CN110684122B - 重组Tau表位嵌合多聚体抗原、其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了重组Tau表位嵌合多聚体抗原、其制备方法和应用。本发明提供了重组Tau表位嵌合多聚体抗原，为6或12个串联的“Tau蛋白的磷酸酶激活域和两个辅助性T细胞表位Th”的基本单元。本发明重组6/12×(Tau2‑18‑Th)嵌合抗原低剂量少次免疫普通和模型小鼠后都能产生高水平Th2型抗Tau2‑18抗体，且没有产生针对Tau2‑18的T细胞免疫反应，并且减少模型小鼠脑内Aβ(包括可溶性寡聚体)和Tau(包括总Tau和磷酸化Tau)病理水平，上调了相关突触蛋白水平，改善了学习记忆能力。因此该靶向Tau2‑18的重组嵌合表位疫苗是AD新型疫苗研究的一个新方向，在阿尔茨海默病的预防中具有非常大的潜力和应用前景。

Description

重组Tau表位嵌合多聚体抗原、其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物制药和基因工程技术领域，具体涉及重组Tau表位嵌合多聚体抗原、其 制备方法和应用。
背景技术
阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)又称老年痴呆，是一种慢性的长期的神经退行 性老年疾病，主要临床特征为由突触及神经元缺失引起的认知和记忆功能减退。β淀粉样蛋 白在脑组织内沉积导致的神经炎性斑块和Tau蛋白磷酸化引起的神经元纤维缠结是出现在 AD中的两大主要病理学特征。近年来全世界范围内已有超过5000万的痴呆症患者，持续上 涨的发病率给患者的家庭和社会造成了极大的经济负担和压力，随着社会老龄化现象的日益 严重，阿尔茨海默病的研究和治疗水平亟需得到提高，目前已上市治疗AD的几种药物只能 在一定程度上缓解症状而不能达到根治的效果，相较传统的药物治疗，主动免疫疗法治疗AD 被认为是更有潜力的一种策略。
目前关于阿尔茨海默病的致病机制有很多不同观点，被普遍认可的淀粉样蛋白级联假说 使得Aβ作为一个重要靶标用于AD的主动免疫治疗，由于AN-1792疫苗采用全长Aβ42进 行的临床试验中有6％受试者出现脑膜炎，而研究结果表明患者存在自身毒性T细胞免疫反 应可能是炎症出现的原因(参见Orgogozo JM,et al.,Neurology,2003,61:46-54；Cribbs DH,et al.,Int Immunol,2003,15:505-14)。因此后续AD免疫治疗的研究方向是选择靶向Aβ42肽的B 淋巴细胞表位Aβ1-15，并用外源性的T细胞表位替代自身T细胞表位，以提高疫苗的安全性。 已有多个采用这种策略的主动免疫疫苗进入临床研究阶段，但是有一些由于副作用或其他不 明原因而终止试验，如ACC-001、Affitope AD02和AD03、V950等，现在仍然在研的疫苗 包括CAD106、UB-311、MER 5101和Lu AF20513(GodyńJ,et al.,Pharmacological Reports Pr 2016；68(1):127；J.Cummings,et al.,Alzheimers Dement(N Y).2017,3:367-84.)由诺华公司开 发的CAD106疫苗是采用Aβ1-6连接了Qb噬菌体外壳蛋白，动物实验阶段产生了良好的抗 体反应，且避免了T细胞免疫反应，临床Ⅰ期和Ⅱa期结果验证了其良好的安全性和耐受性， 现已进入临床Ⅱ/Ⅲ期试验；由United Biochemical公司开发的UB311疫苗采用Aβ1-14混合 CpG，并联合铝佐剂配制而成，该疫苗已进入临床Ⅱ期；MerciaPharma公司的MER 5101是 将Aβ1-15偶联到白喉毒素载体上，临床前实验已证明其可改善突触损伤和认知功能，现进入 临床Ⅰ期研发阶段。这些已经完成的临床试验都没有达到改善认知能力的治疗效果，可能原 因是这些疫苗免疫后主要产生的不是针对Aβ寡聚体的特异性抗体，不能有效中和对突触功 能和神经元有较大毒性的寡聚体(Meli G,etal.,Nature Communications,2014；5(5):3867.)，从 而无法使认知能力得到改善。
目前靶向Aβ的主动免疫疫苗没有直接靶向Tau分子，以解决Tau相关的病理症状。在 AD中，Tau蛋白的修饰特别是高度磷酸化被认为是诱导其聚集的主要因素，高度磷酸化使 Tau蛋白结构发生改变，从单体聚集成寡聚体，继而形成双螺旋神经细丝(pairedhelical flaments,PHF)，最终导致神经元纤维缠结发生。Tau寡聚体出现在AD病理早期，可能是神 经变性疾病中的毒性形式，也可能是免疫治疗AD的另一个重要靶标。与淀粉样斑块水平相 比，Tau相关的病理指标，特别是Tau寡聚体，与痴呆程度相关度更好。并且，在AD病程 发展中，Tau病理症状产生于淀粉样斑块形成之前，并且Tau也可能介导了Aβ的神经毒性。 Aβ和Tau是相互关联、相关作用的。因此，靶向Tau的AD免疫治疗策略也被认为是个重要的方向。两个靶向Tau蛋白的疫苗(AAD vac1和ACI-35)在模型动物上的实验结果表明它 们能够减少Tau磷酸化负荷，改善认识能力，目前它们正在开展临床试验(Kontsekova E,etal, Alzheimers Research&Therapy 2014；6(4):44；Novak P,et al.Lancet Neurology2017；16(2): 123)。
总之，越来越多的证据证明Tau病理在AD发病机制中起关键作用，Tau起源学说开始 受到人们的重视(Giacobini E,et al,Nature Reviews Neurology 2013；9(12):677-86；Wischik CM, et al.Biochemical Pharmacology 2014；88(4):529-39.)，这提示靶向Tau蛋白同样可作为AD主 动免疫治疗的另一种有效策略。研究发现只有聚集且含有暴露磷酸酶激活域 (phosphatase-activating domain，PAD)的Tau蛋白会抑制快速轴突转运的进行，导致神经元 的功能障碍或变性(Kanaan NM,et al.Journal of Neuroscience,2011；31(27):9858；Jeganathan S, et al,Biochemistry 2006；45(7):2283-93.)。自然状态下Tau蛋白是一个“回形针”结构，其N 端和C端相互作用避免磷酸激活域PAD暴露，Tau蛋白的不正常修饰如高度磷酸化等造成的 聚集会改变这种结构，从而异常暴露出PAD，激活PP1-GSK3级联反应，抑制快速轴突转运 (fast axonal transport，FAT)进行。只有聚集的Tau(形成寡聚体)会抑制FAT，而即使是高 浓度的Tau单体却不会起抑制作用，实验也证明缺失PAD的聚集Tau或PAD位点的封闭也 不会抑制FAT，这提示了PAD在活化PP1-GSK3途径中起关键作用。基于磷酸化的Tau形成 寡聚体暴露PAD是AD早期的一个重要病理事件的事实，它提示Tau-PAD可能是一个重要的 靶标，结合这个区域能够阻止Tau寡聚体的神经毒性和过度磷酸化。
发明内容
本发明的目的是提供一种涉及重组Tau表位嵌合多聚体抗原、其制备方法和应用。
第一方面，本发明要求保护重组Tau表位嵌合多聚体抗原。
本发明所要求保护的重组Tau表位嵌合多聚体抗原，可为如下任一：
(A1)由6个串联的基本单元组成；
(A2)由12个串联的所述基本单元组成；
(A3)在(A1)或(A2)所限定的蛋白质的N端和/或C端连接蛋白标签后得到的融合蛋白。
所述基本单元由依次融合连接的Tau蛋白的磷酸酶激活域(作为B细胞表位，命名为 Tau2-18)和两个辅助性T细胞表位Th(作为T细胞表位)组成，该基本结构单位命名为Tau2-18-Th。
其中，所述Tau蛋白的磷酸酶激活域的氨基酸序列具体如SEQ ID No.3的第1-17位所示。
其中，所述两个辅助性T细胞表位Th分别可为通用型DR辅助性T细胞表位PADRE 和破伤风毒素人CD4+表位P2。
进一步地，所述通用型DR辅助性T细胞表位PADRE的氨基酸序列如SEQ ID No.3的第18-30位所示。所述破伤风毒素人CD4+表位P2的氨基酸序列如SEQ ID No.3的第33-46 位所示。
更进一步地，(A1)中所述重组Tau表位嵌合多聚体抗原(即6×(Tau2-18-Th))的氨基 酸序列具体如SEQ ID No.3所示；(A2)中所述重组Tau表位嵌合多聚体抗原(即12×(Tau2-18-Th))的氨基酸序列具体如SEQ ID No.4所示。
本发明所提供的重组Tau表位嵌合多聚体抗原包括6或12个串联的Tau2-18-Th分子。 其中每个Tau2-18-Th多肽分子大小为46氨基酸，包含Tau蛋白的B细胞表位Tau2-18和两 个辅助性T细胞表位Th。
上述蛋白质中，所述蛋白标签(protein-tag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白 一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋 白标签可为His标签、Flag标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO 标签等。
第二方面，本发明要求保护编码前文所述重组Tau表位嵌合多聚体抗原的核酸分子。
其中，编码所述Tau蛋白的磷酸酶激活域的核酸分子可为SEQ ID No.1的第1-51位。编 码所述通用型DR辅助性T细胞表位PADRE的核酸分子可为SEQ ID No.1的第52-90位)。 编码所述破伤风毒素人CD4+表位P2的核酸分子可为SEQ ID No.1的第97-138位。
进一步地，编码所述重组Aβ1-42样寡聚体抗原的核酸分子可为如下任一：
(B1)SEQ ID No.1所示的DNA分子(对应(A1))；
(B2)SEQ ID No.2所示的DNA分子(对应(A2))。
第三方面，本发明要求保护含有前文所述核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系 或重组菌。
第四方面，本发明要求保护一种制备前文所述重组Tau表位嵌合多聚体抗原的方法。
本发明所要求保护的制备前文所述重组Tau表位嵌合多聚体抗原的方法，可包括如下步 骤：将前文所述核酸分子克隆到原核表达载体，然后通过原核表达系统获得所述重组Tau表 位嵌合多聚体抗原(可溶性表达)。
在本发明的具体实施方式中，所述原核表达载体为pTIG-Trx，具体为将所述重组Tau表 位嵌合多聚体抗原的编码基因(SEQ ID No.2或SEQ ID No.1)克隆到pTIG-Trx载体的酶切 位点EcoR I和Xho I之间。所述原核表达系统具体为大肠杆菌表达系统。
本发明人工合成靶向Tau的PAD结构域Tau2-18的重组嵌合抗原的基因，并通过原核表 达系统获得表达，经纯化后的重组Tau表位嵌合多聚体抗原产生强的抗Tau2-18表位的血清 抗体，具有结合PAD能力，能够阻止Tau寡聚体的神经毒性和过度磷酸化，是一种全新的重 组抗原，因此该亚单位疫苗对于AD有新的免疫治疗效果和特征。
第五方面，本发明要求保护如下任一应用：
(C1)前文所述的重组Tau表位嵌合多聚体抗原在作为或制备阿尔茨海默病亚单位疫苗 中的应用；
(C2)前文所述的重组Tau表位嵌合多聚体抗原在作为或制备用于预防和/或治疗阿尔 茨海默病的药物中的应用；
(C3)前文所述的重组Tau表位嵌合多聚体抗原在制备用于提高阿尔茨海默病患者学习 记忆能力的产品(如药品)中的应用；
在本发明的具体实施方式中，是采用Morris水迷宫法来检测所述学习记忆能力的。
(C4)前文所述的重组Tau表位嵌合多聚体抗原在制备用于减少阿尔茨海默病患者脑组 织中Tau含量的产品(如药品)中的应用；
进一步地，所述Tau含量为总Tau含量和/或磷酸化的Tau含量。
更进一步对，所述总Tau含量和/或磷酸化的Tau含量和可溶性总Tau含量和/或可溶性 磷酸化的Tau含量。
(C5)前文所述的重组Tau表位嵌合多聚体抗原在制备用于减少阿尔茨海默病患者脑内 Aβ寡聚体(特别是6体和12体Aβ寡聚体)和/或Aβ含量的产品(如药品)中的应用；
(C6)前文所述的重组Tau表位嵌合多聚体抗原在制备用于降低阿尔茨海默病患者脑内 钙蛋白酶活性的产品(如药品)中的应用；
(C7)前文所述的重组Tau表位嵌合多聚体抗原在制备用于上调阿尔茨海默病患者脑内 与神经突触功能相关蛋白的表达量或者保护与神经突触功能相关蛋白降解的产品(如药品) 中的应用；
其中，所述与神经突触功能相关蛋白具体为Dynamin 1蛋白和/或PSD-95蛋白。
(C8)前文所述核酸分子或重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在制备前文所述 的重组Tau表位嵌合多聚体抗原中的应用。
第六方面，本发明要求保护一种用于预防和/或治疗阿尔茨海默病的疫苗或药物。
本发明所要求保护的用于预防和/或治疗阿尔茨海默病的疫苗或药物，其活性成分为前文 所述的重组Tau表位嵌合多聚体抗原。
本发明选取了包含PAD的Tau2-18作为靶点，同时加入了两个外源辅助性T细胞表位T 和P2，形成一个嵌合分子Tau2-18-T-P2，命名为Tau2-18-Th。这两个外源辅助性T细胞表位 Th能够刺激机体产生趋向于Th2型的T淋巴细胞反应，增加Tau2-18抗原表位的免疫原性。 同时基于先前的研究结果表明聚集状态下Tau蛋白是具有毒性作用的，因此设想将上述嵌合 分子进行了6个和12个重复串联，形成多聚体结构的重组融合抗原6×(Tau2-18-Th)和 12×(Tau2-18-Th)。通过原核表达获得了可溶性重组6×(Tau2-18-Th)和12×(Tau2-18-Th)嵌合抗 原蛋白，低剂量少次数免疫普通和模型小鼠后都能够产生高水平Th2型抗Tau2-18抗体，而 没有产生针对Tau2-18的T细胞免疫反应，并且减少了模型小鼠脑内Aβ(包括可溶性寡聚体) 和Tau病理水平，上调了相关突触蛋白水平，改善了学习记忆能力。
本发明的重组Tau表位嵌合多聚体抗原6×(Tau2-18-Th)和12×(Tau2-18-Th)亚单位疫苗具 有如下优点与创新点：
1)重组Tau表位嵌合多聚体抗原的设计原理与结构特征。
基于磷酸化的Tau形成寡聚体暴露PAD是AD早期的一个重要病理事件的事实，它提示 Tau-PAD可能是一个重要的靶标，结合这个区域能够阻止Tau寡聚体的神经毒性和过度磷酸 化。因此本研究设计的重组融合抗原6×(Tau2-18-Th)和12×(Tau2-18-Th)选取了包含PAD的 Tau2-18作为靶点，同样加入了两个外源辅助性T细胞表位T和P2，能够刺激机体产生趋向 于Th2型的T淋巴细胞反应，增加抗原的免疫原性，同时基于研究表明聚集状态下Tau蛋白 的毒性作用，而进行了6个和12个多拷贝重复串联，形成多聚体结构。
2)重组Tau表位嵌合多聚体抗原中Tau2-18是B细胞表位：
单分子的Tau2-18多肽免疫后无抗体，但它与KLH偶联后的融合分子Tau2-18-KLH则免 疫后能够产生特异性抗体反应。本研究6×(Tau2-18-Th)和12×(Tau2-18-Th)重组抗原低剂量免 疫动物也产生更高的抗体水平，并且无Tau2-18特异的T细胞反应，仅仅产生了Th特异的细 胞免疫反应。这些结果进一步验证了本发明的重组Tau表位嵌合多聚体抗原中Tau2-18是B 细胞表位，而两个辅助性T细胞表位Th是T细胞表位，并且通过多聚体结构制备的抗原具 有强的免疫原性，极大地增强了Tau2-18的免疫原性。
3)重组Tau表位嵌合多聚体抗原作为AD免疫预防亚单位疫苗的效应与特性。
重组Tau表位嵌合多聚体抗原作为亚单位疫苗免疫3×Tg-AD模型小鼠改善了学习记忆能 力，减少脑组织中的Tau和Aβ病理状态，减少Aβ寡聚体(特别是6体和12体Aβ寡聚体毒性分子)水平和磷酸化Tau(早期和中期高度磷酸化的Tau)。同时，该重组Tau表位嵌合 多聚体抗原免疫模型动物后上调与神经突触功能相关的蛋白，从而达到保护神经突触功能，或改善行为学能力。
总之，这些结果表明该重组Tau表位嵌合多聚体抗原作为亚单位疫苗能够同时减弱Tau 和Aβ病理状态，达到预防AD的目的；也证实了磷酸化的Tau形成寡聚体后暴露PAD是一 个重要的免疫治疗靶标，靶向的Tau-PAD的疫苗免疫后仅仅阻止它的过度磷酸化或它的进一 步聚集，而不影响它的正常功能，从而能够达到安全有效的免疫保护。
同时，以上结果进一步提示，Aβ和Tau是相互关联、相关作用的，通过靶向Tau时，能够同时减弱Tau和Aβ病理状态。总之，该靶向Tau2-18的重组Tau表位嵌合多聚体抗原嵌 合疫苗是下一代AD新型疫苗的研究方向，为疫苗的研发提出了许多新的思路，对寻找合适 的针对AD病的疫苗具有重要的意义。
本发明重组Tau表位嵌合多聚体抗原能够仅仅靶向Tau寡聚体的神经毒性和过度磷酸化， 而不影响它的正常功能，从而能够达到一种安全有效的免疫预防作用。因此，该靶向Tau2-18 的重组嵌合表位疫苗是AD新型疫苗研究的一个新方向，在阿尔茨海默病(AD)的预防中具有 非常大的潜力和应用前景。
附图说明
图1为重组Tau表位嵌合多聚体抗原6×(Tau2-18-Th)和12×(Tau2-18-Th)的制备和它在 AD模型小鼠的免疫与评价方案示意图。A为重组Tau表位嵌合多聚体抗原6×(Tau2-18-Th) 和12×(Tau2-18-Th)的分子结构示意图。B为重组Tau表位嵌合多聚体抗原6×(Tau2-18-Th) 和12×(Tau2-18-Th)的原核表达载体结构示意图。C为重组Tau表位嵌合多聚体抗原 6×(Tau2-18-Th)和12×(Tau2-18-Th)蛋白纯化产物SDS-PAGE和Western Blot鉴定图。泳道 1和3为6×(Tau2-18-Th)；泳道2和4为12×(Tau2-18-Th)。蛋白Marker从上往下依次为：95、 72、55、43、34、26kDa)；箭头示目的蛋白。D为重组Tau表位嵌合多聚体抗原 6×(Tau2-18-Th)和12×(Tau2-18-Th)嵌合疫苗在3×Tg AD模型小鼠的免疫与评价方案示意 图。
图2为重组Tau表位嵌合多聚体抗原6×(Tau2-18-Th)和Tau2-18多肽免疫原性比较结果。 A为6×(Tau2-18-Th)和Tau2-18多肽抗原免疫小鼠2-4次后的抗体滴度。B为6×(Tau2-18-Th) 和Tau2-18多肽抗原免疫小鼠4次后的多肽特异性刺激后的T淋巴细胞增殖反应结果。
图3为重组Tau表位嵌合多聚体抗原6×(Tau2-18-Th)和12×(Tau2-18-Th)嵌合疫苗免疫 小鼠后体液和细胞免疫反应结果。A为两种重组Tau表位嵌合多聚体抗原免疫小鼠2-4次后 的抗体滴度。B为重组Tau表位嵌合多聚体抗原免疫小鼠4次后的抗体亚型分析结果。C为 多肽特异性刺激后的T淋巴细胞增殖反应结果。D-E为多肽特异性刺激后的T淋巴细胞产生 的细胞因子分析。其中，D为细胞因子IL-4水平；E为细胞因子IFN-γ水平。Tau2-18和Th 是指分别用Tau2-18和Th特异性刺激的T淋巴细胞产生的增殖反应与其分泌的细胞因子水 平。
图4为重组Tau表位嵌合多聚体抗原6×(Tau2-18-Th)和12×(Tau2-18-Th)嵌合疫苗免疫 模型动物小鼠后长期抗体水平检测和抗体亚型分析结果。A为6×(Tau2-18-Th)和12×(Tau2-18-Th)嵌合疫苗免疫模型动物小鼠后长期抗体水平检测结果。箭头示免疫次数与时 间点。B为6×(Tau2-18-Th)和12×(Tau2-18-Th)嵌合疫苗三次免疫模型动物小鼠后的抗体亚 型分析结果。
图5为重组Tau表位嵌合多聚体抗原6×(Tau2-18-Th)和12×(Tau2-18-Th)免疫组和对照 组小鼠在Morris水迷宫的学习和记忆能力结果。A为隐藏平台获得实验训练时间为7天，分 别为各组1-7的潜伏期时间；B为动物初次到达平台的时间；C为动物到达平台的次数。B和 C数据反映小鼠的学习记忆能力。
图6为重组Tau表位嵌合多聚体抗原6×(Tau2-18-Th)和12×(Tau2-18-Th)亚单位疫苗免 疫AD模型小鼠后脑组织中Tau蛋白变化的分析结果。A为17月龄模型小鼠脑内海马区总 Tau蛋白水平的脑组织切片免疫组化染色代表图；B为总Tau蛋白水平的脑组织切片免疫组化 染色定量分析结果图。数据为各组的平均值，表示脑内海马区总Tau蛋白的水平；C为ELISA 测定各免疫组AD模型鼠脑组织中可溶性和不可溶性总Tau蛋白水平。D为Westernblot检 测各免疫组脑组织中的可溶性Tau蛋白水平图。E为定量分析各免疫组脑组织中的可溶性Tau 蛋白水平结果。
图7为重组Tau表位嵌合多聚体抗原6×(Tau2-18-Th)和12×(Tau2-18-Th)亚单位疫苗免 疫AD模型小鼠后脑组织中不同磷酸化程度Tau蛋白变化的分析结果。A为Westernblot检 测各免疫组脑组织中的可溶性Tau蛋白不同磷酸化程度图。B为定量分析各免疫组可溶性脑 组织蛋白中早期高度磷酸化的Tau蛋白水平。AT100抗体检测早期高度磷酸化的Tau。C为定 量分析各免疫组可溶性脑组织蛋白中中期高度磷酸化的Tau蛋白水平。AT8检测中期高度磷 酸化的Tau。
图8为重组Tau表位嵌合多聚体抗原6×(Tau2-18-Th)和12×(Tau2-18-Th)亚单位疫苗免疫 AD模型小鼠后脑组织中Aβ含量变化的分析结果。A为17月龄模型小鼠脑内海马区淀粉样 斑块含量的脑组织切片免疫组化染色代表图；B为淀粉样斑块含量的脑组织切片免疫组化染 色定量分析结果图。数据为各组的平均值，表示脑内海马区淀粉样斑块的负荷；C为ELISA 测定各免疫组AD模型鼠脑组织中Aβ40含量。D为ELISA测定各免疫组AD模型鼠脑组织 中Aβ42含量。
图9为重组Tau表位嵌合多聚体抗原6×(Tau2-18-Th)和12×(Tau2-18-Th)亚单位疫苗减少 了17月龄AD模型小鼠脑内可溶性Aβ寡聚体的含量。A和B为重组Tau表位嵌合多聚体抗 原亚单位疫苗减少了17月龄AD模型小鼠脑内可溶性Aβ寡聚体的含量，A为点杂交染色图， B为定量分析结果；C、D和E为重组Tau表位嵌合多聚体抗原亚单位疫苗减少了17月龄AD模型小鼠脑内6体和12体Aβ寡聚体的含量结果。C为Western blot图，D为6体Aβ寡聚体 的含量定量分析结果，E为12体Aβ寡聚体的含量定量分析结果。
图10为Western blot检测重组Tau表位嵌合多聚体抗原6×(Tau2-18-Th)和 12×(Tau2-18-Th)亚单位疫苗AD模型小鼠后脑组织中相关突触蛋白水平的表达情况。A为Western blot检测脑组织中的可溶性Dynamin 1和PSD-9蛋白水平情况；B为Western blot检测脑组织中Dynamin 1和PSD-9相关突触蛋白水平的定量分析结果。
注：实验数据均使用统计软件GraphPad Prism 5，以单因素方差的统计方法进行统计学 分析，免疫组与3×Tg-AD组小鼠进行比较(n＝8)，P＜0.05(*)则认为差异有统计学显著意义， P＜0.01(**)和P＜0.001(***)则认为差异有统计学极显著意义。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》(Sambrook，J.，Russell，David W.，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold Spring Harbor)。DNA基因均由上海生物工 程技术服务有限公司(上海)合成；所用引物均由上海生物工程技术服务有限公司合成。
实施例1、重组原核表达载体的构建及重组Tau表位嵌合多聚体抗原在大肠杆菌中的表 达与纯化
一、6×(Tau2-18-Th)和12×(Tau2-18-Th)基因设计与合成
根据密码子简并性人工合成了编码6个拷贝串联的6×(Tau2-18-Th)基因(见SEQID No.1) 和12个拷贝串联的12×(Tau2-18-Th)基因(见SEQ ID No.2)，直接合成克隆于pMD18-T (TaKaRa)T载体中命名为pMD18-6×(Tau2-18-Th)和pMD18-12×(Tau2-18-Th)，分别编码 6×(Tau2-18-Th)和12×(Tau2-18-Th)(氨基酸序列见SEQ ID No.3和SEQ IDNo.4)，各个 Tau2-18-Th间用GS柔性肽连接(图1中A)。每个Tau2-18-Th分子中，Tau2-18是Tau蛋白 的酸酶激活域(phosphatase-activating domain，PAD)，该多肽Tau2-18分子可作为此嵌合多聚 体抗原的B细胞表位，序列为AEPRQEFEVMEDHAGTY；Th (AKFVAAWTLKAAA-GS-QYIKANSKFIGITE)为辅助性T细胞表位，包括通用型DR辅助 性T细胞表位PADRE序列(AKAVAAWTLKAAA，Pan-DR helper T cell epitopes)，记为T； 和QYIKANSKFIGITE序列来源于破伤风毒素的人CD4+表位，记为P2，两个表位之间用GS 柔性肽连接。每个Tau2-18-Th嵌合分子大小为46氨基酸，包括B和T细胞表位。
以上基因设计采用大肠杆菌常用的密码子，同时兼顾真核细胞常用的密码子，并保证所 编码的氨基酸残基序列不变。对于串联重复的Tau2-18-Th基因采用不同密码子使之不完全一 样，减少重复序列并提高基因的表达翻译水平。
二、重组原核表达载体的构建
用EcoR I和Xho I分别双酶切上述获得的质粒pMD18-6×(Tau2-18-Th)和 pMD18-12×(Tau2-18-Th)，用DNA回收试剂盒分别回收长度约860和1730bp的目的片段， 与经相同酶双酶切的原核表达载体pTIG-Trx(见专利：ZL200710089588.2)连接，将连接产 物转化大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，提质粒，测序，获得序列及插入 位置均正确的重组原核表达载体，分别命名为pTIG-Trx-6×(Tau2-18-Th)和 pTIG-Trx-12×(Tau2-18-Th)(图1中B)。
三、重组多肽抗原在大肠杆菌中的表达及表达产物的纯化
1、重组Tau表位嵌合多聚体抗原在大肠杆菌中的表达及表达产物的SDS-PAGE检测
将步骤二构建的2个重组原核表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞(TIANGEN 公司)，筛选阳性重组子，以转化有pTIG-Trx空载体的重组菌为阴性对照。挑单克隆接种到 含Amp的LB培养基中，37℃220r/min条件下振荡培养至菌液OD值为0.6～1.0时，然后按1:100的比例将阳性重组菌接种至含100mg/mL氨苄青霉素的500mL的LB液体培养基中，在 37℃、250rpm下进行大量培养，培养至对数生长期(OD600约为0.6～1.0)时加入化学诱导 剂IPTG至终浓度为0.4mmol/L，30℃220r/min振荡培养4～5小时或16℃220r/min培养12小时。培养结束后，离心收集菌体，重悬于20mM磷酸钠缓冲液中(pH 8.0)，超声打碎 细胞，离心收集上清进行12％SDS-PAGE检测，结果表明，经诱导表达的重组蛋白都获得了 表达并能够以可溶性方式存在，而未诱导的菌株和诱导的空载体对照未出现该目的蛋白带，说明所表达的蛋白可能就是目的蛋白即重组Tau表位嵌合多聚体抗原。
2、表达产物的纯化及鉴定
步骤1所表达的重组Tau表位嵌合多聚体抗原的C端含有六个组氨酸标签，因此用Ni-NTA亲和层析柱(法玛西亚公司)并参照说明书对可溶性表达产物进行纯化，得到洗脱纯化蛋白，然后对经纯化的蛋白进行12％SDS-PAGE检测，检测结果表明得到了纯化的目的蛋白。图1中C所示是2种目的蛋白纯化后的SDS-PAGE电泳图。
3、表达产物的Western blot和ELISA鉴定
以特异性抗Tau的抗体HT7(Thermo)为一抗，以辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗鼠IgG(Sigma公司)为二抗，对纯化的重组抗原蛋白进行Western blot分析，结果显示表达目的蛋白与抗Tau抗体特异性结合，阳性条带大小位置与电泳位置一致，与6×(Tau2-18-Th)和 12×(Tau2-18-Th)的理论大小(分别为约31kDa和约62kDa)相当，表明诱导表达或经纯化的 重组蛋白即为目的蛋白(图1中C)。同时，通过ELISA确定了该抗体也能够与这些重组抗 原蛋白结合，而与空载体诱导表达产物不结合，进一步表明我们表达和纯化的重组Tau表位 嵌合多聚体抗原含有Tau或Tau2-18的B细胞表位抗原表位。
实施例2、重组Tau表位嵌合多聚体抗原诱导普通小鼠产生高水平的Th2型抗Tau2-18 抗体反应
以实施例1中表达并经纯化的重组Tau表位嵌合多聚体抗原蛋白6×(Tau2-18-Th)和 12×(Tau2-18-Th)作为免疫原即亚单位疫苗免疫小鼠，以检测其免疫原性。具体方法为：将 C57/BL6小鼠(8周龄，雌性，SPF级，军事医学研究院实验动物中心)随机分为3组，每组 8只，免疫10μg重组蛋白，而对照组(Control)免疫不含重组蛋白的PBS，共免疫四次。 免疫前，将抗原稀释于终浓度为10％(V/V)铝佐剂(AlhydrogelTM，Brenntag Biosector,Frederikssund,Denmark)。每只100μl进行肌肉注射免疫，加强免疫时，间隔3周，剂量和方法同上。同时，以合成的Tau2-18多肽(氨基酸序列为SEQ ID No.3的第1-17位)和Tau2-18-KLH (KLH，钥孔血蓝蛋白；Tau2-18-KLH偶联物，氨基酸序列为SEQ ID No.3的第1-17位的多肽与KLH的偶联物，由上海生物工程技术服务有限公司合成)为对照组，每只动物免疫，剂量为100μg，用于比较其免疫原性。每次免疫前，以及最后一次免疫后第3周，小鼠尾部采血，分离血清，用ELISA法测定特异性抗体水平。用酶联免疫板包被Tau2-18(AEPRQEFEVMEDHAGTY)或Tau2-18-KLH抗原，浓度为2μg/mL，用分离的免疫小鼠血 清为一抗，以HRP标记羊抗鼠IgG(Santa Cruz Biotechnology,Inc.)为二抗测定血清抗体水 平，终末稀释ELISA法测定免疫动物血清中的特异性抗体滴度。以空对照组小鼠血清为阴性 对照(即N)，重组多肽抗原免疫组的OD492值(即P值)达到0.2以上，并且P/N≥2.1为阳 性。每组的平均抗体滴度以每组单个血清样品抗体滴度以几何平均数(GMT±SD)表示。同 时，以HRP标记羊抗鼠IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgGM(Santa Cruz Biotechnology,Inc.) 为二抗测定血清抗体中各亚型抗体水平。另外，以HT7抗体为标准品，通过ELISA法制定 标准曲线，并与标准品进行对比，也定量测定了血清抗体中特异性抗Tau抗体的水平。
ELISA检测结果表明，重组Tau表位嵌合多聚体6×(Tau2-18-Th)抗原组随着免疫次数的 增加，抗体滴度也得到极大的提高；对照组血清与免疫前相比始终为阴性，低于100；高剂 量的Tau2-18多肽免疫组抗体水平较低，表明该多肽其免疫原性弱，而Tau2-18-KLH则能够 增强该多肽的免疫原性，但其抗体水平远远低于6×(Tau2-18-Th)抗原组，各次免疫后抗体滴 度如图2中A；另外，6×(Tau2-18-Th)和12×(Tau2-18-Th)均产生高滴度的特异性抗体水平， 平均抗体滴度2次免疫后可达到100000以上，3次可达到200000以上，4次可达到800000 以上(图3中A)，其血清抗体没有明显的IgG2a亚型抗体，主要为IgG1抗体，表明其免疫 应答完全为Th2(图3中B)，这与其免疫后没有产生明显的针对Tau2-18刺激的淋巴细胞增 殖是一致的。
淋巴细胞的增殖能力是细胞免疫应答的一个重要指标，用MTS法测定淋巴细胞的增殖能 力，方法为：最后一次免疫后第3周取脾细胞，制备浓度为106个/mL的脾细胞悬液，在体 外用抗原多肽Tau2-18或T细胞表位(AKFVAAWTLKAAAGSQYIKANSK FIGITE)Th多肽， 浓度为10μg/mL，进行刺激，4天后用MTS法检测T细胞增殖能力。淋巴细胞增殖能力的 MTS法测定结果表明，Tau2-18多肽和Tau2-18-KLH均没有产生特异的T细胞免疫反应(图 2中B)，而6×(Tau2-18-Th)和12×(Tau2-18-Th)免疫组小鼠体内诱导产生了特异的针对T细胞 表位多肽的T细胞免疫反应，但是没有产生针对Tau2-18刺激的淋巴细胞增殖的T细胞免疫 反应和细胞因子(图3中C、D和E)。Th特异性的IL-4和IFN-γ细胞因子测定的结果也表 明其免疫类型为Th2型，产生了低水平的IFN-γ，并且IL-4/IFN-γ大于1。这两种抗原的免疫 反应水平两者间无明显差异。
总之，单分子的Tau2-18多肽免疫后无抗体，但它与KLH偶联后的融合分子Tau2-18-KLH 则免疫后能够产生特异性抗体反应。这些结果进一步验证了本发明的重组Tau表位嵌合多聚 体抗原中Tau2-18是B细胞表位，而两个辅助性T细胞表位Th是T细胞表位，并且通过多 聚体结构制备的抗原具有强的免疫原性，极大地增强了Tau2-18的免疫原性。因此，该重组 Tau表位嵌合多聚体抗原可作为阿尔茨海默病(AD)候选疫苗，低剂量就能够诱导小鼠产生 高水平抗Tau2-18抗体，并且免疫应答反应为Th2型。
实施例3、重组Tau表位嵌合多聚体抗原亚单位疫苗免疫3×Tg AD模型小鼠后诱导产生 高水平的抗Tau2-18抗体
本发明进一步通过3×Tg AD模型小鼠评价该重组Tau表位嵌合多聚体抗原亚单位疫苗的 免疫原性和免疫治疗效果(方案见图1中D)。具体方案如下，AD模型小鼠为3×Tg AD模型 小鼠，是在敲入了早老素蛋白PS1M146V基因的小鼠中显微注射包含TauP301L和APPSwe的共基 因序列，构建一种能够表达这三种蛋白的AD病理模型小鼠，这种模型小鼠的病程发展会随 着鼠龄的增长表现出一定的渐进性，6月龄时就发生了胞内Aβ沉积，9月龄时能够观察突触 体Tau病理特征，相比其他的单转基因小鼠，能够更全面更贴切地模拟AD患者的病变进程 及病理特征，是用来研究AD主动免疫疫苗有效性的较合适小鼠模型(参考文献：OddoS.,et al.,Neuron,2003,39:409-21；Billings L.M.,et al.,Neuron,2005,45:675-88.)。该AD模型由本 课题组从美国的Jackson Lab(MN)引进，并经授权保种繁殖使用。该亚单位疫苗与之前的制 备和配制方法相同；转基因小鼠(5月龄，雌性，SPF级)随机分为3组，每组8只，20μg 重组抗原与终浓度为10％(V/V)铝佐剂配制成疫苗，总体积100μl/只，阴性对照组为不含重 组蛋白的PBS，共免疫五次，前三次间隔1个月，最后两次间隔4个月，每只100μl进行肌 肉注射免疫，加强免疫时，剂量和方法同上。ELISA法测定免疫动物血清中的特异性抗体滴 度的方法同上。另外，设置一组非转基因模型小鼠(转基因模型小鼠的母本C57/BL6)，用于 评价行为学实验的阳性对照。
ELISA检测结果表明，随着免疫次数的增加，抗体水平也得到相应提高，经过三次免疫 后就产生了高滴度的特异性抗体水平，达到850000以上，这两种抗原免疫效果无差异，如图 4中A。抗体亚型也主要为IgG1(如图4中B)，表明其免疫应答主要为Th2，这与先前在普 通小鼠的结果是一致的。经过两次加强免疫后，模型动物的抗体水平得到了增强，并且最后 高滴度的血清抗体水平能够一直维持17月龄，达到200000以上。总之，研究结果表明，该 重组嵌合抗原免疫后就能够诱导AD模型小鼠产生高水平抗Tau2-18抗体，并且免疫应答反 应为Th2型。下一步对其行为学能力和脑组织中Tau和Aβ含量的变化进行评价，进一步证 实该重组嵌合疫苗的药效学效果。
实施例4、重组Tau表位嵌合多聚体抗原亚单位疫苗免疫AD模型小鼠后的学习记忆能 力评价
对重组嵌合抗原亚单位疫苗免疫的AD模型小鼠于最后一次加强免疫后2个月(即17月 龄)进行行为学能力的评价，采用Morris水迷宫方法。实验可分为隐藏平台获得实验和空间 搜索实验两步。隐藏平台获得实验用于测量动物在水迷宫中的学习和记忆能力，实验历时7 天。以非转基因C57BL/6小鼠为阳性对照(正常小鼠)，未免疫或PBS免疫的转基因模型小 鼠为阴性对照(AD模型小鼠-Control组)。其评价方法为：对每只小鼠分别从四个象限入水 点放入，记录动物寻找并爬上平台所需时间即逃避潜伏期，计算每天各组4次逃避潜伏期的 平均值。Morris水迷宫中的潜伏期是采用重复测量的数据取平均值评价。空间搜索实验用于 测量动物对平台空间位置准确记忆，即记忆保持能力。隐藏平台获得实验后第8天撤除平台， 将动物从任一入水点放人水中，评价动物在目标象限和其他各象限的游泳时间和穿越原平台 位置次数等指标。如图5，各组小鼠在Morris水迷宫的学习和记忆能力结果(注：隐藏平台 获得实验训练时间为7天，然后第8天进行空间搜索实验)表明，随着时间延长，除阴性对 照(AD模型小鼠)外，其他各组动物的潜伏期时间相继缩短；到第4天时有明显的差异， 第7天时效果最佳，第8天时具有明显的记忆能力(图5中B和C)。但是阴性对照(AD模 型小鼠)组一直无明显变化，表明其学习能力弱和无记忆能力。总体上，两个重组嵌合抗原 亚单位疫苗免疫后，AD模型小鼠的学习记忆能力都得到了明显的改善，其能力与正常的 C57BL/6小鼠相当，提示该重组亚单位疫苗达到了预期免疫预防AD病症的效果。
实施例5、重组Tau表位嵌合多聚体抗原亚单位疫苗免疫AD模型小鼠后脑组织中Tau 含量变化的分析
在完成以上AD模型动物行为学指标的观察后，然后对重组嵌合抗原亚单位疫苗免疫的 AD模型小鼠于最后一次加强免疫后2个月(即17月龄)进行病理组织切片及免疫组织化学 染色以及蛋白分子水平的检测。检测方法：开颅取脑后固定、脱水等过程后，进行冠状冷冻 切片。切片PBS冲洗，经过溶于PBST进行过氧化反应，封闭处理后，加入鼠源抗Tau单克隆抗体HT7(1:40)，摇匀、孵育过夜。然后，在室温下加入羊抗鼠IgG二抗摇匀、孵育，室 温摇匀、孵育，显色。最后，经过常规粘片、干燥、脱水、透明、封片，光学显微镜下观察 并拍摄，其免疫组化结果如图6中A。与AD模型对照组脑组织相比，重组嵌合抗原亚单位 疫苗免疫的AD模型小鼠脑组织中的阳性神经元则相对少些，使用Quantity One-4.6.2通过分 析染色点对结果进行定量分析，结果显示与对照组相比，免疫组有统计学显著差异(图6中 B)。
对脑内的Tau含量也进行了定量测定。用ELISA试剂盒检测免疫组与对照组3×Tg-AD 模型小鼠的脑提取蛋白液中Tau的含量。方法：(1)首先提取脑组织蛋白。100μl脑组织匀浆液中加入Tris缓冲液(TBS)，经过超声处理后转移到超速离心管，用超低温超速离心机4℃100000g离心1h，收集上清即为可溶性脑组织蛋白，而沉淀用100μl pH 8.0的5×盐酸胍(5M guanidine HCl、50nM Tris-HCl)溶解，即为不可溶性脑组织蛋白。以上各样品，测定蛋白质浓度后，-20℃保存备用。取部分上述蛋白样品进行ELISA定量试剂盒(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)检测人源总Tau的含量。按说明书进行，首先利用标准品制定Tau标准 曲线，然后测定各组样品值，通过标准曲线计算各样品中Tau的含量。检测的统计结果如图 6中C，6/12×(Tau2-18-Th)免疫组与对照组相比可溶性和不可溶性Tau含量均有降低，且不可溶性Tau含量具有统计学显著差异(P<0.05)。
同时用Western Blot方法测定了不同磷酸化程度Tau的水平，方法如下：首先对可溶性 脑组织蛋白进行10％聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后进行转膜，封闭后按适当比例(1:100)加入 HT7(检测总的Tau)、AT100(检测早期高度磷酸化的Tau)和AT8(检测中期高度磷酸化的 Tau)一抗，室温2h或者4℃过夜孵育，一抗结束后TBST洗膜，每次10分钟，共洗3次，用HRP标记的二抗在室温下孵育PVDF膜30min，用TBST洗5次，每次10分钟。配制一 定量的显色液，滴到膜上，使用Image Analysis System软件进行曝光，每个实验至少重复2 次。曝光结束后，使用Quantity One-4.6.2通过分析目的条带对结果进行分析。检测结果如图 6中D和E，表明免疫组明显减少了总的Tau含量。进一步分析早中期高度磷酸化的Tau蛋 白水平(图7中A、B和C)，结果表明这些病理状态的Tau水平也得到了明显的减少。
总之，以上结果提示免疫组不仅减少了总的Tau含量(主要是病理状态的Tau)，而且磷 酸化后的病理状态Tau蛋白含量也得到了极其显著减少，这些结果也提示该免疫治疗达到了 阻止Tau寡聚体的神经毒性和过度磷酸化，并具有中和并或清除Tau寡聚体的作用，最终达 到减轻AD的病理症状。因此，重组嵌合抗原亚单位疫苗免疫AD模型小鼠后起到了靶向作 用，达到了预防效果，有效减缓了AD病理。
实施例6、重组Tau表位嵌合多聚体抗原亚单位疫苗免疫AD模型小鼠后脑组织中Aβ含量变化的分析
在AD病程发展中，Tau病理症状产生于淀粉样斑块形成之前，并且Tau也可能介导了Aβ 的神经毒性。Aβ和Tau是相互关联、相关作用的。同时，本研究也检测了免疫的AD模型小 鼠脑组织中Aβ含量变化。免疫组化(一抗为6E10，1:500)和ELISA试剂盒(Invitrogen,Carlsbad, CA,USA)检测人源Aβ40和Aβ42的含量方法同实施例5中方法。其免疫组化结果如图8中A，AD模型对照组脑组织中有明显的淀粉样斑块存在，而重组嵌合抗原亚单位疫苗免疫的 AD模型小鼠脑组织中的淀粉样斑块则明显相对少和小。使用Quantity One-4.6.2通过分析染 色点对结果进行定量分析，结果显示与对照组相比，免疫组有统计学显著差异(图8中B)。
脑内的Aβ含量检测结果如图8中C和D，6/12×(Tau2-18-Th)免疫组与对照组相比，可溶 性Aβ40和Aβ42和不可溶性Aβ42含量明显降低且具有显著的差异(P<0.01)，但不可溶性 Aβ40含量有一定下降但没有明显统计学差异。以上结果表明，重组嵌合抗原亚单位疫苗免疫 后AD模型小鼠脑组织中的淀粉样斑块或Aβ含量明显减少，提示疫苗免疫后抗体能够清除/ 中和小鼠脑组织中的淀粉样斑块或Aβ含量。以上对Aβ和Tau指标检测的这些结果与行为学 指标结果一起表明，疫苗免疫后达到了减少模型小鼠脑内Aβ和Tau含量即病理特征和改善 学习记忆能力的目标。
实施例7、重组Tau表位嵌合多聚体抗原亚单位疫苗免疫AD模型小鼠后脑组织中Aβ寡聚体含量的分析
目前的学术观点进一步表明在Aβ分子中具毒性的是Aβ寡聚体，特别是12聚体Aβ42， 即Aβ*56，与记忆能力和突触功能损伤相关，并且在AD病人和模型动物脑中已检测到了强 毒性的Aβ寡聚体包括Aβ*56。无论针对主动免疫治疗还是被动免疫治疗，治疗阿尔茨海默 病的着手点应该是检测AD病人脑中出现的可溶性Aβ及寡聚体，以判断其免疫治疗效果。
本发明推测模拟6体和12体Aβ寡聚体结构的重组Tau表位嵌合多聚体6/12×(Tau2-18-Th) 抗原疫苗可能对AD模型小鼠后脑组织中Aβ寡聚体具有特异性的免疫治疗作用，因此本研 究取实施例5中的可溶性脑组织蛋白进行Aβ寡聚体总体水平和不同分子寡聚体水平的检测， 以验证该疫苗的效应。检测方法为点杂交和Western Blot。
点杂交简单步骤为：①先用TBS(20mM Tris-Hcl，PH7.5，0.8％NaCl)处理NC膜以备用。②各组各个可溶性脑组织蛋白样品点于处理的NC膜上，固定。③使用5％脱脂奶粉封 闭过夜。④用A11(1:2,000,Invitrogen)这个Aβ寡聚体特异性的抗体去检测可溶性脑组织 蛋白中的总Aβ寡聚体水平，37℃温箱中反应1h。⑤使用PBS-T清洗5次，每次5min。⑥用 1：1000稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的酶标IgG作为二抗，37℃温箱中反应0.5h。 ⑦使用PBS-T清洗5次，每次5min。⑧使用增强型HRP-DAB底物显色试剂盒显色。结果 如图9中A，使用Quantity One-4.6.2通过分析染色点对结果进行定量(图9中B)， 6/12×(Tau2-18-Th)免疫组与对照组相比可溶性Aβ寡聚体含量明显减少(分别减少了45％和 43％)且具有显著的差异(P<0.05)。
Western Blot检测时，以6E10(1:1,000)为一抗，其他同实施例5，检测结果如图9中 C，模型动物组在28kDa和56kDa处有明显的两条带，分别为6体和12体Aβ寡聚体，这 两种分子是Aβ寡聚体最为常见，最具毒性的分子，而免疫组则明显减少或弱，定量结果也 显示有极其显著的差异，见图9中D和E。因此，该重组嵌合抗原亚单位疫苗免疫AD模型 小鼠后减少脑组织中的Aβ寡聚体，特别是6和12体Aβ寡聚体毒性分子减少得非常明显。 以上结果提示该重组嵌合抗原可能具备更优的构象表位，通过直接或间接的机制更有利于清 除6体和12体Aβ寡聚体，这将在今后的临床应用和效应上具有更好的效果。
实施例8、重组Tau表位嵌合多聚体抗原亚单位疫苗免疫AD模型小鼠后脑组织中各突 触蛋白水平的分析
Tau蛋白主要在中枢神经系统的神经元轴突中表达，其主要功能是与微管蛋白结合，维 持微管的稳定性，此外Tau蛋白还涉及参与轴突运输和突触功能的调节等。PSD-95存在于神 经元后突触区，对突触的稳定性极为重要。Dynamin 1主要存在突触前体，负责囊泡的循环。 另外，Aβ通过NMDAR造成持续的胞外钙流，激活钙蛋白酶(Calpain)活性，导致dynamin 1降解而下调；而PSD-95作为突触后膜上标记蛋白，钙蛋白酶激活也会导致PSD-95降解， 从而造成神经功能障碍及认知能力下降。最近的研究结果强调了Aβ寡聚体通过NMDAR或 AMPA受体诱导或介导了AD的突触功能损伤。
总之，鉴于Aβ和Tau是相互关联、相关作用的。因此，本专利通过最模拟阿尔茨海默病的3×Tg AD模型小鼠来研究6/12×(Tau2-18-Th)免疫后dynamin 1和PSD-95等表达模式或 变化情况，用于评价AD免疫治疗的效应。
本研究对免疫治疗和对照组3×Tg-AD模型小鼠的脑蛋白进行Western blot检测。方法： 参照实施例5，一抗分别为anti-dynamin 1(C16,1:2,000,Santa CruzBiotechnology,Inc.)， anti-PSD-95(1:500,Invitrogen)和anti-β-actin(1:10,000,Sigma,MO,USA，作为内参对照)， 用于检测各自蛋白。检测和定量结果如图10。对照组3×Tg-AD模型小鼠与C57BL/6小鼠相 比，各种突触蛋白水平下调或降解，表明它们的认识功能障碍和认识能力发生了损伤，这与 脑内富集Aβ寡聚体和Tau以及行为学能力下降是直接相关的。重组嵌合抗原亚单位疫苗免 疫组小鼠内Dynamin 1和PSD-95突触蛋白水平均得到了显著的上调(图10)，其水平与正常 C57BL/6小鼠相当。因此，本研究结果提示通过重组嵌合抗原亚单位疫苗免疫减少3×Tg-AD 模型小鼠Aβ和Tau水平，可降低钙蛋白酶活性，进而上调与神经突触功能相关的蛋白或保 护了与神经突触功能相关蛋白的降解，从而保护神经突触功能，或改善行为学能力。
总之，本发明设计和制备的重组Tau表位嵌合多聚体抗原6/12×(Tau2-18-Th)具有独特结 构特性，是一种全新的重组抗原，其单分子结构为Tau2-18 B细胞表位+辅助性T细胞表位， 即Tau2-18-Th。而6或12个串联的Tau2-18-Th分子形成多聚体结构，即6×(Tau2-18-Th)和 12×(Tau2-18-Th)，以模拟聚集状态下Tau蛋白特别是异常暴露出PAD，以期能够诱导产生针 对Tau的抗体结合这个区域能够阻止Tau寡聚体的神经毒性和过度磷酸化。其作为亚单位疫 苗免疫3×Tg-AD模型小鼠改善了学习记忆能力，减少脑组织中的Tau和Aβ病理状态，减少 Aβ寡聚体水平和磷酸化Tau等毒性分子。同时，该重组Tau表位嵌合多聚体抗原免疫模型动 物后上调与神经突触功能相关的蛋白，从而达到保护神经突触功能，或改善行为学能力。总 之，这些结果表明该重组Tau表位嵌合多聚体抗原作为亚单位疫苗能够同时减弱Tau和Aβ 病理状态，阻止寡聚体的神经毒性和过度Tau磷酸化，达到预防AD的目的；也证实了磷酸 化的Tau形成寡聚体后暴露PAD是一个重要的免疫治疗靶标，有望作为阿尔茨海默病的免疫 预防和治疗的新型疫苗候选，具有良好的应用前景和研究价值。
对比例：
本发明所提供的重组Tau表位嵌合多聚体抗原6/12×(Tau2-18-Th)与文献“HaykDavtyan, et al.MultiTEP platform-based DNA epitope vaccine targeting N-terminus of tau induces strong immune responses and reduces tau pathology inTHY-Tau22 mice，Vaccine 35(2017)2015–2024” 中的AV-1980D核酸DNA疫苗相比，不同之处和优势如下：
1、抗原分子结构和疫苗形式不同
本发明是一个Tau2-18多肽与两个外源辅助性T细胞表位T和P2，形成一个嵌合分子 Tau2-18-T-P2作为基本，命名为Tau2-18-Th。同时基于先前的研究结果表明聚集状态下Tau 蛋白是具有毒性作用的，因此设想将上述嵌合分子进行了6个和12个重复串联，形成多聚体 结构的重组融合抗原6×(Tau2-18-Th)和12×(Tau2-18-Th)，构成一个大分子重组抗原。
而对比文献中的AV-1980D是核酸DNA疫苗，其结构如下：
Figure RE-GDA0002787885830000011
AV-1980D疫苗分子结构是三个串联的Tau2-18-Tau2-18-Tau2-18分子加上12个不同的辅 助性T细胞表位融合构成的大分子；无基本单元结构，无6或12个多聚体结构特性。
另外，AV-1980D是核酸疫苗，通过将DNA注射体内，通过机体表达该抗原分子来诱导 免疫；本发明是通过原核表达获得了可溶性重组6×(Tau2-18-Th)和12×(Tau2-18-Th)嵌合抗原 蛋白，经过纯化后与铝佐剂配制后作为亚单位疫苗使用。
2、疫苗评价指标和免疫效果不同
AV-1980D疫苗免疫了THY-Tau22动物模型，评价了免疫反应水平，2-7次免疫后产生的 抗体水平较低，仅仅为250μg/ml，多次免疫后没有增强抗体水平。
仅仅针对Tau的病理症状进行检测，包括免疫组化和定量检测进行了Tau水平，结果是 总Tau和AT180特异的磷酸化Tau减少有显著差异，其他指标无效果。并且其他免疫治疗效 果指标均未进行检测与评价。
而本发明6/12×(Tau2-18-Th)嵌合抗原疫苗免疫了普通动物和模型动物，各种指标均进行 了检测。结果表明重组6/12×(Tau2-18-Th)嵌合抗原低剂量少次免疫普通和模型小鼠后都能产 生高水平Th2型抗Tau2-18抗体，可达到了1000μg/ml以上，且没有产生针对Tau2-18的T 细胞免疫反应，并且减少模型小鼠脑内Aβ(包括可溶性寡聚体)和Tau病理水平包括总Tau 和磷酸化Tau，上调了相关突触蛋白水平，改善了学习记忆能力。
总之，本发明综合地评价了疫苗的效果，表明该靶向Tau2-18的重组嵌合表位疫苗是AD 新型疫苗研究的一个新方向，在阿尔茨海默病的预防中具有非常大的潜力和应用前景。
<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院
<120> 重组Tau表位嵌合多聚体抗原、其制备方法和应用
<130> GNCLN192278
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 858
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 1
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gttgccgctt ggactctgaa agccgcggct ggttctcagt acatcaaagc taactctaag 120
ttcattggca tcaccgaggg ttccgctgag ccgcgtcaag agtttgaggt tatggaggat 180
catgctggca cttatgctaa gtttgtggca gcctggacct tgaaggctgc agcgggctcc 240
caatatatta aggccaattc caaatttatc ggtattactg agggctctgc cgagccacgc 300
caggagttcg aggtaatgga agatcacgct ggtacttacg cgaaattcgt agctgcctgg 360
actctgaaag cagcggctgg ttcccagtat atcaaggcga actctaaatt cattggtatc 420
accgaaggat ctgctgaacc gcgtcaagaa tttgaagtaa tggaggacca tgccggcacc 480
tatgccaagt ttgttgcggc ttggacctta aaggctgccg caggctctca atacattaaa 540
gccaattcca agtttatcgg tattactgag ggctccgccg aaccgcgcca ggaatttgag 600
gtgatggagg atcacgccgg cacttacgcc aaattcgtag ctgcatggac tttgaaagca 660
gctgcgggat ctcagtatat caaggctaac tctaaattca ttggcattac cgaaggttct 720
gctgagccac gtcaggagtt cgaagttatg gaagaccacg ctggtaccta tgccaagttt 780
gtggcagctt ggaccctgaa ggcggccgca ggctcccagt acattaaagc caattcgaag 840
ttcatcggga tcactgaa 858
<210> 2
<211> 1722
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 2
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<210> 3
<211> 286
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<400> 3
Ala Glu Pro Arg Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly Thr
1 5 10 15
Tyr Ala Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala Gly Ser
20 25 30
Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Gly Ser
35 40 45
Ala Glu Pro Arg Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly Thr
50 55 60
Tyr Ala Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala Gly Ser
65 70 75 80
Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Gly Ser
85 90 95
Ala Glu Pro Arg Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly Thr
100 105 110
Tyr Ala Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala Gly Ser
115 120 125
Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Gly Ser
130 135 140
Ala Glu Pro Arg Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly Thr
145 150 155 160
Tyr Ala Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala Gly Ser
165 170 175
Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Gly Ser
180 185 190
Ala Glu Pro Arg Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly Thr
195 200 205
Tyr Ala Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala Gly Ser
210 215 220
Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Gly Ser
225 230 235 240
Ala Glu Pro Arg Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly Thr
245 250 255
Tyr Ala Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala Gly Ser
260 265 270
Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu
275 280 285
<210> 4
<211> 574
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<400> 4
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1 5 10 15
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260 265 270
Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Gly Ser
275 280 285
Ala Glu Pro Arg Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly Thr
290 295 300
Tyr Ala Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala Gly Ser
305 310 315 320
Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Gly Ser
325 330 335
Ala Glu Pro Arg Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly Thr
340 345 350
Tyr Ala Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala Gly Ser
355 360 365
Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Gly Ser
370 375 380
Ala Glu Pro Arg Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly Thr
385 390 395 400
Tyr Ala Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala Gly Ser
405 410 415
Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Gly Ser
420 425 430
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435 440 445
Tyr Ala Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala Gly Ser
450 455 460
Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Gly Ser
465 470 475 480
Ala Glu Pro Arg Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly Thr
485 490 495
Tyr Ala Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala Gly Ser
500 505 510
Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Gly Ser
515 520 525
Ala Glu Pro Arg Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly Thr
530 535 540
Tyr Ala Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala Gly Ser
545 550 555 560
Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu
565 570

Claims (14)

1.重组Tau表位嵌合多聚体抗原，为如下任一：
（A1）由6个串联的基本单元组成；
（A2）由12个串联的所述基本单元组成；
（A3）在（A1）或（A2）所限定的蛋白质的N端和/或C端连接蛋白标签后得到的融合蛋白；
所述基本单元由依次融合连接的Tau蛋白的磷酸酶激活域和两个辅助性T细胞表位Th组成；
所述Tau蛋白的磷酸酶激活域的氨基酸序列如SEQ ID No.3的第1-17位所示。
2.根据权利要求1所述的重组Tau表位嵌合多聚体抗原，其特征在于：所述两个辅助性T细胞表位Th分别为通用型DR辅助性T细胞表位PADRE和破伤风毒素人CD4+表位P2。
3.根据权利要求2所述的重组Tau表位嵌合多聚体抗原，其特征在于：所述通用型DR辅助性T细胞表位PADRE的氨基酸序列如SEQ ID No.3的第18-30位所示。
4.根据权利要求2所述的重组Tau表位嵌合多聚体抗原，其特征在于：所述破伤风毒素人CD4+表位P2的氨基酸序列如SEQ ID No.3的第33-46位所示。
5.根据权利要求1-4中任一所述的重组Tau表位嵌合多聚体抗原，其特征在于：（A1）中所述重组Tau表位嵌合多聚体抗原的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示；（A2）中所述重组Tau表位嵌合多聚体抗原的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。
6.编码权利要求1-5中任一所述的重组Tau表位嵌合多聚体抗原的核酸分子。
7.根据权利要求6所述的核酸分子，其特征在于：编码所述Tau蛋白的磷酸酶激活域的核酸分子为SEQ ID No.1的第1-51位。
8.根据权利要求6所述的核酸分子，其特征在于：编码所述通用型DR辅助性T细胞表位PADRE的核酸分子为SEQ ID No.1的第52-90位。
9.根据权利要求6所述的核酸分子，其特征在于：编码所述破伤风毒素人CD4+表位P2的核酸分子为SEQ ID No.1的第97-138位。
10.根据权利要求6-9中任一所述的核酸分子，其特征在于：编码所述重组Tau表位嵌合多聚体抗原的核酸分子为如下任一：
（B1）SEQ ID No.1所示的DNA分子；
（B2）SEQ ID No.2所示的DNA分子。
11.含有权利要求6-10中任一所述核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
12.一种制备权利要求1-5中任一所述的重组Tau表位嵌合多聚体抗原的方法，包括如下步骤：将权利要求6-10中任一所述核酸分子克隆到原核表达载体，然后通过原核表达系统获得所述重组Tau表位嵌合多聚体抗原。
13.如下任一应用：
（C1）权利要求1-5中任一所述的重组Tau表位嵌合多聚体抗原在制备阿尔茨海默病亚单位疫苗中的应用；
（C2）权利要求1-5中任一所述的重组Tau表位嵌合多聚体抗原在制备用于预防和/或治疗阿尔茨海默病的药物中的应用；
（C3）权利要求1-5中任一所述的重组Tau表位嵌合多聚体抗原在制备用于提高阿尔茨海默病患者学习记忆能力的产品中的应用；
（C4）权利要求6-10中任一所述核酸分子或权利要求11所述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在制备权利要求1-5中任一所述的重组Tau表位嵌合多聚体抗原中的应用。
14.一种用于预防和/或治疗阿尔茨海默病的疫苗或药物，其活性成分为权利要求1-5中任一所述的重组Tau表位嵌合多聚体抗原。
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002096350A3 (en) * 2001-05-25 2004-11-11 United Biomedical Inc Immunogenic peptide composition for the prevention and treatment of alzheimer's disease
CN101277714A (zh) * 2005-09-06 2008-10-01 三一治疗公司 治疗免疫介导的神经疾病的方法
CN102596221A (zh) * 2009-06-10 2012-07-18 纽约大学 病理tau蛋白的免疫靶向
WO2014031697A2 (en) * 2012-08-21 2014-02-27 The Institute Of Molecular Medicine COMPOSITIONS AND METHODS RELATED TO DISEASES ASSOCIATED WITH DEPOSITS OF AMYLOID, TAU, AND α-SYNUCLEIN

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002096350A3 (en) * 2001-05-25 2004-11-11 United Biomedical Inc Immunogenic peptide composition for the prevention and treatment of alzheimer's disease
CN101277714A (zh) * 2005-09-06 2008-10-01 三一治疗公司 治疗免疫介导的神经疾病的方法
CN102596221A (zh) * 2009-06-10 2012-07-18 纽约大学 病理tau蛋白的免疫靶向
WO2014031697A2 (en) * 2012-08-21 2014-02-27 The Institute Of Molecular Medicine COMPOSITIONS AND METHODS RELATED TO DISEASES ASSOCIATED WITH DEPOSITS OF AMYLOID, TAU, AND α-SYNUCLEIN

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MultiTEP platform-based DNA epitope vaccine targeting N-terminus oftau induces strong immune responses and reduces tau pathology in THY-Tau22 mice;Hayk Davtyan etal;《Vaccine》;20170318;第35卷(第2017期);第2015-2024页 *
Peripherally administered sera antibodies recognizing amyloid-beta oligomers mitigate Alzheimer’s disease-like pathology and cognitive decline in aged 3xTg-AD mice;Hai-Chao Wang etal;《Vaccine》;20160302;第34卷(第2016期);第1758-1766页 *
阿尔茨海默病重组基因工程亚单位疫苗研究;李庆丽;《中国优秀硕士学位论文全文数据库》;20180615;第E059-64页 *

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