PT1613347E - Anticorpos humanizados que reconhecem o péptido betaamilóide - Google Patents

Description

ΡΕ1613347 1

DESCRIÇÃO "ANTICORPOS HUMANIZADOS QUE RECONHECEM O PÉPTIDO BETA- AMILÓIDE"

Antecedentes da invenção A doença de Alzheimer é uma doença progressiva que resulta em demência senil. Ver geralmente Selkoe, TINS 16:403 (1993); Hardy et al., WO 92/13069; Selkoe, J.

Neuropathol. Exp. Neurol.53:438 (1994); Duff et al., Nature 373: 476 (1995); Games et al., Nature 373:523(1995). Em termos gerais, a doença encontra-se em duas categorias: inicio tardio que ocorre em idade avançada (65+ anos) e inicio precoce, que se desenvolve bastante antes do período senile, i.e. entre os 35 e os 60 anos. Em ambos os tipos de doença, a patologia é a mesma mas as anomalies tendem a ser mais severas e espalhadas em casos que começam numa idade precoce. A doença é caracterizada por pelo menos dois tipos de lesões no cérebro, emaranhados (novelos) neurofibrilares e placas senis. Os emaranhados neurofibrilares são depósitos intracelulares de proteína tau associada a microtúbulos que consistem em dois filamentos enrolados um no outro em pares. Placas senis (i.e. placas amilóides) são áreas de neurópilos desorganizados, até 150 pm de lado a lado com depósitos amilóides extracelulares no centro, que são visíveis por análise microscópica de secções de tecidos de 2 ΡΕ1613347 cérebro. A acumulação de placas amilóides no cérebro também está associada com o síndroma de Down e outras desordens cognitivas. 0 principal constituinte das placas é um péptido denominado Αβ ou péptido β-amilóide. 0 péptido Αβ é um fragmento interno de 4 kDa, de 39-43 aminoácidos, de uma glicoproteína transmembranar maior denominada proteína precursora amilóide (amyloid precursor protein-APP). Como resultado de processamento proteolítico de APP, por diferentes enzimas secretase, Αβ é principalmente encontrado em duas formas, uma forma curta, de 40 aminoácidos de comprimento e uma forma longa, que varia entre 42-43 aminoácidos de comprimento. Parte do domínio transmembranar hidrofóbico de APP é encontrado no terminal carboxi de Αβ e pode contribuir para a capacidade de Αβ para se agregar em placas, particularmente no caso da forma longa. A acumulação de placas amilóides no cérebro conduz, a longo prazo a morte celular neuronal. Os sintomas físicos associados com este tipo de deterioração neuronal caracteriza a doença de Alzheimer. para Várias mutações na proteína APP foram correlacionadas com a presença de doença de Alzheimer. Ver e.g., Goate et al., Nature 349:704)(1991)(valina717 para isoleucina); Chartier Harlan et al. Nature 353:844 (1991) (valina717 para glicina); Murrel et al., Science 254:97 (1991) (valina717 para fenil-alanina); Mullan et al., Nature Genet. 1: 345 (1992) (uma mutação dupla que altera lisina595-metionina596 3 ΡΕ1613347 595 π > 596 asparagma -leucma ) . Pensa-se que estas mutações causem a doença de Alzheimeratravés de um processamento aumentado ou alterado de APP a Αβ, particularmente processamento de APP a quantidades aumentadas da forma longa de Αβ (i.e., Αβ1-42 e Αβ1-43). Pensa-se que mutações noutros genes, tais como os genes de presenilina, PS1 e PS2 afectam indirec-tamente o processamento de APP para gerar quantidades aumentadas de forma longa Αβ (ver Hardy, TINS 20:154 (1997)) .

Foram usados com sucesso modelos de rato para determinar o significado de placas amilóides na doença de Alzheimer (Games et al., supra, Johnson-Wood et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 94: 1550 (1997)). Em particular quando ratinhos transgénicos PDAPP (que expressam uma forma mutante de APP humana e desenvovem doença de Alzheimer numa idade jovem) , são injectados com a forma longa de Αβ, apresentam uma diminuição na progressão da doença de

Alzheimer e um aumento nos títulos de anticorpo para o péptido Αβ (Shenk et al., Nature 400, 173 (1999). As observações discutidas acima indicam que Αβ, particular- mente na sua forma longa, é um elemento causativo na doença de Alzheimer.

McMichael, EP 526,511, propõe a administração de doses homeopáticas (menor ou igual a 10“2 mg/dia) de Αβ a doentes com doença de Alzheimer pré-estabelecida. Num humano típico com cerca de 5 litros de plasma, esperar-se-ia que, mesmo o limite superior desta dose gerasse uma 4 ΡΕ1613347 concentração de não mais do que 2 pg/ml. A concentração normal de Αβ no plasma humano encontra-se tipicamente no intervalo de 50-200 pg/ml (Seubert et al., Nature 359: 325(1992)). Já que a dose proposta em EP 526, 511 alteraria pouco o nível de Αβ endógeno circulante, e já que EP 526,511 não recomenda o uso de um adjuvante como imunosti-mulante, parece pouco plausível que resulte qualquer benefício terapêutico. WO 02/46237 fornece agents melhorados e métodos para doenças associadas com depósitos amilóides de beta amilóide no cérebro de um doente. Agentes preferidos incluem certas variantes humanizadas e quiméricas do anticorpo anti-beta amilóide 3D6 que compreendem uma região Fc IgGl tipo selvagem humana.

No entanto, existe a necessidade de novas terapias e reagentes para o tratamento dadoença de Alzheimer, em particular, terapias e reagentes capazes de produzir um benefício terapêutico a doses fisiológicas (e. g., não tóxicas).

Sumário da Invenção A presente invenção apresenta novos reagentes tipo anticorpo, terapêuticos, como enumerado nas reivindicações, para prevenção e tratamento de doenças amiloidogénicas (e.g., doença de Alzheimer). É descrita a identificação e caracterização de um anticorpo monoclonal 5 ΡΕ1613347 que se liga especificamente ao péptido Αβ e é eficaz a reduzir a sobrecarga de placas e/ou a reduzir a distrofia neuritica associada com desordens amiloidogénicas. A análise estrutural e funcional deste anticorpo conduz ao projecto de vários anticorpos humanizados para uso profiláctico ou terapêutico, especificamente, é descrita a humanização das regiões variáveis destes anticorpos e imunoglobulina humanizada ou cadeias de anticorpo, imuno-globulinas humanizadas intactas ou anticorpos e imunoglobulina funcional ou fragmentos de anticorpos, especificamente, são descritos fragmentos de ligação ao antigénio dos anticorpos apresentados. É revelado o uso de anticorpos no tratamento de doenças amiloidogénicas ou perturbações (e.g., doença de Alzheimer), assim como composições farmacêuticas e kits para uso nestas aplicações.

Também são apresentados métodos para identificar residuos dentro dos anticorpos monoclonais apresentados, que são importantes para a função imunológica correcta e para identificar residuos que são susceptiveis de substituição no projecto de anticorpos humanizados com afinidades de ligação aumentadas e/ou imunogenicidade reduzida, quando usados como reagentes terapêuticos.

Os anticorpos (e.g., anticorpos humanizados) da invenção têm funções efectoras alteradas, e usos terapêuticos . 6 ΡΕ1613347

Breve Descrição das Figuras A Figura 1 representa um alinhamento das sequências de aminoácidos da cadeia leve de ratinho 3D6, 3D6 humanizado, Kabat ID 109230 e anticorpos AI9 germinais. As regiões CDR estão indicadas por setas. Negrito e itálico indicam resíduos murinos raros. Negrito indica resíduos de empacotamento (VH+VL). O fundo a preto indica resíduos canónicos/de interacção com CDR. Asteriscos indicam resíduos seleccionados para mutação reversa em 3D6 humanizados, versão 1. A Figura 2 representa um alinhamento das sequências de aminoácidos da cadeia pesada de ratinho 3D6, 3D6 humanizado, Kabat ID 045919 e anticorpos VH3-23 germinais. A anotação é a mesma do que na figura 1. A Figura 3 representa graficamente as propriedades de ligação a Αβ de 3D6, 3D6 quimérico e 10D5. A Figura 3 A é um gráfico que representa a ligação de Αβ a 3D6 quimérico(PK1614) comparado com 3D6 murino. A Figura 3B é um gráfico que representa a competição de 3D6 biotinilado versus 3D6 não marcado, PK1614 e 10D5 para ligação a Αβ.

A Figura 4 representa um modelo de homologia de VH e VL de 3D6, mostrando a linha de esqueleto de carbono-a. VH está apresentada como uma linha mesclada e VL 7 ΡΕ1613347 apresenta-se como uma linha a cheio. As regiões CDR estão indicadas em forma de fita. A Figura 5 representa graficamente as propriedades de ligação a Αβ de 3D6 quimérico e 3D6 humanizado. A Figura 5 A representa resultados de ELISA medindo a ligação de 3D6vl humanizado e 3D6 quimérico para agregar Αβ. A Figura 5B representa resultados de ELISA medindo a ligação de 3D6vl e 3D6v2 para agregar Αβ. A Figura 6 é um gráfico quantificando a ligação de 3D6 humanizado e 3D6 quiméric,o a placas de Αβ de secções de cérebro de ratinhos PDAPP. A Figura 7 é um gráfico que mostra resultados de um ensaio de ligação competitiva que testa a capacidade de 3D6 humanizado versões 1 e 2, 3D6 quimérico, 3D6 murino e 10D5 para competir com 3D6 murino para ligação a Αβ. A Figura 8 representa um ensaio de fagocitose ex vivo que testa a capacidade de 3D6v2 humanizados, 3D6 quiméricos e IgG humano para mediar a captação de Αβ por células microgliais. A Figura 9 representa um alinhamento de sequências de 10D5VL e 3D6VL. Negrito indica resíduos que correspondem exactamente a 10D5. ΡΕ1613347 A Figura 10 representa um alinhamento de sequências de 10D5 VH e 3D6 VH. Negrito indica resíduos que correspondem exactamente a 10D5.

Descrição Detalhada da Invenção A presente invenção apresenta novos reagentes imunológicos como enumerados nas reivindicações, para evitar ou tratar a doença de Alzheimer ou outras doenças amiloidogénicas. É descrita a caracterização de imunoglo-bulinas monoclonais, 3D6 efectivas a ligar a proteína beta amilóide (Αβ) (e.g., ligar Αβ solúvel e/ou agregada), mediar a fagocitose (e.g., de Αβ agregada), reduzir a sobrecarga de placas e/ou reduzir a distrofia neurítica (e.g., num doente). Também é descrita a determinação e caracterização estrutural da estrutura primária e secundária das cadeias variáveis leves e pesadas destas imunoglobulinas e a identificação de resíduos importantes para a actividade e imunogenicidade.

As imunoglobulinas incluem uma cadeia variável leve humanizada e uma cadeia variável pesada humanizada. Cadeias variável leve e variável pesada incluem uma região determinante de complementaridade (complementary deter-mining region-CDR) da imunoglobulina monoclonal (e.g., imunoglobulina dadora) e regiões de estrutura variável substancialmente da imunoglobulina aceitadora humana. A expressão "Substancialmente de uma imunoglobulina aceitadora humana" significa que a maioria dos resíduos de 9 ΡΕ1613347 estrutura chave são da sequência aceitadora humana, permitindo, no entanto a substituição de resíduos em certas posições por resíduos seleccionados, para melhorar a actividade da imunoglobulina humanizada (e.g., alterar a actividade de modo que imite mais proximamente a actividade da imunoglobulina dadora), ou seleccionada para diminuir a imunogenicidade da imunoglobulina humanizada. A invenção apresenta uma cadeia leve ou pesada de imunogloulina humanizada que inclui região variável 3D6 regiões determinantes de complementaridade (CDRs)(e.g., inclui três CDRs da sequência de região variável da cadeia leve apresentada como SEQ ID NO:2 e inclui três CDRs da sequência da região variável da cadeia pesada, apresentada como SEQ ID N0:4) e inclui uma região estrutural variável substancialmente de uma sequência de cadeia leve ou pesada de uma imunoglobulina aceitadora humana, desde que pelo menos um resíduo estrutural seja substituído com o resíduo de aminoácido correspondente da sequência de região variávelda cadeia leve ou pesada do ratinho 3D6, em que o resíduo estrutural é seleccionado do grupo consistindo em (a) um resíduo que se liga directamente ao antigénio de forma não covalente; (b) um resíduo adjacente a CDR; (c) um resíduo que interage com CDR (identificado e.g.,através do modelo da cadeia leve ou pesada na estrutura resolvida de uma cadeia de imunglobulina homóloga conhecida); e (d) um resíduo que participa na interface VL-VH. A invenção apresenta uma cadeia leve ou pesada de 10 ΡΕ1613347 imunoglobulina humanizada que inclui CDRs da região variável de 3D6 e regiões estruturais variáveis de uma sequência de cadeia leve ou pesada de imunoglobulina aceitadora humana, desde que pelo menos um resíduo estrutural seja substituído pelo resíduo de aminoácido correspondente da sequência da região variável da cadeia pesada ou leve de ratinho 3D6, em que o resíduo estrutural é um resíduo capaz de afectar a conformação ou a função da região variável da cadeia leve, como identificada por análise de um modelo tridimensional da região variável, por exemplo um resíduo capaz de interagir com o antigénio, um resíduo próximo do sítio de ligação do antigénio, um resíduo capaz de interagir com um CDR, um resíduo adjacente a um CDR, um resíduo na proximidade de 6 Â de um resíduo CDR, um resíduo canónico, um resíduo de zona vernier, um resíduo de empacotamento intercadeias, um resíduo invulgar, ou um resíduo do local de glicosilação à superfície do modelo estrutural. A invenção apresenta uma cadeia leve de imunoglobulina humanizada que inclui CDRs da região variável de 3D6 (e.g., da sequência da região variável da cadeia leve de 3D6 apresentada como SEQ ID NO:2), e inclui uma região estrutural variável da imunoglobulina aceitadora humana, desde que pelo menos um resíduo estrutural seleccionado do grupo que consiste em Ll, L2, L36 e L46 (convenção de numeração de Kabat) seja substituído pelo resíduo de aminoácido correspondente da sequência da região variável da cadeia leve de 3D6, de ratinho. Numa outra 11 ΡΕ1613347 implementação, a invenção apresenta uma cadeia pesada de imunoglobulina humanizada que inclui CDRs da região variável de 3D6 (e.g., da sequência da região variável da cadeia pesada de 3D6, apresentada como SEQ ID NO:4) e inclui uma região estrutural variável de imunoglobulina aceitadora humana, desde que pelo menos um resíduo estrutural seleccionado do grupo que consiste em H49, H93 e H94 (convenção de numeração de Kabat)é substituído pelo resíduo de aminoácido correspondente da sequência da região variável da cadeia pesada de 3D6 de ratinho.

Cadeias leves preferidas incluem regiões estruturais Kapa II do subtipo kapa II (convenção de Kabat), por exemplo, regiões estruturais da imunoglobulina aceitadora Kabat ID 019230, Kabat ID 005131, Kabat ID005058, Kabat ID005057, Kabat ID 005059, Kabat ID U21040 e Kabat ID U41645. Cadeias pesadas preferidas incluem regiões estruturais do subtipo III(convenção de Kabat), por exemplo regiões estruturais da imunoglobulina aceitadora Kabat ID 045919, Kabat ID 000459, Kabat ID 000553, Kabat ID 000386 e Kabat ID M23691. A invenção apresenta, para além das substituições descritas acima, uma substituição de pelo menos um resíduo estrutural humano raro. Por exemplo, um resíduo raro pode ser substituído por um resíduo de aminoácido que é comum, para as sequências da cadeia variável humana, nessa posição. Alternativamente, um resíduo raro pode ser substituído com um resíduo de aminoácido correspondente de uma 12 ΡΕ1613347 sequência de cadeia variável germinal homóloga (e.g., um resíduo de estrutural de cadeia leve raro pode ser substituído com um resíduo germinal correspondente de uma sequência de imunoglobulina germinal de Al, A17, A18, A2, ou A19 ou um resíduo estrutural de cadeia pesada raro pode ser substituído por um resíduo germinal correspondente de uma sequência de imunoglobulina germinal VH3-48, VH3-23, VH3-7, VH3-21 ou VH3-11. A invenção apresenta uma imunoglobulina humanizada que inclui uma cadeia leve e uma cadeia pesada, como descrito acima, ou um fragmento de ligação ao antigénio da referida imunoglobulina. Numa implementação exemplar, a imunoglobulina humanizada liga-se (e.g., liga-se especifi-camente)ao péptido β amilóide (Ap)com uma afinidade de ligação de pelo menos 107M_1, 108M_1, ou 109M_1. Noutra implementação, a imunoglobulina ou fragmento de ligação ao antigénio inclui uma cadeia pesada contendo o isotipo γΐ. Noutra implementação, a imunoglobulina ou fragmento de ligação ao antigénio liga-se (e.g., liga-se especificamen-te) a ambos péptido amilóide beta solúvel (Αβ) e Αβ agregado. Noutra implementação, a imunoglobulina ou fragmento de ligação ao antigénio medeia a fagocitose (e.g., induz a fagocitose) de péptido beta amilóide (Αβ) . Ainda numa outra implementação, a imunoglobulinaou fragmento de ligação ao antigénio através a a barreira sangue-cérebro num indivíduo. Ainda numa outra implementação, a imunoglobulina ou fragmento de ligação ao antigénio reduz tanto a sobrecarga de péptido beta amilóide (Αβ) como a distrofia neurítica num indivíduo. 13 ΡΕ1613347

Numa outra implementação, a invenção apresenta imunoglobulinas quiméricas que incluem regiões variáveis 3D6 (e.g., as sequências de região variável apresentada como SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:4) . Como aqui usado, um anticorpo ou sequência de imunoglobulina compreendendo uma sequência VL e/ou VH como apresentado em, por exemplo, SEQ ID NO:2 ou SEQ ID N0:4pode compreender ou a sequência total VL ou VH ou pode compreender a sequência VL ou VH madura (í.e. péptido maduro sem o péptido sinal ou líder). Numa outra implementação ainda, a invenção apresenta uma imunoglobulina, ou um fragmento de ligação ao antigénio desta, incluindo uma região de cadeia pesada variável como apresentada na SEQ ID NO: 8 e uma região de cadeia leve variável como apresentado na SEQ ID NO:5. Numa outra implementação ainda, a invenção apresenta uma imunoglobulina, ou um fragmento de ligação ao antigénio desta, incluindo uma região de cadeia pesada variável como apresentada na SEQ ID NO:12 e uma região de cadeia leve variável como apresentada na SEQ ID NO: 11.

As imunoglobulinas descritas aqui são particularmente convenientes para uso em métodos terapêuticos dirigidos para a prevenção ou tratamento de doenças amiloidogénicas. Numa implementação, a invenção apresenta uso na prevenção ou tratamento de doenças amiloidogénicas (e.g., doença de Alzheimer) que envolve a administração ao doente de uma dose efectiva de uma imunoglobulina humanizada como aqui descrito. Noutra implementação, a invenção 14 ΡΕ1613347 apresenta composições farmacêuticasque incluem uma imuno-globulina humanizada como aqui descrito e um veiculo farmacêutico. Também são apresentadas moléculas de ácido nucleico isoladas, vectores e células hospedeiro para produzir as imunoglobulinas ou fragemntos de imunoglobulina ou cadeias descriats aqui, assim como métodos para produzir as referidas imunoglobulinas, fragmentos de imunoglobulinas ou cadeias de imunoglobulina. A imunoglobulina da invenção possui uma região Fc alterada em que pelo menos um resíduo de aminoácido na região Fc foi substituído por um resíduo diferente ou cadeia lateral. Numa implementação, a imunoglobulina modificada é da classe IgG, compreende pelo menos uma substituição de resíduo de aminoácido na região Fc, de tal modo que a imunoglobulina tem uma função efectora alterada, e.g.,comparada com uma imunoglobulina não-modifiçada. Em implementações particulares, a imunoglobulina da invenção tem uma função efectora alterada de modo que é menos imunogénica (e.g., não provoca actividade celular efectora não desejada, lise ou ligação de complemento) , tem propriedades de depuração amilóide melhoradas, e/ou tem uma mea-vida desejável.

Antes da descrição da invenção, pode ser útil para a sua compreensão apresentar definições de certos termos que vão ser usados aqui, em seguida. 0 termo "imunoglobulina" ou "anticorpo" (usados 15 ΡΕ1613347 aqui de forma permutável) refere-se a uma proteína de ligação a antigénio possuindo uma estrutura básica de quatro cadeias polipeptídicas consistindo em duas cadeias pesadas e duas cadeias leves, sendo as referidas cadeias estabilizadas, por exemplo, por ligações dissulfureto intercadeias, que tem a capacidade de se ligar especi-ficamente ao antigénio. Tantos as cadeias pesadas como as cadeias leves são dobradas em domínios. 0 termo "domínio" refere-se a uma região globular de polipéptido de cadeia pesada ou leve, compreendendo loops peptídicos (e.g., compreendendo 3 a 4 loops peptídicos) estabilizados, por exemplo, por folhas pregueadas β e/ou ligações disulfureto intracadeias. Os domínios serão em seguida referidos como "constante" ou "variável", baseado na falta relativa de variação de sequência nos domínios de vários membros da classe no caso de um domínio "constante", ou a variação significativa entre os domínios de vários membros da classe no caso de um domínio "variável". Domínios "constantes" na cadeia leve são referidos de forma permutável como "regiões constantes da cadeia leve", domínios constantes da cadeia leve", regiões "CL" ou domínios "CL". Domínios "constantes" na cadeia pesada são referidos de forma permutável como "regiões constantes de cadeia pesada", "domínios constantes de cadeia pesada", regiões "CH" ou domínios "CH". Domínios variáveis na cadeia leve são referidos de forma permutável como "regiões variáveis da cadeia leve", "domínios variáveis da cadeia leve", regiões "VL"ou domínios "VL". Domínios variáveis na cadeia pesada são referidos de forma permutável como "regiões variáveis da cadeia pesada", 16 ΡΕ1613347 "domínios variáveis da cadeia pesada", regiões "VH" ou domínios "VH" . O termo região refere-se a uma parte ou porção de uma cadeia de anticorpo e inclui domínios constantes ou variáveis como aqui definido, assim como partes mais discretas ou porções dos referidos domínios. Por exemplo, domínios variáveis de cadeia leve ou regiões incluem "regiões determinantes de complementaridade" ou "CDRs(complementarity determining regions)" espalhadas entre "regiões de estrutura" ou "FRs(framework regions)", como aqui definido.

Imunoglobulinas ou anticorpos podem existir na forma monomérica ou polimérica. 0 termo "fragmento de ligação ao antigénio" refere-se a um fragmento polipeptí-dico de uma imunoglobulina que se liga ao antigénio ou compete com o anticorpo intacto (i.e. com o anticorpo intacto a partir do qual eles derivaram) para ligação ao antigénio (i.e. ligação específica). 0 termo "conformação" refere-se à estrutura terciária de uma proteína ou poli-péptido (e.g., um anticorpo, cadeia de anticorpo, domínio ou região deste). Por exemplo, a expressão "conformação de cadeia leve (ou pesada)" refere-se à estrutura terciária de uma região variável da cadeia leve (ou pesada), e a expressão "conformação do anticorpo" ou "conformação do fragmento de anticorpo" refere-se à estrutura terciária de um anticorpo ou fragmento deste. 17 ΡΕ1613347 "Ligação específica" de um anticorpo significa que um anticorpo exibe afinidade aperciável para antigénio ou um epitopo preferido e preferivelmente, não exibe reactividade cruzada significativa. Ligação "apreciável" ou preferida inclui ligação com uma afinidade de pelo menos ΙΟ6, ΙΟ7, 108, 109M_1, ou 1010M_1. Afinidades maiores do que 107Μ_1, preferivelmente maiores do que 108M_1 são mais preferidas.è de intenção que valores intermediários dos apresentados aqui também se encontrem no âmbito da presente invenção e uma afinidade de ligação preferida pode ser indicada como um intervalo de afinidades, por exemplo 106 a 1010M_1, preferivelmente 107 a 101°M'1,mais preferivelmente 108 a 1010M_1. Um anticorpo que "não exibe reactividade cruzada significativa" é aquele que não se liga em medida apreciável a uma entidade não desejável (e.g., uma entidade proteinácea não desejável). Por exemplo um anticorpo que se liga especificamente a Αβ ligar-se-á de modo aperciável a Αβ mas não reagirá significativamente com proteínas não Αβ ou péptidos (e.g., proteínas não-Αβ ou péptidos incluídos em placas). Um anticorpo específico para um epitopo preferido, por exemplo terá a característica de não apresentar reacção cruzada significativa com epitopos na mesma proteína ou péptido. Ligação específica pode ser determinada de acordo com meios reconhecidos na matéria para determinar este tipo de ligação. Preferivelmente, ligação específica é determinada de acordo com análise Scatchard e/ou ensaios de ligação competitiva.

Fragmentos de ligação são produzidos através de 18 ΡΕ1613347 técnicas de DNA recombinante, ou por clivagem enzimática ou quimica de imunoglobulinas intactas. Fragmentos de ligação incluem Fab, Fab', F(ab')2, Fabc, Fv, cadeias simples e anticorpos de cadeia simples. Imunoglobulinas e anticorpos que não "biespecíficos" ou "bifuncionais", entende-se que uma imunoglobulina ou anticorpo tenho os seus locais de ligação idênticos. Um anticorpo "biespecifico" ou "bifuncional" é um anticorpo híbrido artificial que tem dois pares de cadeias pesada/leve diferentes e dois locais (sítios) de ligação diferentes. Anticorpos biespecíficos podem ser produzidos por uma variedade de métodos incluindo fusão de hibridomas ou ligação de fragmentos Fab'. Ver, e.g., Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immun. 79:315-321 (1990); Kotelny et al., J. Immunol. 148, 1547-1553 (1992). O termo "imunoglobulina humanizada" ou "anticorpo humanizado" refere-se a uma imunoglobulina ou anticorpo que inclui pelo menos uma imunoglobulina humanizada ou cadeia de anticorpo (i.e., pelo menos uma cadeia leve ou pesada humanizada). O termo "cadeia de imunoglobulina humanizada" ou "cadeia de anticorpo humanizada" (i.e. uma "cadeia leve de imunoglobulina humanizada" ou "cadeia pesada de imunoglobulina humanizada) refere-se a uma cadeia de imunoglobulina ou anticorpo (i.e. uma cadeia leve ou pesada respectivamente) contendo uma região variável que inclui uma região de estrutura variável substancialmente de uma imunoglobulina ou anticorpo humanos e regiões determinantes de complementaridade (CDRs) (e.g., pelo menos uma CDR, preferivelmente duas CDRs, mais preferivelmente três CDRs) 19 ΡΕ1613347 substancialmente de uma imunoglobulina ou anticorpo não-humanos, e ainda inclui regiões constantes (e.g., pelo menos uma região constante ou porção desta, no caso da cadeia leve, e preferivelmente três regiões constantes no caso de uma cadeia pesada). 0 termo "região variável humanizada" (e.g., "região variável da cadeia leve humanizada" ou "região variável da cadeia pesada humanizada") refere-se a uma região variável gue inclui uma região uma região de estrutura variável substancialmente de uma imunoglobulina ou anticorpo humanos e regiões determinantes de complementaridade (CDRs) substancialmente de uma imunoglobulina ou anticorpo não humanos. A expressão "substancialmente de uma imunoglobulina ou anticorpo humanos" ou "substancialmente humano" significa que, quando alinhado com uma sequência de aminoácidos de imunoglobulina humana ou anticorpo para comparação, a região partilha pelo menos 80-90%, preferivelmente 90-95%, mais preferivelmente 95-99% de identidade (í.e.identidade de sequência local) com a sequência da região estrutural ou constante humanas, permitindo, por exemplo, substituições conservativas, substituições de sequência consensus, substituições germinais, mutações reversas e afins. A introdução de substituições conservativas, substituições de sequência consensus, substituições germinais, mutações reversas e afins é frequentemente referida como "optimização" de um anticorpo ou cadeia humanizados. A expressão "substancialmente de uma imunoglobulina ou anticorpo não-humanos" ou 20 ΡΕ1613347 "substancialmente não-humano" significa tendo uma sequência de imunoglobulina ou anticorpo pelo menos 80-95%, preferivelmente 90-95%, mais preferivelmente 96%, 97%, 98%, ou 99% idênticas à de um organismo não-humano, e.g., um mamífero não-humano.

De acordo com isto, todas as regiões ou resíduos de uma imunoglobulina ou anticorpo humanizados, ou de uma imunoglobulina ou cadeia de anticorpo humanizadas, excepto possivelmente as CDRs, são substancialmente idênticas às regiões correspondentes ou resíduos de uma ou mais sequências de imunoglobulina humana nativas. O termo "região correspondente" ou " resíduo correspondente" refe-re-se a uma região ou resíduo numa segunda sequência de aminoácidos ou nucleótidos que ocupa a mesma (i.e. equivalente) posição do que a região ou resíduo numa primeira sequência de aminoácidos ou nucleótidos, quando a primeira e a segunda sequências são optimamente alinhadas para efeitos de comparação. Não se pretende que os termos "imunoglobulina humanizada" ou "anticorpo humanizado" envolvam imunoglo-bulinas ou anticorpos quiméricos, como definido infra . Embora imunoglobulinas ou anticorpos humanizados sejam quiméricas na sua construção (i.e. compreendem regiões de mais do que uma espécie de proteína), elas incluem carac-terísticas adicionais (i.e. regiões variáveis compreendendo resíduos CDR dadores e resíduos estruturais aceitadores) que não se encontram em imunoglobulinas ou anticorpos quiméricos, tal como aqui definido. 21 ΡΕ1613347 0 termo "identidade significativa" significa que duas sequências polipeptidicas, quando alinhadas optima-mente, tal como pelos programas GAP ou BESTFIT usando ponderação para folgas predefinida, partilham pelo menos 50-60% de identidade de sequência, preferivelmente 60-70% de identidade de sequência, mais preferivelmente 70-80% da identidade de sequência, mais preferivelmente 80-90% de identidade, ainda mais preferivelmente 90-95% de identidade e ainda mais preferivelmente pelo menos 95% de identidade de sequência ou mais (e.g.- 99% de identidade de sequência ou mais). O termo "identidade substancial" significa que duas sequências polipeptidicas, quando optimamente alinhadas, tal como pelos programas GAP ou BESTFIT usando ponderação de folgas predefinida, partilham pelo menos 80-90% de identidade de sequência, preferivelmente 90-95% de identidade de sequência e, mais preferivelmente pelo menos 95% de identidade de sequência ou mais (e.g. 99% de identidade de sequência ou mais). Para comparação de sequências, tipicamente uma sequência actua como a sequência de referência, com a qual as sequências teste são comparadas. Quando se usa um algoritmo de comparação de sequência, as sequências teste e de referência são importadas num computador, são designadas coordenadas subsequentes, se necessário e são designados parâmetros do programa de algoritmos. O algoritmo de comparação da sequência calcula, então, a percentagem de identidade de sequência para a(s) sequência(s) teste relativamente à sequência de referência, baseado nos parâmetros do programa designados. Os termos 22 ΡΕ1613347 "identidade de sequências" e "identidade de sequências" são usados aqui de modo permutável.

Alinhamento óptimo de sequências para comparação pode ser realizado, e.g., pelo algoritmo de homologia local de Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981), pelo algoritmo de alinhamento de homologia de Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), pelos métodos de busca de semelhança de Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sei.USA 85: 2444 (1988), por implementação computarizada destes algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, e TFASTA no

Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), ou por inspecção visual (ver gralmente Ausubel et al., Current Protocols in

Molecular Biology). Um exemplo de algoritmo que é conveniente para determinar a identidade de sequência em percentagem e a semelhança de sequência é o algoritmo BLAST, que está descrito em Altschul et al., J.Mol.Biol. 215:403 (1990). Software para realizar análises de BLAST está disponível publicamente através do National Center for Biotechnology Information (com acesso ao público através do server de internet do National Institutes of Health NCBI). Tipicamente, parâmetros de programa pré-definidos podem ser usados para levar a cabo a comparação de sequência, embora também possam ser usados parâmetros ajustados. Para sequências de aminoácidos o programa BLASTP usa como predefiniçõs um wordlength (W) de 3, uma expectation (E) de 10 e a matriz de pontuação BLOSUM62 (ver Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:10915 (1989)). 23 ΡΕ1613347

Preferivelmente, posições de resíduos que não são idênticas, diferem por substituições de aminoácidos conser-vativas. Para efeito de classificação de substituições de aminoácidos como conservativas e não-conservativas, os aminoácidos são agrupados como se segue: Grupo I (cadeias laterais hidrofóbicas): leu, met, ala, vai, leu, ile; Grupo II (cadeias laterais hidrofílicas neutras): cys, ser, thr; Grupo III (cadeias laterais acídicas): asp, glu; Grupo IV (cadeias laterais básicas) : asn, gin, his, lys, arg; Grupo V (resíduos que influenciam a orientação da cadeia): gly, pro; e Grupo VI (cadeias laterais aromáticas): trp, tyr, phe. Substituições conservativasenvolvem substituições entre aminoácidos na mesma classe. Substituições não-conservativas constituem trocar um membro de uma destas classes por um membro de outra.

Preferivelmente, imunoglobulinas ou anticorpos humanizados ligam-se ao antigénio com uma afinidade que é de um factor de três, quatro ou cinco a do anticorpo não-humano correspondente. Por exemplo, se o anticorpo não-humano tem uma afinidade de ligação de 109M_1, anticorpos humanizados terão uma afinidade de ligação de pelo menos 3x109M-1, 4x109M_1 ou 109M_1. Quando se descreve as propriedades de ligação de uma imunoglobulina ou cadeia de anticorpo, a cadeia pode ser descrita baseada na sua capacidade de "conduzir a ligação ao antigénio (e.g., Αβ)". Diz-se que a cadeia "conduz a ligação ao antigénio quando confere confere perante uma imunoglobulina ou anticorpo 24 ΡΕ1613347 intactos (ou fragmentos destes de ligação ao antigénio) uma propriedade de ligação especifica ou afinidade de ligação. Diz-se que uma mutação (e.g., uma mutação reversa) afecta substancialmente a capacidade de uma cadeia pesada ou leve para dirigir a ligação ao antigénio, se afecta (e.g., diminui) a afinidade de ligação de uma imunoglobulina intacta ou anticorpo (ou fragmento destes de ligação ao antigénio), compreendendo a referida cadeia, por pelo menos uma ordem de grandeza comparada com a do anticorpo (ou fragmento deste de ligação ao antigénio) compreendendo uma cadeia equivalente sem a referida mutação.

Uma mutação "não afecta substancialmente"(e.g., decresce) a capacidade de uma cadeia para dirigir a ligação ao antigénio" se afecta (e.g. ,decresce) a afinidade de ligação de uma imunoglobulina intacta ou anticorpo ( ou fragmento deste de ligação ao antigénio) compreendendo a referida cadeia, só por um factor de dois, três ou quatro o do anticorpo (ou fragmento deste de ligação ao antigénio), compreendendo uma cadeia equivalente sem a referida mutação. 0 termo "imunoglobulina quimérica" ou anticorpo refere-se a uma imunoglobulina ou anticorpo cujas regiões variáveis derivam de uma primeira espécie e cujas regiões constantes derivam de uma segunda espécie. Imunoglobulinas quiméricas ou anticorpos podem ser construídos, por exemplo por engenharia genética, a partir de segmentos de gene de imunoglobulina pertencendo a espécies diferentes. 25 ΡΕ1613347

Um "antigénio" é uma entidade (e.g., entidade proteinácea ou péptido) à qual um anticorpo se liga especi-ficamente. 0 termo "epitopo" ou "determinate antigénico refere-se ao local (sitio) num antigénio ao qual uma imunoglobulina ou anticorpo (ou fragmento deste de ligação ao antigénio) se liga especificamente. Os epitopos podem ser formados a partir de aminoácidos contíguos ou não-contíguos justapostos por enrolamento terciário de uma proteína. Os epitopos formados a partir de aminoácidos contíguos são tipicamente retidos por exposição a agentes desnaturantes, enquanto os epitopos formados por enrolamento terciário são tipicamente perdidos pelo tratamento com agentes desnaturantes. Um epitopo inclui tipicamente pelo menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, ou 15 aminoácidosnuma conformação espacial única. Métodos para determinar a conformação espacial de epitopos incluem, por exemplo, cristalografia de raios-x e ressonância magnética nuclear 2-dimensional. Ver, e.g., Protocolos de Mapeamento de Epitopos em Métodos em Biologia Molecular, Vol.66, G.E.Morris, Ed. (1996) .

Anticorpos que reconhecem o mesmo epitopo podem ser identificados num imunoensaio simples que mostra a capacidade de um anticorpo para bloquear a ligação de outro anticorpo a um antigénio alvo, i.e., ensaio de ligação competitiva. Ligação competitiva é determinada num ensaio 26 ΡΕ1613347 no qual a imunoglobulina a ser testada inibe a ligação especifica de um anticorpo de referência a um antigénio comum, tal como Αβ. São conhecidos numerosos tipos de ensaios de ligação competitivos, por exemplo radioimuno-ensaio directo ou indirecto de fase sólida (radioimmu-noassay-RIA), imunoensaio enzimático directo ou indirecto de fase sólida (enzyme immunoassay-EIA) , ensaios de competição de sandwich (ver Stahli et al., Methods in Enzymology 9:242(1983)); EIA directo biotina-avidina de fase sólida (ver Kirkland et al., J. Immunol. 137: 3614 (1986)); ensaio de marcação directa de fase sólida, ensaio sandwich de marcação directa de fase sólida (ver Harlow e Lane; Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988)); RIA de marcação directa de fase sólida usando o marcador 1-125 (ver Morei et al., Mol. Immunol. 25(1): 7(1988)); EIA biotina-avidina directo de fase sólida (Cheung et al., Virology 176: 546 (1990)); e RIA de marcação directa (Moldenhauer et al., Scand.J. Immunol. 32:77(1990)). Tipicamente um ensaio deste tipo envolve o uso de antigénio purificado ligado a uma superfície sólida ou células contendo ou uma imunoglobulina teste não-marcada ou uma imunoglobulina de referência marcada. Inibição competitiva é medida determinando a quantidade de marcador ligado à superfície sólida ou células na presença da imunoglobulina teste. Normamente a imunoglobulina teste está presente em excesso. Normalmente, quando um anticorpo em competição está presente em excesso, inibirá a ligação especifica de um anticorpo de referência a um antigénio comum em pelo menos 50-55%, 55-60%, 60-65%, 65-70%, 70-75% ou mais. 27 ΡΕ1613347

Um epitopo também é reconhecido por células imunologicas, por exempo, células B e/ou células T. 0 reconhecimento celular de um epitopo pode ser determinada por ensaios in vitro que medem a proliferação dependente de antigénio, como determinada por incorporação de 3H-timidina, por secreção de citoquina, por secreção de anticorpo ou por morte (killing) dependente de antigénio (ensaio de linfócitos T citotóxicos).

Epitopos exemplares ou determinantes antigénicos podem ser encontrados na proteína precursora amilóide humana (APP), mas são preferencialmente encontrados no péptido Αβ de APP. Isoformas múltiplas de APP existem, por exemplo APP695 APP751 e APP770 . Aos aminoácidos na APP são atribuídos números de acordo com a sequência da isoforma APP (ver e.g., GenBank Acesso NO.P05067, também apresentado como SEQ ID NO:38). O péptido Ap(também referido aqui como péptido beta amilóide e A-beta) é um fragmento interno de ~4-kDa de 39-43 aminoácidos de APP (Αβ39, Αβ40, Αβ41, Αβ42 e Αβ43). Αβ40, por exemplo consiste nos resíduos 672-711 de APP e Αβ42 consiste nos resíduos 673-713 de APP. Como resultado de precessamento proteolítico de APP por diferentes enzimas secretases in vivo ou in situ, Αβ é encontrado numa "forma curta", de 40 aminoácidos de comprimento e uma forma longa, que varia entre 42-43 aminoácidos em comprimento. Epitopos ou determinantes antigénicos preferidos, como aqui descritos, estão localizados no terminal N do péptido Αβ e incluem resíduos 28 ΡΕ1613347 dentro dos aminoácidos 1-10 de Αβ, preferivelmente dos resíduos 1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7, 3-7, de Αβ42. Epitopos ou determinantes antigénicos referidos adicionalmente incluem resíduos 2-4, 5, 6, 7, ou 8 de Αβ, resíduos 3-5, 6, 7, 8 ou 9 de Αβ, ou resíduos 4-7, 8, 9 ou 10 de Αβ42. O termo "doença amiloidogénica" inclui qualquer doença associada com (ou causada por) formação ou deposição de fibrilhas amilóides insolúveis. Doenças amiloidogénicas exemplares incluem mas não são limitadas a amiloidose sistémica, doença de Alzheimer, diabetes de início maduro, doença de Parkinson, doença de Huntington, demência fronto-temporal e encefalopatias espongiformes transmissíveis relacionadas com priões (doença de Kuru e Creutzfeldt-Jacob em humanos e tremor epizoótico e BSE em ovinos e bovinos, respectivamente). Doenças amiloidogénicas diferentes são definidas ou caracterizadas pela natureza do componente polipeptídico das fibrilhas depositadas. Por exemplo, em indivíduos ou doentes tendo doença de Alzheimera proteína β-amiloide (e.g., tipo selvagem, variante ou proteína β-amilóide truncada) é o componente polipeptídico caracte-rizante do depósito amilóide. De acordo com isto, a doença de Alzheimer é um exemplo de uma "doença caracterizada por depósitos de Αβ"ου uma "doença associada a depósitos de Αβ", e.g., no cérebro de um indivíduo ou doente. Os termos "proteína β-amilóide" "péptido β-amilóide" "β-amilóide", "Αβ" e "péptido Αβ" são usados aqui de forma inter-permutável. 29 ΡΕ1613347 0 termo "dose efectiva" ou "dosagem efectiva" é definido como uma quantidade suficiente para atingir ou, pelo menos, atingir aprcialmente o efeito desejado. 0 termo "dose efectiva do ponto de vista terapêutico é definido como uma quantidade suficiente para curar ou pelo menos deter parcialmente a doença e as suas complicações num doente que já sofre da doença. Quantidades efectivas para este fim dependerão da severidade da infecção e do estado geral do sistema imunitário do próprio doente. 0 termo "doente" inclui humanos ou outros indivíduos mamífero que recebem um tratamento profiláctico ou terapêutico. Αβ "solúvel ou "dissociado" refere-se a polipé-ptido Αβ não agregante ou desagregado. Αβ "insolúvel" . Αβ " insolúvel refere-se a Αβ polipéptido agregante, por exemplo, Αβ mantido junto por ligações não covalentes. Pensa-se que Αβ(e.g.,Αβ42) se agrega, pelo menos em parte, devido à presença de resíduos hidrofóbicos no terminal C do péptido (parte do domínio transmembranar de APP). Um método para preparar Αβ solúvel é dissolver o péptido liofilizado in DMSO puro com sonificação. A solução resultante é centrifugada para remover quaisquer partículas insolúveis. 0 termo "função efectora" refere-se a uma actividade que reside na região Fc de um anticorpo (e.g., um anticorpo IgG) e inclui, por exemplo, a capacidade do anticorpo se ligar a moléculas efectoras tais como 30 ΡΕ1613347 complemento e/ou receptores Fc, que podem controlar várias funções imunitárias do anticorpo tais como actividade celular efectora, lise, actividade mediada por complemento, depuração de anticorpo e meia vida do anticorpo. 0 termo "molécula efectora" refere-se a uma molécula que é capaz de se ligar à região Fc de um anticorpo (e.g., um anticorpo IgG)incluindo, mas não limitado a, uma proteína complemento ou um receptor Fc. O termo "célula efectora" refere-se a uma célula capaz de se ligar à porção Fc de um anticorpo (e. g., um anticorpo IgG) tipicamente via um receptor Fc expresso à superfície da célula efectora incluindo, mas não sendo limitado a , linfócitos, e.g., células apresentadoras de antigénio ou células T. O termo "região Fc" refere-se a uma região C-terminal de um anticorpo IgG, em particular a região C-terminal da(s) cadeia(s) pesada (s) do referido anticorpo IgG. Embora os limites da região Fc de uma cadeia pesada de IgG possam variar ligeiramente, uma região Fc é tipicamente definida como abrangendo de cerca do resíduo de aminoácido Cys226 ao terminal carboxilo de uma cadeia(s) pesada de IgG. O termo "numeração de Kabat", a não ser que especificado de outro modo, é definido como a numeração dos resíduos em, e.g., anticorpo de cadeia pesada IgG usando o 31 ΡΕ1613347 índice EU como em Kabat et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)) . 0 termo "receptor Fc" ou "FcR (Fc Recep-tor) refere-se a um receptor que se liga à região Fc de um anticorpo. Receptores Fc típicos que se ligam a uma região que se ligam a uma região Fc de um anticorpo (e.g., um anticorpo IgG) incluem, mas não estão limitados a, receptores das subclasses FcyRI, FcyRII e FcyRIII, incluindo variantes alélicas e formas de splice alternativo destes receptores. Receptores Fc são revistos em Ravetch e Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capei et al., Immuno-methods 4: 25-34 (1994); e de Haas et al., J.Lab. Clin. Med 126:330-41 (1995). I. Reagentes Imunolóqicos e Terapêuticos

Reagentes imunológicos e terapêuticos da invenção compreendem ou consistem de imunogénios ou santicorpos, ou fragmentos destes funcionais ou de ligação ao antigénio, como aqui definido. Sabe-se que a unidade estrutural básica do anticorpo compreende um tetrâmero de subunidades. Cada tetrâmero é composto de dois pares idênticos de cadeias polipeptídicas, tendo cada par uma cadeia "leve" (cerca de 25 kDa) e uma cadeia "pesada" (cerca de 50-70 kDa). A porção amino-terminal de cada cadeia inclui uma região variável de cerca de 100 a 110 ou mais aminoácidos primariamente responsável pelo reconhecimento do antigénio. 32 ΡΕ1613347 A porção carboxi-terminal de cada cadeia define uma região constante primariamente responsável pela função efectora.

As cadeias leves são classificadas ou como cadeia kappa ou lambda e têm cerca de 230 residuos de comprimento. As cadeias pesadas são classificadas como gamma(Y), mu(μ), alfa(a), delta (δ), ou epsilon (ε) e têm cerca de 450-600 residuos de comprimento e definem o isótopo do anticorpo como IgG, IgM, IgA, IgD, e IgE, respectivamente. Tanto as cadeias pesadas, como as leves estão dobradas em dominios. O termo "domínio" refere-se a uma região globular da proteína, por exemplo, uma imunoblobulina ou anticorpo. Domínios de imunoglobulina ou anticorpo incluem, por exemplo, 3 ou 4 loops polipeptídicos estabilizados por folhas pregueadas β e ligação dissulfureto intercadeias. As cadeias leves intactas têm, por exemplo dois domínios (VL e CL) e as cadeias pesadas intactas têm, por exemplo, qatro ou cinco domínios (VH, CH1, CH2, e CH3) .

Nas cadeias leves e pesadas, as regiões variável e constante são unidas por uma região "J" de cerca de 12 ou mais aminoácidos, incluindo a cadeia pesada uma região "D" de cerca de 10 ou mais aminoácidos (ver geralmente, Fundamental Immunology (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989), Ch.7).

As regiões variáveis de cada par cadeia leve/pesada formam o sítio de ligação do anticorpo. Assim, um anticorpo intacto possui dois sítios de ligação. Excepto 33 ΡΕ1613347 em anticorpos bifuncionais ou biespecíficos, os dois sitios de ligação são os mesmos.As cadeias exibem todas a mesma estrutura geral de regiões de estrutura (framework regions-FR) relativamente conservadas unidas através de regiões hipervariáveis, também chamadas regiões determinantes de complementaridade ou CDRs(complementarity determining regions). Cadeias que ocorrem naturalmente ou cadeias produzidas de forma recombinate, podem ser expressas com uma sequência líder que é removida durante o processamento celular para produzir uma cadeia madura. As cadeias maduras também podem ser produzidas de forma recombinante tendo uma sequência líder que ocorre não-naturalmente, por exemplo, para aumentar a secreção ou alterar o processamento de uma cadeia particular de interesse.

Os CDRs de duas cadeias maduras de cada par são alinhadas pelas regiões de estrutura, permitindo a ligação a um epitopo específico. Do terminal-N ao terminal-C, ambas as cadeias leves e pesadas compreendem os domínios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 e FR4 . "FR4" também é referido na área como a região D/J da cadeia pesada variável e a região J da cadeia leve variável. A atribuição de aminoácidos a cada domínio é de acordo com as definições de Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1987 e 1991) . Uma deifinição estrutural alternativa foi proposta por Clothia et al., J.Mol.Biol. 196:901 (1987); Nature 342:878(1989); e J. Mol. Bio. 186:651 (1989) daqui para a frente aqui referida como "Clothia et al. "). 34 ΡΕ1613347 A. Anticorpos contra Αβ

Agentes terapêuticos da invenção incluem anticorpos que se ligam especificamente a Αβ ou outro componente das placas amilóides. Estes anticorpos podem ser monoclonais ou policlonais. Alguns destes anticorpos ligam-se especificamente à forma agregada de Αβ, sem se ligar à forma solúvel. Alguns ligam-se especificamente à forma solúvel sem se ligar à forma agregada. Alguns ligam-se tanto à forma agregada como à forma solúvel. Alguns destes anticorpos ligam-se a uma forma curta de Αβ que ocorre naturalmente (i.e. Αβ39, 40 ou 41) sem se ligar à forma longa que ocorre naturalmente (i.e., Αβ42 e Αβ43). Alguns anticorpos ligam-se a uma forma longa de Αβ sem se ligar a uma forma curta. Alguns anticorpos ligam-se a Αβ sem se ligar à proteína percursora amilóide de comprimento total. Anticorpos usados em métodos terapêuticos têm preferivelmente uma região constante intacta ou, pelo menos região constante suficiente para interagir com um receptor Fc. O isótopo humano IgGl é preferido porque tem a maior afinidade dos isótopos humanos para o receptor FcRI em células fagocíticas. Fragmentos Fab biespecíficos também podem ser usados, nos quais um braço do anticorpo tem especificidade para Αβ e a outra para um receptor Fc. Anticorpos preferidos ligam-se a Αβ com uma afinidade de ligação maior do que (ou igual a cerca de 106, 107, 108, 109, ou 1010M-1 (incluindo afinidades intermediárias destes valores). 35 ΡΕ1613347

Soros policlonais contêm tipicamente populações mistas de anticorpos que se ligam a vários epitopos ao longo do comprimento de Αβ. No entanto, soros policlonais podem ser específicos para um segmento particular de Αβ, tal como Αβ1-10. Anticorpos monoclonais ligam-se a um antiepitopo específicoem Αβ que pode ser um epitopo conformacional ou não-conformacional. Eficácia profiláctica e terapêutica de anticorpos pode ser testada usando os precedimentos de modelos de animais transgénicos descritos nos Exemplos. Anticorpos monoclonais preferidos ligam-se a um epitopo nos resíduos 1-10 de Αβ (sendo o primeiro resíduo N-terminal de Αβ designado 1) . Alguns anticorpos monoclonais preferidos ligam-se a um epitopo nos amino-ácidos 1-5, e alguns a um epitopo entre 5-10. Alguns anticorpos preferidos ligam-se a epitopos entre os amino-ácidos 1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7 ou 3-7. Alguns anticorpos preferidos ligam-se a um epitopo que começa nos resíduos 1-3 e acaba nos resíduos 7-11 de Αβ. Anticorpos menos preferidos incluem os que se ligam a epitopos com resíduos 10-15, 15-20, 25-30, 10-20, 20, 30, ou 10-25 de Αβ. É recomendado que estes anticorpos sejam triados em relação à actividade nos modelos de rato descritos nos Exemplos antes de uso. Por exemplo, descobriu-se que certos anticorpos para epitopos entre os resíduos 10-18, 16-24, 18-21, e 33-42 não têm actividade (e.g., não têm capacidade de reduzir a sobrecarga de placa e/ou resolver a patologia neurítica associada à doença de Alzheimer). Nalguns métodos, são usados anticorpos monoclonais múltiplos que têm especifi- 36 ΡΕ1613347 cidades de ligação a diferentes epitopos. Estes anticorpos podem ser administrados sequencialmente ou simultâneamente. Também podem ser usados anticorpos para outros componentes amilóides que não Αβ (e.g., administrados ou co-adminis-trados). Por exemplo, anticorpos podem ser dirigidos para a proteína associada a amilóide sinucleína.

Quando se diz que um anticorpo se liga a um epitopo entre resíduos específicos, tais como Αβ 1-5 por exemplo, o que se quer dizer é que o anticorpo se liga especificamente a um polipéptido contendo o resíduo especificado (í.e. Αβ 1-5 neste exemplo). Este tipo de anticorpo não contacta necessariamente com cada resíduo em Αβ 1-5. Nem qualquer substituição ou delecção individual em Αβ1-5 afectará necessariamente a afinidade de ligação de forma significativa. A especificidade epitópica de um anticorpo pode ser determinada, por exemplo, formando uma biblioteca de "display" de fagos nos quais membros diferentes apresentam diferentes subsequências de Αβ. A biblioteca de display de fagos é então seleccionada para membros que se liguem especificamente a um anticorpo a testar. É isolada uma família de sequências. Tipicamente, uma família deste tipo contem uma sequência "núcleo" comum e vários comprimentos de sequências flanco em diferentes membros. A sequência "núcleo" mais curta que apresenta ligação específica ao anticorpo define o epitopo ligado pelo anticorpo. Anticorpos também podem ser testados quanto à especificidade para o anticorpo num ensaio de competição com um anticorpo cuja especificidade para o epitopo já foi 37 ΡΕ1613347 determinada. Por exemplo, anticorpos que competem com o anticorpo 3D6 para ligação a Αβ ligam-se ao mesmo epitopo, ou semelhante do que 3D6, i.e., entre os resíduos Αβ1-5. A triagem de anticorpos para especificidade para o anticorpo é um indicador útil de eficácia terapêutica. Por exemplo, um anticorpo que se determine que se liga a um epitopo entre os resíduos 1-7 de Αβ é provável que seja efectivo na prevenção e tratamento de doença de Alzheimer de acordo com as metodologias da presente invenção.

Anticorpos monoclonais que se ligam especifica-mente a um segmento preferido de Αβ, sem se ligar a outras regiões de Αβ, têm algumas vantagens em relação a anticorpos monoclonais que se ligam a outras regiões ou soros policlonais para Αβ intacto. Primeiro, para iguais doses de massa, doses de anticorpo que se ligam especificamente a segmentos preferidos contêm uma dose molar mais elevada de anticorpos efectivos na depuração de placas amilóides. Segundo, anticorpos que se ligam especificamente a segmentos prefceridos pode induzir uma resposta depurativa contra depósitos amilóides sem induzir uma rresposta depurativa contra o polipéptido APP intacto, reduzindo assim os potenciais efeitos secundários. 1.Anticorpos Quiméricos e Humanizados A presente invenção apresenta anticorpos quiméricos e/ou humanizados (i.e. imunoglobulinas quiméricas e/ou humanizadas) específicas para o péptido beta amilóide. 38 ΡΕ1613347

Anticorpos quiméricos e/ou humanizados têm a mesma especificidade de ligação ou semelhante e afinidade do que um anticorpo de ratinho ou outro não-humano que fornece o material de inicio para a construção de um anticorpo quimérico ou humanizado. A. Produção de Anticorpos Quiméricos 0 termo "anticorpo quimérico" refere-se a um anticorpo cujos genes da cadeia leve e pesada foram construídos, tipicamente por engenharia genética, de segmentos de gene de imunoglobulina, que pertencem a espécies diferentes. Por exemplo, os segmentos variáveis (V) dos genes de um anticorpo monoclonal de ratinho podem ser unidos a segmentos constantes (C) humanos tais como IgGl e IgG4. 0 isótopo IgGl é preferido. Um anticorpo quimérico típico é, assim uma proteína híbrida que consiste no domínio de ligação ao antigénio ou V de um anticorpo de rato e no domínio efector ou C de um anticorpo humano. B. Produção de Anticorpos Humanizados 0 termo "anticorpo humanizado" refere-se a um anticorpo que compreende pelo menos pelo menos uma cadeia que compreende pelo menos uma cadeia que compreende resíduos estruturais da região variável substancialmente de uma cadeia de anticorpo humano (referida como a imunoglobulina ou anticorpo aceitadores) e pelo menos uma região determinante de complementaridade substancialmente de um 39 ΡΕ1613347 anticorpo de ratinho (referida como imunoglobulina ou anticorpo dador). Ver Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86:10029-10033 (1989), US 5, 530, 101, US 5, 585, 089, US 5, 693, 761, US 5, 693, 762, Selick et al., WO 90/07861, e Winter, US 5, 225, 539. A região constante (s), se presente, também são substancialmente ou inteiramente de uma imunoglobulina humana. A substituição de CDRs de ratinho numa região estrutural de domínio variável humana resulta muito provavelmente em retenção da sua orientação espacial correcta se a região estrutural de domínio variável humano adopta a mesma ou conformação semelhante do que a região estrutural variável de ratinho da qual os CDRs originaram. Isto é conseguido obtendo os domínios variáveis humanos de anticorpos humanos cujas sequências estruturais exibem um elevado grau de identidade de sequência com os domínios estruturais variáveis murinos dos quais os CDRs são derivados. As regiões estruturais variáveis da cadeia pesada ou leve podem ser derivadas da mesma ou de sequências de anticorpo humanas diferentes. As sequências de anticorpo humanas podem ser as sequências de anticorpos humanos ocorrendo naturalmente ou podem ser sequências consensus de vários anticorpos humanos. Ver Kettleborough et al. Protein Engineering 4: 773 (1991); Kolbinger et al., Protein Engineering 6: 971 (1993) and Cárter et al. WO 92/22653.

Tendo identificado as regiões determinantes de 40 ΡΕ1613347 complementaridade da imunoglobulina dadora murina e as apropriadas imunoglobulinas aceitadoras humanas, o próximo passo é determinar quais, se algums, resíduos destes componentes deveriam ser substituídos para optimizar as propriedades do anticorpo humanizado resultante. Em geral, substituição de resíduos de aminoácidos humanos com murinos deveria se minimizada, porque a introdução de resíduos murinos aumenta o risco de que o anticorpo elicite uma resposta de anticorpo-humano-anti-ratinho (human-anti-mouse-antibody-HAMA) em humanos. Métodos reconhecidos na arte (área) para determinar a resposta imunitária podem ser realizados para monitorizar a resposta ΗΔΜΑ em particular num doente particular ou durante ensaios clínicos. Anticorpos humanizados administrados a doentes podem ser avaliados quanto à imunogenicidade no princípio e durante a administração da referida terapia. A resposta HAMA é medida, por exemplo, detectando anticorpos para o reagente terapêutico humanizado, em amostras de soro do doente usando métodos conhecidos de um indivíduo na área, incluindo tecnologia de ressonância de plasma de superfície (BIACORE) e/ou ensaios de ELISA de fase sólida.

Certos aminoácidos dos resíduos estruturais da região variável são seleccionados por substituição baseada na sua possível influência na conformação CDR e/ou ligação ao antigénio. A justaposição não-natural de regiões CDR murinas com regiões estruturais variáveis humanas pode resultar em restrições conformacionais não naturais que, se não forem corrigidas porsubstituição de certos resíduos de aminoácidos, conduzam a perda de afinidade de ligação. 41 ΡΕ1613347 A selecção de resíduos de aminoácidos para substituição é determinada, em aprte, por modelação de computador. Hardware e software de computador são aqui descritos para produzir imagens tridimensionais de moléculas de imunoglobulina. Em geral, modelos moleculares são produzidos começando a partir de estruturas resolvidas para cadeias de imunoglobulina ou domínios destas. As cadeias a ser modeladas são comparadas quanto à semelhança na sequência de aminoácidos com cadeias ou domínios de estruturas tridimensionais resolvidas, e as cadeias ou domínios que apresentam a maior semelhança na sequência é/são selec-cionada(s) como pontos de partida para construção do modelo molecular. Cadeias ou domínios que partilham pelo menos 50% de identidade de sequência são seleccionadas para modelação e preferivelmente as que partilham pelo menos 60%, 70%, 80%, 90% de identidade de sequência ou mais são selecci onadas para modelação. As estruturas de início resolvidas são modificadas, para ter em conta diferenças entre os aminoácidos actuais, nas cadeias de imunoglobulina, ou domínios a ser modelados e os na estrutura de início. As estruturas modificadas são então unidas numa imunoglobulina composta. Finalmente o modelo é refinado por minimização de energia e verificando que todos os átomos estão a distâncias uns dos outros e que comprimentos de ligação e angúlos estão dentro de limites quimicamente aceitáveis. A selecção de resíduos de aminoácidos para substituição também pode ser determinada , em parte, pelo 42 ΡΕ1613347 exame de características dos aminoácidos em posições particulares, ou observação empírica dos efeitos de substituição ou mutagénese de aminoácidos particulares. Por exemplo, quando um aminoácido difere entre um resíduo de uma região estrutural variável murina e um resíduo estrutural da região humana seleccionado, o aminoácido da região estrutural humana deveria ser habitualmente substituído pelo aminoácido da região estrutural equivalente do anticorpo de ratinho quando se prevê razoavelmente que o aminoácido: (1) se liga ao antigénio directamente de forma não- covalente,

(2) é adjacente a uma região CDR (3) de outro modo interage com a região CDR (e.g., está a menos de cerca de 3-6Â de uma região CDR de acordo com a determinação por modelação de computador) ou (4) participa na interface VL-VH.

Resíduos que "se ligam directamente ao antigénio de forma não covalente" incluem aminoácidos em posições nas regiões estruturais, que têm uma boa probabilidade de interagir directamente com aminoácidos no antigénio, de acordo com forças químicas estabelecidas, por exemplo, por ligações de hidrogénio, forças de Van der Waals, interac-ções hidrofóbicas e afins. CDR e regiões estruturais são, como definido por Kabat et al ou Cothia et al., supra. Quando resíduos 43 ΡΕ1613347 estruturais, como definido por Kabat et al., supra, constituem resíduos loop estruturais como definido por Clothia et al., supra, os aminoácidos presentes no anticorpo de ratinho podem ser seleccionados para substituição, no anticorpo humanizado. Resíduos que são "adjacentes a uma região CDR" incluem resíduos de aminoácidos em posições imediatamente adjacentes a um ou mais dos CDRs na sequência primária da cadeia de imunoglobulina humanizada, por exemplo, em posições imediatamente adjacentes a uma CDR como definido por Kabat, ou uma CDR como definido por Chothia (ver e.g., Chothia e Lesk JMB 196:901 (1987)). Estes aminoácidos são particularmente prováveis de interagir com os aminoácidos nas CDRs e, se escolhidos do aceitador, de distorcer as CDRs do dador e reduzir a afinidade. Mais ainda, os aminoácidos adjacentes podem interagir directamente com o antigénio (Amit et al.,

Science, 233:747 (1986) e seleccionar estes aminoácidos do dador pode ser desejável para manter todos os contactos do antigénio que fornecem afinidade no anticorpo original.

Resíduos que "de outro modo interagem com uma região CDR" incluem os que se determina, por análise estrutural secundária, estarem em orientação espacial suficiente para efectuarem uma região CDR. Numa implementação, resíduos que "de outro modo interagem com uma região CDR" são identificados analizando um modelo tridimensional da imunoglobulina dadora (e.g., um modelo gerado por computador) . Um modelo tri-dimensional, tipicamente do anticorpo dador original, mostra que certos aminoácidos fora das CDRs 44 ΡΕ1613347 estão perto das CDRs e têm uma boa probabilidade de interagir com aminoácidos nas CDRs por ligações de hidrogénio, forças de Van der Waals, interacções hidrofóbicas, etc. Nessas posições de aminoácidos, pode ser seleccionado o aminoácido da imunoglobulina dadora, em vez do aminoácido da imunoglobulina aceitadora. De acordo com este critério, aminoácidos terão geralmente um átomo da cadeia lateral até 3 unidades angstrom (Â) de distância de algum átomo nas CDRs e têm de conter um átomo que poderia interagir com os átomos de CDR de acordo com forças qimicas estabelecidas, tais como as listadas acima.

No caso de átomos que podem formar uma ligação de hidrogénio, os 3 Â são medidos entre o seu núcleo, mas para átomos que não formam ligação, os 3 Â são medidos entre as suas superfícies de Van der Waals. Por isso, no último caso, os núcleos têm que estar a cerca de 6 Â (3 Â mais a soma dos raios de Van der Waals) para os átomos serem considerados capazes de interactuar. Em muitos casos os núcleos estarão separados de 4 ou 5 a 6 Â. Na determinação de se um aminoácido pode interagir com os CDRs, é preferido não considerar os últimos 8 aminoácidos de CDR 2 da cadeia pesada como parte das CDRs, porque, do ponto de vista da estrutura, estes 8 aminoácidos comportam-se mais como parte da "região estrutural".

Aminoácidos que são capazes de interagir com aminoácidos nos CDRs, podem ser ainda identificados ainda de outra maneira. A área de superfície acessível ao 45 ΡΕ1613347 solvente de cada aminoácido " estrutural" é calculada de dois modos( 1) no anticorpo intacto, (2) numa molécula hipotética consistindo no anticorpo com as suas CDRs removidas. Uma diferença significativa entre estes números de cerca de 10 angstroms quadrados ou mais mostra que o acesso do aminoácido estrutural ao solvente é, pelo menos parcialmente, bloqueado pelos CDRs, e por isso, que o aminoácido faz contacto com os CDRs. A área de superfície acessível ao solvente de um aminoácido pode ser calculada baseada num modelo tridimensional de um anticorpo, usando algoritmos conhecidos na área (e.g., Connolly, J. Appl. Cryst. 16:548 (1983) e Lee e Richards, J. Mol. Biol.55:379 (1971) ) . Aminoácidos estruturais podem assim ocasionalmente interagir com as CDRs indirectamente, afectando a conformação de outro aminoácido estrutural que, por sua vez, contacta as CDRs.

Sabe-se que aminoácidos em várias posições na região estrutural são capazes de interagir com os CDRs em vários anticorpos (Chothia e Lesk, supra, Cothia et al., supra e Tramontano et al., J. Mol. Biol. 215:175 (1990)). Notavelmente, sabe-se que os aminoácidos nas posições 2, 48, 64, e 71 da cadeia leve e 26-30, 71 e 94 da cadeia pesada (numeração de acordo com Kabat) são capazes de interagir com as CDRs em muitos anticorpos. Os aminoácidos nas posições 35 na cadeia leve e 93 e 103 na cadeia pesada também interagem provavelmente com as CDRs. Em todas estas posições numeradas é preferível a escolha do aminoácido 46 ΡΕ1613347 dador em vez do aminoácido aceitador (quando eles diferem) para estarem na imunoglobulina humanizada. Por outro lado, certos resíduos capazes de interagir com a região CDR, tal como os primeiros 5 aminoácidos da cadeia leve, podem às vezes ser escolhidos da imunoglobulina aceitadora sem perda de afinidade na imunoglobulina humanizada.

Resíduos que "participam na interface VL-VH" ou resíduos de empacotamento" incluem os resíduos na interface entre VL e VH como definido, por exemplo, por Novotny e Haber, Proc.Natl. Acad. Sei. USA, 82: 4592-66(1985) ou Chothia et al, supra. Geralmente, resíduos de empacotamento invulgares deveriam ser retidos no anticorpo humanizado, se diferem dos existentes nas regiões de estrutura humanas.

Em geral, um ou mais dos aminoácidos que preenchem os critérios acima referidos é substituído. Nalgumas implementações, todos ou a maioria dos aminoácidos que preenchem os critérios acima são substituídos. Ocasial-mente, há alguma ambiguidade acerca de se um aminoácido particular preenche os critérios acima e são produzidas imunoglobulinas variantes alternativas, uma das quais tem essa substituição particular , a outra das quais não tem. Imunoglobulinas variantes alternativas assim produzidas podem ser testadas em qualquer dos ensaios descritos aqui, para a actividade desejada, e a imunoglobulina preferida seleccionada. 47 ΡΕ1613347

Normalmente as regiões CDR em anticorpos humanizados são substancialmente idênticos e mais habitualmente, idênticos às regiões CDR correspondentes do anticorpo dador. Embora não seja normalmente desejável, às vezes é possivel fazer uma ou mais substituições de aminoácidos conservativas de resíduos CDR sem afectar apreciavelmente a afinidade de ligação da imunoglobulina humanizada resultante. Por substituições consevativas entende-se combinações como gly, ala; vai, ile, leu; asp, glu; asn, gin; ser, thr; lys, arg; e phe, tyr.

Candidatos adicionais para substituição são aminoácidos da região estrutural humana do aceitador que são invulgares ou "raros" para uma imunoglobulina humana naquela posição. Estes aminoácidos podem ser substituídos por aminoácidos da posição equivelente do anticorpo dador de rato ou de posições equivalentes de imunoglobulinas humanas mais típicas. Por exemplo, substituição pode ser desjável quando o aminoácido numa região de estrutura humana da imunoglobulina aceitadora é raro para aquela posição e o aminoácido correspondente na imunoglobulina dadora é comum para aquela posição em sequências de imunoglobulina humana; ou quando o aminoácido na imunoglobulina aceitadora é raro para aquela posição e o aminoácido correspondente na imunoglobulina dadora também é raro, relativamente a outras sequências humanas. Este critério ajuda a assegurar que um aminoácido atípico na região estrutural humana não perturba a estrutura do anticorpo. 48 ΡΕ1613347

Mais ainda, substituindo um aminoácido aceitador humano invulgar com um aminoácido do anticorpo dador que por acaso é típico para anticorpos humanos, o anticorpo humanizado pode ser tornado menos imunogénico. 0 termo "raro" como aqui usado, indica um aminoácido que ocorre naquela posição em menos do que 20% mas normalmente menos do que cerca de 10% das sequências numa amostra representativa de sequências, e o termo "comum", como usado aqui, indica um aminoácido ocorrendo em mais do que cerca de 25% mas normalmente mais do que cerca de 50% de sequências numa amostra representativa. Por exemplo, todas as sequências da região variável da cadeia leve e pesada humana são respectivamente agrupadas em "subgrupos" de sequências que são especialmente homólogas umas às outras e têm os mesmos aminoácidos em certas posições críticas (Kabat et al., supra). Ao decidir se um aminoácido numa sequência aceitadora humana é "raro" ou "comum" entre as sequências humanas, é frequentemente preferível considerar só as sequências humanas no mesmo subgrupo como sequência aceitadora.

Candidatos adicionais para substituição são aminoácidos estruturais humanos aceitadores que seriam identificados como parte de uma região CDR sob a definição alternativa proposta por Chothia et al., supra. Candidatos adicionais para substituição são aminoácidos estruturais humanos aceitadores que seriam identificados como parte de uma região CDR sob o AbM e/ou definições de contacto. 49 ΡΕ1613347

Notavelmente, CDRl na cadeia pesada variável é definido como incluindo os resíduos 26-32.

Candidatos adicionais para substituição são resíduos estruturais aceitador que correspondem a resíduos estruturais dadores raros ou invulgares. Resíduos estruturais dadores raros ou invulgares são os que são raros ou invulgares (como aqui definido) para anticorpos murinos naquela posição. Para anticorpos murinos, o subgrupo pode ser determinado de acordo com Kabat e são identificadas as posições dos resíduos que diferem do consensus. Estas diferenças específicas do dador podem apontar para mutações somáticas na sequência murina que aumentam a actividade. Resíduos invulgares que se prevê que afectem a ligação são retidos, enquanto os resíduos que se prevê que não são importantes para a ligação podem ser substituídos.

Candidatos adicionais para substituição são resíduos não-germinais que ocorrem numa região estrutural aceitadora. Por exemplo, quando uma cadeia de anticorpo aceitador (í.e. uma cadeia de anticorpo humana que partilha uma identidade de sequência significativa com a cadeia de anticorpo doador) é alinhada com uma cadeia de anticorpo germinal (do mesmo modo, partilhando uma identidade de sequência significativa com a cadeia doadora), os resíduos que não correspondem entre a região estrutural da cadeia aceitadora e a região estrutural da cadeia germinal podem ser substituídos pelos resíduos correspondentes da sequência germinal. 50 ΡΕ1613347

Para além das substituções de aminoácidos específicos discutidoas acima, as regiões estruturais de imuno-globulinas humanizadas são normalmente substancialmente idênticas, e mais frequentemente, idênticas às regiões estruturais dos anticorpos humanos dos quais são derivados. Com certeza, muitos dos aminoácidos na região estrutural não contribuem ou contribuem pouco para a especificidade ou afinidade de um anticorpo. Assim, muitas substituições conservativas individuais de resíduos da imunoglobulina humanizada resultante podem ser toleradas, sem modificação apreciável da especificidade ou afinidade. Assim, numa implementação, a região de estrutural variável da imunoglobulina humanizada partilha pelo menos 85% de identidade de sequência com uma sequência da região estrutural variável humana ou consensus destas sequências. Noutra implementação, a região estrutural variável da imunoglobulina humanizada partilha pelo menos 90%, preferivelmente 95%, mais preferivelmente 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com uma sequência de região estrutural varável humana ou consensus destras sequências. Em geral, no entanto, estas substituições não são desejáveis.

Os anticorpos humanizados exibem preferivelmente uma afinidade de ligação específica para antigénio de pelo menos ΙΟ7, ΙΟ8, 109 ou IO10 M_1. Normalmente o limite superior da afinidade de ligação dos anticorpos humanizados para o antigénio está num factor de três, quatro ou cinco 51 ΡΕ1613347 em relação à imunoglobulina dadora. Frequentemente o limite inferior da afinidade de ligação também se encontra num factor de três, quatro ou cinco em relação à da imunoglobulina dadora. Alternativamente, a afinidade de ligação pode ser comparada com a do anticorpo humanizado que não possui tem substituições (e.g., um anticorpo que tem CDRs dadoras e FRs aceitadoras, mas não tem substituições FR) . Nestas condições, a ligação do anticorpo optimizado (com substituições) é preferivelmente pelo menos duas a três vezes maior, ou três a quatro-vezes maior do que a do anticorpo não substituído. Para fazer comparações, pode ser determinada a actividade de vários anticorpos, por exemplo por BACORE (í.e. ressonância plasmon de superfície usando reagentes não não marcados) ou ensaios de ligação competitiva. C. Produção de Anticorpos 3D6 Humanizados

Uma implementação preferida da presente invenção apresenta um anticorpo humanizado dirigido ao N-Terminal de Αβ, em particular para uso nas metodologias terapêuticas ou diagnósticas descritas aqui. Um material de início particularmente preferido para produção de anticorpos humanizados é 3D6. 3D6 é específico para o terminal N de Αβ e mostrou-se que medeia a fagocitose (e.g., induz fago-citose) de placa amilóide (ver exemplos I-V). A clonagem e sequenciação de cDNA que codifica as regiões variáveis das cadeias leve e pesada do anticorpo 3D6 é descrito no exemplo VI. 52 ΡΕ1613347

Sequências de anticorpo aceitador humano adequadas são identificadas por comparações de computador das sequências de aminoácidos das regiões variáveis de ratinho com as sequências de anticorpos humanos conhecidos. A comparação é realizada separadamente para as cadeias pesadas e leves mas os princípios são semelhantes para cada. Em particular, domínios variáveis para anticorpos humanos cujas sequências estruturais exibem um elevado grau de identidade de sequência com as regiões estruturais VL e VH murinas foram identificadas por consulta da base de dados de Kabat usando NCBI BLAST (acessível publicamente através do server de internet do National Institute of Health NCBI) com as respectivas sequências estruturais murinas. Numa implementação, são seleccionadas sequências de anticorpo aceitadores que partilham identidade de sequência maior do que 50% com as sequências dadoras murinas. Preferivelmente, são seleccionadas sequências de anticorpo aceitadoras que partilham 60%, 70%, 80%, 90% ou mais.

Uma comparação por computador de 3D6 revelou que a cadeia leve de 3D6 apresenta a maior identidade de sequência com as cadeias leves humanas de subtipo kappa II, e que a cadeia pesada de 3D6 apresenta a maior identidade de sequência com as cadeias pesadas humanas do subtipo III, como definido por Kabat et al., supra. Assim, as regiões estruturais humanas leves e pesadas são preferivelmente 53 ΡΕ1613347 derivadas de anticorpos humanos destes subtipos ou de sequências consensus destes subtipos. As regiões variáveis humanas de cadeia leve preferidas que apresentam maior identidade de sequência com a região correspondente de 3D6 são de anticorpos contendo os númeris ID de Kabat 019230, 005131, 005058, 005057, 005059, U21040 e U41645, sendo 019230 mais preferida. As regiões variáveis humanas de cadeia pesada preferidas apresentando a maior identidade de sequência com a região correspondente de 3D6 são de anticorpos tendo números ID de Kabat 045919, 000459, 000553, 000386 e M23691, sendo 045919 preferido.

Os resíduos são em seguida seleccionados para substituição, como se segue. Quando um aminoácido difere entre uma região estrutural variável de 3D6 e uma região estrutural variável humana equivalente, o aminoácido estrutural humano deveria ser normalmente substituído por um aminoácido de ratinho equivalente se é razoavelmente esperado que o aminoácido: (1) se ligue directamente ao antigénio de forma não covalente, (2) seja adjacente a uma região CDR, seja parte de uma região CDR sob a definição alternativa proposta por Chothia et ai., supra, ou interage de outro modo com uma região CDR (e.g., encontra-se a cerca de 3Ã de uma região CDR) (e.g., aminoácidos nas posições L2, H49, e H94 de 3D6), ou 54 ΡΕ1613347 (3) participa na intergace VL-VH (e.g., aminoácidos nas posições L36, L46 e H93 de 3D6).

Modelação por computador das regiões variáveis da cadeia pesada e leve do anticorpo 3D6 e humanização do anticorpo 3D6 é descrito no exemplo VII. Brevemente, um modelo tridimensional foi gerado com base nas estruturas de anticorpo murino resolvidas para as cadeias pesada e leve. Para este efeito, um anticorpo designado 1CR9 (Banco de dados de proteinas-Protein data bank-PDB) ID: 1CR9, Kanyo et al., J.Mol.Biol.293:855 (1999) foi escolhido como molde para medelar a cadeia leve de 3D6, e um anticorpo designado 10PG (PBD ID: 10PG, Kodandapani et al., J-Biol.Chem. 270:2268 (1995)) foi escolhido como molde para modelar a cadeia pesada. O modelo foi ainda refinado por uma série de passos de minimização de energia para libertar contactos atómicos desfavoráveis e optimizar as interações electros-táticas e de van der Walls. A estrutura resolvida de lqkz (PBD ID: 1QKZ, Derrick et al., J.Mol.Biol. 293:81 (1999) foi escolhida como molde para modelar CD3 da cadeia pesada já que 3D6 e 10PG não exibiam homologia de sequência significativa nesta região quando alinhada para efeitos de comparação. A informação estrutural tridimensional para os anticorpos descrita aqui está disponível publicamente, por exemplo, do banco de dados de proteínas (protein data bank-PDB) do Research Collaboratory for Structural Bioin- 55 ΡΕ1613347 formatics. 0 PDB está acessível livremente via internet World Wide Web e eé descrito por Berman et al. (2000) Nucleic Acids Research, 28: 235. Modelação por computador permite a identificação de resíduos que interactuam com CDR. O modelo por computador da estrutura de 3D6 pode, por sua vez, servir como um ponto de partida para predizer a estrutura tridimensional de um anticorpo contendo as regiões determinantes de complementaridade de 3D6 substituídas em estruturas estruturais humanas. Modelos adicionais podem ser construídos representando a estrutura quando são introduzidas outras substituições de amino-ácidos.

Em geral, é desejável a substituição de um, a maioria ou todos os aminoácidos que preenchem os critérios acima. De acordo com com isto, os anticorpos humanizados da presente invenção conterão normalmente uma substituição de um resíduo estrutural da cadeia leve humana com um resíduo 3D6 correspondente em pelo menos 1, 2 ou 3, e mais habiltualmente 4, das seguintes posições: Ll, L2, L36, e L46. Os anticorpos humanizados também contêm normalmente uma substituição de um resíduo estrutural da cadeia pesada humana com um resíduo 3D6 correspondente em pelo menos 1, 2, e por vezes 3 das seguintes posições: H49, H93 e H94. Anticorpos humanizados também podem conter uma substituição de um resíduo estrutural da cadeia pesada com um resíduo germinal correspondente em pelo menos 1, 2, e por vezes 3, das seguintes posições: H74, H77 e H89. 56 ΡΕ1613347

Ocasionalmente, no entanto, há alguma ambiguidade acerca de se um aminoácido particular preenche os critérios acima, e são produzidas imunoglobulinas variantes alternativas, uma das quais tem essa substituição particular, a outra das quais não tem. Em casos em que a substituição com um resíduo murino introduziria um resíduo que é raro em imunoglobulinas humanas numa posição particular, pode ser desejável testar o anticorpo quanto à actividade com e sem a substituição particular. Se a actividade (e.g., actividade de ligação e/ou especificidade de ligação) for a mesma com ou sem a substituição, o anticorpo sem substituição pode ser preferido, já que se espera que ele elicite uma menor resposta HAHA, como aqui descrito.

Outros candidatos para substituição são amino-ácidos da região estrutural humana aceitadora que são invulgares para a imunoglobulina humana nessa posição. Estes aminoácidos podem ser substituídos por aminoácidos da posição equivalente de imunoglobulinas humanas mais típicas. Alternativamente, aminoácidos de posições equivalentes em 3D6 de ratinho podem ser introduzidos nas regiões estruturais humanas quando estes aminoácidos foram típicos de imunoglobulina humana nas posições equivalentes.

Em implementações adicionais, quando a imunoglobulina aceitadora estrutural de cadeia leve humana é o número ID de Kabat 019230, a cadeia leve contem substituições em pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 57 ΡΕ1613347 12, ou mais habitualmente 13, das seguintes posições: L7, LIO, L12, L15, L17, L39, L45, L63, L78, L83, L85, L100 ou L104. Em implementações adicionais quando a imunoglobulina aceitadora de região estrutural de cadeia pesada humana é o número ID da Kabat 045919, a cadeia pesada contem substituições em pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, ou mais habitualmente 15, das seguintes posições: H3, H5, H13, H16, H19, H40, H41, H42, H44, H72, H77, H82A, H83, H84, ou H108. Estas posições são substituídas com os aminoácidos da posição equivalente de uma imunoglobulina humana que contem um resíduo de aminoácido mais típico. Exemplos de aminoácidos apropriados para substituição mostram-se nas figuras 1 e 2.

Outros candidatos para substituição são resíduos não-germinais que ocorrem numa região estrutural. Uma comparação por computador de 3D6 com sequências germinais revelou que cadeias leves que mostram o maior grau de identidade de sequência incluem sequências de região variável germinais VH3-48, VH3-23, VH3-7, VH3-21 e VH3-11, sendo VH3-23 mais preferida. Alinhamento de Kabat ID 045919 com VH3-23 revela que resíduos H74, H77 e/ou H89 podem ser seleccionados para substituição com pelos resíduos germinais correspondentes (e.g., resíduos H74, H77 e/ou H89 quando se compara ID de Kabat 045919 e VH3-23). Do mesmo modo sequências germinais contendo o maior grau de identidade com a cadeia leve de 3D6 incluem Al, A17, A18, A2 e A19, sendo A19 preferido. Resíduos que não correspondem entre região estrutural aceitador na acdeia leve selec- 58 ΡΕ1613347 cionado e uma destas sequências germinais poderia ser seleccionado para substituição pelo correspondente resíduo germinal. A Tabela 1 sumariza a análise de sequência das regiões VH e VL de 3D6. Estruturas de ratinho e humanas adicionais que podem ser usadas para modelação por computador do anticorpo 3D6 e anticorpos humanos adicionais são apresentados assim como sequências germinais que podem ser usadas na selecção de substituições de aminoácidos. Resíduos de ratinho raros também são apresentados na Tabela 1. Resíduos de rato raros são identificados comparando as sequências VL e/ou VH com as sequências de outros membros do grupo às quais pertencem as sequências VL e/ou VH dadoras (de cacordo com Kabat)e identificar as posições de resíduos que diferem do consensus. Estas diferenças específicas do dador podem indicar mutações somáticas que aumentam a actividade. Resíduos invulgares ou raros, perto do sítio de ligação podem possivelmente contactar o antigénio, tornando desejável reter o resíduo de ratinho. No entanto, se o resíduo de ratinho invulgar não é importante para a ligação, o uso do resíduo aceitador correspondente é preferível já que o resíduo de ratinho pode criar neoepitopos imunogénicos no anticorpo humanizado. Na situação em que um resíduo invulgar na sequência dadora é , de facto um resíduo comum na sequência aceitador correspondente, o resíduo preferido é claramente o resíduo aceitador. 59 ΡΕ1613347

Tabela 1: Sumário da sequência da região V de 3D6

Cadeia Pesada Leve Subgrupo Ratinho IIID (002688) 11(005840-005844,005851- (Kabat seq ID#) 005853,005857,005863) Homólogos de Ratinho 002727/163, l'C 005840/1210,7 (Kabat/Banco de genes) 002711/H35-C6' CL 005843/42.4b.12.2'CL 002733/8-1-12-5-3-1 (A2-1) 'a 005842/EXW-14'CL 002715/ASWA2'CL 005841/42.7B3.2'CL 020669/#14'CL 005851/36-60CRI- Aminoácidos raros (% N40 (0,233%) Y1 (,035%) frequência de D42 (0,699%) 115(3,3%) ocorrência em classe) D27(0,867%)-CDR1 178(0,677%) L85 (0,625% W89 (0,815%)CDR K106A(0,295%) Subgrupo Humano III (000488-000491,000503,000624 II (005046) GrouposCDR Clothia Hl:classe l[2fbj] Ll:classe 4[lrmf] canónicos H2:classe 3[ligc] L2: classel [ llrtik] L3:classel[ltet] Estruturas de ratinho PDB ID:10PG Kodandapani et PCB ID:lCR9;Kanyo et al., supra; mais prox.resolvidas al.,supra; (72% 2Â) (94% 2Â)PDB ID:lNLD;Davies et al., Acta Crystallcgr.D.Biol. Crystallog.53:186(1997); (98%,2,8Â) Estruturas humanas lVH(68%,nmr) 1LVE(57%,LEN) mais prox.resolvidas 443560 (65%, IgG,mielcm^, 1,8Â) 1B6DA(54%,B-J dírtero, KOL/2FB4H(60%, mielcma, 3k) 2,8Â) ;1VGEL (54%,autoftb) Resultados de Consulta VH3-48(4512283/ Al(x63402 germinal (Hu) (top 4) BAA75032.1) A17(x63403) VH3-23(4512287/ A18(x63396) BAA75046.1) A2 (m31952) VH3-7(4512300/ BAA75056.1) VH3-21(4512287/ ΒΔΑ75047.1) VH3-11(4152300/ ΒΔΑ75053.1) A19(x63397) *Cadeia pesada e cadeia leve do mesmo anticorpo(0-81,Hirabayashi et al.NAR 20:2601) 60 ΡΕ1613347

As sequências ID de Kabat referenciadas aqui estão disponíveis publicamente, por exemplo, da base de dados de Kabat de sequências de proteínas de interesse imunológico, do departamento de Engenharia Biomédica da Universidade Northwestern. Informação estrutural tridimensional para anticorpos descrita aqui está disponível publicamente, por exemplo do banco de dados de proteínas Protein Data Bank (PDB) do "Research Collaboratory for Structural Bioinformatics'" . O PBD está acessível via internet World Wide Web e está descrito por Berman et al. (2000) Nucleic Acids Research, p235-242. Sequências de genes germinais aqui referenciadas estão disponíveis publicamente, por exemplo das sequências da base de dados do "National Center for Biotechnology Information (NCBI) em colecções de genes germinais V de Igh, Ig kapa e Ig lambda (como divisão da "National Library of Medicine (NLM)" e "National Institutes of Health" (NIH)). A pesquisa de homologia da base de dados do NCBI "Ig Germline Genes" é fornecida por IgG Blast™ .

Numa implementação preferida, um anticorpo humanizado da presente invenção contem (i) uma cadeia leve que compreende um domínio variável compreendendo CDRs VL de 3D6 murino e uma famework aceitadora humana, tendo a região estrutural pelo menos um, preferivelmente dois, três ou quatro resíduos seleccionados que consiste em Ll, L2, L36 e L46 subtituidos pelo resíduo correspondente 3D6 e (ii) uma cadeia pesada compreendendo CDRs VH de 3D6 e uma região 61 ΡΕ1613347 estrutural aceitadora humana, tendo a região estrutural pelo menos um, preferivelmente dois ou três resíduos selec-cionados do grupo que consiste em H49, H93 e H94 substituídos pelo resíduo 3D6 correspondente, e, opcionalmente, pelo menos um, preferivelmente dois ou três resíduos seleccionados do grupo que consiste em H74, H77 e H89 é substituído por um resíduo germinal humano correspondente.

Numa implementação mais preferida, um anticorpo humanizado da presente invenção contem (i) uma cadeia leve que compreende um domínio variável compreendendo CDRs VL de 3D6 murinos e uma região estrutural aceitadora humana, tendo a região estrutural resíduo 1 substituído por uma tyr(Y), resíduo 2 substituído por uma vai (V), resíduo 36 substituído por uma leu (L) e/ou resíduo 46 substituído por uma arg(R) , e (ii) uma cadeia pesada que compreende CDRs VH de 3D6 e uma região estrutural aceitadora humana, tendo a região estrutural o resíduo 49 substituído por uma ala(A), resíduo 93 substituído por uma vai (V) e/ou o resíduo 94 substituído por uma arg (R) , e opcionalmente, tendo o resíduo 74 substituído por ser(S), o resíduo 77 substituído por uma thr(T) e/ou o resíduo 89 substituído por uma vai(V).

Numa implementação particularmente preferida, um anticorpo humanizado da presente invenção tem caracterís-ticas estruturais, como aqui descrito, e tem ainda pelo menos uma (preferivelmente duas, três, quatro ou todas) as seguintes actividades: (1) liga-se a Αβ1-42 agregado(e.g., 62 ΡΕ1613347 determinado por ELISA); (2) liga-se a Αβ em placas (e.g., cloração de placas de AD e/ou PDAPP); (3) liga-se a Αβ com de duas a três vezes maior afinidade de ligação em comparação com 3D6 quimérico (e.g., tendo 3D6 sequências de região variável murinas e sequências de região constante humanas); (4) medeia fagocitose de Αβ (e.g., num ensaio de fagocitose ex vivo, como aqui descrito); e (5) atravessa a barreira sangue-cérebro (e.g., demonstra localização no cérebro a curto prazo, por exemplo num modelo animal PDAPP, como aqui descrito).

Noutra implementação, um anticorpo humanizado da presente invenção tem caracteristicas estruturais, como aqui descrito, liga-se a Αβ de um modo ou com uma afinidade suficiente para obter pelo menos um dos seguintes efeitos in vivo: (1)reduzir a sobrecarga de placa Αβ; (2) evitar a formação de placa; (3) reduzir os níveis de Αβ solúvel; (4) reduzir a patologia neurítica associada com a perturbação amiloidogénica; (5) diminui ou melhora pelo menos um sintoma fisiológico associado com uma perturbação amiloidogénica; e/ou (6)melhora a função cognitiva.

Noutra implementação, um anticorpo humanizado da presente invenção tem caracteristicas estruturais, como aqui descrito e liga-se especificamente a um epitopo que compreende os resíduos 1-5 ou 3-7 de Αβ.

As actividades descritas acima podem ser determinadas utilizando um de entre uma variedade de ensaios 63 ΡΕ1613347 descritos aqui ou na área (e.g., ensaios de ligação, ensaios de fagocitose, etc). Podem ser ensaiadas actividades in vivo (e.g., usando componentes de ensaio marcadas e/ou técnicas de imagem) ou in vitro (e.g., usando amostras ou especimens derivados de um indivíduo). Actividades podem ser ensaiadas directa ou indirecatamente. Em certas implementações preferidas, são ensaiados "endpoints"(parâmetros) neurológicos (e.g., sobrecarga amilóide, sobrecarga neurítica, etc). Estes "endpoints" (parâmetros) podem ser ensaiados em indivíduos vivos (e.g., em modelos animais da doença de Alzheimer ou em indivíduos humanos, por exemplo, submetidos a imunoterapia) usando metodologias de detecção não invasivas. Alternativamente, estes "endpoints" (parâmetros) podem ser ensaiados em indivíduos postmortem. Ensaiar estes "endpoints" (parâmetros) em modelos animais e/ou indivíduos humanos post mortem é útil para avaliar a efectividade de vários agentes (e.g., anticorpos humanizados) a ser utilizados em aplicações imunoterapêuticas semelhantes. Noutras implementações preferidas podem ser avaliados parâmetros comportamentais ou neurológicos como indicadores da actividades neuropatológicas acima ou "endpoints". 2. Produção de Regiões Variáveis

Tendo seleccionado conceptualmente os componentes CDR e região estrutural das imunoglobulinas humanizadas, estão disponíveis uma variedade de métodos para produzir estras imunoglobulinas. Porque causa da degenerescência do 64 ΡΕ1613347 código, uma variedade de sequências de ácidos nucleicos codificarão cada sequência de aminoácidos da imunoglo-bulina. As sequências de ácido nucleico desejadas podem ser produzidas por síntese de DNA de novo de fase sólida ou por mutagénese por PCR de uma variante, preparada anterior-mente, do polinucleótido desejado. Mutagénese mediada por oligonucleótidos é um método preferido para preparar variantes de substituição, delecção e inserção de DNA polipeptídico alvo. Ver Adelman et al., DNA 2:183 (1983). Brevemente, DNA do (que codifica o) polipéptido alvo é alterado hibridizando um oligonucleotido que codifica a mutação desejada com um molde de DNA de cadeia simples. Após a hibridização, a DNA polimerase é usada para sinte- tizar uma segunda cadeia complementar do molde que incorpora o oligonucleotido iniciador e codifica a alteração seleccionada no DNA do (que codifica o) polipéptido alvo. 3. Selecção de Regiões Constantes

Os segmentos variáveis dos anticorpos produzidos como descrito supra (e.g., as regiões variáveis da cadeia pesada e leve de anticorpos quiméricos, humanizados ou humanos) estão tipicamente ligados a pelo menos uma porção de uma região constante (Fc)de imunoglobulina, tipicamente a de uma imunoglobulina humana. As sequências de DNA da região constante humana podem ser isoladas de acordo com procedimentos bem conhecidos de uma variedade de células humanas, mas preferivelmente células B imortalizadas (ver 65 ΡΕ1613347

Kabat et al., supra, e Liu et al., wo87/02671) ) . Vulgarmente, o anticorpo conterá as regiões constantes da cadeia leve e da cadeia pesada. A região constante da cadeia pesada inclui normalmente regiões CHI, charneira, CH2, CH3 e CH4. Os anticorpos descritos aqui incluem anticorpos contendo todos os tipos de regiões constantes incluindo IgM, IgG, IgD, IgA e IgE e qualquer isótopo incluindo igGl, IgG2, IgG3 e IgG4. A escolha da região constante depende, em parte de, se é ou não desejado complemento dependente do anticorpo ou toxicidade mediada por células. Por exemplo, isótopos igGl e lgG3 têm acti-vidade de complemento e isótopos IgG2 e IgG4 não têm. Quando é desejado que o anticorpo (e.g., o anticorpo humanizado) exiba actividade citotóxica, o domínio constante é normalmente um domínio contante de fixação de complemento e a classe é tipicamente IgGl. Quando esta actividade cititóxica não é desejável, o domínio constante pode ser da classe IgG2. A escolha do isótipo pode também afectar a passagem do anticorpo para o cérebro. 0 isótopo humano IgGl é preferido. As regiões constantes da cadeia leve podem ser lambda ou kapa. 0 anticorpo humanizado pode compreender sequências de mais do que uma classe ou iso-tipo. Anticorpos podem ser expressos como tetrâmeros contendo duas cadeias leves e duas cadeias pesadas, como cadeias pesadas separadas, cadeias leves, como Fab, Fab', F(ab')2, e Fv, ou como anticorpos de cadeia simples nos quais os domínios variáveis da cadeia pesada e leve são ligados através de um spacer. 66 ΡΕ1613347 4. Expressão de Anticorpos Recombinantes

Anticorpos quiméricos, humanizados e humanos são tipicamente produzidos por expressão recombinante. Ácidos nucleicos que codificam as regiões variáveis da cadeia leve e pesada, opcionalmente ligados a regiões constantes, são inseridos em vectores de expressão. As cadeias leve e pesada podem ser clonadas no mesmo ou diferentes vector de expressão. Os segmentos de DNA que codificam cadeias de imunoglobulina são ligados operacionalmente a sequências controlo no(s) vector(es) de expressão que asseguram a expressão de polipéptidos da imunoglobulina. Squências de controlo da expressão incluem, mas não estão limitadas a, promotores (e.g., associados naturalmente ou promotores heterólogos), sequências de sinalização, elementos activa-dores (potenciador) e sequências de terminação de transcrição. Preferivelmente, as sequências de controlo da expressão são sistemas promotores eucarióticos em vectores capazes de transformar ou transfectar células hospedeiro eucarióticas. Uma vez que o vector tenha sido incorporado no hospedeiro apropriado, o hospedeiro é mantido sob condições convenientes para expressão a nivel elevado de sequências nucleotidicas e a recolha e purificação dos anticorpos com reação cruzada.

Estes vectores de expressão são tipicamente replicáveis nos organismos hospedeiro, ou como epissomas ou como uma parte integral do DNA cromossomal do hospedeiro. Usualmente, os vectores de expressão contêm marcadores de 67 ΡΕ1613347 selecção (e.g., resistência à ampicilina, resistência à higromicina, resistência à tetraciclina ou resistência à neomicina) para permitir detecção das células transformadas com as sequências de DNA desejadas (ver, e.g., Itakura et al., US Patent 4, 704, 362) E.coli é um hospedeiro procariota paticular-mente útil para clonar os polinucleótidos (e.g., as sequências de DNA) da presente invenção. Outros hospedeiros microbianos convenientes para uso incluem bacilos, tais como Bacillus subtilus, e outras enterobacteriáceas, tais como Salmonella, Serratia e várias espécies de Pseudomonas. Nestes hospedeiros procariotas, também se podem fazer vectores de expressão, que conterão tipicamente sequências de controlo de expressão compatíveis com a células hospedeiro (e.g., uma origem de replicação) . Além disso estarão presentes um número de uma variedade de promotores bem conhecidos, tais como sistema promotor de lactose, um sistema promotor de triptofano (trp) um sistema promotor de beta-lactamase, ou um sistema promotor do fabo lambda. Os promotores controlarão tipicamente a expressão, opcionalmente com uma sequência operadora, e têm sequências do sítio de ligação ao ribossomas e afins, para iniciar e completar a transcrição e tradução.

Outros micróbios, tais como leveduras também são úteis para expressão. Saccharomyces é um hospedeiro levedura preferido, com vectores convenientestendo sequências de controlo da expressão (e.g., promotores), uma origem de 68 ΡΕ1613347 replicação, sequências de terminação e afins como desejado. Promotores tipicos incluem 3-fosfoglicerato cinase e outras enzimas glicoliticas. Promotores de levedura indutiveis incluem, entre outros, promotores da álcool desidrogenase, isocitocromio C, e enzimas responsáveis pela utilização da maltose e galactose.

Para além de microorganismos, culturas de células de tecidos de mamíferos também podem ser usadas para exprimir e produzir os polipéptidos da presente invenção (e.g., polinucleótidos que codificam imunoglobulinas ou fragmentos destes). Ver Winnacker, From Genes to Clones, VCH Publishers, N.Y., N.Y. (1987). Células eucariótas são normalmente preferidas, porque foram desenvolvidas na área várias linhas celulares hospedeiro convenientes, capazes de segregar proteínas heterólogas (e.g., imunoglobulinas intactas) e incluem linhas celulares CHO, várias linhas celulares Cos, células HeLa, preferivelmente linhas celulares de mieloma, ou células B transformadas ou hibridomas. Preferivelmente as células são não-humanas. Vectores de expressão para estas células podem incluir sequências de controlo de expressão tal como uma origem de replicação, um promotor e um activador (potenciador)(Queen et al., Immunol. Rev. 89:49 (1986)) e locais de informação de processamento necessários, tais como sítios de ligação ao ribossoma, sítios de splice de RNA, sítios de poli-adenilação e sequências de terminação da transcrição. Sequências de controlo de expressão preferidas são promotores derivados de genes de imunoglobulina, SV40, 69 ΡΕ1613347 adenovirus, vírus do papiloma bovino, citomegalovirus e afins. Ver Co et al., J.Immunol. 148: 1149 (1992).

Alternativamente, sequências codificadras de anticorpos podem ser incorporadas em transgenes para introdução no genoma de um animal transgénico e subsequente expressão no leite do animal transgénico (ver, e.g., Deboer et al., US 5, 741, 957, Rosen, US 5, 304, 489, e Meade et al., US 5, 849, 992). Transgenes apropriados incluem sequências que codificam as cadeias leve e/ou pesada com ligação operativa com um promotor ou activador (potenciador) de um gene específico de uma glandula mamária, tal como caseína ou beta lactoglobulina.

Os vectores que contêm as sequências polinu-cleotídicas de interesse (e.g., as sequências de codificação para as cadeias pesada e leve e sequências de controlo da expressão) podem ser transferidas para a células hospedeiro através de métodos bem conhecidos, que variam dependendo do tipo de hospedeiro celular. Por exemplo, transfecção com cloreto de cálcio é usualmente utilizada para células procarioticas, enquanto tratamento com fosfato de cálcio, electroporação, lipofecção, biolística ou transfecção de base virai pode ser usada para outros hospedeiros celulares. (Ver geralmente Sambrook et al., Moelecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press, 2nd ed., 1989). Outros métodos usados para transformar células de mamíferos incluem o uso de polibreno, fusão protoplástica, lipossomas, electroporação 70 ΡΕ1613347 e microinjecção (ver geralmente, Sambrook et al., supra). Para a produção de animais transgénicos os transgenes podem ser microinjectados em oócitos fertilizados, ou podem ser incorporados no genoma de células estaminais embrionárias e o núcleo destas células transferido em oocitos enucleados.

Quando as cadeias pesada e leve são clonadas em vectores de expressão separados, os vectores são co-transfectados para obter expressão e reunião das imunoglo-bulinas intactas. Uma vez expressos, os anticorpos completos, os seus dimeros, cadeias leves e pesadas individuais ou outras formas de imunoglobulina da presente invenção podem ser purificadas de acordo com procedimentos Standard na área, incluindo precipitação com sulfato de amónio, colunas de afinidade, cromatografia em coluna, purificação por HPLC, electroforese de gel e afins (ver geralmente Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, N.Y., (1982)). Substancialmente imunoglobulinas puras de pelo menos cerca de 90 a 95% de homogenidade são preferidas, e 98 a 99% de homogenidade ou mais é principalmente preferida para usos farmacêuticos. 5. Testando anticorpos quanto à Eficácia Terapêutica em Modelos Animais

Grupos de ratinhos PDAPP de 7-9 meses de idade é, cada um injectado com 0,5 mg de anticorpos anti-Αβ policlonais ou anticorpos monoclonais anti-Αβ específicos em PBS. Todas as preparações de anticorpo são purificadas 71 ΡΕ1613347 para ter baixos níveis de endotoxina. Monoclonais poem ser preparados contra um fragmento injectando o fragmento ou uma forma mais longa de Αβ num ratinho, preparando hibridomas e fazendo a triagem (screening)dos hibridomas para um anticorpo que se liga especificamente a um fragmento desejado de Αβ sem se ligar a outros fragmentos de Αβ não sobrepostos.

Ratinhos são injectados intraperitonealmente segundo a necessidade, durante um período de 4 meses, para manter a concentração de anticorpo circulante, medido por um título de ELISA de mais de 1/1000, definido por ELISA para Αβ42 ou outro imunogénio. Os títulos são monitorizados e os ratinhos são eutanizados ao fim de 6 meses de injecçõs. Histoquímica, níveis de Αβ e toxiclogia são realizados post mortem. São usados dez ratinhos por grupo. 6. Triagem (Screening) de Anticorpos para Actividade de

Depuração A invenção também fornece métodos para triagem de um anticorpo para actividade na depuração de um depósito amilóideou qualquer outro antigénio, ou entidade biológica associada, para a qual é desejada actividade de depuração. Para a triagem de actividadecontra um depósito amilóide, uma amostra de tecido de um cérebro de um doente com doença de Alzheimer ou um modelo animal tendo patologia de Alzheimer característica é posto em contacto com células fagocíticas com um receptor Fc, tais como células 72 ΡΕ1613347 microgliais, e o anticorpo a testar num meio invitro. As células fagociticas podem ser uma cultura primária ou uma linha celular, tal como BV-2, C8-B4 ou THP-1. Nalguns métodos os componentes são combinados num slide de micriscópio para facilitar a monitorização microscópica. Nalguns métodos, são levadas a cabo reacções múltiplas em paralelo nos poços de uma placa de microtitulo. Neste formato, pode ser montado em poços separados um slide de microscópio miniatura separado, ou pode ser usado um formato de detecção não-microscópica, tal como detecção de Αβ por ELISA. Preferivelmente, é feita uma série de medidas da quantidade de depósito amilóide na mistura reaccional in vitro, começando por um valor baseline antes que a reacção tenha proseguido e um ou mais valores teste durante a reacção. 0 antigénio pode ser detectado corando, por exemplo com um anticorpo marcado com fluorescência para Αβ ou outro componente das placas amilóides. 0 anticorpo usado para coloração pode ou não ser o mesmo do que o anticorpo testado para actividade de depuração. Uma relativa redução a baseline, durante a reacção, dos depósitos amilóides indica que o anticorpo sob teste tem actividade de depuração. É provável que estes anticorpos sejam úteis na prevenção ou tratamento de doença de Alzheimer e outras doenças amiloidogénicas. Métodos análogos podem ser usados para triar anticorpos para a actividade na depuração de outros tipos de entidades biológicas. 0 ensaio pode ser usado para detectar actividade de depuração contra virtualmente 73 ΡΕ1613347 qualquer tipo de entidade biológica. Tipicamente, a entidade biológica tem um papel numa doença humana ou animal. A entidade biológica pode ser fornecida como uma amostra de tecido ou de forma isolada. Se fornecida como uma amostra de tecido, a amostra de tecido é preferivelmente não fixada para permitir acesso fácil a componentes da amostra de tecido e para evitar perturbar a conformação dos componentes incidental na fixação. Exemplos de amostras de tecido que podem ser testadas neste ensaio incluem tecido canceroso, tecido precanceroso, tecido contendo crescimentos benignos tais como verrugas ou molas, tecido infectado com microorganismos patogénicos, tecido infectado com células inflamatórias, tecido contendo matizes patológicas entre as células (e.g., pericardite fibrinosa), tecido contendo antigénios aberrantes e tecido de cicatriz. Exemplos de entidades biológicas isoladas que podem ser usadas incluem Αβ, antigénios virais ou virus, proteo-glicanos, antigénios de outros microorganismos patogénicos, antigénios tumorais e moléculas de adesão. Estes antigénios podem ser obtidos de fontes naturais, expressão recom-binante ou síntese química, entre outros meios. A amostra de tecido ou a entidade biológica isolada é posta em contacto com célula fagocíticas contendo receptores Fc, tais como monócitos ou células microgliais e um anticorpo a ser testado num meio. 0 anticorpo pode ser direccionado à entidade biológica a testar ou para um antigénio associado com a entidade. Na última situação, o objectivo é testar se a entidade biológica é vicariamente fagocitada com o antigénio. Normalmente , embora não seja necessário, o 74 ΡΕ1613347 anticorpo e a entidade biológica (às vezes com um antigénio associado), são postas em contacto umas com as outras antes de adicionar as células fagociticas. A concentração da entidade biológica e/ou do antigénio associado que fica no meio, se presente, é então monitorizado. Uma redução na quantidade ou concentração de antigénio ou da entidade biológica associada no meio indica que o anticorpo uma resposta de depuração contra o antigénio e/ou entidade biológica associada em conjunção com as células fagociticas (ver e.g., Exemplo IV). 7. Anticorpos Quiméricos/Humanizados com Função Efectora Alterada

Os anticorpos acima descritos da invenção compreendem uma região constante (região Fc) com função efectora da molécula alterada. Geralmente, a função efectora de um anticorpo reside na região constante ou Fc da molécula que pode mediar a ligação a várias moléculas efectoras, e.g., proteinas complemento ou receptores Fc. A ligação de complemento à região Fc é importante, por exemplo na opsonizaçãoe lise de patogénios celulares e a activação de respostas inflamatórias. A ligação de um anticorpo a receptores Fc, por exemplo à superfície de células efectoras pode desencadear um número de respostas biológicas importantes e diversas incluindo, por exemplo, sequestro e destruição de patogénios revestidos por anticorpos ou partículas, depuração de complexos imunitários, lise de células alvo revestidas de anticorpos por células killer 75 ΡΕ1613347 (i.e. citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos, ou ADCC), libertação de mediadores inflamatórios, transferência placentária de anticorpos e controlo de produção de imunoglobulina.

De acordo com isto, dependendo de uma aplicação terapêutica ou diagnóstica particular, podem ser desejáveis as funções imunitárias acima mencionadas, ou funções imunitárias seleccionadas. Alterando a região Fc do anticorpo, são atingidos vários aspectos da função efectora da molécula, incluindo aumentar ou suprimir várias reacções do sistema imunitário, com efeitos benéficos no diagnóstico e terapia.

Podem ser produzidos anticorpos da invenção que reagem somente com certos tipos de receptores Fc, por exemplo, os anticorpos da invenção podem ser modificados de modo a ligar-se somente a certos receptores Fc, ou se desjado, com completa ausência de ligação a receptores Fc, por delecção ou alteração do sitio de ligação do receptor Fc localizado na região Fc do anticorpo. Outras alterações desejáveis da região Fc de um anticorpo da invenção estão catalogadas abaixo. Tipicamente o sistema de numeração de Kabat é usado para indicar que residuo(s) de aminoácido (s) da região Fc (e.g., de um anticorpo IgG)estão alterados (e.g., por substituição de aminoácidos)para atingir a modificação desejada na função efectora. 0 sistema de numeração também é empregado para comparar anticorpos entre as espécies de modo que uma função efectora desejada 76 ΡΕ1613347 observada, por exemplo num anticorpo de ratinho, pode então ser sistematicamente rearranjadas num anticorpo humano, humanizado ou quimérico da invenção.

Por exemplo, foi observado que anticorpos (e.g., anticorpos IgG) podem ser agrupados de acordo com os que demontraram exibir ligação forte intermédia ou fraca a um freceptor Fc (e.g., um receptor Fc em monócitos humanos (FcyRI)). Por comparação das sequências de aminoácidos nestes grupos de afinidade diferentes,foi identificado um site de ligação a monócito na região de ligação charneira (Leu234-Ser239) . Mais ainda o receptor FcyRI humano liga-se a IgGl humana e IgG2a de ratinho como um monómero, mas a ligação de IgG2b de ratinho é 100 vezes mais fraca. Uma comparação da sequência destas proteínas na região link-charneira mostra que a sequência 234 a 238, i.e., Leu-Leu-Gly-Gly-Pro nos que se ligam mais fortemente torna-se Leu-Glu-Gly-Gly-Pro em gama 2b de ratinho, i.e. que se ligam fracamente. De acordo com isto, pode ser feita uma modificação correspondente numa sequência charneira de um anticorpo humano, se se deseja ligação reduzida ao receptor Fcyl. Compreende-se que podem ser feitas outras alterações para atingir os mesmos ou semelhantes resultados. Por exemplo, a afinidade de ligação a FcyRI pode ser alterada substituindo o resíduo especificado por um resíduo contendo um grupo funcional inapropriado na sua cadeia lateral, ou introduzindo um grupo funcional carregado (e.g., Glu ou Asp) ou por exemplo um resíduo aromático não polar (e.g., Phe, Tyr, ou Trp). 77 ΡΕ1613347

Estas modificações pode ser igualmente aplicadas aos sistemas murino, humano e rato dada a homologia de sequência entre as diferentes imunoglobulinas. Mostrou-se que para IgG3 humana, que se liga ao receptor FcyRI humano, mudando Leu 235 para Glu destrói a interacção do mutante para o receptor. 0 sitio de ligação para este receptor pode assim ser ligado ou desligado fazendo a mutação apropriada.

Mutações em sitios adjacentes ou próximos na região charneira link (e.g., substituindo os resíduos 234, 236 ou 237 por Ala)indicam que alterações nos resíduos 234, 235, 236, e 237 pelo menos afectam a afinidade para o receptor FcyRI. De acordo com isto, os anticorpos da invenção têm uma região Fc alterada com uma afinidade de ligação para FcyRI alterada em comparação com o anticorpo não modificado. Um anticorpo deste tipo tem, convenientemente, uma modificação no resíduo de aminoácido 234, 235, 236, ou 237. A afinidade para outros receptores Fc pode ser alterada através de uma abordagem semelhante, para controlar a resposta imunitária de diversos modos.

Como um exemplo adicional, as propriedades líti-cas de anticorpos IgG a seguir à ligação do componente Cl do complemento pode ser alterada. 0 primeiro componente do sistema complemento, Cl, 78 ΡΕ1613347 compreende três proteínas conhecidas como Clq, Ck e Cls que se ligam firmemente umas às outras. Mostrou-se que Clq é responsável por ligar o complexo de três proteínas a um anticorpo.

De acordo com isto, a actividade de ligação Clq de um anticorpo pode ser alterada fornecendo um anticorpo com um domínio CH2 alterado no qual pelo menos um dos resíduos de aminoácido 318, 320, e 322 da cadeia pesada foi trocado por um resíduo contendo uma cadeia lateral diferente. A numeração dos resíduos na cadeia pesada é a do index EU (ver Kabat et al., supra). Outras alterações convenientes para alterar, e.g., reduzir ou abolir a ligação de Clq a um anticorpo incluem mudar qualquer um dos resíduos 318 (Glu), 320 (Lys) e 322 (Lys) para Ala.

Além disso, fazendo mutações nestes resíduos, mostrou-se que a ligação de Clq é retida, desde que o resíduo 318 tenha uma cadeia lateral com ligação de hidrogénio e os resíduos 320 e 322, ambos tenham uma cadeia lateral carregada positivamente. A actividade de ligação de Clq pode ser abolida substituindo qualquer dos três resíduos especificados por um resíduo tendo uma funcionalidade inapropriada na sua cadeia lateral. Não é necessário substituir os resíduos iónicos só por Ala para abolir a ligação de Clq. Também é possível usar outros resíduos alquil-substituídos não-iónicos, tais como Gly, Ile, Leu, ou Vai ou resíduos 79 ΡΕ1613347 aromáticos não polares tais como Phe, Tyr, Trp e Pro no lugar de qualquer dos três resíduos para abolir a ligação de Clq. Além disso, também é possível usar resíduos não iónicos polares tais como Ser, Thr, Cys, e Met no lugar dos resíduos 320 e 322, mas não 318, para abolir a actividade de ligação de Clq.

Também é de notar que as cadeias laterais em resíduos iónicos ou não iónicos polares serão capazes de formar ligações de hidrogénio de um modo semelhante às ligações formadas pelo resíduo Glu. Por isso, substituição do resíduo 318 (Glu) por um resíduo polar pode modificar mas não abolir a a actividade de ligação de Clq.

Também é conhecido que substituir o resíduo 297 (Asn) por Ala resulta na remoção de actividade lítica, reduzindo só ligeiramente (cerca de três vezes mais fraca) a afinidade para Clq. Esta alteração destrói o sítio de glicosilação e a presença de hidrato de carbono que é requerida para a activação do complemento. Qualquer outra substituição neste sítio também destruirá o sítio de glicosilação. A invenção também fornece um anticorpo possuindo uma função efectora alterada em que o anticorpo tem uma região charneira modificada. A região charneira modificada pode compreender uma região charneira completa derivada de um anticorpo de classe de anticorpo diferente ou subclasse da do domínio CHI. Por exemplo, o domínio constante (CHI) 80 ΡΕ1613347 de um anticorpo classe IgG pode ser ligado a uma região charneira de um anticorpo de classe IgG4. Alternativamente, a nova região charneira pode abranger parte de uma charneira natural ou uma unidade de repetição na qual cada unidade no repetido é derivada de uma região charneira natural. Num exemplo, a região charneira natural é alterada convertendo um ou mais resíduos de cisteína num resíduo neutro, tal como alanina, ou convertendo resíduos convenientemente situados em resíduos de cisteína. Estas alterações são realizadas usando química de proteínas reconhecida na área e, preferivelmente técnicas de engenharia genética, tal como aqui descritas.

Numa implementação da invenção, o número de resíduos de cisteína na região charneira do anticorpo é reduzido, por exemplo a um resíduo de cisteína. Esta modificação tem a vantagem de facilitar a montagem do anticorpo, por exemplo, moléculas de anticorpo biespe-cíficas e moléculas de anticorpo em que a porção Fc foi substituída por uma molécula efectora ou repórter, já que só é necessário formar uma única ligação dissulfureto. Esta modificação também providencia um alvo específico para ligar a região charneira ou a outra região charneira ou a uma molécula efectora ou repórter, directa ou indirec-tamente, por exemplo através de meios químicos.

Inversamente, o número de resíduos de cisteína na região charneira do anticorpo é aumentado, por exemplo, pelo menos um mais do que o número de resíduos de cisteína 81 ΡΕ1613347 que ocorrem normalmente. 0 aumento do número de resíduos de citeína pode ser usado para estabilizar as interacções entre charneiras adjacentes. Outra vantagem desta modificação é que facilita o uso de grupos tiol cisteína para ligar moléculas efectoras ou repórter ao anticorpo alterado, por exemplo um marcador radioactivo.

De acordo com isto, a invenção prevê uma permuta de regiões charneira entre classes de anticorpos, em particular, classes IgG e/ou um aumento ou diminuição no número de resíduos de cisteína na região charneira para atingir uma função efectora alterada (ver por exemplo Patente U.S No. 5,677,425. Uma determinação da função efectora do anticorpo alterada é feita usando os ensaios descritos aqui ou outras técnicas reconhecidas na área.

Um ponto importante, o anticorpo resultante pode ser submetido a um ou mais ensaios para avaliar qualquer modificação na actividade biológica em comparação com o anticorpo de partida. Por exemplo, a capacidade do anticorpo com uma região Fc alterada para se ligar ao complemento ou a receptores Fc pode ser avaliada usando os ensaios revelados aqui assim como qualquer outro ensaio reconhecido no meio. A produção dos anticorpos da invenção é levada a cabo por quaiquer técnicas covenientes incluindo técnicas descritas aqui assim como técnicas conhecidas dos especialistas na matéria. Por exemplo uma sequência de 82 ΡΕ1613347 proteínas apropriada, e.g., formando parte ou todo de um domínio constante relevante, e.g., região Fc, i.e., domínio (s) CH2 e/ou CH3 de um anticorpo, e incluem apropriadamente resíduo (s) alterados, pode ser sintetizada e depois quimicamente unida no local apropriado numa molécula de anticorpo.

Preferivelmente, são usadas técnicas de engenharia genética para produzir um anticorpo alterado. Técnicas preferidas incluem, por exemplo, preparar iniciadores convenientes para uso em amplificação em cadeia por polimerase (PCR) de tal modo que uma sequência de DNA que codifica pelo menos parte de uma cadeia pesada de IgG, e.g., uma região Fc ou constante (e.g., CH2, e/ou CH3) está alterada, em um ou mais resíduos. 0 segmento pode então ser ligado operacionalmente à porção restante do anticorpo, e.g., a região variável do anticorpo e elementos reguladores necessários para a expressão numa célula. A presente invenção também inclui vectores usados para transformar a linha celular, vectores usados na produção de vectores transformantes, linhas celulares transformadas com os vectores transformantes, linhas celulares transformadas com vectores preparativos e métodos para a sua produção.

Preferivelmente, a linha celular que é transformada para produzir o anticorpo com uma região Fc 83 ΡΕ1613347 alterada (í.e. de função efectora alterada) é uma linha celular de mamífero imortalizada (e.g., células CHO).

Embora a linha celular usada para produzir o anticorpo com uma região Fc alterada seja preferivelmente uma linha celular de mamífero, pode ser usada alternativamente qualquer outra linha celular conveniente, tal como uma linha celular bacteriana ou uma linha celular de levedura. B. Ácidos Nucleicos que Codificam Agentes Imunolóqicos e Terapêuticos

Respostas imunes contra depósitos amilóides também podem ser induzidas por administração de ácidos nucleicos que codificam anticorpos e as suas cadeias componentes usadas para imunização passiva. Estes ácidos nucleicos podem ser DNA ou RNA. Um segmento de ácido nucleico que codifica um imunogénio está tipicamente ligado a elementos reguladores, tais como um promotor e um "potenciador", que permitem a expressão do segmento de DNA na célula alvo pretendida de um doente. Para expressão em células sanguíneas, como é desejável para indução de uma resposta imune, elementos promotores e potenciadores de genes de imunoglobulina da cadeia leve ou pesada ou o promotor e potenciador precoce imediato principal de CMV (citomegalovirus) são convenientes para dirigir a expressão. Os elementos reguladores ligados e as sequências codificadoras são, muitas vezes, clonados num vector. Para 84 ΡΕ1613347 administração de anticorpos de cadeia dupla, as duas cadeias podem ser clonadas no mesmo vector ou em vectores separados.

Estão disponíveis numerosos sistemas de vectores virais incluindo sistemas retrovirais (ver, e.g., Lawrie e Tumin, Cur. Opin. Genet. Develop. 3: 102-109 (1993); vectores adenovirais (ver, e.g., Bett et al., J. Virol. 67:5911 (1993); vectores de virus adeno-associados (ver, e.g.,., Zhou et al., J. Exp. Med. 179:1867 (1994)), vectores virais da família pox incluindo virus da vaccinia e os vírus pox aviários, vectores virais do género alfa virus tais como os derivados de virus Sindbis e Semliki Forest (ver, e.g., Dubensky et al., J. Virol. 70:508 (1986)), virus da encefalite equina venezuelana (ver Johnston et al., US 5, 643, 576) e rabdovirus, tal como o virus da estomatite vesicular (ver Rose, WO 96/34625) e virus do papiloma (Ohe et al., Human Gene Therapy 6:325 (1995); WO 94/12629 e Xiao & Brandsma, Nucleic Acids. Res. 24, 2630-2622 (1996)). DNA que codifica um imunogénio, ou um vector contendo o mesmo, pode ser empacotado em lipossomas. Lí-pidos convenientes e análogos relacionados estão descritos por Eppstein et al., US 5,208,036, Felgner et al., US 5,264,618, Rose, US 5,279, 833 e Epand et al., US 5, 283, 185. Vectores e DNA que codifica um imunogénio podem também ser adsorvidos a ou associados com veículos apropriados, exemplos dos quais incluem polímeros de metacrilato de 85 ΡΕ1613347 polimetilo e polilactidos e poli (lactido-co-glicolidos), ver,e.g., McGee et al., J. Micro Encap. (1996).

Vectores de terapia genética ou polipéptidos nús (e.g., DNA) podem ser distribuídos in vivo por administração a um doente individual, tipicamente por administração sitémica (e.g.,intravenosa, intraperitoneal, nasal, gástrica, intradermal, intramuscular, subdermal ou infusão intracranial) ou aplicação tópica (ver e.g., Anderson et al., US 5, 399, 346). 0 termo "polinucleótido nú" refere-se a um polinucleótido não complexado com materiais coloidais. Polinucleótidos nús são por vezes clonados num vector plasmídico. Estes vectores podem ainda incluir agentes facilitantes tais como bupivacina (Attardo et al., US 5, 593, 970) . O DNA também pode ser administrado usando uma "gene gun". Ver Xiao & Brandsma, supra. O DNA que codifica um imunogénio é precipitado sobre a superfície de contas de metal microscópicas. Os microprojecteis são acelerados com uma onda de choque ou expandindo gas helium e penetram tecidos com uma profundidade de várias camadas. Por exemplo, AccelTM Gene Delivery Device fabricado por Agacetus, Inc. Middleton WI é conveniente. Alternativamente, DNA nú pode passar através da pele para a corrente sanguínea simplesmente passando o DNA na pele através de irritação química ou mecânica (ver Howell et al. WO 95/05853) .

Numa variação adicional, vectores que codificam imunogénios podem ser distribuídos a células ex vivo, tais 86 ΡΕ1613347 como células explantadas de um doente individual (e.g., linfócitos, aspirados de medula óssea, biópsias de tecido) ou células estaminais de dador universal, seguidas de reimplatação das células num doente, normalmente após selecção de células que incorporaram o vector. II. Usos Profilácticos e Terapêuticos A presente invenção é dirigida inter alia para o tratamento de doença de Alzheimer e outras doenças amiloidogénicas por administração de reagentes imunológicos terapêuticos (e.g., imunoglobulinas humanizadas) para epitopos específicos em Αβ, a um doente em condições que geram uma resposta terapêutica benéfica num doente (e.g., indução de fagocitose de Αβ, redução da sobrecarga de placa, inibição da formação de placa, redução de distrofia neurítica, melhoria da função cognitiva e/ou reverter, tratar ou evitar o declínio cognitivo) no doente, por exemplo, para a prevenção ou tratamento de doenças amiloidogénicas. A invenção também é dirigida para uso dos reagentes imunológicos revelados (e.g., imunoglobulinas humanizadas) na produção de um medicamento para o tratamento ou prevenção de doença amiloidogénica. 0 termo "tratamento" como aqui usado, é definido como a aplicação ou administração de um agente terapêutico a um doente, ou aplicação ou administração de um agente terapêutico a um tecido isolado ou linha celular de um doente, que tem uma doença, um sintoma de doença ou uma 87 ΡΕ1613347 predesposição para uma doença, com o propósito de curar, tratar, aleviar, libertar, alterar, remediar, melhorar ou afectar a doença, os sintomas de doença ou a predesposição para a doença.

Num aspecto, a invenção fornece anticorpos para uso na prevenção ou tratamento de uma doença associada com depósitos amilóides de Αβ no cérebro de um doente. Estas doenças incluem doença de Alzheimer, síndroma de Down e deterioração cognitiva. Esta última pode ocorrer com ou sem outras características de uma doença amiloidogénica. A última pode ocorrer com ou sem outras características de uma doença amiloidogénica. Alguns métodos da invenção acarretam a administração ao doente de uma dose efectiva de um anticorpo que se liga especificamente a um componente de um depósito amilóide. Estes usos são particularmente úteis para prevenir ou tratar doença de Alzheimer em doentes humanos. Métodos exemplares implicam a administração de uma dose efectiva de um anticorpo que se liga a Αβ. Usos preferidos implicam a administração de uma dose efectiva de um anticorpo que se liga especificamente a um epitopo nos resíduos 1-10 de Αβ, por exemplo, anticorpos que se ligam especificamente a epitopo entre os resíduos 1-3 de Αβ, anticorpos que se ligam especificamente a um epitopo entre os resíduos 1-4 de Αβ , anticorpos que se ligam especificamente a um epitopo entre os resíduos 1-5 de Αβ, anticorpos que se ligam especificamente a um epitopo entre os resíduos 1-6 de Αβ, anticorpos que se ligam especificamente a um epitopo entre os resíduos 1-7 de Αβ, ou anticorpos que se ligam especificamente a um epitopo entre os resíduos 3-7 ΡΕ1613347 de Αβ. Num outro aspecto ainda, a invenção representa administrar anticorpos que se ligam a um epitopo que compreende um resíduo N-terminal livre de Αβ. Noutro aspecto ainda, a invenção representa administrar anticorpos que se ligam a um epitopo entre os resíduos 1-10 de Αβ em que o resíduo 1 e/ou o resíduo 7 de Αβ é ácido aspártico. Num outro aspecto ainda, a invenção representa administrar anticorpos que se ligam especificamente ao péptido Αβ sem se ligar à proteína precursora amilóide de comprimento total (APP). Noutro aspecto ainda, o isótopo do anticorpo é IgGl humana.

Noutro aspecto ainda, a invenção representa administrar anticorpos que se ligam a um depósito amilóide no doente e induzir uma resposta depurativa contra o depósito amilóide. Por exemplo, uma resposta depurativa deste tipo pode ser efectuada por fagocitose mediada por receptor Fc.

Agentes terapêuticos da invenção são tipicamente substancialmente puros de contaminantes não desejados. Isto significa que um agente é tipicamente pelo menos cerca de 50% peso/peso de pureza, assim como substancialmente livre de proteínas interferentes e contaminantes. Por vezes os agentes são pelo menos 80% peso/peso e, mais preferivelmente pelo menos 90 ou cerca de 95% p/p de pureza. No entanto, usando técnicas convencionais de purificação de proteínas, podem ser obtidos péptidos homogéneos de cerca de 99% p/p. O tratamento pode ser usado nos doentes assin- 89 ΡΕ1613347 tomáticos e nos que mostram actualmente sintomas de doença. Os anticorpos usados podem ser humanizados ou quiméricos, ou fragmentos destes (e.g., fragmentos de ligação ao antigénio)como aqui descrito. Num outro aspecto ainda a invenção representa administrar anticorpos preparados a partir de um humano imunizado com péptido Αβ, o qual humano pode ser o doente a ser tratado com o anticorpo.

Noutro aspecto, a invenção representa administrar um anticorpo com um veiculo farmacêutico, na forma de uma composição farmacêutica. Alternativamente, o anticorpo pode ser administrado a um doente, administrando um polinu-cleótido que codifica pelo menos uma cadeia de anticorpo. 0 polinucleótido é expresso para produzir a cadeia de anticorpo no doente. Opcionalmente, o polinucleótido codifica cadeias pesada e leve do anticorpo. 0 polinucleótido é expresso para produzir as cadeias leve e pesada no doente. Em implementações exemplares, o doente é monitorizado para o nivel de anticorpo administrado, no sangue do doente.

Assim, a invenção cumpre uma necessidade de longa data para regimes terapêuticos para evitar ou melhorar a neuropatologia e, nalguns doentes, a deterioração cognitiva associada com a doença de Alzheimer. A. Doentes Indicados para Tratamento

Os doentes indicados para o tratamento incluem indivíduos em risco da doença mas que não apresentam 90 ΡΕ1613347 sintomas, assim como doentes que apresentam presentemente sintomas. No caso da doença de Alzheimer, praticamente qualquer pessoa está em risco de sofrer de doença de Alzheimer se ele ou ela viverem durante tempo suficiente. Assim, os presentes métodos podem ser administrados profi-lacticamente à população geral sem necessidade de avaliação de risco do doente sujeito. Os métodos presentes são especialmente úteis para indivíduos que têm risco genético conhecido de doença de Alzheimer. Estes indivíduos incluem os que têm familiares que experimentaram esta doença e aqueles cujo risco é determinado por análise de marcadores genéticos ou bioquímicos. Marcadores genéticos de risco para doença de Alzheimer incluem mutações no gene APP, particularmente mutações na posição 717 e posições 670 e 671 referidas como mutações Hardy e Suecas respectivamente (ver Hardy, supra) . Outros marcadores de risco são mutações nos genes da presenilina, PSl e PS2, e ApoE4, história familiar de doença de Alzheimer, hipercolesterolemia ou aterosclerose. Indivíduos que sofrem presentemente de doença de Alzheimer podem ser reconhecidos por demência característica, assim como a presença de factores de risco descritos acima. Além disso, estão disponíveis testes diagnósticos paera identificar indivíduos que têm doença de Alzheimer. Estes incluem medida dos níveis de CSF tau e Αβ42. Níveis elevados de tau e diminuídos de Αβ42 significam a presença de doença de Alzheimer. Indivíduos que sofrem de doença de Alzheimer também podem ser diagnosticados por critérios ADRDA como discutido na secção dos Exemplos. 91 ΡΕ1613347

Em doentes assintomáticos, o tratamento pode começar em qualquer idade (e.g., 10, 20, 30). Normalmente, no entanto, não é necessário começar o tratamento até que um doente atinja 40, 50, 60 ou 70. O tratamento tipicamente acarreta doses múltiplas durante um período de tempo. O tratamento pode ser monitorizado ensaiando os níveis de anticorpo ao longo do tempo. Se a resposta decai, é indicada uma dose suplementar. No caso de doentes potências com síndrome de Down, o tratamento pode começar pré-natal por administração do agente terapêutico à mãe ou pouco tempo após o nascimento. B. Regimes de Tratamento e Doses

Em aplicações profilácticas, as composições farmacêuticas ou medicamentos são administradas a um doente susceptível de, ou de outro modo em risco de doença de Alzheimer, numa quantidade suficiente para eliminar ou reduzir o risco, diminuir a severidade ou atrasar o início da doença, incluindo sintomas bioquímicos, histológicos e/ou comportamentais, as suas complicações e fenótipos patológicos intermediários que se apresentem durante o desenvolvimento da doença. Em aplicações terapêuticas , composições ou medicamentos são administrados a um doente suspeito de, ou já a sofrer de uma doença deste tipo numa quantidade suficiente para curar, ou pelo menos parar parcialmente deter, os sintomas da doença (bioquímicos, histológicos e/ou comportamentais), incluindo as suas 92 ΡΕ1613347 complicações e fenótipos patológicos intermediários no desenvolvimento da doença.

Nalguns usos, a administração do agente reduz ou elimina a deterioração miocognitiva em doentes que ainda não desenvolveram patologia de Alzheimer caracteristica. Uma quantidade adequada para conseguir um tratamento terapêutico ou profiláctico é definida como dose terapeu-ticamente ou profilacticamente efectiva. Em ambos regimes profilácticos e terapêuticos, os agentes são normalmente administrados em várias doses até que tenha sido atingida uma resposta imunitária suficiente. 0 termo "resposta imunitária" ou "resposta imunulógica" inclui o desenvolvimento de uma resposta humoral (mediada por anticorpos) e/ou celular (mediada por células T especificas de antigénio ou os seus produtos de secreção) dirigida contra um antigénio num imdividuo recipiente. Uma resposta deste tipo pode ser uma resposta activa, í.e. induzida por administração de imunogénio, ou uma resposta passiva, i.e., induzida por administração de imunoglobulina ou anticorpo ou células T estimuladas.

Um agente imunogénico" ou "imunogénio" é capaz de induzir uma resposta imunitária contra si próprio pela administração a um mamífero, opcionalmente em conjunção com um adjuvante. Tipicamente, a resposta imune é monitorizada e são dadas doses repetidas se a resposta imunitária começa a diminuir. 93 ΡΕ1613347

Doses efectivas das composições da presente invenção, para o tratamento das condições acima descritas variam dependendo de vários factores, incluindo meios de administração, local alvo, esta do fisiológico do doente, quer o doente seja humano ou um animal, outra medicação administrada, e se o tratamento é profiláctico ou terapêutico. Normalmente, o doente é um humano mas mamíferos não humanos, incluindo mamíferos transgénicos também podem ser tratados. As doses de tratamento têm que ser tituladas para optimizar a segurança e a eficácia.

Para imunização passiva com um anticorpo, a dose varia de cerca de 0,0001 a 100 mg/kg e mais habitualmente 0,01 a 5 mg/kg de peso corporal do hospedeiro. Por exemplo doses podem ser 1 mg/kg de peso corporal ou 10 mg/kg de peso corporal ou no intervalo de 1-10 mg/kg, preferivelmente pelo menos 1 mg/kg. Estas doses podem ser administradas aos indivíduos diariamente, em dias alternados, semanalmente ou de acordo com qualquer outro programa determinado por análise empírica. Um tratamento exemplo implica administração em doses múltiplas por um período prolongado, por exemplo de pelo menos seis meses. Regimes de tratamentos exemplo adicionais implica a administração uma vez por semane, duas semanas ou uma vez por mês ou uma vez de três em três, a seis em seis meses. Programas de dose exemplo incluem 1-10 mg/kg ou 15 mg/kg em duas consecutivos, 30 mg/kg em dias alternados ou 60 mg/kg semanalmente. Nalguns métodos, dois ou mais anticorpos mono-clonais com especificidades de ligação diferentes são admi- 94 ΡΕ1613347 nistrados simultâneamente, caso em que a dose de cada anticorpo administrado se encontra nos intervalos indicados. 0 anticorpo é normalmente administrado em ocasiões múltiplas. Os intervalos entre as doses individuais podem ser semanais, mensais ou anuais. Os intervalos também podem ser irregulares por indicação da medida dos níveis do sangue de anticorpo para Αβ no doente. Nalguns métodos a dose é ajustada para atingir uma concentração de anticorpo no plasma de 1-1000 yg/ml e nalguns métodos 25-300 yg/ml. Alternativamente o anticorpo pode ser administrado com uma fórmula de libertação contínua, sendo neste caso requerida administração menos frequente. A dose e a frequência variam dependendo da meia-vida do anticorpo no doente. Em geral anticorpos humanos apresentam a meia-vida mais longa, seguidos dos anticorpos humanizados, anticorpos quiméricos e anticorpos não humanos. A dose e a frequência de adminitração podem variar dependendo de se o tratamento é profiláctico ou terapêutico. Em aplicações profilácticas as composições contendo os anticorpos presentes ou um cocktail destes são administrados não num estado já de doença para aumentar a resistência do doente. Uma quantidade destas é definida como uma "dose efectiva profiláctica". Neste uso, as quantidades precisas dependem de novo do estado de saúde do doente e imunidade geral, mas gralmente variam entre 0,1 a 25 mg por dose, especialmente 0,5 a 2,5 mg por dose. Uma dose relativamente baixa é administrada em intervalos 95 ΡΕ1613347 relativamente infrequentes por um longo período de tempo. Alguns doentes continuam a receber tratamento para o resto das suas vidas.

Em aplicações terapêuticas, é às vezes requerida uma dose relativamente elevada (e.g., de cerca de 1 a 200 mg de anticorpo por dose, sendo usadas doses de cerca de 5 a 25 mg mais habitualmente)em intervalos relativamente curtos até que a progressão da doença seja reduzida ou terminada, e, preferivelmente até que o doente apresente melhoria parcial ou completa dos sintomas da doença. A partir daí pode ser administrtado ao doente um regime profiláctico.

Doses para ácidos nucléicos que codificam anticorpos variam de cerca de 10 ng a 1 ng, 100 ng a 100 mg, 1 yg a 10 mg, ou 30-300 yg de DNA ppor doente. Doses para infecções com vectores virais variam de 10-100, ou mais viriões por dose.

Agentes terapêuticos podem ser administrados por via parental, tópica, intravenosa, oral, subcutânea, intra-arterial, intracranial, intraperitoneal, intranasal ou intramuscular para tratamento profiláctico e/ou terapêutico. A via de administração mais típica de um agente imunogénico é subcutânea embora outras vias possam ser igualmente efectivas. A via seguinte mais comum de administração é a injecção intramuscular. Este tipo de injecção é mais tipicamente realizada nos músculos do braço ou da 96 ΡΕ1613347 perna. Nalguns métodos os agentes são injectados directa-mente num tecido particular onde se acumularam depósitos, por exemplo injecção intracranial. Injecção intramuscular ou infusão intravenosa são preferidos para administração de anticorpo. Nalguns métodos, anticorpos terapêuticos particulares são injectados directamente no crânio. Nalguns métodos os anticorpos são administrados como uma composição ou dispositivo de libertação continua, tal como um dispositivo Medipad™ .

Os agentes da invenção podem ser opcionalmente administrados em combinação com outros agentes que são, pelo menos parcialmente efectivos no tratamento de doença amiloidogénica. No caso de de doença de Alzheimer e síndroma de Down, nos quais ocorrem depósitos amilóides no cérebro, agentes da invenção também podem ser administrados em conjunção com outros agentes que aumentam a passagem dos agentes da invenção através da barreira sangue-cérebro. C.Composições Farmacêuticas

Os agentes da invenção são muitas vezes administrados na forma de composições na forma de composições farmacêuticas que compreendendo um agente terapêutico activo, e uma variedade de outros componentes aceitáveis do ponto de vista farmacêutico. Ver Remington's Pharmaceutical Science (15th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania (1980) ) . A forma preferida depende do modo de administração pretendido e aplicação terapêutica. As 97 ΡΕ1613347 composições também podem incluir, dependendo da formulação desejada, veículos ou diluentes não tóxicos, aceitáveis do ponto de vista farmacêutico, que são definidos como veículos usados normalmente para formular composições farmacêutcas para administração animal ou humana. 0 diluente é seleccionado de modo a não afectar a actividade biológica da combinação. Exemplos destes diluentes são água destilada, solução salina tamponada de fosfato fisiológica, soluções de Ringer, solução de dextrose e solução de Hank. Além disso, a composição farmacêutica ou formulação pode também incluir outros veículos, adjuvantes ou estabilizadores não-tóxicos, não-terapêuticos, não imunogénicos e afins.

Composições farmacêuticas também podem incluir macromoléculas grandes, de metabolização lenta tais como proteínas, polisacáridos tais como quitosano, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos e copolímeros (tais como sepharose funcionalizada com latex (TM),agarose, celulase e afins, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos e agregados lipídicos (tais como gotícula de óleo ou lipossomas). Adicionalmente, estes veículos podem funcionar como agentes imunostimulantes (i.e. adjuvantes).

Para administração parenteral, os agentes da invenção podem ser administrados como doses injectáveis de uma solução ou suspensão da substância num diluente fisiologicamente aceitável com um veículo farmacêutico que pode ser um líquido estéril tal como água, óleos, solução 98 ΡΕ1613347 salina, glicerol, ou etanol. Adicionalmente, substâncias auxiliares tais como agentes humidificantes ou emulsio-nantes, tensioactivos, substâncias tamponadoras de pH e afins podem estar presentes em composições. Outros componentes de composições farmacêuticas são petróleo de origem animal, vegetal ou sintética, por exemplo, óleo de amendoim, óleo de soja, e óleo minaral. Em geral glicóis tais como propilenoglicol ou polietilenoglicol são veículos líquidos preferidos, particularmente para soluções injec-táveis. Anticorpos podem ser administrados na forma de uma injecção depósito ou preparação de implante, que pode ser formulada de modo a permitir uma libertação contínua do ingrediente activo. Uma composição exemplar compreende anticorpo a 5 mg/ml, formulada em tampão aquoso consistindo em L-histidina 50 mM, NaCl 150 mM, ajustado a pH 6,0 com HC1.

Tipicamente, as composições são preparadas como injectáveis, como soluções líquidas ou suspensões; também podem ser preparadas formas sólidas convenientes para solução em, ou suspensão em veículos líquidos antes da injecção. A preparação também pode ser emulsionada ou encapsulada em lipossomas ou micropartículas tais como polilactido, poliglicólido ou copolímero para efeitos adjuvantes aumentados como discutido acima (ver Langer, Science 249: 1527 (1990) e Hanes, Advanced Drug Delivery Reviews 28:97 (1997)). Os agentes desta invenção podem ser administrados na forma de injecção de depósito ou preparação de implante, que pode ser formulada de tal modo 99 ΡΕ1613347 a permitir uma libertação continua ou pulsátil do ingrediente activo.

Formulações adicionais convenientes para outros modos de administração incluem formulações orais, intra-nasais e pulmonares, supositórios e aplicações transdér-micas. Para supositórios, aglutinantes e veículos incluem, por exemplo polialquilenoglicóis ou triglicéridos; estes supositórios podem ser formados a partir de misturas contendo o ingrediente activo no intervalo de 0,5% a 10%, preferivelmente l%-2%. Formulações orais incluem exci-pientes, tais como graus farmacêuticos de manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina de sódio, celulose e carbonato de magnésio. Estas composições tomam a forma de soluções, suspensões, comprimidos, pilulas, cápsulas, formulações de libertação continua ou pós e contêm 10%—95% de ingrediente activo, preferivelmente 25%-70%.

Aplicação tópica pode resultar em distribuição trandermal ou intradermal. A administração tópica pode ser faciliatad por co-administração do agente com toxina da cólera ou derivados destoxifiçados ou subunidades destes ou outras toxinas de bactérias semelhantes (ver Glenn et al., Nature 391, 851 (1998)). Co-administração pode ser atingida usando os componentes como uma mistura ou como moléculas ligadas obtidas por crosslinkinkg químico ou expressão como uma proteína de fusão. 100 ΡΕ1613347

Alternativamente, a distribuição trandermal pode ser atingida usando uma via dermatológica ou usando transferossomas (Paul et al., Eur. J. Immunol. 25: 3521 (1995); Ceve et al., Biochem. Biophys. Acta 1368: 201-15 (1998) ) . III. Monitorização do Decurso do Tratamento A invenção fornece métodos para monitorizar o tratamento de um doente que sofra ou seja susceptível para Alzheimer, i.e. para monitorizar o decurso do tratamento que está a ser administrado ao doente. Os métodos podem ser usados para monitorizar ambos o tratamento terapêutico em doentes sintomáticos e o tratamento profiláctico em doentes assintomáticos. Em particular, os métodos são úteis para monitorizar imunização passiva (e.g., medindo o nível de anticorpo administrado).

Alguns métodos implicam determinar um valor de base, por exemplo, de um nível de anticorpo ou perfil num doente, antes de administrar uma dose de um agente e comparar este com um valor para o perfil ou nível após o tratamento. Um aumento significativo (i.e. maior do que a margem típica de erro experimental em medições repetidas da mesma amostra, , expressa como um desvio padrão da média destas medições) no valor do nível ou perfil sinaliza um resultado positivo do tratamento (i.e., que a administração do agente atingiu uma resposta desejada). Se o valor para a 101 ΡΕ1613347 resposta imunitária não se alterar significativamente, ou diminui, é indicado um resultado negativo.

Noutros métodos, um valor controlo (í.e., uma média e desvio padrão) de nível ou perfil é determinado para uma polulação controlo. Tipicamente os indivíduos na população controlo não receberam tratamento anterior. Valores medidos do nível ou perfil num doente após administração de um agente terapêutico são então comparadas com o valor controlo. Um aumento significativo relativamente ao valor controlo (e.g., maior do que um desvio padrão da média) sinaliza um resultado positivo ou de suficiente tratamento. A ausência de um aumento significativo ou uma diminuição sinaliza um resultado negativo ou de insuficiente tratamento. Administração de agente é geralmente continuada enquanto o nível está a aumentar relativamente ao valor controlo. Como anteriormente, consecução de um plateau relativamente a valores controlo é um indicador de que a administração de tratamento pode ser suspendida ou reduzida em dose e/ou frequência.

Noutros métodos, um valor controlo do nível ou perfil (e.g., uma média e desvio padrão) é determinado de uma população controlo de indivíduos que foram submetidos a tratamento com um agente terapêutico e cujos níveis ou perfis atingiram um plateau em resposta ao tratamento. Valores medidos de níveis ou perfis num doente são comparados com o valor controlo. Se o valor medido num 102 ΡΕ1613347 doente não for significativamente diferente (e.g., mais do que um desvio padrão) do valor controlo, o tratamento pode ser suspendido. Se o nivel num doente estiver sensivelmente abaixo do valor controlo, a administração continuada do agente é garantida. Se o nível no doente persistir abaixo do valor controlo, então pode ser indicada uma modificação no tratamento.

Noutros métodos, um doente que não está presentemente a receber tratamento, mas foi sumetido a um curso anterior de tratamento, é monitorizado para níveis de anticorpo ou perfis, para determinar se é requerida um recomeço de tratamento. O nível medido ou perfil no doente pode ser comparado com um valor previamente atingido no doente após um curso de tratamento anterior. Uma diminuição significativa relativamente à medição anterior (í.e. maior do que uma margem típica de erro em medições repetidas da mesma amostra) é uma indicação de que o tratamento pode ser recomeçado. Alternativamente, o valor medido num doente pode ser comparado com um valor controlo (média mais desvio padrão) determinado numa população de doentes após terem sido sumetidos a um curso de tratamento. Alternativamente, o valor medido num doente pode ser comparado com um valor controlo em populações de doentes tratados profilac-ticamente que permanecem livre de sintomas de doença, ou populações de doentes terapeuticamente tratados que apresentam melhoria das características da doença. Em todos estes casos, uma diminuição significativa em relação aos 103 ΡΕ1613347 níveis controlo 8i.e. mais do que um desvio padrão) é um indicador de que o tratamento deve ser retomado num doente. A amostra de tecido para análise é tipicamente sangue, plasma, soro, fluído de muco ou fluído cerebrospinal do doente. A amostra é analisada, por exemplo, quanto aos níveis ou perfis de anticorpos para o péptido Αβ, e.g., níveis ou perfis de anticorpos humanizados. Os métodos de ELISA para detectar anticorpos específicos para Αβ são descritos na secção dos Exemplos. Nalguns métodos, o nível ou perfil de um anticorpo administrado é determinado usando um ensaio de depuração, por exemplo, num ensaio de fago-citose in vitro, como aqui descrito. Nestes métodos, uma amostra de tecido de um doente a ser testado é posta em contacto com depósitos amilóides (e.g., de um ratinho PDAPP) e células fagociticas contendo receptores Fc. Subsequentemente a depuração do depósito amilóide é então monitorizada. A existência e extensão de resposta depurativa, fornece uma indicação da existência, e nivel de anticorpos efectivo para depurar Αβ, na amostra de tecido do doente sob teste. O perfil de anticorpo em seguimento à imunização passiva apresenta tipicamente um pico imediato na concentração de anticorpo seguido de um declínio exponencial. Sem uma dose adicional, o declínio aprroxima-se dos valores pretratamento num período de dias a meses dependendo da meia vida do anticorpo administrado. Por exemplo a meia 104 ΡΕ1613347 vida de alguns anticorpos humanos é na ordem de 20 dias.

Nalguns métodos, uma medida de base de anticorpo para Αβ no doente é feita antes da administração, uma segunda medida é feita pouco tempo depois para determinar o nivel de anticorpo de pico, e uma ou mais medições adicionais são realizadas em intervalos para monitorizar o declínio dos níveis de anticorpo. Quando o nível de anticorpo declinou para nível de base ou uma percentagem pré-determinada do pico menos nível de base (e.g., 50%, 25% ou 10%) é administrada uma dose adicional de anticorpo. Nalguns métodos, níveis pico ou subsequentemente medidos menos background são comparados com níveis de referência previamente determinados para constituir um regime profiláctico benéfico ou de tratamento terapêutico noutros doentes. Se o nível de anticorpo medido é significativamente menor do que um nível de referência (e.g., menos do que a Γη'dia menos um desvio padrão do valor de referência em população de doentes a beneficiar do tratamento) administração de uma dose adicional de anticorpo é indicada. Métodos adicionais incluem monitorizar, durante o decurso do tratamento, qualquer sintoma fisiológico reconhecido na área (e.g., sintoma físico ou mental) dependendo routinamente de investigadores ou médicos para diagnosticar ou monitorizar doenças amiloidogénicas (e.g., doença de Alzheimer). Por exemplo, pode monitorizar-se 105 ΡΕ1613347 deterioração cognitiva. A última é um sintoma de doença de Alzheimer e sindroma de Down mas também pode ocorrer sem outras caracteristicas de qualquer destas doenças. Por exemplo, deterioração cognitiva pode ser monitorizada determinando o resultado de um doente no mini exame de estado mental de acordo com convenção durante o decurso do tratamento.

Os seguintes exemplos não limitantes são somente para efeitos ilustrativos.

EXEMPLOS

Exemplo I. Eficácia Terapêutica de Anticorpos Anti-Αβ: mÃb 2H3, mAb 10D5, mAb 266, mAb 21F12 e pAb Αβ1-42

Este exemplo testa a capacidade de vários anticorpos monoclonais e policlonais para Αβ para inibir a acumulação de Αβ no cérebro de ratinhos heterozigóticos transgénicos A. Projecto do estudo

Sessenta machos e fêmeas, ratinhos transgénicos PDAPP heterozigóticos, de 8,5 a 10,5 meses de idade foram obtidos do Laboratório Charles River. Os ratinhos foram distribuídos em seis grupos a ser tratados com vários anticorpos dirigidos a Αβ. Os animais foram distribuídos, 106 ΡΕ1613347 tanto quanto possível para corresponder no sexo, idade, ascendência e fonte dos animais entre os grupos. A tabela 2 representa o projecto experimental.

Tabela 2: Projecto Experimental

Gripo de Tratamento tf Anticorpo de Tratamento Especificidade do Anticorpo Isotipo do Anticorpo 1 9 Nenhum (PBS só) NAb ΝΑ 2 10 Policlonal Αβ1-42 mistura 3 0 Mabd 2H3 Αβ1-12 IgGl 4 8 mAb 10D5 Αβ3-7 Igd 5 6 MAb 266 Αβ13-28 IgGl 6 8 MAb 21Π.2 Αβ33-42 IgG2a a. Número de ratinhos em grupo à terminação da eperiência. Todos os grupo começaram com 10 animais por grupo b. NA: não aplicável c. Policlonal de ratinho: anti-Ap42 agregado d. mAb: anticorpo monoclonal

Como se mostra na Tabela 2, os anticorpos incluíam quatro anticorpos monoclonais específicos para Αβ murinos, 2H3 (dirigidos para os resíduos 1-12 de Αβ), 10D5 (dirigido para os resíduos 3-7 de Αβ) , 266 (dirigido para os resíduos 13-28 e liga-se a AN1792 solúvel mas não ao agregado), 21F12 (dirigido para os resíduos 33-42 de Αβ) . Um quinto grupo foi tratado com um fracção de anticorpo policlonal específica para Αβ (criada por imunização com AN1792 agregado). O grupo controlo negativo recebeu o solvente PBS só, sem anticorpo. 107 ΡΕ1613347 B. Monitorização do Curso de Tratamento

Os anticorpos monoclonais foram injectados a uma dose de cerca de 10 mg/kg (assumindo que os ratinhos pesavam 50 g). Os títulos de anticorpo foram monitorizados durante as 28 semanas de tratamento. As injecções foram administradas intraperitonealmente de sete em sete dias em média para manter os títulos de anti-Αβ acima de 1000. Embora tenham sido medidos títulos mais baixos para mAb 266, já que este não se liga bem ao AN1792 agregado usado como antigénio de captura neste ensaio, foi mantido o mesmo programa de dose para este grupo. O grupo que recebeu o anticorpo monoclonal 2H3 foi suspendido nas primeiras três semanas já que o anticorpo era depurado com demasiada rapidez in vivo.

Para a determinação dos títulos de anticorpo, um subgrupo de três ratinhos escolhidos ao acaso de cada grupo foram sangrados mesmo antes de cada inoculação intrape-ritoneal, num total de 30 sangramentos. Os títulos de anticorpo foram medidos como anticorpo de ligação a Αβ1-42 usando um ELISA sandwich com placas multipoços de plástico revestidas com Αβ1-42 como descrito em detalhe em Materiais e Métodos Gerais. Os títulos médios para cada sangramento estão apresentados na Tabela 3 para o anticorpo policlonal e os monoclonais 10D5 e 21F12. ΡΕ1613347 108

Tabela 3:

Semanas 21F12 21F12 Semanas 10D5 10D5 Semanas poli poli 0,15 500 0,15 3000 0,15 1600 0,5 800 0,5 14000 0,5 4000 1 2500 1 5000 1 4500 1,5 1800 1,1 5000 1,5 3000 2 1400 1,2 1300 2 1300 3 6000 2 3000 3 1600 3,5 550 3 4000 3,5 650 4 1600 3,5 500 4 1300 5 925 4 2400 5 450 6 3300 5 925 6 2100 7 4000 6 1700 7 1300 8 1400 7 1600 8 2300 9 1900 8 4000 9 700 10 1700 9 1800 10 600 11 1600 10 1800 11 600 12 1000 11 2300 12 1000 13 1500 12 2100 13 900 14 1300 13 2800 14 1900 15 1000 14 1900 15 1200 16 1700 15 2700 16 700 17 1700 16 1300 17 2100 18 5000 17 2200 18 1800 19 900 18 2200 19 1800 20 300 19 2500 20 1200 22 1750 20 980 22 1000 23 1600 22 2000 23 1200 24 1000 23 1000 24 675 25 1100 24 850 25 850 26 2250 25 600 26 1600 27 1400 26 1100 27 1900 28 27 1450 28 28 109 ΡΕ1613347

Os títulos eram em média cerca de 1000 neste período de tempo para a preparação de anticorpo policlonal e eram ligeiramente acima deste nível para os animais tratados com 10D5 e 21F12. O tratamento foi continuado por um período de 6 meses para um total de 196 dias. Os animais foram eutanasiados uma semana após a dose final. C. Níveis de Αβ e APP no cérebro:

Após cerca de seis meses de tratamento com as várias preparações de anticorpo Αβ, os cérebros foram removidos dos animais seguidamente a perfusão salina. Um hemisfério foi preparado para análise imuno-histoquímica e o segundo foi usado para a quantificação dos níveis de Αβ e APP. Para medir as concentrações de várias formas de péptido beta amilóide e proteína precursora amilóide (APP), o hemisfério foi dissecado e foram preparados homogenatos das regiões hipocampal, cortical e cerebelar em guanidina 5M. Estes foram diluídos em série e o nível de péptido amilóide ou APP foi quantificado por comparação com uma série de diluições de padrões de péptido Αβ ou APP de concentrações conhecidas num formato ELISA. 110 ΡΕ1613347

Os níveis de Αβ total e Αβ1-42 medido por ELISA em homogenatos do córtex e do hipocampo e o nível de Αβ total no cerebelo estão apresentados nas tabelas 4, 5 e 6 respectivamente. A concentração mediana de Αβ total para o grupo controlo, inoculasdo com PBS era 3,6 vezes mais elevada no hipocampo do que no córtex (mediana de 63,389 ng/g no tecido hipocampal comparado com 17,818 ng/g para o córtex). O nível mediano no cerebelo do grupo controlo (30,6 ng/g de tecido) era mais do que 2 000 vezes mais baixa do que no hipocampo. Estes níveis são semelhantes aos reportados anteriormente para ratinhos transgénicos PDAPP heterozigóticos desta idade (Johnson-Wood et al., supra).

Para o córtex, um grupo de tratamento tinha um nível mediano de Αβ, medido como Αβ1-42, que diferia significativamente do do grupo controlo (p<0,05), recebendo esses animais o anticorpo policlonal anti-Αβ como se mostra na tabela 4. O nível mediano de Αβ1-42 era reduzido em %, comparado com o controlo para este grupo de tratamento. Os níveis medianos de Αβ1-42 também foram significativamente reduzidos de 55%, comparados com os controlo num grupo adicional de tratamento, animais tratados com o mAb (anticorpo monoclonal) 10D5 (p=0,0433). ΡΕ1613347 111

Tabela 4 CÓRTEX Grupo de Tratamento N3 Medianas Medias Αβ Total Αβ42 Αβ Total Αβ42 Valor13 ELISA Valor0 P %Varia- ção Valor ELISA ValorP %Varia- ção Valor ELISA Valor ELISA EBS 9 17818 NAd NA 13802 NA NA 16150+/- 7456 12621+/- 5738 Anti-Ap42 Policlonal 10 6160 0,0055 -65 4892 0,0071 -65 5912+/- 4492 4454+/- 3347 mAb 10D5 8 7915 0,1019 -56 6214 0,0433 -55 9695+/- 6929 6943+/- 3351 mAb 266 6 9144 0,1255 -49 8481 0,1255 -39 9204+/- 9293 7489+/- 6921 mab21F12 8 15158 0,2898 -15 13578 0,7003 -2 12481+/- 7082 11005+/- 6324 Notas: a. Número de animais por gripo no final da experiência b. ng/g de tecido c. Análise Mann Whitney d. NA: não aplicável e. Desvio Badrão

No hipocampo, a mediana da redução em percentagem de Αβ associada com tratamento com anticorpo Αβ policlonal (50%, p=0,0055) não foi tão grande como a observada no córtex (65%) (Tabela 5). No entanto, a magnitude da redução foi quase 3 vezes maior no hipocampo do que no córtex, uma redução liquida de 31 683 ng/g de tecido no hipocampo versus 11 658 ng/g de tecido no córtex. Quando medido como o nivel da forma mais amiloidogénica de Αβ, Αβ1-42 em vez 112 ΡΕ1613347 de Αβ total, a redução obtida com o anticorpo policlonal foi significativa (p=0,0025). Os niveis medianos em grupos tratados com os mAbs(anticorpos monoclonais)10D5 e 266 foram reduzidos de 33% e 21%, respectivamente.

Tabela 5 HIPOCAMPO Grupo de Tratamento tf* Medianas I#dias Αβ Total Αβ42 Αβ Total Αβ42 Vaiar*5 ELISA Valorc P %Varia- ção Valor ELISA ValorP %Varia- çao Valor ELISA Valor ELISA PBS 9 63389 NAd NA 54429 NA NA 58351+/- 13308® 52801+/- 14701 Anti-A342 Policlonal 10 31706 0,0055 -50 27127 0,0025 -50 30058+/- 22454 24853+/- 18262 mAb 10D5 8 46779 0,0675 -26 36290 0,0543 -33 44581+/- 18632 36465+/- 17146 mAb 266 6 48689 0,0990 -23 43034 0,0990 -21 36419+/- 27304 32919+/- 25372 mab21EL2 8 51563 0,7728 -19 47961 0,8099 -12 57327+/- 28927 50305+/- 23927 Notas: a. Número de animais por grupo no final da experiência b. ng/g de tecido c. Análise Nánn Whitney d. NA: não aplicável e. Desvio Padrão Αβ total foi também medida no cerebelo (Tabela 6). Os grupos doseados com o anticorpo policlonal anti-Αβ e 266 apresentaram reduções significativas dos niveis de Αβ total (43% e 46% p=0,0033 e p=0,0184, respectivamente) e o 113 ΡΕ1613347 grupo tratado com 10D5 teve uma redução quase significativa (29%, p=0,0675).

Tabela 6 CEREEED3 Grupo de tratamento N3 Medianas Médias Αβ Total Αβ Total Valor'3 ELISA Valorc P %Variação Valor ELISA PBS 9 30,64 Nad NA 40,00+/-31,890 Anti-Ap42 Policlonal 10 17,61 0,0033 -43 18,15+/-4,36 mAb 10D5 8 21,68 0,0675 -29 27,29+/-19,43 mAb 266 6 16,59 0,0184 -46 19,59+/-6,59 mab21F12 8 29,80 >0,9999 -3 32,88+/-9,90 Notas: a. Número de animais por grupo no final da experiência b. ng/g de tecido c. Análise Nbnn ífaLtney d. NA: não aplicável e.Desvio Padrão A concentração de APP também foi determinada por ELISA no córtex e cerebelo de ratinhos tratados anticorpo e controlos tratados com PBS. Foram utilizados dois ensaios APP diferentes. O primeiro, designado ΑΡΡ-α/FL (full length, comprimento total) reconhece APP-alfa (a, a forma secretada de APP que foi clivada na sequência Αβ) e formas de comprimento total(FL) de APP, enquanto a segunda reconhece somente APP-α. Em contraste com a diminuição de Αβ associada ao tratamento num subgrupo de tratamento, os níveis de APP permaneceram virtualmente sem modificação em todos os animais tratados comparados com os animais 114 ΡΕ1613347 controlo. Estes resultados indicam que a imunização com anticorpo Αβ reduzem Αβ sem reduzir APP.

Em resumo, os níveis de Αβ foram significativamente reduzidos no córtex, hipocampo e cerebelo em animais tratados com o anticorpo policlonal criado contra AN1792. Em menor extensão, anticorpos monoclonais para a região amino terminal de Αβ1-42, especificamente amino-ácidos 1-16 e 13-28 também apresentaram efeitos de tratamento significativos. D. Análises histoquímicas: A morfologia das placas Αβ imuno-reactivas em subgrupos de cérebros de ratinhos em grupos de tratamento PBS, Αβ42 policlonal, 21F12, 266 e 10D5 foi comparada qualitativamente com a de estudos prévios nos quais foram seguidos procedimentos de imunização Standard com Αβ42. A maior alteração na extensão e na aparência de placas amilóides ocorreu nos animais imunizados com o anticorpo Αβ42 policlonal. A redução de carga amilóide, morfologia de placa corroída e imuno-reactividade de Αβ associada a células assemelhava-se bastante aos efeitos produzidos pelo procedimento de imunização Standard. Estas observações apoiam os resultados do ELISA nos quais reduções significativas tanto no Αβ total como Αβ42 foram atingidos por administração de anticorpo policlonal Αβ42. 115 ΡΕ1613347

Em avaliações qualitativas semelhantes, picas amilóides no grupo 10D5 também foram reduzidas em número e aparência, com alguma evidência de imuno-reactividade Αβ associada às células. Em relação aos animais tratados controlo, a fracção Ig policlonal contra Αβ e um dos anticorpos monoclonais (10D5) reduziram a carga de placa em 93% e 81% respectivamente (p<0,005). 21F12 parecia ter um efeito relativamente modesto na carga de placa. Micrografos de cérebro após tratamento com pAbAβl-42 mostraram depósitos difusos e ausência de muitas das placas maiores, no grupo tratado com ρΑόΑβ1-42, em relação aos animais tratados com controlo. E. Respostas Linfoproliferativas A linfoproliferação dependente de Αβ foi medida usando células de baço colhidas oito dias após a infusão de anticorpo final. Células colhidas de fresco, 105 por poço, foram cultivadas durante 5 dias na presença de Αβ1-40 a uma concentração de 5μΜ para estimulação. Como controlo positivo, foram cultivados poços adicionais com o mitogénio de células T, PHA e, como controlo negativo, as células foram cultivadas sem adição de péptido. Células de baço de ratinhos PDAPP idosos imunizados passivamente com vários anticorpos anti-Αβ, foram estimulados in vitro com AN1792 e foram medidas as respostas proliferativa e de citoquinas. 0 objectivo destes ensaios era determinar se a imunização passiva facilitava a 116 ΡΕ1613347 apresentação de antigénio e, assim activação T específicas para AN1792. Não foram observadas respostas proliferativas específicas de AN1792 ou respostas de citoquinas em ratinhos imunizados passivamente com os anticorpos anti-Αβ.

Exemplo II: Eficácia Terapêutica de Anticorpos Anti-Αβ: mAb 2H3, mAb 10D5, mAb 266, mAb 21F12, mAb 3D6, mAb 16C11 e pAb Αβ1-42

Num segundo estudo, foi repetido o tratamento com 10D5 e foram testados dois anticorpos anti-Αβ adicionais, os monoclonais 3D6 (Αβ1-5) e 16C11(Αβ33-42). Os grupos de controlo receberam ou PBS ou um anticorpo irrelevante com isotipo correspondente(TM2a) . Os ratinhos eram mais velhos (11,5-12 meses hetrozigóticos) do que estudo anterior, e no restante o projecto experimental era o mesmo. De novo, após seis meses de tratamento, 10D5 reduziu a carga de placa em mais de 80% em relação aos controlos PBS ou anticorpo com isotipo correspondente (p=0,003). Um dos outros anticorpos contra Αβ. 3D6, foi igualmente efectivo, produzindo uma redução de 86% (p=0,003). Em contraste, o terceiro anticorpo contra o péptido, 16C11 não apresentou efeito na carga de placa. Resultados semelhantes foram obtidos com medições de Αβ42 por ELISA.

Estes resultados demonstram que uma resposta de anticorpo contra o péptido Αβ, na ausência de imunidade celular T, é suficiente para diminuir a deposição amilóide em ratinhos PDAPP, mas que nem todos os anticorpos anti-Αβ 117 ΡΕ1613347 são igualmente eficazes. Anticorpos dirigidos a epitopos que compreendem os aminoácidos 1-5 ou 3-7 de Αβ são particularmente eficazes. Em resumo, pode ser demontrado que anticorpos passivamente administrados contra Αβ (i.e., imunização passiva) reduz a extensão de deposição de placa num modelo de ratinho de doença de Alzheimer.

Exemplo III: Monitorização de ligação de Anticorpo no CNS

Este exemplo demontra que quando mantidos a concentrações de soro modestas (25-70 yg/ml), os anticorpos ganharam acesso ao CNS a níveis suficientes para decorar as placas β-amilóides.

Para determinar se anticorpos contra Αβ poderiam estar a actuar directamente no CNS, cérebros tirados de ratinhos perfusados com solução salina no fim do exemplo II, foram examinados quanto à presença de anticorpos administrados periféricamente. Secções de cérebro crios-táticas não fixas foram expostas a um reagente fluorecente contra imunoglobulina de ratinho (IgG-Cy3 anti-ratinho de cabra) . Placas nos cérebros dos grupos 10D5 e 3D6 foram fortemente decoradas com anticorpo, enquanto no grupo 16C11 não ocorreu coloração. Para revelar a extensão total de deposição de placa, secções em série de cada cérebro foram primeiro imunoreagidas com um anticorpo anti-Αβ e depois com o reagente secundário. 10D5 e 3D6, após administração periférica conseguiram acesso à maioria das placas no CNS. A carga de placa foi grandemente reduzida nestes grupo de 118 ΡΕ1613347 tratamento comparado com o grupo 16C11. A entrada de anticorpo para o CNS não foi devida a uma fuga anormal na barreira sangue-cérebro já que não houve aumento na permeabilidade vascular, medida por Evans Blue em ratinhos PDAPP. Além disso, a concentração de anticorpo na parênquima do cérebro de ratinhos PDAPP idosos foi a mesma do que em ratinhos não transgénicos, representando 0,1% da concentração de anticorpo no soro (independentemente do isotipo) .

Estes dados indicam que anticorpos administrados perifericamente podem entrar no CNS onde podem desencadear depuração amilóide. É provável que 16C11 também tenha tido acesso às placas mas não se tenha conseguido ligar.

Exemplo IV: Ensaio de Triagem Ex vivo para a Actividade de um Anticorpo Contra Depósitos Amilóides

Para examinar o efeito de anticorpos na depurção de placas, estabelecemos um ensaio ex vivo no qual células microgliais primárias foram cultivadas com secções crios-táticas não fixadas de cérebros de ratinho PDAPP ou humanos AD. Células microgliais foram obtidas dos córtices cerebrais de ratinhos recém-nascidos DBA/2N (1-3 dias). Os córtices foram dissociados mecanicamente em HBSS“ (solução salina balanceada de Hank, Sigma) com Dnase I 50 yg/ml (Sigma). As células dissociadas foram filtradas com um "cell strainer" (filtro celular) 100 ym (Falcon) e centri-fugadas a 1000 rpm durante 5 minutos. O pelete foi 119 ΡΕ1613347 ressuspendido em meio de crescimento (DMEM glucose elevada, FBS 10%, rmGM-CSF 25 ng/ml) e as células foram plaqueadas a uma densidade de 2 cérebros por frasco de cultura T-75. Após 7-9 dias, os flacos foram rotados num agitador orbital a 200 rpm durante 2h a 37°C. A suspensão celular foi centrifugada a 1000 rpm e ressuspendida no meio de ensaio.

Secções criostáticas de cérebros de ratinhos PDAPP ou humanos AD (intervalo postmortem < 3hr) foram montadas para descongelação em lamelas de vidro redondas revestidas de poli-lisina e colocadas em poços de placas de cultura de tecidos de 24 poços. As lamelas foram lavadas duas vezes com meio de ensaio que consiste em H-SFM (meio de hibroma, sem soro, Gibco BRL) com 1% FBS, glutamina, penicilina/streptomicina e rmGM-CSF(R&D) 5 ng/ml. Controlo ou anticorpos anti-Αβ foram adicionados a uma concentração de 2x (5yg/ml final)durante 1 hora. As células microgliais foram então cultivadas a uma densidade de 0,8xl06 célu-las/ml de meio de ensaio. As culturas foram mantidas num incubador humidificado (37°C, 5%C02) durante 24 hr ou mais. No final da incubação, as culturas foram fixadas com para-formaldeído 4% e permeabilizadas com 0,1% de Triton-X100. As secções foram coradas com 3D6 biotinilado seguido de um conjugado streptavidina/Cy3 (Jackson Immuno Research). As células microgliais exógenas foram visualizadas através de um corante nuclear (DAPI). As culturas foram observadas com um microscópio de fluorescência invertido (Nikon, TE300) e foram tirados fotomicrografias com uma câmera digital SPOT usando software SPOT (Diagnostic Instruments). Para análise 120 ΡΕ1613347 por Western blot, as culturas foram extraídas em ureia 8M, diluídas 1:1 em tampão amostra redutor e carregadas num gel de tricina 16% (Novex). Após a transferência para imobilon, os blots foram expostos a pabAp42 5yg/ml seguido de um anticorpo anti-ratinho conjugado com HRP e revelado com ECL(Amersham).

Quando o ensaio foi realizado com secções de cérebro de PDAPP na presença de 16C11 (um dos anticorpos contra Αβ que não era eficaz in vivo), as placas β-amilóides permaneceram intactas e não foi observada fagocitose. Em contraste, quando secções adjacentes foram cultivadas na presença de 10D5, os depósitos amilóides desarareceram em grande parte e as células microgliais apresentaram numerosas vesículas fagocíticas contendo Αβ. Resultados idênticos foram obtidos com secções de cérebro AD; 10D5 induziu fagocitose de placas AD, enquanto 16C11 não era eficaz. Além disso, o ensaio forneceu resultados comparáveis quando realizado com células microgliais de ratinho ou humanas, e com anticorpos contra Αβ de ratinho, coelho ou primata. A Tabela 7 compara a ligação de Αβ versus fagocitose para várias especificidades de ligação de anticorpo diferentes. Pode observar-se que anticorpos que se ligam a epitopos nos aa 1-7 ligam-se e depuram os depósitos amilóides, por outro lado anticorpos que se ligam a epitopos nos aminoácidos 4-10 ligam-se sem depurar os depósitos amilóides. Os anticorpos que se ligam a epitopos 121 ΡΕ1613347 C-terminal ao resíduo 10, nem se ligam, nem depuram os depósitos amilóides.

Tabela 7: Análise de Especificidade de Epitopo

Anticorpo epitopo isotipo Coloração Fagocitose N-term mab 3D6 1-5 IgG2b + + 10D5 3-7 IgGl + + 22C8 3-7 IgG2a + + 6E10 5-10 IgGl + - 14A8 4-10 IgGl de rato + - aa 13-28 18G11 10-18 IgGl de rato - - 266 16-24 IgGl - - 22D12 18-21 IgG2b - - C-term 2G3 -40 IgGl - - 16C11 -40/-42 IgGl - - 21F12 -42 IgG2a - - Imuno soro coelho (CFA) 1-6 + + ratinho (CFA) 3-7 + + ratinho(QS-21 3-7 + + macaco(QS-21) 1-5 + + ratinho(MAPI-7) A tabela 8 mostra resultados obtidos com vários anticorpos contra Αβ, comparando as suas capacidades de 122 ΡΕ1613347 induzir fagocitose no ensaio ex vivo e de reduzir in vivo a carga de placa em estudos de tranferência passiva. Embora 16C11 e 21F12 se ligassem a péptido Αβ sintético agregado com avidez elevada, estes anticorpos não eram capazes de reagir com placas β-amilóides em secções de cérebro não fixas, não eram capazes de desencadear fagocitose no ensaio ex vivo e não eram eficazes in vivo. 10D5, 3D6 e o anticorpo policlonal contra Αβ eram activos em todas as três medições. Estes resultados mostram que a eficácia in vivo é devida a depuração directa mediada por anticorpos das placas no CNS, e que o ensaio ex vivo é preditivo da eficácia in vivo.

Tabela 8: 0 ensaio ex vivo como prognóstico da eficácia in vivo

Antiaorpo Isotipo Avidez para Αβ agregado (fM) Ligação a placas β-amilóides Eficácia ex vivo Eficácia vivo Manoclanal 3D6 IgG2b 470 + + + 10D5 IgGl 43 + + + 160.1 IgGl 90 - - - 2102 IgG2a 500 - - - TM2a IgGl - - - - Policlonal 1-42 mistura 600 + + + 0 mesmo ensaio foi usado para testar a actividade depurante de um anticorpo contra um fragmento de sinucleína referido como NAC. Mostrou-se que a sinucleína é uma 123 ΡΕ1613347 proteína associada às placas amilóides. Um anticorpo para NAC foi posto em contacto com amostra de tecido de cérebro contendo placas amilóides e células microgliais, como anteriormente. Soro de coelho foi usado como controlo. Monitorização subsequente mostrou uma redução marcada no número e tamanho de placas indicativo de actividade depurativa do anticorpo.

Microscopia confocal foi usada para confirmar que Αβ foi internalizado no decurso do ensaio ex vivo. Na presença de anticorpos controlo, as células microgliais exógenas permaneciam no plano confocal acima do tecido, não havia vesículas fagocíticas contendo Αβ e as placas permaneciam intactas na secção. Na presença de 10D5, quase todo o material de placa estava contido em vesículas nas células microgliais exeógenas. Para determinar o destino do péptido internalizado, culturas tratadas com 10D5 foram extraídas com ureia 8M a vários pontos de tempo e examinadas por análise Western blot. Ao ponto de tempo uma hora, quando ainda não tinha ocorrido fagocitose, reacção com um anticorpo policlonal contra Αβ revelou uma banda forte a 4 kD (correspondendo ao péptido Αβ) . A imuno-reactividade de Αβ diminuiu ao dia 1 e estava ausente ao dia 3. Assim, fagocitose mediada por anticorpo de Αβ leva à sua degradação.

Para determinar se fagocitose no ensaio ex vivo era mediada por Fc, foram preparados fragmentos F(ab')2 do anticorpo anti-Αβ 3D6. Embora os fragmentos F(ab')2 tivessem retido a sua total capacidade para reagir com 124 ΡΕ1613347 placas, não eram capazes de desncadear fagocitose por células microgliais. Além disso, fagocitose com o anticorpo total podia ser bloqueada por um reagente contra receptores Fc murinos (anti-CD16/32). Estes dados indicam que in vivo a depuração de Αβ ocorre através de fagocitose mediada por receptor Fc.

Exemplo V: Passagem de Anticorpos através da Barreira Sangue-Cérebro

Este exemplo determina a concentração de anticorpo distribuída ao cérebro seguidamente a injecção intravenosa num tecido periférico de ratinhos normais ou PDAPP. Seguidamente ao tratamento, ratinhos PDAPP ou controlos normais foram perfundidos com NaCl 0,9%. As regiões do cérebro (hipocampo ou córtex) foram dissecadas e rapidamente congeladas. Os cérebros foram homogenizados em triton 0,1% + inibidores de protease. A imunoglobulina foi detectada em extractos por ELISA. F(ab)'2 de cabra anti-IgG de ratinho, foram usados para revestir uma placa de RIA como reagente de captura. O soro ou os extractos de cérebro foram incubados durante 1 hr. Os isotipos foram detectados com IgGl-HRP ou IgG2a-HRP ou IgG2b-HRP anti-ratinho (Caltag). Anticorpos, idependentemente do isotipo estavam presentes no CNS a uma concentração que é 1:1000 da encontrada no sangue. Por exemplo, quando a concentração de IgGl era três vezes a de IgG2a no sangue, também era três vezes IgG2 no cérebro, estando os dois presentes a 0,1% dos seus níveis respectivos no sangue. Este resultado foi obsevado tanto nos ratinhos trasgénicos como não 125 ΡΕ1613347 transgénicos indicando que os PDAPP não tem uma fenda única na barreira sangue cérebro

Exemplo VI. Clonagem e Sequenciação das Regiões variáveis do Ratinho 3D6

Clonagem e Análise de Sequência de VH de 3D6. A região VH variável da cadeia pesada de 3D6 foi clonada por RT-PCR usando mRNA preparado de células de hibridoma através de dois métodos independentes. No primeiro, iniciadores consensus foram empregues para o péptido lider da região VH abrangendo o codão de iniciação da tradução como o iniciador 5' (DNA #3818-3829), e iniciador 3' especifico para as regiões constantes de g2b (DNA #3832) . As sequências do produto amplificado por PCR, assim como de clones derivados independentemente, múltiplos, estavam completamente em acordo umas com as outras. Como confirmação adicional da sequência da região VH de 3D6, o resultado foi confirmado sequenciando um fragmento VH obtido por metodologia RACE RT-PCR e o iniciador 3'especifico para g2b (DNA #3832) . De novo, a sequência foi derivada do produto de PCR, assim como clones múltiplos isolados independentemente. Ambas as sequências estão em completa concordância uma com a outra, (com a excepção da substituição V8l na região lider do produto 5'RACE), indicando que as sequências são derivadas do mRNA que codifica a região VH de 3D6. 0 nucleótido (SEQ ID NO:3) e a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 4) da região VH de 3D6 estão apresentadas na tabela 9 A e na Figura 2, respectivamente. 126 ΡΕ1613347

Tabela 9 Ά: Sequência Nucleotídica de VH de 3D6 de Ratinho

ATGAACTTCGGGCTCAGCTTGATTTTCCTTGTCCTTGTTTTAAAAGGTGTCCAGTGTGA

AGTGAAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGCGTCTCTGAAACTCT

CCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAACTATGGCATGTCTTGGGTTCGCCAGAAT ΦΡ Ά ΡΆ P Ά /XPaPPPTPPftPTPPPTTPPft ΦΡΡΒΤΤΆΠΠ&ΠΤΠΠΤΠίΤΓΠΠΤ^& Λ ΡΡΦΒ ΡΤη χ χ υυηυ χ wvju χ χ nj ν^\_*Γ1χ xAwnJAVJxVJVJxwwx VJwxrxxjxxra^w χχχ^χχχ TTCAGACAATGTAAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGAGAATGCCAAGAACACCCTGT ACCTGCAAATGAGTAGTCTGAAGTCTGAGGACACGGCCTTGTATTATTGTGTCAGATAT GATCACTATAGTGGTAGCTCCGACTACTGGGGCCAGGGCACCACT (SEQ ID NO:3) *Péptido Lider está sublinhado

Clonagem e análise de Sequência de VL de 3D6. A região VL variável da cadeia leve de 3D6 foi clonada de modo análogo à região VH. No primeiro ensaio um conjunto de iniciador consensus foi desenhado para amplificação das regiões VL murinas como se segue: iniciadores 5' (DNA #3806-3816) foram desenhados para hibridizar com a região VL que abrange o codão de iniciação de tradução e um iniciador 3' (DNA #3817) era especifico para a região Ck murina a jusante da região de reunião V-J. A análise de sequência de DNA do fragmento de PCR,assim como clones derivados independentemente usando este conjunto de iniciadores da dadeia leve consensus, revelaram que o cDNA obtido era derivado de uma mensagem rearranjada não-funcionalmente já que a sequência continha uma mutação frameshift entre a junção da região V-J.

Num segundo trial (estudo), 5'RACE foi usado para clonar um segundo cDNA que codifica VL. Análise da sequência de DNA deste produto (consensus 11) mostrou que 127 ΡΕ1613347 este codificava um mRNA funcional. Assim, pode concluir-se que a sequência codifica o mRNA da cadeia leve de 3D6 correcta. A sequência de nucleótidos (SEQ ID N0:1) e a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO:2) da região VL de 3D6 estão apresentados na Tabela 9B e na Figura 1, respectivamente.

Tabela 9B: Sequência Nucleotídica de VL de 3D6 de Ratinho ATGATGAGTCCTGCCCAGTTCCTGTTTCTGTTAGTGCTCTGGATTCGGGMACCAACGG TTATGTTGTGATGACCCAGACTCCACTCACTTTGTCGGTTACCATTGGACAACCAGCCT CCATCTCTTGCAAGTCAAGTCAGAGCCTCTTAGATAGTGATGGAAAGACATATTTGAAT TGGTTGTTACAGAGGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCGCCTAATCTATCTGGTGTCTAAACT GGACTCTGGAGTCCCTGACAGGTTCACTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTTACACTGA AAATCAGCAGAATAGAGGCTGAGGATTTGGGACTTTATTATTGCTGGCAAGGTACACAT TTTCCTCGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA (SEQ ID N0:1) *Péptido Lider está sublinhado

Os iniciadores usados para a clonagem de cDNA de VL de 3D6 estão apresentados na Tabela 10 ENA Tamanho Cadeia Codificadora? Sequência de ΟΧΙΑ Cotentários 3806 40 Sim ACT.AGT.O^.CAT.GAA.GrT.QCC.TGr. TSG.GCr.GTT.GGr.QCr.G (SEQ ID ND: 39) iniciador variável kappa de ratinhol%A+T=50,00[20]; 04050,00[20]Davis, Botstein, Roth Temp de fusão C.72,90 3807 39 Sim ACr.AGT.Q]A.CAT.Q?A.QWC.A£A.CAC. ACT.CCr.GYT.AIG.Q3r (SEQ ID ND 40) iniciador variável kappa de ratinho 2MKV INICIADOR 2, MR3 set A+T=46,15[18]; 0+048, 72 [19] Davis, Botstein, Roth Temp. de Desnaturação 72,05 ΡΕ1613347 128 (continuação) ενά Tamanho Cadeia Codificadora? Sequência de Et®. Comentários 3808 40 Sim ACT.AGr.a34.CAT.O43.I3T.Q0r.O43. TO4.G3T.a0T.G3S.GIT.G (SEQ ID NO: 41) Iniciador variável kappa de ratinho 3MKV INICIADOR 3, MRC set;%A+T=45.00 [18] ;GK3=52,50 [21]Davis, Botstein, Roth Tertp. de fusão C.73,93 3809 43 Sim 1431.1431.034. CAT.043. GKG.003. TOO. TGA.G/JT.TYT.TQG.MWT.CTT.GÍSEQ ID NO:42) Iniciador variável kappa de ratinho INICIADOR 4MKV, MRC set; %A+T=41.86 [18] ;C-H3= 46,51[20] Davis, Botstein, Roth Tertp.de fusão C.72,34 3810 40 Sim ACT.AGr.C34.CAT.Q34.T]C.W04.G3r. Q34.04T.TWr.043.CIT.C (SBQ ID NO: 43) Iniciador variável kapa de Ratinho 5 INICIADOR 5, MRC set %A+T=52,50 [21];%CK3=42,50 [17]Davis, Botstein, Roth Temp fusão C. 69,83 3811 37 Sim 143Γ. 143Γ.034. OIT.043. GIK. CYY. TGY. TSA .GYT.YCT.GR3.G (SEQ ID N3:44) Iniciador variável kapa de Ratinho 6 %A+T=37,84 [14]; %C-H3 =40,54 [15]Davis, Botstein, Roth Tenp fusão C. 68,01 3812 41 Sim ACT. 143Γ.034. G4T.033. CWT. CAA. GAT. 034 .GIC.AD4.KWY.YiOJ.QG (SEQ ID N3:45) Iniciador variável kapa de Ratinho 7 INICIADOR 7, MRC set % A+TK39,02 [16]; %C-H3=46,34 [19]Davis, Botstein, Roth Temp fusão C. 71,70 3813 41 Sim ACI. AGI. 03A. CAT. GIG.033. AYC. TKI TTY.CNM.TTT.TTC.AAT.TC (SBQ ID N0:46 Iniciador variável kapa de Ratinho 8 INICIADOR 8, MRC set %A+T=53,66 [22]; %CK3=334,15 [14]Davis, Botstein, Roth Temp fusão C. 66,70 3814 35 Sim ACI .AGI.034. CAT. Q3I. RTC. CWC. ASC. I04.GIT.03r.TG (SEQ ID N0:47) Iniciador variável kapa de Ratinho 9% A+T=45, 71 [16]; %C-H3= 45,71 [16]Davis, Botstein, Roth Temp fusão C. 69,36 ΡΕ1613347 129 (continuação) ενά Tamanho Cadeia Codificadora? Sequência de Et®. Comentários 3815 37 Sim act .agi . a®. cat . Gm. tat . atg . τη. GIT.GIC.TAT.TIC.T (SEQ ID NO:48) Iniciador variável kapa de Ratinho 10 INICIADOR 10, MRC set % A+T=70,27[26];%C+G=29,73 [11]Davis, Botstein, Roth Temp fusão C. 63,58 3816 38 Sim AGI .AGI. 031. CAT. 031. AQC. CCS. AQC. TCA.QCT.TCT.CTT.OC(S0Q ID NO:49) Iniciador variável kapa de Ratinho 11 INICIADOR 11, MRC set % A+T=44,74[17];%C4G=55,26 [21]Davis, Botstein, Roth Temp fusão C. 74,40 3817 27 Não a®. TOS. CGS. GIG. (®T. Q3T. GSS. AAG ATG (SEjQ ID NO:50) Iniciador reverso cadeia leve de Ratinho, aa 116-122, iniciador da região constanteCk, MRCset + Smal site %A+T=47,06 [8];%C4G=52,94 [9]Davis, Botstein, Roth Temp fusão C. 57,19 3818 37 Sim ATT. AGT. 0®. CAT. (®A. ATG. CAG. CIG Q3T.®T.STT.CIT.C (SEjQ ID N0:51) Iniciador 1 variável pesada de Ratinho iniciador 1 MHV, MRC set; 3819 36 Sim ACT.AGT.O®.®T.Q33®TG.GAG.CIR.®T .®T.SYT.CIT (SEjQ ID NO:52) Iniciador 2 variável pesada de Ratinho iniciador 2MHV, MRC set; 3820 37 Sim ACT. AGT. 0®. ®T. GAA. GWT. GIG. GTT. AAA.CIG.QGT.TIT.T (SEjQ ID NO:53) Iniciador 3 variável pesada de Ratinho iniciador 3MHV, MRC set; 3821 35 Sim ACT. AGT. 0®. ®T. GE®. CTT. TGG. GiT. CAG.CIT.GRT.TT (SEQ ID N0:54) Iniciador 4 variável pesada de Ratinho iniciador 4MHV, MRC set; 3822 40 Sim ACT. AGT. 0®. ®T. G®. CIC. CAG. GCT. CAA .TTT.AGT.TTT.CIT.T (SEQ ID N3:55) Iniciador 5 variável pesada de Ratinho iniciador 5MHV, MRC set; 3823 37 Sim ACT. AGT. 0®. ®T. Q3C. TGT. CYT. RGS. GCT .PCI.CIT.CIG.C (SEQ ID 10:56) Iniciador 6 variável pesada de Ratinho iniciador 6MHV, MRC set; 130 ΡΕ1613347 (continuação) rm Tamanho Cadeia Go-dificadora? Sequência (te ENA Ccmentários 3824 36 Sim ACT.AGT.03UCAT.Q31.A3G.(3G.CíG. GKT.CIT.TMr.CIT (SEQ ID ND:57) Iniciador 7 variável pesada de Patinho iniciador 7MHV, MRC set; 3825 33 Sim ACI.AGT.03GCAr.<3G.AGr.QDr.®T. ICI.TTI.GIG (SEQ ID NO:58) Iniciador 8 variável pesada de Patinho iniciador 8MHV, MRC set; 3826 40 Sim ACI.AGI.03I.CAT.Q3yi.TIG.Q3I.GIG. SW.Cn.QOI.An.aOI.G (SEQ ID ND: 59) Iniciador 9 variável pesada de Ratinho iniciador 9MHV, MRC set; 3827 37 Sim ACT. AGI. CGA. CAT. QQG. CAG. ACI. ΊΑΟ. ATT .CIC.ATT.OCT.G (SEQ ID ND:60) Iniciador 10 variável pesada de Ratinho iniciador 10MHV, MRC set; 3828 38 Sim ACT.AGI.OGA.CAT.QSA.TIT. TGG. QDT.GAT.TIT.TIT.mT.TG (SEQ ID ND: 61) Iniciador 11 variável pesada de Ratinho iniciador 3MHV, MRC set; 3829 37 Sim ACT. AGT .CGA. CAT .GAT. QQT. GTT. AAG. TCT .Gm.CCT.G (SEQ ID ND:62) Iniciador 12 variável pesada de Ratinho iniciador 12MHV, MRC set; 3832 27 Não Q3A.T0C.03G.®G.TQG.ATA.®C.t®.TQ3 (SEQ ID ND: 63) Cadeia pesada IgG2b de Ratinho aa posição 119-124, MRC Set;

Do terminal N para o terminal C, ambas as cadeias leves e pesadas compreendem os domínios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 e FR4. A atribuição dos aminoácidos a acada domínio é de acordo com a convenção de numeração de Kabat et al., supra.

Expressão do Anticorpo 3D6 Quimérico: As regiões variáveis da cadeia pesada e leve foram modificados para codificar sequências dadoras splice a jusante das 131 ΡΕ1613347 respectivas junções VDJ ou VJ e clonadas nos vectores de expressão de mamíferos pCMV-hyl para a cadeia pesada e pCMV-hKl para a cadeia leve. Estes vectores codificam as regiões constantes yl e Ck humanos como fragmentos exónicos a jusante da cassette de região variável inserida. Após verificação de sequências, os vectores de expressão da cadeia pesada e da cadeia leve foram co-transfectados em células COS. Dois clones diferentes para a cadeia pesada (H2.2 & H3.2) foram transfectados idependentemente com 3 clones de cadeia leve quiméricos diferentes (L3, L4, &L10) para confirmar a reprodutibilidade do resultado. Uma transfecção de anticorpo 21.6 quimérico foi realizada como controlo positivo para os vectores. Meio condicionado foi colhido 48 hrs pós-tranfecção e ensaiado por análise western blot para a produção de anticorpo ou ELISA para ligação a Αβ.

Os transfectantes múltiplos exprimiam todos combinações de cadeia pesada + cadeia leve que são reconhecidas por um anticorpo anti-IgG (H+L)humano de cabra num western blot.

Ligação directa dos anticorpos 3D6 e 3D6 quimérico (PK1614) a Αβ foi testada por análise ELISA. Observou-se que 3D6 quimérico ligava-se a Αβ com avidez elevada, semelhante à demonstrada por 3D6 (Figura 3 A). Além disso um ensaio de inibição competitiva baseado em ELISA revelou que 3D6 quimérico e o anticorpo 3D6 murino competiam igualmente com 3D6 biotinilado na ligação a Αβ 132 ΡΕ1613347 (Figura 3B). 0 anticorpo quimérico apresentava propriedades de ligação indistinguíveis da amostra de referência de 3D6.

Tabela 11

Cone (pg/ml) 3D6 PK1614 IgGl 0,037 119,3 0,11 118, 6 118,9 0,33 99,7 71,25 1 98,63 84,53 134,4

Mais ainda, ambos 3D6 e PK1614 eram efectivos na depuração de placas Αβ. O ensaio ex vivo demonstra que à medida que a concentração de anticorpo aumenta, diminui a quantidade de Αβ de modo semelhante para ambos os anticorpos murino e quimérico. Assim, pode ser concluído que as sequências codificam cadeia pesadas e cadeias leves de 3D6 funcionais respectivamente.

Exemplo VII. Humanização de 3D6

Homologia/ Modelação molecular. Para identificar resíduos framework estruturais chave no anticorpo 3D6 murino, foi gerado um um modelo tridimensional baseado nos anticorpos murinos mais próximos para as cadeias pesada e leve. Para este efeito, foi escolhido um anticorpo designado 1 CR9 como molde para modelar a cadeia leve de 3D6 (PBD ID:1CR9, Kanyo et al., supra), e um anticorpo designado por 10PG foi escolhido como molde para modelar a cadeia pesada (PBD ID: 10PG Kondandapani et al., supra) 133 ΡΕ1613347 (Ver também Tabela 1.). 0 alinhamento da sequência de aminoácidos de 3D6 com a cadeia leve e a cadeia pesada destes anticorpos revelou que, com a excepção de CDR3 da cadeia pesada, os anticorpos 1CR9 e 10PG partilham homoloqia de sequência siqnificativa com 3D6. Além disso, os loops de CDR dos anticorpos seleccionados entram nas mesmas classses estruturais Clothia canónicas do que os loops CDR de 3D6, exceptuando de novo CDR3 da cadeia pesada. Por isso, 1CR9 e 10PG foram seleccionados inicialmente como anticorpos de estrutura resolvida para modelação de homologia de 3D6.

Um primeiro modelo de homologia da região variável de 3D6 baseado nos anticorpos referidos acima foi construído usando o pacote de software Look & SegMod Modules GeneMine(v3.5) . Este software foi comprado sob uma licença perpétua de Molecular Applications Group (Paio Alto,CA). Este pacote de software, cujos autores são Dr. Michael Levitt e Dr Chris Lee, facilita o processo de modelação molecular automatizando os passos envolvidos na modelação estrutural de uma sequência primária num molde de estrutura conhecida baseado em homologia de sequência. Trabalhando numa estação de trabalho IRIS Silicon Graphics num ambiente UNIX, a estrutura modelada é automaticamente refinada por uma série de passos de minimização de energia para libertar contactos atómicos desfavoráveis e optimizar as interações electrotáticas e van der Walls.

Um modelo refinado adicional foi construído 134 ΡΕ1613347 usando a capacidade de modelação de QuantaR. Cconsulta da base de dados PDB com CDR3da cadeia pesada de 3D6 identificou lqkz como 0 mais homólogo e tendo o número idêntico de resíduos do que 3D6. Assim, CD3 da cadeia pesada de 3D6 foi modelada usando a estrutura cristalina de lqkz como molde. A parte do esqueleto carbonado α do modelo 3D6 apresenta-se na Figura 4. O domínio VH está apre-sentdado como a uma linha a mesclado e o domínio VL mostra-se como uma linha a sólido e os loops CDR estão indicados na forma de fita.

Selecção das sequências de anticorpo aceitadoras humanas. Sequências de anticorpo aceitadoras humanas convenientes foram identificadas através de comparações por computador das sequências de aminoácidos das regiões variáveis de ratinho com as sequências de anticorpos humanos conhecidos. A comparação foi levada a cabo separadamente para as cadeias pesada e leve de 3D6. Em particular, domínios variáveis de anticorpos humanos cujas sequências estruturais exibiam um elevado grau de identidade de sequência com as regiões estruturais VL e VH murinas foram identificadas por consulta da base de dados Kabat usando NCBI BLAST (acessível publicamente através do server de internet NCBI dos National Institutes of Health) com as respectivas sequências framework murinas.

Duas sequências candidatas foram escolhidas como sequências aceitadoras baseado nos seguintes critérios: (1) homologia com a sequência sujeito; (2) partilha de estru- 135 ΡΕ1613347 turas CDR canónicas com a sequência dadora; e (3) não contendo residuos de aminoácidos raros nas regiões framework. A sequência aceitadora seleccionada para VL é Kabat Numero ID (KABID)019230 (Genbank No de acesso S40342), e para VH é KABID 045919 (Genbank No. De acesso AF115110). As primeiras versões do anticorpo 3D6 humanizado utilizam estas sequências de anticorpo aceitador seleccionadas.

Substituição de Residuos de Aminoácidos. Como referido supra, os anticorpos humanizados da invenção compreendem regiões framework variáveis, substancialmente de uma imunoglobulina humana (imunoglobulina aceitadora) e regiões determinantes de complementaridade, substancialmente de uma imunoglobulina de ratinho (imunoglobulina dadora) denominado 3D6. Tendo identificado as regiões determinantes de complementaridade de 3D6 e imunoglobulinas aceitadoras humanas apropriadas, o próximo passo seria determinar quais, se alguns, residuos destes componentes substituir para optimizar as propriedades do anticorpo humanizado resultante. Os critérios descritos supra foram usados para seleccionar os residuos para substituição.

As Figuras 1 e 2 representam alinhamentos das VL e VH, respectivamente de 3D6 murino original, com a res-pectiva versão 1 da sequência humanizada, a sequência aceitadora framework humana correspondente e, finalmente a sequência da região V germinal humana, mostrando a mais elevada homologia com a sequência aceitadora estrutural humana. As sequências marcadas indicam os aminoácidos conó- 136 ΡΕ1613347 nicos (a cheio), vernier (rodeados a tracejado), de empacotamento (negrito) e raros (a negrito itálico) e estão indicadas na figura. Os asteriscos indicam resíduos que sofreram mutação reversa a resíduos murinos na sequência framework aceitadora humana e as regiões CDR mostram-se sobrelinhadas. Um sumário das modificações incorporadas na versão 1 de VH e VL de 3D6 humanizado está apresentada na tabela 12.

Tabela 12. Sumário das modificações em 3D6.vl humanizado iTDdificaçces VL (112 resíduos) VH (119 resíduos) Hu->Mu: Framework 4/112 3/119(1 cânon, 1 CDR1 6/16 3/5 CDR2 4/7 7/14 CDR3 5/8 4/10 Hu->Mu 19/112 (17%) 17/119(14%) Mu->Hu: Framework 13/112 14/119 Notas nutação reversa 1.I2V que é ma posição canónica. 4.S49A Vemier/abaixo dos CIRs Notas aceitador 2.Y36L que é um resíduo de 5.A93V que é um resíduo de tinta germinal do enchimento e tantén se encontra preenchimento e (¾ zona vemier aceitador abaixo de CDRs 6.K94R é um resíduo canónico 7.ΚΆΒΤΠ 019230/Geribank Acc#S40342 ll.MBID045919/Geribank Aoc#AFll5110 8.Hu κ IC subgrupo II 12 .Hu Hc subgrpo III 9.CDRs do iteano grupo estrutural 13.CERS do iteano grupo estrutural canónico do que o dador (m3D6) canónico do que o dador (m3D6) LL=classe 4 Hl=classe 1 1 H2=classe 3 I2=adasse L3= classe 1 14. Reconhece polissacárido 10. Especificidade desconhecida capsular de Neisseria neningitidis 15.VH3-23 16 .A3 & A19

As Tabelas 13 e 14 apresentam chaves de numeração ΡΕ1613347 - 137 - de Kabat para as várias cadeias leves e pesadas, respec-tivamente.

Tabela 13: Chave para a Numeração de Kabat para cadeia leve KAB TIEE 3D6 VL de HUM KABID A19- Comentário # # ratinho Germinal 1 1 FRl Y Y D D Ratinho Raro, pode contactar CDR 2 2 V V I I Canónico/contacto CDR 3 3 V V V V 4 4 M M M M 5 5 T T T T 6 6 Q Q Q Q 7 7 T s S S 8 8 P P P P 9 9 L L L L 10 10 T S S S 11 11 L L L L 12 12 S P P P 13 13 V V V V 14 14 T T T T 15 15 I P P P 16 16 G G G G 17 17 Q E E E 18 18 P P P P 19 19 A A A A 20 20 S S S S 21 21 I I I I 22 22 s s s s 23 23 c c c c 24 24 CDR1 K K R R 25 25 s s S S 26 26 s s S S ΡΕ1613347 138

(continuação) KAB # # TIEE 3D6 VL de ratinho HUM KABID A19- Germinal 27 27 Q Q Q Q 27A 28 S S S S 27B 29 L L L L 27C 30 L L L L 27D 31 D D H H 27E 32 S S S S 28 33 D D N N 29 34 G G G G 30 35 K K Y Y 31 36 T T N N 32 37 Y Y Y Y 33 38 L L L L 34 39 N N D D

Comentário

35 40 FR2 W 36 41 L 37 42 L 38 43 Q 39 44 R 40 45 P 41 46 G 42 47 Q 43 48 S 44 49 P 45 50 K 46 51 R 47 52 L 48 53 I 49 54 Y 50 55 CDR2 L

W W W L Y Y L L L Q Q Q K K K P P P G G G Q Q Q S s s P P P Q Q Q R L L L L L I I I Y Y Y

Resíduo de empacotamento

Resíduo de empacotamento

51 56 v 52 57 S K 53 58

L L L V G G S S S K N N ΡΕ1613347 139 (continuação)

ΚΆΒ # # TIEE 3D6 VL de ratinho HUM KABID A19- Germinal 54 59 L L R R 55 60 D D A A 56 61 S S S S 57 62 FR3 G G G G 58 63 V V V V 59 64 P P P P 60 65 D D D D 61 66 R R R R 62 67 F F F F 63 68 T S S S 64 69 G G G G 65 70 S S S S 66 71 G G G G 67 72 S S S S 68 73 G G G G 69 74 T T T T 70 75 D D D D 71 76 F F F F 72 77 T T T T 73 78 L L L L 74 79 K K K K 75 80 I I I I 76 81 S S S S 77 82 R R R R 78 83 I V V V 79 84 E E E E 80 85 A A A A 81 86 E E E E 82 87 D D D D 83 88 L V V V 84 89 G G G G 85 90 L V V V 86 91 Y Y Y Y 87 92 Y Y Y Y

Comentário ΡΕ1613347 140 (continuação)

KAB # # TIEE 3D6 VL de ratinho HUM KABID A19- Germinal 88 93 C C C C 89 94 CDR3 w w M M 90 95 Q Q Q Q 91 96 G G A A 92 97 T T L L 93 98 H H Q Q 94 99 F F T T 95 100 P P P P 96 101 R R R 97 102 T T T 98 103 FR4 F F F 99 104 G G G 100 105 G Q Q 101 106 G G G 102 107 T T T 103 108 K K K 104 109 L V V 105 110 E E E 106 111 I I I 10 6A 112 K K K

Tabela 14. Chave para a Numeração de Kabat para Cadeia Pesada

KAB # # TYEE 3D6VH de ratinho HUM 3D6VH KABID VH3-23 Germinal 1 1 FR1 E E E E 2 2 V V V V 3 3 K Q Q Q 4 4 L L L L 5 5 V L L L 6 6 E E E E 7 7 S S S S ΡΕ1613347 141 (continuação)

ΚΆΒ # # ΤΥΡΕ 3D6VH de ratinho HUM 3D6VH KABID VH3-23 Germinal 8 8 G G G G 9 9 G G G G 10 10 G G G G 11 11 L L L L 12 12 V V V V 13 13 K Q Q Q 14 14 P P P P 15 15 G G G G 16 16 A G G G 17 17 S S S S 18 18 L L L L 19 19 K R R R 20 20 L L L L 21 21 S S S S 22 22 C C C C 23 23 A A A A 24 24 A A A A 25 25 S S S S 26 26 G G G G 27 27 F F F F 28 28 T T T T 29 29 F F F F 30 30 S S S S 31 31 CDRl N N S S 32 32 Y Y Y Y 33 33 G G A A 34 34 M M V M 35 35 S S S S 36 36 FR2 w w w W 37 37 V V V V 38 38 R R R R 39 39 Q Q Q Q

Comentário ΡΕ1613347 142 (continuação)

ΚΆΒ # # ΤΥΡΕ 3D6VH de ratinho HUM 3D6VH KABID VH3-23 Germinal Comentário 40 40 N A A A Ratinho raro, substituir w/Hum 41 41 S P P P 42 42 D G G G Ratinho raro, substituir w/Hum 43 43 K K K K 44 44 R G G G 45 45 L L L L 46 46 E E E E 47 47 W W W W 48 48 V V V V 49 49 A A S S CDR contacto/aparência 50 50 CDR2 S S A A 51 51 I I I I 52 52 R R S S 52A 53 S S G G 53 54 G G S S 54 55 G G G G 55 56 G G G G 56 57 R R S S 57 58 T T T T 58 59 Y Y Y Y 59 60 Y Y Y Y 60 61 S S A A 61 62 D D D D 62 63 N N S S 63 64 V V V V 64 65 K K K K 65 66 G G G G 66 67 FR3 R R R R 67 68 F F F F 68 69 T T T T 69 70 I I I I ΡΕ1613347 143 (continuação)

ΚΆΒ # # ΤΥΡΕ 3D6VH de ratinho HUM 3D6VH KABID VH3-23 Germinal Comentário 70 71 S S S S 71 72 R R R R 72 73 E D D D 73 74 N N N N 74 75 A A A S 75 76 K K K K 76 77 N N N N 77 78 T S S T 78 79 L L L L 79 80 Y Y Y Y 80 81 L L L L 81 82 Q Q Q Q 82 83 M M M M 82A 84 S N N N 82B 85 S S S S 82C 86 L L L L 83 87 K R R R 84 88 S A A A 85 89 E E E E 86 90 D D D D 87 91 T T T T 88 92 A A A A 89 93 L L L V 90 94 Y Y Y Y 91 95 Y Y Y Y 92 96 C C C C 93 97 V V A A Resíduo de empacota- mento, usar ratinho 94 98 R R K K Cannónico, usar ratinho 95 99 CDR3 Y Y D 96 100 D D N 97 101 H H Y 98 102 Y Y D ΡΕ1613347 144 (continuação) KAB # # TYEE 3D6VH de ratinho HUM 3D6VH 99 103 S S 100 104 G G 100A 105 S S 100B 106 S S 100C 107 - - 100D 108 - - 101 109 D D 102 110 Y Y 103 111 FR4 W W 104 112 G G 105 113 Q Q 106 114 G G 107 115 T T 108 116 T L 109 117 V V 110 118 T T 111 119 V V 112 120 s S 113 121 s s KABID VH3-23 Comentário _Germinal_

F

W

S

G

T

F

D

V W G Q G T L

V T

V s s

Os anticorpos humanizados exibem preferivelmente uma afinidade de ligação especifica para Αβ de pelo menos ΙΟ7, ΙΟ8, 109, ou 1010M-1. Normalmente o limite superior da afinidade de ligação dos anticorpos humanizados para Αβ está num factor de três, quatro ou cinco do de 3D6 (i.e., --10¾-1) . Muitas vezes o limite inferior da afinidade de ligação também se encontra num factor de três, quatro ou cinco do de 3D6.

Reunião e Expressão de VH e VL 3D6 Humanizados, Versão 1 Brevemente, para cada região V, foram sintetizados 145 ΡΕ1613347 4 grandes oigonucleotidos que se sobrepõem. Além disso, foram ainda sintetizados 4 iniciadores curtos de PCR para cada região V para facilitar adicionalmente a reunião da região V particular. As sequências de DNA dos oligonucleótidos empregues para este fim mostram-se na Tabela 15.

Tabela 15: Oligonucleótidos de DNA DNA# SIZE Codifi- Sequência comentários cadora 4060 136 Sim tccgc aagct tgccg ATGGA CATGC GCGTG ccacc CCCGC hum 3D6 VL-A CCAGC TGCTG GGCCT GCTGA TGCTG TGGGT GTCCG GCTCC TCCGG CTACG TGOTG ATGAC CCAGT CCCCC CTGTC CCTGC CCGTG ACCCC CGGCG A (SEQID NO:17) 4061 131 Não CTGGG GGGAC TGGCC TCTGC AGCAG CCAGT GGGCT TCAGG hum 3D6 VL-B TAGGT CTTGC CGTCG GAGTC CAGCA GGGAC TGGGA GGACT TGCAG GAGAT GGAGG CGGGC TCGCC GGGGG TCACG GGACA GGGGG G (SEQIDNO.-18) GGCAG 4062 146 Sim ACCTG AACTG GCTGC AAGCC CGGCC AGTCC TGCAG CCCCA hum 3D6 VL-C GCGCC TGATC TACCT GGTGT CCAAG CTGGA CTCCG GCGTG CCCGA CCGCT TCTCC GGCTC CGGCT CCGGC ACCGA CTTCA CCCTG AAGAT CTCCC GCGTG GAGGC C (SEQ ID NO:19) 4063 142 Não aattc tagga tccac CTTGA TCTCC ACCTT tcacg GGTGC hum 3D6 VL-D CCTGG CCGAA GGTGC GGGGG AAGTG GGTGC CCTGC CAGCA GTAGT ACACG CCCAC GTCCT CGGCC TCCAC GCGGG AGATC TTCAG GGTGA AGTCG gg (SEQ ID NO:20) GTGCC 4064 16 Não CTGGG GGGAC TGGCC (SEQ ID NO: 21) G hum 3D6 VL A+B back %A+T =18,75 [3]; % C+G = 81.2 [13] Davis,Botstein,Roth Melting Temp C. 66,96 ΡΕ1613347 146 (continuação) DNA# SIZE Codifi- Sequência comentários cadora 4065 22 Sim ACCTG AACTG GCTGC AA (SEQID NO:22) TGCAG hum 3D6 VL C+D frente % A+T = 45,45 [10]; % C+G = 54,55 [12] Davis,Botstein,Roth Melting Temp C. 64,54 4066 138 Sim acaga aagct tgccg ATGGA GTTTG GGCTG ccacc AGCTG hum 3D6 VH-A GCTTT TTCTT GTGGC TATTT TAAAA GGTGT CCAGT GTGAG GTGCA GCTGC TGGAG TCCGG CGGCG GCCTG GTGCA GCCCG GCGGC TCCCT GCGCC TGT (SEQ ID NO:23) 4067 135 Não GCCGC CGGAG CGGAT CCACC CACTC CAGGC GGAGG CCTTG hum 3D6 VH-B CCGGG GGCCT GGCGC ACCCA GGACA TGCCG TAGTT GGAGA AGGTG AAGCC GGAGG CGGCG CAGGA CAGGC GCAGG GCCGG GCTGC ACCAG (SEQ ID NO:24) GAGCC 4068 142 Sim CTGGA GTGGG TGGCC CCGCT CCGGC GGCGG TCCAT CCGCA hum 3D6 VH-C CCTAC TACTC CGACA ACGTG AAGGG CCGCT TCACC ATCTC CCGCG ACAAC GCCAA GAACT CCCTG TACCT GCAGA TGAAC TCCCT GCGCG CCGAG CG (SEQ ID NO:25) GACAC 4069 144 Não ctgca aggat ccact GAGGA CACGG TCACC caccG AGGGT hum 3D6 VH-D GCCCT GGCCC CAGTA GTCGG AGGAG CCGGA GTAGT GGTCG TAGCG CACGC AGTAG TACAG GGCGG TGTCC TCGGC GCGCA GGGAG TTCAT CTGCA AGGG (SEQ ID NO:26) GGTAC 4070 16 Não GCCGC CGGAG CGGAT 2 (SEQ ID NO:27) hum 3D6 VH A+B atrás % A+T = 18,75 [3]; % C+G = 81,25[13] Davis, Botstein, Roth Melting Temp C. 66,96 4071 20 Sim CTGGA GTGGG TGGCC TCCAT (SEQ ID hum 3D6 VH C+D frente NO:28) % A+T = 35,00 [7]; % C+G = 65,00 [13] Davis, Botstein, Roth Melting Temp C. 66,55 147 ΡΕ1613347 (continuação) DNA# SIZE Codifi cadora Sequência comentários 4072 19 Sim tcc gca age ttg ccg cca c (SEQ ID NO:29) Hum 3D6 VL A+B Frente % A+T = 31,58 [6]; % C+G = 68,42[13] Davis, Botstein, Roth Melting Temp C. 66,64 4073 29 Não aat tet agg ate cac tea cgC TTG ATC TC (SEQ ID NO:30) Hum 3D6 VL C+D Atrás % A+T = 55,17[16]; % C+G = 44,83 [13] Davis, Botstein, Roth Melting Temp C. 66,04 4074 23 Sim aca gaa age ttg ccg cca ccA TG (SEQ ID NO:31) Hum 3D6 VH A+B Frente % A+T = 43,48 [10]; % C+G = 56,52 [13] Davis, Botstein, Roth Melting Temp C. 66,33 4075 22 Não ctg caa gga tcc act cac cGG A (SEQ ID NO:32) Hum 3D6 VH C+D Atrás % A+T = 40,91 [9]; % C+G = 59,09[13] Davis, Botstein, Roth Melting Temp C. 66,40 A cadeia leve humanizada foi montada usando PCR. Análise de sequência de DNA de mais de duas dúzias de clones revelaram mutações pontuais dispersas e deleções na região VL em relação à sequência esperada. Análise das sequências indicaram que o clone 2.3 era sensível a reparação de 2 delecções nucleotídicas individuais próximasna região amino-terminal. Assim foi levada a cabo mutagénese dirigida a sítio no clone pCRShum3D6vl2.3 usando oligonu-cleótidos para introduzir os dois nucleótidos deletados e a reparação das mutações pontuais foi confirmada por análise 148 ΡΕ1613347 de sequência de DNA e o insert VL foi clonado no vector de expressão de cadeia leve pCMV-cK.

Montagem de VH humanizada usando métodos baseados em PCR resultou em clones com delecções grosseiras na metade 5' da sequência. Esforços adicionais para optimizar as condições de PCR tiveram sucesso parcial. Os clones obtidos via condições de PCR optimizadas ainda tinham 10-20 delecções nt na região de sobreposição de fragmentos A+B. Consequentemente, foi empregue uma estratégia alternativa para a montagem de VH utilizando DNA polimerase (T4, Klenow e Sequenase)extensão de sobreposição mediada, seguida de T4 DNA ligase para unir covalentemente as extremidades sobrepostas. Análise de sequência de DNA de um subgrupo dos clones resultantes de montagem de VH usando a última abordagem revelaram mutações pontuais dispersas e delecções entre os clones. Análise de mais de duas dúzias de clones revelaram essencialmente o mesmo padrão como ilustrado para os clones. Os resultados semelhantes seguindo a montagem de clones VH e VL sugere que os erros de sequência de DNA observados resultaram de erros do sintetizador automatizado durante a síntese do longo DNA empregue para a montagem. O clone 2.7 de VH humanizada foi seleccionado para reparação mediada por mutagénese "site-directed" (dirigida a um locus) das três delecções de nucleótido que se observou nele contidas. 149 ΡΕ1613347

Exemplo XIII: Caracterização do Anticorpo 3D6v2 Humanizado

Foi criada uma segunda versão de 3D6 humanizado contendo cada uma das substituições indicada para a versão 1, excepto a substituição D->Y no resíduo 1. A substituição neste resíduo foi levada a cabo na versão 1 porque o resíduo foi identificado como um resíduo que interactua com CDR . No entanto a substituição delectou um resíduo que era raro para imunoglobulinas humanas naquela posição. Por isso, foi criada uma versão sem a substituição. Mais ainda, resíduos não-germinais nas regiões framework da cadeia pesada foram substituídos por resíduos germline, nomeadamente, H74=S, H77=T e H89=V. A numeração de Kabat para a versão 2 cadeias leve e pesada, é a mesma como representada nas Tabelas 13 e 14 respectivamente, excepto que o resíduo 1 da versão 2 cadeia leve é asp (D), o resíduo 74 da cadeia pesada é ser (S), resíduo 77 da cadeia pesada é thr (T) e o resíduo 89 da cadeia pesada é vai (V). A sequência nucleotídica das cadeias leve e pesada da versão 1 de 3D6 humanizado estão apresentadas como SEQ ID Nos: 34 e 36, respectivamente. A sequência nucleotídica das cadeias leve e pesada da versão 2 de 3D6 humanizado estão apresentadas nas SEQ ID Nos: 35 e 37, respectivamente.

Exemplo IX: Teste funcional de Anticorpos 3D6 humanizados

Ligação de 3D6vl humanizado a Αβ. Teste funcional de 3D6vl humanizado foi realizado usando meio condicional de células COS transfectadas transientemente. As células foram transfectadas com anticorpo completo quimérico, uma 150 ΡΕ1613347 mistura de cadeia pesada quimérica + cadeia leve humanizada, ou cadeia leve quimérica + cadeia pesada humanizada e, por fim, anticorpo completo humanizado. O meio condicionado foi testado para ligação a Αβ1-42 agregado por ensaio ELISA. O anticorpo humanizado apresentou boa acti-vidade dentro do erro experimental e apresentou propriedades de ligação indistinguiveis da amostra de referência de 3D6 quimérico. Os resultados estão apresentados na Tabela 16.

Tabela 16

Ng/ml Quimérico Hu VH/QuiVL QuiVH/HuVL HuVH/HuVL 690 0,867 600 0,895 260 0,83 230 0,774 200 0,81 190 0,811 87 0,675 77 0,594 67 0,689 63 0,648 29 0,45 25 0,381 22 0,496 21 0,438 9,6 0,251 8,5 0,198 7,4 0,278 7 0,232 3,2 0,129 2,3 0,124 151 ΡΕ1613347

Para comparar as afinidades de ligação de anticorpos 3D6vl e 3D6v2 humanizados, foi realizada análise ELISA usando Αβ agregado como antigénio. Os resultados mostram que ambos 3D6vl (H1L1) e 3D6v2 (H2L2) propriedades de ligação a Αβ quase idênticas (Figura 5).

Análise de Substituição NET (Replacement NET-rNET) de h3D6v2. 0 ensaio de mapeamento de epitopos rNET fornece informação acerca da contribuição de residuos individuais no epitopo para a actividade total de ligação do anticorpo. Análise rNET usa análogos peptidicos, substituídos individualmente, sistematicamente sintetizados. A ligação de um anticorpo a ser testado é determinada versus o péptido nativo (antigénio nativo) e versus 19 péptidos "substituídos individualmente" alternativos, sendo cada péptido substituído numa primeira posição por um dos 19 aminoácidos não-nativos para essa posição. Gera-se um perfil que reflecte o efeito da substituição naquela posição pelos vários resíduos não-nativos. Os perfis são, da mesma maneira, gerados em posições sucessivas ao longo do péptido antigénico. 0 perfil combinado, ou mapa de epitopo (reflectindo a substituição em cada posição por todos os 19 resíduos não-nativos) pode então ser comparado com um mapa gerado de forma semelhante para um segundo anticorpo. Mapas substancialmente semelhantes ou idênticos indicam que os anticorpos comparados têm a mesma ou semelhante especificidade de epitopo. 152 ΡΕ1613347

Esta análise foi levada a cabo para 3D6 e 3D6 humanizado, versão 2. Anticorpos foram testados para ligação contra o péptido Αβ nativo DAEFRHDSGY (SEQ ID NO: 33) . Os resíduos 1-8 foram sistematicamente substituídos por cada um dos 19 resíduos não-nativos para essa posição. Os mapas foram gerados conformemente para 3D6 e h3D6v2. Os resultados estão apresentados de forma tabular na Tabela 17.

Tabela 17: Mapeamento de Substituição em Epitopos NET (Replacement NET Epitope-rNET) de 3D6 tipo selvagem e 3D6 humanizado

Substituição 3D6 Tipo Selvagem [OD] 3D6 Humanizado [OD] Substituição 3D6 Tipo Selvagem [0D1 3D6 Humanizado [OD] Resíduo 1 = A 0,464 0,643 Resíduo 5 = A 0,275 0,435 C 0,450 0,628 C 0,359 0,635 D 0,577 0,692 D 0,080 0,163 E 0,576 0,700 E 0,115 0,187 F 0,034 0,062 F 0,439 0,569 G 0,569 0,738 G 0,485 0,679 H 0,054 0,117 H 0,577 0,680 I 0,048 0,118 I 0,510 0,671 K 0,033 0,057 K 0,573 0,693 L 0,073 0,148 L 0,517 0,691 M 0,039 0,072 M 0,418 0,611 N 0,587 0,757 N 0,476 0,655 P 0,069 0,144 P 0,093 0,198 Q 0,441 0,689 Q 0,388 0,565 R 0,056 0,155 R 0,613 0,702 ΡΕ1613347 153 (continuação)

Substituição 3D6 Tipo Sei- 3D6 Humani- Substituição 3D6 Tipo Sei- 3D6 Humani- vagem [OD] zado [OD] vagem [03] zado [CD] S 0,569 0,762 S 0,487 0,633 T 0,450 0,702 T 0,530 0,639 V 0,057 0,190 V 0,493 0,562 w 0,031 0,070 w 0,393 0,461 Y 0,341 0,498 Y 0,278 0,230 Resíduo 2 = A 0,548 0,698 Resíduo 6 = A 0,587 0,707 C 0,553 0,694 C 0,585 0,703 D 0,119 0,222 D 0,584 0,701 E 0,563 0,702 E 0,579 0,702 F 0,577 0,717 F 0,586 0,704 G 0,527 0,720 G 0,592 0,709 H 0,534 0,741 H 0,596 0,688 I 0,522 0,722 I 0,602 0,708 K 0,548 0,722 K 0,585 0,691 L 0,482 0,705 L 0,584 0,688 M 0,535 0,705 M 0,583 0,687 N 0,525 0,735 N 0,580 0,686 P 0,445 0,707 P 0,587 0,705 Q 0,567 0,756 Q 0,570 0,695 R 0,562 0,719 R 0,576 0,686 S 0,587 0,705 S 0,573 0,689 T 0,552 0,712 T 0,573 0,700 V 0,550 0,702 V 0,588 0,715 W 0,553 0,701 W 0,576 0,696 Y 0,547 0,704 Y 0,595 0,708 Resíduo 3 = A 0,038 0,061 Resíduo 7 = A 0,580 0,688 C 0,222 0,410 C 0,559 0,676 ΡΕ1613347 154 (continuação)

Substituição 3D6 Tipo Selvagem [OD] 3D6 Humanizado [OD] Substituição 3D6 Tipo Selvagem [03] 3D6 Humanizado [CD] D 0,019 0,027 D 0,573 0,681 E 0,542 0,689 E 0,565 0,677 F 0,034 0,060 F 0,546 0,668 G 0,016 0,019 G 0,562 0,679 H 0,016 0,020 H 0,557 0,675 I 0,019 0,024 I 0,552 0,681 K 0,053 0,090 K 0,565 0,685 L 0,019 0,026 L 0,566 0,701 M 0,019 0,027 M 0,562 0,697 N 0,024 0,032 N 0,573 0,688 P 0,017 0,020 P 0,582 0,678 Q 0,153 0,406 Q 0,563 0,679 R 0,015 0,023 R 0,551 0,677 S 0,016 0,021 S 0,563 0,674 T 0,015 0,019 T 0,560 0,685 V 0,016 0,021 V 0,563 0,687 W 0,149 0,304 W 0,547 0,685 Y 0,016 0,020 Y 0,560 0,682 Resíduo 4=A 0,016 0,020 Resíduo 8=A 0,573 0,687 C 0,020 0,023 C 0,583 0,700 D 0,017 0,020 D 0,586 0,697 E 0,016 0,021 E 0,601 0,701 F 0,557 0,703 F 0,586 0,687 G 0,016 0,020 G 0,569 0,681 H 0,470 0,723 H 0,559 0,683 I 0,119 0,360 I 0,568 0,686 K 0,015 0,018 K 0,557 0,698 155 ΡΕ1613347 (continuação)

Substituição 3D6 Tipo Selvagem [OD] 3D6 Humanizado [OD] Substituição 3D6 Tipo Selvagem [CD] 3D6 Humanizado [OD] L 0,559 0,716 L 0,570 0,686 M 0,549 0,725 M 0,571 0,693 N 0,085 0,089 N 0,573 0,700 P 0,030 0,056 P 0,574 0,694 Q 0,065 0,110 Q 0,590 0,703 R 0,016 0,019 R 0,589 0,699 S 0,026 0,031 S 0,599 0,719 T 0,016 0,021 T 0,586 0,689 V 0,213 0,494 v 0,578 0,688 W 0,291 0,568 w 0,567 0,687 Y 0,529 0,730 Y 0,574 0,680

Notavelmente, os perfis são praticamente idênticos para 3D6 e h3D6v2 quando se observa as substituições em cada posição (í.e., flutuam de modo idêntico quando se compara os dados na coluna 1 (3D6) versus coluna 2 (h3D6v2). Estes dados demontram que a especificidade de h3D6v2 é preservada, já que o mapa de epitopo rNET de h3D6v2 é praticamente idêntico a m3D6 usando os resíduos Αβ 1-4 e 5-8.

Imunoquímica de secções de cérebro de PDAPP demontram especificidade do anticorpo h3D6vl. Anticorpo 3D6vl humanizado reconheceu Αβ em secções criostáticas de cérebro de ratinhos PDAPP. 3D6vl humanizado e PK1614 ligaram-se a placas PDAPP do mesmo modo dose resposta, como medido pela quantidade de fluorescência (quantificada em pixels) por slide versus a quantidade de anticorpo usado para corar o tecido (Figura 6) . Anticorpos secundários 156 ΡΕ1613347 anti-humanos idênticos foram usados nesta experiência. Os procedimentos de seccionamento, coloração e imagem foram descritos anteriormente. Em experiências idênticas, análise por imagem de coloração de h3D6v2 em secções de cérebro de PDAPPe AD revelaram que h3D6v2 reconhece placas Αβ de modo semelhante a 3D6vl (e.g., placas altamente decoradas).

Análise de ligação competitiva de h3D6. A capacidade anticorpos h3D6 vl e v2 para competir com 3D6 murino foi medida por ELISA usando um anticorpo 3D6 biotinilado. Análise de ligação competitiva revelou que h3D6vl, h3D6v2 e PK1614 quimérico podem todos competir com m3D6 para se ligar a Αβ (Figura 7) . H3D6vl e h3D6v2 eram idênticos na sua capacidade para competir com 3D6 para Αβ. 0 anticorpo 10D5 foi usado como controlo negativo já que tem um epitopo de ligação diferente de 3D6. Análise BIAcore também revelou uma elevada afinidade de h3D6vl e h3D6v2 para Αβ (Tabela 18).

Tabela 18: Medidades de Afinidade de Anticorpos para Αβ usando Tecnologia BIAcore

Anticorpo Kal (1/Ms) Kdl (1/s) Kd(nM) Mu 3D6 4,06E+05 3,57E-04 0,88 3D6 Quimérico 4,58E+05 3,86E-04 0,84 Hu 3D6vl 1,85E+05 3,82E-04 2,06 Hu 3D6v2 l,70E+05 3,78E-04 2,24

Em comparação com 3D6, que tem um Kd de 0,88nM, ambos h3D6vl e h3D6v2 apresentavam cerca de 2 a 3 vezes 157 ΡΕ1613347 menor afinidade de ligação, medida a 2,06 nM e 2,24 nM para h3D6vl e h3D6v2, respectivamente. O ensaio de ligação competitiva ELISA revelou uma afinidade de ligação aproxima-damente 6 vezes menor para h3D6vl e h3D6v2. Tipicamente, anticorpos humanizados perdem cerca de 3-4 vezes em afinidade de ligação em comparação com os seus correspondentes murinos. Assim, uma perda de cerca de 3 vezes (média dos resultados de ELISA e BIAcore) para h3D6vl e h3D6v2 está dentro do intervalo aceitável.

Ensaio ex vivo usando o anticorpo h3D6v2. A capacidade de h3D6v2 para estimular células microgliais foi testado através de um ensaio de fagocitose ex vivo (Figura 8) . H3D6v2 era tão efectivo como 3D6 quimérico a induzir fagocitose de agregados de Αβ de tecido de cérebro de ratinhod PDAPP. IgG foi usada como controlo negativo nesta experiência porque é incapaz de se ligar a Αβ e, por isso, não consegue induzir fagocitose.

Localização de h3D6 no cérebro in vivo. H3D6v2 marcado com 125I, mrD6v2, m3D6 e anticorpo DAE13 foram cada 4 injectados em 14 ratinhos PDAPP individuais em experiências separadas. Os ratinhos foram sacrificados após o Dia 7 e perfusados para análise adicional. As suas regiões cerebrais foram dissecadas e foi medida a actividade de I em regiões específicas do cérebro. Os resultados estão apresentados nas tabelas 19 e 20, para o soro e regiões do cérebro, respectivamente. ΡΕ1613347 158

Tabela 19 m3D6 DAE13 Hu3D6 30389,1 17463,9 40963,8 12171 13200,6 24202,2 3418,2 36284,7 12472,4 18678,9 421,3 33851,8 27241 19702 27187,3 26398,8 24855,8 29016,9 27924,8 29287,4 33830,7 12008,4 12733,1 26734,9 29487,8 27722,5 30144,5 25498,6 30460,7 35126,9 9652 23320,1 28414,8 24599,3 7119,1 16956,1 29240 28093,5 18190,7 11922,7 24659,7 25671,4 17443,1 26748,9

Tabela 20 m3D6 DAE13 Hu3D6 (H2L2) cere cort hipo cere cort hipo cere cort hipo 1991,9 1201,1 4024 1277,5 2522,9 5711,9 2424,6 3759,4 11622 238,9 746,1 2523 502,5 2123,5 6965,8 1509,8 2274,9 7018,2 645, 9 603 1241,1 2325 3528,2 7801,6 500 2265,9 5316,3 1000 2508,2 4644,2 232,7 849,8 1891,9 2736,2 5703,7 10395,5 1266,9 3737,9 7975,8 891,6 2621 8245,2 1192,2 3188 10170 1422 2398,7 7731,1 1102,6 2087,5 7292,3 2269,4 3481,4 9621,6 1700,4 2154,4 7124,1 1650,6 3488,4 10284,8 1526,7 3028 8331,3 542,5 812,4 2456,8 712,9 2318,5 6643,3 1538,1 4194,1 11244,8 1309 3010,5 8693,5 1172,9 1953,6 7363 1245,7 1699,4 6831,2 1372,2 997,5 2425,4 1067,9 3697,2 12280,7 2708,8 2789 7887,4 778,6 1291,9 5654,4 1952,2 2120,7 6412,7 2251,3 3897,5 11121,5 1199,3 1683,4 4887,3 1005,2 1852,5 5121,4 1529,6 1772,2 7986,9 1021,8 3234,5 8036,2 961,5 3382,9 8473,1 644,1 1663,4 5056,5 742,1 1056,7 3405,2 852,3 1943,2 6717,4 1516,4 1620,6 9888 1273,7 1320,8 4262,6 997,5 3065,7 10213,1 159 ΡΕ1613347

Os dados mostram que h3D6v2 estava localizado no cérebro, e estava particularmente concentrado na região do hipocampo onde se sabe que se agrega Αβ. As contagens no cérebro para m3D6 e DAE13 eram comparáveis a h3D6v2. Todos os três anticorpos conseguiam atravessar a barreira do sangue, como demonstrado pela ligação de placa Αβ in vivo.

Exemplo X. Clonagem e Sequenciação das Regiões variáveis 10D5 de Ratinho

Clonagem e Análise de Sequência de VH de 10D5. As regiões VH e VL de 10D5 de células de hibridoma foram clonadas por RT-PCR usando procedimentos 5'RACE. A sequência nucleotídica (SEQ ID NO:13) e sequência de

aminoácidos deduzida (SEQ ID N0:14) derivada de dois clones de cDNA independentes que codificam o presumido domínio VL de 10D5, estão apresentados na Tabela 21 e Figura 9. A sequência nucleotídica (SEQ ID NO:15) e sequência de aminoácidos deduzida (SEQ ID N0:16), derivada de dois clones de cDNA independentes, que codificam o presumido domínio VH de 10D5 estão apresentados na Tabela 22 e Figura 10. As sequências VL e VH de 10D5 preenchem os critérios para regiões V funcionais na medida em que contêm um ORF contíguo à metionina iniciadora para a região C, e partilham resíduos conservados característicos de genes da região V de imunoglobulina. 160 ΡΕ1613347

Tabela 21: Sequência de DNA de VL de 10D5 de Ratinho ATGMSTTaCCfgfTAàQCTQTTGGTÃCmTgTTCTgQÃTTCCTGCTTCCÃCCAGTGÃ TGTTTTGATQACCCMftCTCCACTCTCCCTGCCTgTCAGTCTTGGAGATCMgCCTCCA.

TCTCTTGCAGATCTAGTCAGàACàTTATACATAGTMTGGÁMCACCTATmGAATGG TACCTGCAGÂAACCÂGGCCAGTCTCCMAGCTCCTGATCTACMAGTTTCCMCCGATT rTCTSGGGTCCCAGACAGGTTCAGTSGCâGTGGATC&GGGâCAGATTTCAClCTCAAGA TCMGAAaGTGGAGGCTGAGGATCXGGGMTTTATTACTGCrTTCMGGTTC^CATGTT CCGCTOiCGOTCGGTGCTGGGACCMGCTGGMÍCTGGM (SEQ 1D KOj13) *Péptido lider sublinhado

Tabela 22: Sequência de DNA de VH de 10D5 de Ratinho atggacaggcttacttcctcrttcctgctgctgattgtccctgcatátotcctgtccca

GGCI^CTCTGAMGÁGTÇTGGCCÇTGGMTÃrrGCAGTCCTCCCMACCCTCASTCTGA

CTTGTTCTTTCTG^GGTTTTC^CrQAGCACTTCírGGTATGGGàGTGAGCTGGMTCGT

CAGCCTfCA^MÁGGéTCTGGAGTGGCTGGCACACAI^TACTGGCGiTGATGACMGCG ctataaccc&tçcctgmgagccggctcacmtctccaaggatacciccagmagcagg TATlCCTa^lTCACCÃOTGTGGACCCTGCAGATÃCTGCCACATACTACTGTGTTCGA ÃGGCCCAmCTCCGGTIOAGTCaATGCTAimCTAC^GGGTCMGGAACCTCAGT CACCGTCTCCTCA (3EQ ID 330:15} *Péptido lider sublinhado

Exemplo XI: Eficácia de mAB 3D6 em várias parâmetros neuroplatológicos em Ratinhos PDAPP

Este exemplo descreve a eficácia de mAb murino em vários parâmetros neuropatológicos. È feita uma comparação entre imunização passiva com 3D6 (a várias doses) e imunização activa com péptido Αβ. 161 ΡΕ1613347

Imunizações

Ratinhos PDAPP foram imunizados passivamente com mAb 3D6 a três doses diferentes, 10 mg/kg, 1 mg/kg e 10 mg/kg uma vez por mês (1x4) . Um anticorpo IgGy2 não relacionado (TY 11/15) e injecções de PBS foram utilizados como controlos. Imunização activa com péptido Αβ foi utilizado como comparação. Foram analisados em cada grupo entre 20 e 35 animais.

Os parâmetros neropatológicos ensaiados incluíram carga amilóide e carga neurítica.

Carga Amilóide A extensão do córtex frontal ocupado por depósitos amilóides foi determinado por imunocoloração com 3D6 seguida de análise de imagem quantitativa. Os resultados desta análise mostram-se na Tabela 6. Cada uma das imunoterapias conduziu a uma redução significativa da carga amilóide.

Carga Neurítica

Foi determinada a carga neurítica após imunização passiva com 3D6 foi determinada em ratinhos PDAPP por imunocoloração de secções de cérebro com anticorpo anti-APP 8E5 seguido de análise or imagem quantitativa. Distrofia neurítica é indicada pelo aparecimento de neurites distróficas (e.g., neurites com uma aparência globular) 162 ΡΕ1613347 localizadas na vizinhança imediata de placas amilóides. Os resultados desta análise estão apresentados na Tabela 7. 3D6 (isotipo IgGy2a, reconhecendo Αβ1-5) não reduziu significativamente a carga neuritica comparado com a imunização activa com péptido Αβ. Anteriormente, tinha sido observado que 10D5 (isotipo igGyl que reconhece Αβ3-7) era incapaz de reduzir significativamente a carga neuritica.

Tabela 23: Carga Amilóide do Córtex Frontal IBS ΤΪ11/15 3D6,10tng/kg 3D6,lmg/kg 3D6,10mg/kg/ 4semanas Activo N 31 30 29 31 32 24 Mediana (%NB) 15,182297 13,303288 0,865671 2,286513 1,470956 2,162772 Intervalo 0,160-31,961 0-61,706 0-7,064 0,077-63,362 0-10,688 0-30,715 Valor p (*M-W) 0,9425ns ***0,0001 ***,<,0001 ***<0,0001 ***0,0004 %Variação N/A 12% 94% 85% 90% 86%

Tabela 24: Carga Neuritica do Córtex Frontal IBS TY11/15 3D6,10mg/kg 3D6,lmg/kg 3D6,lQmg/kg/ 4ssnanas Activo N 31 30 29 31 32 24 Msdiana (%NB) 31 30 29 31 32 24 Intervalo 0,3946 0,3958 0,4681 0,3649 0,4228 0,2344 Valor p (*M-W) 0-1,3828 0-2,6800 0-1,3098 0-1,5760 0-1,8215 0-1,1942 %Variação 0,8967ns 0,9587 ns 0,6986 ns <0,9999 ***0,0381 A caracterização de vários parâmetros neuropa-tológicos no modelo de ratinho PDAPP para doença de Alzhei-mer podem ajudar o perito na matéria na concepção protocolos de imunização terapêuticos humanos apropriados. 163 ΡΕ1613347

Exemplo XII. Prevenção e Tratamento de Indivíduos Humanos 0 ensaio de fase I, de dose única é realizado para determinar a segurança em humanos. Um agente terapêutico é administrado em doses crescentes a doentes doentes a começar por cerca de 0,01 o nivel de presumida eficácia e aumentando por um factor de três até ter sido atingido um nivel de cerca de 10 vezes a dose de ratinho efectiva.

Para determinar a eficácia terapêutica é realizado um ensaio de fase II. São seleccionados doentes com doença de Alzheimer precoce a moderada, definidos usando os critérios da Associação para a doença de Alzheimer e perturbações relacionadas (Alzeimer's disease and Related Disorders Association-ADRDA) para prováveis AD. Doentes adequados apresentam uma pontuação no intervalo de 12-26 no mini exame de estado mental (Mini-Mental State Exam-MMSE). Outros critérios de selecção são que seja provável que os doentes sobrevivam à duração do ensaio e não apresentem questões complicantes tais como uso de medicação concomitante que possa interferir. Avaliações de base da função do doente são feitas usando medidas psicométricas clássicas, tais como MMSE e ADAS, que é uma escala completa para avaliar doentes com estado de doença de Alzheimer e função. Estas escalas psicométricas fornecem uma medida de progressão da condição de Alzheimer. Escalas de qualidade de vida convenientes também podem ser usadas para monitorizar o tratamento. A progressão da doença também pode ser monitorizada por MRI. Também podem ser monitorizados perfis 164 ΡΕ1613347 sanguíneos de doentes, incluindo ensaios de anticorpos específicos para um imunogénio e respostas de células T.

Seguidamente às medidas de base, os doentes começam a receber o tratamento. São aleatorizados e tratados ou com um agente terapêutico ou placbo de forma oculta, anónima. Os doentes são monitorizados pelo menos de seis em seis meses. A eficácia é determinada por uma redução significativa na progressão de um grupo de tratamento relativamente a um grupo placebo.

Um segundo ensaio de fase II é realizado para avaliar a conversão de doentes de um estado perda precoce de memória de doença não-Alzheimer, às vezes referida como deterioração cognitiva moderada para doença de Alzheimer como definido por critérios ADRDA. Doentes com um elevado risco para conversão para doença de Alzheimer são seleccionados de uma população não clínica por triagem de populações de referência para sinais precoces de perda de memória ou outras dificuldade associadas com sintomatologia pré-Alzheimer, uma história familiar de doença de Alzheimer, factores genéticos de risco, idade, sexo, e outras características que revelaram predizer um risco elevado para doença de Alzheimer. São recolhidos resultados de base em métricas convenientes, incluindo o MMSE e o ADAS, juntamente com outras métricas designadas para avaliar uma população mais normal. Estas populações de doentes são divididas em grupos convenientes com comparação de placebo versus alternativas de dose com o agente. Estas 165 ΡΕ1613347 populações de doentes são seguidas em intervalos de cerca de seis meses, e o parâmetro final para cada doente é se ele ou ela se converte, ou não para doença de Alzheimer provável como definido por citérios ADRDA no fim da observação.

Materiais e Métodos Gerais A. Preparação de Anticorpos contra Αβ Policlonais e e Monoclonais

0 anticorpo policlonal anti-Αβ foi preparado a partir de sangue colhido de dois grupos de animais. O primeiro grupo consistiu em 100 ratinhos fêmeas Swiss Webmaster, de 6 a 8 semanas de idade. Foram imunizados nos aos dias 0, 1792 combinado com CFA/IFA. Uma quarta injecção foi dada ao dia 36 com uma meia-dose de AN1792. Os animais foram exsanguinados sobre sacrifício ao dia 42, foi preparado soro e os soros foram reunidos para criar um total de 64 ml. Um segundo grupo consistiu em 24 ratinhos fêmea isogénicos com os ratinhos PDAPP mas não transgénicos para o gene humano APP, de 6 a 9 semanas de idade. Foram imunizados aos dias 0, 14, 28, e 56 com 100yg de AN1792 combinado com CFA/IFA. Estes animais também foram exsanguinados sobre sacrifício ao dia 63, foi preparado soro e reunidos para um total de 14 ml. Os dois lotes de soro foram reunidos. A fracção de anticorpo foi purificada usando duas séries de precipitação com sulfato de amónio 50% saturado. O precipitado final foi dialisado contra PBS 166 ΡΕ1613347 e testado para endotoxina. 0 nível de endotoxina era inferior a lEU/mg.

Os anticorpos monoclonais foram preparados a partir de fluído de ascites. 0 fluído foi primeiramente deslipidado pela adição de sulfato de dextran e sódio concentrado a fluído de ascites arrefecido por agitação em gelo para atingir uma concentração final de 0,238%. CaCl2 concentrado foi então adicionado com agitação para atingir uma concentração final de 64 mM. Esta solução foi centrifigada a lOOOOxg e o pelete foi desprezado. O sobrenadante foi agitado em gelo com um volume equivalente de sulfato de amónio saturado adicionado gota a gota. A solução foi centrifugada novamente a lOOOOxg e o sobrenadante foi desprezado. O pelete foi ressuspendido e dalisado contra Tris-HCl 20 mM, NaCl 0,4 M, pH 7,5. Esta fracção foi aplicada a uma coluna Sepharose Q FPLC Pharmacia e eluída com um gradiente reverso de NaCl 0,4 M a 0,275 M em Tris-HCl 20 mM, pH 7,5. O pico do anticorpo foi identificado por absor-vância a 280 nm e as fracções apropriadas foram reunidas. A preparação de anticorpo purificado foi caracterizada medindo a concentração de proteína usando o método BCA e a pureza usando SDS-PAGE. O pool (volume reunido) também foi testado para endotoxina. O nível de endotoxina era inferior a 1 EU/mg. A títulos inferiores a 100 foi arbitrariamente atribuído um valor de 25. 167 ΡΕ1613347 B. Medida de Títulos de Anticorpo

Os ratinhos foram sangrados fazendo um corte pontual na veia da cauda e colhendo cerca de 200μ1 de sangue num tubo de microfuga. Cobaias foi recolhido sangue raspando primeiramente a parte de anterior do tarso e usando então uma agulha de calibre 18 para um corte pontual na veia metatarsal e recolhendo e sangue para tibos de microfuga. 0 sangue foi deixado coagular durante uma hora à temperatura ambiente, agitado no viortex e depois centrifugado a 14 OOOxg durante 10 min para separar o coágulo do soro. O soro foi então transferido para um tubo de centrífuga limpo e armazenado a 4°C até à titulação.

Os títulos de anticorpo foram medidos por ELISA. Placs de microtítulo de 96 poços (placs Costar EIA) foram revestidas com ΙΟΟμΙ de uma solução contendo ou 10pg/ml de Αβ42 ou SAPP ou outros antigénios conforme anotado em cada um dos relatórios individuais em Tampão Well Coating (fosfato de sódio 0,1M, pH 8,5, azida de sódio 0,1%) e mantido de um dia para o outro à temperatura ambiente. Os poços foram aspirados e o soro adicionado aos poços começando com uma diluição de 1/100 em solvente de amostra (fosfato de sódio 0,014 M, pH7,4, NaCl 0,15 M, albumina de soro bovina 0,6%, thimerosal 0,05%). Foram efectuadas sete diluições em série das amostras directamente nas placas em passos de três vezes para atingir uma diluição final de 1/218700. As diluições foram incubadas nos poços revestidos durante uma hora à temperatura ambiente. As placas foram 168 ΡΕ1613347 então lavadas quatro vezes com PBS contendo 0,05% de Tween 20. O segundo anticorpo, Um Ig anti-ratinho de cabra conjugado com peroxidase de rábano silvestre (obtido de Boeringer Manheim), foi adicionado aos poços como ΙΟΟμΙ de uma solução 1/3000 em solvente de amostra e incubado durante uma hora à temperatura ambiente. As placas foram lavadas de novo quatro vezes com PBS, Tween 20. Para revelar o cromogénio foi adicionado a cada poço ΙΟΟμΙ de Slow TMB (3, 3', 5, 5'-tetrametilbenzidina obtido de Pierce Chemicals e incubado durante 15 min à temperatura ambiente. A reacção foi parada pela adição de 25 μΐ de H2S04 2M. A intensidade da côr foi lida num Molecular Devices Vmax a (450-650nm).

Os títulos foram definidos como o recíproco da diluição de soro que produz metade do OD máximo. O OD máximo era geralmente tomado de uma diluição inicial 1/100, excepto em casos com títulos muito elevados em cujo caso era necessária uma diluição inicial mais elevada para estabelecer o máximo OD. Se o ponto 50% se situava entre duas diliuições, foi feita uma extrapolação linear para calcular o título final. Para calcular títulos de anticorpo de média geométrica, a títulos inferiores a 100 foi arbitrariamente atribuído um valor de título de 25. C. Preparação de Tecido de Cérebro

Após eutanásia, os cérebros foram removidos e um hemisfério foi preparado para análise imuno-histoquímica, e 169 ΡΕ1613347 do outro hemisfério foram dissecadas três regiões do cérebro (hipocampo, córtex e cerebelo) e usadas para medir a concentração de várias proteínas Αβ e formas APP usando ELISAs específicos (Johnson-Wood et al., supra).

Tecidos destinados para ELISA foram homogenizados em 10 volumes de tampão guanidina gelado (guanidina-HCl 5,0 M, Tris-HCl 50mM, pH 8) . Os homogenados foram misturados por agitação suave usando um misturador "Adams Nutator" (Fisher) durante três a quatro horas à temperatura ambiente e em seguida armazenado a -20°C antes da quantificação de Αβ e APP. Experiências anteriores tinham mostrarado que os analitos eram estáveis nesta condições de armazenamento, e que a proteína Αβ sintética (Bachem) poderia ser quantitativamente recuperada quando quando adicionado como referência a homogenatos de tecido de cérebro controlo de ratinhos de mesma ninhada (Johnson-Wood et al., supra) D. Medida dos níveis de Αβ

Os homogenatos de cérebro foram diluídos 1:10 com diluente de caseína gelado (caseína 0,25%, PBS, azida de sódio 0,05%, aprotinina 20yg/ml, EDTA 5mM pH8,0, leupeptina 10pg/ml) e depois centrifugados a 16,000 x g durante 20 min a 4°C. Os Standards de proteína Αβ sintética (1-42 aminoácidos) e os standards APP foram preparados para incluir guanidina 0,5 M e albumina de soro bovino (bovin seruem albumin-BSA) na composição final. A ELISA de sandwich de Αβ "total" o anticorpo monoclonal 266, 170 ΡΕ1613347 específico para os aminoácidos 13-28 de Αβ (Seubert et al, supra) como o anticorpo de captura e um anticorpo monoclonal biotinilado 3D6, específico para os aminoácidos 1-5 de Αβ (Johnson-Wood et al., supra) como anticorpo repórter. O anticorpo monoclonal 3D6 não reconhece APP segregado de comprimento total, mas detecta somente espécies Αβ com um ácido aspártico amina terminal. Este ensaio tem um limite de sensibilidade inferior de ~50 ng/ml (11 nM e não apresenta reactividade cruzada com a proteína Αβ murina a concentrações até 1 ng/ml (Johnson-Wood et al., supra). O ELISA sandwich específico para Αβ1-42 emprega mA 21F12 específico para os aminoácidos 33-42 de Αβ (Johnson Wood, et al, supra) como anticorpo de captura. MA 3D6 biotinilado também é o anticorpo repórter neste ensaio que tem um limite de sensibilidade inferior de cerca de 125 pg/ml (28 μΜ, Johnson-Wood et al, supra). Para os ELISAS de Αβ, ΙΟΟμΙ de ηιΑβ 266 (a 10 yg/ml) ou ιηΑβ 21F12 a (5yg/ml) foram revestidos nos poços de placas de imunoensaio de 96 poços (Costar) por incubação de um dia para o outro à temperatura ambiente. A solução foi removida por aspiração e os poços foram bloqueados pela adição de 200 μΐ de 0,25% de albumina sérica humana em tampão PBS durante pelo menos lhr à temperatura ambiente. A solução bloquante foi removida e as placas foram armazenadas em condições excicantes a 4°C até ao uso. As placas foram rehidratadas com Tampão de Lavagem [Solução salina tamponada com 171 ΡΕ1613347

Tris(NaCl 0,15 M, Tris-HCl 0,01M, pH 7,5), mais Tween 20 0,05%] antes de uso. As amostras e padrões foram adicionadas em aliquotas em triplicado de ΙΟΟμΙ por poço e depois incubadas de um dia para o outro a 4°C. As placas foram lavadas pelo menos três vezes com Tampão de Lavagem entre cada passo do ensaio. Ο ιηΑβ 3 3D6 biotinilado, diluído a 0,5 yg/ml em Tampão de ensaio Caseína (0,25% caseína, PBS, Tween 20 0,05%, pH 7,4), foi adicionado e incubado nos poços durante 1 hr à temperatura ambiente. Foi então adicionado aos poços um conjugado avidina-peroxidae de rábano silvestre, (Avidina-HRP obtida de Vector, Burlingame, CA), diluída 1:4000 em Tampão de Ensaio Caseína, durante 1 hr à temperatura ambiente. Foi adicionado o substracto colorimétrico, Slow TBM-ELISA (Pierce) e deixado reagir durante 15 minutos à temperatura ambiente, após a qual a reacção enzimática foi parada pela adição de 25μ1 H2SO4 N. O produto de reacção foi quantificado usando Vmax Molecular Devices medindo a diferença de absorvância a 450 nm e 650 nm.

E. Medida de níveis APP

Foram itilizados dois ensaios APP diferentes. O primeiro designado ΑΡΡ-α/FL, reconhece tanto a forma APP-alpha (a) como a forma de comprimento total de APP (full length (FL). O segundo ensaio é específico para ΑΡΡ-α. O ensaio ΑΡΡ-α/FL reconhece APP segregada incluindo os primeiros 12 aminoácidos de Αβ. Já que o anticorpo repórter 172 ΡΕ1613347 (2Η3) não é especifico para o site α-clip, ocorrendo entre os aminoácidos 612-613 de APP695 (Esch et al., Science 248: 1122-1124 (1990)), este ensaio também reconhece APP de comprimento total (APP-FL) . Experiências preliminares usando anticorpos APP imobilizados para a cauda citoplasmática de APP-FL para reduzir os homogenatos de cérebro de APP-FL, sugerem que aproximadamente 30-40% de ΑΡΡ-α/FL APP é FL(full length-comprimento total)(dados não mostrados). O anticorpo de captura para ambos os ensaios ΑΡΡ-α/FL e APP-a é mAb 8E5, produzido contra os aminoácidos 444 a 592 da forma APP695 (Games et al., supra). O mAb repórter para o ensaio ΑΡΡ-α/FL é o mAb 2H3, especifico para os aminoácidos 597-608 de APP695 (Johnson-Wood et al.,supra) e o anticorpo repórter para o ensaio APP-a é um derivado biotinilado do anticorpo mAb 16H9 produzido para os aminoácidos 605 a 611 de APP. O limite inferior de sensibilidade do ensaio APP-aFL é cerca de 11 ng/ml (150 pm)(Johnson-Wood et al.) e o do ensaio especifico APP-a é 22 ng/ml (0,3 nM). Para ambos os ensaios APP, o mAb 8E5 foi usado para revestir os poços de placas EIA de 96 poços como descrito acima para o mAb 266. APPa segregado, recombinante purificado foi usado como o padrão de referência para o ensaio APP-a e para o ensaio APP-a/FL (Esch et al., supra). As amostras de homogenato de cérebro em guanidina 5M foram diluidas 1:10 em Diluente ELISA Specimen ( tampão fosfato 0,014 M, pH 7,4, albumina sérica bovina 0,6%, thimerosal 0,05%, NaCl 0,5 Μ, NP40 0,1%). 173 ΡΕ1613347

Foram diluídas 1:4 em Diluente Specimen contendo 0,5M de guanidina. Os homogenatos diluídos foram então centrifigados a 16000 x g durante 15 segundos à temperatura ambiente. Os padrões APP e amostras foram adicionados à placa em aliquotas duplicadas e incubados durante 1,5 hr à temperatura ambiente. O anticorpo biotinilado 2H3 ou 16H9 foi incubado com amostras durante 1 hr à temperatura ambiente. Estreptavidina-fosfatase alcalina (Boehringer Mannheim), diluída 1:1000 em diluente Specimen foi incubada nos poços durante lhr à temperatura ambiente. O substracto fluorescente 4-metil-umberiferil fosfato foi adicionado para uma incubação de 30 min à temperatura ambiente e as placas foram lidas num fluorímetro Cytofluor tm 2350 (Milipore) a 365 nm de excitação e 450 nm de emissão. F. Imuno-histoquímica

Os cérebros foram fixados durante três dias a 40°C em paraformaldeído em PBS e depois armazenados de um a sete dias a 4°C em paraformaldeído 1%, PBS até à secção. Secções coronais de quarenta micron de espessura foram cortadas num vibrátomo à temperatura ambiente e armazenados em crioprotector (glicerol 30%, etilenoglicol 30% em tampão fosfato) a -20°C antes do processamento imuno-histoquímico. Para cada cérebro, seis secções ao nível do hipocampo dorsal, cada uma separada por intervalos consecutivos de 240ym, foram incubadas de um dia para o outro com um dos anticorpos seguintes: (1) um anti-Αβ biotinilado (mAb, 3D6, 174 ΡΕ1613347 específico para Αβ humana) diluído a uma concentração de 2pg/ml em PBS e soro de cavalol%; ou (2) um mAb biotinilado, específico para APP humano, 8E5, diluído para uma concentração de 3yg/ml em PBS e soro de cavalo a 1,0%; ou (3) um mAb específico para proteína acídica fibrilar glial (glial fibrillary acidic protein-GFAP; Sigma Chemical Co.) diluída 1:500 com Triton X-100 0,25% e soro de cavalo 1% em solução salina tamponada com Tris, pH 7,4(TBS); ou (4) mAb específico para CDllb, antigénio MAC-1 (Chemicon International) diluído 1:100 com Triton X-100 0,25% e soro de coelho 1% em TBS; ou (5) um mAb específico para o antigénio MHC II (Pharmingen) diluído 1:100 com Triton X-100 e soro de coelho 1% em TBS; ou (6) um mAb de rato específico para CD 43 (Pharmingen) diluído 1:100 com soro de coelho 1% em PBS ou (7) um mAb de rato específico para CD 45RA(Pharmingen) diluído 1:100 com 1% de soro de coelho em PBS; ou (8) um Αβ monoclonal de rato específico para CD45B (Pharmingen) diluído 1:100 com soro de coelho 1% em PBS; ou (9) um Αβ monoclonal de ratoespecífico para CD 45 (Pharmingen)diluído 1:100 com soro de coelho 1% em PBS; ou (10)um Αβ poliblonal de hamster biotinilado específico para CD3e (Pharmingen) diluído 1:100 com soro de coelho 1% em PBS ou (11) um mAb de rato específico para CD3 (Serotec) diluído 1:200 com soro de coelho 1% em PBS; ou com (12) uma solução de PBS sem anticorpo primário contendo soro de cavalo normal 1%.

As secções que reagiram com as soluções de 175 ΡΕ1613347 anticorpo listadas em 1,2 e 6-12 acima foram pre-tratadas com Triton X-100 1,0%, peróxido de hidrogénio 0,4% em PBS durante 20 min à temperatura ambiente para bloquear a peroxidase endógena. Em seguida foram incubadas de um dia para o outro a 4°C com anticorpo primário. As secções que reagiram com 3D6 ou 8E5 ou mAbs CD3e foram depois feitas reagir durante uma hr à temperatura ambiente com um complexo peroxidase de rábano silvestre -avidina-biotina com componentes de kit "A" e "B" e diluídas 1:75 em PBS (kit Vector Elite Standard, Vector Labs, Burlingame, CA).As secções que reagiram com anticorpos específicos para CD45RA, CD45RB, CD45, CD3 e a solução de PBS sem anticorpo primário foram incubadas durante 1 hora à temperatura ambiente com IgG anti-rato biotinilada (Vector) diluída 1:75 em PBS ou IgG anti-ratinho biotinilada (Vector) diluída 1:75 em PBS, respectivamente. As secções foram então feitas reagir durante uma hr à temperatura ambiente com um complexo peroxidase de rábano silvestre-avidina-biotina com componentes "A" e"B" diluídosl:75 em PBS (Kit Vector Elite Standard, Vector Labs, Burlingame, CA)

As secções foram reveladas em peróxido de hidrogénio 0,01%, 3,3'-diaminobenzina (DAB)0,05% à temperatura ambiente. As secções destinadas para incubação com anticorpos específicos GFAP-, MAC-1 e MHC II foram pre-tratadas com peróxido de hidrogénio 0,6% à temperatura ambiente para bloquear a peroxidase endógena e em seguida incubadas de um dia para o outro com o anticorpo primário a 176 ΡΕ1613347 4°C. As secções que reagiram com o anticorpo GFAP foram incubadas durante 1 hr igG anti-ratinho feita em cavalo biotinilada (Laboratórios Vector, kit Vectastain Elite ABC) diluído 1:200 com TBS. As secções foram em seguida feitas reagir durante 1 hr com complexo avidina-biotina-peroxidase ( Laboratórios Vector; kit Vectastain Elite ABC) diluído 1:1000 com TBS. A secções incubadas com MAC-1 ou anticorpo monoclonal específico para MHC II como anticorpo primário foram subsequentemente feitas reagir durante 1 hr à temperatura ambiente com IgG anti-rato feita em coelho biotinilada diluída 1:200 com TBS, seguida de incubação durante uma hr com complexo avidina-biotina-peroxidase diluído 1:1000 com TBS. As secções incubadas com anticorpos específicos para GFAP-, MAC-1 e MHC II foram então visualizados por tratamento à temperatura ambiente com DAB 0,05%, peróxido de hidrogénio 0,01%, cloreto de níquel 0,04%, TBS durante 4 e 11 min, respectivamente.

Para a contracoloração de placas Αβ, um subgrupo de secções GFAP positivas foram montadas em slides Superfrost e incubadas em Tioflavina S(Sigma) 1% durante 7 min a seguir a processamento imuno-histoquímico. As secções foram então desidratadas e limpas em Propar, depois cobertas com lamelas montadas com Permount. G. Análise de Imagem

Um Sistema de Análise de Imagem Videométrico 150 177 ΡΕ1613347 (Oncor, Inc, Gaithersburg, MD) ligado a um microscópio Nikon Microphot-FX através de uma câmara CCD e um monitor Sony Trinitron foi usado para quantificação dos slides imuno-reactivos. A imegem da secção foi aramazeanada num tampão de video e um patamar de côr- e saturação foi determinado para seleccionar e calculara área total pixel ocupada pelas estruturas imunomarcadas. Para cada secção, o hipocampo foi manualmente delimitado e foi calculada a area total pixel ocupada pelo hipocampo. A percentagem de carga amilóide foi medida como:(a fracção da área hipocampal que contem depósitos Αβ imuno-reactivos com mAb3D6) x 100. De modo semelhante, a percentagem de carga neuritica foi medida como: (a fracção da área do hipocampo contendo neurites distróficas reactivas com o anticorpo monoclonal 8E5) x 100. O sistema C-Imaging (Compix Inc., Cranberry Township, PA)operando o programa Simple 32 Software Application foi ligado a um microscópio Microphot-FX através de uma câmara Optronics e usada para quantificar a percentagem de córtex retrosplenial ocupado pelos astrócitos positivos para GFAP e microgalia positiva para MAC-1 e MHC II. A imagem da secção imunoreagida foi armazenada num tampão vídeo e foi determinado um patamar de base monocrómica para seleccionar e calcular a área pixel total ocupada por células imunomarcadas. Para cada secção o córtex retrosplenial foi delimitado manualmente e foi calculada área total pixel ocupada pelo córtex retrosplenial. A percentagem de astrocitose foi definida como (a fracção de córtex retrosplenial ocupado pelos astrócitos reactivos com GFAP)xl00. De modo semelhante, a 178 ΡΕ1613347 percentagem de microgliose foi definida como:(a fracção do córtex retrosplenial ocupada por microglia que reage com MAC-1 ou MHCII) x 100. Para todas análises de imagem foram quantificadas para cada animal, seis secções ao nivel do hipocampo dorsal, cada uma separada por intervalos consecutivos de 240 ym. Em todos os casos, o estado de tratamento dos animais era desconhecido para o observador.

Do apresentado será evidente que a invenção proporciona vários usos. Por exemplo, a invenção proporciona o uso de qualquer dos anticorpos para Αβ descrito acima, no tratamento, profilaxia de doença amiloidogénica, ou na produção de um medicamento para uso na mesma. LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> NEURALAB LIMITED, et al.

<120> ATICORPOS HUMANIZADOS QUE RECONHECEM O PÉPTIDO BETA-AMILÓIDE

<130> ELN-002CPPC <150> US 10/388,389 <151> 2003-03-12 <160> 63 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 396

<212> DNA <213> Mus musculus <2 2 0 >

<221> CDS <222> (1) ... (396) <221> péptido_sin <222> (1) ... (60) <400> 1 179 ΡΕ1613347 âfcg atg agt ect gee aag tfcc cfcg fcfct ctg tta gtg ctc tgg att tgg 48 Met Met Ser Pro Ala Gin Phe Leu Phe Leu Leu Val Leu Trp ile Arg *20 -15 -10 -s gaa ace aac ggt tat gfct gtg atg ace cag act cca ctc act ttg teg 96 Glu Thr Asa Gly Tyr Val Val Set Thr Gin Thr Pro Leu Thr Leu Ser 1 5 10 SC c afct sga caa cca gee fccc ate tet tgc aag tea agt cag age 144 Vai Thr Ile Gly 01a Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Glu Ser 15 30 25 ctc tfcs gat agt gat ggâ aca tafc ttg aat tgg fctg tta cag agg 192 Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Glu ftrg 30 35 40 cca ggc cag tet cca aag ege cta ate tat ctg gtg tet aaa ctg gac 240 Pro Gly Gin Ser Pro lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp 45 50 55 60 tcfc 93« gtc cct gac agg tfcc act sgc agt gga tea gsg aca gat fctt 288 Ser Gly Vai Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 65 70 75 aca ctg aaa ate age aga ata g&g gcfc sag gat ttg SSá ctt tat tat 336 ar Leu I.ys Ile Ser Arg Ile Gltt Ala Glu Asp Leu Gly Leu Tyr Tyr 80 85 90 tgc tgg caa ggt aca Côt fctt cct cgg acg ttc sst gga 9SC acc aag 384 Cy$ Trp Glu Gly Thr His Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys 95 100 105 ctg gaa ate aaa 396

Leu Glu Ile Lys 110

<210> 2 <211> 132 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> SINAL <222> (1) ... (20) <400> 2 180 ΡΕ1613347

Met Met Ser Pro Ala Gin Phe Leu Phe Leu Leu val Leu Trp Ile Arg -20 -15 -10 -5 Glu Thr Asn Sly Tyr val Val Met Thr Gin Thr Pro Leu Thr Leu Ser 1 5 10 val Thr Ile Gly Gin Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gin Ser 15 20 25 Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn trp Leu Leu Gin Arg 30 35 40 Pro Gly Gin Ser Pro Lys Arg Leu lie Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp 45 50 55 60 Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 65 70 75 Thr Leu Lys Ile Ser Arg Ile Glu Ala GlU Asp Leu Gly Leu Tyr Tyr 80 85 90 Cys Trp Gin Gly Thr HÍS Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lyâ 95 100 105 Leu Glu Ile Lys 110 <210 > 3 <211> 414

<212> DNA <213> Mus musculus <22 0 > <221> CDS <222> (1)... (414) <221> péptido_sin <222> (1)...(57) <400> 3 atg ââC ttc 933 etc age ttg afct ttc ctt gtc ctt gtt tta aaa ggt Met Asn Píie Gly Leu Ser Leu Ile Phe Leu Val Leu Val Leu Lys Gly -15 -10 -S gtc cag tgt gaa gtg aag etg gtg gag tct 359 gga ggc tta gtg aag Val Gin Cys Glu 1 Val Lys Leu Val 5 Glu Ser Gly Gly Gly 10 Leu val Lys cct gga m tct ctg aaa ctc tce tgt gea gee tct 93a ttc act ttc Pro Gly Ala Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 15 20 25 181 ΡΕ1613347 agt aac tat ggc atg tct tgg gtt cgc cag aat tea gac aag agg ctg 192 Ser Asn Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gin Asn Ser Asp Lys Arg Leu 30 35 40 45 gag tgg gtt gca tcc att agg agt ggt ggt ggt aga acc tac tat tea 240 Glu Trp Val Ala Ser Ue Arg Ser Gly Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ser 50 55 60 gac aat gtt aag ggc cga ttc acc ate fceo aga gag aat gee aag aac 288 ASp Asn Vsl Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn 55 70 75 acc ctg tac ctg caa atg agt agt ctg aag tct gag gac acg gee ttg 336 Thr Leu Tyr Leu Gin Met Ser Ser Leu hys Ser Glu Asp Thr Ala Leu 80 85 90 tat tat tgt gtc aga tat gat cac tat agt ggt age tcc gac tac tgg 384 Tyr Tyr Cys Val Arg Tyr Asp His Tyr Ser Gly Ser Ser Asp Tyr Trp 95 100 105 ggc cag ggc acc act gtc aca gtc tcc tea 414 Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 110 115

<210 > 4 <211> 138 <212> PRT <213> Mus musculus <2 2 0 > <221> SINAL <222> (1) ... (19)

<4 0 0 > 4 Met Asn Phe Gly Leu Ser Leu Ile Phe Leu Val Leu Val Leu Lys Gly ”15 -10 -5 Val Gin Cys Glu 1 Val Lys Leu Val c Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys O M Ai Gly Ala X Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser AU Gly Phe Thr Phe 15 20 25 Ser Asn Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gin Ase Ser Asp Lys Arg Leu 30 35 40 45 Glu Trp val Ala Ser Ile Arg Ser Gly Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ser 50 55 6õ ASp Asn val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu km Ala Lys Asn 65 70 75 Thr Leu Tyr Leu Gin Met ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Leu 80 85 90 Tyr Tyr Cys Val Arg Tyr Asp Hís Tyr Ser Gly Ser Ser Asp Tyr Trp 95 100 105 eiy Gin Gly Thr Thr val Thr Val Ser Ser 110 11S 182 ΡΕ1613347

<210> 5 <211> 132 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220>

<221> SINAL <222> (1) ... (20) <223> região variável de cadeia leve 3D6 humanizada <4 0 0 > 5 MSt Gly Leu Leu Met Leu Trp Vai Ser Gly Ser Ser Gly Asp Ile Vai -10 -5 1 Mefc Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Vai Thr Pro Gly Glu Pro Ala 5 10 15 Ser lie Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Leu HiS Ser Asn Gly Tyr 20 25 30 35 Asn Tyr Leu Âsp Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro Gin Leu 40 45 50 Leu Ile Tyr Leu Gly ser Asm Arg Alâ Ser Gly Vai Pro Asp Arg Phe 55 50 55 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Vai 70 75 80 Glu Ala Glu Asp Vai Gly Vai Tyr Tyr Cys Met Gin Ala Leu Gin Thr 85 90 95 Pro Arg Thr Phe Gly Gin Gly Thr lys Vai Glu Ile Lys 100 105 110

<210> 6 <211> 125 <212 > PRT <213> Homo sapiens <220> <221> SINAL <222> (1)...(13) <4 00> 6 183 ΡΕ1613347

Met Met Ser Pro Ala Gin Phe Leu Phe Leu Leu Vai Leu Trp Ile Arg -20 -15 -10 -5 Glu Thr Asn Gly Tyr Vai Vai Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro 1 5 10 Vai Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gin Ser 15 20 25 Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gin Lys 30 35 40 Pro Gly Gin Ser Pro Gin Arg Leu Ile Tyr Leu Vai Ser Lys Leu Asp 45 50 55 60 Ser Gly Vai Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 65 70 75 Thr Leu Lys Ile Ser Arg Vai Glu Ala Glu Asp Vai Gly Vai Tyr Tyr 80 85 90 Cys Trp Gin Gly Thr His Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys 95 100 105 Vai Glu Ile Lys 110

<210 > 7 <211> 100 <212 > PRT <213> Homo sapiens <4 00> 7 &&£ vai Mêfc TJsr Qi» ser aro La» ser Leu pro vai Thr Pro 6-ly 1 B 10 15 úlu fto M*· s«r 11« Ser Cye Arg S*r Ser sln ser .te» teu Hi» Ser 20 25 30

Asa óly tyr m» fyr Lea Asp Trp Tyr Leu S3» l>ye Pro sly 01» Ser 35 40 «5 tro 01» L#u Leu il* Tyr Leu õiy Ser te Arg Ala Ser sly 'Vai Sro $0 SS ' €0

Asp Arg Phe ser 81γ Ser Oly Ser ôly Thr Asp ãfee Thr Leu Lys 11« 55 TO 75 00 ser Arg vai οχ.» Ala 91» &s$ vai Oly Vai Tyr Tyr cya mt 01» Ma

ss 00 ÍS

Leu 8X& Thr Pr® 100

<210> 8 <211> 138 <212 PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Região variável de cadeia pesada 3D6 humanizada <221> SINAL <222> (1) . . . (19) <400> 8 ΡΕ1613347 184

Met Asn Phe Gly Leu Ser Leu Ile Phe Léu Vâl Leu Vai Leu Lys Gly ~15 -10 -5 Vai Gin Cys Glu Vai Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin 1 5 10 Pro Sly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala ser Gly Pbe Thr Phe 15 20 25 Ser Mn Tyr Gly Met Ser Trp Vai àrg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 30 35 40 45 (Eu Trp Vai Ala Ser Ile Arg Ser Gly Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ser 50 55 60 Asp Asn Vai Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn 65 70 75 Ser teu Tyr teu Glu Met &sn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu 80 85 90 Tyr -ryr cys Vai Arg Tyr Asp His Tyr Ser Gly Ser Ser Asp Tyr Trp 95 100 105 Gly Gin Gly Thr Leu Vâl Thr Vai Ser Ser 110 115

<210 > 9 <211> 121 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 00> 9

Glu Vai Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Vai Ser Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp ser Vai 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asp Asn Tyr Asp Phe Trp Ser Gly Thr Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 115 120 <2io> ; 10 <211> 98 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 185 ΡΕ1613347

Glu Vai Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Vai 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile1 Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys

<210 > 11 <211> 132 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <221> SINAL <222> (1)...(20) <223> região variável de cadeia leve 3D6 humanizada

<4 0 0 > 11 Met Met Ser Pro Ala Gin Phe Leu Phe Leu Leu Vai Leu Trp Ile Arg -20 *15 -10 -5 Glu Thr Asa Gly Asp Vai Vai Met Thr Gin Ser Pro Leu sar Leu Pro 1 5 10 Vai Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gin ser 15 20 25 Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gin Lys 30 35 40 Pro Gly Gin. Ser Pro Gin Arg Leu Ile Tyr Leu Vai Ser Lys Leu Asp 45 50 55 60 Ser Gly Vai Pro Asp Arg Phe Ser Gly ser Gly Sar Gly Thr Asp Phe 65 70 n Thr Leu Lys ile Ser Arg Vai Glu Ala Glu Asp val Gly Val Tyr Tyr 30 m <3fS £p T tp Gin Gly Thr Bis Phe Pro Arg Thr Phs Gly 8ln Gly Thr Lys 95 100 105 m Glu m Lys <210> 12 <211> 138 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Humanized 3D6 light chain variable region <221> SINAL m 186 ΡΕ1613347 <222> (1) . . .(19) <4 Ο Ο > 12

Met Asn Phe Gly Leu Ser Leu Ile Phe Leu Vai Leu Vai Leu Lys Gly -15 -10 -5 Vai Gin Cys Glu Vai Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu val Gin 1 5 10 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 15 20 25 Ser Asn Tyr Gly Met Ser Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 30 35 40 45 Glu Trp Vai Ala Ser Ile Arg Ser Gly Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ser 50 55 60 Asp Asn Vai Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 65 70 75 Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 80 85 90 Tyr Tyr Cys Vai Arg Tyr Asp His Tyr Ser Gly Ser Ser Asp Tyr Trp 95 100 105 Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 110 115 <210> 13 <211> 393

<212> DNA <213> Mus musculus <2 2 Ο > <221> CDS <222> (1) ... (393) <221> péptido_sin <222> (1) . . . (57) <4 Ο Ο > 13 atg aag ttg cct gtt m ctg ttg gta ctg atg fcfce tgg afct ceb gct 48 Met Lys Leu Pro Val Arg hm Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala -15 -10 -5 tec age agt gat gtt ttg atg acc caa act cca etc tec ctg cct gtc 96 Ser Ser Ser Asp Val Leu Met Thr Gin Thr Pro Leu Ser Leu Pro Vâl 15 10 ΡΕ1613347 187 agt ctt gga gat caa Ser Leu Gly Asp Gin 15 ata cat agt aat gga Ile HlS ser Asn Gly 30 ggc cag tct cca aag Sly Gin Ser Pro Lyg 50 393 gtc cca gac agg 0 ly Vai Pro Asp Arg 65 ctc aag ate aag aaa Leu Lys Ile Lys .Lys 80 ttt ca a 99t tca c&t Phe Gin Gly Ser Bis 95 gag ctg gaa Glu Leu Glu 110 A o t—1 CM V 14 <211> 131 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> SINAL <222> (1) ... (19) gcc tcc afcc tct tgc aga Ala Ser ile ser cys Arg ao aac acc tat tta gaa t33 Asn Thr Tyr Leu Glu Trp 35 40 ctc ctg ate tac aaa gtt Leu Leu Ile Tyr Lys Vai 55 ttc agt SBC agt gga tca Phfi Ser Gly Ser sly Ser 70 gtg gag gct gag gat ctg Vai Glu Ala Glu Asp Leu 85 gtt ccg ctc aeg ttc ggt Vai Pro Leu Thr Phe Gly 100 tct agt cag aac atfc 144 Ser ser Gin Asn Ile 25 tac ctg cag aaa cca 192 Tyr Leu SlB Lys Pro 45 tcc aac cga ttt tct 240 Ser Asn Arg Phe Ser 60 ggg aca gat ttc aca 288 Qly Thr Asp Phe Thr 75 ggs att tat tac tgc 335 Gly lie Tyr Tyr Cys 90 gct 399 acc aag ctg 234 Ala Gly Thr Lys Leu 105 393 <400> 14 188 ΡΕ1613347

Mefc Lys Lau Pro Vai Arg Leu Leu Vai Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala -IS *10 *5

Ser Ser Ser Asp Vai Leu Met Thr Gin Thr Pro Leu Ser Leu Pro Vai 15 10

Ser Leu Gly Asp Gin àlâ Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gin Aân Ile 15 20 25

Ile His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gin Lys Pro 30 35 40 45

Gly Gin Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Vai Ser Asn Arg Phe Ser 50 55 ¢0

Gly Vai Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 65 70 75

Leu Lys Ile Lys Lys Vâl Gltí Ala Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Tyr Cys 80 85 90

Phe Gin Gly Ser His Vai Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu §5 100 105

Glu Leu Glu 110 <210> 15 <211> 426

<212> DNA <213> Mus musculus <2 2 0 >

<221> CDS <222> (1) ... (426) <221> péptido_sin <222> (1) ... (57) <4 0 0 > 15 189 ΡΕ1613347 atg gac agg ctt act tcc tea ttc ctg ctg ctg att gtc cct gea tat 48 Met Asp Arg Leu Thr Ser Ser Phe Leu Leu Leu Ile Val Pro Ala Tyr -15 -10 -5 gtc ctg tcc cag gct act ctg aaa gag tet ggc cct gga ata ttg cag 96 Vai Leu Ser Gin Ala Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gin 1 5 10 tcc tcc cag acc ctc agt ctg act tgt tet ttc tet ggg ttt tea ctg 144 Ser Ser Gin Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu 15 20 25 age act tet ggt atg gga gtg age tgg att cgt cag cct tea gga aag 192 Ser Thr Ser Gly Met Gly Vai Ser Trp Ile Arg Gin Pro Ser Gly Lys 30 35 40 45 ggt ctg gag tgg ctg gea cac att tac tgg gat gat gac aag ege tat 240 Gly Leu Glu Trp Leu Ala His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr 50 55 60 aac cca tcc ctg aag age cgg ctc aca ate tcc aag gat acc tcc aga 288 Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Arg 65 70 75 aag cag gta ttc ctc aag ate acc agt gtg gac cct gea gat act gee 336 Lys Gin Vai Phe Leu Lys Ile Thr Ser Val Asp Pro Ala Asp Thr Ala 80 85 90 aca tac tac tgt gtt cga agg ccc att act ccg gta cta gtc gat gct 384 Thr Tyr Tyr Cys Vai Arg Arg Pro Ile Thr Pro Val Leu Val Asp Ala 95 100 105 atg gac tac tgg ggt caa gga acc tea gtc acc gtc tcc tea 426 Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 110 115 120

<210> 16 <211> 142 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> SINAL <222> (1) ... (19) <4 Ο Ο > 16 190 ΡΕ1613347

Met Asp Arg Leu aar Ser Ser Phe Leu Leu Leu Ile Val Pro Ala Tyr *15 -10 -5 Vai Leu Ser Gin Ala Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gin 1 5 10 Ser Ser Gin Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu is 20 25 Ser Thr Ser Gly Met Gly Vai Ser Trp Ile Arg Gin Pro ser Gly Lys 30 35 40 45 Gly Leu Glu Trp Leu Alá His ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr 50 55 60 Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Arg 65 70 75 Lys ôla Vai Phe Leu Lys Ile Thr Ser Val Asp Pro Ala Asp Thr Ala 80 85 90 •Thr Tyr Tyr Cys val Arg Arg Pro Ile Thr Pro Val Leu Val Asp Ala 35 100 105 Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Ser val Thr Val Ser Ser 110 115 120

<210 > 17 <211> 136 <212 > DNA <213> Sequência Artificial <2 2 0 > <223> iniciador <400> 17 tccgcaagcfc tgccgccacc atggacatgc gcgtgcccgc ccagcfcgctg ggcctgctga 60 tgctgtgggt gtccggctcc tccggctacg tggtgatgac ccagtccccc ctgtccctgc 120 ccgtgaeccc cggcga 136 <210> 18 <211> 131 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <223> iniciador A O O V 18 ctggggggac tggccgggct tctgcagcag ccagttcagg taggtcttgc cgtcggagtc 60 cagcagggac tgggaggact tgcaggagat ggaggcgggc tcgccggggg tcacgggcag 120 ggacaggggg g 131

<210> 19 <211> 146 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <223> iniciador <400> 19 191 ΡΕ1613347 acctgaactg gçtgctgcag aagcccggcc agtcccccca gcgcctgatc tacctggtgt 60 ccaagctgga ctccggcgtg cccgaccgct tctccggctc cggdtccggc accgacttca 120 ccctgaagat cfccccgcgfcg caggcc 146

<211> 142 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <223> iniciador <400> 20 aatfcetagga tccactcacg cttgatctcc accttggtgc cctggccgaa ggtgcggggg 60 aagtgggtgc cctgccagca gtagtacacg cccacgtcct cggcetccac gcgggagatc 120 ttcagggtga agtcggtgcc gg 142

<210> 21 <211> 16 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0 > <223> iniciador <4 00> 21 ctggggggac tggccg 16

<210> 22 <211> 22 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <223> iniciador <400> 22 acctqaactg gctgctgcag aa 22

<210> 23 <211> 138 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0 > <223> iniciador <400> 23 acagaaagct tgccgccacc atggagtttg ggctgagctg gcttttfcctt gtggctattt 60 taaaaggtgt ccagtgtgag gtgcagctgc tggagtccgg cggcggcetg gtgcegccçg 120 gcggctccct gcgcctgt 138

<210> 24 <211> 135 <212> DNA <213> Sequência Artificial 192 ΡΕ1613347 <220> <223> iniciador <400> 24

gccgccggag cggafcggagg ecacccactc caggeccttg ccgggggcct ggcgcaccca 60 ggacafcgccg tagttggaga aggtgaagcc ggaggcggcg eaggacaggc gcagggãgcc 120 gccgggctgc accag 13S

<210> 25 <211> 142 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <223> iniciador <400> 25 ctggagtggg tggcctccat ccgctccggc ggcggccgca cctactactc cgacaacgtg 60 aagggccgct tcaccatctc ccgcgacaac gccaagaact ccctgtacct gcagatgaac 120 tccctgcgcg ccgaggacac cg 142

<210> 26 <211> 144 <212> DNA <213> Sequência Artificial <2 2 0 > <223> iniciador <400> 26 ctgcaaggafc ccacfccaccg gaggacacgg tcaccagggt gccctggccc cagtagtcgg 60 aggagccgga gtagtggtcg tagcgcacgc agtagtacag ggcggtgtcc tcggcgcgca 12δ gggagttcat: ctgcaggfcac aggg 144

<210> 27 <211> 16 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <223> iniciador <400> 27 gccgccggag cggatg 16

<210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <223> iniciador <400> 28 193 ΡΕ1613347 ctggagtggg tggcctccat 20 <210> <211> <212> <213> 29 19 DNA Sequência Artificial <220> <223> iniciador Λ O o V 29 tccgcaagct tgccgccac 19 <210> <211> 30 29 <212> <213> DNA Sequência Artificial <220> <223> iniciador <4 0 0 > 30 aattctagga tccactcacg cttgatctc 29 <210> <211> <212> <213> 31 23 DNA Sequência Artificial <220> <223> iniciador <4 0 0 > 31 acagaaagct tgccgccacc atg 23 <210> <211> 32 22 <212> <213> DNA Sequência Artificial <220> <223> iniciador <4 0 0 > 32 ctgcaaggat ccactcaccg ga 22 <210> <211> <212> <213> 33 10 PRT Sequência Artificial <220> <223> native ABeta peptide <400> 33 194 ΡΕ1613347

Asp Ala Gla Phe Arg Kís Asp Ser Giy Tyr 1 S xo

<210> 34 <211> 402 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <223> h3D6 version 1 VL <400> 34 atggacatgc gcgtgcccgc ccagctgctg ggcctgctga tgctgtgggt gtccggctcc 60 tccggctacg tggtgatgac ccagtccccc ctgtccctgc ccgtgacccc cggcgagccc 120 gcctccatct cctgcaagtc ctcccagtcc ctgctggact ccgacggcaa gacctacctg 180 aactggctgc tgcagaagcc cggccagtcc ccccagcgcc tgatctacct ggtgtccaag 240 ctggactccg gcgtgcccga ccgcttctcc ggctccggct ccggcaccga cttcaccctg 300 aagatctccc gcgtggaggc cgaggacgtg ggcgtgtact actgctggca gggcacccac 360 ttcccccgca ccttcggcca gggcaccaag gtggagatca ag 402

<210> 35 <211> 402 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <223> h3D6 version 2 VL <400> 35 atggacatgc gcgtgcccgc ccagctgctg ggcctgctga tgctgtgggt gtccggctcc 60 fcccggcgacg tggtgatgac ccagtccccc ctgtccctgc ccgtgacccc cggcgagccc 120 gcctccatct cctgcaagtc ctcccagtcc ctgctggact ccgacggcaa gacctacctg 180 aactggctgc tgcagaagcc cggccagtcc ccccagcgcc tgatctacct ggtgtccaag 240 ctggactccg gcgtgcccga ccgcttctcc ggctccggct ccggcaccga cttcaccctg 300 aagatctccc gcgtggaggc cgaggacgtg ggcgtgtact actgctggca gggcacccac 360 ttcccccgca ccttcggcca gggcaccaag gtggagatca ag 402

<210> 36 <211> 414 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <223> h3D6 version 1 VH <400> 36 gtggctattt taaaaggtgt ccagtgtgag 60 gtgcagcccg gcggctccct gcgcctgtcc 120 tacggcatgt cctgggtgcg ccaggccccc 180 cgctccggcg gcggccgcac ctactactcc 240 cgcgacaacg ccaagaactc cctgtacctg 300 gccctgtact actgcgtgcg ctacgaccac 360 ggcaccctgg tgaccgtgtc ctcc 414 atggagtttg ggctgagctg gctttttctt gtgcagctgc tggagtccgg cggcggcctg tgcgccgcct ccggcttcac cttctccaac ggcaagggcc tggagtgggt ggcctccatc gacaacgtga agggccgctt caccatctcc cagatgaact ccctgcgcgc cgaggacacc tactccggct cctccgacta ctggggccag 195 ΡΕ1613347

<210> 37 <211> 414 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <223> h3D6 version 2 VH <400> 37 ggetgãgctg gcttfcfciefcfc gtggetstfct fcaaaaggfcgfc ssagbgtg&g €0 gtgcagetgc tggagfceogg egg«g§e«tg gfcg«sge«cg g$ggçfc$<se£ gçgeefcgtse 1.2C fcgcgeegeet. e«ggc£fceác ctfccfccoaac fcaeggemtgfc çcfcgggfcgsg ççaggessce UÔ gs&Mtgs&tC t$Sagfcssgfc ggçetesmfce egcfcCGggsg gcgseogea© <Aaeta*stsee £4 a gsesãf-gtga agggccgett caceafcetec cgcgacaac& ccaag&ac&ç «etgtaectg $09 cagssgaact- ©ccfcgcgçgç agaggacacc gesgfcgtaes act.gçgtgog «fcacg&esac 3§0 fcÃetaçigfçt: eefcçcgacta etggggse&g ggsaccctgg fcgsçssgtgta? ctse 41« <210> 38 <211> 770

<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 38 196 ΡΕ1613347

Het L«U 1 Pro 81y Leu s Ala Itèu Leu Lí!» L®u Ala iô Ala Trp Tfer Ala Arg 15 Alá teu Glu Vai Ho 20 Tisr Aap 9iy Asn 3$ Ala Gly hau Leu Alá M Glu Pro gin Π® ftl* 3S M«t Ha Gya exy Mg 40 Léu ÃSE Mfit Mis Set 45 Asn val Gin Asm Gly 53 E,ya Trp Âsp Ser Asp 55 fXQ Sát Gly TM·· nys so Thr Gyu lie Asp Tb: 3; bys ss fila 3ly lie Lee. 70 Gin Tyr Cyá GXu Glu 73 %%I fyr Pr© Glu Leu 00 ela Ha mx Âen Vai $5 Vai Ala AS» sis vre .90 Vál yht Xle Glu Asn 05 Hp cys by$ Arg Giy 10« Arg Lyss Gin Cvs im Lys Th'; H-iá Pro Siá 110 Phe Vel Xle Ho Tyr 115 arg Cys Leu Vai SXy 120 Gltt Pita Vai S&r Asp IMS Ala Leu Leu vai pre 130 Asp Lys Cys Lye Pias UB 1-ea Mia Gin Glu Arg 140 S4át Ásp Vai cys Glu xhr 145 EÍS Leu Eis Trp ISO lís TliT YáX Ala sya 153 Gin Xfex Cy.s Ser Glu ISO Lys Ser Th.r Ase Leu 155 ais Asp Syr Gly Máfc teu 170 Itsu Prcs Cj's Sly lie 175 Asp Lye pfee Ara Gly :18 b Vai Gin Phs vai 185 Cys Çye Pro Láu Ala 150 Glu Glu Ser Asp AS 7! ÍS5 Ser Ala &SP 200 Ala Glu Glu ÁSp Asp 295 Ser Aap Vál Trp Trp 210 aíy Oly Ala k&p Thií 2X5 ASp Tyr Ala Aap GXy 220 Glu ftsp hys 'Vsl Vál. 225 m « Vai Ala Gin, 230 Gin Glu Glu ?8l Alá 23S Glu vai Gin Gla Glu 240 Glu Ala Asp Asp Asp 345 Glu ASp h$p Glu ABp Gly 250 Asp Glu Vai Glu Glu 355 Glu Ala si» 01¾ Ptq 2€·β Tvx Glu Gin Ala 26$ & Glu Arg Tfer Tfer 270 Ser Ile Alá Tfcr Xhr .27,3 ?nt Th*- Thr Tta Tsxr 2SO íSlu Ser vai Gin, Glu S8S Vai Vai Arg Slti Vsl 350 Cyfi Ser Gin Gin ,5í1«í MB Glu Thr Oly Pro Cys 3Q0 Arg Alá Hat lie Ser &jsg 305 Típ lyr phs Asp 31D V&l flr Gin, Gly Lys 315 Gys Ala P» Phe He 32Ò Tyr Oly aiy Cys sly Gly Asn Arg Aso Aan Ph« Asp Tlsr Glu Glu Τ'/r O/s KéÇ Alá v«l Cy» 340 Gly ler Ala S&fc 345 Ssr Gin Gat Leu Leu 3 SÓ 53 £ kys 'Ihr Thr Gin (31¾ 355 Pre Leu Ala Arg Asp 340 Pr<s Vai .hys Leu Pro 385 Thr Thr Alá Alá 3et .Π0 Vfer Pr<s Asp Alá Vai 375 Aáp lys Tyr Leu Glu 380 Thr P.rp Gly ASp 01a Asa 335 Olá His Alá Mis 330 Ãfcá ain lys Alã 3Uy# 3½ Glu Arg L«u Glu Ma 400 lya Ki.s Arg oiu Arg 405 Mèfe Sás? G.l» Vai Get Arg 410 Glu 7t.'p Glu Glu Ala 4X5 Glu Arcj Glu Ma 1¾¾ 42 0 As» Lei: PTó ij,yg 435 Alá Aap Lya Lys Ma 41 a Vai He Gin Me He 435 Gin Slã lys Vai Glu 440 Ssr inu Glu Gin Glu 443 Ala Ala Asn Glu Arg 453 Gin Gin Leu vai Glu *§£ TM: λΪ.?> Λ»' 8et .Ala Arg 4S0 Vai Glu Alá m Leu Ase 4iS Àep Arg Arg feg 4.70 Leu Ala lea Glu Asn 475 xyr- Ile Tisr Ma Leu 480 197 ΡΕ1613347 âlft Ala Vai Ptre: Pro Arg Pm A*S His Vai PM &sti Met Leu Lvs Lvs 4&5 490 405 Tyr ¥al ATf Ala Sltí Gin lys Asp Arg Gl» His Thr Leu Lys His Phe 500 SOS 518 eia His. Vai Arg MM Vai Asp Pr» Lya l.ys Aís Ala Glii ne Arg Ser SIS 530 635 Gin Vai Met Tkr Ki# Leu Arg V*1 He Tyr Qiu &rg Mét Asa 01» Ser 530 535 MG Ser- Leu leu ?yr ΜΆ vai Pro .Ala Vai Ala Gla Glu Ilfi 0in Ase 545 550 555 560 Slo Vai Asp eiu Ls3tt SfiS Lee. Gin Lys GlU Gin Ásfi ®s7D vyx Ser Mp Asp Vai teu Alia Asa Met Ser Glw Pro Arg lisa ser Tyr Giy Abk Asp Ala sso 5SS 5 se hm Met Pr© Se? Leu Thr Gin Thr Lys ®r Thr Vai 01« Mu Leu pro 5175 600 605 Vai Asa siy Glu PM $%T Leu ÂSp ASp Leu Gin Pro Trp His Ser phe €1.0 ¢15 620 Gly Ala Asp Ser Vai Pro Ala Asa Thr Olu Asn Gltl Vai Ol U Pro ¥ãl 525 «30 SS6 64 ti &sp Ala Atg Pro Ala. Ala Asp A*» SXy Leu Thr Tht km Era Oly ser 645 650 655 Qly Leu 'Thr A®n íla Lys mv Glu Glu 1,1© Ser Sltt Vai Lys Mefc Aep 660 sss 670 .Ala Qlu FM Eis Asp Ser siy •Tyr Glu Vai His Gin Lys Le« 675 600 S85 Vai EM FM GlU Αερ vai. Giy Ser Aao Ly» <sly Ala 11« Ile Oly SFS 605 7 00 Leu «et Vai Oly ciy VSl Vai lie Ala Thr Vai lie Vai. He Thr Leu 785 710 715 720 Vai LftXl Lys Ayss lys οι» Tyi* TM Ser lie His His Oly Vai Vai 7 as 730 735 Olu Vai Asp Ala Ala Vai Thr Pr© Olu, Olu Arg His Lee Ser Lys Met 74« 745 750 Gin Gin Asn «ly Tyr Glu MS. .Pro Thr Tyr Lys ph© PAe <3ltt ola Met

75S 768 7SS ¢1¾ Α&& 770

<210> 39 <211> 40 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <223> iniciador <400> 39 actagtcgac atgaagttgc ctgttaggct gttggtgctg 40

<210> 40 <211> 39 <212> DNA <213> Sequência Artificial <2 2 0 > <223> iniciador 198 ΡΕ1613347 <4 Ο Ο > 40 actagtcgac atggagwcag acacactcct gytatgggt 39

<210> 41 <211> 40 <212 DNA <213> Sequência Artificial <220> <223> iniciador <4 0 0 > 41 actagtcgac atgagtgtgc tcactcaggt cctggsgttg 40 <210> <211> <212> <213> 42 43 DNA Sequência Artificial <220> <223> iniciador <4 0 0 > 42 actagtcgac atgaggrccc ctgctcagwt tyttggmwtc ttg 43 <210> <211> <212> <213> 43 40 DNA Sequência Artificial <220> <223> iniciador <4 0 0 > 43 actagtcgac atggatttwc aggtgcagat twtcagcttc 40 <210> <211> <212> <213> 44 37 DNA Sequência Artificial <220> <223> iniciador <4 0 0 > 44 actagtcgac atgaggtkcy ytgytsagyt yctgrgg 37 <210> <211> <212> <213> 45 41 DNA Sequência Artificial <220> <223> iniciador 199 ΡΕ1613347 <4 Ο Ο > 45 actagtcgac atgggcwtca agatggagtc acakwyycwg g 41 <210> <211> 46 41 <212> <213> DNA Seguência Artificial <220> <223> iniciador <4 0 0 > 46 actagtcgac atgtggggay ctktttycmm tttttcaatt g 41 <210> <211> 47 35 <212> <213> DNA Seguência Artificial <220> <223> iniciador <4 0 0 > 47 actagtcgac atggtrtccw casctcagtt ccttg 35 <210> <211> 48 37 <212> <213> DNA Seguência Artificial <220> <223> iniciador <4 0 0 > 48 actagtcgac atgtatatat gtttgttgtc tatttct 37 <210> <211> <212> <213> 49 38 DNA Seguência Artificial <220> <223> iniciador <4 0 0 > 49 actagtcgac atggaagccc cagctcagct tctcttcc 38 <210> <211> 50 27 <212> <213> DNA Sequência Artificial <220> <223> iniciador 200 ΡΕ1613347 <400> 50 ggatcccggg tggatggtgg gaagatg 27 <210> <211> <212> <213> 51 37 DNA Seguência Artificial <220> <223> iniciador <4 0 0 > 51 actagtcgac atgaaatgca gctgggtcat sttcttc 37 <210> <211> 52 36 <212> <213> DNA Seguência Artificial <220> <223> iniciador <4 0 0 > 52 actagtcgac atgggatgga gctrtatcat sytctt 36 <210> <211> 53 37 <212> <213> DNA Seguência Artificial <220> <223> iniciador <4 0 0 > 53 actagtcgac atgaagwtgt ggttaaactg ggttttt 37 <210> <211> <212> <213> 54 35 DNA Seguência Artificial <220> <223> iniciador <4 0 0 > 54 actagtcgac atgractttg ggytcagctt grttt 35 <210> <211> 55 40 <212> <213> DNA Sequência Artificial <220> <223> iniciador 201 ΡΕ1613347 <400> 55 actagtcgac atggactcca ggctcaattt agttttcctt 40 <210> <211> <212> <213> 56 37 DNA Seguência Artificial <220> <223> iniciador <4 0 0 > 56 actagtcgac atggctgtcy trgsgctrct cttctgc 37 <210> <211> 57 36 <212> <213> DNA Seguência Artificial <220> <223> iniciador <4 0 0 > 57 actagtcgac atggratgga gckggrtctt tmtctt 36 <210> <211> 58 33 <212> <213> DNA Seguência Artificial <220> <223> iniciador <4 0 0 > 58 actagtcgac atgagagtgc tgattctttt gtg 33 <210> <211> <212> <213> 59 40 DNA Seguência Artificial <220> <223> iniciador <4 0 0 > 59 actagtcgac atggmttggg tgtggamctt gctattcctg 40 <210> <211> 60 37 <212> <213> DNA Sequência Artificial <220> <223> iniciador 202 ΡΕ1613347 <400> 60 actagtcgac atgggcagac ttacattctc attcctg 37

<210> 61 <211> 38 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <223> iniciador <4 00> 61 actagtcgac atggattttg ggctgatttt ttttattg 38

<210> 62 <211> 37 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <223> iniciador <400> 62 actagtcgac atgatggtgt taagtcttct gtacctg 37

<210> 63 <211> 27 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <223> iniciador <400> 63 ggatcccggg agtggataga ctgatgg 27

Lisboa, 17 de Novembro de 2010

Claims (11)

1. ΡΕ1613347 1 REIVINDICAÇÕES 1. Uma imunoglobulina humanizada para uso em terapia, que compreende uma região variável de cadeia pesada como apresentada nos resíduos 1-119 da SEQ ID NO:12 e uma região variável de cadeia leve como apresentada nos resíduos 1-112 da SEQ ID NO: 11, em que a imunoglobulina compreende uma região Fc que compreende uma modificação de aminoácido no resíduo de aminoácido 234, 235, 236, ou 237, com respeito a IgGl 3D6 humanizado de modo que a modificação reduza a ligação a ligação a um receptor FcyRI.
2. 2. A imunoglobulina humanizada da reivindicação 1, que é do isotipo IgGl humano.
3. 3. Uma imunoglobulina quimérica para uso em terapia, que compreende as sequências de região variável da imunoglobulina 3D6, apresentadas como resíduos 1 a 112 da SEQ ID N0:2 e resíduos 1 a 119 da SEQ ID N0:4 e sequências de região constante da cadeia pesada e da cadeia leve humanas, em que a sequência da região constante da cadeia pesada humana compreende uma região Fc, que compreende uma modificação de aminoácido no resíduo de aminoácido 234, 235, 236, ou 237 com respeito a IgGl 3D6 quimérico, de modo que a imunoglobulina modificada tenha ligação reduzida a um receptor FcyRI.
4. 4. A imunoglobulina humanizada da reivindicação 1 ou reivindicação 2 para uso na prevenção ou tratamento de uma doença amiloidogénica. 2 ΡΕ1613347
5. 5. A imunoglobulina humanizada da reivindicação 4 em que a doença amiloidogénica é doença de Alzheimer.
6. 6. A imunoglobulina humanizada da reivindicação 4 ou reivindicação 5 em que a dose efectiva é 1 mg/kg ou 10 mg/kg de peso corporal.
7. 7. Uma composição farmacêutica que compreende a imunoglobulina humanizada da reivindicação 1 ou reivindicação 2 e um veiculo farmacêutico.
8. 8. Uma molécula ou moléculas de ácido nucleico isolada(s) que codificam a cadeia pesada e a cadeia leve da imunoglobulina de qualquer das reivindicações precedentes.
9. 9. Um vector compreendendo a molécula de ácido nucléico da reivindicação 8.
10. 10. Uma célula hospedeiro compreendendo a molécula de ácido nucléico da reivindicação 8.
11. 11. Um método de produzir um anticorpo, que compreende cultivar a célula hospedeiro da reivindicação 10 em condições tais que o anticorpo seja produzido e o isolamento do referido anticorpo da célula hospedeiro ou da cultura. Lisboa, 17 de Novembro de 2010