CN102596221B

CN102596221B - 病理tau蛋白的免疫靶向

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Publication number: CN102596221B
Application number: CN201080036213.XA
Authority: CN
Inventors: E·M·西瓜德森
Original assignee: New York University NYU
Current assignee: New York University NYU
Priority date: 2009-06-10
Filing date: 2010-06-10
Publication date: 2019-06-04
Anticipated expiration: 2030-06-10
Also published as: JP2022180615A; EP4218794A2; JP7229980B2; CN106390107B; WO2010144711A2; JP2016094426A; CN102596221A; US20140302046A1; CA2765099A1; EP2440234A4; JP5917394B2; US8748386B2; JP6795649B2; CN106390107A; JP2021042219A; US20170183400A1; US11787854B2; US20210061894A1; EA201171397A1; EP2440234A2

Abstract

本发明涉及在有效地治疗、预防或诊断阿尔茨海默病或其他tau蛋白病的条件下通过施用识别免疫原性tau表位的免疫原性tau肽或抗体，来在受试者中治疗、预防和诊断阿尔茨海默病或其他tau蛋白病的方法和组合物。本发明还公开促进从受试者脑清除聚集体和在受试者中减缓tau病理相关的行为表型进展的方法。

Description

病理TAU蛋白的免疫靶向

本申请要求2009年6月10日提交的美国临时专利申请序列No61/185,895的权益，其由此以引用的方式全部并入本文。

本发明的主题在来自美国政府的支持在国家卫生研究院下进行，授权No.AG032611。美国政府享有某些权利。

技术领域

本发明涉及用于在受试者中预防、治疗和诊断阿尔茨海默病和相关的tau蛋白病(tauopathy)、以及抑制神经原纤维缠结和/或它们的病理tau前体积聚的免疫学方法和组合物。

背景技术

新兴的阿尔茨海默病(AD)治疗方法是清除β-淀粉样蛋白(Aβ)的免疫治疗。在AD和额颞叶失智症中，另一个重要标志是神经原纤维缠结和/或它们的病理tau蛋白构象异构体，它们的存在于痴呆程度非常有关系(Terry R.，″Neuropathological Changes inAlzheimer Disease，″Prog Brain Res.101：383-390(1994)；Goedert M.，″Tau Proteinand Neurodegeneration，″Semin Cell Dev Biol.15：45-49(2004))。tau病理免疫治疗的目的是，抗-tau抗体能清除可影响神经元活性的tau蛋白聚集。其他免疫系统的成分可在所述清除过程中发挥作用。tau是可溶性蛋白，其可以促进微管蛋白组装、微管稳定性和细胞骨架完整性。虽然根据唐氏综合征研究，tau病理有可能是在Aβ聚集之后发生，但对AD脑和小鼠模型的分析表明这些病状是具有协同性的(Sigurdsson et al.，″Local and DistantHistopathological Effects of Unilateral Amyloid-beta 25-35 Injections intothe Amygdala of Young F344 Rats，″Neurobiol Aging 17：893-901(1996)；Sigurdssonet al.，″Bilateral Injections of Amyloid-β25-35 into the Amygdala of YoungFischer Rats：Behavioral，Neurochemical，and Time Dependent HistopathologicalEffects，″Neurobiol Aging 18：591-608(1997)；Lewis et al.，″EnhancedNeurofibrillary Degeneration in Transgenic Mice Expressing Mutant Tau andAPP，″Science 293(5534)：1487-91(2001)；Gotz et al.，″Formation ofNeurofibrillary Tangles in P301L Tau Transgenic Mice Induced by A-beta 42Fibrils，″Science 293：1491-1495(2001)；Delacourte et al.，″Nonoverlapping butSynergetic Tau and APP Pathologies in Sporadic Alzheimer′s Disease，″Neurology.59：398-407(2002)；Oddo et al.，″Abeta Immunotherapy Leads toClearance of Early，But Not Late，Hyperphosphorylated Tau Aggregates via theProteasome，″Neuron 43：321-332(2004)；Ribe et al.，″Accelerated AmyloidDeposition，Neurofibrillary Degeneration and Neuronal Loss in Double MutantAPP/Tau Transgenic Mice，″Neurobiol Dis.(2005))。因此，以两种病理为目标可显著提升治疗效果。迄今，没有在AD中观察到tau突变，然而在中额颞叶失智症中，在染色体17(FTDP-17)上的突变是该疾病的诱发因素，其进一步支持基于tau蛋白的治疗方案(Poorkajet al.，″Tau is a Candidate Gene for Chromosome 17 Frontotemporal Dementia，″Ann Neurol.43：815-825(1998)；Spillantini et al.，″Frontotemporal Dementia andParkinsonism Linked to Chromosome 17：A New Group of Tauopathies，″BrainPathol.8：387-402(1998))。表达突变的转基因小鼠已经发展出很多该疾病的方面，并且该小鼠对于研究tau病理相关的神经变性的发病机理和评估潜在的疗法来说，是有价值的工具。这些模型中的一种，P301L小鼠模型(Lewis et al.，″Neurofibrillary Tangles，Amyotrophy and Progressive Motor Disturbance in Mice Expressing Mutant(P301L)Tau Protein，″Nat Genet.25：402-405(2000))，概括了很多额颞叶失智症的特征，虽然tau蛋白聚集的CNS分布主要地导致了感觉运动异常，其使认知评价复杂化。纯合系小鼠模型具有中枢神经病和有关的功能损伤的及早发作，这种特点使它们理想地用于最初评估免疫治疗、病理tau构象异构体靶向的可行性。

其他tau-相关的治疗方案包括：(1)抑制激酶或激活磷酸酶(影响tau磷酸化的状态)的药物(Iqbal et al.，″Inhibition of Neurofibrillary Degeneration：APromising Approach to Alzheimer′s Disease and Other Tauopathies，″Curr DrugTargets5：495-502(2004)；Noble et al.，Inhibition of Glycogen Synthase Kinase-3by Lithium Correlates with Reduced Tauopathy and Degeneration In Vivo，″ProcNatl Acad Sci U S A 102：6990-6995(2005))；(2)微管稳定药物(Michaelis et al.，{beta}-Amyloid-Induced Neurodegeneration and Protection by StructurallyDiverse Microtubule-Stabilizing Agents，″J Pharmacol Exp Ther.312：659-668(2005)；Zhang et al.，″Microtubule-Binding Drugs Offset Tau Sequestration byStabilizing Microtubules and Reversing Fast Axonal Transport Deficits in aTauopathy Model，″Proc Natl Acad Sci U S A 102：227-231(2005))；(3)干扰tau蛋白聚集体的化合物(Pickhardt et al.，″Anthraquinones Inhibit Tau Aggregation andDissolve Alzheimer′s Paired Helical Filaments In Vitro and in Cells，″J BiolChem.280：3628-3635(2005))；和(4)促进热休克蛋白调节tau蛋白清除的药物(Dickey etal.，″Development of a High Throughput Drug Screening Assay for the Detectionof Changes in Tau Levels--Proof of Concept with HSP90 Inhibitors，″CurrAlzheimer Res.2：231-238(2005))。虽然全部这些方案肯定值得继续做，但靶向特异性和毒性是一个关注事项，其强调了同时研发其他tau-靶向治疗的重要性，例如免疫治疗。

本发明涉及克服在本领域这些的和其他的缺点。

发明概述

本发明的第一个方面涉及在受试者中预防或治疗阿尔茨海默病或其他tau蛋白病的方法。该方法包括有效治疗或预防受试者的阿尔茨海默病或其他tau蛋白病的条件下，向受试者施用任一种或多种免疫原性tau肽，其含有选自由SEQ ID NO：2-75组成的组的氨基酸序列，或一种或多种抗体，其识别免疫原性tau表位(包含选自由SEQ ID NO：2-75和101-103组成的组的氨基酸序列)。

另外一个本发明的方面涉及促进从受试者脑中清除tau蛋白聚集的方法。该方法包括在有效于促进从受试者脑中清除tau蛋白聚集的条件下，向受试者施用任一种或多种免疫原性tau肽，其含有选自由SEQ ID NO：2-75组成的组的氨基酸序列，或一种或多种抗体，其识别免疫原性tau表位(包含选自由SEQ ID NO：2-75和101-103组成的组的氨基酸序列)。

本发明的第3个方面涉及减缓tau病理相关的行为表型进展的方法。该方法包括在有效减缓受试者的tau病理相关的行为表型的条件下，向受试者施用任一种或多种免疫原性tau肽，其含有选自由SEQ ID NO：2-75组成的组的氨基酸序列，或一种或多种抗体，其识别免疫原性tau表位(包含选自由SEQ ID NO：2-75和101-103组成的组的氨基酸序列)。

本发明的第4个方面涉及分离的tau肽，其包含选自由SEQ ID NO：2-75和101-103组成的组的氨基酸序列。免疫原性tau肽在受试者中，是有效预防和治疗阿尔茨海默病或其他tau蛋白病，促进从受试者脑清除聚集，并且在受试者中减缓tau病理相关的行为表型的进展。

对于预防和治疗阿尔茨海默病和其他tau-相关的神经变性病，神经原纤维缠结和它们的病理TAU蛋白构象异构体是非常重要的目标。然而，对于靶向和清除神经原纤维缠结和/或病理tau构象异构体，缺乏一种高靶向特异性和少到没有的毒性的策略。如本文所述，设计免疫原性tau肽和抗体以克服这些缺点。因为本发明的免疫原性tau肽，模拟病理tau的狭义磷酸基-表位，和识别这些相同的狭义磷酸基-表位的抗体，以获得提高的专一性和安全性。本方案也应用于针对游离的病理tau片段的N-或C-末端产生的如本文所述的抗体。相应地，使用如本文所述的免疫治疗，能对病理TAU蛋白产生强烈免疫应答，同时对正常tau蛋白产生不利免疫应答的风险极小。

附图简述

图1A-1B描述在JNPL3 P301L缠结小鼠模型中，对本发明的免疫原性tau肽的免疫应答。2-3个月龄的小鼠以2周为间隔接受最初2次免疫，其后每月接受一次。为评估抗体应答，在首次免疫之前给小鼠抽血，其后定期地在疫苗施用后1周给小鼠抽血，并且在8-9个月龄时处死小鼠以获得组织。如在图1A和1B中所示，在第6次免疫(T3)1周后，以及在被处死的8-9个月龄时(Tf＝T最终)，测定IgG和IgM。图1A显示：用通过GPSL接头连接于破伤风毒素T辅助细胞表位(TT947-967)的Tau210-216[P-Thr₂₁₂-Ser₂₁₄](SEQ ID NO：2)免疫JNPL3P301L小鼠，在该小鼠中产生强烈IgG和IgM免疫应答。图1B显：针对破伤风毒素表位产生了强烈的抗体应答，这由以下测试所示，IgG和IgM结合于通过GPSL连接于TT947-967的无关的tau蛋白表位Tau260-264[P-Ser₂₆₂]。ELISA板涂有0.5μg每孔的肽和稀释至1∶200的血浆。

图2A-2C显示：用通过GPSL接头连接于破伤风毒素T辅助细胞表位(TT947-967)的Tau260-264[P-Ser₂₆₂](SEQ ID NO：3)(也是指T299肽)免疫JNPL3 P301L缠结小鼠，该小鼠对免疫原产生了强烈IgG应答。图2A显示：用Tau260-264[P-Ser₂₆₂]肽免疫之后，小鼠中的IgG抗体应答。如上所述，小鼠以2周间隔接受最初的两次免疫，其后从2-3月龄至8-9月龄每月接受免疫。图2B显示：对破伤风毒素表位产生了大量抗体应答，这由以下测试所示，IgG结合于不相关的通过GPSL连接于TT947-967的tau蛋白表位Tau210-216[P-Thr₂₁₂-Ser₂₁₄]。图2c显示：对tau蛋白表位产生了大量抗体应答，这由以下测试所示，IgG结合于更大的含有Tau260-264[P-Ser₂₆₂]区域的tau蛋白表位Tau240-270[P-Ser₂₆₂]。ELISA板涂有0.5μg每孔的肽和稀释至1∶200的血浆。TO-T最终，分别在接种疫苗之前(T0)，第三次(T1)、第六次(T2)、第七次(T3)免疫后一周，和在获取组织(Tf)时，对小鼠抽血。

图3显示：在用连接于破伤风毒素T辅助细胞表位(TT947-967]的Tau229-237[P-Thr₂₃₁-Ser₂₃₅](SEQ ID NO：4)免疫的JNPL3 P301L缠结模型小鼠中，产生了强烈抗体(IgG)应答。从2-3月龄开始免疫小鼠，2周间隔，其后每月免疫，并且在第三次免疫后一周(T1)抽血。ELISA板涂有0.5μg每孔的肽和稀释至1∶200的血浆。

图4显示：在用明矾佐剂中的磷酸化的免疫原Tau379-408[Asp_396，404](SEQ ID NO：57)免疫的JNPL3 P301L缠结模型小鼠中，产生了强烈抗体(IgG)应答。重要地，这些抗体识别磷酰基-表位Tau379-408[P-Ser_396，404]，并达到相似的程度。从2-3月龄开始对小鼠免疫，最初两次以2周为间隔，其后每月免疫。在获取8-9月龄小鼠的组织时，对小鼠抽血(Tf)。ELISA板涂有0.5μg每孔的肽和稀释至1∶200的血浆

图5A-5B显示：在Tau免疫治疗之后，在缠结小鼠模型的脑干(图5)和齿状回(图5B)中观察到病理tau减少。用T299(Tau260-264[P-Ser₂₆₂](SEQ ID NO：3))免疫纯合JNPL3 tauP301L小鼠，该T299通过GPSL接头序列连接于破伤风毒素T辅助细胞表位。通过PHF1抗体免疫染色来评估在脑干和齿状回中的病理tau。PHF1是识别tau的单克隆抗体，该tau在C-末端的丝氨酸氨基酸404和396上是磷酸化的(Greenberg et al.，“Hydrofluoric Acid-Treated Tau PHF Proteins Display the Same Biochemical Properties as NormalTau，”J Biol Chem 267：564-569(1992)，其由此以引用的方式全部并入本文)。相比只施用佐剂的对照，在用T299肽积极免疫动物的脑干和齿状回中，观察到病理tau染色蛋白的显著减少。

图6显示：用磷酸化Tau379-408[P-Ser_396，404](SEQ ID NO：82)免疫原性肽免疫对htau/PS1进行免疫，使在梨状皮质中的tau蛋白聚集数量减少56％。在免疫组和对照组之间观察到显著的差异(单因素ANOVA，p＜0.01)。析因分析也显示免疫的htau/PS1小鼠区别于它们的htau/PS1对照(p＜0.01)。 ^**p＜0.01。

图7A-7B显示：Tau免疫治疗在缠结小鼠模型中预防功能损伤。使用通过GPSL接头序列连接于破伤风毒素辅助T细胞表位(TT947-967)的磷酸化免疫原性Tau 299肽(Tau260-264[P-Ser₂₆₂](SEQ ID NO：3))，免疫纯合JNPL3 P301L小鼠。对照动物只施用佐剂。利用在8月龄时的横梁测试评估预防功能损伤的Tau260-264[P-Ser₂₆₂]肽疫苗施用效果，结果显示相对于对照动物，免疫的动物录得更少量的失足(图7A)。另外，通过在5-6月龄和在8-9月龄时的转杆测试，评估预防功能损伤的Tau260-264[P-Ser₂₆₂]肽疫苗施用效果(图7B)。

图8A-8B显示：用磷酸化Tau379-408[P-Ser_396，404](SEQ ID NO：82)对htau/PS1小鼠的免疫提高在八臂迷宫(图8A)和目标识别测试中的表现(图8B)。如图8A所示，在八臂迷宫测试中，在免疫组合对照组之间观察到显著差异(两因素ANOVA重复测量，p＜0.0001)。Neuman-Keuls析因检验显示：在所有天内，免疫的htau/PS1小鼠比对照htau/PS1小鼠表现更好(即，更少犯错)(p＜0.01-0.001)。在目标识别测试中，在各组之间观察到显著差异(单因素ANOVA，p＝0.005)(图8B)。Neuman-Keuls析因检验显示：免疫的htau/PS1小鼠比相同的对照小鼠具有更好的短期记忆(p＜0.01)。这充分确定相对于旧的目标，认知正常的小鼠用大约它们的70％时间在新目标上。 ^**p＜0.01。

图9A-9C显示：用磷酸化Tau379-408[P-Ser_396，404](SEQ ID NO：82)对htau/PS1小鼠的免疫提高在封闭域对称迷宫测试中的表现。在每个迷宫测试中，在免疫组合对照组之间观察到关于犯错次数的显著差异9A-9C(单因素ANOVA，迷宫A：p＜0.001，迷宫B：p＜0.0001，迷宫C：p＜0.01)。析因分析显示：处理过的htau/PS1组比它们相同的对照小鼠表现更好(htau/PS1对照)(迷宫A：p＜0.01，迷宫B，C：p＜0.001)。析因分析也发现在一些其他组之间的随迷宫而定的显著差异，但这些差异缺乏关联性，因而不在这里详述。错误次数显示，这三个迷宫的复杂性依次上升(注意Y轴刻度不同)。 ^**p＜0.01，^***p＜0.001。

图10A-10F中图表描述：在用磷酸化Tau379-408[P-Ser_396，404](SEQ ID NO：82)免疫的htau/PS1小鼠和相应的对照中，通过western印迹分析检测到的可溶性和不溶性tau(总tau和病理Tau)的水平。相对于总tau，Tau免疫治疗使病理Tau降低35-43％(图10C和10D)。如用B19抗体测试所示，免疫治疗不影响总tau水平，这对本方法安全性重要(图10A和10B)。相对于htau/PS1对照，PHF1可溶性tau显著降低(p＜0.001)而且可溶性tau比例(PHF1/总tau)降低35％(p＜0.05)(图10E)。在PHF1不溶性tau中也观察到强烈的下降趋势(p＝0.06)，并且不溶性tau比例(PHF1/总tau)降低43％(p＝0.08)(图10F)。^*p＜0.05，^***p＜0.001

图11A-11C显示：靶向磷酸化tau 396和404表位的被动免疫治疗预防功能衰退，以及在P301L缠结小鼠中降低蛋白病。图11A的图表显示：由IgG注射的对照和PHF1免疫的P301L小鼠在横梁测试中发生的失足次数的显著差异，当穿越横梁时对照动物具有更多失足(联合试验，p＝0.03)。图11B的图表显示：在免疫的和对照P301L小鼠的齿状回中的tau免疫染色的比例。相比对照，PHF1免疫的P301L小鼠在齿状回中PHF1染色的tau病理少58％(p＝0.02)。如图11C所示，在血浆中的PHF-1抗体(μg/μL)数量在2周之内下降4倍。在对照中没有观察到可检测的抗体，而免疫的动物中的该水平随时间推移而下降。这里有免疫的小鼠的平均值。T0：首次免疫之前、T1：第12次注射后24h、T2：第13次和最后一次注射后7天、T3：最后注射后14天。ELISA板涂有Tau379-408[P-Ser_396，404]。

图12A-12B的图表显示：PHF1抗体和tau病理的血浆水平的逆相关。在脑干中观察到显著相关(图12A；p＜0.01)，以及在皮层运动区中观察到相关性的强烈趋势(图12B；p＝0.06)。

图13A-13B的图表描述：针对免疫原性tau肽产生单克隆抗体，该免疫原性tau肽包含氨基酸386-408(SEQ ID NO：13)，并含有在第396和404的氨基酸上磷酸化的丝氨酸的表位。如图13A所示，针对免疫原Tau-386-408[P-Ser_396，404]tau位点(红)，产生非常强的效价，这由血浆系列稀释检测而知。血浆抗体优选地识别磷酰基-Ser404表位(蓝)和非-磷酰基表位(白)。磷酰基-Ser396表位(绿)被识别的程度较低。检测到大量强阳性克隆(＞50)。其中，选择8个磷酰基-特异性克隆用于第一次亚克隆(图13B)。所有都显示出稳定，并且选择其中3个用于第二次亚克隆(全部IgG1)。从不特异性识别磷酸化-表位的克隆中，选择6个用于初次亚克隆。所有都显示出稳定，并且选择其中3个用于第二次亚克隆亚克隆(IgG1、IgG2a和IgM)。

图14A-14B的图表显示：第三次亚克隆后，通过ELISA，测定表位结合于稳定的磷酰基-特异性(图14A)和非-磷酰基-特异性(图14B)Tau-386-408[P-Ser_396，404]抗体克隆。从中选择磷酰基-特异性单克隆抗体用于进一步亚克隆，6个中的4个维持它们对磷酰基-Ser₄₀₄表位的特异性(参见图14A中的克隆1F12C2、1F12G6、4E6E3，和4E6G7)。另外2个克隆具有较差的磷酰基-特异性(8B2D1)或非-特异性(8B2D4)(图14A)。在进一步亚克隆后，非-磷酰基-特异性单克隆抗体中的6B2E9和6B2G12尤其地维持它们的非-特异性(图14B)。在培养上清液的1∶810稀释液中获得所示数据。

图15A-15B中的western印迹显示：4个Tau-386-408[P-Ser_396，404]磷酰基-特异性(图15A)和非-磷酰基-特异性(图15B)单克隆抗体克隆与来自JNPL3 P301L小鼠和野生型(Wt)小鼠的脑匀浆的反应。4个磷酰基-特异性克隆中的4E6G7显示最强的反应，这与图14A的ELISA结果一致。与也识别tau P-Ser_396，404表位的PHF-1抗体不同，相比Wt匀浆，所有克隆更好地与JNPL3 P301L脑匀浆反应。如预料的一样，非-磷酰基-特异性克隆反应更快，正如多数tau是非-磷酸化的。

图16A-16B显示：针对包含氨基酸260-271(SEQ ID NO：12)并含有磷酸化丝氨酸262表位的免疫原性tau肽，产生单克隆抗体。如图16A所示，针对免疫原Tau260-271[P-Ser₂₆₂](紫)产生强的效价，但血浆抗体也识别非-磷酰基肽Tau260-271(No-P；白)。选择8个稳定的磷酰基-特异性克隆用于进一步分析(图16B)。

图17中的western印迹显示：3个磷酰基-特异性Tau260-271[P-Ser₂₆₂]单克隆抗体克隆的反应性。相比其他磷酰基-特异性克隆，2C11抗体克隆识别更高分子量带，而且它不区分野生型和P301L组织。5F7D10和5F7E9是其他克隆的代表。Tau-5识别总tau并别结合于在tau氨基酸216-227附近的表位。CP27识别人类tau而不是鼠tau。

图18A-18E的免疫组织化学显微照片显示：在P301L缠结小鼠脑切片中，利用5F7D10抗体克隆检测tau病理。在P301L脑切片中，相对于野生型(图18B)，5F7D10单克隆抗体显示强组织染色(图18A)。在同样的缠结小鼠中，PHF1抗体筛选tau病理(图18C)，虽然它的图案与5F7D10抗体的图案是不一样的，但这也不奇怪，因为他们识别不同的tau表位。图18D是图18A方框区域的放大图，其描述了带有聚集的tau的神经元。图18E是利用5F7D10检测的缠结-样病状(在不同JNPL3 P301L小鼠中)的更高的放大图。

发明详述

本发明的第一个方面涉及在受试者中预防或治疗阿尔茨海默病或其他tau蛋白病的方法。该方法包括在有效治疗或预防受试者的阿尔茨海默病或其他tau蛋白病的条件下，向受试者施用任一种或多种免疫原性tau肽，其具有选自由SEQ ID NO：2-75组成的组的氨基酸序列，或一种或多种抗体，其识别免疫原性tau表位(包含选自由SEQ ID NO：2-75和101-103组成的组的氨基酸序列)。

如本文所用tau蛋白病包含任一神经变性病，其包含在脑中微管TAU 蛋白的病态聚集。相应地，除了家族性遗传性和偶发性阿尔茨海默病，能够用本发明方法治疗的其他tau蛋白病，包括但不仅限于，连锁于17号染色体的伴帕金森病的额颞叶痴呆(frontotemporal dementia，parkinsonism linked to chromosome 17，FTDP-17)、进行性核上性麻痹、皮质基底节变性(corticobasal degeneration)、皮克病、进行性皮质下胶质增生、仅痴呆缠结(tangle only dementia)、伴发钙化的弥漫性神经原纤维缠结、嗜银颗粒性痴呆(argyrophilic grain dementia)、肌萎缩性侧索硬化帕金森-痴呆复征、拳击员痴呆、唐氏综合征、Gerstmann-Straussler-Scheinker病、Hallerworden-Spatz病、包涵体肌炎、Creutzfeld-Jakob病、多系统萎缩、C型Niemann-Pick病、朊病毒蛋白大脑淀粉样血管病、亚急性硬化性全脑炎、强直性肌营养不良、非-guanamian伴发神经原纤维缠结的运动神经元病(non-guanamian motor neuron disease with neurofibrillary tangles)、慢性外伤脑病，和脑炎后帕金森综合征。

另外一个本发明的方面涉及促进从受试者脑中清除tau蛋白聚集的方法。该方法包括，在有效于促进从受试者脑中清除tau蛋白聚集的条件下，向受试者施用任一种或多种免疫原性tau肽，其含有选自由SEQ ID NO：2-75组成的组的氨基酸序列，或一种或多种抗体，其识别免疫原性tau表位(包含选自由SEQ ID NO：2-75和101-103组成的组的氨基酸序列)。

清除tau蛋白聚集包括清除神经原纤维缠结和/或神经原纤维缠结的病态tau蛋白前体。神经原纤维缠结经常与神经变性病有关，该神经变性病包含例如，偶发性和家族性阿尔茨海默病、肌萎缩性侧索硬化、嗜银颗粒性痴呆、拳击员痴呆、慢性外伤脑病、伴发钙化的弥漫性神经原纤维缠结、唐氏综合征、Gerstmann-Straussler-Scheinker病、Hallerworden-Spatz病、遗传性额颞叶失智症、染色体17(FTDP-17)相关的帕金森病、包涵体肌炎、Creutsfeld-Jakob病、多系统萎缩、C型Niemann-Pick病、皮克病、朊病毒蛋白大脑淀粉样血管病、偶发性皮质基底节变性、进行性核上性麻痹、亚急性硬化性全脑炎、强直性肌营养不良、有神经原纤维缠结的运动神经元疾病、仅痴呆缠结，和进行性皮质下胶质增生。

另外一个本发明的方面涉及减缓tau病理相关的行为表型进展的方法。该方法包括，在有效减缓受试者的tau病理相关的行为表型的条件下，向受试者施用任一种或多种免疫原性tau肽，其含有选自由SEQ ID NO：2-75组成的组的氨基酸序列，或一种或多种抗体，其识别免疫原性tau表位(包含选自由SEQ ID NO：2-75和101-103组成的组的氨基酸序列)。

如本文所用，tau病理相关的行为表型包括但不仅限于，认知损伤、早期的人格改变和失控、冷漠、意志力丧失、缄默症、失用、持续言语、刻板的动作/行为、多言、混乱、无法计划或组织顺序的任务、自私/无情、反社会的特征、缺乏换位思考、停止、相对保存完好的理解的频繁错语和无语法的讲话、受损的理解和选词障碍、缓慢渐进的步态不稳、后退、不动、经常跌倒、非左旋多巴响应的轴向刚性、核上凝视麻痹、方波抽搐、缓慢垂直扫视、假性球麻痹、肢体失用、肌张力障碍、皮质感觉丧失和震颤。

根据本发明的方法，在一个实施方案中，向有需要的受试者施用免疫原性tau肽或免疫原性tau肽的联合物。合适的tau蛋白的免疫原性tau肽包含一种或多种抗原性表位，其模拟tau蛋白的病理型。示例性的免疫原性tau蛋白表位在一种或多种氨基酸上是磷酸化的，其是在tau蛋白的病理型中被磷酸化，而不是在正常的或非病理型tau蛋白中磷酸化。

在一个本发明优选的实施方案中，施用免疫原性tau肽，以诱导出针对免疫原性tau肽和tau病理理型的主动免疫应答，从而促进和tau蛋白聚集体相关的清除、减缓tau病理相关的行为进展以及治疗潜在的tau蛋白病。根据本发明的这个方面，免疫应答包含良性体液(抗体介导)和/或细胞(由抗原-特异性T细胞或它们的分泌物介导)应答，其直接对抗免疫原性tau肽。

通过测试来自受试者生物样品(例如，血液、血浆、血清、尿液、唾液、脑脊液或淋巴液)，测定和监视体液免疫应答，从而测定和免疫原性tau肽有关的抗体。在生物样品中检测抗体的方法是在本领域熟知的，例如ELISA、斑点印迹、SDS-PAGE胶或ELISPOT。通过在该领域已知的增殖试验(CD4+T细胞)或CTL(细胞毒素T淋巴细胞)试验，测定细胞介导的免疫反应。

分离的本发明的免疫原性tau肽包含任一如下表1所示的SEQ ID NO：2-30的氨基酸序列。每个序列的被磷酸化的氨基酸残基以粗体显示并用星号标记。表1中肽的名字和这些肽的氨基酸位置相对应，其中最长的人类tau蛋白同种型具有如下所示的氨基酸序列SEQID NO：1。

Met Ala Glu Pro Arg Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly

l 5 10 15

Thr Tyr Gly Leu Gly Asp Arg Lys Asp Gln Gly Gly Tyr Thr Met His

20 25 30

Gln Asp Gln Glu Gly Asp Thr Asp Ala Gly Leu Lys Glu Ser Pro Leu

35 40 45

Gln Thr Pro Thr Glu Asp Gly Ser Glu Glu Pro Gly Ser Glu Thr Ser

50 55 60

Asp Ala Lys Ser Thr Pro Thr Ala Glu Asp Val Thr Ala Pro Leu Val

65 70 75 80

Asp Glu Gly Ala Pro Gly Lys Gln Ala Ala Ala Gln Pro His Thr Glu

85 90 95

Ile Pro Glu Gly Thr Thr Ala Glu Glu Ala Gly Ile Gly Asp Thr Pro

100 105 110

Ser Leu Glu Asp Glu Ala Ala Gly His Val Thr Gln Ala Arg Met Val

115 120 125

Ser Lys Ser Lys Asp Gly Thr Gly Ser Asp Asp Lys Lys Ala Lys Gly

130 135 140

Ala Asp Gly Lys Thr Lys Ile Ala Thr Pro Arg Gly Ala Ala Pro Pro

145 150 155 160

Gly Gln Lys Gly Gln Ala Asn Ala Thr Arg Ile Pro Ala Lys Thr Pro

165 170 175

Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ser Ser Gly Glu Pro Pro Lys Ser Gly

180 185 190

Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser

195 200 205

Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr Arg Glu Pro Lys

210 215 220

Lys Val Ala Val Val Arg Thr Pro Pro Lys Ser Pro Ser Ser Ala Lys

225 230 235 240

Ser Arg Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro Met Pro Asp Leu Lys Asn Val

245 250 255

Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu Lys His Gln Pro Gly Gly

260 265 270

Gly Lys Val Gln Ile Ile Asn Lys Lys Leu Asp Leu Ser Asn Val Gln

275 280 285

Ser Lys Cys Gly Ser Lys Asp Asn Ile Lys His Val Pro Gly Gly Gly

290 295 300

Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp Leu Ser Lys Val Thr Ser

305 310 315 320

Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His His Lys Pro Gly Gly Gly Gln

325 330 335

Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe Lys Asp Arg Val Gln Ser

340 345 350

Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr His Val Pro Gly Gly Gly Asn

355 360 365

Lys Lys Ile Glu Thr His Lys Leu Thr Phe Arg Glu Asn Ala Lys Ala

370 375 380

Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser Pro Val Val Ser

385 390 395 400

Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu Ser Asn Val Ser Ser Thr Gly Ser

405 410 415

Ile Asp Met Val Asp Ser Pro Gln Leu Ala Thr Leu Ala Asp Glu Val

420 425 430

Ser Ala Ser Leu Ala Lys Gln Gly Leu

435 440

表1：免疫原性tau肽

上述免疫原性肽的变体和类似物，其针对能够使用的优选的tau蛋白表位，诱导抗体和/或与抗体交叉反应。包含等位基因的型式、种、诱导的变体的类似物，通常在1个、2个或多个位置，而经常借助连续的取代，区别于自然产生的肽。通常类似物至少具有与天然肽80或90％的序列一致性。一些类似物包含非天然氨基酸，或者在1个、2个或多个位置的N-或C-末端的氨基酸的修饰结构。

在本发明的一个实施方案中，变异的免疫原性tau肽是伪-磷酸化肽。通过用酸性氨基酸，例如谷氨酸和天冬氨酸，取代一种或多种tau肽的磷酸化丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基，制备伪-磷酸化肽丝氨酸(Huang et al.，“Constitutive Activation of Mekl byMutation of Serine Phosphorylation Sites，”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91(19)：8960-3(1994)，其由此以引用的方式全部并入本文)。示例性的本发明的分离的免疫原性伪-磷酸化tau肽如下表2所示。在每个表2的序列中，以X说明氨基酸残基取代的位置，其中x是谷氨酸或天冬氨酸残基取代

表2：免疫原性伪-磷酸化Tau肽

每个本发明的tau蛋白，即SEQ ID NO：2-75和87-88(下文表3)优选地在N-末端被乙酰化和在C-末端被酰胺化，从而更紧密地组装相同的完整长度tau蛋白的内部氨基酸。本发明的tau肽也能够包含一种或多种D-氨基酸残基以提高肽的稳定性。这些D-氨基酸能以相同的顺序以L-型肽型式存在，或以相反于L-型序列的顺序组装，从而维持总体上的天然序列拓扑结构(Ben-Yedidia et al.，“A Retro-Inverso Peptide Analogue ofInfluenza Virus Hemagglutinin B-cell Epitope 91-108 Induces a Strong Mucosaland Systemic Immune Response and Confers Protection in Mice after IntranasalImmunization，”Mol Immunol.39：323(2002)；Guichard，et al.，“Antigenic Mimicry ofNatural L-peptides with Retro-Inverso-Peptidomimetics，”PNAS 91：9765-9769(1994)；Benkirane，et al.，“Antigenicity and Immunogenicity of ModifiedSynthetic Peptides Containing D-Amino Acid Residues，”J.Bio.Chem.268(35)：26279-26285(1993)，其全部通过引用的方式被并入本文)。

每个上面的肽序列可连接于免疫原性载体分子以提高免疫原性。合适的免疫原性载体分子，包括但不限于T辅助细胞表位，例如破伤风类毒素(例如P2和P30表位)，肝炎B表面抗原，霍乱毒素B、类毒素、白喉类毒素、麻疹病毒F蛋白、沙眼衣原体主要外部膜蛋白、恶性疟原虫环子孢子蛋白T，P.恶性疟原虫CS抗原、磷酸异构酶、百日咳博德特氏菌、破伤风杆菌、Pertusaria trachythallina、大肠杆菌TraT、和流行性感冒病毒红血球凝集素(HA)(参见授予Wang的美国专利No.6,906,169；授予Wang 的美国专利申请公开No.20030068325和授予Wang的WO/2002/096350，其全部通过引用的方式被并入本文)。在本发明优选的实施方案中，T辅助细胞表位是破伤风毒素947-967(P30)表位，其具有氨基酸序列FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE(SEQ ID NO：76)。在另一个实施方案中，T辅助细胞表位是破伤风毒素830-843(P2)表位，其具有氨基酸序列QYIKANSKFIGIT(SEQ ID NO：77)。

利用短氨基酸接头序列，将本发明的免疫原性tau肽连接于免疫原性载体分子。在一个本发明优选的实施方案中，GPSL(SEQ ID NO：78)接头序列用于将免疫原性tau肽连接到免疫原性载体分子。其他合适的接头序列包含甘氨酸-富集的(例如G3-5)或丝氨酸-富集的(例如GSG，GSGS(SEQ ID NO：79)、GSGSG(SEQ ID NO：80)，GSNG)接头序列，或单性免疫球蛋白接头，其公布于授予Huang et al的美国专利No.5,516,637)，并由此以引用的方式全部并入本文。

可选地，利用化学交联，将本发明的免疫原性tau肽连接于免疫原性载体分子。将免疫原连接到免疫原性载体分子的技术，包括构造二硫键，利用N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶基-硫代)丙酸盐(SPDP)和琥珀酰亚胺4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)(如果肽缺乏硫基，可以通过添加半胱氨酸残基的方式提供硫基)。这些药剂在它们自己和一个蛋白上的肽半胱氨酸残基之间构建二硫键，以及通过在赖氨酸上的ε氨基，或在其他氨基酸上的其他游离氨基的酰胺健。多种这样的二硫键/氨酰键形成剂描述于Jansen et al.，“Immunotoxins：Hybrid Molecules Combining High Specificity and PotentCytotoxicity”Immun Rev 62：185-216(1982)，其以引用的方式全部并入本文。其他的双官能团偶联剂形成硫醚而不是二硫键。很多这些硫醚形成剂是可从商业途径获得的，并且包含6-马来酰亚胺己酸、2-溴乙酸、2-碘苯甲酸、4-N-马来酰亚胺-甲基)环己烷-1-羧酸。通过将羰基与琥珀酰亚胺或1-羟基-2-硝基-4-磺酸结合、钠盐能激活羰基基团。

通过固相肽合成或重组表达系统，能合成本发明的免疫原性tau肽。可以从很多供应商以商业方式获得自动肽合成器，例如Applied Biosystems (Foster City，Ca.)。重组表达系统可包含细菌，例如E.coli、酵母，昆虫细胞，或哺乳动物细胞。重组表达的方法描述于Sambrook et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(C.S.H.P.Press，NY 2ded.，1989)，其由此以引用的方式全部并入本文。

能够将本发明的免疫原性tau肽单独或联合其他本发明的免疫原性tau肽施用于有需要的受试者。在一个实施方案中，本发明的免疫原性tau肽联合一种或多种如表3所示的免疫原性tau肽的施用，描述于授予igurdsson的美国专利申请公开No.20080050383，其由此以引用的方式全部并入本文。表3中肽的名字和这些肽的氨基酸位置相对应，其中最长的tau蛋白同种型具有氨基酸序列SEQ ID NO：1。每个序列的被磷酸化的氨基酸残基以粗体显示并用星号标记。

表3：用于联合施用的免疫原性tau肽序列

能够将本发明的免疫原性tau肽联合合适的佐剂联合施用，以在受试者中获得所需要的免疫应答。能够在本发明的免疫原性tau肽施用之前、之后或同时施用合适的佐剂。优选的佐剂提高针对免疫原的内在应答，而不在免疫原中引起构象改变，其影响应答定性的形成。

优选的的佐剂类别是铝盐(明矾)，例如氢氧化铝、磷酸铝和硫酸铝。这样的佐剂可和/不和其他特异性免疫刺激性药剂一起使用，例如3脱-O-酰化单磷酰基脂质A(MPL)或3-DMP、聚合或单体氨基酸，例如聚谷氨酸或聚赖氨酸。这样的佐剂可和/不和其他特异性免疫刺激性药剂一起使用，例如胞壁酰基肽(例如，N-乙酰基胞壁酰基-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰基-非胞壁酰基-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(非-MDP)、N-乙酰基胞壁酰基-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺-L-丙氨酸-2-(1′-2′二棕榈酰基-sn-丙三氧基-3-羟基磷酰基氧基)-胺(MTP-PE)、N-乙酰基葡萄糖胺基-N-乙酰基胞壁酰基-L-Al-D-异谷氨酸-L-Ala-二棕榈酰氧基丙基酰胺(DTP-DPP)theramide^TM)，或其他细菌的细胞壁组分。水包油乳液包含MF59(参见授予Van Nest et al.的WO90/14837，其由此以引用的方式全部并入本文)，其包含，通过微射流被制备进入亚微微粒的5％鲨烯、0.5％ Tween 80，和0.5％Span 85(可选地包含各种量的MTP-PE)；SAF，包含10％鲨烯、0.4％Tween80、5％聚醚-嵌段聚合物L121，和thr-MDP，其中任一被微射流入亚微乳液或被涡旋以产生更大微粒乳液；和Ribi^TM佐剂系统(RAS)(Ribi ImmunoChem，Hamilton，Mont.)，包含2％鲨烯、0.2％Tween 80，和一种或多种细菌的细胞壁组分，该组分选自下列的组：单磷酰基脂质A(MPL)、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)，和细胞壁骨架(CWS)、优选地MPL+CWS (Detox^TM)。其他佐剂包含Complete Freund′s佐剂(CFA)、Incomplete Freund′s佐剂(IFA)，和细胞因子，例如白介素(IL-1、IL-2，和IL-12)、巨噬细胞克隆刺激因子(M-CSF)，和肿瘤坏死因子(TNF)。

佐剂的选择取决于含有佐剂的免疫原性制剂的稳定性、施用途径、剂量安排、对已接种疫苗的种的佐剂效果，以及在人类中，药学上可接受的佐剂是一种已经被相关监管机构证明或是可被证明的用于人类施用的佐剂。例如明矾、MPL或Incomplete Freund′s佐剂(Chang et al.，Advanced Drug Delivery Reviews 32：173-186(1998)，其由此以引用的方式全部并入本文)单独地或可选地其所有联合物是适合于人类施用。

本发明的另一个方面涉及含有一种或多种上文所述的免疫原性tau肽的药物组合物，和药物载体(如下文所述)。药物组合物可含有相同免疫原性tau肽的混合物。可选地，药物组合物含有一种或多种不同的本发明的免疫原性tau肽的混合物。在一个优选的实施方案中，如上文所述，本发明的药物组合物包含一种或多种合适的佐剂。

在另一个本发明的实施方案中，对有需要的受试者施用抗体，该抗体识别一种或多种本发明的免疫原性tau表位。本发明合适的抗体包含任一特异地结合于免疫原性tau表位的免疫球蛋白分子，该表位包含任一SEQ ID NO：2-75和101-103的氨基酸序列。在一个优选的实施方案中，本发明的抗体，特异地针对病理型tau蛋白，识别且结合于表位，而且与正常tau蛋白或非tau蛋白几乎没有交叉反应。

如本文所述，产生单克隆抗体，其识别包含SEQ ID NO：13(Tau 386-408[P-Ser396，404])和SEQ ID NO：12(Tau 260-271[P-Ser262])的免疫原性tau表位。这些抗体是磷酸基特异性的且，因此对病理tau蛋白型具有特异性，而与正常tau蛋白几乎没有交叉反应。

除了识别磷酸化病理tau蛋白表位的抗体，本发明还涉及抗体，其优选地识别涉及促进神经元毒素和/或强化tau蛋白聚集的病理tau片段。例如，胱天冬酶裂解tau蛋白，优选地在tau蛋白天冬氨酸残基421(D421)，产生截断的分子，其与缠结共存并与在阿尔茨海默病中和tau蛋白病动物模型中的进展有关系(参见Calignon et al.，“Caspase ActivationPrecedes和 Leads to Tangles，”Nature 464：1201-1205(2010)，其由此以引用的方式全部并入本文)。针对裂解的tau蛋白游离D421末端的抗体将是特异于病理tau，且促进病理tau而非正常tau的移除。相应地，本发明涉及抗体，优选地是单克隆抗体，其针对在裂解的病理TAU蛋白游离C-末端的D421，该D421不存在于正常的tau蛋白中。在本发明的一个实施方案中，用本文所述的方法，以包含氨基酸序列HLSNVSSTGSIDMVD(SEQ ID NO：101)的免疫原性tau肽，产生抗体。

谷氨酸残基391(E391)的截断，是与在阿尔茨海默病患者脑中的神经原纤维缠结形成有关。(Basurto-Islas et al.，“Accumulation of Aspartic Acid421-and GlutamicAcid391-Cleaved Tau in Neurofibrillary Tangles Correlates with Progression inAlzheimer Disease，”J Neuropathol Exp Neurol67：470-483(2008)，其由此以引用的方式全部并入本文)。相应地，本发明也涉及抗体，优选地是单克隆抗体，其针对在裂解的病理TAU蛋白游离C-末端的E391，该E391不存在于正常的tau蛋白中。在本发明的一个实施方案中，用本文所述的方法，以包含氨基酸序列RENAKAKTDHGAE(SEQ ID NO：102)的免疫原性tau肽，产生抗体。

钙蛋白酶也调节tau蛋白裂解，产生毒性17kDa tau片段，其提高Aβ-诱导的神经毒性(Park et al.，“The Generation of a 17kDa Neurotoxic Fragment：An AlternativeMechanism by which Tau Mediates β-Amyloid-Induced Neurodegeneration，”JNeurosci 25(22)：5365-75(2005)，其由此以引用的方式全部并入本文)。相应地，本发明的实施方案也涉及抗体，优选地是单克隆抗体，特异性地识别毒性tau片段的游离的N-和/或游离的C-末端，而不识别正常tau蛋白，如下文SEQ ID NO：103所示，该抗体包含tau(SEQ IDNO：1)的氨基酸残基45-230。

Glu Ser Pro Leu Gln Thr Pro Thr Glu Asp Gly Ser Glu Glu Pro Gly

1 5 10 15

Ser Glu Thr Ser Asp Ala Lys Ser Thr Pro Thr Ala Glu Asp Val Thr

20 25 30

Ala Pro Leu Val Asp Glu Gly Ala Pro Gly Lys Gln Ala Ala Ala Gln

35 40 45

Pro His Thr Glu Ile Pro Glu Gly Thr Thr Ala Glu Glu Ala Gly Ile

50 55 60

Gly Asp Thr Pro Ser Leu Glu Asp Glu Ala Ala Gly His Val Thr Gln

65 70 75 80

Ala Arg Met Val Ser Lys Ser Lys Asp Gly Thr Gly Ser Asp Asp Lys

85 90 95

Lys Ala Lys Gly Ala Asp Gly Lys Thr Lys Ile Ala Thr Pro Arg Gly

100 105 110

Ala Ala Pro Pro Gly Gln Lys Gly Gln Ala Asn Ala Thr Arg Ile Pro

115 120 125

Ala Lys Thr Pro Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ser Ser Gly Glu Pro

130 135 140

Pro Lys Ser Gly Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser Pro Gly

145 150 155 160

Thr Pro Gly Ser Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr

165 170 175

Arg Glu Pro Lys Lys Val Ala Val Val Arg

180 185

如本文所用，术语“抗体”包含完整免疫球蛋自，其源自自然来源或重组来源，以及完整免疫球蛋白的免疫反应性位点(即抗原结合部分)。本发明的抗体可以多种形式出现，包含，例如多克隆抗体、单克隆抗体、细胞内抗体(内抗体)，抗体片段(例如，Fv、Fab和F(ab)₂)，以及单链抗体(scFv)、嵌合抗体和人源化抗体。(Ed Harlow and David Lane，Using Antibodies：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press，1999)；Houston et al.，“Protein Engineering of Antibody Binding Sites：Recoveryof Specific Activity in an Anti-Digoxin Single-Chain Fv Analogue Produced inEscherichia coli，“Proc Natl Acad Sci USA85：5879-5883(1988)；Bird et al，“Single-Chain Antigen-Binding Proteins，”Science242：423-426(1988))

利用本文所述的或其他在本领域熟知的技术，完成单克隆抗体的制备方法(Monoclonal Antibodies-Production，Engineering and Clinical Applications(MaryA.Ritter and Heather M.Ladyman eds.，1995)，其由此以引用的方式全部并入本文)。通常，该过程包括从哺乳动物的脾获得免疫细胞(淋巴细胞)，以有用抗原(即免疫原性tau肽)在体内或体外事先免疫该脾。示例性tau肽如上文所述。为了用SEQ ID NO：2-75的tau肽或SEQ ID NO：101-103的tau肽产生多克隆抗体，可将半胱氨酸残基添加到每个序列的N-或C-末端，以促进载体蛋白的连接，该载体蛋白可以在免疫过程中抗体产出。合适的载体蛋白包括但不仅限于钥孔戚血篮素、蓝载体免疫原性蛋白(源自Concholepas concholepas)、牛血清清蛋白(BSA)、卵白蛋白、阳离子BSA。

抗体分泌淋巴细胞与能在细胞培养物中无限复制的骨髓瘤细胞或转化细胞融合，从而产生永生化的、免疫球蛋白分泌的细胞系。通过标准的熟知的技术，可以完成与能在细胞培养物中无限复制的骨髓瘤细胞或其他融合伴侣的融合，例如利用聚乙二醇(PEG)或其他融合药剂(Milstein and Kohler，“Derivation of Specific Antibody-ProducingTissue Culture and Tumor Lines by Cell Fusion，”Eur J Immunol 6：511(1976)，其由此以引用的方式全部并入本文)。选择优选地是鼠科动物，但也可以源自其他哺乳动物种的细胞的永生化的细胞系，该细胞系应该缺乏利用某种营养所必须的酶，应该可以迅速生长，并具有良好的融合能力。筛选所得到的融合细胞，或培养的杂交瘤以及所得到的集落，以产生所需要的单克隆抗体。克隆产生这样抗体的集落，在体内或体外培养以产生大量的抗体。

可选地，利用如授予Cabilly等人的美国专利4,816,567所述的重组DNA方法，制备单克隆抗体，该专利以引用的方式全部并入本文。例如，通过RT-PCR使用寡核糖核酸引物(其特异性地扩增编码抗体的重和轻链的基因)，从成熟的B细胞核杂交瘤细胞分离编码单克隆抗体的聚核苷酸。然后，将分离得到的编码重和轻链的聚核苷酸克隆进入合适的表达载体，其立刻被转染进入宿主细胞例如E.coli细胞、类人猿COS细胞、中国地鼠卵巢(CHO)细胞，或不另外产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞、宿主细胞产生的单克隆抗体。并且，从噬菌体展示文库能分离得到所需种类的重组单克隆抗体或其片段(McCafferty et al.，“Phageantibody：Filamentous Phage Displaying antibody Variable Domains，”Nature 348：552-554(1990)；Clackson et al.，“Making antibody Fragments using Phage DisplayLibraries，”Nature 352：624-628(1991)；和Marks et al.，“By-PassingImmunizatio.Human antibody from V-Gene Libraries Displayed on Phage，”J.Mol.Biol.222：581-597(1991)，其全部通过引用的方式被并入本文。

利用DNA技术能进一步修饰编码单克隆抗体的聚核苷酸，以产生可选的抗体。例如，能用小鼠单克隆抗体轻链和重链的恒定区取代人源抗体的那些区域，以产生嵌合抗体。可选地，能用小鼠单克隆抗体轻链和重链的恒定区取代非免疫球蛋白多肽，以产生嵌合抗体。在其他的实施方案中，截断或去除恒定区以产生所需的单克隆抗体的抗体片段。此外，可变区的定向位点或高密度诱变可以用于优化单克隆抗体的特异性和亲和力。

本发明的单克隆抗体可以是人源化抗体。人源化抗体是含有来自非人源(例如鼠科动物)抗体可变区内的最小序列的抗体。当这样的抗体被施用于人类受试者时，这样的抗体在治疗上用于降低抗原性和人源抗-小鼠抗体应答。

通过用具有所需特异性、亲和力和能力的非人源抗体(例如，小鼠、大鼠、兔、仓鼠等)的体互补决定区(CDR)取代人源抗体(CDR)，能够人源化抗体(Jones et al.，“Replacing the Complementarity-Determining Regions in a Human antibody WithThose From a Mouse，”Nature 321：522-525(1986)；Riechmann et al.，“ReshapingHuman antibody for Therapy，”Nature 332：323-327(1988)；Verhoeyen et al.，“Reshaping Human antibody：Grafting an Antilysozyme Activity，”Science 239：1534-1536(1988)，其全部通过引用的方式被并入本文)。通过在Fv构架区中和/或在被代替的非人源残基中用其他残基取代，能够进一步修饰人源化抗体，以提高和优化抗体特异性、亲和力和/或能力。

在本领域内，能够使用多种技术制备人源抗体。能够制备在体外被免疫的或从被免疫个体分离的永生化人源B淋巴细胞，其可以产生直接对抗靶向抗原的抗体(参见例如Reisfeld et al.，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy 77(Alan R.Liss ed.，1985)和美国专利No.5,750,373(Garrard)，其全部通过引用的方式被并入本文)。可选地，人源抗体能选自噬菌体文库，其中噬菌体文库表达人源抗体(Vaughan et al.，“Humanantibody with Sub-Nanomolar Affinities Isolated from a Large Non-immunizedPhage Display Library，”Nature Biotechnology，14：309-314(1996)；Sheets et al.，“Efficient Construction of a Large Nonimmune Phage antibody Library：TheProduction of High-Affinity Human Single-Chain antibody to Protein Antigens，”Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95：6157-6162(1998)；Hoogenboom et al.，“By-passingImmunization.Human antibody From Synthetic Repertoires of Germline VH GeneSegments Rearranged In Vitro，”J.Mol Biol 227：381-8(1992)；Marks et al.，“By-passing Immunization.Human antibody from V-gene Libraries Displayed onPhage，”J Mol Biol 222：581-97(1991)，其全部通过引用的方式被并入本文)。也能够在含有人源免疫球蛋白基因座的转基因小鼠中制备人源抗体，该转基因小鼠可以进行产生全部人源抗体的免疫作用，而不产生内源性免疫球蛋白。这种方法描述于授予Surani et al.的美国专利No.5,545,807；授予Lonberg et al.的5,545,806；授予Lonberg et al.的5,569,825；授予Lonberg et al.的5,625,126；授予Lonberg et al.的5,633,425和授予Lonberget al.的5,661,016，其全部通过引用的方式被并入本文。

制备单克隆抗体的方法是在本领域熟知的。通常，通过向新西兰白兔皮下施用含有所需表位的肽(即任一选自由SEQ ID NO：2-75或SEQ ID NO：101-103组成的组的tau肽)，可以制备这样的抗体，该白兔已经被抽血以获得免疫前血清。可以联合佐剂注射该抗原。在初次注射后大约每两周对兔抽血，并定期地用相同的抗原每6周执行3次。通过亲和色谱法，利用相应的抗原以获取抗体，从血清中回收单克隆抗体。这种以及其他制备单克隆抗体的方法描述于Ed Harlow and David Lane，Using Antibodies：A Laboratory Manual(ColdSpring Harbor Laboratory Press，1988)，其由此以引用的方式全部并入本文。

除了完整抗体，本方面包括这样的抗体的结合位点。这样的结合位点包含单价的Fab片段、Fv片段(例如单-链抗体scFv)，和但可变V_H和V_L区域，和双价F(ab’)₂片段、双特异抗体、三链抗体、微抗体。能够通过常规方法制备这些抗体片段，例如蛋白水解片段方法，描述于James Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice 98-118(Academic Press，1983)and Ed Harlow and David Lane，Antibodies：A LaboratoryManual(Cold Spring Harbor Laboratory，1988)，其全部通过引用的方式被并入本文，或其他本领域已知的方法。

结合于细胞内蛋白(即胞内抗体)的工程化抗体片段也是适合用于本发明。针对免疫原性tau表位(包含任一SEQ ID NO：2-75或SEQ ID NO：101-103)的胞内抗体，能预防病态tau在神经元或胶质细胞内聚集和积聚，和/或促进聚集清除。胞内抗体技术应用于治疗神经疾患，包含tau蛋白病，综述于Miller et al.，“Intrabody Applications inNeurological Disorders：Progress and Future Prospects，”Mol Therapy 12：394-401(2005)，其由此以引用的方式全部并入本文。

通常，通过从具有2个可变域(即，重链可变域和轻链可变域的异二聚体)的抗体的可变区选择单可变域，获得胞内抗体。对于胞内抗体发展，单链Fv片段、Fab片段、ScFv-Ck融合蛋白、单链双特异抗体、V_H-C_H1片段，和甚至完整IgG分子式适合是合适的形式(Kontermann R.E.，“Intrabodies as Therapeutic Agents，”Methods 34：163-70(2004)，其由此以引用的方式全部并入本文)。

能够从噬菌体展示、酵母表面展示或核糖体表明展示，获得对病理TAU蛋白表位具有抗原特异性的胞内抗体。制备胞内抗体文库或分离所需胞内抗体的方法进一步描述于授予Zauderer的美国已公布专利中请No.20030104402和授予Rabbitts的美国已公布专利申请No.20050276800，其由此以引用的方式全部并入本文。提高胞内抗体稳定性和结合特性亲和力的方法描述于WO2008070363(Zhenping and Contreras-Martinez et al.，)“Intracellular Ribosome Display via SecM Translation Arrest as a Selectionfor antibody with Enhanced Cytosolic Stability，”J Mol Biol 372(2)：513-24(2007)，其由此以引用的方式全部并入本文。

尤其就抗体片段而言，需要进一步修饰抗体，以提高血清半衰期。这个目的可以通过以下方法达成，例如，通过将结合表位的挽救受体掺入抗体片段、通过在抗体片段中的合适区域的突变，或通过将表位掺入肽标签，该标签随后融合于抗体片段的两端或中间(例如通过DNA或肽合成)。

根据本发明，抗体模拟物适合使用。在本领域已知的大量抗体模拟物包括但不仅限于，那些称为单体，其源自第10人类III型纤连蛋白域 (10Fn3)(Koide et al.，“Thefibronectin Type III Domain as a Scaffold for Novel Binding Proteins，”J MolBiol 284：1141-1151(1998)；Koide et al.，“Probing Protein Conformational Changesin Living Cells by Using Designer Binding Proteins：Application to theEstrogen Receptor，”Proc Natl Acad Sci USA99：1253-1258(2002)，其由此以引用的方式全部并入本文)，和那些称为亲和体，其源自葡萄球菌蛋白A的稳定的α-螺旋细菌受体域Z(Nord et al.，“Binding Proteins Selected from Combinatorial Libraries of analpha-helical Bacterial receptor Domain，”Nature Biotechnol 15(8)：772-777(1997)，其由此以引用的方式全部并入本文)。

本发明进一步涉及药物组合物，该药物组合物包含一种或多种识别如上文所述的本发明的免疫原性tau肽的抗体。这种药物组合物可含有识别相同tau表位的相同抗体的混合物。可选地，该药物组合物可含有识别一种或多种不同tau表位的一种或多种抗体。

本发明的药物组合物进一步含有，如下文所述的药学上可接受的载体或其他药学上可接受的组分。其含有免疫原性tau肽或识别免疫原性tau肽的抗体的本发明的药物组合物，除有效治疗药剂意外，还包含多种其他药学上可接受的组分(参见Remington′sPharmaceutical Science(15th ed.，Mack Publishing Company，Easton，Pa.，1980)，其由此以引用的方式全部并入本文)。优选的药物组合物制剂取决于所需要的施用模式和治疗应用。该组合物能够包含药学上可接受的非毒性载体或稀释剂，其被定义为媒介物，通常用于制备药物组合物(施用于动物或人类)。选择稀释剂以便不影响联合物的生物学活性。稀释剂的示例是蒸馏水、生理磷酸盐缓冲盐水、Ringer′s溶液、右旋糖溶液，和Hank′s溶液。此外，药物组合物或制剂也可包含其他载体、佐剂、或非毒性、非治疗性、非-免疫原性稳定剂等。

药物组合物可包含大的、缓慢代谢的高分子，例如蛋白、多糖例如壳聚糖、聚氨基酸、聚氨基酸和共聚物(例如，乳胶官能琼脂糖凝胶、琼脂糖、纤维素等等)、聚合的氨基酸、氨基酸共聚物和脂质聚集和脂质聚集(例如，油滴或脂质体)。另外，这些载体能够发挥免疫刺激性药剂的功能(即，佐剂)。

本发明的药物组合物可能进一步包含合适的递送媒介物。合适的递送媒介物包括但不仅限于病毒、细菌、生物可降解的微球体、微粒，纳米粒子、脂质体、胶原质微球和螺旋状。

在本发明的一个实施方案中，递送媒介物是病毒或细菌，而且免疫原性tau肽表现为病毒或细菌作为免疫原性组合物的一部分。根据本发明的这个实施方案，将编码免疫原性肽的核酸分子掺入病毒或细菌的基因组或游离基因。可选地，用这样的方法将核酸分子掺入，在该方法中，以分泌蛋白，或与病毒外表面蛋白或细菌跨膜蛋白的融合蛋白的形式，表达免疫原性肽，从而显示肽。在这样的方法中使用的病毒或细菌是非病理的或是毒性减弱的。合适的病毒包含，腺病毒、单纯疱疹病毒、委内瑞拉马脑炎病毒和其他α病毒、水疱性口炎病毒、和其他rhabdo病毒，牛痘和禽痘。腺病毒，单纯疱疹病毒，委内瑞拉马脑炎病毒和其他α病毒，水疱性口炎病毒，和其他rhabdo病毒，牛痘和禽痘。合适的细菌包含沙门氏菌和Shigella。将免疫原性肽与HBV的HbsAg融合是非常合适的。

在另一个本发明的实施方案中，药物组合物包含脂质体递送媒介物。脂质体包含一种或多种特定顺序的脂质脂质双分子层，其封装水相。本发明的免疫原性tau肽或针对免疫原性tau肽制备的抗体，可以使用脂质体媒介物膜进行表面包裹、封装，或与这种膜结合。多种合适于tau肽疫苗递送的脂质体在本领域是已知的(参见例如Hayashi et al.，“ANovel Vaccine Delivery System Using Immunopotentiating Fusogenic Liposomes，”Biochem Biophys Res Commun 261(3)：824-28(1999)和美国专利公开No.20070082043(Michaeli et al.)，其全部通过引用的方式被并入本文)。其他制备用于本发明的脂质体的方法描述于Bangham et al.，“Diffusion of Univalent Ions Across the Lamellaeof Swollen Phospholipids，”J.Mol.Biol.13：238-52(1965)；授予Hsu的美国专利No.5,653,996；授予Lee et al.的美国专利No.5,643,599；授予Holland et al.的美国专利No.5,885,613；授予Dzau & Kaneda的美国专利No.5,631,237；和授予Loughrey et al.的美国专利No.5,059,421，其由此以引用的方式全部并入本文。

在另一个本发明的实施方案中，利用基因疗法递送系统，施用编码本发明的免疫原性tau肽或tau抗体的核酸分子。合适的基因疗法载体包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、并疱疹病毒载体。

能够迅速制备和应用腺病毒载体递送媒介物，描述于Berkner，“Development ofAdenovirus Vectors for the Expression of Heterologous Genes，”Biotechniques 6：616-627(1988)和Rosenfeld et al.，“Adenovirus-Mediated Transfer of aRecombinant Alpha 1-Antitrypsin Gene to the Lung Epithelium In Vivo，”Science252：431-434(1991)，WO 93/07283(Curiel et al.)，WO 93/06223(Perricaudet et al.)和WO 93/07282(Curiel et al.)，其由此以引用的方式全部并入本文。腺伴随病毒递送媒介物能被构建并用于递送编码本发明tau抗体的核酸进入细胞，描述于Shi et al.，“Therapeutic Expression of an Anti-Death Receptor-5Single-Chain FixedVariable Region Prevents Tumor Growth in Mice，”Cancer Res.66：11946-53(2006)；Fukuchi et al.，“Anti-Aβ Single-Chain Antibody Delivery via Adeno-AssociatedVirus for Treatment of Alzheimer’s Disease，”Neurobiol.Dis.23：502-511(2006)；Chatterjee et al.，“Dual-Target Inhibition of HIV-1 In Vitro by Means of anAdeno-Associated Virus Antisense Vector，”Science 258：1485-1488(1992)；Ponnazhagan et al.，“Suppression of Human Alpha-Globin Gene ExpressionMediated by the Recombinant Adeno-Associated Virus 2-Based AntisenseVectors，”J.Exp.Med.179：733-738(1994)；以及Zhou et al.，“Adeno-associated Virus2-Mediated Transduction and Erythroid Cell-Specific Expression of a HumanBeta-Globin Gene，”Gene Ther.3：223-229(1996)，其由此以引用的方式全部并入本文。这些媒介物体内用途描述于Flotte et al.，“Stable in Vivo Expression of the CysticFibrosis Transmembrane Conductance Regulator With an Adeno-Associated VirusVector，”Proc.Nat′l.Acad.Sci.90：10613-10617(1993)和Kaplitt et al.，“Long-TermGene Expression and Phenotypic Correction Using Adeno-Associated VirusVectors in the Mammalian Brain，”Nature Genet.8：148-153(1994)，其由此以引用的方式全部并入本文。其他类型的腺病毒载体描述于授予Wickham et al.的美国专利No.6,057,155；授予Bout et al.的美国专利No.6,033,908；授予Wilson et al.的美国专利No.6,001,557；授予Chamberlain et al.的美国专利No.5,994,132；授予Kochanek et al.的美国专利No.5,981,225；授予Spooner et al.的美国专利No.5,885,808；和授予 Curiel的美国专利No.5,871,727，其由此以引用的方式全部并入本文。

已修饰的逆转录病毒载体形成的传染转化系统，该系统也可用于递送编码针对靶向细胞的所需肽或抗体核酸分子。一种这样类型的逆转录病毒载体公开于授予Kriegleret al.的美国专利No.5,849,586，其由此通过引用的方式并入本文。

例如通过下列方式将承载编码免疫原性tau肽或tau抗体的核酸分子的基因疗法载体施用于受试者：静脉注射局部施用(授予Nabel et al.的美国专利No.5,328,470，其由此以引用的方式全部并入本文)；或立体定向注射(参见例如Chen et al.，“Gene Therapyfor Brain Tumors：Regression of Experimental Gliomas by Adenovirus MediatedGene Transfer In Vivo，”Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 91：3054-3057(1994)，其由此以引用的方式全部并入本文)。基因疗法载体的药物制剂可包括在可接受的稀释剂中的基因疗法载体，或可包含其中嵌入基因递送媒介物的缓释基质。

在本发明方法的实施中，在施用本发明的免疫原性肽或抗体之前，优选选择：患有阿尔茨海默病或其他tau蛋白病或处于患有阿尔茨海默病或其他tau蛋白病的风险中的受试者；脑中具有tau聚集体的受试者；或展现出混乱相关的行为表型的受试者。易于治疗的受试者包括处于疾病风险但还没有表现出症状的个体、以及目前表现出症状的患者。就阿尔茨海默病而言，事实上任何人都处于遭受阿尔茨海默病的风险之中。因此，本方法可以预防性应用于普通人群，而不需要评估受试患者的风险。本方法尤其适用于这样的个体，该个体确定具有已知的阿尔茨海默病的遗传风险。这样的个体包括亲属经历该疾病的那些、以及通过遗传或生物化学标志物分析测定的那些。针对阿尔茨海默病的风险的遗传标志物包括APP基因中的突变，尤其是717位的突变、以及670和671位的突变，分别称为Hardy和Swedish突变。风险的其他标志物包括早老素基因、PS1和PS2、以及ApoE4基因中的突变、AD和高胆固醇血症或动脉硬化症的家族史。目前遭受阿尔茨海默病的个体可以通过存在上述风险因子从特征性痴呆来识别。另外，可得多种诊断测试用于鉴定具有AD的个体。这些包括测量CSFtau和Aβ42水平。增加的tau和降低的Aβ42水平表示存在AD。遭受阿尔茨海默病的个体还可以通过阿尔茨海默病和相关病患联合会标准来诊断。

在无症状患者中，可以在任何年龄(例如10，20，30岁的年龄)开始治疗。然而，通常不必在患者达到40，50，60或70岁的年龄才开始治疗。治疗典型地在一定时间期限内需要多种剂量。治疗可以通过下列方式来监控：随着时间的消逝，测定针对治疗剂的抗体或激活的T-细胞或B-细胞应答。如果应答下降，表示加强剂量。在潜在唐氏综合征的患者的情况下，可以通过向母体出生前或出生后立即施用治疗剂来开始治疗。

在预防应用中，以这样的量将含有免疫原性tau肽的药物组合物施用至易患阿尔茨海默病或其他tau蛋白病或者处于患有阿尔茨海默病或其他tau蛋白病的风险中的患者，该量足以消除或降低风险、降低严重性、或延迟疾病的发作(包括疾病的生物化学、组织学和/或行为症状)、在疾病发展过程中展现的其并发症和中间病理表型。在治疗应用中，以这样的量将含有tau抗体的组合物施用至患有或已经遭受这些疾病的患者，该量足以治愈或至少部分阻止疾病症状(生物化学、组织学和/或行为症状)，包括在疾病发展过程中展现的其并发症和中间病理表型。在一些方法中，施用药剂会在仍未发展为特征性阿尔茨海默病理的患者中降低或消除温和认知损伤。足以实现预防或治疗疗法的量定义为预防或治疗性有效剂量。在预防和治疗方案中，药剂通常以数种剂量来施用，直到已经实现足够的免疫应答。典型地，免疫应答被监控，并且如果免疫应答开始衰弱则给予重复剂量。

为了治疗上述病症，本发明组合物的有效剂量取决于多种不同因素而改变，包括施用方式、靶点、患者的生理状态、施用的其他药物、以及治疗是预防性还是治疗性的。治疗剂量需要改变以优化安全性和效果。免疫原的量取决于是否还施用佐剂，在不存在佐剂的条件下需要更高剂量。对于人的施用，免疫原的施用量有时从1至500μg/患者变化，更通常从5至500μg/注射变化。偶尔，使用1-2mg/注射的更高剂量。典型地约10，20，50或100μg用于每次人注射。免疫原的质量还取决于免疫原内免疫原性表位的质量和免疫原整体的质量的比。典型地，每微克的免疫原使用10^-3至10^-5微摩尔的免疫原性表位。注射时间可以从一天一次、一年一次至十年一次显著地变化。在给予免疫原剂量的任何给定天，如果还施用佐剂，剂量大于1μg/患者，并且通常大于10μg/患者，如果不存在佐剂，剂量大于10μg/患者，并且通常大于100μg/患者。典型方案包括先进行免疫，然后在时间间隔(例如6周间隔)进行加强注射。另外方案包括先进行免疫，然后1，2和12月后进行加强注射。另外方案需要每两个月进行注射以生存。或者，加强注射可以定期进行，这由免疫应答的监控而指示。

对于使用抗体进行被动免疫，剂量为约0.0001至100mg/kg，更通常为0.01至5mg/kg的宿主体重。例如剂量可以为1mg/kg体重或10mg/kg体重或在1-10mg/kg的范围内。示例性治疗方案需要每两周施用一次或者每月施用一次或者每3至6个月施用一次。在一些方法中，同时施用具有不同结合特异性的两种或多种单克隆抗体，在这种情况下施用的各抗体的剂量落入指示的范围内。抗体通常在多个间隔内施用。单词给药之间的间隔可以为每周、每月或每年。在一些方法中，调节剂量以实现血浆抗体浓度为1-1000μg/ml，并且在一些方法中为25-300μg/ml。或者，抗体可以作为缓释制剂来施用，在这种情况下需要施用的频率更少。剂量和频率取决于抗体在患者中的半衰期而改变。通常，人抗体显示最初半衰期，其次是人源化抗体、嵌合抗体和非人抗体。施用的剂量和频率可以取决于治疗是预防性还是治疗性的而改变。在预防应用中，在较长时间期限内以相对不频繁的间隔来施用相对较低剂量。一些患者持续接受治疗以度过余生。在治疗应用中，有时需要以相对较短间隔的相对较高剂量，直到降低或终止疾病进展，优选直到患者显示部分或完全改善疾病的症状。此后，患者可以按照预防性方案来施用。

编码免疫原的核酸的剂量为每个患者约10ng至约1g、约100ng至约100mg、约1μg至约10mg或约30至约300μg的DNA。传染病毒载体的剂量为每剂10-100或更多个病毒粒子。

用于诱导免疫应答的药剂可以通过胃肠外、局部、静脉、口服、皮下、动脉、颅内、腹腔内、鼻内或肌内方式来施用以用于预防和/或治疗疗法。免疫原性药剂的最典型的施用途径是皮下，尽管其他途径可以是相等效果的。然后最通常的途径是肌内注射。这种注射途径最典型地在手或腿肌肉中进行。在一些情况下，可以期望将本发明的治疗剂直接注射到其中积聚沉积物的特定组织中，例如颅内注射。肌内注射或静脉输注优选用于施用抗体。在一些方法中，特定治疗抗体直接注射到颅骨中。在一些方法中，抗体作为缓释组合物或装置施用，例如Medipad^TM装置(Elan Pharm.Technologies，Dublin，Ireland)。

本发明的另一个方面涉及联合疗法，其中识别本发明的免疫原性tau表位的免疫原性tau肽或抗体联合这样的药剂来施用，该药剂有效地预防或治疗和促淀粉样变蛋白(amyloidogenic protein)或肽的沉积相关或者源自其的其他病症或疾病。经历沉积的促淀粉样变蛋白/肽包括但不限于β蛋白前体，朊病毒和朊病毒蛋白，α-突触核蛋白(α-synuclein)，tau，ABri前体蛋白，ADan前体蛋白，胰岛淀粉样多肽，载脂蛋白AI，载脂蛋白AII，溶菌酶，半胱氨酸蛋白酶抑制剂C，凝溶胶蛋白，心钠素，降钙素，角膜上皮素，乳铁蛋白，免疫球蛋白轻链，运甲状腺素蛋白，A淀粉样变性(A amyloidosis)，β2-微球蛋白，免疫球蛋白重链，纤维蛋白原α链，催乳素，角蛋白和medin。因此，本发明的联合治疗将包括识别免疫原性tau表位的免疫原性tau肽或抗体、和靶向上述促淀粉样变蛋白或肽中的一种或多种的一种或多种药剂。

在遗传性淀粉样病(例如阿尔茨海默病和唐氏综合征)的情况下，免疫调节以清除淀粉样-β(Aβ)沉积物是脱颖而出的疗法。靶向Aβ的免疫疗法恒定地导致认知改善。可能的是，tau和Aβ病理学是协同的。因此，同时靶向清除tau和Aβ以及Aβ-相关病理学的联合疗法可比单独靶向各种的方法更加有效。

在帕金森氏症和相关神经变性病的情况下，清除α-突触核蛋白的聚集形式的免疫调节也是脱颖而出的疗法。同时靶向tau和α-突触核蛋白的清除的联合疗法可比单独靶向各种蛋白的方法更加有效。

在朊病毒病和相关神经变性病的情况下，清除朊病毒蛋白PrP^Sc的疾病相关形式的免疫调节是脱颖而出的疗法。因此，同时靶向tau和病理PrP^Sc蛋白的清除的联合疗法可比单独靶向各种蛋白的方法更加有效。

患有II型糖尿病的个体可更易于发展阿尔茨海默病。因此，联合疗法包括靶向胰岛淀粉样多肽的清除的药剂和预防阿尔茨海默病的发展或进展(即预防tau沉积)的药剂，这将对于个体具有增强的治疗益处。

本发明的另一个方面涉及在受试者中诊断阿尔茨海默病或其他tau蛋白病的方法。该方法包括在受试者中使用诊断试剂来检测病理Tau构象异构体的存在情况，其中诊断试剂是本发明的抗体或其活性结合片段。如上所述，抗体对于具有选自SEQ ID No：2-75或SEQ ID No：101-103的氨基酸序列的分离的tau肽具有抗原性特异性。阿尔茨海默病或其他tau蛋白病的诊断基于受试者中病理tau构象异构体的检测。

使用本发明的诊断抗体药剂在受试者中诊断病理Tau构象异构体的存在情况可以通过下列方式来实现：从受试者中获得生物样品(例如血液、尿液、脑脊液)，使生物样品接触诊断抗体药剂，以及在来自受试者的样品中检测诊断抗体药剂和病理Tau蛋白构象异构体的结合。使用本发明的诊断抗体在生物样品中实施病理Tau蛋白的检测的测定法是本领域熟知的，并且包括但不限于ELISA、免疫组织化学、western印迹。

或者，使用本发明的诊断抗体药剂在受试者检测病理Tau蛋白构象异构体的存在情况可以使用体内成像技术来实现。体内成像包括：向受试者施用对于病理Tau肽或表位(即SEQ ID No：2-75和101-103)具有抗原性特异性的诊断抗体，并且体内检测诊断抗体药剂和病理Tau蛋白构象异构体的结合。如上所述，优选抗体结合病理Tau蛋白而不结合非-tau蛋白并不结合tau的非-病理形式。

诊断抗体或类似药剂可以通过静脉注射施用到患者体内，或通过颅内注射直接施加到脑内。抗体剂量应该在治疗方法的相同范围内。典型地，抗体被标记，尽管在一些方法中，对于病理Tau蛋白具有亲和性的第一抗体未被标记，并且第二标记药剂用于结合第一抗体。标记的选择取决于检测方式。例如荧光标记适于光学检测。顺磁性标记的使用适于在没有手术干预的条件下的X线断层摄影术检测。放射活性标记也可以使用PET或SPECT来检测。

通过下列方式来进行诊断：使在来自受试者的样品中或在受试者中的标记的病理Tau构象异构体、tau聚集体和/或神经原纤维缠结的数量、尺寸和/或强度比较于对应的基线数值。基线数值可以表示未生病个体的群体的平均水平。基线数值还可以表示在相同受试者中测定的之前水平。

上述诊断方法还可以用于监控受试者对于疗法的应答。在该实施方案中，在受试者中检测病理tau的存在情况在开始治疗之前进行确定。在该时间点受试者中病理tau的水平用作基线数值。在治疗过程中的多个时间处重复病理Tau蛋白构象异构体、tau聚集体和/或神经原纤维缠结的检测，并且此后将测量的数值和基线数值比较。数值相对于基线下降是针对治疗的阳性应答的信号。数值还可以在生物流体中暂时增加，因为病理tau从脑中清除。

本发明还涉及用于进行上述诊断和监控方法的试剂盒。典型地，这些试剂盒包括诊断试剂，优选对于病理tau肽(即SEQ ID No：2-75和101-103)具有抗原性特异性的本发明的抗体。试剂盒还可以包括可检测的标记。诊断抗体本身可以含有可检测的标记(例如荧光分子，生物素等)，其可直接检测或通过第二反应(例如和链酶亲和素反应)检测。或者，可以使用含有可检测的标记的第二药剂，其中第二药剂具有针对第一抗体的结合特异性。在适于测量生物样品中的病理tau蛋白的诊断试剂盒中，试剂盒的抗体可以预结合固相(例如微量滴定盘的孔)来供应。

本发明的诊断试剂盒还包括这样的试剂盒，其用于在施用本发明的免疫原性tau肽后在受试者中检测抗体的产生。典型地，这种试剂盒包括含有由受试者产生的抗体的抗原性表位的药剂。试剂盒还包括可检测的标记。在优选的实施方案中，标记通常为标记的抗-个体基因型抗体的形式。试剂盒的药剂可以预结合固相(例如微量滴定盘的孔)来供应。

下列实施例示出在本发明的治疗方法中用于组合物的多种方法。实施例旨在描述而不以任何方式限制本发明的范围。

实施例

实施例1-肽

在Keck设施(Yale University)里，利用Biosearch SAM 2合成仪(Biosearch，Inc.，San Rafael，Ca.)，通过固相技术在p-甲基-二苯甲胺树脂上合成肽免疫原。用HF从树脂切割肽，并且在冻干之前用乙醚和醋酸提取。随后，通过使用反相支持媒介物(Delta-Bondapak)的HPLC，在0.78x30cm柱用上，以在0.1％TFA中的0-66％线性梯度乙腈提纯肽。

实施例2用于研究的动物

在转基因(Tg)JNPL3 P301L小鼠模型中进行研究，该小鼠模型在多个脑区域和脊髓中发展神经原纤维缠结(Taconic，Germantown，NY)(Lewis et al.，″NeurofibrillaryTangles，Amyotrophy and Progressive Motor Disturbance in Mice ExpressingMutant(P301L)Tau Protein，″Nat Genet 25：402-405(2000)，其由此以引用的方式全部并入本文)。虽然这个模型对AD研究来说并不理想，但对缠结发展后果研究，以及筛选可预防这些聚集产生的疗法来说，它是很好的模型。这些动物其他的优点是相当早的病状发作。在纯合系中，在至少最早3个月龄时，能够观察到和tau病理有关的行为异常，而且这些动物在8月龄之前维持相当的健康。换句话说，在8月龄时，该动物可以自主行动和进食，而且能够有效地完成行为任务，这使得治疗效果可以得到监视。

除了JNPL3 P301L模型，也可以利用htau/PS1(M146L)小鼠模型进行研究(Boutajangout et al.，“Presenilin 1 Mutation Promotes Tau Phosphorylation andAggregation in a Novel Alzheimer’s Disease Mouse Model，”Alzheimer’s andDementia 4：T185(2008)，其由此以引用的方式全部并入本文)。htau小鼠在没有鼠tau的背景下，表达未突变的人源tau蛋白，而且在发作年龄和脑分布方面，更类似于阿尔茨海默tau病理(Andorfer et al.，“Hyperphosphorylation and Aggregation of Tau in MiceExpressing Normal Human Tau Isoforms，”J Neurochem 86：582-90(2003)，其由此以引用的方式全部并入本文)。在Presenlin 1蛋白中带有突变(M146L)的PS1模型，当与Tg2576小鼠杂交时，显示出升高的Aβ水平和促进Aβ沉积(Duff et al.，“Increased Amyloid-beta42(43)in Brains of Mice Expressing Mutant Presenilin 1，”Nature 383：710-713(1996)and Holcomb et al.，“Accelerated Alzheimer-Type Phenotype in TransgenicMice Carrying Both Mutant Amyloid Precursor Protein and Presenilin 1Transgenes，”Nature Med 4：97-100(1998)，其全部通过引用的方式被并入本文)。

使表达6种人源tau同种型的htau小鼠与PS1(M146L)小鼠杂交，并维持小鼠tau基因敲除背景(htau/PS1/mtau-/-)。PS1突变促进在这种模型中tau高度磷酸化，这导致比htau模型中更具有攻击性的更早发作的tau病理(Boutajangout et al.，“Presenilin 1Mutation Promotes Tau Phosphorylation and Aggregation in a Novel Alzheimer’sDisease Mouse Model，”Alzheimer’s and Dementia 4：T185(2008)，其由此以引用的方式全部并入本文)。

实施例3-疫苗施用

以1mg/ml浓度将Phos-tau肽与Adju-Phos佐剂(Brenntag Biosector，Denmark)混合，并在施用之前将溶液在4℃转动过夜，以使得肽吸附于磷酸铝微粒。

对JNPL3 P301L小鼠皮下注射100μl，接着2周之后注射第二次，并且其后每月注射(除非有其他说明)。在2-3月龄时接种疫苗而且继续接种至8-9个月，此时灌注动物并获取器官用于分析。在处死之前，在5-6月龄以及8-9月龄时，对小鼠进行感觉运动测试笼饲。对照小鼠只施用佐剂。

以磷酸化tau免疫原Tau379-408[P-Ser_396，404]免疫htau/PS1/mtau-/-小鼠(n＝12)。3个未-免疫对照组属于只施用佐剂的组。主对照组包含一样的未免疫的小鼠(htau/PS1对照；n＝16)。其他对照组是表达小鼠tau(htau/PS1/mtau；n＝8)的htau/PS1小鼠，以及有小鼠tau基因敲除背景的htau同窝出生仔畜(htau对照；n＝10)。

htau/PS1/mtau-/-小鼠(3-4月龄)，每隔2周，接受3次在明矾主机中的100μg磷酸化tau衍生物腹膜内(i.p.)注射。其后隔月施用。对照组只施用佐剂。在7-8月龄时，小鼠接受更多的行为测试，以测定治疗效果，然后在8-9月龄时处死小鼠用于分析。进行活动能力、横梁，和转杆测试，以确定在学习和记忆任务中测量得到的认知障碍是否归因于感觉运动异常。利用八臂迷宫、封闭域对称迷宫，和目标识别测试进行认知测试(Sigurdsson etal.，“An Attenuated Immune Response is Sufficient to Enhance Cognition in anAlzheimer’s Disease Mouse Model Immunized with Amyloid-beta Derivatives，”JNeurosci 24：6277-6282(2004)，Asuni et al.， “Vaccination of Alzheimer′s ModelMice with Abeta Derivative in Alum Adjuvant Reduces Abeta Burden WithoutMicrohemorrhages.”Eur J Neurosci.24：2530-42(2006)，and Asuni et al.，“Immunotherapy Targeting Pathological Tau Conformers in a Tangle Mouse ModelReduces Brain Pathology with Associated Functional Improvements，”J Neurosci27：9115-9129(2007)，其全部通过引用的方式被并入本文)。

实施例4tau免疫治疗产生强烈抗体应答

在研究开始之前(T0)、第三次注射一周之后、其后定期地，和在处死时(Tf)，对小鼠抽血。通过利用ELISA测验血浆稀释液(1∶200除非有其他说明)，以确定针对疫苗的抗体应答，近期描述于(Sigurdsson et al.，″Immunization with a Non-Toxic/Non-Fibrillar Amyloid-β Homologous Peptide Reduces Alzheimer′s Disease AssociatedPathology in Transgenic Mice，″Am J Pathol.159：439-447(2001)and Sigurdsson etal.，″An Attenuated Immune Response is Sufficient to Enhance Cognition in anAlzheimer′s Disease Mouse Model Immunized with Amyloid-beta Derivatives，″JNeurosci.24：6277-6282(2004)，其全部通过引用的方式被并入本文)，其中将免疫原覆盖于Immulon^TM微孔(Thermo Fischer Scientific，Waltham，MA，)。为了检测，连接于辣根过氧物酶的山羊抗-鼠IgG(Pierce，Rockford，IL)或抗-鼠IgM(Sigma，St.Louis，MO)以1∶3000稀释使用。四甲联苯胺(Pierce)是基质。

图1A显示：用通过GPSL接头连接于破伤风毒素T辅助细胞表位(TT947-967)的Tau210-216[P-Thr212-Ser214](SEQ ID NO：2)免疫JNPL3P301L小鼠，在该小鼠中强烈IgG和IgM免疫应答。2-3个月龄的小鼠以2周为间隔接受最初2次免疫，其后每月接受一次。为评估抗体应答，在首次免疫之前给小鼠抽血，其后定期地在疫苗施用后1周给小鼠抽血，并且在8-9个月龄时处死小鼠以获得组织。图1A显示：在第6次免疫(T3)1周后，以及在被处死的8-9个月龄时(Tf＝T最终)，测定的IgG和IgM抗体应答。图1B显示：针对破伤风毒素表位本身产生了强烈的抗体应答，这由以下测试所示，IgG和IgM结合于通过GPSL连结合于TT947-967的无关的tau蛋白表位Tau260-264[P-Ser₂₆₂]。

图2A显示：用通过GPSL接头连接于破伤风毒素T辅助细胞表位 (TT947-967)的Tau260-264[P-Ser₂₆₂](SEQ ID NO：3)免疫的JNPL3 P301L缠结小鼠，针对免疫原产生了强烈IgG应答。如上所述，小鼠以2周间隔接受最初的两次免疫，其后从2-3月龄至8-9月龄每月接受免疫。对破伤风毒素表位产生了大量抗体应答，这由以下测试所示，IgG结合于不相关的通过GPSL连接于TT947-967的tau蛋白表位Tau210-216[P-Thr₂₁₂-Ser₂₁₄](图2B)。然而，如图2c所示，对tau蛋白表位也产生了大量抗体应答，因为测试发现IgG结合于更大的含有Tau260-264[P-Ser₂₆₂]区域的tau蛋白表位Tau240-270[P-Ser₂₆₂]。TO-T最终，分别在接种疫苗之前(T0)，第三次(T1)、第六次(T2)、第七次(T3)免疫后一周，和在获取组织(Tf)时，对小鼠抽血。

在用连接于破伤风毒素T辅助细胞表位(TT947-967]的Tau229-237[P-Thr₂₃₁-Ser₂₃₅](SEQ ID NO：4)免疫的JNPL3 P301L缠结模型小鼠中，产生了强烈抗体(IgG)应答(图3)。从2-3月龄开始免疫小鼠，2周间隔，其后每月免疫，并且在第三次免疫后一周(T1)抽血。

在用明矾佐剂中的磷酸化的免疫原Tau379-408[Asp_396，404](SEQ ID NO：57)免疫的JNPL3 P301L缠结模型小鼠中，也产生了强烈抗体(IgG)应答。重要地，这些抗体识别磷酰基-表位Tau379-408[P-Ser_396，404]，并达到相似的程度。从2-3月龄开始对小鼠免疫，最初两次以2周为间隔，其后每月免疫。在获取7-8月龄小鼠的组织时，对小鼠抽血(Tf)。

实施例5Tau免疫治疗降低在脑中的tau蛋白聚集

为了tau病理组织学分析，用戊巴比妥钠(120mg/kg，i.p.)麻醉并用PBS经皮层灌输小鼠，以及如前所述地处理脑(Sigurdsson et al.，″Immunization with a Non-Toxic/Non-Fibrillar Amyloid-β Homologous Peptide Reduces Alzheimer′s DiseaseAssociated Pathology in Transgenic Mice，″Am J Pathol 159：439-447(2001)；Sigurdsson et al.，″An Attenuated Immune Response is Sufficient to EnhanceCognition in an Alzheimer′s Disease Mouse Model Immunized with Amyloid-betaDerivatives，″J Neurosci 24：6277-6282(2004)；and Sigurdsson E.，″HistologicalStaining of Amyloid-beta in Mouse Brains，″Methods Mol Biol 299：299-308(2005)，其全部通过引用的方式被并入本文)。简要地说，在高碘酸盐-赖氨酸-多聚甲醛(PLP)中固定浸泡右半脑过夜，而速冻左半脑用于tau蛋白分析。固定之后，将脑移至含有20％甘油和2％二甲亚砜(DMSO)的磷酸盐缓冲溶液，并保存于4℃直至切片之前。制备一系列冠脑切片(40μm)，并且用PHF1单克隆抗体对每十分之一切片染色，PHF1识别位于在PHFtau蛋白C-末端上的微管结合重复序列之内的磷酸化丝氨酸396和404(Otvos et al.，″MonoclonalAntibody PHF-1 Recognizes Tau Protein Phosphorylated at Serine Residues 396and 404，″J Neurosci Res 39：669-673(1994)，其由此以引用的方式全部并入本文)。

完成Tau抗体染色的方法描述于Sigurdsson et al.，″Immunization with aNon-Toxic/Non-Fibrillar Amyloid-β Homologous Peptide Reduces Alzheimer′sDisease Associated Pathology in Transgenic Mice，″Am J Pathol 159：439-447(2001)and Sigurdsson et al.，″An Attenuated Immune Response is Sufficient toEnhance Cognition in an Alzheimer′s Disease Mouse Model Immunized withAmyloid-beta Derivatives，″J Neurosci 24：6277-6282(2004)，其由此以引用的方式全部并入本文。简要地说，在主PHF1抗体1∶100到1∶1000稀释液中孵育切片。使用鼠-鼠免疫检测试剂盒(Vector Laboratories，Burlingame，CA)，其中以1∶2000稀释，使用抗-鼠IgG第二抗体。

用Bioquant影像分析系统量化组织切片分析。软件利用色调、饱和度和强度分割影像区域中的目标。用在标准的系列幻灯片上精确鉴定的目标建立阀值，而且这些分割阀值在整个分析过程中保持恒定。建立这些阀值后，用抓帧器数字化影像区域。Bioquant在背景照明(空白去校正)中校正异质性，并且为整个区域计算参数。为了免疫组组化学量化影像分析，最初选择齿状回粒层，其一贯含有神经元内tau蛋白聚集(前缠结和缠结)。观察结果符合这种模型的最初特点(Lewis et al.，″Neurofibrillary Tangles，Amyotrophy andProgressive Motor Disturbance in Mice Expressing Mutant(P301L)Tau Protein，″Nat Genet 25：402-405(2000)，其由此以引用的方式全部并入本文)。不考虑研究的实验条件，所有过程都由个体完成。在组织处理之前，随机化样品号码，并且仅在分析完成之后破坏标号。对来自小鼠脑部的第10个切片取样，测量值是以X200放大倍数的测量视野中的面积百分率，其由在视野的左侧处齿状回的顶端的反应产物占据。对每个动物的4到5个切片进行分析。

相对于只施用佐剂的对照小鼠，用连接于TT947-967(T299)的Tau260-264[P-Ser₂₆₂](SEQ ID NO：3)对纯合系JNPL3 tau P301L小鼠进行免疫，该免疫降低在脑干(图5A)和齿状回(图5B)中的病理tau。相似地，用磷酸化Tau379-408[P-Ser396，404]免疫原性肽免疫对htau/PS1进行的免疫，使在梨状皮质中的tau蛋白聚集数量减少56％。(图6，免疫的htau/PS1和htau/PS1对照的对比)。在免疫组和对照组之间观察到显著的差异(单因素ANOVA，p＜0.01)。后hoc分析也显示免疫的htau/PS1小鼠区别于它们的htau/PS1对照(p＜0.01)。^**p＜0.01。

实施例6-Tau免疫治疗预防认知衰退

为测定是否Tau免疫治疗预防或逆转在P301L中观察到的年龄相关的感觉运动异常或是否它在htau/PS1小鼠中引起任一运动损伤，用多种如下文所述的感觉运动和认知测试，评估被施用免疫原性Tau260-264[P-Ser₂₆₂](SEQ ID NO：3)或Tau 379-408[P-Ser_396，404](SEQ ID NO：82)的动物。

转杆测试：将动物放置在杆(直径3.6cm)装置上，以通过测量上肢和下肢运动协调和平衡来评价运动协调和平衡中的区别(Rotarod 7650加速模型；Ugo Basile，BiologicalResearch Apparatus，Varese，Italy)。该方法设计以评价运动行为而没有混淆的实施。通过接受两种试验的训练阶段而使动物习惯于装置，这足以实现实施的基线水平。然后，使小鼠另外测试三次，其中速度增加。在习惯过程中，转杆设定为1.0rpm，其每30sec逐渐增加，并且在各阶段后也使用30％乙醇溶液清洗干净。在该装置下面放置软泡沫垫以防止可能的摔伤。各动物对于三个阶段都测试(整合数据用于接下来的分析)，其中各个阶段间隔15min，并且进行测量从旋转筒的顶部潜在落入或反转(通过粘紧)。

横梁：该任务测试平衡和普通运动协调和功能整合。通过下列方式来评价小鼠：测量它们穿过分级的狭窄木梁以达到目标箱的能力(Torres et al.，″Behavioural，Histochemical and Biochemical Consequence of Selective Immunolesions inDiscrete Regions of the Basal Forebrain Cholinergic System，″Neuroscience 63：95-122(1994)，其由此以引用的方式全部并入本文)。将小鼠放置在1.1cm宽的梁上，该梁为50.8cm长，并且通过两个相同的柱而悬挂在成垫表面上30cm。在梁的各个末端处附接遮蔽的目标箱。使小鼠以垂直取向放置在梁上以习惯，然后监控最多60sec。在落入或达到目标箱之前，记录各小鼠的失足数量用于四个连续试验中的每个。误差定义为失足并且数字地记录。

八臂迷宫：该迷宫装置是由胶质玻璃构建的8-臂举起的放射迷宫。每个臂是35cm长和7cm宽，且在每个臂的末端放置一个直径1cm的水杯。15cm高的侧壁延伸进入每个臂12cm，以防止动物在各个臂之间跨越。中央区域是八边形的直径14cm的中心。通过滑轮系统控制各臂的入口，遥控透明的胶质玻璃闸门。将迷宫升至高于地面75cm并安置在一个房间内，在该房间中一些在固定位置的明显目标起外部暗示的作用。在测试之前，让小鼠适应5天。在这段时间内，该小鼠每天接受0.1％糖水1小时，适应16小时后让它可以接近放置于每个臂末端的水杯中的糖溶液。起初2天的适应在Y-迷宫中进行，在该迷宫中小鼠可以自由地探索。其后3天的适应在八臂迷宫中进行，在迷宫中定期地升起和放下闸门，以使动物适应于它们选择有关的声音。在9天测试期间，维持同样的缺水安排。在这段时间内该小鼠保持良好的健康。每次测试开始，都将小鼠置于中央区域，并升起所有的闸门。当小鼠进入一个臂时，所有闸门落下。小鼠吃完糖水后，升起小鼠所在臂的门，让小鼠回到中央区域。5秒间隔后，同时开启所有的门，以启动下一个试验。这个过程一直持续到该动物进入所有的8个臂，或者直到用完10分钟。每日的获取阶段持续9天。记录错误次数(进入刚去过的臂)和完成每个阶段的时间。

目标识别：该自发的目标识别测试应用于测量短期记忆缺陷，并且该测试在正方形开放域盒子中进行(48cm正方形，带有由黑色胶质玻璃制作的18cm高围墙)，将盒子升高至里地面50cm。将光强设置为30lx。测试前一天，使小鼠经历独自习惯阶段，在该阶段小鼠可以探索空盒子15分钟。在训练阶段，将2个新目标放置于开放域的两个成对角的角，并且让动物探索15分钟。对于特定的试验，成对的目标是10cm高，且由相同的材质构成，由此它们不能容易地通过嗅觉暗示区别。通过跟踪系统(San Diego Instruments，San Diego，CA)记录探索每个目标所用的时间，并且在该训练阶段结束时，将小鼠从盒子移走，维持一段记忆力延迟(RD＝3h)。延迟以后，正常小鼠在1小时之内记住特定目标，而且在记忆力试验期间，用它们的主要时间探寻新目标。在记忆力测试期间，将动物放回同样的盒子，在该盒子中放置一个前面训练期间使用过的相似目标和第二个新目标，并且让小鼠自由探索6分钟。不同目标对用于给定动物的各试验，并且暴露于目标对的顺序以及各对的标识样品和新目标在组内和组间平衡。开发新的和熟悉目标所花费的时间记录为6分钟。

封闭域对称迷宫：该装置为矩形视场30cm正方形，9cm高的壁，分为36个9.5cm正方形，并被透明胶质玻璃盖覆盖。将均为11x16x9cm的纸盒(Endboxes)安置在视场的对角线拐角。对称迷宫是上面讨论的Hebb-Williams和Rabinovitch-Rosvold型测试的改进(Asuniet al.，“Vaccination of Alzheimer′s Model Mice with Abeta Derivative in AlumAdjuvant Reduces Abeta Burden without Microhemorrhages，”Eur J Neurosci 24：2530-2542(2006)，其由此以引用的方式全部并入本文)。简言之，主要差别是各个末端隔室是开始箱和目标箱的功能，并且小鼠在交替轨道上沿相反方向跑动，从而消除种族间的处理。将屏障以对称图案放置在视场中，使得小鼠面向相同转变方向，从而在给定问题内沿任一方向进行。在测试前，小鼠适应于限制饮水方案(每天2h接近水)。小鼠分为两个适应阶段，之后开始测试。在第一阶段，所有动物在目标箱中被给予糖精味的水10分钟。在第二阶段中，它们放置于开始室中，并允许开发视场和进入目标箱，其中给予水(0.05mL)。当小鼠可靠地从开始室跑向目标箱时，它们在简单问题上被分为三个实施阶段，其中一个或两个屏障放置在视场的不同位置处，以阻止直接到达目标箱。正式测试包括基于之前的数据展示难以分级的三个问题(Asuni et al.，“Vaccination of Alzheimer′s Model Mice withAbeta Derivative in Alum Adjuvant Reduces Abeta Burden withoutMicrohemorrhages，”Eur J Neurosci 24：2530-2542(2006)，其由此以引用的方式全部并入本文)和用于小鼠的公开的基准。一个问题是每天展示，并且在各问题上小鼠被给予五个试验，其中种族间间隔为2分钟。通过相同观察者就误差而言手动记录性能(即进入和再进入标识的误差区段)和时间以完成各个试验。

这些实验地目的是评价疫苗接种对于感觉运动(即，横梁和转杆)和认知行为(即，八臂迷宫、目标识别测试，和封闭域对称迷宫测试)的作用。纯合P301L小鼠早在3月龄时就患有缠结病状，在5和8月龄时测试这些小鼠。在7-8月龄时测试htau/PS1动物。

用连接于破伤风毒素辅助T细胞表位(TT947-967)的磷酸化免疫原性tau肽Tau260-264[P-Ser₂₆₂]，免疫纯合JNPL3 tau P301L小鼠，预防与神经原纤维缠结发展有关的功能损伤，这由使用8月龄时的横梁测试(图7A)以及5-6月龄和8-9月龄时的转杆测试(图7B)评估。对照JNPL3 tau P301L小鼠只施用佐剂。

用磷酸化Tau379-408[P-Ser396，404]免疫htau/PS1小鼠，预防在全部3个所用测试中的认知衰退：1)八臂迷宫(RAM；两因素ANOVA重复测量，p＜0.0001，图8A)，2)目标识别测试(ORT；单因素ANOVA，p＝0.005，图8B)，和3)封闭域对称迷宫(CFSM；单因素ANOVA，迷宫A：p＜0.001，迷宫B：p＜0.0001，迷宫C：p＜0.01，图9A-9C)。在RAM和CFSM中，所有天内(RAM；p＜0.01-0.001)和在所有复杂程度不断提高的迷宫中，免疫的htau/PS1小鼠比对照htau/PS1小鼠表现好，这由错误次数(注意Y轴刻度不同；CFSM迷宫A：p＜0.01，迷宫B、C：p＜0.001)显示。在ORT中，析因分析发现免疫的htau/PS1小鼠比相同的对照小鼠，具有更好地短期记忆(p＜0.01)。这充分确定相对于旧的目标，认知正常的小鼠用大约它们的70％时间在新目标上(Asuni et al.，“Immunotherapy Targeting Pathological Tau Conformersin a Tangle Mouse Model Reduces Brain Pathology with Associated FunctionalImprovements，”J Neurosci 27：9115-9129(2007)，其由此以引用的方式全部并入本文)。在任一感觉运动任务(转杆、横梁、活动能力)中，免疫的htau/PS1小鼠与它们的未免疫的相同对照小鼠没有显著区别。这些发现说明免疫后观察到的认知提高，不能由感觉运动效果解释，这进一步强化了结果。

实施例7-Tau免疫治疗降低病理Tau水平

在含有0.1mM 2-(N-吗啉代)乙磺酸、0.5mM MgSO₄、1mM EGTA、 2mM二硫苏糖醇、pH6.8、0.75mM NaCl、2mM苄基磺酰氯化物、Complete mini蛋白酶抑制剂混合物(1片10ml水；Roche)和磷酸酶抑制剂(20mM NaF和0.5mM原钒酸钠)的缓冲液中，使脑组织均质。然后以(20,000xg)在4℃离心30分钟，以分离可溶性性细胞部分(上清液1)和不溶性部分(细胞沉淀1)。用相同体积的缓冲液重悬细胞沉淀，该缓冲液没有蛋白酶和磷酸酶抑制剂但含有％(v/v)Triton X-100和0.25％(w/v)脱氧胆酸钠，并且以50,000高速离心30分钟，以获得清洁剂-提取的作为不溶性部分分离得到的上清液2。上清液1和2于100℃加热5分钟，并且使相同量的蛋白在12％(w/v)聚丙烯酰胺胶上经电泳。在含有0.1％Tween-20的TBS的5％脱脂奶中，阻止印迹，并且与不同的抗体孵育过夜，然后洗涤并与共轭过氧化物酶、抗-鼠或抗-兔IgG在室温孵育1小时。随后，用ECL(Pierce)检测结合抗体。通过NIH Image J程序完成免疫印迹密度分析，并且相对于总tau蛋白量而不是肌动蛋白水平，将病理Tau水平正常化。一些研究报告病理生理学情况的改变和于胞内基质的交互作用能够改变肌动蛋白合成，使激动蛋白对内部标准来说成为不合适的。

对于Western印迹分析，用单克隆B19抗体测量总，而用单克隆PHF1抗体检测病理Tau(图10A-10F)。总可溶性和不溶性tau的水平在各组之间没有显著差异(图10A-10B)，然而相对于他们一样的对照，在免疫的小鼠中可溶性PHF1染色的tau水平显著降低(41％，p＜0.001)(图10C)。观察到的趋势是不溶性PHF1活性tau降低了(22％)(图10D)。进一步的分析显示了非常强的趋势：免疫治疗在可溶性和不溶性部分中的PHF1/B19比例分别降低35％和43％(图10E和10F)。这些发现说明优选地将病理Tau清除。

重要的是，观察到的在接受免疫治疗的htau/PS1小鼠中的认知改善和染色的tau聚集的减少(由免疫组织化学测试而知)是相符的。在全部3个记忆测试中，都观察到显著的关联性(RAM(分析测试的最后一天)：r＝0.36，p＝0.01；CFSM：迷宫A，r＝0.33，p＝0.02；迷宫C，r＝0.40，p＝0.01；ORT：r＝-0.31，p＝0.03)。关于western印迹片段，在八臂迷宫模型中，观察到在可溶性和不溶性部分以及它们相对于总tau的比例之间有显著的相关性(可溶性PHF1：r＝0.41，p＜0.01；可溶性PHF1/总可溶性tau：r＝0.34，p＜0.05；不溶性PHF1：r＝0.52，p＜0.001；不溶性PHF1/总不溶性tau：r＝0.33，p＜0.05)，但在其他2个认知测试没有观察到。

实施例8靶向P-396，404表位的被动免疫治疗预防功能衰退和在脑中减少Tau聚集

为测定被动免疫治疗的可行性，对纯合P301L小鼠腹膜内(i.p.)注射施用PHF1，该PHF1是一种单克隆tau抗体(由Dr.Peter Davies提供)，其在P301L(JNPL3)小鼠模型和在AD中识别NFT和前缠结(Lewis et al，“Neurofibrillary Tangles，Amyotrophy andProgressive Motor Disturbance in Mice Expressing Mutant(P301L)Tau Protein，”Nat Genet 25：402-40522(2000)，其由此以引用的方式全部并入本文)。这种单克隆抗体识别tau，该tau在C-末端的丝氨酸氨基酸404和396上是磷酸化的(Greenberg et al.，“Hydrofluoric Acid-Treated Tau PHF Proteins Display the Same BiochemicalProperties as Normal Tau，”J Biol Chem 267：564-569(1992)，其由此以引用的方式全部并入本文)。因而，它是一种主动免疫方法原型的单克隆类似物(Asuni et al.，“Immunotherapy Targeting Pathological Tau Conformers in a Tangle Mouse ModelReduces Brain Pathology with Associated Functional Improvements，”J Neurosci27：9115-9129(2007)，其由此以引用的方式全部并入本文)，Tau379-408[P-Ser396，404]含有PHF1抗体表位。

PHF1的剂量是溶解于PBS的250μg/125μL。向对照注射相同剂量的在PBS中的小鼠IgG。在9到12周龄之间施用首次注射。接着动物每周接受注射，总共接受13次注射，然后在5-6月龄时接受行为测试，其后在6-7月时对其进行组织分析。

在P301L小鼠模型中，用PHF1抗体进行的被动免疫预防tau病理相关的运动能力衰退。如图11A所示，在横梁测试中，在IgG注射的对照和PHF1免疫的动物之间存在显著差异，当穿越横梁时，对照动物比免疫的动物具有更多的失足(试验合并，p＝0.03)。另外，PHF1免疫的P301L小鼠在齿状回中PHF1染色的tau病理少58％(p＝0.02)(图11B)。在脑干中观察到在血浆PHF1抗体水平和tau病理之间的逆相关(图12A；p＜0.01)，以及在皮层运动区中观察到相关性的强烈趋势(图12B；p＝0.06)。

在血浆中的PHF-1抗体(μg/μL)数量在2周之内下降4倍(图11C)。在对照中没有观察到可检测的抗体。这里有免疫的小鼠的平均值。

实施例9-制备单克隆Tau抗体

用通过添加到N-末端的半胱氨酸残基连接于KLH的Tau386-408[P-Ser_396，404](SEQID NO：13)，免疫10只balb/c小鼠。针对免疫原的tau位点，产生了强抗体效价，这由血浆系列稀释检测而知(图13A)。两只小鼠被选择用于细胞融合，并且初始筛选使用不具有KLH的免疫原肽来进行。第二筛选使用相同肽以及Tau386-408[P-Ser₃₉₆]、Tau386-408[P-Ser₄₀₄]和非-磷酰基肽Tau386-408来进行(图13B)。基于该筛选，克隆被选择用于第一和第二亚克隆。重要地，鉴定多种强阳性克隆(＞50)，并且已经鉴别稳定克隆，该克隆特异性识别该区域内的磷酰基-表位或结合该区域内的非-磷酸化位点，从而允许在分子的相同区域内结合磷酰基-或非-磷酰基tau表位的抗体的效果和安全性性能的比较。

从中选择磷酰基-特异性单克隆抗体用于进一步亚克隆，6个中的4个维持它们对磷酰基-Ser404表位的特异性(参见图14A中的克隆1F12C2、1F12G6、4E6E3，和4E6G7)。另外2个克隆具有较差的磷酰基-特异性(8B2D1)或非-特异性(8B2D4)(图14A)。在进一步亚克隆后，非-磷酰基-特异性单克隆抗体中的6B2E9和6B2G12尤其地维持它们的非-特异性(图14B)。

针对来自JNPL3 P301L小鼠和野生型(Wt)小鼠的脑匀浆，测试4个P-Ser396，404tau磷酰基-特异性(图15A)和非-磷酰基-特异性(图15B)单克隆抗体克隆的反应。4个磷酰基-特异性克隆中的4E6G7显示最强的反应(图15)，这与图14A的ELISA结果一致。与也识别tau P-Ser396，404表位的PHF-1抗体不同，相比Wt匀浆，所有克隆更好地与JNPL3 P301L脑匀浆反应。如预料的一样，非-磷酰基-特异性克隆反应更快，，正如多数tau是非-磷酸化的。

用通过在C-末端上的半胱氨酸残基连接于KLH的Tau260-271[P-Ser₂₆₂](SEQ IDNO：12)，免疫其他一组10只balb/c小鼠。虽然针对免疫原Tau260-271[P-Ser₂₆₂]免疫原产生强的效价，但血浆抗体也识别非-磷酰基肽Tau260-271(图16A)。从第二次亚克隆，选择8个稳定的磷酰基-特异性克隆用于进一步分析(图16B)，并且选择2C11克隆用于抗体产生，因为它是IgG2a的同种型。IgG3具有较短的半衰期，因而对被动免疫研究来说是不理想的。

测试3个磷酰基-特异性P-Ser₂₆₂ tau单克隆抗体克隆针对来自JNPL3P301L和野生型(Wt)小鼠脑匀浆的反应(图17)。相比其他磷酰基-特异性克隆，2C11抗体克隆识别更高分子量带，而且它不区分野生型和P301L组织。5F7D10和5F7E9是其他克隆的代表。Tau-5识别总tau并别结合于在tau氨基酸216-227附近的表位。CP27识别人类tau而不是鼠tau。

如图18A-18E所示，在P301L缠结小鼠脑切片中，5F7D10抗体克隆易于检测tau病理。在P301L脑切片中，相对于野生型(图18B)，5F7D10单克隆抗体显示强组织染色(图18A)。在同样的缠结小鼠中，PHF1抗体筛选tau病理(图18C)，虽然它的图案与5F7D10抗体的图案是不一样的，但这也不奇怪，因为他们识别不同的tau表位。图18D是图18A方框区域的放大图，其描述了带有聚集的tau的神经元。图18E是利用5F7D10检测的缠结-样病状(在不同JNPL3 P301L小鼠中)的更高的放大图。

虽然本文详细地描写和叙述了优选的实施方案，但对相关领域熟练的技术人员来说，非常明白的是在不脱离本发明精神的条件下可以做很多修饰、添加、替换等等，而且如在权利要求所定义，这些都被认为是在本发明的范围之内。

Claims

1.免疫原性tau肽或者特异性识别所述免疫原性tau肽的抗体或其抗原结合部分在制备用于治疗或预防受试者的阿尔茨海默病或其他tau蛋白病的药物中的用途，所述免疫原性tau肽的序列由SEQ ID NO: 57的氨基酸序列组成，其中所述其他tau蛋白病选自：连锁于17号染色体的伴帕金森病的额颞叶痴呆(FTDP-17)、进行性核上性麻痹、皮质基底节变性、皮克病、进行性皮质下胶质增生、仅痴呆缠结、伴发钙化的弥漫性神经原纤维缠结、嗜银颗粒性痴呆、肌萎缩性侧索硬化帕金森-痴呆复征、拳击员痴呆、唐氏综合征、Gerstmann-Straussler-Scheinker病、Hallerworden-Spatz病、包涵体肌炎、Creutzfeld-Jakob病、多系统萎缩、C型Niemann-Pick病、朊病毒蛋白大脑淀粉样血管病、亚急性硬化性全脑炎、强直性肌营养不良、非-guanamian伴发神经原纤维缠结的运动神经元病、慢性创伤脑病和脑炎后帕金森综合征。

2.根据权利要求1所述的用途，其中所述药物用于治疗或预防患有阿尔茨海默病或所述其他tau蛋白病或者处于患有阿尔茨海默病或所述其他tau蛋白病的风险中的受试者的阿尔茨海默病或所述其他tau蛋白病。

3.根据权利要求1所述的用途，其中所述药物包含所述抗体或其抗原结合部分。

4.根据权利要求1所述的用途，其中所述药物还包含佐剂。

5.根据权利要求1所述的用途，其中所述药物还包含一种或多种其他的免疫原性tau肽。

6.根据权利要求5所述的用途，其中所述一种或多种其他的免疫原性tau肽包含选自SEQ ID NO: 5、13、23、52和74的氨基酸序列并且任选与免疫原性载体连接。

7.根据权利要求5所述的用途，其中所述一种或多种其他的免疫原性tau肽包含选自由SEQ ID NO:81–100组成的组的氨基酸序列。

8.根据权利要求1所述的用途，其中所述药物用于治疗或预防阿尔茨海默病或额颞叶痴呆。

9.免疫原性tau肽或者特异性识别所述免疫原性tau肽的抗体或其抗原结合部分在制备用于促进从受试者脑中清除tau聚集体的药物中的用途，所述免疫原性tau肽的序列由SEQ ID NO: 57的氨基酸序列组成。

10.根据权利要求9所述的用途，其中所述药物用于治疗或预防脑中具有tau聚集体的受试者的阿尔茨海默病或其他tau蛋白病，其中所述其他tau蛋白病选自：连锁于17号染色体的伴帕金森病的额颞叶痴呆(FTDP-17)、进行性核上性麻痹、皮质基底节变性、皮克病、进行性皮质下胶质增生、仅痴呆缠结、伴发钙化的弥漫性神经原纤维缠结、嗜银颗粒性痴呆、肌萎缩性侧索硬化帕金森-痴呆复征、拳击员痴呆、唐氏综合征、Gerstmann-Straussler-Scheinker病、Hallerworden-Spatz病、包涵体肌炎、Creutzfeld-Jakob病、多系统萎缩、C型Niemann-Pick病、朊病毒蛋白大脑淀粉样血管病、亚急性硬化性全脑炎、强直性肌营养不良、非-guanamian伴发神经原纤维缠结的运动神经元病、慢性创伤脑病和脑炎后帕金森综合征。

11.根据权利要求9所述的用途，其中所述药物包含所述抗体或其抗原结合部分。

12.根据权利要求9所述的用途，其中所述药物还包含佐剂。

13.根据权利要求9所述的用途，其中所述药物还包含一种或多种其他的免疫原性tau肽。

14.根据权利要求13所述的用途，其中所述一种或多种其他的免疫原性tau肽包含选自SEQ ID NO: 5、13、23、52和74的氨基酸序列并且任选与免疫原性载体连接。

15.根据权利要求13所述的用途，其中所述一种或多种其他的免疫原性tau肽包含选自由SEQ ID NO:81–100组成的组的氨基酸序列。

16.根据权利要求9所述的用途，其中所述tau聚集体是神经原纤维缠结或它们的病理tau前体。

17.免疫原性tau肽或者特异性识别所述免疫原性tau肽的抗体或其抗原结合部分在制备用于治疗或预防受试者的tau病理相关的行为表型进展的药物中的用途，所述免疫原性tau肽的序列由SEQ ID NO: 57的氨基酸序列组成。

18.根据权利要求17所述的用途，其中所述药物用于治疗或预防患有tau病理相关的行为表型的受试者的阿尔茨海默病或其他tau蛋白病，其中所述其他tau蛋白病选自：连锁于17号染色体的伴帕金森病的额颞叶痴呆(FTDP-17)、进行性核上性麻痹、皮质基底节变性、皮克病、进行性皮质下胶质增生、仅痴呆缠结、伴发钙化的弥漫性神经原纤维缠结、嗜银颗粒性痴呆、肌萎缩性侧索硬化帕金森-痴呆复征、拳击员痴呆、唐氏综合征、Gerstmann-Straussler-Scheinker病、Hallerworden-Spatz病、包涵体肌炎、Creutzfeld-Jakob病、多系统萎缩、C型Niemann-Pick病、朊病毒蛋白大脑淀粉样血管病、亚急性硬化性全脑炎、强直性肌营养不良、非-guanamian伴发神经原纤维缠结的运动神经元病、慢性创伤脑病和脑炎后帕金森综合征。

19.根据权利要求17所述的用途，其中所述药物包含所述抗体或其抗原结合部分。

20.根据权利要求17所述的用途，其中所述药物还包含佐剂。

21.根据权利要求17所述的用途，其中所述药物还包含一种或多种其他的免疫原性tau肽。

22.根据权利要求21所述的用途，其中所述一种或多种其他的免疫原性tau肽包含选自SEQ ID NO: 5、13、23、52和74的氨基酸序列并且任选与免疫原性载体连接。

23.根据权利要求22所述的用途，其中所述一种或多种其他的免疫原性tau肽包含选自由SEQ ID NO:81–100组成的组的氨基酸序列。

24.一种分离的tau肽，其氨基酸序列由SEQ ID NO: 57的氨基酸序列组成。

25.根据权利要求24所述的分离的tau肽，进一步包含：

连接所述分离的tau肽的免疫原性载体。

26.一种药物组合物，包含：

一种或多种根据权利要求24所述的分离的tau肽；和

药物载体。

27.权利要求26所述的药物组合物，进一步包含：

药学上可接受的佐剂。

28.权利要求26所述的药物组合物，进一步包含一种或多种其他的免疫原性tau肽，所述肽具有选自SEQ ID NO: 5、13、23、52和74的氨基酸序列，并任选与免疫原性载体连接。

29.权利要求26所述的药物组合物，进一步包含：

一种或多种其他的免疫原性tau肽，其具有选自由SEQ ID NO:81–100组成的组的氨基酸序列。

30.一种抗体或其结合部分，其对根据权利要求24所述的分离的tau肽具有抗原特异性。

31.根据权利要求30所述的抗体或其结合部分，其中所述分离的tau肽是磷酸化的。

32.根据权利要求30所述的抗体或其结合部分，其中所述抗体是单克隆抗体、多克隆抗体，或其活性结合部分。

33.一种联合免疫治疗剂，包含：

根据权利要求30所述的抗体；和

识别一种或多种不同促淀粉样变蛋白或肽的一种或多种抗体或其抗原结合部分。

34.根据权利要求33所述的联合免疫治疗剂，其中所述一种或多种促淀粉样变蛋白或肽选自：β蛋白前体、朊病毒和朊病毒蛋白、α-突触核蛋白、淀粉样蛋白-β、胰岛淀粉样多肽、载脂蛋白AI、载脂蛋白AII、溶菌酶、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、凝溶胶蛋白、心钠素、降钙素、角膜上皮素、乳铁蛋白、免疫球蛋白轻链、运甲状腺素蛋白、A淀粉样变性、β2-微球蛋白、免疫球蛋白重链、纤维蛋白原α链、催乳素、角蛋白和Medin。

35.可检测的诊断试剂在制备用于诊断受试者中的阿尔茨海默病或其他tau蛋白病的试剂中的用途，其中所述诊断试剂包含权利要求30所述的抗体或其活性结合片段，其中所述其他tau蛋白病选自：连锁于17号染色体的伴帕金森病的额颞叶痴呆(FTDP-17)、进行性核上性麻痹、皮质基底节变性、皮克病、进行性皮质下胶质增生、仅痴呆缠结、伴发钙化的弥漫性神经原纤维缠结、嗜银颗粒性痴呆、肌萎缩性侧索硬化帕金森-痴呆复征、拳击员痴呆、唐氏综合征、Gerstmann-Straussler-Scheinker病、Hallerworden-Spatz病、包涵体肌炎、Creutzfeld-Jakob病、多系统萎缩、C型Niemann-Pick病、朊病毒蛋白大脑淀粉样血管病、亚急性硬化性全脑炎、强直性肌营养不良、非-guanamian伴发神经原纤维缠结的运动神经元病、慢性创伤脑病和脑炎后帕金森综合征。

36.根据权利要求35所述的用途，其中所述可检测诊断试剂与病理tau蛋白构象异构体结合并允许检测病理tau蛋白构象异构体。

37.根据权利要求35所述的用途，其中所述可检测诊断试剂可使用体内成像设备检测。

38.一种诊断试剂盒，包含：

权利要求30所述的抗体或其抗原结合部分；和

可检测的标记。