CN101094685B - 鞭毛蛋白在鼠疫耶尔森氏菌的免疫疗法中的用途 - Google Patents
鞭毛蛋白在鼠疫耶尔森氏菌的免疫疗法中的用途 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101094685B CN101094685B CN200580045581.XA CN200580045581A CN101094685B CN 101094685 B CN101094685 B CN 101094685B CN 200580045581 A CN200580045581 A CN 200580045581A CN 101094685 B CN101094685 B CN 101094685B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- flagellin
- antigen
- pestis
- fusion rotein
- cell
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Abstract
本发明提供了包含鞭毛蛋白佐剂和鼠疫耶尔森氏菌抗原的融合蛋白。还提供了包含鞭毛蛋白佐剂和鼠疫耶尔森氏菌抗原的组合物。本发明还公开了制备包含鞭毛蛋白佐剂和鼠疫耶尔森氏菌抗原的融合蛋白的方法。本发明还提供了用于诱导针对鼠疫耶尔森氏菌的免疫应答的药物制剂和方法。
Description
相关申请信息
本申请要求2004年12月16日提交的美国临时申请序号60/636,635和2005年8月19日提交的美国临时申请序号60/709,609的优先权,将这些临时申请的公开内容通过引用完整并入本文。
联邦政府支持声明
本发明得到来自国家健康研究所(NationalInstitutesofHealth)的根据授权号P01-AI060642的政府支持。美国政府拥有本发明的某些权利。
发明领域
本发明涉及鞭毛蛋白佐剂、来自鼠疫耶尔森氏菌(Yersiniapestis)的抗原和其融合蛋白用于产生针对鼠疫耶尔森氏菌的免疫应答(例如,在对鼠疫耶尔森氏菌感染的预防性治疗中)的用途。
发明背景
尽管疫苗开发中从完整病原体到各抗原的变化已经导致更安全的疫苗,但是功效已经显著降低。疫苗佐剂促进对可溶性重组蛋白质抗原的强的适应性应答。Toll样受体(TLR)激动剂如革兰氏阴性LPS和细菌CpGDNA的前炎性效果已经导致了对它们的佐剂性质和对树突细胞的影响的评价(Jager等人(2002)Curr.Opin.Immunol.14:178-182;Ko等人(2003)Clin.Cancerres.9:3222-3234;Medzhitov(2001)Nat.Immunol.1:135-145)。多数TLR激动剂通过刺激细胞因子的产生和树突细胞的成熟从而将先天性和适应性免疫(adaptiveimmunity)联系起来而发挥佐剂功能。
鼠疫的病原体鼠疫耶尔森氏菌是革兰氏阴性生物,在三个主要的流行期间造成大约2千万人死亡。在人类中,鼠疫具有通过感染性质命名的三种形式:腹股沟淋巴结炎性、肺炎性和白血病性。而腹股沟淋巴结炎性鼠疫通过受感染的跳蚤的叮咬传播,肺炎形式可以通过人到人传播。没有医药治疗时,肺炎性鼠疫是快速发展的疾病,死亡率接近100%(McSorley等人(2002)JImmunol.169:3914-3919;Means等人(2003)JImmunol.170:5165-5175)。
对鼠疫使用完整细胞疫苗已经引起了安全性问题的关注。用鼠疫耶尔森氏菌的鞭毛蛋白和合适的佐剂免疫引起保护性应答,其与抗F1IgG抗体的效价相关(Davila和Celis(2000)JImmunol.165:539-547;Brunner等人(2000)J.Immunol.165:6278-6286)。当用F1和V抗原或者重组的F1/V融合蛋白免疫动物时,得到协同保护作用(Ciacci-Woolwine等人(1998)Infect.Immun.66:1127-1134;Moors等人(2001)Infect.Immun.69:4424-4429;Gewirtz等人(2001)JClin.Invest.107:99-109;Steiner等人(2000)JClin.Invest.105:1769-1777)。尽管观察到高度可变的应答,但是1期临床试验表明用含有F1和V的疫苗进行肌内免疫在人体中是免疫原性的(Eaves-Pyles等人(2001)JImmunol.1666:1248-1260)。
人们希望提供用于产生针对病原体如鼠疫耶尔森氏菌的免疫应答的改进的试剂、药物制剂和方法。
发明概述
本发明的第一方面是融合蛋白,其组成为或者基本上为:(a)鞭毛蛋白佐剂,该鞭毛蛋白佐剂组成为或者基本上为(i)鞭毛蛋白N-末端恒定区;(ii)鞭毛蛋白C-末端恒定区;和(b)在N-末端恒定区和C-末端恒定区之间的鼠疫耶尔森氏菌抗原(例如,插入到或者代替鞭毛蛋白高变区的部分或者全部,该鞭毛蛋白高变区任选被部分或者完全缺失)构成。
本发明的另一方面是编码如上文所述的融合蛋白的核酸。在一些实施方案中,核酸可操作地连接启动子。
本发明的另一方面是包含如上文所述的核酸的载体。
本发明的另一方面是包含如上文所述的核酸或者载体的宿主细胞。在一些实施方案中,宿主细胞表达所编码的融合蛋白。
本发明的另一方面是制备如上文所述的融合蛋白的方法,该方法包括将包含编码如上文所述的融合蛋白的核酸的宿主细胞在合适的培养基中于足够产生所述融合蛋白的条件下培养。任选地,从宿主细胞或者培养基收集融合蛋白。
本发明的另一方面是组合物(例如,用于粘膜递送),其包含、组成为或者组成基本上为:(a)鞭毛蛋白佐剂,和(b)鼠疫耶尔森氏菌抗原(鼠疫耶尔森氏菌抗原和鞭毛蛋白佐剂是分开的或者相互连接,即融合蛋白的形式,例如,如本文描述的融合蛋白)。
本发明的另一方面是药物制剂,其包含处于可药用载体中的如上文所述的融合蛋白或者组合物。
本发明的另一方面是在受试者中产生对鼠疫耶尔森氏菌抗原的免疫应答(例如,产生抗体和/或诱导细胞介导的免疫应答)的方法,其包括以在该受试者中诱导对鼠疫耶尔森氏菌抗原的免疫应答的有效量对所述受试者施用如上文所述的融合蛋白、组合物或者药物制剂。
本发明的再一方面是治疗受试者的鼠疫耶尔森氏菌感染(例如,接种患者以抵抗鼠疫耶尔森氏菌感染)的方法,其包括以治疗鼠疫耶尔森氏菌感染(例如在该受试者中产生对鼠疫耶尔森氏菌感染的预防性保护性免疫应答和/或产生保护性免疫应答)的有效量对所述受试者施用如上述的融合蛋白、组合物或者药物制剂。
在本发明方法的一些具体实施方案中,受试者是哺乳动物受试者、灵长类受试者或者人类受试者。
本发明的另一方面是如本文所述的融合蛋白或者组合物用于制备进行如本文所述的治疗方法的药物的用途。
本发明的这些和其它方法在下面本发明的描述中给出。
附图简述
图1描绘了通过鞘内滴注给予鞭毛蛋白或者突变的鞭毛蛋白229的BALB/c小鼠的肺中TNFα表达。
图2描绘了鞭毛蛋白对肿瘤生长的影响。空心圆圈代表给予Fra-1抗原和失活形式的鞭毛蛋白的小鼠。实心圆圈代表给予Fra-1抗原和活性形式的鞭毛蛋白的小鼠。
图3显示用鼠疫耶尔森氏菌的鞭毛蛋白和F1抗原免疫导致大量的抗-F1抗体产生。(图a)用10μgF1+1μg鞭毛蛋白(FliC)气管内(i.t.)或者鼻内(i.n)免疫雌性BALB/c小鼠。对照动物仅用10μgF1或者1μg229突变的鞭毛蛋白气管内免疫。在4周时对小鼠用相同的方式强化,并且在2周后通过ELISA分析收集血浆。条形内的数字表示IgG1/IgG2a同种型的比例。*指出相对于对照的统计学显著性,**指出鼻内效价在统计学上大于气管内(p<0.007)。(图b)从用10μgF1+1μg鞭毛蛋白鼻内免疫的小鼠得到的抗-F1抗体效价。每条线代表一只小鼠并且箭头指示强化免疫。(图c)用10μgF1和增加量的FliC或者5μg229气管内免疫雌性BALB/c小鼠并在第4周时强化。在强化后2周测定血浆抗-F1IgG效价。(图d)仅用5μg鞭毛蛋白鼻内免疫一组雌性BALB/c小鼠并在第4周时以相同的方式强化。在2周后测定抗-Flic抗体效价(平均抗-Flic效价=8.5x105)然后用10μgF1+1μgFlic对经鞭毛蛋白免疫的小鼠鼻内免疫和强化。强化后2周,测定抗-F1效价并与用10μgF1+1μgFlic或者229免疫的未接触鞭毛蛋白的动物的效价比较。条形代表平均抗体效价±s.e.m。每个免疫组使用7只雌性BALB/c小鼠。
图4显示鞭毛蛋白刺激抗原特异性应答并且需要T细胞。(图a)用10μgF1抗原+1μg鞭毛蛋白(Flic)对7只雌性BALB/c小鼠的组进行鼻内免疫并在第4周时用PBS、仅1μgFlic、仅10μgF1或者10μgF1+1μgFliC强化。强化后3周收集血浆,用于通过ELASA进行分析。*指出相对于用PBS或者仅FliC强化的动物的统计学显著性,**指出用F1+FliC强化导致抗体效价在统计学上大于仅F1抗原的情况(p<0.01)。条形代表平均抗体效价±s.e.m。(图b)用10μgF1+1μgFliC对一组7只无胸腺的裸鼠(BALB/cAnNCr-nu/nu)进行鼻内免疫和强化。在强化后2周,收集血浆用于通过ELISA进行抗F1IgG效价的分析。*指出与以相同方式免疫的正常BALB/c小鼠相比的统计学显著性(p<0.001)。
图5描绘了对于鞭毛蛋白佐剂效果的需要。用10μgF1抗原+1μg鞭毛蛋白(FliC)或者突变的鞭毛蛋白(229)对TNFR-/-(图a)或者IL6-/-(图b)和野生型B6;129对照小鼠进行气管内免疫。*指出TNFR-/-效价在统计学上小于B6;129对照(p<0.001)。用10μgF1+1μgFliC或者229(图c)对C3H/HeJ(Tlr4P712H突变体)和野生型C3H/HeN小鼠免疫。用10μgF1+1μgFHC或者229对IFNα/βR- /-(图d)和IFNγ-/-(图e)小鼠和对应的野生型对照进行鼻内免疫。每个免疫组中用7只雌性小鼠。在4周以相同的方式强化小鼠并在2周后收集血浆,用于通过ELISA分析抗-F1效价。条形代表平均抗体效价±s.e.m。
图6显示鞭毛蛋白促进对于用鼠疫耶尔森氏菌CO92鼻内感染的保护性应答。用10μgF1抗原+1μg鞭毛蛋白(FliC)或者仅PBS免疫15只雌性BALB/c小鼠(图a)的组,并在4周用相同的方式强化。强化后2周收集血浆,用于通过ELISA分析抗体效价(平均抗-F1效价=9.4×105)。1周后用等于100xLD50的鼠疫耶尔森氏菌CO92剂量对小鼠进行鼻内攻击。攻击(challenge)后监视小鼠30天。用10μgF1+1μgFliC或者仅PBS对10只抗体缺乏型IgH-/-小鼠(图b)组鼻内免疫,并在4周时以相同的方式强化。2周后用等于155xLD50的鼠疫耶尔森氏菌剂量鼻内攻击。用10μgF1+1μgFliC对10只野生型C57BL/6小鼠(组c)和雌性IFNγ-/-小鼠(图d)的组进行鼻内免疫和强化。强化后2周收集血浆,用于通过ELISA分析抗体效价(抗-F1效价≥1×106)。1周后用等于150xLD50的鼠疫耶尔森氏菌剂量进行鼻内攻击,并在攻击后监视16天。
图7显示鞭毛蛋白是非人灵长类动物的有效佐剂。用150μgF1/V融合蛋白+50μg鞭毛蛋白鼻内(n=6)或者肌内(n=6)免疫雌性猕猴(Macacafascicularis)。仅用PBS鼻内或者肌内免疫对照动物(n=3)。在12小时内体温没有显著改变,并在免疫后4h、12h和24h收集血浆中的TNF-α。在4周以相同的方式对动物进行强化,并在2周后收集血浆用于通过ELISA进行分析。条形指出平均的抗-F1/V抗体效价±s.e.m,*表示相对于鼻内免疫的统计学显著性(p<0.006)。
图8显示含有鞭毛蛋白和鼠疫耶尔森氏菌F1和V蛋白质的融合蛋白保留鞭毛蛋白生物学活性。
优选实施方案详述
本发明部分是基于发现鞭毛蛋白和其片段可以作为佐剂,包括作为粘膜佐剂用来增强在受试者中产生的针对鼠疫耶尔森氏菌的免疫应答。
除非另外指出,本文使用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域技术人员通常理解的相同的含义。本发明说明书中使用的术语仅用于描述具体的实施方案并且不意在限定本发明。本文提到的所有出版物、专利申请、专利和其它其它参考文献都通过引用完整并入本文。
除非上下文中明确指出不同,在本发明说明书和所附的权利要求书中使用的单数形式的“a”、“an”和“the”意在包括复数形式。
本文使用的“组成基本为”(consistingessentiallyof)指所指出的肽、蛋白质、融合蛋白、核酸、化合物、组合物等等不包括任何其它物质成分(即,实质上影响所述肽、蛋白质、融合蛋白、核酸、化合物或者组合物的结构和/或功能的成分)。
在本发明的一些代表性实施方案中,本发明的肽、蛋白质、融合蛋白、核酸和/或细胞是“经分离的”。“经分离的”指肽、蛋白质、融合蛋白、核酸和/或细胞至少从其它组分部分纯化。
1.鼠疫耶尔森氏菌抗原
术语“免疫原”和“抗原”在本文中可互换使用,其指可以针对其产生细胞免疫应答和/或体液免疫应答的化合物(包括肽和蛋白质)。
可以用任何合适的鼠疫耶尔森氏菌抗原实施本发明。从鼠疫耶尔森氏菌得到的可以用于实施本发明的抗原是已知的,例如在美国专利号6,706,522、6,638,510和5,985,285中对其有所描述。在一些具体实施方案中,抗原是鼠疫耶尔森氏菌V抗原和/或鼠疫耶尔森氏菌F1抗原(这些术语包括完整蛋白质和其片段,其可以长为至少约10、15、20、30或者50个连续氨基酸),如美国专利号5,985,285中所述;或者鼠疫耶尔森氏菌V抗原和F1抗原的融合物(再次说明,这些术语包括完整蛋白质和其片段,其可以长为至少约10、15、20、30或者50个连续氨基酸)。在一些实施方案中,抗原包含成熟的鼠疫耶尔森氏菌V蛋白质和/或F1蛋白质的全部或者片段,或者备选地,可以包含鼠疫耶尔森氏菌V和/或F1前体的全部或者片段。合适的片段包含一个或多个表位,其诱导免疫应答并且任选地赋予保护。在一些代表性实施方案中,片段包含蛋白质的细胞外部分的全部或者部分。此外,本文使用的“鼠疫耶尔森氏菌抗原”或者“来自鼠疫耶尔森氏菌的抗原”等术语包括但不限于天然存在的鼠疫耶尔森氏菌抗原和其修饰形式,其可以在受试者中诱导免疫应答,任选地保护性免疫应答。例如,可以修饰天然抗原,以增强安全性和/或免疫原性。
鼠疫耶尔森氏菌抗原可以为融合肽,如F1/V融合肽或者V/F1融合肽的形式,其包括但不限于Titball等人的美国专利号5,985,285和S.Leary等人,(1997)MicrobialPathogenesis23:167-179中描述的那些。当两种抗原连接为融合肽时,它们可以直接相互连接或者通过肽连接或者“铰链”区段(例如,2、3、4、6、8、10、15、20、30、50或者更多氨基酸的区段)连接。
2.鞭毛蛋白
发明人已确定鞭毛蛋白可以发挥佐剂的功能,包括作为粘膜佐剂,以增强宿主产生的对鼠疫耶尔森氏菌抗原的主动免疫应答。本文使用的术语“佐剂”具有本领域技术人员通常理解含义。例如,可以将佐剂定义为增强抗原在受试者中刺激针对该抗原的免疫应答的能力的物质。在一些具体实施方案中,佐剂将针对抗原的免疫应答增强至少约2、3、4、5、10、15、20、30、40、50、60、75、100、150、500、1000倍或者以上。在其它一些实施方案中,佐剂减少实现特定水平的免疫应答(细胞和/或体液和/或粘膜的)所需的抗原的量,例如,减少至少约15%、25%、35%、50%、65%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或以上。佐剂还可以是延长免疫应答持续的时间、任选地保护性免疫应答持续的时间(例如,至少约2倍、3倍、5倍、10倍、20倍更长的时间或者以上)的物质。在一些情况中,不存在佐剂的情况下,宿主中不能引起显著免疫应答。
鞭毛蛋白是已知的,并且例如在美国专利号6,585,980、6130,082、5,888,810、5,618,533、4,886,748和美国专利公布号US2003/0044429A1和Donnelly等人、(2002)JBiol.Chem.43:40456中有所描述。多数革兰氏阴性细菌表达鞭毛蛋白,其是提供运动性的表面结构。从基体、丝体(filament)和连接两者的钩子(hook)形成鞭毛蛋白。丝体由单种蛋白——鞭毛蛋白的长的多聚体形成,在末端具有小的帽蛋白。鞭毛蛋白的聚合由N和C末端的保守区介导,而鞭毛蛋白的间插区(interveningregion)在物种之间非常不同。
在本发明的一些说明性实施方案中,提供了融合蛋白,其包含鞭毛蛋白佐剂和一种或多种鼠疫耶尔森氏菌抗原。通常,本发明的融合蛋白包含、组成基本上为、或者组成为:(a)鞭毛蛋白佐剂,该佐剂包含(i)鞭毛蛋白N-末端恒定区;和(ii)鞭毛蛋白C-末端恒定区;和(b)鼠疫耶尔森氏菌抗原,其中该鼠疫耶尔森氏菌抗原在N-末端恒定区和C-末端恒定区之间。在一些实施方案中,恒定区之间的鞭毛蛋白高变区被缺失(全部或者部分);在其它一些实施方案中,存在高变区。当存在高变区(全部或者部分)时,抗原可以插入到(i)高变区内,(ii)鞭毛蛋白N-末端恒定区和高变区之间,或者(iii)鞭毛蛋白C-末端恒定区和高变区之间。
此外,N-末端恒定区和C-末端恒定区可以通过铰链区连接。高变区或者鼠疫耶尔森氏菌抗原可以作为铰链区发挥作用。此外,或者备选地,约2、3、4、6、8、10、15、20、30、50或者更多氨基酸的区段可以作为铰链区发挥作用。
鞭毛蛋白的保守区是本领域中公知的,并且已经例如在Mimori-Kiyosue等人,(1997)J.Mol.Virol.270:222-237;lino等人,(1977)Ann.Rev.Genet.11:161-182;和Schoenhals等人,(1993)JBacteriol175:5395-5402中有所描述。如本领域技术人员理解的,恒定区的大小将在一定程度上依赖于鞭毛蛋白蛋白质的来源而变。通常,N-末端恒定区包括约170或180个蛋白质N-末端氨基酸,而C-末端恒定区通常跨越约85到100个C-末端氨基酸。中心高变区随着细菌中的大小和序列而有很大变化,这是分子量差异的主要原因。来自多种细菌的鞭毛蛋白蛋白质的N-和C-末端恒定区是已知的,其它的可以由本领域技术人员使用已知的比对技术容易地鉴定,鞭毛蛋白单体的晶体结构的阐明方便了所述比对技术(Samatey等人,(2001)Nature41:331)。
本文使用的术语“鞭毛蛋白N-末端恒定区”和“鞭毛蛋白C-末端恒定区”包括活性片段(例如,长为至少约50、100或者120个氨基酸的片段)和前述任一种增强对鼠疫耶尔森氏菌抗原的免疫应答的修饰(例如,通过激活TLR5途径)。例如,可对天然的鞭毛蛋白区加以修饰,以增强安全性和/或免疫应答。在一些实施方案中,鞭毛蛋白N-末端和/或C-末端恒定区包含全长区域或者备选地,可以仅包含一个或两个区域的片段。
在一些具体实施方案中,N-末端和/或C-末端恒定区包含TLR5识别位点并且能够激活TLR5途径。在一些代表性实施方案中,N-末端恒定区包含如Eaves-Pyles等人(2001)JImmunology167:7009-7016描述的N-末端RINSA结构域(S.dublin鞭毛蛋白的氨基酸31-52),或者其同源物或者增强鼠疫耶尔森氏菌抗原的免疫原性的修饰形式。在其它一些实施方案中,N-末端恒定区包含D1和D2结构域,并且C-末端恒定区包含D1和D2结构域(Eaves-Pyles等人(2001)JImmunology167:7009-7016)或者其增强鼠疫耶尔森氏菌抗原的免疫原性的修饰形式。
在其它一些实施方案中,鞭毛蛋白N-末端和/或C-末端恒定区包含、组成为、或者组成基本上为:如美国专利公布号US2003/0044429A1或者Alderem等人描述的肽GAVQNRFNSAIT(SEQIDNO:4),或者其同源物或者增强鼠疫耶尔森氏菌抗原的免疫原性的修饰形式。
在再一些实施方案中,N-末端恒定区包含Kanneganti等人,(2004)JBiol.Chem.279:5667-5676鉴定的基序N”(例如,S.muenchen鞭毛蛋白的氨基酸98-108)和/或C-末端恒定区包含“基序C”(例如,S.muenchen鞭毛蛋白的氨基酸441-449),或者其同源物或者增强鼠疫耶尔森氏菌抗原的免疫原性的修饰形式。
在其它一些阐明性实施方案中,N-末端恒定区包含铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)鞭毛蛋白的氨基酸88-97(见例如Verma等人,(2005)Infect.Immun.73:8237-8246)或者其同源物或者增强鼠疫耶尔森氏菌抗原的免疫原性的修饰形式。
Smith等人(2003)Nat.Immunol.4:1247-1253已经鉴定了鞭毛蛋白的参与TLR5信号传递的区域(例如,S.typhimurium鞭毛蛋白的氨基酸78-129、135-173和394-444或者其同源物或者修饰形式)。
鞭毛蛋白N-末端恒定区、C-末端恒定区和高变区可以来自任何合适来源的鞭毛蛋白,这些区域的一些或者全部来自相同生物或者来自不同的生物。已经克隆并测序了许多鞭毛蛋白基因(见例如,Kuwajima等人,(1986)JBact.168:1479;Wei等人,(1985)JMol.Biol.186:791-803;和Gill等人,(1983)JBiol.Chem.258:7395-7401)。鞭毛蛋白的非限制性来源包括但不限于,S.enteritidis、S.typhimurium、S.dublin、幽门螺旋杆菌(H.pylori)、V.cholera、S.marcesens、S.flexneri、S.enterica、T.pallidum、L.pneumophila、B.burgdorferei、C.difficile、A.tumefaciens、R.meliloti、B.clarridgeiae、R.lupine、P.mirabilis、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)和大肠杆菌(E.coli)。
在本文的工作实施例中提供了本发明的融合蛋白的非限制性例子。
任选地,融合蛋白可以包含任何其它肽或者蛋白质。例如,融合蛋白可以还包含来自其它生物的一种或多种抗原。在一些代表性实施方案中,融合蛋白还包含免疫调节化合物。例如,本领域已知可以通过免疫调节性细胞因子或者趋化因子(如α-干扰素、β-干扰素、γ-干扰素、ω-干扰素、τ-干扰素、白介素-1α、白介素-1β、白介素-2、白介素-3、白介素-4、白介素-5、白介素-6、白介素-7、白介素-8、白介素-9、白介素-10、白介素-11、白介素-12、白介素-13、白介素-14、白介素-18、B细胞生长因子、CD40配体、肿瘤坏死因子-α、肿瘤坏死因子-β、单核细胞趋化蛋白-1、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、淋巴细胞毒素、CCL25[MECK]和CCL28[TECH])增强免疫应答。
本发明还提供了包含鞭毛蛋白佐剂和鼠疫耶尔森氏菌抗原的组合物。根据该实施方案,鞭毛蛋白佐剂可以是全长鞭毛蛋白或者可以是包含如上文更详细描述的N-末端和/或C-末端恒定区的鞭毛蛋白肽。此外,还如上文描述的,鞭毛蛋白佐剂可以与鼠疫耶尔森氏菌抗原偶联(例如,融合),以形成融合蛋白。在一些示例性实施方案中,鼠疫耶尔森氏菌抗原是鼠疫耶尔森氏菌F1蛋白质、鼠疫耶尔森氏菌V蛋白质或者其融合蛋白。组合物可以包含与鞭毛蛋白佐剂融合的一种或多种鼠疫耶尔森氏菌抗原,并且,任选地,组合物中存在的一种或多种鼠疫耶尔森氏菌抗原不与鞭毛蛋白佐剂融合。在其它实施方案中,鞭毛蛋白佐剂不与鼠疫耶尔森氏菌抗原偶联。
除非另外指出,融合蛋白本身作为蛋白质(或者编码蛋白质的核酸)施用,而不作为活的、杀死的或者重组细菌或者病毒载体疫苗的部分施用。
4.重组核酸和融合蛋白的产生
除了另外指出,可以本领域技术人员已知的标准方法用于克隆基因、扩增和检测核酸、产生融合构建体、在宿主细胞或者生物中表达肽,等等。此类技术是本领域技术人员已知的。见例如,Sambrook等人,″MolecularCloning″ALaboratoryManual第二版(ColdSpringHarbor,NY,1989);F.M.Ausubel等人CurrentProtocolsinMolecularBiology(GreenPublishingAssociates,Inc.andJohnWiley&Sons,Inc.,NewYork)。
如本文使用的,“核酸”包括RNA和DNA,包括cDNA、基因组DNA、合成的(例如,化学合成的)DNA和RNA和DNA的嵌合体。核酸可以是双链或单链的。可以使用寡核苷酸类似物或者衍生物(例如,次黄苷或者硫代磷酸酯核苷酸)合成核酸。此类寡核苷酸可以例如用于制备具有改变的碱基配对能力或者对核酸酶的增加的耐受性的核酸。
可以在表达编码用于多种目的(例如,产生免疫原性组合物,作为诊断或者研究试剂等等)的融合蛋白的异源核酸的培养的细胞或者生物中产生本发明的融合蛋白,并任选从所述细胞或者生物对其进行纯化。
在一些实施方案中,可以从宿主细胞收集并任选纯化融合蛋白。例如,可以从条件培养基收集融合蛋白。根据该实施方案,表达可操作连接分泌信号序列的融合蛋白可能是有利的。备选地,可以从宿主细胞分离融合蛋白(例如,可以裂解宿主细胞并从中分离融合蛋白)。
在其它一些实施方案中,收集宿主细胞并并且不从中分离融合蛋白。
通常,将异源核酸掺入到表达载体(病毒或者非病毒的)中。合适的表达载体包括但不限于,质粒、噬菌体、细菌人工染色体(bacs)、酵母人工染色体(yacs)、粘粒、病毒载体等等。与多种宿主细胞相容的表达载体是本领域中公知的,并且含有用于核酸的转录和翻译的合适元件。典型地,表达载体含有“表达盒”,其在5’到3’方向包括启动子、编码与启动子可操作的连接的融合蛋白的编码序列,和任选地,终止序列,其包括针对RNA聚合酶的终止信号和针对多聚腺苷酸酶(polyadenylase)的多聚腺苷酸化信号。
可以对表达载体加以设计,用于在原核或真核细胞中表达多肽。例如,可以在细菌细胞(如大肠杆菌)、昆虫细胞(例如,杆状病毒表达系统)、酵母细胞、哺乳动物细胞、或者植物细胞中表达多肽。用于在酿酒酵母中表达的载体的例子包括pYepSecl(Baldari等人,(1987)EMBOJ.6:229-234),pMFa(KurjanandHerskowitz,(1982)Cell30:933-943),pJRY88(Schultz等人,(1987)Gene54:113-123),和pYES2(InvitrogenCorporation,SanDiego,Calif.)。可用于在培养的昆虫细胞(例如,Sf9细胞)表达核酸以产生蛋白质的杆状病毒载体包括pAc系列(Smith等人,(1983)Mol.Cell.Biol.3:2156-2165)和pVL系列(Lucklow,V.A.,和Summers,M.d.(1989)Virology170:31-39)。
此外,表达载体将通常包括表达控制序列(例如,转录/翻译控制信号和多聚腺苷酸化信号),其可操作地连接编码本发明的融合蛋白的核酸序列。应当理解,取决于所希望的水平和组织特异性表达,可以使用多种启动子/增强子元件。启动子可以是组成型的或者诱导型的(例如,金属硫蛋白启动子或者激素诱导型启动子),这取决于所希望的表达模式。启动子可以是本来天然有的或者外源的并且可以是天然或者合成的序列。外源指启动子不在该启动子所导入的野生型宿主中发现。选择启动子使得它在目标靶细胞中发挥功能。此外,一般提供特异性起始信号以有效翻译插入的蛋白质编码序列。这些翻译控制序列(可以包括ATG起始密码子和相邻序列)可以是多种来源的,可以是天然和合成的。其中表达载体包含两个将被转录的可读框的本发明实施方案中,可读框可以可操作地连接单独的启动子或者单个上游启动子和一个或多个下游内部核糖体进入位点(IRES)序列(例如,细小核糖核酸病毒EMCIRES序列)。
哺乳动物表达载体的例子包括pCDM8(Seed,(1987)Nature329:840)和pMT2PC(Kaufman等人(1987),EMBOJ.6:187-195)。当用于哺乳动物细胞中时,表达载体的控制功能通常通过病毒调节元件提供。例如,常用的启动子来自多瘤、腺病毒2、巨细胞病毒和猿猴病毒40。本发明还提供了(暂时或稳定)包含编码本发明的融合蛋白的核酸的宿主细胞。合适的宿主细胞是本领域中公知的,并且包括原核和真核细胞。见,例如,Goeddel,GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology185,AcademicPress,SanDiego,Calif.(1990)。公知:蛋白质可以在细菌细胞如大肠杆菌、昆虫细胞(例如,杆状病毒表达系统)、酵母细胞、植物细胞或者哺乳动物细胞(例如,人、大鼠、小鼠、仓鼠、牛、猪、绵羊、山羊、马、猫、狗、兔形目动物、猿等等)中表达。宿主细胞可以是培养的细胞,如原代细胞或者永生化细胞系的细胞。宿主细胞可以是基本上用作生物反应器的微生物、动物或者植物的细胞。在本发明的一些具体实施方案中,宿主细胞是允许表达载体复制的昆虫细胞。例如,宿主细胞可以来自草地夜蛾(Spodopterafrugiperda),如Sf9或者或者Sf21细胞系、果蝇细胞系,或者蚊子细胞系,例如,白纹伊蚊(Aedesalbopictus)来源的细胞系。昆虫细胞表达异源蛋白质的用途,以及将核酸,如载体,例如,昆虫细胞相容的载体(如杆状病毒载体)导入此类细胞中的方法和培养保持此类细胞的方法有详细记载。见例如,MethodsinMolecularBiology,ed.Richard,HumanaPress,NJ(1995);O′Reilly等人,BaculovirasExpressionVectors,ALaboratoryManual,OxfordUniv.Press(1994);Samulski等人,J.Vir.63:3822-8(1989);Kajigaya等人,Proc.NatlAcad.SciUSA88:4646-50(1991);Ruffing等人,J.Vir.66:6922-30(1992);Kimbauer等人,Vir.219:37-44(1996);Zhao等人,Vir.272:382-93(2000);和Samulski等人的美国专利号6,204,059。在本发明的一些具体实施方案中,昆虫细胞是Sf9细胞。
可以通过常规转化或者转染技术向原核或者真核细胞中引入载体。本文使用的术语“转化”和“转染”指本领域中公知的将外源核酸(例如DNA)导入宿主细胞的多种方法,包括磷酸钙或者氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂转染、电穿孔、显微注射、装载DNA的脂质体、脂转染胺(lipofectamine)-DNA复合体、细胞超声处理、使用高速微粒进行基因轰击,和病毒介导的转染。用于转化或者转染宿主细胞的合适方法可以见Sambrook等人(MolecularCloning:ALaboratoryManual,第二版,ColdSpringHarborLaboratorypress(1989))和其它实验室手册。
在本发明的另一些实施方案中,宿主细胞可以用编码融合蛋白的异源核酸序列稳定转化。本文使用的“稳定转化”通常指异源核酸序列整合到宿主细胞的基因组中,这与“瞬时转化”相反,瞬时转化中,导入宿主细胞的异源核酸不整合到宿主细胞的基因组中。术语“稳定转化”还可以指游离体(episome)(例如,EB病毒(EBV))在细胞中的稳定保持。
当产生稳定转化的细胞时,通常仅一小部分细胞(尤其哺乳动物细胞)将外源细胞整合到它们的基因组中。为了鉴定和选择这些整合体,可以将编码选择标记(例如,抗生素抗性)的核酸与目的核酸一起导入宿主细胞。优选的选择标记包括赋予对药物(如G418、潮霉素和氨甲蝶呤)的抗性的那些选择标记。可以将编码选择标记的核酸在与包含目的核酸的载体相同的载体上导入宿主细胞中,或者可以导入单独的载体上。可以通过药物选择来鉴定用导入的核酸稳定转染的细胞(例如,已经包括进选择标记基因的细胞将存活,而其它细胞死亡)。
还可以在转基因植物中产生融合蛋白,所述植物中,编码融合蛋白的经分离的核酸已经插入到细胞核或者质体的基因组中。植物转化是本领域中已知的;一般而言,见MethodsinEnzymologyVol.153(″RecombinantDNAPartD″)1987,Wu和GrossmanEds.,AcademicPress和欧洲专利申请EP693554。
可以通过几种方法将外源核酸导入植物细胞或者原生质体中。例如,可以通过使用微量移液器直接显微注射到植物细胞中,来机械地转移核酸。还可以通过使用聚乙二醇,向植物细胞中转入外源核酸,聚乙二醇与遗传物质形成沉淀复合体,其被细胞吸收(Paszkowski等人(1984)EMBOJ.3:2712-22)。可以通过电穿孔向植物细胞中导入外源核酸(Fromm等人(1985)Proc.Natl.Acad.SciUSA82:5824)。在该技术中,在含有相关的遗传构建体的质粒或者核酸存在的情况下,对植物原生质体进行电穿孔。高场强的电脉冲可逆地透化生物膜,这允许质粒的导入。经电穿孔的植物原生质体再形成细胞壁、分裂并形成植物愈伤组织。使用表型标记可以完成对包含外源核酸的经转化的植物细胞的选择。
花椰菜花叶病毒(CaMV)可以用作向植物细胞中导入外源核酸的载体(Hohn等人(1982)″MolecularBiologyofPlantTumors,″AcademicPress,NewYork,pp.549-560;Howell,美国专利号4,407,956)。CaMV病毒DNA基因组插入到亲本细菌质粒中,产生可以在细菌中增殖的重组DNA分子。通过导入希望的DNA序列可以进一步修饰重组质粒。然后从亲本细菌质粒切下重组质粒的经修饰的病毒部分,用于接种植物细胞或者植物。
通过小颗粒进行的高速射弹穿透可以用于向植物细胞中导入外源核酸。核酸被布置在小珠或者颗粒的基质内,或者在表面上(Klein等人(1987)Nature327:70-73)。尽管典型地仅需要单次导入新的核酸区段,但是该方法也提供多次导入。
通过用经核酸转化的根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)感染植物细胞、外植体、分生组织或者种子,可以向植物细胞中导入核酸。在合适的条件下,可以培养经转化的植物细胞以形成枝条、根,并进一步发育成植物。例如,可以通过根癌农杆菌的Ti质粒向植物细胞中导入核酸。当根癌农杆菌感染时,Ti质粒转移进植物细胞,并稳定整合到植物基因组中(Horsch等人,(1987)Science227:1229-1231;Fraley等人(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA80:4803)。
可以从可操作地连接其它肽或者蛋白质,如可操作地连接纯化信号(如多聚His)的核酸或者作为与其它蛋白质(例如,细胞因子)的嵌合体来表达融合蛋白。
5.施用本发明的融合蛋白、鞭毛蛋白佐剂和组合物的方法
为了治疗和预防目的,可以根据已知的技术(见例如,Pizzo等人PCT申请WO2004/101737)实施本发明。
通常,预防性实施本发明,以防止鼠疫耶尔森氏菌感染和/或减小和/或减轻鼠疫耶尔森氏菌感染的作用。然而,在其它一些实施方案中,实施本发明的方法,以治疗已经受到鼠疫耶尔森氏菌感染的受试者。用于本发明方法中的免疫原性组合物在下文描述。可以在数周、数月或者数年的时间过程内进一步施用强化剂量。在慢性感染中,最初的高剂量后接着施用加强剂量可能是有益的。
术语“治疗”(或者语法上等同的术语)指受试者病况的严重性降低或者至少部分改善或者减轻,和/或实现了至少一种临床症状的一定的减轻、缓和或者减退,和/或状况的进展被延迟,和/或对疾病或者病症发作的预防或者延迟。术语“治疗”等还包括对受试者的预防性治疗(例如,预防感染或者癌症的发作)。本文使用的术语“预防”(和其语法等同物)不意在暗含疾病的完全消除,其包括任何类型的预防性治疗,其减少状况的发病率,延迟状况的发作和/或进展,和/或减轻与该状况有关的症状。从而,术语“治疗”(或者语法上等同的术语)指预防和治疗方案。
术语“接种”或者“免疫”是本领域中公知的,除非另有指明,其在本文中互换使用。例如,术语接种或者免疫可被理解为增加生物对抗原的免疫应答并因此抵抗或者克服感染的方法。在本发明的情况中,针对鼠疫耶尔森氏菌的接种或者免疫增强生物对鼠疫耶尔森氏菌的抵抗和免疫应答。
本文使用的“治疗有效量”是足够治疗(如本文定义)受试者的量。
“主动免疫应答”或者“主动免疫”的特征是“遇到免疫原后,宿主组织和细胞的参与。它涉及淋巴网状组织中免疫活性细胞的分化或者增殖,这导致抗体的合成或者细胞介导的反应性的发展,或者两者均被导致”。HerbertB.Herscowitz,Immunophysiology:CellFunctionandCellularInteractionsinAntibodyFormation,inIMMUNOLOGY:BASICPROCESSES117(JosephA.Bellantied.,1985)。或者可以说,通过感染或者接种暴露于免疫原后,宿主发动主动免疫应答。主动免疫与被动免疫相反,被动免疫中,通过“来自主动免疫的宿主的预先形成的物质(抗体、转移因子、胸腺移植物、白介素-2)转移到非免疫宿主”获得被动免疫。
如本文使用的“保护性”免疫应答或者“保护性”免疫性指:该免疫应答对受试者赋予一定的益处,因为它防止或者减小疾病的发生率和/或严重性。备选地,保护性免疫应答或者保护性免疫可以用于对现有疾病的治疗性治疗。
可以为了医学或者兽医目的实施本发明。本发明方法可治疗的受试者包括鸟类和哺乳动物受试者(哺乳动物受试者包括但不限于人)、非人灵长类(例如,猴子、猿、狒狒和黑猩猩)、狗、猫、兔、山羊、马、猪、牛、绵羊等等(包括雄性和雌性受试者和所有年龄的受试者,包括婴儿、青少年、青年和成年受试者)。可以为了任何目的治疗受试者,例如,为了引起保护性免疫应答;为了引起抗体在受试者(典型地,动物受试者)中的产生,可以收集抗体并用于其它目的,如诊断目的或者施用于其它受试者以在其中产生被动免疫,等等。在一些具体实施方案中,受试者已经处于或者被认为处于鼠疫耶尔森氏菌感染的危险中。
在一些实施方案中,受试者是年老受试者,例如,50或者60岁或者更老的人类受试者,其中其它佐剂如明矾通常效果较低。
因此,在一些具体实施方案中,本发明提供了在受试者(如哺乳动物受试者,例如人或者灵长类动物)中诱导针对鼠疫耶尔森氏菌的免疫应答的方法,该方法包括对受试者以免疫原性有效量施用本发明的融合蛋白或者其药物组合物。在一些代表性实施方案中,实施方法以保护受试者(如哺乳动物受试者,例如人或者灵长类动物)免于鼠疫耶尔森氏菌感染的影响,该方法包括对受试者以能有效保护该受试者免疫鼠疫耶尔森氏菌感染的影响的量施用本发明的融合蛋白或者其药物组合物。任选地,通过向粘膜表面(例如,通过鼻内或者吸入施用)递送融合蛋白或者药物组合物实施这些方法。
本发明还提供了在受试者(如哺乳动物受试者,例如人或者灵长类动物)中诱导对鼠疫耶尔森氏菌的免疫应答的方法,该方法包括对受试者以免疫原性有效量施用鞭毛蛋白佐剂或者鼠疫耶尔森氏菌抗原,或者其药物组合物。在一些代表性实施方案中,实施该方法以保护受试者(如哺乳动物受试者,例如人或者灵长类动物)免于鼠疫耶尔森氏菌感染的影响,该方法包括对受试者以能保护受试者(如哺乳动物受试者,例如人或者灵长类动物)免于鼠疫耶尔森氏菌感染的影响的量施用鞭毛蛋白佐剂或者鼠疫耶尔森氏菌抗原,或者其药物组合物。任选地,通过向粘膜表面(例如,通过鼻内或者吸入施用)递送融合蛋白或者药物组合物实施该方法。可以在相同或者分别的组合物中施用鞭毛蛋白佐剂和鼠疫耶尔森氏菌抗原。如果作为单独的组合物施用,任选地,它们可以同时施用。本文使用的术语“同时”指时间上足够接近以产生组合效果(即,同时可以是同时的,或者它可以是在相互之前和之后的短时间期间[例如,几分钟或者小时]内发生的两个或多个事件)。
施用可以通过本领域中已知的任何途径来进行。作为非限制性例子,施用途径可以是通过吸入(例如,经口和/或鼻吸入)、经口、口含(例如,舌下)、直肠、阴道、局部(包括施用于呼吸道)、眼内、经皮、通过肠胃外(例如,肌内[包括施用于骨骼肌、心肌和/或膈肌]、静脉内、皮下、皮内、胸膜内、脑内和动脉内、和鞘内)途径,以及直接肌肉或器官注射,或者通过施用于中枢神经系统(例如,趋实体性(stereotactic)施用于脑)。
在具体实施方案中,施用到粘膜表面,例如,通过鼻内、吸入、气管内、经口、直肠或者阴道施用,等等。通常,粘膜施用指递送到粘膜表面,如呼吸道、胃肠道、泌尿道、生殖道等等的表面。
施用于呼吸道表面的方法包括但不限于,经粘膜、鼻内、吸入或者气管内施用或者施用于肺。其它粘膜施用方法包括经口、口含(例如,舌下)、气管内、直肠、阴道和眼内施用。
可以通过递送编码本发明蛋白质的核酸中间体并在宿主中表达产生所述蛋白质,来递送本发明的蛋白质,如Feigner等人的美国专利号5,589,466中描述。
免疫调节化合物,如免疫调节性趋化因子和细胞因子(优选地,CTL诱导型细胞因子)可以共同施用于受试者。可以通过本领域中已知的任一种方法施用细胞因子。可以将外源的细胞因子施用于受试者,或者备选地,使用合适的载体可以将编码细胞因子的核苷酸序列递送到受试者,并在体内产生该细胞因子。在一些具体实施方案中,细胞因子作为与鞭毛蛋白佐剂和/或鼠疫耶尔森氏菌抗原的融合蛋白提供。例如,可以施用包含鞭毛蛋白佐剂、鼠疫耶尔森氏菌抗原和免疫调节性细胞因子(例如,γ-干扰素)的融合蛋白。备选地,可以施用包含细胞因子和鼠疫耶尔森氏菌抗原或者鞭毛蛋白佐剂的融合蛋白。
除了它们用于预防或者治疗目的的用途外,可以对受试者施用本发明的融合蛋白和组合物,用于产生针对鼠疫耶尔森氏菌抗原的抗体的目的,该抗体又可以用于人和动物受试者中的诊断或者治疗/预防目的。
6.药物组合物
本发明还提供了包含处于可药用载体中的本发明融合蛋白的药物组合物(例如,免疫原性组合物)。在一些具体实施方案中,配制药物组合物用于粘膜递送。“可药用”指并非有毒的或者不希望的物质。
在一些代表性实施方案中,融合蛋白在药物组合物中以“免疫原性有效”量存在。“免疫原性有效量”是足够在施用了药物组合物的受试者中引起主动免疫应答(即,细胞和/或体液的)的量。任选地,剂量足够产生保护性免疫应答(感染发生后预防性或者治疗性的)。赋予的保护程度不必是完全的或者持久的,只要施用药物组合物的益处超过其任何缺点即可。免疫学有效量取决于蛋白质、施用方式、被治疗的疾病的阶段和严重性、受试者的体重和一般健康状态,和处方医生的判断。
可以通过本领域已知的方法来确定药学活性化合物的剂量,见例如,Remington′sPharmaceuticalSciences(MaackPublishingCo.,Easton,Pa)。在一些具体实施方案中,对于典型的(例如,70kg)受试者,本发明的融合蛋白的剂量为约0.1、0.5、1、10、25、250、100、150或250μg到约300、500、1000、2500、5000或10,000μg融合蛋白的范围。在一些具体实施方案中,对于典型的受试者,剂量为约50到2000μg、约100到1500μg,或者约250到1000μg的范围。最初剂量后,可以在数周、数月或者数年内进行约1μg到250、500或者1000μg的强化剂量,这取决于受试者对最初剂量的应答。
本发明还提供了下述药物组合物,其包含:(a)鞭毛蛋白佐剂;和(b)鼠疫耶尔森氏菌抗原。在一些具体实施方案中,配制药物组合物用于粘膜施用。如本文更详细描述的,鼠疫耶尔森氏菌抗原可以是鼠疫耶尔森氏菌F1抗原、鼠疫耶尔森氏菌V抗原、或者其融合肽。任选地,鼠疫耶尔森氏菌抗原与鞭毛蛋白佐剂偶联,即为与鞭毛蛋白抗原的融合蛋白的形式。根据该实施方案,所述组合物可以还包含一种或多种额外的、不与鞭毛蛋白佐剂偶联(即,不是与鞭毛蛋白佐剂的融合蛋白的部分)的鼠疫耶尔森氏菌抗原。
任选地,鼠疫耶尔森氏菌抗原以如本文定义的免疫原性有效量存在。此外,在一些实施方案中,鞭毛蛋白佐剂以“佐剂有效量”存在。“佐剂有效量”是下述量的鞭毛蛋白佐剂的量,该量足以增强或者刺激宿主发起的针对鼠疫耶尔森氏菌抗原的主动免疫应答(细胞和/或体液的),任选主动的粘膜免疫应答。在具体实施方案中,宿主的主动免疫应答(例如,粘膜免疫应答)被增强至少约2、3、4、5、10、15、20、30、40、50、60、75、100、150、500、1000倍或者以上。在其它一些实施方案中,“佐剂有效量”是下述量的鞭毛蛋白佐剂的量,该量能减少实现特定水平的免疫(细胞和/或体液的)、任选粘膜免疫所需的抗原的量,例如,抗原的量减少至少约15%、25%、35%、50%、65%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或者以上。作为另一选择,“佐剂有效量”可以指下述量的鞭毛蛋白佐剂的量,该量能加速宿主中免疫应答的诱导和/或减小对加强免疫以实现保护的需要。作为再一个选择,“佐剂有效量”可以是能延长免疫应答(任选地保护性免疫应答)持续的时间期限(例如,至少约2倍、3倍、5倍、10倍、20倍更长的时间期限或者更长)的量。
本领域技术人员可以确定鞭毛蛋白佐剂和鼠疫耶尔森氏菌抗原(如果不是融合蛋白的形式)的剂量。在一些具体实施方案中,对于典型的(例如70kg)受试者,鞭毛蛋白佐剂的剂量为约0.1、0.5、1、10、25、50、100或150μg到约200、250、300、500、1000或2500μg的范围。在具体实施方案中,对于典型的受试者,剂量为约10到1000μg,或者约50到500μg,或者约150到300μg。对于典型的(例如70kg)受试者,鼠疫耶尔森氏菌抗原的合适的剂量可以为约0.1、0.5、1、10、25、50、100或150μg到约200、300、500、1000、1500、2000、2500或5000μg。在一些具体实施方案中,对于典型的受试者,鼠疫耶尔森氏菌抗原的剂量为约50到2000μg,约150到约1500μg,或者约300到约1000μg。最初剂量后,可以在数周、数月或者数年内进行约1μg到约1000μg的强化剂量,这取决于受试者对最初剂量的应答。
本发明的药物组合物可以任选包含其它药用剂、制药剂、稳定剂、缓冲剂、载体、稀释剂、盐、张力调节剂、增湿剂等等,例如,乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、脱水山梨醇单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯,等等。
对于注射,载体将典型地为液体。对于其它施用方法,载体可以为固体或者液体。对于吸入施用,载体将是可以呼吸的,并且通常为固体或者液体微粒形式。
尽管通常不需要鞭毛蛋白之外的佐剂,但是组合物可以任选包含额外的佐剂,如完全或者不完全弗氏佐剂、磷酸铝、氢氧化铝、明矾、细胞因子、TLR配体等等。
药物组合物中蛋白质的浓度可以变化很大,例如,从按重量计小于约0.01%或者0.1%到至少约2%到多大20%到50%或者以上,并且将主要通过流体体积、粘度等等根据所选的具体施用方式对其进行选择。
可以根据已知的技术用药物载体配制蛋白质,以用于施用。见例如,Remington,TheScienceAndPracticeofPharmacy(第九版,1995)。在对根据本发明的药物组合物的生产中,通常将蛋白质(包括其生理上可接受的盐)与可接受的载体混合。载体可以为固体或者液体或者两者,并且任选用化合物配制为单位剂量剂型,例如片剂。可以使用多种可药用的水性载体,如水、经缓冲的水、0.9%盐水、0.3%甘氨酸、透明质酸、无致热原的水、无致热原的磷酸缓冲盐溶液、抑菌水或者CremophorEL[R](BASF,Parsippany,N.J.),等等。可以通过常规技术对这些组合物灭菌。可以将一种或多种蛋白质掺入本发明的制剂中,可以通过药剂学的任一种公知技术配制本发明的制剂。
药物组合物可以经包装后原样使用,或者被冻干,冻干的制剂通常与在施用前与无菌水溶液组合。组合物还可以包装在单位/剂量或者多剂量容器,如封闭的安瓿和小瓶中。
可以根据药剂学的常规技术配制药物组合物,以用于通过本领域中任一种已知的方法施用。例如,可以配制组合物进行鼻内施用、通过吸入(例如,经口吸入)、经口、口含(例如,舌下)、直肠、阴道、局部、鞘内、眼内、经皮施用、通过肠胃外施用(例如,肌内(包括施用于骨骼肌、心肌和/或膈肌]、静脉内、皮下、皮内、胸膜内、脑内和动脉内、和鞘内)途径,局部(例如,施用于皮肤和粘膜表面,包括呼吸道表面)以及直接肌肉或器官注射,或者通过施用于中枢神经系统(例如,趋实体性(stereotactic)施用于脑)施用。
在具体实施方案中,将药物组合物施用于粘膜表面,例如,通过鼻内、吸入、气管内、经口、直肠或者阴道施用,等等。
对于鼻内或者吸入施用,可以将药物组合物配制为气溶胶(该术语包括液体和干粉气溶胶)。例如,药物组合物可以以细分的形式与表面活性剂和推进剂一起提供。组合物的典型的百分数是按重量计0.01-20%,优选1-10%。表面活性剂通常是无毒的,并且可溶于推进剂中。此类物质的代表是含有6到22个碳原子的脂肪酸(如己酸、辛酸、十二烷酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、olestericacid和油酸)与脂肪族多元醇或者其环酐的酯或者部分酯。可以使用混合的酯,如混合的或者天然甘油酯。表面活性剂可以构成组合物重量的0.1-20%,优选0.25-5%。组合物的差额通常是推进剂。如需要,还可以包括载体,如用于鼻内递送的卵磷脂。可以通过任何合适的方式,如用压力驱动的气溶胶喷雾器或者超声喷雾器,来产生液体颗粒的气溶胶,如本领域技术人员已知。见例如,美国专利号4,501,729。通过药学领域中已知的技术,类似地,可以用任何固态微粒药物气溶胶发生器产生固体颗粒的气溶胶。也可以通过小滴施用于鼻表面进行鼻内施用。
可注射的制剂可以以常规形式制备,如作为液体溶液剂或者混悬剂、适于在注射前溶解或者混悬于液体中的固体形式,或者作为乳剂。备选地,可以以局部而不是全身方式,如以贮库制剂(depot)或者持续释放制剂施用药物组合物。
可以从以前描述的种类的无菌粉剂、粒剂和片剂,来制备临时注射溶液和混悬液。例如,可以在密闭的容器中以单位剂型提供本发明的可注射的、稳定的无菌组合物。可以以冻干物的形式提供组合物,可以用合适的可药用载体重构冻干物以形成适于注射到受试者的液体组合物。单位剂型可以为约1μg到约10g本发明的组合物。当组合物基本上是水不溶的时候,可以以足够的量包括足够量的可药用乳化剂以在水性载体中乳化组合物。一种此类有用的乳化剂是磷脂酰胆碱。
适于经口施用的药物组合物可以为离散单位,如胶囊剂、扁囊剂、糖锭剂或者片剂,作为粉剂或者粒剂;作为水性或非水性液体中的溶液剂或者混悬剂;或者作为水包油或者油包水乳剂。通过将本发明的化合物与能够抵抗动物肠中消化酶的降解的载体复合,来进行经口递送。此类载体的例子包括塑料胶囊或者片剂,如本领域中已知。可以通过药剂学的任何合适的方法制备此类制剂,所述方法包括使化合物和合适的载体(其可以含有如上述的一种或多种辅助成分)联合。通常,通过将化合物与液体或者细分的固态载体或者两者均匀和紧密地预先混合,如果必要,再将所得混合物成形,可以制备药物组合物。例如,可以通过对含有化合物的粉末或者粒剂,任选地与一种或多种辅助成分进行压紧或者模制,来制备片剂。可以通过在合适的机器中对自由流动形式的组合物(如任选与粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂和/或表面活性剂/分散剂混合的粉剂或者粒剂)进行压片,来制备经压片的片剂。可以通过在合适的机器中对用惰性液体粘合剂湿润的粉末化化合物进行模制,来制备经模制的片剂。
适于口含(舌下)施用的药物组合物包括糖锭剂:其包含增香的基质(通常为蔗糖和阿拉伯树胶或者西黄蓍胶中化合物(tragacanth));和锭剂,其包含惰性基质(如明胶和甘油或者蔗糖和阿拉伯树胶)中的化合物。
本发明的适于肠胃外施用的药物组合物可以包含本发明化合物的无菌水性和非水性注射溶液,该制剂优选与预期的受试者的血液等渗。这些制剂可以含有抗氧化剂、缓冲剂、制菌剂和溶质,其使得组合物与预期的受试者的血液等渗。水性和非水性无菌混悬剂、溶液剂和乳剂可以包括悬浮剂和增稠剂。非水性溶质的例子是丙二醇、聚乙二醇、植物油,如橄榄油,和可注射的有机酯,如油酸乙酯。水性载体包括水、醇/水溶液、乳液或者混悬液,包括盐水和缓冲介质。肠胃外载体包括氯化钠溶液、林格(Ringer’s)葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸林格液或者不挥发油(fixedoil)。静脉内载体包括流体和营养补充剂、电解质补充剂(如基于林格葡萄糖的那些),等等。还可以存在防腐剂和其它添加剂,如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等等。
适于直肠施用的药物组合物优选作为单位剂量栓剂存在。这些可以通过将化合物与一种或多种常规固态载体(如可可脂)混合,然后对所得混合物加以成型来制备。
适于局部应用于皮肤的本发明的药物组合物优选采用软膏剂(ointment)、霜剂、洗剂、糊剂、凝胶剂、喷雾剂、气溶胶或者油的形式。可以使用的载体包括,但不限于矿脂、羊毛脂、聚乙二醇、醇、经皮增强剂,和它们两种或多种的组合。在一些实施方案中,例如,可以通过将本发明的药物组合物与能够穿过皮肤的亲脂试剂(例如,DMSO)混合,来进行局部递送。
适于经皮施用的药物组合物可以为离散贴剂的形式,其适于与受试者的表皮长时间保持紧密接触。适于经皮施用的组合物还可以通过离子电渗疗法(见例如,PharmaceuticalResearch3:318(1986))施用,并且典型地,采取化合物的任选缓冲的水溶液的形式。合适的制剂可以包含柠檬酸或者bis/tris缓冲液(pH6)或者乙醇/水,并且其可以含有0.1到0.2M活性成分。
此外,可以将化合物配制为脂质体制剂。用于形成脂质体混悬液的技术是本领域中公知的。当化合物或者其盐是水溶性盐时,可以使用常规的脂质体制剂,将所述盐掺入到脂囊泡中。在这种情况下,由于化合物或者盐的水溶性,化合物或者盐将基本上被导引于亲水中心或者脂质体的核心中。使用的脂质层可以为任何常规的组合物,并且可以含有胆固醇或者可以是无胆固醇的。当目的化合物或者盐是水溶性的,再次使用常规脂质体形成技术,盐可以基本上被导引于疏水脂质双层中,该双层形成脂质体的结构。在任一情况下,产生的脂质体可以减小尺寸,如通过使用标准超声处理和匀浆技术。
可以冻干脂质体制剂以产生冻干物,可以用可药用的载体,如水对其进行重构,以再生脂质体混悬液。
已经描述了本发明,将在下面的实施例中更详细地解释本发明,本文中包括进这些实施例仅用于阐明目的,并且不意在限制本发明。本发明中使用缩写如下GM-CSF,粒细胞巨噬细胞集落刺激因子;IL,白介素;i.n.,鼻内;i.t.,气管内;NK,自然杀伤细胞;NO;一氧化氮;s.c,皮下的;TLR,toll样受体;TGF-β,转化生长因子β。
实施例1癌抗原和其疫苗
鞭毛蛋白对小鼠肺中先天免疫的影响。1μg鞭毛蛋白的非手术气管内(i.t.)滴注足够在约4小时后诱导TNFα的最大产生(图1)。12-24小时后,支气管肺洗出液中的细胞因子水平回到基线水平。注意:不结合TLR5并从而缺乏信号传递活性的突变的鞭毛蛋白不诱导细胞因子产生。除了TNFα外,几种其它细胞因子(包括IL-6、G-CSF)和趋化因子MIP-2和KC被诱导到相对高的水平。细胞因子表达的增加,之后接着是嗜中性粒细胞的暂时浸润(在12-14小时时最大)。强调鞭毛蛋白引起的先天免疫应答不导致严重的组织损伤炎症是重要的。诱导的炎性应答在性质上是相对适度和急性的。这些发现以及其它研究人员的发现一起确立了鞭毛蛋白作为先天免疫的激活剂的体内潜能。
小鼠肺中鞭毛蛋白的佐剂效果。除了分析鞭毛蛋白诱导的先天应答外,还检查了鞭毛蛋白对抗体应答的效果。用10μgF1抗原与1μg鞭毛蛋白或者失活的鞭毛蛋白突变蛋白通过非手术的气管内(i.t.)或者鼻内(i.n.)滴注免疫BALB/c小鼠。4周后,用相同的方案对小鼠进行强化,然后2周后测定抗F1IgG的血清水平。鞭毛蛋白,而非无活性的突变体,显示出通过血清抗-F1IgG水平测量得到的格外强烈的佐剂活性。在i.t.免疫的动物中,抗体效价为20,000到大于100,000,而对于i.n.免疫的动物的情况,其为90,000到大于300,000。i.n.免疫的结果在表1中给出。使用敲除小鼠对该应答的细胞因子需要的分析表明鞭毛蛋白的佐剂效果不需要IL-6、IL-12,也不需要TNF-α(图5)。此外,用比在小鼠的呼吸道中先天性免疫应答的最大诱导所需的剂量小5-10x的鞭毛蛋白剂量(1μg)实现了鞭毛蛋白的最大佐剂效果。从而,用产生有限的炎症的鞭毛蛋白剂量实现了最大的佐剂活性。
鞭毛蛋白 | 总IgG效价 |
无活性突变体(7只小鼠) | <100 |
野生型小鼠1 | >300,000 |
小鼠2 | >300,000 |
小鼠3 | >300,000 |
小鼠4 | 90,000 |
小鼠5 | >300,000 |
小鼠6 | 300,000 |
表1.用鼠疫耶尔森氏菌F1抗原和野生型鞭毛蛋白鼻内免疫导致强的抗F1IgG应答。用10μgF1抗原和1μg野生型或者突变的鞭毛蛋白对小鼠给予两次免疫。通过ELISA测量血清抗F1IgG效价。
实施例2鞭毛蛋白作为佐剂以产生抗原特异性乳腺癌应答
乳腺瘤体内治疗。用Fra-1(在许多乳腺瘤中过表达的抗原)、鞭毛蛋白或者鞭毛蛋白的失活形式免疫BALB/c小鼠。在皮下注射一种乳腺癌肿瘤D2F2细胞前,对小鼠进行一次强化。监视小鼠的肿瘤生长并测定肿瘤体积。数据在图2中显示。空心圆圈代表给予Fra-1抗原和失活形式的鞭毛蛋白的小鼠。实心圆圈代表给予Fra-1抗原和活性形式的鞭毛蛋白的小鼠。从图中显而易见,鞭毛蛋白+Fra-1抗原对肿瘤的生长具有显著影响。
评估鞭毛蛋白是否可以促进针对小鼠模型中D2F2乳腺癌细胞的保护性免疫应答。使用Fra-1作为抗原,评价鞭毛蛋白促进针对D2F2乳腺癌细胞的免疫的保护状态的能力,Fra-1是这些癌细胞过表达的一种蛋白质。这些实验包括:免疫,然后用D2F2细胞攻击(challenge),以及攻击后免疫,此外,确定诱导的效应抗体对比溶细胞性T细胞和/或NK细胞的性质。
A.对纯化的重组Fra-1抗原的制备。编码编码鼠Fra-1的cDNA的pET22表达载体(由Dr.RongXiang(TheScrippsResearchInstitute)友情提供),用于在Rosetta-gami-pLysS细菌中表达Fra-1蛋白质。使用Talon亲和树脂(通过Fra-1上His标签的识别)纯化蛋白质,并通过纯化的蛋白质穿过Detoxi-凝胶柱(McDermott等人(2000)Infect.Immun.68:5525-5529)来除去污染性内毒素。使用该方法,此前已经得到了mg量的几种蛋白质(例如,鞭毛蛋白、F1抗原和IRAK-4[一种真核蛋白])。
B.评估鞭毛蛋白是否促进用Fra-1抗原和鞭毛蛋白免疫的BALB/c小鼠中对D2F2乳腺癌细胞的保护性免疫。用10μgFra-1蛋白与或不与1μg鞭毛蛋白或者突变的鞭毛蛋白229腹膜内(i.p.)或者肌内(i.m.)免疫7只小鼠的组。2周后,对小鼠进行强化,然后用1x106D2F2攻击(皮下(s.c.)给予)。跟踪肿瘤质量和小鼠存活大约3个月。不存在免疫时,约50%的小鼠在攻击后4周内死亡。测量皮下肿瘤的宽度和长度,从而可以计算肿瘤体积。如果观察到鞭毛蛋白的显著效果,那么确定产生最大应答的鞭毛蛋白的剂量。一旦建立其鞭毛蛋白的最佳剂量,就确定鞭毛蛋白是否可以促进现有肿瘤的清除。用D2F2细胞通过皮下注射攻击7只小鼠的组,然后用Fra-1(与或者不与鞭毛蛋白一起)在攻击时或者1、3、7和21天后免疫。在每种情况下,2周后攻击小鼠。确定肿瘤体积和小鼠的存活。
C.鉴定针对表达Fra-1的D2F2细胞的鞭毛蛋白促进的应答中潜在的效应子。为了鉴定鞭毛蛋白促进的应答中诱导的效应子,确定循环的抗Fra-1抗体的水平,以及CD8+溶细胞性T细胞(CTL)和NK细胞的相对数目。用Fra-1和鞭毛蛋白或者突变的鞭毛蛋白,根据上述方案,免疫BALB/c小鼠。
1.抗-Fra-1抗体。用D2F2细胞攻击后两周,对小鼠进行安乐死,并取血清样品用于通过ELISA分析循环的抗Fra-1抗体。使用合适的抗同种型抗体,评估循环的总IgG和IgM以及IgG1和IgG2a的水平。
2.抗-Fra-1特异性CD8+CTL。通过分离脾细胞,并用标准的51Cr释放测定法评估它们的细胞溶解活性,来确定抗Fra-1特异性CD8+CTL。CD8+CTL介导的裂解将被抗-MHCI类抗体阻断。因此,在该抗体存在和不存在的情况下分析细胞样品。通过改变效应子与靶标的比例,得到对用Fra-1和鞭毛蛋白或者突变的鞭毛蛋白免疫的小鼠中CD8+CTL的增加的相对估计。还可以使用针对γ干扰素(INF-γ)产生的ELISPOT测定法,来测定激活的CD8+CTL的数目。使用抗CD8MACSMicroBeads(MiltenylBiotech),从免疫的小鼠分离CD8+脾细胞,并将细胞与经辐射的D2F2细胞一起温育24小时。针对INF-γ的产生,通过ELISPOT测定法来分析细胞。如果存在足够数目的细胞,那么将细胞内细胞因子染色(ICS)用作第二种方法。
3.NK细胞。使用YAC-I细胞作为靶标,在51Cr释放测定中评估激活的NK细胞的相对数目。从经免疫和D2F2攻击的小鼠得到脾细胞,并评估针对YAC-I细胞的细胞溶解活性。因为DX5的表达与NK细胞有关,使用可通过商业途径得到的PE标记的抗体,通过流式细胞术测量该标记的表达。鞭毛蛋白对NK细胞的扩大的刺激效果应该与DX5表达的增加有关。
含有Fra-1表位的重组鞭毛蛋白在针对D2F2乳腺癌细胞的保护性应答中的功效。进一步确定鞭毛蛋白是否可以作为疫苗载体和佐剂。如果是这样的,那么产生编码来自不同肿瘤抗原的多种表位的重组鞭毛蛋白。
可得到的证据表明:人乳腺癌在它们表达的肿瘤特异性抗原中显示出很大的异质性(heterogeneity)。例如,MAGE-3在约14%的乳腺癌中表达,而Her2/neu在约40%、NY-BR-62在60%、NY-BR-85在约90%的乳腺癌中表达(Scanlan和Jager(2001)BreastCancerRes.3:95-98)。确定含有全长Fra-1抗原的重组鞭毛蛋白蛋白质是否可以与这两种蛋白质以相同的方式发挥功能。如果是这样的,那么对参与诱导保护性应答的Fra-1内的表位作图。用其它主要的乳腺癌抗原靶标进行相同的事将是直接的工作。可以产生表达来自一系列靶抗原的表位的鞭毛蛋白蛋白质。备选地,可以使用鞭毛蛋白蛋白质的混合物-每种鞭毛蛋白表达一小组靶表位。此外,将外源表位导入蛋白质的高变区-不参与鞭毛蛋白与TLR5的相互作用的区域(Donnelly和Steiner(2002)J.BiolChem.277:40456-40461;Smith等人(2003)Nat.Immunol.4:1247-1253;Murthy等人(2004)J.BiolChem.279:5667-5675),不可能以任何显著的方式实现鞭毛蛋白的生物活性。
鞭毛蛋白/Fra-1嵌合体的产生。将Fra-1完整序列插入到鞭毛蛋白的高变区并将所得构建体克隆进pET22a表达载体,并在Rosetta-gami-pLysS细菌中表达蛋白质。使用Detoxi凝胶柱除去内毒素。使用RAW264.7细胞的TNFα生产,来评估嵌合蛋白的生物活性。滴定嵌合体,并将其功效与野生型鞭毛蛋白的进行比较。
对Fra-1表位的作图需要针对D2F2细胞的保护。评价了嵌合体保护BALB/c小鼠免于D2F2细胞的攻击的能力。如果嵌合体诱导保护性免疫,那么产生Fra-1序列的重叠截短,并在鞭毛蛋白的背景中测试功效。为了减少构建体数目,制备覆盖Fra-1的完整序列的三种重叠片段。如果这些截短之一是活性的,那么产生额外的截短以界定出保护所需的最小序列。如果三种截短没有一种自身是有功能的,那么对这些进行成对测试,以确定所需的序列是否在蛋白质的不同部分。使用该方法,可以确定所需的最小序列。
实施例3鞭毛蛋白是针对鼠疫耶尔森氏菌的致死性呼吸攻击的免疫的有效粘膜佐剂
方法:
质粒和细胞培养物。将鼠疫耶尔森氏菌的F1抗原的编码序列caf1(含有整个caf操纵子的质粒,由Dr.J.B.Bliska(StateUniversityofNewYork,StonyBrook)友情提供)亚克隆进来自Novagen(EMDBiosciences,Inc.,Madison,WI)的pET29a表达载体的NdeI和XhoI位点中。对重组的F1/V融合构建体(Heat等人(1998)Vaccine16:1131-1137)(由Drs.G.Andrews和P.Worsham,USAMRIID提供)进行测序,并亚克隆进pET16b中。测序揭示不存在对应于F1的信号序列的21个氨基酸。
试剂和抗体。如以前描述的(Honko和Mizel(2004)Infect.Immun.72:6676-6679;McDermott等人(2000)Infect.Immun.68:5525-5529),制备来自肠炎沙门氏菌(Salmonellaenteritidis)的经纯化的、重组的、经His标记的鞭毛蛋白。以相同的方式纯化229突变的鞭毛蛋白以及F1和F1/V抗原。如通过来自CambrexCorporation(EastRutherford,NJ)的QCL-ChromogenicLALTestKit所检测的,内毒素水平≤1pg/μg。使用OptEIAELISA试剂盒(mono/mono)按照生产商的使用说明(BDBiosciences)检测TNF-α。从ResearchDiagnostics,Inc.(Flanders,NJ)得到的抗-F1小鼠单克隆IgG1、克隆YPF19用作为抗-F1ELISA中的对照。从SouthernBiotech(Birmingham,AL)购买山羊抗小鼠IgG-HRP。从ResearchDiagnostics,Inc.(Flanders,NJ)购买山羊抗猴IgG-HRP。
小鼠。从FrederickCancerResearchandDevelopmentCenter(Frederick,MD)购买雌性BALB/cAnNCr小鼠。从JacksonLaboratory(BarHarbor,ME)购买雌性IL-6-/-小鼠(B6;129S2-Il6/J)、TNFR1小鼠(tm1Kopf-/-B6;129S-Tnfrsf1aTnfrsf1b/J)、IFNγ(tm1Imxtm1Imx-/-B6.129S7-Ifngtm1Ts/J)和对照小鼠(C57BL/6J,B6;129SF2/J和129/SvJ)。IFNα/βR-/-小鼠由Dr.C.Schindler,ColumbiaUniversity,NewYork(Müller等人(1994)Science264:1918-1921)提供。将小鼠保持于特定的无病原体的设施中,并且所有研究都遵从WakeForestUniversityAnimalCareandUseCommittee规定的联邦和机构准则。
小鼠的非手术气管内和鼻内免疫。对于器官内免疫,用阿佛丁(2,2,2-三溴代乙醇,Sigma;叔戊醇,Fisher)通过腹膜内注射麻醉小鼠,并将其用一定长度的线通过它们的前门牙(frontincisor)对其进行悬吊。使用轻轻插入进气管的、装载凝胶的无菌吸头,施用总共50μL无致热原的PBS中的10μgF1抗原和指示量的鞭毛蛋白或者鞭毛蛋白突变体229。对于鼻内施用,对经麻醉小鼠的鼻孔使用PBS中的小体积(总共9-12μL)抗原和佐剂。在4周时对小鼠进行强化,并在强化后2-3周收集血浆用于对抗体效价的分析。
对猴子的免疫。按照WakeForestUniversityAnimalCareandUseCommittee规定的联邦和机构准则,保持15只健康的成年雌性猕猴(Macacafascicularis)。用7-10m/kg氯胺酮肌内对动物进行麻醉,以用于免疫并收集血液。对于鼻内免疫,将150μgF1/V融合蛋白和50μg鞭毛蛋白逐滴递送(100μL/鼻孔)给动物,这以卧位递送来进行。以1ml体积向四头肌施用肌内免疫。对照动物鼻内和肌内接受PBS。
通过酶联免疫吸附测定(ELISA)分析血浆抗体效价。用肝素化管(StatSpin;FisherScientific)或者BDVacutainerPST管进行血浆收集。然后将血浆等分试样,并在-70℃冷冻直到分析。用100μL抗原以无菌PBS中的10μg/mL对ELISA板进行4℃下的过夜包被,并用PBS中的10%FCS封闭。加入一式两份或者一式三份的血浆稀释液,并在4℃过夜温育平板,接着将其与二级抗-Ig抗体在室温温育2小时。用3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)LiquidSubstrateSystem(Sigma-Aldrich)检测过氧化物酶活性,并用2MH2SO4终止反应。将终点稀释效价定义为:导致吸收值(OD450)比未曾进行实验血浆>0.1的最高稀释度的倒数。
用鼠疫耶尔森氏菌CO92进行呼吸攻击。CentersforDiseaseControl(CDC)DivisionofVector-BorneInfectiousDiseases(FortCollins,CO)提供了鼠疫耶尔森氏菌CO92biovarorientalis的原种培养物,其是从人原发性肺鼠疫的致死病例分离的菌株(Doll等人(1994)Am.J.Trop.Med.Hyg.51:109-114)。用来自亚培养板的单个菌落接种心浸液培养基,并在28℃培养到约1×109个菌落形成单位(cfu)/mL的密度。用以PBS稀释到~1.8×107cfu/mL(等于1.2×104cfu的150×50%致死剂量(LD50)的剂量)的10μL培养物,对小鼠进行鼻内攻击(数据未显示)。通过在胰蛋白(sryptose)血液琼脂板上平板接种连续稀释液,来确定实际的cfu/mL值。所有实验都根据CDC批准的关于VirginiaTech的InfectiousDiseaseUnit的BSL3和ABSL3设施的标准操作步骤(CDC批准#C20031120-0016)进行。
统计学分析。数据以单个值表示,标有平均值和标准误。对方差齐(equalityofvariance)的F检验和斯氏单侧t检验用于给出p<0.05或者p<0.01时的统计学显著性。用SigmaStat3.1(SystatSoftware,Inc.,Richmond,CA)通过非线性回归确定LD50值。
结果:
用鞭毛蛋白免疫促进了对鼠疫耶尔森氏菌的F1抗原的有效的主动应答。为了确定鞭毛蛋白促进对于鼠疫耶尔森氏菌的F1抗原的体液免疫应答的能力,用10μgF1抗原和1μg重组鞭毛蛋白(FliC)对BALB/c小鼠进行气管内(i.t.)或者鼻内(i.n.)免疫。用PBS中的F1抗原或者F1和鞭毛蛋白的突变形式(称作229)对对照动物免疫。4周后,以相同的方式对小鼠进行强化,并收集血浆用于分析在强化后不同时间的循环抗体效价。在对照组中没有检测到F1特异性IgG。然而,含有F1和鞭毛蛋白的疫苗刺激总IgG效价的显著增加(图1,a),并且具有高水平的F1特异性IgG1和IgG2a。当i.t.施用鞭毛蛋白和F1时,IgG1与IgG2a的平均比例(条形内指出)为30-170,当i.n.给药时,为约3。尽管i.n.和i.t.免疫导致混合型Th应答,但是气管内免疫后,对表观Th2应答的偏向更明显。注意到鞭毛蛋白不促进显著的F1-特异性IgE产生是重要的。用F1和鞭毛蛋白免疫的小鼠在两次免疫后显示出抗-F1IgG的持续效价(图3,b)。在16周时的第三次免疫提高了具有较低最初效价的两只小鼠中的抗体应答。
在以前的研究中展示出:在5-15μg的鞭毛蛋白剂量下,肺中对鞭毛蛋白的先天性应答是最大的(Honko和Mizel(2004)Infect.Immun.72:6676-6679)。为了确定在细胞因子应答和鞭毛蛋白促进的抗体应答的幅度之间是否存在线性关系,用F1抗原和1μg、5μg和15μg鞭毛蛋白免疫BALB/c小鼠(图3,c)。在这些剂量下抗-F1IgG效价没有显著不同,表明在1μg鞭毛蛋白下佐剂效果是最大的。然而,我们注意到:使用增加剂量的鞭毛蛋白时,倾向于更大的IgG1/IgG2a比。从而,似乎最大的适应性应答不需要最大的先天性应答。
当考虑到鞭毛蛋白用作佐剂时,对鞭毛蛋白的预先存在的免疫是明显受到关注的。因此,我们评价了在高效价的抗鞭毛蛋白抗体存在下,用鞭毛蛋白和F1免疫的有效性。用5μg鞭毛蛋白免疫并强化雌性BALB/c小鼠,并测定抗鞭毛蛋白抗体效价。免疫前,鞭毛蛋白特异性IgG效价低于检测水平,其显著增加,平均抗-FliCIgG效价为8.5×105。然后用10μgF1和1μgFliC鼻内免疫和强化这些小鼠。强化后2周,在未曾用于实验的和FliC免疫小鼠之间,抗-FliCIgG效价是相似的(图3,d),表明循环的抗鞭毛蛋白抗体没有积极或者消极地改变对鞭毛蛋白的应答。我们的结果支持了如下结论:在对鞭毛蛋白的先前免疫性存在下,鞭毛蛋白是有效的佐剂。
鞭毛蛋白的佐剂效果刺激抗原特异性应答并且依赖于T淋巴细胞。免疫记忆的发生是有效疫苗的基本特征,这让免疫系统准备在感染期间再次暴露于抗原后快速反应。为了评价二次免疫中对鞭毛蛋白刺激的需要,用F1抗原和鞭毛蛋白免疫四组BALB/c小鼠,并随后用PBS、仅鞭毛蛋白、仅F1抗原或者鞭毛蛋白和F1强化(图4,a)。用仅PBS或者鞭毛蛋白强化的小鼠中,F1特异性IgG效价保持于500-1100,其是首次应答后典型的值。然而,在二次免疫中仅接受F1抗原的小鼠具有显著增加的抗F1IgG效价。尽管在强化中不需要鞭毛蛋白,但是当存在鞭毛蛋白时,抗F1抗体效价显著增加。这些发现类似于Pasare和Medzhitov(2004)Immunity21:733-741使用LPS作为佐剂所报导的结果。作者提示一旦用LPS作为佐剂建立了CD4+记忆,那么这些淋巴细胞的活化不再需要TLR刺激。尽管我们系统中的记忆应答仍然有待完全分析,但是,在用鞭毛蛋白和F1免疫的无胸腺裸鼠(BALB/cAnNCr-nu/nu)中F1特异性IgG应答的缺乏,表明在对该疫苗的体液应答中需要T细胞。
TNF-α、IL-6和干扰素不是鞭毛蛋白的佐剂效应所需的。此前确定了鞭毛蛋白在肺中诱导高水平的TNF-α和IL-6(实施例1;Honko和Mizel(2004)Infect.Immun.72,6676-6679)。因此,评估了这些细胞因子在鞭毛蛋白的佐剂活性中的作用。TNF-α是一种多效细胞因子,其促进树突细胞成熟(Banchereau等人(2000)Annu.Rev.Immunol.18,767-811)。如图5,a中所示,在这些小鼠中,抗F1抗体应答保持非常高,表明TNF-α不是鞭毛蛋白的佐剂效果所需的。然而,鞭毛蛋白刺激的TNF-α产生看起来能增强对F1抗原的抗体应答,因为TNFR-/-小鼠中的效价相对于野生型的B6;129小鼠减小约两倍。使用IL-6-/-小鼠评估了IL-6——一种促进B细胞增殖和分化的细胞因子(Kaminura等人(2003)Rev.PhysiolBiochem.Pharmacol.149:1-38)——在鞭毛蛋白的佐剂活性中的作用。用F1和FliC免疫后,这些小鼠中抗-F1IgG的产生没有缺陷(图5,b),表明该细胞因子也不是鞭毛蛋白的佐剂效果必需的。
在体外,通过经由功能性TLR5/4异数复合体的信号传递,鞭毛蛋白刺激一氧化氮和β干扰素(IFN-β)的产生。C3H/HeJ小鼠具有非功能的突变TLR4(Poltorak等人(1998)Science282:2085-2088),这提供了分离体内TLR5/4异数(heteromeric)和TLR5/5同数(hemomeric)信号传递效果的模型。在肺中,对TNF-α、IL-6、G-CSF(粒细胞集落刺激因子)、角质形成细胞衍生趋化因子(KC)、巨噬细胞炎症蛋白2(MIP-2)和MIP-1α的经鞭毛蛋白刺激的产生在C3H/HeJ小鼠中未受破坏(实施例1;Honko和Mizel(2004)Infect.Immun.72:6676-6679);然而,没有对干扰素产生加以评估。已提出:I型IFN通过刺激MHC和抗原呈递细胞上共刺激分子的上调,从而将先天性和适应性免疫应答联系起来(LeBon和Tough(2002)Curr.Opin.Immunol14:432-436)。为了确定TLR5/4信号传递对鞭毛蛋白的佐剂效果的影响,用F1抗原和鞭毛蛋白免疫后,将C3H/HeJ小鼠中的抗-F1抗体效价与它们的野生型副本C3H/HeN小鼠比较(图5,c)。由于抗体产生中没有缺陷,通过TLR5/4复合体的信号传递不是鞭毛蛋白的佐剂效果所需的。通过确定缺少I型干扰素信号传递(IFNα/βR-/-)或者产生γ干扰素(IFNγ/-)的能力的小鼠中的抗体应答,直接评估干扰素在鞭毛蛋白的佐剂活性中的作用(图5,d和e)。由于两种品系的小鼠都以与用F1抗原和鞭毛蛋白免疫的野生型小鼠相似的方式应答,所以干扰素不是鞭毛蛋白的佐剂效果所需的。
鞭毛蛋白促进对鼠疫耶尔森氏菌CO92的鼻内攻击的保护性应答。对疫苗的基本测试是提供对病原体攻击的保护能力。作为针对呼吸感染的模型,用毒性鼠疫耶尔森氏菌CO92对经免疫的和对照小鼠进行鼻内攻击。为了确保诱导足够保护的接种,基于NIAID和FDA(2004年10月13-14日)发起的最近的PlagueVaccineWorkshop的推荐,选用是鼠疫耶尔森氏菌的鼻内感染的50%致死剂量(LD50)的约150倍的攻击剂量。用等于100×LD50的剂量攻击后,用鞭毛蛋白和F1鼻内免疫和强化的BALB/c小鼠具有93%的存活率,相比之下,对照组中仅为7%(图6,a)。用B细胞缺陷的IgH-/-小鼠来评价保护性应答的B细胞/抗体依赖性(图6,b)。在约150×LD50的剂量下,所有对照和经免疫小鼠都死于鼠疫耶尔森氏菌感染,表明在该攻击剂量下的保护是B细胞介导的,并且从而可能是抗体介导的。以前,Elvin等人使用具有缺陷的IL-12和IFN-γ介导的细胞免疫应答的Stat4-/-动物,检查了1型效应子功能在保护免疫鼠疫耶尔森氏菌感染中的作用(Elvin和Williamson(2004)Microb.Patho.37:177-184)。而经免疫的Stat4-/-小鼠与它们的野生型副本产生类似水平的抗-F1和抗VIgG,这些动物对于高剂量攻击受到的保护较弱。为了处理我们的系统中鼻内攻击后IFN-γ介导的保护的作用,用F1抗原和鞭毛蛋白免疫并强化IFN-γ-/-和野生型C57BL/6小鼠组,之后用150×LD50鼠疫耶尔森氏菌进行攻击。野生型C57BL/6小鼠受到鞭毛蛋白和F1的鼻内免疫的完全保护,相比之下,仅10%对照受到保护(图6,c)。经免疫的IFN-γ-/-小鼠在攻击后具有80%存活(图6,d),表明IFN-γ介导的应答不是保护所需的。由于这些动物具有高效价的抗-F1IgG,所以这些结果证实了F1特异性抗体在保护免于鼠疫耶尔森氏菌感染中的重要性,并且支持了利用循环IgG效价作为保护功效的相关物的用途。两只IFN-γ-/-小鼠死于感染这一观察提示:IFN-γ可能增加对鼠疫耶尔森氏菌的抗体介导的保护,可能是通过促进吞噬细胞中的呼吸爆发来实现的。
鞭毛蛋白是非人灵长类中的有效佐剂。考虑到鞭毛蛋白促进鼠模型中适应性免疫应答的能力,我们接下来评估了鞭毛蛋白作为非人灵长类中佐剂的有效性。用由鼠疫耶尔森氏菌的F1和V抗原组成的重组融合蛋白免疫雌性猕猴。用150μgF1/V融合蛋白和50μg鞭毛蛋白鼻内或者肌内(i.m.)免疫6只猕猴组。额外的对照动物(n=3)通过两种途径接受PBS。免疫前,猴子显示出约9.8×104的抗鞭毛蛋白抗体效价。在免疫后的前24小时内,用鞭毛蛋白免疫的猴子不显示出体温或者血浆TNF-α水平的改变,并且在注射部位没有不发生可观察到的炎症。在4周以相同的方式对动物加以强化,并在2周后确定血浆抗-F1/VIgG效价(图7)。经免疫的猴子显示出F1/V特异性抗体效价的显著增加。没有检测到抗原特异性IgE。这些结果清楚地表明:鞭毛蛋白是在非人灵长类动物中发生抗体应答的有效佐剂,即使存在循环的抗鞭毛蛋白抗体的情况下也是如此。
实施例4鼠疫耶尔森氏菌抗原和疫苗
以与实施例2相似的方式,用鼠疫耶尔森氏菌V抗原、鼠疫耶尔森氏菌F1抗原或者其融合肽产生用于诱导对鼠疫耶尔森氏菌的免疫应答的融合蛋白。此类融合蛋白可以用于诱导免疫应答,任选地保护性免疫应答,如本文所述。任选地,应答是粘膜免疫应答。合适的融合蛋白的特定非限制性例子为:
例子A:FliC/F1/V氨基酸序列(SEQIDNO:1)
1MAQVINTNSLSLLTQNNLNKSQSSLSSAIERLSSGLRINSAKDDAAGQAI
51ANRFTSNIKGLTQASRNANDGISIAQTTEGALNEINNNLQRVRELSVQAT
101NGTNSDSDLKSIQDEIQQRLEEIDRVSNQTQFNGVKVLSQDNQMKIQVGA
151NDGETITIDLQKIDVKSLGLDGFNVNGPKEATVGDLKSSFKNVTGRSMAD
201LTASTTATATLVEPARITLTYKEGAPITIMDNGNIDTELLVGTLTLGGYK
251TGTTSTSVNFTDAAGDPMYLTFTSQDGNNHQFTTKVIGKDSRDFDISPKV
301NGENLVGDDVVLATGSQDFFVRSIGSKGGKLAAGKYTDAVTVTVSNQGSI
351EGRNRAYEQNPQHFIEDLEKVRVEQLTGHGSSVLEELVQLVKDKNIDISI
401KYDPRKDSEVFANRVITDDIELLKKILAYFLPEDAILKGGHYDNQLQNGI
451KRVKEFLESSPNTQWELRAFMAVMHFSLTADRIDDDILKVIVDSMNHHGD
501ARSKLREELAELTAELKIYSVIQAEINKHLSSSGTINIHDKSINLMDKNL
551YGYTDEEIFKASAEYKILEKMPQTTIQVDGSEKKIVSIKDFLGSENKRTG
601ALGNLKNSYSYNKDNNELSHFATTCSDKSRPLNDLVSQKTTQLSDITSRF
651NSAIEALNRFIQKYDSVMQRLLDDTSGKRSATGDKITLAGKTMFIDKTAS
701GVSTLINEDAAAAKKSTANPLASIDSALSKVDAVRSSLGAIQNRFDSAIT
751NLGNTVTNLNSARSRIEDADYATEVSNMSKAQILQQAGTSVLAQANQVPQ
801NVLSLLRLEHHHHHH*
例子B:FliC/F1氨基酸序列(SEQIDNO:2)
1MAQVINTNSLSLLTQNNLNKSQSSLSSAIERLSSGLRINSAKDDAAGQAI
51ANRFTSNIKGLTQASRNANDGISIAQTTEGALNEINNNLQRVRELSVQAT
101NGTNSDSDLKSIQDEIQQRLEEIDRVSNQTQFNGVKVLSQDNQMKIQVGA
151NDGETITIDLQKIDVKSLGLDGFNVNGPKEATVGDLKSSFKNVTGRSMAD
201LTASTTATATLVEPARITLTYKEGAPITIMDNGNIDTELLVGTLTLGGYK
251TGTTSTSVNFTDAAGDPMYLTFTSQDGNNHQFTTKVIGKDSRDFDISPKV
301NGENLVGDDVVLATGSQDFFVRSIGSKGGKLAAGKYTDAVTVTVSNQRSA
351TGDKITLAGKTMFIDKTASGVSTLINEDAAAAKKSTANPLASIDSALSKV
401DAVRSSLGAIQNRFDSAITNLGNTVTNLNSARSRIEDADYATEVSNMSKA
451QILQQAGTSVLAQANQVPQNVLSLLRLEHHHHHH*
例子C:FliC/V氨基酸序列(SEQIDNO:3)
1MAQVINTNSLSLLTQNNLNKSQSSLSSAIERLSSGLRINSAKDDAAGQAI
51ANRFTSNIKGLTQASRNANDGISIAQTTEGALNEINNNLQRVRELSVQAT
101NGTNSDSDLKSIQDEIQQRLEEIDRVSNQTQFNGVKVLSQDNQMKIQVGA
151NDGETITIDLQKIDVKSLGLDGFNVNGPKEATVGDLKSSFKNVTGRSMIR
201AYEQNPQHFIEDLEKVRVEQLTGHGSSVLEELVQLVKDKNIDISIKYDPR
251KDSEVFANRVITDDIELLKKILAYFLPEDAILKGGHYDNQLQNGIKRVKE
301FLESSPNTQWELRAFMAVMHFSLTADRIDDDILKVIVDSMNHHGDARSKL
351REELAELTAELKIYSVIQAEINKHLSSSGTINIHDKSINLMDKNLYGYTD
401EEIFKASAEYKILEKMPQTTIQVDGSEKKIVSIKDFLGSENKRTGALGNL
451KNSYSYNKDNNELSHFATTCSDKSRPLNDLVSQKTTQLSDITSRFNSAIE
501ALNRFIQKYDSVMQRLLDDTSGKRSATGDKITLAGKTMFIDKTASGVSTL
551INEDAAAAKKSTANPLASIDSALSKVDAVRSSLGAIQNRFDSAITNLGNT
601VTNLNSARSRIEDADYATEVSNMSKAQILQQAGTSVLAQANQVPQNVLSL
651LRLEHHHHHH *
注释:FliC从肠炎沙门氏菌得到。在这些融合蛋白的每一种中,FliC的N-末端恒定区在氨基酸残基198处结束,C末端恒定区(以粗体和下划线表示的前7个氨基酸)在例子A(SEQIDNO:1)的氨基酸残基679处开始,例子B(SEQIDNO:2)的氨基酸残基348处开始,例子C(SEQIDNO:3)的氨基酸残基524处开始。
实施例5含有鞭毛蛋白和鼠疫耶尔森氏菌的F1和V抗原的融合肽的生物活性
为了制备编码作为单种蛋白质的鞭毛蛋白和鼠疫耶尔森氏菌F1和V抗原的表达质粒,除去编码肠炎沙门氏菌鞭毛蛋白的高变区的核苷酸序列的大部分,并用串联的F1和V序列替代,所述F1和V序列由编码6个氨基酸的18核苷酸桥分开(见上面的例子A,SEQIDNO:1)。在BL21细胞中产生重组蛋白质,并通过在金属亲和树脂上亲和层析纯化。使用Acrodisc层析滤器除去内毒素和污染性核酸。为了确定所得蛋白质是否保留鞭毛蛋白活性,将TLR5-阴性和TLR5-阳性RAW264.7细胞与三融合蛋白温育,并确定肿瘤坏死因子α产生的程度。TLR5-阴性RAW细胞用于控制可能在该测定中具有影响的任何污染性因子。如图8中所示,含有鞭毛蛋白和鼠疫耶尔森氏菌F1和V蛋白的融合蛋白在TLR5-阳性细胞中保留了鞭毛蛋白生物活性。该蛋白质在TLR5-阴性RAW264.7细胞中不传递信号。
将Toll-样受体5(TLR5)阴性RAW264.7细胞或者TLR5-阳性RAW264.7细胞(通过用编码TLR5-增强的黄色荧光蛋白的构建体稳定转染RAW264.7细胞产生的细胞系)与增加浓度的编码鞭毛蛋白和鼠疫耶尔森氏菌F1和V蛋白的融合蛋白温育4小时,然后通过ELISA测定培养基的TNF-α含量。
为了确定鞭毛蛋白+F1+V或者含有所有三种组分的单种蛋白质是否能针对鼠疫耶尔森氏菌CO92的致死攻击提供保护,将仅用磷酸缓冲盐水(PBS)或者含有三种蛋白质-1mg鞭毛蛋白+5mg每种F1和V的疫苗或者含有包含鞭毛蛋白、F1和V的单种蛋白质(鞭毛蛋白/F1/V;10mg)的疫苗对C3H/HeJ小鼠进行免疫和强化。在4周后用相同的方案强化小鼠,然后用约150LD50的鼠疫耶尔森氏菌CO92进行攻击。在攻击前对小鼠取血,并通过ELISA确定抗-F1IgG效价。如表2中所示,鞭毛蛋白+鼠疫耶尔森氏菌的F1和V抗原或者含有鞭毛蛋白和鼠疫耶尔森氏菌的F1和V抗原的融合蛋白提供了对鼠疫耶尔森氏菌的致死性呼吸攻击的完全保护。
表2.用鞭毛蛋白+鼠疫耶尔森氏菌的F1和V抗原或者含有鞭毛蛋白和鼠疫耶尔森氏菌的F1和V抗原的融合蛋白免疫的小鼠对鼠疫耶尔森氏菌的致死性呼吸攻击的保护研究结果
上文阐明了本发明,并且不作为本发明的限制。本发明通过下面的权利要求来限定,其中包括权利要求的等同方案。
Claims (16)
1.经分离的融合蛋白,其由下列组成:
(a)鞭毛蛋白佐剂,该鞭毛蛋白佐剂由下列组成:
(i)鞭毛蛋白N-末端恒定区,其中,所述的鞭毛蛋白N-末端恒定区是肠炎沙门氏菌(Salmonellaenteritidis)的FliC的N-末端恒定区的全长区域或其活性片段;
(ii)鞭毛蛋白C-末端恒定区,其中,所述的鞭毛蛋白C-末端恒定区是肠炎沙门氏菌的FliC的C-末端恒定区的全长区域或其活性片段;和
(iii)部分缺失的高变区;
(b)在N-末端恒定区和C-末端恒定区之间的鼠疫耶尔森氏菌(Yersiniapestis)抗原,其中所述的鼠疫耶尔森氏菌抗原是鼠疫耶尔森氏菌F1抗原和/或鼠疫耶尔森氏菌V抗原,和
(c)一个或多个肽铰链区段,
其中,所述经分离的融合蛋白在哺乳动物对象中产生针对鼠疫耶尔森氏菌的免疫应答,
其中,所述鞭毛蛋白N-末端和/或C-末端恒定区包含TLR5识别位点并且能够激活TLR5途径。
2.权利要求1的融合蛋白,其中所述鼠疫耶尔森氏菌抗原插入在(i)部分缺失的高变区内,(ii)鞭毛蛋白N-末端恒定区和部分缺失的高变区之间,或者(iii)鞭毛蛋白C-末端恒定区和部分缺失的高变区之间。
3.权利要求1的融合蛋白,其中鼠疫耶尔森氏菌抗原是鼠疫耶尔森氏菌F1抗原和鼠疫耶尔森氏菌V抗原。
4.编码权利要求1-3中任一项的融合蛋白的核酸。
5.包含权利要求4的核酸的载体。
6.包含权利要求4的核酸或者权利要求5的载体的宿主细胞,其中所述宿主细胞不能发育成植物。
7.制备权利要求1-3中任一项的融合蛋白的方法,该方法包括:在足够产生所述融合蛋白的条件下,在培养基中培养权利要求6的宿主细胞。
8.权利要求7的方法,其中从宿主细胞或者培养基收集融合蛋白。
9.免疫原性组合物,其包含处于可药用载体中的、权利要求1-3中任一项的融合蛋白。
10.用于粘膜施用的免疫原性组合物,其包含可药用载体中的权利要求1-3中任一项的融合蛋白。
11.权利要求9或10的免疫原性组合物,其还包含不与鞭毛蛋白佐剂偶联的第二种鼠疫耶尔森氏菌抗原。
12.权利要求1-3中任一项的融合蛋白或权利要求9或10中任一项的组合物在制备用于在哺乳动物受试者中产生针对鼠疫耶尔森氏菌的免疫应答的药物中的应用。
13.权利要求1-3中任一项的融合蛋白或权利要求9或10中任一项的组合物在制备用于保护哺乳动物受试者免于鼠疫耶尔森氏菌感染影响的药物中的应用。
14.权利要求1的融合蛋白,其中,所述的鼠疫耶尔森氏菌抗原是鼠疫耶尔森氏菌F1抗原。
15.权利要求1的融合蛋白,其中,所述的鼠疫耶尔森氏菌抗原是鼠疫耶尔森氏菌V抗原。
16.经分离的融合蛋白,其由下列序列组成:
MAQVINTNSLSLLTQNNLNKSQSSLSSAIERLSSGLRINSAKDDAAGQAIANRFTSNIKGLTQASRNANDGISIAQTTEGALNEINNNLQRVRELSVQATNGTNSDSDLKSIQDEIQQRLEEIDRVSNQTQFNGVKVLSQDNQMKIQVGANDGETITIDLQKIDVKSLGLDGFNVNGPKEATVGDLKSSFKNVTGRSMADLTASTTATATLVEPARITLTYKEGAPITIMDNGNIDTELLVGTLTLGGYKTGTTSTSVNFTDAAGDPMYLTFTSQDGNNHQFTTKVIGKDSRDFDISPKVNGENLVGDDVVLATGSQDFFVRSIGSKGGKLAAGKYTDAVTVTVSNQGSIEGRNRAYEQNPQHFIEDLEKVRVEQLTGHGSSVLEELVQLVKDKNIDISIKYDPRKDSEVFANRVITDDIELLKKILAYFLPEDAILKGGHYDNQLQNGIKRVKEFLESSPNTQWELRAFMAVMHFSLTADRIDDDILKVIVDSMNHHGDARSKLREELAELTAELKIYSVIQAEINKHLSSSGTINIHDKSINLMDKNLYGYTDEEIFKASAEYKILEKMPQTTIQVDGSEKKIVSIKDFLGSENKRTGALGNLKNSYSYNKDNNELSHFATTCSDKSRPLNDLVSQKTTQLSDITSRFNSAIEALNRFIQKYDSVMQRLLDDTSGKRSATGDKITLAGKTMFIDKTASGVSTLINEDAAAAKKSTANPLASIDSALSKVDAVRSSLGAIQNRFDSAITNLGNTVTNLNSARSRIEDADYATEVSNMSKAQILQQAGTSVLAQANQVPQNVLSLLR。
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US63663504P | 2004-12-16 | 2004-12-16 | |
US60/636,635 | 2004-12-16 | ||
US70960905P | 2005-08-19 | 2005-08-19 | |
US60/709,609 | 2005-08-19 | ||
PCT/US2005/045954 WO2006066214A2 (en) | 2004-12-16 | 2005-12-16 | Use of flagellin in the immunotherapy of yersinia pestis |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN101094685A CN101094685A (zh) | 2007-12-26 |
CN101094685B true CN101094685B (zh) | 2016-01-13 |
Family
ID=38992525
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CNA2005800456672A Pending CN101094686A (zh) | 2004-12-16 | 2005-12-16 | 鞭毛蛋白在肿瘤免疫疗法中的用途 |
CN200580045581.XA Expired - Fee Related CN101094685B (zh) | 2004-12-16 | 2005-12-16 | 鞭毛蛋白在鼠疫耶尔森氏菌的免疫疗法中的用途 |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CNA2005800456672A Pending CN101094686A (zh) | 2004-12-16 | 2005-12-16 | 鞭毛蛋白在肿瘤免疫疗法中的用途 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (2) | CN101094686A (zh) |
Families Citing this family (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102000329B (zh) * | 2009-11-27 | 2013-03-13 | 中国科学院武汉病毒研究所 | 一种改造的非致病细菌来源的鞭毛素粘膜佐剂及制备方法 |
CN102002098B (zh) * | 2009-11-27 | 2013-07-24 | 中国科学院武汉病毒研究所 | 一种改造的鞭毛素蛋白及其制备方法和应用 |
CN102816246B (zh) * | 2012-09-04 | 2014-07-23 | 成都蓉生药业有限责任公司 | 一种人巨细胞病毒免疫原融合蛋白及其制备方法和用途 |
CN107158372A (zh) * | 2017-04-19 | 2017-09-15 | 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所 | 鼠毒素作为粘膜免疫佐剂的应用及含有该佐剂的鼠疫菌粘膜疫苗 |
CN110559424B (zh) * | 2019-08-26 | 2021-08-20 | 君维安(武汉)生命科技有限公司 | 一种外膜蛋白在制备恶性肿瘤免疫治疗药物中的应用 |
JP2022546465A (ja) * | 2019-08-30 | 2022-11-04 | ゲノム プロテクション,インコーポレイテッド | ワクチン有効性の増加方法 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5985285A (en) * | 1995-03-13 | 1999-11-16 | The Secretary Of State For Defence In Her Britanic Majesty's Government Of The United Kingdom Of Great Britain And Northern Ireland | Vaccines for plague |
US6130082A (en) * | 1988-05-05 | 2000-10-10 | American Cyanamid Company | Recombinant flagellin vaccines |
-
2005
- 2005-12-16 CN CNA2005800456672A patent/CN101094686A/zh active Pending
- 2005-12-16 CN CN200580045581.XA patent/CN101094685B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6130082A (en) * | 1988-05-05 | 2000-10-10 | American Cyanamid Company | Recombinant flagellin vaccines |
US5985285A (en) * | 1995-03-13 | 1999-11-16 | The Secretary Of State For Defence In Her Britanic Majesty's Government Of The United Kingdom Of Great Britain And Northern Ireland | Vaccines for plague |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN101094686A (zh) | 2007-12-26 |
CN101094685A (zh) | 2007-12-26 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US8198424B2 (en) | Use of flagellin in the immunotherapy of Yersinia pestis | |
US9260509B2 (en) | Flagellin fusion proteins and use thereof to induce immune responses against Pseudomonas aeruginosa | |
US11000581B2 (en) | Engineering gut commensal bacteria to express heterologous proteins in their outer membrane vesicles (OMVs) for delivery to the GI-tract | |
CN101094685B (zh) | 鞭毛蛋白在鼠疫耶尔森氏菌的免疫疗法中的用途 | |
Duan et al. | Oral immunization with a recombinant Lactobacillus expressing CK6 fused with VP2 protein against IPNV in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) | |
JPH04504656A (ja) | ボルデテラワクチン | |
CN1322250A (zh) | 呼吸合胞病毒的吸附(g)蛋白衍生的肽 | |
CN111607605B (zh) | 一种多价表位和亚单位疫苗的构建方法 | |
JP2002509421A (ja) | グラム陽性菌の表面上のハイブリッド表面タンパク質の供給及び発現 | |
US9119803B2 (en) | Carious tooth vaccine and preparation method | |
Webb et al. | Immunostimulation with peptidoglycan or its synthetic derivatives | |
WO1999005304A1 (en) | Genetically engineered rhodococcus vaccine | |
WO2002079240A2 (en) | Intimins for the prevention or treatment of infections: i | |
JP2002502883A (ja) | インターロイキン−12および呼吸合法体ウイルス抗原を含んで成るワクチン | |
WO2021205408A1 (en) | Igy immunoglobulins targeting coronavirus, methods of preparing same, and methods of using same | |
Hu | Adjuvanticity of chicken interleukin-2 in DNA vaccines and protein vaccines delivered via microspheres | |
Wang et al. | Protection against lethal subcutaneous challenge of virulent Y. pestis strain 141 using an F1-V subunit vaccine | |
US20080226661A1 (en) | Phage Screening Assay | |
MXPA06014880A (es) | Propiedades potenciadoras adyuvantes e inmunes de productos naturales de onchocerca volvulus | |
CN1923289A (zh) | 杂交酵母禽流感疫苗 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20160113 Termination date: 20181216 |
|
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |