CN102002098B - 一种改造的鞭毛素蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种优化改造的鞭毛素蛋白及其制备方法和应用。该蛋白为缺失高变区的蛋白,高变区为鞭毛素蛋白的第180至400位氨基酸区域,该蛋白包括FliCΔ190-278、FliCΔ220-320或FliCΔ180-400。制备该蛋白,将鞭毛素蛋白高变区进行缺失,使鞭毛素蛋白的第180至400位氨基酸区域缺失。首先构建鞭毛素蛋白重组质粒;再以之为模板,构建鞭毛素缺失克隆,并表达纯化。本发明还提供了将上述改造的鞭毛素蛋白应用为佐剂。本发明的改造鞭毛素蛋白降低了其可能具有的潜在的危险性;并且通过去除其主要的免疫原性区及抗原活性区,降低它的抗原性、免疫原性以及由其引发的炎症反应。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,具体涉及一种优化改造的鞭毛素蛋白及其制备方法和应用。
背景技术
现在已知致病菌来源的鞭毛素蛋白具有免疫佐剂效果,它是通过鞭毛素蛋白与Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)5相结合,引发NF-κB途径引发先天性免疫,进而引发特异性免疫。通过鞭毛素蛋白与目的蛋白混合或融合后免疫,可以显著提高对目的抗原的免疫应答,并且可达到抵抗带有目的抗原的病原微生物的效果。但是因其来源于致病菌,可能具有潜在的危险性,并且它还可以引起炎症反应,产生大量针对鞭毛素自身的免疫反应,导致可能的耐受性以及其它可能的免疫副反应。
发明内容
本发明的目的是提供一种优化改造的鞭毛素蛋白,并将其作为佐剂,使得在保证其佐剂活性的前提下降低它的抗原性、免疫原性以及由其引发的炎症反应。
本发明的第一个目的是提供一种改造的鞭毛素蛋白,该改造的鞭毛素蛋白为缺失高变区的蛋白,所述高变区为鞭毛素蛋白的第180至400位氨基酸区域。
优化的,所述改造的鞭毛素蛋白包括FliCΔ190-278、FliCΔ220-320或FliCΔ180-400。
本发明的目的之二在于提供一种改造鞭毛素蛋白的制备方法,将鞭毛素蛋白高变区进行缺失,所述高变区为鞭毛素蛋白的第180至400位氨基酸区域。
具体来说,其制备方法包括如下步骤:
(1)构建鞭毛素蛋白重组质粒;
(2)以所述步骤(1)得到的鞭毛素蛋白重组质粒为模板,构建鞭毛素缺失克隆,并表达纯化。
优选的,上述步骤(1)构建鞭毛素蛋白重组质粒中的模板为人肠道沙门氏菌J341基因组,引物为如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的序列,连接载体为pET28。
优选的,上述步骤(2)构建鞭毛素缺失克隆的引物为如SEQ ID NO:3至SEQ ID NO:6所示的序列,以得到改造鞭毛素蛋白FliCΔ190-278;或所用引物如SEQ ID NO:7至SEQ ID NO:10所示的序列,以得到改造鞭毛素蛋白FliCΔ220-320;或所用引物如SEQ ID NO:11至SEQ ID NO:14所示的序列,以得到改造鞭毛素蛋白FliCΔ180-400。具体见实施例。
本发明还提供了将上述改造的鞭毛素蛋白应用为佐剂。因为该佐剂是通过对鞭毛素蛋白改造而得到的,因而,可以在保证其佐剂活性的前提下降低它的抗原性、免疫原性以及由其引发的炎症反应。
与现有技术相比,本发明具有如下有益效果:
通过改造鞭毛素蛋白,去除其主要的免疫原性区及抗原活性区,降低它的抗原性、免疫原性以及由其引发的炎症反应。
附图说明
图1是纯化的蛋白分别经过SDS-PAGE和Western Blot的验证结果图;
图2是FliC刺激后诱导Caco-2细胞释放IL-8和MCP-1的水平检测图,其中,图A是FliC刺激后诱导Caco-2细胞释放IL-8的水平检测图,图B是FliC刺激后诱导Caco-2细胞释放MCP-1的水平检测图;
图3是FliC的佐剂活性检测实验相关结果,其中,图A是血清中p24-特异性IgG的滴度比较结果,图B是血清中p24-特异性IgA的滴度比较结果,图C是唾液样品中p24-特异性IgA的滴度比较结果,图D是阴道样品中IgA滴度比较结果,图E是血清中IgG的滴度比较结果;
图4是鞭毛素高变区部分缺失蛋白的稳定性的相关实验的图片,其中,图A是构建的三种缺失蛋白的结构示意图,图B是构建的三种缺失蛋白的三维结构,图C是FliCΔ190-278的电泳图片,图D是FliCΔ220-320的电泳图片,图E是FliCΔ180-400的电泳图片;
图5是ELISA检测血清中FliC-特异的和FliC-改造克隆-特异的IgG滴度的实验结果图,其中,图A是ELISA检测血清中FliC特异的IgG滴度比较图。图B是ELISA检测血清中FliC改造克隆特异的IgG滴度比较图;
图6为将缺失改造克隆FliCΔ190-278、FliCΔ220-320及FliCΔ180-400以不同的浓度(0.1、1、10、100、1000、10000ng/ml)分别刺激Caco-2细胞后,ELISA检测IL-8和MCP-1的结果图其中,图A是ELISA检测IL-8的结果图,图B是ELISA检测MCP-1的结果图;
图7是以p24为抗原,分别与FliC、FliCΔ190-278、FliCΔ220-320及FliCΔ180-400混合免疫BALB/c小鼠后,ELISA检测血、唾液样及阴道样p24-特异性和佐剂-特异性的抗体滴度的结果图,其中,图A是ELISA检测血清中p24-特异性和佐剂-特异性的IgG抗体滴度的结果图,图B是ELISA检测血清中p24-特异性和佐剂-特异性的IgA抗体滴度的结果图,图C是ELISA检测唾液样p24-特异性和佐剂-特异性的IgA抗体滴度的结果图,图D是ELISA检测阴道样p24-特异性和佐剂-特异性的IgA抗体滴度的结果图;
图8是毒性试验的预试,将小鼠经滴鼻途径免疫,免疫后常规饲养,连续观察7天,记录小鼠体重的结果图;
图9是FliC1滴鼻免疫C57BL/6小鼠,分别于免疫后6h、12h、24h、36h、48h及一周杀小鼠,观察肝脏病变情况,其中,图A是解剖的PBS组小鼠肝组织HE染色结果图,图B1是处理组12h时肝组织HE染色结果图,图B2是处理组24h时肝组织HE染色结果图,图B3是处理组1周时肝组织HE染色结果图;
图10是FliC1处理组肝脏不同时间,观察肝脏病变情况,其中,图A是PBS组肝组织HE染色结果图,图B1是FliC1处理组肝脏12h时肝组织HE染色结果图,图B2是FliC1处理组肝脏24h时肝组织HE染色结果图,图B3是FliC1处理组肝脏1周解剖后的小鼠肝组织HE染色结果图;
图11是取FliC1处理组血清,对反应肝细胞损伤的生化指标进行生化分析的结果图,其中,图A、B、C、D、E、F、G和H分别是对ALT和AST、TP、ALB、TBiL、DBiL、BUN和CREA的生化分析的结果图;
图12为FliCΔ220-320的安全性的相关实验结果,其中,图A为FliC免疫组血清中ALT和AST浓度的比较图,图B为FliC免疫组肝脏解剖学观察对比图,图C为FliC免疫组肝脏组织病理学观察对比图。
具体实施方式
为使本发明更加容易理解,下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
下面实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如Sambrook等分子克隆实验手册中所述的条件。
实施例1:克隆构建
(1)FliC重组质粒构建
以人肠道沙门氏菌J341基因组为模板,以primer1/primer2为引物(引物序列见表1)进行PCR扩增,引物下划线部分分别为NcoI和XhoI酶切位点,为方便重组蛋白纯化,在primer2引物设计时缺失掉flic基因的终止密码子TAA,使其与载体pET28酶切位点XhoI后的6聚组氨酸标签形成融合表达。PCR产物经NcoI和XhoI双酶切后,与经同样双酶切线性化的pET28a载体连接。连接产物转化BL21(DE3)star;挑取阳性克隆进行酶切及测序鉴定,将正确的重组质粒命名为FliC,其表达产物C-端带有6聚组氨酸标签。
(2)鞭毛素缺失克隆FliCΔ180-400、FliCΔ190-278及FliCΔ220-320的构建
FliCΔ180-400构建:以重组质粒FliC1为模板,分别以primer21/primer22、primer23/primer24为引物(引物序列见表1,表1所示是寡核苷酸引物序列),分别扩增片段FliC(1-180AA)和FliC(400-560AA),在primer21和primer225’端分别设计酶切位点NcoI和EcoRI,在primer23和primer24 5’端分别设计酶切位点EcoRI和XhoI,PCR产物分别经NcoI/EcoRI及EcoRI/XhoI酶切后,在FliC(1-180AA)片段的C-端及FliC(400-560AA)片段的N-端产生相同的EcoRI粘性末端。将酶切后片段按1∶1的比例置于4℃链接1小时,连接产物跑胶纯化,将纯化的酶切产物与经NcoI和XhoI双酶切线性化的pET28a载体连接。连接产物分别转化BL21(DE3)star,挑取阳性克隆进行酶切及测序鉴定,将正确的重组质粒分别命名为FliCΔ180-400。
FliCΔ190-278-320及FliCΔ220-320构建,分别以primer13/primer14和primer15/primer16及primer17/primer18和primer19/primer20为引物(引物序列见表1)进行PCR扩增,构建过程同重组质粒FliCΔ180-400的构建。
表1
实施例2:重组蛋白的表达与纯化
挑单菌落过夜活化菌体(37℃,220rpm),卡那霉素50μg/ml,次日按1%转接至新鲜2YT培养基(胰蛋白胨16g/L,酵母粉10g/L,NaCl 5g/L)(37℃,220rpm),卡那霉素50μg/ml,转接2-3h(细菌生长至对数早-中期)后加IPTG诱导表达(终浓度为0.5mM),诱导表达4~5h后,离心收集菌体,以每克菌体20ml 1×结合缓冲液(20mM Tris-HCl,500mM NaCl,5mM咪唑,pH 7.9)重悬,超声破碎菌体,离心(13000rpm,20min,4℃),取上清过镍柱纯化,结合的重组蛋白经洗脱缓冲液洗脱(20mM Tris-HCl,500mM NaCl,250mM咪唑,pH 7.9),收集的重组蛋白经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测其纯度和分子大小。
Western blot分析时,将纯化的鞭毛蛋白进行SDS-PAGE转印至硝酸纤维素膜,以1%脱脂奶粉室温封闭2h后,用小鼠抗his-tag单克隆抗体(1∶2000稀释)孵育膜,4℃孵育过夜;TBST洗膜5次,每次10min,再以HRP标记的羊抗小鼠抗IgG抗体(1∶100000稀释)孵育膜,室温1h;TBST洗膜5次,用化学发光显色液(Pierce)显色5min,观察结果。
结果见图1。图1是纯化的蛋白分别经过SDS-PAGE和Western Blot的验证结果图。在37℃条件下培养至OD600值0.6-1.0时加入0.5mmol/L的IPTG,37℃诱导4h后收集菌体,超声破碎过Ni柱纯化。纯化的蛋白分别经过SDS-PAGE和Western Blot验证,由图1可见,成功获得了一个约52KD的蛋白。
将重组蛋白进行内毒素去除及检测,具体如下:
亲和层析法:纯化的鞭毛蛋白过多粘菌素B亲和层析柱(Pierce)去除内毒素,鲎试剂凝胶法检测残余的内毒素含量,残余的内毒素含量<0.06EU/mg。
实施例3:MCP-1和IL-8释放实验
据文献报道Caco-2细胞组成型表达TLR5,鞭毛素是TLR5的配体,鞭毛素刺激Caco-2细胞后能诱导Caco-2细胞释放高水平的趋化因子IL-8和MCP-1,为研究沙门氏菌J341来源的鞭毛素是否同样具有刺激活性,将培养好的Caco-2细胞传代接种至24孔板,2×105/孔,培养7-21天使细胞极化,刺激前先使细胞饥饿8-12小时后,刺激时先去掉饥饿培养液,用新鲜的无血清培养基将细胞洗2次,样品用无血清培养基稀释,浓度分别为FliC 0.1、1、10、100、1000ng/ml,将稀释好的样品分别加入每孔,1ml/孔,每个处理4个重复。阴性对照细胞分别用FliC297-471和无血清培养基刺激,刺激6小时后收集培养液,2000rpm离心10分钟,取上清用于细胞因子检测IL-8和MCP-1。
结果见图2,图2是FliC刺激后诱导Caco-2细胞释放IL-8和MCP-1的水平,其中,图A是FliC刺激后诱导Caco-2细胞释放IL-8的水平检测图,图B是FliC刺激后诱导Caco-2细胞释放MCP-1的水平检测图。由图2可知,与对照相比,FliC刺激后能诱导Caco-2细胞释放高水平的IL-8和MCP-1,但两者趋势一致,低剂量(<100ng/ml)刺激时具有明显的剂量效应,当剂量>1000ng/ml时,刺激活性达到饱和。考虑到残余的内毒素可能会干扰鞭毛素的刺激活性,为确认这种刺激活性是鞭毛素特异的,对照细胞用经同样表达纯化的无刺激活性的FliC297-471蛋白刺激,结果显示,FliC297-471处理的细胞与只加无血清培养基处理的细胞没差别,说明这种刺激活性是鞭毛素特异的。
实施例4:小鼠实验研究鞭毛素蛋白的佐剂活性
6-8周龄BALB/c或C57BL/6小鼠购买于湖北疾病控制中心,饲养于中科院武汉病毒研究所实验动物中心,免疫前饲养3-7天使其适应环境。滴鼻免疫:先腹腔注射120-150μl(10mg/ml)戊巴比妥钠麻醉小鼠,样品用无内毒素的PBS稀释,滴鼻总体积为10μl,5μl/次,滴两次,保证样品被充分吸收。免疫策略:初免(0周)-加强(第4周)-加强(第6周),根据情况决定是否加强及加强免疫的次数。最后一次免疫2周后杀小鼠,血、唾液样、阴道样。杀小鼠前应禁食(不禁水)1天。唾液样:先注射卡巴可(carbachore,200μg/ml),100μl/只,观察小鼠唾液分泌情况,1~2min后,将分泌的唾液吸至1.5ml EP管;阴道样:90~100μl PBS灌洗小鼠阴道,30μl/次,灌洗3次;支气管灌洗液(BALF):1ml PBS灌洗小鼠支气管,500μl/次,灌洗2次。血液样品置于4℃孵育3~4h,1500rpm离心30in,取上清-80℃保存待测;粘膜样10000rpm离心10min,取上清-80℃保存待测。
为进一步研究鞭毛素蛋白的佐剂活性,以HIV核心蛋白p2410ug为模式抗原。将6-8周龄BALB/c小鼠分成5组,分别用PBS,FliC297-471,FliC 2.5、5、10ug滴鼻免疫BALB/c小鼠,初免4周后加强免疫1次,最后一次免疫2周后杀小鼠,分别取血清、粘膜样ELISA检测p24-特异性的和FliC-特异性的抗体滴度。结果见图3,图3是FliC的佐剂活性检测实验相关结果,其中,图A是血清中p24-特异性IgG的滴度比较结果,图B是血清中p24-特异性IgA的滴度比较结果,图C是唾液中p24-特异性IgA的滴度比较结果,图D是阴道样品中IgA滴度比较结果,图E是血清中IgG的滴度比较结果。图3结果表明,与对照PBS组和FliC297-471组相比,FliC免疫组能显著提高血清中p24-特异性IgG、IgA及粘膜样中IgA滴度(图3,A、B、C和D),说明FliC具有很强的佐剂活性。意外的是我们发现FliC 10μg时,p24-特异性的血清IgG和IgA滴度都比低剂量2.5μg和5μg时低,为弄清楚这个原因,我们进一步分析了血清中FliC-特异性的IgG滴度,结果发现,FliC-特异性的IgG滴度2-3倍高于p24-特异性IgG,特别是FliC 10μg时,FliC特异性的IgG滴度10倍高于p24-特异性IgG(图3,E),说明FliC的强免疫原性可能干扰目的抗原的免疫反应。
实施例5:鞭毛素高变区部分缺失蛋白的稳定性的相关实验
鉴于FliC本身的强免疫原性,结合FliC本身的结构特征,即N端(约170个氨基酸)和C端(约100个氨基酸)非常保守,是TLR5的结合区,与佐剂活性密切相关,而其中央区(180-400氨基酸)在氨基酸序列和大小方面差别很大,一般认为它与鞭毛素蛋白的抗原性、蛋白质折叠及粘附功能有关,据文献报道,去掉中间高变区并不影响鞭毛素的佐剂活性。我们推测缺失中间180-400氨基酸序列,鞭毛素仍然具有良好的佐剂活性,基于这点,我们首先构建了鞭毛素缺失克隆FliCΔ180-400,然而我们发现FliCΔ180-400结构很不稳定,它以包涵体形式表达(图4,C、D和E),图4是鞭毛素高变区部分缺失蛋白的稳定性的相关实验的图片,其中,图A是构建的三种缺失蛋白的结构示意图,图B是构建的三种缺失蛋白的三维结构,图C是FliCΔ190-278的电泳图片,图D是FliCΔ220-320的电泳图片,图E是FliCΔ180-400的电泳图片。虽然可以通过包涵体变性、复性达到蛋白质可溶,但这费时费力,同时在蛋白操作过程中也很容易变性,对佐剂这种基于应用的蛋白质而言,尤其不可取。通过查阅相关文献及运用生物信息学的方法(http://www.expasy.org/spdbv/),我们发现鞭毛素氨基酸序列变化最大的地方位于190-350这个区域,其中超变区又分别集中在190-280及220-320这两个区域,于是我们又构建了FliCΔ190-278和FliCΔ220-320这两个克隆,分别缺失190-278和220-320氨基酸部分。幸运的是这两个高变区部分缺失克隆具有良好的可溶性(图4,C、D和E)。
实施例6:高变区氨基酸序列部分缺失显著降低了鞭毛素的抗原性和免疫原性的实验
为了分析缺失改造克隆的抗原性和免疫原性,分别用FliC、FliCΔ190-278、FliCΔ220-320及FliCΔ180-400滴鼻免疫BALB/c小鼠,2.5ug/只,5只/组,初免4周后加强免疫一次,2周后杀小鼠,摘眼球取血,ELISA检测血清中FliC-特异的和FliC-改造克隆-特异的IgG滴度。结果见图5,图5是ELISA检测血清中FliC-特异的和FliC-改造克隆-特异的IgG滴度的实验结果图,其中,图A是ELISA检测血清中FliC-特异的IgG滴度比较图。图B是ELISA检测血清中FliC-改造克隆-特异的IgG滴度比较图。与全长鞭毛素FliC相比,缺失改造克隆均降低了鞭毛素素本身的抗原性和免疫原性(图5,A和B),但FliCΔ190-278较全长仅降低了2-3倍,而FliCΔ220-320和FliCΔ180-400较全长降低了100-200倍,达到了显著的差别(p<0.05)(图5,A和B)。
实施例7:FliCΔ190-278、FliCΔ220-320及FliCΔ180-400具有良好的体外细胞刺激活性
高变区部分缺失或完全缺失是否会影响鞭毛素的结构,进而影响与TLR5的结合?我们以Caco-2为模式细胞,以IL-8和MCP-1为检测指标,分别检测了各缺失克隆刺激Caco-2细胞的能力。我们将缺失改造克隆FliCΔ190-278、FliCΔ220-320及FliCΔ180-400以不同的浓度(0.1、1、10、100、1000、10000ng/ml)分别刺激Caco-2细胞,ELISA检测IL-8、MCP-1。结果见图6,图6为将缺失改造克隆FliCΔ190-278、FliCΔ220-320及FliCΔ180-400以不同的浓度(0.1、1、10、100、1000、10000ng/ml)分别刺激Caco-2细胞后,ELISA检测IL-8和MCP-1的结果图,其中,图A是ELISA检测IL-8的结果图,图B是ELISA检测MCP-1的结果图。结果发现,缺失改造克隆在不同浓度刺激条件下,均具有良好的细胞刺激活性。同时我们发现,在低剂量10ng/ml时,FliCΔ220-320就表现了良好的刺激活性,其诱导释放的IL-8水平与全长鞭毛素蛋白FliC相当,显著高于FliCΔ190-278和FliCΔ180-400(图6,A)。同时对MCP-1的检测我们意外发现,缺失克隆FliCΔ190-278、FliCΔ220-320及FliCΔ180-400诱导释放的MCP-1显著高于全长鞭毛素蛋白FliC(图6,B)(p<0.05)。我们推测高变区可能存在某种负调控因子,但目前还没有相关的文献报道。
实施例8:FliCΔ220-320较FliCΔ190-278和FliCΔ180-400更具粘膜佐剂活性
为了进一步分析改造克隆的粘膜佐剂活性,以p24为抗原(10μg/只),分别与FliC、FliCΔ190-278、FliCΔ220-320及FliCΔ180-400(2.5μg/只)混合免疫BALB/c小鼠,阳性对照用CTB做佐剂(2μg/只),阴性对照用PBS或p24,初免4周后加强免疫一次,最后一次免疫2周后杀小鼠,取血、唾液样及阴道样ELISA检测p24-特异性和佐剂-特异性的抗体滴度。结果见图7,图7是以p24为抗原(10μg/只),分别与FliC、FliCΔ190-278、FliCΔ220-320及FliCΔ180-400(2.5μg/只)混合免疫BALB/c小鼠后,ELISA检测血、唾液样及阴道样p24-特异性和佐剂-特异性的抗体滴度的结果图,其中,图A是ELISA检测血清中p24-特异性和佐剂-特异性的IgG抗体滴度的结果图,图B是ELISA检测血清中p24-特异性和佐剂-特异性的IgA抗体滴度的结果图,图C是ELISA检测唾液样p24-特异性和佐剂-特异性的IgA抗体滴度的结果图,图D是ELISA检测阴道样p24-特异性和佐剂-特异性的IgA抗体滴度的结果图。与对照相比,鞭毛素缺失克隆均显示了良好的佐剂活性。其中克隆FliCΔ220-320免疫组血清中p24-特异性的IgG和IgA滴度与全长鞭毛素FliC及CTB免疫组相当,无显著差别,但是粘膜样中p24-特异性IgA滴度显著高于全长鞭毛素FliC免疫组(p<0.05),与CTB免疫组相当,显示了良好的粘膜佐剂活性(图7)。FliCΔ190-278和FliCΔ180-400血清中p24-特异性的IgG显著低于全长鞭毛素FliC免疫组,血清和粘膜样中IgA滴度与FliC免疫组相当或略高于FliC免疫组,但显著低于CTB免疫组(图7)。综合考虑以上情况,克隆FliCΔ220-320是一个较全长鞭毛素蛋白FliC更好的粘膜佐剂。
实施例9:FliCΔ220-320展示了更高的安全性的相关实验
鞭毛素作为一种应用导向型的新型佐剂,其安全性是我们最关心的问题,然而有关鞭毛素安全性的问题存在很多相互矛盾的报道。有文献报道鞭毛素与克罗恩疾病(Crohn disease)、肺囊肿等有关;Vijay-Kumar和Burdelya等研究小组报道鞭毛素具有抗肿瘤、抗细菌、抗病毒功能。针对这种情况,本课题对鞭毛素的急性毒性方面进行了初步的研究。研究方法参照《化学药物急性毒性试验指导原则》。
(一)鞭毛素有潜在的肝脏急性毒性
预试:毒性试验所选动物为6-8周龄BALB/c SFP级雌性小鼠,将小鼠分成4个不同的剂量组2.5μg、50μg、250μg及1000μg/只(鞭毛素FliC1常规佐剂剂量为2.5μg,毒性试验剂量相当于常规佐剂用量的1倍、20倍、100倍和400倍),5只/组,经滴鼻途径免疫,阴性对照免疫同体积的PBS,非特异性的蛋白对照免疫本实验室纯化的HIV核心抗原蛋白p24,剂量为1000μg/只。免疫后常规饲养,连续观察7天,逐日记录小鼠体重及动物毒性反应的症状。结果:①中毒症状观察:FliC1高剂量组(即1000μg/只)免疫后48h内自发活动减少,静卧不动,被毛粗燥,48-72h内,活动慢慢恢复,72h后精神和采食情况恢复正常;FliC1低剂量组2.5μg/组和50μg/组,同对照p24及PBS组一样活动正常,没见明显异常反应。②小鼠体重变化:FliC1 1000μg组体重下降严重,免疫后2天内体重一直下降,到第2天、第3天时体重最轻,较免疫前下降20%左右,随后体重有所恢复,但较免疫前平均下降15%左右,到第6天时体重仍然没有恢复;FliC 250μg组体重下与1000μg组表现出相同的趋势,但较1000μg组下降少,为体重的11%左右,虽然第3天后体重稍有恢复,但一直到第6天较免疫前平均下降6%左右;FliC1 2.5μg/组和50μg/组,免疫后1天内体重有点下降,较免疫前下降平均8%左右,随后体重开始慢慢恢复,第6天时体重恢复到免疫前的98%左右;p24组免疫后较免疫前稍有下降,下降1%左右。对照PBS组免疫过程中体重一直没有下降。结果见图8,图8是毒性试验的预试,将小鼠经滴鼻途径免疫,免疫后常规饲养,连续观察7天,记录小鼠体重的结果图。综合以上两点说明:鞭毛素毒性有剂量效应,2.5μg/只时几乎没影响,50μg/只时,24h内有轻微的影响,24h后开始恢复,且恢复较快,250μg和1000μg对小鼠有很严重的毒性,250μg较1000μg毒性稍轻。C57BL/6小鼠表现了同BALB/c小鼠相同的反应,数据没有展示。
正式试验:在上述预试验基础上,为进一步分析鞭毛素对各脏器的影响,FliC1 250μg滴鼻免疫C57BL/6小鼠,5只/组,不做任何处理的小鼠及仅免疫PBS的小鼠为阴性对照,分别于免疫后6h、12h、24h、36h、48h及一周杀小鼠。(1)取血清生化分析反应肝细胞损伤的生化指标ALT和AST,反应肝合成和贮备功能的生化指标TP和ALB,反应肝脏分泌和排泄功能的TBiL、DBiL及反应肾功能病变的BUN、CREA;(2)解剖时肉眼观察小鼠各脏器可能的病理改变,并取心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏及小肠组织固定包埋,HE染色后对各脏器进行组织病理学观察。
(1)系统解剖观察:相关实验结果见图9,图9是FliC1滴鼻免疫C57BL/6小鼠,分别于免疫后6h、12h、24h、36h、48h及一周杀小鼠,观察肝脏病变情况,其中,图A是解剖的PBS组小鼠肝脏表面结果图,图B1是处理组12h时肝脏表面结果图,图B2是处理组24h时肝脏表面结果图,图B3是处理组1周时肝脏表面结果图,图C是FliC免疫组肝脏组织病理学观察对比图。小鼠解剖时,心脏、脾脏、肺脏、肾脏及小肠组织未见肉眼可见的病变,FliC1处理组肝脏病变明显,12h时肝脏表面出现红色斑点,斑点尺寸较小,主要集中在肝脏边缘(图9,B1),到24h时,斑点由红色变成白色,尺寸增大,斑点由边缘向中间延伸,整个肝脏表面到处都可见白色斑点(图9,B2),到48h时仍有这个现象,但是斑点尺寸及斑点数量均开始减少,到1周时肝脏表面未见明显的白色斑点(图9,B3)。整个过程中相同时间解剖的PBS组小鼠肝脏表面未见任何斑点(图9,A)。
(2)组织病理学观察:取上述组织经福尔马林固定,石蜡包埋,HE染色后观察各组织的病理变化。结果发现:(1)FliC1处理组心脏、脾脏、肾脏及小肠组织未见病变,肝脏病变较严重,结果见图10,图10是FliC1处理组肝脏不同时间,观察肝脏病变情况,其中,图A是PBS组肝组织HE染色结果图,图B1是FliC1处理组肝脏12h时肝肝组织HE染色结果图,图B2是FliC1处理组肝脏24h时肝肝组织HE染色结果图,图B3是FliC1处理组肝脏1周解剖后的小鼠肝肝组织HE染色结果图。具体来说,肝脏6h时较空白对照组及PBS组未见异常,12-48h肝脏结构清楚,但出现肝细胞坏死,12h时即现肝细胞坏死伴出血(图10,B1),24h时最严重,肝细胞大量坏死,且坏死斑很大(图10,B2),36h及48h是与24h时有相同的症状,但症状较24h轻,1周解剖后的小鼠肝脏未见24h时的坏死斑,但肝索和肝窦结构不清晰,肝细胞表现为水肿,空泡变性(图10,B3)。
(3)血清生化指标分析:鉴于上述形态学及组织病理学观察结果,对小鼠血清进行生化分析(生化分析仪检测),结果见图11,图11是取FliC1处理组血清,对反应肝细胞损伤的生化指标进行生化分析的结果图,其中,图A、B、C、D、E、F、G和H分别是对ALT、AST、TP、ALB、TBiL、DBiL、BUN和CREA的生化分析的结果图。该图表明:FliC1处理组血清中TP和ALB(图11,C和D)、TBiL和DBiL(图11,E和F)及BUN、CREA(图11,G和H)与空白对照组及PBS组没差别,ALT和AST值于免疫后12h开始上升,24h时达到峰值600IU/L,ALT和AST值较PBS组有显著上升,分别为PBS组的10倍和4倍,提示有大量肝细胞损伤(图11,A和B),24h后ALT和AST值开始下降,于免疫1周时降到背景水平。
综合以上三点考虑,鞭毛素滴鼻免疫有严重的肝脏毒性
(二)FliCΔ220-320较全长鞭毛素显著降低了肝脏毒性
为分析缺失改造克隆与全长鞭毛素的肝脏毒性,将6-8周龄C57BL/6雌性小鼠分成5组,分别为空白对照组、溶媒组(PBS组)、FliC、FliCΔ220-320及FliCΔ180-400,滴鼻免疫,250μg/只小鼠。免疫前过夜禁食不禁水,于免疫后6h、12h、24h、36h、48h、1W杀小鼠,取血检测肝、肾功能生化指标(ALT、AST、TP、ALB、BUN、CREA);取心、肝、脾、肺、肾、肠、及脑组织固定包埋,做石蜡切片,观察脏器的病理改变。结果见图12,图12为FliCΔ220-320的安全性的相关实验结果,其中,图A为FliC免疫组血清中ALT和AST浓度的比较图,图B为FliC免疫组肝脏解剖学观察对比图,图C为FliC免疫组肝脏组织病理学观察对比图。具体来说,由图12,结果:①FliC免疫组血清ALT和AST较空白对照组及PBS组有5-10倍的升高,于24h达到峰值,随后开始下降,1周时降到背景水平;FliCΔ190-278免疫组血清ALT和AST与FliC免疫组相当;FliCΔ180-400免疫组血清ALT有显著升高,其峰值FliC免疫组相当,于12h达到峰值,随后迅速下降,48h时降到背景,AST稍微有点升高,其峰值为空白对照组及PBS组的2-3倍,从12h一直持续到36h,随后开始下降,48h降到背景水平;FliCΔ220-320免疫组ALT和AST整个过程都没有升高,与空白对照组及PBS组相当(图12,A);鞭毛素FliC、FliCΔ220-320及FliCΔ180-400免疫组其它生化指标与对照组无差别。②解剖学观察:FliC免疫组12h时肝脏表面出现红色斑点,斑点尺寸较小,主要集中在肝脏边缘,到24h时,斑点由红色变成白色,尺寸增大,斑点由边缘向中间延伸,整个肝脏表面到处都可见白色斑点,到48h时仍有这个现象,但是斑点尺寸及斑点数量均开始减少,到1周时肝脏表面未见明显的白色斑点(图12,B)。FliCΔ190-278免疫组症状同FliC免疫组,肝脏表面出现大量白色坏死斑;FliCΔ220-320及FliCΔ180-400免疫组24h-48h解剖时,肝脏表面仅见少数几个白色斑点,且斑点尺寸很小,到1周时未见任何白色斑点。③组织病理学观察:肝脏:FliC免疫组出现大量肝细胞坏死,伴随大量炎性细胞浸润,尤其是在24h-48阶段,症状尤其严重,与解剖时观察的现象比较吻合(图12,C)。FliCΔ220-320及FliCΔ180-400免疫组24h-48阶段也出现肝细胞坏死,但是坏死灶仅见少数几个,症状较FliC免疫组轻。所有鞭毛素免疫组其它脏器无论是解剖学观察还是组织病理学观察,均未见任何明显毒性。综合生化指标,FliC解剖学观察及组织病理学观察,FliC有潜在的肝细胞急性毒性,完全缺失高变区或缺失高变区220-320氨基酸序列,可著降低了鞭毛素的毒性,综合血清生化指标,FliCΔ220-320较FliC、FliCΔ190-278及FliCΔ180-400展示了更高的安全性。
以上实验中,ELISA检测血清及粘膜样中抗体滴度的操作如下:
用包被缓冲液将抗原稀释至3μg/ml,4℃过夜;洗涤:270/孔,洗涤3次,每次5min;封阻:封阻液(PBS+0.05%Twee-20)250μl/孔,37℃孵育1~2h;将待测样品4倍梯度稀释后分别加入每孔,37℃孵育1~2h;洗涤,加AP标记的二抗(1∶2000),37℃孵育1h,洗涤后加AP显色底物,37℃显色30min,读OD405吸光值。实验组和阴性对照组光吸收比值≥2.0时最大的血清稀释倍数定义为抗体滴度。
最后应当说明的是,以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制,尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明,本领域的普通技术人员应当理解,可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换,而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
序列表
<120>一种改造的鞭毛素蛋白及其制备方法和应用
<160>16
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列primer1
<400>1
cgcgccatgg cacaagtcat taatacaaac a 31
<210>1
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列primer2
<400>2
cggtctcgag acgcagtaaa gagaggacgt tttg 34
<210>1
<211>29
<212>DNA
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<400>3
cctacgccat ggcacaagtc attaataca 29
<210>1
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<212>DNA
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<400>4
ggcagtgaat tctttatcaa cggttacagc agt 33
<210>1
<211>33
<212>DNA
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cgatgcgaat tcataaccca caaccaaatt gct 33
<210>1
<211>33
<212>DNA
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<400>6
gatccgctcg agacgcagta aagagaggac gtt 33
<210>1
<211>29
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<400>7
gcgttccat ggcacaagtc attaataca 29
<210>1
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ccagtagaat tcagtaaccc ccgttgcacc acc 33
<210>1
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<212>DNA
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<400>9
ccagtggaat tctttgagga taaaaacggt aag 33
<210>1
<211>36
<212>DNA
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<400>10
gccgatctcg agacgcagta aagagaggac gttttg 36
<210>1
<211>29
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cgcgttccat ggcacaagtc attaataca 29
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<400>12
ggcttggaat tcggtgtagg catcttggac att 33
<210>1
<211>33
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ggcacggaat tcaacttcag aacaggcggt gag 33
<210>1
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列primer24
<400>14
gccgatctcg agacgcagta aagagaggac gttttg 36
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<211>32
<212>DNA
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<400>15
ctcgatccat ggttgcggct caacttgctg ca 32
<210>1
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列primer32
<400>16
ggctgactcg agtgcgtagt cggaatcttc gat 33
Claims (1)
1.一种改造的鞭毛素蛋白,其特征在于,所述改造的鞭毛素蛋白为在高变区有缺失的蛋白,所述改造的鞭毛素蛋白为FliCΔ220-320;所述FliCΔ220-320是将鞭毛素蛋白高变区进行缺失得到的,缺失位置为鞭毛素蛋白的第220-320位氨基酸区域;所述FliCΔ220-320的制备包括如下步骤:
(1)构建鞭毛素蛋白重组质粒:所用模板为人肠道沙门氏菌J341基因组,所用引物为如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的序列,连接载体为pET28;
(2)以所述步骤(1)得到的鞭毛素蛋白重组质粒为模板,构建鞭毛素缺失克隆,并表达纯化:构建鞭毛素缺失克隆所用引物为或如SEQ ID NO:7至 SEQ ID NO:10所示的序列。
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