CN110128511B - 一种用于减肥的重组蛋白、疫苗及其构建方法 - Google Patents

一种用于减肥的重组蛋白、疫苗及其构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于疫苗技术领域，公开了一种用于减肥的重组蛋白、疫苗及其构建方法，用于减肥的疫苗为重组蛋白1；重组蛋白1的蛋白序列为SEQ ID NO：1；重组蛋白1的基因DNA序列为SEQ ID NO：2。本发明通过独特结构的重组蛋白免疫，通过中和体内分泌的生长抑素，相对增加生长激素的分泌量，有效降低营养性肥胖小鼠的体重与脂肪含量；从而解决了现有技术中减肥药物需长期使用、不良反应大、治疗费用高等问题。

Description

一种用于减肥的重组蛋白、疫苗及其构建方法
技术领域
本发明属于疫苗技术领域，具体涉及一种用于减肥的重组蛋白、疫苗及其构建方法。
背景技术
目前，业内常用的现有技术是这样的：据调查，近30年来，中国的超重和肥胖人数就位列美国之后，处于全球第二，并且呈“肥胖爆炸性增长”。世界卫生组织将肥胖认定为全球成人最大的慢性疾病。
肥胖按发生原因可分为三大类，第一类是遗传性肥胖，常有家族性肥胖倾向。第二类为继发性肥胖，主要指内分泌障碍而导致的肥胖。以上两类肥胖病人占整个肥胖人数的10％以下。最后一类为单纯性肥胖，主要是指排除由遗传性、代谢性疾病、外伤或其他疾病所引起的继发性、病理性肥胖，而单纯由于营养过剩所造成的全身性脂肪过量积累，占肥胖人总数的90％以上。
肥胖不仅是心血管病一个重要的独立危险因素，而且还容易诱发某些癌症。肥胖导致的疾病，成为全球卫生保健和卫生资源的沉重负担。
现可供选择的抗肥胖药物却仅主要有去甲肾上腺素再摄取抑制剂盐酸芬特明(phentermine hydrochloride)和脂酶抑制剂奥利司他(orlistat/Xenical,Alli)2个药物，其中获准长期(＞6个月)管理肥胖和超重患者体重的只有奥利司他1个药物。
奥利司他能在胃肠道中与胃和胰脂酶结合，由此阻止这些酶将膳食脂肪水解成可吸收的游离脂肪酸，而未水解的脂肪则与胆固醇和脂溶性维生素一起随粪排出。奥利司他可阻止近30％膳食脂肪的吸收，安全性尚好。不过，奥利司他的减重疗效有限，仅能使肥胖和超重患者的体重自基线降低约3％。此外，因作用机制关系，奥利司他的不良反应较为常见，特别是便急、便失禁和油样便等症状非常令人讨厌，致使患者的依从性和耐受性不佳。
肥胖症是一种慢性、复发性、多成因疾病，需长期治疗以减少肥胖相关疾病风险。正因为需要长期治疗，所以抗肥胖药物的有效性和安全性非常重要。
根据已发表的资料，近百种机制可能或多或少地参与了肥胖症的形成和发展。国内外各在药厂投入了大量人力和资金对其中一些胡苗头的机制进行新药开发研究。
综上所述，现有技术存在的问题是：
现有的技术中对于肥胖的控制均是先发现再抑制或质量，所以失去了先机，增加减肥者的心理负担和精神压力，增加减肥所用费用。
而且现有技术中减肥药物需长期使用、不良反应大、治疗费用高。
解决上述技术问题的难度：
从药物开发的角度讲，中枢性减肥药的研究有一定困难。第一个困难是如何使药物有效地通过血脑屏障；第二个困难是药物引起的中枢性副作用。与中枢性减肥药相比，外周作用的药物产生的副作用较轻，但这类药物的一个潜在的危险因素是药物在肝脏积累的可能性；另一个值得考虑的因素是抑制某一代谢酶的活性后，酶的底物有可能在体内积聚。
解决上述技术问题的意义：
基于这样的时代背景，如能够开发出具有良好减肥效果的、使用方便安全的减肥药物是有重要意义的。本发明即为解决这一难题提供了一种可能。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种用于减肥的重组蛋白、疫苗及其构建方法。
本发明是这样实现的，一种用于减肥的重组蛋白，所述用于减肥的重组蛋白氨基酸序列SEQ ID NO：1。
重组蛋白1蛋白序列：
>Protein1LIJUN_20180822：
MAPQTITELCSEYRNTQIYTINDKILSYTESMAGKREMVIITFKSGETFQVEVPGSQHIDSQKKAIERMKDTLRITYLTETKIDKLCVWNNKTPNSIAAISMKNEFAKFVAAWTLKAAAGSAGCKNFFWKTFTSCLEHHHHHH。
注释：N端第1位是甲硫氨酸，这是因为采用大肠杆菌表达系统的缘故。N端第2位至第104位(103AA)为LTB(大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位)。N端第105-106位为接头序列EF，N端第107-119位为免疫增强序列，N端第120-121位为接头序列GS，第122-135位为生长抑素序列，第136-137位为接头序列LE，第138-143位6His标签。
本发明的另一目的在于提供一种编码所述用于减肥的重组蛋白的基因，所述用于减肥的重组蛋白的基因DNA序列为SEQ ID NO：2。
>Protein1-Gene LIJUN_20181017：
ATGGCTCCCCAGACTATTACAGAACTATGTTCGGAATATCGCAACACACAAATATATACGATAAATGACAAGATACTATCATATACGGAATCGATGGCAGGCAAAAGAGAAATGGTTATCATTACATTTAAGAGCGGCGAAACATTTCAGGTCGAAGTCCCGGGCAGTCAACATATAGACTCCCAGAAAAAAGCCATTGAAAGGATGAAGGACACATTAAGAATCACATATCTGACCGAGACCAAAATTGATAAATTATGTGTATGGAATAATAAAACCCCCAATTCAATTGCGGCAATCAGTATGAAAAACGAATTCGCTAAATTCGTTGCTGCATGGACCCTGAAAGCTGCTGCTGGATCCGCAGGCTGCAAGAACTTCTTCTGGAAAACCTTCACCAGCTGTCTCGAGCACCACCACCACCACCACTGA。
本发明的另一目的在于提供一种所述用于减肥的重组蛋白的构建方法，所述用于减肥的重组蛋白的构建方法包括：
1)LTB基因的克隆：
根据大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位的基因序列(>LTB LIJUN 20180910)设计引物，引物两端为NcoI和EcoRI酶切位点序列；从产肠毒素大肠杆菌K88菌株(可从中国兽医微生物菌种保藏管理中心或美国菌种保藏机构NTCC等菌毒种保藏机构购买)提取质粒DNA，利用PCR扩增LTB基因，在NcoI和EcoRI酶切位点插入原核表达载体pET-28a，构建重组质粒LTB/pET28a转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株，测序验证。
2)重组蛋白SEQ ID NO：3表达载体的构建：
委托相关生物技术公司合成重组蛋白基因SEQ ID NO：4，在NcoI和XhoI两个酶切位点处插入原核表达载体pET-28a，转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株，测序验证，成功构建用于重组蛋白SEQ ID NO：3表达的基因工程菌。
重组蛋白SEQ ID NO：3氨基酸序列为：
>Protein4LIJUN_20181017：
MAKFVAAWTLKAAAGSAGCKNFFWKTFTSCLEHHHHHH。
注释：N端第1位为甲硫氨酸，N端第2-14位为免疫相关序列1，N端第15-16位为甘氨酸与丝氨酸，N端第17-30位为生长抑素序列，N端第31-32位为亮氨酸与谷氨酸，羧基端6个氨基酸为6个组氨酸标签。
重组蛋白基因SEQ ID NO：4DNA序列为：
>Protein4-Gene LIJUN_20181017：
CCATGGCTAAATTCGTTGCTGCATGGACCCTGAAAGCTGCTGCTGGATCCGCAGGCTGCAAGAACTTCTTCTGGAAAACCTTCACCAGCTGTCTCGAGCACCACCACCACCACCACTGA。
3)重组蛋白SEQ ID NO：1的表达载体的构建：
从重组蛋白SEQ ID NO：3的基因工程菌提取质粒DNA，设计引物用PCR方法克隆蛋白基因SEQ ID NO：4，在EcoRI与XhoI酶切位点处插入重组质粒LTB/pET28a，转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株，测序验证，成功构建用于重组蛋白SEQ ID NO：1表达的基因工程菌；将该基因工程菌按常规方法用IPTG诱导表达，离心收集菌体，超声破碎，离心分离上清液与包涵体，用SDS-PAGE进行检测，未检测到表达条带，反复优化工艺仍未能获得表达条带，说明重组蛋白SEQ ID NO：1用该方法不能获得目标蛋白。
4)重组蛋白工程菌的诱导表达：
从重组蛋白SEQ ID NO：1的E.coli BL21(DE3)基因工程菌中按常规方法用质粒DNA提取试剂盒提取重组蛋白SEQ ID NO：1的表达质粒载体，转入E.coli Rosetta(DE3)菌株中，测序验证，成功构建用于重组蛋白SEQ ID NO：1表达的基因工程菌。再通过工程菌的发酵、重组蛋白的分离、纯化、复性等步骤获得重组蛋白SEQ ID NO：1。将该基因工程菌按常规方法用IPTG诱导表达，离心收集菌体，超声破碎，离心分离上清液与包涵体，用SDS-PAGE进行检测，并用His标签抗体进行免疫印迹检测，证明诱导后在分子量约1.4万处出现了目标蛋白条带，说明构建与表达成功。
进一步，重组蛋白SEQ ID NO：3的表达载体的构建方法包括：
委托相关生物技术公司合成重组蛋白基因SEQ ID NO：4，在NcoI和XhoI两个酶切位点处插入原核表达载体pET-28a，转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株，测序验证，成功构建了用于重组蛋白3表达的基因工程菌。将该基因工程菌按常规方法用IPTG诱导表达，离心收集菌体，超声破碎，离心分离上清液与包涵体，用SDS-PAGE进行检测，未检测到表达条带，再用小肽电泳Tris-Tricine-SDS-PAGE进行检测，仍未检测到表达条带，说明重组蛋白SEQ ID NO：3用该方法不能获得目标蛋白。
本发明的另一目的在于提供一种利用所述用于减肥的重组蛋白制备的疫苗。
本发明的另一目的在于提供一种利用所述的疫苗在用于验证疫苗药效的动物模型构建方法，所述动物模型构建方法包括：
第一步，用重组蛋白SEQ ID NO：1免疫昆明种小鼠，分离血清，ELISA法测效价，证明可在小鼠体内产生有效的免疫。
第二步，用高脂饲料饲喂C57BL/6J小鼠，构建了营养性肥胖小鼠模型。在第三次免疫后一周称重，实验组肥胖模型小鼠体重下降幅度与模型对照组小鼠相比极为显著(P<0.01)。实验组肥胖模型小鼠腹部脂肪重量小于肥胖模型对照组小鼠腹部脂肪重量，二者有极显著差异(P<0.01)。小鼠肝脏的组织切片显示，肥胖模型对照组小鼠肝细胞广泛地发生脂肪变性，而实验组只有部分肝细胞发生脂肪变性。说明重组蛋白1免疫肥胖小鼠，可以减少内脏脂肪重量，减轻肝细胞脂肪变性程度，减轻肥胖小鼠体重。
综上所述，本发明的优点及积极效果为：
本发明通过独特结构的重组蛋白免疫，通过中和体内分泌的生长抑素，相对增加生长激素的分泌量，可有效降低营养性肥胖小鼠的体重与脂肪含量；从而解决了现有技术中减肥药物需长期使用、不良反应大、治疗费用高等问题。
本发明通过实验实例充分证明了该重组蛋白的减肥效果，本发明的重组蛋白具有自主设计的独特的蛋白序列与结构，重组蛋白单独使用即可刺激机体产生高效价的抗体，这是任何现有技术都未能实现的。现有技术中，生长抑素抗体用于减肥，仅检索到一篇文献，但该文献中提到的重组蛋白在免疫时使用了佐剂。
本发明克服了现有技术偏见：本领域一般公认，重组蛋白作为抗原，必须与额外添加的免疫佐剂现时使用，若不然，则产生的免疫效果较差，不具备临床应用前景。而本发明不用添加任何额外的免疫佐剂。
附图说明
图1是本发明实施例提供的用于减肥的重组蛋白1的构建方法流程图。
图2是本发明实施例提供的采用SPSS17.0软件分析结果，组间P/N值差异用t检验图一。
图3是本发明实施例提供的采用SPSS17.0软件分析结果，组间P/N值差异用t检验图二。
图4是本发明实施例提供的采用SPSS17.0软件分析结果，组间P/N值差异用t检验图三。
图5是本发明实施例提供的采用SPSS17.0软件分析结果，组间P/N值差异用t检验图四。
图6是本发明实施例提供的采用SPSS17.0软件分析结果，组间P/N值差异用t检验图五。
图7是本发明实施例提供的采用SPSS17.0软件分析结果，组间P/N值差异用t检验图六。
图8是本发明实施例提供的实验2组与4组肥胖模型小鼠体重下降幅度与模型对照组小鼠相比无显著差异图。图中group3为重组蛋白1。
图9是本发明实施例提供的实验2组与4组肥胖模型小鼠体重下降幅度与模型对照组小鼠相比无显著差异图。图中group4为重组蛋白2。
图10是本发明实施例提供的第3组(重组蛋白1)小鼠的腹部脂肪重量与肥胖模型组相比有极显著差异(P<0.01)图一。
图中group3为重组蛋白1。
图11是本发明实施例提供的第3组(重组蛋白1)小鼠的腹部脂肪重量与肥胖模型组相比有极显著差异(P<0.01)图二。
图中group4为重组蛋白2。
图12是本发明实施例提供的小鼠内脏脂肪组织图片。
图中：group3为重组蛋白1，group4为重组蛋白2。
图中：Group1-4:实验组，group5:模型对照组，group6:正常对照组。
图13是本发明实施例提供的肝脏HE切片图片。
图14是本发明实施例提供的胰岛素样生长因子-1(IGF-1)含量测定标准曲线图。
图15是本发明实施例提供的小鼠IGF-1含量图一。
图16是本发明实施例提供的小鼠IGF-1含量图二。
图17是本发明实施例提供的重组蛋白1的SDS-PAGE电泳图，箭头所示为重组蛋白1。
图18是本发明实施例提供的用His标签抗体进行的重组蛋白1的免疫印迹图，证明诱导表达的是目标蛋白图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
现有的技术中对于肥胖的控制均是先发现在抑制或质量，失去了先机，增加减肥者的心理负担和精神压力，增加减肥所用费用问题。
为解决上述技术问题，下面结合具体方案对本发明作详细描述。
本发明实施例提供的用于减肥的重组蛋白1，氨基酸序列SEQ ID NO：1。
重组蛋白1蛋白序列：
>Protein1LIJUN_20180822：
MAPQTITELCSEYRNTQIYTINDKILSYTESMAGKREMVIITFKSGETFQVEVPGSQHIDSQKKAIERMKDTLRITYLTETKIDKLCVWNNKTPNSIAAISMKNEFAKFVAAWTLKAAAGSAGCKNFFWKTFTSCLEHHHHHH。
注释：N端第1位是甲硫氨酸，这是因为采用大肠杆菌表达系统的缘故。N端第2位至第104位(103AA)为LTB(大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位)。N端第105-106位为接头序列EF，N端第107-119位为免疫增强序列，N端第120-121位为接头序列GS，第122-135位为生长抑素序列，第136-137位为接头序列LE，第138-143位6His标签。
本发明实时提供的一种编码所述用于减肥的重组蛋白1的基因，DNA序列为SEQ IDNO：2。
>Protein1-Gene LIJUN_20181017：
ATGGCTCCCCAGACTATTACAGAACTATGTTCGGAATATCGCAACACACAAATATATACGATAAATGACAAGATACTATCATATACGGAATCGATGGCAGGCAAAAGAGAAATGGTTATCATTACATTTAAGAGCGGCGAAACATTTCAGGTCGAAGTCCCGGGCAGTCAACATATAGACTCCCAGAAAAAAGCCATTGAAAGGATGAAGGACACATTAAGAATCACATATCTGACCGAGACCAAAATTGATAAATTATGTGTATGGAATAATAAAACCCCCAATTCAATTGCGGCAATCAGTATGAAAAACGAATTCGCTAAATTCGTTGCTGCATGGACCCTGAAAGCTGCTGCTGGATCCGCAGGCTGCAAGAACTTCTTCTGGAAAACCTTCACCAGCTGTCTCGAGCACCACCACCACCACCACTGA。
下面结合附图对本发明技术方案作进一步描述。
如图1所示，本发明实施例提供用于减肥的重组蛋白1的构建方法，包括：
S101，LTB基因的克隆：根据大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位的基因序列(>LTBLIJUN20180910)设计引物，引物两端为NcoI和EcoRI酶切位点序列；从产肠毒素大肠杆菌K88菌株提取质粒DNA，利用PCR扩增LTB基因，在NcoI和EcoRI酶切位点插入原核表达载体pET-28a，构建重组质粒LTB/pET28a转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株，测序验证。
S102，重组蛋白4表达载体的构建：委托相关生物技术公司合成重组蛋白4的重组蛋白基因SEQ ID NO：4，在NcoI和XhoI两个酶切位点处插入原核表达载体pET-28a，转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株，测序验证，成功构建用于重组蛋白4表达的基因工程菌。重组蛋白4氨基酸序列为：>Protein4LIJUN_20181017：MAKFVAAWTLKAAAGSAGCKNFFWKTFTSCLEHHHHHHSEQ ID NO：3。
其中，N端第1位为甲硫氨酸，N端第2-14位为免疫相关序列1，N端第15-16位为甘氨酸与丝氨酸，N端第17-30位为生长抑素序列，N端第31-32位为亮氨酸与谷氨酸，羧基端6个氨基酸为6个组氨酸标签。
重组蛋白4的重组蛋白基因SEQ ID NO：4DNA序列为：
>Protein4-Gene LIJUN_20181017：
CCATGGCTAAATTCGTTGCTGCATGGACCCTGAAAGCTGCTGCTGGATCCGCAGGCTGCAAGAACTTCTTCTGGAAAACCTTCACCAGCTGTCTCGAGCACCACCACCACCACCACTGA。
S103，重组蛋白1的表达载体的构建：从重组蛋白4的基因工程菌提取质粒DNA，设计引物用PCR方法克隆蛋白基因SEQ ID NO：4，在EcoRI与XhoI酶切位点处插入重组质粒LTB/pET28a，转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株，测序验证，成功构建用于重组蛋白1表达的基因工程菌；将该基因工程菌按常规方法用IPTG诱导表达，离心收集菌体，超声破碎，离心分离上清液与包涵体，用SDS-PAGE进行检测，未检测到表达条带，反复优化工艺仍未能获得表达条带，说明重组蛋白SEQ ID NO：1用该方法不能获得目标蛋白。
S104，重组蛋白工程菌的诱导表达：从重组蛋白1的E.coli BL21(DE3)基因工程菌中按常规方法用质粒DNA提取试剂盒提取重组蛋白SEQ ID NO：1的表达质粒载体，转入E.coli Rosetta(DE3)菌株中，测序验证，成功构建用于重组蛋白1表达的基因工程菌。再通过工程菌的发酵、重组蛋白的分离、纯化、复性等步骤获得重组蛋白1。将该基因工程菌按常规方法用IPTG诱导表达，离心收集菌体，超声破碎，离心分离上清液与包涵体，用SDS-PAGE进行检测，并用His标签抗体进行免疫印迹检测，证明诱导后在分子量约1.4万处出现了目标蛋白条带，说明构建与表达成功。如图17-18所示。
步骤S102中，BL21(DE3)菌株为表达型大肠杆菌菌株，生物公司均可买到。其它所有的基因工程菌均为自主构建，且说明书实例中提供了具体构建方法与过程，符合专利法及其实施条例的要求。本发明的生物材料的基因工程制备方法中还涉及除自主构建的基因工程菌外，其他的多个基因序列、酶切位点、工程菌株根据说明书中的起始质粒材料图谱可以确认，均属于现有技术，该生物材料是可以通过基因工程重复制得的，不属于“公众不能得到的生物材料”。
在本发明实施例中，重组蛋白4的表达载体的构建方法包括：委托相关生物技术公司合成重组蛋白基因SEQ ID NO：4，在NcoI和XhoI两个酶切位点处插入原核表达载体pET-28a，转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株，测序验证，成功构建了用于重组蛋白3表达的基因工程菌。将该基因工程菌按常规方法用IPTG诱导表达，离心收集菌体，超声破碎，离心分离上清液与包涵体，用SDS-PAGE进行检测，未检测到表达条带，再用小肽电泳Tris-Tricine-SDS-PAGE进行检测，仍未检测到表达条带，说明重组蛋白SEQ ID NO：3用该方法不能获得目标蛋白。
在本发明实施例中，提供一种用于验证疫苗在减肥效果的动物模型的构建方法，包括：
第一步，用重组蛋白SEQ ID NO：1免疫昆明种小鼠，分离血清，ELISA法测效价，证明可在小鼠体内产生有效的免疫。
第二步，用高脂饲料饲喂C57BL/6J小鼠，构建了营养性肥胖小鼠模型。在第三次免疫后一周称重，实验组肥胖模型小鼠体重下降幅度与模型对照组小鼠相比极为显著(P<0.01)。实验组肥胖模型小鼠腹部脂肪重量小于肥胖模型对照组小鼠腹部脂肪重量，二者有极显著差异(P<0.01)。小鼠肝脏的组织切片显示，肥胖模型对照组小鼠肝细胞广泛地发生脂肪变性，而实验组只有部分肝细胞发生脂肪变性。说明重组蛋白1免疫肥胖小鼠，可以减少内脏脂肪重量，减轻肝细胞脂肪变性程度，减轻肥胖小鼠体重。
下面结合具体实施例对本发明作进一步描述。
实例1-------重组蛋白1的构建与表达，包括：
1)重组蛋白1蛋白序列>Protein1LIJUN_20180822：
MAPQTITELCSEYRNTQIYTINDKILSYTESMAGKREMVIITFKSGETFQVEVPGSQHIDSQKKAIERMKDTLRITYLTETKIDKLCVWNNKTPNSIAAISMKNEFAKFVAAWTLKAAAGSAGCKNFFWKTFTSCLEHHHHHH。
N端第1位是甲硫氨酸，这是因为采用大肠杆菌表达系统的缘故。N端第2位至第104位(103AA)为LTB(大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位)。N端第105-106位为接头序列EF，N端第107-119位为免疫增强序列，N端第120-121位为接头序列GS，第122-135位为生长抑素序列，第136-137位为接头序列LE，第138-143位6His标签。
重组蛋白1蛋白基因序列>Protein1-Gene LIJUN_20181017：
ATGGCTCCCCAGACTATTACAGAACTATGTTCGGAATATCGCAACACACAAATATATACGATAAATGACAAGATACTATCATATACGGAATCGATGGCAGGCAAAAGAGAAATGGTTATCATTACATTTAAGAGCGGCGAAACATTTCAGGTCGAAGTCCCGGGCAGTCAACATATAGACTCCCAGAAAAAAGCCATTGAAAGGATGAAGGACACATTAAGAATCACATATCTGACCGAGACCAAAATTGATAAATTATGTGTATGGAATAATAAAACCCCCAATTCAATTGCGGCAATCAGTATGAAAAACGAATTCGCTAAATTCGTTGCTGCATGGACCCTGAAAGCTGCTGCTGGATCCGCAGGCTGCAAGAACTTCTTCTGGAAAACCTTCACCAGCTGTCTCGAGCACCACCACCACCACCACTGA。
重组蛋白1LTB蛋白序列为>LTB LIJUN 20180910：
APQTITELCSEYRNTQIYTINDKILSYTESMAGKREMVIITFKSGETFQVEVPGSQHIDSQKKAIERMKDTLRITYLTETKIDKLCVWNNKTPNSIAAISMKN。
2)重组蛋白1表达载体的构建及其表达：
①根据大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位的基因序列(>LTB LIJUN 20180910)设计引物，引物两端为NcoI和EcoRI酶切位点序列；从产肠毒素大肠杆菌K88菌株提取质粒DNA，利用PCR扩增LTB基因，在NcoI和EcoRI酶切位点插入原核表达载体pET-28a(公共知识获得)，转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株，测序验证。
②从重组蛋白4的基因工程菌提取质粒DNA，设计引物用PCR方法克隆蛋白4基因，在EcoRI与XhoI酶切位点处插入上述重组质粒，转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株，测序验证，成功构建了用于重组蛋白1表达的基因工程菌。将该基因工程菌按常规方法用IPTG诱导表达，离心收集菌体，超声破碎，离心分离上清液与包涵体，用SDS-PAGE进行检测，未检测到表达条带，反复优化工艺仍未能获得表达条带，说明重组蛋白1用该方法不能获得目标蛋白。
③从重组蛋白1的E.coli BL21(DE3)基因工程菌中按常规方法用质粒DNA提取试剂盒提取重组蛋白1表达质粒载体，转入E.coli Rosetta(DE3)菌株中，测序验证，成功构建了用于重组蛋白1表达的基因工程菌。将该基因工程菌按常规方法用IPTG诱导表达，离心收集菌体，超声破碎，离心分离上清液与包涵体，用SDS-PAGE进行检测，并用His标签抗体进行免疫印迹检测，证明诱导后在分子量约1.4万处出现了目标蛋白条带，说明构建与表达成功。
实例2-------重组蛋白4的构建与表达，包括：
1)重组蛋白4蛋白序列：
>Protein4LIJUN_20181017：
MAKFVAAWTLKAAAGSAGCKNFFWKTFTSCLEHHHHHH。
N端第1位为甲硫氨酸，N端第2-14位为免疫相关序列1，N端第15-16位为甘氨酸与丝氨酸，N端第17-30位为生长抑素序列，N端第31-32位为亮氨酸与谷氨酸，羧基端6个氨基酸为6个组氨酸标签。
重组蛋白4基因序列为>Protein4-Gene LIJUN_20181017：
CCATGGCTAAATTCGTTGCTGCATGGACCCTGAAAGCTGCTGCTGGATCCGCAGGCTGCAAGAACTTCTTCTGGAAAACCTTCACCAGCTGTCTCGAGCACCACCACCACCACCACTGA。
2)重组蛋白4表达载体的构建及其表达：委托相关生物技术公司合成重组蛋白4基因，在NcoI和XhoI两个酶切位点处插入原核表达载体pET-28a，转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株，测序验证，成功构建了用于重组蛋白4表达的基因工程菌。将该基因工程菌按常规方法用IPTG诱导表达，离心收集菌体，超声破碎，离心分离上清液与包涵体，用SDS-PAGE进行检测，未检测到表达条带，再用小肽电泳Tris-Tricine-SDS-PAGE进行检测，仍未检测到表达条带，说明重组蛋白4用该方法不能获得目标蛋白。
实例3-------重组蛋白1的免疫原性，包括：
免疫：取6周龄昆明种小鼠(SPF级，雌性)16只，随机分成试验组与对照组，每组8只，分别于0天、21天、42天进行足垫免疫，试验组采用重组蛋白为免疫原，免疫剂量为50μg/只，对照组采用PBS缓冲液免疫。末次免疫后一周从小鼠眼眶静脉丛采血，分离血清，-20℃冷冻保存。
组织切片：采血后将所有小鼠处死，解剖，分离免疫相关脏器，称重，用4％多聚甲醛固定，送公司制作病理切片。
免疫印迹(Western blot)：取纯化后的重组蛋白进行SDS-PAGE电泳，电泳结束后将含目的蛋白的凝胶切下，用半干式转移法将凝胶上的蛋白条带转至PVDF膜上。转膜之后，进行封闭与杂交，具体操作如下：(1)洗涤：转膜结束后，将膜取出放入湿盒中，浸没于TBST中，在室温下缓慢摇动(70r/min)洗涤10min，共洗涤3次。(2)封闭：洗涤后，将膜浸没于封闭液中，在室温下缓慢摇动(40r/min)封闭1h。(3)结合一抗：用TBST将膜漂洗一遍，浸入用封闭液稀释的兔抗生长抑素多抗(博士德，1:300)溶液中，4℃，缓慢摇动(40r/min)约12h-16h。(4)洗涤：将膜从湿盒取出，浸没于TBST中，在室温下缓慢摇动(70r/min)洗涤10min，共洗涤3次。(5)结合二抗：将膜浸入用封闭液稀释的羊抗兔HRP-IgG(生工生物(上海)有限公司，1:8000)溶液中，室温缓慢摇动(40r/min)1h。(6)洗涤：将膜从湿盒取出，浸没于TBST中，在室温下缓慢摇动(70r/min)洗涤10min，共洗涤3次。(7)显色鉴定：根据DAB试剂盒说明书进行显色反应。
ELISA：采用间接ELISA方法检测抗生长抑素抗体的滴度。具体操作如下：用PBS将重组蛋白稀释至10μg/mL包被酶标板，100μL/孔，并做一个重复孔，设阴性对照。37℃温育2小时，4℃过夜。洗涤，加入封闭液300μL，37℃温育1h；而后，加被检血清，用封闭液倍比稀释，37℃温育2h；洗涤，加稀释至1:8000的二抗100μL，37℃温育1h，最后，根据EL-TMB显色试剂盒说明书进行显色反应，检测血清中抗生长抑素抗体效价。以P/N值≥2.1判为阳性，其中P为待测血样的吸光值，N为阴性对照血样吸光值，采用SPSS17.0软件分析结果，组间P/N值差异用t检验。如图2-图3所示。
实例4-------重组蛋白2的构建与表达，包括：
1)重组蛋白2蛋白序列>Protein2LIJUN_20180822：
MAPQTITELCSEYRNTQIYTINDKILSYTESMAGKREMVIITFKSGETFQVEVPGSQHIDSQKKAIERMKDTLRITYLTETKIDKLCVWNNKTPNSIAAISMKNEFQYIKANSKFIGITEGSAGCKNFFWKTFTSCLEHHHHHH。
N端第1位是甲硫氨酸，这是因为采用大肠杆菌表达系统的缘故。N端第2位至第104位(103AA)为LTB(大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位)。N端第105-106位为接头序列EF，N端第107-120位为免疫增强序列，N端第121-122位为接头序列GS，第123-136位为生长抑素序列，第137-138位为接头序列LE，第139-144位6His标签。
重组蛋白2基因序列>Protein2-Gene LIJUN_20181018：
ATGGCTCCCCAGACTATTACAGAACTATGTTCGGAATATCGCAACACACAAATATATACGATAAATGACAAGATACTATCATATACGGAATCGATGGCAGGCAAAAGAGAAATGGTTATCATTACATTTAAGAGCGGCGAAACATTTCAGGTCGAAGTCCCGGGCAGTCAACATATAGACTCCCAGAAAAAAGCCATTGAAAGGATGAAGGACACATTAAGAATCACATATCTGACCGAGACCAAAATTGATAAATTATGTGTATGGAATAATAAAACCCCCAATTCAATTGCGGCAATCAGTATGAAAAACGAATTCCAGTATATCAAGGCAAACAGCAAGTTCATCGGTATTACAGAAGGATCCGCAGGCTGCAAGAACTTCTTCTGGAAAACCTTCACCAGCTGTCTCGAGCACCACCACCACCACCACTGA。
重组蛋白2LTB蛋白序列>LTB LIJUN 20180910：
APQTITELCSEYRNTQIYTINDKILSYTESMAGKREMVIITFKSGETFQVEVPGSQHIDSQKKAIERMKDTLRITYLTETKIDKLCVWNNKTPNSIAAISMKN。
2)重组蛋白2表达载体的构建及其表达：
①根据大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位的基因序列(>LTB LIJUN 20180910)设计引物，引物两端为NcoI和EcoRI酶切位点序列；从产肠毒素大肠杆菌K88菌株提取质粒DNA，利用PCR扩增LTB基因，在NcoI和EcoRI酶切位点插入原核表达载体pET-28a，转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株，测序验证。
②从重组蛋白3的基因工程菌提取质粒NDA，设计引物用PCR方法克隆蛋白3基因，在EcoRI与XhoI酶切位点处插入上述重组质粒，转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株，测序验证，成功构建了用于重组蛋白2表达的基因工程菌。将该基因工程菌按常规方法用IPTG诱导表达，离心收集菌体，超声破碎，离心分离上清液与包涵体，用SDS-PAGE进行检测，并用His标签抗体进行免疫印迹检测，证明诱导后在分子量约1.4万处出现了目标蛋白条带，说明构建与表达成功。
实例5-------重组蛋白3的构建与表达，包括：
1)重组蛋白3蛋白序列>Protein3LIJUN_20181004
MGQYIKANSKFIGITEGSAGCKNFFWKTFTSCLEHHHHHH。
注释：N端第1位为甲硫氨酸，N端第2位为甘氨酸，N端第3-16位为免疫相关序列2，N端第17-18位为甘氨酸与丝氨酸，N端第19-32位为生长抑素序列，N端第33-34位为亮氨酸与谷氨酸，羧基端6个氨基酸为6个组氨酸标签。
重组蛋白3基因序列>Protein3-Gene LIJUN_20181004：
CCATGGGTCAGTATATCAAGGCAAACAGCAAGTTCATCGGTATTACAGAAGGATCCGCAGGCTGCAAGAACTTCTTCTGGAAAACCTTCACCAGCTGTCTCGAGCACCACCACCACCACCACTGA。
2)重组蛋白3表达载体的构建及其表达：委托相关生物技术公司合成重组蛋白3基因，在NcoI和XhoI两个酶切位点处插入原核表达载体pET-28a，转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株，测序验证，成功构建了用于重组蛋白3表达的基因工程菌。将该基因工程菌按常规方法用IPTG诱导表达，离心收集菌体，超声破碎，离心分离上清液与包涵体，用SDS-PAGE进行检测，未检测到表达条带，再用小肽电泳Tris-Tricine-SDS-PAGE进行检测，仍未检测到表达条带，说明重组蛋白3用该方法不能获得目标蛋白。
实例6-------重组蛋白2的免疫原性，包括：
免疫：取6周龄昆明种小鼠(SPF级，雌性)16只，随机分成试验组与对照组，每组8只，分别于0天、21天、42天进行足垫免疫，试验组采用重组蛋白为免疫原，免疫剂量为50μg/只，对照组采用PBS缓冲液免疫。末次免疫后一周从小鼠眼眶静脉丛采血，分离血清，-20℃冷冻保存。
组织切片：采血后将所有小鼠处死，解剖，分离免疫相关脏器，称重，用4％多聚甲醛固定，送公司制作病理切片。
免疫印迹(Western blot)：取纯化后的重组蛋白进行SDS-PAGE电泳，电泳结束后将含目的蛋白的凝胶切下，用半干式转移法将凝胶上的蛋白条带转至PVDF膜上。转膜之后，进行封闭与杂交，具体操作如下：(1)洗涤：转膜结束后，将膜取出放入湿盒中，浸没于TBST中，在室温下缓慢摇动(70r/min)洗涤10min，共洗涤3次。(2)封闭：洗涤后，将膜浸没于封闭液中，在室温下缓慢摇动(40r/min)封闭1h。(3)结合一抗：用TBST将膜漂洗一遍，浸入用封闭液稀释的兔抗生长抑素多抗(博士德，1:300)溶液中，4℃，缓慢摇动(40r/min)约12h-16h。(4)洗涤：将膜从湿盒取出，浸没于TBST中，在室温下缓慢摇动(70r/min)洗涤10min，共洗涤3次。(5)结合二抗：将膜浸入用封闭液稀释的羊抗兔HRP-IgG(生工生物(上海)有限公司，1:8000)溶液中，室温缓慢摇动(40r/min)1h。(6)洗涤：将膜从湿盒取出，浸没于TBST中，在室温下缓慢摇动(70r/min)洗涤10min，共洗涤3次。(7)显色鉴定：根据DAB试剂盒说明书进行显色反应。
ELISA：采用间接ELISA方法检测抗生长抑素抗体的滴度。具体操作如下：用PBS将重组蛋白稀释至10μg/mL包被酶标板，100μL/孔，并做一个重复孔，设阴性对照。37℃温育2小时，4℃过夜。洗涤，加入封闭液300μL，37℃温育1h；而后，加被检血清，用封闭液倍比稀释，37℃温育2h；洗涤，加稀释至1:8000的二抗100μL，37℃温育1h，最后，根据EL-TMB显色试剂盒说明书进行显色反应，检测血清中抗生长抑素抗体效价。以P/N值≥2.1判为阳性，其中P为待测血样的吸光值，N为阴性对照血样吸光值，采用SPSS17.0软件分析结果，组间P/N值差异用t检验。如图4-图5所示。
实例7--------重组蛋白1和重组蛋白2的药效(减肥)学试验，包括：
营养性小鼠肥胖模型的建立：取雄性C57BL/6J断乳小鼠，造模组断乳小鼠自由摄食高脂饲料(D12492)，对照组小鼠摄食对照饲料(D12450-B)2周，以适应环境。从造模组挑选出生长较快的小鼠，继续高脂喂养5周，并采用耳标法标记小鼠。实验过程中，定期称量食物摄取量和小鼠体重。
(1)肥胖度公式：肥胖度(％)＝((实验组实际体重-对照组平均体重)/对照组平均体重×100。
(2)脂肪组织系数：脂肪组织系数＝小鼠腹部脂肪湿重/体重×100(腹部脂肪是取附睾、肾周、肠系膜处脂肪)。
抗肥胖药效学评价：
(1)实验动物分组及免疫：将小鼠分为实验组、模型组以及对照组，每组10只。实验组、模型组小鼠分别于0天、15天、30天进行三次免疫，均采用足垫免疫方式，免疫剂量50μg/只，模型组小鼠给予等体积PBS。
(2)采集血清与解剖：在第三次免疫后一周于小鼠眼眶静脉丛采血，分离血清，-20℃冷冻保存。将所有小鼠均称重并解剖，分离免疫相关脏器，称重，拍照；并使用4％多聚甲醛固定，送公司制作病理切片。
(3)间接ELISA法检测抗生长抑素抗体滴度：用PBS(pH7.4)将重组蛋白稀释至10μg/mL包被酶标板，100μL/孔，并做一个重复孔，设阴性对照。37℃温育2小时，4℃过夜。洗涤，加入封闭液300μL，37℃温育1h；而后，加被检血清，用封闭液将血清按一定比例稀释，37℃温育2h；洗涤，加稀释至1:8000的二抗100μL，37℃温育1h，最后，根据EL-TMB显色试剂盒说明书进行显色反应，检测血清中抗生长抑素抗体效价。以P/N值≥2.1判为阳性，其中P为待测血样的吸光值，N为阴性对照血样的吸光值，采用SPSS17.0软件分析结果，组间P/N值差异用t检验。如图6-图7所示。
(4)对小鼠体重、腹部脂肪、相关脏器重量以及相关脏器切片图从宏观与微观角度展开药效学与安全性评价。
①对小鼠体重的影响：在第三次免疫后一周称重，实验1组与3组肥胖模型小鼠体重下降幅度与模型对照组小鼠相比更加显著(P<0.5)，其中，第3组小鼠体重下降幅度极为显著(P<0.01)；而实验2组与4组肥胖模型小鼠体重下降幅度与模型对照组小鼠相比无显著差异。其结果如下图8-图9所示；图8中，group3为重组蛋白1，图9中group4为重组蛋白2。
②对小鼠内脏脂肪的影响：1-4组小鼠腹部脂肪重量与肥胖模型组相比均有显著差异(P<0.05)，即实验各组肥胖小鼠腹部脂肪均少于模型组，其中第3组(重组蛋白1)小鼠的腹部脂肪重量与模型组相比有极显著差异(P<0.01)。虽然免疫治疗时间很短，药效未能充分体现出来，但从实验结果来看，与模型对照组相比，实验组小鼠腹部脂肪重量明显减少，说明对肥胖的免疫治疗已产生了有益的效果。其结果如下图10-图11所示。图10中，group3为重组蛋白1。图11中，group4为重组蛋白2。
内脏脂肪组织图片如图12，图12中，group3为重组蛋白1，group4为重组蛋白2。
Group1-4:实验组，group5:模型对照组，group6:正常对照组，图中，group3为重组蛋白1，group4为重组蛋白2。
图13为小鼠肝脏组织切片图。图中，group3:蛋白1，group4:蛋白2。
肝脏分析：第3组镜下见，一部分肝细胞形态异常，发生脂肪变，但也有一部分趋于正常。第4组镜下所见肝组织形态趋近于正常，仅有小部分肝细胞内可见有脂滴空泡且脂滴空泡较小，发生轻微脂肪变。第5组镜下所见肝细胞广泛地发生脂肪变，即在肝细胞中可见有大小不等的脂滴空泡，空泡大者可将肝细胞核挤压至一侧。严重区域可见有肝细胞坏死及肝索排列紊乱。对照组镜下所见肝细胞形态正常，肝索排列整齐。肝部切片主要以脂肪变为主，并未见有炎细胞浸润，严重程度为5组>2组>4组。说明各实验组与肥胖模型对照组相比，肝脏脂肪变性程度均不同程度有所缓解。
(5)小鼠体内胰岛素样生长因子-1(IGF-1)的浓度：
按照IGF-I含量测定试剂盒(夹心ELISA法)的说明书进行操作。以IGF-1浓度X(ng/mL)为横坐标，吸光值Y(450nm)为纵坐标绘制标准曲线，可以得到标准曲线回归方程：Y＝0.914X+0.1346，R2＝0.9765。如图14所示。图中，group3为重组蛋白1，group4为重组蛋白2。
如图15-图16所示，图16小鼠IGF-1含量图二。图16中，group3为重组蛋白1，group4为重组蛋白2。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 海南大学
<120> 一种用于减肥的重组蛋白、疫苗及其构建方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 143
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Ala Pro Gln Thr Ile Thr Glu Leu Cys Ser Glu Tyr Arg Asn Thr
1 5 10 15
Gln Ile Tyr Thr Ile Asn Asp Lys Ile Leu Ser Tyr Thr Glu Ser Met
20 25 30
Ala Gly Lys Arg Glu Met Val Ile Ile Thr Phe Lys Ser Gly Glu Thr
35 40 45
Phe Gln Val Glu Val Pro Gly Ser Gln His Ile Asp Ser Gln Lys Lys
50 55 60
Ala Ile Glu Arg Met Lys Asp Thr Leu Arg Ile Thr Tyr Leu Thr Glu
65 70 75 80
Thr Lys Ile Asp Lys Leu Cys Val Trp Asn Asn Lys Thr Pro Asn Ser
85 90 95
Ile Ala Ala Ile Ser Met Lys Asn Glu Phe Ala Lys Phe Val Ala Ala
100 105 110
Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala Gly Ser Ala Gly Cys Lys Asn Phe Phe
115 120 125
Trp Lys Thr Phe Thr Ser Cys Leu Glu His His His His His His
130 135 140
<210> 2
<211> 432
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atggctcccc agactattac agaactatgt tcggaatatc gcaacacaca aatatatacg 60
ataaatgaca agatactatc atatacggaa tcgatggcag gcaaaagaga aatggttatc 120
attacattta agagcggcga aacatttcag gtcgaagtcc cgggcagtca acatatagac 180
tcccagaaaa aagccattga aaggatgaag gacacattaa gaatcacata tctgaccgag 240
accaaaattg ataaattatg tgtatggaat aataaaaccc ccaattcaat tgcggcaatc 300
agtatgaaaa acgaattcgc taaattcgtt gctgcatgga ccctgaaagc tgctgctgga 360
tccgcaggct gcaagaactt cttctggaaa accttcacca gctgtctcga gcaccaccac 420
caccaccact ga 432
<210> 3
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Met Ala Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala Gly Ser
1 5 10 15
Ala Gly Cys Lys Asn Phe Phe Trp Lys Thr Phe Thr Ser Cys Leu Glu
20 25 30
His His His His His His
35
<210> 4
<211> 119
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ccatggctaa attcgttgct gcatggaccc tgaaagctgc tgctggatcc gcaggctgca 60
agaacttctt ctggaaaacc ttcaccagct gtctcgagca ccaccaccac caccactga 119

Claims (6)

1.一种用于减肥的重组蛋白，其特征在于，所述用于减肥的重组蛋白氨基酸序列SEQID NO：1。
2.一种编码权利要求1所述用于减肥的重组蛋白的基因，其特征在于，所述用于减肥的重组蛋白的基因DNA序列为SEQ ID NO：2。
3.一种如权利要求1所述用于减肥的重组蛋白的构建方法，其特征在于，所述用于减肥的重组蛋白的构建方法包括：
1)LTB基因的克隆：根据大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位的基因序列设计引物，引物两端为NcoI和EcoRI酶切位点序列；从产肠毒素大肠杆菌K88菌株提取质粒DNA，利用PCR扩增LTB基因，在NcoI和EcoRI酶切位点插入原核表达载体pET-28a，构建重组质粒LTB/pET28a转化大肠杆菌BL21菌株，测序验证；
2)重组蛋白SEQ ID NO：3表达载体的构建：合成重组蛋白基因SEQ ID NO：4，在NcoI和XhoI两个酶切位点处插入原核表达载体pET-28a，转化大肠杆菌BL21菌株，测序验证，构建用于重组蛋白SEQ ID NO：3表达的基因工程菌；
3)重组蛋白SEQ ID NO：1的表达载体的构建：
从重组蛋白SEQ ID NO：3的基因工程菌提取质粒DNA，设计引物用PCR方法克隆蛋白基因SEQ ID NO：4，在EcoRI与XhoI酶切位点处插入重组质粒LTB/pET28a，转化大肠杆菌BL21菌株，测序验证，构建用于重组蛋白SEQ ID NO：1表达的基因工程菌；
4)重组蛋白工程菌的诱导表达：
从重组蛋白SEQ ID NO：1的E.coli BL21基因工程菌中用质粒DNA提取试剂盒提取重组蛋白SEQ ID NO：1的表达质粒载体，转入E.coli Rosetta菌株中，测序验证构建用于重组蛋白SEQ ID NO：1表达的基因工程菌；再通过工程菌的发酵、重组蛋白的分离、纯化、复性步骤获得重组蛋白SEQ ID NO：1。
4.如权利要求3所述的用于减肥的重组蛋白的构建方法，其特征在于，重组蛋白SEQ IDNO：3的表达载体的构建方法包括：
合成重组蛋白基因SEQ ID NO：4，在NcoI和XhoI两个酶切位点处插入原核表达载体pET-28a，转化大肠杆菌BL21菌株，测序验证，构建用于重组蛋白3表达的基因工程菌。
5.一种利用权利要求1所述用于减肥的重组蛋白制备的疫苗。
6.一种利用权利要求5所述的疫苗在用于验证疫苗药效的动物模型构建方法，其特征在于，所述动物模型构建方法包括：
第一步，用重组蛋白SEQ ID NO：1免疫昆明种小鼠，分离血清，ELISA法测效价；
第二步，用高脂饲料饲喂C57BL/6J小鼠，构建营养性肥胖小鼠模型；在第三次免疫后一周称重，进行实验组肥胖模型小鼠体重下降幅度与模型对照组小鼠体重下降幅度对比、实验组肥胖模型小鼠腹部脂肪重量与肥胖模型对照组小鼠腹部脂肪重量对比。
CN201910474375.4A 2019-05-31 2019-05-31 一种用于减肥的重组蛋白、疫苗及其构建方法 Active CN110128511B (zh)

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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1996031526A1 (en) * 1995-04-06 1996-10-10 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Anti-obesity agents
JP2002335977A (ja) * 2000-08-24 2002-11-26 Takeda Chem Ind Ltd 新規ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質およびそのｄｎａ
WO2005079525A2 (en) * 2004-02-19 2005-09-01 Gtc Biotherapeutics, Inc. A method for the production of transgenic proteins useful in the treatment of obesity and diabetes
CN105002195A (zh) * 2015-08-01 2015-10-28 吉林农业大学 一种猪蓝耳病重组疫苗

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1996031526A1 (en) * 1995-04-06 1996-10-10 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Anti-obesity agents
JP2002335977A (ja) * 2000-08-24 2002-11-26 Takeda Chem Ind Ltd 新規ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質およびそのｄｎａ
WO2005079525A2 (en) * 2004-02-19 2005-09-01 Gtc Biotherapeutics, Inc. A method for the production of transgenic proteins useful in the treatment of obesity and diabetes
CN105002195A (zh) * 2015-08-01 2015-10-28 吉林农业大学 一种猪蓝耳病重组疫苗

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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重组嵌合生长抑素工程菌的构建、表达与免疫;贡长慧等;《海南大学学报(自然科学版)》;20180522(第02期);全文 *

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