Xaa Arg

Xaa

<210> <211> <212> <213>

61 30 белок синтетический

<220>

<223> псевдофосфорилированный тау пептид <220>

<221> разное <222> (18)..(18) <223> Хаа это глютаминовая кислота или остаток аспарагиновой кислоты <220>

<221> разное <222> (29)..(29)

- 59 032675 <223> Хаа это глютаминовая кислота или остаток аспарагиновой кислоты <400>61

Met Ala Glu	Pro Arg Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly
1	5	10	15

Thr Xaa Gly Leu Gly Asp Arg Lys	Asp Gln Gly Gly Xaa Thr
20	25	30

<210>	62
<211>	31
<212>	белок
<213>	синтетический
<220>
<223>	псевдофосфорилированный тау пептид

<220>

<221> разное <222> (10)..(10)

<223>	Хаа это глютаминовая	кислота	или	остаток	аспарагиновой	кислоты
<220>
<221>	разное
<222>	(17)..(17)
<223>	Хаа это глютаминовая	кислота	или	остаток	аспарагиновой	кислоты
<220>
<221>	разное
<222>	(21)..(21)
<223>	Хаа это глютаминовая	кислота	или	остаток	аспарагиновой	кислоты
<220>
<221>	разное
<222>	(23)..(23)
<223>	Хаа это глютаминовая	кислота	или	остаток	аспарагиновой	кислоты
<220>
<221>	разное
<222>	(27)..(27)
<223>	Хаа это глютаминовая	кислота	или	остаток	аспарагиновой	кислоты
<400>	62
Thr Met His Gln Asp Gln Glu	Gly Asp	Xaa	Asp Ala	Gly Leu Lys Glu
1	5		10		15

Xaa Pro Leu Gln Xaa Pro Xaa Glu Asp Gly Xaa	Glu Glu Pro Gly
20	25	30

<210>63 <211>31 <212> белок <213> синтетический <220>

<223> псевдофосфорилированный тау пептид

- 60 032675 <220>

<221> разное

<222> <223>	(9). Хаа	.(10) это глютаминовая	кислота	или	остаток	аспарагиновой кислоты
<220>
<221>	разное
<222>	(12)	..(12)
<223>	Хаа	это глютаминовая	кислота	или	остаток	аспарагиновой кислоты
<400>	63
Gly Ser	Glu	Thr Ser Asp Ala	Lys Xaa	Xaa	Pro Xaa	Ala Glu Asp Val
1		5		10		15
Thr Ala	Pro	Leu Val Asp Glu	Gly Ala	Pro	Gly Lys	Gln Ala Ala
		20	25			30

<210> 64 <211> 31 <212> белок <213> синтетический <220>

<223> псевдофосфорилированный тау пептид <220>

<221> разное <222> (6)..(6)

<223>	Хаа это глютаминовая	кислота	или	остаток	аспарагиновой	кислоты
<220>
<221>	разное
<222>	(12)..(13)
<223>	Хаа это глютаминовая	кислота	или	остаток	аспарагиновой	кислоты
<220>
<221>	разное
<222>	(24)..(24)
<223>	Хаа это глютаминовая	кислота	или	остаток	аспарагиновой	кислоты
<400>	64
Ala Ala Gln Pro His Xaa Glu	Ile Pro	Glu	Gly Xaa	Xaa Ala Glu Glu
1	5		10		15

Ala Gly Ile Gly Asp Thr Pro Xaa Leu	Glu Asp Glu Ala Ala Gly
20	25	30

<210> 65 <211> 31 <212> белок <213> синтетический <220>

<223> псевдофосфорилированный тау пептид

- 61 032675 <220>

<221> разное <222> (4)..(4)

<223>	Хаа это глютаминовая	кислота	или	остаток	аспарагиновой	кислоты
<220>
<221>	разное
<222>	(12)..(12)
<223>	Хаа это глютаминовая	кислота	или	остаток	аспарагиновой	кислоты
<220>
<221>	разное
<222>	(30)..(30)
<223>	Хаа это глютаминовая	кислота	или	остаток	аспарагиновой	кислоты
<400>	65
Gly His	Val Xaa Gln Ala Arg	Met Val	Ser	Lys Xaa	Lys Asp Gly Thr
1	5		10		15
Gly Ser	Asp Asp Lys Lys Ala	Lys Gly	Ala	Asp Gly	Lys Xaa Lys
	20	25			30

<210> 66 <211> 31 <212> белок <213> синтетический <220>

<223> псевдофосфорилированный тау пептид <220>

<221> разное <222> (26)..(26) <223> Хаа это глютаминовая кислота или остаток аспарагиновой кислоты <400>66

Lys Ile Ala Thr Pro Arg Gly Ala Ala Pro	Pro Gly Gln Lys Gly Gln
1	5	10	15

Ala Asn Ala Thr Arg Ile Pro Ala Lys Xaa Pro Pro Ala Pro Lys
20	25	30

<210>67 <211>31 <212> белок <213> синтетический <220>

<223> псевдофосфорилированный тау пептид <220>

<221> разное <222> (2)..(2)

- 62 032675

<223>	Хаа это глютаминовая	кислота	или	остаток	аспарагиновой	кислоты
<220>
<221>	разное
<222>	(5)..(6)
<223>	Хаа это глютаминовая	кислота	или	остаток	аспарагиновой	кислоты
<220>
<221>	разное
<222>	(18)..(20)
<223>	Хаа это глютаминовая	кислота	или	остаток	аспарагиновой	кислоты
<220>
<221>	разное
<222>	(23)..(23)
<223>	Хаа это глютаминовая	кислота	или	остаток	аспарагиновой	кислоты
<220>
<221>	разное
<222>	(26)..(26)
<223>	Хаа это глютаминовая	кислота	или	остаток	аспарагиновой	кислоты
<220>
<221>	разное
<222>	(29)..(29)
<223>	Хаа это глютаминовая	кислота	или	остаток	аспарагиновой	кислоты
<400>	67
Lys Xaa Pro Pro Xaa Xaa Gly	Glu Pro	Pro	Lys Ser	Gly Asp Arg Ser
1	5		10		15

Gly Xaa Xaa Xaa Pro Gly Xaa Pro Gly Xaa Pro Gly Xaa Arg Ser
20	25	30

<210> 68 <211> 31 <212> белок <213> синтетический <220>

<223> псевдофосфорилированный тау пептид

<220> <221> <222> <223>	разное	или	остаток	аспарагиновой	кислоты
(3). Хаа	.(3) это	глютаминовая	кислота
<220>
<221>	разное
<222>	(5).	.(5)
<223>	Хаа	это	глютаминовая	кислота	или	остаток	аспарагиновой	кислоты
<220>
<221>	разное
<222>	(8).	.(8)
<223>	Хаа	это	глютаминовая	кислота	или	остаток	аспарагиновой	кислоты

<220>

<221> разное

- 63 032675 <222> (22)..(22)

<223>	Хаа это глютаминовая	кислота	или	остаток	аспарагиновой	кислоты
<220>
<221>	разное
<222>	(26)..(26)
<223>	Хаа это глютаминовая	кислота	или	остаток	аспарагиновой	кислоты
<220>
<221>	разное
<222>	(28)..(29)
<223>	Хаа это глютаминовая	кислота	или	остаток	аспарагиновой	кислоты
<400>	68
Ser Arg Xaa Pro Xaa Leu Pro	Xaa Pro	Pro	Thr Arg	Glu Pro Lys Lys
1	5		10		15

Val Ala Val Val Arg Xaa Pro Pro Lys Xaa Pro Xaa Xaa Ala Lys
20	25	30

<210> <211> <212> <213>

69 31 белок синтетический

<220>

<223> псевдофосфорилированный тау пептид <220>

<221> разное <222> (23)..(23) <223> Хаа это глютаминовая кислота или остаток аспарагиновой кислоты <400>69

Lys	Ser Arg Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro Met Pro Asp Leu Lys Asn
1	5	10	15

Val Lys Ser Lys	Ile Gly Xaa Thr Glu Asn Leu Lys	His Gln Pro
20	25	30

<210>70 <211>31 <212> белок <213> синтетический <220>

<223> псевдофосфорилированный тау пептид <220>

<221> разное <222> (24)..(24) <223> Хаа это глютаминовая кислота или остаток аспарагиновой кислоты <400> 70

- 64 032675

Pro Gly Gly Gly Lys Val Gln Ile Ile Asn Lys Lys Leu Asp Leu Ser

5 10 15

Asn Val Gln Ser

Lys Cys Gly Xaa Lys

Asp Asn Ile

Lys His Val

<210> <211> <212> <213>

71 31 белок синтетический

<220>

<223> псевдофосфорилированный тау пептид <220>

<221> разное

<222> <223>	(11) Хаа	..(11) это глютаминовая	кислота	или	остаток	аспарагиновой	кислоты
<220>
<221>	разное
<222>	(25)	..(25)
<223>	Хаа	это глютаминовая	кислота	или	остаток	аспарагиновой	кислоты
<400>	71
Val Pro	Gly	Gly Gly Ser Val	Gln Ile	Val	Xaa Lys	Pro Val Asp Leu
1		5		10		15
Ser Lys	Val	Thr Ser Lys Cys	Gly Xaa	Leu	Gly Asn	Ile His His
		20	25			30

<210> 72 <211> 31 <212> белок <213> синтетический <220>

<223> псевдофосфорилированный тау пептид <220>

<221> разное <222> (27)..(27) <223> Хаа это глютаминовая кислота или остаток аспарагиновой кислоты <400>72

His Lys Pro Gly Gly Gly Gln Val	Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp
1	5	10	15

Phe Lys Asp Arg Val Gln Ser Lys Ile Gly Xaa	Leu Asp Asn Ile
20	25	30

<210>73 <211>31

- 65 032675 <212> белок <213> синтетический <220>

<223> псевдофосфорилированный тау пептид <220>

<221> разное <222> (2)..(2)

<223>	Хаа это глютаминовая	кислота	или	остаток	аспарагиновой	кислоты
<220>
<221>	разное
<222>	(14)..(14)
<223>	Хаа это глютаминовая	кислота	или	остаток	аспарагиновой	кислоты
<220>
<221>	разное
<222>	(27)..(27)
<223>	Хаа это глютаминовая	кислота	или	остаток	аспарагиновой	кислоты
<400>	73
Ile Xaa His Val Pro Gly Gly	Gly Asn	Lys	Lys Ile	Glu Xaa His Lys
1	5		10		15

Leu Thr Phe Arg Glu Asn Ala Lys Ala Lys Xaa Asp His Gly Ala
20	25	30

<210>	74
<211>	31
<212>	белок
<213>	синтетический
<220>
<223>	псевдофосфорилированный тау пептид

<220>

<221> разное <222> (5)..(5)

<223>	Хаа это глютаминовая	кислота	или	остаток	аспарагиновой	кислоты
<220>
<221>	разное
<222>	(7)..(7)
<223>	Хаа это глютаминовая	кислота	или	остаток	аспарагиновой	кислоты
<220>
<221>	разное
<222>	(11)..(11)
<223>	Хаа это глютаминовая	кислота	или	остаток	аспарагиновой	кислоты
<220>
<221>	разное
<222>	(14)..(15)
<223>	Хаа это глютаминовая	кислота	или	остаток	аспарагиновой	кислоты
<220>
<221>	разное

- 66 032675 <222> (20)..(20) <223> Хаа это глютаминовая кислота или остаток аспарагиновой кислоты <220>

<221> разное <222> (23)..(24) <223> Хаа это глютаминовая кислота или остаток аспарагиновой кислоты <400> 74

Ala 1

Glu

Ile

Val

Xaa 5

Lys

Xaa

Pro

Val

Val 10

Xaa

Gly

Asp

Xaa

Xaa Pro 15

Arg

His

Leu

Xaa 20

Asn

Val

Xaa

Xaa

Thr 25

Gly

Ser

Ile

Asp

Met 30

Val

<210> <211> <212> <213>

75 31 белок синтетический

<220>

<223> псевдофосфорилированный тау пептид <220>

<221> разное <222> (2)..(3)

<223>	Хаа это глютаминовая	кислота	или	остаток	аспарагиновой	кислоты
<220>
<221>	разное
<222>	(12)..(12)
<223>	Хаа это глютаминовая	кислота	или	остаток	аспарагиновой	кислоты
<400>	75
Val Xaa	Xaa Thr Gly Ser Ile	Asp Met	Val	Asp Xaa	Pro Gln Leu Ala
1	5		10		15
Thr Leu	Ala Asp Glu Val Ser	Ala Ser	Leu	Ala Lys	Gln Gly Leu
	20	25			30

<210>	76
<211>	21
<212>	белок
<213>	синтетический
<220>
<223>	эпитоп T-хелперной клетки
<400>	76
Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp	Leu Arg Val	Pro Lys Val Ser
1	5	10	15

Ala Ser His Leu Glu

- 67 032675

<210> <211> <212> <213>

77 13 белок синтетический

<220> <223>	эпитоп T-хелперной клетки
<400>	77

Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr

1	5 10
<210> <211> <212> <213>	78 4 белок синтетический

<220> <223>	линкер
<400>	78

Gly Pro Ser Leu

<210> <211> <212> <213>

79 4 белок синтетический

<220> <223>	линкер
<400>	79

Gly Ser Gly Ser

<210> <211> <212> <213>

80 5 белок синтетический

<220> <223>	линкер
<400>	80

Gly Ser Gly Ser Gly

1	5
<210> <211> <212> <213>	81 30 белок синтетический

- 68 032675

<220> <223>	тау пептид
<400>	81

Asp

Gly

Thr

Gly

Ser

Asp

Asp

Lys

Lys

Ala

Lys

Gly

Ala

Asp

Gly Lys

1

5

10

15

Thr

Lys

Ile

Ala

Thr

Pro

Arg

Gly

Ala

Ala

Pro

Pro

Gly

Gln

20

25

30

<210> 82 <211> 30 <212> белок <213> синтетический <220>

<223> тау пептид <220>

<221> MOD_RES <222> (18)..(18) <223> фосфорилирование <220>

<221> MOD_RES <222> (26)..(26) <223> фосфорилирование <400> 82

Arg Glu Asn Ala Lys Ala Lys

5

Thr Asp His Gly Ala Glu

Ile Val Tyr

Lys Ser Pro Val Val Ser Gly Asp

Thr

Ser Pro Arg His

Leu

<210>	83
<211>	30
<212>	белок
<213>	синтетический
<220>
<223>	тау пептид

<220>

<221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> фосфорилирование <220>

<221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> фосфорилирование <221> MOD_RES <220>

- 69 032675 <222> (14)..(14) <223> фосфорилирование <220>

<221> MOD_RES <222> (21)..(21) <223> фосфорилирование <220>

<221> MOD_RES <222> (23)..(23) <223> фосфорилирование <400>83

Gly Asp Arg	Ser Gly Tyr Ser	Ser Pro Gly Ser	Pro Gly Thr Pro Gly
1	5	10	15

Ser Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr Arg
20	25	30

<210>84 <211>30 <212> белок <213> синтетический <220>

<223> тау пептид <220>

<221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> фосфорилирование <220>

<221> MOD_RES <222> (15)..(15) <223> фосфорилирование <400> 84

Arg Glu Pro Lys Lys Val Ala Val Val Arg Thr Pro Pro Lys

5 10

Ser Pro

Ser Ser Ala Lys

Ser Arg Leu Gln Thr Ala Pro Val 25

Pro Met

<210>	85
<211>	29
<212>	белок
<213>	синтетический
<220>
<223>	тау пептид
<400>	85
Ser Ser Gly Glu Pro Pro Lys Ser Gly Asp Arg Ser Gln Tyr Ser Ser

- 70 032675

1	5
Pro Gly Ser Pro Gly Thr	Pro	Gly	Ser
	20			25
<210>	86
<211>	30
<212>	белок
<213>	синтетический
<220>
<223>	тау пептид
<220>
<221>	MOD_RES
<222>	(18)..(18)
<223>	фосфорилирование
<220>
<221>	MOD_RES
<222>	(29)..(29)
<223>	фосфорилирование
<400>	86
Met Ala Glu Pro Arg Gln	Glu	Phe	Glu
1	5
Thr Tyr Gly Leu Gly Asp	Arg	Lys	Asp
	20			25
<210>	87
<211>	31
<212>	белок
<213>	синтетический
<220>
<223>	тау пептид
<400>	87
Thr Met His Gln Asp Gln	Glu	Gly	Asp
1	5
Ser Pro Leu Gln Thr Pro	Thr	Glu	Asp
	20			25
<210>	88
<211>	31
<212>	белок
<213>	синтетический
<220>
<223>	тау пептид
<400>	88

Ser Arg Thr

Met Glu Asp His Ala Gly

Gly Gly Tyr Thr

Asp Ala Gly Leu Lys Glu

Ser Glu Glu Pro Gly

- 71 032675

Gly Ser	Glu Thr	Ser Asp	Ala	Lys	Ser
1		5
Thr Ala	Pro Leu	Val Asp	Glu	Gly	Ala
	20				25
<210>	89
<211>	31
<212>	белок
<213>	синтетический
<220>
<223>	тау пептид
<400>	89
Ala Ala	Gln Pro	His Thr	Glu	Ile	Pro
1		5
Ala Gly	Ile Gly	Asp Thr	Pro	Ser	Leu
	20				25
<210>	90
<211>	31
<212>	белок
<213>	синтетический
<220>
<223>	тау пептид
<400>	90
Gly His	Val Thr	Gln Ala	Arg	Met	Val
1		5
Gly Ser	Asp Asp	Lys Lys	Ala	Lys	Gly

25 <210> 91 <211> 31 <212> белок <213> синтетический <220>

<223> тау пептид <220>

<221> MOD_RES <222> (26)..(26) <223> фосфорилирование

<400> 91
Lys Ile Ala 1	Thr Pro Arg Gly Ala Ala 5

Pro Thr Ala Glu Asp Val

Gly Lys Gln Ala Ala

Gly Thr Thr Ala Glu Glu

Asp Glu Ala Ala Gly

Lys Ser Lys Asp Gly Thr

Asp Gly Lys Thr Lys

Pro Gly Gln Lys Gly Gln

- 72 032675

Ala Asn Ala Thr Arg Ile Pro Ala

Lys

Thr Pro

Pro Ala Pro Lys <210> 92 <211> 31 <212> белок <213> синтетический <220>

<223> тау пептид <220>

<221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> фосфорилирование <220>

<221> MOD_RES <222> (5)..(6) <223> фосфорилирование <220>

<221> MOD_RES <222> (18)..(20) <223> фосфорилирование <220>

<221> MOD_RES <222> (23)..(23) <223> фосфорилирование <220>

<221> MOD_RES <222> (26)..(26) <223> фосфорилирование <220>

<221> MOD_RES <222> (29)..(29) <223> фосфорилирование <400> 92

Lys Thr Pro Pro Ser Ser Gly Glu Pro

5

Pro Lys

Ser Gly Asp

Arg Ser

Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser

Pro Gly Thr

Pro Gly Ser Arg Ser

<210> <211> <212> <213>

93 31 белок синтетический

<220>

<223> тау пептид

- 73 032675 <220>

<221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> фосфорилирование <220>

<221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> фосфорилирование <220>

<221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> фосфорилирование <220>

<221> MOD_RES <222> (22)..(22) <223> фосфорилирование <220>

<221> MOD_RES <222> (26)..(26) <223> фосфорилирование <220>

<221> MOD_RES <222> (28)..(29) <223> фосфорилирование <400> 93

Ser Arg	Thr Pro Ser Leu	Pro	Thr	Pro	Pro	Thr	Arg	Glu	Pro	Lys
1	5				10					15
Val Ala	Val Val Arg Thr	Pro	Pro	Lys	Ser	Pro	Ser	Ser	Ala	Lys
	20			25					30
<210>	94
<211>	31
<212>	белок
<213>	синтетический
<220>
<223>	тау пептид
<220>
<221>	MOD_RES
<222>	(23)..(23)
<223> фосфорилирование
<400>	94
Lys Ser	Arg Leu Gln Thr	Ala	Pro	Val	Pro	Met	Pro	Asp	Leu	Lys
1	5				10					15
Val Lys	Ser Lys Ile Gly	Ser	Thr	Glu	Asn	Leu	Lys	His	Gln	Pro
	20			25					30

Lys

Asn

- 74 032675

<210>	95
<211>	31
<212>	белок
<213>	синтетический
<220>
<223>	тау пептид

<220>
<221>	MOD_RES
<222>	(24)..(24)
<223>	фосфорилирование
<400>	95

Pro Gly Gly Gly

Lys Val Gln Ile

Ile Asn Lys Lys

Leu Asp Leu Ser

Asn Val Gln Ser

Lys Cys Gly Ser

Lys Asp Asn Ile

Lys His Val <210> 96 <211> 31 <212> белок <213> синтетический <220>

<223> тау пептид <220>

<221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> фосфорилирование <220>

<221> MOD_RES <222> (25)..(25) <223> фосфорилирование <400> 96

Val Pro Gly Gly Gly Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys

5 10

Pro Val Asp Leu

Ser Lys Val

Thr Ser Lys

Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile

His

His

<210> <211> <212> <213>

97 31 белок синтетический

<220>

<223> тау пептид

- 75 032675 <220>

<221> MOD_RES <222> (27)..(27) <223> фосфорилирование <400> 97

His Lys 1

Pro Gly

Gly Gly 5

Gln Val

Glu

Val 10

Lys

Ser

Glu

Lys

Leu 15

Asp

Phe Lys

Asp

Arg

Val

Gln

Ser

Lys

Ile

Gly

Ser

Leu

Asp

Asn

Ile

20

25

30

<210>

98

<211>

31

<212>

белок

<213>

синтетический

<220>

<223>

тау

пептид

<400>

98

Ile Thr

His

Val

Pro

Gly

Gly

Gly

Asn

Lys

Lys

Ile

Glu

Thr

His

Lys

1

5

10

15

Leu Thr

Phe

Arg

Glu

Asn

Ala

Lys

Ala

Lys

Thr

Asp

His

Gly

Ala

20

25

30

<210> 99 <211> 31 <212> белок <213> синтетический <220>

<223> тау пептид <220>

<221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> фосфорилирование <220>

<221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> фосфорилирование <220>

<221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> фосфорилирование <220>

<221> MOD_RES <222> (14)..(15) <223> фосфорилирование

- 76 032675 <220>

<221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> фосфорилирование <220>

<221> MOD_RES <222> (23)..(24) <223> фосфорилирование <400> 99

Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser Pro Val Val Ser Gly Asp Thr Ser Pro
1	5	10	15

Arg His Leu Ser Asn Val Ser Ser Thr Gly Ser Ile Asp Met Val
20	25	30

<210> 100 <211> 31 <212> белок <213> синтетический <220>

<223> тау пептид <220>

<221> MOD_RES <222> (2)..(3) <223> фосфорилирование <220>

<221> MOD_RES <222> (12)..(12) <223> фосфорилирование

<400>

100

Val

Ser

Ser

Thr

Gly

Ser

Ile

Asp

Met

Val

Asp

Ser

Pro

Gln

Leu Ala

1

5

10

15

Thr

Leu

Ala

Asp

Glu

Val

Ser

Ala

Ser

Leu

Ala

Lys

Gln

Gly

Leu

20

25

30

<210>	101
<211>	15
<212>	белок
<213>	синтетический
<220>
<223>	тау пептид
<400>	101
His Leu	Ser Asn Val Ser	Ser Thr Gly Ser	Ile Asp Met Val Asp
1	5	10	15

- 77 032675 <210> 102 <211> 13 <212> белок <213> синтетический <220>

<223> тау пептид <400>102

Arg Glu Asn Ala Lys Ala Lys Thr Asp His Gly Ala Glu

510 <210>103 <211> 186 <212> белок <213> синтетический <220>

<223> тау пептид <400> 103

Glu 1

Ser

Pro

Leu

Gln Thr 5

Pro

Thr

Glu

Asp Gly Ser 10

Glu

Glu

Pro 15

Gly

Ser

Glu

Thr

Ser

Asp

Ala

Lys

Ser

Thr

Pro

Thr

Ala

Glu

Asp

Val

Thr

20

25

30

Ala

Pro

Leu

Val

Asp

Glu

Gly

Ala

Pro

Gly

Lys

Gln

Ala

Ala

Ala

Gln

35

40

45

Pro

His

Thr

Glu

Ile

Pro

Glu

Gly

Thr

Thr

Ala

Glu

Glu

Ala

Gly

Ile

50

55

60

Gly

Asp

Thr

Pro

Ser

Leu

Glu

Asp

Glu

Ala

Ala

Gly

His

Val

Thr

Gln

65

70

75

80

Ala

Arg

Met

Val

Ser

Lys

Ser

Lys

Asp

Gly

Thr

Gly

Ser

Asp

Asp

Lys

85

90

95

Lys

Ala

Lys

Gly

Ala

Asp

Gly

Lys

Thr

Lys

Ile

Ala

Thr

Pro

Arg

Gly

100

105

110

Ala

Ala

Pro

Pro

Gly

Gln

Lys

Gly

Gln

Ala

Asn

Ala

Thr

Arg

Ile

Pro

115

120

125

Ala

Lys

Thr

Pro

Pro

Ala

Pro

Lys

Thr

Pro

Pro

Ser

Ser

Gly

Glu

Pro

130

135

140

Pro

Lys

Ser

Gly

Asp

Arg

Ser

Gly

Tyr

Ser

Ser

Pro

Gly

Ser

Pro

Gly

145

150

155

160

- 78 032675

Thr Pro Gly

Ser

Arg Glu Pro

Lys

180

Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr

165 170 175

Lys Val Ala Val Val Arg

Claims (36)

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. (1) фосфорилированного или псевдофосфорилированного иммуногенного тау-пептида, имеющего аминокислотную последовательность, которая состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 2-6, 8-75; и (2) иммуногенного тау-пептида, имеющего аминокислотную последовательность, которая состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 101-103.

   (1) фосфорилированного или псевдофосфорилированного иммуногенного тау-пептида, имеющего аминокислотную последовательность, которая состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 2-6 и 8-75; или (2) иммуногенного тау-пептида, имеющего аминокислотную последовательность, которая состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 101-103.

   (1) фосфорилированного или псевдофосфорилированного иммуногенного тау-пептида, имеющего аминокислотную последовательность, которая состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 2-6 и 8-75;

   (1) фосфорилированного или псевдофосфорилированного иммуногенного тау-пептида, имеющего аминокислотную последовательность, которая состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 2-6 и 8-75;

   1. Способ лечения или предотвращения болезни Альцгеймера или другой таупатии у пациента, включающий введение пациенту одного или более иммуногенных фосфорилированных или псевдофосфорилированных тау-пептидов, имеющих аминокислотную последовательность, которая состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 2-6 и 8-75.
2. (2) иммуногенного тау-пептида, имеющего аминокислотную последовательность, которая состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 101-103.

   (2) иммуногенного тау-пептида, имеющего аминокислотную последовательность, которая состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 101-103.

   2. Способ лечения или предотвращения болезни Альцгеймера или другой таупатии у пациента, включающий введение пациенту одного или более антител, распознающих эпитоп:
3. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный иммуногенный тау-пептид связан с иммуногенным носителем.
4. 4. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный способ дополнительно включает введение адъюванта до, после или одновременно с указанным введением одного или более иммуногенных таупептидов.
5. 5. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный способ дополнительно включает введение одного или более дополнительных иммуногенных тау-пептидов, где указанный один или более дополнительных иммуногенных тау-пептидов вводят до, после или одновременно с указанным введением указанного одного или более иммуногенных фосфорилированных или псевдофосфорилированных таупептидов, имеющих аминокислотную последовательность, которая состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 2-6 и 8-75.
6. 6. Способ по п.5, отличающийся тем, что один или более дополнительных иммуногенных таупептидов включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 81-100.
7. 7. Способ по любому из пп.1, 2, отличающийся тем, что таупатию выбирают из группы, включающей лобно-височную деменцию, паркинсонизм, связанный с 17 хромосомой (FTDP-17), прогрессивный надъядерный паралич, кортикобазальную дегенерацию, болезнь Пика, прогрессирующий подкорковый глиоз, деменцию сплетения, диффузные нейрофибриллярные сплетения с кальцификацией, аргирофильную зернистую деменцию, комплекс амиотрофического латерального склероза и паркинсонизмдеменции, деменцию боксеров, синдром Дауна, болезнь Герстманна-Штреусслера-Шейнкера, болезнь Галлерворден-Шпатца, миозит с включенными тельцами, болезнь Крейцфельда-Якоба, множестенную системную атрофию, болезнь Ниманна-Пика типа С, церебральную амилоидную ангиопатию белка приона, подострый склерозирующий панэнцефалит, миотоническую дистрофию, не-гуанаминное заболевание двигательных нейронов с нейрофибриллярными сплетениями, хроническую травматическую энцефалопатию и постэнцефалитный паркинсонизм.
8. 8. Способ ускорения выведения тау-агрегатов из мозга пациента, включающий введение пациенту одного или более иммуногенных фосфорилированных или псевдофосфорилированных тау-пептидов, имеющих аминокислотную последовательность, которая состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 2-6 и 8-75.
9. 9. Способ ускорения выведения тау-агрегатов из мозга пациента, включающий введение пациенту одного или более антител, распознающих эпитоп:
10. 10. Способ по п.8, отличающийся тем, что указанный иммуногенный тау-пептид связан с иммуно

    - 79 032675 генным носителем.
11. 11. Способ по п.8, отличающийся тем, что указанный способ дополнительно включает введение адъюванта до, после или одновременно с указанным введением одного или более иммуногенных таупептидов.
12. 12. Способ по п.8, отличающийся тем, что указанный способ дополнительно включает введение одного или более дополнительных иммуногенных тау-пептидов, где указанный один или более дополнительных иммуногенных тау-пептидов вводят до, после или одновременно с указанным введением указанного одного или более иммуногенных фосфорилированных или псевдофосфорилированных таупептидов, имеющих аминокислотную последовательность, которая состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 2-6 и 8-75.
13. 13. Способ по п.12, отличающийся тем, что один или более дополнительных иммуногенных таупептидов включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 81-100.
14. 14. Способ по любому из пп.8, 9, отличающийся тем, что агрегаты являются нейрофибриллярными сплетениями или их патологическими тау-предшественниками.
15. 15. Способ замедления прогрессирования связанного с тау-патологией поведенческого фенотипа у пациента, включающий введение пациенту одного или более иммуногенных фосфорилированных или псевдофосфорилированных тау-пептидов, имеющих аминокислотную последовательность, которая состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 2-6 и 8-75.
16. 16. Способ замедления прогрессирования связанного с тау-патологией поведенческого фенотипа у пациента, включающий введение пациенту одного или более антител, распознающих эпитоп:
17. 17. Способ по п.15, отличающийся тем, что указанный иммуногенный тау-пептид связан с иммуногенным носителем.
18. 18. Способ по п.15, отличающийся тем, что указанный способ дополнительно включает введение адъюванта до, после или одновременно с указанным введением одного или более иммуногенных таупептидов.
19. 19. Способ по п.15, отличающийся тем, что указанный способ дополнительно включает введение одного или более дополнительных иммуногенных тау-пептидов, где указанный один или более дополнительных иммуногенных тау-пептидов вводят до, после или одновременно с указанным введением указанного одного или более иммуногенных фосфорилированных или псевдофосфорилированных таупептидов, имеющих аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 2-6 и 8-75.
20. 20. Способ по п.19, отличающийся тем, что один или более дополнительных иммуногенных таупептидов включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 81-100.
21. 21. Изолированный тау-пептид, имеющий аминокислотную последовательность, которая состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из:
22. 22. Изолированный тау-пептид по п.21, отличающийся тем, что дополнительно включает иммуногенный носитель, связанный с изолированным пептидом.
23. 23. Фармацевтическая композиция для лечения болезни Альцгеймера или другой таупатии у пациента, ускорения выведения тау-агрегатов из мозга пациента или замедления прогрессирования связанного с тау-патологией поведенческого фенотипа у пациента, включающая один или более изолированных пептидов по п.21 или 22 в эффективном количестве и фармацевтический носитель.
24. 24. Фармацевтическая композиция по п.23, отличающаяся тем, что дополнительно включает фармацевтически приемлемый адъювант.
25. 25. Фармацевтическая композиция по п.23 или 24, отличающаяся тем, что дополнительно включает один или более дополнительных иммуногенных тау-пептидов, содержащих аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 81-100.
26. 26. Антитело или его связывающая часть, имеющее антигенную специфичность по отношению к

    - 80 032675 изолированному тау-пептиду по п.21 или 22.
27. 27. Антитело или его связывающая часть по п.26, отличающееся тем, что указанный изолированный пептид является фосфорилированным.
28. 28. Антитело или его связывающая часть по п.26, отличающееся тем, что антитело является моноклональным антителом или поликлональным антителом.
29. 29. Антитело или его связывающая часть по п.28, где указанное антитело или его связывающая часть получены рекомбинантным способом.
30. 30. Антитело или его связывающая часть по п.28, где указанное антитело или его связывающая часть соединены детектируемой меткой.
31. 31. Иммунотерапевтическая комбинация для лечения болезни Альцгеймера или другой таупатии у пациента, ускорения выведения тау-агрегатов из мозга пациента или замедления прогрессирования связанного с тау-патологией поведенческого фенотипа у пациента, включающая в эффективном количестве антитело по п.26 и одно или более антител или их связывающих частей, распознающих один или более различных амилоидогенных протеинов или пептидов.
32. 32. Иммунотерапевтическая комбинация по п.31, отличающаяся тем, что один или более амилоидогенных протеинов или пептидов выбран из группы, состоящей из предшественника бета-протеина, приона и белков приона, а-синуклеина, амилоид-β, островкового амилоидного полипептида, аполипопротеина AI, аполипопротеина AII, лизозима, цистатина С, гельсолина, атриального натрийуретического пептида, кальцитонина, кератоэпителина, лактоферрина, легкой цепи иммуноглобулина, транстиретина, А амилоидоза, β2-микроглобулина, тяжелой цепи иммуноглобулина, фиброгенной альфа-цепи, пролактина, кератина и медина.
33. 33. Способ диагностирования болезни Альцгеймера или другой таупатии у пациента, включающий введение диагностического реагента на основе антитела пациенту, где указанный диагностический реагент включает детектируемое меченное антитело по п.30 или его детектируемый меченный активный связывающих фрагмент, и определение связывания указанного введенного антитела или его активного связывающего фрагмента с тау-пептидом указанного пациента;

    где выявление указанного связывания указывает на присутствие патологического тау-пептида у указанного пациента и является диагностическим показателем указанной болезни Альцгеймера или другой таупатии у указанного пациента.
34. 34. Способ по п.31, где указанная метка выявляется с использованием фотодетектора in vivo.
35. 35. Способ диагностирования болезни Альцгеймера или другой таупатии у пациента, включающий контактирование биологического образца пациента с диагностическим реагентом в условиях, эффективных для связывания диагностического реагента с патологическим конформером тау-протеина в образце в случае присутствия в образце, где указанный диагностический реагент содержит детектируемое меченное антитело по п.30 или его меченный активный связывающих фрагмент; и определение связывания указанного диагностического реагента с патологическим конформером тау-протеина в образце;

    где выявление такого связывания указывает на присутствие патологического тау-протеина у указанного пациента и является диагностическим относительно болезни Альцгеймера или другой таупатии у указанного пациента.
36. 36. Диагностический набор для диагностирования болезни Альцгеймера или другой таупатии у пациента или присутствия тау-агрегатов в мозге пациента или тау-патологии поведенческого фенотипа у пациента, включающий детектируемое меченное антитело или его детектируемую меченную связывающую часть, имеющее антигенную специфичность по отношению к изолированному тау-пептиду по п.21 или 22, и реагент, который содержит пептид, имеющий эпитоп, который связывается с указанным антителом или его связывающейся частью.